(57)【要約】  本発明は、植物体のＳｎｆ１関連タンパク質キナーゼ（ＳｎＲＫ）遺伝子およびＳｎＲＫ遺伝子産物の単離、精製、特徴づけ、および使用に関する。本発明は、単離および精製されたＳｎＲＫ  ＤＮＡを包含し、該遺伝子を用いて、水分喪失量および植物体の乾燥耐性、スクロース含量、デンプン含量、種子油含量、脂肪酸合成量、種子油のアシル組成、種子のサイズ／重量、生物ストレスに対する抵抗性／耐性、根のバイオマスの増大、ならびに／または他の種子成分内、植物体への炭素フラックスを制御する方法、ならびに、該遺伝子により形質転換された組織および植物体に関する。本発明はまた、導入された本発明のＤＮＡ配列を含有するゲノムを有する、トランスジェニック植物体、植物組織、および植物種子、ならびにこのような植物体および植物種子を作製する方法にも関する。
2012523237.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物体、植物種子、またはその後代を作製するプロセスであって、
Ｓｎｆ１関連タンパク質キナーゼタンパク質をコードする核酸配列により、植物細胞を形質転換するステップと、
植物体が種子をつけるまで、前記植物細胞から植物体を生育させるステップと、
前記植物体から種子を採取するステップと
を含むプロセス。
【請求項２】
Ｓｎｆ１関連タンパク質キナーゼタンパク質をコードする核酸配列が前記植物細胞のゲノム中に組み込まれる、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
前記植物細胞のゲノム中に組み込まれたＳｎｆ１関連タンパク質キナーゼタンパク質をコードする核酸配列を有する種子を選択するステップをさらに含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項４】
Ｓｎｆ１関連タンパク質キナーゼタンパク質をコードする核酸配列が、配列番号１または配列番号３の配列を含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項５】
Ｓｎｆ１関連タンパク質キナーゼタンパク質が、ＳｎＲＫ２−６を含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項６】
Ｓｎｆ１関連タンパク質キナーゼタンパク質をコードする核酸配列が、配列番号２または配列番号４のペプチドをコードする核酸配列を含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項７】
請求項１に記載のプロセスにより作製される植物体から採取される種子。
【請求項８】
土壌中に前記種子を植え付けるステップと、
前記種子から第２の植物体を生育させるステップと、
前記第２の植物体から種子を採取するステップと
をさらに含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項９】
Ｓｎｆ１関連タンパク質キナーゼタンパク質をコードする核酸配列により、植物細胞を形質転換するステップが、
Ｓｎｆ１関連タンパク質キナーゼタンパク質をコードする核酸配列により、アグロバクテリウム属（Agrobacterium）細胞を形質転換するステップと、
前記アグロバクテリウム属細胞により、前記植物細胞を形質転換するステップと
を含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１０】
植物細胞のゲノム中に組み込まれたＳｎｆ１関連タンパク質キナーゼタンパク質をコードする核酸配列を有する種子を選択するステップが、
種子からゲノム核酸を単離するステップと、
前記種子から単離されたゲノム核酸から、Ｓｎｆ１関連タンパク質キナーゼタンパク質をコードする核酸配列を増幅するステップと
を含む、請求項３に記載のプロセス。
【請求項１１】
植物体が、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、ルリジサ（Borago）属種、キャノーラ、トウゴマ（Ricinus）属種、カカオ（Theobroma）属種、トウモロコシ（Zea）属種、ワタ（Gossypium）属種、ハマナ（Crambe）属種、タバコソウ（Cuphea）属種、アマ（Linum）属種、レスケレーラ（Lesquerella）属種、リムナンテス（Limnanthes）属種、リノーラ、ノウゼンハレン（Tropaeolum）属種、マツヨイグサ（Oenothera）属種、オリーブ（Olea）属種、アブラヤシ（Elaeis）属種、ラッカセイ（Arachis）属種、ナタネ、ベニバナ（Carthamus）属種、ダイズ（Glycine）属種、ダイズ（Soja）亜属種、ヒマワリ（Helianthus）属種、タバコ（Nicotiana）属種、ショウジョウハグマ（Vernonia）属種、コムギ（Triticum）属種、オオムギ（Hordeum）属種、イネ（Oryza）属種、カラスムギ（Avena）属種、モロコシ（Sorghum）属種、ライムギ（Secale）属種、アブラナ（Brassicaceae）科、およびイネ科（Gramineae）植物の他のメンバーからなる群から選択される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１２】
採取された種子から油を抽出するステップをさらに含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１３】
そのゲノム中に組み込まれたＳｎｆ１関連タンパク質キナーゼタンパク質をコードする核酸配列を有する植物体、植物種子、またはその後代。
【請求項１４】
植物体、植物体の貯蔵器官、または植物種子の油含量、糖含量、またはデンプン含量を変化させる方法であって、
センスまたはアンチセンス核酸構築物を植物体形質転換ベクター中に導入して、改変植物体形質転換ベクターを作製するステップであって、前記センスまたはアンチセンス核酸構築物が、シロイヌナズナ属のＳｎｆ１関連タンパク質キナーゼ（ＳｎＲＫ）タンパク質をコードする単離核酸配列、精製核酸配列、または組換え核酸配列を含むステップと、
前記改変植物体形質転換ベクターにより、前記植物体、植物体の貯蔵器官、または植物種子のゲノムを形質転換するステップと、
前記植物体、植物体の貯蔵器官、または植物種子を生育させ、前記油または生体高分子を抽出するステップと
を含む方法。
【請求項１５】
前記ゲノムが、請求項１４に記載のベクターにより形質転換されていることを特徴とする、遺伝子形質転換植物体。
【請求項１６】
請求項１４に記載のベクターにより形質転換されていることを特徴とする、遺伝子形質転換植物種子。
【請求項１７】
同じ遺伝子型の遺伝子改変されていない植物体と比較して、呼吸速度の変化を示すことを特徴とする、請求項１５に記載の植物体。
【請求項１８】
同じ遺伝子型の遺伝子改変されていない植物体と比較して、種子油含量の変化を示すことを特徴とする、請求項１５に記載の植物体。
【請求項１９】
同じ遺伝子型の遺伝子改変されていない植物体と比較して、脂肪酸組成の変化を示すことを特徴とする、請求項１５に記載の植物体。
【請求項２０】
同じ遺伝子型の遺伝子改変されていない植物体と比較して、バイオマスの増大を示すことを特徴とする、請求項１５に記載の植物体。
【請求項２１】
同じ遺伝子型の遺伝子改変されていない植物体と比較して、生体高分子を蓄積する能力の増強を示すことを特徴とする、請求項１５に記載の植物体。
【請求項２２】
同じ遺伝子型の遺伝子改変されていない植物体と比較して、炭水化物含量の変化を示すことを特徴とする、請求項１５に記載の植物体。
【請求項２３】
同じ遺伝子型の遺伝子改変されていない植物体と比較して、スクロース含量およびデンプン含量の変化を示すことを特徴とする、請求項２２に記載の植物体。
【請求項２４】
同じ遺伝子型の遺伝子改変されていない植物体と比較して、呼吸速度の変化を示すことを特徴とする、請求項１６に記載の植物種子。
【請求項２５】
同じ遺伝子型の遺伝子改変されていない植物体と比較して、種子油含量の変化を示すことを特徴とする、請求項１６に記載の植物種子。
【請求項２６】
同じ遺伝子型の遺伝子改変されていない植物体と比較して、脂肪酸組成の変化を示す植物体をもたらすことを特徴とする、請求項１６に記載の植物種子。
【請求項２７】
同じ遺伝子型の遺伝子改変されていない植物体と比較して、バイオマスの増大を示す植物体をもたらすことを特徴とする、請求項１６に記載の植物種子。
【請求項２８】
同じ遺伝子型の遺伝子改変されていない植物体と比較して、生体高分子を蓄積する能力の増強を示す植物体をもたらすことを特徴とする、請求項１６に記載の植物種子。
【請求項２９】
植物体におけるＳｎｆ１関連タンパク質キナーゼタンパク質レベルを調節する方法であって、
プロモーターに作動可能に連結された、植物体Ｓｎｆ１関連タンパク質キナーゼポリヌクレオチドにより、植物細胞を安定に形質転換するステップであって、前記ポリヌクレオチドが、センス配向またはアンチセンス配向であるステップと、
前記植物細胞を、植物生育条件下において生育させて、植物体におけるＳｎｆ１関連タンパク質キナーゼタンパク質を調節するのに十分な時間にわたり前記ポリヌクレオチドを発現することが可能な再生植物体をもたらすステップと
を含む方法。
【請求項３０】
植物体のＳｎｆ１関連タンパク質キナーゼポリヌクレオチドにより、植物細胞を安定に形質転換するステップが、配列番号１および配列番号３からなる群から選択されるポリヌクレオチドにより、植物細胞を安定に形質転換するステップを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
トランスジェニック種子から油を抽出するプロセスであって、
Ｓｎｆ１関連タンパク質キナーゼタンパク質をコードする手段により、植物細胞を形質転換するステップと、
植物体が種子をつけるまで、前記植物細胞から植物体を生育させるステップと、
前記植物体から種子を採取するステップと、
採取された種子から油を抽出するステップと
を含むプロセス。
【請求項３２】
Ｓｎｆ１関連タンパク質キナーゼタンパク質をコードする手段が、配列番号２および配列番号３をコードする核酸配列からなる群から選択される、請求項３１に記載のプロセス。
【請求項３３】
請求項３１に記載のプロセスにより生成される油。
【請求項３４】
植物細胞を形質転換するためのベクターであって、配列番号１、もしくは配列番号１の一部、または配列番号１と実質的に相同な配列のデオキシリボ核酸配列を含有することを特徴とするベクター。
【請求項３５】
前記配列が、前記ベクター内にセンス配向で存在する、請求項３４に記載のベクター。
【請求項３６】
植物細胞を形質転換するためのベクターであって、配列番号３、もしくは配列番号３の一部、または配列番号３と実質的に相同な配列のデオキシリボ核酸配列を含有することを特徴とするベクター。
【請求項３７】
前記配列が、前記ベクター内にアンチセンス配向で存在する、請求項３６に記載のベクター。
【請求項３８】
プラスミドｐＳｎＲＫ２−６ｃＤＮＡ。
【請求項３９】
プラスミドｐＳｎＲＫ２−６遺伝子。
【請求項４０】
配列番号１もしくは配列番号３、または配列番号１もしくは配列番号３の一部、あるいは配列番号１もしくは配列番号３と実質的に相同な配列の導入ヌクレオチド配列を含有することを特徴とするゲノムを有する植物体。
【請求項４１】
配列番号１もしくは配列番号３、または配列番号１もしくは配列番号３の一部、あるいは配列番号１もしくは配列番号３と実質的に相同な配列の導入ヌクレオチド配列を含有することを特徴とするゲノムを有する植物種子。
【請求項４２】
トランスジェニック植物体のゲノム中にヌクレオチド配列を導入することにより前記植物体を作製する方法であって、前記ゲノム中に導入される前記ヌクレオチド配列が、配列番号１もしくは配列番号３、または配列番号１もしくは配列番号３の一部、あるいは配列番号１もしくは配列番号３、または配列番号１もしくは配列番号３の一部と実質的に相同な配列を包含することを特徴とする方法。
【請求項４３】
前記植物体が、シロイヌナズナ、トウモロコシ（Zea mays）、ルリジサ（Borago属種）、キャノーラ、トウゴマ（Ricinus communis）、カカオ豆（Theobroma cacao）、ワタ（Gossypium属種）、ハマナ（Crambe）属種、タバコソウ（Cuphea）属種、アマ（Linum属種）、レスケレーラ（Lesquerella）およびリムナンテス（Limnanthes）属種、リノーラ、ノウゼンハレン（Tropaeolum属種）、マツヨイグサ（Oenothera）属種、オリーブ（Olea属種）、アブラヤシ（Elaeis属種）、ラッカセイ（Arachis属種）、ナタネ、ベニバナ（Carthamus属種）、ダイズ（Glycine属種およびSoja亜属種）、ヒマワリ（Helianthus属種）、タバコ（Nicotiana属種）、ショウジョウハグマ（Vernonia）属種、コムギ（Triticum属種）、オオムギ（Hordeum属種）、イネ（Oryza属種）、カラスムギ（Avena属種）、モロコシ（Sorghum属種）、ライムギ（Secale属種）、ならびにイネ（Gramineae）科の他のメンバーからなる群から選択されることを特徴とする、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
センスまたはアンチセンス核酸構築物を、植物体形質転換ベクター中に導入し、前記ベクターを用いて植物体または植物種子のゲノムを形質転換し、次いで、前記植物体または植物種子を生育させ、前記植物種子から油を抽出することにより、前記植物体の油含量、脂肪酸組成、糖／デンプン／炭水化物レベル、または種子収量を変化させる方法であって、前記核酸配列が、配列番号１もしくは配列番号３、または配列番号１もしくは配列番号３の一部、あるいは配列番号１もしくは配列番号３と実質的に相同な配列であることを特徴とする方法。
【請求項４５】
植物体、植物種子、または植物体の後代からなる群から選択される植物材料であって、プロモーターと機能的に関連している、植物材料の油含量を改変するためのＳｎｆ１関連タンパク質キナーゼ手段を含むベクターによりさらに形質転換されている植物材料。
【請求項４６】
Ｓｎｆ１関連タンパク質キナーゼ手段が、核酸配列である、請求項４５に記載の植物材料。
【請求項４７】
プロモーターが、ＣｓＶＭＶである、請求項４５に記載の植物材料。
【請求項４８】
前記プロモーターが、天然プロモーターである、請求項４５に記載の植物材料。
【請求項４９】
前記プロモーターが、Ｕｂｉ１プロモーターである、請求項４５に記載の植物材料。
【請求項５０】
前記植物材料が、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、ルリジサ（Borago）属種、キャノーラ、トウゴマ（Ricinus）属種、カカオ（Theobroma）属種、トウモロコシ（Zea）属種、ワタ（Gossypium）属種、ハマナ（Crambe）属種、タバコソウ（Cuphea）属種、アマ（Linum）属種、レスケレーラ（Lesquerella）属種、リムナンテス（Limnanthes）属種、リノーラ、ノウゼンハレン（Tropaeolum）属種、マツヨイグサ（Oenothera）属種、オリーブ（Olea）属種、アブラヤシ（Elaeis）属種、ラッカセイ（Arachis）属種、ナタネ、ベニバナ（Carthamus）属種、ダイズ（Glycine）属種、ダイズ（Soja）亜属種、ヒマワリ（Helianthus）属種、タバコ（Nicotiana）属種、ショウジョウハグマ（Vernonia）属種、コムギ（Triticum）属種、オオムギ（Hordeum）属種、イネ（Oryza）属種、カラスムギ（Avena）属種、モロコシ（Sorghum）属種、ライムギ（Secale）属種、アブラナ（Brassicaceae）科、ならびにイネ科（Gramineae）植物の他のメンバーからなる群から選択される、請求項４５に記載の植物材料。
