(57)【要約】本発明は、がんにおいてＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子が果たす役割に関連し、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子に対する二本鎖分子またはそれをコードするベクターを含む組成物を投与することによってがんを治療するための方法を特徴とする。本発明はまた、ＪＡＲＩＤ１Ｂの発現を検出することによってがんを診断するための方法も特徴とする。そのために、ＪＡＲＩＤ１Ｂはがんに対する血清学的バイオマーカーとして役立つ。また、がん細胞におけるＪＡＲＩＤ１Ｂの発現またはＪＡＲＩＤ１Ｂの発現に起因する細胞増殖を指針として用いて、がんを治療もしくは予防するため、またはがん細胞増殖を阻害するための候補剤を同定する方法も開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
がんを検出または診断するための方法であって、
（ａ）対象由来の生物試料における、ｊｕｍｏｎｊｉ，  ＡＴ  ｒｉｃｈ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ  ｄｏｍａｉｎ  １Ｂ（ＪＡＲＩＤ１Ｂ）遺伝子の発現レベルを、
（ｉ）ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子のｍＲＮＡを検出すること；
（ｉｉ）ＪＡＲＩＤ１Ｂタンパク質を検出すること；および
（ｉｉｉ）ＪＡＲＩＤ１Ｂタンパク質の生物活性を検出すること
からなる群より選択される方法のいずれか１つによって決定する段階；ならびに
（ｂ）該遺伝子の正常対照レベルと比較した、段階（ａ）で測定された発現レベルの増大を、がんの存在と関連付ける段階
を含む、方法。
【請求項２】
前記がんが、急性骨髄性白血病、膀胱癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌および腎細胞癌からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記対象由来の生物試料が、生検試料、喀痰、血液、胸水または尿を含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
（ａ）ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子のｍＲＮＡを検出するための試薬；
（ｂ）ＪＡＲＩＤ１Ｂタンパク質を検出するための試薬；および
（ｃ）ＪＡＲＩＤ１Ｂタンパク質の生物活性を検出するための試薬
からなる群より選択される試薬を含む、がんを診断するためのキット。
【請求項５】
前記がんが、急性骨髄性白血病、膀胱癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌または腎細胞癌からなる群より選択される、請求項４記載のキット。
【請求項６】
単離された二本鎖分子であって、該分子がＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子を発現している細胞に導入された場合に該遺伝子の発現を阻害し、該分子がセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、該鎖が互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成し、該センス鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１または３０に対応する核酸配列を含み、該分子が約１９〜約２５ヌクレオチド長を有する、分子。
【請求項７】
センス鎖および／またはアンチセンス鎖の３'末端のいずれかまたは両方に、２〜１０ヌクレオチドからなる１つまたは２つの３'オーバーハングを有する、請求項６記載の二本鎖分子。
【請求項８】
介在性の一本鎖核酸配列によって連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含む単一のポリヌクレオチドからなる、請求項６記載の二本鎖分子。
【請求項９】
一般式
５'−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ'］−３'
を有し、［Ａ］がセンス鎖であり、［Ｂ］が３〜２３ヌクレオチドからなる介在一本鎖核酸配列であり、かつ［Ａ'］が［Ａ］に対する相補的配列を含むアンチセンス鎖である、請求項８記載の二本鎖分子。
【請求項１０】
請求項６〜９のいずれか一項記載の二本鎖分子をコードする、ベクター。
【請求項１１】
センス鎖核酸およびアンチセンス鎖核酸を含むポリヌクレオチドの組み合わせのそれぞれを含むベクターであって、該センス鎖核酸がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１または３０のヌクレオチド配列を含み、該アンチセンス鎖核酸が該センス鎖に相補的な配列からなり、該センス鎖および該アンチセンス鎖の転写物が互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成し、該ベクターが、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子を発現している細胞に導入された場合に細胞増殖を阻害する、ベクター。
【請求項１２】
単離された二本鎖分子または該二本鎖分子をコードするベクターを対象に投与する段階を含む、がんを治療または予防するための方法であって、該分子がＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子を発現している細胞に導入された場合に該遺伝子の発現を阻害し、該分子がセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、該鎖が互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成し、該センス鎖がＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の核酸配列またはその断片に対応する核酸配列を含み、該分子が約１９〜約２５ヌクレオチド長を有する、方法。
【請求項１３】
前記二本鎖分子が、請求項６〜９のいずれか一項記載の二本鎖分子である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記がんが、急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌および腎細胞癌からなる群より選択される、請求項１２または１３記載の方法。
【請求項１５】
単離された二本鎖分子または該二本鎖分子をコードするベクターを含む、がんを治療または予防するための組成物であって、該分子がＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子を発現している細胞に導入された場合に該遺伝子の発現を阻害し、該分子がセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、該鎖が互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成し、該センス鎖がＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の核酸配列またはその断片に対応する核酸配列を含み、該分子が約１９〜約２５ヌクレオチド長を有する、組成物。
【請求項１６】
前記二本鎖分子が請求項６〜９のいずれか一項記載の二本鎖分子である、請求項１５記載の組成物。
【請求項１７】
前記がんが、急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌または腎細胞癌からなる群より選択される、請求項１５または１６記載の組成物。
【請求項１８】
がんを治療もしくは予防するためまたはがん細胞増殖を阻害するための候補剤をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験剤をＪＡＲＩＤ１Ｂポリペプチドと接触させる段階；
（ｂ）該ポリペプチドと試験剤との間の結合活性を検出する段階；および
（ｃ）該ポリペプチドと結合する試験剤を候補剤として選択する段階
を含む、方法。
【請求項１９】
がんを治療または予防するためまたはがん細胞増殖を阻害するための候補剤をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験剤をＪＡＲＩＤ１Ｂポリペプチドと接触させる段階；
（ｂ）該ポリペプチドの生物活性を検出する段階；および
（ｃ）試験剤の非存在下で検出される生物活性と比較して、該ポリペプチドの生物活性を抑制する該試験剤を、候補剤として選択する段階
を含む、方法。
【請求項２０】
前記生物活性が、細胞増殖活性、抗アポトーシス活性、Ｅ２Ｆ１遺伝子またはＥ２Ｆ２遺伝子の発現の促進活性、および脱メチル化活性からなる群より選択される、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
がんを治療または予防するためまたはがん細胞増殖を阻害するための候補剤をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験剤の存在下で、ＪＡＲＩＤ１Ｂポリペプチドを、脱メチル化される基質と、該基質の脱メチル化に適した条件下で接触させる段階；
（ｂ）該基質のメチル化レベルを検出する段階；および
（ｃ）試験剤の非存在下で検出されるメチル化レベルと比較して、該基質のメチル化レベルを増大させる該試験剤を、候補剤として選択する段階
を含む、方法。
【請求項２２】
前記基質がメチル化ヒストンＨ３である、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記メチル化レベルをヒストンＨ３のリシン４で検出する、請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
がんを治療または予防するためまたはがん細胞増殖を阻害するための候補剤をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験剤を、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子を発現している細胞と接触させる段階；
（ｂ）該細胞におけるヒストンＨ３のメチル化レベルを検出する段階：および
（ｃ）試験剤の非存在下で検出されるメチル化レベルと比較して、ヒストンＨ３のメチル化レベルを増大させる該試験剤を、候補剤として選択する段階
を含む、方法。
【請求項２５】
前記メチル化レベルをヒストンＨ３のリシン４で検出する、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
がんを治療または予防するための候補剤をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験剤を、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子を発現している細胞と接触させる段階；
（ｂ）ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の発現レベルを検出する段階；および
（ｃ）試験剤の非存在下で検出される発現レベルと比較して、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の発現レベルを低下させる該試験剤を、候補剤として選択する段階
を含む、方法。
【請求項２７】
がんを治療または予防するための候補剤をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験剤を、ＪＡＲＩＤ１Ｂの転写調節領域および該転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子を含むベクターが導入された細胞と接触させる段階、
（ｂ）該レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を測定する段階；ならびに
（ｃ）試験剤の非存在下における発現レベルまたは活性レベルと比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性レベルを低下させる該試験剤を、候補剤として選択する段階
を含む、方法。
【請求項２８】
前記がんが、急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌または腎細胞癌からなる群より選択される、請求項１８〜２７のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権
本出願は、２００９年２月２３日に出願された米国特許仮出願第６１／２０８，４３２号の恩典を主張し、その全内容が、参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
技術分野
本発明は生物科学の分野に関し、より具体的には、がん研究、がん診断およびがん治療法の分野に関する。特に、本発明は、がんを検出および診断するための方法、ならびにがんを治療および予防するための方法に関する。さらに本発明は、がんの治療および／または予防のための候補化合物をスクリーニングするための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
がんは主要死因の１つであり、世界中で毎年数百万人もの人々ががんのために死亡している。がんの症例数は世界的に増加している。がんの治療は基本的に、外科手術、放射線療法および化学療法によって行われる。しかし、これらの治療の有効性は依然として限定的である。その上、これらの治療は有害作用を引き起こすことがあるため、多くのがん患者が治療後に身体的衰弱を来す。
膀胱癌は２番目に多い泌尿生殖器腫瘍であり、世界中で毎年およそ３５７，０００例の新たな症例が発生している（非特許文献１）。膀胱癌のおよそ３分の１は、診断時点で浸潤性または転移性の疾患であると推測される（非特許文献１〜３）。世界の多くの地域では浸潤性膀胱癌に対する根治的膀胱切除術が未だに標準治療であるが、そのような患者の半数近くは切除術後２年以内に転移を発症し、その後、この疾患のために死亡する。過去２０年間にわたり、ＣＭＶ（シスプラチン、メトトレキサートおよびビンブラスチン）またはＭ−ＶＡＣ（メトトレキサート、ビンブラスチン、ドキソルビシンおよびシスプラチン）といったシスプラチンに基づく併用化学療法レジメンが、進行期膀胱癌の患者に対して主に適用されている（非特許文献３〜６）。しかし、全体的な予後は依然として極めて不良であり、これらの併用化学療法によって引き起こされる有害反応は非常に重篤である（非特許文献７）。したがって、膀胱癌に対する新たな分子標的薬の開発が切実に望まれている。
肺癌は世界中のがんによる死亡の主因であり、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）が症例の８０％近くを占める（非特許文献８）。肺癌の発生および進行に関連する遺伝学的変化は数多く報告されているが、その正確な分子機序は依然として不明である（非特許文献９）。過去１０年間に、いくつかの新たに開発された化学療法剤、例えばパクリタキセル、ドセタキセル、ゲムシタビンおよびビノレルビンにより、進行期肺癌患者の治療に関する複数の選択肢が提供され始めている；しかし、シスプラチンに基づく治療法と比較して、そのような各レジメンがもたらす生存度への恩恵はごくわずかに過ぎない（非特許文献１０、１１）。それ故、分子標的薬などの新規な治療戦略が強く待ち望まれている。
【０００４】
ヒストンのメチル化はクロマチンの動的構造を調節する上で重要な役割を果たす。開放型および閉鎖型のクロマチンの正確な協調および組織化が、ＤＮＡの複製、修復、組換えおよび転写といった正常な細胞プロセスのためには極めて重要である。最近まで、ヒストンのメチル化は静的修飾とみなされてきたが、ヒストンデメチラーゼ酵素の同定により、ヒストンのメチル化は動的に調節されていることが判明した（非特許文献１２、１３）。ヒストンデメチラーゼは修飾それ自体を調節するだけでなく、修飾クロマチンに対するエフェクタータンパク質の結合に拮抗することによって間接的にも機能する。このことはＪＨＤＭ３Ａ／ＪＭＪＤ２Ａによって例証されており、これはＨＰ１が認識するＨ３Ｋ９メチル化の目印を除去することによってクロマチンからＨＰ１を除き、ＨＰ１による周囲のクロマチンへのＨ３Ｋ９メチル化の広がりを防止する（非特許文献１４〜１６）。酵母からヒトに至る広範なタンパク質ファミリーがＪｍｊＣドメインを含んでおり、これは最近、ヒストンデメチラーゼのシグネチャーモチーフとして特徴決定された（非特許文献１７）。転写調節におけるヒストンデメチラーゼの顕著な役割に関する知見は増加しているにもかかわらず、特にヒト疾患に関して、それらの生理的機能の理解は依然として限定的である。
本発明者らは以前、ヒストンメチルトランスフェラーゼの１つであるＳＭＹＤ３がそのメチルトランスフェラーゼ活性を通じて細胞増殖を刺激し、ヒトの発がんにおいて重要な役割を果たすことを示した（特許文献１、非特許文献１８〜２２）。ヒストンメチルトランスフェラーゼがヒト細胞における悪性化に寄与することは、他の研究によっても示されている（非特許文献２４〜２６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開公報第２００５／０７１１０２号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｐａｒｋｉｎ  ＤＭ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  ２００５  ５５：７４−１０８
【非特許文献２】Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ  ＣＮ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ  １９９５  ６：１１３−２６
【非特許文献３】Ａｒｄａｖａｎｉｓ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００５  ９２：６４５−５０
【非特許文献４】Ｌｅｈｍａｎｎ  Ｊ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｕｒｏｌ  ２００２  ２０：１４４−５０
【非特許文献５】Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ＪＥ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｕｒｏｌｏｇｙ  ２００５  １７４：１４−２０
【非特許文献６】Ｔｈｅｏｄｏｒｅ  Ｃ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００５  ４１：１１５０−７
【非特許文献７】Ｖａｕｇｈｎ  ＤＪ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １９９９  Ｓｕｐｐｌ  ２；１１７−２２
【非特許文献８】Ｇｒｅｅｎｌｅｅ  ＲＴ  ｅｔ  ａｌ．，  ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  ２００１  Ｊａｎ−Ｆｅｂ，  ５１（１）：  １５−３６
【非特許文献９】Ｓｏｚｚｉ  Ｇ，  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００１  Ｏｃｔ，  ３７  Ｓｕｐｐｌ  ７：  Ｓ６３−７３
【非特許文献１０】Ｋｅｌｌｙ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００１  Ｊｕｌ  １，  １９（１３）：  ３２１０−８
【非特許文献１１】Ｓｃｈｉｌｌｅｒ  ＪＨ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２００２  Ｊａｎ  １０，  ３４６（２）：  ９２−８
【非特許文献１２】Ｓｈｉ  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｅｌｌ  ２００４；１１９：  ９４１−５３
【非特許文献１３】Ｔｓｕｋａｄａ  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  ２００６；４３９：  ８１１−６
【非特許文献１４】Ｃｌｏｏｓ  ＰＡ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  ２００６；４４２：  ３０７−１１
【非特許文献１５】Ｆｏｄｏｒ  ＢＤ  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ２００６；２０：  １５５７−６２
【非特許文献１６】Ｋｌｏｓｅ  ＲＪ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  ２００６；４４２：  ３１２−６
【非特許文献１７】Ｋｌｏｓｅ  ＲＪ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ  ２００６；７：  ７１５−２７
【非特許文献１８】Ｈａｍａｍｏｔｏ  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２００４；６：  ７３１−４０
【非特許文献１９】Ｈａｍａｍｏｔｏ  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ  ２００６；９７：  １１３−８
【非特許文献２０】Ｋｕｎｉｚａｋｉ  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００７；６７：  １０７５９−６５
【非特許文献２１】Ｓｉｌｖａ  ＦＰ  ｅｔ  ａｌ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２００８；２７：  ２６８６−９２
【非特許文献２２】Ｔｓｕｇｅ  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２００５；３７：  １１０４−７
【非特許文献２３】Ｓｐａｒｍａｎｎ  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００６；６：  ８４６−５６
【非特許文献２４】Ｔａｋｅｓｈｉｔａ  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ２００５；１０２：  １２１７７−８２
【非特許文献２５】Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２００２；２７：  ３９６−４０２
【発明の概要】
【０００７】
本発明の目的は、がん、例えば急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌および腎細胞癌、特に膀胱癌および肺癌に対する新規な診断戦略および治療戦略を提供することである。
本発明は、ＪＡＲＩＤファミリーに属するＨ３Ｋ４デメチラーゼであるＪＡＲＩＤ１Ｂ（ｊｕｍｏｎｊｉ，  ＡＴ  ｒｉｃｈ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ  ｄｏｍａｉｎ  １Ｂ）遺伝子の発現レベルが、膀胱癌および肺癌を含む多くの種類のがんにおいて、正常組織と比較してアップレギュレートされているという発見に基づく。本発明者らはさらに、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子を標的とする低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）ががん性細胞の増殖に及ぼす影響についても検討し、そのようなｓｉＲＮＡががん性細胞の増殖を阻害する能力を有することを確認した。したがって本発明は、がんマーカーとしてのＪＡＲＩＤ１Ｂの使用、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子を標的とする二本鎖分子、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子を標的とするがんを診断または治療する方法、ならびにがんを治療するために有用な候補剤または候補化合物をスクリーニングする方法に関する。
【０００８】
本発明の１つの局面は、がんを診断するための方法であって、該方法は（ａ）対象由来の生物試料におけるＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の発現レベルを測定する段階、および（ｂ）該遺伝子の正常対照レベルと比較した、段階（ａ）で測定された発現レベルの増大を、がんの存在と関連付ける段階、を含む。本方法の１つの態様において、診断されるがんは、急性骨髄性白血病、膀胱癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌および腎細胞癌であり、より好ましくは膀胱癌および肺癌である。生物試料は、例えば、生検試料、喀痰、血液、リンパ液、胸水または尿などを対象から採取することによって調製することができる。
別の局面において、本発明は、がんマーカーとしてのＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子産物の使用を提供する。例えば、細胞、組織、血液または他の体液などの生物試料において、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子に由来するｍＲＮＡまたはポリペプチドが、非がん性試料と比較して過剰量で検出される場合、該生物試料にはがん性細胞が混入していると判定することができる。
【０００９】
本発明の別の局面は、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子を標的とする単離された二本鎖分子であって、該二本鎖分子はセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、該鎖は互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成し、該センス鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１または３０に対応する核酸配列を標的配列として含む。該二本鎖分子は、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子を過剰発現している可能性のあるがん性細胞に導入されると、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の発現だけでなく細胞増殖も阻害する。したがって該二本鎖分子は、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の過剰発現と関連するがんを治療するために有用でありうる。
いくつかの態様において、該二本鎖分子は約１９〜約２５ヌクレオチド長を有する。より好ましくは、該二本鎖分子は、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の３'末端のいずれかまたは両方に、数個のヌクレオチドからなる１つまたは２つの３'オーバーハングを有する。別の態様において、該二本鎖分子は、介在性の一本鎖核酸配列によって連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含む単一のポリヌクレオチドからなる。
本発明の二本鎖分子は、それをコードするベクターから、該ベクターを細胞に導入することによって産生させることができる。したがって、本発明はまた、該二本鎖分子をコードするベクター、ならびに単離された分子も範囲に含む。
本発明の単離された二本鎖分子およびベクターは、急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌および腎細胞癌、より好ましくは膀胱癌および肺癌を治療するのに適している。
【００１０】
本発明の別の局面は、がん細胞増殖を阻害するための方法、および同じく、がんを治療または予防するための方法である。本発明の方法は、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子を標的とする単離された二本鎖分子またはそれをコードするベクターを対象に投与する段階を含む。二本鎖分子はセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、該鎖は互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成し、該センス鎖はＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の核酸配列またはその断片に対応する核酸配列を含む。
いくつかの態様において、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の核酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の配列である。より好ましくは、該二本鎖分子は約１９〜約２５ヌクレオチド長を有する。より好ましくは、センス鎖および／またはアンチセンス鎖のいずれかまたは両方が、数個のヌクレオチドからなる３'オーバーハングを有する。より好ましくは、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子断片の核酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１または３０の核酸配列である。別の態様において、該二本鎖分子は、介在性の一本鎖によって連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含む単一のポリヌクレオチド分子からなる。
【００１１】
好ましくは、本方法は、急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌および腎細胞癌、より好ましくは膀胱癌および肺癌に対して適用することができる。
本発明の別の局面は、がん細胞増殖を阻害するための、およびがんを治療または予防するための、組成物である。本組成物は、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子を標的とする単離された二本鎖分子またはそれをコードするベクターを含む。該二本鎖分子はセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、該鎖は互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成し、該センス鎖は、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の核酸配列またはその断片に対応する核酸配列を含む。
いくつかの態様において、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の核酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の配列である。より好ましくは、該二本鎖分子は約１９〜約２５ヌクレオチド長を有する。より好ましくは、センス鎖および／またはアンチセンス鎖のいずれかまたは両方は、数個のヌクレオチドからなる３'オーバーハングを有する。より好ましくは、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子断片の核酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１または３０の核酸配列である。別の態様において、該二本鎖分子は、介在性の一本鎖によって連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含む単一のポリヌクレオチドからなる。
本組成物は、急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌および腎細胞癌、好ましくは膀胱癌および肺癌などのがんのリスクを有する対象に投与することにより、がんを治療するために用いることができる。
【００１２】
本発明の別の局面は、がん細胞増殖を阻害するための化合物をスクリーニングする方法である。該スクリーニング法によって同定された化合物は、がんを治療または予防するための候補化合物となりうる。そのような候補化合物は、急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌および腎細胞癌、好ましくは膀胱癌および肺癌を治療するのに適している可能性がある。
１つの態様において、本スクリーニング法は、（ａ）試験剤または試験化合物をＪＡＲＩＤ１Ｂポリペプチドと接触させる段階、（ｂ）該ポリペプチドと該試験剤または試験化合物との間の結合活性を検出する段階、および（ｃ）該ポリペプチドと結合する試験剤または試験化合物を候補剤または候補化合物として選択する段階を含む。
【００１３】
別の態様において、本スクリーニング法は、（ａ）試験剤または試験化合物をＪＡＲＩＤ１Ｂポリペプチドと接触させる段階、（ｂ）該ポリペプチドの生物活性を検出する段階、および（ｃ）試験剤または試験化合物の非存在下で検出される生物活性と比較して、該ポリペプチドまたは断片の生物活性を抑制する該試験剤または試験化合物を、候補剤または候補化合物として選択する段階を含む。本発明において、生物活性は、細胞増殖活性、アポトーシス誘導活性、およびヒストンＨ３脱メチル化活性の群から選択される。
別の態様において、本スクリーニング法は、（ａ）試験剤または試験化合物を、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子を発現している細胞と接触させる段階、（ｂ）ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の発現レベルを測定する段階、および（ｃ）試験剤または試験化合物の非存在下で検出される発現レベルと比較して、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の発現レベルを低下させる該試験剤または試験化合物を、候補剤または候補化合物として選択する段階を含む。ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の発現レベルは、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子からの転写産物または翻訳産物を測定することによって直接的に決定することもでき、下流遺伝子、Ｅ２Ｆ１およびＥ２Ｆ２などの下流遺伝子の発現レベルを測定することによって間接的に決定することもできる。
【００１４】
別の態様において、本スクリーニング法は、（ａ）試験剤または試験化合物を、ＪＡＲＩＤ１Ｂの転写調節領域および該転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子を含むベクターが導入された細胞と接触させる段階、（ｂ）該レポーター遺伝子の発現または活性を測定する段階、および（ｃ）試験剤または試験化合物の非存在下における発現レベルまたは活性レベルと比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性レベルを低下させる該試験剤または試験化合物を、候補剤または候補化合物として選択する段階を含む。
好ましくは、上記スクリーニング法によって選択された候補剤または候補化合物を、がん細胞と接触させること、および次にがん細胞増殖を阻害する候補剤または候補化合物を選択することにより、さらにスクリーニングする。本発明の１つまたは複数の局面はある目的を達成できるが、一方、１つまたは複数の他の局面は他の目的を達成できることが、当業者には理解されるであろう。各目的は、そのすべての点において、本発明のあらゆる局面に対して等しく適用されるわけではない。このように、前述の目的は、本発明のいずれか１つの局面に関して択一的に捉えることができる。本発明の上記および他の目的および特徴は、以下の詳細な説明を添付の図面および以下の実施例と併せて読むことにより、より十分に明らかになると考えられる。しかし、前記の本発明の概要および以下の詳細な説明はいずれも好ましい態様であり、本発明または本発明の他の代替的な態様を限定するものではないことが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ−Ｃ】図１は、英国人および日本人の患者の膀胱癌におけるＪＡＲＩＤ１Ｂ発現の上昇を表す。Ａは、正常膀胱組織および臨床病期別に分類した膀胱癌組織における、定量的リアルタイムＰＣＲを用いて測定したＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子発現レベルの散布図を示す。Ｂは、英国人症例での正常膀胱組織および腫瘍膀胱組織におけるＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子発現を表す。ＪＡＲＩＤ１Ｂの発現レベルを定量的リアルタイムＰＣＲによって分析し、結果を箱ひげ図（中央の５０％を四角で囲む）によって示す。相対的ｍＲＮＡ発現は、ＧＡＰＤＨおよびＳＤＨの発現によって正規化した値を示す。統計分析にはマン・ホイットニーのＵ検定を用いた。Ｃは、日本人患者における膀胱の正常組織と腫瘍組織との間の発現比を表す。各試料のシグナル強度はｃＤＮＡマイクロアレイによって分析されたものであり、発現比は腫瘍組織におけるシグナル強度を正常組織のそれによって除算したものである（１が正常）。
