(57)【要約】１つの態様では、本発明は微生物、例えばクロストリジウム・フィトフェルメンタンスによる同時の加水分解および発酵によるバイオマスから有用な発酵最終生成物の生産に関する。本発明はまた、高変換効率（収率）を有する、リグノセルロース系バイオマスの最終生成物への効率的な前処理および変換のためのプロセスの開発に関する。別の態様では、微生物、例えばクロストリジウム・フィトフェルメンタンスによりヘキソース（Ｃ６）およびペントース（Ｃ５）糖を発酵させることにより発酵最終生成物を生産するための方法もまた、本明細書で開示する。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘキソースおよびペントースサッカリドを第１の微生物と共に含むリグノセルロース系バイオマスを発酵させることにより、１つ以上の発酵最終生成物を生産させるための方法であって、前記第１の微生物は前記リグノセルロース系バイオマスを同時に加水分解し、発酵させ、発酵最終生成物を生産する、方法。
【請求項２】
前記発酵最終生成物の少なくとも１つはエタノールであり、前記エタノールは少なくとも約４５ｇ／Ｌのタイターで生産される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記第１の微生物はクロストリジウム株である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記クロストリジウム株はクロストリジウム・フィトフェルメンタンスである、請求項３記載の方法。
【請求項５】
第２の微生物を使用したヘキソースおよびペントースサッカリドの発酵をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記第２の微生物はサッカロミセス・セレビシエ、Ｃ．サーモセラム、Ｃ．アセトブチリクム、Ｃ．セルロボランス、またはザイモモナス・モビリスである、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記ヘキソースサッカリドは、セルロース、ヘミセルロース、デンプン、マンナン、フルクトース、グルコース、ガラクトース、ラムノース、およびマンノースからなる群より選択される炭水化物を含む、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記ペントースサッカリドは、キシラン、ヘミセルロース、キシロース、およびアラビノースからなる群より選択される炭水化物を含む、請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記クロストリジウム・フィトフェルメンタンスは非組換えまたは組換え微生物である、請求項４記載の方法。
【請求項１０】
前記クロストリジウム・フィトフェルメンタンスは１つ以上の異種ポリヌクレオチドを含む、請求項４記載の方法。
【請求項１１】
前記第１の微生物の増殖中に、培地にヘキソースまたはペントースサッカリドを含む１つ以上の培地補充物を添加することをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
前記ヘキソースまたはペントースサッカリドは、前記第１の微生物により他の化合物に変換された糖の量との関連で添加される、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記バイオマスの前処理をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
前記前処理は水蒸気爆砕または温水抽出、酸もしくはアルカリ条件への曝露を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
発酵培地補充物を添加することをさらに含み、前記発酵培地補充物は脂肪酸、界面活性剤、キレート剤、ビタミン、ミネラル、ｐＨ調整剤、酵母エキス、および塩である、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
前記第１の微生物は前記ヘキソースおよびペントースサッカリドを同時に発酵させる、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
１つ以上の酵素を添加することをさらに含み、前記１つ以上の酵素は第１の微生物に由来しない、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
前記１つ以上の酵素は、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ガラクツロナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、カルボヒドラーゼ、キシラナーゼ、グルカナーゼ、およびエンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、グルコシダーゼ、アミラーゼ、フィターゼ、またはラッカーゼである、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記ヘキソースおよびペントースサッカリドは、麦芽シロップ、コーンスティープリカー、ジスチラースドライドグレインまたはコーンスティープソリッドを含む、請求項１記載の方法。
【請求項２０】
バイオマス固体のボーラス添加を用いたバイオマスの流加発酵をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項２１】
前記バイオマス固体はふるいを用いて回収される、請求項１記載の方法。
【請求項２２】
前記ふるいは直径が約１５０〜２５０μｍの複数の開口を含む、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
クロストリジウム・フィトフェルメンタンス株を、リグノセルロース系バイオマスを含む培地で培養することにより生産され、前記クロストリジウム・フィトフェルメンタンスは前記リグノセルロース系バイオマスを同時に加水分解し、発酵させる、バイオ燃料生成物。
【請求項２４】
ａ）クロストリジウム・フィトフェルメンタンス株をリグノセルロース系バイオマスを含む培地で培養する工程であって、前記クロストリジウム・フィトフェルメンタンスは前記リグノセルロース系バイオマスを同時に加水分解し、発酵させる工程；および
ｂ）約４５ｇ／Ｌを超える収率でエタノールを生産する工程
を含む、エタノールを生産する方法。
【請求項２５】
前記クロストリジウム・フィトフェルメンタンスの増殖中に、前記培地に１つ以上の培地補充物を添加することをさらに含み、１つ以上の前記培地補充物は１つ以上のヘキソースおよび／またはペントース糖化合物を含み、前記１つ以上の糖化合物は、前記クロストリジウム・フィトフェルメンタンスにより他の化合物に変換された糖の量との関連で添加される、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
（ａ）発酵容器;
（ｂ）リグノセルロース系バイオマス;および
（ｃ）前記リグノセルロース系バイオマスを同時に加水分解し、発酵させる第１の微生物
を含み、前記発酵容器は、前記リグノセルロース系バイオマスの同時の加水分解および発酵に好適な条件を提供するように適合される、発酵最終生成物の生産のためのシステム。
【請求項２７】
ヘキソースおよびペントースサッカリドを含む培地補充物をさらに含む、請求項２６記載のシステム。
【請求項２８】
前記第１の微生物はクロストリジウム株である、請求項２６記載のシステム。
【請求項２９】
前記クロストリジウム株はクロストリジウム・フィトフェルメンタンスである、請求項２６記載のシステム。
【請求項３０】
前記クロストリジウム・フィトフェルメンタンスは１つ以上の異種ポリヌクレオチドを含む、請求項２９記載のシステム。
【請求項３１】
前記バイオマスは前記第１の微生物との接触前に、水蒸気爆砕または温水抽出、酸もしくはアルカリ条件への曝露により前処理される、請求項２６記載のシステム。
【請求項３２】
前記前処理されたバイオマスは、前記第１の微生物に由来しない１つ以上の酵素でさらに処理される、請求項３１記載のシステム。
【請求項３３】
前記ヘキソースおよびペントースサッカリドは、コーンスティープソリッド、コーンスティープリカー、麦芽シロップ、キシラン、セルロース、ヘミセルロース、フルクトース、グルコース、マンノース、ラムノース、またはキシロースのうちの１つ以上を含む、請求項２７記載のシステム。
【請求項３４】
前記発酵培地は前記第１の微生物に由来しない１つ以上の酵素をさらに含む、請求項２６記載のシステム。
【請求項３５】
前記発酵培地は、脂肪酸、界面活性剤、キレート剤、ビタミン、ミネラル、ｐＨ調整剤、酵母エキス、および塩からなる群より選択される発酵培地補充物をさらに含む、請求項２６記載のシステム。
【請求項３６】
第２の微生物をさらに含む、請求項２６記載のシステム。
【請求項３７】
前記第２の微生物は、サッカロミセス・セレビシエ、Ｃ．サーモセラム、Ｃ．アセトブチリクム、Ｃ．セルロボランス、またはザイモモナス・モビリスである、請求項３６記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は２００９年4月２０日に出願された米国特許仮出願第６１／１７１，０７７号、２００９年４月２２日に出願された同第６１／１７１，８３１号、および２００９年６月２９日に出願された同第６１／２２１，５１９号（これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に対し優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、糖およびオリゴマーの同時の加水分解および発酵による、バイオマスからの有用な発酵最終生成物の生産に関する。本発明はまた、高変換効率（収率）を有する、リグノセルロース系バイオマスの最終生成物への効率的な前処理および変換のためのプロセスの開発に関する。
【背景技術】
【０００３】
様々な形態のバイオマスが、その莫大な利用性および低コストのために、エタノール生産のための再生可能原料としての可能性を有している。しかしながら、発酵最終生成物、例えばエタノールおよび他の化学化合物またはバイオ燃料を生産するために入手可能な原料を使用する低コストでロバストな方法に対して満たされていない要求が依然として存在する。
【０００４】
バイオ燃料、例えばアルコール（例えばメタノール、エタノール、ブタノールまたはプロパノール）を生産するためのバイオマス発酵は、世界的なエネルギー問題に対する切望される解決策を提供することができる。リグノセルロース系バイオマスはセルロースおよびヘミセルロースを２つの主成分として有する。これらの成分の加水分解によりヘキソース（Ｃ６）ならびにペントース（Ｃ５）糖の両方が得られる。バイオマス変換効率は、燃料変換プロセスに対するバイオマスにおいて使用される生物によって利用され得る炭化水素の範囲に著しく依存する。特に、エタノールへの変換に対し、ヘキソース（例えば、セロビオース、グルコース）およびペントース（例えば、アラビノース、キシロース）糖の両方を使用することができないと、ある量のバイオマスから生産させることができるバイオ燃料または他の化学物質の総量が著しく制限され得る。そのため、リグノセルロース系バイオマスのエタノールへの高い変換効率（収率）を得るためには、ヘキソースおよびペントース糖の両方をうまくエタノールに発酵させることができることが重要である。
【０００５】
しかしながら、ペントース糖（キシロースおよびアラビノース）の発酵は、バイオマスからのエタノール生産にとって依然として技術的な障害となっている。この制限によって、低効率でのエタノール生産、発酵反応における低い最大達成バイオ燃料タイター、および低いバイオ燃料生産性となってしまう可能性がある。さらに、バイオマスの炭化水素量の多くが、前処理中のペントース糖の可溶化により失われる可能性がある。一般に、収率の低下および生産性の低下により、生産コストが高くなり、これは結果として、競争上不利になり得、これは、微生物の他の特徴によって埋め合わせることができない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
１つの態様では、本発明は、第１の微生物を用いてヘキソースおよびペントースサッカリドを含むリグノセルロース系バイオマスを発酵させることにより１つ以上の発酵最終生成物を生産するための方法であって、前記第１の微生物はリグノセルロース系バイオマスを同時に加水分解し、発酵させ、発酵最終生成物を生産する方法を開示する。１つの実施形態では発酵最終生成物の少なくとも１つはエタノールであり、ここで、エタノールは少なくとも約４５ｇ／Ｌのタイターで生産される。別の実施形態では、第１の微生物はクロストリジウム株である。別の実施形態ではクロストリジウム株はクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）である。別の実施形態では、方法は、第２の微生物を使用したヘキソースおよびペントースサッカリドの発酵をさらに含む。別の実施形態では第２の微生物は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｃ．サーモセラム（ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）、Ｃ．アセトブチリクム（ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、Ｃ．セルロボランス（ｃｅｌｌｏｖｏｒａｎｓ）、またはザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）である。別の実施形態では、ヘキソースサッカリドはセルロース、ヘミセルロース、デンプン、マンナン、フルクトース、グルコース、ガラクトース、ラムノース、およびマンノースからなる群より選択される炭水化物を含む。別の実施形態では、ペントースサッカリドはキシラン、ヘミセルロース、キシロース、およびアラビノースからなる群より選択される炭水化物を含む。別の実施形態では、クロストリジウム・フィトフェルメンタンスは非組換え型または組換え型である。別の実施形態では、クロストリジウム・フィトフェルメンタンスは１つ以上の異種ポリヌクレオチドを含む。別の実施形態では、ヘキソースまたはペントースサッカリドを含む１つ以上の培地補充物は第１の微生物の増殖中に培地に添加される。別の実施形態では、ヘキソースまたはペントースサッカリドは、第１の微生物により他の化合物に変換された糖の量との関連で添加される。別の実施形態では方法は、バイオマスの前処理を含む。別の実施形態では、前処理は水蒸気爆砕または温水抽出、酸またはアルカリ条件への曝露を含む。別の実施形態では、方法は発酵培地補充物の添加を含み、ここで、発酵培地補充物は、脂肪酸、界面活性剤、キレート剤、ビタミン、ミネラル、ｐＨ調整剤、酵母エキス、および塩である。別の実施形態では、第１の微生物は、前記ヘキソースおよびペントースサッカリドを同時に発酵させる。別の実施形態では、方法は１つ以上の酵素を添加することを含み、ここで、１つ以上の酵素は第１の微生物に由来しない。別の実施形態では、１つ以上の酵素は、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ガラクツロナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、カルボヒドラーゼ、キシラナーゼ、グルカナーゼ、およびエンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、グルコシダーゼ、アミラーゼ、フィターゼ、またはラッカーゼである。別の実施形態では、ヘキソースおよびペントースサッカリドは、麦芽シロップ、コーンスティープリカー、ジスチラースドライドグレインまたはコーンスティープソリッドである。別の実施形態では、方法はバイオマス固体のボーラス添加を有する流加バイオマス発酵をさらに含む。別の実施形態では、バイオマス固体はふるいを用いて回収される。別の実施形態では、ふるいは直径が約１５０−２５０μｍの間の複数の開口を含む。
【０００７】
別の態様では、本発明は、リグノセルロース系バイオマスを含む培地でクロストリジウム・フィトフェルメンタンス株を培養することにより生産させたバイオ燃料生成物を開示し、ここで、クロストリジウム・フィトフェルメンタンスは、リグノセルロース系バイオマスを同時に、加水分解し、発酵させる。
【０００８】
別の態様では、本発明は、リグノセルロース系バイオマスを含む培地でクロストリジウム・フィトフェルメンタンスの株を培養する工程であって、クロストリジウム・フィトフェルメンタンスは、リグノセルロース系バイオマスを同時に、加水分解し、発酵させる工程と、約４５ｇ／Ｌを超える収率でエタノールを生産する工程を含む、エタノールを生産する方法を開示する。１つの実施形態では、方法は、クロストリジウム・フィトフェルメンタンスの増殖中に、１つ以上の培地補充物を培地に添加することをさらに含み、ここで、１つ以上の培地補充物は１つ以上のヘキソースおよび／またはペントース糖化合物を含み、１つ以上の糖化合物はクロストリジウム・フィトフェルメンタンスにより他の化合物に変換された糖の量との関連で添加される。
【０００９】
別の態様では、本発明は、発酵容器と、リグノセルロース系バイオマスと、リグノセルロース系バイオマスを同時に加水分解し、発酵させる第１の微生物とを備える発酵最終生成物を生産させるためのシステムを開示し、ここで、発酵容器は、リグノセルロース系バイオマスの同時の加水分解および発酵のために好適な条件を提供するように適合される。１つの実施形態では、ヘキソースおよびペントースサッカリドと共に培地補充物をさらに含む。別の実施形態では、第１の微生物はクロストリジウム株である。別の実施形態では、クロストリジウム株は、クロストリジウム・フィトフェルメンタンスである。別の実施形態ではクロストリジウム・フィトフェルメンタンスは１つ以上の異種ポリヌクレオチドを含む。別の実施形態では、バイオマスは、第１の微生物との接触前に、水蒸気爆砕または温水抽出、酸またはアルカリ条件への曝露により前処理される。別の実施形態では前処理されたバイオマスは第１の微生物に由来しない１つ以上の酵素によりさらに処理される。別の実施形態では、ヘキソースおよびペントースサッカリドはコーンスティープソリッド、コーンスティープリカー、麦芽シロップ、キシラン、セルロース、ヘミセルロース、フルクトース、グルコース、マンノース、ラムノース、またはキシロースのうちの１つ以上を含む。別の実施形態では、発酵培地はさらに、第１の微生物に由来しない１つ以上の酵素を含む。別の実施形態では、発酵培地はさらに、脂肪酸、界面活性剤、キレート剤、ビタミン、ミネラル、ｐＨ調整剤、酵母エキス、および塩からなる群より選択される発酵培地補充物を含む。別の実施形態では、システムはさらに第２の微生物を含む。別の実施形態では、第２の微生物はサッカロミセス・セレビシエ、Ｃ．サーモセラム、Ｃ．アセトブチリクム、Ｃ．セルロボランス、またはザイモモナス・モビリスである。
【００１０】
本発明の新規特徴は、特に添付の特許請求の範囲において記載される。本発明の特徴および利点のよりよい理解は、本発明の原理が使用されている例示的な実施形態を記載する下記詳細な説明および添付の図面を参照することにより得られるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】約１５日の期間にわたって発酵反応に送り込まれた、処理バイオマス固体の累積総量を示す図である。
【図２】本明細書で記載される方法に従い、サイズ減少およびアルカリにより処理したトウモロコシ茎葉バイオマスの炭水化物組成を示す円グラフである。
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｂは指定された時間点での発酵反応に対する糖およびエタノール濃度プロファイルを示す。図３Ａはセロビオースとキシロースの同時発酵に対する糖およびエタノール濃度プロファイルを示す。
【図３Ｂ】図３Ａ〜３Ｂは指定された時間点での発酵反応に対する糖およびエタノール濃度プロファイルを示す。図３Ｂはグルコースとキシロースの同時発酵に対する糖およびエタノール濃度プロファイルを示す。
