(57)【要約】ナノトランスデューサーを標的部位で局在化させる工程と、超音波によるナノトランスデューサーの外部刺激により同部位で電気刺激を誘発する工程とを含む、電気刺激によるｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞刺激処置に使用される圧電性ナノトランスデューサー。【選択図】なし
2012523452.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
前記ナノトランスデューサーを標的部位に局在させる工程と、
超音波によるナノトランスデューサーの外部刺激によって同部位で電気刺激を誘発する工程と、
を含む、電気刺激によるｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞刺激処置に使用するための圧電性ナノトランスデューサー。
【請求項２】
前記ナノトランスデューサーが、薬学的に許容可能なポリマーでコーティングすることによって生体適合性となる、請求項１に記載の圧電性ナノトランスデューサー。
【請求項３】
前記ナノトランスデューサーが、前記標的部位に対して親和性を有する特定のリガンドおよび／またはその追尾を可能とするマーカー分子で官能化される、請求項１または２に記載の圧電性ナノトランスデューサー。
【請求項４】
前記圧電性ナノトランスデューサーが、窒化ホウ素ナノチューブである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の圧電性ナノトランスデューサー。
【請求項５】
前記ナノトランスデューサーが、安定した懸濁液に非凝集形態で分散される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の圧電性ナノトランスデューサー。
【請求項６】
前記処置が、組織の再生または再構成処置または疼痛処置もしくは損傷した組織の治癒処置である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の圧電性ナノトランスデューサー。
【請求項７】
前記ナノトランスデューサーの局在化が、細胞の内在化により起こる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の圧電性ナノトランスデューサー。
【請求項８】
前記標的部位には、筋細胞、筋芽細胞、神経細胞、心筋細胞、骨芽細胞、破骨細胞、幹細胞、感覚細胞、例えば、内耳有毛細胞、網膜の桿細胞および錐細胞、味細胞、触覚細胞および嗅細胞が含まれる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の圧電性ナノトランスデューサー。
【請求項９】
電気療法の処置で使用するための超音波リモートフィールドによって刺激することが可能な圧電性ナノチューブおよび薬学的に許容可能な賦形剤を含む、医薬製剤。
【請求項１０】
非凝集形態で分散された前記ナノチューブおよび分散剤としての生体適合性ポリマーを含む、液体形態の請求項９に記載の医薬製剤。
【請求項１１】
無害な気体を含む脂質またはリン脂質微小気泡中にカプセル化した前記圧電性ナノチューブを含む、請求項９または１０に記載の医薬製剤。
【請求項１２】
前記ナノチューブが、薬学的に許容可能なポリマーでコーティングすることによって生体適合性となり、および／または、標的部位に対して親和性を有する特定のリガンドおよび／またはその追尾を可能とするマーカー分子で官能化される、請求項９または１１に記載の医薬製剤。
【請求項１３】
前記ナノチューブが、窒化ホウ素ナノチューブである、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項１４】
超音波による外部刺激の結果として電気刺激を発生することが可能な圧電性ナノトランスデューサーを含む、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞成長または組織工学用の高分子またはセラミック支持体（足場）。
【請求項１５】
前記ナノトランスデューサーが、薬学的に許容可能なポリマーでコーティングすることによって生体適合性となり、および／または、特定のリガンドおよび／またはその追尾を可能とするマーカー分子で官能化される、請求項１４に記載の支持体。
【請求項１６】
前記圧電性トランスデューサが、窒化ホウ素ナノチューブである、請求項１４または１５に記載の支持体。
【請求項１７】
請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の支持体を調製する方法であって、
前記圧電性ナノトランスデューサーを前記ポリマーまたはそのモノマーを含む溶液または分散液またはエマルジョンに分散させる工程と、
前記液体培地を取り除いて、前記ナノトランスデューサーを含む固体または半固体マトリックスを得る工程と
を含む、方法。
【請求項１８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの電気刺激による細胞刺激の方法であって、
圧電性ナノトランスデューサーを培地または細胞成長支持体に分散させる工程と、
前記細胞を前記培地または成長支持体中でインキュベートする工程と、
前記培地または成長支持体の外部の超音波場によるナノトランスデューサーの刺激により電気刺激を誘発する工程と
を含む、方法。
【請求項１９】
前記成長支持体が、組織工学用の高分子またはセラミック足場、インプラント、または接着基体である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ナノトランスデューサーが、薬学的に許容可能なポリマーでコーティングすることによって生体適合性となり、および／または、標的部位に対して親和性を有する特定のリガンドおよび／またはその追尾を可能とするマーカー分子で官能化される、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ナノトランスデューサーが、窒化ホウ素ナノチューブである、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、圧電性ナノ運搬体を使用することにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で非侵襲性の電気細胞刺激を誘発する方法に関する。特に、これは、特定の非侵襲性外部刺激（超音波）を電気入力に変換して細胞を刺激することが可能な窒化ホウ素ナノチューブ（ＢＮＮＴ）である。
【背景技術】
【０００２】
電気療法
電気細胞刺激により、脳深部刺激（deep brain stimulation）、胃不全麻痺後の胃の刺激、心臓刺激、筋刺激などの生物医学分野での数多くの用途が見出されている。特に、神経障害において、電気脳刺激は、しばしば唯一の治療形態である。適当な電気刺激により、特定物質の増殖、代謝、または産生に関して培養細胞中でポシティブな応答が誘発されることが長い間実証されている。Ｓｕｐｒｏｎｏｗｉｃｚおよび共同作業者は、カーボンナノチューブ存在下での電気刺激により、電流インパルスによって刺激されたｉｎ  ｖｉｔｒｏでの骨芽細胞の細胞外物質の増殖および産生が改善されることを実証している（Supronowicz et al. (2002) Journal of Biomedical Materials Research, 59, p. 499-506）。Chachques et al. (2004) International Journal of Cardiology, 95, p. 68-69は、心筋幹細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで電気刺激することによって、管状筋細胞での増殖、発達、組織化、および分化がどのように増加するかを示している。
【０００３】
脳深部刺激は、パーキンソン病、慢性の震え、ジストニー、および他の多動障害などの影響の大きい病状に対して効果が証明された処置である。国際的に承認されている機能的電気刺激の臨床用途はすべて、神経構造の直接的な興奮および筋機能の場合には筋の間接的な活性化に基づいている。
【０００４】
さらに、ラットの研究において、電気刺激は、様々な程度の変性後でさえ、筋膜の電気特性および電気化学特性の再構築が１回だけでなく繰り返し可能であることが実証されている。
【０００５】
