【手続補正書】
【提出日】平成21年9月3日(2009.9.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８３】
細胞内サイトカイン染色(ICS)アッセイ
前述のように、トランスフェクトされた刺激細胞を用いてICSアッセイにより、DNA免疫感作により誘発された特異的CD8 T細胞レベルを測定した(97)。比較目的のため、アッセイの2または4週間前に1.2x105PFUのTC-MCMVを腹腔内感染させた、1群当たり3匹のBALB/cマウスにおいて、MCMV感染により生じたCD8 T細胞レベルを測定した。最終pDNA免疫感作の2〜3週間後、ICSアッセイのために免疫感作群または感染群のそれぞれから3匹のマウスを屠殺した。簡潔に言えば、BALB SV40(H-2d)細胞を96ウェル組織培養プレートに播種し、1日後、プラスミドDNA0.5μgおよびFuGene6(Roche)1.25μl/ウェルで細胞(およそ60〜75%集密的)をトランスフェクトした。トランスフェクションの2日後、脾細胞を採取し、赤血球を溶解し(BD Pharm Lyse, BD Biosciences)、ブレフェルディンA(GolgiPlug, BD Pharmingen) の存在下で、トランスフェクトされた BALB SV40細胞の2連ウェルに免疫感作マウスまたは感染マウスからの8x105脾細胞を加えた。ペプチド刺激のために、2x106脾細胞を含む2連ウェルのそれぞれを、ブレフェルディンAの存在下、Ld拘束性ノナペプチドエピトープであるTEl(168YPHFMPTNL176（配列番号９５）) 1μMで刺激した。CD8およびIFN-γ染色のゲート制御の役割をする脾細胞をペプチドは刺激した。37℃および7%CO2での刺激の8時間後、染色のために、脾細胞の2連ウェルを96ウェル丸底プレートの1ウェルにあわせた。フィコエリスリン-Cy5(PE-Cy5)で標識した抗マウスCD8a(Ly-2)抗体クローン53-6.7(eBioscience)で脾細胞を終夜表面染色し、固定および浸透化(BD Cytofix/Cytoperm, BD Biosciences)に次いで、フルオレセインイソチオシアナート(FITC)で標識した抗マウスIFN-γ抗体クローンXMG1.2(eBioscience)で脾細胞を染色した。リンパ球はゲートされ、二重染色された脾細胞を、Research Flow Cytometry Core Facility, VA Medical Center, La Jolla, CaliforniaでのBD FACSDivaソフトウェアを用い、BD FACSCantoフローサイトメーター (BD Biosciences)で計数した。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８６】
MCMV DNA pol(M54)、プライマーゼ(M70)およびヘリカーゼ(M105)のクローニング、配列決定および発現
Smith株由来細菌人工染色体であるMCMV MW97.01から、pcDNA3.1/V5-His-TOPO(カルボキシ末端V5エピトープおよび6xHisタグ（配列番号９４）を提供するベクター(97))に、M54、M70およびM105遺伝子をクローニングした。クローニングされたM54およびM105 ORFの全配列はMCMV Smith株の公表された配列(71)と同一であった。クローニングされたM70 ORFの配列は、M70 ORFの3'末端とベクターによりコードされるエピトープタグ配列の間での1個のTの挿入を除けばMCMV Smithと同一であった。この変異はimmediate終止コドンを生じ、従って、M70タンパク質の、タグなし全コード配列を生じた。M54、M70およびM105の全連続的リーディングフレームの確認は、共役in vitro転写-翻訳(TNT T7 Quick)反応および[35S]メチオニン標識(図3A)により行った。SDS-PAGEおよびオートラジオグラフィーにより、プラスミドのそれぞれは、予測相対分子量:M54に対して128.8kDa、タグなしM70に対して109.6kDaおよびM105に対して111.4kDaを有する単一の標識ポリペプチドを発現する事が見いだされた。マウスの皮内免疫感作のために、これらのDNAクローンの大規模なエンドトキシンフリー製剤を調製した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６２】
【図１】脾臓におけるチャレンジウイルス複製に対して矛盾のない防御を示す、M54(DNAポリメラーゼ)またはM105(ヘリカーゼ)でのマウスのDNA免疫感作の結果の図形描画である。1群当たり4匹のBALB/cマウスに、空ベクターDNA(pc3Δneo)またはIE1、M54、M70もしくはM105をコードするDNAのいずれかで2週間に3回皮内免疫感作した。最終免疫感作の2週間後、図面に示されたSG-MCMVの3つのLD5O用量のうちの1つでマウスに腹腔内チャレンジした。チャレンジ後6日目に脾臓を摘出し、ホモジナイズしてMCMVの力価を測定した。棒および円は、群ごとの平均および脾臓のそれぞれのウイルス力価の各Log10をそれぞれ示す。横線は高感度プラークアッセイの検出限界を示す。
【図２】免疫感作およびチャレンジ感染のスケジュール表の例である。
