(57)【要約】本発明は、概して、食品と飲料の分野に関する。特に、例えば、酒石酸及び／又はコーヒー酸を対象に供給することを可能にする組成物を提供する。本発明の一実施形態は、チコリ酸及び／又はその誘導体を含有する素材と、チコリ酸及び／又はその誘導体を加水分解し、酒石酸及び／又はコーヒー酸を生成することが可能な乳酸菌とを含む組成物である。【選択図】なし
2012515541.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
チコリ酸及び／又はその誘導体を含有する素材と、チコリ酸及び／又はその誘導体を加水分解し、酒石酸及び／又はコーヒー酸を生成することが可能な乳酸菌とを含む組成物。
【請求項２】
タンパク源、糖質源、及び／又は脂質源をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
タンパク源が乳タンパク及び／又は植物性タンパクを含み、脂質源が乳脂肪及び／又は植物性脂肪を含み、及び／又は、糖質源が乳糖及び／又は植物性糖質を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
食製品、補助食品、若しくは飲料、又は非経口的適用のための組成物である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
粉末の形態である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
チコリ酸及び／又はその誘導体を加水分解し、酒石酸及び／又はコーヒー酸を生成することが可能な乳酸菌が、クロロゲン酸エステラーゼ活性及び／又はフェルロイルエステラーゼ活性などのエステラーゼ活性を有するプロバイオティック乳酸菌である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
乳酸菌が、Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ及びＢ．Ｌａｃｔｉｓ、特に、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ（ＣＮＣＭ  Ｉ−１２２５）、Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ  ＢＢ５３６、Ｂ．ｌａｃｔｉｓ（ＣＮＣＭ  Ｉ−３４４６）及びＢ．ｌａｃｔｉｓ  ＢＢ１２からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
チコリ酸含有素材が、レタス、チコリ、タンポポ、ブドウ、ブドウの搾りかす、又はその組み合わせ若しくは抽出物などの自然食品である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
チコリ酸を加水分解し、酒石酸及び／又はコーヒー酸を生成することが可能な酵素をさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
特に、細菌及び／又はウイルス感染症に関連する炎症性障害の治療又は予防、ヒト又は動物における抗酸化能力の増強、酸化ストレス関連障害の治療又は予防、糖尿病などの代謝障害の治療又は予防、骨密度に関連する障害の治療又は予防、及び／又は、癌の治療又は予防を行う組成物の調製のための請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項１１】
チコリ酸及び／又はその誘導体を含有する組成物における、チコリ酸及び／又はその誘導体を加水分解し、酒石酸及び／又はコーヒー酸を生成することが可能な乳酸菌の使用。
【請求項１２】
チコリ酸及び／又はその誘導体を加水分解し、酒石酸及び／又はコーヒー酸を生成することが可能な乳酸菌が、クロロゲン酸エステラーゼ活性及び／又はフェルロイルエステラーゼ活性などのエステラーゼ活性を有するプロバイオティック乳酸菌である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
組成物が、請求項１〜７のいずれか一項に記載の食品組成物である、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１４】
食製品又は補助食品又は飲料を調製するためのキットであって、
ａ）チコリ酸及び／又はその誘導体含有の食品素材を含む第１部分と、
ｂ）チコリ酸及び／又はその誘導体を加水分解し、酒石酸及び／又はコーヒー酸を生成することが可能な乳酸菌を含む第２部分
