(57)【要約】  本発明は、ステント移植後に再狭窄に罹る個体のリスクを決定する方法に関する。この方法は、ＣＣＮＢ１遺伝子のｒｓ３５００９９、ｒｓ３５０１０４、ｒｓ１６４３９０およびｒｓ８７５４５９、および場合によっては、それぞれＣＣＮＡ１およびＣＤＫＮ１Ａ遺伝子のｒｓ２２８２４１１および／またはｒｓ７３３５９０から選択される少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）における遺伝子型を決定するための試料の分析に基づいており、前記多型のいずれかにおけるある種の対立遺伝子の存在が再狭窄に罹るリスクを示す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ステントの移植後に再狭窄を発生する個体のリスクを決定する方法であって、ａ）個体の試料からゲノムＤＮＡを得て、ｂ）前記試料を分析して、図３に定義されているＣＣＮＢ１遺伝子のＳＮＰ１、ＳＮＰ２、ＳＮＰ３およびＳＮＰ４から選択される少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）の遺伝子型を決定することを含んでなり、ＳＮＰ１のＴＴ遺伝子型、ＳＮＰ２のＣＣ遺伝子型、ＳＮＰ３のＧＧ遺伝子型およびＳＮＰ４のＧＧ遺伝子型の存在が再狭窄を発生するリスクを示す、方法。
【請求項２】
段階ｂ）が多型ＳＮＰ１およびＳＮＰ２の遺伝子型を決定することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＤＮＡ試料が唾液、血液、または血液から精製した白血球から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
図３に定義されているＣＣＮＡ１遺伝子の多型ＳＮＰ５の遺伝子型を決定することを更に含んでなり、共優性モデルにおけるＴＴまたはＴＣ遺伝子型、または優性モデルにおけるＧＧ遺伝子型の存在が再狭窄を発生するリスクを示す、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
図３に定義されているＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の多型ＳＮＰ６の遺伝子型を決定することを更に含んでなり、ＴＴ遺伝子型の存在が再狭窄を発生するリスクを示す、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ＳＮＰ１、ＳＮＰ２、ＳＮＰ３、ＳＮＰ４およびそれらの組み合わせから選択されるＣＣＮＢ１遺伝子の少なくとも１つのＳＮＰの遺伝子型の決定に適当なオリゴヌクレオチドと試薬とのセットを含んでなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法を行うためのキット。
【請求項７】
ＳＮＰ１の遺伝子型の決定が、配列番号７および８の配列のオリゴヌクレオチドの対によって行われる、請求項６に記載のキット。
【請求項８】
ＳＮＰ２の遺伝子型の決定が、配列番号９および１０の配列のオリゴヌクレオチドの対によって行われる、請求項６に記載のキット。
【請求項９】
ＳＮＰ３の遺伝子型の決定が、配列番号１１および１２の配列のオリゴヌクレオチドの対によって行われる、請求項６に記載のキット。
【請求項１０】
ＳＮＰ４の遺伝子型の決定が、配列番号１３および１４の配列のオリゴヌクレオチドの対によって行われる、請求項６に記載のキット。
【請求項１１】
ＣＣＮＡ１遺伝子のＳＮＰ５の遺伝子型の決定に適当なオリゴヌクレオチドを更に含んでなる、請求項６に記載のキット。
【請求項１２】
ＳＮＰ５の遺伝子型の決定が、配列番号１５および１６の配列のオリゴヌクレオチドの対によって行われる、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子のＳＮＰ６の遺伝子型の決定に適当なオリゴヌクレオチドを更に含んでなる、請求項６に記載のキット。
【請求項１４】
ＳＮＰ６の遺伝子型の決定が、配列番号１７および１８の配列のオリゴヌクレオチドの対によって行われる、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
図３に定義されている多型ＳＮＰ１、ＳＮＰ２、ＳＮＰ３、ＳＮＰ４、および場合によっては、ＳＮＰ５およびＳＮＰ６の１つ以上の、ステント移植後に再狭窄を発生する個体のリスクマーカーとしての使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、分子生物学分野における健康管理部門で適用される。詳細には、本発明は、一塩基多型（ＳＮＰ）の検出に基づくステント移植による血行再建後の再狭窄の発生するリスクを診断する方法を得ようとするものである。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
動脈硬化症に冒されている血管の血行再建に最もよく用いられる臨床治療は、経皮的冠動脈形成術（ＰＣＴＡ）である。この介入としばしば関連付けられる病理学的過程は、手術した血管の過度の再閉塞からなる再狭窄である。再狭窄は、ＰＣＴＡを繰り返すことや、または罹患した患者に代替血行再建療法（例えば、大動脈冠状動脈バイパス）を施すことが必要になるので、健康管理および社会経済的に大きな影響を及ぼす。進行が遅い（典型的には、数十年）ことを特徴とする本来のアテローム性病変と比較して、再狭窄病変は、通常はＰＣＴＡ後の最初の４〜１２ヶ月の間に成長する（Serruys, Kutryk and Ong,「冠状動脈ステント（Coronary-artery stents）」, N Engl J Med 2006, 354, 483-95)。現在では、９０％を超えるＰＣＴＡで、処置の安全性を高め、かつ典型的には通常のＰＣＴＡに関連した再狭窄率が２５〜５０％であるのと比較して再狭窄率を１５〜３０％にまで減少させているステントと呼ばれる支持用の金属製体内プロテーゼが用いられている(Serruys, Kutryk and Ong,「冠状動脈ステント（Coronary-artery stents）」, N Engl J Med 2006, 354, 483-95, Andres,「サイクリン依存性キナーゼシグナリングによる血管細胞増殖および移動の制御：新たな展望および治療可能性（Control of vascular cell proliferation and migration by cyclin-dependent kinase signalling: new perspectives and therapeutic potential）」， Cardiovasc Res 2004, 63, 11-21)。再狭窄率は、薬剤溶出ステントの使用によって更に低下する。
【０００３】
再狭窄は、主として血小板、単球／マクロファージ、内皮細胞（ＥＣ）、および平滑筋細胞（ＳＭＣ）のような様々な細胞型が介在する多因子過程である。新生内膜病変とも呼ばれる再狭窄病変の増殖は、ステントの移植が引き起こす機械的損傷によって開始される過程である(Andres,「サイクリン依存性キナーゼシグナリングによる血管細胞増殖および移動の制御：新たな展望および治療可能性（Control of vascular cell proliferation and migration by cyclin-dependent kinase signaling: new perspectives and therapeutic potential）」, Cardiovasc Res 2004, 63, 11-21, Costa and Simon,「再狭窄の分子基盤および薬剤溶出ステント（Molecular basis of restenosis and drug-eluting stents）」, Circulation 2005, 111, 2257-73)。再狭窄の初期の急性期は、損傷した動脈表面上で循環する単球、好中球およびリンパ球の動員を伴う血小板および局在化血栓の活性化を含んでいる。これらの細胞型は、中膜に内在するＳＭＣの活性化を特徴とする慢性的炎症反応を招き、形態変化、収縮性タンパク質の胚性アイソフォームの発現、成長および走化性刺激に対する高応答性、および細胞外マトリックスの豊富な合成を特徴とする「合成的」表現型をとっている。