(57)【要約】  減少した分解時間を有するハイドロゲル組織接着剤を記述する。ハイドロゲル組織接着剤は、ハイドロゲルの分解を増進する、オリゴマー添加物の存在下で、酸化多糖類を水分散性多分枝状ポリエーテルアミンと反応させることにより形成される。本ハイドロゲルは、止血用シーラントとしての使用、あるいは外傷または外科手術に起因する望ましくない組織−組織癒着を防止するための使用等の、医療用途用の組織接着剤またはシーラントとして有用であり得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）アルデヒド基を含有する少なくとも１つの酸化多糖類であって、約１，０００〜約１，０００，０００ダルトンの重量平均分子量を有し、また約６５〜約１５００ダルトンのアルデヒド基当たりの当量を有する前記酸化多糖類；
ｂ）アームの少なくとも３つが少なくとも１つの一級アミン基で終結されている少なくとも１つの水分散性多分枝状ポリエーテルアミンであって、約４５０〜約２００，０００ダルトンの数平均分子量を有する前記多分枝状ポリエーテルアミン；および
ｃ）式：
Ｒ１−（ＰＳ）−Ｒ２
の少なくとも１つのオリゴマー；
{式中：
（ｉ）ＰＳは、エチレンオキシドモノマーか、またはエチレンオキシドモノマーとプロピレンオキシドモノマーとの組合せを含む直鎖状ポリマーセグメントであって、前記エチレンオキシドモノマーは、前記ポリマーセグメントの少なくとも約５０重量％を構成し；
（ｉｉ）Ｒ１は、アルデヒド基と反応して少なくとも１つの可逆的共有結合を形成することができる少なくとも１つの求核基であり；
（ｉｉｉ）Ｒ２は、水性媒体中で（ａ）のみまたは（ｂ）のみのいずれかと混合されるとき、前記オリゴマーがゲル化を誘発しないように、アルデヒド、一級アミン、二級アミン、またはＲ１と反応して共有結合を形成することができない少なくとも１つの官能基であり；
（ｉｖ）前記オリゴマーは、約２００〜約１０，０００ダルトンの重量平均分子量を有し；また
（ｖ）前記オリゴマーは水溶性である｝
を含むキット。
【請求項２】
前記酸化多糖類が第１の水溶液または分散の成分であり、前記水分散性多分枝状ポリエーテルアミンが第２の水溶液または分散の成分であり、前記オリゴマーが：（ｉ）前記第１の水溶液または分散；（ｉｉ）前記第２の水溶液または分散；または（ｉｉｉ）第３の水溶液または分散；の少なくとも１つの成分である、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
前記第１の水溶液または分散が、前記溶液または分散の総重量と比較して約５％〜約４０重量％の濃度で前記酸化多糖類を含む、請求項２に記載のキット。
【請求項４】
前記第２の水溶液または分散が、前記溶液または分散の総重量と比較して約５％〜約７０重量％の濃度で前記水分散性多分枝状ポリエーテルアミンを含む、請求項２に記載のキット。
【請求項５】
前記第１の水溶液または分散、前記第２の水溶液または分散、または前記第３の水溶液または分散の少なくとも１つが、前記溶液または分散の総重量と比較して約０．２５％〜約３０重量％の濃度で前記オリゴマーを含む、請求項２に記載のキット。
【請求項６】
前記酸化多糖類が、デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、澱粉、寒天、セルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、プルラン、イヌリン、レバン、およびヒアルロン酸の酸化誘導体からなる群から選択される、請求項１に記載のキット。
【請求項７】
前記酸化多糖類が酸化デキストランである、請求項６に記載のキット。
【請求項８】
前記水分散性多分枝状ポリエーテルアミンが、アミノ末端星状ポリエチレンオキシド類、アミノ末端樹枝状ポリエチレンオキシド類、アミノ末端櫛状ポリエチレンオキシド類、アミノ末端星状ポリプロピレンオキシド類、アミノ末端樹枝状ポリプロピレンオキシド類、アミノ末端櫛状ポリプロピレンオキシド類、アミノ末端星状ポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシドコポリマー類、アミノ末端樹枝状ポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシドコポリマー類、アミノ末端櫛状ポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシドコポリマー類、およびポリオキシアルキレントリアミン類からなる群から選択される、請求項１に記載のキット。
【請求項９】
ＰＳは前記セグメントの両端のメチレン基で終結する直鎖状ポリマーセグメントであって、前記セグメントは、ポリエチレンオキシド、ポリエチレンオキシドおよびポリプロピレンオキシドのブロックコポリマーまたはランダムコポリマー、およびポリエチレンオキシドおよびポリプロピレンオキシドのトリブロックコポリマーからなる群から選択されるポリマーに由来する、請求項１に記載のキット。
【請求項１０】
前記Ｒ１は、一級アミン、二級アミン、およびカルボキシヒドラジドからなる群から選択される、請求項１に記載のキット。
【請求項１１】
Ｒ２は、ヒドロキシ、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、およびフェノキシからなる群から選択される、請求項１に記載のキット。
【請求項１２】
前記オリゴマーが、ＰＳがポリエチレンオキシドに由来する直鎖状ポリマーセグメントであり、Ｒ１が一級アミンであり、Ｒ２がメトキシである、メトキシポリエチレングリコールアミンである、請求項１に記載のキット。
【請求項１３】
ａ）溶媒中で（ｉ）アルデヒド基を含有する少なくとも１つの酸化多糖類であって、約１，０００〜約１，０００，０００ダルトンの重量平均分子量を有し、また約６５〜約１５００ダルトンのアルデヒド基当たりの当量を有する前記酸化多糖類を、（ｉｉ）アームの少なくとも３つが、少なくとも１つの一級アミン基で終結される少なくとも１つの水分散性多分枝状ポリエーテルアミンであって、約４５０〜約２００，０００ダルトンの数平均分子量を有する前記多分枝状ポリエーテルアミン、および（ｉｉｉ）式：
Ｒ１−（ＰＳ）−Ｒ２
｛ここで：
（Ａ）ＰＳは、エチレンオキシドモノマーか、またはエチレンオキシドモノマーとプロピレンオキシドモノマーとの組合せを含む直鎖状ポリマーセグメントであって、前記エチレンオキシドモノマーは前記ポリマーセグメントの少なくとも約５０重量％を構成し；
（Ｂ）Ｒ１は、アルデヒド基と反応して少なくとも１つの可逆的共有結合を形成することができる少なくとも１つの求核基であり；
（Ｃ）Ｒ２は、水性媒体中で（ｉ）のみまたは（ｉｉ）のみのいずれかと混合されるとき、前記オリゴマーがゲル化を誘発しない、アルデヒド、一級アミン、二級アミン、またはＲ１と反応して共有結合を形成することができない少なくとも１つの官能基であり；
（Ｄ）前記オリゴマーは、約２００〜約１０，０００ダルトンの重量平均分子量を有し；また
（Ｅ）前記オリゴマーは水溶性である；｝
の少なくとも１つのオリゴマー
を混合してハイドロゲルを形成するステップ、および
ｂ）前記溶媒の少なくとも一部を除去するために前記ハイドロゲルを処理して、前記乾燥ハイドロゲルを形成するステップ
を含む方法で形成される乾燥ハイドロゲル。
【請求項１４】
ａ）約１，０００〜約１，０００，０００ダルトンの重量平均分子量を有するアルデヒド基を含有する少なくとも１つの酸化多糖類であって、約６５〜約１５００ダルトンのアルデヒド基当たりの当量を有する前記酸化多糖類；
ｂ）アームの少なくとも３つが少なくとも１つの一級アミン基で終結される少なくとも１つの水分散性多分枝状ポリエーテルアミンであって、約４５０〜約２００，０００ダルトンの数平均分子量を有する前記多分枝状ポリエーテルアミン；および
ｃ）式：
Ｒ１−（ＰＳ）−Ｒ２
の少なくとも１つのオリゴマー；
｛ここで：
（ｉ）ＰＳは、エチレンオキシドモノマーか、またはエチレンオキシドモノマーとプロピレンオキシドモノマーとの組合せを含む直鎖状ポリマーセグメントであって、前記エチレンオキシドモノマーは、前記ポリマーセグメントの少なくとも約５０重量％を構成し；
（ｉｉ）Ｒ１は、アルデヒド基と反応して少なくとも１つの可逆的共有結合を形成することができる少なくとも１つの求核基であり；
（ｉｉｉ）Ｒ２は、水性媒体中で（ａ）のみまたは（ｂ）のみのいずれかと混合されるとき、前記オリゴマーがゲル化を誘発しない、アルデヒド、一級アミン、二級アミン、またはＲ１と反応して共有結合を形成することができない少なくとも１つの官能基であり；
（ｉｖ）前記オリゴマーは、約２００〜約１０，０００ダルトンの重量平均分子量を有し；また
（ｖ）前記オリゴマーは水溶性である；｝
の反応生成物を含む組成物。
【請求項１５】
部位に
ａ）約１，０００〜約１，０００，０００ダルトンの重量平均分子量を有するアルデヒド基を含有する少なくとも１つの酸化多糖類であって、約６５〜約１５００ダルトンのアルデヒド基当たりの当量を有する前記酸化多糖類；
ｂ）アームの少なくとも３つが少なくとも１つの一級アミン基で終結される少なくとも１つの水分散性多分枝状ポリエーテルアミンであって、約４５０〜約２００，０００ダルトンの数平均分子量を有する前記多分枝状ポリエーテルアミン；および
ｃ）式：
Ｒ１−（ＰＳ）−Ｒ２
の少なくとも１つのオリゴマー；
｛ここで：
（ｉ）ＰＳは、エチレンオキシドモノマーか、またはエチレンオキシドモノマーとプロピレンオキシドモノマーとの組合せを含む直鎖状ポリマーセグメントであって、前記エチレンオキシドモノマーは、前記ポリマーセグメントの少なくとも約５０重量％を構成し；
（ｉｉ）Ｒ１は、アルデヒド基と反応して少なくとも１つの可逆的共有結合を形成することができる少なくとも１つの求核基であり；
（ｉｉｉ）Ｒ２は、水性媒体中で（ａ）のみまたは（ｂ）のみのいずれかと混合されるとき、前記オリゴマーがゲル化を誘発しない、アルデヒド、一級アミン、二級アミン、またはＲ１と反応して共有結合を形成することができない少なくとも１つの官能基であり；
（ｉｖ）前記オリゴマーは、約２００〜約１０，０００ダルトンの重量平均分子量を有し；また
（ｖ）前記オリゴマーは水溶性である；｝
を適用することを含み、
ここで（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）は、任意の順序で部位に適用されるか、または（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）は前もって混合され、生じた混合物が、その混合物が完全に硬化する前に部位に適用される、
生存生物の組織上の解剖学的部位にコーティングを適用する方法。
【請求項１６】
前記酸化多糖類が、第１の水溶液または分散の成分であり、前記水分散性多分枝状ポリエーテルアミンが第２の水溶液または分散の成分であり、前記オリゴマーが（ｉ）第１の水溶液または分散；（ｉｉ）第２の水溶液または分散；または（ｉｉｉ）第３の水溶液または分散；の少なくとも１つの成分である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記酸化多糖類が、デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、澱粉、寒天、セルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、プルラン、イヌリン、レバン、およびヒアルロン酸の酸化誘導体からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記水分散性多分枝状ポリエーテルアミンが、アミノ末端星状ポリエチレンオキシド類、アミノ末端樹枝状ポリエチレンオキシド類、アミノ末端櫛状ポリエチレンオキシド類、アミノ末端星状ポリプロピレンオキシド類、アミノ末端樹枝状ポリプロピレンオキシド類、アミノ末端櫛状ポリプロピレンオキシド類、アミノ末端星状ポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシドコポリマー類、アミノ末端樹枝状ポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシドコポリマー類、アミノ末端櫛状ポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシドコポリマー類、およびポリオキシアルキレントリアミン類からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
ＰＳが前記セグメントの両端のメチレン基で終結する直鎖状ポリマーセグメントであり、前記セグメントが、ポリエチレンオキシド、ポリエチレンオキシドおよびポリプロピレンオキシドのブロックコポリマーまたはランダムコポリマー、およびポリエチレンオキシドおよびポリプロピレンオキシドのトリブロックコポリマーからなる群から選択されるポリマーに由来する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
少なくとも１つの酸化多糖類（成分Ａ）および少なくとも１つの水分散性多分枝状ポリエーテルアミン（成分Ｂ）から形成されるハイドロゲルの分解時間を減少させる方法であって、前記アルデヒド基を含有する少なくとも１つの酸化多糖類は、約１，０００〜約１，０００，０００ダルトンの重量平均分子量および約６５〜約１５００ダルトンのアルデヒド基当たりの当量を有し、前記少なくとも１つの水分散性多分枝状ポリエーテルアミンは、そのアームの少なくとも３つが少なくとも１つの一級アミン基で終結され、前記多分枝状ポリエーテルアミンは約４５０〜約２００，０００ダルトンの数平均分子量を有し；前記方法は、成分Ａおよび成分Ｂを、水性媒体および式：
Ｒ１−（ＰＳ）−Ｒ２
