【手続補正書】
【提出日】平成21年9月1日(2009.9.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式(Ｉ)の化合物またはそのカルボン酸バイオアイソスター(bioisostere)：
【化１】
2009514935.tif 000001
〔式中：
ＶはＣＲ１Ｒ２、ＣＲ１Ｒ２−ＣＲ１Ｒ２であるか、またはＶはＳ(Ｏ)ｎＣＲ１Ｒ２(ここで、ｎは０、１または２である)、ＮＲ１１ＣＲ１Ｒ２、ＣＣＲ１Ｒ２、ＣＲ１Ｒ２ＣまたはＣＲ１ＣＲ２であり；
Ｒ１およびＲ２は、独立して、水素原子、ハロゲン、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、Ｃ３−Ｃ７シクロアルキルまたはＣ１−６アルキル基であり、後４者の基は、所望によりハロゲン、Ｃ３−Ｃ７シクロアルキル、ＮＲ９Ｒ１０、ＯＲ８、Ｓ(Ｏ)ｎＲ７(ここで、ｎは０、１または２である)から独立して選択される１個以上の置換基で置換されているか；
または
Ｒ１およびＲ２は、一緒になって、Ｏ、Ｓ、ＮＲ１１から選択される１個以上の原子を所望により含む３−８員環を形成でき、そしてそれ自体、所望により１個以上のＣ１−Ｃ３アルキルまたはハロゲンで置換されており；
Ｗは、水素、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ＳＯ２Ｒ７、ＳＯ２ＮＲ９Ｒ１０、ＯＲ８、またはＣ１−６アルキルであり、後者は、所望によりハロゲン、ＯＲ８およびＮＲ７Ｒ８、Ｓ(Ｏ)ｎＲ５(ここで、ｎは０、１または２である)から独立して選択される１個以上の置換基で置換されており；
Ｒ３は、水素、ハロゲン、ＣＮ、ニトロ、ＳＯ２Ｒ７、ＯＲ８、ＳＲ７、ＳＯＲ７、ＳＯ２ＮＲ９Ｒ１０、ＣＯＮＲ９Ｒ１０、ＮＲ９Ｒ１０、ＮＲ１１ＳＯ２Ｒ７、ＮＲ１１ＣＯ２Ｒ７、ＮＲ１１ＣＯＲ７またはＣ１−６アルキルから独立して選択される１個以上の置換基であり、後者は、所望によりハロゲン、ＯＲ８およびＮＲ９Ｒ１０、Ｓ(Ｏ)ｎＲ７(ここで、ｎは０、１または２である)から独立して選択される１個以上の置換基で置換されており；
Ｘは、結合、またはＣ１−Ｃ６アルキル（所望により、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ６アルキルから独立して選択される１個以上の置換基で置換されており、後者は、所望によりハロゲン、ＯＲ６およびＮＲ７Ｒ８、Ｓ(Ｏ)ｎＲ５(ここで、ｎは０、１または２である)から独立して選択される１個以上の置換基で置換されている)であり；
Ｙは、以下のタイプのジアミンであり：−
【化２】
2009514935.tif 000002
Ｒ４およびＲ５は、独立して、水素、ＳＯ２Ｒ７、Ｃ(Ｏ)Ｒ７、ＣＯ２Ｒ７およびＣ１−Ｃ６アルキルであり、後者は、所望により、アリール、ヘテロアリール、ハロゲン、ＯＲ８およびＮＲ９Ｒ１０、Ｓ(Ｏ)ｎＲ７(ここで、ｎは０、１または２である)から独立して選択される１個以上の置換基で置換されており；
Ｒ４およびＲ５は、一緒になって、またはＲ４とＲ５の一方がＰまたはＱに結合して、１個または２個の環内窒素原子を有する飽和ヘテロ環式３−１０員環を形成し；
ＰおよびＱは、所望により、独立して、(＝Ｏ)、ハロゲン、ＯＲ８およびＮＲ９Ｒ１０、Ｓ(Ｏ)ｎＲ７(ここで、ｎは０、１または２である)、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル、アリールまたはヘテロアリール(後２者は、所望によりハロゲン、ＯＲ８およびＮＲ９Ｒ１０、ＣＯＮＲ９Ｒ１０、Ｓ(Ｏ)ｎＲ７(ここで、ｎは０、１または２である)から独立して選択される１個以上の置換基で置換されている)から選択される１個以上の置換基で置換されているＣ１−Ｃ６アルキルであり；
Ｚは、結合、(ＣＲ１２)ｎ−Ｃ(Ｏ)、(ＣＲ１２)ｎ−Ｓ(Ｏ)ｎ、Ｃ(Ｏ)(ＣＲ１２)ｎ、またはＳ(Ｏ)２(ＣＲ１２)ｎ、Ｓ(Ｏ)２Ｎ(ＣＲ１２)ｎ（ここで、ｎ＝０、１または２である）であり；
