(57)【要約】  本発明は、a)個体から得られた試料中のマーカーエンドスタチンの濃度を測定する工程、b)任意に該試料中の1つ以上の心不全の他のマーカーの濃度を測定する工程、ならびに工程(a)で測定した濃度および任意に工程(b)で測定した濃度（1つまたは複数）を、対照試料中で確立された1つまたは複数のこれらの濃度と比較する工程を含む、個体における心不全を評価する方法に関する。心不全の評価におけるマーカータンパク質としてのエンドスタチンの使用、エンドスタチンを含むマーカー組合せおよびエンドスタチンの測定のためのキットも開示される。
2012524282.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
a)個体から得られた試料中のマーカーエンドスタチンの濃度を測定する工程、
b)任意に、該試料中の1つ以上の心不全の他のマーカーの濃度を測定する工程、ならびに
c)工程(a)で測定された濃度および任意に工程(b)で測定された濃度(1つまたは複数)を、対照試料において確立されたこのマーカー(1つまたは複数)の濃度と比較することによって心不全を評価する工程
を含む、個体において心不全を評価するための方法。
【請求項２】
前記試料が血清、血漿および全血からなる群より選択されることをさらに特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記１つ以上の他のマーカーが、ナトリウム利尿ペプチドマーカー、心臓トロポニンマーカー、および炎症マーカーからなる群より選択されることをさらに特徴とする、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記1つ以上の他のマーカーがNT-proBNPであることをさらに特徴とする、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記1つ以上の他のマーカーがトロポニンTであることをさらに特徴とする、請求項３記載の方法。
【請求項６】
心不全の評価におけるマーカー分子としてのタンパク質エンドスタチンの使用。
【請求項７】
心不全の評価におけるエンドスタチンおよび1つ以上の心不全の他のマーカーを含むマーカー組み合わせの使用。
【請求項８】
１つ以上の他のマーカーが、ナトリウム利尿ペプチドマーカー、心臓トロポニンマーカー、および炎症マーカーからなる群より選択される、請求項７記載のマーカー組み合わせの使用。
【請求項９】
少なくともエンドスタチンおよびNT-proBNPを含む、請求項８記載のマーカー組み合わせの使用。
【請求項１０】
エンドスタチンおよび任意に1つ以上の心不全の他のマーカーを特異的に測定するために必要な試薬を含む、請求項１記載の方法を行なうためのキット。
【請求項１１】
マーカーエンドスタチンが、心不全のリスクがある個体から得られた試料中で測定される、請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、a)個体から得られた試料中のマーカーエンドスタチンの濃度を測定する工程、b)任意に、試料中の1種類以上の心不全の他のマーカーの濃度を測定する工程、ならびに工程(a)で測定された濃度および任意に工程(b)で測定された濃度（1つまたは複数）を、対照試料において確立されたこのマーカー（1つまたは複数）の濃度と比較することにより心不全を評価する工程を含む、個体における心不全を評価する方法に関する。心不全の評価におけるマーカータンパク質としてのエンドスタチンの使用、エンドスタチンを含むマーカー組合せおよびエンドスタチンを測定するためのキットも開示される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
心不全（HF）は、増大している主要な公衆衛生課題である。例えば、米国では、およそ500万人の患者がHFを有しており、毎年、新たに55万人を超える患者がHFと診断されている（In: American Heart Association、Heart Disease and Stroke Statistics: 2008年最新版、Dallas、Texas、American Heart Association（2008））。同様に、米国の統計によると、HFは、1200万〜1500万件の来診の主な理由であり、毎年650万人が在院していると示されている。1990年から1999年に、年間の入院件数は、初診でHFに関して約81万人から100万人を超えるまで増加し、初診または二次診断でHFに関して、240万人から360万人まで増加している。2001年には、ほぼ53,000人の患者が、HFが主な原因として死亡している。心不全は主に高齢者の病気であるので、「人口の高齢化」もHFの発病の増加に寄与していると広く認識されている。HFの発病率は、65歳を超える集団では1000人当たり10人に達している。米国単独では、2005年にHFにかかった直接および間接的な推定総額はおよそ279億ドルであり、年間29億ドルがHFの治療薬に費やされている（上述のAHA統計を参照）。
【０００３】
心不全
心不全は、身体が必要とするだけ多くの血液をポンプ輸送する心臓の能力の低下を特徴とする。機能不全は心臓のポンプ輸送が停止することを意味するものではないが、通常ほど効率的には血液をポンプ輸送することができなくなることを意味する。
【０００４】
NYHA [New York Heart Association(ニューヨーク心臓協会)]およびACC/AHA[American Association of Cardiology/American Heart Association(米国心臓学会/米国心臓協会)]は共に、疾患の進行を評価するためのHFの機能的クラスを確立した。NYHA分類体系は病状の4つのクラスを有する：クラス1は任意の労作レベルで無症候である。クラス2は重労作時に症候性であり、クラスIIIおよびIVはそれぞれ軽い労作時および無労作時に症候性である。
【０００５】
ACC/AHA体系の4つの病期において、病期Aは無症候であるがHFを発症するリスクがある。病期Bでは、症状はないが心臓機能不全の徴候がある。病期Cでは、症状があり心臓機能不全の徴候がある。病期Dでは、被験体は最大限の治療にも関わらずHFの症状を有する。
【０００６】
HFの病因
医学的に、心不全（HF）は複雑な疾患であると認識されるべきである。心不全は、心筋梗塞（心臓発作）などの誘発事象が生じることで引き起こされることがあるか、または高血圧、糖尿病もしくは心臓形成異常、例えば心臓弁膜症などの他の原因に続発性であることがある。心筋梗塞またはHFの他の原因は、例えば心筋の損傷により心臓のポンプ輸送能力の最初の低下を引き起こす。1つ以上の代償機構が活性化するために、ポンプ輸送能力の低下はすぐには気づかれないことがある。しかし、HFの進行は患者の血流力学的状態とは独立していることが分かった。そのため、該疾患により引き起こされる損傷の変化は、患者が無症候のままであっても存在し、進行している。実際に、HFの初期の段階で正常な心臓血管機能を維持する代償機構は、実際に、例えば循環中に充分なレベルの血流を維持し得る心臓およびその能力に悪影響を及ぼすことによって、長期的に疾患の進行に寄与することがある。
【０００７】
HFを引き起こすさらに重要な病態生理学的変化のいくつかは、(i)視床下部-下垂体-副腎軸の活性化、(ii)全身性の内皮機能不全および（iii）心筋リモデリングである。
【０００８】
(i)視床下部-下垂体-副腎軸の活性化と拮抗するように特異的に指向される治療としては、β-アドレナリン作動性遮断剤（B-ブロッカー）、アンジオテンシン転換酵素（ACE）インヒビター、特定のカルシウムチャネル遮断薬、硝酸塩およびエンドセリン-1遮断剤が挙げられる。カルシウムチャネル遮断薬および硝酸塩は臨床的改善を生じるが生存を延長することは明確には示されておらず、一方でB-ブロッカーおよびACEインヒビターは、アルドステロンアンタゴニストと同様に有意に寿命を延長することが示されている。エンドセリン-1遮断剤を使用した実験的研究により有益な効果が示された。
【０００９】
(ii)全身性の内皮機能不全は、充分に認識されたHFの特徴であり、左心室機能不全の徴候が現れる時点までに明白に存在する。内皮機能不全は、心筋微小循環と心筋細胞の密接な関係について、重要である。その証拠は、微小血管機能不全が、進行性心筋不全を引き起こす心筋機能不全および形態学的変化に大きく寄与していることを示唆する。
【００１０】
基礎となる病態生理に関して、証拠により、NADH依存性オキシダーゼによる血管O2形成の増加およびその後のNOの過剰な除去に起因し得るNOの相対的欠如により内皮機能不全が引き起こされ得ることが示唆される。O2生成の増加の潜在的な寄与因子としては、交感神経系の緊張、ノルエピネフリン、アンギオテンシンII、エンドセリン-1およびTNF-αの増加が挙げられる。また、重要な抗炎症性サイトカインであるIL-10のレベルは、TNF-αのレベルに関係して不適切に低い。現在、IL-6などの前炎症性サイトカインと関連するTNF-αおよび可溶性TNF-α受容体のレベルの上昇は、心筋収縮性の低下、両心室の拡張および緊張低下を引き起こしてHFの進行に大きな役割を果たし、おそらく内皮の活性化および機能不全に関与していると考えられる。また、TNF-αは、重度のHF患者で生じるこれまで説明されていなかった筋肉の消耗において、ある役割を果たしている可能性があるとも考えられる。可溶性TNF受容体療法による少数の患者における予備研究では、NYHA機能分類の改善および生活の質指数で測定した場合の患者の満足度の改善が示された。
【００１１】
(iii)心筋リモデリングは、無症候性から症候性の心不全への変化を伴う複雑なプロセスであり、心室の形状、大きさおよび容積の変化などの心筋内の一連の適応変化として説明され得る（Piano, M.R., et al., J. Cardiovasc. Nurs. 14 (2000) 1-23；Molkentin, J.D., Ann. Rev. Physiol. 63 (2001) 391-426）。心筋リモデリングの主な構成要素は、筋細胞生物学的変化、例えば心筋肥大、壊死またはアポトーシスによる筋細胞の欠損、細胞外マトリックスの変化、左心室構造の変化である。心筋リモデリングは長期間の神経ホルモン性刺激の毒性効果への曝露の数年後に起こる単純な標的器官の応答であるのか、または心筋リモデリングは心不全の進行に独立して寄与するのかは不明である。これまでの証拠により、適切な治療によって心筋リモデリングの進行を遅延または停止することができることが示唆されている。
【００１２】
マーカーおよび疾患状態
上記のように、心筋肥大はHFへの第1段階の1つを表していると思われる。心筋肥大は、p-ミオシン重鎖およびトロポニンT（TnT）などの収縮タンパク質、ならびにA型およびB型ナトリウム利尿ペプチド等のいくつかの非収縮タンパク質をコードするいくつかの遺伝子の発現の増加、細胞の大きさの増加、かつ細胞骨格の変化を特徴とする（Piano, M.R., et al., J. Cardiovasc. Nurs. 14 (2000) 1-23；Molkentin, J.D., Ann. Rev. Physiol. 63 (2001) 391-426）。
