(57)【要約】  本発明は、喫煙未経験者における肺癌の診断、予後および治療のための新規方法および組成物を提供する。本発明はまた、抗肺癌剤を同定する方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのアンチセンスｍｉＲおよび少なくとも１つのさらなる組成物を含む、物質の組成物であって、
アンチセンスｍｉＲが、野生型喫煙未経験者癌細胞に比較して、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）喫煙未経験者突然変異体癌細胞において示差的に発現されるｍｉＲに対してアンチセンスであり、そして少なくとも１つのさらなる組成物が癌を治療するのに有用である
前記組成物。
【請求項２】
少なくとも１つのさらなる組成物が：化学療法薬剤；ＡＧ１４７８；ゲフィチニブ（イレッサ（登録商標））；エルロチニブ（タルセバ（登録商標））；セツキシマブ；パニツマブ（ｐａｎｉｔｕｍａｂ）；ザルツママブ（ｚａｌｕｔｕｍａｍａｂ）；ニモツザマブ（ｎｉｍｏｔｕｚａｍａｂ）；マツズマブ；およびラパチニブを含む群より選択される、請求項１の組成物。
【請求項３】
アンチセンスｍｉＲが、群：ｍｉＲ−２１；ｍｉＲ−２１０；ｍｉＲ−１２９より選択されるｍｉＲに対してアンチセンスであるｍｉＲより選択される、請求項１の組成物。
【請求項４】
少なくとも１つのアンチセンスｍｉＲがｍｉＲ−２１に対してアンチセンスである、請求項１の組成物。
【請求項５】
癌を治療するのに有用な少なくとも１つのさらなる組成物が上皮増殖因子受容体チロシンキナーゼ阻害剤である、請求項４の組成物。
【請求項６】
上皮増殖因子受容体チロシンキナーゼ阻害剤がＡＧ１４７８である、請求項５の組成物。
【請求項７】
少なくとも１つのｍｉＲおよび少なくとも１つのさらなる組成物を含む物質の組成物であって、ｍｉＲが、野生型喫煙未経験者癌細胞に比較して、上皮増殖因子受容体（ＥＧＲＦ）突然変異体喫煙未経験者癌細胞において上方制御され、そして少なくとも１つのさらなる組成物が癌を治療するのに有用である、前記組成物。
【請求項８】
ｍｉＲが、群：ｍｉＲ−４８６；ｍｉＲ−１２６：ｍｉＲ−１３８；ｍｉＲ−５２１；ｍｉＲ−４５１；ｍｉＲ−１４１；ｍｉＲ−３０ｄ；およびｍｉＲ−３０ａより選択される、請求項７の組成物。
【請求項９】
少なくとも１つのアンチセンスｍｉＲおよび少なくとも１つの組成物を含む物質の組成物であって、アンチセンスｍｉＲが、野生型喫煙未経験者癌細胞に比較して、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）突然変異体喫煙未経験者癌細胞において上方制御されるｍｉＲに対してアンチセンスであり、そして少なくとも１つのさらなる組成物が癌を治療するのに有用である、前記組成物。
【請求項１０】
アンチセンスｍｉＲが：ｍｉＲ−２１；ｍｉＲ−２１０；およびｍｉＲ−１２９を含む群より選択されるｍｉＲに対してアンチセンスであるｍｉＲより選択される、請求項９の組成物。
【請求項１１】
試験試料において、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）突然変異体癌細胞を同定する方法であって、試験試料におけるｍｉＲレベルを、対照のｍｉＲレベルに比較する工程を含み、ｍｉＲレベルが示差的に発現されていると、試験試料が上皮増殖因子受容体突然変異体癌細胞を含有すると同定される、前記方法。
【請求項１２】
ｍｉＲが：ｍｉＲ−２１；ｍｉＲ−２１０；ｍｉＲ−１２９；ｍｉＲ−４８６；ｍｉＲ−１２６：ｍｉＲ−１３８；ｍｉＲ−５２１；ｍｉＲ−４５１；ｍｉＲ−１４１；ｍｉＲ−３０ｄ；およびｍｉＲ−３０ａを含む群より選択される、請求項１１の方法。
【請求項１３】
喫煙未経験被験体が肺癌を有するか、または発症するリスクがあるかどうかを診断する方法であって、試験試料におけるｍｉＲレベルを、対照のｍｉＲレベルに比較する工程を含み、ｍｉＲレベルが示差的に発現されていると、該被験体が肺癌を有するか、または発症するリスクがあると診断される、前記方法。
【請求項１４】
試験試料および対照における上皮増殖因子受容体突然変異体状態を比較する工程をさらに含む、請求項１３の方法。
【請求項１５】
上皮増殖因子受容体チロシンキナーゼ阻害剤を用いて、上皮増殖因子受容体突然変異体状態を決定する、請求項１４の方法。
【請求項１６】
ｍｉＲが：ｍｉＲ−２１；ｍｉＲ−２１０；ｍｉＲ−１２９；ｍｉＲ−４８６；ｍｉＲ−１２６：ｍｉＲ−１３８；ｍｉＲ−５２１；ｍｉＲ−４５１；ｍｉＲ−１４１；ｍｉＲ−３０ｄ；およびｍｉＲ−３０ａを含む群より選択される、請求項１３の方法。
【請求項１７】
喫煙未経験癌患者における予後を提供する方法であって：試験試料におけるｍｉＲレベルを、対照のｍｉＲレベルに比較する工程を含み、ｍｉＲレベルが示差的に発現されていると、劣った予後が示される、前記方法。
【請求項１８】
ｍｉＲが：ｍｉＲ−２１；ｍｉＲ−２１０；ｍｉＲ−１２９；ｍｉＲ−４８６；ｍｉＲ−１２６：ｍｉＲ−１３８；ｍｉＲ−５２１；ｍｉＲ−４５１；ｍｉＲ−１４１；ｍｉＲ−３０ｄ；およびｍｉＲ−３０ａを含む群より選択される、請求項１７の方法。
【請求項１９】
患者において上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）突然変異体癌を診断する方法であって、試験試料におけるｍｉＲレベルを、対照のｍｉＲレベルに比較する工程を含み、ｍｉＲレベルが示差的に発現されていると、該被験体が上皮増殖因子受容体突然変異体癌を有すると診断される、前記方法。
【請求項２０】
ｍｉＲが：ｍｉＲ−２１；ｍｉＲ−２１０；ｍｉＲ−１２９；ｍｉＲ−４８６；ｍｉＲ−１２６：ｍｉＲ−１３８；ｍｉＲ−５２１；ｍｉＲ−４５１；ｍｉＲ−１４１；ｍｉＲ−３０ｄ；およびｍｉＲ−３０ａを含む群より選択される、請求項１９の方法。
【請求項２１】
上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）突然変異体癌患者における予後を提供する方法であって：試験試料におけるｍｉＲレベルを、対照のｍｉＲレベルに比較する工程を含み、ｍｉＲレベルが示差的に発現されていると、劣った予後が示される、前記方法。
【請求項２２】
ｍｉＲが：ｍｉＲ−２１；ｍｉＲ−２１０；ｍｉＲ−１２９；ｍｉＲ−４８６；ｍｉＲ−１２６：ｍｉＲ−１３８；ｍｉＲ−５２１；ｍｉＲ−４５１；ｍｉＲ−１４１；ｍｉＲ−３０ｄ；およびｍｉＲ−３０ａを含む群より選択される、請求項２１の方法。
【請求項２３】
癌治療が必要な喫煙未経験患者において癌を治療する方法であって、薬学的に有効な量の請求項１の組成物を投与する工程を含む、前記方法。
【請求項２４】
治療する癌が：神経芽細胞腫；肺癌；胆管癌；非小細胞肺癌；肝細胞癌；リンパ腫；鼻咽頭癌；卵巣癌；頭頸部扁平上皮癌；子宮頸部扁平上皮癌；胃癌；結腸癌；子宮頸癌；胆嚢癌；前立腺癌；乳癌；精巣胚細胞腫瘍；大細胞型リンパ腫；濾胞性リンパ腫；結腸直腸癌；悪性胸膜中皮腫；神経膠腫；甲状腺癌；基底細胞癌；Ｔ細胞リンパ腫；ｔ（８；１７）−前リンパ球性白血病；骨髄異形成症候群；膵臓癌；ｔ（５；１４）（ｑ３５．１；ｑ３２．２）白血病；悪性線維性組織球腫；胃腸間質腫瘍；および肝芽腫を含む群より選択される、請求項２３の方法。
【請求項２５】
癌治療が必要な喫煙未経験患者において癌を治療する方法であって、薬学的に有効な量の請求項４の組成物を投与する工程を含む、前記方法。
【請求項２６】
治療する癌が肺癌である、請求項２５の方法。
【請求項２７】
癌治療が必要な患者において癌を治療する方法であって、薬学的に有効な量の請求項５の組成物を投与する工程を含む、前記方法。
【請求項２８】
治療する癌が腺癌である、請求項２７の方法。
【請求項２９】
癌治療が必要な喫煙未経験患者において癌を治療する方法であって、薬学的に有効な量のアンチセンスｍｉＲを投与する工程を含み、アンチセンスｍｉＲが：ｍｉＲ−２１；ｍｉＲ−２１０；ｍｉＲ−１２９を含む群より選択されるｍｉＲに対してアンチセンスである、前記方法。
【請求項３０】
癌治療が必要な喫煙未経験患者において癌を治療する方法であって、薬学的に有効な量のアンチセンスｍｉＲを投与する工程を含み、アンチセンスｍｉＲがｍｉＲ−２１に対してアンチセンスである、前記方法。
【請求項３１】
治療する癌が肺癌である、請求項３０の方法。
【請求項３２】
治療する癌が腺癌である、請求項３０の方法。
【請求項３３】
アジュバントを投与する工程をさらに含む、請求項３０の方法。
【請求項３４】
化学療法薬剤；ＡＧ１４７８；ゲフィチニブ（イレッサ（登録商標））；エルロチニブ（タルセバ（登録商標））；セツキシマブ；パニツマブ；ザルツママブ；ニモツザマブ；マツズマブ；およびラパチニブを含む群より選択される少なくとも１つの化合物を含む群より選択される化合物を投与する工程をさらに含む、請求項３０の方法。
【請求項３５】
上皮増殖因子受容体チロシンキナーゼ阻害剤を投与する工程をさらに含む、請求項３０の方法。
【請求項３６】
ＡＧ１４７８または薬学的に許容されうるその配合物を投与する工程をさらに含む、請求項３０の方法。
【請求項３７】
上皮増殖因子受容体突然変異体癌を治療する必要がある患者において、こうした癌を治療する方法であって、薬学的に有効な量の請求項１の組成物を投与する工程を含む、前記方法。
【請求項３８】
上皮増殖因子受容体突然変異体癌を治療する必要がある患者において、こうした癌を治療する方法であって、薬学的に有効な量の請求項４の組成物を投与する工程を含む、前記方法。
【請求項３９】
上皮増殖因子受容体突然変異体癌を治療する必要がある患者において、こうした癌を治療する方法であって、薬学的に有効な量のｍｉＲ発現阻害剤を投与する工程を含み、ｍｉＲが：ｍｉＲ−２１；ｍｉＲ−２１０；およびｍｉＲ−１２９を含む群より選択される、前記方法。
【請求項４０】
上皮増殖因子受容体突然変異体癌を治療する必要がある患者において、こうした癌を治療する方法であって、薬学的に有効な量のｍｉＲ−２１発現阻害剤を投与する工程を含む、前記方法。
【請求項４１】
化学療法薬剤；ＡＧ１４７８；ゲフィチニブ（イレッサ（登録商標））；エルロチニブ（タルセバ（登録商標））；セツキシマブ；パニツマブ；ザルツママブ；ニモツザマブ；マツズマブ；およびラパチニブを含む群より選択される化合物を投与する工程をさらに含む、請求項４０の方法。
【請求項４２】
上皮増殖因子受容体チロシンキナーゼ阻害剤を投与する工程をさらに含む、請求項４０の方法。
【請求項４３】
ＡＧ１４７８または薬学的に許容されうるその配合物を投与する工程をさらに含む、請求項４０の方法。
【請求項４４】
上皮増殖因子受容体突然変異体癌を治療する必要がある患者において、こうした癌を治療する方法であって、薬学的に有効な量のｍｉＲ発現促進組成物を投与する工程を含み、ｍｉＲが：ｍｉＲ−４８６；ｍｉＲ−１２６：ｍｉＲ−１３８；ｍｉＲ−５２１；ｍｉＲ−４５１；ｍｉＲ−１４１；ｍｉＲ−３０ｄ；およびｍｉＲ−３０ａを含む群より選択される、前記方法。
【請求項４５】
上皮増殖因子受容体突然変異体癌細胞のアポトーシスを誘導するための方法であって、アポトーシスに有効な量の請求項１の組成物を導入する工程を含む、前記方法。
【請求項４６】
上皮増殖因子受容体突然変異体癌細胞のアポトーシスを誘導するための方法であって、アポトーシスに有効な量の請求項４の組成物を導入する工程を含む、前記方法。
【請求項４７】
上皮増殖因子受容体突然変異体癌細胞のアポトーシスを誘導するための方法であって、アポトーシスに有効な量のアンチセンスｍｉＲを導入する工程を含み、該アンチセンスｍｉＲがｍｉＲ−２１に対してアンチセンスである、前記方法。
【請求項４８】
上皮増殖因子受容体突然変異体癌細胞が腺癌細胞である、請求項４７の方法。
【請求項４９】
腺癌細胞が：Ｈ３２５５細胞；Ｈ１９７５細胞；およびＨ１６５０細胞を含む群より選択される、請求項４７の方法。
【請求項５０】
アジュバントを導入する工程をさらに含む、請求項４７の方法。
【請求項５１】
化学療法薬剤；ＡＧ１４７８；ゲフィチニブ（イレッサ（登録商標））；エルロチニブ（タルセバ（登録商標））；セツキシマブ；パニツマブ；ザルツママブ；ニモツザマブ；マツズマブ；およびラパチニブを含む群より選択される化合物を導入する工程をさらに含む、請求項４７の方法。
【請求項５２】
上皮増殖因子受容体チロシンキナーゼ阻害剤を投与する工程をさらに含む、請求項４７の方法。
【請求項５３】
ＡＧ１４７８または薬学的に許容されうるその配合物を投与する工程をさらに含む、請求項４７の方法。
【請求項５４】
上皮増殖因子受容体突然変異体癌細胞のアポトーシスを誘導するための方法であって、アポトーシスに有効な量のｍｉＲ発現阻害剤を導入する工程を含み、ｍｉＲが：ｍｉＲ−２１；ｍｉＲ−２１０；およびｍｉＲ−１２９を含む群より選択される、前記方法。
【請求項５５】
上皮増殖因子受容体突然変異体癌細胞のアポトーシスを誘導するための方法であって、アポトーシスに有効な量のｍｉＲ−２１発現阻害剤を導入する工程を含む、前記方法。
【請求項５６】
化学療法薬剤；ＡＧ１４７８；ゲフィチニブ（イレッサ（登録商標））；エルロチニブ（タルセバ（登録商標））；セツキシマブ；パニツマブ；ザルツママブ；ニモツザマブ；マツズマブ；およびラパチニブを含む群より選択される化合物を投与する工程をさらに含む、請求項５４の方法。
【請求項５７】
上皮増殖因子受容体チロシンキナーゼ阻害剤を投与する工程をさらに含む、請求項５４の方法。
【請求項５８】
ＡＧ１４７８または薬学的に許容されうるその配合物を投与する工程をさらに含む、請求項５４の方法。
【請求項５９】
上皮増殖因子受容体突然変異体癌細胞のアポトーシスを誘導するための方法であって、アポトーシスに有効な量のｍｉＲ発現促進組成物を導入する工程を含み、ｍｉＲが：ｍｉＲ−４８６；ｍｉＲ−１２６：ｍｉＲ−１３８；ｍｉＲ−５２１；ｍｉＲ−４５１；ｍｉＲ−１４１；ｍｉＲ−３０ｄ；およびｍｉＲ−３０ａを含む群より選択される、前記方法。
【請求項６０】
薬学的に有用な組成物を同定するための方法であって：
ｉ）上皮増殖因子受容体突然変異体癌細胞培養物にアンチセンスｍｉＲを導入し、ここでアンチセンスｍｉＲは：ｍｉＲ−２１；ｍｉＲ−２１０；ｍｉＲ−１２９を含む群より選択されるｍｉＲに対してアンチセンスであり；
ｉｉ）上皮増殖因子受容体突然変異体癌細胞培養物に試験組成物を導入し；そして
ｉｉｉ）アポトーシスを誘導する試験組成物を、薬学的に有用な組成物と同定する；
工程を含む前記方法。
【請求項６１】
薬学的に有用な組成物を同定するための方法であって：
ｉ）上皮増殖因子受容体突然変異体癌細胞培養物にアンチセンスｍｉＲを導入し、ここでアンチセンスｍｉＲは：ｍｉＲ−２１に対してアンチセンスであり；
ｉｉ）上皮増殖因子受容体突然変異体癌細胞培養物に試験組成物を導入し；そして
ｉｉｉ）アポトーシスを誘導する試験組成物を、薬学的に有用な組成物と同定する；
工程を含む前記方法。
【請求項６２】
癌細胞が肺癌細胞である、請求項６１の方法。
【請求項６３】
リン酸化上皮増殖因子受容体レベルを同定する工程をさらに含む、請求項６１の方法。
【請求項６４】
肺癌と診断された患者の臨床転帰を予測する方法であって、患者から得た癌細胞試料においてｍｉＲ−２１発現レベルを検出する工程を含み、対照に比較してｍｉＲ−２１レベルの１．５倍以上の増加があると、上皮増殖因子受容体突然変異体状態と組み合わせて、生存減少が予測される、前記方法。
【請求項６５】
肺癌治療用の療法剤を同定する方法であって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで候補剤をスクリーニングして、ｍｉＲ２１の発現を減少させる剤を選択し、それによって肺癌治療用の剤を同定する工程を含む、前記方法。
【請求項６６】
肺癌において示差的に発現されるｍｉＲを同定するためのキットであって：ｍｉＲ−２１；ｍｉＲ−２１０；ｍｉＲ−１２９；ｍｉＲ−４８６；ｍｉＲ−１２６：ｍｉＲ−１３８；ｍｉＲ−５２１；ｍｉＲ−４５１；ｍｉＲ−１４１；ｍｉＲ−３０ｄ；およびｍｉＲ−３０ａを含む群より選択されるｍｉＲの少なくとも１つの分子同定因子を含む、前記キット。
【請求項６７】
肺癌において示差的に発現されるｍｉＲ−２１を同定するためのキットであって、ｍｉＲ−２１の少なくとも１つの分子同定因子を含み、分子同定因子が：プローブ；プライマー；抗体；または小分子を含む群より選択される、前記キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対するクロスリファレンス
[0001]本出願は、その開示が本明細書に援用される、２００９年２月２６日出願の米国仮出願第６１／１５５，７０９号の優先権を請求する。
【０００２】
連邦が支援する研究に関する言及
[0002]本発明は、壁内研究プログラム、ならびに米国衛生研究所、米国癌研究所、および癌研究センターの元で政府の援助を受けて行われた。米国政府は本発明に特定の権利を有する。
【０００３】
配列表
[0003]本出願は、ＥＦＳウェブを通じて提出されており、そしてその全体が本明細書に援用される配列表を含有する。２０１０年２月２３日に作製されたＡＳＣＩＩコピーは、６０４ ５０７５３ ＳＥＱ ＬＩＳＴ ０６００８−２．ｔｘｔと名付けられており、そしてサイズは７５８バイトである。
【背景技術】
【０００４】
[0004]肺癌は、癌による死亡の主因であり、そして米国および世界の両方において、喫煙関連死亡の最も一般的な原因である。しかし、すべての肺癌症例のおよそ１０〜２５％は、喫煙に起因しない。喫煙未経験者における肺癌に特に関心を向ける最近の研究によって、これらが喫煙者におけるものとは異なる特性を有することが示唆された：  ｐ５３およびＫ−ｒａｓ突然変異のＧからＴへのトランスバージョンは、喫煙者由来の肺腺癌におけるより、喫煙未経験者由来のものでより頻度が減っており；そして上皮増殖因子受容体（ＥＦＧＲ）遺伝子の突然変異は、喫煙未経験者の症例でより頻繁に観察される。
【０００５】