ＨＥＴは、アリールまたはヘテロアリールであり；
Ｒ６は、水素、ハロゲン、ＣＮ、ニトロ、ＣＯＲ７、ＣＯ２Ｒ８、ＳＯ２Ｒ７、ＯＲ８、ＳＲ８、ＳＯＲ７、ＳＯ２ＮＲ９Ｒ１０、ＣＯＮＲ９Ｒ１０、ＮＲ９Ｒ１０、ＮＲ８ＳＯ２Ｒ７、ＮＲ８ＣＯ２Ｒ８、ＮＲ８ＣＯＲ７、ＮＲ８ＣＯＮＲ９Ｒ１０、ＮＲ８ＳＯ２ＮＲ９Ｒ１０、アリール、ヘテロアリール、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、Ｃ３−Ｃ７シクロアルキルまたはＣ１−６アルキルから独立して選択される１個以上の置換基であり、後４者の基は、所望によりハロゲン、Ｃ３−Ｃ７シクロアルキル、ＣＮ、ＯＲ８、ＮＲ９Ｒ１０、Ｓ(Ｏ)ｎＲ７(ここで、ｎは０、１または２である)、ＣＯＮＲ９Ｒ１０、ＮＲ８ＣＯＲ７、ＳＯ２ＮＲ９Ｒ１０およびＮＲ８ＳＯ２Ｒ７から独立して選択される１個以上の置換基で置換されており；
Ｒ７は、Ｃ１−Ｃ６アルキル、アリールまたはヘテロアリール基であり、これら全て、所望によりハロゲン原子、ＯＲ８、ＮＲ１４Ｒ１５で置換されていてよく；
Ｒ８は水素、Ｃ１−Ｃ６、アルキル、アリールまたはヘテロアリール基であり、これら全て、所望によりハロゲン原子、ＯＲ８、ＮＲ１４Ｒ１５で置換されていてよく；
Ｒ９およびＲ１０は、独立して、水素、Ｃ３−Ｃ７シクロアルキルまたはＣ１−６アルキルであり、後２者の基は、所望によりハロゲン、Ｃ３−Ｃ７シクロアルキル、ＯＲ６およびＮＲ１４Ｒ１５、Ｓ(Ｏ)ｎＲ６(ここで、ｎ＝０、１または２である)、ＣＯＮＲ７Ｒ８、ＮＲ６ＣＯＲ７、ＳＯ２ＮＲ７Ｒ８およびＮＲ６ＳＯ２Ｒ５から独立して選択される１個以上の置換基で置換されているか；
または
Ｒ９およびＲ１０は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、所望によりＯ、Ｓ(Ｏ)ｎ(ここで、ｎ＝０、１または２である)、ＮＲ１３から選択される１個以上の原子を含む３−８員飽和ヘテロ環式環であり、それ自体、所望によりハロゲンまたはＣ１−３アルキルで置換されており；
Ｒ１１は、水素原子、Ｃ(Ｏ)Ｒ９、Ｃ１−Ｃ６アルキルアリールまたはヘテロアリール基(後３者は、所望によりハロゲンで置換されていてよい)であり；
Ｒ１２は、水素、またはＣ１−６アルキル基からの１個以上であり、後者は、所望によりハロゲン、Ｃ３−Ｃ７シクロアルキル、ＮＲ１４Ｒ１５、ＯＲ８、Ｓ(Ｏ)ｎＲ７(ここで、ｎは０、１または２である)から独立して選択される１個以上の置換基で置換されており；
Ｒ１３は、水素、Ｃ１−４アルキル、−ＣＯＣ１−Ｃ４アルキル、ＣＯＹＣ１−Ｃ４アルキル（ここで、ＹはＯまたはＮＲ７である）であり；そして
Ｒ１４およびＲ１５は、独立して、水素、Ｃ１−４アルキルであるか、
または
Ｒ１４およびＲ１５は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、所望によりＯ、Ｓ(Ｏ)ｎ(ここで、ｎ＝０、１または２である)、ＮＲ１３から選択される１個以上の原子を含む３−８員飽和ヘテロ環式環を形成でき、それ自体、所望によりハロゲンまたはＣ１−３アルキルで置換されている。〕
およびそれらの薬学的に許容される塩。
【請求項２】
ＶがＣＲ１Ｒ２、ＣＲ１Ｒ２−ＣＲ１Ｒ２、ＣＣＲ１Ｒ２またはＣＲ１Ｒ２Ｃである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｗが水素、ハロゲンまたはＣＦ３である、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ１およびＲ２が水素である、請求項１から３のいずれかに記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ３が水素である、請求項１から４のいずれかに記載の化合物。
【請求項６】
ＸがＣＨ２である、請求項１から５のいずれかに記載の化合物。
【請求項７】
