(57)【要約】  農作物においてエチレン応答を阻害する方法が開示されており、前記農作物の少なくとも一つの植物の少なくとも一部分に対して、前記少なくとも一つの植物においてエチレン応答を阻害するのに効果的な量の水溶性シクロプロピル−１−エニル−プロパン酸塩（ＷＳ−ＣＰＤ、式Ｉ）の溶液を適用する工程を含んでおり、式中のＭは、ナトリウム（Ｎａ）、リチウム（Ｌｉ）、カリウム（Ｋ）、および、１／２カルシウム（Ｃａ）からなるグループから選択される。【選択図】なし
2012515197.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
農作物においてエチレン応答を阻害する方法であって、前記農作物の少なくとも一つの植物の少なくとも一部分に対して、前記少なくとも一つの植物においてエチレン応答を阻害するのに効果的な量の水溶性シクロプロピル−１−エニル−プロパン酸塩（ＷＳ−ＣＰＤ、式Ｉ）の溶液を適用する工程を含み、式中のＭが、ナトリウム（Ｎａ）、リチウム（Ｌｉ）、カリウム（Ｋ）、および、１／２カルシウム（Ｃａ）からなるグループから選択される、農作物においてエチレン応答を阻害する方法。
【化１】
2012515197.tif 000008
【請求項２】
前記Ｍが、ナトリウムである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記溶液が、水溶液である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記溶液を適用する工程が、（ａ）前記少なくとも一つの植物と前記溶液との接触、（ｂ）前記溶液への前記少なくとも一つの植物の少なくとも一部分の浸漬、（ｃ）前記少なくとも一つの植物の少なくとも一部分に対する前記溶液の噴霧、（ｄ）前記少なくとも一つの植物に対する前記溶液の灌注、（ｅ）前記溶液を用いた前記少なくとも一つの植物の少なくとも一部分のブラッシング、および、（ｆ）これらの組み合わせ、からなるグループから選択された所定の技術によって前記溶液を適用する別の工程をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記エチレン応答が、老化、植物の葉柄の離脱、および、クロロフィル分解からなるグループから選択される請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記農作物が、穀物、マメ科植物、油脂生産植物、繊維生産植物、および、タバコからなるグループから選択される請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記穀物が、小麦、大麦、米、トウモロコシ（コーン）、および、オート麦からなるグループから選択される請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記マメ科植物が、大豆、エンドウ豆、落花生、および、豆類からなるグループから選択される請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記油脂生産植物が、ヒマワリ、ベニバナ、トウゴマ、亜麻、胡麻、エゴマ、および、菜種からなるグループから選択される請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記繊維生産植物が、綿花、および、麻からなるグループから選択される請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記エチレン応答の阻害が、（ａ）収穫量の増大、（ｂ）葉柄の離脱率の減少、（ｃ）葉のクロロフィル含量の分解率の減少、（ｄ）止め葉の老化の遅延、（ｅ）穂の緑色器官の老化の遅延、および、（ｆ）これらの組み合わせ、からなるグループから選択された差異によって明白となり、前記差異が、前記エチレン応答が阻害されていない植物と比較して測定される請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
界面活性ＷＳ−ＣＤＰ含有水溶液を得るに十分な量の界面活性剤を加える別の工程をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
農作物の老化を遅延する方法であって、前記農作物の少なくとも一つの植物の少なくとも一部分に対して、前記少なくとも一つの植物の寿命を延ばすのに効果的な量の水溶性シクロプロピル−１−エニル−プロパン酸塩（ＷＳ−ＣＰＤ、式Ｉ）の溶液を適用する工程を含み、式中のＭが、ナトリウム（Ｎａ）、リチウム（Ｌｉ）、カリウム（Ｋ）、および、１／２カルシウム（Ｃａ）からなるグループから選択される、農作物の老化を遅延する方法。
【化２】
2012515197.tif 000009
【請求項１４】
前記Ｍが、ナトリウムである請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記溶液が、水溶液である請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記農作物が、葉菜、香辛料生産植物、および、薬草からなるグループから選択される請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記溶液を適用する工程が、（ａ）前記少なくとも一つの植物と前記溶液との接触、（ｂ）前記溶液への前記少なくとも一つの植物の少なくとも一部分の浸漬、（ｃ）前記少なくとも一つの植物の少なくとも一部分に対する前記溶液の噴霧、（ｄ）前記少なくとも一つの植物に対する前記溶液の灌注、（ｅ）前記溶液を用いた前記少なくとも一つの植物の少なくとも一部分のブラッシング、および、（ｆ）これらの組み合わせ、からなるグループから選択された所定の技術によって前記溶液を適用する別の工程をさらに含む請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、農作物でのエチレン応答をブロックするための水溶性組成物および方法に関し、具体的には、３−（シクロプロピル−１−エニル）−プロパンナトリウム塩（ＷＳ−ＣＰＤ）を用いることで、農作物においてエチレンが制御している生長、再生、および、生産などの様々なプロセスを阻害するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
