【手続補正書】
【提出日】平成21年9月28日(2009.9.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の表現型を変化するための方法であって、
包括的な転写機構、および随意にそのプロモーターをコードする核酸を変異させること、
前記核酸を細胞に発現させ、変異した包括的な転写機構を含む、変化した細胞を提供すること、および、
前記変化した細胞を培養すること、
を含み、
随意に、変化した細胞の表現型を決定することをさらに含み、
随意に、核酸の変異を繰り返し、第ｎ世代の変化した細胞を産生することをさらに含み、好ましくは包括的な転写機構の変異の繰り返しのステップが、変異した包括的な転写機構をコードする核酸、および随意にそのプロモーターを変化した細胞から単離すること、前記核酸を変異させること、ならびに前記変異した核酸を別の細胞へと導入することを含み、
随意に、第ｎ世代の変化した細胞の表現型を決定することをさらに含み、
随意に、細胞が原核細胞であり、好ましくは原核細胞が細菌細胞または古細菌細胞であり、好ましくは包括的な転写機構がシグマ因子またはアンチシグマ因子であり、好ましくはシグマ因子をコードする核酸がｒｐｏＤ（σ７０）遺伝子、ｒｐｏＦ（σ２８）遺伝子、ｒｐｏＳ（σ３８）遺伝子、ｒｐｏＨ（σ３２）遺伝子、ｒｐｏＮ（σ５４）遺伝子、ｒｐｏＥ（σ２４）遺伝子またはｆｅｃＩ（σ１９）遺伝子であり、またはシグマ因子またはアンチシグマ因子が発現ベクターから発現され、
随意に、細胞が真核細胞であり、好ましくは真核細胞が酵母細胞、哺乳類細胞、植物細胞、昆虫細胞、幹細胞、または真菌細胞であり、随意に真核細胞が多細胞生物に含有され、
随意に、核酸が、細胞において組織特異性プロモーター、細胞特異性プロモーター、または細胞小器官特異性プロモーターから発現され、
随意に、包括的な転写機構が、ＲＮＡポリメラーゼＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、またはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ、あるいはＲＮＡポリメラーゼＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、またはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのプロモーターに結合し、好ましくは包括的な転写機構がＴＦＩＩＤまたはそのサブユニットであり、好ましくはサブユニットがＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）またはＴＢＰ関連因子（ＴＡＦ）、例えばＴＡＦ２５であり、好ましくは包括的な転写機構をコードする核酸が、ＧＡＬ１１遺伝子、ＳＩＮ４遺伝子、ＲＧＲ１遺伝子、ＨＲＳ１遺伝子、ＰＡＦ１遺伝子、ＭＥＤ２遺伝子、ＳＮＦ６遺伝子、ＳＮＦ２遺伝子またはＳＷＩ１遺伝子であり、好ましくは包括的な転写機構が、核酸メチルトランスフェラーゼ、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンアセチラーゼまたはヒストンデアセチラーゼであり、好ましくは包括的な転写機構が発現ベクターから発現され、
随意に、核酸が真核細胞の細胞小器官の核酸であり、好ましくは細胞小器官がミトコンドリアまたは葉緑体であり、
随意に、核酸が発現ベクターの一部であり、
随意に、核酸が核酸の集団の一員であり、好ましくは細胞に該集団を導入することをさらに含み、
随意に、核酸を発現させるステップが、核酸をゲノム中へと融合させること、または内因性の包括的な転写機構をコードする核酸を置換することを含み、
随意に、核酸の変異が核酸の指向進化を含み、好ましくは指向進化がエラープローンＰＣＲまたは遺伝子シャッフリングによる変異を含み、
随意に、核酸の変異が、核酸を１つまたは２つ以上の変異とともに合成することを含み、
随意に、核酸の変異が１つまたは２つ以上の点変異であり、
随意に、核酸の変異が１つまたは２つ以上の切断または欠失であり、好ましくは包括的な転写機構のプロモーター結合領域が、１つまたは２つ以上の切断または欠失によって中断または除去されず、
随意に、変異した包括的な転写機構が、非変異の包括的な転写機構に対して増加した遺伝子の転写を呈し、
随意に、変異した包括的な転写機構が、非変異の包括的な転写機構に対して低下した遺伝子の転写を呈し、
随意に、変異した包括的な転写機構が、非変異の包括的な転写機構に対して増加した遺伝子転写の抑制を呈し、
随意に、変異した包括的な転写機構が、非変異の包括的な転写機構に対して低下した遺伝子転写の抑制を呈し、
随意に、既定の表現型へと変化した細胞を選択することをさらに含み、好ましくは、選択のステップが、変化した細胞を選択条件下で培養することを含み、または好ましくは、選択のステップが表現型に対する個々の細胞のハイスループットアッセイを含み、または好ましくは、表現型が、有害な培養条件への増加した耐性であり、
