(57)【要約】  本発明は、筋ジストロフィーの症状を示している個体、又は筋ジストロフィーを発症する傾向を有する個体を特定するための方法であって、個体由来の組織試料中の、ｐａｘ−７、カベオリン−３、及び／又は速筋ミオシンから選択される１つ又は複数のタンパク質の発現レベルを決定することを含む方法を記述する。筋ジストロフィーを治療するためのカベオリン−３の使用、及び該化合物を含有する組成物の使用も特許請求される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
筋ジストロフィーの症状を示している個体を特定するための、筋ジストロフィーの治療又は進行をモニターするための、又は筋ジストロフィーを発症する傾向を有する個体を特定する方法であって、前記個体由来の組織試料中の、ｐａｘ−７、カベオリン−３、及び／又は速筋ミオシンから選択される１つ又は複数のタンパク質の発現レベルを決定することを含む方法。
【請求項２】
ｐａｘ−７が測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
カベオリン−３が測定される、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
速筋ミオシンが測定される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記組織試料中のインスリン様増殖因子−２（Ｉｇｆ−２）、ＣＤＫＮ１ｃ／Ｐ５７ｋｉｐ２、及び／又はｐＡｋｔの１つ又は複数の発現レベルを決定することをさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記筋ジストロフィーが、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）及び／又は肢帯筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記組織試料が、乳児の出生前又は出生後の前記乳児に由来する、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記タンパク質の発現レベルが、イムノアッセイにより決定される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記タンパク質の１つ又は複数の発現レベルが、
（ｉ）前記試料を免疫染色することにより、及び／又は
（ｉｉ）タンパク質の免疫ブロットにより、
決定されることを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記各タンパク質の発現レベルが、定量ポリメラーゼ連鎖反応（ＱＰＣＲ）で決定される、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
ｐａｘ−７、カベオリン−３、及び／若しくは速筋ミオシンの２つ以上に特異的な２つ以上の抗体、又はｐａｘ−７、カベオリン−３、及び／若しくは速筋ミオシンの２つ以上をコードするｍＲＮＡに特異的な２対以上のＰＣＲプライマーを含む、前記請求項のいずれかに記載の方法で使用するためのキット。
【請求項１２】
前記タンパク質が、ｐａｘ−７タンパク質又はｐａｘ−７をコードするｍＲＮＡである、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
前記タンパク質が、カベオリン−３又はカベオリン−３をコードするｍＲＮＡである、請求項１１又は１２に記載のキット。
【請求項１４】
前記タンパク質が、速筋ミオシン又は速筋ミオシンをコードするｍＲＮＡである、請求項１１〜１３に記載のキット。
【請求項１５】
パラホルムアルデヒドとともに、ｐａｘ−７タンパク質に特異的な抗体を含む、請求項
１〜７に記載の方法で使用するためのキット。
【請求項１６】
Ｉｇｆ−２に特異的な抗体又はＰＣＲプライマー対を含む、請求項１１〜１５に記載のキット。
【請求項１７】
チラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）用の１つ又は複数の試薬を含む、請求項１１〜１６に記載のキット。
【請求項１８】
患者にカベオリン−３を投与すること、又は患者のカベオリン−３発現を増加させることを含む、筋ジストロフィーを治療する方法。
【請求項１９】
薬学的に許容される担体と組み合わせて、カベオリン−３を含む医薬製剤。
【請求項２０】
筋ジストロフィーを治療するために使用されるカベオリン−３。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
アッセイ
本発明は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）及び肢帯筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）等の筋ジストロフィーを有するか又は発症する可能性が高い個体を特定するための方法、及びアッセイキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、筋細胞膜貫通型ジストロフィン−糖タンパク質複合体（ＤＧＣ）の機能障害に関連した衰弱性先天性疾患の最も重篤なファミリーである。典型的なＤＭＤは、骨格筋肉組織全体に影響を与え、ＤＧＣ、ジストロフィンの本質的な細胞内成分の喪失に起因する（Hoffman et al., 1987）。症状は、初期の（約３歳）骨格筋機能の進行性障害を特徴とし、広範な筋損傷に結び付き、若年死（通常は２０歳代）を引き起こす。しかしながら、一般的に呼吸筋の機能不全から生じる合併症が死院となり、ＤＭＤを有する患者の９５％は心筋症を発生し、そのうち１０〜３０％の症例でそれが死亡の主原因となる（Cox and Kunkel, 1997）。ＤＭＤのジストロフィン欠損モデルであるｍｄｘマウスは、心筋症；線維再生の勃発に関連する骨格筋ジストロフィー；線維症；骨格筋筋芽細胞の過剰増殖及びアポトーシスを含むＤＭＤの出生後特徴の多くを示す（Harper et al., 2002; Smith et al., 1995）。表現型は、ｍｄｘの寿命が野生型
と比べて短縮されるものの、ヒトＤＭＤほど重篤ではない（Chamberlain et al., 2007）。カベオリン−３の喪失は、罹患筋肉群が主に肢帯及び心臓である軽度な形態のＭＤ、ＬＧＭＤ−１ｃをもたらし、カベオリン−３欠損マウス（ｃａｖ−３-/-）は、ＬＧＭＤ、
Ｔ管欠損、心筋症、及び骨格筋アポトーシスを示す（Hagiwara et al., 2000; Minetti et al., 2002）。
【０００３】
胚骨格筋は、体節の皮筋板領域に由来する（Cossu et al., 1996; Hollway and Currie, 2003）。ニワトリ胚では、真皮性筋節の全ての領域は、時間依存的な様式で筋原性前駆体をこのプロセスに提供すると考えられる（Gros et al., 2004）。ジストロフィンは、
Ｅ９．５由来の胚体節で最初に発現され、従って初期筋形成に機能を有する場合がある（Huang et al., 2000; Ilsley et al., 2002）。筋板は、周囲組織により分泌される誘導
因子の制御下で、それぞれ（Ｅ１０．５から）軸上（深背筋）筋肉、及び（Ｅ１１．５から）軸下（肢、腹部、横隔膜）筋肉を生成する（ｍｙｆ−５+）幹細胞集団になる細胞を
産生する（Hollway and Currie, 2003で概説されている）。
【０００４】
哺乳類胚骨格筋分化では、軸下系統を生成して一次筋管の足場を産生し、その後多数の二次筋管を産生する２つの筋形成急増があると考えられており、それらは新生筋肉の大部分を構成する（Cossu et al., 1996）。二次筋管は、単一のより大きな一次筋管の周囲でまとまって形成する、一次筋管より長くてより薄い、形態学的に異なる筋管のサブセットである（Cho et al., 1994）。
【０００５】
筋管分化は、機能的な筋肉幹細胞集団の存在に依存する。Ｍｙｆ−５は、体節で発現され、Ｅ８．５における最も初期の筋原性制御因子（ＭＲＦ）であり、筋肉分化の前に見出される唯一のＭＲＦであり、一次及び二次筋形成の両方の全体にわたって胚筋肉群全てにおいて存続する（Cossu et al., 1996）。従って、Ｍｙｆ−５は、胚筋芽細胞集団の良好なマーカーである。系統分析により、衛星細胞の大多数は、体節に由来することが示唆されている（Armand et al., 1983）。広範な証拠により、今では、成体衛星細胞集団の、
特にその修復機能の正しい機能性に不可欠であるものとして、ｐａｘ−７＋細胞集団が関連付けられている（Zammit et al., 2006に概説されている）。Ｐａｘ−７は、筋形成の
転写因子、抑制因子であり、成体骨格筋幹細胞集団（「衛星」細胞）の維持及び特化に重要な役割を果たし、Ｅ１１．５由来の体節から出現する未分化筋肉幹細胞で発現される（Merrick et al., 2007: Relaix et al., 2006; Seale et al., 2000）。
【０００６】
個々の骨格筋群の機能の特異性は、妊娠後期中に開始されるプロセスである、異なる筋管への速筋ミオシンアイソフォームの適切な局在化に依存する（Merrick et al., 2007）。哺乳動物胚では、発生中（胚性及び新生児性）ミオシンアイソフォームは、成体速筋ミオシンアイソフォームを有する新生二次筋管で同時発現される（Cho et al., 1994）。後期段階では、発生中ミオシンアイソフォームは下方制御され、筋肉特異的パターンで成体ミオシン重鎖（ＭｙＨＣ）アイソフォームにより置換され、このプロセスは出生後数週間になるまで終了しない（Agbulut et al., 2003; Merrick et al., 2007）。胚心臓は、時間的に制御された様式で、２つのミオシンアイソフォーム（心筋ミオシンα及び遅筋／心筋ミオシンβ）を発現する。β−心筋ミオシンの突然変異は、心筋症に関与する（Geisterfer-Lowrance et al., 1990）。
【０００７】
ジストロフィンは、筋細胞膜の細胞内側でジストログリカンのベータサブユニットと結合し、細胞外マトリックスを骨格筋筋管のアクチン細胞骨格に結合させる多機能タンパク質複合体であるＤＧＣの本質的な成分である（Ervasti and Cambell, 1993）。出生後の
筋肉では、ジストロフィン欠乏は、ＤＧＣの完全な解体、及び大多数のＤＧＣタンパク質の二次的下方制御をもたらす（Ohlendieck et al., 1993）。カベオリン−３は、骨格筋
カベオラ及びＤＧＣの両方に局在化し、特異的ＷＷドメインにより、ジストロフィンを認識及び結合するβ−ジストログリカンｃ−末端の同じＰＰＸＹモチーフに結合し、従ってジストロフィンとβ−ジストログリカンとの相互作用を阻止する（Jung et al., 1995; Sotgia et al., 2000）。
【０００８】
β−ジストログリカン結合部位に対する、カベオリン−３とジストロフィンとの競合的相互作用は、筋肉発生の幾つかの局面に重要である可能性があるが、これは、広範には研究されていない。３つの遺伝子は全て、ニワトリ胚、マウス胚、ゼブラフィッシュ胚、及びツメガエル胚で発生の初期に発現される（Biederer et al., 2000; Houzelstein et al., 1992; Nixon et al., 2005; Razani et al., 2002; Shin et al., 2003; Anderson et
al., 2007）。ゼブラフィッシュでは、これらタンパク質のいずれかの喪失が、筋形成に障害を起こし、肉眼的筋異常を引き起こすことが示されており、マウスでは、ジストログリカン欠乏が初期胚致死に結び付く（Bassett et al., 2003; Nixon et al., 2005; Parsons et al., 2002; Williamson et al., 1997）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Agbulut, O., Noirez, P., Beaumont, F. and Butler-Browne, G. (2003). Myosin heavy chain isoforms in postnatal muscle development of mice. Biol Cell 95, 399-406.
【非特許文献２】Anderson, C, Winder, S. J., and Borycki, A-G. (2007). Dystroglycan Protein Distribution Coincides with Basement Membranes and Muscle Differentiation During Mouse Embryogenesis Devel. Dynamics 236, 2627-2635.
【非特許文献３】Aravamudan, B., Volonte, D., Ramani, R., Gursoy, E., Lisanti, M. P., London, B. and Galbiati, F. (2003). Transgenic overexpression of caveolin-3 in the heart induces a cardiomyopathic phenotype. Hum MoI Genet 12, 2777-88.
【非特許文献４】Armand, O., Boutineau, A. M., Mauger, A., Pautou, M. P. and Kieny, M. (1983). Origin of satellite cells in avian skeletal muscles. Arch Anat Microsc Morphol Exp 72, 163-81.
【非特許文献５】Baghdiguian, S., Martin, M., Richard, I., Pons, F., Astier, C, Bourg, N., Hay, R. T., Chemaly, R., Halaby, G., Loiselet, J. et al. (1999). Calpain 3 deficiency is associated with myonuclear apoptosis and profound perturbation of the IkappaB alpha/NF-kappaB pathway in limb-girdle muscular dystrophy type 2A. Nat Med S, 503-11.
【非特許文献６】Bassett, D. L, Bryson-Richardson, R. J., Daggett, D. F., Gautier, P., Keenan, D. G. and Currie, P. D. (2003). Dystrophin is required for the formation of stable muscle attachments in the zebrafish embryo. Development 130, 5851-60.
【非特許文献７】Biederer, C. H., Ries, S. J., Moser, M., Florio, M., Israel, M. A., McCoπnick, F. and Buettner, R. (2000). The basic helix-loop-helix transcription factors myogenin and Id2 mediate specific induction of caveolin-3 gene expression during embryonic development. J. Biol Chem 275, 26245-51.
【非特許文献８】Chamberlain, J. S., Metzger, J., Reyes, M., Townsend, D. and Faulkner, J. A. (2007). Dystrophin-deficient mdx mice display a reduced life span and are susceptible to spontaneous rhabdomyosarcoma. Faseb J 21, 2195-204.
【非特許文献９】Chan, S., Head, S. and Morley, J. (2007). Branched fibers in dystrophic mdx muscle are associated with a loss of force following lengthening contractions. Am J Physiol Cell Physiol.
【非特許文献１０】Cho, M., Hughes, S. M., Karsch-Mizrachi, I., Travis, M., Leinwand, L. A. and Blau, H. M. (1994). Fast myosin heavy chains expressed in secondary mammalian muscle fibers at the time of their inception. JCe// Sci 107 ( Pt 9), 2361-71.
【非特許文献１１】Cossu, G., Tajbakhsh, S. and Buckingham, M. (1996). How is myogenesis initiated in the embryo? Trends Genet 12, 218-23.
【非特許文献１２】Cox, G. F. and Kunkel, L. M. (1997). Dystrophies and heart disease. Curr Opin Cardiol 12, 329-43.
【非特許文献１３】Cuda, G., Fananapazir, L., Zhu, W. S., Sellers, J. R. and Epstein, N. D. (1993). Skeletal muscle expression and abnormal function of beta-myosin in hypertrophic cardiomyopathy. J. Clin Invest 91, 2861-5.
【非特許文献１４】Cusella-De Angelis, M. G., Lyons, G., Sonnino, C, De Angelis, L., Vivarelli, E., Farmer, K., Wright, W. E., Molinaro, M., Bouche, M., Buckingham, M. et al. (1992). MyoD, myogenin independent differentiation of primordial myoblasts in mouse somites. J Cell Biol 116, 1243-55.
【非特許文献１５】Ervasti, J. and Campbell, K. (1993). A role for the dystrophin-glycoprotein complex as a transmembrane linker between laminin and actin. Journal of Cell Biology 122, 809-823.
【非特許文献１６】Finsterer, J., Gelpi, E. and Stollberger, C. (2005). Left ventricular hypertrabeculation/noncompaction as a cardiac manifestation of Duchenne muscular dystrophy under non-invasive positive-pressure ventilation. Acta Cardiol 60, 445-8.
【非特許文献１７】Frock, R. L., Kudlow, B. A., Evans, A. M., Jameson, S. A., Hauschka, S. D. and Kennedy, B. K. (2006). Lamin A/C and emerin are critical for skeletal muscle satellite cell differentiation. Genes Dev 20, 486-500.
【非特許文献１８】Galbiati, F., Engleman, J., Volonte, D., Zhang, X., Minetti, C, Li, M., Hou, H., Kneitz, B., Edelmann, W. and Lisanti, M. (2001). Caveolin-3 Null Mice Show a Loss of Caveolae, Changes in the Microdomain Distribution of the Dystrophin-Glycoprotein Complex, and T-tubule Abnormalities. The Journal of Biological Chemistry 276, 21425-21433.
【非特許文献１９】Galbiati, F., Volonte, D., Chu, J. B., Li, M., Fine, S. W., Fu, M., Bermudez, J., Pedemonte, M., Weidenheim, K. M., Pestell, R. G. et al. (2000). Transgenic overexpression of caveolin-3 in skeletal muscle fibers induces a Duchenne-like muscular dystrophy phenotype. Proc Natl Acad Sci USA 97, 9689-94.
【非特許文献２０】Geisterfer-Lowrance, A. A., Kass, S., Tanigawa, G., Vosberg, H. P., McKenna, W., Seidman, C. E. and Seidman, J. G. (1990). A molecular basis for familial hypertrophic cardiomyopathy: a beta cardiac myosin heavy chain gene missense mutation. Cell 62, 999-1006.
【非特許文献２１】Glass, D. (2005). A signalling role for dystrophin: inhibiting skeletal muscle atrophy pathways. Cancer Cell 5, 351-2.
【非特許文献２２】Gros, J., Scaal, M. and Marcelle, C. (2004). A two-step mechanism for myotome formation in chick. Dev Cell 6, 875-82.
【非特許文献２３】Gross, M. K., Moran-Rivard, L., Velasquez, T., Nakatsu, M. N., Jagla, K. and Goulding, M. (2000). Lbxl is required for muscle precursor migration along a lateral pathway into the limb. Development 127, 413-24.
