【手続補正書】
【提出日】平成20年12月12日(2008.12.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つのPam3Cysおよびインフルエンザウイルスタンパク質の少なくとも一つの内在性膜タンパク質の少なくとも一部を含む組成物。
【請求項２】
インフルエンザウイルスタンパク質がインフルエンザA型ウイルスタンパク質、インフルエンザB型ウイルスタンパク質またはインフルエンザC型ウイルスタンパク質である、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
内在性膜タンパク質が、赤血球凝集素膜タンパク質、ノイラミニダーゼ膜タンパク質およびM2膜タンパク質からなる群より選ばれる少なくとも一員である、請求項２記載の組成物。
【請求項４】
内在性膜タンパク質がM2タンパク質を含み、M2タンパク質が配列番号13の少なくとも一部を含む、請求項３記載の組成物。
【請求項５】
M2タンパク質が配列番号15、配列番号19および配列番号34からなる群より選ばれる少なくとも一員を含む、請求項３記載の組成物。
【請求項６】
内在性膜タンパク質が配列番号64および配列番号67からなる群より選ばれる少なくとも一員の少なくとも一部を含む赤血球凝集素タンパク質を含む、請求項３記載の組成物。
【請求項７】
赤血球凝集素タンパク質が配列番号35、配列番号36、配列番号37および配列番号38からなる群より選ばれる少なくとも一員を含む、請求項６記載の組成物。
【請求項８】
少なくとも一つのPam2Cysをさらに含む、請求項１記載の組成物。
【請求項９】
Pam3Cys、Pam2Cysおよび内在性膜タンパク質が融合タンパク質の成分である、請求項８記載の組成物。
【請求項１０】
Pam3Cysおよび内在性膜タンパク質が融合タンパク質の成分である、請求項１記載の組成物。
【請求項１１】
組成物の少なくとも一つのPam3Cysと少なくとも一つの内在性膜タンパク質の間のリンカーをさらに含む、請求項１０記載の組成物。
【請求項１２】
組成物の少なくとも二つの内在性膜タンパク質の間のリンカーをさらに含む、請求項１記載の組成物。
【請求項１３】
リンカーがアミノ酸リンカーである、請求項１１または１２記載の組成物。
【請求項１４】
TLR5アゴニストをさらに含む、請求項１記載の組成物。
【請求項１５】
TLR5アゴニストがフラジェリンである、請求項１４記載の組成物。
【請求項１６】
フラジェリンがFljb/STF2、大腸菌fliC、およびサルモネラミュンヘンfliCからなる群より選ばれる少なくとも一員である、請求項１５記載の組成物。
【請求項１７】
少なくとも一つの病原体関連分子パターンおよび少なくとも一つのインフルエンザM2タンパク質を含み、ここで病原体関連分子パターンがPam2Cysではない融合タンパク質。
【請求項１８】
M2タンパク質が配列番号13の少なくとも一部を含む、請求項１７記載の融合タンパク質。
【請求項１９】
少なくとも一つの病原体関連分子パターンと少なくとも一つのM2タンパク質の間のリンカーをさらに含む、請求項１８記載の融合タンパク質。
【請求項２０】
少なくとも二つのM2タンパク質の間のリンカーをさらに含む、請求項１８記載の融合タンパク質。
【請求項２１】
M2タンパク質が配列番号15を含む、請求項１８記載の融合タンパク質。
【請求項２２】
病原体関連分子パターンがTLR5アゴニストである、請求項１７記載の融合タンパク質。
【請求項２３】
TLR5アゴニストがフラジェリンである、請求項２２記載の融合タンパク質。
【請求項２４】
フラジェリンがfljB/STF2、大腸菌fliC、およびサルモネラミュンヘンfliCからなる群より選ばれる少なくとも一員である、請求項２３記載の融合タンパク質。
【請求項２５】
フラジェリンがfljB/STF2を含み、fljB/STF2が配列番号1の少なくとも一部を含む、請求項２４記載の融合タンパク質。
【請求項２６】
fljB/STF2が配列番号3を含む、請求項２５記載の融合タンパク質。
【請求項２７】
フラジェリンが大腸菌fliCを含み、大腸菌fliCが配列番号5の少なくとも一部を含む、請求項２４記載の融合タンパク質。
【請求項２８】
大腸菌fliCが配列番号66を含む、請求項２７記載の融合タンパク質。
【請求項２９】
フラジェリンがサルモネラミュンヘンfliCを含み、サルモネラミュンヘンfliCが配列番号7の少なくとも一部を含む、請求項２４記載の融合タンパク質。
