(57)【要約】  本発明は、天然のアネキシンＡ３を認識する新規抗体に関する。これらの抗体は、診断及び治療的用途に適している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトアネキシンＡ３のアミノ酸配列５９〜６７：
ＥＹＱＡＡＹＧＫＥ（配列番号１）
中のエピトープに対応する天然のアネキシンＡ３を認識する抗体又は前記抗体の抗原結合フラグメント。
【請求項２】
（ｉ）抗体
−ＴＧＣ４２
−ＴＧＣ４３又は
−ＴＧＣ４９
（ｉｉ）（ｉ）からの抗体と同一の抗原結合部位を有する抗体及び
（ｉｉｉ）前記抗体の抗原結合フラグメント
から選択される、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
ヒトアネキシンＡ３のアミノ酸配列１〜１０６中の立体構造エピトープに対応する天然のアネキシンＡ３を認識する抗体又は前記抗体の抗原結合フラグメント。
【請求項４】
ヒトアネキシンＡ３のアミノ酸配列１〜３４中の立体構造エピトープに対応する請求項３に記載の抗体又は前記抗体の抗原結合フラグメント。
【請求項５】
ヒトアネキシンＡ３のアミノ酸配列３５〜１０６の立体構造エピトープに対応する請求項３に記載の抗体又は前記抗体の抗原結合フラグメント。
【請求項６】
（ｉ）抗体
−ＴＧＣ４４又は
−ＴＧＣ４８、
（ｉｉ）（ｉ）からの抗体と同一の抗原結合部位を有する抗体及び
（ｉｉｉ）前記抗体の抗原結合フラグメント
から成る群から選択される、請求項３、４又は５に記載の抗体。
【請求項７】
（ｉ）抗体ＴＧＣ４２、ＴＧＣ４３、ＴＧＣ４４、ＴＧＣ４５、ＴＧＣ４６、ＴＧＣ４７、ＴＧＣ４８又はＴＧＣ４９
（ｉｉ）（ｉ）からの抗体と同一の結合部位を有する抗体及び
（ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）からの抗体と天然のヒトアネキシンＡ３上で同一のエピトープを認識する抗体及び
（ｉｖ）前記抗体の抗原結合フラグメント
から選択される、天然のアネキシンＡ３を認識する抗体。
【請求項８】
モノクローナル抗体、ダイマー抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体又は組み換え抗体又はこれらのフラグメントである、請求項１から７までのいずれか１項に記載の抗体。
【請求項９】
医薬、特にヒト医薬における使用のための、請求項１から８までのいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１０】
診断又は治療的用途のための、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
癌、特に前立腺癌の診断のための、請求項９又は１０に記載の抗体。
【請求項１２】
天然の条件下で実施する診断アッセイにおける使用のための、請求項９、１０又は１１に記載の抗体。
【請求項１３】
ＥＬＩＳＡにおいて使用するための、請求項１２に記載の抗体。
【請求項１４】
試料を、天然のアネキシンＡ３の存在及び／又は量に関して分析する、癌の診断方法。
【請求項１５】
天然のアネキシンＡ３を、請求項１から８までのいずれか１項に記載の抗体との反応によって検出する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
試料が体液、特に尿又は圧搾尿である、請求項１４又は１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、天然のアネキシンＡ３を認識する新規抗体に関する。これらの抗体は、診断的及び治療的用途に適している。
【０００２】
従来の研究において、ＡＮＸＡ３は前立腺疾患及び前立腺癌の進行及び種々の段階と顕著に関係していることが示された。なおも、ヒト前立腺におけるＡＮＸＡ３の役割及び生態に関して知られているのはわずかである。これまでＡＮＸＡ３は、種々の上皮から放出される小胞である、いわゆるエキソソームの一部であるとされている。ＡＮＸＡ３の診断的性能の基礎となるこの現象は、前立腺癌における自己免疫の複雑な調整によるものであることが示されている。
【０００３】