新生内膜病変の細胞によって産生される過度の走化性および分裂促進因子は、中膜のＳＭＣの最初の増殖期と病変へのそれらの移動に続いて、新生内膜病変のＳＭＣの第二の増殖性応答を引き起こす（Andres,「サイクリン依存性キナーゼシグナリングによる血管細胞増殖および移動の制御：新たな展望および治療可能性（Control of vascular cell proliferation and migration by cyclin-dependent kinase signaling: new perspectives and therapeutic potential）」, Cardiovasc Res 2004, 63, 11-21, Costa and Simon,「再狭窄の分子基盤および薬剤溶出ステント（Molecular basis of restenosis and drug-eluting stents）」， Circulation 2005, 111, 2257-73)。ＰＣＴＡの後期段階における血管病変の炎症消散および瘢痕化は、新生内膜ＳＭＣの収縮型表現型の再生と細胞外マトリックスの組成変化を伴い、損傷を受けていない動脈壁に一層似てくる。上記のように、再狭窄が過度である場合には、臨床症状が再発して、更なる血行再建介入が必要となる。
【０００４】
動物およびヒトの研究で同定された新生内膜過形成調節因子の中では、下記のものが挙げられる：血栓形成因子（例えば、組織因子、トロンビン受容体）、細胞接着分子（例えば、ＶＣＡＭ、ＩＣＡＭ、ＬＦＡ−１、Ｍａｃ−１）、シグナルトランスデューサー（例えば、ＰＩ３Ｋ、ＭＥＫ／ＥＲＫ）、転写因子（例えば、ＮＦ−κＢ、Ｅ２Ｆ、ＡＰ−１、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｂ、ＹＹ１、Ｇａｘ）、細胞周期調節タンパク質（例えば、ｐＲｂ、ｐ２１、ｐ２７、ＣＤＫ２、ＣＤＣ２、サイクリンＢ１、ＰＣＮＡ）、増殖因子（例えば、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＴＧＦβ、ＦＧＦ、ＩＧＦ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ）、炎症性サイトカイン（例えば、ＴＮＦα）、走化性因子（例えば、ＣＣＲ２、ＭＣＰ−１）、およびメタロプロテアーゼ（例えば、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９）。
【０００５】
再狭窄の本質的過剰増殖性は、細胞周期調節遺伝子がこの病理学的過程において果たすことがある役割の研究に大きな興味を生じた。哺乳類では、細胞周期は、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）と呼ばれる触媒サブユニットとサイクリンと呼ばれる調節サブユニットからなるホロ酵素によって正に調節される(Ekholm and Reed,「哺乳類の細胞周期におけるＧ（１）サイクリン依存性キナーゼの調節」, Curr Opin Cell Biol 2000, 12, 676-84)。ＣＤＫ／サイクリンの逐次活性化により、細胞増殖に関連した細胞基質の異なる事象のリン酸化が可能となる。一方、ＣＫＩ（ＣＤＫ阻害剤）と呼ばれるＣＤＫ／サイクリンの阻害タンパク質があり、これはＣＩＰ／ＫＩＰ（ｐ２１、ｐ２７およびｐ５７）およびＩＮＫ４（ｐ１５、ｐ１６、ｐ１８およびｐ１９）サブファミリーに再分される。抗分裂促進刺激に呼応するＣＫＩの蓄積は、ＣＤＫ／サイクリン複合体の可逆阻害を誘発する。発現研究および遺伝子療法実験から、新生内膜病変の発生におけるこれらの分子の重要性が明らかになっている。例えば、血管形成術の動物およびヒトモデルにおける機械的損傷によって誘発された閉塞性血管病変の分析は、細胞周期調節遺伝子（例えば、ＣＤＫ、サイクリン、ＣＫＩ、ｐ５３、ｐＲｂ）の発現における変化を明らかに示しており、また多数の実験動物による研究は、ＣＤＫおよびサイクリン（例えば、サイクリンＢ、ＣＤＫ２、ＣＤＫ１）の不活性化または増殖抑制因子（例えば、ｐ２１、ｐ２７、ｐＲｂ、ｐ５３）の過剰発現は、血管形成術後の閉塞性血管病変の発生を阻害することを示している（Andres,「サイクリン依存性キナーゼシグナリングによる血管細胞増殖および移動の制御：新たな展望および治療可能性（Control of vascular cell proliferation and migration by cyclin-dependent kinase signaling: new perspectives and therapeutic potential）」， Cardiovasc Res 2004, 63, 11-21, Nabel,「ＣＤＫおよびＣＫＩ：組織リモデリングのための分子標的」， Nat Rev Drug Discov 2002, 1, 587-98, Dzau, Braun-Dullaeus and Sedding,「血管増殖およびアテローム性動脈硬化症：新たな展望および治療法（Vascular proliferation and atherosclerosis: new perspectives and therapeutic strategies）」， Nat Med 2002, 8, 1249-56)。
【０００６】
様々な動物モデルに由来する有望な前臨床データーにも拘わらず、再狭窄を予防し、または治療するための数多くの全身療法は、臨床試験に失敗した。しかしながら、抗増殖性の薬剤溶出性ステント（ＤＥＳ）が最近導入されたことにより、インターベンション心臓病学に大変革が起きた。細胞増殖の共通の最終経路である真核細胞の有糸分裂周期を標的とする２種類の親油性薬剤であるシロリムス（ラパマイシンまたはラパミューンとも呼ばれる）およびパクリタキセル（タキソールとも呼ばれる）を運ぶためのステントの使用を強調すべきである。損傷した動脈壁において高用量の薬剤を局部的に放出するこれらの装置の使用により、再狭窄率が有意に減少した(Costa and Simon,「再狭窄の分子基盤および薬剤溶出性ステント（Molecular basis of restenosis and drug-eluting stents）」， Circulation 2005, 111, 2257-73, Wessely, Schomig and Kastrati,「ポリマー基剤の薬剤溶出性ステント上のシロリムスおよびパクリタキセル：類似点と相違点（Sirolimus and Paclitaxel on polymer-based drug-eluting stent: similar but different）」， J Am Coll Cardiol 2006, 47, 708-14)。このため、ヨーロッパで現在移植に用いられている３種類総てのステントのうち２種類のＤＥＳが移植されている（Baz, Mauri, Albarran and Pinar,「［スペインの心臓カテーテル法および冠動脈インターベンションレジストリー（Spanish Cardiac Catheterization and Coronariy Intervention Registry）。スペイン心臓病学会ワーキンググループの心臓カテーテル法およびインターベンション心臓病学についての第１６回公式報告（１９９０−２００６）］」， Rev Esp Cardiol 2007, 60, 1273-89)。通常のステントと比較してＤＥＳを用いることの関連する欠点は、それらの価格が高価であり（２〜３倍以上）、遅発性血栓症に関連した有害事象を回避するための抗血小板治療を長くする必要があることである(Lazaro and de Mercado, “Stents recubiertos de farmacos: eficacia, efectividad, eficiencia y evidencia”, Revista Espanola de Cardiologia 2004, 57, 608-12で概説）。
【０００７】