別のラット研究（Carraro et al. (2002) Basic and Applied Myology, 12, p. 53-63）は、未処置の除神経筋（denervated muscle）において、低いけれども長く続く再生能（再生された筋形成）を細胞レベルで実証し、さらに、筋病変の繰り返し後におけるこの活性の顕著な増加を実証している。同様に、下肢の末梢性除神経を有する対麻痺患者では筋原性刺激が並行して観察された。
【０００６】
しかしながら、電気刺激を行うための現在の方法は、侵襲性が高い。脳刺激を行う方法では、脳内電極を挿入し、移植できるインパルス発生器を適用して、電極自体に接続することが企図される。このｉｎ  ｖｉｖｏでの刺激は、非常に多くの禁忌を伴う。それらの中には、随伴する精神病理学とともに、制御不能な凝固因子異常および術後痴呆症を発症する潜在的リスクに言及する必要がある。さらに、脳室拡大の発症のリスク、硬膜下、クモ膜下、心室内、または脳内血腫の発症のリスクも無視できない。最後だからといって重要でないということではないが、出血のリスクは、深刻なものでさえ、各患者の３〜５％付近に達する一方、卒中、感染症、および脳障害の場合もある。これらの発作はすべて長期の障害となり、最悪のケースでは患者は死に至る。さらに、抗生物質処置に対応しない、装置によって引き起こされるしばしば起こる感染症では、明確に電極を除去する必要がある。
【０００７】
すべてのこれらの複雑性のため、効果的で有望ではあるが、神経刺激が、如何に今日まで、病理学の進んだ段階の単なる処置に制限されている一方、すべての他の薬理学的治療が全く効果的でないことを理解することは容易である。
【０００８】
筋組織での試験においても、機能的電気刺激は、除神経筋肉組織を維持し、機能的に回復し、再構築するための効果的で効力な手段であることが実証されている。しかしながら、当該技術は、神経刺激のケースで既に見出されている、侵襲性が高いという同じ問題を伴う。
【０００９】
ヒト治療および診断において、ナノ粒子、ナノチューブ、ナノフィブリルなどのナノ構造体の使用が知られている。
【００１０】
欧州特許出願第ＥＰ−Ａ−１５９３４０６号（M．Pizziら）には、焦電性または圧電性複合材料および薬物からなるマイクロキャパシタまたはナノキャパシタから構成される電気化学治療用装置が記載されている。当該装置は、血液循環に入れ、外部から稼動させて、薬物を放出することができる。当該マイクロキャパシタ／ナノキャパシタは、振動源または電磁放射線源によって稼動させることができる。上記文献では、細胞刺激に言及しておらず、ナノチューブまたは外部供給源としての超音波にも言及していない。
【００１１】
欧州特許出願ＥＰ−Ａ−１８１８０４６号（M．Pizziら）には、膜によって封入され、かつ、薬物を含む強誘電性材料、焦電性材料、または圧電性材料からなるナノキャパシタから構成されるマイクロ装置が記載されている。当該装置は、血流に投入することができ、外部から、適当な刺激を用いて、膜を穿孔し（エレクトロポレーション）、かつ、薬物を放出する電位差を発生させることができる。当該装置の目的及び構成は、本発明の目的から逸脱したものである。
【００１２】
米国特許出願第ＵＳ２００９０２２６５号には、ＢＮＣＴ（ホウ素中性子捕捉療法（Boron Neutron-Captur Therapy））による癌治療用の窒化ホウ素ナノチューブが記載されている。この文献には、抗腫瘍薬物の運搬体としてのカーボンナノチューブの使用も記載されている。本発明の実施形態では、薬物を含むカーボンナノチューブが高出力超音波によって破裂される。この文献は、細胞刺激を記載しておらず、窒化ホウ素ナノチューブの圧電性効果の適用についても記載していない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、今日の電気療法技術によく見られる深刻な副作用を与えることなく電気細胞刺激の適用を可能とする、新規な機器および技術を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、圧電性ナノトランスデューサーが完全に非侵襲性の電気療法の治療において効果的に用いることができるとの驚くべき発見に基づくものであり、ナノトランスデューサーによって発生する電気刺激は、適当な出力の超音波により患者の身体外部の（ワイアレスタイプの）ストレスを介して引き起こされる。したがって、本発明は、圧電性ナノトランスデューサーが局在化している系の外部で発生される超音波場によって圧電性ナノトランスデューサーが刺激されるというだけではなく、標的細胞内部に局在化するナノトランスデューサーによって発生する電気刺激がｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの実（real）細胞系での効果的な電気刺激を引き起こすのに十分に高いものである、との実験による実証に基づいている。
【００１５】
したがって、本発明の第１の目的は、ナノトランスデューサーを標的部位で局在化させる工程と、超音波によるナノトランスデューサーの外部刺激によって同部位において電気刺激を誘発する工程とを含む、電気刺激による細胞刺激のｉｎ  ｖｉｖｏ処置に使用するための圧電性ナノトランスデューサーである。
【００１６】
本発明の実施形態において、圧電性ナノトランスデューサーは、薬学的に許容可能なポリマーでコーティングすることによって生体適合性となり、および／または標的部位に対して親和性を有する特定のリガンドで官能化されおよび／またはその追尾を可能とするマーカー分子で官能化される。
【００１７】
本発明の特定の実施形態において、圧電性ナノトランスデューサーは、ナノチューブ、例えば、窒化ホウ素ナノチューブである。
【００１８】
本発明のナノトランスデューサーは、組織細胞での内在化およびその後にそれらを電気刺激することによる種々の組織の再生または再構成処置において利用される。
【００１９】
本発明の第２の目的は、電気療法処置で使用するための超音波リモートフィールド（ultrasonic remote field）により刺激することが可能な圧電性ナノチューブおよび薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬使用のための製剤およびこれを調製する方法；特に、非凝集形態の前記ナノチューブおよび分散剤としての生体適合性ポリマーを含む懸濁液／溶液の液体形態である製剤である。
【００２０】
本発明の第３の目的は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの電気細胞刺激（電気刺激による細胞刺激）の方法であって、
圧電性ナノトランスデューサーを培地または細胞成長支持体に分散する工程と、
前記培地または成長支持体中で細胞をインキュベートする工程と、
外部超音波場によるナノトランスデューサーの刺激により電気刺激を誘発する工程と
を含む、方法である。この目的の実施形態において、成長支持体は、組織工学用の高分子足場またはインプラントまたは接着基体である。
【００２１】
本発明のさらなる目的は、超音波（ＵＳ）による外部刺激の結果として電気刺激を発生することが可能な上述の圧電性ナノトランスデューサーを含む、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞成長用支持体（足場）もしくは細胞接着基体または組織工学における使用のための支持体（足場）である。
【００２２】
本発明によって提起される解決策は、電気細胞刺激の利益を最大にするが現在の臨床技術により引き起こされる悪影響の問題および副作用をなくすか劇的に減少させる効果的な電気刺激を誘発する利点を提供する。提起する方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの組織の電気刺激のための現在の方法における非侵襲性を完全に低減し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける電気刺激のいずれの形態を非常に簡単なものとする。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞刺激に関し、提起する解決策では、刺激用の電気回路、電気接続、または培地に接続する他の装置が必要なく、これにより、当該系において細胞成長条件を改善することが容易となる。ナノトランスデューサーは、培地（ＣＭ）中に分散され、あるいは、細胞成長のための支持構造体（高分子足場、接着など）に包埋され、次いで、超音波場で刺激することができる。さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ用途いずれにおいても、様々な必要性によりよく対応するために、使用する電力を個々の場合で調整することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明を例示する細胞モデル図を報告するものである。外部超音波刺激の結果として、ＢＮＮＴを内在化するすべての細胞に内部電気刺激を与える。