【図４】指定された時間点での発酵反応における、指定されたヘキソース（グルコース、セロビオース）およびペントース（キシロース）糖の規格化された取り込みおよび利用を示す。
【図５】指定された時間点でのキシロース、セロビオース、およびデンプンのエタノールへの同時発酵に対する糖およびエタノール濃度プロファイルを示す。
【図６】指定された時間点でのグルコース、キシロース、およびアラビノースのエタノールへの同時発酵に対する糖およびエタノール濃度プロファイルを示す。
【図７】デンプン、セルロース、キシラン、およびセロビオースの同時発酵に対するエタノール濃度プロファイルを示す。
【図８】加水分解ユニットにおいて最初に高温、高圧で酸によりバイオマスを処理することにより、バイオマスから発酵最終生成物を生産するための方法を示す。
【図９】バイオマスを発酵容器に投入することによりバイオマスから発酵最終生成物を生産するための方法を示す。
【図１０】ヘキソースもしくはペントースサッカリドまたはオリゴマーを生産する前処理を開示し、これらはその後、処理されず、またはさらに処理され、別々にもしくは一緒に発酵される。
【図１１】クロストリジウム・フィトフェルメンタンスを形質転換するために使用されるプラスミドｐＩＭＰＴ１０２９の地図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
参照による組み込み
本明細書で言及された全ての出版物、特許および特許出願は、各々の出版物、特許または特許出願が特定的に、個々に参照により組み込まれることが示されたのと同じ程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。
【００１３】
発明の詳細な説明
下記説明および実施例は本発明の実施形態を詳細に説明する。当業者であれば、本発明の範囲内に含まれる多くの変更および改変が存在することを認識するであろう。したがって、好ましい実施形態の説明は、本発明の範囲を制限するものと見なすべきではない。
【００１４】
定義
異なって特徴づけられない限り、本明細書で使用される技術および科学用語は本発明が属する技術分野における当業者に普通に理解されるものと同じ意味を有する。
【００１５】
参照数値との関連における「約」という用語は、値＋または−その値からの１５％の範囲を含む。例えば、「約１０」は８．５〜１１．５の量を含む。
【００１６】
本明細書では、「燃料」または「バイオ燃料」という用語は、当業者に知られているその普通の意味を有し、液体燃料、気体燃料、試薬、化学原料として好適な１つ以上の化合物を含むことができ、炭化水素、水素、メタン、バイオディーゼル、ヒドロキシ化合物、例えばアルコール（例えば、エタノール、ブタノール、プロパノール、メタノール、など）、およびカルボニル化合物、例えばアルデヒドおよびケトン（例えば、アセトン、ホルムアルデヒド、１−プロパナール、など）が挙げられるが、それらに限定されない。
【００１７】
本明細書では、「発酵最終生成物」または「最終生成物」という用語は、当業者に知られているその普通の意味を有し、１つ以上のバイオ燃料、化学添加物、加工助剤、食品添加物、有機酸（例えば、酢酸、乳酸、ギ酸、クエン酸など）、有機酸誘導体、例えばエステル（例えば、ろうエステル、グリセリドなど）および他の官能性化合物を含むことができ、１、２−プロパンジオール、１、３−プロパンジオール、乳酸、ギ酸、酢酸、コハク酸、ピルビン酸、酵素、例えばセルラーゼ、ポリサッカラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、リグニナーゼ、およびヘミセルラーゼが挙げられるが、それらに限定されず、純粋化合物、混合物、または不純もしくは希釈形態として存在することができる。発酵最終生成物のさらなる例としては、下記が挙げられるが、それらに限定されない：１，４二酸（コハク酸、フマル酸およびリンゴ酸）、２，５フランジカルボン酸、３ヒドロキシプロピオン酸、アスパラギン酸、グルカル酸、グルタミン酸、イタコン酸、レブリン酸、３−ヒドロキシブチロラクトン、グリセロール、ソルビトール、キシリトール／アラビニトール、ブタンジオール、ブタノール、メタン、メタノール、エタン、エテン、エタノール、ｎ−プロパン、１−プロペン、１−プロパノール、プロパナール、アセトン、プロピオネート、ｎ−ブタン、１−ブテン、１−ブタノール、ブタナール、ブタノエート、イソブタナール、イソブタノール、２−メチルブタナール、２−メチルブタノール、３−メチルブタナール、３−メチルブタノール、２−ブテン、２−ブタノール、２−ブタノン、２，３−ブタンジオール、３−ヒドロキシ−２−ブタノン、２，３−ブタンジオン、エチルベンゼン、エテニルベンゼン、２−フェニルエタノール、フェニルアセトアルデヒド、１−フェニルブタン、４−フェニル−１−ブテン、４−フェニル−２−ブテン、１−フェニル−２−ブテン、１−フェニル−２−ブタノール、４−フェニル−２−ブタノール、１−フェニル−２−ブタノン、４−フェニル−２−ブタノン、１−フェニル−２，３−ブタンジオール、１−フェニル−３−ヒドロキシ−２−ブタノン、４−フェニル−３−ヒドロキシ−２−ブタノン、１−フェニル−２，３−ブタンジオン、ｎ−ペンタン、エチルフェノール、エテニルフェノール、２−（４−ヒドロキシフェニル）エタノール、４−ヒドロキシフェニルアセトアルデヒド、１−（４−ヒドロキシフェニル）ブタン、４−（４−ヒドロキシフェニル）−１−ブテン、４−（４−ヒドロキシフェニル）−２−ブテン、１−（４−ヒドロキシフェニル）−１−ブテン、１−（４−ヒドロキシフェニル）−２−ブタノール、４−（４−ヒドロキシフェニル）−２−ブタノール、１−（４−ヒドロキシフェニル）−２−ブタノン、４−（４−ヒドロキシフェニル）−２−ブタノン、１−（４−ヒドロキシフェニル）−２，３−ブタンジオール、１−（４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−２−ブタノン、４−（４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−２−ブタノン、１−（４−ヒドロキシフェニル）−２，３−ブタノンジオン、インドリルエタン、インドリルエテン、２−（インドール−３−）エタノール、ｎ−ペンタン、１−ペンテン、１−ペンタノール、ペンタナール、ペンタノエート、２−ペンテン、２−ペンタノール、３−ペンタノール、２−ペンタノン、３−ペンタノン、４−メチルペンタナール、４−メチルペンタノール、２，３−ペンタンジオール、２−ヒドロキシ−３−ペンタノン、３−ヒドロキシ−２−ペンタノン、２，３−ペンタンジオン、２−メチルペンタン、４−メチル−１−ペンテン、４−メチル−２−ペンテン、４−メチル−３−ペンテン、４−メチル−２−ペンタノール、２−メチル−３−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノン、２−メチル−３−ペンタノン、４−メチル−２，３−ペンタンジオール、４−メチル−２−ヒドロキシ−３−ペンタノン、４−メチル−３−ヒドロキシ−２−ペンタノン、４−メチル−２，３−ペンタンジオン、１−フェニルペンタン、１−フェニル−１−ペンテン、１−フェニル−２−ペンテン、１−フェニル−３−ペンテン、１−フェニル−２−ペンタノール、１−フェニル−３−ペンタノール、１−フェニル−２−ペンタノン、１−フェニル−３−ペンタノン、１−フェニル−２，３−ペンタンジオール、１−フェニル−２−ヒドロキシ−３−ペンタノン、１−フェニル−３−ヒドロキシ−２−ペンタノン、１−フェニル−２，３−ペンタンジオン、４−メチル−１−フェニルペンタン、４−メチル−１−フェニル−１−ペンテン、４−メチル−１−フェニル−２−ペンテン、４−メチル−１−フェニル−３−ペンテン、４−メチル−１−フェニル−３−ペンタノール、４−メチル−１−フェニル−２−ペンタノール、４−メチル−１−フェニル−３−ペンタノン、４−メチル−１−フェニル−２−ペンタノン、４−メチル−１−フェニル−２，３−ペンタンジオール、４−メチル−１−フェニル−２，３−ペンタンジオン、４−メチル−１−フェニル−３−ヒドロキシ−２−ペンタノン、４−メチル−１−フェニル−２−ヒドロキシ−３−ペンタノン、１−（４−ヒドロキシフェニル）  ペンタン、１−（４−ヒドロキシフェニル）−１−ペンテン、１−（４−ヒドロキシフェニル）−２−ペンテン、１−（４−ヒドロキシフェニル）−３−ペンテン、１−（４−ヒドロキシフェニル）−２−ペンタノール、１−（４−ヒドロキシフェニル）−３−ペンタノール、１−（４−ヒドロキシフェニル）−２−ペンタノン、１−（４−ヒドロキシフェニル）−３−ペンタノン、１−（４−ヒドロキシフェニル）−２，３−ペンタンジオール、１−（４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシ−３−ペンタノン、１−（４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−２−ペンタノン、１−（４−ヒドロキシフェニル）−２，３−ペンタンジオン、４−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）  ペンタン、４−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）−２−ペンテン、４−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）−３−ペンテン、４−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）−１−ペンテン、４−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）−３−ペンタノール、４−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）−２−ペンタノール、４−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）−３−ペンタノン、４−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）−２−ペンタノン、４−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）−２，��−ペンタンジオール、４−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）−２，３−ペンタンジオン、４−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−２−ペンタノン、４−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシ−３−ペンタノン、１−インドール−３−ペンタン、１−（インドール−３）−１−ペンテン、１−（インドール−３）−２−ペンテン、１−（インドール−３）−３−ペンテン、１−（インドール−３）−２−ペンタノール、１−（インドール−３）−３−ペンタノール、１−（インドール−３）−２−ペンタノン、１−（インドール−３）−３−ペンタノン、１−（インドール−３）−２，３−ペンタンジオール、１−（インドール−３）−２−ヒドロキシ−３−ペンタノン、１−（インドール−３）−３−ヒドロキシ−２−ペンタノン、１−（インドール−３）−２，３−ペンタンジオン、４−メチル−１−（インドール−３−）ペンタン、４−メチル−１−（インドール−３）−２−ペンテン、４−メチル−１−（インドール−３）−３−ペンテン、４−メチル−１−（インドール−３）−１−ペンテン、４−メチル−２−（インドール−３）−３−ペンタノール、４−メチル−１−（インドール−３）−２−ペンタノール、４−メチル−１−（インドール−３）−３−ペンタノン、４−メチル−１−（インドール−３）−２−ペンタノン、４−メチル−１−（インドール−３）−２，３−ペンタンジオール、４−メチル−１−（インドール−３）−２，３−ペンタンジオン、４−メチル−１−（インドール−３）−３−ヒドロキシ−２−ペンタノン、４−メチル−１−（インドール−３）−２−ヒドロキシ−３−ペンタノン、ｎ−ヘキサン、１−ヘキセン、１−ヘキサノール、ヘキサナール、ヘキサノエート、２−ヘキセン、３−ヘキセン、２−ヘキサノール、３−ヘキサノール、２−ヘキサノン、３−ヘキサノン、２，３−ヘキサンジオール、２，３−ヘキサンジオン、３，４−ヘキサンジオール、３，４−ヘキサンジオン、２−ヒドロキシ−３−ヘキサノン、３−ヒドロキシ−２−ヘキサノン、３−ヒドロキシ−４−ヘキサノン、４−ヒドロキシ−３−ヘキサノン、２−メチルヘキサン、３−メチルヘキサン、２−メチル−２−ヘキセン、２−メチル−３−ヘキセン、５−メチル−１−ヘキセン、５−メチル−２−ヘキセン、４−メチル−１−ヘキセン、４−メチル−２−ヘキセン、３−メチル−３−ヘキセン、３−メチル−２−ヘキセン、３−メチル−１−ヘキセン、２−メチル−３−ヘキサノール、５−メチル−２−ヘキサノール、５−メチル−３−ヘキサノール、２−メチル−３−ヘキサノン、５−メチル−２−ヘキサノン、５−メチル−３−ヘキサノン、２−メチル−３，４−ヘキサンジオール、２−メチル−３，４−ヘキサンジオン、５−メチル−２，３−ヘキサンジオール、５−メチル−２，３−ヘキサンジオン、４−メチル−２，３−ヘキサンジオール、４−メチル−２，３−ヘキサンジオン、２−メチル−３−ヒドロキシ−４−ヘキサノン、２−メチル−４−ヒドロキシ−３−ヘキサノン、５−メチル−２−ヒドロキシ−３−ヘキサノン、５−メチル−３−ヒドロキシ−２−ヘキサノン、４−メチル−２−ヒドロキシ−３−ヘキサノン、４−メチル−３��ヒドロキシ−２−ヘキサノン、２，５−ジメチルヘキサン、２，５−ジメチル−２−ヘキセン、２，５−ジメチル−３−ヘキセン、２，５−ジメチル−３−ヘキサノール、２，５−ジメチル−３−ヘキサノン、２，５−ジメチル−３，４−ヘキサンジオール、２，５−ジメチル−３，４−ヘキサンジオン、２，５−ジメチル−３−ヒドロキシ−４−ヘキサノン、５−メチル−１−フェニルヘキサン、４−メチル−１−フェニルヘキサン、５−メチル−１−フェニル−１−ヘキセン、５−メチル−１−フェニル−２−ヘキセン、５−メチル−１−フェニル−３−ヘキセン、４−メチル−１−フェニル−１−ヘキセン、４−メチル−１−フェニル−２−ヘキセン、４−メチル−１−フェニル−３−ヘキセン、５−メチル−１−フェニル−２−ヘキサノール、５−メチル−１−フェニル−３−ヘキサノール、４−メチル−１−フェニル−２−ヘキサノール、４−メチル−１−フェニル−３−ヘキサノール、５−メチル−１−フェニル−２−ヘキサノン、５−メチル−１−フェニル−３−ヘキサノン、４−メチル−１−フェニル−２−ヘキサノン、４−メチル−１−フェニル−３−ヘキサノン、５−メチル−１−フェニル−２，３−ヘキサンジオール、４−メチル−１−フェニル−２，３−ヘキサンジオール、５−メチル−１−フェニル−３−ヒドロキシ−２−ヘキサノン、５−メチル−１−フェニル−２−ヒドロキシ−３−ヘキサノン、４−メチル−１−フェニル−３−ヒドロキシ−２−ヘキサノン、４−メチル−１−フェニル−２−ヒドロキシ−３−ヘキサノン、５−メチル−１−フェニル−２，３−ヘキサンジオン、４−メチル−１−フェニル−２，３−ヘキサンジオン、４−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）ヘキサン、５−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）−１−ヘキセン、５−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）−２−ヘキセン、５−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）−３−ヘキセン、４−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）−１−ヘキセン、４−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）−２−ヘキセン、４−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）−３−ヘキセン、５−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）−２−ヘキサノール、５−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）−３−ヘキサノール、４−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）−２−ヘキサノール、４−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）−３−ヘ
キサノール、５−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）−２−ヘキサノン、５−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）−３−ヘキサノン、４−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）−２−ヘキサノン、４−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）−３−ヘキサノン、５−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）−２，３−ヘキサンジオール、４−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）−２，３−ヘキサンジオール、５−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−２−ヘキサノン、５−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシ−３−ヘキサノン、４−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−２−ヘキサノン、４−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシ−３−ヘキサノン、５−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）−２，３−ヘキサンジオン、４−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）−２，３−ヘキサンジオン、４−メチル−１−（インドール−３−）ヘキサン、５−メチル−１−（インドール−３）−１−ヘキセン、５−メチル−１−（インドール−３）−２−ヘキセン、５−メチル−１−（インドール−３）−３−ヘキセン、４−メチル−１−（インドール−３）−１−ヘキセン、４−メチル−１−（インドール−３）−２−ヘキセン、４−メチル−１−（インドール−３）−３−ヘキセン、５−メチル−１−（インドール−３）−２−ヘキサノール、５−メチル−１−（インドール−３）−３−ヘキサノール、４−メチル−１−（インドール−３）−２−ヘキサノール、４−メチル−１−（インドール−３）−３−ヘキサノール、５−メチル−１−（インドール−３）−２−ヘキサノン、５−メチル−１−（インドール−３）−３−ヘキサノン、４−メチル−１−（インドール−３）−２−ヘキサノン、４−メチル−１−（インドール−３）−３−ヘキサノン、５−メチル−１−（インドール−３）−２，３−ヘキサンジオール、４−メチル−１−（インドール−３）−２，３−ヘキサンジオール、５−メチル−１−（インドール−３）−３−ヒドロキシ−２−ヘキサノン、５−メチル−１−（インドール−３）−２−ヒドロキシ−３−ヘキサノン、４−メチル−１−（インドール−３）−３−ヒドロキシ−２−ヘキサノン、４−メチル−１−（インドール−３）−２−ヒドロキシ−３−ヘキサノン、５−メチル−１−（インドール−３）−２，３−ヘキサンジオン、４−メチル−１−（インドール−３）−２，３−ヘキサンジオン、ｎ−ヘプタン、１−ヘプテン、１−ヘプタノール、