【手続補正書】
【提出日】平成21年5月15日(2009.5.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３５】
【化２】
2006512906.tif 000001
（結果）
上記のように、インフルエンザウイルスの複製時、ｖＲＮＡが転写されてｃＲＮＡ（より多くのｖＲＮＡ合成のためのテンプレートとして作用する）およびｍＲＮＡ（タンパク質合成のためのテンプレートとして作用する）を産生する（１）。ＲＮＡｉは配列特異的様式でｍＲＮＡの分解をターゲティングすることが公知であるが（１６〜１８）、インフルエンザＡウイルスのｖＲＮＡがヌクレアーゼに感受性を示すため、ｖＲＮＡおよびｃＲＮＡもｓｉＲＮＡの標的である可能性がある（１）。種々のＲＮＡ種の分解に対するｓｉＲＮＡの効果を調査するために、配列特異的プライマーを使用した逆転写およびその後のリアルタイムＰＣＲを使用して、ｖＲＮＡ、ｃＲＮＡ、およびｍＲＮＡのレベルを定量することができた。図１６は、インフルエンザウイルスｖＲＮＡ、ｍＲＮＡ、およびｃＲＮＡの間の関係を示す。図１６Ａおよび１６Ｂに示すように、ｃＲＮＡはｖＲＮＡの正確な相補体であるが、ｍＲＮＡは、５’末端にキャップ構造および宿主細胞ｍＲＮＡ由来のさらなる１０〜１３ヌクレオチドを含み、ｍＲＮＡは、ｖＲＮＡセグメントの５’末端から１５〜２２ヌクレオチド下流の部位に相補的な部位から始まるポリＡ配列を３’末端に含む。したがって、ｖＲＮＡおよびｃＲＮＡと比較すると、ｍＲＮＡは３’末端の１５〜２２ヌクレオチドを欠く。３つのウイルスＲＮＡ種を区別するために、第１の逆転写反応においてｖＲＮＡに特異的なプライマー、ｃＲＮＡに特異的なプライマー、およびｍＲＮＡに特異的なプライマーを使用した（図１６Ｂ）。ｍＲＮＡについて、プライマーとしてポリｄＴ１８（配列番号１１２）を使用した。ｃＲＮＡについて、ｍＲＮＡから失われたＲＮＡの３’末端に相補的なプライマーを使用した。ｖＲＮＡについて、ｖＲＮＡに相補的であり、且つ５’末端にあまり接近しない限り、プライマーは、ＲＮＡの間のほとんどどこでも良い。たった１つのＲＮＡから転写して得られたｃＤＮＡを、リアルタイムＰＣＲによって増幅した。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３６４】
【図１Ａ】図１Ａ（Ｊｕｌｋｕｎｅｎ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．（本明細書中で参考として援用される）を適用）は、インフルエンザウイルスの略図を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂ（Ｆｉｅｌｄｓ’Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（本明細書中で参考として援用される）を適用）は、インフルエンザウイルスのゲノム構造およびインフルエンザゲノム由来の転写物を示す。ｍＲＮＡの５’末端および３’末端の細線は、非翻訳領域を示す。影をつけた領域または斜線の領域は、それぞれ０または＋１読み取り枠中のコード領域を示す。Ｖ型の線はイントロンを示す。ｍＲＮＡの５’末端の小さな四角は、ウイルス核酸に共有結合した異種細胞ＲＮＡを示す。Ａ（ｎ）は、ポリＡテールを示す。
【図２】図２（Ｊｕｌｋｕｎｅｎ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．（本明細書中で参考として援用される）を適用）は、インフルエンザウイルス複製サイクルを示す。
【図３】図３は、ドロソフィラ系で認められるｓｉＲＮＡの構造を示す。
【図４】図４は、ドロソフィラにおけるＲＮＡ干渉に関与する工程の略図を示す。
【図５】図５は、本発明で有用なｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ構造の種々の例を示す。