【請求項３０】
サルモネラミュンヘンfliCが配列番号98を含む、請求項２９記載の融合タンパク質。
【請求項３１】
病原体関連分子パターンがインフルエンザM2タンパク質のカルボキシ末端またはアミノ末端に融合する、請求項１７記載の融合タンパク質。
【請求項３２】
少なくとも一つの病原体関連分子パターンが少なくとも二つのインフルエンザM2タンパク質の間にある、請求項１７記載の融合タンパク質。
【請求項３３】
病原体関連分子パターンがTLR2アゴニストである、請求項１７記載の融合タンパク質。
【請求項３４】
TLR2アゴニストがPam3Cysである、請求項３３記載の融合タンパク質。
【請求項３５】
赤血球凝集素膜タンパク質またはノイラミニダーゼ膜タンパク質の少なくとも一部をさらに含む、請求項１７記載の融合タンパク質。
【請求項３６】
インフルエンザB型ウイルスタンパク質およびインフルエンザC型ウイルスタンパク質からなる群より選ばれる少なくとも一員をさらに含む、請求項１７記載の融合タンパク質。
【請求項３７】
インフルエンザB型ウイルスタンパク質またはインフルエンザC型ウイルスタンパク質が内在性膜タンパク質である、請求項３６記載の融合タンパク質。
【請求項３８】
病原体関連分子パターンおよびM2タンパク質を含み、ここで病原体関連分子パターンがPam2Cysではない組成物。
【請求項３９】
少なくとも一つの病原体関連分子パターンの少なくとも一部および少なくとも一つのインフルエンザM2タンパク質の少なくとも一部を含み、ここで病原体関連分子パターンがPam2Cysを含む場合、Pam2Cysの少なくとも一部がインフルエンザM2タンパク質に融合せず、インフルエンザM2タンパク質の少なくとも一部がPam2Cysに融合しない組成物。
【請求項４０】
少なくとも一つの病原体関連分子パターンの少なくとも一部および少なくとも一つのインフルエンザM2タンパク質の少なくとも一部を含み、ここで病原体関連分子パターンがPam2Cysを含む場合、Pam2Cysの少なくとも一部がインフルエンザM2タンパク質に融合せず、インフルエンザM2タンパク質の少なくとも一部がPam2Cysに融合しない融合タンパク質。
【請求項４１】
被験体における免疫応答を刺激するための医薬の製造における、少なくとも一つのPam3Cysおよびインフルエンザウイルスタンパク質の少なくとも一つの内在性膜タンパク質の少なくとも一部を含む組成物の使用。
【請求項４２】
病原体関連分子パターンがPam2Cysではない、被験体における免疫応答を刺激するための医薬の製造における、少なくとも一つの病原体関連分子パターンおよび少なくとも一つのインフルエンザM2タンパク質を含む融合タンパク質を含む組成物の使用。
【請求項４３】
病原体関連分子パターンがPam2Cysではなく、M2タンパク質がM2eタンパク質ではない、被験体における免疫応答を刺激するための医薬の製造における、少なくとも一つの病原体関連分子パターンおよび少なくとも一つのインフルエンザM2タンパク質を含む組成物の使用。
【請求項４４】
病原体関連分子パターンがPam2Cysを含む場合、Pam2Cysの少なくとも一部がインフルエンザM2タンパク質に融合せず、インフルエンザM2タンパク質の少なくとも一部がPam2Cysに融合しない、被験体における免疫応答を刺激するための医薬の製造における、少なくとも一つの病原体関連分子パターンの少なくとも一部および少なくとも一つのインフルエンザM2タンパク質の少なくとも一部を含む組成物を含む組成物の使用。
【請求項４５】
病原体関連分子パターンがPam2Cysを含む場合、Pam2Cysの少なくとも一部がインフルエンザM2タンパク質に融合せず、インフルエンザM2タンパク質の少なくとも一部がPam2Cysに融合しない、被験体における免疫応答を刺激するための医薬の製造における、少なくとも一つの病原体関連分子パターンの少なくとも一部および少なくとも一つのインフルエンザM2タンパク質の少なくとも一部を含む融合タンパク質を含む組成物の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