ヘプタナール、ヘプタノエート、２−ヘプテン、３−ヘプテン、２−ヘプタノール、３−ヘプタノール、４−ヘプタノール、２−ヘプタノン、３−ヘプタノン、４−ヘプタノン、２，３−ヘプタンジオール、２，３−ヘプタンジオン、３，４−ヘプタンジオール、３，４−ヘプタンジオン、２−ヒドロキシ−３−ヘプタノン、３−ヒドロキシ−２−ヘプタノン、３−ヒドロキシ−４−ヘプタノン、４−ヒドロキシ−３−ヘプタノン、２−メチルヘプタン、３−メチルヘプタン、６−メチル−２−ヘプテン、６−メチル−３−ヘプテン、２−メチル−３−ヘプテン、２−メチル−２−ヘプテン、５−メチル−２−ヘプテン、５−メチル−３−ヘプテン、３−メチル−３−ヘプテン、２−メチル−３−ヘプタノール、２−メチル−４−ヘプタノール、６−メチル−３−ヘプタノール、５−メチル−３−ヘプタノール、３−メチル−４−ヘプタノール、２−メチル−３−ヘプタノン、２−メチル−４−ヘプタノン、６−メチル−３−ヘプタノン、５−メチル−３−ヘプタノン、３−メチル−４−ヘプタノン、２−メチル−３，４−ヘプタンジオール、２−メチル−３，４−ヘプタンジオン、６−メチル−３，４−ヘプタンジオール、６−メチル−３，４−ヘプタンジオン、５−メチル−３，４−ヘプタンジオール、５−メチル−３，４−ヘプタンジオン、２−メチル−３−ヒドロキシ−４−ヘプタノン、２−メチル−４−ヒドロキシ−３−ヘプタノン、６−メチル−３−ヒドロキシ−４−ヘプタノン、６−メチル−４−ヒドロキシ−３−ヘプタノン、５−メチル−３−ヒドロキシ−４−ヘプタノン、５−メチル−４−ヒドロキシ−３−ヘプタノン、２，６−ジメチルヘプタン、２，５−ジメチルヘプタン、２，６−ジメチル−２−ヘプテン、２，６−ジメチル−３−ヘプテン、２，５−ジメチル−２−ヘプテン、２，５−ジメチル−３−ヘプテン、３，６−ジメチル−３−ヘプテン、２，６−ジメチル−３−ヘプタノール、２，６−ジメチル−４−ヘプタノール、２，５−ジメチル−３−ヘプタノール、２，５−ジメチル−４−ヘプタノール、２，６−ジメチル−３，４−ヘプタンジオール、２，６−ジメチル−３，４−ヘプタンジオン、２，５−ジメチル−３，４−ヘプタンジオール、２，５−ジメチル−３，４−ヘプタンジオン、２，６−ジメチル−３−ヒドロキシ−４−ヘプタノン、２，６−ジメチル−４−ヒドロキシ−３−ヘプタノン、２，５−ジメチル−３−ヒドロキシ−４−ヘプタノン、２，５−ジメチル−４−ヒドロキシ−３−ヘプタノン、ｎ−オクタン、１−オクテン、２−オクテン、１−オクタノール、オクタナール、オクタノエート、３−オクテン、４−オクテン、４−オクタノール、４−オクタノン、４，５−オクタンジオール、４，５−オクタンジオン、４−ヒドロキシ−５−オクタノン、２−メチルオクタン、２−メチル−３−オクテン、２−メチル−４−オクテン、７−メチル−３−オクテン、３−メチル−３−オクテン、３−メチル−４−オクテン、６−メチル−３−オクテン、２−メチル−４−オクタノール、７−メチル−４−オクタノール、３−メチル−４−オクタノール、６−メチル−４−オクタノール、２−メチル−４−オクタノン、７−メチル−４−オクタノン、３−メチル−４−オクタノン、６−メチル−４−オクタノン、２−メチル−４，５−オクタンジオール、２−メチル−４，５−オクタンジオン、３−メチル−４，５−オクタンジオール、３−メチル−４，５−オクタンジオン、２−メチル−４−ヒドロキシ−５−オクタノン、２−メチル−５−ヒドロキシ−４−オクタノン、３−メチル−４−ヒドロキシ−５−オクタノン、３−メチル−５−ヒドロキシ−４−オクタノン、２，７−ジメチルオクタン、２，７−ジメチル−３−オクテン、２，７−ジメチル−４−オクテン、２，７−ジメチル−４−オクタノール、２，７−ジメチル−４−オクタノン、２，７−ジメチル−４，５−オクタンジオール、２，７−ジメチル−４，５−オクタンジオン、２，７−ジメチル−４−ヒドロキシ−５−オクタノン、２，６−ジメチルオクタン、２，６−ジメチル−３−オクテン、２，６−ジメチル−４−オクテン、３，７−ジメチル−３−オクテン、２，６−ジメチル４−オクタノール、３，７−ジメチル４−オクタノール、２，６−ジメチル−４−オクタノン、３，７−ジメチル−４−オクタノン、２，６−ジメチル−４，５−オクタンジオール、２，６−ジメチル−４，５−オクタンジオン、２，６−ジメチル−４−ヒドロキシ−５−オクタノン、２，６−ジメチル−５−ヒドロキシ−４−オクタノン、３，６−ジメチルオクタン、３，６−ジメチル−３−オクテン、３，６−ジメチル−４−オクテン、３，６−ジメチル−４−オクタノール、３，６−ジメチル−４−オクタノン、３，６−ジメチル−４，５−オクタンジオール、３，６−ジメチル−４，５−オクタンジオン、３，６−ジメチル−４−ヒドロキシ−５−オクタノン、ｎ−ノナン、１−ノネン、１−ノナノール、ノナナール、ノナノエート、２−メチルノナン、２−メチル−４−ノネン、２−メチル−５−ノネン、８−メチル−４−ノネン、２−メチル−５−ノナノール、８−メチル−４−ノナノール、２−メチル−５−ノナノン、８−メチル−４−ノナノン、８−メチル−４，５−ノナンジオール、８−メチル−４，５−ノナンジオン、８−メチル−４−ヒドロキシ−５−ノナノン、８−メチル−５−ヒドロキシ−４−ノナノン、２，８−ジメチルノナン、２，８−ジメチル−３−ノネン、２，８−ジメチル−４−ノネン、２，８−ジメチル−５−ノネン、２，８−ジメチル−４−ノナノール、２，８−ジメチル−５−ノナノール、２，８−ジメチル−４−ノナノン、２，８−ジメチル−５−ノナノン、２，８−ジメチル−４，５−ノナンジオール、２，８−ジメチル−４，，５−ノナンジオン、２，８−ジメチル−４，−ヒドロキシ−５−ノナノン、２，８−ジメチル−５−ヒドロキシ−４−ノナノン、２，７−ジメチルノナン、３，８−ジメチル−３−ノネン、３，８−ジメチル−４−ノネン、３，８−ジメチル−５−ノネン、３，８−ジメチル−４−ノナノール、３，８−ジメチル−５−ノナノール、３，８−ジメチル−４−ノナノン、３，８−ジメチル−５−ノナノン、３，８−ジメチル−４，５−ノナンジオール、３，８−ジメチル−４，５−ノナンジオン、３，８−ジメチル−４−ヒドロキシ−５−ノナノン、３，８−ジメチル−５−ヒドロキシ−４−ノナノン、ｎ−デカン、１−デセン、１−デカノール、デカノエート、２，９−ジメチルデカン、２，９−ジメチル−３−デセン、２，９−ジメチル−４−デセン、２，９−ジメチル−５−デカノール、２，９−ジメチル−５−デカノン、２，９−ジメチル−５，６−デカンジオール、２，９−ジメチル−６−ヒドロキシ−５−デカノン、２，９−ジメチル−５，６−デカンジオンｎ−ウンデカン、１−ウンデセン、１−ウンデカノール、ウンデカナール、ウンデカノエート、ｎ−ドデカン、１−ドデセン、１−ドデカノール、ドデカナール、ドデカノエート、ｎ−ドデカン、１−デカデセン、１−ドデカノール、ドデカナール、ドデカノエート、ｎ−トリデカン、１−トリデセン、１−トリデカノール、トリデカナール、トリデカノエート、ｎ−テトラデカン、１−テトラデセン、１−テトラデカノール、テトラデカナール、テトラデカノエート、ｎ−ペンタデカン、１−ペンタデセン、１−ペンタデカノール、ペンタデカナール、ペンタデカノエート、ｎ−ヘキサデカン、１−ヘキサデセン、１−ヘキサデカノール、ヘキサデカナール、ヘキサデカノエート、ｎ−ヘプタデカン、１−ヘプタデセン、１−ヘプタデカノール、ヘプタデカナール、ヘプタデカノエート、ｎ−オクタデカン、１−オクタデセン、１−オクタデカノール、オクタデカナール、オクタデカノエート、ｎ−ノナデカン、１−ノナデセン、１−ノナデカノール、ノナデカナール、ノナデカノエート、エイコサン、１−エイコセン、１−エイコサノール、エイコサナール、エイコサナノエート、３−ヒドロキシプロパナール、１，３−プロパンジオール、４−ヒドロキシブタナール、１，４−ブタンジオール、３−ヒドロキシ−２−ブタノン、２，３−ブタンジオール、１，５−ペンタンジオール、ホモシトレート、ホモイソシトレート、ｂ−ヒドロキシアジペート、グルタレート、グルタルセミアルデヒド、グルタルアルデヒド、２−ヒドロキシ−１−シクロペンタノン、１，２−シクロペンタンジオール、シクロペンタノン、シクロペンタノール、（Ｓ）−２−アセトラクテート、（Ｒ）−２，３−ジヒドロキシイソバレレート、２−オキソイソバレレート、イソブチリル−ＣｏＡ、イソブチレート、イソブチルアルデヒド、５−アミノペントアルデヒド、１，１０−ジアミノデカン、１，１０−ジアミノ−５−デセン、１，１０−ジアミノ−５−ヒドロキシデカン、１，１０−ジアミノ−５−デカノン、１，１０−ジアミノ−５，６−デカンジオール、１，１０−ジアミノ−６−ヒドロキシ−５−デカノン、フェニルアセトアルデヒド、１，４−ジフェニルブタン、１，４−ジフェニル−１−ブテン、１，４−ジフェニル−２−ブテン、１，４−ジフェニル−２−ブタノール、１，４−ジフェニル−２−ブタノン、１，４−ジフェニル−２，３−ブタンジオール、１，４−ジフェニル−３−ヒドロキシ−２−ブタノン、１−（４−ヒデオキシフェニル）−４−フェニルブタン、１−（４−ヒデオキシフェニル）−４−フェニル−１−ブテン、１−（４−ヒデオキシフェニル）−４−フェニル−２−ブテン、１−（４−ヒデオキシフェニル）−４−フェニル−２−ブタノール、１−（４−ヒデオキシフェニル）−４−フェニル−
２−ブタノン、１−（４−ヒデオキシフェニル）−４−フェニル−２，３−ブタンジオール、１−（４−ヒデオキシフェニル）−４−フェニル−３−ヒドロキシ−２−ブタノン、１−（インドール−３）−４−フェニルブタン、１−（インドール−３）−４−フェニル−１−ブテン、１−（インドール−３）−４−フェニル−２−ブテン、１−（インドール−３）−４−フェニル−２−ブタノール、１−（インドール−３）−４−フェニル−２−ブタノン、１−（インドール−３）−４−フェニル−２，３−ブタンジオール、１−（インドール−３）−４−フェニル−３−ヒドロキシ−２−ブタノン、４−ヒドロキシフェニルアセトアルデヒド、１，４−ジ（４−ヒドロキシフェニル）ブタン、１，４−ジ（４−ヒドロキシフェニル）−１−ブテン、１，４−ジ（４−ヒドロキシフェニル）−２−ブテン、１，４−ジ（４−ヒドロキシフェニル）−２−ブタノール、１，４−ジ（４−ヒドロキシフェニル）−２−ブタノン、１，４−ジ（４−ヒドロキシフェニル）−２，３−ブタンジオール、１，４−ジ（４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−２−ブタノン、１−（４−ヒドロキシフェニル）−４−（インドール−３−）ブタン、１−（４−ヒドロキシフェニル）−４−（インドール−３）−１−ブテン、１−ジ（４−ヒドロキシフェニル）−４−（インドール−３）−２−ブテン、１−（４−ヒドロキシフェニル）−４−（インドール−３）−２−ブタノール、１−（４−ヒドロキシフェニル）−４−（インドール−３）−２−ブタノン、１−（４−ヒドロキシフェニル）−４−（インドール−３）−２，３−ブタンジオール、１−（４−ヒドロキシフェニル−４−（インドール−３）−３−ヒドロキシ−２−ブタノン、インドール−３−アセトアルデヒド、１，４−ジ（インドール−３−）ブタン、１，４−ジ（インドール−３）−１−ブテン、１，４−ジ（インドール−３）−２−ブテン、１，４−ジ（インドール−３）−２−ブタノール、１，４−ジ（インドール−３）−２−ブタノン、１，４−ジ（インドール−３）−２，３−ブタンジオール、１，４−ジ（インドール−３）−３−ヒドロキシ−２−ブタノン、コハク酸セミアルデヒド、ヘキサン−１，８−ジカルボン酸、３−ヘキセン−１，８−ジカルボン酸、３−ヒドロキシ−ヘキサン−１，８−ジカルボン酸、３−ヘキサノン−１，８−ジカルボン酸、３，４−ヘキサンジオール−１，８−ジカルボン酸、４−ヒドロキシ−３−ヘキサノン−１，８−ジカルボン酸、フコイダン、ヨウ素、クロロフィル、カロテノイド、カルシウム、マグネシウム、鉄、ナトリウム、カリウム、ホスフェート、乳酸、酢酸、ギ酸、イソプレノイド、およびポリイソプレン、例えばゴム。
【００１８】
本明細書では「発酵」という用語は、当業者に知られているその普通の意味を有し、微生物に好適な培地中または培地上で微生物または微生物群を培養することを含むことができる。微生物は、好気性菌、嫌気性菌、通性好気性菌、従属栄養生物、独立栄養生物、光独立栄養生物、光従属栄養生物、化学合成独立栄養生物、および／または化学合成従属栄養生物とすることができる。細胞増殖を含む細胞活性は、好気的、微好気的、または嫌気的増殖とすることができる。細胞はいずれの増殖期とすることもでき、遅滞期（または誘導期）、対数期、移行期、静止期、死亡期、休止期、栄養生長期、胞子形成期などが含まれる。
【００１９】
本明細書では「植物ポリサッカリド」という用語は、当業者に知られているその普通の意味を有し、糖および糖誘導体の１つ以上の炭水化物ポリマー、ならびに糖ポリマーの誘導体および／または植物性物質中で発生する他のポリマー材料を含むことができる。例示的な植物ポリサッカリドとしては、リグニン、セルロース、デンプン、ペクチン、およびヘミセルロースが挙げられる。他のものは、キチン、スルホン化ポリサッカリド、例えばアルギン酸、アガロース、カラゲナン、ポルフィラン、ファーセレランおよびフノランである。一般に、ポリサッカリドは２つ以上の糖ユニットまたは糖ユニットの誘導体を有することができる。糖ユニットおよび／または糖ユニットの誘導体は、規則的なパターンで、または別の方法で繰り返すことができる。糖ユニットはヘキソースユニットまたはペントースユニット、あるいはそれらに組み合わせとすることができる。糖ユニットの誘導体は糖アルコール、糖酸、アミノ糖などとすることができる。ポリサッカリドは直鎖、分枝、架橋またはそれらの混合物とすることができる。ポリサッカリドの１つの型またはクラスは、ポリサッカリドの別の型またはクラスに架橋させることができる。
【００２０】
本明細書では、「発酵性糖」という用語は、当業者に知られているその普通の意味を有し、微生物により炭素源として使用され得る１つ以上の糖および／または糖誘導体を含むことができ、モノマー、ダイマー、および２つ以上のこれらの化合物を含むこれらの化合物のポリマーが挙げられる。場合によっては、生物はこれらのポリマーを、例えば、加水分解により分解し、その後、分解された材料を組み入れることができる。例示的な発酵性糖としては、グルコース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、マンノース、ラムノース、セロビオース、ラクトース、スクロース、マルトース、およびフルクトースが挙げられるが、それらに限定されない。
【００２１】
本明細書では、「糖化」という用語は当業者に知られているその普通の意味を有し、植物ポリサッカリドの、生物がすぐに使用することができる低分子量種への変換を含むことができる。いくつかの生物では、これは、モノサッカリド、ジサッカリド、トリサッカリド、および約７個のモノマーユニットまでのオリゴサッカリド、ならびに糖誘導体の同様のサイズの鎖、ならびに糖および糖誘導体の組み合わせへの変換を含むであろう。いくつかの生物では、許容される鎖長は、より長く（例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個以上のモノマーユニット）、いくつかの生物では、許容される鎖長は、より短い（例えば、１、２、３、４、５、６モノマーユニット）。
【００２２】
本明細書では、「バイオマス」という用語は当業者に知られているその普通の意味を有し、バイオ燃料、化学または他の生成物に変換させることができる１つ以上の生物材料を含むことができる。バイオマスの１つの例示的な起源は、植物性物質である。植物性物質は、例えば、木本物質、非木本物質、セルロース材料、リグノセルロース材料、ヘミセルロース材料、炭水化物、ペクチン、デンプン、イヌリン、フルクタン、グルカン、トウモロコシ、トウモロコシ茎葉、サトウキビ、草、スイッチグラス、竹、藻類、クランベ、ココナッツ、ヤトロファ、ジュートおよびこれらから誘導される材料とすることができる。植物性物質はさらに、存在する化学種、例えばタンパク質、ポリサッカリドおよび油を参照して記載され得る。ポリサッカリドとしては、グルコース、フルクトース、ラクトース、ガラクツロン酸、ラムノース、などを含む様々なモノサッカリドおよびモノサッカリドの誘導体のポリマーが挙げられる。植物性物質はまた、農業廃棄物副産物または副流、例えば、搾りかす、コーンスティープリカー、コーンスティープソリッド、トウモロコシ茎葉、トウモロコシ蒸留廃液、トウモロコシ穂軸、トウモロコシグレイン、蒸留器グレイン、蒸留器溶質、バガス、蒸留器グレイン、皮、壁孔、発酵廃棄物、木質チップ、鋸ダスト、木粉、木材パルプ、製紙用パルプ、製紙用パルプ廃棄物流ストロー、材木、下水、シードケーキ、外皮、もみ殻、葉、刈り取った芝生、トウモロコシ茎葉、（トウモロコシ粉砕物）、および食べ残しを含む。これらの材料は、農場、水域環境、森林地、工業原料、家庭などに由来することがある。バイオマスの別の非制限的な例は、動物性物質であり、例えば、乳、肉、脂肪、骨粉、動物処理廃棄物、および動物廃棄物が挙げられる。「原料」はしばしば、プロセス、例えば本明細書で記載されるもののために使用されるバイオマスに言及するために使用される。
【００２３】
本明細書では、「培地」という用語は当業者に知られているその普通の意味を有し、可溶性および不溶性物質、懸濁物質、細胞および培地の組み合わせの全ての内容物を含むことができ、例えば、発酵反応の全内容物は発酵培地と呼ばれ得る。
【００２４】
本明細書では、「生産性」という用語は当業者に知られているその普通の意味を有し、一定の期間、一定の容積で生産される対象の材料の質量を含むことができる。単位は、例えば、１リットル−時間あたりのグラム、または質量、体積および時間のいくつかの他の組み合わせとすることができる。発酵では、生産性は、しばしば、生成物が一定の発酵容積内でどれくらい速く生成物が生成され得るかを特徴づけるために使用される。溶積は、発酵容器の総容積、発酵容器の作動容積、または発酵される培地の実際の容積と示すことができる。句の状況は、当業者用の意味を示すであろう。生産性（例えば、ｇ／Ｌ／ｄ）は「タイター」（例えば、ｇ／Ｌ）と、生産性が時間項を含み、タイターは濃度に類似する点で異なっている。
【００２５】
本明細書では、「生体触媒」という用語は当業者に知られているその普通の意味を有し、１つ以上の酵素および／または微生物を含むことができ、酵素および微生物の溶液、懸濁液および混合物が挙げられる。いくつかの状況では、この単語は、特定の機能を果たす酵素または微生物のいずれかの可能な使用を示し、他の状況ではその用語は２つの併用を示し、他の状況では、この単語は２つのうちの１つのみを示すであろう。句の状況は、当業者用の意味を示すであろう。
【００２６】
本明細書では、「変換効率」または「収率」という用語は当業者に知られているその普通の意味を有し、基質のある質量から生成される生成物の質量を含むことができる。この用語は、基質の開始質量からの生成物の％収率として表すことができる。グルコースからのエタノールの生産では、正味の反応は、一般に下記として許容され：
C6H12O6 →  2 C2H5OH  +  2 CO2 
理論的な最大変換効率または収率は５１％（ｗｔ．）である。しばしば、変換効率は、理論的最大値を基準とし、例えば、「理論的最大値の８０％」である。グルコースのエタノールへの変換の場合、この記述は４１％（ｗｔ．）の変換効率を示すであろう。句の状況は、当業者用の基質および生成物を示すであろう。バイオマスなどで見られるような異なる炭素源（キシラン、キシロース、グルコース、セロビオース、アラビノースセルロース、ヘミセルロースなど）の混合物を含む基質では、バイオマスのエタノールへの理論的最大変換効率は、各炭素源の相対濃度により加重された個々の炭素源成分の最大変換効率の平均である。場合によっては、理論的最大変換効率は、推定糖化効率に基づいて計算される。ほんの一例として、１０ｇのセルロースを含む炭素源を考えると、理論的最大変換効率は、約７５重量％のセルロースの同化できる炭素源グルコースへの糖化を仮定することにより計算することができる。この例では、１０ｇのセルロースは７．５ｇのグルコースを提供することができ、これは、約７．５ｇ＊５１％または３．８ｇのエタノールの最大理論変換効率を提供することができる。他の場合、糖化工程の効率は計算または決定（すなわち、測定）することができる。本発明により予測される糖化効率としては、単一のモノサッカリドサブユニットより大きな任意の炭水化物炭素源に対し、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または約１００％が挙げられる。
