【手続補正書】
【提出日】平成23年4月5日(2011.4.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）固相ホスホルアミダイト法、液相ホスホルアミダイト法、固相Ｈ−ホスホナート法、液相Ｈ−ホスホナート法、固相−液相ハイブリッドホスホリアミダイト法および固相−液相ハイブリッドＨ−ホスホナート法に基づく合成法よりなる群から選択される方法を用いて、１以上のヌクレオチドを含む核酸分子を合成し；
（ｂ）前記工程（ａ）からの核酸分子を、該核酸分子から、2'-アミノ保護基、環外のアミノ（塩基）保護基および／またはホスフェート保護基を除去するのに適した条件下で、水性アルキルアミン、アンモニア、低揮発性のアミノ化合物、またはそれらの組合せと接触させ；
（ｃ）前記工程（ｂ）からの核酸分子を含む反応混合物を、ピリジン−HF、DMAP-HF、尿素−HF、TSAF、DAST、ポリビニルピリジン−HF、または下記構造式AAで表されるアミン−HF試薬：
【化１】
2008195731.tif 000001
（ここで、
R1  は、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルまたはヘテロアラルキルであり；
R2  は、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルまたはヘテロアラルキルであり；さらに、
R3  は、アリールまたはヘテロアリールであり；
ｎは１から20である）
ならびに極性溶媒と、シリル保護基および／または2'-OH保護基の除去に適した条件下で接触させ；
（ｄ）前記工程（ｃ）からの核酸分子を含む反応混合物を、適切な緩衝液中においてクロマトグラフィーに装填し；そして
（ｅ）適切な溶出緩衝液を用いて精製勾配をかけ、フラクションを分析し、さらに精製フラクションをプールしさらに脱塩する；
工程を含む方法。
【請求項２】
前記核酸分子が、１以上のリボヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記核酸分子がsiRNA分子であることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記核酸分子が、１以上の2'-デオキシ-2'-フルオロヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項５】
前記核酸分子が、１以上のデオキシリボヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項６】
前記核酸分子が、糖修飾、塩基修飾、骨格の修飾、および１以上の親油性部分へのコンジュゲーションから成る群より選択される１以上の化学修飾を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記糖修飾が、2'-糖修飾または3'-糖修飾であることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記2'-糖修飾が、2'-O−メチル修飾であることを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記骨格の修飾が、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホナート、チオノアルキルホスホナート、ホスフィナート、ホスホロアミダート、チオノホスホロアミダート、ボラノホスフェート、およびそれらの組合せより成る群から選択されるホスフェート骨格の修飾であることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項１０】
前記化学修飾が、１以上の親油性部分へのコンジュゲーションであり、該親油性部分がコレステロールまたはコレステロール誘導体を含むことを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項１１】
前記核酸分子が、該核酸分子の3'末端、5'末端、または3'末端および5'末端の両方において、１以上の末端修飾を含むことを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項１２】
前記工程（ａ）の合成法が、固相ホスホルアミダイト法、液相ホスホルアミダイト法、または固相−液相ハイブリッドホスホリアミダイト法であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１３】
前記水性アルキルアミンが水性メチルアミンであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１４】
前記低揮発性アミノ化合物が、ポリアミン、PEHA、PEG-NH2 、短鎖PEG-NH2 、シクロアルキルアミン、ヒドロキシシクロアルキルアミン、ヒドロキシアミン、K2CO3/MeOH、チオアルキルアミン、チオール化アミン、β−アミノ−エチル−スルホン酸またはその硫酸ナトリウム塩、ならびにそれらの組合せよりなる群から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１５】
前記水性アルキルアミン、アンモニア、低揮発性のアミノ化合物、またはそれらの組合せを、エタノールと予め混合することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１６】
