【手続補正書】
【提出日】平成21年4月16日(2009.4.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遠隔サンプル由来のＤＮＡ断片を提供する方法であって、
ＤＮＡを含む遠隔サンプルを提供することと、
前記遠隔サンプルからＤＮＡを単離することと、
メチル化シトシンと非メチル化シトシンの区別を可能にする試薬または酵素によって、単離したＤＮＡを処理することと、
を含む、遠隔サンプル由来のＤＮＡ断片を提供する方法。
【請求項２】
前記遠隔サンプルのＤＮＡは、ＤＮＡの約５％未満、約３％未満、約１％未満、または約０．１％未満が限定された細胞、細胞集団、組織、または器官に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記遠隔サンプルは、１ｍｌ中約１００ｎｇ未満のＤＮＡ、１ｍｌ中約６０ｎｇ未満のＤＮＡ、または１ｍｌ中約１０ｎｇ未満のＤＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＤＮＡの損失を、高収量のＤＮＡによって特徴付けられるＤＮＡの単離方法の選択、高精度および高信頼性によって特徴付けられる非メチル化シトシンとメチル化シトシンの区別をする方法の選択、高精度なピペット操作、ピペット操作器具の再使用、およびＤＮＡと接触した器具の再使用から成る群から選択される少なくとも１つの方法によって最小限にする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記遠隔サンプルが、血液サンプル、血漿サンプル、血清サンプル、体液サンプル、唾液サンプル、尿サンプル、精液サンプル、胸腔液サンプル、胸腔液サンプル、脳脊髄液サンプル、上皮表面の塗抹標本、喀痰試料、糞便サンプル、射精サンプル、涙液サンプル、汗サンプル、リンパ液サンプル、気管支洗浄液サンプル、胸水サンプル、髄膜液サンプル、腺液サンプル、微細針吸引液サンプル、乳頭吸引液サンプル、髄液サンプル、結膜液サンプル、膣液サンプル、十二指腸液サンプル、膵液サンプル、および胆液サンプルを含む群から選択される少なくとも１つのサンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記遠隔サンプルが血漿であり、前記遠隔サンプルの提供が、
個体から少なくとも約５ｍｌ、約１０ｍｌ、約１５ｍｌ、約２０ｍｌ、約２５ｍｌ、約３０ｍｌ、約３５ｍｌ、約４０ｍｌ、約４５ｍｌ、約５０ｍｌの血液を得ることと、
穏やかに混合することを含め、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を血液に加えることと、
穏やかに混合することを含め、血液を最終濃度約２．２μｍｏｌ／ｌ、約３．２μｍｏｌ／ｌ、約３．７μｍｏｌ／ｌ、約４．０μｍｏｌ／ｌ、約４．５μｍｏｌ／ｌ、約４．９μｍｏｌ／ｌ、約５．４μｍｏｌ／ｌ、約５．９μμｍｏｌ／ｌ、または約６．９μｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡ二カリウム（エチレンジアミン四酢酸二カリウム）に調節することと、
血液‐ＥＤＴＡ混合物を約７５０×ｇ、約１０００×ｇ、約１５００×ｇ、または約２０００×ｇで約４分、約８分、約１０分、約１２分、または約２０分間、約１℃、約４℃、約７℃、約１０℃、約１５℃、約２１℃、または約２７℃で遠心分離することと、
前記血漿を新しい容器に移動することと、
前記血漿を約７５０×ｇ、約１０００×ｇ、約１５００×ｇ、または約２０００×ｇで約４分、約８分、約１０分、約１２分、または約２０分間、約１℃、約４℃、約７℃、または約１０℃で遠心分離することと、
再遠心分離した血漿を新しい容器に移動することと、
血漿含有サンプルを約０℃、約２℃、約４℃、約６℃、または約１０℃で冷却することと、
血漿含有サンプルを少なくとも約−１０℃、約−２０℃、約−５０℃、約−６０℃、約−７０℃、約−８０℃、約−９０℃、または約−１９６℃で凍結、保管、または運搬する、