【００１３】
心不全のヒトおよび動物モデルの研究により、心不全の後期病期における筋細胞機能の低下が示唆されている。筋細胞機能不全の基礎となる機構は、カルシウム操作ネットワーク、筋フィラメントおよび細胞骨格の変化を伴うことが示唆されている（de Tombe, P.P., Cardiovasc. Res. 37 (1998) 367-380）。例えば、心不全のヒトおよび動物モデルにおいて、筋小胞体カルシウムATPase酵素活性は減少しているが、筋線維膜Na+/Ca2+交換体のmRNAおよびタンパク質のレベルは共に増加している。さらに、心不全のヒトおよび動物モデルの両方においてTnTのアイソフォームスイッチング、トロポニンI（TnI）のリン酸化の減少、筋原繊維アクトミオシンATPase活性の減少および微小管形成の増強が見られる。
【００１４】
最初に、心筋リモデリングを引き起こす心臓の変化は、身体の酸素および栄養要求を持続するために、心筋の疾患部分の代償が意図される。しかしながら、心不全の代償期は限られており、最終的に、心不全の心臓は、身体の要求に答えるための適切な心拍出量を維持することができなくなる。従って、代償期から代償不全期への変化が生じる。代償不全期において、心臓の変化のカスケードは継続するがもはや有益ではなく、患者は心不全へと進行し、慢性状態となり最終的に死亡する。
【００１５】
「ACC/AHA 2005 Guideline Update for the Diagnosis and Management of Chronic Heart Failure in the Adult」（S. Hunt et al., www.acc.org = the ACC/AHA practice guidelines）によると、心不全の分野での疾患の連続体は、現在では上記のように4つの病期に分類される。病期AおよびBでは、心不全を発症するリスクのある個体が見られ、病期CおよびDでは心不全の徴候および症候を示す患者の群が表される。上記参考文献に示した異なる病期A〜Dを定義する詳細は、参照により本明細書に含まれる。
【００１６】
心不全の診断方法
HFを有する患者の評価における最も有用な単一の診断試験は、心筋層、心臓弁または心膜の異常が存在するか、どの房室が関与しているかを調べるためのドップラー血流検査と組み合わせた包括的な二次元心エコー図である。3つの基本的な質問に取り組まなければならない：1)LVEFは保たれているか、低下しているか、2)LVの構造は正常であるか、異常であるか、および3)弁、心膜または右心室の異常など臨床所見を説明し得る他の構造の異常はあるか？この情報は、EFの数値予測、心室の寸法および/または容積の測定、壁の厚さの測定、ならびに房室構造および局所壁運動の評価により定量すべきである。右心室の大きさおよび心収縮期の振る舞いを評価すべきである。心房の大きさも半定量的に測定すべきであり、左心房の寸法および/または容積も測定されるべきである。
【００１７】
心エコー検査時に得られた非侵襲性血流力学のデータは、EFが保たれているかまたは低下している患者について、さらなる重要な相関因子である。僧帽弁流入パターン、肺静脈流入パターン、僧帽弁環状速度の定量を組み合わせると、LV充填および左心房圧の特性についてのデータが提供される。下大静脈の寸法および呼吸時のその応答の測定と組み合わせた三尖弁逆流勾配の評価により、肺動脈収縮圧および中心静脈圧の評価が提供される。
【００１８】
1回拍出量は、寸法の測定とLV流出路のパルスドップラーの組合せにより決定され得る。しかし、HFが非存在の場合は、これらのパラメータのいずれかに異常が存在し得る。必ずしもこれらの1つがHFと特異的に相関するとは限らないが、全体的に正常な充填パターンは、臨床的HFの反証となる。
【００１９】
臨床的観点から、該疾患は、代償期および初期代償不全期において臨床的には無症候である（病期Aでは完全に無症候であり、病期Bでは構造的心臓疾患を有するがHFの徴候および症候はない、ACC/AHA実施ガイドライン参照）。該疾患の外観的な徴候（例えば息切れ）は、代償不全期（すなわち、ACC/AHAガイドラインによると病期CおよびD）に充分に移行するまで現れない。現在の診断は、病期CおよびDの患者の外観的症状に基づいている。
【００２０】
典型的に、心不全を有する患者は、心不全に関与する特異的な機構と相互作用する薬剤による標準的な治療を受ける。これらの特異的な機構を確実に反映し、正しい患者に対して医師が正しい薬物（および用量）（例えばACEインヒビター、AT II、βブロッカー等）を選択することを補助する診断試験はない。
【００２１】
マーカーによるHFに関する患者の早期評価
心不全のリスクがある患者の早期評価は、この病期では、心不全を発症するリスクのある個体はまだ臨床的HF症状がないため、生化学的マーカーのみによって可能なようである。該疾患の症状が出る前の確実な評価に現在利用可能な確立された生化学的マーカーはない。現在、HFの診断が確立される時点までに、該疾患はすでに進行している。
【００２２】
ナトリウム利尿ペプチドファミリー、特に心房性ナトリウム利尿ペプチドファミリーおよび脳ナトリウム利尿ペプチドファミリーは、HFの評価に重要な価値があることがここ数年で証明された。
【００２３】
HF予後および必要性
少なくとも一部は、診断の遅れにより、HFの患者の50％は診断の2年以内に死亡する。5年生存率は30％未満である。現在、心不全の初期診断を補助する新規の生化学マーカーに関して大きな必要性がある。
【００２４】
心不全のリスクのある個体、すなわち心不全について臨床的に無症候な個体の早期評価の改善は当然である。
【００２５】
近年、B型ナトリウム利尿ペプチドマーカーはHFの患者における疾患の進行のモニタリングおよび心臓発作などの心臓血管合併症のリスクの評価に優れたツールとなることが確立された。
【００２６】
しかしながら、多くの他の診断領域について、単一マーカーでは充分でない。
【００２７】
NT-proBNPの低い値はHFまたはLVDを除外するための非常に高い負の予測値を有するが、前述および他の研究（Triepels R.H., et al., Clin. Chem. 49, Suppl. A (2003) 37-38参照）においては、心不全についての正の予測値は50〜60％の範囲であることが見出された。従って、単独で、またはNT-proBNPと組み合わせて、NT-proBNP単独と比較して、高いまたは改善されたHFの正の予測値を有する、心不全のリスクのある個体の評価に有用なマーカーが臨床/実施において非常に重要である。
【００２８】
心不全を有する患者の評価を補助するマーカーはまた、この臨床的に非常に重要で要求の厳しい診断領域において、さらなる技術的進歩を達成するために非常に重要である。
【発明の概要】
【００２９】
発明の概要
本発明で、マーカーエンドスタチンは心不全の評価を補助し得るということが見出され、確立された。一態様において、該マーカーは、個体が心不全を発症するリスクを有するかどうかの評価に役立ち得る。さらなる局面において、該マーカーは、疾患の進行の評価を補助し得る。別の態様において、該マーカーは、心不全の発症の予測を補助し得る。別の態様において、該マーカーは、心不全を予防または治療するための適切な治療計画の評価および選択を補助し得る。
【００３０】
個体から得られた試料中でマーカーエンドスタチンの濃度を測定する工程、任意に、該試料中で1種類以上の心不全の他のマーカーの濃度を測定する工程、ならびにエンドスタチンの濃度および任意に1種類以上の他のマーカーの濃度を、対照試料中で確立されたこのマーカー（１つまたは複数）の濃度と比較することにより心不全を評価する工程を含む、個体における心不全を評価する方法が本明細書に開示される。
【００３１】
本発明はまた、心不全の評価におけるマーカー分子としてのタンパク質エンドスタチンの使用に関する。
【００３２】
さらに、心不全の評価におけるエンドスタチンおよび1種類以上の心不全の他のマーカーを含むマーカー組合せの使用が開示される。
【００３３】
試料中のマーカーエンドスタチンの濃度を測定する工程、任意に、試料中の1種類以上の心不全の他のマーカーの濃度を測定する工程、ならびにエンドスタチンの濃度および任意に1種類以上の他のマーカーの濃度を、参照集団中で確立された一種類以上のマーカーの濃度と比較することにより心不全を評価する工程を含む、インビトロで心不全を評価する方法を実施するためのキットであって、エンドスタチンおよび任意に1種類以上の他の心不全のマーカーを特異的に測定するために必要な試薬を含むキットも提供される。
【００３４】
本発明のさらなる局面および利点は、以下の記載を参照して明白である。しかしながら、本発明の精神および範囲内の種々の変更および改変は、本発明の詳細な説明から当業者に明白であるので、詳細な説明および具体例は、本発明の好ましい態様を示すが、単なる例示として示されることを理解されたい。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
発明の詳細な説明
第一の態様において、本発明は、a)個体から得られた試料中のマーカーエンドスタチンの濃度を測定する工程、b)任意に、試料中の1種類以上の他の心不全のマーカーの濃度を測定する工程、ならびにc)工程(a)で測定された濃度および任意に工程(b)で測定された濃度（1つまたは複数）を、対照試料中で確立された一種類以上のこれらのマーカーの濃度と比較することにより心不全を評価する工程を含む、個体における心不全を評価する方法に関する。
【００３６】
本明細書で使用する場合、以下のそれぞれの用語は、このセクションにおける意味と関連する意味を有する。
【００３７】
冠詞「a」および「an」は、本明細書で使用する場合、1つまたは1つより多く（すなわち少なくとも1つ）の該冠詞の文法上の対象をいう。例として、「抗体（an antibody）」は、1つの抗体または1つより多くの抗体を意味する。
【００３８】
表現「1（種類）以上」は、1〜50、好ましくは1〜20、また好適には2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、または15を表す。
【００３９】
用語「マーカー」または「生化学マーカー」は、本明細書で使用される場合、患者の試験試料を分析するための標的として使用される分子のことをいう。一態様において、かかる分子標的の例はタンパク質またはポリペプチドである。本発明においてマーカーとして使用されるタンパク質またはポリペプチドは、前記タンパク質の天然に存在する断片、特に免疫学的に検出可能な断片を含むことを企図する。免疫学的に検出可能な断片は、好ましくは、前記マーカーポリペプチドの少なくとも6、7、8、10、12、15または20個の連続したアミノ酸を含む。当業者は、細胞により放出されるかまたは細胞外マトリックスに存在するタンパク質は、例えば炎症の際に損傷して、かかる断片に分解または切断され得ることを理解しよう。ある種のマーカーは不活性形態で合成され、その後タンパク質分解により活性化され得る。当業者が理解するように、タンパク質またはその断片は複合体の一部としても存在し得る。かかる複合体が本発明の意味におけるマーカーとして使用されることもある。また、あるいは代替的に、マーカーポリペプチドは翻訳後修飾を有することもある。翻訳後修飾の例は、特に、グリコシル化、アシル化および/またはリン酸化である。
