(57)【要約】  本明細書には、ポリマー合成のための方法、装置、及び他の成分が開示される。いくつかの実施形態において、多数の部位が互いに多重化されて、効果的な核酸合成が可能となる。
2012523236.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程（ａ）〜（ｉ）を含むことを特徴とする所望のポリマーを合成するための方法：
（ａ）前記反応部位の表面に付着した第１モノマーを含む第１反応部位を提供する工程；（ｂ）前記第１反応部位に選択的に照射することによって、付加モノマーを前記第１モノマーにカップリングする工程；
（ｃ）所望のビルディング断片が合成されるまで前記照射を繰り返す工程であって、前記第１モノマーが表面に付着している間に前記所望のビルディング断片が生成される前記工程；
（ｄ）前記表面から前記所望のビルディング断片を分離する工程；
（ｅ）所望するように、（ａ）〜（ｄ）の工程を繰り返して、所望の数の所望のビルディング断片を生成する工程；
（ｆ）第１の所望のビルディング断片と、第２の所望のビルディング断片とを結合させて、第１副ポリマーを生成する工程；
（ｇ）第１貯蔵部位に前記第１副ポリマーを格納する工程；
（ｈ）（ａ）〜（ｆ）の工程を繰り返して第２副ポリマーを生成し、第２貯蔵部位に第２副ポリマーを格納する工程；並びに
（ｉ）前記第１副ポリマー及び前記第２副ポリマーを結合して、所望のポリマーを形成する工程。
【請求項２】
前記照射工程が光発生試薬中で行われ、ポリマーが核酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記核酸がＤＮＡを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記工程（ｄ）が、前記所望のビルディング断片に付加モノマーを不注意に加えることなく、前記反応部位の表面への第１モノマーの付着を中断する光波長を用いて前記所望のビルディング断片に照射することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第１反応部位が、前記第２反応部位から流体的に隔離されているチャンバーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記工程（ｆ）が、前記第１の所望のビルディング断片を前記第２の所望のビルディング断片と結合して、第１レベル断片を生成することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記第１レベル断片が、二本鎖核酸、多重鎖断片、又は二本鎖断片及び多重鎖断片を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記工程（ｆ）が、（ｉ）前記第１の所望のビルディング断片を、（ｉｉ）前記第２の所望のビルディング断片及び（ｉｉｉ）第３の所望のビルディング断片と結合して、第１レベル断片を形成することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記第１レベル断片が化学的に連結又は酵素連結して、第１連結第１レベル断片を形成する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項９及び１０の工程を繰り返して、第２連結第１レベル断片を形成し、前記第１連結第１レベル断片及び前記第２連結第１レベル断片が結合して、前記第１連結第１レベル断片及び前記第２連結第１レベル断片が互いにハイブリダイズするのを可能にして、第２レベル断片を形成する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
連結反応を行うことによって、連結第２レベル断片を形成する工程を更に含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記１以上の連結第２レベル断片を結合して、前記副ポリマーを生成することを更に含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記所望のビルディング断片がランダムヌクレオチド配列を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
前記第１反応部位に選択的に照射することによって、モノマーを前記第１モノマーにカップリングすることが１００ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲の波長を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
前記工程（ｄ）が１００ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲の波長を含み、前記工程（ｄ）の前記波長が前記工程（ｂ）及び／又は（ｃ）の波長と重ならない、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
反応部位で合成されている所望でないビルディング断片が前記副ポリマー中に含まれないように、１以上の濾過工程を更に含む、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
結合部位で合成されている所望でない最終ポリマーが最終遺伝子合成生成物の中に含まれないように、精製の工程を更に含む、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
以下の（ｉ）〜（ｉｖ）を有することを特徴とする、並行且つ連続的なポリマー生成のための装置：
（ｉ）第１反応部位；
（ｉｉ）第２反応部位（前記第１反応部位及び前記第２反応部位が各反応部位の表面へのポリマーの付着を可能にする表面を含み、少なくとも２つの反応部位が光発生試薬の生成を可能にする第１セットの光波長に対して事実上光学的に透明であり、前記第１反応部位及び前記第２反応部位が核酸を前記表面に接続する結合の開裂を可能にする第２セットの光波長に対して事実上光学的に透明である）；
（ｉｉｉ）第１レベル結合部位（前記第１反応部位及び前記第２反応部位が第１レベル結合部位と流体連結しており、前記流体連結が前記第１反応部位からのサンプルと第２反応部位からのサンプルとの結合を可能にし、第１レベル結合部位と、核酸アニーリングを制御するように前記第１レベル結合部位の温度を制御する加熱要素とが結合している）；並びに
（ｉｖ）前記第１レベル結合部位に制御可能に流体的に接続されている、１以上の貯蔵部位（前記１以上の貯蔵部位が第１レベル結合部位から制御可能に流体的に封止されることができる）。
【請求項１９】
少なくとも１０，０００ヌクレオチドの長さである核酸を更に有する、請求項１８記載の装置。
【請求項２０】
光を前記第２反応部位に導くことを回避しながら、選択的に光を前記第1反応部位に導く導光装置を更に有する、請求項１８記載の装置。
【請求項２１】
前記反応部位が、ＳｉＯ２、ガラス、ｐ−ｎ−ドープＳｉ半導体、ドープされた半導体、導体、絶縁体、金、チオール化合物、遷移金属、遷移金属化合物、有機化合物、無機化合物、フィルム、液晶層、ビオチン、ストレプトアビジン、タンパク質、抗体、レセプタ、ラングミュア−ブロジェット膜、リンカー、導電ポリマー、酵素、生物学的触媒、化学触媒、イオン化表面、キレート化表面、高反応性官能基、有機及び無機ポリマー、フッ化ポリマー、自動アセンブルされた上部構造、ＤＮＡプローブ、ＰＮＡプローブ、ＲＮＡプローブ、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、核酸結合タンパク質、レクチン、炭水化物、脂質表面、又は脂質二重層表面のうちの１以上を有する、請求項１８記載の装置。
【請求項２２】
第１レベル結合部位が少なくとも２つの反応部位を互いに接続するチャネルを有する、請求項１８記載の装置。
【請求項２３】
前記装置が、少なくとも７７７６の反応部位；少なくとも２１６の第１レベル結合部位；少なくとも３６の第２レベル結合部位；少なくとも６の第３レベル結合部位；並びに、少なくとも６の貯蔵部位を有する、請求項１８記載の装置。
【請求項２４】
以下の（ｉ）〜（ｉｖ）を有することを特徴とする、ポリマー合成装置：
（ｉ）結合部位に流体的に接続された、第1反応部位及び第２反応部位（前記結合部位は、第１貯蔵部位に流体的に接続されている）；
（ｉｉ）結合部位に流体的に接続された、第３反応部位及び第４反応部位（前記結合部位は、第２貯蔵部位に流体的に接続されている）；
（ｉｉｉ）前記第１貯蔵部位及び前記第２貯蔵部位に流体的に接続された、第２結合部位；並びに
（ｉｖ）放出口（前記放出口は、前記第２結合部位における流体が前記装置を抜け出るのを許容する）。
【請求項２５】
以下の（ｉ）〜（ｉｖ）を有することを特徴とする、ポリマー合成装置：
（ｉ）後に結合部位が続く精製部位に流体的に接続された、第１反応部位及び第２反応部位（前記結合部位が流体的に貯蔵部位に接続されている）；
（ｉｉ）後に結合部位が続く精製部位に流体的に接続された、第３反応部位及び第４反応部位（前記結合部位が流体的に第２の貯蔵部位に接続されている）；
（ｉｉｉ）前記第１貯蔵部位及び前記第２貯蔵部位に流体的に接続された、第２結合部位；並びに
（ｉｖ）放出口（前記放出口は、前記第２結合部位の流体が、最終精製部位に入り、その後、前記装置から出ることを許容する）。
【請求項２６】
サイズ排除濾過システムである精製部位を更に含む、請求項２５記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、米国仮特許出願第６１／１６８，７３０号（出願日：２００９年４月１３日）及び米国仮特許出願第６１／１６８，１７０号（出願日：２００９年４月９日）の優先権を主張する。これらは、それら全体で引用により本明細書に援用する。
【０００２】
本明細書に記載された実施形態は、ポリマー合成の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
核酸合成のために、様々な方法が利用できる。斯かる方法には、２００８年１２月２５日に公開された米国特許出願公開第２００８／０３１８８０６号明細書に開示された方法が含まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００８／０３１８８０６号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
いくつかの実施形態において、核酸の合成が許容されるように、種々の部位を多重化可能にする装置及び方法が提供される。
いくつかの実施形態において、多重化は、比較的長鎖のポリマーを生成している間に、多数の副反応（所望のビルディング断片合成（building fragment synthesis）、及び／又は、斯かる断片の組合せ）が比較的小サイズ又は少量で起こることを可能にする。
いくつかの実施形態において、ポリマーは核酸を含む。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
いくつかの実施形態において、所望のポリマーの合成方法が提供される。
いくつかの実施形態において、前記方法は、（ａ）前記反応部位の表面に付着した第１モノマーを含む第１反応部位を提供する工程、（ｂ）前記第１反応部位に選択的に照射（irradiating）することによって、付加モノマーを前記第１モノマーにカップリングする工程、（ｃ）所望の一本鎖断片が合成されるまで前記照射を繰り返す工程であって、前記第１モノマーが表面に付着している間に前記所望の一本鎖断片が生成される前記工程（ｄ）前記表面から前記所望の一本鎖断片を分離する工程、（ｅ）所望するように（ａ）〜（ｄ）の工程を繰り返して、所望の数の所望の一本鎖断片を生成する工程と、（ｆ）所定の長さ及び配列の第１の所望の一本鎖断片と、所定の長さ及び配列の第２の所望の一本鎖断片とを結合させて、第１副ポリマーを生成する工程と、（ｇ）第１貯蔵部位に前記第１副ポリマーを格納する工程と、（ｈ）（ａ）〜（ｆ）の工程を繰り返して第２副ポリマーを生成し、第２貯蔵部位に第２副ポリマーを格納する工程、（ｉ）前記第１副ポリマー及び前記第２副ポリマーを結合して、所望のポリマーを形成する工程とを含む、又は、これらの工程からなる、又は実質的にこれらの工程からなる。
いくつかの実施形態において、前記照射工程は、光発生試薬（photo generated reagent）中で行われ、前記ポリマーが核酸を含む。
いくつかの実施形態において、前記核酸がＤＮＡを含む。
いくつかの実施形態において、前記工程（ｄ）が、前記所望の一本鎖断片に付加的モノマーを不注意に加えることなく、前記反応部位の表面への第１モノマーの付着を中断する光波長を用いて前記所望の一本鎖断片に照射することを含む。
いくつかの実施形態において、前記第１及び第２の所望の一本鎖断片が結合部位において結合されている。
いくつかの実施形態において、前記第１反応部位が、前記第２反応部位から流体的に隔離されているチャンバーを含む。
いくつかの実施形態において、前記工程（ｆ）が、前記第１の所望の一本鎖断片を前記第２の所望の一本鎖断片に結合して、第１レベル断片を生成する。
いくつかの実施形態において、前記第１レベル断片が、二本鎖核酸、多重鎖断片、又は、二本鎖断片及び多重鎖断片を含む。
いくつかの実施形態において、前記工程（ｆ）が、（ｉ）前記第１の所望の一本鎖断片を、（ｉｉ）前記第２の所望の一本鎖断片及び（ｉｉｉ）第３の所望の一本鎖断片に結合して、第１レベル断片を形成する。
いくつかの実施形態において、前記第１レベル断片が化学的に連結又は酵素連結して、第１連結第１レベル断片を形成する。
いくつかの実施形態において、上記工程のいずれか（例えば、上記２つの工程）を繰り返して、第２連結第１レベル断片を形成し、前記第１連結第１レベル断片及び前記第２連結第１レベル断片が結合して、前記第１連結第１レベル断片及び前記第２連結第１レベル断片が互いにハイブリダイズするのを可能にして、第２レベル断片を形成する。
いくつかの実施形態において、前記方法は、連結反応を行うことによって、連結第２レベル断片を形成する工程を更に含む。
いくつかの実施形態において、前記方法は、上記２つの工程を所望回数繰り返して、１以上の付加的な連結第２レベル断片を形成する工程を更に含む。
いくつかの実施形態において、前記方法は、１以上の連結第２レベル断片を結合して、第３レベル断片を生成する工程と、前記第３レベル断片を結合する工程とを更に含む。
いくつかの実施形態において、前記方法は、上記工程を１回以上繰り返して、１つ以上の連結第３レベル断片を生成する工程を更に含む。
いくつかの実施形態において、前記方法は、１以上の連結第３レベル断片を結合して、第４レベル断片を生成する工程を更に含む。
いくつかの実施形態において、前記方法は、上記工程を１回以上繰り返して、１つ以上の連結第４レベル断片を生成する工程を更に含む。
いくつかの実施形態において、前記方法は、前記１つ以上の連結第４レベル断片を結合して、副ポリマーを生成する工程を更に含む。
いくつかの実施形態において、前記第１の所望の一本鎖断片及び前記第２の所望の一本鎖断片は、第１レベル断片を形成するときに、互いにハイブリダイズする。