個体から血液を得ることから対応する再遠心分離した血漿を凍結するまでの遠隔サンプルの提供を約１、約２、約３、約４、約５、約６、または約８時間以内に実施することのうち、１つ以上を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記遠隔サンプルが尿であり、前記遠隔サンプルの提供が、
前立腺の触診、前立腺マッサージ、またはその両方を前立腺の中心から前立腺の左側、前立腺の右側または両側へ約１０秒、約３０秒、約５０秒、約６０秒、約７５秒、または約１２０秒間実施することと、
排せつされた尿の最初の約５ｍｌ、約１０ｍｌ、約１５ｍｌ、約２０ｍｌ、約２５ｍｌ、約３０ｍｌ、約４０ｍｌを収集することと、
ＥＤＴＡを前記尿に加えることと、
前記尿を最終濃度約３ｍｍｏｌ／ｌ、約６ｍｍｏｌ／ｌ、約７ｍｍｏｌ／ｌ、約８ｍｍｏｌ／ｌ、約９ｍｍｏｌ／ｌ、約９．８０ｍｍｏｌ／ｌ、約１０ｍｍｏｌ／ｌ、約１１ｍｍｏｌ／ｌ、約１２ｍｍｏｌ／ｌ、約１３ｍｍｏｌ／ｌ、約１４ｍｍｏｌ／ｌ、約１８ｍｍｏｌ／ｌ、または約２５ｍｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）でｐＨ約５．０、約６．０、約７．０、約７．５、約８．０、約８．５、約９．０、約１０に調節することと、
尿含有サンプルを約０℃、約２℃、約４℃、約６℃、または約１０℃に冷却することと、
尿含有サンプルを少なくとも約−２０℃、約−５０℃、約−６０℃、約−７０℃、約−８０℃、約−９０℃、または約−１９６℃で凍結、保管または運搬することと、
排せつされた尿の最初のｍｌを収集することから対応する尿‐ＥＤＴＡ混合物を凍結するまでの尿サンプルの提供を約１５、約３０、約４５、約６０、約７５、約９０、または約１２０分以内に実施することのうち、１つ以上を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記遠隔サンプルが、前記遠隔サンプルの提供の後でサブサンプルに分けられる、及び／又は、前記遠隔サンプルまたは前記遠隔サンプルの少なくとも１つの成分が、遠隔サンプルの提供の後で濃縮される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
濃縮が、限外ろ過、体積減少、またはその両方を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＤＮＡの単離が、
前記遠隔サンプルをプロテアーゼで処理することと、
前記遠隔サンプルを少なくとも１つのタンパク質変性試薬または溶液で処理することと、
遠隔サンプルの前記ＤＮＡをＤＮＡ精製装置に接触させることと、
前記ＤＮＡを前記ＤＮＡ精製装置で洗浄することと、
前記ＤＮＡを前記ＤＮＡ精製装置から回収することのうち、１つ以上を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
非メチル化シトシンをウラシルへ変換し、メチル化シトシンをそのままにする前記試薬が、バイサルファイト試薬であり、
バイサルファイト試薬によるＤＮＡの処理が、
ＤＮＡを含む約１０〜約２５０μｌの溶液と約４５〜約７５０μｌのバイサルファイト溶液を混合することを含み、前記バイサルファイト溶液は、約４．８３〜約４．９３ｍｏｌ／ｌの亜硫酸水素を含んで約５．４５〜約５．５０の範囲のｐＨを有し、
約５〜約５００μｌの有機ラジカルスカベンジャー液を加えることを含み、前記有機ラジカルスカベンジャー液は、有機溶媒および約１０〜約７５０ｍｍｏｌ／ｌの６‐ヒドロキシ‐２，５，７，８‐テトラメチル‐クロマン‐２‐カルボン酸を含み、
約８５〜約１００℃の初期温度上昇を含め、約８５〜約１００℃までの約２〜約５回のさらなる温度上昇を伴い（いずれの場合も約０．５〜約１０分）約０〜約８０℃の温度範囲で反応が行われる温度プロトコルを、約２〜約１８時間適用することを含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前期メチル化状態の区別を可能にする試薬または酵素でのＤＮＡの処理が、処理したＤＮＡの精製を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記遠隔サンプルのＤＮＡにおける少なくとも１つのシトシンであって、それぞれが限定された位置にあるシトシンのメチル化状態を決定することと、