[0005]ゲフィチニブおよびエルロチニブを含むＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤（ＥＧＦＲ−ＴＫＩ）は、現在、臨床的に使用されており、そしてＥＧＦＲ突然変異体症例において、優先的に有効である。しかし、３０％ものＥＧＦＲ突然変異体症例および９０％ものＥＧＦＲ野生型症例は、ＥＧＦＲ−ＴＫＩに療法的反応を示さなかった。
【０００６】
[0006]マイクロＲＮＡ［交換可能に：「ｍｉＲＮＡ」、「ｍｉＲ（単数または複数）」、「ｍｉＲ（単数または複数）」の遺伝子産物（単数または複数）］は、癌において欠失するかまたは増幅される染色体領域に頻繁に位置する遺伝子によってコードされる、約１８〜２５ヌクレオチドの小分子ノンコーディングＲＮＡ分子であり、ｍｉＲがヒト腫瘍形成に関与する新規クラスの遺伝子であることが示唆される。ｍｉＲの発現レベルは、肺癌を含む多様なタイプのヒト癌において改変される。最近、ｍｉＲは、白血病、肺癌および結腸癌における診断および予後マーカーとして示されてきている。本発明者らは、本明細書において、ｍｉＲがヒト癌における療法的ターゲットになりうると考えている。
【０００７】
[0007]本発明者らは、以前、１０４の肺癌のｍｉＲ発現プロフィールを分析してきており、このうち９９は喫煙者由来であり、そして高ｍｉＲ−１５５および低ｌｅｔ−７ａは劣った生存と相関することを見出した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
[0008]要約すると、新規療法ターゲットおよびＥＧＦＲ−ＴＫＩ療法を改善する方法の同定は、癌、特に肺癌のより優れた治療に対して非常に重要である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
[0009]本発明は、少なくとも部分的に、喫煙未経験者由来の肺癌におけるｍｉＲの広範囲の発現プロフィールの発見に基づく。喫煙未経験者対喫煙者症例において、およびＥＧＦＲ野生型対ＥＧＦＲ突然変異体症例において、ｍｉＲ発現プロフィールを比較すると、喫煙未経験者由来の肺癌のユニークな病因が示され、そしてｍｉＲ発現のＥＧＦＲが仲介する制御が明らかになる。
【００１０】
[0010]本明細書に提示するｉｎ  ｖｉｖｏ機能分析はまた、ｍｉＲをコードする特定の遺伝子またはその遺伝子産物の調節が、単独で、他のこうした調節因子と組み合わせて、他の癌治療と組み合わせてのいずれかで療法的であり、そしてＥＧＦＲ−ＴＫＩ治療と組み合わせて療法的でありうることも示す。
【００１１】
[0011]広い態様において、本発明は、少なくとも１つのアンチセンスｍｉＲおよび少なくとも１つのさらなる組成物を含む、物質の組成物である組成物であって、アンチセンスｍｉＲが、野生型喫煙未経験者癌細胞に比較して、上皮増殖因子受容体喫煙未経験者突然変異体癌細胞において示差的に発現されるｍｉＲに対してアンチセンスであり、そして少なくとも１つのさらなる組成物が癌を治療するのに有用である、前記組成物を提供する。特定の態様において、少なくとも１つのさらなる組成物は：化学療法薬剤；ＡＧ１４７８；ゲフィチニブ（イレッサ（登録商標））；エルロチニブ（タルセバ（登録商標））；セツキシマブ；パニツマブ（ｐａｎｉｔｕｍａｂ）；ザルツママブ（ｚａｌｕｔｕｍａｍａｂ）；ニモツザマブ（ｎｉｍｏｔｕｚａｍａｂ）；マツズマブ；およびラパチニブを含む群より選択されうる。
【００１２】
[0012]また、特定の態様において、こうした組成物は、アンチセンスｍｉＲが、群：ｍｉＲ−２１；ｍｉＲ−２１０；ｍｉＲ−１２９より選択されうるｍｉＲに対してアンチセンスであるｍｉＲより選択される。やはり特定の態様において、こうした組成物には、少なくとも１つのアンチセンスｍｉＲがｍｉＲ−２１に対してアンチセンスであるもの；癌を治療するのに有用な少なくとも１つのさらなる組成物が上皮増殖因子受容体チロシンキナーゼ阻害剤であるもの；または好ましくは、上皮増殖因子受容体チロシンキナーゼ阻害剤がＡＧ１４７８であるものが含まれてもよい。
【００１３】
[0013]本発明がやはり提供するのは、少なくとも１つのアンチセンスｍｉＲおよび少なくとも１つのさらなる組成物を含む物質の組成物であって、ｍｉＲが、野生型喫煙未経験者癌細胞に比較して、上皮増殖因子受容体突然変異体喫煙未経験者癌細胞において上方制御され、そして少なくとも１つのさらなる組成物が癌を治療するのに有用である、前記組成物である。特定の態様において、ｍｉＲは、群：ｍｉＲ−４８６；ｍｉＲ−１２６：ｍｉＲ−１３８；ｍｉＲ−５２１；ｍｉＲ−４５１；ｍｉＲ−１４１；ｍｉＲ−３０ｄ；およびｍｉＲ−３０ａより選択される。
【００１４】
[0014]やはり提供するのは、少なくとも１つのアンチセンスｍｉＲおよび少なくとも１つの組成物を含む物質の組成物であって、アンチセンスｍｉＲが、野生型喫煙未経験者癌細胞に比較して、ＥＧＦＲ突然変異体喫煙未経験者癌細胞において上方制御されるｍｉＲに対してアンチセンスであり、そして少なくとも１つのさらなる組成物が癌を治療するのに有用である、前記組成物である。特定の態様において、これらの組成物は、アンチセンスｍｉＲが、群：ｍｉＲ−２１；ｍｉＲ−２１０；およびｍｉＲ−１２９より選択されるｍｉＲに対してアンチセンスであるｍｉＲより選択されうるものである。
【００１５】
[0015]他の広い態様において、試験試料において、上皮増殖因子受容体突然変異体癌細胞を同定する方法であって、試験試料におけるｍｉＲレベルを、対照のｍｉＲレベルに比較する工程を含み、ｍｉＲレベルが示差的に発現されていると、試験試料が上皮増殖因子受容体突然変異体癌細胞を含有すると同定される、前記方法を提供する。特定の態様において、これらの方法には、ｍｉＲが：ｍｉＲ−２１；ｍｉＲ−２１０；ｍｉＲ−１２９；ｍｉＲ−４８６；ｍｉＲ−１２６：ｍｉＲ−１３８；ｍｉＲ−５２１；ｍｉＲ−４５１；ｍｉＲ−１４１；ｍｉＲ−３０ｄ；およびｍｉＲ−３０ａを含む群より選択されるものが含まれる。
【００１６】
[0016]他の広い態様において、喫煙未経験被験体が肺癌を有するか、または発症するリスクがあるかどうかを決定する方法であって、試験試料におけるｍｉＲレベルを、対照のｍｉＲレベルに比較する工程を含み、ｍｉＲレベルが示差的に発現されていると、該被験体が肺癌を有するか、または発症するリスクがあると診断される、前記方法を提供する。特定の態様において、こうした方法は、試験試料および対照における上皮増殖因子受容体突然変異体状態を比較する工程をさらに含んでもよい。また、特定の態様において、これらの方法には、上皮増殖因子受容体チロシンキナーゼ阻害剤を用いて、上皮増殖因子受容体突然変異体状態を決定するものが含まれてもよい。やはり好ましいのは、ｍｉＲが、群：ｍｉＲ−２１；ｍｉＲ−２１０；ｍｉＲ−１２９；ｍｉＲ−４８６；ｍｉＲ−１２６：ｍｉＲ−１３８；ｍｉＲ−５２１；ｍｉＲ−４５１；ｍｉＲ−１４１；ｍｉＲ−３０ｄ；およびｍｉＲ−３０ａより選択される、記載するような方法である。
【００１７】
[0017]他の広い態様において、喫煙未経験癌患者における予後を提供する方法であって：試験試料におけるｍｉＲレベルを、対照のｍｉＲレベルに比較する工程を含み、ｍｉＲレベルが示差的に発現されていると、劣った予後が示される、前記方法を提供する。特定の態様において、こうした方法には、ｍｉＲが、群：ｍｉＲ−２１；ｍｉＲ−２１０；ｍｉＲ−１２９；ｍｉＲ−４８６；ｍｉＲ−１２６：ｍｉＲ−１３８；ｍｉＲ−５２１；ｍｉＲ−４５１；ｍｉＲ−１４１；ｍｉＲ−３０ｄ；およびｍｉＲ−３０ａより選択されるものが含まれてもよい。
【００１８】
[0018]別の広い態様において、患者において上皮増殖因子受容体突然変異体癌を診断する方法であって、試験試料におけるｍｉＲレベルを、対照のｍｉＲレベルに比較する工程を含み、ｍｉＲレベルが示差的に発現されていると、該被験体が上皮増殖因子受容体突然変異体癌を有すると診断される、前記方法を提供する。特定の態様において、方法には、ｍｉＲが、群：ｍｉＲ−２１；ｍｉＲ−２１０；ｍｉＲ−１２９；ｍｉＲ−４８６；ｍｉＲ−１２６：ｍｉＲ−１３８；ｍｉＲ−５２１；ｍｉＲ−４５１；ｍｉＲ−１４１；ｍｉＲ−３０ｄ；およびｍｉＲ−３０ａより選択されるものが含まれてもよい。
【００１９】
[0019]別の広い態様において、上皮増殖因子受容体突然変異体癌患者における予後を提供する方法であって：試験試料におけるｍｉＲレベルを、対照のｍｉＲレベルに比較する工程を含み、ｍｉＲレベルが示差的に発現されていると、劣った予後が示される、前記方法を提供する。特定の態様において、こうした方法には、ｍｉＲが、群：ｍｉＲ−２１；ｍｉＲ−２１０；ｍｉＲ−１２９；ｍｉＲ−４８６；ｍｉＲ−１２６：ｍｉＲ−１３８；ｍｉＲ−５２１；ｍｉＲ−４５１；ｍｉＲ−１４１；ｍｉＲ−３０ｄ；およびｍｉＲ−３０ａより選択されるものが含まれてもよい。
【００２０】
[0020]別の広い態様において、癌治療が必要な喫煙未経験患者において癌を治療する方法であって、薬学的に有効な量の本明細書の組成物を投与する工程を含む、前記方法を提供する。特定の態様において、該方法には、治療する癌が：神経芽細胞腫；肺癌；胆管癌；非小細胞肺癌；肝細胞癌；リンパ腫；鼻咽頭癌；卵巣癌；頭頸部扁平上皮癌；子宮頸部扁平上皮癌；胃癌；結腸癌；子宮頸癌；胆嚢癌；前立腺癌；乳癌；精巣胚細胞腫瘍；大細胞型リンパ腫；濾胞性リンパ腫；結腸直腸癌；悪性胸膜中皮腫；神経膠腫；甲状腺癌；基底細胞癌；Ｔ細胞リンパ腫；ｔ（８；１７）−前リンパ球性白血病；骨髄異形成症候群；膵臓癌；ｔ（５；１４）（ｑ３５．１；ｑ３２．２）白血病；悪性線維性組織球腫；胃腸間質腫瘍；および肝芽腫を含む群より選択されるものが含まれる。
【００２１】
[0021]別の広い態様において、癌を治療する必要がある喫煙未経験患者において、こうした癌を治療する方法であって、薬学的に有効な量の、ｍｉＲ−２１に対してアンチセンスである組成物を投与する工程を含む、前記方法を提供する。特定の態様において、これらの方法には、治療する癌が肺癌であるものが含まれてもよい。やはり特定の態様において、これらの方法は、アンチセンスｍｉＲ−２１および上皮増殖因子受容体チロシンキナーゼ阻害剤を投与する工程をさらに含んでもよく；そして特定の態様において、上皮増殖因子受容体チロシンキナーゼ阻害剤はＡＧ１４７８である。１つの特定の態様において、これらの方法には、治療する癌が腺癌であるものが含まれる。
【００２２】
[0022]別の広い態様において、癌治療が必要な喫煙未経験患者において癌を治療する方法であって、薬学的に有効な量のアンチセンスｍｉＲを投与する工程を含み、アンチセンスｍｉＲが、群：ｍｉＲ−２１；ｍｉＲ−２１０；ｍｉＲ−１２９より選択されるｍｉＲに対してアンチセンスである、前記方法を提供する。
【００２３】
[0023]別の広い態様において、癌治療が必要な喫煙未経験患者において癌を治療する方法であって、薬学的に有効な量のアンチセンスｍｉＲを投与する工程を含み、アンチセンスｍｉＲがｍｉＲ−２１に対してアンチセンスである、前記方法を提供する。特定の態様において、これらの方法には、治療する癌が：神経芽細胞腫および肺癌を含む群より選択されるものが含まれる。やはり特定の態様において、これらの方法には、治療する癌が腺癌であるものが含まれてもよい。やはり特定の態様において、これらの方法は、アジュバントを投与する工程をさらに含んでもよい。やはり特定の態様において、これらの方法は、化学療法薬剤；ＡＧ１４７８；ゲフィチニブ（イレッサ（登録商標））；エルロチニブ（タルセバ（登録商標））；セツキシマブ；パニツマブ；ザルツママブ；ニモツザマブ；マツズマブ；およびラパチニブを含む群より選択される化合物を投与する工程をさらに含んでもよい。やはり特定の態様において、これらの方法は、上皮増殖因子受容体チロシンキナーゼ阻害剤を投与する工程をさらに含んでもよい。やはり特定の態様において、これらの方法は、ＡＧ１４７８または薬学的に許容されうるその配合物を投与する工程をさらに含んでもよい。
【００２４】
[0024]別の広い態様において、上皮増殖因子受容体突然変異体癌を治療する必要がある患者において、こうした癌を治療する方法であって、薬学的に有効な量の本明細書の組成物を投与する工程を含む、前記方法を提供する。やはり提供するのは、薬学的に有効な量のアンチセンスｍｉＲ−２１を投与する工程を含む、上皮増殖因子受容体突然変異体癌を治療する必要がある患者において、こうした癌を治療する方法である。
【００２５】
[0025]別の広い態様において、上皮増殖因子受容体突然変異体癌を治療する必要がある患者において、こうした癌を治療する方法であって、薬学的に有効な量のｍｉＲ発現阻害剤を投与する工程を含み、ｍｉＲが群：ｍｉＲ−２１；ｍｉＲ−２１０；およびｍｉＲ−１２９より選択される、前記方法を提供する。やはり提供するのは、上皮増殖因子受容体突然変異体癌を治療する必要がある患者において、こうした癌を治療する方法であって、薬学的に有効な量のｍｉＲ−２１発現阻害剤を投与する工程を含む、前記方法である。特定の態様において、これらの方法は：化学療法薬剤；ＡＧ１４７８；ゲフィチニブ（イレッサ（登録商標））；エルロチニブ（タルセバ（登録商標））；セツキシマブ；パニツマブ；ザルツママブ；ニモツザマブ；マツズマブ；およびラパチニブを含む群より選択される化合物を投与する工程をさらに含んでもよい。やはり特定の態様において、これらの方法は、上皮増殖因子受容体チロシンキナーゼ阻害剤を投与する工程をさらに含んでもよい。やはり特定の態様において、これらの方法は、ＡＧ１４７８または薬学的に許容されうるその配合物を投与する工程をさらに含んでもよい。
【００２６】
[0026]別の広い態様において、上皮増殖因子受容体突然変異体癌を治療する必要がある患者において、こうした癌を治療する方法であって、薬学的に有効な量のｍｉＲ発現促進組成物を投与する工程を含み、ｍｉＲが、群：ｍｉＲ−４８６；ｍｉＲ−１２６：ｍｉＲ−１３８；ｍｉＲ−５２１；ｍｉＲ−４５１；ｍｉＲ−１４１；ｍｉＲ−３０ｄ；およびｍｉＲ−３０ａより選択される、前記方法を提供する。
【００２７】
[0027]別の広い態様において、上皮増殖因子受容体突然変異体癌細胞のアポトーシスを誘導するための方法であって、アポトーシスに有効な量の本明細書の組成物を導入する工程を含む、前記方法を提供する。
【００２８】
[0028]別の広い態様において、上皮増殖因子受容体突然変異体癌細胞のアポトーシスを誘導するための方法であって、上皮増殖因子受容体チロシン（ＥＧＦＲ）キナーゼ阻害剤と組み合わせて、アポトーシスに有効な量のアンチセンスｍｉＲ−２１を導入する工程を含む、前記方法を提供する。
【００２９】
[0029]別の広い態様において、上皮増殖因子受容体突然変異体癌細胞のアポトーシスを誘導するための方法であって、アポトーシスに有効な量のアンチセンスｍｉＲを導入する工程を含み、アンチセンスｍｉＲがｍｉＲ−２１に対してアンチセンスである、前記方法を提供する。特定の態様において、これらの方法には、上皮増殖因子受容体突然変異体癌細胞が腺癌細胞であるものが含まれてもよい。やはり特定の態様において、これらの方法には、腺癌細胞が、群：Ｈ３２５５細胞；Ｈ１９７５細胞；およびＨ１６５０細胞より選択されるものが含まれてもよい。やはり特定の態様において、これらの方法は、アジュバントを導入する工程をさらに含んでもよい。やはり特定の態様において、これらの方法は、群：化学療法薬剤；幹細胞；ＡＧ１４７８；ゲフィチニブ（イレッサ（登録商標））；エルロチニブ（タルセバ（登録商標））；セツキシマブ；パニツマブ；ザルツママブ；ニモツザマブ；マツズマブ；およびラパチニブより選択される組成物を導入する工程をさらに含んでもよい。やはり特定の態様において、これらの方法は、上皮増殖因子受容体チロシンキナーゼ阻害剤を投与する工程をさらに含んでもよい。やはり特定の態様において、これらの方法は、ＡＧ１４７８または薬学的に許容されうるその配合物を投与する工程をさらに含んでもよい。
【００３０】
[0030]別の広い態様において、上皮増殖因子受容体突然変異体癌細胞のアポトーシスを誘導するための方法であって、アポトーシスに有効な量のｍｉＲ発現阻害剤を導入する工程を含み、ｍｉＲが：ｍｉＲ−２１；ｍｉＲ−２１０；およびｍｉＲ−１２９を含む群より選択される、前記方法を提供する。
【００３１】
[0031]別の広い態様において、上皮増殖因子受容体突然変異体癌細胞のアポトーシスを誘導するための方法であって、アポトーシスに有効な量のｍｉＲ−２１発現阻害剤を導入する工程を含む、前記方法を提供する。特定の態様において、これらの方法は：化学療法薬剤；幹細胞；ＡＧ１４７８；ゲフィチニブ（イレッサ（登録商標））；エルロチニブ（タルセバ（登録商標））；セツキシマブ；パニツマブ；ザルツママブ；ニモツザマブ；マツズマブ；およびラパチニブを含む群より選択される化合物を投与する工程をさらに含んでもよい。やはり特定の態様において、これらの方法は、上皮増殖因子受容体チロシンキナーゼ阻害剤を投与する工程をさらに含んでもよい。やはり特定の態様において、これらの方法は、ＡＧ１４７８または薬学的に許容されうるその配合物を投与する工程をさらに含んでもよい。
【００３２】
[0032]別の広い態様において、上皮増殖因子受容体突然変異体癌細胞のアポトーシスを誘導するための方法であって、アポトーシスに有効な量のｍｉＲ発現促進組成物を導入する工程を含み、ｍｉＲが、群：ｍｉＲ−４８６；ｍｉＲ−１２６：ｍｉＲ−１３８；ｍｉＲ−５２１；ｍｉＲ−４５１；ｍｉＲ−１４１；ｍｉＲ−３０ｄ；およびｍｉＲ−３０ａより選択される、前記方法を提供する。
【００３３】
[0033]別の広い態様において、薬学的に有用な組成物を同定するための方法であって：ｉ）上皮増殖因子受容体突然変異体癌細胞培養物にアンチセンスｍｉＲを導入し、ここでアンチセンスｍｉＲは：ｍｉＲ−２１；ｍｉＲ−２１０；ｍｉＲ−１２９；ｍｉＲ−４８６；ｍｉＲ−１２６：ｍｉＲ−１３８；ｍｉＲ−５２１；ｍｉＲ−４５１；ｍｉＲ−１４１；ｍｉＲ−３０ｄ；およびｍｉＲ−３０ａの群より選択されるｍｉＲに対してアンチセンスであり；ｉｉ）上皮増殖因子受容体突然変異体癌細胞培養物に試験組成物を導入し；そしてｉｉｉ）アポトーシスを誘導する試験組成物を、薬学的に有用な組成物と同定する工程を含む、前記方法を提供する。