基ＺがＳＯ２、ＳＯ２ＣＨ２、Ｃ(Ｏ)ＣＨ２である、請求項１から６のいずれかに記載の化合物。
【請求項８】
基Ｙが、それが結合している２個の窒素原子と一緒になって、所望によりＣ１−４アルキルで置換されている４−７員飽和環を形成する、請求項１から７のいずれかに記載の化合物。
【請求項９】
カルボン酸バイオアイソスターが、式(XI)から(XV)：
【化３】
2009514935.tif 000003
の基である、請求項１から８のいずれかに記載の化合物。
【請求項１０】
３−(２−{[４−(ベンジルスルホニル)ピペラジン−１−イル]メチル}−４−クロロフェニル)プロパン酸ナトリウム；
３−(２−{[(３Ｓ)−４−(ベンジルスルホニル)−３−メチルピペラジン−１−イル]メチル}−４−クロロフェニル)プロパン酸；
３−(４−クロロ−２−{[(３Ｓ)−３−メチル−４−(フェニルスルホニル)ピペラジン−１−イル]メチル}フェニル)プロパン酸ナトリウム；
３−(４−クロロ−２−{[(３Ｓ)−３−メチル−４−(フェニルアセチル)ピペラジン−１−イル]メチル}フェニル)プロパン酸；
３−[４−クロロ−２−({(３Ｓ)−３−メチル−４−[(４−メチルベンジル)スルホニル]ピペラジン−１−イル}メチル)フェニル]プロパン酸；
３−[４−クロロ−２−({(３Ｓ)−３−メチル−４−[(３−メチルベンジル)スルホニル]ピペラジン−１−イル}メチル)フェニル]プロパン酸；
３−[４−クロロ−２−({(３Ｓ)−３−メチル−４−[(２−メチルベンジル)スルホニル]ピペラジン−１−イル}メチル)フェニル]プロパン酸；
(２−{[(３Ｓ)−３−メチル−４−(フェニルスルホニル)ピペラジン−１−イル]メチル}フェニル)酢酸；
(４−クロロ−２−{[(３Ｓ)−３−メチル−４−(フェニルスルホニル)ピペラジン−１−イル]メチル}フェニル)酢酸；
{４−クロロ−２−[((３Ｓ)−３−メチル−４−{[４−(トリフルオロメチル)フェニル]アセチル}ピペラジン−１−イル)メチル]フェニル}酢酸；
[４−クロロ−２−({(３Ｓ)−４−[(４−メトキシフェニル)アセチル]−３−メチルピペラジン−１−イル}メチル)フェニル]酢酸；
[４−クロロ−２−({(３Ｓ)−４−[(２,４−ジフルオロフェニル)アセチル]−３−メチルピペラジン−１−イル}メチル)フェニル]酢酸；
[４−クロロ−２−({(３Ｓ)−４−[(３,４−ジフルオロフェニル)アセチル]−３−メチルピペラジン−１−イル}メチル)フェニル]酢酸；
(２−{[(３Ｓ)−４−(ベンジルスルホニル)−３−メチルピペラジン−１−イル]メチル}−４−クロロフェニル)酢酸；
[４−クロロ−２−({(３Ｓ)−４−[(４−クロロフェニル)アセチル]−３−メチルピペラジン−１−イル}メチル)フェニル]酢酸；
(４−クロロ−２−{[(３Ｓ)−３−メチル−４−(フェニルアセチル)ピペラジン−１−イル]メチル}フェニル)酢酸；
[４−クロロ−２−({(３Ｓ)−４−[(４−フルオロフェニル)アセチル]−３−メチルピペラジン−１−イル}メチル)フェニル]酢酸；
[４−クロロ−２−({(３Ｓ)−３−エチル−４−[(４−フルオロフェニル)アセチル]ピペラジン−１−イル}メチル)フェニル]酢酸；
[４−クロロ−２−({(３Ｓ)−４−[(４−クロロフェニル)アセチル]−３−エチルピペラジン−１−イル}メチル)フェニル]酢酸；
２−(２−{[(３Ｓ)−４−(ベンジルスルホニル)−３−メチルピペラジン−１−イル]メチル}−４−クロロフェニル)−Ｎ−(メチルスルホニル)アセトアミド
およびそれらの薬学的に許容される塩
から選択される、請求項１から５のいずれかに記載の化合物。
【請求項１１】
治療に使用するための、請求項１から１０のいずれかに記載の式(Ｉ)の化合物。
【請求項１２】
プロスタグランジン類が仲介する疾患の処置方法であって、患者に治療的有効量の請求項１から１０のいずれかに記載の式(Ｉ)の化合物、または薬学的に許容される塩を投与することを含む、方法。
【請求項１３】