【請求項５１】
植物体の乾燥耐性を改変する方法であって、
Ｓｎｆ１関連タンパク質キナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列を含む核酸構築物を、植物体形質転換ベクター中に導入するステップと、
前記植物体形質転換ベクターにより、植物体または植物種子のゲノムを形質転換するステップと、
前記核酸配列を発現させるステップと、
前記植物体または植物種子を生育させるステップと、
同一の条件下で生育させた植物体と同じ遺伝子型であるが前記導入核酸配列を有さない、統計学的に有意な数の植物体の平均乾燥耐性と比較して、乾燥耐性の変化を有する形質転換植物体を選択するステップと
を含む方法。
【請求項５２】
植物体の根のバイオマスを改変する方法であって、
Ｓｎｆ１関連タンパク質キナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列を含む核酸構築物を、植物体形質転換ベクター中に導入するステップと、
前記植物体形質転換ベクターにより、植物体または植物種子のゲノムを形質転換するステップと、
前記核酸配列を発現させるステップと、
前記植物体または植物種子を生育させるステップと、
同一の条件下で生育させた植物体と同じ遺伝子型であるが導入核酸配列は有さない、統計学的に有意な数の植物体の根の平均バイオマスと比較して、根のバイオマスの変化を有する形質転換植物体を選択するステップと
を含む方法。
【請求項５３】
植物体、植物種子、または後代における水分喪失に対する抵抗性、乾燥耐性、炭素同化量、植物体の生育および成長、脂肪酸バイオアセンブリー、または根の生育を向上させる、１または複数のさらなる異種遺伝子または改変遺伝子を含む、請求項１３に記載の植物体、植物種子、またはその後代。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
本出願は、「植物ＳＮＦ１関連タンパク質キナーゼ遺伝子」について、２００９年４月１０日に出願された、米国特許仮出願第６１／１６８，５３２号の出願日の利益を主張するものである。
【０００２】
本発明は一般に、植物の特徴を遺伝子操作するのに有用な植物の遺伝子に関する。より具体的には、本発明は、例えば、商用植物または作物植物における、植物体の水分喪失量および植物体の乾燥耐性、スクロース含量、デンプン含量、種子油含量、脂肪酸合成量、種子油のアシル組成、種子のサイズ／重量、生物ストレスに対する抵抗性／耐性、根のバイオマスの増大、ならびに／または他の種子成分への炭素フラックスを改変するために、有用なＳｎｆ１関連タンパク質キナーゼ（ＳｎＲＫ）遺伝子の同定、単離、および導入に関する。
【背景技術】
【０００３】
Ｓｎｆ１関連タンパク質キナーゼが、酵母細胞および哺乳動物細胞における栄養ストレスおよび環境ストレスに応答して、基礎的な代謝経路を調節する重要な制御物質として機能することは、多くの証拠により裏付けられている（Ｈａｒｄｉｅ、２００７；ＨａｒｄｉｅおよびＣａｒｌｉｎｇ、１９９７；ＨｅｄｂａｃｋｅｒおよびＣａｒｌｓｏｎ、２００８）。酵母である出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）において、スクロース非発酵キナーゼであるＳｎｆ１は、グルコース抑制遺伝子の転写を抑制解除させるのに必要とされる、セリン／トレオニンタンパク質キナーゼである。Ｓｎｆ１はまた、糖新生、グリコーゲンの蓄積、ミトコンドリアおよびペルオキシソームの生合成、ならびに胞子形成にも関与する。哺乳動物における酵母Ｓｎｆ１のオーソログは、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）活性化タンパク質キナーゼ（ＡＭＰＫ）である。
【０００４】
細胞によりストレス応答がなされてＡＴＰが枯渇すると、ＡＭＰＫが活性化し、これにより、コレステロールおよび脂肪酸の生合成に関与する酵素がリン酸化および阻害される。ＡＭＰＫは、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリール−ＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）レダクターゼ（コレステロールならびに他のイソプレノイド化合物が合成される際に重要となる制御酵素）、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）（マロニルＣｏＡの合成における律速酵素）、およびホルモン感受性リパーゼも同様に不活化しうることが十分に立証されている。同時に、ＡＭＰＫは、脂肪酸異化経路を誘発し、ＡＴＰ生成も促進する。例えば、ＡＭＰＫは、マロニルＣｏＡの分解に関与する酵素である、マロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ（ＭＣＤ）をリン酸化および活性化する。より近年において、哺乳動物細胞では、グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼを不活化する際のＡＭＰＫの役割もまた示唆されている。したがって、ＡＭＰＫは、トリグリセリドおよびコレステリルエステルの合成および分解を制御する可能性を有する。
【０００５】
シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ゲノムおよびイネゲノムの全配列についてのバイオインフォマティックス研究により、植物には、酵母に由来する古典的なＳｎｆ１型のキナーゼと関連する、大きな一群のキナーゼが存在することが明らかとなった。シロイヌナズナ属（Arabidopsis）では、Ｓｎｆ１関連キナーゼ（ＳｎＲＫ）は、５つの染色体すべてにおいて見られ、３８のメンバーからなる。配列類似性により、これらのキナーゼを、３つの亜群：ＳｎＲＫ１（３のメンバー）、ＳｎＲＫ２（１０のメンバー）、およびＳｎＲＫ３（２５のメンバー）に類別することができる（Ｅ．Ｍ．Ｈｒａｂａｋら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００３、１３２、６６６〜６８０）。個々のキナーゼの構造は、キナーゼドメインおよび制御ドメインを含む。これらのキナーゼは、Ｎ末端のキナーゼ触媒ドメインにおいて比較的高度の類似性を示すが、Ｃ末端におけるそれらの制御ドメインは、高度に多様であり、これらは、タンパク質間相互作用において機能するか、またはキナーゼ活性を制御すると考えられている（Ｅ．Ｍ．Ｈｒａｂａｋら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００３、１３２、６６６〜６８０）。このことは、各キナーゼの複雑な機能性を強調する。
【０００６】
ＳｎＲＫ１キナーゼは、配列類似性に基づいて、酵母Ｓｎｆ１キナーゼおよび哺乳動物ＡＭＰＫに最も近い相同体である。ＳｎＲＫ１キナーゼは、ライムギ、シロイヌナズナ属、タバコ、オオムギ、イネ、テンサイ、およびバレイショを含めた多様な種から単離されている。ライムギ遺伝子およびタバコ遺伝子が、酵母におけるＳｎｆ１の突然変異を相補しうるという知見により、Ｓｎｆ１に対する植物ＳｎＲＫ１遺伝子の機能的な類似性が予測される。したがって、糖代謝における植物ＳｎＲＫ１の役割が示唆されている。バレイショにおいてＳｎＲＫ１のアンチセンスを発現させたところ、糖誘導性のスクロースシンターゼの発現が結果として失われた（Ｐｕｒｃｅｌｌら、Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １９９８、１４：１９５〜２０２）。これらのアンチセンス系統についてのさらなる研究により、デンプンの生合成において重要な制御ステップである、ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼの翻訳後修飾を調節することを介して炭素フローに影響を及ぼす、ＳｎＲＫ１キナーゼの潜在的な役割が示されている（Ｔｉｅｓｓｅｎら、Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２００３、３５：４９０〜５００）。オオムギにおいてＳｎＲＫ１のアンチセンスを発現させたところ、花粉粒内にほとんどまたはまったくデンプンが蓄積されず、雄の不妊が結果として引き起こされたという知見（Ｙ．Ｚｈｅｎｇら、Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２００１、２８：４３１〜４４１）から、さらに支持する証拠が得られた。
【０００７】
ＳｎＲＫ１群と異なり、動物および真菌においてＳｎＲＫ２群およびＳｎＲＫ３群を代表するものは見出されておらず、植物におけるこれらの細胞応答の独特の制御が予測される。近年、ＣＩＰＫ（ＣＢＬ相互作用型タンパク質キナーゼ）とも称する、ＳｎＲＫ３キナーゼが、カルシニューリンＢ様タンパク質（ＣＢＬ）と称する植物カルシウムセンサーの新規のファミリーと相互作用しうることが示されている（Ｋｕｄｌａら、１９９９；Ｓｈｉら、１９９９；Ｋｉｍら、２０００）。シロイヌナズナ属では、ＣＢＬファミリーに１０のメンバーが存在し、各メンバーは、カルシウムに結合する３つのＥＦハンドを含有する（Ｋｏｌｕｋｉｓａｏｇｌｕら、２００４）。ストレス条件下では、カルシウムシグネチャーにより、異なるＣＢＬメンバーとＳｎＲＫ３（ＣＩＰＫ）メンバーとの特異的相互作用が変化し、これが解読され、下流における遺伝子の発現が変化し、その後、特異的な生理学的応答がもたらされる。例えば、ＣＢＬ１が、ＣＩＰＫ７およびＣＩＰＫ９と相互作用して、乾燥に対する応答を促進するのに対し、ＣＢＬ９は、ＣＩＰＫ３を活性化して、寒冷に対する応答を増強する。ＣＢＬ−ＳｎＲＫ３（ＣＩＰＫ）ネットワークは、ストレス応答におけるその中心的な役割のためにストレスホルモンと称される植物ホルモンである、アブシジン酸（ＡＢＡ）と主として相互作用することが留意される。この機構を裏付ける証拠には、（ｉ）ストレス条件下におけるのと同様に、ＡＢＡは、ＣＢＬ１遺伝子およびＣＩＰＫ３遺伝子の発現を誘導しうること、（ｉｉ）ｃｂｌ９突然変異体およびｃｉｐｋ３突然変異体は、ＡＢＡに対して感受性過剰であること、ならびに（ｉｉｉ）シロイヌナズナ属において、ＳｎＲＫ３群のメンバー（ＰＫＳ１８と称し、注釈つきのＡｔ５ｇ４５８２０に対応する）を過剰発現させたところ、種子発芽時においてＡＢＡに感受性過剰が付与される一方、該遺伝子をサイレンシングさせたところ、ＡＢＡの感受性喪失が結果としてもたらされたこと（Ｄ．Ｇｏｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００３、２７７：４２０８８〜４２０９６）が含まれる。
【０００８】
キナーゼＣ末端ドメインの配列類似性が低いため、ＳｎＲＫ２群は、２つの亜群、すなわち、ＳｎＲＫ２ａおよびＳｎＲＫ２ｂへとさらに類別することができる（Ｍ．Ｂｏｕｄｓｏｃｑら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００４、２７９：４１７５８〜６６；Ｔ．Ｕｍｅｚａｗａら、ＰＮＡＳ  ２００４、１０１：１７３０６〜１７３１１）。ＳｎＲＫ２ａは、ＳｎＲＫ２．２、ＳｎＲＫ２．３、ＳｎＲＫ２．６、ＳｎＲＫ２．７、およびＳｎＲＫ２．８からなる。他の５つのメンバーであるＳｎＲＫ２．１、ＳｎＲＫ２．４、ＳｎＲＫ２．５、ＳｎＲＫ２．９、およびＳｎＲＫ２．１０は、ＳｎＲＫ２ｂ亜群に属する（Ｕｍｅｚａｗａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２００４、１０１：１７３０６〜１１）。複数の研究は、ＳｎＲＫ２亜群における個々のキナーゼが、生物学的プロセスにおいて異なる役割を有しうることを示している。例えば、ＳｎＲＫ２．２と、ＳｎＲＫ２．３とは、配列類似性に基づいて、ＳｎＲＫ２．６と最も密接に関連する２つのタンパク質キナーゼである（Ｈｒａｂａｋら、２００３）が、それらは、ＳｎＲＫ２．６と極めて異なる形で機能する。ＳｎＲＫ２．２およびＳｎＲＫ２．３は、種子の発芽時および苗の成長時において、ＡＢＡシグナル伝達を媒介する重要なタンパク質キナーゼであることが示されている。しかし、ＡＢＡシグナル伝達の正の制御物質としてのＳｎＲＫ２．６が、ＡＢＡを介する気孔開度の制御に関与する一方、シロイヌナズナ属のＳｎＲＫ２．６突然変異体でも、種子の休眠および発芽が損なわれることはない（Ｍｕｓｔｉｌｌｉら、２００２；Ｙｏｓｈｉｄａら、２００６）。
【０００９】
ＳｎＲＫ２亜群の各キナーゼに関する特別な機能性を強調する、少なくとも３つの因子が存在すると考えられている。第一に、個々のキナーゼは、時間的および空間的に異なる発現を示しうる。例えば、ＳｎＲＫ２−８の発現は、根では高度であるが、葉および長角果では低度であり（Ｕｍｅｚａｗａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２００４、１０１：１７３０６〜１１）、ＳｎＲＫ２−６は主に、シロイヌナズナ属の孔辺細胞および脈管組織において発現し（Ｍｕｓｔｉｌｌｉら、２００２）、ＳｎＲＫ２−２およびＳｎＲＫ２−３はいずれも、各種の組織において広範な発現を示すが、ＳｎＲＫ２−３は、根の先端部において特に高度に発現する（Ｆｕｊｉｉら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、２００７、１９：４８５〜４９４）。第二に、Ｃ末端における制御ドメインは、異なるＳｎＲＫ２キナーゼ間で高度に多様であるが、キナーゼドメインはよく保存されている。例えば、ＳｎＲＫ２−４キナーゼと、ＳｎＲＫ２−６キナーゼとの全体的な配列類似性が７０％であるのに対し、Ｃ末端ドメインで見られる同一性は、３０％に過ぎない。これは、ＳｎＲＫ２−６による他のシグナル伝達構成要素との相互作用が、ＳｎＲＫ２−４による相互作用とは異なりうることを示唆し、これにより、これらの２つのキナーゼにより付与される機能は異なることが予測される。支持する証拠は、これらの２つのキナーゼが異なる環境要因に応答するという知見から得られた（Ｍ．Ｂｏｕｄｓｏｃｑら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００４、２７９：４１７５８〜６６）。加えて、該キナーゼの生理学的機能の制御におけるＣ末端ドメインの役割が、実験的に検証された（Ｂｅｌｉｎら、２００６；Ｙｏｓｈｉｄａら、２００６）。最後に、該キナーゼの構造がわずかに異なれば、異なる細胞内局在をもたらしうる。各キナーゼがどのように機能するかを理解するためには、それが生細胞内のどこに局在するかを理解することが必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の一実施形態は、植物体、植物種子、またはその後代を作製するプロセスであって、Ｓｎｆ１関連タンパク質キナーゼタンパク質をコードする核酸配列により、植物細胞を形質転換するステップと、植物体が種子をつけるまで、前記植物細胞から植物体を生育させるステップと、前記植物体から種子を採取するステップとを含むプロセスを対象とする。本発明の別の実施形態は、前記植物体を作製するプロセスにより作製される植物体から採取される種子を包含する。また、そのゲノム中に組み込まれたＳｎｆ１関連タンパク質キナーゼタンパク質をコードする核酸配列を有する植物体、植物種子、またはその後代も包含される。