【図３】HCMV DNAポリメラーゼ(M54)、プライマーゼ(M70)およびヘリカーゼ(M105)のMCMVホモログのin vitroおよびin vivoでの発現を示す図である。A)pcDNA3.1/V5-His-TOPOにクローニングしたMCMV ORFを、[35S]メチオニンを用いる共役in vitro転写/翻訳反応(すなわちTNT T7 Quick)により、T7プロモーターを用いて発現させた。SDS-PAGEおよびオートラジオグラフィーにより、プラスミドのそれぞれは、予測相対分子量:M54に対して128.8kDa、タグなしM70に対して109.6kDaおよびM105に対して111.4kDaを有する単一の標識ポリペプチドを発現する事が見いだされた。各反応の一部を7%ポリアクリルアミドゲルで還元条件SDS-PAGEにかけ、標識タンパク質をオートラジオグラフィーで検出した。左側の数字および線はマーカータンパク質の位置および相対分子量を示す。VectはDNAベクター単独を用いて行ったTNT反応を示す。コードされるタンパク質の予測分子量は:M54、128.8kDa;M70(タグなし)、109.6kDa;およびM105、111.4kDaである。B)M70クローンを変異させてV5-および6xHis-タグ（配列番号９４）をつけたM70*を得た後、プラスミドをCOS-7細胞に一過性にトランスフェクトし、トランスフェクション後48時間で還元条件SDS-PAGEサンプル緩衝液中に全細胞を溶解し可溶化した。上記のようにSDS-PAGEによりタンパク質溶解物を分離し、ニトロセルロース膜にエレクトロブロットし、続いてこれをマウス抗V5モノクローナル抗体で試験した。左側の数字は(A)の場合と同様であり、Vectは空プラスミドベクターでトランスフェクトされた細胞からの溶解物を示す。M70*タンパク質の予測分子量は114.7kDaである。
【図４】独立した実験においてM54およびM105により誘発される、脾臓におけるウイルス複製に対する防御を示す図である。図2の場合と同様に、6匹のBALB/c群を治療せずに放置(Naive)するかまたは免疫感作した。最終免疫感作の3週間後、0.5x LD50のSG-MCMVでマウスに腹腔内チャレンジし、チャレンジ後6日目に脾臓を採取し、図2の場合と同様に力価を測定した。棒、円および横線は図2の場合と同様に記載されている。
【図５】一過性にトランスフェクトされた刺激細胞を用いる、IE1、M54またはM105を発現するDNAで免疫感作したBALB/cマウスにおけるCD8 T細胞応答のフローサイトメトリー分析を示す図である。空プラスミドベクター(Vect DNA)またはIE1、M54もしくはM105を発現するプラスミドDNA.のいずれかでマウスに4回皮内免疫感作した。MCMV感染により誘発されるCD8 T反応を測定するために、1.2□105PFUのTC-MCMVで他の群のマウスに腹腔内感染させた。最終DNA免疫感作またはMCMV感染の2週間後、マウスをICSアッセイのために屠殺した。実施例に記載されているように、脾細胞を調製し、計測し、ブレフェルディンAの存在下で、(Stimulation)で示されるIE1、M54またはM105のいずれかを発現するプラスミドDNAで48時間前にトランスフェクトされたBALB SV40(H-2d)刺激細胞とインキュベートした。刺激後、脾細胞をPE-Cy5-抗マウス-CD8aで表面染色し、固定し、FITC-抗マウス-IFNγ抗体で細胞内染色し、フローサイトメトリーで分析した。マウス#2を任意に選択し、免疫感作/感染および刺激群に対する1匹のマウスの散布図を示す。示されている百分率は、刺激後IFN-γ+であったCD8+T細胞の百分率であり、CD8およびIFN-γの二重陽性細胞の細胞数は、象限Q2における細胞数からゲートP4におけるバックグラウンド染色を差し引いたものとして算出される。
【図６】IE1、M54またはM105を発現するDNAで免疫感作したBALB/cマウスにおけるCD8 T細胞応答を示す図である。図4の場合と同様に、マウスの各群をDNA免疫感作またはMCMV感染した。A)最終DNA免疫感作またはMCMV感染の2週間後、ICSアッセイのために1群当たり3匹のマウスを屠殺した。図4における実験の全データにおいて、棒は各ワクチン群に関してIFN-γ+であったCD8+T細胞の群平均百分率を示し、記号は群における各マウスの個々の値を示す。同一の3つのTC-MCMV感染したマウスからの脾細胞は3つの刺激細胞群のそれぞれで試験したことに注意されたい。B)最終DNA免疫感作の3週間後またはTC-MCMVでの感染の4週間後のマウスでICSアッセイを行ったこと以外は(A)の場合と同じに行った。
【図７】SG-MCMVでのチャレンジ後5日目にDNA免疫感作またはTC-MCMV感染したマウスにおけるCD8 T反応を示す図である。空ベクターまたはIE1、M54もしくはM105のいずれか発現するプラスミドDNAのいずれかで3匹のBALB/cマウスを2週間で3回免疫感作した。図4の場合と同様にTC-MCMVで他の群のマウスを腹腔内感染させた。最終DNA免疫感作の7週間後またはMCMV感染の6週間後、1.2x105PFUのSG-MCMVでマウスに腹腔内チャレンジし、上記のようにチャレンジ後5日目にこれらのマウスの脾細胞にICSアッセイを行った。棒および記号は図5の場合と同様である。
【図８】HCMV(AD169株)の23個の保存された必須遺伝子のアミノ酸およびヌクレオチド配列ならびにそれらのMCMV(Smith株)ホモログのアミノ酸配列である。
【図９】HCMV(AD169株)に高度に保存された単純ヘルペスウイルス2型(HG52株)の12個の必須遺伝子のアミノ酸配列および対応するヌクレオチド配列である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８−２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図８−２１】
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