【００４０】
用語「心不全を評価する」は、本発明の方法により、例えば、個体が心不全を発症するリスクを有するかどうかを医師が評価することが補助されること、またはHFの診断に関連のある1つまたは複数の他の分野における医師のHF患者の評価において、医師を補助することを示すために使用される。HFを有する個体の評価に診断的に関連のある好ましい分野は、心不全の病期分類、急性心不全と慢性心不全の鑑別診断、疾患進行のリスクの判断、適切な薬物の選択の手引き、治療に対する応答のモニタリング、およびHF患者の追跡である。
【００４１】
本発明の意味における「心不全のマーカー」は、マーカーエンドスタチンと組み合わせた場合、HFの評価において調査中の診断問題に関連情報を付加するマーカーである。HFの評価に関して、一定の特異性での感度、または一定の感度での特異性のそれぞれが、既にマーカーエンドスタチンを含むマーカー組合せに前記マーカーを含むことで改善され得る場合には、該情報は、関連があるまたは付加価値であると見なされる。好ましくは、感度または特異性の改善はそれぞれ、p=0.05、0.02、0.01以下の有意性のレベルで統計学的に有意である。好ましくは、1種類以上の心不全の他のマーカーは、ナトリウム利尿ペプチドマーカー、心臓トロポニンマーカー、および炎症マーカーからなる群より選択される。
【００４２】
用語「試料」は、本明細書で使用される場合、インビトロでの評価目的で得られた生物学的試料をいう。本発明の方法において、好ましくは試料または患者試料は、任意の体液を含み得る。好ましい試験試料としては、血液、血清、血漿、尿、唾液および滑液が挙げられ得る。好ましい試料は、全血、血清、血漿または滑液であり、血漿または血清が最も簡便な種類の試料である。当業者が理解するように、任意のかかる評価はインビトロでなされる。患者試料はその後廃棄される。患者試料は本発明のインビトロ方法のみに使用され、患者体内には戻されない。典型的に、試料は液体試料、例えば全血、血清または血漿である。
【００４３】
表現「〜の濃度を対照試料中で確立された濃度と比較する」は、何らかの方法において当業者に明らかであることをさらに説明するためだけに使用される。対照試料は、内部または外部対照試料であり得る。一態様において、内部対照試料が使用され、すなわち、（1つまたは複数の）マーカーの（1つまたは複数の）レベルに何らかの変化があるかどうかを決定するために、前記マーカーレベル(１つまたは複数)が試験試料中および同一の被験体から得られた1種類以上の他の試料中で評価される。別の態様において、外部対照試料が使用される。外部対照試料に関して、個体由来の試料中のマーカーの存在または量は、所定の状態に罹患することがわかっているかまたは該状態のリスクを有することがわかっている個体あるいは所定の状態を有さないことがわかっている個体、すなわち「正常個体」中のマーカーの存在または量と比較される。例えば、患者試料中のマーカーレベルは、HFにおける特定の疾患の経過と関連することが知られるレベルと比較することができる。通常、試料のマーカーレベルは、直接または間接的に診断と相関し、マーカーレベルは、例えば個体がHFのリスクを有するかどうかを決定するために使用される。あるいは、試料のマーカーレベルは、例えば、疾患進行のリスクの判断またはHF患者の追跡において、HF患者における治療に対する応答、急性心不全と慢性心不全の鑑別診断、HFを治療するための適切な薬物の選択の手引きと関連があることがわかっているマーカーレベルと比較することができる。意図される診断使用目的に応じて適切な対照試料が選択され、それに対してマーカーについての対照値または参照値が確立される。一態様におけるかかる対照試料は、年齢が一致し、混同性疾患を有さない参照集団から得られることが当業者には理解されよう。また、当業者に明白なように、対照試料において確立される絶対マーカー値は、使用されるアッセイに依存する。好ましくは、対照（参照）値を確立するために、適切な参照集団由来の100個の充分に特徴付けされた個体由来の試料が使用される。また、好ましい参照集団は、20、30、50、200、500または1000の個体からなるように選択され得る。健常個体は、対照値を確立するための好ましい参照集団である。
【００４４】
エンドスタチン
エンドスタチンは、最初に、マウス血管内皮腫から、XVIII型コラーゲンの20kDAのタンパク質分解性断片として単離された(O’Reilly，M.S. et al.，Cell 88 (1997) 277-285)。
【００４５】
コラーゲンは、組織構造の完全性の維持に主要な役割を果たしている超分子凝集塊を形成している特徴的な三重らせんコンホメーションを有する細胞外マトリックスタンパク質のファミリーの1つである。過剰なコラーゲン沈着は、周囲組織の正常な機能発揮を破壊する線維症をもたらす。
【００４６】
XVIII型コラーゲン(COL18A1、FLJ27325、FLJ34914、KNO、KNO1、MGC74745、gxHOMSA10749、コラーゲン、XVIII型、α1)は、中央の三重らせんドメイン内に多数の中断部と、主に基底膜においてC末端に特有の非三重らせんドメインを有するコラーゲンのマルチプレキシン(Multiplexin)ファミリーの一構成員である。XVIII型コラーゲンのヒト型α1鎖の短いアイソフォームの配列(SwissProt: P39060)を配列番号:1に示す。
【００４７】
エンドスタチンは、種々のタンパク質分解酵素の作用によってXVIII型コラーゲンのα1鎖から放出される(詳細については、Ortega，N. and Werb，Z.，Journal of Cell Science 115 (2002) 4201-4214を参照のこと-この論文の全開示は参照により本明細書に援用される)。エンドスタチンは、本質的に、配列番号:1のアミノ酸位置1337〜アミノ酸位置1519にまたがるXVIII型コラーゲン断片で表される。XVIII型コラーゲンのα鎖のC末端のヒンジ領域は、いくつかのプロテアーゼ感受性部位を含み、およびいくつかの酵素、例えば、好中球エラスターゼ、カテプシンおよびマトリックスメタロプロテイナーゼは、この領域内のコラーゲン鎖を切断することによりエンドスタチンを生成させることが知られている。これらのプロテアーゼはエンドスタチンを排他的に放出するだけでなく、エンドスタチン配列を含む他の大きな断片も放出し得る。当業者には自明のように、かかる大きな断片も、エンドスタチンのイムノアッセイによって測定される。
【００４８】
単量体のエンドスタチン(血管新生剤、多機能タンパク質MFP)の生理学的血清レベルは、異なる細胞型の遊走、増殖、アポトーシスまたは生存の刺激、および種々の形態発生事象(目の形態発生および血管の成熟)の抑制に役割を果たす。
【００４９】
エンドスタチンは、血管新生および血管成長の強力なインヒビターである。エンドスタチンとサイトカインネットワークとの関係は不明であるが、エンドスタチンは、広範な遺伝子の発現を改変できることが知られている(Abdollahi，A. et al.，Mol. Cell 13 (2004) 649-663)。
【００５０】
VEGFとエンドスタチンの生成の不均衡による血管新生の乱れにより、血管新生関連疾患 (全身性硬化症、アテローム血栓症性血管疾患、子癇前症)の病因がもたらされる。
【００５１】
エンドスタチンは、内皮増殖を阻害し、腫瘍成長を抑制することが知られている。エンドスタチンの循環レベルの上昇は多くの形態の癌と関連している(Dubois，S. et al.，Cancer 109 (2007) 814-819)。
【００５２】
また、エンドスタチンレベルの上昇は特発性肺線維症を有する患者の肺胞空間でも見られた (Richter，A.G. et al.，Thorax 64 (2009) 156-161)。
【００５３】
心臓疾患におけるエンドスタチンの病態生理学については、ほとんど知られていない。予備データにより、心筋虚血/再灌流に応答して、VEGFと平行したエンドスタチンの血清レベルの変化が報告されている(Seko，Y. et al.，Clinical Science 106 (2004) 439-442)。 EP 1 719 779は、心筋梗塞後のエンドスタチンの治療的使用に関する。急性左心室心不全は、組換えヒトエンドスタチンでの癌患者の治療の心臓副作用と記載されている(Jing、Q. et al.，Clin.Oncol. 20 (2008) 268)。
【００５４】
XVIII型コラーゲンmRNAの識別的発現は子宮内膜症に苦しむ患者において測定された(US 2003/0077589)。
【００５５】
いくつかの特許出願は、XVIII型コラーゲンまたはエンドスタチンポリペプチドの種々の広範な疾患の診断剤、予防剤および治療剤としての潜在的有用性を扱っている。例えば、EP 1 925 940は、エンドスタチンが、抗腫瘍治療の成功が予測されるいくつかの血清マーカーの1つであり得ることが特許請求の範囲に記載されており、WO 1998/056399には、肝臓線維症または肝細胞癌と関連する血清中のXVIII型コラーゲンの免疫学的検出が提案されている。
【００５６】
先行技術において、体液中のタンパク質エンドスタチンの存在またはレベルが心不全の評価に診断有用性を有するとは知られていないかまたは示唆されていないようである。
【００５７】
本発明の発明者らは、個体由来の体液試料から測定した場合のエンドスタチンの値の増加が心不全を示すということを見出し、確立し得た。
【００５８】
対照群または対照集団において測定されたエンドスタチンの値は、例えばカットオフ値または参照範囲を確立するために使用される。かかるカットオフ値よりも高い値または参照範囲の外側の値、およびその高い末端は上昇したと見なされる。
【００５９】
一態様において、固定カットオフ値が確立される。かかるカットオフ値は目的の診断問題に見合うように選択される。
【００６０】
一態様において、対照群または対照集団中で測定したエンドスタチンの値は、参照範囲を確立するために使用される。好ましい態様において、エンドスタチン濃度は、測定した値が参照範囲の90パーセンタイル（%-percentile）より高い場合に上昇したと見なされる。さらに好ましい態様において、エンドスタチン濃度は、測定した値が参照範囲の95パーセンタイル、96パーセンタイル、97パーセンタイルまたは97.5パーセンタイルよりも高い場合に上昇したと見なされる。
【００６１】
一態様において、対照試料は内部試料である。この態様において、一連の試料は調査中の個体から得られ、マーカーレベルが比較される。例えば、これは治療の有効性の評価に有用であり得る。
【００６２】
本発明の方法は、個体から得られた液体試料およびかかる試料中のエンドスタチンの測定に基づく。本明細書で使用される場合、「個体」は単一のヒトまたは非ヒト生物をいう。したがって、本明細書に記載される方法および組成物はヒトおよび獣医学的疾患の両方に適用可能である。好ましくは、個体はヒトである。
【００６３】
好ましくは、マーカーエンドスタチンは特異的結合剤の使用により、液体試料から特異的に測定される。
