【手続補正書】
【提出日】平成21年5月28日(2009.5.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
DnaJ様タンパク質 (例えば、JEM1)、Hsp70ファミリーのタンパク質 (例えば、LHS1) およびSIL1から選択される２種またはそれ以上のヘルパータンパク質を過剰発現するように宿主細胞が遺伝的に修飾されており、ここで過剰発現される２種またはそれ以上のヘルパータンパク質の少なくとも1種はJEM1、LHS1およびSIL1から選択され、そしてDnaJ様タンパク質はSCJ1ではないことを特徴とする、選択されたタンパク質生成物の産生の増強に適当な宿主細胞。
【請求項２】
下記を過剰発現するように、宿主細胞を遺伝的に修飾されている、請求項１に記載の宿主細胞:
（ａ）DnaJ様タンパク質およびHsp70ファミリーのタンパク質; または
（ｂ）DnaJ様タンパク質およびSIL1; または
（ｃ）Hsp70ファミリーのタンパク質およびSIL1。
【請求項３】
３種またはそれ以上のヘルパータンパク質を過剰発現するように宿主細胞は遺伝的に修飾されており、ここで3種またはそれ以上のヘルパータンパク質はDnaJ様タンパク質、Hsp70ファミリーのタンパク質およびSIL1を含んでなり、そしてDnaJ様タンパク質はSCJ1ではないことを特徴とする、選択されたタンパク質生成物の産生の増強に適当な宿主細胞。
【請求項４】
Hsp70ファミリーのタンパク質がER内腔に局在化するタンパク質である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項５】
Hsp70ファミリーのタンパク質が原核生物のHsp70ファミリーのタンパク質ではなく、そして好ましくは真核生物 (例えば、酵母) のHsp70ファミリーのタンパク質である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項６】
Hsp70ファミリーのタンパク質がLHS1、KAR2、SSA1、SSA2、SSA3、SSA4、SSE1、SSE2、SSB1、SSB2またはECM10、好ましくはLHS1である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項７】
DnaJ様タンパク質がER膜に局在化するタンパク質である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項８】
DnaJ様タンパク質が原核生物のDnaJ様タンパク質ではなく、そして好ましくは真核生物 (例えば、酵母) のHsp70ファミリーのタンパク質である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項９】
DnaJ様タンパク質がJEM1、MDJ1、MDJ2、SEC63、YDJ1、XDJ1、APJ1、SIS1、DJP1、ZUO1、SWA2、JJJ1、JJJ2、JJJ3、CAJ1、CWC23、PAM18、JAC1、JID1、SCJ1、HLJ1およびERJ5、好ましくはJEM1である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
ERO1、ERV2、EUG1、MPD1、MPD2、EPS1およびPDI1から成る群から選択される他のタンパク質中のジスルフィド結合形成に関係する少なくとも1、2、3、4、5、6または7つのタンパク質を過剰発現するように宿主細胞がさらに遺伝的に修飾されている、請求項１〜９のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１１】
宿主細胞がJEM1またはSIL1から選択される第１ヘルパータンパク質をコードする第1遺伝子またはその変異型と、選択された必要なタンパク質生成物をコードする第2遺伝子とを含んでなり、そして宿主細胞が第1ヘルパータンパク質を過剰発現するように遺伝的に修飾されており、そして下記の条件を満足することを特徴とする、選択されたタンパク質生成物の産生の増強に適当な宿主細胞:
（ａ）第１遺伝子および第２遺伝子の両方は宿主細胞内の同一2μm-ファミリープラスミド上に存在しない; および
（ｂ）宿主細胞は第１ヘルパータンパク質と異なるそれ以上のヘルパータンパク質を過剰発現するように遺伝的に修飾されていず、そしてそれ以上のヘルパータンパク質がAHA1、CCT2、CCT3、CCT4、CCT5、CCT6、CCT7、CCT8、CNS1、CPR3、CPR6、ERO1、EUG1、FMO1、HCH1、HSP10、HSP12、HSP104、HSP26、HSP30、HSP42、HSP60、HSP78、HSP82、JEM1、MDJ1、MDJ2、MPD1、MPD2、PDI1、PFD1、ABC1、APJ1、ATP11、ATP12、BTT1、CDC37、CPR7、HSC82、KAR2、LHS1、MGE1、MRS11、NOB1、ECM10、SSA1、SSA2、SSA3、SSA4、SSC1、SSE2、SIL1、SLS1、ORM1、ORM2、PER1、PTC2、PSE1、UBI4およびHAC1; またはトランケート無イントロンHAC1から成る群から選択される。
【請求項１２】
前記第１ヘルパータンパク質がJEM1又はSIL1である請求項11に記載の宿主細胞。
【請求項１３】
宿主細胞がそれ以上のヘルパータンパク質をコードする遺伝子の組換えコピー、例えば、プラスミドコード化コピー、または染色体的に組込まれた組換えコピーを含まない、請求項11又は12に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
第1ヘルパータンパク質が宿主細胞により過剰発現される唯一のヘルパータンパク質である、請求項11、12または13に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
選択されたタンパク質生成物が異種タンパク質でありそして/または、好ましくは酵母において、分泌を引き起こすために有効であるリーダー配列を含んでなる、請求項１〜14のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
選択されたタンパク質生成物が真核生物のタンパク質、またはそのフラグメントまたは変異型、好ましくは脊椎動物または真菌 (例えば、酵母) のタンパク質である、請求項１〜15のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