前立腺癌及び他の尿生殖路の上皮癌の治療又は診断のためのタンパク質バイオマーカーは、US 2005 130 876, 20、WO 03 086 461、WO 2005 078 124、EP 05 011 042.8及びEP 05 026 092.6に記載されている。これら文献の内容は、本願明細書中に引用により含まれる。
【０００４】
US 60/812,089及びUS 60/859,489は、癌の診断を開示しており、その際、試料は、高い特異性を有するモノクローナル抗体を用いて、アネキシンＡ３の存在及び／又は量に関して分析されている。これら文献の内容は、本願明細書中に引用により含まれる。
【０００５】
ＡＮＸＡ３は、前立腺癌のためのマーカーとして及び組織切片中の良性、前悪性及び悪性の状態における種々の診断に関する方法のための特異的抗体として利用可能であることが知られているが、これらの抗体による尿及び圧搾尿（exprimate urine）中のＡＮＭＸＡ３の測定は、極めて困難である。
【０００６】
尿中の「天然の」ＡＮＸＡ３の立体構造は、ウェスタンブロット又は組織染色において高い特異性を有する現在入手可能な抗体がタンパク質画分を検出するにとどまる。これは、おそらくは、タンパク質の特異的認識のために重要なエピトープとの接触を困難とする、エキソソーム／プロスタソーム中のＡＮＸＡ３のフォールディングによる。これらのエピトープは、先行する特許出願において調査され、かつ詳細に記載されている。
【０００７】
本発明の目的は、体液、例えば尿及び圧搾尿中の天然のＡＮＸＡ３の存在割合を定量的に調べることである。
【０００８】
本発明によれば、変性条件及びウェスタンブロット技術を使用することによってのみ予想的関連性（prognostic relevance）が可能であった従来の抗ＡＮＸＡ３抗体を使用して、尿中のＡＮＸＡ３の効果的な検出が見出された。これらの従来の抗体のいずれもが、圧搾尿を「天然の」条件下で試験するＥＬＩＳＡベースの試験においては良好に働くものではなかった。
【０００９】
驚くべきことに、ＡＮＸＡ３の完全特異的「抗体−反応性表面」を構成し、かつ従来記載されたエピトープの隣に、尿、圧搾尿及び他の体液（例えば血漿又は血清）中の「天然」のＡＮＸＡ３を認識する抗体が、天然のＡＮＸＡ３を特異的に認識するための付加的なエピトープを有することを見出した。
【００１０】
第１の態様において、本発明は、天然のアネキシンＡ３、特に天然のヒトアネキシンＡ３を認識する抗体に関する。これらの抗体は、非変性条件下で、すなわち体液、例えば尿及び圧搾尿中で、ＡＮＸＡ３に特異的に結合することが可能である。
【００１１】
第１の好ましい実施態様において、本発明は、天然のアネキシンＡ３を認識する抗体又は前記抗体の抗原結合フラグメントに関し、この場合、この抗体は、ヒトアネキシンＡ３のアミノ酸配列５９〜６７：
ＥＹＱＡＡＹＧＫＥ（配列番号１）
のエピトープに対応するものである。
【００１２】
このような抗体の特別な例は、以下のものから選択される：
（ｉ）抗体
−ＴＧＣ４２、
−ＴＧＣ４３又は
−ＴＧＣ４９
（ｉｉ）（ｉ）の抗体と同一の抗原結合部位を有する抗体及び
（ｉｉｉ）前記抗体の抗原結合フラグメント。
【００１３】
他の好ましい実施態様は、ヒトアネキシンＡ３のアミノ酸配列１〜１０６中の立体構造エピトープに対応する天然のアネキシンＡ３を認識する抗体又は前記抗体の抗原結合フラグメントに関する。
【００１４】
例えば、この抗体は、ヒトアネキシンＡ３のアミノ酸配列１〜３４中の立体構造エピトープに対応するものであってもよいか、あるいは、前記抗体の抗原結合フラグメントであってもよい。代替的に、この抗体は、ヒトアネキシンＡ３のアミノ酸配列３５〜１０６中の立体構造エピトープに対応するものであってもよいか、あるいは、前記抗体の抗原結合フラグメントであってもよい。
【００１５】
このような抗体の特別な例は、以下のものから選択される：
（ｉ）抗体
−ＴＧＣ４４又は
−ＴＧＣ４８、
（ｉｉ）（ｉ）の抗体と同一の抗原結合部位を有する抗体及び
（ｉｉｉ）前記抗体の抗原結合フラグメント。
【００１６】
さらに他の実施態様において、本発明の抗体は以下のものから選択される：