【非特許文献２４】Hadchouel, J., Carvajal, J. J., Daubas, P., Bajard, L., Chang, T., Rocancourt, D., Cox, D., Summerbell, D., Tajbakhsh, S., Rigby, P. W. et al. (2003). Analysis of a key regulatory region upstream of the Myf5 gene reveals multiple phases of myogenesis, orchestrated at each site by a combination of elements dispersed throughout the locus. Development 130, 3415-26.
【非特許文献２５】Hagiwara, Y., Sasaoka, T., Araishi, K., Imamura, M., Yorifuji, H., Nonaka, L, Ozawa, E. and Kikuchi, T. (2000). Caveolin-3 deficiency causes muscle degeneration in mice. Hum MoI Genet 9, 3047-54.
【非特許文献２６】Harper, S. Q., Hauser, M. A., DelloRusso, C, Duan, D., Crawford, R. W., Phelps, S. F., Harper, H. A., Robinson, A. S., Engelhardt, J. F., Brooks, S. V. et al. (2002). Modular flexibility of dystrophin: implications for gene therapy of Duchenne muscular dystrophy. Nat Med 8, 253-61.
【非特許文献２７】Hayashi, T., Arimura, T., Ueda, K., Shibata, H., Hohda, S., Takahashi, M., Hori, H., Koga, Y., Oka, N., Imaizumi, T. et al. (2004). Identification and functional analysis of a caveolin-3 mutation associated with familial hypertrophic cardiomyopathy. Biochem Biophys Res Commun 313, 178-84.
【非特許文献２８】Hoffman, E., Brown, R. and Kunkel, L. (1987). Dystrophin: The protein product of the Duchenne Muscular Dystrophy locus. Cell 51, 919-928.
【非特許文献２９】Hollway, G. E. and Currie, P. D. (2003). Myotome meanderings. Cellular morphogenesis and the making of muscle. EMBO Rep 4, 855-60.
【非特許文献３０】Houzelstein, D., Lyons, G. E., Chamberlain, J. and Buckingham, M. E. (1992).
【非特許文献３１】Localization of dystrophin gene transcripts during mouse embryogenesis. J Cell Biol 119, 811-21.
【非特許文献３２】Huang, X., Poy, F., Zhang, R., Joachimiak, A., Sudol, M. and Eck, M. (2000). Structure of a WW domain-containing fragment of dystrophin complexed with beta-dystroglycan. Nat. Struct. Biol 7, 634-638.
【非特許文献３３】Ilsley, J. L., Sudol, M. and Winder, S. J. (2002). The WW domain: linking cell signalling to the membrane cytoskeleton. Cell Signal 14, 183-9.
【非特許文献３４】Jung, D., Yang, B., Meyer, J., Chamberlain, J. and Campbell, K. (1995). Identification and characterization of the dystrophin anchoring site on beta-dystroglycan. Journal of Biological Chemistry 270, 27305-27310.
【非特許文献３５】Kaufman, M. (1992). The Atlas of Mouse Development: London Academic Press.
【非特許文献３６】Kaufman, M. H. (1995). The Atlas of mouse development. Cambridge: Academic Press, Harcourt Brace & Company.
【非特許文献３７】Lehmann, R. (2001). Cell migration in invertebrates: clues from border and distal tip cells. Curr Opin Genet Dev 11, 457-63.
【非特許文献３８】Lindon, C, Montarras, D. and Pinset, C. (1998). Cell cycle-regulated expression of the muscle determination factor Myf5 in proliferating myoblasts. JCe// Biol 140, 111-8.
【非特許文献３９】Merrick, D., Ting, T., Stadler, L. and Smith, J. (2007). A role for Insulin-like growth factor 2 in specification of the fast skeletal muscle fibre. BMC Developmental Biology 7:65, doi:10.1186/1471-213X-7-65.
【非特許文献４０】Minetti, C, Bado, M., Broda, P., Sotgia, F., Bruno, C, Galbiati, F., Volonte, D., Lucania, G., Pavan, A., Bonilla, E. et al. (2002). Impairment of caveolae formation and T-system disorganization in human muscular dystrophy with caveolin-3 deficiency. Am JPathol 160, 265-70.
【非特許文献４１】Nixon, S. J., Wegner, J., Ferguson, C, Mery, P. F., Hancock, J. F., Currie, P. D., Key, B., Westerfield, M. and Parton, R. G. (2005). Zebrafish as a model for caveolin-associated muscle disease; caveolin-3 is required for myofibril organization and muscle cell patterning. HMW MoI Genet 14, 1727-43.
【非特許文献４２】Ohlendieck, K., Matsumura, K., Ionasescu, V. V., Towbin, J. A., Bosch, E. P., Weinstein, S. L., Sernett, S. W. and Campbell, K. P. (1993). Duchenne muscular dystrophy: deficiency of dystrophin-associated proteins in the sarcolemma. Neurology 43, 795-800.
【非特許文献４３】Ott, M. O., Bober, E., Lyons, G., Arnold, Η. and Buckingham, M. (1991). Early expression of the myogenic regulatory gene, myf-5, in precursor cells of skeletal muscle in the mouse embryo. Development 111, 1097- 107.
【非特許文献４４】Oustanina, S., Ηause, G. and Braun, T. (2004). Pax7 directs postnatal renewal and propagation of myogenic satellite cells but not their specification. Embo J 23, 3430-9.
【非特許文献４５】Parsons, M. J., Campos, I., Hirst, E. M. and Stemple, D. L. (2002). Removal of dystroglycan causes severe muscular dystrophy in zebrafish embryos. Development 129 , 3505-12.
【非特許文献４６】Quinlan, J. G., Hahn, H. S., Wong, B. L., Lorenz, J. N., Wenisch, A. S. and Levin, L. S. (2004). Evolution of the mdx mouse cardiomyopathy: physiological and morphological findings. Neuromuscul Disord 14, 491-6.
【非特許文献４７】Razani, B., Park, D. S., Miyanaga, Y., Ghatpande, A., Cohen, J., Wang, X. B., Scherer, P. E., Evans, T. and Lisanti, M. P. (2002). Molecular cloning and developmental expression of the caveolin gene family in the amphibian Xenopus laevis. Biochemistry 41, 7914-24.
【非特許文献４８】Reimann, J., Irintchev, A. and Wernig, A. (2000). Regenerative capacity and the number of satellite cells in soleus muscles of normal and mdx mice. Neuromuscul Disord 10, 276-82.
【非特許文献４９】Relaix, F., Montarras, D., Zaffran, S., Gayraud-Morel, B., Rocancourt, D., Tajbakhsh, S., Mansouri, A., Cumano, A. and Buckingham, M. (2006). Pax3 and Pax7 have distinct and overlapping functions in adult muscle progenitor cells. JCe// Biol 172, 91-102.
【非特許文献５０】Roig, M., Roma, J., Fargas, A. and Munell, F. (2004). Longitudinal pathologic study of the gastrocnemius muscle group in mdx mice. Acta Neuropathol 107, 27-34.
【非特許文献５１】Roma, J., Munell, F., Fargas, A. and Roig, M. (2004). Evolution of pathological changes in the gastrocnemius of the mdx mice correlate with utrophin and beta-dystroglycan expression. Acta Neuropathol 108, 443-52.
【非特許文献５２】Schofield, J., Houzelstein, D., Davies, K., Buckingham, M. and Edwards, Y. H. (1993). Expression of the dystrophin-related protein (utrophin) gene during mouse embryogenesis. Dev Dyn 198, 254-64.
【非特許文献５３】Schofield, J. N., Gorecki, D. C, Blake, D. J., Davies, K. and Edwards, Y. H. (1995). Dystroglycan mRNA expression during normal and mdx mouse embryogenesis: a comparison with utrophin and the apo-dystrophins. Dev Dyn 204, 178-85.
【非特許文献５４】Seale, P., Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Mansouri, A., Gruss, P. and Rudnicki, M. A. (2000). Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells. Cell 102, 777- 86.
【非特許文献１】Shin, D. H., Kim, J. S., Kwon, B. S., Lee, K. S., Kim, J. W., Kim, M. H., Cho, S. S. and Lee, W. J. (2003). Caveolin-3 expression during early chicken development. Brain Res Dev Brain Res 141, 83-9.
【非特許文献５５】Smith, J. (1996). Muscle Growth factors, ubiquitin and apoptosis in dystrophic muscle: Apoptosis declines with age in the mdx mouse. B. Appl. Myol. 6, 279-284.
【非特許文献５６】Smith, J., Fowke, G. and Schofield, P. (1995). Programmed cell death in dystrophic (mdx) muscle is inhibited by IGF-II. Cell Death Differ. 2, 243 -251.
【非特許文献５７】Smith, J., Goldsmith, C, Ward, A. and LeDieu, R. (2000). IGF-II ameliorates the dystrophic phenotype and coordinately down-regulates programmed cell death. Cell Death & Differentiation 7, 1109-1118.
【非特許文献５８】Smith, J. and Merrick, D. (2008). Embryonic skeletal muscle micro-explant culture and isolation of skeletal muscle stem cells: Humana Press.
【非特許文献５９】Smith, J. and Schofield, P. N. (1994). The effects of fibroblast growth factors in long-term primary culture of dystrophic (mdx) mouse muscle myoblasts. Exp Cell Res 210, 86-93.
【非特許文献６０】Smith, J. and Schofield, P. N. (1997). Stable integration of an mdx skeletal muscle cell line into dystrophic (mdx) skeletal muscle: evidence for stem cell status. Cell Growth Differ 8, 927-34.
【非特許文献６１】Smythe, G. M., Eby, J. C, Disatnik, M. H. and Rando, T. A. (2003). A caveolin-3 mutant that causes limb girdle muscular dystrophy type 1C disrupts Src localization and activity and induces apoptosis in skeletal myotubes. J Cell Sci 116, 4739-49.
【非特許文献６２】Sotgia, F., Lee, J., Das, K., Bedford, M., Petrucci, T., Macioce, P., Sargiacomo, M., Dagna Bricarelli, F., Minetti, C, Sudol, M. et al. (2000). Caveolin-3 Directly Interacts with the C-terminal Tail of β-Dystroglycan. The Journal of Biological Chemistry 275, 38048- 38058.
【非特許文献６３】Spencer, M. J., Walsh, C. M., Dorshkind, K. A., Rodriguez, E. M. and Tidball, J. G. (1997). Myonuclear apoptosis in dystrophic mdx muscle occurs by perforin-mediated cytotoxicity. J Clin Invest 99, 2745-51.
【非特許文献６４】Vaghy, P., Frang, J., Wu, W. and Vaghy, L. (1998). Increased caveolin-3 levels in mdx mouse muscles. FEBS Letters 431, 125-127.
【非特許文献６５】Volonte, D., Peoples, A. J. and Galbiati, F. (2003). Modulation of myoblast fusion by caveolin-3 in dystrophic skeletal muscle cells: implications for Duchenne muscular dystrophy and limb-girdle muscular dystrophy-lC. MoI Biol Cell 14, 4075-88.
【非特許文献６６】Webster, C, Silberstein, L., Hays, A. P. and Blau, H. M. (1988). Fast muscle fibers are preferentially affected in Duchenne muscular dystrophy. Cell 52, 503-13.
【非特許文献６７】Weir, A. P., Morgan, J. E. and Davies, K. E. (2004). A-utrophin up-regulation in mdx skeletal muscle is independent of regeneration. Neuromuscul Disord 14, 19-23.
【非特許文献６８】Wilding, J., Jurgen, E., Schneider, A., Sang, E., Davies, K., Neubauer, S. and K, C. (2005). Dystrophin- and MLP-deficient mouse hearts: marked differences in morphology and function, but similar accumulation of cytoskeletal proteins. The FASEB Journal 19, 79-81.
【非特許文献６９】Williamson, R. A., Henry, M. D., Daniels, K. J., Hrstka, R. F., Lee, J. C, Sunada, Y., Ibraghimov-Beskrovnaya, O. and Campbell, K. P. (1997). Dystroglycan is essential for early embryonic development: disruption of Reichert's membrane in Dag 1 -null mice. Hum MoI Genet 6, 831-41.
【非特許文献７０】Woodman, S. E., Park, D. S., Cohen, A. W., Cheung, M. W., Chandra, M., Shirani, J., Tang, B., Jelicks, L. A., Kitsis, R. N., Christ, G. J. et al. (2002). Caveolin-3 knock-out mice develop a progressive cardiomyopathy and show hyperactivation of the p42/44 MAPK cascade. J Biol Chem 277, 38988-97.
【非特許文献７１】Yue Y, Li Z, Harper SQ, Davisson RL, Chamberlain JS and D., D. (2003). Microdystrophin gene therapy of cardiomyopathy restoresdystrophin-glycoprotein complex and improves sarcolemma integrity in the mdx mouse heart. Circulation 108, 1626-32.