いくつかの実施形態において、第３、第４、第５及び第６の一本鎖断片が結合し、互いにハイブリダイズして、第１レベル断片を形成する。
いくつかの実施形態において、前記所望のポリマーは、プログラム化された、特定の、及び／又は、ランダムなヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、所望の一本鎖断片は、プログラム化された、特定の、及び／又は、ランダムなヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、前記第１反応部位に選択的に照射して、モノマーを前記第１モノマーにカップリングすることは、１００ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲の波長を含む。
いくつかの実施形態において、工程（ｄ）は、１００ｎｍ〜１０００ｎｍの波長を含み、工程（ｄ）の波長は、工程（ｂ）及び／又は（ｃ）の波長と重なってもよいし、重なっていなくてもよい。
いくつかの実施形態において、前記方法は、反応部位で合成された所望でない一本鎖断片が副ポリマー中に含まれないように濾過する工程を更に含む。
いくつかの実施形態において、前記濾過は、工程（ｄ）後に行われる。
いくつかの実施形態において、前記濾過工程は、所望でない一本鎖断片より短い一本鎖断片が前記所望の一本鎖断片と結合する前に、システムから排除又は除外されるようなサイズ排除フィルタを含む。
【０００７】
いくつかの実施形態において、並行且つ連続的なポリマー生成のための装置は、
（ｉ）第1反応部位及び第２反応部位（（ａ）前記第１反応部位及び第２反応部位が各反応部位の表面へのポリマー付着を可能にする表面を含み、（ｂ）前記少なくとも２つの反応部位が光発生試薬（photo generated reagent）の生成を可能にする第１セットの光波長に対して事実上光学的に透明であり、（ｃ）前記第１反応部位及び前記第２反応部位が核酸を前記表面に接続する結合の開裂を可能にする第２セットの光波長に対して事実上光学的に透明である）；
（ｉｉ）第１レベル結合部位（（ａ）前記第１反応部位及び第２反応部位が第１レベル結合部位と流体連結しており、前記流体連結が前記第１反応部位からのサンプルと第２反応部位からのサンプルとの結合を可能にし、（ｂ）前記第１レベル結合部位と、核酸アニーリングを制御するように第１レベル結合部位の温度を制御する加熱要素とが結合している）；
（ｉｉｉ）前記第１レベル結合部位に制御可能に流体的に接続されている、１以上の貯蔵部位（１つ以上の貯蔵部位が第１レベル結合部位から制御可能に流体的に封止されることができる）を有するように提供される。
いくつかの実施形態では、前記装置は、少なくとも５００ヌクレオチドの長さである核酸を更に有する。
いくつかの実施形態では、前記装置は、少なくとも１００００ヌクレオチドの長さである核酸を更に有する。
いくつかの実施形態では、前記装置は、液体を前記反応部位に添加するための１つ以上の流体流入口を更に有する。
いくつかの実施形態では、前記装置は、液体を前記第１レベル結合部位に添加するための１以上の流体流入口を更に有する。
いくつかの実施形態では、前記装置は、光を前記第２反応部位に導くことを回避しながら、選択的に光を前記第1反応部位に導く導光装置を更に有する。
いくつかの実施形態では、前記導光装置は、鏡が接合されたパネルを有する。
いくつかの実施形態では、第１レベル結合部位が少なくとも２つの反応部位を互いに接続するチャネルを有する。
いくつかの実施形態では、前記装置は、第２レベル結合部位を更に有し、少なくとも２つの第1レベル結合部位が、前記第２レベル結合部位に流体的に接続されている。
いくつかの実施形態では、第２レベル結合部位と、第２レベル結合部位における核酸のアニーリング及び連結を制御するために前記第２レベル結合部位の温度を制御する加熱要素と、が結合している。
いくつかの実施形態では、前記装置は、第３レベル結合部位を更に有し、少なくとも２つの第２レベル結合部位が第３レベル結合部位に流体的に接続されている。
いくつかの実施形態では、前記第３レベル結合部位と、前記第３レベル結合部位における核酸のアニーリングを制御するために、第３レベル結合部位の温度を制御する加熱要素と、が結合している。
いくつかの実施形態では、前記装置は、第４レベル結合部位を更に有し、少なくとも２つの第３レベル結合部位が前記第４レベル結合部位に流体的に接続されている。
いくつかの実施形態では、第４レベル結合部位と、前記第４レベル結合部位における核酸のアニーリングを制御するために第４レベル結合部位の温度を制御する加熱要素と、が結合している。
いくつかの実施形態では、前記装置が、少なくとも７７７６の反応部位;少なくとも２１６の第１レベル結合部位;少なくとも３６の第２レベル結合部位;少なくとも６の第３レベル結合部位：並びに、少なくとも６の貯蔵部位を有する。
いくつかの実施形態では、前記装置は、放出口を更に有する。
【０００８】
いくつかの実施形態では、前記装置は、液体を前記反応部位に添加及び除去するための一つ以上の流体流入口及び放出口を更に有する。
いくつかの実施形態では、前記装置は、液体を前記第1レベル結合部位に添加及び除去するための一つ以上の流体流入口及び放出口を更に有する。
いくつかの実施形態では、前記装置は、光を前記第２反応部位に導くことを回避しながら、選択的に光を前記第1反応部位に導く導光装置を更に有する。
いくつかの実施形態では、前記導光装置は、鏡が接合されたパネルを有する。
いくつかの実施形態では、第１レベル結合部位が少なくとも２つの反応部位を互いに接続するチャネルを有する。
いくつかの実施形態では、前記装置は、液体を第２レベル結合部位に添加及び除去するための一つ以上の流体流入口及び放出口を更に含む。
いくつかの実施形態では、前記装置は、第２レベル結合部位を更に有し、少なくとも２の第1レベル結合部位が前記第２レベル結合部位に流体的に接続している。
いくつかの実施形態では、前記第２レベル結合部位と、前記第２レベル結合部位における核酸のアニーリング及び連結を制御するために第２レベル結合部位の温度を制御する加熱要素と、が結合している。
いくつかの実施形態では、前記装置は、第３レベル結合部位を更に有し、少なくとも２つの第２レベル結合部位は、前記第３レベル結合部位に流体的に接続されている。
いくつかの実施形態では、前記第３レベル結合部位と、前記第３レベル結合部位における核酸のアニーリングを制御するために、第３レベル結合部位の温度を制御する加熱要素と、が結合している。
いくつかの実施形態では、前記装置は、第４レベル結合部位を更に有し、少なくとも２つの第３レベル結合部位は、前記第４レベル結合部位に流体的に接続されている。
いくつかの実施形態では、前記第４レベル結合部位と、前記第４レベル結合部位における核酸のアニーリングを制御するために、前記第４レベル結合部位の温度を制御する加熱要素とが、結合している。
いくつかの実施形態では、前記装置は、少なくとも７７７６の反応部位;少なくとも２１６の第１レベル結合部位;少なくとも３６の第２レベル結合部位;少なくとも６の第３レベル結合部位;、及び、少なくとも６の貯蔵部位を有する。
いくつかの実施形態では、前記装置は、放出口を更に有する。
【０００９】
いくつかの実施形態では、ポリマー合成装置は、
（ｉ）結合部位に流体的に接続された第1反応部位及び第２反応部位と（前記結合部位は、第１貯蔵部位に流体的に接続されている）、
（ｉｉ）結合部位に流体的に接続された前記第３反応部位及び前記第４反応部位と（前記結合部位は、第２貯蔵部位に流体的に接続されている）、
（ｉｉｉ）前記第１貯蔵部位及び前記第２貯蔵部位に流体的に接続された、第２結合部位と、
（ｉｖ）放出口と（前記放出口は、前記第２結合部位における流体が前記装置を抜け出るのを許容する）、を有する。
【００１０】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ合成のシステムは、多重化が２つ以上の反応部位を単一のチャネルへ崩壊させる(collapse)ために使用されるように提供される。
【００１１】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ合成方法は、ｓｓＤＮＡのアセンブリ及び光開裂（photocleavage）工程のために、光生成された酸の両方を結合するように提供される。
【００１２】
いくつかの実施形態では、長さ１００ｂｐより大きいｄｓＤＮＡのセグメントをアセンブルする主流体チャネルに沿って分岐チャネルを使用する方法が提供される。
【００１３】
いくつかの実施形態では、ポリマー合成装置が提供される。
前記装置は、
（ｉ）結合部位に流体的に接続された第１反応部位及び第２反応部位と（前記結合部位が第１貯蔵部位に流体的に接続され）、
（ｉｉ）結合部位に流体的に接続された第３反応部位及び第４反応部位と（前記結合部位が第２貯蔵部位に流体的に接続されている）、
（ｉｉｉ）前記第１貯蔵部位及び前記第２貯蔵部位に流体的に接続された第２結合部位と、
（ｉｖ）放出口と（前記放出口は、前記第２結合部位における流体が前記装置を抜け出るのを許容する）、を有することができる。
【００１４】
いくつかの実施形態では、ポリマー合成装置が提供される。
前記装置は、
（ｉ）後に結合部位が続く精製部位に流体的に接続された、第１反応部位及び第２反応部位と（前記結合部位が流体的に貯蔵部位に接続されている）、
（ｉｉ）後に結合部位が続く精製部位に流体的に接続された、第３反応部位及び第４反応部位と（前記結合部位が流体的に第２の貯蔵部位に接続されている）、
（ｉｉｉ）前記第１の貯蔵部位及び前記第２の貯蔵部位に流体的に接続された、第２結合部位と、
（ｉｖ）放出口と（前記放出口は、前記第２結合部位の流体が、最終精製部位に入り、その後、前記装置から出ることを許容する）、を有することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】図１Ａは、連続／並行したポリマー合成のための各種実施形態の第１部分を表す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、連続／並行したポリマー合成のための各種実施形態の第２部分を表す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、図１Ａに示された枠囲み部分の拡大を表し、連続／並行したポリマー合成のための各種実施形態の一部を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
ポリマー生成のための装置及び方法は、本明細書で示される。
いくつかの実施形態では、装置及び／又は方法は、多数の反応部位（例えば、反応ウェル又は反応部位など）を含み、そこでは短いポリマー断片が、望まれるように、最初に生成される。いくつかの実施形態では、これは、多数の反応部位について並行して同時に起こり、それによって、多数の所望のビルディング断片が生成される（各々が各自の反応部位において生成可能であるにもかかわらず）。反応部位は、次のアセンブリのために少なくとも２つの反応部位からの断片の同じチャネル、チャンバー、又はウェルへの輸送を許容するように、流路を介して接続され得る。
このように、一旦、断片（それは、単一ヌクレオチド又はポリマー単位と同程度短くなり得る）が生成されると、前記断片は、前記部位から取り外されて、チャネル、結合部位、又はチャンバーにおいて、整然と結合され得る。
いくつかの実施形態では、これが多数の部位で繰り返されることによって、多数の部位からの連続した及び／又は並行な(及び制御された)断片の共有チャネル又はチャネルへの追加を許容して、それがシステムを通じて移動するにつれて、順序付けられた様式でポリマーが長くなる。
いくつかの実施形態では、合成部位及びチャネルは、微細加工され、Ｓｉ、ガラス、ポリマーベース基板、等の物質から製造され得る。
いくつかの実施形態では、前記部位におけるポリマー断片の合成は、第１波長光によって達成され、一方、前記部位からの断片の取り外しは、第２波長光を介して達成される。この第２波長光は、前記第１波長光と同じ又は異なることがあり得て、第１及び第２波長光は、他の工程と不利に干渉しない（例えば、各々の部位の位置において、著しい意図的でない断片の取り外し又は生成がない）。
いくつかの実施形態では、装置における前記部位は、関連した光波長に対して十分に透明である。
【００１７】
多数の反応部位が並行に配置されて、次いで一対ずつ又は大多数で一緒に流れ、種々の所望のビルディング断片の結合(combination)が、流路配置によって、及び、反応部位からの断片の取り外しによって、制御され得る。
このことは、所望のビルディング断片が、伸長されて、第1副ポリマー（より大きな所望のビルディング断片）となるのを可能にする。
この副ポリマーは、その後、「貯蔵部位」に格納され得る。一方、第２の又はより上位の所望のビルディング断片及び続く第２の又はより上位の所望の副ポリマーの生成のために前記装置（又はそれの副部品）が用いられ、又は、再使用されることができ、副ポリマーの各々は、別々の貯蔵部位に格納され得る。
一旦、十分な数の副ポリマーが所望の完全なポリマーの断片を含むように生成されると、貯蔵部位からの副ポリマーは、次いで全長所望ポリマーを生成するために、結合部位において一緒に結合されることができる。並行した合成、順序付けられた結合、副貯蔵、及び副ポリマーの結合の組合せは、長いポリマーの合成について非常に減少したサイズ要求を有する多重化反応部位を可能にする。
いくつかの実施形態では、前記ポリマーは、ＤＮＡ又はＲＮＡ等の核酸であり得る。
【００１８】
＜定義＞
本願明細書において用いられる部分見出は、機能的目的だけのためであって、いかなる形であれ、記載されている内容を制限するものとして解釈されるものではない。
本出願において引用された全ての文献及び類似した資料は、特許、特許出願、記事、本、論文及びインターネット・ウェブ・ページに限定されるものではないが、いかなる目的のためにも、それらの全体において明確に参照することにより組み込まれる。
引用文献における文言の定義が、本明細書において提供された定義と異なるように見える場合は、本明細書において提供された定義が優先する。
言うまでもなく、本明細書において記載された、温度、濃度、回数、等の前には、黙示的に、「約」があるものとする。よって、僅かな実体的でない偏差は、本願明細書における教示の範囲内である。
本明細書では、特に定義されない限り、単数の使用は、複数をも含むものとする。
また、「comprise」、「comprises」、「comprising」、「contain」、「contains」、「containing」、「include」、「includes」、「including」、「compose」、「composes」及び「composing」の使用は、制限されることを意図しない。
当然のことながら、前述の一般的記載及び以下の詳細な説明は、いずれも、例示的且つ説明的であるだけで、本発明を制限するものでない。
「及び／又は」との文言は、一緒に使用され得るか、又は、択一的に使用され得る提供された可能性を意味する。よって、「及び／又は」との文言は、両方の選択が可能性のセットのために存在することを意味する。