【００２７】
「前処理」または「前処理された」は本明細書では、バイオマスを酵素および／または微生物による攻撃に対しより感受性を高くするためにバイオマスの破壊または膨張を達成する、任意の機械、化学、熱、生物化学プロセスまたはこれらのプロセスの組み合わせ（１つの組み合わせられた工程であるか順次実施されるかに関係なく）を示すために使用される。いくつかの実施形態では、前処理は、例えば、酸または塩基による処理による、リグニンの除去または破壊を含むことができ、そのため、植物バイオマス中のセルロースおよびヘミセルロースポリマーがセルロース分解性酵素および／または微生物に対しより有効になる。いくつかの実施形態では、前処理としては、１つの型の微生物を使用して、植物ポリサッカリドを別の型の微生物により利用可能にすることが挙げられる。いくつかの実施形態では、前処理としてはまた、セルロースおよび／またはヘミセルロース材料の破壊または膨張が挙げられる。水蒸気爆砕、およびアンモニア繊維膨張（または爆砕）（ＡＦＥＸ）がよく知られた熱／化学技術である。加水分解、例えば酸および／または酵素を使用する方法を使用することができる。他の熱、化学、生物化学、酵素技術もまた使用することができる。
【００２８】
本明細書では、「流加」または「流加発酵」という用語は当業者に知られているその普通の意味を有し、栄養分、他の培地成分、または生体触媒（例えば、酵素、新鮮生物、細胞外培地、など）が培養中に発酵槽に供給されるが、発酵終了まで発酵槽から培地は回収されない微生物を培養する方法を含むことができるが、「自然播種」または「部分回収」技術もまた含むことができ、この場合、発酵槽容積の一部が回収され、その後新鮮な培地が発酵槽内の残りの培地に添加され、接種材料の少なくとも一部が発酵槽内に残された培地となる。いくつかの実施形態では、流加プロセスは、「細胞増大を伴う流加」などの句と共に言及されるであろう。この句は、栄養分および微生物細胞が添加される操作または実質的な量の栄養分を有さない微生物細胞が添加される操作を含むことができる。より一般的な句「流加」はこれらの操作を同様に含む。これらの句のいずれかが使用される状況は、考慮される技術を当業者に示すであろう。
【００２９】
本明細書では、「フィテート」という用語は当業者に知られているその普通の意味を有し、フィチン酸、その塩、およびそれらの結合形態、ならびにこれらの組み合わせを含むことができる。
【００３０】
本明細書では、「糖化合物」という用語は当業者に知られているその普通の意味を有し、モノサッカリド糖、例えば限定はされないがヘキソースおよびペントース；糖アルコール；糖酸；糖アミン；直接的に、または共有もしくはイオン結合を介して間接的に共に結合されたこれらのうちの２つ以上を含む化合物；ならびにそれらの混合物を含むことができる。ジサッカリド；トリサッカリド；オリゴサッカリド；ポリサッカリド；および任意の長さの分枝および／または直鎖の糖鎖はこの記載に含まれる。
【００３１】
序論
バイオマスはエネルギーの再生可能資源であり、生物学的に発酵させることができ、最終生成物、例えば移動式エンジンのための可搬式燃料（例えばアルコール、エタノール、有機酸、酢酸、乳酸、メタン、または水素）または他の市販目的のための化学化合物が生産される。バイオマスとしては、農業残渣（トウモロコシ茎、草、わら、穀粒へた、バガス、など）、動物廃棄物（ウシ、トリ、およびブタ由来の堆肥）、藻類、木質材料（木材または皮、おがくず、木材残骸、およびミルスクラップ）、自治体廃棄物（古紙、再生紙トイレットペーパー、庭の刈り取った草，など）、およびエネルギー作物（ポプラ材、柳、スイッチグラス、アルファルファ、大草原ウシクサ、など）が挙げられる。リグノセルロース系バイオマスはセルロースおよびヘミセルロースを２つの主成分として有する。リグノセルロース系バイオマスの最終生成物への高い発酵効率（収率）を得るためには、リグニン内容物の少なくとも一部を除去し、および／または解毒するため、ならびにセルロースおよびヘミセルロースを酵素加水分解により適したものとするための適当な前処理を提供することが重要である可能性がある。
【００３２】
近年では、セルロースおよびヘミセルロース中のポリマーヘキソースおよびペントース糖のエタノールへの変換が達成されている。Ｅｎｇｌｉｓｈらへの米国特許第４，３４９，６２８号を参照されたい；Ｚｅｉｋｕｓらへの米国特許第４，４００，４７０号；Ｉｎｇｒａｍらへの米国特許第５，０００，０００号；Ｉｎｇｒａｍらへの米国特許第５，０２８，５３９号；およびＩｎｇｒａｍらへの米国特許第５，１６２，５１６号もまた参照されたい。これらは全て参照により本明細書に組み込まれる。
【００３３】
いくつかの実施形態では、バイオマスからの燃料生産は、酵素加水分解続いて発酵を含む２段階プロセスである。バイオマスの酵素加水分解は、市販の加水分解酵素カクテル、特定の生物もしくは生物群から誘導した酵素、費やした発酵培地、または炭水化物分解もしくは糖化酵素の任意の源を用いて達成させることができる。１つの実施形態では、バイオマスの処理に有用な酵素としては、キシラナーゼ、エンド−１，４−β−キシラナーゼ、キシロシダーゼ、β−Ｄ−キシロシダーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、カルボヒドラーゼ、グルカナーゼ、エンドグルカナーゼ、エンド−１，４−β−グルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、グルコシダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、アミラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、エキソセロビオヒドロラーゼ、フィターゼ、プロテアーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ガラクツロナーゼ、ラッカーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、キチナーゼ、ペクチナーゼ、またはケラチナーゼが挙げられるが、それらに限定されない。
【００３４】
有用な最終生成物への発酵または変換のための、バイオマスの処理、バイオマスの前処理、バイオマスの酵素処理、またはバイオマスの調製のための追加の方法および組成物は、米国特許出願第２００９００５３７７０号、２００７００３１９１８号、２００７００３１９５３号、２００９００５３７７７号、２００９００４２２５９号、２００９００４２２６６号、２００９０００４６９８号、２００９０００４６９２号、２００９０００４７０６号、２００９００１１４７４号、２００９００１１４８４号、２００８０２２７１６１号、２００８０２２７１６２号、２００８００４４８７７号、２００８０１８２３２３号、２００７０１４８７５１号、２００６０２４６５６３号、ならびに米国特許第５８６５８９８号、５６２８８３０号、５６９３２９６号、５８３７５０６号、および６０９０５９５号により提供され、これらの各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。バイオマスの酵素処理より、高分子量炭水化物ポリマーはより小さなオリゴサッカリド、場合によっては、最終的には、モノマーヘキソースおよびペントース糖へ分解される。第２の工程では、これらの糖は、例えば酵母または細菌株を使用して発酵され、最終生成物（例えば、アルコール、エタノール、有機酸、酢酸、乳酸、メタン、または水素）となる。
【００３５】
他の実施形態では、加水分解および発酵プロセスは組み合わせて単一工程にすることができる。場合によっては、これは、資本コストおよび運転コストを減少させることにより、例えば、外部酵素処理の必要性を最小に抑えることにより、２工程プロセスよりも経済的なプロセスを提供することができる。さらに他の実施形態では、ヘキソースおよびペントース糖の両方の最終生成物への変換は、ヘキソースのみまたはペントースのみの変換に比べ、あるいは主にペントースを変換するが、実質的にはヘキソースを変換しない、または主にヘキソースを変換するが、実質的にはペントースを変換しないプロセスに比べ、１ｇのバイオマスあたりの最終生成物の収率を増強させることができる。酵母（サッカロミセス・セレビシエ）、真菌および細菌の普通使用される種が、ヘキソース糖(グルコース)をエタノールに容易に変換することができることが報告されている。しかしながら、ペントース糖(キシロースおよびアラビノース)の発酵は依然として、バイオマスからのエタノール生産に対し技術的障害となっている。研究者の幾人かは、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、大腸菌、サッカロミセスおよび他の酵母の組換え型を得るために遺伝的手段を使用している。
【００３６】
本発明は微生物、例えばクロストリジウム・フィトフェルメンタンスまたはクロストリジウム種（いくつかの実施形態では、リグノセルロース系バイオマスを同時に加水分解し、発酵させる能力を有する）を使用するための方法を提供する。１つの実施形態では、微生物は同時にヘキソースおよびペントース画分の両方を発酵させ、発酵最終生成物を生産させる。別の実施形態では、クロストリジウム・フィトフェルメンタンスまたは他のクロストリジウム種は、ポリサッカリドおよびより高いサッカリドを加水分解して低分子量サッカリド、オリゴサッカリド、ジサッカリド、およびモノサッカリドとすることができる酵素を生成することができることにより、バイオマスのエタノールまたは他の発酵最終生成物（例えば、アルコール、有機酸、酢酸、乳酸、メタン、または水素）への変換に対し、有用な利点を提供することができる。いくつかの実施形態では、微生物（例えば、クロストリジウム・フィトフェルメンタンスまたは他のクロストリジウム種）を、本明細書で記載される方法で、糖および／またはより高いサッカリドもしくはポリサッカリドを含む高分子量バイオマスを加水分解してより低い糖とし、セルロースおよびヘミセルロースの両方由来のオリゴサッカリド、ジサッカリド，モノサッカリドを発酵させて、１つ以上の発酵最終生成物（エタノール、メタン、水素、および他の化合物、例えば、有機酸、例えばギ酸、酢酸、および乳酸が挙げられるが、それらに限定されない）とする組み合わせられた工程を実施するために、使用することができる。本明細書で記載される方法はさらに、微生物、例えば、クロストリジウム・フィトフェルメンタンスまたは別のクロストリジウム種の、高いエタノール濃度、高い糖濃度、低い糖濃度、不溶性炭素源の使用、および嫌気性条件を含む条件下での、増殖、培養、発酵を提供する。
【００３７】
１つの実施形態では、クロストリジウム・フィトフェルメンタンスまたは他のクロストリジウム種は、モノサッカリドではなく、優先的にオリゴマーを発酵させる。この代謝的特性は、バイオマスの前処理の時間および苛酷性を減少させるのに使用することができる。例えば、モノサッカリドではなくオリゴマーを放出させることになるより苛酷性の低い酸処理は、前処理プロセスの時間および化学薬品コストを減少させる。これにより、発酵最終生成物を生産する全体コストを低下させることができる。そのようなプロセス中ではより少ない糖が分解され、バイオマスのより高いサッカリド内容物へ添加され、エタノールまたは他の化学生成物の収率が増加する。
【００３８】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、発酵プロセス、例えば、連続発酵プロセス、バッチ発酵プロセス、または流加発酵プロセス（例えば、一定または可変容積）を提供する。いくつかの実施形態では、方法は微生物、例えばクロストリジウム・フィトフェルメンタンスまたは他のクロストリジウム種を用いたバイオマス発酵を提供する。場合によっては、微生物、例えばクロストリジウム・フィトフェルメンタンスまたは別のクロストリジウム種を使用する、バイオマス（例えば、トウモロコシ茎葉または本明細書で提供される任意のバイオマス）からのエタノール生産のための流加発酵プロセスが提供される。１つの実施形態では、方法は約０．５〜２０ｇ／Ｌ／ｄの生産速度で、５〜２００ｇ／Ｌのエタノールのタイターを提供する。別の実施形態では、方法は発酵槽に投入されるバイオマス１ｇにつき約０．１〜１ｇのエタノールのエタノール収率を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、発酵最終生成物（例えばアルコール、エタノール、有機酸、酢酸、乳酸、メタン、または水素）のの理論的最大可能収率約４５％〜９９．５％以上の収率を提供する。
【００３９】
１つの実施形態では、方法は、約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ｇ／Ｌ／ｄ以上の生産速度で、少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４、１４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、もしくは２００ｇ／Ｌまたはそれ以上のエタノールのタイターを提供する。別の実施形態では、方法は発酵槽に投入される１ｇのバイオマスあたり約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、または１ｇ以上のエタノールのエタノール収率を提供する。いくつかの実施形態では，方法は、発酵最終生成物（例えばアルコール、エタノール、有機酸、酢酸、乳酸、メタン、または水素）の理論的最大可能収率の少なくとも約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％以上の収率を提供する。
【００４０】
ｂ．方法
発酵
下記記載および実施例は、本発明のある好ましい実施形態を詳細に説明する。当業者であれば、その範囲に含まれる多くの変更および改変が存在することを認識するであろう。したがって、好ましい実施形態の記載は本発明の範囲を制限すると見なすべきではない。本明細書では、バイオマス発酵のための方法および、アルコール、エタノール、、有機酸、酢酸、乳酸、メタン、もしくは水素または他の化学物質を含むがそれらに限定されない有用な最終生成物のその後の生産が提供される。いくつかの実施形態では、バイオマス(例えばトウモロコシ茎葉)は、発酵前に処理または前処理される。１つの実施形態では、前処理方法としては、バイオマス粒子サイズ減少、例えば、断片化、ミリング、チップ化、粉砕、破砕、または微粉化が挙げられるが、それらに限定されない。いくつかの実施形態では、バイオマス粒子サイズ減少は、サイズ分離法、例えばふるい分け、またはサイズに基づき材料を分離するための当技術分野で知られている他の好適な方法を含むことができる。１つの実施形態では、サイズ分離は収率増強を提供することができる。いくつかの実施形態では,より大きな粒子からの、細かく断片化されたバイオマス(例えば、直径が約８ｍｍより小さな粒子、例えば、８、７．９、７．７、７．５、７．３、７、６．９、６．７、６．５、６．３、６、５．９、５．７、５．５、５．３、５、４．９、４．７、４．５、４．３、４、３．９、３．７、３．５、３．３、３、２．９、２．７、２．５、２．３、２、１．９、１．７、１．５、１．３、１、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、または０．１ｍｍ)の分離は、より大きな粒子をサイズ減少プロセスに戻す再利用を可能にし、これにより、処理されたバイオマスの最終収率が増加する。
【００４１】
いくつかの実施形態では、前処理方法は、高いまたは低いｐＨ条件下での処理を含むことができる。高いまたは低いｐＨ処理としては、濃酸もしくは濃アルカリを用いた処理、または希酸もしくは希アルカリを用いた処理が挙げられるがそれらに限定されない。本発明の方法においてバイオマスを処理するのに有用なアルカリ組成物としては、腐食剤、例えば石灰、苛性ソーダ、苛性カリ、ナトリウム、カリウム、もしくはカルシウム水酸化物、または酸化カルシウムが挙げられるが、それらに限定されない。いくつかの実施形態では、バイオマスの処理に有用なアルカリの好適な量は、処理される１ｇのバイオマスに対し０．０１ｇ〜３ｇのアルカリ（例えば、腐食剤）の範囲である。いくつかの実施形態では、バイオマスの処理に有用なアルカリの好適な量としては、処理される１ｇのバイオマスに対し約０．０１ｇのアルカリ（例えば、腐食剤）、０．０２ｇ、０．０３ｇ、０．０４ｇ、０．０５ｇ、０．０７５ｇ、０．１ｇ、０．２ｇ、０．３ｇ、０．４ｇ、０．５ｇ、０．７５ｇ、１ｇ、２ｇ、または約３ｇのアルカリ（例えば、腐食剤）が挙げられるが、それらに限定されない。
【００４２】
別の実施形態では、バイオマスは、高温および／または高圧で前処理することができる。１つの実施形態では、バイオマスは２０℃〜４００℃の温度範囲で前処理される。別の実施形態ではバイオマスは約２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、８０℃、９０℃、１００℃、１２０℃、１５０℃、２００℃、２５０℃、３００℃、３５０℃、４００℃以上の温度で前処理される。別の実施形態では、高温は蒸気、温水、または熱ガスにより提供される。１つの実施形態では、蒸気はバイオマスを含む容器に注入することができる。別の実施形態では、蒸気、温水、または熱ガスは容器ジャケットに注入することができ、そのため、バイオマスを加熱するが、直接バイオマスに接触しない。
【００４３】
別の実施形態では、バイオマスは高圧で処理することができる。１つの実施形態では、バイオマスは、約１ｐｓｉ〜約３０ｐｓｉの圧力範囲で前処理される。別の実施形態では、バイオマスは約１ｐｓｉ、２ｐｓｉ、３ｐｓｉ、４ｐｓｉ、５ｐｓｉ、６ｐｓｉ、７ｐｓｉ、８ｐｓｉ、９ｐｓｉ、１０ｐｓｉ、１２ｐｓｉ、１５ｐｓｉ、１８ｐｓｉ、２０ｐｓｉ、２２ｐｓｉ、２４ｐｓｉ、２６ｐｓｉ、２８ｐｓｉ、３０ｐｓｉ以上の圧力で前処理される。いくつかの実施形態では、バイオマスは、蒸気を、バイオマスを含む容器に注入することにより高圧で処理することができる。他の実施形態では、バイオマスは、アルカリもしくは酸処理または本明細書で提供される任意の他の処理の前あるいは後に、真空条件まで処理することができる。
【００４４】
１つの実施形態では、アルカリまたは酸で前処理されたバイオマス（例えば、水（温または冷）または他の溶媒、例えばアルコール（例えば、エタノール））で洗浄され、ｐＨが酸、塩基または緩衝剤（例えば、リン酸、クエン酸、ホウ酸または炭酸塩）で中和され、または乾燥され、その後、発酵される。１つの実施形態では、乾燥工程は、水または他の溶媒の蒸発速度を増加させるように真空下で実施することができる。また、あるいはさらに、乾燥工程は、高温、例えば約２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、８０℃、９０℃、１００℃、１２０℃、１５０℃、２００℃、２５０℃、３００℃以上で実施することができる。
【００４５】
本発明のいくつかの実施形態では、前処理工程は固体回収工程を含む。固体回収工程は、前処理(例えば、酸またはアルカリ前処理)中もしくは後、または乾燥工程前とすることができる。いくつかの実施形態では、本発明の方法により提供される固体回収工程は、液体と固体画分を分離するためのふるい、フィルタ、スクリーン、または膜の使用を含む。１つの実施形態では、好適なふるい細孔直径サイズは、約０．００１μｍ〜８ｍｍ、例えば約０．００５μｍ〜３ｍｍまたは約０．０１μｍ〜１ｍｍの範囲である。１つの実施形態では、 a ふるい細孔サイズは約０．０１μｍ、０．０２μｍ、０．０５μｍ、０．１μｍ、０．５μｍ、１μｍ、２μｍ、４μｍ、５μｍ、１０μｍ、２０μｍ、２５μｍ、５０μｍ、７５μｍ、１００μｍ、１２５μｍ、１５０μｍ、２００μｍ、２５０μｍ、３００μｍ、４００μｍ、５００μｍ、７５０μｍ、１ｍｍ以上の細孔直径を有する。
【００４６】