の少なくとも２つの部分を含むキット。
【請求項１５】
チコリ酸及び／又はその誘導体を加水分解し、酒石酸及び／又はコーヒー酸を生成することが可能な乳酸菌が、クロロゲン酸エステラーゼ活性及び／又はフェルロイルエステラーゼ活性などのエステラーゼ活性を有するプロバイオティック乳酸菌である、請求項１４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、食品及び飲料の分野に関する。特に、例えば、酒石酸及び／又はコーヒー酸を対象に供給することを可能にする組成物を提供する。本発明の一実施形態は、チコリ酸及び／又はその誘導体を含有する素材と、チコリ酸及び／又はその誘導体を加水分解し、酒石酸及び／又はコーヒー酸を生成することが可能な乳酸菌とを含む組成物である。
【背景技術】
【０００２】
コーヒー酸（ＣＡ）は、腫瘍縮小特性を有することが示された。ＣＡの皮下投与及び経口投与は、肝転移を著しく減少させた。これらの結果により、ＣＡの治療可能性が裏付けられ、ＣＡの抗転移効果及び抗腫瘍効果が、ＭＭＰ−９酵素活性の選択的抑制と、ＮＦ−κＢ並びにＭＭＰ−９触媒活性の二重阻害による転写下方制御を介して仲介されることが示唆される。［Ｔａｅ−Ｗｏｏｋ  Ｃｈｕｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ．２００４；１８：１６７０−１６８１］
【０００３】
コーヒー酸の誘導体であるコーヒー酸フェネチルエステル（ＣＡＰＥ）は、抗分裂促進、抗腫瘍形成、抗炎症及び免疫調節特性を有することが知られている。［Ｎａｔａｒａｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１９９６  Ａｕｇｕｓｔ  ２０；９３（１７）：９０９０−９０９５］ＣＡＰＥはまた、急性の免疫反応及び炎症反応を抑制する。［Ｏｒｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＮｅｕｒｏｌｍｍｕｎｏＭｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ２０００；７：９９−１０５］
【０００４】
抗炎症及び抗癌特性により、紫外線（ＵＶ）、特に、ＵＶＣ線［ＮＥＲＡＤＩＬ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｆｏｌｉａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ（Ｐｒａｈａ）．２００３；４９：１９７−２０２］及びＵＶＢ線に暴露された場合に、皮膚細胞が保護されることも示された。［Ｓｔａｎｉｆｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２００６  ２７（９）：１８０３−１８１１］
【０００５】
酒石酸により、以下の保健上の利点が得られることが知られている。すなわち、便軟化剤を増し、腸管通過時間を減少させることができ（Ｓｐｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ（２００３），９０，８０３−８０７）、酸塩基状態に関与し得る（Ｓａｂｂｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７），９８，７２−７７）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、上記の利点を生み出すために、コーヒー酸及び／又は酒石酸を含む食製品を利用できれば望ましかろう。しかし、これらの化合物は、経時的に活性を失う恐れがあるので、単にコーヒー酸及び／又は酒石酸で食料品を補充するだけでは理想的とはならないであろう。
【０００７】
したがって、コーヒー酸及び／又は酒石酸を対象に提供することができる貯蔵安定性があり、製造が容易な食料品を調製することが、本発明の目的であった。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、前駆物質であるチコリ酸及び／又はその誘導体から、コーヒー酸及び／又は酒石酸をｉｎ  ｓｉｔｕで生成することが可能な食品組成物を提供することによって、この目的を達成することができる。
【０００９】
チコリ酸は、
【化１】
2012515541.tif 000003
であり、チコリ酸の誘導体は、
【化２】
2012515541.tif 000004
