(57)【要約】  本発明は、ＳＴＩＭ２の阻害剤またはＳＴＩＭ２制御性細胞膜カルシウムチャネル活性の阻害剤、ならびに場合によって医薬的に許容されうるキャリアー、賦形剤および／または希釈剤を含む医薬組成物に関する。さらに、本発明は、病的に増加した細胞質カルシウム濃度に関連する神経学的障害の治療および／または防止のための、ＳＴＩＭ２の阻害剤またはＳＴＩＭ２制御性細胞膜カルシウムチャネル活性の阻害剤に関する。本発明はまた、病的に増加した細胞質カルシウム濃度に関連する神経変性障害を治療し、そして／または防止する方法であって、医薬的に有効な量のＳＴＩＭ２の阻害剤またはＳＴＩＭ２制御性細胞膜カルシウムチャネル活性の阻害剤を、その必要がある被験者に投与する工程を含む、前記方法に関する。本発明はさらに、病的に増加した細胞質カルシウム濃度に関連する神経学的障害の治療および／または防止のためのリード化合物および／または薬剤として適した化合物を同定する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
間質相互作用分子２（ＳＴＩＭ２）の阻害剤またはＳＴＩＭ２制御性細胞膜カルシウムチャネル活性の阻害剤、ならびに場合によって医薬的に許容されうるキャリアー、賦形剤および／または希釈剤を含む医薬的組成物。
【請求項２】
病的に増加した細胞質カルシウム濃度に関連する神経学的障害の治療および／または防止のための、間質相互作用分子２（ＳＴＩＭ２）の阻害剤またはＳＴＩＭ２制御性細胞膜カルシウムチャネル活性の阻害剤。
【請求項３】
病的に増加した細胞質カルシウム濃度に関連する神経学的障害を治療し、そして／または防止する方法であって、医薬的に有効な量の間質相互作用分子２（ＳＴＩＭ２）の阻害剤またはＳＴＩＭ２制御性細胞膜カルシウムチャネル活性の阻害剤を、その必要がある被験者に投与する工程を含む、前記方法。
【請求項４】
阻害剤が、抗体またはその断片もしくは誘導体、アプタマー、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス核酸分子、これらの阻害剤の修飾型または低分子である、請求項１の医薬組成物または請求項２の阻害剤または請求項３の方法。
【請求項５】
ＳＴＩＭ２制御性細胞膜カルシウムチャネル活性がＯＲＡＩ１、ＯＲＡＩ２、ＯＲＡＩ３および／またはＴＲＰチャネルである、請求項１または４の医薬組成物あるいは請求項２または４の阻害剤あるいは請求項３または４の方法。
【請求項６】
神経保護および／または神経再生物質および／または抗血栓物質を同じまたは別個の容器中にさらに含む、請求項１、４または５のいずれか一項の医薬組成物あるいは請求項２、４または５のいずれか一項の阻害剤。
【請求項７】
神経保護および／または神経再生物質が、グルタミン酸アンタゴニスト、グルタミン酸受容体アンタゴニスト、グルタミン酸放出阻害剤、酸化防止剤、フリーラジカル還元剤、カルシウム・アンタゴニスト、カルシウムチャネル遮断剤、カルシウム・キレーター、カリウムチャネル活性化因子、ＧＡＢＡアゴニスト、オピエート・アンタゴニスト、白血球接着阻害剤、サイトカイン阻害剤、膜安定化剤、好中球調節因子、グリシン・アンタゴニスト、アポトーシス調節因子、ニューロン誘導調節因子、神経栄養因子および幹細胞調節因子からなる群より選択される、請求項６の医薬組成物または阻害剤。
【請求項８】
抗血栓物質が組換え組織プラスミノーゲン活性化因子である、請求項６の医薬組成物または阻害剤。
【請求項９】
病的に増加した細胞質カルシウム濃度に関連する神経学的障害が、脳虚血、脳卒中、虚血性脳卒中、出血性脳卒中、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、常染色体優性脊髄小脳失調症、緑内障、筋萎縮性脊索硬化症、癲癇、統合失調症、外傷性脳傷害およびＨＩＶ痴呆より選択される、請求項２または４〜８のいずれか一項の阻害剤、あるいは請求項３〜５のいずれか一項の方法。
【請求項１０】
療法において、同時に、別個に、または連続して使用するための、間質相互作用分子２（ＳＴＩＭ２）の阻害剤またはＳＴＩＭ２制御性細胞膜カルシウムチャネル活性の阻害剤、ならびに神経保護および／または神経再生物質および／または抗血栓物質、ならびに場合によって医薬的に活性であるキャリアー、賦形剤および／または希釈剤を組み合わせた医薬組成物。
【請求項１１】
病的に増加した細胞質カルシウム濃度に関連する障害を治療し、そして／または防止するための、あるいは病的に増加した細胞質カルシウム濃度に関連する神経学的障害を治療し、そして／または防止するための薬剤を開発するためのリード化合物としての、請求項１０の組み合わせた医薬組成物。
【請求項１２】
病的に増加した細胞質カルシウム濃度に関連する神経学的障害の治療および／または防止のためのリード化合物および／または薬剤として適した化合物を同定する方法であって：
ａ）細胞において、ＳＴＩＭ２タンパク質またはＳｔｉｍ２転写物のレベルを測定し；
ｂ）前記細胞または同じ細胞集団の細胞と、試験化合物を接触させ；
ｃ）試験化合物と接触させた後、前記細胞において、ＳＴＩＭ２タンパク質またはＳｔｉｍ２転写物のレベルを測定し；そして
ｄ）工程（ｃ）において測定したＳＴＩＭ２タンパク質またはＳｔｉｍ２転写物のレベルを、工程（ａ）において測定したＳＴＩＭ２タンパク質またはＳｔｉｍ２転写物のレベルと比較する、ここで工程（ａ）と比較した際の工程（ｃ）におけるＳＴＩＭ２タンパク質またはＳｔｉｍ２転写物のレベルが減少していると、試験化合物が、病的に増加した細胞質カルシウム濃度に関連する神経学的障害の治療および／または防止のためのリード化合物および／または薬剤として適切な化合物であることが示される
工程を含む、前記方法。
【請求項１３】
病的に増加した細胞質カルシウム濃度に関連する神経学的障害の治療および／または防止のためのリード化合物および／または薬剤として適した化合物を同定する方法であって：
ａ）細胞外カルシウムの非存在下で、ＳＴＩＭ２タンパク質を含有する細胞の細胞内カルシウム貯蔵を空にし、そして細胞外カルシウムを添加した際の細胞内カルシウム濃度の増加を測定し；
ｂ）ＳＴＩＭ２タンパク質を含有する前記細胞または同じ細胞集団の細胞と、試験化合物を接触させ；
ｃ）試験化合物と接触させた後、細胞外カルシウムの非存在下で、（ｂ）の細胞の細胞内カルシウム貯蔵を空にし、そして前記細胞において、細胞外カルシウムを添加した際の細胞内カルシウム濃度の増加を測定し；そして
ｄ）工程（ｃ）において測定した細胞内カルシウム濃度の増加を、工程（ａ）において測定した細胞内カルシウム濃度の増加と比較する、ここで工程（ａ）と比較した際の工程（ｃ）における細胞内カルシウム濃度の増加がないかまたは細胞内カルシウム濃度の増加がより少ないと、試験化合物が、病的に増加した細胞質カルシウム濃度に関連する神経学的障害の治療および／または防止のためのリード化合物および／または薬剤として適切な化合物であることが示される
工程を含む、前記方法。
【請求項１４】
ＳＴＩＭ２タンパク質を含む前記細胞がニューロンである、請求項１２または１３の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、間質相互作用分子２（ＳＴＩＭ２）の阻害剤またはＳＴＩＭ２制御性細胞膜カルシウムチャネル活性の阻害剤、特にＯＲＡＩ２またはＯＲＡＩ３（ＣＲＡＣＭ２またはＣＲＡＣＭ３とも称される）の阻害剤、ならびに場合によって医薬に許容されうるキャリアー、賦形剤および／または希釈剤を含む医薬組成物に関する。さらに、本発明は、病的に増加した細胞質カルシウム濃度に関連する神経変性障害の治療および／または防止に使用するための、ＳＴＩＭ２の阻害剤またはＳＴＩＭ２制御性細胞膜カルシウムチャネル活性の阻害剤に関する。本発明はまた、病的に増加した細胞質カルシウム濃度に関連する神経変性障害を治療し、そして／または防止する方法であって、医薬的に有効な量のＳＴＩＭ２の阻害剤またはＳＴＩＭ２制御性細胞膜カルシウムチャネル活性の阻害剤を、その必要がある被験者に投与する工程を含む、前記方法に関する。本発明はさらに、病的に増加した細胞質カルシウム濃度に関連する神経変性障害の治療および／または防止のためのリード化合物および／または薬剤として適した化合物を同定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書において、特許出願および製造者のマニュアルを含むいくつかの文書が引用される。これらの文書の開示は、本発明の特許性に関して関連するとは見なされないが、その全体が本明細書に援用される。より具体的には、すべての参照文書は、各個々の文書が特にそして個々に本明細書に援用されると示されるのと同じ度合いに、本明細書に援用される。
【０００３】
細胞内Ｃａ２＋濃度［Ｃａ２＋］ｉは、すべての真核細胞における生理学的状態の主要な決定要因である（Ｂｅｒｒｉｄｇｅ、２００３）。ニューロンにおいて、細胞内貯蔵または細胞外空間から得られるＣａ２＋シグナルは、シナプス伝達および可塑性を含む基本的な機能に必須である。他方、過剰な細胞質Ｃａ２＋集積、すなわち「カルシウム過負荷」、例えば病的状態下で観察されるようなものは、ニューロン死を誘導しうる。このカルシウム過負荷誘導性ニューロン死の根底にある機構は、ほとんど理解されていない（Ｌｉｐｔｏｎ、１９９９；  Ｂｅｒｒｉｄｇｅ、１９９８；  Ｗｏｊｄａ、２００８；  Ｍａｔｔｓｏｎ、２００７）。
【０００４】
Ｃａ２＋のニューロン内への流入を仲介するための、２つの主なタイプのＣａ２＋チャネルが確実に確立されている：電位作動型Ｃａ２＋チャネル（ＶＯＣＣ）およびイオンチャネル型受容体作動型（リガンド開口型）チャネル（ＲＯＣ）であり、これには、興奮性神経伝達物質であるグルタミン酸によって活性化される、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体（ＮＭＤＡＲ）およびいくつかのα−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−イソキサゾール−４−プロピオン酸受容体（ＡＭＰＡＲ）が含まれる。グルタミン酸興奮毒性は、「カルシウム過負荷」およびそれに続く虚血における神経変性に寄与する、よく研究された機構である（Ｗｏｊｄａ、２００８；  Ｂｕｒｎａｓｈｅｖ、２００５；  Ｒａｏ、２００７）。
【０００５】
対照的に、Ｃａ２＋貯蔵枯渇に反応して活性化されて、容量性Ｃａ２＋流入（ＣＣＥ−貯蔵作動型Ｃａ２＋流入、ＳＯＣＥとも称される）および貯蔵補充を可能にする、細胞膜Ｃａ２＋チャネル（貯蔵作動型Ｃａ２＋（ＳＯＣ）チャネルとも称される）に関しては、非常にわずかしか知られていない。非興奮性細胞においては、ＣＣＥは、小胞体（ＥＲ）常在性Ｃａ２＋センサーＳＴＩＭ１によって調節され、一方、非常に近縁のＳＴＩＭ２は、基底細胞質およびＥＲ  Ｃａ２＋濃度を制御し、ＣＣＥにはわずかにしか寄与しないと提唱されている。
【０００６】
Ｗｏｊｄａら、２００８は、ニューロン変性におけるカルシウムイオンの役割を概説する。該著者らはまた、潜在的な神経保護剤として現在試験されている化合物も要約する。これまでに、臨床試験のために認定された化合物は、グルタミン酸受容体または電位作動型カルシウムチャネルのいずれかに対して作用する化合物のみである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｂｅｒｒｉｄｇｅ、２００３
【非特許文献２】Ｌｉｐｔｏｎ、１９９９
【非特許文献３】Ｂｅｒｒｉｄｇｅ、１９９８
【非特許文献４】Ｗｏｊｄａ、２００８
【非特許文献５】Ｍａｔｔｓｏｎ、２００７
【非特許文献６】Ｂｕｒｎａｓｈｅｖ、２００５
【非特許文献７】Ｒａｏ、２００７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の根底にある技術的な問題は、病的に増加した細胞質カルシウム濃度と関連する神経変性障害の治療および／または防止のための基礎を形成するか、あるいはそのための、より満足できる薬剤を開発することを可能にしうる、これらの疾患を成功裡に治療するための代替となるおよび／または改善された手段および方法の提供である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
この技術的問題に対する解決法は、請求項において特徴付けられる態様を提供することによって達成される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１−１】ＳＴＩＭ２は、ニューロンにおける主なＳＴＩＭアイソフォームである。ａ、２ヶ月齢マウスの異なる臓器におけるＳＴＩＭ１およびＳＴＩＭ２発現のウェスタンブロット分析；α−チューブリン発現を装填対照として用いた。ＬＮ＝リンパ節、Ｐｌｔ＝血小板。ｂ、野生型マウス由来の培養海馬ニューロン（ＮｅｕＮ）およびＣＤ４＋  Ｔ細胞のＳＴＩＭ１（上部）およびＳＴＩＭ２（下部）の免疫蛍光染色。細胞核をＤＡＰＩで対比染色する。スケールバー、１００μｍ（ニューロン）、１０μｍ（Ｔ細胞）。ｃ、ＳｔｉｍおよびＯｒａｉプライマーを用いた、ニューロンおよび心臓ｃＤＮＡのＲＴ−ＰＣＲ。
【図１−２】ｄ、Ｓｔｉｍ２−／−マウスの生成のためのターゲティング戦略；  Ｎｅｏ−ＬａｃＺ：ネオマイシン耐性およびＬａｃＺカセット。ｅ、外部プローブで標識した、野生型（＋／＋）、ヘテロ接合体（＋／−）またはＳｔｉｍ２ノックアウト（−／−）マウスのＢａｍＨＩ消化ゲノムＤＮＡのサザンブロット分析。ｆ、成体野生型およびＳｔｉｍ２−／−マウスの脳およびリンパ節（ＬＮ）細胞におけるＳＴＩＭ２およびＳＴＩＭ１発現のウェスタンブロット分析。
【図２−１】ＳＴＩＭ２は、皮質ニューロンにおいて、Ｃａ２＋ホメオスタシスを制御する。ａ、ニューロン培養（ＤＩＶ  ５−９）にＦｕｒａ−２を装填し、そしてＳｔｉｍ２−／−における平均［Ｃａ２＋］ｉ反応を野生型（ＷＴ）細胞に、Ｓｔｉｍ１−／−における反応をＳｔｉｍ１＋／＋細胞に、そしてＯｒａｉ１−／−における反応をＯｒａｉ１＋／＋細胞に比較した（ｎ＝各２０〜３５細胞）。細胞をシクロピアゾン酸（ＣＰＡ；２０μＭ）で刺激し、その後、１ｍＭ  ＥＧＴＡを２ｍＭ  Ｃａ２＋に交換した。示す時間間隔中に、基底およびピーク［Ｃａ２＋］ｉを得た。
【図２−２】ｂ、ＥＧＴＡの存在下で、５μＭイオノマイシンを添加することによって、細胞内貯蔵からのＣａ２＋放出を監視した。１ｍＭ  ＥＧＴＡを２ｍＭ  Ｃａ２＋に交換した後の最大反応に対して、このＣａ２＋放出を標準化した。ｃ、［Ｃａ２＋］ｉに対する、酸素−グルコース枯渇（ＯＧＤ）組み合わせの影響。連続してＮ２でバブリングしているグルコース不含浴溶液に、培養ニューロン（ＤＩＶ  １２−１４）を１時間（ＷＴ）または２時間（Ｓｔｉｍ２−／−）、曝露した。ｄ、ＣＣＣＰ（２μＭ、３０分間）によって、Ｓｔｉｍ２−／−またはＷＴ細胞において、化学的無酸素症を誘導した。ＣＣＣＰを６０分間洗い流した後、［Ｃａ２＋］ｉの増加からの回復が得られた。すべてのバーは、５〜７回の実験の平均を示す。エラーバーはＳＥＭを示す。アスタリスクは、有意な相違を示す（ｐ＜０．０５、両側マン−ホイットニーＵ検定）。
【図３−１】ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏの虚血条件下で、ＳＴＩＭ２の欠如は神経保護性である。ａ、対照（０時間、Ｏ２）条件下、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ虚血（６時間、Ｎ２）後の、野生型およびＳｔｉｍ２−／−動物由来のアポトーシス性（Ｃａｓｐ３）培養海馬ニューロン（ＭＡＰ２ａ／ｂ）の代表的な画像。スケールバーは５０μｍを示す。ｂ、異なる実験条件下での死亡ニューロン（％）の棒グラフ提示。
【図３−２】ｃ、脳切片における虚血および対照条件下での、カスパーゼ３（Ｃａｓｐ３）陽性海馬ニューロン（ＮｅｕＮ）の代表的な画像。ＤＡＰＩ対比染色（ＤＡＰＩ）。スケールバーは、１０（左パネル）または１００μｍ（右パネル）を示す。ｄ、Ｓｔｉｍ２−／−マウスおよび対照同腹仔における、正常（６時間、Ｏ２、黒いカラム）および虚血条件（６時間、Ｎ２、グレーのカラム）下でのニューロン死（死亡ニューロン／ｍｍ２）の棒グラフ提示。結果を平均±ｓ．ｄ．で示す。修飾スチューデントｔ検定を用いた、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図４−１】Ｓｔｉｍ２−／−マウスは、脳虚血後、ニューロン損傷から保護される。ａ〜ｃ、野生型およびＳｔｉｍ２−／−マウスを、一過性の中大脳動脈閉塞（ｔＭＣＡＯ）に供し、そして２４時間後に分析した。平行して、Ｓｔｉｍ２−／−骨髄を移植した野生型マウス（Ｓｔｉｍ２＋／＋ＢＭ−／−）および野生型骨髄を移植したＳｔｉｍ２−／−マウス（Ｓｔｉｍ２−／−ＢＭ＋／＋）を用いて実験を行った。ａ、異なる群の３つの対応する冠状脳切片の代表的なＴＴＣ（２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロリド）染色。ｂ、ｔＭＣＡＯ  １日後の面積測定法によって測定した際の脳梗塞体積（ｎ＝８〜１０／群）。ｃ、神経学的ベダーソン・スコア、およびｄ、ｔＭＣＡＯ  １日後に評価した際のグリップ試験。グラフは平均±ｓ．ｄ．をプロットする（ｎ＝８〜１０／群）。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、野生型マウスに対して試験した、ボンフェローニ一方向ＡＮＯＶＡ。
【図４−２】ｅ、野生型およびＳｔｉｍ２−／−マウスの虚血半球における、ヘマトキシリンおよびエオジン（ＨＥ）染色切片。梗塞はＳｔｉｍ２−／−マウスでは基底核に限定されているが、野生型では一貫して新皮質が含まれることに注目されたい。スケールバー、３００μｍ。
【図５】Ｓｔｉｍ２−／−マウスの性質決定。ａ、３〜４週齢同腹仔において決定した際のＳｔｉｍ２−／−マウスのメンデル法則にしたがった出生率。ｂ、８週齢の雄Ｓｔｉｍ２−／−（−／−）マウスおよび同腹仔対照マウス（＋／＋）の代表的な写真。
【図６】Ｓｔｉｍ２−／−マウスにおける正常な脳構造。３ヶ月齢野生型（ａ〜ｄ）およびＳｔｉｍ２−／−（ｅ〜ｈ）マウス（ｎ＝各５）の５μｍ矢状パラフィン脳切片の代表的なニッスル染色。野生型（ａ）およびＳｔｉｍ２−／−（ｅ）脳の巨視的写真。異なる脳領域のより高い拡大率：小脳（ｂ、ｆ）、海馬（ＣＡ１、ＣＡ２、ＣＡ３領域および歯状回）（ｃ、ｇ）、新皮質の前頭極および体性運動（ｓｏｍａｔｏｍｏｔｏｒ）領域（ｄ、ｈ）。スケールバー＝２．５ｍｍ（ａ、ｅ）および２５０μｍ（ｂ〜ｄ、ｆ〜ｈ）。
