(57)【要約】  本発明は、種々の官能化ナノダイヤモンド粒子を提供する。特に、本発明は、ナノダイヤモンド粒子および治療薬の可溶性複合体、例えば不溶性治療、アントラサイクリンおよび／またはテトラサイクリン化合物、核酸、タンパク質等を提供する。
2012528197.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
可溶性複合体を含む組成物であって、前記可溶性複合体は、
ａ）  １つ以上の表面カルボキシル基を含むナノダイヤモンド粒子と、
ｂ）  治療薬であって、前記治療薬は本質的に不水溶性または水に溶けにくく、前記治療薬は、前記可溶性複合体を形成するように前記ナノダイヤモンド粒子に吸着され、前記可溶性複合体は、水において可溶性である、治療薬と、
を含む、可溶性複合体を含む組成物。
【請求項２】
可溶性複合体を作成する方法であって、治療薬が、前記ナノダイヤモンド粒子に吸着することにより可溶性複合体を形成するように、酸性溶液の存在において、ナノダイヤモンド粒子を前記治療薬に混合することであって、前記治療薬は、本質的に不水溶性または水に溶けにくいことを含む、方法。
【請求項３】
前記酸性溶液は、酢酸を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ナノダイヤモンド核酸複合体を含む組成物であって、前記複合体は、
ａ）１つ以上の表面ポリエチレンイミン分子を含むナノダイヤモンド粒子と、
ｂ）核酸分子であって、前記核酸分子および前記ナノダイヤモンド粒子は、ナノダイヤモンド核酸複合体を形成する、核酸分子と、
を含む、組成物。
【請求項５】
前記ナノダイヤモンド粒子および前記核酸分子は、前記ナノダイヤモンド粒子上の正の電荷および前記核酸分子上の負の電荷の引力によって、前記ナノダイヤモンド核酸複合体を形成する、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記ナノダイヤモンド核酸複合体内の前記核酸分子は、細胞移入の際に放出されるように、前記ナノダイヤモンド粒子に付着される、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
前記ポリエチレンイミン分子は低分子量のポリエチレンイミン分子である、請求項４に記載の組成物。
【請求項８】
アルカリ感受性のナノダイヤモンドタンパク質複合体を含む組成物であって、前記アルカリ感受性のナノダイヤモンド複合体は、
ａ）  １つ以上の表面カルボキシル基またはヒドロキシル基を含むナノダイヤモンド粒子と、
ｂ）  タンパク質であって、前記タンパク質は、前記アルカリ感受性のナノダイヤモンドタンパク質複合体を形成するように、前記ナノダイヤモンド粒子に吸着され、前記タンパク質は、十分にアルカリ性の条件下においてのみ、前記ナノダイヤモンド粒子から脱着するように構成される、タンパク質と、
を含む、組成物。
【請求項９】
前記アルカリ性の条件は、少なくとも９．０のｐＨである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記アルカリ性の条件は、少なくとも１０．０のｐＨである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
可溶性複合体を含む組成物であって、前記可溶性複合体は、
ａ）  ナノダイヤモンド粒子と、
ｂ）  治療薬であって、前記治療薬はアントラサイクリン類化合物またはテトラサイクリン類化合物を含む、治療薬と、
を含む、組成物。
【請求項１２】
前記アントラサイクリン類化合物またはテトラサイクリン類化合物は、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、バルルビシン、ミトキサントロン、テトラサイクリン、クロロテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、リメサイクリン、メクロサイクリン、メタサイクリン、ミノサイクリン、およびロリテトラサイクリンから選択される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記可溶性複合体内の前記アントラサイクリン類化合物またはテトラサイクリン類化合物は、細胞移入の際に放出される、請求項１１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔関連出願の相互参照〕
本発明は、参照により全体として本出願により組み込まれる、２００９年５月２８日出願の米国仮特許出願一連番号６１／１８１，９９３号に対する優先権を主張する。
【０００２】
〔連邦支援の調査または開発に関する記述〕
本発明は、アメリカ国立科学財団による付与番号第ＣＭＭＩ−０８４６３２３号、ＣＭＭＩ−０８５６４９２号、およびＤＭＩ−０３２７０７７号（カリフォルニア大学バークレイ校からの請負契約、請負契約番号ＳＡ５８８０−２１５９３）、およびアメリカ国立衛星研究所からの付与番号第Ｕ５４  ＡＩ０６５３５９号の下で、政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明において特定の権利を有する。
【０００３】
〔技術分野〕
本発明は、種々の官能化ナノダイヤモンド粒子を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、ナノダイヤモンド粒子および治療薬で構成される複合体を提供する。一定の実施形態において、本発明は、ナノダイヤモンド粒子および不水溶性または水に溶けにくい治療薬で構成される可溶性複合体を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、ナノダイヤモンド粒子およびアントラサイクリンおよび／またはテトラサイクリン化合物を含む複合体を提供する。他の実施形態において、本発明は、ポリエチレンイミン表面官能化ナノダイヤモンド粒子および核酸分子で構成されるナノダイヤモンド核複合体を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、ナノダイヤモンド粒子およびナノダイヤモンド粒子に吸着されたタンパク質で構成されるアルカリ感受性のナノダイヤモンドタンパク質複合体を提供し、タンパク質は、十分にアルカリ性の条件においてナノダイヤモンド粒子から脱着するように構成される。
【０００４】
〔背景技術〕
効果的な薬物放出賦形剤としての、さらに、機械的、電気的およびＭＥＭＳ応用におけるナノ粒子の応用が、カーボンナノチューブ、ナノダイヤモンド、ナノ粒子埋め込みフィルム、天然および合成ポリマー、脂質小胞および多数の他のナノスケール種［８、９、１７−２７］と共に実証されてきた。これらのうち、爆轟されたナノダイヤモンドが、主に、それらの小分子荷重能力［９、２８］、官能化表面［２９］および生体適合性［１５、３０−３２］のために、関心を集めている。これらの属性は、ＮＤおよび他の粒子または分子の間の相互作用をＮＤ表面の特性によって定義できる、動的な界面を作成する。かかる相互作用の一例が、特徴的な表面電荷のために親水性のヒドロキシルおよびカルボキシル官能基を有し、水［８、２８、２９］における分散を可能にする、提供されたＮＤによって与えられる。生物医学的応用およびそれらの推奨される生体適合性におけるＮＤの今後の展望から、好ましい炭素系生体適合材料としてのＮＤが明らかになっている。
【０００５】
〔発明の概要〕
本発明は、種々の官能化ナノダイヤモンド粒子を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、ナノダイヤモンド粒子および治療薬で構成される複合体を提供する。一定の実施形態において、本発明は、ナノダイヤモンド粒子および水溶性、不水溶性、または水に溶けにくい治療薬で構成される複合体を提供する。一定の実施形態において、本発明は、ナノダイヤモンド粒子および不水溶性または水に溶けにくい治療薬で構成される可溶性複合体を提供する。いくつかの実施形態において、ナノダイヤモンド粒子は、１つ以上の治療薬について高い結合能力を示す。他の実施形態において、本発明は、ポリエチレンイミン表面官能化ナノダイヤモンド粒子および核酸分子で構成されるナノダイヤモンド核複合体を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、ナノダイヤモンド粒子およびナノダイヤモンド粒子に吸着されたタンパク質で構成されるアルカリ感受性のナノダイヤモンドタンパク質複合体を提供し、タンパク質は、十分にアルカリ性の条件において、ナノダイヤモンド粒子から脱着するように構成される。
【０００６】
いくつかの実施形態において、本発明は、可溶性複合体を含む組成物を提供し、可溶性複合体は、ａ）１つ以上の表面カルボキシル基を含むナノダイヤモンド粒子と、ｂ）治療薬と、を含み、治療薬は本質的に不水溶性または水に溶けにくく（例えば疎水性）、治療薬は、可溶性複合体を形成するためにナノダイヤモンド粒子へ吸着され、可溶性複合体は、水において可溶性であり（例えば体内等の体液における可溶性）、ヒトへの生体内投与に適している。一定の実施形態において、本発明は、ナノダイヤモンド粒子に吸着された治療薬を含む組成物を提供し、ナノダイヤモンド粒子は、１つ以上の表面カルボキシル基を含み、治療薬は、ナノダイヤモンド粒子に吸着されていない場合に不水溶性または水に溶けにくく、治療薬は、ナノダイヤモンド粒子に吸着される場合に水溶性である。
【０００７】
いくつかの実施形態において、本発明は、複合体を含む組成物を提供し、複合体は、ａ）ナノダイヤモンド粒子と、ｂ）治療薬とを含む。いくつかの実施形態において、治療薬は、テトラサイクリン類治療薬を含む。いくつかの実施形態において、治療薬は、アントラサイクリン類治療薬を含む。いくつかの実施形態において、治療薬は、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミノサイクリン、テトラサイクリン、オキシテトラサイクリンのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態において、治療薬は、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、バルルビシン、ミトキサントロン、テトラサイクリン、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、リメサイクリン、メクロサイクリン、メタサイクリン、ミノサイクリン、および／またはロリテトラサイクリンのうちの１つ以上を含む。
【０００８】
他の実施形態において、本発明は、治療薬が、ナノダイヤモンド粒子に吸着することにより、可溶性複合体を形成するように、酸性溶液の存在下においてナノダイヤモンド粒子を治療薬と混合させることであって、治療薬は、本質的に不水溶性または水に溶けにくいことを含む、可溶性複合体を作成する方法を提供する。特定の実施形態において、酸性溶液は、酢酸を含む。
【０００９】
いくつかの実施形態において、本発明は、ナノダイヤモンド核酸複合体を含む組成物を提供し、複合体は、ａ）１つ以上の表面ポリエチレンイミン分子を含む官能化ナノダイヤモンド粒子と、ｂ）核酸分子であって、核酸分子および官能化ナノダイヤモンド粒子はナノダイヤモンド核酸複合体を形成する、核酸分子と、を含む。
【００１０】
一定の実施形態において、本発明は、ａ）官能化ナノダイヤモンド粒子を生成するために、ナノダイヤモンド粒子をポリエチレンイミン分子と混合することと、ｂ）ナノダイヤモンド核酸複合体を生成するために、官能化ナノダイヤモンド粒子を核酸と混合することと、を含む、ナノダイヤモンド核酸複合体を作成するための方法を提供する。
【００１１】
特定の実施形態において、官能化ナノダイヤモンド粒子および核酸分子は、官能化ナノダイヤモンド粒子における正の電荷および核酸分子における負の電荷の引力によって、ナノダイヤモンド核酸複合体を形成する。他の実施形態において、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、対象の遺伝子、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはプラスミドを含む。特定の実施形態において、ナノダイヤモンド核酸複合体内の核酸分子は、核酸分子が細胞移入の際に放出されるように、ナノダイヤモンド粒子に付着される。一定の実施形態において、ポリエチレンイミン分子は、低分子量ポリエチレンイミン分子である。
【００１２】
いくつかの実施形態において、本発明は、アルカリ感受性のナノダイヤモンドタンパク質複合体を含む組成物を提供し、アルカリ感受性のナノダイヤモンド複合体は、ａ）１つ以上の表面カルボキシルまたはヒドロキシル基を含むナノダイヤモンド粒子と、ｂ）タンパク質（例えばヒトインシュリンまたは他の治療タンパク質）とを含み、タンパク質は、アルカリ感受性のナノダイヤモンドタンパク質複合体を形成するように、ナノダイヤモンド粒子に吸着され、タンパク質は、十分にアルカリ性の条件においてのみ、ナノダイヤモンド粒子から脱着するように構成される。特定の実施形態において、アルカリ性の条件は、少なくとも、８．０．．．８．５．．．９．０．．．９．５．．．１０．０．．．１０．５．．．１１．０．．．１２．０．．．１３．０．．．または１４．０のｐＨである。
【００１３】
さらなる実施形態において、本発明は、ａ）ｉ）アルカリ性のｐＨを有する治療を含む被験者と、ｉｉ）アルカリ感受性のナノダイヤモンド複合体を含む組成物であって、アルカリ感受性のナノダイヤモンド複合体は、Ａ）１つ以上の表面カルボキシルまたはヒドロキシル基を含むナノダイヤモンド粒子と、Ｂ）タンパク質であって、タンパク質はアルカリ感受性のナノダイヤモンドタンパク質複合体を形成するようにナノダイヤモンド粒子に吸着される、タンパク質と、を含む、組成物と、を提供することと、ｂ）ｉ）アルカリ感受性のナノダイヤモンド複合体が治療部位に達するように、かつ、ｉｉ）タンパク質が治療部位におけるアルカリ性のｐＨに応答して、アルカリ感受性のナノダイヤモンド複合体から脱着するような条件において、被験者へ組成物を（例えば全身的、局所的、経口的等）投与することと、を含む、被験者を治療する方法を提供する。特定の実施形態において、アルカリ性の条件は、少なくとも８．０．．．８．５．．．９．０．．．９．５．．．１０．０．．．１０．５．．．１１．０．．．１２．０．．．１３．０．．．または１４．０のｐＨである。他の実施形態において、治療部位は、創傷であり、投与は局所的である。いくつかの実施形態において、タンパク質は、インシュリン（例えばヒトインシュリン）を含む。
【００１４】
〔図面の簡単な説明〕
［図１］ＮＤは、水にプルバラノールＡおよび４−ＯＨＴを分散させる能力を向上させる。バックグラウンドに対してバイアルが調製され、ＮＤによって行われた濁度の低減が、以下の条件、つまり、Ａ）水における５％のＤＭＳＯ内の１ｍｇ／ｍｌのＮＤ、Ｂ）水における５％のＤＭＳＯ内の１ｍｇ／ｍｌのＮＤ、０．１ｍｇ／ｍｌのプルバラノールＡ、Ｃ）水における５％のＤＭＳＯ内の０．１ｍｇ／ｍｌのプルバラノールＡ、Ｄ）水における２５％のＤＭＳＯ内の１ｍｇ／ｍＬのＮＤ、Ｅ）水における２５％のＤＭＳＯ内の１ｍｇ／ｍＬのＮＤ、０．１ｍｇ／ｍＬの４−ＯＨＴ、Ｆ）水における２５％ＤＭＳＯ内の０．１ｍｇ／ｍＬ４−ＯＨＴにおいて確認された。Ｇ）本来のＮＤのＴＥＭ画像である。Ｈ）４−ＯＨＴ残留物が、ＮＤと薬物の相互作用を確認するために、ＮＤ表面において確認できた。スケールバーは、１０ｎｍを示した。
