【手続補正書】
【提出日】平成20年12月19日(2008.12.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ライブラリー中の各プローブが認識配列タグおよび検出部分から構成され、各オリゴヌクレオチドプローブの少なくとも１つのモノマーが修飾モノマーアナログであることにより各プローブは対応する非修飾オリゴヌクレオチドと比較して相補的ターゲット配列に対する結合親和性が増大しており、これにより該ライブラリープローブが配列特異的結合に、および、トランスクリプトームのようないずれかの所定のターゲット集団中の全ての各標的核酸の少なくとも70％、またはトランスクリプトーム中の全ての各標的核酸の少なくとも90％の検出に十分な安定性を有し、かつ相異なる認識配列の数が所定の長さのすべての可能性ある配列タグの10％未満に含まれる、オリゴヌクレオチドプローブライブラリーであって、
各プローブの検出部分が検出のためのフルオロフォア−クエンチャーペアを含み、該クエンチャーは以下の式（I)を有し：
【化１】
2008523828.tif 000001
［式中、R1、R4、R5およびR8のうち１または２は独立して、結合、または、置換もしくは非置換アミノ基から選択され、オリゴヌクレオチドプローブの残り部分とのリンカーを構成し、残っているR1からR8基はそれぞれ独立して、水素、または、置換もしくは非置換ヒドロキシ、アミノ、アルキル、アリール、アリールアルキルまたはアルコキシである］、
ライブラリー中のオリゴヌクレオチドプローブの20％未満が、5'および／または3'位にグアニジル（G）残基を有していてもよい、ライブラリー。
【請求項２】
クエンチャーが以下から選択される、請求項１に記載のライブラリー：
1,4-ビス-(3-ヒドロキシ-プロピルアミノ)-アントラキノン、1-(3-(4,4'-ジメトキシ-トリチルオキシ)プロピルアミノ)-4-(3-ヒドロキシプロピルアミノ)-アントラキノン、1,5-ビス-(3-ヒドロキシ-プロピルアミノ)-アントラキノン、1-(3-ヒドロキシプロピルアミノ)-5-(3-(4,4'-ジメトキシ-トリチルオキシ)プロピルアミノ)-アントラキノン、1,4-ビス-(4-(2-ヒドロキシエチル)フェニルアミノ)-アントラキノン、1-(4-(2-(4,4'-ジメトキシ-トリチルオキシ)エチル)フェニルアミノ)-4-(4-(2-ヒドロエチル)フェニルアミノ)-アントラキノン、1,8-ビス-(3-ヒドロキシ-プロピルアミノ)-アントラキノン、1,4-ビス(3-ヒドロキシプロピルアミノ)-6-メチルアントラキノン、1-(3-(4,4'-ジメトキシ-トリチルオキシ)プロピルアミノ)-4-(3-ヒドロキシプロピルアミノ)-6(7)-メチル-アントラキノン、1,4-ビス(4-(2-ヒドロエチル)フェニルアミノ)-6-メチル-アントラキノン、1,4-ビス(4-メチル-フェニルアミノ)-6-カルボキシ-アントラキノン、1,4-ビス(4-メチル-フェニルアミノ)-6-(N-(6,7-ジヒドロキシ-4-オキソ-ヘプタン-1-イル))カルボキサミド-アントラキノン、1,4-ビス(4-メチル-フェニルアミノ)-6-(N-(7-ジメトキシトリチルオキシ-6-ヒドロキシ-4-オキソ-ヘプタン-1-イル))カルボキサミド-アントラキノン、1,4-ビス(プロピルアミノ)-6-カルボキシ-アントラキノン、1,4-ビス(プロピルアミノ)-6-(N-(6,7-ジヒドロキシ-4-オキソ-ヘプタン-1-イル))カルボキサミド-アントラキノン、1,4-ビス(プロピルアミノ)-6-(N-(7-ジメトキシトリチルオキシ-6-ヒドロキシ-4-オキソ-ヘプタン-1-イル))カルボキサミド-アントラキノン、1,5-ビス(4-(2-ヒドロエチル)フェニルアミノ)-アントラキノン、1-(4-(2-ヒドロエチル)フェニルアミノ)-5-(4-(2-(4,4'-ジメトキシ-トリチルオキシ)エチル)フェニルアミノ)-アントラキノン、1,8-ビス(3-ヒドロキシプロピルアミノ)-アントラキノン、1-(3-ヒドロキシプロピルアミノ)-8-(3-(4,4'-ジメトキシ-トリチルオキシ)プロピルアミノ)-アントラキノン、1,8-ビス(4-(2-ヒドロエチル)フェニルアミノ)-アントラキノンおよび1-(4-(2-ヒドロエチル)フェニルアミノ)-8-(4-(2-(4,4'-ジメトキシ-トリチルオキシ)エチル)フェニルアミノ)-アントラキノン。
【請求項３】
クエンチャーが、l,4-ビス(2-ヒドロキシ-エチルアミノ)-6-メチルアントラキノンである、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項４】
オリゴヌクレオチドプローブの10％未満、例えば5％未満が、5'末端にGを有する、請求項１−３のいずれかに記載のライブラリー。
【請求項５】
ライブラリー中のいずれのオリゴヌクレオチドも、5'末端にGを有さない、請求項４に記載のライブラリー。
【請求項６】
ライブラリー中のプローブの認識配列タグセグメントが以下の方法の少なくとも１つにより修飾されている、請求項１−５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブライブラリー：
i) 少なくとも１つの非天然ヌクレオチドによる置換；
ii)プローブの安定性を増大させる少なくとも１つの化学的部分による置換。