【図６】図６は、ＤＩＣＥＲ酵素がステム中の塩基ミスマッチを有する基質を切断して標的転写物の３’ＵＴＲに結合して翻訳を阻害する阻害産物を作製する別の阻害経路の図を示す。
【図７】図７は、本発明のｓｉＲＮＡの両方の鎖の転写を指示するために使用することができる構築物の一例を示す。
【図８】図８は、ハイブリッド形成して本発明のｓｈＲＮＡを形成する１つのＲＮＡ分子の転写を指示するために使用することができる構築物の一例を示す。
【図９−１】図９は、ヒト宿主起源のインフルエンザウイルスＡの６つの株の間の配列比較を示す。濃く影をつけた領域を使用して、ｓｉＲＮＡを設計し、実施例２に記載のように試験した。基本配列は、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４株の配列である。薄く影をつけた文字は、基本配列と異なるヌクレオチドを示す。
【図９−２】図９は、ヒト宿主起源のインフルエンザウイルスＡの６つの株の間の配列比較を示す。濃く影をつけた領域を使用して、ｓｉＲＮＡを設計し、実施例２に記載のように試験した。基本配列は、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４株の配列である。薄く影をつけた文字は、基本配列と異なるヌクレオチドを示す。
【図９−３】図９は、ヒト宿主起源のインフルエンザウイルスＡの６つの株の間の配列比較を示す。濃く影をつけた領域を使用して、ｓｉＲＮＡを設計し、実施例２に記載のように試験した。基本配列は、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４株の配列である。薄く影をつけた文字は、基本配列と異なるヌクレオチドを示す。
【図９−４】図９は、ヒト宿主起源のインフルエンザウイルスＡの６つの株の間の配列比較を示す。濃く影をつけた領域を使用して、ｓｉＲＮＡを設計し、実施例２に記載のように試験した。基本配列は、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４株の配列である。薄く影をつけた文字は、基本配列と異なるヌクレオチドを示す。
【図９−５】図９は、ヒト宿主起源のインフルエンザウイルスＡの６つの株の間の配列比較を示す。濃く影をつけた領域を使用して、ｓｉＲＮＡを設計し、実施例２に記載のように試験した。基本配列は、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４株の配列である。薄く影をつけた文字は、基本配列と異なるヌクレオチドを示す。
【図９−６】図９は、ヒト宿主起源のインフルエンザウイルスＡの６つの株の間の配列比較を示す。濃く影をつけた領域を使用して、ｓｉＲＮＡを設計し、実施例２に記載のように試験した。基本配列は、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４株の配列である。薄く影をつけた文字は、基本配列と異なるヌクレオチドを示す。
【図１０−１】図１０は、ヒト宿主起源のインフルエンザウイルスＡの２つの株および動物宿主起源のインフルエンザウイルスＡの５つの株の間の配列比較を示す。濃く影をつけた領域を使用して、ｓｉＲＮＡを設計し、実施例２に記載のように試験した。基本配列は、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４株の配列である。薄く影をつけた文字は、基本配列と異なるヌクレオチドを示す。
【図１０−２】図１０は、ヒト宿主起源のインフルエンザウイルスＡの２つの株および動物宿主起源のインフルエンザウイルスＡの５つの株の間の配列比較を示す。濃く影をつけた領域を使用して、ｓｉＲＮＡを設計し、実施例２に記載のように試験した。基本配列は、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４株の配列である。薄く影をつけた文字は、基本配列と異なるヌクレオチドを示す。
