【手続補正書】
【提出日】平成21年1月30日(2009.1.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体由来の試験されるべきDNAを含む、回収されている母親サンプルから単離した胎児細胞サンプルからの、正常な健康状態、健康なキャリア状態、又は嚢胞性線維症に罹患するキャリア状態の非侵襲的出生前in vitro検出方法であって、以下の工程：
a）胎児起源の細胞を含み得る純粋又は希釈母親サンプルにおける胎児細胞を豊富化する工程；
b）保持された細胞を分析し、胎児起源であると推定される細胞を選択する工程；
c）前記工程b）で選択した1つ又は複数の細胞の胎児起源を遺伝分析により実証する工程；並びに
d）前記工程c）で選択した細胞の胎児DNAについて、以下の工程：
・CFTR遺伝子上の調査される既知の突然変異を保持できる遺伝子座、又は分離の間にCFTR遺伝子の突然変異と遺伝的に連鎖（リンケージ）する遺伝子型多型を含む遺伝子座を増幅できるその能力について選択されるプライマー対を用いて胎児DNAを増幅する工程；
・前記増幅したDNA断片に対応する対立遺伝子について、調査される既知のCFTR遺伝子突然変異、若しくはCFTR遺伝子と遺伝的に連鎖する多型遺伝子座が存在するか又は不在であるかを同定する工程；並びに
・胎児対立遺伝子と、コントロールサンプルの対応する対立遺伝子とを比較し、増幅対立遺伝子の観察から、試験個体において、正常な健康状態、健康なキャリア状態、又は嚢胞性線維症に罹患するキャリア状態の検出を測定する工程、
を用いて、ΔF508突然変異若しくは他の既知の突然変異を保持するCFTR遺伝子の対立遺伝子を調べるか、又はCFTR遺伝子の非同定病的突然変異と遺伝的に連鎖する遺伝子型多型を保持する遺伝子座の対立遺伝子を調べる工程、
を含む、方法。
【請求項２】
前記工程c）における、選択細胞の胎児起源の実証が、以下の工程：
i）所定の遺伝的多型を増幅して母親対立遺伝子と父親対立遺伝子とを区別でき、各選択細胞において、父親対立遺伝子及び母親対立遺伝子の存在により胎児ゲノムを認識できる、情報提供プライマーと称されるプライマーを用いて、1つ又は複数の選択細胞から、個々に回収したDNAを増幅する工程；
ii）前記細胞由来のDNAの対立遺伝子と、対応する父親対立遺伝子とを比較する工程；
iii）同定された遺伝的多型について、母親対立遺伝子と父親対立遺伝子とを含む細胞由来のDNAを選択し、前記細胞由来のDNAの胎児起源を実証する工程、
を用いた前記細胞の遺伝子型決定により実施される、請求項１記載の正常な健康状態、健康なキャリア状態、又は嚢胞性線維症に罹患するキャリア状態の非侵襲的出生前in vitro検出方法。
【請求項３】
前記工程c）及びd）で用いられるプライマーが、少量のDNAを増幅できる、請求項１又は２記載の正常な健康状態、健康なキャリア状態、又は嚢胞性線維症に罹患するキャリア状態の非侵襲的出生前in vitro検出方法。
【請求項４】
前記工程c）及びd）で用いられるプライマーが、単一細胞由来のDNAを増幅できる、請求項１又は２記載の正常な健康状態、健康なキャリア状態、又は嚢胞性線維症に罹患するキャリア状態の非侵襲的出生前in vitro検出方法。
【請求項５】
用いられる前記プライマーが、5 pg未満の量のDNA、特に2 pgオーダーの量のDNAを増幅できる、請求項３又は４記載の正常な健康状態、健康なキャリア状態、又は嚢胞性線維症に罹患するキャリア状態の非侵襲的出生前in vitro検出方法。
【請求項６】
前記工程c）の増幅工程、及び／又は前記工程d）の増幅工程が、外部プライマーを用いて実施される第一増幅フェーズと、内部プライマーを用いて実施される第二増幅フェーズとを含む、請求項１乃至５のいずれか一項記載の正常な健康状態、健康なキャリア状態、又は嚢胞性線維症に罹患するキャリア状態の非侵襲的出生前in vitro検出方法。
【請求項７】
前記工程c）で用いられる情報提供プライマーが、第16染色体、第21染色体、及び第7染色体から選択される染色体の配列に由来する、請求項１乃至６のいずれか一項記載の正常な健康状態、健康なキャリア状態、又は嚢胞性線維症に罹患するキャリア状態の非侵襲的出生前in vitro検出方法。