【図７】Ｓｔｉｍ２−／−マウスの認知欠陥。学習および記憶の空間形式および関連形式を評価するための標準法であるモリス水迷路タスクにおける、Ｓｔｉｍ２−／−およびその野生型同腹仔。ａは、隠れたプラットフォームを見つける前にマウスが泳いだ総距離を示す。値を平均±ＳＥＭで示す、Ｆ（１、１２）＝１９．７３、ｐ＜０．００１、反復測定に関するＡＮＯＶＡ。ｂ、不安関連パラダイムとしての高架式十字迷路（ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｐｌｕｓ  ｍａｚｅ）におけるＳｔｉｍ２−／−およびその野生型同腹仔。値を平均±ＳＥＭで示す、スチューデントｔ検定、ｎ．ｓ．。左側の２つのパネルは、開放または閉鎖アームのいずれかでマウスが費やした時間量を割合で示す。最後のパネルは、閉鎖アームの総訪問割合を示す。
【図８】Ｓｔｉｍ２−／−マウスにおけるｔＭＣＡＯ後の持続された神経保護。ｔＭＣＡＯ  １日後および５日後での、野生型またはＳｔｉｍ２−／−マウスの代表的な冠状Ｔ２−ｗ  ＭＲ脳画像。白い矢印によって梗塞を示す。脳損傷が重度であったため、すべての野生型マウスは第１日で屠殺され、そしてしたがって、第５日にはＭＲＩによって評価されなかった。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
したがって、本発明は、間質相互作用分子２（ＳＴＩＭ２）の阻害剤またはＳＴＩＭ２制御性細胞膜カルシウムチャネル活性の阻害剤、ならびに場合によって医薬的に許容されうるキャリアー、賦形剤および／または希釈剤を含む医薬組成物に関する。
【００１２】
用語「医薬組成物」は、本発明にしたがって、患者、好ましくはヒト患者に投与するための組成物に関する。本発明の医薬組成物は、少なくとも１つ、例えば少なくとも２つ、例えば少なくとも３つ、さらなる態様において、少なくとも４つ、例えば結局、５つの上述の阻害剤を含む。本発明はまた、ＳＴＩＭ２の阻害剤およびＳＴＩＭ２制御性細胞膜カルシウムチャネル活性の阻害剤の混合物も想定する。１より多い阻害剤が組成物中に含まれる場合、これらの阻害剤のいずれも、組成物中にやはり含まれる他の阻害剤に対して、阻害効果を持たないことが理解される。
【００１３】
組成物は、固体、液体または気体型であってもよく、そしてとりわけ、粉末（単数または複数）、錠剤（単数または複数）、溶液（単数または複数）またはエアロゾル（単数または複数）の形であってもよい。
【００１４】
前記医薬組成物が、医薬的に許容されうるキャリアー、賦形剤および／または希釈剤を含むことが好ましい。当該技術分野において、適切な医薬的キャリアー、賦形剤および／または希釈剤の例が周知であり、そしてこれには、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、エマルジョン、例えば油／水エマルジョン、多様なタイプの湿潤剤、無菌溶液等が含まれる。周知の慣用法によって、こうしたキャリアーを含む組成物を配合してもよい。これらの医薬組成物を適切な用量で被験者に投与してもよい。異なる方式で、例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋内、局所、皮内、鼻内または気管支内投与によって、適切な組成物の投与を達成してもよい。脳または冠動脈などの血流中の部位に、あるいはそれぞれの組織内に直接、注射および／または送達によって、前記投与を行うことが特に好ましい。また、本発明の組成物をターゲット部位に直接投与してもよく、外部または脳のような内部ターゲット部位に、例えば微粒子銃送達によって投与してもよい。投薬措置は、医師および臨床的要因によって決定されるであろう。医学業に周知であるように、いかなる１人の患者に対する投薬も、患者の大きさ、体表面積、年齢、投与しようとする特定の化合物、性別、投与時間および経路、全身の健康状態、ならびに同時に投与される他の薬剤を含む、多くの要因に応じる。タンパク質性医薬活性物質は、用量あたり１ｎｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の間の量で存在してもよい；が、この例示的な範囲より低いかまたは高い用量が、特に前述の要因を考慮して想定される。措置が連続注入である場合、これもまた、１分あたり体重１キログラムあたり０．０１μｇ〜１０ｍｇ単位の用量範囲であるべきである。連続注入措置は、１ｎｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量範囲の装填用量で完了可能である。
【００１５】
定期的評価によって、進行を監視してもよい。本発明の組成物を局所または全身性に投与してもよい。非経口投与用の調製には、無菌水性または非水性溶液、懸濁物、およびエマルジョンが含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能有機エステルである。水性キャリアーには、水、アルコール性／水性溶液、エマルジョンまたは懸濁物が含まれ、生理食塩水および緩衝媒体が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲル・デキストロース液、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液、または不揮発性油が含まれる。静脈内ビヒクルには、液体および栄養補充剤、電解質補充剤（例えばリンゲル・デキストロース液に基づくもの）等が含まれる。例えば、抗微生物剤、酸化防止剤、キレート剤、および不活性ガス等の、保存剤および他の添加剤もまた存在してもよい。前記医薬組成物が、神経変性をアンタゴナイズする、当該技術分野に知られるさらなる剤を含むことが特に好ましい。本発明の医薬調製は、上述の阻害剤に頼るため、言及されるさらなる剤は、補充剤としてのみ用いられ、すなわち、例えばさらなる剤によって与えられる副作用を減少させるために、唯一の薬剤として用いられる際に推奨される用量に比較して、減少した用量で用いられる。慣用的な賦形剤には、結合剤、充填剤、潤滑剤、および湿潤剤が含まれる。
【００１６】
用語「ＳＴＩＭ２」は、「間質相互作用分子２」に関連し、そしてどちらの用語も本明細書において、交換可能に用いられる。ＳＴＩＭ２は、ＣＣＥを制御する、小胞体／筋小胞体（ＥＲ／ＳＲ）常在性カルシウム感知分子の最近発見されたファミリーのメンバーである。ＳＴＩＭ１は、別のファミリーメンバーであり、リンパ球（Ｌｉｏｕ、２００５；  Ｚｈａｎｇ、２００５；  Ｏｈ−Ｈｏｒａ、２００８）、血小板（Ｖａｒｇａ−Ｓｚａｂｏ、２００８）および（興奮性）骨格筋細胞（Ｓｔｉｂｅｒ、２００８）を含む、異なる細胞タイプにおいて、ＣＣＥの必須構成要素であることが示されてきており、こうした部位で、ＳＴＩＭ１は、ＯＲＡＩ１（Ｆｅｓｋｅ、２００６）（ＣＲＡＣＭ１とも呼ばれる（Ｖｉｇ、２００６））およびおそらく他のＳＯＣチャネルを活性化する。一方、ＳＴＩＭ２は、基底細胞質カルシウム濃度を制御し、そしてカルシウム濃度を保存し（Ｂｒａｎｄｍａｎ、２００７）、いくつかの細胞タイプにおいて、ＣＣＥに軽度に寄与するのみであると提唱されてきている（Ｏｈ−Ｈｏｒａ、２００８）。ヒトＳＴＩＭ２のｍＲＮＡ配列は、例えば、ＮＣＢＩ寄託番号ＮＭ＿０２０８６０．２（ＮＣＢＩ  ｍＲＮＡ参照配列：  ＮＭ＿０２０８６０．２、ＳＴＩＭ２  間質相互作用分子２［ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）］；  ＳＴＩＭ２のｃＤＮＡとして配列番号１）下に見出されうる。
【００１７】
用語「カルシウム」は、本明細書において、「Ｃａ２＋」または「Ｃａ２＋」と交換可能に用いられる。本発明全体で用いた際、用語「［Ｃａ２＋］ｉ」は、細胞内Ｃａ２＋濃度を指す。
【００１８】
用語「阻害剤」は、本発明にしたがって、特定のターゲットタンパク質の生物学的機能を減少させる阻害剤を指す。阻害剤は、阻害しようとするタンパク質の生物学的機能を減少させるため、任意の１以上の以下の効果を実行しうる：（ｉ）阻害しようとするタンパク質をコードする遺伝子の転写を低下させる、すなわちｍＲＮＡレベルを低下させる、（ｉｉ）阻害しようとするタンパク質をコードするｍＲＮＡの翻訳を低下させる、（ｉｉｉ）阻害剤の存在下では、タンパク質が、低下した効率で生化学的機能を実行する、および（ｉｖ）阻害剤の存在下では、タンパク質が、低下した効率で細胞機能を実行する。
【００１９】
阻害剤は、本発明にしたがって、特定の態様において、タンパク質性化合物として、または阻害剤をコードする核酸分子として提供されてもよい。例えば、阻害剤をコードする核酸分子を、制御要素、例えば特異的プロモーターを含む発現ベクター内に取り込んでもよく、そしてしたがって、これを細胞内に送達してもよい。細胞のターゲット化トランスフェクションのための方法および適切なベクターは、当該技術分野に知られており、例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌ（“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，”  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  ニューヨーク（２００１））を参照されたい。阻害剤をコードする核酸分子の発現ベクター内への取り込みによって、レシピエントの任意の細胞または選択される細胞サブセットにおけるコードされる阻害剤レベルの永続的な上昇が可能になる。したがって、例えばニューロンに限定された、組織および／または時間依存性の阻害剤発現が達成可能である。したがって、好ましい態様において、阻害剤はニューロン特異的阻害剤である。
【００２０】
本発明にしたがって、用語「ＳＴＩＭ２の阻害剤」は、ＳＴＩＭ２の生物学的機能を減少させる阻害剤を指す。生物学的機能は、特に、本発明にしたがって解明される機能を含む、ＳＴＩＭ２の任意の既知の生物学的機能を示す。前記生物学的機能の例は、ＣＣＥの誘導および基本的細胞質カルシウム含量の制御、ならびに本明細書に言及するＳＯＣチャネル候補を含む細胞膜Ｃａ２＋チャネル、例えば一過性受容器電位チャネル（ＴＲＰＣ）またはチャネルのＯＲＡＩファミリーメンバー、特にＯＲＡＩ２および／またはＯＲＡＩ３の開口を制御する下流結合パートナーへのＳＴＩＭ２の結合能、虚血誘導性カルシウム流入への寄与およびその結果のニューロンにおけるカルシウム過負荷およびニューロン損傷またはニューロン死である。当該技術分野に知られる多様な標準法、例えば図２ａおよび実施例４に記載するようなカルシウム測定に関するものなどのいずれを用いて、あるいは場合によって実施例に引用する文書の解説と組み合わせて、以下に提供する実施例の解説に基づいてのいずれかで、これらの機能すべてを試験してもよい。
【００２１】
好ましい態様において、阻害剤は、ＳＴＩＭ２の生物学的機能を少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９０％、そしてさらにより好ましくは少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％または１００％でさえ減少させる。用語、少なくとも、例えば７５％の減少は、ＳＴＩＭ２がその機能の７５％を失い、そしてその結果、阻害されていないＳＴＩＭ２に比較した際、２５％の活性しか残っていないように、生物学的機能が減少することを指す。
【００２２】
本発明に言及する任意の阻害剤の機能は、ハイスループットスクリーニングアッセイ（ＨＴＳ）を用いることによって、同定および／または検証可能である。ハイスループットアッセイは、生化学、細胞または他のアッセイであるのとは独立に、一般的に、マイクロタイタープレートのウェルで行われ、各プレートは、例えば９６、３８４または１５３６ウェルを含有してもよい。周囲温度以外の温度でのインキュベーション、およびアッセイ混合物と試験化合物を接触させる工程を含む、プレートの取り扱いは、好ましくは、ピペッティング・デバイスを含む、１またはそれより多いコンピュータ制御ロボット系によって達成される。試験化合物の巨大ライブラリーをスクリーニングしようとする場合、そして／またはスクリーニングを短時間のうちに達成しようとする場合、例えば１０、２０、３０、４０、５０または１００の試験化合物の混合物を各ウェルに添加してもよい。ウェルが生物学的活性を示す場合、試験化合物の前記混合物をデコンボルート（ｄｅ−ｃｏｎｖｏｌｕｔｅｄ）して、観察された生物学的活性を生じさせる、前記混合物中の１またはそれより多い試験化合物を同定してもよい。例えば、阻害剤を用いた機能／活性アッセイを行う前に、結合試験分子を同定するのに用いることが可能な任意の結合アッセイ、好ましくは生物物理的結合アッセイにおいて、潜在的阻害剤の結合の決定を達成してもよい。適切な生物物理的結合アッセイが当該技術分野に知られ、そしてこれは、蛍光極性（ＦＰ）アッセイ、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）アッセイおよび表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイを含む。
【００２３】
阻害剤が、ターゲットタンパク質の発現レベルを減少させることによって作用する場合、タンパク質の発現レベルの決定は、例えば、核酸レベルまたはアミノ酸レベルで実行可能である。
【００２４】
核酸レベルでタンパク質の発現を決定するための方法には、限定されるわけではないが、ノーザンブロッティング、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲまたはリアルＲＴ−ＰＣＲが含まれる。ＰＣＲは当該技術分野に周知であり、そして多数のターゲット配列コピーを作製するために使用される。これは、自動化サイクラーデバイス上で行われ、該デバイスは、非常に短時間で、反応混合物を含む容器を加熱し、そして冷却することも可能である。ＰＣＲは、一般的に、周期の多数回の反復からなり、該反復は：（ａ）ＤＮＡ分子の両方の鎖を融解し、そしてすべての先の酵素反応を終結させる、変性工程；（ｂ）ＤＮＡ分子の融解した鎖に、プライマーが特異的にアニーリングするのを可能にすることを目的とするアニーリング工程；および（ｃ）テンプレート鎖によって提供される情報を用いることによって、アニーリングしたプライマーを伸長させる伸長工程からなる。一般的に、ＰＣＲは、例えば、５μｌの１０ｘＰＣＲ緩衝液とともに、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００μＭの各デオキシヌクレオシド三リン酸、０．５μｌの各プライマー（１０μＭ）、約１０〜１００ｎｇのテンプレートＤＮＡおよび１〜２．５単位のＴａｑポリメラーゼを含有する５０μｌ反応混合物中で実行可能である。増幅のためのプライマーは標識されていてもまたは標識されていなくてもよい。例えばモデル２４００サーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティ）で：９４℃２分間、その後、アニーリング（例えば５０℃３０秒間）、伸長（例えば７２℃１分間、ＤＮＡテンプレートの長さおよび用いる酵素に応じる）、変性（例えば９４℃１０秒間）および最終アニーリング工程、５５℃１分間からなる３０〜４０周期、ならびに最終伸長工程、７２℃５分間で、ＤＮＡ増幅を行ってもよい。ＤＮＡテンプレートとともに使用するのに適したポリメラーゼには、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩまたはそのクレノウ断片、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）Ｖｅｎｔから単離された熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、Ａｍｐｌｉｔａｑ、ＰｆｕおよびＫＯＤが含まれ、これらのいくつかは、校正機能および／または異なる温度最適値を示す可能性もある。しかし、当該技術分野において、異なる長さおよび／または組成のプライマーを用いて、特定の核酸分子を増幅するためのＰＣＲ条件をどのように最適化し、あるいは反応混合物体積をどのように減少させまたは増加させるかは、当該技術分野で周知である。「逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応」（ＲＴ−ＰＣＲ）は、増幅しようとする核酸がＲＮＡからなる場合に用いられる。用語「逆転写酵素」は、デオキシリボヌクレオシド三リン酸の重合を触媒して、リボ核酸テンプレートに相補的なプライマー伸張産物を形成する酵素を指す。該酵素は、プライマーの３’端で合成を開始し、そして合成が終結するまで、テンプレートの５’端に向かって進行する。ＲＮＡターゲット配列を、相補的コピーＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列に変換する、適切な重合剤の例には、鳥類骨髄芽球ウイルス逆転写酵素およびサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒによって市販される、逆転写酵素活性を持つ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼがある。典型的には、最初の逆転写工程後の最初の変性工程中に、ゲノムＲＮＡ／ｃＤＮＡ二重鎖テンプレートが熱変性されて、ＤＮＡ鎖が増幅テンプレートとして利用可能であるように残る。高温ＲＴは、より高いプライマー特異性および有効性改善を提供する。米国特許出願第０７／７４６，１２１号、１９９１年８月１５日出願は、同じプライマーおよびポリメラーゼが、逆転写およびＰＣＲ増幅工程の両方に十分であり、そして両方の反応が試薬を変化させずに起こるように反応条件を最適化した、「均一ＲＴ−ＰＣＲ」を記載する。サーマス・サーモフィルスＤＮＡポリメラーゼは、逆転写酵素として機能可能な熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであり、テンプレートに関わらず、すべてのプライマー伸長工程に使用可能である。どちらのプロセスも、試薬を交換するかまたは添加するために、試験管を開口する必要を伴わずに実行可能である；最初の周期（ＲＮＡテンプレート）および残りの増幅周期（ＤＮＡテンプレート）の間で、温度プロファイルのみを調整する。例えば：４μｌの５ｘＡＭＶ−ＲＴ緩衝液、２μｌのオリゴｄＴ（１００μｇ／ｍｌ）、２μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、１μｌ総ＲＮＡ、１０単位のＡＭＶ逆転写酵素、および２０μｌ最終体積までのＨ２Ｏを含有する２０μｌ反応混合物中で、ＲＴ反応を行ってもよい。以下の条件を用いることによって、反応を実行してもよい：反応を７０℃で１５分間保持して、逆転写を可能にする。次いで、反応温度を９５℃に１分間上昇させて、ＲＮＡ−ｃＤＮＡ二重鎖を変性させる。次に、反応温度は、２周期の９５℃１５分間および６０℃２０秒間を経て、その後、３８周期の９０℃１５秒間および６０℃２０秒間が続く。最後に、最終伸長工程のため、反応温度を６０℃で４分間保持して、１５℃に冷却し、そして増幅された試料のさらなるプロセシングまでその温度で保持する。上述の反応条件のいずれも、特定の場合の必要性に応じて、スケールアップしてもよい。生じた産物をアガロースゲル上に装填して、そしてエチジウムブロミドまたはＳｙｂｒＧｒｅｅｎなどの挿入色素で核酸分子を染色した後、バンド強度を比較する。処理しない試料に比較した際、阻害剤で処理した試料のバンド強度がより低ければ、阻害剤がタンパク質を成功裡に阻害することが示される。
