(57)【要約】  式（Ｉ）：【化９】2012524113.tif 000037［式中，基ａ，ｂ，ｃ，ｄ，Ｅ，ＺおよびＶの定義は明細書に記載されるとおりである］に示されるゲムシタビン構造に基づくプロドラッグ，ならびにその合成法および用途が開示される。Ｎ４基を修飾することにより，プロドラッグの溶解性，生物利用性および臓器特異性が改善される。すなわち，製造されるプロドラッグ化合物により代謝が速いという問題点が解決される。ゲムシタビンにより誘発される腸毒性が低下する。このことにより，プロドラッグは診療所において経口投与することができる。また，その抗腫瘍，抗癌，抗感染および拡散予防能力をさらに高めることができ，かつ肝臓または結腸で特異的に作用することができる。合成法は簡単でありかつ工業的製造に適している。
2012524113.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化６】
2012524113.tif 000034
［式中，ａは０−６の整数であり；ｂは０−６の整数であり；ｃは１−１８の整数であり；ｄは１−４の整数であり；
Ｅは，５員または６員の環状アルキル，１−４個の複素原子を有する５員または６員のシクロアルキル，アリール，またはヘテロアリールであり，ここで，複素原子はＯ，ＮまたはＳから選択され；
Ｚは，Ｏ，ＮまたはＳから選択され；
Ｖは，水素，アルキル，アルコキシ，エステル基，ハロゲン，アミド基，アミノまたは置換アミノから選択される］
の構造を有するゲムシタビンの構造に基づくプロドラッグ。
【請求項２】
Ｅは，以下のいずれかの構造：
【化７】
2012524113.tif 000035
から選択される，請求項１記載のゲムシタビンの構造に基づくプロドラッグ。
【請求項３】
Ｅは，以下のいずれかの構造：
【化８】
2012524113.tif 000036
から選択される，請求項２記載のゲムシタビンの構造に基づくプロドラッグ。
【請求項４】
ａは０または１であり，ｂは０または１であり，ＺはＯまたはＮであり，ｃは１０−１６えあり，ｄは１または２であり；Ｖは，水素またはアルキル基から選択される，請求項１記載のゲムシタビンの構造に基づくプロドラッグ。
【請求項５】
請求項１記載のゲムシタビンの構造に基づくプロドラッグを製造する方法であって，
１）酸無水物または塩化アシルをアルコールまたはアミンと，直接または有機溶媒に溶解して，酸無水物または塩化アシル対アルコールまたはアミンのモル比１：１−１：１．５で混合し，そして，室温から融点までの範囲の温度で２−８時間反応させて，対応する置換酸を生成し；
２）ゲムシタビン塩酸塩，工程１から得られた置換酸，ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジニルホスホニウムヘキサフルオロホスフェートおよび４−ジメチルアミノピリジンを，ゲムシタビン塩酸塩，工程１から得られた置換酸，ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジニルホスホニウムヘキサフルオロホスフェートおよび４−ジメチルアミノピリジンのモル比１：（１−２）：（０．９−１．５）：（１−３）で有機溶媒に溶解し，そして室温で１２−２４時間撹拌し；
３）工程２からの反応溶液を水に加え，抽出し，乾燥し，そして単離された有機相を精製して，所望の生成物を得る，
の各工程を含む方法。
【請求項６】
工程１における酸無水物は，無水フタル酸，無水ホモフタル酸，無水シクロヘキサン−１，２−ジカルボン酸，無水シクロペンタン−１，２−ジカルボン酸，無水ピラジンジカルボン酸，無水ピリジンジカルボン酸，無水チオフェンジカルボン酸，無水フランジカルボン酸，無水ピロールジカルボン酸，無水１，２，３，６−テトラヒドロフタル酸から選択される，請求項５記載のゲムシタビンの構造に基づくプロドラッグを製造する方法。
【請求項７】
工程１におけるアルコールは，ｎ−オクチルアルコール，ｎ−ノニルアルコール，ｎ−デシルアルコール，ｎ−ウンデシルアルコール，ラウリルアルコール，ｎ−デトラデカノール，ｎ−ヘキサデカノール，またはｎ−オクタデカノールから選択され，工程１におけるアミンは，ｎ−オクチルアミン，ｎ−ノニルアミン，ｎ−デシルアミン，ｎ−ウンデシルアミン，ｎ−ラウリルアミン，ｎ−テトラデシルアミン，ｎ−ヘキサデシルアミンまたはｎ−オクタデシルアミンから選択される，請求項５記載のゲムシタビンの構造に基づくプロドラッグを製造する方法。
【請求項８】
工程１における塩化アシルは，二酸とＳＯＣｌ２，ＰＣｌ５，ＰＣｌ３またはＰＯＣｌ３との反応から得られるものであり，ここで，二酸は，ピラジン−２，３−ジカルボン酸，ピリダジン−３，６−ジカルボン酸，イソフタル酸，ピリミジン−４，６−ジカルボン酸，ピリジン−２，５−ジカルボン酸，ピリジン−２，３−ジカルボン酸，ピリジン−２，６−ジカルボン酸，ジフェニル−２，２’−ジカルボン酸，チオフェン−２，５−ジカルボン酸，ピリジン−３，４−ジカルボン酸，ピリジン−２，４−ジカルボン酸，ピラゾール−３，５−ジカルボン酸，フタル酸，テレフタル酸，チオフェン−２，３−ジカルボン酸，チオフェン−３，４−ジカルボン酸，チオフェン−２，４−ジカルボン酸，ピラゾール−３，４−ジカルボン酸，シクロヘキサン−１，２−ジカルボン酸，シクロヘキサン−１，３−ジカルボン酸，シクロヘキサン−１，４−ジカルボン酸，シクロペンタン−１，２−ジカルボン酸，シクロペンタン−１，３−ジカルボン酸，シクロペンタン−１，４−ジカルボン酸，ピロール−２，３−ジカルボン酸，ピロール−２，４−ジカルボン酸，ピロール−２，５−ジカルボン酸，フラン２，３−ジカルボン酸，フラン−２，４−ジカルボン酸またはフラン−２，５−ジカルボン酸から選択される，請求項５記載のゲムシタビンの構造に基づくプロドラッグを製造する方法。
【請求項９】
工程１の反応時間は３−４時間であり，工程２において，ゲムシタビン塩酸塩，工程１から得られた置換酸，ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジニルホスホニウムヘキサフルオロホスフェートおよび４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＰ）を１：（１．１−１．３）：（１．１−１．３）：（１．１−１．３）のモル比で反応させ，工程１および２における有機溶媒は，Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド，テトラヒドロフラン，ジオキシン，ジメチルスルホキシド，スルホランまたはピリジンから選択される，請求項５記載のゲムシタビンの構造に基づくプロドラッグを製造する方法。
【請求項１０】
請求項１記載のゲムシタビンの構造に基づくプロドラッグの，肺癌，膵臓癌，乳癌，結腸癌，胃癌および肝癌の治療用の薬剤の製造における使用であって，薬剤は診療所で静脈内または経口で投与される，上記使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，ヌクレオシド剤分野に属し，特にゲムシタビンの構造に基づくプロドラッグ，その合成方法，および癌と関連疾病の治療用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＷＨＯの統計によると，２００７年に新たに癌と診断された患者は１２００万人に上り，世界中で癌により死亡した患者は毎年７００万人を超える。この数字は，急性心血管疾患より死亡した患者数と非常に近い。癌はいずれ世界死者数の最大の病気になると予想される。
【０００３】
ヌクレオシド剤，例えばシタラビン，ゲムシタビン，デシタビン，アザシチジン，クラドリビン，フルダラビン，アトロミド，ネララビン，６−アザウリジンおよびチアゾフリンなどはすでに幅広い範囲で各種の癌の治療に応用されている。同時に，多くのヌクレオシド剤が臨床研究段階にあり，その例として４’−チオ−フルオロ−アラ−Ｃ，２’−デオキシ−２’−フルオロメチルシチジン，４’−チオ−アラ−Ｃおよび３’−エチニルシチジン（ＥＣＹＤ）が挙げられる。
【０００４】
ゲムシタビン塩酸塩（Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ），化学名：２−デオキシ−２，２−ジフルオロシチジン塩酸塩はヌクレオシド剤である。これはアメリカのＥｌｉ  Ｌｉｌｌｙ社が開発し，１９９５年にオーストリア，フィンランドなどで商品名Ｇｅｍｚａｒ（中国語名称は健選）として上市された。ゲムシタビン塩酸塩は細胞周期特異性抗代謝剤である。主としてＤＮＡ合成期の腫瘍細胞，即ちＳ期細胞に作用する。ある条件下で，Ｇ１期からＳ期に進行することを阻止できる。ゲムシタビン塩酸塩は一つのプロドラッグとして，チミンデオキシリボシドキナーゼのリン酸化の良い基質であり，酵素の作用により次の代謝物に変換される：ゲムシタビン一リン酸（ｄＦｄＣＭＰ），ゲムシタビン二リン酸（ｄＦｄＣＤＰ）およびゲムシタビン三リン酸（ｄＦｄＣＴＰ）。これらの中で，ｄＦｄＣＤＰとｄＦｄＣＴＰは活性化体である。ｄＦｄＣＤＰはリボヌクレオチド還元酵素を抑制し，ＤＮＡ修復に必要なデオキシヌクレオチドの量を減少させる。ゲムシタビン塩酸塩は非小細胞肺癌，すい臓癌，膀胱癌，乳癌およびその他の実体腫瘍の治療に有効である。ゲムシタビンが引き起こす腸毒性およびその低生物利用性のため，臨床ではゲムシタビンは静脈注射により投与しなければならず，経口投与はできない。
【０００５】
５−ＦＵ（５−フルオロウラシル）は後期大腸癌を治療する基本薬物である。ゲムシタビン塩酸塩は５−ＦＵとそのターゲット（チミジル酸合成酵素）との結合を促進し，後者がＤＮＡ合成を抑制する効果を増強する。大腸癌は悪性の結腸上皮腫瘍である。ヨーロッパ，北米とオーストラリアでは最も一般的な悪性腫瘍の一つである。大腸癌は癌死亡原因の第二位を占める。アフリカ，アジア，南米では，大腸癌の発生率は低いが，ライフスタイルの洋風化により発生率が上がる傾向がある。
【０００６】
しかし，この薬物は肝臓で速やかに不活性化されるので，ゲムシタビン塩酸塩は肝臓癌の治療には応用できない。
【０００７】
肝臓癌は，世界で癌の中で第三位の死亡原因である。肝臓癌の危険因子には，ＨＢＶやＨＣＶが含まれている。世界的に，ＨＢＶが肝細胞癌の６０％−８０％を引き起こすと考えられている。有効な化学療法剤が欠如しているため，肝臓癌については，まだ標準的治療法が確立していない。ドキソルビシンが最も広く使用されている薬剤であると報告されているが，唯一の６０例患者を対象とした無作為化対照試験で有効性が示唆されているにすぎない。ドキソルビシンが致命的な合併症を引き起こす可能性は約２５％である。ミトロキサントロンは，肝細胞癌の治療薬として認可されているが，肝細胞癌の治療に有効な薬物だとは考えられない。
【０００８】
２００７年米国臨床腫瘍学第４３回年次総会で発表されたソラフェニブ（Ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）の肝細胞癌用薬評価プログラム（ＳＨＡＲＰ）の臨床試験結果が注目された。研究結果は，ソラフェニブは後期肝細胞癌患者の生存期間を延ばすことができる最初の薬剤であることを示した。この結果は，後期肝臓癌の標準治療法の歴史を書き換える可能性がある。
【０００９】