【００１１】
本発明の別の態様は、植物体、植物体の貯蔵器官、または植物種子の油含量、糖含量、またはデンプン含量を変化させる方法を包含し、そのプロセスは、センスまたはアンチセンスの核酸構築物を植物体形質転換ベクター中に導入して、改変植物体形質転換ベクターを作製するステップであって、前記センスまたはアンチセンスの核酸構築物が、シロイヌナズナ属のＳｎｆ１関連タンパク質キナーゼ（ＳｎＲＫ）タンパク質をコードする単離核酸配列、精製核酸配列、または組換え核酸配列を含むステップを包含する。植物体、植物体の貯蔵器官、または植物種子のゲノムは、前記改変植物体形質転換ベクターにより形質転換される。この植物体、植物体の貯蔵器官、または植物種子を生育させ、次いで、油または生体高分子が抽出される。このベクターにより形質転換されているゲノムを有する、遺伝子形質転換植物体および植物種子もまた、本発明のさらなる態様として包含される。このような植物体および植物種子は、同じ遺伝子型の遺伝子改変されていない植物体と比較して、呼吸速度の変化、種子油含量の変化、脂肪酸組成の変化、バイオマスの増大、生体高分子を蓄積する能力の増強、根の成長の増大を示すものとして特徴づけることができる。
【００１２】
特定の実施形態では、植物体におけるＳｎｆ１関連タンパク質キナーゼタンパク質レベルを調節する方法が、プロモーターに作動可能に連結された、植物体のＳｎｆ１関連タンパク質キナーゼポリヌクレオチドにより、植物細胞を安定に形質転換するステップであって、前記ポリヌクレオチドが、センス配向またはアンチセンス配向であるステップと、前記植物細胞を、植物生育条件下において生育させて、植物体におけるＳｎｆ１関連タンパク質キナーゼタンパク質を調節するのに十分な時間にわたり前記ポリヌクレオチドを発現することが可能な再生植物体をもたらすステップとを包含する。
【００１３】
別の実施形態は、トランスジェニック種子から油を抽出するプロセスであって、Ｓｎｆ１関連タンパク質キナーゼタンパク質をコードする手段により、植物細胞を形質転換するステップと、植物体が種子をつけるまで、前記植物細胞から植物体を生育させるステップと、前記植物体から種子を採取するステップと、採取された種子から油を抽出するステップとを含むプロセスを対象とする。このプロセスのプロセスにより生成される油もまた、包含される。
【００１４】
さらに別の実施形態は、植物細胞を形質転換するためのベクターであって、配列番号１もしくは配列番号３、または配列番号１もしくは配列番号３の一部、あるいは配列番号１もしくは配列番号３と実質的に相同な配列によるデオキシリボ核酸配列を含有することを特徴とするベクターを対象とする。また、配列番号１もしくは配列番号３、または配列番号１もしくは配列番号３の一部、あるいは配列番号１もしくは配列番号３と実質的に相同な配列の導入ヌクレオチド配列を含有することを特徴とするゲノムを有する植物体または植物種子も、実施形態として包含される。同様に、トランスジェニック植物体のゲノム中にヌクレオチド配列を導入することにより前記植物体を作製する方法であって、前記ゲノム中に導入される前記ヌクレオチド配列が、配列番号１もしくは配列番号３、または配列番号１もしくは配列番号３の一部、あるいは配列番号１もしくは配列番号３、または配列番号１もしくは配列番号３の一部と実質的に相同な配列を包含することを特徴とする方法も、特定の実施形態に包含される。
【００１５】
本発明の別の態様は、センスまたはアンチセンスの核酸構築物を、植物体形質転換ベクター中に導入し、該ベクターを用いて植物体または植物種子のゲノムを形質転換し、次いで、該植物体または植物種子を生育させ、該植物種子から油を抽出することにより、該植物体の油含量、脂肪酸組成、または種子収量を変化させる方法であって、前記核酸配列が、配列番号１もしくは配列番号３、または配列番号１もしくは配列番号３の一部、あるいは配列番号１もしくは配列番号３と実質的に相同な配列であることを特徴とする方法を包含する。本発明のさらに別の態様は、プロモーターと機能的に関連している、植物材料の油含量を改変するためのＳｎｆ１関連タンパク質キナーゼ手段を含むベクターによりさらに形質転換される植物体、植物種子、または植物体の後代を包含する。
【００１６】
本発明のさらに別の実施形態は、植物体の乾燥耐性を改変する方法であって、Ｓｎｆ１関連タンパク質キナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列を含む核酸構築物を、植物体形質転換ベクター中に導入するステップと、前記植物体形質転換ベクターにより、植物体または植物種子のゲノムを形質転換するステップと、前記核酸配列を発現させるステップと、前記植物体または植物種子を生育させるステップと、同一の条件下で生育させた植物体と同じ遺伝子型であるが前記導入核酸配列は有さない、統計学的に有意な数の植物体の平均乾燥耐性と比較して、乾燥耐性の変化を有する形質転換植物体を選択するステップとを包含する方法を対象とする。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】３４日齢のシロイヌナズナの、野生型（ｗｔ）系統の茎における側枝数と、３４０２９３、３４０３１８、３４０３６７、３４０３７８、および３４０３９７と称するＳｎＲＫ２−６トランスジェニック系統の茎における側枝数との比較を示すグラフである。誤差バーは、±ＳＤである。
【図２】２７日齢のシロイヌナズナの、野生型（ｗｔ）系統およびトランスジェニック系統の切断した地上部における水分喪失量を示すプロットである。データ点の各々は、シロイヌナズナの５つの個別のトランスジェニック系統の平均を表わす。水分喪失量は、地上部を植物体から切断した０〜６時間後における、初期の新鮮時重量に対する百分率として報告される。ｗｔ系統と、トランスジェニック系統との間における水分喪失量の有意差を、Ｐ＜０．００４（ｔ検定）により示す。
【図３】２７日齢のシロイヌナズナのＳＡＬＫ＿００８０６８株におけるＴ−ＤＮＡ挿入について、ホモ接合（ノックアウト）およびヌル（ヌル）の切断した地上部における水分喪失量を示すプロットである。水分喪失量は、地上部を植物体から切断した０〜６時間後における、初期の新鮮時重量に対する百分率として報告される。ｗｔ系統と、トランスジェニック系統との間における水分喪失量の有意差を、Ｐ＜０．００４（ｔ検定）により示す。
【図４】３０日齢のシロイヌナズナの、野生型（ｗｔ）系統およびＴ３  ＳｎＲＫ２−６トランスジェニック系統（３４０２９３、３４０３１８、３４０３６７、３４０３７８、および３４０３９７）に由来する葉における可溶性糖含量（ナノモル／ｇ単位のグルコース、フルクトース、およびスクロース）を示すグラフである。データ点の各々は、シロイヌナズナの５つの個別のＳｎＲＫ２−６トランスジェニック系統（３４０２９３、３４０３１８、３４０３６７、３４０３７８、および３４０３９７）の平均を表わす。誤差バーは、±ＳＤである（試料採取した各系統につき、ｎ＝８または１０ずつの植物体）。
【図５】３０日齢のシロイヌナズナの、野生型（ｗｔ）系統、ならびに５つの個別のＳｎＲＫ２−６トランスジェニック系統に由来する葉におけるデンプン含量を示すグラフである。データ点の各々は、シロイヌナズナの５つの個別のＳｎＲＫ２−６トランスジェニック系統（３４０２９３、３４０３１８、３４０３６７、３４０３７８、および３４０３９７）の平均を表わす。デンプン含量は、各系統に由来する葉の、ナノモル／ｇ単位の総デンプン含量として報告される。誤差バーは、±ＳＤである（試料採取した各系統につき、ｎ＝８または１０ずつの植物体）。
【図６】シロイヌナズナの、野生型（ｗｔ）系統に由来する葉の脂肪酸組成と、ＳｎＲＫ２−６トランスジェニック系統に由来する葉の脂肪酸組成との比較を示すグラフである。データ点の各々は、シロイヌナズナの５つの個別のＳｎＲＫ２−６トランスジェニック系統（３４０２９３、３４０３１８、３４０３６７、３４０３７８、および３４０３９７）の平均を表わす。脂肪酸の比率は、各系統に由来する葉の全組成に対するモル％として報告される。誤差バーは、±ＳＤである（試料採取した各系統につき、ｎ＝１０ずつの植物体）。
【図７】シロイヌナズナの、野生型（ｗｔ）系統における植物体１株当たりの種子収量と、ＳｎＲＫ２−６トランスジェニック系統における植物体１株当たりの種子収量との比較を示すグラフである。より具体的には、通常の乾燥生育条件下、穏やかな乾燥生育条件下、ならびに厳しい乾燥生育条件下における種子収量の比較である。「通常」条件下で生育させた植物体には、全生育期間中において、十分に施水した。「穏やかな」乾燥条件下で生育させた植物体では、開花期の６日間にわたり灌漑を停止した。「厳しい」乾燥条件下で生育させた植物体では、栄養成長期の１６日間にわたり灌漑を停止した。誤差バーは、±ＳＤである（試料採取した各系統につき、ｎ＝３０ずつの植物体）。ｗｔ系統と、トランスジェニック系統との間における種子収量の有意差を、Ｐ＜０．００１（ｔ検定）により示す。
【図８】３４日齢のヌル分離個体（ヌル）およびＳｎＲＫ２−６トランスジェニック系統のトウモロコシ植物体（トランスジェニック）の切断葉部分における水分喪失量を示すプロットである。データ点の各々は、トウモロコシ植物体の８つの個別のトランスジェニック系統の平均を表わす。それらのすべてが極めて類似のサイズを示す、各個別の系統に由来する５株ずつのヌル分離個体、ならびに５株ずつのキナーゼ含有植物体を用いた。各植物体について、頸領が目に見える頂端部の葉を切り取り、アッセイで用いた。水分喪失量は、地上部を植物体から切断した０分〜１８０分後における、初期の新鮮時重量に対する百分率として報告される。ヌル系統と、トランスジェニック系統との間における水分喪失量の有意差を、Ｐ＜０．００３（ｔ検定）により示す。
【図９Ａ】３４日齢の、３つの個別の系統に由来するヌル分離個体（ヌル）、ならびにＳｎＲＫ２−６を含有するトウモロコシ植物体（トランスジェニック）の切断葉における水分喪失量を示すプロットである。データ点の各々は、同じ系統に由来する５株ずつの個別のトウモロコシ植物体の平均を表わす。各植物体について、頸領が目に見える頂端部の葉を切り取り、アッセイで用いた。水分喪失量は、地上部を植物体から切断した０分〜９０分後における、初期の新鮮時重量に対する百分率として報告される。
【図９Ｂ】３４日齢の、３つの個別の系統に由来するヌル分離個体（ヌル）、ならびにＳｎＲＫ２−６を含有するトウモロコシ植物体（トランスジェニック）の切断葉における水分喪失量を示すプロットである。データ点の各々は、同じ系統に由来する５株ずつの個別のトウモロコシ植物体の平均を表わす。各植物体について、頸領が目に見える頂端部の葉を切り取り、アッセイで用いた。水分喪失量は、地上部を植物体から切断した０分〜９０分後における、初期の新鮮時重量に対する百分率として報告される。
【図９Ｃ】３４日齢の、３つの個別の系統に由来するヌル分離個体（ヌル）、ならびにＳｎＲＫ２−６を含有するトウモロコシ植物体（トランスジェニック）の切断葉における水分喪失量を示すプロットである。データ点の各々は、同じ系統に由来する５株ずつの個別のトウモロコシ植物体の平均を表わす。各植物体について、頸領が目に見える頂端部の葉を切り取り、アッセイで用いた。水分喪失量は、地上部を植物体から切断した０分〜９０分後における、初期の新鮮時重量に対する百分率として報告される。
【図１０】２２８０（１）００６．００６Ｒ．０１１Ｒ、２２８０（２）０１５．００６Ｒ．００８Ｒ、２２８０（２）０１６．００４Ｒ．０１７Ｒ、および２２８０（３）０２５．００６Ｒ．００７Ｒと称する４つの個別の系統に由来する、ヌル分離個体（ヌル）における根のバイオマスと、ＳｎＲＫ２−６を含有するトウモロコシ植物体（トランスジェニック）における根のバイオマスとの比較を示すグラフである。地上部を切り取り、土壌を除去することにより根を回収し、次いで、７日間にわたり温室内で乾燥させて、異なる試料間における水分のばらつきを排除した。
【図１１】ベクターとして用いうるプラスミドであるｐＤＡＢ４５０４のマップである。該ベクターは、本発明において植物体を形質転換するための以下の顕著な特色：ＣｓＶＭＶプロモーター、ＳｎＲＫ２−６、およびＡｔｕＯＲＦ２４  ３’−ＵＴＲを含有する。
【図１２】ベクターとして用いうるプラスミドであるｐＤＡＢ７７０２のマップである。該ベクターは、本発明において植物体を形質転換するための以下の顕著な特色：Ｕｂｉ１プロモーター、ＳｎＲＫ２−６ｈｖ、およびＺｍＰｅｒ５  ３’ＵＴＲを含有する。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の一実施形態は、商用植物油の収量を増大させる目的、またはそれらの組成を改変して、植物体および植物製品の特定の商用の改善を達成する目的で植物体内のトリアシルグリセロールの自然形成を改変するために用いうる遺伝子エレメントの同定、単離、およびクローニングを対象とする。
【００１９】
本発明の別の実施形態は、シロイヌナズナ属種に由来するＳｎｆ１関連タンパク質キナーゼ（ＳｎＲＫ）遺伝子配列およびＳｎＲＫ  ｃＤＮＡ配列を単離および特徴づけし、植物体の遺伝子操作においてこれらの配列を用いることに関する。
【００２０】
本発明のさらに別の実施形態は、プロモーター（例えば、ＣｓＶＭＶまたはＵｂｉ１）の制御下にある、センス配向のシロイヌナズナ属に由来する全長ＳｎＲＫコード配列またはＳｎＲＫ配列の大部分を含有するベクターを提供し、これをシロイヌナズナ属種中に再導入するか、または他の植物体中に導入することである。本発明の代替的な実施形態では、それ自身の５’側上流の制御配列の制御下にある、シロイヌナズナ属種に由来する全長ＳｎＲＫ遺伝子またはＳｎＲＫ配列の大部分からなる、シロイヌナズナ属に由来するゲノム断片を含有するベクターが提供され、これがシロイヌナズナ属種中に再導入されるか、または他の植物体中に導入される。
【００２１】
また、プロモーターの制御下にある、アンチセンス配向のシロイヌナズナ属に由来する全長ＳｎＲＫ配列またはＳｎＲＫ配列の大部分を含有するベクターを構築し、これをシロイヌナズナ属種中に再導入するか、または他の植物体中に導入する方法も包含される。別の具体的な方法は、シロイヌナズナ属および他の植物体を改変して、それらの種子油含量、それらの脂肪酸組成、それらの平均種子重量もしくは平均種子サイズ、ならびに／またはそれらの水分喪失量および植物体の乾燥耐性を改変するステップを包含する。本発明の他の方法は、シロイヌナズナ属および他の植物体を改変して、根のバイオマスを増大させるなど、生育および成長を促進するか、またはそれらの光合成活性を改変して、これにより、糖含量およびデンプン含量を増大させるステップを包含する。
【００２２】