の少なくとも１つのオリゴマー
｛ここで：
（ｉ）ＰＳは、エチレンオキシドモノマーか、またはエチレンオキシドモノマーとプロピレンオキシドモノマーとの組合せを含む直鎖状ポリマーセグメントであって、前記エチレンオキシドモノマーは、前記ポリマーセグメントの少なくとも約５０重量％を構成し；
（ｉｉ）Ｒ１は、アルデヒド基と反応して少なくとも１つの可逆的共有結合を形成することができる少なくとも１つの求核基であり；
（ｉｉｉ）Ｒ２は、水性媒体中で成分Ａのみまたは成分Ｂのみのいずれかと混合されるとき、前記オリゴマーがゲル化を誘発しない、アルデヒド、一級アミン、二級アミン、またはＲ１と反応して共有結合を形成することができない少なくとも１つの官能基であり；
（ｉｖ）前記オリゴマーは、約２００〜約１０，０００ダルトンの重量平均分子量を有し；また
（ｖ）前記オリゴマーは水溶性である；｝
の存在下で接触させるステップを含み、
ここで、前記方法において、所定の条件で生じたハイドロゲルの分解時間を、前記オリゴマーが存在しないことを除けば前記所定の条件で形成されるハイドロゲルの分解時間と比較して少なくとも約１０％減少させるのに十分な量でオリゴマーが使用される、
ハイドロゲルの分解時間を減少させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本願は、米国特許法第１１９条の下、米国仮特許出願番号第６１／１６７８７７号、第６１／１６７８８１号、および第６１／１６７８７９号（全て２００９年４月９日出願）、の優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は、医療用接着剤の分野に関する。より詳細には、本発明は、酸化多糖類を水分散性多分枝状ポリエーテルアミンと反応させることにより形成されるハイドロゲル組織接着剤であって、そのハイドロゲルはハイドロゲルの分解時間を減少させるオリゴマー添加物を含む、ハイドロゲル組織接着剤に関する。
【背景技術】
【０００３】
組織接着剤には、内部外科手技における縫合糸またはステープルを補完または代替する、創傷閉鎖、角膜への合成アンレーまたはインレーの接着、薬物送達用具、および術後癒着を防止するための抗接着バリヤーを含む、多くの潜在的医療用途がある。従来の組織接着剤は一般に、広範囲の接着用途に適さない。たとえば、シアノアクリレート系接着剤は局所創傷閉鎖に使用されてきたが、有毒な分解生成物の放出により、体内用途への使用が制限される。フィブリン系接着剤は緩速硬化性であり、不十分な機械強度を有し、またウイルス感染のリスクがある。さらに、フィブリン系接着剤は基礎組織に共有結合しない。
【０００４】
改良された接着性および凝集性を有し、また無毒である、数種類のハイドロゲル組織接着剤が開発されている（たとえばＳｅｈｌら、米国特許出願公開第２００３／０１１９９８５号明細書、およびＧｏｌｄｍａｎｎ、米国特許出願公開第２００５／０００２８９３号明細書を参照）。これらのハイドロゲルは一般に、求核基を有する成分を、第１の成分の求核基と反応して共有結合により架橋網目構造を形成することができる、求電子基を有する成分と反応させることによって形成される。しかし、これらのハイドロゲルは一般に膨潤し、余りにも速く溶け去るか、あるいは十分な粘着力または機械強度が欠けており、その結果、外科用接着剤としての有効性を低下させる。
【０００５】
Ｋｏｄｏｋｉａｎら（同時係属および共同所有の米国特許出願公開第２００６／００７８５３６号明細書）は、酸化多糖類を水分散性多分枝状ポリエーテルアミンと反応させることによって形成されるハイドロゲル組織接着剤を記述している。これらの接着剤は、改良された粘着性および凝集性を提供し、体温で容易に架橋し、初期に寸法安定性を維持し、急速に分解せず、そして細胞に対して無毒であり、また組織に対して非炎症性である。しかし、止血用シーラントとしての使用あるいは外傷または外科手術に起因する望ましくない組織−組織癒着を防止するための使用等の、ある用途では、速くゲル化し、優れた接着強さおよび凝集強さを有し、より急速に分解する組織接着剤が必要である。ゲル化時間の望ましくない増加なしに、ハイドロゲルの分解時間を減少させることは困難なこともある。
【０００６】
Ｆｉｇｕｌｙら（同時係属および共同所有の米国特許出願公開第１２／１４５７３７号明細書）は、水分散性多分枝状ポリエーテルアミンと反応してハイドロゲルを形成するための、酸化多糖類のゲル形成時間を延長する方法を記述している。本方法はまた、ハイドロゲルの分解時間も減少させる。本方法は、酸化多糖類または水分散性多分枝状ポリエーテルアミンの官能基と反応し、その結果、架橋に利用できる基の数を減少させる化学添加物を利用する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、速くゲル化し、優れた接着強さ、凝集強さを有し、従来のハイドロゲル接着剤よりも急速に分解するハイドロゲル組織接着剤の必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、酸化多糖類と水分散性多分枝状ポリエーテルアミンとを反応させることにより形成されるハイドロゲル組織接着剤であって、そのハイドロゲルが、ハイドロゲルの分解時間を減少させるオリゴマー添加物を含むハイドロゲル組織接着剤を提供することにより、上記必要に対処する。
【０００９】
したがって、一実施態様で、本発明は、
ａ）アルデヒド基を含有する少なくとも１つの酸化多糖類であって、約１，０００〜約１，０００，０００ダルトンの重量平均分子量を有し、また約６５〜約１５００ダルトンのアルデヒド基当たりの当量を有する上記酸化多糖類；
ｂ）アームの少なくとも３つが少なくとも１つの一級アミン基で終結される少なくとも１つの水分散性多分枝状ポリエーテルアミンであって、約４５０〜約２００，０００ダルトンの数平均分子量を有する上記多分枝状ポリエーテルアミン；および
ｃ）式：
Ｒ１−（ＰＳ）−Ｒ２
の少なくとも１つのオリゴマー
｛ここで：
（ｉ）ＰＳは、エチレンオキシドモノマーか、またはエチレンオキシドモノマーとプロピレンオキシドモノマーとの組合せを含む直鎖状ポリマーセグメントであって、上記エチレンオキシドモノマーは、上記ポリマーセグメントの少なくとも約５０重量％を構成し；
（ｉｉ）Ｒ１は、アルデヒド基と反応して少なくとも１つの可逆的共有結合を形成することができる少なくとも１つの求核基であり；
（ｉｉｉ）Ｒ２は、水性媒体中で（ａ）のみまたは（ｂ）のみのいずれかと混合されるとき、上記オリゴマーがゲル化を誘発しない、アルデヒド、一級アミン、二級アミン、またはＲ１と反応して共有結合を形成することができない少なくとも１つの官能基であり；
（ｉｖ）上記オリゴマーは、約２００〜約１０，０００ダルトンの重量平均分子量を有し；また
（ｖ）上記オリゴマーは水溶性である｝
を含むキットを提供する。
【００１０】
別の実施態様で、本発明は、
ａ）溶媒中で（ｉ）アルデヒド基を含有する少なくとも１つの酸化多糖類であって、約１，０００〜約１，０００，０００ダルトンの重量平均分子量を有し、また約６５〜約１５００ダルトンのアルデヒド基当たりの当量を有する上記酸化多糖類を、（ｉｉ）アームの少なくとも３つが、少なくとも１つの一級アミン基で終結される少なくとも１つの水分散性多分枝状ポリエーテルアミンであって、約４５０〜約２００，０００ダルトンの数平均分子量を有する上記多分枝状ポリエーテルアミンと、（ｉｉｉ）式：
Ｒ１−（ＰＳ）−Ｒ２
｛ここで：
（Ａ）ＰＳは、エチレンオキシドモノマーか、またはエチレンオキシドモノマーとプロピレンオキシドモノマーとの組合せを含む直鎖状ポリマーセグメントであって、上記ポリマーセグメントの少なくとも約５０重量％を構成し；
（Ｂ）Ｒ１は、アルデヒド基と反応して少なくとも１つの可逆的共有結合を形成することができる少なくとも１つの求核基であり；
（Ｃ）Ｒ２は、水性媒体中で（ｉ）のみまたは（ｉｉ）のみのいずれかと混合されるとき、上記オリゴマーがゲル化を誘発しない、アルデヒド、一級アミン、二級アミン、またはＲ１と反応して共有結合を形成することができない少なくとも１つの官能基であり；
（Ｄ）上記オリゴマーは、約２００〜約１０，０００ダルトンの重量平均分子量を有し；また
（Ｅ）上記オリゴマーは水溶性である｝
の少なくとも１つのオリゴマーとを混合してハイドロゲルを形成するステップ；
および
ｂ）上記溶媒の少なくとも一部を除去するために上記ハイドロゲルを処理して、乾燥ハイドロゲルを形成するステップ；
を含む方法で形成される乾燥ハイドロゲルを提供する。
【００１１】
別の実施態様で、本発明は
ａ）約１，０００〜約１，０００，０００ダルトンの重量平均分子量を有するアルデヒド基を含有する少なくとも１つの酸化多糖類であって、約６５〜約１５００ダルトンのアルデヒド基当たりの当量を有する酸化多糖類；
ｂ）アームの少なくとも３つが少なくとも１つの一級アミン基で終結される少なくとも１つの水分散性多分枝状ポリエーテルアミンであって、約４５０〜約２００，０００ダルトンの数平均分子量を有する上記多分枝状ポリエーテルアミン；および
ｃ）式：
Ｒ１−（ＰＳ）−Ｒ２
の少なくとも１つのオリゴマー；
｛ここで：
（ｉ）ＰＳは、エチレンオキシドモノマーか、またはエチレンオキシドモノマーとプロピレンオキシドモノマーとの組合せを含む直鎖状ポリマーセグメントであって、上記エチレンオキシドモノマーは、上記ポリマーセグメントの少なくとも約５０重量％を構成し；
（ｉｉ）Ｒ１は、アルデヒド基と反応して少なくとも１つの可逆的共有結合を形成することができる少なくとも１つの求核基であり；
（ｉｉｉ）Ｒ２は、水性媒体中で（ａ）のみまたは（ｂ）のみのいずれかと混合されるとき、上記オリゴマーがゲル化を誘発しない、アルデヒド、一級アミン、二級アミン、またはＲ１と反応して共有結合を形成することができない少なくとも１つの官能基であり；
（ｉｖ）上記オリゴマーは、約２００〜約１０，０００ダルトンの重量平均分子量を有し；また
（ｖ）上記オリゴマーは水溶性である｝
の反応生成物を含む組成物を提供する。
【００１２】
別の実施態様で、本発明は、
部位に
ａ）約１，０００〜約１，０００，０００ダルトンの重量平均分子量を有する、アルデヒド基を含有する少なくとも１つの酸化多糖類であって、約６５〜約１５００ダルトンのアルデヒド基当たりの当量を有する上記酸化多糖類；
ｂ）アームの少なくとも３つが少なくとも１つの一級アミン基で終結される少なくとも１つの水分散性多分枝状ポリエーテルアミンであって、約４５０〜約２００，０００ダルトンの数平均分子量を有する上記多分枝状ポリエーテルアミン；および
ｃ）式：
Ｒ１−（ＰＳ）−Ｒ２
の少なくとも１つのオリゴマー；
｛ここで：
（ｉ）ＰＳは、エチレンオキシドモノマーか、またはエチレンオキシドモノマーとプロピレンオキシドモノマーとの組合せを含む直鎖状ポリマーセグメントであって、上記エチレンオキシドモノマーは、上記ポリマーセグメントの少なくとも約５０重量％を構成し；
（ｉｉ）Ｒ１は、アルデヒド基と反応して少なくとも１つの可逆的共有結合を形成することができる少なくとも１つの求核基であり；
（ｉｉｉ）Ｒ２は、水性媒体中で（ａ）のみまたは（ｂ）のみのいずれかと混合されるとき、上記オリゴマーがゲル化を誘発しない、アルデヒド、一級アミン、二級アミン、またはＲ１と反応して共有結合を形成することができない少なくとも１つの官能基であり；
（ｉｖ）上記オリゴマーは、約２００〜約１０，０００ダルトンの重量平均分子量を有し；また
（ｖ）上記オリゴマーは水溶性である｝
を適用することを含み、
ここで、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）は、任意の順序で部位に適用するか、または（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）をもって混合され、生じた混合物を、その混合物が完全に硬化する前に部位に適用される、
生存生体の組織上の解剖学的部位にコーティングを適用する方法を提供する。
【００１３】
別の実施態様で、本発明は、少なくとも１つの酸化多糖類（成分Ａ）および少なくとも１つの水分散性多分枝状ポリエーテルアミン（成分Ｂ）から形成されるハイドロゲルの分解時間を減少させる方法であって、アルデヒド基を含有する上記少なくとも１つの酸化多糖類は、約１，０００〜約１，０００，０００ダルトンの重量平均分子量および約６５〜約１５００ダルトンのアルデヒド基当たりの当量を有し、上記少なくとも１つの水分散性多分枝状ポリエーテルアミンはそのアームの少なくとも３つが少なくとも１つの一級アミン基で終結され、上記多分枝状ポリエーテルアミンは約４５０〜約２００，０００ダルトンの数平均分子量を有し；上記方法は成分Ａおよび成分Ｂを、水性媒体および式：
Ｒ１−（ＰＳ）−Ｒ２
の少なくとも１つのオリゴマー
｛ここで：
ｉ）ＰＳは、エチレンオキシドモノマーか、またはエチレンオキシドモノマーとプロピレンオキシドモノマーとの組合せを含む直鎖状ポリマーセグメントであって、上記エチレンオキシドモノマーは、上記ポリマーセグメントの少なくとも約５０重量％を構成し；
（ｉｉ）Ｒ１は、アルデヒド基と反応して少なくとも１つの可逆的共有結合を形成することができる少なくとも１つの求核基であり；
（ｉｉｉ）Ｒ２は、水性媒体中で成分Ａのみまたは成分Ｂのみのいずれかと混合されるとき、上記オリゴマーがゲル化を誘発しない、アルデヒド、一級アミン、二級アミン、またはＲ１と反応して共有結合を形成することができない少なくとも１つの官能基であり；
（ｉｖ）上記オリゴマーは、約２００〜約１０，０００ダルトンの重量平均分子量を有し；また
（ｖ）上記オリゴマーは水溶性である｝
の存在下で接触させるステップを含み、
ここで、上記方法において、所定の条件で生じたハイドロゲルの分解時間を、上記オリゴマーが存在しないことを除けば上記所定の条件で形成されるハイドロゲルの分解時間と比較して少なくとも約１０％減少させるのに十分な量でオリゴマーが使用される、方法を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