［図２］ＵＶ−Ｖｉｓは、ＮＤ：４−ＯＨＴおよびＤｅｘ−ＮＤ複合体プルダウンの分光光度分析である。Ａ）遠心分離後のＮＤ試料のＵＶ−Ｖｉｓ分析は、ＵＶ−Ｖｉｓ吸収度の低下を明らかにし、４−ＯＨＴと界面を接続するための薬剤としてＮＤを利用し、ペレット化したＮＤ試料へ薬物を引き付ける能力を確認する。Ｂ）４−ＯＨＴおよびＮＤ：４−ＯＨＴのＵＶ／Ｖｉｓ吸収度の間の比較プロットは、ＮＤおよび４−ＯＨＴの界面接続を示す。溶液における自由４−ＯＨＴは、遠心分離によって水溶液から除去された、ＮＤへの物理吸着の結果として低下した。なお、それぞれ、遠心分離前後の４−ＯＨＴを表す、重複する黒い点線および黒い実線によって示されるように、ＮＤが存在しない場合に、水性上清相から４−ＯＨＴを分離することへの影響は認められない。Ｃ）さらに、遠心分離後のＤｅｘの封鎖によって示されるように、Ｄｅｘ−ＮＤ複合体形成が確認された。
［図３］粒子サイズおよびＮＤ薬物複合体のゼータ電位のＤＬＳ分析。（図３Ａ−３Ｃ）：すべての薬の平均粒子サイズは、ＮＤの物理吸着の際に低下した。（図３Ｄ−３Ｆ）：すべての試料のゼータ電位は、ＮＤとの錯化の際により正になった。
［図４］治療的生体機能性分析は、ＮＤの錯化による強化された分散の際の維持された薬物活性を確認する。Ａ）プルバラノールＡ活性の保存は、以下のレーン指定、つまり、Ａ）ＤＮＡマーカ、Ｂ）負の制御（追加なし）、Ｃ）水溶液における５％のＤＭＳＯ、Ｄ）水溶液における５％のＤＭＳＯ内の１ｍｇ／ｍｌのＮＤ、Ｅ）水溶液における５％ＤＭＳＯ内の１ｍｇ／ｍｌのＮＤ、０．１ｍｇ／ｍｌのプルバラノールＡ、Ｆ）水溶液における５％ＤＭＳＯ内の０．１ｍｇ／ｍｌのプルバラノールＡによる、ＤＮＡ断片化分析によって確認された。レーンＥは、ＮＤプルバラノールＡ複合体の強力な活性を確認した。Ｂ）ＭＴＴ細胞生存率分析は、ＮＤによる複合体形成後に、４−ＯＨＴの保存された治療活性を確認するために実行された。以下の条件、つまり、（−）：負の制御、（＋）：正の制御、７．５ｕｇ／ｍＬの４−ＯＨＴ、ＮＤ：７５ｕｇ／ｍＬのＮＤ、ＮＤ：４−ＯＨＴ：７５ｕｇ／ｍＬのＮＤ、７．５ｕｇ／ｍＬの４−ＯＨＴが検査された。すべての条件は、１．３１ｍＭ酢酸を含有する培地内であった。正の制御およびＮＤ：４−ＯＨＴ試料の間の細胞生存率レベルの比較は、ＮＤに錯体形成される場合に保存された４−ＯＨＴの効力を示す。３つのうちのある代表的な実験を示す。
［図５］（Ａ）アミノ官能化ナノダイヤモンドおよび（Ｂ）低分子量ポリエチレンイミン（ＰＥＩ８００）修飾ナノダイヤモンドの概略図。
［図６］ナノダイヤモンドおよびｐＤＮＡ結合前の官能化Ｅナノダイヤモンドのサイズ（Ａ）およびゼータ電位（Ｂ）。粒子を、６０ｕｇ／ｍｌの濃度、３ｕｇのｐＤＮＡ／ｍｌの固定濃度を有するｐＤＮＡ結合後のナノダイヤモンドおよび官能化ナノダイヤモンドのサイズ（Ｃ）およびゼータ電位（Ｄ）で、脱イオン化水に懸濁した。１７３°の散乱角において２５℃でＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）を使用して、サイズ計測が実行された。平均流体力学直径は、累積分析によって決定された。ゼータ電位計測は、自動モードのひだ状の毛細血管内細胞を用いて実行された、水性媒体内の粒子の電気泳動移動度に基づく。データは、平均±標準偏差（ｎ＝２）として表す。（Ｅ）ＮＤ−ＰＥＩ８００／ＤＮＡのＴＥＭ画像。スケールバーは２０ｎｍである。
［図７］ＰＥＩ８００官能化ナノダイヤモンドは、ＨｅＬａ細胞における効率的な遺伝子トランスフェクションを媒介した。ＨｅＬａ細胞は、トランスフェクション前２４時間、１０５／ウェルの密度で、２４ウェルプレートに播種された。ナノ粒子が細胞に添加され、３７℃で４時間培養された。洗浄の際に、細胞は、４４時間さらに培養された。粒子濃度は、３μｇ／ウェルの標的ｐＬｕｃ用量で、異なる重量比を元にして計算された。トランスフェクション後４８時間、細胞採集およびルシフェラーゼ分析が実行された。データは、平均±標準偏差（ｎ＝２）として表される。＊は、細胞溶解物内のタンパク質の１０ＲＬＵ／ｍｇよりも低いトランスフェクション効率を有する粒子を表す。
［図８］５（Ａ）および１５（Ｂ）の重量比におけるＮＤ−ＰＥＩ８００／ｐＧＦＰ、５（Ｃ）および１５（Ｄ）の重量比における非修飾ナノダイヤモンド／ｐＧＦＰ、５（Ｅ）および１５（Ｆ）の重量比におけるＰＥＩ８００／ｐＧＦＰ、および裸ｐＧＦＰ（Ｇ）によって、行われた生体ＨｅＬａ細胞内のＧＦＰ発現の明視野およびＧＦＰ共焦点像作成。ＨｅＬａ細胞は、トランスフェクション前の２４時間、１．５Ｘ１０５／ウェルの密度で２４ウェルプレートに播種された。ナノ粒子は、細胞に添加され、４時間、３７℃で培養された。洗浄の際に、細胞は、４４時間、さらに培養された。粒子濃度は、６μｇ／ウェルの標的ｐＬｕｃ用量に基づいて計算された。生体ＨｅＬａ細胞がＰＢＳによって洗浄され、トランスフェクション後４８時間、共焦点顕微鏡（ライカ反転レーザー走査系、アルゴンレーザー励起４８８ｎｍ）においてライブで観察された。（スケールバー：５０ｕｍ）
［図９］ＮａＯＨの存在下での水中のＮＤへのインシュリン吸着および脱着を示す仮想概略図。インシュリン非共有は、静電および他の相互作用によって、水中でＮＤ表面へ結合する。アルカリ性環境へのシフトにより、インシュリン表面電荷特性を変質させ、それによってＮＤ表面からの放出を生じさせる。
［図１０］（ａ）そのままのＮＤ、（ｂ）水溶液内の吸着されたインシュリンを有するＮＤ、および（ｃ）ｐＨ１０．５に調整された１ｍＭのＮａＯＨによる治療後の吸着されたインシュリンを有するＮＤのＴＥＭ画像。約５−１０ｎｍの厚さの、そのままのＮＤ（ａ）と比較して、ＮＤ（ｂ）の表面上に明らかな層またはコーティングが存在する。インシュリンの添加は（ａ）および（ｂ）の間の試料調製における差にすぎないため、視覚可能な層は、インシュリン吸着を示すことがある。材料は、ＮａＯＨ処理したＮＤ上に存在しない（ｃ）。スケールバーは、（ａ）において２０ｎｍ、（ｂ、ｃ）において５０ｎｍを示す。
［図１１］（ａ）ＦＩＴＣインシュリン、（ｂ）そのままのＮＤおよび（ｃ）ＮＤインシュリン複合体の赤外線スペクトル。矢印は、そのままのＮＤスペクトルと比較した、ＮＤインシュリンスペクトル上に存在するインシュリンの特徴的なスペクトルを示す。画像（ｃ）は、差スペクトルによって示されるように、ＮＤインシュリン複合体の形成を示唆する。データは、ＮＤへのインシュリンの非共有吸着を示唆する。
［図１２］ｐＨ７およびｐＨ１０．５におけるインシュリンおよびＮＤの錯体に関連付けられたゼータ電位の変化。ＮＤは、インシュリンおよびＮＤインシュリン複合体の負の電位と比較した、両方のｐＨ値におけるわずかに正のゼータ電位を明らかにする。ＮＤおよびＮＤインシュリン複合体の間のゼータ電位における明らかな差は、ＮＤおよびインシュリンの間の相互作用を示す。
［図１３］ＮＤからのインシュリンの吸着および脱着のＵＶ／ｖｉｓ定量化。（ａ）ＮＤに対するＦＩＴＣインシュリンの吸着は、４８５ｎｍで計測された、初期のおよび遠心分離されたＮＤインシュリンの間の到達された差の吸収度値によって示される。（ｂ）５６２ｎｍで計測された、ＢＣＡタンパク質分析を実施するウシインシュリンの吸収度。（ｃ）種々のｐＨ値に調整された、１ｍＭのＮａＯＨにおける、ＮＤからのＦＩＴＣインシュリンの脱着。試料は、アルカリ性条件において遠心分離され、生成された溶液が計測された。（ｄ）ＢＣＡタンパク質分析を使用したＮＤからのウシインシュリンの脱着。放出吸収度スペクトルから、より大量のインシュリンが、アルカリ性環境において脱着され、ＮａＯＨがインシュリンの電荷特性に影響することを示す。
［図１４］ＮａＯＨ（ｐＨ１０．５）および水で処理したＮＤインシュリン試料の５日間のインシュリン脱着試験、アルカリ性ｐＨ環境内のインシュリン放出を示す。放出されたインシュリンの累積重量パーセンテージが計測された。ＮａＯＨ試料は、最初の２日間内の増加した脱着および４５．８±３．８％の全脱着のために放出された量の平準化を示す。しかしながら、水で処理した試料は、合計で２．２±１．２％の、インシュリンの一部のみを放出した。１日目までに生じたＮａＯＨによって放出されたインシュリンの大部分は、アルカリ溶液が、完全に吸着されたＮＤ上に、その最大影響を有していたことを示す。
［図１５］様々な培地条件におけるＲＡＷ２６４．７マクロファージ細胞のＭＴＴ細胞生存率分析。細胞は、８時間、血清飢餓が行われ、次いで、示された溶液媒体、つまり、（１）ＤＭＥＭ、（２）０．１μＭインシュリン、（３）１μＭインシュリン、（４）ＮａＯＨ（ｐＨ１０．５）によるＮＤインシュリンから放出された約０．１μＭのインシュリン、（５）水における、遠心分離されたＮＤインシュリンからの生成された溶液、（６）ＮａＯＨ（１μＭ全インシュリン）によって処理したＮＤインシュリン、（７）インシュリンと結合した（ＮＤインシュリン、１μＭ全インシュリン）ＮＤおよび（８）ＤＭＥＭ１０％ＦＢＳによる、２４時間の回収期間が生じる。ＮａＯＨ（６）で処理したＮＤインシュリンの相対生存率は、高いインシュリン濃度（３）の相対生存率と同様であり、これは、放出されたインシュリンによる効果的な回収を示す。ＮａＯＨ（４）によって放出されたインシュリンは、水（５）によって放出されたインシュリンの相対生存率よりも高い相対生存率を示し、これは、アルカリ溶液を介したより大きい脱着を表す。ＡＮＯＶＡ統計分析により、Ｐ＜０．０１が得られ、基の間の顕著な差を表す。
［図１６］（ａ）３Ｔ３−Ｌ１前駆脂肪細胞および（ｂ）分化した脂肪細胞は、２つの細胞タイプの間の形態の明白な差を示す。前駆含脂肪細胞線維芽細胞は、インシュリン、デキサメタゾンおよびＩＢＭＸによる培地の補完の際に分化を実行し、移入後１０日目までに完全に分化する。脂質小胞形成は、分化の間に生じ、（ｂ）２５０Ｘ倍率で確認することができる。
［図１７］培地条件におけるＩｎｓ１およびＣｓｆ３／Ｇ−ｃｓｆのリアルタイムのＰＣＲ遺伝子発現。３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞は、異なる溶液媒体、つまり、（１）ＤＭＥＭ、（２）０．１μＭのインシュリン、（３）ＮａＯＨ（ｐＨ１０．５）によってＮＤインシュリンから放出された０．１μＭのインシュリン、（４）水における遠心分離されたＮＤインシュリンから生成された溶液、（５）ＮａＯＨで処理したＮＤインシュリン（１μＭの全インシュリン）および（６）インシュリンで結合されたＮＤ（ＮＤインシュリン、１μＭの全インシュリン）において、２時間の回収期間の前４時間、血清飢餓された。両遺伝子は、ＮａＯＨによって放出されたインシュリン（３）およびＮａＯＨで処理したＮＤインシュリン（５）の増加した発現を示し、活性を保存する一方で、アルカリ性条件による効果的なインシュリン放出を示す。水（４）およびＮＤインシュリン（６）によって放出されたインシュリンは、比較的、タンパク質機能を防止するＮＤ表面へのインシュリンの隔離について示唆する、両遺伝子についての低い相対発現を示した。ＲＴ−ＰＣＲ試料の代表的な遺伝子発現プロット。ＡＮＯＶＡ：Ｐ＜０．０１。
［図１８］ナノダイヤモンド−ダウノルビシン（ＮＤ−Ｄａｕｎ）吸着の分光分析。吸収度曲線は、各溶液に存在するＮＤまたはＮＤ−Ｄａｕｎ複合体をペレット化するために、１５分スピン（１４０００ｒｐｍ）前（ＢＳ）および後（ＡＳ）に計測された。
［図１９］ナノダイヤモンド−ダウノルビシン（ＮＤ−Ｄａｕｎ）吸着の比較。１４０００ｒｐｍでの１５分遠心分離前（Ａ）および後（Ｂ）のＮＤ（１）、Ｄａｕｎ（２）、ＮＤ−Ｄａｕｎ（３）、およびＮＤ−Ｄａｕｎ＋ＮａＯＨ（４）溶液。
［図２０］それぞれ、水およびＰＢＳにおけるナノダイヤモンド共役からのＤＡＵＮの脱着。放出特性は、薬物溶出が数時間にわたって持続することを明らかにする。吸収度は４８５ｎｍで計測された。
［図２１］ナノダイヤモンドエピルビシン（ＮＤ−Ｅｐｉ）吸着の分光分析。吸収度曲線は、各溶液内に存在するＮＤまたはＮＤ−Ｅｐｉ複合体をペレット化するために、１５分スピン（１４０００ｒｐｍ）の前（ＢＳ）および後（ＡＳ）で計測された。
［図２２］ナノダイヤモンドエピルビシン（ＮＤ−Ｅｐｉ）吸着の比較。１４０００ｒｐｍにおける１５分遠心分離の前（Ａ）および後（Ｂ）の、ＮＤ（１）、Ｅｐｉ（２）、ＮＤ−Ｅｐｉ（３）、およびＮＤ−Ｅｐｉ＋ＮａＯＨ（４）溶液。
［図２３］それぞれ、水およびＰＢＳにおけるナノダイヤモンド共役からのＥＰＩの脱着。放出特性は、数時間にわたって薬物溶出が持続することを明らかにする。吸収度は４８５ｎｍで計測された。
［図２４］ナノダイヤモンドイダルビシン（ＮＤ−ＩＤＡ）吸着の分光分析。吸収度曲線は、各溶液に存在するＮＤまたはＮＤ−ＩＤＡ複合体をペレット化するために、２時間のスピンの前（ＢＳ）および後（ＡＳ）で計測された。
［図２５］ＮＤ−Ｉｄａ吸着の比較。１４０００ｒｐｍにおける１５分の遠心分離の前（Ａ）および後（Ｂ）の、ＮＤ（１）、Ｉｄａ（２）、ＮＤ−Ｉｄａ（３）、およびＮＤ−Ｉｄａ＋ＮａＯＨ（４）溶液。
［図２６］それぞれ、水およびＰＢＳにおけるナノダイヤモンド共役からのＩＤＡの脱着。放出特性は、数時間にわたって薬物溶出が持続することを明らかにする。吸収度は４８５ｎｍで計測された。
［図２７］ＮＤ−Ｄａｕｎ−Ｄｏｘ−Ｅｐｉ−Ｉｄａ吸着の分光分析。吸収度曲線は、各溶液において存在するＮＤまたはＮＤ−Ｄａｕｎ＋Ｄｏｘ＋Ｅｐｉ＋Ｉｄａ複合体をペレット化するために、１５分スピン（１４０００ｒｐｍ）の前（ＢＳ）および後（ＡＳ）で計測された。
［図２８］ＮＤ−Ｄａｕｎ−Ｄｏｘ−Ｅｐｉ−Ｉｄａ吸着の比較。１４０００ｒｐｍにおける１５分遠心分離の前（Ａ）および後（Ｂ）の、ＮＤ（１）、Ｄａｕｎ＋Ｄｏｘ＋Ｅｐｉ＋Ｉｄａ（２）、ＮＤ−Ｄａｕｎ＋Ｄｏｘ＋Ｅｐｉ＋Ｉｄａ（３）、およびＮＤ−Ｄａｕｎ＋Ｄｏｘ＋Ｅｐｉ＋Ｉｄａ＋ＮａＯＨ（４）溶液。
［図２９］ナノダイヤモンドミノサイクリン（ＮＤ−Ｍｉｎｏ）吸着の分光分析。吸収度曲線は、各溶液内に存在するＮＤまたはＮＤ−Ｍｉｎｏ複合体のペレット化のために、１５分スピン（１４０００ｒｐｍ）の前（ＢＳ）および後（ＡＳ）で計測された。
［図３０］ナノダイヤモンドミノサイクリン（ＮＤ−Ｍｉｎｏ）吸着の比較。１４０００ｒｐｍにおける１５分遠心分離の前（Ａ）および後（Ｂ）の、ＮＤ（１）、Ｍｉｎｏ（２）、ＮＤ−Ｍｉｎｏ（３）、およびＮＤ−Ｍｉｎｏ＋ＮａＯＨ（４）溶液。
［図３１］ナノダイヤモンド共役からのミノサイクリンの脱着。水において実行される放出特性（上）およびＰＢＳ（下）は、最初の数時間における持続的放出を示す。
［図３２］ナノダイヤモンドテトラサイクリン（ＮＤテトラ）吸着の分光分析。吸収度曲線は、各溶液に存在するＮＤまたはＮＤテトラ複合体をペレット化するために、１５分スピン（１４０００ｒｐｍ）の前（ＢＳ）および後（ＡＳ）で計測された。
［図３３］ナノダイヤモンドテトラサイクリン（ＮＤテトラ）吸着の比較。１４０００ｒｐｍにおける１５分遠心分離の前（Ａ）および後（Ｂ）の、ＮＤ（１）、テトラ（２）、ＮＤテトラ（３）、およびＮＤテトラ＋ＮａＯＨ（４）溶液。
［図３４］ナノダイヤモンド共役からのテトラサイクリンの脱着。水（上）およびＰＢＳ（下）において実行される放出特性は、最初の数時間における持続的放出を示す。
［図３５］ナノダイヤモンドドキシサイクリン（ＮＤ−Ｄｏｘｙ）吸着の分光分析。吸収度曲線は、各溶液に存在するＮＤまたはＮＤ−Ｄｏｘｙ複合体のペレットを作成するために、１５分スピン（１４０００ｒｐｍ）の前（ＢＳ）および後（ＡＳ）で計測された。
［図３６］ナノダイヤモンドドキシサイクリン（ＮＤ−Ｄｏｘｙ）吸着の比較。１４０００ｒｐｍにおける１５分遠心分離の前（Ａ）および後（Ｂ）の、ＮＤ（１）、Ｄｏｘｙ（２）、ＮＤ−Ｄｏｘｙ（３）、およびＮＤ−Ｄｏｘｙ＋ＮａＯＨ（４）溶液。
［図３７］ナノダイヤモンド共役からのドキシサイクリンの脱着。水（上）およびＰＢＳ（下）において実行される放出特性は、最初の数時間における持続的放出を示す。
［図３８］ナノダイヤモンドオキシテトラサイクリン（ＮＤ−Ｏｘｙ）吸着の分光分析。吸収度曲線は、各溶液に存在するＮＤまたはＮＤ−Ｏｘｙ複合体のペレット化のために、１５分スピン（１４０００ｒｐｍ）の前（ＢＳ）および後（ＡＳ）に計測された。