本発明の別の態様によれば、配列番号１（ｐＳｎＲＫ  ｃＤＮＡ）の、単離および精製されたデオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）を、センス配向で植物細胞中に導入するための、該ｃＤＮＡを含有するベクターが提供される。本発明の別の態様によれば、配列番号３（ｐＳｎＲＫ２−６ｈｖ５遺伝子）の、単離および精製された植物最適化デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を、センス配向で植物細胞中に導入するための、該遺伝子を含有するベクターが提供される。本発明のさらに別の態様によれば、配列番号１もしくはその一部、または配列番号３もしくはその一部を、アンチセンス配向で植物細胞中に導入するための、該遺伝子または部分遺伝子を含有するベクターを調製する方法が提供される。
【００２３】
別の実施形態は、シロイヌナズナの突然変異体の種子系統を提供するステップを包含する。該突然変異体の種子系統は、ＳｎＲＫ遺伝子内に挿入突然変異を有し（下記の表１に示される）、ＳｎＲＫ活性が増大しており、その結果、葉のサイズおよび側枝数が増大し、水分喪失量が減少し、糖含量およびデンプン含量が増大し、種子中の脂肪アシル組成が改変され、種子収量が増大し、根のバイオマスが増大する植物体をもたらす。ＳｎＲＫ２−６のｃＤＮＡ配列を配列番号１に示し、その植物最適化ＤＮＡ配列を配列番号３に示し、ＳｎＲＫ２−６の翻訳されたタンパク質配列を配列番号２に示す。
【００２４】
本発明はまた、導入された配列番号１または配列番号３のＤＮＡ配列を含有するゲノムを有する、トランスジェニック植物体およびトランスジェニック植物種子、ならびにこのような植物体および植物種子を作製する方法にも関する。
【００２５】
本発明は、当業者により理解される通り、配列番号１または配列番号３の配列情報を用いて、既知の方法により単離および／または特徴づけされる、２５％以上のアミノ酸配列の推定同一性、ならびに５０％以上のアミノ酸配列の推定類似性を有する植物体に由来する、実質的に相同的なＤＮＡ配列と、アンチセンス適用または共抑制（ＪｏｒｇｅｎｓｅｎおよびＮａｐｏｌｉ、１９９４）適用で用いることにより、遺伝子発現の阻害剤としてなおも機能しうる、長さが短縮された部分とにさらに関する。特定の遺伝子配列におけるヌクレオチドの同一性のわずかな変化により、その遺伝子の有効性が結果として低減または増強される場合があり、一部の適用（例えば、アンチセンス適用または共抑制適用）では、部分配列が、しばしば全長形と同様に有効に作用することは、当業者により理解されるであろう。改変遺伝子の有効性を調べる方法と同様、遺伝子配列を変異または短縮させうる方法も、当業者にはよく知られている。したがって、このような遺伝子の変異型のすべては、本発明の一部として特許請求される。
【００２６】
葉のサイズ、側枝数、水分喪失量、または糖、デンプン、もしくは油の含量もしくは組成の改変を考慮する場合は、本発明による、統計学的に有意な数の植物体または種子の平均から得られた結果を、同一の条件下で同時に生育させた、統計学的に有意な数の、形質転換されていない（対照の）、同じ遺伝子型の植物体または種子の平均から得られた結果と比較することが最善である。特に、このような植物体を異なる条件下で生育させる場合は、遺伝子型が同じ個別の植物体のばらつきが許容される。必要とされる平均を成すのに用いられる植物体または種子の実際の数は変化しうるが、このような数を選択するいかなる場合でも一般に、一定の平均をもたらすのに十分な数であるものとする。一般に、この数は、少なくとも１０であり、少なくとも２０、３０、５０、または１００であることがより好ましい。
【００２７】
本発明のＳｎＲＫは、植物体におけるＳｎＲＫ活性、ならびに水分喪失量、乾燥耐性、炭素同化量、植物体の生育および成長、脂肪酸バイオアセンブリー、ならびに根の成長を操作するのに有用である。例えば、プロモーター（例えば、ＣｓＶＭＶまたはＵｂｉ１）の制御下において、センス配向でＳｎＲＫ遺伝子を含有する構築物により植物体を形質転換することにより、ＳｎＲＫ  ｃＤＮＡの発現および乾燥耐性を向上させることができ、該植物体の組成を改変することができる。これは、乾燥耐性、および根の作物中のデンプン／油比を改変するのに特に有利でありうる。一部の実施形態では、ＳｎＲＫ遺伝子を含有する構築物により形質転換した植物体はまた、これらの植物体における水分喪失に対する抵抗性、乾燥耐性、炭素同化量、植物体の生育および成長、脂肪酸バイオアセンブリー、ならびに根の成長をさらに向上させる、さらなる異種遺伝子または改変遺伝子も包含しうる。
【００２８】
代替的に、アンチセンス現象または共抑制（トランスイッチ（Transwitch））現象（Ｄｅ  Ｌａｎｇｅら、１９９５；Ｍｏｌら、１９９０；ＪｏｒｇｅｎｓｅｎおよびＮａｐｏｌｉ、１９９４；Ｋｉｎｎｅｙ、１９９５；Ｖａｕｃｈｅｒｅｔら、１９９８；Ｔａｙｌｏｒ、１９９８）によりある程度までは、ＳｎＲＫの発現をサイレンシングすることもできる。例えば、種子特異的な形でＳｎＲＫをサイレンシングする結果として、ＳｎＲＫの蓄積を低下させることができる。これは、種子根作物中のデンプン、糖、および／または油の含量または比率を低下させて、貯蔵期間中の安定性を向上させることに適用されうるであろう。
【００２９】
ＳｎＲＫ遺伝子またはその一部を用いて可能となる操作および成果物の一部には、以下の油含量を増加または減少させた種子、含有する糖含量またはデンプン含量を増加または減少させた葉、脂肪酸組成が改変された種子油、水分喪失量が減少している植物体、他の貯蔵器官（例えば、塊茎、根、および葉）内の貯蔵化合物の蓄積能が増強または改変されている植物体、ならびに根の成長および根のバイオマスが増大している植物体が含まれるがこれらに限定されない。
【００３０】
複数のＳｎＲＫ２キナーゼおよびＳｎＲＫ３キナーゼが、ＡＢＡシグナル伝達カスケードを介し、非生物的ストレスに応答して極めて重要な役割を果たすことが示されている。植物の脂質代謝におけるＡＢＡの極めて重要な役割を踏まえるなら、これは、一部のＳｎＲＫキナーゼが、この代謝の制御物質として機能しうる可能性を示唆する。種子の発芽期間において、ＡＢＡは、貯蔵脂質であるトリアシルグリセロールをスクロースへと転換するのに不可欠な経路である、脂肪酸ベータ酸化回路およびグリオキシル酸回路に関与する遺伝子の転写を低下させる（Ｓ．Ｌ．Ｐｒｉｔｃｈａｒｄら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２００２、３１：６３９〜６４７）。他方、ＡＢＡは、胚発生期間において、トリアシルグリセロール合成を増大させ、その正の制御物質としてふるまう。種子特異的な免疫調節によりＡＢＡを抑制すると、タバコ種子油の生成が結果として減少することが示されている（Ｊ．Ｐｈｉｌｌｉｐｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１９９７、１６：４４８９〜４４９６）。逆に、ＡＢＡ（４μＭ）で未成熟トウモロコシ胚を処理したところ、脂肪酸アシルトランスフェラーゼ活性が上昇し、これにより、油収量が増大した（Ｆ．Ｐａｃｈｅｃｏ−Ｍｏｉｓｅｓら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９７、１１４：１０９５〜１１０１）。この効果は、シロイヌナズナ属、アブラナ属（Brassica）（アブラナ（Brassica napus）、カラシナ（Brassica juncea）、およびハクサイ（Brassica rape））、ラッカセイ（peanut）、ニンジン、コムギ、トウヒ、アーモンド、およびラッカセイ（ground-nut）（Arachis hypogaea）を含めた他の多くの種からも観察されている。にもかかわらず、ＳｎＲＫキナーゼが、種子油合成に対するＡＢＡによる制御を媒介するかどうかは、今なお知られていない。
【００３１】
種子油の生成に関与するこれらの重要なキナーゼを同定しようと試みる中で、逆遺伝学的手法が用いられた。これは、遺伝子内へのＳＡＬＫ  Ｔ−ＤＮＡ挿入についてスクリーニングした後で、種子油含量および種子収量に対する遺伝子ノックアウトの影響を判定することに基づく。大規模なスクリーニングの後、種子油生成におけるＳｎＲＫ２−６遺伝子（Ａｔ４ｇ３３９５０）の役割が明らかとなった。ＯＳＴ１（ＯＰＥＮ  ＳＴＯＭＡＴＡ  １）遺伝子とも称するこの遺伝子は、かつて、カルシウム依存性タンパク質セリン／トレオニンキナーゼ活性を保有するタンパク質をコードし、ＡＢＡ媒介性気孔開度を制御することが示された（Ｍｕｓｔｉｌｌｉら、２００２）。Ｔ−ＤＮＡ挿入によりこの遺伝子を不活化したところ、脱水条件下において、種子収量が２４％〜５０％結果として減少した。加えて、ノックアウト株であるＳＡＬＫ＿００８０６８株では、種子油含量の７％〜２５％の減少が検出された。しかし、この挿入についてホモ接合である植物体におけるタンパク質含量（２１．３％）と、ヌル分離個体におけるタンパク質含量（２０．９％）とでほとんど変化が示されなかったことから、ＳｎＲＫ２ａ亜群のメンバーであるＳｎＲＫ２−６が、種子油生成に対して正の制御物質として作用することが示唆される。
【００３２】
ＳｎＲＫ２−６は、かつて、シロイヌナズナ属における気孔組織および脈管組織において優先的に発現する、ＡＢＡ媒介性気孔伝導度の制御物質として同定された（Ｍｕｓｔｉｌｌｉら、２００２；Ｆｕｊｉｉら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、２００７、１９：４８５〜４９４）。本発明における逆遺伝学的研究は、種子油生成におけるその役割を明らかにした。
【００３３】
ＳｎＲＫ２−６は、シロイヌナズナ属において、構成的プロモーターであるＣｓＶＭＶ下で異所性発現させた。ＳｎＲＫ２−６を、ＣｓＶＭＶにより強制的に異所性発現させると、天然プロモーターにより駆動されるＳｎＲＫ２−６発現の、空間的に高度に局在化されたパターンを破壊することから、正常なパターンとは異なるパターンがもたらされる可能性がある。このような撹乱は、植物体の生育および代謝に影響を及ぼしうる。
【００３４】
図１を参照すると、シロイヌナズナ属においてＳｎＲＫ２−６を過剰発現させたところ、葉の成長が促進され、側枝数がさらに増大することが示された。加えて、切り取ったトランスジェニック植物体では、野生型植物体と比較して、水分喪失量が実質的に減少することが示されたことから、ＳｎＲＫ２−６の過剰発現が、植物体地上部の蒸散率を低下させうることが裏付けられた。これに対し、図３に示す通り、この遺伝子をノックアウトしたところ、水分喪失が加速化された。
【００３５】
図４に示す通り、トランスジェニックのシロイヌナズナ属植物体において炭素同化量が増大したことは、ＳｎＲＫ２−６の過剰発現が、植物体の生育を促進しうることを裏付けうる。より具体的に述べると、ＳｎＲＫ２−６を過剰発現するトランスジェニックのシロイヌナズナ属植物体は、通常の温室条件下にあるトランスジェニックの葉内の、フルクトース、グルコース、およびスクロースの含量を劇的に増大させた。トランスジェニックの葉内の全糖含量は、野生型の葉内の全糖含量の２倍であった。トランスジェニック植物体のデンプン含量は、野生型レベルの実に１５６％であった。図４および５を参照すると、ＳｎＲＫ２−６をノックアウトしても、可溶性糖含量または可溶性デンプン含量には大きな影響が及ばなかった。まとめると、これらの結果は、ＳｎＲＫ２−６導入遺伝子（transgene）を構成的に発現させると、葉の光合成活性が上昇することから、炭素同化量が増大しうることを示唆する。
【００３６】
図６は、トランスジェニック葉において、脂肪酸組成が劇的に変化することを示す。トランスジェニック植物体の葉の２つのトリエン脂肪酸である１６：３および１８：３が、野生型と比べて、それぞれ、８１％および２６％増大したことから、導入遺伝子により、不飽和プロセスが強化されることが示唆される。
【００３７】
葉の光合成活性の増大と一致して、トランスジェニック植物体において種子収量の大幅な増大が検出された。野生型の植物体と比較したところ、トランスジェニック植物体は、通常条件下、穏やかな乾燥条件下、ならびに厳しい乾燥条件下において、種子収量がそれぞれ、２４％、１６％、および３５％増大した（図７）。結果は、導入遺伝子が、植物体の乾燥耐性を増強するだけでなく、他の生理学的プロセスも改変することから、通常の生育条件下における種子生成も増大させることを示唆する。
【００３８】
種子油についての解析は、ＣｓＶＭＶにより促進されるＳｎＲＫ２−６の発現が、種子油含量の大幅な変化を結果としてもたらさないことを示した。しかし、導入遺伝子によって種子収量が増大したために、全種子油生成量も増大した。
【００３９】
まとめると、シロイヌナズナ属の葉内において、ＳｎＲＫ２−６を構成的に過剰発現させたところ、可溶性の糖およびデンプンの含量が大幅に増大し、脂質の生合成が改変された。この結果さらに、通常条件下および乾燥条件下の両方において、種子収量が大幅に増大した。
【００４０】
図１０に示す通り、トランスジェニックのトウモロコシ植物体において根のバイオマスが増大したことは、ＳｎＲＫ２−６の過剰発現が根の成長を促進しうることを裏付けうる。ＳｎＲＫ２−６を過剰発現するトランスジェニックのトウモロコシ植物体は、ヌル植物体と比較して、根のバイオマスを劇的に増大させた（すなわち、１１％、２５％、９２％、および１５％）。これらの結果は、ＳｎＲＫ２−６キナーゼが根の成長を促進しうることを示唆する。このような機構は、トウモロコシの乾燥耐性の増大と関連しうる。
【００４１】
本発明による改変に特に好ましい植物には、シロイヌナズナ、ルリジサ（Borago属種）、キャノーラ、トウゴマ（Ricinus communis）、カカオ豆（Theobroma cacao）、トウモロコシ（Zea mays）、ワタ（Gossypium属種）、ハマナ属種（Crambe）、タバコソウ属種（Cuphea）、アマ（Linum属種）、レスケレーラ属種（Lesquerella）およびリムナンテス属種（Limnanthes）、リノーラ、ノウゼンハレン（Tropaeolum属種）、マツヨイグサ（Oenothera属種）、オリーブ（Olea属種）、アブラヤシ（Elaeis属種）、ラッカセイ（Arachis属種）、ナタネ、ベニバナ（Carthamus属種）、ダイズ（Glycine属種およびSoja亜属種）、ヒマワリ（Helianthus属種）、タバコ（Nicotiana属種）、ショウジョウハグマ（Vernonia属種）、コムギ（Triticum属種）、オオムギ（Hordeum属種）、イネ（Oryza属種）、カラスムギ（Avena属種）、モロコシ（Sorghum属種）、ライムギ（Secale属種）、ならびにイネ（Gramineae）科の他のメンバーが含まれる。
【００４２】
本発明は、油糧種子作物から生成される油糧種子の収量または組成を改変するのに用いられる場合に、特に有用である。油糧種子作物とは、食用油または産業において有用な油を商業的に有意な収量で生成することが可能な植物種であり、上記で列挙した植物種の多くを包含する。このような油糧種子作物は、当業者によく知られている。
【００４３】
ＳｎＲＫ２−６遺伝子は、植物体に所望の形質を付与する１または複数の他の遺伝子と共に導入することができる。例えば、場合によって、ストレス耐性遺伝子または乾燥耐性遺伝子を、ＳｎＲＫ２−６遺伝子と組み合わせて導入することができる。
【００４４】
以下の例示的な実施例を用いて、本発明をさらに説明する。
【実施例】
【００４５】
［実施例１］
ＰＣＲによる、シロイヌナズナ属ＳｎＲＫ遺伝子内へのＴ−ＤＮＡ挿入の同定