上述のように、M2、HAおよびNAは、インフルエンザウイルス（インフルエンザA、B、C）の内在性膜タンパク質（例えば、ウイルスの外部表面からウイルスの内部表面まで伸びているタンパク質）である。インフルエンザウイルスの内在性膜タンパク質について本明細書で使用する場合、「少なくとも一部」は、全内在性膜タンパク質の任意の一部を意味する。例えば、M2タンパク質の24アミノ酸N末端（例えば配列番号：13）、EVETPIRNEWG（配列番号：15）、EVETPIRNE（配列番号：19）、EVETPIRNEW（配列番号：34）またはEVETPIRN（配列番号：20）はM2タンパク質の少なくとも一部であり、PAKLLKERGRRGAIAGFLE（配列番号：33）はHAタンパク質の少なくとも一部である。配列番号：15はGAGGTTGAGACCCCGATTCGCAACGAATGGGGT（配列番号：96）にコードされる。GAGGTCGAAACACCTATCAGAAACGAATGG（配列番号：16）にコードされるタンパク質もM2の少なくとも一部である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
内在性膜タンパク質は、AGCTTGCTGACTGAGGTTGAGACCCCGATTCGCAACGAATGGGGTTCCCGTTCCAACGATTCTTCCGACCCG（配列番号：106）にコードされる配列番号：14または配列番号：47の少なくとも一部にコードされる、SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDP（配列番号：13）の少なくとも一部を含むM2タンパク質を含み得る。M2タンパク質としては、さらにEVETPIRNEWG（配列番号：15）、EVETPIRNE（配列番号：19）、EVETPIRNEW（配列番号：34）；SLLTEVETPTRNEWESRSSDSSDP（配列番号：39）（Flu A H5N1 M2e、システインをセリンで置換した2004ベトナム単離体）；SLLTEVETPTRNEWECRCSDSSDP（配列番号：40）（Flu A H5N1 M2e、2004ベトナム単離体）；SLLTEVETLTRNGWGSRSSDSSDP（配列番号：41）（Flu A H5N1 M2e、システインをセリンで置換したホンコン97単離体）；SLLTEVETLTRNGWGCRCSDSSDP（配列番号：42）（Flu A H5N1 M2e、ホンコン97単離体）；SLLTEVETPTRNGWESKSSDSSDP（配列番号：43）（Flu A H7N2 M2e、システインをセリンで置換したニワトリ／ニューヨーク95単離体）；SLLTEVETPTRNGWECKCSDSSDP（配列番号：44）（Flu A H7N2 M2e、ニワトリ／ニューヨーク95単離体）；SLLTEVETLTRNGWESKSRDSSDP（配列番号：45）（Flu A H9N2 M2e、システインをセリンで置換したホンコン99単離体）；およびSLLTEVETLTRNGWECKCRDSSDP（配列番号：46）（Flu A、ホンコン99単離体）からなる群より選択される少なくとも一員が挙げられ得る。M2タンパク質の少なくとも一部の天然に存在する配列中の特定のシステイン残基、例えば配列番号：40のアミノ酸16および18；配列番号：42、44および46のアミノ酸17および19はセリンで置換される（配列番号：41、43、45および47それぞれ参照）。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
内在性膜タンパク質は、例えば配列番号：65および68それぞれにコードされる配列番号：64および67の少なくとも一部を含む、赤血球凝集素タンパク質を含み得る。赤血球凝集素タンパク質としては、PAKLLKERGRRGAIAGFLE（配列番号：33）（インフルエンザB）；SLWSEEPAKLLKERGFFGAIAGFLEE（配列番号：35）（Flu B）；SLWSEENIPSIQSRGLFGAIAGFIEE（配列番号：36）（Flu A H1/H0）；SLWSEENVPEKQTRGIFGAIAGFIEE（配列番号：37）（Flu A H3/H0）；SLWSEEEWEERERRRKKRGLFGAIAGFIEE（配列番号：38）（Flu A H5/H0）；PAKLLKERGFFGAIAGFLEE（配列番号：102）（Flu B）；NIPSIQSRGLFGAIAGFIEE（配列番号：103）（Flu A H1/H0）；NVPEKQTRGIFGAIAGFIEE（配列番号：104）（Flu A H3/H0）；およびRERRRKKRGLFGAIAGFIEE（配列番号：105）（Flu A H5/H0）からなる群より選択される少なくとも一員の少なくとも一部が挙げられ得る。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