【請求項７】
認識配列タグの長さが6〜12ヌクレオチドである、請求項１−６のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブライブラリー。
【請求項８】
認識配列タグの長さが8または9ヌクレオチドである、請求項７に記載のオリゴヌクレオチドプローブライブラリー。
【請求項９】
認識配列タグがLNAヌクレオチドにより置換されている、請求項８に記載のオリゴヌクレオチドプローブライブラリー。
【請求項１０】
90％を上回るオリゴヌクレオチドプローブが、核酸集団中の少なくとも２つのターゲット配列に結合してそれらを検出することができる、請求項１−９のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブライブラリー。
【請求項１１】
認識配列タグが核酸集団中の少なくとも２つのターゲット配列に相補的である、請求項１０に記載のライブラリー。
【請求項１２】
請求項１−１１のいずれかに規定するオリゴヌクレオチドプローブのサブセットの混合物を含む、長さ8および9ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドプローブライブラリー。
【請求項１３】
核酸集団中の相異なるターゲット配列の数が少なくとも100である、請求項１−１２のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブライブラリー。
【請求項１４】
各オリゴヌクレオチドプローブにおける少なくとも１つのヌクレオチドが、非天然ヌクレオチドアナログ、デオキシリボースもしくはリボースアナログ、またはホスホジエステル結合以外のヌクレオチド間結合により置換されている、請求項１−１３のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブライブラリー。
【請求項１５】
検出部分が共有もしくは非共有結合したマイナーグルーブバインダーまたは以下を含む群から選択されるインターカレーターのような化学的部分を含む、請求項１−１４のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブライブラリー：不斉シアニン色素、DAPI、SYBR Green I、SYBR Green II、SYBR Gold、PicoGreen、チアゾールオレンジ、Hoechst 33342、エチジウムブロマイド、1-O-(1-ピレニルメチル)グリセロール、およびHoechst 33258。
【請求項１６】
ホスホジエステル結合以外のヌクレオチド間結合が非リン酸ヌクレオチド間結合である、請求項１４または１５に記載のオリゴヌクレオチドプローブライブラリー。
【請求項１７】
ヌクレオチド間結合が以下からなる群より選択される、請求項１６に記載のオリゴヌクレオチドプローブライブラリー：アルキルホスホネート、ホスホラミダイト、アルキルホスホトリエステル、ホスホロチオエート、およびホスホロジチオエート結合。
【請求項１８】
オリゴヌクレオチドプローブが、相補的核酸配列へのそれらの結合を増強する以下のような非天然ヌクレオチドを含む、請求項１−１７のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブライブラリー：2'-O-メチル、ジアミンプリン、2-チオウラシル、5-ニトロインドール、ユニバーサルもしくはディジェネレート塩基、インターカレート核酸、またはマイナーグルーブバインダー。
【請求項１９】
すべてのオリゴヌクレオチドプローブが少なくとも１つの5-ニトロインドール残基を含む、請求項１８に記載のライブラリー。
【請求項２０】
相異なる認識配列が所定の長さのすべての可能性あるオリゴヌクレオチドの1％未満に含まれる、請求項１−１９のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブライブラリー。
【請求項２１】
各プローブが二重標識を用いてモレキュラービーコンアッセイ原理により検出可能である、請求項１−２０のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブライブラリー。
【請求項２２】
各プローブが二重標識を用いて5'ヌクレアーゼアッセイ原理により検出可能である、請求項１−２０のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブライブラリー。
【請求項２３】
各プローブがモレキュラービーコンアッセイ原理により検出可能な検出部分を１つ含む、請求項１−２２のいずれかに記載のライブラリー。
【請求項２４】
ターゲット核酸集団がmRNAサンプル、cDNAサンプル、またはゲノムDNAサンプルである、請求項１−２３のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブライブラリー。
【請求項２５】
ターゲットmRNAまたはターゲットcDNA集団がヒト、マウス、ラット、シロイヌナズナ、キイロショウジョウバエ、チンパンジーまたは線虫のトランスクリプトームに由来する、請求項２４に記載のオリゴヌクレオチドプローブライブラリー。
【請求項２６】
プローブターゲット配列がターゲット核酸集団中の4％を上回る相異なるターゲット核酸に少なくとも１つ存在する、請求項１−２５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブライブラリー。