【００３４】
[0034]別の広い態様において、薬学的に有用な組成物を同定するための方法であって：ｉ）上皮増殖因子受容体突然変異体癌細胞培養物にアンチセンスｍｉＲを導入し、ここでアンチセンスｍｉＲは：ｍｉＲ−２１に対してアンチセンスであり；ｉｉ）上皮増殖因子受容体突然変異体癌細胞培養物に試験組成物を導入し；そしてｉｉｉ）アポトーシスを誘導する試験組成物を、薬学的に有用な組成物と同定する工程を含む、前記方法を提供する。特定の態様において、これらの方法には、癌細胞が肺癌細胞であるものが含まれてもよい。やはり特定の態様において、これらの方法は、リン酸化上皮増殖因子受容体レベルを同定する工程をさらに含んでもよい。
【００３５】
[0035]別の広い態様において、肺癌と診断された患者の臨床転帰を予測する方法であって、患者から得た癌細胞試料においてｍｉＲ−２１発現レベルを検出する工程を含み、対照に比較してｍｉＲ−２１レベルの１．５倍以上の増加があると、上皮増殖因子受容体突然変異体状態と組み合わせて、生存減少が予測される、前記方法を提供する。
【００３６】
[0036]別の広い態様において、肺癌治療用の療法剤を同定する方法であって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで候補剤をスクリーニングして、ｍｉＲ−２１の発現を減少させる剤を選択し、それによって肺癌治療用の剤を同定する工程を含む、前記方法を提供する。
【００３７】
[0037]別の広い態様において、肺癌において示差的に発現されるｍｉＲを同定するためのキットであって、群：ｍｉＲ−２１；ｍｉＲ−２１０；ｍｉＲ−１２９；ｍｉＲ−４８６；ｍｉＲ−１２６：ｍｉＲ−１３８；ｍｉＲ−５２１；ｍｉＲ−４５１；ｍｉＲ−１４１；ｍｉＲ−３０ｄ；およびｍｉＲ−３０ａより選択されるｍｉＲの少なくとも１つの分子同定因子を含む、前記キットを提供する。
【００３８】
[0038]別の広い態様において、肺癌において示差的に発現されるｍｉＲ−２１を同定するためのキットであって、ｍｉＲ−２１の少なくとも１つの分子同定因子を含み、分子同定因子が、群：プローブ；プライマー；抗体；ｍｉＲ；ロック化ｍｉＲ；または小分子より選択される、前記キットを提供する。
【００３９】
[0039]本発明の多様な目的および利点は、付随する図を踏まえて読むと、好ましい態様の以下の詳細な説明から、当業者には明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】[0040]図１Ａ〜１Ｂ：  ヒト肺癌細胞株におけるｍｉＲ−２１発現。
【００４１】
[0041]図１Ａ：  ｑＲＴーＰＣＲによってｍｉＲ−２１発現レベルを分析し、そしてＨＢＥＴ２（ｈＴＥＲＴ不死化正常ヒト気管支上皮細胞）（１．０と定義、未提示）に対して表した。データは３回の独立の実験由来の平均±ＳＤであった。＊、ＨＢＥＴ２と比較した際のｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定。ＭＴＳアッセイによって細胞増殖に対するＡＧ１４７８の抑制効果を決定し、そしてＩＣ５０（最大阻害濃度の半分）として示した。Ｓｑ、扁平上皮癌；Ｌａ、大細胞型癌；Ａｄ、腺癌；Ｓ、喫煙者の症例由来；Ｎ、喫煙未経験者の症例由来；Ｎ／Ａ、情報入手不能；Ｗｔ、ＥＧＦＲ野生型；Ｍｔ＊、ＥＧＦＲ突然変異体ΔＥ７４６−Ａ７５０；Ｍｔ＊＊、Ｌ８５８ＲおよびＴ７９０Ｍ；Ｍｔ＊＊＊、Ｌ８５８Ｒ。
【００４２】
[0042]図１Ｂ：  ｍｉＲ−２１発現およびｐ−ＥＧＦＲレベル間の相関（Ｐｅａｒｓｏｎ相関、ｒ＝０．７１、ｐ＜０．０５）。ｍｉＲ−２１データは図１Ａ由来であり、そしてｐ−ＥＧＦＲデータは、図６に示す結果を定量的に分析することによって得られた。
【図２】[0043]図２Ａ〜２Ｂ：  ＡＧ１４７８は、ｍｉＲ−２１発現を抑制する。ｍｉＲ−２１の高発現およびＥＧＦＲ突然変異によって特徴付けられるＨ３２５５肺腺癌細胞を、２４時間血清枯渇させ、そして次いで、ＡＧ１４７８（２μＭまたは１０μＭ）の存在下または非存在下のいずれかで、２時間増殖させ、その後、２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦに１５分間曝露し、または曝露しなかった。
【００４３】
[0044]図２Ａ：  ホスホＥＧＦＲ（ｐ−ＥＧＦＲ）およびホスホＡｋｔ（ｐ−Ａｋｔ）発現に対するＡＧ１４７８の影響。βアクチンは装填対照であった。
【００４４】
[0045]図２Ｂ：  ＥＧＦリガンド刺激を伴いまたは伴わずに、ＡＧ１４７８処理（２μＭまたは１０μＭ）した後の、ｑＲＴ−ＰＣＲによるｍｉＲ−２１発現レベル分析。ｍｉＲ−２１発現レベルを、ＥＧＦの非存在下での未処理細胞に対する相対値として表した。データは、４回の独立の実験由来の平均±ＳＤであった。＊、ｐ＜０．０５、対応のあるｔ検定。
【図３Ａ】[0046]図３Ａ〜３Ｄ：  ｍｉＲ−２１の阻害はＡＧ１４７８が誘導するアポトーシスを増進する。
【００４５】
[0047]図３Ａ：  細胞を４０ｎＭのアンチｍｉＲ−２１（＋）または対照オリゴヌクレオチド（アンチＥＧＦＰ）（−）で７２時間トランスフェクションし、そしてｑＲＴ−ＰＣＲによって調べた。アンチｍｉＲ−２１トランスフェクション後のｍｉＲ−２１発現レベルを、対照に対する相対値として表した。データは、３回の独立の実験由来の平均±ＳＤであった。＊、ｐ＜０．０５、対応のあるｔ検定。
【図３Ｂ】図３Ａ〜３Ｄ：  ｍｉＲ−２１の阻害はＡＧ１４７８が誘導するアポトーシスを増進する。
【００４６】
[0048]図３Ｂ〜３Ｃ：  細胞（Ｈ３２５５またはＨ４４１）を４０ｎＭのアンチｍｉＲ−２１（＋）またはアンチＥＧＦＰ（−）で７２時間トランスフェクションし、そして次いで、０．２μＭのＡＧ１４７８の存在下または非存在下で２４時間（Ｈ３２５５）、あるいは１０μＭの存在下または非存在下で７２時間（Ｈ４４１）、増殖させた。カスパーゼ３／７の活性を、アンチｍｉＲ−２１およびＡＧ１４７８の非存在下での細胞の活性に対する相対値として表した。データは、少なくとも４回の独立の実験由来の平均±ＳＤであった。＊、ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定。
【図３Ｃ】図３Ａ〜３Ｄ：  ｍｉＲ−２１の阻害はＡＧ１４７８が誘導するアポトーシスを増進する。
【００４７】
[0048]図３Ｂ〜３Ｃ：  細胞（Ｈ３２５５またはＨ４４１）を４０ｎＭのアンチｍｉＲ−２１（＋）またはアンチＥＧＦＰ（−）で７２時間トランスフェクションし、そして次いで、０．２μＭのＡＧ１４７８の存在下または非存在下で２４時間（Ｈ３２５５）、あるいは１０μＭの存在下または非存在下で７２時間（Ｈ４４１）、増殖させた。カスパーゼ３／７の活性を、アンチｍｉＲ−２１およびＡＧ１４７８の非存在下での細胞の活性に対する相対値として表した。データは、少なくとも４回の独立の実験由来の平均±ＳＤであった。＊、ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定。
【図３Ｄ】図３Ａ〜３Ｄ：  ｍｉＲ−２１の阻害はＡＧ１４７８が誘導するアポトーシスを増進する。
【００４８】
[0049]図３Ｄ：  未切断ＰＡＲＰをウェスタンブロットによって評価した。上記のように、細胞をアンチｍｉＲ−２１またはアンチＥＧＦＰでトランスフェクションし、そして次いで、２μＭのＡＧ１４７８の存在下または非存在下で７２時間増殖させた。βアクチンは装填対照であった。
【図４Ａ】[0050]図４Ａ〜４Ｃ：  喫煙未経験者試料由来のｍｉＲ−２１（図４Ａ）、ｍｉＲ−１２６（図４Ｂ）およびｍｉＲ−４８６（図４Ｃ）発現。ｑＲＴ−ＰＣＲを用いて、２０対の腫瘍および正常組織における各ｍｉＲの発現レベルを分析した。１５の症例は、ＥＧＦＲ野生型（症例番号１、３、５、６、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２３、２６および２７）であり、そして５つの症例はＥＧＦＲ突然変異体（症例番号２、４、２４、２５および２８）であった。高レベルのｍｉＲ−２１を発現する５つの腫瘍は、３つのＥＧＦＲ突然変異体（症例番号２４、２５および２８）および２つのＥＧＦＲ野生型（症例番号５および２３）症例由来であった。反応は、各試料に関して３つ組であった。発現レベルをＲＮＵ６Ｂで規準化し、２−ΔΔＣＴ法を用いて決定し、そして正常組織の平均値に比較して提示した。＊、ｐ＜０．０５、対応のあるｔ検定。
【図４Ｂ】[0050]図４Ａ〜４Ｃ：  喫煙未経験者試料由来のｍｉＲ−２１（図４Ａ）、ｍｉＲ−１２６（図４Ｂ）およびｍｉＲ−４８６（図４Ｃ）発現。ｑＲＴ−ＰＣＲを用いて、２０対の腫瘍および正常組織における各ｍｉＲの発現レベルを分析した。１５の症例は、ＥＧＦＲ野生型（症例番号１、３、５、６、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２３、２６および２７）であり、そして５つの症例はＥＧＦＲ突然変異体（症例番号２、４、２４、２５および２８）であった。高レベルのｍｉＲ−２１を発現する５つの腫瘍は、３つのＥＧＦＲ突然変異体（症例番号２４、２５および２８）および２つのＥＧＦＲ野生型（症例番号５および２３）症例由来であった。反応は、各試料に関して３つ組であった。発現レベルをＲＮＵ６Ｂで規準化し、２−ΔΔＣＴ法を用いて決定し、そして正常組織の平均値に比較して提示した。＊、ｐ＜０．０５、対応のあるｔ検定。
【図４Ｃ】[0050]図４Ａ〜４Ｃ：  喫煙未経験者試料由来のｍｉＲ−２１（図４Ａ）、ｍｉＲ−１２６（図４Ｂ）およびｍｉＲ−４８６（図４Ｃ）発現。ｑＲＴ−ＰＣＲを用いて、２０対の腫瘍および正常組織における各ｍｉＲの発現レベルを分析した。１５の症例は、ＥＧＦＲ野生型（症例番号１、３、５、６、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２３、２６および２７）であり、そして５つの症例はＥＧＦＲ突然変異体（症例番号２、４、２４、２５および２８）であった。高レベルのｍｉＲ−２１を発現する５つの腫瘍は、３つのＥＧＦＲ突然変異体（症例番号２４、２５および２８）および２つのＥＧＦＲ野生型（症例番号５および２３）症例由来であった。反応は、各試料に関して３つ組であった。発現レベルをＲＮＵ６Ｂで規準化し、２−ΔΔＣＴ法を用いて決定し、そして正常組織の平均値に比較して提示した。＊、ｐ＜０．０５、対応のあるｔ検定。
【図５Ａ】[0051]図５Ａ〜５Ｃ：  喫煙者に対する、喫煙未経験者におけるｍｉＲ−２１（図５Ａ）、ｍｉＲ−１２６＊（図５Ｂ）およびｍｉＲ−１３８（図５Ｃ）発現。肺腺癌および正常肺組織の喫煙未経験者由来の１３対および喫煙者由来の１４対をｑＲＴ−ＰＣＲによって分析した。反応は、各試料に関して３つ組であった。Ｌｏｇ２  ２−ΔＣＴとして相対的発現を定量化し、ここでΔＣＴ＝（ＣＴｍｉＲ−ＣＴＲＮＵ６Ｂ）であった。＊、ｐ＜０．０５、対応のあるｔ検定。
【図５Ｂ】[0051]図５Ａ〜５Ｃ：  喫煙者に対する、喫煙未経験者におけるｍｉＲ−２１（図５Ａ）、ｍｉＲ−１２６＊（図５Ｂ）およびｍｉＲ−１３８（図５Ｃ）発現。肺腺癌および正常肺組織の喫煙未経験者由来の１３対および喫煙者由来の１４対をｑＲＴ−ＰＣＲによって分析した。反応は、各試料に関して３つ組であった。Ｌｏｇ２  ２−ΔＣＴとして相対的発現を定量化し、ここでΔＣＴ＝（ＣＴｍｉＲ−ＣＴＲＮＵ６Ｂ）であった。＊、ｐ＜０．０５、対応のあるｔ検定。
【図５Ｃ】[0051]図５Ａ〜５Ｃ：  喫煙者に対する、喫煙未経験者におけるｍｉＲ−２１（図５Ａ）、ｍｉＲ−１２６＊（図５Ｂ）およびｍｉＲ−１３８（図５Ｃ）発現。肺腺癌および正常肺組織の喫煙未経験者由来の１３対および喫煙者由来の１４対をｑＲＴ−ＰＣＲによって分析した。反応は、各試料に関して３つ組であった。Ｌｏｇ２  ２−ΔＣＴとして相対的発現を定量化し、ここでΔＣＴ＝（ＣＴｍｉＲ−ＣＴＲＮＵ６Ｂ）であった。＊、ｐ＜０．０５、対応のあるｔ検定。
【図６Ａ】[0052]８つのＮＳＣＬＣ細胞株のウェスタンブロット分析。ホスホＥＧＦＲ（ｐ−ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲおよびホスホＡｋｔ（ｐ−Ａｋｔ）のタンパク質発現をウェスタンブロット分析によって調べた。Ａ；非腺癌細胞株（扁平上皮癌Ｈ１５７および大細胞型癌Ｈ１２９９）、Ｂ；野生型ＥＧＦＲを伴う腺癌細胞株（Ａ５４９、Ｈ２３およびＨ４４１）、Ｃ；突然変異体ＥＧＦＲを伴う腺癌細胞株（Ｈ１６５０、Ｈ１９７５およびＨ３２５５）。βアクチンは装填対照であった。ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ  Ｊ１．４０ｇを用いて、シグナル強度を測定することによって、これらの画像を定量化した。
【図６Ｂ】[0052]８つのＮＳＣＬＣ細胞株のウェスタンブロット分析。ホスホＥＧＦＲ（ｐ−ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲおよびホスホＡｋｔ（ｐ−Ａｋｔ）のタンパク質発現をウェスタンブロット分析によって調べた。Ａ；非腺癌細胞株（扁平上皮癌Ｈ１５７および大細胞型癌Ｈ１２９９）、Ｂ；野生型ＥＧＦＲを伴う腺癌細胞株（Ａ５４９、Ｈ２３およびＨ４４１）、Ｃ；突然変異体ＥＧＦＲを伴う腺癌細胞株（Ｈ１６５０、Ｈ１９７５およびＨ３２５５）。βアクチンは装填対照であった。ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ  Ｊ１．４０ｇを用いて、シグナル強度を測定することによって、これらの画像を定量化した。
【００４９】
【図６Ｃ】[0052]８つのＮＳＣＬＣ細胞株のウェスタンブロット分析。ホスホＥＧＦＲ（ｐ−ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲおよびホスホＡｋｔ（ｐ−Ａｋｔ）のタンパク質発現をウェスタンブロット分析によって調べた。Ａ；非腺癌細胞株（扁平上皮癌Ｈ１５７および大細胞型癌Ｈ１２９９）、Ｂ；野生型ＥＧＦＲを伴う腺癌細胞株（Ａ５４９、Ｈ２３およびＨ４４１）、Ｃ；突然変異体ＥＧＦＲを伴う腺癌細胞株（Ｈ１６５０、Ｈ１９７５およびＨ３２５５）。βアクチンは装填対照であった。ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ  Ｊ１．４０ｇを用いて、シグナル強度を測定することによって、これらの画像を定量化した。
【図７】[0053]ＡＧ１４７８は、Ｈ４４１肺腺癌細胞において、ｍｉＲ−２１発現を抑制する。ＥＧＦの非存在下でのＡＧ１４７８処理（２μＭまたは１０μＭ）後、ｑＲＴ−ＰＣＲによって、ｍｉＲ−２１発現レベルを分析し、そして未処理細胞に比較して表した。データは３つ組由来の平均±ＳＤであった。＊、ｐ＜０．０５、対応のあるｔ検定。
【図８】[0054]表１−非小細胞肺癌に罹患した喫煙未経験患者の特性。
【図９】[0055]表２−非小細胞肺癌に罹患した喫煙未経験患者の特性（ｎ＝２８）。
【図１０】[0056]表３−２８の喫煙未経験者由来の肺癌組織および正常肺組織間で示差的に発現されるｍｉＲ。
【図１１】[0057]表４  肺腺癌に罹患した喫煙患者の特性（ｎ＝２３）。
【図１２Ａ】[0058]図１２Ａ〜Ｃ：表５−示差的に発現され、そして喫煙状態に関連する４３のｍｉＲ。
【図１２Ｂ】[0058]図１２Ａ〜Ｃ：表５−示差的に発現され、そして喫煙状態に関連する４３のｍｉＲ。
【図１２Ｃ】[0058]図１２Ａ〜Ｃ：表５−示差的に発現され、そして喫煙状態に関連する４３のｍｉＲ。
【図１３】[0059]表６−喫煙未経験者由来のＥＧＦＲ突然変異体および野生型肺癌間で示差的に発現されるｍｉＲ。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
[0060]肺癌症例のおよそ１５％は、喫煙に関連せず、そして喫煙者におけるものとは異なる分子的および臨床的特性を示す。上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）遺伝子突然変異は、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤（ＥＧＦＲ−ＴＫＩ）に対する感受性と相関し、喫煙未経験者肺癌においてより頻繁である。
【００５１】
[0061]本明細書において、２８の喫煙未経験者肺癌症例のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）発現プロファイリングによって、異常に発現されるｍｉＲが同定され、これは喫煙者の肺癌でははるかに低く、そしてこれには、喫煙者症例において、以前同定されたｍｉＲ（例えば上方制御されるｍｉＲ−２１）および同定されていないｍｉＲ（例えば下方制御されるｍｉＲ−１３８）が含まれることが、現在、示されている。
【００５２】
[0062]これらのｍｉＲのいくつかの発現における変化は、ＥＧＦＲ突然変異を伴わないものよりも、ＥＧＦＲ突然変異を伴う症例において、より顕著であり：最も上方制御されるｍｉＲであるｍｉＲ−２１は、ＥＧＦＲ突然変異を伴う癌において、より豊富であった。肺癌細胞株におけるリン酸化ＥＧＦＲ（ｐ−ＥＧＦＲ）およびｍｉＲ−２１レベル間の有意な相関、ならびにＥＧＦＲ−ＴＫＩであるＡＧ１４７８によるｍｉＲ−２１の抑制によって、現在、ＥＧＦＲシグナル伝達経路が、ｍｉＲ−２１発現を正に制御することが示されている。突然変異体ＥＧＦＲ、ならびに高レベルのｐ−ＥＧＦＲおよびｍｉＲ−２１を伴う喫煙未経験者由来の肺腺癌細胞株Ｈ３２５５において、ｍｉＲ−２１のアンチセンス阻害は、ＡＧ１４７８が誘導するアポトーシスを増進させた。野生型ＥＧＦＲを伴う喫煙未経験者由来腺癌細胞株Ｈ４４１では、アンチセンスｍｉＲ−２１はＡＧ１４７８に付加的な効果を示すだけでなく、それ自体、アポトーシスを誘導した。ｍｉＲ−２１の異常に増加した発現は、活性化されたＥＧＦＲシグナル伝達経路によってさらに増進され、こうした発現は、喫煙未経験者における肺癌形成に役割を果たし、そしてＥＧＦＲ突然変異体および野生型症例両方における潜在的な療法ターゲットである。
