【手続補正書】
【提出日】平成21年10月26日(2009.10.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記：
ａ．検出構築物をコードする核酸配列を発現する工程であって、該検出構築物が核酸結合モチーフにコンジュゲーションした第一のポリペプチドフラグメントおよび核酸結合モチーフにコンジュゲーションした少なくとも１つの他のポリペプチドフラグメントを含み、該２つのポリペプチドフラグメントは結合して活性化状態で検出タンパク質を形成し、該２つのフラグメントは活性的野生型タンパク質と比較した場合、活性的でコンフォメーション的に正常な形態にある工程；および
ｂ．レポーター構築物をコードする核酸配列を発現する工程であって、該レポーター構築物が対象となるヌクレオチドおよび核酸結合配列を含み、該核酸結合配列は該検出構築物中の２つ以上の該核酸結合モチーフにより認識され；該ポリペプチドフラグメントの２つ以上の核酸結合モチーフが該核酸結合配列に結合することによって、該活性的検出タンパク質がリアルタイムに再構成される工程；および
ｃ．該再構成された検出タンパク質を検出する手段、
を含む、リアルタイム核酸検出法。
【請求項２】
検出がインビトロまたはインビボである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該検出がインビボである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
該核酸がＲＮＡである、請求項１記載の方法。
【請求項５】
該核酸がＤＮＡである、請求項１記載の方法。
【請求項６】
該検出タンパク質の第一のポリペプチドフラグメントと会合した該核酸結合モチーフが全長モチーフの一部であり、残りのモチーフが該検出タンパク質の少なくとも１つの他のポリペプチドフラグメントと会合している、請求項１、３または４記載の方法。
【請求項７】
該検出タンパク質の第一のポリペプチドフラグメントと会合した該核酸結合モチーフが、該検出タンパク質の少なくとも１つの他のポリペプチドフラグメントと会合した該核酸結合モチーフから独立した全長モチーフである、請求項１、３、４または６記載の方法。
【請求項８】
該核酸結合モチーフがマルチドメイン核酸結合分子のドメインを含む、請求項７記載の方法。
【請求項９】
該検出タンパク質が蛍光タンパク質である、請求項１、３または４記載の方法。
【請求項１０】
該蛍光タンパク質が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）；高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）；緑色蛍光タンパク質様タンパク質（ＧＦＰ様）；黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）；高感度黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）；青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）；高感度青色蛍光タンパク質（ＥＢＦＰ）；シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）；高感度シアン蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）；赤色蛍光タンパク質（ｄｓＲＥＤ）；ならびにその改変型およびフラグメントからなる群より選択される、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
該蛍光タンパク質がＥＧＦＰである、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
第一および第二のＥＧＦＰフラグメント間に位置する切断産物をさらに含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
ＥＧＦＰの第一のフラグメントがアミノ酸１からおよそアミノ酸１５８であり、ＥＧＦＰの第二のフラグメントがおよそアミノ酸１５９からアミノ酸２３９である、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
該検出タンパク質が酵素である、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
該酵素が、ベータ−ガラクトシダーゼ、ベータ−ラクタマーゼ、ベータ−グルコシダーゼ、ベータ−グルクロニダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）からなる群より選択される、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
該酵素がベータ−ラクタマーゼである、請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
該ベータ−ラクタマーゼの第一のフラグメントがおよそアミノ酸２４からアミノ酸１９７であり、該ベータ−ラクタマーゼの第二のフラグメントがおよそアミノ酸１９８からアミノ酸２４０である、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
該核酸結合モチーフがタンパク質である、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
該核酸結合モチーフタンパク質が２つ以上のフラグメントに断片化され、１つのフラグメントが第一の検出ポリペプチドフラグメントにコンジュゲーションし、残りのフラグメントが１つ以上の相補性ポリペプチドフラグメントにコンジュゲーションし、該フラグメントは：（ａ）活性化コンフォメーションにあり；（ｂ）それ自身では活性的ではなく；（ｃ）該レポーター構築物中で該核酸結合配列に結合することにより、相補対形成し、リアルタイムに該活性な検出タンパク質を再構成する、請求項１、３または４記載の方法。
【請求項２０】
該核酸結合モチーフがＭＳ２コートタンパク質であり、該核酸結合配列がＲＮＡステムループであるか、あるいは該核酸結合モチーフがＴＡＲであり、該核酸結合配列がＴａｔＢＩＶ−１ステムループであるか、あるいは該核酸結合モチーフがＧ３／Ｃ３ステムループの３つのリピートであり、該核酸結合配列が転写活性化因子であるか、あるいは該核酸結合モチーフがｅＩＦ４Ａに特異的なアプタマーであり、該核酸結合配列がｅＩＦ４ａであるか、あるいは該核酸結合モチーフが該レポーター構築物中に存在する該核酸結合配列に特異的なアプタマーであるか、あるいは該レポーター構築物中に存在する該核酸結合配列がアプタマータグである、請求項１、３または４記載の方法。