随意に、表現型が溶媒耐性または有害廃棄物耐性であり、好ましくは溶媒がエタノール、ヘキサンまたはシクロヘキサンであり、
随意に、表現型が工業媒体への耐性であり、
随意に、表現型が高糖分濃度への耐性であり、
随意に、表現型が高塩分濃度または浸透圧ストレスへの耐性であり、
随意に、表現型が高温への耐性であり、
随意に、表現型が極度のｐＨへの耐性であり、
随意に、表現型が界面活性剤への耐性であり、
随意に、表現型が複数の有害な条件への耐性、好ましくは高糖分濃度および高エタノール濃度への耐性であり、
随意に、表現型が増加した代謝産生物産生であり、好ましくは代謝産生物がリコピンまたはエタノール、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）または治療用タンパク質であり、随意に、治療用タンパク質が抗体または抗体断片であり、
随意に、表現型が毒性基質、代謝中間体または産生物に対する耐性であり、好ましくは毒性代謝産生物が有機溶媒、酢酸またはパラ−ヒドロキシ安息香酸（ｐＨＢＡ）、または過剰発現したタンパク質であり、
随意に、表現型が抗生物質抵抗性であり、
随意に、表現型がアポトーシスに対する増加した抵抗性であり、
随意に、細胞が多細胞物に含有され、好ましくは表現型が、１つまたは２つ以上の成長特性、世代時間、１つまたは２つ以上の疫病または疾患に対する抵抗性、植物の果実またはその他の部分の産生、１つまたは２つ以上の発育変動、１つまたは２つ以上の寿命変化、機能の獲得または損失、および／または増加したロバスト性であり、
随意に、前記方法において使用される細胞が、包括的な転写機構の変異に先立ち、表現型に対して最適化されており、
随意に、変化した細胞における遺伝子発現の変化を同定することをさらに含み、好ましくは遺伝子発現の変化を核酸マイクロアレイを用いて決定する、前記方法。
【請求項２】
細胞の表現型を変化させるための方法であって、
第２の細胞における遺伝子発現の変化を検出することにより同定される第１の細胞における１つまたは２つ以上の遺伝子産生物の発現を変化させ、そこにおいて前記第２の細胞における遺伝子発現の変化が前記第２の細胞の包括的な転写機構を変異させることにより産生されること、
を含み、
随意に、第１の細胞における１つまたは２つ以上の遺伝子産生物の発現を変化させることが、第２の細胞において増加した１つまたは２つ以上の遺伝子産生物の発現を増加させることを含み、
好ましくは、１つまたは２つ以上の遺伝子産生物の発現が、第１の細胞へ１つまたは２つ以上の遺伝子産生物を発現する１つまたは２つ以上の発現ベクターを導入することにより増加され、
好ましくは、１つまたは２つ以上の遺伝子産生物の発現が、１つまたは２つ以上の遺伝子産生物をコードする１つまたは２つ以上の内因性遺伝子の転写を増加させることにより増加され、随意に１つまたは２つ以上の内因性遺伝子の転写を増加させることが１つまたは２つ以上の遺伝子の転写制御配列を変異させることを含み、
随意に、第１の細胞における１つまたは２つ以上の遺伝子産生物の発現を変化させることが、変化した細胞において低下した１つまたは２つ以上の遺伝子産生物の発現を減少させることを含み、
好ましくは、１つまたは２つ以上の遺伝子産生物の発現が、第１の細胞へ１つまたは２つ以上の遺伝子産生物の発現を低下させる核酸分子を導入することにより低下され、随意に核酸分子がｓｉＲＮＡ分子であるか、またはｓｉＲＮＡ分子を発現し、
好ましくは、１つまたは２つ以上の遺伝子産生物の発現が、１つまたは２つ以上の遺伝子産生物をコードする１つまたは２つ以上の遺伝子、あるいは前記１つまたは２つ以上の遺伝子の転写制御配列を変異させることにより低下され、
随意に、第２の細胞における遺伝子発現の変化が、核酸マイクロアレイを用いて決定され、
随意に、第２の細胞における遺伝子発現の変化が、遺伝子またはタンパク質ネットワークのモデルを構築するために用いられ、そこにおいて、前記モデルがネットワークにおける１つまたは２つ以上の遺伝子産生物のいずれを変化させるかを選択するために用いられる、前記方法。
【請求項３】
包括的な転写機構が１つより多い核酸および／またはポリペプチドを含むか、または１つより多い核酸によりコードされる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の方法により産生される細胞。
【請求項５】
代謝産生物の産生を変化させるための方法であって、
請求項１〜３のいずれかに記載の方法に従って、選択された代謝産生物を産生する細胞の包括的な転写機構を変異させ、変化した細胞を産生すること、および、
増加したまたは減少した量の前記選択された代謝産生物を産生する変化した細胞を単離すること、
を含み、
随意に、前記方法が、単離された細胞を培養すること、および、前記細胞または前記細胞培養物から代謝産生物を回収することをさらに含み、
随意に、代謝産生物がリコピンまたはエタノールであり、