（ｉ）抗体ＴＧＣ４２、ＴＧＣ４３、ＴＧＣ４４、ＴＧＣ４５、ＴＧＣ４６、ＴＧＣ４７、ＴＧＣ４８又はＴＧＣ４９、
（ｉｉ）（ｉ）の抗体と同一の抗原結合部位を有する抗体及び
（ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）の抗体と天然のヒトアネキシンＡ３上で同一のエピトープを認識する抗体及び
（ｉｖ）前記抗体の抗原結合フラグメント。
【００１７】
ハイブリドーマ細胞系生産抗体ＴＧＣ４２（ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２９７２）、ＴＧＣ４３（ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２９７０）、ＴＧＣ４４（ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２９７６）、ＴＧＣ４５（ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２９７４）、ＴＧＣ４６（ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２９７５）、ＴＧＣ４７（ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２９７７）、ＴＧＣ４８（ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２９７１）及びＴＧＣ４９（ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２９７３）を、ブダペスト条約に基づき、ＤＳＭＺ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH）Inhoffenmstr.7B, 38124 Braunschweigにおいて、２００８年９月１７日に寄託した。
【００１８】
本発明の抗体はモノクローナル抗体、キメラ化抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体又は組み換え抗体、例えば単鎖抗体又はこのような抗体の抗原結合フラグメント、例えばタンパク質分解フラグメント又は組み換え単鎖抗体フラグメントであってもよい。この抗体は、医薬、特にヒト医薬において有用である。より詳細には、抗体は診断的又は治療的用途において使用することができる。より好ましくは、抗体は癌、例えば前立腺癌の診断のために使用される。有利には、本発明の抗体は、診断的アッセイにおける使用のためのものであり、この場合、このアッセイは天然の条件下で、例えば捕捉（capture）アッセイ、例えばＥＬＩＳＡ下で実施され、この際、天然のアネキシンＡ３の存在及び／又は量を測定する。
【００１９】
治療的及び診断的用途のために、本発明の抗体は、公知のエフェクター基又は標識基と結合していてもよい。エフェクター基は、細胞毒性基又は化合物、例えば化学療法剤又は放射性核種から選択することができる。標識基は、任意の公知標識基、例えばフルオレセンス基、ルミネセンス基、酵素標識、放射性標識等から選択されてもよい。抗体に対するエフェクター基又は標識基の結合は、公知の技術によって実施することができる。
【００２０】
他の実施態様において、本発明は癌、好ましくは前立腺癌を診断するための方法に関し、この際、体液試料は、天然のアネキシンＡ３の存在及び／又は量に関して分析される。
【００２１】
好ましくは、本発明の診断的方法は、天然のアネキシンＡ３、特に天然のヒトアネキシンＡ３の、前記の抗体との反応による検出を含む。試料は、好ましくは体液、例えば尿又は圧搾尿である。
【００２２】
本発明によって診断することができる癌は、好ましくは尿生殖器及び／又は胃腸管の癌、たとえば前立腺、膀胱、腎臓、尿道、卵巣、子宮又は結腸の癌であってもよい。特に、この癌は上皮癌である。特に好ましい実施態様において、癌は前立腺癌である。
【００２３】
好ましい実施態様において、本発明は、疾病段階及び／又は予後評価の種々の診断を含む。例えば、本発明は、以下のものから選択された疾病段階の種々の診断を可能にする：