［図３９］ナノダイヤモンドオキシテトラサイクリン（ＮＤ−Ｏｘｙ）吸着の比較。１４０００ｒｐｍにおける１５分遠心分離の前（Ａ）および後（Ｂ）の、ＮＤ（１）、Ｏｘｙ（２）、ＮＤ−Ｏｘｙ（３）、およびＮＤ−Ｏｘｙ＋ＮａＯＨ（４）溶液。
【００１５】
〔発明を実施するための形態〕
本発明は、種々の官能化ナノダイヤモンド粒子を提供する。一定の実施形態において、本発明は、ナノダイヤモンド粒子および不水溶性または水に溶けにくい治療薬で構成される可溶性複合体を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、ナノダイヤモンド粒子およびアントラサイクリンおよび／またはテトラサイクリン化合物を含む複合体を提供する。他の実施形態において、本発明は、ポリエチレンイミン表面官能化ナノダイヤモンド粒子および核酸分子で構成されるナノダイヤモンド核複合体を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、ナノダイヤモンド粒子およびナノダイヤモンド粒子に吸着されたタンパク質で構成されるアルカリ感受性のナノダイヤモンドタンパク質複合体を提供し、タンパク質は、十分にアルカリ性の条件でナノダイヤモンド粒子から脱着するように構成される。
【００１６】
（Ｉ．ナノダイヤモンド薬物複合体）
いくつかの実施形態において、本発明は、ナノダイヤモンド粒子および治療薬で構成される複合体を提供する。一定の実施形態において、本発明は、水溶性、不水溶性、または水に溶けにくい治療薬を有するナノダイヤモンド粒子の複合体を提供する。一定の実施形態において、本発明は、不水溶性または水に溶けにくい治療薬を有するナノダイヤモンド粒子の可溶性複合体を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、アントラサイクリンおよび／またはテトラサイクリン類の治療薬（例えばアントラサイクリン、テトラサイクリン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミノサイクリン、テトラサイクリン、オキシテトラサイクリン等）を有するナノダイヤモンド粒子の複合体を提供する。いくつかの実施形態において、ナノダイヤモンド粒子は、１つ以上の治療薬について高い結合能力を示す。
【００１７】
幅広い範囲の水溶性化合物が、癌および炎症を含む多種多様な医学的および生理的障害に対する治療関連の特性を示してきた。しかしながら、これらの化合物の水への分散の媒介に対する、拡張可能で、容易な、生体適合性のあるルートの模索の継続は、医学におけるそれらの幅広い応用を制限してきた。本発明の開発において実行された実験は、保存の機能性を有する、水へのそれらの懸濁を強化するためのいくつかの例示的な治療薬による、水分散可能なナノダイヤモンドクラスタ媒介の相互作用の基礎的なアプローチ（これにより以前には実現できなかった新規の治療パラダイムを可能にする）を示す。これらの治療薬は、プルバラノールＡ、肝細胞癌（肝臓癌）治療のための非常に将来性のある化合物（４−ヒドロキシタモキシフェン（４−ＯＨＴ））、乳癌の治療のための新しい薬物、およびデキサメタゾン（血液の癌および脳腫瘍からリウマチおよび腎臓障害までの合併症を範囲とする、多種多様な疾患を解決する、臨床関連の抗炎症薬）を含む。任意の不水溶性または水に溶けにくい治療薬を利用してもよい。例示的な水溶性薬剤は、例えば、アロプリノール、アセトヘキサミド、ベンズチアジド、クロロプロマジン、クロルジアゼポキシド、ハロペリドール、インドメタシン、ロラゼパム、メトキサレン、メチルプレドニゾン、ニフェジピン、オキサゼパム、オキシフェンブタゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、ピリメタミン、フェニンジオン、スルフイソキサゾール、スルファジアジン、テマゼパム、スルファメラジン、および／またはトキオキサレンを含む。本発明の実施形態で使用される不水溶性、水に溶けにくい、または脂質可溶性の治療薬は、中枢神経系薬物、末梢神経系薬物、感覚器官薬物、心血管疾患系薬物、呼吸器系薬物、ホルモン、泌尿・生殖器系薬物、肛門疾患用薬物、ビタミン、肝臓疾患用薬物、抗痛風薬物、酵素、抗糖尿病薬、免疫抑制剤、共役因子、抗腫瘍薬物、放射性薬物、抗アレルギー薬物、抗生物質、化学療法薬、生物学的製剤、および体外診断用薬剤を含む。特に、本発明のＮＤ複合体で使用される不水溶性、水に溶けにくい、および／または脂質可溶性の治療薬は、ステロイド性薬物（例えばデキサメタゾン、プレドニゾロン、ベタメタゾン、プロピオン酸ベクロメタゾン、トリアムシノロン、ヒドロコルチゾン、フルドロコルチゾンおよびプラステロン、その塩、およびそれらの脂溶性誘導体）、β−アドレナリン作動薬（例えばプロカテロール、オルシプレナリン、塩酸イソプロテレノール、ピルブテロール、テルブタリン、ヘキソプレナリン、臭化水素酸フェノテロール、硫酸ヘキソプレナリン、硫酸テルブタリン、硫酸サルブタモール、硫酸オキシプレナリン、フマル酸ホルモテロール、塩酸イソプレナリン、塩酸ピルブテロール、塩酸プロカテロール、塩酸マブテロール、およびツロブテロール、その塩、およびそれらの脂溶性誘導体）、キサンチン誘導体（例えばジプロフィリン、プロキシフィリン、アミノフィリンおよびテオフィリン、その塩、およびそれらの脂溶性誘導体）、抗生物質（例えばペンタミジンイセチオネート、セフメノキシム、カナマイシン、フラジオマイシン、エリスロマイシン、ジョサマイシン、テトラサイクリン、ミノサイクリン、���ロラムフェニコール、ストレプトマイシン、ミデカマイシン、アンフォテリシンＢ、イトラコナゾールおよびナイスタチン、その塩、およびそれらの脂溶性誘導体）、および他の部類（例えば臭化イプラトロピウム、塩酸メチルエフェドリン、塩酸トリメトキノール、クレンブテロール塩酸、臭化オキシトロピウム、臭化フルトロピウム、メトキシフェナミン塩酸、クロルプレナリン塩酸クロモグリク酸ナトリウム等）の治療薬を含む。いくつかの実施形態において、複合体は、ＮＤおよび上記に列挙された薬剤または当業者によって理解される他の薬剤のうちの２つ以上の組み合わせ（例えば２つの治療薬、３つの治療薬、４つの治療薬、５つの治療薬・・・１０の治療薬・・・２０の治療薬等）に基づく。ナノダイヤモンド処理の拡張性および官能基化のために、このアプローチは、治療関連のシナリオに対し、不水溶性化合物を変換するための容易で、広く影響する、有効なルートとして役立つ。
【００１８】
多くの生物医学関連の化合物は、水に可溶化することは困難であるため、それらの治療可能性を制限している［１−５］。これらの化合物は、肝臓および乳癌［１−２］等の疾患に対して、体外での注目すべき治療特性を示している。しかしながら、これらの治療薬は、主に、注入に適していないものとして一般的にみなされている溶剤に可溶性であるため、これらの薬物によって可能となる患者治療への新しいルートの実現が妨げられている。容易な送達のためにこれらの化合物をパッケージングする幅広いニーズがいまだにあり、多種多様な高分子および炭素系ナノ材料が模索されている［６−１５］。例えば、ブロック共重合体安定化ナノエマルジョンが、最近、極性および無極性薬剤［６］の賦形剤として模索されてきた。さらに、脂質ＰＥＧシェルおよびポリ（乳酸−共−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）疎水性核で構成される脂質ポリマーハイブリッドナノ粒子が、水に溶けにくい薬物の放出のために開発されている［７］。水に溶けにくい薬物の分散のための炭素系戦略に関して、ＰＥＧ化されたナノ酸化グラフェンが、最近、芳香族カンプトセシン（ＣＰＴ）類似体の送達のために模索されている［１５］。
【００１９】
ナノダイヤモンド（ＮＤ）は、いくつかの医学的に有効な特性を有する材料の重要な、新規の部類を表す［１６−３６］。４−６ｎｍの非常に均一な粒子直径を作成するために、ＮＤは、超音波処理、遠心分離、および圧延方法［２２，２６］によって安価に加工できる。さらに、不純物を除くための酸性処理は、同時に、以降の薬物界面作成に対して利用できるカルボキシル基表面官能基化を生じさせることができる。さらに、表面結合したカルボキシル基は、水における安定したＮＤ懸濁を可能にする。したがって、これらの合理化されたプロセスにより、ＮＤを薬剤について拡張可能な材料にするための、迅速で、安価および非常に効率的なアプローチを提供する。ＮＤについての以前の研究は、ドキソルビシンによるそれらのキャリア機能、生体適合性のあるまたは脂肪親和性の薬剤によるＮＤのコーティングを必要としない細胞の内在化、およびマウスのマクロファージおよびヒトの大腸の癌細胞系における薬物有効性の維持を示している。さらに、炎症性サイトカインの定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）調査を用いた総合的な生体適合性分析が、それらの生体適合性特性を明らかにしている。２６本発明の実施形態の開発において、ＮＤクラスタが、さらに、水におけるそれらの分散特性を高めるために、水に溶けにくい薬物との錯化をさらに可能にすることが示されている。ＮＤの基礎的機能を実証するために、重要な意味合い（プルバラノールＡ、４−ヒドロキシタモキシフェン）を有する３つの薬物、または示された関連物（デキサメタゾン）がモデル系として機能した。
【００２０】
ナノダイヤモンドは、広範囲の小分子、タンパク質、抗体、およびＲＮＡ／ＤＮＡ治療薬の容易な可溶化の基礎を提供する。本発明は、使用されている治療薬によって制限を受けない。本発明の実施形態の開発において実行された作業は、ナノダイヤモンドパウダープラットフォームが、水のみにおける（例えば現在、ヒトの利用が可能ではないＤＭＳＯ、エタノール、すべての溶剤における可溶性）それらの不溶性のために、現在、翻訳的に困難である幅広い治療的化合物の迅速な水の可溶化に対して適用できることを示してきた。官能基化／薬物リンクプロセスにおいて少量の酸（例えば１％以下）を添加することにより、４−ヒドロキシタモキシフェン（４−０ＨＴ、エタノールで可溶性の乳癌治療薬）、プルバラノールＡ（ＤＭＳＯで可溶性の肝臓癌治療薬）、およびデキサメタゾン（エタノール／メタノールで可溶性の抗炎症薬）等の化合物のリンクを実証してきた。酸性官能基化プロセスは、増殖分析によって示されるように、細胞にとって有毒ではなく、数時間内に通常のレベルに迅速に戻るｐＨのわずかで単純な変化が存在する。これは、ナノダイヤモンド産生、精製、および官能基化の非常に経済的な特性を考えると、大きく拡張可能なプロセスである。さらに、一定の実施形態において、これは、１ステップのプロセスであり、数分で完了できるため、これは、おそらくは、水溶性薬物の可溶化のための最も拡張可能なプロセスになる。変形的治療の可能性があるが抑制的水不溶性を有する非常に広範囲の既に公知および未発見の化合物を考えると、本発明は、生体適合性がある、経済的／拡張可能、およびプロセス速度において非常に迅速であることにより、最適化された薬物可溶化という目的を達成する。
【００２１】
多くの潜在的に有用な薬剤は、毒性のために、臨床的応用において使用できない。いくつかの実施形態において、本発明は、ナノダイヤモンド粒子および有毒または潜在的に有毒な治療薬で構成される複合体を提供する。いくつかの実施形態において、ナノダイヤモンド粒子への治療薬の錯化は、薬物毒性を低減し、臨床的応用のための薬物の安全性をもたらす。
【００２２】
いくつかの実施形態において、本発明は、ナノダイヤモンド粒子およびワクチンの複合体を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、被験者への１つ以上のワクチンの送達および持続的放出を提供する。いくつかの実施形態において、本発明の複合体からのワクチン放出は、ワクチン送達の副作用を低減し、ワクチン送達の効率を高める。いくつかの実施形態において、本発明で使用されるワクチンは、インフルエンザワクチン、コレラワクチン、腺ペストワクチン、ポリオワクチン、肝炎Ａワクチン、狂犬病ワクチン、黄熱病、はしか／おたふくかぜ／風疹、腸チフスワクチン、破傷風ワクチン、ジフテリアワクチン、マイコバクテリウム属結核ワクチン等を含むが、これらに制限されない。
【００２３】
いくつかの実施形態において、本発明は、ナノダイヤモンド粒子および１つ以上の抗菌剤の複合体を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、被験者への１つ以上の抗菌剤の送達および持続的放出を提供する。いくつかの実施形態において、本発明の複合体からの抗菌剤の放出は、副作用を低減し、抗菌薬の送達効率を高める。いくつかの実施形態において、本発明で使用される抗菌剤は、抗生物質、抗ウィルス物質、抗真菌剤、および駆虫薬を含むが、これらに制限されない。
【００２４】
いくつかの実施形態において、本発明は、ナノダイヤモンド粒子およびアントラサイクリンおよび／またはテトラサイクリン類治療薬（例えばアントラサイクリン、テトラサイクリン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミノサイクリン、テトラサイクリン、オキシテトラサイクリン等）の複合体を提供する。いくつかの実施形態において、アントラサイクリンおよび／またはテトラサイクリン類治療薬、またはその誘導体は、不水溶性である、または水において溶けにくい。いくつかの実施形態において、アントラサイクリンおよび／またはテトラサイクリン類の治療薬、またはその誘導体は、水溶性である。いくつかの実施形態において、ＮＤアントラサイクリン複合体および／またはＮＤテトラサイクリン複合体は、ＮＤ表面および治療的化合物の間の顕著な結合能力を示す。本発明の実施形態の開発において実施された実験は、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミノサイクリン、テトラサイクリン、オキシテトラサイクリンを含む治療薬によるＮＤ表面およびＮＤ複合体内の治療的化合物の間の例外的な結合を実証する。いくつかの実施形態において、ＮＤの間の複合体および１つ以上の任意の適したアントラサイクリンおよび／またはテトラサイクリン類の治療は、高い結合能力を示す。いくつかの実施形態において、複合体は、ＮＤおよび、アントラサイクリン（例えばダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、バルルビシン、ミトキサントロン等）およびテトラサイクリン（例えばテトラサイクリン、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、リメサイクリン、メクロサイクリン、メタサイクリン、ミノサイクリン、ロリテトラサイクリン）のうちの１つまたはいずれかの組み合わせに基づく。本発明の実施形態の開発において実施された実験は、水において分散されながら、ＮＤ／アントラサイクリン類複合体および／またはＮＤ／テトラサイクリン類複合体が非常に緊密に結合することを示す。本発明は作用のいずれかの特定のメカニズムに制限されず、作用メカニズムの理解は本発明の実施には必要ではないが、酸性洗浄されたＮＤおよび治療的化合物の表面の間の反対電荷により、ＮａＯＨまたはＫＯＨ処置の後で高い効力結合が生じると考えられる。いくつかの実施形態において、ＮＤ／アントラサイクリン類複合体および／またはＮＤ／テトラサイクリン類複合体からの薬物放出が持続的に生じる。本発明の実施形態の開発において実施された実験は、薬物耐性疾患モデル（例えば癌）のために、非常に緊密なＮＤ薬物結合が細胞へ薬物を運ぶことを可能にし、ＮＤが細胞内の薬物の存在を維持するため、耐性が弱められる可能性があることを示している。このため、薬物駆出／流出が防止される。いくつかの実施形態において、ＮＤ／アントラサイクリン類複合体および／またはＮＤ／テトラサイクリン類複合体は、複数薬物耐性疾患（例えば癌、結核、細菌感染等）の効果的な治療を提供する。いくつかの実施形態において、ＮＤ／アントラサイクリン類複合体および／またはＮＤ／テトラサイクリン類複合体は、細胞からの薬物駆出／流出が防止されるため、複数薬物耐性疾患（例えば癌、結核、細菌感染等）の効果的な治療を提供する。