プロスタグランジンＤ２が仲介する疾患の処置方法であって、患者に治療的有効量の請求項１から１０のいずれかに記載の式(Ｉ)の化合物、または薬学的に許容される塩を投与することを含む、方法。
【請求項１４】
喘息および鼻炎のような呼吸器疾患を有するまたは危険性のある患者における、該疾患の処置方法であって、該患者に、治療的有効量の請求項１から１０のいずれかに記載の式(Ｉ)の化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を投与することを含む、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
Ｒ７は、Ｃ１−Ｃ６アルキル、アリールまたはヘテロアリール基であり、これら全て、所望によりハロゲン原子、ＯＲ８、ＮＲ１４Ｒ１５で置換されていてよく；
Ｒ８は、水素、Ｃ１−Ｃ６、アルキル、アリールまたはヘテロアリール基であり、これら全て、所望によりハロゲン原子、ＯＲ８、ＮＲ１４Ｒ１５で置換されていてよく；
Ｒ９およびＲ１０は、独立して、水素、Ｃ３−Ｃ７シクロアルキルまたはＣ１−６アルキルであり、後２者の基は、所望によりハロゲン、Ｃ３−Ｃ７シクロアルキル、ＯＲ６およびＮＲ１４Ｒ１５、Ｓ(Ｏ)ｎＲ６(ここで、ｎ＝０、１または２である)、ＣＯＮＲ７Ｒ８、ＮＲ６ＣＯＲ７,ＳＯ２ＮＲ７Ｒ８およびＮＲ６ＳＯ２Ｒ５から独立して選択される１個以上の置換基で置換されているか；
または
Ｒ９およびＲ１０は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、所望によりＯ、Ｓ(Ｏ)ｎ(ここで、ｎ＝０、１または２である)、ＮＲ１３から選択される１個以上の原子を含む３−８員飽和ヘテロ環式環であり、それ自体、所望によりハロゲンまたはＣ１−３アルキルで置換されており；
Ｒ１１は、水素原子、Ｃ(Ｏ)Ｒ９、Ｃ１−Ｃ６アルキルアリールまたはヘテロアリール基(後３者は、所望によりハロゲンで置換されていてよい)であり；
Ｒ１２は、水素、またはＣ１−６アルキル基からの１個以上であり、後者は、所望によりハロゲン、Ｃ３−Ｃ７シクロアルキル、ＮＲ１４Ｒ１５、ＯＲ８、Ｓ(Ｏ)ｎＲ７(ここで、ｎは０、１または２である)から独立して選択される１個以上の置換基で置換されており；
Ｒ１３は、水素、Ｃ１−４アルキル、−ＣＯＣ１−Ｃ４アルキル、ＣＯＹＣ１−Ｃ４アルキル（ここで、ＹはＯまたはＮＲ７である）であり；そして
Ｒ１４およびＲ１５は、独立して、水素、Ｃ１−４アルキルであるか、
または
Ｒ１４およびＲ１５は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、所望によりＯ、Ｓ(Ｏ)ｎ(ここで、ｎ＝０、１または２である)、ＮＲ１３から選択される１個以上の原子を含む３−８員飽和ヘテロ環式環を形成でき、それ自体、所望によりハロゲンまたはＣ１−３アルキルで置換されている。〕
およびそれらの薬学的に許容される塩に関する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
式(II)の化合物は、式(III)の化合物から、スキーム１に記載の通り製造する。
【化５】
2009514935.tif 000004
スキーム１
〔式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ１５、Ｐ、Ｑ、Ｗ、Ｘ、ＹおよびＺは式(II)の化合物において定義の通りであるか、またはそれらの保護された誘導体である。〕
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
式(VIｂ)の化合物はスキーム２に概説の通り形成できる：
【化９】
2009514935.tif 000005
スキーム２
〔式中、Ｒ４、Ｒ５、Ｐ、Ｑ、およびＰ２は先に式(Ｉ)の化合物について定義の通りであるか、またはそれらの保護された誘導体である。〕。Ｐ２は式(VIｂ)の化合物について定義の通りである。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
