(57)【要約】  本発明は、その発現が癌疾患に関連する遺伝子産物に関する。本発明はまた、前記遺伝子産物が発現されるまたは異常発現される疾患、特に癌疾患の治療および診断に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ｉ）腫瘍関連抗原の発現もしくは活性を阻害する、および／または
（ＩＩ）腫瘍阻害活性を有し、腫瘍関連抗原をコードする核酸もしくは腫瘍関連抗原を発現するもしくは異常発現する細胞に選択的である、および／または
（ＩＩＩ）投与された場合、ＭＨＣ分子と腫瘍関連抗原もしくはその一部との間の複合体の量を選択的に増大させる
作用物質を含有する医薬組成物であって、前記腫瘍関連抗原が、
（ａ）配列番号：６３４、１〜５４０、５４１、５４５、５４９、５５３、５５７、５６０、５６３、５６６、５７０、５７４、５７７、５８０、５８３、５８７、５９１、５９５、５９９、６０２、６０６、６１０、６１３、６１７、６２０、６２４、６３８、６４２、６４６、６４９、６５３、６５６、６６０、６６４、６６８、６７１、６７５、６７９、６８２および６８６からなる群より選択される核酸配列、その一部または誘導体を含む核酸、
（ｂ）ストリンジェントな条件下で前記（ａ）の核酸とハイブリダイズする核酸、
（ｃ）前記（ａ）または前記（ｂ）の核酸に対して縮重している核酸、ならびに
（ｄ）前記（ａ）、前記（ｂ）または前記（ｃ）の核酸に相補的な核酸
からなる群より選択される核酸によってコードされる配列を有する、医薬組成物。
【請求項２】
前記（Ｉ）または前記（ＩＩ）の下での作用物質が、腫瘍関連抗原をコードする核酸と選択的にハイブリダイズするアンチセンス核酸であるか、または腫瘍関連抗原に選択的に結合する抗体である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記作用物質が、
（ｉ）腫瘍関連抗原またはその一部、
（ｉｉ）腫瘍関連抗原またその一部をコードする核酸、
（ｉｉｉ）腫瘍関連抗原またその一部に結合する抗体、
（ｉｖ）腫瘍関連抗原をコードする核酸と特異的にハイブリダイズするアンチセンス核酸、
（ｖ）腫瘍関連抗原をコードする核酸に対するｓｉＲＮＡ、
（ｖｉ）腫瘍関連抗原またその一部を発現する宿主細胞、および
（ｖｉｉ）腫瘍関連抗原またその一部とＭＨＣ分子との間の単離された複合体
からなる群より選択される１またはそれ以上の成分を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
（ｉ）腫瘍関連抗原またはその一部、
（ｉｉ）腫瘍関連抗原またはその一部をコードする核酸、
（ｉｉｉ）腫瘍関連抗原またはその一部に結合する抗体、
（ｉｖ）腫瘍関連抗原をコードする核酸と特異的にハイブリダイズするアンチセンス核酸、
（ｖ）腫瘍関連抗原をコードする核酸に対するｓｉＲＮＡ、
（ｖｉ）腫瘍関連抗原またはその一部を発現する宿主細胞、および
（ｖｉｉ）腫瘍関連抗原またはその一部とＭＨＣ分子との間の単離された複合体
からなる群より選択される１またはそれ以上の成分を含有する医薬組成物であって、前記腫瘍関連抗原が、
（ａ）配列番号：６３４、１〜５４０、５４１、５４５、５４９、５５３、５５７、５６０、５６３、５６６、５７０、５７４、５７７、５８０、５８３、５８７、５９１、５９５、５９９、６０２、６０６、６１０、６１３、６１７、６２０、６２４、６３８、６４２、６４６、６４９、６５３、６５６、６６０、６６４、６６８、６７１、６７５、６７９、６８２および６８６からなる群より選択される核酸配列、その一部または誘導体を含む核酸、
（ｂ）ストリンジェントな条件下で前記（ａ）の核酸とハイブリダイズする核酸、
（ｃ）前記（ａ）または前記（ｂ）の核酸に対して縮重している核酸、ならびに
（ｄ）前記（ａ）、前記（ｂ）または前記（ｃ）の核酸に相補的な核酸
からなる群より選択される核酸によってコードされる配列を有する、医薬組成物。
【請求項５】
前記宿主細胞が、腫瘍関連抗原またはその一部に結合するＭＨＣ分子を付加的に発現し、宿主細胞が、好ましくは抗原提示細胞である、請求項３または４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記抗体が、モノクローナル、キメラ、ヒトもしくはヒト化抗体であるか、または抗体のフラグメントである、請求項２乃至４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記抗体が治療薬または診断薬に結合されている、請求項２乃至４および６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
癌の治療または予防のために使用し得る、請求項１乃至７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
癌が、肺腫瘍、胸部腫瘍、前立腺腫瘍、黒色腫、結腸腫瘍、胃腫瘍、膵臓腫瘍、ＥＮＴ腫瘍、卵巣腫瘍、結腸直腸腫瘍、子宮頸癌、結腸癌または乳癌である、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
ワクチンの形態であり、好ましくは治療用および／または予防用である、請求項１、３乃至５、８および９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
癌疾患を診断する方法、または観測する方法であって、患者から単離された生物学試料において、
（ｉ）腫瘍関連核酸もしくはその一部、および／または
（ｉｉ）腫瘍関連抗原もしくはその一部、および／または
（ｉｉｉ）腫瘍関連抗原もしくはその一部に結合する抗体、および／または
（ｉｖ）腫瘍関連抗原もしくはその一部に特異的なＴリンパ球
を検出するまたはその量を測定することを含み、前記腫瘍関連核酸が、
（ａ）配列番号：６３４、１〜５４０、５４１、５４５、５４９、５５３、５５７、５６０、５６３、５６６、５７０、５７４、５７７、５８０、５８３、５８７、５９１、５９５、５９９、６０２、６０６、６１０、６１３、６１７、６２０、６２４、６３８、６４２、６４６、６４９、６５３、６５６、６６０、６６４、６６８、６７１、６７５、６７９、６８２および６８６からなる群より選択される核酸配列、その一部または誘導体を含む核酸、
（ｂ）ストリンジェントな条件下で前記（ａ）の核酸とハイブリダイズする核酸、
（ｃ）前記（ａ）または前記（ｂ）の核酸に対して縮重している核酸、ならびに
（ｄ）前記（ａ）、前記（ｂ）または前記（ｃ）の核酸に相補的な核酸
からなる群より選択され、前記腫瘍関連抗原が、前記の核酸の群より選択される核酸によってコードされる配列を有する、癌疾患を診断する方法、または観測する方法。
【請求項１２】
検出または量の測定が、
（ｉ）生物学的試料を、腫瘍関連核酸もしくはその一部、腫瘍関連抗原もしくはその一部、抗体またはＴリンパ球に特異的に結合する作用物質と接触させること、および
（ｉｉ）作用物質と、核酸もしくはその一部、腫瘍関連抗原もしくはその一部、抗体またはＴリンパ球との間の複合体の形成を検出するまたは複合体の量を測定すること
を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
腫瘍関連核酸またはその一部に特異的に結合する作用物質が、前記核酸または前記その一部に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
腫瘍関連抗原またはその一部に特異的に結合する作用物質が、前記腫瘍関連抗原または前記その一部に特異的に結合する抗体である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
抗体に特異的に結合する作用物質が、前記抗体に特異的に結合するタンパク質またはペプチドである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
Ｔリンパ球に特異的に結合する作用物質が、腫瘍関連抗原またはその一部とＭＨＣ分子との間の複合体を提示する細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記疾患の前記観測が、前記疾患を有するまたは前記疾患に罹患することが疑われる患者からの試料において前記疾患の後退、経過または発症を測定することを含む、請求項１１乃至１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記作用物質が検出可能に標識されている、請求項１２乃至１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記試料が体液および／または体組織を含む、請求項１１乃至１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記癌疾患が、前記腫瘍関連核酸を発現または異常発現するものであり、好ましくは前記腫瘍関連核酸によってコードされる腫瘍関連抗原発現または異常発現するものである、請求項１１乃至１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
腫瘍関連抗原が発現または異常発現する疾患を治療するまたは予防する方法であって、請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与することを含み、前記腫瘍関連抗原が、
（ａ）配列番号：６３４、１〜５４０、５４１、５４５、５４９、５５３、５５７、５６０、５６３、５６６、５７０、５７４、５７７、５８０、５８３、５８７、５９１、５９５、５９９、６０２、６０６、６１０、６１３、６１７、６２０、６２４、６３８、６４２、６４６、６４９、６５３、６５６、６６０、６６４、６６８、６７１、６７５、６７９、６８２および６８６からなる群より選択される核酸配列、その一部または誘導体を含む核酸、
（ｂ）ストリンジェントな条件下で前記（ａ）の核酸とハイブリダイズする核酸、
（ｃ）前記（ａ）または前記（ｂ）の核酸に対して縮重している核酸、ならびに
（ｄ）前記（ａ）、前記（ｂ）または前記（ｃ）の核酸に相補的な核酸
からなる群より選択される核酸によってコードされる配列を有する、前記疾患を治療する方法、または予防する方法。
【請求項２２】
腫瘍関連抗原の発現または異常発現する疾患を治療する、予防する、診断するまたは観測する方法であって、前記腫瘍関連抗原またはその一部に結合する、治療薬または診断薬に連結された抗体を投与することを含み、前記腫瘍関連抗原が、
（ａ）配列番号：６３４、１〜５４０、５４１、５４５、５４９、５５３、５５７、５６０、５６３、５６６、５７０、５７４、５７７、５８０、５８３、５８７、５９１、５９５、５９９、６０２、６０６、６１０、６１３、６１７、６２０、６２４、６３８、６４２、６４６、６４９、６５３、６５６、６６０、６６４、６６８、６７１、６７５、６７９、６８２および６８６からなる群より選択される核酸配列、その一部または誘導体を含む核酸、
（ｂ）ストリンジェントな条件下で前記（ａ）の核酸とハイブリダイズする核酸、
（ｃ）前記（ａ）または前記（ｂ）の核酸に対して縮重している核酸、ならびに
（ｄ）前記（ａ）、前記（ｂ）または前記（ｃ）の核酸に相補的な核酸
からなる群より選択される核酸によってコードされる配列を有する、前記疾患を治療する方法、予防する方法、診断する方法、または観測する方法。
【請求項２３】
前記抗体が、モノクローナル、キメラ、ヒトもしくはヒト化抗体であるか、または抗体のフラグメントである、請求項１４または２２に記載の方法。
【請求項２４】
腫瘍関連抗原の発現または異常発現する疾患を有する患者を治療する方法であって、
（ｉ）免疫反応性細胞を含有する試料を提供すること、
（ｉｉ）前記試料を、前記腫瘍関連抗原またはその一部に対する細胞溶解性またはサイトカイン放出性Ｔ細胞の産生を促進する条件下で、前記腫瘍関連抗原またはその一部を発現する宿主細胞と接触させること、および
（ｉｉｉ）細胞溶解性またはサイトカイン放出性Ｔ細胞を、腫瘍関連抗原またはその一部を発現する細胞を溶解するのに適した量で患者に導入すること
を含み、前記腫瘍関連抗原が、
（ａ）配列番号：６３４、１〜５４０、５４１、５４５、５４９、５５３、５５７、５６０、５６３、５６６、５７０、５７４、５７７、５８０、５８３、５８７、５９１、５９５、５９９、６０２、６０６、６１０、６１３、６１７、６２０、６２４、６３８、６４２、６４６、６４９、６５３、６５６、６６０、６６４、６６８、６７１、６７５、６７９、６８２および６８６からなる群より選択される核酸配列、その一部または誘導体を含む核酸、
（ｂ）ストリンジェントな条件下で前記（ａ）の核酸とハイブリダイズする核酸、
（ｃ）前記（ａ）または前記（ｂ）の核酸に対して縮重している核酸、ならびに
（ｄ）前記（ａ）、前記（ｂ）または前記（ｃ）の核酸に相補的な核酸
からなる群より選択される核酸によってコードされる配列を有する、前記疾患を有する患者を治療する方法。
【請求項２５】
前記宿主細胞が、腫瘍関連抗原もしくはその一部に結合するＭＨＣ分子を組換え発現するか、または腫瘍関連抗原もしくはその一部に結合するＭＨＣ分子を内因性に発現する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の医薬組成物の有効量を投与することを含む、患者において癌の発症を抑制する方法。
【請求項２７】
（ａ）配列番号：６３４、１〜５４０、５４１、５４５、５４９、５５３、５５７、５６０、５６３、５６６、５７０、５７４、５７７、５８０、５８３、５８７、５９１、５９５、５９９、６０２、６０６、６１０、６１３、６１７、６２０、６２４、６３８、６４２、６４６、６４９、６５３、６５６、６６０、６６４、６６８、６７１、６７５、６７９、６８２および６８６からなる群より選択される核酸配列、その一部または誘導体を含む核酸、
（ｂ）ストリンジェントな条件下で前記（ａ）の核酸とハイブリダイズする核酸、
（ｃ）前記（ａ）または前記（ｂ）の核酸に対して縮重している核酸、ならびに
（ｄ）前記（ａ）、前記（ｂ）または前記（ｃ）の核酸に相補的な核酸
からなる群より選択される核酸によってコードされるタンパク質またはポリペプチドまたはその一部に特異的に結合する作用物質。
【請求項２８】
抗体、好ましくはモノクローナル、キメラ、ヒトもしくはヒト化抗体、または抗体のフラグメントである、請求項２７に記載の作用物質。
【請求項２９】
（ｉ）タンパク質またはポリペプチドまたはその一部と、
（ｉｉ）前記タンパク質またはポリペプチドまたは前記その一部が結合するＭＨＣ分子
との複合体に選択的に結合し、（ｉ）または（ｉｉ）単独には結合しない抗体であって、前記タンパク質またはポリペプチドが、
（ａ）配列番号：６３４、１〜５４０、５４１、５４５、５４９、５５３、５５７、５６０、５６３、５６６、５７０、５７４、５７７、５８０、５８３、５８７、５９１、５９５、５９９、６０２、６０６、６１０、６１３、６１７、６２０、６２４、６３８、６４２、６４６、６４９、６５３、６５６、６６０、６６４、６６８、６７１、６７５、６７９、６８２および６８６からなる群より選択される核酸配列、その一部または誘導体を含む核酸、
（ｂ）ストリンジェントな条件下で前記（ａ）の核酸とハイブリダイズする核酸、
（ｃ）前記（ａ）または前記（ｂ）の核酸に対して縮重している核酸、ならびに
（ｄ）前記（ａ）、前記（ｂ）または前記（ｃ）の核酸に相補的な核酸
からなる群より選択される核酸によってコードされる、抗体。
【請求項３０】
モノクローナル、キメラもしくはヒト化抗体であるか、または抗体のフラグメントである、請求項２９に記載の抗体。
【請求項３１】
請求項２７もしくは２８に記載の作用物質または請求項２９もしくは３０に記載の抗体と、治療薬または診断薬との間の複合体。
【請求項３２】
癌を検出するためのキットであって、
（ｉ）腫瘍関連核酸もしくはその一部、および／または
（ｉｉ）腫瘍関連抗原もしくはその一部、および／または
（ｉｉｉ）腫瘍関連抗原もしくはその一部に結合する抗体、および／または
（ｉｖ）腫瘍関連抗原もしくはその一部とＭＨＣ分子との間の複合体に特異的なＴ細胞
を検出するまたはその量を測定するための作用物質を含み、前記腫瘍関連核酸が、
（ａ）配列番号：６３４、１〜５４０、５４１、５４５、５４９、５５３、５５７、５６０、５６３、５６６、５７０、５７４、５７７、５８０、５８３、５８７、５９１、５９５、５９９、６０２、６０６、６１０、６１３、６１７、６２０、６２４、６３８、６４２、６４６、６４９、６５３、６５６、６６０、６６４、６６８、６７１、６７５、６７９、６８２および６８６からなる群より選択される核酸配列、その一部または誘導体を含む核酸、
（ｂ）ストリンジェントな条件下で前記（ａ）の核酸とハイブリダイズする核酸、
（ｃ）前記（ａ）または前記（ｂ）の核酸に対して縮重している核酸、ならびに
（ｄ）前記（ａ）、前記（ｂ）または前記（ｃ）の核酸に相補的な核酸
からなる群より選択され、前記腫瘍関連抗原が、前記の核酸の群より選択される核酸によってコードされる配列を有する、癌を検出するためのキット。
【請求項３３】
腫瘍関連抗原が、配列番号：６３５、５４２、５４６、５５０、５５４、５６７、５７１、５８４、５８８、５９２、５９６、６０３、６０７、６１４、６２１、６２５、６３９、６４３、６５０、６５７、６６１、６６５、６７２、６７６および６８３からなる群より選択されるアミノ酸配列、その一部または誘導体を含む、請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の医薬組成物、請求項１１乃至２６のいずれか一項に記載の方法、または請求項３２に記載のキット。
【請求項３４】
タンパク質またはポリペプチドが、配列番号：６３５、５４２、５４６、５５０、５５４、５６７、５７１、５８４、５８８、５９２、５９６、６０３、６０７、６１４、６２１、６２５、６３９、６４３、６５０、６５７、６６１、６６５、６７２、６７６および６８３からなる群より選択されるアミノ酸配列、その一部または誘導体を含む、請求項２７もしくは２８に記載の作用物質、請求項２９もしくは３０に記載の抗体、または請求項３１に記載の複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌において発現される核酸およびコードされるポリペプチドに関する。本発明はまた、上記ポリペプチドに結合する作用物質に関する。上記核酸、そのような核酸によってコードされるポリペプチドおよびそれに由来するペプチド、ならびに関連する抗体および細胞溶解性Ｔリンパ球は、中でも特に、診断および治療状況において有用である。
【背景技術】
【０００２】
学際的なアプローチおよび古典的治療法の網羅的な使用にもかかわらず、癌は現在もなお死亡の主要原因の１つである。
【０００３】
癌治療におけるごく最近の治療概念は、組換え腫瘍ワクチンおよび抗体療法のような他の特定の手段を使用することによって患者の免疫系を全体的な治療の概念に組み込むことを目指している。そのような方策の成功のための必要条件は、腫瘍特異的または腫瘍関連抗原またはエピトープが、そのエフェクター機能を介入措置によって増強しようとする患者の免疫系によって認識されることである。
【０００４】
腫瘍細胞は、生物学的に、それらの起源である非悪性細胞とは実質上異なる。これらの相違は、腫瘍発現の間に獲得される遺伝的変化に起因し、中でも特に、癌細胞における質的または量的に変化した分子構造体の形成も生じさせる。腫瘍を保持する宿主の特異的免疫系によって認識されるこの種の腫瘍関連構造体は、腫瘍関連抗原と称される。
【０００５】
腫瘍関連抗原の特異的認識は、２つの機能的に相互連結された単位である細胞性機構および体液性機構を含む：ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔリンパ球は、それぞれＭＨＣ（主要組織適合遺伝子複合体）クラスＩおよびＩＩの分子上に提示されるプロセシングされた抗原を認識し、一方Ｂリンパ球は、プロセシングされていない抗原に直接結合する循環抗体分子を産生する。腫瘍関連抗原の潜在的な臨床−治療上の重要性は、免疫系による腫瘍細胞上の抗原の認識が細胞傷害性エフェクター機構の開始を導き、ヘルパーＴ細胞の存在下で、癌細胞の除去をもたらすことができるという事実から生じる（Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：５２５−３１，１９９８）。
【０００６】
抗体に基づく癌治療は、臨床の場に導入されて成功を収め、この１０年間に腫瘍学における最も有望な治療法として浮上してきた。８つの抗体が腫瘍性疾患の治療に関して承認されているが、それらの大部分はリンパ腫および白血病における治療である（Ａｄａｍｓ  ＧＰ，Ｗｅｉｎｅｒ  ＬＭ，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２３：１１４７−５７，２００５）。
【０００７】
次世代の改良された抗体ベースの癌治療の出現のために克服すべき課題の１つは、良好な毒性／効果プロフィールのための鍵となる、適切な標的分子の選択である。
【０００８】
健常組織の大部分では固く沈黙している遺伝子についての検索は、配偶子形成および／または栄養膜系譜の遺伝子がしばしば異所性に活性化され、ヒト癌において堅固に発現されるという興味深い所見に関心の焦点を移している。生殖細胞、妊娠性栄養膜細胞および癌細胞の間の表現型類似性に基づき、Ｊｏｈｎ  Ｂｅａｒｄは、１００年も前に「癌の栄養膜理論（ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ）」（Ｂｅａｒｄ  Ｊ，Ｌａｎｃｅｔ  １：１７５８−６３，１９０２；Ｇｕｒｃｈｏｔ  Ｃ，Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ３１：３１０−３，１９７５）を提唱した。癌細胞による絨毛性性腺刺激ホルモン、α−フェトプロテイン、ＣＥＡおよび他の栄養膜ホルモンの散発性産生の発見は、新生細胞と栄養膜細胞との間で共有される最初の分子を提供した（Ａｃｅｖｅｄｏ  ＨＦ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  ７６：１４６７−７５，１９９５；Ｄｉｒｎｈｏｆｅｒ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｐａｔｈｏｌ  ２９：３７７−８２，１９９８；Ｇｕｒｃｈｏｔ  Ｃ，Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ３１：３１０−３，１９７５；Ｉｌｅｓ  ＲＫ，Ｃｈａｒｄ  Ｔ，Ｊ  Ｕｒｏｌ  １４５：４５３−８，１９９１；Ｌａｕｒｅｎｃｅ  ＤＪ，Ｎｅｖｉｌｌｅ  ＡＭ，Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２６：３３５−５５，１９７２）。この概念は、各々が様々な腫瘍型を発現する１００以上の成員を示す、着実に増殖する、いわゆる癌／生殖系（ＣＧ）クラスの遺伝子の確立によって再び注目された。栄養膜および配偶子形成プログラム全体が転写サイレンシングを免れ、癌細胞において異所性に活性化されるという所見は（Ｋｏｓｌｏｗｓｋｉ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６４：５９８８−９３，２００４；Ｓｉｍｐｓｏｎ  ＡＪ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ５：６１５−２５，２００５）、極めて選択的な組織分布を有するこのクラスの遺伝子の中で、ｍＡＢ療法のための適切な標的を見出し得ることを示唆する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
癌の診断および治療のための標的構造体を提供することが本発明の目的であった。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
この目的は、各請求項の主題によって達成される。
【００１１】
本発明によれば、腫瘍細胞において選択的にまたは異常に発現され、従って治療的および診断的アプローチのための標的構造体を提供する、胎盤特異的遺伝子が同定される。
【００１２】
腫瘍細胞において選択的にまたは異常に発現されると本発明によって同定される核酸は、（ａ）配列表の配列番号：１〜５４０、５４１、５４５、５４９、５５３、５５７、５６０、５６３、５６６、５７０、５７４、５７７、５８０、５８３、５８７、５９１、５９５、５９９、６０２、６０６、６１０、６１３、６１７、６２０、６２４、６３４、６３８、６４２、６４６、６４９、６５３、６５６、６６０、６６４、６６８、６７１、６７５、６７９、６８２および６８６からなる群より選択される核酸配列、その一部または誘導体を含む核酸、（ｂ）ストリンジェントな条件下で（ａ）の核酸とハイブリダイズする核酸、（ｃ）（ａ）または（ｂ）の核酸に対して縮重している核酸、ならびに（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の核酸に相補的な核酸からなる群より選択される。これらの核酸はまた、本明細書では「腫瘍関連核酸」とも称される。
【００１３】
もう１つの態様では、本発明は、本発明によって同定される腫瘍関連核酸によってコードされる抗原に関する。従って、本発明によって同定される腫瘍関連抗原は、（ａ）配列表の配列番号：１〜５４０、５４１、５４５、５４９、５５３、５５７、５６０、５６３、５６６、５７０、５７４、５７７、５８０、５８３、５８７、５９１、５９５、５９９、６０２、６０６、６１０、６１３、６１７、６２０、６２４、６３４、６３８、６４２、６４６、６４９、６５３、６５６、６６０、６６４、６６８、６７１、６７５、６７９、６８２および６８６からなる群より選択される核酸配列を含む核酸、その一部または誘導体、（ｂ）ストリンジェントな条件下で（ａ）の核酸とハイブリダイズする核酸、（ｃ）（ａ）または（ｂ）の核酸に対して縮重している核酸、ならびに（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の核酸に相補的な核酸からなる群より選択される核酸によってコードされるアミノ酸配列を有する。好ましい実施形態では、本発明によって同定される腫瘍関連抗原は、配列表の配列番号：５４２、５４６、５５０、５５４、５６７、５７１、５８４、５８８、５９２、５９６、６０３、６０７、６１４、６２１、６２５、６３５、６３９、６４３、６５０、６５７、６６１、６６５、６７２、６７６および６８３からなる群より選択されるアミノ酸配列、その一部または誘導体を含む。
【００１４】
本発明により、特定の核酸配列を含む核酸または特定のアミノ酸配列を含む腫瘍関連抗原に言及する場合、これはまた、核酸または腫瘍関連抗原が、それぞれ、これら特定の核酸配列またはアミノ酸配列からなる実施形態も包含する。
【００１５】
本発明は、一般に、本発明によって同定される腫瘍関連核酸または腫瘍関連抗原を標的することによる治療および／または診断を包含する。これは、そのような腫瘍関連核酸および／または腫瘍関連抗原を発現する細胞の選択的検出および／または細胞の根絶を提供し、それにより、そのような腫瘍関連核酸および／または腫瘍関連抗原を発現しない正常細胞への有害作用を最小限に抑える。従って、治療または診断のための好ましい疾患は、腫瘍疾患などの、本発明によって同定される腫瘍関連核酸および／または腫瘍関連抗原の１またはそれ以上が発現されるもの、特に本明細書で述べるような癌疾患である。
【００１６】
本発明は、一般に、腫瘍疾患などの腫瘍性疾患、特に本明細書で述べるような癌疾患の治療、予防、診断および／または観測のための、本発明によって同定される腫瘍関連核酸および腫瘍関連抗原またはその一部もしくは誘導体、前記腫瘍関連核酸に対する核酸、本発明によって同定される腫瘍関連抗原に対する抗体もしくはＴ細胞またはその一部もしくは誘導体、および／または本発明によって同定される腫瘍関連抗原を発現する宿主細胞の使用を含む。
【００１７】
これはまた、これらの核酸、抗原、抗体、Ｔ細胞および／または宿主細胞のうち、２つまたはそれ以上の組合せの使用を含み得る。
【００１８】
本発明によって同定される腫瘍関連抗原に対する抗体またはその一部もしくは誘導体の使用に関する本発明の実施形態では、本発明によって同定される腫瘍関連抗原に対するＴ細胞受容体またはその一部もしくは誘導体も、場合によりＭＨＣ分子との複合体として、使用し得る。
【００１９】
腫瘍関連抗原の非膜貫通部分、特に細胞外部分に対応するまたはそれからなる、本発明によって同定される腫瘍関連抗原の一部は、治療、予防、診断および／または観測のために特に適切である。このため、本発明によれば、腫瘍関連抗原の非膜貫通部分、特に細胞外部分に対応するまたはそれからなる、本発明によって同定される腫瘍関連抗原の一部、または本発明によって同定される腫瘍関連抗原をコードする核酸の対応する部分は、治療、予防、診断および／または観測のために好ましい。同様に、腫瘍関連抗原の非膜貫通部分、特に細胞外部分に対応するまたはそれからなる、本発明によって同定される腫瘍関連抗原の一部に対する抗体の使用は好ましい。
【００２０】
治療、予防、診断および／または観測のための好ましい疾患は、本発明によって同定される腫瘍関連核酸の１またはそれ以上が選択的に発現されるまたは異常発現される疾患である。治療、予防、診断および／または観測のための特に好ましい疾患は、本発明によって同定される腫瘍関連核酸の１もしくはそれ以上および／またはそれによってコードされる腫瘍関連抗原の１もしくはそれ以上が選択的に発現されるまたは異常発現される疾患である。
【００２１】
１つの態様では、本発明は、本発明によって同定される腫瘍関連抗原または腫瘍関連抗原をコードする核酸を認識し、好ましくは本発明によってまたは腫瘍関連抗原をコードする核酸によって同定される腫瘍関連抗原の発現または異常発現を有する細胞に選択的である作用物質を含有する医薬組成物に関する。
【００２２】
さらなる態様では、本発明は、（Ｉ）本発明によって同定される腫瘍関連抗原の発現もしくは活性を阻害する、および／または（ＩＩ）腫瘍阻害活性もしくは腫瘍破壊活性を有し、本発明によって同定される腫瘍関連核酸および／もしくは腫瘍関連抗原を発現するもしくは異常発現する細胞に選択的である、および／または（ＩＩＩ）投与された場合、ＭＨＣ分子と本発明によって同定される腫瘍関連抗原もしくはペプチドエピトープなどのその一部との間の複合体の量を選択的に増大させる作用物質を含有する医薬組成物に関する。特定の実施形態では、前記作用物質は、細胞死の誘導、細胞増殖の低減、細胞膜への損傷またはサイトカインの分泌を生じさせることができ、好ましくは腫瘍阻害活性を有し得る。
【００２３】
１つの実施形態では、腫瘍関連抗原の発現または活性を阻害する作用物質は、本発明によって同定される腫瘍関連核酸に特異的である。もう１つの実施形態では、腫瘍関連抗原の発現または活性を阻害する作用物質は、本発明によって同定される腫瘍関連抗原に特異的である。本発明によれば、「発現および／または活性を阻害する」という語句は、発現および／または活性の完全なまたは基本的に完全な阻害ならびに発現および／または活性の低減を包含する。好ましくは、本発明によって同定される腫瘍関連抗原の発現の前記阻害は、本発明によって同定される腫瘍関連抗原をコードする転写産物、すなわちｍＲＮＡの産生を阻害するまたはそのレベルを低下させることによって、例えば転写を阻害するまたは転写産物の分解を誘導することによって、および／または本発明によって同定される腫瘍関連抗原の産生を阻害することによって、例えば本発明によって同定される腫瘍関連抗原をコードする転写産物の翻訳を阻害することによって行われ得る。好ましくは、本発明によって同定される腫瘍関連抗原の発現および／または活性の前記阻害は、腫瘍細胞の増殖を低減し、および／または腫瘍細胞死を誘導し、従って腫瘍阻害作用または腫瘍破壊作用を有する。