上記および本発明の記述を通して使用されるとき、下記の用語は他に指示がない限り、以下の通りに定義されるものとする：
【００１５】
用語「酸化多糖類」は、アルデヒド基を分子に導入するために酸化剤と反応させておいた多糖を指す。
【００１６】
用語「アルデヒド基当たりの当量」は、分子に導入されたアルデヒド基の数で割った酸化多糖類の分子量を指す。
【００１７】
用語「水分散性多分枝状ポリエーテルアミン」は、中心構造から出ている、直鎖状または分枝状であってもよく、単一原子、コア分子、またはポリマー骨格であってもよい、分枝（「アーム」）の少なくとも３つが少なくとも１つの一級アミン基で終結されている、３つ以上のポリマー鎖（「アーム」）を有するポリエーテルを指す。水分散性多分枝状ポリエーテルアミンは、水溶性であるかまたは、水に分散させて、水溶液または水性分散で第２の反応物と反応できるコロイド懸濁液を形成することができる。
【００１８】
本明細書で使用されるとき、用語「分散」は、水性媒体中で第２の反応物と反応できるコロイド懸濁液を指す。
【００１９】
用語「ポリエーテル」は反復単位［−Ｏ−Ｒ］−を有し、Ｒは２〜５個の炭素原子を有するヒドロカルビレン基である、ポリマーを指す。ポリエーテルはまた、様々なＲ基を有する様々な反復単位を含むランダムコポリマーまたはブロックコポリマーであってもよい。
【００２０】
用語「ヒドロカルビレン基」は、炭化水素由来の２つの異なる炭素原子からそれぞれ１つずつ、２つの水素原子を除去することにより形成される二価基を指す。
【００２１】
用語「分枝状ポリエーテル」は、星状ポリエーテル、樹枝状ポリエーテル、櫛状ポリエーテル、および超分枝状ポリエーテルを含む、１つまたは複数の分岐点（「アーム」）を有するポリエーテルを指す。
【００２２】
用語「樹枝状ポリエーテル」は、樹状構造を有する高度に分岐したポリエーテルを指す。
【００２３】
用語「櫛状ポリエーテル」は、それぞれから直鎖状アームが出ている多数の三官能性分岐点がある主鎖を有するポリエーテルを指す。
【００２４】
用語「星状ポリエーテル」は、単一原子または化学基であってもよい、中心分岐点を有し、そこから直鎖状アームが出ている、ポリエーテルを指す。
【００２５】
用語「超分枝状ポリエーテル」は、樹枝状ポリエーテルよりも少ない分枝および規則性が低い分岐を有する、高度に分岐したポリエーテルを指す。
【００２６】
用語「一級アミン」は、２つの遊離水素を有する中性アミノ基を指す。アミノ基は、一級、二級または三級炭素に結合していてもよい。
【００２７】
用語「多官能性アミン」は、少なくとも２つの官能基を含み、その少なくとも１つは一級アミン基である、化学物質を指す。
【００２８】
用語「架橋」は、２つの異なるポリマー鎖間に付いて連結する、原子類の結合または鎖を指す。
【００２９】
用語「架橋密度」は、本明細書では、架橋連結部位間の鎖原子の平均数の逆数として定義される。
【００３０】
用語「重量％（％ｂｙ  ｗｅｉｇｈｔ）」は、本明細書では「ｗｔ％」とも表され、他に特に規定がない限り、溶液または分散の総重量と比較した重量パーセントを指す。
【００３１】
用語「求核基」は、本明細書で使用されるとき、電子を供与することにより化学結合を形成する、分子内の原子または原子群を指す、すなわち、求核基は電子供与基である。
【００３２】
用語「官能基」は、本明細書で使用されるとき、特徴的な化学反応を受ける分子内の原子または原子群を指す。
【００３３】
用語「可逆的共有結合」は、本明細書で使用されるとき、可逆的反応を受ける共有結合を指す。
【００３４】
用語「可逆的反応」は、本明細書で使用されるとき、物理的条件を変えることにより、いずれの方向（すなわち、前方または逆方向）にも進ませることができる化学反応を指す。
【００３５】
用語「共有結合」は、本明細書で使用されるとき、原子間で電子対を共有することを特徴とする化学結合の一種を指す。
【００３６】
用語「水溶性」は、本明細書で使用されるとき、ある物質が少なくとも１重量％の濃度で水に溶解でき、また温度１８〜２５℃かつ大気圧（すなわち、７４０〜７６０ｍｍ水銀柱）で、溶液の状態でいることを意味する。
【００３７】
用語「解剖学的部位」は、ヒトまたは動物の任意の体外部分または体内部分を指す。
【００３８】
用語「組織」は、ヒトまたは動物における、生存しているものと死んでいるものの両方の、生物組織を指す。
【００３９】
用語「ハイドロゲル」は、共有結合性架橋によって結合している巨大分子の三次元網目構造からなり、かなりの量の水を吸収して弾性ゲルを形成することができる、水膨張性ポリマーマトリクスを指す。
【００４０】
用語「乾燥ハイドロゲル」は、中に含まれる溶媒の少なくとも一部を除去するために処理されたハイドロゲルを指す。好ましくは、溶媒の実質的に全部がハイドロゲルから除去される。
【００４１】
用語「ＰＥＧ］は、本明細書で使用されるとき、ポリエチレングリコールを指す。
【００４２】
用語「Ｍｗ」は、本明細書で使用されるとき、重量平均分子量を指す。
【００４３】
用語「Ｍｎ」は、本明細書で使用されるとき、数平均分子量を指す。
【００４４】
用語「医療用途」は、ヒトおよび動物に関連した医療用途を指す。
【００４５】
使用した略語の意味は以下の通りである：「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｄ」は日を意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｃｍ」はセンチメートルを意味し、「ｍｍ」はミリメートルを意味し、「μｍ」はマイクロメートルを意味し、「ｍｏｌ」はモルを意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「ｍｇ」はミリグラムを意味し、「重量％」は重量によるパーセントを意味し、「ｍｏｌ％」はモルパーセントを意味し、「Ｖｏｌ」は体積を意味し、「ｖ／ｖ」体積当たりの体積を意味し、「Ｄａ」はダルトンを意味し、「ｋＤａ」はキロダルトンを意味し、記号「１０Ｋ」は、ポリマー分子が、１０キロダルトンの数平均分子量を持つことを意味し、「Ｍ」はモル濃度を意味し、「Ｐａ」はパスカルを意味し、「ｋＰａ」はキロパスカルを意味し、「ｍＴｏｒｒ」はミリトルを意味し、「１Ｈ  ＮＭＲ」は、プロトン核磁気共鳴分光法を意味し、「ｐｐｍ」は百万分率を意味し、「ＰＢＳ」はリン酸緩衝生理食塩水を意味し、「ＲＴ」は室温を意味し、「ｒｐｍ」は１分当たりの回転数を意味し、「ｐｓｉ」は１平方インチ当たりのポンドを意味する。
【００４６】
「Ａｌｄｒｉｃｈ」への言及または「Ｓｉｇｍａ」への言及は、上記化学薬品または成分をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手したことを意味する。
【００４７】
酸化多糖類を水分散性多分枝状ポリエーテルアミンと反応させることにより形成されるハイドロゲル組織接着剤であって、そのハイドロゲルが、ハイドロゲルの分解時間を減少させるオリゴマー添加物を含む、ハイドロゲル組織接着剤を本明細書に開示する。ハイドロゲルは、止血用シーラントとしての使用、あるいは外傷または外科手術に起因する望ましくない組織−組織癒着を防止するための使用を含むがその限りではない、より速やかな分解を必要とする医療用途用の組織接着剤またはシーラントとして有用であろう。
【００４８】
酸化多糖類
本発明で有用な酸化多糖類としては、デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、澱粉、寒天、セルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、プルラン、イヌリン、レバン、およびヒアルロン酸の酸化誘導体などが挙げられるが、その限りではない。出発多糖類は、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）等の供給者から市販されている。一般に、多糖類は、異なる分子量の分布を有する不均質混合物であり、当該技術分野で周知の通り、平均分子量、たとえば、重量平均分子量（Ｍｗ）、または数平均分子量（Ｍｎ）を特徴とする。好適な酸化多糖類は、約１，０００〜約１，０００，０００ダルトン、より詳細には約３，０００〜約２５０，０００ダルトン、より詳細には約５，０００〜約１００，０００ダルトン、そしてより詳細には約１０，０００〜約６０，０００ダルトンの重量平均分子量を有する。一実施態様では、酸化多糖類は、本明細書でデキストランアルデヒドとも呼ばれる、酸化デキストランである。
【００４９】
酸化多糖類は、過ヨウ素酸塩類、次亜塩素酸塩類、オゾン、過酸化物、ヒドロペルオキシド類、過硫酸塩類、および過炭酸塩類を含むがその限りではない、任意の好適な酸化剤を使用し、多糖を酸化してアルデヒド基を導入することにより調製することができる。たとえば、多糖は、Ｍｏら（Ｊ．Ｂｉｏｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｅｄｎ．１１:３４１−３５１，２０００）により記述されている通り、過ヨウ素酸ナトリウムとの反応により酸化することが可能である。多糖を様々な量の過ヨウ素酸塩と反応させて、酸化の程度が異なる、したがってアルデヒド基の量が異なる、多糖類を生じさせることが可能である。さらに、酸化多糖類は、Ｃｏｈｅｎら（同時係属および共同所有の国際特許出願公開第２００８／１３３８４７号パンフレット）により記述されている方法で調製することが可能である。酸化多糖類を製造するその方法は、本明細書後段の実施例で詳述する通り、過ヨウ素酸塩を用いた多糖の酸化により形成される酸化多糖類を精製するための沈殿ステップと分離ステップの組合せを含み、非常に低レベルのヨウ素含有種を含む酸化多糖類を提供する。本明細書で酸化転換とも呼ばれる、酸化多糖類の酸化の程度は、当該技術分野で周知の方法を使用して測定することができる。たとえば、酸化多糖類の酸化の程度は、Ｈｏｆｒｅｉｔｅｒら（Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．２７：１９３０−１９３１，１９５５）により記述されている方法を使用して測定することが可能である。その方法では、特定の反応条件下で、酸化多糖類中のジアルデヒド１モル当たりのアルカリ消費量がｐＨ滴定で決定される。あるいは、酸化多糖類の酸化の程度は、本明細書後段の実施例に詳述されている通り、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法を使用して決定してもよい。一実施態様では、酸化多糖類のアルデヒド基当たりの当量は、約６５〜約１５００ダルトン、より詳細には約９０〜約１５００ダルトンである。
【００５０】
水分散性多分枝状ポリエーテルアミン類
本明細書で定義されるとき、水分散性多分枝状ポリエーテルアミンは、反復単位［−Ｏ−Ｒ］−を有する水分散性ポリエーテルであり、ここでＲは２〜５個の炭素原子を有するヒドロカルビレン基である。一般に、本明細書で使用するのに好適な多分枝状ポリエーテルアミンは、約４５０〜約２００，０００ダルトン、より詳細には、約２，０００〜約４０，０００ダルトン、そしてより詳細には約２，０００〜約１０，０００ダルトンの数平均分子量を有する。好適な水分散性多分枝状ポリエーテルアミンとしては、アミノ末端星状ポリエチレンオキシド類、アミノ末端樹枝状ポリエチレンオキシド類、アミノ末端櫛状ポリエチレンオキシド類、アミノ末端星状ポリプロピレンオキシド類、アミノ末端樹枝状ポリプロピレンオキシド類、アミノ末端櫛状ポリプロピレンオキシド類、アミノ末端星状ポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシドコポリマー類、アミノ末端樹枝状ポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシドコポリマー類、アミノ末端櫛状ポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシドコポリマー類、およびＨｕｎｔｓｍａｎ  ＬＬＣ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）によりＪｅｆｆａｍｉｎｅ（登録商標）トリアミンの商品名で販売されているポリオキシアルキレントリアミン類などが挙げられるが、その限りではない。星状ポリエチレンオキシドアミン類の例としては、様々な多分枝状ポリエチレングリコールアミン類、および一級アミンで終結される、３、４、６、または８アームを有する星状ポリエチレングリコール類（本明細書では、それぞれ、３、４、６、または８アーム星状ＰＥＧアミンと表される）などが挙げられるが、その限りではない。好適なＪｅｆｆａｍｉｎｅ（登録商標）トリアミン類の例としては、Ｊｅｆｆａｍｉｎｅ（登録商標）Ｔ−４０３（ＣＡＳ  Ｎｏ．３９４２３−５１−３）、Ｊｅｆｆａｍｉｎｅ（登録商標）Ｔ−３０００（ＣＡＳ  Ｎｏ．６４８５２−２２−８）、およびＪｅｆｆａｍｉｎｅ（登録商標）Ｔ−５０００（ＣＡＳ  Ｎｏ．６４８５２−２２−８）などが挙げられるが、その限りではない。一実施態様では、水分散性多分枝状ポリエーテルアミンは、一級アミン基で終結される８つのアームを持ち、また約１０，０００ダルトンの数平均分子量を有する、８アームポリエチレングリコールである。
【００５１】
