【手続補正書】
【提出日】平成21年5月26日(2009.5.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの抗原に対する特異性を有する結合分子であって、当該少なくとも１つの抗原がＦｃγＲＩＩＩＡであり、当該ＦｃγＲＩＩＩＡに対する特異性は抗体またはその抗原結合断片によって与えられ、かつ特異的にＦｃγＲＩＩＩＢに結合しない結合分子。
【請求項２】
抗原結合断片が、免疫グロブリン軽鎖、免疫グロブリン重鎖、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、Ｆｖ、Ｆａｂ、ｄｉ−Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、およびＣＤＲからなる群から選択される、請求項１記載の結合分子。
【請求項３】
前記抗体または前記抗原結合断片の抗体が、配列番号２０、２３、２６、２９、３３、３４、２１、２４、２７、３０、３１、３５、２２、２５、２８、３２、１７、１８、および１９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのヒトＣＤＲを含む、請求項２記載の結合分子。
【請求項４】
抗体または抗原結合断片が、配列番号１０〜１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するヒト軽鎖可変部を含む、請求項２または３記載の結合分子。
【請求項５】
抗体または抗原結合断片が、配列番号９のアミノ酸配列を有するヒト重鎖可変部を含む、請求項２〜４のいずれか１項に記載の結合分子。
【請求項６】
抗体または抗原結合断片が完全ヒト型である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の結合分子。
【請求項７】
ＦｃγＲＩＩＩＡを発現しているヒト細胞を活性化できる、先行する請求項のいずれか１項に記載の結合分子。
【請求項８】
ＮＫ細胞媒介細胞殺滅を誘導可能な請求項７記載の結合分子。
【請求項９】
ＦｃγＲＩＩＩＡを発現しているヒト細胞の活性化を阻害する請求項６記載の結合分子。
【請求項１０】
結合分子が少なくとも１つの更なる抗原に対する特異性を有する、先行する請求項のいずれか１項に記載の結合分子。
【請求項１１】
少なくとも１つの更なる抗原が細胞表面抗原である請求項１０記載の結合分子。
【請求項１２】
細胞表面抗原がＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ラミニン受容体前駆体、ＥＧＦＲ１、ＥＧＦＲ２、ＥＧＦＲ３、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＰＬＡＰ、トムセン−フリーデンライヒ抗原、ＭＵＣ−１、ＩＬ４−Ｒアルファー、ＩＬ１３−Ｒ、ＩＧＦＲ、ＦｃεＲＩおよびＣＤ５から選択される、請求項１１記載の結合分子。
【請求項１３】
少なくとも１つの更なる抗原が病原体由来である請求項１０または請求項１１記載の結合分子。
【請求項１４】
病原体がウイルス、細菌、真菌、マイコプラズマ、寄生体またはプリオンである請求項１３記載の結合分子。
【請求項１５】
ダイアボディまたはＴａｎｄＡｂである請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の結合分子。
【請求項１６】
前記結合分子が更に機能ドメインを含有する、先行する請求項のいずれか１項に記載の結合分子。
【請求項１７】
機能ドメインが、抗体Ｆｃドメイン、抗体依存酵素プロドラッグ治療における使用のための酵素、Ｆｃ受容体に結合可能なペプチド、結合分子の血中半減期を増加させるためのタンパク質またはペプチドから選択される、請求項１６記載の結合分子。
【請求項１８】
前記結合分子が、ＦｃγＲＩＩＩＡ１５８Ｖ対立形質変種に結合する親和性とほぼ同じ親和性で、ＦｃγＲＩＩＩＡ１５８Ｆ対立形質変種に結合可能である、先行する請求項のいずれか１項に記載の結合分子。
【請求項１９】
結合分子が標識分子または毒素に結合している、先行する請求項のいずれか１項に記載の結合分子。
【請求項２０】
先行する請求項のいずれか１項に記載の結合分子、および少なくとも１つの更なる成分を含有する組成物
【請求項２１】
適当な薬学的担体、賦形剤、希釈剤および／または安定剤を含有する請求項２０記載の組成物。
【請求項２２】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載の結合分子をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２３】
ＦｃγＲＩＩＩＡに対する特異性を有する抗体または抗原結合断片が
ａ）配列番号２〜８からなる群から選択される核酸配列によってコードされるヒト軽鎖可変領域および／または；
ｂ）配列番号１の核酸配列によってコードされるヒト重鎖可変領域
を含有する請求項２２記載のポリヌクレオチド。
【請求項２４】