【図１０−３】図１０は、ヒト宿主起源のインフルエンザウイルスＡの２つの株および動物宿主起源のインフルエンザウイルスＡの５つの株の間の配列比較を示す。濃く影をつけた領域を使用して、ｓｉＲＮＡを設計し、実施例２に記載のように試験した。基本配列は、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４株の配列である。薄く影をつけた文字は、基本配列と異なるヌクレオチドを示す。
【図１０−４】図１０は、ヒト宿主起源のインフルエンザウイルスＡの２つの株および動物宿主起源のインフルエンザウイルスＡの５つの株の間の配列比較を示す。濃く影をつけた領域を使用して、ｓｉＲＮＡを設計し、実施例２に記載のように試験した。基本配列は、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４株の配列である。薄く影をつけた文字は、基本配列と異なるヌクレオチドを示す。
【図１０−５】図１０は、ヒト宿主起源のインフルエンザウイルスＡの２つの株および動物宿主起源のインフルエンザウイルスＡの５つの株の間の配列比較を示す。濃く影をつけた領域を使用して、ｓｉＲＮＡを設計し、実施例２に記載のように試験した。基本配列は、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４株の配列である。薄く影をつけた文字は、基本配列と異なるヌクレオチドを示す。
【図１０−６】図１０は、ヒト宿主起源のインフルエンザウイルスＡの２つの株および動物宿主起源のインフルエンザウイルスＡの５つの株の間の配列比較を示す。濃く影をつけた領域を使用して、ｓｉＲＮＡを設計し、実施例２に記載のように試験した。基本配列は、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４株の配列である。薄く影をつけた文字は、基本配列と異なるヌクレオチドを示す。
【図１０−７】図１０は、ヒト宿主起源のインフルエンザウイルスＡの２つの株および動物宿主起源のインフルエンザウイルスＡの５つの株の間の配列比較を示す。濃く影をつけた領域を使用して、ｓｉＲＮＡを設計し、実施例２に記載のように試験した。基本配列は、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４株の配列である。薄く影をつけた文字は、基本配列と異なるヌクレオチドを示す。
【図１１Ａ】図１１Ａ〜１１Ｆは、ｓｉＲＮＡがＭＤＣＫ細胞におけるインフルエンザウイルス産生を阻害することを示す実験結果を示す。種々のウイルス転写物をターゲティングする６つの異なるｓｉＲＮＡをエレクトロポレーションによってＭＤＣＫ細胞に移入し、その後８時間細胞にウイルスを感染させた。図１１Ａは、種々のｓｉＲＮＡまたはコントロールｓｉＲＮＡの存在下または非存在下で０．０１の感染多重度（ＭＯＩ）でウイルス株Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）（ＰＲ８）による感染後の種々の時間での血球凝集素アッセイによって測定した培養上清中のウイルス力価を示す経時変化である。
【図１１Ｂ】図１１Ａ〜１１Ｆは、ｓｉＲＮＡがＭＤＣＫ細胞におけるインフルエンザウイルス産生を阻害することを示す実験結果を示す。種々のウイルス転写物をターゲティングする６つの異なるｓｉＲＮＡをエレクトロポレーションによってＭＤＣＫ細胞に移入し、その後８時間細胞にウイルスを感染させた。図１１Ｂは、種々のｓｉＲＮＡまたはコントロールｓｉＲＮＡの存在下または非存在下で０．０１のＭＯＩでインフルエンザウイルス株Ａ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）（ＷＳＮ）での感染後の種々の時間での血球凝集素アッセイによって測定した培養上清中のウイルス力価を示す経時変化である。