本明細書中で使用される場合、「融合タンパク質」とは、共有または非共有結合する少なくとも二つの同様または異なる成分（例えば、Pam2Cys、Pam3Cys、PAMP、インフルエンザウイルスタンパク質の内在性膜タンパク質の少なくとも一部）から生じるタンパク質のことを言う。融合タンパク質の成分は、例えば合成により（例えばPam3Cys、Pam2Cys）、または組換え核酸技術により（例えば、PAMPの少なくとも一部またはインフルエンザウイルスタンパク質の内在性膜タンパク質の少なくとも一部等の融合タンパク質の成分をコードする核酸配列を用いた宿主細胞のトランスフェクション）作製され得る。融合タンパク質の一成分（例えば、Pam2Cys、Pam3Cys、PAMP、インフルエンザウイルスタンパク質の内在性膜タンパク質の少なくとも一部）は、ペプチド結合を含む化学結合技術を用いて、または融合タンパク質構築物の生成等の組換え技術を含む分子生物学的技術を用いて、融合タンパク質の別の成分（例えば、Pam2Cys、Pam3Cys、PAMP、インフルエンザウイルスタンパク質の内在性膜タンパク質の少なくとも一部）と結合し得る。本発明の例示的な融合タンパク質としては、配列番号：32（図14）にコードされる配列番号：31（図13）；配列番号：63（図22）にコードされる配列番号：62（図21）；配列番号：61（図20）にコードされる配列番号：60（図19）；配列番号：83（図29）にコードされる配列番号：82（（図28）；配列番号：85（図31）にコードされる配列番号：84（図30）；配列番号：87（図33）にコードされる配列番号：86（図32）；配列番号：91（図37）にコードされる配列番号：90（図36）；配列番号：93（図39）にコードされる配列番号：92（図38）；配列番号：95（図41）にコードされる配列番号：94（図40）；および図15に示されるようなPam3Cysが挙げられる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
さらに別の態様において、本発明の組成物、融合タンパク質およびポリペプチドとしては、配列番号：98を含むサルモネラミュンヘンfliC等の、配列番号：7の少なくとも一部を含むサルモネラミュンヘンfliCを含むフラジェリン、または配列番号：99等の、配列番号：8の少なくとも一部をコードする核酸配列が挙げられ得る。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
さらに別の態様において、本発明は配列番号：9、31、64、60、82、84、86、88、90、92および94を含むポリペプチド、ならびに配列番号：10、32、63、61、83、85、87、89、91、93および95にコードされるポリペプチドを含む。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
さらなる態様において、本発明は、配列番号：9、31、64、60、82、84、86、88、90、92および94のポリペプチドならびに配列番号：10、32、63、61、83、85、87、89、91、93および95の核酸配列に少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%および少なくとも約99%の配列同一性を有するポリペプチド、を含む。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
二つのアミノ酸配列（または二つの核酸配列）のパーセント同一性は、（例えば、第一配列の配列中にギャップが挿入され得る）最適な比較のために配列を整列することにより決定され得る。次いで、アミノ酸配列または核酸配列は対応する位置で比較され、二配列間のパーセント同一性は配列に共有される同一である位置の数の関数（すなわち％同一性＝同一である位置の＃／位置の総計＃ x 100）である。