【請求項８】
用いられる前記プライマーが、第7染色体の配列に由来し、かつ嚢胞性線維症についての病的対立遺伝子に近接する、請求項７記載の正常な健康状態、健康なキャリア状態、又は嚢胞性線維症に罹患するキャリア状態の非侵襲的出生前in vitro検出方法。
【請求項９】
前記工程d）において、CFTR遺伝子のΔF508遺伝子座の突然変異を保持する少なくとも1つの対立遺伝子が調べられ、試験胎児DNAが、CFTR遺伝子のΔF508遺伝子座を増幅できるプライマーを用いて増幅される、請求項１乃至７のいずれか一項記載の正常な健康状態、健康なキャリア状態、又は嚢胞性線維症に罹患するキャリア状態の非侵襲的出生前in vitro検出方法。
【請求項１０】
以下：
【表１】
2008526247.tif 000001
から選択されるプライマー対が、ΔF508遺伝子座を増幅するために用いられる、請求項１乃至９のいずれか一項記載の正常な健康状態、健康なキャリア状態、又は嚢胞性線維症に罹患するキャリア状態の非侵襲的出生前in vitro検出方法。
【請求項１１】
CFTR遺伝子上の調べられる異常が未知であり、前記工程c）及びd）が、以下：
・分離の間にCFTR遺伝子と遺伝的に連鎖（リンケージ）する遺伝子型多型を含む遺伝子座を増幅できる情報提供増幅プライマーを用いて、前記工程c）及びd）の増幅を組み合わせて実施する；及び
・前記工程d）のコントロールサンプルとの比較が、胎児DNAから同定された対立遺伝子と、対応する父親対立遺伝子、対応する母親対立遺伝子、及び嚢胞性線維症に罹患した同一家系の子供の対応する対立遺伝子との比較を含む、
という条件下で実施される、請求項１乃至７のいずれか一項記載の正常な健康状態、健康なキャリア状態、又は嚢胞性線維症に罹患するキャリア状態の非侵襲的出生前in vitro検出方法。
【請求項１２】
嚢胞性線維症についての病気対立遺伝子と連鎖を形成する遺伝的多型を保持する少なくとも1つの対立遺伝子の存在又は不在を同定するために、胎児DNA、母親DNA、父親DNA、及び同一家系の子供由来のDNAを増幅するための少なくとも1つの増幅フェーズが、以下：
【表２】
2008526247.tif 000002
から選択される1つ又は複数のプライマー対を用いて実施される、請求項１乃至１１のいずれか一項記載の正常な健康状態、健康なキャリア状態、又は嚢胞性線維症に罹患するキャリア状態の非侵襲的出生前in vitro検出方法。
【請求項１３】
前記工程c）が、単一の回収胎児細胞のゲノム由来のDNA調製物について、1つ若しくは複数の遺伝的多型マーカー又は前記マーカーの組み合わせ物を同定する工程、並びに前記細胞由来のDNAの二親性の寄与を実証し、結果として、少なくとも1つの前記細胞の胎児起源を実証する工程を含むか、又は前記工程からなる、請求項１乃至１０のいずれか一項記載の正常な健康状態、健康なキャリア状態、又は嚢胞性線維症に罹患するキャリア状態の非侵襲的出生前in vitro検出方法。
【請求項１４】
前記工程c）で用いられる情報提供プライマー対と称されるプライマー対が、以下：
【表３】
2008526247.tif 000003
から選択される、請求項１３記載の正常な健康状態、健康なキャリア状態、又は嚢胞性線維症に罹患するキャリア状態の非侵襲的出生前in vitro検出方法。
【請求項１５】
前記工程c）において、第一増幅フェーズを実施するために、以下のプライマー：
【表４】
2008526247.tif 000004
が用いられ；
第二増幅フェーズを実施するために、以下のプライマー：
【表５】
2008526247.tif 000005
が用いられる、請求項１１記載の正常な健康状態、健康なキャリア状態、又は嚢胞性線維症に罹患するキャリア状態の非侵襲的出生前in vitro検出方法。
【請求項１６】
ΔF508遺伝子座を増幅できる、用いられるプライマーが、前記第一増幅フェーズについては、F：5'−TGGAGCCTTCAGAGGGTAAA−3'（SEQ ID NO：25）、R：5'−TGCATAATCAAAAAGTTTTCACA−3'（SEQ ID NO：26）であり、前記第二増幅フェーズについては、F：5'−TCTGTTCTCAGTTTTCCTGG−3'（SEQ ID NO：27）、R：5'−TCTTACCTCTTCTAGTTGGC−3'（SEQ ID NO：28）である、請求項１０記載の正常な健康状態、健康なキャリア状態、又は嚢胞性線維症に罹患するキャリア状態の非侵襲的出生前in vitro検出方法。