【図１Ｄ−Ｅ】Ｄは、日本人患者における正常膀胱組織と腫瘍膀胱組織の間でのＪＡＲＩＤ１Ｂ発現の比較を表す。各試料のシグナル強度をｃＤＮＡマイクロアレイによって分析し、結果を箱ひげ図（中央の５０％を四角で囲む）によって示す。統計分析にはマン・ホイットニーのＵ検定を用いた。Ｅは、膀胱組織におけるＪＡＲＩＤ１Ｂの免疫組織化学染色を表す。ＩｇＧの非特異的結合からまたは二次抗体からの偽陽性応答の可能性を除くために、非免疫マウスＩｇＧを一次抗体の代わりに用いた。対比染色はヘマトキシリンおよびエオジンによって行った。元の倍率は×４０および×４００。
【図２】図２は、ＪＡＲＩＤ１Ｂのタンパク質発現に関する標準的な免疫組織化学法によって染色した、さまざまな背景の膀胱腫瘍の組織マイクロアレイ画像を表す。対比染色はヘマトキシリンおよびエオジンによって行った。元の倍率は×１００、×２００、および×４００。
【図３Ａ−Ｂ】図３は、肺癌におけるＪＡＲＩＤ１Ｂ発現の上昇を表す。Ａは、正常肺組織と非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）組織の間での発現比を表す。各試料のシグナル強度はｃＤＮＡマイクロアレイによって分析されたものであり、発現比は腫瘍組織におけるシグナル強度を正常組織のそれによって除算したものである（１が正常）。Ｂは、正常肺組織と小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）組織の間での発現比を表す。各試料のシグナル強度はｃＤＮＡマイクロアレイによって分析されたものであり、発現比は腫瘍組織におけるシグナル強度を正常組織のそれによって除算したものである（１が正常）。
【図３Ｃ−Ｄ】Ｃは、正常肺組織と腫瘍肺組織の間でのＪＡＲＩＤ１Ｂ発現の比較を表す。各試料のシグナル強度をｃＤＮＡマイクロアレイによって分析し、結果を箱ひげ図によって示す（中央の５０％を四角で囲む）。統計分析にはマン・ホイットニーのＵ検定を用いた。Ｄは、肺組織におけるマウスモノクローナル抗ＪＡＲＩＤ１Ｂ抗体を用いた免疫組織化学染色像を表す。ＩｇＧの非特異的結合からまたは二次抗体からの偽陽性応答の可能性を確認するために、非免疫マウスＩｇＧを一次抗体の代わりに用いた。対比染色はヘマトキシリンおよびエオジンによって行った。元の倍率は×４０、および×４００。
【図４】図４は、ＪＡＲＩＤ１Ｂのタンパク質発現について標準的な免疫組織化学法によって染色したさまざまな背景を持つ肺腫瘍の組織マイクロアレイ画像を表す。各切片に関する臨床情報を組織像の上方に示す。対比染色はヘマトキシリンおよびエオジンによって行った。元の倍率は×１００、×２００、および×４００。
【図５】図５は、日本人群のＡＭＬ、子宮頸癌、ＣＭＬ、乳癌および腎細胞癌におけるＪＡＲＩＤ１Ｂ発現の上昇を表す。ＪＡＲＩＤ１Ｂの発現レベルを正常組織と腫瘍組織の間で比較した。各試料のシグナル強度をｃＤＮＡマイクロアレイによって分析し、結果を箱ひげ図（中央の５０％を四角で囲む）によって示す。統計分析にはマン・ホイットニーのＵ検定を用いた。
【図６】図６は、７．５μｇ／ｍｌのアフィジコリンを用いた２４時間の処理による細胞周期停止に供し、次にアフィジコリン除去から４時間後および１２時間後に抗ＪＡＲＩＤ１Ｂモノクローナル抗体（Ａｌｅｘａ５９４）、ファロイジン（Ｆ−アクチン、Ａｌｅｘａ４８８）および４'，６'−ジアミジン−２'−フェニルインドール二塩酸塩（ＤＡＰＩ）を用いて免疫細胞化学染色した、ＳＢＣ５細胞を表す。挿入図は、アフィジコリン処理から４時間後（上）および１２時間後（下）における細胞周期停止の同期的解除を実証するＦＡＣＳ分析を示す。
【図７Ａ−Ｅ】図７は、膀胱癌細胞および肺癌細胞の増殖におけるＪＡＲＩＤ１Ｂの関与を表す。Ａは、１２種の膀胱癌細胞株、４種の非小細胞肺癌細胞株および１種の小細胞肺癌細胞株におけるＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の発現パターンを表す。Ｂは、ＳＷ７８０細胞およびＡ５４９細胞におけるＪＡＲＩＤ１Ｂを標的とするｓｉＲＮＡ（ｓｉＪＡＲＩＤ１Ｂ＃１）によるＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の内在性発現の抑制を示す、定量的リアルタイムＰＣＲを表す。ＥＧＦＰを標的とするｓｉＲＮＡ（ｓｉＥＧＦＰ）を対照として用いた。３回の独立した実験の平均値±ＳＤを示した。Ｃは、膀胱癌細胞株（ＲＴ４、ＳＷ７８０およびＵＭＵＣ３）および肺癌細胞株（ＬＣ３１９、ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＡＩおよびＳＢＣ５）の生存率に対するＪＡＲＩＤ１Ｂ  ｓｉＲＮＡノックダウンの影響を表す。細胞生存率は３回調べた。３回の独立した実験の平均値±ＳＤ。Ｐ値はスチューデントのｔ検定を用いて算出した。Ｄは、対照ｓｉＲＮＡまたはＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ（ｓｉＪＡＲＩＤ１Ｂ＃１）による処理から７２時間後にＦＡＣＳによって分析した、ＳＢＣ５細胞のＤＮＡ含量を表す。Ｅは、細胞周期の状態毎に細胞を分類した、ＤにおけるＦＡＣＳの結果の数値解析を表す。サブＧ１期のがん細胞の割合は、対照ｓｉＲＮＡで処理したがん細胞と比較して、ｓｉＪＡＲＩＤ１Ｂ＃１による処理後の方が有意に高い。３回の独立した実験の平均値±ＳＤを示した。Ｐ値はスチューデントのｔ検定を用いて算出した。
【図７Ｆ−Ｇ】Ｆは、ＳＷ７８０細胞、Ａ５４９細胞およびＳＢＣ５細胞における２種類の異なるＪＡＲＩＤ１Ｂ特異的ｓｉＲＮＡ（ｓｉＪＡＲＩＤ１Ｂ＃１および＃２）による内在性ＪＡＲＩＤ１Ｂ発現の抑制を示す、定量的リアルタイムＰＣＲの結果を表す。ｓｉＥＧＦＰおよびｓｉＮＣを対照として用いた。ｍＲＮＡ発現レベルはＧＡＰＤＨおよびＳＤＨの発現によって正規化されたものであり、値はｓｉＥＧＦＰに対して相対的である（ｓｉＥＧＦＰ＝１）。３回の独立した実験の平均値±ＳＤを示した。Ｇは、膀胱癌細胞株（ＳＷ７８０およびＲＴ４）および肺癌細胞株（Ａ５４９、ＬＣ３１９およびＳＢＣ５）の生存率に対するＪＡＲＩＤ１Ｂ  ｓｉＲＮＡノックダウンの影響を表す。相対的細胞数は、ｓｉＥＧＦＰで処理した細胞に対して正規化した値を示す。３回の独立した実験の平均値±ＳＤを示した。Ｐ値はスチューデントのｔ検定を用いて算出した。
【図８】図８は、ＪＡＲＩＤ１Ｂ発現をノックダウンした後のＳＷ７８０およびＡ５４９のｍＲＮＡ発現プロファイルの、二次元の教師なし階層型クラスター分析を表す。差次的に発現している遺伝子をこの分析のために選択した。赤色はアップレギュレートされた遺伝子を示す（左の１列）；緑色はダウンレギュレートされた遺伝子を示す（右の２列）。
【図９】図９は、Ｅ２Ｆ１およびＥ２Ｆ２がＪＡＲＩＤ１Ｂの下流遺伝子であることの確認を表す。ＡおよびＢは、ＳＷ７８０細胞、Ａ５４９細胞およびＳＢＣ５細胞におけるＥ２Ｆ１（Ａ）およびＥ２Ｆ２（Ｂ）の発現レベルを表しており、これらはＪＡＲＩＤ１Ｂを標的とするｓｉＲＮＡ（ｓｉＪＡＲＩＤ１Ｂ＃１）またはＥＧＦＰ（対照）による処理後に定量的リアルタイムＰＣＲによって分析された。相対的ｍＲＮＡ発現は任意値であるが、各細胞群についての発現をＧＡＰＤＨおよびＳＤＨの発現に対して正規化した。統計分析は３回の独立した実験に基づいて行った。Ｐ値はスチューデントのｔ検定を用いて算出した。Ｃは、リアルタイムＰＣＲによって測定したＥ２Ｆ１およびＥ２Ｆ２の発現を表しており、非腫瘍性膀胱組織と比較して、膀胱腫瘍組織において有意にアップレギュレートされ、腫瘍組織におけるＪＡＲＩＤ１Ｂ発現に相関していた。１３種のがん組織および正常組織をそれぞれ分析し、統計分析にはマン・ホイットニーのＵ検定およびスピアマンの順位相関係数を用いた。Ｄは、Ｅ２Ｆの転写活性に対するＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子発現のｓｉＲＮＡノックダウンの影響を表す。このアッセイにはＣｉｇｎａｌ（商標）Ｅ２Ｆ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔを用いた。３回の独立した実験の平均値±ＳＤを示した。Ｐ値はスチューデントのｔ検定を用いて算出した。Ｅは、ＪＡＲＩＤ１Ｂ、Ｅ２Ｆ１およびＥ２Ｆ２の発現をタンパク質レベルで表す。ｓｉＪＡＲＩＤ１Ｂ＃１またはｓｉＪＡＲＩＤ１Ｂ＃２による処理後のＡ５４９細胞およびＳＢＣ５細胞由来の溶解物を、抗ＪＡＲＩＤ１Ｂ抗体、Ｅ２Ｆ１抗体、Ｅ２Ｆ２抗体およびアクチン抗体を用いてイムノブロットした。アクチンは内部対照として利用した。
【図１０】図１０は、ＪＡＲＩＤ１Ｂのタンパク質発現に関する標準的な免疫組織化学法によって染色した正常な心臓、腎臓および肝臓の画像を表す。対照染色は、二次抗体からの偽陽性応答の可能性を除くために一次抗体を用いずに行い、対比染色は、ヘマトキシリンおよびエオジンによって行った。元の倍率は×４０および×４００である。
【図１１】図１１は、Ａ５４９細胞におけるＪＡＲＩＤ１Ｂの細胞内局在を表す。Ａ５４９細胞。これらの細胞を、７．５μｇ／ｍｌのアフィジコリンを用いた２４時間の処理による細胞周期停止に供し、次に、アフィジコリン除去から０、４、８、１２および２４時間後に抗ＪＡＲＩＤ１Ｂモノクローナル抗体（Ａｌｅｘａ４８８［緑色］）、ファロイジン（Ｆ−アクチン、Ａｌｅｘａ５９４［赤色］）および４'，６'−ジアミジン−２'−フェニルインドール二塩酸塩（ＤＡＰＩ；青色）を用いて免疫細胞化学的に染色した。挿入図は、細胞周期停止の同期的解除を実証するＦＡＣＳ分析を示しており、矢印はＪＡＲＩＤ１Ｂの細胞質局在を示す。Ａ５４９細胞を４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ（−）で２０分間固定し、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むＰＢＳ（−）を室温で２分間用いて透過性にした。引き続いて、該細胞を、３％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ（−）を用いて室温で１時間覆って非特異的ハイブリダイゼーションを遮断し、その後、希釈比１：１００で希釈したマウス抗ＪＡＲＩＤ１Ｂ抗体（１Ｇ１０、Ａｂｎｏｖａ）とともにインキュベーションした。ＰＢＳ（−）で洗浄した後に、細胞を、１：１０００希釈したＡｌｅｘａ５９４結合抗マウス二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）によって染色した。核を、４'，６'−ジアミジン−２'−フェニルインドール二塩酸塩（ＤＡＰＩ）で対比染色した。蛍光画像をＴＣＳ  ＳＰ２  ＡＯＢＳ顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）下で得た。
【図１２】図１２は、ＳＢＣ５細胞におけるＪＡＲＩＤ１Ｂの細胞内局在を表す。ＳＢＣ５細胞を、７．５μｇ／ｍｌのアフィジコリンを用いた２４時間の処理による細胞周期停止に供し、次に、アフィジコリン除去から０、４、８、１２および２４時間後に、抗ＪＡＲＩＤ１Ｂモノクローナル抗体（Ａｌｅｘａ４８８［緑色］）、ファロイジン（Ｆ−アクチン、Ａｌｅｘａ５９４［赤色］）および４'，６'−ジアミジン−２'−フェニルインドール二塩酸塩（ＤＡＰＩ；青色）を用いて免疫細胞化学的に染色した。挿入図は、細胞周期停止の同期的解除を実証しているＦＡＣＳ分析を示しており、矢印はＪＡＲＩＤ１Ｂの細胞質局在を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
態様の説明
本明細書に記載されたものと類似または同等の方法および材料を本発明の態様の実施または試験に用いることができるが、ここでは例示的な方法および材料について説明する。しかし、本発明は規定の実験および最適化に応じて変更されうるので、本明細書に記載された特定の分子、組成物、方法論またはプロトコールに限定されないことが理解されるべきである。また、説明に用いられる専門用語は特定の型または態様を説明することのみを目的としており、添付の特許請求の範囲のみによって限定される本発明の範囲を限定することは意図していないことも理解されるべきである。
別に定義する場合を除き、本明細書で用いられる技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。しかし、矛盾する場合は、定義を含めて本明細書が優先する。したがって、本発明の文脈においては、以下の定義が適用される：
【００１７】
定義：
「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」という単語は、本明細書で用いる場合、別に特記する場合を除き、「少なくとも１つの」を意味する。
「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」という用語は、核酸残基のポリマーを指すのに本明細書において互換的に用いられ、かつ、別に特記する場合を除き、それらの一般に認められている一文字記号で呼ばれる。これらの用語は、１つまたは複数の核酸がエステル結合によって連結された核酸（ヌクレオチド）ポリマーに、適用される。核酸ポリマーはＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの組み合わせで構成されてよく、天然および非天然の核酸ポリマー両方を包含する。
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すのに本明細書において互換的に用いられる。これらの用語は、天然アミノ酸ポリマーならびに、１つまたは複数のアミノ酸残基が修飾残基または非天然残基、例えば対応する天然アミノ酸の人工の化学的模倣物である、アミノ酸ポリマーにも適用される。
別に定義する場合を除き、「がん」という用語は、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子を過剰発現しているがんを指す。ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子を過剰発現しているがんの例には、急性骨髄性白血病、膀胱癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌および腎細胞癌、より好ましくは膀胱癌および肺癌が非限定的に含まれる。
【００１８】
ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子：
ＪＡＲＩＤ１Ｂは、Ｐｌｕ１とも呼ばれ、ヒトにおいてパラロガスなＪＡＲＩＤ−ファミリー遺伝子の１つによってコードされる（Kortschak RD et al. Trends Biochem Sci 2000;25: 294-9、Wilsker D. et al. Genomics 2005;86: 242-51）。これは、ＪｍｊＣドメインに加えて、ＪｍｊＮドメイン、Ｂｒｉｇｈｔ／Ａｒｉｄドメイン、Ｃ５Ｈ２Ｃジンクフィンガー、およびいくつかのＰＨＤドメインを含む、転写調節因子に共通する他のドメインも含む。ＪＡＲＩＤファミリーの４つのメンバーはすべて、Ｈ３Ｋ４デメチラーゼ活性を有する（Christensen J. et al. Cell 2007;128: 1063-76、Iwase S. et al. Cell 2007;128: 1077-88, Klose RJ et al. Cell 2007;128: 889-900、Lee MG et al. Cell 2007;128: 877-87、Yamane K. et al. Mol Cell 2007;25: 801-12）。機能的に重複している可能性はあるものの、各メンバーは、異なる染色体領域への動員および異なる酵素活性を通じて、異なる生物学的プロセスに関与するようである（Klose RJ et al. Nat Rev Genet 2006;7: 715-27）。
ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の例示的な核酸配列およびポリペプチド配列がそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および２に示されているが、これらに限定されるわけではない。
さらに、配列データを、例えば、それぞれアクセッション番号ＮＭ＿００６６１８およびＮＰ＿００６６０９を介して入手することもできる。
【００１９】
本発明の１つの局面によれば、機能的等価物も「ＪＡＲＩＤ１Ｂポリペプチド」であるとみなされる。本明細書において、ＪＡＲＩＤ１Ｂタンパク質の「機能的等価物」とは、ＪＡＲＩＤ１Ｂタンパク質と同等の生物活性を有するポリペプチドのことである。すなわち、ＪＡＲＩＤ１Ｂタンパク質の生物学的能力を保持する任意のポリペプチドを、本発明においてそのような機能的等価物として用いることができる。例えば、機能的等価物には、ＪＡＲＩＤ１Ｂタンパク質と類似した細胞増殖活性、抗アポトーシス活性、デメチラーゼ活性、またはＥ２Ｆ１発現およびＥ２Ｆ２発現の促進活性を有するポリペプチドが含まれる。
一般的に、タンパク質中の１つまたは複数のアミノ酸の改変は、該タンパク質の機能に影響しないことが知られている。実際、変異タンパク質または改変タンパク質、すなわち特定のアミノ酸配列のアミノ酸残基の１つもしくは複数の置換、欠失、挿入、および／もしくは付加によって改変されたアミノ酸配列を有するタンパク質は、元の生物活性を保持することが知られている（Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 81: 5662-6 (1984)；Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 10:6487-500 (1982)；Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 79: 6409-13 (1982)）。したがって当業者は、単一のアミノ酸もしくはわずかな割合のアミノ酸を変更する、アミノ酸配列に対する個々の付加、欠失、挿入、もしくは置換、またはタンパク質の変化により類似の機能を有するタンパク質がもたらされる「保存的改変」であるとみなされるものが、本発明の文脈において許容されることを認識するであろう。
【００２０】
ＪＡＲＩＤ１Ｂタンパク質の活性が維持されている限り、アミノ酸変異の数は特に限定されない。しかしながら、アミノ酸配列の２０％またはそれ未満、より好ましくはアミノ酸配列の１０％またはそれ未満、より好ましくはアミノ酸配列の５％またはそれ未満を変更することが一般的に好ましい。したがって、好ましい態様において、このような変異体において変異させるアミノ酸の数は一般的に、３０アミノ酸またはそれ未満、好ましくは２０アミノ酸またはそれ未満、より好ましくは１０アミノ酸またはそれ未満、より好ましくは６アミノ酸またはそれ未満、およびさらにより好ましくは３アミノ酸またはそれ未満である。
【００２１】
「保存的改変」という語句は、変異されるアミノ酸残基が、アミノ酸側鎖の特性が保存された別のアミノ酸に好ましくは変異される改変を指す。アミノ酸側鎖の特性の例は、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、および共通して以下の官能基または特徴を有する側鎖である：脂肪族側鎖（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）；ヒドロキシル基を含有する側鎖（Ｓ、Ｔ、Ｙ）；硫黄原子を含有する側鎖（Ｃ、Ｍ）；カルボン酸およびアミドを含有する側鎖（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）；塩基を含有する側鎖（Ｒ、Ｋ、Ｈ）；および芳香族を含有する側鎖（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）。機能的に類似したアミノ酸を規定する保存的置換表は当技術分野で周知である。例えば、以下の８つの群はそれぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Creighton, Proteins 1984を参照されたい）。
このように保存的に修飾されたポリペプチドが本発明のタンパク質に含まれる。しかしながら、本発明はこれらに限定されず、タンパク質は、少なくともＪＡＲＩＤ１Ｂタンパク質の生物活性が保持されている限り、非保存的修飾を含む。さらに、修飾タンパク質は、多型変異体、種間ホモログ、およびこれらのタンパク質の対立遺伝子によりコードされるものも含む。
【００２２】
本発明のポリペプチドは、これを産生させるために用いた細胞もしくは宿主または使用した精製法に応じて、アミノ酸配列、分子量、等電点、糖鎖の有無、または形態に差異を有しうる。しかしながらこれは、ＪＡＲＩＤ１Ｂタンパク質と同等の機能を有する限り、本発明の範囲内に含まれる。
【００２３】
他の態様において、本発明のポリペプチドは、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の天然ヌクレオチド配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされることができる。「ストリンジェントな条件」という語句は、典型的には核酸の複雑な混合物中で、核酸分子がその標的配列とはハイブリダイズするが、他の配列とは検出可能な程度にハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、異なる状況下では異なる。配列が長いほど、より高温で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範な手引きは、Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes, 「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays」(1993)において見出される。一般的に、ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度  ｐＨにおける特定の配列の融解温度（Ｔｍ）よりも約５〜１０℃低くなるように選択される。Ｔｍとは、（所定のイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度のもとで）標的配列に相補的なプローブの５０％が平衡状態で該標的配列とハイブリダイズする温度である（Ｔｍにおいて標的配列が過剰に存在する場合、プローブの５０％が平衡状態で占められる）。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によって達成してもよい。選択的または特異的ハイブリダイゼーションに関して、陽性シグナルはバックグラウンドの少なくとも２倍、好ましくはバックグラウンドハイブリダイゼーションの１０倍である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例には、以下のものが含まれる：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％ＳＤＳ、４２℃でのインキュベーション、または、５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃でのインキュベーション、ならびに０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ、５０℃での洗浄。
【００２４】
本発明の文脈において、ＪＡＲＩＤ１Ｂタンパク質と機能的に等価なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離するためのハイブリダイゼーションの条件は、当業者によって規定通り選択され得る。例えば、「Ｒａｐｉｄ−ｈｙｂ緩衝液」（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＬＩＦＥ  ＳＣＩＥＮＣＥ）を用いて６８℃で３０分間またはそれ以上プレハイブリダイゼーションを行い、標識プローブを添加し、６８℃で１時間またはそれ以上加温することにより、ハイブリダイゼーションを行うことができる。それに続く洗浄工程は、例えば低ストリンジェント条件下で行い得る。例示的な低ストリンジェント条件には、４２℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳが含まれ得る。高ストリンジェント条件の使用が好ましいことが多い。例示的な高ストリンジェント条件には、２×ＳＳＣ、０．０１％ＳＤＳにおける室温で２０分間の洗浄を３回行った後に、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおける３７℃で２０分間の洗浄を３回行い、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおける５０℃で２０分間の洗浄を２回行うことが含まれ得る。しかしながら、温度および塩濃度などのいくつかの要素がハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与え得るため、当業者は必要なストリンジェンシーを達成するためにこれらの要素を適切に選択することができる。
【００２５】
さらに、本発明の遺伝子は、タンパク質のそのような機能的等価物をコードするポリヌクレオチドを包含する。上記の配列情報に基づき合成されたプライマーを用いて、ＪＡＲＩＤ１Ｂタンパク質と機能的に等価なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離するために、ハイブリダイゼーションに加え、遺伝子増幅法、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を利用することができる。
ヒトの遺伝子およびタンパク質とそれぞれ機能的に等価なポリヌクレオチドおよびポリペプチドは通常、元のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に対して高い相同性（「配列同一性」とも称される）を有する。「高い相同性」（または高い配列同一性）とは典型的に、４０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％、９３％、９５％、９７％、またはそれ以上の相同性を指す。特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの相同性は、「Wilbur and Lipman, Proc Natl Acad Sci USA 80: 726-30 (1983)」のアルゴリズムに従って決定することができる。
【００２６】
がんマーカーとしてのＪＡＲＩＤ１Ｂの使用：
ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の発現は、表３に示されたようなさまざまな種類のがん組織において特異的に上昇していることが見出された。したがって、ＪＡＲＩＤ１Ｂはさまざまな種類のがんにおけるがんマーカーとして有用である。最近、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子は乳癌および前立腺癌において過剰発現することが報告された（Yamane K. et al. Mol Cell 2007;25: 801-12、Xiang Y. et al. Proc Natl Acad Sci Ｕ S A 2007;104: 19226-31）。しかし、１つの種類のがんにおける遺伝子発現プロファイルは一般に他の種類のがんのものとは異なるため、ＪＡＲＩＤ１Ｂが他のがんのがんマーカーとして有用であるか否かは不明であった。急性骨髄性白血病、膀胱癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌および腎細胞癌におけるＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の過剰発現を明らかにしたのは本発明が初めてである。したがって本発明は、そのようながんにおけるがんマーカーとしてのＪＡＲＩＤ１Ｂの使用を提供する。
本発明によれば、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の過剰発現を検出することにより、生物試料ががん性細胞を含み、その結果がん性細胞由来の産物を含むと判定することができる。すなわち、本発明は、生物試料にがん性細胞またはがん性産物が混入しているか否かを判定するための方法を提供し、該方法は、該生物試料におけるＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の発現レベルを定量する段階、および該発現レベルを、がんを有さないことが判明している非がん性試料における発現レベルと比較する段階を含む。
【００２７】
本明細書で用いる場合、「生物試料」という用語は、生物体全体、または、その組織、細胞もしくは構成部分（例えば、血液、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、唾液、羊水、羊膜臍帯血（ａｍｎｉｏｔｉｃ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ）、尿、膣液、および精液を非限定的に含む体液）のサブセットを指す。「生物試料」とはさらに、生物体全体、またはその細胞、組織もしくは構成部分のサブセット、またはそれらの画分もしくは部分から調製された、ホモジネート、溶解物、抽出物、細胞培養物または組織培養物も指す。さらに、「生物試料」とは、タンパク質またはポリヌクレオチドなどの細胞成分を含む、生物体を増殖させた栄養ブロスまたはゲルなどの培地も指す。
例示的な生物試料には、血液、喀痰、胸水または尿などの生検標本、体組織および体液が非限定的に含まれる。好ましくは生物試料は、上皮細胞、より好ましくはがん性であると疑われる組織に由来する上皮細胞を含む、細胞群を含む。さらに、必要に応じて、得られた体組織および体液から細胞を精製した後、生物試料として用いてもよい。しかしながら、目的となるＪＡＲＩＤ１Ｂの転写産物または翻訳産物を含む限り、いかなる生物材料も判定のための生物試料として用いることができる。
【００２８】
例えば、本発明によれば、急性骨髄性白血病、膀胱癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌および腎細胞癌を含むがんを診断することができる。または、本発明は、生物試料におけるこれらのがんのがん細胞を検出するための方法も提供する。これらのがんを診断するため、またはがん細胞を検出するために、診断または検出される対象から採取した以下の臓器に由来する生物試料を、生物試料として用いることができる：
リンパ球、またはリンパ球を含む血液試料：急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、
膀胱：膀胱癌、
子宮頸部：子宮頸癌、
肺：肺癌、および
腎臓：腎細胞癌。
ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の発現レベルは、当技術分野において公知の方法を用いてＪＡＲＩＤ１ＢのｍＲＮＡ、タンパク質または活性を検出することによって定量することができる。これらの方法の詳細は、「がんを診断するための方法」で後述される。
本方法は、生物材料の利用、がん診断、がん治療法などに対する有用な情報を提供することができる。
【００２９】
がんを診断するための方法：
本発明はまた、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の発現レベルを利用する、がん細胞を検出するためまたはがんを診断するための方法も提供する。本方法は、急性骨髄性白血病、膀胱癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌および腎細胞癌を診断するのに適している。
本発明に従って、対象の状態を試験するための中間的な結果が与えられ得る。対象が疾患を患っていると、医師、看護師、または他の実施者が診断するのを補助するために、そのような中間的な結果をさらなる情報と組み合わせてもよい。代替的に本発明は、対象由来の生物試料においてがん性細胞を検出するため、および対象が疾患を患っていると診断するのに有用な情報を医師に与えるために、使用され得る。
あるいは本発明は、対象由来の生物試料中のがん細胞を検出または同定するための方法を提供し、該方法は、対象由来の生物試料中のＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の発現レベルを測定する段階を含み、該遺伝子の正常対照レベルと比較して該発現レベルが上昇していることにより、組織中にがん細胞が存在することまたはその疑いがあることが示される。
【００３０】
対象が疾患に罹患していると診断する際の医師、看護師、または他の医療従事者を支援するために、このような結果を付加的な情報と組み合わせることができる。換言すれば、本発明は、対象が疾患に罹患していると診断するのに有用な情報を医師に提供し得る。例えば本発明によると、対象から得られた組織中にがん細胞の存在が疑われる場合には、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の発現レベルに加えて、組織病理学、公知の血中腫瘍マーカーのレベル、および対象の臨床経過等を含む疾患の様々な局面を考慮することによって、医療従事者は臨床判断を下すことができる。例えば、急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌、または腎細胞癌の周知の血中診断マーカーの一部は以下である。
急性骨髄性白血病；ＷＴ１
膀胱癌；ＳＣＣ、ＴＰＡ、またはＩＡＰ
乳癌；ＢＣＡ２２５、ＴＰＡ、ＣＥＡ、ＩＡＰ、またはＣＡ１５−３
慢性骨髄性白血病；ＢＣＲ−ＡＢＬ
子宮頸癌；ＳＣＣ、ＴＰＡ、またはＣＡ１２５
肺癌；ＡＰ、ＡＣＴ、ＢＦＰ、ＣＡ１９−９、ＣＡ５０、ＣＡ７２−４、ＣＡ１３０、ＣＥＡ、ＫＭＯ−１、ＮＳＥ、ＳＣＣ、ＳＰ１、Ｓｐａｎ−１、ＴＰＡ、ＣＳＬＥＸ、ＳＬＸ、ＳＴＮ、およびＣＹＦＲＡ
前立腺癌；ＰＳＡ、またはＰＡＰ
腎細胞癌；ＩＡＰ
【００３１】
すなわち、本発明のこの特定の態様において、遺伝子発現解析の結果は、対象の疾患状態をさらに診断するための中間的な結果として役立つ。
別の態様において、本発明は、がんの診断マーカーを検出するための方法を提供し、該方法は、急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌、または腎細胞癌の診断マーカーとして、対象由来の生物試料中のＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の発現を検出する段階を含む。
本方法は、
（ａ）対象由来の生物試料において、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の発現レベルを測定する段階；および
（ｂ）該遺伝子の正常対照レベルと比較した、段階（ａ)で測定した発現レベルの増大を、がん性細胞の存在と関連付ける段階
を含む。
本方法によって診断される対象は好ましくは哺乳動物である。例示的な哺乳動物には例えば、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマおよびウシが非限定的に含まれる。
【００３２】
本発明に従って、対象由来の生物試料におけるＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の発現レベルが測定される。発現レベルは、当技術分野で既知の方法を用いて、転写産物レベルとして測定することができる。例えば、ＪＡＲＩＤ１ＢのｍＲＮＡを、プローブを用いて、ハイブリダイゼーション法（例えばノーザンハイブリダイゼーション）によって定量してもよい。検出は、チップまたはアレイ上で実施してもよい。ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子を含む複数の遺伝子（例えば様々ながん特異的遺伝子）の発現レベルの検出に関しては、アレイの使用が好ましい。当業者は、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の配列情報を利用して、そのようなプローブを調製することができる。そのような配列情報は、ウェブ上の配列データベース、例えばＧｅｎｅＢａｎｋ（商標）より得ることができるが、これに限定されるわけではない。例えば、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の例示的な配列は、これに限定されるわけではないが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００６６１８）に示されている。プローブは通常、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子配列の少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個のヌクレオチドを含む。ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子のこれらの断片に加えて、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子のｃＤＮＡをプローブとして使用してもよい。必要に応じて、色素、蛍光、および同位元素などの適切な標識でプローブを標識してもよく、該遺伝子の発現レベルを、ハイブリダイズした標識の強度として検出してもよい。
【００３３】