【請求項２７】
自己相補的プローブ配列が除かれている、請求項１−２６のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブライブラリー。
【請求項２８】
自己相補的配列が選択により除かれている、請求項２７に記載のオリゴヌクレオチドプローブライブラリー。
【請求項２９】
自己相補的配列が以下のような配列特異的修飾により除かれている、請求項２７に記載のオリゴヌクレオチドプローブライブラリー：非標準ヌクレオチド、SBC核酸塩基を有するヌクレオチド、2'-O-メチル、ジアミンプリン、2-チオウラシル、ユニバーサルもしくはディジェネレート塩基、またはマイナーグルーブバインダー。
【請求項３０】
各プローブの融解温度 (Tm) がLNAのような非天然修飾による置換によってPCRに基づくアッセイに好適なように調節されており、相補的核酸配列に対するそれらの結合を増大させるSBC核酸塩基、2'-O-メチル、ジアミンプリン、2-チオウラシル、5-ニトロインドール、ユニバーサルもしくはディジェネレート塩基、インターカレート核酸またはマイナーグルーブバインダーにより修飾されていてもよい、請求項１−２９のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブライブラリー。
【請求項３１】
各プローブの融解温度 (Tm) が少なくとも50℃である、請求項１−３０のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブライブラリー。
【請求項３２】
各プローブがDNAヌクレオチドを5'末端に有する、および／またはDNAヌクレオチドを3'末端に有する、請求項１−３１のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブライブラリー。
【請求項３３】
各プローブがモレキュラービーコン原理により検出できる、請求項１−３２のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブライブラリー。
【請求項３４】
ターゲット集団がヒトトランスクリプトームである、請求項１−３３のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブライブラリー。
【請求項３５】
各オリゴヌクレオチドプローブが、可能性ある最大数の相異なるターゲット核酸を検出し、その結果該ライブラリーによる所定のターゲット核酸集団のカバレージが最大となる、請求項１−３４のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブライブラリー。
【請求項３６】
オリゴヌクレオチドプローブが、最大級の検出を得るため核酸ターゲット集団内に可能な限り多くのターゲット配列または結合部位を有するように選択される、請求項１−３５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブライブラリー。
【請求項３７】
オリゴヌクレオチドプローブが、最大級の検出を得るため核酸ターゲット集団内の可能な限り多くのターゲット核酸において少なくとも１つのターゲット配列を有するように選択される、請求項１−３６のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブライブラリー。
【請求項３８】
いずれかの所定の核酸集団において相補的配列を検出することができる、以下の表１、表１ａ、表Ａまたは表Ｂのオリゴヌクレオチドプローブライブラリー：
2008523828.tif 000002
【表２】
2008523828.tif 000003
2008523828.tif 000004
2008523828.tif 000005
【表５】
2008523828.tif 000006
【表６】
2008523828.tif 000007
。
【請求項３９】
以下の表１または表１ａに挙げる認識エレメントを有する各々のプローブを含み、および／または該表１に挙げる認識エレメントに相補的な認識エレメントを有する各々のプローブを含む、請求項１−３８のいずれかに記載のライブラリー：
2008523828.tif 000008
2008523828.tif 000009
2008523828.tif 000010
2008523828.tif 000011
。
【請求項４０】
ターゲット配列のサンプルを請求項１−３９のいずれかに記載のライブラリーと接触させること、および該ターゲット配列に結合するプローブ配列を検出、特徴決定、または定量することを含む、複数のターゲット配列のプロファイルを調べるための方法。
【請求項４１】
複数の配列の10％未満に存在する、マルチプローブ配列が結合する核酸配列の検出を提供する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
ターゲットmRNA配列またはcDNA配列がトランスクリプトームを構成する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
トランスクリプトームがヒトトランスクリプトームである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