１つの実施形態では、流加発酵は処理されたバイオマス上で実施され、発酵最終生成物、例えばアルコール、エタノール、有機酸、酢酸、乳酸、メタン、または水素が生産される。１つの実施形態では、発酵プロセスは、１つ以上の微生物、例えばクロストリジウム株、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）株、サッカロミセス株、ザイモモナス株、またはバイオマス発酵に好適な別の微生物を使用したバイオマスの同時の加水分解および発酵を含む。別の実施形態では、発酵プロセスは、クロストリジウム・フィトフェルメンタンス、クロストリジウム・アルギディキシラノリティカム、クロストリジウム・キシラノリティカム、クロストリジウム・セルロボランス（ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓ）、クロストリジウム・セルロリティカム（ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）、クロストリジウム・サーモセラム、クロストリジウム・ジョスイ（ｊｏｓｕｉ）、クロストリジウム・パピロソルベンス（ｐａｐｙｒｏｓｏｌｖｅｎｓ）、クロストリジウム・セロビオパルム（ｃｅｌｌｏｂｉｏｐａｒｕｍ）、クロストリジウム・ヒュンガティ（ｈｕｎｇａｔｅｉ）、クロストリジウム・セルロシ（ｃｅｌｌｕｌｏｓｉ）、クロストリジウム・ステルコラリウム（ｓｔｅｒｃｏｒａｒｉｕｍ）、クロストリジウム・ターマイティディス（ｔｅｒｍｉｔｉｄｉｓ）、クロストリジウム・サーモコプリアエ（ｔｈｅｒｍｏｃｏｐｒｉａｅ）、クロストリジウム・セレレクレッセンス（ｃｅｌｅｒｅｃｒｅｓｃｅｎｓ）、クロストリジウム・ポリサッカロリチカム（ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）、クロストリジウム・ポプレティ（ｐｏｐｕｌｅｔｉ）、クロストリジウム・レントセルム（ｌｅｎｔｏｃｅｌｌｕｍ）、クロストリジウム・カルタタビダム（ｃｈａｒｔａｔａｂｉｄｕｍ）、クロストリジウム・アルドリチイ（ａｌｄｒｉｃｈｉｉ）、クロストリジウム・ハービボランス（ｈｅｒｂｉｖｏｒａｎｓ）、アセチブリオ・セルロリチカス（Ａｃｅｔｉｖｉｂｒｉｏ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）、バクテロイデス・セルロソルベンス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｏｌｖｅｎｓ）、カルディセルロシルプター・サッカロリティカム（Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）、ルミノコッカス・アルブス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ａｌｂｕｓ）、ルミノコッカス・フラヴェファシエンス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ）、フィブロバクター・サクシノゲネス（Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、ユーバクテリウム・セルロソルベンス（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｏｌｖｅｎｓ）、ブチリビブリオ・フィブリソルベンス（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓ）、アナエロセラム・サーモフィルム（Ａｎａｅｒｏｃｅｌｌｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）、ハロセラ・セルロリティカ（Ｈａｌｏｃｅｌｌａ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃａ）、サーモアナエロバクテリウム・サーモサッカロリティカム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）、サッカロファガス・デグラダンス（Ｓａｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ  ｄｅｇｒａｄａｎｓ）、またはサーモアナエロバクテリウム・サッカロリティカム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）である微生物を使用したバイオマスの同時の加水分解および発酵を含む。
【００４７】
１つの実施形態では、バイオマス発酵のために使用される１つ以上の微生物は野生型微生物である。野生型微生物は、自然環境から得られる単離物と実質的に同様の微生物であり、研究室環境で増殖された単離物を含む。別の実施形態では、１つ以上の微生物は望ましい特色に対し、繁殖され、および／または選択される。選択または繁殖の方法としては、発酵最終生成物の生産において使用される炭素源である、またはその炭素源に近似する炭素源を含む培地を用いた増殖が挙げられる。所望の特色としては、バイオマス糖化の増加、特定発酵最終生成物の生産の増加、エタノール生産の増加、エタノール耐性の増加、酵素合成の増加または胞子形成の減少が挙げられるが、それらに限定されない。選択方法としてはさらに、所望の微生物群を発生させる変異誘発(例えば、化学または照射手段による)の使用が挙げられる。突然変異微生物は、その後、所望の特色に対し選択することができ、より高い度数の所望の単離物が得られる。別の実施形態では、発酵のために使用される１つ以上の微生物は組換え微生物とすることができる。組換え微生物は、個々の野生型微生物と比べその核酸に対し、自発（すなわち自然）突然変異により生じなかった１つ以上の変化を含む。１つの実施形態では、組換え微生物は別の種（例えば別の微生物）由来の外因性ポリ核酸、合成ポリ核酸、または同じ種から単離され、または誘導されたポリ核酸を含む。
【００４８】
１つの実施形態では、発酵プロセスは、１つ以上の酵素、例えばキシラナーゼ、エンド−１，４−β−キシラナーゼ、キシロシダーゼ、β−Ｄ−キシロシダーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、カルボヒドラーゼ、グルカナーゼ、エンドグルカナーゼ、エンド−１，４−β−グルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、グルコシダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、アミラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、エキソセロビオヒドロラーゼ、フィターゼ、プロテアーゼ、ペルオキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ガラクツロナーゼ、またはラッカーゼを用いた、バイオマスの同時の加水分解および発酵を含むことができる。１つの実施形態では、バイオマスを処理するために使用される１つ以上の酵素は、熱安定性である。別の実施形態では、バイオマスは発酵前に、１つ以上の酵素、例えば本明細書で提供されるものにより処理される。別の実施形態では、バイオマスは発酵中に、１つ以上の酵素、例えば本明細書で提供されるものにより処理される。別の実施形態では、バイオマスは発酵前および発酵中に、１つ以上の酵素、例えば本明細書で提供されるものにより処理される。別の実施形態では、バイオマスの前処理のために使用される酵素は、発酵中に添加されるものと同じである。別の実施形態では、バイオマスの前処理のために使用される酵素は、発酵中に添加されるものと異なる。
【００４９】
いくつかの実施形態では、発酵は、バイオリアクター、発酵容器、かくはん槽型反応器、または流動層反応器などの装置で実施することができる。１つの実施形態では、処理されたバイオマスには、１つ以上の発酵生物の大幅な増殖を促進するために好適な化学物質を補充することができる。１つの実施形態では、有用な補充物質としては、窒素源および／またはアミノ酸、例えば酵母エキス、システイン、またはアンモニウム塩（例えば、硝酸塩、硫酸塩、リン酸塩など）；単純炭水化物源、例えばコーンスティープリカー、および麦芽シロップ；ビタミン源、例えば酵母エキス；緩衝剤、例えば塩（クエン酸塩、リン酸塩、または炭酸塩が挙げられるが、それらに限定されない）；またはミネラル栄養分、例えばマグネシウム、カルシウム、または鉄の塩が挙げられるが、それらに限定されない。いくつかの実施形態では、酸化還元調整剤が発酵混合物に添加され、システインまたはメルカプトエタノールが挙げられるが、それらに限定されない。
【００５０】
本発明の方法において使用される化学物質は容易に入手可能であり、商業的供給者、例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入することができる。さらに、市販の酵素カクテル（例えば、アクセレラーゼ（商標）１０００、ＣｅｌｌｕＳｅｂ−ＴＬ、ＣｅｌｌｕＳｅｂ−ＴＳ、Ｃｅｌｌｉｃ（商標）ＣＴｅｃ、ＳＴＡＲＧＥＮ（商標）、Ｍａｘａｌｉｑ（商標）、Ｓｐｅｚｙｍｅ（登録商標）、Ｄｉｓｔｉｌｌａｓｅ（登録商標）、Ｇ−Ｚｙｍｅ（登録商標）、Ｆｅｒｍｅｎｚｙｍｅ（登録商標）、Ｆｅｒｍｇｅｎ（商標）、ＧＣ  ２１２、またはＯｐｔｉｍａｓｈ（商標））または任意の他の市販の酵素カクテルは、ベンダー、例えばＳｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｅｎｚｙｍｅｓ＆Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｃｏ．、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ、またはＮｏｖｏｚｙｍｅｓから購入することができる。また、酵素カクテルは、１つ以上の生物、例えば、真菌（例えば、トリコデルマ、サッカロミセス、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、白色腐朽菌（Ｗｈｉｔｅ  Ｒｏｔ  Ｆｕｎｇｕｓ）など）、細菌（例えば、クロストリジウム（例えば、クロストリジウム・フィトフェルメンタンス）、または大腸菌型細菌、ザイモモナス細菌、サッカロファガス・デグラダンスなど）を好適な培地中で増殖させ、それらから産生される酵素を回収することにより調製することができる。いくつかの実施形態では、回収は酵素の１つ以上の精製工程を含むことができる。
【００５１】
１つの実施形態では、微生物（例えばクロストリジウム・フィトフェルメンタンス）による発酵最終生成物生産のタイターおよび／または生産性は、微生物をヘキソースおよび／またはペントース糖を含む１つ以上の化合物を含有する培地で培養することにより改善される。１つの実施形態では、プロセスは、開始材料（例えば、バイオマス）をバイオ燃料、例えば１つ以上のアルコールに変換することを含む。１つの実施形態では、本発明の方法は、ヘキソース（例えばグルコース、セロビオース）およびペントース（例えば、キシロース、アラビノース）サッカリドの両方を含む基質をＣ５およびＣ６サッカリドを加水分解しエタノールを生産することができる微生物と接触させることを含む。別の実施形態では、本発明の方法は、ヘキソース（例えば、グルコース、セロビオース）およびペントース（例えば、キシロース、アラビノース）サッカリドの両方を含む基質をＣ．フィトフェルメンタンスと接触させエタノールを生産させることを含む。
【００５２】
本発明のいくつかの実施形態では、本発明の方法を用いた、ヘキソースおよびペントースサッカリドの混合物の微生物(例えば、クロストリジウム・フィトフェルメンタンス)によるバッチ発酵は、約０．１〜８ｇ／Ｌ／ｈ以上のヘキソース（例えば、グルコース、セルロース、セロビオースなど）、および約０．１〜８ｇ／Ｌ／ｈ以上のペントース（キシロース、キシラン、ヘミセルロースなど）の取り込み速度を提供する。本発明のいくつかの実施形態では、本発明の方法を用いた、ヘキソースおよびペントースサッカリドの混合物の微生物(例えば、クロストリジウム・フィトフェルメンタンス)によるバッチ発酵は、約０．１、０．２、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、１、２、３、４、５、または６ｇ／Ｌ／ｈ以上のヘキソース（例えば、グルコース、セルロース、セロビオースなど）、および約０．１、０．２、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、１、２、３、４、５、または６ｇ／Ｌ／ｈ以上のペントース（キシロース、キシラン、ヘミセルロースなど）の取り込み速度を提供する。
【００５３】
１つの実施形態では、エタノールを生産するための方法は、４０以下の時間で約１０ｇ／ｌ〜１２０ｇ／ｌを生産する。別の実施形態では、エタノールを生産するための方法は、バイオマス発酵により４０時間で、約１０ｇ／ｌ、１１ｇ／Ｌ、１２ｇ／Ｌ、１３ｇ／Ｌ、１４ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、１６ｇ／Ｌ、１７ｇ／Ｌ、１８ｇ／Ｌ、１９ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、２１ｇ／Ｌ、２２ｇ／Ｌ、２３ｇ／Ｌ、２４ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、２６ｇ／Ｌ、２７ｇ／Ｌ、２８ｇ／Ｌ、２９ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、３１ｇ／Ｌ、３２ｇ／Ｌ、３３ｇ／Ｌ、３４ｇ／Ｌ、３５ｇ／Ｌ、３６ｇ／Ｌ、３７ｇ／Ｌ、３８ｇ／Ｌ、３９ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、４１ｇ／Ｌ、４２ｇ／Ｌ、４３ｇ／Ｌ、４４ｇ／Ｌ、４５ｇ／Ｌ、４６ｇ／Ｌ、４７ｇ／Ｌ、４８ｇ／Ｌ、４９ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、５１ｇ／Ｌ、５２ｇ／Ｌ、５３ｇ／Ｌ、５４ｇ／Ｌ、５５ｇ／Ｌ、５６ｇ／Ｌ、５７ｇ／Ｌ、５８ｇ／Ｌ、５９ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、６１ｇ／Ｌ、６２ｇ／Ｌ、６３ｇ／Ｌ、６４ｇ／Ｌ、６５ｇ／Ｌ、６６ｇ／Ｌ、６７ｇ／Ｌ、６８ｇ／Ｌ、６９ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、７１ｇ／Ｌ、７２ｇ／Ｌ、７３ｇ／Ｌ、７４ｇ／Ｌ、７５ｇ／Ｌ、７６ｇ／Ｌ、７７ｇ／Ｌ、７８ｇ／Ｌ、７９ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、８１ｇ／Ｌ、８２ｇ／Ｌ、８３ｇ／Ｌ、８４ｇ／Ｌ、８５ｇ／Ｌ、８６ｇ／Ｌ、８７ｇ／Ｌ、８８ｇ／Ｌ、８９ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、９１ｇ／Ｌ、９２ｇ／Ｌ、９３ｇ／Ｌ、９４ｇ／Ｌ、９５ｇ／Ｌ、９６ｇ／Ｌ、９７ｇ／Ｌ、９８ｇ／Ｌ、９９ｇ／Ｌ、１００  ｇ／Ｌ、１１０ｇ／ｌ、１２０ｇ／ｌ以上のエタノールを生産する。別の実施形態では、エタノールはヘキソースおよびペントースサッカリドの同時発酵を含む方法により生産される。別の実施形態では、エタノールは微生物により生産され、ヘキソースおよびペントースサッカリドの同時発酵を含む。
【００５４】
別の実施形態では、発酵最終生成物を生産する微生物は、高いアルコール（例えば、エタノールまたはブタノール）濃度の存在下で耐容性を示す。１つの実施形態ではクロストリジウム・フィトフェルメンタンスは高いアルコール（例えば、エタノールまたはブタノール）濃度の存在下で耐容性を示す。１つの実施形態では微生物は１５％ｖ／ｖまでのアルコール（例えば、エタノールまたはブタノール）濃度で増殖し、機能することができる。別の実施形態では微生物は１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、または１５％ｖ／ｖのアルコール（例えば、エタノールまたはブタノール）濃度で増殖し、機能することができる。１つの実施形態では、高いアルコール濃度での機能としては、アルコールおよび／または存在する他の成分による過度の阻害または抑制なしにアルコールを生産し続ける能力が挙げられる。別の実施形態では、高いアルコール濃度での機能としては、効率的にバイオマス原料中のヘキソースおよびペントース炭素源を発酵最終生成物、例えばアルコールに変換する能力が挙げられる。１つの実施形態では、クロストリジウム・フィトフェルメンタンスは高いアルコール（例えば、エタノールまたはブタノール）濃度の存在下で耐容性を示す。
【００５５】
クロストリジウム・フィトフェルメンタンスを含む発酵培地中のエタノール濃度は、約３６〜４８時間のバッチ発酵後に約１５ｇ／Ｌのプラトーに到達し、炭素基質は培地中に残ったままであることが観察されている。別の実施形態では、発酵ｐＨを約６．５に低下させると、および／または、不飽和脂肪酸を発酵培地に添加すると、生物により生産されるエタノール量が著しく増加し、約２０ｇ／Ｌ〜約３０、４０、５０、６０、または７０ｇ／Ｌ以上の間のエタノールが４８〜９６時間以上の発酵後に培地中で観察された。さらに、生物の生産性はエタノールタイターが低い場合に高くなり（約１０ｇ／Ｌ−ｄまで）、エタノール濃度が高いと低くなった（約２０ｇ／Ｌ−ｄまで）こともまた観察されている。ｐＨを減少させ、および／または脂質（例えば、脂肪酸）を添加した発酵は、非調整発酵培地に比べ、約２〜１０倍（例えば、２ｘ、３ｘ、４ｘ、５ｘ、６ｘ、７ｘ、８ｘ、９ｘ、または１０ｘ増加）以上エタノール生産速度を増加させることができる。本発明のいくつかの実施形態では、ヘキソースおよびペントースサッカリドの両方の同時発酵はまた、エタノール生産性および／または収率の増加を可能にすることができる。場合によっては、ヘキソースおよびペントース炭水化物基質の同時発酵は、ｐＨを減少させ、および／または脂質（例えば、脂肪酸)を添加した発酵と組み合わせて使用することができ、さらに、生産性および／または収率を増加させることができる。１つの実施形態では脂質は脂肪または油であり、脂肪酸のグリセリドエステル、関連するホスファチド、ステロール、アルコール、炭化水素、ケトン、および関連化合物が挙げられるが、それらに限定されない。別の実施形態では、脂質はリン脂質である。１つの実施形態では、脂肪酸は脂肪族または芳香族モノカルボン酸である。別の実施形態では、脂肪酸は不飽和脂肪酸である。１つの実施形態では、不飽和脂肪酸は１〜３の二重結合を有する脂肪酸であり、「高度不飽和脂肪酸」は４つ以上の二重結合を有する脂肪酸を意味する。別の実施形態では、不飽和脂肪酸はω−３高度不飽和脂肪酸、例えば、エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、αリノレン酸、ドコサヘキサエン酸、およびそれらの複合物である。別の実施形態では、脂肪酸は、飽和脂肪酸である。別の実施形態では、脂肪酸は植物油、例えば、部分水素化されており、ヤシ油、綿実油、トウモロコシ油、ピーナツ油、パーム核油、ババス油、ヒマワリ油、サフラワー油、またはそれらの混合物が挙げられる。別の実施形態では、脂肪酸を含む組成物はさらに、ワックス、例えば蜜蝋、石油ワックス、米ぬかワックス、カスターワックス、マイクロクリスタリンワックス、またはそれらの混合物を含む。
【００５６】
別の実施形態では、バイオマスは微生物による発酵前に、界面活性剤で前処理される。別の実施形態では、バイオマスは微生物による発酵中に界面活性剤と接触させられる。１つの実施形態では、界面活性剤はＴｗｅｅｎシリーズの界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ２０またはＴｗｅｅｎ８０）あるいはＴｒｉｔｏｎシリーズの界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）である。別の実施形態では、界面活性剤はポリソルベート６０、ポリソルベート８０、プロピレングリコール、スルホコハク酸ジオクチルナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、脂肪酸の乳酸エステル、脂肪酸のポリグリセロールエステル、またはそれらの混合物である。別の実施形態では、バイオマスは微生物による発酵前に、界面活性剤および脂質で前処理される。別の実施形態では、バイオマスは微生物による発酵中に界面活性剤および脂質と接触させられる。