再狭窄の健康管理および社会経済的影響が大きいため、血行再建を必要とする患者では再現性があり信頼性が高くかつ価格的に有効な形態で定量することができるバイオマーカーを有することはきわめて有用である。これらの患者での再狭窄のリスクを評価することができれば、大動脈冠状動脈バイパスに対してステントの移植、またはＤＥＳに対して通常のステント使用（費用が一層かかりかつ遅発性血栓症のリスクが増加する）など治療法を決定するのに役立つこととなる。
【０００８】
一塩基多型（ＳＮＰ）は、ヒトゲノム中に数百万存在する遺伝子変異体である。近年、ＳＮＰは、β２−アドレナリン作動性受容体、ＣＤ１４、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、エオタキシン、カスパーゼ−１、Ｐ２ＲＹ１２受容体、およびインターロイキン−１０の遺伝子など再狭窄を発生する多少のリスクと関連しているヒト遺伝子で同定された(Monraats et al.「炎症およびアポトーシス遺伝子、および経皮冠動脈インターベンショナン後の再狭窄の危険性（Inflammation and apoptosis genes and the risk of restenosis after percutaneous coronary intervention）， Pharmacogenet Genomics 2006, 16, 747-754; Monraats et al.「インターロイキン１０：経皮的冠動脈インターベンション後の再狭窄発生の新たなリスクマーカー（Interleukin 10: a new risk marker for the development of restenosis after percutaneous coronary intervention）」, Genes Immun 2007, 8, 44-50; Monraats et al.「遺伝子炎症性因子は経皮的冠動脈インターベンション後の再狭窄を予測する（Genetic inflammatory factors predict restenosis after percutaneous coronary interventions）」， Circulation 2005, 112, 2417-25; Rudez et al.「血小板受容体Ｐ２ＲＹ１２ハプロタイプは経皮的冠動脈インターベンション後の再狭窄を予測する（Platelet receptor P2RY12 haplotypes predict restenosis after percutaneous coronary interventions）」, Hum Mutat 2008, 29, 375-80)。
【０００９】
しかしながら、遺伝子型−表現型の関連は、再狭窄を発生する多少のリスクを有する細胞周期調節遺伝子のＳＮＰに関してはこれまでは報告されていない。
【発明の概要】
【００１０】
本発明者らは、重要な研究作業の後、再狭窄を発生する遺伝子リスクマーカーとしての潜在的診断値を有する様々な細胞周期調節遺伝子における異なるＳＮＰを同定した。具体的に言えば、本発明者らは、ＣＣＮＢ１遺伝子（サイクリンＢ１タンパク質）においてＳＮＰｒｓ１６４３９０、ｒｓ３５００９９、ｒｓ３５０１０４、ｒｓ８７５４５９；ＣＣＮＡ１遺伝子（サイクリンＡ１タンパク質）においてｒｓ２２８２４１１；およびＣＤＫＮ１Ａ遺伝子（ｐ２１Ｋｉｐ１／Ｃｉｐ１タンパク質）においてｒｓ７３３５９０を、再狭窄を発生するリスク診断マーカーとして同定した。
【００１１】
これらのマーカーは、治療法の決定においてきわめて重要な進歩を構成する。例えば、再狭窄を発生するリスクが比較的低い患者は、通常のステントを受けることができ、ＤＥＳ（一層高価で、遅発性血栓症のリスクを有する）の使用はリスクの一層高い患者に限定できる。
【００１２】
これらの知見に基づいて、本発明者らは、前記リスク診断マーカーとしてのこれら６つのＳＮＰの検出に基づくステントの移植後の再狭窄のリスクを決定する方法を開発した。また、前記診断を行うためのキットも開発した。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】サイクリン遺伝子で検討した２５多型をまとめた表。
【図２】細胞増殖抑制遺伝子で検討した２２多型をまとめた表。
【図３】ステントの移植後、再狭窄を発生するリスクと統計学的に有意に関連した６つのＳＮＰをまとめた表。
【図４】ステントの移植後、再狭窄を発生するリスクと関連したＳＮＰの対数回帰分析の結果をまとめた表。分析は、ＳＮＰＳｔａｔソフトウェアを用いて行った。
【図５】ＳＮＰｒｓ３５００９９（ＳＮＰ１）およびｒｓ３５０１０４（ＳＮＰ２）の局在化、および転写因子ＮＦ−Ｙ（ＮＦ−Ｙｂｓ）の結合部位を示すヒトＣＣＮＢ１遺伝子のプロモーター領域の略図。
【図６】ゲルシフトアッセイ（ＥＭＳＡ）に用いたプローブのリスト。
【図７】放射性標識プローブＮＦ−Ｙｃｏｎｓ、ＳＮＰ１−ＴおよびＳＮＰ１−Ｃを子宮頚癌（ＨｅＬａ）由来のヒト細胞の可溶性核画分の抽出物と共にインキュベーションしたものから得られるＥＭＳＡ。スーパーシフト分析は、抗−ＮＦ−ＹＢおよび抗−ＣＲＥＢＩＩ抗体（後者は、特異性コントロールとして用いた）とインキュベーションすることによって行った。
【図８】子宮頚癌（ＨｅＬａ）由来のヒト細胞の可溶性核画分の抽出物を放射性標識したＮＦ−Ｙｃｏｎｓプローブ、および過剰の未標識二本鎖オリゴヌクレオチドＮＦ−Ｙｃｏｎｓ、ＮＦ−Ｙｍｕｔ、ＳＮＰ１−ＴおよびＳＮＰ１−Ｃと共にインキュベーションすることによって得られるＥＭＳＡ法によって行った競合分析。
【図９】子宮頚癌（ＨｅＬａ）由来のヒト細胞の可溶性核画分の抽出物を放射性標識ＮＦ−Ｙプローブ（−３０／−１０）および過剰の未標識二本鎖オリゴヌクレオチドＮＦ−Ｙ（−３０／−１０）、ＳＮＰ１−ＴおよびＳＮＰ１−Ｃと共にインキュベーションすることによって得られるＥＭＳＡ法によって行った競合分析。
【図１０】ａ）ヒト骨肉腫上皮細胞（Ｕ２ＯＳ）の可溶性核画分の抽出物を放射性標識ＡＰ−１ｃｏｎｓプローブ、および過剰の未標識二本鎖オリゴヌクレオチドＡＰ−１ｃｏｎｓ、ＳＮＰ２−ＣおよびＳＮＰ２−Ｔと共にインキュベーションすることによって得られるＥＭＳＡ法によって行われる競合分析。ｂ）５回のＥＭＳＡの平均のＤＮＡ−タンパク質複合体の相対強度、および片側ＡＮＯＶＡおよびＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ  ｐｏｓｔ−ｈｏｃ検定による統計解析。コンペティターを有する分析におけるバンド強度対コンペティターなしのバンド強度の比較は、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１として表している。
【図１１】ステントの移植後、再狭窄の発生リスクと統計的に有意な関連を示す６つのＳＮＰに隣接するヌクレオチドの配列。
【図１２】ＳＮＰ１の融解曲線。ａ）正常および（温度に依存する）多型の存在によってシフトした曲線を表す。ｂ）正常曲線および（温度に依存する）多型の存在によってシフトした曲線間の差を表す。融解曲線の差は、それぞれの遺伝子型によって変化する試料を分類するＰＣＲ産物の配列における変動の差の結果である。
【図１３】ＳＮＰ２の融解曲線。ａ）正常および（温度に依存する）多型の存在によってシフトした曲線を表す。ｂ）正常曲線および（温度に依存する）多型の存在によってシフトした曲線間の差を表す。融解曲線の差は、それぞれの遺伝子型によって変化する試料を分類するＰＣＲ産物の配列における変動の差の結果である。
【図１４】ＳＮＰ３の融解曲線。ａ）正常および（温度に依存する）多型の存在によってシフトした曲線を表す。ｂ）正常曲線および（温度に依存する）多型の存在によってシフトした曲線間の差を表す。融解曲線の差は、それぞれの遺伝子型によって変化する試料を分類するＰＣＲ産物の配列における変動の差の結果である。
【図１５】ＳＮＰ４の融解曲線。ａ）正常および（温度に依存する）多型の存在によってシフトした曲線を表す。ｂ）正常曲線および（温度に依存する）多型の存在によってシフトした曲線間の差を表す。融解曲線の差は、それぞれの遺伝子型によって変化する試料を分類するＰＣＲ産物の配列における変動の差の結果である。
【図１６】ＳＮＰ５の融解曲線。ａ）正常および（温度に依存する）多型の存在によってシフトした曲線を表す。ｂ）正常曲線および（温度に依存する）多型の存在によってシフトした曲線間の差を表す。融解曲線の差は、それぞれの遺伝子型によって変化する試料を分類するＰＣＲ産物の配列における変動の差の結果である。