式(VI)の化合物のアミノ基は、式(IV)の化合物との反応前に保護する必要があるかもしれない。適当な保護基は、先に記載の方法を使用して容易に除去できるＢＯＣ、トリチルまたはベンジルである。いくつかの保護された式(VI)の化合物は、市販されている。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８５】
本発明の化合物はまた、骨関節症の既に存在する治療剤と組み合わせても使用できる。組み合わせる適当な薬剤は、標準非ステロイド性抗炎症剤(以後ＮＳＡＩＤ)、例えばピロキシカム、ジクロフェナク、プロピオン酸、例えばナプロキセン、フルルビプロフェン(フルルビプロフェン)、フェノプロフェン、ケトプロフェンおよびイブプロフェン、フェナメート、例えばメフェナム酸、インドメタシン、スリンダク、アパゾン、ピラゾロン、例えばフェニルブタゾン、サリチレート、例えばアスピリン、ＣＯＸ−２阻害剤、例えばセレコキシブ、バルデコキシブ、ロフェコキシブおよびエトリコキシブ、鎮痛剤、および関節内治療、例えばコルチコステロイドおよびヒアルロン酸誘導体、および栄養補助食品、例えばグルコサミンを含む。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２３】
(iii)(２Ｓ)−２−メチル−１−ピペラジンカルボン酸−１,１−ジメチルエチルエステル
２Ｍ  ＨＣｌ(５０ml)を、パートｂ)の生成物(３４ｇ)のエタノール(１５００ml)溶液に滴下し、反応を１.５時間撹拌した。固体ＮａＨＣＯ３(８.４ｇ)を添加し、１時間撹拌し、次いで減圧下濃縮した。残渣をクロマトグラフィー(シリカ、溶離剤として５−１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ)で精製して副産物を除き、次いで１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭで溶出して、副題化合物を得た、収量１６.５ｇ。
1H NMR(CDCl3)δ4.51(1H, t), 4.07(1H, d), 3.46-3.33(2H, m), 3.21(1H, d), 3.09(1H, dd), 2.88(1H, td)および1.49-1.43(12H, m)。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４２】
(ii)[４−クロロ−２−(ヒドロキシメチル)フェニル]酢酸メチル
ボラン(１.７ml、ＴＨＦ中１Ｍ溶液)を、工程(ｉ)の生成物(３９８mg)のＴＨＦ(５ml)溶液に−０℃で滴下し、次いで２時間にわたりＲＴに到達させた。反応混合物を水でクエンチし、ｐＨ３まで酸性化し、ＥｔＯＡｃ(×３)で抽出した。合わせた有機抽出物を乾燥させ(Ｎａ２ＳＯ４)、次いで減圧下濃縮した。残渣をシリカクロマトグラフィーで精製し(溶離剤ＥｔＯＡｃ)、副題化合物を黄色油状物として得た、収量３３５mg
1H NMR CDCl3:δ7.43(1H, d), 7.25(1H, dd), 7.17(1H, d), 4.65(2H, s), 3.72(2H, s), 3.71(3H, s)。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４３】
(iii)(２Ｓ)−４−[５−クロロ−２−(２−メトキシ−２−オキソエチル)ベンジル]−２−メチルピペラジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル
メタンスルホニルクロライド(１.８１ml)を、工程(ii)の生成物(２.８５ｇ)、トリエチルアミン(３.７２ml)のＤＣＭ(１５ml)溶液に０℃で添加した。反応を１時間、ＲＴで撹拌して、次いで希釈した。有機相を水で洗浄し、乾燥させ(Ｎａ２ＳＯ４)、次いで減圧下濃縮した。残渣をシリカクロマトグラフィー(溶離剤１：１  エーテル／イソヘキサン)で精製し、メシレートを黄色油状物として得た。このメシレートをＤＭＦ(７ml)溶解し、Ｋ２ＣＯ３(０.９４ｇ)、次いで実施例５  工程(iii)の生成物(１.３７ｇ)を加え、７５℃で４時間加熱した。反応混合物をＲＴに冷却し、ＥｔＯＡｃおよび水に分配した。有機層を水で洗浄し、乾燥させ(Ｎａ２ＳＯ４)、次いで減圧下濃縮した。残渣をシリカクロマトグラフィー(溶離剤３：７、次いで１：１  エーテル／イソヘキサン)で精製し、副題化合物を黄色油状物として得た、収量１.５１ｇ。
1H NMR DMSO-D6:δ7.37(1H, d), 7.33(1H, dd), 7.27(1H, d), 4.09(1H, m), 3.87(1.4H, s), 3.67(1H, d), 3.62(3H, s), 3.45(1H, d), 3.35(1H, d), 3.33(0.6H, s), 2.89(1H, dt), 2.58(2H, m), 2.08(1H, dd), 1.87(1H, dt), 1.40(9H, s), 1.12(3H, d)。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６７】
薬理学的データ
リガンド結合アッセイ
[３Ｈ]ＰＧＤ２をPerkin Elmer Life Sciencesから、１００−２１０Ci／mmolの特異的活性で購入した。全ての他の化学物質は分析グレードであった。
ｒｈＣＲＴｈ２／Ｇα１６を発現するＨＥＫ細胞を、１０％ウシ胎児血清(HyClone)、１mg／mlジェネテシン、２mM  Ｌ−グルタミンおよび１％非必須アミノ酸含有ＤＭＥＭで慣用的に維持した。膜調製のために、接着したトランスフェクトＨＥＫ細胞を、二層組織培養ファクトリーでコンフルエンスに増殖させた(Fisher, catalogue number TKT-170-070E)。受容体発現の最大レベルを、５００mM  酪酸ナトリウムを培養の最後１８時間に添加することにより誘発した。接着性細胞を１回リン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ、５０ml／細胞ファクトリー)で洗浄し、５０ml／細胞ファクトリーの氷冷膜ホモゲニゼーション緩衝液[２０mM  ＨＥＰＥＳ(ｐＨ７.４)、０.１mM  ジチオスレイトール、１mM  ＥＤＴＡ、０.１mM  フェニルメチルスルホニルフルオリドおよび１００mｇ／ml  バシトラシン]により剥がした。細胞を２２０ｘｇで１０分、４℃で遠心することによりペレット化し、元の半量の新鮮な膜ホモゲニゼーション緩衝液を使用して再懸濁し、Polytronホモゲナイザーを２×２０秒バーストを使用して、破壊し、チューブをこの全時間氷上に維持した。非破壊細胞を２２０ｘｇで１０分、４℃の遠心により除去し、膜フラクションを９００００ｘｇで３０分、４℃での遠心によりペレット化した。最終ペレットを４mlの膜ホモゲニゼーション緩衝液／使用細胞ファクトリーに再懸濁し、およびタンパク質含量を決定した。膜を−８０℃で適当なアリコートで貯蔵した。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６８】
全アッセイをCorning透明底、白色９６ウェルＮＢＳプレート(Fisher)で行った。アッセイ前に、ＣＲＴｈ２含有ＨＥＫ細胞膜をＳＰＡ  ＰＶＴ  ＷＧＡビーズ(Amersham)上にコーティングした。コーティングのために、膜をビーズと典型的に２５μg膜タンパク質／mgビーズで、４℃で、一晩一定に撹拌しながらインキュベートした。(最適コーティング濃度を各膜のバッチについて決定した)ビーズを遠心(８００ｘｇで７分、４℃)によりパレット化し、１回アッセイ緩衝液(５mM  塩化マグネシウム含有５０mM  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７.４)で洗浄し、最後に１０mg／mlビーズ濃度でアッセイ緩衝液に再懸濁した。