多分枝状ポリエーテルアミン類は、上述の通り市販されているか、または当該技術分野で周知の方法を使用して調製することが可能である。たとえば、アームの少なくとも３つが一級アミン基で終結されている、多分枝状ポリエチレングリコール類は、Ｂｕｃｋｍａｎｎら（Ｍａｋｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．１８２：１３７９−１３８４，１９８１）により記述されている方法を使用して、多分枝状ポリエチレングリコール（たとえば、Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ；ＳｕｎＢｉｏ，Ｉｎｃ．，（Ａｎｙａｎｇ  Ｃｉｔｙ，Ｓｏｕｔｈ  Ｋｏｒｅａ）；ＮＯＦ  Ｃｏｒｐ．，（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）；またはＪｅｎＫｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＵＳＡ，（Ａｌｌｅｎ，ＴＸ）等の会社から入手可能な３、４、６、および８アーム星状ポリエチレングリコール）上にアミン末端を付けることにより調製することが可能である。その方法では、多分枝状ポリエチレングリコールを臭化チオニルと反応させてヒドロキシル基を臭素に転換し、これを次には１００℃でアンモニアとの反応によってアミン類に転換する。本方法は、他の多分枝状ポリエーテルアミン類の調製に広く応用できる。さらに、多分枝状ポリエーテルアミンは、Ｃｈｅｎａｕｌｔ（同時係属および共同所有の米国特許出願公開第２００７／０２４９８７０号明細書）によって記述されている方法を使用して、多分枝状ポリオール類から調製することが可能である。その方法では、多分枝状ポリエーテルを塩化チオニルと反応させてヒドロキシル基を塩素基に転換し、これを次にはアンモニア水または無水アンモニアとの反応によってアミンに転換する。多分枝状ポリエーテルアミン類の調製に使用することが可能な他の方法は、Ｍｅｒｒｉｌｌらにより米国特許第５，８３０，９８６号明細書に、またＣｈａｎｇらにより国際公開第９７／３０１０３号パンフレットに、記述されている。
【００５２】
本明細書で使用するのに好適な水分散性多分枝状ポリエーテルアミン類はまた、Ａｒｔｈｕｒ（同時係属および共同所有の国際特許出願公開第２００８／０６６７８７号パンフレット）によって記述されている通り、多アーム分枝状末端ポリエーテルアミンであってもよい。多アーム分枝状末端ポリエーテルアミン類は、ポリマーアームの各末端に２つまたは３つの一級アミン基を有する分枝状ポリマーである。官能基の多様性は、所与の鎖端における反応の統計学的確率を高め、分枝状分子のポリマー網目構造へのより効率よい組み込みを可能にする。分枝状末端ポリエーテルアミン類の調製に使用される出発材料は、櫛状ポリエーテルポリオール類および星状ポリエーテルポリオール類を含むがその限りではない多分枝状ポリエーテルポリオール類であってもよい。多アーム分枝状末端ポリエーテルアミン類は、当該技術分野で周知の方法を使用して、ヒドロキシル基との反応により多数のアミン基を多分枝状ポリエーテルポリオールの末端に付けることにより調製することができる。たとえば、ポリマーアームの各末端上に２つのアミン官能基を有する分枝状末端ポリエーテルアミン類は、トルエン等の好適な溶媒中で、上記の出発材料を塩化チオニルと反応させることによって塩化物誘導体を生じさせ、続いてこれをトリス（２−アミノエチル）アミンと反応させて、ポリマーアームの末端に２つの一級アミン基を有する多アーム分枝状末端ポリエーテルアミンを生じさせることにより、調製することができる。
【００５３】
水分散性多分枝状ポリエーテルアミンは一般に、アーム長の分布、および時には様々なアーム数をもつ種の分布を有する、幾らか不均質混合物であることを認識すべきである。多分枝状ポリエーテルアミンが様々なアーム数を有する種の分布を有するとき、その分布における平均アーム数に基づいて表すことができる。たとえば、一実施態様では、多分枝状ポリエーテルアミンは８アーム星状ＰＥＧアミンであって、一部は８未満のアームを有し、また一部は９以上のアームを有するが、混合物中の多分枝状星状ＰＥＧアミン類は平均８つのアームを有する、多分枝状星状ＰＥＧアミン類の混合物を含む。それ故、用語「８アーム」、「６アーム」、「４アーム」および「３アーム」は、多分枝状ポリエーテルアミン類に言及するために本明細書で使用されるとき、アーム長の分布、時には様々なアーム数を持つ種の分布、を有する不均質混合物を指すと解釈すべきであり、その場合、列挙されるアーム数は混合物中の平均アーム数を指す。
【００５４】
オリゴマー添加物
オリゴマー添加物は、酸化多糖類と水分散性多分枝状ポリエーテルアミンとの反応の結果として生じたハイドロゲルの分解時間を減少させるのに役立ち、使用濃度によって、ハイドロゲルを形成するゲル化速度を減少させることもあり減少させないこともある。好適なオリゴマー添加物は一般式：
Ｒ１−（ＰＳ）−Ｒ２    （１）
を有し、ここで：ＰＳはエチレンオキシドモノマーか、またはエチレンオキシドモノマーとプロピレンオキシドモノマーとの組合せを含む直鎖状ポリマーセグメントであり、そのエチレンオキシドモノマー類は、ポリマーセグメントの少なくとも約５０重量％を構成し、より詳細には少なくとも約６０重量％、より詳細には少なくとも約７０重量％、より詳細には少なくとも約８０重量％、より詳細には少なくとも約９０重量％、そしてより詳細にはポリマーセグメントの１００重量％を構成する。ＰＳは、エチレンオキシドおよびプロピレンオキシドのランダムコポリマーまたはブロックコポリマーを含んでもよい。ポリマーセグメントは、下記のような、Ｒ１およびＲ２をポリマーセグメントの末端に付けるためのリンカーも含んでもよい。一実施態様では、ＰＳはセグメントの両端のメチレン基で終結する直鎖状ポリマーセグメントであり；セグメントは、ポリエチレンオキシド、ポリエチレンオキシドおよびポリプロピレンオキシドのブロックコポリマーまたはランダムコポリマー、およびポリエチレンオキシドおよびポリプロピレンオキシドのトリブロックコポリマーからなる群から選択されるポリマーに由来する。本明細書で使用されるとき、ポリマーセグメントに言及するときの「ポリマーに由来する」は、ポリマーセグメントが、ポリマーの末端基（たとえば、ヒドロキシル基）を含まない、したがって、ポリマーセグメントの両端がメチレン基で終結している、ポリマーの構造を有することを意味する。
【００５５】
Ｒ１は、アルデヒド基と反応して少なくとも１つの可逆的共有結合を形成することができる少なくとも１つの求核基である。好適なＲ１基としては、一級アミン、二級アミン、およびカルボキシヒドラジドなどが挙げられるが、その限りではない。Ｒ２は、水性媒体中で酸化多糖類のみか、または水分散性多分枝状ポリエーテルアミンのみのいずれかと混合する（すなわち、オリゴマーは架橋剤として機能しない）とき、上記オリゴマーがゲル化を含まないように、アルデヒド、一級アミン、二級アミン、またはＲ１と反応して共有結合を形成することができない、少なくとも１つの官能基である。好適なＲ２基としては、ヒドロキシ、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、およびフェノキシなどが挙げられるが、その限りではない。好適なオリゴマーは、約２００〜約１０，０００ダルトン、より詳細には約３５０〜約５，０００ダルトン、そしてより詳細には約３５０〜約２，０００ダルトンの重量平均分子量を有する。オリゴマーは水溶性である。
【００５６】
好適なオリゴマーは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）等の会社から市販されているか、または当該技術分野で周知の方法を使用して合成することができる。たとえば、メトキシＰＥＧアミンは、本明細書後段の実施例に詳述されている通り、好適な分子量のメトキシＰＥＧアルコール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能）をメシル化し、続いてメシル化中間体をアミノ化することによって調製できる。さらに、ポリマーセグメントの両端の様々な連結基を使用して、Ｒ１およびＲ２をポリマーセグメントに付けることが可能である。連結基の非限定的な例としては、Ｓ−Ｒ２−ＣＨ２、およびＮＨ−Ｒ２−ＣＨ２などがあり、ここでＲ２は、１〜５個の炭素原子を有するアルキレン基である。たとえば、好適な分子量のメトキシＰＥＧアルコールは、トリペンチルアミン等の塩基の存在下、ジクロロメタン等の好適な溶媒中でメタンスルホニルクロリドと反応させてメシラート誘導体を形成し、続いてこれをエチレンジアミン等のジアミンと反応させ、ポリマーセグメントの一端にあるリンカーＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２を介してＲ１（一級アミン基）が付いているオリゴマー（すなわち、ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｒ１）を形成することができる。
【００５７】
一実施態様では、オリゴマーは、ＰＳがポリエチレンオキシドに由来する直鎖状ポリマーセグメントであり、Ｒ１が一級アミン基であり、Ｒ２がメトキシ基である、メトキシポリエチレングリコールアミンである。
【００５８】
一実施態様では、アルデヒド基を含有する酸化多糖類は酸化デキストランであり、水分散性多分枝状ポリエーテルアミンは多分枝状ポリエチレングリコールアミンであり、オリゴマーは、ＰＳがポリエチレンオキシドに由来する直鎖状ポリマーセグメントあり、Ｒ１が一級アミンであり、Ｒ２がメトキシである、メトキシポリエチレングリコールアミンである。
【００５９】
ハイドロゲル組織接着剤を使用する方法
本明細書に開示のハイドロゲル組織接着剤は、様々な形で使用することが可能である。一実施態様では、アルデヒド基を含有する酸化多糖類、水分散性多分枝状ポリエーテルアミン、およびオリゴマー添加物が、水溶液または分散の成分として使用される。酸化多糖類を含む水溶液または分散（本明細書では、「第１の水溶液または分散」と呼ぶ）を調製するために、少なくとも１つの酸化多糖類を水に加えて、溶液または分散の総重量と比較して約５重量％〜約４０重量％、より詳細には約５重量％〜約３０重量％、そしてより詳細には約１０重量％〜約３０重量％の濃度を生じさせる。さらに、異なる重量平均分子量、異なる酸化程度、または異なる重量平均分子量と異なる酸化程度の両方を有する少なくとも２つの異なる酸化多糖類の混合物を使用してもよい。酸化多糖類の混合物が使用される場合、酸化多糖類の総濃度は、溶液または分散の総重量と比較して約５重量％〜約４０重量％、より詳細には約５重量％〜約３０重量％、そしてより詳細には約１０重量％〜約３０重量％である。
【００６０】
同様に、水分散性多分枝状ポリエーテルアミンを含む水溶液または分散（本明細書では「第２の水溶液または分散」と呼ぶ）を調製するために、少なくとも１つの水分散性多分枝状ポリエーテルアミンを水に加えて、溶液または分散の総重量と比較して約５重量％〜約７０重量％、より詳細には約２０重量％〜約５０重量％の濃度を生じさせる。使用すべき最適濃度は、所期の用途および第１の水溶液または分散で使用される酸化多糖類の濃度によって異なる。さらに、様々な数平均分子量、様々なアーム数、または様々な数平均分子量および様々なアーム数の両方を有する様々な水分散性多分枝状ポリエーテルアミン類の混合物を使用してもよい。水分散性多分枝状ポリエーテルアミン類の混合物を使用する場合、多分枝状ポリエーテルアミン類の総濃度は、溶液または分散の総重量と比較して約５重量％〜約７０重量％、より詳細には約２０重量％〜約５０重量％である。
【００６１】
上述のような、少なくとも１つのオリゴマー添加物の有効量を、下記の溶液または分散の少なくとも１つに加える：酸化多糖類を含む水溶液または分散（すなわち、第１の水溶液または分散）、水分散性多分枝状ポリエーテルアミンを含む水溶液または分散（すなわち、第２の水溶液または分散）、または第３の水溶液または分散。オリゴマー添加物は、本明細書後段の実施例に示す通り、酸化多糖類を含む水溶液または分散（すなわち、第１の水溶液または分散）に加えたとき、ハイドロゲルの分解時間に対して最大の効果を有する。さらに、本明細書後段の実施例に示す通り、本オリゴマーは、第１の水溶液または分散の調製中に添加されたとき、酸化多糖類の溶解速度を高める。
【００６２】
オリゴマー添加物を含有する溶液または分散は、幾つもの方法で調製することが可能である。たとえば、本オリゴマーを、上述の通りに調製された酸化多糖類を含有する第１の水溶液または分散に添加してもよく、または上述の通りに調製された水分散性多分枝状ポリエーテルアミンを含有する第２の水溶液または分散に添加してもよい。あるいは、オリゴマーを先ず水に溶解し、続いて酸化多糖類または多分枝状ポリエーテルアミンを加えてもよい。さらにオリゴマーを含有する水溶液または分散を、第１または第２の水溶液または分散のいずれかと合併してもよい。本オリゴマーの有効量は、所望の分解時間をハイドロゲルに提供するのに十分な任意の量である。概して、オリゴマーの使用量が多いほど、ハイドロゲルの分解時間の減少に対する効果は大きい。低負荷オリゴマーでは、すなわち、アルデヒド−反応基（Ｒ１）が、酸化多糖類上のアルデヒドの総モル数と比較して約５モルパーセント以下を示す場合、オリゴマーは、ハイドロゲルを形成するためのゲル化時間または他のハイドロゲル特性に影響を及ぼさずに分解時間を減少させる。高負荷オリゴマーでは（すなわち、アルデヒド−反応基（Ｒ１）が、酸化多糖類上のアルデヒドの総モル数と比較して５モルパーセント超を示す場合）、オリゴマーはゲル化を遅らせる上に分解時間を減少させる。所望の分解時間を達成するために使用すべきオリゴマーの量は、ルーチンの実験を使用して当業者が決定できる。
【００６３】
一実施態様では、オリゴマー添加物の有効量は、水溶液または分散、具体的には、第１の水溶液または分散、第２の水溶液または分散、または第３の水溶液または分散の、総重量と比較して、約０．２５重量％〜約３０重量％、より詳細には約０．５重量％〜約３０重量％，そしてより詳細には約０．７５重量％〜約２０重量％である。