【００６４】
特異的結合剤は、例えばエンドスタチンに対するレセプター、エンドスタチンに結合するレクチンまたはエンドスタチンに対する抗体である。特異的結合剤は、その対応する標的分子に対して少なくとも107l/molの親和性を有する。特異的な結合剤は、その標的分子に対して、好ましくは1081/mol、さらにより好ましくは1091/molの親和性を有する。当業者が理解するように、用語特異的は、試料中に存在する他の生体分子がエンドスタチンに特異的な結合剤に有意に結合しないことを示すために使用される。好ましくは、標的分子以外の生体分子への結合のレベルはわずか10％以下、より好ましくはわずか5％以下のそれぞれの標的分子に対する親和性である結合親和性を生じる。好ましい特異的結合剤は、親和性および特異性について上述の最低基準の両方を満たす。
【００６５】
好ましくは、特異的結合剤は、エンドスタチンに反応性の抗体である。用語抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、かかる抗体の抗原結合断片、単鎖抗体、ならびに抗体の結合ドメインを含む遺伝子構築物をいう。
【００６６】
特異的結合剤の上述の基準を有する任意の抗体断片を使用することができる。例えばTijssen（Tijssen, P., Practice and theory of enzyme immunoassays, Elsevier Science Publishers B. V., Amsterdam (1990)、書籍全体、特に43〜78頁）に記載されるように、当該技術分野の技術水準の手法により抗体を生成する。また、当業者は、抗体の特異的な単離に使用できる免疫吸着に基づく方法を熟知している。これらの手段により、免疫アッセイにおけるポリクローナル抗体の質およびそれらの性能を高めることができる（Tijssen, P., 前掲、108〜115頁）。
【００６７】
本発明に開示される成果のために、ヤギで生成したポリクローナル抗体を使用してもよい。しかしながら、明白に、異なる種、例えばラット、ウサギまたはモルモット由来のポリクローナル抗体ならびにモノクローナル抗体を使用することもできる。モノクローナル抗体は一定の性質で、任意の必要量で生成することができるので、臨床的常套手段のアッセイの開発における理想的なツールである。
【００６８】
本発明の方法における、エンドスタチンに対するモノクローナル抗体の生成および使用はそれぞれ、さらなる他の好ましい態様を表す。
【００６９】
天然供給源からエンドスタチンを精製することは容易ではない。エンドスタチンの組換え生成は、より多量のエンドスタチンを得るために選択される方法である。好ましい態様において、真核生物発現系を使用して、組み換え発現によりエンドスタチンを生成する。真核生物発現系の例は、バキュロウイルス発現、酵母での発現および哺乳動物発現系での発現である。好ましい一態様において、エンドスタチンの発現は、哺乳動物発現系で行われる。哺乳動物発現系の例は、CHO細胞、HEK細胞、骨髄腫細胞等である。さらに好ましい態様において、組み換え生成したエンドスタチンは、エンドスタチンに対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体の生成において抗原として使用される。また、本明細書に上述される組換えにより生成したエンドスタチンを使用して、エンドスタチン免疫吸着物質に対する免疫吸着によりポリクローナル抗体を精製することも好ましい。
【００７０】
当業者が本発明において、エンドスタチンは、HFの評価に有用なマーカーとして同定されたことを認識するため、本発明の成果と同等の結果を達成するために代替的な方法を使用してもよい。例えば、抗体を生成するための代替的なストラテジーを使用してもよい。かかるストラテジーは、特に、免疫のために臨床的に関連のあるエンドスタチンのエピトープを提示する合成または組換えペプチドの使用を含む。あるいは、DNAワクチン接種として公知であるDNA免疫を使用してもよい。
【００７１】
測定のために、個体から得られた液体試料を、結合剤エンドスタチン複合体の形成に適した条件下でエンドスタチンに対する特異的結合剤とインキュベートする。当業者は任意の創意努力を必要とせずにかかる適切なインキュベーション条件を容易に特定できるので、かかる条件を明記する必要はない。結合剤エンドスタチン複合体の量を測定して、HFの評価に使用する。当業者が理解するように、特異的結合剤エンドスタチン複合体の量を測定するために多くの方法があり、全ては関連の教本に詳細に記載される（例えば、Tijssen P.、前掲、またはDiamandis, E. P. and Christopoulos, T.K. (編), Immunoassay, Academic Press, Boston (1996)参照）。
【００７２】
好ましくは、エンドスタチンはサンドイッチ型アッセイ形式で検出される。かかるアッセイにおいて、第1の特異的結合剤は一方側でエンドスタチンを捕捉するために使用され、直接または間接的に検出可能に標識された第2の特異的結合剤は他方側で使用される。好ましくは、定性的（エンドスタチンの存在もしくは非存在）または定量的（エンドスタチンの量を測定する）免疫アッセイにエンドスタチンに対する抗体を使用する。
【００７３】
本発明の発明者らは、驚くべきことに、体液試料中でタンパク質エンドスタチンを検出することができる。さらにより驚くべきことに、本発明者らは、個体から得られたかかる液体試料中のエンドスタチンの存在をHFと相関し得ることを示すことができる。HFの評価においてマーカーエンドスタチンを使用するために組織も生検試料も必要とされない。タンパク質エンドスタチンのレベルを測定することは、HFの分野において非常に有利であると思われる。
【００７４】
好ましい態様において、本発明の方法は、液体試料材料として血清を用いて実施される。さらに好ましい態様において、本発明の方法は、液体試料材料として血漿を用いて実施される。さらに好ましい態様において、本発明の方法は、液体試料材料として全血を用いて実施される。
【００７５】
さらに好ましい態様において、本発明は、個体から得られた液体試料からの心不全の評価におけるマーカー分子としてのタンパク質エンドスタチンの使用に関する。
【００７６】
診断の理想的なシナリオは、感染性疾患のように単一の事象またはプロセスによりそれぞれの疾患が引き起こされるような状況である。全ての他の場合において、特に、例えばHFの場合のように、疾患の病因が十分に理解されていない場合、正確な診断は非常に困難であり得る。当業者が認識するように、HFの分野において、ある種の診断上の疑問に関して、100％の特異性と同時に100％の感度で診断される生化学マーカーはない。むしろ、生化学マーカーは、一定の可能性または予測値で、存在する診断上の疑問を評価するために使用される。当業者は、評価対象の診断上の疑問について、相対的なリスクまたは尤度を計算するための常套的に使用される数学的/統計学的方法に精通している。日常的な臨床実務において、一般的に、医師は、既存の疾患の診断、治療および管理において種々の臨床徴候および生物学的マーカーを一緒に考慮する。
【００７７】
好ましくは、本発明のさらに好ましい態様において、HFの評価方法は、エンドスタチンおよび1種類以上の他のマーカーの濃度を測定すること、ならびにHFの評価においてエンドスタチンおよび1種類以上の他のマーカーの濃度を使用することにより実施される。
【００７８】
HFの評価において、マーカーエンドスタチンは、以下の状況：心不全について個体のリスクを評価すること、または心不全を有する患者を例えば心不全の病期を特定する目的で評価すること、急性心不全と慢性心不全を区別すること、疾患進行のリスクを判断すること、適切な治療の選択のガイダンスを提供すること、治療に対する患者の応答をモニタリングすること、および疾患の経過をモニタリングすること、すなわちHF患者の追跡の1つ以上において医師を補助する。
【００７９】
スクリーニング（個体が心不全を発症するリスクを有するかどうかの評価）
好ましい態様において、本発明は、試料中でマーカーエンドスタチンの濃度を測定する工程、任意に、試料中の1種類以上の他の心不全のマーカーの濃度を測定する工程、ならびにエンドスタチンの濃度および任意に1種類以上の他のマーカーについて任意に測定された濃度（1つまたは複数）を、その参照値（1つまたは複数）に対する該マーカー（1つまたは複数）の濃度と比較することにより前記個体の心不全を発症するリスクを評価する工程を含む、個体が心不全を発症するリスクを有するかどうかを評価するインビトロ方法に関する。
【００８０】
本発明の意味において、スクリーニングは、心不全を発症する個体のリスクに関する個体の不偏な評価に関する。理論的に、かかるスクリーニングは任意の試料で実施されるが、臨床実務においては、通常、心不全を発症する何らかのリスクを有する個体に対してかかるスクリーニングの選択肢が提供される。上述のように、かかる個体は臨床的に無症候であり、すなわち、HFの徴候または症候を有さない。好ましい一態様において、HFのスクリーニングは、心不全を発症するリスクを有する個体、例えばACC/AHA実務ガイドラインに規定される病期AまたはBに該当する個体に対して行われる。
【００８１】
上述のように、先進国において、心不全は最も一般的に見られ、費用がかかり生命を脅かす疾患の1つである。その高い有病率および長い無症候期のために、HFを発症するリスクを有する個体の特定には、疾患に介入することおよび可能な場合は疾患の経過を止めることが最も重要である。非常に早期のリスク評価がなければ、無症候状態からHFの症候状態への疾患の進行を予防することは不可能であると思われる。
【００８２】
心不全のリスクは、当業者に充分知られ、理解されている数学的/統計学的な方法により評価される。好ましくは、個体の心不全のリスクは、相対的観点で示される、いわゆる相対リスク（=RR）として示される。心不全のためのかかるRRを計算するために、エンドスタチンについての個体の値を参照集団、好ましくは心不全を発症していない健常個体において確立されたエンドスタチンの値と比較する。また、心不全についてのかかるRRの好ましい評価は、研究期間中、好ましくは一年、同様に好ましくは二年以内に心不全を発症した個体の群および同じ研究期間中に心不全を発症しなかった個体の群に基づくものである。
【００８３】
別の好ましい態様において、本発明は心不全のスクリーニングにおけるマーカーエンドスタチンの使用に関する。当業者に公知のように、用語「マーカーとしての使用」は、マーカー分子の濃度が適切な手段により定量されること、およびかかるマーカーについての測定値が、その後疾患または臨床状態の存在または非存在を示すため、すなわち示すために使用されることを示唆する。例えば、定量のための適切な手段は、抗体などの特異的結合剤である。
【００８４】
好ましくは、HFのスクリーニングは、将来心不全を発症するリスクを有することが疑われる個体において実施される。この意味において、将来の心不全のリスクを有する患者は、高血圧、アテローム性動脈硬化疾患、糖尿病、肥満およびメタボリックシンドロームを有すると診断された患者である。好ましくは、将来の心不全のリスクは、高血圧、アテローム性動脈硬化疾患、糖尿病、および/またはメタボリックシンドロームに苦しむ個体で評価される。