【図１７】ＳＮＰ６の融解曲線。ａ）正常および（温度に依存する）多型の存在によってシフトした曲線を表す。ｂ）正常曲線および（温度に依存する）多型の存在によってシフトした曲線間の差を表す。融解曲線の差は、それぞれの遺伝子型によって変化する試料を分類するＰＣＲ産物の配列における変動の差の結果である。
【００１４】
本発明の目的
本発明の目的は、ＣＣＮＢ１遺伝子におけるｒｓ３５００９９、ｒｓ３５０１０４、ｒｓ１６４３９０およびｒｓ８７５４５９、および場合によってはそれぞれＣＣＮＡ１およびＣＤＫＮ１Ａ遺伝子におけるｒｓ２２８２４１１および／またはｒｓ７３３５９０から選択される少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）における遺伝子型を決定するための試料の分析に基づいた、ステントの移植後に再狭窄を発生する個体のリスクを決定する方法であって、下記に示すように、これらの多型のいずれかにおける特定の対立遺伝子の存在が再狭窄を発生するリスクを示す、方法である。
【００１５】
引用された多型の遺伝子型の決定に適当なプローブと試薬とのセットを含んでなる、前記方法を行うためのキットも、本発明の目的である。
【００１６】
最後に、本発明の目的は、引用された多型ｒｓ３５００９９、ｒｓ３５０１０４、ｒｓ１６４３９０、ｒｓ８７５４５９、および場合によってはｒｓ２２８２４１１およびｒｓ７３３５９０の１つ以上の、ステントの移植後に再狭窄を発生する個体のリスクマーカーとしての使用である。
【発明の具体的説明】
【００１７】
本発明の主態様は、ステントの移植後に再狭窄を発生する個体のリスクを決定する方法であって、ａ）個体の試料からゲノムＤＮＡを得て、ｂ）試料のＤＮＡを分析して、図３に定義されているｒｓ３５００９９（ＳＮＰ１）、ｒｓ３５０１０４（ＳＮＰ２）、ｒｓ１６４３９０（ＳＮＰ３）およびｒｓ８７５４５９（ＳＮＰ４）から選択されるＣＣＮＢ１遺伝子における少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）の遺伝子型を決定することを含んでなり、これらの多型のいずれかにおける特定の対立遺伝子の存在が、下記に定義されるように、再狭窄を発生するリスクを示す、方法である（図４参照）。
【００１８】
好ましい態様では、段階ｂ）は、試料のＤＮＡを分析して多型ＳＮＰ１およびＳＮＰ２の遺伝子型の組み合わせを決定することを含んでなる。
【００１９】
多型ｒｓ３５００９９（ＳＮＰ１）（図３参照）は、機械的血管損傷によって誘発される新生内膜病変の発生（Morishita, Gibbons, Kaneda, Ogihara and Dzau,「インビボでの血管壁におけるアンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチド（サイクリンＢ１およびＣＤＣ２キナーゼ）の薬物動態：ＨＶＪ−リポソーム送達による再狭窄に対する治療上の有用性の増加（Pharmacokinetics of antisense oligodeoxyribonucleotides (cyclin B1 and CDC 2 kinase)）」,Gene 1994, 149, 13-9）など、様々な生理病理学的状況において細胞増殖に本質的な正の調節因子であるサイクリンＢ１タンパク質をコードするＣＣＮＢ１遺伝子の転写開始から−９５７のプロモーター領域に局在している（Santamaria and Ortega,「発生および癌におけるサイクリンおよびＣＤＫＳ：遺伝子修飾マウスからの教訓（Cyclins and CDKS in development and cancer: lessons from genetically modified mice）」,Front Biosci 2006, 11, 1164-88)。−９５７位はＣＣＮＢ１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋデーターベースのアクセス番号Ｕ２２３６４）の１１７２塩基対（ｂｐ）の配列の３６位の塩基にも対応する。ヒトにおけるステントの移植後に再狭窄を発生するリスクの診断マーカーとしてのその使用は、このＳＮＰのホモ接合（Ｔ／Ｔ遺伝子型）におけるＴ対立遺伝子の検出によって決定される（図４参照）。更に、本発明者らは、Ｔ対立遺伝子を有する配列において、転写因子ＮＦ−Ｙに対する特異的結合部位を構成する配列（ＣＣＡＡＴ）を同定した（図７〜９参照）。
【００２０】
転写因子ＮＦ−Ｙは、ヒト遺伝子プロモーターＣＣＮＢ１の領域−１５０〜＋１８２領域に局在化している２つのシス−調節配列へのその結合により、高増幅率を有する細胞におけるその転写活性化に本質的である(Sciortino, Gurtner, Manni, Fontemaggi, Dey, Sacchi, Ozato and Piaggio,「サイクリンＢ１遺伝子はＨｅＬａ細胞において有糸分裂の際に積極的に転写される（The cyclin B1 gene is actively transcribed during mitosis in HeLa cells）」，EMBO Rep 2001, 2, 1018-23, Farina, Manni, Fontemaggi, Tiainen, Cenciarelli, Bellorini, Mantovani, Sacchi and Piaggio,「末端が分化した骨格筋におけるサイクリンＢ１遺伝子転写のダウンレギュレーションは、機能性ＣＣＡＡＴ−結合ＮＦ−Ｙ複合体の喪失と関連している（Down-regulation of cyclin B1 gene transcription in terminally differentiated skeletal muscle cells is associated with loss of functional CCAAT-binding NF-Y complex）」,Oncogene 1999, 18, 2818-27)。
【００２１】
図５は、ＥＭＳＡ分析によって検討したＳＮＰ（ＳＮＰ１およびＳＮＰ２）の局在化を示すヒトＣＣＮＢ１遺伝子のプロモーター領域の略図である。ＮＦ−Ｙｂｓボックスは、転写因子ＮＦ−Ｙが結合しているプロモーターの−２１／−１７位に位置したＣＣＡＡＴ配列を表す。転写の開始は、＋１の値で表され、これは曲がった矢印で表されている。
【００２２】
多型ｒｓ３５０１０４（ＳＮＰ２）（図３参照）は、サイクリンＢ１タンパク質をコードするＣＣＮＢ１遺伝子の転写開始から−４７５のプロモーター領域に局在化している。−４７５位はまた、ＣＣＮＢ１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋデーターベースのアクセス番号Ｕ２２３６４）の１１７２ｂｐの配列の５１９位の塩基に対応している。ヒトにおけるステント移植後に再狭窄を発生するリスクの診断マーカーとしてのその使用は、このＳＮＰのホモ接合（Ｃ／Ｃ遺伝子型）におけるＣ対立遺伝子の検出によって決定される（図４参照）。更に、本発明者らは、この多型のＴ対立遺伝子を有する配列と比較して一層大きなアフィニティーの転写因子ＡＰ−１についての結合部位を、Ｃ対立遺伝子を有する配列で同定した（図１０参照）。
【００２３】
ＡＰ−１は、サイクリンなどの多量の細胞周期遺伝子の活性化の調節過程に広く関係している転写因子である（Shaulian and Karin,「細胞増殖および生存におけるＡＰ−１（AP-1 in cell proliferation and survival）」, Oncogene 2001, 20, 2390-400）。
【００２４】
多型ｒｓ１６４３９０（ＳＮＰ３）（図３参照）は、サイクリンＢ１タンパク質をコードするＣＣＮＢ１遺伝子の＋１０２位の５’非翻訳領域に局在化している。＋１０２位はまた、ＣＣＮＢ１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋデーターベースのアクセス番号ＮＣ＿０００００５）の１１１６０ｂｐの配列の１０４位の塩基に対応している。再狭窄を発生するリスクの診断マーカーとしてのその使用は、このＳＮＰのホモ接合（Ｇ／Ｇ遺伝子型）におけるＧ対立遺伝子の検出によって決定される（図４参照）。
【００２５】