【００６４】
一実施態様では、使用されるオリゴマーの量は、所定の条件で、オリゴマーが存在しないこと以外は同条件で形成されるハイドロゲルの分解時間と比較して、少なくとも約１０％の分解時間の減少を提供するのに十分である。一連の所定の条件について、生じたハイドロゲルの分解時間は、当該技術分野で周知の方法を使用して測定することができる。たとえば、本明細書後段の実施例に記載の通りに、ハイドロゲルが形成された後、指定された温度および撹拌速度で振盪しながら水性媒体中でインキュベートし、ハイドロゲルが溶解するのに要する時間を測定することができる。
【００６５】
生存組織で使用する場合、第１の水溶液または分散および第２の水溶液または分散を滅菌して感染を防止することが好ましい。成分が反応して有効なハイドロゲルを形成する能力に悪影響を及ぼさない当該技術分野で周知の任意の好適な滅菌方法を使用することが可能であり、電子ビーム照射、ガンマ照射、エチレンオキシド滅菌、または０．２μｍ細孔膜を通す限外濾過などが挙げられるが、その限りではない。オリゴマーが第３の水溶液または分散に含まれる場合、その溶液または分散は、上述の方法を使用して滅菌することもできる。
【００６６】
第１の水溶液または分散、第２の水溶液または分散、および／または第３の水溶液または分散（使用するのであれば）は、所期の用途に応じて、様々な添加物をさらに含んでもよい。好ましくは、添加物は、ハイドロゲルを形成するための有効なゲル化を妨げない。使用される添加物の量は、個々の用途によって異なり、またルーチンの実験を使用して、当業者により容易に決定され得る。たとえば、第１の水溶液または分散、第２の水溶液または分散、および／または第３の水溶液または分散は、ｐＨ調節剤、抗菌薬、着色剤、界面活性剤、医薬品および治療薬から選択される少なくとも１つの添加物を含んでもよい。
【００６７】
第１の水溶液または分散、第２の水溶液または分散、および／または第３の水溶液または分散には、溶液または分散のｐＨを調整するために、少なくとも１つのｐＨ調節剤が含まれてもよい。好適なｐＨ調節剤は、当該技術分野で周知である。ｐＨ調節剤は、酸性または塩基性の化合物であってもよい。酸性ｐＨ調節剤の例としては、カルボン酸類、無機酸類、およびスルホン酸類などが挙げられるが、その限りではない。塩基性ｐＨ調節剤の例としては、水酸化物類、アルコキシド類、一級アミンおよび二級アミン以外の窒素含有化合物、ならびに塩基性の炭酸塩類およびリン酸塩類などが挙げられるが、その限りではない。
【００６８】
第１の水溶液または分散、第２の水溶液または分散、および／または第３の水溶液または分散には、少なくとも１つの抗菌薬が含まれてもよい。好適な抗菌性保存剤は、当該技術分野で周知である。好適な抗菌薬の例としては、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、およびブチルパラベン等のアルキルパラベン類、；トリクロサン；クロルヘキシジン；クレゾール；クロロクレゾール；ハイドロキノン；安息香酸ナトリウム；および安息香酸カリウムなどが挙げられるが、その限りではない。
【００６９】
第１の水溶液または分散、第２の水溶液または分散、および／または第３の水溶液または分散には、溶液または分散の可視性を高めるために、少なくとも１つの着色剤が含まれてもよい。好適な着色剤は、染料、顔料、および天然着色料を含む。好適な着色剤の例としては、ＦＤ＆Ｃ着色剤およびＤ＆Ｃ着色剤、たとえばＦＤ＆Ｃ  Ｖｉｏｌｅｔ  Ｎｏ．２、ＦＤ＆Ｃ  Ｂｌｕｅ  Ｎｏ．１、Ｄ＆Ｃ  Ｇｒｅｅｎ  Ｎｏ．６、Ｄ＆Ｃ  Ｇｒｅｅｎ  Ｎｏ．５、Ｄ＆Ｃ  Ｖｉｏｌｅｔ  Ｎｏ．２等；および天然着色量、たとえばビート根赤、カンタキサンチン、クロロフィル、エオシン、サフラン、およびカルミンなどが挙げられるが、その限りではない。
【００７０】
第１の水溶液または分散、第２の水溶液または分散、および／または第３の水溶液または分散には、少なくとも１つの界面活性剤が含まれてもよい。界面活性剤は、本明細書で使用されるとき、水の表面張力を下げる化合物を指す。界面活性剤は、ラウリル硫酸ナトリウム等のイオン性界面活性剤であってもよく、またはポリオキシエチレンエーテル類、ポリオキシエチレンエステル類、およびポリオキシエチレンソルビタン等の中性界面活性剤であってもよい。
【００７１】
さらに、第１の水溶液または分散、第２の水溶液または分散、および／または第３の水溶液または分散には、少なくとも１つの医薬品または治療薬が含まれてもよい。好適な薬剤および治療薬は、当該技術分野で周知である（たとえば、米国薬局方（ＵＳＰ）、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（Ｔｈｏｍｓｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）、Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １８ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｒｋ  Ｈ．Ｂｅｅｒｓ  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔ  Ｂｅｒｋｏｗ（ｅｄｓ．），Ｍｅｒｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ，２００６；または動物の場合にはＴｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，９ｔｈ  ｅｄ．，Ｋａｈｎ，Ｃ．Ａ．（ｅｄ．），Ｍｅｒｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ，２００５を参照されたい）。非限定的な例としては、消炎剤、たとえば、プレドニゾン、デキサメタゾン、ブデソニド等のグルココルチコイド類；インドメタシン、酢酸サリチル酸、イブプロフェン、スリンダク、ピロキシカム、およびナプロキセン等の非ステロイド性消炎剤；組織プラスミノゲン活性化剤およびストレプトキナーゼ等の線維素溶解薬；へパリン、ヒルジン、アンクロッド、ジクマロール、シンクマール（ｓｉｎｃｕｍａｒ）、イロプロスト、Ｌ−アルギニン、ジピラミドールおよび他の血小板機能阻害薬等の抗凝血薬；抗体類；核酸類；ペプチド類；ホルモン類；成長因子類；サイトカイン類；ケモカイン類；凝血因子類；内因性凝固インヒビター；抗菌薬；抗ウイルス薬；抗真菌薬；抗癌剤；細胞接着阻害薬；治癒促進剤；ワクチン類；トロンビン、フィブリノゲン、ホモシステイン、およびエストラムシチン等の血栓形成薬；硫酸バリウムおよび金粒子等の放射線不透過性化合物および放射標識；などが挙げられるが、その限りではない。
【００７２】
さらに、水分散性多分枝状ポリエーテルアミンを含む第２の水溶液または分散には、他の有益な特性、たとえば、疎水性または変更された架橋密度等を提供するために、１つまたは複数の一級アミン基を有する少なくとも１つの他の多官能性アミンが含まれてもよい。多官能性アミンは、水溶液または分散中で酸化多糖類と混合されたとき、ゲル化を誘導することができる。多官能性アミンは、たとえば上述されているような、第２の水分散性多分枝状ポリエーテルアミンであってもよく、またジアミノアルカン類、ポリアミノアルカン類、およびスペルミン等の直鎖状および分枝状ジアミン類；ポリエチレンイミン等の、分枝状ポリアミン類；Ｎ，Ｎ’−ビス（３−アミノプロピル）ピペラジン、５−アミノ−１，３，３−トリメチルシクロヘキサンメチルアミン、１，３−ビス（アミノメチル）シクロヘキサン、１，４−ジアミノシクロヘキサン、およびｐ−キシリレンジアミン等の、環状ジアミン類；３−アミノプロピルトリメトキシシランおよび３−アミノプロピルトリエトキシシラン等の、アミノアルキルトリアルコキシシラン類；３−アミノプロピルジエトキシメチルシラン等のアミノアルキルジアルコキシアルキルシラン類、アジピン酸ジヒドラジド等のジヒドラジド類；直鎖状ポリエチレンイミン等の直鎖状のポリマージアミン類、α，ω−アミノ−末端ポリエーテル類、α，ω−ビス（３−アミノプロピル）ポリブタンジオール、β，ω−１−アミノ−末端ポリエーテル類（直鎖状Ｊｅｆｆａｍｉｎｅｓ（登録商標））；キトサン、ポリアリルアミンおよびポリリシン等の、櫛状ポリアミン類、ならびにビス（カルボキシヒドラジド）ポリエーテル類およびポリ（カルボキシヒドラジド）星状ポリエーテル類等の、ジヒドラジド類およびポリヒドラジド類；を含むがその限りではない、別のタイプの多官能性アミンであってもよい。これらの化合物の多くは、Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈおよびＨｕｎｔｓｍａｎ  ＬＬＣ等の会社から市販されている。一般に、存在するのであれば、多官能性アミンは、水溶液または分散中の多分枝状ポリエーテルアミンの重量と比較して約５重量％〜約１０００重量％の濃度で使用される。
【００７３】
一実施態様では、第１の水溶液または分散および第２の水溶液または分散（その少なくとも１つがオリゴマー添加物を含む）は、生存生物の組織上の解剖学的部位に適用するために使用することが可能である。２つの水溶液または分散は、幾つもの方法で適用することが可能である。いったん、両溶液または分散が部位上で合併されると、一般に約２〜３分で、それらは架橋してハイドロゲルを形成する（本明細書で硬化と呼ばれる過程）。ハイドロゲルは、部位上にコーティングを提供する。
【００７４】
一実施態様では、２つの水溶液または分散は、吹き付け、綿棒またはブラシによるブラッシング、あるいはピペットまたは注射器を使用した押出を含むがその限りではない、任意の好適な手段を順次使用して部位に適用される。溶液または分散は、任意の順序で適用してもよい。次いで、溶液または分散は、綿棒、スパーテル、あるいはピペットまたは注射器の先端等の任意の好適な装置を使用して、部位で混合される。
【００７５】
別の実施態様では、２つの水溶液または分散は、部位に適用される前に手作業で混合される。次いで、生じた混合物が、完全に硬化する前に、上述のような好適なアプリケーターを使用して部位に適用される。
【００７６】
別の実施態様では、第１の水溶液または分散および第２の水溶液または分散が部位に同時に塗布され、そこで混合してハイドロゲルを形成する。たとえば、２つの水溶液または分散は、双筒式注射器の別の筒に入っていてもよい。この方法では、２つの水溶液または分散が、注射器で部位に同時に適用される。好適な双筒式注射器アプリケーターは、当該技術分野で周知である。たとえば、Ｒｅｄｌは、本発明で使用するのに適した幾つかのアプリケーターを、米国特許第６，６２０，１２５号明細書（特に、４段１０行目〜６段４７行目に記述されている、図１、５、および６）に記述している。２つの水溶液または分散はまた、たとえばＢｉｓｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）から入手可能なもの等の、二重内腔カテーテルを使用して、部位に適用することも可能である。さらに、２つの液体成分を内視鏡的に体内に同時に導入するための射出装置は、当該技術分野で周知であり、また本明細書に記載の２つの水溶液または分散の送達用に改変することが可能である（たとえば、Ｌｉｎｄｅｒら、米国特許第５，３２２，５１０号明細書を参照されたい）。
【００７７】
別の実施態様では、第１の水溶液または分散および第２の水溶液または分散を前もって混合し、ＣｏｎＰｒｏｔｅｃ，Ｉｎｃ．（Ｓａｌｅｍ，ＮＨ）またはＭｉｘｐａｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＡＧ（Ｒｏｔｋｒｅｕｚ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から入手可能なもの等の、静止ミキサーが入っている双筒式注射器を使用して、部位に送達する。あるいは、Ｃｒｕｉｓｅらによって米国特許第６，４５８，１４７号明細書に記載されているもの等の、スプレーヘッドを、混合チップに備え付ける。さらに、カテーテルまたは内視鏡を使用して、双筒式注射器からの２つの水溶液または分散の混合物を部位に適用することが可能である。２つの液体成分組織接着剤を混合し、生じた混合物を内視鏡的に送達するための装置は当該技術分野で周知であり、本明細書に開示されている２つの水溶液または分散の混合および送達用に改変することが可能である（たとえば、Ｎｉｅｌｓｏｎ、米国特許第６，７２３，０６７号明細書；およびＲｅｄｌら、米国特許第４，６３１，０５５号明細書参照）。
【００７８】
別の実施態様では、Ｆｕｋｕｎａｇａら（米国特許第５，５８２，５９６号明細書）、Ｄｅｌｍｏｔｔｅら（米国特許第５，９８９，２１５号明細書）またはＳａｗｈｎｅｙ（米国特許第６，１７９，８６２号明細書）によって記述されているもの等の噴霧装置を使用して、２つの水溶液または分散を部位に適用することが可能である。
【００７９】
別の実施態様では、Ｓａｗｈｎｅｙ（米国特許第７，３４７，８５０号明細書）によって記述されているもの等の、低侵襲性外科的アプリケーターを使用して、２つの水溶液または分散を部位に適用することが可能である。
【００８０】
オリゴマー添加物が第３の水溶液または分散に含まれている別の実施態様では、上述の方法のいずれかを使用して任意の順序で、３つの水溶液または分散を解剖学的部位に適用することが可能である。この実施態様では、３つの水溶液または分散を送達するように、使用する送達装置を修正することが可能である。たとえば、水溶液または分散のそれぞれに１つずつ、３つの筒を有するように、双筒式注射器を修正することが可能である。
【００８１】