【請求項１７】
前記工程a）の間に保持された細胞が、特にマイクロダイセクションにより、個々に回収される、請求項１乃至１６のいずれか一項記載の正常な健康状態、健康なキャリア状態、又は嚢胞性線維症に罹患するキャリア状態の非侵襲的出生前in vitro検出方法。
【請求項１８】
前記工程a）の間に保持された細胞が、前記細胞を個々に回収することなく、前記工程b）の間に、回収され、ついでin situで分析される、請求項１乃至１６のいずれか一項記載の正常な健康状態、健康なキャリア状態、又は嚢胞性線維症に罹患するキャリア状態の非侵襲的出生前in vitro検出方法。
【請求項１９】
前記工程a）が、胎児起源の細胞を含み得る純粋又は希釈母親サンプルをろ過して、胎児起源の細胞を含む特定の細胞のサイズに応じてフィルター上に濃縮する工程からなり、かつ前記工程b）が、前記フィルター上に保持された細胞を分析する工程、及び胎児起源であると推定される細胞を選択する工程からなる、請求項１乃至１８のいずれか一項記載の正常な健康状態、健康なキャリア状態、又は嚢胞性線維症に罹患するキャリア状態の非侵襲的出生前in vitro検出方法。
【請求項２０】
前記工程c）及び／又は工程d）を実施するために用いられ得る少なくとも1つのプライマーが、変異オリゴヌクレオチドであって、その配列が前記プライマーの1つの配列に由来し、その配列が由来する前記プライマーと、少なくとも60％の同一性、好ましくは80％、より好ましくは95％以上の同一性を有する変異オリゴヌクレオチドに置き換えられる、請求項１０、１２、１４、１５、又は１６記載の正常な健康状態、健康なキャリア状態、又は嚢胞性線維症に罹患するキャリア状態の非侵襲的出生前in vitro検出方法。
【請求項２１】
前記工程d）が、前記工程c）で個々に選択された複数の細胞由来のDNAプールに対して実施されることを特徴とする、請求項１乃至２０のいずれか一項記載の正常な健康状態、健康なキャリア状態、又は嚢胞性線維症に罹患するキャリア状態の非侵襲的出生前in vitro検出方法。
【請求項２２】
以下の配列：
【表６】
2008526247.tif 000006
の1つを含むか、又は前記配列の1つからなる配列のポリヌクレオチドから選択されることを特徴とする、生物学的サンプル由来のDNA量を増幅するためのプライマーとして使用するためのポリヌクレオチド。
【請求項２３】
以下の配列：
【表７】
2008526247.tif 000007
を含むか、又は前記配列からなる配列のポリヌクレオチド対から選択されることを特徴とする、生物学的サンプル由来のDNA量を増幅するためのプライマー対として使用するためのポリヌクレオチド対。
【請求項２４】
請求項２２記載の配列と、少なくとも60％の同一性、好ましくは80％、より好ましくは95％以上の同一性を有する、ポリヌクレオチド。
【請求項２５】
DNA調製物の第一増幅フェーズで使用される、標的配列に対して外部プライマーと称されるプライマー対と、前記第一増幅フェーズにより得られる増幅産物に対する第二増幅フェーズで使用される、前記外部プライマーに対して内部プライマー又はネスティッドプライマーと称される別のプライマー対との組み合わせ物であって、前記プライマー対の組み合わせ物が、以下：
・外部プライマーとして、
【表８】
2008526247.tif 000008
及び、内部プライマーとして、
【表９】
2008526247.tif 000009
；又は
・外部プライマーとして、
【表１０】
2008526247.tif 000010
及び、内部プライマーとして、
【表１１】
2008526247.tif 000011
；又は
・外部プライマーとして、
【表１２】
2008526247.tif 000012
及び、内部プライマーとして、
【表１３】
2008526247.tif 000013
；又は
・外部プライマーとして、