【００２４】
特定の実施形態では、本発明によって同定される腫瘍関連抗原の発現を阻害する作用物質は、本発明によって同定される腫瘍関連核酸に選択的にハイブリダイズし、前記腫瘍関連核酸に対して特異的であり、それにより、その転写および／または翻訳を阻害する（例えば低減する）、阻害性核酸（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、ｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはそれらをコードするＤＮＡ）である。
【００２５】
阻害性核酸は、標的核酸に対してアンチセンス方向の配列を有するオリゴヌクレオチドを含む。適切な阻害性オリゴヌクレオチドは、典型的には５〜数百ヌクレオチドの長さ、より典型的には約２０〜７０ヌクレオチド長またはそれ以下、より一層典型的には約１０〜３０ヌクレオチド長にわたる。これらの阻害性オリゴヌクレオチドは、遊離（裸の）核酸としてまたは保護された形態で、例えばリポソームに封入されて投与され得る。リポソームまたは他の保護された形態の使用は、インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での安定性を高めることができ、従って標的部位への送達を促進し得るので、好都合であり得る。
【００２６】
また、標的腫瘍関連核酸は、腫瘍細胞中の対応するｍＲＮＡの切断を標的するリボザイムを設計するためにも使用し得る。同様に、これらのリボザイムは、遊離（裸の）形態でまたは安定性および／もしくは標的化を増強する送達システム、例えばリポソームを使用して投与され得る。
【００２７】
また、標的腫瘍関連核酸は、腫瘍関連核酸の発現を阻害する（例えば低減する）ことができるｓｉＲＮＡを設計するためにも使用し得る。ｓｉＲＮＡは、遊離（裸の）形態でまたは安定性および／もしくは標的化を増強する送達システム、例えばリポソームを使用して投与され得る。それらはまた、それらの前駆体またはそれらをコードするＤＮＡの形態でも投与され得る。
【００２８】
さらなる実施形態では、本発明によって同定される腫瘍関連抗原の活性を阻害する作用物質は、前記腫瘍関連抗原に特異的に結合する抗体である。腫瘍関連抗原への抗体の結合は、例えば結合活性または触媒活性を阻害することによって、腫瘍関連抗原の機能を妨げることができる。
【００２９】
また、本発明は、もう１つの態様では、標的分子、すなわち本発明によって同定される腫瘍関連核酸または腫瘍関連抗原のリガンドの投与を含む、腫瘍疾患の治療のための療法に関する。これに関して、これらの標的を発現する細胞、例えば腫瘍細胞を選択的に標的し、死滅させるために、治療エフェクター部分、例えば放射性標識、細胞毒、細胞傷害性酵素等に結合した、標的核酸に選択的にハイブリダイズする核酸を投与し得るか、または標的抗原に特異的に結合する抗体を投与し得る。
【００３０】
上記で述べた態様の１つの実施形態では、作用物質は、腫瘍関連抗原をコードする核酸と選択的にハイブリダイズするアンチセンス核酸である。さらなる実施形態では、作用物質は、好ましくはセンスＲＮＡ鎖とアンチセンスＲＮＡ鎖を含むｓｉＲＮＡであり、前記ｓｉＲＮＡにおいてセンスＲＮＡ鎖とアンチセンスＲＮＡ鎖はＲＮＡ二本鎖を形成し、センスＲＮＡ鎖は、腫瘍関連抗原をコードする核酸、好ましくは腫瘍関連抗原をコードするｍＲＮＡ中の約１９〜約２５個の連続するヌクレオチドの標的配列と実質的に同一なヌクレオチド配列を含む。さらなる実施形態では、作用物質は、腫瘍関連抗原に選択的に結合する抗体、特に腫瘍関連抗原に選択的に結合する補体活性化抗体または毒素結合抗体である。好ましい実施形態では、腫瘍関連抗原に選択的に結合する抗体は、治療上有用な物質に連結されている、および／または前記腫瘍関連抗原を発現するもしくは異常発現する前記細胞に、天然もしくは人為的エフェクター機構を動員する。さらなる実施形態では、作用物質は、細胞上のＭＨＣ分子によって結合された腫瘍関連抗原またはその一部を認識し、このように標識された細胞を溶解する、細胞傷害性Ｔリンパ球である。さらなる実施形態では、作用物質は、細胞上のＭＨＣ分子によって結合された腫瘍関連抗原またはその一部を認識し、前記腫瘍関連抗原またはその一部を特異的に認識する他の細胞のエフェクター機能を増強する、Ｔヘルパーリンパ球である。
【００３１】
さらなる実施形態では、作用物質は、各々が異なる腫瘍関連抗原もしくは腫瘍関連抗原をコードする異なる核酸を認識する、および／または異なる腫瘍関連抗原の発現もしくは活性を阻害する、および／または腫瘍阻害活性もしくは腫瘍破壊活性を有する、異なる腫瘍関連抗原を発現するもしくは異常発現する細胞に選択的である、および／または投与された場合、ＭＨＣ分子と種々の異なる腫瘍関連抗原もしくはその一部との間の複合体の量を選択的に増大させる、２またはそれ以上の作用物質を含み、前記の異なる腫瘍関連抗原の少なくとも１つは本発明によって同定される腫瘍関連抗原である。
【００３２】
好ましくは、選択的に腫瘍に限定される腫瘍関連抗原は、エフェクター機構をこの特定位置に動員するための標識として働く。この態様では、本発明は、作用物質が、それ自体では腫瘍関連抗原の活性または腫瘍阻害もしくは腫瘍破壊活性を阻害する能力を有さないが、特にエフェクター機構、中でも細胞損傷能を有する機構を特定位置、特に腫瘍または腫瘍細胞に動員することによってそのような作用を媒介する実施形態を包含する。
【００３３】
好ましくは、本発明によって同定される腫瘍関連核酸および／または腫瘍関連抗原を発現するまたは異常発現する前記細胞は、非胎盤細胞である。
【００３４】
本発明によって同定される腫瘍関連抗原の活性は、タンパク質またはペプチドの任意の活性であり得る。１つの実施形態では、この活性は酵素活性である。
【００３５】
本発明によれば、「発現または活性を阻害する」という語句は、発現または活性の完全な阻害または基本的に完全な阻害および発現または活性の低減を包含する。
【００３６】
ＭＨＣ分子と本発明によって同定される腫瘍関連抗原またはその一部との間の複合体の量を選択的に増大させる作用物質は、投与された場合、（ｉ）腫瘍関連抗原またはその一部、（ｉｉ）前記腫瘍関連抗原またはその一部をコードする核酸、（ｉｉｉ）前記腫瘍関連抗原またはその一部を発現する宿主細胞、および（ｖｉ）前記腫瘍関連抗原からのペプチドエピトープとＭＨＣ分子との間の単離された複合体からなる群より選択される１またはそれ以上の成分を含む。
【００３７】
本発明はさらに、（ｉ）本発明によって同定される腫瘍関連抗原またはその一部、（ｉｉ）本発明によって同定される腫瘍関連抗原またはその一部をコードする核酸、（ｉｉｉ）本発明によって同定される腫瘍関連抗原またはその一部に結合する抗体、（ｉｖ）本発明によって同定される腫瘍関連核酸／本発明によって同定される腫瘍関連抗原をコードする核酸と特異的にハイブリダイズするアンチセンス核酸、（ｖ）本発明によって同定される腫瘍関連核酸／本発明によって同定される腫瘍関連抗原をコードする核酸に対するｓｉＲＮＡ、（ｖｉ）本発明によって同定される腫瘍関連抗原またはその一部を発現する宿主細胞、および（ｖｉｉ）本発明によって同定される腫瘍関連抗原またはその一部とＭＨＣ分子との間の単離された複合体からなる群より選択される１またはそれ以上の成分を含有する医薬組成物に関する。
【００３８】
１つの実施形態では、本発明によって同定される腫瘍関連抗原またはその一部をコードする核酸は、発現ベクター内でおよびプロモーターに機能的に連結されて、医薬組成物中に存在する。さらなる実施形態では、本発明によって同定される腫瘍関連抗原またはその一部をコードする核酸は、以下でさらに述べるようにウイルス内で医薬組成物中に存在する。
【００３９】
本発明の医薬組成物中に存在する宿主細胞は、腫瘍関連抗原またはその一部を分泌して、それを表面上に発現することができ、好ましくは前記腫瘍関連抗原またはその一部に結合するＭＨＣ分子を付加的に発現し得る。１つの実施形態では、宿主細胞はＭＨＣ分子を内因性に発現する。さらなる実施形態では、宿主細胞は、ＭＨＣ分子および／または腫瘍関連抗原もしくはその一部を組換え発現する。宿主細胞は、好ましくは非増殖性である。好ましい実施形態では、宿主細胞は、抗原提示細胞、特に樹状細胞、単球またはマクロファージである。
【００４０】
さらなる実施形態では、本発明の医薬組成物中に存在する抗体は、モノクローナル抗体である。さらなる実施形態では、抗体は、キメラ、ヒトもしくはヒト化抗体、抗体のフラグメントまたは合成抗体である。抗体は、本明細書では治療薬または治療物質あるいは診断薬または診断物質と称される、治療上または診断上有用な作用物質に連結され得る。
【００４１】
本発明の医薬組成物中に存在するアンチセンス核酸は、本発明によって同定される腫瘍関連抗原をコードする核酸の６〜５０、特に１０〜３０、１５〜３０および２０〜３０個の連続するヌクレオチドの配列を含み得る。
【００４２】
さらなる実施形態では、直接にまたは核酸の発現を介して本発明の医薬組成物によって提供される、腫瘍関連抗原またはその一部は、細胞の表面でＭＨＣ分子に結合し、前記結合は、好ましくは細胞溶解応答を生じさせるおよび／またはサイトカイン放出を誘導する。
【００４３】
本発明の医薬組成物は、医薬的に適合性の担体および／または補助薬を含有し得る。
【００４４】
本発明の医薬組成物は、好ましくは、腫瘍関連核酸および／または腫瘍関連抗原の選択的発現または異常発現する疾患の治療または予防のために使用される。好ましい実施形態では、疾患は、腫瘍性疾患、好ましくは癌である。
【００４５】
好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物は、治療的または予防的に使用され得るワクチンの形態である。そのようなワクチンは、好ましくは、本発明によって同定される腫瘍関連抗原もしくはその一部、および／または本発明によって同定される腫瘍関連抗原もしくはその一部をコードする核酸を含有する。特定の実施形態では、核酸は、ウイルスまたは宿主細胞内に存在する。
【００４６】
本発明はさらに、本発明によって同定される１またはそれ以上の腫瘍関連核酸の発現または異常発現を特徴とし、好ましくは本発明によって同定される１またはそれ以上の腫瘍関連抗原の発現または異常発現も同時に生じさせる疾患、好ましくは腫瘍性疾患、特に癌を治療する、予防する、診断するまたは観測する、すなわち前記疾患の後退、進行、経過および／または発症を測定する方法に関する。１つの実施形態では、治療または予防は本発明の医薬組成物の投与を含有する。
【００４７】
本発明による診断の方法および／または観測の方法は、一般に、患者から、好ましくは前記疾患を有する、前記疾患を有するもしくは罹患することが疑われる、または前記疾患の潜在的可能性を有する患者から単離された生物学的試料における、（ｉ）本発明によって同定される腫瘍関連核酸またはその一部、（ｉｉ）本発明によって同定される腫瘍関連抗原またはその一部、（ｉｉｉ）本発明によって同定される腫瘍関連抗原またはその一部に対する抗体、および（ｉｖ）本発明によって同定される腫瘍関連抗原もしくはその一部および／または腫瘍関連抗原もしくはその一部とＭＨＣ分子との間の複合体に特異的なＴリンパ球、好ましくは細胞傷害性Ｔリンパ球またはＴヘルパーリンパ球からなる群より選択される１またはそれ以上のパラメータの検出および／またはその量の測定に関する。前記検出および／または量の測定を達成するための手段は、本明細書において説明され、当業者に明らかになる。
【００４８】
好ましくは、前記核酸もしくはその一部、前記腫瘍関連抗原もしくはその一部、前記抗体および／または前記Ｔリンパ球の存在、ならびに／あるいは前記疾患を有していない患者および／または組織と比較して増大している、前記核酸もしくはその一部、前記腫瘍関連抗原もしくはその一部、前記抗体および／または前記Ｔリンパ球の量は、前記疾患の存在または前記疾患の発現の潜在的可能性の指標となる。
【００４９】
本発明の診断の方法および／または観測の方法はまた、前記核酸もしくはその一部、前記腫瘍関連抗原もしくはその一部、前記抗体および／または前記Ｔリンパ球の検出またはその量の測定により、前記疾患の転移挙動を評価するおよび／または予後判定することが可能である実施形態を包含し、前記実施形態では、好ましくは、前記核酸もしくはその一部、前記腫瘍関連抗原もしくは前記その一部、前記抗体および／または前記Ｔリンパ球の存在、ならびに／あるいは前記疾患を有していないまたは前記疾患の転移を有していない患者と比較して増大している、前記核酸もしくはその一部、前記腫瘍関連抗原もしくはその一部、前記抗体および／または前記Ｔリンパ球の量は、前記疾患の転移挙動または前記疾患の転移挙動の潜在的可能性の指標となる。
【００５０】
特定の実施形態では、前記検出または量の測定は、（ｉ）生物学的試料を、腫瘍関連核酸もしくはその一部、腫瘍関連抗原もしくはその一部、抗体またはＴリンパ球に特異的に結合する作用物質と接触させること、および（ｉｉ）作用物質と、核酸もしくはその一部、腫瘍関連抗原もしくはその一部、抗体またはＴリンパ球との間の複合体の形成を検出するまたは複合体の量を測定することを含む。
【００５１】
１つの実施形態では、疾患は、好ましくは２またはそれ以上の異なる腫瘍関連抗原の発現または異常発現も同時に生じさせる、２またはそれ以上の異なる腫瘍関連核酸の発現または異常発現を特徴とし、検出または量の測定は、２もしくはそれ以上の異なる腫瘍関連核酸もしくはその一部、２もしくはそれ以上の異なる腫瘍関連抗原もしくはその一部、前記２もしくはそれ以上の異なる腫瘍関連抗原もしくはその一部に結合する２もしくはそれ以上の抗体、および／または前記２もしくはそれ以上の異なる腫瘍関連抗原もしくはその一部またはＭＨＣ分子とのその複合体に特異的な２またはそれ以上のＴリンパ球の検出またはその量の測定を含む。さらなる実施形態では、患者から単離された生物学的試料を、匹敵する正常な生物学的試料と比較する。
【００５２】
本発明による観測の方法は、好ましくは、第１に、第１試料において、および第２に、でさらなる試料において、上述したパラメータの１またはそれ以上を検出するまたはその量を測定することを含み、２つの試料を比較することによって疾患の経過を判定する。
【００５３】
好ましくは、前記核酸もしくはその一部、前記腫瘍関連抗原もしくはその一部、前記抗体および／または前記Ｔリンパ球のレベルが、患者から以前に採取した試料と比較して試料中で上昇していることは、患者が癌および／または癌の転移および／または癌の再発を発症したまたは発症しかかっていることを指示する。好ましくは、前記核酸もしくはその一部、前記腫瘍関連抗原もしくはその一部、前記抗体および／または前記Ｔリンパ球のレベルが、患者から以前に採取した試料と比較して試料中で低下していることは、前記患者における癌および／または癌の転移の後退を指示し、従って、好ましくは癌治療の成功を指示する。
【００５４】
本発明によれば、核酸もしくはその一部の検出または核酸もしくはその一部の量の測定は、前記核酸もしくはその一部に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドプローブを使用して実施し得るか、または前記核酸もしくはその一部の選択的増幅によって、例えばＰＣＲ増幅を用いて実施し得る。１つの実施形態では、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドプローブは、前記核酸の６〜５０個、特に１０〜３０個、１５〜３０個および２０〜３０個の連続するヌクレオチドの配列を含む。
【００５５】
特定の実施形態では、本発明の方法において検出されるまたはその量が測定される腫瘍関連抗原またはその一部は、細胞内、細胞表面上またはＭＨＣ分子との複合体中に存在する。
【００５６】
本発明によれば、腫瘍関連抗原もしくはその一部の検出または腫瘍関連抗原もしくはその一部の量の測定は、前記腫瘍関連抗原またはその一部に特異的に結合する抗体を使用して実施し得る。
【００５７】
本発明によれば、抗体の検出または抗体の量の測定は、前記抗体に特異的に結合するタンパク質またはペプチドを使用して実施し得る。
【００５８】
本発明によれば、腫瘍関連抗原もしくはその一部および／またはＭＨＣ分子とのその複合体に特異的なＴリンパ球の検出またはその量の測定は、前記腫瘍関連抗原またはその一部とＭＨＣ分子との間の複合体を提示する細胞を使用して実施し得る。Ｔリンパ球は、付加的に、それらの増殖、それらのサイトカイン産生、およびＭＨＣ分子と腫瘍関連抗原またはその一部との複合体での特異的刺激によって開始されるそれらの細胞傷害活性を検出することによって検出し得る。Ｔリンパ球はまた、組換えＭＨＣ分子または１もしくはそれ以上の腫瘍関連抗原の免疫原性フラグメントが負荷された２もしくはそれ以上のＭＨＣ分子の複合体を用いて検出し得る。
【００５９】
オリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドプローブ、抗体、タンパク質もしくはペプチド、または細胞などの、本発明の方法における検出または量の測定のために使用される作用物質は、好ましくは検出可能に、特に放射性マーカーまたは酵素マーカーなどの検出可能なマーカーによって標識される。
【００６０】
本発明の特定態様では、本発明によって同定される腫瘍関連抗原の発現または異常発現する疾患を治療する、予防する、診断するまたは観測する方法であって、前記腫瘍関連抗原またはその一部に結合し、且つ治療薬または診断薬に連結されている抗体を投与することを含む方法に関する。抗体はモノクローナル抗体であり得る。さらなる実施形態では、抗体は、キメラもしくはヒト化抗体または抗体のフラグメントである。
【００６１】
ある実施形態では、疾患を診断するまたは観測する本発明の方法は、播種性腫瘍細胞または転移性腫瘍細胞などの腫瘍細胞を含むまたは含むことが疑われる生物学的試料に関して実施される。そのような生物学的試料は、例えば組織、血液、血清、骨髄、痰、気管支吸引液および／または気管支洗浄液を含む。好ましくは、疾患を診断するまたは観測する本発明の方法は、胎盤細胞を含まない、特に、被験者から単離された非胎盤生物学的試料である生物学的試料に関して実施される。１つの実施形態では、生物学的試料は組織または器官に由来し、前記組織または器官が腫瘍を含まない場合、その細胞は本発明によって同定される腫瘍関連抗原および／または本発明によって同定される腫瘍関連核酸を実質的に発現しない。
【００６２】
１つの特定態様では、本発明は、本発明によって同定される腫瘍関連抗原の発現または異常発現する疾患を有する患者を治療する方法であって、（ｉ）前記患者からまたは同じ種の別の個体、特に健常個体から、または異なる種の個体から得た、免疫反応性細胞を含む試料を提供すること、（ｉｉ）前記試料を、前記腫瘍関連抗原またはその一部に対する細胞溶解性Ｔ細胞の産生を促進する条件下で、前記腫瘍関連抗原またはその一部を発現する宿主細胞と接触させること、および（ｉｉｉ）細胞溶解性Ｔ細胞を、腫瘍関連抗原またはその一部を発現する細胞を溶解するのに適した量で患者に導入することを含む方法に関する。１つの実施形態では、その方法は、得られた細胞溶解性Ｔ細胞のＴ細胞受容体をクローニングすることおよびＴ細胞受容体をコードする核酸を、前記患者からまたは同じ種の別の個体、特に健常個体から、または異なる種の個体から得た、Ｔ細胞に移入することを含み、このようにして前記Ｔ細胞は所望の特異性を受容し、（ｉｉｉ）におけるように、患者に導入され得る。
【００６３】
１つの実施形態では、宿主細胞はＭＨＣ分子を内因性に発現する。さらなる実施形態では、宿主細胞は、ＭＨＣ分子および／または腫瘍関連抗原もしくはその一部を組換え発現する。好ましくは、宿主細胞は、ＭＨＣ分子によって腫瘍関連抗原またはその一部をその表面に提示する。宿主細胞は、好ましくは非増殖性である。好ましい実施形態では、宿主細胞は、抗原提示細胞、特に樹状細胞、単球またはマクロファージである。
【００６４】
本発明はまた、本発明によって同定される腫瘍関連抗原の発現または異常発現する疾患を治療する方法であって、（ｉ）異常量の腫瘍関連抗原を発現する、患者からの細胞を同定すること、（ｉｉ）前記細胞の試料を単離すること、（ｉｉｉ）前記細胞を培養すること、および（ｉｖ）前記細胞を、細胞に対する免疫応答を開始させるのに適した量で患者に導入することを含む方法に関する。
【００６５】
本発明はさらに、（ａ）配列番号：１〜５４０、５４１、５４５、５４９、５５３、５５７、５６０、５６３、５６６、５７０、５７４、５７７、５８０、５８３、５８７、５９１、５９５、５９９、６０２、６０６、６１０、６１３、６１７、６２０、６２４、６３４、６３８、６４２、６４６、６４９、６５３、６５６、６６０、６６４、６６８、６７１、６７５、６７９、６８２および６８６からなる群より選択される核酸配列、その一部または誘導体を含む核酸、（ｂ）ストリンジェントな条件下で（ａ）の核酸とハイブリダイズする核酸、（ｃ）（ａ）または（ｂ）の核酸に対して縮重している核酸、ならびに（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の核酸に相補的な核酸からなる群より選択される核酸に関する。
【００６６】
さらなる態様では、本発明は、本発明の核酸を含む、組換え核酸分子、特にＤＮＡまたはＲＮＡ分子に関する。
【００６７】
本発明はまた、本発明の核酸または組換え核酸分子を含む宿主細胞に関する。
【００６８】
宿主細胞はまた、ＭＨＣ分子をコードする核酸を含み得る。１つの実施形態では、宿主細胞はＭＨＣ分子を内因性に発現する。さらなる実施形態では、宿主細胞は、ＭＨＣ分子および／または本発明の核酸もしくは組換え核酸分子もしくはその一部を組換え発現する。好ましくは、宿主細胞は非増殖性である。好ましい実施形態では、宿主細胞は、抗原提示細胞、特に樹状細胞、単球またはマクロファージである。
【００６９】
さらなる実施形態では、本発明は、本発明によって同定される核酸とハイブリダイズし、遺伝子プローブとしてまたは「アンチセンス」分子として使用し得るオリゴヌクレオチドに関する。本発明によって同定される核酸またはその一部とハイブリダイズする、オリゴヌクレオチドプライマーまたはコンピテントプローブの形態の核酸分子は、例えばＰＣＲ増幅、サザンおよびノーザンハイブリダイゼーションによって、前記核酸を検出するためおよび／または本発明によって同定される前記核酸に相同な核酸を見出すために使用し得る。ハイブリダイゼーションは、低い厳密性の条件下で、より好ましくは普通の厳密性の条件下で、最も好ましくは高い厳密性の条件下で実施し得る。
【００７０】
さらなる態様では、本発明は、（ａ）配列番号：１〜５４０、５４１、５４５、５４９、５５３、５５７、５６０、５６３、５６６、５７０、５７４、５７７、５８０、５８３、５８７、５９１、５９５、５９９、６０２、６０６、６１０、６１３、６１７、６２０、６２４、６３４、６３８、６４２、６４６、６４９、６５３、６５６、６６０、６６４、６６８、６７１、６７５、６７９、６８２および６８６からなる群より選択される核酸配列、その一部または誘導体を含む核酸、（ｂ）ストリンジェントな条件下で（ａ）の核酸とハイブリダイズする核酸、（ｃ）（ａ）または（ｂ）の核酸に対して縮重している核酸、ならびに（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の核酸に相補的である核酸からなる群より選択される核酸によってコードされるタンパク質またはペプチドに関する。好ましい実施形態では、前記タンパク質またはペプチドは、配列表の配列番号：５４２、５４６、５５０、５５４、５６７、５７１、５８４、５８８、５９２、５９６、６０３、６０７、６１４、６２１、６２５、６３５、６３９、６４３、６５０、６５７、６６１、６６５、６７２、６７６および６８３からなる群より選択されるアミノ酸配列、その一部または誘導体を含む。
【００７１】
さらなる態様では、本発明は、本発明によって同定される腫瘍関連抗原の免疫原性フラグメントに関する。前記フラグメントは、好ましくはＭＨＣ分子または抗体、好ましくはヒトＨＬＡ受容体またはヒト抗体に結合する。本発明によれば、一部またはフラグメントは、好ましくは少なくとも５、少なくとも６、特に少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０または少なくとも５０個のアミノ酸の配列を含む。
【００７２】
さらなる態様では、本発明は、本発明によって同定される腫瘍関連抗原またはその一部に結合する作用物質に関する。好ましい実施形態では、作用物質は、タンパク質またはペプチド、特に抗体、Ｔ細胞受容体またはＭＨＣ分子である。さらなる実施形態では、抗体は、モノクローナル、キメラ、ヒトもしくはヒト化抗体、コンビナトリアル技術によって作製される抗体、または抗体のフラグメントである。１つの好ましい実施形態では、本発明は、（ｉ）本発明によって同定される腫瘍関連抗原またはその一部と（ｉｉ）本発明によって同定される前記腫瘍関連抗原または前記その一部が結合しているＭＨＣ分子との複合体に選択的に結合し、（ｉ）または（ｉｉ）単独には結合しない抗体に関する。
【００７３】
本発明によれば、「結合」という用語は、好ましくは特異的結合に関する。「特異的結合」は、抗体などの作用物質が、それが特異的であるエピトープなどの標的に対して、別の標的への結合と比較してより強く結合することを意味する。ある作用物質が、ある解離定数（ＫＤ）で第１標的に結合し、その解離定数が第２標的に対する解離定数よりも低い場合、作用物質は第２標的に比べて第１標的により強く結合する。好ましくは、作用物質が特異的に結合する標的についての解離定数（ＫＤ）は、作用物質が特異的に結合しない標的についての解離定数（ＫＤ）よりも１０倍以上、好ましくは２０倍以上、より好ましくは５０倍以上、さらに一層好ましくは１００倍、２００倍、５００倍または１０００倍以上低い。
【００７４】
そのような特異的抗体は、例えば前記ペプチドを使用した免疫によって入手し得る。
【００７５】
本発明はさらに、本発明によって同定される腫瘍関連抗原もしくはその一部または本発明の抗体に結合する本発明の作用物質と治療薬または診断薬との間の複合体に関する。１つの実施形態では、治療薬または診断薬は毒素である。
【００７６】
さらなる態様で本発明は、本発明によって同定される１またはそれ以上の腫瘍関連核酸の発現または異常発現を特徴とし、好ましくは本発明によって同定される１またはそれ以上の腫瘍関連抗原の発現または異常発現も同時に生じさせる疾患、好ましくは腫瘍性疾患、特に癌を検出するためのキットであって、（ｉ）腫瘍関連核酸もしくはその一部、（ｉｉ）腫瘍関連抗原もしくはその一部、（ｉｉｉ）腫瘍関連抗原もしくはその一部に結合する抗体、および／または（ｉｖ）腫瘍関連抗原もしくはその一部またはＭＨＣ分子とのその複合体に特異的なＴ細胞の検出またはその量の測定のための作用物質を含むキットに関する。そのような作用物質は、本明細書中上記で説明されている。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】正常組織および癌組織における本発明によって同定される腫瘍関連核酸の発現を示す図である。  配列番号：５４０の核酸配列の有意の発現は、胎盤組織および乳癌においてのみ認められた。
【図２】正常組織および癌組織における本発明によって同定される腫瘍関連核酸の定量的発現を示す図である。  定量的ＲＴ−ＰＣＲは、胎盤組織および乳癌において配列番号：５４０の核酸配列の選択的発現を示した。
【図３】ＭＣＦ−７乳癌細胞における配列番号：５４０のｍＲＮＡの定量的発現を示す図である。  ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを形質転換した２４時間後のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、２つの配列番号：５４０特異的ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ  Ｎｏ．１（配列番号６３０、６３１）、ｓｉＲＮＡ  Ｎｏ．２（配列番号６３２、６３３））が配列番号：５４０の発現の堅固なサイレンシングを誘導することを示した。
【図４】ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを形質転換することによる配列番号：５４０発現のサイレンシングは、ＭＣＦ−７乳癌細胞の増殖低下を生じさせることを示す図である。  ｓｉＲＮＡを形質転換した９６時間後に、新たに合成されたＤＮＡ鎖へのＢｒｄＵの組込みを測定することによって増殖を定量した。これらの結果は、配列番号：５４０が乳癌細胞の増殖のための正の因子であることを示す。
【図５】正常組織および癌組織における配列番号：５４１の定量的発現を示す図である。  リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、肺癌における配列番号：５４１の核酸配列の過剰発現を示した。
【図６】正常組織および癌組織における配列番号：５４５の定量的発現を示す図である。  リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、悪性黒色腫における配列番号：５４５の核酸配列の過剰発現を示した。
【図７】正常組織および癌組織における配列番号：５４９の定量的発現を示す図である。  リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、卵巣癌における配列番号：５４９の核酸配列の過剰発現を示した。
【図８】正常組織および癌組織における配列番号：５５３の定量的発現を示す図である。  リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、結腸癌および卵巣癌における配列番号：５５３の核酸配列の過剰発現を示した。
【図９】正常組織および癌組織における配列番号：５５７の定量的発現を示す図である。  リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、乳癌における配列番号：５５７の核酸配列の過剰発現を示した。
【図１０】正常組織および癌組織における配列番号：５６０の定量的発現を示す図である。  リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、結腸癌および卵巣癌における配列番号：５６０の核酸配列の過剰発現を示した。
【図１１】正常組織および癌組織における配列番号：５６３の定量的発現を示す図である。  リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、乳癌、結腸癌、卵巣癌、肺癌および黒色腫における配列番号：５６３の核酸配列の過剰発現を示した。
【図１２】正常組織および癌組織における配列番号：５６６の定量的発現を示す図である。  リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、胃癌、乳癌、結腸癌、卵巣癌、肺癌および黒色腫における配列番号：５６６の核酸配列の過剰発現を示した。
【図１３】正常組織および癌組織における配列番号：５７０の定量的発現を示す図である。  リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、卵巣癌、肺癌および黒色腫における配列番号：５７０の核酸配列の過剰発現を示した。