肝機能の特異性のため，ヌクレオシド剤は肝臓で速やかに代謝され非活性体になり，効力を失う。これまで，肝臓癌を治療できるヌクレオシド剤はない。米国Ｍｅｔａｂａｓｉｓ社は直接に肝で酵素分解する技術，すなわち，肝でサイクリックリン酸のプロドラッグを酵素分解する方法を開発した。これを用いて，非環状および環状抗ウイルス剤或いは抗腫瘍ヌクレオシド化合物の臨床研究に成功した。シタラビン系のプロドラッグの肝臓癌に対する臨床評価が進められている（ＵＳ２００５／０１０１７７５；Ｍａｒｋ  Ｅｒｉｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００４，１２６，５１５４−５１６３）。しかし，Ｍｅｔａｂａｓｉｓ社の研究はシタラビンのＯ５位におけるサイクリックリン酸化に限定されている。
【００１０】
肝臓を標的としたヌクレオシドプロドラッグは以下の特徴を持つ：
ａ）肝臓特異性があり，肝臓癌のターゲット治療に用いることができる；ｂ）インビボでリン酸化の律速段階を加速し，その効果を増加できる；ｃ）吸収，浸透，安定性，パイク特性などの物理化学性質を改善できる；ｄ）ヌクレオシド剤の副作用を減らし，付加毒性を引き起こさない。
【００１１】
しかし，癌細胞の薬剤耐性は一般的であり，新たな抗癌剤が緊急に求められているため，ヒトの健康を改善するために異なる角度から，安全で信頼性の高い新たな抗癌剤が緊急に必要である。臓器特異性を持つヌクレオシド類プロドラッグは最も有望な新たな方法の一つである。
【００１２】
ヌクレオシド類プロドラッグは抗癌剤の副作用を減らす最も有望な新たな方法である。抗癌剤のプロドラッグは目標臓器にデリバリーされると，酵素の作用で活性な化合物に変換されて，効果を発揮する。ヌクレオシド剤の欠点を克服するため，カペシタビンとエノシタビンなどのプロドラッグが開発されている。現在，多くの製薬会社は癌を治療する他のプロドラッグを積極的に研究している（Ｇ．Ｘｕ，Ｈ．Ｌ．ＭｃＬｅｏｄ，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２００１，７，３３１４−３３２４；Ｍ．Ｒｏｏｓｅｂｏｏｍ，Ｊ．Ｎ．Ｍ．Ｃｏｍｍａｎｄｅｕｒ，Ｎ．Ｐ．Ｅ．Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．，２００４，５６，５３−１０２；Ｗ．Ｄ．Ｗｕ，Ｊ．Ｓｉｇｍｏｎｄ，Ｇ．Ｊ．Ｐｅｔｅｒｓ，Ｒ．Ｆ．Ｂｏｒｃｈ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００７，５０，３７４３−３７４６）。
【００１３】
ＷＯ２００５／０２５５５２およびＷＯ２００６／０３０２１７は，カルボン酸エステルでゲムシタビン環の５’−ＯＨを保護した一連のプロドラッグを合成した。その中には，モノカルボン酸エステルおよびビスカルボン酸エステルが含まれる。一般式は次のとおりである：
V-(L)n-COO-(L)m-D
V-(L)n-COO-(L)p-COO-(L)m-D
式中，Ｄは活性な薬物成分，ｎ，ｍ，ｐは０または１，ＬはＣ１−２０，好ましくは１−１０，より好ましくは１−３の炭素鎖であり，Ｌは（ＣＨ２）ｑであり，ｑは１−３或いは４以上である。Ｖは保護された鎖の末端であり，Ｖは代謝過程において切断しうる基或いは原子でありうる。Ｓｏｎｇらは，アミノ酸エステルでゲムシタビン環の５’−ＯＨを保護することを報告した（Ｓｏｎｇ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ２００４，２，１５７−１６７）。Ｗｕらは，リン酸アミドでゲムシタビン環の５’−ＯＨを保護することを報告した（Ｗ．Ｄ．Ｗｕ，Ｊ．Ｓｉｇｍｏｎｄ，Ｇ．Ｊ．Ｐｅｔｅｒｓ，Ｒ．Ｆ．Ｂｏｒｃｈ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００７，５０，３７４３−３７４６）。最近，ＷＯ２００９／０５３６５４は，リン酸エステル基でゲムシタビン環の５’−ＯＨを保護することを報告した。ＷＯ９８／３２７６２，ＷＯ０４／０４１２０３，ＷＯ２００６／０９８６２８およびＵＳ２００７／２２５２４８は，飽和および不飽和カルボン酸エステルでＯ５およびＮ４を同時に保護して，生物学試験を行っている。
【００１４】
最近，米国Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ社は分枝鎖のカルボン酸アミノ基で保護したゲムシタビンのＮ４プロドラッグであるＬＹ２３３４７３７を報告した（ＷＯ２００６／０６５５２５，ＷＯ２００７／１４９８９１，Ｂｅｎｄｅｒ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００９，５２，６９５８−６９６１）。これは臨床試験中であるが，腸毒性の副作用はまだ完全に解決されていない。
【００１５】
これまで，環状ジカルボン酸基，例えば，エステル基，アミド基，カルボキシル基など）でゲムシタビンのＮ４を保護することを報告する特許または文献はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】ＵＳ２００５／０１０１７７５
【特許文献２】ＷＯ２００５／０２５５５２
【特許文献３】ＷＯ２００６／０３０２１７
【特許文献４】ＷＯ２００９／０５３６５４
【特許文献５】ＷＯ９８／３２７６２
【特許文献６】ＷＯ０４／０４１２０３
【特許文献７】ＷＯ２００６／０９８６２８
【特許文献８】ＵＳ２００７／２２５２４８
【特許文献９】ＷＯ２００６／０６５５２５
【特許文献１０】ＷＯ２００７／１４９８９１
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Ｍａｒｋ  Ｅｒｉｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００４，１２６，５１５４−５１６３
【非特許文献２】Ｇ．Ｘｕ，Ｈ．Ｌ．ＭｃＬｅｏｄ，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２００１，７，３３１４−３３２４
【非特許文献３】Ｍ．Ｒｏｏｓｅｂｏｏｍ，Ｊ．Ｎ．Ｍ．Ｃｏｍｍａｎｄｅｕｒ，Ｎ．Ｐ．Ｅ．Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．，２００４，５６，５３−１０２
【非特許文献４】Ｗ．Ｄ．Ｗｕ，Ｊ．Ｓｉｇｍｏｎｄ，Ｇ．Ｊ．Ｐｅｔｅｒｓ，Ｒ．Ｆ．Ｂｏｒｃｈ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００７，５０，３７４３−３７４６
【非特許文献５】Ｓｏｎｇ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ２００４，２，１５７−１６７
【非特許文献６】Ｂｅｎｄｅｒ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００９，５２，６９５８−６９６１
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１８】
発明の開示
従来の技術における問題点に鑑みて，本発明の目的は，ゲムシタビンの構造に基づくプロドラッグ，およびゲムシタビンの構造に基づくプロドラッグを製造する方法を提供することである。本発明のゲムシタビンは，ヌクレオシド抗癌剤のプロドラッグの基本構造として用いられる。１つの観点においては，プロドラッグは，肺癌細胞および膵臓癌細胞における薬剤耐性の可能性を回避するよう設計される。また，Ｎ４位を改変することにより，その溶解性，生物利用性および臓器特異性を改良することができる。プロドラッグは，高代謝の欠点を克服し，ゲムシタビンにより引き起こされる腸の毒性を低減させ，その生物利用性を改善し，診療所における経口投与を可能とする。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は，ゲムシタビン構造に基づくプロドラッグを提供する。プロドラッグの一般構造式は式（Ｉ）で示される：
【化１】
2012524113.tif 000003
［式中，ａは０−６の整数であり；ｂは０−６の整数であり；ｃは１−１８の整数であり；ｄは１−４の整数であり；
Ｅは，５員または６員の環状アルキル，１−４個の複素原子を有する５員または６員のシクロアルキル，アリール，またはヘテロアリールであり，複素原子は，Ｏ，ＮまたはＳから選択される。
【００２０】
環中の接続位置は，化学的に許容される任意の位置であることができる。環は，置換基を有していなくてもよく，または化学的に許容される環上の任意の位置に１またはそれ以上の置換基を有していてもよい。
【００２１】
Ｚは，Ｏ，ＮまたはＳから選択され；Ｖは，水素，アルキル，アルコキシ，エステル基，ハロゲン，アミド基，アミノまたは置換アミノから選択される。
【００２２】
好ましくは，Ｅは，以下のいずれかの構造：
【化２】
2012524113.tif 000004
から選択される。
【００２３】
より好ましくは，Ｅは，以下のいずれかの構造：
【化３】
2012524113.tif 000005
から選択される。
【００２４】
好ましくは，ａは０または１であり；ｂは０または１であり；ＺはＯまたはＮであり；ｃは１０−１６であり；ｄは１または２であり；好ましくは，Ｖは水素またはアルキルから選択される。
【００２５】
ゲムシタビンプロドラッグ誘導体の代表的な合成経路は以下に示されるとおりである：
【化４】
2012524113.tif 000006
［式中，Ｒ１は，
【化５】
2012524113.tif 000007
であり，Ｅ，Ｚ，Ｖは上で定義したとおりである］。
【００２６】
本発明はまた，これらのゲムシタビンの構造に基づくプロドラッグの合成方法を提供する。該方法は，以下の工程を含む：
１）酸無水物または塩化アシルを，酸無水物または塩化アシル対アルコールまたはアミンのモル比１：１−１：１．５で，アルコールまたはアミンと直接混合するか，またはアルコールまたはアミンとともに有機溶媒に溶解し，そして，室温から反応物の融点までの範囲の温度で２−８時間反応させて，対応する置換酸を生成し；
２）ゲムシタビン塩酸塩，工程１からの置換酸，ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジニルホスホニウムヘキサフルオロホスフェートおよび４−ジメチルアミノピリジンを，モル比１：（１−２）：（０．９−１．５）：（１−３）で有機溶媒に溶解し，そして室温で１２−２４時間撹拌し；
３）工程２の反応溶液を水に注加し，そして抽出する。抽出した有機相を乾燥し，精製して，所望の生成物を得る。
【００２７】
好ましくは，工程１における酸無水物は，無水フタル酸，無水ホモフタル酸，無水シクロヘキサン−１，２−ジカルボン酸，無水シクロペンタン−１，２−ジカルボン酸，無水ピラジンジカルボン酸，無水ピリジンジカルボン酸，無水チオフェンジカルボン酸，無水フランジカルボン酸，無水ピロールジカルボン酸，または無水１，２，３，６−テトラヒドロフタル酸から選択される。
【００２８】
好ましくは，工程１におけるアルコールは，メタノール，ｎ−オクチルアルコール，ｎ−ノニルアルコール，ｎ−デシルアルコール，ｎ−ウンデシルアルコール，ラウリルアルコール，ｎ−デトラデカノール，ｎ−ヘキサデカノール，またはｎ−オクタデカノールから選択される。
【００２９】
好ましくは，工程１におけるアミンは，ｎ−オクチルアミン，ｎ−ノニルアミン，ｎ−デシルアミン，ｎ−ウンデシルアミン，ｎ−ラウリルアミン，ｎ−テトラデシルアミン，ｎ−ヘキサデシルアミンまたはｎ−オクタデシルアミンから選択される。
【００３０】