【００１９】
本明細書において記載された発明に関連して用いられる科学的且つ専門的な文言は、特に定義されない限り、当業者により共通して理解される意味を有する。
さらに、内容によって必要でない限り、単数語は複数を含み、複数語は単数を含む。
通常、本明細書において記載されている、関連利用される命名法、分子生物学、そして、タンパク質及びオリゴ糖、又は、ポリヌクレオチド化学及びハイブリダイゼーションの技術は、従来技術において周知で一般的に用いられるものである。
例えば、遺伝物質（核酸）の精製及び調製、化学分析、再結合物核酸、及びオリゴヌクレオチド合成のための標準的な技術を用いることができる。
酵素反応及び精製技術は、製造業者の仕様説明書に従って、又は、従来技術において通常行われるように、若しくは、本明細書において記載されているようにして、実行される。
本明細書において記載された技術及び手順は、通常、当該技術分野において周知の慣用方法に従って、及び、本明細書を通じて引用及び記載される一般的な且つより詳細な種々の文献に説明されたように実行される。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual(第３版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、 Cold Spring Harbor, N.Y. 2000)を参照。
本明細書において記載されている、関連利用される命名法、実験手順、及び実験技術は、当該技術分野において周知であり、慣習的に使用される。
【００２０】
発明者は、必要に応じて、彼らは自分自身が辞書編集者となり得ることに充分に認識している。
発明者は、他に明確に述べない限り、辞書編集者として、本明細書及びクレームの文言の平易且つ通常の意味のみを使用することを明確に選択する。
【００２１】
本明細書において提供される実施形態に従って利用されるように、以下の文言は、特に明記しない限り、以下の意味を有するものと理解される：
【００２２】
「所望のポリマー」は、本願明細書において開示された装置及び／又は方法を介して生成される全長ポリマーを意味する。もちろん、所望のポリマーに他の改変を、チップの使用時又は使用後において起こすことができる（更なるモノマー添加又はハイブリダイゼーションを含む）。
いくつかの実施形態では、所望のポリマーは、１つの反応部位から１０６の反応部位までの範囲の単一の遺伝子合成チップ上で、少なくとも２つの塩基〜２５，０００ｋｂの長さである。
最先端の遺伝子合成は、最高３５ｋｂｐまでポリマーのアセンブリを許容する９６〜１５３６の反応部位を提供する。
【００２３】
「モノマー」との文言は、ポリマーを形成する各々のビルディングブロックを示す。このように、核酸について、前記モノマーは、ヌクレオチド（天然又は人工）であり得る。
【００２４】
「断片(fragment)」との文言は、２つ以上のモノマーの集合体（collection）を示す。これらのモノマーは、互いに共有結合的に結び付けられる。
【００２５】
「所望のビルディング断片」との文言は、所望の様式で、一緒に結び付けられたモノマーの集合体（collection）を示す。
「所望の」との文言は、それが所望の化学組成を有することを示す。
核酸の場合において、これは、所望の核酸配列を示す。
いくつかの実施形態では、「所望の」配列は、ユニークな及び／又は指定された配列となり得る。そして、いくつかの実施形態では、前記配列は、第１、第２、第３、第４のレベル等の断片を組み立てるときに、次のハイブリダイゼーションイベントのために使用できる配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、所望のビルディング断片は、ランダムヌクレオチド等のランダムモノマーを有する、からなる、又は実質的にからなる。いくつかの実施形態では、所望のビルディング断片は、ランダムヌクレオチドを含まない。
【００２６】
「第１レベル断片」との文言は、少なくとも２つの所望のビルディング断片を有する断片を示す。
「第２レベル断片」との文言は、少なくとも２つの第１レベル断片を有する断片を示す。
「第３レベル断片」との文言は、少なくとも２つの第２レベル断片を有する断片を示す。
「第４レベル断片」との文言は、少なくとも２つの第３レベル断片を有する断片を示す。
「第５レベル断片」との文言は、少なくとも２つの第４レベル断片を有する断片を示す。
理論的には、断片が有することができる断片の可能なレベルの数には制限がない。
このように、「xxxx-レベル断片」は、限定されるものではなく、そのように指定され得る（よって、第６、第７、８〜第ｎレベル断片が本願明細書に記載されている）。
【００２７】
「連結された」断片は、断片において一本鎖切断も取り除くように、一緒に連結された断片を示す。このように、個々のストランドは、現在十分に連続的である。核酸の場合において、これは、互いにハイブリダイズされた２つの連続的なストランドがあるように、二本鎖断片の個々のストランドが一緒に連結された（例えば、リガーゼを介して、又は、化学的方法によってなされ得る）ことを意味する。非核酸の実施形態が用いられた場合に、「連結された」とは、単に、断片が互いに結び付けられたことを示す。
【００２８】
「副ポリマー」との文言は、共有結合して互いに結び付けられ、次いで貯蔵部位に格納された「２つ以上の断片の集合体」を示す。
【００２９】
「オリゴ」との文言は、概して長さの２〜５００モノマーであるＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ及び／又は他の核酸類似体であり得る一本鎖核酸であるオリゴヌクレオチドを示す。
【００３０】
「反応部位」との文言は、領域（例えば、チャンバー又はウェルなど）を示し、斯かる領域では、特定の化学反応が、他の反応部位から相対的な隔離して起こり得る。いくつかの実施形態では、反応部位は様々な光波長の伝送を可能にし、いくつかの実施形態では、モノマーからの断片生成を誘導すること、及び／又は、反応部位の壁又は表層から断片を取り外すことができる。
【００３１】
「貯蔵部位」との文言は、他の貯蔵部位から隔離された位置を示す。副ポリマー又は断片は、貯蔵部位に格納され、一方、上流システムは、別個の副ポリマーを生成するために、再利用され得る。
【００３２】
「重なり」との文言は、カップリングのための光波長、及び分離（又は脱離）のための光波長との間に重なりが全く無いことに言及する場合、光学的な重なりの程度は、使用されるシステムに対して問題がないことを示す。
上記から明らかなように、種々の化学物質は、（単に１つ又は２つの波長よりむしろ）波長の範囲を吸収し得る;しかしながら、両端におけるこの吸収スペクトルの効率が、重なりからいかなる問題も生じないように、十分に低くすることができる（例えば、意図しないカップリング及び／又は分離の量が、ノイズレベル又は生成物の微量の範囲内である）。
いくつかの実施形態では、重なりが全くない。
いくつかの実施形態では、いかなる重なりも、他のイベント上のイベントのうちの１つに、少なくとも１００倍のバイアスをもたらす（例えば、少なくとも１０００、１０，０００、１００，０００、１，０００，０００又はそれ以上のバイアス）。
いくつかの実施形態では、カップリングの波長及びオリゴヌクレオチドの隔離（又は分離）のための波長は、同一波長であるか又は重なる。
いくつかの実施形態では、これは光生成された開裂試薬を用いて達成され得る。
【００３３】
「選択的に照射する」との文言は、光エネルギー（いかなる波長でも）が所望の位置に導かれることを示す。
いくつかの実施形態では、第２の位置（例えば、第２反応部位）に導かれることなく、光は第1の位置に選択的に導かれる。
いくつかの実施形態では、光が反応部位の周りに流出し得て、しかしながら、光の強度が、有意な量の予想外の反応（カップリング及び／又は分離（又は脱離））を起こすのに十分な大きさを有さない。光は、鏡、フィルタ、レンズ、等を含むあらゆる方法で、導かれ得る。
【００３４】
「事実上透明な」との文言は、所望の波長の十分な量の光が、構造物を通過することができることを示す。
従来技術における1つの技術により明らかなように、その目的にかなうのに十分である量が所望の位置（例えば、反応部位内）に供給される限り、光は構造物によって吸収されるであろうし且つされてもよい。透明度の程度は、また、システムに用いられる光の強さに基づいても変化可能である。
【００３５】
「結合部位」との文言は、チャンバー又はウェルとなり得る位置を示す。ここで、２本以上の予め隔離されたチャネル又は流路は、結合されて、通常の容積となる。
前記結合部位は、流路が流入するチャンバーと同様に、流路自体を含むことができる。
いくつかの実施形態では、結合部位は、結合部位のサンプルの加熱及び／又は冷却を許容するために、加熱要素及び／又は冷却要素に隣接して配置される。
【００３６】
本明細書で使用されるように、「ポリヌクレオチド」は、共有結合で結び付けられる２つ以上のヌクレオチドを意味することを意図する。例えば、ヌクレオチドはリン酸ジエステル結合を通じて、一緒に結び付けられ得る。ポリヌクレオチドは、４つのヌクレオチド（アデニン、グアニン、シトシン、及びチミン）又は、ヌクレオチド類似体及び誘導体（例えば、イノシン、ジデオキシヌクレオチド、又は、ヌクレオチドのチオール誘導体等）を含む。ヌクレオシド又はホスホロアミダイト等のヌクレオチドの異なる化学形態は、ポリヌクレオチドを生成するために用いることができる。加えて、ヌクレオチドは、放射性標識、蛍光色素、強磁性体、発光タグ等の検出可能部分、又は、ビオチン・ストレプトアビジン等の検出可能部分、次の合成及び／又は分岐ポリマー及び小分子側鎖の付加のための化学リンカー等の検出可能部分を更に組み込むことができる。
ポリヌクレオチドは、例えば、ＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）及び本技術分野で周知の他のポリヌクレオチド・バリエーション及び/又は前記ポリヌクレオチドの組み合わせを含む。
【００３７】
＜詳細な実施形態＞
ポリマーを生成するための各種実施形態は、本明細書において提供される。
いくつかの実施形態では、合成されたポリマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、又は、オリゴ糖類であり、多数の（例えば、数百、数千、又は、それ以上、例えば７７７６）反応部位を介して、断片（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡの一片）が順にアセンブルされ得る。
【００３８】
ポリマー生成装置の各種実施形態は、図１Ａ〜１Ｃに示される。
装置１の拡大部が、図１Ａの下半分に示され、図１Ｂへと続いている。
示されるように、いくつかの実施形態では、多数の反応部位１０及び２０が表面に提供される。
前記反応部位が、セットにおいて流体的に結び付けられて、多数の反応部位が、流路（反応部位２０用流路５０及び反応部位１０用流路５１）を介して結合チャンバー６０（６１及び６２）に結び付けられる。前記結合チャンバー６０（６１及び６２）は、生成物（所望のビルディング断片）を一緒に混ぜ合わせて、第1レベル断片を形成するのに用いられ得る。他の反応部位（不図示）は、また、付加的な流路５２を介して、システムに結び付けられ得る。
そして、流路５２はより大きい流路７０に導かれる。そして、流路７０は順に第２レベル結合部位及び第２レベル結合チャンバー１６０に導かれる。
従来技術により明らかなように、種々の反応部位からの生成物は、生成物が反応部位１０，２０から離れるにつれて、流路５０、５１及び５２及びチャンバー６０自体内の両方において、結合され得る。
この領域の組み合わせ（例えば、５０、５１、５２及び６０）は、通常、結合部位１００として示される。
結合チャンバー６０内で、核酸がアセンブルされたときに、結合部位が選択的/特異的なハイブリダイゼーションイベント及び連結イベントを可能にするように、内部溶液の温度を変更するように制御され得る。
この点で、結合部位１００、１０１、１０２、１０３、１０４及び１０５は、「第1レベル結合部位」として示される。
【００３９】
第1レベル断片の形成に続いて、結合反応又は結び付け反応（例えば、連結反応）は、第1レベル断片の種々の部分を共有的に接続して、いくつかの実施形態の装置で実行され得る;よって、いくつかの実施形態では、前記装置のこの区域は、連結反応の溶液パラメータ（例えば、温度、バッファー、リガーゼ、など）を変更する性能のために構成される。
【００４０】
前記第１レベル結合部位は、任意に、流路７０、７１等を介して接続され、そして、任意に更なる流路１５０、１５１、１５２、１５３、１５４及び１５５を介して第２レベル結合チャンバー１６０、１６１、１６２、１６３、１６４及び１６５（図１Ｂ）に接続され、第２レベル結合部位２００が、第２レベル結合チャンバー１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５と、流路（１５０、１５１、１５２、１５３、１５４及び１５５）との両方を有し、より大きい流路７０、７１等も同様に有する。上述したように、この第２レベル結合部位２００及び／又はチャンバー１６０、１６１、１６２、１６３、１６４及び１６５は、システムに種々の成分を付加するために構成され得るし、加熱及び冷却のために構成され得る。
【００４１】
この「崩壊」工程は、何回でも（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１００、１０００、等、又は、より多くの回数）繰り返されて、さらなる結合が許容され得る。しかし、図１Ｂに示されたように、最終的には、構造の崩壊が止まり、崩壊構造が１以上の流路３１０及び３１６を介して貯蔵部位１００１に結び付けられる。
前記貯蔵部位は、上述の前記装置の上流区域から、可逆的に流体的に封止することができ、上記工程を介して生成された第1副ポリマーは、貯蔵部位に格納され得る。一方、前記装置は、一つ以上の付加的な副ポリマーを生成するために用いられ、各副ポリマーは、別々の貯蔵部位１００２、１００３、１００４、１００５及び１００６に入れられることができる。採用される貯蔵部位の数には制限がなく、いくつかの実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００以上の貯蔵部位が採用され、装置上にある。
【００４２】
前記貯蔵部位（１００１、１００２、１００３、１００４、１００５、及び１００６）が流路１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、及び１０１５を介して一緒に結び付けられ、第４レベル結合部位４００となり、この第４レベル結合部位４００は、フローチャンバー３５０及び結合チャンバー３６０を含むことができる。必要に応じて、リガーゼ５００（又は、他の連結剤）は、組合せ部位のための付加的なリガーゼを提供するために提供され得る。
上述したように、前記結合部位４００は、加熱要素を有する又は加熱要素に近接することができ、溶液温度の操作を許容する。