プローブライブラリーが固体支持体に共有結合している、請求項４０−４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
固体支持体がマイクロタイタープレートを含み、該マイクロタイタープレートの各ウェルが相異なるライブラリープローブを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
検出工程がライブラリープローブに相補的な認識配列を含むターゲット核酸配列を増幅することにより行われる、請求項４０−４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
ターゲット核酸の増幅がライブラリープローブに相補的な認識配列を挟むオリゴヌクレオチドプライマーのペアを用いて行われる、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
１以上のターゲット核酸配列の存在または発現レベルがある種の表現型と相関する、請求項４０−４７のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
表現型が疾患である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
請求項１−３９のいずれかに記載のライブラリーを用いて核酸混合物を解析する方法であって、以下の工程を含む方法：
(a) ターゲットオリゴヌクレオチドを標識オリゴヌクレオチドプローブのライブラリーと接触させ、該ターゲットオリゴヌクレオチドを少なくとも１つの該プローブライブラリーのメンバーにハイブリダイズさせ、それによりハイブリダイズ済ライブラリーを形成する、ここで該オリゴヌクレオチドプローブは各々既知の配列を有し、かつ固体支持体に既知の位置で連結している；
(b) 標識プローブまたはその断片がハイブリダイズした該ハイブリダイズ済ライブラリーの該位置を同定し、該ターゲットオリゴヌクレオチドの配列を決定する；または、
(c) 該ハイブリダイズ済ライブラリーを二本鎖オリゴヌクレオチドを切断可能なヌクレアーゼと接触させ、該ハイブリダイズ済ライブラリーから該標識オリゴヌクレオチドプローブまたはその断片の一部を解離させ、標識プローブまたはその断片が除去された該ハイブリダイズ済ライブラリーの該位置を同定し、該非標識ターゲットオリゴヌクレオチドの配列を決定する。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
本発明は、それゆえ、オリゴヌクレオチドプローブライブラリーであって、ライブラリー中の各プローブが認識配列タグおよび検出部分からなり、各オリゴヌクレオチドプローブの少なくとも１つのモノマーが修飾モノマーアナログであることにより対応する非修飾オリゴヌクレオチド（例えば非修飾オリゴデオキシリボヌクレオチドまたはオリゴリボヌクレオチドであり得る）と比較して相補的ターゲット配列に対する結合親和性が増大しており、これによりライブラリープローブがいずれの所定のターゲット集団においても配列特異的結合およびターゲット核酸の相当な画分の検出に十分な安定性を有し、かつ相異なる認識配列の数が所定の長さのすべての可能性ある配列タグの10％未満に含まれる、オリゴヌクレオチドプローブライブラリーに関する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７０】
細菌はかなりATリッチであり得る。このことはヒトプローブライブラリーのプローブが良いカバレージを示さない理由を説明している。ATリッチな生物についてプローブを設計するのは、融点が低いので難題である。プローブはその融点を達成するためにより長くなくてはならないが、するとカバレージが下がる。主にATリッチなゲノムについてのプローブライブラリーを以下の「細菌の表」（同様に図１７のプログラムにより同定された）に示す。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７８】
このデータベース中のターゲット配列は、マルチプローブライブラリーの最適なターゲットの例である。これらの最適マルチプローブは以下の表１に挙げられ、これらは5' フルオレセインフルオロフォアおよび 3' Eclipse または他のクエンチャーを含む（以下参照）。
【表１１】
2008523828.tif 000012
【表１２】
2008523828.tif 000013
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１８】
実施例１６
ヒト遺伝子のためのqPCR
プローブライブラリーは、以下のようなリアルタイムPCR設計ソフトウェアと組み合わせて使用する：
・インプット配列を、独自の識別子を介して、またはサブミットされている核酸配列を登録することにより認識できる、
・その核酸をターゲットとできるすべてのプローブを同定できる、
・ターゲット配列の選択基準、例えば3’末端への近接性またはイントロン-エクソンの境界への近接性、にしたがいプローブをソートできる、
・可能であれば、その核酸配列をターゲットとするプローブを挟むPCRプライマーをPCR設計ルールにしたがい設計できる、
・利用可能なリアルタイムPCRアッセイを上記手順に基づき提案できる。