【非特許文献７２】Zammit, P. S., Partridge, T. A. and Yablonka-Reuveni, Z. (2006). The skeletal muscle satellite cell: the stem cell that came in from the cold. JHistochem Cytochem 54, 1177-91.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明者らは、筋形成中のこれら２つのタンパク質の機能的役割を実証し、筋ジストロフィーを早期診断するためのアッセイを特定するために、骨格筋発生に対するカベオリン−３及びジストロフィン喪失の影響を調査した。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、異なるが機能的に関連する２つの骨格筋ジストロフィー変異体（ｍｄｘ及びｃａｖ−３-/-）を調査することにより、ＤＭＤ及びＬＧＭＤ１Ｃ型の病理の重要な
要素が胚心筋及び骨格筋パターン形成過程の障害に起因すると初めて実証されることを示した。筋形成の障害は、ｃａｖ−３-/-よりｍｄｘでより初期に生じ、ＬＧＭＤ−１ｃの
表現型がより軽度であり、ジストロフィンが初期に（Ｅ９．５）発現されることと一致する。筋形成は、発生遅延、筋管形態及び置換欠損、並びに異常幹細胞挙動を示すｍｄｘ胚で重度の障害を受けた。カベオリン−３タンパク質は、ｍｄｘ胚で上昇する。ｃａｖ−３-/-（Ｅ１５．５から）及びｍｄｘ（Ｅ１１．５から）は両方とも、ｍｙｆ−５＋胚筋芽
細胞の過剰増殖及びアポトーシス、ｉｎ  ｓｉｔｕでのｐａｘ−７＋筋芽細胞の消耗、及び妊娠後期での全ｐａｘ−７タンパク質の枯渇を示す。両方とも、心臓欠陥を有する。ｃａｖ−３-/-では、腹側筋欠乏、過剰、形成異常肥大筋管、筋核の２倍増、及び速筋ミオ
シン重鎖（ＦＭｙＨＣ）含有量の低減を含む、より限定された表現型が存在する。筋管発育不全、筋管数の低減、及びＦＭｙＨＣの増加を含む幾つかのｍｄｘ胚病理は、ｃａｖ−３-/-との相反性を示す。ジストロフィンが欠損し（ｍｄｘ）、カベオリン−３がヘテロ
接合性である（ｃａｖ−３+/-）二重突然変異体（ｍｄｘｃａｖ+/-）胚では、カベオリン−３は、野生型の５０％に低減され、これらの表現型は重度に悪化し、肋間筋線維密度は７１％低減され、ｐａｘ−７陽性細胞は、下肢から完全に枯渇し、他所で著しく低減され
、カベオリン−３レベルの上昇に対する貢献的役割ではなく代償的役割を示唆するデータが、ｍｄｘ胚で見出された。これらのデータは、初期筋肉形成におけるジストロフィンの重要な役割を実証し、カベオリン−３及びジストロフィンが、正確な線維型特化及び幹細胞機能の創出にとって不可欠であることを実証する。これらのデータは、ＭＤの自然経過における重要なギャップを埋め、ＤＭＤ／ＬＧＭＤの初期診断の確立、及びこれら患者のより良好な臨床転帰に結び付く初期治療プロトコールの設計に非常に有用である。
【００１２】
従来のデュシェンヌ型筋ジストロフィーのアッセイは、ジストロフィン遺伝子の多型性を捜すことを含む。この遺伝子は大型であり、全ての多型性について検査が実施されるわけではない。例えば、１９個の突然変異の検査は、６５％の症例を特定したに過ぎない。現在は、疾患の家族歴がある場合のみ、この検査が実施される。しかしながら、全症例のおよそ３分の１は、個体に自然発症的に生じる新規性である。
【００１３】
本発明者らにより特定された検査は、ジストロフィン遺伝子の多型性に基づくものではなく、筋ジストロフィーの全ての形態に潜在的に適用可能である。さらに、本検査は、出生前及び出生後のいずれの乳児にも適用可能である。より従来型の形態の診断は、小児が３〜５歳に達するまで実施されない。本アッセイは、この疾患の早期診断を可能にし、それにより、この疾患の早期治療（例えば、ｐａｘ−７陽性幹細胞を置換することによる）を可能にする。
【００１４】
Ｐａｘ−７／Ｍｙｆ５細胞幹細胞は、治療用途に使用されることが示唆されている（国際公開第２００７／０５９６１２号）。そのような細胞は、筋原性前駆細胞として、筋ジストロフィーを含む筋肉疾患の治療に使用されることが示唆されている。これらの細胞は、新しい筋細胞の供給源としてこの疾患の治療に使用される。しかしながら、筋ジストロフィーのマーカーとしてＰａｘ−７を使用することは示唆されていない。このタンパク質は、使用される幹細胞の亜集団を特定するための２つのマーカーのうちの１つとして単に使用される。
【００１５】
本発明は、筋ジストロフィーの症状を示している個体を特定するための、筋ジストロフィーの治療又は進行をモニターするための、又は筋ジストロフィーの症状を発症する傾向を有する個体を特定する方法であって、患者由来の組織試料中の、ｐａｘ−７、カベオリン−３、及び／又は速筋ミオシンから選択される１つ又は複数のタンパク質の発現レベルを決定することを含む方法を提供する。
【００１６】
本方法は、この疾患の症状を示している個体又は症状を発症する傾向を有する個体を特定するために使用することができる。
【００１７】
治療又は進行がモニターされる場合、試料中のレベルは、数日、数週間、又は数か月前等の、以前に採取された個体由来の試料中のレベルと比較することができる。
【００１８】
この又は各々のタンパク質の発現レベルは、例えば、筋ジストロフィーの症状を示していないか、又は筋ジストロフィーを発症する傾向を有していない個体に関連する所定のレベルと比較してもよく、及び／又は筋ジストロフィーを示している又は発症する傾向を有する個体に関連していると以前に特定されている所定のレベルと比較してもよい。
【００１９】
Ｐａｘ−７及びカベオリン−３は、例えば、乳児又は早期産乳児が、筋ジストロフィーを発症する可能性が高いかどうかの初期決定に特に関連性を有すると特定されている。好ましくは、ｐａｘ−７及び／又はカベオリン−３の１つ又は両方が測定される。Ｐａｘ−７が測定されてもよい。カベオリン−３が測定されてもよい。
【００２０】
Ｐａｘ−７及び／又はカベオリン−３は、速筋ミオシンの測定と共に又は速筋ミオシンを測定せずに、測定してもよい。
【００２１】
これら２つのマーカー（ｐａｘ−７及びカベオリン−３）は、特に、個体が筋ジストロフィーを発症する可能性を早期に特定することを可能にする。これまでは、この疾患の発症を待つ必要があり、この疾患は個体が数歳になるまで認識されないことが多い。或いは、例えば、ジストロフィン遺伝子の特定の多型性を捜す多数の従来技術のアッセイが存在する。しかしながら、そのようなアッセイは、典型的には、そのような多型性の家族歴がある特定の家族に関連した多型性向けである。さらに、そのようなアッセイの正確性は、典型的には依然として低い。
【００２２】
このように、組織試料は、個体の出生前に個体から採取されてもよく、又は出生後に採取されてもよい。筋形成は、典型的には妊娠８〜９週目から生じる。従って、潜在的には、その期以降の試料を採取してもよい。個体は、例えば小児、例えば１６歳未満、１２歳未満、１０歳未満、６歳未満、３歳未満、２歳未満、又は１歳未満であってもよく、まだ子宮内にいてもよい。個々の患者は、年齢が出生から３又は６か月の間であってもよい。
【００２３】
筋ジストロフィー（ＭＤ）は、ヒト等の哺乳動物の筋肉を衰弱させる一群の遺伝子的な遺伝性筋肉疾患を指す。ＭＤは、通常、進行性骨格筋衰弱、筋タンパク質の欠損、並びに筋細胞及び組織の死滅を特徴とする。好ましい疾患には、デュシェンヌ型（ＤＭＤ）、肢帯型（ＬＧＭＤ）、エメリードレフュス型、眼咽頭型、遠位型、筋緊張性、先天性、ベッカー型、及び／又は顔面肩甲上腕型が含まれる。疾患は、ＤＭＤ及び／又はＬＧＭＤであってもよい。
【００２４】
典型的には、正常個体と比較したｐａｘ−７の発現減少又はカベオリン−３の発現変更は、筋ジストロフィーの症状を示しているか又は症状を発症する傾向を有する個体を示す。
【００２５】
個体は、ヒト個体であってもよいが、筋ジストロフィー様症状を発症する多くの様々な動物も存在する。そのような動物は、典型的には哺乳動物であり、マウス、ラット、ヒツジ、イヌ、ウマ、ネコ、及び非ヒト霊長類が含まれる。
【００２６】
速筋ミオシンが測定されてもよい。本発明者らは、速筋ミオシンが、異なる疾患で異なる発現レベルを示すことを決定した。例えば、速筋ミオシンは、デュシェンヌ型筋ジストロフィーのマウスモデルでは増加するが、肢帯筋ジストロフィーでは減少する。従って、そのタンパク質の発現レベルをアッセイすることにより、この疾患の発症可能性が高いことが示されると考えられる。好ましくは、速筋ミオシンは、ｐａｘ−７及び／又はカベオリン−３の１つ又は両方のアッセイと組み合わせてアッセイされる。速筋ミオシンを単独で使用して、例えば、ＤＭＤ及びＬＧＭＤ等の特定のタイプの筋ジストロフィーを診断することもできる。
【００２７】
このアッセイは、組織試料中のインスリン様増殖因子−２（Ｉｇｆ−２）の発現レベルを決定することをさらに含んでいてもよい。Ｉｇｆ−２は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー等の筋ジストロフィーで過剰発現され、カベオリン−３欠乏型ＬＧＭＤでは低減される。また、これは、この疾患の予後の指標をもたらす。
【００２８】
さらに、Ｉｇｆ−２の下流にある次の遺伝子産物をアッセイしてもよい：ＣＤＫＮ１ｃ／Ｐ５７ｋｉｐ２及び／又はｐＡｋｔ。
【００２９】
Ｉｇｆ−２、ＣＤＫＮ１ｃ／Ｐ５７ｋｉｐ２、及び／又はｐＡｋｔは、他のタンパク質
とは別々にアッセイすることもできる。すなわち、例えば、Ｉｇｆ−２は、ｐａｘ−７及びカベオリン−３を測定せずに、別々にアッセイしてもよい。Ｉｇｆ−２は、ＣＤＫＮ１ｃ／Ｐ５７ｋｉｐ２及び／又はｐＡｋｔと共に使用してもよい。
【００３０】
Merrick D et al（BMC Develop. Biol. (2007), 7, page 65）には、インスリン様増殖因子−２（Ｉｇｆ−２）が、胎児期に発現される増殖因子であることが開示された。これは既知だったが、それが骨格筋筋管で特異的に発現されることは知られていなかった。この論文の主な知見は、Ｉｇｆ−２が、速筋ミオシン陽性線維の比率に影響を及ぼすということだった。
【００３１】
上述のタンパク質は全て、当技術分野で一般的に知られており、それらのタンパク質配列及びそのようなタンパク質をコードする核酸配列は、当技術分野で一般的に知られている。
【００３２】
組織試料は、典型的には、例えば生検試料の形態の筋組織試料である。しかしながら、個体内の筋線維が変性するため、速筋ミオシン及びカベオリン−３は、筋ジストロフィーを有する個体の血液内にも見出される場合があると考えられる。
【００３３】
タンパク質発現は、試料中のｍＲＮＡレベルを決定することによりタンパク質発現レベルを直接的又は間接的のいずれかで測定することにより決定することができる。
【００３４】
典型的には、タンパク質の発現レベルは、イムノアッセイにより決定することができる。上述のタンパク質に特異的な抗体は、当技術分野で一般的に知られている。そのような抗体は、当技術分野で一般的に知られている方法により、直接的又は間接的に標識することができる。例えば、組織試料は、適切に標識された抗体で免疫染色することができる。試料は、染色する前に固定することができる。本発明者らは、タンパク質に特異的な抗体、特にｐａｘ−７に特異的な抗体と共に使用する場合、パラホルムアルデヒドが特に有効であることを見出した。従って、好ましくは、使用される固定剤は、パラホルムアルデヒドである。タンパク質と抗体との結合は、当技術分野で一般的に知られている方法により決定することができる。例えば、アビジン−ビオチン法は、当技術分野で一般的に知られている。そのようなアッセイでは、典型的には、ホースラディッシュペルオキシダーゼを、３’，３，５，５’テトラメチル−ベンジジン等の基質と組み合わせて使用して有色産物を形成させ、その後それを例えば顕微鏡で視覚化することができる。本発明者らは、特に、チラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）が、例えばｐａｘ−７と共に使用された場合、特に良好な染色をもたらすことを見出した。従って、好ましくは、ＴＳＡを免疫染色に使用する。
【００３５】
アルカリホスファターゼを使用することもできる。これには、３つの酵素分子（アルカリホスファターゼ）及び２つの抗体分子で構成される、予め形成された環式酵素抗酵素免疫複合体が使用される。この技術は、典型的には青色染料（Ｆａｓｔ  Ｂｌｕｅ  ＢＮ）又は赤色染料（Ｆａｓｔ  Ｒｅｄ  ＴＲ）を使用することにより視覚化することができる。
【００３６】
イムノアッセイは、直接的に標識された抗タンパク質抗体を使用して視覚化することができる。或いは、それらは、抗タンパク質抗体に結合する抗免疫グロブリン抗体を使用することにより、間接的に視覚化してもよい。その二次抗体は、それ自体が標識されていてもよい。
【００３７】
この抗体又は各抗体は、蛍光体で標識されていてもよい。そのような蛍光体は、当技術分野で一般的に知られている。それらには、例えば、フルオレセイン、フルオレセインイ
ソチオシアナート（ＦＩＴＣ）、及びローダミンが含まれる。そのような蛍光体は、異なる色の蛍光を発する。従って、好ましくは、このアッセイ（及び実際は下記で規定するキット）で使用される抗体は、異なる蛍光体を有しているか、及び／又は視覚化法が異なっており、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼを用いて、様々なタンパク質が、同じ組織試料からアッセイされることを可能にする。
【００３８】
タンパク質は、組織試料、部分的に精製された試料、又は試料から得られた精製タンパク質に標識抗体を添加することにより視覚化して、試料に結合した全抗体を特定することができる。試料中のタンパク質は、免疫ブロットにより精製及び視覚化してもよい。
【００３９】
その代わり又はそれに加えて、タンパク質の発現レベルは、この組織試料で発現されたｍＲＮＡレベルを特定することにより決定してもよい。ｍＲＮＡ発現のレベルは、定量ポリメラーゼ連鎖反応（ＱＰＣＲ）又はリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）により決定してもよい。この技術では、タンパク質をコードするｍＲＮＡに特異的な１対のプライマーが使用される。そのような技術は、当技術分野で一般的に周知である。
【００４０】
当技術分野には、例えば、ＳＹＢＲ（商標）染色を使用して、定量ＰＣＲを可能にする市販の系が多数存在する。製造業者には、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ社及びＰｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社が含まれる。
【００４１】