【００５７】
別の実施形態では、発酵培地はキレート剤(例えば、クエン酸三ナトリウム二水和物、またはＥＤＴＡ）を含む。１つの実施形態では、キレート剤はある金属イオンと可溶性の複合分子を形成する化学物質であり、そのイオンを不活性化し、そのため、それらは他の元素またはイオンと反応しない。１つの実施形態では、発酵培地中のキレート剤の濃度は約０．２ｇ／Ｌ超、約０．５ｇ／Ｌ超、または約１ｇ／Ｌ超である。別の実施形態では、発酵培地中のキレート剤の濃度は約１０ｇ／Ｌ未満、ｌ約５ｇ／Ｌ未満、または約２ｇ／Ｌ未満である。１つの実施形態では、生物学的に許容されるキレート剤は５−スルホサリチル酸二水和物、クエン酸水素二アンモニウム、シュウ酸アンモニウム一水和物、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物、Ｌ−（＋）−酒石酸、シュウ酸カリウム一水和物、酒石酸カリウムナトリウム四水和物、クエン酸三ナトリウム二水和物、Ｌ−酒石酸二ナトリウム二水和物、シュウ酸ナトリウム、エチレングリコール−ビス（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、二クエン酸三マグネシウム九水和物、エチレンジアミン四酢酸ジアンモニウム塩、エチレンジアミン四酢酸ジカリウム塩二水和物、二シュウ酸三水素カリウム二水和物、酒石酸ナトリウム二塩基性二水和物、エチレンジアミン四酢酸三カリウム塩二水和物、エチレンジアミン四酢酸三ナトリウム塩二水和物、酒石酸ジアンモニウム、クエン酸三リチウム四水和物、クエン酸一カリウム、重酒石酸ナトリウム一水和物、クエン酸一ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム塩水和物、Ｎ，Ｎ−ジメチルデシルアミンＮ−オキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルドデシルアミンＮ−オキシド、ニトロ三酢酸、クエン酸三カリウム、Ｄ−酒石酸一カリウム、過硫酸カリウム、酒石酸カリウムナトリウム、ピロメリット酸水和物、酒石酸ナトリウム二塩基性溶液、濃クエン酸溶液、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩、エデト酸二ナトリウム、クエン酸ナトリウム、エチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン酸）、ジカルボキシメチルグルタミン酸、エチレンジアミンジコハク酸（ＥＤＤＳ）、メチルアミン、ピオシアニン、ピオベルジン、エンテロバクチン、メチオニン、例えば、フィトケラチン、リンゴ酸、ニトロ三酢酸、シュウ酸、またはデスフェリオキサミンＢである。１つの実施形態ではキレート剤は、キレート化のために標的とされる金属（複数）の特異性に基づき、および／またはキレート剤の前処理環境において機能する能力により選択される。１つの実施形態では、アルカリ性ｐＨが原料にアルカリ剤を添加することにより維持される場合、選択されるキレート剤はアルカリ性ｐＨで機能することができる。別の実施形態では、原料に酸性剤が添加されることにより酸性ｐＨが維持される場合、選択されるキレート剤は酸性ｐＨで機能することができる。別の実施形態では、前処理中に高温が使用される場合、選択されるキレート剤は高温で機能することができる。別の実施形態では、発酵培地が１を超えるキレート剤を含む。１つの実施形態では、１つ以上のキレート剤が微生物、例えばクロストリジウム・フィトフェルメンタンスによるバイオマスの発��中に発酵培地に添加される。
【００５８】
バイオマス
いくつかの実施形態では、微生物(例えば、クロストリジウム・フィトフェルメンタンス)は、前処理されたまたは前処理されていない、セルロース,ヘミセルロース,および／またはリグノセルロース材料を含む原料と接触させられる。追加の栄養分は存在することができ、または微生物により処理されるバイオマス材料に添加することができ、窒素含有化合物、例えばアミノ酸、タンパク質、加水分解タンパク質、アンモニア、尿素、ニトレート、ニトライト、ダイズ、ダイズ誘導体、カゼイン、カゼイン誘導体、粉乳、乳誘導体、乳清、酵母エキス、加水分解酵母、自己消化酵母、コーンスティープリカー、コーンスティープソリッド、グルタミン酸ナトリウム、および／または他の発酵窒素源、ビタミン、および／またはミネラル補充物が挙げられる。いくつかの実施形態では、１つ以上の追加のより低い分子量の炭素源、例えば、グルコース、スクロース、マルトース、コーンシロップ、ジスチラースドライドソリュブル（ＤＤＳ）、ジスチラースドライドグレイン（ＤＤＧ）、コンデンスドジスチラースソリュブル（ＣＤＳ）、ジスチラースウエットグレイン（ＤＷＧ）、ソリュブルを有するジスチラースドライドグレイン（ＤＤＧＳ）、乳酸、などは添加することができ、または存在することができる。
【００５９】
そのようなより低い低分子量の炭素源は、発酵期間開始時に初期炭素源を提供すること、細胞数の構築を助けること、炭素／窒素比を制御すること、過剰窒素を除去すること、またはいくつかの他の機能を含む複数の機能を果たすことができる。いくつかの実施形態では、別の培地補充物、例えば、ｐＨ調整剤、脂質（例えば、脂肪酸）、界面活性剤またはキレート剤が添加される。
【００６０】
いくつかの実施形態では、セルロースまたはリグノセルロース材料の燃料および化学物質への生物変換のために好気性/嫌気性サイクリングが使用される。いくつかの実施形態では、嫌気性微生物はバイオマスを直接、前処理の必要なしで発酵させることができる。いくつかの実施形態では、原料は、植物由来ポリマー材料を低分子量生成物に分解することができる生体触媒と接触させられ、生成物はその後、生体触媒により燃料および／または他の所望の化学物質に変換させることができる。
【００６１】
いくつかの実施形態では、本発明は、微生物による、バイオマス由来のセルロース固体の燃料または別の発酵最終生成物への同時の糖化および発酵のためのプロセスを提供する。１つの実施形態では、微生物はクロストリジウム・フィトフェルメンタンスである。
【００６２】
１つの実施形態では、微生物による、前処理された原料の加水分解およびオリゴサッカリドの加水分解は単一の発酵反応容器内で同時に起こる。１つの実施形態では、微生物はクロストリジウム・フィトフェルメンタンスである。別の実施形態では、前処理された原料の加水分解、オリゴサッカリドの加水分解およびモノサッカリドのエタノールへの変換は単一の反応容器内で同時に起こることができる。１つの実施形態では、単一の微生物が加水分解と変換の両方を実施する。１つの実施形態では、微生物はクロストリジウム・フィトフェルメンタンスである。別の実施形態では、微生物の第１および第２の種が加水分解および変換工程を実施する。
【００６３】
１つの実施形態では、プロセスはバイオマスを密閉容器内でＣ５／Ｃ６サッカリドを糖化することができる微生物で処理することを含む。別の実施形態では、プロセスは、バイオマスを密閉容器内で、クロストリジウム・フィトフェルメンタンス細菌または別のクロストリジウム種で、クロストリジウム・フィトフェルメンタンスまたは他の微生物がバイオマスをモノサッカリドおよびジサッカリドに実質的に変換するのに十分な糖分解酵素を生産する条件下で、処理することを含む。別の実施形態では、プロセスは、バイオマスを容器内で、Ｃ５／Ｃ６サッカリドを糖化することができる微生物で処理し、１つ以上の酵素を添加し炭水化物またはリグノセルロース材料の分解または解毒を助けることを含む。別の実施形態では、プロセスは、バイオマスを容器内で、クロストリジウム・フィトフェルメンタンスまたは別の同様のＣ５／Ｃ６クロストリジウム種で処理し、１つ以上の酵素を添加し炭水化物またはリグノセルロース材料の分解または解毒を助けることを含む。いくつかの実施形態では、培養物はそれから、第１の微生物（例えばクロストリジウム・フィトフェルメンタンス）による発酵後、第２の微生物と接触させることができ、ここで、第２の生物は、モノサッカリドおよびジサッカリドを所望の発酵最終生成物、例えば燃料（例えば、エタノールまたはブタノール）に実質的に変換することができる。１つの実施形態では、第２の微生物は真菌である。別の実施形態では、第２の微生物は酵母である。別の実施形態では、第２の微生物は、サッカロミセス・バイアヌス（ｂａｙａｎｕｓ）、サッカロミセス・ブラウディ（ｂｏｕｌａｒｄｉｉ）、サッカロミセス・ブルデリ（ｂｕｌｄｅｒｉ）、サッカロミセス・カリオカヌス（ｃａｒｉｏｃａｎｕｓ）、サッカロミセスカリオカス（ｃａｒｉｏｃｕｓ）、サッカロミセス・セレビシエ、サッカロミセスチェバリエリ（ｃｈｅｖａｌｉｅｒｉ）、サッカロミセス・ダイレネンシス（ｄａｉｒｅｎｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・エリプソイデウス（ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅｕｓ）、サッカロミセス・マルチニアエ（ｍａｒｔｉｎｉａｅ）、サッカロミセス・モナセンシス（ｍｏｎａｃｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・ノルベンシス（ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・パラドキサス（ｐａｒａｄｏｘｕｓ）、サッカロミセス・パストリアヌス（ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）、サッカロミセス・スペンセロラム（ｓｐｅｎｃｅｒｏｒｕｍ）、サッカロミセス・ツリセンシス（ｔｕｒｉｃｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・ユニスポラス（ｕｎｉｓｐｏｒｕｓ）、サッカロミセス・ウバルム（ｕｖａｒｕｍ）、サッカロミセス・ゾナタス（ｚｏｎａｔｕｓ）である。別の実施形態では、第２の微生物はサッカロミセスまたはカンジダ（Ｃａｎｄｉｄｉａ）である。別の実施形態では、第２の微生物は、クロストリジウム種、例えばＣ．サーモセラム、Ｃ．アセトブチリクム、およびＣ．セルロボランス、またはザイモモナス・モビリスである。
【００６４】
いくつかの実施形態では、リグニン含有バイオマスからバイオ燃料または他の化学物質を生産するためのプロセスが提供される。プロセスは１）リグニン含有バイオマスを、リグニン含有バイオマスの少なくとも一部を加水分解するのに十分な濃度のアルカリ水溶液と接触させること；２）処理されたバイオマスを５〜９の間（例えば５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、または９）のｐＨまで中和すること；３）バイオマスを密閉容器内で、クロストリジウム・フィトフェルメンタンスまたは別の同様のＣ５／Ｃ６クロストリジウム種細菌で、クロストリジウム・フィトフェルメンタンスが、任意で１つ以上の酵素の容器への添加と共に、実質的に処理されたバイオマスをモノサッカリドおよびジサッカリド、および／またはバイオ燃料もしくは発酵最終生成物に変換する条件下で処理すること；ならびに４）任意で、第２の微生物培養物（第２の生物はモノサッカリドおよびジサッカリドを発酵最終生成物、例えばバイオ燃料に実質的に変換することができる）を導入することを含む。
【００６５】
微生物の遺伝子改変
別の態様では、遺伝子改変微生物の作成および使用により、発酵最終生成物、例えば１つ以上のアルコール、例えば、エタノールを生産するための組成物および方法が提供される。１つの実施形態では、遺伝子改変微生物はクロストリジウム・フィトフェルメンタンスである。１つの実施形態では、遺伝子改変は、発酵生物化学経路に関連するタンパク質、糖分解酵素の発現、または発酵中の環境条件の耐容性の増加を制御またはコードする核酸配列に対するものである。別の実施形態では、遺伝子改変は微生物中の核酸配列に対するものである。１つの実施形態では，微生物は対象の経路、酵素またはタンパク質に対する１つ以上の遺伝子をコードするポリヌクレオチドで形質転換される。別の実施形態では，微生物は対象の経路、酵素またはタンパク質に対する１つ以上の遺伝子の複数のコピーを生成するように形質転換される。いくつかの実施形態では、微生物に形質転換されたポリヌクレオチドは異種である。他の実施形態では、ポリヌクレオチドは微生物由来である。１つの実施形態では、微生物はヘキソースの発酵のための酵素をコードする１つ以上の遺伝子をコードする異種ポリヌクレオチドで形質転換され、前記遺伝子は、前記微生物形質転換体に、形質転換していない微生物に比べ、増加した濃度、生産性レベルまたは収率でエタノールを生成する能力を付与するのに十分なレベルで発現される。別の実施形態では、微生物はペントースの発酵のための酵素をコードする１つ以上の遺伝子をコードする異種ポリヌクレオチドで形質転換され、前記遺伝子は、前記微生物形質転換体に、形質転換していない微生物に比べ、増加した濃度、生産性レベルまたは収率でエタノールまたは他の最終生成物を生産する能力を付与するのに十分なレベルで発現される。さらに他の実施形態では、微生物はヘキソースおよびペントースサッカリドの発酵のための酵素の組み合わせで形質転換される。いくつかの実施形態では、最終生成物生産速度の増強を達成することができる。別の実施形態では、微生物は、ポリサッカリドの糖化のための糖分解酵素をコードする１つ以上の遺伝子をコードする異種ポリヌクレオチドで形質転換され、前記遺伝子は、形質転換微生物に、形質転換していない微生物に比べ、モノ、ジまたはオリゴサッカリドの増加した濃度、糖化速度または収率でポリサッカリドをモノ、ジまたはオリゴサッカリドに糖化する能力を付与するのに十分なレベルで発現される。
【００６６】
別の実施形態では、遺伝子改変はクロストリジウム・フィトフェルメンタンスの核酸配列に対するものである。１つの実施形態では、クロストリジウム・フィトフェルメンタンスは、対象の経路、酵素またはタンパク質に対する１つ以上の遺伝子をコードするポリヌクレオチドで形質転換される。別の実施形態では、クロストリジウム・フィトフェルメンタンスは、対象の経路、酵素またはタンパク質に対する１つ以上の遺伝子の複数のコピーを生成するように形質転換される。いくつかの実施形態では、クロストリジウム・フィトフェルメンタンスに形質転換されたポリヌクレオチドは異種である。他の実施形態では、ポリヌクレオチドはクロストリジウム・フィトフェルメンタンス由来である。１つの実施形態では、クロストリジウム・フィトフェルメンタンスはヘキソースの発酵のための酵素をコードする１つ以上の遺伝子をコードする異種ポリヌクレオチドで形質転換され、前記遺伝子は、前記クロストリジウム・フィトフェルメンタンス形質転換体に、形質転換していないクロストリジウム・フィトフェルメンタンスに比べ、増加した濃度、生産性レベルまたは収率でエタノールを生産する能力を付与するのに十分なレベルで発現される。別の実施形態では、クロストリジウム・フィトフェルメンタンスはペントースの発酵のための酵素をコードする１つ以上の遺伝子をコードする異種ポリヌクレオチドで形質転換され、前記遺伝子は、前記クロストリジウム・フィトフェルメンタンス形質転換体に、形質転換していないクロストリジウム・フィトフェルメンタンスに比べ、増加した濃度、生産性レベルまたは収率でエタノールまたは他の最終生成物を生産する能力を付与するのに十分なレベルで発現される。さらに他の実施形態では、クロストリジウム・フィトフェルメンタンスはヘキソースおよびペントースサッカリドの発酵のための酵素の組み合わせで形質転換される。いくつかの実施形態では、最終生成物生産速度の増強を達成することができる。
【００６７】
別の実施形態では、クロストリジウム・フィトフェルメンタンスは、ポリサッカリドの糖化のための糖分解酵素をコードする１つ以上の遺伝子をコードする異種ポリヌクレオチドで形質転換され、前記遺伝子は、前記クロストリジウム・フィトフェルメンタンス形質転換体に、形質転換していないクロストリジウム・フィトフェルメンタンスに比べ、モノ、ジまたはオリゴサッカリドの増加した濃度、糖化速度または収率でモノ、ジまたはオリゴサッカリドにポリサッカリドを糖化する能力を付与するのに十分なレベルで発現される。宿主による糖分解酵素の生産、およびその糖分解酵素の培地中へのその後の放出により、バイオマスまたはポリサッカリドを発酵性モノサッカリドおよびオリゴサッカリドに分解するのに必要とされる市販の酵素の量が減少する。糖分解ＤＮＡは宿主原産とすることができるが、よりしばしば、ＤＮＡは外来性、すなわち異種である。有利な糖分解遺伝子としては、セルロース分解性、キシラン分解性、およびデンプン−分解酵素、例えばセルラーゼ、キシラナーゼ、グルカナーゼ、グルコシダーゼ、およびアミラーゼが挙げられる。糖分解酵素は、宿主により少なくとも部分的に分泌され得、または、その後の放出のために実質的に細胞内に蓄積され得る。有利なことに、熱安定性である、細胞内に蓄積された酵素は、熱により誘導された溶解により所望とされる場合に放出される。酵素の組み合わせは、異種ＤＮＡによりコードすることができ、それらのいくらかが分泌され、それらのいくらかが蓄積される。
【００６８】
別の実施形態では、組換え微生物による最終生成物(例えば、エタノール)生産を増強させるためにさらなる改変がなされ得る。１つの実施形態では、組換え微生物は、追加の異種DNAセグメントをさらに含むことができ、その発現生成物は、モノおよび／またはオリゴサッカリドの組換え宿主への輸送に関係するタンパク質である。同様に、解糖系由来の追加の遺伝子を、宿主に組み込むことができる。このように、エタノール生産速度の増強が達成できる。
【００６９】
発酵最終生成物(例えば、エタノール)生産を改善するために、転写制御因子、有機酸の形成のための遺伝子、炭水化物トランスポーター遺伝子、胞子形成遺伝子、酵素補助因子の形成／再生に影響する遺伝子、エタノール耐性に影響する遺伝子、塩耐性に影響する遺伝子、増殖速度に影響する遺伝子、酸素耐性に影響する遺伝子、異化代謝産物抑制に影響する遺伝子、水素生産に影響する遺伝子、重金属に対する抵抗性に影響する遺伝子、酸に対する抵抗性に影響する遺伝子、またはアルデヒドに対する抵抗性に影響する遺伝子において改変が可能である。
【００７０】
当業者であれば、本明細書で例示した方法に対し多くの改変が可能であることを認識するであろう。例えば、組換えクロストリジウム・フィトフェルメンタンス宿主において異種遺伝子の発現を駆動するために様々なプロモーターが使用できる。本開示の利益を有する当業者は、この目的のために有効な様々なプロモーターのうちのいずれか１つを容易に選択し、使用することができるであろう。同様に、当業者は定められた手順の優先傾向の問題として、より高いコピー数のプラスミドを使用することができる。別の実施形態では、所望の遺伝子の染色体組込みのためにコンストラクトを調製することができる。外来遺伝子の染色体組込みは、商業的プロセスに対しある制限を有するプラスミドに基づく構築に対しいくつかの利点を提供することができる。エタノール生産遺伝子は、大腸菌Ｂにおいて染色体に組み込まれている；Ohta  et  al.  (1991)  Appl.  Environ.  Microbiol.  57:893-900を参照されたい。一般に、これは、（１）抗生物質抵抗性遺伝子から上流の所望の遺伝子および（２）標的生物由来の相同ＤＮＡのフラグメントを含むＤＮＡフラグメントの精製により達成される。このＤＮＡは、連結され、レプリコンなしで環を形成することができ、形質転換のために使用することができる。このように、対象遺伝子は大腸菌などの異種宿主に導入することができ、短い、ランダムフラグメントが単離され、クロストリジウム・フィトフェルメンタンスにおいて連結され得、相同組換えが促進される。
【００７１】