【図２】初代ヒト骨芽細胞（ＨＯＢ）を０（コントロール）、５、１０、１５μｇ／ｍｌのＢＮＮＴ（ｎ＝６）とともに２４時間、４８時間、７２時間インキュベートした後のＭＴＴアッセイの結果を図示するものである。各群の間には、統計的有意差は観察されなかった。
【図３】細胞内在化試験の結果を報告するものである。蛍光マーカー（量子ドット）で標識した。ＢＮＮＴ含有ＣＭとともにＨＯＢを６時間インキュベートした後、蛍光顕微鏡法により、ＢＮＮＴが細胞内部で検出された。
【図４】ＨＯＢもしくはコントロールの細胞質断片またはＢＮＮＴで処置したＨＯＢの細胞質断片のＴＥＭ顕微鏡写真を示すものである。この結果では、ＢＮＮＴの内在化が確認され、細胞質小胞中にＢＮＮＴに匹敵するナノ粒子の存在が示される。ＢＮＮＴの内在化は、エンドサイトーシスによって起こる。
【図５】ＲＴ−ＰＣＲ分析結果を報告し、単一の刺激（ＢＮＮＴまたはＵＳのいずれか）および組み合わせた刺激（ＢＮＮＴ＋ＵＳ）の両方で処置したＨＯＢの遺伝子発現を示すものである。Ｒｕｎｘ２の発現はＢＮＮＴによってダウンレギュレーションとなるが、ＯＰＮ発現レベルはＵＳによって高くなることが見出された。コラーゲンＩの発現は変化がなかったが、ＡＰおよびＯＣＮの発現はＢＮＮＴおよびＵＳの両方の処置によって相乗的に影響を受けた。
【図６】細胞あたりのＯＣＮ産生レベルを報告するものである。ＢＮＮＴおよびＢＮＮＴ＋ＵＳで処置した試料は、ＵＳで処置した試料およびコントロールよりも高いＯＣＮ産生を示した。
【図７】ｖｏｎＫｏｓｓａによる比色細胞化学分析の結果を報告するものである。分析は、未処置（黒）、超音波（ＨＯＢ＋ＵＳ）での刺激、ナノチューブ（ＨＯＢ＋ＢＮＮＴ）での刺激、あるいはナノチューブでの刺激、かつ、超音波（ＨＯＢ＋ＢＮＮＴ＋ＵＳ）での刺激を行った、初代ヒト骨芽細胞（ＨＯＢ）の試料上のカルシウム塩の産生に関する。最大の石灰沈着（より黒色の染色）は、ＢＮＮＴで処置し、かつ、ＵＳで刺激したＨＯＢで達成された。
【図８】葉酸で（ａ）官能化されたまたは（ｂ）官能化されていない、１０μｇ／ｍｌの蛍光ＢＮＮＴ（量子ドットと結合されている）とともに９０分間インキュベートしたヒト膠芽細胞腫多形細胞の蛍光画像を報告するものである。
【図９】実施例１４で記載するように５日間の処置後のカルセイン標識したＰＣ１２細胞の画像である。図９ａ：ＧＣ−ＢＮＮＴとともにインキュベートせず、かつ、超音波で処置していない細胞；図９ｂ：ＧＣ−ＢＮＮＴとともにインキュベートし、かつ、超音波で処置していない細胞；図９ｃ：ＧＣ−ＢＮＮＴとともにインキュベートせず、かつ、超音波で処置した細胞；図９ｄ：ＧＣ−ＢＮＮＴとともにインキュベートし、かつ、超音波で処置した細胞。
【図１０】実施例１４で記載するように処置したＰＣ１２細胞を示すものである。図１０ａ：分化傾向の分析；図１０ｂ：細胞あたりの神経突起の数；図１０ｃ：神経突起の長さ。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
ナノトランスデューサー
本発明に好適な圧電性ナノトランスデューサーは、圧電性材料からなるまたは圧電性材料を含む、１００ｎｍ未満の少なくとも１次元、好ましくは２次元または３次元の、それ自体既知であるナノ構造体、例えば、粒子、チューブ、ロッド、球体、フィブリル、フィラメントである。有用な材料の具体例は、窒化ホウ素であり、他の有用な材料の具体例には、例えば、チタン酸バリウム、チタン酸ストロンチウム（一般に、すべてのペロブスカイト）およびポリフッ化ビリニデン（ＰＶＤＦ）が包含される。ナノチューブの群には、単壁、二重壁、または多重壁ナノチューブが包含され、それらは、２つの端および単に一端が開いてもよく、あるいは２つの端が閉じていてもよい。そのようなナノチューブの具体例は、窒化ホウ素ナノチューブである。
【００２５】
窒化ホウ素ナノチューブ（ＢＮＮＴ）は、より有名なカーボンナノチューブ（ＣＮＴ）（古典的な形態である巻き上げたグラファイトシートにおいて、原子間距離はほとんど変わらずに、交互するＢおよびＮ原子をＣ原子に完全に置き換えたもの）と構造が類似している。ＢＮＮＴは、Chen Y. et al (1999) Chemical Physics Letter, 299, p 260-264またはYu J. et al (2005) Chemistry of Materials, 17, p 5172-5176で記載されるように、ボールミルアトマイゼーション法を行い、続いて、アニーリングすることによって作製される。国際的な科学団体では、それらの関心の急激な高まりの声があがっており（Chopra et al. (1995) Science, 269, p. 966-967）、特有の関連する物理化学特性に起因して非常に注目され、それらはいくつかの構造及び電子用途の理想的な候補となっている（Terronesら (2007) Materials Today, 10, p. 30-38）。
【００２６】
ＣＮＴと同様の高いヤング率に加えて（Chopra et al. (1998) Solid State Communications 105, p. 297-300）、ＢＮＮＴは、優れた化学的及び熱的安定性を有する。半導体に典型的な電気挙動から優れた伝導体の電気挙動の範囲までの様々な電気挙動を示すＣＮＴとは異なり、ＢＮＮＴは、ＣＮＴと比較してより安定な電気特性を示し、５．５ｅＶの均一なバンドギャップを有する。実際に、ＣＮＴの対掌性（したがってその電気特性）の制御に対する進展は緩やかである一方、ＢＮＮＴは、Ｂ−Ｎ結合の極性のために、好ましくは「ジグザグ」と定義される構造を示す。これらの特性すべてにより、ＢＮＮＴは、多くのナノ技術用途について特に興味深いものとなる。ＢＮＮＴは、優れた圧電性を有する。圧電性は、ある結晶が適用する機械的圧力に応じて電位差を生成する能力である。ＢＮＮＴの自発分極および圧電性特性の第一原理（ab initio）計算により、ＢＮＮＴは、ほとんどの圧電性ポリマーよりも大きい応答値を有し、かつウルツ鉱をベースとする半導体によって示される応答値に匹敵する応答値を有し、優れた圧電性系として機能することが実証されている。さらに、ＢＮＮＴの曲げ力が、高分解能透過電子顕微鏡法（ＨＲＴＥＭ）内で直接測定され、これらの構造の並外れた可撓性が確認されている（Golberg et al. (2007) Advanced Materials, 19, p. 2413-2432）。これらの観察は、効果的かつ革新的なナノ運搬体としてのＢＮＮＴの顕著な可能性を裏付けるものである。
【００２７】
生体適合性ナノトランスデューサー
生物医学用途で最初に求められるものは、免疫反応を起こさずに投与することができ、かつ、対象とする細胞に容易に内在できるナノトランスデューサーの、生理溶液中で安定であって生体適合性である懸濁液の生成である。非常に有望なアプローチは、ナノ構造をコーティングし、かつ、該ナノ構造が生体適合性となり、水性媒体に容易に分散可能となるかまたは準溶液となる、ポリマーの使用である。この目的に好適なポリマーは、例えば、ポリサッカライド、例えば、キトサン、グリコールキトサン、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリアスパラギン酸などのポリマー、またはそれらのコポリマーである。ポリマーは、陽イオンポリマー、例えば、ポリリジンおよびポリエチレンイミンであることが好ましい。ポリエチレンイミンなどの正電荷ポリマーを用いたナノチューブの高分子かつ共有または非共有コーティング方法が、Ciofaniら (2008) J. Nanosci. Nanotechnol, 8, p. 6223-6231または Ciofaniら (2008) Biotechnology and Bioengineering, 101, p. 850-858に記載されている。ポリリジンでのコーティング方法は、本明細書の実施例において後述する。