【図１４】正常組織および癌組織における配列番号：５７４の定量的発現を示す図である。  リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、肺癌および黒色腫における配列番号：５７４の核酸配列の過剰発現を示した。
【図１５】正常組織および癌組織における配列番号：５７７の定量的発現を示す図である。  リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、胃癌、乳癌および肺癌における配列番号：５７７の核酸配列の過剰発現を示した。
【図１６】正常組織および癌組織における配列番号：５８０の定量的発現を示す図である。  リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、卵巣癌および肺癌における配列番号：５８０の核酸配列の過剰発現を示した。
【図１７】正常組織および癌組織における配列番号：５８３の定量的発現を示す図である。  リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、結腸癌、卵巣癌および肺癌における配列番号：５８３の核酸配列の過剰発現を示した。
【図１８】正常組織および癌組織における配列番号：５８７の定量的発現を示す図である。  リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、肺癌における配列番号：５８７の核酸配列の過剰発現を示した。
【図１９】正常組織および癌組織における配列番号：５９１の定量的発現を示す図である。  リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、乳癌、結腸癌、卵巣癌、肺癌および黒色腫における配列番号：５９１の核酸配列の過剰発現を示した。
【図２０】正常組織および癌組織における配列番号：５９５の定量的発現を示す図である。  リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、胃癌、結腸癌、卵巣癌、肺癌および黒色腫における配列番号：５９５の核酸配列の過剰発現を示した。
【図２１】正常組織および癌組織における配列番号：５９９の定量的発現を示す図である。  リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、胃癌、乳癌、肺癌および黒色腫における配列番号：５９９の核酸配列の過剰発現を示した。
【図２２】正常組織および癌組織における配列番号：６０２の定量的発現を示す図である。  リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、卵巣癌および肺癌における配列番号：６０２の核酸配列の過剰発現を示した。
【図２３】正常組織および癌組織における配列番号：６０６の定量的発現を示す図である。  リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、胃癌、結腸癌および肺癌における配列番号：６０６の核酸配列の過剰発現を示した。
【図２４】正常組織および癌組織における配列番号：６１０の定量的発現を示す図である。  リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、胃癌、乳癌および肺癌における配列番号：６１０の核酸配列の過剰発現を示した。
【図２５】正常組織および癌組織における配列番号：６１３の定量的発現を示す図である。  リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、乳癌、肺癌および黒色腫における配列番号：６１３の核酸配列の過剰発現を示した。
【図２６】正常組織および癌組織における配列番号：６１７の定量的発現を示す図である。  リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、肺癌および黒色腫における配列番号：６１７の核酸配列の過剰発現を示した。
【図２７】正常組織および癌組織における配列番号：６２０の定量的発現を示す図である。  リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、卵巣癌および黒色腫における配列番号：６２０の核酸配列の過剰発現を示した。
【図２８】正常組織および癌組織における配列番号：６２４の定量的発現を示す図である。  リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、胃癌および肺癌における配列番号：６２４の核酸配列の過剰発現を示した。
【図２９】正常組織および癌組織における配列番号：６３４の定量的発現を示す図である。  リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、卵巣癌および肺癌における配列番号：６３４の核酸配列の過剰発現を示した。
【図３０】正常組織および癌組織における配列番号：６３８の定量的発現を示す図である。  リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、結腸癌、卵巣癌、肺癌および悪性黒色腫における配列番号：６３８の核酸配列の過剰発現を示した。
【図３１】正常組織および癌組織における配列番号：６４２の定量的発現を示す図である。  リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、乳癌、卵巣癌、肺癌および悪性黒色腫における配列番号：６４２の核酸配列の過剰発現を示した。
【図３２】正常組織および癌組織における配列番号：６４６の定量的発現を示す図である。  リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、胃癌、卵巣癌および肺癌における配列番号：６４６の核酸配列の過剰発現を示した。
【図３３】正常組織および癌組織における配列番号：６４９の定量的発現を示す図である。  リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、卵巣癌、肺癌および悪性黒色腫における配列番号：６４９の核酸配列の過剰発現を示した。
【図３４】正常組織および癌組織における配列番号：６５３の定量的発現を示す図である。  リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、結腸癌および肺癌における配列番号：６５３の核酸配列の過剰発現を示した。
【図３５】正常組織および癌組織における配列番号：６５６の定量的発現を示す図である。  リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、肺癌および悪性黒色腫における配列番号：６５６の核酸配列の過剰発現を示した。
【図３６】正常組織および癌組織における配列番号：６６０の定量的発現を示す図である。  リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、胃癌、卵巣癌および悪性黒色腫における配列番号：６６０の核酸配列の過剰発現を示した。
【図３７】正常組織および癌組織における配列番号：６６４の定量的発現を示す図である。  リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、胃癌、結腸癌、肺癌および悪性黒色腫における配列番号：６６４の核酸配列の過剰発現を示した。
【図３８】正常組織および癌組織における配列番号：６６８の定量的発現を示す図である。  リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、肺癌における配列番号：６６８の核酸配列の過剰発現を示した。
【図３９】正常組織および癌組織における配列番号：６７１の定量的発現を示す図である。  リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、肺癌および悪性黒色腫における配列番号：６７１の核酸配列の過剰発現を示した。
【図４０】正常組織および癌組織における配列番号：６７５の定量的発現を示す図である。  リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、肺癌およおび悪性黒色腫における配列番号：６７５の核酸配列の過剰発現を示した。
【図４１】正常組織および癌組織における配列番号：６７９の定量的発現を示す図である。  リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、肺癌における配列番号：６７９の核酸配列の過剰発現を示した。
【図４２】正常組織および癌組織における配列番号：６８２の定量的発現を示す図である。  リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、胃癌、乳癌および悪性黒色腫における配列番号：６８２の核酸配列の過剰発現を示した。
【図４３】正常組織および癌組織における配列番号：６８６の定量的発現を示す図である。  リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、乳癌、卵巣癌および肺癌における配列番号：６８６の核酸配列の過剰発現を示した。
【発明を実施するための形態】
【００７８】
本明細書における数値の範囲への言及は、前記範囲に含まれる個々の数値の各々を指定し、言及すると理解されるべきである。例えば、配列番号１〜５４０への言及は、以下の個々の配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０１、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６、５０７、５０８、５０９、５１０、５１１、５１２、５１３、５１４、５１５、５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９および５４０の１つ１つに言及すると理解されるべきである。
【００７９】
本発明によれば、参照試料または参照生物などの「参照物」は、試験試料または試験生物、すなわち患者から本発明の方法において得られた結果を相互に関連付け、比較するために使用し得る。典型的には、参照試料は、健常組織、特に癌によって冒されていない対応する組織からの試料であり、または参照生物は、健常生物、特に癌に罹患していない生物である。
【００８０】
「参照値」は、膨大な数の参照物を測定することによって、経験的に決定することができる。好ましくは、参照値は、少なくとも２、好ましくは少なくとも３、好ましくは少なくとも５、好ましくは少なくとも８、好ましくは少なくとも１２、好ましくは少なくとも２０、好ましくは少なくとも３０、好ましくは少なくとも５０、または好ましくは少なくとも１００の参照物を測定することによって決定される。
【００８１】
本発明によれば、核酸は、好ましくはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）である。核酸は、本発明によれば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、組換え生産された分子および化学合成された分子を含む。本発明によれば、核酸は、一本鎖または二本鎖としておよび直鎖状分子または共有結合閉環分子として存在し得る。
【００８２】
「本発明によって同定される腫瘍関連核酸」および「本発明によって同定される腫瘍関連抗原をコードする核酸」という用語は、同様の意味を有する。しかし、一部の実施形態では核酸、特にｍＲＮＡの発現だけが関連し、タンパク質の発現は重要な因子ではないという事実を説明するために異なる用語が本明細書で使用される。
【００８３】
本明細書で使用される、「ＲＮＡ」という用語は、少なくとも１個のリボヌクレオチド残基を含む分子を意味する。「リボヌクレオチド」とは、β−Ｄ−リボフラノース部分の２'位置にヒドロキシル基を有するヌクレオチドを意味する。この用語は、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、部分的に精製されたＲＮＡのような単離されたＲＮＡ、基本的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換え生産されたＲＮＡ、ならびに１またはそれ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または変化によって天然に生じるＲＮＡとは異なる変化したＲＮＡを包含する。そのような変化は、ＲＮＡの末端または内部などへの、例えばＲＮＡの１またはそれ以上のヌクレオチドにおける、非ヌクレオチド物質の付加を含み得る。ＲＮＡ分子中のヌクレオチドはまた、非天然に生じるヌクレオチドまたは化学合成ヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドなどの、非標準ヌクレオチドも含み得る。これらの変化したＲＮＡは、類似体または天然に生じるＲＮＡの類似体と称され得る。
【００８４】
本明細書において核酸の検出または核酸の量の測定に言及する場合、実際に検出されるべき核酸またはその量が実際に測定されるべきである核酸は、好ましくはｍＲＮＡである。しかし、これはまた、ｍＲＮＡが間接的に検出されるまたはｍＲＮＡの量が間接的に測定される実施形態を含み得ることが了解されるべきである。例えば、ｍＲＮＡがｃＤＮＡに変換されて、そのｃＤＮＡが検出されてもよいまたはその量が測定されてもよい。ｍＲＮＡは、本明細書ではｃＤＮＡの等価物として示される。当業者は、ｃＤＮＡ配列がｍＲＮＡ配列と等価であり、本明細書では同じ目的のため、例えば検出されるべき核酸にハイブリダイズするプローブの作製のために使用できることを理解する。従って、本明細書において配列表に示す配列に言及する場合、これは、上記配列のＲＮＡ等価物も包含する。
【００８５】
本発明に従って述べる核酸は、好ましくは単離されている。「単離核酸」という用語は、本発明によれば、核酸が、（ｉ）インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅された、（ｉｉ）クローニングすることで組換え生産された、（ｉｉｉ）例えば切断とゲル電気泳動による分画によって精製された、または（ｉｖ）例えば化学合成によって合成されたことを意味する。単離核酸は、組換えＤＮＡ技術による操作のために使用可能な核酸である。
【００８６】
本発明による縮重核酸は、遺伝暗号の縮重のためにコドン配列が参照核酸とは異なる核酸である。
【００８７】
例えば核酸およびアミノ酸配列に関する、「誘導体」という用語は、本発明によれば、任意の変異体、特に突然変異体、スプライス変異体、立体配座変異体、アイソフォーム、対立遺伝子変異体、種変異体および種ホモログ、特に天然に存在するものを包含する。対立遺伝子変異体は、遺伝子の正常な配列の変化に関するが、その重要性はしばしば不明である。完全な遺伝子配列決定は、多くの場合、所与の遺伝子に対する数多くの対立遺伝子変異体を同定する。種ホモログは、所与の核酸またはアミノ酸配列のものとは異なる種を起源とする核酸またはアミノ酸配列である。
【００８８】
本発明による核酸の「誘導体」は、単一または複数の、例えば少なくとも２、少なくとも４、または少なくとも６、および好ましくは３まで、４まで、５まで、６まで、１０まで、１５まで、または２０までのヌクレオチド置換、欠失および／または付加を含む核酸を包含する。さらに、「誘導体」という用語はまた、ヌクレオチド塩基、糖またはリン酸上の核酸の化学的誘導体化を含む。「誘導体」という用語はまた、天然では生じないヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体を含む核酸を含む。好ましくは、核酸の誘導体化はその安定性を高める。
【００８９】
好ましくは、本明細書で述べる特定の核酸配列と、上記特定核酸配列の誘導体である、上記特定核酸配列とハイブリダイズする、および／または上記特定核酸配列に対して縮重している核酸配列との間の相同性の程度は、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに一層好ましくは少なくとも９０％、または最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。相同性の程度は、好ましくは少なくとも約３０、少なくとも約５０、少なくとも約７０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約１５０、少なくとも約２００、少なくとも約２５０、少なくとも約３００、または少なくとも約４００ヌクレオチドの領域に関して与えられる。好ましい実施形態では、相同性の程度は、配列表に記載されている核酸配列などの、参照核酸配列の全長に関して与えられる。
【００９０】
２つの配列が互いにハイブリダイズして、安定な二本鎖を形成することができる場合、核酸はもう１つの別の核酸に「相補的」であり、ハイブリダイゼーションは、好ましくはポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件（ストリンジェントな条件）下で実施される。ストリンジェントな条件は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｉｔｏｒｓ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９またはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋの中に記載されており、例えば、ハイブリダイゼーション緩衝液（３．５×ＳＳＣ、０．０２％フィコール、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％ウシ血清アルブミン、２．５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７）、０．５％ＳＤＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）中６５℃でのハイブリダイゼーションを参照されたい。ＳＳＣは、０．１５Ｍ塩化ナトリウム／０．１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７である。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡが移入された膜を、例えば室温にて２×ＳＳＣ中で、次に６８℃までの温度で０．１〜０．５×ＳＳＣ／０．１×ＳＤＳ中で洗浄する。
【００９１】
相補性パーセントは、第２の核酸配列と水素結合（例えばワトソン−クリック塩基対合）を形成することができる、核酸分子内の連続する残基のパーセンテージを示す（例えば１０個のうち５、６、７、８、９、１０個は、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％および１００％相補的である）。「完全に相補的（ｐｅｒｆｅｃｔｌｙ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙまたはｆｕｌｌｙ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」とは、核酸配列のすべての連続する残基が第２の核酸配列内の同じ数の連続する残基と水素結合することを意味する。好ましくは、本発明による相補性の程度は、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに一層好ましくは少なくとも９０％、または最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。最も好ましくは、本発明による相補性の程度は１００％である。
【００９２】
「配列類似性」は、同一であるかまたは保存的アミノ酸置換であるアミノ酸のパーセンテージを示す。２つのポリペプチドまたは核酸配列の間の「配列同一性」は、配列間で同一であるアミノ酸またはヌクレオチドのパーセンテージを示す。
【００９３】
「相同性のパーセンテージ」は、最良のアラインメント後に得られた、比較する２つの配列の間で同一であるヌクレオチドまたはアミノ酸残基のパーセンテージを表わすことが意図されており、このパーセンテージは純粋に統計的であって、２つの配列の間の相違は無作為におよびそれらの長さ全体にわたって分布する。２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の配列比較は、従来、これらの配列を最適に整列した後に比較することによって実施され、前記比較は、配列類似性の局所領域を同定し、比較するためにセグメントごとにまたは「比較ウインドウ」ごとに実施される。比較のための配列の最適アラインメントは、手操作による以外に、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｓ  Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．２，４８２の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｄｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３の局所相同性アルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５，２４４４の類似性検索法によって、またはこれらのアルゴリズムを使用したコンピュータプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ  Ｐ、ＢＬＡＳＴ  ＮおよびＴＦＡＳＴＡ）によって作成され得る。
【００９４】
相同性のパーセンテージは、比較する２つの配列の間の同一位置の数を決定し、これら２つの配列の間の相同性のパーセンテージを得るためにこの数を比較する位置の数で除して、得られた結果に１００を乗じることによって計算される。
【００９５】
１つの実施形態では、特定の核酸配列の誘導体である、特定核酸配列に対して縮重しているまたは特定核酸配列の一部である核酸配列は、特定核酸配列の関連する機能および／または活性を有する、すなわち特定核酸配列によってコードされるタンパク質またはペプチドと同じ活性または免疫学的性質を有するタンパク質またはペプチドをコードすることができ、１つの実施形態では、同じタンパク質またはペプチドをコードする。
【００９６】
腫瘍関連抗原をコードする核酸は、本発明によれば、単独でまたは他の核酸、特に異種核酸との組合せで存在し得る。好ましくは、腫瘍関連抗原またはその一部をコードする核酸は、前記腫瘍関連抗原またはその一部を発現する。好ましい実施形態では、核酸は、上記核酸に関して同種または異種であってよい発現制御配列または調節配列に機能的に連結されている。コード配列と調節配列は、それらが、上記コード配列の発現または転写が上記調節配列の制御下または影響下にあるように互いに共有結合で連結されている場合、互いに「機能的に」連結されている。コード配列が機能的タンパク質に翻訳される場合、調節配列が上記コード配列に機能的に連結されていれば、上記調節配列の誘導は、コード配列内にフレームシフトを引き起こすことなくまたは上記コード配列が所望タンパク質もしくはペプチドに翻訳されるのを不可能にすることなく、上記コード配列の転写を生じさせる。
【００９７】
「発現制御配列」または「調節配列」という用語は、本発明によれば、プロモーター、エンハンサーおよび遺伝子の発現を調節する他の制御エレメントを含む。本発明の特定の実施形態では、発現制御配列を調節することができる。調節配列の正確な構造は、種または細胞型に応じて異なり得るが、一般には、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列等のような、それぞれ転写および翻訳の開始に関与する５'非転写配列および５'非翻訳配列を含む。より詳細には、５'非転写調節配列は、機能的に連結された遺伝子の転写制御のためのプロモーター配列を含有するプロモーター領域を含む。調節配列はまた、エンハンサー配列または上流活性化配列も含み得る。
【００９８】
本発明によれば、核酸はさらに、上記核酸によってコードされるタンパク質またはペプチドの宿主細胞からの分泌を制御するペプチドをコードする別の核酸と組み合わせて存在し得る。本発明によれば、核酸はまた、コードされるタンパク質またはペプチドが宿主細胞の細胞膜に固定されるまたは上記細胞の特定小器官に分画されることを生じさせるペプチドをコードする別の核酸と組み合わせて存在し得る。同様に、レポーター遺伝子または任意の「タグ」である核酸との組合せが可能である。
【００９９】
好ましい実施形態では、組換え核酸分子は、本発明によれば、核酸、例えば本発明によって同定される腫瘍関連抗原をコードする核酸の発現を制御する、適切な場合はプロモーターを有する、ベクターである。「ベクター」という用語は、本明細書ではその最も一般的な意味で使用され、核酸が、例えば原核細胞および／または真核細胞に導入されて、適切な場合は、ゲノムに組み込まれることを可能にする、前記核酸のための任意の中間ビヒクルを含む。この種のベクターは、好ましくは細胞内で複製および／または発現される。中間ビヒクルは、例えば、電気穿孔法、微粒子銃、リポソーム投与、アグロバクテリアを用いた導入、またはＤＮＡもしくはＲＮＡウイルスを介した挿入における使用に適合させ得る。ベクターは、プラスミド、ファージミド、バクテリオファージまたはウイルスゲノムを含む。
【０１００】
本発明によって同定される腫瘍関連抗原をコードする核酸は、宿主細胞に導入するために使用し得る。本明細書における核酸は、組換えＤＮＡおよびＲＮＡの両方を意味する。組換えＲＮＡは、ＤＮＡ鋳型のインビトロ転写によって作製し得る。さらに、適用の前に配列の安定化、キャップ形成およびポリアデニル化によって修飾してもよい。
【０１０１】
本発明によれば、「宿主細胞」という用語は、外来性核酸を形質転換または導入することができる任意の細胞に関する。「宿主細胞」という用語は、本発明によれば、原核細胞（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））または真核細胞（例えば樹状細胞、Ｂ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｋ５６２細胞、酵母細胞および昆虫細胞）を含む。ヒト、マウス、ハムスター、ブタ、ヤギ、霊長動物からの細胞などの哺乳動物細胞が特に好ましい。細胞は様々な組織型に由来してよく、一次細胞および細胞株を含み得る。具体的な例は、ケラチノサイト、末梢血白血球、骨髄の幹細胞および胚性幹細胞を含む。さらなる実施形態では、宿主細胞は、抗原提示細胞、特に樹状細胞、単球またはマクロファージである。核酸は、単一コピーまたは２もしくはそれ以上のコピーの形態で宿主細胞内に存在することができ、１つの実施形態では、宿主細胞において発現される。
【０１０２】
本発明によれば、「発現」という用語は、その最も一般的な意味で使用され、ＲＮＡの産生またはＲＮＡとタンパク質の産生を含む。この用語はまた、核酸の部分的発現を含む。さらに、発現は一過性にまたは安定に実施され得る。哺乳動物細胞における好ましい発現系は、ｐｃＤＮＡ３．１およびｐＲｃ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を含み、これらは、Ｇ４１８に対する耐性を付与する遺伝子のような選択マーカー（従って安定にトランスフェクトされた細胞株を選択することを可能にする）およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のエンハンサー−プロモーター配列を含有する。
【０１０３】
ＭＨＣ分子が腫瘍関連抗原またはその一部を提示する本発明の場合、発現ベクターはまた、上記ＭＨＣ分子をコードする核酸配列を含み得る。ＭＨＣ分子をコードする核酸配列は、腫瘍関連抗原またはその一部をコードする核酸と同じ発現ベクターに存在してもよく、または２つの核酸が異なる発現ベクターに存在してもよい。後者の場合は、２つの発現ベクターを細胞に同時に形質転換し得る。宿主細胞が腫瘍関連抗原もしくはその一部またはＭＨＣ分子のいずれも発現しない場合は、それぞれをコードする２つの核酸を同じ発現ベクターまたは異なる発現ベクターを細胞に形質転換し得る。細胞が既にＭＨＣ分子を発現する場合は、腫瘍関連抗原またはその一部をコードする核酸配列だけを細胞に導入することができる。
【０１０４】
本発明はまた、核酸の検出および／または核酸の量の測定のためのキットを含む。そのようなキットは、例えば、検出しようとするまたはその量を測定しようとする核酸にハイブリダイズする一対の増幅プライマーを含む。プライマーは、好ましくは前記核酸の６〜５０、特に１０〜３０、１５〜３０および２０〜３０個の連続するヌクレオチドの配列を含み、プライマー二量体の形成を回避するため、オーバーラップしていない。プライマーの一方は核酸の一方の鎖にハイブリダイズし、他方のプライマーは、核酸の増幅を可能にする配置で相補的な鎖にハイブリダイズする。
【０１０５】
「アンチセンス分子」または「アンチセンス核酸」は、核酸の発現を調節する、特に低減するために使用し得る。「アンチセンス分子」または「アンチセンス核酸」という用語は、本発明によれば、オリゴリボヌクレオチド、オリゴデオキシリボヌクレオチド、修飾オリゴリボヌクレオチドまたは修飾オリゴデオキシリボヌクレオチドであり、特定遺伝子を含むＤＮＡまたは上記遺伝子のｍＲＮＡに生理的条件下でハイブリダイズして、それにより上記遺伝子の転写および／または上記ｍＲＮＡの翻訳を阻害するオリゴヌクレオチドを指す。本発明によれば、「アンチセンス分子」はまた、その天然プロモーターに対して逆方向に核酸またはその一部を含む構築物を包含する。核酸またはその一部のアンチセンス転写産物は、天然に生じるｍＲＮＡと二本鎖を形成することができ、従ってｍＲＮＡの蓄積または翻訳を妨げ得る。もう１つの可能性は、核酸を不活性化するためのリボザイムの使用である。
【０１０６】
本発明による好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的核酸の６〜５０、特に１０〜３０、１５〜３０および２０〜３０個の連続するヌクレオチドの配列を有し、好ましくは標的核酸またはその一部に完全に相補的である。
【０１０７】
好ましい実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｎ末端または翻訳開始部位、転写開始部位もしくはプロモーター部位などの５'上流部位とハイブリダイズする。さらなる実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、３'非翻訳領域またはｍＲＮＡスプライシング部位とハイブリダイズする。
【０１０８】
１つの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはその組合せからなり、１つのヌクレオチドの５'末端ともう１つのヌクレオチドの３'末端がホスホジエステル結合によって互いに連結されている。これらのオリゴヌクレオチドは、従来の方法で合成され得るかまたは組換え生産され得る。
【０１０９】