配列の類似性により、シロイヌナズナ属のＳｎＲＫキナーゼを、３つの亜群であるＳｎＲＫ１、ＳｎＲＫ２、およびＳｎＲＫ３へと類別することができる。ＳｎＲＫ１亜群は、それぞれ、Ａｔ３ｇ０１０９０、Ａｔ３ｇ２９１６０、およびＡｔ５ｇ３９４４０によりコードされる３つのキナーゼを包含する。ＳｎＲＫ２亜群は、それぞれ、遺伝子Ａｔ４ｇ４００１０、Ａｔ２ｇ２３０３０、Ａｔ１ｇ６０９４０、Ａｔ１ｇ１０９４０、Ａｔ５ｇ６３６５０、Ａｔ５ｇ０８５９０、Ａｔ１ｇ７８２９０、Ａｔ３ｇ５０５００、Ａｔ５ｇ６６８８０、およびＡｔ４ｇ３３９５０に対応する１０のメンバーからなる。ＳｎＲＫ３は、遺伝子、すなわち、Ａｔ５ｇ５７６３０、Ａｔ３ｇ１７５１０、Ａｔ１ｇ４８２６０、Ａｔ４ｇ２４４００、Ａｔ５ｇ３５４１０、Ａｔ２ｇ２６９８０、Ａｔ１ｇ３０２７０、Ａｔ１ｇ０１１４０、Ａｔ４ｇ１４５８０、Ａｔ３ｇ２３０００、Ａｔ２ｇ３８４９０、Ａｔ５ｇ０１８２０、Ａｔ２ｇ３０３６０、Ａｔ２ｇ３４１８０、Ａｔ１ｇ２９２３０、Ａｔ５ｇ４５８１０、Ａｔ４ｇ１８７００、Ａｔ４ｇ３０９６０、Ａｔ５ｇ４５８２０、Ａｔ５ｇ５８３８０、Ａｔ５ｇ０７０７０、Ａｔ５ｇ０１８１０、Ａｔ２ｇ２５０９０、Ａｔ５ｇ２５１１０、およびＡｔ５ｇ１０９３０によりコードされる２５のメンバーを伴う最大の亜群である。
【００４６】
表１および２に示す通り、ＳｎＲＫ遺伝子中にＴ−ＤＮＡを挿入したＳＡＬＫ株において、ＰＣＲにより、この挿入についてホモ接合、ヘテロ接合、およびヌルの植物体をスクリーニングした。ＰＣＲ反応で用いたゲノムＤＮＡは、シロイヌナズナ属の葉から単離した。例として述べると、ＧＳＰ１０８プライマーおよびＬＢａ１プライマーを用いて、ＳＡＬＫ＿００８０６８株のＳｎＲＫ２−６（Ａｔ４ｇ３３９５０）遺伝子へのＴ−ＤＮＡ挿入を保有する植物体についてスクリーニングした。他方、Ａｔ４ｇ３３９５０遺伝子の２つの遺伝子特異的プライマーである、ＧＳＰ１０８およびＧＳＰ１２４を用いて、該遺伝子の野生型コピーが、ＳＡＬＫ＿００８０６８株の分離個体内に存在するかどうかを判定した。
【００４７】
【表１−１】
2012523237.tif 000003
【表１−２】
2012523237.tif 000004
【００４８】
【表２】
2012523237.tif 000005
【００４９】
種子油生成における各キナーゼの機能を確定するため、ガスクロマトグラフィーにより、該キナーゼ遺伝子への該挿入を保有するＳＡＬＫ株の種子における油プロファイルを決定した。該キナーゼ遺伝子の破壊により引き起こされる影響をよりよく評価するため、同じ株に由来するヌルの同胞種を対照として用いた。理論的に述べると、ヌルの同胞種は、該挿入についてホモ接合およびヘテロ接合である他の分離個体との遺伝子バックグラウンドの類似性が、野生型の場合と比較して高度である。
［実施例２］
【００５０】
シロイヌナズナ属種子の脂肪酸メチルエステルの解析
シロイヌナズナ属種子の抽出および誘導
成熟シロイヌナズナ属種子を採取し、種子以外のすべての植物材料を除去した。採取した全種子から、約１０ｍｇずつのアリコートを採取し、１ｍｌ容量の９６ウェルプレートへと分注した。精度が±２μｇである分析用秤を用いることにより、正確な重量測定値を得、これらを記録した。使用前に、ウェルプレートをヘキサンですすぎ、直径４ｍｍのステンレス鋼製ホモジナイズ用ビーズ２個を各ウェル内に入れた。試料を分注した後で、７５ｐｐｍのヘプタデカン酸メチルおよび０．５Ｍナトリウムメトキシド０．２ｍｌを含有する０．４ｍｌヘキサンを、各ウェルへと分注した。次いで、各ウェルにキャップをはめ、バーティカルシェーカーに入れて１分間当たり５００ストロークで２分間にわたり振とうし、次いで、１分間当たり２５０ストロークで５８分間に変更した。次いで、振とうが完了したら、５６００ｒｃｆで５分間にわたり、ウェルプレートを遠心分離にかけた。遠心分離後、上部のヘキサン抽出物層を採取し、別の９６ウェルプレートに入れた。０．４ｍｌヘキサンによりさらに２回にわたり抽出を実施し、後続の各抽出物を、第１の抽出物と混合した。第２および第３の抽出では、垂直振とう条件を、１回の抽出につき、１分間当たり２５０ストロークで３０分間ずつに変更した。混合した１．２ｍｌのヘキサン抽出物を１０倍に希釈して、別の９６ウェルプレートに入れ、ＧＣ−ＦＩＤにより解析した。
【００５１】
脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）の解析
結果として得られる脂肪酸メチルエステルである、シロイヌナズナ属種子脂質を、１ｍｌ／分の水素をキャリアガスとして、３種類の傾きによる温度勾配を用いる（１．３４分間にわたり６０℃を維持し、４１．３℃／分で１５０℃とし、９．１℃／分で１８０℃とし、４１．３℃／分で２２０℃として、１．８６分間にわたり維持する）ＳＧＥ製ＢＰＸ７０型キャピラリーカラム（１５ｍ、内径０．２２、膜厚０．２５）において分解した。投入温度は２３０℃であり、水素炎イオン化検出器の温度は２４０℃であった。貯留時間によるＦＡＭＥ解析の同定および定量化は、７５ｐｐｍのヘプタデカン酸メチルを伴うナタネ油基準物質（Ｍａｔｒｅｙａ製）により達成した。
［実施例３］
【００５２】
シロイヌナズナ属葉の脂肪酸メチルエステルの解析
シロイヌナズナ属葉脂質の抽出および誘導
凍結させたシロイヌナズナ属葉を、液体窒素下で、乳鉢および乳棒により微粉へとすりつぶした。この粉末から、約５０ｍｇずつのアリコートを採取し、１ｍｌ容量の９６ウェルプレートへと分注した。使用前に、ウェルプレートをヘキサンですすぎ、直径４ｍｍのステンレス鋼製ホモジナイズ用ビーズを各ウェル内に入れた。試料を分注した後で、０．５ｍｌヘキサンおよび０．５Ｍナトリウムメトキシド０．２５ｍｌを、各ウェルへと分注した。次いで、各ウェルにキャップをはめ、バーティカルシェーカーに入れて１分間当たり２５０ストロークで３０分間にわたり振とうした。次いで、５６００ｒｃｆで５分間にわたり、ウェルプレートを遠心分離にかけた。遠心分離後、上部のヘキサン抽出物層を採取し、別の９６ウェルプレートに入れ、ガスクロマトグラフ水素炎イオン化により解析した。
【００５３】
ＦＡＭＥの解析
結果として得られる脂肪酸メチルエステルである、シロイヌナズナ属葉脂質を、１ｍｌ／分の水素をキャリアガスとして、３種類の傾きによる温度勾配を用いる（１．３４分間にわたり６０℃を維持し、４１．３℃／分で１５０℃とし、９．１℃／分で１８０℃とし、４１．３℃／分で２２０℃として、１．８６分間にわたり維持する）ＳＧＥ製ＢＰＸ７０型キャピラリーカラム（１５ｍ、内径０．２２、膜厚０．２５）において分解した。投入温度は２３０℃であり、水素炎イオン化検出器の温度は２４０℃であった。ＦＡＭＥ解析の、貯留時間によるＦＡＭＥの同定は、ナタネ油基準物質（Ｍａｔｒｅｙａ製）により達成した。
［実施例４］
【００５４】
シロイヌナズナ属種子の全タンパク質の解析
シロイヌナズナ属種子の酸による消化（タンパク質の加水分解）
成熟シロイヌナズナ属種子を採取し、種子以外のすべての植物材料を除去した。採取した全種子から、約２０ｍｇずつのアリコートを採取し、ゴム製のＯ字型環状ネジ式キャップを伴う、オートクレーブ処理可能な２ｍｌの遠心管へと分注した。精度が±２μｇである分析用秤を用いることにより、正確な重量測定値を得、これらを記録した。使用前に、酸で洗浄した４ｍｍのガラス製ビーズ１０個ずつを、各遠心管へと添加した。試料を分注した後で、遠心管をバーティカルシェーカーに取り付け、１分間当たり５００ストロークで５分間にわたり振とうした。次いで、０．１％フェノールおよび１％２−メルカプトエタノールを伴う６Ｎの塩酸１．４ｍｌを、各試料に添加した。次いで、遠心管を、再度バーティカルシェーカーに取り付け、１分間当たり５００ストロークで１５分間にわたり垂直振とうした。垂直振とうが完了したら、遠心管を加熱ブロックへと取り付け、１００℃で２４時間にわたり加熱して消化を完了させた。消化プロセスが終了したら、遠心管を室温まで冷却し、０．４μｍのガラス製フィルターにより、消化物を濾過した。濾過された消化物のうちの０．１ｍｌを、０．３ｍｌの２Ｎ水酸化ナトリウム、０．６ｍｌの水、および高速液体クロマトグラフィー蛍光検出による解析のための内部基準物質として１０００ピコモル／μｌのノルバリンを含む０．１ｍｌの水を含む１．５ｍｌのガラス製注入用バイアル内で希釈した。
【００５５】
アミノ酸残基の誘導
一級アミノ酸は、ｏ−フタルアルデヒド（ＯＰＡ）により誘導した。二級アミノ酸は、９−フルオレニルメチルクロロホルメート（ＦＭＯＣ）により誘導した。いずれの誘導反応も、カラム処理前に、ＨＰＬＣ注入用ループを用いて達成した。試料はまず、１０．２ｐＨの０．４Ｎホウ酸緩衝液により緩衝処理し（１μｌの試料に対して４μｌの緩衝液）、次いで、ＯＰＡおよびＦＭＯＣ（１μｌのＯＰＡおよび１μｌのＦＭＯＣの順序で）と混合した。次いで、試料を注入し、解析した。
【００５６】
ＨＰＬＣ−ＦＬＤによるアミノ酸残基の解析
誘導したアミノ酸残基は、４０℃で２種類の溶出勾配を用いる、１５０×３．０ｍｍの５μｍＣ１８（２）逆相カラム上で分解した。水相（溶出物Ａ）は、７．８ｐＨの４０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液からなり、有機相（溶出物Ｂ）は、アセトニトリル：メタノール：水（４５：４５：１０のｖ／ｖ／ｖ）からなった。溶媒の勾配系は、０〜１．９分Ａ／Ｂ（％）＝１００：０；１．９〜１８．１分Ａ／Ｂ（％）＝４３：５７；１８．１〜１８．６分Ａ／Ｂ（％）＝０：１００；１８．６〜２２．３分Ａ／Ｂ（％）＝０：１００；２２．３〜２３．２分Ａ／Ｂ（％）＝１００：０；２３．２〜２６Ａ／Ｂ（％）＝１００：０であった。流速は、２ｍｌ／分で一定であった。
【００５７】
蛍光検出器のパラメータは、解析の最初の１５分間にわたり、３４０ｎｍの励起波長、および４５０ｎｍの発光波長に設定した。次いで、残りの解析時間にわたり、検出器を、２６６ｎｍの励起波長、ならびに３０５ｎｍの発光波長へと切り替えた。解析の最初の１５分間は、ＯＰＡによる誘導残基を検出するのに最適化させ、残り時間は、ＦＭＯＣによる誘導残基を検出するために最適化させた。
【００５８】
アミノ酸残基の同定および定量化は、９０．９ピコモル／μｌのノルバリン内部基準物質を含有するアミノ酸基準混合物（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入）により較正した。定量化された残基は、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、ヒスチジン、グリシン、トレオニン、アルギニン、アラニン、チロシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、リシン、およびプロリンであった。各残基の回収質量を計算し、合計して、おおおその全タンパク質質量を求め、次いで、各シロイヌナズナ属種子試料について、タンパク質の比率を計算した。
［実施例５］
【００５９】
新鮮なシロイヌナズナ属の全デンプンの解析
新鮮なシロイヌナズナ属葉を、液体窒素下で、乳鉢および乳棒で組織を砕くことにより微粉へとすりつぶした。デンプンについての解析を行う前に、８０％エタノールにより、試料を脱糖化した。デンプンの消化は、それぞれ、α−アミラーゼおよびアミログルコシダーゼにより実施した。放出されたグルコースは、グルコースオキシダーゼベースの酵素アッセイおよびペルオキシダーゼベースの酵素アッセイにより検出した。デンプン含量は、遊離グルコースをデンプンへと補正した、放出グルコースに基づいて計算した。
［実施例６］
【００６０】
ＬＣ／ＭＳＭＳによる代謝物の解析
液体窒素ならびに乳鉢および乳棒を伴う手作業により、シロイヌナズナ属葉組織をすりつぶし、極微粉試料を得た。細かくすりつぶした葉組織約１００ｍｇを、８０：２０のメタノール；０．１Ｎ  ＨＣｌ溶液により抽出し、十分に混合し、３５０ｍｇ／ｍＬの抽出物を結果として得た。試料をペレット状の微粒子へと遠心分離し、抽出された代謝物を含有する上清アリコートを除去し、内部基準物質としての、グルコースの安定的同位体を含有する８０：２０のアセトニトリル：水により１：１０に希釈し、タンデム質量分析による検出を伴う液体クロマトグラフィー（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）により解析した。
【００６１】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳは、種子組織抽出物などの複雑な生物学的マトリックス中の一次代謝物および二次代謝物の定量的な解析に適する選択性および感度をもたらす。ＭＳ／ＭＳによる定量化を行う前に、液体クロマトグラフィーにより分離することは、対象の化合物のイオン化／応答を阻害しうるマトリックス成分から、対象の化合物を分離するのに望ましい。分析物をイオン化するには、陽（＋）イオンまたは陰（−）イオンによるエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、ならびに陽イオン／陰イオンによる大気化学イオン化（ＡＰＣＩ）を含めた、複数の技法が利用可能である。ＭＳ／ＭＳによる化合物の解析は、本質的に４ステップ、すなわち、１）対象の化合物に特異的な分子イオンの形成、２）分子イオンの選択、３）化合物特異的なフラグメントイオンの形成、４）化合物特異的なフラグメントイオンの検出によるプロセスである。ＬＣカラムからの溶出物をＭＳへと導入すると、ＭＳにより、この４ステップによるプロセスがミリ秒の時間枠で連続的に実行される。
【００６２】
本研究におけるＬＣ−ＭＳＭＳ解析は、ＴｕｒｂｏＩｏｎ（商標）Ｓｐｒａｙによる注入部を装備する、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製Ｓｃｉｅｘ（商標）３０００型三連式四重極タンデム質量分析器とインターフェース接続した、Ａｇｉｌｅｎｔ製１１００型液体クロマトグラフ上で実施した。種子組織抽出物についてＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析を行う前に、以下のパラメータ、すなわち、
Ｑ１：＋／−の分子イオンのｍ／ｚ
ＤＰ：最大の分子イオン形成についてのデクラスタリングポテンシャル
Ｑ３：分子イオンから生成される生成物イオンのｍ／ｚ
ＣＥ：最大の生成物イオン形成についての衝突エネルギー
ＣＸＰ：細胞脱出ポテンシャル
を確定する目的で、個々の二次代謝物の基準物質（約１０μｇ／ｍＬ）を、質量分析器中に注入した。
【００６３】
以下の表３のＱ１欄に示す通り、本研究においてモニタリングされたシロイヌナズナ属代謝物は、陰イオンモードのＥＳＩを用いて予測される［Ｍ−Ｈ］−分子イオンを形成することが判明した。代謝物の各々を定量化するのに用いたフラグメントイオンを、以下の表のＱ３欄に列挙する。以下の表は、代謝物の各々を定量化するのに用いたＭＳＭＳパラメータを列挙する（Ｇ１Ｐ＝グルコース−１−ホスフェート、Ｇ６Ｐ＝グルコース−６−ホスフェート、ＡＤＰ−ｇ＝アデノシンジホスフェート−グルコース、ＧＤＰ−ｇ＝グアノシン５’−ジホスフェート−グルコース、ＵＤＰ−ｇ＝ウリジン５’−ジホスフェート−グルコース）。
【００６４】
【表３】
2012523237.tif 000006
【００６５】