【００２８】
ナノトランスデューサーを生体適合性にすることに加えて、上記のポリマーの使用により、均一で、凝集体がなく、したがって標的細胞中において容易に内在可能な分散体を得ることができる。
【００２９】
さらに、本発明のナノトランスデューサーは、種々のタイプの分子で官能化してもよく、第一には、標的細胞内部までその追尾（tracking）を確実にする検出可能なマーカー分子で官能化してもよい。
【００３０】
細胞アッセイに好適な任意のタイプの既知マーカー、例えば、蛍光基質、発色団、または放射性同位をこの目的のために用いることができる。次いで、ナノトランスデューサーは、治療または診断用に対象の細胞に対して標的とする特定のリガンドで官能化してもよい。これらのリガンドは、ＩｇＧなどの特定の抗体またはそれらの断片、葉酸または他の既知のバイオパートナー（biopartner）などの特定の膜受容体に特異的なリガンドである。上記の基質に対する受容体を過剰発現する膠芽細胞腫細胞（図８）によって葉酸で官能化したＢＮＮＴが如何に好ましくは内在化されることが最近示されている（Ciofani et aL (2009) Nanoscale Res Lett, 4, p. 113-121）。
【００３１】
特定の分子による官能化はｉｎ  ｖｉｖｏで特に有用であり、標的細胞による運搬体の認識を可能とする。特定の細胞の効果を標的化することは、ｉｎ  ｖｉｖｏで、例えば、神経または筋刺激の適用などにおいて非常に重要である。例えば、血流中に注入された官能化ＢＮＮＴの分散液を電気刺激が必要な部位に局在化させ、次いで、後者は、外部の超音波場を適用することにより行われる。
【００３２】
ナノトランスデューサーの局在化／投与
本発明の圧電性ナノ運搬体は、標的部位で局在化される。このことは、標的部位への直接投与、例えば、処置組織でのｉｎ  ｓｉｔｕ注射などの結果として、当該部位の細胞でのナノトランスデューサーの内在化によって起こる。代替の侵襲性がより低い投与経路は、親和性に起因してナノ構造を運び、標的部位に蓄積することで、対象の細胞により内在化が可能となる特定のリガンドで官能化されたナノ運搬体を血流に投与することである。
【００３３】
さらなる投与の選択肢は、造影剤（臨床使用用製品であるＳｏｎｏＶｕｅなど）として用いられるものなどの、脂質微小気泡中のＢＮＮＴのカプセル化から成る。このリン脂質微小気泡は、六フッ化硫黄ＳＦ６（肺レベルで除去された、完全に無害でほとんど溶けない気体）を含み、懸濁液の注入によって血流に入り、赤血球（２〜５μｍ）に匹敵するサイズを有する。次いで、上記のリン脂質微小気泡は、毛細血管には到達するが血流からは出ない。上記の微小気泡は、ＢＮＮＴを対象の部位に導入し、運び入れる。前者は超音波刺激で破裂され、後者の束縛をなくす。これに対して、ＢＮＮＴは、微小循環を出て、エコグラフィック監視下で標的部位に到達する。上記の微小気泡は、さらに、標的とする化学治療用の可能性のある薬物担体として用いることができる。
【００３４】
本発明に従って処置を行いやすい代表的な組織は、筋、神経、骨、軟骨、心筋組織、内耳有毛細胞、網膜の桿細胞および錐細胞、味細胞、触覚細胞および嗅細胞などのすべての感覚細胞を含む組織、すなわち、化学受容体、温度受容体、光受容体、機械受容体を有し、かつ、受けた刺激を付近のニューロンを活性化する膜分極の差異に変換するすべてのそれらの細胞を含む組織、あるいは、再生もしくは再構成処置、または急性、慢性、神経筋疼痛処置、または損傷した組織の治癒処置が必要である任意の他の組織または器官、例えば腱および靱帯である。
【００３５】
圧電性ナノトランスデューサーの電気刺激によって成長が活性化され、刺激され、または促進される特定の細胞の種類には、一般に、筋細胞、筋芽細胞、神経細胞、心筋細胞、骨芽細胞、破骨細胞、心臓幹細胞、幹細胞、および上記の感覚細胞が含まれる。
【００３６】
例として、神経系レベルでの刺激の場合、ＢＮＮＴ懸濁液をｉｎ  ｓｉｔｕで注入するかあるいは適当な官能化に際して血流に注入し、次いで、外部刺激により出力（power）を発生することができ、高侵襲性の経皮的かつ貫通性のインプラントを必要としない。
【００３７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法および細胞成長用支持体
本発明の代替の実施形態において、圧電性ナノ運搬体は、電気刺激による細胞の活性化、刺激、または成長促進および／または再生のためのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法で利用される。
【００３８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの刺激および組織工学用途に関し、本発明は、細胞刺激、ならびに代謝、増殖、細胞外マトリックスの産生および代謝産物の産生に関する培養組織の状態を改善する可能性を促進する。実際に、いくつかの細胞類型学において、電気刺激は、その成長に対して正の効果を有することが長い間証明されてきた。本発明によって示される解決策により、刺激用の電気回路、電気接続、または培地に接続された他の装置を必要とすることなく、これらの結果を達成することが可能である。さらに、提案するナノトランスデューサーは、上記のように培地中で投与することができ、高分子足場または接着基体などの細胞成長用の支持構造体中に包埋し、次いで、後述のような超音波場によって刺激することができる。
【００３９】
液体培地を培養する場合、圧電性ナノトランスデューサーは、好ましくは生体適合性となりおよび／または上記のような特定のリガンドまたはマーカー分子で官能化され、培養細胞に対して毒性効果を示す濃度ではない培地中に安定的かつ均一に分散される。５〜１００μｇ／ｍｌで含まれる濃度、例えば、５、１０、１５、２５、５０、７５μｇ／ｍｌの濃度では、７２時間までのインキュベーション後において全く毒性効果を生じなかった。
【００４０】
１〜１０時間、例えば、細胞の種類に依存して、１、３、５、６時間インキュベートすることは、細胞でのナノトランスデューサーの内在化を得るのに十分であることが蛍光アッセイにより明確となっている。６時間インキュベートすることは、窒化ホウ素ナノチューブをヒト骨芽細胞中に内在化するのに有効であることが証明された。
【００４１】
高分子支持体などの固体支持体またはゲルなどの半固体支持体上での培養の場合、圧電性ナノトランスデューサーは、支持体中にその調製中、均一な形で包埋される。特に、支持体の調製方法には、圧電性ナノトランスデューサーをポリマーまたはそのモノマーを含む溶液または分散液またはエマルジョンに分散する工程と、モノマーを重合する工程と、液体培地を取り除き、ナノトランスデューサーを含む固体または半固体マトリックスを得る工程とが企図される。細胞成長用の支持体は、それ自体既知である。それらの調製に利用するポリマーは、生体適合性かつ細胞親和性（cytocompatible）ポリマーである。特に、組織のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの産生およびその後のｉｎ  ｖｉｖｏでの移植用に組織工学で利用されるポリマーは、さらに、次の性質：生体吸収性、（または生物分解性もしくは生侵食性（bioerodible））、免疫不活性、非毒性、非発癌性であることが必要である。
【００４２】
成長支持体の調製に有用な既知のポリマーは、例えば、ポリ乳酸、ポリグリコレート、それらのコポリマー、ポリピロリドン、セルロースに由来するポリマー、キトサン／キチン、ポリリジン、ポリエチレンイミンである。本発明の支持体の調製に好適なその他のポリマーは、国際公開公報第ＷＯ−Ａ−２００１／０８７１９３号に記載され、その内容は本出願に取り入れられる。請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の支持体を調製する方法には、以下の工程、すなわち、圧電性ナノトランスデューサーをポリマーまたはそのモノマーを含む溶液または分散液またはエマルジョンに分散させる工程と、前記液体培地を取り除き、ナノトランスデューサーを含む固体または半固体マトリックスを得る工程とが含まれる。
【００４３】
標的細胞での内在化
ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施する際のいずれも、細胞刺激処置の効果は、対象の細胞における圧電性ナノトランスデューサーの内在化のレベルに依存する。蛍光試験により、インキュベーション時間を１〜１０時間とすることは、本発明のナノトランスデューサーの効果的な内在化を達成するのに十分であることが実証された。例えば葉酸で官能化された１０μｇ／ｍｌの蛍光ＢＮＮＴとともに９０分間インキュベートしたヒト膠芽細胞腫多形細胞は、高い内在化レベルであることが実証された（図８）。また、初代ヒト骨芽細胞の培養物も、６時間インキュベートした後、ポリ−Ｌ−リジンで処理され蛍光マーカーで標識した窒化ホウ素ナノチューブを効果的に内在化した（図３）。
【００４４】
神経ＰＣ１２細胞の培養物も、１２時間インキュベートした後に、グリコール−キトサンで処理した窒化ホウ素ナノチューブを効果的に内在化した。
【００４５】
超音波は、非侵襲性が低く、ほとんど副作用がないので、いくつかの医用分野で広く利用されている。既知の主要な用途の中では、診断（超音波検査）、外傷後疼痛治療、リハビリテーションでの適用、美容医学（aestheticmedicine）などがある。
【００４６】
本発明によれば、標的部位においてｉｎ  ｖｉｖｏで局在化し、対象細胞によって内在化したら、あるいは、培地に分散するかまたは接着基体または細胞成長用の高分子支持体（足場）に包埋した場合に、圧電性ナノトランスデューサーを、機械的音波である超音波場によって刺激する。これらは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞系の外部のまたは処置を受ける患者身体の外部の発電機によって作り出される。ｉｎ  ｖｉｖｏ処置において、場は、通常、標的部位の近くに位置する。
【００４７】
本発明に好適な超音波を生成するためには、信号周波数および電圧、したがって信号強度を調整することができる任意の市販の装置を用いることができる。例えば、エコグラフィック刺激頭部ならびに調整可能な電源および周波数を有する標準の機器を用いることができる。
【００４８】
単なる例として、ここで、ナノ運搬体（ナノチューブ）の圧電性挙動モデルを記載する。本発明書で既に述べた圧電性は、材料の電気的挙動とフックの法則との組み合わせであり、そのような組み合わせは次式によって纏めることができる。
【数１】
2012523452.tif 000003
ここで、Ｄは材料の全分極であり、Ｅは電場であり、ε０は真空誘電率であり、εｒは比誘電率であり、Ｐは、
【数２】
2012523452.tif 000004
によって示される圧電現象に起因する分極であり、ここで、ｄは圧電定数の３×６マトリックスであり、σは応力テンソルであり、６成分に簡潔化する。材料内部における電荷の非存在下で、マックスウェルの式から、
【数３】
2012523452.tif 000005
が得られ、したがって、以下の系が得られる：
【数４】
2012523452.tif 000006
【００４９】
簡潔化の目的のため、長さｌのナノチューブに、超音波の効果により垂直軸ｚに沿って応力σｚｚを与えると仮定する。
【００５０】
Ｐの唯一の非空（non-nil）成分は、
【数５】
2012523452.tif 000007
となり、ここから、
【数６】
2012523452.tif 000008
が演繹され、ｚ軸に沿ってＥｚを積分すると、
【数７】
2012523452.tif 000009
が得られ、これは、機械的応力σｚｚの適用によって発生するナノチューブ端での電位差を示している。言うまでもなく、この応力の制御パラメータ（本発明者らの場合、超音波場、インパルスの周波数、数、期間、および強度）は用途に依存して変化する。すべての細胞系に対して有効な結果を得るための最適な条件は、当業者が経験的に容易に得ることができる。
【００５１】
２０ｋＨｚ〜２０ＭＨｚの範囲の任意の周波数を本発明の方法で有用に用いることができる一方、超音波信号強度は、照射を受けた細胞および組織の損傷の臨界閾値未満である必要がある。この臨界閾値は、本方法がｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで適用される場合に様々であり、適用時間に強く依存する。本発明の方法において、信号適用時間は５〜３０秒であり、１日あたり及び１週間あたり２回もしくは３回以上繰り返す。
【００５２】
上記の適用時間に対して、信号強度は、５０ｍＷ／ｃｍ２〜２５Ｗ／ｃｍ２の範囲で変化してもよい。ｉｎ  ｖｉｖｏでの処置では、最大強度の場合、３０秒以下の適用時間で１００ｍＷ／ｃｍ２〜１０Ｗ／ｃｍ２の強度を用いることが好ましい。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの処置ではより高い強度が許容され、常に５〜３０秒の適用時間で、１０Ｗ／ｃｍ２〜２５Ｗ／ｃｍ２の範囲で変化し、上記のように繰り返す。５〜３０秒の適用時間で２０Ｗ／ｃｍ２の強度を用いる場合、１００〜６００Ｊ／ｃｍ２に等しいエネルギーを発生する。
【００５３】
ＵＳ波誘発細胞電気療法の効果は、細胞の発達、分化、成熟または生存能（vitality）の指標として一般に認識されている種々の細胞パラメータを分析することによって容易に評価することができる。
【００５４】
有効な試験は、当業者に周知の技術：ＰＣＲもしくはＲＴ−ＰＣＲまたは任意の他の既知アッセイによる典型的な遺伝子の細胞発現レベルの評価である。
【００５５】
もう一つの試験は、例えば、そのレベルが活性化または細胞の生存能自体の程度に関連し得る、細胞によて発現されるタンパク質または代謝産物もしくは任意の他の細胞によって生成される有機または無機物質の酵素アッセイ、酵素抗体法、免疫放射定量測定法、または比色アッセイによる決定である。
【００５６】
細胞膜電位の研究（パッチクランプ、ボルテージクランプ、カレントクランプなどの計画下で）に通常用いられる電気生理学的試験は、ナノチューブが仲介する刺激が、特に神経ネットワークにおいて電位自体および電気信号伝播の際に誘発する干渉を検証するのに特に有用である。
【００５７】
用途
細胞の非侵襲性電気刺激は、脳深部刺激、胃不全麻痺後の胃の刺激、心臓刺激、筋刺激など、臨床および前臨床の両方における生物医学分野での数多くの用途が見出される。臨床用途に関して、脳深部刺激は、パーキンソン病、慢性の震え、ジストニーおよび他の多動障害などの影響の大きい病状に対して効果が証明されている治療である。
【００５８】
さらに、細胞刺激は、再生薬および／または組織工学用途での広範な使用が見出される。この技術は、種々の原因の筋除神経（muscle denervations）を有する患者を回復させるための新規な方法としての使用について高い可能性を有している。組織工学および再生薬用途に関しては、ＢＮＮＴを細胞成長に好適な高分子基体または足場に取り入れる可能性を考慮すべきである。
【００５９】
さらに、この非侵襲性方法により、細胞外マトリックスの代謝、増殖、および産生のための培養組織の状態を改善することが可能となる。
【００６０】
放棄（Disclaimer）
本出願で具体的に特定される任意の構成要素は、例示であって限定するものではないと理解するものであり、したがって、本発明の要旨を変更することなしに、付与される保護範囲から除かれ得るものである。
【００６１】
本発明を後述の実施例によって例示する。
【実施例】
【００６２】
実施例１：ヒト骨芽細胞（ＨＯＢ）の単離および展開
インフォームドコンセントを得た後、大腿骨関節置換術施術を行った患者の大腿骨骨頭から取り除いた柱骨（trabecularbone）試料を用いた。試料を無菌条件下でより細かい断片に分断した。その後、骨断片を抗生物質および抗真菌剤を補充した無菌の生理食塩水中に入れ、数回洗浄し、脂肪、骨髄、組織の残渣および血液細胞を取り除いた。確立した方法（Di Silvio et al. Human cell culture. London (UK): Kluwer Academic Publishers; 2001. p. 221-241）に従い、単離を行った。ネイティブの組織からの細胞移動が１〜２週間以内に観察され、外植片の付近に骨様の層が形成された。細胞を、ＤＭＥＭ低グルコース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミラノ、イタリア）、１０％ＦＣＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１０％Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、非必須アミノ酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、アスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、抗生物質および抗真菌剤（ミネラル補充はない）を含む培地（ＣＭ）中で培養した。コンフルエンスに達したとき、細胞は１：３で及第した。Ｐ１細胞を用いて、細胞化学および免疫組織化学による特徴づけを行った。Ｐ２ヒト骨芽細胞（ＨＯＢ）をＢＮＮＴでの研究に用いた。