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及び／又はＲ４は、同一でもよく、互いに異なっていてもよい。
を含む。
【００１０】
一実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及び／又はＲ４は、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、フェニル、ベンジル、トリル、ｏ−キシリルアルキルなどのアリール、Ｃ１〜Ｃ３アシル、アミノ酸及び単糖類、二糖類又はオリゴ糖類からなる群から選択される。オリゴ糖類は、２〜９の単糖ユニットを含む。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、同一でもよく、互いに異なっていてもよい。
【００１１】
チコリ酸の典型的な誘導体は、例えば、以下の化合物である：
【化３】
2012515541.tif 000005
【００１２】
次に、チコリ酸及び／又はその誘導体は、チコリ酸及び／又はその誘導体を加水分解することが可能な乳酸菌によって、加水分解され得る。この加水分解ステップは、酒石酸及び／又はコーヒー酸を生成することとなる。
【００１３】
理論に縛れることを望まないが、本発明者らは、この加水分解は以下のスキームで説明されるように生じていると考える。「酵素」によって触媒されるすべての反応ステップは、本願に記載される乳酸菌及び／又は乳酸菌及び酵素の組み合わせによっても触媒され得ることに注意されたい。
【化４】
2012515541.tif 000006
【００１４】
本発明者らは、驚いたことに、チコリ酸及び／又はその誘導体を含む素材を、チコリ酸及び／又はその誘導体を加水分解して酒石酸及び／又はコーヒー酸を生成することが可能な乳酸菌で処理することにより、例えば、該素材の抗酸化及び／又は抗炎症特性が改良されることを見出した。
【００１５】
さらに、ヒト又は動物が、クロロゲン酸を加水分解してフェノール酸を生成することが可能な乳酸菌と組み合わせて、チコリ酸及び／又はその誘導体を含む組成物を経口摂取する場合に、この処理がｉｎ  ｖｉｖｏで行われ得ることを見出した。
【００１６】
したがって、本発明の一実施形態は、チコリ酸及び／又はその誘導体を含有する素材と、チコリ酸及び／又はその誘導体を加水分解し、酒石酸及び／又はコーヒー酸を生成することが可能な乳酸菌とを含む組成物である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】クロロゲン酸エステラーゼを用いたチコリ酸（黒ダイヤ）のコーヒー酸（黒三角）及びカフタル酸（黒丸）への加水分解を示す図である。
【図２】Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉの噴霧乾燥調製物を用いたチコリ酸（黒ダイヤ）のコーヒー酸（黒三角）及びカフタル酸（黒丸）への加水分解を示す図である。
【図３】チコリ酸で処理したＡＲＥｃレポーター細胞株の結果を示す図である。
【図４】Ｌａ１で加水分解したチコリ酸で処理した、ＡＲＥｃレポーター細胞株の結果を示す図である。黒四角は５０％加水分解であり、白四角は１００％加水分解である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の組成物は、好ましくは、食製品、補助食品若しくは飲料として経口投与、又は非経口的適用を目的とし得る。
【００１９】
好ましい実施形態では、該素材は、チコリ酸及び／又はその誘導体に富んでいる。例えば、該素材及び／又は該組成物は、チコリ酸及び／又はその誘導体を、乾燥重量の０．００１〜９９．９９重量％、好ましくは、乾燥重量の０．１〜５０重量％、最も好ましくは、乾燥重量の０．１〜１０重量％の範囲の量で含むことができる。該素材及び／又は該組成物は、チコリ酸及び／又はその誘導体を加水分解し、酒石酸及び／又はコーヒー酸を生成することが可能な乳酸菌を、乾燥重量の０．００１〜９９．９９重量％、好ましくは、乾燥重量の０．１〜５０重量％、最も好ましくは、乾燥重量の０．１〜１０重量％の範囲の量で含むことができる。
【００２０】
例えば、本発明の組成物は、チコリ酸及び／又はその誘導体を含有する素材と、チコリ酸及び／又はその誘導体を加水分解し、酒石酸及び／又はコーヒー酸を生成することが可能な乳酸菌を含む別の素材とを含むことができる。
【００２１】
チコリ酸及び／又はその誘導体を含有する素材は、チコリ酸及び／又はその誘導体を、自然に又は添加された形で含有するいずれの素材でもよいが、レタス、チコリ、タンポポ、ブドウ、ブドウ搾りかす、又はその組み合わせ、若しくは抽出物などの自然食品であることが好ましい。