（ｉ）良性の状態、特に良性の前立腺の状態、例えば良性の前立腺増殖症（ＢＰＨ）、繊維症及び慢性の前立腺炎、
（ｉｉ）前悪性の状態、例えば高いレベルの前立腺上皮内新生物（ＨＧＰＩＮ）を含む種々の段階（ＰＩＮ−１−３）の前立腺上皮内新生物、及び／又は
（ｉｉｉ）悪性の状態、例えば前立腺癌、特にグリーソン分類によって示された進行状態における進行した前立腺癌。
【００２４】
より好ましくは、本発明は、一方で良性又は前悪性の状態と、他方で悪性の状態との間の種々の診断を可能にする。
【００２５】
本発明の好ましい実施態様において、天然のＡＮＸＡ３の存在、量及び／又は分布は、体液又は組織試料であってもよい試料中で測定する。存在、量及び細胞間の局在は、同一の組織試料又は同一対象からの種々の試料、例えば体液試料及び組織試料において測定されてもよい。
【００２６】
試料中の天然のＡＮＸＡ３の高い量、例えば、組織試料の強い染色に相当するものは、良性状態に関する第一の指標である。天然のＡＮＸＡ３の中程度の量／低い量は、前悪性状態又は初期／初期〜中期の段階の悪性状態に関する指標である。試料中の天然のＡＮＸＡ３の不在は、悪性状態に関する指標であり、主に、例えば中期又は末期の段階の進行した段階における悪性状態に関する指標である。
【００２７】
小胞、例えばエキソソーム及び／又はプロスタソーム中の天然のＡＮＸＡ３の存在は、良性又は前悪性の状態に関する主な指標である。これらの小胞は、種々の遠心分離によって尿又は体液中から得ることができるので、本発明は、前記体液の任意のフラクション中の天然のＡＮＸＡ３の検出に関する。
【００２８】
さらに本発明の方法は、アネキシンＡ３に対する自己抗体の検出を含むものであってもよい。
【００２９】
ＡＮＸＡ３に対する自己免疫応答の存在、例えばＡＮＸＡ３に対する自己抗体の存在は、悪性の状態、特に進行した状態における悪性の状態に関する主な指標である。
【００３０】
本発明は、試料中のポリペプチドの測定を含む。好ましくは、この測定は、免疫学的方法を含み、その際、試料中の成分の存在、量及び／又は局在は、免疫学的試薬を用いて測定する。
【００３１】
試料中の天然のＡＮＸＡ３を測定するための試薬は、好ましくは天然のＡＮＸＡ３に対して特異的な抗体、例えばポリクローナル抗体又は前記モノクローナル抗体である。
【００３２】
試料中のＡＮＸＡ３自己抗体を測定するための試薬は、好ましくは認識のために重要な特異的エピトープを含むＡＮＸＡ３ポリペプチド又はこれらのフラグメントである。より好ましくは、ＡＮＸＡ３ポリペプチドは、天然の状態に再生された、組み換えＡＮＸＡ３ポリペプチドであるか、あるいは、ヒト又は他の哺乳類源から単離された天然ＡＮＸＡ３である。
【００３３】
本発明の方法は、免疫学的測定のために適した任意の試験様式で実施することができ、これは自動化装置のために適した試験様式を含むものである。いくつかの試験様式において、標識基、たとえば視覚化標識、例えばラテックス又はゴールドビーズ、フルオレセンス標識基、酵素標識基等を含む試薬を使用することが好ましいものであってもよい。試薬及び標識基の結合体は、標準的方法、たとえば試薬の反応性アミノ酸側鎖、たとえばカルボキシ基、アミノ基及び／又はチオール基に対する標識基での、たとえば二官能性スペーサー分子を介しての共有結合によって製造することができる。
【００３４】
試料は好ましくはヒト患者から得られる。いつくかの実施態様において、方法は非破壊的診断手段であり、その際、試料は例えば尿試料、特に尿試料、圧搾尿試料又は糞便試料であってもよい。好ましい場合には、試料は予備処理手段、例えばゲルろ過を実施することができる。他の実施態様において、方法は形態化学的手段であってもよく、その際、試料は組織試料、特に生検、例えばパンチ生検であってもよい。組織化学的手段において、細胞間又は細胞外ＡＮＸＡ３の選択的測定は、試料の範囲内におけるＡＮＸＡ３の局在化を測定することによって実施することができる。
【００３５】