前記遠隔サンプルのＤＮＡにおけるメチル化パターンを決定することのうち、少なくとも１つを含む、前記遠隔サンプルのＤＮＡにおける少なくとも１つのシトシンのメチル化状態、メチル化パターン、またはその両方を決定するための、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ＣｐＧの位置が１つのＤＮＡ断片内に含まれ、シスに集中し、メチル化パターンが状態Ａによって特徴付けられる細胞、細胞集団、組織、または個体由来のＤＮＡと状態Ｂによって特徴付けられる細胞、細胞集団、組織、または個体由来のＤＮＡで異なる、少なくとも２つの前記ＣｐＧの位置のメチル化状態を含む少なくとも１つのメチル化パターンの同定と、
カットオフ値と同等またはそれ以上のパーセント値が状態Ａを示し、カットオフ値未満のパーセント値が状態Ｂを示す、またはカットオフ値未満のパーセント値が状態Ａを示し、カットオフ値と同等またはそれ以上のパーセント値が状態Ｂを示す、ＤＮＡ断片の混合物内で同定したメチル化パターンによって特徴付けられるＤＮＡ断片のパーセントに対するカットオフ値を選択することとをさらに含む、マーカーを同定するための請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
状態Ａ、状態Ｂ、またはその両方が、健全な状態または少なくとも１つの有害事象であって、前記有害事象は、望ましくない薬物間相互作用、癌、増殖性疾患またはそれに伴う関連疾患、ＣＮＳ機能不良、損傷または疾患、攻撃性の症状または行動障害、脳障害の臨床的、心理的および社会的因果関係、精神障害および人格障害、認知症および／または関連症候群、消化管機能不全の循環器疾患、呼吸器系の機能不良、損傷または疾患、病変、炎症、感染、免疫および／または回復、発育過程異常としての体の機能不良、損傷または疾患、皮膚、筋肉、結合組織または骨の機能不良、損傷または疾患、内分泌および代謝の機能不良、損傷または疾患、および頭痛または性的機能不良から成る群から選択される少なくとも１つのカテゴリーを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも１つの核酸を増幅する方法であって、
少なくとも１つの核酸分子を含む核酸サンプルを提供することと、
前記サンプル由来の少なくとも１つの核酸分子を前記核酸分子内のメチル化塩基と前記核酸分子内の非メチル化塩基を区別する酵素または試薬で処理することと、
前記サンプル由来の少なくとも１つの核酸分子の少なくとも１つの鎖を少なくとも１つのヌクレオチドまたはＰＮＡ‐モノマーによって伸長することと、
少なくとも１つの伸長した核酸分子を増幅することと、
を含む、少なくとも１つの核酸を増幅する方法。
【請求項１７】
前記伸長が、少なくとも１つの核酸の少なくとも１つの鎖が、
１つ以上の単一ヌクレオチドまたはＰＮＡ‐モノマー、
１つ以上のオリゴヌクレオチドまたはＰＮＡ‐オリゴマー、
提供される核酸サンプル由来の第２の核酸、または
それらの組み合わせによって伸長することを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１８】
前記伸長が、単独で触媒したテンプレートである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記伸長が、トランスフェラーゼ、リン含有基を移動させるトランスフェラーゼ、ヌクレオチジルトランスフェラーゼ、ＤＮＡヌクレオチジルエキソトランスフェラーゼ、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）、リボヌクレオチドトランスフェラーゼ活性を有する酵素、ポリリボヌクレオチドヌクレオチジルトランスフェラーゼ、ｔＲＮＡヌクレオチジルトランスフェラーゼ、ＲＮＡウリジルトランスフェラーゼ、リガーゼ、リン酸エステル結合を形成するリガーゼ、ＤＮＡリガーゼ、ＡＴＰ依存ＤＮＡリガーゼ、単鎖ＤＮＡリガーゼ、分子内環状化を触媒するＡＴＰ依存単鎖ＤＮＡリガーゼ、及びＣｉｒｃリガーゼｓｓＤＮＡリガーゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