配列番号２〜８からなる群から選択される核酸配列によってコードされる第１の軽鎖可変領域、配列番号１の核酸配列によってコードされる第１の重鎖可変領域、第２の軽鎖可変領域、および第２の重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドであって、当該第２の軽鎖および重鎖の可変領域がＣＤ１９に対する親和性を有する、請求項２２または請求項２３記載のポリヌクレオチド。
【請求項２５】
配列番号２〜８からなる群から選択される核酸配列によってコードされる第１の軽鎖可変領域、配列番号１の核酸配列によってコードされる第１の重鎖可変領域、第２の軽鎖可変領域、および第２の重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドであって、当該第２の軽鎖および重鎖の可変領域がＣＤ３０に対する親和性を有する、請求項２２または請求項２３記載のポリヌクレオチド。
【請求項２６】
作動可能にプロモーター領域および所望により転写終結領域に連結された請求項２２〜２５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
【請求項２７】
ポリヌクレオチドが作動可能にプロモーター領域およびシグナル配列に連結された請求項２６記載のベクター。
【請求項２８】
請求項２２〜２５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、または請求項２６記載もしくは請求項２７のベクターを含有する宿主細胞。
【請求項２９】
請求項２２〜２５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、または請求項２６記載もしくは請求項２７のベクターを宿主細胞へ導入することと、結合分子が発現される条件下で宿主細胞を培養培養することとを含有する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の結合分子の製造方法。
【請求項３０】
更に結合分子の単離および所望による精製を含有する請求項２５記載の方法。
【請求項３１】
自己免疫疾患、炎症疾患、感染症、アレルギーまたはがんの診断または治療における使用のための、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の結合分子、または請求項２０もしくは請求項２１記載の組成物。
【請求項３２】
がんが、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、悪性リンパ肉芽腫症、固形腫瘍、微小残存病変、および転移性腫瘍からなる群から選択される、請求項３１記載の結合分子又は組成物。
【請求項３３】
ＦｃγＲＩＩＩＡを発現する細胞の染色、生体外での患者細胞プロファイルの分析、または生体外治療のためのＮＫ細胞の単離のための試薬としての請求項１９記載の結合分子の使用。
【請求項３４】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載の結合分子およびＦｃγＲＩＩＩＡへの結合時の結合分子を検出する手段を含有するキット。  
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６８】
【図１】ｓｃＦｖ５０ＮＩのストレプトアビジン捕捉ＣＤ１６−Ｆｃへの結合を示すＥＬＩＳＡの結果  ＥＬＩＳＡプレートを、ウエルあたり、１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．６中、５００ｎｇのストレプトアビジンおよび３００ｎｇのヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ、ドイツ）でコートした。ついで、３００ｎｇのビオチン化ＣＤ１６Ａ−ＦｃをＰＢＳ中、室温で、３０分間、吸着させた。ストレプトアビジン捕捉ＣＤ１６Ａ−Ｆｃ、ストレプトアビジンおよびヒトＩｇＧを、ＰＢＳ／ＴＷＥＥＮ  ０．１％／２％  スキムミルク粉末中、１μｇ／ｍＬのマウスＭＡｂ  Ａ９または５０μｌのクローン５０ＮＩ由来粗精製ペリプラズム抽出物とともに、インキュベーションした。ＭＡｂ  Ａ９の結合を、ヤギ抗−マウス抗体−ＨＲＰ複合体を用いて検出した。ｓｃＦｖ  ５０ＮＩの結合を、抗−ペンタＨｉｓ  抗体−ＨＲＰ−複合体を用いて検出した。ＨＲＰ−基質  テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）の４５０ｎｍでの吸収を、５０μｌの０．５Ｍ  硫酸での反応終結後に測定した。