【００２２】
チコリ酸及び／又はその誘導体を含有する素材と混合する素材は、チコリ酸及び／又はその誘導体を加水分解し、酒石酸及び／又はコーヒー酸を生成することが可能な乳酸菌を含む。これら２つの素材は、摂取前に軽く混合されてもよいし、直ぐに摂取できる組成物として供給されてもよい。
【００２３】
チコリ酸及び／又はその誘導体を加水分解し、酒石酸及び／又はコーヒー酸を生成することが可能な好ましい乳酸菌は、クロロゲン酸エステラーゼ及び／又はフェルロイルエステラーゼなどのエステラーゼ活性を有するプロバイオティック乳酸菌であり、好ましくは、例えば、Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ、及びＢ．ｌａｃｔｉｓ（ＣＮＣＭ  Ｉ−３４４６）、さらに好ましくは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ  Ｌａ１（ＣＮＣＭ  Ｉ−１２２５）、Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ  ＢＢ５３６、及びＢ．ｌａｃｔｉｓ  ＢＢ１２などのラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）又はビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）である。
【００２４】
Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ  ＢＢ５３６は、Ｍｏｒｉｎａｇａ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｏｄｓ，Ｉｎｃ．から市販されている。
【００２５】
Ｂ．ｌａｃｔｉｓ  ＢＢ１２は、例えば、Ｃｈｒ．Ｈａｎｓｅｎ、ＤＫ−２９７０  Ｈｏｒｓｈｏｌｍから市販されている。
【００２６】
本発明の一実施形態では、乳酸菌は、非複製型で使用され得る。
【００２７】
チコリ酸及び／又はその誘導体を加水分解し、酒石酸及び／又はコーヒー酸を生成するための乳酸菌又はその一部の能力は、実施例２、３及び／又は４で、Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ（Ｌａ１）に関して詳細に記述している通りに試験され得る。
【００２８】
該乳酸菌は、消化の間に、酒石酸及び／又はコーヒー酸を生成するためにかなりの量のチコリ酸を加水分解するのに十分な量で存在すべきである。必要とされる乳酸菌及び／又は酵素の量は、例えば、治療される対象、又は酒石酸及び／又はコーヒー酸が遊離されるべき速さに応じて、例えば当業者によって決定され得る。好ましくは、該組成物中に含まれるチコリ酸のうち少なくとも５％（例えば、少なくとも３０％、少なくとも５０％、又は少なくとも７５％など）が、摂取の前及び／又は摂取の最中に加水分解される。
【００２９】
別の実施形態では、チコリ酸を加水分解し、酒石酸及び／又はコーヒー酸を生成することが可能な酵素が、さらに乳酸菌に添加される。好ましくは、こうした酵素は、クロロゲン酸エステラーゼ、タンナーゼ及び／又はフェルロイルエステラーゼなどのエステラーゼからなる群から選択される。こうした酵素は、該組成物に存在するチコリ酸のうち、好ましくは、少なくとも５％（例えば、少なくとも３０％、少なくとも５０％、又は少なくとも７５％など）が、摂取の前及び／又は摂取の最中に加水分解されるような量で添加され得る。
【００３０】
本発明の枠組みで使用することができる適切な酵素には、例えば、アスペルギルスジャポニカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）（キッコーマン株式会社、日本から市販されている）由来のクロロゲン酸エステラーゼ、アスペルギルスオリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  Ｏｒｙｚａｅ）由来のタンナーゼ（ＥＣ  ３．１．１．２０）（キッコーマン株式会社、日本から市販されている）、及びパラターゼ２００００Ｌ（ＥＣ  ３．１．１．３）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ、デンマークから市販されている）などのエステラーゼなどが含まれる。該酵素は、精製酵素として、又は、例えば、微生物の細胞可溶化物の形で存在することができる。適切な細胞としては、例えば、上で言及した微生物の細胞とすることができる。細胞可溶化物を生成するための適切な方法は、当技術分野で知られている。