【００５３】
[0063]本発明は、したがって、これらの新規発見に関連する材料および方法を提供する。特に、癌、特に肺癌を治療するのに有用な組成物を提供する。しかし、癌を治療するのに有用なさらなる組成物を同定する方法、癌を診断する方法、癌の予後を提供する方法、アポトーシスを誘導する方法などもまた提供する。これらの発見に関連する研究ツール、特にキット等もまた提供する。
【００５４】
[0064]略語
[0065]ＤＮＡ  デオキシリボ核酸
[0066]ｍＲＮＡ  メッセンジャーＲＮＡ
[0067]ＰＣＲ  ポリメラーゼ連鎖反応
[0068]プレｍｉＲ  前駆体マイクロＲＮＡ
[0069]ｑＲＴ−ＰＣＲ  定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応
[0070]ＲＮＡ  リボ核酸
[0071]用語
[0072]前述の一般的な説明および以下の詳細な説明は、例示および説明のみのためのものであり、そして本解説の範囲を限定することを意図されない。本出願において、具体的に別に明記しない限り、単数形の使用には、複数形が含まれる。
【００５５】
[0073]単語「ａ」または「ａｎ」の使用は、請求項および／または明細書において、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と組み合わせて用いた場合、「１つ」を意味する可能性もあるが、これはまた、「１以上」、「少なくとも１つ」、および「１つまたは１より多く」の意味とも一致する。
【００５６】
[0074]また、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」および「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅ）」の使用、またはこれらの語根の修飾、例えば限定されるわけではないが、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、「ｃｏｎｔａｉｎｅｄ」、および「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」は限定することを意図しない。用語「および／または」は、前後の用語が一緒にまたは別個に採用されうることを意味する。例示目的のためであるが、制限としてではなく、「Ｘおよび／またはＹ」は、「Ｘ」または「Ｙ」あるいは「ＸおよびＹ」を意味してもよい。
【００５７】
[0075]ｍｉＲはゲノム配列または遺伝子に由来することが理解される。これに関して、用語「遺伝子」は、わかりやすくするために、所定のｍｉＲに関して、前駆体ｍｉＲをコードするゲノム配列を指す。しかし、本発明の態様は、その発現に関与するｍｉＲのゲノム配列、例えばプロモーターまたは他の制御配列を伴うことも可能である。
【００５８】
[0076]用語「ｍｉＲ」は、一般的に、一本鎖分子を指すが、特定の態様において、本発明で実行される分子はまた、同じ一本鎖分子の別の領域に、または別の核酸に、部分的に相補的（鎖の長さに渡って１０〜５０％の間で相補的）、実質的に相補的（鎖の長さに渡って５０％より大きいが、１００％未満相補的）、または完全に相補的である、領域またはさらなる鎖も含むであろう。したがって、核酸は、１以上の相補鎖もしくは自己相補鎖（単数または複数）または分子を含む特定の配列の「相補体（単数または複数）」を含む分子を含んでもよい。例えば、前駆体ｍｉＲは最大１００％相補的な自己相補性領域を有してもよく、本発明のｍｉＲプローブは、そのターゲットに６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００％相補的であってもよいし、少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００％相補的であってもよい。
【００５９】
[0077]用語「その組み合わせ」は、本明細書において、該用語に先行する列挙された項目のすべての順列および組み合わせを指す。例えば「Ａ、Ｂ、Ｃ、またはその組み合わせ」は：Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ、またはＡＢＣ、および特定の文脈において順序が重要である場合、また、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＡＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＢＡＣ、またはＣＡＢの少なくとも１つを含むよう意図される。
【００６０】
[0078]別に示さない限り、技術用語は、慣用的使用にしたがって用いられる。分子生物学における一般的な用語の定義は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ，  Ｇｅｎｅｓ  Ｖ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ刊行，  １９９４（ＩＳＢＮ  ０−１９−８５４２８７−９）；  Ｋｅｎｄｒｅｗら（編），  Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．刊行，  １９９４（ＩＳＢＮ  ０−６３２−０２１８２−９）；およびＲｏｂｅｒｔ  Ａ．  Ｍｅｙｅｒｓ（編），  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，  ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｉｎｃ．刊行，  １９９５（ＩＳＢＮ  １−５６０８１−５６９−８）に見出されうる。
【００６１】
[0079]開示の多様な態様の再検討を容易にするため、特定の用語の以下の説明を提供する：
[0080]補助療法：一次治療の効果を改善するため、一次治療と組み合わせて用いられる治療。
【００６２】
[0081]臨床転帰：疾患または障害のための治療後、あるいは治療の非存在下での患者の健康状態を指す。臨床転帰には、限定されるわけではないが、死亡までの時間の長さの増加、死亡までの時間の長さの減少、生存可能性の増加、死亡リスクの増加、生存、無病生存率、慢性疾患、転移、進行したまたは侵襲性疾患、疾患再発、死亡、ならびに療法に対する好ましいまたは劣った反応が含まれる。
【００６３】
[0082]対照：「対照」は、実験試料、例えば患者から得られる腫瘍試料と比較するために用いられる試料または標準を指す。
【００６４】
[0083]サイトカイン：他の細胞の振る舞いに影響を及ぼす、非常に多様な造血および非造血細胞によって産生されるタンパク質。サイトカインは、自然免疫および適応免疫反応の両方に重要である。
【００６５】
[0084]生存減少：本明細書において、「生存減少」は、患者が死亡するまでの時間の長さの減少、または患者に関する死亡するリスクの増加を指す。
【００６６】
[0085]発現レベルの検出：例えば、「ｍｉＲまたはｍｉＲ発現レベルの検出」は、ｍｉＲまたは試料に存在するｍｉＲの量を定量化することを指す。当該技術分野に知られるかまたは本明細書に記載する方法いずれかを用いて、例えばｑＲＴ−ＰＣＲによって、特定のｍｉＲ、またはマイクロＲＮＡいずれかの発現の検出を達成してもよい。ｍｉＲ発現の検出には、ｍｉＲの成熟型、またはｍｉＲ発現と相関する前駆体型のいずれかの発現の検出が含まれる。典型的には、ｍｉＲ検出法は、配列特異的検出、例えばＲＴ−ＰＣＲによるものを伴う。当該技術分野に知られ、そして本明細書の配列番号におけるように提供される、前駆体および成熟ｍｉＲ核酸配列を用いて、ｍｉＲ特異的プライマーおよびプローブを設計してもよい。
【００６７】
[0086]マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）：遺伝子発現を制御する一本鎖ＲＮＡ分子。マイクロＲＮＡは、一般的に、長さ２１〜２３ヌクレオチドである。マイクロＲＮＡは、プリｍｉＲ（pri-miR）として知られる一次転写物から、前駆体（プレ）ｍｉＲと呼ばれる短いステムループ構造に、そして最終的に、機能する成熟マイクロＲＮＡにプロセシングされる。成熟マイクロＲＮＡ分子は、１以上のメッセンジャーＲＮＡ分子に部分的に相補的であり、そしてその主な機能は、遺伝子発現を下方制御することである。マイクロＲＮＡは、ＲＮＡｉ経路を通じて、遺伝子発現を制御する。
【００６８】
[0087]ｍｉＲ発現：本明細書において、「ｍｉＲ低発現」および「ｍｉＲ高発現」は、試料中に見られるｍｉＲのレベルを指す、相対的な用語である。いくつかの態様において、ｍｉＲ低発現および高発現は、対照試料および試験試料の群におけるｍｉＲレベルの比較によって決定される。次いで、試料中のｍｉの発現が、平均または中央値ｍｉＲ発現レベルより上（高発現）または下（低発現）であるかに基づいて、各試料に対して、低発現および高発現を割り当ててもよい。個々の試料に関しては、高発現または低発現を有することが知られる対照または参照試料に対して試料を比較することによって、あるいは標準値に比較することによって、ｍｉＲ高発現または低発現を決定してもよい。ｍｉＲ低発現および高発現には、ｍｉＲの前駆体または成熟型いずれか、あるいは両方の発現が含まれてもよい。
【００６９】
[0088]患者：本明細書において、用語「患者」には、ヒトおよび非ヒト動物が含まれる。治療のために好ましい患者はヒトである。「患者」および「被験体」は、本明細書において、交換可能に用いられる。
【００７０】
[0089]薬学的に許容されうるビヒクル：本開示で有用な薬学的に許容されうるキャリアー（ビヒクル）は、慣用的である。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｅ．  Ｗ．  Ｍａｒｔｉｎ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ，  第１５版（１９７５）は、１以上の療法化合物、分子または剤の薬学的送達に適した組成物および配合物を記載する。
【００７１】
[0090]一般的に、キャリアーの性質は、使用する特定の投与様式に応じるであろう。例えば、非経口配合物は、通常、薬学的および生理学的に許容されうる液体、例えば水、生理学的生理食塩水、平衡化塩溶液、水性デキストロース、グリセロール等をビヒクルとして含む、注射可能液体を含む。固形組成物（例えば粉末、丸剤、錠剤、またはカプセル型）に関しては、慣用的な非毒性固形キャリアーには、例えば、薬剤等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムが含まれてもよい。生物学的中性キャリアーに加えて、投与すべき薬学的組成物は、少量の非毒性補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤、保存剤、およびｐＨ緩衝剤等、例えば酢酸ナトリウムまたはモノラウリン酸ソルビタンを含有してもよい。
【００７２】
[0091]疾患の防止、治療または軽減：疾患の「防止」は、疾患の完全発展を阻害することを指す。「治療」は、疾患または病理学的状態が発展し始めた後、これらの徴候または症状を軽減する療法的介入を指す。「軽減」は、疾患の徴候または症状の数または重症度の減少を指す。
【００７３】
[0092]スクリーニング：本明細書において、「スクリーニング」は、こうした疾患に影響を及ぼす候補剤を評価し、そして同定するために用いられるプロセスを指す。当該技術分野に知られ、そして本明細書に記載するいくつかの技術のいかなる１つを用いて、例えばマイクロアレイ分析によって、またはｑＲＴ−ＰＣＲによって、マイクロＲＮＡの発現を定量化してもよい。
【００７４】
[0093]小分子：典型的には約１０００ダルトン未満、またはいくつかの態様において、約５００ダルトン未満の分子量を持つ分子であって、何らかの測定可能な度合いまで、ターゲット分子の活性を調節可能である、前記分子。
【００７５】
[0094]療法的：診断および治療の両方を含む包括的な用語。
【００７６】
[0095]療法剤：被験体に適切に投与された際、望ましい療法的または予防的効果を誘導可能な、化学的化合物、小分子、または他の組成物、例えばアンチセンス化合物、抗体、プロテアーゼ阻害剤、ホルモン、ケモカインまたはサイトカイン。
【００７７】
[0096]本明細書において、「候補剤」は、療法剤として機能可能であるかどうかを決定するスクリーニングのために選択される化合物である。「インキュベーションする」には、剤が細胞または組織と相互作用するのに十分な時間が含まれる。「接触させる」には、固体型または液体型の剤を細胞または組織とインキュベーションすることが含まれる。剤で細胞または組織を「治療する」には、剤と細胞または組織を接触させるかまたはインキュベーションすることが含まれる。
【００７８】
[0097]療法的に有効な量：剤で治療される被験体または細胞において、望ましい効果を達成するのに十分な、明記される薬学的剤または療法剤の量。剤の有効量は、いくつかの要因に応じ、こうした要因には、限定されるわけではないが、治療される被験体または細胞、および療法組成物の投与方式が含まれる。
【００７９】
[0098]本発明のいくつかの態様において、「対照」の使用が望ましい。これに関して、対照は、同じ患者から得た非癌性組織試料、または健康な被験体、例えば健康な組織ドナーから得た組織試料であってもよい。別の例において、対照は、歴史的値から計算された標準である。当該技術分野に知られる任意の方法にしたがって、腫瘍試料および非癌性組織試料を得てもよい。例えば、切除術を受けた癌患者から腫瘍および非癌性試料を得てもよいし、あるいは皮下針を用いた抽出によって、顕微解剖によって、またはレーザー捕捉によって、試料を得てもよい。例えば、屍体ドナーから、または健康なドナーから、対照（非癌性）試料を得てもよい。
【００８０】
[0099]いくつかの態様において、スクリーニングは、候補剤を細胞と接触させる工程を含む。細胞は患者から得た初代細胞であってもよいし、あるいは細胞は不死化または形質転換細胞であってもよい。
【００８１】
[00100]「候補剤」は、タンパク質、ペプチド、小分子、抗体または核酸などの任意のタイプの剤であってもよい。いくつかの態様において、候補剤はサイトカインである。いくつかの態様において、候補剤は小分子である。スクリーニングには、ハイスループットスクリーニング、および個々のまたは小さいグループの候補剤のスクリーニングの両方が含まれる。
【００８２】
[00101]本明細書のいくつかの方法において、試料中に存在するｍｉＲを同定することが望ましい。
【００８３】
[00102]前駆体マイクロＲＮＡ（プレｍｉＲ）および成熟ｍｉＲの配列は公的に入手可能であり、例えばＳａｎｇｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによってオンラインで入手可能なｍｉＲＢａｓｅデータベース（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３６：Ｄ１５４−Ｄ１５８，  ２００８；  Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３４：Ｄ１４０−Ｄ１４４，  ２００６；およびＧｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３２：Ｄ１０９−Ｄ１１１，  ２００４を参照されたい）を通じて入手可能である。現在開示される好ましいファミリーメンバーの前駆体および成熟型の配列を本明細書に提供する。
【００８４】
[00103]当該技術分野に周知であり（例えば、本明細書に援用される米国特許出願公報第２００６／０２１１０００号および第２００７／０２９９０３０号を参照されたい）、そして以下に記載する、いくつかの方法の任意の１つによって、ＲＮＡ発現の検出および定量化を達成してもよい。ＲＮＡファミリーメンバーに関する既知の配列を用いて、適切なように、以下に記載する検出法において使用するため、特異的プローブおよびプライマーを設計可能である。
【００８５】
[00104]いくつかの場合、ＲＮＡ検出法は、試料、例えば細胞または組織試料からの核酸の単離を必要とする。当該技術分野に知られる任意の適切な技術を用いて、ＲＮＡそして特にｍｉＲを含む核酸を単離してもよい。例えば、フェノールに基づく抽出は、ＲＮＡの単離のための一般的な方法である。フェノールに基づく試薬は、細胞および組織破壊、ならびにそれに続く混入物質からのＲＮＡの分離のため、変性剤およびＲＮアーゼ阻害剤の組み合わせを含有する。フェノールに基づく単離法は、１０〜２００ヌクレオチドの範囲のＲＮＡ種（例えば前駆体および成熟ｍｉＲ、５Ｓおよび５．８ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、ならびにＵ１小分子核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ））を回収可能である。さらに、ＴＲＩＺＯＬＴＭまたはＴＲＩ試薬ＴＭを用いるものなどの抽出法は、巨大および小分子のすべてのＲＮＡを精製し、そしてｍｉＲおよび小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含有する生物学的試料から総ＲＮＡを単離するのに効率的な方法である。
【００８６】
[00105]いくつかの態様において、マイクロアレイの使用が望ましい。マイクロアレイは、核酸、タンパク質、小分子、細胞または他の物質の顕微鏡的な規則正しいアレイであり、複雑な生化学的試料の並行分析を可能にする。ＤＮＡマイクロアレイは、マイクロチップ、ガラススライドまたは微小球体サイズのビーズであってもよい固体支持体に化学的に付着する、捕捉プローブとして知られる、異なる核酸プローブからなる。マイクロアレイを用いて、例えば多数のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）および／またはｍｉＲの発現レベルを同時に測定することも可能である。