【図１１Ｃ】図１１Ａ〜１１Ｆは、ｓｉＲＮＡがＭＤＣＫ細胞におけるインフルエンザウイルス産生を阻害することを示す実験結果を示す。種々のウイルス転写物をターゲティングする６つの異なるｓｉＲＮＡをエレクトロポレーションによってＭＤＣＫ細胞に移入し、その後８時間細胞にウイルスを感染させた。図１１Ｃは、偽トランスフェクトするかｓｉＲＮＡ  ＮＰ−１４９６でトランスフェクトしたウイルス感染細胞由来の培養上清中のウイルス力価を示すプラークアッセイを示す。
【図１１Ｄ】図１１Ａ〜１１Ｆは、ｓｉＲＮＡがＭＤＣＫ細胞におけるインフルエンザウイルス産生を阻害することを示す実験結果を示す。種々のウイルス転写物をターゲティングする６つの異なるｓｉＲＮＡをエレクトロポレーションによってＭＤＣＫ細胞に移入し、その後８時間細胞にウイルスを感染させた。図１１Ｄは、異なる用量のｓｉＲＮＡでのインフルエンザウイルス産生阻害を示す。ＭＤＣＫ細胞を、表示量のＮＰ−１４９６  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、その後０．０１のＭＯＩでＰＲ８ウイルスを感染させた。感染から４８時間後にウイルス力価を測定した。２つの実験のうちの１つに由来の代表的なデータを示す。
【図１１Ｅ】図１１Ａ〜１１Ｆは、ｓｉＲＮＡがＭＤＣＫ細胞におけるインフルエンザウイルス産生を阻害することを示す実験結果を示す。種々のウイルス転写物をターゲティングする６つの異なるｓｉＲＮＡをエレクトロポレーションによってＭＤＣＫ細胞に移入し、その後８時間細胞にウイルスを感染させた。図１１Ｅは、ウイルス感染後に投与したｓｉＲＮＡによるインフルエンザウイルス産生阻害を示す。ＭＤＣＫ細胞に０．０１のＭＯＩのＰＲ８ウイルスを２時間感染させ、その後ＮＰ−１４９６（２．５ｎｍｏｌ）でトランスフェクトした。感染後の表示の時間でウイルス力価を測定した。２つの実験のうちの１つに由来の代表的なデータを示す。
【図１２】図１２は、ヒトまたは動物宿主起源の１２種のインフルエンザＡウイルスのサブタイプまたは単離物の間のＮＰ配列の３’領域部分の間の配列比較を示す。影をつけた領域を使用して、ｓｉＲＮＡを設計し、実施例２および３に記載のように試験した。基本配列は、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４株の配列である。影をつけた文字は、基本配列と異なるヌクレオチドを示す。
【図１３】図１３は、インフルエンザウイルス阻害の有効性と相関付けた、インフルエンザウイルス遺伝子セグメントと比較した種々のｓｉＲＮＡの位置を示す。
【図１４Ａ】図１４Ａは、ｓｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ／送達因子組成物の注射領域を示す成長中のニワトリ胚の略図である。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、種々のｓｉＲＮＡの成長中のニワトリ胚におけるインフルエンザウイルス産生を阻害する能力を示す。
【図１５】図１５は、核タンパク質のウイルスＲＮＡ分子との相互作用を示す略図である。
【図１６Ａ】図１６Ａおよび１６Ｂは、インフルエンザウイルスのｖＲＮＡと、ｍＲＮＡと、ｃＲＮＡ（テンプレートＲＮＡ）との間の相違およびこれらの間の関係を示す略図を示す。
【図１６Ｂ】図１６Ａおよび１６Ｂは、インフルエンザウイルスのｖＲＮＡと、ｍＲＮＡと、ｃＲＮＡ（テンプレートＲＮＡ）との間の相違およびこれらの間の関係を示す略図を示す。各インフルエンザＡウイルスｖＲＮＡセグメントの３’末端の保存された１２個のヌクレオチドおよび５’末端の１３個のヌクレオチドを図１６Ｂに示す。ｍＲＮＡは、７ＧｐｐｐＮｍキャップ構造および宿主細胞ＲＮＡのサブセット由来の平均して１０〜１３個のヌクレオチドを含む。ｖＲＮＡセグメントの５’末端から１５〜２２ヌクレオチド（配列番号２７２）前の位置に対応するｍＲＮＡ中の部位でｍＲＮＡのポリアデニル化が起こる。矢印は、各ＲＮＡ種に特異的なプライマーの位置を示す（引用文献（１）の適用）。