随意に、代謝産生物がポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）であり、
随意に、代謝産生物が治療用タンパク質であり、好ましくは治療用タンパク質が組み換えタンパク質、または抗体または抗体断片であり、
随意に、細胞が原核細胞であり、好ましくは原核細胞が細菌細胞または古細菌細胞であり、
随意に、細胞が真核細胞であり、好ましくは真核細胞が酵母細胞、哺乳類細胞、植物細胞、昆虫細胞、幹細胞、または真菌細胞であり、
随意に、包括的な転写機構が真核細胞の細胞小器官の核酸によりコードされ、好ましくは細胞小器官がミトコンドリアまたは葉緑体である、前記方法。
【請求項６】
複数の異なる核酸分子種を含む集団であって、個々の核酸分子種が異なる変異を含む包括的な転写機構をコードし、
随意に、包括的な転写機構がシグマ因子またはアンチシグマ因子であり、好ましくはシグマ因子をコードする核酸が、ｒｐｏＤ（σ７０）遺伝子、ｒｐｏＦ（σ２８）遺伝子、ｒｐｏＳ（σ３８）遺伝子、ｒｐｏＨ（σ３２）遺伝子、ｒｐｏＮ（σ５４）遺伝子、ｒｐｏＥ（σ２４）遺伝子またはｆｅｃＩ（σ１９）遺伝子であり、
随意に、包括的な転写装置が、ＲＮＡポリメラーゼＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ、あるいはＲＮＡポリメラーゼＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのプロモーターに結合し、好ましくは包括的な転写機構がＴＦＩＩＤまたはそのサブユニットであり、随意にサブユニットがＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）またはＴＢＰ関連因子（ＴＡＦ）、例えばＴＡＦ２５であり、
随意に、包括的な転写機構が、核酸メチルトランスフェラーゼ、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンアセチラーゼまたはヒストンデアセチラーゼであり、
随意に、核酸分子種が発現ベクターに含有され、好ましくは核酸が組織特異性プロモーター、細胞特異性プロモーター、または細胞小器官特異性プロモーターから発現され、または発現ベクターが複数の異なる核酸分子種を含有し、それぞれの核酸分子種が異なる包括的な転写機構をコードし、
随意に、包括的な転写機構が指向進化により変異され、好ましくは指向進化がエラープローンＰＣＲまたは遺伝子シャッフリングを用いて実行され、
随意に、包括的な転写機構における変異が１つまたは２つ以上の点変異であり、
随意に、包括的な転写機構における変異が１つまたは２つ以上の切断または欠失であり、好ましくは切断が包括的な転写機構のプロモーター結合領域を含まず、
随意に、細胞の包括的な転写機構が請求項１〜３のいずれかに記載の方法に従って変異される、前記集団。
【請求項７】
請求項６に記載の核酸分子の集団を含む細胞の集団であって、
随意に、複数の細胞を含み、前記複数の細胞のそれぞれが１つまたは２つ以上の核酸分子を含み、
随意に、細胞が原核細胞であり、好ましくは原核細胞が細菌細胞または古細菌細胞であり、
随意に、細胞が真核細胞であり、好ましくは真核細胞が酵母細胞、哺乳類細胞、植物細胞、昆虫細胞、幹細胞、または真菌細胞であり、
随意に、核酸分子が細胞のゲノムへと融合され、または内因性の包括的な転写機構をコードする核酸を置換する、前記集団。
【請求項８】
複数のラウンドの変異により産生される包括的な転写機構をコードする核酸であって、
随意に、複数のラウンドの変異が指向進化を含み、好ましくは指向進化がエラープローンＰＣＲまたは遺伝子シャッフリングによる変異を含み、
随意に、核酸が複数の異なる包括的な転写機構種をコードし、
随意に、核酸が複数の異なるバージョンの同じ型の包括的な転写機構種をコードする、前記核酸。
【請求項９】
請求項８に記載の核酸によりコードされる包括的な転写機構。
【請求項１０】
（カルボキシ末端）領域４を含む、切断されたシグマ因子タンパク質。
【請求項１１】
選択された廃棄物のバイオレメディエーションのための方法であって、
請求項１〜３のいずれかに記載の方法に従って、細胞の包括的な転写機構を変異させ、変化した細胞を産生すること、
変化していない細胞に対して増加した量の選択された廃棄物を代謝する変化した細胞を単離すること、
前記単離された細胞を培養すること、および、
前記変化した細胞を前記選択された廃棄物へと暴露し、それにより前記選択された廃棄物のバイオレメディエーションを提供すること、
を含む、前記方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
図１０は、最少グルコース媒体における、増加した指数増殖期に対して選択された株を示す。図１０Ａは、シグマ因子エンジニアリングを用いて獲得された、さまざまな株（赤色および黄色のバーは対照群を表す）に対する結果を表す。図１０Ｂは、トランスポゾン突然変異生成を用いて作られたランダムノックアウトライブラリーから選択された株の結果を表す。