【００２５】
リアルタイムＰＣＲは、当該技術分野において、ＴａｑＭａｎプローブともまた呼ばれる、５’端に共有結合したレポーター色素および３’端の消光剤を有する、特異的プローブを使用する。ＰＣＲ反応のアニーリング工程において、ＰＣＲ反応の伸長期中、ＴａｑＭａｎプローブが、増幅されているポリヌクレオチドの相補部位にハイブリダイズされた後、Ｔａｑポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性によって、５’フルオロフォアが切断される。これによって、以前には、ＴａｑＭａｎプローブ配列中の３’アクセプターに非常に近接しているために消光されていた、５’ドナーの蛍光が増進する。それによって、増幅プロセスを直接、そしてリアルタイムで監視可能であり、これによって、慣用的な終点ＰＣＲよりも発現レベルの有意により正確な決定が可能になる。やはりリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ実験で使用されるのは、二本鎖ＤＮＡ分子のｄｅ  ｎｏｂｏ合成を監視するための、ＳｙｂｒＧｒｅｅｎなどのＤＮＡ挿入色素である。
【００２６】
アミノ酸レベルでのタンパク質発現の測定法には、限定されるわけではないが、ウェスタンブロッティング、あるいはクーマシーブリリアントブルーまたは銀染色などのタンパク質染色技術と組み合わせたポリアクリルアミドゲル電気泳動が含まれる。総タンパク質をポリアクリルアミドゲル上に装填し、そして電気泳動する。その後、電流を適用することによって、別個のタンパク質を、膜、例えばポリビニルジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜上にトランスファーする。膜上のタンパク質を、関心対象のタンパク質を特異的に認識する抗体に曝露する。洗浄後、第一の抗体を特異的に認識し、そして蛍光色素などの読み取り系を所持する第二の抗体を適用する。阻害剤で処理した試料由来のタンパク質および未処理試料由来のタンパク質の蛍光強度を比較することによって、関心対象のタンパク質の量を決定する。阻害剤で処理した試料由来のタンパク質の蛍光強度がより低いならば、タンパク質阻害剤として成功していることが示される。タンパク質定量化にやはり用いられるのはＡｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ技術である。
【００２７】
本発明にしたがって用いた際、用語「ＳＴＩＭ２制御性細胞膜カルシウムチャネル活性の阻害剤」は、直接または間接的に、ＳＴＩＭ２制御性細胞膜カルシウムチャネル活性を、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９０％、そしてさらにより好ましくは少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％または１００％でさえ減少させる阻害剤に関する。ＳＴＩＭ２制御性細胞膜カルシウムチャネル活性の限定されない例には、ＳＴＩＭ２に感受性である細胞膜Ｃａ２＋チャネルの開口を達成するＳＴＩＭ２の下流結合パートナー（単数または複数）、例えば限定されるわけではないが、ＯＲＡＩ１、ＯＲＡＩ２、ＯＲＡＩ３およびＴＲＰチャネル、ならびにアダプター分子が含まれる。特に、ＳＴＩＭ２制御性細胞膜カルシウムチャネル活性は、ＯＲＡＩ２およびＯＲＡＩ３からなる群より選択される。ＳＴＩＭ２制御性細胞膜カルシウムチャネル活性の最も好ましい阻害剤は、ＯＲＡＩ２の阻害剤である。ＯＲＡＩ２の生物学的機能の例は、ＳＴＩＭ１またはＳＴＩＭ２または他の制御因子に対するＯＲＡＩ２の結合、貯蔵作動型Ｃａ２＋（ＳＯＣ）チャネルとして作用するその機能、ＳＯＣＥのその仲介、ならびに場合によってそれらと組み合わせられる、虚血誘導性カルシウム流入に関するその必要性、ならびにその結果のニューロンにおけるカルシウム過負荷、およびニューロン損傷またはニューロン死である。共通の一般的な知識に基づいて、または本明細書の解説に基づいてのいずれかで、場合によって本明細書に引用する文書の解説と組み合わせて、当業者はこれらの機能すべてを試験可能である。
【００２８】
阻害剤は、直接、カルシウムチャネルに作用して、その活性を阻害することも可能であるし、または阻害剤は間接的に制御分子に作用して、該分子が次に、ＳＴＩＭ２制御性細胞膜カルシウムチャネル活性を制御することも可能である。ＳＴＩＭ２制御性細胞膜カルシウムチャネル活性を評価する多様な方法が当該技術分野に知られる。例えば、図２ａおよび実施例４に記載するように、試験細胞内へのカルシウム流入を測定することによって、ＳＴＩＭ２制御性細胞膜カルシウムチャネル活性を決定してもよい。
【００２９】
本発明にしたがって、驚くべきことに、ＳＴＩＭ２が、ニューロンにおける、容量性カルシウム流入および虚血誘導性細胞質Ｃａ２＋集積に必須であるが、ＳＴＩＭ１は必須ではないことが見出された。Ｓｔｉｍ２−／−マウス由来のニューロンは、野生型対照に比較して、培養および急性海馬切片調製においての両方で、低酸素条件下での有意な生存増加を示した。ｉｎ  ｖｉｖｏの局所的脳虚血のモデルにおいて、Ｓｔｉｍ２−／−マウスは、神経学的損傷から顕著に保護された。
【００３０】
したがって、本発明にしたがって、ＳＴＩＭ２がニューロンにおいてＣＣＥを制御し、そしてＳＴＩＭ２が存在しないと、これらの細胞におけるＣａ２＋ホメオスタシス改変が生じることが示された。これは、多様な細胞タイプにおいてよく確立された現象であるＣＣＥが、脳ニューロンにおいて、（病態）生理学的に重要であることの最初の直接的な証明である。これまでに研究されたすべての他の細胞タイプにおいて、ＣＣＥに関する緊密に関連するＳＴＩＭ１の本質的な役割を考慮すると（Ｏｈ−Ｈｏｒａ（２００８）、Ｖａｒｇａ−Ｓｚａｂｏ（２００８）、Ｓｔｉｂｅｒ（２００８））、このプロセスにおいて、ＳＴＩＭ１ではなくＳＴＩＭ２が中心的な役割を果たしているのは驚くべきことである。ニューロンが、ＣＣＥを制御するのに、なぜＳＴＩＭ１ではなくＳＴＩＭ２を使用するのかは明らかではないが、束縛されることは望ましくないものの、全体のＣａ２＋ホメオスタシスにおける個々の細胞タイプ間の相違が、ありうる説明を提供しうると仮定される。非興奮性細胞におけるＣＣＥの最大の作用として広く認められる、枯渇した細胞内Ｃａ２＋貯蔵の単純な補充は、ニューロンにおいては主な機能でない可能性もあり、これは、通常のニューロン活性に関連する連続したＣａ２＋装填（Ｈｅｌｍｃｈｅｎ（１９９６））が、Ｃａ２＋の十分な供給を提供するはずであるためである。さらに、シナプス活動中に生じる限局性樹状Ｃａ２＋放出事象（Ｔａｋｅｃｈｉ（１９９８））は、ニューロンのすべての部分に渡る、広く連続したＥＲ内でのＣａ２＋の往復（Ｂｅｒｒｉｄｇｅ（１９９８））によって、迅速に相殺される。ニューロンＣＣＥの生理学的役割は、自発的な伝達物質放出およびシナプス可塑性などの幾分予期されない機能も含みうる（Ｅｍｐｔａｇｅ（２００１））。実際、本発明にしたがって、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）型イオンチャネル型グルタミン酸受容体の遮断後に観察されるもの（Ｍｏｒｒｉｓ（１９８６））と類似の空間学習障害が、Ｓｔｉｍ２−／−マウスにおいて見出された。病態生理学的条件に関して、本発明の結果は、Ｃａ２＋依存性細胞死において、ＣＣＥに重要な役割を割り当てる。無酸素症は、ニューロンにおける筋小胞体（小胞体）Ｃａ２＋−ＡＴＰアーゼ（ＳＥＲＣＡ）活性を減少させる（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ（１９９３）、Ｈｅｎｒｉｃｈ（２００８））が、また、イノシトール１，４，５三リン酸（ＩＰ３）受容体またはリアノジン受容体（ＲｙＲ）の遮断を通じた、興奮毒性傷害に対するニューロンの保護（Ｆｒａｎｄｓｅｎ（１９９１）、Ｍａｔｔｓｏｎ（２０００））によって明らかであるように、ＥＲ  ＩＰ３およびＲｙＲチャネルからの能動的なＣａ２＋放出も伴うようである。総合すると、これらの事象は、細胞質におけるＣａ２＋集積および対応する貯蔵枯渇を導き、後者がＣＣＥを通じてさらなるＣａ２＋装填を誘導する。次に、グルタミン酸の放出およびイオンチャネル型グルタミン酸受容体の活性化を増加させることによって、ＣＣＥがさらなるＣａ２＋流入を誘発しうる。ＣＣＥおよびグルタミン酸作動性Ｃａ２＋流入はどちらも、次に、細胞質Ｃａ２＋濃度を損傷レベルまで迅速に押し上げる。ＳＴＩＭ２を欠く���ューロンは、ＣＣＥを経ず、そしてさらなる利点として、貯蔵含量がより低く、これによって最初のＣａ２＋放出が限定され、そして虚血曝露中、残りのＣａ２＋隔離能をよりよく利用することが補助されるため、こうしたニューロンは、虚血状態で有意によりよく生き延びる。
【００３１】
したがって、本発明は、ＳＴＩＭ２およびその下流結合パートナー（単数または複数）、特に、ＯＲＡＩ２および／またはＯＲＡＩ３を、ニューロンＣＣＥの本質的な仲介因子として確立し、そしてこの経路が低酸素症誘導性ニューロン死の間に最も重要であることを示す。したがって、上記発見は、間質相互作用分子２（ＳＴＩＭ２）の阻害剤またはＳＴＩＭ２制御性細胞膜カルシウムチャネル活性の阻害剤に基づく医薬組成物の調製を可能にする。これらの発見に基づいて、虚血性脳卒中、および細胞内Ｃａ２＋ホメオスタシスの妨害が主な病態生理学的構成要素であると考えられる他の神経変性障害（Ｗｏｊｄａ（２００８）、Ｍａｔｔｓｏｎ（２００７））の治療のための新規神経保護剤が、現在、開発可能である。ＯＲＡＩ２およびＯＲＡＩ３は、細胞膜において発現されるため、病的に増加したカルシウム濃度と関連する神経学的障害を防止し、そして／または治療するため、ＳＴＩＭ２と比較した際に、薬理学的阻害のさらにより好ましいターゲットでありうる。
【００３２】
本発明は、病的に増加した細胞質カルシウム濃度に関連する神経変性障害の治療および／または防止に使用するための、間質相互作用分子２（ＳＴＩＭ２）の阻害剤またはＳＴＩＭ２制御性細胞膜カルシウムチャネル活性の阻害剤に、さらに関する。
【００３３】
用語「神経学的障害」は、本明細書において、機能不全および能力障害を生じるニューロンまたはそのミエリン鞘の劣化から生じる、いかなる疾患も指す。表現型的に、神経学的障害は、ニューロンまたはそのミエリン鞘の劣化が運動に影響を及ぼす運動失調、およびニューロンまたはそのミエリン鞘の劣化が記憶機能に影響を及ぼす痴呆に分けることも可能である。神経学的障害が神経変性障害であることが特に好ましい。
【００３４】
本発明にしたがって、用語「病的に増加した細胞質カルシウム濃度に関連する神経学的障害」は、病的に増加した細胞質カルシウム濃度が、疾患の原因であるか、または疾患に寄与するか、または疾患の結果である、神経学的障害に関する。用語「病的に増加した細胞質カルシウム濃度」は、本明細書において、非低酸素細胞における細胞質カルシウム濃度に比較して増加した、細胞質カルシウム濃度を指す。例えば、ＮＭＤＡまたはＡＭＰＡ受容体の過剰活性化（例えば脳外傷または脳卒中のような脳傷害の背景における神経伝達物質グルタミン酸によるもの）は、ニューロン死を、そしてその結果、神経変性を導く、細胞内カルシウム濃度の増加を導きうる。あるいは、病的に増加した細胞質カルシウム濃度は、例えば、脊髄傷害、脳卒中、外傷性脳傷害、癲癇、多発性硬化症、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病およびハンチントン病における、神経学的障害または神経学的障害の結果に寄与しうる。
【００３５】
あるいは、言及したＳＴＩＭ２の阻害剤またはＳＴＩＭ２制御性細胞膜カルシウムチャネル活性の阻害剤を、病的に増加した細胞質カルシウム濃度に関連する障害を治療し、そして／または防止するための薬剤を開発するためのリード化合物として用いてもよい。これらのリード化合物はまた、新規の非常に有効であるが安全な神経保護剤の開発も可能にしうる。これらの薬剤の開発において、以下の発展が考慮される：（ｉ）カルボキシル基のエステル化、または（ｉｉ）カルボン酸でのヒドロキシル基のエステル化、または（ｉｉｉ）ヒドロキシル基の、例えばリン酸エステル、ピロリン酸エステルもしくは硫酸エステルもしくはヘミコハク酸エステルへのエステル化、または（ｉｖ）医薬的に許容されうる塩の形成、または（ｖ）医薬的に許容されうる複合体の形成、または（ｖｉ）薬理学的活性ポリマーの合成、または（ｖｉｉ）親水性部分の導入、または（ｖｉｉｉ）芳香族（ａｒｏｍａｔｅ）もしくは側鎖上の置換基の導入／交換、置換基パターンの変更、または（ｉｘ）等比体積（ｉｓｏｓｔｅｒｉｃ）もしくは生物学的等価性（ｂｉｏｉｓｏｓｔｅｒｉｃ）部分の導入による修飾、または（ｘ）相同化合物の合成、または（ｘｉ）分枝側鎖の導入、または（ｘｉｉ）アルキル置換基の環状類似体への変換、または（ｘｉｉｉ）ヒドロキシル基のケタール、アセタールへの誘導体化、または（ｘｉｖ）アミド、フェニルカルバメートへのＮアセチル化、または（ｘｖ）マンニッヒ塩基、イミンの合成、または（ｘｖｉ）ケトンもしくはアルデヒドの、シッフ塩基、オキシム、アセタール、ケタール、エノールエステル、オキサゾリジン、チアゾリジンへの転換、またはその組み合わせによる、（ｉ）作用部位、活性スペクトル、臓器特異性の修飾、および／または（ｉｉ）強度改善、および／または（ｉｉｉ）毒性減少（療法指標改善）、および／または（ｉｖ）副作用減少、および／または（ｖ）療法作用発現、影響期間の修飾、および／または（ｖｉ）薬物動態学的パラメータ（吸収、分布、代謝および排出）の修飾、および／または（ｖｉｉ）物理化学的パラメータ（可溶性、吸湿性、色、味、匂い、安定性、状態）の修飾、および／または（ｖｉｉｉ）全身特異性、臓器／組織特異性の改善、および／または（ｉｘ）適用型および経路の最適化。
【００３６】
上に列挙する多様な工程は、当該技術分野に一般的に知られる。これらは、定量的構造−作用関係（ＱＳＡＲ）分析（Ｋｕｂｉｎｙｉ，  “Ｈａｕｓｃｈ−Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ”，  ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ，  Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，  １９９２）、コンビナトリアル生化学、古典的化学反応およびその他を含み、またはこれらに頼る（例えば、ＨｏｌｚｇｒａｂｅおよびＢｅｃｈｔｏｌｄ，  Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ａｐｏｔｈｅｋｅｒ  Ｚｅｉｔｕｎｇ  １４０（８），  ８１３−８２３，  ２０００を参照されたい）。
【００３７】
本発明はさらに、病的に増加した細胞質カルシウム濃度によって引き起こされる神経学的障害を治療し、そして／または防止する方法であって、医薬的に有効な量のＳＴＩＭ２の阻害剤またはＳＴＩＭ２制御性細胞膜カルシウムチャネル活性の阻害剤を、その必要がある被験者に投与する工程を含む、前記方法に関する。
【００３８】
本発明の医薬組成物または阻害剤の好ましい態様において、阻害剤は、抗体またはその断片もしくは誘導体、アプタマー、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス核酸分子、これらの阻害剤の修飾型または低分子である。
【００３９】
用語「抗体」は、本発明にしたがって用いた際、例えば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を含む。さらに、また、結合特異性をなお保持する、その誘導体または断片が、用語「抗体」に含まれる。抗体断片または誘導体は、とりわけ、ＦａｂまたはＦａｂ’断片、ならびにＦｄ、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖまたはｓｃＦｖ断片を含む；例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ  “Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８８ならびにＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ  “Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９９を参照されたい。用語「抗体」にはまた、キメラ（ヒト定常ドメイン、非ヒト可変ドメイン）、一本鎖およびヒト化（非ヒトＣＤＲを例外とするヒト抗体）抗体などの態様も含まれる。
【００４０】
抗体産生のための多様な技術が当該技術分野に周知であり、そして例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）および（１９９９）、同箇所に記載される。したがって、抗体をペプチド模倣体によって産生してもよい。さらに、一本鎖抗体の産生のために記載される技術（とりわけ、米国特許４，９４６，７７８を参照されたい）を適応させて、本発明のターゲットに特異的な一本鎖抗体を産生してもよい。また、トランスジェニック動物または植物（例えば、米国特許６，０８０，５６０を参照されたい）を用いて、本発明のターゲットに特異的な（ヒト化）抗体を発現させてもよい。最も好ましくは、抗体は、ヒトまたはヒト化抗体などのモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体調製のため、連続細胞株培養によって産生される抗体を提供する任意の技術が使用可能である。こうした技術の例は、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）および（１９９９）同箇所に記載され、そしてこれには、ハイブリドーマ技術（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６（１９７５），  ４９５−４９７）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ，  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４（１９８３），  ７２）およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．（１９８５），  ７７−９６）が含まれる。ＢＩＡｃｏｒｅ系で使用されるような表面プラズモン共鳴を用いて、ファージ抗体が、ＳＴＩＭ２のエピトープ、またはＳＴＩＭ２制御性細胞膜カルシウムチャネルのエピトープに結合する効率を増加させてもよい（Ｓｃｈｉｅｒ，  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ７（１９９６），  ９７−１０５；  Ｍａｌｍｂｏｒｇ，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８３（１９９５），  ７−１３）。本発明の背景において、用語「抗体」が、細胞中で発現可能な抗体構築物、例えばとりわけウイルスまたはプラスミドベクターを介してトランスフェクションされ、そして／または形質導入されてもよい抗体構築物を含むこともまた想定される。