他の実施形態では、所望の特性、例えば、増加した生産性、増加した収率、または増加したタイターを示すクロストリジウム・フィトフェルメンタンス単離物が、組換えＤＮＡ技術を使用せずに得ることができる。例えば、変異誘発、またはランダム変異誘発は、化学的手段により、または微生物の照射により実施することができる。突然変異微生物群は、その後、１つ以上の望ましい特性を示す有益な変異に対してスクリーニングすることができる。スクリーニングは、発酵による最終生成物の生産中に使用される炭素源を含む基質上で突然変異生物を増殖させることにより実施することができる。スクリーニングはまた、生物の増殖中の最終生成物の生産を測定すること、または、炭素源(複数)の消化または同化を測定することを含むことができる。そのように得られた単離物は、さらにバイオ燃料生産を増強させるために、さらに、組換えポリヌクレオチドで形質転換し、または本明細書で提供された方法および組成物のいずれかと組み合わせて使用することができる。
【００７２】
バイオ燃料を生産するバイオ燃料プラントおよびプロセス
１つの態様では、高分子量炭水化物を含むバイオマス材料を加水分解するように構成された加水分解ユニット、および培地を収容し、その中に分散された微生物を含むように構成された発酵槽を含む燃料プラントが本明細書で提供される。１つの実施形態では、微生物はクロストリジウム・フィトフェルメンタンスである。
【００７３】
別の態様では、微生物（例えば、クロストリジウム・フィトフェルメンタンス細胞または同様のＣ５／Ｃ６クロストリジウム種）およびリグノセルロース材料（および／または他のバイオマス材料）を培地中で合わせること、発酵最終生成物、例えば燃料（例えば、エタノール、プロパノール、メタンまたは水素）を生産させるのに十分な条件下、十分な時間リグノセルロース材料を発酵させることを含む、燃料または化学最終生成物を製造する方法が本明細書で提供される。
【００７４】
いくつかの実施形態では、バイオマスから酸加水分解前処理を用いて発酵最終生成物(例えばエタノールまたは水素)を生産するためのプロセスが提供される。いくつかの実施形態では、バイオマスから酵素加水分解前処理を用いて発酵最終生成物(例えばエタノールまたは水素)を生産するためのプロセスが提供される。別の実施形態では、バイオマスから、酵素的に前処理されていないバイオマスを用いて発酵最終生成物(例えばエタノールまたは水素)を生産するためのプロセスが提供される。別の実施形態では、バイオマスから、化学的にまたは酵素的に前処理されていないが、任意で蒸気処理されたバイオマスを用いて発酵最終生成物(例えばエタノールまたは水素)を生産するためのプロセスが提供される。
【００７５】
別の態様では、本明細書で記載されるプロセスのいずれかにより製造される最終生成物が提供される。
【００７６】
当業者であれば、本明細書で例示した方法に対し多くの改変が可能であることを認識するであろう。例えば、組換え微生物（例えば、クロストリジウム・フィトフェルメンタンス）において異種遺伝子の発現を駆動するために様々なプロモーターが使用できる。本開示の利益を有する当業者は、この目的のために有効な様々なプロモーターのうちのいずれか１つを容易に選択し、使用することができるであろう。同様に、当業者は定められた手順の優先傾向の問題として、より高いコピー数のプラスミドを使用することができる。別の実施形態では、所望の遺伝子の染色体組込みのためにコンストラクトを調製することができる。外来遺伝子の染色体組込みは、商業的プロセスに対しある制限を有するプラスミドに基づく構築に対しいくつかの利点を提供することができる。エタノール生産遺伝子は、大腸菌Ｂにおいて染色体に組み込まれている；Ohta  et  al.  (1991)  Appl.  Environ.  Microbiol.  57:893-900を参照されたい。一般に、これは、（１）抗生物質抵抗性遺伝子から上流の所望の遺伝子および（２）標的生物由来の相同ＤＮＡのフラグメントを含むＤＮＡフラグメントの精製により達成される。このＤＮＡは、連結され、レプリコンなしで環を形成することができ、形質転換のために使用することができる。このように、対象遺伝子は大腸菌などの異種宿主に導入することができ、短い、ランダムフラグメントが単離され、クロストリジウム・フィトフェルメンタンスにおいて連結され得、相同組換えが促進される。
【００７７】
バイオマスからの大規模発酵最終生成物生産
１つの態様では、発酵最終生成物(例えば、エタノール)はバイオマスから大規模に、微生物、例えばＣ．フィトフェルメンタンスを使用して生産される。１つの実施形態では、最初に、高分子量炭水化物を含むバイオマス材料を低分子量炭水化物に加水分解し、その後、低分子量炭水化物を、微生物細胞を使用して発酵させ、エタノールを生産させる。別の実施形態では、バイオマス材料自体を化学および／または酵素前処理なしで発酵させる。第１の方法では、加水分解は酸、例えばＢｒｏｎｓｔｅｄ酸（例えば、硫酸または塩酸）、塩基、例えば水酸化ナトリウム、熱水プロセス、水蒸気爆砕、アンモニア繊維爆砕プロセス（「ＡＦＥＸ」）、石灰プロセス、酵素、またはこれらの組み合わせを使用して達成することができる。水素、および他の発酵生成物は、所望であれば獲得し、精製することができ、あるいは、例えば、燃焼により廃棄することができる。例えば、水素ガスは燃やすことができ、またはプロセスにおいてエネルギー源として使用することができ、例えば、燃焼により、例えば蒸気ボイラを駆動することができる。バイオマスの加水分解および／または蒸気処理は、例えば、バイオマスの多孔性および／または表面積を増加させ、しばしば、セルロース材料の微生物細胞への曝露を増大させ、これにより、発酵速度および収率が増加し得る。リグニンの除去は、例えば、ボイラを駆動するための可燃性燃料を提供することができ、かつ、例えば、バイオマスの多孔性および／または表面積を増加させることもでき、しばしば、発酵速度および収率が増加する。いくつかの実施形態では、培地中の炭水化物の初期濃度は２０ｍＭより多く、例えば、３０ｍＭ、５０ｍＭ、７５ｍＭ、１００ｍＭ、１５０ｍＭ、２００ｍＭより多く、さらに、５００ｍＭより多い。
【００７８】
バイオマス処理プラントおよびバイオマスから生成物を生産するプロセス
１つの態様では、本発明は、高分子量炭水化物を含むバイオマス材料を加水分解するように構成された加水分解ユニット、Ｃ５／Ｃ６加水分解微生物（例えば、クロストリジウム・フィトフェルメンタンス）が分散された培地を収容するように構成された発酵槽、および１つまたは複数の最終生成物ならびに関連する副生成物および副産物を単離するための１つ以上の生成物回収システムを含む燃料プラントを特徴とする。
【００７９】
別の態様では、本発明は、Ｃ５／Ｃ６加水分解微生物（例えば、クロストリジウム・フィトフェルメンタンス）およびバイオマス供給物を培地中で合わせること、バイオ燃料、化学生成物または発酵最終生成物（例えば、エタノール、プロパノール、水素、リグニン、テルペノイドなど）を生産させるのに十分な条件下、十分な時間バイオマス材料を発酵させることを含む、１つまたは複数の最終生成物を製造する方法を特徴とする。
【００８０】
別の態様では、本発明は本明細書で記載されるプロセスのいずれかにより製造される最終生成物を特徴とする。
【００８１】
バイオマスからの発酵最終生成物の大規模生産
一般に、バイオマスから、大規模に、Ｃ５／Ｃ６加水分解微生物（例えば、クロストリジウム・フィトフェルメンタンス）を使用して１つ以上の発酵最終生成物を生産する２つの基本的なアプローチが存在する。全ての方法において、バイオマスの型およびその物理的発現によって、プロセスの１つは、湿式または乾式ミリングによる炭素質材料のミリングを含み、材料のサイズを減少させ、表面対容積比を増加させることができる（物理的改変）。
【００８２】
１つの実施形態では、高分子量炭水化物を含むバイオマス材料材料は、加水分解され、脱リグニンされ、または炭水化物化合物が非炭水化物化合物から分離される。熱、化学、および／または酵素処理の組み合わせを使用して、加水分解された材料を分離し、液体および脱水流を形成することができ、これは別々に処理され得、分離したままとされ、あるいは再び合わされ、その後、Ｃ５／Ｃ６加水分解微生物(例えば、クロストリジウム・フィトフェルメンタンス)を使用して低分子量炭水化物を発酵させ、１つ以上の化学生成物を生産させる。第２の方法では、バイオマス材料自体を熱、化学および／または酵素前処理なしで発酵させる。第１の方法では、加水分解は酸、例えば酸（例えば、硫酸または塩酸）、塩基（例えば水酸化ナトリウム）、熱水プロセス、アンモニア繊維爆砕プロセス（「ＡＦＥＸ」）、石灰プロセス、酵素、またはこれらの組み合わせを使用して達成することができる。バイオマスの加水分解および／または蒸気処理は、例えば、バイオマスの多孔性および／または表面積を増加させ、しばしば、セルロース材料のＣ５／Ｃ６加水分解微生物(例えば、クロストリジウム・フィトフェルメンタンス)への曝露を増大させ、これにより、発酵速度および収率が増加し得る。バイオマスの加水分解および／または蒸気処理は、例えば、発酵速度および収率を改善するために分離または処理することができ、あるいはプロセスを実施するための電力を生成させるために使用され、あるいはさらなる処理を用いて、またはさらなる処理なしで生成物として使用され得る副生成物または副産物を生産することができる。リグニンの除去は、例えば、ボイラを駆動するための可燃性燃料を提供することができる。ガス(例えば、メタン、水素またはＣＯ２）、液体(例えば、エタノールおよび有機酸)、または固体(例えば、リグニン)、発酵生成物は、所望であれば獲得し、精製することができ、あるいは、例えば、燃焼により廃棄することができる。例えば、水素ガスは燃やすことができ、またはプロセスにおいてエネルギー源として使用することができ、例えば、燃焼により、例えば蒸気ボイラを駆動することができる。発酵槽を出て行く生成物は、さらに処理することができ、例えば、エタノールは蒸留および精留に移すことができ、濃縮エタノール混合物または固体が、エネルギーを提供するために、または化学生成物として、使用するために分離され得る。
【００８３】
いくつかの実施形態では、処理は、酸による処理工程を含む。いくつかの実施形態では、酸は希酸である。いくつかの実施形態では、酸処理は、約８５〜１４０℃の間の高温で実施される。いくつかの実施形態では、方法はさらに、例えばふるいを使用することによる、酸処理されたバイオマス固体の回収を含む。いくつかの実施形態では、ふるいは直径約１５０〜２５０の開口を含む。いくつかの実施形態では、方法は、水または他の溶媒による、処理されたバイオマスの洗浄を含む。いくつかの実施形態では、方法はさらに、酸をアルカリで中和することを含む。いくつかの実施形態では、方法はさらに酸処理されたバイオマスを乾燥することを含む。いくつかの実施形態では、乾燥工程は、約１５〜４５℃の間の高温で実施される。いくつかの実施形態では、分離された材料の液体部分はさらに処理されて、毒性材料が除去される。いくつかの実施形態では、液体部分は固体から分離され、その後、別々に発酵される。いくつかの実施形態では、固体および液体のスラリーが酸処理から形成され、その後、共に発酵される。
【００８４】
図１１は、最初に、バイオマスを酸で、高温、高圧で加水分解ユニットで処理することにより、バイオマスから化学生成物を生産するための方法の一例を示す。バイオマスは最初に、温水または蒸気を添加することにより加熱することができる。水中に懸濁されたバイオマスに二酸化硫黄ガスを通気することにより、または強酸、例えば、硫酸、塩酸または硝酸を、予熱／前蒸気処理／水添加と共に、またはそれらなしで添加することによりバイオマスを酸性化することができる。酸性化中、ｐＨは低レベル、例えば約５未満で維持される。温度および圧力は酸添加後に上昇させることができる。酸性化ユニットにおけるかねてからの酸の他に、任意で、金属塩、例えば、硫酸第一鉄、硫酸第二鉄、塩化第二鉄、硫酸アルミニウム、塩化アルミニウム、硫酸マグネシウム、またはこれらの混合物を添加して、バイオマスの加水分解を助けることができる。酸含浸バイオマスは前処理ユニットの加水分解セクションに送り込まれる。蒸気が前処理ユニットの加水分解部分に注入され、バイオマスに直接接触し、これを所望の温度まで加熱する。蒸気添加後のバイオマスの温度は、例えば、約１３０℃〜２２０℃の間である。その後、加水分解物が前処理ユニットのフラッシュタンク部分に排出され、タンク内で、バイオマスを、例えば、オリゴサッカリドおよびモノマー糖にさらに加水分解する期間の間維持される。さらにバイオマスを分解するために、水蒸気爆砕もまた使用することができる。また、バイオマスは任意の高圧前処理プロセスのための圧力ロックを介する排出に供することができる。加水分解物はその後、前処理反応器から、水の添加と共に、または水の添加なしで、例えば、約１５％〜６０％の間の固体濃度で排出される。
【００８５】
前処理後、バイオマスは例えば、搾りもしくは遠心分離により、または濾過により、例えば、向流抽出器、ウォッシュプレス、フィルタプレス、加圧フィルタ、ねじ形コンベヤ抽出器、または真空ベルト抽出器を使用して、脱水および／またはある量の水で洗浄することができ、酸性化流体が除去される。酸性化流体は、さらなる処理、例えばアルカリ（例えば石灰）および／またはアンモニア（例えば、リン酸アンモニウム）の添加により、またはさらなる処理なしで、例えば、前処理ユニットの酸性化部分で再利用することができ、または発酵に添加することができ、他の用途／処理のために回収することができる。生成物は、酸性化流体、例えば、石こうまたはリン酸アンモニウムの処理から誘導することができる。酵素または酵素混合物、例えば、セルロース、ヘミセルロース、ペクチン、およびデンプンの成分に対して活性なエンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ）、β−グルコシダーゼ、グリコシドヒドロラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、リアーゼ、およびエステラーゼは、前処理中に添加することができ、高分子量成分の加水分解を助けることができる。
【００８６】
発酵槽には、加水分解されたバイオマス、バイオマス前処理からの任意の液体画分、クロストリジウム・フィトフェルメンタンス細胞の活性種培養物、所望であれば、共発酵微生物、例えば酵母または大腸菌、および、必要であれば、クロストリジウム・フィトフェルメンタンスまたは他の微生物の増殖を促進する栄養分が供給される。また、前処理されたバイオマスまたは液体画分は複数の発酵槽に分割して入れることができ、各々が、異なる異なる株のクロストリジウム・フィトフェルメンタンスおよび／または他の微生物を含み、それぞれが特定の物理条件下で操作される。発酵は例えば、約１５〜１５０時間の間の期間進行させられ、その間、温度が例えば約２５℃〜５０℃の間で維持される。発酵中に生成したガスは発酵槽から一掃され、放出され、回収され、または、追加の処理と共に、追加の処理なしで燃やされ、例えば、水素ガスは回収され、電力源として使用され得、あるいは副産物として精製され得る。
【００８７】
発酵後、発酵槽の中身は生成物回収に移される。生成物は抽出され、例えば、エタノールが蒸留および精留により回収される。
【００８８】
前処理なしでのバイオマスからの化学物質生産
図１２は、バイオマスを発酵容器に入れることによりバイオマスから化学物質を生産するための方法を示す。バイオマスは一定期間、水、酵素、または酸／アルカリを添加して、またはその添加なしで浸漬させることができる。処理容器内の圧力は、大気圧以上で維持することができる。酸またはアルカリを、中和のために前処理期間の終わりに添加することができる。前処理期間の終わりに、前処理が開始するのと同時に、Ｃ５／Ｃ６加水分解微生物、例えば、クロストリジウム・フィトフェルメンタンス）の活性種培養物および、所望であれば、共発酵微生物、例えば酵母または大腸菌、および、必要であれば、Ｃ５／Ｃ６加水分解微生物（例えば、クロストリジウム・フィトフェルメンタンス）の増殖を促進する栄養分が添加される。発酵は、上記のように進行することができる。発酵後、発酵槽の中身は上記にように、生成物回収に移される。
【００８９】
化学的生産方法および／または特徴の任意の組みあわせを使用して、ハイブリッド生産方法を作成することができる。本明細書で記載される方法のいずれにおいても、任意の工程で生成物を除去し、添加し、または合わせることができる。Ｃ５／Ｃ６加水分解微生物(例えば.クロストリジウム・フィトフェルメンタンス)は単独で、または１つ以上の他の微生物(例えば、酵母、真菌、または他の細菌)と組み合わせて相乗的に使用することができる。いくつかの実施形態では、異なる最終生成物を生産するために、単一のプラント内で異なる方法を使用することができる。
【００９０】
別の態様では、本発明は、高分子量炭水化物を含むバイオマス材料を加水分解するように構成された加水分解ユニット、および培地を収容し、その中に分散されたＣ５／Ｃ６加水分解微生物（例えば、クロストリジウム・フィトフェルメンタンス)を含むように構成され発酵槽を含む燃料プラントを特徴とする。
【００９１】
別の態様では、本発明はＣ５／Ｃ６加水分解微生物（例えば、クロストリジウム・フィトフェルメンタンス）およびリグノセルロース材料(および／または他のバイオマス材料)を培地中で合わせること、１つ以上の燃料、例えば、エタノール、プロパノールおよび／または水素、または別の化学化合物を生産させるのに十分な条件下、十分な時間リグノセルロース材料を発酵させることを含む１つ以上の燃料を製造する方法を特徴とする。
【００９２】
いくつかの実施形態では、本発明はバイオマスから酸加水分解前処理を使用してエタノールおよび水素を生産するためのプロセスを提供する。いくつかの実施形態では、本発明はバイオマスから酵素加水分解前処理を使用してエタノールおよび水素を生産するためのプロセスを提供する。他の実施形態は、酵素的に前処理されていないバイオマスを使用してバイオマスからエタノールおよび水素を生産するためのプロセスを提供する。さらに別の実施形態は、バイオマスから化学的または酵素的に前処理されていないが、任意で蒸気処理されたバイオマスを使用してエタノールおよび水素を生産するためのプロセスを提供する。
【００９３】
図１０は、ヘキソースもしくはペントースサッカリドまたはオリゴマーを生産する前処理を開示し、それらはその後、処理されず、またはさらに処理され、別々にもしくは一緒に発酵される。図１０Ａは、固相および液相を生産するプロセス（例えば、酸前処理）を示し、それらはその後、別部右に発酵される。図１０Ｂは固相および液相を生産する同様の前処理を示す。液相は、固体から分離され、発酵微生物にとって毒性である要素は発酵前に除去される。発酵開始時に、２つの相が再び合わせられ、一緒に共発酵される。これは、相を別々に発酵させるより費用効率が高いプロセスである。第３のプロセス（図１０Ｃ）は最もコストが低い。前処理によりその後、共発酵される液体または固体のスラリーが得られる。サッカリド成分の損失がほとんどなく、必要な機器が最小に抑えられる。
【実施例】
【００９４】
実施例
実施例１:バイオマス処理および前処理手順
トウモロコシ茎をナイフミルで刻み、１／４インチサイズとし、続いて２ｍｍのふるいを通してスクリーニングした。スクリーニングしたトウモロコシ茎葉を水と混合し、１０％（ｗ／ｖ）スラリーを調製した。トウモロコシ茎葉スラリーのアルカリ消化をオートクレーブ内、１２１℃および１５ＰＳＩで２時間、１ｇのトウモロコシ茎葉あたり、０．２ｇ  ＮａＯＨを使用して実施した。
【００９５】
消化させたトウモロコシ茎葉を水道水(5-7容積)で洗浄し、ｐＨを中和した。中和後、固体を濾過により２５０μｍのふるいを通して回収し、３５℃で、水分量が約５％となるまで乾燥させた。乾燥塊を粉砕し、その後、発酵槽に添加した。
【００９６】
培地の脱ガスおよび滅菌手順
接種材料増殖のために使用される血清バイアルを全て、真空（約４００ｍｂａｒ絶対圧力）下で約５分間、室温で脱ガスし、窒素パージで真空を破壊した。最低３回の脱ガスサイクルを実施した。血清バイアル、培地および発酵槽容器を、１２１℃の温度、１５ＰＳＩの圧力で３０分間オートクレーブ処理することにより滅菌した。発酵槽をＮ２ガスで１時間超、拡散させ、接種前に約−３００ｍＶまで酸化還元電位を低下させた。
【００９７】
接種材料調製