本発明は、ｐａｘ−７、カベオリン−３、及び／若しくは速筋ミオシンの２つ以上に特異的な２つ以上の抗体、又はｐａｘ−７、カベオリン−３、及び／若しくは速筋ミオシンの２つ以上をコードするｍＲＮＡに特異的な１対のＰＣＲプライマーを含む、本発明による方法で使用されるキットも提供する。
【００４２】
タンパク質は、ｐａｘ−７タンパク質又はｐａｘ−７をコードするｍＲＮＡであってもよい。その代わり又はそれに加えて、タンパク質は、カベオリン−３又はカベオリン−３をコードするｍＲＮＡであってもよい。
【００４３】
加えて、タンパク質は、速筋ミオシン又は速筋ミオシンをコードするｍＲＮＡであってもよい。
【００４４】
抗体は、上述のものの１つ等の好適な標識で直接標識されていてもよい。そのような標識には、蛍光標識、及びアルカリホスファターゼ又はホースラディッシュペルオキシダーゼ等の酵素に基づく標識が含まれる。
【００４５】
キットは、１つのタンパク質に対する抗体及び第２のタンパク質のための１対のプライマーを含んでいてもよい。或いは、キットは、２つ以上の他のタンパク質のためのＰＣＲプライマーを含んでいてもよい。キットは、異なるタンパク質に対する２つ以上の抗体を含んでいてもよい。後者の場合は、抗体は、各タンパク質の量の実質的同時測定を可能にするために、異なる標識で標識されていてもよい。
【００４６】
キットは、パラホルムアルデヒドをさらに含んでいてもよい。パラホルムアルデヒドは、筋肉試料の固定を可能にするのに特に効果的であることが見出されている。これは、ｐａｘ−７タンパク質に特異的な抗体と組み合わせて提供されてもよい。
【００４７】
キットは、Ｉｇｆ−２に特異的な抗体又はＰＣＲプライマー対をさらに含んでいてもよい。
【００４８】
抗体がキットに提供される場合、キットは、チラミドシグナル増幅用の１つ又は複数の
試薬を含んでいてもよい。これには、例えばビオチン化チラミドが含まれていてもよい。
【００４９】
本発明によるキットは、試料を固定するための１つ又は複数の固定剤を含んでいてもよい。
【００５０】
キットは、キットと共に使用説明書を含んでいてもよい。説明書は、例えば、筋ジストロフィーの症状を示しているか又は筋ジストロフィーを発症する傾向を有する個体に関連するタンパク質発現の典型的なレベルに関する詳細を含んでいてもよい。説明書は、正常個体における発現レベルに関する詳細を含んでいてもよい。これにより、取得されたデータの妥当性を開業医が評価することを可能にするために、比較される個体に由来する試料から得られたデータと所定の値との比較が可能になる。既知濃度のタンパク質を有する１つ又複数の対照が提供されていてもよい。
【００５１】
ＰＣＲプライマーが提供される場合、キットは、定量ＰＣＲの実施を可能にするための１つ又は複数の標識又は他の試薬をさらに含んでいてもよい。これには、例えば、ＳＹＢＲ（商標）ｇｒｅｅｎが含まれていてもよい。
【００５２】
また、キットは、アッセイ内で標準物質として使用するために、所定の濃度の１つ又は複数のタンパク質対照試料を含んでいてもよい。
【００５３】
本発明者らにより得られた結果は、カベオリン−３を使用して、筋ジストロフィーの症状を緩和することができることも示している。
【００５４】
従って、本発明は、患者にカベオリン−３を投与すること、又は患者におけるカベオリン−３発現を増加させることを含む、筋ジストロフィーの治療方法を提供する。筋ジストロフィーの治療においてタンパク質の発現を増加させるか又はタンパク質を提示させる方法は、以前にユートロフィンについて実証されている。カベオリン−３を同様の様式で使用できることが予測される。
【００５５】
ユートロフィンは、筋ジストロフィーの治療に有用であることが実証されている。例えば、米国特許出願第２００９／０５４３２７号、米国特許出願第２００８／１６０１０８号、及び国際公開第９７１２２６９６号（参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）には、このタンパク質がそのような治療に使用される方法が開示されている。
【００５６】
カベオリン−３を薬学的に許容される担体と組み合わせて含む医薬製剤も提供される。本発明は、筋ジストロフィーを治療するため使用されるカベオリン−３も提供する。
【００５７】
以降、以下の図面を例示の目的のみで参照して、本発明を説明することにする。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１−１】（Ａ）ｍｄｘ筋管の骨格筋管分岐：（ＩＣ）肋間、（Ｌ）肢、（Ｆ）顔面筋群；０：異常は非検出。（Ｂ）筋管分岐、Ｅ１５．５  ｍｄｘ二頭筋。挿入図、切片の拡大。染色：ヘマトキシリン及びエオシン。（Ｃ〜Ｈ）汎ミオシン（ＭＦ２０）、近位筋、青色バーは野生型（ＷＴ）筋管幅を示す（Ｃ、Ｆ）ＷＴ；（Ｄ、Ｇ）ｍｄｘ、発育不全筋管、黒色矢印は筋管分割；（Ｅ、Ｈ）ｃａｖ−３-/-、肥大筋管。（Ｆ〜Ｈ）（Ｆ）ＷＴと比較した（Ｇ）ｍｄｘ及び（Ｈ）ｃａｖ−３-/-筋線維の様々な筋管直径。
【図１−２】（Ｉ）総計数の割合としての誤配置筋管（接線性筋管及び誤整列筋管の混合）。０：誤配置線維はない（Ｊ）誤配置筋管の得点化戦略：正中から＞２５°は接線性（Ｔ）、＜２５°は誤整列（Ｍ）。（Ｋ）Ｅ１３．５における誤整列ｍｄｘ筋管の割合。（Ｌ〜Ｎ）Ｅ１３．５  ＩＣ筋肉、ＭＦ２０；（Ｍ）ｍｄｘ誤整列筋管（黒色矢印、Ｍ）（Ｌ）ＷＴ（Ｎ）ｃａｖ−３-/-に筋管の誤配置はない。エラーバー：ｓ．ｄ．サイズバー  ２０マイクロメートル。スチューデントｔ−検定；*ｐ＜０．０１；**ｐ＜０．００１、ＷＴ値との比較。
【図２−１】（Ａ〜Ｆ、Ｉ〜Ｎ）β−心筋ミオシン重鎖（Ｎ２．２６１）について免疫染色された中央切片心臓  Ｅ１３．５（Ａ）ＷＴ；（Ｂ）ｍｄｘ；（Ｃ）（Ｄ）ＷＴと比較して（Ｂ）軽度の及び（Ｃ）広範な心室壁肥大を示すｃａｖ−３-/-、Ｅ１４．５心室頂端構造は、ｃａｖ−３-/-（Ｅ）では組織崩壊し、ｍｄｘ（Ｆ）ではそれほど良好に発生していない。（Ｇ〜Ｈ）ＭＦ２０は、Ｅ１５．５のｃａｖ−３-/-心臓を染色し（Ｇ）心室壁の組織崩壊、（Ｈ）心筋細胞は互いに交差している。
【図２−２】（Ｉ〜Ｊ）Ｅ１４．５の心房小柱（ｔｂ）は、（Ｉ）ｃａｖ−３-/-では短くて太く、（Ｊ）ｍｄｘではかぎ形である。（Ｋ〜Ｐ）Ｅ１７．５の心房；（Ｌ〜Ｐ）（Ｋ、Ｎ）ＷＴと比較した、（Ｌ、Ｏ）ｃａｖ−３-/-小柱（ｔｂ）及び（Ｍ、Ｐ）ｍｄｘ心房壁におけるＮ２．２６１標識の減少及び細胞層の拡延。サイズバー  ２０マイクロメートル。（Ｑ）心臓の最も中央の部分を通って矢状断的に切片化された心臓の配向及び一致を例示するためのＭＦ２０標識ｍｄｘ心臓の低倍率画像。
【図３−１】Ｅ１５．５の近位筋における筋核の配置：（Ａ）ＷＴ、螺旋状、間隔は均一；（Ｂ）ｍｄｘ、中央位置；（Ｃ）ｃａｖ−３-/-、中央位置付近、間隔は不規則。重ねて示されている白色星印（*）、１つの筋管の筋核；小さな白色矢印、筋核。野生型では（Ａ）、小さな白色矢印は、２つの別々の筋管の末梢核を示す。末梢核は、ｍｄｘ及びｃａｖ−３-/-筋肉（Ｂ〜Ｃ）では明白ではない。（Ｄ）筋管端部での筋核の集群化、ｃａｖ−３-/-。（Ｅ〜Ｇ）Ｅ１５．５のＷＴ（Ｅ）、ｍｄｘ（Ｆ）、及び（Ｇ）ｃａｖ−３-/-低近位肢筋管の横断面は、末梢筋核（矢印）が、野生型と関連するが、この期のジストロフィー胚筋管とは関連しないことを示す。ｍｄｘの発育不全及びｃａｖ−３-/-筋管の肥大も観察することができる；緑色線は、野生型筋管直径を示す。低近位肢領域の（Ｈ）ＷＴ、（Ｉ）ｍｄｘ、及び（Ｊ）ｃａｖ−３-/-の低倍率画像は、一致した胚切片の野生型と比較して、ｍｄｘの線維密度の低減及びｃａｖ−３-/-筋線維の密度増加を示す。
【図３−２】（Ｋ）筋核数は、野生型と比較して、ｃａｖ−３-/-（Ｅ１３．５〜Ｅ１７．５）では２倍である；*ｐ＜０．０５。ｍｄｘ筋核（Ｅ１３．５〜Ｅ１７．５）のわずかな（統計的に有意でない）低減。筋管の平均筋核含有量は、Ｅ１３．５〜１７．５で一定である。（Ｌ）野生型と比較したｃａｖ−３-/-（Ｅ１３．５〜Ｅ１７．５）筋管密度の増加、及びｍｄｘ（Ｅ１３．５）筋管密度の減少。各系統及び期について、筋管を一定の一致した筋肉区域で計数した、*ｐ＜０．０５。サイズバー  ２０マイクロメートル。
【図４−１】（Ａ）筋肉外植片培養に由来する胚筋芽細胞のアウトグロース（outgrowth）率は、同時に培養された野生型外植片と比較して、Ｅ１１．５に由来するｍｄｘ、及びＥ１５．５〜Ｅ１７．５のｃａｖ−３-/-で増加する。（Ｂ）Ｍｙｆ−５免疫染色された外植片。（Ｃ）Ｋｉ６７＋免疫反応性により決定された、Ｅ１１．５に由来するｍｄｘ及びＥ１５．５に由来するｃａｖ−３-/-における胚筋芽細胞の過剰増殖（Ｄ）。（Ｇ〜Ｈ）Ｅ１５．５の一次培養野生型胚筋芽細胞（Ｇ）Ｍｙｆ−５染色（Ｈ）二次抗体対照。（Ｉ）Ｅ１１．５の野生型外植片のアウトグロース率は、Ｅ１１．５  ｍｄｘ外植片馴化培地（ｍｄｘ  ＣＭ）で増加するが（ｐ＜０．０５、*）、ｃａｖ−３-/-又はＷＴ  ＣＭでは増殖しない。エラーバー、ｓ．ｄ．。
【図４−２】（Ｅ）ｍｄｘでのＥ１１．５及びｃａｖ−３-/-でのＥ１５．５からのアポトーシス増加（Ｆ）Ｄａｐｉ染色、矢印はアポトーシス性細胞を示す。*ｐ＜０．０５、ＷＴから；**ｐ＜０．０１、ＷＴから；#ｐ＜０．０５、ｍｄｘ及びｃａｖ−３-/-間。
【図５−１】ＷＴ、ｍｄｘ、ｃａｖ−３-/-、及びｍｄｘｃａｖ+/-低近位肢におけるＰａｘ  ７免疫染色；（Ａ〜Ｆ、ＭＮ、ＱＲ）Ｅ１５．５（Ｇ〜Ｌ）Ｅ１７．５。（Ａ〜Ｅ；Ｇ〜Ｋ）低倍率；（Ｂ〜Ｆ；Ｈ〜Ｌ）高倍率；サイズバー  １０マイクロメートル。Ｑ〜Ｒ  ＷＴ（Ｑ）及びｍｄｘｃａｖ−３+/-低近位肢の全体領域視界。ｍｄｘｃａｖ+/-、ｃａｖ−３-/-、及びｍｄｘの推定アポトーシス性（断片化した）ｐａｘ−７+核、Ｅ１５．５のＷＴ（Ｂ、Ｄ、及びＦ）及び（Ｌ）Ｅ１７．５のｍｄｘ（黒色矢印）ではアポトーシス性ではない。ｐａｘ−７染色の減少、ｃａｖ−３-/-及びｍｄｘｃａｖ−３+/-の白色矢印（ＣＤ及びＭＮ）Ｅ１５．５；（Ｉ〜Ｊ）Ｅ１７．５。（Ｍ〜Ｒ）。Ｅ１７．５では、ｍｄｘｃａｖ−３+/-低近位肢筋肉は、ｐａｘ−７＋細胞を欠いている（Ｏ〜Ｐ）。（Ｓ）免疫ブロット、（ｉ〜ｉｉｉ）カベオリン−３、（ｉｖ）ｐａｘ−７。接触（ｉ）１０秒；（ｉｉ）１分；（ｉｉｉ）４分。（ｉｖ）ｐａｘ−７タンパク質は、Ｅ１５．５及びＥ１７．５のジストロフィー胚で低減される。４分間の接触では、ｐａｘ−７は、Ｅ１１．５のＷＴでのみ検出される。（Ｔ）デンシトメトリー分析、カベオリン−３：α−チューブリン比は、ｍｄｘにおけるカベオリン−３の増加を確認する。*ｐ＜０．０５；。
【図５−２】（Ｕ）表は、３つの胚期を別々に分析した後の（１期当たり４回の実験）、ｍｄｘにおけるカベオリン−３の倍数増の推定を示す（野生型と比べて）。全ての期でｐ＝０．０５。（Ｖ）デンシトメトリー分析、ｐａｘ−７：α−チューブリンは、ｃａｖ−３-/-及びｍｄｘ（Ｅ１５．５〜Ｅ１７．５）におけるｐａｘ−７タンパク質の低減を実証する。Ｅ１３．５のｃａｖ−３-/-胚は、野生型より著しく多くのｐａｘ−７を含有する。*ｐ＜０．０５；（Ｔ、Ｖ）２つの別々の実験の平均±ｓ．ｄ．。（Ｗ）免疫ブロットは、カベオリン−３タンパク質が、Ｅ１５．５のｍｄｘｃａｖ−３+/-胚において低減され（ＷＴ#に対して５０％）、カベオリン−３が増加するＥ１５．５のｍｄｘ胚兄弟と比較して、著しく低減されることを実証する。ネオマイシン免疫染色は、ｃａｖ−３-/-及びｍｄｘｃａｖ−３+/-におけるｃａｖ−３ＫＯ導入遺伝子の存在を確認する。ｃａｖ−３-/-と比較して、ｍｄｘｃａｖ−３+/-胚で見られるネオマイシン染色の低減は、ｃａｖ−３ＫＯ導入遺伝子についてそれらがヘテロ接合性であることを反映している。＃デンシトメトリー：カベオリン−３：α−チューブリン比、トラック３及び４と比較したトラック１  ＷＴ、ｍｄｘｃａｖ−３+/-。
【図６−１】（Ａ〜Ｆ）Ｅ１３．５でのＦＭｙＨＣ免疫染色、（Ａ〜Ｃ）横隔膜、（Ｄ〜Ｆ）肋間。（Ａ、Ｄ）ＷＴ、（Ｂ、Ｅ）ｍｄｘ、及び（Ｃ、Ｆ）ｃａｖ−３-/-は、（Ｂ、Ｅ）ｍｄｘにおけるＦＭｙＨＣの低減、及び（Ｃ、Ｆ）ｃａｖ−３-/-呼吸筋におけるＦＭｙＨＣの増加。（Ｇ〜Ｌ）Ｅ１５．５の呼吸筋におけるＦＭｙＨＣ（Ｇ〜Ｉ）横隔膜；（Ｊ〜Ｌ）肋間（Ｇ、Ｊ）ＷＴ；（Ｈ、Ｋ）ｍｄｘ（Ｉ、Ｌ）ｃａｖ−３-/-。（Ｍ）ＷＴ  Ｅ１７．５近位肢と比較した、（Ｎ）ｍｄｘにおけるＦＭｙＨＣ染色の増加、及び（Ｏ）ｃａｖ−３-/-におけるＦＭｙＨＣ染色の減少。（Ｐ〜Ｓ）ｍｄｘｃａｖ−３+/-では、ＦＭｙＨＣは、Ｅ１７．５（Ｑ）及び（Ｓ）（近位肢が示されている）及びＥ１５．５（Ｒ）（肋間及び横隔膜が示されている）での野生型と比較しても増加する。Ｅ１７．５のｃａｖ−３-/-（Ｐ）及び（Ｑ）ｍｄｘｃａｖ−３+/-の比較により、ジストロフィン欠乏が、ｃａｖ−３-/-胚及び野生型胚で見られたＦＭｙＨＣの下方制御を抑制することが実証される。野生型胚（Ｍ）と比較して、Ｅ１７．５のｃａｖ−３-/-におけるＦＭｙＨＣの過剰喪失も、はっきり見ることができる（Ｑ）。
【図６−２】（Ｔ）野生型、ｃａｖ−３-/-、及びｍｄｘの免疫ブロットは、野生型と比較して、ｃａｖ−３-/-におけるＦＭｙＨＣの減少、及びｍｄｘ胚におけるＦＭｙＨＣの産生遅延を示す。（Ｕ）デンシトメトリー、ＦＭｙＨＣ：α−チューブリン比は、それぞれＥ１７．５のｍｄｘ胚及びｃａｖ−３-/-胚における、統計的に有意なＦＭｙＨＣ含有量の増加及び低減を実証する。Ｅ１３．５では、ｃａｖ−３-/-胚のＦＭｙＨＣは著しく過剰である；２つの別々の実験の平均±ｓ．ｄ．。（Ｖ）野生型胚、ｍｄｘ胚、及びｃａｖ−３-/-胚（Ｅ１３．５、Ｅ１５．５、及びＥ１７．５）における総計数の割合として表されたＦＭｙＨＣ陽性筋管。エラーバー、ｓ．ｄ．。*ｐ＜０．０５；**ｐ＜０．０１。サイズバー  ２０マイクロメートル。
【図７−１】妊娠後期（Ｅ１７．５）胚の筋肉におけるｐａｘ−７筋芽細胞及び筋線維密度の広範な喪失を示すために、汎ミオシン（ＭＦ２０）（Ｂ、Ｅ、Ｇ、Ｊ）又はｐａｘ−７（Ａ、Ｃ〜Ｄ及びＦ、Ｈ〜Ｉ）で免疫染色された（Ａ〜Ｅ）野生型及び（Ｆ〜Ｊ）カベオリン−３がヘテロ接合性であるｍｄｘマウス（ｍｄｘｃａｖ−３+/-）。
【図７−２】（Ｋ〜Ｐ）ＭＦ２０標識肋間筋切片（各胚の第４肋間と一致）のより高倍率の画像は、（Ｋ）ＷＴ、（Ｌ）ｍｄｘ、（Ｍ）ｃａｖ−３-/-、及び（Ｎ〜Ｐ）３つの異なるｍｄｘｃａｖ−３+/-Ｅ１７．５胚間の筋管密度の相異を示す。Ｅ１７．５のＷＴ、ｍｄｘ、及びｍｄｘｃａｖ+/-（ｈｅｔ）胚肋間筋の（Ｒ）一定のグリッド区域で評価された線維密度、及び（Ｓ）線維密度の低減パーセント。Ｍｙ３２抗体で標識された（Ｔ）ＷＴ及び（Ｕ）ｍｄｘｃａｖ+/-のＥ１７．５肋間は、ほとんど全ての線維がＦＭｙＨＣ陽性であることを示す。線維は、多くのＷＴでＦＭｙＨＣを下方制御するが、ｍｄｘｃａｖ−３+/-肋間線維は下方制御しないことに留意されたい。