【００２５】
本発明は、一般的に、癌から炎症までの、再生医療等への極めて範囲の広い種類の治療戦略に適用可能である。いくつかの実施形態において、本発明の組成物および方法は、急性骨髄性白血病、薬物耐性白血病、乳癌、リンパ腫、子宮癌、肺癌、卵巣癌、マラリア、獣医学的応用、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）、パーキンソン病（例えば神経保護剤として）、線維筋痛、動物の咬傷による感染症（例えば動物パスツレラ症病原菌、肺パスツレラ等）、リウマチ性関節炎、反応性関節炎、慢性炎症性肺疾患（例えば汎細気管支炎、ぜんそく、嚢胞性線維症、気管支炎等）、サルコイドーシス、マルファン症候群の患者の大動脈瘤の防止、多発性硬化症、マイボーム腺機能不全、座瘡、アミーバ赤痢、炭疽病、コレラ、淋病（例えばペニシリン投与が不可能な場合）、グジュロー・カートイド症候群、ライム病、腺ペスト、歯周病、呼吸器官の感染（例えば肺炎）、ＨＩＶ（例えばＨＡＡＲＴに対するアジュバントとして）、ロッキー山発疹熱、梅毒（例えばペニシリン投与が不可能な場合）、尿道感染、直腸感染、子宮頚管感染、上部呼吸器管感染（例えば化膿連鎖球菌、肺炎連鎖球菌および好血菌インフルエンザによって生じる）、下気道感染（例えば化膿連鎖球菌、肺炎連鎖球菌、マイコプラズマ肺炎、皮膚および軟部組織感染によって生じる（例えば化膿連鎖球菌、黄色ブドウ球菌によって生じる）、リケッチアによって生じる感染（例えばロッキー山発疹熱、発疹チフス群感染、Ｑ熱、リケッチア痘瘡）、おうむ病のオウム病（例えばオウム病クラミジアによって生じる）、クラミジアトラコマチスによって生じる感染（例えば合併症のない尿道、子宮頚管、または直腸感染、封入体結膜炎、トラコーマ、性病性リンパ肉芽腫等）、鼠径部肉芽腫（例えばカリマトバクテリウム属肉芽種症によって生じる）、回帰熱（例えばボレリア属によって生じる）、バルトネラ症（例えば杆菌状バルトネラによって生じる）、軟性下疳（例えば軟性下疳菌によって生じる）、ツラレミア（例えば野兎病菌によって生じる）、斑（例えばペスト菌によって生じる）、コレラ（例えばビブリオ菌コレラによって生じる）、カンピロバクターフィタス感染、腸アメーバ症（例えば赤痢アメーバによって生じる）、尿路感染（例えば感染しやすい大腸菌株、クレブシエラ等によって生じる）、感染しやすいグラム陰性の有機体（例えば大腸菌、エンテロバクター属腸菌、赤痢菌属、アシネトバクター属、クレブシエラ属、およびバクテロイデス属）によって生じる感染、重度の座瘡等を含むがこれらに制限されない１つ以上の疾患、兆候、症状、および障害の治療、症状の軽減および／または防止を提供する。いくつかの実施形態において、特に、非常に安定しているナノダイヤモンド等の不活性物質に迅速に結合できる場合、および、必要であれば、単純な遠心分離プロセスによって容易に除去できる場合に、本発明の組成物および方法は、可溶性薬剤の水の可溶化を必要とする非生物学的プロセスにも関連する。生物学的応用のために、ナノダイヤモンドは、泌尿器系を介して、生体内で除去できることが示されており、これは、それらの生体敏感性（ｂｉｏ−ａｍｅｎａｂｉｌｉｔｙ）を確認する。
【００２６】
（ＩＩ．ナノダイヤモンド核酸複合体）
本発明は、保存の機能によって核酸放出を可能にするナノダイヤモンド核酸複合体を提供する。一定の実施形態において、かかる複合体は、非ウィルス遺伝子送達ベクトルとして役立つ。かかるＮＤ核酸複合体を、例えば、癌、炎症、自己免疫疾患、創傷治癒、痛み、神経障害、および他の種類の障害を含む幅広い範囲の医学的障害に利用してもよい。低分子量ポリエチレンイミン（例えばＰＥＩ８００）によってＮＤ表面を官能基化することにより、ＤＮＡプラスミドは、細胞移入の際に放出されることができ、一方で、官能基化ステップなしに、ＤＮＡは（物理吸着により）ＮＤへ結合できるが、放出できないことが示された。ＮＤ核酸複合体を、例えば、癌、炎症、痛み、瘢痕化／創傷治癒、感染、および糖尿病インシュリン送達の治療、および遺伝子治療タイプのアプローチによって治療を可能にする他の障害において使用してもよい。
【００２７】
（ＩＩＩ．アルカリ感受性のナノダイヤモンドタンパク質複合体）
本発明は、例えば、アルカリ環境内のタンパク質の脱着を可能にするナノダイヤモンドタンパク質複合体を提供する。本発明の実施形態の開発において実施された作業は、ｐＨ依存タンパク質放出（例えば糖尿病治療ならびに創傷治癒における応用のための）を可能にするナノダイヤモンド（ＮＤ）インシュリン複合体の開発によって、本発明の例を示す。これは、皮膚火傷の後、インシュリンが、感染、主な合併症を防ぐために直ちに投与されることを示すことから、重要である。さらに、火傷の後の皮膚のｐＨレベルが基本レベル（例えば１０−１１）に達する可能性があることが示されている。本発明の実施形態の開発において実施された作業は、かかる複合体は、ｐＨレベルにおいて選択的にインシュリンを放出できるが、放出されていないインシュリン機能は、送達されるまで封鎖されることを示している。タンパク質がインシュリンである場合等の、一定の実施形態において、ＮＤタンパク質複合体は、とりわけ、創傷治癒、感染、および糖尿病インシュリン送達の治療に使用される。
【００２８】
関連付けられた合併症を低減させながら治療影響を最大限にするための薬物送達の強化された方法が強く求められている。系統的な治療は、体への薬物暴露の広範囲の使用に関して種々の問題を引き起こし、治療の利点を上回る有害な副作用につながりかねない。薬物組織の相互作用を制限するための薬物送達の効果的な標的化および制御が、望ましい成果である。このため、部位特異的薬物放出は、癌から心血管疾患治療までの範囲の多数の病気について非常に有利である。ナノ医薬品における最近の進歩（例えば画像作成および診断［１−３］、薬物送達［４−１０］および遺伝子治療［１１−１３］）は、薬物濃度の低減、標的放出、減退した合併症および生体適合性［３、１４−１６］を含む、ナノ粒子治療法の利点を示した。
【００２９】
多くの研究により、化学薬剤、有機分子およびタンパク質［２９、３３、３４］を含む、ＮＤへの一時的な連結剤または結合剤および治療分子の有効性が示されている。ＮＤ［８、９］の薬物放出特性に関して最近、研究が行われたが、タンパク質系薬物の放出に関しては化学的な調査はほとんど行われていない。タンパク質系薬物の例は、サイトカイン、単クローン性抗体、ホルモンおよび凝固因子を含み、これらはすべて、将来性が大きい、または標的薬物送達性について実証されている。
【００３０】
薬物送達における高い特異性は、治療薬を局地的に濃縮し、負の副作用を低減することにより、系統的な溶出方法における向上を目的とする。以下の例２に記載されるように、ウシインシュリンは、水溶液における物理的吸着を介して、爆轟されたナノダイヤモンドに非共有結合され、水酸化ナトリウムのアルカリ性環境においてｐＨ依存脱着を実証した。ＮＤへのインシュリン吸着は、ＦＴ−ＩＲ分光法およびゼータ電位計測によって確認され、一方で、吸着および脱着の両方は、タンパク質検出分析を使用して定量化された、ＴＥＭ画像作成によって視覚化され、タンパク質機能は、ＭＴＴおよびＲＴ−ＰＣＲによって実証された。４：１の比率でインシュリンと組み合わせられたＮＤは、それぞれ、ｐＨが中性およびアルカリ性の溶液における７９．８±４．３％吸着および３１．３±１．６％脱着を示した。さらに、ＮａＯＨ（ｐＨ１０．５）および中性の溶液における５日間の脱着分析は、それぞれ、４５．８±３．８％および２．２±１．２％脱着を生じさせた。ＭＴＴ生存率分析および数量的ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｓ１およびＣｓｆ３／Ｇ−ｃｓｆ遺伝子の発現）からは、結合したインシュリンがアルカリ媒介脱着まで非活性のままであることが明らかである。このため、本発明は、実証された調節可能な放出および保存活性による、治療的タンパク質ＮＤ複合体を利用する、持続的薬物放出、創傷治療および画像作成の応用を提供する。
【００３１】
〔実施例〕
以下の例は、特定の例示的な本発明の実施形態を提供するために示されており、その範囲を制限することを意図されているのではない。
【００３２】
〔実施例１：可溶性ナノダイヤモンド薬物複合体〕
この例は、可溶性ナノダイヤモンド薬物複合体の調製および試験について記載する。
【００３３】
（ＮＤ薬物複合体調製）
ＤＭＳＯに懸濁したＮＤ（２０ｍｇ／ｍｌ）、ＮＤ：プルバラノールＡ（１０：１の比率、２０ｍｇ／ｍｌＮＤ、２ｍｇ／ｍｌプルバラノールＡ）、およびプルバラノールＡのみ（２ｍｇ／ｍｌ）の試料が調製された。ＤＭＳＯ混合物は、ＮＤおよび薬物の種々の混合物で、５％ＤＭＳＯ溶液を作成するために、水で２０倍に希釈された。
【００３４】
ＮＤ：４−ＯＨＴ複合体を調製するために、１ｍｇ４−ＯＨＴが、脱イオン化水内の１７４ｍＭ酢酸において可溶化された。ＮＤ（１０ｍｇ／ｍｌ）は、４時間、超音波分解され、４−ＯＨＴ試料に添加されて渦混合器で混合され、ＮＤ：４−ＯＨＴ共役溶液（５ｍｇ／ｍｌＮＤ、０．５ｍｇ／ｍｌ４−ＯＨＴ）を生じさせた。溶剤のみ（１７４ｍＭ酢酸）、ＮＤのみ（５ｍｇ／ｍｌ）、および４−ＯＨＴのみ（０．５ｍｇ／ｍｌ）溶液が、対照として調製された。
【００３５】
（薬物吸着／脱着のＵＶ−Ｖｉｓ分光光度特性化）
走査の前に、すべての試料は、それぞれ、４−ＯＨＴおよびＮＤについて、５０μｇ／ｍｌおよび５００μｇ／ｍｌの濃度に希釈された。すべての試料は、２５℃で、２時間、１４，０００ｒｐｍで遠心分離され、ここで、上清は、２００ｎｍから６００ｎｍへ分光スキャンのために、以降、回収された。薬物負荷濃度は、初期の吸収度読み取りで構成されるＮＤ複合体プルダウン実験によって決定され、２５℃および１４０００ｒｐｍでのすべての試料の２時間の遠心分離後、最終的な吸収度読み取りが行われた。次いで、負荷をかけられた薬物濃度が、初期および最終的な読み取りの間の差を計測することによって計算された。
【００３６】
（透過電子顕微鏡法）
ＴＥＭは、ＮＤ：４−ＯＨＴ溶液を超音波分解し、炭素ＴＥＭ格子（Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ）へ、液滴をピペット注入することにより、実行された。２時間の乾燥後、ＪＥＯＬ２１００Ｆの電界放射電子銃ＴＥＭが、高電圧２００ｋＶの画像作成のために用いられた。本来のＮＤ試料が、同じプロトコルにより、さらに画像作成された。
【００３７】
（粒子サイズおよびゼータ電位計測）
複合体の粒子サイズおよびゼータ電位が、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて計測された。ＮＤ：４−ＯＨＴおよびＤｅｘ−ＮＤ複合体が、以前に記載されたように、２５％の水性ＤＭＳＯ内に調製された。ＮＤ：プルバラノールＡ複合体は、以前に記載されたように、５％の水性ＤＭＳＯ内に同様に調製された。ＮＤおよびすべての複合体における治療薬の最終的な濃度は、それぞれ、１ｍｇ／ｍＬおよび０．１ｍｇ／ｍＬであった。すべてのサイズ計測は、９０°散乱角において２５℃で実行された。平均流体力学直径は、１１回の計測の累積分析により得られた。ゼータ電位計測は、２５℃において毛細血管内ウェルを用いて実行され、平均電位が、１５回の計測の累積分析によって得られた。
【００３８】
（ＤＮＡ断片化分析）
水における５％ＤＭＳＯの１：１０の希釈、水における５％ＤＭＳＯ内のＮＤ（１ｍｇ／ｍｌ）、水における５％ＤＭＳＯ内のＮＤ：プルバラノールＡ（１０：１の比率−１ｍｇ／ｍｌＮＤ、０．１ｍｇ／ｍｌプルバラノールＡ）、および水における５％ＤＭＳＯ内のプルバラノールＡ（０．１ｍｇ／ｍｌ）が、ＨｅｐＧ２組織培養細胞に添加され、２４時間、生育された。培養された細胞は、５００μＬの溶解緩衝剤（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００）内に溶解された。３７℃での３０分の培養後、別のＲＮａｓｅ  ＡおよびプロテイナーゼＫ処理が行われた。フェノールクロロホルム抽出後、核ＤＮＡがイソプロピルアルコールにおいて単離され、−８０℃で、一晩保存された。次いで、試料がＤＥＰＣ水に再び懸濁され、その後、７０％エタノールが、０．８％アガロースジェルを使用して洗浄および電気泳動され、最後に、臭化エチジウムによって着色された。
【００３９】
（ＭＴＴ細胞生存率分析）
ＭＣＦ−７細胞は、７５ｕｇ／ｍｌのＮＤを含有するｐＨ７．１ＭＥＭ／ＥＢＳＳ培地、またはＮＤ：４−ＯＨＴ複合体（７５ｕｇ／ｍＬのＮＤ、７．５ｕｇ／ｍＬの４−ＯＨＴ）の９６ウェルプレート内の５０％合流点へプレートされた。７．５ｕｇ／ｍＬ４−ＯＨＴは、陽性対照として使用された。すべての試料は、４−ＯＨＴ  ＮＤ複合体溶液に関連付けられた１．３１ｍＭ酢酸から成る。培養は、製造業者の規定（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に従い、ＭＴＴ系の細胞生存率分析を実行する前に、４４時間、３７℃、５％のＣＯ２で維持された。吸収度は、Ｓａｆｉｒｅ  ｍｕｌｔｉｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ（Ｔｅｃａｎ）およびＭａｇｅｌｌａｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｔｅｃａｎ）を用いて、５７０ｎｍで決定された。すべての試料は、３つ実行された。
【００４０】
（結果）
ＮＤは、以前記載されたように［２２，２６］、合成、精製、および処理された。フーリエ変換赤外線分光法（ＦＴＩＲ）計測は、汚染物質［２６］を除去するための精製プロセスにおける酸性治療の結果として沈着した表面上のカルボキシル基の存在を確認した。カルボキシル基の有用性は、薬物が外部刺激の際に最終的に放出できるように、物理吸着または静電相互作用によって、ＮＤが薬物分子に接続できる能力に貢献すると仮定された。この例において、この仮説は、機能性分析に加え、多くの薬物ＮＤ画像作成および特性化実験、および薬物ＮＤ界面接続の分析のＵＶ−Ｖｉｓによって確認された。
【００４１】
肝臓癌の化学療法としてのその非常に大きい可能性のため、プルバラノールＡは、ＮＤを有する複合体にとって理想的な薬物であった。ＤＭＳＯに可溶性のプルバラノールＡは、細胞サイクル連鎖を中断可能な、サイクリン依存キナーゼ阻害因子である。菌、つまり、多くの場合、癌において連続的に発現する主要遺伝子を過剰に発現する細胞系において、死を促進することが示されている。細胞増殖における菌の役割のため、その過剰発現または突然変異は、多くの場合、癌を発生させる。４−ヒドロキシタモキシフェン（４−ＯＨＴ）、不水溶性乳癌治療薬が、エストロゲン関連の癌に対する有効性の実証のために、別のモデル薬物系として選択された。最後に、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）が、適用可能な他の生理学的条件の中でも、ステロイド性抗炎症薬としてのその幅広い臨床的関連性のため、さらなる薬物モデルとして選択された。すべてのＮＤ薬物複合体は、水において迅速に分散可能であることが実証され、拡張可能で、不水溶性の治療的化合物送達薬剤として、ＮＤプラットフォームの潜在的な適用性を示している。
【００４２】