【００４１】
アプタマーは、特定のターゲット分子に結合する核酸分子またはペプチド分子である。アプタマーは、通常、巨大なランダム配列プールから選択することによって生成されるが、天然アプタマーはまた、リボスイッチ中にも存在する。アプタマーを、巨大分子薬剤として、基礎研究および臨床目的のための両方で使用してもよい。アプタマーをリボザイムと組み合わせて、ターゲット分子の存在下で、自己切断させてもよい。これらの化合物分子は、さらなる研究、産業および臨床適用を有する（Ｏｓｂｏｒｎｅら（１９９７），  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  １：５−９；  Ｓｔｕｌｌ  ＆  Ｓｚｏｋａ（１９９５），  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １２，  ４：４６５−４８３）。
【００４２】
より具体的には、アプタマーを、核酸アプタマー、例えばＤＮＡまたはＲＮＡアプタマー、あるいはペプチドアプタマーとして分類してもよい。前者は、一般的に、（通常は短い）オリゴヌクレオチド鎖からなり、後者は、好ましくは、短い可変ペプチドドメインからなり、両端でタンパク質骨格に付着している。
【００４３】
核酸アプタマーは、通例、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択の反復周期、または同等に、ＳＥＬＥＸ（指数的濃縮によるリガンドの計画的進化）を通じて操作されて、低分子、タンパク質、核酸などの多様な分子、ならびにさらに細胞、組織および生物に結合する核酸種である。
【００４４】
ペプチドアプタマーは、通常、細胞内の他のタンパク質相互作用に干渉するよう設計されたペプチドまたはタンパク質である。これらは、タンパク質骨格に両端が付着した可変ペプチドループからなる。この二重構造拘束は、ペプチドアプタマーの結合アフィニティを抗体のものに匹敵するレベル（ナノモル濃度範囲）に増加させる。可変ペプチドループは、典型的には、１０〜２０アミノ酸を含み、そして骨格は、優れた可溶性特性を有するいかなるタンパク質であってもよい。現在、細菌タンパク質、チオレドキシンＡは、最も一般的に用いられる骨格タンパク質であり、可変ペプチドループがレドックス活性部位内に挿入されており、該ループは野生型タンパク質では−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−ループであり、２つのシステイン外側鎖はジスルフィド架橋を形成可能である。異なる系を用いて、ペプチドアプタマー選択を行ってもよいが、現在、最も広く用いられているのは、酵母２ハイブリッド系である。
【００４５】
アプタマーは、一般的に用いられる生体分子、特に抗体のものと匹敵する分子認識特性を提供するため、バイオテクノロジーおよび療法的適用のために有用性を提供する。差別的認識に加えて、アプタマーは、試験管中で完全に操作可能であり、化学合成によって容易に産生され、望ましい保存特性を所持し、そして療法適用において、免疫原性をほとんどまたはまったく誘発しないため、抗体に勝る利点を提供する。非修飾アプタマーは血流中で迅速にクリアランスされ、半減期は数分から数時間であり、これは主に、アプタマーが生得的に低分子量であるために、ヌクレアーゼ分解および腎臓による体からのクリアランスを経ることによるものである。
【００４６】
非修飾アプタマー適用は、現在、血液凝固などの一過性状態の治療、または局所送達が可能な目などの臓器の治療に重点を置く。この迅速なクリアランスは、ｉｎ  ｖｉｖｏ診断画像化などの適用において、利点を有しうる。２’−フッ素置換ピリミジン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）連結、アルブミンまたは他の半減期延長タンパク質への融合などの、アプタマーの半減期を数日またはさらに数週間増加させうるようないくつかの修飾が、科学者らに利用可能である。
【００４７】
用語「ペプチド」は、本明細書において、３０までのアミノ酸からなる分子群を記載し、一方、用語「タンパク質」は、本明細書において、３０より多いアミノ酸からなる分子群を記載する。ペプチドおよびタンパク質は、二量体、三量体およびより高次のオリゴマー、すなわち同一であってもまたは非同一であってもよい１より多い分子からなるものをさらに形成しうる。対応するより高次の構造は、その結果、ホモまたはヘテロ二量体、ホモまたはヘテロ三量体などと称される。用語「ペプチド」および「タンパク質」（ここで「タンパク質」は、「ポリペプチド」と交換可能に用いられる）はまた、天然修飾ペプチド／タンパク質も指し、ここで、修飾は、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化等によって達成される。こうした修飾は、当該技術分野に周知である。
【００４８】
本発明にしたがって、短分子干渉ＲＮＡまたはサイレンシングＲＮＡとしてもまた知られる、用語「低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）」は、生物学において多様な役割を果たす、長さ１８〜３０、好ましくは１９〜２５、最も好ましくは２１〜２３またはさらにより好ましくは２１ヌクレオチドの二本鎖ＲＮＡ分子のクラスを指す。最も顕著には、ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路に関与し、ここで、ｓｉＲＮＡは、特定の遺伝子の発現に干渉する。ＲＮＡｉ経路における役割に加えて、ｓｉＲＮＡはまた、ＲＮＡｉ関連経路においても、例えば抗ウイルス機構として、またはゲノムのクロマチン構造を形作る際にも作用する。
【００４９】
ｓｉＲＮＡは、天然には、実際、よく定義された構造：どちらかの端に２ｎｔの３’オーバーハングを持つ、短い二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を有する。各鎖は、５’リン酸基および３’ヒドロキシル（−ＯＨ）基を有する。この構造は、長いｄｓＲＮＡまたは短いヘアピンＲＮＡのいずれかを、ｓｉＲＮＡに変換する酵素であるダイサーによるプロセシングの結果である。また、ｓｉＲＮＡを外因性に（人工的に）細胞内に導入して、関心対象の遺伝子の特異的ノックダウンを引き起こすことも可能である。本質的には、適切に仕立てられた（ｔａｉｌｏｒｅｄ）ｓｉＲＮＡとの配列相補性に基づいて、配列が知られているいかなる遺伝子も、こうしてターゲティングされることが可能である。二本鎖ＲＮＡ分子またはその代謝プロセシング産物は、ターゲット特異的核酸修飾を仲介することが可能であり、特にＲＮＡ干渉および／またはＤＮＡメチル化がある。外因性に導入されるｓｉＲＮＡはその３’および５’端のオーバーハングを欠いていてもよいが、少なくとも１つのＲＮＡ鎖が５’および／または３’オーバーハングを有することが好ましい。好ましくは、二本鎖の一方の端が、１〜５ヌクレオチド、より好ましくは１〜３ヌクレオチド、そして最も好ましくは２ヌクレオチドの３’オーバーハングを有する。もう一方の端は、平滑端でもよいし、または最大６ヌクレオチドの３’オーバーハングを有する。一般的に、ｓｉＲＮＡとして作用するのに適した任意のＲＮＡ分子が、本発明で想定される。最も効率的なサイレンシングは、これまでのところ、２ｎｔの３’オーバーハングを有する方式で対形成した、２１ｎｔセンスおよび２１ｎｔアンチセンス鎖で構成されるｓｉＲＮＡ二重鎖で得られた。２ｎｔの３’オーバーハングの配列は、最初の塩基対に隣接した非対ヌクレオチドに限定された、ターゲット認識の特異性に対する小さい寄与を行う（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１）。３’オーバーハング中の２’−デオキシヌクレオチドは、リボヌクレオチドと同程度に効率的であるが、しばしば合成がより安価であり、そしておそらく、よりヌクレアーゼ耐性である。当該技術分野に知られる方法のいずれかを用いて、例えばｓｉＲＮＡを生理食塩水と合わせ、そしてこの組み合わせを静脈内または鼻内投与することによって、あるいはグルコース（例えば５％グルコースなど）または陽イオン性脂質中にｓｉＲＮＡを配合することによって、ｓｉＲＮＡの送達を達成してもよく、そしてｉｎ  ｖｉｖｏで、静脈内（ＩＶ）または腹腔内（ＩＰ）いずれかの全身経路を通じて、ｓｉＲＮＡ送達のためにポリマーを用いてもよい（Ｆｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓら（２００８），  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，  ８：２８０−２８５；  Ｌｕら（２００８），  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｖｏｌ．  ４３７：  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  −第３章：  Ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ  Ｓｍａｌｌ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ  ｆｏｒ  Ｎｏｖｅｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）。
【００５０】
短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉を通じて、遺伝子発現をサイレンシングするのに使用可能な、緊密なヘアピンターンを作るＲＮＡ配列である。ｓｈＲＮＡは、細胞内に導入されるベクターを用い、そしてｓｈＲＮＡが常に発現されることを確実にするため、Ｕ６プロモーターを利用する。このベクターは、通常、娘細胞に受け継がれ、遺伝子サイレンシングが遺伝することを可能にする。ｓｈＲＮＡヘアピン構造は、細胞性機構によってｓｉＲＮＡに切断され、これが次いで、ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に結合する。この複合体は、結合するｓｉＲＮＡにマッチするｍＲＮＡに結合し、そしてこれを切断する。本発明で用いるｓｉ／ｓｈＲＮＡは、好ましくは、適切に保護されたリボヌクレオシド・ホスホロアミダイトおよび慣用的なＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置を用いて化学的に合成される。ＲＮＡ合成試薬の供給業者は、Ｐｒｏｌｉｇｏ（ドイツ・ハンブルグ）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（米国コロラド州ラファイエット）、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅの一部、米国イリノイ州ロックフォード）、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（米国バージニア州スターリング）、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（米国マサチューセッツ州アッシュランド）、およびＣｒｕａｃｈｅｍ（英国グラスゴー)である。最も好適には、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、異なる品質およびコストのＲＮＡ合成産物を販売する、商業的ＲＮＡオリゴ合成供給業者から得られる。一般的に、本発明で適用可能なＲＮＡは、慣用的に合成され、そしてＲＮＡｉに適した品質で容易に提供される。
【００５１】
ＲＮＡｉを達成するさらなる分子には、例えば、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が含まれる。前記ＲＮＡ種は、一本鎖ＲＮＡ分子であり、内因性ＲＮＡ分子として遺伝子発現を制御する。相補性ｍＲＮＡ転写物への結合によって、ＲＮＡ干渉に類似のプロセスを通じて、前記ｍＲＮＡ転写物の分解が誘発される。したがって、ＳＴＩＭ２の阻害剤またはＳＴＩＭ２制御性細胞膜カルシウムチャネル活性、特にＯＲＡＩ２および／またはＯＲＡＩ３の阻害剤として、ｍｉＲＮＡを使用してもよい。
【００５２】
リボザイム（リボ核酸酵素からの名称、ＲＮＡ酵素または触媒性ＲＮＡとも呼ばれる）は、化学的反応を触媒するＲＮＡ分子である。多くの天然リボザイムは、それ自体の切断または他のＲＮＡの切断のいずれかを触媒するが、リボソームのアミノトランスフェラーゼ活性も触媒することもまた見出されてきている。よく性質決定された低分子自己切断性ＲＮＡの限定されない例は、ハンマーヘッド、ヘアピン、デルタ肝炎ウイルス、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択される鉛依存性リボザイムであり、一方、グループＩイントロンは、より大きいリボザイムの例である。触媒性自己切断の原理は、ここ１０年でよく確立されてきている。ハンマーヘッドリボザイムは、リボザイム活性を持つＲＮＡ分子の中で最もよく性質決定されている。ハンマーヘッド構造が異種ＲＮＡ配列内に組み込まれうることが示されており、そしてリボザイム活性がそれによってこれらの分子にトランスファーされうることが示されているため、ターゲット配列が潜在的にマッチングする切断部位を含有する限り、ほぼいかなるターゲット配列に対する触媒性アンチセンス配列も生成可能である。ハンマーヘッドリボザイムを構築する基本的な原理は以下の通りである：ＧＵＣ（またはＣＵＣ）３つ組を含有するＲＮＡの関心対象の領域を選択する。各々、通常６〜８ヌクレオチドを含む２つのオリゴヌクレオチド鎖を採用し、そして触媒性ハンマーヘッド配列をその間に挿入する。このタイプの分子を多くのターゲット配列のために合成した。これらは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、そしていくつかの場合、ｉｎ  ｖｉｖｏでもまた、触媒活性を示した。最適な結果は通常、短いリボザイムおよびターゲット配列で得られる。
【００５３】
本発明にしたがってやはり有用である最近の発展は、低分子化合物を認識するアプタマーとハンマーヘッドリボザイムの組み合わせである。結合に際して、アプタマーで誘導されるコンホメーション変化は、リボザイムの触媒機能を制御すると想定される。
【００５４】
用語「アンチセンス核酸分子」が当該技術分野に知られ、そしてこれはターゲット核酸に相補的な核酸を指す。本発明にしたがって、アンチセンス分子は、ターゲット核酸と相互作用可能であり、より具体的には、ターゲット核酸とハイブリダイズ可能である。ハイブリッドが形成されるため、ターゲット遺伝子（単数または複数）の転写および／またはターゲットｍＲＮＡの翻訳は減少するかまたは遮断される。アンチセンス技術に関連する標準法が記載されてきている（例えば、Ｍｅｌａｎｉら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９１）５１：２８９７−２９０１を参照されたい）。
【００５５】
用語「これらの阻害剤の修飾型」は、本発明にしたがって、（ａ）カルボキシル基のエステル化、または（ｂ）カルボン酸でのヒドロキシル基のエステル化、または（ｃ）ヒドロキシル基の、例えばリン酸エステル、ピロリン酸エステルもしくは硫酸エステルもしくはヘミコハク酸エステルへのエステル化、または（ｄ）医薬的に許容されうる塩の形成、または（ｅ）医薬的に許容されうる複合体の形成、または（ｆ）薬理学的活性ポリマーの合成、または（ｇ）親水性部分の導入、または（ｈ）芳香族もしくは側鎖上の置換基の導入／交換、置換基パターンの変更、または（ｉ）等比体積もしくは生物学的等価性部分の導入による修飾、または（ｊ）相同化合物の合成、または（ｋ）分枝側鎖の導入、または（ｋ）アルキル置換基の環状類似体への変換、または（ｌ）ヒドロキシル基のケタール、アセタールへの誘導体化、または（ｍ）アミド、フェニルカルバメートへのＮアセチル化、または（ｎ）マンニッヒ塩基、イミンの合成、または（ｏ）ケトンもしくはアルデヒドの、シッフ塩基、オキシム、アセタール、ケタール、エノールエステル、オキサゾリジン、チアゾリジンへの転換、またはその組み合わせによる、ｉ）活性スペクトル、臓器特異性の修飾、および／またはｉｉ）強度改善、および／またはｉｉｉ）毒性減少（療法指標改善）、および／またはｉｖ）副作用減少、および／またはｖ）療法作用発現、影響期間の修飾、および／またはｖｉ）薬物動態学的パラメータ（吸収、分布、代謝および排出）の修飾、および／またはｖｉｉ）物理化学的パラメータ（可溶性、吸湿性、色、味、匂い、安定性、状態）の修飾、および／またはｖｉｉｉ）全身特異性、臓器／組織特異性の改善、および／またはｉｘ）適用型および経路の最適化を達成するよう修飾されている阻害剤型を指す。
【００５６】
上に列挙する多様な工程は、当該技術分野に一般的に知られる。これらは、定量的構造−作用関係（ＱＳＡＲ）分析（Ｋｕｂｉｎｙｉ，  “Ｈａｕｓｃｈ−Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ”，  ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ，  Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，  １９９２）、コンビナトリアル生化学、古典的化学反応およびその他を含み、またはこれらに頼る（例えば、ＨｏｌｚｇｒａｂｅおよびＢｅｃｈｔｏｌｄ，  Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ａｐｏｔｈｅｋｅｒ  Ｚｅｉｔｕｎｇ  １４０（８），  ８１３−８２３，  ２０００を参照されたい）。
【００５７】