好ましくは，工程１または２における有機溶媒は，Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド，テトラヒドロフラン，ジオキシン，ジメチルスルホキシド，スルホランまたはピリジンから選択される。
【００３１】
好ましくは，工程１における塩化アシルは，ジカルボン酸とＳＯＣｌ２，ＰＣｌ５，ＰＣｌ３またはＰＯＣｌ３との反応により得られる。工程１におけるジカルボン酸は，ピラジン−２，３−ジカルボン酸，ピリダジン−３，６−ジカルボン酸，イソフタル酸，ピリミジン−４，６−ジカルボン酸，ピリジン−２，５−ジカルボン酸，ピリジン−２，３−ジカルボン酸，ジフェニル−２，２’−ジカルボン酸，ピリジン−２，６−ジカルボン酸，チオフェン−２，５−ジカルボン酸，ピリジン−３，４−ジカルボン酸，ピリジン−２，４−ジカルボン酸，ピラゾール−３，５−ジカルボン酸，フタル酸，テレフタル酸，チオフェン−２，３−ジカルボン酸，チオフェン−３，４−ジカルボン酸，チオフェン−２，４−ジカルボン酸，ピラゾール−３，４−ジカルボン酸，シクロヘキサン−１，２−ジカルボン酸，シクロヘキサン−１，３−ジカルボン酸，シクロヘキサン−１，４−ジカルボン酸，シクロペンタン−１，２−ジカルボン酸，シクロペンタン−１，３−ジカルボン酸，シクロペンタン−１，４−ジカルボン酸，ピロール−２，３−ジカルボン酸，ピロール−２，４−ジカルボン酸，ピロール−２，５−ジカルボン酸，フラン−２，３−ジカルボン酸，フラン−２，４−ジカルボン酸またはフラン−２，５−ジカルボン酸から選択される。
【００３２】
好ましくは，工程１における反応時間は３−４時間であり；好ましくは，工程２において，ゲムシタビン塩酸塩，工程１から得られる置換酸，ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジニルホスホニウムヘキサフルオロホスフェートおよび４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＰ）のモル比は，１：（１．１−１．３）：（１．１−１．３）：（１．１−１．３）である。
【００３３】
本発明はまた，ゲムシタビンの構造に基づくプロドラッグの用途を提供し，ここで，プロドラッグは，肺癌，膵臓癌，胃癌，乳癌，結腸癌および肝癌の治療用の薬剤の製造のために用いられる。
【００３４】
本発明の有益な効果は次のとおりである：
本発明の臓器特異的プロドラッグの研究は，上述のＯ５位の環状リン酸化を有するシタラビンのプロドラッグの研究に基づくものである。より優れた抗癌効果を有するゲムシタビンをこれらのヌクレオシド抗癌プロドラッグの基本構造として用いる。これは，肺癌細胞または膵臓癌細胞におけるゲムシタビンの薬剤耐性を克服することができる。さらに，Ｎ４位を別の置換基，例えば，芳香族環または異なる複素環を含む脂肪族鎖で修飾することにより，薬剤の溶解性，生物利用性および臓器特異性を高めることができる。得られるプロドラッグは，高代謝の欠点を克服し，ゲムシタビンにより引き起こされる腸の毒性を低減させ，その生物利用性を改善し，診療所における経口投与を可能とする。さらに，これは薬剤の抗腫瘍，抗癌，抗感染および抗拡散の能力を改善することができ，特に肝臓および結腸において作用することができる。
【００３５】
本発明の合成経路は，単純な方法および容易に入手可能な材料を利用し，高い収率かつ低いコストであり，工業的製造に適している。
【００３６】
ゲムシタビンの構造に基づくプロドラッグを製造するための，合成法およびスクリーニング方法，特に，種々の癌および関連する疾患を治療するための方法および成分に関連する研究を含む本発明の方法は，シトシン，その置換体または５−Ｎ−ヘテロシトシン構造を含む他のヌクレオシド抗癌プロドラッグにも適用することができる。
【００３７】
本発明は，特定の臓器，例えば，肺，肝臓，結腸等に直接作用することができる（臓器特異的）関連するヌクレオシドプロドラッグの設計，合成，医薬組成物および適用方法を含む。さらに，本発明の方法は，他のヌクレオシド抗癌剤にも拡張することができる。したがって，本発明の研究は，ゲムシタビンのみならず，他のヌクレオシド抗癌剤，例えば，アザシチジン，デシタビン，アザシトシン，チアゾフリン，ネララビン，６−アザウリジンおよびシタラビン等にも適用可能であり，これらに限定されない。本発明の方法はまた，臨床試験中のヌクレオシド抗癌剤，例えば，２’−デオキシ−２’−フルオロ−メチル，４’−チオ−アラシチジン，４’−チオフルオロ−アラシチジン，３’−エチニルシチジン等にも応用することができる。特定の機能をもつヌクレオシドプロドラッグは，ゲムシタビンに起因する腸毒性を回避し，その生物利用性を改善し，診療所において経口投与により利用できるようにするための合理的な設計および合成により得ることができる。そして，ヌクレオシド薬剤の肝臓における速い代謝に起因する活性喪失の欠点を克服することができる。本発明の研究は，後期肝癌および結腸癌の新規な治療を開発することができる。
【実施例】
【００３８】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明する。ただし，本発明はこれらの実施例により限定されない。
【００３９】
ゲムシタビン塩酸塩はＮｉｎｇｂｏ  Ｔｅａｍｐｈａｒｍ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．より購入した。
（ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ）トリピロリジニルホスホニウムヘキサフルオロホスフェートはＧＬ  Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｌｔｄ．より購入した。
４−ジメチルアミノピリジンはＧＬ  Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｌｔｄ．より購入した。
【００４０】
実施例１
ドデシル−２−（（１−（（２Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−３，３−ジフルオロ−４−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロフラン−２−イル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル）カルバモイル）ベンゾエート（化合物Ｎｏ．１）
無水Ｏ−フタル酸（５．０ｇ，３４ｍｍｏｌ），１−ドデカノール（７．５ｇ，４０ｍｍｏｌ）および４−ジメチルアミノピリジン（２４０ｍｇ，２ｍｍｏｌ）の混合物を融解するまで加熱し，４時間反応させ，次に室温まで冷却して，２−（ドデシルオキシカルボニル）安息香酸を得た。
【００４１】
ゲムシタビン塩酸塩（０．７ｇ，２．３４ｍｍｏｌ），２−（ドデシルオキシカルボニル）安息香酸（１．０２ｇ，３．０４ｍｍｏｌ），（ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ）トリピロリジニルホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（１．３４ｇ，２．５７ｍｍｏｌ），および４−ジメチルアミノピリジン（４２８ｍｇ，３．５１ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）に溶解し，室温で一晩撹拌した。反応混合物を水に注加し，次に酢酸エチルで３回抽出した。単離した有機相を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を減圧下で蒸発させることにより除去した。残渣をシリカカラムクロマトグラフィー（展開剤：ジクロロメタン／メタノール＝３０／１）により精製して，３６２．５ｍｇのドデシル−２−（（１−（（２Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−３，３−ジフルオロ−４−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロフラン−２−イル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル）カルバモイル）ベンゾエートを得た。ＬＣ純度９８％（ＵＶ２５４）．ＬＣ−ＭＳｍ／ｚ５８０［Ｍ＋Ｈ］＋（分子式：Ｃ２９Ｈ３９Ｆ２Ｎ３Ｏ７，分子量５７９，）。化合物の構造および特性データは表１に示される。
【００４２】
実施例２
ウンデシル−２−（（１−（（２Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−３，３−ジフルオロ−４−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロフラン−２−イル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル）カルバモイル）ベンゾエート（化合物Ｎｏ．２）
表題化合物は，実施例１に記載の方法により，１−ドデカノールの代わりに１−ウンデカノールを用いて製造した。ＬＣ純度：９５％（ＵＶ２５４）．ＬＣ−ＭＳｍ／ｚ５６６［Ｍ＋Ｈ］＋（分子式：Ｃ２８Ｈ３７Ｆ２Ｎ３Ｏ７，分子量：５６５）
【００４３】
実施例３
ヘキサデシル−２−（（１−（（２Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−３，３−ジフルオロ−４−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロフラン−２−イル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル）カルバモイル）ベンゾエート（化合物Ｎｏ．３）
表題化合物は，実施例１に記載の方法により，１−ドデカノールの代わりに１−ヘキサデカノールを用い，Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドの代わりにＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドを用い，反応時間を６時間としてて製造した。ＬＣ純度９６％（ＵＶ２５４）．ＬＣ−ＭＳｍ／ｚ６３６［Ｍ＋Ｈ］＋，（分子式：Ｃ３３Ｈ４７Ｆ２Ｎ３Ｏ７，分子量：６３５）
【００４４】
実施例４
ドデシル−３−（（１−（（２Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−３，３−ジフルオロ−４−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロフラン−２−イル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル）カルバモイル）ピラジン−２−カルボキシレート（化合物Ｎｏ．４，以下ＳＬ−０１と表記）
ピラジン−２，３−ジカルボン酸（５０４ｍｇ，３．０ｍｍｏｌ）およびＤＭＦ（２滴）を１５ｍＬのＳＯＣｌ２に加えた。反応混合物を５時間還流した。ＳＯＣｌ２を除去し，６１２ｍｇのピラジン−２，３−ジカルボニル二塩化物がほぼ定量的に得られた。ピラジン−２，３−ジカルボニル二塩化物（６１２ｍｇ，３．０ｍｍｏｌ）をジオキシン（２０ｍＬ）に溶解した。ジオキシン（５ｍＬ）中の１−ドデカノール（５５８ｍｇ）およびＥｔ３Ｎ（２ｍＬ）を氷水浴中の溶液に滴加し，４時間反応させ，濃縮し，乾固した。残渣を水に溶解し，ｐＨを２−３に調節し，酢酸エチルで３回抽出した。単離した有機相を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を減圧下で蒸発させることにより除去して，３−（ドデシルオキシカルボニル）ピラジン−２−カルボン酸をほぼ定量的に得た。