【００８７】
[00106]ガラススライド上への微細な先端のピンでのプリンティング、あらかじめ作製したマスクを用いたフォトリソグラフィー、動的マイクロミラーデバイスを用いたフォトリソグラフィー、インクジェットプリンティング、または微小電極アレイ上の電気化学を含む、多様な技術を用いて、マイクロアレイを製作してもよい。
【００８８】
[00107]例えば、ｍｉＲのマイクロアレイ分析（これらの方法は、任意のＲＮＡ分析のために修飾された形式で使用可能であるが）を、当該技術分野に知られる任意の方法にしたがって達成してもよい（例えば、各々、本明細書に援用される、ＰＣＴ公報第ＷＯ２００８／０５４８２８号；  Ｙｅら，  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ９（４）：４１６−４２３，  ２００３；  Ｃａｌｉｎら，  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３５３（１７）：１７９３−１８０１，  ２００５を参照されたい）。１つの例において、ＲＮＡを細胞または組織試料から抽出し、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて、小分子ＲＮＡ（１８〜２６ヌクレオチドＲＮＡ）を総ＲＮＡよりサイズ選択する。オリゴヌクレオチドリンカーを小分子ＲＮＡの５’および３’端に付着させ、そして生じた連結産物を、１０サイクルの増幅を伴うＲＴ−ＰＣＲ反応のためのテンプレートとして用いる。センス鎖ＰＣＲプライマーは、５’端に付着したフルオロフォアを有し、それによって、ＰＣＲ産物のセンス鎖を蛍光標識する。ＰＣＲ産物を変性させ、そして次いでマイクロアレイにハイブリダイズさせる。アレイ上の対応するｍｉＲ捕捉プローブ配列に相補的である、ターゲット核酸と称されるＰＣＲ産物は、塩基対形成を通じて、捕捉プローブが固定されたスポットにハイブリダイズするであろう。次いで、スポットは、マイクロアレイレーザースキャナを用いて励起された際に、蛍光を生じるであろう。次いで、いくつかの陽性および陰性対照、ならびにアレイデータ規準化法を用いて、各スポットの蛍光強度を、特定のｍｉＲのコピー数に関して評価し、これが特定のｍｉＲ発現レベルの評価を生じるであろう。
【００８９】
[00108]別の方法において、細胞または組織試料から抽出される小分子ＲＮＡ分画（ｍｉＲを含む）を含有する総ＲＮＡを、小分子ＲＮＡのサイズ選択を伴わずに直接用いて、そしてＴ４  ＲＮＡリガーゼおよびどちらかの蛍光標識された短いＲＮＡリンカーを用いて３’端標識する。３０℃で２時間インキュベーションすることによって、ＲＮＡ試料を標識した後、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼを８０℃で５分間熱不活性化する。アレイ上の対応するｍｉＲ捕捉プローブ配列に相補的なフルオロフォア標識ｍｉＲは、塩基対形成を通じて、捕捉プローブが固定されたスポットにハイブリダイズするであろう。マイクロアレイスキャニングおよびデータプロセシングを上記のように行う。
【００９０】
[00109]使用可能ないくつかのタイプのマイクロアレイがあり、これにはスポット化オリゴヌクレオチドマイクロアレイ、作製済みのオリゴヌクレオチドマイクロアレイおよびスポット化長鎖オリゴヌクレオチドアレイが含まれる。スポット化オリゴヌクレオチドマイクロアレイにおいて、捕捉プローブは、ｍｉＲ配列に相補的なオリゴヌクレオチドである。このタイプのアレイは、典型的には、２つの異なるフルオロフォアで標識された、比較しようとする２つの試料（例えば非癌性組織および癌性または試料組織）由来のサイズ選択された小分子ＲＮＡの増幅ＰＣＲ産物とハイブリダイズされる。あるいは、小分子ＲＮＡ分画（ｍｉＲを含む）を含有する総ＲＮＡを２つの試料から抽出し、そして小分子ＲＮＡのサイズ選択を伴わずに、そしてＴ４  ＲＮＡリガーゼおよび２つの異なるフルオロフォアで標識された短鎖ＲＮＡリンカーを用いて３’端標識した。試料を混合し、そして単一のマイクロアレイにハイブリダイズさせ、これを次いでスキャンして、１つのアッセイにおいて、上方制御されたおよび下方制御されたｍｉＲ遺伝子の視覚化を可能にする。
【００９１】
[00110]作製済みのオリゴヌクレオチドマイクロアレイまたは単一チャネルマイクロアレイにおいて、プローブは、既知のまたは予測されるｍｉＲの配列にマッチするように設計される。完全ゲノムを含む、商業的に入手可能な設計がある（例えばＡｆｆｉｍｅｔｒｉｘまたはＡｇｉｌｅｎｔから）。これらのマイクロアレイは、遺伝子発現の絶対値の概算を提供し、そしてしたがって、２つの状態の比較は、２つの別個のマイクロアレイの使用を必要とする。
【００９２】
[00111]スポット化長鎖オリゴヌクレオチドアレイは、５０〜７０量体のオリゴヌクレオチド捕捉プローブで構成され、そしてインクジェットまたはロボットプリンティングのいずれかによって産生される。短鎖オリゴヌクレオチドアレイは、２０〜２５量体オリゴヌクレオチドプローブで構成され、そしてフォトリソグラフィー合成（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）によって、またはロボットプリンティングによって産生される。
【００９３】
[00112]いくつかの態様において、定量的ＲＴ−ＰＣＲの使用が望ましい。定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）は、ポリメラーゼ連鎖反応産物の量を迅速に測定するのに用いられる、ポリメラーゼ連鎖反応の修飾法である。ｑＲＴ−ＰＣＲは、一般的に、遺伝子配列、例えばｍｉＲが試料中に存在するかどうか、そして存在する場合には、試料中のコピー数を決定する目的のために用いられる。ｍｉＲを含む核酸分子の発現を決定可能な任意のＰＣＲ法が本開示の範囲内に属する。当該技術分野に知られるｑＲＴ−ＰＣＲ法のいくつかの変型があり、このうち３つを以下に記載する。
【００９４】
[00113]定量的ポリメラーゼ連鎖反応のための方法には、限定されるわけではないが、アガロースゲル電気泳動を介するもの、ＳＹＢＲグリーン（二本鎖ＤＮＡ色素）を用いるもの、および蛍光レポータープローブを用いるものが含まれる。後者の２つは、リアルタイムで分析可能である。
【００９５】
[00114]アガロースゲル電気泳動を用いて、増幅用の既知の濃度の類似のサイズのターゲットＤＮＡ部分とともに、未知の試料および既知の試料を調製する。どちらの反応も同一条件（好ましくは同じプライマー、または少なくとも類似のアニーリング温度のプライマーを用いる）において、同じ時間、反応させる。アガロースゲル電気泳動を用いて、その元来のＤＮＡから反応産物を分離し、そしてプライマーを取り置く。既知および未知の試料の相対量を測定して、未知の量を決定する。
【００９６】
[00115]ＳＹＢＲグリーン色素の使用は、アガロースゲル法より正確であり、そしてリアルタイムで結果を生じうる。ＤＮＡ結合色素は、すべての新規合成二本鎖ＤＮＡに結合し、そして蛍光強度増加を測定し、こうして最初の濃度の決定を可能にする。しかし、ＳＹＢＲグリーンは、いかなる予期せぬＰＣＲ産物、ならびにプライマー二量体も含む、すべての二本鎖ＤＮＡを標識するので、複雑化する要因およびアーチファクトにつながる可能性もある。反応は、蛍光二本鎖ＤＮＡ色素を添加して、通常と同様に調製する。反応を実行し、そして蛍光レベルを監視する（色素は二本鎖ＤＮＡに結合した場合にのみ蛍光を生じる）。標準試料または標準曲線を参照して、ＰＣＲ中の二本鎖ＤＮＡ濃度を決定してもよい。
【００９７】
[00116]蛍光レポータープローブ法は、プローブ配列のみを定量化し、そしてすべての二本鎖ＤＮＡを定量化しないように、配列特異的な核酸に基づくプローブを用いる。これは一般的に、蛍光レポーターおよび隣接位に保持される消光剤を含むＤＮＡに基づくプローブ（いわゆる二重標識プローブ）を用いて実行される。消光剤に対してレポーターがごく近接していると、蛍光が防止され；蛍光が検出されるのは、プローブが分解した際のみである。このプロセスは、関与するポリメラーゼの５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性に依存する。
【００９８】
[00117]二重標識プローブを添加して、リアルタイム定量的ＰＣＲ反応を調製する。二本鎖ＤＮＡテンプレートを変性させた際、プローブは、テンプレートＤＮＡの関心対象の領域中の相補配列に結合可能である。ＰＣＲ反応混合物を加熱してポリメラーゼを活性化させた際、ポリメラーゼは、プライミングされた一本鎖テンプレートＤＮＡに対する相補鎖を合成し始める。重合が進むにつれて、ポリメラーゼは相補配列に結合したプローブに到達し、次いで、プローブは、ポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性のために加水分解され、それによって蛍光レポーターおよび消光剤分子が分離する。これは蛍光の増加を生じ、これを検出する。リアルタイムＰＣＲ反応の熱サイクリング中、各ＰＣＲサイクル中に加水分解された二重標識プローブから放出された際の蛍光の増加を監視し、これによって、ＤＮＡの最終の、そしてしたがって最初の量の正確な決定が可能になる。
【００９９】
[00118]いくつかの態様において、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの使用が望ましい。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）は、単一細胞レベルに、核酸ハイブリダイゼーション技術を適用し、そして当てはめ（ｅｘｔｒａｐｏｌａｔｅ）、そして細胞化学、免疫細胞化学および免疫組織化学の技術と組み合わされて、維持しそして同定しようとする形態の維持および細胞マーカーの同定を可能にし、そして組織および血液試料などの集団内の特定の細胞に対する配列の位置決定を可能にする。ＩＳＨは、相補的核酸を用いるハイブリダイゼーションの一種であり、組織の部分または切片における１以上の特異的核酸配列を位置決定する（ｉｎ  ｓｉｔｕ）か、または組織が十分に小さい場合は、全組織において位置決定する（全載ＩＳＨ）。ＲＮＡ  ＩＳＨを用いて、組織における発現パターン、例えばｍｉＲ発現をアッセイしてもよい。
【０１００】
[00119]試料細胞または組織を処理し、浸透性を増加させて、プローブ、例えばｍｉＲ特異的プローブが細胞に進入するのを可能にする。プローブを、処理した細胞に添加し、適切な温度でハイブリダイズを可能にし、そして過剰なプローブを洗い流す。相補的プローブを、放射性、蛍光または抗原性タグで標識し、オートラジオグラフィ、蛍光顕微鏡またはイムノアッセイを用いて、組織におけるプローブの位置および量を決定してもよい。
【０１０１】
[00120]いくつかの態様において、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲの使用が望ましい。ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲは、ＩＳＨの前にターゲット核酸配列のＰＣＲに基づく増幅を行う。ＲＮＡを検出するため、細胞内逆転写工程を導入して、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲの前に、ＲＮＡテンプレートから相補ＤＮＡを生成する。これによって、低コピー数ＲＮＡ配列の検出が可能になる。
【０１０２】
[00121]ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲの前に、細胞または組織試料を固定し、そして透過処理して形態を保持し、そして増幅しようとする細胞内配列へのＰＣＲ試薬のアクセスを可能にする。次に、懸濁中に保持された損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）細胞中、または直接、細胞遠心分離調製物中、またはガラススライド上の組織切片中のいずれかで、ターゲット配列のＰＣＲ増幅を行う。前者のアプローチでは、ＰＣＲ反応混合物中に懸濁された固定細胞を、慣用的なサーマルサイクラーを用いて熱サイクリングする。ＰＣＲ後、ガラススライド上に細胞を細胞遠心分離して、ＩＳＨまたは免疫組織化学によって細胞内ＰＣＲ産物を視覚化する。カバーガラスの下、試料にＰＣＲ混合物を重層し、これを次いで密封して反応混合物の蒸発を防止することによって、ガラススライド上のｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲを行う。ガラススライドを、慣用的なまたは特別に設計されたサーマルサイクラーの加熱ブロック上に直接置くか、あるいは熱サイクリングオーブンを用いることによるかのいずれかで、熱サイクリングを達成する。
【０１０３】
[00122]一般的に、２つの異なる技術、ＰＣＲ産物特異的プローブを用いたＩＳＨによる間接的ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲ、または熱サイクリング中にＰＣＲ産物内に取り込まれている標識ヌクレオチド（例えば、ジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰ、フルオレセイン−ｄＵＴＰ、３Ｈ−ＣＴＰまたはビオチン−１６−ｄＵＴＰ）の直接検出を通じた、ＩＳＨを伴わない直接ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲのうちの１つによって、細胞内ＰＣＲ産物の検出を達成する。
【０１０４】
[00123]示差的に発現されるｍｉＲ、ならびに肺癌の予後の予測マーカーとしての、および肺癌の治療のための療法剤の同定のためのｍｉＲの使用
[00124]ｍｉＲの特定の発現パターンは、ＥＧＦＲ突然変異体状態指標とともに、ＥＧＦＲ突然変異体患者における生存予後の予測因子であることを本明細書に開示する。示差的に発現されるｍｉＲ（この例を図１３−表６に示す）を伴うＥＧＦＲ突然変異体癌細胞試料（例えば組織生検試料）は、野生型ＥＧＦＲ腫瘍組織と比較した際、生存減少を予測する。したがって、腫瘍において示差的に発現されるｍｉＲ状態を、肺癌患者の予後および治療における臨床ツールとして用いることも可能である。本明細書において、「劣った予後」は、一般的に、生存の減少、あるいは言い換えると、死亡リスクの増加または死亡までの時間の減少を指す。劣った予後はまた、疾患重症度の増加、例えば他の臓器への癌の蔓延（転移）の増加も指してもよい。１つの態様において、それぞれのマーカーは、対照に比較して、発現の少なくとも１．５倍の増加または減少を示す。他の態様において、劣った予後は、野生型腫瘍対照の数値に比較して、マーカーの少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、または少なくとも４倍の増加または減少によって示される。
【０１０５】
[00125]候補剤をスクリーニングして、疾患治療のための療法剤を同定する方法は、当該技術分野に周知である。ＲＮＡおよびタンパク質の発現レベルを検出する方法が当該技術分野に知られ、そして本明細書に記載され、これには例えば、限定されるわけではないが、マイクロアレイ分析、ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲを含む）、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲ、およびノーザンブロット分析がある。１つの態様において、スクリーニングはハイスループットスクリーニングを含む。別の態様において、候補剤は個々にスクリーニングされる。
【０１０６】
[00126]候補剤は任意のタイプの分子であってもよく、これには例えば、限定されるわけではないが、核酸分子、タンパク質、ペプチド、抗体、脂質、小分子、化学薬品、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、あるいは直接または間接的にのいずれかで癌疾患状態（単数または複数）を改変しうる任意の他のタイプの分子がある。いくつかの態様において、候補剤は、ＮＦκＢ／ＩＬ−６シグナル伝達経路において役割を果たす分子である。他の態様において、候補剤は、ＩＬ−１０、ＳＴＡＴ３またはインターフェロン誘導性因子シグナル伝達ネットワークにおいて役割を果たす分子である。１つの態様において、候補剤はサイトカインである。別の態様において、候補剤は小分子である。
【０１０７】
[00127]本明細書にやはり記載するのは、ＥＧＦＲ突然変異体喫煙未経験者の癌を特徴付けるための方法であって、ＥＧＦＲ突然変異体喫煙未経験者の癌の少なくとも１つの特徴が：ＥＧＦＲ突然変異体癌の存在または非存在；ＥＧＦＲ突然変異体癌の診断；ＥＧＦＲ突然変異体癌の予後；療法転帰予測；療法転帰監視；ＥＧＦＲ突然変異体癌の治療に対する適切さ、例えば化学療法治療および／または放射線治療に対するＥＧＦＲ突然変異体癌の適切さ；ホルモン治療に対するＥＧＦＲ突然変異体癌の適切さ；侵襲性手術による除去に関するＥＧＦＲ突然変異体癌の適切さ；併用アジュバント療法に対するＥＧＦＲ突然変異体癌の適切さ；を含む群の１以上より選択される、前記方法である。
【０１０８】
[00128]本明細書にやはり記載するのは、ＥＧＦＲ突然変異体癌を検出するためのキットであり、該キットには、ｍｉＲまたはＥＧＦＲ突然変異体癌において示差的に発現されると本明細書に開示されるｍｉＲを含む少なくとも１つの検出プローブが含まれてもよい。キットはオリゴヌクレオチドアレイの形であってもよいし、またはオリゴヌクレオチドアレイを含んでもよい。
【０１０９】