好ましい実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは「修飾」オリゴヌクレオチドである。本明細書では、オリゴヌクレオチドは、例えばその安定性または治療効果を高めるために、その標的に結合する能力を損なわずに多種多様な方法で修飾し得る。本発明によれば、「修飾オリゴヌクレオチド」という用語は、（ｉ）そのヌクレオチドの少なくとも２個が合成ヌクレオシド間結合（すなわちホスホジエステル結合ではないヌクレオシド間結合）によって互いに連結されている、および／または（ｉｉ）通常は核酸中で認められない化学基がオリゴヌクレオチドに共有結合で連結されている、オリゴヌクレオチドを意味する。好ましい合成ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート、アルキルホスホネート、ホスホロジチオエート、リン酸エステル、アルキルホスホノチオエート、ホスホルアミデート、カルバメート、カルボネート、リン酸トリエステル、アセトアミデート、カルボキシメチルエステルおよびペプチドである。
【０１１０】
「修飾オリゴヌクレオチド」という用語はまた、共有結合で修飾された塩基および／または糖を有するオリゴヌクレオチドを含む。「修飾オリゴヌクレオチド」は、例えば、３'位のヒドロキシル基および５'位のリン酸基以外の低分子量有機基に共有結合した糖残基を有するオリゴヌクレオチドを含む。修飾オリゴヌクレオチドは、例えば２'−Ｏ−アルキル化リボース残基またはリボースの代わりにアラビノースのような別の糖を含み得る。
【０１１１】
オリゴヌクレオチドに関して上述したすべての実施形態は、ポリヌクレオチドにも適用され得ることが了解されるべきである。
【０１１２】
本明細書で使用される「低分子干渉ＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」とは、標的遺伝子または分解されるべきｍＲＮＡを同定するために使用される、好ましくは１０ヌクレオチド長より大きい、より好ましくは１５ヌクレオチド長より大きい、最も好ましくは１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチド長の単離されたＲＮＡ分子を意味する。１９〜２５ヌクレオチドの範囲がｓｉＲＮＡについての最も好ましい大きさである。
【０１１３】
本発明によるｓｉＲＮＡは、部分的に精製されたＲＮＡ、実質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、または組換え生産されたＲＮＡ、ならびに１またはそれ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または改変により、天然に生じるＲＮＡとは異なる変化したＲＮＡを含み得る。そのような変化は、ｓｉＲＮＡの末端またはｓｉＲＮＡの１もしくはそれ以上の内部ヌクレオチドなどへの、非ヌクレオチド物質の付加；ｓｉＲＮＡをヌクレアーゼ消化に対して抵抗性にする修飾（例えば２'置換リボヌクレオチドの使用もしくは糖−リン酸骨格への修飾）；またはデオキシリボヌクレオチドによるｓｉＲＮＡ内の１もしくはそれ以上のヌクレオチドの置換を含み得る。さらに、ｓｉＲＮＡは、修飾オリゴヌクレオチドに関して上述したようにその安定性を高めるために、特に１またはそれ以上のホスホロチオエート結合を導入することによって修飾し得る。
【０１１４】
ｓｉＲＮＡの一方の鎖または両方の鎖はまた、３'突出末端を含み得る。本明細書で使用される、「３'突出末端」は、ＲＮＡ鎖の３'末端から伸長している少なくとも１つの不対ヌクレオチドを指す。従って１つの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、１〜約６ヌクレオチド（リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドを含む）長、好ましくは１〜約５ヌクレオチド長、より好ましくは１〜約４ヌクレオチド長、特に好ましくは約２〜約４ヌクレオチド長の少なくとも１つの３'突出末端を含む。ｓｉＲＮＡ分子の両方の鎖が３'突出末端を含む実施形態では、突出末端の長さは同じであってもよくまたは各々の鎖について異なってもよい。最も好ましい実施形態では、３'突出末端はｓｉＲＮＡの両方の鎖に存在し、２ヌクレオチド長である。例えば、本発明のｓｉＲＮＡの各々の鎖は、ジデオキシチミジル酸（「ＴＴ」）またはジウリジル酸（「ｕｕ」）の３'突出末端を含み得る。
【０１１５】
ｓｉＲＮＡの安定性を高めるために、３'突出末端を分解に対して安定化することもできる。１つの実施形態では、突出部は、アデノシンまたはグアノシンヌクレオチドなどのプリンヌクレオチドを含むことによって安定化される。あるいは、修飾類似体によるピリミジンヌクレオチドの置換、例えば２'−デオキシチミジンによる３'突出末端内のウリジンヌクレオチドの置換は耐容され、ＲＮＡｉ分解の効率に影響を及ぼさない。特に、２'−デオキシチミジン中に２'−ヒドロキシルが存在しないことは、組織培養培地中での３'突出末端のヌクレアーゼ耐性を有意に増強する。
【０１１６】
ｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖は、２つの相補的な一本鎖ＲＮＡ分子を含み得るか、または２つの相補的な部分が塩基対合し、一本鎖の「ヘアピン」領域によって共有結合で連結されている単一分子を含み得る。すなわち、センス領域とアンチセンス領域はリンカー分子を介して共有結合で連結され得る。リンカー分子は、ポリヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカーであり得る。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、後者のタイプのｓｉＲＮＡ分子のヘアピン領域は、「ダイサー」タンパク質（またはその等価物）によって細胞内で切断され、２つの個別の塩基対合ＲＮＡ分子のｓｉＲＮＡを形成すると考えられる。
【０１１７】
本明細書で使用される、「標的ｍＲＮＡ」は、下方調節のための標的であるＲＮＡ分子を指す。
【０１１８】
ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターからのＲＮＡの発現は、最初に転写されるヌクレオチドがプリンである場合にのみ効率的であると考えられるので、標的する部位を変化させずにｐｏｌ  ＩＩＩ発現ベクターからｓｉＲＮＡを発現させることができる。
【０１１９】
本発明によるｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡ配列（「標的配列」）のいずれかにおいて任意の一続きの約１９〜２５個の連続するヌクレオチドを標的することができる。ｓｉＲＮＡについての標的配列を選択するための技術は、例えば、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、２００２年１０月１１日に改訂された、Ｔｕｓｃｈｌ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，「Ｔｈｅ  ｓｉＲＮＡ  Ｕｓｅｒ  Ｇｕｉｄｅ」に示されている。「Ｔｈｅ  ｓｉＲＮＡ  Ｕｓｅｒ  Ｇｕｉｄｅ」は、ワールドワイドウエブ上の、Ｄｒ．Ｔｈｏｍａｓ  Ｔｕｓｃｈｌ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｏｆ  ＲＮＡ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡによって運営されているウエブサイトで入手可能であり、ｔｈｅ  Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙのウエブサイトにアクセスして、「ｓｉＲＮＡ」のキーワードで検索することによって見出される。従って、本発明のｓｉＲＮＡのセンス鎖は、標的ｍＲＮＡ内の任意の連続する一続きの約１９〜約２５ヌクレオチドと実質的に同一のヌクレオチド配列を含む。
【０１２０】
一般に、標的ｍＲＮＡ上の標的配列は、好ましくは開始コドンより５０〜１００ヌクレオチド下流（すなわち、３'方向）から始まる、標的ｍＲＮＡに対応する所与のｃＤＮＡ配列から選択され得る。標的配列は、しかし、５'もしくは３'非翻訳領域、または開始コドンに近接する領域に位置し得る。
【０１２１】
ｓｉＲＮＡは、当業者の公知の多くの技術を用いて入手することができる。例えば、ｓｉＲＮＡは、化学合成できるかまたは当技術分野で公知の方法を用いて、例えばその開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｔｕｓｃｈｌ ｅｔ ａｌ．の米国特許出願公開第２００２／００８６３５６号に記載されているショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）インビトロ系を使用して組換え生産できる。
【０１２２】
好ましくは、ｓｉＲＮＡは、適切に保護されたリボヌクレオシドホスホルアミダイトおよび従来のＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置を用いて化学合成される。ｓｉＲＮＡは、２個の別々の相補的なＲＮＡ分子として、または２つの相補的な領域を有する１個のＲＮＡ分子として合成することができる。
【０１２３】
あるいは、ｓｉＲＮＡもまた、任意の適切なプロモーターを使用して組換え環状または線状ＤＮＡプラスミドから発現させることができる。そのような実施形態は、本明細書でｓｉＲＮＡの投与または医薬組成物へのｓｉＲＮＡの組込みに言及する場合、本発明によって包含される。プラスミドから本発明のｓｉＲＮＡを発現するための適切なプロモーターは、例えばＵ６またはＨ１  ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター配列およびサイトメガロウイルスプロモーターを含む。
【０１２４】
他の適切なプロモーターの選択は当技術分野の技術範囲内である。本発明の組換えプラスミドはまた、特定の組織または特定の細胞内環境におけるｓｉＲＮＡの発現のための誘導的プロモーターまたは調節性プロモーターを含み得る。
【０１２５】
組換えプラスミドから発現されるｓｉＲＮＡは、培養細胞発現系から標準的な技術によって単離することができるか、または細胞内で発現させることができる。インビボでｓｉＲＮＡを細胞に送達するための組換えプラスミドの使用は以下でより詳細に論じる。ｓｉＲＮＡは、２個の別々の相補的なＲＮＡ分子として、または２つの相補的な領域を有する１個のＲＮＡ分子として組換えプラスミドから発現させることができる。
【０１２６】
ｓｉＲＮＡを発現するのに適したプラスミドの選択、ｓｉＲＮＡを発現するための核酸配列をプラスミドに挿入する方法、および対象とする細胞に組換えプラスミドを送達する方法は、当技術分野の技術範囲内である。
【０１２７】
ｓｉＲＮＡはまた、インビボで組換えウイルスベクターから細胞内で発現させることができる。組換えウイルスベクターは、ｓｉＲＮＡをコードする配列およびｓｉＲＮＡ配列を発現するための任意の適切なプロモーターを含む。組換えウイルスベクターはまた、特定の組織または特定の細胞内環境におけるｓｉＲＮＡの発現のための誘導的プロモーターまたは調節性プロモーターを含み得る。ｓｉＲＮＡは、２個の別々の相補的なＲＮＡ分子として、または２つの相補的な領域を有する１個のＲＮＡ分子として組換えウイルスベクターから発現させることができる。
【０１２８】
「ペプチド」という用語は、オリゴペプチドおよびポリペプチドを含み、ペプチド結合によって共有結合で連結された２またはそれ以上、好ましくは３またはそれ以上、好ましくは４またはそれ以上、好ましくは６またはそれ以上、好ましくは８またはそれ以上、好ましくは１０またはそれ以上、好ましくは１３またはそれ以上、好ましくは１６またはそれ以上、好ましくは２１またはそれ以上、および好ましくは８、１０、２０、３０、４０または５０まで、特に１００までのアミノ酸を含む物質を指す。「タンパク質」という用語は、大きなペプチド、好ましくは１００を超えるアミノ酸残基を有するペプチドを指すが、一般に「ペプチド」と「タンパク質」という用語は同義語であり、本明細書では交換可能に使用される。
【０１２９】
好ましくは、本発明に従って述べるタンパク質およびペプチドは単離されている。「単離されたタンパク質」または「単離されたペプチド」という用語は、タンパク質またはペプチドがその天然環境から分離されていることを意味する。単離されたタンパク質またはペプチドは、基本的に精製された状態であり得る。「基本的に精製された」という用語は、タンパク質またはペプチドが、自然界でまたはインビボで結合している他の物質を基本的に含まないことを意味する。
【０１３０】
そのようなタンパク質およびペプチドは、例えば抗体の作製において、および免疫学的アッセイもしくは診断アッセイにおいて、または治療薬として使用し得る。本発明に従って述べるタンパク質およびペプチドは、組織または細胞ホモジネートなどの生物学的試料から単離され得、また、多種多様な原核生物または真核生物発現系において組換え発現され得る。
【０１３１】
本発明のために、タンパク質もしくはペプチドまたはアミノ酸配列の「誘導体」は、アミノ酸挿入変異体、アミノ酸欠失変異体および／またはアミノ酸置換変異体を含む。
【０１３２】
アミノ酸挿入変異体は、アミノ末端および／またはカルボキシ末端融合、ならびに特定アミノ酸配列における１個または２個またはそれ以上のアミノ酸の挿入を含む。挿入を有するアミノ酸配列変異体の場合は、１またはそれ以上のアミノ酸残基がアミノ酸配列内の特定部位に挿入されるが、生じる産物の適切なスクリーニングにより、ランダムな挿入も可能である。
【０１３３】
アミノ酸欠失変異体は、配列からの１またはそれ以上のアミノ酸の除去を特徴とする。
【０１３４】
アミノ酸置換変異体は、配列内の少なくとも１個の残基が除去され、別の残基がその位置に挿入されていることを特徴とする。相同なタンパク質またはペプチドの間で保存されていないアミノ酸配列内の位置に修飾が存在することおよび／またはアミノ酸を類似の性質を有する他のアミノ酸で置換することが好ましい。
【０１３５】
「保存的置換」は、例えば、極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性および／または関与する残基の両親媒性の類似性に基づいて行われ得る。例えば：（ａ）非極性（疎水性）アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンを含む；（ｂ）極性中性アミノ酸は、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンを含む；（ｃ）正に荷電した（塩基性）アミノ酸は、アルギニン、リシンおよびヒスチジンを含む；ならびに（ｄ）負に荷電した（酸性）アミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。置換は、典型的には（ａ）〜（ｄ）の群の中で行われ得る。加えて、グリシンとプロリンは、α−ヘリックスを破壊するそれらの能力に基づき、相互に置換され得る。一部の好ましい置換は、以下の群の中で行われ得る：（ｉ）ＳとＴ；（ｉｉ）ＰとＧ；および（ｉｉｉ）Ａ、Ｖ、ＬおよびＩ。公知の遺伝暗号、ならびに組換えおよび合成ＤＮＡ技術を考慮して、当業者は、保存的アミノ酸変異体をコードするＤＮＡを容易に構築することができる。
【０１３６】
好ましくは、本明細書で述べる特定のアミノ酸配列と上記特定アミノ酸配列の誘導体であるアミノ酸配列との間の類似性の程度、好ましくは相同性の程度は、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、さらに一層好ましくは少なくとも９０％、または最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。類似性または相同性の程度は、好ましくは少なくとも約２０、少なくとも約４０、少なくとも約６０、少なくとも約８０、少なくとも約１００、少なくとも約１２０、少なくとも約１４０、少なくとも約１６０、少なくとも約２００または２５０アミノ酸の領域に対して与えられる。好ましい実施形態では、類似性または相同性の程度は、参照アミノ酸配列の全長に対して与えられる。
【０１３７】
上述したアミノ酸変異体は、公知のペプチド合成技術を用いて、例えば固相合成（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，１９６４）および類似の方法によって、または組換えＤＮＡ操作などによって容易に作製し得る。置換、挿入または欠失を有するタンパク質およびペプチドを作製するためのＤＮＡ配列の操作は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）において詳細に説明されている。
【０１３８】
本発明によれば、タンパク質およびペプチドの「誘導体」は、タンパク質およびペプチドの修飾形態を含む。そのような修飾は、任意の化学修飾を含み、炭水化物、脂質および／またはタンパク質もしくはペプチドなどの、タンパク質またはペプチドに関連する任意の分子の単一または複数の置換、欠失および／または付加を含む。「誘導体」という用語はまた、前記タンパク質およびペプチドのすべての機能性の化学的等価物に及ぶ。
【０１３９】
本発明によれば、タンパク質、ペプチドまたは核酸、例えば腫瘍関連抗原または腫瘍関連核酸の一部またはフラグメントまたは誘導体は、好ましくはそれが由来するタンパク質、ペプチドまたは核酸の機能的特性を有する。そのような機能的特性は、抗体との相互作用、他のペプチドまたはタンパク質との相互作用、核酸の選択的結合および酵素活性を含む。１つの実施形態では、タンパク質、ペプチドまたは核酸の一部またはフラグメントまたは誘導体は、それが由来するタンパク質、ペプチドまたは核酸と免疫学的に等価である。１つの実施形態では、機能的特性は免疫学的特性である。特定の特性は、ＭＨＣ分子と複合体を形成し、適切な場合、好ましくは細胞傷害性細胞またはＴヘルパー細胞を刺激することによって、免疫応答を生じさせる能力である。
【０１４０】
本明細書で述べる腫瘍関連抗原またはアミノ酸配列の一部またはフラグメントは、好ましくは腫瘍関連抗原またはアミノ酸配列の少なくとも６、特に少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０または少なくとも５０の連続するアミノ酸の配列を含む。本明細書で述べる腫瘍関連抗原またはアミノ酸配列の一部またはフラグメントは、好ましくは腫瘍関連抗原またはアミノ酸配列の８まで、特に１０まで、１２まで、１５まで、２０まで、３０までまたは５５までの連続するアミノ酸の配列を含む。本明細書で述べる腫瘍関連抗原またはアミノ酸配列の一部またはフラグメントは、好ましくは、抗原またはアミノ酸配列の非膜貫通部分、特に細胞外部分に対応するまたはそれからなる、腫瘍関連抗原またはアミノ酸配列の部分である。本明細書で述べる腫瘍関連抗原またはアミノ酸配列の一部またはフラグメントは、ＭＨＣ分子と共に提示され得、そのように提示された場合、細胞応答を刺激することができる、腫瘍関連抗原またはアミノ酸配列の部分である。
【０１４１】
「細胞応答」は、腫瘍関連抗原をＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩと共に提示することを特徴とする細胞に対する細胞応答を含むことが意図されている。細胞応答は、「ヘルパー」または「キラー」のいずれかとして働く、Ｔ細胞またはＴリンパ球と呼ばれる細胞に関する。ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞とも称される）は、免疫応答を調節することによって中心的役割を果たし、キラー細胞（細胞傷害性Ｔ細胞、細胞溶解性Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＴＬとも称される）は、腫瘍細胞を死滅させ、より多くの腫瘍細胞の産生を阻止する。両方の免疫応答が必要であると考えられるが、癌を抑制するためにはＣＴＬ応答がより重要であると考えられる。
【０１４２】
「腫瘍関連抗原をＭＨＣクラスＩと共に提示することを特徴とする細胞」または「腫瘍関連抗原をＭＨＣクラスＩと共に提示する細胞」または同様の表現は、腫瘍細胞または、ＭＨＣクラスＩ分子に関連して、それが発現する腫瘍関連抗原もしくは、例えば腫瘍関連抗原のプロセシングによる、前記腫瘍関連抗原に由来するフラグメントを提示する抗原提示細胞などの細胞を意味する。同様に、「腫瘍関連抗原をＭＨＣクラスＩと共に提示することを特徴とする腫瘍」という用語は、腫瘍関連抗原をＭＨＣクラスＩと共に提示することを特徴とする細胞を含む腫瘍を表す。
【０１４３】
本明細書で述べる腫瘍関連抗原またはアミノ酸配列の好ましい一部またはフラグメントは、インビボでの細胞傷害性Ｔリンパ球の刺激に特に適するが、エクスビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）での治療的養子移入のための、増殖され、刺激されたＴリンパ球の生産にも適する。
【０１４４】
１つの態様では、本明細書で述べる腫瘍関連抗原またはアミノ酸配列の一部またはフラグメントは、前記腫瘍関連抗原またはアミノ酸配列の配列に由来するアミノ酸配列を含む。好ましくは本明細書で述べる腫瘍関連抗原またはアミノ酸配列の一部またはフラグメントは、本発明によって同定される腫瘍関連抗原をＭＨＣクラスＩと共に提示することを特徴とする細胞に対する細胞応答を刺激することができる、および／またはそれ自体でもしくは免疫原性担体に結合して使用された場合、本発明によって同定される腫瘍関連抗原に特異的に結合する抗体を惹起することができる。好ましくは、本明細書で述べる腫瘍関連抗原またはアミノ酸配列の一部またはフラグメントは、直接またはプロセシング後に、ＭＨＣクラスＩ分子と共に提示され得る。好ましくは、本明細書で述べる腫瘍関連抗原またはアミノ酸配列の一部またはフラグメントは、ＭＨＣクラスＩおよび／もしくはクラスＩＩ提示ペプチドであるか、またはＭＨＣクラスＩおよび／もしくはクラスＩＩ提示ペプチドを生じるようにプロセシングされ得る。好ましくは、本明細書で述べる腫瘍関連抗原またはアミノ酸配列の一部またはフラグメントは、本明細書で述べる腫瘍関連抗原またはアミノ酸配列のフラグメントのアミノ酸配列に実質的に対応するアミノ酸配列を含む。
【０１４５】
本明細書で述べる腫瘍関連抗原またはアミノ酸配列の一部またはフラグメントは、本発明により、それ自体でまたは付加的なアミノ酸配列と組み合わせたペプチドまたはペプチド抗原として存在し得る、すなわちそれは、ペプチドまたはペプチド抗原で構成され得る。そのようなペプチドまたはペプチド抗原は、本発明の組成物および方法において有用であり、一般に、本明細書では「腫瘍関連抗原」という用語に包含される。一般に、そのようなペプチドまたはペプチド抗原は、本明細書で述べる腫瘍関連抗原またはアミノ酸配列の一部またはフラグメントのアミノ酸配列に実質的に対応するアミノ酸配列を含むオリゴペプチドまたはポリペプチドに関する。好ましくは、そのようなペプチドまたはペプチド抗原は、本明細書で同定される腫瘍関連抗原をＭＨＣクラスＩと共に提示することを特徴とする腫瘍に対する細胞応答を刺激することができる、および／または本発明によって同定される腫瘍関連抗原に特異的に結合する抗体を惹起することができる。
【０１４６】
ペプチドまたはペプチド抗原が直接、すなわちプロセシングされずに、特に切断されずに提示される場合、それは、ＭＨＣ分子、特にＭＨＣクラスＩ分子に結合するのに適した長さを有し、好ましくは７〜２０アミノ酸長、より好ましくは７〜１２アミノ酸長、より好ましくは８〜１１アミノ酸長、特に９または１０アミノ酸長である。好ましくは、直接提示されるペプチドまたはペプチド抗原の配列は、本明細書で述べる腫瘍関連抗原またはアミノ酸配列のアミノ酸配列に由来する、すなわちその配列は、本明細書で述べる腫瘍関連抗原またはアミノ酸配列のフラグメントに実質的に対応し、好ましくは完全に同一である。ペプチドまたはペプチド抗原がプロセシング後に、特に切断後に提示される場合、プロセシングによって生成されるペプチドは、ＭＨＣ分子、特にＭＨＣクラスＩ分子に結合するのに適した長さを有し、好ましくは７〜２０アミノ酸長、より好ましくは７〜１２アミノ酸長、より好ましくは８〜１１アミノ酸長、特に９または１０アミノ酸長である。好ましくは、プロセシング後に提示されるペプチドの配列は、本明細書で述べる腫瘍関連抗原またはアミノ酸配列のアミノ酸配列に由来する、すなわちその配列は、本明細書で述べる腫瘍関連抗原またはアミノ酸配列のフラグメントに実質的に対応し、好ましくは完全に同一である。従って、本発明によるペプチドまたはペプチド抗原は、１つの実施形態では、本明細書で述べる腫瘍関連抗原またはアミノ酸配列のフラグメントに実質的に対応し、好ましくは完全に同一である、７〜２０アミノ酸長、より好ましくは７〜１２アミノ酸長、より好ましくは８〜１１アミノ酸長、特に９または１０アミノ酸長の配列を含み、ペプチドまたはペプチド抗原のプロセシング後に、提示されるペプチドを形成する。しかし、ペプチドまたはペプチド抗原はまた、上記で述べた配列よりもさらに一層長い、本明細書で述べる腫瘍関連抗原またはアミノ酸配列のフラグメントに実質的に対応し、好ましくは完全に同一である配列を含み得る。１つの実施形態では、ペプチドまたはペプチド抗原は、本明細書で述べる腫瘍関連抗原またはアミノ酸配列の配列全体を含み得る。
【０１４７】
ＴＣＲ認識には影響を及ぼさないが、ＭＨＣへの結合の安定性を改善する残基において異なるアミノ酸配列を有するペプチドは、ペプチドまたはペプチド抗原の免疫原性を改善することができ、本明細書では「最適化ペプチド」と称され得る。これらの残基のいずれが、ＭＨＣまたはＴＣＲのどちらかへの結合に影響を及ぼす可能性がより高いと考えられるかについての既存の知識を利用して、実質的に対応するペプチドの設計への合理的なアプローチを使用し得る。機能性である生じたペプチドは本明細書において企図される。
【０１４８】
１つの実施形態では、腫瘍関連抗原をコードする核酸の一部またはフラグメントは、本発明によれば、上記で定義されたように、少なくとも腫瘍関連抗原および／または上記腫瘍関連抗原の一部またはフラグメントをコードする、上記核酸の部分に関する。腫瘍関連抗原をコードする核酸の一部またはフラグメントは、好ましくはオープンリーディングフレームに対応する、核酸のその部分である。
【０１４９】
本発明によれば、特定の実施形態は、腫瘍関連抗原に由来する「ドミナントネガティブ」タンパク質またはペプチドを提供することを含むべきである。ドミナントネガティブタンパク質またはペプチドは、細胞機構と相互作用することにより、活性タンパク質またはペプチドを細胞機構とのその相互作用から排除するまたは活性タンパク質またはペプチドと競合し、それによって前記活性タンパク質の作用を低下させる、不活性なタンパク質またはペプチド変異体である。
【０１５０】
標的タンパク質に特異的に結合する特異的抗体を含む抗血清は、様々な標準的工程によって調製できる；例えば、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」ｂｙ  Ｐｈｉｌｉｐ  Ｓｈｅｐｈｅｒｄ，Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ｄｅａｎ  ＩＳＢＮ  ０−１９−９６３７２２−９；「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」ｂｙ  Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，ＩＳＢＮ：０８７９６９３１４２および「Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：Ｐｏｒｔａｂｌｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ＮＯ」ｂｙ  Ｅｄｗａｒｄ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ＩＳＢＮ  ０８７９６９５４４７参照。それにより、複合体膜タンパク質をそれらの天然形態で認識するアフィン（ａｆｆｉｎｅ）および特異的抗体を作製することも可能である（Ａｚｏｒｓａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２２９：３５−４８，１９９９；Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：１８９９−１９０４，１９８９；Ｇａｒｄｓｖｏｌｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３４：１０７−１１６，２０００）。これは、治療的に使用される予定の抗体の作製のために特に適切であるが、多くの診断適用にも適切である。これに関して、全長タンパク質、細胞外部分配列ならびに生理的に折りたたまれた形態で標的分子を発現する細胞で免疫することが可能である。
【０１５１】
モノクローナル抗体は、伝統的にハイブリドーマ技術を用いて作製される（技術的詳細については：「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」ｂｙ  Ｐｈｉｌｉｐ  Ｓｈｅｐｈｅｒｄ，Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ｄｅａｎ  ＩＳＢＮ  ０−１９−９６３７２２−９；「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」ｂｙ  Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ  ＩＳＢＮ：０８７９６９３１４２；「Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：Ｐｏｒｔａｂｌｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ＮＯ」ｂｙ  Ｅｄｗａｒｄ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ＩＳＢＮ：０８７９６９５４４７参照）。
【０１５２】
抗体分子の小さな部分であるパラトープだけが、抗体がそのエピトープに結合することに関与することは公知である（Ｃｌａｒｋ，Ｗ．Ｒ．（１９８６），Ｔｈｅ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｒｏｉｔｔ，Ｉ．（１９９１），Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，７ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ参照）。ｐＦｃ'およびＦｃ領域は、例えば、補体カスケードのエフェクターであるが、抗原結合には関与しない。Ｆ（ａｂ'）２フラグメントと称される、ｐＦｃ'領域が酵素的に除去されたまたはｐＦｃ'領域なしで生成された抗体は、完全抗体の両方の抗原結合部位を担持する。同様に、Ｆａｂフラグメントと称される、Ｆｃ領域が酵素的に除去されたまたは前記Ｆｃ領域なしで生成された抗体は、無傷抗体分子の一方の抗原結合部位を担持する。さらに、Ｆａｂフラグメントは、共有結合で連結された抗体の軽鎖およびＦｄと称される、前記抗体の重鎖の一部からなる。Ｆｄフラグメントは抗体特異性の主要決定基であり（１つのＦｄフラグメントは、抗体の特異性を変化させずに１０までの異なる軽鎖と結合できる）、Ｆｄフラグメントは、単離されたとき、エピトープに結合する能力を保持する。