【００４５】
ゲムシタビン塩酸塩（５００ｍｇ，１．６７ｍｍｏｌ），３−（ドデシルオキシカルボニル）ピラジン−２−カルボン酸（６７４ｍｇ，２．０１ｍｍｏｌ），（ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（９５５ｍｇ，１．８４ｍｍｏｌ），および４−ジメチルアミノピリジン（２４４ｍｇ，２．０ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）に溶解し，室温で一晩撹拌した。反応混合物を水に注加し，次に酢酸エチルで３回抽出した。単離した有機相を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を減圧下で蒸発させることにより除去した。残渣をシリカカラムクロマトグラフィー（展開剤；ジクロロメタン／メタノール＝４０／１）により精製して，２２５．７ｍｇのドデシル−３−（（１−（（２Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−３，３−ジフルオロ−４−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロフラン−２−イル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル）カルバモイル）ピラジン−２−カルボキシレートを得た。ＬＣ純度９８％（ＵＶ２５４）．ＬＣ−ＭＳｍ／ｚ５８２［Ｍ＋Ｈ］＋，（分子式：Ｃ２７Ｈ３７Ｆ２Ｎ５Ｏ７，分子量：５８１）。化合物の構造および特性データは表１に示される。
【００４６】
実施例５
ウンデシル−３−（（１−（（２Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−３，３−ジフルオロ−４−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロフラン−２−イル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル）カルバモイル）ピラジン−２−カルボキシレート（化合物Ｎｏ．５）
表題化合物は，実施例４に記載の方法により，１−ドデカノールの代わりに１−ウンデカノールを用い，ジオキシンの代わりにテトラヒドロフランを用いて製造した。ＬＣ純度９７％（ＵＶ２５４）．ＬＣ−ＭＳｍ／ｚ５６８［Ｍ＋Ｈ］＋，（分子式：Ｃ２６Ｈ３５Ｆ２Ｎ５Ｏ７，分子量：５６７）．化合物の構造および特性データは表１に示される。
【００４７】
実施例６
デシル−３−（（１−（（２Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−３，３−ジフルオロ−４−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロフラン−２−イル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル）カルバモイル）ベンゾエート（化合物Ｎｏ．６）
表題化合物は，実施例４に記載の方法により，ピラジン−２，３−ジカルボン酸の代わりにｍ−フタル酸を用い，ジオキシンの代わりにスルホランを用い，１−ドデカノールの代わりに１−デカノールを用いて製造した。ＬＣ純度９６％（ＵＶ２５４ｎｍ）．ＬＣ−ＭＳｍ／ｚ５５２［Ｍ＋Ｈ］＋，（分子式：Ｃ２７Ｈ３５Ｆ２Ｎ３Ｏ７，分子量：５５１）
【００４８】
実施例７
ウンデシル−３−（（１−（（２Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−３，３−ジフルオロ−４−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロフラン−２−イル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル）カルバモイル）ベンゾエート（化合物Ｎｏ．７）
表題化合物は，実施例４に記載の方法により，ピラジン−２，３−ジカルボン酸の代わりにｍ−フタル酸を用い，ジオキシンの代わりにジメチルスルホキシドを用い，１−ドデカノールの代わりに１−ウンデカノールを用いて製造した。ＬＣ純度８８％（ＵＶ２５４ｎｍ）．ＬＣ−ＭＳｍ／ｚ５６６［Ｍ＋Ｈ］＋，（分子式：Ｃ２８Ｈ３７Ｆ２Ｎ３Ｏ７，分子量：５６５）
【００４９】
実施例８
ドデシル−６−（（１−（（２Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−３，３−ジフルオロ−４−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロフラン−２−イル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル）カルバモイル）ニコチネート（化合物Ｎｏ．８）
表題化合物は，実施例４に記載の方法により，ピラジン−２，３−ジカルボン酸の代わりにピリジン−２，５−ジカルボン酸を用い，反応時間を３時間として製造した。ＬＣ純度９７％（ＵＶ２５４ｎｍ）．ＬＣ−ＭＳｍ／ｚ５８１［Ｍ＋Ｈ］＋，（分子式：Ｃ２８Ｈ３８Ｆ２Ｎ４Ｏ７，分子量：５８０）．化合物の構造および特性データは表１に示される。
【００５０】
実施例９
ドデシル−５−（（１−（（２Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−３，３−ジフルオロ−４−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロフラン−２−イル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル）カルバモイル）ピコリネート（化合物Ｎｏ．９）
表題化合物は，実施例４に記載の方法により，ピラジン−２，３−ジカルボン酸の代わりにピリジン−２，５−ジカルボン酸を用い，ジオキシンの代わりにピリジンを用いて製造した。ＬＣ純度９４％（ＵＶ２５４ｎｍ）．ＬＣ−ＭＳｍ／ｚ５８１［Ｍ＋Ｈ］＋，（分子式：Ｃ２８Ｈ３８Ｆ２Ｎ４Ｏ７，分子量：５８０）．化合物の構造および特性データは表１に示される。
【００５１】
実施例１０
ウンデシル−６−（（１−（（２Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−３，３−ジフルオロ−４−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロフラン−２−イル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル）カルバモイル）ニコチネート（化合物Ｎｏ．１０）
表題化合物は，実施例４に記載の方法により，ピラジン−２，３−ジカルボン酸の代わりにピリジン−２，５−ジカルボン酸を用い，１−ドデカノールの代わりに１−ウンデカノールを用いて製造した。ＬＣ純度９９％（ＵＶ２５４ｎｍ）．ＬＣ−ＭＳｍ／ｚ５６７［Ｍ＋Ｈ］＋，（分子式：Ｃ２７Ｈ３６Ｆ２Ｎ４Ｏ７，分子量：５６６）．化合物の構造およびデータは表１に示される。
【００５２】
実施例１１
ウンデシル−５−（（１−（（２Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−３，３−ジフルオロ−４−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロフラン−２−イル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル）カルバモイル）ピコリネート（化合物Ｎｏ．１１）
表題化合物は，実施例４に記載の方法により，ピラジン−２，３−ジカルボン酸の代わりにピリジン−２，５−ジカルボン酸を用い，１−ドデカノールの代わりに１−ウンデカノールを用いて製造した。ＬＣ純度９７％（ＵＶ２５４ｎｍ）．ＬＣ−ＭＳｍ／ｚ５６７［Ｍ＋Ｈ］＋，（分子式：Ｃ２７Ｈ３６Ｆ２Ｎ４Ｏ７，分子量：５６６）．化合物の構造および特性データは表１に示される。
【００５３】
実施例１２
ドデシル−３−（（１−（（２Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−３，３−ジフルオロ−４−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロフラン−２−イル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル）カルバモイル）ピコリネート（化合物Ｎｏ．１２）
表題化合物は，実施例４に記載の方法により，ピラジン−２，３−ジカルボン酸の代わりにピリジン−２，３−ジカルボン酸を用いて製造した。ＬＣ純度９７％（ＵＶ２５４ｎｍ）．ＬＣ−ＭＳｍ／ｚ５８１［Ｍ＋Ｈ］＋，（分子式：Ｃ２８Ｈ３８Ｆ２Ｎ４Ｏ７，分子量：５８０）
【００５４】
実施例１３
ドデシル−２−（（１−（（２Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−３，３−ジフルオロ−４−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロフラン−２−イル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル）カルバモイル）ニコチネート（化合物Ｎｏ．１３）
表題化合物は，実施例４に記載の方法により，ピラジン−２，３−ジカルボン酸の代わりにピリジン−２，３−ジカルボン酸を用いて製造した。ＬＣ純度９７％（ＵＶ２５４ｎｍ）．ＬＣ−ＭＳｍ／ｚ５８１［Ｍ＋Ｈ］＋，（分子式：Ｃ２８Ｈ３８Ｆ２Ｎ４Ｏ７，分子量：５８０）
【００５５】
実施例１４
ウンデシル−２−（（１−（（２Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−３，３−ジフルオロ−４−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロフラン−２−イル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル）カルバモイル）ニコチネート（化合物Ｎｏ．１４）
表題化合物は，実施例４に記載の方法により，ピラジン−２，３−ジカルボン酸の代わりにピリジン−２，３−ジカルボン酸を用い，１−ドデカノールの代わりに１−ウンデカノールを用いて製造した。ＬＣ純度９８％（ＵＶ２５４ｎｍ）．ＬＣ−ＭＳｍ／ｚ５６７［Ｍ＋Ｈ］＋，（分子式：Ｃ２７Ｈ３６Ｆ２Ｎ４Ｏ７，分子量：５６６）
【００５６】
実施例１５
ウンデシル−３−（（１−（（２Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−３，３−ジフルオロ−４−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロフラン−２−イル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル）カルバモイル）ピコリネート（化合物Ｎｏ．１５）