[00129]本明細書にやはり記載するのは、治療に関する、ＥＧＦＲ突然変異体癌患者の適切さを決定するための方法であって：ｉ）ＥＧＦＲ突然変異体癌に罹患した患者から少なくとも１つの組織試料を単離し；ｉｉ）少なくとも１つの組織試料の特徴付けを行い、そして／または検出プローブを利用して、ＥＧＦＲ突然変異体示差ｍｉＲ発現パターンを同定し、ｉｉｉ）工程ｉｉ）で同定した少なくとも１つの特徴に基づいて、患者の生理学的状態を診断し；ｉｖ）工程ｉｉｉ）で得た診断に基づいて、患者がＥＧＦＲ突然変異体癌の治療から利益を受けるかどうかを決定する工程を含む、前記方法である。特定の態様において、癌の少なくとも１つの特徴は：癌の存在または非存在；癌のタイプ；癌の起源；癌の診断；癌の予後；療法転帰予測；療法転帰監視；治療に対する癌の適切さ、例えば化学療法治療および／または放射線治療に対する癌の適切さ；ホルモン治療に対する癌の適切さ；侵襲性手術による除去に関する癌の適切さ；併用アジュバント療法に対する癌の適切さ；を含む群の１以上より選択される。
【０１１０】
[00130]本明細書にやはり記載するのは、治療に関する癌の適切さを決定するための方法であって、癌の少なくとも１つの特徴が、治療に対する癌の適切さ、例えば化学療法治療および／または放射線治療に対する癌の適切さ；ホルモン治療に対する癌の適切さ；侵襲性手術による除去に関する癌の適切さ；併用アジュバント療法に対する癌の適切さ；を含む群の１以上より選択される、前記方法である。
【０１１１】
[00131]本明細書にやはり記載するのは、癌患者のありうる予後を決定するための方法であって：ｉ）癌に罹患した患者から少なくとも１つの組織試料を単離し；そしてｉｉ）少なくとも１つの組織試料を特徴付けして、ＥＧＦＲ突然変異体ｍｉＲ示差発現パターンを同定する工程を含み；特徴が癌患者のありうる予後の決定を可能にする、前記方法である。
【０１１２】
[00132]本発明は、以下の実施例においてさらに定義され、ここで、別に言及しない限り、すべての部分および割合は重量であり、そして度は摂氏である。これらの実施例は、本発明の好ましい態様を示すが、例示目的のためのみに提供されることを理解しなければならない。上記考察およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的な特徴を確認可能であり、そして本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明の多様な変化および修飾を作製して、多様な使用および条件に適応させることも可能である。本明細書において言及される特許および非特許文献を含むすべての刊行物は、本明細書に完全に援用される。以下の実施例は、本発明の特定の好ましい態様を例示するよう意図され、そしてそう明記されない限り、請求項に定義するような本発明の範囲を限定するように解釈されてはならない。
【０１１３】
[00133]本発明の価値は、したがって、本明細書の実施例を参照することによって理解されうる。
【実施例】
【０１１４】
[00134]実施例Ｉ
[00135]喫煙未経験者由来の肺癌におけるマイクロＲＮＡ発現プロフィール
[00136]喫煙未経験者（図８−表１および図９−表２）由来の肺癌および非癌性肺組織の２８のマッチした対において、オハイオ州ｍｉＲマイクロアレイ・バージョン３．０（２１）を用いることによって、ｍｉＲ発現プロフィールを調べた。
【０１１５】
[00137]Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｒａｎｃｈ（ＢＲＢ）アレイツールを用いたクラス比較分析において、１８のｍｉＲが、非癌性組織に比較して、癌において示差的に発現されることが見出された（ｐ＜０．０１、偽発見率（ＦＤＲ）＜０．１５）（図１０−表３）。
【０１１６】
[00138]これらの１８のｍｉＲの発現プロフィールは、癌および対の非癌性組織間を区別し、３近傍法を用いると８４％の予測正確さであり、そしてＢＲＢアレイツール内のサポートベクターマシーンアルゴリズムを用いると８２％の予測正確さであった（１０倍交差検定を１００回反復）。
【０１１７】
[00139]５つのｍｉＲが癌組織においてより高いレベルで発現され、ｍｉＲ−２１は最大２．３５倍濃縮された。１３のｍｉＲの発現レベルは癌においてより低く、ｍｉＲ−４８６およびｍｉＲ−１２６＊は最大０．４５倍抑制された。
【０１１８】
[00140]２つの異なるプローブによって単一のｍｉＲが同定され（ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−５２１およびｍｉＲ−５１６ａ）、単一のステムループプレｍｉＲから２つの成熟ｍｉＲが生成され（ｍｉＲ−１２６およびｍｉＲ−１２６＊）、そして１より多くのｍｉＲが染色体でクラスター形成し、そしておそらく同時制御されている（６ｑ１３上のｍｉＲ−３０ａおよびｍｉＲ−３０ｃ；８ｑ２４．２２上のｍｉＲ−３０ｂおよびｍｉＲ−３０ｄ；ならびに１９ｑ１３．４１上のｍｉＲ−５１６ａ、ｍｉＲ−５２０およびｍｉＲ−５２１）ことはすべて、該分析の妥当性を裏付けた。
【０１１９】
[00141]喫煙未経験者肺腺癌症例のｍＲＮＡマイクロアレイデータ（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ／、寄託番号＝ＧＳＥ１００７２）はまた、２つの宿主遺伝子、ＴＭＥＭ４９およびＥＧＦＬ７（図１０−表３）が、内在ｍｉＲ（それぞれ、ｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−１２６／１２６＊）と同じ方向に、癌および非癌性組織間で示差的に発現されることも示した。３つのｍｉＲ（ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１２６およびｍｉＲ−４８６）の発現レベルを、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によって調べた（図４Ａ〜４Ｃ）。ｍｉＲ−２１発現は、非癌性組織におけるより、癌組織において有意により高く（ｐ＜０．０５、対応のあるｔ検定）（図４Ａ）、そしてｍｉＲ−１２６およびｍｉＲ−４８６は、癌において有意により低いレベルで発現され（ｐ＜０．０５、対応のあるｔ検定）（図４Ｂおよび図４Ｃ）、マイクロアレイ分析の結果がさらに検証された。
【０１２０】
[00142]喫煙者に対する喫煙未経験者由来の肺癌における示差ｍｉＲプロフィール
[00143]喫煙状態に関連する、ｍｉＲ発現における癌関連変化を同定するため、本発明者らは、本研究の喫煙未経験者の症例のｍｉＲ発現プロフィールと、本発明者らの先の研究（Ｙａｎａｉｈａｒａ  Ｎら（２００６）  Ｕｎｉｑｕｅ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｉｎ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ９：１８９−１９８）における５８の喫煙者肺腺癌症例、およびさらなる２３の喫煙者肺腺癌症例（図１１−表４）を比較した。
【０１２１】
[00144]５つのｍｉＲでは、喫煙未経験者および喫煙者の症例において、共通した発現変化が同定され、このなかにｍｉＲ−２１の増加があった（図１２−表５）。２つのｍｉＲ、ｍｉＲ−１３８およびｌｅｔ−７ｃのみが、喫煙未経験者症例において有意に変化する（どちらも下方制御される）一方、３６のｍｉＲの発現改変は、喫煙者症例と優先的に関連し（図１２−表５）、これはおそらく、喫煙者由来肺癌において、より広範囲に遺伝子的およびエピジェネティックな変化が多いことを反映する。
【０１２２】
[00145]本発明者らは、ｑＲＴ−ＰＣＲによって、喫煙未経験者腺癌におけるｍｉＲ−１３８の特異的下方制御、ならびに喫煙状態に関わらないｍｉＲ−２１の上方制御およびｍｉＲ−１２６＊の下方制御を検証した（図５）。興味深いことに、ｍｉＲ−１３８は染色体３ｐ２１．３３に位置し、これは肺癌抑制因子遺伝子を所持する候補遺伝子座であり、そして多様な細胞性およびウイルス性の発癌機構が作用するヒト・テロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）遺伝子をターゲットとすると報告された。肺癌の病因におけるこのｍｉＲの役割は、さらなる研究に値する。
【０１２３】
[00146]ＥＧＦＲ遺伝子突然変異に関連するｍｉＲ発現プロフィール
[00147]喫煙未経験者由来の２８の肺癌組織におけるＤＮＡ配列決定によって、ＥＧＦＲ遺伝子の状態を決定した（図９−表２）。６つの症例は、ＥＧＦＲのチロシンキナーゼドメインに活性化突然変異を有することが見出され；４つの症例には、コドン８５８でのロイシンからアルギニンへのアミノ酸置換（Ｌ８５８Ｒ）が見られ；１つにはコドン８６１でのロイシンからグルタミン酸へのアミノ酸置換（Ｌ８６１Ｅ）が見られ；そして１つには、コドン７４７〜７５２のインフレーム欠失（ΔＬ７４７〜Ｓ７５２）が見られた。２２のＥＧＦＲ野生型および６つのＥＧＦＲ突然変異体症例間のｍｉＲ発現のクラス比較分析によって、ＥＧＦＲ突然変異体症例において、有意により豊富であるかまたはより少ない、１２のｍｉＲが見出された（ｐ＜０．０１、ＦＤＲ＜０．１５）（図１３−表６）。
【０１２４】
[00148]１２のｍｉＲのうち１０（ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−４８６、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１２６＊、ｍｉＲ−１３８、ｍｉＲ−５２１、ｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−３０ｄおよびｍｉＲ−３０ａ）が、非癌性組織対癌の比較において、同じ方向に変化していると上記で同定され（図１０−表３）、これによって、ＥＧＦＲ突然変異が、喫煙未経験者における肺癌形成と関連するいくつかのｍｉＲの異常な制御を強いている可能性もあることが示された。癌対非癌性組織において、それぞれ、最も上方制御されているおよび下方制御されている、ｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−４８６は、再び、ＥＧＦＲ突然変異体および野生型癌間で最大の相違を示した（それぞれ、〜１．７倍および０．６０倍）。図４に示すｑＲＴ−ＰＣＲデータは、限定された数の症例に対して行われ、それによって、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１２６またはｍｉＲ−４８６発現のいずれにおけるＥＧＦＲ突然変異体および野生型症例間の統計的に有意な相違を示す能力も限定されているが、癌において最高レベルのｍｉＲ−２１を発現している３つの症例（症例２４、２５および２８）はすべて、ＥＧＦＲの活性化突然変異を有したことに注目すべきである（図４および図９−表２）。
【０１２５】
[00149]肺癌細胞株におけるｍｉＲ−２１の発現およびＥＧＦＲシグナル伝達状態
[00150]癌対非癌性組織において最も顕著に増加し、そしてＥＧＦＲ−ＴＫＩに対する感受性の指標となるＥＧＦＲ突然変異と関連していることから、ｍｉＲ−２１をさらなる分析のために選択した。ｍｉＲ−２１発現レベルおよびＥＧＦＲシグナル伝達経路の状態間の相関を調べるため、８つの非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞株をウェスタンブロット（図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃ）およびｑＲＴ−ＰＣＲ分析で調べた（図１Ａ）。
【０１２６】
[00151]この中で、３つの腺癌細胞株は、ＥＧＦＲに関して突然変異体であった：Ｈ３２５５はＬ８５８Ｒを含み；Ｈ１９７５はＬ８５８Ｒおよびコドン７９０でのスレオニンからメチオニンへの置換（Ｔ７９０Ｍ）の両方を含み；そしてＨ１６５０はコドン７４６から７５０のインフレーム欠失（ΔＥ７４６−Ａ７５０）を含んだ。これらの３つのＥＧＦＲ突然変異体細胞株は、高レベルのリン酸化ＥＧＦＲ（ｐ−ＥＧＦＲ）、ならびに増加した量の総ＥＧＦＲタンパク質およびリン酸化Ａｋｔ（ｐ−Ａｋｔ）の誘導を有し（図６Ｃ）、これは、これらの細胞におけるＥＧＦＲシグナル伝達経路の恒常的活性化と一致した。３つのうち２つ（Ｈ３２５５およびＨ１９７５）は上昇したレベルのｍｉＲ−２１を発現したが、第三の細胞株（Ｈ１６５０）は上昇したレベルでは発現しなかった（図１Ａ）。
【０１２７】
[00152]検出可能なレベルのｐ−ＥＧＦＲを伴う（Ｈ４４１）または伴わない（Ａ５４９およびＨ１２９９）、５つのＥＧＦＲ野生型細胞株のうちの３つ（図６ＡおよびＢ）もまた、対照非形質転換細胞よりも有意により高いレベルのｍｉＲ−２１を発現した（図１Ａ）。ｍｉＲ−２１およびｐＥＧＦＲレベルの定量的比較によって、これらの２つの間で、有意な正の相関が示された（Ｐｅａｒｓｏｎ相関、ｒ＝０．７１、ｐ＜０．０５）（図１Ｂ）。これらの結果によって、活性化されたＥＧＦＲシグナル伝達経路は、ｍｉＲ−２１制御の主要な、しかし単独ではない機構であることが示唆される。ｍｉＲ−２１発現および／またはＥＧＦＲ状態が、最大阻害濃度の半分（ＩＣ５０）として示される、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ、ＡＧ１４７８に対する感受性と相関することが見出されたこともまた注目に値した（図１Ａ）：ＡＧ１４７８で細胞増殖阻害を示す５つの細胞株は、突然変異体ＥＧＦＲを有する（Ｈ１６５０）か、または＞２倍増加したレベルでｍｉＲ−２１を発現する（Ｈ４４１およびＡ５４９）か、あるいはその両方であった（Ｈ３２５５およびＨ１９７５）。ｍｉＲ−２１の機能アッセイのため、喫煙未経験者の癌由来の２つの肺腺癌細胞株を選択した（以下を参照されたい）：ＡＧ１４７８に高い感受性を持つ（ＩＣ５０、０．３μＭ）Ｈ３２５５は、突然変異体ＥＧＦＲおよび最高レベルのｍｉＲ−２１を伴う喫煙未経験者肺癌症例（例えば、図４Ａおよび図９−表２の症例番号２４、２５および２８）を模倣し；そしてＡＧ１４７８に対して中程度の感受性を持つ（ＩＣ５０、１０μＭ）Ｈ４４１は、野生型ＥＧＦＲを持つが、なお有意に増加したレベルのｍｉＲ−２１を持つもの（例えば図４Ａおよび図９−表２の症例番号５および２３）を模倣した。
【０１２８】
[00153]活性化されたＥＧＦＲシグナル伝達は、ｍｉＲ−２１発現を増進させる
[00154]活性化されたＥＧＦＲシグナル伝達が、ｍｉＲ−２１発現レベルの上昇に関与しているかどうかを実験的に検証するため、ＥＧＦＲ突然変異体Ｈ３２５５細胞を、ＥＧＦの存在下または非存在下でＡＧ１４７８で処理した（図２）。
【０１２９】
[00155]２μＭまたは１０μＭいずれかのＡＧ１４７８は、ｐ−ＥＧＦＲおよびｐ−Ａｋｔの減少によって示されるように、ＥＧＦリガンド刺激を伴うまたは伴わない条件下で、ＥＧＦＲシグナル伝達を効率的に阻害し（図２Ａ）、これはこの細胞株における０．３μＭのＩＣ５０値と一致した。ＥＧＦの非存在下でのｍｉＲ−２１発現レベルは、どちらの濃度のＡＧ１４７８での処理によっても有意に抑制された（ｐ＜０．０１、対応のあるｔ検定）（図２Ｂ、左）。ＥＧＦを添加すると、ｍｉＲ−２１発現の〜２．５倍の上方制御が生じ、これはなお、いずれの濃度のＡＧ１４７８処理によっても基底レベルに戻るまで阻害された（ｐ＜０．０５、対応のあるｔ検定）（図２Ｂ、右）。
【０１３０】
[00156]これらの結果は、ｍｉＲ−２１発現が、活性化ＥＧＦＲ突然変異を持つ癌細胞において活性化されたＥＧＦＲシグナル伝達によって正に制御されることを示し、そしてＥＧＦＲ−ＴＫＩがｍｉＲ−２１の異常な増加を有効に抑制しうることを示す。野生型ＥＧＦＲを持つＨ４４１細胞において、１０μＭのＡＧ１４７８（この細胞株におけるＩＣ５０値と同等）はｍｉＲ−２１発現を有意に抑制した（ｐ＜０．０５、対応のあるｔ検定）が、２μＭでは抑制しなかった（図７）。
【０１３１】
[00157]したがって、Ｈ４４１細胞における野生型ＥＧＦＲからの活性化されたシグナル伝達（図６Ｂ）は、おそらく、自己が産生したトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−アルファ刺激を通じて、やはり、ＡＧ１４７８によって阻害可能であり、ｍｉＲ−２１の抑制を生じる。
【０１３２】
[00158]ｍｉＲ−２１のアンチセンス阻害は、ＥＧＦＲ−ＴＫＩと協調してアポトーシスを誘導する
[00159]喫煙未経験者由来肺癌において上昇したｍｉＲ−２１発現の生物学的活性を調べるため、Ｈ３２５５およびＨ４４１細胞を、ｍｉＲ−２１をターゲットとするアンチセンスオリゴヌクレオチド（アンチｍｉＲ−２１）でトランスフェクションした。これらの細胞におけるｍｉＲ−２１のアンチセンス仲介抑制をｑＲＴ−ＰＣＲによって確認した（図３Ａ）。ｍｉＲ−２１は、報告によれば抗アポトーシス活性を有しているため、本発明者らは、本明細書において、ｍｉＲ−２１の阻害がこれらの細胞においてアポトーシスを誘導するかどうかを、カスパーゼ−３およびカスパーゼ−７酵素活性を測定するアッセイによって決定した（図３Ｂおよび３Ｃ）。Ｈ３２５５細胞において、アンチｍｉＲ−２１は、単独ではアポトーシスを誘導しなかった（図３Ｂ、左）。しかし、特に、０．２μＭ（ＩＣ５０値よりわずかに低い濃度）のＡＧ１４７８と組み合わせて用いた際、アンチｍｉＲ−２１は、ＡＧ１４７８が誘導するアポトーシス反応を有意に増進した（図３Ｂ、右）。Ｈ４４１細胞において、アンチｍｉＲ−２１はそれ自体で、アポトーシス反応の有意な増加を生じた（図３Ｃ、左）が、これは１０μＭ（ＩＣ５０値と同等の濃度）でのＡＧ１４７８処理よりも有効でなかった。Ｈ３２５５細胞で観察された併用効果と同様に、アンチｍｉＲ−２１は、Ｈ４４１細胞において、１０μＭのＡＧ１４７８によって誘導されるアポトーシス反応をさらに増進した（図３Ｃ、右）。
【０１３３】
[00160]アポトーシスに対するアンチｍｉＲ−２１の影響を、アポトーシス反応におけるカスパーゼ−３の主な切断ターゲットであるポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）のウェスタンブロット分析によってさらに立証した（図３Ｄ）。アンチｍｉＲ−２１およびＡＧ１４７８両方で処理したＨ３２５５細胞において、そしてＡＧ１４７８の存在下および非存在下でアンチｍｉＲ−２１で処理したＨ４４１細胞において、未切断ＰＡＲＰの量は顕著に減少し、ここで、アンチｍｉＲ−２１はカスパーゼ３／７活性の有意な増加を引き起こした。