ＮＤの移入による可溶性の変化を試験するために、ＤＭＳＯに懸濁したＮＤ（２０ｍｇ／ｍｌ）、ＮＤ：プルバラノールＡ（１０：１の比率、２０ｍｇ／ｍｌＮＤ、２ｍｇ／ｍｌプルバラノールＡ）、およびプルバラノールＡのみ（２ｍｇ／ｍｌ）の試料が比較された。ＤＭＳＯ混合物は、ＮＤおよび薬物（図１Ａ−１Ｃ）の種々の混合で５％のＤＭＳＯ溶液を作成するように、水で２０倍に希釈された。水での希釈後、プルバラノールＡは、溶液から沈殿し、混濁液を生成した（図１Ｃ）。ＮＤの存在は、溶液内の遊離型プルバラノールＡの低減を示唆する、おそらくは効率的な薬物吸着によるＮＤ表面へ、プルバラノールＡ水溶液の濁度を大幅に低減する。ＮＤおよび治療薬の間のこの表面接続は、この研究における多数の種類の薬物（例えばドキソルビシン、４−ヒドロキシタモキシフェン、デキサメタゾン等）について確認されている。本発明を理解または実行する必要はない、また、本発明を制限するのではないが、物理吸着が、プルバラノールＡおよびＮＤの間の主な相互作用であると仮定されている。塩の添加および除去によるこの相互作用の調製により、小分子放出の可能性が以前に実証されている。２６プルバラノールＡとＮＤの接続面の可逆的な性質のために、複合体は、水において最初に薬物を分散させ、その以降の放出を促進させるための有利なプラットフォームとして役立つ。
【００４３】
４−ヒドロキシタモキシフェン（４−ＯＨＴ）は、エストロゲン受容体（ＥＲ）陽性乳癌のトリフェニルエチレン（ＴＰＥ）治療戦略としてのその重要性から、ＮＤ薬物錯化のための第２の治療として選択された。４−ＯＨＴは、エタノールにおいて可溶性であり、多くの場合、他の薬物によって非特異的影響が生じることができる、系統的な投与および治療によって、乳房への局部的な活性のために処方される。４−ＯＨＴ投与は、乳房［３７−４０］への新たな原発腫瘍の移入を防ぐことで、局部的再発のリスクを低減することが示されている。
【００４４】
水における４−ＯＨＴ溶解性のＮＤ媒介の向上は、プルバラノールＡ（図１Ｄ−１Ｆ）で行われた界面試験と同様の、２５％のＤＭＳＯ内にＮＤ、４−ＯＨＴ、およびＮＤ：４−ＯＨＴ試料を含むバイアルによって、視界の度合いを観察することにより、質的に検査および確認された。さらに、ＮＤ：４−ＯＨＴの界面接続を視覚的に確認するために、結合した４−ＯＨＴを有する、および有しないＮＤの透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像が比較された（図１Ｇ−１Ｈ）。ＮＤ溶液（図１Ｈ）への薬物の添加の際に不定形の４−ＯＨＴ残留物が存在したことが、明確に観察された。
【００４５】
さらに、ＮＤ：４−ＯＨＴ界面接続が、ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度分析（図２）に結合されたＮＤプルダウン分析によって質的に確認された。錯体形成されていないＮＤの波長走査は、ＮＤの大部分が遠心分離の際にペレット化したことを明らかにし、上清（図２Ａ）においてＮＤ残留物はほとんど残っていない。対照的に、錯体形成されていない４−ＯＨＴの同様の制御分析が、遠心分離の前後に実行された。ＵＶ−Ｖｉｓ吸収度におけるわずかな変化は、ＮＤが存在しない場合に、遠心分離にもかかわらず上清内に同じ量の自由４−ＯＨＴが残留したことを実証した（図２Ｂ）。この読み取りは、遠心分離のために錯体形成されていない４−ＯＨＴ分散の変化を特徴付けるための対照として役立った。したがって、これは、ＮＤ：４−ＯＨＴ複合体が遠心分離の際にペレット化し、錯体形成されていない４−ＯＨＴが、上清内の４−ＯＨＴ濃度の低下を生じさせる上清内に残留することを論理的にフォローする。この共役スキームは、ＮＤおよび４−ＯＨＴの対照と同じ条件および濃度（図２Ｂ）における遠心分離の前後に、ＮＤ：４−ＯＨＴ溶液のＵＶ−Ｖｉｓ脱着を計測することにより、試験された。この実験は、大量の４−ＯＨＴが、おそらくはＮＤ：４−ＯＨＴの物理吸着およびクラスタ化によって、ＮＤと共にプルダウンされたことを示す、遠心分離されていないおよび遠心分離されたＮＤ：４−ＯＨＴ試料の間の吸収度の大きな変化を明らかにした。これらのデータは、ＮＤが、４−ＯＨＴのみと比較して、２５％ＤＭＳＯにおける４−ＯＨＴの溶解性を高めるという観察結果を確認する。同じクラスタ化の影響が、ＦＩＴＣ標識Ｄｅｘ−ＮＤ複合体（図２Ｃ）を使用してプルダウン分析内で観察された。
【００４６】
本発明は、特定のメカニズムに制限されるものではなく、メカニズムの理解は本発明を実施するために必要ではないが、プルバラノールＡおよびＮＤの間の相互作用と同様に、４−ＯＨＴおよびＮＤの間の相互作用は、さらに、主に、本質的には物理吸着および／または静電に起因するものと考えられる。４−ＯＨＴの構造から存在する電位双極子の結果として、表面カルボキシル基の存在が、ＮＤ：４−ＯＨＴ隔離を保存するために２つの構成要素の間の界面作成に貢献することができたであろう。
【００４７】
ＮＤおよび各治療薬の間の静電相互作用の物理的効果を決定するために、複合体の粒子サイズおよびゼータ電位が、動的光散乱（ＤＬＳ）によって検査された（図３）。３つの薬物のうちの溶解性の欠如は、最終的に、ＤＭＳＯから水の滴定の際の粒子凝集によるものである。５％のＤＭＳＯにおいて、ＮＤは、４６．９６ｎｍの平均直径を有し、プルバラノールＡ、４−ＯＨＴ、およびＤｅｘは、それぞれ、３４０μｍ、４８５．１ｎｍ、および１．２４５μｍの粒子に凝集した。ＮＤが錯化する際に、平均のプルバラノールＡ、４−ＯＨＴ、およびＤｅｘ、粒子のサイズは、それぞれ５５６ｎｍ、２７８．９ｎｍ、および７７．５５ｎｍ（図３Ａ−３Ｃ）に低減した。試験されたすべての薬物の粒子サイズの低減が、ＮＤの粒子の表面への薬物分子の物理吸着の証拠である。これらのデータは、ＮＤに関連付ける薬物分子の能力を実証し、その結果として、粒子サイズの顕著な低減、場合によっては、けたちがいな低減が生じる。さらに、各薬物のゼータ電位は、ＮＤとの関連付けの際に、より正となることが示された（図３Ｄ−３Ｆ）。この増加したゼータ電位は、中性の分子と比較して、荷電した複合体の周囲に水和シェルを形成するためのより大きな親和性を有する水分子のため、水中でのＮＤ薬物複合体の増加した溶解性に貢献する。
【００４８】
さらに、実証されている増加した薬物溶解性は、粒子がより小さく、かつ、わずかに正に荷電した場合に細胞内在化が強化されることが示されているため［４１−４２］、増加した治療有効性に関する潜在的な臨床的利点をさらに有し得る。両方の特性は、負に荷電したプラズマ膜における内在化に有利であり、飲食作用および飲作用による薬物摂取を促進し得る。
【００４９】
ＮＤ錯化による水における強化された分散後の薬物官能性を査定するために、プルバラノールＡ−誘導ＤＮＡ断片化（図４Ａ）を確認するように、ＤＮＡラダリング分析が実行された。断片化は、ＮＤ：プルバラノールＡおよびプルバラノールＡの試料の両方において明らかであり、ＮＤへの隔離およびＮＤからの放出を実行後、プルバラノールの保持された生物学的活性を示した。このため、分析は、水溶液において水に溶けにくい薬物を分散させるだけでなく、さらに、プルバラノールＡの治療活性を維持するための、ＮＤの能力に対して証明した。
【００５０】
さらに、ＮＤ：４−ＯＨＴ複合体の化学療法の効果が、ＭＴＴ細胞生存率分析（図４Ｂ）によって評価された。図４Ｂは、ＮＤの報告された生体適合性を確認する、ＮＤによるおよびＮＤなしのＭＣＦ−７培養の間の細胞生存率の顕著な差がないことを示す。さらに、ＮＤ：４−ＯＨＴ複合体および４−ＯＨＴの陽性対照の間の細胞生存率の比較は、ＮＤ：４−ＯＨＴ複合体が、薬物のみとしての化学療法効力と同じ大きさを有することを実証する。ＮＤ：４−ＯＨＴ複合体への暴露は、陰性対照およびＮＤ培養に対して７倍以上、細胞生存率を下げた。最も重要なことには、これらの観察により、包括的に、ＮＤの、薬物機能性を維持しながら、水溶性のＮＤ：４−ＯＨＴ複合体の形成により、水における４−ＯＨＴ分散を増加させる能力を確認する。
【００５１】
この例は、水に溶けにくい治療薬の水分散を高めるためのＮＤの応用を実証している。プルバラノールＡおよび４−ＯＨＴ／デキサメタゾンが、それぞれ、ＤＭＳＯおよびエタノールにおいて特徴的に可溶性であるために、モデル薬物として選択された。さらに、幅広く関連するサイクリン依存キナーゼ阻害因子／化学療法薬としてのプルバラノールＡおよび強力な乳癌薬物としての４−ＯＨＴの機能性のため、それらの向上した水溶解性がは、臨床的領域へのそれらの継続的な転換を触媒する。ＮＤは、水におけるそれらの懸濁を可能にするための疎水性薬物による迅速かつ高スループットの複合体形成および臨床的関連の応用を可能にする、医学的に重要なナノ材料類を示した。このため、ＮＤは、維持された生体適合性によるこれらの薬物の容易な送達を促進できる拡張可能プラットフォームとして機能する。
【００５２】
〔実施例２：アルカリ感受性のナノダイヤモンドタンパク質複合体〕
本例は、ナノダイヤモンドタンパク質複合体の調製および試験について述べる。
【００５３】
（細胞培養）
マウス細胞系ＲＡＷ２６４．７マクロファージおよび３Ｔ３−Ｌ１線維芽細胞（ＡＴＣＣ  Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）は、３７℃において、５％のＣＯ２内に、それぞれ１０％のＢＳ（ＡＴＣＣ）および１０％のＣＢＳ（ＡＴＣＣ）を含有する１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｅａｓｔ  Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ，ＮＪ）により、ＤＭＥＭ（Ｃｅｌｌｇｒｏ，Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）内に維持された。３Ｔ３−Ｌ１線維芽細胞は、９０％の密集度に達するまで、１０％ＣＢＳで補完されたＤＭＥＭにおいて培養され、一方で、含脂肪細胞分化が、以前に確立されたプロトコル［３５、３６］に従って開始した。培地は、ＤＭＥＭ、１０％のＦＢＳ、０．８６μＭのインシュリン、０．２５μＭのデキサメタゾンおよび０．５ｍＭのイソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で、４日間、取り替えられ、２日目に培地を新しくした。培地は、４日目に、ＤＭＥＭ、１０％のＦＢＳおよび０．８６μＭのインシュリンで取り替えられ、再び、６日目に、さらに４日間、ＨＤＭＥＭ、１０％のＦＢＳで取り替えられた。細胞は１０日目に完全に分化し、以降、ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンで培養された。
【００５４】
（ＮＤインシュリン複合体の形成）
水に分散されたナノダイヤモンド（ＮａｎｏＣａｒｂｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｎａｇａｎｏ，Ｊａｐａｎ）が、ＮＤ集合体をさらに分散するように、４時間（１００Ｗ、ＶＷＲ１５０Ｄ  Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）、超音波処理が行われた。水性インシュリンが様々な比率でＮＤ溶液へ添加され、物理的吸着によるＮＤへのインシュリン結合を促進するために、完全に混合された。
【００５５】
（タンパク質特性化）
ＦＩＴＣ標識インシュリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）が、１ｍＭの原液に溶解された。試料は、約４９４ｎｍ（ピークは溶剤によって変化する）のピーク吸収度で、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＤＵ７３０ＵＶ／ｖｉｓ分光光度計（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）を用いて計測された。酢酸（ｐＨ３）内に溶解され、１ｍＭのＮａＯＨで中性化されたウシインシュリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）は、ＦＩＴＣインシュリンからの結果を補完するように使用された。タンパク質検出は、Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡタンパク質分析キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して実行され、５６２ｎｍの吸収度を計測した。
【００５６】
（ＦＴ−ＩＲおよびＴＥＭ特性化）
インシュリンに対し４：１の比率のＮＤが調製され、１４，０００ｒｐｍで２時間遠心分離され、上清が除去された。ＮＤインシュリンペレットは、水で清浄され、真空下で乾燥された。個別のＮＤおよびインシュリン試料が、各溶液の脱水化によってさらに調製された。さらに、ｐＨ１０．５に調整した１ｍＭのＮａＯＨをＮＤインシュリンに添加し、１４，０００ｒｐｍで２時間遠心分離し、ＮＤペレットを解離することで、ＴＥＭ画像作成のために、ＮａＯＨ処理したＮＤインシュリンの試料を調製した。試料は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｎｉｃｏｌｅｔ  Ｎｅｘｕｓ  ８７０  ＦＴ−ＩＲ分光計およびＨｉｔａｃｈｉ  Ｈ−８１００ＴＥＭ（Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，ＣＡ）を使用して、室温で特性化された。
【００５７】
（ＤＬＳ分析）
試料の流体力学サイズおよびゼータ電位が、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）によって計測された。ＮＤおよびインシュリンは、以前記載されているように調製された。簡単に、粒子が、５０ｍｇ／ｍＬの濃度で、対応するｐＨで、緩衝剤に懸濁された。サイズ計測は、２５℃および１７３°の散乱角で実行された。平均流体力学直径が、累積分析によって決定された。ゼータ電位計測は、自動モードでひだ状の毛細血管内細胞を使用して実行された、水性媒体内の微粒子の電気泳動移動度に基づいた。
【００５８】
（インシュリン吸着および脱着）
ＮＤへのインシュリン吸着の決定が、遠心分離の前後に、タンパク質検出分析によって実行された。インシュリンは、ＮＤ懸濁へ添加され、２時間、１４，０００ｒｐｍで遠心分離され、生成された溶液が抽出および定量化された。脱着されたインシュリンの検出は、懸濁しているＮＤインシュリン試料に対し、様々なｐＨに調整された、１ｍＭのＮａＯＨのアルカリ溶液を添加することにより、実行された。結合の比率は、吸着試験と同様に決定された。
【００５９】
さらに、累積インシュリン放出を決定するために、５日脱着試験が実施された。試料は、ＮＤおよびインシュリン（４：１の比率）を組み合わせ、１４，０００ｒｐｍで２時間遠心分離し、吸着されていないインシュリンを除去するために残留溶液を抽出することにより、調製された。以降、ｐＨ１０．５に調整された１ｍＭのＮａＯＨ溶液は、ＢＣＡ分析を利用してタンパク質濃度を決定するように、試料に添加され、完全に混合され、２４時間後に遠心分離された。アルカリ媒介放出に加えて、水が、別個の試料の組に添加された。各条件の各計測後に試料がＮａＯＨまたは水で補給され、５日にわたって、２４時間毎にプロセスが繰り返された。
【００６０】
（ＭＴＴ細胞生存率分析）