別の実施態様では、本発明のハイドロゲル組織接着剤を使用して、少なくとも２つの解剖学的部位を結合することが可能である。この実施態様では、上述の方法を使用して、第１の水溶液または分散を少なくとも１つの解剖学的部位に適用し、第２の水溶液または分散を同一部位または他の一部位のいずれかの少なくとも１つに適用する。２つ以上の部位を接触させ、そして手作業で、または手術用クランプ等の他の何らかの手段を使用して、混合物が硬化するのに十分な時間、結合させる。あるいは、２つの水溶液または分散の混合物を、上述の方法を使用して結合すべき解剖学的部位の少なくとも１つに適用する。２つ以上の部位を接触させ、そして手作業で、または手術用クランプ等の他の何らかの手段を使用して、混合物が硬化するのに十分な時間、結合させる。
【００８２】
オリゴマー添加物が第３の水溶液または分散に含まれており、少なくとも２つの解剖学的部位を結合するために第１の水溶液または分散および第２の水溶液または分散と一緒に使用される別の実施態様では、３つの水溶液または分散のそれぞれを任意の順序で少なくとも１つの解剖学的部位に適用することが可能である。水溶液または分散は、同一部位に適用しても異なる部位に適用してもよい。あるいは、上述の方法のいずれかを使用して３つの水溶液または分散を予め混合し、生じた混合物を、その混合物が完全に硬化する前に、結合すべき解剖学的部位の少なくとも１つに適用する。次いで、２つ以上の部位を接触させ、そして手作業で、または手術用クランプ等の他の何らかの手段を使用して、混合物が硬化するのに十分な時間、結合させる。
【００８３】
別の実施態様では、酸化多糖類、水分散性多分枝状ポリエーテルアミン、およびオリゴマーを微粉の形で使用することが可能である。粉末は、任意の好適な方法を使用して調製することが可能である。たとえば、熱、真空、熱と真空の組合せを使用して、または凍結乾燥によって、上述の水溶液または分散を乾燥させ、粉末を形成することが可能である。場合により、粉末は、乳鉢および乳棒を用いた粉砕（ｇｒｉｎｄｉｎｇ）、摩砕（ｍｉｌｌｉｎｇ）、または破砕（ｃｒｕｓｈｉｎｇ）を含むがその限りではない当該技術分野で周知の方法を使用して、より細かい粒子に粉砕されてもよい。微粉は、上述の方法を使用して滅菌することが可能である。微粉は、様々な方法で、生存生物の組織上の解剖学的部位に適用することが可能である。たとえば、粉末は、振りかけまたは吹き付けにより任意の順序で部位に個々に適用してもよい。さらに、粉末を予め混合し、生じた混合物を、振りかけまたは吹き付けにより部位に適用してもよい。水または好適な緩衝液（たとえば、リン酸緩衝生理食塩水）等の水溶液を加えることにより、または部位に存在する生理液によって、粉末を部位上で水和させることが可能である。微粉もまた、水溶液または分散に関して上述したように、２つの解剖学的部位を結合するために使用することが可能である。あるいは、使用前に粉末を水または好適な水溶液で水和させて、上述の、第１および第２の水溶液または分散を形成してもよい。
【００８４】
別の実施態様では、本明細書に開示されているハイドロゲル組織接着剤は、乾燥ハイドロゲルの形で使用することが可能である。この実施態様では、少なくとも１つの酸化多糖類と少なくとも１つの水分散性多分枝状ポリエーテルアミンおよび式（１）の少なくとも１つのオリゴマーを溶媒中で合併してハイドロゲルを形成し、そして溶媒の少なくとも一部を除去するためにハイドロゲルを処理して乾燥ハイドロゲルを形成することにより、乾燥ハイドロゲルが調製される。好適な溶媒としては、水、エタノール、イソプロパノール、テトラヒドロフラン、ヘキサン類、ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物などが挙げられるが、その限りではない。２つの異なる溶媒が使用される場合、その２つの溶媒は互いに混和する。一実施態様では、溶媒は水である。酸化多糖類、水分散性多分枝状ポリエーテルアミン、およびオリゴマーは、様々な方法で合併することが可能である。たとえば、酸化多糖類を含む第１の水溶液または分散および水分散性多分枝状ポリエーテルアミンを含む第２の水溶液または分散（その少なくとも１つはオリゴマー添加物を含む）を、上述の通りに調製および混合してハイドロゲルを形成することが可能である。あるいは、酸化多糖類を含む第１の水溶液または分散、水分散性多分枝状ポリエーテルアミンを含む第２の水溶液または分散、およびオリゴマー添加物を含む第３の水溶液または分散を上述の通りに調製および混合してハイドロゲルを形成してもよい。ハイドロゲルを調製するために使用される溶液または分散は、所期の用途に応じて様々な添加物をさらに含んでもよい。上述の添加物のいずれを使用してもよい。次いで、中に含まれる溶媒の少なくとも一部を除去するためにハイドロゲルを処理して、乾燥ハイドロゲルを形成する。好ましくは、溶媒の実質的に全部がハイドロゲルから除去される。当該技術分野で周知の方法を使用して、たとえば、熱、真空、熱と真空の組合せを使用して、あるいはハイドロゲルの上を乾燥空気または窒素等の乾燥不活性ガスの流れを通して、ハイドロゲルから溶媒を除去することが可能である。乾燥ハイドロゲルは、上述の方法を使用して滅菌することが可能である。乾燥ハイドロゲルは、下記の通り、多くの方法で解剖学的部位に適用することが可能である。水または好適な緩衝液（たとえば、リン酸緩衝生理食塩水）等の水溶液を加えることにより、または部位に存在する生理液によって、乾燥ハイドロゲルを部位上で水和させることが可能である。
【００８５】
一実施態様では、乾燥ハイドロゲルをフィルムの形で使用することが可能である。乾燥ハイドロゲルフィルムは、溶液または分散の混合物を好適な基材上に流延し、生じたハイドロゲルを処理して乾燥ハイドロゲルフィルムを形成することが可能である。乾燥ハイドロゲルフィルムは、解剖学的部位に直接適用することが可能である。さらに、本乾燥ハイドロゲルフィルムを使用して、解剖学的部位を結合することが可能である。
【００８６】
別の実施態様では、乾燥ハイドロゲルを微細粒子の形で使用することが可能である。乾燥ハイドロゲル粒子は、乳鉢および乳棒を用いた粉砕、摩砕、または破砕を含むがその限りではない当該技術分野で周知の方法を使用して粉砕することにより、形成することが可能である。乾燥ハイドロゲルは、振りかけまたは吹き付け等の様々な方法で解剖学的部位に適用することが可能であり、また２つの解剖学的部位を結合するために使用することも可能である。
【００８７】
分解時間を減少させる方法
別の実施態様では、本発明は少なくとも１つの酸化多糖類（成分Ａ）および少なくとも１つの水分散性多分枝状ポリエーテルアミン（成分Ｂ）から形成されるハイドロゲルの分解時間を減少させる方法であって、上記アルデヒド基を含有する少なくとも１つの酸化多糖類は約１，０００〜約１，０００，０００ダルトンの重量平均分子量および約６５〜約１５００ダルトンのアルデヒド基当たりの当量を有し、また上記少なくとも１つの水分散性多分枝状ポリエーテルアミンは、そのアームの少なくとも３つが少なくとも１つの一級アミン基で終結され、約４５０〜約２００，０００ダルトンの数平均分子量を有する、ハイドロゲルの分解時間を減少させる方法を提供し；上記方法は：
水性媒体および約２００〜約１０，０００ダルトンの重量平均分子量を有する式（１）の少なくとも１つのオリゴマーの存在下で、成分Ａと成分Ｂを接触させて、生じたハイドロゲルを形成する混合物を形成するステップを含み、上記方法では、オリゴマーは、所定の条件で、生じたハイドロゲルの分解時間を、上記オリゴマーが存在しないこと以外は上記条件で形成されるハイドロゲルの分解時間と比べて少なくとも約１０％減少させるのに十分な量で使用される。
【００８８】
一連の所定の条件について、生じたハイドロゲルの分解時間を、当該技術分野で周知の方法を使用して測定することができる。たとえば、本明細書後段の実施例に記載の通りに、ハイドロゲルが形成された後、指定された温度および撹拌速度で振盪しながら水性媒体中でインキュベートし、ハイドロゲルが溶解するのに要する時間を測定することができる。同じ所定の条件でオリゴマーを添加することにより、分解時間が少なくとも約１０％減少させる結果となる。
【００８９】
キット
一実施態様では、本発明は、上述のような、アルデヒド基を含有する少なくとも１つの酸化多糖類、アームの少なくとも３つが少なくとも１つの一級アミン基で終結される少なくとも１つの水分散性多分枝状ポリエーテルアミン、および式（１）の少なくとも１つのオリゴマーを含むキットを提供する。
【００９０】
別の実施態様では、本キットはアルデヒド基を含有する少なくとも１つの酸化多糖類を含む第１の水溶液または分散；少なくとも１つの水分散性多分枝状ポリエーテルアミンを含む第２の水溶液または分散；および式（１）の少なくとも１つのオリゴマー；を含む。オリゴマーは、上述の通り、第１の水溶液または分散、第２の水溶液または分散、または第３の水溶液または分散の少なくとも１つの成分である。水溶液または分散のそれぞれが、バイアルまたは注射筒等の、任意の好適な容器に入っていてもよい。
【００９１】
別の実施態様では、キットは、上述のように、微粉の形で、少なくとも１つの酸化多糖類、少なくとも１つの水分散性多分枝状ポリエーテルアミン、および式（１）の少なくとも１つのオリゴマーを含む。粉末は、別々の容器に入っていてもよく、あるいは予め混合されて一つの容器に入っていてもよい。キットは、粉末を水和させるための水溶液も含んでもよい。
【００９２】
別の実施態様では、キットは上述の乾燥ハイドロゲルを含む。乾燥ハイドロゲルは、フィルム、微細粒子、または他の乾燥形状であってもよい。キットは、乾燥ハイドロゲルを水和させるための水溶液をさらに含んでもよい。乾燥ハイドロゲル粒子は、任意の好適な容器に入っていてもよい。
【００９３】
医療用途：
本明細書に記載のハイドロゲルは、止血用シーラントとしての使用、あるいは外傷または外科手術に起因する望ましくない組織−組織癒着を防止するための使用を含むがその限りではない医療用途に、組織接着剤またはシーラントとして有用であろう。これらの用途では、上述の方法を使用して、酸化多糖類、水分散性多分枝状ポリエーテルアミン、およびオリゴマー添加物または乾燥ハイドロゲルを所望の解剖学的部位に適用することが可能である。
【実施例】
【００９４】
本発明を、以下の実施例でさらに明確にする。これらの実施例は、本発明の好ましい実施態様を示すが、例として示すにすぎないことを理解されたい。上記論考およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的特徴を確認することができ、またその精神および範囲から逸脱することなく、本発明の様々な変更および修飾を行って様々な使用および条件に適合させることができる。
【００９５】
試薬
幾つかの平均分子量（すなわち、５０００、２０００、および７５０Ｄａ）のメトキシＰＥＧアミン類（ＣＡＳ  Ｎｏ．８０５０６−６４−５）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。平均分子量３５０Ｄａを有するメトキシＰＥＧアミンは、下記の通りに合成した。平均分子量７５０Ｄａを有するメトキシＰＥＧアミンもまた、同一手順を使用して合成した。平均分子量７５０Ｄａを有するメトキシＰＥＧアミンは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手し、合成された材料の使用が特に示される場合を除き、下記の実施例で使用した。下記の実施例では、メトキシＰＥＧアミンは、平均分子量が後続する“ＭＰＡ”として表される。たとえば、ＭＰＡ２０００は、平均分子量２０００Ｄａを有するメトキシＰＥＧアミンである。
【００９６】
ＭＰＡ３５０の調製
分子量３５０のメトキシＰＥＧアミンは、類似した分子量のメトキシＰＥＧアルコールのメシル化、後続するメシル化中間体のアミノ化を含む、二段階手順を使用して合成した。
【００９７】
ステップ１−メトキシＰＥＧアルコールのメシル化：
【化１】
2012523289.tif 000002
第１ステップでは、５００ｍＬ用三口丸底フラスコ内、室温（ＲＴ）で、平均分子量３５０Ｄａを有するメトキシＰＥＧアルコール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）１７．５０２ｇ（０．０５ｍｏｌ）を塩化メチレン２５０ｍＬに溶解した。この溶液に、トリエチルアミン１３．９４ｍＬ（０．１ｍｏｌ）を加え、続いてメタンスルホニルクロリド７．７４ｍＬ（０．１ｍｏｌ）を滴加した（発煙、軽微発熱）。窒素ブランケットを維持しながら、生じた反応溶液を室温で一晩撹拌した。次いで、反応溶液をクロロホルム２５０ｍＬで希釈し、１．０Ｍリン酸水素カリウム（２×１００ｍＬ）、１．０Ｍ炭酸カリウム（２×１００ｍＬ）、および脱イオン水（３×１００ｍＬ）で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、ロータリー・エバポレーターを使用して濃縮して琥珀色油脂生成物を生じた。高真空下（すなわち、１００ｍＴｏｒｒ（１３．３Ｐａ）未満）で一晩、琥珀色油脂生成物を乾燥した。乾燥生成物の最終重量は２０．３２ｇであった。生成物の同一性は、重水素化クロロホルム中での１Ｈ  ＮＭＲで確認した。
【００９８】
ステップ２−メシル化生成物のアミノ化：
【化２】
2012523289.tif 000003
第２ステップでは、蓋のしっかり閉まった瓶内で、ステップ１からのメシル化生成物１９．８ｇを水酸化アンモニウム溶液（水中２８〜３０％）４００ｍＬに溶解し、ＲＴで５日間撹拌した。次いでこの溶液に窒素を６時間スパージして残留アンモニアを追い出す（元の体積のほぼ８５％まで）。生じた溶液を、２．０Ｍ炭酸カリウム溶液２００ｍＬで希釈し、クロロホルム（３×１５０ｍＬ）で抽出した。クロロホルム層を合併し、硫酸マグネシウムで乾燥し、ロータリー・エバポレーターを使用して濃縮して淡黄色油を生じた。この油を、高真空下（すなわち、９０ｍＴｏｒｒ（１２．０Ｐａ）未満）でさらに乾燥した。生じた生成物の最終重量は１４．４ｇであった。生成物の同一性は、重水素化ジメチルスルホキシド中での１Ｈ  ＮＭＲで確認した。