【００６３】
実施例２：ＢＮＮＴの調製および結合
オーストラリア国際大学（キャンベラ、オーストラリア）から供給されたＢＮＮＴを、ボールミリングおよびアニーリング法（Chen Y et al. (1999) Chemical Physics Letter 299, p. 260-264; Yu J et al. (2005) Chemistry of Materials 17, p. 5172-5176）を用いて作製した。試料の純度および組成（供給元から提供されたもの）に関する詳細は、収率＞８０％、窒化ホウ素＞９７ｗｔ％、ミリングプロセス由来の金属触媒（ＦｅおよびＣｒ）約１．５ｗｔ％、吸着Ｏ２約１．５ｗｔ％であった。
【００６４】
ＢＮＮＴの懸濁水溶液および分散水溶液に用いるポリマーは、Ｆｌｕｋａ（８１３３９）から入手したポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）（分子量７０、０００〜１５０、０００）とした。すべての実験は、上述のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）中で行った（Ciofani G. et al. (2008) Biotechnol. Bioeng. 101 , p. 850-858）。簡単に言うと、０．１％ＰＬＬ溶液中のＢＮＮＴ粉末試料をＢｒａｎｓｏｎ超音波発生装置２５１０（Ｂｒａｎｓｏｎｉｃ）で１２時間超音波処置した。すべての実験において、超音波発生装置の出力を２０Ｗに設定した。次に、試料を１，１００×ｇで１０分間遠心分離し、非分散の残渣および不純物を取り除いた。
【００６５】
過剰なＰＬＬを、３サイクル、３０、０００×ｇ、３０分間、４℃（Ａｌｌｅｇｒａ  ６４Ｒ、Ｂｅｃｋｍａｎ）での超遠心分離によって取り除いた。ＰＬＬでナノチューブを非共有コーティングした結果として、ＰＬＬ−ＢＮＮＴ分散液を得た。分光学的分析をＬＩＢＲＡＳ１２分光光度計ＵＶＡ／Ｖｉｓ／ＮＩＲ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）で行い、分散液を特徴付けし、ＢＮＮＴ濃度を定量化した（Ciofani et al. (2008) J. Nanosci. Nanotechnol. 8, p. 6223-6231）。
【００６６】
ＰＬＬ−ＢＮＮＴを、局在化／細胞の追尾研究のためにカルボキシル基で官能化した量子ドットと共有結合した。カルボキシル量子ドットは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｑｄｏｔ（商標）  ６０５ＩＴＫ（登録商標））から供給された。
【００６７】
ＰＬＬのアミノ基と量子ドットのカルボキシル基との間の結合反応を供給元の指示通りに行った。簡単に言うと、ＰＬＬ−ＢＮＮＴ（５０μｇ／ｍｌ）４ｍｌを、量子ドット（８μＭ）４μｌおよびアクチベーターとしての１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ−プロピル）カルボジイミド（１０ｍｇ／ｍｌ、ＥＤＣ、０３４５０、Ｆｌｕｋａから入手）６０μｌと混合した。
【００６８】
最適な結合のために、溶液を室温で９０分間穏やかに撹拌し、最後に遠心分離して（１、０００×ｇ、１０分間）大きな凝集体を取り除いた。最後に、超遠心分離（２サイクル、３０，０００×ｇ、３０分間、４℃）を行い、未結合の量子ドットを取り除き、これにより、標識したＢＮＮＴ（ＱＤ−ＰＬＬ−ＢＮＮＴ）の分散液を得た。
【００６９】
実施例３：ＭＴＴアッセイ
細胞生存能を評価するために、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド、Ｍ−２１２８、Ｓｉｇｍａ）細胞成長アッセイを、５、１０、および１５μｇ／ｍｌのＢＮＮＴ最終濃度を含むＰＬＬ−ＢＮＮＴ修飾培地とともに２４時間、４８時間、および７２時間インキュベートした後に行った。トリプシン化処理し、Ｂｕｒｋｅｒチャンバーで細胞計数を行った後、ＨＯＢを９６ウェルプレートで平板培養した。接着が確認されたら（播種から約６時間後）、細胞をＭＴＴ０．５ｍｇ／ｍｌとともに２時間インキュベートした。次いで、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、Ｓｉｇｍａ）１００μｌを各ウェルに添加し、５５０ｎｍでの吸収度をＶＥＲＳＡＭａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で測定した。参考試験（ＢＮＮＴ非存在下で培養した細胞）をコントロールとして行った。
【００７０】
実施例４：蛍光ＢＮＮＴの細胞内追尾
ＱＤ−ＰＬＬ−ＢＮＮＴを培地に１：１０比で添加し、５．０μｇ／ｍｌのＰＬＬ−ＢＮＮＴ最終濃度とした。６時間インキュベートした後に蛍光顕微鏡法を用いて、細胞内在化の研究を行った（２４ウェルプレート中の６０，０００個の細胞）。リソソーム追尾アッセイを、Ｌｙｓｏ  Ｔｒａｃｋｅｒ色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともにインキュベートしたＨＯＢについて行った。これは、生細胞中の酸性の細胞小器官を標識するための蛍光酸親和性色素（fluorescent acidotropic dye）である。蛍光色素は、低ｐＨによって特徴付けされる細胞区画に蓄積した。これらの研究では、細胞を、ＱＤ−ＰＬＬ−ＢＮＮＴに６時間暴露した後に１：２，５００の希釈でＬｙｓｏ  ｔｒａｃｋｅｒを含む培地中で２時間インキュベートした。
【００７１】
実施例５：透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）による分析
ＴＥＭ分析のために、１０μｇ／ｍｌ（ＨＯＢ＋ＢＮＮＴ）の濃度でＢＮＮＴを含むＣＭで一晩処置したＨＯＢ（コントロール）およびＨＯＢを用いた。細胞をＣＭから取り除いた後に遠心分離し、ＰＢＳ（０．１Ｍ、ｐＨ７．２）中の０．５％ｗ／ｖグルタルアルデヒド−４％ｗ／ｖホルムアルデヒド溶液に４℃で２時間固定した。洗浄後、試料を１％ｗ／ｖのＯｓＯ４  ＰＢＳ（０．１Ｍ、ｐＨ７．２）中で１時間、後固定し（post-fixed）、洗浄し、酸性化アセトン−ジメチルアセタール（Ｆｌｕｋａ、ブークス、スイス）で乾燥した（dehydrated）。最後に、試料をＢＥＥＭカプセル＃００（ＳｔｒｕｃｔｕｒｅＰｒｏｂｅ、ウエストチェスター、米国）中のＥｐｏｎ／Ｄｕｒｃｕｐａｎ樹脂に５６℃で４８時間包埋した。ダイヤモンド・ナイフ（Ｄｉａｔｏｍｅ、ビール / ビエンヌ、スイス）を備えたＵｌｔｒｏｔｏｍｅ  Ｎｏｖａウルトラミクロトーム（ＬＫＢ、ブロンマ、スウェーデン）を用いて、超薄断片（厚さ２０〜３０ｎｍ）を得た。これらの断片を２００正方形メッシュニッケルグリッド上に置き、飽和酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛水溶液で対比染色し、次いで、Ｊｅｏｌ  ＪＥＭ−Ｉ００ＳＸ透過型電子顕微鏡で観察した。
【００７２】
実施例６：電気刺激するためのＢＮＮＴトランスデューサの超音波（ＵＳ）適用
この研究は、表１（下記）で報告する通りに計画した。ＢＮＮＴの内在化するＨＯＢまたはＢＮＮＴを内在化しないＨＯＢに超音波を暴露し、非暴露のコントロールと比較した。
【表１】
2012523452.tif 000010
【００７３】
２０Ｗ、５秒、１日あたり３回を１週間行うスキームでＵＳ刺激を行った。
【００７４】
刺激終了の際、試料をすべての群について３つずつ（３００，０００個の細胞／フラスコ）用いて、ＤＮＡおよび骨特異的生体分子（アルカリホスファテーシス(alkaline phosphatasis）およびオステオカルシン）の定量アッセイを行った一方、各群あたり１つの試料を用いて、ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現（Ｒｕｎｘ２、ＡＰ、オステオポンチン、コラーゲンＩ、オステオカルシン遺伝子）を調べた。さらに、他のＨＯＢ試料を、細胞化学研究（カルシウム沈着に対するＶｏｎＫｏｓｓａ染色）のためにスライド（２０，０００個の細胞／スライド）上で培養した。