さらに、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の転写産物を、プライマーを用いて増幅に基づく検出法（例えばＲＴ−ＰＣＲ）によって定量してもよい。そのようなプライマーは、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の配列情報に基づいて調製することもできる。例えば、実施例で使用されるプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、８、９、および１０）は、ＲＴ−ＰＣＲまたはノーザンブロット分析による検出に用いられ得るが、本発明はこれらに限定されるわけではない。
具体的には、本発明の方法に用いられるプローブまたはプライマーは、ストリンジェントな条件下、中程度にストリンジェントな条件下、または低ストリンジェントな条件下で、ＪＡＲＩＤ１ＢのｍＲＮＡとハイブリダイズする。本明細書で用いる「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」という語句は、プローブまたはプライマーがその標的配列とはハイブリダイズするが、他の配列とはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、様々な状況下で異なる。より長い配列の特異的ハイブリダイゼーションは、より短い配列よりも高温で観察される。一般に、ストリンジェントな条件の温度は、所定のイオン強度およびｐＨにおける特定の配列の熱融解温度（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。Ｔｍとは、（所定のイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度のもとで）標的配列に相補的なプローブの５０％が平衡状態で該標的配列とハイブリダイズする温度である。Ｔｍにおいて標的配列は一般に過剰に存在するため、プローブの５０％が平衡状態で占められる。典型的には、ストリンジェントな条件とは、ｐＨ  ７．０〜８．３において塩濃度がナトリウムイオン約１．０  Ｍ未満、典型的にはナトリウムイオン（または他の塩）約０．０１〜１．０  Ｍであり、かつ温度が、短いプローブまたはプライマー（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）に関しては少なくとも約３０℃、およびより長いプローブまたはプライマーに関しては少なくとも約６０℃である条件である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によって達成してもよい。
【００３４】
あるいは、本発明の診断のために翻訳産物を検出してもよい。例えば、ＪＡＲＩＤ１Ｂタンパク質の量を測定してもよい。翻訳産物としてのタンパク質の量を測定するための方法には、該タンパク質を特異的に認識する抗体を使用するイムノアッセイ法が含まれる。抗体はモノクローナルでもポリクローナルでもよい。さらに、ＪＡＲＩＤ１Ｂタンパク質との結合能を保持している限り、抗体の任意の断片または変異体（例えばキメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ等）を検出に使用することができる。該タンパク質の検出のためにこれらの種類の抗体を調製する方法が当技術分野で周知であり、そのような抗体およびその等価物を調製するために本発明において任意の方法を利用することができる。
【００３５】
ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の発現レベルをその翻訳産物に基づいて検出するための別の方法として、ＪＡＲＩＤ１Ｂタンパク質に対する抗体を用いる免疫組織化学解析によって、染色強度を観察してもよい。即ち、強い染色が観察されることは、タンパク質の存在量の増大を示すと同時に、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の高い発現レベルを示す。
さらに、ヒストン脱メチル化などのＪＡＲＩＤ１Ｂタンパク質の生物活性を測定することによって、ＪＡＲＩＤ１Ｂタンパク質の量を決定することができる。上記の通り、ＪＡＲＩＤ１Ｂは、ヒストンＨ３リシン４のメチル基を特異的に除去しうるリシンデメチラーゼファミリーの１つとして特徴づけされている（Yamane K. et al. Mol Cell 2007;25: 801-12）。このため、ヒストン脱メチル化活性は、その生物活性に基づくＪＡＲＩＤ１Ｂタンパク質の定量のために有用である。ヒストン脱メチル化レベルは、当技術分野で周知の方法によって決定することができる。ＪＡＲＩＤ１Ｂタンパク質の定量のためにヒストン脱メチル化活性を利用する場合には、対象の組織または細胞から調製したホモジネート、溶解物または抽出物を生物試料として用いることが好ましいが、これらに限定されるわけではない。生物試料をメチル化ヒストンとともにインキュベーションした後、例えばヒストン脱メチル化に起因するホルムアルデヒドもしくは過酸化水素の放出を検出することによって、またはメチル化ヒストンに対する抗体を用いて残留メチル化ヒストンを検出することによって、脱メチル化レベルを推定する。ヒストン脱メチル化アッセイのために、ＥｐｉＱｕｉｋ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｈｉｓｔｏｎｅ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｅｐｉｇｅｎｔｅｋ  Ｇｒｏｕｐ  Ｉｎｃ．）などのいくつかの市販の製品を利用してもよい。
【００３６】
または、ＪＡＲＩＤ１Ｂタンパク質の生物活性として、細胞増殖活性を利用してもよい。本発明によれば、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の発現の阻害は、膀胱癌細胞および肺癌細胞における細胞増殖につながり、したがって、ＪＡＲＩＤ１Ｂタンパク質は細胞増殖を促進すると推測される。ＪＡＲＩＤ１Ｂタンパク質の細胞増殖活性を決定するために、生物試料の存在下で細胞を培養した後、増殖速度を検出することにより、または細胞周期もしくはコロニー形成能を測定することにより、該生物試料の細胞増殖活性を決定することができる。
さらに、診断の精度を向上させるために、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の発現レベルに加えて、他のがん関連遺伝子、例えばがんにおいて差次的に発現されることが知られている遺伝子の発現レベルを測定してもよい。生物試料におけるＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の発現レベルの増大は、対照レベルとの比較によって検出することができる。
【００３７】
疾患状態（がん性または非がん性）が既知である対象（複数可）から以前に採取して保存していた試料（複数可）を使用することによって、試験される生物試料と同時に対照レベルを決定してもよい。代替的に、疾患状態が既知である対象の試料において以前に測定されたＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の発現レベル（複数可）を解析することによって得られた結果に基づき、統計学的方法によって対照レベルを決定してもよい。さらに対照レベルは、以前に試験された細胞由来の発現パターンのデータベースであることもできる。さらに、本発明の一局面によれば、生物試料におけるＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の発現レベルを、複数の参照試料から決定した複数の対照レベルと比較することができる。患者由来の生物試料の組織型と類似した組織型に由来する参照試料から決定した対照レベルを用いることが好ましい。さらに、疾患状態が既知である群におけるＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の発現レベルの標準値を用いることが好ましい。標準値は、当技術分野で既知の任意の方法によって得ることができる。例えば、平均±２Ｓ．Ｄ．または平均±３Ｓ．Ｄ．の範囲を標準値として使用することができる。
本発明の文脈において、がん性でないことが既知である生物試料から決定した対照レベルは「正常対照レベル」と称する。他方で、がん性生物試料から決定した場合、対照レベルは「がん性対照レベル」と称する。
ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の発現レベルが正常対照レベルに比べて増大しているか、またはがん性対照レベルと類似している場合、生物試料はがん性細胞を含む可能性があり、これは、対象ががんを患っているかまたはその発症リスクを有し得ることを示す。
【００３８】
試験される生物試料の発現レベルと対照レベルとの間の相違を、細胞のがん性状態または非がん性状態に応じて発現レベルが変わらない対照遺伝子、例えばハウスキーピング遺伝子の発現レベルに対して、正規化することができる。例示的な対照遺伝子には、βアクチン、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼおよびリボソームタンパク質Ｐ１が、非限定的に含まれる。
生物試料における発現レベルは、正常対照レベルよりも、例えば１０％、２５％、もしくは５０％増大していれば；または１．１倍超、１．５倍超、２．０倍超、３．０倍超、５．０倍超、１０．０倍超、もしくはそれ以上増大していれば、増大したとみなすことができる。一方、生物試料における発現レベルは、がん性対照レベルとの相違が１０％以内、２５％以内、または５０％以内であれば、増大したとみなすことができる。
【００３９】
がんを検出するためのキット：
本発明は、急性骨髄性白血病、膀胱癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌および腎細胞癌などのがんを検出するためのキットを提供する。本試薬は生物試料におけるがん性細胞を検出するために用いることができ、がんの診断のために有用でありうる。
具体的には、本試薬は生物試料におけるＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の発現を検出することができ、該試薬は以下の群より選択されうる：
（ａ）ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子のｍＲＮＡを検出するための試薬；および
（ｂ）ＪＡＲＩＤ１Ｂタンパク質を検出するための試薬。
（ｃ）ＪＡＲＩＤ１Ｂタンパク質の生物活性を検出するための試薬。
ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子のｍＲＮＡの検出に適した試薬には、ＪＡＲＩＤ１Ｂ  ｍＲＮＡと特異的に結合するかそれを同定するオリゴヌクレオチド、例えばＪＡＲＩＤ１Ｂ  ｍＲＮＡの一部に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。これらの種類のオリゴヌクレオチドは、ＪＡＲＩＤ１Ｂ  ｍＲＮＡに特異的なプライマーおよびプローブによって例示される。これらの種類のオリゴヌクレオチドは、例えば「がんを診断するための方法」に記載されたような当技術分野で周知の方法に基づいて調製することができる。必要に応じて、ＪＡＲＩＤ１Ｂ  ｍＲＮＡを検出するための試薬を固体マトリックス上に固定化してもよい。
【００４０】
一方、ＪＡＲＩＤ１Ｂタンパク質の検出に適した試薬には、ＪＡＲＩＤ１Ｂタンパク質に対する抗体が含まれる。抗体はモノクローナルでもポリクローナルでもよい。さらに、ＪＡＲＩＤ１Ｂタンパク質に対する結合能を保持している限り、抗体の任意の断片または変異体（例えば、キメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖなど）も試薬として用いることができる。ＪＡＲＩＤ１Ｂタンパク質の検出のためのこれらの種類の抗体を調製する方法は当技術分野において周知であり、かつ本発明において、そのような抗体およびそれらの等価物を調製するためにいかなる方法を用いてもよい。さらに、直接的な連結または間接的な標識技術を介して、抗体をシグナル生成分子で標識してもよい。標識、ならびに、抗体を標識するための方法、およびその標的に対する抗体の結合を検出するための方法は当技術分野において周知であり、任意の標識および方法を本発明のために用いることができる。必要に応じて、ＪＡＲＩＤ１Ｂタンパク質を検出するための試薬を固体マトリックス上に固定化してもよい。
さらに、ＪＡＲＩＤ１Ｂタンパク質を、ＪＡＲＩＤ１Ｂタンパク質の生物活性として検出することができる。ヒストン脱メチル化活性および細胞増殖活性は、ＪＡＲＩＤ１Ｂタンパク質の例示的な生物活性である。生物試料におけるヒストン脱メチル化活性は、メチル化ヒストンを該生物試料とともにインキュベーションした後に、メチル化ヒストンに対する抗体を用いて残留メチル化ヒストンを検出することによって、決定することができる。したがって、本キットはメチル化ヒストンおよび抗メチル化ヒストン抗体を含んでもよい。さもなくば本キットは、ヒストン脱メチル化によって放出されたホルムアルデヒドを検出するための、標識されたメチル基を有するメチル化ヒストンを含んでもよい。一方、生物試料における細胞増殖活性は、生物試料の存在下で細胞を培養した後、増殖速度を検出することによって、または細胞周期もしくはコロニー形成能を測定することによって、決定することができる。したがって、本キットは、細胞の培養のための培地および容器を含むことができる。
【００４１】
本キットは、前述の試薬を二種類以上含んでもよい。本キットは、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子に対するプローブまたはＪＡＲＩＤ１Ｂに対する抗体を結合させるための固体マトリックスおよび試薬、細胞を培養するための培地および容器、陽性および陰性の対照試薬、ならびに、ＪＡＲＩＤ１Ｂタンパク質に対する抗体を検出するための二次抗体を含んでもよい。本発明のキットはさらに、緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、シリンジおよび、使用説明書を載せた添付文書（例えば、書面、テープ、ＣＤ−ＲＯＭなど）を含む、商業的な観点および利用者の観点から望まれる他の材料を含んでもよい。これらの試薬などは、ラベルを付けた容器中に含めることができる。適した容器には、瓶、バイアルおよび試験管が含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの種々の材料から形成されてよい。
本発明の１つの態様として、試薬がＪＡＲＩＤ１Ｂ  ｍＲＮＡに対するプローブである場合には、少なくとも１つの検出部位を形成するために、該試薬を多孔質ストリップなどの固体マトリックス上に固定化してもよい。多孔質ストリップの測定領域または検出領域は、それぞれがオリゴヌクレオチド（プローブ）を含む複数の部位を含んでもよい。試験ストリップはまた、陰性対照および／または陽性対照用の部位を含んでもよい。あるいは、対照部位を、試験ストリップから隔てられたストリップ上に配置してもよい。任意で、異なる検出部位は異なる量の固定化オリゴヌクレオチドを含んでもよい、すなわち、第１の検出部位ではより多い量であり、以降の部位ではそれより少ない量である。試験試料を添加すると、検出可能なシグナルを提示する部位の数により、試料中に存在するＪＡＲＩＤ１Ｂ  ｍＲＮＡ量の定量的指標が得られる。検出部位は好適に検出可能な任意の形状で構成することができ、典型的には、試験ストリップの幅全体にわたるバーまたはドットの形状である。
【００４２】
本発明のキットはさらに、陽性対照試料またはＪＡＲＩＤ１Ｂ標準試料を含んでもよい。本発明の陽性対照試料は、急性骨髄性白血病、膀胱癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌および腎細胞癌に由来する細胞などのｊＡＲＩＤ１Ｂ陽性試料を採取した後、それらのＪＡＲＩＤ１Ｂレベルを分析することによって、調製され得る。あるいは、精製されたＪＡＲＩＤ１Ｂタンパク質またはＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子を細胞にトランスフェクトして、陽性試料またはＪＡＲＩＤ１Ｂの標準物質を形成させてもよい。
別の態様において、本発明のキットはさらに陰性対照試料を含んでもよい。本発明の陰性対照試料は、非がん性細胞などの、ＪＡＲＩＤ１Ｂを発現しない細胞または組織である。
【００４３】
二本鎖分子：
本明細書で用いる場合、「単離された二本鎖分子」という用語は、標的遺伝子の発現を阻害する核酸分子を指し、これには例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ；例えば、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）または低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））および低分子干渉ＤＮＡ／ＲＮＡ（ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡ；例えば、ＤＮＡとＲＮＡの二本鎖キメラ（ｄｓＤ／Ｒ−ＮＡ）またはＤＮＡとＲＮＡの低分子ヘアピンキメラ（ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ））が含まれる。
本明細書で用いる場合、標的配列のセンス鎖とは、ある遺伝子のｍＲＮＡ配列またはｃＤＮＡ配列の内部のヌクレオチド配列であり、これは本発明の二本鎖核酸分子が該遺伝子を発現している細胞内に導入された場合にそのｍＲＮＡ全体の翻訳の抑制をもたらしうる。遺伝子のｍＲＮＡ配列またはｃＤＮＡ配列の内部のヌクレオチド配列は、標的配列に対応する配列を含む二本鎖ポリヌクレオチドが、該遺伝子を発現している細胞において該遺伝子の発現を阻害する場合、該標的配列であると判定され得る。遺伝子発現を抑制する二本鎖ポリヌクレオチドは、標的配列と２〜５ヌクレオチド長を有する３'オーバーハング（例えば、ｕｕ）とからなってよい。
本明細書で使用される「ｓｉＲＮＡ」という用語は、標的ｍＲＮＡの翻訳を妨害する二本鎖ＲＮＡ分子を指す。ＲＮＡが転写される鋳型をＤＮＡとした技術を含む、ｓｉＲＮＡを細胞に導入する標準的な技術を用いる。ｓｉＲＮＡには、標的遺伝子のセンス核酸配列の一部（「センス鎖」とも称される）、標的遺伝子のアンチセンス核酸配列の一部（「アンチセンス鎖」とも称される）、またはその両方が含まれる。単一転写産物が、標的遺伝子のセンス核酸配列と相補的なアンチセンス核酸配列との両方、例えばヘアピンを有するように、ｓｉＲＮＡを構築してもよい。ｓｉＲＮＡはｄｓＲＮＡまたはｓｈＲＮＡのいずれかであり得る。
【００４４】
本明細書で使用される「ｄｓＲＮＡ」という用語は、互いに対する相補配列からなり、且つ二本鎖ＲＮＡ分子を形成するように相補配列を介して共にアニーリングしている、２つのＲＮＡ分子の構築物を指す。２本の鎖のヌクレオチド配列は、標的遺伝子配列のタンパク質コード配列から選択される「センス」または「アンチセンス」ＲＮＡだけでなく、標的遺伝子の非コード領域から選択されるヌクレオチド配列を有するＲＮＡ分子も含み得る。
本明細書で使用される「ｓｈＲＮＡ」という用語は、互いに対して相補的である第１の領域および第２の領域、即ちセンス鎖およびアンチセンス鎖からなる、ステムループ構造を有するｓｉＲＮＡを指す。領域の相補性および配向性の程度は、塩基対形成が領域間で起こるのに十分であり、第１の領域および第２の領域がループ領域によって連結され、該ループは、ループ領域内のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）間の塩基対形成の欠失によって生じる。ｓｈＲＮＡのループ領域は、センス鎖とアンチセンス鎖との間に介在する一本鎖領域であり、「介在一本鎖」とも称され得る。
【００４５】
本明細書で使用される「ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡ」という用語は、ＲＮＡとＤＮＡの両方からなる二本鎖核酸分子を指し、ＲＮＡとＤＮＡのハイブリッドおよびキメラを含み、標的ｍＲＮＡの翻訳を妨害する。本明細書中で、ハイブリッドとは、ＤＮＡからなるポリヌクレオチドとＲＮＡからなるポリヌクレオチドとが互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成する分子を示し、一方キメラとは、二本鎖分子を構成する鎖の一方または両方がＲＮＡおよびＤＮＡを含有し得るものを示す。ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡを細胞に導入する標準的な技術が用いられる。ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡには、標的遺伝子のセンス核酸配列の一部（「センス鎖」とも称される）、標的遺伝子のアンチセンス核酸配列の一部（「アンチセンス鎖」とも称される）またはその両方が含まれる。単一転写産物が、標的遺伝子由来のセンス核酸配列および相補的アンチセンス核酸配列の両方、例えばヘアピンを有するように、ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡを構築してもよい。ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡはｄｓＤ／Ｒ−ＮＡまたはｓｈＤ／Ｒ−ＮＡのいずれかであり得る。
本明細書で使用される「ｄｓＤ／Ｒ−ＮＡ」という用語は、互いに対する相補配列からなり、且つ二本鎖ポリヌクレオチド分子を形成するように相補配列を介して共にアニーリングしている、２つの分子の構築物を指す。２つの鎖のヌクレオチド配列は、標的遺伝子配列のタンパク質コード配列から選択される「センス」または「アンチセンス」核酸配列だけでなく、標的遺伝子の非コード領域から選択される核酸配列を有するポリヌクレオチドも含み得る。ｄｓＤ／Ｒ−ＮＡを構築する２つの分子の一方または両方がＲＮＡおよびＤＮＡの両方から構成される（キメラ分子）か、あるいは代替的に、一方の分子がＲＮＡから構成され、もう一方がＤＮＡから構成される（ハイブリッド二本鎖）。
【００４６】
本明細書で使用される「ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ」という用語は、互いに対して相補的である第１の領域および第２の領域、即ちセンス鎖およびアンチセンス鎖からなる、ステムループ構造を有するｓｉＤ／Ｒ−ＮＡを指す。領域の相補性および配向性の程度は、領域間で塩基対形成が起こるのに十分であり、第１の領域および第２の領域がループ領域によって連結し、該ループは、ループ領域内のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）間の塩基対形成の欠失によって生じる。ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡのループ領域は、センス鎖とアンチセンス鎖との間に介在する一本鎖領域であり、「介在一本鎖」とも称され得る。
本明細書で用いられる「単離された」という用語は、その元の環境（例えば、天然由来である場合には天然の環境）から取り出され、かつしたがって総合的にその天然状態から改変された状態である。
【００４７】
ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子に対する二本鎖分子は、ＪＡＲＩＤ１Ｂ  ｍＲＮＡとハイブリダイズする分子であり、該遺伝子の正常な一本鎖ｍＲＮＡ転写物と会合し、それによって翻訳に干渉し、したがってＪＡＲＩＤ１Ｂタンパク質の発現を阻害することによって、該タンパク質の産生を低下させるかまたは阻害する。本明細書において実証されているように、膀胱癌細胞株および肺癌細胞株におけるＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の発現はｄｓＲＮＡによって阻害され（図７Ｂ、Ｆ）、その結果として、該細胞株の増殖は抑制された（図７Ｃ、Ｇ）。
したがって本発明は、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子を発現している細胞に導入された場合に、該遺伝子の発現ならびに細胞増殖を阻害することができる、単離された二本鎖分子を提供する。本発明の二本鎖分子は、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の過剰発現に関連するがん細胞増殖を阻害するために有用であり、したがって、がんを治療するための新規方法を提供しうる。例えば、本発明の二本鎖分子は、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の過剰発現が観察された（表３）、急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌および腎細胞癌などのがんへの適用に適している。より好ましくは、膀胱癌および肺癌が本発明の二本鎖分子に適している。
【００４８】
細胞内の標的遺伝子発現を阻害する能力をもつ二本鎖分子を設計する方法が知られている（例えば、その全体が本明細書中で参照により組み入れられる、国際公開公報第２００４／０４８５６６号および米国特許第６，５０６，５５９号を参照されたい）。例えば、ｓｉＲＮＡを設計するためのコンピュータプログラムは、Ａｍｂｉｏｎのウェブサイトから入手可能である（www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html）。
コンピュータプログラムは、以下のプロトコルに基づき、二本鎖分子に対する標的ヌクレオチド配列を選択する。
標的部位の選択：
１．転写産物のＡＵＧ開始コドンから始めて、ＡＡジヌクレオチド配列について下流を探索する。潜在的なｓｉＲＮＡ標的部位として、個々のＡＡとその３'側に隣接する１９ヌクレオチドとの出現を記録する。Tuschl et al.は、５'非翻訳領域（ＵＴＲ）および３'非翻訳領域および開始コドン近傍（７５塩基以内）の領域に対してｓｉＲＮＡを設計することを避けることを推奨している。これらの領域は調節タンパク質結合部位がより多く存在する可能性があり、ＵＴＲ結合タンパク質および／または翻訳開始複合体が、ｓｉＲＮＡエンドヌクレアーゼ複合体の結合に干渉する可能性があるためである。
２．潜在的な標的部位と、適当なゲノムデータベース（ヒト、マウス、ラット等）とを比較し、他のコード配列に対して有意な相同性を有する任意の標的配列を考慮から外す。基本的には、www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/におけるＮＣＢＩサーバー上のＢＬＡＳＴを用いる（Altschul SF et al., Nucleic Acids Res 1997 Sep 1, 25(17): 3389-402）。
３．合成用の的確な標的配列を選択する。遺伝子の長さに従って標的配列をいくつか選択して評価するのが一般的である。
上記の設計方法を用い、本発明の単離された二本鎖分子の標的配列を、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１および３０として設計した。上述の標的配列を標的とする二本鎖分子を、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子を発現する細胞の増殖を抑制する能力に関して調べた。したがって、本発明の例示的な二本鎖分子は、標的配列としてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１または３０に対応する核酸配列を含む。しかしながら、本発明の二本鎖分子がＪＡＲＩＤ１Ｂの発現および細胞増殖を阻害する能力を保持している限り、ＪＡＲＩＤ１Ｂ由来の任意の配列を、該二本鎖分子のための標的配列とすることができる。
【００４９】
本発明の二本鎖分子は単一の標的配列に対する指向性を有してもよい。
本発明の二本鎖分子には、標的配列の核酸配列および／または標的配列に相補的な配列のいずれかを含む単離されたポリヌクレオチドが含まれる。本発明の二本鎖分子に対するポリヌクレオチドの例として、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１もしくは３０に対応する核酸配列および／または該配列に相補的な配列を含むものが挙げられる。しかしながら本発明はこれらの例に限定されず、改変された分子がＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の発現を抑制する能力を保持している限り、上述の核酸配列における軽微な改変が許容可能である。本明細書において核酸配列に関連して用いられる「軽微な改変」という語句は、該配列に対する１つ、２つまたはいくつかの核酸の置換、欠失、付加または挿入を示す。本発明の文脈において、核酸の置換、欠失、付加および／または挿入に適用される「いくつかの」という用語は、３〜７個の、好ましくは３〜５個の、より好ましくは３〜４個の、さらにより好ましくは３個の核酸残基を意味しうる。
【００５０】
本発明の二本鎖分子に対する単離されたポリヌクレオチドがＲＮＡまたはその誘導体からなる場合、ヌクレオチド配列において塩基「ｔ」は「ｕ」に置き換えるものとする。本明細書で使用される「相補性」という用語は、ポリヌクレオチドのヌクレオチド単位間のワトソンクリック型またはフーグスティーン型の塩基対形成を指し、「結合」という用語は、２つのポリヌクレオチド間の物理的なまたは化学的な相互作用を意味する。ポリヌクレオチドが修飾ヌクレオチドおよび／または非リン酸化ジエステル結合を含む場合、これらのポリヌクレオチドもまた同じように互いに結合し得る。一般的に、相補的なポリヌクレオチド配列は、適当な条件下でハイブリダイズして、ほとんどまたは全くミスマッチを含まない安定な二重鎖を形成する。さらに、センス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖は、ハイブリダイゼーションによって二本鎖分子またはヘアピンループ構造を形成することができる。１つの好ましい態様において、このような二重鎖は１０個のマッチあたりわずか１個のミスマッチしか含有しない。特に好ましい態様では、二重鎖の鎖が完全に相補的である場合、このような二重鎖はミスマッチを含有しない。
ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子については、二本鎖分子が６３９３ヌクレオチド長未満であることが好ましい。例えば、二本鎖分子は、５００ヌクレオチド長、２００ヌクレオチド長、１００ヌクレオチド長、７５ヌクレオチド長、５０ヌクレオチド長、または２５ヌクレオチド長未満である。さらに、二本鎖分子のセンス鎖は１９ヌクレオチドより長くてよく、好ましくは２１ヌクレオチドより長く、より好ましくは約１９〜２５ヌクレオチド長である。したがって本発明は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖分子を提供し、該センス鎖は、標的配列に相当するヌクレオチド配列を含む。好ましい態様において、センス鎖は標的配列でアンチセンス鎖とハイブリダイズして、１９〜２５ヌクレオチド対の長さを有する二本鎖分子を形成する。
【００５１】
本発明によれば、本発明の二本鎖分子は、実施例で利用される方法を用いて、その能力に関して試験することができる。例えば、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子のｍＲＮＡの一部のセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖からなる二本鎖分子を、標準的な方法に従い、膀胱癌および肺癌の細胞株（例えば、膀胱癌については２５３Ｊ、２５３Ｊ−ＢＶ、ＨＴ１１９７、ＨＴ１３７６、Ｊ８２、ＳＣａＢＥＲ、ＵＭＵＣ３、ＥＪ２８、ＲＴ４、Ｔ２４、およびＳＷ７８０；肺癌についてはＳＢＣ５、Ａ５４９、Ｈ２１７０、ＬＣ３１９、およびＲＥＲＦ−ＬＣ−ＡＩ）におけるＪＡＲＩＤ１Ｂ  ｍＲＮＡの産生を低減させる能力に関してインビトロで試験した。さらに例えば、候補分子の非存在下で培養した細胞に比べて、候補二本鎖分子と接触させた細胞におけるＪＡＲＩＤ１Ｂ  ｍＲＮＡの低減は、例えば、実施例１「定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ」の項で言及されたＪＡＲＩＤ１Ｂ  ｍＲＮＡに対するプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲにより検出することができる。インビトロ細胞ベースのアッセイにおいてＪＡＲＩＤ１Ｂ  ｍＲＮＡの産生を低減する配列を、次に、細胞増殖に対するこれらの阻害効果に関して試験することができる。その後、インビトロ細胞ベースのアッセイにおいて細胞増殖を阻害する配列を、がんを有する動物、例えばヌードマウス異種移植片モデルを用いてこれらのインビボでの能力に関して試験し、ＪＡＲＩＤ１Ｂ  ｍＲＮＡの産生の低減およびがん細胞増殖の低減を確認することができる。
【００５２】
二本鎖分子は、該二本鎖分子を細胞に導入した場合にＲＩＳＣ複合体のｍＲＮＡにおける相同配列を同定するための案内として役立つ。同定された標的ＲＮＡはダイサーのヌクレアーゼ活性によって切断および分解され、これにより該二本鎖分子は最終的に、該ＲＮＡによってコードされるポリペプチドの産生（発現）を低下させるかまたは阻害する。したがって、本発明の二本鎖分子は、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子のｍＲＮＡとストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする一本鎖を生成できる能力によって定義することができる。本明細書において、二本鎖分子から生成された一本鎖とハイブリダイズするｍＲＮＡの部分は「標的配列」または「標的核酸」または「標的ヌクレオチド」と称される。本発明において、「標的配列」のヌクレオチド配列は、ｍＲＮＡのＲＮＡ配列を用いてだけでなく、該ｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡのＤＮＡ配列を用いても示すことができる。
本発明の二本鎖分子は、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドおよび／または非リン酸化ジエステル結合を含有し得る。当技術分野において周知である化学修飾は、二本鎖分子の安定性、利用可能性および／または細胞取り込みを増大させることができる。当業者は、本発明の分子に組み込まれ得る他の種類の化学修飾も認識するであろう（国際公開公報第０３／０７０７４４号、国際公開公報第２００５／０４５０３７号）。一態様では、分解耐性の向上または取り込みの改善を与えるために、修飾を用いることができる。このような修飾の例には、ホスホロチオエート結合、２'−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（特に二本鎖分子のセンス鎖上で）、２'−デオキシ−フルオロリボヌクレオチド、２'−デオキシリボヌクレオチド、「普遍的塩基（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂａｓｅ）」ヌクレオチド、５'−Ｃ−メチルヌクレオチド、および逆デオキシ脱塩基残基（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄｅｏｘｙｂａｓｉｃ  ｒｅｓｉｄｕｅ）の組み込み（ＵＳ２００６０１２２１３７）が、非限定的に含まれる。
【００５３】
別の態様において、二本鎖分子の安定性を向上させるために、または標的化効率を増大させるために修飾を用いることができる。そのような修飾の例には、二本鎖分子の相補鎖２つの間の化学架橋結合、二本鎖分子の鎖の３'末端または５'末端の化学修飾、糖修飾、核酸塩基修飾および／または骨格修飾、２−フルオロ修飾リボヌクレオチドおよび２'−デオキシリボヌクレオチドが含まれる（国際公開公報第２００４／０２９２１２号）が、これらに限定されるわけではない。別の態様において、標的ｍＲＮＡにおけるおよび／または相補的二本鎖分子鎖における相補的ヌクレオチドに対する親和性を増減するために修飾を用いることができる（国際公開公報第２００５／０４４９７６号）。例えば、非修飾ピリミジンヌクレオチドを２−チオピリミジン、５−アルキニルピリミジン、５−メチルピリミジン、または５−プロピニルピリミジンに置換することができる。さらに、非修飾プリンを７−デアザプリン、７−アルキルプリン、または７−アルケニルプリンに置換することができる。
別の好ましい態様において、本発明の二本鎖分子は、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の３'末端のいずれかまたは両方において数個のヌクレオチドからなる３'オーバーハングを有する。該二本鎖分子が３'オーバーハングを有する二本鎖分子である場合、３'突出ヌクレオチドを、デオキシリボヌクレオチドで置換してもよい（Elbashir SM et al., Genes Dev 2001 Jan 15, 15（2）: 188-200）。好ましくは、本発明の二本鎖分子の３'オーバーハングは２個のデオキシリボヌクレオチド「ｔ」からなる。例えば、３'オーバーハングを有する本発明の二本鎖分子の例示的な配列は、センス鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９または２８に、アンチセンス鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０または２９に示されており、これらは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１または３０に対応する標的配列と２個のデオキシリボヌクレオチド「ｔ」からなる３'オーバーハング配列とを含む。さらなる詳細については、ＵＳ２００６０２３４９７０などの公開文献が入手可能である。
本発明は、これらの例には限定されず、得られる分子が標的遺伝子の発現を阻害する能力を保持している限り、任意の既知の化学修飾を本発明の二本鎖分子に対して利用することができる。