【００３１】
本発明の組成物及び／又は素材は、乳酸菌株が保管中に発酵しないように、又は保管中に該組成物と反応しないように処方すべきである。このことは、例えば、乾燥粉末として組成物を処方することによって、及び／又は該組成物が少なくとも一つの他の素材と混合された時、又は消化の最中にのみ、乳酸菌が放出されるように、乳酸菌をカプセル化することによって、達成され得る。
【００３２】
本発明の組成物は、完全栄養処方食、乳製品、冷蔵又は常温保存可能な飲料、授乳中の母親用の食品、液体飲料、スープ、健康補助食品、代替食、栄養バー、菓子、ミルク又は発酵乳製品、ヨーグルト、粉ミルク、経腸栄養剤、乳児用調製粉乳、乳児用の栄養食品、ピューレ、シリアル製品又は発酵穀物製品、アイスクリーム、キャンディー、スイーツ、ビスケット、ケーキ、チョコレート、カプチーノ、コーヒー、調理製品（マヨネーズ、トマトピューレ又はサラダドレッシングなど）、ペットフード又はペット飲料とすることができる。
【００３３】
製品が経口投与のための栄養補助食品である場合は、カプセル、ゼラチンカプセル、ソフトカプセル、錠剤、糖衣錠、丸剤、ペースト剤又は香錠、ガム、又は、飲料溶液若しくはエマルション、シロップ、又はゲルの中に含有させることができる。こうした補助食品は、甘味料、安定剤、抗酸化剤、添加剤、調味料及び／又は着色料も含むこともある。
【００３４】
個々の素材は、いかなる種類の食用の化合物をも含むことができる。特定の飲料における食品組成物のための典型的な素材は、当技術分野で周知である（例えば、ミルク、クリーム、コーヒーホワイトナー、及びコーヒー用クリーム）。或いは、素材を、例えば、サラダドレッシング又はその一部とすることもできる。こうした化合物は、例えば、組成物の香り、外観及び食感などを修正するために、消費者によって使用される。該素材は、液体又は乾燥した形態とすることができる（例えば、飲料に溶解及び／又は懸濁される粉末として）。
【００３５】
本発明の組成物は、食品組成物中に含有されるのに適した素材をさらに含むことができる。通常の素材は、例えば、糖、人工甘味料、乳化剤、安定剤、増粘剤、流動剤、着色料、調味料、香料などとすることができる。適切な人工甘味料としては、サッカリン、チクロ、アセトスルファム、アスパルテームなどのＬ−アスパルチル系の甘味料、及びこれらの混合物が挙げられる。適切な乳化剤としては、モノグリセリド、ジグリセリド、レシチン、モノジグリセリドのジアセチル酒石酸エステル、乳化デンプン、及びその混合物が挙げられる。適切な安定剤としては、リン酸二カリウム及びクエン酸ナトリウムが挙げられる。適切な流動剤は、アルミノケイ酸ナトリウムである。一実施形態では、該組成物は、乳タンパク質及び／又は植物性タンパク質を含む。さらなる一実施形態では、該組成物は、乳脂肪及び／又は植物性脂肪を含む。
【００３６】
本発明の組成物は、タンパク質、糖質源、及び／又は脂質源を含むことができる。該組成物が、完全食又は代替食として使用されることを意図する場合には、該組成物は、治療される対象にとって必要とされる栄養が満たされるように、タンパク源、糖質源、及び脂質源を含むことが好ましい。
【００３７】
最高の栄養価を保証するために、例えば、タンパク源は、乳タンパク及び／又は植物性タンパクを含むことができ、脂質源は、乳脂肪及び／又は植物性脂肪を含むことができ、及び／又は、糖質源は、乳及び／又は植物性糖質を含むことができる。
【００３８】
さらに、該組成物は、例えば、ＵＳＲＤＡなどの政府機関の推奨に従って、経口又は経腸投与のために適した有機又は無機担体材料、並びにビタミン、ミネラルの微量元素及び他の微量栄養素を含むことができる。
【００３９】
一実施形態では、本発明は、ａ）チコリ酸及び／又は誘導体抽出物を含む乾燥した水溶性組成物と、ｂ）チコリ酸及び／又はその誘導体を加水分解し、酒石酸及び／又はコーヒー酸を生成することが可能な乳酸菌とを含む粉末飲料に関する。
【００４０】
本発明による粉末飲料は、粉末を液体（例えば、水又はミルク）中に溶解又は懸濁させることによって、飲料の調製のために使用される粉末である。
【００４１】
本発明の生成物は、例えば、Ｎｒｆ２媒介遺伝子発現経路を増加させること、すなわち、グルタチオン−Ｓ−転移酵素（ＧＳＴ）などの解毒酵素を誘導することによって、例えば、本発明の生成物から調製される飲料を摂取するヒト又は動物のｉｎ  ｖｉｖｏでの抗酸化能力を向上させるために使用され得る。Ｎｒｆ２関連遺伝子の活性の増加により、解毒作用が向上し、酸化ストレスに対する内因性防御を刺激することが報告されている。