【図８】Ｐａｘ−７ヒト筋生検：Ｐａｘ−７免疫染色をして、保管ヒト若年筋生検のｐａｘ−７＋骨格筋幹細胞を識別する。Ｐａｘ−７は細胞核を標識する。暗染色は、ｐａｘ−７＋核を示す。薄染色は、ｐａｘ−７陰性細胞核の位置を示すヘマトキシリン対比染色である。
【図９】ＲＴ−ＰＣＲ分析（Ａ）６つのＷＴ及び６つのｍｄｘマウス筋芽細胞単離物におけるｐａｘ−７  ｍＲＮＡ発現のデンシトメトリー分析により、Ｐａｘ−７発現がジストロフィー筋芽細胞で統計的に有意に抑制されることが実証される。示されているデータは、個々の筋芽細胞単離物のデンシトメトリー結果の平均及び標準偏差である。（Ｂ）ＲＴ−ＰＣＲは、６つのＷＴ及び６つのｍｄｘ筋芽細胞におけるｐａｘ−＆ｍＲＮＡの検出を示す。Ｐａｘ−７発現は、ＷＴと比較してジストロフィー（ｍｄｘ）筋芽細胞で一貫して抑制された。
【図１０】Ｉｇｆ−２はＭＤマウスで障害を受けた胚骨格筋を、Ｅ１４．５〜Ｅ１７．５期のインスリン様増殖因子２（Ｉｇｆ−２）について免疫染色した。（Ａ〜Ｄ）野生型（ＷＴ）筋肉は、Ｉｇｆ−２の特徴的な縞模様パターンを示し、線維の５０％はＩｇｆ−２免疫染色陽性である。（Ｅ〜Ｈ）ジストロフィン欠損（ｍｄｘ）筋肉は、Ｅ１４．５〜Ｅ１７．５でＩｇｆ−２を過剰発現し、ＷＴの「縞模様」免疫染色パターンを失う。対照的に（Ｉ〜Ｌ）Ｉｇｆ−２は、カベオリン−３欠損（ｃａｖ−３-/-）筋肉では失われる。（Ｍ）免疫染色パターンの定量化は、これらの結論を確認する。（Ｎ）ＲＴ−ＰＣＲは、Ｉｇｆ−２メッセージ（ｍＲＮＡ）が、ｍｄｘ及びｃａｖ−３-/-胚で上昇することを実証する。従って、カベオリン欠損胚におけるＩｇｆ−２の抑制は、転写後レベルにおいてである。
【図１１】Ｉｇｆ２の下流遺伝子Ｉｇｆ−２の下流遺伝子（ＣＤＫＮ１ｃ／Ｐ５７ｋｉｐ２及びｐＡｋｔ）も、ジストロフィーマウスでは障害を受け、（この場合もＲＴ−ＰＣＲ又は免疫検出するための）一群の遺伝子に含めることができる。図を参照されたい。ＣＤＫＮ１ｃ／ｐ５７ｋｉｐ２のレベルは、ジストロフィン欠損及びカベオリン欠損マウス胚の両方で、野生型と比較して著しく及び再現性よく低減される。（Ｂ）ｐＡｋｔはｍｄｘで上昇し、ｃａｖ−３-/-マウス胚では抑制される。
【図１２】ヒト骨格ＤＭＤにおけるＰａｘ−７筋芽細胞の枯渇を示す図である。
【図１３】対照と比較した、ヒトＤＭＤ及びＢＭＤにおけるＰａｘ−７筋芽細胞の枯渇を示すグラフを示す図である。
【図１４】ｍｄｘにおいてカベオリン−３レベルが野生型に低減されることにより、重症度が増し、ｍｄｘマウス筋肉におけるジストロフィー表現型の進行を持続させる。
【図１５】ジストロフィー筋芽細胞に対するＩｇｆ−２の影響；Ｐａｘ−７及びＰａｘ−３は、Ｉｇｆ−２処理により上方制御される。ジストロフィー筋芽細胞におけるカベオリン−３レベルの増加は、Ｉｇｆ−２処理により増強される。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
方法
マウスモデル
野生型（Ｃ５７ＢＬ１０）及び同質遺伝子型ｍｄｘ及びｃａｖ−３-/-マウス系統を使
用し、Ｃ５７Ｂ１１０を背景とするｃａｖ−３-/-ジストロフィーマウスは、Yoshito Hagiwara（東京）（Hagiwara et al., 2000）から得た。Ｍｄｘ及びＣ５７ＢＬ１０は、自己施設で生成した（Merrick et al., 2007）。二重突然変異体マウス（ｍｄｘｃａｖ＋／−）は、ジストロフィンがヌルであり（ｄｙｓ−／−）、カベオリン−３がヘテロ接合性であり（ｃａｖ−３＋／−）、Ｉｇｆ−２導入遺伝子がヘテロ接合性のジストロフィン欠損変異体を生成するために以前に記述された戦略を使用して（ｍｄｘＩｇｆ−２＋／−；（Smith et al., 2000））、ｍｄｘ及びｃａｖ−３-/-を交雑させることにより生成した。
遺伝子型決定は、ネオマイシン（ｃａｖ−３ＫＯ導入遺伝子を検出するため）及びカベオリン−３（ＷＴ、ｍｄｘ、及びｃａｖ−３+/-により発現されるが、ｃａｖ−３-/-では発現されない；図７）のＰＣＲにより達成した。示されたデータは、およそ５０：５０比率のｍｄｘ及びｍｄｘｃａｖ+/-胚を含有するＥ１５．５及びＥ１７．５胚の各々の２匹の
異なる同腹子に由来する。同腹子数（１同腹子当たり７〜９個の胚）は、ＷＴ及びｍｄｘから得られたものと同等だった。
【００６０】
マウス胚の調製
載物台に載せた野生型（ＷＴ）、ｃａｖ−３-/-、ｍｄｘ、及びｍｄｘｃａｖ+/-胚を、以前と同じように固定及び処理し、パラフィンろうで包埋した（Smith and Merrick, 2008）。プラグ検出の朝（morning of plug detection）を、Ｅ０．５と推定した。切片は全て矢状断だった（５μＭ）。切断の平面及び深さは、Kaufman's Atlas of embryology（Kaufman, 1992）を使用して、胚の正中線（二分点）で確定した。１系統当たり少なくとも３つの別々の胚に由来する一致した野生型（ＷＴ）、ｃａｖ−３-/-、ｍｄｘ、及びｍｄ
ｘｃａｖ−３+/-切片を、全ての分析に使用した。
【００６１】
免疫組織化学法
Ｉｇｆ−２、汎ミオシン（ＭＦ２０）、速筋ミオシン重鎖ＦＭｙＨＣ（Ｍｙ３２）、及びｐａｘ−７抗体の免疫染色及び条件は、以前に記述されており（Merrick et al., 2007）、ＣＤＮＫ１ｃ／ｐ５７ｋｉｐ２の免疫染色も、以前に記述されている（Westbury et al, 2001）。ｐＡｋｔ検出は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（英国）Ｌｔｄ社から取得した抗ｐＡｋｔウサギポリクローナル（Ｎｏ．９２７７）を使用して、１／１００の至適力価で達成した。。長期にわたるペルオキシダーゼブロッキングステップは、全ての染色実行に含まれていた。二次抗体対照は、非染色を示した。Ｂ−心筋ミオシンは、Ｎ２．２６１抗体（１／１０００；ＤＨＳＢ社製、アイオワシティ）を使用して検出した。ＣＤＮＫ１ｃ／ｐ５７ｋｉｐ２、ｐＡｋｔ、ＩＧＦ−２、及びＦＭｙＨＣ染色を、ＦＭｙＨＣ及びＩＧＦ−２について以前に記述されているように（Merrick et al., 2007）、一定のグリッド区域での抗体陽性筋管の割合を計数することにより定量化した。データを、スチューデントｔ検定及びＡＮＯＶＡを使用して分析した。少なくとも３０００個の筋管を、各データポイントで計数した。
【００６２】
Ｐａｘ−７免疫染色を、保管してあった若年ヒト筋肉生検でも実施した（図８を参照）。
【００６３】
ＭＦ２０染色切片における筋管形態及び定量化の分析
野生型（ＷＴ）、ｃａｖ−３-/-、及びｍｄｘに由来する矢状切断ＭＦ２０染色胚を、
切片の期、平面、及び角度に関して一致させた。アーチファクトを回避するために、本発明者らは、完全に切断面にある分割及び分岐のみを計数し、これは、切片間で注意深く制御された。この分析は、分割／分岐事象を過小評価する場合がある。Ｅ１３．５、Ｅ１５．５、及びＥ１７．５胚に由来する矢状断切片は、一致を容易にするために胚の正中地点で、発表されているマウスアトラス（Kaufman, 1995）に対して形態学的特徴の位置を注
意深く一致させた。切片は、誤整列及び分岐表現型の両方について、盲検法で及び２人の異なる観察者によって計数し、統計分析にかけた。得点化した各突然変異体及び野生型胚
について、グリッド目盛りを使用して、肋間筋、上肢筋及び下肢筋、並びに顔面筋領域の同じ縦に伸びる筋肉の一定の区域で、分岐を得点化した。誤整列線維の得点化は、縦断面の筋線維方向をグリッド目盛りに対して配向させ、２５度の角度を超えて逸脱した線維を一定の区域で得点化することにより達成した。本発明者らは、２人の実験者がスライドを計数し、第２の実験者は系統を知らされておらず、分割／分岐がｍｄｘでのみ特定され、統計的に有意だった場合、データは、分割／分岐の信頼できる指標であると確信する。筋管を計数する場合、本発明者らは、全ての筋管端部の確定を試みることはしなかったが（胚切片では不可能な課題である）、その代わり１系統当たり３つの異なる胚の近位、遠位、肋間、及び深背部筋の一致した切片を、一定の区域にわたって注意深く計数した（１系統当たりの計数された合計筋管：２〜３０００個）。本発明者らは、これにより、筋管に対する筋核の比率、及び１切片当たりの筋管の平均数を評価することが可能だった。データ分析：ＡＮＯＶＡ及びスチューデントｔ検定。
【００６４】
胚外植片
Ｅ１１．５〜Ｅ１７．５胚を解剖して、骨格筋細胞が豊富な区域を単離した。全ての胚で、頭部、脊髄、及び内臓を取り除いた。より後期胚（Ｅ１５．５〜Ｅ１７．５）では、皮膚及び軟骨／硬骨を取り除いた。筋肉が豊富な組織を顕微解剖して微小外植片にし、微小ウエルで培養した（Smith and Merrick, 2008；Smith and Schofield, 1994）。ＷＴ、ｍｄｘ、又はｃａｖ-/-  Ｅ１１．５外植片馴化培地（ＣＭ）を、コンフルエント培養か
ら取り出し、ろ過し（０．２μｍ  Ａｃｒｏｄｉｓｃ（登録商標）注射器フィルター；ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社、英国）、標準的培地補完剤（２０％ＦＣＳ；２ｍＭグルタミン）を補充し、新しいＥ１１．５野生型外植片に添加し、１８日間培養した（Smith and Schofield, 1997）。３つの胚に由来する１８０個の外植片を、この研究に含
めた３つの系統の各々について分析した。データはＡＮＯＶＡにより分析した。
【００６５】
アウトグロース分析
アウトグロースは、骨格筋外植片の増殖率の、信頼性があり高度に再現性のある尺度である（Smith and Schofield, 1994）。外植片を３週間養殖し、各ウエルの細胞のコンフ
ルエンスレベルにより得点化した。Ｍｙｆ−５免疫染色（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社製；力価１／５０００、ウサギ抗−Ｍｙｆ−５  ｃ２０）を使用して、Ｅ１１．５〜Ｅ１７．５
野生型（ＷＴ）、ｍｄｘ、及びｃａｖ−３-/-外植片培養の筋肉由来を実証し、８５％
を超える細胞がｍｙｆ−５＋だった（Smith and Merrick, 2008）。各切片を用いて実施
された二次抗体対照は、常に負に染色された。Ｍｙｆ−５  ｃ２０を使用して、筋形成を広範に実証する（Frock et al., 2006；Lindon et al., 1998）。
【００６６】
アポトーシス及び増殖の測定
筋芽細胞の形態学的特徴を有するコンフルエント外植片培養を、ディスパーゼと共に二次培養し（Smith and Schofield, 1994）、固定する前に６時間カバーガラスに播種した
（５×１０3細胞／ｃｍ2）。アポトーシス性核細胞を１０μｇ／ｍＬのＤＡＰＩで３分間染色した（Smith et al., 1995）。増殖細胞を、Ｋｉ６７（ウサギ抗Ｋｉ６７、力価１／１０００：Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｔｄ．社製、英国）で上記のように免疫染色した。抗原回収の場合（圧力鍋を使用した）、標準的紙クリップを使用して、カバーガラスをまずしっかりとスライドガラス上に取り付けた。３回の別々の実験を、各系統（Ｃ５７ＢＬ１０、ｃａｖ−３-/-、ｍｄｘ）について重複して実施した
。
【００６７】
タンパク質の単離及び免疫ブロット
胚からタンパク質を直接的に抽出して、ＲＩＰＡ緩衝液を含有するガラス製ホモジナイザー（１〜５ｍＬ；ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製、英国）に入れた。標準的プロトコールを使用して免疫ブロットを実施し、ＥＣＬ（Ｐｉｅｒｃｅ社製Ｅｎｄｏｇｅ
ｎ  Ｈｙｃｌｏｎｅ）により検出した。抗体：速筋ミオシン（Ｍｙ３２、１：１０００）；α−チューブリン（１：１０００、Ｓｉｇｍａ社製）；ｐａｘ−７（１／１０００）；カベオリン−３（ｌ／１０００）。ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（１：２０００、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）。タンパク濃度は、ＥＬＩＳＡ形式のブラッドフォードアッセイを使用して決定した（Merrick et al., 2007）。
【００６８】
Ｐａｘ−７  ＲＴ（逆転写）リアルタイムＰＣＲ
逆転写（ＲＴ）ＰＣＲを実施して、野生型（ＷＴ）及びｍｄｘマウス骨格筋から単離された筋芽細胞のｐａｘ−７  ｍＲＮＡ量を定量化した（Smith & Schofield, 1994）。定
量データを得るために、Ｐａｘ−７産物の線形化及び等化を、Ｉｇｆ−２について記述されているように実施した（Merrick et al, 2007）。ＲＴ−ＰＣＲを、これら定量下で、
野生型の６つの別々の単離物及びｍｄｘ筋芽細胞の６つの単離物に対して実施した。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ｃＤＮＡ試料を、Merrick et al, (2007)に記述された
ＲＴ−ＰＣＲ法により生成し、以下の試薬混合物中でのＰＣＲにかけた：
・５μＬの５×ＰＣＲ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）
・１．５μＬの２５ｍＭ  ＭｇＣｌ2（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）
・５μＬの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）。
・１μＬの２５μＭプライマー混合物、ＰＣＲ  ｄＨ2Ｏ（Ｓｉｇｍａ社製）中の１２
．５μＭ順方向及び１２．５μＭ逆方向プライマー（Ａｌｔａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）。
・１μＬのｃＤＮＡ
・１μＬのＴａｑ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）−最後に添加された試薬
【００６９】
ＴａｑポリメラーゼをＰＣＲ混合物（上記のような）に最後に添加して、ランダム転写を防止した。試料をプログラム可能な熱コントローラーに負荷し、熱コントローラーを、以下の通り、この遺伝子について特別にプログラムした：
【００７０】
【表１】
2012525576.tif 000002
【００７１】
プライマー配列：
ｐａｘ７−順方向：ｇｃｔ−ａｃｃ−ａｇｔ−ａｃａ−ｇｃｃ−ａｇｔ−ａｔｇ
ｐａｘ７−逆方向：ｇｔｃ−ａｃｔ−ａａｇ−ｃａｔ−ｇｇｇ−ｔａｇ−ａｔｇ
【００７２】
Ｉｇｆ−２
インスリン様増殖因子２（Ｉｇｆ−２）は以前に報告されている。染色法及びＰＣＲ法は、Merrick D et al (2007)に考察されている。典型的には、筋生検をアッセイした。
【００７３】
結果
分岐、線維誤整列、及び奇形筋管は、筋ジストロフィーの胚表現型を特徴付ける
野生型（ＷＴ）、ｃａｖ−３-/-、及びｍｄｘマウスを汎ミオシン抗体（ＭＦ２０）で