【００５４】
さらに、本発明の二本鎖分子はＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含み得る（例えばｄｓＤ／Ｒ−ＮＡまたはｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ）。特に、ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖とのハイブリッドポリヌクレオチドまたはＤＮＡ−ＲＮＡキメラポリヌクレオチドは、安定性の増大を示す。ＤＮＡとＲＮＡとの混合、即ちＤＮＡ鎖（ポリヌクレオチド）とＲＮＡ鎖（ポリヌクレオチド）とからなるハイブリッド型二本鎖分子、一本鎖（ポリヌクレオチド）の一方または両方にＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含むキメラ型二本鎖分子等を、二本鎖分子の安定性を向上させるために形成してもよい。
ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖とのハイブリッドは、標的遺伝子を発現している細胞に導入した場合に該遺伝子の発現を阻害できる限り、センス鎖がＤＮＡでありアンチセンス鎖がＲＮＡであるか、またはその反対のいずれであってもよい。好ましくは、センス鎖のポリヌクレオチドはＤＮＡであり、アンチセンス鎖のポリヌクレオチドはＲＮＡである。また、キメラ型二本鎖分子は、遺伝子を発現する細胞に導入した場合に標的遺伝子の発現を阻害する活性を有する限り、センス鎖とアンチセンス鎖の両方がＤＮＡおよびＲＮＡからなってもよく、またはセンス鎖とアンチセンス鎖のいずれか一方がＤＮＡおよびＲＮＡからなってもよい。二本鎖分子の安定性を向上させるために、該分子は可能な限り多くのＤＮＡを含有する方が好ましいが、標的遺伝子発現の阻害を誘導するためには、発現の十分な阻害を誘導する範囲内で分子がＲＮＡであることが必要である。
【００５５】
キメラ型二本鎖分子の好ましい例として、二本鎖分子の上流部分領域（即ちセンス鎖またはアンチセンス鎖内の標的配列またはその相補配列に隣接する領域）はＲＮＡである。好ましくは、上流部分領域とは、センス鎖の５'側（５'末端）およびアンチセンス鎖の３'側（３'末端）を示す。あるいは、センス鎖の５'末端に隣接する領域および／またはアンチセンス鎖の３'末端に隣接する領域を、上流部分領域と称する。即ち、好ましい態様では、アンチセンス鎖の３'末端に隣接する領域、または、センス鎖の５'末端に隣接する領域とアンチセンス鎖の３'末端に隣接する領域との両方がＲＮＡからなる。例えば、本発明のキメラまたはハイブリッド型二本鎖分子は以下の組み合わせを含む。
センス鎖：
５'−［−−−ＤＮＡ−−−］−３'
３'−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−５'
：アンチセンス鎖、
センス鎖：
５'−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−３'
３'−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−５'
：アンチセンス鎖、および
センス鎖：
５'−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−３'
３'−（−−−ＲＮＡ−−−）−５'
：アンチセンス鎖。
【００５６】
好ましくは上流部分領域は、二本鎖分子のセンス鎖またはアンチセンス鎖内で、標的配列またはこれに対する相補配列の末端から数えて９〜１３ヌクレオチドからなるドメインである。さらに、そのようなキメラ型二本鎖分子の好ましい例には、少なくともポリヌクレオチドの上流半分の領域（センス鎖では５'側領域およびアンチセンス鎖では３'側領域）がＲＮＡでありかつもう半分がＤＮＡである、１９〜２１ヌクレオチド鎖長を有するものが含まれる。そのようなキメラ型二本鎖分子では、アンチセンス鎖全体がＲＮＡである場合、標的遺伝子の発現を阻害する効果がかなり高くなる（ＵＳ２００５０００４０６４）。
本発明において、二本鎖分子は、ヘアピン、例えばショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）および、ＤＮＡとＲＮＡからなるショートヘアピン（ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ）を形成してもよい。ｓｈＲＮＡまたはｓｈＤ／Ｒ−ＮＡは、ＲＮＡ干渉を介して遺伝子発現をサイレンシングするのに使用することができる緊密なヘアピンターンを作製する、ＲＮＡの配列またはＲＮＡとＤＮＡの混合物の配列である。ｓｈＲＮＡまたはｓｈＤ／Ｒ−ＮＡは、単一ポリヌクレオチド上にセンス標的配列とアンチセンス標的配列とを含み、これらの配列はループ配列によって分かれている。一般的に、ヘアピン構造は細胞機構によって切断されてｄｓＲＮＡまたはｄｓＤ／Ｒ−ＮＡとなり、続いてＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合する。この複合体は、ｄｓＲＮＡまたはｄｓＤ／Ｒ−ＮＡの標的配列に一致するｍＲＮＡと結合し、これを切断する。
【００５７】
ヘアピンループ構造を形成するために、任意のヌクレオチド配列からなるループ配列を、センス配列とアンチセンス配列との間に配置することができる。したがって、本発明は、一般式
５'−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ'］−３'
を有し、［Ａ］は標的配列に相当する配列を含むセンス鎖であり、［Ｂ］は介在一本鎖であり、［Ａ'］は［Ａ］に対する相補配列を含むアンチセンス鎖である、二本鎖分子も提供する。標的配列は例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１または３０に対応する配列であり得る。
【００５８】
本発明はこれらの例には限定されず、［Ａ］における標的配列は、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の発現を抑制する能力を該二本鎖分子が保持する限り、これらの例に由来する改変配列であってもよい。領域［Ａ］は領域［Ａ'］とハイブリダイズし、領域［Ｂ］からなるループを形成する。介在一本鎖部分［Ｂ］、即ちループ配列は、好ましくは３〜２３ヌクレオチド長であり得る。例えばループ配列は以下の配列の中から選択することができる（www.ambion.com/techlib/tb/tb_506.html）。さらに、２３個のヌクレオチドからなるループ配列は活性ｓｉＲＮＡも提供する（Jacque JM et al., Nature 2002 Jul 25, 418（6896）: 435-8, Epub 2002 Jun 26）：
ＣＣＣ、ＣＣＡＣＣ、またはＣＣＡＣＡＣＣ：Jacque JM et al., Nature 2002 Jul 25, 418（6896）: 435- 8, Epub 2002 Jun 26；
ＵＵＣＧ：Lee NS et al., Nat Biotechnol 2002 May, 20（5）: 500-5、Fruscoloni P et al., Proc Natl Acad Sci USA 2003 Feb 18, 100（4）: 1639-44, Epub 2003 Feb 10；および
ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ：Dykxhoorn DM et al., Nat Rev Mol Cell Biol 2003 Jun, 4（6）: 457-67。
ヘアピンループ構造を有する本発明の二本鎖分子の好ましい例を以下に示す。以下の構造では、ループ配列は、ＡＵＧ、ＣＣＣ、ＵＵＣＧ、ＣＣＡＣＣ、ＣＴＣＧＡＧ、ＡＡＧＣＵＵ、ＣＣＡＣＡＣＣおよびＵＵＣＡＡＧＡＧＡの中から選択することができるが、本発明の好ましい例はこれらに限定されない：
ＣＡＧＵＧＡＡＵＧＡＧＣＵＣＣＧＧＣＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１）−［Ｂ］−ＵＧＣＣＧＧＡＧＣＵＣＡＵＵＣＡＣＵＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２）
（標的配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）。
本発明の別の好ましい例は以下である：
ＧＧＡＡＵＡＵＧＧＡＧＣＵＧＡＣＡＵＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）−［Ｂ］−ＡＡＵＧＵＣＡＧＣＵＣＣＡＵＡＵＵＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４）
（標的配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）。
【００５９】
さらに、二本鎖分子の阻害活性を高めるために、数個のヌクレオチドを３'オーバーハングとして標的配列のセンス鎖および／またはアンチセンス鎖の３'末端に付加することができる。付加されるヌクレオチドの数は少なくとも２個、一般に２〜１０個、好ましくは２〜３個である。ヌクレオチドの種類は限定されないが、好ましくは「ｕ」または「ｔ」である。付加されるヌクレオチドは二本鎖分子のセンス鎖および／またはアンチセンス鎖の３'末端で一本鎖を形成する。
二本鎖分子がヘアピンループ構造を有する場合、アンチセンス鎖の３'末端に３'オーバーハングが付加される。そのような二本鎖分子の好ましい例には以下が含まれるが、これらに限定されるわけではない：
ＣＡＧＵＧＡＡＵＧＡＧＣＵＣＣＧＧＣＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１）−［Ｂ］−ＵＧＣＣＧＧＡＧＣＵＣＡＵＵＣＡＣＵＧＴＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）
（標的配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）および
ＧＧＡＡＵＡＵＧＧＡＧＣＵＧＡＣＡＵＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）−［Ｂ］−ＡＡＵＧＵＣＡＧＣＵＣＣＡＵＡＵＵＣＣＴＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）
（標的配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）。
【００６０】
二本鎖分子を調製するための方法は特に限定されないが、当技術分野で既知の任意の化学合成法を使用することが好ましい。化学合成法に従って、一本鎖のセンスおよびアンチセンスポリヌクレオチドを別々に合成した後、それらを適当な方法により共にアニーリングして二本鎖分子を得る。アニーリングに関する特定の例には、合成した一本鎖ポリヌクレオチドを好ましくは少なくとも約３：７のモル比で、より好ましくは約４：６のモル比で、最も好ましくは実質的に等モル量（即ち約５：５のモル比）で混合することが含まれる。次に、混合物を二本鎖分子が解離する温度まで加熱した後、徐々に冷ます。アニーリングした二本鎖ポリヌクレオチドは、当技術分野で既知の通常利用される方法によって精製することができる。精製法の例には、アガロースゲル電気泳動を利用する方法、または、残存する一本鎖ポリヌクレオチドが任意で、例えば適当な酵素を用いる分解によって取り除かれる方法が含まれる。
その発現を独立して、あるいは時間的または空間的な様式で調整することができるように、ＪＡＲＩＤ１Ｂ配列に隣接する調節配列は同一であってもまたは異なっていてもよい。ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子鋳型を、例えば低分子核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）Ｕ６由来のＲＮＡポリＩＩＩ転写ユニットまたはヒトＨ１  ＲＮＡプロモーターを含有するベクターにクローニングすることによって、二本鎖分子を細胞内で転写することができる。
【００６１】
本発明の二本鎖分子をコードするベクター：
本明細書に記載の１つまたは複数の二本鎖分子をコードするベクター、およびそのようなベクターを含有する細胞も、本発明に包含される。
本発明のベクターは、発現可能な形態で本発明の二本鎖分子をコードする核酸配列を含むことが好ましい。本明細書において、「発現可能な形態で」という語句は、細胞に導入されると、ベクターが該分子を発現することを示す。好ましい態様において、ベクターは、二本鎖分子の発現に必要な調節エレメントを含む。本発明のそのようなベクターは、本発明の二本鎖分子を産生させるために用いることができ、またはがんを治療するための有効成分として直接用いることができる。
【００６２】
あるいは本発明は、センス鎖核酸およびアンチセンス鎖核酸を有するポリヌクレオチドの組み合わせのそれぞれを含むベクターを提供し、ここで該センス鎖核酸がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１または３０のヌクレオチド配列を含み、該アンチセンス鎖核酸が該センス鎖に相補的な配列からなり、該センス鎖および該アンチセンス鎖の転写産物が互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成し、かつ該ベクターは、ＪＡＲＩＤ１Ｂを発現している細胞に導入されると、該遺伝子の発現を阻害する。好ましくは、本ポリヌクレオチドは、約１９〜２５ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド配列に由来する連続したヌクレオチド）である。より好ましくは、ポリヌクレオチドの組み合わせは、一本鎖ヌクレオチド配列を介して連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖を有する単一のヌクレオチド転写産物を含む。より好ましくは、ポリヌクレオチドの組み合わせは、一般式
５'−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ'］−３'
を有し、［Ａ］はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１または３０を含むヌクレオチド配列であり；［Ｂ］は約３〜約２３ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり；かつ［Ａ'］は［Ａ］に相補的なヌクレオチド配列である。
【００６３】
本発明のベクターは、例えば、調節配列が（ＤＮＡ分子の転写によって）両方の鎖の発現を可能にする様式で機能的にＪＡＲＩＤ１Ｂ配列に連結されるように、ＪＡＲＩＤ１Ｂ配列を発現ベクターにクローニングすることによって作製することができる（Lee NS et al., Nat Biotechnol 2002 May, 20（5）: 500-5）。例えば、ｍＲＮＡに対するアンチセンス鎖であるＲＮＡ分子が第１のプロモーター（例えばクローニングされるＤＮＡの３'末端に隣接するプロモーター配列）によって転写され、該ｍＲＮＡに対するセンス鎖であるＲＮＡ分子が第２のプロモーター（例えば該クローニングされるＤＮＡの５'末端に隣接するプロモーター配列）によって転写される。センス鎖とアンチセンス鎖とがインビボでハイブリダイズして、遺伝子をサイレンシングするための二本鎖分子構築物を生成する。代替的に、二本鎖分子のセンス鎖およびアンチセンス鎖をそれぞれコードする２つのベクター構築物を利用してセンス鎖とアンチセンス鎖とをそれぞれ発現させた後、二本鎖分子構築物を形成させる。さらに、クローニングした配列は、二次構造（例えばヘアピン）を有する構築物、即ち標的遺伝子のセンス配列および相補的アンチセンス配列の両方を含有するベクターの単一転写産物をコードすることができる。
本発明のベクターはまた、標的細胞のゲノムへの安定した挿入を達成するように包含されてもよい（例えば相同的組換えカセットベクターの説明に関しては、Thomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12を参照されたい）。例えば、Wolff et al., Science 1990, 247: 1465-8、米国特許第５，５８０，８５９号、同第５，５８９，４６６号、同第５，８０４，５６６号、同第５，７３９，１１８号、同第５，７３６，５２４号、同第５，６７９，６４７号、および国際公開公報第９８／０４７２０号を参照されたい。ＤＮＡベースの送達技術の例には、「ネイキッドＤＮＡ」、促進性（ブピバカイン、ポリマー、ペプチドに媒介される）送達、カチオン性脂質複合体、および、粒子媒介性（「遺伝子銃」）または圧力媒介性の送達が挙含まれる（例えば米国特許第５，９２２，６８７号を参照されたい）。
【００６４】
本発明のベクターは、例えばウイルス性または細菌性のベクターを含む。発現ベクターの例には、牛痘ウイルスまたは鶏痘ウイルスなどの弱毒化ウイルス宿主が含まれる（例えば米国特許第４，７２２，８４８号を参照されたい）。このアプローチは、例えば二本鎖分子をコードするヌクレオチド配列を発現させるためのベクターとしての、牛痘ウイルスの使用を伴う。標的遺伝子を発現する細胞に導入されると、組換え牛痘ウイルスが分子を発現し、それにより該細胞の増殖を抑制する。使用することのできるベクターの別の例にはカルメット・ゲラン桿菌（Bacille Calmette Guerin；ＢＣＧ）が含まれる。ＢＣＧベクターはStover et al., Nature 1991, 351: 456-60に記載される。広範な他のベクターが、二本鎖分子の治療的投与および生成に有用である。例には、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、チフス菌（Salmonella typhi）ベクター、無毒化炭疽菌毒素ベクター等が含まれる。例えば、Shata et al., Mol Med Today 2000, 6: 66-71、Shedlock et al., J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806、およびHipp et al., In Vivo 2000, 14: 571-85を参照されたい。
【００６５】
本発明の二本鎖分子を用いた、がん細胞増殖を阻害するかまたは低下させる方法およびがんを治療する方法：
本発明において、細胞増殖を阻害する能力に関して、ｄｓＲＮＡを試験した。ｄｓＲＮＡは、細胞増殖の抑制と同時に、膀胱癌細胞株および肺癌細胞株における遺伝子発現を効果的にノックダウンした（図７）。
したがって本発明は、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子発現の阻害を介してＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の機能不全を誘導することによって、細胞増殖、すなわちがん細胞増殖を阻害するための方法を提供する。本発明によれば、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の発現は、急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌および腎細胞癌において特異的に上昇していた（表３）。したがって、本発明の方法は、そのようながんにおける細胞増殖を阻害するのに有用である可能性がある。ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の発現は、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子を特異的に標的とする前述の本発明の二本鎖分子のいずれかによって、または該二本鎖分子のいずれかを発現することのできる本発明のベクターによって、阻害することができる。例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１または３０に相当する核酸配列を標的配列として含む二本鎖分子を、好ましくは、本方法のために用いることができる。
がん細胞の細胞増殖を阻害する本発明の二本鎖分子およびベクターのそのような能力により、上記がんを治療するための方法に関してこれらが使用可能であることが明らかに示される。したがって本発明は、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子に対する二本鎖分子または該分子を発現するベクターを投与することによって、がんを有する患者を治療するための方法を提供する。
【００６６】
ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子を発現している細胞の増殖は、該細胞を、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子に対する二本鎖分子、該分子を発現するベクター、またはそれを含む組成物と接触させることによって阻害してもよい。該細胞を、トランスフェクション剤とさらに接触させてもよい。適切なトランスフェクション剤は当技術分野において公知である。「細胞増殖の阻害」という語句は、分子に曝露されていない細胞と比較して、細胞がより低い速度で増殖すること、またはその生存度が低下していることを示す。細胞増殖は、当技術分野において公知の方法により、例えば、ＭＴＴ細胞増殖アッセイを用いて測定することができる。
ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子を発現または過剰発現する限り、任意の種類の細胞の増殖を、本発明に従って抑制することができる。例示的な細胞には、急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌および腎細胞癌、特に膀胱癌および肺癌が含まれる。
したがって、本発明の二本鎖分子の少なくとも１つ、該分子の少なくとも１つを発現する少なくとも１つのベクター、または該分子の少なくとも１つを含む少なくとも１つの組成物を投与することによって、ＪＡＲＩＤ１Ｂに関連する疾患に罹患しているかまたはその発症リスクを有する患者を治療することができる。例えば、肺癌または膀胱癌の患者が本方法に従って治療されうる。がんの種類は、診断される特定の種類の腫瘍に応じた標準的な方法によって同定することができる。例えば肺癌は、肺癌マーカーとしてのＣＥＡ、ＣＹＦＲＡなどを用いて、または胸部Ｘ腺検査および／もしくは喀痰細胞診によって診断することができる。膀胱癌は、尿分析、Ｘ線分析または膀胱鏡検査によって診断することができる。より好ましくは、患者から採取した試料におけるＪＡＲＩＤ１Ｂの発現レベルをＲＴ−ＰＣＲおよびイムノアッセイなどの従来の方法を用いて検出することにより、本発明の方法によって治療される患者を選択してもよい。好ましくは、本発明の治療の前に、当技術分野において公知の方法、例えば免疫組織化学分析またはＲＴ−ＰＣＲを用いて、対象由来の生検標本をＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の過剰発現に関して確認する。
【００６７】
本発明の方法によると、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子に対する複数種の二本鎖分子（またはそれらを発現するベクターもしくはそれらを含む組成物）を投与に用いることができる。
細胞増殖を阻害するために、本発明の二本鎖分子を、該分子に対応するｍＲＮＡ転写産物との結合を達成するための形態で細胞内に直接導入してもよい。代替的に、上記のように、二本鎖分子をコードするＤＮＡを、ベクターとして細胞に導入してもよい。二本鎖分子およびベクターを細胞内に導入するために、ＦｕＧＥＮＥ（Ｒｏｃｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（和光純薬工業株式会社）などのトランスフェクション増強剤を利用してもよい。
ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子発現の低減または対象におけるがんのサイズ、有病率もしくは転移能の低下などの臨床的利点がもたらされる場合、治療は「有効」であると見なされる。治療を予防的に適用する場合、「有効」とは、がんの形成を遅らせる若しくは妨害すること、またはがんの臨床症状を予防もしくは緩和することを意味する。有効性（Efficaciousness）は、特定の腫瘍の種類を診断または治療するための任意の既知の方法に関連して決定される。
【００６８】
本発明の二本鎖分子は、準化学量論的な量でＪＡＲＩＤ１Ｂ  ｍＲＮＡを分解することが理解される。いずれかの理論に束縛されるわけではないが、本発明の二本鎖分子は、触媒的な様式で標的ｍＲＮＡの分解を引き起こすと考えられる。したがって、標準的ながん治療に比べて、治療効果を発揮するためにがん部位またはその近くに送達されねばならない二本鎖分子は、有意に少ない。
当業者は、対象の体重、年齢、性別、疾患の種類、症状および他の状態；投与経路；ならびに投与が局所的であるのか全身的であるのかなどの要素を考慮することにより、所定の対象に投与されるべき本発明の二本鎖分子の有効量を、容易に決定することができる。概して、本発明の二本鎖分子の有効量は、がん部位またはその近傍での細胞間濃度約１ナノモル（ｎＭ）〜約１００ｎＭ、好ましくは約２ｎＭ〜約５０ｎＭ、より好ましくは約２．５ｎＭ〜約１０ｎＭである。より多いまたはより少ない量の二本鎖分子も投与可能であることが意図される。特定の状況に関して必要とされる正確な投与量は、当業者によって容易かつ規定通りに決定され得る。
【００６９】
本発明の方法を用いて、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子を発現しているがん；例えば急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌、および腎細胞癌、特に膀胱癌および肺癌の増殖または転移を阻害することができる。具体的には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１または３０に相当する標的配列を含む二本鎖分子が、肺癌の治療のために特に好ましい。
がんを治療するために、本発明の二本鎖分子を該二本鎖分子とは別の薬剤と組み合わせて対象に投与することもできる。代替的に、本発明の二本鎖分子を、がんを治療するために設計された別の治療法と組み合わせて対象に投与することができる。例えば、本発明の二本鎖分子は、がんの治療またはがん転移の予防に現在利用されている治療法（例えば放射線療法、外科的手術、および化学療法剤を用いた治療）と組み合わせて投与することができる。
本方法において、二本鎖分子を、送達試薬と組み合わせたネイキッド二本鎖分子として、または該二本鎖分子を発現する組換えプラスミドもしくはウイルスベクターとして、対象に投与することができる。
本発明の二本鎖分子と組み合わせて投与するのに適した送達試薬には、Ｍｉｒｕｓ  Ｔｒａｎｓｉｔ  ＴＫＯ脂溶性試薬、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、またはポリカチオン（例えばポリリシン）またはリポソームが含まれる。好ましい送達試薬はリポソームである。
【００７０】
リポソームは、網膜組織または腫瘍組織などの特定の組織への二本鎖分子の送達を支援でき、かつまた該二本鎖分子の血中半減期も増大させ得る。本発明の方法における使用に適したリポソームは標準的な小胞形成脂質から形成され、これは一般に、中性のまたは負に帯電したリン脂質および、コレステロールなどのステロールを含む。一般に脂質の選択は、所望のリポソームのサイズおよび血流中におけるリポソームの半減期などの要素を考慮して導かれる。リポソームの調製に関しては、例えばSzoka et al., Ann Rev Biophys Bioeng 1980, 9: 467、および米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号、同第４，８３７，０２８号、および同第５，０１９，３６９号（その開示全体が参照により本明細書に引用される）に記載されたような様々な方法が知られている。
【００７１】
一部の態様において、本発明の二本鎖分子を封入するリポソームは、該リポソームをがん部位に送達することができるリガンド分子を含む。腫瘍または小胞内皮細胞に多く存在する受容体に結合するリガンド、例えば腫瘍抗原または内皮細胞表面抗原と結合するモノクローナル抗体が、好ましい。
加えて、本発明の二本鎖分子を封入するリポソームは、例えばその構造の表面に結合したオプソニン化阻害部分を有することによって、単核マクロファージおよび網内系によるクリアランスを回避するように修飾することができる。一つの態様では、本発明のリポソームは、オプソニン化阻害部分およびリガンドの両方を含み得る。
本発明のリポソームを調製するのに用いるオプソニン化阻害部分は典型的に、リポソーム膜と結合する巨大な親水性ポリマーである。本明細書で使用されるように、オプソニン化阻害部分は、化学的にまたは物理的にリポソーム膜に付着すると、例えば脂質可溶性アンカーの膜自体へのインターカレーションによって、または膜脂質の活性基への直接結合によって、リポソーム膜と「結合」する。これらのオプソニン化阻害親水性ポリマーは、例えばその開示全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第４，９２０，０１６号に記載されるように、マクロファージ−単球系（「ＭＭＳ」）および網内系（「ＲＥＳ」）によるリポソームの取り込みを有意に低減する保護表面層を形成する。したがって、オプソニン化阻害部分で修飾されたリポソームは非修飾リポソームよりもずっと長く循環中に残存する。このため、そのようなリポソームは「ステルス」リポソームと呼ばれることもある。
【００７２】
ステルスリポソームは、多孔性または「漏出性（leaky）」の微小血管系が流れ込む組織内に蓄積することが知られている。したがって、そのような微小血管系欠損を特徴とする標的組織、例えば固形腫瘍では効率的にこれらのリポソームが蓄積する。Gabizon et al., Proc Natl Acad Sci USA 1988, 18: 6949-53を参照されたい。さらに、ＲＥＳによる取り込みの低減は、肝臓および脾臓への有意な蓄積を妨害することによってステルスリポソームの毒性を低下させる。したがって、オプソニン化阻害部分で修飾された本発明のリポソームは、本発明の二本鎖分子を腫瘍細胞に送達することができる。
リポソームを修飾するのに適したオプソニン化阻害部分は、好ましくは分子量が約５００ダルトン〜約４００００ダルトン、より好ましくは約２０００ダルトン〜約２００００ダルトンの水溶性ポリマーである。そのようなポリマーには、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）誘導体；例えばメトキシＰＥＧまたはＰＰＧ、およびステアリン酸ＰＥＧまたはステアリン酸ＰＰＧ；ポリアクリルアミドまたはポリＮ−ビニルピロリドンなどの、合成ポリマー；直鎖、分岐鎖またはデンドリマーのポリアミドアミン；ポリアクリル酸；多価アルコール、例えば、カルボン酸基またはアミノ基が化学結合したポリビニルアルコールおよびポリキシリトール、ならびにガングリオシドＧＭ１などのガングリオシドが含まれる。ＰＥＧ、メトキシＰＥＧもしくはメトキシＰＰＧのコポリマー、またはそれらの誘導体も好適である。さらに、オプソニン化阻害ポリマーはまた、ＰＥＧと、ポリアミノ酸、多糖、ポリアミドアミン、ポリエチレンアミン、またはポリヌクレオチドのいずれかとのブロックコポリマーであり得る。オプソニン化阻害ポリマーは、アミノ酸またはカルボン酸を含有する天然多糖、例えばガラクツロン酸、グルクロン酸、マンヌロン酸、ヒアルロン酸、ペクチン酸、ノイラミン酸、アルギン酸、カラギーナン；アミノ化多糖またはオリゴ糖（直鎖または分岐鎖）；あるいは、たとえばカルボン酸基の連結が得られたカルボン酸の誘導体と反応させた、カルボキシル化多糖またはカルボキシル化オリゴ糖でもあり得る。
【００７３】
好ましくは、オプソニン化阻害部分はＰＥＧ、ＰＰＧ、またはその誘導体である。ＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体で修飾されたリポソームは「ＰＥＧ化リポソーム」と呼ばれることもある。
オプソニン化阻害部分は、多くの既知の技術のいずれか１つによってリポソーム膜と結合させることができる。例えば、ＰＥＧのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルは、ホスファチジル−エタノールアミン脂質可溶性アンカーと結合し、続いて膜と結合することができる。同様に、デキストランポリマーは、Ｎａ（ＣＮ）ＢＨ３および溶媒混合物、例えば比率３０：１２のテトラヒドロフランと水を用いる６０℃での還元アミノ化によって、ステアリルアミン脂質可溶性アンカーで誘導体化することができる。
本発明の二本鎖分子を発現するベクターが上記で述べられた。本発明の二本鎖分子を少なくとも１つ発現するそのようなベクターもまた、直接、または、Ｍｉｒｕｓ  Ｔｒａｎｓｉｔ  ＬＴ１脂溶性試薬、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、またはポリカチオン（例えばポリリシン）またはリポソームを含む好適な送達試薬と組み合わせて、投与することができる。本発明の二本鎖分子を発現する組換えウイルスベクターを患者のがん領域に送達する方法は当技術分野内である。
【００７４】
本発明の二本鎖分子は、該二本鎖分子をがん部位に送達するのに適した任意の手段によって、対象に投与することができる。例えば二本鎖分子は、遺伝子銃、電気穿孔法、または他の好適な非経口投与経路もしくは腸内投与経路によって投与することができる。
好適な腸内投与経路には、経口送達、直腸送達、または鼻腔内送達が含まれる。
好適な非経口投与経路には、静脈内投与（例えば静脈ボーラス注射、静脈注入、動脈内ボーラス注射、動脈内注入および血管系へのカテーテル点滴注入）；組織周囲および組織内注射（例えば腫瘍組織周囲注射および腫瘍内注射）；皮下注入を含む皮下注射または皮下沈着（例えば浸透圧ポンプによる）；例えばカテーテルもしくは他の留置装置（placement device）（例えば、多孔性、非孔性またはゼラチン様の材料を含む、坐剤またはインプラント）によるがん部位の領域またはその近傍への直接適用；ならびに吸入が含まれる。二本鎖分子またはベクターの注射または注入は、がん部位またはその近傍で行われることが好ましい。
本発明の二本鎖分子は、単回投与量または複数回投与量で投与することができる。本発明の二本鎖分子の投与が注入による場合、該注入は、単回の持続投与量であってもよく、または複数回の注入によって送達することもできる。組織内への剤の直接注射は、がん部位またはその近傍が好ましい。がん部位またはその近傍の組織への剤の複数回注射が特に好ましい。
【００７５】
当業者はまた、本発明の二本鎖分子を所定の対象に投与するための適当な投与レジメンを容易に決定することもできる。例えば二本鎖分子を、例えばがん部位またはその近傍での単回注射または沈着として、対象に一回で投与することができる。代替的に、二本鎖分子を、約３日〜約２８日、より好ましくは約７日〜約１０日の期間にわたり、１日１回または２回、対象に投与することができる。好ましい投与レジメンでは、二本鎖分子を７日間、１日１回、がん部位またはその近傍に注射する。投与レジメンに複数回投与が含まれる場合、対象に投与される二本鎖分子の有効量は、投与レジメン全体を通して投与される二本鎖分子の総量を含むことができることが理解される。
【００７６】
本発明の二本鎖分子を含む組成物：
上記に加えて、本発明はまた、本発明の二本鎖分子の少なくとも１つまたはそれをコードするベクターを含む医薬組成物も提供する。該医薬組成物は、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の発現を阻害してその結果がん細胞増殖を抑制し、したがってこれらは、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の過剰発現に関連するがん、例えば、急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌および腎細胞癌を治療または予防するために有用であり得る。好ましくは、該医薬組成物を、膀胱癌および肺癌を治療または予防するために用いることができる。
ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子を標的とする本発明の任意の二本鎖分子、または該二本鎖分子をコードする本発明の任意のベクターを、本発明の組成物に関して用いることができる。二本鎖分子およびベクターの詳細については上述している。好ましくは、二本鎖分子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１または３０に相当する核酸配列を標的配列として含む。
本発明の二本鎖分子は、当技術分野で既知の技術に従って、対象に投与する前に医薬組成物として製剤化することが好ましい。本発明の医薬組成物は、少なくとも無菌であり且つパイロジェンフリーであることを特徴とする。本明細書で使用される「医薬組成物」とは、ヒトおよび獣医学的用途のための組成物を含む。本発明の医薬組成物を調製する方法は、例えばその開示全体が参照により本明細書に組み入れられるRemington's Pharmaceutical Science, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1985)に記載のように、当技術分野の技術の範囲内である。
【００７７】