【００４２】
本発明の組成物は、例えば、プロスタグランジンＥ２レベルを低下させることによって、例えば、炎症を減少させるために使用され得る。
【００４３】
多くの健康問題及び障害、特に加齢性の障害は、酸化ストレス及び炎症と関連している。本発明の生成物は、本発明の生成物から調製される飲料を摂取するヒト又は動物におけるこうした問題又は障害を治療又は予防するために使用され得る。関連する問題及び障害は、例えば、脳障害、炎症、肥満、及び癌である。
【００４４】
本発明の組成物は、さらに、例えば、血糖値を低下させ、及び／又は、レプチン、インスリン及び／又はＣ−ペプチドの血中レベルを上昇させることによる抗糖尿病薬、例えば、骨密度を増加させることによる、例えば、エストロゲン及び／又はプロゲステロン及び／又はアルカリホスファターゼ活性の血清レベルを増加させることによる骨リモデリング薬、例えば、抗血管新生作用を有する抗転移薬として使用され得る。
【００４５】
したがって、本発明の一実施形態は、特に細菌及び／又はウイルス感染症と関連する炎症性障害の治療又は予防、ヒト又は動物の抗酸化能力の増強、酸化ストレス関連障害の治療又は予防、糖尿病などの代謝障害の治療又は予防、骨密度に関連する障害の治療又は予防、或いは、癌の治療又は予防を行う組成物の調製を目的とした、本明細書に記載するような組成物の使用である。
【００４６】
一実施形態では、本発明は、食製品、例えば、少なくとも２つの部分、すなわち、ａ）チコリ酸及び／又はその誘導体含有の食品素材を含む第１部分と、ｂ）チコリ酸及び／又はその誘導体を加水分解し、酒石酸及び／又はコーヒー酸を生成することが可能な乳酸菌を含む第２部分とを含む飲料を調製するためのキットに関する。この２つの部分は、食製品、例えば、飲料の調製のために一緒に販売され得るが、該製品を容器に入れる時に、物理的に分離され得る。摂取され得る最終的な食製品は、摂取の直前に、２つの部分を混合することによって調製され得る。一方又は両方の部分が、液体の形態である場合には、それらを直接混合することができ、任意選択でさらに液体（例えば水又はミルク）を添加することができる。２つの部分はまた、液体（例えば水又はミルク）中に、２つの部分を溶解させ、懸濁させることによって混合され得る。液体が使用される場合は、熱くても冷たくてもよい。熱い液体が使用される場合、食料品、補助食品又は飲料の摂取の前に、乳酸菌及びもしあれば酵素を失活させるほどには熱くはない温度とすることが好ましい。
【００４７】
該キットの第１部分は、チコリ酸及び／又はその誘導体を含有する食製品又は抽出物を含むことができる。好ましい一実施形態では、第１部分は乾燥した形態（例えば粉末の形態）である。第１部分は、液体の形態とすることもできる。加えて、第１部分は、他のいかなる適切な素材（例えば、芳香添加物、安定剤、塩、及び／又は甘味料）を含むことができる。第１部分は、いずれの適切な方法でも、例えば、小袋、瓶、又は缶の中に詰めることができる。
【００４８】
第２部分は、チコリ酸及び／又はその誘導体を加水分解し、酒石酸及び／又はコーヒー酸を生成することが可能な乳酸菌を含む。好ましくは、この第２部分は、第１部分と混合されるような組成物の形態とすることができる。この組成物の形態は、乾燥した形態（例えば粉末として）又は液体の形態とすることができ、いずれの適切な方法でも、例えば、小袋、瓶又は缶の中に詰めることができる。この組成物は、乳酸菌が、保管中に、発酵又は他の素材と反応しないように処方しなければならない。このことは、例えば、該組成物を、乾燥粉末として処方することによって、及び／又は、乳酸菌をカプセル化することによって、達成され得る。
【００４９】
少なくとも２つの部分を一緒に、いずれの適切な方法でも詰めることができる。これらの少なくとも２つの部分は、例えば、これらの部分が、保管中に、物理的に分離した状態を保ち、容器を開けた時に混合されるような複合容器に詰めてもよいし、食料品、補助食品又は飲料の調製のために、一緒に販売される別々の容器に入れられてもよい。
【００５０】
当業者は、開示しているような本発明の範囲から逸脱せずに、本明細書で記述している本発明の全ての特徴を自由に組み合わせることができることを理解されよう。特に、本発明の使用のために記述している特徴は、本発明の組成物及び／又はキットに適用することができ、逆もまたしかりである。
【実施例】
【００５１】