比較のために整列されたPAMP、インフルエンザウイルスタンパク質の少なくとも一部、本発明の融合タンパク質または本発明のポリペプチドをコードするタンパク質または核酸の長さは、参照配列、例えば、例えば配列番号:9、31、64、60、82、84、86、88、90、92および94ならびに配列番号：10、32、63、61、83、85、87、89、91、93および95で示されるような、PAMP、インフルエンザウイルスタンパク質の内在性膜タンパク質の少なくとも一部またはポリペプチドもしくは融合タンパク質の核酸配列の長さの少なくとも30%、好ましくは、少なくとも40%、より好ましくは、少なくとも60%、およびさらにより好ましくは、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%または100%である。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
PAMP、インフルエンザウイルスタンパク質の内在性膜タンパク質の少なくとも一部、本発明の融合タンパク質および本発明のポリペプチドをコードする核酸配列は、選択的ハイブリダイゼーション条件（例えば高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件）下で、例えば、fljB/STF2（例えば配列番号：2、4）、fliC（例えば配列番号：6、8、99）、インフルエンザウイルスタンパク質の内在性膜タンパク質の少なくとも一部（例えば、配列番号：11、13、15、18、19、21、33、35〜59、64および67）および本発明の融合タンパク質（例えば、配列番号：31、64および60）にハイブリダイズする核酸配列を含み得る。本明細書で使用する場合、用語「低ストリンジェンシー下でハイブリダイズする」、「中程度ストリンジェンシー下でハイブリダイズする」、「高ストリンジェンシー下でハイブリダイズする」または「非常に高いストリンジェンシー下でハイブリダイズする」は、核酸配列のハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を表す。水性および非水性の方法を含み得るハイブリダイゼーション反応を行なうガイダンスは、その教示が全体として本明細書に援用される、Aubusel, F.M., et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (2001)中に見出され得る。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２６】
「異種配列」とは本明細書で使用される場合、異なる種からの配列を意味する。例えば、H1配列はヒトの配列であり、H5配列はトリの配列である。従って、H1配列およびH5配列は異種配列である（例えば、
tctctgctgactgaagtagaaactccaacgcgtaatgaatgggaatcccgttctagcgactcctctgatcctctcgagtccctgctgacggaggttgaaaccccgacccgcaacgagtgggaaagccgttcctccgattcctctgatccggagagcagcctgctgaccgaggtagaaaccccgacccgtaatgagtgggaatctcgctcctctgattcttctgacccgggatcctctctgctgaccgaagtggagactccgactcgcaacgaatgggagagccgttcttctgactcctctgacccg（配列番号101）でコードされる
SLLTEVETPTRNEWESRSSDSSDPLESLLTEVETPTRNEWESRSSDSSDPESSLLTEVETPTRNEWESRSSDSSDPGSSLLTEVETPTRNEWESRSSDSSDP（配列番号100）。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２８】
異種構築物としては、例えば配列番号86および87においてH1（ヒト）およびH5（トリ）などの少なくとも２つの内在性膜タンパク質が挙げられる。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２９】