最後に、放出口５００が提供され、この放出口５００によって、生成されたポリマーが集められ得る。いくつかの実施形態では、前記装置の任意の１つ以上の弁（丸で囲まれた「X」を通じて図１Ｂに示される）を含む。また、いくつかの実施形態では、一つ以上の弁が装置から離れて位置して、このように、弁はチップ自体の一部である必要はない。
【００４３】
明らかなように、上記配置は、方法を変化させる際に改変され得る。さらにまた、上述した部分の各々のための各種実施形態は、以下に提供される。
【００４４】
いくつかの実施形態では、レベルの数（結合チャンバー及び／又は結合部位の各レベルのため）は、増減され得る。
いくつかの実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上のレベルが存在し、そこで２つ以上の先行部位（それは、反応部位及び／又は結合部位及び／又は貯蔵部位でありえる）が単一又はより少ない部位に崩壊する。いくつかの実施形態では、１０レベル以上がある。
【００４５】
部位の各々で、及び、流路の始点、終点、又は、中間のいずれかの点で、液体流入口と同様に、部位の内部又は外部への流れを制御するための弁が存在し、システムに液体を加えることを許容する。前記弁は、以下の群から選択されることができる：ソレノイド、ボール、隔膜、ピストン、針、磁気、ピンチ、熱膨張/収縮、メモリ・ポリマー、逆止め弁、又は、動作のために必要な試薬及び圧力を扱うことができる他の弁装置。
【００４６】
いくつかの実施形態では、前記結合部位は、流路及び結合チャンバーを有する。
いくつかの実施形態では、流路は収束し、別の結合チャンバーを要しない（加熱要素が、依然として、これらの構造の各々と結合していることがあり得るにもかかわらず）。
【００４７】
いくつかの実施形態では、流体流入を制御するためのマニホールド及び弁は、また、ポリマー合成チップに製造され得る。
いくつかの実施形態では、前記流入口は、異なる反応体が加えられるのを可能にするために、切換弁を有する。
いくつかの実施形態では、示されたチップは、７７７６反応部位の合計のための反応部位の７２本の柱（全ては図示されていない）によって、１０８列の反応部位（全ては図示されていない）を有する。
この柱においては、１０８列の反応部位は、図１Ａにおいて、実線、明点線、又は暗点線で表された単一の流路に一度で３６に崩壊される。
図１Ａは、４０より小さい反応部位（１０、２０）を示すだけであり、それのうちの３６が黒２０であり、残りの４つが灰色１０である。
１０８×７２アレイが、図１Ａにおいて表されるにもかかわらず、いかなる配列サイズも製造の限界が与えられ得る。
いくつかの実施形態では、装置は、Ｓｉウェーハを有する。
いくつかの実施形態では、Ｓｉウェーハが２５ｍｍ〜３００ｍｍの範囲であり、もって、最大１０００００掛ける１０００００のアレイサイズが、単一ウェーハに可能である。
いくつかの実施形態では、Ｓｉウェーハは、３５ｎｍ〜３００ｍｍである。
いくつかの実施形態では、Ｓｉウェーハは、３５ｎｍ〜３ｍである。
【００４８】
＜核酸実施形態＞
図１Ａ〜図１Ｃのいくつかの実施形態が、核酸を製造するための装置及び方法を含む。
例として図１Ａを使用すると、流入口５は、合成手順が要求する装置に緩衝液及びリガーゼと同様に、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ｕ又はいかなる修飾核酸又は核酸類似体前駆体をも加えるために用いることができる。この流入口チャネル５は、分裂して、反応部位アレイ部分の全ての柱３０、３１、３２、３３、３４及び３５を付与する。
いくつかの実施形態では、合成試薬を供給するための複数の流入口があり得る。
いくつかの実施形態では、少なくとも８つの他のポートがチップ上にある：この少なくとも８つの他のポートは、（ｉ）添加リガーゼを工程全体に亘って減少する補充にかん流させるための少なくとも１つのポート、（ｉｉ）ＤＮＡセグメントを格納及び分配する少なくとも６つのポート、及び（ｉｉｉ）廃棄物及び最終生成物を分配する放出口５００である。
いくつかの実施形態では、前記ポート、入口、及び放出口には、前記ＤＮＡ合成チップから離れて位置するオン／オフバルブを備えつけてある。
【００４９】
いくつかの実施形態では、反応部位の核酸モノマーの連結が、光発生酸、塩基、酵素等の光生成試薬の使用を通じて、且つ、個々の反応部位（図１Ａにおける１０、２０）がスクリーン上のピクセルのようにアドレスされることを許容する、個々にアドレス可能なデジタル光処理（ＤＬＰ）投影技術を通じて達成される。
この工程を通じて、いかなる配列及び増加長の一本鎖ＤＮＡの一片が得られ得る。
【００５０】
いくつかの実施形態では、反応部位の壁からのｓｓＤＮＡ（これらの実施形態において所望のビルディング断片である）の開裂が、光発生酸、塩基、酵素等の光生成試薬の使用を通じて、且つ、個々の反応部位（図１Ａに示された１０、２０）がスクリーン上のピクセルのようにアドレスされることを許容する、個々にアドレス可能なデジタル光処理（ＤＬＰ）投影技術を通じて達成される。
また、反応部位の壁からのｓｓＤＮＡ（これらの実施形態において所望のビルディング断片である）の開裂が、反応部位の表面に対してｓｓＤＮＡを固定する光分解性リンカー分子によっても達成され得る。
このような実施形態では、合成に用いられた光波長は、開裂に使用された光波長に、有意に干渉しないであろう。
カップリングに必要な光発生試薬が、的確な光活性化可能なカップリング前駆体の存在下のみにおいて、光アドレスされたピクセル内で形成され、開裂に必要な光発生試薬が、的確な光活性化可能な開裂前駆体の存在下のみにおいて、光アドレスされたピクセル内で形成された場合、同波長がカップリング及び開裂に使用されてもよい。
いくつかの実施形態では、光酸発生と続くインデックス可能な光開裂との組合せは、チップ弁を使用することなく、ＤＮＡ合成を可能にする。
いくつかの実施形態では、ＮＨ４ＯＨ又はメチルアミンが用いられ得る。
いくつかの実施形態では、弁は、反応部位の内容物が結合部位を開閉するのに使われる。
この場合、ｓｓＤＮＡは、ｄｓＤＮＡストランドをアセンブリしてＮＨ４ＯＨを取り除く前に凍結乾燥される。
いくつかの実施形態では、状況脱保護（situation deprotection）は、ガス相水酸化アンモニウム、methalymine、又は他のガス相脱保護剤を使用して提供される。
【００５１】
所望のビルディング断片の生成に続いて、精製工程は、所望のビルディング断片生成と第1レベル断片となる所望の２つ以上のビルディング断片の組合せとの間で実行され得る。
いくつかの実施形態では、前記精製が、結合チャンバー６０又は結合部位１００に入ることから比較的短い一本鎖断片の数を取り除く又は減少させるサイズ排除精製である。
いくつかの実施形態では、２相精製がある。
精製Ｎｏ．１は、反応部位表面に依然として付着したオリゴ類の精製となり得る。精製Ｎｏ．２は、一旦、生成物が反応部位の表層から離れるときに、サンプルの精製となり得る。
【００５２】
本発明は、また、誘導体化された基板上で合成されたポリマーを脱保護し、洗浄し、取り外す改良方法をも提供する。特に、上記の通りに、アンカー部分は、選択的に光開裂する。成長ポリマー鎖が基本的条件（例えば、無水ＥｔＯＨのＥＤＡ）の下で、連続的に脱保護されるにつれて、基板に付着するポリマーは、基板から開裂されない。脱保護反応が完了すると、基板表面をすすいで、脱保護により得られる小分子断片を除去する。
これにより、ポリマーが付着し、塩及び他の小分子汚染物質がない表面が提供される。
次いで、前記ポリマーは光開始開裂反応を通じて基板から除去される。反応部位表面に付着したままのオリゴ類の精製である精製Ｎｏ．１は、米国特許出願公開第２００３／０１２００３５号明細書に教示され、この米国特許出願公開第２００３／０１２００３５号明細書は、本明細書に援用される。
【００５３】
所望のビルディング断片の生成に続いて、緩衝液においてけん濁されたリガーゼは、一緒に崩壊される反応部位を通じてかん流され（例えば、同時に３６から２１６になる、流路５０、５１及び５２を介した結合チャンバー６０、６１及び６２）、ｓｓＤＮＡ（本実施形態における所望のビルディング断片）が、二本鎖ＤＮＡ（本実施形態のｄｓＤＮＡ第１レベル断片）へアセンブルされる。
これらは、順に結合されて（例えば、同時に６）、大きい流路７０（７１等）となる。反応部位から生成される２以上の所望のビルディング断片（例えば、ｓｓＤＮＡ）を単一流路５０又は結合チャンバー６０へ多重化するこの方法は、チップの保存的な設置面積を可能にする。
いくつかの実施形態では、反応部位１０及び２０は、結合部位で結合される前に、独立流路５０、５１及び５２を供給する。
結合部位１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５（又は、結合チャンバー６０、６１、６２）に反応部位を接続するこれらの流体チャネル（fluidic channels）は、１ｎｍ（ｄｓＤＮＡの半径）〜１０ｍｍの範囲内となり得る（例えば、１０ｎｍ〜１ｍｍ又は１００ｎｍ〜１００μｍ）。
いくつかの実施形態では、結合チャンバー６０、６１及び６２は、任意であり、省略され得る;このように、断片の結合は、流路内で様々な流路が一緒に合流する時に生じる。
【００５４】
一旦、十分な流体が、開裂したｓｓＤＮＡ（本実施形態における所望のビルディング断片）を置換するために結合部位に加えられると、チップ（又は、結合部位に近接したその副部品）は、一緒にＤＮＡ片をアニーリング及び連結するように温度サイクルにさらされる。
【００５５】
いくつかの実施形態では、レベル1結合アセンブリにおいて、６片のｓｓＤＮＡが結合して、相補塩基配列の重なりを有する単一片のｄｓＤＮＡの３つの線形ストランド、又は、長い増加（ｉｎｃｒｅｍｅｎｔｓ）（即ち、３つのフォワードストランド及び３つのリバースストランド、又は、増加）を形成する。
その後、続くアッセンブリレベルは、アニーリング及び連結のためにｄｓＤＮＡの切片を一緒にし、１８、１０８、及び６４８の線形増加長のｄｓＤＮＡの切片を形成する。
５０塩基長のｓｓＤＮＡ増加を仮定すると、ｄｓＤＮＡが６４８のＤＮＡ線形増加の長さに達した後、ｄｓＤＮＡの長さが、約３２，４００塩基対長となる。
ｄｓＤＮＡの長さは、１０ｋｂｐから５０ｋｂｐの範囲の大部分のウィルス・ゲノムに類似する（on the order of）。
結合し、アニール化し、連結するこの工程は、貯蔵部位まで継続する。
【００５６】
ＤＮＡ含有量がレベル３及び／又は流路３１６を超えた後に、それは貯蔵部位１００１、１００２、１００３、１００４、１００５及び１００６とこれ以後に称する６つのチャネル又は部位のうちの１つに格納される。
前記貯蔵部位１〜６が所望するようにも満たされる（又は、貯蔵部位の適当数が、所望するようにも満たされる）まで、前記チップの領域は、先のレベル1〜３又は４からの温度サイクルから隔離され得て、３１０Ｋ未満で維持され得る。
【００５７】
前記貯蔵部位は、多数の反応部位からの単一又は複数レベルを用いる合理的なサイズの単一チップ上での多数のｓｓＤＮＡセグメントの調製、崩壊及びアセンブリを許容するように機能する。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ片は、シンプルオフチップバルブシステム（simple off chip valving system）を介して、ガス及び／又は液及び／又は浸透圧及び／又は毛管の及び／又は化学ポテンシャル差を通じて、これらの貯蔵部位に追い込まれる。
いくつかの実施形態では、同一長のＤＮＡストランドは、前記実施形態における貯蔵部位と同じ多くのチップを使用して製造され、一般的な方法を通じて、後続のチップ上で結合され、又は、後に結合され得る。
ＤＮＡ貯蔵部位１のポートを制御する弁を開放することによって、開放したポートを通じて流体がかん流することができ、ＤＮＡが１００１（Ｐ１、貯蔵部位１）に押し込まれる。一方、１００２〜１００６（Ｐ２〜Ｐ６）を制御するポートと、放出口とは、閉鎖されている。次のアセンブリランのために、Ｐ１（１００１）が閉鎖されており、放出口は開かれ、そして、ＤＮＡが貯蔵部位の上のレベルに達した後、前記工程はこのパス上で繰り返され、その代わりに、Ｐ１  １００１、１００３−１００６（Ｐ３〜Ｐ６）及び放出口が閉鎖されている間、Ｐ２  １００２は開かれる。
【００５８】
一旦、全ての（又は、所望の数の）貯蔵部位が満たされると、バッファーは、Ｐ１〜Ｐ６上のポートを通じてかん流して、リガーゼが、ポートを通じて貯蔵部位の上流で直接加えられて、連結される最終的な結合部位４００にＰ１〜Ｐ６の内容物を押し込む。
その結果物は、１９４ｋｂｐ（本実施形態における所望のポリマー）のｄｓＤＮＡアセンブリ（５０塩基長のｓｓＤＮＡ増加を与えられる）である。
いくつかの実施形態では、これは、チップ合成上の１の最小のゲノム・オペレーティングシステムのサイズである。
【００５９】
いくつかの実施形態では、この工程方法は、弁又は複数層結合チップ等の複雑な構成要素を必要とすることなく、単一層における該装置の単純な低コスト製造を採用して、この種のチップのコストに衝撃を与える。
いくつかの実施形態では、貯蔵部位が最終結合レベルに設計されない場合、第１レベルから出るチャネルの数は、必要な多数の個々にインデックス可能な弁及び／又はサイズにより、この種の装置を製造不可能とする。
例えば、７７７６チャネルは、１ミクロン（マイクロメートル）・チャネルが与えられる第１レベルから配管されて、１ミクロン・ステップ７７７６チャネルは１５ｍｍの長さを占める。しかしながら、克服すべき圧力降下が相当なものとなる。チャネルの寸法が１０ミクロンに増やされるだけの場合であっても、チップが約７７ｍｍとなり、単一のＳｉウェーハ上の相当な数の装置を得るためには大きすぎる（２５ｍｍ〜３００ｍｍの直径範囲の一般のＳｉウェーハを与えられる）。
【００６０】
＜ＤＮＡ断片合成＞
従来技術により明らかなように、核酸を生産する多くの方法がある。
【００６１】
ポリヌクレオチド（別名、オリゴヌクレオチド）を合成する方法は、公知技術であり、例えば、下記文献に記載されているのを発見することができる：Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach, Gate, ed., IRL Press, Oxford（1984）; Weiler et al., Anal. Biochem. 243:218 (1996); Maskos et al., Nucleic Acid Res. 20 (7): 1679(1992); Atkinson et al., Solid-Phase Synthesis of Oligodeoxvribonucleotides bv the Phosphitetriester Method, in Oligonucleotide Synthesis 35 (M. J. Gait ed., 1984); Blackburn and Gait (eds.), Nucleic Acids in Chemistry and Biology, Second Edition, New York: Oxford University Press (1996), and in Ansubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD (1999). 