前記2'-OH保護基が、t-ブチルジメチルシリル（TBDMSi）保護基を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１７】
前記極性溶媒が、水、DMSO、DMF、エタノール、イソプロパノール、メタノール、アセトニトリル、およびそれらの組合せより成る群から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１８】
前記工程（ｃ）においてピリジン-HFを用い、それを、DMSO、ならびにDBU、Hunig塩基、ピリジン、ピペリジンおよびN-メチルイミダゾールよりなる群から選択される塩基と、予め混合することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１９】
前記工程（ｃ）において、ポリビニルピリジン-HFを用いることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項２０】
前記核酸分子が、二本鎖核酸分子であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項２１】
前記核酸分子が、一本鎖核酸分子であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項２２】
前記クロマトグラフィーがイオン交換クロマトグラフィーであり、装填用の緩衝液が、水、エタノールまたはアセトニトリルを含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項２３】
前記工程（ｅ）において脱塩工程を適用しあるいは脱塩工程を適用しないで、前記核酸分子を第２の核酸分子とアニーリングさせて二本鎖核酸分子を形成し；さらに
前記二本鎖核酸分子をクロマトグラフィー精製にかける；工程をさらに含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項２４】
（ａ）固相ホスホルアミダイト法、液相ホスホルアミダイト法、固相Ｈ−ホスホナート法、液相Ｈ−ホスホナート法、固相−液相ハイブリッドホスホリアミダイト法および固相−液相ハイブリッドＨ−ホスホナート法に基づく合成法よりなる群から選択される方法を用いて、１以上のヌクレオチドを含む核酸分子を合成し；
（ｂ）前記工程（ａ）からの核酸分子を、該核酸分子から、2'-アミノ保護基、環外のアミノ（塩基）保護基および／またはホスフェート保護基を除去するのに適した条件下で、水性アルキルアミン、アンモニア、低揮発性のアミノ化合物、またはそれらの組合せと接触させ；
（ｃ）前記工程（ｂ）からの核酸分子からを含む反応混合物を、ピリジン−HF、DMAP-HF、尿素−HF、TSAF、DAST、ポリビニルピリジン−HF、または下記の構造式AAで表されるアミン−HF試薬：
【化２】
2008195731.tif 000002
（ここで、
R1  は、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルまたはヘテロアラルキルであり；
R2  は、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルまたはヘテロアラルキルであり；さらに、
R3  は、アリールまたはヘテロアリールであり；
ｎは１から20である）
ならびに極性溶媒と、シリル保護基および／または2'-OH保護基の除去に適した条件下で接触させ；
（ｄ）前記工程（ｃ）からの核酸分子を含む反応混合物を、水、約20mMリン酸ナトリウム中のエタノールまたは約20mMリン酸ナトリウム中のアセトニトリルを含む装填用緩衝液中においてイオン交換クロマトグラフィーに装填し；そして
（ｅ）適切な溶出緩衝液を用いて精製勾配をかけ、フラクションを分析し、さらに精製フラクションをプールしさらに脱塩する；
工程を含む方法。
【請求項２５】
前記核酸分子を含む反応混合物を、前記工程（ｄ）の前または後に、適切な緩衝液中において逆相クロマトグラフィーに装填する工程をさらに含む請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記工程（ｅ）において脱塩工程を適用しあるいは脱塩工程を適用しないで、前記核酸分子を第２の核酸分子とアニーリングさせて二本鎖核酸分子を形成し；さらに
前記二本鎖核酸分子をクロマトグラフィー精製にかける；工程をさらに含むことを特徴とする請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
前記二本鎖核酸分子をクロマトグラフィー精製にかける工程が：
前記二本鎖核酸分子を適切な緩衝液中においてクロマトグラフィーに装填し；そして
適切な溶出緩衝液を用いて精製勾配をかけ、フラクションを分析し、さらに精製フラクションをプールしさらに脱塩する；工程を含むことを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
前記クロマトグラフィー精製が、高速液体クロマトグラフィーであることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
前記核酸分子が、１以上のリボヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項３０】
前記二本鎖核酸分子がsiRNAであることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の名称
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の名称】オリゴヌクレオチドの脱シリル化の方法