本発明にしたがった「低分子」は、例えば有機分子であってもよい。有機分子は、炭素に基づいて、炭素−炭素結合によってともに連結される炭素原子を有する化学的化合物のクラスに関連するかまたはこれに属する。用語、有機の元来の定義は、化学的化合物の供給源に関連し、有機化合物は、植物または動物または微生物供給源から得られる炭素含有化合物であり、一方、無機化合物はミネラル供給源から得られた。有機化合物は天然または合成であってもよい。あるいは、本発明にしたがった「低分子」は、無機化合物であってもよい。無機化合物は、ミネラル供給源から得られ、そしてこれには、炭素原子を含まない（二酸化炭素、一酸化炭素および炭酸塩を除く）すべての化合物が含まれる。好ましくは、低分子は、約２０００ａｍｕ未満、または約１０００ａｍｕ未満、例えば約５００ａｍｕ未満、そしてさらにより好ましくは約２５０ａｍｕ未満の分子量を有する。当該技術分野に周知の方法、例えば質量分析によって、低分子のサイズを決定してもよい。例えば、ターゲット分子の結晶構造に基づいて、低分子を設計してもよく、この場合、生物学的活性におそらく関与する部位を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）アッセイなどのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイで、同定し、そして検証することも可能である。
【００５８】
本発明の医薬組成物または阻害剤または方法の別の好ましい態様において、ＳＴＩＭ２制御性細胞膜カルシウムチャネルは、ＯＲＡＩ１、ＯＲＡＩ２、ＯＲＡＩ３およびＴＲＰチャネルからなる群より選択される。本発明の医薬組成物または阻害剤または方法のより好ましい態様において、ＳＴＩＭ２制御性細胞膜カルシウムチャネルは、ＯＲＡＩ２および／またはＯＲＡＩ３である。最も好ましい態様において、ＳＴＩＭ２制御性細胞膜カルシウムチャネルは、ＯＲＡＩ２である。
【００５９】
用語「ＯＲＡＩ１」、「ＯＲＡＩ２」および「ＯＲＡＩ３」は、本明細書において、ＯＲＡＩタンパク質ファミリー（ＣＲＡＣＭとも呼ばれる）のメンバーを指す。このファミリーのタンパク質は、４つの膜貫通セグメントを形成する細胞膜タンパク質である。ＯＲＡＩファミリーのタンパク質のＮＣＢＩ寄託番号は：  ＯＲＡＩ１に関してＮＭ＿０３２７９０．３（ＯＲＡＩ  カルシウム放出依存性カルシウム調節因子１）；  ＯＲＡＩ２に関してＮＭ＿００１１２６３４０．１（ＯＲＡＩ  カルシウム放出依存性カルシウム調節因子２、転写物変異体１）、ＯＲＡＩ２に関してＮＭ＿０３２８３１．２（ＯＲＡＩ  カルシウム放出依存性カルシウム調節因子２、転写物変異体２）、およびＯＲＡＩ３に関してＮＭ＿１５２２８８．２（ＯＲＡＩ  カルシウム放出依存性カルシウム調節因子３）である。
【００６０】
用語「ＴＲＰチャネル」は、本発明にしたがって用いた際、四量体に組み立てられて、非選択性陽イオン性チャネルを形成し、細胞内へのカルシウムイオンの流入を可能にすると仮定される、６つの膜貫通ドメインを有するサブユニットを形成する一過性受容器電位（ＴＲＰ）チャネルタンパク質のファミリーを指す。ＴＲＰチャネルタンパク質は、少なくとも３３のチャネルサブユニット遺伝子によってコードされ、ＴＲＰＣ（規準）、ＴＲＰＶ（バニロイド）、ＴＲＰＡ（アンキリン）、ＴＲＰＭ（メラスタチン）、ＴＲＰＰ（ポリシスチン）、ＴＲＰＭＬ（ムコリピン）およびＴＲＰＮ（ＮＯＭＰＣ−ｎｏ  ｍｅｃｈａｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｃ）を含む７つのサブファミリーに分けられる。より好ましい態様において、ＴＲＰチャネルは、ＴＲＰＣまたはＴＲＰＭチャネルより選択される。さらにより好ましい態様において、ＴＲＰＣチャネルはＴＲＰＣ１である。
【００６１】
別の好ましい態様において、本発明の医薬組成物または本発明の阻害剤は、神経保護および／または神経再生物質および／または抗血栓物質を同じまたは別個の容器中にさらに含む。
【００６２】
さらに、本発明は、療法において、同時に、別個に、または連続して使用するための、間質相互作用分子２（ＳＴＩＭ２）の阻害剤またはＳＴＩＭ２制御性細胞膜カルシウムチャネル活性の阻害剤、特にＯＲＡＩ２および／またはＯＲＡＩ３の阻害剤、ならびに神経保護および／または神経再生物質および／または抗血栓物質を組み合わせた医薬組成物に関する。この組み合わせた医薬組成物は、場合によって、医薬活性キャリアー、賦形剤および／または希釈剤を含有する。
【００６３】
好ましい態様において、この組み合わせた医薬組成物に関する療法における使用は、病的に増加した細胞質カルシウム濃度に関連する障害を治療し、そして／または防止する際の、あるいは病的に増加した細胞質カルシウム濃度に関連する障害を治療し、そして／または防止するための薬剤を開発するためのリード化合物としての使用である。
【００６４】
用語「神経保護物質」は、本発明にしたがって、例えば脳傷害後、または慢性神経変性疾患の結果として、神経系、そして特にニューロンを、変性または細胞死（アポトーシスおよび／または壊死）から保護する物質に関する。用語「神経再生物質」は、本発明全体で用いた際、神経系、特にニューロンの一部の増殖および再生を刺激するかまたは増進する物質を指す。
【００６５】
用語「抗血栓物質」は、本発明にしたがって、血栓形成、すなわち血餅形成を減少させることが可能な物質を指す。例えば、血小板の遊走または凝集を限定することによって、あるいは抗凝固剤を用いて血小板が凝固する能力を限定することによって、あるいは血栓溶解物質を用いて、血餅が形成された後にこれらを溶解させることによってのいずれかで、血栓形成を減少させることも可能である。抗血栓物質が血栓溶解物質であることが、特に好ましい。
【００６６】
より好ましい態様において、神経保護および／または神経再生物質は、グルタミン酸アンタゴニスト（例えば、限定されるわけではないが、グルタミン酸受容体アンタゴニストおよびグルタミン酸放出阻害剤）、フリーラジカル還元剤（すなわち酸化防止剤またはフリーラジカルスカベンジャー）、カルシウム・アンタゴニスト（例えば、限定されるわけではないが、カルシウムチャネル遮断剤およびカルシウム・キレーター）、カリウムチャネル活性化因子、ＧＡＢＡアゴニスト、オピエート・アンタゴニスト、白血球接着阻害剤、サイトカイン阻害剤、膜安定化剤、好中球調節因子、グリシン・アンタゴニスト、アポトーシス調節因子、ニューロン誘導調節因子、神経栄養因子および幹細胞調節因子からなる群より選択される。
【００６７】
本発明にしたがって、用語「グルタミン酸アンタゴニスト」は、グルタミン酸受容体遮断、グルタミン酸放出阻害、グルタミン酸取り込み増進によるか、または他の機構を通じてのいずれかによって、グルタミン酸活性の影響をアンタゴナイズするかまたは阻害する物質を指す。グルタミン酸アンタゴニストの限定されない例には、アプチガネル（ＣＮＳ−１１０２、セレスタット）、ガベスチネル、デキストロルファン、ＣＧＳ  １９７５５（セルフォテル）、エリプロディル、ＡＣＥＡ  １０２１、ＹＭ８７２、ＺＫ−２００７７５、マグネシウム、シパトリジン（Ｓｉｐａｔｒｉｇｉｎｅ）およびホスフェニトインが含まれる。
【００６８】
用語「フリーラジカル還元剤」は、本発明にしたがって、他の分子の酸化を遅延させるかまたは防止し、あるいはフリーラジカルを捕捉することが可能な物質または系を指す。フリーラジカル還元剤の限定されない例には、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ＮＸＹ−０５９（セロビブ）、エブセレン、メシル酸チリラザドおよびエダラボンが含まれる。
【００６９】
本発明にしたがって、用語「カルシウム・アンタゴニスト」は、カルシウム受容体遮断、カルシウム放出阻害、遊離カルシウム捕捉によるか、または他の機構を通じてのいずれかによって、カルシウム活性の影響をアンタゴナイズするかまたは阻害する物質を指す。カルシウム・アンタゴニストの限定されない例には、ジヒドロピリジン（例えばニモジピン）、フルナリジンおよびＤＰ−ｂ９９が含まれる。
【００７０】
用語「カリウムチャネル活性化因子」は、本発明にしたがって、カリウムチャネルを活性化する物質を指す。カリウムチャネルは、脳、膵臓β細胞、心臓および平滑筋を含む、多くの組織において発現される。とりわけ、血管平滑筋におけるカリウムチャネルの活性化は、膜過分極および動脈血管拡張を引き起こす。ニコランジルはまた、硝酸様静脈拡張効果も有する。カリウムチャネル活性化因子の限定されない例には、ＢＭＳ−２０４３５２およびニコランジルが含まれる。
【００７１】
用語「ＧＡＢＡアゴニスト」は、本発明全体で使用した際、ＧＡＢＡ受容体での作用を刺激するかまたは増加させる物質を指す（ＧＡＢＡ（ガンマアミノ酪酸）は、脊椎動物中枢神経系において、主な阻害性神経伝達物質である）。とりわけ、抗不安、鎮静および筋弛緩効果が起こりうる。ＧＡＢＡアゴニストの限定されない例には、クロメチアゾールおよびジアゼパムが含まれる。
【００７２】
用語「オピエート・アンタゴニスト」は、本発明全体で使用した際、オピエート活性の影響をアンタゴナイズするかまたは阻害する物質を指す。オピエート・アンタゴニストの限定されない例には、ナルメフェン（セルベン、ＲｅＶｅｘ）およびナロキソンが含まれる。
【００７３】
本発明にしたがって、用語「白血球接着阻害剤」は、とりわけ、炎症プロセスにおける重要な機能である、白血球が細胞性物質を認識し、そしてこれに接着する能力をアンタゴナイズするかまたは阻害する物質を指す。白血球接着阻害剤の限定されない例には、抗ＩＣＡＭ−１抗体（エンリモマブ）およびＨＵ２３Ｆ２Ｇが含まれる。
【００７４】
用語「サイトカイン阻害剤」は、本発明にしたがって、サイトカインの影響をアンタゴナイズするかまたは阻害する物質を指す。サイトカイン阻害剤の限定されない例には、ＩＬ−１受容体アンタゴニストが含まれる。
【００７５】
用語「膜安定化剤」は、本発明全体で使用した際、細胞膜を安定化し、したがって機能障害プロセスに干渉する物質を指す。膜安定化剤の限定されない例には、シチコリンが含まれる。
【００７６】
用語「好中球調節因子」は、本発明全体で使用する際、好中球の機能を調節する物質を指す。好中球活性の調節は、炎症反応を制御するアプローチを構成し、望ましい効果は、好中球の保護特性および組織修復特性、ならびに組織を破壊するその潜在能力間のバランスである。好中球調節因子の限定されない例には、好中球阻害因子が含まれる。
【００７７】
用語「グリシン・アンタゴニスト」は、本発明にしたがって、グリシン受容体または結合部位の遮断によるか、あるいは他の機構を通じてのいずれかによって、グリシン活性の影響をアンタゴナイズするかまたは阻害する物質を指す。グリシン・アンタゴニストの限定されない例には、ＧＶ１５０５２６（ガバスチネル（Ｇａｖａｓｔｉｎｅｌ））が含まれる。
【００７８】
用語「アポトーシス調節因子」は、本発明全体で使用する際、アポトーシスプロセスに関与するタンパク質の阻害によるか、または他の機構を通じてのいずれかによって、アポトーシス細胞シグナル伝達に干渉する物質を指す。アポトーシス調節因子の限定されない例はメラトニンである。
【００７９】
本発明にしたがって、用語「ニューロン誘導調節因子」は、軸索伸長増進または軸索伸長方向付けによるか、あるいは他の機構を通じてのいずれかによって、ニューロン誘導プロセスを調節する物質を指す。ニューロン誘導調節因子の限定されない例には、神経増殖因子が含まれる。
【００８０】
用語「神経栄養因子」は、本発明全体で使用する際、とりわけ、ニューロン生存、分化または増殖に影響を及ぼすことが可能な物質を指す。神経栄養因子の限定されない例は、脳由来神経栄養因子、神経増殖因子およびニューロトロフィンである。
【００８１】
用語「幹細胞調節因子」は、本発明にしたがって、とりわけ、幹細胞増殖、分化および誘導に影響を及ぼすことが可能な物質を指す。幹細胞調節因子の限定されない例は幹細胞因子である。
【００８２】
別のより好ましい態様において、抗血栓物質は、組換え組織プラスミノーゲン活性化因子であるが、また、任意の他の血栓溶解物質であってもよい。
本発明にしたがって、本明細書において略語ｒＴＰＡと交換可能に用いられる用語「組換え組織プラスミノーゲン活性化因子」は、当業者に周知であり、そして組換え的に産生された組織プラスミノーゲン活性化因子を指し、該因子は、血管内皮細胞中に見られる天然存在線維素溶解剤である。組織プラスミノーゲン活性化因子は、血栓溶解および血栓形成間のバランスに関与する。該因子は、有意なフィブリン特異性およびアフィニティを示す。血栓部位で、ｔＰＡおよびプラスミノーゲンのフィブリン表面への結合は、コンホメーション変化を誘導して、プラスミノーゲンからプラスミンへの変換を促進し、そして血餅を溶解する。
【００８３】
さらにより好ましい態様において、病的に増加した細胞質カルシウム濃度に関連する神経学的障害は、脳虚血、脳卒中（すなわち虚血性脳卒中および出血性脳卒中）、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、常染色体優性脊髄小脳失調症、緑内障、筋萎縮性脊索硬化症、癲癇、統合失調症、外傷性脳傷害およびＨＩＶ痴呆より選択される。
【００８４】
用語「脳虚血」は、本発明全体で使用する際、脳への血流が減少して、したがって脳損傷が導かれることに関する。脳虚血はまた、脳への血流が、脳組織の代謝要求を満たす十分な量ではない任意の状況でもある。脳虚血は、脳低酸素症、すなわち脳組織に対する酸素の欠乏に関連付けられてきており、そして長引いた場合は虚血性脳卒中を導く。
【００８５】
用語「脳卒中」は、本発明にしたがって用いた際、脳血流の混乱、その後の迅速に発展する脳機能（単数または複数）の喪失を指す。脳卒中は、血管内部の血餅の形成である血栓症、または塞栓症、すなわち体の別の部分から移動してきた物体による血管遮断、または上述の低灌流によって引き起こされる虚血（虚血性脳卒中；血液供給の欠如）であることも可能である。脳卒中はまた、出血によるものであってもよい（出血性脳卒中）。脳血流混乱の結果として、細胞内カルシウムの長期上昇が観察され、これがニューロン死を生じる（Ｗｏｊｄａ、２００８）。
【００８６】
本発明にしたがって、「アルツハイマー病」は、前脳および特に海馬中のニューロンの緩慢で漸進的な変性および死によって特徴付けられる、年齢に関連する神経変性性慢性痴呆を指す。アルツハイマー病患者の罹患脳領域には、とりわけ、カルシウムレベルの増加、およびカルシウム依存性酵素の活性化増加が示される。アルツハイマー病の病因は、カルシウム・ホメオスタシス不全（ｄｙｓｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ）、ならびにアミロイド・ベータ（Ａβ）および高リン酸化タウタンパク質などのアルツハイマー病の神経病理学的特徴間の相互作用に基づくと示唆されてきている（Ｗｏｊｄａ、２００８）。
【００８７】
「パーキンソン病」は、本発明にしたがって、加齢に強く関連する、進行性神経変性疾患および最も一般的な運動系障害である。動作緩慢、強剛性、振戦および他の運動症状は、黒質緻密部におけるドーパミン作動性ニューロンの選択的変性および喪失に起因する。カルシウム・ホメオスタシス不全は、環境障害、例えば重金属、駆除剤、神経毒素または炎症によって、あるいは遺伝的素因のために悪化した際、パーキンソン病の神経変性に関連付けられてきている（Ｗｏｊｄａ、２００８）。
【００８８】
「ハンチントン病」は、本発明にしたがって、運動および精神症状、例えば線条体中の中型有棘ニューロンの選択的および進行性喪失と関連する舞踏病および漸進的痴呆によって特徴付けられる、遺伝性常染色体優性神経変性疾患を指す。ハンチントン病は、異常なタンパク質、ハンチンチン（Ｈｔ）によって引き起こされ、該タンパク質は、Ｎ末端領域にポリグルタミン伸長を含有する。突然変異体Ｈｔに割り当てられるいくつかの毒性機能、例えば、ミトコンドリア・カルシウム・ホメオスタシスの混乱、またはＩＰ３による活性化に対するＩＰ３Ｒの感作によるＥＲカルシウム貯蔵の機能不全は、カルシウム・ホメオスタシス不全に変わる（Ｗｏｊｄａ、２００８）。
【００８９】
本発明にしたがって、「常染色体優性脊髄小脳失調症」は、眼筋麻痺、錐体路および錐体外路徴候、痴呆、色素性網膜症および末梢神経障害に多様に関連する、歩行運動および四肢の進行性小脳失調症によって特徴付けられる、神経変性障害の複合群を指す。ニューロンのカルシウムシグナル伝達妨害は、脊髄小脳失調症の神経変性に関与すると考えられる（Ｗｏｊｄａ、２００８）。
【００９０】
「緑内障」は、本発明にしたがって、盲目を生じる神経変性疾患群に関する。緑内障は、視神経に対する構造的損傷および網膜神経節細胞の緩慢で進行性の死によって特徴付けられる（Ｗｏｊｄａ、２００８）。
【００９１】
「筋萎縮性脊索硬化症」は、本発明にしたがって、進行性でそして非常に選択的な、皮質、脊髄、および脳幹運動ニューロンの喪失によって特徴付けられる、多因子神経変性疾患を指し、そして筋力および呼吸能の進行性の喪失、嚥下困難および四肢痙縮が伴う。グルタミン酸興奮毒性、タンパク質凝集体のカルシウム依存性形成、およびカルシウム誘発性ミトコンドリア機能不全を含む、細胞内カルシウム・ホメオスタシスの混乱が、運動ニューロンのこの選択的破壊を導く機構において、重要な役割を果たしていると考えられる（Ｗｏｊｄａ、２００８）。
【００９２】
本発明にしたがって、「癲癇」は、非挑発性発作を生じる、ニューロンによる調節不能で過剰な放電によって特徴付けられる、慢性神経学的状態を指す。カルシウム・ホメオスタシスにおける傷害誘導性改変が、後天性癲癇の発展および維持に役割を果たすことが示唆されてきている（Ｗｏｊｄａ、２００８）。
【００９３】
「統合失調症」は、本発明にしたがって、現実性の知覚または表現における異常によって特徴付けられる精神障害を指す。これは、最も一般的には、重大な社会的または職業的機能障害を伴う幻聴、偏執性のまたは奇異な妄想、あるいは混乱した発話および思考として現れる。細胞内カルシウムシグナル伝達改変は、統合失調症を導く分子機構のため、潜在的に、非常に重要な役割を果たすと見なされている（Ｗｏｊｄａ、２００８）。
【００９４】
「外傷性脳傷害」は、本発明にしたがって、頭部傷害後の脳損傷を指し、傷害の接触型または加速／失速型に分けることも可能である。接触傷害は、通常、前脳損傷を生じ、一方、加速／失速傷害は、広範囲の軸索損傷、虚血性脳傷害および散在性脳腫脹によって特徴付けられる散在性脳損傷を導く。外傷性脳傷害後の細胞外グルタミン酸レベルの劇的な増加は、興奮性アミノ酸受容体の過剰刺激およびニューロン内への過剰なカルシウム流入を生じる。さらに、軸索の外傷性変形は、機械的に感受性であるナトリウムチャネルを通じた異常なナトリウム流入を誘導し、これが続いて、軸索内カルシウムの増加を誘発する。ニューロンにおけるカルシウム・ホメオスタシスのこの重度の妨害が、最終的に、細胞傷害および死を生じる（Ｗｏｊｄａ、２００８）。
【００９５】
「ＨＩＶ痴呆」は、本発明にしたがって、１型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）感染の影響によって引き起こされる痴呆である。該疾患はしばしば、皮質ニューロンおよび網膜神経節細胞（ＲＧＣ）の喪失を生じ、これには、樹状突起分枝の複雑性の喪失が伴う。ウイルスｇｐ１２０タンパク質は、ＮＭＤＡ受容体動力学を修飾して、ニューロンのカルシウム過負荷、およびカルシウム誘発性機構による細胞破壊または死を生じる能力を通じて、ＨＩＶ痴呆に寄与すると考えられる。ウイルスＴａｔタンパク質は、百日咳毒素感受性ホスホリパーゼＣ活性を通じて、ＩＰ３感受性細胞内貯蔵からのカルシウム放出を誘導し、これにグルタミン酸受容体が仲介するカルシウム流入およびニューロン死が続く（Ｗｏｊｄａ、２００８）。