選択されたタンパク質生成物が下記を含んでなる、請求項１〜16のいずれか１項に記載の宿主細胞: アルブミン、モノクローナル抗体、エトポシド、血清タンパク質 (例えば、血液凝固因子)、アンチスタシン、ダニ抗凝固タンパク質、トランスフェリン、ラクトフェリン、エンドスタチン、アンギオスタチン、コラーゲン、免疫グロブリン、または免疫グロブリンに基づく分子またはいずれかのフラグメント (例えば、dAb、Fab'フラグメント、F(ab’)2、scAb、scFvまたはscFvフラグメント)、クニッツドメインタンパク質 (例えば、アプロチニンおよびアミロイド前駆体タンパク質)、インターフェロン (例えば、インターフェロンα種および亜種、インターフェロンβ種および亜種、インターフェロンγ種および亜種)、インターロイキン (例えば、IL10、IL11およびIL12)、レプチン、CNTFおよびそのフラグメント (例えば、CNTFAX15` (AxokineTM))、IL1レセプターアンタゴニスト、エリトロポイエチン (EPO) およびEPO模倣物、トロンボポイエチン (TPO) およびTPO模倣物、プロサプチド、シアノビリン-N、5-ヘリックス、T20ペプチド、T1249ペプチド、HIV gp41、HIV gp120、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ、tPA、ヒルジン、血小板由来増殖因子、副甲状腺ホルモン、プロインスリン、インスリン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド、インスリン様増殖因子、カルシトニン、成長ホルモン、トランスフォーミング増殖因子β、腫瘍壊死因子、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、FGF、下記を包含するが、これらに限定されないプレ形態および活性形態の両方の凝固因子: プラスミノゲン、フィブリノゲン、トロンビン、プレトロンビン、プロトロンビン、フォン・ウィルブランド因子、α1-抗トリプシン、プラスミノーゲンアクチベーター、因子VII、因子VIII、因子IX、因子Xおよび因子XIII、神経増殖因子、LACI、血小板由来内皮細胞増殖因子 (PD-ECGF)、グルコースオキシダーゼ、血清コリンエステラーゼ、インターαトリプシンインヒビター、アンチトロンビンIII、アポリポタンパク質種、タンパク質C、タンパク質S、または上記のいずれかの変異型またはフラグメント、またはアルブミンと上記のいずれかとの融合物。
【請求項１８】
選択されたタンパク質生成物がアルブミンまたはその変異型またはフラグメントの配列を含んでなる、請求項１〜17のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
選択されたタンパク質生成物がトランスフェリンファミリーのメンバー、好ましくはトランスフェリンまたはラクトフェリン、またはそれらの変異型またはフラグメントの配列を含んでなる、請求項１〜18のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項２０】
選択されたタンパク質生成物が他のタンパク質の配列に直接的または間接的に融合した、融合タンパク質、例えば、アルブミンまたはトランスフェリンファミリーのメンバーまたはいずれかの変異型またはフラグメントを含んでなる、請求項１〜19のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項２１】
選択されたタンパク質生成物をコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１〜20のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項２２】
選択されたタンパク質生成物をコードするポリヌクレオチド配列が外因的ポリヌクレオチドである、請求項21に記載の宿主細胞。
【請求項２３】
外因的ポリヌクレオチドが宿主細胞の染色体中に組込まれている、請求項22に記載の宿主細胞。
【請求項２４】
外因的ポリヌクレオチドが宿主細胞中に複製可能なベクター、例えば、プラスミドの一部分として存在する、請求項22に記載の宿主細胞。
【請求項２５】
下記工程を含んでなる、選択されたタンパク質生成物を製造する方法：
（ａ）請求項21〜24のいずれか１項に記載の宿主細胞を準備し、そして
（ｂ）宿主細胞を増殖させ、
これにより、同一条件下に、１種または２種以上のヘルパータンパク質を過剰発現させるように遺伝的に修飾されていない同一宿主細胞を増殖することによって達成される選択したタンパク質生成物の産生レベルに比較して、増加したレベルで選択したタンパク質生成物を含んでなる細胞培養物または組換え生物を産生する。
【請求項２６】
宿主細胞を増殖させる工程が培地中で宿主細胞を培養することを含む、請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
こうして発現された選択したタンパク質生成物を培養した宿主細胞、組換え生物または培地から精製する工程をさらに含んでなる、請求項25または26に記載の方法。
【請求項２８】
精製された選択したタンパク質生成物を担体または希釈剤と配合し、必要に応じてこうして配合されたタンパク質を単位投与形態で提供する工程をさらに含んでなる、請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
こうして精製された選択したタンパク質生成物を凍結乾燥する工程をさらに含んでなる、請求項27記載の方法。
【請求項３０】
ポリヌクレオチドが下記を含んでなるリストから選択されるヘルパータンパク質をコードする配列を含んでなる、前記ポリヌクレオチドで宿主細胞を形質転換することによる、請求項１〜24のいずれか１項に記載の宿主細胞の調製におけるポリヌクレオチドの使用:
（ａ）DnaJ様タンパク質 (例えば、請求項７〜９のいずれか１項に記載のDnaJ様タンパク質)、Hsp70ファミリーのタンパク質 (例えば、請求項４〜６のいずれか１項に記載のHsp70ファミリーのタンパク質) およびSIL1から選択されるシャペロン、そしてここでDnaJ様タンパク質はSCJ1ではない; および
（ｂ）ERO1、ERV2、EUG1、MPD1、MPD2、EPS1およびPDI1から成る群から選択されるジスルフィド結合形成に関係するタンパク質。
【請求項３１】
ポリヌクレオチドが請求項14〜20のいずれか１項に記載の選択したタンパク質生成物をコードする配列を含んでなる、前記ポリヌクレオチドで請求項１〜20のいずれか１項に記載の宿主細胞を形質転換することよる、請求項１〜24のいずれか１項に記載の宿主細胞の調製におけるポリヌクレオチドの使用。