pMT/STF2Δを生成するために、配列番号2のフラジェリン遺伝子全てのアミノ酸170から415にわたる超可変領域を除去し、TLR5シグナル伝達に必要なアミノ末端配列およびカルボキシ末端配列の相互作用を容易にするように設計した短い（10個のアミノ酸）フレキシブルリンカー（GAPVDPASPW、配列番号97）と置き換えた。この構築物から発現されるタンパク質は、単独で発現されようと試験抗原と融合して発現されようと、強力なTLR5活性を保持する。従って、予言的に、M2e構築物の第二の系列をpMT/STF2Δに基づき生成する。予言的に、10％FBSおよび抗生物質を補足したシュナイダー培地で室温にて生育したショウジョウバエDmel-2細胞（Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA）を、製造業者の使用説明書に従いCellfectin試薬（Invitrogen）を用いて上述の構築物でトランスフェクトする。トランスフェクション24時間後、予言的に、FBSを欠いた培地において細胞を0.5mM CuSO4で誘導して、さらに48時間インキュベートする。予言的に、誘導した培養物からならし培地（CM）を採取して、SDS-PAGEならびに抗フラジェリンおよび抗M2e特異的抗体を用いるウェスタンブロット分析によりタンパク質発現についてスクリーニングする。予言的に、ELISAおよび免疫原性についてのインビボマウス調査により評価される、融合タンパク質の同一性、TLR生物活性、抗原性を実施する。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６５】
【図１】図1は、ヒンジ領域に下線を引いたネズミチフス菌フラジェリン2型（fljB/STF2）のアミノ酸配列（配列番号：1）を示す。
【図２】図2は、配列番号：1をコードする核酸配列（配列番号：2）を示す。ヒンジ領域をコードする核酸配列に下線を引く。
【図３】図3は、ヒンジ領域を有さないfljB/STF2のアミノ酸配列（本明細書中で「fljB/STF2Δ」または「STF2Δ」ともいう）（配列番号：3）を示す。
【図４】図4は、配列番号：3をコードする核酸配列（配列番号：4）を示す。
【図５】図5は、ヒンジ領域に下線を引いた大腸菌フラジェリンfliC（本明細書中で「大腸菌fliC」ともいう）のアミノ酸配列（配列番号：5）を示す。
【図６】図6は、配列番号：5をコードする核酸配列（配列番号：6）を示す。ヒンジ領域をコードする核酸配列に下線を引く。
【図７】図7は、下線を引いたヒンジ領域を有するサルモネラミュンヘンフラジェリンfliC（本明細書中で「サルモネラミュンヘンfliC」ともいう）のアミノ酸配列（配列番号：7）を示す。
【図８】図8は、配列番号：7をコードする核酸配列（配列番号：8）を示す。ヒンジ領域をコードする核酸配列に下線を引く。
【図９】図9は、PMT/STF2のアミノ酸配列を示す。リンカーに下線を引き、BiP分泌シグナルの配列を太字にする（配列番号：9）。
【図１０】図10は、配列番号：9の核酸配列（配列番号：10）を示す。リンカーをコードする核酸配列に下線を引き、BiP配列をコードする核酸配列を太字にする。
【図１１】図11は、M2タンパク質のアミノ末端の多量体（4単位）（本明細書中で「4xM2e」ともいう）をコードする核酸配列（配列番号：17）を示す。
【図１２】図12は、配列番号：17にコードされるアミノ酸配列（配列番号：18）を示す。
【図１３】図13は、fljB/STF2およびM2タンパク質のアミノ末端の四つの24アミノ酸配列を含む融合タンパク質（本明細書中で「fljB/STF2-4xM2e」または「fljB/STF2.4xM2e」ともいう）のアミノ酸配列（配列番号：31）を示す。
【図１４】図14は、配列番号：31をコードする核酸配列（配列番号：32）を示す。
【図１５】図15は、Pam3Cys.M2e融合タンパク質を示す。M2eのアミノ酸配列（配列番号：13）を太字体で示す。
【図１６】図16は、Toll様レセプター（TLR）シグナル伝達による抗原提示細胞（APC）の活性化を示す。
【図１７Ａ】図17Aは、H1およびH5（配列番号：39）インフルエンザA単離物のM2（例えば配列番号：13、47）のアミノ末端を発現するプラスミド構築物を示す。pMT：メタロチオネインプロモーターに基づく発現ベクター。BiP：免疫グロブリン結合タンパク質の分泌シグナル配列。STF2：ネズミチフス菌の完全長フラジェリン。STF2Δ：ヒンジ領域を欠損したSTF2。MCS：マルチプルクローニングサイト。
【図１７Ｂ】図17Bは、H1およびH5（配列番号：39）インフルエンザA単離物のM2（例えば配列番号：13、47）のアミノ末端を発現するプラスミド構築物を示す。pMT：メタロチオネインプロモーターに基づく発現ベクター。BiP：免疫グロブリン結合タンパク質の分泌シグナル配列。STF2：ネズミチフス菌の完全長フラジェリン。STF2Δ：ヒンジ領域を欠損したSTF2。MCS：マルチプルクローニングサイト。