【０１３４】
[00161]実施例Ｉの考察
[00162]実施例Ｉは、ここで、喫煙未経験者における肺癌におけるｍｉＲ発現プロフィールを初めて解明した。該プロフィールを喫煙者の症例のものと比較し、そしてＥＧＦＲ遺伝子の状態にしたがってデータを分析することによって、実施例Ｉは、喫煙未経験者における肺癌の新規分子シグネチャーを示す：
１）比較的少数のｍｉＲの発現変化が、喫煙未経験者における肺癌形成に関与している；
２）ＥＧＦＲ突然変異は、ｍｉＲ発現のこれらの変化のいくつか、例えばｍｉＲ−２１の増加を強化している可能性もある；
３）長らく探し求められてきた肺癌抑制因子遺伝子を所持する染色体領域、３ｐ２１．３３上のｍｉＲ−１３８は、喫煙未経験者症例において、優先的に下方制御されている；そして
４）ｍｉＲ−２１は、喫煙未経験者および喫煙者症例の両方において、最も異常に増加するｍｉＲの１つである。
【０１３５】
[00163]これらの発見によって、ｍｉＲ−２１が、肺癌形成において発癌上の役割を果たしていると同定された。したがって、本発明者らは、喫煙未経験者、ならびに喫煙者の肺癌治療における新規分子ターゲットの候補としてこれを選択した。理論によって束縛されることは望ましくないが、ＥＧＦＲ突然変異およびｍｉＲ−２１上方制御の間の関連を考慮すると、本発明者らは、本明細書において、現在、このｍｉＲは、その有効性がＥＧＦＲ遺伝子状態および患者の喫煙歴と相関するＥＧＦＲ−ＴＫＩ療法の改善に関与すると考えている。
【０１３６】
[00164]高レベルのｍｉＲ−２１発現は、喫煙者および喫煙未経験者（本発明）両方由来の肺癌を含む、多様なタイプのヒト腫瘍において見出されるが、発癌中にどのような機構がｍｉＲ−２１を上方制御するかはよく理解されていない。
【０１３７】
[00165]ＥＧＦＲ突然変異体症例において、ｍｉＲ−２１がより高レベルであることを示すｍｉＲマイクロアレイデータ（図１３−表６）に加えて、ＮＳＣＬＣ細胞株を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析によって、活性化されたＥＧＦＲシグナル伝達がｍｉＲ−２１発現を上方制御することが示された。ＮＳＣＬＣ細胞株において、ｍｉＲ−２１発現レベルおよびｐ−ＥＧＦＲレベル間で、統計的に有意な正の相関が観察された（図１Ｂ）。さらに、ｐ−ＥＧＦＲが上昇している２つのＮＳＣＬＣ細胞株、ＥＧＦＲ突然変異体Ｈ３２５５（図２）およびＥＧＦＲ野生型Ｈ４４１（図７）において、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ（ＡＧ１４７８）での処理によって、ｍｉＲ−２１発現が阻害されたことから、活性化されたＥＧＦＲシグナル伝達経路およびｍｉＲ−２１の異常な上方制御、ならびにＥＧＦＲ活性化を伴う肺癌におけるｍｉＲ−２１の阻害に関する療法的基礎の間の機構的関連が提供された。多発性骨髄腫細胞において、ＩＬ６が誘導するｍｉＲ−２１の上方制御をシグナル伝達すると報告されるＳＴＡＴ３、または増加したｐ−Ａｋｔ（図２Ａおよび図６）は、ＥＧＦＲシグナル伝達が誘導するｍｉＲ−２１の上方制御を仲介しうる。にもかかわらず、ＥＧＦＲ突然変異またはｐ−ＥＧＦＲを伴わないＡ５４９細胞においてｍｉＲ−２１が高レベルであること（図１Ａおよび図６Ｂ）、そしてＥＧＦＲ突然変異およびｐ−ＥＧＦＲ増加を伴うＨ１６５０細胞においてｍｉＲ−２１発現の増加がないこと（図１Ａおよび図６Ｃ）によって、ｍｉＲ−２１発現を制御するＥＧＦＲ独立機構もまた存在するはずであることが示唆される。
【０１３８】
[00166]ＥＧＦＲ突然変異の存在下または非存在下で、ｍｉＲ−２１を上昇したレベルで発現し、喫煙未経験者由来のいくつかの肺癌症例を反復するようである２つのＮＳＣＬＣ細胞株、Ｈ３２５５およびＨ４４１（図４Ａ）において、アンチセンスオリゴヌクレオチドが仲介するノックダウンを成功裡に行って、ｍｉＲ−２１発現を阻害した（図３Ａ）。Ｈ４４１細胞において、ｍｉＲ−２１のアンチセンス阻害は、それ自体、増加したアポトーシス反応を導き（図３Ｃおよび図３Ｄ）、ｍｉＲ−２１もまた肺癌において療法ターゲットでありうることが示唆された。重要なことに、どちらの細胞株においても、アンチｍｉＲ−２１は、ＡＧ１４７８によって誘導されるアポトーシス反応を有意に増進した（図３Ｂおよび図３Ｃ）。Ｈ３２５５細胞において、アンチｍｉＲ−２１単独では効果がないこと（図３Ｂ）によって、最高レベルのｐ−ＥＧＦＲ（図３Ｃ）およびｍｉＲ−２１（図１Ａ）によって明らかである、細胞生存に向けて恒常的に活性化されたＥＧＦＲシグナル伝達経路を有効に減弱させるには、アンチｍｉＲ−２１およびＥＧＦＲ−ＴＫＩの併用が必要であることが示唆される可能性がある。ＥＧＦＲ−ＴＫＩは、肺癌のための臨床使用に広く用いられており、そして発癌性ｍｉＲの阻害は、癌療法における新規の有望なアプローチであるが、実施例Ｉは、これらの２つの療法戦略の併用が、いずれか単独よりも有意により有効でありうることを、初めて明らかにする。この発見は、現在のＥＧＦＲ−ＴＫＩ療法により反応性でない傾向がある非アジア民族の肺癌患者のためのよりよい治療を開発する際に、特に重要である。実施例Ｉはまた、ＮＳＣＬＣにおいて、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ耐性が獲得されるのを防止し、そしてレスキューする有用性も例示し、これは臨床関連の重要な問題である。二次的Ｔ７９０Ｍ突然変異およびＭＥＴ増幅獲得に加えて、野生型／突然変異体混合のバックグラウンド上で、ＥＧＦＲ野生型下位集団が選択されることによって、ＮＳＣＬＣにおけるＥＧＦＲ−ＴＫＩ耐性獲得につながる。ＥＧＦＲ−ＴＫＩおよびアンチｍｉＲ−２１の併用を用いて、野生型ＥＧＦＲに関する選択による、こうした耐性獲得を防止し、そしてレスキューすることも可能であり、これは、アンチｍｉＲ−２１がＥＧＦＲ野生型および突然変異体腫瘍細胞の両方に対して有効であるためである。最近、ロック化核酸で修飾したオリゴヌクレオチド（ＬＮＡ−アンチｍｉＲ）を静脈内投与すると、霊長類において肝臓で発現されたｍｉＲ−１２２がアンタゴナイズされ、これによって、ヒト疾患の療法において、ｍｉＲをｉｎ  ｖｉｖｏでターゲティングする実現可能性が裏付けられた。
【０１３９】
[00167]したがって、実施例Ｉは、喫煙未経験者における肺癌が、喫煙者における肺癌とは別個の新規分子特性として、ユニークなｍｉＲ発現プロフィールを有することを示す。ｍｉＲ−２１は、活性化されたＥＧＦＲシグナル伝達経路の下流エフェクターであり、そしてＥＧＦＲ突然変異を伴うおよび伴わない肺癌における療法的ターゲットでありうる。ｍｉＲ−２１のアンチセンス阻害は、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ療法に対する臨床反応を改善するのに有用でありうる。
【０１４０】
[00168]実施例Ｉの材料および方法
[00169]臨床試料
[00170]米国におけるメリーランド大学医学センター（ｎ＝１５）、メイヨークリニック（ｎ＝７）、ならびに日本における浜松大学医学部（ｎ＝６）で、２０００年から２００４年に外科的切除を受けた、喫煙未経験者から、２８対の肺癌組織および対応する非癌性肺組織を得た（表１およびＳ１）。すべての組織を、手術中に新鮮に収集し、瞬間凍結し、そして−８０℃で保存した。世界保健機構ＴＮＭ（腫瘍−リンパ節−転移）病期決定にしたがうと、２１人の患者が第Ｉ期疾患を有し、１人が第ＩＩ期疾患を有し、４人が第ＩＩＩ期疾患を有し、そして２人が第ＩＶ期疾患を有した。２２の症例はＥＧＦＲ野生型であり、そして６つの症例はＥＧＦＲ突然変異体であった（図８−表１および図９−表２）。各収集部位で、施設審査委員会認可およびすべての患者からの書面のインフォームドコンセントを得た。
【０１４１】
[00171]細胞培養
[00172]６つの肺腺癌細胞株（Ａ５４９、Ｈ２３、Ｈ４４１、Ｈ１６５０、Ｈ１９７５およびＨ３２５５）、１つの扁平細胞株（Ｈ１５７）および１つの大細胞型癌細胞株（Ｈ１２９９）を本研究で用いた。Ｈ３２５５は米国癌研究所によって提供され、そしてこれを５％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ）を含むＡＣＬ−４培地（ＧＩＢＣＯ）中で維持した。Ａ５４９、Ｈ２３、Ｈ４４１、Ｈ１６５０、Ｈ１９７５、Ｈ１５７およびＨ１２９９をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）より購入し、そして１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ  １６４０（ＧＩＢＣＯ）中で維持した。ｈＴＥＲＴ不死化正常ヒト気管支上皮細胞（ＨＢＥＴ２）を樹立した。
【０１４２】
[00173]マイクロアレイ分析
[00174]製造者の指示にしたがって、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）によって総ＲＮＡを単離した。先に記載するようにマイクロアレイ分析を行った。簡潔には、３８９プローブを３つ組で含有するｍｉＲマイクロアレイチップ（オハイオ州マイクロＲＮＡマイクロアレイ・バージョン３．０、オハイオ州コロンバス）上でのハイブリダイゼーションのため、５μｇの総ＲＮＡを用いた。ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＳｃａｎＡｒｒａｙ  ＸＬ５Ｋスキャナを用いて、プロセシングしたスライドをスキャンした。Ｒを用い、画像定量化ソフトウェアＧｅｎｅＰｉｘ  Ｐｒｏ  ６．０．１．００によってフラグを付けられておらず、そして表面強度がバックグラウンド強度よりも高いスポット値のみを用いた。次いで、残りのスポットをＬＯＥＳＳ（局所荷重スキャッタープロット平滑化）で規準化し、そして複製スポットを平均化した。次いで、あらかじめプロセシングし、そして規準化したデータを、ＢＲＢ−アレイツール・バージョン３．５．０（ｌｉｎｕｓ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＲＢ−ＡｒｒａｙＴｏｏｌｓ．ｈｔｍｌ）内にインポートした。最後に、試料の７５％より多くに存在する、欠損していない記録値（ｌｏｇ  ｖａｌｕｅ）を持つ２９１のｍｉＲを選択した。
【０１４３】
[00175]リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析
[00176]ＴａｑＭａｎヒト・マイクロＲＮＡアッセイキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティ）を用いたｑＲＴ−ＰＣＲ分析を用いて、成熟ｍｉＲ発現を調べた。ＲＮＵ６Ｂを内因性対照として用いた（＃４３７３３８１、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。ＰＲＩＳＭ  ７７００配列検出系（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、反応を行った。遺伝子発現を定量化し、そして値を２−ΔΔＣＴとして報告した。データを３つ組由来の平均±ＳＤとして示した。
【０１４４】
[00177]細胞処理および増殖阻害アッセイ
[00178]ＡＧ１４７８をＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ（カリフォルニア州サンディエゴ）より購入した。上皮増殖因子（ＥＧＦ）をＰｒｏｍｅｇａ（ウィスコンシン州マディソン）より購入した。ＥＧＦＲシグナル伝達経路およびｍｉＲ−２１発現レベルに対するＡＧ１４７８の影響を評価するため、肺癌細胞株を２４時間血清枯渇させ、ＡＧ１４７８（２μＭまたは１０μＭ）の存在下または非存在下で２時間インキュベーションし、そして次いで、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下で、さらに１５分間インキュベーションした。
【０１４５】
[00179]ＭＴＳアッセイ（同仁堂、日本）によって増殖阻害を評価して、肺癌細胞株に対するＡＧ１４７８の影響を調べた。細胞懸濁物（５，０００細胞／ウェル）を９６ウェルプレート内に植え付け、そして増加する濃度のＡＧ１４７８（０、０．４、２．０、１０および５０μＭ）を添加した。３７℃で７２時間インキュベーションした後、ＭＴＳ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）２Ｈ−テトラゾリウム、内塩］を各ウェルに添加し、そして３７℃で２時間インキュベーションし、そして次いで、４５０ｎｍの試験波長で、マイクロプレート読み取り装置を用いて、吸光度を測定した。ＩＣ５０値は、ＡＧ１４７８での処理による増殖の５０％減少に必要な濃度として定義された。各実験を少なくとも３つ組で行い、そして独立に４回行った。データを平均±ＳＤで示した。
【０１４６】
[00180]抗体およびウェスタンブロット分析
[00181]５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ７．６、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、１％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、および０．５％デオキシコール酸ナトリウムを含有する緩衝液中で、細胞を溶解した。溶解物を氷上で３０分間維持し、そして次いで、１３０００ｇで３０分間遠心分離した。上清を収集し、そして次いで、１０μｇのタンパク質を１０％ゲル上でのゲル電気泳動によって分離し、ニトロセルロース膜にトランスファーし、そして化学発光系（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を用いたイムノブロッティングによって検出した。ＮＩＨ  ＩｍａｇｅＪ１．４０ｇ（ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）を用いてシグナル強度を測定することによって、画像を定量化した。ＥＧＦＲ、ホスホＥＧＦＲ（Ｔｙｒ１１７３）、ホスホ−Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）、ＰＡＲＰおよびβアクチンを検出する抗体を、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（マサチューセッツ州ビバリー）から購入した。
【０１４７】
[00182]オリゴヌクレオチドトランスフェクションおよびアポトーシスアッセイ
[00183]２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドを、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（アイオワ州コーラルビル）で化学的に合成した。２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドは、以下の配列を有した：２’ＯＭｅ増進緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）（アンチＥＧＦＰ）５’−ＡＡＧ  ＧＣＡ  ＡＧＣ  ＵＧＡ  ＣＣＣ  ＵＧＡ  ＡＧＵ−３’［配列番号１］および２’ＯＭｅ−ｍｉＲ−２１（アンチｍｉＲ−２１）５’−ＵＣＡ  ＡＣＡ  ＵＣＡ  ＧＵＣ  ＵＧＡ  ＵＡＡ  ＧＣＵＡ−３’［配列番号２］。Ｈ４４１およびＨ３２５５細胞を３つ組で９６ウェルプレートにプレーティングした。ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、プレーティング２４時間後、細胞をトランスフェクションした。製造者の指示にしたがって、トランスフェクション複合体を調製し、そして最終オリゴヌクレオチド濃度４０ｎＭまで、細胞に直接添加した。トランスフェクション培地をトランスフェクション８時間後に交換した。７２時間後、０．２μＭのＡＧ１４７８の存在下または非存在下、２４時間（Ｈ３２５５）、あるいは１０μＭのＡＧ１４７８の存在下または非存在下、７２時間（Ｈ４４１）、細胞をインキュベーションした。製造者の指示にしたがって、ＡｐｏＯＮＥ均質カスパーゼ３／７アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、カスパーゼ３およびカスパーゼ７の活性を分析した。カスパーゼ基質と６時間インキュベーションした後、励起および発光のため、それぞれ４８５および５３５ｎｍの波長を用い、蛍光プレート読み取り装置上で試料を測定した。各実験を３つ組で、そして少なくとも４回、独立に行った。データを平均±ＳＤで示した。
【０１４８】
[00184]統計分析：
[00185]対応のあるｔ検定は、肺癌組織および正常肺組織間で示差的に発現されるｍｉＲを同定した（ｐ＜０．０１、ＦＤＲ＜０．１５）。本発明者らはまた、Ｆ検定を用いて、ＥＧＦＲ突然変異体および野生型肺癌間で示差的に発現されるｍｉＲも同定した（ｐ＜０．０１、ＦＤＲ＜０．１５）。対応のあるｔ検定を用いて、腫瘍および対応する正常組織間で、ｑＲＴ−ＰＣＲデータに関して、ｍｉＲ発現（ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１２６およびｍｉＲ−４８６）の相違を分析した。Ｐｅａｒｓｏｎ相関に関して、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖ５．０（Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｓｏｆｔｏｗａｒｅ  Ｉｎｃ、カリフォルニア州ラホヤ）分析を用いた。すべての統計検定は両側であり、そして統計的有意性をＰ＜０．０５と定義した。