ＲＡＷ２６４．７マウスマクロファージが、９６ウェルプレートでプレートされ、８時間血清飢餓され、２４時間培養された。飢餓後の培地は、以下の条件、つまり、ＤＭＥＭ、０．１μＭのインシュリン、１μＭのインシュリン、ＤＭＥＭ１０％のＦＢＳ、ｐＨ１０．５でＮａＯＨによってＮＤインシュリン複合体から放出された約０．１μＭのインシュリン（インシュリンは培地に存在する）、水における遠心分離されたＮＤインシュリンから生成された溶液、ｐＨ１０．５（１μＭ全インシュリン、ＮＤインシュリン複合体が培地に存在する）でＮａＯＨで処理したＮＤインシュリン、およびＮＤインシュリン（１μＭの全インシュリン、ＮＤインシュリン複合体が培地に存在する）で構成された。ＮａＯＨ内に吸着されたインシュリンでＮＤの試料を遠心分離し、０．１μＭのインシュリンに対して培地で再構成できる、生成溶液を抽出することにより、ＮＤから放出されたインシュリンが調製された。同様に、関連する脱着分析の中性の溶液として水が利用された。全量の１０％に相当する、臭化メチルチアゾリルジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ）溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）が添加され、３時間培養された。ホルマザン結晶形成の後、培地が除去され、ＭＴＴ溶剤、無水イソプロパノール内の０．１Ｎ  ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）が、ＭＴＴ着色剤を可溶化するために試料に添加された。試料の吸収度計測は５７０ｎｍであり、６９０ｎｍの波長のバックグラウンドから成る。
【００６１】
（数量的ＲＴ−ＰＣＲ）
ＲＴ−ＰＣＲ手順は、以前に記載されたように実施された［３５］。３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞は、６ウェルプレートにおいてプレートされ、４時間血清飢餓され、次いで、ＤＭＥＭの溶液媒体、０．１μＭインシュリン、ＮａＯＨ（ｐＨ１０．５）によってＮＤインシュリンから放出された約０．１μＭのインシュリン、ｐＨが中性の水における遠心分離されたＮＤインシュリン、ＮａＯＨで処理したＮＤインシュリン（１μＭの全インシュリン）およびインシュリンと結合したＮＤ（ＮＤインシュリン、１μＭの全インシュリン）からの生成溶液の、媒体溶液で、回収された。ＤＭＥＭ、インシュリン、ＮＤおよびＮａＯＨ含有の溶液媒体の調製は、ＭＴＴ分析で実行されるものと同様に実施された。ＲＮＡ解離は、遠心分離によって遺伝子材料を取得するように、トリゾール試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）によって細胞を溶解し、クロロホルムに添加することで、完了した。ｃＤＮＡ合成は、ｉＳｃｒｉｐｔ  Ｓｅｌｅｃｔ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｈｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して実行された。Ｉｎｓ  １およびＣｓｆ３／Ｇ−ｃｓｆ遺伝子（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）のＰＣＲ発現は、ＳＹＢＥＲ  Ｇｒｅｅｎ検出試薬（Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて、ＭｙｉＱ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｏｌｏｒ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲマシン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）によって定量化された。Ｒｐｌ３２遺伝子（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、試料の中でもｃＤＮＡの正規化のハウスキーピング遺伝子として役立った。遺伝子のプライマ連鎖は、次のように与えられた。Ｉｎｓ１，５’−ＡＧＧＴＧＧＣＣＣＧＧＣＡＧＡＡＧ−３’（配列番号：１）および５’−ＧＣＣＴＴＡＧＴＴＧＣＡＧＴＡＧＴＴＣＴＣＣＡＧＣＴ−３’（配列番号：２）、Ｃｓｆ３／Ｇ−ｃｓｆ，５’−ＣＣＡＧＡＧＧＣＧＣＡＴＧＡＡＧＣＴＡＡＴ−３’（配列番号：３）および５’−ＣＧＧＣＣＴＣＴＣＧＴＣＣＴＧＡＣＣＡＴ−３’（配列番号：４）、Ｒｐｌ３２，５’−ＡＡＣＣＧＡＡＡＡＧＣＣＡＴＴＧＴＡＧＡＡＡ−３’（配列番号：５）および５’−ＣＣＴＧＧＣＧＴＴＧＧＧＡＴＴＧＧ−３’（配列番号：６）。
【００６２】
（ＦＴ−ＩＲおよびＴＥＭ）
本発明は、特定のメカニズムに制限されず、メカニズムの理解は本発明の実施に必要ではないが、図９は、それぞれ中性およびアルカリ性の溶液内のインシュリン吸着および脱着の提案されたメカニズムの図を示す。図１０内の透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）画像は、そのままのＮＤ（ａ）、吸着されたインシュリンを有するＮＤ（ｂ）、およびＮａＯＨによる処理後のＮＤインシュリン複合体（ｃ）を示す。（ｂ）において、厚さ約５〜１０ｎｍのＮＤをコーティングする材料の明らかな層が存在する。ＮａＯＨ処理したＮＤインシュリン試料（ｃ）は、質的に、ＮＤ上の材料の減退した層を示し、ＮＤインシュリンのＮａＯＨ処理が、ＮＤ表面上に存在する材料を除去したことを示唆する。フーリエ変換赤外（ＦＴ−ＩＲ）分光法（図１１）は、ＮＤ上のインシュリンの存在を示す。インシュリン（１）、そのままのＮＤ（２）およびＮＤインシュリン（３）の試料が示され、ＮＤインシュリン上のスペクトルピークは、インシュリンと同様の特徴的なピークを示す。
【００６３】
（ＤＬＳ分析）
ＮＤおよびインシュリンの間の相互作用は、動的光散乱（ＤＬＳ）分析によって特性化され、表１にまとめられた流体力学ナノ粒子クラスタサイズおよび多分散指数ならびに図１２に図示されたゼータ電位を明らかにする。平均のＮＤクラスタサイズはｐＨ７および１０．５において同様のままであり、一方で、インシュリンは、ｐＨ１０．５より大きい平均サイズを示した。ＮＤインシュリン複合体は、そのままのＮＤおよび低下した多分散性指数と同程度の平均サイズを実証した。ＮＤは、ｐＨ７および１０．５の両方においてわずかに正のゼータ電位を示し、インシュリンおよびＮＤインシュリンは、負の値を生じさせた。ｐＨ１０．５におけるインシュリンおよびＮＤインシュリンゼータ電位は、実質的に、ｐＨ７において同様の試料よりも負であった。
【００６４】
（吸着）
図９は、中性溶液内のインシュリンがＮＤへの物理的吸着によってどのように結合するかの仮想的な概略を示す。様々な濃度のＦＩＴＣインシュリン試料は、吸着を促進するために、１００μｇ／ｍＬのＮＤと完全に混合された。ＮＤインシュリン（図１３−ａ）の吸収度スペクトルは、ＮＤへのインシュリンの吸着のために、水性インシュリンの吸収度スペクトルとは異なる。しかしながら、ＮＤインシュリン複合体は、インシュリンの存在を定量化するために必要なスペクトル特性を保持する。ＮＤの分子量は、吸着された材料に加え、遠心分離による構成要素の分離を可能にする。残留溶液の分離および分析により、荷重能力およびＮＤからの生成された放出に関するサポートデータが生じる。図１３−ａは、ＮＤ対インシュリンの５：１の比率でのＦＩＴＣインシュリンのタンパク質吸着を示し、これは、水における８９．８±８．５％の結合を示す。ＮＤインシュリンおよびインシュリン試料は、遠心分離の前後で計測され、遠心分離のため、インシュリン試料と比較して、ＮＤインシュリン試料より低いインシュリン濃度が生じた。
【００６５】
ＢＣＡタンパク質分析を実施する標準ウシインシュリンを用いて、同様の試験が実施された。２５μｇ／ｍＬインシュリンの１００μｇ／ｍＬのＮＤ（ＮＤ対インシュリンの比率４：１）への吸着は、インシュリン上の遠心分離のプルダウンの影響を考慮して、７９．８±４．３％結合を示した。図１３−ｂは、遠心分離の前後のＮＤインシュリン試料の吸収度スペクトルを示し、ピーク吸収度は５６２ｎｍであった。遠心分離された試料の吸収度は、初期の試料の吸収度より大幅に低い。
【００６６】
タンパク質結合の比率が、初期および遠心分離された試料の間の吸収度の差を計算し、初期および遠心分離されたインシュリン制御の差を減算することにより、決定された。インシュリン対照は、インシュリンが遠心分離される場合に形成されるわずかな勾配によって考慮する必要がある。
【００６７】
（脱着）
脱着分析が、吸着分析と同様に実施された。ＦＩＴＣ標識および標準インシュリンの水溶液が、それぞれ５：１および４：１の比率でＮＤ懸濁に添加された。初期および遠心分離された試料が計測され、脱着されたインシュリン量が計算された。ｐＨ値８．９０、９．３５、１０．３５および１１．５３で放出されたＦＩＴＣインシュリンを比較すると、最大脱着は、最もアルカリ性が高いｐＨ（図１３−ｃ）で示された。ｐＨ１０．７における別個の試験は、５３．３±１．２％脱着を実現するＮＤインシュリン複合体を示す。ｐＨ７．１、９．３および１０．６におけるＮＤからの標準インシュリン放出は、さらに、１０．６（図１３−ｄ）のｐＨで生じた最も大きい溶出を示した。この脱着特性は、インシュリン放出が、溶液のｐＨへの比例を実証することを示す。ｐＨ１０．５におけるＮａＯＨの存在下の４：１の比率でのＮＤおよびインシュリンで実施された別個の試験は、インシュリンの３１．３±１．６％放出を生じさせた。
【００６８】
図１４は、ＮａＯＨ（ｐＨ１０．５）および水における５日間にわたるＮＤからのインシュリン放出を示す。溶出された累積インシュリンは、吸着された全インシュリンの重量パーセンテージで定量化された。アルカリ性条件（ｐＨ１０．５）から１日目までに放出されたインシュリン量は、０．２±０．１重量％の水の試料のものと比較して、３２．７±１．９重量％であり、２つの試料の間の放出の大きな差が明らかになった。３日目までに、両試料は、横ばい状態になり、インシュリン放出は大きく減少する傾向となり、５日目までに、ＮａＯＨおよび水によって溶出された全インシュリン量はそれぞれ、４５．８±３．８重量％および２．２±１．２重量％であった。これらの値は、水を含有するものと比べ、ＮａＯＨを含有する試料から放出されたインシュリン量は２０倍よりも多いことを示す。
【００６９】
（ＭＴＴ細胞生存率分析）
異なるインシュリンおよびＮＤ条件、つまり、ＤＭＥＭ（１）、０．１μＭのインシュリン（２）、１μＭのインシュリン（３）、ＮａＯＨ（ｐＨ１０．５）によってＮＤインシュリン複合体から放出された約０．１μＭのインシュリン（４）、水において遠心分離されたＮＤインシュリンから生成された溶液（５）、ＮａＯＨで処理したＮＤインシュリン（１μＭの全インシュリン）（６）、インシュリンと結合したＮＤ（ＮＤインシュリン、１μＭの全インシュリン）（７）およびＤＭＥＭ１０％ＦＢＳ（８）における細胞生存率試験が実施された（図１５）。なお、両方のＮＤ含有試料でＮＤに吸着されたインシュリン量は、インシュリンがＮＤ表面から完全に解離する場合に、培地内の１μＭと等しい。０．１μＭ（２）から１μＭ（３）インシュリンへ、より大幅に高い相対生存率が生じ、より高いインシュリン濃度では生存率が増加することが推論される。ＮａＯＨ（４）によりＮＤインシュリンから放出されたインシュリンの相対生存率は、０．１μＭ〜１μＭのインシュリン廼相対生存率の間の相対生存率と同程度である。以前の脱着結果は、生成溶液におけるインシュリンの顕著なレベルを明らかにしているが、水（５）によって脱着されたインシュリンは、０．１μＭのインシュリンの相対生存率と同様の相対生存率を示した。ＮａＯＨ（６）で処理したＮＤインシュリンは、１μＭのインシュリンの相対生存率よりも大きいが１０％のＦＢＳ培地の相対生存率未満である、より向上した相対生存率を実証した。ＮＤインシュリン（７）により、水によって放出されたＤＭＥＭおよびインシュリンと比較して低い相対細胞生存率が生じる。ＮａＯＨで処理したＮＤインシュリンおよびＮＤインシュリン条件において、ＮＤは、ＮＤが存在しない同様の試料と比較して、ＮＤによる細胞相互作用を可能にする、回収期間、培地に存在した。標準的な培地、ＤＭＥＭ（８）における１０％ＦＢＳは、最も高い相対生存率を示した。差異分析（ＡＮＯＶＡ）統計検査が実施され、Ｐ＜０．０１となったが、これは、試料基における顕著な差を示す。
【００７０】
（数量的ＲＴ−ＰＣＲ）
前駆含脂肪細胞分化により、細胞の９０％超（図１６）内の形態変化および脂質小胞形成の観察に基づき、移入後１０日目までに脂肪細胞が生じる。前駆脂肪細胞（ａ）は、はっきりと視覚可能な脂質小胞によって、脂肪細胞（ｂ）とは異なる。脂肪細胞上の放出されたインシュリンの効果が、遺伝子インシュリン１（Ｉｎｓ１）および顆粒球コロニー刺激因子（Ｃｓｆ３／Ｇ−ｃｓｆ）のＲＴ−ＰＣＲによって定量化され、ハウスキーピング遺伝子リボソームタンパク質Ｌ３２（Ｒｐｌ３２）によって正規化される。様々な溶液媒体に対応するＩｎｓ１の相対発現が示される（図１７−ａ）。ＤＭＥＭ（１）と比較して、ＮａＯＨ（３）によって放出されたインシュリンおよびＮａＯＨ（５）で処理したＮＤインシュリンが、最も高い相対発現を示し、これらの条件が、Ｉｎｓ１における最も大きい影響を有することを示す。水（４）およびＮＤインシュリン（６）によって放出されたインシュリンは、インシュリンのみの条件（２）と比較して中程度の発現レベルを生じさせ、これは、Ｉｎｓ１の最も低い発現を示す。Ｃｓｆ３／Ｇ−ｃｓｆ相対発現は図１７−ｂに示され、水（４）によって放出されたインシュリンおよびインシュリン（６）と結合したＮＤは大幅に低いが、ＮａＯＨ（３）によって放出されたインシュリンおよびＮａＯＨ（５）で処理したＮＤインシュリンの両方は、高い発現レベルを実証するという点で、Ｉｎｓ１と同様の傾向を示す。しかしながら、Ｃｓｆ３／Ｇ−ｃｓｆ上の０．１μＭのインシュリンの効果は、Ｉｎｓ１の効果と比較して高かった。ＡＮＯＶＡ統計検査は、Ｐ＜０．０１となり、試料基における顕著な差を示す。
【００７１】
（物理的吸着）
ＮＤ合成中の条件は、水溶液［８、２８、２９］内の特徴的な表面電荷をもたらすことができる、ヒドロキシルおよびカルボキシル基の非常に官能化された親水性の炭素表面を生じさせる。かかる官能基は、陰イオンの末端基（−ＣＯＯ−）およびポリペプチドのプロトン化アミノ基（−ＮＨ３＋）の間の静電引力による、タンパク質の物理的吸着の有利な条件を示す。電荷と電荷相互作用に加え、水素結合は、１０〜３０ｋｃａｌ／ｍｏｌ［３３、３４、３７］の間のエネルギーを結合するＨ結合により、−ＮＨ３＋および−ＣＯＯ−または他のＣＯ含有表面基の間に形成できる。インシュリン分子の外部の荷電したアミノ酸性残留物はその親水性に貢献し、ＮＤ表面に付着できる。インシュリンの等電点は、中性のｐＨにおけるわずかに負の正味電荷を示す、約５．６［３８］であるが、ＮＤ官能基およびアミン生分子の間の静電相互作用およびＨ結合によって、引力のある相互作用が生じ得る。図９は、中性の環境内のＮＤへのインシュリン吸着の概念を仮想的に示す。
【００７２】
ＴＥＭ画像は、そのままのＮＤ（ａ）と比較して、ＮＤ表面をコーティングする材料の視覚可能な層を有する、水性インシュリン（図１０−ｂ）の浸漬後のＮＤを示す。インシュリン（ｂ）の添加は、識別要因にすぎないため、吸着されたインシュリンとして識別される材料層（厚さ５−１０ｎｍ）よりも優先される。図１０に見られるＮＤクラスタは、ＮＤ上の官能基への実質的なインシュリン吸着を可能にする、非常に高い表面エリアを有している。実際に、ＮＤ特性化は、以前に、４５０ｍ２／ｇ［９］の顕著な表面エリアを示していた。ＴＥＭ画像作成は、タンパク質結合の視覚的認識を提供し、吸着は、ＦＴ−ＩＲ分光法によって定量化可能である。ＮＤへのインシュリン吸着は、インシュリン、そのままのＮＤおよびインシュリンと結合したＮＤのＦＴ−ＩＲ特徴化によって検証される（図１１）。特徴的な多種多様のインシュリン（ａ）は、吸着されたインシュリン（ｂ）なしにはＮＤから取得されない定量化可能な結果である、インシュリンと結合した多種多様なＮＤ（ｃ）においてよく見られる。ＴＥＭおよびＦＴ−ＩＲは、ＮＤ表面へのインシュリン吸着のさらなる証拠を提供する。
【００７３】