本発明の医薬組成物は、生理学的に許容可能な担体媒体と混合した、本発明の二本鎖分子の少なくとも１つまたはこれをコードするベクター（例えば０．１重量％〜９０重量％）、または該分子の生理学的に許容可能な塩を含む。好ましい生理学的に許容可能な担体媒体は例えば、水、緩衝水、生理食塩水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸等である。
本発明によれば、本組成物は複数種の二本鎖分子を含有してもよく、該分子のそれぞれが、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子に指向性を有し得る。
さらに本発明の組成物は、１つまたは複数の二本鎖分子をコードするベクターを含有してもよい。例えば該ベクターは、１種類または２種類の二本鎖分子をコードしてもよい。代替的に本発明の組成物は複数種のベクターを含有してもよく、該ベクターのそれぞれが別々の二本鎖分子をコードする。
その上、本発明の二本鎖分子は、本発明においてリポソーム内に含有され得る。リポソームの詳細については上述されている。
【００７８】
本発明の医薬組成物はまた、従来の医薬賦形剤および／または添加剤も含み得る。好適な医薬賦形剤には、安定剤、抗酸化剤、浸透圧調整剤、緩衝液およびｐＨ調整剤が含まれる。好適な添加剤には、生理学的に生体適合性がある緩衝液（例えば塩酸トロメタミン）、（例えばＤＴＰＡまたはＤＴＰＡ−ビスアミドなどの）キレート剤（chelant）の添加またはカルシウムキレート錯体（例えばカルシウムＤＴＰＡ、ＣａＮａＤＴＰＡ−ビスアミド）、あるいは任意でカルシウム塩またはナトリウム塩の添加（例えば塩化カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、グルコン酸カルシウムまたは乳酸カルシウム）が含まれる。本発明の医薬組成物は、液体形態での使用のために包装されていても、または凍結乾燥されていてもよい。
固体組成物については、従来の非毒性固体担体、例えば医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム等を使用することができる。
例えば、経口投与用の固体医薬組成物は、上記で列挙された任意の担体および賦形剤と、１０％〜９５％、好ましくは２５％〜７５％の１つまたは複数の本発明の二本鎖分子とを含むことができる。エアロゾル（吸入）投与のための医薬組成物は、上記のようにリポソーム内に封入された、０．０１重量％〜２０重量％、好ましくは１重量％〜１０重量％の１つまたは複数の本発明の二本鎖分子と、噴霧剤とを含むことができる。所望に応じて、担体、例えば鼻内送達用のレシチンを含むことができる。
【００７９】
上記に加えて、本発明の組成物は、本発明の二本鎖分子のインビボ機能を阻害しない限り、他の薬学的に活性な成分を含有してもよい。例えば本組成物は、がんを治療するのに従来使用される化学療法剤を含有してもよい。
別の態様において、本発明はまた、急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌および腎細胞癌などのがん、特に膀胱癌および肺癌を治療するための医薬組成物の製造における、本発明の二本鎖核酸分子の使用も提供する。例えば本発明は、細胞におけるＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の発現を阻害する二本鎖核酸分子の使用に関し、該分子はセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含む。細胞に導入された場合にＪＡＲＩＤ１Ｂの発現および細胞増殖を阻害する能力を有する限り、任意の本発明の二本鎖分子をこの使用のために提供することができる。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１または３０に相当する標的配列を含む二本鎖分子は、本発明の使用に適している。
【００８０】
あるいは本発明は、急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌および腎細胞癌などのがんの治療用の医薬組成物を製造するための方法またはプロセスをさらに提供し、該方法またはプロセスは、薬学的または生理的に許容される担体を、有効成分としての本発明の二本鎖分子とともに製剤化する段階を含む。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１または３０に相当する標的配列を含む二本鎖分子は、本発明の方法またはプロセスに適している。
別の態様において、本発明はまた、急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌および腎細胞癌などのがんの治療用の医薬組成物を製造するための方法またはプロセスも提供し、該方法またはプロセスは、有効成分を薬学的または生理的に許容される担体と混合する段階を含み、該有効成分は、本発明の二本鎖分子である。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１または３０に相当する標的配列を含む二本鎖分子は、本発明の方法またはプロセスに適している。
【００８１】
本発明において、ＪＡＲＩＤ１Ｂを過剰発現しているがんを、
（ａ）本発明の二本鎖分子、
（ｂ）それをコードするＤＮＡ、および
（ｃ）それをコードするベクター
からなる群より選択される少なくとも１つの有効成分によって治療することができる。
がんには、急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌または腎細胞癌が非限定的に含まれる。したがって、有効成分を含む医薬組成物の投与の前に、治療されるがん性細胞または組織におけるＪＡＲＩＤ１Ｂの発現レベルが、同じ臓器の正常細胞と比較して増大しているか否かを確認することが好ましい。したがって、１つの態様において、本発明は、ＪＡＲＩＤ１Ｂを（過剰）発現しているがんを治療するための方法を提供し、該方法は、
ｉ）治療されるがんを有する対象から入手したがん細胞または組織におけるＪＡＲＩＤ１Ｂの発現レベルを測定する段階；
ｉｉ）ＪＡＲＩＤ１Ｂの該発現レベルを正常対照と比較する段階；ならびに
ｉｉｉ）正常対照と比較してＪＡＲＩＤ１Ｂを過剰発現しているがんを有する対象に対して、
（ａ）本発明の二本鎖分子、
（ｂ）それをコードするＤＮＡ、および
（ｃ）それをコードするベクター
からなる群より選択される少なくとも１つの成分を投与する段階
を含んでもよい。
【００８２】
あるいは本発明は、ＪＡＲＩＤ１Ｂを過剰発現しているがんを有する対象への投与に用いるための、
（ａ）本発明の二本鎖分子、
（ｂ）それをコードするＤＮＡ、および
（ｃ）それをコードするベクター
からなる群より選択される少なくとも１つの成分を含む医薬組成物も提供する。言い換えれば、本発明は、治療される対象を
（ａ）本発明の二本鎖分子、
（ｂ）それをコードするＤＮＡ、または
（ｃ）それをコードするベクター
を用いて同定するための方法をさらに提供し、該方法は、対象由来のがん細胞または組織におけるＪＡＲＩＤ１Ｂの発現レベルを測定する段階を含んでよく、該遺伝子の正常対照レベルと比較した該レベルの増大により、該対象が、
（ａ）本発明の二本鎖分子、
（ｂ）それをコードするＤＮＡ、または
（ｃ）それをコードするベクター
によって治療されうるがんを有することが示される。
本発明のがん治療法を、以下により詳細に説明する。
本方法によって治療される対象は、好ましくは哺乳動物である。例示的な哺乳動物には、例えば、ヒト、非ヒト霊長動物、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマおよびウシが非限定的に含まれる。
【００８３】
本発明に従って、対象から採取したがん細胞または組織におけるＪＡＲＩＤ１Ｂの発現レベルが測定される。発現レベルは、当技術分野で既知の方法を用いて、転写（核酸）産物レベルとして測定することができる。例えば、ＪＡＲＩＤ１ＢのｍＲＮＡを、プローブを用いて、ハイブリダイゼーション法（例えばノーザンハイブリダイゼーション）によって定量してもよい。検出は、チップまたはアレイ上で実施してもよい。ＪＡＲＩＤ１Ｂの発現レベルの検出に関しては、アレイの使用が好ましい。当業者は、ＪＡＲＩＤ１Ｂの配列情報を利用して、そのようなプローブを調製することができる。例えば、ＪＡＲＩＤ１ＢのｃＤＮＡをプローブとして使用してもよい。必要に応じて、色素、蛍光物質、および同位元素などの適切な標識でプローブを標識してもよく、該遺伝子の発現レベルを、ハイブリダイズした標識の強度として検出してもよい。
【００８４】
さらに、ＪＡＲＩＤ１Ｂ（例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）の転写産物を、プライマーを用いて増幅に基づく検出法（例えばＲＴ−ＰＣＲ）によって定量してもよい。そのようなプライマーは、該遺伝子についての入手可能な配列情報に基づいて調製してもよい。
具体的には、本発明の方法に用いられるプローブまたはプライマーは、ストリンジェントな条件下、中程度にストリンジェントな条件下、または低ストリンジェントな条件下で、ＪＡＲＩＤ１ＢのｍＲＮＡとハイブリダイズする。本明細書で用いる「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」という語句は、プローブまたはプライマーがその標的配列とはハイブリダイズするが、他の配列とはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、様々な状況下で異なる。より長い配列の特異的ハイブリダイゼーションは、より短い配列よりも高温で観察される。一般に、ストリンジェントな条件の温度は、所定のイオン強度およびｐＨにおける特定の配列の熱融解温度（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。Ｔｍとは、（所定のイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度のもとで）その標的配列に相補的なプローブの５０％が平衡状態で該標的配列とハイブリダイズする温度である。Ｔｍにおいて標的配列は一般に過剰に存在するため、プローブの５０％が平衡状態で占められる。典型的には、ストリンジェントな条件とは、ｐＨ  ７．０〜８．３において塩濃度がナトリウムイオン約１．０  Ｍ未満、典型的にはナトリウムイオン（または他の塩）約０．０１〜１．０  Ｍであり、かつ温度が、短いプローブまたはプライマー（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）に関しては少なくとも約３０℃、およびより長いプローブまたはプライマーに関しては少なくとも約６０℃である条件である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によって達成してもよい。
【００８５】
あるいは、本発明の診断のために翻訳産物を検出してもよい。例えば、ＪＡＲＩＤ１Ｂタンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）の量を測定してもよい。翻訳産物としてのタンパク質の量を測定するための方法には、該タンパク質を特異的に認識する抗体を使用するイムノアッセイ法が含まれる。抗体はモノクローナルでもポリクローナルでもよい。さらに、抗体の任意の断片または修飾抗体がＪＡＲＩＤ１Ｂタンパク質との結合能を保持している限り、該断片または修飾（例えばキメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ等）を検出に使用することができる。該タンパク質の検出のためにこれらの種類の抗体を調製する方法が当技術分野で周知であり、そのような抗体およびその等価物を調製するために本発明において任意の方法を利用することができる。
ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の発現レベルをその翻訳産物に基づいて検出するための別の方法として、ＪＡＲＩＤ１Ｂタンパク質に対する抗体を用いる免疫組織化学解析によって、染色強度を測定してもよい。即ちこの測定において、強い染色は、タンパク質の存在量／レベルの増大を示すと同時に、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の高い発現レベルを示す。
【００８６】
がん細胞における標的遺伝子、例えばＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の発現レベルは、該標的遺伝子の対照レベル（例えば、正常細胞におけるレベル）よりも、例えば１０％、２５％、もしくは５０％増大していれば；または１．１倍超、１．５倍超、２．０倍超、５．０倍超、１０．０倍超、もしくはそれ以上に増大していれば、増大したと判定することができる。
【００８７】
疾患状態（がん性または非がん性）が既知である対象（複数可）から以前に採取して保存していた試料（複数可）を使用することによって、がん細胞と同時に対照レベルを決定してもよい。さらに、治療されるがんを有する臓器の非がん性領域から採取した正常細胞を正常対照として使用してもよい。代替的に、疾患状態が既知である対象の試料において以前に測定されたＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の発現レベル（複数可）を解析することによって得られた結果に基づき、統計学的方法によって対照レベルを決定してもよい。さらに対照レベルは、以前に試験された細胞由来の発現パターンのデータベースに由来することもできる。その上、本発明の一局面によれば、生物試料におけるＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の発現レベルを、複数の参照試料から決定した複数の対照レベルと比較することができる。対象由来の生物試料の組織型と類似した組織型に由来する参照試料から決定した対照レベルを用いることが好ましい。さらに、疾患状態が既知である群におけるＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の発現レベルの標準値を用いることが好ましい。標準値は、当技術分野で既知の任意の方法によって得ることができる。例えば、平均±２Ｓ．Ｄ．または平均±３Ｓ．Ｄ．の範囲を標準値として使用することができる。
【００８８】
本発明の文脈において、非がん性であることが既知である生物試料から決定した対照レベルは「正常対照レベル」と称する。他方で、がん性生物試料から決定した場合、対照レベルは「がん性対照レベル」と称する。
ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の発現レベルが正常対照レベルに比べて増大しているか、またはがん性対照レベルと類似している／同等である場合、対象は、治療されるべきがんを有すると診断される。
より具体的には、本発明は、（ｉ）治療されるべきがんを対象が有する否かを診断し、かつ／または（ｉｉ）がん治療のための対象を選択する方法を提供し、該方法は、
ａ）治療されるべきがんを有することが疑われる対象から入手したがん細胞または組織におけるＪＡＲＩＤ１Ｂの発現レベルを測定する段階；
ｂ）ＪＡＲＩＤ１Ｂの該発現レベルを正常対照レベルと比較する段階；
ｃ）ＪＡＲＩＤ１Ｂの発現レベルが該正常対照レベルと比較して増大しているならば、対象を、治療されるべきがんを有すると診断する段階；および
ｄ）段階ｃ）において対象が治療されるべきがんを有すると診断されたならば、該対象をがん治療のために選択する段階
を含む。
あるいは、そのような方法は、
ａ）治療されるべきがんを有することが疑われる対象から入手したがん細胞または組織におけるＪＡＲＩＤ１Ｂの発現レベルを測定する段階；
ｂ）ＪＡＲＩＤ１Ｂの該発現レベルをがん性対照レベルと比較する段階；
ｃ）ＪＡＲＩＤ１Ｂの発現レベルが該がん性対照レベルと類似しているかまたは同等であるならば、対象を、治療されるべきがんを有すると診断する段階；および
ｄ）段階ｃ）において対象が治療されるべきがんを有すると診断されたならば、該対象をがん治療のために選択する段階
を含む。
【００８９】
本発明はまた、本発明の二本鎖分子またはそれをコードするベクターによって治療することのできるがんに罹患している対象を決定するためのキットも提供し、該キットはまた、がん治療の有効性の評価および／またはモニタリングにおいても有用であり得る。好ましくは、該がんには、急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌、または腎細胞癌が非限定的に含まれる。より具体的には、本キットは、対象由来のがん細胞におけるＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の発現を検出するための少なくとも一つの試薬を含むことが好ましく、該試薬は以下の群より選択されうる：
（ａ）ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子のｍＲＮＡを検出するための試薬；
（ｂ）ＪＡＲＩＤ１Ｂタンパク質を検出するための試薬；および
（ｃ）ＪＡＲＩＤ１Ｂタンパク質の生物活性を検出するための試薬。
ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子のｍＲＮＡの検出に適した試薬には、ＪＡＲＩＤ１Ｂ  ｍＲＮＡと特異的に結合するかそれを同定する核酸、例えばＪＡＲＩＤ１Ｂ  ｍＲＮＡの一部に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。これらの種類のオリゴヌクレオチドは、ＪＡＲＩＤ１Ｂ  ｍＲＮＡに特異的なプライマーおよびプローブによって例示される。これらの種類のオリゴヌクレオチドは、当技術分野で周知の方法に基づいて調製することができる。必要に応じて、ＪＡＲＩＤ１Ｂ  ｍＲＮＡを検出するための試薬を固体マトリックス上に固定化してもよい。さらに、ＪＡＲＩＤ１Ｂ  ｍＲＮＡを検出するための二種類以上の試薬を本キットに含めてもよい。
【００９０】
一方、ＪＡＲＩＤ１Ｂタンパク質の検出に適した試薬には、ＪＡＲＩＤ１Ｂタンパク質に対する抗体が含まれる。抗体はモノクローナルでもポリクローナルでもよい。さらに、抗体の任意の断片または修飾抗体がＪＡＲＩＤ１Ｂタンパク質に対する結合能を保持している限り、該断片または修飾（例えば、キメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖなど）も試薬として用いることができる。タンパク質の検出のためのこれらの種類の抗体を調製する方法は当技術分野において周知であり、かつ本発明において、そのような抗体およびそれらの等価物を調製するためにいかなる方法を用いてもよい。さらに、直接的な連結または間接的な標識技術を介して、抗体をシグナル生成分子で標識してもよい。標識、ならびに、抗体を標識するための方法、およびその標的に対する抗体の結合を検出するための方法は当技術分野において周知であり、任意の標識および方法を本発明のために用いることができる。さらに、ＪＡＲＩＤ１Ｂタンパク質を検出するための二種類以上の試薬を本キットに含めてもよい。
キットは、前述の試薬を二種類以上含んでもよい。例えば、がんを有さない対象または癌に罹患している対象から採取した組織試料は、有用な対照試薬として役立ちうる。本発明のキットはさらに、緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、シリンジおよび、使用説明書を載せた添付文書（例えば、書面、テープ、ＣＤ−ＲＯＭなど）を含む、商業的な観点および利用者の観点から望まれる他の材料を含んでもよい。これらの試薬などは、ラベルを付けた容器中で保持することができる。適した容器には、瓶、バイアルおよび試験管が含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの種々の材料から形成されてよい。
【００９１】
本発明の１つの態様において、試薬がＪＡＲＩＤ１Ｂ  ｍＲＮＡに対するプローブである場合には、少なくとも１つの検出部位を形成するために、該試薬を多孔質ストリップなどの固体マトリックス上に固定化してもよい。多孔質ストリップの測定領域または検出領域は、それぞれが核酸（プローブ）を含む複数の部位を含んでもよい。試験ストリップはまた、陰性対照および／または陽性対照用の部位を含んでもよい。あるいは、対照部位を、試験ストリップから隔てられたストリップ上に配置してもよい。任意で、異なる検出部位は異なる量の固定化核酸を含んでもよい、すなわち、第１の検出部位ではより多い量であり、以後の部位ではそれより少ない量である。試験試料を添加すると、検出可能なシグナルを提示する部位の数により、試料中に存在するＪＡＲＩＤ１Ｂ  ｍＲＮＡ量の定量的指標が得られる。検出部位は好適に検出可能な任意の形状で構成することができ、典型的には、試験ストリップの幅全体にわたるバーまたはドットの形状である。
本発明のキットはさらに、陽性対照試料またはＪＡＲＩＤ１Ｂ標準試料を含んでもよい。本発明の陽性対照試料は、ＪＡＲＩＤ１Ｂ陽性試料を採取した後、それらのＪＡＲＩＤ１Ｂレベルを分析することによって、調製され得る。または、精製されたＪＡＲＩＤ１Ｂタンパク質またはポリヌクレオチドを、ＪＡＲＩＤ１Ｂを発現しない細胞に添加して、陽性試料またはＪＡＲＩＤ１Ｂ標準試料を形成させてもよい。本発明において、精製されたＪＡＲＩＤ１Ｂは組換えタンパク質であってもよい。陽性対照試料のＪＡＲＩＤ１Ｂレベルは、例えばカットオフ値を上回ってもよい。
【００９２】
抗がん化合物のスクリーニング：
本発明は、がん細胞、例えば急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌および腎細胞癌の増殖を阻害する能力を有する化合物をスクリーニングする方法を提供する。本スクリーニング方法は、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子またはタンパク質を標的とすることによって実施できる。本方法によってスクリーニングされた化合物は、急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌および腎細胞癌などのがんを治療するための優れた候補化合物であり得る。特に、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子発現の阻害は膀胱癌および肺癌における細胞増殖の抑制を導くことが確認された（図７）。したがって、本方法によってスクリーニングされた化合物は好ましくは、膀胱癌および肺癌を治療するために用いることができる。
【００９３】
スクリーニング用の剤または化合物：
本発明の文脈において、本スクリーニング法により同定される剤または化合物は、複数の化合物を含む任意の化合物または組成物であってもよい。さらに、本発明のスクリーニング法によって細胞またはタンパク質に曝露される試験剤または試験化合物は、単一の化合物であってもよく、化合物の組み合わせであってもよい。本方法において化合物の組み合わせを使用する場合、該化合物を連続的にまたは同時に接触させることができる。
本発明のスクリーニング法においては、任意の試験剤または試験化合物、例えば細胞抽出物、細胞培養物上清、発酵微生物の生成物、海洋生物由来の抽出物、植物抽出物、精製タンパク質または粗タンパク質、ペプチド、非ペプチド化合物、合成微小分子化合物（核酸構築物、例えばアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、およびアプタマー等または抗体を含む）、および天然化合物を使用することができる。本発明の試験剤または試験化合物は、（１）生物学的ライブラリ法、（２）空間的にアドレス可能なパラレル固相ライブラリ法または溶液相ライブラリ法、（３）逆重畳積分を必要とする合成ライブラリ法、（４）「一ビーズ一化合物」ライブラリ法、および（５）アフィニティークロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリ法を含む、当技術分野で既知のコンビナトリアルライブラリ法における多数のアプローチのいずれかを用いて得ることもできる。アフィニティークロマトグラフィー選択を用いる生物学的ライブラリ法はペプチドライブラリに限定されるが、他の４つのアプローチは化合物のペプチドライブラリ、非ペプチドオリゴマーライブラリ、または低分子ライブラリにも適用可能である（Lam, Anticancer Drug Des 1997, 12: 145-67）。分子ライブラリを合成する方法の例は、当技術分野において見つけることができる（DeWitt et al., Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90: 6909-13、Erb et al., Proc Natl Acad Sci USA 1994, 91: 11422-6、Zuckermann et al., J Med Chem 37: 2678-85, 1994、Cho et al., Science 1993, 261: 1303-5、Carell et al., Angew Chem Int Ed Engl 1994, 33: 2059、Carell et al., Angew Chem Int Ed Engl 1994, 33: 2061、Gallop et al., J Med Chem 1994, 37: 1233-51）。化合物のライブラリは、溶液中（Houghten, Bio/Techniques 1992, 13: 412-21を参照されたい）、または、ビーズ（Lam, Nature 1991, 354: 82-4）、チップ（Fodor, Nature 1993, 364: 555-6）、細菌（米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（米国特許第５，５７１，６９８号、同第５，４０３，４８４号、および同第５，２２３，４０９号）、プラスミド（Cull et al., Proc Natl Acad Sci USA 1992, 89: 1865-9）、もしくはファージ（Scott and Smith, Science 1990, 249: 386-90、Devlin, Science 1990, 249: 404-6、Cwirla et al., Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87: 6378-82、Felici, J Mol Biol 1991, 222: 301-10、米国特許出願第２００２１０３３６０号）の表面に提供され得る。
【００９４】
本スクリーニング法のいずれかによってスクリーニングされた化合物の構造の一部が付加、欠失、および／または置換により変換された化合物は、本発明のスクリーニング法により得られる剤または化合物に含まれる。
さらに、スクリーニングした試験剤または試験化合物がタンパク質である場合、該タンパク質をコードするＤＮＡを得るために、該タンパク質の全アミノ酸配列を決定して該タンパク質をコードする核酸配列を推定してもよく、または得られた該タンパク質の部分アミノ酸配列を分析し、該配列に基づいてオリゴＤＮＡをプローブとして調製し、該プローブを用いてｃＤＮＡライブラリをスクリーニングして、該タンパク質をコードするＤＮＡを得ることができる。得られたＤＮＡを、がんを治療または予防するための候補である試験剤の調製における有用性について確認する。
本明細書中に記載されるスクリーニングにおいて有用な試験剤または試験化合物とは、ＪＡＲＩＤ１Ｂタンパク質または元のタンパク質の生物活性が欠如したその部分ペプチドにインビボで特異的に結合する、抗体でもあり得る。
試験剤または試験化合物のライブラリの構築は当技術分野で周知であるが、以下本明細書において、本発明のスクリーニング法に関する試験剤の同定およびそのような剤または化合物のライブラリの構築についてのさらなるガイダンスを提供する。
【００９５】
（ｉ）分子モデリング：
試験剤または試験化合物のライブラリの構築は、求められる特性を有することが既知である化合物の分子構造、および／または、阻害される標的分子の、すなわちＪＡＲＩＤ１Ｂタンパク質の分子構造を知ることでより容易になる。さらなる評価に適した試験剤または試験化合物を予備スクリーニングするための1つのアプローチは、試験剤とＪＡＲＩＤ１Ｂタンパク質との間の相互作用のコンピュータモデリングである。
コンピュータモデリング技術により、選択した分子の三次元原子構造の可視化、および該分子と相互作用すると考えられる新たな化合物の合理的設計が可能になる。三次元の構築は典型的に、選択した分子のＸ線結晶解析またはＮＭＲイメージングのデータに依存する。分子ダイナミクスは力場データを必要とする。コンピュータグラフィックシステムによって、新たな化合物が標的分子にどのように結合するかを予測することが可能になり、該化合物および該標的分子の構造の実験的操作が結合特異度を改善できるようになる。軽微な変化を一方または両方に加えた場合に、分子−化合物間の相互作用がどうなるのかを予測するには、通常は分子設計プログラムと使用者との間にユーザーフレンドリーなメニュー形式のインターフェースを備えた、分子力学ソフトウェアおよび計算集約型（computationally intensive）コンピュータが必要である。
【００９６】
上記に概説される分子モデリングシステムの例には、ＣＨＡＲＭｍプログラムおよびＱＵＡＮＴＡプログラム（Polygen Corporation，Waltham，Mass）が含まれる。ＣＨＡＲＭｍは、エネルギー最小化および分子ダイナミクスの機能を実行する。ＱＵＡＮＴＡは分子構造の構築、グラフィックモデリング、および分析を実行する。ＱＵＡＮＴＡにより、互いに対する分子のインタラクティブな構築、修飾、可視化、および挙動分析が可能になる。
多数の論文、例えばRotivinen et al. Acta Pharmaceutica Fennica 1988, 97: 159-66、Ripka, New Scientist 1988, 54-8、McKinlay & Rossmann, Annu Rev Pharmacol Toxiciol 1989, 29: 111-22、Perry & Davies, Prog Clin Biol Res 1989, 291: 189-93、Lewis & Dean, Proc R Soc Lond 1989, 236: 125-40, 141-62、および核酸成分のモデル受容体に関するAskew et al., J Am Chem Soc 1989, 111: 1082-90で、特異的タンパク質と相互作用する薬物のコンピュータモデリングが概説されている。
化学物質をスクリーニングおよび図式化する他のコンピュータプログラムは、BioDesign, Inc.（Pasadena，Calif.）、Allelix, Inc（Mississauga，Ontario，Canada）、およびHypercube, Inc.（Cambridge，Ontario）等の企業から市販されている。例えば、DesJarlais et al., J Med Chem 1988, 31: 722-9、Meng et al., J Computer Chem 1992, 13: 505-24、Meng et al., Proteins 1993, 17: 266-78、Shoichet et al., Science 1993, 259: 1445-50を参照されたい。
後述のように、推定インヒビターが同定されたら、コンビナトリアル化学技術を用いて、同定された推定インヒビターの化学的構造に基づいて任意の数の変異体を構築することができる。得られた推定インヒビターまたは「試験剤」のライブラリを、本方法を用いてスクリーニングし、がんを治療または予防する試験剤または試験化合物を同定してもよい。
【００９７】
（ｉｉ）コンビナトリアル化学合成：
試験剤または試験化合物のコンビナトリアルライブラリは、既知のインヒビター中に存在するコア構造の知識を必要とする合理的薬物設計プログラムの一部として作製してもよい。このアプローチにより、適当なサイズにライブラリを維持することが可能になり、これによってハイスループットスクリーニングが容易になる。代替的に、ライブラリを構成する分子ファミリーの全順列を単に合成することにより、単純な、特に短い重合体分子ライブラリを構築してもよい。この後者のアプローチの一例は、全ペプチドが６アミノ酸長のライブラリである。そのようなペプチドライブラリは６アミノ酸ごとの配列順列を含み得る。このタイプのライブラリは、線形コンビナトリアル化学ライブラリと称される。
コンビナトリアル化学ライブラリの調製は当業者に周知であり、化学合成または生物学的合成のいずれによって作成してもよい。コンビナトリアル化学ライブラリには、ペプチドライブラリ（例えば米国特許第５，０１０，１７５号、Furka, Int J Pept Prot Res 1991, 37: 487-93、Houghten et al., Nature 1991, 354: 84-6を参照されたい）が非限定的に含まれる。化学的多様性ライブラリを作成するための他の化学を使用することもできる。そのような化学としては、ペプチド（例えば国際公開公報第９１／１９７３５号）、コード化ペプチド（例えば国際公開公報第９３／２０２４２号）、ランダムバイオオリゴマー（random bio-oligomer）（例えば国際公開公報第９２／０００９１号）、ベンゾジアゼピン（例えば米国特許第５，２８８，５１４号）、ヒダントイン、ベンゾジアゼピン、およびジペプチド等のダイバーソマー（diversomer）（DeWitt et al., Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90: 6909-13）、ビニローグ（ｖｉｎｙｌｏｇｏｕｓ）ポリペプチド（Hagihara et al., J Amer Chem Soc 1992, 114: 6568）、グルコース骨格を有する非ペプチド性（nonpeptidal）ペプチド模倣体（Hirschmann et al., J Amer Chem Soc 1992, 114: 9217-8）、低分子化合物ライブラリの類似有機合成（Chen et al., J. Amer Chem Soc 1994, 116: 2661）、オリゴカルバメート（oligocarbamate）（Cho et al., Science 1993, 261: 1303）、および／またはペプチジルホスホネート（peptidylphosphonate）（Campbell et al., J Org Chem 1994, 59: 658）、核酸ライブラリ（Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology 1995 supplement: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, USAを参照されたい）、ペプチド核酸ライブラリ（例えば米国特許第５，５３９，０８３号を参照されたい）、抗体ライブラリ（例えば、Vaughan et al., Nature Biotechnology 1996, 14(3): 309-14、および国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／１０２８７号を参照されたい）、糖質ライブラリ（例えば、Liang et al., Science 1996, 274: 1520-22、米国特許第５，５９３，８５３号を参照されたい）、ならびに有機低分子ライブラリ（例えば、ベンゾジアゼピン（Gordon EM. Curr Opin Biotechnol. 1995 Dec 1; 6(6): 624-31.）、イソプレノイド（米国特許第５，５６９，５８８号）、チアゾリジノンおよびメタチアゾノン（metathiazanone）（米国特許第５，５４９，９７４号）、ピロリジン（米国特許第５，５２５，７３５号および同第５，５１９，１３４号）、モルホリノ化合物（米国特許第５，５０６，３３７号）、ベンゾジアゼピン（米国特許第５，２８８，５１４号）等を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【００９８】
（ｉｉｉ）ファージディスプレイ：
別のアプローチは、ライブラリを作成するために組換えバクテリオファージを使用する。この「ファージ法」（Scott & Smith, Science 1990, 249: 386-90、Cwirla et al., Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87: 6378-82、Devlin et al., Science 1990, 249: 404-6）を用いて、非常に大きなライブラリを構築することができる（例えば１０６個〜１０８個の化学物質）。第２のアプローチは、主として化学的な方法を使用するが、Geysenの方法（Geysen et al., Molecular Immunology 1986, 23: 709-15、Geysen et al., J Immunologic Method 1987, 102: 259-74）、およびFodor et al.の方法（Science 1991, 251: 767-73）がその例である。Furka et al.（14th International Congress of Biochemistry 1988, Volume #5, Abstract FR: 013; Furka, Int J Peptide Protein Res 1991, 37: 487-93）、Houghten（米国特許第４，６３１，２１１号）、およびRutter et al.（米国特許第５，０１０，１７５号）は、アゴニストまたはアンタゴニストとして試験可能なペプチドの混合物を生成する方法を記載している。