上記参照文献の全ては、それらの全体において本願明細書に援用される。
【００６２】
ポリヌクレオチド及び他のポリマー配列のアレイを生成するための固相合成方法は、下記文献に記載されているのを発見することができる：Pirrung et al.,米国特許第５,１４３,８５４号明細書(国際公開第９０／１５０７０号パンフレット参照), Fodor et al.,国際公開第９２／１００９２号パンフレット;Fodor et al., Science (1991) 251:767-777. 及び Winkler et al.,米国特許第６，１３６，２６９号明細書; Southern et al. 国際公開第８９／１０９７７号パンフレット,及び Blanchard国際公開第９８／４１５３１号パンフレット。
このような方法は、オリゴヌクレオチドアレイの、マイクロピン、フォトリソグラフィ及びインクジェット合成を用いたアレイの合成及び印刷を含む。
ポリヌクレオチドの連続的なアニーリングによって大きな核酸ポリマーを合成する方法は、エヴァンズの国際公開第９９／１４３１８号パンフレット、及び、エヴァンズの米国特許第６,５２１,４２７号明細書内に記載されているのを発見することができる。上記参照文献の全ては、それらの全体において、本願明細書に援用される。
【００６３】
ポリヌクレオチドは、ホスホロアミダイト化学を用いた市販の核酸シンセサイザーにより生成することができる。
実際の処方系は、ホスホロアミダイト及び代替の合成戦略を再検討した（Brown, T., and Dorkas, J.S. Oligonucleotides and Analogues a Practical approach, Ed. F. Eckstien, IRL Press Oxford UK（1995）））。
ポリヌクレオチドの化学合成は、４つのビルディングブロック（ホスホロアミダイト塩基）が線形ポリマーとして接続される方法である。
前記塩基成分に加えて、多くの試薬がヌクレオチド間結合の形成において援助し、酸化して、キャップして、脱トリチレートして、脱保護するために必要とされる。
オートメーション化した合成は、経時的な化学反応のための足場として役立つ固体支持マトリックス;試薬をマトリックスに供給する一連の弁及びタイマー；及び精製、定量化、生成物品質管理（ＱＣ）、凍結乾燥等を含む合成後の流れ処理で実行され得る。
いくつかの標準のＤＮＡ塩基（Ｇ、Ｃ及びＡ）は、反応性の一級アミンを含む;従って、第１級環外アミンは、合成時における不要な反応に参加しないように保護基で修飾され得る。さらに、４つのホスホラミダイトは、同様に保護されていることを要するリン結合を含む。これらの感応性部位を保護するために用いる化学基は、ＤＮＡ合成サイクルの間、元のままとなり得るが、合成後に容易に除去されて正常な非修飾ＤＮＡが生じる。多くの異なる保護戦略が開発されている。例えば、b-シアノエチル保護されたリンを有するホスホロアミダイトが用いられ得る。複素環式塩基のために、一級アミンの保護が、アデニンおよびシトシンのためのベンゾイル基、及び、グアニンのためのジメチルホルムアミジン基（dimethylfonmamidine）又はイソブチリル基（isobutyrl）によってしばしば提供される。チミン（第１級アミンを欠いている）は、塩基保護を必要としない。これらの保護基は、合成時に使用された条件下で安定であるが、アンモニアを用いる処理によって、急速且つ効果的に除去される。
また、活性化したモノマーがそれら自身と反応せずに固体支持体につながれた成長ポリヌクレオチド鎖上の５'-ＯＨとのみ反応し得るように、ホスホロアミダイト塩基の５'-ＯＨをブロックすることが望ましい。
例えば、現在の化学は、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）基を採用する。濃縮後、ＤＭＴ基は、酸処理によって、新たに添加されたＤＮＡ塩基から開裂される。放出されたＤＭＴカチオンがオレンジであり、ＤＮＡカップリング効率の進行は、４９０ｎｍでの分光測光法の測定値によってモニタされ得る。
【００６４】
デオキシリボース糖の３'水酸基は、非常に反応性が高いリン酸化（phosphitylating）試薬により誘導体化される。
この基上のリン酸酸素が、通常、高温でアンモニア水酸化物処理を用いる１３-除去によって取り除かれ得る１３-シアノエチル部分によってマスキングされる。
【００６５】
オートメーション化された合成は、固体支持体上でなされ得る。いくつかの実施形態では、塩基は、（ＤＮＡポリメラーゼによる酵素合成に反して）３'から５'方向での成長鎖に加えられる。
【００６６】
「自在の」支持体が存在するにもかかわらず、合成は、３'-水酸基におけるエステル結合を介して付着した第1塩基によってすでに誘導体化された表面を使用して、より頻繁に開始される。
【００６７】
合成が、固体支持体に付着した第1塩基（それは、モノマー、ダイマー、トリマー、テトラマー、ペンタマー、又はヘキサマーのヌクレオチドホスホロアミダイトであり得る）から開始され、３'から５'方向に伸びる。
【００６８】
ポリヌクレオチド合成サイクルは、以下の４つのステップで行われる：
（１）デブロッキング;
（２）活性化/カップリング;
（３）キャッピング;及び
（４）酸化。
【００６９】
デブロッキング：
前記合成サイクルは、ジクロロメタン中（ＤＣＭ）のジクロロ酢酸（ＤＣＡ）又はトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）への短い曝露によって、５'-端末塩基の５'水酸基からのＤＭＴ基の除去から始まる。
結果として生じるトリチルカチオンの収率が測定され得て、合成反応の効率をモニタするのを助ける。
ヌクレオシドビルディングブロック上の反応性核種（１級アミン及び遊離水酸基）の保護は、露出した５'-水酸基がカップリング反応（次のステップ）に参加することができる唯一の反応性求核剤であることを確実にする。
【００７０】
活性化/カップリング：
ＤＮＡ（モノマー、ダイマー、トリマー、テトラマー、ペンタマー、又はヘキサマーのヌクレオチド）ホスホロアミダイトは、カップリング時にテトラゾール又はテトラゾール誘導体の処理によって、より反応性が高い形態へ変換する。
これらの工程は、ホスホロアミダイトの急速な脱プロトン化に続くホスホロテトラゾリド（phosphorotetrazolide）中間体の可逆性及び比較的遅い形成を通じて起こる。活性化されたデオキシリボヌクレオシド−ホスホロアミダイト試薬を用いるカップリング反応は、急速且つ効率的である。
【００７１】
ホスホロアミダイトに対するテトラゾール（tetrazole）の過剰は、完全な活性及びＣＰＧにカップリングされた反応性ポリヌクレオチドに対するホスホロアミダイトの過剰を確実にするために用いられ得る。これらの種類の条件下で、９９％より大きいカップリング効率が成し遂げられ得る。
【００７２】
キャッピング：
塩基カップリング反応が１００％効率ではないので、ＣＰＧ支持体上の少しの割合の成長ポリヌクレオチドは、カップリングしないで、所望でなく且つ切断された種となるであろう。
保護されない限り、これらの切断された又は部分的なポリヌクレオチド生成物は、後のサイクルの基質として機能し続けて、伸長して、内部欠失を有する略全長ポリヌクレオチドが得られる。
これらの切断された又は部分的なポリヌクレオチド生成物は、（n-l）塩基長種（(n-1)-mer species）と呼ばれる。
これらの「反応不良」は、主に、無水酢酸で遊離５'-ＯＨをアセチル化することを含む「キャッピング」によって、次の合成サイクルに参加するのを防止することができる。
【００７３】
酸化：
この時点で、ＤＮＡ塩基は、潜在的に不安定な三価の亜リン酸三エステルによって接続される。この種は、酸化により、安定な５価の燐酸三エステル連結に変換される。
水/ピリジン/テトラヒドロフラン中の希薄ヨウ素を用いた反応生成物の処理が、加水分解されて５価のリン含有化合物を生成するヨウ素リン含有付加物を形成する。
酸化工程は、１サイクルのポリヌクレオチド合成を完了する;次のサイクルは、新しく加えられた５'−塩基からの５'−ＤＭＴの除去から開始する。
【００７４】
開裂及び脱保護：
合成完了後、いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、室温で、濃縮水酸化アンモニウムにより、固体支持体から開裂され得る。
高温でのアンモニア中での継続的なインキュベーションは、シアノエチル基のＢ-除去を介してリン含有化合物を脱保護するであろうし、また複素環式塩基から保護基も除去するであろう。いくつかの実施形態では、上記の如く、開裂は、光化学反応を経て起こる。
【００７５】
合成後処理：
合成の間、全長ポリヌクレオチド及び切断生成物又は部分的なポリヌクレオチド生成物は、ＣＰＧ支持体に付着したままである。
合成に続いて、いくつかの実施形態では、前記種は、同様に開裂され、回復されて、最終的な反応生成物が所望の種と所望でない種との異種混合物となる。
ポリヌクレオチド長が増加するにつれて、不純物はより大きな程度に蓄積する。
さらに、また、開裂された保護基が存在する。この時点で、ポリヌクレオチドは、小分子不純物（保護基及び短い切断生成物）がゲル濾過又は有機固相抽出（ＳＰＥ）方法を使用して除去される方法により、慣例的に「脱塩される」。
【００７６】
単純なアプリケーション（例えば、ありふれたＰＣＲ又はＤＮＡシークエンス等）に短いプライマーを用いる場合に、付加的な精製なしに脱塩されたポリヌクレオチドを使用することが適切となり得る。
しかしながら、クローニング、部位特異的突然変異生成、又は遺伝子アッセンブリアプリケーションで使われる場合、ｎ−１及び他の切断又は部分的なポリヌクレオチド種が欠失変異体に至り得る。
【００７７】
いくつかの実施形態では、PAGE又はHPLCによる精製は、切断された又は部分的なポリヌクレオチド種を除去するために用いられ得る。
いくつかの実施形態では、ポリマー長がエラーを減らすために短く保たれる。
他の実施形態において、濾過工程は、所望の断片サイズの下で断片を除外するために用いられる。
もちろん、他のステップが、また、全長断片から所望でない部分的断片を濾過することにとって可能である。
【００７８】
ポリヌクレオチド合成効率は、概して、化学反応の各サイクルにおいて約９８−９９％であるので、各サイクルについて、反応生成物の約１−２％は、予想よりも1塩基短いであろう。
いくかの切断種は、「キャッピング」に失敗して、ＤＮＡ合成の付加的なサイクルに参加し続ける。
６０塩基長のポリヌクレオチドについて、最終製品の５０％未満は、所望の全長分子であろう。最終的な合成生成物は、（ｎ−ｌ）塩基長及び（ｎ−２）塩基長等の分子の混合集団を含み、配列の異質なコレクション（事実上、あらゆる可能な位置での欠失変異体のプール）を表す。
【００７９】
合成スケールは出発材料の量に言及し、一方、合成収率は合成及び精製工程が完了された後に回収された最終生成物の量に言及する。ポリヌクレオチド合成において、３'末端塩基は、顧客に注文されたスケールで、固体支持体に付着させられる。３'から５'への方向で、塩基は一つずつ加えられる。
理想的には、各々の添加塩基が１００％の効率でカップリングし、結果として、１００％の収率になる。
実際は、カップリング効率がいくらか１００％未満であり、そして、この小さい減少が最終的なオリゴヌクレオチドの収率の実質的な減少に結果としてなり得る（カップリング効率の効果が追加的であるため）。
さらに、カップリング効率が添加された各塩基について変化し、よって、配列自体が、収率における広範囲な変化の一因となり得る。
２５０ナノモル−スケールの反応について、脱保護及び精製後の最終的な収率は、１０〜１００ナノモルまで変動し得る。
いくつかの配列は、他よりも高収率を生じる傾向があり、そして、この傾向は、通常再現可能である。
２つの配列について同じ試薬を用いて、同一装置で、同日に実行される場合であっても、１つの２０塩基配列の合成についての収率は、異なる２０塩基配列について得られたものの２倍となり得る。
また、収率の若干の変動は、使用される個々の機械にも由来する。
【００８０】
所定の合成についての理論収率は、カップリング効率を表すＥｆｆ及びポリヌクレオチドにおける塩基の数を表すｎで表されるＥｆｆ（ｎ−１）である。
カップリング効率が９９％（Ｅｆｆ＝０．９９）である場合、合成後に存在する全長生成物の割合は、２０塩基長については、おおよそ（０．９９）１９、即ち８３％であり；５０塩基長については、ほぼ（０．９９）４９、即ち６１％であり；７５塩基長については（０．９９）７４、即ち４８％である。カップリング効率のわずかな減少は、予想された収率における実質的な減少に結果としてなるであろう。
例えば、カップリング効率が９９％である場合、１００塩基長についての収率が（０．９９）９９、即ち３７％であるが、カップリング効率が９８％に落ちる場合、収率は（０．９８）９９、即ち１３％に落ちる。
【００８１】
しかしながら、カップリング効率は、加えられる各々の塩基によって変化する。恐らく、固体支持体の表面近くの立体障害のため、カップリング効率は、最初の５〜６つの塩基については低い。
次いで、カップリング効率は、第２０塩基の追加に特徴づけられる約９９％の最適条件まで増加し、そして、もう一度、長さが増加するにつれて、最適レベル以下のレベルまで降下する。
ポリヌクレオチドが非常に長くなるにつれて、カップリング効率が実際に減少するので、１００塩基長の収率はしばしば１０％未満となり得る。
また、いかなる精製工程の間も、生成物がいくらか消失する。そして、それは更に収率を低下させる。
【００８２】
いくつかの実施形態では、（ｉ）各々の生成ポリヌクレオチドを品質について点検することができ、又は、（ｉｉ）生成ポリヌクレオチドのサンプリングを選択して、例えば、ベックマンＰ／ＡＣＥ  ＭＤＱ  ９６−ｗｅｌｌ  ＣＥ、及び／又はＨＰＬＣ、及び／又は質量分析計で、品質について検査することができる。
純度はポリヌクレオチド・主ピークのパーセント領域又は、ＣＥ又はＨＰＬＣカーブのＮをとることによって算出される。
【００８３】
＜光生成試薬−核酸合成含有＞
いくつかの実施形態では、より長い断片を生成するためにモノマー及び試薬を連続的に反応部位に添加する代わりに、光生成試薬を用いることにより、断片を生成するための種々のモノマーを生成し、又は、活性化させることができる。
【００８４】
いくつかの実施形態では、米国特許第６，４２６，１８４号明細書において概説される方法及び組成物を用いて、最初のモノマーを反応部位の表面に付着させることができる（本願明細書において、完全に、そして、この態様に関して、援用される）。
【００８５】
いくつかの実施形態では、米国特許出願公開第２００３／０１４３１３１号明細書において概説される方法及び組成物を用いて、光生成前駆体を光発生試薬に選択的に変換することができる。よって、更なる断片構造を可能にする（本願明細書において、完全に、そして、この態様に関して、参照によって組み込まれる）。
【００８６】
いくつかの実施形態では、米国特許出願公開第２００３／０１３８３６３号明細書、米国特許出願公開第２００３／０１８６４２７号明細書、米国特許出願公開第２００４／００２３３６８号明細書、及び国際公開第９９／４１００７号パンフレットにおいて概説される方法、装置及び組成物を用いて、更なる断片合成のために脱保護及び壁への部分付着の開始を行う（本願明細書において、全体として、この態様を参照して援用される）。
【００８７】
いくつかの実施形態では、選択的に開裂可能なリンカーに関して、米国特許出願公開第２００３／０１２００３５号明細書で概説される方法および組成物を使用することができる（本願明細書において、完全に、及び、この態様に関して、援用される）。