【００８５】
ACC/AHA実務ガイドラインに従った病期Bの個体、すなわち心不全の症候は示さないが心臓の構造変化を示す個体についての将来の心不全のリスクの評価におけるマーカーエンドスタチンの使用も好ましい。
【００８６】
さらに好ましい態様において、本発明は、HFスクリーニング目的のHFマーカー組合せのマーカーの1つとしてのエンドスタチンの使用に関する。
【００８７】
スクリーニングの状況において、エンドスタチンのレベルの上昇は、個体の心不全を発症する高いリスクについての陽性指標となる。
【００８８】
患者の病期分類
好ましい態様において、本発明は、a)試料中のマーカーエンドスタチンの濃度を測定する工程、b)任意に、試料中の1種類以上の心不全の他のマーカーの濃度を測定する工程、ならびに工程(a)で測定した濃度および任意に工程(b)で測定した（1つまたは複数の）濃度を、その参照値（1つまたは複数）に対するこのマーカーの濃度と比較することにより心不全を病期分類する工程を含む、インビトロにおける心不全患者の病期分類を補助する方法に関する。好ましくは、マーカーエンドスタチンのレベルは、調査される個体を、臨床的に「正常な」個体（すなわち、ACA/ACC分類に従った病期Aの個体）の群、構造的心臓疾患を有する無症候患者（ACA/ACC分類に従った病期B）および心不全を有する患者（すなわち、ACA/ACC分類に従った病期Cまたは病期Dの患者）の群に分類すことの補助として使用される。
【００８９】
急性心臓事象と慢性心臓疾患の識別
好ましい態様において、本発明は、試料中のマーカーエンドスタチンの濃度を測定する工程、任意に、試料中の1種類以上の心不全の他のマーカーの濃度を測定する工程、ならびに工程(a)で測定した濃度および任意に工程(b)で測定した（1つまたは複数の）濃度を、その参照値（1つまたは複数）に対するこのマーカーの濃度と比較することにより、急性心臓事象と慢性心臓疾患の鑑別診断を確立する工程を含む、急性心臓事象と慢性心臓疾患の鑑別診断を補助するインビトロ方法に関する。
【００９０】
当業者は、「急性心臓事象」と「慢性心臓疾患」の意味に精通している。
【００９１】
好ましくは、「急性心臓事象」は、心臓の急性状態、疾患または機能異常、特に急性心不全、例えば心筋梗塞（MI）または不整脈に関する。MIの程度に応じて、LVDおよびCHFが続いて起こり得る。
【００９２】
好ましくは、「慢性心臓疾患」は、例えば心臓の虚血、冠動脈疾患、または以前の、特に小心筋梗塞（1つまたは複数）（その後LVDが続くことがある）のために心臓機能が弱まることである。炎症性疾患、心臓弁欠陥（例えば僧帽弁欠陥）、拡張型心筋症、肥大型心筋症、心臓脈欠損（不整脈）および慢性閉塞性肺疾患のためにも弱まることがある。従って、慢性心臓疾患に急性冠動脈症候群、例えばMIに苦しんだが現時点では急性心臓事象に苦しんでいない患者が含まれ得ることは明白である。
【００９３】
急性心臓事象と慢性心臓疾患は全く異なる治療計画が必要とされ得るので、急性心臓事象と慢性心臓疾患を識別することは重要である。例えば、急性心筋梗塞を示す患者には、再灌流の早期治療が最も重要であり得る。しかし、慢性心不全を有する患者に実施される再灌流の治療は、この患者にとっては全く有害でないかまたはほんのわずかに有害である。
【００９４】
本発明のさらに好ましい態様において、急性および慢性心不全の鑑別診断においてマーカーエンドスタチンが使用される。
【００９５】
疾患進行のリスクの評価
好ましい態様において、本発明は、試料中のマーカーエンドスタチンの濃度を測定する工程、任意に、試料中の1種類以上の心不全の他のマーカーの濃度を測定する工程、ならびにエンドスタチンの濃度および任意に1種類以上の他のマーカーについて任意に測定された濃度（1つまたは複数）を、その参照値（1つまたは複数）に対するこのマーカー（1つまたは複数）の濃度と比較することにより前記個体の疾患進行のリスクを確立する工程を含む、HF患者の疾患進行のリスクを評価するインビトロ方法に関する。
【００９６】
現在、HFであると診断された患者がいくぶん安定な状態を有するかどうか、または疾患が進行して結果的に患者の健康状態が悪化しそうであるかどうかを妥当な尤度で評価またはさらには予測することは非常に困難である。心不全の重症度および進行は、通常、臨床的症候を評価することまたは心エコー検査などの画像化技術を使用した有害な変化の同定により臨床的に確立される。一態様において、心不全の悪化は、左心室駆出率（LVEF）をモニタリングすることにより確立される。LVEFの5％以上の悪化は、疾患進行と見なされる。
【００９７】
従って、さらに好ましい態様において、本発明は、HFに苦しむ患者の疾患進行のリスクの評価におけるマーカーエンドスタチンの使用に関する。HFに苦しむ患者の疾患進行の評価において、エンドスタチンのレベルの上昇は、疾患進行のリスクの増加の指標である。
【００９８】
適切なHF治療の選択における手引き
好ましい態様において、本発明は、試料中のマーカーエンドスタチンの濃度を測定する工程、任意に、試料中の1種類以上の心不全の他のマーカーの濃度を測定する工程、ならびにエンドスタチンの濃度および任意に1種類以上の他のマーカーについて任意に測定された（1つまたは複数の）濃度を、その参照値（1つまたは複数）に対するこのマーカー（1つまたは複数）の濃度と比較することにより、適切な治療を選択する工程を含む、適切なHF治療の選択を補助するインビトロ方法に関する。
【００９９】
マーカーエンドスタチンは、医師が心不全の領域ですぐに使える種々の治療計画から最も適切な治療計画を選択することの補助に有用であることが予想される。従って、さらに好ましい態様において、HFに苦しむ患者の治療計画の選択におけるマーカーエンドスタチンの使用に関する。
【０１００】
治療に対する患者の応答のモニタリング
好ましい態様において、本発明は、a)試料中のマーカーエンドスタチンの濃度を測定する工程、b)任意に、試料中の1種類以上の心不全の他のマーカーの濃度を測定する工程、ならびに工程(a)で測定された濃度および任意に工程(b)で測定された（1つまたは複数の）濃度を、その参照値（1つまたは複数）に対するこのマーカー（1つまたは複数）の濃度と比較することにより、HF治療に対する患者の応答をモニタリングする工程を含む、HF治療に対する患者の応答をモニタリングするインビトロ方法に関する。
【０１０１】
あるいは、治療に対する患者の応答をモニタリングするための前記方法は、エンドスタチンおよび任意に1種類以上の他のマーカーについての治療前および治療後のマーカーレベルを確立すること、ならびに治療前および治療後のマーカーレベル（1つまたは複数）を比較することにより実施され得る。
【０１０２】
心不全の診断は臨床的に確立される。本発明によると、患者がACC/AHA実務ガイドラインにより規定された病期CまたはDの基準を満たす場合、HFは臨床的に確立されたとみなされる。このガイドラインによると、病期Cは構造的心臓疾患を有し、以前または現在心不全の症候を有する患者をいう。病期Dの患者は、特殊な介入を必要とする難治性心不全を有する患者である。
【０１０３】
さらに上述されるように、NT-proBNPの測定値は心不全の重症度と高度に相関する。しかしながら、BNPとNT-proBNPは両方、治療に対する患者の応答のモニタリングには理想的ではないように思われる。例えばBeck-da-Silva, L., et al., Congest. Heart Fail. 11 (2005) 248-253, quiz 254-255参照。
【０１０４】
マーカーエンドスタチンは、治療に対する患者の応答のモニタリングに適切であると思われる。従って、本発明は、治療に対する患者の応答のモニタリングにおけるエンドスタチンの使用にも関する。この診断領域において、マーカーエンドスタチンは治療前のベースライン値を確立するため、および治療後の1つまたはいくつかの時点でエンドスタチンを測定するためにも使用できる。HF患者の追跡において、エンドスタチンのレベルの低下は、HFの有効な治療の陽性指標である。
【０１０５】
マーカー組合せ
生化学的マーカーは、個々に測定され得るか、または本発明の好ましい態様においてチップ系またはビーズ系アレイ技術を用いて同時に測定され得るかのいずれかである。次いで、バイオマーカーの濃度は、各マーカーの個々のカットオフを用いて独立して解釈されるか、または解釈のために組み合わされる、すなわち、マーカー組合せを形成する。
【０１０６】
当業者には認識されるように、マーカーレベルを一定の尤度またはリスクに相関させる工程は、種々の様式で行なわれ、達成され得る。好ましくは、マーカーエンドスタチンおよび1種類以上の他のマーカーの測定値を数学的に組み合わせ、組み合せた値を根本の診断上の疑問と相関させる。マーカー値は、任意の適切な当該分野の技術水準の数学的方法によってエンドスタチンの測定値と組み合わされ得る。
【０１０７】
好ましくは、マーカーの組合せに適用される数学的アルゴリズムは、ロジスティック関数である。かかる数学的アルゴリズムまたはかかるロジスティック関数を適用した結果は、好ましくは単一の値である。根本の診断上の疑問に応じて、かかる値は、例えば、個体の心不全のリスクまたはHFの患者の評価に有用な他の意図される診断上の使用に容易に相関され得る。好ましい様式において、かかるロジスティック関数は、a)例えば、正常群、心不全のリスクのある個体群、急性または慢性心不全を有する患者群などへの個体の分類、b)単変量解析によるこれらの群間で有意に異なるマーカーの同定、c)これらの異なる群の評価に有用なマーカーの独立した識別値を評価するためのロジスティック回帰分析、ならびにd)独立した識別値を組み合わせるためのロジスティック関数の構築によって得られる。この型の分析において、マーカーはもはや独立ではなく、マーカー組合せを提示する。
【０１０８】
好ましい態様において、エンドスタチンの値と少なくとも1つのさらなるマーカーの値を組み合わせるために使用されるロジスティック関数は、a)正常群および心不全のリスクのある個体群それぞれへの個体の分類、b)エンドスタチンの値および少なくとも1つのさらなるマーカーの値の確立、c)ロジスティック回帰分析の実施、ならびにd)エンドスタチンのマーカー値と少なくとも1つのさらなるマーカーの値を組み合わせるためのロジスティック関数の構築によって得られる。
【０１０９】