【００９９】
ＭＰＡ７５０の調製
分子量７５０のメトキシＰＥＧアミンは、ＭＰＡ３５０の調製について上述した二段階手順を使用して合成した。約７５０ダルトンの平均分子量を有する出発メトキシＰＥＧアルコールは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。
【０１００】
デキストランアルデヒド（Ｄ１０〜５０）の調製
デキストランアルデヒドは、水溶液中で、デキストランをメタ過ヨウ素酸ナトリウムで酸化することにより製造した。約５０％が酸化転換した（すなわち、デキストランポリマー中のグルコース環の約半分がジアルデヒドに酸化されている）酸化デキストランは、Ｃｏｈｅｎら（同時係属および共同所有の国際特許出願公開第２００８／１３３８４７号パンフレット）によって記述されている方法で、８，５００〜１１，５００ダルトンの重量平均分子量を有するデキストラン（Ｓｉｇｍａ）から調製した。代表的な手順を本明細書に記述する。
【０１０１】
メカニカルスターラー、滴下ロート、内部温度プローブ、および窒素パージを備えた２０−Ｌ用反応器に、デキストラン１０００ｇおよび脱イオン水９．００Ｌを入れた。混合物を周囲温度で撹拌してデキストランを溶解し、次いで１０〜１５℃に冷却した。冷却したデキストラン溶液に、反応温度を２５℃未満に保ちながら１時間にわたって、脱イオン水９．００Ｌに溶解した過ヨウ素酸ナトリウム１０００ｇの溶液を加えた。いったん全ての過ヨウ素酸ナトリウム溶液を加えたら、混合物を２０〜２５℃でさらに４時間撹拌する。次いで反応混合物を０℃に冷却し、濾過して澄ませる。塩化カルシウム（５００ｇ）を濾液に加え、その混合物を周囲温度で３０分間撹拌し、次いで濾過する。ヨウ化カリウム（４００ｇ）を濾液に加え、その混合物を周囲温度で３０分間撹拌する。得られた赤色溶液のうち３Ｌを、添加している間ずっとメカニカルスターラーで勢いよく撹拌しながら、１０〜１５分にわたってアセトン９．０Ｌに加える。さらに数分間撹拌した後、凝集生成物を上澄液から分離する。第２の濾液にヨウ化カリウムを加えることによって得られる残留赤色溶液を、上記と同様に処理する。合併した凝集生成物を断片に粉砕し、大きいステンレススチールブレンダー内でメタノール２Ｌと合わせ、固形物が粒状になるまでブレンドする。粒状固体を濾過で回収し、窒素でパージしながら真空下で乾燥する。ついで粒状固体をハンマーミルで微粉にする。２０Ｌ用反応器に、脱イオン水１０．８Ｌおよびメタノール７．２Ｌを入れ、その混合物を０℃に冷却する。前ステップで形成された粒状固体を反応器に加え、そのスラリーを勢いよく１時間撹拌する。撹拌を中止し、固体を反応器の底に沈ませる。真空で上澄液を傾瀉し、メタノール１５Ｌを反応器に加えて、そのスラリーを０℃に冷却しながら３０〜４５分間撹拌する。スラリーを何回かに分けて濾過し、回収された固体をメタノールで洗浄し、窒素パージをしながら真空下で乾燥して約６００ｇの酸化デキストランを生じさせる（これを本明細書では、Ｄ１０−５０と表す）。
【０１０２】
生成物の酸化の程度は、プロトンＮＭＲにより約５０％（アルデヒド基当たりの当量＝１４６）であると決定される。ＮＭＲ方法では、２つのピーク範囲、具体的には、約６．２百万分率（ｐｐｍ）〜約４．１５ｐｐｍにおける−Ｏ２ＣＨｘ−（ＨＯＤピークを引く）および約４．１５ｐｐｍ〜約２．８ｐｐｍにおける−ＯＣＨｘ−（存在するのであれば、メタノールピークを引く）について、積分を実行する。酸化レベルの計算は、これらの面積について算出された比率（Ｒ）、具体的には、Ｒ＝（ＯＣＨ）／（Ｏ２ＣＨ）に基づく。
【０１０３】
８アームＰＥＧ１０Ｋオクタアミン（Ｐ８−１０−１）の調製：
８アームＰＥＧ  １０Ｋオクタアミン（Ｍｎ＝１０ｋＤａ）は、Ｃｈｅｎａｕｌｔにより同時係属および共同所有の米国特許出願公開第２００７／０２４９８７０号明細書に記述されている二段階手順を使用して合成される。第１ステップでは、塩化チオニルと８アームＰＥＧ  １０Ｋオクタアルコールとの反応により、８アームＰＥＧ  １０Ｋ塩化物を製造する。第２ステップでは、８アームＰＥＧ  １０Ｋ塩化物を水性アンモニアと反応させて、８アームＰＥＧ  １０Ｋオクタアミンを生成する。代表的な手順を本明細書に記述する。
【０１０４】
８アームＰＥＧ  １０Ｋオクタアルコール（Ｍｎ＝１００００；ＳｕｎＢｒｉｇｈｔ  ＨＧＥＯ−１００００；ＮＯＦ  Ｃｏｒｐ．）、（５００ｍＬ用丸底フラスコ内に１００ｇ）を、真空下（０．０６ｍｍ水銀柱（８．０Ｐａ））、８５℃で撹拌しながら４時間加熱するか、または減圧下（２ｋＰａ）、ポット温度６０℃でのトルエン５０ｇとの共沸蒸留のいずれかによって、乾燥させる。８アームＰＥＧ  １０Ｋオクタアルコールを室温まで冷却させ、塩化チオニル（３５ｍＬ，０．４８ｍｏｌ）を、還流コンデンサーを備えたフラスコに加え、その混合物を、窒素ブランケット下、撹拌しながら８５℃に２４時間加熱する。余分の塩化チオニルを回転蒸発（浴温４０℃）で除去する。トルエンを５０ｍＬずつ連続２回加え、塩化チオニルが完全に除去されるまで減圧下で蒸発させる（２ｋＰａ，浴温６０℃）。一合成から得られるプロトンＮＭＲは：
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ３．７１−３．６９（ｍ，１６Ｈ），３．６７−３．６５（ｍ，１６Ｈ），３．５０（ｓ，約８００Ｈ）
である。
【０１０５】
８アームＰＥＧ  １０Ｋオクタクロリド（１００ｇ）を濃アンモニア水（２８重量％）６４０ｍＬに溶解し、圧力容器内、６０℃で４８時間加熱する。この溶液に乾燥窒素を１〜２時間スパージしてアンモニア５０〜７０ｇを追い出す。次いで、溶液を、水酸化物型の強塩基性陰イオン交換樹脂（Ｐｕｒｏｌｉｔｅ（登録商標）Ａ−８６０，Ｔｈｅ  Ｐｕｒｏｌｉｔｅ  Ｃｏ．，（Ｂａｌａ−Ｃｙｎｗｙｄ，ＰＡ））のカラム（床体積５００ｍＬ）を通過させる。溶離液を回収し、脱イオン水を２５０ｍＬずつ３回、カラムを通過させて、やはり回収する。水溶液を合併し、減圧下（２ｋＰａ，浴温６０℃）で約２００ｇに濃縮し、ポーションで凍結して凍結乾燥し、本明細書でＰ８−１０−１として表される８アームＰＥＧ  １０Ｋオクタアミンを、無色の蝋様固体として生じる。
【０１０６】
一般的方法
ハイドロゲル前駆体溶液の調製
酸化デキストラン溶液および多分枝状ＰＥＧアミン溶液は、所望の濃度（重量％）を達成するために、所望の量の酸化デキストランまたは多分枝状ＰＥＧアミンを蒸留水に溶解することにより調製した。多分枝状ＰＥＧアミンは一般に、室温で容易に溶解した。添加物の非存在下で、酸化デキストランは室温でゆっくり溶解したが、３７℃に一晩加熱した後、完全に溶解した。
【０１０７】
様々なメトキシＰＥＧアミン類を、酸化デキストラン溶液または多分枝状ＰＥＧアミン溶液のいずれか、またはその両方に加えた。対照処方からある量の水を除去し、同量の添加物を補充することによって、添加物を含む処方を設計した。添加物を導入するための具体的な手順は、以下の実施例に記載する。
【０１０８】
ゲル化時間測定
インビボ使用のための適用しやすさを評価するために、ハイドロゲル前駆体溶液を混合した際のゲル化時間を試験した。酸化デキストラン溶液（０．１０ｍＬ）をバイアルに入れた。次いで、多分枝状ＰＥＧアミン溶液０．１０ｍＬをバイアルに加え、その混合物が流動せずにその形状を保持するところまでゲル化するまで、小さいスパーテルで直ちに撹拌した。この時間を測定し、ゲル化時間とみなした。
【０１０９】
分解時間測定
ｐＨ７．４のＤｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ，カルシウムまたはマグネシウムを含まない１×，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）；ｃａｔ．１４１９０またはＭｅｄｉａｔｅｃｈ，（Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）；ｃａｔ．２１−０３１）中、３７℃で、ハイドロゲルの分解挙動を下記の通りに試験し、インビボ使用のためのハイドロゲル処方の許容性を評価した。１６−ステップ静的混合チップ付き双筒式注射器（１：１ｖ／ｖ）を使用して、ハイドロゲルテストストリップを作製した。酸化デキストラン溶液を双筒式注射器の片側に加え、多分枝状ＰＥＧアミン溶液を反対側に加えた。混合チップを端から５ｍｍ切断して、より大きい出口径を作った。
【０１１０】
混合チップ付き双筒式注射器を使用して、ハイドロゲル調合物を厚さ１ｍｍ×幅６．８ｍｍ×長さ約７０ｍｍの型に流延した。１５分後、端を切り取り、得られたハイドロゲルストリップを、それぞれ大きさが３０ｍｍ×６．８ｍｍ×１ｍｍの２つのテストストリップに切断した。秤量後、ストリップを、ＤＰＢＳ緩衝液が入っている２０ｍＬ用バイアルにそれぞれ入れた。バイアルの蓋を閉め、３７℃および８０ｒｐｍのインキュベーターシェーカーに入れた。ハイドロゲルテストストリップは、第１日の２時間および５時間、ならびにその後、テストストリップの重量がその初期重量の５０％未満になるまで２４時間毎に秤量した。毎回、ハイドロゲルストリップを緩衝液から取り出して余分の液体を排除し、秤量した。次いで、そのストリップを用時調製したＤＰＢＳと一緒にバイアルに入れ、インキュベーターに戻した。
【０１１１】
この手順の結果として、初期重量のパーセントと時間で表した、ハイドロゲル重量と時間とのプロットが得られた。一般に、平衡膨潤による重量の初期増加があり、その後に架橋が壊れるため若干の付加的膨潤が続き、最後に可溶性の分解生成物がハイドロゲルから拡散するため減量する。暫くの間、ハイドロゲルの破片が残存することがある。調合物を比較するために、初期重量の５０％までの時間を、分解曲線の重要なパラメーターとして使用した。本明細書で分解時間と呼ばれるこの時間は、重量が５０％のすぐ上である時点と、重量が５０％のすぐ下である時点との間の補間によって推定した。報告値は、２つのハイドロゲルストリップ試料に対する測定値の平均である。
【０１１２】
実施例１〜４
異なる分子量のメトキシＰＥＧアミンが酸化デキストランの溶解に及ぼす影響
これらの実施例の目的は、酸化デキストラン類の溶解速度に及ぼすメトキシＰＥＧアミンの影響を証明することである。
【０１１３】
７５０Ｄａ、２０００Ｄａ、および５０００Ｄａの平均分子量を有するメトキシＰＥＧアミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手）を、それぞれバイアル内の脱イオン水に溶解した。次いで、酸化デキストランＤ１０−５０粉末を一度に全部バイアルに流し入れた。バイアルの蓋を閉め、次いで、ＲＴで、マグネティックスターラーで撹拌した。比較のため、同量のＤ１０−５０を、メトキシＰＥＧアミンを含まない脱イオン水と一緒にバイアルに流し入れた（比較用の例４）。組成および観察結果を表１に要約する。
【０１１４】
表1
酸化デキストランの溶解速度に及ぼすメトキシPEGアミンの影響
2012523289.tif 000004
【０１１５】
表１の結果から、８重量％のＭＰＡ７５０を含有する組成物（実施例１）およびＭＰＡ２０００を含有する組成物（実施例２）中で、酸化デキストランは室温でほんの数分で完全に溶解したことが示唆される。ＭＰＡ５０００を含有する組成物（実施例３）中およびＭＰＡを含まない比較用調合物（比較用の例４）中で、酸化デキストランは２４時間後でさえも完全に溶解しなかった。こうした組成物は、酸化デキストランの完全な溶解をもたらすために、３７℃のインキュベーター内で数分を要した。
【０１１６】
実施例５〜８
メトキシＰＥＧアミン類の存在下で、酸化デキストランおよび多分枝状ＰＥＧアミンからハイドロゲルを形成するためのゲル化時間
これらの実施例の目的は、メトキシＰＥＧアミン添加物の存在下での、酸化デキストラン（Ｄ１０−５０）および多分枝状ＰＥＧアミン（Ｐ８−１０−１）からのハイドロゲル形成を証明することであった。ハイドロゲルを形成するために要する時間（すなわち、ゲル化時間）も測定した。
【０１１７】
一般的方法で上述した方法を使用して、メトキシＰＥＧアミンを含有する酸化デキストラン（すなわち、Ｄ１０−５０）を含有する水溶液と、多分枝状ＰＥＧアミン（すなわち、Ｐ８−１０−１）を含有する水溶液とを混合することにより、ハイドロゲルを形成した。使用した酸化デキストラン溶液は、実施例１〜４に記載されている。結果を、表２に要約する。
【０１１８】
表2
ハイドロゲル形成のためのゲル化時間
2012523289.tif 000005
【０１１９】
表２に示した結果から、デキストラン−アルデヒドの溶解を劇的に増強する、より低分子量のＭＰＡ添加物（実施例５および６）はまた、メトキシＰＥＧアミン添加物を含まない比較例（比較用の例８）と比較して、ゲル化時間を有意に遅らせることが示唆される。
【０１２０】
実施例９〜１２
酸化デキストランの溶解に及ぼす、様々な濃度のメトキシＰＥＧアミン７５０の影響
様々な濃度のＭＰＡ７５０を、バイアル内の脱イオン水にそれぞれ溶解した。次いで、酸化デキストランＤ１０−５０粉末を一度に全部、バイアルに流し入れた。バイアルの蓋を閉め、次いで、Ｄ１０−５０が溶解するまで、ＲＴで、マグネティックスターラーで撹拌した。組成および観察結果を表３に要約する。
【０１２１】
表3
酸化デキストランの溶解速度に及ぼすMPA750の影響
2012523289.tif 000006
【０１２２】
表３に示した結果から、僅か１重量％または２重量％のＭＰＡ７５０（実施例１１および１２）が、Ｄ１０−５０（比較用の例４参照）の溶解速度を高めることが示唆される。
【０１２３】
実施例１３〜１６