コンビナトリアルライブラリを調製するための装置は市販されている（例えば、３５７  ＭＰＳ、３９０  ＭＰＳ（Advanced Chem Tech，Louisville KY）、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ（Rainin，Woburn，MA）、４３３Ａ（Applied Biosystems，Foster City，CA）、９０５０  Ｐｌｕｓ（Millipore，Bedford，MA）を参照されたい）。また、多数のコンビナトリアルライブラリ自体も市販されている（例えば、ComGenex（Princeton，N.J.）、Tripos, Inc.（St. Louis，MO）、3D Pharmaceuticals（Exton，PA）、Martek Biosciences（Columbia，MD）等を参照されたい）。
【００９９】
ＪＡＲＩＤ１Ｂに結合する剤または化合物のスクリーニング：
本発明において、正常器官での発現と比べて、急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌、および腎細胞癌ではＪＡＲＩＤ１Ｂの過剰発現が検出された（表３）。したがって本発明は、ＪＡＲＩＤ１Ｂタンパク質に結合する剤をスクリーニングする方法を提供する。そのようながんにおけるＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の発現により、ＪＡＲＩＤ１Ｂタンパク質に結合する剤または化合物は、がん細胞の増殖を抑制することおよびしたがってがんを治療または予防するのに有用であることが予想される。したがって本発明はまた、ＪＡＲＩＤ１Ｂポリペプチドを用いて、がん細胞の増殖を抑制する剤または化合物をスクリーニングする方法、および肺癌を治療または予防するための候補剤または候補化合物をスクリーニングする方法も提供する。具体的には、このスクリーニング法の１つの態様は、
（ａ）試験剤または試験化合物を、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子に由来するＪＡＲＩＤ１Ｂポリペプチドと接触させる段階；
（ｂ）該ポリペプチドと該試験剤または試験化合物との間の結合活性を検出する段階；および
（ｃ）該ポリペプチドに結合する試験剤または試験化合物を候補剤または候補化合物として選択する段階
を含む。
本発明に従って、細胞増殖の阻害に対する試験剤もしくは試験化合物の治療効果、またはＪＡＲＩＤ１Ｂ関連疾患を治療もしくは予防するための候補剤もしくは候補化合物の治療効果を、評価することができる。したがって本発明は、がん細胞の増殖を抑制する候補剤または候補化合物をスクリーニングするための方法、および、がんを治療または予防するための候補剤または候補化合物をスクリーニングするための方法も提供する。
【０１００】
より具体的には、本方法は、
（ａ）試験剤または試験化合物を、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子に由来するＪＡＲＩＤ１Ｂポリペプチドと；
（ｂ）該ポリペプチドと該試験または試験化合物との間の結合レベルを検出する段階；
（ｃ）（ｂ）の結合レベルを、該試験剤または試験化合物の非存在下で検出した結合レベルと比較する段階；および
（ｄ）（ｃ）の結合レベルを、該試験剤または試験化合物の治療効果と関連付ける段階
を含む。
本発明において、治療効果は、ＪＡＲＩＤ１Ｂポリペプチドの結合レベルと相関し得る。例えば、試験剤または試験化合物がＪＡＲＩＤ１Ｂポリペプチドに結合する場合には、該試験剤または試験化合物を、治療効果を有する候補剤または候補化合物として同定または選択することができる。代替的に、試験剤または試験化合物がＪＡＲＩＤ１Ｂポリペプチドに結合しない場合には、該試験剤または試験化合物を、有意な治療効果を有さない剤または化合物として同定することができる。
【０１０１】
本発明の方法を以下でより詳細に説明する。
本発明のスクリーニング方法に使用されるＪＡＲＩＤ１Ｂポリペプチドは、組み換えポリペプチドまたは天然由来のタンパクもしくはその部分ペプチドであり得る。試験剤または試験化合物と接触させるポリペプチドは例えば、精製ポリペプチド、可溶性タンパク質、担体と結合した形態、または他のポリペプチドと融合した融合タンパク質であり得る。
例えば、ＪＡＲＩＤ１Ｂポリペプチドと結合するタンパク質をスクリーニングする方法としては、当業者に周知の多くの方法を用いることができる。そのようなスクリーニングは例えば、特に以下の様式の、免疫沈降法によって実施することができる。ＪＡＲＩＤ１Ｂポリペプチドをコードする遺伝子を外来遺伝子に対する発現ベクター、例えばｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐｃＤＮＡ  Ｉ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＣＡＧＧＳおよびｐＣＤ８に挿入することによって、該遺伝子を宿主（例えば、動物）細胞等において発現させる。
発現に使用するプロモーターは、一般的に使用可能な任意のプロモーターであってよく、例えばＳＶ４０初期プロモーター（Rigby in Williamson（ed.), Genetic Engineering, vol. 3. Academic Press, London, 83-141（1982））、ＥＦ−αプロモーター（Kim et al., Gene 91: 217-23（1990））、ＣＡＧプロモーター（Niwa et al., Gene 108: 193(1991)）、ＲＳＶ  ＬＴＲプロモーター（Cullen, Methods in Enzymology 152: 684-704(1987)）、ＳＲαプロモーター（Takebe et al., Mol Cell Biol 8: 466(1988)）、ＣＭＶ前初期プロモーター（Seed and Aruffo, Proc Natl Acad Sci USA 84: 3365-9(1987)）、ＳＶ４０後期プロモーター（Gheysen and Fiers, J Mol Appl Genet 1: 385-94(1982)）、アデノウイルス後期プロモーター（Kaufman et al., Mol Cell Biol 9: 946(1989)）、ＨＳＶ  ＴＫプロモーター等が含まれる。
【０１０２】
外来遺伝子を発現させるために、任意の方法、例えば電気穿孔法（Chu et al., Nucleic Acids Res 15: 1311-26(1987)）、リン酸カルシウム法（Chen and Okayama, Mol Cell Biol 7: 2745-52(1987)）、ＤＥＡＥデキストラン法（Lopata et al., Nucleic Acids Res 12: 5707-17(1984)、Sussman and Milman, Mol Cell Biol 4: 1641-3(1984)）、リポフェクチン法（Derijard B., Cell 76: 1025-37(1994)、Lamb et al., Nature Genetics 5: 22-30(1993)、Rabindran et al., Science 259: 230-4(1993)）等に従って、宿主細胞への遺伝子の導入を実施することができる。
ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子によってコードされるポリペプチドは、その特異性が明らかになっているモノクローナル抗体の認識部位（エピトープ）を該ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に導入することによって、モノクローナル抗体のエピトープを含む融合タンパク質として発現させることができる。市販のエピトープ−抗体システムを用いることができる（Experimental Medicine 13: 85-90（1995））。その複数のクローニング部位を使用することによって、例えばβ−ガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等との融合タンパク質を発現することができるベクターが、市販されている。また、融合によってＪＡＲＩＤ１Ｂポリペプチドの特性が変わらないように、数アミノ酸〜１２アミノ酸からなる小さなエピトープのみを導入することによって調製された、融合タンパク質も報告されている。ポリヒスチジン（Ｈｉｓタグ）、インフルエンザ凝集素ＨＡ、ヒトｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−ＧＰ）、Ｔ７遺伝子１０タンパク質（Ｔ７タグ）、ヒト単純ヘルペスウイルス糖タンパク質（ＨＳＶタグ）、Ｅタグ（モノクローナルファージ上のエピトープ）等のエピトープ、およびこれらを認識するモノクローナル抗体は、ＪＡＲＩＤ１Ｂポリペプチドに結合するタンパク質をスクリーニングするためのエピトープ−抗体システムとして使用することができる（Experimental Medicine 13: 85-90（1995））。
【０１０３】
免疫沈降において、適当な界面活性剤を使用して調製された細胞溶解物にこれらの抗体を加えることによって、免疫複合体が形成される。免疫複合体は、ＪＡＲＩＤ１Ｂポリペプチドと、該ポリペプチドとの結合能を含むポリペプチドと、抗体とからなる。上記エピトープに対する抗体の使用に加えて、ＪＡＲＩＤ１Ｂポリペプチドに対する抗体を使用して免疫沈降を実施することもできる。抗体がマウスＩｇＧ抗体である場合、例えばプロテインＡセファロースまたはプロテインＧセファロースによって免疫複合体を沈降させることができる。ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子によってコードされるポリペプチドを、ＧＳＴなどのエピトープとの融合タンパク質として調製する場合、免疫複合体は、ＪＡＲＩＤ１Ｂポリペプチドに対する抗体の使用と同じように、これらのエピトープと特異的に結合する物質、例えばグルタチオン−セファロース４Ｂを用いて形成することができる。
免疫沈降は、例えば文献（Harlow and Lane, Antibodies, 511-52, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York（1988））の方法に従ってまたは準じて実施することができる。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは免疫沈降タンパク質の解析に一般的に使用され、結合したタンパク質を、適当な濃度のゲルを用いて該タンパク質の分子量によって解析することができる。ＪＡＲＩＤ１Ｂポリペプチドに結合したタンパク質は、クマシー染色または銀染色などの一般的な染色法では検出が困難であるため、放射性同位体、３５Ｓ−メチオニンまたは３５Ｓ−システインを含有する培養培地中で細胞を培養する段階、細胞中のタンパク質を標識する段階、該タンパク質を検出する段階により、該タンパク質に対する検出感度を向上させることができる。タンパク質の分子量が明らかである場合、標的タンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから直接精製することができ、その配列を決定することができる。
【０１０４】
ＪＡＲＩＤ１Ｂポリペプチドを用いて該ポリペプチドと結合するタンパク質をスクリーニングする方法として、例えばウェスト−ウェスタンブロット解析（Skolnik et al., Cell 65: 83-90（1991））を使用することができる。具体的には、ファージベクター（例えばＺＡＰ）を用いて、ＪＡＲＩＤ１Ｂポリペプチドと結合するタンパク質を発現していると予想される培養細胞からｃＤＮＡライブラリを調製する段階、ＬＢ−アガロース上で該タンパク質を発現させる段階、発現した該タンパク質をフィルター上に固定する段階、精製および標識したＪＡＲＩＤ１Ｂポリペプチドを上記のフィルターと反応させる段階、ならびに、標識に従って、ＪＡＲＩＤ１Ｂポリペプチドと結合するタンパク質を発現したプラークを検出することによって、ＪＡＲＩＤ１Ｂポリペプチドと結合するタンパク質を得ることができる。本発明のポリペプチドは、ビオチンとアビジンとの結合を利用することによって、またはＪＡＲＩＤ１Ｂポリペプチドと特異的に結合する抗体、またはＪＡＲＩＤ１Ｂポリペプチドと融合したペプチドもしくはポリペプチド（例えばＧＳＴ）を利用することによって、標識してもよい。放射性同位体または蛍光色素等を使用する方法を使用してもよい。
あるいは、本発明のスクリーニング方法の別の態様において、細胞を利用するツーハイブリッドシステムを使用してもよい（「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ」、「Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ」、「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ」（Clontech）、「ＨｙｂｒｉＺＡＰ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ」（Stratagene）、「Dalton and Treisman, Cell 68: 597-612（1992）」、「Fields and Sternglanz, Trends Genet 10: 286-92（1994）」を参照されたい）。
ツーハイブリッドシステムにおいて、ＪＡＲＩＤ１Ｂポリペプチドを、ＳＲＦ結合領域またはＧＡＬ４結合領域に融合させ、酵母細胞内で発現させる。ＪＡＲＩＤ１Ｂポリペプチドと結合するタンパク質を発現することが予想される細胞から発現したらＶＰ１６またはＧＡＬ４の転写活性化領域と融合するように、ｃＤＮＡライブラリを調製する。次に、該ｃＤＮＡライブラリを上記の酵母細胞に導入し、検出された陽性クローン（ＪＡＲＩＤ１Ｂポリペプチドと結合するタンパク質が酵母細胞で発現すると、両者の結合がレポーター遺伝子を活性化し、これにより陽性クローンが検出可能となる）から、該ライブラリに由来するｃＤＮＡを単離する。上記で単離されたｃＤＮＡを大腸菌に導入する段階および該タンパク質を発現させる段階によって、該ｃＤＮＡによってコードされたタンパク質を調製することができる。ＨＩＳ３遺伝子に加えて、レポーター遺伝子として、例えばＡｄｅ２遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、ＣＡＴ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子等を用いることができる。
【０１０５】
ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子によってコードされるポリペプチドと結合する剤または化合物を、アフィニティークロマトグラフィを用いてスクリーニングすることもできる。例えば、ＪＡＲＩＤ１Ｂポリペプチドをアフィニティーカラムの担体上に固定化してもよく、ＪＡＲＩＤ１Ｂポリペプチドと結合可能なタンパク質を含有する試験剤または試験化合物を該カラムにアプライする。本明細書における試験剤または試験化合物は例えば、細胞抽出物、細胞溶解物等であり得る。試験剤をロードした後、カラムを洗浄し、ＪＡＲＩＤ１Ｂポリペプチドと結合した剤を調製することができる。試験剤または試験化合物がタンパク質である場合、得られたタンパク質のアミノ酸配列を解析し、該配列に基づきオリゴＤＮＡを合成し、プローブとして該オリゴＤＮＡを用いてｃＤＮＡライブラリをスクリーニングして、該タンパク質をコードするＤＮＡを得る。
表面プラズモン共鳴現象を用いるバイオセンサが、本発明において結合した剤を検出または定量するための手段として使用され得る。そのようなバイオセンサを使用する場合、ＪＡＲＩＤ１Ｂポリペプチドと試験剤との相互作用は、標識を用いることなく微量のポリペプチドだけを用いて、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムで観察することができる（例えばＢＩＡｃｏｒｅ、Pharmacia）。したがって、ＢＩＡｃｏｒｅなどのバイオセンサを用いて、ＪＡＲＩＤ１Ｂポリペプチドと試験剤または試験化合物との結合を評価することが可能である。
【０１０６】
ＪＡＲＩＤ１Ｂタンパク質と結合するタンパク質だけでなく化学物質（アゴニストおよびアンタゴニストを含む）も単離するための、固定化ＪＡＲＩＤ１Ｂポリペプチドを合成化学物質、または天然物質バンクまたはランダムファージペプチド提示ライブラリに曝露した場合に結合する分子をスクリーニングする方法、および、コンビナトリアル化学技術に基づきハイスループットを用いてスクリーニングする方法（Wrighton et al., Science 273: 458-64（1996）、Verdine, Nature 384: 11-13（1996）、Hogan, Nature 384: 17-9(1996)）は、当業者に既知である。
本発明において、ＪＡＲＩＤ１Ｂの発現を抑制することにより、細胞増殖が低下することが明示される。したがって、ＪＡＲＩＤ１Ｂポリペプチドと結合する候補化合物のスクリーニングによって、がんを治療または予防する可能性のある候補化合物を同定することができる。これらの候補化合物ががんを治療または予防する可能性は、がんに対する治療剤または治療化合物を同定するための二次および／またはさらなるスクリーニングによって評価することができる。
【０１０７】
ＪＡＲＩＤ１Ｂの生物活性を抑制する剤または化合物のスクリーニング：
ＪＡＲＩＤ１Ｂタンパク質はヒストンＨ３脱メチル化活性を有しており（Yamane K. et al. Mol Cell 2007;25: 801-12）、本発明によれば、該タンパク質は、Ｅ２Ｆ１遺伝子およびＥ２Ｆ２遺伝子の発現を促進する活性（図９）、細胞増殖を促進する活性（図７Ｃ）または抗アポトーシス活性（図７Ｅ）を有する。これらの生物活性を利用して、本発明は、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の過剰発現に関連するがん細胞の増殖を抑制する剤または化合物をスクリーニングするための方法、および、そのようながんを治療または予防するための候補剤または候補化合物をスクリーニングするための方法を提供する。したがって本発明は、
（ａ）試験剤または試験化合物を、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子に由来するポリペプチドと接触させる段階；
（ｂ）段階（ａ）のポリペプチドの生物活性を検出する段階；および
（ｃ）該生物活性を、試験剤または試験化合物の非存在下における生物活性と比較して抑制する該試験剤または試験化合物を、候補剤または候補化合物として選択する段階
を含む方法を提供する。
本発明に従って、細胞増殖の阻害に対する試験剤もしくは試験化合物の治療効果、またはＪＡＲＩＤ１Ｂ関連がんを治療もしくは予防するための候補剤もしくは候補化合物の治療効果を評価することができる。したがって本発明はまた、ＪＡＲＩＤ１Ｂポリペプチドまたはその断片を用いて、細胞増殖を阻害するための候補剤もしくは候補化合物、またはＪＡＲＩＤ１Ｂ関連がんを治療もしくは予防するための候補剤もしくは候補化合物をスクリーニングする方法も提供し、該方法は、
ａ）試験剤または試験化合物を、ＪＡＲＩＤ１Ｂポリペプチドまたはその機能的断片と接触させる段階；および
ｂ）段階（ａ）のポリペプチドまたは断片の生物活性を検出する段階；および
ｃ）ｂ）の生物活性を試験剤または試験化合物の治療効果と関連付ける段階
を含む。
【０１０８】
本発明において、治療効果はＪＡＲＩＤ１Ｂポリペプチドまたはその機能的断片の生物活性と相関し得る。例えば、試験剤または試験化合物が、該試験剤または試験化合物の非存在下で検出されたレベルと比較して、ＪＡＲＩＤ１Ｂポリペプチドまたはその機能的断片の生物活性を抑制または阻害する場合には、該試験剤または試験化合物を、治療効果を有する候補剤または候補化合物として同定または選択することができる。あるいは、試験剤または試験化合物が、該試験剤または試験化合物の非存在下で検出されたレベルと比較して、ＪＡＲＩＤ１Ｂポリペプチドまたはその機能的断片の生物活性を抑制も阻害もしない場合には、該試験剤または試験化合物を、有意な治療効果を有さない剤または化合物として同定することができる。
本発明の方法を、以下でより詳細に説明する。
ＪＡＲＩＤ１Ｂタンパク質の生物活性を含む限り、任意のポリペプチドをスクリーニングのために用いることができる。そのような生物活性には、ヒストンＨ３脱メチル化活性、Ｅ２Ｆ１遺伝子およびＥ２Ｆ２遺伝子の発現を促進する活性、細胞増殖活性ならびに抗アポトーシス活性が含まれる。例えば、ＪＡＲＩＤ１Ｂタンパク質を用いることができ、これらのタンパク質と機能的に等価なポリペプチドを用いることもできる。そのようなポリペプチドは、細胞によって内因的または外因的に発現されうる。
【０１０９】
別の局面において、本発明はまた、「ＪＡＲＩＤ１Ｂに結合する剤または化合物のスクリーニング」に記載された方法に続くスクリーニング方法も提供し、該方法は、
ａ）試験剤または試験化合物を、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子に由来するＪＡＲＩＤ１Ｂポリペプチドと接触させる段階；
ｂ）該ポリペプチドと該試験剤または試験化合物との間の結合を検出する段階；
ｃ）該ポリペプチドと結合する試験剤または試験化合物を選択する段階；
ｄ）段階ｃ）において選択された試験剤または試験化合物を、ＪＡＲＩＤ１Ｂポリペプチドと接触させる段階；
ｅ）該ポリペプチドの生物活性を、該試験剤または試験化合物の非存在下で検出される生物活性と比較する段階；および
ｆ）該ポリペプチドの生物活性を抑制する試験剤または試験化合物を、がんを治療または予防するための候補剤または候補化合物として選択する段階
を含む。
このスクリーニングにより単離された剤または化合物は、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子によってコードされるポリペプチドのアンタゴニストの候補である。「アンタゴニスト」という用語は、ポリペプチドに結合することによってその機能を阻害する分子を指す。該用語はまた、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の発現を減少させるまたは阻害する分子を指す。さらに、このスクリーニングによって単離された剤または化合物は、ＪＡＲＩＤ１Ｂポリペプチドと分子（ＤＮＡおよびタンパク質を含む）とのインビボでの相互作用を阻害する剤または化合物の候補である。
本発明の方法において検出されるべき生物活性が細胞増殖である場合には、例えば、ＪＡＲＩＤ１Ｂポリペプチドを発現する細胞を調製し、該細胞を試験化合物の存在下で培養して、細胞増殖速度を決定、細胞周期等を測定、および生存細胞またはコロニー形成活性を測定することによって、それを検出することができる。ＪＡＲＩＤ１Ｂを発現した細胞の増殖速度を減少させる化合物を、がんを治療または予防するための候補化合物として選択する。
【０１１０】
より具体的には、本方法は、
（ａ）試験化合物を、ＪＡＲＩＤ１Ｂを過剰発現している細胞と接触させる段階；
（ｂ）細胞増殖活性を測定する段階；および
（ｃ）試験化合物の非存在下における細胞増殖活性と比較して、細胞増殖活性を減少させる該試験化合物を選択する段階
を含む。
好ましい態様において、本発明の方法は以下の段階をさらに含み得る：
（ｄ）ＪＡＲＩＤ１Ｂをほとんどまたは全く発現しない細胞に対して全く影響を与えない試験化合物を選択する段階
を含む。
本方法において検出される生物活性が抗アポトーシス活性である場合、さまざまな市販のキットを用いるサブＧ１細胞数の測定、ＴＵＮＥＬ法またはＬＭ−ＰＣＲ法などの当業者によって行われる通常の方法により、決定することができる。例えば、サブＧ１細胞数は、ＦＡＣＳを用いることによって決定することができる。またアポトーシスは、付属のマニュアルに従ったＡｐｏｔａｇ  Ｄｉｒｅｃｔ（ｏｎｃｏｒ）を用いるＴＵＮＥＬ法またはＡｐｏＡｌｅｒｔ  ＬＭ−ＰＣＲラダーアッセイキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いるＬＭ−ＰＣＲによって調べることもできる。
【０１１１】
本発明の方法において検出される生物活性が脱メチル化活性である場合には、ＪＡＲＩＤ１Ｂポリペプチドを、基質（例えば、トリ−またはジ−メチル化リシン４を含むヒストンＨ３）と、該基質の脱メチル化に適した条件下で接触させて、基質の脱メチル化レベルを検出することによって、測定することができる。
より具体的には、本方法は、
（ａ）ＪＡＲＩＤ１Ｂポリペプチドを、脱メチル化される基質と、試験剤または試験化合物の存在下、該基質の脱メチル化を可能にする条件下で接触させる段階；
（ｂ）該基質のメチル化レベルを検出する段階；および
（ｃ）該基質のメチル化レベルを、試験剤の非存在下で検出されるメチル化レベルと比較して増大させる試験剤または試験化合物を、候補剤として選択する段階
を含む。
好ましくは、ＪＡＲＩＤ１Ｂポリペプチドによって脱メチル化される基質は、ヒストンＨ３または、ヒストンＨ３のトリメチル化リシン４もしくはジメチル化リシン４を含むその断片である。
【０１１２】
本発明において、ＪＡＲＩＤ１Ｂポリペプチドの脱メチル化活性は、当技術分野において公知の方法によって測定することができる。例えば、ＪＡＲＩＤ１Ｂポリペプチドを、標識されたメチル化部位を有する基質とともに、脱メチル化に適した条件下でインキュベーションすることができる。例えば、第４のアミノ酸残基にトリ−もしくはジ−［メチル−１４Ｃ］−リシン、またはトリ−もしくはジ−［メチル−３Ｈ］−リシンを有するヒストンＨ３ペプチドを、脱メチル化のための基質として好ましく用いることができる。脱メチル化活性は、インキュベーション後の基質における放射活性に基づいて測定することができる（すなわち、基質における放射活性が高ければ高いほど、ＪＡＲＩＤ１Ｂポリペプチドの脱メチル化活性がより低いことが示される）。基質における放射活性は、例えば、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびオートラジオグラフィーによって検出することができる。または、インキュベーションの後に、ゲル濾過および免疫沈降などの従来法によって基質をＪＡＲＩＤ１Ｂから分離させて、基質における放射活性を当技術分野において周知の方法によって測定することもできる。基質におけるメチル基と結合できる他の適した標識、例えば発色性および蛍光性の標識など、ならびにこれらの標識を検出する方法は、当技術分野において公知である。
【０１１３】
あるいは、ＪＡＲＩＤ１Ｂポリペプチドの脱メチル化活性を、質量分析法を用いて、またはメチル化基質を選択的に認識する試薬を用いて測定してもよい。例えば、メチル化基質に対する抗体を、そのような試薬として好ましく用いることができる。そのような抗体を用いる任意の免疫学的手法を、基質のメチル化レベルの検出のために用いることができる。例えば、基質がメチル化ヒストンである場合には、メチル化ヒストン（例えば、トリ−またはジ−メチル化リシン４を含むヒストンＨ３）に対する抗体を、好ましく用いることができる。そのような抗体は市販されている（例えば、Ａｂｃａｍ  Ｌｔｄ．）。例えば、メチル化基質を認識する抗体を用いるＥＬＩＳＡまたはイムノブロット法を、本発明のために用いることができる。
さらに、脱メチル化活性を検出する本方法は、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子を発現している細胞を調製し、該細胞を試験化合物の存在下で培養し、細胞におけるヒストンのメチル化レベルを、例えばヒストンのメチル化領域と特異的に結合する抗体を用いることによって決定することにより、実施できる。
より具体的には、本方法は、
（ａ）試験剤または試験化合物を、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子を発現している細胞と接触させる段階；
（ｂ）ヒストンＨ３リシン４のメチル化レベルを検出する段階；および
（ｃ）試験剤または試験化合物の非存在下で検出されるメチル化レベルと比較して、メチル化レベルを上昇させる該試験剤または試験化合物を、候補剤または候補化合物として選択する段階
を含む。
【０１１４】
あるいは、検出される生物活性が、Ｅ２Ｆ１遺伝子またはＥ２Ｆ２遺伝子の発現を促進する活性である場合には、例えば、実施例１に示されているＥ２Ｆレポーターアッセイを用いて測定することができる。この方法に関しては、試験化合物を、がん細胞などのＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子を発現している細胞と接触させる。
より具体的には、本方法は、
（ａ）試験剤または試験化合物を、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子を発現している細胞と接触させる段階；
（ｂ）Ｅ２Ｆ１遺伝子またはＥ２Ｆ２遺伝子の発現レベルを測定する段階；および
（ｃ）試験剤または試験化合物の非存在下における発現レベルと比較して、Ｅ２Ｆ１遺伝子またはＥ２Ｆ２遺伝子の発現レベルを減少させる該試験剤または試験化合物を、候補剤または候補化合物として選択する段階
を含む。
Ｅ２Ｆ１遺伝子の例示的な核酸配列およびポリペプチド配列は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５および３６に示されているが、これらに限定されるわけではない。さらに、配列データは、例えば、それぞれアクセッション番号ＮＭ＿００５２２５．２およびＮＰ＿００５２１６．１で入手することもできる。
Ｅ２Ｆ２遺伝子の例示的な核酸配列およびポリペプチド配列も、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７および３８に示されているが、これらに限定されるわけではない。さらに、配列データは、例えば、それぞれアクセッション番号ＮＭ＿００４０９１．２およびＮＰ＿００４０８２．１で入手することもできる。
【０１１５】
ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子を発現している細胞には、例えば、がんから樹立された細胞株（例えば、膀胱癌については５６３７、２５３Ｊ、２５３Ｊ−ＢＶ、ＨＴ１１９７、ＨＴ１３７６、Ｊ８２、ＳＣａＢＥＲおよびＵＭＵＣ３、肺癌についてはＳＢＣ５またはＨ２１７０およびＬＣ３１９）ならびに臨床的がん組織から精製された細胞が含まれ、そのような細胞を本スクリーニング方法のために用いることができる。Ｅ２Ｆ１遺伝子またはＥ２Ｆ２遺伝子の発現レベルの測定は、Ｅ２Ｆ１遺伝子またはＥ２Ｆ２遺伝子の転写調節領域および該調節領域の制御下にあるレポーター遺伝子を含むベクターを、試験剤または試験化合物と接触させる前または後の細胞に導入し、その後、該レポーター遺伝子の発現レベルを検出することによって実施することができる。Ｅ２Ｆ１遺伝子およびＥ２Ｆ２遺伝子の転写調節領域は当技術分野において周知である（例えば、Araki et al. Oncogene 2003, 22: 7632-41、Pilon et al. Mol Cell Biol 2008, 28: 7394-401）。レポーター遺伝子は、例えば、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、イソギンチャクモドキ（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ  ｓｐ．）赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ｌａｃＺ、およびβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）などであってよい。これらに加えて、Ｃｉｇｎａｌ（商標）Ｅ２Ｆ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＳｕｐｅｒＡｒｒａｙ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）などのいくつかの市販の製品を、Ｅ２Ｆレポーターアッセイに利用することもできる。代替的に、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロットアッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、免疫染色、ＥＬＩＳＡアッセイおよびフローサイトメトリー分析といった当技術分野において周知の方法を用いてこれらの遺伝子の転写産物または翻訳産物を直接検出することによって、Ｅ２Ｆ１遺伝子およびＥ２Ｆ２遺伝子の発現レベルを測定してもよい。
【０１１６】
本発明において、所与のタンパク質と機能的に等価なポリペプチドを調製するための方法は当業者に周知であり、これには、タンパク質に突然変異を導入する既知の方法が含まれる。一般的に、タンパク質中の１つまたは複数のアミノ酸の改変は、該タンパク質の機能に影響しないことが知られている（Mark DF et al., Proc Natl Acad Sci USA 1984, 81: 5662-6; Zoller MJ &amp; Smith M, Nucleic Acids Res 1982, 10: 6487-500; Wang A et al., Science 1984, 224:1431-3; Dalbadie-McFarland G et al., Proc Natl Acad Sci USA 1982, 79: 6409-13）。実際、変異タンパク質または改変タンパク質、すなわち特定のアミノ酸配列のアミノ酸残基の１つもしくは複数の置換、欠失、挿入、および／もしくは付加によって改変されたアミノ酸配列を有するタンパク質は、元の生物活性を保持することが知られている（Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 81: 5662-6 (1984)；Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 10:6487-500 (1982)；Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 79: 6409-13 (1982)）。したがって当業者は、単一のアミノ酸もしくはわずかな割合のアミノ酸を変更する、アミノ酸配列に対する個々の付加、欠失、挿入、もしくは置換、またはタンパク質の変化により類似の機能を有するタンパク質がもたらされる「保存的改変」であるとみなされるものが、本発明の文脈において意図されることを認識するであろう。
本明細書において定義される「生物活性の抑制」とは、剤または化合物の非存在下と比較した、ＪＡＲＩＤ１Ｂの生物活性の好ましくは少なくとも１０％の抑制、より好ましくは少なくとも２５％、５０％、または７５％の抑制、および最も好ましくは９０％の抑制である。
【０１１７】
本発明において、ＪＡＲＩＤ１Ｂの発現を抑制することにより、細胞増殖が減少することが明らかとなる。したがって、ＪＡＲＩＤ１Ｂポリペプチドの生物活性を阻害する候補化合物をスクリーニングすることにより、がんを治療または予防する可能性のある候補化合物を同定することができる。これらの候補化合物ががんを治療または予防する可能性は、がんに対する治療剤または治療化合物を同定するための二次スクリーニングおよび／またはさらなるスクリーニングによって評価することができる。例えば、ＪＡＲＩＤ１Ｂタンパク質に結合する化合物が、がんの上記活性を阻害する場合には、そのような化合物がＪＡＲＩＤ１Ｂ特異的治療効果を有すると結論づけることができる。
好ましい態様においては、ＪＡＲＩＤ１Ｂポリペプチドを発現しない対照細胞を用いる。したがって本発明はまた、ＪＡＲＩＤ１Ｂポリペプチドまたはその断片を用いて、細胞増殖を阻害するための候補物質またはＪＡＲＩＤ１Ｂと関連するがんを治療もしくは予防するための候補物質をスクリーニングする方法も提供し、該方法は、
ａ）ＪＡＲＩＤ１Ｂポリペプチドまたはその機能的断片を発現している細胞、およびＪＡＲＩＤ１Ｂポリペプチドもその機能的断片も発現しない対照細胞を、試験物質の存在下で培養する段階；
ｂ）該タンパク質を発現している細胞および対照細胞の生物活性を検出する段階；ならびに
ｃ）対照細胞においておよび前記試験物質の非存在下で検出される増殖と比較して、該タンパク質を発現している細胞における生物活性を阻害する試験化合物を選択する段階
を含む。
【０１１８】
ＪＡＲＩＤ１Ｂの発現を変化させる剤または化合物のスクリーニング：
本発明において、ｓｉＲＮＡによるＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の発現の低下は、がん細胞増殖の阻害を引き起こす（図７）。したがって本発明は、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の発現を阻害する剤または化合物のスクリーニング法を提供する。ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の発現を阻害する剤または化合物は、がん細胞の増殖を抑制すると予想され、それ故にがんを治療または予防するために有用である。したがって本発明は、がん細胞の増殖を抑制する剤または化合物をスクリーニングするための方法、およびがんを治療または予防するための剤または化合物をスクリーニングするための方法も提供する。
本発明によると、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の発現は、急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌および腎細胞癌において上昇することが確認された。したがって、本方法によってスクリーニングされた剤または化合物は、これらのがんを治療するのに適している可能性がある。より具体的には、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の発現を阻害する化合物が膀胱癌および肺癌における細胞増殖を阻害することが確認されている（図７）ため、膀胱癌および肺癌は、本方法によってスクリーニングされる剤または化合物の好適な標的である。
【０１１９】
本発明の文脈において、そのようなスクリーニングは、例えば