多型ｒｓ８７５４５９（ＳＮＰ４）（図３参照）は、サイクリンＢ１タンパク質をコードするＣＣＮＢ１遺伝子の転写開始に関する＋７０１０に局在化している。＋７０１０位はまた、ＣＣＮＢ１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋデーターベースのアクセス番号ＮＣ＿０００００５）の１１１６０ｂｐの配列の７０１２位の塩基にも対応している。再狭窄を発生するリスクの診断マーカーとしてのその使用は、このＳＮＰのホモ接合（Ｇ／Ｇ遺伝子型）におけるＧ対立遺伝子の検出によって決定される（図４参照）。
【００２６】
特定態様では、この方法の段階ｂ）は、図３に定義されているＣＣＮＡ１遺伝子の多型ｒｓ２２８２４１１（ＳＮＰ５）の遺伝子型を決定することを更に含んでなる。
【００２７】
多型ｒｓ２２８２４１１（ＳＮＰ５）（図３参照）は、細胞周期の正の調節因子でもあるタンパク質サイクリンＡ１をコードするＣＣＮＡ１遺伝子の転写開始に関する＋７７３３に局在化している（Santamaria and Ortega,「発生および癌におけるサイクリンおよびＣＤＫＳ：遺伝子修飾マウスからの教訓（Cyclins and CDKS in development and cancer: lessons from genetically modified mice）」, Front Biosci 2006, 11, 1164-88）。＋７７３３位は、ＣＣＮＡ１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋデーターベースのアクセス番号ＮＣ＿００００１３）の１０３７６ｂｐの配列の７７３５位の塩基にも対応している。再狭窄ヒトにおけるステントの移植後に再狭窄を発生するリスクの診断マーカーとしてのその使用は、このＳＮＰの共優性モデルにおいてホモ接合またはヘテロ接合（ＴＴまたはＣＴ遺伝子型）におけるＴ対立遺伝子の検出、または優性モデル（ＧＧ遺伝子型）においてホモ接合におけるＧ対立遺伝子の検出によって決定される（図４参照）。
【００２８】
もう一つの特定態様では、この方法の段階ｂ）は、図３に定義されているＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の多型ｒｓ７３３５９０（ＳＮＰ６）の遺伝子型の決定を更に含んでなる。
【００２９】
多型ｒｓ７３３５９０（ＳＮＰ６）（図３参照）は、機械的血管損傷によって誘発される新生内膜病変の発生（Andres,「サイクリン依存性キナーゼシグナリングによる血管細胞増殖および移動の制御：新たな展望および治療可能性（Control of vascular cell proliferation and migration by cyclin-dependent kinase signaling: new perspectives and therapeutic potential）」,Cardiovasc Res 2004, 63, 11-21, Nabel,「ＣＤＫおよびＣＫＩ：組織リモデリングのための分子標的（CDKs and CKIs: molecular targets for tissue remodelling）」Nat Rev Drug Discov 2002, 1, 587-98）など、様々な生理病理学的状況において細胞周期の負の調節因子であるタンパク質ｐ２１Ｋｉｐ１／Ｃｉｐ１をコードするＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の転写開始から−１２８４のプロモーター領域に局在化している（Massague,「Ｇ１細胞周期制御および癌（G1 cell-sycle control and cancer）」， Nature 2004, 432, 298-306)。−１２８４位は、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子（アクセス番号：ＡＦ４９７９７２、ＧｅｎＢａｎｋデーターベース）の１０９０７ｂｐの配列の５７位の塩基にも対応している。ヒトにおけるステントの移植後に再狭窄を発生するリスクの診断マーカーとしてのその使用は、このＳＮＰの優性および共優性モデルのいずれにおいても、ホモ接合（Ｔ／Ｔ遺伝子型）におけるＴ対立遺伝子の検出を含んでなる（図４参照）。
【００３０】
図１１は、パブリックデーターベースＧｅｎＢａｎｋ(“National Center of Biotechnology Information”, NCBI)に記録されている情報に従って６つのＳＮＰ（ＳＮＰ１〜ＳＮＰ６）に隣接するヌクレオチドの６つの配列（配列番号１〜６）を示している。それぞれのＳＮＰの２つの多型変異体を、括弧内に示している。
【００３１】
この方法は、唾液、血液または血液から精製した白血球のような患者の様々な試料から得られるＤＮＡに適用することができる。
【００３２】
本発明の目的であるＳＮＰの遺伝子型解析を、ステント移植後に再狭窄を発生するリスクを診断するキットの開発に用いる。ＳＮＰの同定に最適方法は、ミニシークエンシング（多型および伸張の前に自動シークエンサーで検討するために蛍光標識したｄｄＮＴＰと共にプローブの使用）、定量的ＰＣＲ（それぞれの多型が見られる領域の増幅、および様々なタイプのプローブまたは融解曲線による同定）、ＰＣＲおよび制限による消化（多型がある領域を増幅するための制限部位を作り出すように修飾されたＰＣＲオリゴヌクレオチドの反応におけるプライマーの使用、および自動シークエンサー、アガロースゲルなどと共にその使用に適した制限酵素による消化）、および自動シークエンサー、アガロースゲルなどにおける対立遺伝子特異増幅および検出である。
【００３３】
好ましくは、これらの多型を決定するため、「高解像度融解曲線」による融解曲線の方法を用い、目的の多型が見出される領域からＤＮＡを増幅し、融解曲線を定量的サーモサイクラーで分析する。これは、単純で迅速かつ信頼性のある方法であり、多型を含む領域からの適当なオリゴヌクレオチドを用いて増幅することからなり、後者は、得られた産物を、用いた系の特徴に準じて温度ランプ(temperature ramp)に当てるときに得られる融解曲線によって同定される。これにより、単純かつ信頼性のある方法での診断試験を開発することができる。
【００３４】
従って、本発明のもう一つの主態様では、本発明の方法を行うためのキットであって、オリゴヌクレオチドと、ＳＮＰ１、ＳＮＰ２、ＳＮＰ３、ＳＮＰ４およびそれらの組み合わせから選択されるＣＣＮＢ１遺伝子の多型の遺伝子型を決定するのに適した試薬とのセットを含んでなるキットが考えられる。
【００３５】
好ましい態様では、ＳＮＰ１の遺伝子型解析に用いられるオリゴヌクレオチド（プライマー）の対は、配列番号７（センス）および配列番号８（アンチセンス）の配列を有する（表３参照）。
【００３６】
もう一つの好ましい態様では、ＳＮＰ２の遺伝子型解析に用いられるオリゴヌクレオチドの対は、配列番号９（センス）および配列番号１０（アンチセンス）の配列を有する（表３参照）。
【００３７】
もう一つの好ましい態様では、ＳＮＰ３の遺伝子型解析に用いられるオリゴヌクレオチドの対は、配列番号１１（センス）および配列番号１２（アンチセンス）の配列を有する（表３参照）。
【００３８】
もう一つの好ましい態様では、ＳＮＰ４の遺伝子型解析に用いられるオリゴヌクレオチドの対は、配列番号１３（センス）および配列番号１４（アンチセンス）の配列を有する（表３参照）。
【００３９】
場合によっては、特定態様では、キットは、ＣＣＮＡ１遺伝子のＳＮＰ５の遺伝子型解析に適当なオリゴヌクレオチドを更に含むことができる。好ましくは、用いられるオリゴヌクレオチドは、配列番号１５（センス）および１６（アンチセンス）の配列を有する（表３参照）。
【００４０】
もう一つの特定態様では、キットは、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子のＳＮＰ６の遺伝子型解析に適当なオリゴヌクレオチドを更に含むことができる。好ましくは、用いられるオリゴヌクレオチドは、配列番号１７（センス）および１８（アンチセンス）の配列を有する（表３参照）。
【００４１】
最後に、本発明のもう一つの主態様は、ステントの移植後に再狭窄を発生する個体のリスクマーカーとして、図３に定義されている多型ＳＮＰ１、ＳＮＰ２、ＳＮＰ３、ＳＮＰ４、および場合によっては、ＳＮＰ５およびＳＮＰ６の１つ以上の使用に関する。