【００７５】
実施例７：全ＲＮＡおよび逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）
全ＲＮＡを、ＨｉｇｈＰｕｒｅＲＮＡ単離キット（Ｒｏｃｈｅ、マンハイム、ドイツ）を用いて、製造元の指示に従って細胞培養物（１試料／群）から単離した。抽出したＲＮＡをジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ−水）で処理した水に再懸濁し、２６０ｎｍの吸収度を評価することによってＲＮＡ濃度を測定した。同一量のＲＮＡを、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｒｏｃｈｅ）を用いてｃＤＮＡに逆転写した
【００７６】
続いて、ｃＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。Ｒｕｎｘ２／ｃｂｆａ−１、アルカリホスファテーシス（ＡＰ）、オステオポンチン（ＯＰＮ）、コラーゲンＩ型及びＩＩ型（ＣｏＩＩ−Ｉ）、オステオカルシン（ＯＣＮ）、およびハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨの増幅に利用したＰＣＲ条件およびプライマーを表２に報告する。ＰＣＲ産物を２．５％アガロースゲル上に充填し、エチジウムブロミドで染色した。
【表２】
2012523452.tif 000011
【００７７】
実施例８：定量分析用の細胞試料の調製
以下のアッセイ（ＤＮＡおよびＯＣＮ含量）について、細胞試料をＴ２５フラスコ中で１週間培養した（ｎ＝３）。両アッセイを同じ試料で連続して行った。さらに、操作誤差を最小限にするために、個々の試料について３回ずつ実施した。簡単にいうと、培地を細胞試料から注意深く取り除き、ｄｄＨ２Ｏを添加した。次いで、試料を−２０℃で冷凍し、その後のアッセイ用に保存した。細胞溶解物を得るために、試料を２回の冷凍／解凍サイクルにかけた：一晩−２０℃で冷凍し、水浴中で３７℃で１０分間解凍し、続いて１５秒撹拌し、ＤＮＡおよびタンパク質を溶液中に入れた。
【００７８】
９．予備アッセイ
図１は、本発明を再生するための図式モデルを示している。
【００７９】
９．１．最初に、ＨＯＢをＢＮＮＴ含有培地に曝した。ＰＬＬを分散剤として用いて、培地中のＢＮＮＴの安定な分散液を得た。ＰＬＬは、正のアミノ末端基を有する細胞親和性ポリマーである。異なる濃度のＰＬＬ−ＢＮＮＴ（５、１０、および１５μｇ／ｍｌ）とともに２４、４８、７２時間インキュベーションを行った後、ＨＯＢ生存能はコントロールと区別されなかった（図２）。ＨＯＢは、使用濃度でのＰＬＬ−ＢＮＮＴともにインキュベートした後、代謝活性の統計的に有意な減少を示さなかった（すべの場合で、コントロールに関してｐ＞０．０５）。１０μｇ／ｍｌ用量を用いて、続いて実験を行った。
【００８０】
９．２．蛍光ＢＮＮＴでの蛍光アッセイにより、ヒト骨芽細胞におけるＢＮＮＴ内在化が、ＢＮＮＴ含有培地とともに細胞を６時間インキュベートした後に起こることが明確に示された（図３）。
【００８１】
９．３．ＨＯＢによるＢＮＮＴ内在化は、ＴＥＭによっても確認された。ＴＥＭ分析により、上記のＢＮＮＴに匹敵する形状およびサイズを有する無機ナノ粒子が、処置した細胞試料のみの細胞質小胞中で検出し得ることが明確に示された（図４）。内在化は、エンドサイトーシスによって起こる。
【００８２】
１０．ＨＯＢ培地物でのナノトランスデューサーおよびＵＳの効果
１０．１ＤＮＡ含量
細胞溶解物中の二重鎖ＤＮＡ（ｄｓ−ＤＮＡ）含量を、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、ユージン、オレゴン州）を用いて測定した。ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ色素はｄｓ−ＤＮＡに結合し、得られる蛍光強度は溶液中のｄｓ−ＤＮＡ濃度と正比例する。０〜６μｇ／ｍＬの範囲の濃度でのｄｄＨ２Ｏ中のＤＮＡ標準溶液を調製し、測定する５０μｌの標準物または試料を９６ウェルプレート中に充填して定量した。作業用緩衝液およびＰｉｃｏＧｒｅｅｎ色素溶液を製造元の指示に従って調製し、１００μｌ／ウェルおよび１５０μｌ／ウェルをそれぞれ添加した。暗所において室温でインキュベートした後、プレートリーダー（Ｖｉｃｔｏｒ３、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｉｎｃ．社、ＭＡ、米国）で励起波長４８５ｎｍおよび発光波長５３５ｎｍを用いて蛍光強度を測定した。細胞数を次の関係を考慮することによって計数した：１ヒト２倍体細胞＝７．１８ｐｇ  ＤＮＡ．
【００８３】
１０．２．オステオカルシン（ＯＣＮ）産生
オステオカルシン（γ−カルボキシグルタミン酸）は、骨芽細胞によって合成される特異性の高い骨タンパク質であり、これらの細胞に特異的な代謝活性マーカーとみなすことができる。酵素抗体ＥＬＩＳＡ  Ｎ−ＭＩＤ  オステオカルシンキット（Ｃｏｂａｓ、Ｒｏｃｈｅ、インディアナポリス、インディアナ州、米国）を用い、製造元の指示に従って、同じ溶解物を用いてＯＣＮを測定し、ＡＬＰ活性およびＤＮＡ含量を評価した。
【００８４】
１０．３．カルシウムマトリックスの細胞化学分析
ヒドロキシアパタイトマトリックスの沈着を実証するＶｏｎＫｏｓｓａ染色を用いて、ＨＯＢ成熟を調べた。スライド上で成長させたＨＯＢを１％ホルマリン（Ｂｉｏ−Ｏｐｔｉｃａ）を用いて４℃で１０分間固定し、１％硝酸銀（Ｆｌｕｋａ、ミルウォーキー、ウィスコンシン州、米国、およびＳｉｇｍａ）を用いて１５分間染色した。０．５％のピロガロール（Ｆｌｕｋａ）とともに細胞をインキュベートし、次いで、それらを５％のチオ硫酸ナトリウム（Ｆｕｌｋａ）ともに５分間、５回攪拌することによって染色を行った。最後に、細胞を０．１％のヌクレアファーストレッド（ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｓｔ  ｒｅｄ）色素（Ｆｌｕｋａ）で対比染色した。試料を乾燥し、ＤＰＸ（Ｆｌｕｋａ）でマウントした。光学顕微鏡法を用いることにより、鉱物の沈着を黒色の顆粒として評価した。
【００８５】
１０．４．統計的分析方法
データ分析を分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって行い、続いて有意性を試験するためのスチューデントのｔ−試験を行い、これは５％ＭＴＴに設定した。ＭＴＴ試験は２回ずつ行い、他のすべてのアッセイは３回ずつ行った。すべての場合において、３つの独立した実験を行った。結果は、平均値±標準誤差（ＳＥＭ）として表わす。
【００８６】
１０．５．結果
のようにして、ＨＯＢ細胞（ＨＯＢ）をＢＮＮＴ＋ＵＳの組み合わせた刺激で１週間処置した。
【００８７】
特に初期（Ｒｕｎｘ２、コラーゲンＩ、ＡＰ、ＯＰＮ）および後期（ＯＰＮ、ＯＣＮ）分化のＨＯＢ成熟を示す遺伝子発現をＲＴ−ＰＣＲによって調べた。ＯＰＮは、増殖段階の初期であり、かつ、石化（mineralization)の開始における後期であり得る、二峰性（bimodal）発現を有する。結果を図５に報告する。ＲＴ−ＰＣＲによる増幅により、単一の処置（ＢＮＮＴまたはＵＳ）または組み合わせた処置（ＢＮＮＴおよびＵＳ）の結果としてのＨＯＢ分化に対する電気刺激の効果が明確に示された。具体的に、Ｒｕｎｘ２は、ＢＮＮＴによって低下することが見出された一方、ＯＰＮ発現レベルはＵＳによって刺激された。コラーゲンＩの発現は変わらなかったが、ＡＰおよびＯＣＮの発現はＢＮＮＴ＋ＵＳの組み合わせた処置によって相乗的に影響された。特に、ＡＰは、ＵＳによってＢＮＮＴよりも低下し、組み合わせた処置（ＢＮＮＴ＋ＵＳ）によってその発現がさらに低減された。逆に、ＯＣＮの発現は個々の処置のいずれによっても刺激され、さらに、組み合わせた処置（ＢＮＮＴ＋ＵＳ）後に最大レベルに達する。
【００８８】
さらに、遺伝子活性化に続く、骨芽細胞の後期に非常に特異的であるタンパク質であるＯＣＮの合成を定量した（図６）。ＨＯＢでのＯＣＮ合成は、ＵＳによる単一の処置によってわずかに増加し、ＢＮＮＴによる単一の処置で大幅に増加した。ＢＮＮＴ＋ＵＳの組み合わせた処置の結果、細胞中のＯＣＮ産生は最大となり、相乗効果が明確に示された。