【図１８】図18は、H1およびH5インフルエンザA単離物のHAを発現するように設計されたプラスミド構築物を示す。AOX1：pPICZα発現ベクター（Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA）のAOX1プロモーター。αf：酵母の分泌シグナル配列。STF2：ネズミチフス菌の完全長フラジェリン。STF2Δ：ヒンジ領域を欠損したSTF2。MCS：マルチプルクローニングサイト。
【図１９】図19は、STF2Δ（ヒンジ領域を有さないSTF2）およびHAの間に下線を引いたリンカーを有するSTF2Δ.HA融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：60）を示す。
【図２０】図20は、配列番号：60をコードする核酸配列（配列番号：61）を示す。リンカーに下線を引く。
【図２１】図21は、STF2ΔおよびHAの間にリンカーを有するSTF2Δ.HA（インフルエンザA型ウイルスのプエルトリコ8（PR8）株）融合タンパク質の核酸配列（配列番号：62）を示す。
【図２２】図22は、配列番号：62をコードする核酸配列（配列番号：63）を示す。リンカーに下線を引く。
【図２３】図23は、HA（PR8）のアミノ酸配列（配列番号：64）を示す。
【図２４】図24は、配列番号：64をコードする核酸配列（配列番号：65）を示す。
【図２５】図25は、ヒンジ領域を有さない大腸菌fliCのアミノ酸配列（配列番号：66）を示す。
【図２６】図26は、インフルエンザA H5N1 HAのアミノ酸配列（配列番号：67）を示す。
【図２７】図27は、配列番号：67をコードする核酸配列を示す。
【図２８】図28は、pMT/STF2.4xM2e（H1）のアミノ酸配列（配列番号：82）を示す。STF2および4xM2eの間のリンカーに下線を引き、ショウジョウバエBiP分泌シグナルを太字にする。
【図２９】図29は、配列番号：82をコードする核酸配列（配列番号：83）を示す。リンカーをコードする核酸配列に下線を引き、BiP分泌シグナルをコードする核酸配列を太字にする。
【図３０】図30は、アミノ酸配列pMT/STF2.4xM2e（H5）（配列番号：84）を示す。STF2および4xM2eの間のリンカー配列に下線を引き、分泌シグナルを太字にする。
【図３１】図31は、配列番号：84をコードする核酸配列（配列番号：85）を示す。リンカーをコードする核酸配列に下線を引き、BiP分泌シグナルをコードする核酸配列を太字にする。
【図３２】図32は、pMT/STF2.4xM2e（H1H5）のアミノ酸配列（配列番号：86）を示す。STF2および4xM2eの間のリンカー配列に下線を引き、BiP分泌シグナルを太字にする。
【図３３】図33は、配列番号：86をコードする核酸配列（配列番号：87）を示す。リンカーをコードする核酸配列に下線を引き、BiP分泌シグナルをコードする核酸配列を太字にする。
【図３４】図34は、pMT/STF2Δのアミノ酸配列（配列番号：88）を示す。リンカー配列に下線を引きBiP分泌シグナルを太字にする。
【図３５】図35は、配列番号：88をコードする核酸配列（配列番号：89）を示す。リンカーをコードする核酸配列に下線を引き、BiP分泌シグナルをコードする核酸配列を太字にする。
【図３６】図36は、pMT/STF2Δ.4xM2e（H1）のアミノ酸配列（配列番号：90）を示す。リンカー配列に下線を引き、BiP分泌シグナルを太字にする。
【図３７】図37は、配列番号：90をコードする核酸配列（配列番号：91）を示す。リンカーをコードする核酸配列に下線を引き、BiP分泌シグナルをコードする核酸配列を太字にする。
【図３８】図38は、pMT/STF2Δ.4xM2e（H5）のアミノ酸配列（配列番号：92）を示す。リンカー配列に下線を引き、BiP分泌シグナルを太字にする。
【図３９】図39は、配列番号：92をコードする核酸配列（配列番号：93）を示す。リンカーをコードする核酸配列に下線を引き、BiP分泌シグナルをコードする核酸を太字にする。
【図４０】図40は、pMT/STF2Δ.4xM2e（H1H5）のアミノ酸配列（配列番号：94）を示す。リンカー配列に下線を引き、BiP分泌シグナルを太字にする。