【００９６】
本明細書に記載する疾患はすべて、当業者に周知であり、そして先行技術および当業者に共通の一般的知識にしたがって定義される。
本発明はまた、病的に増加した細胞質カルシウム濃度に関連する神経変性障害の治療および／または防止のためのリード化合物および／または薬剤として適した化合物を同定する方法であって、（ａ）細胞において、ＳＴＩＭ２タンパク質またはＳｔｉｍ２転写物のレベルを測定し；（ｂ）前記細胞または同じ細胞集団の細胞と、試験化合物を接触させ；（ｃ）試験化合物と接触させた後、前記細胞において、ＳＴＩＭ２タンパク質またはＳｔｉｍ２転写物のレベルを測定し；そして（ｄ）工程（ｃ）において測定したＳＴＩＭ２タンパク質またはＳｔｉｍ２転写物のレベルを、工程（ａ）において測定したＳＴＩＭ２タンパク質またはＳｔｉｍ２転写物のレベルと比較する、ここで工程（ａ）と比較した際の工程（ｃ）におけるＳＴＩＭ２タンパク質またはＳｔｉｍ２転写物のレベルが減少していると、試験化合物が、病的に増加した細胞質カルシウム濃度に関連する神経変性障害の治療および／または防止のためのリード化合物および／または薬剤として適切な化合物であることが示される工程を含む、前記方法にも関する。
【００９７】
この態様は、ＳＴＩＭ２タンパク質または転写物（ｍＲＮＡ）の安定性に影響を及ぼすことによるか、あるいはＳＴＩＭ２の転写または翻訳に干渉することによるかいずれかで、ＳＴＩＭ２の発現に干渉することによって、その阻害活性を発揮する阻害剤を同定可能な、細胞スクリーンに関する。
【００９８】
「化合物」は、本発明にしたがって、上に定義する任意の阻害剤、すなわち、抗体またはその断片もしくは誘導体、アプタマー、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス核酸分子、これらの阻害剤の修飾型または低分子であってもよい。試験化合物には、さらに、限定されるわけではないが、Ｉｇテール化融合ペプチドおよびランダムペプチドライブラリーメンバー（例えば、Ｌａｍら（１９９１）  Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４；  Ｈｏｕｇｈｔｅｎら（１９９１）  Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８４−８６を参照されたい）を含む可溶性ペプチドなどのペプチド、ならびにＤおよび／またはＬ配置アミノ酸またはホスホペプチド（例えばランダムおよび部分的縮重定方向ホスホペプチドライブラリーのメンバー、例えばＳｏｎｇｙａｎｇら（１９９３）  Ｃｅｌｌ  ７２：７６７−７７８を参照されたい）で作製されるコンビナトリアルケミストリー由来分子ライブラリーが含まれる。
【００９９】
用語「前記細胞または同じ細胞集団の細胞」は、本明細書において、工程（ａ）で用いられる細胞、または工程（ａ）の細胞と同じ起源であり、そして（ａ）の細胞と特徴が同一である細胞のいずれかを指す。さらに、この用語はまた、細胞集団、例えば同一の特性を有する細胞からなる均質な細胞集団を含み、そしてしたがって単細胞分析に限定されない。
【０１００】
上記のように、ＳＴＩＭ２は、ニューロンＣＣＥに必須の仲介因子である。したがって、病的に増加した細胞質カルシウム濃度に関連する神経変性障害の治療および／または防止に適した化合物発見のためのターゲットとしてのＳＴＩＭ２の使用もまた、本発明に含まれる。上記のような化合物によって与えられるＳＴＩＭ２の発現レベルの減少は、病的に増加した細胞質カルシウム濃度からの神経保護に寄与する可能性もあり、そして上記のようなそれに関連する状態を改善する可能性もあることが想定される。したがって、ＳＴＩＭ２タンパク質またはＳｔｉｍ２転写物レベルの測定を用いて、上記アッセイの読み取りを決定してもよい。
【０１０１】
例えば、上述の細胞は、試験化合物と接触させる前に、ＳＴＩＭ２タンパク質またはＳｔｉｍ２転写物の検出可能なレベルを示すことも可能であり、そして試験化合物と細胞の接触後に、ＳＴＩＭ２タンパク質またはＳｔｉｍ２転写物レベルが低下するかまたは検出不能になることも可能であり、これは、化合物が、病的に増加した細胞質カルシウム濃度に関連する神経変性障害の治療および／または防止に適しているか、あるいはこの治療のための化合物開発のため、リード化合物として適していることを示す。好ましくは、試験化合物と細胞を接触させた後のＳＴＩＭ２タンパク質またはＳｔｉｍ２転写物のレベルは、試験化合物と細胞を接触させる前のＳＴＩＭ２タンパク質またはＳｔｉｍ２転写物のレベルと比較した際、例えば、少なくとも１０、２０、３０、４０または５０％減少している。より好ましくは、試験化合物と細胞を接触させた後のＳＴＩＭ２タンパク質またはＳｔｉｍ２転写物のレベルは、試験化合物と細胞を接触させる前のＳＴＩＭ２タンパク質またはＳｔｉｍ２転写物のレベルと比較した際、例えば、少なくとも６０、７０、８０、９０または９５％減少している。最も好ましくは、試験化合物と細胞を接触させた後のＳＴＩＭ２タンパク質またはＳｔｉｍ２転写物のレベルは、試験化合物と細胞を接触させる前のＳＴＩＭ２タンパク質またはＳｔｉｍ２転写物のレベルと比較した際、１００％減少している。用語「ＳＴＩＭ２タンパク質またはＳｔｉｍ２転写物のレベルは・・・％減少している」は、試験化合物と細胞を接触させる前のＳＴＩＭ２タンパク質またはＳｔｉｍ２転写物のレベルと比較した、相対的な減少を指す。例えば、少なくとも４０％の減少は、試験化合物と細胞を接触させた後、試験化合物と細胞を接触させる前のＳＴＩＭ２タンパク質またはＳｔｉｍ２転写物のレベルと比較した際、ＳＴＩＭ２タンパク質またはＳｔｉｍ２転写物の残りのレベルが６０％またはそれ未満しかないことを意味する。１００％の減少は、試験化合物と細胞を接触させた後、ＳＴＩＭ２タンパク質またはＳｔｉｍ２転写物が、検出可能なレベルで残らないことを意味する。
【０１０２】
タンパク質レベルの測定ならびに転写物レベルの測定は、上述のように、いくつかの方式で達成可能である。
好ましい態様において、方法はｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法は上述のように、ハイスループットアッセイを確立する可能性を提供する。
【０１０３】
同定された、いわゆるリード化合物を最適化して、医薬組成物中で使用可能な化合物に到達することも可能である。スクリーンで同定される化合物、リード化合物の薬理学的特性を最適化するための方法は、当該技術分野に知られ、そして例えば、本発明の好ましい阻害剤の修飾型に関して上述する方法を含む。
【０１０４】
本発明は、さらに、病的に増加した細胞質カルシウム濃度に関連する神経変性障害の治療および／または防止のためのリード化合物および／または薬剤として適した化合物を同定する方法であって：（ａ）細胞外カルシウムの非存在下で、ＳＴＩＭ２タンパク質を含有する細胞の細胞内カルシウム貯蔵を空にし、そして細胞外カルシウムを添加した際の細胞内カルシウム濃度の増加を測定し；（ｂ）ＳＴＩＭ２タンパク質を含有する前記細胞または同じ細胞集団の細胞と、試験化合物を接触させ；（ｃ）試験化合物と接触させた後、細胞外カルシウムの非存在下で、（ｂ）の細胞の細胞内カルシウム貯蔵を空にし、そして前記細胞において、細胞外カルシウムを添加した際の細胞内カルシウム濃度の増加を測定し；そして（ｄ）工程（ｃ）において測定した細胞内カルシウム濃度の増加を、工程（ａ）において測定した細胞内カルシウム濃度の増加と比較する、ここで工程（ａ）と比較した際の工程（ｃ）における細胞内カルシウム濃度の増加がないかまたは細胞内カルシウム濃度の増加がより少ないと、試験化合物が、病的に増加した細胞質カルシウム濃度に関連する神経変性障害の治療および／または防止のためのリード化合物および／または薬剤として適切な化合物であることが示される工程を含む、前記方法に関する。
【０１０５】
この態様は、ＳＴＩＭ２と物理的に相互作用することによって、またはあるいは（またはさらに）ＳＴＩＭ２と機能的に相互作用することによって、すなわち細胞アッセイで使用する細胞に存在する経路（単数または複数）に干渉することによって、ならびにＳＴＩＭ２制御性細胞膜カルシウムチャネル活性と物理的および／または機能的に相互作用することによって、すなわちＳＴＩＭ２の下流結合パートナー（単数または複数）に干渉することによって、その阻害活性を発揮する阻害剤を同定可能な、細胞スクリーンに関する。その結果、ＳＴＩＭ２またはＳＴＩＭ２制御性細胞膜カルシウムチャネルの生物学的活性が、直接または間接的に改変される。
【０１０６】
この方法には、最初の工程として、ＳＴＩＭ２タンパク質を含有する細胞の細胞内カルシウム貯蔵を空にする工程が含まれる。細胞内貯蔵からカルシウムを放出するのに適した化合物は、当該技術分野に周知であり、そしてこれには、限定されるわけではないが、シクロピアゾン酸（ＣＰＡ）およびタプシガルジンが含まれる。細胞外カルシウムの非存在下で貯蔵を空にし、これは例えば、この工程を、カルシウムキレーターであるＥＧＴＡまたはＥＤＴＡの存在下で実行することによって達成可能である。次いで、細胞外カルシウムを添加し、そして必要であれば、ＥＧＴＡなどのカルシウムキレート剤を除去することによって、細胞がＳＴＩＭ２仲介ＣＣＥを実行する能力を決定する。ＳＴＩＭ２仲介ＣＣＥが可能な細胞において、細胞内カルシウム濃度の対応する増加が観察されるであろう。上述のような細胞内カルシウムの増加をどのように決定するかに関する例は、実施例４に、そして特に図２（ａ）に提供される。
【０１０７】
方法の次の工程において、ＳＴＩＭ２タンパク質を含有する細胞または同じ細胞集団の細胞と、試験化合物を接触させ、そして第三の工程において、試験化合物と接触させた後、前記細胞がＳＴＩＭ２仲介ＣＣＥを実行する能力を上述のように決定する。やはり、ＳＴＩＭ２仲介ＣＣＥは、観察される細胞内カルシウム濃度の増加に基づいて決定される。細胞内カルシウム量のこうして観察される増加を、試験化合物の非存在下で行う第一の工程、および試験化合物との接触後に行う第三の工程の間で比較する。試験化合物と接触させた後、細胞内カルシウムにまったく増加が観察されなければ、試験化合物は、ＣＣＥを完全に成功裡に、すなわち１００％阻害しており、そしてしたがって、病的に増加した細胞質カルシウム濃度に関連する神経変性障害の治療および／または防止のためのリード化合物および／または薬剤として適している。また、試験化合物の非存在下で観察される増加に比較した際、試験化合物と接触させた後に観察される細胞内カルシウム濃度増加がより小さいならば、試験化合物は、前記疾患の治療および／または防止のためのリード化合物および／または薬剤として適している。このより小さい増加は、本発明にしたがって、試験化合物の非存在下で観察される増加に比較した際、７０％より低く、好ましくは５０％より低く、より好ましくは４０％より低く、そしてさらにより好ましくは３０％より低く、例えば少なくとも２０％より低くてもよい。
【０１０８】
本発明の方法の好ましい態様において、ＳＴＩＭ２タンパク質を含む細胞は、ニューロンである。
用語「ニューロン」は、本発明にしたがって、電気化学シグナル伝達によって情報をプロセシングし、そして伝達する、神経系、すなわち脳、脊髄および末梢神経の細胞の任意の１つを指す。好ましくは、前記ニューロンは、一次皮質ニューロンまたはあるいは海馬ニューロンである。
【実施例】
【０１０９】
実施例は本発明を例示する。
実施例１：材料および方法
マウス。地方自治体（Ｒｅｇｉｅｒｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｕｎｔｅｒｆｒａｎｋｅｎ）の規制にしたがって実験を行い、そして実験は、すべての参加施設の施設審査委員会によって認可された。標準的分子技術を用いて、Ｓｔｉｍ２遺伝子のエクソン４〜７の大部分を欠失させることによって、Ｓｔｉｍ２−／−ノックアウトマウスを生成した。簡潔には、ＰＣＲによって先に単離されたマウスＳｔｉｍ２エクソン４に特異的なプローブを用いて、マウスＳｔｉｍ２遺伝子をコードする２つのゲノムＤＮＡクローン（ＲＰＣＩ２２−４４６Ｅ８；  ＲＰＣＩ２２−３９４Ｉ２２）を１２９Ｓｖ  ＢＡＣライブラリー（Ｃｈｏｒｉ、米国）から単離した。エクソン４〜７の大部分が欠失するように、ターゲティング構築物を設計した。１２９Ｓｖマウス株由来のＲ１胚性幹（ＥＳ）細胞において、相同組換えによって、Ｓｔｉｍ２をターゲティングした。遺伝子特異的外部プローブを用いたサザンブロットによって、ターゲティングされた幹細胞クローンをスクリーニングした。Ｓｔｉｍ２＋／−  ＥＳ細胞をＣ５７Ｂｌ／６胚盤胞に注入して、キメラマウスを生成した。キメラマウスをＣ５７Ｂｌ／６（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に戻し交配して、そして続く子孫を交雑して、Ｓｔｉｍ２−／−マウスを得た。以下のプライマー対を用いたＰＣＲ分析によって、遺伝子型を決定した：
Ｓｔｉｍ２野生型５’：  ＣＣＣＡＴＡＴＧＴＡＧＡＴＧＴＧＴＴＣＡＧ；
Ｓｔｉｍ２野生型３’：  ＧＡＧＴＧＴＴＧＴＴＣ−ＣＣＴＴＣＡＣＡＴ；
Ｓｔｉｍ２ノックアウト５’：  ＴＴＡＴＣＧＡＴＧＡＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＴＡＴＧＣ；
Ｓｔｉｍ２ノックアウト３’：  ＧＣＧＣＧＴＡＣＡＴＣＧＧＧＣＡＡＡＴＡＡＴＡＴＣ。
【０１１０】
骨髄キメラ生成のため、５〜６週齢のＳｔｉｍ２＋／＋およびＳｔｉｍ２−／−雌マウスに単回用量の１０Ｇｙを照射し、そして同腹仔の６週齢のＳｔｉｍ２＋／＋およびＳｔｉｍ２−／−マウス由来の骨髄細胞を照射マウス内に静脈内注射した（４ｘ１０６細胞／マウス）。
【０１１１】
先に記載されるように（Ｖａｒｇａ−Ｓｚａｂｏ（２００８）、Ｂｒａｕｎ（２００８））、Ｓｔｉｍ１ー／ーおよびＯｒａｉ１−／−マウスを生成した。
マウスタンパク質ＳＴＩＭ２、ＳＴＩＭ１およびＯＲＡＩ１のｍＲＮＡ配列に関するＮＣＢＩ寄託番号は：マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）間質相互作用分子２に関してＮＭ＿００１０８１１０３．１（ＳＴＩＭ２；  ＳＴＩＭ２のｃＤＮＡとして配列番号２）；マウス間質相互作用分子１に関してＮＭ＿００９２８７．４（ＳＴＩＭ１；  ＳＴＩＭ１のｃＤＮＡとして配列番号３）；マウスＯＲＡＩカルシウム放出依存性カルシウム調節因子１に関してＮＭ＿１７５４２３．３（Ｏｒａｉ１；  ＯＲＡＩ１のｃＤＮＡとして配列番号４）である。
【０１１２】
ウェスタンブロット。ＲＩＰＡ緩衝液で抽出した異なるマウス臓器から、総タンパク質溶解物を用いて、標準的プロトコルで、ウェスタンブロッティングを行った。以下の一次抗体をウェスタンブロッティングに用いた：ウサギ抗ＳＴＩＭ２−ＣＴ（１：４００、ＰｒｏＳｃｉ）、ウサギ抗ＳＴＩＭ１（１：５００、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ラット抗α−チューブリン（１：１０００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）。すべてのＨＲＰ−コンジュゲート化抗体は、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ（英国サフォーク）またはＤｉａｎｏｖａ（ドイツ・ハンブルグ）より購入した。結合した抗体を、増進化学発光Ｗｅｓｔｅｒｎ  ＬｉｇｈｔｎｉｎｇＴＭ  Ｐｌｕｓ−ＥＣＬ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で検出した。
【０１１３】
ＲＴ−ＰＣＲ分析。レーザーキャプチャーマイクロダイセクションによって単離した５０の単一ニューロンから、マウスｍＲＮＡを抽出し、そして逆転写した。Ｓｔｉｍ１およびＳｔｉｍ２  ｍＲＮＡを、以下のような特異的プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲによって、３’領域（ＳＴＩＭ間で最も不均一である領域）の増幅によって検出した：
Ｓｔｉｍ１ＲＴ  ５’：  ＣＴＴＧＧＣＣＴＧＧＧＡＴＣＴＣＡＧＡＧ；
Ｓｔｉｍ１ＲＴ  ３’：  ＴＣＡＧＣＣＡＴＴＧＣＣＴＴＣＴＴＧＣＣ；
Ｓｔｉｍ２ＲＴ  ５’：  ＧＣＡＧＧＡＴＣＴＴＴＡＧＣＣＡＧＡＡＧ；
Ｓｔｉｍ２ＲＴ  ３’：  ＡＣＡＴＣＴＧＣＴＧＴＣＡＣＧＧＧＴＧＡ。
【０１１４】
先に記載されるようなＯｒａｉプライマーを用いた（Ｂｒａｕｎ（２００８））。
組織診断。パラフィン（Ｈｉｓｔｏｌａｂ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ＡＢ）パラホルムアルデヒド固定臓器を５μｍ厚の切片に切り取り、そしてマウントした。パラフィンを除去した後、標準的プロトコルにしたがって、ヘマトキシリンおよびエオジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で、またはニッスル染色法で、組織を染色した。
【０１１５】
免疫細胞化学。培養した海馬細胞培養を、４％ＰＦＡ（Ｍｅｒｃｋ、ドイツ）で固定し、１０ｍＭ  ＰＢＳで３回洗浄し、そして５％ヤギ血清（ＧＳ；  ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、オーストリア）および０．３％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００（Ｓｉｇｍａ、ドイツ）を含有する１０ｍＭ  ＰＢＳ中、４℃で６０分間インキュベーションした。一次抗体（マウスＭＡＰ２ａ／ｂ  １：２００、ａｂｃａｍ、英国；ウサギ切断カスパーゼ３  １：１５０、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、マサチューセッツ州）を１０ｍＭ  ＰＢＳ中で希釈し、そして４℃で１２時間インキュベーションした。１０ｍＭ  ＰＢＳでの洗浄工程後、二次抗体（Ａｌｅｘａ  ４８８標識ヤギ抗マウス  １：１００、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃｙ−３標識ヤギ抗ウサギ  １：３００、Ｄｉａｎｏｖａ、ハンブルグ）とのインキュベーションを同じ方式で行った。０．５μｇ／ｍｌ  ＤＡＰＩ（Ｍｅｒｃｋ、ドイツ）での染色を７分間行った。最後に、培養を洗浄し、そして続いてＤＡＢＣＯ（Ｍｅｒｃｋ、ダルムシュタット）で覆った。免疫蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏｐｈｏｔ；  Ｚｅｉｓｓ、イエナ）によって画像を収集した。
【０１１６】