本発明のさらなる利点及び特徴は、以下の実施例と図から明らかである。
【００５２】
１．クロロゲン酸エステラーゼを用いたチコリ酸の加水分解
【００５３】
クロロゲン酸エステラーゼ（０．８ｍｇ、２４Ｕ／ｇ、キッコーマン株式会社、日本製）のリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）１００μｌ中の溶液を、チコリ酸（０．５７ｍｇ）のリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）１００μｌ中の溶液に添加した。次に、この混合物を３７℃で４時間インキュベートした。反応時間後、酵素活性を、熱処理（５分、９０℃）によって停止させ、混合物を遠心分離した（ｍｉｃｒｏｃｏｎ  ＹＭ１０、３０分、１４０００ｇ）。次に、上澄み液を、ＨＰＬＣによって分析した。酵素を含まないこと以外は同じ反応条件下で、対照反応を並行して行った。
【００５４】
２．Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ（Ｌａ１）の新鮮細胞を用いたチコリ酸の加水分解
【００５５】
Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ（ＣＮＣＭ  Ｉ−１２２５）の細胞を増殖させ（７．０  Ｅ０８  ｃｆｕ／ｍｌ）、遠心分離し（５０００ｇ、１０分）、ペレットを、リン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）中で、０．６１ｇ／ｍｌの濃度に再懸濁した。１００μｌのこの細胞溶液に、１００μｌのチコリ酸溶液（１２ｍＭ）を添加し、この混合物を３７℃でインキュベートした。様々な反応時間で試料を取り出し、遠心分離し（３０００ｇ、５分）、孔径０．４５μｍのシリンジフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＳＬＨＡ  ０２５  ＢＳ）を通して濾過し、ＨＰＬＣによって分析した。
【００５６】
細菌を含まないこと以外は同じ条件下で、対照反応を並行して行った。
【００５７】
３．Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ抽出物（溶解細胞）を用いたチコリ酸の加水分解
【００５８】
Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ（ＣＮＣＭ  Ｉ−１２２５）の細胞を増殖させ（７．０  Ｅ０８  ｃｆｕ／ｍｌ）、遠心分離し（５０００ｇ、１０分）、ペレットを、リン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）中で、０．６１ｇ／ｍｌの濃度に再懸濁した。次に、この細胞を、ガラスビーズ法を用いて溶解させた。６００μｌの調製細胞を、ミニビードビーター（Ｍｉｎｉ−Ｂｅａｄｂｅａｔｅｒ）に入れ、１分間激しく振盪させた後、氷中で冷却し、もう一度、ミニビードビーターに１分間入れた。次に、粗細胞抽出物（１００μｌ）を、１００μｌのチコリ酸溶液（１２ｍＭ、リン酸緩衝液５０ｍＭ、ｐＨ７．０）に添加し、この混合物を３７℃でインキュベートした。様々な反応時間で試料を取り出し、遠心分離し（３０００ｇ、５分）、孔径０．４５μｍのシリンジフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＳＬＨＡ  ０２５  ＢＳ）を通して濾過し、ＨＰＬＣによって分析した。
【００５９】
４．Ｌａ１の噴霧乾燥調製物を用いたチコリ酸の加水分解
【００６０】
１０ｍｇのＬａ１（３．３  Ｅ０９  ｃｆｕ／ｇ）の噴霧乾燥調製物を、１００μｌのリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）中に溶解させた。この溶液に、１００μｌのチコリ酸溶液（１２ｍＭ、リン酸緩衝液５０ｍＭ、ｐＨ７．０）を添加した。次に、この混合物を３７℃でインキュベートし、様々な反応時間で試料を取り出した。遠心分離（３０００ｇ、５分）と濾過（孔径０．４５μｍのシリンジフィルター、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＳＬＨＡ  ０２５  ＢＳ）の後に、ＨＰＬＣによって試料を分析した。
【００６１】
ＨＰＬＣ分析
【００６２】