素を用いて触媒される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記メチル化塩基と非メチル化塩基を区別する酵素または試薬が、バイサルファイト試薬である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記少なくとも１つの伸長した核酸分子の増幅が、増幅法、ＰＣＲ法、等温増幅法、ＮＡＳＢＡ法、ＬＣＲ法、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される少なくとも１つの方法の使用を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
少なくとも１つのＤＮＡ分子を含むＤＮＡサンプルを提供することと、
前記提供される少なくとも１つのＤＮＡ分子の少なくとも１つの鎖を少なくとも１つの単一ヌクレオチドまたはＰＮＡ‐モノマーによって伸長することと、
前記伸長した少なくとも１つのＤＮＡ鎖を前記ＤＮＡ分子内のメチル化シトシンと前記ＤＮＡ分子内の非メチル化シトシンを区別する酵素または試薬で処理することと、
少なくとも１つの伸長した鎖を含む少なくとも１つの処理したＤＮＡ分子を増幅することと、
を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
容器と、
尿含有サンプルを収集するための１つ以上の溶液、物質、装置またはそれらの組み合わせと、
血漿含有サンプルを収集するための１つ以上の溶液、物質、装置またはそれらの組み合わせと、
ＤＮＡ単離のための１つ以上の溶液、物質、装置またはそれらの組み合わせと、
ＤＮＡのバイサルファイト処理のための１つ以上の溶液、物質、装置またはそれらの組み合わせと、
バイサルファイト変換したＤＮＡの増幅のための１つ以上の溶液、物質、装置またはそれらの組み合わせと、
メチル化状態またはメチル化パターン決定のための１つ以上の溶液、物質、装置またはそれらの組み合わせと、
前請求項の１つに記載される方法を実行するための説明のうち、少なくとも１つを含む、請求項１、請求項１７、またはその両方の方法を実行するためのキット。
【請求項２４】
少なくとも１つのＤＮＡのメチル化状態、少なくとも１つのＤＮＡのメチル化レベル、または少なくとも１つのＤＮＡメチル化パターンの分析のための前請求項の１つに記載される方法またはキットの使用。
【請求項２５】
ａ）病変した細胞、細胞集団、組織、または器官由来のＤＮＡ断片の混合物内にある限定されたメチル化パターンによって特徴付けられるＤＮＡ断片の割合を検出することと、
ｂ）健康な細胞、細胞集団、組織、または器官由来のＤＮＡ断片の混合物内にある限定されたメチル化パターンによって特徴付けられるＤＮＡ断片の割合を検出することと、
ｃ）前記病変した細胞、細胞集団、組織、または器官由来のＤＮＡの割合と前記健康な細胞、細胞集団、組織、または器官由来のＤＮＡの差異に基づいて指標特異的対象を明確にすることと、
を含む、指標特異的対象を同定するための請求項２５に記載の方法またはキットの使用。
【請求項２６】
患者または個体に関して、状態を診断する、状態を予知する、治療反応を予測する、状態の素因を診断する、状態の進行を診断する、状態を等級分けする、状態を病期分類する、状態の区分、状態の特性化、またはそれらの組み合わせのうち、少なくとも１つのための請求項２５に記載される方法またはキットの使用であり、状態が健全な状態または有害事象であって、有害事象が、望ましくない薬物間相互作用、癌、増殖性疾患またはそれに伴う関連疾患、ＣＮＳ機能不良、損傷または疾患、攻撃性の症状または行動障害、脳障害の臨床的、心理的および社会的因果関係、精神障害および人格障害、認知症および／または関連症候群、消化管機能不全の循環器疾患、呼吸器系の機能不良、損傷または疾患、病変、炎症、感染、免疫および／または回復、発育過程異常としての体の機能不良、損傷または疾患、皮膚、筋肉、結合組織または骨の機能不良、損傷または疾患、内分泌および代謝の機能不良、損傷または疾患、および頭痛または性的機能不良を含む群から選択される少なくとも１つのカテゴリーを含む、使用。