【表１４】
2008526247.tif 000014
及び、内部プライマーとして、
【表１５】
2008526247.tif 000015
；又は
・外部プライマーとして、
【表１６】
2008526247.tif 000016
及び、内部プライマーとして、
【表１７】
2008526247.tif 000017
；又は
・外部プライマーとして、
【表１８】
2008526247.tif 000018
及び、内部プライマーとして、
【表１９】
2008526247.tif 000019
；又は
・外部プライマーとして、
【表２０】
2008526247.tif 000020
及び、内部プライマーとして、
【表２１】
2008526247.tif 000021
；又は
・外部プライマーとして、
【表２２】
2008526247.tif 000022
及び、内部プライマーとして、
【表２３】
2008526247.tif 000023
；又は
・外部プライマーとして、
【表２４】
2008526247.tif 000024
及び、内部プライマーとして、
【表２５】
2008526247.tif 000025
から選択される、プライマー対の組み合わせ物。
【請求項２６】
プライマーが以下：
【表２６】
2008526247.tif 000026
から選択されることを特徴とする、母親サンプルから単離された胎児細胞のゲノムDNAからの、正常な健康状態、健康なキャリア状態、又は嚢胞性線維症に罹患するキャリア状態の非侵襲的出生前in vitro検出方法と関連するプライマーの使用。
【請求項２７】
プライマーが以下：
【表２７】
2008526247.tif 000027
から選択されることを特徴とする、母親サンプルから回収された単一細胞のゲノム由来のDNA調製物に対する、前記単一回収細胞の胎児特性のin vitro同定方法と関連するプライマーの使用。
【請求項２８】
請求項２７中に記載の1つ又は複数のプライマーと、適切な場合には、DNA増幅用試薬及び／又は正常なキャリア状態若しくは嚢胞性線維症に罹患するキャリア状態を検出するための説明書とを含む、正常な健康状態、健康なキャリア状態、又は嚢胞性線維症に罹患するキャリア状態の非侵襲的出生前検出用キット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６７】
従って、本発明の方法の工程d）は、以下：
− ΔF508タイプの突然変異用：
・外部ΔF508アウトプライマー対（F：5'−TGGAGCCTTCAGAGGGTAAA−3'（SEQ ID NO：25）；R：5'−TGCATAATCAAAAAGTTTTCACA−3'（SEQ ID NO：26）であって、単独で用いられるか、又は実施される場合には工程d）の第一増幅フェーズの間に用いられる；及び
・ΔF508内部インプライマー対（F：5'−TCTGTTCTCAGTTTTCCTGG−3'（SEQ ID NO：27）；R：5'−TCTTACCTCTTCTAGTTGGC−3'（SEQ ID NO：28）であって、工程d）の第二増幅フェーズの間に用いられるか、又は工程d）の単一増幅の場合には単独で用いられる；
− ΔF508遺伝子座とは別の不確定な突然変異用：
・CFTR遺伝子とリンケージを形成するDNA断片を増幅する、第7染色体上で同定されたプライマーであって、以下：
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７８】
ΔF508遺伝子座を増幅可能な前記プライマーは、以下のプライマー：
・外部ΔF508アウトプライマー対（F：5'−TGGAGCCTTCAGAGGGTAAA−3'（SEQ ID NO：25）；R：5'−TGCATAATCAAAAAGTTTTCACA−3'（SEQ ID NO：26）であって、工程d）の第一増幅フェーズの間に用いられる；及び
・内部ΔF508インプライマー対（F：5'−TCTGTTCTCAGTTTTCCTGG−3'（SEQ ID NO：27）；R：5'−TCTTACCTCTTCTAGTTGGC−3'（SEQ ID NO：28）であって、工程d）の第二増幅フェーズの間に用いられる、
である。