【０１５３】
抗体の抗原結合部分内に位置するのは、抗原エピトープと直接相互作用する相補性決定領域（ＣＤＲ）およびパラトープの三次構造を維持するフレームワーク領域（ＦＲ）である。ＩｇＧ免疫グロブリンの重鎖のＦｄフラグメントと軽鎖の両方が、各々の場合に３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）によって分けられた４つのフレームワーク領域（ＦＲ１〜ＦＲ４）を含む。ＣＤＲ、特にＣＤＲ３領域、さらに一層特定すると重鎖のＣＤＲ３領域は、抗体特異性に大きく関与する。
【０１５４】
哺乳動物抗体の非ＣＤＲ領域は、もとの抗体のエピトープに対する特異性を保持しつつ、同じかまたは異なる特異性を有する抗体の類似領域によって置換され得ることが公知である。これは、機能的抗体を生産するために、非ヒトＣＤＲがヒトＦＲおよび／またはＦｃ／ｐＦｃ'領域に共有結合で連結された「ヒト化」抗体の開発を可能にした。
【０１５５】
もう１つの例として、国際公開公報第ＷＯ９２／０４３８１号は、マウスＦＲ領域の少なくとも一部がヒト起源のＦＲ領域で置換されたヒト化マウスＲＳＶ抗体の生産と使用を述べている。抗原結合能力を有する無傷抗体のフラグメントを含む、この種の抗体は、しばしば「キメラ」抗体と称される。
【０１５６】
本発明によれば、「抗体」という用語はまた、抗体のＦ（ａｂ'）２、Ｆａｂ、ＦｖおよびＦｄフラグメント、Ｆｃおよび／またはＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が相同なヒトまたは非ヒト配列で置換されているキメラ抗体、ＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が相同なヒトまたは非ヒト配列で置換されているキメラＦ（ａｂ'）２フラグメント抗体、ＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が相同なヒトまたは非ヒト配列で置換されているキメラＦａｂフラグメント抗体、ＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２領域が相同なヒトまたは非ヒト配列で置換されているキメラＦｄフラグメント抗体を包含する。「抗体」という用語はまた、「一本鎖」抗体を含む。
【０１５７】
本発明はまた、腫瘍関連抗原に特異的に結合するタンパク質およびペプチドを含む。この種の結合物質は、例えば、単に溶液中にて固定化形態でまたはファージディスプレイライブラリーとして作製され得る縮重ペプチドライブラリーによって提供され得る。同様に、１またはそれ以上のアミノ酸を有するペプチドのコンビナトリアルライブラリーを作製することが可能である。ペプトイドおよび非ペプチド合成残基のライブラリーも作製し得る。
【０１５８】
抗体はまた、腫瘍関連抗原を発現する細胞および組織を提示するための特異的診断物質に連結し得る。それらはまた、治療上有用な物質にも連結し得る。
【０１５９】
診断物質または診断薬は、（ｉ）検出可能なシグナルを提供する；（ｉｉ）第一もしくは第二標識によって提供される検出可能なシグナルを修飾するように第二標識と相互作用する、例えばＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）；（ｉｉｉ）電荷、疎水性、形状もしくは他の物理的パラメータによって運動性、例えば電気泳動移動度に影響を及ぼす；または（ｉｖ）捕捉部分、例えば親和性、抗体／抗原もしくはイオン錯体形成を提供する、ように機能する任意の標識を含む。標識として適切であるのは、蛍光標識、発光標識、発色団標識、放射性同位体標識、同位体標識、好ましくは安定な同位体標識、同重体標識、酵素標識、粒子標識、特に金属粒子標識、磁性粒子標識、ポリマー粒子標識、ビオチンなどの有機低分子、受容体のリガンドまたは細胞接着タンパク質もしくはレクチンなどの結合分子、結合物質の使用によって検出できる核酸および／またはアミノ酸残基を含む標識配列等のような構造体である。診断物質は、非限定的に、硫酸バリウム、イオセタム酸、イオパノ酸、カルシウムイポデート、ジアトリゾ酸ナトリウム、ジアトリゾ酸メグルミン、メトリザミド、チロパノ酸ナトリウム、ならびにフッ素−１８および炭素−１１などの陽電子放射体、ヨウ素−１２３、テクネチウム−９９ｍ、ヨウ素−１３１およびインジウム−１１１などのγ放射体、フッ素およびガドリニウムなどの核磁気共鳴のための核種を含む放射性診断物質を含む。
【０１６０】
本発明によれば、「治療上有用な物質」、「治療物質」または「治療薬」という用語は、治療効果を及ぼし得る任意の分子を意味する。本発明によれば、治療上有用な物質は、好ましくは１またはそれ以上の腫瘍関連抗原を発現する細胞へと選択的に誘導され、抗癌剤、放射性ヨウ素標識化合物などの放射性化合物、毒素、細胞増殖抑制性または細胞溶解性薬剤等を含む。抗癌剤は、例えば、アミノグルテチミド、アザチオプリン、硫酸ブレオマイシン、ブスルファン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、シクロスポリン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、タキソール、エトポシド、フルオロウラシル、インターフェロンα、ロムスチン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトタン、塩酸プロカルバジン、チオグアニン、硫酸ビンブラスチンおよび硫酸ビンクリスチンを含む。他の抗癌剤は、例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ，「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」，８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９０，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｉｎｃ．、特にＣｈａｐｔｅｒ  ５２（Ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ（Ｐａｕｌ  Ｃａｌａｂｒｅｓｉ  ａｎｄ  Ｂｒｕｃｅ  Ａ．Ｃｈａｂｎｅｒ）に記載されている。毒素は、アメリカヤマゴボウ（ｐｏｋｅｗｅｅｄ）抗ウイルスタンパク質などのタンパク質、コレラ毒素、百日咳毒素、リシン、ゲロニン、アブリン、ジフテリア外毒素またはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素であり得る。毒素残基はまた、コバルト−６０などの高エネルギーを放出する放射性核種であり得る。
【０１６１】
「主要組織適合遺伝子複合体」または「ＭＨＣ」という用語は、すべての脊椎動物に存在する遺伝子の複合体に関する。ＭＨＣタンパク質または分子は、ペプチドに結合して、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）による認識のためにそれらを提示することにより、正常な免疫反応におけるリンパ球と抗原提示細胞の間のシグナル伝達に関与する。ＭＨＣ分子は、細胞内プロセシング画分内でペプチドに結合し、これらのペプチドをＴ細胞による認識のために抗原提示細胞の表面に提示する。ＨＬＡとも称されるヒトＭＨＣ領域は、第６番染色体上に位置し、クラスＩおよびクラスＩＩ領域を含む。本発明のすべての態様の１つの好ましい実施形態では、ＭＨＣ分子はＨＬＡ分子である。
【０１６２】
本明細書で使用される「低減する」または「阻害する」は、参照試料（例えばｓｉＲＮＡで処理されていない試料）と比較してレベル、例えばタンパク質またはｍＲＮＡのレベルの好ましくは２０％またはそれ以上、より好ましくは５０％またはそれ以上、最も好ましくは７５％またはそれ以上の全体的低下を生じさせる能力を意味する。ＲＮＡまたはタンパク質発現のこの低減または阻害は、標的ｍＲＮＡの切断または分解を介して起こり得る。タンパク質発現または核酸発現に関するアッセイは当技術分野において公知であり、例えば、タンパク質発現についてはＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット分析、ＲＮＡについてはノーザンブロット法またはＲＮアーゼプロテクションアッセイを含む。
【０１６３】
「患者」という用語は、本発明によれば、ヒト、非ヒト霊長動物または別の動物、特にウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコなどの哺乳動物またはマウスおよびラットなどのげっ歯動物を意味する。特に好ましい実施形態では、患者はヒトである。
【０１６４】
本発明によれば、「増大した」または「増大した量」という用語は、好ましくは少なくとも１０％、特に少なくとも２０％、少なくとも５０％または少なくとも１００％の増加を指す。物質の量はまた、試験試料では検出可能であるが参照試料中には存在しないまたは検出不能である場合も、参照試料と比較して生物学的試料などの試験試料において増大している。
【０１６５】
本発明によれば、「疾患」という用語は、腫瘍関連核酸および／または腫瘍関連抗原が発現されるまたは異常発現される何らかの病的状態を指す。本発明によれば、「腫瘍」または「腫瘍性疾患」という用語は、細胞（新生細胞または腫瘍細胞と呼ばれる）の異常増殖によって形成される腫脹または病変を指す。「腫瘍細胞」とは、急速で制御されない細胞増殖によって成長し、新たな増殖を開始させた刺激が停止した後も成長し続ける異常細胞を意味する。腫瘍は、構造機構および正常組織との機能的協調の部分的または完全な欠如を示し、通常、良性、前悪性または悪性であり得る明確な組織塊を形成する。好ましくは、本発明による腫瘍性疾患は、癌疾患、すなわち悪性疾患であり、腫瘍細胞は癌細胞である。好ましくは、腫瘍性疾患は、本発明によって同定される腫瘍関連核酸および／または腫瘍関連抗原が発現されるまたは異常発現される細胞を特徴とし、腫瘍細胞または循環もしくは転移性腫瘍細胞は、本発明によって同定される腫瘍関連核酸および／または腫瘍関連抗原の発現または異常発現する。好ましくは、腫瘍性疾患、腫瘍細胞または循環もしくは転移性腫瘍細胞は、本発明によって同定される腫瘍関連抗原をＭＨＣクラスＩと共に提示することを特徴とする。
【０１６６】
「異常発現」は、本発明によれば、健常個体における状態と比較して、発現が変化している、好ましくは増大していることを意味する。発現の増大は、少なくとも１０％、特に少なくとも２０％、少なくとも５０％または少なくとも１００％の増加を指す。１つの実施形態では、発現は疾患組織においてのみ認められ、健常組織における発現は、抑制されているかまたは基本的に抑制されている。そのような疾患の一例は癌であり、本発明による「癌」という用語は、白血病、精上皮腫、黒色腫、奇形腫、リンパ腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、直腸癌、子宮内膜癌、腎癌、副腎癌、甲状腺癌、血液癌、皮膚癌、脳の癌、子宮頸癌、腸癌（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、肝癌、結腸癌、胃癌、腸癌（ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  ｃａｎｃｅｒ）、頭頸部癌、消化器癌、リンパ節癌、食道癌、結腸直腸癌、膵癌、耳鼻咽喉（ＥＮＴ）癌、乳癌、前立腺癌、子宮の癌、卵巣癌および肺癌ならびにそれらの転移を含む。その例は、肺癌腫、乳癌腫、前立腺癌腫、結腸癌腫、腎細胞癌腫、子宮頸癌腫、または上述した癌型または腫瘍の転移である。本発明による癌という用語はまた、癌の転移を包含する。
【０１６７】
「転移」とは、そのもとの部位から身体の別の部分への癌細胞の広がりを意味する。転移の形成は非常に複雑な過程であり、原発腫瘍からの悪性細胞の分離、細胞外マトリックスの侵襲、体腔および脈管に入るための内皮基底膜の貫入、および次に、血液によって輸送された後、標的器官の浸潤に依存する。最後に、標的部位における新たな腫瘍の成長は血管新生に依存する。腫瘍転移は、しばしば原発腫瘍が除去された後でも起こり、これは、腫瘍細胞または成分が残存し、転移能を発現し得るからである。１つの実施形態では、本発明による「転移」という用語は、原発腫瘍および所属リンパ節系から離れた転移に関連する「遠隔転移」に関する。
【０１６８】
本発明によれば、生物学的試料は、体液を含む組織試料および／または細胞試料であり得、パンチ生検を含む組織生検、および血液、気管支吸引液、痰、尿、糞便または他の体液を採取することなどによる、従来の方法で入手し得る。１つの実施形態では、生物学的試料は、本明細書で同定される標的核酸または標的抗原の発現と癌疾患の間の結びつきが本明細書で明らかにされる組織から得る。１つの実施形態では、生物学的試料は、正常組織と比較して、癌組織における本明細書で同定される標的核酸または標的抗原の過剰発現が本明細書で明らかにされる組織から得る。この実施形態では、本明細書で開示される診断方法は、前記組織の癌を診断することを目的とする。例えば肺癌の場合は、試料は、肺組織を含む試料であり得る。本発明によれば、「生物学的試料」という用語はまた、生物学的試料の画分または単離物、例えば核酸およびペプチド／タンパク質単離物のような加工された生物学的試料を包含する。好ましくは、本発明による「生物学的試料」という用語は、胎盤組織に由来する試料または癌に罹患していない場合でも本明細書で同定される標的核酸または標的抗原の発現を示す組織に由来する試料を含まない。
【０１６９】
本発明の一部の態様は、以下のように要約できる能動または受動免疫治療アプローチを用いて、本発明によって同定される腫瘍関連核酸および腫瘍関連抗原を利用した腫瘍性疾患、特に癌疾患の免疫療法を想定する：
【０１７０】
免疫療法
Ｉ．能動免疫療法（「癌ワクチン」）
以下のものでの免疫する：
ｉ）抗原またはペプチド（天然または修飾）
ｉｉ）抗原またはペプチドをコードする核酸
ｉｉｉ）抗原またはペプチドをコードする組換え細胞
ｉｖ）抗原またはペプチドをコードする組換えウイルス
ｖ）抗原もしくはペプチド（天然もしくは修飾）でパルスした、または抗原もしくはペプチドをコードする核酸でトランスフェクトした抗原提示細胞
【０１７１】
ＩＩ．受動免疫療法（「養子免疫療法」）
ｖｉ）抗原を認識する抗体またはＴ細胞受容体の移入
ｖｉｉ）抗原（バルクまたはクローン化集団）に対してインビトロで感作された細胞の移入
ｖｉｉｉ）抗原を認識し、好ましくは腫瘍特異的クラスＩ  ＭＨＣ提示ペプチドに対して応答性であるＴ細胞受容体をコードする核酸で形質導入したエフェクター細胞（または幹細胞）の移入
【０１７２】
樹状細胞（ＤＣ）などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、ＭＨＣクラスＩ提示ペプチド抗原もしくは腫瘍溶解産物のいずれかを負荷する、または腫瘍関連抗原、特にペプチド抗原をコードするアデノウイルスを用いた形質導入などによって核酸を導入することができる。
【０１７３】
好ましい実施形態では、本発明の抗腫瘍ワクチンは、ペプチド抗原を負荷したＡＰＣを含有する。これに関して、プロトコールは、人為的にペプチド抗原を提示するように操作されたＤＣのインビトロ培養／分化に依存し得る。遺伝的に操作されたＤＣの生産は、腫瘍関連抗原またはペプチド抗原をコードする核酸をＤＣに導入することを含み得る。ｍＲＮＡのＤＣへの導入は、強力な抗腫瘍免疫を刺激する有望な抗原負荷技術である。
【０１７４】
受動抗腫瘍免疫療法のために使用される場合、抗体は、標的化細胞毒性、すなわち腫瘍細胞の死滅を提供するために治療エフェクター部分、例えば放射性標識、細胞毒、治療酵素、アポトーシスを誘導する物質等に結合されてもよくまたは結合されなくてもよい。本発明の１つの実施形態では、そのような抗体またはフラグメントを、標識または非標識形態で、単独でまたは他の治療薬、例えば癌治療に適したシスプラチン、メトトレキサート、アドリアマイシン等のような化学療法剤と共に投与する。
【０１７５】
好ましくは、本明細書で述べる抗体は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）媒介性溶解、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）媒介性溶解、アポトーシス、同型接着、および／または食作用を誘導することによって、好ましくはＣＤＣ媒介性溶解および／またはＡＤＣＣ媒介性溶解を誘導することによって細胞の死滅を媒介する。本明細書で述べる抗体は、好ましくは免疫系の成分と、好ましくはＡＤＣＣまたはＣＤＣを介して相互作用する。しかし、本発明の抗体はまた、単に細胞表面の腫瘍関連抗原に結合することによって、従って、例えば細胞の増殖をブロックすることによっても作用を及ぼし得る。
【０１７６】
ＡＤＣＣは、好ましくは標的細胞が抗体によってマークされることを必要とする、本明細書で述べるエフェクター細胞、特にリンパ球の細胞死滅能力を表す。
【０１７７】
ＡＤＣＣは、好ましくは、抗体が腫瘍細胞上の抗原に結合し、抗体Ｆｃドメインが免疫エフェクター細胞の表面のＦｃ受容体（ＦｃＲ）に係合する場合に起こる。Ｆｃ受容体のいくつかのファミリーが同定されており、特定の細胞集団は、定められたＦｃ受容体を特徴的に発現する。ＡＤＣＣは、様々な程度の即時腫瘍破壊を直接誘導する機構とみなすことができ、前記機構はまた、抗原提示および腫瘍に対するＴ細胞応答の誘導も導く。好ましくは、ＡＤＣＣのインビボでの誘導は、抗腫瘍Ｔ細胞応答および宿主由来の抗体応答を導く。
【０１７８】
ＣＤＣは、抗体によって指令され得るもう１つの細胞死滅方法である。ＩｇＭは補体活性化のために最も有効なアイソタイプである。ＩｇＧ１およびＩｇＧ３も、古典的補体活性化経路を介してＣＤＣを指令するうえで非常に有効である。好ましくは、このカスケードにおいて、抗原−抗体複合体の形成は、ＩｇＧ分子などの関与抗体分子のＣＨ２ドメイン上のごく近接する多数のＣ１ｑ結合部位の暴露を生じさせる（Ｃ１ｑは補体Ｃ１の３つのサブ成分の１つである）。好ましくは、これらの暴露されたＣ１ｑ結合部位は、それまでの低親和性Ｃ１ｑ−ＩｇＧ相互作用を高いアビディティーの相互作用へと変換し、それが、一連の他の補体タンパク質を含む事象のカスケードを開始させ、エフェクター細胞化学走性／活性化物質Ｃ３ａおよびＣ５ａのタンパク質分解性放出をもたらす。好ましくは、補体カスケードは、細胞内および細胞外への水と溶質の自由な通過を促進し、アポトーシスを導き得る細胞膜の孔を作り出す、膜傷害性複合体の形成で終了する。
【０１７９】
腫瘍関連抗原を認識できる免疫細胞（場合により遺伝的に修飾された）での受動免疫療法は、選択された患者において癌の退縮を媒介するのに有効である。これらの技術は、腫瘍反応性Ｔ細胞のクローン化またはポリクローナル培養物のエクスビボでの再活性化と増殖に基づき得る。培養後、Ｔ細胞をＩＬ−２と共に患者に再注入し得る。ヒトリンパ球を、抗原提示細胞上に提示される腫瘍ペプチド抗原に対してインビトロで感作するインビトロ技術が開発されている。インビトロでの反復刺激によって、ヒト腫瘍関連抗原を認識する大きな能力を備えた細胞を導出することができる。これらの細胞の養子移入は、従来通りに増殖された細胞よりも、インビボで腫瘍退縮を媒介するのにより有効であり得る。
【０１８０】
本発明によれば、「免疫反応性細胞」という用語は、適切な刺激によって免疫細胞（Ｂ細胞、Ｔヘルパー細胞または細胞溶解性Ｔ細胞など）へと成熟することができる細胞を意味する。免疫反応性細胞は、ＣＤ３４＋造血幹細胞、未熟および成熟Ｔ細胞ならびに未熟および成熟Ｂ細胞を含む。腫瘍関連抗原を認識する細胞溶解性細胞またはＴヘルパー細胞の生産を所望する場合は、免疫反応性細胞を、細胞溶解性Ｔ細胞およびＴヘルパー細胞の産生、分化および／または選択を促進する条件下で腫瘍関連抗原を発現する細胞と接触させる。Ｔ細胞前駆体の細胞溶解性Ｔ細胞への分化は、抗原に暴露された場合、免疫系のクローン選択に類似する。
【０１８１】
「Ｔ細胞」および「Ｔリンパ球」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、Ｔヘルパー細胞および細胞溶解性Ｔ細胞を含む細胞傷害性Ｔ細胞を包含する。
【０１８２】
一部の治療方法は、１またはそれ以上の腫瘍関連抗原を提示する癌細胞などの抗原提示細胞の溶解を生じさせる、患者の免疫系の反応に基づく。これに関連して、例えば腫瘍関連抗原とＭＨＣ分子との複合体に特異的な自家細胞傷害性Ｔリンパ球を、細胞異常を有する患者に投与する。インビトロでのそのような細胞傷害性Ｔリンパ球の生産は公知である。Ｔ細胞を分化させる方法の一例は、国際公開広報第ＷＯ−Ａ−９６３３２６５号に見出される。一般に、血液細胞などの細胞を含む試料を患者から採取し、その細胞を、前記複合体を提示し、細胞傷害性Ｔリンパ球（例えば樹状細胞）の増殖を生じさせることができる細胞と接触させる。標的細胞は、ＣＯＳ細胞などの遺伝子導入された細胞であり得る。これらの形質転換体は、所望複合体をそれらの表面に提示し、細胞傷害性Ｔリンパ球と接触させた場合、後者の増殖を刺激する。次に、クローン増殖した自家細胞傷害性Ｔリンパ球を患者に投与する。
【０１８３】
抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球を選択するもう１つの方法では、細胞傷害性Ｔリンパ球の特異的クローンを得るためにＭＨＣクラスＩ分子／ペプチド複合体の蛍光性四量体を使用する（Ａｌｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：９４−９６，１９９６；Ｄｕｎｂａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．８：４１３−４１６，１９９８）。
【０１８４】
本発明はまた、養子移入と称される治療方法を含み（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３６（５）：１９１７，１９８６；Ｒｉｄｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：２３８，１９９２；Ｌｙｎｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：１４０３−１４１０，１９９１；Ｋａｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ５９：６０３−６１４，１９８９）、この方法では、所望複合体を提示する細胞（例えば樹状細胞）を、治療される患者の細胞傷害性Ｔリンパ球と組み合わせて、特異的細胞傷害性Ｔリンパ球の増殖を生じさせる。増殖した細胞傷害性Ｔリンパ球を、次に、特異的複合体を提示する特定の異常細胞によって特徴づけられる細胞異常を有する患者に投与する。細胞傷害性Ｔリンパ球は、その後異常細胞を溶解し、それによって所望治療効果を達成する。
【０１８５】
さらに、所望複合体を提示する細胞（例えば樹状細胞）を、高い親和性で特異的細胞傷害性Ｔリンパ球の増殖を生じさせ得る健常個体または別の種（例えばマウス）の細胞傷害性Ｔリンパ球と組み合わせ得る。これらの増殖した特異的Ｔリンパ球の高親和性Ｔ細胞受容体をクローニングし、場合により種々の程度にヒト化して、次に、このようにして得られたＴ細胞受容体を、例えばレトロウイルスベクターを使用して、患者のＴ細胞に遺伝子導入することを介して形質導入し得る。その後、これらの遺伝的に変化したＴリンパ球を使用して養子移入を実施し得る（Ｓｔａｎｉｓｌａｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：９６２−７０，２００１；Ｋｅｓｓｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：９５７−６１，２００１）。
【０１８６】
養子導入は、本発明により適用できる唯一の治療形態ではない。細胞傷害性Ｔリンパ球はまた、それ自体公知の方法でインビボにて作製し得る。１つの方法は、複合体を発現する非増殖性細胞を使用する。本明細書で使用する細胞は、照射された腫瘍細胞または複合体の提示に必要な一方もしくは両方の遺伝子（すなわち抗原性ペプチドと提示ＭＨＣ分子）を導入された細胞のような、通常は複合体を発現する細胞である。もう１つの好ましい形態は、例えばリポソーム移入または電気穿孔法によって細胞に導入し得る、組換えＲＮＡの形態での腫瘍関連抗原の導入である。生じる細胞は対象複合体を提示し、自家細胞傷害性Ｔリンパ球によって認識されて、その後増殖する。
【０１８７】
抗原提示細胞への組込みをインビボで可能にするために、腫瘍関連抗原またはそのフラグメントを補助薬と組み合わせることによって同様の作用を達成することができる。腫瘍関連抗原またはそのフラグメントは、タンパク質として、ＤＮＡ（例えばベクター内の）として、またはＲＮＡとして示され得る。腫瘍関連抗原は、ＭＨＣ分子に対するペプチドパートナーを生じるようにプロセシングされるが、そのフラグメントはさらなるプロセシングを必要とせずに提示され得る。後者は特に、これらがＭＨＣ分子に結合できる場合に該当する。有効な免疫応答のために必要とされるＴヘルパー細胞応答も生じさせ得る形態でもあるため、完全な抗原が樹状細胞によってインビボでプロセシングされる投与形態が好ましい（Ｏｓｓｅｎｄｏｒｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ．７４：７５−９，２０００；Ｏｓｓｅｎｄｏｒｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：６９３−７０２，１９９８）。一般に、例えば皮内注射によって有効量の腫瘍関連抗原を患者に投与することが可能である。しかし、注射はまた、リンパ節内にも実施し得る（Ｍａｌｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：３２９９−３０３，２００１）。
【０１８８】
本発明に従って述べる医薬組成物および治療方法はまた、本明細書で述べる疾患を治療的に処置する、または予防するための免疫またはワクチン接種のためにも使用し得る。本発明によれば、「免疫」または「ワクチン接種」という用語は、好ましくは抗原に対する免疫応答の増大または活性化に関する。腫瘍関連抗原またはそれをコードする核酸を使用することによる癌への免疫効果を試験するために動物モデルを用いることが可能である。例えば、ヒト癌細胞をマウスに導入して腫瘍を生じさせ、腫瘍関連抗原をコードする１またはそれ以上の核酸を投与し得る。癌細胞への効果（例えば腫瘍径の縮小）を、核酸による免疫の有効性についての尺度として測定し得る。
【０１８９】
免疫またはワクチン接種のための組成物の一部として、好ましくは１またはそれ以上の腫瘍関連抗原またはその刺激性フラグメントを、免疫応答を誘導するためまたは免疫応答を増大させるために１またはそれ以上の補助薬と共に投与する。補助薬は、抗原に組み込まれるまたは抗原と共に投与される、免疫応答を増強する物質である。補助薬は、抗原貯蔵所を提供し（細胞外にまたはマクロファージ中に）、マクロファージを活性化するおよび／または特定リンパ球を刺激することによって免疫応答を増強し得る。補助薬は公知であり、非限定的に、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ，ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ）、ＱＳ２１（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ）、ＤＱＳ２１（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ；国際公開広報第ＷＯ９６／３３７３９号）、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８およびＱＳ−Ｌ１などのサポニン（Ｓｏ  ｅｔ  ａｌ．,Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ  ７：１７８−１８６，１９９７）、不完全フロイントアジュバント、完全フロイントアジュバント、ビタミンＥ、モンタニド、ミョウバン、ＣｐＧオリゴヌクレオチド（Ｋｒｅｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３７４：５４６−９，１９９５参照）ならびにスクアランおよび／またはトコフェロールなどの生分解性油から調製される様々な油中水型エマルションを含む。好ましくは、ペプチドをＤＱＳ２１／ＭＰＬとの混合物中で投与する。ＤＱＳ２１対ＭＰＬの比率は、典型的には約１：１０〜１０：１、好ましくは約１：５〜５：１、特に約１：１である。ヒトへの投与に関しては、ワクチン製剤は、典型的には約１μｇ〜約１００μｇの範囲内のＤＱＳ２１およびＭＰＬを含有する。
【０１９０】
患者の免疫応答を刺激する他の物質も投与し得る。例えば、リンパ球に対するそれらの調節特性の故に、サイトカインをワクチン接種において使用することが可能である。そのようなサイトカインは、例えば、ワクチンの防御作用を高めることが示されたインターロイキン１２（ＩＬ−１２）（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８：１４３２−１４３４，１９９５参照）、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−１８を含む。
【０１９１】
免疫応答を増強し、それ故ワクチン接種において使用し得る数多くの化合物が存在する。前記化合物は、Ｂ７−１およびＢ７−２（それぞれＣＤ８０およびＣＤ８６）のようなタンパク質または核酸の形態で提供される共刺激性分子を含む。
【０１９２】
本発明はまた、核酸、タンパク質またはペプチドの投与を提供する。タンパク質およびペプチドは、それ自体公知の方法で投与し得る。１つの実施形態では、核酸をエクスビボ法によって、すなわち患者から細胞を取り出し、腫瘍関連抗原を組み込むために上記細胞を遺伝的に修飾して、改変された細胞を患者に再導入することによって投与する。これは一般に、遺伝子の機能的コピーをインビトロで患者の細胞に導入することおよび遺伝的に改変された細胞を患者に再導入することを含む。遺伝子の機能的コピーは、遺伝的に改変された細胞において該遺伝子が発現されることを可能にする調節エレメントの機能的制御下にある。形質転換および形質導入法は当業者に公知である。本発明はまた、ウイルスおよび標的制御リポソームなどのベクターを使用することによってインビボで核酸を投与することを提供する。本発明により、核酸の投与または医薬組成物への組込みに言及する場合、これは、核酸がそのようなベクター中に存在する実施形態を包含する。
【０１９３】
好ましい実施形態では、腫瘍関連抗原をコードする核酸を投与するためのウイルスまたはウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルスおよび弱毒化ポックスウイルスを含むポックスウイルス、セムリキ森林ウイルス、レトロウイルス、シンドビスウイルスおよびＴｙウイルス様粒子からなる群より選択される。アデノウイルスおよびレトロウイルスが特に好ましい。レトロウイルスは、典型的には複製欠損型である（すなわち感染性粒子を生成することができない）。
【０１９４】