【実施例】
【００４２】
患者のコホートの説明
患者母集団
１２ヶ月間、Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａ（ナポリ、イタリア）に入院しかつ下記の参入基準を満たしている総ての継続患者を検討に登録した：１）本来の冠動脈における経皮的冠動脈インターベンション（ＰＣＩ）、２）デ・ノボ病変の治療、３）むき出しの金属ステントの移植、および４）６〜９ヶ月目に冠動脈造影を行う有用性。地元の倫理委員会は、この研究プロトコルを承認し、総ての患者は文書によるインフォームド・コンセントを与えた。
【００４３】
研究に登録された４３４名の患者の中、２８４名（６５％）が６〜９ヶ月目の冠動脈造影による追跡調査を受けた。これらの２８４名の患者が患者の母集団を表している。
【００４４】
生化学的測定
血中総コレステロール、高密度リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）、低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）およびトリグリセリドは、酵素法で測定した。評価した糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）は、腎疾患における食事療法のレベル調節変更（ＭＤＲＤ）式を適用することによって計算した。慢性腎疾患は、ｅＧＦＲ＜６０ｍｌ／分／１．７３ｍ２として定義した。
【００４５】
血液サンプリング
静脈血試料を、ＰＣＩ前に患者から採取した。総ての試料はクエン酸三ナトリウムコーティングした試験管に集め、直ちに氷に入れた。採取の１時間以内に、血液試料を４０００ｒｐｍ（１４００ｇ）で２０分間遠心分離し、血漿を採取して、バッチ分析まで−８０℃で分割保管した。
【００４６】
経皮的冠状血管形成術
患者は、最初および最後の血管造影図の前にイソソルビドジニトレート（０．１〜０．３ｍｇ）の冠状動脈内投与を受け、血管をできるだけ拡張した。血管造影は、自動コンピューター利用システム（ＱＣＡ−ＣＭＳ  ｖｅｒｓｉｏｎ３．０、MEDIS、ライデン、オランダ）を用いて測定した。追跡の再狭窄は、ステント後６〜９ヶ月目の最小管腔直径（ＭＬＤ）を測定することによって分析した。更に、下記の変数を評価した：処置後のＭＬＤから処置前のＭＬＤを引いたものと定義される初期獲得（acute gain）；処置後のＭＬＤから追跡時のＭＬＤを引いたものと定義される晩期損失（late loss）；および晩期損失対初期獲得の平均比率と定義される損失係数（loss index）。再狭窄は、追跡時の狭窄の程度が≧５０％と定義された。
【００４７】
統計分析
連続変数は、平均値±標準偏差（ＳＤ）として表される。２群（血管造影による病変の進行によって定義される）の連続値の差は、適宜Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定またはＭａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定によって行った。カテゴリー変数は、χ２検定によって分析した。検定は、二方向であった。データーは、ＳＰＳＳ  Ｗｉｎｄｏｗｓ用、ｖｅｒｓｉｏｎ１３．０(SPSS Inc.,シカゴ、イリノイ)で解析した。
【００４８】
【表１】
2012521744.tif 000002
【００４９】
【表２】
2012521744.tif 000003
【００５０】
本研究では、増殖アクチベーター（サイクリンＡ１、Ｅ１、Ｂ１およびＤ１）（図１参照）および細胞増殖抑制因子（ｐ２１、ｐ２７、ｐ５７およびｐ５３）（図２参照）を含む細胞周期を調節する８つのヒト遺伝子に局在化した４７のＳＮＰを分析した。
【００５１】
図１は、細胞周期アクチベーター遺伝子およびそれらが括弧内でコードするタンパク質：ＣＣＮＡ１（サイクリンＡ１）、ＣＣＮＥ１（サイクリンＥ１）、ＣＣＮＢ１（サイクリンＢ１）およびＣＣＮＤ１（サイクリンＤ１）において検討した２５のＳＮＰを示している。「多型」欄は、位置および前記多型に結合した対立遺伝子を含む。多型の位置は、ヌクレオチド塩基＋１として同定される遺伝子転写の開始に関して示されている。多型は、それが転写の開始前に見出されるときには負の数で示され、それが後の位置に局在しているときには正の数で示される。「局在化」欄は、遺伝子の機能的構造に関する多型の位置を表している。更に詳細には、「プロモーター領域」局在化は、多型が遺伝子の転写を調節する領域に局在化していることを示し、転写の開始前に局在化している（＋１と表示）。「エクソン」局在化は、多型が遺伝子のコード領域に局在化していることを示している。「イントロン」局在化は、多型が遺伝子の非コードイントロン領域に局在化していることを示している。ＵＴＲ３’およびＵＴＲ５’局在化は、多型がそれぞれ領域３’または５’の非翻訳配列に局在化していることを示している。
【００５２】
図２は、細胞周期阻害遺伝子およびそれらが括弧内でコードするタンパク質ＣＤＫＮ１Ａ（ｐ２１  Ｋｉｐ１／Ｃｉｐ１）、ＣＤＫＮ１Ｂ（ｐ２７  Ｋｉｐ１／Ｃｉｐ１）、ＣＤＫＮ１Ｃ（ｐ５７  Ｋｉｐ１／Ｃｉｐ１）およびＴＰ５３（ｐ５３）において検討した２２のＳＮＰを示している。
【００５３】
４７のＳＮＰ（以下に記載）の遺伝子型決定は、ステント移植による血行再建を受けた２８４名の患者のうち、１６８名は再狭窄に罹っておらず、１１６名はこの疾患（再狭窄は、血管の管腔の内径が、介入後６〜９ヶ月期間に行った血管造影評価後に介入部分に隣接する部位の管腔に比較して５０％以上の減少と定義する）に罹っている者の循環白血球から精製したＤＮＡの試料で行った。再狭窄を発生するリスクを増加する可能性がある多型を同定するための統計分析は、ＳＮＰｔａｔプログラムを用いるロジスティック回帰分析によって行った(Sole, Guino, Valls, Iniesta and Moreno,「ＳＮＰＳｔａｔｓ：関連度研究の分析のためのウェブツール（SNPStats: a web tool for the analysis of association studies）」, Bioinformatics 2006, 22, 1928-9)。分析した全部で４７のＳＮＰから、再狭窄のリスクが一層大きい統計的に有意な関連性は、ＣＣＮＢ１遺伝子におけるＳＮＰ１〜４のｒｓ１６４３９０、ｒｓ３５００９９、ｒｓ３５０１０４、ｒｓ８７５４５９；ＣＣＮＡ１遺伝子におけるＳＮＰ５のｒｓ２２８２４１１、およびＣＤＫＮ１Ａ遺伝子におけるＳＮＰ６のｒｓ７３３５９０にのみ見られた。
【００５４】
図３は、ステント移植後に再狭窄を発生するリスクと統計的に有意な関連性を示した６つのＳＮＰをまとめている。
【００５５】
図４は、ステント移植後の再狭窄のリスクと関連性を示したＳＮＰのロジスティック回帰分析の結果を示している。分析は、ＳＮＰＳｔａｔソフトウェア(Sole, Guino, Valls, Iniesta and Moreno,「ＳＮＰｔａｔｓ：関連度研究の分析のためのウェブツール（SNPStats: a web tool for the analysis of association studies）」, Bioinformatics 2006, 22, 1928-9)を用いて行い、年齢および性別によって補正した。
【００５６】
結果は、ＳＮＰ１に関しては、ホモ接合（Ｔ／Ｔ）のＴ対立遺伝子を有する個体は、ホモ接合（Ｃ／Ｃ）またはヘテロ接合（Ｃ／Ｔ）のＣ対立遺伝子を有する個体と比較して再狭窄を発生するリスクが有意な１．７４倍の増加となることを示した（図４参照）。
【００５７】
ＳＮＰ２に関しては、ホモ接合（Ｃ／Ｃ）のＣ対立遺伝子を有する個体は、ホモ接合（Ｔ／Ｔ）またはヘテロ接合（Ｔ／Ｃ）のＴ対立遺伝子を有する個体と比較して再狭窄を発生する引き起こす可能性リスクを有意な１．７７倍の増加とする（図４参照）。
【００５８】
ＳＮＰ３に関しては、ホモ接合（Ｇ／Ｇ）のＧ対立遺伝子を有する個体は、ホモ接合（Ｔ／Ｔ）またはヘテロ接合（Ｇ／Ｔ）のＴ対立遺伝子を有する個体と比較して再狭窄を発生する可能性を有意な１．８１倍の増加とする（図４参照）。
【００５９】