免疫染色して、筋線維構造を明らかにした（図１）。分岐及び線維分割は、Ｅ１３．５〜Ｅ１７．５のｍｄｘ軸上（背部）、軸下（肢筋、呼吸筋）、及び顔面筋で見出され、それが筋管形成に関連する初期事象であることと一致する、動的な時間的及び空間的パターンを示す（図１−１Ａ〜Ｃ及びＧ）。一致した期及び筋肉群では、ｍｄｘ筋管は、野生型と比べてジストロフィー胚で発育不全であり、ｃａｖ  ３-/-筋管は肥大性であり、筋管幅
は様々である（図１−１Ｃ〜Ｅ、青色バー）。最大の形態学的欠陥は、近位肢（Ｅ１５．５）よりｍｄｘ肋間（Ｅ１３．５）でより初期に生じ、これら筋肉の後期発生と一致する（図１−１Ａ）。ｃａｖ−３-/-及び野生型胚筋管では、線維分割はない（図１−１Ａ、
Ｃ、Ｅ、及びＦ、Ｈ）。筋管整列も、ｍｄｘ筋形成の初期に障害を受ける（図１−２Ｉ）。Ｅ１３．５では、最大１／８のｍｄｘ筋管は、近位肢、肋間、及び顔面筋の正中線維整列から誤配置されている（図１−２Ｉ）。これは、筋管の５％未満が誤配置されていたＥ１３．５の野生型及びｃａｖ−３-/-筋肉とは統計的に異なる。筋管を、正中から２５°
を超えて逸脱しているもの（誤整列）及び２５°未満誤配置されているもの（接線性線維）に分類すると、半分を超える誤配置Ｅ１３．５ｍｄｘ筋管（７〜９％）が、誤整列しており（図１−２Ｋ）、残りは接線性であったが、野生型又はｃａｖ−３-/-筋肉では、誤
配置筋管は全て接線的に誤配置されていた。これは、調査した他の期にも該当した（データ非表示）。誤配置筋管の割合は、在胎齢と共に減少し、筋肉群に依存する（図１−２Ｉ）。Ｅ１３．５では、ｍｄｘ肋間筋の筋管の１２％が不正確に整列しており、これは、在胎齢と共に減少するが、本発明者らは、全ての在胎期でｍｄｘ肋間筋における筋管の誤整列及び接線性の誤配置を見出した（Ｅ１３．５〜Ｅ１７．５、図１−２Ｉ、Ｍ）。同じ期のＷＴ及びｃａｖ−３-/-の肋間筋管は、正中に対して正確に整列しており、ＷＴ又はｃ
ａｖ−３-/-の肋間に筋管の逸脱はなく、これら筋肉の整列機序がしっかりと制御されて
おり、ｍｄｘでは重度に障害を受けることを示唆する（図１−２Ｈ〜Ｎ）。
【００７４】
ジストロフィー胚心臓の形態学的欠陥
心筋症は、ＬＧＭＤ（１Ｃ）及びＤＭＤの両方の重要な臨床的帰結である。本発明者らは、ＭＦ２０及び心筋β−ミオシン特異的抗体Ｎ２．２６１を使用して、ジストロフィー胚心臓及び野生型胚心臓の形態及びミオシン局在化パターンを実証した（図２）。文献と一致して、骨格速筋ミオシンアイソフォーム（ＦＭｙＨＣ）は、Ｅ１３．５〜Ｅ１７．５の胚心臓では検出することができなかった（Ｍｙ３２抗体、データ非表示）。心筋β−ミオシンは、Ｅ１３．５〜Ｅ１７．５の野生型及びジストロフィー心室及び心房筋細胞に存在する（図２−１Ａ〜Ｆ、図２−２Ｉ〜Ｐ）。両突然変異体は、心室壁肥厚（図２−１Ａ〜Ｆ）及び心筋細胞組織崩壊を示し、これは、ｃａｖ−３-/-において大幅により悪化し
ており、筋細胞が交差した様式で形成し互いに重なりあっている（図２−１Ｅ〜Ｆ及びＧ〜Ｈ）。心房小柱形成も、ジストロフィー胚では障害を受けており、長くてかぎ形のｍｄｘ小柱とは対照的に、Ｅ１４．５のｃａｖ−３-/-胚では短くて太い（図２−２Ｉ〜Ｊ）
。Ｅ１７．５では、染色が均一であり２つの層がしっかりと隣接している野生型心房とは対照的に（図２−２Ｋ，Ｎ）、ジストロフィー心房の心筋及び心内膜細胞層の拡延又は分離、及び心筋β−ミオシンの喪失がある（図２−２Ｋ〜Ｐ）。２つのジストロフィー心臓間には明確な相異があり、Ｅ１７．５のｃａｖ−３-/-では、心筋壁の染色にムラ及び減
少があり、それは小柱で最も顕著である（図２−２Ｏ）。ｍｄｘでは、染色の喪失は、心筋層の小柱間領域に広がっているが、小柱の端部では大部分が保持されている（図２−２Ｐ）。
【００７５】
筋核誤配置及び融合異常
Ｅ１５．５の野生型胚では、筋核は、筋管の長さに沿って均等に離間されており、新生筋管を除いて、縁部周辺では均等に及び螺旋形に配置されている（図３−１Ａ、白色の星印）。ｍｄｘでは、筋核は、野生型より中心により多く配置されており、わずかにさらに離間している（図３−１Ｂ）。対照的に、ｃａｖ−３-/-筋核は、互いにより近接してお
り、重度に障害を受けた筋核間隔及び核「集群化」を示し、それは筋管の端部で特に顕著である（図３−１Ｃ〜Ｄ）。横断面は、野生型筋肉ではこの期（Ｅ１５．５）に末梢核及び中心核が存在することを実証し、ｍｄｘ及びｃａｖ−３-/-筋肉では、中心核のみが存
在することを示す（図３−１Ｅ〜Ｇ）。これら表現型を定量化するために、本発明者らは、一定区域での筋核及び筋線維の合計を得点化して、ｃａｖ−３-/-筋管は、ｍｄｘ又は
野生型の筋管の２倍の筋核を含有していたことを実証し、これは、Ｅ１３．５、Ｅ１５．５、及びＥ１７．５において統計的に有意である（図３−２Ｋ；ｐ＜０．０５）。これらの期では、ｃａｖ−３-/-にも筋管が大幅に過剰に存在し（ｐ＜０．０５）、ｍｄｘの筋
管数は、わずかだが有意に（ｐ＜０．０５）より少ない（図３−１Ｈ〜Ｊ、図３−２Ｌ）。ｃａｖ−３-/-胚及びｍｄｘ胚の筋管数の不均衡は、Ｅ１３．５〜Ｅ１７．５で減少す
るが、野生型とは全ての期で統計的に異なっている。
【００７６】
培養胚筋肉幹細胞の過剰増殖及びアポトーシス
胚筋肉幹細胞集団を特徴付けるため、本発明者らは、ジストロフィー及び野生型（Ｅ１１．５〜Ｅ１７．５）胚筋芽細胞培養を使用した（Smith and Merrick, 2008）。これら
細胞の体節由来を、ｍｙｆ−５染色を使用して実証した（図４）。ｍｄｘ及びｃａｖ−３-/-外植片は両方とも、野生型（ＷＴ）とは異なるアウトグロース率を示す（図４−１Ａ
〜Ｂ）。野生型と比較して、ｍｙｆ−５＋細胞のアウトグロースは、ｍｄｘでは全ての期（Ｅ１１．５〜Ｅ１７．５）で、及びｃａｖ−３-/-ではＥ１５．５〜Ｅ１７．５で有意
により大きい。より初期の段階（Ｅ１１．５〜Ｅ１３．５）では、ｃａｖ−３-/-アウト
グロース率は、野生型と判別不能であり、欠陥はこの突然変異体ではより後期に生じることを示唆する。筋芽細胞増殖（ｋｉ６７免疫反応性）及びアポトーシス（Ｄａｐｉ染色）は両方とも、Ｅ１１．５〜Ｅ１７．５のｍｄｘで有意に上昇したが、ｃａｖ−３-/-では
、アポトーシス及び増殖率は、両パラメーターがｍｄｘ胚のアポトーシス及び増殖率に接近するレベルに急上昇するＥ１５．５まで野生型のアポトーシス及び増殖率と同じである（図４−１Ｃ、図４−２Ｅ）。ｍｄｘでは、増殖（及びアポトーシス）は、野生型レベルより依然として有意に高いままであるが、Ｅ１３．３からＥ１７．５まで減少し、しかしながら、ｃａｖ−３-/-筋芽細胞の増殖及びアポトーシスは、Ｅ１５．５まで増加する（
図４−１Ｃ〜Ｄ、図４−２Ｅ〜Ｆ）。Ｅ１７．５では、ｃａｖ−３-/-の増殖率は、ｍｄ
ｘレベルと一致してわずかに減少するが、アポトーシス率は、Ｅ１５．５のｃａｖ−３-/-筋芽細胞のレベルで維持される（図４−２Ｅ）。ｍｄｘ外植片由来の可溶性因子増殖因
子は、Ｅ１１．５ＷＴ外植片のアウトグロースを増加させる（図４−１Ｉ）。
【００７７】
ｐａｘ−７骨格筋幹細胞集団は、ジストロフィー胚では減少及び組織崩壊される
Ｅ１７．５では、ｐａｘ−７+幹細胞集団は、骨格筋筋管間でより低密度で分散してい
るが、ｐａｘ−７タンパク質は、筋肉サイズと共に増加し続ける（（Merrick et al., 2007）；図５−１Ａ〜Ｂ、Ｇ〜Ｈ、Ｍ及びＯ）。野生型胚では、ｐａｘ−７染色強度は、在胎齢に関わらず均一及び一定である（図５−１Ａ〜Ｂ、Ｇ〜Ｈ、及びＱ；低近位肢）。Ｅ１５．５〜Ｅ１７．５では、ｃａｖ−３-/-及びｍｄｘは両方とも、それらの筋肉組織の
全体にわたってそれらのｐａｘ−７+細胞集団の減少を起こし、そのため、両突然変異体
ではＥ１７．５までｐａｘ−７染色及びｐａｘ−７タンパク質が有意に減少する（図５−１Ｃ〜Ｌ、Ｍ、Ｐ；低近位肢について示されている）。これは、ｐａｘ−７陽性細胞が、Ｅ１７．５ではほとんど存在せず、それら残りの染色が非常に弱いｃａｖ−３-/-近位後
肢筋肉で特に明白である（図５−１Ｊ、白色の矢印）。Ｅ１５．５（ｃａｖ−３-/-及び
ｍｄｘ）及びＥ１７．５（ｍｄｘ）では、ｐａｘ−７陽性細胞断片が、ジストロフィー筋肉で見出され（図５−１Ｌ、黒色矢印により示される）、これら細胞がアポトーシスを起こしている可能性を示唆する。ジストロフィンが欠損し（ｍｄｘ）、カベオリン−３がヘテロ接合性だった（ｃａｖ−３+/-）突然変異胚（ｍｄｘｃａｖ−+/-）は、近位肢で非常により重度の表現型を示し、ｐａｘ−７陽性細胞が、Ｅ１５．５では非常に低密度で存在し（図５−１ＭＮ、及びＲ）、Ｅ１７．５では低近位肢にほとんど全く存在せず（図５−
１Ｏ〜Ｐ）、筋組織全体にわたって非常に減少する（図７を参照）。
【００７８】
全胚免疫ブロットは、Ｅ１１．５及び１３．５と比較して、Ｅ１５．５〜Ｅ１７．５のＷＴ（及びｍｄｘ）胚でカベオリン−３タンパク質が増加することを実証し、ｃａｖ−３-/-では、カベオリン−３タンパク質が存在しないことを確認する（図５−１Ｍ〜Ｎ）。
ｍｄｘでは、カベオリン−３は、４つの別々のゲル泳動でのデンシトメトリーにより測定したところ、Ｅ１１．５では検出されないが（図５−１ＭＮ）、Ｅ１３．５〜Ｅ１７．５のＷＴよりカベオリン−３含有量が数倍増加する（３つの期全てで、ｐ＝０．０５；図５−１Ｏ）。Ｐａｘ−７含有量は、野生型胚では妊娠と共に増加するが、Ｅ１５．５〜Ｅ１７．５のｃａｖ−３-/-及びｍｄｘでは大幅に減少し、減少は、両期においてｍｄｘより
ｃａｖ−３-/-でより大きく、カベオリン−３が、妊娠後期のｐａｘ−７+筋芽細胞生存を制御している可能性を示唆する。Ｅ１５．５では、ｍｄｘ及びｃａｖ−３-/-ジストロフ
ィー胚のｐａｘ−７バンド強度が、それぞれ１５％及び６０％低減する（図５−１Ｎ、Ｐ）。Ｅ１３．５では、ｐａｘ−７は、ｃａｖ−３-/-ではわずかに上昇し、ｍｄｘでは低
減し、これは、この期のｃａｖ−３-/-胚及びｍｄｘ胚にそれぞれ見出だされる筋管数の
増減に関連している可能性があり（図３を参照）、発生のタイミングが、これら胚で障害を受けている可能性を示唆する。
【００７９】
ジストロフィー胚の速筋ミオシンアイソフォームの誤局在化は、カベオリン−３及びジストロフィン欠乏胚筋肉で相反的パターンに従う
野生型では、ＦＭｙＨＣは、早ければＥ１１．５において少数の二次筋管に存在し、Ｅ１５．５までに、広範囲の筋肉群にわたって二次筋管の約４５％に強く局在化する。筋管の約８０％は、Ｅ１７．５においてＦＭｙＨＣを含有するが、染色強度は、多くの筋管で不均質で弱い（Merrick et al., 2007）。この動的で筋肉特異的な速筋ミオシン局在化パターンは、ｃａｖ−３-/-及びｍｄｘ突然変異体胚で障害を受けており、ＦＭｙＨＣ染色
の発生タイミング、存在する速筋ミオシン陽性筋管の総数、及び速筋ミオシン染色の強度に関する異常を示す（図６、図Ｓ１）。Ｅ１３．５では、ＦＭｙＨＣは、幾つかのｃａｖ−３-/-筋肉ではＷＴを超えて上昇するが（呼吸筋で顕著）、全てのｍｄｘ筋肉及びｃａ
ｖ−３-/-近位筋では大幅に減少する（図６−１Ａ〜Ｆ）。
【００８０】
ＦＭｙＨＣ+筋管の出現は、ｍｄｘ胚及びＥ１３．５のｍｄｘ胚では遅延され、同じ期
のＷＴ又はｃａｖ−３-/-胚と比較して、ＦＭｙＨＣ+筋管は筋肉組織の全体にわたって非常に少数である（呼吸筋、図６−１Ａ〜Ｆ；近位筋は同様の表現型を示す（非表示））。この知見は、ｍｄｘ  Ｅ１３．５バンドの強度が統計的に有意に低減される免疫ブロットにより（図６−２Ｔ及びＵ）、及びＥ１３．５ｍｄｘ胚のＦＭｙＨＣ+筋管が統計的に有
意に（ｐ＜０．０５）欠乏していることを実証する筋管の計数（図６−２Ｖ）により支援される。合計６つのｍｄｘ及び４つのＷＴ  Ｅ１３．５胚を使用して、これらのデータを実証した。ｍｄｘでは、ＦＭｙＨＣ陽性筋管の染色強度及び割合が大幅に増加し、そのためＥ１５．５からＥ１７．５まで、ジストロフィン欠乏筋管のＭｙ３２染色は、野生型と比較して大幅に過剰であり、全胚免疫ブロットのＦＭｙＨＣバンドの染色強度が増加する（図６−１Ｇ〜Ｏ、図６−２Ｔ）。ｍｄｘ胚ＦＭｙＨＣ含有量の増加及びｃａｖ−３-/-
胚ＦＭｙＨＣ含有量の減少を明らかにしたデンシトメトリーにより、この結論が確認された。これは、統計的に有意であり、それぞれＰ＜０．００１及びｐ＜０．０５である（図６−２Ｕ）。野生型胚及びジストロフィー胚の一致したＦＭｙＨＣ免疫染色筋肉切片の定量化により、ＦＭｙＨＣ陽性筋管の割合が、ｃａｖ−３-/-胚及びｍｄｘ胚でかく乱され
ることを実証した（図６−２Ｖ）。ｃａｖ−３がヘテロ接合性であるｍｄｘ胚（ｍｄｘｃａｖ−３+/-）も、Ｅ１５．５（図６−１Ｒ）及びＥ１７．５（図６−１Ｑ、Ｓ）では、
筋管が著しく枯渇する肋間筋等の筋肉（図７−２Ｔ〜Ｕ）においてでさえ、ＦＭｙＨＣを下方制御せず、筋肉組織の全体にわたってＦＭｙＨＣ染色を増加させた。
【００８１】
ｍｄｘｃａｖ+/-突然変異体胚における広範な肋間筋線維喪失及びｐａｘ−７枯渇
上方制御されたカベオリン−３が、ｍｄｘ／ＤＭＤ表現型に対して寛解性である可能性が高いか、又は寄与性である可能性が高いかを実証するために、本発明者らは、ジストロフィンが欠損し（ｍｄｘ）、カベオリン−３ヌル突然変異がヘテロ接合性だった（ｃａｖ−３+/-）二重突然変異体胚を生成した。Ｅ１５．５では、これら胚は、野生型胚と比較
して、カベオリン−３の５０％低減を示す（図５）。ＭＦ２０及びｐａｘ−７を用いた免疫染色により、Ｅ１７．５ではｍｄｘｃａｖ−３+/-胚が、後肢ｐａｘ−７筋芽細胞の喪
失（図５を参照）に加えて、ｐａｘ−７陽性肋間筋芽細胞の有意な減少（図７−１Ａ〜Ｊ）を伴うそれらの肋間筋線維の著しい枯渇も含む、より重度の表現型を示すことが実証される。線維喪失表現型は、野生型肋間筋線維では互いに密集しているｍｄｘｃａｖ+/-肋
間の線維間に隙間（「白色の空間」）が存在することにより、低倍率でさえ識別することができる（図７−１Ａ、Ｄ、及びＦ、Ｉ）。より高い倍率（図７−２Ｋ〜Ｐ）では、この表現型が、野生型（ＷＴ）、ｍｄｘ、又はｃａｖ−３+/-肋間筋と比較して、線維クラス
ターがはるかに少数であることの結果であることは明らかである。この表現型は、非常に一貫しており、３つの異なるｍｄｘｃａｖ+/-胚が示されている（図７−２Ｎ〜Ｐ；ｍｄ
ｘｃａｖ−３+/-  １、２、及び３）。ｍｄｘでも、肋間線維は、野生型よりも低密度に
分布していると考えられ、この表現型のより軽度の形態であることが示唆される。線維密度の定量化は、一定のグリッド区域の肋間線維数を計数することにより達成し、ｍｄｘ及びｈｅｔ（ｍｄｘｃａｖ−３+/-）が両方とも線維密度の低減を示したことを実証した。
これは、ｈｅｔ突然変異体では統計的に有意な低減である（ｐ＜０．０５；図７−２Ｒ）。野生型の割合として表すと、ｍｄｘｃａｖ−３+/-突然変異体胚が、Ｅ１７．５までに
それらの肋間筋管の７１．２％の大量枯渇を示すが（図７−２Ｓ；３つの異なるＥ１７．５  ｍｄｘｃａｖ−３+/-胚数の平均）、ｍｄｘは、３分の１（３７．５％）の枯渇を示