インビトロまたはインビボで核酸を細胞に導入する方法は、核酸のリン酸カルシウム沈殿物の導入、ＤＥＡＥと結合した核酸の導入、対象核酸を担持する上記ウイルスによる導入または感染、リポソームを介した導入等を含む。特定の実施形態では、核酸に特定の細胞を指向させることが好ましい。そのような実施形態では、核酸を細胞に投与するために使用される担体（例えばレトロウイルスまたはリポソーム）は、結合した標的制御分子を有し得る。例えば、標的細胞上の表面膜タンパク質に特異的な抗体または標的細胞上の受容体に対するリガンドなどの分子を核酸担体に組み込み得るまたは結合し得る。好ましい抗体は、腫瘍関連抗原に選択的に結合する抗体を含む。リポソームを介した核酸の投与を所望する場合は、標的の制御および／または取込みを可能にするために、エンドサイトーシスに関連する表面膜タンパク質に結合するタンパク質をリポソーム製剤に組み込み得る。そのようなタンパク質は、特定の細胞型に特異的なキャプシドタンパク質またはそのフラグメント、インターナライズされるタンパク質に対する抗体、細胞内部位を指向するタンパク質等を含む。
【０１９５】
本発明の治療組成物は、医薬的に適合性の製剤中で投与し得る。そのような製剤は、通常、医薬的に適合性の濃度の塩、緩衝物質、防腐剤、担体、補助薬などの補足的免疫増強物質、例えばＣｐＧオリゴヌクレオチド、サイトカイン、ケモカイン、サポニン、ＧＭ−ＣＳＦおよび／またはＲＮＡならびに、適切な場合は、他の治療的に活性な化合物を含有し得る。
【０１９６】
本発明の治療的に活性な化合物は、注射または注入を含む任意の従来経路によって投与し得る。投与は、例えば経口的、静脈内、腹腔内、筋肉内経路、皮下的または経皮的に実施し得る。好ましくは、抗体は、肺エアロゾルとして治療的に投与される。アンチセンス核酸は、好ましくは徐放静脈内投与によって投与される。
【０１９７】
本発明の組成物は有効量で投与される。「有効量」は、単独でまたはさらなる投与物と共に所望反応または所望効果を達成する量を指す。１またはそれ以上の腫瘍関連抗原の発現を特徴とする特定疾患または特定状態の治療の場合、所望反応は、好ましくは疾患の経過の阻止に関する。これは、疾患の進行を緩慢にすること、特に疾患の進行を妨げるまたは逆転させることを含む。疾患または状態の治療における所望反応はまた、前記疾患または前記状態の発症の遅延または発症の防止であり得る。本発明によれば、癌の診断または治療はまた、既に形成されたまたは今後形成される癌転移の診断または治療を含む。本発明によれば、「治療」という用語は、治療的処置および予防的処置、すなわち防止を含む。
【０１９８】
本発明の組成物の有効量は、治療される状態、疾患の重症度、患者の年齢、生理的状態、大きさおよび体重を含む患者の個体別パラメータ、治療の期間、付随する治療の種類（存在する場合）、特定投与経路および同様の因子に依存する。
【０１９９】
本発明の医薬組成物は、好ましくは無菌であり、所望反応または所望効果を生じさせるための治療的に活性な物質の有効量を含有する。
【０２００】
本発明の組成物の投与される用量は、投与の種類、患者の状態、所望投与期間等のような様々なパラメータに依存し得る。患者における反応が初期用量で不十分である場合は、より高用量（または異なる、より限局された投与経路によって達成される効果的により高い用量）を使用し得る。
【０２０１】
一般に、１ｎｇ〜１ｍｇ、好ましくは１０ｎｇ〜１００μｇの腫瘍関連抗原の用量が、治療のためまたは免疫応答を生じさせるもしくは増大させるために製剤され、投与される。腫瘍関連抗原をコードする核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）の投与を所望する場合は、１ｎｇ〜０．１ｍｇの用量が製剤され、投与される。
【０２０２】
本発明の医薬組成物は、一般に医薬的に適合性の量でおよび医薬的に適合性の組成物中で投与される。「医薬的に適合性」という用語は、医薬組成物の活性成分の作用と相互作用しない非毒性物質を指す。この種の製剤は、通常、塩、緩衝物質、防腐剤、担体および、適切な場合は、他の治療的に活性な化合物を含有し得る。薬剤中で使用される場合、塩は医薬的に適合性であるべきである。しかし、医薬的に適合性ではない塩も、医薬的に適合性の塩を調製するために使用されてもよく、本発明に包含される。この種の薬理学的および医薬的に適合性の塩は、非限定的に、以下の酸から調製されるものを含む：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸等。医薬的に適合性の塩はまた、ナトリウム塩、カリウム塩またはカルシウム塩などの、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩としても調製され得る。
【０２０３】
本発明の医薬組成物は、医薬的に適合性の担体を含有し得る。本発明によれば、「医薬的に適合性の担体」という用語は、ヒトへの投与に適する、１またはそれ以上の適合性固体または液体充填剤、希釈剤または被包物質を指す。「担体」という用語は、適用を容易にするために活性成分が組み合わされる、天然または合成の有機または無機成分を指す。本発明の医薬組成物の成分は、通常、所望医薬効果を実質的に損なう相互作用が生じない成分である。
【０２０４】
本発明の医薬組成物は、塩中の酢酸、塩中のクエン酸、塩中のホウ酸および塩中のリン酸などの適切な緩衝物質を含有し得る。
【０２０５】
医薬組成物はまた、適切な場合は、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベンおよびチメロサールなどの適切な防腐剤を含有し得る。
【０２０６】
医薬組成物は、通常は均一投与形態で提供され、それ自体公知の方法で調製され得る。本発明の医薬組成物は、例えばカプセル、錠剤、ロゼンジ、溶液、懸濁液、シロップ、エリキシルの形態、またはエマルションの形態であり得る。
【０２０７】
非経口投与に適する組成物は、通常、好ましくは受容者の血液と等張である、活性化合物の滅菌水性または非水性製剤を含む。適合性担体および溶媒の例は、リンガー液および等張塩化ナトリウム溶液である。加えて、通常は滅菌固定油が溶液または懸濁液の媒質として使用される。
【０２０８】
本発明を以下の図面および実施例によって詳細に説明するが、それらは例示のためにのみ使用されるものであり、限定を意図されない。図面の説明および実施例により、同様に本発明に包含されるさらなる実施形態が当業者に利用可能である。
【実施例】
【０２０９】
本明細書で言及する技術および方法は、それ自体公知の方法で実施され、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．に記載されている。キットおよび試薬の使用を含むすべての方法は、特に指示されない限り製造者の情報に従って実施される。
【０２１０】
実施例１；腫瘍において異常に活性化された胎盤特異的遺伝子のスクリーニング
【０２１１】
組織および細胞株
組織は、通常の診断または治療手順の間のヒト余剰材料として入手し、使用時まで−８０℃で保存した。細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）およびＧｅｒｍａｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＤＳＭＺ）より購入した。
【０２１２】
ＲＮＡの単離およびマイクロアレイハイブリダイゼーション
ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔプロトコール（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して全ＲＮＡを単離した。紫外分光法を用いて単離したＲＮＡの定量を実施し、Ａ２６０／Ａ２８０比およびＡｇｉｌｅｎｔバイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の両方によって品質を測定した。全ＲＮＡ  ５μｇを、５ｐｍｏｌ／μｌ−１のＴ７−オリゴ（ｄＴ）２４プライマーでのｃＤＮＡ合成のために使用し、ＲＴ−ＰＣＲのためのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ−Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて４３℃で９０分間実施した。２番目の鎖の合成は完全なｃＤＮＡを用いて実施した。ｃＤＮＡ溶液を１６℃で２時間インキュベートし、次いで６Ｕ  Ｔ４−ＤＮＡポリメラーゼと共に１６℃で２０分間インキュベートして、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ  １０μｌを用いて反応を停止させた。ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｍｏｄｕｌｅ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を使用して二本鎖ｃＤＮＡを精製した後、製造者の指示に従ってビオチン−１１−ＣＴＰおよびビオチン−１６−ＵＴＰ（Ｅｎｚｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を添加したインビトロ転写反応により、ｃＤＮＡ試料から標識ｃＲＮＡを作製した。ｃＲＮＡをＡ２６０によって定量し、ｌａｂｃｈｉｐバイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて品質を測定した。高品質を有するｃＲＮＡ標本だけをさらなる分析のために選択した。断片化したｃＲＮＡ（１５μｇ）を使用して、０．１ｍｇ／ｍｌ−１ニシン精子ＤＮＡおよび０．５ｍｇ／ｍｌ−１アセチル化ウシ血清アルブミンを含むハイブリダイゼーションカクテル（１００ｍＭ  ＭＥＳ、１Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０）３００μｌを調製した。アレイ間のハイブリダイゼーション効率を比較し、測定した転写レベルの定量を標準化するために対照ｃＲＮＡを使用し、Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌキット'（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）の成分として含めた。カクテルを９５℃で５分間加熱し、４５℃で５分間平衡させて、遠心分離によって清澄化した。カクテルをＨＧ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０アレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）に４５℃で１６時間ハイブリダイズした。アレイを洗浄し、製造者の指示に従ってＧｅｎｅＣｈｉｐ  ｆｌｕｉｄｉｃｓ  ｓｔａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ＥｕｋＧＥ−ＷＳ２（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を使用してストレプトアビジン結合フッ素で染色した。アレイをアルゴンイオンレーザー共焦点スキャナ−（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）で走査し、５７０ｎｍで検出した。Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｕｉｔｅバージョン５．０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いてデータを抽出し、遺伝子当たり２，５００の平均強度を達成するために線形にスケールした。テキストファイルをエクスポートして、各々の問合せオリゴヌクレオチドの完全にマッチするプローブ細胞またはミスマッチプローブ細胞の強度を決定した。加えて、ｍＲＮＡの５'末端と３'末端の比率を、２４のヒトハウスキーピング／メンテナンス遺伝子（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を含むマイクロアレイ試験チップ（Ｔｅｓｔ３  Ａｒｒａｙ）を使用して６つの無作為に選択した標本（各群から２つ）について分析し、ＲＮＡの分解を認めなかった。
【０２１３】
バイオインフォマティクス解析
ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  １．４（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）およびＡｒｒａｙＡｓｓｉｓｔソフトウエアパッケージ５．２（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を統計解析のために使用した。
【０２１４】
結果
以下の表１に示す１８の正常組織および以下の表２に示す種々の実体の３０の腫瘍細胞株からの試料のスクリーニングは、検討した正常組織の中では胎盤においておよび腫瘍細胞株において発現される、本明細書で述べる配列を生じさせた。
【０２１５】
【表１】
2012525121.tif 000002
【０２１６】
【表２】
2012525121.tif 000003
【０２１７】
実施例２；同定された腫瘍関連マーカーの確認
【０２１８】
１．ＲＮＡ発現の検査
同定された腫瘍関連マーカーを、最初に、様々な組織からまたは組織特異的細胞株から得られるＲＮＡを用いて確認する。腫瘍組織と比較した健常組織の示差的発現パターンはその後の治療適用のために決定的に重要であるので、標的遺伝子を、好ましくはこれらの組織試料を用いて特徴づける。
【０２１９】
全ＲＮＡは、分子生物学の標準的な方法によって天然組織試料からまたは腫瘍細胞株から単離される。上記単離は、例えば、製造者の指示に従ってＲＮｅａｓｙ  Ｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号７５１６２）を用いて実施し得る。この単離方法は、カオトロピック試薬、イソチオシアン酸グアニジンの使用に基づいている。あるいは、酸性フェノールを単離のために使用することができる（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ  ＆  Ｓａｃｃｈｉ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６−１５９，１９８７）。イソチオシアン酸グアニジンによって組織を処理した後、ＲＮＡを酸性フェノールで抽出し、その後イソプロパノールで沈殿させて、ＤＥＰＣ処理水中に取る。
【０２２０】
このようにして単離したＲＮＡ２〜４μｇを、その後、例えば製造者のプロトコールに従ってＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ   ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ｃＤＮＡに転写する。該当する製造者の標準プロトコールに従ってランダムヘキサマー（例えばＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用してｃＤＮＡ合成を開始させる。品質管理のために、低い程度にのみ発現されるｐ５３遺伝子に特異的なプライマーを使用して、ｃＤＮＡを３０サイクルにわたって増幅する。ｐ５３陽性のｃＤＮＡ試料だけをその後の反応工程のために使用する。
【０２２１】
様々な正常および腫瘍組織からならびに腫瘍細胞株から単離したｃＤＮＡアーカイブに基いてＰＣＲまたは定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を用いて発現解析を実施することにより、標的を詳細に分析する。このために、上記反応混合物のｃＤＮＡ０．５μｌを、特定の製造者のプロトコールに従ってＤＮＡポリメラーゼ（例えば１ＵのＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｑｉａｇｅｎ）によって増幅する（反応混合物の総容量：２５〜５０μｌ）。上記ポリメラーゼの他に、増幅混合物は、０．３ｍＭ  ｄＮＴＰ、反応緩衝液（ＤＮＡポリメラーゼの製造者に従って、最終濃度１×）、および各々０．３ｍＭの遺伝子特異的「センス」および「アンチセンス」プライマーを含む。
【０２２２】
標的遺伝子の特異的プライマーは、可能な限り、ゲノム汚染が偽陽性結果を導くことがないように２つの異なるエクソンに位置するように選択する。非定量的エンドポイントＰＣＲでは、ＤＮＡを変性し、Ｈｏｔ−Ｓｔａｒｔ酵素を活性化するため、ｃＤＮＡを、典型的には９５℃で１５分間インキュベートする。その後ＤＮＡを３５サイクル（９５℃で１分間、プライマー特異的ハイブリダイゼーション温度（約５５〜６５℃）で１分間、アンプリコンを伸長させるために７２℃で１分間）増幅する。その後、ＰＣＲ混合物１０μｌをアガロースゲルに投与し、電場中で分画する。臭化エチジウムで染色することによってＤＮＡをゲル中で可視化し、ＰＣＲ結果を写真として記録する。
【０２２３】
従来のＰＣＲに代わるものとして、標的遺伝子の発現を定量的リアルタイムＰＣＲによっても分析し得る。また、様々な解析システムがこの分析のために利用可能であり、その中で最もよく知られているのは、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ配列検出システム（ＴａｑＭａｎ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ｉＣｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏｒａｄ）およびＬｉｇｈｔ  ｃｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）である。上述したように、特異的ＰＣＲ混合物をリアルタイム装置における分析に供する。ＤＮＡインターカレート染料（例えば臭化エチジウム、ＣｙｂｒＧｒｅｅｎ）を添加することにより、新たに合成されたＤＮＡを特異的な光励起によって可視化する（染料製造者の情報に従って）。増幅の間に多数の時点で測定することにより、プロセス全体を観測し、標的遺伝子の核酸濃度を定量的に測定することが可能となる。ハウスキーピング遺伝子（例えば１８Ｓ  ＲＮＡ、β−アクチン）を測定することによってＰＣＲ混合物を基準化する。蛍光標識ＤＮＡプローブを介した選択的な方法も、同様に特定組織試料の標的遺伝子の定量的測定を可能にする（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓからのＴａｑＭａｎの適用参照）。
【０２２４】
図１に示すように、ＲＴ−ＰＣＲ分析において、胎盤は配列番号：５４０の核酸配列を発現する唯一の健常組織として確認された。他のいずれの健常組織においても有意の発現を認めなかった。しかし、乳癌では高く且つ有意のレベルの発現を認めた。
【０２２５】
定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析は、配列番号：５４０の核酸配列が分析した乳癌試料の大部分において有意のレベルで発現されることを明らかにした；図２参照。
【０２２６】
２．クローニング
腫瘍関連マーカーのさらなる特徴づけのために必要とされる完全な標的遺伝子を、一般的な分子生物学的方法に従ってクローニングする（例えば「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」，Ｊｏｈｎ   Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｌｔｄ．，Ｗｉｌｅｙ  ＩｎｔｅｒＳｃｉｅｎｃｅ）。標的遺伝子をクローニングするためまたはその配列を分析するために、前記遺伝子を、最初に、校正機能を有するＤＮＡポリメラーゼ（例えばｐｆｕ、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）によって増幅する。次にアンプリコンを標準的な方法によってクローニングベクターに連結する。陽性クローンを配列解析によって同定し、その後予測プログラムと公知のアルゴリズムを用いて特徴づける。
【０２２７】
３．タンパク質の予測
本発明によって見出される遺伝子（特にＲｅｆＳｅｑ  ＸＭドメインからの遺伝子）は、完全長遺伝子のクローニング、オープンリーディングフレームの決定およびタンパク質配列の推定と解析を必要とし得る。
【０２２８】
完全長配列をクローニングするために、ｃＤＮＡ末端の迅速な増幅および遺伝子特異的プローブによるｃＤＮＡ発現ライブラリーのスクリーニングのための一般的なプロトコールを使用し得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）。
【０２２９】
このようにして見出されたフラグメントを収集した後、一般的な予測プログラムを用いて潜在的オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を予測することができる。ポリＡ尾部およびポリアデニル化モチーフの位置は潜在的遺伝子産物の方向をあらかじめ決定するので、その特定方向の３つのリーディングフレームだけが、可能な６つのリーディングフレームの中から残る。前者はしばしば、タンパク質をコードし得る十分に大きなオープンリーディングフレームを１つだけ生成するが、その他のリーディングフレームは、終結コドンが多すぎて、現実的なタンパク質をコードしない。別のオープンリーディングフレームの場合は、最適な転写開始のためのコザック基準を考慮することおよび生じ得る推定タンパク質配列を分析することにより、本当の（ａｕｔｈｅｎｔｉｃ）ＯＲＦを同定する助けとなる。前記ＯＲＦは、潜在的ＯＲＦから推定されたタンパク質に対する免疫血清を生成し、組織および細胞株中の実際のタンパク質の認識に関して前記免疫血清を分析することによってさらに確認される。
【０２３０】
４．抗体の作製
本発明によって同定される腫瘍関連抗原は、例えば抗体を使用することによって特徴づけられる。本発明はさらに、抗体の診断的使用または治療的使用を含む。抗体は、天然および／または変性状態のタンパク質を認識し得る（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：１８９９−１９０４，１９８９；Ｇａｒｄｓｖｏｌｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３４：１０７−１１６，２０００；Ｋａｙｙｅｍ  ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０８：１−８，１９９２；Ｓｐｉｌｌｅｒ  ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２２４：５１−６０，１９９９）。
【０２３１】
標的タンパク質に特異的に結合する特異的抗体を含む抗血清は、様々な標準的方法によって調製し得る：例えば、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」ｂｙ  Ｐｈｉｌｌｉｐ  Ｓｈｅｐｈｅｒｄ，Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ｄｅａｎ  ＩＳＢＮ ０−１９−９６３７２２−９、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」ｂｙ  Ｅｄ   Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ  ＩＳＢＮ：０８７９６９３１４２および「Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：Ｐｏｒｔａｂｌｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ＮＯ」ｂｙ  Ｅｄｗａｒｄ   Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｅｄ   Ｈａｒｌｏｗ  ＩＳＢＮ：０８７９６９５４４７参照。また本明細書では、天然形態の複合体膜タンパク質を認識するアフィンおよび特異的抗体を作製することも可能である（Ａｚｏｒｓａ  ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２２９：３５−４８，１９９９；Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：１８９９−１９０４，１９８９；Ｇａｒｄｓｖｏｌｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．２３４：１０７−１１６，２０００）。これは、治療的に使用される予定の抗体の作製において特に重要であるが、多くの診断適用のためにも重要である。このために、完全なタンパク質および細胞外部分配列の両方を免疫に使用し得る。
【０２３２】
ポリクローナル抗体の免疫と作製
様々な免疫プロトコールが公表されている。ある種（例えばウサギ、マウス）を所望標的タンパク質の初回注射によって免疫する。免疫原に対する動物の免疫応答を、定められた期間内に（前回の免疫後約２〜４週間）２回目または３回目の免疫によって増強することができる。前記動物から血液を採取し、再び種々の定められた時間間隔を置いた後、免疫血清を得る（４週間後に１回目の採血、その後２〜３週間ごとに５回まで採取）。このようにして採取した免疫血清は、ウエスタンブロット法において、フローサイトメトリー、免疫蛍光法または免疫組織化学によって標的タンパク質を検出し、特徴づけるために使用し得るポリクローナル抗体を含む。
【０２３３】
通常、４つの広く確立された方法のいずれかによって動物を免疫するが、他の方法も存在する。免疫は、標的タンパク質に特異的なペプチドを使用して、完全なタンパク質を使用して、または実験的にもしくは予測プログラムによって同定され得るタンパク質の細胞外部分配列を使用して実施し得る。予測プログラムは必ずしも完璧に機能するわけではないので、膜貫通ドメインによって互いから分離された２つのドメインを用いることも可能である。この場合、２つのドメインの１つは細胞外でなければならず、これはその後実験的に証明され得る（以下参照）。免疫は、種々のサービス業者によって商業的に提供される。
【０２３４】
（１） 最初の場合、ペプチド（長さ：８〜１２アミノ酸）をインビトロ法によって合成し（場合により商業的サービスによって実施される）、前記ペプチドを免疫のために使用する。通常は３回の免疫を実施する（例えば５〜１００μｇ／免疫の濃度で）。
【０２３５】
（２） あるいは、組換えタンパク質を使用して免疫を実施し得る。このために、標的遺伝子のクローン化ＤＮＡを発現ベクターにクローニングし、標的タンパク質を、例えば無細胞インビトロで、細菌（例えば大腸菌）中で、酵母（例えばサッカロミセス・ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ））中で、昆虫細胞中または哺乳動物細胞中で、特定の製造者（例えばＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｑｉａｇｅｎ）の条件に従って合成する。また、ウイルス発現系（例えばバキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス）を用いて標的タンパク質を合成することも可能である。前記系の１つにおいて合成した後、標的タンパク質を、通常はクロマトグラフィー法を使用することによって、精製する。これに関して、精製を助けるものとして分子足場（例えばＨｉｓタグ、Ｑｉａｇｅｎ；ＦＬＡＧタグ、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ；ＧＳＴ融合タンパク質）を有するタンパク質の免疫のために使用することも可能である。多くのプロトコールが、例えば「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｌｔｄ．，Ｗｉｌｅｙ  ＩｎｔｅｒＳｃｉｅｎｃｅにおいて見出される。標的タンパク質を精製した後、上述したように免疫を実施する。
【０２３６】
（３） 所望タンパク質を内因的に合成する細胞株が利用可能である場合は、特異的抗血清を調製するためにこの細胞株を直接使用することも可能である。この場合、各々約１〜５×１０７細胞での１〜３回の注射によって免疫を実施する。
【０２３７】
（４）免疫はまた、ＤＮＡを注射することによっても実施し得る（ＤＮＡ免疫）。このために、標的遺伝子を、最初に標的配列が強力な真核生物プロモーター（例えばＣＭＶプロモーター）の制御下にあるように発現ベクターにクローニングする。その後、遺伝子銃を使用してＤＮＡ（例えば１回の注射当たり１〜１０μｇ）を生物（例えばマウス、ウサギ）中の強い血流を有する毛細管領域に免疫原として移入する。移入されたＤＮＡは動物の細胞によって取り込まれ、標的遺伝子が発現されて、動物は最終的に標的タンパク質に対する免疫応答を発現する（Ｊｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ  １２：４１−４９，２００１；Ｋａｓｉｎｒｅｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍｉｃｓ  ２１：２８７−２９３，２００２）。
【０２３８】
モノクローナル抗体の作製
モノクローナル抗体は、伝統的にハイブリドーマ技術を用いて作製される（技術的な詳細については、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」ｂｙ  Ｐｈｉｌｉｐ  Ｓｈｅｐｈｅｒｄ，Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ｄｅａｎ  ＩＳＢＮ  ０−１９−９６３７２２−９；「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」ｂｙ  Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ  ＩＳＢＮ：０８７９６９３１４２，「Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：Ｐｏｒｔａｂｌｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ＮＯ」ｂｙ  Ｅｄｗａｒｄ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ＩＳＢＮ：０８７９６９５４４７参照）。同様に使用される新しい方法は、「ＳＬＡＭ」技術である。この技術では、Ｂ細胞を全血から単離し、細胞をモノクローナルにする。その後、単離したＢ細胞の上清をその抗体特異性に関して分析する。ハイブリドーマ技術と異なり、次に抗体遺伝子の可変領域を単細胞ＰＣＲによって増幅し、適切なベクターにクローニングする。このようにしてモノクローナル抗体の作製が加速される（ｄｅ Ｗｉｌｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０７：６１−６７，１９９７）。
【０２３９】
５．抗体を使用したｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓによる標的の確認
上述したように作製できる抗体は、以下のように標的タンパク質をさらに分析するために使用できる：
【０２４０】
抗体の特異性