ＳＮＰ４に関しては、ホモ接合（Ｇ／Ｇ）のＧ対立遺伝子を有する個体は、ホモ接合（Ｔ／Ｔ）またはヘテロ接合（Ｇ／Ｔ）のＴ対立遺伝子を有する個体と比較して再狭窄を発生する可能性を有意な１．７８倍の増加とする。ＳＮＰ４に適用したロジスティック回帰分析は、下記の因子、すなわち再狭窄、性別、年齢、および分析した患者の家族歴を考慮した（図４参照）。
【００６０】
共優性モデルのＳＮＰ５に関しては、ホモ接合（Ｔ／Ｔ）またはヘテロ接合（Ｃ／Ｔ）におけるＴ対立遺伝子の存在は、ホモ接合（Ｃ／Ｃ）のＣ対立遺伝子と比較して再狭窄を発生する可能性をそれぞれ有意な１．２６倍および３．１０倍に増加する。優性モデルでは、ホモ接合（Ｇ／Ｇ）のＧ対立遺伝子の存在は、ホモ接合（Ｔ／Ｔ）またはヘテロ接合（Ｇ／Ｔ）のＴ対立遺伝子と比較して再狭窄を発生する可能性の有意な１．７８倍への増加と関連している。ＳＮＰ５に適用したロジスティック回帰分析は、下記の因子、すなわち再狭窄、性別、年齢、および分析した患者の家族歴を考慮した（図４参照）。
【００６１】
共優性モデルのＳＮＰ６に関しては、ホモ接合（Ｔ／Ｔ）のＴ対立遺伝子の存在は、ヘテロ接合（Ｃ／Ｔ）またはホモ接合（Ｃ／Ｃ）におけるＣ対立遺伝子と比較して再狭窄を発生する可能性をそれぞれ有意な１．９２倍および２．３８倍に増加する。優性モデルでは、ホモ接合（Ｔ／Ｔ）のＴ対立遺伝子の存在は、ヘテロ接合（Ｔ／Ｃ）またはホモ接合（Ｃ／Ｃ）のＣ対立遺伝子と比較して再狭窄を発生する可能性を有意な２．０８倍に増加する（図４参照）。
【００６２】
遺伝子分析
多型の検出および試料の遺伝子型解析のため、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０ＳｃａｎｎｉｎｇソフトウェアおよびＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０ＨｉｇｈＲｅｓｏｌｕｔｉｏｎＭｅｌｔｉｎｇＭａｓｔｅｒキットを用いた。
【００６３】
キットの混合物は、ＤＮＡの二本鎖に均質に結合して、その化学特性により増幅反応を阻害することなく高濃度で用いることができる蛍光体ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０ＲｅｓｏＬｉｇｈｔを含んでいた。
【００６４】
ＰＣＲ反応サイクル中に、増幅断片の形成を観察した。配列に変動を有する試料は、融解曲線の相違によって識別した。この手法を用いることによって、ホモ接合体およびヘテロ接合体試料間と野生および突然変異ホモ接合体間とで区別することかできた。
【００６５】
プライマーのデザイン
遺伝子当たりのＰＣＲ反応に用いるプライマーのそれぞれの対のデザインは、Ｐｒｉｍｅｒ３プログラム（Howard Hughes Medical Institute and National Institutes of Health, National Human Genome Research Institute http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi）を用いて行った（表３参照）。
【００６６】
プライマーのデザインにおいて（表３参照）、融解温度は約６２℃であり、アンプリコンのサイズは１００〜２５０ｂｐであった。
【００６７】
【表３】
2012521744.tif 000004
【００６８】
増幅反応
増幅反応のため、ロシュ・アプライド・サイエンス(Roche Applied Science)製のＨｉｇｈＲｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｔｈｅ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）４８０Ｍａｓｔｅｒキットを用いた。２ｘ混合物は、ＭｇＣｌ２を含まない反応緩衝液中にＦａｓｔＳｔａｒｔＴａｑポリメラーゼＤＮＡおよび蛍光体ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０ＲｅｓｏＬｉｇｈｔを含んでいた。この混合物は、ＧＣ含量の高い配列の増幅を向上させるためのＤＭＳＯ付加と適合しうる。
【００６９】
ＦａｓｔＳｔａｒｔＴａｑポリメラーゼＤＮＡは、化学修飾された熱に安定な酵素であり、７５℃までの温度では活性を示さない。この酵素は高温でのみ活性であり、プライマーは配列に非特異的に結合することはできない。
【００７０】
ａ．試薬および容積
表４に、それぞれの増幅反応に用いた試薬、初期および最終濃度および必要容積を示す。
【００７１】
【表４】
2012521744.tif 000005
【００７２】
ｂ．反応条件
表５に、様々なパラメーターの最適化後の増幅反応の条件を示す。
【００７３】
【表５】
2012521744.tif 000006
【００７４】
検定の推定時間は、ＰＣＲについては７５分間であり、変性曲線（高解像度融解）については１５分間であった。反応は、通常のサーマルサイクラーで行うことができ、結果はＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０システムで解析した。
【００７５】
多型ＳＮＰ１、ＳＮＰ３およびＳＮＰ４の特定の場合には、それぞれの多型について野生型ホモ接合体を有する標準試料１μＬを、増幅反応後で変性段階の前にそれぞれのウェルに加えた。この方法で、２つのホモ接合体を明らかに区別することができる。
【００７６】
結果の分析
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）４８０ＧｅｎｅＳｃａｎｎｉｎｇソフトウェアを用いて、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）４８０ＨｉｇｈＲｅｓｏｌｕｔｉｏｎＭｅｌｔｉｎｇシステムを用いて得られる実験データーの解析によって試料のヘテロ二本鎖構造を決定した。
【００７７】
試料をＰＣＲによって増幅し、変性して融解曲線を得た後、ソフトウェアによってそれらを分析し、同じような融解曲線を有する試料を分類した。
【００７８】
図１２および１３に、ＳＮＰ１およびＳＮＰ２の融解曲線をそれぞれ示す。両多型を含むＣＣＮＢ１遺伝子の２つの断片を、「ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０ＨｉｇｈＲｅｓｏｌｕｔｉｏｎＭｅｌｔｉｎｇＭａｓｔｅｒ」キットを用いてヒトゲノムＤＮＡの様々な試料中で増幅し、「ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０Ｓｃａｎｎｉｎｇ」ソフトウェアによって分析した。このソフトウェアは、ＰＣＲ産物の配列の変動間の差から生じる融解曲線の差を検出し、それぞれの遺伝子型によって試料を分類する。両方の図では、それぞれの遺伝子型は明確に識別され、特にホモ接合体変異体（赤および緑）が識別される。パネル（ａ）では、正常および（温度によって変化する）多型の存在によって変更された曲線の表示を見ることができ、一方、パネル（ｂ）は、正常曲線と（温度によって変化する）多型の存在によって変更された曲線との差を表している。
【００７９】
図１４、１５、１６および１７は、検討を行った多型の残りのもの、すなわちＣＣＮＢ１遺伝子の多型ＳＮＰ３（図１４）およびＳＮＰ４（図１５）、ＣＣＮＡ１遺伝子の多型ＳＮＰ５（図１６）、およびＣＤＫＮ１Ａ遺伝子のＳＮＰ６（図１７）について、前節で記載したのと同じ方法を用いて、標準化融解曲線を示している。
【００８０】
多型ＳＮＰ１およびＳＮＰ２に関連した機能研究
多型ｒｓ３５００９９（ＳＮＰ１）およびｒｓ３５０１０４（ＳＮＰ２）は、ヒトＣＣＮＢ１遺伝子のプロモーター領域に局在化しているので、本発明者らは、ステント移植後に再狭窄を発生する一層大きなリスクと統計的に有意な関連性を示すこれらの多型の対立遺伝子が、転写アクチベーターおよび／または抑制因子の結合を促進し、これらは次に遺伝子の転写活性を修飾することができるという可能性を検討した。
【００８１】
Ｔｒａｎｓｆａｃ（商標）７．０データーベースの使用は、それぞれ多型ＳＮＰ１およびＳＮＰ２のＴおよびＣ対立遺伝子を含むヌクレオチド配列のＮＦ−ＹおよびＡＰ−１結合部位の存在を予測した。これらの可能性を、ＥＭＳＡ法を用いて試験した。
【００８２】