【図２】ＣＤ１６Ａを発現する細胞形質転換体に結合するが、ＣＤ１６Ｂを発現する細胞に結合しない親和性成熟ヒト抗−ＣＤ１６  ｓｃＦｖ  マウスＢＷ細胞およびＣＤ１６Ａ（ＢＷ／ＣＤ１６Ａ）で安定に形質転換したＢＷ細胞、ＨＥＫ−２９３細胞およびＣＤ１６Ｂ（２９３／ＣＤ１６Ｂ）、ＣＤ１６Ａ（２９３／ＣＤ１６Ａ）またはＮＫｐ４６（２９３／ＮＫｐ４６）で形質転換したＨＥＫ−２９３細胞を、１０μｇ／ｍＬのＭＡｂ  Ａ９（抗−ＣＤ１６）またはＭＡｂ１９５３１４（抗−ＮＫｐ４６）で、ついで１５μｇ／ｍＬのＦＩＴＣ−複合化ヤギ抗−マウスＩｇＧで染色した。抗−ＣＤ１６  ｓｃＦｖを５０μｇ／ｍＬの濃度で用い、１０μｇ／ｍＬ  ＭＡｂ  １３／４５／３１−２（抗−ヘキサＨｉｓ）、ついでＦＩＴＣ−複合化ヤギ抗−マウスＩｇＧを用いて検出した。フローサイトメトリー分析で得られた平均蛍光強度を、２次試薬のみを用いた細胞からの染色蛍光値を差し引いて訂正し、図にプロットした。
【図３】組換えＣＤ１６Ａ−ＦｃおよびＣＤ１６ＢにおけるＥＬＩＳＡ  組換えＣＤ１６Ａ−ＦｃおよびＣＤ１６Ｂタンパク質を、０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．８中、８０ｎＭでコートした。ウエルを、ＰＢＳ、２％  スキムミルクでブロックした。組換えタンパク質およびｇｐ３４−Ｆｃ（ネガティブコントロール）へのｓｃＦｖの結合を、抗−ｃ−Ｍｙｃ−ＨＲＰ複合体（１０μｇ／ｍｌ）を用いて検出した。抗−ＣＤ１６  ＭＡｂ  Ａ９（１μｇ／ｍＬ）、ついでヤギ抗−マウスＩｇＧ  ＨＲＰ−複合体（０．５μｇ／ｍＬ）とインキュベーションした。コートされた組換えＣＤ１６Ｂを、抗−Ｈｉｓ−ＨＲＰ（１μｇ／ｍＬ）を用いた染色により直接検出しし、Ｆｃ−融合タンパク質のコーティングを、抗−ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ複合体（０．５μｇ／ｍＬ）によって試験した。ＨＲＰ−基質として、５０μＬのＴＭＢを用いた。５０μＬの０．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を用いた反応終結後、吸収を４５０ｎｍで測定した。
【図４】新たに単離したＮＫ細胞における、ヒト親和性成熟抗−ＣＤ１６  ｓｃＦｖによってリダイレクトされた細胞傷害性のトリガリング  健常ドナーの末梢血由来のＮＫ細胞を単離、濃縮し、標的細胞としてカルセイン標識化Ｐ８１５を用いた細胞傷害性アッセイにおけるエフェクター細胞として用いた。エフェクター（Ｅ）および標的（Ｔ）細胞を、１μｇ／ｍＬの指示抗体の存在下、１０：１のＥ：Ｔ比で３時間インキュベーションした。特異的溶解のパーセンテージを、上清中に放出されたカルセインの測定された蛍光カウントから計算した。３回の平均値および標準偏差をプロットした.
【図５】ＰＭＮおよびＮＫ細胞における親和性成熟抗−ＣＤ１６  ｓｃＦｖのフローサイトメトリー分析  多形核細胞（ＰＭＮ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を健常ドナー由来の末梢血から単離し、フローサイトメトリー染色および分析に用いた。細胞を１０μｇ／ｍＬの抗−ＣＤ１６  ＭＡｂ  Ａ９および抗−ＣＤ５６  ＭＡｂ  Ｂ１５９、ついで１５μｇ／ｍＬ  ＦＩＴＣ−複合化ヤギ抗−マウスＩｇＧで染色した。全てのｓｃＦｖを５０μｇ／ｍＬの濃度で用い、１０μｇ／ｍＬの抗−（Ｈｉｓ）６、ついで１５μｇ／ｍＬのＦＩＴＣ−複合化ヤギ抗−マウスＩｇＧで検出した。フローサイトメトリー分析から得られた平均蛍光強度を、２次試薬のみを用いた細胞染色からの蛍光値を差し引いて訂正し、図にプロットした。
【図６】ＣＤ１６ＡおよびＣＤ１６Ｂアイソフォームの対立遺伝子変種のアミノ酸配列アラインメント  シグナルペプチドを影付きで示す。アスタリスクと斜体テキストは、ＣＤ１６Ｂ対立遺伝子変種の間での相違を示す。ＣＤ１６ＡおよびＣＤ１６Ｂアイソフォームの相違を太字および下線で示す。ＣＤ１６Ａ  １５８Ｖａｌ／Ｐｈｅ多形性の位置をボックスで示す。
【図７】異なるＣＤ１６アイソフォームにおけるＥＬＩＳＡ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商品名）プレートのウエルを、２００ｎｇのＣＤ１６Ａ−Ｆｃ４８Ｒ／１５８Ｖ、ＣＤ１６Ａ−Ｆｃ４８Ｒ／１５８Ｆ、ＣＤ１６Ｂ−ＦｃＳＨ、ＣＤ１６Ｂ−ＦｃＮＡ１、ＣＤ１６Ｂ−ＦｃＮＡ２およびＮＫｐ４６−Ｆｃを含有する１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３でコートした。全ての抗原を、［Ａ］ｓｃＦｖ  ４−ＬＳ２１、ついでＨＲＰ複合化抗−Ｈｉｓ抗体、または［Ｂ］ＭＡｂ  Ａ９、ついでヤギ抗−マウスＨＲＰ複合体（ヒトＩｇＧとの最小交叉反応性）とインキュベーションした。一次抗体として用いた抗−ＮＫｐ４６  ｓｃＦｖは、ネガティブコントロールとして作用した。
【図８】ＴａｎｄＡｂ−活性化ＮＫ細胞による標的特異的殺滅。１×１０４の指示カルセイン標識Ｌ５４０ＣＹ（結果をパネル［Ａ］に示す）またはＪＯＫ−１標的細胞（結果をパネル［Ｂ］に示す）を、１×１０５のＮＫ細胞とともに、指示濃度のＣＤ３０×ＣＤ１６  ＴａｎｄＡｂ（黒い菱形）またはＣＤ１９ｘＣＤ１６  ＴａｎｄＡｂ（白い菱形）の存在下で３時間インキュベーションした。特異的溶解の割合は、測定された放出カルセインの蛍光カウントから計算し、GraphPadPrismソフトウェアを用いて非線形回帰分析で分析した。