細胞培養とその後のウエスタンブロット法に基づくアッセイは、抗体が所望の標的タンパク質にのみ特異的に結合するという事実を明らかにするのに最も適切である（様々な変法が、例えば「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｌｔｄ．，Ｗｉｌｅｙ  ＩｎｔｅｒＳｃｉｅｎｃｅに記載されている）。実証のために、強力な真核生物プロモーター（例えばサイトメガロウイルスプロモーター；ＣＭＶ）の制御下にある標的タンパク質のｃＤＮＡを細胞に導入する。多種多様な方法（例えば電気穿孔法、リポソームに基づくトランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿法）が、細胞株にＤＮＡを導入するために十分に確立されている（例えばＬｅｍｏｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７５：４４１−７，１９９７）。代替法として、標的遺伝子を内因的に発現する細胞株を使用することも可能である（標的遺伝子特異的ＲＴ−ＰＣＲを介した検出）。対照として、理想的な場合は、分析した抗体の特異性をその後のウエスタンブロット法において明らかにすることができるように、相同な遺伝子を実験の中で同時に形質転換する。
【０２４１】
その後のウエスタンブロット法では、標的タンパク質を含む可能性がある細胞培養物または組織試料からの細胞を１％濃度のＳＤＳ溶液に溶解し、その過程でタンパク質を変性させる。溶解産物を８〜１５％濃度の変性ポリアクリルアミドゲル（１％ＳＤＳを含有する）上の電気泳動により大きさによって分画する（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。次に複数のブロット法の１つ（例えばセミドライ電気ブロット法；Ｂｉｏｒａｄ）によって特異的膜（例えばニトロセルロース、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈuｌｌ）に転写する。所望タンパク質をこの膜上で視覚化することができる。このために、最初に、標的タンパク質を認識する抗体（前記抗体の特異性に依存して約１：２０〜１：２００希釈）と共に膜を６０分間インキュベートする。洗浄工程後、膜を、マーカー（例えばペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼなどの酵素）に結合された、第一抗体を認識する第二抗体と共にインキュベートする。その後、呈色反応または化学発光反応（例えばＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）において膜上で標的タンパク質を可視化することが可能である。標的タンパク質に対して高い特異性を有する抗体は、理想的な場合、所望タンパク質自体だけを認識するはずである。
【０２４２】
標的タンパク質の局在化
標的タンパク質の、インシリコアプローチで同定された膜局在化を確認するために様々な方法が使用される。上述した抗体を使用する重要で広く確立された方法は、免疫蛍光法（ＩＦ）である。このために、標的タンパク質を合成するか（ＲＴ−ＰＣＲによるＲＮＡの検出もしくはウエスタンブロット法によるタンパク質の検出）またはプラスミドＤＮＡが導入された、樹立細胞株の細胞を使用する。多種多様な方法（例えば電気穿孔法、リポソームに基づくトランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿法）が、ＤＮＡを細胞株に導入するために十分に確立されている（例えばＬｅｍｏｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７５：４４１−７，１９９７）。免疫蛍光法において細胞に導入されるプラスミドは、非修飾タンパク質をコードし得るかまたは種々のアミノ酸マーカーを標的タンパク質に連結し得る。主要なマーカーは、例えば、様々な示差的蛍光形態の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、高親和性の特異的抗体が利用可能である６〜１２個のアミノ酸の短いペプチド配列、またはそのシステイン特異的蛍光物質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を介して結合できる短いアミノ酸配列、Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｘ−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓである。標的タンパク質を合成する細胞を、例えばパラホルムアルデヒドまたはメタノールで固定する。次に細胞を、必要な場合は、界面活性剤（例えば０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）と共にインキュベートすることによって透過性を上げてもよい。その後、標的タンパク質に対するまたは結合マーカーの１つに対する一次抗体と共に細胞をインキュベートする。洗浄工程後、混合物を、第一抗体に結合する、蛍光マーカー（例えばフルオレセイン、テキサスレッド、Ｄａｋｏ）に連結された二次抗体と共にインキュベートする。次に、このようにして標識された細胞をグリセロールで覆い、製造者の情報に従って蛍光顕微鏡を用いて分析する。特異的蛍光発光は、この場合、使用する物質に依存して特異的励起によって達成される。分析は通常、標的タンパク質の信頼し得る局在化を可能にし、標的タンパク質に加えて、結合アミノ酸マーカーまたはその局在化が文献で既に記述されている他のマーカータンパク質も染色される、二重染色において、抗体の品質と標的タンパク質が確認される。ＧＦＰおよびその誘導体は特殊なケースであり、直接励起可能であって且つそれら自体が蛍光を発する。界面活性剤の使用を通して制御され得る膜透過性は、免疫蛍光法において、免疫原性エピトープが細胞の内側に位置するかまたは細胞外であるのかを明らかにする。従って、選択タンパク質の予測を実験的に裏付けることができる。代替的な可能性は、フローサイトメトリーを用いて細胞外ドメインを検出することである。このために、細胞を非透過処理条件下で固定し（例えばＰＢＳ／アジ化ナトリウム／２％ＦＣＳ／５ｍＭ  ＥＤＴＡを用いて）、製造者の指示に従ってフローサイトメーターで分析する。細胞外エピトープだけが、この方法で分析される抗体によって認識され得る。免疫蛍光法との相違は、例えばヨウ化プロピジウムまたはトリパンブルーを使用することによって死細胞と生細胞を識別することが可能であり、従って偽陽性結果を回避できることである。
【０２４３】
もう１つの重要な検出法は、特定組織試料に関する免疫組織化学（ＩＨＣ）によるものである。この方法の目的は、機能的に無傷の組織集合体においてタンパク質の局在化を同定することである。ＩＨＣは、特に、（１）腫瘍組織および正常組織における標的タンパク質の量を推定することができる、（２）腫瘍組織および健常組織中のどの程度の数の細胞が標的遺伝子を合成するかを分析する、ならびに（３）標的タンパク質が検出可能である組織（腫瘍、健常細胞）中の細胞型を定義するのに役立つ。あるいは、標的遺伝子のタンパク質の量を、デジタルカメラと適切なソフトウエア（例えばＴｉｌｌｖｉｓｉｏｎ，Ｔｉｌｌ−ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した組織免疫蛍光法によって定量し得る。この技術は頻繁に公表されており、それ故染色および顕微鏡検査の詳細は、例えば、「Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」ｂｙ  Ｄａｖｉｄ Ｊ．，ＭＤ  Ｄａｂｂｓ  ＩＳＢＮ：０４４３０６５６６７または「Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ａｎｄ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｆｏｒ  Ｌｉｇｈｔ  ａｎｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」ＩＳＢＮ：０３０６４６７７０４に見出される。抗体の特性により、意味のある結果を得るためには種々のプロトコールを使用しなければならない（一例を以下で述べる）ことに留意すべきである。
【０２４４】
通常、組織学的に定義された腫瘍組織および、参照として、匹敵する健常組織をＩＨＣにおいて使用する。標的遺伝子の存在がＲＴ−ＰＣＲ分析を通して公知である細胞株を陽性および陰性対照として使用することも可能である。バックグラウンド対照は常に含めなければならない。
【０２４５】
ホルマリン固定し（別の固定法、例えばメタノールでの固定も可能である）、パラフィン包埋した厚さ４μｍの組織片をガラス製支持体に載せ、例えばキシレンで脱パラフィン化する。試料をＴＢＳ−Ｔで洗浄し、血清中でブロックする。次いで第一抗体（１：２〜１：２０００希釈）と共に１〜１８時間インキュベートし、これには通常、アフィニティー精製した抗体を使用する。洗浄工程に続いて、アルカリホスファターゼ（あるいは、例えばペルオキシダーゼ）に連結された、第一抗体に対する第二抗体と共に約３０〜６０分間インキュベートする。次いでアルカリホスファターゼを使用した呈色反応を実施する（例えば、Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ． Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．３９：７４１−７４８，１９９１；Ｓｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．６４：６９３−７０２，１９９１参照）。抗体の特異性を明らかにするため、あらかじめ免疫原を添加することによって反応をブロックすることができる。
【０２４６】
タンパク質修飾の分析
例えばＮ−もしくはＯ−グリコシル化またはミリスチル化などの二次タンパク質修飾は、免疫原性エピトープの接近可能性を障害する、さらには完全に妨げる可能性があり、従って抗体療法の効果に問題を生じさせ得る。さらに、二次修飾の種類と量が正常組織と腫瘍組織で異なることがしばしば明らかにされている（例えばＤｕｒａｎｄ  ＆  Ｓｅｔａ，２０００；Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４６：７９５−８０５；Ｈａｋｏｍｏｒｉ，１９９６；Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：５３０９−１８）。これらの修飾の分析は、それ故、抗体治療の成功のために必要不可欠である。潜在的な結合部位は特異的アルゴリズムによって予測することができる。
【０２４７】
タンパク質修飾の分析は、通常、ウエスタンブロット法（上記参照）によって行われる。通常数ｋＤａの大きさを有するグリコシル化は、特により大きな全体質量の標的タンパク質を導き、これはＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて分画することができる。特異的Ｏ−およびＮ−グリコシド結合を検出するために、タンパク質溶解産物をインキュベートした後、Ｏ−またはＮ−グリコシラーゼ（それぞれの製造者の指示に従って、例えばＰＮガーゼ、エンドグリコシダーゼＦ、エンドグリコシダーゼＨ、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いてＳＤＳによって変性する。これに続いて、上述したようにウエスタンブロット法を実施する。従って、グリコシダーゼとのインキュベーション後に標的タンパク質の大きさが縮小している場合、特異的グリコシル化を検出することができ、この方法で、修飾の腫瘍特異性を分析することも可能である。
【０２４８】
標的遺伝子の機能分析
標的分子の機能はその治療的有用性のために極めて重要であり得るので、機能分析は治療的に利用可能な分子の特徴づけにおける重要な構成要素である。機能分析は、細胞培養実験において細胞内でまたは動物モデルを用いてインビボで実施され得る。これは、突然変異によって標的分子の遺伝子のスイッチを切ること（ノックアウト）または標的配列を細胞または生物に挿入すること（ノックイン）のいずれかを含む。従って、最初の場合は、分析しようとする遺伝子の機能喪失による細胞環境での機能的修飾を分析することが可能である（機能の喪失）。２番目の場合は、分析遺伝子の付加によって引き起こされる修飾を分析できる（機能の獲得）。
【０２４９】
ａ．細胞内における機能分析
形質転換。機能の獲得を分析するためには、標的分子の遺伝子を細胞に導入しなければならない。このために、標的分子の合成を可能にする細胞にＤＮＡを導入する。通常、本明細書では標的分子の遺伝子は強力な真核生物プロモーター（例えばサイトメガロウイルスプロモーター；ＣＭＶ）の制御下にある。多種多様な方法（例えば電気穿孔法、リポソームに基づくトランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿法）が、細胞株にＤＮＡを導入するために広く確立されている（例えばＬｅｍｏｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７５：４４１−７，１９９７）。遺伝子は、ゲノムに組み込まれずに一過性に、または例えばネオマイシンによる選択後に、ゲノムに組み込まれて安定に合成され得る。
【０２５０】
ＲＮＡ干渉（ｓｉＲＮＡ）。細胞内の標的分子の機能の完全な喪失を誘導し得る、標的遺伝子の発現の阻害を、細胞におけるＲＮＡ干渉（ｓｉＲＮＡ）技術によって生じさせ得る（Ｈａｎｎｏｎ，ＧＪ．２００２．ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４１８：２４４−５１；Ｃｚａｕｄｅｍａ  ｅｔ  ａｌ．２００３．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．３１：６７０−８２）。このために、標的分子に特異的な約２０〜２５ヌクレオチド長の短い二本鎖ＲＮＡ分子で細胞をトランスフェクトする。次に酵素処理によって標的遺伝子の特異的ＲＮＡ分子の分解、従って標的タンパク質の発現低下を生じさせ、結果として標的遺伝子を機能的に分析することを可能にする。
【０２５１】
形質転換された細胞株、またはｓｉＲＮＡによって修飾された細胞株は、その後種々の方法で分析し得る。最も一般的な例を以下に列挙する。
【０２５２】
１．増殖および細胞周期挙動
細胞増殖を分析するために様々な方法が確立されており、様々な会社によって商業的に供給されている（例えばＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；アッセイ方法の詳細は数多くの適用プロトコールに記載されている）。細胞培養実験における細胞数は、単に計数することによってまたは細胞の代謝活性を測定する比色アッセイ（例えばｗｓｔ−１，Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）によって決定できる。代謝アッセイ法は、酵素マーカーを介して間接的に実験における細胞数を測定する。細胞増殖は、ＤＮＡ合成の速度を分析することによって、例えばブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を添加し、組み込まれたＢｒｄＵを、特異的抗体を介した比色定量で検出することによって、直接測定し得る。
【０２５３】
２．アポトーシスおよび細胞傷害性
細胞のアポトーシスおよび細胞傷害性を検出するための多くのアッセイ系が利用可能である。決め手となる特徴は、不可逆性で、いかなる場合にも細胞死を生じさせる、ゲノムＤＮＡの特異的で酵素依存性の断片化である。これらの特異的ＤＮＡフラグメントを検出するための方法は商業的に入手可能である。利用可能なさらなる方法は、組織切片においてもＤＮＡの一本鎖切断を検出できるＴＵＮＥＬアッセイである。細胞傷害性は、主として、細胞の生命力状態のマーカーとして役立つ変化した細胞透過性を介して検出される。一方で、これは、細胞培養上清において細胞内で典型的に認められるマーカーの分析を含む。他方で、無傷細胞では吸収されない染料マーカーの吸収性を分析することも可能である。染料マーカーの最もよく知られている例はトリパンブルーとヨウ化プロピジウムであり、一般的な細胞内マーカーは、上清中で酵素的に検出できる乳酸デヒドロゲナーゼである。様々な商業的供給者（例えばＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の種々のアッセイ系が利用可能である。
【０２５４】
３．移動アッセイ
細胞が移動する能力は、好ましくはボイデンチャンバー（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ）を使用した、特異的遊走アッセイにおいて分析される（Ｃｉｎａｍｏｎ Ｇ．，Ａｌｏｎ  Ｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００３  Ｆｅｂ；２７３（１−２）：５３−６２；Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２００１．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．１２：１９３７−５６）。このために、特定細孔径のフィルター上で細胞を培養する。移動できる細胞は、このフィルターを通って下にある別の培養容器中へと移動することができる。その後の顕微鏡分析は、従って、標的分子の機能の獲得または機能の喪失によって誘導される、変化した可能性がある移動挙動の測定を可能にする。
【０２５５】
ｂ．動物モデルにおける機能分析
標的遺伝子機能の分析のための細胞培養実験の可能な代替法は、動物モデルにおけるインビボ実験では複雑である。細胞ベースの方法と比較して、これらのモデルは、生物全体に関してのみ検出可能である発育不全または疾患を検出できるという利点を有する。現在では、ヒト疾患のための多くのモデルが利用可能である（Ａｂａｔｅ−Ｓｈｅｎ  ＆  Ｓｈｅｎ．２００２．Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓ１−５；Ｍａｔｓｕｓｕｅ  ｅｔ  ａｌ．２００３．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１１：７３７−４７）。例えば酵母、線虫またはゼブラフィッシュなどの様々な動物モデルが、その後集中的に特徴づけられてきた。しかし、他の種に比べて好ましいモデルは、例えばマウス（ハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ））などの哺乳動物モデルであり、それらはヒトでの生物学的プロセスを再現する最も高い可能性を提供するからである。マウスに関しては、一方で、マウスゲノムに新しい遺伝子を組み込むトランスジェニック法が近年確立された（機能の獲得；Ｊｅｇｓｔｒｕｐ  Ｉ．ｅｔ  ａｌ．２００３．Ｌａｂ  Ａｎｉｍ．２００３  Ｊａｎ．；３７（１）：１−９）。他方で、他の系統的なアプローチは、マウスゲノムにおける遺伝子のスイッチを切り、従って所望遺伝子の機能の喪失を誘導する（ノックアウトモデル、機能の喪失；Ｚａｍｂｒｏｗｉｃｚ  ＢＰ  ＆  Ｓａｎｄｓ  ＡＴ．２００３．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．２００３  Ｊａｎ；２（１）：３８−５１；Ｎｉｗａ  Ｈ．２００１．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．２００１  Ｊｕｎ；２６（３）：１３７−４８）；技術的な詳細は数多く公表されている。
【０２５６】
マウスモデルが作製された後、導入遺伝子によってまたは遺伝子の機能喪失によって誘導される変化を動物全体に関して分析することができる（Ｂａｌｌｉｎｇ  Ｒ，２００１．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．２：４６３−９２）。従って、例えば挙動試験を実施することならびに確立された血液パラメータを生化学的に検討することが可能である。組織学的分析、免疫組織化学または電子顕微鏡検査は、変化を細胞レベルで特徴づけることを可能にする。遺伝子の特異的発現パターンは、インサイチューハイブリダイゼーションによって検出することができる（Ｐｅｔｅｒｓ Ｔ．ｅｔ  ａｌ．２００３．Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ  １２：２１０９−２０）。
【０２５７】
実施例３；同定された腫瘍関連マーカーの詳細な分析
【０２５８】
ＲＮＡの単離、ＲＴ−ＰＣＲおよびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
ＲＮＡの抽出、一本鎖ｃＤＮＡの合成、ＲＴ−ＰＣＲおよびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを先に記述されているように実施した（Ｋｏｓｌｏｗｓｋｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６２，６７５０−６７５５（２００２），Ｋｏｓｌｏｗｓｋｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４，５９８８−５９９３（２００４））。リアルタイムの定量的発現分析は４０サイクルのＲＴ−ＰＣＲにおいて実施した。ＨＰＲＴ（順方向  ５'−ＴＧＡ  ＣＡＣ  ＴＧＧ  ＣＡＡ  ＡＡＣ  ＡＡＴ  ＧＣＡ−３'；逆方向  ５'−ＧＧＴ  ＣＣＴ  ＴＴＴ  ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＣＡＡ  ＧＣＴ−３'、６２℃でアニーリング）に基準化した後、△△ＣＴ計算を用いて腫瘍試料中の遺伝子特異的転写産物を正常組織に対して定量化した。
【０２５９】
二本鎖のｓｉＲＮＡ
配列番号：５４０の二本鎖のｓｉＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）は、配列番号：５４０のｍＲＮＡ配列の標的配列、５'−ＮＮＣ  ＣＡＣ  ＡＧＡ  ＡＧＧ  ＵＡＣ  ＣＡＧ  ＵＵＡ−３'（ｓｉＲＮＡ  Ｎｏ．１；順方向（５'−ＣＣＡ  ＣＡＧ  ＡＡＧ  ＧＵＡ  ＣＣＡ  ＧＵＵ  ＡＵＵ−３'）、逆方向（５'−ＵＡＡ  ＣＵＧ  ＧＵＡ  ＣＣＵ  ＵＣＵ  ＧＵＧ  ＧＵＵ−３'）および５'−ＮＮＣ  ＡＧＣ  ＡＡＧ  ＡＣＵ  ＣＣＣ  ＵＣＵ  ＡＡＡ−３'（ｓｉＲＮＡ  Ｎｏ．２；順方向（５'−ＣＡＧ  ＣＡＡ  ＧＡＣ  ＵＣＣ  ＣＵＣ  ＵＡＡ  ＡＵＵ−３'）、逆方向（５'−ＵＵＵ  ＡＧＡ  ＧＧＧ  ＡＧＵ  ＣＵＵ  ＧＣＵ  ＧＵＵ−３'））に対するものであった。
【０２６０】
細胞増殖分析
二本鎖のｓｉＲＮＡを形質転換した２４時間後に、１０％ＦＣＳを添加した培地中で１ｘ１０４細胞を４８時間培養した。Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ２マルチラベルカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）で、ＤＥＬＦＩＡ細胞増殖キット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を製造者の指示に従って使用して、新たに合成されたＤＮＡ鎖へのＢｒｄＵの組込みを測定することによって増殖を分析した。
【０２６１】
図３は、ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを形質転換した２４時間後のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによる、ＭＣＦ−７乳癌細胞における配列番号：５４０のｍＲＮＡ発現の定量化を示す。非形質転換体および非サイレンシング（ｎｓ）ｓｉＲＮＡを導入した細胞と比較して、２つの配列番号：５４０特異的ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ  Ｎｏ．１（配列番号：６３０、６３１）、ｓｉＲＮＡ  Ｎｏ．２（配列番号：６３２、６３３））は、どちらも配列番号：５４０発現の堅固なサイレンシングを誘導する。
【０２６２】
図４は、ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドの導入による配列番号：５４０発現のサイレンシングが、ＭＣＦ−７乳癌細胞の増殖低下を生じさせることを示す。ｓｉＲＮＡを形質転換した９６時間後に、新たに合成されたＤＮＡ鎖へのＢｒｄＵの組込みを測定することによって増殖を定量化した。これらの結果は、配列番号：５４０が乳癌細胞の増殖のための正の因子であることを示す。
【０２６３】
配列番号：５４１のヌクレオチド配列は、配列番号：６５から推定され、未知の機能の１７７個のアミノ酸のタンパク質（配列番号：５４２）をコードする。正常組織および癌組織における配列番号：５４１の発現を、配列特異的オリゴヌクレオチド（配列番号：５４３、５４４）を使用したリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって定量化した；図５参照。正常組織では、配列番号：５４１は胎盤において高発現され、胸腺で弱い発現だけを示す。配列番号：５４１は肺癌において過剰発現される。これらの発現結果に基づき、配列番号：５４１およびその発現産物は、標的化治療のための、特にこの特定腫瘍型のための分子マーカーおよび／または標的候補物質として適切である。
【０２６４】
配列番号：５４５のヌクレオチド配列は、配列番号：２４９から推定され、膜タンパク質の溶質担体（ＳＬＣ）群の成員（配列番号：５４６）をコードする。内在性膜タンパク質に特有であるように、ＳＬＣは、親水性細胞内または細胞外ループによって互いに結合された多くの疎水性膜貫通αヘリックスを含む。ＳＬＣに依存して、これらの輸送体はモノマーとしてまたは偏性（ｏｂｌｉｇａｔｅ）ホモオリゴマーもしくはヘテロオリゴマーとして機能性である。配列番号：５４５によってコードされるタンパク質は細胞表面タンパク質である。正常組織および癌組織における配列番号：５４５の発現を、配列特異的オリゴヌクレオチド（配列番号：５４７、５４８）を使用したリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって定量化した；図６参照。正常組織と比較して、配列番号：５４５は悪性黒色腫において過剰発現される。これらの発現結果に基づき、配列番号：５４５およびその発現産物は、標的化治療のための、特にこの特定腫瘍型のための分子マーカーおよび／または標的候補物質として適切である。
【０２６５】
配列番号：５４９のヌクレオチド配列は、配列番号：４から推定され、未知の機能の７６３個のアミノ酸のタンパク質（配列番号：５５０）をコードする。このタンパク質は、２つの潜在的膜貫通ドメインおよび１つの典型的なフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインを保持する。フィブロネクチンは、膜貫通受容体タンパク質（インテグリン）に結合する高分子量の細胞外マトリックス糖タンパク質である。インテグリンに加えて、それらはまた、コラーゲン、フィブリンおよびヘパラン硫酸などの細胞外マトリックス成分にも結合する。配列番号：５４９によってコードされるタンパク質は、これまでのところ未知の新しいフィブロネクチン様タンパク質であり得る。正常組織および癌組織における配列番号：５４９の発現を、配列特異的オリゴヌクレオチド（配列番号：５５１、５５２）を使用したリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって定量化した；図７参照。正常組織と比較して、配列番号：５４９は卵巣癌において過剰発現される。これらの発現結果に基づき、配列番号：５４９およびその発現産物は、標的化治療のための、特にこの特定腫瘍型の分子マーカーおよび／または標的候補物質として適切である。
【０２６６】
配列番号：５５３のヌクレオチド配列は、配列番号：１５６から推定され、未知の機能の４９６個のアミノ酸のタンパク質（配列番号：５５４）をコードする。このタンパク質は潜在的膜貫通タンパク質を保持する。正常組織および癌組織における配列番号：５５３の発現を、配列特異的オリゴヌクレオチド（配列番号：５５５、５５６）を使用したリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって定量化した；図８参照。正常組織では、配列番号：５５３は胎盤において高発現される。他の正常組織と比較して、配列番号：５５３は結腸癌および卵巣癌において過剰発現される。これらの発現結果に基づき、配列番号：５５３およびその発現産物は、標的化治療のための、特にこれらの特定腫瘍型のための分子マーカーおよび／または標的候補物質として適切である。
【０２６７】
配列番号：５５７のヌクレオチド配列は配列番号：２７３から推定された。配列番号：５５７は、明らかなオープンリーディングフレームを有さない部分ｃＤＮＡである。正常組織および癌組織における配列番号：５５７の発現を、配列特異的オリゴヌクレオチド（配列番号：５５８、５５９）を使用したリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって定量化した；図９参照。正常組織では、配列番号：５５７の高発現は乳房において検出可能である。正常組織と比較して、配列番号：５５７は乳癌において過剰発現される。これらの発現結果に基づき、配列番号：５５７およびその発現産物は、標的化治療のための、特にこの特定腫瘍型のための分子マーカーおよび／または標的候補物質として適切である。
【０２６８】
配列番号：５６０のヌクレオチド配列は配列番号：１３５から推定された。配列番号：５６０は明らかなオープンリーディングフレームを有さない。正常組織および癌組織における配列番号：５６０の発現を、配列特異的オリゴヌクレオチド（配列番号：５６１、５６２）を使用したリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって定量化した；図１０参照。正常組織では、配列番号：５６０の発現は十二指腸および結腸において検出可能である。正常組織と比較して、配列番号：５６０は結腸癌および卵巣癌において過剰発現される。これらの発現結果に基づき、配列番号：５６０およびその発現産物は、標的化治療のための、特にこれらの特定腫瘍型のための分子マーカーおよび／または標的候補物質として適切である。
【０２６９】
配列番号：５６３のヌクレオチド配列は配列番号：１７７から推定された。配列番号：５６３は明らかなオープンリーディングフレームを有さない。正常組織および癌組織における配列番号：５６３の発現を、配列特異的オリゴヌクレオチド（配列番号：５６４、５６５）を使用したリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって定量化した；図１１参照。配列番号：５６３は胎盤において高発現される。正常組織と比較して、配列番号：５６３は乳癌、結腸癌、卵巣癌、肺癌および黒色腫において過剰発現される。これらの発現結果に基づき、配列番号：５６３およびその発現産物は、標的化治療のための、特にこれらの特定腫瘍型のための分子マーカーおよび／または標的候補物質として適切である。
【０２７０】