対象のシロイヌナズナ属代謝物は極性が強いため、ＨＩＬＩＣ相用液体クロマトグラフィーカラム（ＴＯＳＯＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＬＬＣ製；ＴＳＫゲルアミド８０；１００×２ｍｍ、５μＭ）を用いて分離した。流速５００μＬ／分で４分間にわたり、０：１００のＨＰＬＣ水：アセトニトリルに始まり、１００：０の水：アセトニトリルへと至る直線勾配を用いた。化合物のイオン化を増強するため、ＨＰＬＣ水を、１０ｍＭの酢酸アンモニウムで緩衝した。
【００６６】
標的代謝物ごとに較正曲線を作製し、各抽出物に対して線形回帰分析を用いることにより、定量化を達成した。抽出物中で見出される濃度に希釈係数（１０倍）を乗じることにより、試料中の全濃度をナノモルｇ−１単位で得た。提示されるすべてのデータは、６連の平均であり、このうち３連は解析のための多連であり、２連は温室内での多連である。
［実施例７］
【００６７】
シロイヌナズナ属を形質転換するための、ＳｎＲＫ２−６発現ベクターの構築
シロイヌナズナ属ＳｎＲＫ２−６遺伝子を増幅するため、Ｏｌｉｇｏ  ｄＴ２０をプライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ  ＲＴキット）として用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成するのに、シロイヌナズナ属葉から単離した全ＲＮＡ（９００ｎｇ）を用いた。それらのいずれもがＮｃｏ  Ｉ部位（下線を付した）を包含するプライマー対である５’−ＴＡＡ  ＴＴＴ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＡＴＣ  ＧＡＣ  ＣＡＧ  ＣＡＧ  ＴＧＡ  ＧＴ−３’および５’−ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＡＴＣ  ＡＣＡ  ＴＴＧ  ＣＧＴ  ＡＣＡ  ＣＡＡ  ＴＣＴ  ＣＴ−３’を用いて、このｓｓｃＤＮＡをさらに増幅した。次いで、増幅されたＳｎＲＫ２−６遺伝子を、ＮｃｏＩにより消化し、ゲートウェイエントリーベクターであるｐＤＡＢ３７３１中に挿入した。挿入の方向は、シーケンシングすることにより決定した。結果として得られる、ＣｓＶＭＶ、ＳｎＲＫ２−６、およびＡｔｕＯＲＦ２４  ３’−ＵＴＲを含む植物転写単位（ＰＴＵ）を、ゲートウェイＬＲ反応を用いて、バイナリーゲートウェイデスティネーションベクターであるｐＤＡＢ３７２５中にクローニングした。結果として得られる、ｐＤＡＢ４５０４と称するプラスミド（図１１）を用いて、アグロバクテリウム属（Agrobacterium）を形質転換した。
［実施例８］
【００６８】
合成による、ＳｎＲＫ２−６の植物最適化コード領域
トランスジェニックの双子葉植物および単子葉植物（例えば、トウモロコシ）において、ＳｎＲＫ２−６タンパク質を生成することが可能となるように、シロイヌナズナＳｎＲＫ２−６遺伝子のコード配列合成形をデザインした。出発塩基配列は、配列番号１に開示されるタンパク質コード領域を含み、配列番号２に開示されるタンパク質配列をコードする、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ａｔ４ｇ３３９５０であった。
【００６９】
ＳｎＲＫ２−６タンパク質をコードする植物最適化ＤＮＡ配列をもたらすため、特定の宿主植物（トウモロコシおよび双子葉植物）において見出される遺伝子のタンパク質コード配列からまとめたコドンバイアス表から確定される冗長遺伝子コードを用いてタンパク質のアミノ酸配列をコードするように、ＤＮＡ配列をデザインした。７０６のトウモロコシ遺伝子のタンパク質コード領域は、米国国立医学図書館、国立バイオテクノロジー情報センター（メリーランド州、ベセスダ）から入手可能なＧｅｎｂａｎｋ配列から抽出し、コドン組成は、ウィスコンシン大学、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ウィスコンシン州、マジソン）から入手可能なＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ＰａｃｋａｇｅのＣｏｄｏｎＦｒｅｑｕｅｎｃｙ関数を用いて計算した。タバコ（Nicotiana tabacum；４５３，７９７コドン）、ワタ（Gossypium hirsutum；６２，１１１コドン）、ダイズ（Glycine max；３６２，０９６コドン）、およびキャノーラ（Brassica napus；１９５，００５コドン）についてのコドン使用表は、かずさＤＮＡ研究所（日本）から入所可能である。
【００７０】
【表４Ａ】
2012523237.tif 000007
【００７１】
【表４Ｂ】
2012523237.tif 000008
【００７２】
トウモロコシ遺伝子の天然遺伝子コドン使用を、表４Ａおよび４ＢのＥ欄に示し、双子葉植物遺伝子の天然遺伝子コドン使用を、表４Ａおよび４ＢのＧ〜Ｊ欄に示す。Ｅ欄およびＧ〜Ｊ欄の値は、各アミノ酸の同義コドンの分布（％による、そのアミノ酸に対するすべてのコドンの使用の分布）を示す。各植物種類に最も好ましいコドンを太字で示し、複数の選択が存在する場合は、第２選択、第３選択、または第４選択などのコドンを同定することができる。双子葉植物遺伝子において、一部のアミノ酸に対する一部の同義コドン（例えば、ＣＧＧおよびＴＣＧ）がごくまれにしか見出されないことは、明らかである。また、一部の双子葉植物は、特定のアミノ酸に対するコドンの選択性（例えば、アスパラギンコドンおよびフェニルアラニンコドン）においても幾分か異なる。また、植物タンパク質コード領域では、一部のアミノ酸に対する一部の同義コドン（例えば、ＣＧＡおよびＣＴＡ）がごくまれにしか見出されないことも明らかである。さらに、トウモロコシと双子葉植物とは、コドンの使用が異なる（例えば、アラニンのコドンであるＧＣＣが、双子葉植物遺伝子より、トウモロコシ遺伝子でより頻繁に生じるのに対し、アラニンのコドンであるＧＣＴは、トウモロコシ遺伝子より双子葉植物遺伝子でより多く用いられる）。したがって、１つの植物群の遺伝子に最適なコドン組成を反映するようにデザインされたタンパク質コード領域が、別の植物群で発現するには準最適なコドン組成を有する可能性がある。トウモロコシおよび双子葉植物に共通して最もよく用いられるコドンを含む、バイアスをかけたコドンセットを導出するため、表４Ａおよび４ＢのＦ欄に示す双子葉植物のデータセットについて、各コドンの平均を計算した。
【００７３】
表４Ａおよび４ＢのＥ欄およびＦ欄のデータから、トウモロコシ遺伝子および双子葉植物遺伝子における各コドンの％による平均分布値を計算したが、これを、表４Ａおよび４ＢのＤ欄の「植物平均」として示す。通常、用いられるのがまれであると考えられる（すなわち、トウモロコシ植物体または双子葉植物体の遺伝子における関連アミノ酸をコードする回数の約１０％以下で表わされる）コドンの％による使用値は、解析に含めなかった。表４Ａおよび４ＢのＤ欄では、これらのコドン値を、ＤＮＵ（使用なし（Do Not Use））により示す。これらの場合には、個々のアミノ酸の％による全コドン使用値が、表４Ａおよび４ＢのＤ欄の合計で１００％とならない。
【００７４】
これらのアミノ酸の残りのコドン選択の分布を補正するため、式：
Ｃ１の加重平均％＝１／（％Ｃ１＋％Ｃ２＋％Ｃ３＋その他）×％Ｃ１×１００
［式中、Ｃ１は、問題となるコドンであり、％Ｃ２、％Ｃ３、その他は、表４Ａおよび４ＢのＤ欄で示す、残りの同義コドンに対する、％による植物平均を表わす］
を用いて、各コドンの加重平均についての％表示を計算した。
【００７５】
トウモロコシ遺伝子および双子葉植物遺伝子について計算された％によるコドン分布の植物加重平均を、表４Ａおよび４ＢのＣ欄に示す。したがって、Ｃ欄の％による分布値と共に考え合わせたＢ欄のコドン同一性は、トウモロコシ、ワタ、キャノーラ、タバコ、およびダイズの遺伝子から計算された植物最適化コドンバイアス表を含む。植物最適化遺伝子は、表４Ａおよび４ＢのＣ欄のコドン分布と類似する全コドン分布を有するように決定される。
【００７６】
ＳｎＲＫ２−６タンパク質をコードする植物最適化配列を操作するために、双子葉植物およびトウモロコシのタンパク質コード配列からまとめた冗長植物最適化コドンバイアス表を用いて、該タンパク質のアミノ酸配列をコードするように、ＤＮＡ配列をデザインした。天然のＳｎＲＫ２−６  ＤＮＡ配列（配列番号１）を、ＳｎＲＫ２−６タンパク質の推定アミノ酸配列（配列番号２）に翻訳し、次いで、Ｏｃｉｍｕｍ  Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（インディアナ州、インディアナポリス）から市販されている、ＯｐｔＧｅｎｅ（商標）プログラムを用いて、該タンパク質配列を、植物最適化ＤＮＡ配列へと逆翻訳した。植物細胞における、望ましくない制限酵素認識部位、潜在的な植物イントロンスプライス部位、Ａ／Ｔ残基またはＣ／Ｇ残基のロングラン、ならびにコード領域のＲＮＡの安定性、転写、または翻訳に干渉しうる他のモチーフを除去するように、配列をさらに洗練させた。所望の制限酵素認識部位を導入し、内部の長いオープンリーディングフレーム（＋１以外のフレーム）、ならびに安定的であることがまれなステムループ構造を除去するように、他の変化を作成した。これらの変化はすべて、上記で説明した、植物最適化バイアスをかけたコドン組成を保持する制限範囲内で作成した。ＳｎＲＫ２−６タンパク質をコードする植物最適化配列を、ＳｎＲＫ２−６ｈｖ５と称し、配列番号２をコードする該配列を、配列番号３として開示する。
【００７７】
表５は、植物最適化ＳｎＲＫ２−６ｈｖ５コード領域のコドン組成を、植物最適化コドンバイアス表と比較し、これにより、最適化プロセスの結果を示すものである。
【００７８】
【表５−１】
2012523237.tif 000009
【表５−２】
2012523237.tif 000010
【００７９】
デザインを完結させるため、３つのトップ鎖のリーディングフレーム内のすべてに翻訳終止コドンを含有し、Ｂｂｓ  Ｉ制限酵素に対する認識配列で始まる５’側の非翻訳配列を、ＳｎＲＫ２−６ｈｖ５配列の５’端に付加した。加えて、６つのオープンリーディングフレーム内のすべてに翻訳終止コドンを含有し、ＳａｃＩ制限酵素に対する認識配列で終結する３’側の非翻訳配列を、ＳｎＲＫ２−６ｈｖ５配列の３’端に付加した。ＳｎＲＫ２−６ｈｖ６と称するこの配列を、配列番号４として開示する。デザインされたＳｎＲＫ２−６ｈｖ６配列の合成は、テキサス州、ヒューストンのＰｉｃｏＳｃｒｉｐｔに依頼した。
［実施例９］
【００８０】
トウモロコシを形質転換するためのＳｎＲＫ２−６発現ベクターの構築
トウモロコシのＳｎＲＫ２−６遺伝子を異種発現させるため、そのオープンリーディングフレーム配列を、ヘミコットにおけるコドン使用に従いコドン最適化し、これを、ＳｎＲＫ２−６ｈｖと称した。加えて、「３つのフレーム終止コドン」および「トウモロコシのコンセンサス配列」に対応するヌクレオチド配列を、ＳｎＲＫ２−６ｈｖ遺伝子の５’末端に導入し、「６つのフレーム内の終止コドン」を、その３’末端へと導入した。後続のクローニングを容易にするため、２つの制限部位である、ＢｂｓＩおよびＳａｃＩを、該配列の５’端および３’端へと付加した。次いで、全配列を合成したが、これを、以下でさらに詳細に説明する。
【００８１】
ＢｂｓＩおよびＳａｃＩで消化した上記の合成断片を、Ａｃｃ６５ＩおよびＳａｃＩで消化したｐＤＡＢ４００５へと挿入した。これにより、トウモロコシのＵｂｉ１プロモーター、ＳｎＲＫ２−６ｈｖ、およびＺｍＰｅｒ５  ３’ＵＴＲを含有する植物転写単位（ＰＴＵ）を作製した。ＮｏｔＩで消化することにより、組換えｐＤＡＢ４００５からこのＰＴＵを切り出し、デスティネーションベクターであるｐＤＡＢ３８７８へと挿入した。ｐＤＡＢ７７０２と称し、図１２に示す、結果として得られるプラスミドの配向性および完全性は、シーケンシングすることにより判定した。
［実施例１０］
【００８２】
アグロバクテリウム属およびシロイヌナズナ属の形質転換
形質転換は、ＷｅｉｇｅｌおよびＧｌａｚｅｂｒｏｏｋ（２００２）により説明されている通りに実施した。
【００８３】
シロイヌナズナの生育条件
採取した新鮮な種子を、乾燥剤の存在下において、室温で７日間にわたり乾燥させた。種子を、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（ミズーリ州、セントルイス）から市販されている、０．１％アガロース溶液中に懸濁させた。懸濁させた種子を、４℃で２日間にわたり保管して休眠要件を満たし、種子の同調発芽（層別化）を確保した。
【００８４】
Ｓｕｎ  Ｇｒｏ  Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ  Ｉｎｃ．（ワシントン州、ベルビュー）から市販されているＳｕｎｓｈｉｎｅ  Ｍｉｘ  ＬＰ５を、微粒のバーミキュライトにより覆い、湿潤するまで、ホーグランド液により地下灌漑した。該土壌混合物を、２４時間にわたり排水した。層別化された種子を、バーミキュライト上へと播種し、５〜７日間にわたり、ＫＯＲＤ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（カナダ、オンタリオ州、ブラマリー）から市販されている保湿ドームなどの保湿ドームにより覆った。
【００８５】
種子を発芽させ、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（カナダ、マニトバ州、ウィニペッグ）から市販されているＣｏｎｖｉｒｏｎ（ＣＭＰ４０３０型およびＣＭＰ３２４４型）内において、約２２℃の一定温度下、ならびに約４０％〜約５０％の範囲内の湿度下で、光強度が約１２０マイクロモル／ｍ２秒〜約１５０マイクロモル／ｍ２秒の範囲にある長日条件（１６時間の明期／８時間の暗期）下で、植物体を生育させた。まず、ホーグランド液により、その後、ＤＩ水により植物体に施水し、土壌を保湿はするが、湿潤はさせないようにする。
【００８６】
アグロバクテリウム属の形質転換
ＷｅｉｇｅｌおよびＧｌａｚｅｂｒｏｏｋ（２００２）によるプロトコールを用いて、エレクトロコンピテントのアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）（Ｚ７９７Ｓ株）細胞を調製した。ＷｅｉｇｅｌおよびＧｌａｚｅｂｒｏｏｋ（２００２）による電気穿孔法の変法を用いて、コンピテントのアグロバクテリウム属細胞を形質転換した。５０μｌのコンピテントアグロバクテリウム属細胞を氷上で解凍し、約１０ｎｍ〜約２５ｎｇのプラスミドｐＤＡＢ４５０４を細胞に添加した。ＤＮＡと細胞との混合物を、あらかじめ冷却した２ｍｍの電気穿孔用キュベットに添加した。Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＡＧ（ドイツ、ハンブルグ）から市販されているＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｅｌｅｃｔｏｒｏｐｏｒａｔｏｒ２５１０を用いて、以下の条件：電圧：２．４ｋＶ、パルス長：５ミリ秒で形質転換した。電気穿孔後、１ｍＬのＹＥＰ培養液をキュベットに添加し、細胞−ＹＥＰ懸濁液を、１５ｍｌの培養試験管に移した。一定に振とうしている水浴中２８℃で４時間にわたり、細胞をインキュベートした。インキュベーション後、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（ミズーリ州、セントルイス）から市販されている、スペクチノマイシン（１００ｍｇ／Ｌ）およびストレプトマイシン（２５０ｍｇ／Ｌ）を含むＹＥＰ＋寒天を含むプレートに培養物を播種した。２８℃で２〜４日間にわたり、プレートをインキュベートした。スペクチノマイシン（１００ｍｇ／Ｌ）およびストレプトマイシン（２５０ｍｇ／Ｌ）を含む新鮮なＹＥＰ＋寒天プレート上においてコロニーを選択し、画線し、約２８℃で１〜３日間にわたりインキュベートした。ベクター特異的な制限消化酵素を用いることにより制限消化解析を行い、遺伝子挿入の存在を検証する目的で、コロニーを選択した。製造元の指示書に従い実施される、Ｑｉａｇｅｎ  Ｈｉｇｈ  Ｓｐｅｅｄ  Ｍａｘｉ  Ｐｒｅｐｓを用いて、選択されたアグロバクテリウム属コロニーから、プラスミドＤＮＡを精製した。アグロバクテリウム属の形質転換で用いたバイナリーベクターに由来するプラスミドＤＮＡを、対照として組み入れた。０．５〜１μｇのＤＮＡを用いて、４つの個別の消化反応を行った。約４時間〜約５時間にわたり反応を進め、０．６５％アガロースゲル電気泳動によりこれを解析し、臭化エチジウム染色により可視化した。すべての酵素についてのその消化が、プラスミド対照と同一であるコロニーを選択した。