好ましい実施態様において、本発明は、天然のＡＮＸＡ３の半定量的又は定量的測定を含む。この半定量的又は定量的測定は、予め定められたカットオフ値をベースとする試験結果の評価及び疾病段階の範囲内における評価の結果の相関を含むものであってもよい。カットオフ値は、健康な人及び／又は公知方法にしたがって予め定められた疾病段階を有するヒトからの試料中において、天然のＡＮＸＡ３を測定することによって定められてもよい。さらに、試料中の天然のＡＮＸＡ３の量は、さらに染色された組織試料の評価及び疾病段階を有する評価の結果の相関によって定めることができる。
【００３６】
試料については、例えば、エキソソーム中の天然のＡＮＸＡ３の別個の測定を可能にする、分別手段をおこなってもよい。例えば、試料は、細胞ペレット及び上清を得るために遠心分離することができ、その際、細胞間アネキシンＡ３を細胞ペレット中で測定し、かつ細胞外アネキシンＡ３を上清中で測定する。特別な好ましい実施態様において、方法は、細胞外ＡＮＸＡ３の選択的測定を含む。他の特に好ましい実施態様において、方法は、細胞間ＡＮＸＡ３の選択的測定を含む。
【００３７】
本発明の方法は、付加的に他の癌マーカー、例えば癌マーカーの測定を含むものであってもよい。他のマーカーの測定は、天然のＡＮＸＡ３が測定されるのと同じ試料中で、あるいは種々の試料中で、例えば血液、血清及び／又は血漿試料中で実施されてもよい。特に好ましくは、血液、血清又は血漿マーカーの測定であり、特に、カリクレインプロテアーゼファミリーの少なくとも１種、例えば前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）及び／又は上皮細胞マーカーの少なくとも１種、特に前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）である。
【００３８】
本発明はスクリーニング手段であってもよく、その際、固体又は固体群は癌、特に前立腺癌に対して試験される。他方において、方法は、予後評価又は治療的追跡試験を含むものであってもよく、その際、すでに癌、特に前立腺癌又はその予備段階に関して陽性であると診断された個体については、予後評価及び／又は治療コントロールモニタリングを行う。
【００３９】
特に好ましい実施態様において、本発明は疾病進行の予後評価に関し、これは任意の診断的アセスメント、特に治療コントロールのために重要なツールである。予後評価は、天然のＡＮＸＡ３単独で、あるいは、他のマーカー、例えばＰＳＡ、ＰＣＡ３(Loeb S. Does PCA3 Help Identify Clinically Significant Prostate Cancer? Eur Urol. 2008 Jul 16.)、ＰＣＡＤＭ−１(Ohkia A, Hu Y, Wang M, Garcia FU, Steams ME. Clin Cancer Res. 2004 Apr 1; 10(7):2452-8. Links Evidence for prostate cancer-associated diagnostic marker-1: immunohistochemistry and in situ hybridization studies.)、ＥＰＣＡ−２(Katz MD, Kibel AS. Words of wisdom. Re:EPCA-2: a highly specific serum marker for prostate cancer. Eur Urol. 2008 Jan; 53(1):210), (Diamandis EP. POINT: EPCA-2: a promising new serum biomarker for prostatic carcinoma? Clin Biochem. 2007 Dec; 40(18): 1437-9. Epub 2007 Sep 19.), (Leman ES, Cannon GW, Trock BJ, Sokoll LJ, Chan DW, Mangold L, Partin AW, Getzenberg RH. EPCA-2: a highly specific serum marker for prostate cancer. Urology. 2007 Apr; 69(4):714-20)と組合せての測定をベースとするものであってもよく、この場合、これは前立腺癌に対して陽性に相関する。