マーカー組み合わせを疾患に相関させるロジスティック関数は、好ましくは統計的方法を適用することによって開発されかつ得られたアルゴリズムを使用する。適切な統計的方法は、例えば、識別分析(DA)(即ち、線形-、四分-、正規-DA)、カーネル法(即ち、SVM)、ノンパラメトリック法(即ち、k-最近接分類)、PLS(部分最小二乗)、ツリーベース法(即ち、ロジック回帰、CART、ランダムフォレスト法、ブースティング/バギング法)、一般化線形モデル(即ち、ロジスティック回帰)、主要成分ベース法(即ち、SIMCA)、一般化付加モデル、ファジーロジックベース法、ニューラルネットワークおよび遺伝的アルゴリズムベース法である。当業者は、本発明のマーカー組み合わせを評価して、それによって適切な数学的アルゴリズムを得るための適切な統計的方法を問題なく選択する。好ましくは心不全の評価に使用される数学的アルゴリズムを得るために使用される統計的方法は、DA(即ち、線形-、四分-、正規識別分析)、カーネル法(即ち、SVM)、ノンパラメトリック法(即ち、k-最近接分類)、PLS(部分最小二乗)、ツリーベース法(即ち、ロジック回帰、CART、ランダムフォレスト法、ブースティング法)、または一般化線形モデル(即ち、ロジスティック回帰)から選択される。これらの統計的方法に関する詳細は、以下の文献: Ruczinski, I.ら, J. of Computational and Graphical Statistics 12 (2003) 475-511; Friedman, J.H., J. of the American Statistical Association 84 (1989) 165-175; Hastie, T.ら, The Elements of Statistical Learning, Springer Verlag (2001); Breiman, L.ら Classification and regression trees, Wadsworth International Group, California (1984); Breiman, L., Machine Learning 45 (2001) 5-32; Pepe, M.S., The Statistical Evaluation of Medical Tests for Classification and Prediction, Oxford Statistical Science Series, 28, Oxford University Press (2003); およびDuda, R.O.ら, Pattern Classification, John Wiley & Sons, Inc.,第2版(2001)に見られる。
【０１１０】
生物マーカーの基礎となる組み合わせのための最適化多変量カットオフを使用すること、および状態Aと状態B、例えば、正常と心不全のリスクがある個体、療法に応答するHF患者と療法不応答、急性心不全を有する患者と慢性心不全を有するHF患者、疾患進行を示すHF患者と疾患進行を示さないHF患者それぞれを区別することは、本発明の好ましい態様である。
【０１１１】
受信者動作曲線下面積(=AUC)は、診断手順の性能または精度の指標である。診断方法の精度は、受信者動作特性(ROC)によって最もよく記載される(特にZweig, M.H.,およびCampbell, G., Clin. Chem. 39 (1993) 561-577を参照)。ROCグラフは、観察されたデータの範囲全体に対して判定閾値を連続して変化させることでもたらされる感度／特異性対の全てのプロットである。
【０１１２】
研究室試験の臨床成績は、その診断精度、または被験体を臨床的に関連する亜群に正確に分類する能力に依存する。診断精度は、調査される被験体の2つの異なる状態を正確に区別する試験の能力を評価する。かかる状態は、例えば、健康と疾患または疾患進行対疾患進行なしである。
【０１１３】
それぞれの場合において、ROCプロットは、判定閾値の完全範囲に対する感度対1-特異性のプロットによる2つの分布間の重複を示す。y軸は感度、即ち真陽性部分[(真陽性試験結果の数)/(真陽性の数+偽陰性試験結果の数)として定義される]である。これは、疾患または状態の存在下の陽性度とも呼ばれる。これは、罹患亜群のみから計算される。x軸は、偽陽性部分、即ち1-特異性[(偽陽性結果の数)/(真陰性の数+偽陽性結果の数)として定義される]である。これは、特異性の指標であり、罹患していない亜群全体から計算される。2つの異なる亜群の試験結果を使用することで、真陽性部分および偽陽性部分が完全に別々に計算されるために、ROCプロットは、試料中の疾患の有病率とは独立している。ROCプロット上の各点は、特定の判定閾値に対応する感度/1-特異性対を表す。完全識別を有する試験(2つの結果の分布に重複はない)は、左上隅を通過するROCプロットを有し、この場合真陽性部分は1.0、即ち100%(完全感度)であり、偽陽性部分は0(完全特異性)である。識別のない試験の理論的プロット(2つの群の結果の同一分布)は、左下隅から右上隅の45°の対角線である。ほとんどのプロットは、これらの2つの両端の間に入る。(ROCプロットが45°対角線より下に完全に入る場合、これは「陽性度」の基準を「より大きい」から「より小さい」またはその逆に変換することによって容易に直される。)定性的に、プロットが左上隅に近づくほど、試験の全体精度は高くなる。
【０１１４】
研究室試験の診断精度を定量する1つの都合のよい目標は、1つの数によってその結果を表すことである。最も一般的で包括的な方法は、ROCプロット下面積(AUC)である。約束事で、この面積は常に≧0.5である(そうでない場合、そうなるように判定規則を逆転し得る)。値は1.0(2つの群の試験値が完全に分離する)〜0.5(2つの群の試験値間の明白な分布の違いはない)の範囲である。面積は、対角線に最も近い点または90％特異性での感度などのプロットの特定の部分だけに依存するのでなく、プロット全体に依存する。これは、ROCプロットが完全なもの(面積=1.0)にどれくらい近いかを定量的に記述した表現である。
【０１１５】
アッセイ全体の感度は、本明細書に開示される方法を行なうために必要な特異性に依存する。特定の好ましい設定において、75%の特異性が十分であり得、統計的方法および得られるアルゴリズムは、この特異性要件に基づき得る。好ましい一態様において、心不全のリスクがある個体を評価するために使用される方法は、80%、85%、または好ましくは90%もしくは95%の特異性に基づく。
【０１１６】
上記のように、マーカーエンドスタチンは、心不全を発症する個体のリスクの評価および心不全を有する患者のさらなるインビトロ診断評価を補助する。従って、好ましい態様は、心不全の評価におけるマーカー分子としてのエンドスタチンの使用である。
【０１１７】
HF患者の評価またはHFのリスクがある個体の評価におけるエンドスタチンおよびHFの１つ以上の他のマーカーを含むマーカー組み合わせの使用は、本発明のさらに好ましい態様を表す。かかるマーカー組み合わせにおいて、１つ以上の他のマーカーは、好ましくはナトリウム利尿ペプチドマーカー、心臓トロポニンマーカー、および炎症マーカーからなる群より選択される。
【０１１８】
エンドスタチンの測定と合わせられ得る好ましく選択された1つ以上の他のHFマーカーは、好ましくはナトリウム利尿ペプチドマーカー、心臓トロポニンマーカー、および炎症マーカーからなる群より選択される。好ましくは(1つまたは複数の)測定値をエンドスタチンの測定値と合わせるまたはエンドスタチンを含むHFマーカー組み合わせの一部を形成する、これらの好ましい他のマーカーそれぞれが、以下でより詳細に議論される。
【０１１９】
ナトリウム利尿ペプチドマーカー
ナトリウム利尿ペプチドマーカーは、本発明の意味において、心房ナトリウム利尿ペプチド(ANP)ファミリーから選択されるマーカーまたは脳ナトリウム利尿ペプチド(BNP)ファミリーから選択されるマーカーのいずれかである。
【０１２０】
心房ナトリウム利尿ペプチドファミリーまたは脳ナトリウム利尿ペプチドファミリーのいずれかのポリペプチドマーカーは、対応する活性ホルモンのプレプロ形態に由来する。
【０１２１】
本発明による好ましいナトリウム利尿ペプチドマーカーは、NT-proANP、ANP、NT-proBNP、BNP、およびその免疫学的に検出可能な生理学的断片である。当業者が容易に理解するように、免疫学的に検出可能な断片は、かかる生理学的断片の特異的検出を可能にする少なくとも1つのエピトープを含まなければならない。生理学的断片は、個体の循環系中で天然に存在する断片である。
【０１２２】
両方のナトリウム利尿ペプチドファミリーのマーカーは、対応のプロホルモンの断片、即ちproANPおよびproBNPそれぞれを表す。同様な考慮が両方のファミリーに適用されるために、BNPマーカーファミリーだけを、幾分詳細に記載する。BNPファミリーのプロホルモン、即ち、proBNPは、108個のアミノ酸からなる。proBNPは、生物活性ホルモンBNPを表す32個のC-末端アミノ酸(77〜108)およびN-末端proBNP(またはNT-proBNP)と呼ばれるN-末端アミノ酸1〜76に切断される。BNP、N-末端proBNP(1〜76)ならびにさらなる分解産物(Hunt, P.J.ら, Biochem. Biophys. Res. Com. 214 (1995) 1175-1183)は、血液中で循環する。また、完全な前駆分子(proBNP1〜108)が血漿中にも生じるかどうかは、完全に解決されていない。しかし、血漿中のproBNP(1〜108)の低い放出が検出可能であるが、N-末端での非常に早い部分分解のためにいくつかのアミノ酸がなくなることが記載されている(Hunt, P.J.ら, Peptides 18(1997) 1475-1481)。今日、例えば、NT-proBNPについて、アミノ酸10〜50の間にある分子の中心部分が、生理学的にかなり安定な部分を表すことが一般的に受け入れられている。このNT-proBNPの中心部分を含むNT-proBNP分子が体液から確実に測定され得る。このNT-proBNP分子の中心部分の免疫学的検出に基づいた方法に関連する詳細な開示が、WO 00/45176に示され、読者は詳細についてそれを参照されたい。用語天然NT-proBNPが提案されるNT-proBNPの特定の亜分画だけを測定することがさらに有利であり得る。このNT-proBNPの亜分画に関連する詳細な開示がWO 2004/099253に見られる。当業者は、そこに全て必要な説明を見出す。好ましくは測定されるNT-proBNPは、Roche Diagnostics, GermanyのElecsys（登録商標）NT-proBNPアッセイで測定されるNT-proBNPであるか、またはこれに対応するものである。
【０１２３】
前分析物は、NT-proBNPについて丈夫（robust）であり、中央研究室への試料の簡易輸送を可能にする(Mueller, T.ら, Clin. Chem. Lab. Med. 42 (2004) 942-944)。血液試料は、数日間室温で保存され得、あるいは回収を損失することなく郵送または配達され得る。対照的に、室温または摂氏4℃での48時間のBNPの保存は、少なくとも20％の濃度低下をもたらす(Mueller, T.ら, 上掲; Wu, A.H.ら, Clin. Chem. 50 (2004) 867-873)。
【０１２４】