実験の１つの設定において、培養ニューロンならびに野生型マウス由来の単離ネズミＣＤ４＋  Ｔ細胞を、ポリＬ−リジン（Ｓｉｇｍａ、ドイツ・ダイゼンホッフェン）でコーティングしたカバーガラス上に置き、４％ＰＦＡで固定し、そして抗ＳＴＩＭ１（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、マサチューセッツ州）または抗ＳＴＩＭ２（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、マサチューセッツ州）抗体で染色し、その後、Ｃｙ−３標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｄｉａｎｏｖａ、ハンブルグ）で染色した。細胞核をＤＡＰＩ（Ｍｅｒｃｋ、ドイツ・ダルムシュタット）で染色した。
【０１１７】
ニューロン培養。先に記載される調製プロトコル（Ｍｅｕｔｈ（２００８））にしたがって、Ｓｔｉｍ１−／−、Ｓｔｉｍ２−／−または対照マウス（Ｅ１８）から、ニューロン培養を得た。簡潔には、妊娠したマウスを頸椎脱臼によって屠殺し、そして胚を取り除き、そして温かいハンクス緩衝塩溶液（ＨＢＳＳ）内に移した。海馬を調製した後、５ｍｌのＨＢＳＳ中の０．２５％トリプシンを含有する試験管に、組織を収集した。３７℃で５分間インキュベーションした後、ＨＢＳＳで組織を２回洗浄した。その後、減少するチップ直径を持つ、火で研磨されたパスツールピペットですりつぶす（ｔｒｉｔｕｒａｔｉｎｇ）ことによって、１ｍｌのニューロン培地中で組織を解離させた。ニューロンをニューロン培地（１０％  １０ｘ修飾アール培地（ＭＥＭ）；  ０．２２０５％重炭酸ナトリウム；  １ｍＭピルビン酸ナトリウム；  ２ｍＭ  Ｌ−グルタミン；  ２％  Ｂ２７補充剤（すべてＧｉｂｃｏ，ドイツ）；  ３．８ｍＭグルコース；  １％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ、ドイツ））中で希釈し、そして４ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、デンマーク）中、ポリＤ−リジンでコーティングしたカバーガラス上、６０，０００細胞／ｃｍ２の密度でプレーティングした。実験前に、すべての細胞培養を３７．０℃および５％ＣＯ２でインキュベーションし、そして最長５〜７日間、培養中に保持した。虚血状態を誘導するため、本発明者らはｐＨを６．５に変更し、グルコース濃度を低下させ、そして切片調製に関して記載するように、Ｏ２を制限した。
【０１１８】
カルシウム測定のため、以下を例外として、上述するように、Ｓｔｉｍ１−／−、Ｓｔｉｍ２−／−、Ｏｒａｉ１−／−または対照マウス（Ｅ１８−Ｐ０）から初代ニューロン培養を得た：全皮質から組織を収集し、そして２％  Ｂ２７補充剤、１％  ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシン（すべてＧｉｂｃｏ、ドイツ）を含有するＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ培地中で、細胞を培養した。２４ウェルプレート（Ｓａｒｓｔｅｄｔ、米国）中、ポリＬ−リジンでコーティングしたカバーガラス上、５０，０００細胞／ｃｍ２の密度で細胞をプレーティングし、そして最長１４日まで培養中で保持した。
【０１１９】
カルシウム画像化。倒立顕微鏡（ＢＸ５１ＷＩ、Ｏｌｙｍｐｕｓ、ドイツ）に取り付けられた単色光分光器に基づく画像化系（Ｔ．Ｉ．Ｌ．Ｌ．  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ、ドイツ・グレーフェルフィング）と組み合わせて、蛍光指標ｆｕｒａ−２を用い、単一皮質ニューロンにおける［Ｃａ２＋］ｉの測定を行った。ＣＣＤカメラによって、放出される蛍光を収集した。（ｍＭで）：１４０  ＮａＣｌ、５  ＫＣｌ、１  ＭｇＣｌ２、２  ＣａＣｌ２、１０グルコースおよび１０  ＨＥＰＥＳを含有し、ＮａＯＨでｐＨ７．４に調整された標準的浴溶液中、０．０１％  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７を補充した５μＭ  ｆｕｒａ−２−ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、オランダ・ライデン）を、２０〜２２℃で３５分間、細胞に装填した。［Ｃａ２＋］ｉの測定のため、細胞を標準的浴溶液中に保持し、そして３４０および３８０ｎｍで蛍光を励起した。単一細胞由来の蛍光強度を２秒または２０秒間隔で得た。個々のバックグラウンド蛍光に関して補正した後、蛍光比Ｒ＝Ｆ３４０／Ｆ３８０を計算した。次いで、［Ｃａ２＋］ｉ＝ＫＤβ（Ｒ−Ｒｍｉｎ）／（Ｒｍａｘ−Ｒ）によって、［Ｃａ２＋］ｉの量を計算し、標準的浴溶液に、または２ｍＭ  ＣａＣｌ２の代わりに１０ｍＭ  ＥＧＴＡを含有する溶液に添加された５μＭイオノマイシンの存在下で、単一色素装填細胞から得られる、ＫＤ＝２２４ｎＭ（Ｇｒｙｎｋｉｅｗｉｃｚ（１９８５））、β＝２．６４、Ｒｍｉｎ＝０．２７２およびＲｍａｘ＝１．９８７を用いた。
【０１２０】
酸素−グルコース枯渇（ＯＧＤ）実験のため、（ｍＭで）：１４０  ＮａＣｌ、５  ＫＣｌ、１  ＭｇＣｌ２、２  ＣａＣｌ２、および１０  ＨＥＰＥＳを含有し、ｐＨ７．４に調整されたＮ２バブリング溶液で連続して表面灌流されているＮ２通気チャンバーに、細胞を直ちに移した。すべての実験を２０〜２２℃で行った。すべての化学薬品をＳｉｇｍａ（ドイツ）から得た。
【０１２１】
脳切片調製。海馬を含む脳切片を、先に記載されるように（Ｍｅｕｔｈ（２００３））、６〜１０週齢のＳｔｉｍ２−／−マウスおよび野生型同腹仔から調製した。簡潔には、（ｍＭで）：スクロース、２００；  ＰＩＰＥＳ、２０；  ＫＣｌ、２．５；  ＮａＨ２ＰＯ４、１．２５；  ＭｇＳＯ４、１０；  ＣａＣｌ２、０．５；デキストロース、１０を含有し；ＮａＯＨでｐＨ７．３５に調整された氷冷溶液中、ｖｉｂｒａｔｏｍｅ（Ｖｉｂｒａｔｏｍｅ（登録商標）、シリーズ１０００クラシック、米国セントルイス）上で、冠状切片を切り出した。調製後、ＮａＣｌ  １２０ｍＭ、ＫＣｌ  ２．５ｍＭ、ＮａＨ２ＰＯ４  １．２５ｍＭ、ＨＥＰＥＳ  ３０ｍＭ、ＭｇＳＯ４  ２ｍＭ、ＣａＣｌ２  ２ｍＭおよびデキストロース１０ｍＭを含有する溶液で連続して表面灌流されている保持チャンバーに切片を移した。ＨＣｌを用いてｐＨ値を調整した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ虚血状態を誘導するため、低酸素条件下で、該ｐＨ値を７．２５から６．５に減少させ、そしてグルコース濃度を５ｍＭに低下させた。Ｏ２の制限は、記録前に、少なくとも６０分間窒素をバブリングしておいた外液での灌流によって達成された。
【０１２２】
モリス水迷路。水迷路は、非毒性白色テンペラ・ペンキを添加することによって乳白色にした水（２４〜２６℃、３１ｃｍの深さ）を満たした、濃いグレーの円状のたらい（直径１２０ｃｍ）からなった。円状プラットフォーム（直径８ｃｍ）を、ゴール象限の中央、プールの壁から３０ｃｍ離れた水表面の１ｃｍ下に置いた。実験室環境によって、ナビゲーションのための遠距離視覚的手がかりが提供され；近距離視覚的手がかりは、プール内壁上に貼った４つの異なるポスターからなった。ケージから、乳白色カップ中で、動物をプールに移し、そしてあらかじめ決定されているが連続的ではない順序で、プール周囲上の８つの対称的に配置された位置から動物を放した。マウスがプラットフォームを発見するまで、または１８０秒が経過するまで、マウスを泳がせた。後者の場合、動物をプラットフォームに誘導し、そして２０秒間休ませた。動物を、１日６回の試験に５日間供し、最初の３日間（１８回の試験、習得期）は固定した位置（南東）に、そして最後の２日間（１２回の試験、反転期）は反対の象限（北西）に隠されたプラットフォームを用いた。試験１９および２０は、空間学習の正確さを分析するプローブ試験として定義された。
【０１２３】
高架式十字迷路試験。プラスの形に配置された４アームを持つ迷路の中央に、動物を置いた（Ｐｅｌｌｏｗ（１９８６））。具体的には、迷路は、中央の四角形（５ｘ５ｃｍ）、２つの相対する開放アーム（長さ３０ｃｍ、幅５ｃｍ）、および同じサイズであるが、両側に、そして遠端に、高さ１５ｃｍの壁を装備された、２つの相対する閉鎖アームからなった。該デバイスは、不透明なグレーのプラスチックで作製され、そして床から７０ｃｍ上昇していた。中央の四角形での光強度は７０ルクスであり、開放アーム上では８０ルクスであり、そして閉鎖アーム中では４０ルクスであった。
【０１２４】
各試験の開始時、動物を、開放アームに向けて、中央の四角形に置いた。５分間の試験期間中の動物の動きを、迷路中央上に配置されたビデオカメラによって追跡し、そしてソフトウェアＶｉｄｅｏＭｏｔ２（ＴＳＥ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ドイツ・バートホンブルグ）で記録した。試験後、このソフトウェアを用いて、動物が通った跡を評価し、そして開放アーム内への進入回数、開放アーム上で費やした時間、ならびに試験セッション中に開放および閉鎖アーム中で移動した総距離を決定した。アーム内への進入は、そのアーム上にマウスが４つの足を置いた瞬間と定義された。
【０１２５】
ｔＭＣＡＯモデル。機序駆動性基本的脳卒中研究（Ｄｉｒｎａｇｌ（２００６））における研究のため、公表される推奨にしたがって、１０〜１２週齢Ｓｔｉｍ２−／−または対照キメラに対して実験を行った。管腔内フィラメント（６０２１ＰＫ１０；  Ｄｏｃｃｏｌ  Ｃａｍｐａｎｙ）技術を用いて、吸入麻酔下で、一過性の中大脳動脈閉塞（ｔＭＣＡＯ）を誘導した。６０分後、フィラメントを抜いて再灌流を可能にした。虚血性脳体積を測定するため、動物をｔＭＣＡＯ誘導２４時間後に屠殺し、そして脳切片を２％の２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロリド（ＴＴＣ；  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ドイツ）で染色した。脳梗塞体積を計算し、そして記載されるように浮腫に関して補正した（Ｋｌｅｉｎｓｃｈｎｉｔｚ（２００７））。記載されるように、２人の独立のそして盲検化された研究者が、ｔＭＡＣＯ  ２４時間後、神経学的機能および運動機能を評価した（Ｋｌｅｉｎｓｃｈｎｉｔｚ（２００７））。
【０１２６】
ＭＲＩによる脳卒中評価。記載されるように（Ｋｌｅｉｎｓｃｈｎｉｔｚ（２００７））、１．５テスラＭＲ装置（Ｖｉｓｉｏｎ  Ｓｉｅｍｅｎｓ、ドイツ・エルランゲン）上で、脳卒中２４時間後および７日後に、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を反復して行った。すべての測定に関して、マウス頭部の検査のために設計された特注の二重チャネル表面コイルを用いた（Ａ０６３ＨＡＣＧ；  Ｒａｐｉｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、ドイツ・ブルツブルグ）。画像プロトコルは、冠状Ｔ２−ｗシーケンス（切片厚２ｍｍ）、および冠状３Ｄ  Ｔ２−ｗ勾配エコーＣＩＳＳ（Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  Ｓｔｅａｄｙ  Ｓｔａｔｅ；切片厚１ｍｍ）シーケンスを含んだ。実験群に対して盲検化されたＭＲ画像を、梗塞形態および頭蓋内出血（ＩＨＣ）の発生に関して視覚的に評価した。
【０１２７】
統計分析。用いた統計法を図レジェンドに提供する。
実施例２：ＳＴＩＭ２は、ニューロンにおいて優位なＳＴＩＭアイソフォームである。
マウス脳におけるＳＴＩＭの機能を評価するため、ウェスタンブロット分析によってその発現を試験し、そしてＳＴＩＭ２に関する明らかなシグナルが得られたが、ＳＴＩＭ１はほとんど検出不能であった。他の試験した臓器のいずれにおいても、ＳＴＩＭ２の匹敵する優位な発現が見られた（図１ａ）。免疫細胞化学によって、培養海馬ニューロンにおいて、ＳＴＩＭ１に関するシグナルはほとんど生じなかったが、抗ＳＴＩＭ２抗体では、強い核周辺染色が検出可能であり、これはタンパク質の予期されるＥＲ局在と一致する（図１ｂ）。対照的に、Ｔ細胞において、ＳＴＩＭ１／ＳＴＩＭ２発現比は逆転した（図１ｂ）（Ｏｈ−Ｈｏｒａ（２００８））。レーザーキャプチャー顕微法によって単離された初代ニューロンの逆転写酵素（ＲＴ）−ＰＣＲ分析によって、ＳＴＩＭ２がＳＴＩＭファミリーの主なメンバーであることが確認され（図１ｃ）、ＳＴＩＭ２がこれらの細胞においてＣａ２＋ホメオスタシスに役割を有しうることが示された。Ｓｔｉｍ１同様、Ｏｒａｉ１  ｍＲＮＡはほとんど検出不能であり、一方、強いおよび中程度の発現が、それぞれ、Ｏｒａｉ２およびＯｒａｉ３に関して見られた（図１ｃ）。
【０１２８】
実施例３：ＳＴＩＭ２欠損マウスの生成
ＳＴＩＭ２機能をｉｎ  ｖｉｖｏで評価するため、Ｓｔｉｍ２遺伝子を、マウスにおいて破壊した（図１ｄ、ｅ）。ＳＴＩＭ２−ヌル突然変異に関してヘテロ接合体であるマウスは、見かけ上健康であり、そして正常な寿命を有した（未提示）。これらの動物の交雑によって、予期されるメンデル比でＳｔｉｍ２−／−マウスが生じ、該マウスは成体まで正常に発生し、そして繁殖性であった（図５）。ウェスタンブロット分析によって、脳およびリンパ節（ＬＮ）にＳＴＩＭ２が存在しないことが確認され、一方、ＳＴＩＭ１発現レベルは、改変されなかった（図１ｆ）。Ｓｔｉｍ２−／−マウス由来の主要臓器の組織学的検査によって、明らかな異常は示されなかった（未提示）。Ｓｔｉｍ２−／−マウスは、いかなる明らかな神経学的欠陥も示さず、そして脳切片に対するニッスル染色は、明らかな構造異常を見出さなかった（図６）。しかし、海馬依存性空間記憶に関する標準的試験であるモリス水迷路タスク（Ｍｏｒｒｉｓ（１９８４））に、動物を供すると、顕著な認知欠陥が明らかになった。Ｓｔｉｍ２−／−マウスは、隠されたプラットフォームを見出すのに、より長い潜伏期を有し（未提示）、そして習得期では移動総距離が増加した（図７）が、反転試験では増加しなかった（未提示）。対照的に、高架式十字迷路試験による不安レベルの検査は、Ｓｔｉｍ２−／−および野生型同腹仔間に相違をまったく示さなかった（ｐ＞０．０５；図７）。このように、ＳＴＩＭ２の欠如は、特徴的な認知障害を導き、これはおそらく、脳ニューロンにおける改変されたＣａ２＋ホメオスタシスのためである。
【０１２９】
実施例４：ＳＴＩＭ２は、ニューロンにおけるＣＣＥおよび虚血誘導性Ｃａ２＋集積を制御する
ニューロンＣａ２＋ホメオスタシスに対するＳＴＩＭ２欠損の影響を直接試験するため、皮質組織から抽出されたニューロン培養において、Ｃａ２＋画像化実験を行った。これらの研究中、野生型に比較して、Ｓｔｉｍ２−／−培養は、一貫して、初期培養段階（ＤＩＶ  １−２）でより高い割合の生存細胞を含有し、そして後期培養段階（＞ＤＩＶ  １０）で生存改善を示すことが注目された（未提示）。ＣＣＥを評価するため、細胞外Ｃａ２＋の非存在下で、ＳＥＲＣＡポンプ阻害剤シクロピアゾン酸（ＣＰＡ）によって、Ｃａ２＋貯蔵放出を誘導した。この処理は、一過性Ｃａ２＋シグナルを引き起こし、その後、基底Ｃａ２＋レベルを超える外部Ｃａ２＋添加後、第二の［Ｃａ２＋］ｉ増加が続き、ＣＣＥの存在が示唆された（図２ａ）。顕著なことに、ＣＣＥは、野生型対照に比較して、Ｓｔｉｍ２−／−ニューロンで非常に減少し（２７±９ｎＭ対８２±１６ｎＭ；  ｎ＝７；  ｐ＜０．０５；図２ａ）、一方、それぞれの対照に比較して、ＳＴＩＭ１欠損（Ｂｕｒｎａｓｈｅｖ、２００５）およびＯｒａｉ１欠損（Ｂｒａｕｎ（２００８））マウス由来のニューロンでは有意な改変は見られなかった（図２ａ）。したがって、培養ニューロン中のＣＣＥは、ＳＴＩＭ２によって制御されるが、非興奮性細胞におけるＣＣＥの必須構成要素であるＳＴＩＭ１またはＯｒａｉ１を必要としない。
【０１３０】
Ｂｒａｎｄｍａｎらは、ＳＴＩＭ２が、異なる非ニューロン株の細胞質およびＥＲにおいて、基底Ｃａ２＋濃度を制御することを示した（Ｂｒａｎｄｍａｎ（２００７））。この報告と一致して、Ｓｔｉｍ２−／−ニューロンは、野生型細胞より低い基底細胞質Ｃａ２＋レベルを示し（６２±９ｎＭ対１０３±１２ｎＭ；  ｎ＝７；  ｐ＜０．０５）、一方、Ｓｔｉｍ１−／−およびＯｒａｉ１−／−細胞では改変は見られなかった（図２ａ）。細胞外貯蔵のＣａ２＋含量を評価するため、細胞外Ｃａ２＋の非存在下で、膜透過性カルシウムイオノフォアであるイオノマイシンを適用することによって、この区画からの放出を測定した（Ｂｒａｎｄｍａｎ（２００７））。相対的Ｃａ２＋ピークの振幅は、Ｓｔｉｍ２−／−細胞において減少し（０．１２±０．０２対０．３３±０．０７；  ｎ＝５；  ｐ＜０．０５）、一方、細胞外Ｃａ２＋の再添加によって誘導される、続くＣａ２＋流入は、Ｓｔｉｍ２−／−および対照ニューロン間で区別不能であった（図２ｂ）。したがって、ＳＴＩＭ２はまた、ネズミ皮質ニューロンの細胞質および細胞内貯蔵における基底Ｃａ２＋濃度も制御する。
【０１３１】
脳虚血中、［Ｃａ２＋］ｉの過剰な増加は、ニューロン死の主な活性化因子であると考えられる（Ｌｉｐｔｏｎ（１９９９））。このプロセスにおけるＣＣＥのありうる役割を試験するため、神経傷害におけるカルシウム依存性およびカルシウム非依存性機構の検査のための確立された系である酸素−グルコース枯渇（ＯＧＤ）条件下で、野生型およびＳｔｉｍ２−／−ニューロン培養に対して、Ｃａ２＋画像化実験を行った（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ（１９９３）、Ａａｒｔｓ（２００３））。ＯＧＤは、［Ｃａ２＋］ｉの累積的増加を誘発すると報告され、発作期間が１時間に限定された際に最も可逆性であった（Ａａｒｔｓ（２００３））。本発明者らは、野生型培養において、頑強な［Ｃａ２＋］ｉ上昇（１３１±４６ｎＭ；  ｎ＝５）を確認可能であったが、Ｓｔｉｍ２−／−細胞において、１時間のＯＧＤ中、非常にわずかな増加しか見出さなかった（１１±１５ｎＭ；  ｎ＝５；  ｐ＜０．０５；図２ｃ）。Ｓｔｉｍ２−／−培養において、ＯＧＤを２時間に延長した際にのみ、顕著な［Ｃａ２＋］ｉ増加が見られた。ミトコンドリア脱共役剤、カルボニルシアニドｍ−クロロフェニルヒドラゾン（ＣＣＣＰ）の存在下で、野生型およびＳｔｉｍ２−／−ニューロンの両方において、迅速でそして過剰な［Ｃａ２＋］ｉ増加が検出可能であった（図２ｄ）。しかし、ＣＣＣＰの１時間の休薬後、Ｓｔｉｍ２−／−細胞における細胞質Ｃａ２＋レベルは、野生型細胞よりもより効率的に減少した（８９±３％対７２±３％；  ｎ＝５；  ｐ＜０．０５；図２ｄ）。
【０１３２】