【図１７】図１７は、感染の６〜８時間前に偽トランスフェクトするかｓｉＲＮＡ  ＮＰ−１４９６でトランスフェクトした細胞におけるウイルス感染後の種々の時間でのウイルスＮＰおよびＮＳ  ＲＮＡ種の量を示す。
【図１８】図１８Ａは、インフルエンザウイルス産生の阻害には二重鎖ｓｉＲＮＡ中に野生型（ｗｔ）アンチセンス鎖が必要であることを示す。ＭＤＣＫ細胞を、最初にｗｔ鎖および修飾（ｍ）鎖から形成されたｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、８時間後に０．１ＭＯＩのＰＲ８ウイルスを感染させた。感染から２４時間後に培養上清のウイルス力価をアッセイした。２つの実験のうちの１つに由来の代表的なデータを示す。図１８Ｂは、Ｍ特異的ｓｉＲＮＡが特異的ｍＲＮＡの蓄積を阻害することを示す。ＭＤＣＫ細胞をＭ−３７でトランスフェクトし、０．０１のＭＯＩのＰＲ８を感染させ、感染から１時間、２時間、および３時間後にＲＮＡ単離物を回収した。Ｍ特異的ｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、およびｖＲＮＡのレベルを、ＲＮＡ特異的プライマーを使用した逆転写およびその後のリアルタイムＰＣＲによって測定した。各ウイルスＲＮＡ種のレベルを、同一サンプル中のγ−アクチンｍＲＮＡ（下のパネル）のレベルに正規化する。ＲＮＡの相対レベルを、平均±Ｓ．Ｄ．として示す。２つの実験のうちの１つに由来の代表的なデータを示す。
【図１９Ａ−Ｄ】図１９Ａ〜Ｄは、ＮＰ特異的ｓｉＲＮＡがＮＰだけでなく、ＭおよびＮＳ特異的ｍＲＮＡ、ｖＲＮＡ、およびｃＲＮＡの蓄積も阻害することを示す。ＭＤＣＫ（Ａ〜Ｃ）細胞およびベロ（Ｄ）細胞を、ＮＰ−１４９６でトランスフェクトし、０．１のＭＯＩのＰＲ８ウイルスを感染させ、感染から１時間、２時間、および３時間後にＲＮＡ単離物を回収した。ＮＰ、Ｍ、およびＮＳに特異的なｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、およびｖＲＮＡのレベルを、ＲＮＡ特異的プライマーを使用した逆転写およびその後のリアルタイムＰＣＲによって測定した。各ウイルスＲＮＡ種のレベルを、同一サンプル中のγ−アクチンｍＲＮＡレベル（示さず）に正規化する。ＲＮＡの相対レベルを示す。２つの実験のうちの１つに由来の代表的なデータを示す。
【図１９Ｅ】図１９Ｅ〜Ｇ（各図の右側）は、ＰＡ特異的ｓｉＲＮＡがＰＡだけでなく、ＭおよびＮＳ特異的ｍＲＮＡ、ｖＲＮＡ、およびｃＲＮＡの蓄積も阻害することを示す。ＭＤＣＫ細胞を、ＰＡ−１４９６でトランスフェクトし、０．１のＭＯＩのＰＲ８ウイルスを感染させ、感染から１時間、２時間、および３時間後にＲＮＡ単離物を回収した。ＰＡ、Ｍ、およびＮＳに特異的なｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、およびｖＲＮＡのレベルを、ＲＮＡ特異的プライマーを使用した逆転写およびその後のリアルタイムＰＣＲによって測定した。各ウイルスＲＮＡ種のレベルを、同一サンプル中のγ−アクチンｍＲＮＡレベル（示さず）に正規化する。ＲＮＡの相対レベルを示す。
【図１９Ｆ】図１９Ｇ〜Ｅ（各図の右側）は、ＰＡ特異的ｓｉＲＮＡがＰＡだけでなく、ＭおよびＮＳ特異的ｍＲＮＡ、ｖＲＮＡ、およびｃＲＮＡの蓄積も阻害することを示す。ＭＤＣＫ細胞を、ＰＡ−１４９６でトランスフェクトし、０．１のＭＯＩのＰＲ８ウイルスを感染させ、感染から１時間、２時間、および３時間後にＲＮＡ単離物を回収した。ＰＡ、Ｍ、およびＮＳに特異的なｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、およびｖＲＮＡのレベルを、ＲＮＡ特異的プライマーを使用した逆転写およびその後のリアルタイムＰＣＲによって測定した。各ウイルスＲＮＡ種のレベルを、同一サンプル中のγ−アクチンｍＲＮＡレベル（示さず）に正規化する。ＲＮＡの相対レベルを示す。