脳由来ナトリウム利尿ペプチドファミリー(特にBNPおよびNT-proBNP)は、HFに対する特定の集団のスクリーニングにおいて徹底的に調査された。これらのマーカー、特にNT-proBNPを用いた発見は、かなり有望である。無症候「患者」でもNT-proBNPの上昇値は、「心臓問題」を明らかに示す(Gremmler, B.ら, Exp. Clin. Cardiol. 8 (2003) 91-94)。この著者らは、上昇したNT-proBNPが「心臓-腎臓窮迫」の存在を示し、更なる調査のための参照(refferal)が促進されるはずであることを示した。他のいくつかのグループの研究者と一致して、Gremmlerらは、また、異常なNT-proBNP濃度が、集団におけるHFの排除および呼吸のない被験体における左心室機能不全(=LVD)の可能性の排除の両方で正確な診断試験であることを発見した。HFまたはLVDの可能性を排除するネガティブBNPまたはNT-proBNP値の役割が、他のグループの研究者ら、例えば、McDonagh, T.A.ら, Eur. J. Heart Fail. 6 (2004) 269-273およびGustafsson, F.ら, J. Card. Fail. 11, Suppl. 5 (2005) S15-20参照によって実験されている。
【０１２５】
BNPは、心室で主に(だが専らではない)産生され、壁の緊張が増大する際に放出される。従って、放出されたBNPの増大は、心室の機能不全、または例えば、流入障害もしくは過負荷血液容量によって心房に起因するが、心室に影響を及ぼす機能不全を主に反映する。BNPとは対照的に、ANPは、主に心房から産生され、放出される。従って、ANPのレベルは、心房機能を主に反映し得る。
【０１２６】
ANPおよびBNPは、活性ホルモンであり、それぞれの不活性対応物NT-proANPおよびNT-proBNPよりも短い半減期を有する。BNPは、血液中で代謝されるが、NT-proBNPは、インタクト分子として血中で循環し、従って腎臓で排除される。NT-proBNPのインビボ半減期は、BNPの20分よりも長い120分である(Smith, M.W.ら, J. Endocrinol. 167 (2000) 239-246)。
【０１２７】
従って、目的の時間経過または特性に応じて、ナトリウム利尿ペプチドの活性形態または不活性形態のいずれかの測定が有利であり得る。
【０１２８】
心不全のリスクがある個体の評価において、エンドスタチンについて測定された値は、好ましくはNT-proANPおよび/またはNT-proBNPの値と合わされる。好ましくはNT-proBNPの値は、エンドスタチンの値と合わされる。同様の考慮が、適切な療法の選択、疾患進行のリスクの判断、および疾患の経過のモニタリングに適用される。
【０１２９】
療法に対する患者の応答の評価にエンドスタチンを使用する場合、その測定値は好ましくはANPまたはBNPの測定値と合わされる。
【０１３０】
急性と慢性の心不全を区別するためにエンドスタチンを使用する場合、好ましいマーカー組み合わせはエンドスタチン、ANPまたはproANPおよびBNPまたはproBNPを含む。
【０１３１】
心臓トロポニンマーカー
用語心臓トロポニンは、トロポニンIおよびトロポニンTの心臓アイソフォームに関する。既に先に示したように、用語マーカーはまた、生理学的断片または複合体等のマーカー分子の生理学的バリアントに関する。心臓トロポニンマーカーについて、生理学的に生じる複合体は、診断に関連することが公知であり、本明細書に表現上含まれる。
【０１３２】
トロポニンTは、約37,000Daの分子量を有する。心臓組織に見られるトロポニンTアイソフォーム(cTnT)は、骨格筋TnTと十分に異なっており、これらTnTアイソフォームの両方を区別する抗体の作製が可能になる。TnTは、急性心筋損傷のマーカーとみなされる; Katus, H.A.ら, J. Mol. Cell. Cardiol. 21 (1989) 1349-1353; Hamm, C.W.ら, N. Engl. J. Med. 327 (1992) 146-150; Ohman, E.M.ら, N. Engl. J. Med. 335 (1996) 1333-1341; Christenson, R.H.ら, Clin. Chem. 44 (1998) 494-501;およびEP 0 394 819参照。
【０１３３】
トロポニンI(TnI)は、トロポニン複合体の25kDa阻害性エレメントであり、筋肉組織に見られる。TnIは、Ca2+の非存在下でアクチンと結合し、アクトミオシンのATPase活性を阻害する。心臓組織に見られるTnIアイソフォーム(cTnI)は、骨格筋TnIと40％異なっており、両方のアイソフォームを免疫学的に区別することができる。cTnIの正常血漿濃度は、<0.1 ng/ml(4 pM)である。cTnIは、心臓細胞死の後に血流に放出される; 従って、血漿cTnI濃度は、急性心筋梗塞を有する患者で上昇する(Benamer, H.ら, Am. J. Cardiol. 82 (1998) 845-850)。
【０１３４】
特有の心臓アイソフォームのトロポニンIおよびTは、他方の骨格筋のトロポニンと免疫学的に区別することができる。従って、損傷した心筋からのトロポニンIおよびTの血液への放出は、心臓組織の損傷と特異的に関連付けられ得る。また、今日では、心臓トロポニンが遊離形態または複合体の一部のいずれかとして循環から検出され得ることを当業者は理解している(例えば、米国特許第6,333,397号、米国特許第6,376,206号および米国特許第6,174,686号参照)。
【０１３５】
心不全のリスクがある個体の評価および心不全に苦しむ患者の評価において、エンドスタチンについて測定された値は、好ましくはトロポニンTおよび/またはトロポニンIの心臓アイソフォームの値と合わされる。マーカーエンドスタチンと組み合わせて使用される好ましい心臓トロポニンは、心臓トロポニンTである。
【０１３６】
炎症マーカー
当業者は、用語炎症マーカーに精通している。好ましい炎症マーカーは、インターロイキン-6、C反応性タンパク質、血清アミロイドAおよびS100タンパク質である。
【０１３７】
インターロイキン-6(IL-6)は、多くの生物活性を有する21kDa分泌型タンパク質であり、造血に関与するものおよび先天性免疫応答の活性化に関与するものに分けることができる。IL-6は、急性期反応体であり、接着分子等の様々なタンパク質の合成を刺激する。その主な機能は肝臓タンパク質の急性期産生を媒介することであり、その合成はサイトカインIL-1およびTNF-□によって誘導される。IL-6は通常、マクロファージおよびTリンパ球によって産生される。IL-6の正常血清濃度は、<5pg/mlである。
【０１３８】
C反応性タンパク質(CRP)は、宿主防御に関与する、21kDaサブユニットを有するホモ五量体Ca2+結合急性期タンパク質である。CRP合成は、IL-6によって誘導され、IL-1が肝臓洞様血管のクップファー細胞によるIL-6の合成を誘発し得るために間接的にIL-1によって誘導される。CRPの正常血漿濃度は、健常集団の90％で<3μg/ml(30nM)であり、健常個体の99％で<10μg/ml(100nM)である。血漿CRP濃度は、例えば、測定され得、血清アミロイドA(=SAA)は、低分子量11.7kDaの急性期タンパク質である。これは主にIL-1、IL-6またはTNF-α刺激に応答して肝臓によって合成され、T細胞依存的免疫応答の調節に関与する。急性事象の際、SAAの濃度は、1000倍まで増加し、1ミリリットルあたり1ミリグラムに達する。SAAは、嚢胞性線維症、腎臓移植回復、外傷または感染のような多様な疾患の炎症をモニターするために使用される。関節リウマチでは、特定の場合にCRPの代用物として使用されているが、SAAはまだ広く受け入れられていない。
【０１３９】
S100タンパク質は、一定して増えているCa2+結合タンパク質のファミリーを形成し、今日では20種類より多くを含む。S100タンパク質の生理学的に関連する構造は、ホモダイマーであるが、一部、例えばS100A8およびS100A9は、互いにヘテロダイマーも形成し得る。細胞内機能は、タンパク質リン酸化の調節、酵素活性の調節、または細胞骨格の力学の調節から細胞増殖および分化における関与までの範囲である。いくつかのS100タンパク質がまた、細胞から放出されるために、例えば、神経生存、星状細胞増殖、アポトーシスの誘導および炎症プロセスの調節の細胞外機能も記載されている。S100A8、S100A9、ヘテロダイマーS100A8/A9およびS100A12は炎症に見られ、S100A8は慢性炎症に応答し、S100A9、S100A8/A9およびS100A12は急性炎症で増加する。S100A8、S100A9、S100A8/A9およびS100A12は、ある癌、腎臓同種移植片拒絶、大腸炎および最も重要にはRAなどの炎症成分を有する種々の疾患と関連している(Burmeister, G.,およびGallacchi, G., Inflammopharmacology 3 (1995) 221-230; Foell, D.ら, Rheumathology 42 (2003) 1383-1389)。例えば、本発明によるマーカー組み合わせにおける使用のための、HFのリスクがある個体またはHFを有する患者の評価のための最も好ましいS100マーカーは、S100A8、S100A9、S100A8/A9ヘテロダイマーおよびS100A12である。
【０１４０】
sE-セレクチン(可溶性内皮白血球接着分子-1、ELAM-1)は、内皮細胞のみで、炎症サイトカイン(IL-1β、TNF-α)またはエンドトキシンによる活性化の後だけに発現する、115kDaのI型膜貫通糖タンパク質である。細胞表面E-セレクチンは、炎症の部位での白血球侵出の不可欠な工程である、内皮への白血球の回転接着のメディエーターであり、それによって局在した炎症応答において重要な役割を果たしている。可溶性E-セレクチンは、健常個体の血液中に見られ、おそらくは表面発現分子のタンパク質分解性切断から生じる。血清中のsE-セレクチンの上昇したレベルが、様々な病理学状態で報告されている(Gearing, A.J.およびHemingway, I., Ann. N.Y. Acad. Sci. 667 (1992) 324-331)。
【０１４１】
好ましい態様において、本発明は、個体から得られた液体試料からのHFの評価における1つ以上のHF用マーカー分子と組み合わせたHF用マーカー分子としてのエンドスタチンの使用に関する。
【０１４２】
先に示したように、本発明による好ましい方法において、エンドスタチンの測定値は、ナトリウム利尿ペプチドマーカー、心臓トロポニンマーカー、および炎症マーカーからなる群より選択される少なくとも1つのさらなるマーカーの値と少なくとも合わされる。
【０１４３】
好ましい態様において、本発明は、心不全の評価におけるマーカー組み合わせエンドスタチンおよびNT-proBNPの使用に関する。
【０１４４】
好ましい態様において、本発明は、心不全の評価におけるマーカー組み合わせエンドスタチンおよびトロポニンTの使用に関する。
【０１４５】
好ましい態様において、本発明は、心不全の評価におけるマーカー組み合わせエンドスタチンおよびCRPの使用に関する。
【０１４６】
さらに好ましい態様において、本発明は、マーカーエンドスタチン、トロポニンT、NT-proBNPおよびCRPを含むマーカー組み合わせに関する。
【０１４７】
なおさらに好ましい態様において、本発明は、試料中のエンドスタチンおよびHFの1つ以上の他のマーカーの濃度を測定する工程、ならびに測定された濃度をHFの評価に使用する工程を含む、生化学マーカーによるインビトロでのHFの評価方法に使用されるマーカーパネルに関する。