ＮＤインシュリン複合体のさらなる実体化は、ＵＶ／ｖｉｓ分析によって与えられる。吸着試験は、適した結合能力（生成された溶液における余剰インシュリンの欠如）におけるＮＤのＦＩＴＣインシュリンに対する５：１の比率を明らかにし、８９．８±８．５％の吸着を実証した。遠心分離されたＮＤインシュリン試料（図１３−ａ）に計測可能な吸収度が存在しないことは、ＮＤへの大きなＦＩＴＣインシュリン吸着を表す。初期および遠心分離されたＮＤインシュリン試料の間の４８５ｎｍの吸収度差は、ＮＤの分子量および遠心分離において結合したインシュリンによるＮＤの安定化に起因しており、溶液内には少量の残留インシュリンが残る。初期および遠心分離されたインシュリン制御試料の間のわずかな差は、水溶液に対するインシュリンの分子量が構成要素の分離を可能にすることから、吸着値を正規化するために使用される。図５−ａは、インシュリンの吸収度スペクトルと比較して、ＮＤインシュリンの改変された吸収度スペクトルを明らかにし、インシュリンおよびＮＤインシュリンの吸収度ピークは、４８５ｎｍから５０５ｎｍへ変化している。このピークの変化は、ＦＩＴＣ標識インシュリンがＮＤに吸着する場合の、ＦＩＴＣ分子の最適な特性における変化のためのものであると考えられ、タンパク質構造内の考えられる立体配座の変化は、多くの場合、タンパク質吸着［３９］において観察されることを示す。
【００７４】
同様の結果は、ＮＤ対インシュリン結合の４：１の最適比率を有する標準ウシインシュリン吸着試験から得られた。標準ウシインシュリンのより高い吸着比率は、ＦＩＴＣ標識インシュリンの分子量と比較したインシュリン分子量を考えて、予期される。図１３−ｂは、ＢＣＡタンパク質分析吸収度を示し、実質的な７９．８±４．３％インシュリン吸着に関する初期および遠心分離されたＮＤインシュリン試料のピークについての対照的なピークを明らかにする。
【００７５】
ＦＩＴＣ標識および標準インシュリンを含むインシュリン吸着試験は、タンパク質ＮＤ結合［３４］を検証する以前の調査と合致しており、例外的な吸着機能を示し、インシュリンの約８０％が、最適ＮＤインシュリン比率でＮＤ表面へ結合する。吸着試験によって実証されたＮＤのタンパク質負荷能力は、利用可能なタンパク質の大部分がＮＤ表面に吸着される場合の比較的効率的な薬物負荷プロセスを示唆する。水溶液内の物理的吸着の単純な方法は、薬物または物質の特性に影響を与えかねない共役手順を排除することによる薬物送達調製方法にとって理想的である。
【００７６】
ＮＤおよびインシュリンの間の物理的相互作用が、さらに、動的光散乱（表１）によって特徴付けられた。
【００７７】
【表１】
2012528197.tif 000003
【００７８】
表１は、ｐＨ７および１０．５の流体力学ナノ粒子クラスタサイズおよび関連付けられた多分散指数（ＰＤＩ）のＤＬＳ分析を示す。ＮＤは、両方のｐＨ条件における同様のサイズおよびＰＤＩを示すが、ｐＨ１０．５のインシュリンは、増加したＰＤＩによってより大きい粒子を形成する傾向がある。ＮＤインシュリン複合体の形成の際に、ＰＤＩは低下し、ＮＤは、クラスタの比較的非均一な分布サイズに介在することを示唆する。
【００７９】
インシュリンが、アルカリ溶液内のより大きいサイズへ統合される一方で、ＮＤはｐＨ７および１０．５において同様の流体力学サイズおよび分布のクラスタを形成した。ＮＤによって錯化される際に、多分散指数が低減するだけでなく、クラスタのゼータ電位がさらに負の値に変化した（図１２）。ＰＤＩの低減は、ＮＤインシュリン複合体の形成によって見られるように、インシュリンの形成と比較して、より均一なナノ材料タンパク質複合体のＮＤ媒介発達を示す。ＮＤは、もともと、アルカリ溶液内のわずかに正のゼータ電位を維持していたが、インシュリンは、本質的に、アルカリ溶液においてさらに低減された負のゼータ電位を有していた。このゼータ電位は、ＮＤ表面上へのインシュリン付着を示唆する、ＮＤとの移入の際に保持された。ｐＨ１０．５におけるクラスタのゼータ電位は狭い限られた値の範囲内に存在するため、この結果はさらに検証される。そのままのＮＤおよびＮＤインシュリンの間のゼータ電位の明白な差は、ＮＤおよびインシュリンの間の相互作用を示す。
【００８０】
（ｐＨ媒介脱着）
ＮＤインシュリン複合体からのインシュリンの放出は、水酸化アルカリナトリウム溶液において観察され、ｐＨ修飾によって影響を受ける電荷特性の変化によって説明できる。等電点より上のｐＨの水性環境におけるインシュリンは、官能末端基の電荷の改変のため、負の正味の表面電荷を運搬し得る。以降、負の電荷は、増加したアルカリ性と共に強くなることができ、他の種を有する電荷相互作用に影響する。このため、脱着におけるｐＨの影響は、かなり直接的である。静電相互作用によってＮＤ表面上で荷電された官能基と結合したインシュリン分子および水素結合は、水性環境が中性からアルカリ性へ変わると、改変された電荷特性を表示し始め、したがって、静電反発力によって、ＮＤから放出される。
【００８１】
脱着されたインシュリンの量は、溶液のｐＨに対して比例しているようであり、アルカリ溶液（図１３ｃ−ｄ）における増加したインシュリン放出を示す。ＦＩＴＣ標識インシュリン脱着（図１３−ｃ）の吸収度スペクトルは、ｐＨが８．９０から１１．５３になると、における脱着の増加を表し、標準インシュリンによって同様のパターンが図１３−ｄにおいて表される。これらの結果は、以前記載されたｐＨ依存脱着前提と合致する。ＮａＯＨ内の標準インシュリンの３１．３±１．６％脱着は、インシュリンが、脱着され、ＮＤ表面から水性媒体への以降の放出することが可能であることを実証する。
【００８２】
多くの実用的な応用は時間をかけた薬物放出を必要とし、インシュリンの時間放出を定量化するには、５日の脱着試験が、ＮａＯＨおよび水の両方において結合したインシュリンによるＮＤによって実施された。図１４内の２つの放出曲線間の不均衡は、アルカリ性および中性の溶液の脱着能力の差を例示する。アルカリ性媒介脱着は、５日目までに、水の２．２±１．２％のみと比較して、４５．８±３．８％に達した。脱着の大部分は試験の一日目までに生じ、これはＮＤからのインシュリンの大放出を示唆した。しかしながら、２日目には、中程度のインシュリン放出は生じなかった。インシュリン放出の時間依存度は、ＮＤインシュリン複合体が、アルカリ性環境に暴露される際のインシュリンの遅い放出を可能にする。
【００８３】
（タンパク質機能の維持）
上記で記載した結果は、ｐＨ媒介インシュリン脱着の基礎を確立するが、かかるシステムの実用的利用は、ＮＤ表面からの放出の際の薬物の保持機能に依存する。ＭＴＴ生存率分析およびＲＴ−ＰＣＲから得られたデータは、インシュリン機能が、細胞生存率および遺伝子発現によって示されるように、脱着するように、以降、保存されることを示す。さらに、ＮＤ表面上に封鎖されたインシュリンは、ＮＤインシュリン複合体の存在にもかかわらず、細胞経路に対して非活性のままのようである。
【００８４】
細胞生存率データ（図１５）は、ＮａＯＨおよびＮａＯＨで処理したＮＤインシュリン複合体によって、ＮＤから放出されたインシュリンによる細胞回収の増加を明らかにし、後者は、溶液媒体内のＮＤおよび脱着されたインシュリンで構成される。これらの２つの培地条件における増加した細胞の生存率レベルは、ＤＭＥＭのベースラインと比較して、放出されたインシュリンは、飢餓期間後の細胞回収経路を活性化していることを表す。さらに、ＮａＯＨで処理したＮＤインシュリンの生存率は、放出されたインシュリンおよび、そのままのＮＤ表面を生じさせ得る、または生じさせない場合があるＮａＯＨ処理したＮＤの存在下において、細胞回収が生じることを示す。血清飢餓およびＲＡＷ２６４．７マクロファージ［４０］におけるインシュリン回収を実施する以前の調査は、インシュリン媒介の回収を示す、獲得されたＭＴＴデータと合致する。
【００８５】
水およびＮＤインシュリンによって放出されたインシュリンは、対照的に、低い生存率レベルを生じ、これは、中性の環境においてほとんどまたは全くインシュリン放出がないことを示唆する。ＮＤインシュリン複合体は、吸着されたインシュリンが、ＮＤ表面上に暴露されたインシュリンによって細胞経路に影響を与えることを防いでと思われる。タンパク質は、多くの場合、改変された物理的特性を生じさせる表面［３９］に吸着される場合に、立体配座の変化を実行することが公知であり、ＮＤ表面上のインシュリンの構造の変化は、細胞経路の活性化を防ぐことがある。アルカリ性による媒介までの、可溶性環境からのインシュリンの効果的な隔離が、この系統のインシュリン放出を標的とするための鍵である。
【００８６】
ＲＴ−ＰＣＲからの遺伝子発現は、ＭＴＴ生存率分析からの結果と、密接に相関する。図１７は、含脂肪細胞［３５］のインシュリン刺激によって上方調整される遺伝子Ｉｎｓ１およびＣｓｆ３／Ｇ−ｃｓｆの相対発現を示す。ＮａＯＨによって放出されたインシュリンおよび各遺伝子について増加したＮａＯＨで処理したＮＤインシュリンを含む試料の発現レベルは、ＮＤ表面からの脱着後のインシュリンの効果を実証する。活性インシュリンが存在しない場合、ＤＭＥＭベースラインによって示されるように、発現レベルは増加しない。ＭＴＴの結果と同様に、水およびＮＤインシュリンによって放出されるインシュリンは、各遺伝子について低減した発現レベルを示し、細胞経路を活性化するために、不十分な応答または低減したインシュリン濃度を示す。これは、タンパク質活性が、インシュリン刺激に起因すると考えられる遺伝子発現によって決定されるように、ＮＤから脱着するインシュリンについて保持されることを示す。さらに、吸着されたインシュリンは、ＮＤ表面に結合しているが、細胞生存率または遺伝子発現は増加させない。このように、ＮＤインシュリン複合体は、中性溶液における残留物は安定したまま、アルカリ性環境における標的インシュリン（または他のタンパク質）送達の独自のアプローチを示す。
【００８７】
これらの結果は、さらに、治療目的で拡張可能な観察結果であるＮＤからのインシュリン吸着および溶出がｐＨ依存であることを示す。本発明は特定のメカニズムに制限されず、メカニズムの理解は本発明の実施のために必要ではないが、インシュリン脱着は、おそらくはタンパク質の表面電荷の変化作用によるアルカリ性環境の増加に示され、したがって、ＮＤとインシュリン引力の傾向を低下させる。このｐＨ媒介脱着メカニズムの活用により、向上された薬物送達方法について独自の利点を提供し得る。成長ホルモン［４１−４５］として作用することにより、インシュリンが創傷治癒を加速させることはよく理解されている。さらに、以前の調査により、細菌増殖のため、時には１０．５［４６、４７］もの高いｐＨである、創傷組織のアルカリ度の増加が確認されている。これらの２つの観察結果を考慮すると、ＮＤインシュリン複合体を、創傷治癒の治療の有用な治療薬物送達系として使用してもよい。吸着されたインシュリンによるＮＤの投与は、治癒プロセスを短縮し、アルカリ性創傷エリアにおけるインシュリンの放出により、感染症の発生を低下させることが可能であり得る。インシュリンの系統的な活性化は、インシュリン放出が怪我の部位において発生するため、制限される。このため、本発明は、インシュリン賦形剤としてＮＤを使用する再生治療として、怪我の創傷に方向付けられる標的インシュリン放出メカニズムを提供する。
【００８８】
本発明の実施形態の開発において実施された実験は、単純な物理的吸着によるＮＤへのインシュリンの効率的、非共有吸着を実証し、タンパク質脱着のｐＨ依存を調査した。アルカリ環境へのＮＤインシュリン複合体の暴露は、ＮＤおよびインシュリンの間の相互作用に介在し、タンパク質放出を生じさせる。画像作成方法および吸着／脱着分析から、アルカリ条件におけるＮＤへのインシュリンの効果的な結合および顕著なインシュリン放出が明らかである。ＭＴＴおよびＲＴ−ＰＣＲ分析は、吸着されたインシュリンは大部分が不活性のままである一方での、脱着後の保存の機能を示す。
【００８９】
〔実施例３：ナノダイヤモンド薬物結合分析〕
ナノダイヤモンド薬物結合分析は、幅広い範囲のアントラサイクリンおよびテトラサイクリン化合物の間の強力な相互作用を確認するために、本発明の実施形態の開発において実行された。ダウノルビシン、イダルビシン、およびその他等の治療薬の結合効率が、ＵＶ−ｖｉｓ光度法、ならびに遠心分離分析（図１８〜３９を参照）を使用して分析された。すべての場合において、ナノダイヤモンド薬物相互作用は、治療薬（図１９、２２、２５、２８、３０、３３、３６、および３９を参照）を総合的にペレット化することができ、分光光度分析によってさらに確認された強力な吸着を示した。図１７〜１８、２０〜２１、２３〜２４、２６〜２７、２９を参照、図１７〜１８、２０〜２１、２３〜２４、２６〜２７、２９，１〜３２、３４〜３５、および３７〜３８を参照）。
【００９０】
〔参考文献〕
（Ｉ部（可溶性ナノダイヤモンド薬物複合体）および例１からの参考文献）
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【００９１】
本出願において言及されるすべての刊行物および特許は、参照により、本明細書に組み込まれる。本発明の範囲および精神から逸脱することなく、本発明の記載されている方法および組成物の種々の修正および変形が、当業者には明らかであろう。本発明は、特定の好適な実施形態に関して記載されているが、特許請求される本発明が、かかる特定の実施形態に過度に制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、関連する分野における当業者には自明である、本発明を実施するために記載されている形態の種々の修正は、以下の特許請求の範囲内にあることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】ＮＤは、水にプルバラノールＡおよび４−ＯＨＴを分散させる能力を向上させる。バックグラウンドに対してバイアルが調製され、ＮＤによって行われた濁度の低減が、以下の条件、つまり、Ａ）水における５％のＤＭＳＯ内の１ｍｇ／ｍｌのＮＤ、Ｂ）水における５％のＤＭＳＯ内の１ｍｇ／ｍｌのＮＤ、０．１ｍｇ／ｍｌのプルバラノールＡ、Ｃ）水における５％のＤＭＳＯ内の０．１ｍｇ／ｍｌのプルバラノールＡ、Ｄ）水における２５％のＤＭＳＯ内の１ｍｇ／ｍＬのＮＤ、Ｅ）水における２５％のＤＭＳＯ内の１ｍｇ／ｍＬのＮＤ、０．１ｍｇ／ｍＬの４−ＯＨＴ、Ｆ）水における２５％ＤＭＳＯ内の０．１ｍｇ／ｍＬ４−ＯＨＴにおいて確認された。Ｇ）本来のＮＤのＴＥＭ画像である。Ｈ）４−ＯＨＴ残留物が、ＮＤと薬物の相互作用を確認するために、ＮＤ表面において確認できた。スケールバーは、１０ｎｍを示した。
【図２】ＵＶ−Ｖｉｓは、ＮＤ：４−ＯＨＴおよびＤｅｘ−ＮＤ複合体プルダウンの分光光度分析である。Ａ）遠心分離後のＮＤ試料のＵＶ−Ｖｉｓ分析は、ＵＶ−Ｖｉｓ吸収度の低下を明らかにし、４−ＯＨＴと界面を接続するための薬剤としてＮＤを利用し、ペレット化したＮＤ試料へ薬物を引き付ける能力を確認する。Ｂ）４−ＯＨＴおよびＮＤ：４−ＯＨＴのＵＶ／Ｖｉｓ吸収度の間の比較プロットは、ＮＤおよび４−ＯＨＴの界面接続を示す。溶液における自由４−ＯＨＴは、遠心分離によって水溶液から除去された、ＮＤへの物理吸着の結果として低下した。なお、それぞれ、遠心分離前後の４−ＯＨＴを表す、重複する黒い点線および黒い実線によって示されるように、ＮＤが存在しない場合に、水性上清相から４−ＯＨＴを分離することへの影響は認められない。Ｃ）さらに、遠心分離後のＤｅｘの封鎖によって示されるように、Ｄｅｘ−ＮＤ複合体形成が確認された。
【図３】粒子サイズおよびＮＤ薬物複合体のゼータ電位のＤＬＳ分析。（図３Ａ−３Ｃ）：すべての薬の平均粒子サイズは、ＮＤの物理吸着の際に低下した。（図３Ｄ−３Ｆ）：すべての試料のゼータ電位は、ＮＤとの錯化の際により正になった。