すことを理解することができる。これら線維の大多数は、両突然変異体において速筋ミオシン（ＦＭｙＨＣ）を発現する（図７−２Ｕ）。
【００８２】
ヒト筋生検のＰａｘ−７染色
これは、図８として示されており、ヒト若年筋を上述の様式と類似した様式で染色することができることを実証する。
【００８３】
Ｐａｘ−７遺伝子発現研究
ＲＴ−ＰＣＲを使用してｐａｘ−７  ｍＲＮＡレベルを定量化した。これにより、ＤＭＤ個体のｐａｘ−７レベルが、正常個体より低いことが示された。
【００８４】
Ｉｇｆ−２障害マウス
Merrick et al (2007)は、筋線維におけるＩｇｆ−２について記述している。図９は、障害マウスのＩｇｆ−２を示す。Ｉｇｆ−２メッセージ（ｍＲＮＡ）は、ｍｄｘ胚及びｃｏｗ−３-/-胚で上昇する。カベオリン欠乏胚におけるＩｇｆ−２の抑制は、転写後レベ
ルにおいてである。
【００８５】
Ｉｇｆ−２の下流遺伝子
ＣＤＫＮ１／Ｐ５７ｋｐ２の減少又はｐＡｋｔ（リン酸化Ａｋｔ）の発現変更は、図１１の発現レベルにより示されているように、筋ジストロフィーに特徴的である。ｐＡｋｔは、ＭＤ疾患タイプ特異的な応答を示し、例えば、ｐＡｋｔは、カベオリン−３欠乏／ＬＧＭＤ−１ｃでは、正常筋肉と比較して低減され、ｍｄｘ／ＤＭＤでは増加する。ｐＡｋｔの障害パターンは、Ｉｇｆ−２のパターンと同じである。
【００８６】
考察
本研究では、本発明者らは、ｍｄｘ及びｃａｖ−３-/-ジストロフィーマウスの胚表現
型を実証し、両タンパク質のマウス突然変異体（ｍｄｘｃａｖ−３+/-）では、胚表現型
が著しくより重度であることを示す。本発明者らは、マウス胚発生におけるジストロフィン及びカベオリン−３の重要な役割を実証し、ＤＭＤ及びＬＧＭＤ−１ｃの成体ジストロフィー表現型及び臨床像を規定する病理が、胚筋肉分化の不全に由来することを実証する。この分析の重要な知見は、表２に要約されている。
【００８７】
初期の筋肉パターン形成が、ジストロフィン欠損胚では障害を受ける
ｍｙｆ−５+  ｍｄｘ胚筋芽細胞の増殖挙動は、Ｅ１１．５から障害を受け、ｍｄｘ  
ｍｙｆ−５＋筋芽細胞は、過剰増殖性であり、アポトーシス性である。Ｍｙｆ−５は、胚筋芽細胞集団を特徴付け、筋管分化が開始される前に、筋板で発現され（Ｅ８．５）、筋形成の全体にわたって全ての筋肉群で見出される（Hadchouel et al., 2003；Ott et al., 1991）。ジストロフィンは、Ｅ８．５でＭｙｆ−５が発現された１日後であり、完全に分化した筋板（軸上）筋管が最初に出現し、ミオシン重鎖（ＭｙＨＣ）が最初に発現される２４時間前（Ｅ１０．５）である、筋板分化中の重要な期（Ｅ９．５）で発現される（Houzelstein et al., 1992；Ott et al., 1991；Schofield et al., 1993）。初期の腹側筋形成及び二次筋形成は、ＦＭｙＨＣ、ｐａｘ−７、及びｃａｖ−３タンパク質が後に出現することにより、及びＥ１１．５〜Ｅ１３．５におけるｍｄｘ筋肉組織の不完全形成及び組織崩壊により示されるように、ｍｄｘ胚において重度に障害を受け、遅延される（図１；図６及び補助データの図Ｓ１）。これらのデータは、ジストロフィンが、筋板分化に不可欠な役割を有しており、筋板分化は、ｍｄｘ胚で障害を受けると、筋肉組織全体のパターン形成及び機能に重篤な帰結がもたらされることを示唆する。
【００８８】
また、Ｅ１０．５では、ｍｙｆ−５＋筋芽細胞は、筋板から遊走して腹側筋形成を開始する（Cusella-De Angelis et al., 1992）。筋芽細胞は、ｈｏｘ遺伝子（ｐａｘ３及び
ｌｂｘ）の制御下で遊走し、隣接組織により分泌される増殖因子（ｗｎｔ１及びｓｈｈ）に応答して分化する（Gross et al., 2000；Hadchouel et al., 2003）。胚筋芽細胞遊走を開始させる合図は未知であり、他の組織では、幹細胞遊走は、由来組織及び目的組織からの誘導合図により制御されており、胚構造の正確なパターン形成に不可欠であり、容易に障害を受ける場合がある（Lehmann, 2001）。Ｅ１０．５〜１１．５の軸上筋管が、筋
板からのｍｙｆ−５＋筋芽細胞の遊走を引き起こし、腹側筋形成及び二次筋形成を開始させるシグナル伝達の合図を提供すると考えることは可能である。ジストロフィンの非存在下では、これらの合図は存在せず、遊走及び開始プロセスは両方とも妨げられる。Ｅ１１．５  ｍｄｘＣＭで培養されたＥ１１．５  野生型外植片の異常挙動（図４−１Ｉ）は、Ｅ１１．５筋板が、Ｅ１１．５胚筋芽細胞集団の挙動を修飾する分泌因子を放出するという見解を支持する。ｍｄｘにおける初期筋形成の障害は、ジストロフィンのこれら初期の役割（複数可）が、ユートロフィンの役割とは異なることを示唆する。この結論は、初期胚期で排他的であるジストロフィン及びユートロフィンの公開されているｍＲＮＡのｉｎ
ｓｉｔｕパターンと一致する（Houzelstein et al., 1992；Schofield et al., 1993）。妊娠の後期段階では（以下を参照）、ｍｄｘ筋形成には、これら胚によるカベオリン−３のその後の過剰産生により、又は別のタンパク質、例えばａ−ユートロフィンの代償性発現により媒介され得る「追い付き」プロセスがあると考えられる。生後の筋肉では、ａ−ユートロフィンは、ジストロフィン欠乏筋肉で上方制御され、ｍｄｘではジストロフィンの幾つかの機能を引き継ぐことができる（Weir et al., 2004）。妊娠後期における二
重突然変異体表現型（ｍｄｘｃａｖ−３+/-）の重症度増加により、妊娠後期のｍｄｘ胚
におけるカベオリン−３の代償性効果も主張される。
【００８９】
カベオリン−３は、筋肉制御因子（ＭＲＦ）により制御され、筋管分化中に活性化され、Ｅ１１．５筋板ではジストロフィンより後期で発現される（Biederer et al., 2000）
。これは、本発明者らが、Ｅ１１．５の野生型胚でカベオリン−３を検出したことと一致している。ＭＲＦは、Ｅ１１．５でも出現するｐａｘ−７も制御する（Merrick et al., 2007）。ｃａｖ−３-/-胚では、初期筋肉パターン形成プロセスは無傷であると考えられ
、ｍｙｆ−５＋筋芽細胞挙動は障害を受けておらず、腹側筋形成の局在化及びタイミングは、野生型と同等である。従って、カベオリン−３は、これら初期の筋形成に必要ではないと考えられる。ｍｄｘでは、カベオリン−３及びｐａｘ−７の出現は両方とも遅延され、これは、これら胚における筋形成の発生遅延の帰結であるか、又はジストロフィン活性化不全のより特異的な下流であり得る。
【００９０】
腹側筋形成及び二次筋形成
後期胚事象におけるジストロフィンの役割を解釈することは、Ｅ１３．５からｍｄｘ胚でカベオリン−３が上方制御されることにより複雑になる。出生後の組織では、カベオリン−３の過剰発現は、ジストロフィン下方制御及びＤＭＤ様表現型を引き起こす（Galbiati et al., 2000）。ジストロフィンの喪失は、ＤＧＣの解体及びジストロフィン−関連
タンパク質の抑制を引き起こす（Ohlendieck et al., 1993；Vaghy et al., 1998）。し
かしながら、ＤＭＤ患者及び成体ｍｄｘの筋肉は、それぞれ１．５〜２．４及び２〜３倍過剰なカベオリン−３を有する（Vaghy et al., 1998）。Ｅ１３．５〜Ｅ１７．５のｍｄｘ胚において、本発明者らは、（期依存的な）平均３〜５倍過剰なカベオリン−３を見出し、カベオリン−３発現の障害が、ジストロフィン欠乏の初期の重要な帰結であることが示唆される。ジストロフィンの胚ｍＲＮＡ発現パターンは、野生型におけるジストログリカンの発現パターンと重なるが、ユートロフィンとは重ならず、このパターンは、ｍｄｘ胚では変化しない（Houzelstein et al., 1992；Schofield et al., 1995）。従って、ジストロフィンは、β−ジストログリカンに対して競合的に結合することにより、カベオリン−３を負に制御することができる（Ilsley et al., 2002）。
【００９１】
ゼブラフィッシュの胚では、カベオリン−３突然変異体は、細胞骨格異常及び融合異常を示し、ジストロフィン突然変異体は、不安定な筋肉結合を示し、胚筋管の配置及び配向における役割を示唆する（Bassett et al., 2003；Nixon et al., 2005）。Ｅ１３．５筋形成は、ｃａｖ−３-/-及びｍｄｘで障害を受け、表現型は、マウスカベオリン−３及び
ジストロフィンが、ゼブラフィッシュの対応する物質と同様の役割を有することを示唆する。Ｅ１３．５のｍｄｘにおいて、本発明者らは、筋管の誤配置、分割、及び分岐を見出した。筋管配向性の異常は、カベオリン−３欠損突然変異体では見出されない。その代りに、胚ｃａｖ−３-/-筋核は、筋管端部に集群しており、ｃａｖ−３-/-で出生後に報告されているＴ管異常を示唆する（Minetti et al., 2002）。Ｅ１３．５〜Ｅ１７．５の過剰なｃａｖ−３-/-筋管産生は、筋核含有量の２倍増加及び肥大も見出された。これらのデ
ータは、培養ｃａｖ−３-/-筋芽細胞を使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究データと一致し、
この研究では、相反的表現型（筋管数の低減、より少数の筋核、及び肥大）が、カベオリン−３過剰発現筋芽細胞に見出され、カベオリン−３が筋芽細胞融合を抑制することを示唆する（Volonte et al., 2003）。Ｅ１３．５のｍｄｘ胚は、発育不全筋管及び筋管数の低減を示す過剰発現表現型を部分的に再現する。筋核数は影響を受けない。しかしながら、後期段階（Ｅ１５．５〜Ｅ１７．５）では、カベオリン−３レベルは依然として高いままであるが、ｍｄｘの筋管数は野生型と同等である。これは、カベオリン−３は、筋管サイズを制御することができるが、Ｅ１３．５の筋管異常は、過剰なカベオリン−３によるものではなく、ｍｄｘの腹側筋形成の遅延によるものである（上記の項目を参照）ことを示唆する。
【００９２】
ｃａｖ−３-/-及びｍｄｘにおける速筋線維特異化の相反的な障害
ＦＭｙＨＣ＋筋管は、野生型軸上筋ではＥ１１．５で最初に出現し、二次筋形成の開始を予告する（Merrick et al., 2007）。線維タイプの切り替えは、幾つかの筋管が遅筋及び速筋ミオシン発現間で切り替わり、成体線維タイプ比を実証するプロセスが始まるＥ１５．５で始まる（Cho et al., 1994；Merrick et al., 2007）。ｍｄｘでは、ＦＭｙＨＣ＋筋管分化は、著しく障害を受け（上記の項目を参照）、速筋線維タイプ特異化は、ｍｄｘ及びｃａｖ−３-/-の両方で障害を受ける（図６）。Ｅ１５．５〜Ｅ１７．５では、ｍ
ｄｘが、ＷＴと比較して著しく過剰なＦＭｙＨＣタンパク質及びより高い割合のＦＭｙＨＣ＋筋管を有する相反的表現型が存在し、ｃａｖ−３-/-では、ＦＭｙＨＣが大幅に低減
される。ＦＭｙＨＣの過剰産生は、カベオリン−３の代償的増加により促進される、Ｅ１３．５のｍｄｘ筋肉における「追い付きプロセス」に起因する場合がある。しかしながら、Ｅ１５．５〜１７．５のｃａｖ−３-/-におけるＦＭＹＨＣ＋筋管の喪失は、カベオリ
ン−３も速筋線維特異化に必要であり、ｍｄｘにおけるカベオリン−３の過剰産生は、この表現型には病原性であり、Ｅ１５．５〜Ｅ１７．５のｍｄｘにおけるＦＭｙＨＣ線維の過剰産生を引き起こすことを示唆する。出生後の速筋線維は、ＤＭＤ及びｍｄｘにおいて優先的に変性し、筋肉機能に重篤な帰結がもたらされる（Webster et al., 1988）。カベオリン−３はヘテロ接合性であるが、ジストロフィンを完全に欠損している突然変異体（ｍｄｘｃａｖ−３+/-）では、ＦＭｙＨＣ＋線維は、野生型（ＷＴ）と比較してＥ１７．
５において依然として過剰に存在しており、これが、カベオリン−３レベル単独ではなく、正確な速筋線維の割合に重要なジストロフィンとカベオリン−３との均衡の取れた関係性であることを示唆する。
【００９３】
成体組織では、カベオリン−３及びジストロフィンは、ＤＧＣではβ−ジストログリカンの競合的結合により直接的に相互作用する（Sotgia et al., 2000）。これらのデータ
は、筋形成においてジストロフィン及びカベオリンが別々の役割を果たすことを実証するが、両タンパク質及び機能的ＤＧＣが、繊維タイプ特異化に必要である可能性を示唆する。
【００９４】
ｐａｘ−７筋芽細胞の喪失
Ｅ１５．５〜Ｅ１７．５のｃａｖ−３-/-及びｍｄｘは、ｐａｘ−７+筋芽細胞の消耗及びｐａｘ−７タンパク質の著しい枯渇を示す。ｐａｘ−７の喪失は、カベオリン−３が野生型胚で強力に上方制御される時点であるＥ１５．５のｃａｖ−３-/-で急速に生じ、こ
の喪失は、Ｅ１５．５のｍｄｘよりも大きい。カベオリン−３は、ｐａｘ−７自体と同じように、筋肉での生存シグナル伝達を誘発することができる。本発明者らのデータは、カベオリン−３が、Ｅ１５．５のｃａｖ−３-/-でｐａｘ−７＋筋芽細胞の急速な喪失に直
接的な役割を果たすことを示唆し、ｐａｘ−７＋筋芽細胞の消耗は、それらのカベオリン−３レベルの増加により、ｍｄｘ筋肉中で部分的に補償される場合があることを示唆する（Relaix et al., 2006；Smythe et al., 2003）。この結論は、ｍｄｘｃａｖ+/-突然変
異体では、ｐａｘ−７が、いずれの単一突然変異体よりも大幅に枯渇し、そのためｐａｘ−７細胞は、Ｅ１７．５になるまでｍｄｘｃａｖ+/-低近位肢筋肉には全く存在せず、他
の筋肉中で非常に低減されていることにより支持される。Ｐａｘ−７+筋芽細胞は、正常
な出生後の衛星細胞出現に重要である（Relaix et al., 2006；Seale et al., 2000）。
ｐａｘ−７の非存在下では（ｐａｘ−７-/-マウス）、衛星細胞は、細胞数が低減され、
アポトーシスが上昇する。しかしながら、ｐａｘ−３＋筋芽細胞が存在するため、衛星細胞は完全には失われず、これらマウスの（出生後の）若年筋肉発達を達成及び持続させるのに十分な衛星細胞が存在すると考えられるが、成体での再生は妨げられる（Oustanina et al., 2004；Relaix et al., 2006；Seale et al., 2000）。Ｅ１７．５のｍｄｘｃａ
ｖ+/-胚肋間筋は、筋管並びにｐａｘ−７＋細胞を著しく枯渇しているという知見は、ｐ
ａｘ−７が、胚筋形成にも重要な役割を果たす可能性があることを示唆する。これらにより、ジストロフィー胚は、出生後の生命に受け継がれる可能性がある筋線維を妊娠後期から生成するための能力を低減させることが示唆される。ジストロフィー筋肉再生は、異常であることが知られており、筋芽細胞アポトーシス、過剰増殖、不規則な線維サイズ、及び進行性線維沈着に関連する。ｍｄｘ及びｃａｖ−３-/-筋肉は両方とも、高いレベルの
アポトーシスに関連するそれらの筋肉の変性及び再生の勃発を初期の出生後週で経験する。（Hagiwara et al., 2000；Smith et al., 1995）ｍｄｘでは、４か月目から筋肉再生