この種のリンカーは、含まれるか、又は、反応部位の表面に第１モノマー（又は、次のモノマー）が付着させられたものであり、所望のビルディング断片が後の時点で表面から光学的に開裂され得る。
【００８８】
いくつかの実施形態では、断片を反応部位壁から分離する及び／又は脱離する組成物及び方法は、米国特許第６,５８６,２１１号における１つ以上の実施形態を含む（本願明細書において、完全に、そして、この態様に関して、援用される）。
【００８９】
いくつかの実施形態では、ポリマー合成のために使用される所望のビルディング断片は、長さが５〜２５０、１０〜２００、１０〜１００、又は１０〜５０のモノマーである。
連続したステップにおいて、いずれの場合においても反応部位から部分的に相補的な所望のビルディング断片を分離すること、および結合部位においてハイブリダイゼーション条件の下でそれらを互いに接触させることは、可能である。
【００９０】
いくつかの実施形態では、前記ポリマーが核酸である場合、個々の反応部位で合成される所望のビルディング断片の塩基配列が選択され、前記塩基配列がアセンブリされて核酸二本鎖ハイブリッド（それは、本実施形態において第1レベル断片であろう）を形成することができる。
次いで、所望のビルディング断片は、以下状況における１つ以上のステップにより壁から分離させることができる。複数の、即ち、少なくともいくつかの分離された所望のビルディング断片がアセンブリされて、第１レベルの断片が形成される。
その後、第1レベル断片の１つのストランドを形成する核酸断片が、互いに少なくとも部分的に共有結合的に結び付けられ得る。これは、例えばリガーゼが使用される酵素処理によって、及び／又は、ＤＮＡポリメラーゼを用いてストランドにおけるギャップを充填することによって、実行され得る。
【００９１】
いくつかの実施形態では、所望の一本鎖断片は、in-situ合成により反応支持体上の多数の反応領域において合成される。
これは、例えば、ＤＥ１９９２４３２７．１、ＤＥ１９９４０７４９．５、ＰＣＴ／ＥＰ９９／０６３１６及びＰＣＴ／ＥＰ９９／０６３１７の特許明細書において記載された前記支持体を用いて行われ得る。
これに関連して、各々の反応領域は、長さが約１０〜２５０ヌクレオチドの個々の所与のＤＮＡ配列の個別の特異的な合成に適している。これらのＤＮＡ鎖は、非常に長いＤＮＡ分子の特異的な合成のためのビルディングブロックを形成する。
【００９２】
いくつかの実施形態では、反応部位合成は、流体マイクロプロセッサにおける光依存性位置又は／及び時間分解ＤＮＡ合成によって実施される。
また、前記流体マイクロプロセッサは、特許出願ＤＥ  １９９  ２４  ３２７．１、ＤＥ  １９９  ４０  ７４９．５、ＰＣＴ／ＥＰ９９／０６３１６、及びＰＣＴ／ＥＰ９９／０６３１７（本願明細書において、全体として援用される）においても記載されている。
【００９３】
断片の分離又は脱離
所望のビルディング断片及び固体表面（例えば、反応部位の表面等）間の結合又は関連を切断する多くの方法がある。
いくつかの実施形態では、これは光開裂を介してなされ、したがって、光開裂可能部分が、断片を反応部位の基板又は内部に接続するために使用される。光開裂部分は、例えば、ピバロイルリンカー、フェナシル−エステル類、o-ニトロベンジル光開裂リンカー、ジメトキシニトロベンジル部分からなっていてもよい。
他の実施形態では、光開裂部分は、8−ブロモ−7−ヒドロキシキノリンである。
他の実施形態では、光開裂部分は、ニトロジベンゾフランである。
他の実施形態では、光開裂部分は、６−ブロモ−７−ヒドロキシクマリン−４−イルメチルである。
リンカーは、合成方法における用途を発見する。該合成方法は、例えば、ケージドモルホリノ（米国特許出願２０１０００２２７６１（本願明細書において、完全に、及び、この態様に関して、参照によって組み込まれる）等の光開裂オリゴヌクレオチドの生成を含む。
【００９４】
いくつかの実施形態では、開裂は、ランダムアクセス光開裂（ＲＡＰ）（又は、ランダムアクセス開裂「ＲＡＣ」）によってなされる。
【００９５】
いくつかの実施形態では、断片の分離は、化学開裂によって成し遂げられる。
【００９６】
いくつかの実施形態では、所望のビルディング断片の分離は、熱に基づく開裂を介して成し遂げられる。
いくつかの実施形態では、所望のビルディング断片の分離は、反応部位の壁の音響、磁気、及び／又は、電気分野の態様の変化によって達成される。
いくつかの実施形態では、所望のビルディング断片の分離又は脱離は、反応部位の壁の化学吸着及び／又は物理吸着の態様の変化によって達成される。
いくつかの実施形態では、所望のビルディング断片の分離又は脱離は、適切なリンカーの光生成試薬開裂によって達成される。
いくつかの実施形態では、所望のビルディング断片の分離又は脱離は、反応部位の壁のレセプタ-基板結合態様の変化によって達成される。
いくつかの実施形態では、所望のビルディング断片の分離又は脱離は、反応部位の壁のキレート態様の変化によって達成される。
いくつかの実施形態では、所望のビルディング断片の分離又は脱離は、反応部位の壁の金属結合態様の変化によって達成される。
いくつかの実施形態では、所望のビルディング断片の分離又は脱離は、反応部位の壁の共有結合態様の変化によって達成される。
いくつかの実施形態では、所望のビルディング断片の分離又は脱離は、反応部位の壁のイオン結合態様の変化によって達成される。
【００９７】
＜断片の精製及び／又は濾過及び／又はＱ／Ｃ＞
上記のように、全ての化学反応が１００％効率的であるというわけではない、そして、本システム（実際には多重化システム）は多数の反応を含む。このように、全てのウェルにおける全ての断片が、必ずしも、その断片にとってまさに所望の配列（例えば、質量分析によって、＋又は−１ａｍｕ（原子質量単位）の精度に対する正確な分子量）であるというわけでない。
この問題は、多数の方法で対処され得る。もちろん、各々の断片のサイズを減らすことによって、反応の数は減少して、そしてエラーの確率は減少する;そして、最初の断片のサイズをより短く保つことによって、この問題を減少させることができる。
【００９８】
さらに、いくつかの実施形態では、１の所望の配列を採用し、他の配列を除去するために、全長ポリマーの生成集団からシークエンシングする及び／又は選択することによって、プロセス終了時にこの問題に対処することができる。
【００９９】
いくつかの実施形態では、断片の所望の長さより短いそれらの断片を除外することによって、最初の反応部位レベル生成物において濾過又は精製する（断片のいずれかを結合する前に）付加的工程を含み得る。
大部分のエラーが単位の付加の脱落によるであろう場合、これは十分となり得る。
このように、サイズ排除濾過システムは、いくつかの実施例では、採用され得る。
【０１００】
いくつかの実施形態では、所望のビルディング断片又は第1レベル、第２レベル、断片、副ポリマー、又は、所望のポリマーが、非常に厳密な条件下で相補的ＤＮＡマイクロアレイにアニーリングすることによって濾過されて、単一塩基対ミスマッチ断片が更なる遺伝子アセンブリのために利用可能な所望のＤＮＡ断片を残して洗浄され得る。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、所望の配列又は構造物と結合し所望でない配列又は構造物と結合しない抗体がスクリーニング方法として用いられ得る。
いくつかの実施形態では、一つ以上の上記精製プロセス及び／又は構造が、また（あるいは代わりに）、前記表面からの所望のビルディング断片の分離などに続く工程でより早く用いられ得る。
いくつかの実施形態では、Ｑ／Ｃレベル、装置、構造も、含まれることができて、単一分子ＤＮＡシーケンサを含み得る。
いくつかの実施形態では、これは、最終的なレベル時又は出力の直前に起こる。
いくつかの実施形態では、本願明細書において記載されている精製技術の一つ及び／又は組合せが、いずれかの及び／又は全ての組合せ部位の前後で使用され得る。
【０１０２】
＜光源及び導光装置＞
いくつかの実施形態では、装置及び／又は方法は、所望のビルディング断片合成のための試薬（例えば、酸）を光生成するための光、及び／又は、所望のビルディング断片を所望の反応部位から開裂するための光を使用する。
様々な構造は、これを達成するために使用され得る。
いくつかの実施形態では、これらの工程の各々が、異なる光源を含む。
一方は、開裂に適切な波長（例えば、３００ｎｍ−４００ｎｍ、１９０ｎｍ-６００ｎｍ）を放出することができ、他方は、光脱保護、光カップリング、カップリングのための試薬の光生成、及び開裂のための試薬の光生成に適切な波長（例えば、１９０ｎｍ-６００ｎｍ）を放出することができる。
当業者にとって明らかなように、使用される特定の光源は、光開裂及び光生成のために使用される分子の特性に基づいて変化するであろう;しかしながら、両方の態様が１つの実施態様において使用されるときに、それらは適切に適合されるであろう。
いくつかの実施形態では、複数の光源が使用される（例えば、核酸の各々のタイプのための１つの光源、光開裂のための１つ以上の光源）。
いくつかの実施形態では、光源の全てが、同じ導光装置（例えば、ＤＬＰ）を共有し、そして、他の実施形態では、一つ以上の光源は、一つ以上の導光装置を共有する。
【０１０３】
光は、多数の方法で特定の反応部位に導かれ得る、例えば、複数のＤＬＰが微細化されたシステムに適切なスケールで特定の方向を許容する。いくつかの実施形態では、種々のレンズ及び／又は鏡が、使用され得る。
いくつかの実施形態では、フィルタシステムが用いられ、そうすると、光の広域ビーム光が使用される。しかしながら、光は、それが特定の反応部位のために要求されない限り、除去される。
いくつかの実施形態では、統合されたＬＥＤ又はＬＡＳＥＲを有する反応部位が採用され得る。
いくつかの実施形態では、本願明細書において記載されている単一の技術又はその組合せは、光を導くために用いられてもよい。
【０１０４】
従来技術において、本願明細書により明らかなように、実施されたステップが悪影響を与えない限り、他の光波長が上記工程に含まれ得る。
このように、青い光波長が光生成又は開裂においていかなる光化学的活性も有しない場合、光源及び導光装置はまた、この種の光を送信し及び導くこともできる。
しかしながら、いくつかの実施形態では、断片成長のための酸の光生成が起こる（断片に対して、自由且つ同時添加するものではない限り）ときに、開裂を生じる光は適用されるべきではない。
【０１０５】
従来技術から明らかなように、様々なフィルタが、光源及び／又は導光装置から反応部位まで光の所望の波長が通過するのを可能にする波長のサブセットを選ぶために使用され得る。
いくつかの実施形態では、導光装置は、フィルタを含み得る。
従来技術から明らかなように、反応部位に入る（それが光源を出て、導光装置によって導かれ、いかなる任意のフィルタをも通過した後）のは、いずれの光生成又は光開裂に適切な光の最終波長である。
どのように最終結果が達成されるかは、多数の方法により、上述したように、例えば、光源の数、光源によって放出される光波長、導光装置の数、装置によって導かれる波長、光路に沿って配置されたいかなるフィルタ、及びさらに装置自体の光学特性を変えることによって、変化させることができる。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、光の波長は、１００ｎｍ〜１０００ｎｍの間にある。
いくつかの実施形態についていくつかの有用な範囲は、３５５ｎｍ〜４９０ｎｍ、２６５ｎｍ〜４５０ｎｍ、及び１９０ｎｍ〜５００ｎｍの波長の範囲内である。
いくつかの実施形態では、レーザーは、モノクロの光源（即ち、フィルタを必要としない単一の波長）を供給するために用いることができる。
いくつかの実施形態では、レーザー波長は、光開裂のための活性化スペクトルの範囲内ではなく、光生成試薬のための活性化スペクトルの範囲内となるように選択されてもよい。
【０１０７】
＜反応部位＞
反応部位は、種々の材料でできていることがあり得て、種々の形状及びサイズを呈する。
いくつかの実施形態では、反応部位は、モノマーが異なる反応部位におけるモノマーアセンブリから相対的に隔離してアセンブルされ得る反応容積を提供する。
このように、反応部位の構造は、他の反応部位において不注意で起きているモノマーアセンブリから、該反応部位におけるモノマーアセンブリを隔離するのに適切である。
いくつかの実施形態では、これはチャンバー又はウェルの形状で反応部位を有することによって達成される。そして、反応部位は、流路を経て装置の残りに接続している。
活性化されたモノマー又はＰＧＲのいくらかの「ブリードオーバー（bleed over）」は、これらの活性成分が1つの反応部位から流路を介して他の反応部位に進行するにつれて、発生し得る;しかしながら、その量は、装置の目的にとって有意でない。
弁又はゲートが使われる場合、その量は更に減少され得る。
いくつかの実施形態では、反応部位の工程は多重ラウンドで起こる。よって、試薬のいずれの単回投与も、直後の試薬（又はエネルギー条件）のセットなしに、断片を有意に増大しない。このことにより、試薬の単回投与は、他のウェルにおける意図しないモノマー追加をさらに制限する。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、前記部位は、入口流路及び出口流路を含む。
いくつかの実施形態では、入口流路及び出口流路は、同じ流路である。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、反応部位の表面は、ＭＥＭＳ及びマイクロ流体装置製造に有用であることが本技術分野において公知である、Ｓｉ、ｎ−ｐ−ドープされたＳｉ、他のドープされた半導体、及びドープされていない半導体でできている。
いくつかの実施形態では、表面は、それに対してポリマー断片の付着が考慮され、そして、このように、表面材料が、ＳｉＯ２、ガラス、ｐ−ｎ−ドープＳｉ半導体、ドープされた半導体、導体、絶縁体、金、チオール化合物、遷移金属、遷移金属化合物、有機化合物、無機化合物、フィルム、液晶層、ビオチン、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐａｖａｄｉｎ）、タンパク質、抗体、レセプタ、ラングミュア−ブロジェット（Ｂｌｏｄｇｅｔ）膜、リンカー、導電ポリマー、酵素、生物学的触媒、化学触媒、イオン化表面、キレート化表面、高反応性官能基、有機及び無機ポリマー、フッ化ポリマー、自動アセンブルされた上部構造（superstructure）、ＤＮＡプローブ、ＰＮＡプローブ、ＲＮＡプローブ、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、核酸結合タンパク質、レクチン、炭水化物、脂質表面及び脂質二重層表面、を含み得る。
上記表面が、また、いくつかの実施形態の装置の他の部分（例えば、結合部位、流路、結合チャンバー、貯蔵部位、など）のために使用され得る。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、付加的な材料が、反応部位の表面積を増加させるために、反応部位内に加えられる。
このような実施形態では、前記材料は、ビーズ、ロッド、ランダム成形された対象物を含み得る。より大きな表面積及びそして所望のビルディング断片となる出発モノマーのための付着点が提供される。いくつかの実施形態では、本願明細書において記載された、多孔性Si及び対象物の多孔質バージョンが、単独及び／又は組合せで使用されてもよい。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、反応部位は、大気に対して開放される。