表題化合物は，実施例４に記載の方法により，ピラジン−２，３−ジカルボン酸の代わりにピリジン−２，３−ジカルボン酸を用い，１−ドデカノールの代わりに１−ウンデカノールを用いて製造した。ＬＣ純度９７％（ＵＶ２５４ｎｍ）．ＬＣ−ＭＳｍ／ｚ５６７［Ｍ＋Ｈ］＋，（分子式：Ｃ２７Ｈ３６Ｆ２Ｎ４Ｏ７，分子量：５６６）．化合物の構造および特性データは表１に示される。
【００５７】
実施例１６
メチル−２−（２−（（１−（（２Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−３，３−ジフルオロ−４−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロフラン−２−イル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル）カルバモイル）フェニル−１−イル）ベンゾエート（化合物Ｎｏ．１６）
表題化合物は，実施例４に記載の方法により，ピラジン−２，３−ジカルボン酸の代わりにビフェニル−２，２，−ジカルボン酸を用い，１−ドデカノールの代わりにメタノールを用いて製造した。ＬＣ純度８６％（ＵＶ２５４ｎｍ）．ＬＣ−ＭＳｍ／ｚ５０２［Ｍ＋Ｈ］＋，（分子式：Ｃ２４Ｈ２１Ｆ２Ｎ３Ｏ７，分子量：５０１）
【００５８】
実施例１７
ドデシル−２−（２−（（１−（（２Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−３，３−ジフルオロ−４−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロフラン−２−イル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル）カルバモイル）フェニル−１−イル）ベンゾエート（化合物Ｎｏ．１７）
表題化合物は，実施例４に記載の方法により，ピラジン−２，３−ジカルボン酸の代わりにビフェニル−２，２，−ジカルボン酸を用いて製造した。ＬＣ純度９８％（ＵＶ２５４ｎｍ）．ＬＣ−ＭＳｍ／ｚ６５６［Ｍ＋Ｈ］＋，（分子式：Ｃ３５Ｈ４３Ｆ２Ｎ３Ｏ７，分子量：６５５）
【００５９】
実施例１８
ドデシル−６−（（１−（（２Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−３，３−ジフルオロ−４−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロフラン−２−イル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル）カルバモイル）ピコリネート（化合物Ｎｏ．１８）
表題化合物は，実施例４に記載の方法により，ピラジン−２，３−ジカルボン酸の代わりにピリジン−２，６−ジカルボン酸を用いて製造した。ＬＣ純度９６％（ＵＶ２５４ｎｍ）．ＬＣ−ＭＳｍ／ｚ５８１［Ｍ＋Ｈ］＋，（分子式：Ｃ２８Ｈ３８Ｆ２Ｎ４Ｏ７，分子量：５８０）
【００６０】
実施例１９
ウンデシル−６−（（１−（（２Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−３，３−ジフルオロ−４−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロフラン−２−イル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル）カルバモイル）ピコリネート（化合物Ｎｏ．１９）
表題化合物は，実施例４に記載の方法により，ピラジン−２，３−ジカルボン酸の代わりにピリジン−２，６−ジカルボン酸を用い，１−ドデカノールの代わりにｎ−ウンデカノールを用いて製造した。ＬＣ純度９５％（ＵＶ２５４ｎｍ）．ＬＣ−ＭＳｍ／ｚ５６７［Ｍ＋Ｈ］＋，（分子式：Ｃ２７Ｈ３６Ｆ２Ｎ４Ｏ７，分子量：５６６）
【００６１】
実施例２０
ドデシル−５−（（１−（（２Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−３，３−ジフルオロ−４−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロフラン−２−イル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル）カルバモイル）チオフェン−２−カルボキシレート（化合物Ｎｏ．２０）
表題化合物は，実施例４に記載の方法により，ピラジン−２，３−ジカルボン酸の代わりにチオフェン−２，５−ジカルボン酸を用いて製造した。ＬＣ純度９５％（ＵＶ２５４ｎｍ）．ＬＣ−ＭＳｍ／ｚ５８６［Ｍ＋Ｈ］＋，（分子式：Ｃ２７Ｈ３７Ｆ２Ｎ３Ｏ７Ｓ，分子量：５８５）．化合物の構造および特性データは表１に示される。
【００６２】
実施例２１
ウンデシル−５−（（１−（（２Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−３，３−ジフルオロ−４−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロフラン−２−イル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル）カルバモイル）チオフェン−２−カルボキシレート（化合物Ｎｏ．２１）
表題化合物は，実施例４に記載の方法により，ピラジン−２，３−ジカルボン酸の代わりにチオフェン−２，５−ジカルボン酸を用い，１−ドデカノールの代わりに１−ウンデカノールを用いて製造した。ＬＣ純度９０％（ＵＶ２５４ｎｍ）．ＬＣ−ＭＳｍ／ｚ５７２［Ｍ＋Ｈ］＋，（分子式：Ｃ２６Ｈ３５Ｆ２Ｎ３Ｏ７Ｓ，分子量：５７１）
【００６３】
実施例２２
ウンデシル−３−（（１−（（２Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−３，３−ジフルオロ−４−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロフラン−２−イル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル）カルバモイル）イソニコチネート（化合物Ｎｏ．２２）
表題化合物は，実施例４に記載の方法により，ピラジン−２，３−ジカルボン酸の代わりにピリジン−３，４−ジカルボン酸を用い，１−ドデカノールの代わりに１−ウンデカノールを用いて製造した。ＬＣ純度９７％（ＵＶ２５４ｎｍ）．ＬＣ−ＭＳｍ／ｚ５６７［Ｍ＋Ｈ］＋，（分子式：Ｃ２７Ｈ３６Ｆ２Ｎ４Ｏ７，分子量：５６６）．化合物の構造および特性データは表１に示される。
【００６４】
実施例２３
ウンデシル−４−（（１−（（２Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−３，３−ジフルオロ−４−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロフラン−２−イル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル）カルバモイル）ニコチネート（化合物Ｎｏ．２３）
表題化合物は，実施例４に記載の方法により，ピラジン−２，３−ジカルボン酸の代わりにピリジン−３，４−ジカルボン酸を用い，１−ドデカノールの代わりに１−ウンデカノールを用いて製造した。ＬＣ純度９７％（ＵＶ２５４ｎｍ）．ＬＣ−ＭＳｍ／ｚ５６７［Ｍ＋Ｈ］＋，（分子式：Ｃ２７Ｈ３６Ｆ２Ｎ４Ｏ７，分子量：５６６）．化合物の構造および特性データは表１に示される。
【００６５】
実施例２４
ドデシル−３−（（１−（（２Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−３，３−ジフルオロ−４−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロフラン−２−イル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル）カルバモイル）イソニコチネート（化合物Ｎｏ．２４）
表題化合物は，実施例４に記載の方法により，ピラジン−２，３−ジカルボン酸の代わりにピリジン−３，４−ジカルボン酸を用いて製造した。ＬＣ純度９５％（ＵＶ２５４ｎｍ）．ＬＣ−ＭＳｍ／ｚ５８１［Ｍ＋Ｈ］＋，（分子式：Ｃ２８Ｈ３８Ｆ２Ｎ４Ｏ７，分子量：５８０）
【００６６】
実施例２５
ドデシル−４−（（１−（（２Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−３，３−ジフルオロ−４−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロフラン−２−イル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル）カルバモイル）ニコチネート（化合物Ｎｏ．２５）
表題化合物は，実施例４に記載の方法により，ピラジン−２，３−ジカルボン酸の代わりにピリジン−３，４−ジカルボン酸を用いて製造した。ＬＣ純度９５％（ＵＶ２５４ｎｍ）．ＬＣ−ＭＳｍ／ｚ５８１［Ｍ＋Ｈ］＋，（分子式：Ｃ２８Ｈ３８Ｆ２Ｎ４Ｏ７，分子量：５８０）
【００６７】
実施例２６
ドデシル−２−（（１−（（２Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−３，３−ジフルオロ−４−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロフラン−２−イル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル）カルバモイル）イソニコチネート（化合物Ｎｏ．２６）
表題化合物は，実施例４に記載の方法により，ピラジン−２，３−ジカルボン酸．の代わりにピリジン−２，４−ジカルボン酸を用いて製造した。ＬＣ純度９６％（ＵＶ２５４ｎｍ）．ＬＣ−ＭＳｍ／ｚ５８１［Ｍ＋Ｈ］＋，（分子式：Ｃ２８Ｈ３８Ｆ２Ｎ４Ｏ７，分子量：５８０）．化合物の構造および特性データは表１に示される。
【００６８】
実施例２７
ドデシル−４−（（１−（（２Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−３，３−ジフルオロ−４−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロフラン−２−イル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル）カルバモイル）ピコリネート（化合物Ｎｏ．２７）
表題化合物は，実施例４に記載の方法により，ピラジン−２，３−ジカルボン酸の代わりにピリジン−２，４−ジカルボン酸を用いて製造した。ＬＣ純度８６％（ＵＶ２５４ｎｍ）．ＬＣ−ＭＳｍ／ｚ５８１［Ｍ＋Ｈ］＋，（分子式：Ｃ２８Ｈ３８Ｆ２Ｎ４Ｏ７，分子量：５８０）
【００６９】
実施例２８
ウンデシル−２−（（１−（（２Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−３，３−ジフルオロ−４−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロフラン−２−イル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル）カルバモイル）イソニコチネート（化合物Ｎｏ．２８）