の不全が進行し、それは、ｍｄｘでは、ユートロフィンの上方制御により部分的に媒介される場合がある変性プロセスの同時低減により軽減されるが、ＤＭＤでは軽減されない（
Reimann et al., 2000；Roig et al., 2004；Roma et al., 2004）。再生は、成体ｃａｖ−３-/-では詳細に研究されていない。データによると、ジストロフィー突然変異体の再
生機構は、これら突然変異体がｐａｘ−７を欠損しているため、出生時で異常であり、この早期喪失は、後になって成年期の再生プロセスの進歩性障害の根底をなす可能性があることが示唆される。ｐａｘ−７＋細胞の大量喪失と一緒に、Ｅ１７．５のｍｄｘｃａｖ+/-胚の呼吸筋の筋線維密度が著しく喪失することは、この結論をさらに強化し、カベオリ
ン−３レベルの増加が、ｍｄｘの（及び潜在的にはＤＭＤの初期段階の）変性表現型において重要な代償的役割を果たすことを示唆する。
【００９５】
ジストロフィーマウス表現型とＭＤの臨床病理との相関性
ＤＭＤ及びＬＧＭＤ  １ｃは、心筋及び骨格筋機能並びに筋肉安定性に影響を及ぼす早期発症性で進行性の小児骨格筋疾患である（Hoffman et al., 1987；Minetti et al., 2002）。ＤＭＤでは、全筋肉組織、異常なカベオリン−３発現、筋芽細胞アポトーシス、心筋症、及び再生異常の広範な進行性の機能不全である（Cox and Kunkel, 1997；Smith et
al., 1995；Vaghy et al., 1998）。
【００９６】
ＬＧＭＤ−１Ｃは、類似しているが制限された筋障害性変化を示し、特に肢、横隔膜、及び心臓の筋肉に影響を及ぼす（Galbiati et al., 2001；Hagiwara et al., 2000；Smythe et al., 2003）。ｍｄｘ及びｃａｖ−３-/-の出生後表現型は、ＤＭＤ及びＬＧＭＤの臨床病理とほとんどの点で十分に類似しており、疾患モデルとして広く使用されている（Chamberlain et al., 2007；Chan et al., 2007；Galbiati et al., 2001；Hagiwara et al., 2000；Roig et al., 2004；Vaghy et al., 1998）。ｍｄｘ及びｃａｖ−３-/-のそ
れぞれの胚表現型は、ＬＧＭＤ及びＤＭＤのモデルとして、これらのマウスの妥当性を強化し、ＭＤの根底にある機序並びにジストロフィン及びカベオリン−３の機能様式に対する新しい洞察を提供し、この疾患のヒト形態とネズミ形態との相異を精査する新しい手法を示唆する。本発明者らは、重要な発生段階を特定する；ジストロフィン及びカベオリン−３がそれぞれ重要な役割を果たし、妊娠後期の２つの新規な病理を明らかにする筋板分化（Ｅ１１．５）及び二次筋形成（Ｅ１３．５）；ＭＤ病理の根底にある機序に対する洞察力を提供し、ＭＤの治療介入及び早期診断のための新規経路を示唆する速筋線維特異化及びｐａｘ−７筋芽細胞の消耗。
【００９７】
心筋症、特に左室不全は、ＤＭＤ及び多くの他のＭＤの重要な臨床的帰結であり、ｃａｖ−３-/-、ｍｄｘ、及びカベオリン−３過剰発現マウスの実証されている病理である（Aravamudan et al., 2003；Cox and Kunkel, 1997；Hayashi et al., 2004；Quinlan et al., 2004；Woodman et al., 2002；Yue Y et al., 2003）。ジストロフィン及びカベオリン−３は、それぞれＥ９．５及びＥ１０．５のマウス胚心臓で発現する（Biederer et al., 2000；Houzelstein et al., 1992）。Ｅ１３．５において、ｍｄｘは、心尖部の中程
度の肥厚及び心房小柱異常を有する。ｃａｖ−３-/-では、心室の著しい肥厚、心房異常
、及び心筋症に特徴的な筋細胞組織の次第に悪化する障害があり、３〜４か月のカベオリン−３欠損マウスに見られる早期発症性の出生後心筋症と一致している。これらのデータは、カベオリン−３が正常な心臓発生に必要であり、心筋症に役割（複数可）を有し、Ｅ１７．５のｍｄｘ及びｃａｖ−３-/-でβ−心筋ミオシンが誤局在化されており、小柱が
異常であり、β−心筋ミオシン異常が幾つかのよく知られている心筋症の根底にあり、従ってジストロフィー心臓におけるその発現障害が重要であることを示唆する（Cuda et al., 1993）。心房障害は、以前にいずれのマウスでも報告されていない。このｍｄｘに関
する知見は、２８歳のＤＭＤで小柱が過剰形成されるという最近の報告が発生に由来することを示唆する（Finsterer et al., 2005）。出生後のｍｄｘ心臓は、ＷＴレベルのβ−心筋ミオシン、及びジストロフィン欠乏を補償することができるユートロフィンレベルの増加を示すことが報告されているが、これらマウスは、進行性の心筋症を有する（Quinlan et al., 2004）。β−心筋ミオシンの局在化は、出生後にはまだ実証されておらず、従
ってその心房局在化の障害は、成体でも持続される場合があり、又は出生時若しくは若年期に失われる場合がある（Wilding et al., 2005）。
【００９８】
過剰増殖及び筋細胞アポトーシス上昇は、ＤＭＤ／ｍｄｘ及びＬＧＭＤ−１ｃ／ｃａｖ−３-/-のマウス及びヒト形態の両方並びにほとんどの他のＭＤタイプを特徴付ける、出
生後のＭＤ筋肉病理の十分に実証された広範な特徴である（Baghdiguian et al., 1999；Smith et al., 1995；Smith et al., 2000；Smythe et al., 2003）。ジストロフィン、
ジストログリカン、及びカベオリン−３は、生存シグナル伝達に役割を有する（Glass, 2005；Smythe et al., 2003）。ｍｄｘ筋肉では、高レベルの筋芽細胞アポトーシス及び筋芽細胞過剰増殖は、出生後１週間〜成年期（Smith, 1996；Smith et al., 1995；Spencer
et al., 1997）及び（この研究では）Ｅ１１．５〜Ｅ１７．５の胚期中で実証される。
これらのデータは、幹細胞挙動の障害を示唆し、アポトーシスは、ジストロフィン喪失の初期帰結及びＤＭＤ病理の重要な寄与要因である。筋芽細胞アポトーシスは、後にＥ１５．５のｃａｖ−３-/-で生じ、この表現型が、疾患の重症度の正確な予測因子である可能
性を示唆する。
【００９９】
新しい洞察−ＭＤに対する重要性
これらのデータは、筋ジストロフィーの病因に関する新しい展望を提示し、ジストロフィン及びカベオリン−３に関する胚の役割を実証し、それらは筋形成に関する理解を進歩させ、ｐａｘ−７筋芽細胞の置換及び線維タイプ特異化の修飾を試みる治療戦略が、筋ジストロフィーの初期治療において生産的であり得ることを示唆する。早期診断及び治療介入は、筋ジストロフィー患者の生活の質を改善する可能性が高い。さらに、カベオリン−３、速筋ミオシン、Ｉｇｆ−２、ＣＤＫＮ１ｃ／Ｐ５７ｋｉｐ２、及びｐＡｋｔをアッセイで使用することも示唆される。
【０１００】
さらなる診断アッセイのデータ
本発明者らは、ヒト骨格筋試料でのｐａｘ−７染色を以下の通り実施した：対照（非疾患）小児、３１日齢（図１２Ａ〜Ｃ）；１６週（図１２Ｄ〜Ｆ）及び１２．７週（図１２Ｇ〜Ｉ）の（非疾患）ヒト胎児組織。これらのデータは、正常な胎児及び新生児の骨格筋でのＰａｘ−７染色パターンが、同じ期のマウス胚及び新生児組織に見出されるものと直接比較可能（同等）であることを実証する。Ｐａｘ−７＋筋芽細胞は、ヒト及びマウス胎児及び新生児組織の両方に豊富であり、均一に分布しており、ｐａｘ−７抗体で強く標識される。本発明者らは、１０種の異なる（非筋ジストロフィー）筋肉疾患におけるｐａｘ−７陽性筋芽細胞局在化も調査し、これら疾患の各々では、ｐａｘ−７陽性筋芽細胞は豊富に存在し、非疾患筋肉試料の数は著しくは異なっていなかった。代表的な試料（筋細管ミオパチー）は図１２（Ｊ〜Ｌ）に示されている。しかしながら、デュシェンヌ型及びベッカー型筋ジストロフィー（ＤＭＤ及びＢＭＤ）患者に由来する骨格筋試料では、結果は異なっていた（図１２Ｍ〜Ｐ及び図１３）。ＤＭＤ及びＢＭＤでは、ｐａｘ−７陽性筋芽細胞の数は、対照と比較して著しく枯渇しており、疾患重症度と一致していた（ＤＭＤ筋肉は、Ｐａｘ−７細胞では、より軽度のＭＤ形態であるベッカー型のものより一貫して枯渇していた）。Ｐａｘ−７染色強度も、正常試料と比較して低減され、これは、Ｐａｘ−７陽性筋芽細胞の数が少なく、主にＰａｘ−７がわずかに発現するＤＭＤ患者筋肉で特に明白だった。ＤＭＤ患者筋肉は、大きな領域がｐａｘ−７陽性筋芽細胞を全く含有していなかった（図１２Ｍ〜Ｐ、弱染色ｐａｘ−７＋細胞及びＰａｘ−７＋細胞のない領域は、星印*により示されている）。これらのデータは、ｐａｘ−７枯渇が、他の非ＭＤミオパ
シー及び小児の非疾患筋生検とこれら疾患を識別するために使用することができるＤＭＤ及びＢＭＤの初期マーカーであることを実証する。このマーカーは、単独で、又は筋肉分解のマーカー（例えば、クレアチンキナーゼ）、及び／又は筋肉再生のマーカー（例えば、発生中のミオシン、Ｉｇｆ−２）、及び／又はこの疾患の他のマーカー（例えば、カベオリン−３、速筋ミオシン）と組み合わせて使用して、明白な臨床徴候の発症前に（ＤＭ
Ｄでは、出生前、及び出生から５歳以下まで）、胎児、新生児、及び低年齢小児の筋ジストロフィーを識別することができる。これらのデータは、Ｐａｘ−７を単独で、又は治療効能のマーカーとして及び疾患進行の指標として他のマーカーと組み合わせて使用することも強く支持する。
【０１０１】
さらなる治療データ
カベオリン−３は、ｍｄｘ（マウス）胚及び出生後組織、並びにＤＭＤ（ヒト）筋肉で、正常（野生型）レベルを超えて上昇する。ジストロフィンが欠損しており（ｍｄｘ）、カベオリン−３がヘテロ接合性である二重突然変異体マウス胚は、カベオリン−３のレベル低減、及びジストロフィン欠損（ｍｄｘ）のみに見出されるものより重度の筋肉病理を示し、高レベルのカベオリン−３が、ジストロフィンの喪失を補償することができることを示唆する。図１４は、カベオリン−３のレベルが低減されて、ｍｄｘマウスの非疾患（野生型）レベルに戻ると、ｍｄｘの出生後ジストロフィー表現型では重症度も増加し、これらマウスにおけるカベオリン−３レベル増加の治療効果を確認する（図１４）。ウエスタンブロッティングを使用して、本発明者らは、これら（ＤＭ−二重突然変異体）動物に見出されるカベオリン−３タンパク質のレベルが、ｍｄｘマウスのみに見出されるものと比較して、一貫して低減され、野生型マウスに見出されるレベルと同等であることを実証した（図１４Ａ）。組織学的レベルでは、ｍｄｘマウスのジストロフィー病理は、出生後３〜８週で最も重症である。重要なことには、この疾患の進行は、ｍｄｘと比較して、野生型レベルのカベオリン−３を有するジストロフィン欠損マウスで持続し、同じ年齢（９週齢）のｍｄｘ筋肉と比較して、又はカベオリン−３-/-欠損マウス（ｃａｖ−３-/-）に見出される、より軽度の病理と比較して（図１４Ｄ〜Ｅ）、８週後（図１４Ｂ〜Ｃ）のＤＭ（ｈｅｔ）筋肉において進行性の重度の病理が持続する。まとめると、これらのデータは、カベオリン−３タンパク質レベルの増加が、ジストロフィン欠乏病理に対する治療効果を有し、カベオリン−３の上方制御をデュシェンヌ型筋ジストロフィーの有効な治療であると特定する。
【０１０２】
Ｉｇｆ−２は、ジストロフィー（ｍｄｘ）表現型（Smith et al, 2000）に対する寛解
効果を示すが、その機序は不明である。図１５は、Ｉｇｆ−２が、ジストロフィー筋芽細胞におけるＰａｘ−７、Ｐａｘ−３、及びカベオリン−３の発現を上方制御することができることを実証し、その治療効果の直接的機序を示唆し、このタンパク質を治療剤として別々に又はカベオリン−３等の他の治療と共に使用することに対する強力な支持を提供する（図１５）。（Ａ〜Ｂ）Ｉｇｆ−２は、１０〜２０μｇ／ｍＬのＩｇｆ−２で処理した１５分以内に、野生型（ＷＴ）及びジストロフィー筋芽細胞でＰａｘ−７の発現増加（ｍＲＮＡ）を誘導する。この効果は持続し、Ｐａｘ−７は、少なくとも２４時間後まで筋芽細胞で上方制御され続ける（統計的に有意である、ｐ＜０．０１、スチューデントｔ検定）。（Ｃ−Ｄ）同様に、Ｉｇｆ−２は、１５分以内のＰａｘ−３メッセージの上方制御を誘導し、これは、少なくとも２４時間後まで持続する（２０μｇ／ｍＬのＩｇｆ−２：ｐ＜０．０１）。（Ｅ〜Ｆ）Ｗｔ筋芽細胞のＩｇｆ−２治療の用量反応曲線は、Ｉｇｆ−２も、ｐａｘ−７タンパク質の増殖を誘導する（本明細書では、処理後８時間を示す、ｐ＜０．０１）。（Ｇ）ウエスタンブロッティングにより測定された、野生型（ＷＴ）及びジストロフィー筋芽細胞でのカベオリン−３タンパク質発現の比率は、ジストロフィー筋芽細胞でのカベオリン−３が、野生型で見出されるレベルを超えて２〜３倍上昇することを例示する。１５分以内に、Ｉｇｆ−２処理は、野生型と比較して、ジストロフィン筋芽細胞でのカベオリン−３タンパク質の最大８倍増を誘導し、これは、少なくとも２４時間後まで持続する（ｐ＜０．０１、２０μｇ／ｍＬ  Ｉｇｆ−２）。
【０１０３】
【表２】
2012525576.tif 000003
【図１−１】
2012525576.tif 000004
【図１−２】
2012525576.tif 000005
【図２−１】
2012525576.tif 000006
【図２−２】
2012525576.tif 000007
【図３−１】
2012525576.tif 000008
【図３−２】
2012525576.tif 000009
【図４−１】
2012525576.tif 000010
【図４−２】
2012525576.tif 000011
【図５−１】
2012525576.tif 000012
【図５−２】
2012525576.tif 000013
【図６−１】
2012525576.tif 000014
【図６−２】
2012525576.tif 000015
【図７−１】
2012525576.tif 000016
【図７−２】
2012525576.tif 000017
【図８】
2012525576.tif 000018
【図９】
2012525576.tif 000019
【図１０】
2012525576.tif 000020
【図１１】
2012525576.tif 000021
【図１２】
2012525576.tif 000022
【図１３】
2012525576.tif 000023
【図１４】
2012525576.tif 000024
【図１５】
2012525576.tif 000025
【配列表】
2012525576000001.app
【国際調査報告】
2012525576.tif 000026
2012525576.tif 000027
2012525576.tif 000028
2012525576.tif 000029
2012525576.tif 000030
2012525576.tif 000031