例えば、組織化学的評価及び／又はＰＳＡ又は他の癌マーカーのレベルの測定によって、患者は低いリスク群（例えばＰＳＡレベル≦１０ｎｇ／ｍｌ）、中程度のリスク群（例えばＰＳＡレベル＞１０及び＜２０ｎｇ／ｍｌ）及び高いリスク群（例えばＰＳＡレベル≧２０ｎｇ／ｍｌ）に分類することができる。これら患者におけるＡＮＸＡ３の測定は、他の重要な情報、特に中程度のリスク群において分類されうる患者における重要な情報を導くことができる。これらの中程度のリスク患者がＡＮＸＡ３陽性である場合には、ＰＳＡ不含の生存率の％は、ＡＮＸＡ３に関して陰性であると測定された患者における生存率に比べて極めて高い。したがって本発明は、個々の患者群に対するさらなるリスクの層化を可能にする。好ましくは、中程度のリスクに本来分類されている群の患者は、ＡＮＸＡ３測定の結果をベースとして再分類することができる。ＡＮＸＡ３陽性の患者は、低いリスク群として再度分類されてもよく、かつＡＮＸＡ３陰性の患者（及び場合によってはＡＮＸＡ３に対する自動免疫応答を有するもの）は、高いリスク群に分類される。
【００４０】
さらに、本発明はより詳細には以下の図面及び実施例によって説明することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】アネキシン３の組み換えフラグメントを用いてウェスタンブロット中で試験されたモノクローナル抗体の反応性を実証する、ウェスタンブロット分析を示す図
【図２】ＴＧＣ４２を用いてのペプチドシートの現像写真図
【図３】ポリクローナル血清Ｐｅｔｒｏｓの線状エピトープとの比較におけるアネキシン３特異的抗体のエピトープを示す図
【図４Ａ】変性ＡＮＸＡ３を認識する抗体及び天然のＡＮＸＡ３を認識する抗体によって認識されたエピトープを含む、ＡＮＸＡ３空間構造を示す図
【図４Ｂ】変性ＡＮＸＡ３を認識する抗体及び天然のＡＮＸＡ３を認識する抗体によって認識されたエピトープを含む、ＡＮＸＡ３空間構造を示す図
【００４２】
実施例
マウスを、組み換えヒトアネキシンＡ３を用いて免疫化した。それによって、モノクローナル抗体が製造され、この抗体は、ポリクローナル抗血清Ｐｅｔｒｏｓ（Wozny W, Schroer K, Schwall GP, Poznanovic S, Stegmann W, Dietz K, Rogatsch H, Schaefer G, Huebl H, Klocker H, Schrattenholz A, Cahill MA. Differential radioactive quantification of protein abundance ratios between benign and malignant prostate tissues: cancer association of annexin A3. Proteomics. 2007 Jan; 7(2):313-22）との組合せにおいて、捕捉ＥＬＩＳＡ中で、天然のアネキシンＡ３を認識することが可能である。
【００４３】
得られる抗体は、以下のようにしてデザインされる：
ＴＧＣ４３＝ＤＳＭ  ＡＣＣ２９７０
ＴＧＣ４８＝ＤＳＭ  ＡＣＣ２９７１
ＴＧＣ４２＝ＤＳＭ  ＡＣＣ２９７２
ＴＧＣ４９＝ＤＳＭ  ＡＣＣ２９７３
ＴＧＣ４５＝ＤＳＭ  ＡＣＣ２９７４
ＴＧＣ４６＝ＤＳＭ  ＡＣＣ２９７５
ＴＧＣ４４＝ＤＳＭ  ＡＣＣ２９７６
ＴＧＣ４７＝ＤＳＭ  ＡＣＣ２９７７
【００４４】
１．ウェスタンブロット中の結合部位の局在化
第１の試験群において、ハイブリドーマ細胞１６Ｃ１２（ＴＧＣ４２）、１４Ｂ１０（ＴＧＣ４９）、１５Ｄ６（ＴＧＣ４６）、１８Ｅ９（ＴＧＣ４３）、１７Ｄ９（ＴＧＣ４８）、１７Ｆ１２（ＴＧＣ４４）、１３Ｈ５（ＴＧＣ４７）及び１６Ａ７（ＴＧＣ４５）の細胞培養上清を、組み換えアネキシン３フラグメントｖＡＮＡ１、ｖＡＮＡ４、ｖＡＮＡ５、ｖＡＮＡ７及びｖＡＮＡ８を用いてウェスタンブロット中で試験した。アネキシン３のこれらのフラグメントは、オーバーラッピングフラグメント中で、完全なアネキシン３を示す（図１参照）。すべての抗体上清は、フラグメントｖＡＮＡ１を認識し、かつそれによって、完全長のアネキシンＡ３タンパク質を認識する。さらにすべての試験した抗体は、アネキシン３のＮ−末端領域を示すフラグメントｖＡＮＡ７を検出する（図１参照）。試験した抗体の結合部位は、アネキシン３のＮ−末端１０６ａａの範囲内である。