表題化合物は，実施例４に記載の方法により，ピラジン−２，３−ジカルボン酸の代わりにピリジン−２，４−ジカルボン酸を用い，１−ドデカノールの代わりに１−ウンデカノールを用いて製造した。ＬＣ純度９０％（ＵＶ２５４ｎｍ）．ＬＣ−ＭＳｍ／ｚ５６７［Ｍ＋Ｈ］＋，（分子式：Ｃ２７Ｈ３６Ｆ２Ｎ４Ｏ７，分子量：５６６）．化合物の構造および特性データは表１に示される。
【００７０】
実施例２９
ウンデシル−４−（（１−（（２Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−３，３−ジフルオロ−４−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロフラン−２−イル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル）カルバモイル）ピコリネート（化合物Ｎｏ．２９）
表題化合物は，実施例４に記載の方法により，ピラジン−２，３−ジカルボン酸の代わりにピリジン−２，４−ジカルボン酸を用い，１−ドデカノールの代わりに１−ウンデカノールを用いて製造した。ＬＣ純度９０％（ＵＶ２５４ｎｍ）．ＬＣ−ＭＳｍ／ｚ５６７［Ｍ＋Ｈ］＋，（分子式：Ｃ２７Ｈ３６Ｆ２Ｎ４Ｏ７，分子量：５６６）
【００７１】
実施例３０
ウンデシル−５−（（１−（（２Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−３，３−ジフルオロ−４−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロフラン−２−イル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル）カルバモイル）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボキシレート（化合物Ｎｏ．３０）
表題化合物は，実施例４に記載の方法により，ピラジン−２，３−ジカルボン酸の代わりにピラゾール−３，５−ジカルボン酸を用い，１−ドデカノールの代わりに１−ウンデカノールを用いて製造した。ＬＣ純度９９％（ＵＶ２５４ｎｍ）．ＬＣ−ＭＳｍ／ｚ５５６［Ｍ＋Ｈ］＋，（分子式：Ｃ２５Ｈ３５Ｆ２Ｎ５Ｏ７，分子量：５５５）．化合物の構造および特性データは表１に示される。
【００７２】
実施例３１
ドデシル−５−（（１−（（２Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−３，３−ジフルオロ−４−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロフラン−２−イル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル）カルバモイル）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボキシレート（化合物Ｎｏ．３１）
表題化合物は，実施例４に記載の方法により，ピラジン−２，３−ジカルボン酸の代わりにピラゾール−３，５−ジカルボン酸を用いて製造した。ＬＣ純度９８％（ＵＶ２５４ｎｍ）．ＬＣ−ＭＳｍ／ｚ５７０［Ｍ＋Ｈ］＋，（分子式：Ｃ２６Ｈ３７Ｆ２Ｎ５Ｏ７，分子量：５６９）
【００７３】
実施例３２
ウンデシル−２−（２−（（１−（（２Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−３，３−ジフルオロ−４−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロフラン−２−イル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル）カルバモイル）フェニル）アセテート（化合物Ｎｏ．３２）
表題化合物は，実施例１に記載の方法により，無水Ｏ−フタル酸の代わりに無水ホモフタル酸を用い，１−ドデカノールの代わりに１−ウンデカノールを用いて製造した。ＬＣ純度９６％（ＵＶ２５４ｎｍ）．ＬＣ−ＭＳｍ／ｚ６３６［Ｍ＋Ｈ］＋，（分子式：Ｃ３３Ｈ４７Ｆ２Ｎ３Ｏ７，分子量：６３５）
【００７４】
実施例３３
ウンデシル−２−（２−（１−（（２Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−３，３−ジフルオロ−４−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロフラン−２−イル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イルアミノ）−２−オキソエチル）ベンゾエート（化合物Ｎｏ．３３）
表題化合物は，実施例１に記載の方法により，無水Ｏ−フタル酸の代わりに無水ホモフタル酸を用い，１−ドデカノールの代わりに１−ウンデカノールを用いて製造した。ＬＣ純度９０％（ＵＶ２５４ｎｍ）．ＬＣ−ＭＳｍ／ｚ５８０［Ｍ＋Ｈ］＋，（分子式：Ｃ２９Ｈ３９Ｆ２Ｎ３Ｏ７，分子量：５７９）
【００７５】
実施例３４
ドデシル−２−（２−（（１−（（２Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−３，３−ジフルオロ−４−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロフラン−２−イル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル）カルバモイル）フェニル）アセテート（化合物Ｎｏ．３４）
表題化合物は，実施例１に記載の方法により，無水Ｏ−フタル酸の代わりにホモフタル酸を用いて製造した。ＬＣ純度９３％（ＵＶ２５４ｎｍ）．ＬＣ−ＭＳｍ／ｚ５９４［Ｍ＋Ｈ］＋，（分子式：Ｃ３０Ｈ４１Ｆ２Ｎ３Ｏ７，分子量：５９３）
【００７６】
実施例３５
ドデシル−２−（２−（１−（（２Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−３，３−ジフルオロ−４−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロフラン−２−イル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イルアミノ）−２−オキソエチル）ベンゾエート（化合物Ｎｏ．３５）
表題化合物は，実施例１に記載の方法により，無水Ｏ−フタル酸の代わりに無水ホモフタル酸を用いて製造した。ＬＣ純度９３％（ＵＶ２５４ｎｍ）．ＬＣ−ＭＳｍ／ｚ５９４［Ｍ＋Ｈ］＋，（分子式：Ｃ３０Ｈ４１Ｆ２Ｎ３Ｏ７，分子量：５９３）
【００７７】
実施例３６
ウンデシル−２−（（１−（（２Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−３，３−ジフルオロ−４−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロフラン−２−イル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル）カルバモイル）シクロヘキサンカルボキシレート（化合物Ｎｏ．３６）
表題化合物は，実施例１に記載の方法により，無水Ｏ−フタル酸の代わりに無水シクロヘキサン−１，２−ジカルボン酸を用い，１−ドデカノールの代わりに１−ウンデカノールを用いて製造した。ＬＣ純度９５％（ＵＶ２５４ｎｍ）．ＬＣ−ＭＳｍ／ｚ５７２［Ｍ＋Ｈ］＋，（分子式：ａＣ２８Ｈ４３Ｆ２Ｎ３Ｏ７，分子量：５７１）
【００７８】
実施例３７
Ｎ２−（１−（（２Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−３，３−ジフルオロ−４−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロフラン−２−イル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル）−Ｎ３−ドデシルピラジン−２，３−ジカルボキサミド（化合物Ｎｏ．３７）
ピラジン−２，３−ジカルボン酸（６２４ｍｇ，４．０ｍｍｏｌ），１−ドデシルアミン（７４０ｍｇ，４．０ｍｍｏｌ），ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジニルホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（２．６ｇ，４．８ｍｍｏｌ）および４−ジメチルアミノピリジン（４８８ｍｇ，０．４ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）に溶解し，室温で一晩撹拌した。反応混合物を水に注加し，次に酢酸エチルで３回抽出した。単離した有機相を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を減圧下で蒸発させることにより除去した。残渣をシリカカラムクロマトグラフィー（展開剤：ジクロロメタン／メタノール＝３０／１）により精製して，３−（ドデシルカルバモイル）ピラジン−２−カルボン酸（６５０ｍｇ）を得た。
【００７９】
ゲムシタビン塩酸塩（２００ｍｇ，０．６７ｍｍｏｌ），３−（ドデシルカルバモイル）ピラジン−２−カルボン酸（３２５ｍｇ，１．０１ｍｍｏｌ），ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジニルホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（３２７．６ｍｇ，０．７４ｍｍｏｌ），および４−ジメチルアミノピリジン（９８ｍｇ，０．８０ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）に溶解し，室温で一晩撹拌した。反応混合物を水に注加し，次に酢酸エチルで３回抽出した。単離した有機相を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を減圧下で蒸発させることにより除去した。残渣をシリカカラムクロマトグラフィー（展開剤：ジクロロメタン／メタノール＝１０／１）により精製して，２９０ｍｇのＮ２−（１−（（２Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−３，３−ジフルオロ−４−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロフラン−２−イル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル）−Ｎ３−ドデシルピラジン−２，３−ジカルボキサミド（化合物Ｎｏ．３７）を得た。ＬＣ純度９８％（ＵＶ２５４）．ＬＣ−ＭＳｍ／ｚ５８１［Ｍ＋Ｈ］＋，（分子式：Ｃ２７Ｈ３８Ｆ２Ｎ６Ｏ６，分子量：５８０）．化合物の構造および特性データは表１に示される。
【００８０】
実施例３８
ドデシル−６−（（１−（（２Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−３，３−ジフルオロ−４−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロフラン−２−イル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル）カルバモイル）ピリダジン−３−カルボキシレート（化合物Ｎｏ．３８）
表題化合物は，実施例４に記載の方法により，ピラジン−２，３−ジカルボン酸の代わりにピリダジン−３，６−カルボン酸を用いて製造した。ＬＣ純度９５％（ＵＶ２５４ｎｍ）．ＬＣ−ＭＳｍ／ｚ５８２［Ｍ＋Ｈ］＋，（分子式：Ｃ２７Ｈ３７Ｆ２Ｎ５Ｏ７，ＭＷ：５８１）