【０１４８】
本発明によるマーカーパネルは、好ましくはタンパク質アレイ技術を用いて測定される。アレイは、アドレス可能な個々のマーカーの集合物である。かかるマーカーは、空間的にアドレス可能であり得、例えばアレイがマイクロタイタープレート内に含まれ、または各マーカーが別々のX座標およびY座標に存在する平面表面に印刷される。あるいは、マーカーは、タグ、ビーズ、ナノ粒子、または物理的特性に基づいてアドレス可能であり得る。マイクロアレイは、当業者に公知な方法によって調製され得る(例えば、米国特許第5,807,522号; Robinson, W.H.ら, Nat. Med. 8 (2002) 295-301; Robinson, W.H.ら, Arthritis Rheum. 46 (2002) 885-893を参照)。本明細書で使用されるアレイは、多数のアドレス可能なマーカーを用いた任意の免疫学的アッセイのことをいう。一態様において、アドレス可能なマーカーは抗原である。別の態様において、アドレス可能な構成要素は自己抗体である。マイクロアレイは、ミニチュア化形態のアレイである。本明細書で使用される場合、抗原は、抗体に特異的に結合し得る任意の分子のことをいう。用語自己抗体は、当該技術分野で十分定義されている。
【０１４９】
好ましい態様において、本発明は、マーカーエンドスタチンおよび任意にHFの１つ以上の他のマーカーを含むタンパク質アレイに関する。
【０１５０】
好ましい態様において、本発明は、マーカーエンドスタチンおよびNT-proBNPを含むタンパク質アレイに関する。
【０１５１】
好ましい態様において、本発明は、マーカーエンドスタチンおよびトロポニンTを含むタンパク質アレイに関する。
【０１５２】
好ましい態様において、本発明は、マーカーエンドスタチンおよびCRPを含むタンパク質アレイに関する。
【０１５３】
さらに好ましい態様において、本発明は、マーカーエンドスタチン、トロポニンT、NT-proBNPおよびCRPを含むタンパク質アレイに関する。
【０１５４】
なおさらに好ましい態様において、本発明は、エンドスタチンを特異的に測定するために必要な試薬を含むキットに関する。また、エンドスタチンを特異的に測定するために必要な試薬およびHFマーカー組み合わせにおいて共に使用される心不全の1つ以上の他のマーカーを測定するために必要な試薬を含むキットが好ましい。
【０１５５】
以下の実施例、配列表および図面は、本発明の理解を補助するために提供され、その真の範囲は添付の特許請求の範囲に示される。本発明の精神を逸脱することなく改変が以下に示される手順で行なわれ得ることが理解さよう。
【０１５６】
配列表の説明
配列番号:1  ヒトコラーゲンXVIII型のα1鎖の短いアイソフォームのアミノ酸配列。
【図面の簡単な説明】
【０１５７】
【図１】図1は、37名のHF患者由来の試料および38の対照試料のそれぞれで測定したエンドスタチンである。y軸には濃度をng/mlで示す。それぞれ心不全を有する患者由来の試料をHF（HF=四角）、および健常対照についてはNHS（（正常ヒト血清=NHS=ひし形）と表示する。
【図２】エンドスタチンは、37名のHF患者由来の試料および38の対照試料のそれぞれで測定した。それぞれ、心不全を有する患者由来の試料をHF（HF=四角）、および健常対照由来の試料を（正常ヒト血清=NHS=ひし形）と表して、両方でng/mlの濃度に基づいて四分位数を計算した。ボックスおよび箱髭図は、下および上の四分位数（ボックス）ならびに最大および最低値（髭）を示す。
【実施例】
【０１５８】
実施例1
1.1 ヒト血清および血漿試料中のエンドスタチンの測定のためのELISA
ヒト血清または血漿におけるエンドスタチンの測定のために市販のサンドイッチELISA（Quantikine Human Endostatin Immunoassay, カタログ番号DNST0, R&D Systems）を使用する。製造業者による使用説明書に従って測定を行なう。
【０１５９】
1.2 HFを有する患者の血清および臨床通常業務以外で得られた血清および見かけ上健常なドナーの血清のそれぞれを用いたエンドスタチンELISA
通常の臨床条件下でのエンドスタチンアッセイの有用性をさらに評価するために、HF患者由来の血清（n=37、表1参照)および見かけ上健常な対照患者由来の38の血清（表2参照）を検査する。
【０１６０】
表1は、心不全を有する患者についての結果を示す。
【０１６１】
2012524282.tif 000003
2012524282.tif 000004
【０１６２】
表2は、健常志願者についてのエンドスタチンの結果を示す。
【０１６３】
2012524282.tif 000005
2012524282.tif 000006
【０１６４】
表1および2に要約したデータを、それぞれグラフにして図1に示す。これらの表のデータは、図2に示すボックスブロットを計算するためにも使用した。図1および2により、心不全を有する患者由来の血清中で測定した際の平均エンドスタチンの値は、見かけ上健常な対照個体由来の血清で測定したエンドスタチンの値と比べて大きく異なることが示される。
【０１６５】
実施例2
心不全の評価におけるマーカーエンドスタチンを含むマーカー組合せ
実施例2.1
マーカー組合せNT-proBNPおよびエンドスタチン
病期Bならびに病期CおよびDのそれぞれにおける患者の差についてマーカー組合せNT-proBNPおよびエンドスタチンを評価する。充分に特徴付けられた個体の群すなわちHFの分類のためのACA/ACC基準に従った病期Bの50名の個体ならびにHFに苦しみ、HFの分類のためのACA/ACC基準に従った病期Cを有する50名の患者から得られた個々の液体試料を解析して、診断精度を評価する。市販のアッセイ(Roche Diagnostics, NT-proBNP-アッセイ(Elecsys(登録商標) Systemsイムノアッセイアナライザーについてカタログ番号03 121 640 160)で測定したNT-proBNPおよび上記のように測定したエンドスタチンをこれらの個体のそれぞれから得られた血清試料中で定量する。Zweig, M.H., and Campbell, G.上記に従ってROC解析を行なう。エンドスタチンと確立されたマーカーNT-proBNPの組合せについて、病期Cの患者と病期Bの個体を区別する識別力は、標準化識別解析により計算する(Friedman, J. H., Regularized Discriminant Analysis, Journal of the American Statistical Association 84 (1989) 165-175)。
【０１６６】
実施例2.2
マーカー組合せトロポニンTおよびエンドスタチン
急性心臓事象に苦しむ患者と慢性心臓疾患に苦しむ患者それぞれの違いについて、マーカー組合せトロポニンTおよびエンドスタチンを評価する。充分に特徴付けられた個体、すなわち急性心臓事象を有すると診断された50名の個体および慢性心臓疾患を有する診断された50名の個体から得られた個々の液体試料を解析して、診断精度を評価する。市販のアッセイ(Roche Diagnostics, トロポニンTアッセイ(Elecsys(登録商標) Systemsイムノアッセイアナライザーについてカタログ番号201 76 44)で測定したトロポニンTおよび上述のように測定したエンドスタチンを、これらの個体のそれぞれから得られた血清試料中で定量する。Zweig, M. H., and Campbell, G.上記に従ってROC解析を行なう。エンドスタチンと確立されたマーカートロポニンTの組合せについて、病期Cの患者と病期Bの個体を区別する識別力は、標準化された識別解析により計算する(Friedman, J.H., J. of the American Statistical Association 84 (1989) 165-175)。
【０１６７】
実施例2.3
マーカー組合せエンドスタチンおよびCRP
何も心臓疾患に苦しんでいない対照に対する心筋症を有すると診断された患者それぞれの区別について、マーカー組合せC反応性タンパク質およびエンドスタチンを評価する。心筋症を有する50名の個体の充分に特徴付けられた群および50名の健常対照個体から得られた個々の液体試料を解析して、診断精度を評価する。市販のアッセイ(Roche Diagnostics, CRPアッセイ(Tina-quant C反応性タンパク質(latex)高感度アッセイ-Rocheカタログ番号11972855 216)で測定したCRPおよび上述のように測定したエンドスタチンを、これらの個体のそれぞれから得られた血清試料中で定量する。Zweig, M.H., and Campbell, G.上記に従ってROC解析を行なう。エンドスタチンと確立されたマーカーCRPの組合せについて、病期Cの患者と病期Bの個体を区別する識別力を標準化された識別解析により計算する(Friedman, J.H., J. of the American Statistical Association 84 (1989) 165-175)。
【０１６８】
前記発明は明確性および理解のために幾分詳細に記載されているが、添付の特許請求の範囲における本発明の真の範囲を逸脱することなく、形式および詳細における様々な変更が行なわれ得ることは、本開示の解釈から当業者に理解されよう。
【０１６９】
公開公報、特許および特許出願の全ては、かかる引例のそれぞれが全体を参照することによって援用されることを具体的および個別的に示すように同じ程度で、全体を参照することによって本明細書に援用される。
【図１】
2012524282.tif 000007
【図２】
2012524282.tif 000008
【配列表】
2012524282000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成23年10月20日(2011.10.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
a)個体から得られた試料中のマーカーエンドスタチンの濃度を測定する工程、
b)任意に、該試料中の1つ以上の心不全の他のマーカーの濃度を測定する工程、ならびに
c)工程(a)で測定された濃度および任意に工程(b)で測定された濃度(1つまたは複数)を、対照試料において確立されたこのマーカー(1つまたは複数)の濃度と比較することによって心不全を検出する工程
を含む、個体において心不全を検出するための方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項６】
心不全の検出におけるマーカー分子としてのタンパク質エンドスタチンの使用。
【手続補正３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項７】
心不全の検出におけるエンドスタチンおよび1つ以上の心不全の他のマーカーを含むマーカー組み合わせの使用。
【国際調査報告】
2012524282.tif 000009
2012524282.tif 000010
2012524282.tif 000011
2012524282.tif 000012