【請求項２１】
該レポータータンパク質を検出する手段が定量的または定性的な手段を含む、請求項１、３または４記載の方法。
【請求項２２】
該方法が以下の工程：（ａ）生体試料中の該検出タンパク質のベースラインシグナルを検出する工程；（ｂ）該検出タンパク質のポリペプチドフラグメントにコンジュゲーションした該核酸結合モチーフに、該レポーター構築物の該核酸結合配列を接触させることの改変があるようにアッセイ条件を改変する工程、（ｃ）シグナル変化が対象ヌクレオチドの変化の指標となる、該生体試料から該活性検出タンパク質の変化を即時に検出する工程、をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項２３】
手段が、蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡、電子顕微鏡、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）および外観検査からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項２４】
該構築物を用いる細胞のトランスフォーメーションまたはトランスフェクションにより該検出構築物およびレポーター構築物を細胞中で発現させる、請求項１記載の方法。
【請求項２５】
融合産物が生成されるように、該検出タンパク質および該核酸結合モチーフをコードする２つの核酸がインフレームで融合することによって、該検出タンパク質が該核酸結合モチーフに結合する、請求項１記載の方法。
【請求項２６】
該融合産物がタンパク分解酵素部位またはタグを含み、精製を促進する、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
該タグが６−Ｈｉｓタグまたはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタグまたはペプチドエピトープである、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
下記：
（ｉ）請求項１の該検出構築物；
（ｉｉ）請求項１の該レポーター構築物；または
（ｉｉｉ）（ｉ）の該検出構築物および（ｉｉ）の該レポーター構築物の両方
の少なくとも１つをコードするＤＮＡ配列を含むプラスミド。
【請求項２９】
請求項２８のＤＮＡ配列の少なくとも１つをそのゲノムにコンピテントに組み込んだトランスジェニック生物。
【請求項３０】
下記：
ａ．検出構築物が核酸結合モチーフに結合した第一のポリペプチドフラグメントおよび核酸結合モチーフに結合した少なくとも１つの他のポリペプチドフラグメントを含み、該２つのポリペプチドフラグメントは結合して活性化状態で検出タンパク質を形成し、該２つのフラグメントは活性的野生型タンパク質と比較した場合、活性的でコンフォメーション的に正常な形態にある、該検出構築物をコードする核酸配列；および／または
ｂ．レポーター構築物が対象となるヌクレオチドおよび核酸結合配列を含み、該核酸結合配列は該検出構築物中の２つ以上の該核酸結合モチーフにより認識され；該ポリペプチドフラグメントの２つ以上の核酸結合モチーフが該核酸結合配列に結合することによって、該活性的検出タンパク質がリアルタイムに再構成される、該レポーター構築物をコードする核酸配列
の機能的ゲノム発現をそのゲノムにコンピテントに組み込んだトランスジェニック生物。
【請求項３１】
マウス、ゼブラフィッシュ、線虫（c. elegans）、酵母、細菌、哺乳動物細胞、一次細胞および二次細胞からなる群より選択される、請求項２９または３０のトランスジェニック生物。
【請求項３２】
下記：
ａ．該核酸結合モチーフが特定の疾患または障害に特異的である請求項１で記述した検出構築物に、個体から得たＤＮＡまたはＲＮＡを接触させる工程；および
ｂ．該検出構築物からのシグナル変化の検出が疾患または障害の存在の指標になる、該検出構築物のシグナル変化を検出する工程
の工程を含む、個体における疾患または障害の検出法。
【請求項３３】
該疾患が病原体である、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
該病原体が、ウイルス；インフルエンザ、細菌、真菌、寄生生物および酵母を含む群より選択される請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
該ＤＮＡまたはＲＮＡが疾患に対する遺伝的資質である、請求項３２記載の方法。
【請求項３６】
該検出タンパク質フラグメントが再構築されるとすぐに活性化するように設計されている、請求項１または３記載の方法。
【請求項３７】
該検出ポリペプチドタンパク質フラグメントは活性的野生型タンパク質と比較した場合、活性的でコンフォメーション的に正常な形態にあり、相補性検出ポリペプチドタンパク質フラグメントは標的核酸の存在下ではリアルタイムに該検出タンパク質およびシグナル表現型を再構築する、請求項１記載の方法。
【請求項３８】
リアルタイムに核酸を検出するための、検出構築物およびレポーター構築物をコードする核酸セグメントの使用であって；
（ｉ）該検出構築物は、活性的野生型タンパク質と比較した場合、活性的でコンフォメーション的に正常な形態にある検出タンパク質のフラグメントを含み；それらは核酸結合モチーフにコンジュゲーションし、少なくとも１つの他のポリペプチドフラグメントは核酸結合モチーフにコンジュゲーションしており；そして
（ｉｉ）該レポーター構築物が対象となるヌクレオチドおよび核酸結合配列を含み、該核酸結合配列は該検出構築物中の２つ以上の該核酸結合モチーフにより認識され；該ポリペプチドフラグメントの２つ以上の核酸結合モチーフが核酸結合配列に結合すると活性的検出タンパク質がリアルタイムに再構成される、使用。
【請求項３９】
リアルタイムに検出された該核酸をインビボで検出する、請求項３８の核酸セグメントの使用。
【請求項４０】
下記：
（ｉ）請求項１の検出構築物；
（ｉｉ）請求項１のレポーター構築物；または
（ｉｉｉ）（ｉ）の該検出構築物および（ｉｉ）の該レポーター構築物の両方
の少なくとも１つをコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドを含むキット。
【請求項４１】
該検出構築物が請求項９または１０の該蛍光タンパク質もしくは請求項１５の該酵素を含む、請求項４０記載のキット。
【請求項４２】
該レポーター構築物が請求項２０のアプタマーを含む、請求項４０記載のキット。
【請求項４３】
該検出を、線維芽細胞、神経細胞、卵母細胞、腫瘍細胞、ウイルス感染哺乳動物細胞、上皮細胞、細菌細胞および酵母細胞からなる群より選択された細胞中で行う、請求項１記載の方法。
【請求項４４】
該細胞が遺伝子改変細胞である、請求項４３記載の方法。