したがって、虚血誘導性［Ｃａ２＋］ｉ増加は、野生型に比較してＳｔｉｍ２−／−ニューロンで、より緩慢に発展し、そしてより迅速に回復し、これは部分的に、これらの細胞においては、貯蔵含量がより低いことによって説明されうる。低酸素症が、ＥＲ  Ｃａ２＋貯蔵の緩慢な枯渇を引き起こし、そしてＳＥＲＣＡが感覚ニューロン中の細胞質Ｃａ２＋クリアランスに大きな役割を果たすことが報告されてきている（Ｈｅｎｒｉｃｈ（２００８））。したがって、より低いＥＲ  Ｃａ２＋含量は、そこからの細胞質Ｃａ２＋装填を減少させ、そしてまた虚血後状態下でのＳＥＲＣＡ仲介性Ｃａ２＋回復を促進することも可能である。
【０１３３】
Ｓｔｉｍ２−／−ニューロンにおける、ＯＧＤ誘導性Ｃａ２＋集積の顕著な障害は、虚血条件下でのＳＴＩＭ２不全のありうる神経保護効果を示した。これを直接試験するため、培養海馬ニューロンをＯＧＤに供した（図３ａ、ｂ）。対照培養条件下で５〜７日置いた後、８０．６±４．４％（ｎ＝５）の野生型ニューロンが生存し、これは先の報告と一致する（Ｋｉｍ（２００８））。匹敵する値が、Ｓｔｉｍ１−／−ニューロンで見られ（７６．７±７．８％；  ｎ＝５；  ｐ＜０．０５、未提示）、一方、Ｓｔｉｍ２−／−マウスから調製されたニューロンは生存率増加を示した（８８．７±２．６％；  ｎ＝３；  ｐ＜０．０１）。虚血条件下（低グルコース、Ｎ２、ｐＨ６．５）（Ｐｌａｎｔ（２００２））で６時間置いた後、類似の強い生存減少が、野生型およびＳｔｉｍ１−／−ニューロンで見られ（５１．９±８．４対５２．４±６．６％、ｎ＝５、ｐ＜０．０５、未提示）、一方、Ｓｔｉｍ２−／−ニューロンは、有意によりよく生存した（７２．９±４．３％；  ｎ＝３、ｐ＜０．００１）。
【０１３４】
マウス脳半球切片において、虚血様条件下でのニューロン死もまた監視した（図３ｃ、ｄ）。６時間後、対照条件（正常血糖、Ｏ２、ｐＨ７．２５）下に維持した野生型マウス由来の切片は、ｍｍ２あたり１６．０±１．７の死亡ニューロンを示したが、この数は、虚血条件下に維持した連続切片において増加した（低血糖、Ｎ２、ｐＨ６．５；  ３０±０．９；  ｎ＝３、ｐ＜０．０１）。対照的に、Ｓｔｉｍ２−／−マウス由来の対照条件（７．７±５．７、ｎ＝３、ｐ＜０．０５）および虚血条件（１８．６±０．４、ｎ＝３、ｐ＜０．０５）下の切片では、より少ない死亡ニューロンしか見られなかった。
【０１３５】
実施例５：Ｓｔｉｍ２−／−マウスは虚血性脳卒中から保護される
上記発見のｉｎ  ｖｉｖｏ関連性を決定するため、中大脳動脈（ＭＣＡ）の１時間の閉塞を伴う一過性局所脳虚血のモデルにおいて、Ｓｔｉｍ２−／−マウスにおけるニューロン損傷の発展を研究した（Ｃｈｏｕｄｈｒｉ（１９９８））。２４時間後、Ｓｔｉｍ２−／−マウスにおける梗塞体積は、２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロリド（ＴＴＣ）染色によって評価した際、野生型に比較して＜４０％に減少した（１８．６±５．５対５７．９±１３．１ｍｍ３、ｐ＜０．０１）（図４ａ、ｂ）。梗塞サイズの減少は機能的に関連があり、これは、全体の神経学的機能を評価するベダーソン・スコア（それぞれ、１．６±０．８対３．０±１．０；  ｐ＜０．０５）、ならびに運動機能および協調を特異的に測定するグリップ試験（それぞれ、２．０±１．３対４．１±０．９；  ｐ＜０．０５）が、対照に比較して、Ｓｔｉｍ２−／−マウスで有意によりよかったためである（図４ｃ、ｄ）。最長５日までの生存マウスに対する連続磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）によって、梗塞体積がＳｔｉｍ２−／−マウスで経時的に増加しないことが示され、保護効果が持続されることが示された（図４補足）。これと一致して、組織学的分析によって、Ｓｔｉｍ２−／−マウスにおいて、梗塞が基底核に限定されることが明らかになった（図４ｅ）。対照的に、Ｓｔｉｍ２−／−骨髄で再構成された野生型マウスは通常の梗塞を発展させ、一方、野生型骨髄を移植されたＳｔｉｍ２−／−マウスでは梗塞は小さいままだった（図４ａ〜ｄ）。これらの結果は、ＳＴＩＭ２欠損が、造血系内の機能改変とは独立に、虚血性神経損傷からマウスを保護することを示す。
【０１３６】
実施例６：材料および方法
マウス。標準的分子技術を用いて、それぞれ、Ｏｒａｉ２（またはＯｒａｉ３）遺伝子の必須エクソンを破壊することによって、Ｏｒａｉ２（またはＯｒａｉ３）ノックアウトマウスを生成する。Ｏｒａｉ２＋／−（またはＯｒａｉ３＋／−）ＥＳ細胞をＣ５７Ｂｌ／６胚盤胞に注入して、キメラマウスを生成する。キメラマウスをＣ５７Ｂｌ／６（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に戻し交配して、そして続く子孫を交雑して、それぞれ、Ｏｒａｉ２−／−（またはＯｒａｉ３−／−）マウスを得た。適切なプライマー対を用いたＰＣＲ分析によって、遺伝子型を決定する。
【０１３７】
骨髄キメラ生成のため、５〜６週齢のＯｒａｉ２−／−（またはＯｒａｉ３−／−）雌マウスに単回用量の１０Ｇｙを照射し、そして同腹仔の６週齢の野生型またはＯｒａｉ２−／−（またはＯｒａｉ３−／−）マウス由来の骨髄細胞を照射マウス内に静脈内注射する（４ｘ１０６細胞／マウス）。
【０１３８】
マウスタンパク質ＯＲＡＩ２およびＯＲＡＩ３のｍＲＮＡ配列に関するＮＣＢＩ寄託番号は、ＡＭ７１２３５６  マウスＯＲＡＩ  カルシウム放出依存性カルシウム調節因子２（Ｏｒａｉ２）；  ＡＢ２７１２１６  ＯＲＡＩ  カルシウム放出依存性カルシウム調節因子３である。
【０１３９】
ＲＴ−ＰＣＲ分析。レーザーキャプチャーマイクロダイセクションによって単離した５０の単一ニューロンから、マウスｍＲＮＡを抽出し、そして逆転写する。先に記載されるようなＯｒａｉプライマーを用いる（Ｂｒａｕｎ（２００８））。
【０１４０】
組織診断。パラフィン（Ｈｉｓｔｏｌａｂ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ＡＢ）パラホルムアルデヒド固定臓器を５μｍ厚の切片に切り取り、そしてマウントする。パラフィンを除去した後、標準的プロトコルにしたがって、ヘマトキシリンおよびエオジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で、またはニッスル染色法で、組織を染色した。
【０１４１】
免疫細胞化学。培養した海馬細胞培養を、４％ＰＦＡ（Ｍｅｒｃｋ、ドイツ）で固定し、１０ｍＭ  ＰＢＳで３回洗浄し、そして５％ヤギ血清（ＧＳ；  ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、オーストリア）および０．３％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００（Ｓｉｇｍａ、ドイツ）を含有する１０ｍＭ  ＰＢＳ中、４℃で６０分間インキュベーションする。一次抗体（マウスＭＡＰ２ａ／ｂ  １：２００、ａｂｃａｍ、英国；ウサギ切断カスパーゼ３  １：１５０、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、マサチューセッツ州）を１０ｍＭ  ＰＢＳ中で希釈し、そして４℃で１２時間インキュベーションする。１０ｍＭ  ＰＢＳでの洗浄工程後、二次抗体（Ａｌｅｘａ  ４８８標識ヤギ抗マウス  １：１００、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃｙ−３標識ヤギ抗ウサギ  １：３００、Ｄｉａｎｏｖａ、ハンブルグ）とのインキュベーションを同じ方式で行う。０．５μｇ／ｍｌ  ＤＡＰＩ（Ｍｅｒｃｋ、ドイツ）での染色を７分間行う。最後に、培養を洗浄し、そして続いてＤＡＢＣＯ（Ｍｅｒｃｋ、ダルムシュタット）で覆う。免疫蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏｐｈｏｔ；  Ｚｅｉｓｓ、イエナ）によって画像を収集する。
【０１４２】
ニューロン培養。先に記載される調製プロトコル（Ｍｅｕｔｈ（２００８））にしたがって、Ｏｒａｉ２−／−（またはＯｒａｉ３−／−）または対照マウス（Ｅ１８）から、ニューロン培養を得る。簡潔には、妊娠したマウスを頸椎脱臼によって屠殺し、そして胚を取り除き、そして温かいハンクス緩衝塩溶液（ＨＢＳＳ）内に移す。海馬を調製した後、５ｍｌのＨＢＳＳ中の０．２５％トリプシンを含有する試験管に、組織を収集する。３７℃で５分間インキュベーションした後、ＨＢＳＳで組織を２回洗浄する。その後、減少するチップ直径を持つ、火で研磨されたパスツールピペットですりつぶすことによって、１ｍｌのニューロン培地中で組織を解離させる。ニューロンをニューロン培地（１０％  １０ｘ修飾アール培地（ＭＥＭ）；  ０．２２０５％重炭酸ナトリウム；  １ｍＭピルビン酸ナトリウム；  ２ｍＭ  Ｌ−グルタミン；  ２％  Ｂ２７補充剤（すべてＧｉｂｃｏ，ドイツ）；  ３．８ｍＭグルコース；  １％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ、ドイツ））中で希釈し、そして４ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、デンマーク）中、ポリＤ−リジンでコーティングしたカバーガラス上、６０，０００細胞／ｃｍ２の密度でプレーティングする。実験前に、すべての細胞培養を３７．０℃および５％ＣＯ２でインキュベーションし、そして最長５〜７日間、培養中に保持する。虚血状態を誘導するため、ｐＨを６．５に変更し、グルコース濃度を低下させ、そして切片調製に関して記載するように、Ｏ２を制限する。
【０１４３】
カルシウム測定のため、以下を例外として、上述するように、Ｏｒａｉ２−／−（またはＯｒａｉ３−／−）または対照マウス（Ｅ１８−Ｐ０）から、初代ニューロン培養を得る：全皮質から組織を収集し、そして２％  Ｂ２７補充剤、１％  ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシン（すべてＧｉｂｃｏ、ドイツ）を含有するＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ培地中で、細胞を培養する。２４ウェルプレート（Ｓａｒｓｔｅｄｔ、米国）中、ポリＬ−リジンでコーティングしたカバーガラス上、５０，０００細胞／ｃｍ２の密度で細胞をプレーティングし、そして最長１４日まで培養中で保持する。
【０１４４】
カルシウム画像化。倒立顕微鏡（ＢＸ５１ＷＩ、Ｏｌｙｍｐｕｓ、ドイツ）に取り付けられた単色光分光器に基づく画像化系（Ｔ．Ｉ．Ｌ．Ｌ．  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ、ドイツ・グレーフェルフィング）と組み合わせて、蛍光指標ｆｕｒａ−２を用い、単一皮質ニューロンにおける［Ｃａ２＋］ｉの測定を行う。ＣＣＤカメラによって、放出される蛍光を収集する。（ｍＭで）：１４０  ＮａＣｌ、５  ＫＣｌ、１  ＭｇＣｌ２、２  ＣａＣｌ２、１０グルコースおよび１０  ＨＥＰＥＳを含有し、ＮａＯＨでｐＨ７．４に調整された標準的浴溶液中、０．０１％  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７を補充した５μＭ  ｆｕｒａ−２−ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、オランダ・ライデン）を、２０〜２２℃で３５分間、細胞に装填する。［Ｃａ２＋］ｉの測定のため、細胞を標準的浴溶液中に保持し、そして３４０および３８０ｎｍで蛍光を励起した。単一細胞由来の蛍光強度を２秒または２０秒間隔で得る。個々のバックグラウンド蛍光に関して補正した後、蛍光比Ｒ＝Ｆ３４０／Ｆ３８０を計算する。次いで、［Ｃａ２＋］ｉ＝ＫＤβ（Ｒ−Ｒｍｉｎ）／（Ｒｍａｘ−Ｒ）によって、［Ｃａ２＋］ｉの量を計算し、標準的浴溶液に、または２ｍＭ  ＣａＣｌ２の代わりに１０ｍＭ  ＥＧＴＡを含有する溶液に添加された５μＭイオノマイシンの存在下で、単一色素装填細胞から得られる、ＫＤ＝２２４ｎＭ（Ｇｒｙｎｋｉｅｗｉｃｚ（１９８５））、β＝２．６４、Ｒｍｉｎ＝０．２７２およびＲｍａｘ＝１．９８７を用いる。
【０１４５】
酸素−グルコース枯渇（ＯＧＤ）実験のため、（ｍＭで）：１４０  ＮａＣｌ、５  ＫＣｌ、１  ＭｇＣｌ２、２  ＣａＣｌ２、および１０  ＨＥＰＥＳを含有し、ｐＨ７．４に調整されたＮ２バブリング溶液で連続して表面灌流されているＮ２通気チャンバーに、細胞を直ちに移す。すべての実験を２０〜２２℃で行う。すべての化学薬品をＳｉｇｍａ（ドイツ）から得る。
【０１４６】
脳切片調製。海馬を含む脳切片を、先に記載されるように（Ｍｅｕｔｈ（２００３））、６〜１０週齢のＯｒａｉ２−／−（またはＯｒａｉ３−／−）マウスおよび野生型同腹仔から調製する。簡潔には、（ｍＭで）：スクロース、２００；  ＰＩＰＥＳ、２０；  ＫＣｌ、２．５；  ＮａＨ２ＰＯ４、１．２５；  ＭｇＳＯ４、１０；  ＣａＣｌ２、０．５；デキストロース、１０を含有し；ＮａＯＨでｐＨ７．３５に調整された氷冷溶液中、ｖｉｂｒａｔｏｍｅ（Ｖｉｂｒａｔｏｍｅ（登録商標）、シリーズ１０００クラシック、米国セントルイス）上で、冠状切片を切り出す。調製後、ＮａＣｌ  １２０ｍＭ、ＫＣｌ  ２．５ｍＭ、ＮａＨ２ＰＯ４  １．２５ｍＭ、ＨＥＰＥＳ  ３０ｍＭ、ＭｇＳＯ４  ２ｍＭ、ＣａＣｌ２  ２ｍＭおよびデキストロース１０ｍＭを含有する溶液で連続して表面灌流されている保持チャンバーに切片を移す。ＨＣｌを用いてｐＨ値を調整する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ虚血状態を誘導するため、低酸素条件下で、該ｐＨ値を７．２５から６．５に減少させ、そしてグルコース濃度を５ｍＭに低下させる。Ｏ２の制限は、記録前に、少なくとも６０分間窒素をバブリングしておいた外液での灌流によって達成される（Ｐｌａｎｔ（２００２））。
【０１４７】
ｔＭＣＡＯモデルおよびＭＲＩによる脳卒中評価。Ｓｔｉｍ２−／−マウスの分析に関して上述するように、これらの実験を行う。
実施例７：ＯＲＡＩ２およびＯＲＡＩ３欠損マウスの生成
ＳＴＩＭ２機能をｉｎ  ｖｉｖｏで評価するため、Ｏｒａｉ２（またはＯｒａｉ３）遺伝子を、マウスにおいて破壊する。Ｏｒａｉ２（またはＯｒａｉ３）−ヌル突然変異に関してヘテロ接合体であるマウスは、見かけ上健康であり、そして正常な寿命を有すると予期される。これらの動物の交雑によって、Ｏｒａｉ２−／−（またはＯｒａｉ３−／−）マウスが生じる。ウェスタンブロット分析によって、異なる臓器において、ＯＲＡＩ２（またはＯＲＡＩ３）が存在しないことを確認する。Ｏｒａｉ２−／−（またはＯｒａｉ３−／−）由来の主な臓器の組織学的検査、脳切片に対するニッスル染色を行う。
【０１４８】
実施例８：ＯＲＡＩ２およびＯＲＡＩ３は、ニューロンにおけるＣＣＥおよび虚血誘導性Ｃａ２＋集積を制御する
ニューロンＣａ２＋ホメオスタシスに対するＯＲＡＩ２（またはＯＲＡＩ３）欠損の影響を直接試験するため、皮質組織から抽出されたニューロン培養において、Ｃａ２＋画像化実験を行う。ＣＣＥを評価するため、細胞外Ｃａ２＋の非存在下で、ＳＥＲＣＡポンプ阻害剤シクロピアゾン酸（ＣＰＡ）によって、Ｃａ２＋貯蔵放出を誘導する。ＣＣＥは、野生型対照に比較して、Ｏｒａｉ２−／−（およびＯｒａｉ３−／−）ニューロンで有意に減少すると予期される。
【０１４９】
ニューロン中の虚血誘導性カルシウム集積において、これにおけるＯＲＡＩ２（またはＯＲＡＩ３）仲介性ＣＣＥの役割を試験するため、神経傷害におけるカルシウム依存性およびカルシウム非依存性機構の検査のための確立された系である酸素−グルコース枯渇（ＯＧＤ）条件下で、野生型およびＯｒａｉ２−／−（またはＯｒａｉ３−／−）ニューロン培養に対して、Ｃａ２＋画像化実験を行う（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ（１９９３）、Ａａｒｔｓ（２００３））。ＯＧＤは、［Ｃａ２＋］ｉの累積的増加を誘発すると報告され、発作期間が１時間に限定された際に最も可逆性であった（Ａａｒｔｓ（２００３））。Ｏｒａｉ２−／−（およびＯｒａｉ３−／−）細胞において、１時間のＯＧＤ中、非常にわずかな増加しかないと予期される。
【０１５０】
虚血条件下でのＯＲＡＩ２（またはＯＲＡＩ３）不全のありうる神経保護効果を試験するため、培養海馬ニューロンをＯＧＤに供する。対照培養条件下で５〜７日置いた後、虚血条件下（低グルコース、Ｎ２、ｐＨ６．５）（Ｐｌａｎｔ（２００２））に細胞を６時間曝露する。Ｏｒａｉ２−／−（およびＯｒａｉ３−／−）ニューロンは、野生型対照ニューロンよりも、この虚血性発作で有意によりよく生き延びると予期される。
【０１５１】
マウス脳半球切片において、虚血様条件下でのニューロン死もまた監視する。虚血条件（低血糖、Ｎ２、ｐＨ６．５；  ３０±０．９）下で６時間後、Ｏｒａｉ２−／−（およびＯｒａｉ３−／−）マウス由来の切片では、野生型マウス由来の切片よりも、有意により少ない死亡ニューロンしか見られないと予期される。
【０１５２】
実施例９：Ｏｒａｉ２−／−（またはＯｒａｉ３−／−）マウスは虚血性脳卒中から保護されると予期される
上記発見のｉｎ  ｖｉｖｏ関連性を決定するため、中大脳動脈（ＭＣＡ）の１時間の閉塞を伴う一過性局所脳虚血のモデルにおいて、Ｏｒａｉ２−／−（またはＯｒａｉ３−／−）マウスにおけるニューロン損傷の発展を研究する（Ｃｈｏｕｄｈｒｉ（１９９８））。２４時間後、Ｏｒａｉ２−／−（およびＯｒａｉ３−／−）マウスにおける梗塞体積は、２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロリド（ＴＴＣ）染色によって評価した際、野生型に比較して有意に減少すると予期される。全体の神経学的機能を評価するベダーソン・スコア、ならびに運動機能および協調を特異的に測定するグリップ試験によって試験された際、梗塞サイズの減少は機能的に関連があると予期される。最長５日までの生存マウスに対する連続磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）によって、梗塞体積がＯｒａｉ２−／−（およびＯｒａｉ３−／−）マウスで経時的に増加しないことが示され、保護効果が持続されることが示されると予期される。組織学的分析によって、Ｏｒａｉ２−／−（およびＯｒａｉ３−／−）マウスにおいて、梗塞が基底核に限定されることが明らかになると予期される。
【０１５３】
参考文献
【０１５４】
【化１−１】
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【０１５５】
【化１−２】
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【図７】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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