【図１９Ｇ】図１９Ｇ〜Ｅ（各図の右側）は、ＰＡ特異的ｓｉＲＮＡがＰＡだけでなく、ＭおよびＮＳ特異的ｍＲＮＡ、ｖＲＮＡ、およびｃＲＮＡの蓄積も阻害することを示す。ＭＤＣＫ細胞を、ＰＡ−１４９６でトランスフェクトし、０．１のＭＯＩのＰＲ８ウイルスを感染させ、感染から１時間、２時間、および３時間後にＲＮＡ単離物を回収した。ＰＡ、Ｍ、およびＮＳに特異的なｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、およびｖＲＮＡのレベルを、ＲＮＡ特異的プライマーを使用した逆転写およびその後のリアルタイムＰＣＲによって測定した。各ウイルスＲＮＡ種のレベルを、同一サンプル中のγ−アクチンｍＲＮＡレベル（示さず）に正規化する。ＲＮＡの相対レベルを示す。
【図１９Ｈ】図１９Ｈは、ＮＰ特異的ｓｉＲＮＡがＰＢ１（上のパネル）、ＰＢ２（中央のパネル）、およびＰＡ（下のパネル）特異的ｍＲＮＡの蓄積を阻害することを示す。ＭＤＣＫ細胞を、ＮＰ−１４９６でトランスフェクトし、０．１のＭＯＩのＰＲ８ウイルスを感染させ、感染から１時間、２時間、および３時間後にＲＮＡ単離物を回収した。ＰＢ１、ＰＢ２、およびＰＡのｍＲＮＡに特異的なｍＲＮＡのレベルを、ＲＮＡ特異的プライマーを使用した逆転写およびその後のリアルタイムＰＣＲによって測定した。各ウイルスＲＮＡ種のレベルを、同一サンプル中のγ−アクチンｍＲＮＡレベル（示さず）に正規化する。ＲＮＡの相対レベルを示す。
【図２０】図２０Ａは、ｓｉＲＮＡ  ＣＤ８−６１およびそのヘアピン誘導性ＣＤ８−６１Ｆの配列を示す。図２０Ｂは、ＣＤ８−６１およびＣＤ８−６１ＦによるＣＤ８α発現の阻害を示す。ＣＤ８＋ＣＤ４＋Ｔ細胞株を、エレクトロポレーションによってＣＤ８−６１またはＣＤ８−６１Ｆのいずれかでトランスフェクトした。ＣＤ８α発現を、４８時間後のフローサイトメトリーによってアッセイした。印をつけていない線は偽トランスフェクションを示す。図２０Ｃは、ＣＤ８−６１ＦヘアピンＲＮＡの発現がＨ１ＲＮＡｐｏｌＩＩＩプロモーターによって駆動される、ｐＳＬＯＯＰＩＩＩベクターの略図を示す。Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒはシグナル配列の終結を示す。図２０Ｄは、ｐＳＬＯＯＰＩＩＩを使用したＨｅＬａ細胞中でのＣＤ８αのサイレンシングを示すプロットを示す。非トランスフェクト細胞は、ＣＤ８αを発現しなかった。細胞をＣＤ８α発現ベクターおよび無プロモーターｐＳＬＯＯＰＩＩＩ−ＣＤ８−６１Ｆ構築物、合成ｓｉＲＮＡ、またはプロモーターを含むｐＳＬＯＯＰＩＩＩ−ＣＤ８−６１Ｆのいずれかでトランスフェクトした。
【図２１】図２１Ａは、ＮＰ−１４９６およびＧＦＰ−９４９のｓｉＲＮＡならびにそのヘアピン誘導体／前駆体の略図を示す。図２１Ｂは、２つの異なる順番でのＮＰ−１４９６ＨおよびＧＦＰ−９４９Ｈのタンデムアレイを示す。図２１Ｃは、ｐＳＬＯＯＰＩＩＩ発現ベクターを示す。ｓｉＲＮＡのヘアピン前駆体を、ｐＳＬＯＯＰＩＩＩベクターのみ（上）か、タンデムアレイ（中央）でか、または独立プロモーターおよび終結配列（下）と同時にクローン化する。
【図２２Ａ】図２２Ａは、インフルエンザウイルスでの感染前にカチオン性ポリマーＰＥＩと共に投与した場合にｓｉＲＮＡがマウスにおけるインフルエンザウイルス産生を阻害することを示すプロットである。黒塗りの四角（未処理）、白抜きの四角（ＧＦＰｓｉＲＮＡ）、白抜きの円（３０μｇＮＰｓｉＲＮＡ）、黒塗りの円（６０μｇＮＰｓｉＲＮＡ）。各印は、各動物を示す。異なる群の間のｐ値を示す。
【図２２Ｂ】図２２Ｂは、インフルエンザウイルスでの感染前にカチオン性ポリマーＰＬＬと共に投与した場合にｓｉＲＮＡがマウスにおけるインフルエンザウイルス産生を阻害することを示すプロットである。黒塗りの四角（未処理）、白抜きの四角（ＧＦＰｓｉＲＮＡ）、黒塗りの円（６０μｇＮＰｓｉＲＮＡ）。各印は、各動物を示す。異なる群の間のｐ値を示す。