チコリ酸及び加水分解生成物のＨＰＬＣ−ＤＡＤ分析は、Ａｔｌａｎｔｉｓ  Ｃ１８逆相カラム（４．６×１００ｍｍ、粒径３μｍ）とダイオードアレイ検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １１００システムで実施した。カラムは、０．１％のギ酸を含む水で平衡化した。注入後、５５％の水と４５％のアセトニトリル（０．１％のギ酸含有）の最終溶媒組成物までの直線勾配法を、流速１ｍｌ／分で１２分以内で行った。チコリ酸とコーヒー酸を、３２０ｎｍのＵＶによってモニターし、標準検量線を使用して定量化した。
【００６３】
５．ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験
【００６４】
抗酸化剤応答配列（ＡＲＥ）ルシフェラーゼアッセイ
【００６５】
ネオマイシン選択マーカーを含むｐｃＤＮＡ３．１プラスミドと共にラットグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼＡ２（ＧＳＴＡ２）中に存在するＡＲＥの８コピーを含むｐＧＬ−８×ＡＲＥを、ヒトＭＣＦ７細胞に安定に移入した（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６６，１０９８３−１０９９４，２００６）。ＡＲＥ（抗酸化剤応答配列）は、解毒と酸化ストレスに対する内因性防御に関与する遺伝子を制御する転写因子Ｎｒｆ２の結合部位である。プラスミドｐＧＬ−８×ＡＲＥは、Ｎｒｆ２活性をモニタリングすることを可能にする８個のＮｒｆ２結合部位の下流に位置するルシフェラーゼ遺伝子を含む。チコリ酸及び関連する化合物で処理するために、ＡＲＥｃ３２細胞を、ＤＭＥＭ培養培地を用いた９６穴マイクロタイタープレートに播種した。異なる調製物で２４時間処理した後、ホタルルシフェラーゼ活性を決定した。
【００６６】
結果
【００６７】
試験された細菌
【表１】
2012515541.tif 000007
【００６８】
特に、Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ（Ｌａ１）、Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ  ＢＢ５３６、及びＢ．Ｌａｃｔｉｓ  ＢＢ１２は、チコリ酸を加水分解することができた。反応速度と反応収率に関する最良の結果は、Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ（Ｌａ１）を用いて得られた。
【００６９】
試験された酵素
【表２】
2012515541.tif 000008
【００７０】
クロロゲン酸エステラーゼ及びフェルロイルエステラーゼのみ、チコリ酸をコーヒー酸及び酒石酸に加水分解することができた。
【００７１】
１．クロロゲン酸エステラーゼを用いたチコリ酸の加水分解
【表３】
2012515541.tif 000009
【００７２】
２．Ｌａ１の新鮮細胞を用いたチコリ酸の加水分解
【００７３】
ＨＰＬＣによって分析したところ、４時間の反応後、全てのチコリ酸がコーヒー酸に転換された。
【００７４】
３．Ｌａ１抽出物（溶解細胞）を用いたチコリ酸の加水分解
【００７５】
全細胞と比較して、溶解細胞を用いたチコリ酸の加水分解は、反応速度の上昇をもたらした。実際に、たった２時間後に、全てのチコリ酸がコーヒー酸に転換された。
【００７６】
４．Ｌａ１の噴霧乾燥調製物を用いたチコリ酸の加水分解
【表４】
2012515541.tif 000010
【００７７】
５．ｉｎｖｉｔｒｏ試験
【００７８】
抗酸化剤応答配列（ＡＲＥ）ルシフェラーゼアッセイ
ラットＧＳＴＡ２−ＡＲＥレポーター構成体のコピーを数個安定に移入したヒト乳癌細胞（ＡＲＥｃ３２）は、チコリ酸及び関連する化合物によるＮｒｆ２−ＡＲＥ経路の活性化を実証するために使用した。加水分解されなかったチコリ酸とＬａ１で加水分解されたチコリ酸（５０％及び１００％）は、高用量では飽和不活性化反応を示す、Ｎｒｆ２−ルシフェラーゼレポーター活性（表３、４参照）における正の用量依存性反応を生じた。
【表５】
2012515541.tif 000011
【表６】
2012515541.tif 000012
【図１】
2012515541.tif 000013
【図２】
2012515541.tif 000014
【図３】
2012515541.tif 000015
【図４】
2012515541.tif 000016
【国際調査報告】
2012515541.tif 000017
2012515541.tif 000018
2012515541.tif 000019
2012515541.tif 000020