【００８７】
シロイヌナズナ属の形質転換
フローラルディップ法を用いて、シロイヌナズナ属を形質転換した。選択されたコロニーを用いて、スペクチノマイシン（１００ｍｇ／Ｌ）およびストレプトマイシン（２５０ｍｇ／Ｌ）を含有するＹＥＰ培養液による、１５ｍＬずつの１または複数の前培養物に接種した。２２０ｒｐｍで一定に振とうしながら、約２８℃で一晩にわたり、培養物（複数可）をインキュベートした。各前培養物を用いて、スペクチノマイシン（１００ｍｇ／Ｌ）およびストレプトマイシン（２５０ｍｇ／Ｌ）を含有するＹＥＰ培養液による５００ｍｌの培養物２つずつに接種し、該培養物を、一定に振とうしながら、約２８℃で一晩にわたりインキュベートした。次いで、室温（すなわち、約２４℃）、約８７００×ｇで約１０分間にわたって、細胞をペレット化させ、結果として得られる上清を廃棄した。この細胞ペレットを、１／２倍濃度のムラシゲおよびスクーグ塩ならびにガムボルグのＢ５ビタミン、１０％（ｗ／ｖ）スクロース、０．０４４μＭベンジルアミノプリン（ＤＭＳＯ中に１ｍｇ／ｍｌの原液１０μｌ／リットル）、ならびに、Ｈｅｌｅｎａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（テネシー州、コリアービル）から市販されているＳＩＬＷＥＴ  Ｌ−７７  ３００μｌ／リットルを含有する、５００ｍＬの浸潤用培地中に静かに再懸濁させた。約５週齢の植物体を、約１５秒間にわたり培地内に浸漬し、最新の花序を浸漬したことを確認する。次いで、植物体を横向きに寝かせ、約２４時間にわたり覆い（透明または不透明の覆いで）、次いで、水で洗浄し、直立させる。約２２℃で１６時間の明期／８時間の暗期により、植物体を生育させた。浸漬の約４週間後、種子を採取した。
【００８８】
形質転換した植物体の選択
説明される通り、Ｔ．Ｏ．Ｐｌａｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．（ミネソタ州、クリアウォーター）から市販されている、１０．５インチ×２１インチの発芽用トレー上に、Ｔ１種子を播種し、概説される条件下でこれを生育させた。播種後５〜６日間にわたり、ドームを取り外した。播種の５日後において、ならびに、播種の１０日後に再度、同胞体に、ＤｅＶｉｌｂｉｓｓ（イリノイ州、グレンデールハイツ）製圧縮空気散布チップを用いて、トレー１枚当たり約１０ｍｌの散布容量（７０３Ｌ／ｈａ）で、Ｂａｙｅｒ  Ｃｒｏｐｓｃｉｅｎｃｅから市販されているグルホシネート除草剤の０．２０％溶液（脱イオン化水中２０μｌ／１０ｍＬ）を散布して、１回の適用当たり２８０ｇ／ｈａの有効散布率でグルホシネートを送達した。リバティーの調製量は、以下の通りに計算した：（７０３Ｌ／ｈａの散布量＝２８０ＧＰＡ）。（２８０ｇの有効成分／ｈａ）×（１ｈａ／７０３Ｌ）×（１Ｌ／グルホシネートの有効成分２００ｇ）＝０．２０％溶液（すなわち、２０μｌ／１０ｍｌ）。各トレーにつき１０ｍＬずつの溶液を、２０ｍＬのシンチレーションバイアル内にピペットで注入し、散布した。散布は、水平および垂直の適用パターンを用いて送達した。各散布の後、除草剤名、適用率、および適用日を記した散布ラベルを、各選択トレーに添付した。２回目の散布の４〜７日後に、除草剤抵抗性植物体を同定し、Ｓｕｎｓｈｉｎｅ  ｍｉｘ  ＬＰ５により調製したポット中に移植した。移植された植物体を、上述の生育条件でＣｏｎｖｉｒｏｎ内に入れた。
［実施例１１］
【００８９】
スーパーバイナリーベクター用のアグロバクテリウム属の形質転換
形質転換用に調製するため、２つの異なる大腸菌（E. coli）株（ｐＳＢ１１前駆体（この場合、ｐＤＡＢ７７０２またはｐＤＡＢ３８７８）およびｐＲＫ２０１３を含有するＤＨ５α）を、３７℃で一晩にわたり増殖させた。ＤＨ５α菌株は、ＬＢ培地（５００ｍｌの脱イオン化水中に５ｇのＢａｃｔｏトリプトン、２．５ｇのＢａｃｔｏ酵母抽出物、５ｇのＮａＣｌ、７．５ｇの寒天）＋スペクチノマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するペトリプレート上で増殖させ、ｐＲＫ２０１３菌株は、ＬＢ＋カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）培地を含有するペトリプレート上で増殖させた。インキュベーション後、プレートを約４℃で静置し、アグロバクテリウム属が適用可能となるまで待機した。
【００９０】
ｐＳＢ１を含有するアグロバクテリウム属ＬＢＡ４４０４株（日本たばこ産業株式会社製）を、ストレプトマイシン（２５０μｇ／ｍｌ）およびテトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ）を含む、ＡＢ培地（９００ｍｌの脱イオン化水中に５ｇのグルコース、１５ｇの寒天）を含有するペトリプレート上で、２８℃で３日間にわたり増殖させた。アグロバクテリウム属が準備できた後、抗生剤を含まないＬＢプレート上において、各細菌につき１つずつの接種用ループ（ｐＤＡＢ７７０２またはｐＤＡＢ３８７８、ｐＲＫ２０１３、およびＬＢＡ４４０４＋ｐＳＢ１）を混合することにより、形質転換プレートを準備した。このプレートを、２８℃で一晩にわたりインキュベートした。インキュベーション後、０．９％のＮａＣｌ（５００ｍｌの脱イオン化水中に４．５ｇのＮａＣｌ）溶液１ｍｌを交配プレートに添加し、細胞を溶液中に混合した。次いで、混合物を、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．（ニュージャージー州、フランクリンレーク）から市販されているＦａｌｃｏｎ２０５９など、滅菌表示つき試験管中に移した。
【００９１】
１ｍｌの０．９％ＮａＣｌをプレートに添加し、残りの細胞を溶液中に混合した。次いで、この混合物を、上記と同じ表示付き試験管へと移した。１００μｌの細菌「ストック」液を、表示つきＦａｌｃｏｎ２０５９試験管に入れ、次いで、９００μｌの０．９％ＮａＣｌを添加することにより、１０１〜１０４個の範囲にある細菌細胞の希釈系列を作製した。次いで、選択を確認するため、１００μｌの希釈液を、別個のＡＢ＋スペクチノマイシン（１００μｇ／ｍｌ）／ストレプトマイシン（２５０μｇ／ｍｌ）／テトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ）培地プレートに入れ、２８℃で４日間にわたりインキュベートした。次いで、コロニーを、ＡＢ＋スペクチノマイシン／ストレプトマイシン／テトラサイクリンプレート、およびラクトース培地（５００ｍｌのＤＩ  Ｈ２Ｏ中に０．５ｇの酵母抽出物、５ｇのＤ−ラクトース一水和物、７．５ｇの寒天）プレート上に「パッチ」で植え、インキュベーター内に入れて２８℃で２日間にわたり静置した。ベネディクト液（５００ｍｌの脱イオン化水中に、８６．５ｇの一塩基性クエン酸ナトリウム、５０ｇのＮａ２ＣＯ３、９ｇのＣｕＳＯ４５水和物）でプレートを満たし、アグロバクテリウム属コロニーを黄色に変色させることにより、ラクトース培地上におけるコロニーに対するケト−ラクトース試験を実施した。次いで、黄色となった（アグロバクテリウム属について陽性の）すべてのコロニーをパッチプレートから採取し、２８℃で２日間にわたり、ＡＢ＋スペクチノマイシン／ストレプトマイシン／テトラサイクリン培地プレート上に画線して、単一コロニーを単離した。ＡＢ＋スペクチノマイシン／ストレプトマイシン／テトラサイクリン培地上において第２ラウンドの単一コロニー単離を行うため、プレート１枚につき１つのコロニーを採取し、これを反復して全３ラウンドの単一コロニー単離を行った。単離後、プレート１枚につき１つずつのコロニーを採取し、これを用いて、スペクチノマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（２５０μｇ／ｍｌ）、およびテトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ）を含有する、別個のＹＥＰ（５００ｍｌの脱イオン化水中に５ｇの酵母抽出物、５ｇのペプトン、２．５ｇのＮａＣｌ）液体培養物３ｍｌに接種した。次いで、２００ｒｐｍのドラム式インキュベーター内２８℃で一晩にわたり、これらの液体培養物を増殖させた。
【００９２】
次いで、２ｍｌの接種培養物を、７５ｍｌのＹＥＰ＋スペクチノマイシン／ストレプトマイシン／テトラサイクリン培養物を含有する、２５０ｍｌのディスポーザブルフラスコへと移すことにより、検証培養物とした。次いで、これらを、２００ｒｐｍで振とうしながら、２８℃で一晩にわたり増殖させた。次いで、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）プロトコールに従い、細菌培養物上において、Ｑｉａｇｅｎ（カリフォルニア州、バレンシア）から市販されているＨｉ−Ｓｐｅｅｄ  ｍａｘｉ−ｐｒｅｐｓを実施し、プラスミドＤＮＡを作製した。次いで、５００μｌの溶出ＤＮＡを、１．５ｍｌの表示つきの清浄な試験管２本へと移し、Ｅｄｇｅ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ（メリーランド州、ゲイサーズバーグ）から市販されているＱｕｉｃｋ−Ｐｒｅｃｉｐ  Ｐｌｕｓ（登録商標）プロトコールを実施した。沈殿させた後、ｐＨ８．０の１０ｍＭトリスＨＣｌと１ｍＭエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）との混合物を含めた、総容量１００μｌのＴＥ中に、ＤＮＡを再懸濁させた。５μｌのプラスミドＤＮＡを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州、カールスバード）から市販されている化学的にコンピテントなＤＨ５α大腸菌（E. coli）細胞５０μｌに添加し、これと共に静かに混合した。
【００９３】
次いで、この混合物を、冷却した表示つきＦａｌｃｏｎ２０５９試験管へと移した。反応物を氷上において約３０分間にわたりインキュベートし、次いで、約４５秒間にわたり温度を約４２℃まで上昇させることにより、「熱ショック」を与えた。反応物を氷中に戻して約２分間にわたり静置し、次いで、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州、カールスバード）から市販されているＳＯＣ培地４５０μｌを試験管に添加した。次いで、反応物を、２００ｒｐｍで振とうしながら、３７℃で１時間にわたりインキュベートした。次いで、細胞を、ＬＢ＋スペクチノマイシン／ストレプトマイシン／テトラサイクリン（５０μｌおよび１００μｌずつ用いる）培地プレートに入れ、３７℃で一晩にわたりインキュベートした。プレート１枚につき３つまたは４つのコロニーを採取し、これを用いて、スペクチノマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（２５０μｇ／ｍｌ）、およびテトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ）を含有する、別個のＬＢ（５００ｍｌのＤＩ  Ｈ２Ｏ中に５ｇのＢａｃｔｏトリプトン、２．５ｇのＢａｃｔｏ酵母抽出物、５ｇのＮａＣｌ）液体培養物３ｍｌに接種した。次いで、２００ｒｐｍのドラム式インキュベーター内３７℃で一晩にわたり、これらの液体培養物を増殖させた。次いで、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）プロトコールに従い、細菌培養物上においてｍｉｎｉ−ｐｒｅｐｓ（カリフォルニア州、バレンシア、Ｑｉａｇｅｎ製）を実施し、プラスミドＤＮＡを作製した。次いで、３７℃で１時間にわたり、ＨｉｎｄＩＩＩ酵素およびＳａｌＩ酵素（マサチューセッツ州、ビバリー、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ製）を用いる個別の反応により、５μｌのプラスミドＤＮＡを消化した後、１％アガロースゲル（メイン州、ロックランド、Ｃａｍｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｏｃｌａｎｄ，Ｉｎｃ）上で泳動させた。次いで、適正なバンド形成パターンを示す培養物を用いて、５００μｌの培養物を、５００μｌの滅菌グリセロール（ミズーリ州、セントルイス、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）に添加し、反転させて混合することにより、グリセロール原液を作製した。次いで、混合物をドライアイス上で凍結させ、必要となるまで−８０℃で保管した。
［実施例１２］
【００９４】
アグロバクテリウム属を介する、トウモロコシ植物材料の形質転換
９５％Ｍｅｔｒｏ−Ｍｉｘ  ３６０無土壌生育培地（ワシントン州、ベルビュー、Ｓｕｎ  Ｇｒｏ  Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ製）および５％粘土／ローム土壌による混合物を含有する、５ガロン（１９リットル）のポット内に、Ｈｉｇｈ  ＩＩ  Ｆ１交配（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら、１９９１）による種子を播いた。高圧ハロゲン化ナトリウムランプおよび高圧ハロゲン化金属ランプの組合せを用いて、１６時間：８時間の明暗期を伴う温室内において植物体を生育させた。形質転換用の未成熟Ｆ２胚を得るため、調節同胞受粉を実施した。受粉の８〜１０日後に未成熟胚を単離したが、このとき、胚のサイズは、約１．０〜２．０ｍｍであった。
【００９５】
感染および共培養