【０１４９】
[00186]実施例ＩＩ
[00187]喫煙未経験者および喫煙者由来の肺癌のｍｉＲプロファイリング比較
[00188]本発明の２８の喫煙未経験者症例のオハイオ州ｍｉＲマイクロアレイデータ（バージョン３．０）および本発明者らの以前の研究における５８の喫煙者肺腺癌のもの（バージョン１．０）とさらなる２３の喫煙者症例（バージョン２．０）（図１１−表４）を分析した。すべてのバージョンの間で共通しているプローブのみを含む発現データを、各バージョン群内で、Ｒを用いてＬＯＥＳＳ規準化した。次に、各バージョン内でｚスコアを計算し、そしてすべてのバージョン由来のデータを統合した。次いで、統合したデータセットをＢＲＢ−アレイツール・バージョン３．５．０内にインポートして、示差的に発現されるｍｉＲを同定した（ｐ＜０．０１、ＦＤＲ＜０．２）。
【０１５０】
[00189]宿主遺伝子のｍＲＮＡ発現データ
[00190]２０の喫煙未経験者肺腺癌症例のメッセンジャーＲＮＡマイクロアレイデータを、ＧＥＯデータベース（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ／、ＧＳＥ１００７２）からダウンロードして、そしてＢＲＢ−アレイツール・バージョン３．５．０によって分析した。
【０１５１】
[00191]実施例ＩＩＩ
[00192]肺癌患者を治療する方法
[00193]本実施例は、本明細書の組成物での治療に好ましい反応を有する可能性が高い患者を選択し、そして治療する方法を記載する。
【０１５２】
[00194]肺癌と診断された患者は、通常、まず、治癒を意図して肺切除術を受ける。患者から取り除いた肺組織の一部から肺腫瘍試料を得る。次いで、当該技術分野に周知の任意の適切な小分子ＲＮＡ抽出法を用いて、例えばＴＲＩＺＯＬＴＭを用いることによって、ＲＮＡを組織試料から単離する。次いで、精製したＲＮＡを、ｍｉＲ２１または図１３−表６に開示する他の示差的に発現されるｍｉＲに特異的なプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲに、場合によってＥＧＦＲ遺伝子分析またはＥＧＦＲリン酸化分析と組み合わせて供する。これらのアッセイを行って、腫瘍における関連ＲＮＡの発現レベルを決定する。示差的に発現されるｍｉＲ発現パターンが決定された場合、特に、ＥＧＦＲ突然変異体状態が解明された場合、患者は本明細書の組成物での治療の候補となる。
【０１５３】
[00195]したがって、当該技術分野に知られる方法にしたがって、患者を療法的に有効な量の組成物で治療する。組成物の用量および投薬措置は、多様な要因、例えば患者の健康状態および肺癌の病期に応じて多様であろう。典型的には、治療は、長期に渡り、多数回の用量で投与される。
【０１５４】
[00196]実施例ＩＶ
[00197]ＥＧＦＲ突然変異体肺癌患者を診断する方法
[00198]１つの特定の側面において、本明細書において、ＥＧＦＲ突然変異体肺癌を有するかまたはＥＧＦＲ突然変異体肺癌を発展させるリスクがあるかどうかを診断する方法を提供する。該方法には、一般的に、図１３−表６中のｍｉＲの示差的ｍｉＲ発現パターン、特に対照に比較したｍｉＲ−２１上方制御を測定する工程が含まれる。示差的ｍｉＲ発現パターンが確認された場合、この結果は、被験体がＥＧＦＲ突然変異体肺癌を有するかまたはＥＧＦＲ突然変異体肺癌を発展させるリスクがあるかいずれかの指標となる。特定の態様において、ノーザンブロット分析を用いて、少なくとも１つの遺伝子産物のレベルを測定する。また、特定の態様において、試験試料中の少なくとも１つの遺伝子産物のレベルは、対照試料中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルより低く、そして／または試験試料中の少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、対照試料中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルより大きい。
【０１５５】
[00199]実施例Ｖ
[00200]ｍｉＲ遺伝子産物の測定
[00201]被験体から得た試験試料からＲＮＡを逆転写して、ターゲット・オリゴデオキシヌクレオチド・セットを提供し；ターゲット・オリゴデオキシヌクレオチドを、ｍｉＲ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイにハイブリダイズさせて、試験試料に関するハイブリダイゼーション・プロフィールを提供し；そして試験試料ハイブリダイゼーション・プロフィールを、対照試料から生成したハイブリダイゼーション・プロフィールに比較することによって、少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物レベルを測定してもよい。少なくとも１つのｍｉＲのシグナルが改変されていると、被験体が肺癌、特にＥＧＦＲ突然変異体肺癌を有するか、またはこれを発展させるリスクがあるかいずれかの指標となる。
【０１５６】
[00202]実施例ＶＩ
[00203]診断および療法適用
[00204]別の側面において、本明細書において、対照試料から生じたシグナルに比較して、少なくとも１つのｍｉＲシグナルが脱制御されている（例えば下方制御および／または上方制御される）、被験体においてＥＧＦＲ突然変異体肺癌を治療する方法を提供する。
【０１５７】
[00205]やはり本明細書において、被験体における１以上の不都合な予後マーカーと関連するＥＧＦＲ突然変異体肺癌を有するか、または該癌を発症するリスクがあるかどうかを診断する方法であって、被験体から得た試験試料からＲＮＡを逆転写して、ターゲット・オリゴデオキシヌクレオチドセットを提供し；ターゲット・オリゴデオキシヌクレオチドを、ｍｉＲ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイにハイブリダイズさせて、試験試料に関するハイブリダイゼーション・プロフィールを提供し；そして試験試料ハイブリダイゼーション・プロフィールを、対照試料から生成したハイブリダイゼーション・プロフィールに比較することによる、前記方法もまた提供する。シグナルの変化は、被験体が癌を有するか、癌を発症するリスクがあることを示す。
【０１５８】
[00206]また、本明細書において、表６のｍｉＲの少なくとも２つのｍｉＲ遺伝子産物が、対照細胞に比較して、被験体の癌細胞において下方制御されているかまたは上方制御されている、ＥＧＦＲ突然変異体肺癌を有する被験体において、ＥＧＦＲ突然変異体肺癌を治療する方法も提供する。少なくとも２つの遺伝子産物が癌細胞において下方制御されている場合、該方法は、被験体における癌細胞の増殖が阻害されるように、少なくとも２つの単離遺伝子産物の有効量を被験体に投与する工程を含む。２以上の遺伝子産物が癌細胞において上方制御されている場合、該方法は、被験体における癌細胞の増殖が阻害されるように、少なくとも１つの遺伝子産物の発現を阻害するための少なくとも１つの化合物の有効量を被験体に投与する工程を含む。また、本明細書において、被験体においてＥＧＦＲ突然変異体肺癌を治療する方法であって：ＥＧＦＲ突然変異体肺癌細胞において、対照細胞に比較して、少なくとも２つのｍｉＲ（図１３−表６に示す）遺伝子産物の量を決定し；そして：被験体における癌細胞の増殖が阻害されるように、癌細胞において発現される遺伝子産物の量が、対照細胞で発現される遺伝子産物の量より少ない場合、少なくとも２つの遺伝子産物の有効量を被験体に投与するか；または癌細胞において発現される遺伝子産物の量が、対照細胞で発現される遺伝子産物の量より多い場合、少なくとも２つの遺伝子産物発現を阻害するため少なくとも１つの化合物の有効量を被験体に投与することによって、ＥＧＦＲ突然変異体肺癌細胞で発現される遺伝子産物の量を改変する工程を含む、前記方法も提供する。
【０１５９】
[00207]実施例ＶＩＩ
[00208]組成物
[00209]また、本明細書において、少なくとも２つの単離ｍｉＲ（図１３−表６に示す）遺伝子産物および薬学的に許容されうるキャリアーを含む、ＥＧＦＲ突然変異体肺癌を治療するための薬学的組成物も提供する。特定の態様において、薬学的組成物は、適切な対照細胞に比較して、ＥＧＦＲ突然変異体肺癌細胞において、下方制御されている遺伝子産物に対応する遺伝子産物を含む。
【０１６０】
[00210]別の特定の態様において、薬学的組成物は、少なくとも１つの発現制御因子（例えば阻害剤）化合物および薬学的に許容されうるキャリアーを含む。
【０１６１】
[00211]また、本明細書において、適切な対照細胞に比較して、ＥＧＦＲ突然変異体肺癌細胞で上方または下方制御されている遺伝子産物に特異的な少なくとも１つの発現制御因子化合物を含む、薬学的組成物も提供する。
【０１６２】
[00212]実施例ＶＩＩＩ
[00213]キット
[00214]本明細書記載の任意の組成物は、キット中に含まれてもよい。限定されない例において、ｍｉＲを単離し、ｍｉＲを標識し、そして／またはアレイを用いてｍｉＲ集団を評価するための試薬がキット中に含まれる。キットには、ｍｉＲプローブを生成するかまたは合成するための試薬がさらに含まれてもよい。キットは、したがって、適切な容器手段中に、標識ヌクレオチド、またはその後に標識される未標識ヌクレオチドを取り込むことによって、ｍｉＲを標識するための酵素を含む。キットにはまた、反応緩衝剤、標識緩衝剤、洗浄緩衝剤、もしくはハイブリダイゼーション緩衝剤のような１以上の緩衝剤、ｍｉＲプローブを調製するための化合物、およびｍｉＲを単離するための構成要素が含まれてもよい。他のキットには、ｍｉＲに相補的なオリゴヌクレオチドを含む核酸アレイを作製するための構成要素が含まれてもよく、そしてしたがって、例えば固体支持体が含まれてもよい。
【０１６３】
[00215]アレイを含む任意のキット態様に関して、本明細書の配列いずれかのすべてまたは一部に同一であるかまたは相補的である配列を含有する核酸分子があってもよい。
【０１６４】
[00216]キットの構成要素を水性媒体または凍結乾燥型のいずれかでパッケージングしてもよい。キットの容器手段には、一般的に、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、瓶、シリンジまたは他の容器手段が含まれ、この中に構成要素が配置されてもよく、そして好ましくは適切にアリコットされてもよい。キット中に１より多い構成要素がある（標識試薬および標識はともにパッケージングされてもよい）場合、キットはまた、一般的に、第二、第三または他のさらなる容器を含有し、この中にさらなる構成要素を別個に配置してもよい。しかし、構成要素の多様な組み合わせがバイアル中に含まれてもよい。本発明のキットにはまた、典型的には、商業的販売のための密封状態で（ｉｎ  ｃｌｏｓｅ  ｃｏｎｆｉｎｅｍｅｎｔ）、核酸および任意の他の試薬を含有するための手段が含まれるであろう。こうした容器には、注入またはブロー成形プラスチック容器が含まれてもよく、この中に望ましいバイアルを保持する。
【０１６５】
[00217]キットの構成要素が１つおよび／またはそれより多くの溶液中で提供される場合、溶液は水溶液であり、無菌水溶液が１つの好ましい溶液である。キット中に含まれてもよい他の溶液は、混合試料からｍｉＲを単離しそして／または濃縮する際に関与する溶液である。
【０１６６】
[00218]しかし、キットの構成要素を乾燥粉末（単数または複数）として提供してもよい。試薬および／または構成要素が乾燥粉末として提供される場合、粉末は適切な溶媒の添加によって再構成されてもよい。溶媒はまた、別の容器手段中で提供されてもよいことが想定される。キットにはまた、標識されたｍｉＲの単離を促進する構成要素も含まれてもよい。キットにはまた、ｍｉＲを保存するかまたは維持するか、あるいはその分解に対して保護する構成要素も含まれてもよい。構成要素はＲＮアーゼ不含であってもよいし、またはＲＮアーゼに対して保護してもよい。
【０１６７】
[00219]また、キットは一般的に、適切な手段で、各個々の試薬または溶液に関して別個の容器を含んでもよい。キットにはまた、キット構成要素を使用するための、またそれとともに、キット中に含まれていない任意の他の試薬を使用するための説明書も含まれてもよい。説明書には、実行可能な変型が含まれてもよい。こうした試薬が本発明のキットの態様であることが予期される。また、キットは上に同定される特定の項目に限定されず、そしてキットには、ｍｉＲの操作または特徴付けに使用される任意の試薬が含まれてもよい。
【０１６８】
[00220]ｍｉＲアレイの背景において論じられる任意の態様は、より一般的に、本発明のスクリーニングまたはプロファイリング法またはキットにおいて使用されてもよいこともまた予期される。言い換えると、特定のアレイ中に含まれてもよいものを記載する任意の態様は、より一般的にｍｉＲプロファイリングの背景において実施されてもよく、そしてアレイ自体を伴わなくてもよい。
【０１６９】
[00221]任意のキット、アレイまたは他の検出技術またはツール、あるいは任意の方法は、これらのｍｉＲのいずれに関するプロファイリングを伴ってもよいこともまた予期される。また、ｍｉＲアレイの背景において論じられる任意の態様は、本発明の方法において、アレイ形式を伴いまたは伴わずに実行されてもよく；言い換えると、ｍｉＲアレイ中の任意のｍｉＲを、当業者に知られる任意の技術にしたがって、本発明の任意の方法でスクリーニングするかまたは評価してもよい。アレイ形式は、スクリーニングおよび診断法を実施するのに必要ではない。
【０１７０】
[00222]療法、予後、または診断適用のためにｍｉＲアレイを用いるためのキットおよびこうした使用が、本明細書において、本発明者らによって予期される。キットには、ｍｉＲアレイ、ならびにアレイ上のｍｉＲに関する標準または規準化ｍｉＲプロフィールに関する情報が含まれてもよい。また、特定の態様において、対照ＲＮＡまたはＤＮＡがキット中に含まれてもよい。対照ＲＮＡは、標識および／またはアレイ分析のための陽性対照として使用可能なｍｉＲであってもよい。
【０１７１】
[00223]本解説の方法およびキットは、本明細書において、広くそして一般的に記載されてきている。一般的な開示内に属する、より狭い種および亜属の集団の各々もまた、本解説の一部を形成する。これには、条件付の、または排除される物質が本明細書に具体的に列挙されているかどうかに関わらず、属から任意の対象を除去する負の限定を伴う、本解説の一般的な説明が含まれる。
【０１７２】
[00224]実施例ＩＸ
[00225]アレイ調製およびスクリーニング
[00226]また、本明細書において、複数のｍｉＲ分子または前駆体ｍｉＲ分子に完全にもしくはほぼ完全に相補的であるかまたは同一であり、そして空間的に分離された構成で支持物質上に配置されている、核酸分子（プローブ）の秩序だったマクロアレイまたはマイクロアレイである、ｍｉＲアレイの調製および使用も提供する。マクロアレイは、典型的には、ニトロセルロースまたはナイロンのシートであり、その上にプローブがスポットされている。マイクロアレイは、最大１０，０００の核酸分子が、典型的には１〜４平方センチメートルの領域内にフィット可能であるように、より密に核酸プローブを配置する。
【０１７３】
[00227]核酸分子、例えば遺伝子、オリゴヌクレオチド等を支持体上にスポットするか、または支持体上、ｉｎ  ｓｉｔｕでオリゴヌクレオチド配列を製造することによって、マイクロアレイを製造してもよい。スポットされるまたは製造される核酸分子は、平方センチメートルあたり最大約３０の非同一核酸分子の高密度マトリックスパターンで、またはそれより高密度で、例えば、平方センチメートルあたり最大約１００またはさらに１０００まで適用可能である。マイクロアレイは、典型的には、フィルターアレイのニトロセルロースに基づく物質とは対照的に、コーティングされたガラスを固体支持体として用いる。ｍｉＲ相補核酸試料の秩序だったアレイを有することによって、各試料の位置を追跡し、そして元来の試料と関連付けることも可能である。
【０１７４】
[00228]複数の別個の核酸プローブが固体支持体表面と安定に会合する、多様な異なるアレイデバイスが当業者に知られる。アレイのために有用な支持体には、ナイロン、ガラスおよびシリコンが含まれる。アレイは、いくつかの異なる点で多様であってもよく、これには、平均プローブ長、プローブの配列または種類、プローブおよびアレイ表面間の結合の性質、例えば共有または非共有結合等が含まれる。本明細書記載の標識およびスクリーニング法、ならびにアレイは、プローブがｍｉＲを検出する以外のいかなるパラメーターに関しても、その有用性を限定されず；その結果、方法および組成物を、多様な異なるタイプのｍｉＲアレイとともに用いてもよい。
【０１７５】
[00229]本発明の原理を適用可能な、多くのありうる態様を考慮すると、例示する態様は単に本発明の好ましい例であると認識すべきであり、そして本発明の範囲に対する限定と解釈してはならない。むしろ、本発明の範囲は、以下の請求項によって定義される。本発明者らは、したがって、本発明を、これらの請求項の範囲および精神の範囲内にあるすべてのものと請求する。
【０１７６】
[00230]本発明は、多様なそして好ましい態様に言及して記載されてきているが、本発明の本質的な範囲から逸脱することなく、多様な変化を行ってもよく、そしてその要素を同等物で置換してもよいことが、当業者には理解されなければならない。さらに、本発明の本質的な範囲から逸脱することなく、本発明の解説に対して、特定の状況または物質を適応させるよう、多くの修飾を行ってもよい。したがって、本発明は、本発明を実施するために予期される、本明細書に開示する特定の態様に限定されず、本発明には、請求項の範囲内に属するすべての態様が含まれることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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