例えば、ＳＮＰ１のＴ対立遺伝子を有する配列の分析は、転写因子ＮＦ−Ｙの結合に対して特異性を有するＣＣＡＡＴ配列の存在を予測した。しかしながら、ＳＮＰ１のＣ対立遺伝子についての同じ種類の分析では、前記結合部位を予測しなかった。
【００８３】
これらの予測により、検討で得られたデーターから、ＳＮＰ１にＣ対立遺伝子と比較してＴ対立遺伝子を含む配列にＮＦ−Ｙ因子が効率的かつ特異的に結合することが確認された（図７〜９参照）。
【００８４】
一方、ＳＮＰ２のＣ対立遺伝子を有する配列の分析は、ＡＰ−１結合部位の存在を予測した。しかしながら、ＳＮＰ２のＴ対立遺伝子についての同じ種類の分析では、このような結合部位を予測しなかった。この検討で得られたデーターから、Ｃ対立遺伝子がＳＮＰ２に含まれるときには、同じ多型のＴ対立遺伝子を含む配列と比較して一層大きなＡＰ−１ＤＮＡ結合活性が確認された（図１０参照）。
【００８５】
電気泳動移動度シフト分析（ＥＭＳＡ）
プローブの放射能標識を、二本鎖オリゴヌクレオチド１ｐｍｏｌを最終容積１０μＬで６５℃にて１０分間インキュベーションして行い、可能な二次構造を不安定化した。次いで、これを氷中で素早く冷却し、Ｔ４−ポリヌクレオチドキナーゼ１μＬと、［γ３２Ｐ］−ｄＡＴＰ（１０ｍＣｉ／ｍｌ）１μＬとを加えた。標識反応を、３７℃にて３０分間インキュベーションした。反応を氷中で停止し、プローブをＳｅｐｈａｄｅｘＧ−５０カラムで精製し、最後に、最終容積を１００μＬとした。
【００８６】
図６は、ＥＭＳＡ分析のプローブとして用いた二本鎖オリゴヌクレオチドの詳細なリストを示している。「配列」欄は、それぞれのプローブの２本の相補性鎖の配列を示している。プローブに含まれる配列の詳細な説明を、「説明」欄に示す。ＮＦ−ＹおよびＡＰ−１に対する予測および共通結合配列は太字で強調し、ＳＮＰの対立遺伝子は白箱に囲まれて示されている。
【００８７】
ヒト細胞の可溶性核画分のタンパク質（３μｇ）を、氷中で、ＥＭＳＡ緩衝液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ：７．８、５％グリセロール、３ｍＭＭｇＣｌ２、６０ｍＭＫＣｌ、０．５ｍＭＥＤＴＡ、０．１ｍＭＤＴＴ、５０μｇ／ｍｌポリ（ｄ（Ｉ−Ｃ））の最終容積１７μＬで１０分間予備インキュベーションした。次いで、放射性標識二本鎖オリゴヌクレオチドプローブ１μＬを加え、氷中で３０分間インキュベーションした。最後に、ローディングバッファー（loading buffer）１μＬをそれぞれの試験管に加え、試料を５％未変性ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動によって分離した。分離は、ＴＢＥ０．５Ｘ緩衝液（５Ｘストックから調製）で調製した５％ポリアクリルアミドゲル（８０：１，アクリルアミド：ビスアクリルアミド）中で、ＴＢＥ０．５ｘ緩衝液中において２００ｍＶで約２時間行った。ゲルを８０℃の温度で２時間真空乾燥し、オートラジオグラフィーによって分析した（図７〜１０参照）。競合アッセイのため、過剰の未標識二本鎖オリゴヌクレオチドを、放射性標識プローブの添加前の予備インキュベーション段階中に加えた。スーパーシフトアッセイのため、特異抗体（抗−ＮＦ−ＹＢ  Santacruz Biotechnology,参照番号ｓｃ−１３０４５ｘ）または非特異抗体（抗−ＣＲＥＢ−ＩＩ， Santa Cruz Biotechnology,参照番号ｓｃ−１８０ｘ）を、放射性標識プローブの添加前に核抽出物と共に3０分間インキュベーションした。
【００８８】
図７は、ＥＭＳＡアッセイを用いるＨｅＬａ細胞中のＳＮＰ１−Ｃプローブ（ＳＮＰ１のＣ対立遺伝子を有する多型変異体）にではなく、ＳＮＰ１−Ｔプローブ（ＳＮＰ１のＴ対立遺伝子を有する多型変異体）に関連したＮＦ−Ｙ活性の同定を示す。このアッセイは、プローブであるＮＦ−Ｙｃｏｎｓ、ＳＮＰ１−ＴおよびＳＮＰ１−Ｃであって放射能標識したもの１０ｆｍｏｌ、およびＨｅＬａ細胞の可溶性核画分の抽出物（それぞれタンパク質３μｇ、１２μｇおよび１２μｇ）のインキュベーションによって行った。試料をポリアクリルアミドゲルで分離し、ＤＮＡ−タンパク質複合体をオートラジオグラフィーによって可視化した。結合反応コントロールは、核抽出物の非存在下でインキュベーションした（レーン１、５および９）。スーパーシフトアッセイは、抗−ＮＦ−ＹＢおよび抗−ＣＲＥＢ−ＩＩ抗体（後者は特異性コントロールとして使用）と共に３０分間予備インキュベーションによって行った。
【００８９】
図８は、ＳＮＰ１−Ｃではなく過剰のＳＮＰ１−Ｔプローブが、ＮＦ−ＹｃｏｎｓプローブのＮＦ−Ｙ配列に関連したＤＮＡ結合活性とどのように競合するかを示している。競合アッセイは、ＮＦ−Ｙｃｏｎｓ放射性標識プローブ１０ｆｍｏｌと、ＨｅＬａ細胞の可溶性核画分のタンパク質抽出物３μｇおよび過剰量の放射能標識していないプローブ（「コールド」プローブ）のインキュベーションによって行ったＥＭＳＡ法を用いて行った。競合アッセイに用いた未標識二本鎖オリゴヌクレオチド（過剰量は括弧内に示す）は、ＮＦ−Ｙｃｏｎｓ（レーン３：１００ｘ）、ＮＦ−Ｙｍｕｔ（レーン４：１００ｘ）、ＳＮＰ１−Ｔ（レーン５：１００ｘ；レーン６：３００ｘ；レーン７：９００ｘ）、およびＳＮＰ１−Ｔ（レーン８：１００ｘ；レーン９：３００ｘ；レーン１０：９００ｘ）である。試料をポリアクリルアミドゲルで分離し、ＤＮＡ−タンパク質複合体をオートラジオグラフィーによって可視化した。
【００９０】
図９は、ＳＮＰ１−Ｃではなく過剰のＳＮＰ１−Ｔプローブが、ヒト遺伝子プロモーターＣＣＮＢ１の−３０／−１０領域のＮＦ−Ｙ配列に関連したＤＮＡ結合活性とどのように競合するかを示している。更に詳細には、この図は、ＣＣＮＢ１プロモーターの−２７／−１７領域のＮＦ−Ｙに対する結合配列活性の分析を示している（ＮＦ−Ｙプローブ（−３０／−１０）は、過剰の「コールド」プローブＳＮＰ１−ＴおよびＳＮＰ１−Ｃと競合した。競合研究は、放射能標識したＮＦ−Ｙプローブ（−３０／−１０）１０ｆｍｏｌ、ＨｅＬａ細胞の可溶性核画分のタンパク質抽出物８μｇ、および過剰の「コールド」プローブＮＦ−Ｙ（−３０／−１０）（レーン３：２０ｘ；レーン４：６０ｘ）、ＳＮＰ１−Ｔ（レーン５：２０ｘ；レーン６：６０ｘ）およびＳＮＰ１−Ｃ（レーン７：２０ｘ；レーン８：６０ｘ）をインキュベーションするＥＭＳＡ法によって行った。試料をポリアクリルアミドゲルで分離し、ＤＮＡ−タンパク質複合体をオートラジオグラフィーによって可視化した。
【００９１】
図１０は、ＳＮＰ２−Ｔプローブ（ＳＮＰ２のＴ対立遺伝子を有する多型変異体）と比較して、過剰のＳＮＰ２−Ｃプローブ（ＳＮＰ２のＣ対立遺伝子を有する多型変異体）が、どのようにして共通ＡＰ−１プローブ（ＡＰ−１ｃｏｎｓ）に関連したＤＮＡ結合活性と一層効率的に競合するかを示している。このアッセイは、ヒト骨肉腫上皮細胞（Ｕ２ＯＳ）の可溶性核抽出物と放射性標識ＡＰ−１ｃｏｎｓプローブをインキュベーションするＥＭＳＡ法によって行った。競合実験は、下記の未標識二本鎖オリゴヌクレオチド、すなわちＡＰ−１プローブ（２５倍過剰量，レーン３）、ＳＮＰ２−Ｃ（２５倍〜２００倍，レーン４〜７）、およびＳＮＰ２−Ｔ（２５倍〜２００倍，レーン８〜１１）をインキュベーションすることによって行った。この図は、総数が５つからの代表的ＥＭＳＡを示す。それぞれのＥＭＳＡにおけるＤＮＡ−タンパク質複合体の相対バンド強度を、コンピューター処理によるイメージ分析システム（「Ｍｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェア」）によって独立して分析し、値は平均値±ＳＥＭとしてグラフに表す。結果の統計分析は、片側ＡＮＯＶＡおよびＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ  ｐｏｓｔ−ｈｏｃ検定によって行った。コントロール（コンペティターなし）に対する比較は、＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１として表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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