配列番号：５６６のヌクレオチド配列は、配列番号：１４９から推定され、未知の機能の１５５個のアミノ酸のタンパク質（配列番号：５６７）をコードする。このタンパク質配列は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーの成員と部分的に相同であり、潜在的膜貫通ドメインを保持する。配列番号：５６６によってコードされるタンパク質は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーの新しい成員であり得る。正常組織および癌組織における配列番号：５６６の発現を、配列特異的オリゴヌクレオチド（配列番号：５６８、５６９）を使用したリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって定量化した；図１２参照。正常組織と比較して、配列番号：５６６は胃癌、乳癌、結腸癌、卵巣癌、肺癌および黒色腫において過剰発現される。これらの発現結果に基づき、配列番号：５６６およびその発現産物は、標的化治療のための、特にこれらの特定腫瘍型のための分子マーカーおよび／または標的候補物質として適切である。
【０２７１】
配列番号：５７０のヌクレオチド配列は、配列番号：５３から推定され、カーネルリポカリンスーパーファミリーの成員（配列番号：５７１）をコードする。これらの分泌糖タンパク質は、妊娠に適した子宮環境の調節および受精過程における適切な一連の事象の時期と発生において明確且つ重要な役割を有する。正常組織および癌組織における配列番号：５７０の発現を、配列特異的オリゴヌクレオチド（配列番号：５７２、５７３）を使用したリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって定量化した；図１３参照。配列番号：５７０は胎盤において高発現される。他の正常組織と比較して、配列番号：５７０は卵巣癌、肺癌および黒色腫において過剰発現される。これらの発現結果に基づき、配列番号：５７０およびその発現産物は、標的化治療のための、特にこれらの特定腫瘍型のための分子マーカーおよび／または標的候補物質として適切である。
【０２７２】
配列番号：５７４のヌクレオチド配列は明らかなオープンリーディングフレームを有さない。正常組織および癌組織における配列番号：５７４の発現を、配列特異的オリゴヌクレオチド（配列番号：５７５、５７６）を使用したリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって定量化した；図１４参照。配列番号：５７４は胎盤において高発現される。他の正常組織と比較して、配列番号：５７４は肺癌および黒色腫において過剰発現される。これらの発現結果に基づき、配列番号：５７４およびその発現産物は、標的化治療のための、特にこれらの特定腫瘍型のための分子マーカーおよび／または標的候補物質として適切である。
【０２７３】
配列番号：５７７のヌクレオチド配列は配列番号：２０から推定された。配列番号：５７７は、明らかなオープンリーディングフレームを有さない部分ｃＤＮＡである。正常組織および癌組織における配列番号：５７７の発現を、配列特異的オリゴヌクレオチド（配列番号：５７８、５７９）を使用したリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって定量化した；図１５参照。配列番号５７７：は胎盤において高発現される。他の正常組織と比較して、配列番号：５７７は胃癌、乳癌および肺癌において過剰発現される。これらの発現結果に基づき、配列番号：５７７およびその発現産物は、標的化治療のための、特にこれらの特定腫瘍型のための分子マーカーおよび／または標的候補物質として適切である。
【０２７４】
配列番号：５８０のヌクレオチド配列は配列番号：３２から推定された。配列番号：５８０は、明らかなオープンリーディングフレームを有さない部分ｃＤＮＡである。正常組織および癌組織における配列番号：５８０の発現を、配列特異的オリゴヌクレオチド（配列番号：５８１、５８２）を使用したリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって定量化した；図１６参照。配列番号：５８０は胎盤において高発現される。他の正常組織と比較して、配列番号：５８０は卵巣癌および肺癌において過剰発現される。これらの発現結果に基づき、配列番号：５８０およびその発現産物は、標的化治療のための、特にこれらの特定腫瘍型のための分子マーカーおよび／または標的候補物質として適切である。
【０２７５】
配列番号：５８３のヌクレオチド配列は、配列番号：２５７から推定され、ホメオボックスクラスの転写因子の成員（配列番号：５８４）をコードする。これらのタンパク質の発現は、胚発生の間に空間的および時間的に調節される。正常組織および癌組織における配列番号：５８３の発現を、配列特異的オリゴヌクレオチド（配列番号：５８５、５８６）を使用したリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって定量化した；図１７参照。配列番号：５８３は胎盤および前立腺において高発現される。他の正常組織と比較して、配列番号：５８３は結腸癌、卵巣癌および肺癌において過剰発現される。これらの発現結果に基づき、配列番号：５８３およびその発現産物は、標的化治療のための、特にこれらの特定腫瘍型のための分子マーカーおよび／または標的候補物質として適切である。
【０２７６】
配列番号：５８７のヌクレオチド配列は、配列番号：１４８から推定され、ＩＧＦ−ＩＩ  ｍＲＮＡ結合タンパク質（ＩＭＰ）ファミリーの成員（配列番号：５８８）をコードする。インスリン様増殖因子２（ＩＧＦ２）ｍＲＮＡの５'ＵＴＲに結合し、ＩＧＦ２の翻訳を調節することによって機能する。正常組織および癌組織における配列番号：５８７の発現を、配列特異的オリゴヌクレオチド（配列番号：５８９、５９０）を使用したリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって定量化した；図１８参照。正常組織と比較して、配列番号：５８７は肺癌において過剰発現される。これらの発現結果に基づき、配列番号：５８７およびその発現産物は、標的化治療のための、特にこの特定腫瘍型のための分子マーカーおよび／または標的候補物質として適切である。
【０２７７】
配列番号：５９１のヌクレオチド配列は、配列番号：１９４から推定され、未知の機能の３７２個のアミノ酸のタンパク質（配列番号：５９２）をコードする。正常組織および癌組織における配列番号：５９１の発現を、配列特異的オリゴヌクレオチド（配列番号：５９３、５９４）を使用したリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって定量化した；図１９参照。配列番号：５９１は精巣において高発現される。他の正常組織と比較して、配列番号：５９１は乳癌、結腸癌、卵巣癌、肺癌および黒色腫において過剰発現される。これらの発現結果に基づき、配列番号：５９１およびその発現産物は、標的化治療のための、特にこれらの特定腫瘍型のための分子マーカーおよび／または標的候補物質として適切である。
【０２７８】
配列番号：５９５のヌクレオチド配列は、配列番号：１９１から推定され、未知の機能の３５７個のアミノ酸のタンパク質（配列番号：５９６）をコードする。正常組織および癌組織における配列番号：５９５の発現を、配列特異的オリゴヌクレオチド（配列番号：５９７、５９８）を使用したリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって定量化した；図２０参照。配列番号：５９５は精巣において高発現される。他の正常組織と比較して、配列番号：５９５は胃癌、結腸癌、卵巣癌、肺癌および黒色腫において過剰発現される。これらの発現結果に基づき、配列番号：５９５およびその発現産物は、標的化治療のための、特にこれらの特定腫瘍型のための分子マーカーおよび／または標的候補物質として適切である。
【０２７９】
配列番号：５９９のヌクレオチド配列は、配列番号：１８から推定され、明らかなオープンリーディングフレームを有さない。正常組織および癌組織における配列番号：５９９の発現を、配列特異的オリゴヌクレオチド（配列番号：６００、６０１）を使用したリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって定量化した；図２１参照。配列番号：５９９は胎盤において高発現される。他の正常組織と比較して、配列番号：５９９は胃癌、乳癌、肺癌および黒色腫において過剰発現される。これらの発現結果に基づき、配列番号：５９９およびその発現産物は、標的化治療のための、特にこれらの特定腫瘍型のための分子マーカーおよび／または標的候補物質として適切である。
【０２８０】
配列番号：６０２のヌクレオチド配列は、配列番号：１３３から推定され、細胞外マトリックスタンパク質のフォンビルブラント因子ドメインスーパーファミリーの成員（配列番号：６０３）をコードする。正常組織および癌組織における配列番号：６０２の発現を、配列特異的オリゴヌクレオチド（配列番号：６０４、６０５）を使用したリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって定量化した；図２２参照。正常組織と比較して、配列番号：６０２は卵巣癌および肺癌において過剰発現される。これらの発現結果に基づき、配列番号：６０２およびその発現産物は、標的化治療のための、特にこれらの特定腫瘍型のための分子マーカーおよび／または標的候補物質として適切である。
【０２８１】
配列番号：６０６のヌクレオチド配列は、配列番号：１２８から推定され、ＣＤＣ４２エフェクタータンパク質のＢｏｒｇファミリーの成員（配列番号：６０７）をコードする。Ｂｏｒｇファミリーのタンパク質はＣＲＩＢ（Ｃｄｃ４２／Ｒａｃ相互作用性結合）ドメインを含む。それらはＣＤＣ４２に結合し、その機能を負に調節する。低分子量Ｒｈｏ  ＧＴＰアーゼであるＣＤＣ４２は、下流のエフェクタータンパク質との相互作用を介してＦアクチン含有構造体の形成を調節する。正常組織および癌組織における配列番号：６０６の発現を、配列特異的オリゴヌクレオチド（配列番号：６０８、６０９）を使用したリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって定量化した；図２３参照。正常組織と比較して、配列番号：６０６は胃癌、結腸癌および肺癌において過剰発現される。これらの発現結果に基づき、配列番号：６０６およびその発現産物は、標的化治療のための、特にこれらの特定腫瘍型のための分子マーカーおよび／または標的候補物質として適切である。
【０２８２】
配列番号：６１０のヌクレオチド配列は、配列番号：１１８から推定され、明らかなオープンリーディングフレームを有さない。正常組織および癌組織における配列番号：６１０の発現を、配列特異的オリゴヌクレオチド（配列番号：６１１、６１２）を使用したリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって定量化した；図２４参照。正常組織と比較して、配列番号：６１０は胃癌、乳癌および肺癌において過剰発現される。これらの発現結果に基づき、配列番号：６１０およびその発現産物は、標的化治療のための、特にこれらの特定腫瘍型のための分子マーカーおよび／または標的候補物質として適切である。
【０２８３】
配列番号：６１３のヌクレオチド配列は、配列番号：１１６から推定され、未知の機能の７６個のアミノ酸のタンパク質（配列番号：６１４）をコードする。正常組織および癌組織における配列番号：６１３の発現を、配列特異的オリゴヌクレオチド（配列番号：６１５、６１６）を使用したリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって定量化した；図２５参照。配列番号：６１３は胎盤において高発現される。他の正常組織と比較して、配列番号：６１３は乳癌、肺癌および黒色腫において過剰発現される。これらの発現結果に基づき、配列番号：６１３およびその発現産物は、標的化治療のための、特にこれらの特定腫瘍型のための分子マーカーおよび／または標的候補物質として適切である。
【０２８４】
配列番号：６１７のヌクレオチド配列は配列番号：２６７から推定された。配列番号：６１７は、明らかなオープンリーディングフレームを有さない部分ｃＤＮＡである。正常組織および癌組織における配列番号：６１７の発現を、配列特異的オリゴヌクレオチド（配列番号：６１８、６１９）を使用したリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって定量化した；図２６参照。配列番号：６１７は胎盤および子宮内膜において高発現される。他の正常組織と比較して、配列番号：６１７は肺癌および黒色腫において過剰発現される。これらの発現結果に基づき、配列番号：６１７およびその発現産物は、標的化治療のための、特にこれらの特定腫瘍型のための分子マーカーおよび／または標的候補物質として適切である。
【０２８５】
配列番号：６２０のヌクレオチド配列は、配列番号：１８２から推定され、多数の推定上の膜貫通ドメインおよびパッチドファミリードメインを保持する８２９個のアミノ酸のタンパク質（配列番号：６２１）をコードする。膜貫通タンパク質パッチドは、モルフォゲンであるソニックヘッジホッグに対する受容体である。このタンパク質は、スムーズンドタンパク質と結合してヘッジホッグシグナルを伝達する。配列番号：６２０はパッチドファミリーの新規成員であり得る。正常組織および癌組織における配列番号：６２０の発現を、配列特異的オリゴヌクレオチド（配列番号：６２２、６２３）を使用したリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって定量化した；図２７参照。配列番号：６２０は肺において高発現される。他の正常組織と比較して、配列番号：６２０は卵巣癌および黒色腫において過剰発現される。これらの発現結果に基づき、配列番号：６２０およびその発現産物は、標的化治療のための、特にこれらの特定腫瘍型のための分子マーカーおよび／または標的候補物質として適切である。
【０２８６】
配列番号：６２４のヌクレオチド配列は、配列番号：１８４から推定され、２つの細孔形成Ｐドメインを含むカリウムチャネルタンパク質のスーパーファミリーの成員である、ＴＷＩＫ関連酸感受性Ｋ＋チャネルに類似する３２３個のアミノ酸のタンパク質（配列番号：６２５）をコードする。正常組織および癌組織における配列番号：６２４の発現を、配列特異的オリゴヌクレオチド（配列番号：６２６、６２７）を使用したリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって定量化した；図２８参照。配列番号：６２４は肺において高発現される。他の正常組織と比較して、配列番号：６２４は胃癌および肺癌において過剰発現される。これらの発現結果に基づき、配列番号：６２４およびその発現産物は、標的化治療のための、特にこれらの特定腫瘍型のための分子マーカーおよび／または標的候補物質として適切である。
【０２８７】
配列番号：６３４のヌクレオチド配列は、配列番号：３４６から推定され、ホメオボックスクラスの転写因子の成員（配列番号：６３５）をコードする。これらのタンパク質の発現は、胚発生の間に空間的および時間的に調節される。正常組織および癌組織における配列番号：６３４の発現を、配列特異的オリゴヌクレオチド（配列番号：６３６、６３７）を使用したリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって定量化した；図２９参照。配列番号：６３４は胎盤および子宮内膜において高発現される。他の正常組織と比較して、配列番号：６３４は卵巣癌および肺癌において過剰発現される。これらの発現結果に基づき、配列番号：６３４およびその発現産物は、標的化治療のための、特にこれらの特定腫瘍型のための分子マーカーおよび／または標的候補物質として適切である。
【０２８８】
配列番号：６３８のヌクレオチド配列は、配列番号：２５２から推定され、約４０アミノ酸のモチーフ、Ｆボックスを特徴とするＦボックスタンパク質ファミリーの成員（配列番号：６３９）をコードする。Ｆボックスタンパク質は、リン酸化依存性ユビキチン化において機能する、ＳＣＦ（ＳＫＰ１−クリン−Ｆボックス）と呼ばれるユビキチンタンパク質リガーゼ複合体の４つのサブユニットの１つを構成する。Ｆボックスタンパク質は３つのクラスに分けられる：ＷＤ−４０ドメインを含むＦｂｗｓ、ロイシンに富む反復配列を含むＦｂｌｓ、および異なるタンパク質間相互作用モジュールを含むかまたは認識可能なモチーフを含まないＦｂｘｓ。この遺伝子によってコードされるタンパク質はＦｂｌｓクラスに属する；Ｆボックスに加えて、このタンパク質は１０のロイシンに富む縦列反復配列を含む。このタンパク質はサイクリンＡ−ＣＤＫ２  Ｓ期キナーゼの必須要素である。主としてＳ期にリン酸化されたサイクリン依存性キナーゼ阻害因子１Ｂ（ＣＤＫＮ１Ｂ、ｐ２７またはＫＩＰ１とも称される）を特異的に認識し、Ｓ期キナーゼ結合タンパク質１（ＳＫＰ１またはｐ１９）と相互作用する。正常組織および癌組織における配列番号：６３８の発現を、配列特異的オリゴヌクレオチド（配列番号：６４０、６４１）を使用したリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって定量化した；図３０参照。配列番号：６３８は胎盤において高発現される。正常組織と比較して、配列番号：６３８は結腸癌、卵巣癌、肺癌および悪性黒色腫において過剰発現される。これらの発現結果に基づき、配列番号：６３８およびその発現産物は、標的化治療のための、特にこれらの特定腫瘍型のための分子マーカーおよび／または標的候補物質として適切である。
【０２８９】
配列番号：６４２のヌクレオチド配列は、配列番号：２４８から推定され、未知の機能の１．０２４個のアミノ酸のタンパク質（配列番号：６４３）をコードする。正常組織および癌組織における配列番号：６４２の発現を、配列特異的オリゴヌクレオチド（配列番号：６４４、６４５）を使用したリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって定量化した；図３１参照。配列番号：６４２は胎盤において高発現される。正常組織と比較して、配列番号：６４２は乳癌、卵巣癌、肺癌および悪性黒色腫において過剰発現される。これらの発現結果に基づき、配列番号：６４２およびその発現産物は、標的化治療のための、特にこれらの特定腫瘍型のための分子マーカーおよび／または標的候補物質として適切である。
【０２９０】
配列番号：６４６のヌクレオチド配列は配列番号：２６９から推定された。配列番号：６４６は、明らかなオープンリーディングフレームを有さない部分ｃＤＮＡである。正常組織および癌組織における配列番号：６４６の発現を、配列特異的オリゴヌクレオチド（配列番号：６４７、６４８）を使用したリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって定量化した；図３２参照。配列番号：６４６は胎盤において高発現される。正常組織と比較して、配列番号：６４６は胃癌、卵巣癌および肺癌において過剰発現される。これらの発現結果に基づき、配列番号：６４６およびその発現産物は、標的化治療のための、特にこれらの特定腫瘍型のための分子マーカーおよび／または標的候補物質として適切である。
【０２９１】
配列番号：６４９のヌクレオチド配列は、配列番号：２７から推定され、未知の機能の２５８個のアミノ酸のタンパク質（配列番号：６５０）をコードする。正常組織および癌組織における配列番号：６４９の発現を、配列特異的オリゴヌクレオチド（配列番号：６５１、６５２）を使用したリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって定量化した；図３３参照。配列番号：６４９は胎盤において高発現される。正常組織と比較して、配列番号：６４９は卵巣癌、肺癌および悪性黒色腫において過剰発現される。これらの発現結果に基づき、配列番号：６４９およびその発現産物は、標的化治療のための、特にこれらの特定腫瘍型のための分子マーカーおよび／または標的候補物質として適切である。
【０２９２】
配列番号：６５３のヌクレオチド配列は配列番号：１３９から推定された。配列番号：６５３は、明らかなオープンリーディングフレームを有さない部分ｃＤＮＡである。正常組織および癌組織における配列番号：６５３の発現を、配列特異的オリゴヌクレオチド（配列番号：６５４、６５５）を使用したリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって定量化した；図３４参照。配列番号：６５３は胎盤および皮膚において発現される。他の正常組織と比較して、配列番号：６５３は結腸癌および肺癌において過剰発現される。これらの発現結果に基づき、配列番号：６５３およびその発現産物は、標的化治療のための、特にこれらの特定腫瘍型のための分子マーカーおよび／または標的候補物質として適切である。
【０２９３】
配列番号：６５６のヌクレオチド配列は、配列番号：３０５から推定され、未知の機能の４１９個のアミノ酸のタンパク質（配列番号：６５７）をコードする。正常組織および癌組織における配列番号：６５６の発現を、配列特異的オリゴヌクレオチド（配列番号：６５８、６５９）を使用したリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって定量化した；図３５参照。配列番号：６５６は胎盤および皮膚において発現される。他の正常組織と比較して、配列番号：６５６は肺癌および悪性黒色腫において過剰発現される。これらの発現結果に基づき、配列番号：６５６およびその発現産物は、標的化治療のための、特にこれらの特定腫瘍型のための分子マーカーおよび／または標的候補物質として適切である。
【０２９４】
配列番号：６６０のヌクレオチド配列は、配列番号：１２５から推定され、トロンボスポンジンモチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（配列番号：６６１）をコードする。正常組織および癌組織における配列番号：６６０の発現を、配列特異的オリゴヌクレオチド（配列番号：６６２、６６３）を使用したリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって定量化した；図３６参照。配列番号：６６０は胎盤において高発現される。正常組織と比較して、配列番号：６６０は胃癌、卵巣癌および悪性黒色腫において過剰発現される。これらの発現結果に基づき、配列番号：６６０およびその発現産物は、標的化治療のための、特にこれらの特定腫瘍型のための分子マーカーおよび／または標的候補物質として適切である。
【０２９５】
配列番号：６６４のヌクレオチド配列は、配列番号：６１から推定され、未知の機能の３３４個のアミノ酸のタンパク質（配列番号：６６５）をコードする。正常組織および癌組織における配列番号：６６４の発現を、配列特異的オリゴヌクレオチド（配列番号：６６６、６６７）を使用したリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって定量化した；図３７参照。配列番号：６６４は胎盤および皮膚において発現される。他の正常組織と比較して、配列番号：６６４は胃癌、結腸癌、肺癌および悪性黒色腫において過剰発現される。これらの発現結果に基づき、配列番号：６６４およびその発現産物は、標的化治療のための、特にこれらの特定腫瘍型のための分子マーカーおよび／または標的候補物質として適切である。
【０２９６】
配列番号：６６８のヌクレオチド配列は配列番号：１３から推定された。配列番号：６６８は、明らかなオープンリーディングフレームを有さない部分ｃＤＮＡである。正常組織および癌組織における配列番号：６６８の発現を、配列特異的オリゴヌクレオチド（配列番号：６６９、６７０）を使用したリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって定量化した；図３８参照。配列番号：６６８は胎盤において高発現される。他の正常組織と比較して、配列番号：６６８は肺癌において過剰発現される。これらの発現結果に基づき、配列番号：６６８およびその発現産物は、標的化治療のための、特にこれらの特定腫瘍型のための分子マーカーおよび／または標的候補物質として適切である。
【０２９７】
配列番号：６７１のヌクレオチド配列は、配列番号：４２から推定され、未知の機能の４２６個のアミノ酸のタンパク質（配列番号：６７２）をコードする。正常組織および癌組織における配列番号：６７１の発現を、配列特異的オリゴヌクレオチド（配列番号：６７３、６７４）を使用したリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって定量化した；図３９参照。配列番号：６７１は胎盤および皮膚において発現される。他の正常組織と比較して、配列番号：６７１は肺癌および悪性黒色腫において過剰発現される。これらの発現結果に基づき、配列番号：６７１およびその発現産物は、標的化治療のための、特にこれらの特定腫瘍型のための分子マーカーおよび／または標的候補物質として適切である。
【０２９８】
配列番号：６７５のヌクレオチド配列は、配列番号：３１４から推定され、２．９１２個のアミノ酸のタンパク質（配列番号：６７６）をコードする。正常組織および癌組織における配列番号：６７５の発現を、配列特異的オリゴヌクレオチド（配列番号：６７７、６７８）を使用したリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって定量化した；図４０参照。配列番号：６７５は胎盤において高発現される。他の正常組織と比較して、配列番号：６７５は肺癌および悪性黒色腫において過剰発現される。これらの発現結果に基づき、配列番号：６７５およびその発現産物は、標的化治療のための、特にこれらの特定腫瘍型のための分子マーカーおよび／または標的候補物質として適切である。
【０２９９】
配列番号：６７９のヌクレオチド配列は配列番号：３１から推定された。配列番号：６７９は、明らかなオープンリーディングフレームを有さない部分ｃＤＮＡである。正常組織および癌組織における配列番号：６７９の発現を、配列特異的オリゴヌクレオチド（配列番号：６８０、６８１）を使用したリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって定量化した；図４１参照。配列番号：６７９は胎盤において高発現される。他の正常組織と比較して、配列番号：６７９は肺癌において過剰発現される。これらの発現結果に基づき、配列番号：６７９およびその発現産物は、標的化治療のための、特にこの特定腫瘍型のための分子マーカーおよび／または標的候補物質として適切である。
【０３００】
配列番号：６８２のヌクレオチド配列は、配列番号：２１から推定され、２７８個のアミノ酸のタンパク質（配列番号：６８３）をコードする。正常組織および癌組織における配列番号：６８２の発現を、配列特異的オリゴヌクレオチド（配列番号：６８４、６８５）を使用したリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって定量化した；図４２参照。配列番号：６８２は胎盤、子宮内膜において高発現され、リンパ節においてより低いレベルで発現される。他の正常組織と比較して、配列番号：６８２は胃癌、乳癌および悪性黒色腫において過剰発現される。これらの発現結果に基づき、配列番号：６８２およびその発現産物は、標的化治療のための、特にこれらの特定腫瘍型のための分子マーカーおよび／または標的候補物質として適切である。
【０３０１】
配列番号：６８６のヌクレオチド配列は配列番号：５８から推定された。配列番号：６８６は、明らかなオープンリーディングフレームを有さない部分ｃＤＮＡである。正常組織および癌組織における配列番号：６８６の発現を、配列特異的オリゴヌクレオチド（配列番号：６８７、６８８）を使用したリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって定量化した；図４３参照。配列番号：６８６は胎盤において高発現され、乳房においてより低いレベルで発現される。他の正常組織と比較して、配列番号：６８６は乳癌、卵巣癌および肺癌において過剰発現される。これらの発現結果に基づき、配列番号：６８６およびその発現産物は、標的化治療のための、特にこれらの特定腫瘍型のための分子マーカーおよび／または標的候補物質として適切である。
【図２】
2012525121.tif 000004
【図３】
2012525121.tif 000005
【図４】
2012525121.tif 000006
【図５】
2012525121.tif 000007
【図６】
2012525121.tif 000008
【図７】
2012525121.tif 000009
【図８】
2012525121.tif 000010
【図９】
2012525121.tif 000011
【図１０】
2012525121.tif 000012
【図１１】
2012525121.tif 000013
【図１２】
2012525121.tif 000014
【図１３】
2012525121.tif 000015
【図１４】
2012525121.tif 000016
【図１５】
2012525121.tif 000017
【図１６】
2012525121.tif 000018
【図１７】
2012525121.tif 000019
【図１８】
2012525121.tif 000020
【図１９】
2012525121.tif 000021
【図２０】
2012525121.tif 000022
【図２１】
2012525121.tif 000023
【図２２】
2012525121.tif 000024
【図２３】
2012525121.tif 000025
【図２４】
2012525121.tif 000026
【図２５】
2012525121.tif 000027
【図２６】
2012525121.tif 000028
【図２７】
2012525121.tif 000029
【図２８】
2012525121.tif 000030
【図２９】
2012525121.tif 000031
【図３０】
2012525121.tif 000032
【図３１】
2012525121.tif 000033
【図３２】
2012525121.tif 000034
【図３３】
2012525121.tif 000035
【図３４】
2012525121.tif 000036
【図３５】
2012525121.tif 000037
【図３６】
2012525121.tif 000038
【図３７】
2012525121.tif 000039
【図３８】
2012525121.tif 000040
【図３９】
2012525121.tif 000041
【図４０】
2012525121.tif 000042
【図４１】
2012525121.tif 000043
【図４２】
2012525121.tif 000044
【図４３】
2012525121.tif 000045
【図１】
2012525121.tif 000046
【配列表】
2012525121000001.app
【国際調査報告】
2012525121.tif 000047
2012525121.tif 000048
2012525121.tif 000049
2012525121.tif 000050
2012525121.tif 000051
2012525121.tif 000052