【００４５】
モノクローナル抗体中の結合部位をさらに局在化する目的のために、ウェスタンブロット中の第２の試験群における細胞培養上清を、アネキシン３のフラグメントｖＡＮＡ２及びｖＡＮＡ３に対するその反応性について試験した。ｖＡＮＡ３は、Ｎ−末端領域３４ａａを除いてフラグメントｖＡＮＡ２に相当する。モノクローナル抗体の２種（１７Ｄ９（ＴＧＣ４８）及び１７Ｆ１２（ＴＧＣ４４））は、フラグメントｖＡＮＡ２のみを認識し、残りの抗体は、双方のアネキシン３フラグメントを認識する。これらの試験は、製造された抗体において少なくとも２個の異なる反応性が存在することを示す。モノクローナル抗体１７Ｄ９（ＴＧＣ４８）及び１７Ｆ１２（ＴＧＣ４４））中では、反応性は、Ｎ−末端３４ａａに関連するがその一方で、残りの抗体の結合部位は、アネキシン３配列のアミノ酸３５と１０６との間である。
【００４６】
２．ペプチドスキャンを用いての選択された抗体のエピトープマッピング
モノクローナル抗体１６Ｃ１２（ＴＧＣ４２）、１８Ｅ９（ＴＧＣ４３）、１７Ｆ１２（ＴＧＣ４４）、１４Ｂ１０（ＴＧＣ４９）、１７Ｄ９（ＴＧＣ４８）並びに種々の抗体上清のエピトープを、ペプチドスキャンによって測定した。
【００４７】
２．１  抗体１６Ｃ１２（ＴＧＣ４２）、１８Ｅ９（ＴＧＣ４３）及び１４Ｂ１０（ＴＧＣ４９）のエピトープマッピング
モノクローナル抗体１６Ｃ１２（ＴＧＣ４２）、１８Ｅ９（ＴＧＣ４３）及び１４Ｂ１０（ＴＧＣ４９）の細胞培養上清を、そのエピトープを特徴付けるために希釈されていない形で使用した。これらの３種の抗体は、ペプチドスキャン中で別個の結果を示す。ペプチドシート現像写真の典型的な結果は、図２に示す。モノクローナル抗体１６Ｃ１２（ＴＧＣ４２）、１８Ｅ９（ＴＧＣ４３）及び１４Ｂ１０（ＴＧＣ４９）は、ペプチドシートのペプチドスポット１８〜２０を認識する。
【００４８】
ペプチドシード現像写真の分析
【表１】
2012503634.tif 000002
【００４９】
モノクローナル抗体１６Ｃ１２（ＴＧＣ４２）、１８Ｅ９（ＴＧＣ４２）及び１４Ｂ１０（ＴＧＣ４９）のエピトープは、アミノ酸配列ＥＹＱＡＡＹＧＫＥ（アネキシンＡ３の位置５９〜６７）の範囲内である。
【００５０】
２．２  抗体１７Ｄ９（ＴＧＣ４８）及び１７Ｆ１２（ＴＧＣ４４）のエピトープマッピング
モノクローナル抗体１７Ｄ９（ＴＧＣ４８）及び１７Ｆ１２（ＴＧＣ４４）の細胞培養上清は、そのエピトープの特徴付けのために希釈されていない形で使用した。双方の抗体上清は、ペプチドスキャン中のスポットを示すものではなかった。明らかに、双方の抗体は、アネキシンＡ３の線状のエピトープではなく、立体構造エピトープを認識するものである。
【００５１】
これらの結果に基づいて、抗体１７Ｄ９
（ＴＧＣ４８）及び／又は１７Ｆ１２（ＴＧＣ４４）によって認識された立体構造エピトープは、ヒトアネキシンＡ３のアミノ酸１〜１０６、１〜３４及び／又は３５〜１０６の範囲内で局在化していてもよい。図３は、ポリクローナル抗血清Ｐｅｔｒｏｓの線状エピトープとの比較におけるＡＮＸＡ３特異的抗体によって認識されたエピトープを示す。図は、ポリクローナル血清Ｐｅｔｒｏｓのペプチドスキャンを示す。種々のモノクローナル抗体のエピトープが示される。
【００５２】
図４は、変性ＡＮＸＡ３を認識する抗体及び天然のＡＮＸＡ３を認識する抗体によって認識されたエピトープを含む、ＡＮＸＡ３空間構造を表す。
【図１】
2012503634.tif 000003
【図２】
2012503634.tif 000004
【図３】
2012503634.tif 000005
【図４Ａ】
2012503634.tif 000006
【図４Ｂ】
2012503634.tif 000007
【配列表】
2012503634000001.app
【国際調査報告】
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