ＭＰＡ７５０の存在下、酸化デキストランおよび多分枝状ＰＥＧアミンからのハイドロゲル形成のためのゲル化時間
これらの実施例の目的は、様々な濃度でのＭＰＡ７５０の存在下での、酸化デキストラン（Ｄ１０−５０）および多分枝状ＰＥＧアミン（Ｐ８−１０−１）からのハイドロゲル形成を証明することであった。ハイドロゲルを形成するために要する時間（すなわち、ゲル化時間）も測定した。
【０１２４】
一般的方法で上述した方法を使用して、ＭＰＡ７５０を含有する酸化デキストラン（すなわち、Ｄ１０−５０）を含有する水溶液と、多分枝状ＰＥＧアミン（すなわち、Ｐ８−１０−１）を含有する水溶液とを混合することにより、ハイドロゲルを形成した。使用した酸化デキストラン溶液は、実施例９〜１２に記載されている。結果を、表４に要約する。
【０１２５】
表4
ハイドロゲル形成のためのゲル化時間
2012523289.tif 000007
【０１２６】
表４のデータから、より低いＭＰＡ７５０濃度、すなわち、２重量％（実施例１５）および１重量％（実施例１６）で、ゲル化時間に及ぼす影響はかなり小さいことが示唆される（比較用の例８参照）。２重量％ＭＰＡ７５０および８重量％Ｄ１０−５０で、ＭＰＡ７５０上のアミン類の完全反応は、Ｄ１０−５０上の利用可能なアルデヒド類の約５％に相当するにすぎない。したがって、Ｐ８−１０−１多分枝状ＰＥＧアミンと化合させるとき、Ｄ１０−５０のアルデヒド基の９５％は依然として架橋に利用できるままであろう。
【０１２７】
実施例１７〜２１
高濃度の酸化デキストランに及ぼす様々な濃度のメトキシＰＥＧアミン７５０の影響
様々な濃度のＭＰＡ７５０を、バイアル内の脱イオン水にそれぞれ溶解した。次いで、酸化デキストランＤ１０−５０粉末を一度に全部バイアルに流し入れた。バイアルの蓋を閉め、次いで、Ｄ１０−５０が溶解するまで、ＲＴで、マグネティックスターラーで撹拌した。組成および観察結果を表５に要約する。
【０１２８】
表5
酸化デキストランの溶解速度に及ぼすMPA750の影響
2012523289.tif 000008
【０１２９】
表５に示す結果から、ＭＰＡ７５０を加えても、２５重量％Ｄ１０−５０は数分で完全に溶解しないという結果に終わるものの、その影響は依然として劇的であることが示唆される。ＭＰＡ７５０の非存在下で（比較用の例２１）、Ｄ１０−５０および水の混合物は、徐々にゼラチン状になるまで数時間、撹拌できない固体である。対照してみると、ＭＰＡ７５０を添加することにより、混合物は速やかに流動性を有するようになることができ、またＤ１０−５０の一部または大部分が数分で溶解できるようになる。
【０１３０】
実施例２２〜２６
様々な濃度のＭＰＡ７５０の存在下における、高濃度の酸化デキストランおよび多分枝状ＰＥＧアミンからのハイドロゲル形成のためのゲル化時間
これらの実施例の目的は、様々な濃度のＭＰＡ７５０の存在下、高濃度の酸化デキストラン（Ｄ１０−５０）および多分枝状ＰＥＧアミン（Ｐ８−１０−１）からのハイドロゲル形成を証明することであった。ハイドロゲルを形成するために要する時間（すなわち、ゲル化時間）も測定した。
【０１３１】
一般的方法で上述した方法を使用して、ＭＰＡ７５０を含有する高濃度の酸化デキストラン（すなわち、Ｄ１０−５０）を含有する水溶液を、多分枝状ＰＥＧアミン（すなわち、Ｐ８−１０−１）を含有する水溶液と混合することにより、ハイドロゲルを形成した。使用した酸化デキストラン溶液は、実施例１７〜２１に記載されている。結果を、表６に要約する。
【０１３２】
表6
ハイドロゲル形成のためのゲル化時間
2012523289.tif 000009
【０１３３】
表６のデータから、より低いＭＰＡ７５０濃度、すなわち、５重量％（実施例２４）および２．５重量％（実施例２５）で、ゲル化時間は、ＭＰＡ７５０の非存在下（比較用の例２６）でのゲル化時間に匹敵するため、ゲル化時間に及ぼす影響はかなり小さいことが示唆される（比較用の例８参照）。
【０１３４】
実施例２７〜３２
ハイドロゲルのインビトロ分解時間に及ぼす、異なる分子量を有するメトキシＰＥＧアミン類の影響
水溶液中１２％のＤ１０−５０酸化デキストランおよび水溶液中４０％のＰ８−１０−１多分枝状ＰＥＧアミンの基本調合物を使用して、メトキシＰＥＧアミン添加の影響を試験した。水の代わりに平均分子量７５０、２０００、または５０００のメトキシＰＥＧアミンの様々な量を酸化デキストラン溶液に組み込んで、調合物を調製した。生じたハイドロゲルの分解時間を、一般的方法に記載の通りに測定した。調合物および分解時間を表７に示す。
【０１３５】
表7
ハイドロゲルのインビトロ分解時間
2012523289.tif 000010
【０１３６】
表７に示す結果から、メトキシＰＥＧアミンの添加は、メトキシＰＥＧアミンを含まない同じ調合物（比較用の例２７）と比較して、ハイドロゲルの分解を増進することが示唆される。メトキシＰＥＧアミン類の全ての添加が分解時間を減少させたが、より低分子量のメトキシＰＥＧアミンは、低濃度で、より大きい影響を及ぼした。たとえば、２％のＭＰＡ２０００は、分解時間を１５１時間から１１３時間に減少した（比較例２７を実施例２９と比較されたい）が、僅か１％のＭＰＡ７５０は、分解時間を１５１時間から８８時間に減少させた（比較例２７を実施例２８と比較されたい）。
【０１３７】
実施例３３〜３９
ゲル化時間およびインビトロ分解時間に及ぼすメトキシＰＥＧアミン類の影響
水溶液中８重量％および１０重量％のＤ１０−５０酸化デキストランおよび水溶液中３０重量％のＰ８−１０−１多分枝状ＰＥＧアミンの基本調合物を使用して、ゲル化時間およびインビトロ分解時間に及ぼすメトキシＰＥＧアミン添加の影響を試験した。水の代わりに分子量３５０または７５０のメトキシＰＥＧアミンの様々な量を酸化デキストラン溶液に組み込んで、調合物を調製した。ゲル化時間およびインビトロ分解時間は、一般的な方法に記載の通りに測定した。調合物および分解時間を表８に示す。
【０１３８】
表8
ハイドロゲルのゲル化時間およびインビトロ分解時間
2012523289.tif 000011
【０１３９】
表８に示す結果から、こうした低レベルのメトキシＰＥＧアミン添加物で、ゲル化時間に及ぼす影響は小さいことが示唆される。しかし、分解時間の短縮は劇的である。たとえば、８重量％のＤ１０−５０を含む基本調合物では、僅か１重量％のＭＰＡ３５０または２重量％のＭＰＡ７５０を添加することにより、分解時間は２６時間から４時間に減少する（比較用の例３３と比較した実施例３４および３５）。１０重量％のＤ１０−５０を含む基本調合物に、ＭＰＡ３５０または７５０を添加するとき、類似した大きい影響がみられる（比較用の例３６と比較した実施例３７、３８、および３９）。
【０１４０】
実施例４０
ゲル化時間およびインビトロ分解時間に及ぼす、多分枝状ＰＥＧアミン溶液に添加されたメトキシＰＥＧアミンの影響
メトキシＰＥＧアミンの、多分枝状ＰＥＧアミン溶液への添加の影響を、酸化デキストラン溶液への添加の影響と比較するために、３％ＭＰＡ７５０を多分枝状ＰＥＧアミン溶液に添加したことを除き、等量の水を補充して、実施例３９の調合を繰り返した。ゲル化時間およびインビトロ分解時間は、実施例３３から３９で使用した同方法を使用して測定した。この調合物のゲル化時間は４〜８秒であり、分解時間は４０時間であった。
【０１４１】
これらの結果と、比較用の例３６、および実施例３９の結果との比較により、ＭＰＡの添加方法の有意な影響が説明される。３重量％ＭＰＡ７５０をＰ８−１０−１溶液に添加したとき、分解時間は８５時間から４０時間に減少した（比較用の例３６対実施例４０）。しかし、代わりに同量のＭＰＡ７５０をＤ１０−５０溶液に加えたとき、８５時間から４時間に減少した（比較用の例３６対実施例３９）。３重量％ＭＰＡ７５０をＤ１０−５０溶液に添加した時に認められたゲル化時間に及ぼす中程度の影響とは違って、３重量％ＭＰＡ７５０をＰ８−１０−１溶液に加えることで、ゲル化時間は測定できるほど影響を受けなかった。したがって、これらの結果は、メトキシＰＥＧアミンの、酸化デキストラン溶液への添加は、多分枝状ＰＥＧアミン溶液への添加よりも、分解時間に大きい影響を及ぼすことを示す。
【０１４２】
実施例４１および４２
メトキシＰＥＧアミン類の細胞毒性試験
これらの実施例の目的は、インビトロ細胞毒性試験でメトキシＰＥＧアミンの安全性を証明することであった。
【０１４３】
メトキシＰＥＧアミン溶液（１．０重量％）を調製し、細胞毒性について試験した。Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手したＭＰＡ７５０（１０２．２ｍｇ）（実施例４１）および試薬で記述した通りに合成したＭＰＡ７５０（１０３．３ｍｇ）（実施例４２）を、ＦａｌｃｏｎＴＭ試験管に入れた。Ｄｕｌｂｅｃｃｏの改良必須培地（ＤＭＥＭ）１０ｍＬを各試験官に添加して１０ｍｇ／ｍＬ希釈標準溶液濃度を生じさせた。ＭＰＡを細胞培養培地に溶解した後、両培地は明紫色に変わり、ＭＰＡがｐＨ上昇に関与していることを示した。両ＭＰＡ溶液を細胞培養フラスコに移し、５％ＣＯ２下、３７℃のインキュベーター内で少なくとも１時間インキュベートして、培地のｐＨを中性ｐＨに平衡させた。細胞に適用する前に、両ＭＰＡ溶液を、０．２２μｍフィルターユニットを通して濾過した。
【０１４４】
トリプシンを使用して、ＮＩＨ  ３Ｔ３  Ｐ２０細胞をフラスコの壁から剥離し、試料、陽性対照および陰性対照について、６ウェル平板のウェル当たり５０万細胞の好適細胞濃度で再懸濁した。陽性対照のウェルに、細胞と混合したＴｗｅｅｎ（登録商標）２０  １００μｌを添加した。陰性対照ウェルの細胞は、ＤＭＥＭ培地で培養した。拡張毒性評価のため、２０時間後および４８時間後に、光学顕微鏡を使用して細胞を撮像した。両試料とも、細胞に対して何の毒性も示さなかった。細胞成長は、陰性対照のものと同じであった。したがって、１％ＭＰＡ７５０は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手しても（実施例４１）研究室で合成しても（実施例４２）、ＮＩＨ  ３Ｔ３  Ｐ２０細胞に何の毒性も示さず、このことからメトキシＰＥＧアミンは身体で使用するためのハイドロゲルへの添加物として安全であることが示唆される。
【０１４５】
実施例４３〜４５
メトキシＰＥＧアミン類を含有するハイドロゲルの細胞毒性試験
これらの実施例の目的は、インビトロ細胞毒性試験で、メトキシＰＥＧアミンを含有するハイドロゲルの安全性を証明することであった。
【０１４６】
ハイドロゲルは、表９に示す通り、前駆体溶液を双筒式注射器から１６−ステップ混合チップを通して厚さ０．４５ｍｍの型に分配することにより調製した。生じたゲル化試料を、重量範囲３０〜３５ｍｇの円形ディスクに切断した。ディスクを、６ウェル平板のウェルに入れた。ハイドロゲル形成に使用したツールは全て、汚染を最小限に抑えるために、使用前に７０％エタノールで消毒した。
【０１４７】
表9
ハイドロゲル調製のための前駆体溶液
2012523289.tif 000012
【０１４８】
トリプシンを使用して、ＮＩＨ  ３Ｔ３  Ｐ２０細胞をフラスコの壁から剥離し、試料、陽性対照および陰性対照について、６ウェル平板のウェル当たり約５０万細胞の好適な細胞濃度で再懸濁した。陽性対照のウェルに、細胞と混合したＴｗｅｅｎ（登録商標）２０  １００μｌを添加した。陰性対照ウェルの細胞は、ＤＭＥＭ培地で培養した。拡張毒性評価のため、２０時間後および４８時間後に、光学顕微鏡を使用して細胞を撮像した。三試料全てが、細胞に対して何の毒性も示さなかった。細胞成長は、陰性対照のものと同じであった。実施例４４および４５では、細胞は、ハイドロゲルの近くでさえ申し分なく成長し、ＭＰＡ７５０を含まない、比較用の例４３の場合よりさらに良く成長する。したがって、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手しようと（実施例４４）研究室で合成しようと（実施例４５）、ＭＰＡ７５０を含むハイドロゲルは、ＮＩＨ  ３Ｔ３  Ｐ２０細胞に何の毒性も示さず、このことからメトキシＰＥＧアミンを含有するハイドロゲルは、身体で使用するのに安全であることが示唆される。
【０１４９】
実施例４６〜５１
メトキシＰＥＧアミンを含有するハイドロゲル調合物の破裂強度試験
これらの実施例の目的は、ブタ子宮角における切開の、メトキシＰＥＧアミン添加物を含有するハイドロゲルで作られたシールの破裂強度を示すことであった。
【０１５０】
＃１５外科ブレードを使用して、清潔な、新鮮なブタ子宮角の６〜８ｃｍ切片に、５〜６ｍｍの切開を行った。混合チップ付き双筒式注射器を使用して、１〜２ｍｍの厚さでハイドロゲル調合物を適用することにより、創傷を塞いだ。ハイドロゲルを硬化させておいた（一般に２〜３分）後、子宮角切片の一端をナイロンケーブルタイで金属ニップルに固定し、他端はクランプで閉じた。金属ニップルを、プラスチック管で、圧力計を備えた注射器ポンプに接続した。子宮角の切片をビーカー一杯の水に浸漬し、紫色の染色水を注射器ポンプにより１１ｍＬ／分で切片に注ぎ込んだ。塞いだ創傷が漏れた圧力を書き留め、破裂強度として記録した。報告値は一般に、３〜４の測定値の平均である。ＭＰＡ７５０を含有する幾つかのハイドロゲル調合物の破裂強度を測定した。調合物ならびに、平均値および標準偏差として示した結果を表１０に要約する。
【０１５１】
表10
メトキシPEGアミン含有ハイドロゲルの破裂強度
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【０１５２】
表１０に示す結果から、酸化デキストランの溶解を増強し、且つ分解を増進するレベルでＭＰＡ７５０を含有する調合物は、接着剤および他のインビボ利用に十分な破裂強度も示すことが示唆される。
【国際調査報告】
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