【図４】治療的生体機能性分析は、ＮＤの錯化による強化された分散の際の維持された薬物活性を確認する。Ａ）プルバラノールＡ活性の保存は、以下のレーン指定、つまり、Ａ）ＤＮＡマーカ、Ｂ）負の制御（追加なし）、Ｃ）水溶液における５％のＤＭＳＯ、Ｄ）水溶液における５％のＤＭＳＯ内の１ｍｇ／ｍｌのＮＤ、Ｅ）水溶液における５％ＤＭＳＯ内の１ｍｇ／ｍｌのＮＤ、０．１ｍｇ／ｍｌのプルバラノールＡ、Ｆ）水溶液における５％ＤＭＳＯ内の０．１ｍｇ／ｍｌのプルバラノールＡによる、ＤＮＡ断片化分析によって確認された。レーンＥは、ＮＤプルバラノールＡ複合体の強力な活性を確認した。Ｂ）ＭＴＴ細胞生存率分析は、ＮＤによる複合体形成後に、４−ＯＨＴの保存された治療活性を確認するために実行された。以下の条件、つまり、（−）：負の制御、（＋）：正の制御、７．５ｕｇ／ｍＬの４−ＯＨＴ、ＮＤ：７５ｕｇ／ｍＬのＮＤ、ＮＤ：４−ＯＨＴ：７５ｕｇ／ｍＬのＮＤ、７．５ｕｇ／ｍＬの４−ＯＨＴが検査された。すべての条件は、１．３１ｍＭ酢酸を含有する培地内であった。正の制御およびＮＤ：４−ＯＨＴ試料の間の細胞生存率レベルの比較は、ＮＤに錯体形成される場合に保存された４−ＯＨＴの効力を示す。３つのうちのある代表的な実験を示す。
【図５】（Ａ）アミノ官能化ナノダイヤモンドおよび（Ｂ）低分子量ポリエチレンイミン（ＰＥＩ８００）修飾ナノダイヤモンドの概略図。
【図６】ナノダイヤモンドおよびｐＤＮＡ結合前の官能化Ｅナノダイヤモンドのサイズ（Ａ）およびゼータ電位（Ｂ）。粒子を、６０ｕｇ／ｍｌの濃度、３ｕｇのｐＤＮＡ／ｍｌの固定濃度を有するｐＤＮＡ結合後のナノダイヤモンドおよび官能化ナノダイヤモンドのサイズ（Ｃ）およびゼータ電位（Ｄ）で、脱イオン化水に懸濁した。１７３°の散乱角において２５℃でＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）を使用して、サイズ計測が実行された。平均流体力学直径は、累積分析によって決定された。ゼータ電位計測は、自動モードのひだ状の毛細血管内細胞を用いて実行された、水性媒体内の粒子の電気泳動移動度に基づく。データは、平均±標準偏差（ｎ＝２）として表す。（Ｅ）ＮＤ−ＰＥＩ８００／ＤＮＡのＴＥＭ画像。スケールバーは２０ｎｍである。
【図７】ＰＥＩ８００官能化ナノダイヤモンドは、ＨｅＬａ細胞における効率的な遺伝子トランスフェクションを媒介した。ＨｅＬａ細胞は、トランスフェクション前２４時間、１０５／ウェルの密度で、２４ウェルプレートに播種された。ナノ粒子が細胞に添加され、３７℃で４時間培養された。洗浄の際に、細胞は、４４時間さらに培養された。粒子濃度は、３μｇ／ウェルの標的ｐＬｕｃ用量で、異なる重量比を元にして計算された。トランスフェクション後４８時間、細胞採集およびルシフェラーゼ分析が実行された。データは、平均±標準偏差（ｎ＝２）として表される。＊は、細胞溶解物内のタンパク質の１０ＲＬＵ／ｍｇよりも低いトランスフェクション効率を有する粒子を表す。
【図８】５（Ａ）および１５（Ｂ）の重量比におけるＮＤ−ＰＥＩ８００／ｐＧＦＰ、５（Ｃ）および１５（Ｄ）の重量比における非修飾ナノダイヤモンド／ｐＧＦＰ、５（Ｅ）および１５（Ｆ）の重量比におけるＰＥＩ８００／ｐＧＦＰ、および裸ｐＧＦＰ（Ｇ）によって、行われた生体ＨｅＬａ細胞内のＧＦＰ発現の明視野およびＧＦＰ共焦点像作成。ＨｅＬａ細胞は、トランスフェクション前の２４時間、１．５Ｘ１０５／ウェルの密度で２４ウェルプレートに播種された。ナノ粒子は、細胞に添加され、４時間、３７℃で培養された。洗浄の際に、細胞は、４４時間、さらに培養された。粒子濃度は、６μｇ／ウェルの標的ｐＬｕｃ用量に基づいて計算された。生体ＨｅＬａ細胞がＰＢＳによって洗浄され、トランスフェクション後４８時間、共焦点顕微鏡（ライカ反転レーザー走査系、アルゴンレーザー励起４８８ｎｍ）においてライブで観察された。（スケールバー：５０ｕｍ）
【図９】ＮａＯＨの存在下での水中のＮＤへのインシュリン吸着および脱着を示す仮想概略図。インシュリン非共有は、静電および他の相互作用によって、水中でＮＤ表面へ結合する。アルカリ性環境へのシフトにより、インシュリン表面電荷特性を変質させ、それによってＮＤ表面からの放出を生じさせる。
【図１０】（ａ）そのままのＮＤ、（ｂ）水溶液内の吸着されたインシュリンを有するＮＤ、および（ｃ）ｐＨ１０．５に調整された１ｍＭのＮａＯＨによる治療後の吸着されたインシュリンを有するＮＤのＴＥＭ画像。約５−１０ｎｍの厚さの、そのままのＮＤ（ａ）と比較して、ＮＤ（ｂ）の表面上に明らかな層またはコーティングが存在する。インシュリンの添加は（ａ）および（ｂ）の間の試料調製における差にすぎないため、視覚可能な層は、インシュリン吸着を示すことがある。材料は、ＮａＯＨ処理したＮＤ上に存在しない（ｃ）。スケールバーは、（ａ）において２０ｎｍ、（ｂ、ｃ）において５０ｎｍを示す。
【図１１】（ａ）ＦＩＴＣインシュリン、（ｂ）そのままのＮＤおよび（ｃ）ＮＤインシュリン複合体の赤外線スペクトル。矢印は、そのままのＮＤスペクトルと比較した、ＮＤインシュリンスペクトル上に存在するインシュリンの特徴的なスペクトルを示す。画像（ｃ）は、差スペクトルによって示されるように、ＮＤインシュリン複合体の形成を示唆する。データは、ＮＤへのインシュリンの非共有吸着を示唆する。
【図１２】ｐＨ７およびｐＨ１０．５におけるインシュリンおよびＮＤの錯体に関連付けられたゼータ電位の変化。ＮＤは、インシュリンおよびＮＤインシュリン複合体の負の電位と比較した、両方のｐＨ値におけるわずかに正のゼータ電位を明らかにする。ＮＤおよびＮＤインシュリン複合体の間のゼータ電位における明らかな差は、ＮＤおよびインシュリンの間の相互作用を示す。
【図１３】ＮＤからのインシュリンの吸着および脱着のＵＶ／ｖｉｓ定量化。（ａ）ＮＤに対するＦＩＴＣインシュリンの吸着は、４８５ｎｍで計測された、初期のおよび遠心分離されたＮＤインシュリンの間の到達された差の吸収度値によって示される。（ｂ）５６２ｎｍで計測された、ＢＣＡタンパク質分析を実施するウシインシュリンの吸収度。（ｃ）種々のｐＨ値に調整された、１ｍＭのＮａＯＨにおける、ＮＤからのＦＩＴＣインシュリンの脱着。試料は、アルカリ性条件において遠心分離され、生成された溶液が計測された。（ｄ）ＢＣＡタンパク質分析を使用したＮＤからのウシインシュリンの脱着。放出吸収度スペクトルから、より大量のインシュリンが、アルカリ性環境において脱着され、ＮａＯＨがインシュリンの電荷特性に影響することを示す。
【図１４】ＮａＯＨ（ｐＨ１０．５）および水で処理したＮＤインシュリン試料の５日間のインシュリン脱着試験、アルカリ性ｐＨ環境内のインシュリン放出を示す。放出されたインシュリンの累積重量パーセンテージが計測された。ＮａＯＨ試料は、最初の２日間内の増加した脱着および４５．８±３．８％の全脱着のために放出された量の平準化を示す。しかしながら、水で処理した試料は、合計で２．２±１．２％の、インシュリンの一部のみを放出した。１日目までに生じたＮａＯＨによって放出されたインシュリンの大部分は、アルカリ溶液が、完全に吸着されたＮＤ上に、その最大影響を有していたことを示す。
【図１５】様々な培地条件におけるＲＡＷ２６４．７マクロファージ細胞のＭＴＴ細胞生存率分析。細胞は、８時間、血清飢餓が行われ、次いで、示された溶液媒体、つまり、（１）ＤＭＥＭ、（２）０．１μＭインシュリン、（３）１μＭインシュリン、（４）ＮａＯＨ（ｐＨ１０．５）によるＮＤインシュリンから放出された約０．１μＭのインシュリン、（５）水における、遠心分離されたＮＤインシュリンからの生成された溶液、（６）ＮａＯＨ（１μＭ全インシュリン）によって処理したＮＤインシュリン、（７）インシュリンと結合した（ＮＤインシュリン、１μＭ全インシュリン）ＮＤおよび（８）ＤＭＥＭ１０％ＦＢＳによる、２４時間の回収期間が生じる。ＮａＯＨ（６）で処理したＮＤインシュリンの相対生存率は、高いインシュリン濃度（３）の相対生存率と同様であり、これは、放出されたインシュリンによる効果的な回収を示す。ＮａＯＨ（４）によって放出されたインシュリンは、水（５）によって放出されたインシュリンの相対生存率よりも高い相対生存率を示し、これは、アルカリ溶液を介したより大きい脱着を表す。ＡＮＯＶＡ統計分析により、Ｐ＜０．０１が得られ、基の間の顕著な差を表す。
【図１６】（ａ）３Ｔ３−Ｌ１前駆脂肪細胞および（ｂ）分化した脂肪細胞は、２つの細胞タイプの間の形態の明白な差を示す。前駆含脂肪細胞線維芽細胞は、インシュリン、デキサメタゾンおよびＩＢＭＸによる培地の補完の際に分化を実行し、移入後１０日目までに完全に分化する。脂質小胞形成は、分化の間に生じ、（ｂ）２５０Ｘ倍率で確認することができる。
【図１７】培地条件におけるＩｎｓ１およびＣｓｆ３／Ｇ−ｃｓｆのリアルタイムのＰＣＲ遺伝子発現。３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞は、異なる溶液媒体、つまり、（１）ＤＭＥＭ、（２）０．１μＭのインシュリン、（３）ＮａＯＨ（ｐＨ１０．５）によってＮＤインシュリンから放出された０．１μＭのインシュリン、（４）水における遠心分離されたＮＤインシュリンから生成された溶液、（５）ＮａＯＨで処理したＮＤインシュリン（１μＭの全インシュリン）および（６）インシュリンで結合されたＮＤ（ＮＤインシュリン、１μＭの全インシュリン）において、２時間の回収期間の前４時間、血清飢餓された。両遺伝子は、ＮａＯＨによって放出されたインシュリン（３）およびＮａＯＨで処理したＮＤインシュリン（５）の増加した発現を示し、活性を保存する一方で、アルカリ性条件による効果的なインシュリン放出を示す。水（４）およびＮＤインシュリン（６）によって放出されたインシュリンは、比較的、タンパク質機能を防止するＮＤ表面へのインシュリンの隔離について示唆する、両遺伝子についての低い相対発現を示した。ＲＴ−ＰＣＲ試料の代表的な遺伝子発現プロット。ＡＮＯＶＡ：Ｐ＜０．０１。
【図１８】ナノダイヤモンド−ダウノルビシン（ＮＤ−Ｄａｕｎ）吸着の分光分析。吸収度曲線は、各溶液に存在するＮＤまたはＮＤ−Ｄａｕｎ複合体をペレット化するために、１５分スピン（１４０００ｒｐｍ）前（ＢＳ）および後（ＡＳ）に計測された。
【図１９】ナノダイヤモンド−ダウノルビシン（ＮＤ−Ｄａｕｎ）吸着の比較。１４０００ｒｐｍでの１５分遠心分離前（Ａ）および後（Ｂ）のＮＤ（１）、Ｄａｕｎ（２）、ＮＤ−Ｄａｕｎ（３）、およびＮＤ−Ｄａｕｎ＋ＮａＯＨ（４）溶液。
【図２０】それぞれ、水およびＰＢＳにおけるナノダイヤモンド共役からのＤＡＵＮの脱着。放出特性は、薬物溶出が数時間にわたって持続することを明らかにする。吸収度は４８５ｎｍで計測された。
【図２１】ナノダイヤモンドエピルビシン（ＮＤ−Ｅｐｉ）吸着の分光分析。吸収度曲線は、各溶液内に存在するＮＤまたはＮＤ−Ｅｐｉ複合体をペレット化するために、１５分スピン（１４０００ｒｐｍ）の前（ＢＳ）および後（ＡＳ）で計測された。
【図２２】ナノダイヤモンドエピルビシン（ＮＤ−Ｅｐｉ）吸着の比較。１４０００ｒｐｍにおける１５分遠心分離の前（Ａ）および後（Ｂ）の、ＮＤ（１）、Ｅｐｉ（２）、ＮＤ−Ｅｐｉ（３）、およびＮＤ−Ｅｐｉ＋ＮａＯＨ（４）溶液。
【図２３】それぞれ、水およびＰＢＳにおけるナノダイヤモンド共役からのＥＰＩの脱着。放出特性は、数時間にわたって薬物溶出が持続することを明らかにする。吸収度は４８５ｎｍで計測された。
【図２４】ナノダイヤモンドイダルビシン（ＮＤ−ＩＤＡ）吸着の分光分析。吸収度曲線は、各溶液に存在するＮＤまたはＮＤ−ＩＤＡ複合体をペレット化するために、２時間のスピンの前（ＢＳ）および後（ＡＳ）で計測された。
【図２５】ＮＤ−Ｉｄａ吸着の比較。１４０００ｒｐｍにおける１５分の遠心分離の前（Ａ）および後（Ｂ）の、ＮＤ（１）、Ｉｄａ（２）、ＮＤ−Ｉｄａ（３）、およびＮＤ−Ｉｄａ＋ＮａＯＨ（４）溶液。
【図２６】それぞれ、水およびＰＢＳにおけるナノダイヤモンド共役からのＩＤＡの脱着。放出特性は、数時間にわたって薬物溶出が持続することを明らかにする。吸収度は４８５ｎｍで計測された。
【図２７】ＮＤ−Ｄａｕｎ−Ｄｏｘ−Ｅｐｉ−Ｉｄａ吸着の分光分析。吸収度曲線は、各溶液において存在するＮＤまたはＮＤ−Ｄａｕｎ＋Ｄｏｘ＋Ｅｐｉ＋Ｉｄａ複合体をペレット化するために、１５分スピン（１４０００ｒｐｍ）の前（ＢＳ）および後（ＡＳ）で計測された。
【図２８】ＮＤ−Ｄａｕｎ−Ｄｏｘ−Ｅｐｉ−Ｉｄａ吸着の比較。１４０００ｒｐｍにおける１５分遠心分離の前（Ａ）および後（Ｂ）の、ＮＤ（１）、Ｄａｕｎ＋Ｄｏｘ＋Ｅｐｉ＋Ｉｄａ（２）、ＮＤ−Ｄａｕｎ＋Ｄｏｘ＋Ｅｐｉ＋Ｉｄａ（３）、およびＮＤ−Ｄａｕｎ＋Ｄｏｘ＋Ｅｐｉ＋Ｉｄａ＋ＮａＯＨ（４）溶液。
【図２９】ナノダイヤモンドミノサイクリン（ＮＤ−Ｍｉｎｏ）吸着の分光分析。吸収度曲線は、各溶液内に存在するＮＤまたはＮＤ−Ｍｉｎｏ複合体のペレット化のために、１５分スピン（１４０００ｒｐｍ）の前（ＢＳ）および後（ＡＳ）で計測された。
【図３０】ナノダイヤモンドミノサイクリン（ＮＤ−Ｍｉｎｏ）吸着の比較。１４０００ｒｐｍにおける１５分遠心分離の前（Ａ）および後（Ｂ）の、ＮＤ（１）、Ｍｉｎｏ（２）、ＮＤ−Ｍｉｎｏ（３）、およびＮＤ−Ｍｉｎｏ＋ＮａＯＨ（４）溶液。
【図３１】ナノダイヤモンド共役からのミノサイクリンの脱着。水において実行される放出特性（上）およびＰＢＳ（下）は、最初の数時間における持続的放出を示す。
【図３２】ナノダイヤモンドテトラサイクリン（ＮＤテトラ）吸着の分光分析。吸収度曲線は、各溶液に存在するＮＤまたはＮＤテトラ複合体をペレット化するために、１５分スピン（１４０００ｒｐｍ）の前（ＢＳ）および後（ＡＳ）で計測された。
【図３３】ナノダイヤモンドテトラサイクリン（ＮＤテトラ）吸着の比較。１４０００ｒｐｍにおける１５分遠心分離の前（Ａ）および後（Ｂ）の、ＮＤ（１）、テトラ（２）、ＮＤテトラ（３）、およびＮＤテトラ＋ＮａＯＨ（４）溶液。
【図３４】ナノダイヤモンド共役からのテトラサイクリンの脱着。水（上）およびＰＢＳ（下）において実行される放出特性は、最初の数時間における持続的放出を示す。
【図３５】ナノダイヤモンドドキシサイクリン（ＮＤ−Ｄｏｘｙ）吸着の分光分析。吸収度曲線は、各溶液に存在するＮＤまたはＮＤ−Ｄｏｘｙ複合体のペレットを作成するために、１５分スピン（１４０００ｒｐｍ）の前（ＢＳ）および後（ＡＳ）で計測された。
【図３６】ナノダイヤモンドドキシサイクリン（ＮＤ−Ｄｏｘｙ）吸着の比較。１４０００ｒｐｍにおける１５分遠心分離の前（Ａ）および後（Ｂ）の、ＮＤ（１）、Ｄｏｘｙ（２）、ＮＤ−Ｄｏｘｙ（３）、およびＮＤ−Ｄｏｘｙ＋ＮａＯＨ（４）溶液。
【図３７】ナノダイヤモンド共役からのドキシサイクリンの脱着。水（上）およびＰＢＳ（下）において実行される放出特性は、最初の数時間における持続的放出を示す。
【図３８】ナノダイヤモンドオキシテトラサイクリン（ＮＤ−Ｏｘｙ）吸着の分光分析。吸収度曲線は、各溶液に存在するＮＤまたはＮＤ−Ｏｘｙ複合体のペレット化のために、１５分スピン（１４０００ｒｐｍ）の前（ＢＳ）および後（ＡＳ）に計測された。
【図３９】ナノダイヤモンドオキシテトラサイクリン（ＮＤ−Ｏｘｙ）吸着の比較。１４０００ｒｐｍにおける１５分遠心分離の前（Ａ）および後（Ｂ）の、ＮＤ（１）、Ｏｘｙ（２）、ＮＤ−Ｏｘｙ（３）、およびＮＤ−Ｏｘｙ＋ＮａＯＨ（４）溶液。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図９】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１０ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６ａ】
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【図１６ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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