（ａ）試験剤または試験化合物を、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子を発現している細胞と接触させる段階；
（ｂ）ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の発現レベルを検出する段階；および
（ｃ）試験剤または試験化合物の非存在下における発現レベルと比較して、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の発現レベルを減少させる該試験剤または試験化合物を、候補剤または候補化合物として選択する段階
を含んでもよい。
本発明に従って、細胞増殖の阻害に対する試験剤または試験化合物の治療効果、あるいはＪＡＲＩＤ１Ｂ関連がんを治療または予防するための候補剤または候補化合物の治療効果を評価することができる。したがって、本発明はまた、がん細胞の増殖を抑制する候補剤または候補化合物をスクリーニングするための方法、およびＪＡＲＩＤ１Ｂと関連するがんを治療または予防するための候補剤または候補化合物をスクリーニングするための方法も提供する。
本発明の文脈において、そのようなスクリーニングは、例えば、
ａ）試験剤または試験化合物を、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子を発現している細胞と接触させる段階；
ｂ）ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の発現レベルを検出する段階；および
ｃ）ｂ）の発現レベルを、該試験剤または試験化合物の治療効果と関連付ける段階
を含んでもよい。
本発明において、治療効果をＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の発現レベルと関連付けることができる。例えば、試験剤または試験化合物が、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の発現レベルを該試験剤または試験化合物の非存在下で検出されるレベルと比較して減少させる場合には、該試験剤または試験化合物を、治療効果を有する候補剤または候補化合物として同定または選択することができる。または、試験剤または試験化合物が、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の発現レベルを、該試験剤または試験化合物の非存在下で検出されるレベルと比較して低下させない場合には、該試験剤または試験化合物を、有意な治療効果を有しない剤または化合物として同定することができる。
【０１２０】
本発明の方法を以下でより詳細に説明する。
ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子を発現する細胞には、例えば、がんから樹立された細胞株（例えば、膀胱癌については５６３７、２５３Ｊ、２５３Ｊ−ＢＶ、ＨＴ１１９７、ＨＴ１３７６、Ｊ８２、ＳＣａＢＥＲ、およびＵＭＵＣ３、肺癌についてはＳＢＣ５またはＨ２１７０およびＬＣ３１９）および臨床がん組織から精製した細胞が含まれ、そのような細胞を、本発明の上記のスクリーニングに用いることができる。発現レベルは、当業者に周知の方法、例えばＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロットアッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、免疫染色、またはフローサイトメトリー解析によって評価することができる。本明細書において定義される「発現レベルを減少させる」とは、剤または化合物の非存在下における発現レベルと比較した、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の発現レベルの好ましくは少なくとも１０％の減少、より好ましくは少なくとも２５％、５０％、または７５％のレベル減少、および最も好ましくは９５％のレベル減少である。本明細書における剤または化合物には化学物質、二本鎖分子等が含まれる。二本鎖分子の調製は、上記で記載されている。スクリーニング法において、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の発現レベルを減少させる試験剤または試験化合物は、がん細胞増殖を阻害するために使用される剤または化合物として選択することができ、かつしたがって、がんの治療または予防のための候補剤または候補化合物であることが予想され得る。
本発明において、ＪＡＲＩＤ１Ｂの発現の抑制が細胞増殖を減少させることが明らかになる。したがって、ＪＡＲＩＤ１Ｂポリペプチドの生物活性を阻害する候補化合物のスクリーニングによって、がんを治療または予防する可能性のある候補化合物を同定することができる。これらの候補化合物ががんを治療または予防する可能性は、がんに対する治療剤または治療化合物を同定するための二次および／またはさらなるスクリーニングによって評価することができる。
【０１２１】
さらに、Ｅ２Ｆ１遺伝子またはＥ２Ｆ２遺伝子の発現がＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子発現の阻害によって抑制されることが本発明において確認されたので、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の発現レベルを、Ｅ２Ｆ１遺伝子またはＥ２Ｆ２遺伝子の発現レベルとして検出することができる。Ｅ２Ｆ１遺伝子およびＥ２Ｆ２遺伝子の発現レベルの測定は、前述のＥ２Ｆレポーターアッセイによって、またはＥ２Ｆ１遺伝子もしくはＥ２Ｆ２遺伝子の転写産物もしくは翻訳産物を検出することによって決定することができる。
具体的には、本スクリーニング方法は、
（ａ）試験剤または試験化合物を、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子を発現している細胞と接触させる段階；
（ｂ）Ｅ２Ｆ１遺伝子またはＥ２Ｆ２遺伝子の発現レベルを測定する段階；および
（ｃ）試験剤または試験化合物の非存在下における発現レベルと比較して、Ｅ２Ｆ１遺伝子またはＥ２Ｆ２遺伝子の発現レベルを減少させる該試験剤または試験化合物を、候補剤または候補化合物として選択する段階
を含んでもよい。
好ましい態様において、本発明の方法は、
（ｄ）ＪＡＲＩＤ１Ｂをほとんど発現しない対照細胞に対する影響を全く有さない試験剤または試験化合物を選択する段階
をさらに含んでもよい。
本発明によると、ＪＡＲＩＤ１Ｂの発現を抑制することにより細胞増殖が減少することが明らかになる。さらに、Ｅ２Ｆ１遺伝子およびＥ２Ｆ２遺伝子の発現がＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子発現の阻害によって抑制されたことも明らかになる。したがって、本発明はまた、がん細胞の増殖を抑制する候補剤または候補化合物をスクリーニングするための方法、およびＪＡＲＩＤ１Ｂと関連するがんを治療または予防するための候補剤または候補化合物をスクリーニングするための方法も提供する。
本発明の文脈において、そのようなスクリーニングは、例えば、
ａ）試験剤または試験化合物を、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子を発現している細胞と接触させる段階；
ｂ）Ｅ２Ｆ１遺伝子またはＥ２Ｆ２遺伝子の発現レベルを検出する段階；および
ｃ）ｂ）の発現レベルを、該試験剤または試験化合物の治療効果と関連付ける段階
を含んでもよい。
【０１２２】
本発明において、治療効果をＥ２Ｆ１遺伝子またはＥ２Ｆ２遺伝子の発現レベルと関連付けることができる。例えば、試験剤または試験化合物が、Ｅ２Ｆ１遺伝子またはＥ２Ｆ２遺伝子の発現レベルを該試験剤または試験化合物の非存在下で検出されるレベルと比較して減少させる場合には、該試験剤または試験化合物を、治療効果を有する候補剤または候補化合物として同定または選択することができる。または、試験剤または試験化合物が、Ｅ２Ｆ１遺伝子およびＥ２Ｆ２遺伝子の発現レベルを、該試験剤または試験化合物の非存在下で検出されるレベルと比較して減少させない場合には、該試験剤または試験化合物を、有意な治療効果を有しない剤または化合物として同定することができる。
上記の段階は、Ｅ２Ｆ１遺伝子およびＥ２Ｆ２遺伝子の発現を促進する活性を、「ＪＡＲＩＤ１Ｂの生物活性を抑制する剤または化合物のスクリーニング」に記載されたＪＡＲＩＤ１Ｂポリペプチドの生物活性として用いる方法と同じである。しかし、本方法では、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の発現レベルに注目する。ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の発現レベルの検出のためにＥ２Ｆレポーターアッセイを用いる場合には、Ｅ２Ｆレポーターベクターを、試験剤または試験化合物と接触させる前または後の細胞に導入してもよい。
【０１２３】
本発明において、ＪＡＲＩＤ１Ｂの発現を抑制することにより細胞増殖が減少することが明らかになる。さらに、Ｅ２Ｆ１遺伝子およびＥ２Ｆ２遺伝子の発現がＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子発現の阻害によって抑制されたことが明らかになる。したがって、Ｅ２Ｆ１遺伝子またはＥ２Ｆ２遺伝子の発現レベルを阻害する候補化合物のスクリーニングによって、がんを治療または予防する可能性のある候補化合物を同定することができる。これらの候補化合物ががんを治療または予防する可能性は、がんに対する治療剤または治療化合物を同定するための二次および／またはさらなるスクリーニングによって評価することができる。
あるいは、本発明のスクリーニング方法は、
（ａ）試験剤または試験化合物を、ＪＡＲＩＤ１Ｂの転写調節領域および該転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子を含むベクターが導入された細胞と接触させる段階；
（ｂ）該レポーター遺伝子の発現または活性を測定する段階；および
（ｃ）試験剤または試験化合物の非存在下における発現レベルまたは活性レベルと比較して、該レポーター遺伝子の発現または活性を減少させる該試験化合物を、候補剤または候補化合物として選択する段階
を含んでもよい。
【０１２４】
本発明に従って、細胞増殖の阻害に対する試験剤もしくは試験化合物の治療効果、またはＪＡＲＩＤ１Ｂ関連がんを治療もしくは予防するための候補剤もしくは候補化合物の治療効果を評価することができる。したがって本発明はまた、がん細胞の増殖を抑制する候補剤または候補化合物をスクリーニングする方法、およびＪＡＲＩＤ１Ｂ関連がんを治療または予防するための候補剤または候補化合物をスクリーニングする方法も提供する。
別の局面によると、本発明は、
ａ）試験剤または試験化合物を、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の転写調節領域と該転写調節領域の制御下で発現するレポーター遺伝子とからなるベクターが導入された細胞と接触させる段階；
ｂ）該レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を検出する段階；ならびに
ｃ）ｂ）の発現レベルを該試験剤または試験化合物の治療効果と関連付ける段階
を含む、方法を提供する。
【０１２５】
本発明において、治療効果はレポーター遺伝子の発現レベルまたは活性と相関し得る。例えば、試験剤または試験化合物が、該試験剤または試験化合物の非存在下で検出されたレベルと比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を減少させる場合には、該試験剤または試験化合物を、治療効果を有する候補剤または候補化合物として同定または選択することができる。あるいは、試験剤または試験化合物が、該試験剤または試験化合物の非存在下で検出されたレベルと比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を減少させない場合には、該試験剤または試験化合物を、有意な治療効果を有さない剤または化合物として同定することができる。
適切なレポーター遺伝子および宿主細胞は、当技術分野で周知である。例えば、レポーター遺伝子はルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、イソギンチャクモドキ赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ｌａｃＺ、およびβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）であり、宿主細胞はＣＯＳ７、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ等である。スクリーニングに必要とされるレポーター構築物は、レポーター遺伝子配列をＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の転写調節領域に連結することにより調製することができる。本明細書におけるＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の転写調節領域とは、開始コドンから少なくとも５００  ｂｐ上流まで、好ましくは１０００  ｂｐまで、より好ましくは５０００または１００００  ｂｐ上流までの領域である。転写調節領域を含むヌクレオチドセグメントは、ゲノムライブラリーから単離することができ、またはＰＣＲによって増幅することができる。スクリーニングに必要なレポーター構築物は、レポーター遺伝子配列をこれらの遺伝子のいずれか１つの転写調節領域に連結することにより調製することができる。転写調節領域を同定する方法と、同じくアッセイプロトコールも、周知である（Molecular Cloning third edition chapter 17, 2001, Cold Springs Harbor Laboratory Press）。例えば、ＪＡＲＩＤ１Ｂの転写調節領域は、Catteau et al. Int J Oncol. 2004, 25: 5-16で報告された。
【０１２６】
前記レポーター構築物を含むベクターを宿主細胞に感染させ、該レポーター遺伝子の発現または活性を、当技術分野で周知の方法により（例えば、ルミノメーター、吸光分光計、フローサイトメーター等を用いて）検出する。本明細書において定義される「発現または活性を減少させる」とは、化合物非存在下と比較した、レポーター遺伝子の発現または活性の好ましくは少なくとも１０％の低下、より好ましくは少なくとも２５％、５０％、または７５％の低下、および最も好ましくは９５％の低下である。
本発明において、ＪＡＲＩＤ１Ｂの発現を抑制することにより細胞増殖が低下することが明らかになる。したがって、前記レポーター遺伝子の発現または活性について候補化合物をスクリーニングすることによって、がんを治療または予防する可能性のある候補化合物を同定することができる。これらの候補化合物ががんを治療または予防する可能性は、がんに対する治療剤または治療化合物を同定するための二次および／またはさらなるスクリーニングによって評価することができる。
【０１２７】
Ｅ２Ｆ１およびＥ２Ｆ２の発現を変化させるための方法：
本発明によれば、Ｅ２Ｆ１遺伝子およびＥ２Ｆ２遺伝子の発現は、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子発現の阻害によって抑制された（図９）。これは、Ｅ２Ｆ１遺伝子およびＥ２Ｆ２遺伝子が、ＪＡＲＩＤ１Ｂタンパク質によって影響を受ける下流遺伝子の候補であることを示している。
Ｅ２Ｆ転写因子は網膜芽腫（ＲＢ）タンパク質経路の下流エフェクターであり、基本的な細胞周期制御の多くの局面に関与している（Botz J. et al. Mol Cell Biol 1996;16: 3401-9、DeGregori J. et al. Genes Dev 1995;9: 2873-87、Johnson DG et al. Natｕre 1993;365: 349-52、Mｕller H. et al. Biochim Biophys Acta 2000;1470: M1-12）。Ｅ２Ｆ因子の結合部位は、ｃｄｋ２および４、サイクリンＡ、ＤおよびＥ、ＤＮＡポリメラーゼ、リボヌクレオチドレダクターゼならびにＰＣＮＡを含む、細胞周期およびＤＮＡ合成を制御する多数の遺伝子で同定されている（Yamasaki L. Resｕlts Probl Cell Differ 1998;22: 199-227）。重要なことに、ＲＢ−Ｅ２Ｆカスケードにおける変異が、広範なさまざまな腫瘍実体において見出されている（Dimova DK et al. Oncogene 2005;24: 2810-26、Nevins JR. Hｕm Mol Genet 2001;10: 699-703）。これらの変化の大部分はＲＢまたはＥ２Ｆ転写因子の上流調節因子に影響を及ぼす一方で、Ｅ２Ｆファミリー自体の調節不全が発がんに決定的に関与しているという証拠も増えつつある。実際に、卵巣がんでは、増殖促進性のＥ２Ｆ１転写因子および特にＥ２Ｆ２転写因子が、健常対照組織と比較して過剰発現されていた（Reimer D. et al. Clin Cancer Res 2007;13: 144-51）。加えて、これらの細胞周期促進性転写因子の調節不全は、さまざまな腫瘍における予後指標としても記載されている（Ebihara Y. et al. Dis Esophagｕs 2004;17: 150-4、Foster CS et al. Oncogene 2004;23: 5871-9、Gorgoｕlis VG et al. J Pathol 2002;198: 142-56、Mega S. et al. Dis Esophagｕs 2005;18: 109-13、Oeggerli M. et al. Oncogene 2004;23: 5616-23）。したがって、増殖促進性Ｅ２Ｆ転写因子の過剰発現は、生存不良に寄与する、腫瘍の有意な増殖優位性（ｇｒｏｗｔｈ  ａｄｖａｎｔａｇｅ）に寄与し得ると考えられる。本発明においては、膀胱腫瘍組織におけるＥ２Ｆ１遺伝子およびＥ２Ｆ２遺伝子の両方の発現レベルが、非腫瘍性組織よりも有意に高い。Ｅ２Ｆ／ＲＢ経路の調節不全は種々の組織におけるヒト発がんと密接に関連している可能性があり、ＪＡＲＩＤ１Ｂはこの経路の調節解除を通じて悪性化に寄与していると考えられる。
したがって、本発明はまた、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子発現またはＪＡＲＩＤ１Ｂタンパク質活性を調節することによって、Ｅ２Ｆ１遺伝子およびＥ２Ｆ２遺伝子の発現レベルを変化させるための方法も提供する。Ｅ２Ｆ１およびＥ２Ｆ２の調節不全は発がんに関係しているので、本方法は新たながん療法の開発に寄与するであろう。
【０１２８】
本発明の文脈において、Ｅ２Ｆ１遺伝子およびＥ２Ｆ２遺伝子の発現レベルを変化させるための方法は、細胞においてＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の発現レベルまたはＪＡＲＩＤ１Ｂタンパク質の活性を変化させる段階を含む。そのような段階は、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子発現またはＪＡＲＩＤ１Ｂタンパク質活性を調整する化合物を細胞に投与することによって行われる。そのような化合物は、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子発現またはＪＡＲＩＤ１Ｂタンパク質に対するインヒビターまたはアクチベータであってよく、好ましくは、前述のスクリーニング方法によってスクリーニングされたインヒビターであってよい。例えば、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子を標的とするアンチセンスＲＮＡもしくは二本鎖分子、またはＪＡＲＩＤ１Ｂタンパク質に対する抗体を、本方法のために用いることができる。二本鎖分子を本方法のために用いる場合には、本発明の二本鎖分子を利用することができる。好ましくは、そのような二本鎖分子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１または３０に対応する標的配列を含む。
別の態様において、本発明はまた、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子発現またはＪＡＲＩＤ１Ｂタンパク質活性を調整する化合物を含む、Ｅ２Ｆ１遺伝子またはＥ２Ｆ２遺伝子の発現を変化させるための組成物も提供する。そのような組成物は、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子発現またはＪＡＲＩＤ１Ｂタンパク質活性を阻害または促進する少なくとも１つの化合物を含む。好ましくは、本組成物は、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子発現を阻害する本発明の二本鎖分子またはそれをコードするベクターを含み、より好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１または３０に対応する標的配列を含む二本鎖分子を含む。
本発明において、ＪＡＲＩＤ１Ｂの発現を抑制することにより細胞増殖が減少することが明らかになる。さらに、Ｅ２Ｆ１遺伝子およびＥ２Ｆ２遺伝子の発現がＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子発現の阻害によって抑制されたことも明らかになる。したがって、Ｅ２Ｆ１遺伝子またはＥ２Ｆ２遺伝子の発現レベルを変化させる候補化合物のスクリーニングによって、がんを治療または予防する可能性のある候補化合物を同定することができる。これらの候補化合物ががんを治療または予防する可能性は、がんに対する治療剤または治療化合物を同定するための二次および／またはさらなるスクリーニングによって評価することができる。
【０１２９】
本発明の局面を以下の実施例において説明するが、これらは添付の特許請求の範囲に記載された本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
別に定義する場合を除き、本明細書で用いられる技術的および科学的用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。好適な方法および材料を以下に説明するが、本明細書に記載されたものと類似または同等の方法および材料を本発明の実施または試験に用いることができる。
本発明を以下の実施例においてさらに説明するが、これらは添付の特許請求の範囲に記載された本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０１３０】
本発明を以下の実施例においてさらに説明するが、これらは添付の特許請求の範囲に記載された本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【０１３１】
方法の概要
組織試料およびＲＮＡの調製
原発性尿路上皮癌の外科手術標本１２３例を、膀胱切除術または経尿道的膀胱腫瘍切除術（ＴＵＲ−Ｂｔ）のいずれかの際に採取し、液体窒素中で急速凍結させた。正常膀胱尿路上皮組織の標本２３例は、悪性腫瘍のエビデンスのない患者における、肉眼で見て正常な膀胱尿路上皮の領域から採取した。この研究のための組織の使用は、ケンブリッッジ州のＣａｍｂｒｉｄｇｅ  ｓｈｉｒｅ  Ｌｏｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによる承認を受けた。合計３０例の３０μｍ切片をＲＮＡ抽出のためにホモジナイズし、ＲＮＡ抽出に用いた組織に隣接する２つの７μｍ「サンドイッチ」切片を切り出し、染色して、独立したコンサルタントである泌尿器組織病理学者（ｕｒｏｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｓｔ）が細胞充実度および腫瘍グレードを評価した。さらに、切片を炎症細胞浸潤の程度に応じてグレード分類した（軽度、中等度、および顕著）。顕著な炎症細胞浸潤を示す試料は除外した（Wallard MJ et al. British joｕrnal of cancer 2006;94: 569-77）。
ＴＲＩ  Ｒｅａｇｅｎｔ（商標）（Ｓｉｇｍａ、Ｄｏｒｓｅｔ、ＵＫ）を製造元のプロトコールに従って用いて、全ＲＮＡを抽出した。ＤＮａｓｅの段階を含むＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉｋｉｔ（商標）（ＱＩＡＧＥＮ、Ｃｒａｗｌｅｙ、ＵＫ）を用いて、ＲＮＡの純度を最適化した。Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００（商標）全ＲＮＡバイオアナリシスを行った。各試料由来の１μｌの再懸濁ＲＮＡを、ＲＮＡ  ６０００  Ｎａｎｏ  Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ（商標）にアプライして、製造元の指示に従って処理した。チップおよび試薬すべての供給元は、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）（Ｗｅｓｔ  Ｌｏｔｈｉａｎ、ＵＫ）であった。
【０１３２】
逆転写
全ＲＮＡ濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）ＮＤ１０００分光光度計（Ｎｙｘｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いて測定した。製造元の指示に従って２μｇのランダムヘキサマー（Ａｍｅｒｓｈａｍ）およびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ）を２０μｌ反応で用い、１μｇの全ＲＮＡを逆転写させた。続いてｃＤＮＡをＰＣＲ等級の水で１：１００に希釈して、−２０℃で保存した。
【０１３３】
レーザーキャプチャーマイクロダイセクション
レーザーキャプチャーマイクロダイセクションのための組織を、上記で概説した手順に従って、前向きに採取した。７μｍ厚の連続切片５つを各組織から切り出し、Ｈｉｓｔｏｇｅｎｅ（商標）染色溶液（Ａｒｃｔｕｒｕｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）を製造元のプロトコールに従って用いて染色した。ＰｉｘＣｅｌｌ  ＩＩレーザーキャプチャー顕微鏡（商標）（Ａｒｃｔｕｒｕｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いるマイクロダイセクションのために、その直後にスライドを転写した。この技術では、低出力赤外レーザーを用いて、関心対象の細胞を覆う熱可塑性フィルムを融解させて、細胞をこれに付着させる。
各組織における間質区画および上皮／腫瘍区画の両方からおよそ１００００個の細胞をマイクロダイセクションに供した。ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｃｒａｗｌｅｙ、ＵＫ）を用いてＲＮＡを抽出した。混入を防ぐために、癌、または腫瘍の顕著な炎症領域を含む間質、または顕著な炎症細胞浸潤を含む間質は、除外した。
上記の通りに全ＲＮＡを逆転写させ、ｑＲＴ−ＰＣＲを行った。このような少量の試料からのＲＮＡの収量が少ないことを考慮して、ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）定量は実施しなかったが、内在性１８Ｓ  ＣＴ値に対する補正を完全な出発ＲＮＡの量の正確な基準として用いた。転写物分析をＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子に関して行った。
マイクロダイセクションの精度を確認するために、ビメンチンおよびウロプラキンに対するプライマーおよびプローブを用いるｑＲＴ−ＰＣＴを、製造元の指示に従って行った（Ａｓｓａｙｓ  ｏｎ  ｄｅｍａｎｄ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＵＫ）。ビメンチンは主として間葉組織内で発現されるものであり、これを間質マーカーとして用いた。ウロプラキンは尿路上皮分化のマーカーであり、上皮由来腫瘍の最大９０％で保存されている（Olsbｕrgh J. et al. The Joｕrnal of pathology 2003;199: 41-9）。
【０１３４】
細胞培養
細胞株はすべて、適切な培地中で単層で増殖させた：２５３Ｊ、２５３Ｊ−ＢＶ、ＨＴ１１９７、ＨＴ１３７６、Ｊ８２、ＳＣａＢＥＲ、ＵＭＵＣ３膀胱癌細胞およびＳＢＣ５小細胞肺癌細胞についてはイーグルの最小必須培地（ＥＭＥＭ）；５６３７膀胱癌細胞およびＡ５４９、Ｈ２１７０およびＬＣ３１９非小細胞肺癌細胞についてはＲＰＭＩ１６４０培地；ＥＪ２８膀胱癌細胞およびＲＥＲＦ−ＬＣ−ＡＩ非小細胞肺癌細胞についてはダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）；ＲＴ４およびＴ２４膀胱癌細胞についてはマッコイの５Ａ培地；ＳＷ７８０細胞についてはライボビッツのＬ−１５培地とし、１０％ウシ胎仔血清および１％抗生物質／抗真菌剤溶液（Ｓｉｇｍａ）を加えた。細胞はすべて、５％  ＣＯ２を含むか（２５３Ｊ、２５３Ｊ−ＢＶ、ＨＴ１１９７、ＨＴ１３７６、Ｊ８２、ＳＣａＢＥＲ、ＵＭＵＣ３、ＳＢＣ５、５６３７、Ａ５４９  Ｈ２１７０、ＬＣ３１９、ＥＪ２８、ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＡＩ、ＲＴ４およびＴ２４）またはＣＯ２を含まない（ＳＷ７８０）加湿空気中にて３７℃で維持した。製造元のプロトコールに従ってＦｕＧＥＮＥ６（ＲＯＣＨＥ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、細胞をトランスフェクションした。
【０１３５】
ｃＤＮＡマイクロアレイを用いた、がんにおける発現プロファイリング
本発明者らは、米国国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）のＵｎｉＧｅｎｅデータベースから選択した３６，８６４種のｃＤＮＡまたはＥＳＲを有する、ゲノム全域にわたるｃＤＮＡマイクロアレイを確立した。このマイクロアレイシステムは、本質的には以前に記載した通りに構築した（Kikｕchi T. et al. Oncogene 2003;22: 2192-205、Kitahara O. et al. Cancer Res 2001;61: 3544-9、Nakamｕra T. et al. Oncogene 2004;23: 2385-400）。手短に述べると、さまざまなヒト臓器から単離したポリ（Ａ）＋  ＲＮＡをテンプレートとして用いるＲＴ−ＰＣＲによってｃＤＮＡを増幅した；アンプリコンの長さは２００〜１，１００ｂｐの範囲にわたり、いかなる反復配列もポリ（Ａ）配列も有さなかった。多くの型の腫瘍および対応する非腫瘍性組織を、以前に記載した通りに８μｍ切片として調製した（Kitahara O. et al. Cancer Res 2001;61: 3544-9）。ＥＺ切出しシステム（ＳＬ  Ｍｉｃｒｏｔｅｓｔ  ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を製造元のプロトコールに従って用いて、合計３０，０００〜４０，０００個のがん細胞または非がん性細胞を選択的に採取した。全ＲＮＡの抽出、Ｔ７に基づく増幅およびプローブの標識は、以前に記載した通りに行った（Kitahara O. et al. Cancer Res 2001;61: 3544-9）。続いて、各がん性組織および非がん性組織に由来し、２倍に増幅されたＲＮＡ（ａＲＮＡ）の２．５μｇアリコートの測定単位を、それぞれＣｙ３−ｄＣＴＰまたはＣｙ５−ｄＣＴＰで標識した。
【０１３６】
定量的リアルタイムＰＣＲ
上記の通りに、１２３例の膀胱癌組織および２３例の正常膀胱組織をＣａｍｂｒｉｄｇｅ  Ａｄｄｅｎｂｒｏｏｋｅ'ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌにおいて調製した。定量的ＲＴ−ＰＣＲ反応のために、いずれもヒトのＧＡＰＤＨ（ハウスキーピング遺伝子）、ＳＤＨ（ハウスキーピング遺伝子）、ＪＡＲＩＤ１Ｂ、Ｅ２Ｆ１およびＥ２Ｆ２に対する特異的プライマーを以下の通りに設計した：
ＧＡＰＤＨ−フォワード
５'  ＧＣＡＡＡＴＴＣＣＡＴＧＧＣＡＣＣＧＴＣ  ３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）；
ＧＡＰＤＨ−リバース
５'  ＴＣＧＣＣＣＣＡＣＴＴＧＡＴＴＴＴＧＧ  ３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）；
ＳＤＨ−フォワード
５'  ＴＧＧＧＡＡＣＡＡＧＡＧＧＧＣＡＴＣＴＧ  ３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）；
ＳＤＨ−リバース
５'  ＣＣＡＣＣＡＣＴＧＣＡＴＣＡＡＡＴＴＣＡＴＧ３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）；
ＪＡＲＩＤ１Ｂ−フォワード−１
５'  ＡＴＴＧＣＣＴＣＡＡＡＧＧＡＡＴＴＴＧＧＣＡＧＴＧ３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）；
ＪＡＲＩＤ１Ｂ−リバース−１
５'  ＣＡＴＣＡＣＴＧＧＣＡＴＧＴＴＧＴＴＣＡＡＡＴＴＣ  ３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）；
ＪＡＲＩＤ１Ｂ−フォワード−２
５'  ＴＧＴＣＡＣＡＧＴＧＧＡＡＴＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＣ  ３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）；および
ＪＡＲＩＤ１Ｂ−リバース−２
５'  ＧＣＣＡＣＴＡＴＣＡＡＧＡＴＡＣＴＣＣＴＣＴＴＣＣ  ３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）；
Ｅ２Ｆ１−フォワード
５'  ＧＣＴＧＧＡＣＣＡＣＣＴＧＡＴＧＡＡＴＡＴＣ  ３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）；
Ｅ２Ｆ１−リバース
５'  ＴＣＴＧＣＡＡＴＧＣＴＡＣＧＡＡＧＧＴＣＣＴＧ  ３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）；
Ｅ２Ｆ２−フォワード
５'  ＴＧＧＣＡＡＣＴＴＴＡＡＧＧＡＧＣＡＧＡＣＡＧ  ３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）；
Ｅ２Ｆ２−リバース
５'  ＧＧＧＣＡＣＡＧＧＴＡＧＡＣＴＴＣＧＡＴＧＧ  ３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）。
製造元のプロトコールに従ってＡＢＩ  ｐｒｉｓｍ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＵＫ）を用いて、ＰＣＲ反応を行った。５０％  ＳＹＢＲ  ＧＲＥＥＮ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ＵＮＧ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＵＫ）、各５０ｎＭのフォワードプライマーおよびリバースプライマー、ならびに２μｌの逆転写されたｃＤＮＡを適用した。増幅条件は、まず９５℃で５分間、次に、９５℃で１０秒間、５５℃で１分間、および７２℃で１０秒間からなるサイクル４５回とした。続いて、反応物を９５℃で１５秒間、６５℃で１分間加熱して融解曲線を作成し、１０秒間で５０℃まで冷却させた。標的遺伝子の増幅のための反応条件は上記の通りとし、５ｎｇの逆転写されたＲＮＡに相当する量を各反応に用いた。ｍＲＮＡレベルはＧＡＰＤＨおよびＳＤＨの発現に対して正規化した。
【０１３７】
免疫細胞化学
Ａ５４９（非小細胞肺癌）細胞またはＳＢＣ５（小細胞肺癌）細胞を、４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ（−）で２０分間固定し、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むＰＢＳ（−）によって室温で２分間かけて透過性にした。引き続いて、非特異的ハイブリダイゼーションをブロックするために、細胞を室温で１時間、３％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ（−）で覆い、続いて希釈比１：１００のマウス抗ＪＡＲＩＤ１Ｂ抗体（１Ｇ１０、Ａｂｎｏｖａ）とともにインキュベーションした。ＰＢＳ（−）で洗浄した後に、細胞を、１：１０００希釈したＡｌｅｘａ５９４結合抗マウス二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）によって染色した。核は４'，６'−ジアミジン−２'−フェニルインドール二塩酸塩（ＤＡＰＩ）で対比染色した。蛍光画像をＴＣＳ  ＳＰ２  ＡＯＢＳ顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）によって得た。
【０１３８】
免疫組織化学染色