いくつかの実施形態では、反応部位は、大気に対して密閉される。
いくつかの実施形態では、反応部位表面の少なくとも一つは、一つ以上の光波長に対して十分に透明である。
いくつかの実施形態では、少なくとも一つの反応部位表面が透明である一方、他の表面（例えば、一つ以上の壁等）が光に対して透明でなく、他の反応部位への１つの反応部位における光を通じたブリードを防止又は減少する。
【０１１２】
反応部位の数は、１０〜１０,０００,０００、１００〜１，０００，０００、１，０００〜１００，０００、又は５，０００〜５０，０００の範囲のいずれでもよく、約１０，０００−５０，０００が標準的な数である。
反応部位の容積は変動し得て、いくつかの実施形態では、１ａＬ〜１０ｍＬ、１００ｆＬ〜１ｍＬ、１０００ｐＬ〜１００マイクロリットル、１００ｐＬ〜１マイクロリットル、５０ｐＬ〜１ｎＬである。
いくつかの実施形態では、列の数が、１〜１，０００，０００であり得る（例えば、少なくとも、１、１０、５０、１００、５００、１０００、又は、より多くの列）。
いくつかの実施形態では、柱の数が、１〜１，０００，０００であり得る（例えば、少なくとも、１、１０、５０、１００、５００、１０００、又は、より多くの柱）。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、反応部位（及び／又は結合部位／チャンバー）からの流路は、異なる数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００又はそれ以上（先行するものよりも大きく規定された範囲、又は、先行する２つの間に規定された範囲を含む））一緒に同時に崩壊して、一緒に又は一緒の単一チャンバーになる。
いくつかの実施形態では、生成されたポリマーにおける特異性の程度がより大きくなるように、比較的少ない数のチャンバー、部位、又は、流路は、各々の結合位置で一緒に崩壊する。
このように、いくつかの実施形態では、わずか２本〜１０本の流路は、一緒に1つの結合チャンバーに崩壊する。
いくつかの実施形態では、５００本以下の流路は、1つのチャンバーで一緒に圧壊する。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、反応部位は、所望のビルディング断片の生成に適切な一組の試薬を含む。
いくつかの実施形態では、反応部位は、一つ以上の所望のビルディング断片の合成に適切な一組の試薬を含む。
いくつかの実施形態では、成分は、光生成試薬を含む。
いくつかの実施形態では、ＰＧＲは、ＰＧＲ酸、ＰＧＲ塩基、ＰＧＲ触媒（すなわち、フォトケージ触媒）、ＰＧＲ酵素（すなわち、フォトケージ酵素）、又は断片を生成するために用いられ得る他の光活性成分の一つ以上を含む。
いくつかの実施形態では、これは、本技術分野において公知のフォトケージ試薬を含む。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、図１Ａ-１Ｃにおいて表された黒丸は、任意である。
前記黒丸は、結合チャンバーであり、それらの機能が、いくつかの実施形態で、流路及びその組合せを介して達成される。
いくつかの実施形態では、図１Ａ-１Ｃにおける矩形が、任意の大きな流路（７０、７１、２７０）である。
より大きい流路（７０、７１、２７０、など）のないいくつかの実施形態において、結合部位は、それ自身、溶液が結合する領域に加算する容積を提供するために用いられ得る。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、反応部位は、容積が、１ａＬから１キロリットルの間である。
いくつかの実施例において、好適な範囲は、１００ｆＬ〜１００ｎＬの間である。
いくつかの実施形態では、１ｐＬ〜５０ｐＬが使用され得る。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、反応部位の数は、生成される所望のポリマーに基づいて変化し得る。
いくつかの実施形態では、少なくとも２つの反応部位がある。
いくつかの実施形態では、２〜１００００００の反応部位がある。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、最初のモノマーは、米国特許第６，４２６，１８４号明細書（本願明細書において完全に参照によって組み込まれて、「光生成試薬を使用している化学的反応及び生化学的反応のための方法と装置」と名付けられている）で概説される方法によって、反応部位の表面に付着させられる。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、反応部位は電極表面を有するか又は含む。そして、それによって、バイアスはＤＮＡを保持するか、又は、インデックス付きの反応部位からＤＮＡを取り外すために適用され得る。
【０１２０】
＜結合部位及び結合チャンバー＞
上述したように、結合部位は、２つ以上の所望のビルディング断片の結合を可能にするいかなる領域をも含む。
このように、これは、結合チャンバー自体（６０又は１６０）を含むことができ、それは、流れのさらなる乱流を可能にし、よってさらなる混合を可能にするか、又は、単に液体のより大きな容積を可能にし、よってサンプルのより多くの組合せが一緒に添加され得るか、又は、単に、２本以上の流路のための結合位置として役立つチャンバーとなり得る。
これは、一緒になる流路を含むことができ、これにより、さまざまな生成物（例えば、５０、５１、５２、７０、７１、２５１、２５０及び２５２）の組合せを可能にすることができる。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、加熱要素は、部位又はチャンバーと結合している。
いくつかの実施形態では、入口、又は、部位若しくはチャンバーからの出口は、弁を介して制御される。
いくつかの実施形態では、流入口ポート及び／又は放出口ポートは、結合部位及び／又はチャンバーの内に又は近接して提供される。
いくつかの実施形態では、結合部位の壁の音響、磁気、及び／又は、電気の分野の態様は、結合部位における溶液又はサンプルの加熱を制御するために用いられる。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、結合チャンバーの壁（及び／又は、反応部位、及び／又は、流路、及び／又は、貯蔵部位、など）が、例えば、以下を含むがこれに限らない、異なる材料からなる層でできている：シリコン系化合物（例えば、ＳｉＮ、ＳｉＣ、ドープされたＳｉ、など）、ガラス、ＰＭＭＡ、パリレン、エラストマ、ポリマー、又は金属基板。
いくつかの実施形態では、反応部位、流路、及び結合部位は、リン−ホウ素がドープされたシリコン（Ｐ＋Ｂｏｒｏｎ  ｄｏｐｅｄ  Ｓｉｌｉｃｏｎ）からなる。
いくつかの実施形態では、Ｓｉ層の結晶方位は、＜１００＞である。
いくつかの実施形態では、Ｓｉ層の結晶方位は、＜１００＞、＜１１０＞、＜１１１＞である。
いくつかの実施形態では、部位、チャンバー、流路及び結合部位は、７７４０のコーニングガラスからなる。
いくつかの実施形態では、壁の材料は、壁に対する生成物の意図しない貼付を予防するために、装置で使用される断片及び成分に関して、適切に不活性である。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、結合部位及び／又は結合チャンバーは、１ａＬ〜１キロリットル（例えば、２ｐＬ〜１０００ｐＬ）の間である。
いくつかの実施形態では、結合部位及び／又は結合チャンバーが、１００ｆＬ〜１μＬ間の容積で変動する。
いくつかの実施形態では、結合部位及び／又は結合チャンバーが、加熱要素又は加熱装置と結合し、前記加熱要素又は前記加熱装置は、０時間〜２４時間の期間にわたって、摂氏０度〜１２５度の間で、その中の溶液の温度を調整することができる。
いくつかの実施形態では、温度変化の程度及び温度変化の範囲が、例えば、２つ以上の所望のビルディング断片の特異的なハイブリダイゼーションを可能にして、所望の第１レベルのストランドを形成する。
いくつかの実施形態では、これは、ハイブリダイゼーションイベントの間に溶液温度の制御のために使用されるペルティエ装置又は他の分子生物学装置を介して、チップ全体の加熱及び／又は冷却により、達成され得る。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、結合部位及び／又は結合チャンバーの数が、生成される所望のポリマーに基づいて変化し得る。
いくつかの実施形態では、少なくとも２つの結合部位及び／又は結合チャンバーがある。
いくつかの実施形態では、２〜１００万の結合部位及び／又は結合チャンバーがある。
いくつかの実施形態では、２〜５００、５〜１００，０００、１０〜１０，０００又は１０〜１０００の結合部位及び／又は結合チャンバーが使用される。
【０１２５】
結合部位の数は連続的に関連し、即ち、液体は、１つの結合部位（例えば、第１レベル結合部位）、又は、チャンバーから、第２結合部位（例えば、第２レベル結合部位）内に流入し、そして、このように、結合のレベルは特定のチップ又はアプリケーションについて異なり得る。
いくつかの実施形態では、反応部位が１つの結合部位に結合されるように、少なくとも１つの結合レベルがある。
図１Ａにて図示されるように、第１レベル結合部位（１００−１０５）である多数の結合部位があり、そして、それは第２レベル結合部位２００（図１Ｂ）へ結合されて、そして、それは第３レベル結合部位３００へ結合されて、そして、それは、他の第３レベル結合部位によって、一緒に結合されて、貯蔵部位１００１に格納される。
いくつかの実施形態では、結合レベルの数が、少なくとも１から１００以上、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は、１００（前記値のいずれよりも大きい値として定められる範囲、又は、前記値の二つの間の定められる範囲を含む）となり得る。
いくつかの実施形態では、結合レベルの数が、１〜２０（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０）となり得る。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、各々の結合部位（及び／又はチャンバー）で起こる圧縮又は結合の程度は、少なくとも、２つの異なる反応部位及び／又は結合部位からの２本流路の組合せとなり得る。
いくつかの実施形態では、前記組合せは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は１００の組合せ、及び／又は、反応部位（前記値のいずれよりも大きい値として定められる範囲、又は、前記値の二つの間の定められる範囲を含む）のものである。
いくつかの実施形態では、前記組合せは、２〜１０の組合せ及び／又は反応部位である。
いくつかの実施形態では、前記組合せは、２〜１００の組合せ及び／又は反応部位である。
【０１２７】
＜貯蔵部位＞
いくつかの実施形態では、前記貯蔵部位１００１〜１００６の数が、変化し得る。
前記貯蔵部位の数は、制限される必要はなく、少なくとも１つとなり得る。
いくつかの実施形態では、少なくとも、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５の貯蔵部位（前記値のいずれよりも大きい値として定められる範囲、又は、前記値の二つの間の定められる範囲を含む）がある。
いくつかの実施形態では、２〜１００の貯蔵部位がある。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、前記貯蔵部位に対する流路の数が変化し得る。
このように、図１Ｂにおける実施形態では、６本の流路１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４及び１０１５が存在し、これらの流路は流路３１６に由来し、流路３１６は順に流路３１０、３１１、３１２、３１３、３１４及び３１５に由来するのに対して、いくつかの実施形態では、より多くの又はより少ない流路が存在する。
いくつかの実施形態では、流路は、長さ及びサイズが変化し得る。
いくつかの実施形態では、流路は、サイズが０．１ミクロン〜１０００ミクロンの間にある。
いくつかの実施形態では、流路が結合されるにつれて、チャンバー（及び流路）のサイズと、流れシステム下の距離との間の関係が、量保存を考慮する。
いくつかの実施形態では、流路は、総計で２〜１００の間にある。
【０１２９】
＜チップの作製＞
いくつかの実施形態では、一連のエッチング工程に続き反応部位、貯蔵部位、結合部位、流路、などを含む層の上のアクセスポートを有する光学的に透明なカバー層を封止するために接着することを通じて装置が製造される。いくつかの実施形態では、これらのエッチング工程は、通常、反応部位、流路、結合部位、及び、装置の内部構造へのいかなるアクセスポートものフォトリソグラフィ印刷を含むことができる。
いくつかの実施形態では、反応部位、貯蔵部位、流路、及び／又は、結合部位は、基板においてエッチングされ、そして、アクセスポートはもう一方においてエッチングされる。
いくつかの実施形態では、反応部位、流路、アクセスポート及び結合部位は、シリコン系化合物、ガラス、ＰＭＭＡ、パリレン、エラストマ、ポリマー又は金属基板にエッチングされる。
いくつかの実施形態では、反応部位、流路、アクセスポート及び結合部位、又はそれらの組合せは、結合されるべき層の反対側に形成される。
いくつかの実施形態では、これらの層は、以下を含む異なる材料からなるが、これらに限定されるものではない：シリコン系化合物（例えば、ＳｉＮ、ＳｉＣ、ドーピングしたＳｉ、など）、ガラス、ＰＭＭＡ、パリレン、エラストマ、ポリマー、又は金属基板。
いくつかの実施形態では、反応部位、流路、及び、結合部位は、リン−ホウ素がドープされたシリコン（Ｐ＋Ｂｏｒｏｎ  ｄｏｐｅｄ  Ｓｉｌｉｃｏｎ）からなる。
いくつかの実施形態では、Ｓｉ層の結晶方位は、＜１００＞である。
いくつかの実施形態では、Ｓｉ層の結晶方位は、＜１００＞、＜１１０＞、＜１１１＞である。
いくつかの実施形態では、反応部位、流路、及び結合部位は、７７４０コーニング・ガラスからなる。
いくつかの実施形態では、これらの特徴は、ミリング（ｍｉｌｌｉｎｇ）又は研磨（ｇｒｉｎｄｉｎｇ）のような精密な機械加工を通じて生成され得る。
いくつかの実施形態では、反応部位、結合部位、流路、結合部位、及びアクセスポートの印刷が、複数のフォトリソグラフィ工程によって達成され得る。
いくつかの実施形態では、第１のフォトリソグラフィ工程の後に、エッチング工程が続く。
いくつかの実施形態では、第１のフォトリソグラフィ工程の後に、エッチング工程が続き、第２のフォトリソグラフィ工程の後に、第２のエッチング工程などが続く。
他の実施形態では、犠牲材料は、特定の方向のエッチングを制限するか、又は、特定のチャネル縦横比若しくは深さを達成するために用いてもよい。
いくつかの実施形態では、アクセスポートは、湿式のエッチングを通じて生成される。
いくつかの実施形態では、流路は、ＤＲＩＥ工程によって生成される。
いくつかの実施形態では、反応部位は、ＲＩＥ工程によって生成される。
いくつかの実施形態では、エッチング工程は、以下の一つ以上を含む：反応性イオンエッチング（ＲＩＥ）、深反応性イオンエッチング（ＤＲＩＥ）、プラズマエッチング、化学溶媒による湿式エッチング、イオンミリング及び／又はツールベイストミリング（tool based milling）。