トウモロコシの穂を、液体石鹸で洗浄し、２分間にわたり７０％エタノール中に浸漬し、次いで、３０分間にわたり２０％の市販漂白剤（０．１％次亜塩素酸ナトリウム）中に浸漬した後、滅菌水ですすぐことにより表面殺菌した。２８℃で２〜３日間にわたり、１００ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシン、１０ｍｇ／Ｌのテトラサイクリン、および２５０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含有するＹＥＰ培地（４０ｇ／Ｌのペプトン、４０ｇ／Ｌの酵母抽出物、２０ｇ／ＬのＮａＣｌ、１５ｇ／ＬのＢａｃｔｏ寒天）上で増殖させた１〜２ループの細菌を、１００μＭのアセトシリンゴンを含有する５ｍＬの液体感染培地（ＬＳ塩基性培地（ＬｉｎｓｍａｉｅｒおよびＳｋｏｏｇ、１９６５）、Ｎ６ビタミン培地（Ｃｈｕら、１９６５）、１．５ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、６８．５ｇ／Ｌのスクロース、３６．０ｇ／Ｌのグルコース、６ｍＭのＬ−プロリン、ｐＨ５．２）中へと移すことにより、アグロバクテリウム属懸濁液を調製した。均一な懸濁が達成されるまで、溶液をボルテックスし、紫色のフィルターを用いるクレット−サマーソンによる比色計を用いて、２００クレット単位の最終密度へと濃度を調整した。２ｍＬの感染培地を含有するマイクロ遠心管中に、未成熟胚を直接単離した。３〜５秒間にわたり遠心管をボルテックスにかけ、次いで、液体培地を除去し、新鮮な培地に置き換えて、再度ボルテックスにかけた。培地を三回除去し、密度が２００クレット単位のアグロバクテリウム属液１ｍＬで置き換えた。アグロバクテリウム属および胚による溶液を、最高速度で３０秒間にわたりボルテックスにかけ、次いで、室温で５分間にわたりインキュベートした後、共培養培地（ＬＳ塩基性培地、Ｎ６ビタミン培地、１．５ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、３０．０ｇ／Ｌのスクロース、６ｍＭのＬ−プロリン、０．８５ｍｇ／ＬのＡｇＮＯ3、１００μＭのアセトシリンゴン、３．０ｇ／Ｌのゲランガム培地、ｐＨ５．８）へと移し、２５℃の暗所条件下で５日間にわたり静置した。
【００９６】
共培養後、胚に２ステップの選択スキームを経過させ、その後、約８週間をかけて、形質転換された単離物を得た。選択では、ＬＳベースの培地（ＬＳ塩基性培地、Ｎ６ビタミン培地、１．５ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、０．５ｇ／ＬのＭＥＳ、３０．０ｇ／Ｌのスクロース、６ｍＭのＬ−プロリン、１．０ｍｇ／ＬのＡｇＮＯ3、２５０ｍｇ／Ｌのセフォタキシム、２．５ｇ／Ｌのゲランガム培地、ｐＨ５．７）を、複数の選択レベルのＲ−ハロキシホップ酸と共に用いた。胚を、１００ｎＭのＲ−ハロキシホップを含有する選択培地へと移して１４日間にわたり静置し、次いで、胚形成性単離物が得られるまで、２週間間隔でさらに約３回にわたり、５００ｎＭ  Ｒ−ハロキシホップへと移した。２週間間隔で新鮮な選択培地へと移すことにより回収されたすべての単離物を一緒にして、再生およびさらなる解析に用いた。
【００９７】
再生および種子の生成
再生のためには、培養物を、「２８」誘導培地（ＭＳ塩培地およびビタミン培地、３０ｇ／Ｌのスクロース、５ｍｇ／Ｌのベンジルアミノプリン、０．２５ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、１００ｎＭのＲ−ハロキシホップ酸、２５０ｍｇ／Ｌのセフォタキシム、２．５ｇ／Ｌのゲランガム培地、ｐＨ５．７）へと移し、低光度条件（１４μＥｍ−２秒−１）下で１週間にわたり静置し、次いで、高光度条件（約８９μＥｍ−２秒−１）下で１週間にわたり静置した。その後、組織を、「３６」再生培地（植物生育制御物質を欠くことを除き、誘導培地と同じ）へと移した。小植物体を３〜５ｃｍの長さまで生育させたら、これらを、ＳＨＧＡ培地（ＳｃｈｅｎｋおよびＨｉｌｄｅｂｒａｎｄｔの塩およびビタミン（１９７２））、１．０ｇ／Ｌのミオイノシトール、１０ｇ／Ｌのスクロース、および２．０ｇ／Ｌのゲランガム、ｐＨ５．８）を含有するガラス製培養試験管へと移し、芽および根をさらに生育および成長させた。植物体を、本明細書の前出で説明した混合物と同じ土壌混合物へと移植し、温室内で開花するまで生育させた。調節受粉を実施して、種子を生成させた。
［実施例１３］
【００９８】
ＳｎＲＫ２−６トランスジェニックシロイヌナズナ属の分子的特徴づけ
ＳｎＲＫ２−６の転写単位を保有するトランスジェニックシロイヌナズナ属植物体をスクリーニングするため、それぞれ、ＳｎＲＫ２−６のＴ−ＤＮＡ左側境界近傍の配列、ならびにＳｎＲＫ２−６の３’端配列によりデザインしたプライマー対である５’−ＴＧＡ  ＧＧＴ  ＣＴＡ  ＣＡＧ  ＧＣＣ  ＡＡＡ  ＴＴＣ  ＧＣＴ  ＣＴＴ  ＡＧＣ−３’ および５’−ＡＴＣ  ＡＣＡ  ＴＴＧ  ＣＧＴ  ＡＣＡ  ＣＡＡ  ＴＣＴ  ＣＴ−３’により、ＰＣＲを実施した。Ｔ２トランスジェニック植物体の遺伝的分離は、ＰＡＴインベーダーアッセイおよび除草剤散布を用いて決定した。３：１の分離に適合するトランスジェニック系統は、単一の挿入を保有する可能性が極めて高いので、これらの系統だけを、生化学的研究および生理学的研究のために選択した。
［実施例１４］
【００９９】
ＳｎＲＫ２−６ｈｖトランスジェニックトウモロコシの分子的特徴づけ
ＳｎＲＫ２−６ｈｖの転写単位を保有するトランスジェニックトウモロコシ植物体をスクリーニングするため、それぞれ、ＺｍＵｂｉ１プロモーターおよびＺｍＰｅｒ５  ３’ＵＴＲによりデザインしたプライマー対である５’−ＧＴＧ  ＡＣＣ  ＣＧＧ  ＴＣＧ  ＴＧＣ  ＣＣＣ  ＴＣＴ  ＣＴＡ  ＧＡ−３’および５’−ＣＣＧ  ＴＧＧ  ＡＴＡ  ＴＡＴ  ＧＣＣ  ＧＴＧ  ＡＡＣ  ＡＡＴ  ＴＧ−３’により、ＰＣＲを実施した。
［実施例１５］
【０１００】
ウェスタンブロット解析
ポリクローナル抗体の調製
２つのポリペプチドである「ＣＨＲＤＬＫＬＥＮＴＬＬＤＧＳＰＡＰＲＬＫＩＣＤＦＧＹＳＫＳ」（３０アミノ酸）および「ＭＮＤＮＴＭＴＴＱＦＤＥＳＤＱＰＧＱＳＩＥＥ」（２２アミノ酸）のそれぞれに対して、２つの異なる種類のポリクローナル抗体を調製した。第１のポリペプチドは、ＳｎＲＫ２−６タンパク質のキナーゼドメイン内の１３７〜１６６のアミノ酸位置にあり、第２のペプチドは、ＳｎＲＫ２−６タンパク質の制御ドメイン内の２８６〜３０７のアミノ酸位置にある。これらの２つのポリペプチドを合成し、キャリアタンパク質としてのスカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）にコンジュゲートさせた。結果として得られる２つの異なるペプチド−ＫＬＨコンジュゲートを用いて、ウサギを免疫化し、２つの異なる種類のポリクローナル抗体を生成させた。これらの抗体を精製するため、ペプチドをウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）にコンジュゲートさせ、これらのコンジュゲートを用いて、アフィニティークロマトグラフィーを行った。
【０１０１】
試料の調製
ＳＮＦ１キナーゼを形質転換した植物体および対照植物体に由来するトウモロコシの葉を、ドライアイスと共に試料採取し、液体窒素と共に、極微粉へとすりつぶした。抽出緩衝液（ｐＨ８．０の５０ｍＭトリス、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＤＴＴ、０．０５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）１ｍＬ中に約２００ｍｇの葉粉末を添加することにより、ＳＮＦ１キナーゼを含めたタンパク質を抽出した。Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイにより、抽出物のタンパク質濃度を測定したところ、３．２〜３．８ｍｇ／ｍＬまで異なっていた。
【０１０２】
ウェスタンブロット
タンパク質は、ＭＯＰＳランニングバッファーと共に、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、型番ＮＰ０３０１Ｂｏｘ（カリフォルニア州、カールスバード）から市販されているＮｕｐａｇｅ  １０％ビス−トリスゲルを用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。次いで、それらを、トリス／グリシン緩衝液と共に、ニトロセルロース膜上へと移し、１００Ｖで１時間にわたり泳動させた。３％脱脂粉乳を含有するＰＢＳＴ緩衝液中において、室温（ＲＴ）で１時間にわたり膜をブロッキングした。ミルク溶液を捨て、ウサギ抗ＳｎＲＫ２−６ポリクローナル抗体を含有する新鮮な緩衝液を添加した。ＲＴで１時間にわたり膜をインキュベートし、次いで、ＰＢＳＴにより３回にわたり洗浄した。洗浄後、ヤギ抗ウサギＩｇＧ−西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートを含有する、新鮮なＰＢＳＴ／ミルク溶液を、膜へと添加した。既に説明した通り、ＲＴで１時間にわたりインキュベートした後に、膜を洗浄した。現像するために、ＰＢＳＴ液から膜を取り出し、調製したばかりのＥＣＬ検出試薬（ＰＩＥＲＣＥ製；検出試薬１：過酸化物溶液；型番１８５９７０１、ならびに検出試薬２：ルミノール増強剤溶液；型番１８５９６９８）中に浸漬した。化学発光フィルム（ＣＬ−Ｘｐｏｓｕｒｅフィルム；ＰＩＥＲＣＥ製、型番３１４６０）を、処理された膜に曝露し、Ｋｏｎｉｃａ  ＳＲ−Ｘフィルム現像剤により現像した。
［実施例１６］
【０１０３】
ＳｎＲＫ２−６の異種発現は、トウモロコシの乾燥耐性を増大させる
ＳｎＲＫ２−６キナーゼが、異種染色体バックグラウンドにおける生物学的プロセスに影響を及ぼしうるかどうかを調べるため、本発明者らは、トウモロコシにおいてＳｎＲＫ２−６遺伝子を発現させた。その機能を確定するため、ヘミコットにおけるコドン使用により、遺伝子配列のコドンを最適化し、次いで、トウモロコシＵｂｉ１プロモーターの制御下において、これをＨｉ  ＩＩトウモロコシへと導入した。トウモロコシのトランスジェニック系統におけるＳｎＲＫ２−６の発現は、ＳｎＲＫ２−６ペプチドに対するポリクローナル抗体に基づくウェスタンブロットを用いて決定した。発現したタンパク質は、予測されるサイズ（４２ｋＤ）を有し、大半の系統において、ウェスタンブロットにより容易に検出可能なレベルを示した。対照としての、非形質転換体であるＨｉ  ＩＩ植物体が、検出可能なレベルのタンパク質を４２ｋＤで示すことはなかった（データは示さない）。
【０１０４】
Ｔ０  Ｈｉ  ＩＩトランスジェニックのトウモロコシ植物体を、近親交配系統である５ＸＨ７５１と逆交配させて、Ｔ１種子を生成させた。結果として得られるＴ１分離集団をＰＣＲによりスクリーニングして、ヌルの分離個体と、導入遺伝子を保有する植物体とを分離した。乾燥耐性について調べる目的でデザインした実験では、同じ集団から分離されたトランスジェニック植物体のゲノムバックグラウンドが、互いに極めて類似するため、ヌルの分離個体を、これらのトランスジェニック植物体の対照として用いた。
【０１０５】
ゲノムバックグラウンドの差違から生じる効果を取り除くため、８つの個別のトランスジェニック系統を用いて、トウモロコシの乾燥耐性における導入遺伝子の役割を評価した。転写速度との関連で、ヌルの分離個体およびＳｎＲＫ２−６トランスジェニック植物体の切断葉における水分喪失量を、葉の切断時に測定した。図８および９に示す通り、トランスジェニック植物体は、ヌルの分離個体と比較して、水分喪失速度が低下した。
【０１０６】
目視観察によれば、トランスジェニックのトウモロコシ植物体は、乾燥ストレスに対する耐性が大きいと考えられた。３０日齢のトウモロコシ植物体に、６日間にわたり灌漑を施さずにおいたところ、ヌルの分離個体は、トランスジェニックの植物体より深刻な立ち枯れを示した。加えて、トランスジェニックの植物体は、ヌルの分離個体よりはるかに迅速に水分を再吸収した。表６に示す通り、その前の９日間にわたり植物体に灌漑を施さずにおいた再施水の８日後において、６４日齢のトランスジェニックトウモロコシ植物体上部のバイオマスが、ヌルの分離個体の１１２％〜１５０％であったことは、このことと符合する。表６では、トランスジェニック植物体のバイオマスを、１００として定義するヌルの分離個体に対する百分率として表わす。
【０１０７】
【表６】
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【０１０８】
テキサス州、ハーフウェイで実施された圃場試験では、登熟期における乾燥条件下、ならびに十分な施水条件下において、３つの個別のトランスジェニックトウモロコシイベントが、ＳｎＲＫ２−６導入遺伝子を有さない（ヌルの）それらの同胞体と比較して、穀粒収量を増大させた（表７）。
【０１０９】
【表７】
2012523237.tif 000012
【０１１０】
まとめると、上記の結果は、ＳｎＲＫ２−６の構成的発現が、トウモロコシの乾燥耐性を増大させうることを裏付ける。ＳｎＲＫ２−６の構成的発現は、トウモロコシ植物体を乾燥に対して十分に保護することが可能であり、これにより、乾燥条件下における収量喪失を軽減しうる。
［実施例１６］
【０１１１】
ストレス耐性遺伝子
植物体にストレス耐性を付与する１または複数の遺伝子と組み合わせて、ＳｎＲＫ２−６を植物体に導入することができる。適切なストレス耐性遺伝子の例を、表８に示す。
【０１１２】
【表８】
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［実施例１７］
【０１１３】
乾燥耐性遺伝子
植物体に乾燥耐性を付与する１または複数の遺伝子と組み合わせて、ＳｎＲＫ２−６を植物体に導入することができる。適切な乾燥耐性遺伝子の例を、表９に示す。
【０１１４】
【表９−１】
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【表９−２】
2012523237.tif 000015
【０１１５】
本発明を、特定の実施例の実施形態において説明してきたが、本発明は、本開示の精神および範囲内において、さらに改変することができる。したがって、本出願は、その一般原則を用いる、本発明の任意の変化形、使用、または適応を対象とすることを意図する。さらに、本出願は、本発明が関与し、付属の特許請求の範囲の限度内に収まる、当技術分野における既知または一般的な実践の範囲内に含められる、本開示からの逸脱を対象とすることを意図する。
【０１１６】
本明細書で引用され、論じられる刊行物、特許、および特許出願を含めたすべての参考文献は、それらが、本特許出願の出願日以前に開示されたことだけのために示される。本明細書におけるいずれの内容も、本発明者らが、先行発明のためにそのような開示に先行する権利を有さないことの承認としては解釈されないものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2012523237.tif 000023
【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
2012523237.tif 000026
【図１０】
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【図１１】
2012523237.tif 000028
【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2012523237.tif 000031
2012523237.tif 000032
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