ヒト膀胱癌および肺癌の切片をＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ（商標）ＡＢＣ  ＫＩＴ（ＶＥＣＴＯＲ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ、ＣＡ、ＵＳＡ）によって染色した。手短に述べると、キシレンで脱パラフィン処理し脱水した切片の内在性ペルオキシダーゼ活性を、０．３％  Ｈ２Ｏ２／メタノールによる処理によって阻害させた。切片を３％  ＢＳＡとともに加湿チャンバー内で周囲温度にて３０分間インキュベーションした後に、マウスモノクローナル抗ＪＡＲＩＤ１Ｂ（クローン１Ｇ１０、Ａｂｎｏｖａ）抗体の１：１００希釈物と共に４℃で一晩インキュベーションすることによって、非特異的結合を遮断した。切片をＰＢＳ（−）で２回洗浄し、１％  ＢＳＡを含むＰＢＳ（−）中の５μｇ／μｌのヤギ抗マウスビオチン化ＩｇＧとともに周囲温度で３０分間インキュベーションした後、ＡＢＣ試薬ともに３０分間インキュベーションした。特異的な免疫染色を３，３'−ジアミノベンジジンによって可視化した。段階的なアルコール〜キシレン洗浄によってスライドを脱水させて、カバーガラス上にマウントした。核の対比染色のためにヘマトキシリンを用いた。
【０１３９】
ウエスタンブロット法
ＲＩＰＡ様緩衝液中にて細胞から全タンパク質抽出物を調製した。全タンパク質（５０μｇ）をニトロセルロース膜に転写した。抗ＪＡＲＩＤ１Ｂ（クローン１Ｇ１０、ＡｂｎｏｖａまたはＨＰＡ０２７１７９、Ａｔｌａｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ＡＢ）、抗Ｅ２Ｆ１抗体（ＫＨ−９５、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）および抗Ｅ２Ｆ２抗体（Ｌ−２０、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて、膜を分析した。抗アクチン（Ｉ−１９、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）をローディング対照として用いた。
【０１４０】
ｓｉＲＮＡによるトランスフェクション
ヒトＪＡＲＩＤ１Ｂ転写物を標的とさせるためのｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド二重鎖はＳＩＧＭＡ  Ｇｅｎｏｓｙｓから購入した。ｓｉＥＧＦＰ、ｓｉＦＦＬｕｃ、および、３種類の異なるオリゴヌクレオチド二重鎖の混合物であるｓｉＮｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ（ｓｉＮＣ）を、対照ｓｉＲＮＡとして用いた。これらのｓｉＲＮＡ配列は以下の通りに示される。
ｓｉＥＧＦＰセンス
５'  ＧＣＡＧＣＡＣＧＡＣＵＵＣＵＵＣＡＡＧＴＴ  ３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）；
ｓｉＥＧＦＰアンチセンス
５'  ＣＵＵＧＡＡＧＡＡＧＵＣＧＵＧＣＵＧＣＴＴ  ３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）；
ｓｉＦＦＬｕｃセンス
５'  ＧＵＧＣＧＣＵＧＣＵＧＧＵＧＣＣＡＡＣＴＴ  ３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）；
ｓｉＦＦＬｕｃアンチセンス
５'  ＧＵＵＧＧＣＡＣＣＡＧＣＡＧＣＧＣＡＣＴＴ  ３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）；
ｓｉＮｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｔａｒｇｅｔ＃１センス
５'  ＡＵＣＣＧＣＧＣＧＡＵＡＧＵＡＣＧＵＡ  ３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）；
ｓｉＮｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｔａｒｇｅｔ＃１アンチセンス
５'  ＵＡＣＧＵＡＣＵＡＵＣＧＣＧＣＧＧＡＵ  ３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）；
ｓｉＮｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｔａｒｇｅｔ＃２センス
５'  ＵＵＡＣＧＣＧＵＡＧＣＧＵＡＡＵＡＣＧ  ３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）；
ｓｉＮｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｔａｒｇｅｔ＃２アンチセンス
５'  ＣＧＵＡＵＵＡＣＧＣＵＡＣＧＣＧＵＡＡ  ３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）；
ｓｉＮｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｔａｒｇｅｔ＃３センス
５'  ＵＡＵＵＣＧＣＧＣＧＵＡＵＡＧＣＧＧＵ  ３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）；
ｓｉＮｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｔａｒｇｅｔ＃３アンチセンス
５'  ＡＣＣＧＣＵＡＵＡＣＧＣＧＣＧＡＡＵＡ  ３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）；
ＪＡＲＩＤ１Ｂ＃１センス
５'  ＣＡＧＵＧＡＡＵＧＡＧＣＵＣＣＧＧＣＡＴＴ  ３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）；  
ＪＡＲＩＤ１Ｂ＃１アンチセンス
５'  ＵＧＣＣＧＧＡＧＣＵＣＡＵＵＣＡＣＵＧＴＴ  ３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）；  
ＪＡＲＩＤ１Ｂ＃２センス
５'  ＧＧＡＡＵＡＵＧＧＡＧＣＵＧＡＣＡＵＵＴＴ  ３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）；および
ＪＡＲＩＤ１Ｂ＃２アンチセンス
５'  ＡＡＵＧＵＣＡＧＣＵＣＣＡＵＡＵＵＣＣＴＴ  ３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）。
リポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて７２時間にわたり膀胱癌細胞株および肺癌細胞株にこれらのｓｉＲＮＡ二重鎖（最終濃度１００ｎＭ）をトランスフェクトし、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇキット８（ＤＯＪＩＮＤＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて細胞生存率を調べた。
【０１４１】
フローサイトメトリーアッセイ（ＦＡＣＳ）
細胞周期進行に対するＪＡＲＩＤ１Ｂ発現の影響を調べるために、ＳＢＣ５細胞をｓｉＪＡＲＩＤ１Ｂまたは対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＥＧＦＰおよびｓｉＦＦＬｕｃ）で処理し、ＣＯ２インキュベーター内にて３７℃で７２時間培養した。１×１０５個の細胞をトリプシン処理によって回収し、製造元（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）の指示に従ってヨウ化プロピジウムで染色した。Ｗｉｎｄｏｗｓ用ソフトウエアのＭｕｌｔｉＣｙｃｌｅ（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ）を用いるＦＡＣＳｃａｎ（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ）により、詳細な細胞周期の状態に関して細胞を分析した。細胞周期がＧ０／Ｇ１期、Ｓ期およびＧ２／Ｍ期である細胞、ならびに任意のサブＧ１群のパーセンテージを、ゲートしていない少なくとも２０，０００個の細胞から決定した。
【０１４２】
下流遺伝子の分類のためのマイクロアレイハイブリダイゼーションおよび統計分析
精製した全ＲＮＡを標識し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０オリゴヌクレオチドアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）上に、製造元の指示に従ってハイブリダイズさせた。
各アレイに関して全体的にトリムされた平均シグナル強度値（ｇｌｏｂａｌ  ｔｒｉｍｍｅｄ  ｍｅａｎ  ｓｉｇｎａｌ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  ｖａｌｕｅ）を５００に調整することによって決定された倍率を用いて、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧＣＯＳソフトウェア（バージョン１．１．１）においてハイブリダイゼーションシグナルの調整を行い、それらをＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇバージョン６．２（Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）にインポートした。続いて、シグナル強度の中心を各チップの５０パーセンタイル値に配置し、個々の各遺伝子については、生じうる技術的バイアスを最小限に抑えるためにまず特定の各サブセットの強度の中央値に配置した上で、続いて全試料セットに対して配置した。さらなる分析の後に、あらゆる反復ハイブリダイゼーションの強度は平均化した。すべての試料においてＧＣＯＳソフトウェアにより「存在(ｐｒｅｓｅｎｔ)」または「限界（ｍａｒｇｉｎａｌ）」と表示された遺伝子のみを、さらなる分析のために用いた。差次的に発現される遺伝子を、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ−Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙノンパラメトリック検定（Ｐ＜０．０５）を用いて同定した。Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ偽発見率（ｆａｌｓｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅ）による多重検定補正を、適用可能な場合は常に適用した。同定された各遺伝子セットに関する試料間の相関を評価するために、各比較に対して階層的クラスター分析を行った。
代替的に、プローブシグナル強度をＲＭＡ法および分位数正規化法（Ｑｕａｎｔｉｌｅ  ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）（ＲおよびＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒを用いる）によって正規化した。次に、実験間変動に起因するシグナル強度のゆらぎを推定した。各実験を反復し（１および２）、中点値をｌｏｇ２（（強度１＋強度２）／２）＝５、７、９、１１、１３および１５とする強度範囲セットそれぞれについて、ｌｏｇ２（強度２／強度１）の標準偏差（ｓｔｄｅｖ）を算出した。強度変動は、式ｓｔｄｅｖ（ｌｏｇ２（強度２／強度１））＝ａ＊（ｌｏｇ２（（強度１＋強度２）／２））＋ｂを用いてモデル化し、最小二乗法を用いてパラメーターａおよびｂを推定した。これらの値を用いて、強度のゆらぎの標準偏差を算出した。続いて、各プローブのシグナル強度をｓｉＪＡＲＩＤ１Ｂ（ＥＸＰ）と対照（ＥＧＦＰ／ＦＦＬｕｃ）（ＣＯＮＴ）の間で比較し、以下のｚ−スコアを算出することにより、アップ／ダウンレギュレーションに関して検定した：ｌｏｇ２（強度ＥＸＰ／強度ＣＯＮＴ）／（ａ＊（ｌｏｇ２（（強度ＥＸＰ＋強度ＣＯＮＴ）／２））＋ｂ）。反復セットに関して得られたＰ値を乗算して、各プローブの最終的なＰ値を算出した。これらの手順を、以下の各比較のそれぞれに対して適用した：ＥＧＦＰ対ｓｉＪＡＲＩＤ１Ｂ、ＦＦＬｕｃ対ｓｉＪＡＲＩＤ１Ｂ、およびＥＧＦＰ対ＦＦＬｕｃ。アップ／ダウンレギュレートされた遺伝子セットは、以下の基準を同時に満たすものとして決定した：（１）ＥＧＦＰ対ｓｉＪＡＲＩＤ１Ｂに関してＢｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ偽発見率（ＦＤＲ）＜＝０．０５である、（２）ＦＦＬｕｃ対ｓｉＪＡＲＩＤ１Ｂに関してＦＤＲ＜＝０．０５であり、かつ調節の向きが（１）と同じである、ならびに（３）ＥＧＦＰ対ＦＦＬｕｃが（１）および（２）とは反対の向きであるか、またはＥＧＦＰ対ＦＦＬｕｃに関してＰ＞０．０５である。最後に、アップ／ダウンレギュレートされる遺伝子セットと各ＧＯカテゴリーとの間の重複の確率を、ランダムにサンプリングした別の遺伝子リストに対して比較して算出する超幾何分布検定を用いて、経路分析を行った。この検定を、Ｇｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙデータベースによって定義された「生物学的プロセス」（８５７種のカテゴリー）の各カテゴリーにおいて、同定されたアップ／ダウンレギュレートされる遺伝子に適用し、これらが有意に濃縮されている（ＦＤＲ＜＝０．０５）か否かを調べた。
【０１４３】
Ｅ２Ｆレポーターアッセイ
Ｅ２Ｆの転写活性を、Ｃｉｇｎａｌ（商標）Ｅ２Ｆ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＳｕｐｅｒＡｒｒａｙ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）によって分析した。Ａ５４９細胞およびＳＢＣ５細胞をｓｉＲＮＡ（ｓｉＪＡＲＩＤ１Ｂ、ｓｉＥＧＦＰおよびｓｉＦＦＬｕｃ）で処理し、２４時間にわたって培養した。ｓｉＲＮＡで処理した細胞に対して、最小（ｍ）ＣＭＶプロモーターの制御下にあるホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子とＥ２Ｆ転写応答エレメント（ＴＲＥ）のタンデムリピートとをコードするＥ２Ｆ応答性ルシフェラーゼ構築物、陰性対照、または陽性対照をトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後に、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて二重ルシフェラーゼアッセイを行い、内部正規化のためにＲｅｎｉｌｌａレポーターを用いて、プロモーター活性値を任意単位として表した。実験は３回行い、スチューデントのｔ検定を統計分析として用いた。
【実施例２】
【０１４４】
ＪＡＲＩＤ１Ｂ発現は臨床的がん組織においてアップレギュレートされている
まず、５種のヒストンデメチラーゼ遺伝子であるＪＡＲＩＤ１Ａ、ＪＡＲＩＤ１Ｂ、ＪＡＲＩＤ１Ｃ、ＪＡＲＩＤ１ＤおよびＪＡＲＩＤ２の発現レベルを臨床的膀胱癌試料の小規模サブセットで検討し、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子のみについて正常細胞とがん細胞の間で発現レベルにおける有意差を認めた（データは示さず）。ＪｍｊＣヒストンデメチラーゼの発現レベルが悪性腫瘍においてどの程度変化しているかを検証するために、５種のヒストンデメチラーゼ遺伝子であるＪＡＲＩＤ１Ａ、ＪＡＲＩＤ１Ｂ、ＪＡＲＩＤ１Ｃ、ＪＡＲＩＤ１ＤおよびＪＡＲＩＤ２の発現レベルを臨床的膀胱癌試料の小規模サブセットにおいて定量的リアルタイムＰＣＲを用いて試験し、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子のみについて正常細胞とがん細胞の間で発現レベルにおける有意差を認めた（データは示さず）。したがって、１２３例の膀胱癌試料および２３例の正常対照試料（英国人）を分析し（図１ＡおよびＢ）、正常組織と比較して、腫瘍細胞におけるＪＡＲＩＤ１Ｂの有意な過剰発現が観察された（Ｐ＜０．０００１、マン・ホイットニーのＵ検定、図１Ｂ、表１）。
【０１４５】
【表１】
2012518387.tif 000002
2012518387.tif 000003
2012518387.tif 000004
2012518387.tif 000005
【０１４６】
異なる病期およびグレードの間では、発現レベルにおける有意差は観察されなかった（図１Ａおよび表１、２）。このことは、ＪＡＲＩＤ１Ｂ発現が膀胱癌発生の初期に有意にアップレギュレートされ、該疾患の進行期においても高いままに保たれることを示唆する。転移の状態、性別、喫煙歴および再発状態による腫瘍の下位分類では、ＪＡＲＩＤ１Ｂの発現レベルにおける有意差は同定されなかった（表２）。
【０１４７】
【表２】
2012518387.tif 000006
【０１４８】
続いて、日本人の膀胱癌対象に由来する多数の臨床試料におけるＪＡＲＩＤ１Ｂの発現パターンをｃＤＮＡマイクロアレイによって分析し（図１Ｃ、１Ｄ、表３）、その有意な過剰発現を確認した（Ｐ＜０．０００１、マン・ホイットニーのＵ検定）。
【０１４９】
【表３】
2012518387.tif 000007
＊本発明者らは、同一患者に由来する腫瘍組織と対応する非腫瘍性組織の間で、ＪＡＲＩＤ１Ｂのシグナル強度を比較した。
【０１５０】
膀胱組織におけるＪＡＲＩＤ１Ｂタンパク質の発現レベルを評価するために、抗ＪＡＲＩＤ１Ｂ特異抗体を用いる免疫組織化学分析を行った（図１Ｅ）。強いＪＡＲＩＤ１Ｂ染色が主として悪性細胞の核内で観察されたが、非新腫瘍性組織では有意な染色は観察されなかった。この結果をさらに確認するために、２８例の膀胱組織切片を用いる組織マイクロアレイ実験を実施したところ（図２および表４）、６例では強い染色が観察され、１３例では中程度または弱い染色が観察された。さらに、ＪＡＲＩＤ１Ｂタンパク質発現レベルと臨床病理学的特徴との間に有意な関係は検出されず、これはリアルタイムＰＣＲの結果に合致した。
【０１５１】
【表４】
2012518387.tif 000008
【０１５２】
膀胱組織に加えて、肺組織においてＪＡＲＩＤ１Ｂの発現レベルを試験した（図３、４）。ｃＤＮＡマイクロアレイ実験によりＪＡＲＩＤ１Ｂ発現は、対応する非腫瘍性組織と比較して、肺腫瘍組織においても高度に上昇していることが示された（図３Ａ〜Ｃ）。重要なことに、ＪＡＲＩＤ１Ｂ発現の上昇は非小細胞肺癌および小細胞肺癌の両方で観察され、これは、ＪＡＲＩＤ１Ｂ過剰発現が肺癌発生に幅広く関与することを示す。続いて、免疫組織化学的検査によって、肺組織におけるＪＡＲＩＤ１Ｂタンパク質発現レベルを試験した（図３Ｄ）。がん組織では強いＪＡＲＩＤ１Ｂ染色が観察され、非腫瘍性組織では有意な染色は観察されなかった。さまざまな種類の肺腫瘍組織におけるＪＡＲＩＤ１Ｂタンパク質発現レベルを評価するために、組織マイクロアレイ実験を実施した（図４および表５）。試験した６２例の腫瘍組織切片のうち、５４例では強い染色が観察され、９例では中程度または弱い染色が観察された。
【０１５３】
【表５】
2012518387.tif 000009
2012518387.tif 000010
2012518387.tif 000011
【０１５４】
加えて、日本人対象に由来する多数の臨床試料のマイクロアレイ発現分析データも試験し、対応する非腫瘍性組織と比較して、ＪＡＲＩＤ１Ｂ発現は急性骨髄性白血病、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌および腎細胞癌（ＲＣＣ）、前立腺癌においても有意にアップレギュレートされていることが見出されたが、このことは、これが多くの種類のヒトがんに関与している可能性を示すものである（図５および表６）。
興味深いことに、抗ＪＡＲＩＤ１Ｂ抗体を用いた免疫細胞化学染色により、アフィジコリンを用いて細胞を同期させた後にその細胞内局在が変化することが示された。細胞周期解放から４時間後の、Ｇ０／Ｇ１期およびＳ期初期では、該タンパク質は主として核内に局在していた（図６上）。その後、細胞周期解放から１２時間後の、Ｓ期およびＧ２／Ｍ期では、該タンパク質は核および細胞質の両方に局在していた（図６下）。したがって、ＪＡＲＩＤ１Ｂの細胞内局在は細胞周期の状態に応じて変化し、かつこの酵素は、細胞質ならびに核において生理的役割を果たしている可能性があると考えられる。
【０１５５】
【表６】
2012518387.tif 000012
＊本発明者らは、同一患者に由来する腫瘍組織と対応する非腫瘍性組織の間で、ＪＡＲＩＤ１Ｂのシグナル強度を比較した。
【実施例３】
【０１５６】
ＪＡＲＩＤ１Ｂはがん細胞の増殖調節に影響を与える
ヒト発がんにおけるＪＡＲＩＤ１Ｂの役割を調べるために、ＪＡＲＩＤ１Ｂの発現を特異的に抑制するためのｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド二重鎖（ｓｉＪＡＲＩＤ１Ｂ＃１、配列は前述）を、２種の陰性対照（ｓｉＥＧＦＰおよびｓｉＦＦＬｕｃ）とともに調製した。ＪＡＲＩＤ１Ｂの発現を、トランスフェクトを行っていない１７例の膀胱癌細胞株または肺癌細胞株において検査した（図７Ａ）。続いて、ｓｉＲＮＡを、ＪＡＲＩＤ１Ｂを中程度に発現しているＳＷ７８０細胞およびＡ５４９細胞にトランスフェクトした。ｓｉＪＡＲＩＤ１Ｂ＃１を含む細胞におけるＪＡＲＩＤ１Ｂの発現は、対照と比較して、ＳＷ７８０およびＡ５４９の両方において有意に抑制された（図７Ｂ）。３種の膀胱癌細胞株（ＲＴ４、ＳＷ７８０、ＵＭＵＣ３）、２種の非小肺癌細胞株（ＬＣ３１９、ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＡＩ）および１種の小細胞肺癌細胞株（ＳＢＣ５）において、ｓｉＲＮＡによる処理後に細胞増殖アッセイを行った。すべての例において、癌細胞の増殖は、ｓｉＪＡＲＩＤ１Ｂ＃１による処理後に有意に抑制された（図７Ｃ）。
癌細胞においてＪＡＲＩＤ１Ｂ−ノックダウンによって誘導される増殖抑制の機序を評価するために、ｓｉＲＮＡによる処理後の癌細胞の細胞周期状態をフローサイトメトリーによって分析した（図７Ｄ）。サブＧ１期にある細胞の数は、ｓｉＪＡＲＩＤ１Ｂ＃１による処理後に顕著に増加した。このことは、ＪＡＲＩＤ１Ｂの抑制に応答したアポトーシスの誘導を示唆する。ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞の詳細な分析により、対照−ｓｉＲＮＡで処理した癌細胞よりも、ｓｉＪＡＲＩＤ１Ｂ＃１で処理した細胞において、サブＧ１期にある癌細胞の割合が有意に高いことが示されている（それぞれＰ＝０．００５５［ｓｉＥＧＦＰ、ｓｉＪＡＲＩＤ１Ｂ＃１］およびＰ＝０．００４２［ｓｉＦＦＬｕｃ、ｓｉＪＡＲＩＤ１Ｂ＃１］、図７Ｅ）。加えて、ｓｉＪＡＲＩＤ１Ｂで処理した、Ｓ期後期およびＧ２／Ｍ期の細胞の割合は、対照ｓｉＲＮＡで処理した細胞よりも有意に低かった。したがって、ＪＡＲＩＤ１Ｂは癌細胞の増殖において非常に重要な役割を果たしている可能性があり、ＪＡＲＩＤ１Ｂのノックダウンによってアポトーシスが誘導され得る。
【０１５７】
さらに、ＪＡＲＩＤ１Ｂに対する２種の独立したｓｉＲＮＡ（ｓｉＪＡＲＩＤ１Ｂ＃１および＃２）、および２種の対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＥＧＦＰおよびｓｉＮＣ）を用いるノックダウン実験を行った。これらのｓｉＲＮＡを、ＪＡＲＩＤ１Ｂが高度に発現されているＳＷ７８０細胞、Ａ５４９細胞およびＳＢＣ５細胞にトランスフェクトした（図７Ａ）。ＪＡＲＩＤ１Ｂを標的とする２種の無関係なｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞におけるＪＡＲＩＤ１Ｂの発現レベルは、対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞と比較して有意に抑制された（図７Ｆ）。同じｓｉＲＮＡを用いて細胞増殖アッセイを行い、２種の膀胱癌細胞株（ＳＷ７８０およびＲＴ４）および３種の肺癌細胞株（Ａ５４９、ＬＣ３１９およびＳＢＣ５）では、ＪＡＲＩＤ１Ｂを標的とする２種の独立したｓｉＲＮＡによる有意な増殖抑制が観察されたが、対照ｓｉＲＮＡを用いた場合には全く影響が認められなかった（図７Ｇ）。
【実施例４】
【０１５８】
マイクロアレイ発現分析による下流遺伝子の同定
ＪＡＲＩＤ１Ｂの下流遺伝子、およびＪＡＲＩＤ１Ｂによって誘導されるシグナル経路を同定するためにマイクロアレイ発現分析を行った。ｓｉＪＡＲＩＤ１Ｂ＃１およびｓｉＪＡＲＩＤ１Ｂ＃２による処理の２４時間後にＳＷ７８０細胞およびＡ５４９細胞から全ＲＮＡを単離し、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのＨＧ−Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０  Ａｒｒａｙを用いて、対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＥＧＦＰおよびｓｉＦＦＬｕｃ）で処理した細胞と比較したこれらの細胞の発現プロファイルを分析した。その結果、有意にアップ／ダウンレギュレートされる遺伝子のセットが同定された。さらに、Ｇｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙデータベースを参照してシグナル経路分析を行い（表７）、ＪＡＲＩＤ１Ｂが細胞周期の調節プロセスと密接に関連している可能性を見出した。興味深いことに、ｓｉＪＡＲＩＤ１Ｂによる処理により、Ｅ２Ｆ１およびＥ２Ｆ２の有意なダウンレギュレーションが観察された（いずれもＰ＜０．０００１）（図８）。そのため、ＪＡＲＩＤ１Ｂ発現と、細胞周期の鍵となる調節経路であるＥ２Ｆ／ＲＢ経路との間の機能的関係を分析した。
【０１５９】
【表７】
2012518387.tif 000013
2012518387.tif 000014
【０１６０】
ｓｉＲＮＡで処理した３種の異なる癌細胞株であるＳＷ７８０、ＳＢＣ５およびＡ５４９において、Ｅ２Ｆ１およびＥ２Ｆ２の発現のダウンレギュレーションが、定量的リアルタイムＰＣＲによって観察された（図９Ａ、９Ｂ）。さらに、ＪＡＲＩＤ１Ｂが過剰発現した臨床腫瘍組織においては、Ｅ２Ｆ１およびＥ２Ｆ２両方の発現レベルが非腫瘍性組織よりも高いことが見出された（それぞれＰ＝０．０００９およびＰ＝０．０００２）。このデータは、ＪＡＲＩＤ１Ｂの発現上昇と相関して、Ｅ２Ｆ１およびＥ２Ｆ２の両方が腫瘍組織において高度に発現された可能性を示す（スピアマンの順位相関係数：それぞれｒ＝０．６６６（Ｅ２Ｆ１）およびｒ＝０．７５６（Ｅ２Ｆ２））（図９Ｃ）。
ＪＡＲＩＤ１ＢによるＥ２Ｆの転写調節についてより詳細に確認するために、Ｅ２Ｆ応答性ルシフェラーゼ構築物を用いてルシフェラーゼレポーターアッセイを行った（図９Ｄ）。対照（ｓｉＥＧＦＰ）またはｓｉＪＡＲＩＤ１Ｂによる処理後の癌細胞株に、この構築物を形質転換により導入した。Ａ５４９細胞およびＳＢＣ５細胞のいずれにおいても、Ｅ２Ｆに駆動される転写活性はｓｉＪＡＲＩＤ１Ｂ＃１による処理後に有意に抑制された。さらに、Ｅ２Ｆ１およびＥ２Ｆ２両方の発現の抑制を、ＪＡＲＩＤ１Ｂを標的とする２種の無関係なｓｉＲＮＡによる処理後のＡ５４９細胞およびＳＢＣ５細胞においてタンパク質レベルで確認した（図９Ｅ）。これらの結果により、Ｅ２Ｆ転写因子によって調節される転写活性がＪＡＲＩＤ１Ｂのノックダウン後に抑制されうることが明らかであり、そして、この経路の崩壊が、本発明者らが観察した細胞周期変化の原因である可能性がある。
これらの結果は、ＪＡＲＩＤ１Ｂが、ヒトの発がんにおいてＥ２Ｆ／ＲＢ経路を通じた細胞周期調節の重要因子の１つとして働きうることを示す。
【０１６１】
考察
メチル化、アセチル化、リン酸化およびユビキチン化を含む、クロマチンのヒストン修飾は、クロマチン構造の調節を通じて、転写の活性化および抑制のパターン形成の際に決定的な役割を果たす。ＪＡＲＩＤ１Ｂは、ヒストンＨ３リシン４のメチル基を特異的に除去するリシンデメチラーゼファミリーに属する（Yamane K. et al. Mol Cell 2007;25: 801-12）。本発明では、膀胱癌および肺癌、ならびにさまざまな他の種類のがんにおけるＪＡＲＩＤ１Ｂの有意なアップレギュレーションが、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、免疫組織化学的検査およびマイクロアレイに基づく遺伝子発現プロファイルを用いて実証された。
重要な臓器における有意なＪＡＲＩＤ１Ｂ染色は、免疫組織化学分析では観察されなかった（図１Ｅ、３Ｄ、１０）。したがって、対応する非腫瘍性組織と比較した、任意の腫瘍におけるＪＡＲＩＤ１Ｂの異常な過剰発現によって、これはがん検出のための、および治療標的としての理想的な分子標的となる。既に、古典的ＨＤＡＣの合成インヒビターは後成的研究におけるツールとして広く用いられており、その多くがインビトロでがん細胞における増殖抑制効果を示し、かつ初期臨床試験にも用いられている（Jones PA et al. Cell 2007, 128:683-692；Paris M et al. J Med Chem 2008, 51:1505-1529）。加えて、ヒストンメチルトランスフェラーゼインヒビターおよびデメチラーゼインヒビターも最近いくつか報告されている（Greiner D et al. Nat Chem Biol 2005, 1:143-145；Hｕang Y et al. Proc Natl Acad Sci Ｕ S A 2007, 104:8023-8028；Kｕbicek S et al. Mol Cell 2007, 25:473-481）。
【０１６２】
Ｅ２Ｆ１およびＥ２Ｆ２はＪＡＲＩＤ１Ｂによって調節される下流モジュレーターであることが実証された。ｓｉＲＮＡ処理と組み合わせたルシフェラーゼレポーターアッセイにより、ＪＡＲＩＤ１ＢとＥ２Ｆエレメントの間の分子間相互作用を裏づける間接的な証拠が得られた。Ｅ２Ｆ転写因子は網膜芽腫（ＲＢ）タンパク質経路の下流エフェクターであり、基本的な細胞周期制御の多くの局面に関与する（Botz J et al. Mol Cell Biol 1996, 16:3401-3409；DeGregori J et al. Genes Dev 1995, 9:2873-2887；Johnson DG et al: Natｕre 1993, 365:349-352；Mｕller H et al. Biochim Biophys Acta 2000, 1470:M1-12）。Ｅ２Ｆ因子の結合部位は、ｃｄｋ２および４、サイクリンＡ、ＤおよびＥ、ＤＮＡポリメラーゼ、リボヌクレオチドレダクターゼ、ＵＨＲＦ１、ならびにＰＣＮＡを含む、細胞周期およびＤＮＡ合成を制御する多数の遺伝子で同定されている（Ｕnoki M et al. Oncogene 2004, 23:7601-7610；Yamasaki L. Resｕlts Probl Cell Differ 1998, 22:199-227）。重要なことに、ＲＢ−Ｅ２Ｆカスケードにおける変異は、多種多様な種類の腫瘍で見出されている（Dimova DK et al. Oncogene 2005, 24:2810-2826；Nevins JR. Hｕm Mol Genet 2001, 10:699-703）。これらの変化の大部分はＲＢまたはＥ２Ｆ転写因子の上流調節因子に影響を及ぼし、かつ、Ｅ２Ｆファミリーそれ自体の調節不全が発がんに決定的に関与するという証拠も増えつつある。実際に、卵巣癌では、増殖促進性のＥ２Ｆ１転写因子およびＥ２Ｆ２転写因子が、健常対照組織と比較して過剰発現されていた（Reimer D et al. Clin Cancer Res 2007, 13:144-151）。それらの調節不全は、さまざまな腫瘍に対する予後指標として提唱されている（Ebihara Y et al. Dis Esophagｕs 2004, 17:150-154；Foster CS et al. Oncogene 2004, 23:5871-5879；Gorgoｕlis VG et al. J Pathol 2002, 198:142-156；Mega S et al. Dis Esophagｕs 2005, 18:109-113；Oeggerli M et al. Oncogene 2004, 23:5616-5623）。増殖を促進するＥ２Ｆ転写因子の過剰発現が、腫瘍、特に予後不良な腫瘍に有意な増殖優位性を与えると議論されている。本研究において、本発明者らは、膀胱腫瘍組織におけるＥ２Ｆ１およびＥ２Ｆ２両方の発現レベルが非腫瘍性組織よりも有意に高いことを実証したが、これはおそらくＪＡＲＩＤ１Ｂの異常な転写調節に起因するものである。Ｇｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙに基づく詳細な経路分析により（表７）、いくつかの細胞周期プロセスにおけるＪＡＲＩＤ１Ｂの関与が明らかになった。
【０１６３】
マイクロアレイデータによれば、他のいくつかの遺伝子がＪＡＲＩＤ１Ｂによってアップレギュレートされうると考えられる。Ｈ３Ｋ４のメチル化が真性クロマチンのマーカーとなることから、ＪＡＲＩＤ１Ｂの主な機能の１つは、そのデメチラーゼ活性を通じた転写抑制であると考えられている（Yamane K et al. Mol Cell 2007, 25:801-812）。マイクロアレイデータからは、ＪＡＲＩＤ１Ｂがその下流遺伝子の転写を活性化できると考えられる機序として３つを提唱することができる。（ｉ）ＪＡＲＩＤ１Ｂによって直接調節される転写因子を通じて、転写を間接的に活性化する；（ｉｉ）ＪＡＲＩＤ１Ｂがタンパク質−タンパク質相互作用を通じて、下流候補の発現をトランス活性化する。例えば、ＪＡＲＩＤ１Ｂはアンドロゲン受容体と会合して、その転写活性を高める（Xiang Y et al. Proc Natl Acad Sci Ｕ S A 2007, 104:19226-19231）。ＪＡＲＩＤ１Ｂはその結合パートナー次第で、遺伝子発現のアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションの両方を行う可能性がある。（ｉｉｉ）ＪＡＲＩＤ１Ｂが未知の基質を脱メチル化する。同様に、ＬＳＤ１は当初はＨ３Ｋ４特異的デメチラーゼであると報告され（Shi Y et al. Cell 2004, 119:941-953）、後にヒストンＨ３リシン９およびｐ５３を脱メチル化することが見出された（Hｕang J et al. Natｕre 2007, 449:105-108；Metzger E et al. Natｕre 2005, 437:436-439）。興味深いことに、ＪＡＲＩＤ１Ｂは一部の細胞周期時期には細胞質に局在することが見出されており（図１１、１２）、このことにより、それが細胞質中の未知の基質を脱メチル化し、次に細胞周期の進行に影響を及ぼすという可能性が提起される。いくつかのがん細胞株を用いて得られた結果は、がん細胞の増殖におけるＪＡＲＩＤ１Ｂの関与を強く支持している。
【産業上の利用可能性】
【０１６４】
本明細書において実証されたように、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子を特異的に標的とする二本鎖分子によって細胞増殖が抑制される。したがって、この新規な二本鎖分子は抗がん医薬として有用である。例えば、ＪＡＲＩＤ１Ｂタンパク質の発現を阻止し、かつ／またはその活性を妨げる剤は、抗がん剤として、特に急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌および腎細胞癌の治療のための、特に膀胱癌および肺癌の治療のための抗がん剤としての、治療的有用性を有する。
ＪＡＲＩＤ１Ｂの発現は、正常臓器と比較して、がんにおいて顕著に上昇している。したがって、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子またはタンパク質は、がんの診断マーカーとして好都合に用いることができる。
さらに、ＪＡＲＩＤ１Ｂポリペプチドは抗がん医薬の開発のための有用な標的である。例えば、ＪＡＲＩＤ１Ｂポリペプチドと結合するかまたはＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の発現を阻止するかまたはその活性を妨げる剤は、抗がん剤として、特に急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌および腎細胞癌の治療のための抗がん剤として治療的有用性を有する可能性がある。
本明細書において引用された刊行物、データベース、配列、特許および特許出願はすべて、参照により本明細書に組み入れられる。
本発明を詳細に、その具体的な態様を参照しながら説明してきたが、その境界および範囲が添付の特許請求の範囲によって設定されている本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、さまざまな変更および改変を加えることができることは、当業者には明らかであろう。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
2012518387.tif 000028
【図７Ｂ】
2012518387.tif 000029
【図７Ｃ】
2012518387.tif 000030
【図７Ｄ】
2012518387.tif 000031
【図７Ｅ】
2012518387.tif 000032
【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
2012518387.tif 000034
【図８】
2012518387.tif 000035
【図９】
2012518387.tif 000036
【図１０】
2012518387.tif 000037
【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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