いくつかの実施形態では、接着工程は、以下の一つ以上を含む：接着剤、共有結合、非共有結合、疎水性結合、水素結合、プラズマ結合、熱結合、溶接、拡散結合、陽極結合、融着接合、及び／又は、共晶接合の生成である。
いくつかの実施形態では、最終的なチップは、多くの装置を含むより大きなウェーハからダイスカットされる。
しかしながら、従来技術において明らかなように、前記装置製造の詳細は、前記装置の意図された使用及び所望の性質に基づいて変化する。
【０１３０】
＜装置のための材料＞
いくつかの実施形態では、装置は、Ｓｉ基板、ガラス基板、ＰＭＭＡ等のポリマー系基板、金属基板、又は他の適切な基板材料においてエッチングされ、ガラス又は他の材料により封止されて、所望のビルディング断片を形成し、且つ、所望のビルディング断片を分離する適切な光波長の十分な透過を許容する。もちろん、このような性質は、露光されるであろう領域のために使用されることを要するのみである。
このように、いくつかの実施形態では、反応ウェルだけが構成されている。
いくつかの実施形態では、前記材料は、ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）（もちろん、全ての実施形態が、このことを要求するものでない）と適合性を有する。
他の材料が、種々の部位及びチャンバーに関して上で提供されており、それらが用いられ得る。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、封止層が、ｓｓＤＮＡの合成及び開裂のための光の通過を可能にするクォーツ、ホウケイ酸ガラス、ＰＭＭＡ、パリレン、又は他の材料からなり得る。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、前記チップは、面外で流体接続を有する（with out of plane fluidic connection）多数層からなる。
これらの層は、結合される、又は、独立して流体管と接続され得る。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、ＭＥＭＳマイクロ流体装置の製作（例えば、化学蒸着（ＣＶＤ）、ＰＶＤ（プラズマ蒸着）、電気化学的分子層エピタクシ（ＥＭＯＬＥ）、アンダーポテンシャル析出（ＵＰＤ）、分子線エピタクシ（ＭＢＥ）、原子層エピタクシ（ＡＬＥ）、有機金属（ｍｅｔａｌｌｏｏｒｇａｎｉｃ）分子線エピタクシ（ＭＯＭＢＥ）、有機金属化学蒸着（ＭＯＣＶＤ）、など）の本技術分野で既知の種々の堆積プロセスが、所望のポリマー断片の第１モノマーに適切な付着部位を有する反応部位の表面を覆うのに用いられる。
【０１３４】
＜流れ制御＞
いくつかの実施形態では、種々の流路及び部位間の流れが制御され得る。
いくつかの実施形態では、これは、１つの区域から他の区域までの液体の流れを妨げるか、減少させるか、又は、完全に遮断することができる１つ以上の弁を介して、達成され得る。
この種の弁の位置は、各々の部位の位置、流路の始まり、終わり又はいずれもの中間の位置をも含む。
弁が、液体流入口と同様に部位の中又は部位の外の流れを制御して、液体をシステムに加えることができる。
前記弁は、以下の群から選択されることができる：ソレノイド、ボール、隔膜、ピストン、針、磁気、ピンチ、熱膨張／収縮、メモリポリマー、逆止め弁、又は、動作のために必要な試薬及び圧力を扱うことができる他のいかなる弁装置。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、システムの全体にわたるサンプルの流れは、システムへの液体又はガスの流れを制御することによって制御され得る。これは、サンプルを種々のチャンバーを通じて押し込むことができるか、又は、運動速度を種々のチャンバーを通じて効果的に減少させることができる。
いくつかの実施形態では、システムへの流れは、液体又はガスを添加することによって調整され、他の実施形態では、システムへの流れは、システムに加えられた流れを除去する、又は、逆転させることによって調整される。
いくつかの実施形態では、前記流れは、システムから外への流れを制御することによって、制御され得る。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、流れは比較的一貫しており、断片移動の制御が、少なくとも反応部位レベルで、光学操作（生成された所望のビルディング断片の反応部位の表面からの分離又は脱離など）を介して、達成され得る。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、上記のオプションの一つ以上が結合される。
例えば、いくつかの実施形態では、反応部位１０及び２０が流路（５０−５２）に関してゲート又は弁で調節されずに、弁が、１つ以上の結合チャンバー、反応部位、及び１つ以上の貯蔵部位で、又は、それより前に存在し得る。
このように、いくつかの実施形態では、これは、種々の所望のビルディング断片（又は、第１レベル、第２レベル、第３のレベル、等の断片）の一緒の調整された追加を可能にし、いくつかを結合部位（閉じた弁）に入れることができ、そして、所望のビルディング断片の結合が結合部位で起こり、更なる所望のビルディング断片の更なる合成及び取り外しが反応部位の上流で起こり得る。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、米国特許出願公開第２００４／０１０１４４４号明細書に記載された流体制御システムは、本願明細書において全体が援用される。
いくつかの実施形態では、チップ又は装置が、ポンプをさらに有するか、又は、ポンプ及び／又は真空に接続されている。
【０１３９】
＜温度制御＞
いくつかの実施形態では、１つ以上の流路、反応部位、結合部位、貯蔵部位、精製領域、結合チャンバー、又はこれらの組合せが、摂氏０度〜１２５度まで装置の温度を制御することを許容する装置を含む、又は、結合する。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、前記温度制御は、公知技術のプログラム可能なサーモサイクラを通じて行われる。
サーモサイクラは、時間の関数として、摂氏０度〜１２５度のいかなる温度間でも循環するようにプログラムされてもよい。
特定温度＝ｆ（時間）方程式は、アニーリングプロセス及び連結プロセスにとって重要である温度グラフ（温度ランプ）を特定する。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、これは、装置又はチップの熱循環部材を介して達成される。
いくつかの実施形態では、チップ又は装置の一部分だけが加熱される。
いくつかの実施形態では、加熱は、１つ以上の反応部位、結合部位、及び／又は、結合チャンバー、及び／又は、流路、及び／又は、部位に対して選択的である。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、チップにおける溶液温度は、チップ自体の抵抗性層又は加熱要素によって制御される。
前記層又は前記加熱要素は、チップ全体内にある、又は、種々の部位及び／又はチャンバー、及び／又は流路と結合し得る。
いくつかの実施形態では、多くの加熱層又は加熱要素が提供され、独立して制御可能である。
いくつかの実施形態では、ｐ−ｎドープされたＳｉアレンジメント（arrangement）は、ペルティエ冷却−加熱装置において使用されるように、チップの一部として作製され得る。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、チップの材料は、１つの部位、流路、又はチャンバー内の溶液の温度を第２の部位、流路、又はチャンバー内の第２の溶液の温度から、隔離するのに役立つ。
いくつかの実施形態では、結合部位又はチャンバーを形成する材料、及び、隣接した部位又はチャンバーの間の距離が、逆に又は意図せずに近接した部位又はチャンバーを加熱することなく、加熱するのを許容する。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、前記チップ又は前記装置は、外側の熱源によって加熱される。
いくつかの実施形態では、前記チップは、外部熱源との対流又は直接接触によって加熱される。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、これは、光エネルギーをチャンバーに集中させることによって達成され得る。
いくつかの実施形態では、光エネルギーは、優れた熱伝送を促進するために選択される。
いくつかの実施形態では、前記光が、赤外線となり得て、１つ以上の加熱されるチャンバーまで、導光装置を介して、導かれ得る。
いくつかの実施形態では、前記光は、装置の外表面に差し込み、溶液に入る。
いくつかの実施形態では、前記光は、外表面を加熱して、よって間接的に溶液内部を加熱する。
いくつかの実施形態では、電磁放射は、１つ以上のチャンバー表面を加熱するチャンバー内の要素と相互に作用するために用いられる。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、本願明細書に記載された方法及び装置は、弁又は多層結合チップのような複雑な構成要素を必要とすることなく、単一層内のこの種の装置の単純な低コスト作製を可能にし、この種のチップの製造可能性及びコストに衝撃を与える。
いくつかの実施形態では、反応部位の結合部位へ及び次いで貯蔵部位への圧縮の組合せ（多数の貯蔵部位からの生成物の組合せが続く）なしに、第１レベルから出るチャネル数が、この種の装置を、必要な多数の個々にインデックス可能な弁及び／又はサイズのために製造不可能にする。
【０１４７】
以下の実施例は、例示する目的だけのために提供されて、いかなる形であれ、本発明の範囲を制限することを目的としない。
実際には、本発明の種々の変形例は、本願明細書において示され及び記載されたものに加えて、前述の説明から当業者にとって明らかになり、添付の請求の範囲の範囲内に含まれる。
【実施例】
【０１４８】
本実施例は、核酸合成のために、本願明細書において開示されたいくつかの実施形態をどのように使用するかを概説する。
【０１４９】
７７７６の反応部位を含むＤＮＡの合成装置が提供される。
このレイアウトの代表例は、図１Ａ及び１Ｂに示され得る。
図１Ａ及び１Ｂでは、流入口が示され、該流入口内では、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ｕ、又は、修飾核酸、又は、核酸類似体前駆体（個々のモノマー、ダイマー（例えば、Ａ−Ｇ）、トリマー（例えば、Ｔ−Ｇ−Ｇ）、テトラマー（例えばＴ−Ｃ−Ｕ−Ｇ）、ペンタマー、ヘキサマー、及び／又は、本願明細書に記載されている前駆体の全ての組合せ）が、合成手順要求としての緩衝液及びリガーゼと同様に、かん流され得る。
この流入口チャネルは、反応部位アレイの全ての柱を供給するために分裂する。
【０１５０】
前記流入口は、異なる反応体を加えることを可能にする切換弁を有する。
前記模式的なものにおいて、代表的なチップは、１０８本の列掛ける７２本の柱の合計７７７６の反応部位を有する。
あらゆる柱において、反応部位の１０８本の列は、一度に３６個に崩壊し、単一のチャネルとなった。図１Ａのみが低い４０を示す。
【０１５１】
核酸モノマーの結合が、スクリーン上のピクセルのようにアドレスされる個々の反応部位（図１Ａ及び１Ｂに示される）を許容する個々のアドレス指定可能なデジタル光処理（ＤＬＰ）投影技術を通じた光生成酸の使用により、達成される。
この工程によって、いかなる配列及び増加長の一本鎖ＤＮＡの一片もが得られる。
反応部位の壁からのｓｓＤＮＡの開裂は、ｓｓＤＮＡを反応部位の表面に固定している光分解可能な結合分子によって達成される。
合成において使用される光の波長は、開裂において使用される光の波長に干渉しない。
インデックス可能な光酸生成とそれに続くインデックス可能な光開裂との組合せは、オンチップ弁を使用することなくＤＮＡ合成が起こることを可能にする。
【０１５２】
緩衝液において懸濁されたリガーゼは、それから、一度に３６個に崩壊し、２１６の個別チャネルとなった７７７６の反応部位を通じて、かん流される。
これらのチャネルは、一度に６個結合し、ｓｓＤＮＡが二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）へアセンブルされるアセンブリチャンバーに結合される。
【０１５３】
一旦、十分な流体が、切断されたｓｓＤＮＡを置換するためにアセンブリチャンバーに加えられると、チップはＤＮＡ片を一緒にアニールするために温度サイクルを受ける。組合せの第１のレベルで、ｓｓＤＮＡの６片は、結合して、ｄｓＤＮＡの３本の線形ストランド又は増加長（即ち、３つのフォワードストランド及び３つのリバースストランド又は増加）を形成する。
次のアセンブリレベルは、次いで１８、１０８、６４８の線形増加長のｄｓＤＮＡ片を形成する連結のために、ｄｓＤＮＡ片を一緒にまとめる。
５０塩基長のｓｓＤＮＡ増加を仮定すると、ｄｓＤＮＡが６４８のＤＮＡ線形増加の長さに達した後、ｄｓＤＮＡの長さは、約３２，４００塩基対長となる。
ｄｓＤＮＡの長さは、１０ｋｂｐ〜５０ｋｂｐの範囲の大部分のウィルス・ゲノムと類似する。
【０１５４】
ＤＮＡ内容物が結合された後、それらは貯蔵部位の６本のチャネルのうちの１本に格納される。チップのこの領域は、先の結合部位上の温度サイクルから隔離されて、貯蔵空間のうちの少なくとも２つが満たされるまで３１０Ｋ未満で維持される。
前記ＤＮＡ片は、オフチップバルブシステムを通じて、これらの一時置きの空間に追い込まれる。
ＤＮＡ貯蔵部位のポートを制御している弁を開くことによって、Ｐ２〜Ｐ６を制御するポート及び放出口が閉じている間、流体が開ポートを通じてかん流されてＤＮＡをＰ１（貯蔵部位１）に押し込むことができる。
次のアセンブリランのために、Ｐ１が閉じられ、放出口が開かれ、前記プロセスがこのパスで繰り返されるが、ＤＮＡが結合された後、代わりに、Ｐ１、Ｐ３〜Ｐ６及び出口が閉じている間Ｐ２が開かれる。
一旦、全ての貯蔵部位が満たされると、緩衝液は、Ｐ１〜Ｐ６上のポートを通じてかん流され、リガーゼは、ポートを通じて一時置きの空間の上流に直接添加されて、連結される最終的な結合部位／チャンバーへＰ１〜Ｐ６の内容物を押し込む。
この結果は、５０塩基長のｓｓＤＮＡ増加を仮定すると、１９４ｋｂｐのｄｓＤＮＡアセンブリである。
これは、チップ合成上の最小のゲノムオペレーティングシステムのサイズである。
【０１５５】
本出願の全体にわたって、種々の刊行物は、括弧の範囲内で参照された。
これらの刊行物の開示は、全体に亘って、本発明が属する技術の状態を記載するために、本出願において全体として本願明細書に援用されるものとする。
【０１５６】
本発明が開示された実施形態を参照して記載されていたにもかかわらず、当業者は詳述される特定の実験が本発明を例示するだけであると直ちに認める。
本発明の精神から逸脱することなく、種々の改良がなされることができると理解されなければならない。
従って、本発明は、以下の請求項のみによって制限される。
【０１５７】
＜均等物＞
前述の記載及び実施例は、本発明の特定実施形態を詳述し、発明者によって考察された最良の形態を記載する。
しかしながら、前述が本文においてどの程度詳細であるかにかかわらず、本発明は多くの方法で実施されてもよい。そして、本発明は添付の請求の範囲及びそれのいかなる均等物に従って解釈されるべきである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【国際調査報告】
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