【００８１】
実施例３９
ドデシル−６−（（１−（（２Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−３，３−ジフルオロ−４−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロフラン−２−イル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル）カルバモイル）ピリミジン−４−カルボキシレート（化合物Ｎｏ．３９）
表題化合物は，実施例４に記載の方法により，ピラジン−２，３−ジカルボン酸の代わりにピリミジン−４，５−ジカルボン酸を用いて製造した。ＬＣ純度９６％（ＵＶ２５４ｎｍ）．ＬＣ−ＭＳｍ／ｚ５８２［Ｍ＋Ｈ］＋，（分子式：Ｃ２７Ｈ３７Ｆ２Ｎ５Ｏ７，ＭＷ：５８１）
【００８２】
【表１】
2012524113.tif 000008
【００８３】
【表２】
2012524113.tif 000009
【００８４】
【表３】
2012524113.tif 000010
【００８５】
【表４】
2012524113.tif 000011
【００８６】
【表５】
2012524113.tif 000012
【００８７】
【表６】
2012524113.tif 000013
【００８８】
【表７】
2012524113.tif 000014
【００８９】
【表８】
2012524113.tif 000015
【００９０】
【表９】
2012524113.tif 000016
【００９１】
【表１０】
2012524113.tif 000017
【００９２】
【表１１】
2012524113.tif 000018
【００９３】
【表１２】
2012524113.tif 000019
【００９４】
【表１３】
2012524113.tif 000020
【００９５】
薬理試験
細胞分析方法：
プロドラッグ化合物をMTT分析方法を用いて種々の腫瘍細胞に対して試験した。
【００９６】
材料
１）  細胞株：ＮＣＩ−Ｈ４６０，Ａ５４９，ＬＯＶＯ，ＨＴ−２９，ＭＤＡ−ＭＢ−２３１，ＳＧＣ７９０１，ＨｅｐＧ２或いはＢＥＬ−７４０２細胞株。培養：１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）を含むＤ−ＭＥＭで付着培養した。初期細胞濃度は約３ｘ１０５／ｍｌである。細胞は，２−３日ごとに１：３に希釈して継代した。実験の前日に１：２に希釈して継代し，実験時の細胞濃度は５−１０ｘ１０５／ｍｌであった。
２）  化合物の溶解と希釈：提供された薬物の重量と分子量によって，１００−２００μｌのＤＭＳＯを加えた。次に，生理食塩水を加え，希釈後の最終薬物濃度を５ｍＭ（ＤＭＳＯ最終濃度が１０％を超えないことに注意）とした。
３）  Ｄ−ＭＥＭあるいはＲＰＭＩ１６４０培地，Ｇｉｂｃｏ社
４）  ウシ胎児血清，Ｈｙｃｌｏｎｅ社
５）  細胞解離バッファ，０．２５％トリプシン＋０．０２％ＥＤＴＡ
６）  ＭＴＴ溶液，ＭＴＴ粉末（Ｓｉｇｍａ）をＰＢＳで溶解し，５ｍｇ／ｍｌの溶液とした。０．２２μｍの細孔膜で濾過した後，−２０℃で保存する。
７）  ＰＢＳバッファ
８）  １０％酸性化ＳＤＳ，０．０１Ｎ  ＨＣｌ
９）  遠心チューブ，ピペットなど（ＢＤ社），９６ウエルプレート（Ｃｏｓｔａｒ社）
【００９７】
手順：
１）  細胞接種：継代後２４時間成長させ状態のよい細胞を用いた。細胞は定法により回収し，新鮮な培養液で細胞濃度を２ｘ１０５／ｍｌ（付着細胞）から３ｘ１０５／ｍｌ（浮遊細胞）に調整した。付着細胞は１００μｌ／ウエルで接種し，３７℃，５％ＣＯ２インキュベーターで２４時間培養した。古い培養液を廃棄し，新鮮な培養液を９５μｌ／ウエルで加えた。浮遊細胞は９５μｌ／ウエルで直接接種した。
【００９８】
２）  薬物処理：各薬物につき９つの濃度段階を設けた。各濃度につき３つのウエルを用いた。対照群は５つのウエルを用いた。各試験について，同時に対照も試験した。加える薬物の最終濃度は，それぞれ０．２５，０．１２５，０．０６２５，０．０３１２５，０．０１６，０．００８，０．００４，０．００２ｍＭであり，対照群には５μｌの生理食塩水を加えた。
【００９９】
３）  細胞培養と検出：細胞は薬物を加えた後，３７℃，５％ＣＯ２インキュベーターで７２時間培養し，次に各ウエルにＭＴＴ１０μｌを加え，引き続き４時間培養した。各ウエルに１００μｌの１０％ＳＤＳ（含０．０１ＮＨＣｌ）を加えた。２４時間後Ｂｉｏ−ｒａｄ６８０型ＥＬＩＳＡで各ウエルの吸光度（Ａ）を測定した。測定波長は５７０ｎｍ，参考波長は６３０ｎｍである。
【０１００】
計算：まず各ウエルの平均吸光度（差が大きすぎるデータを除く）を計算した。各細胞株の各薬物濃度での阻害率（ＩＲ）を次式により算出した：
ＩＲ（％）＝（１−Ａｎ／Ａ０）×１００％
Ａｎは試験ウエルの平均吸光度であり，Ａ０は対照ウエルの平均吸光度である。ＥＸＣＥＬソフトウェアで，薬物濃度効果曲線を描き，合理的な計算方法を採用して，５０％細胞生存の薬物濃度（ＩＣ５０）を計算した。
【０１０１】
【表１４】
2012524113.tif 000021
【０１０２】
薬物動態学実験
１．実験材料
１．装置
ＣＸ−２５０超音波クリーナー（北京医療機器二場）；ＬＣ−１０ＡＴＶＰ−ＯＤＳ高速液体クロマトグラフィー（日本島津製作所）；ＳＰＤ−１０ＡＶＰＵＶ検出器（日本島津製作所）；８０−２型遠心機（国華機器有限会社）ＴＧＬ−１６Ｇ−Ａ高速冷却遠心機（上海安亭科学機器工場）；ＧＬ−８８１３ボルテックスミキサー（江蘇海門其林医用機器工場）
【０１０３】
２．動物
昆明マウス（２５±１ｇ，山東大学実験動物センターから提供，雌雄半々）
２．方法および結果
１．インビトロでの生理学的安定性の評価：
１．１．模倣腸液中におけるゲムシタビンと２種のプロドラッグのインビトロ安定性の評価
ゲムシタビンと２種のプロドラッグを模倣腸液に溶解し，それぞれ０，１，２，４，６，８，１２，２４時間でサンプルを採取した。ＨＰＬＣ測定方法によって薬物濃度を測定し，ゲムシタビンおよび２種のプロドラッグの模倣腸液における安定性を測定した。結果を表３に示す。
【０１０４】
【表１５】
2012524113.tif 000022
【０１０５】
結果：表に示されるように，ゲムシタビンは模倣腸液で分解し，ＳＬ−０１とＳＬ−０２は模倣腸液で安定であった。
【０１０６】
１．２．ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）中での生理学的安定性の評価
ゲムシタビンをＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）に溶解し，それぞれ０，１，２，４，６，８，１２，２４時間でサンプルを採取し，ＨＰＬＣ測定方法によって薬物濃度を測定して，ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）におけるゲムシタビンの安定性を評価した。結果を表４に示す。
【０１０７】
【表１６】
2012524113.tif 000023
【０１０８】
結果：表に示されるように，ゲムシタビン，ＳＬ−０１およびＳＬ−０２はＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）中で安定であった。
【０１０９】
２．ゲムシタビンおよび２種のプロドラッグの血漿における安定性
２．１．血漿サンプルの処理
血漿サンプル２００μｌを，ＥＤＴＡ処理した２．５μｌのテトラヒドロウリジン溶液（ＴＨＵ，１０ｍｇ／ｍｌ，シチジンデアミナーゼ阻害剤，ゲムシタビンのデオキシウリジンへの代謝を防止しうる）を含む遠心チューブに加えた。血漿サンプルに１ｍｌイソプロピルアルコールを加え，３０秒間渦動し，５分間静置した。２．５ｍｌの酢酸エチルを加えて渦動し，４０００ｒｐｍで１５分間遠心した。上清を窒素気流中で乾燥させた。乾燥したサンプルを２００μｌのＨＰＬＣ流動相溶液に溶解し，２０μｌをＨＰＬＣに注入した。
【０１１０】
２．２．ゲムシタビンとプロドラッグのヒト血漿中における安定性
ゲムシタビン，ＳＬ−０１およびＳＬ−０２標準溶液をそれぞれ血漿で希釈して，０，１，２，４，６，８，１２，２４時間でサンプルを採取した。サンプルは標準方法によって処理した。２０μｌのサンプルを注入して，クロマトグラムのピーク面積を記録し，これを用いて薬物濃度を測定して，ゲムシタビン，ＳＬ−０１およびＳＬ−０２の血漿中での安定性を調べた。結果を表５に示す。
【０１１１】
【表１７】
2012524113.tif 000024
【０１１２】
結果：表に示されるように，ゲムシタビンは血漿中で安定であり，ＳＬ−０１およびＳＬ−０２は血漿中で分解した。
【０１１３】
３．動物実験
３．１．ゲムシタビン
適量のゲムシタビンを秤量し，ゲムシタビン６．２５ｍｇ／ｍｌを含む対照溶液を調製した。溶液を０．２２μｍのマイクロフィルター膜で濾過滅菌した。
【０１１４】
１２０匹の健康な昆明マウスを無行為２群に分けた。第１群にはゲムシタビンを経口投与し（強制経口投与による），第２群には尾部静脈からゲムシタビンを静脈注射した。各時点につき５匹を並行設定した。投与薬剤量は５０ｍｇ／ｋｇ（各マウスに０．２ｍｌ投与する）。投与前に１２時間絶食させ，水は自由に摂取させた。薬剤を投与した後，５分，１５分，３０分，４５分，１，２，４，６，８，１２，２４，４８時間に目底の静脈から採血し，２．５μｌテトラヒドロウリジン（ＴＨＵ，１０ｍｇ／ｍｌ）を含むヘパリンナトリウム処理遠心チューブに入れ，４０００ｒ／ｍｉｎで１５分間遠心した。上清に１ｍｌイソプロピルアルコールを加え，３０秒間渦動し，５分間静置した。２．５ｍｌの酢酸エチルを加え，渦動し，４０００ｒｐｍで１５分間遠心し，上清を窒素気流中で乾燥させた。乾燥したサンプルを２００μｌのＨＰＬＣ流動相溶液に溶解し，２０μｌのサンプルをＨＰＬＣに注入した。クロマトグラムのピーク面積を記録した。ゲムシタビンの血漿濃度を計算して，ゲムシタビンの平均濃度を時間に対してプロットした。結果を表６に示す。
【０１１５】
【表１８】
2012524113.tif 000025
【０１１６】
３．２．ＳＬ−０１およびＳＬ−０２の薬物動態学
ＳＬ−０１およびＳＬ−０２サンプルを１２５ｍｇ正確に秤量し，１０ｍｌの容量フラスコに入れた。メモリまで水を加え（０．１％Ｔｗｅｅｎ−８０を含む），均一に混合し，ＳＬ−０１およびＳＬ−０２懸濁液を得た。
【０１１７】
１００匹の健康な昆明マウスを無行為に２群に分けた，第１群にはＳＬ−０１を投与し，第２群にはＳＬ−０２を投与した。各時点につき５匹を並行設定した。ＳＬ−０１およびＳＬ−０２を投与量１００ｍｇ／ｋｇ（各マウスに０．２ｍｌ投与する）で強制経口投与した。マウスは投与前に１２時間絶食させ，水は自由に摂取させた。血液サンプルは，薬剤を投与した後，５分，１５分，３０分，４５分，１，２，４，６，８，１２，および２４時間で目底の静脈から採血し，２．５μｌのテトラヒドロウリジン溶液（ＴＨＵ，１０ｍｇ／ｍｌ）を含むヘパリンナトリウム処理遠心チューブに入れた。４０００ｒ／ｍｉｎで１５分間遠心した。上層溶液に１ｍｌイソプロピルアルコールを加え，３０秒間渦動し，５分間静置した。２．５ｍｌの酢酸エチルを加え，渦動し，４０００ｒｐｍで１５分間遠心し，上清を窒素気流中で乾燥させた。乾燥サンプルを２００μｌのＨＰＬＣ流動相に溶解し，２０μｌを注入した。クロマトグラムのピーク面積を記録した。ＳＬ−０１およびＳＬ−０２の血漿濃度を計算した。ＳＬ−０１およびＳＬ−０２の平均濃度を時間に対してプロットした。結果を表７および表８に示す。