【図２２Ｃ】図２２Ｃは、インフルエンザウイルスでの感染前にカチオン性ポリマーｊｅｔＰＥＩと共に投与した場合に、ＰＢＳ中で投与した場合よりも有意により有効にｓｉＲＮＡがマウスにおけるインフルエンザウイルス産生を阻害することを示すプロットである。白抜きの四角（未処理）、白抜きの三角（ＰＢＳ中のＧＦＰｓｉＲＮＡ）、黒塗りの三角（ＰＢＳ中のＮＰｓｉＲＮＡ）、白抜きの円（ｊｅｔＰＥＩを含むＧＦＰｓｉＲＮＡ）、黒塗りの円（ｊｅｔＰＥＩを含むＮＰｓｉＲＮＡ）。各印は、各動物を示す。異なる群の間のｐ値を示す。
【図２３】図２３は、インフルエンザウイルスでの感染前に共に投与した場合にインフルエンザウイルスＮＰおよびＰＡ転写物にターゲティングされたｓｉＲＮＡがさらなる効果を示すことを示すプロットである。黒塗りの四角（未処理）、白抜きの円（６０μｇＮＰｓｉＲＮＡ）、白抜きの三角（６０μｇＰＡｓｉＲＮＡ）、黒塗りの円（６０μｇＮＰｓｉＲＮＡ＋６０μｇＰＡｓｉＲＮＡ）。各印は、各動物を示す。異なる群の間のｐ値を示す。
【図２４】図２４は、インフルエンザウイルスでの感染後に投与した場合にｓｉＲＮＡがマウスにおけるインフルエンザウイルス産生を阻害することを示すプロットである。黒塗りの四角（未処理）、白抜きの四角（６０μｇＧＦＰｓｉＲＮＡ）、白抜きの三角（６０μｇＰＡｓｉＲＮＡ）、白抜きの円（６０μｇＮＰｓｉＲＮＡ）、黒塗りの円（６０μｇＮＰ＋６０μｇＰＡｓｉＲＮＡ）。各印は、各動物を示す。異なる群の間のｐ値を示す。
【図２５】図２５Ａは、ｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスベクターの略図である。ｓｈＲＮＡの転写は、Ｕ６プロモーターによって駆動される。ＥＧＦＰ発現は、ＣＭＶプロモーターによって駆動される。ＳＩＮ−ＬＴＲ、Ψ、ｃＰＰＴ、およびＷＲＥは、レンチウイルス構成要素である。ＮＰ−１４９６ｓｈＲＮＡの配列を示す。図２５Ｂは、図２５Ｂに示すレンチウイルスに感染したベロ細胞が用量依存的にＥＧＦＰを発現することを証明するフローサイトメトリーの結果のプロットを示す。ＮＰ−１４９６ａ  ｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡベクターおよびパッケージングベクターの２９３Ｔ細胞への同時トランスフェクションによってレンチウイルスを産生した。培養上清（０．２５ｍｌまたは１．０ｍｌ）を使用して、ベロ細胞を感染させた。得られたベロ細胞株（ベロ−ＮＰ−０．２５およびベロ−ＮＰ−１．０）ならびにコントロール（非感染）ベロ細胞を、フローサイトメトリーによってＧＦＰ発現について分析した。ベロ−ＮＰ−０．２５（図の上部）およびベロ−ＮＰ−１．０（図の下部）細胞の平均蛍光強度を示す。影をつけた曲線は、コントロール（非感染）ベロ細胞の平均蛍光強度を示す。図２５Ｃは、ＮＰ−１４９６ｓｈＲＮＡを発現するベロ細胞におけるインフルエンザウイルス産生の阻害を示すプロットである。親ベロ細胞およびＮＰ−１４９６  ｓｈＲＮＡ発現ベロ細胞に、０．０４、０．２、および１のＭＯＩのＰＲ８ウイルスを感染させた。上清中のウイルス力価を、感染から４８時間後に血球凝集素（ＨＡ）アッセイによって判定した。
【図２６】図２６は、インフルエンザウイルス転写物にターゲティングされたｓｉＲＮＡを発現するＤＮＡベクターの投与によってマウスにおけるインフルエンザウイルス産生が阻害されることを示すプロットである。６０μｇのＲＳＶ、ＮＰ−１４９６（ＮＰ）、またはＰＢ１−２２５７（ＰＢ１）ｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡを、４０μｌのＩｎｆａｓｕｒｆと混合し、点滴注入法によってマウスに投与した。未処理（ＮＴ）群について、マウスに６０μｌの５％グルコースを点滴した。１３時間後、マウスにＰＲ８ウイルスを１２０００ｐｆｕ／マウスで鼻腔内感染させた。感染２４時間後にＭＤＣＫ／血球凝集素アッセイによって肺のウイルス力価を測定した。各データポイントは１匹のマウスを示す。群間のｐ値を示す。