【００８９】
最後に、スライド上へのｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色による細胞化学分析により、組み合わせた処置を受けた試料におけるカルシウム沈着（黒色染色）の合成が最も高かったことが示された（図７）。カルシウムマトリックスの沈着は、成熟後期としての成熟骨芽細胞で起こった。
【００９０】
結論
本発明者らの注目すべき結果により、組み合わせた処置は、単に個々の刺激の合計によるものではない特定の方法で細胞系に影響を及ぼすことが明確に示される。特に、ＢＮＮＴ＋ＵＳで処置した試料では、初期遺伝子（Ｒｕｎｘ２、ＡＰ）のダウンレギュレーションおよび後期遺伝子（ＯＰＮおよびＯＣＮ）のアップレギュレーションが観察された。ＯＣＮは、成熟骨芽細胞の分化および石化の進行を示す骨形成の後期に特異性の高いマーカーである。このＯＣＮ産生を定量化し、２７ｆｇ／細胞であることが見出されれた。最後に、細胞化学により、カルシウム沈着の誘発が示された。したがって、ＢＮＮＴは、超音波刺激後にｉｎ  ｖｉｔｒｏでの骨芽細胞の成熟を促進する細胞内のナノトランスデューサーとして働くと結論できる。
【００９１】
実施例１１：窒化ホウ素ナノチューブを含むグリコール−キトサンポリマー（ＧＣ−ＢＮＮＴ）の調製
ＢＮＮＴを、the Nano and Ceramic Materials Research Center, Wuhan Institute of Technology（中国）から購入した。（供給元によって提供される）試料の純度および組成の詳細は、収率＞８０％、窒化ホウ素９８．５重量％を含む。
【００９２】
ＢＮＮＴの分散および安定化のために用いるポリマーは、グリコールキトサン（Ｇ−キトサン８１３３９、Ｓｉｇｍａから購入、コードＧ７７５３）とした。すべての実験をリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）中で行った。簡単に言うと、ＢＮＮＴ（５ｍｇ）をポリスチレンチューブ中の１０ｍｌの０．１％Ｇ−キトサン溶液中に混合した。試料を、２０Ｗの出力を用いて１２時間超音波処置し（Ｂｒａｎｓｏｎｉｃ超音波発生装置２５１０による）、これにより、ＢＮＴＴナノチューブ壁がＧ−キトサンの非共有結合コーティングを有する、安定なＧ−キトサン−ＢＮＮＴ分散液が得られた。したがって、得られた分散液は、ＬＩＢＲＡ  Ｓ１２分光光度計ＵＶ／Ｖｉｓ／ＮＩＲ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）を用いて分光学的分析によって特徴付けした。ＢＮＮＴ分散液の顕微写真を、ＦＥＩ  ２００  ＦＩＢ顕微鏡およびＺｅｉｓｓ  ９０２  ＴＥＭを用いて得た。
【００９３】
実施例１２：  窒化ホウ素ナノチューブを含むグリコール−キトサンポリマー（ＧＣ−ＢＮＮＴ）調製物で修飾された培地とともにインキュベートしたＰＣ１２細胞を用いたＭＴＴアッセイ
生存能試験のため、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド、Ｍ−２１２８、Ｓｉｇｍａから入手）細胞成長アッセイを、ＰＣ１２細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ−１７２１）について、０〜１００μｇ／ｍｌで含まれるＢＮＮＴ最終濃度を含むＧＣ−ＢＮＮＴ分散液で修飾された培地とともに２４、４８、７２時間インキュベートした後に行った。トリプシン化処理およびＢｕｒｋｅｒチャンバーでの細胞計数後、ＨＯＢを６つの９６ウェルプレートに播いた。接着を確認したら（播種後約６時間）、細胞をＭＴＴ０．５ｍｇ／ｍｌとともに２時間インキュベートした。次いで、１００μｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、Ｓｉｇｍａ）を各ウェルに添加し、５５０ｎｍでの吸収度をＶＥＲＳＡＭａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で測定した。参照コントロール試験（ｋ−；ＢＮＮＴ非存在下で培養した細胞）を行った。
【００９４】
実施例１３：  ＰＣ１２細胞での窒化ホウ素ナノチューブを含むグリコール−キトサンポリマー（ＧＣ−ＢＮＮＴ）調製物の内在化試験
ＧＣ−ＢＮＮＴ分散液の内在化の研究をＰＣ１２細胞系（ＡＴＣＣＣＲＬ−１７２１）に対して行った。ＰＣ１２細胞を、１０％ウマ血清、５％ウシ胎仔血清、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、および２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを含むダルベッコ修飾培地で培養した。細胞を３７℃で維持した（すなわち９５％空気／５％ＣＯ２）。
【００９５】
ナノチューブ（ＧＣ−ＢＮＮＴ）の内在化をＴＥＭ（透過型電子顕微鏡法）によって分析した。ＰＣ１２細胞を培養し、２×１０６細胞／Ｔ２５プレートの濃度にした。接着後、細胞をＧＣ−ＢＮＮＴを含有するＣＭとともに１２時間インキュベートし、５μｇ／ｍｌの最終濃度とした。細胞をＣＭから取り除いた後に遠心分離し、４℃で２時間、ＰＢＳ（０．１Ｍ、ｐＨ７．２）中の０．５％ｗ／ｖグルタルアルデヒド−４％ｗ／ｖホルムアルデヒド溶液で固定した。洗浄後、試料を１時間、１％ｗ／ｖＯｓＯ４  ＰＢＳ（０．１Ｍ、ｐＨ７．２）中で後固定し、洗浄し、酸性化アセトン−ジメチルアセタール（Ｆｌｕｋａ、Ｂｕｃｈｓ、スイス）で乾燥した。最後に、試料をＢＥＥＭ＃００カプセル（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｐｒｏｂｅ、ウエストチェスター、米国）中のＥｐｏｎ／Ｄｕｒｃｕｐａｎ樹脂に５６℃で４８時間包埋した。ダイヤモンド・ナイフ（Ｄｉａｔｏｍｅ、ビール / ビエンヌ、スイス）を備えたＵｌｔｒｏｔｏｍｅ  Ｎｏｖａウルトラミクロトーム（ＬＫＢ、ブロンマ、スウェーデン）を用いて、超薄断片（厚さ２０〜３０ｎｍ）を得た。これらの断片を２００正方形メッシュニッケルグリッド上に置き、飽和酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛水溶液で対比染色し、次いで、Ｚｅｉｓｓ  ９０２透過型電子顕微鏡で観察した。
【００９６】
実施例１４：ＰＣ１２細胞刺激実験
ＰＣ１２細胞を平板培養し、標準の培養条件で２４時間保存した。次いで、標準のＣＭを、２％ウシ胎仔血清、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、および６０ｎｇ／ｍｌの濃度のＮＧＦ（ＳＩＧＭＡから購入）を含む分化培地に置き換えた。このように調製した細胞を並行して行った４つの実験で用いた：１）超音波（ＵＳ）刺激を行わず、分化培地中で細胞培養する、２）ＵＳ刺激を行って、分化培地で細胞培養する、３）ＧＣ−ＢＮＮＴ（５μｇ／ｍｌ）を含む培地の存在下で細胞培養する、４）ＵＳ刺激を行って、ＧＣ−ＢＮＮＴ（５μｇ／ｍｌ）を含む培地の存在下で細胞を培養する。Ｂｒａｎｓｏｎｉｃ  ２５１０超音波発生装置を利用して、２０Ｗ、４０ｋＨｚ、５秒、４回／日、５日間の刺激を用いた。
【００９７】
４つの各実験について、５０個超の細胞を２μＭカルセインで標識し、分化、神経突起の長さ、細胞あたりの神経突起の数の評価についてデジタル画像によって分析した。
【００９８】
実施例１５：ＰＣ１２細胞刺激実験から得られた結果
上記のように、ＰＣ１２細胞をＧＣ−ＢＮＮＴおよび超音波（ＵＳ）の組み合わせた刺激で５日間処置した。４つの各実験において、細胞分化における有意差は検出されず（図１０ａ）、すべての細胞は９５％分化に達し、統計的有意差はなかった（ｐ＞０．０５）。図６ｃは、ＧＣ−ＢＮＮＴとともにインキュベートし、かつ、超音波で刺激された細胞の群が、他の群よりも大きい平均の神経突起の長さを有することを示している。これらの結果は、ナノチューブを含むポリマーの存在下でインキュベートした細胞の超音波刺激が、神経細胞における神経突起の顕著な成長を決定することを明らかに示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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