【０１１８】
【表１９】
2012524113.tif 000026
【０１１９】
【表２０】
2012524113.tif 000027
【０１２０】
Ｄ：投与量
４．ゲムシタビン，ＳＬ−０１およびＳＬ−０２の肝ミクロゾーム酵素による代謝
４．１．肝Ｓ９の調製
マウスの肝臓を摘出し，冷食塩水で洗浄し，ろ紙で乾燥し，切断して小片とした。溶出液が無色あるいは淡黄色となるまで氷冷ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）溶液で２−３回洗浄した。肝臓の小片を細かく切断した。肝臓の重量の約４倍のＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）溶液を加えた。酵素活性の低下を避けるために，氷浴中で均質化した。均質化混合物をストッパー付き遠心チューブに入れて，２０分間（４０００ｒ／ｍｉｎ）遠心して，上清を回収した。次に上清を２０分間（１２０００ｒ／ｍｉｎ）遠心分離して，得られた上清をＳ９画分とした。
【０１２１】
４．２．酵素代謝実験
肝ミクロソームＳ９画分を薬物溶液と混合した。混合物１８００μｌをテストチューブに入れて，３７℃水浴で５分間プレインキュベーションした。２００μｌの１０ｍｍｏｌ／ＬのＮＡＤＰＨ溶液を加えて反応を開始した。反応液の終体積は２ｍｌである。０，１０，２０，４０分，１，２，４，６および１２時間で，２００μｌのインキュベーション溶液を採取した。直ちに１ｍｌイソプロピルアルコールを加え，３０秒間渦動し，５分間静置した。２．５ｍｌの酢酸エチルを加え，渦動し，４０００ｒｐｍで１５分間遠心し，上清を回収して窒素気流中で乾燥させた。２００μｌのＨＰＬＣ流動相に溶解し，２０μｌを注入した。クロマトグラムのピーク面積を記録した。結果を表９に示す。
【０１２２】
【表２１】
2012524113.tif 000028
【０１２３】
ＳＬ−０１静脈注射による癌細胞成長の抑制の動物実験
１．化合物の溶解および希釈：ゲムシタビン塩酸塩（５０６．６ｍｇ）またはＳＬ−０１粉末（４８２．４ｍｇ）をそれぞれ生理食塩水（ＮＳ）とＤＭＳＯ（ＳＩＧＭＡ）に溶解した。両者の最高濃度はそれぞれ１０ｍｇ／ｍｌと２４０ｍｇ／ｍｌである。薬物はＧｒｅｐｈｏｒ  ＥＬ，ＥｔＯＨと生理食塩水を用いて希釈した。具体的な方法については表１０を参照。各マウスの体重が２０ｇであり，０．１ｍｌの薬剤を投与すると仮定して計算すると，ＳＬ−０１を５，１０および２０ｍｇ／Ｋｇ投与するのに必要な薬物濃度はそれぞれ１，２，４ｍｇ／ｍｌである。薬物は包装して−２０℃で保存した。
【０１２４】
【表２２】
2012524113.tif 000029
【０１２５】
２．細胞株および培養：ＮＣＩ−Ｈ４６０肺癌細胞株，ＨｅｐＧ２肝臓癌細胞株，或いはＨＴ２９大腸癌細胞株は，１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）を含むＤ−ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社）で付着培養により培養した。２−３日ごとに１：３希釈することにより継代した。細胞は２５個の１０ｃｍ培養皿になるまで継代し，回収した。
【０１２６】
３．実験方法：
３．１．ヌードマウス移植腫瘍モデルの樹立：良好に成長したＮＣＩ−Ｈ４６０細胞，ＨＴ２９細胞或いはＨｅｐＧ２細胞（２５個１０ｃｍ培養皿）を回収した。無血清ＤＭＥＭで細胞濃度を１．５×１０７／ｍｌに調節した。１ｍｌシリンジを用いて２００μｌの細胞懸濁液を６週齢の雄ＢＡＬＢ／Ｃヌードマウス右側背部皮下に接種した。
【０１２７】
３．２．動物の群分けと処置：腫瘍体積が３００ｍｍ３になったときに，ヌードマウスを無行為に各群３−４匹の５群に分けた。（１）対照群，（２）陽性対照ゲムシタビン（ＧＥＭ）群（１０ｍｇ／Ｋｇ），（３）ＳＬ−０１低用量群（５ｍｇ／Ｋｇ），（４）ＳＬ−０１中用量群（１０ｍｇ／Ｋｇ），（５）ＳＬ−０１高用量群（２０ｍｇ／Ｋｇ）。処置開始時を第１日（ｄ０）として，３日ごとに対応する薬剤を尾静脈に静脈注射した。各マウスの投与容量は体重により調節して，計４回（ｄ０，ｄ３，ｄ６，ｄ９）投与した。投与開始時および投与後３日ごとにカリパスで腫瘍長短径を測定した。腫瘍体積Ｖ（Ｖ＝１／２ａｂ２，ａ：腫瘍長径，ｂ：腫瘍短径）を計算した。横軸を時間，縦軸を腫瘍体積として成長曲線を描いた。対照群腫瘍体積が約３０００ｍｍ３になったときに実験を終えた。眼球から血液を採取した後，頚椎脱臼法で各群のヌードマウスを犠牲死させた。腫瘍組織を取り出して秤量し，腫瘍成長の阻害率を計算した。腫瘍成長阻害率（％）＝（１−治療群平均腫瘍重量／対照群平均腫瘍重量）×１００％。
【０１２８】
４．実験結果：
４．１．腫瘍成長曲線および腫瘍体重によれば，ＳＬ−０１およびゲムシタビンの両方ともＮＣＩ−Ｈ４６０腫瘍移植ヌードマウスに対して阻害効果を有していた。ただし，ゲムシタビンと比べると，ＳＬ−０１の阻害作用はより弱かった。ＳＬ−０１高用量群（２０ｍｇ／Ｋｇ）の阻害効果はＧＥＭ（１０ｍｇ／Ｋｇ）と同様であった。しかし，体重減少の点から薬物毒性を評価すると，陽性対照ＧＥＭは試験終了時の体重減少率は１４％であるが，ＳＬ−０１高用量群（２０ｍｇ／Ｋｇ）の体重減少率はわずか７％であり，ＳＬ０１の毒性はＧＥＭより低い。
【０１２９】
４．２．ヌードマウスに移植したＨｅｐＧ２肝臓癌細胞株の腫瘍成長の処置における，低，中，高用量群のＳＬ−０１の用量は１０，２０および４０ｍｇ／Ｋｇであった。腫瘍成長曲線および腫瘍体重から判定して，ＳＬ−０１もゲムシタビンもヌードマウスに移植したＨｅｐＧ２腫瘍成長に対して明らかな阻害作用を示さなかった。ＳＬ−０１高用量群（４０ｍｇ／Ｋｇ）はＧＥＭと同様の阻害効果を有する。体重減少により薬物の毒性を評価すると，ＧＥＭ陽性対照は体重減少率は９％であり，ＳＬ−０１低（１０ｍｇ／Ｋｇ），中（２０ｍｇ／Ｋｇ），および高用量群（４０ｍｇ／Ｋｇ）での体重減少率はそれぞれ１１．６％，１４％および３．５％であった。
【０１３０】
４．３．相対体積から求めた腫瘍成長曲線から判定して，ＧＥＭ群，ＳＬ−０１中用量群（２０ｍｇ／Ｋｇ），および高用量群（４０ｍｇ／Ｋｇ）は，ヌードマウスに移植したＨＴ２９腫瘍成長に対して一定の阻害作用を有していた。試験終了時の阻害率はそれぞれ１５％，２３％と７％である。同用量では，ＳＬ−０１の阻害効果は同等の量のＧＥＭより大きい。体重減少の程度から薬物毒性を評価すると，陽性対照ＧＥＭとＳＬ−０１とも明らかな毒性を示さなかった。同用量のＧＥＭ（２０ｍｇ／Ｋｇ）およびＳＬ−０１（２０ｍｇ／Ｋｇ）群の体重減少率（％）は第１７日でそれぞれ４％と８％であった。
【０１３１】
ＳＬ−０１の経口投与による癌細胞阻害の動物実験
１．実験材料
１．  ＳＬ−０１は，白色の粉末製品であり，水に難溶である。胃内投与用に，２．５％澱粉を用いて懸濁製剤を調製した。ゲムシタビンは白色の粉末製品であり，水に易溶である。試験においては生理食塩水に溶解し，マイクロフィルタ膜で濾過してから尾部に静脈内投与した。陽性対照：フトラフール（ＦＴ−２０７），経口製剤，斉魯製薬有限会社製。
【０１３２】
２．  実験動物：Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス（雌）５０匹，４−５週齢，北京大学医学部実験動物科学部から購入した。
【０１３３】
３．  腫瘍細胞，培地および各種溶液：
Ｈ４６０細胞，ヒト肺癌細胞株，中国科学院上海細胞庫から購入した。
ＲＰＭＩ−１６４０培地，米国ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入した。
ウシ胎児血清，中米協力蘭州民海生物工程有限会社から購入した。
その他の試薬：０．０２％ＥＤＴＡ−０．２５％トリプシン溶液，ＰＢＳ，生理食塩水
【０１３４】
４．  実験装置：細胞インキュベーター，クリーンベンチ，遠心分離機，ラット／マウスラミナーフローテーブル，キャリパー，手術器具，シリンジ，強制経口投与器具，オートクレーブなど。
【０１３５】
２．実験方法
１．  腫瘍細胞の培養：Ｈ４６０細胞株を１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地を用いて３７℃，５％ＣＯ２インキュベーターで培養した。細胞は定法により継代した。
【０１３６】
２．  ヌードマウスに腫瘍細胞を接種する方法：培養フラスコで８０フラスコまで成長したときに細胞を回収した。消化する前に，ＰＢＳで細胞を２回洗浄し，各フラスコに消化液を１．５ｍｌ加えた。顕微鏡下で観察して，細胞がはがれたときに消化を終了した。細胞を懸濁し，５０ｍｌ遠心チューブに入れ，遠心分離してＰＢＳで２回洗浄した。計数してから，約１０ｍｌの生理食塩水に懸濁して，ヌードマウス接種用の腫瘍細胞懸濁液を得た。各ヌードマウスの左前肢の脇下に１×１０７／０．２ｍｌの腫瘍細胞を接種した。接種後，腫瘍成長状況を観察した。
【０１３７】
３．  試験デザイン，投与方法および用量の調節：腫瘍細胞を接種した５日後，ヌードマウスを無行為に５匹ずつ６群に分けて，（１）陰性対照群６匹，（２）陽性対照群６匹，（３）ＳＬ−０１中用量群６匹，（４）ＳＬ−０１低用量群６匹および（５）ゲムシタビン対照群６匹とした。
【０１３８】
【表２３】
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【０１３９】
４．薬物治療効果の評価方法：薬投与を開始する前と投与後，毎週体重を測定した。腫瘍長径（ａ）と短径（ｂ）を測定した。腫瘍体積の計算式は，Ｖ＝（ａ×ｂ２）／２である。３週間投与した後，ヌードマウスを犠牲死させた。腫瘍を摘出して秤量し，次式により腫瘍に対する薬剤の成長阻害率を計算した。
腫瘍成長阻害率％＝（Ｗ０−Ｗ）／Ｗ０×１００％
式中，Ｗ０は陰性対照群腫瘍の重量であり，Ｗは投与群腫瘍の重量である。
【０１４０】
３．実験結果：試験期間は３０日であり，その内投与期間は２２日であり，７回投与した。結果は以下の通りである。
【０１４１】
腫瘍体積に対する薬剤の影響：投与後の７，１４，１８，２２日目で各群のヌードマウスの腫瘍体積を測定した。表１２を参照。
【０１４２】
【表２４】
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【０１４３】
２．ヌードマウス体重に及ぼす薬剤の影響：ゲムシタビン静脈投与群，ＳＬ−０１中用量群と小用量群では動物の体重減少に明らかな影響を示した。表１３に示されるように，ゲムシタビン治療群の体重は２０．９％減少し，ＳＬ−０１中用量群とＳＬ−０１小用量群の体重はそれぞれ１４．８％と１４．３％減少した。
【０１４４】
【表２５】
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【０１４５】
３．腫瘍重量に対する薬剤の影響：試験終了時，動物を犠牲死させて，腫瘍を摘出し，秤量した。結果を表１４に示す。
【０１４６】
【表２６】
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【０１４７】
ｔ検定により分析して，陽性対照群，ゲムシタビン群，ＳＬ−０１中用量群およびＳＬ−０１小用量群は有意な有効性を示した。
【国際調査報告】
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