【図２７Ａ】図２７Ａは、ｓｉＲＮＡとポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）との間の複合体形成を検出するための電気泳動移動度シフトアッセイの結果を示す。１５０ｎｇのＮＰ−１４９６ｓｉＲＮＡと漸増量のポリマー（０〜１２００ｎｇ）との室温で３０分間の混合によって、ｓｉＲＮＡ−ポリマー複合体を形成させた。次いで、反応混合物を、４％アガロースゲルで泳動し、ｓｉＲＮＡを臭化エチジウム染色を使用して視覚化した。
【図２７Ｂ】図２７Ｂは、ｓｉＲＮＡとポリ−Ｌ−アルギニン（ＰＬＡ）との間の複合体形成を検出するための電気泳動移動度シフトアッセイの結果を示す。１５０ｎｇのＮＰ−１４９６ｓｉＲＮＡと漸増量のポリマー（０〜１２００ｎｇ）との室温で３０分間の混合によって、ｓｉＲＮＡ−ポリマー複合体を形成させた。次いで、反応混合物を、４％アガロースゲルで泳動し、ｓｉＲＮＡを臭化エチジウム染色を使用して視覚化した。
【図２８Ａ】図２８Ａは、ｓｉＲＮＡ／ＰＬＬ複合体の細胞傷害性を示すプロットである。９６ウェルプレート中のベロ細胞を、ｓｉＲＮＡ（４００ｐｍｏｌ）／ポリマー複合体で６時間処理した。次いで、ポリマー含有培地を、ＤＭＥＭ−１０％ＦＣＳと交換した。２４時間後にＭＴＴアッセイの使用によって細胞の代謝活性を測定した。四角＝ＰＬＬ（分子量約８Ｋ）、円＝ＰＬＬ（分子量約４２Ｋ）、黒塗りの四角＝２５％、白抜きの三角＝５０％、黒塗りの三角＝７５％、Ｘ＝９５％。三つ組みの平均としてデータを示す。
【図２８Ｂ】図２８Ｂは、ｓｉＲＮＡ／ＰＬＡ複合体の細胞傷害性を示すプロットである。９６ウェルプレート中のベロ細胞を、ｓｉＲＮＡ（４００ｐｍｏｌ）／ポリマー複合体で６時間処理した。次いで、ポリマー含有培地を、ＤＭＥＭ−１０％ＦＣＳと交換した。２４時間後にＭＴＴアッセイの使用によって細胞の代謝活性を測定した。三つ組みの平均としてデータを示す。
【図２９Ａ】図２９Ａは、ＰＬＬがｓｉＲＮＡの細胞取り込みを刺激することを示すプロットである。２４ウェルプレート中のベロ細胞を、リポフェクタミン＋ｓｉＲＮＡ（４００ｐｍｏｌ）またはｓｉＲＮＡ（４００ｐｍｏｌ）／ポリマー複合体と６時間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、０．０４のＭＯＩのＰＲ８ウイルスを感染させた。感染後、異なる時点での培養上清中のウイルス力価を、ＨＡアッセイによって測定した。ポリマー：ｓｉＲＮＡ比を示す。白抜きの円＝未処理、黒塗りの四角＝リポフェクタミン、黒塗りの三角＝ＰＬＬ（分子量約４２Ｋ）、白抜きの三角＝ＰＬＬ（分子量約８Ｋ）。
【図２９Ｂ】図２９Ｂは、ポリ−Ｌ−アルギニンがｓｉＲＮＡの細胞取り込みを刺激することを示すプロットである。２４ウェルプレート中のベロ細胞を、ｓｉＲＮＡ（４００ｐｍｏｌ）／ポリマー複合体と６時間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、０．０４のＭＯＩのＰＲ８ウイルスを感染させた。感染後、異なる時点での培養上清中のウイルス力価を、ＨＡアッセイによって測定した。ポリマー：ｓｉＲＮＡ比を示す。０，２５％、５０％、７５％、および９５％は、イミダゾールアセチル基に置換したＰＬＬ上のε−アミノ基の割合をいう。黒塗りの円＝非トランスフェクション、白抜きの円＝リポフェクタミン、白抜きおよび黒塗りの四角＝０％および２５％（０％と２５％のデータポイントは同一であることに留意のこと）、黒塗りの三角＝５０％、白抜きの三角＝７５％、Ｘ＝９５％。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2006512906000001.app