クロストリジウム・フィトフェルメンタンスの凍結培養物を、３５℃で４８時間、ＤＩ水中に、０．３％  セロビオースを１．５ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、２．９ｇ／Ｌ  Ｋ２ＨＰＯ４、４．６ｇ／Ｌ硫酸アンモニウム、２ｇ／Ｌシステイン−ＨＣｌ、１ｇ／Ｌ  ＭｇＣｌ２  ６Ｈ２Ｏ、０．１５ｇ／Ｌ  ＣａＣｌ２  ２Ｈ２Ｏ、０．００１２５ｇ／Ｌ  ＦｅＳＯ４  ７Ｈ２Ｏと共に含む１０ｍＬ管内で増殖させた。培地のｐＨを２Ｎ  ＮａＯＨで７．５に調整した。試験管内での増殖に続き、接種材料を３５℃で２４時間、１００ｍＬ血清バイアル中で、２％（ｖ／ｖ）種サイズを使用して増殖させた。血清バイアルはＤＩ水に２０ｇ／Ｌ麦芽シロップ、１．５ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、２．９ｇ／Ｌ  Ｋ２ＨＰＯ４、４．６ｇ／Ｌ硫酸アンモニウム、２ｇ／Ｌシステイン−ＨＣｌ、３ｇ／Ｌ  クエン酸ナトリウム、１ｇ／Ｌ  ＭｇＣｌ２  ６Ｈ２Ｏ、０．１５ｇ／Ｌ  ＣａＣｌ２  ２Ｈ２Ｏ、０．００１２５ｇ／Ｌ  ＦｅＳＯ４  ７Ｈ２Ｏを有した。
【００９８】
バイオマスの同時加水分解および発酵
５Ｌかくはん槽型反応器を、２Ｌ開始容積で、流加モード下動作させた。培地は、５０ｇ／Ｌの前処理したトウモロコシ茎葉を、３ｇ／Ｌ  Ｋ２ＨＰＯ４、１．６ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、２ｇ／Ｌクエン酸三ナトリウム・２Ｈ２Ｏ、１．２ｇ／Ｌクエン酸Ｈ２Ｏ、０．５ｇ／Ｌ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、１ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、０．８ｇ／Ｌ  ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．１ｇ／Ｌ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．００１２５ｇ／Ｌ  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１ｇ／ＬシステインＨＣｌ、１０ｇ／Ｌ酵母エキス（Ｂａｃｔｏ）と共に、ＤＩ水に溶解した５ｇ／Ｌのトウモロコシスティープパウダーと共に含んだ。
【００９９】
場合によっては、５０ｍＬのＣｅｌｌｕＳｅｂ−ＴＬを発酵槽に、接種前に０．２μｍフィルタを通して添加し、加水分解を増強し、収率を増加させた。その後、発酵槽をＮ２ガスで１時間超、拡散させ、約−３００ｍＶまで酸化還元電位を低下させ、続いて、濃縮接種材料２０ｍｌを接種した。動作ｐＨおよび温度はそれぞれ、６．５および３５℃であり、発酵槽３００ｒｐｍで連続して撹拌した。
【０１００】
２５〜５０ｇの前処理したトウモロコシ茎葉のボーラスを、規則的な時間間隔で与えた。追加量の７．５および２５ｍＬ酵素を接種後７２および２４０時間で与えた。
【０１０１】
試料回収および分析
試料を時間間隔で回収し、糖、有機酸およびエタノールに対し、Ａｍｉｎｅｘ（特録商標）ＨＰＸ−８７Ｈ排除カラム（３００ｍｍ×７．８ｍｍ）およびＲＩ検出器を備えたＨＰＬＣを用いて分析した。０．０１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を移動相として０．６ｍＬ／分で使用し、カラムを５５℃で維持した。
【０１０２】
結果
５０ｇ／Ｌの固体を投入して発酵を開始させた。２５ｇ／Ｌの前処理したトウモロコシ茎葉固体の追加のボーラス供給を、第３日および第４日に与えた。初期エタノール生産速度は、約１０ｇ／Ｌ−ｄであることが観察され、これは、トウモロコシ茎葉のさらなる追加なしでは、第４日〜第８日の間に約２ｇ／Ｌ−ｄまで遅くなった。図１に示されるように、第９日以降、固体ボーラス供給量を１２．５ｇ／Ｌまで減少させ、２４時間毎に投与した。これは、エタノール生産速度を３ｇ／Ｌ−ｄ超まで改善するのを助けた。
【０１０３】
エタノールが発酵の主生成物であった。前処理したトウモロコシ茎葉の組成分析を、酸加水分解を用いて実施した。組成分析の結果は、グルカン、キシラン、アラビナンおよび不溶性物質の割合がそれぞれ、６４％、２６％、３％および６％であることを示した（図２）。組成に基づき、前処理したトウモロコシ茎葉中の発酵性物質の量は約９３％であった。９０％の糖化効率を仮定すると、観察されたエタノール収率は投入したバイオマス１ｇあたり０．３９ｇであると計算された。
【０１０４】
実施例２
ヘキソースおよびペントースサッカリドからのエタノール生産
バッチ発酵を実施し、かくはん槽型反応器においてクロストリジウム・フィトフェルメンタンスを使用する、ヘキソース(グルコース、セロビオース)ならびにペントース(キシロースおよびアラビノース)糖の同時発酵により、エタノールを生産させた。
【０１０５】
使用した化学物質
この実験において使用した化学物質は全て、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製の試薬グレードとした。
【０１０６】
脱ガスおよび滅菌手順
接種材料増殖のために使用される反応器および血清バイアルを全て、真空（約４００ｍｂａｒ絶対圧力）下で約５分間、室温で脱ガスし、窒素パージで真空を破壊した。最低３回の脱ガスサイクルを実施した。容器を、１２１℃の温度、１５ＰＳＩの圧力で３０分間オートクレーブ処理することにより滅菌した。
【０１０７】
接種材料調製
クロストリジウム・フィトフェルメンタンスの凍結培養物を、３５℃で４８時間、ＤＩ水中に、０．３％  セロビオースを１．５ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、２．９ｇ／Ｌ  Ｋ２ＨＰＯ４、４．６ｇ／Ｌ  硫酸アンモニウム、２ｇ／Ｌ  システイン−ＨＣｌ、１ｇ／Ｌ  ＭｇＣｌ２  ６Ｈ２Ｏ、０．１５ｇ／Ｌ  ＣａＣｌ２  ２Ｈ２Ｏ、０．００１２５ｇ／Ｌ  ＦｅＳＯ４  ７Ｈ２Ｏと共に含む１０ｍＬ管内で培養し、増殖させた。培地のｐＨを２Ｎ  ＮａＯＨで７．５に調整した。オートクレーブ処理後、接種材料を３５℃で２４時間、１００  ｍＬ血清中で、２％（ｖ／ｖ）種サイズを使用して増殖させた。血清バイアルはＤＩ水に２０ｇ／Ｌセロビオース、１．５ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、２．９ｇ／Ｌ  Ｋ２ＨＰＯ４、４．６ｇ／Ｌ硫酸アンモニウム、２ｇ／Ｌシステイン−ＨＣｌ、３ｇ／Ｌクエン酸ナトリウム、１ｇ／Ｌ  ＭｇＣｌ２  ６Ｈ２Ｏ、０．１５ｇ／Ｌ  ＣａＣｌ２  ２Ｈ２Ｏ、０．００１２５ｇ／Ｌ  ＦｅＳＯ４  ７Ｈ２Ｏを含んだ。増殖させた接種材料を純度について調べ、３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、各発酵槽のための接種材料として使用される１０ｍＬの濃縮バイオマス（２〜４ｇ／Ｌ総懸濁固体）を生成させた。
【０１０８】
ヘキソースおよびペントース糖の同時発酵
４００ｍＬ作動容積の２つの撹拌タンク反応器をバッチモードで動作させた。バイオリアクター、ＢＲ１中では、３０ｇ／Ｌのセロビオースおよび３０ｇ／Ｌのキシロースを炭素源として、３ｇ／Ｌ  Ｋ２ＨＰＯ４、１．６ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、２ｇ／Ｌクエン酸三ナトリウム・２Ｈ２Ｏ、１．２ｇ／Ｌクエン酸Ｈ２Ｏ、０．５ｇ／Ｌ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、１ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、０．８ｇ／Ｌ  ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．１ｇ／Ｌ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．００１２５ｇ／Ｌ  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１ｇ／ＬシステインＨＣｌ、１０ｇ／Ｌ酵母エキス（Ｂａｃｔｏ）と共に、ＤＩ水に溶解した５ｇ／Ｌのトウモロコシスティープパウダーと共に使用した。第２の反応器、ＢＲ２は、３０ｇ／Ｌのグルコースおよび３０ｇ／Ｌのキシロースを炭素源として、ＢＲ１と同じ栄養分と共に含んだ。各発酵槽には１０ｍｌの接種材料を接種した。発酵槽を３５℃およびｐＨ６．５で動作させ、３００ｒｐｍで連続して混合した。
【０１０９】
試料を異なる時間間隔で回収し、糖、有機酸およびエタノールに対し、Ａｍｉｎｅｘ（特録商標）ＨＰＸ−８７Ｈ排除カラム（３００ｍｍ×７．８ｍｍ）およびＲＩ検出器を備えたＨＰＬＣを用いて分析した。０．００５Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を移動相として０．６ｍＬ／分で使用し、カラムを５５℃で維持した。
【０１１０】
表１ならびに図３Ａおよび３Ｂにおいて示される結果により、ヘキソースおよびペントースサッカリド基質の両方のロバストな使用および発酵プロセス中のそれらの基質のエタノールへの変換が示される。結果から、ペントースサッカリド(例えば、キシロース)がヘキソースサッカリド(例えば、セロビオースまたはグルコース)と少なくとも同じくらい迅速にかつ完全にエタノールに変換されることも示唆される。
【表１】
2012523852.tif 000002
【０１１１】
ＢＲ１およびＢＲ２発酵実行の規格化された炭水化物使用結果が図７に示され、これにより、異なる炭素源間のより直接的な比較が可能になる。図７はさらに、ペントース炭水化物（例えば、キシロース）が、少なくともヘキソース炭水化物（例えば、セロビオース、またはグルコース）と同様にエタノールに変換されることを示唆する。
【０１１２】
実施例３  デンプン、セロビオース、およびキシロースからのエタノール生産
バッチ発酵を実施し、クロストリジウム・フィトフェルメンタンスを使用して、ヘキソース（デンプン、セロビオース）およびペントース（キシロース）糖の同時発酵によりエタノールを生産させた。
【０１１３】
α−１，４−結合グルカン（デンプン）、β−１，４−結合グルカン（セロビオース）、およびキシロースの１０ｇ／Ｌ混合物を、クロストリジウム・フィトフェルメンタンス誘導株と共に、３５℃で４８時間インキュベートした。図５および下記表２に示される発酵結果から、生物は３つ全ての炭素源のエタノールの同時使用および変換が可能であることが示される。
【表２】
2012523852.tif 000003
【０１１４】
実施例４．ヘキソース（グルコース）およびペントース（キシロース、アラビノース）からのエタノール生産
バッチ発酵を実施し、クロストリジウム・フィトフェルメンタンスを使用して、ヘキソース（グルコース）またはペントース(キシロース、アラビノース)の発酵によりエタノールを生産させた。
【０１１５】
バッチ発酵反応を、様々な炭水化物基質からのエタノール生産を試験するために設定した。キシロース、グルコース、およびアラビノースの混合物を含む発酵培地を調製した。得られた培地をその後、クロストリジウム・フィトフェルメンタンス誘導株と共に、３５℃で４８時間インキュベートした。図６で示される発酵結果により、生物はは３つ全ての炭素源を効率的に、かつ迅速に使用することができ、および約４８時間で少なくとも約２５〜３０ｇ／Ｌのエタノールを生産することができることが示される。
【０１１６】
実施例５．デンプン、微結晶セルロース、キシラン、およびセロビオースからのエタノール生産
バッチ発酵を実施し、クロストリジウム・フィトフェルメンタンスを使用して、ヘキソース(デンプン、微結晶セルロース、セロビオース)またはペントース(キシラン)糖の発酵によりエタノールを生産させた。
【０１１７】
バッチ発酵反応を、様々な炭水化物基質からのエタノール生産を試験するために設定した。下記を含む、４つの異なる発酵培地を試験した：１）３０ｇ／Ｌキシラン、２）３０ｇ／Ｌデンプン、３）３０ｇ／Ｌ  Ａｖｉｃｅｌ微結晶セルロース（ＡＶＣ）、および２０ｇ／Ｌセロビオース。得られた培地をその後、クロストリジウム・フィトフェルメンタンス誘導株と共に、３５℃で４８時間インキュベートした。図７および下記表３で示される発酵結果により、生物は４つ全ての炭素源を効率的に、かつ迅速に変換することができ、微結晶セルロースの変換は最も遅いエタノール生産性を示し、続いて、キシラン、セロビオース、およびデンプンであることが示される。
【表３】
2012523852.tif 000004
【０１１８】
実施例６．増加したバイオ燃料、例えばエタノールを生産させるためのクロストリジウム・フィトフェルメンタンスの遺伝子改変
Ｃ．  フィトフェルメンタンスにおいて使用するのに好適なプラスミドを、細菌株保存機関から入手したプラスミドの一部を使用して構築した。プラスミドｐＩＭＰ１は大腸菌内で複製することができる非接合プラスミドであり、ならびに様々なグラム陽性細菌種であり、エリスロマイシンに対する抵抗性をコードする。野生型Ｃ．フィトフェルメンタンスはエリスロマイシンに対し高感度である。野生型Ｃ．フィトフェルメンタンスは、１ｍｌの微生物増殖培地あたり０．５μｇのエリスロマイシンの濃度では、増殖しない。広い宿主範囲の接合プラスミドＲＫ２は細菌接合系に必要とされる遺伝子を全て含み、下記が挙げられる：接合系のＤＮＡポリメラーゼに特異的な複製開始点、接合ＤＮＡ複製遺伝子、および可能なレシピエント細菌細胞の認識を可能にし、一本鎖プラスミドＤＮＡが細胞−細胞接触によりドナーからレシピエント細胞にそこを通って伝達される導管として機能する線毛の合成をコードする遺伝子。ＲＫ２接合系に対する伝達開始点は、プラスミドｐＲＫ２９Ｏから得られ、これは、Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＤＳＭＺ）からＤＳＭ３９２８として得られ、他のＲＫ２の接合機能は、ＤＳＭＺからＤＳＭ５５９９として得られたｐＲＫ２０１３から得られた。ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、ｗ  ｏｒｉＴ領域に隣接するＣｌａ１制限部位を追加するプライマーを使用して、ｐＲＫ２９Ｏから１１２塩基対転写開始領域（ｏｒｉＴ）を増幅させた。このＤＮＡフラグメントをｐＩＭＰｌのＣｌａｌ部位に挿入して、プラスミド  ｐＩＭＰＴを得た。ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、フィトフェルメンタンス染色体由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子Ｃ．フィトフェルメンタンス１０２９のプロモーターを増幅させ、これを使用してｐＩＭＰＴにおいてエリスロマイシン遺伝子のプロモーターを置換して、ｐＩＭＰＴ１０２９を作成した。他の接合機能を提供するために、ｐＲＫ２０１３もまた存在する場合、ｐＩＭＰＴ１０２９  は大腸菌からＣ．フィトフェルメンタンスへ接合により伝達され得る。プラスミドＤＮＡのＣ．フィトフェルメンタンスへの伝達の成功は、ｐＩＭＰＴ１０２９を含むＣ．フィトフェルメンタンス誘導体が、１０μｇ／ｍｌまでのエリスロマイシンを含む培地で増殖できることにより、およびＣ．フィトフェルメンタンス誘導体由来のｐＩＭＰＴ１０２９に特異的であるが、プラスミドを含まない対照Ｃ．フィトフェルメンタンス培養物由来のものにはそうではない２つの遺伝子領域を特異的に増幅させるＰＣＲプライマーを使用することにより、証明された。
【０１１９】
大腸菌からＣ．フィトフェルメンタンスへのｐＩＭＰＴ１０２９の接合伝達を達成する方法は、最初に、ｐＩＭＰＴ１０２９およびｐＲＫ２０ｌ３の両方を含む大腸菌株（ＤＨ５α）を構築することから構成された。その後、この大腸菌培養物の新鮮な細胞およびＣ．フィトフェルメンタンスレシピエント培養物の新鮮な細胞を得た。２つの細菌培養物をその後、遠心分離し、細胞ペレットを得、ペレットを同じ培地に再懸濁させ、約１０倍に濃縮され、約１０１０細胞／ｍｌの細胞密度を有する細胞懸濁液を得た。これらの濃縮細胞懸濁液をその後混合し、５対１のドナー対レシピエント比を達成した。この細胞懸濁液をＱＭ１寒天プレート上にスポットし、嫌気的に３０℃で２４時間インキュベートした。その後、細胞混合物をＱＭ１プレートから除去し、エリスロマイシン耐性を表したＣ．フィトフェルメンタンスレシピエント細胞に対して選択された抗生物質を含む固体上または液体ＱＭ１培地中に配置した。これは、２０μｇ／ｍｌのトリメトプリム、２５０μｇ／ｍｌのサイクロセリン、および１０μｇ／ｍｌのエリスロマイシンから構成される抗生物質の組み合わせを使用して達成させた。大腸菌ドナーは、これらの濃度のトリメトプリムおよびサイクロセリンへの曝露に対し生き残ることができなかったが、野生型Ｃ．フィトフェルメンタンスレシピエントは、この濃度のエリスロマイシンへの曝露に対し生き残ることができなかった（が、これらの濃度のトリメトプリムおよびサイクロセリンに耐容性を示した）。したがって、これらの抗生物質を含むプレートまたは液体培地の５〜７日間の、３０℃での、嫌気的条件下でのインキュベーション後、エリスロマイシン耐性であるＣ．フィトフェルメンタンスの誘導体が得られ、これらのＣ．フィトフェルメンタンス誘導体をはその後、ＰＣＲ分析により証明されるように、ｐＩＭＰＴ１０２９を含むことが示された。
【０１２０】
驚くべき結果は、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子由来のＣ．フィトフェルメンタンスプロモータを含んだエリスロマイシン耐性遺伝子の特別に構築させた誘導体のみがＣ．フィトフェルメンタンスにおいて機能的に発現させることができたことであった。
【０１２１】
Ｃ．フィトフェルメンタンスまたは異種起源のいずれか由来の対象の他の遺伝子が、ｐＩＭＰＴコンストラクトに導入され、Ｃ．フィトフェルメンタンスを形質転換するのに使用されるであろう。Ｃ．フィトフェルメンタンスを形質転換するのに使用される遺伝子としては、Ｃ．フィトフェルメンタンスのエタノール、酸性ｐＨ、またはバイオ燃料生産中に遭遇する他の毒性中間体に対する環境耐性を増加させる遺伝子産物を発現するものが挙げられる。
【０１２２】
プラスミドｐＩＭＰＴ１０２９の地図を図１１において作成し、加えて、このプラスミドのＤＮＡ配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１として提供する。
【０１２３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １：
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【０１２４】
本発明の好ましい実施形態を本明細書で図示し、説明してきたが、当業者には、そのような実施形態はほんの一例として提供されたにすぎないことは明らかであろう。本発明から逸脱せずに、当業者は多くの改変、変更、および置換を思いつくであろう。本明細書で記載される本発明の実施形態に対する様々な選択肢は本発明を実施する際に使用することができることを理解すべきである。以下の特許請求の範囲は、本発明の範囲を規定し、これらの特許請求の範囲内にある方法および構造ならびにそれらの等価物は本発明の範囲に含まれることが意図される。
【図１】
2012523852.tif 000005
【図２】
2012523852.tif 000006
【図３Ａ】
2012523852.tif 000007
【図３Ｂ】
2012523852.tif 000008
【図４】
2012523852.tif 000009
【図５】
2012523852.tif 000010
【図６】
2012523852.tif 000011
【図７】
2012523852.tif 000012
【図８】
2012523852.tif 000013
【図９】
2012523852.tif 000014
【図１０】
2012523852.tif 000015
【図１１】
2012523852.tif 000016
【配列表】
2012523852000001.app
【国際調査報告】
2012523852.tif 000017