【図４１】図41は、配列番号：94をコードする核酸配列（配列番号：95）を示す。リンカーをコードする核酸配列に下線を引き、BiP分泌シグナルをコードする核酸を太字にする。
【図４２】図42は、本明細書中で「サルモネラミュンヘンfliCΔ」ともいう、ヒンジ領域を有さないサルモネラミュンヘン（Salmonella muenchen）fliCのアミノ酸配列（配列番号：98）を示す。
【図４３】図43は、配列番号：98をコードするサルモネラミュンヘンfliCの核酸配列（配列番号：99）を示す。
【図４４】図44は、TLR5+細胞の刺激後のIL-8分泌を示す。
【図４５】図45は、TLR2+細胞の刺激後のTNF分泌を示す。
【図４６】図46は、M2e特異的IgGを示す。
【図４７】図47は、OVA特異的IgGを示す。
【図４８】図48は、M2e特異的IgG血清力価を示す。
【図４９】図49は、追加後のM2e特異的血清IgG力価を示す。
【図５０】図50は、Pam3Cys.M2e用量反応を示す。
【図５１】図51は、M2e特異的血清IgG力価を示す。
【図５２】図52は、M2eに対するウサギIgG応答を示す。
【図５３】図53は、一次免疫後14日目のウサギのSTF2.4xM2eの免疫原性を示す。
【図５４】図54は、ウイルス攻撃試験後の生存を示す。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２８】
2008524261.tif 000001
【手続補正１６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２９】
2008524261.tif 000002
【手続補正１７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３０】
2008524261.tif 000003
【手続補正１８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３１】
2008524261.tif 000004
【手続補正１９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３２】
2008524261.tif 000005
【手続補正２０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３３】
2008524261.tif 000006
【手続補正２１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３４】
2008524261.tif 000007
【手続補正２２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３５】
2008524261.tif 000008
【手続補正２３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３６】
2008524261.tif 000009
【手続補正２４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３７】
2008524261.tif 000010
【手続補正２５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３８】
2008524261.tif 000011
【手続補正２６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３９】
2008524261.tif 000012
【手続補正２７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４０】
2008524261.tif 000013
【手続補正２８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４１】
2008524261.tif 000014
【手続補正２９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４２】
2008524261.tif 000015
【手続補正３０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４３】
2008524261.tif 000016