エチレンは、様々な植物の生長プロセスを調節する揮発性の植物ホルモンである。例えば、エチレンは、オーキシン輸送のブロッキングや、アブシジン酸（ＡＢＡ）の合成の誘発などのプロセスにおいて、植物体内のホルモンバランスの調節に関与している。また、エチレンは、果実熟成の促進、酵素活性の向上、熟成および老化ならびに休眠の促進、クロロフィル分解、葉および果実の離脱、上偏生長、ならびに植物生長方位および植物根の生長などのその他の変化、ならびに重力屈性反応の改変といった植物のライフサイクルにおける様々な現象の制御にも関与している。植物におけるエチレン生産は、高温、冷却および凍結、干ばつ、および、過度の水分供給または洪水、放射線、機械的ストレス、ならびに病原体または昆虫による攻撃などの様々な形態の環境ストレスによって増長される。２０世紀初頭以来、生産者たちは、収穫期の前後に、収穫量を調整するためにエチレンを使用してきた。熟成前の果実の落下の予防や、果実の保持に要する支持力を減少させるなどの目的でエチレンの作用を阻害するか、あるいは、綿花の葉の離脱を促して機械的収穫を容易にしたり、果実の寿命を延ばしたり、そして、切り花の花もちを良くしたりなどの目的でエチレンを利用することによって、エチレンの奏する効果を制御する必要性が故に、科学者たちは、エチレンの生合成または作用をブロックする化学物質の開発を試みる一方で、エチレンを放出する化学物質の開発にもあたってきた。ローヌ・プーラン社から市販されているエテフォン（商標）（以下、「エテフォン」と称する）は、エチレン放出性化学物質の一例であり、また、アミノエトキシビニルグリシン（ＡＶＧ）は、エチレンの生合成をブロックし、そして、揮発性化合物である１−メチル−シクロプロペン（１−ＭＣＰ）は、植物におけるエチレン作用に対するアンタゴニストである。１−ＭＣＰは、この１５年の内に広く普及するに至った化学物質であり、収穫後の取り扱いにおいて、果実の熟成を阻害して品質保持期限を延ばしたり、葉菜や切り花の老化を遅延させたりするために用いられているが、最大の欠点は、閉環境での使用が必須であるその揮発性である。１−ＭＣＰは、非常に有効なエチレンアンタゴニストであるので、これまでのところ、非揮発性（そして、以下に詳述するように、好ましくは、水溶性）のシクロプロペン誘導体の開発を主目的として研究が行われてきた。
【０００３】
ガス状の、またはより多くの場合はエテフォン（商標）のようなエチレン放出化合物の手段によるエチレンの適用は、主に、小さな果実を間引くために使用されたり、機械的収穫を円滑にするために熟れた果実を落実させたり、目的に応じて落葉を促したり、開花を誘発したり、そして、熟成（バナナ）や斑入（柑橘類）を促したりするために用いられている。また、エチレンは、若枝の生長を阻害するために、広範に利用がされている。その一方で、エチレンアンタゴニストも農業分野で広範に利用されている。エチレンアンタゴニストの用途の例としては、様々な植物器官の離脱の予防、花卉、果実および野菜の商品寿命の延長、および、葉の老化のブロッキングまたは遅延がある。
【０００４】
様々な農作物、とりわけ、穀物での登熟は、主に、止め葉や、小麦の穂およびトウモロコシの穂の様々な箇所での光合成の速度と期間によって決定される。最終的な穀物の重量に対する穂のみの光同化部分の寄与率は、約２５％であると見積もられている。止め葉や未熟な穂の部分からの光同化性の供給を制限する主な因子は、老化である。エチレンは、老化を開始する主たる因子の一つである。多くの農作物は、特に、農作物がよく直面する干ばつのようなストレスを被る条件下にあっては、自然にエチレンを生産している。エチレンアンタゴニストを利用することで、小麦の収穫量が向上することが報告されている。おそらく、この効果は、老化を遅延または妨害するエチレンアンタゴニストの作用に起因するものであり、これにより、植物が光合成作用を呈する期間が延長されることとなる。エチレンアンタゴニストのこの特性は、すべての農作物に共通する代謝プロセスに影響を与えるものであるので、その特性は、すべての農作物に及ぶものと考えられる。
【０００５】
通常、水に対する溶解性は、利用した化学物質を植物の組織に浸透させる上で有利に作用する。多くの植物ホルモン、ならびに、合成ホルモンおよびホルモンアンタゴニストは、水に難溶性の酸である。これら化学物質の水溶液の調製に際しては、これら化学物質を、まず最初に有機溶媒に溶解するか、あるいは、ｐＨを７の近傍またはそれ以上に維持する必要がある。しかしながら、これらの手順は、大規模生産の形態には適していない。上記化学物質の利用を容易にするための一般的な方法として、それら物質を、水に対して容易に溶解する塩形態に変換する方法がある。この例として、発根ホルモンであるインドール−３−酢酸がある。挿し木の端部を浸漬するための苗床として、長年にわたって、タルク粉末に遊離酸を混合したものが利用されている。ホルモン溶液に挿し木の端部を浸漬することが、遊離酸へ浸漬した場合よりも多くの場合有益であるとの知見から、水溶性に富んだインドール−３−酪酸のカリウム塩の合成へと至ったのである。現在のところ、この産物は、遊離酸よりも多くの苗床に好まれている。この知見とその他の知見が、揮発性シクロプロペン誘導体に基づいた水溶性エチレンアンタゴニストの研究と開発を促すに至っている。
【０００６】
幾つかの文献、特に、ノースカロライナ大学のシスラーの研究グループに由来する文献は、シクロプロペニルアルカン酸の合成に対する様々なアプローチを開示している。例えば、米国特許第６，３６５，５４９号公報、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  １９９６，  ５２，  ３４０９、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  １９９６，  ５２，  １２５０９、および、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ２００４，  ６０，  １８０３を、参照されたい。そこに開示された方法の内、シクロプロペニルプロパン酸の合成に最も好適であると先験的に考えられる方法は、成功しないということが分かっている。したがって、シクロプロペニルプロパン酸の製造のための新たな合成戦略が、必要とされているのである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
このように、農作物において利用可能であり、しかも、室温で固体を呈し、また、長期安定性を示し、そして、水溶性に富んだ性質を有する植物エチレン応答の阻害剤が、依然として待望されているのである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
したがって、本願発明の目的は、農作物においてエチレン応答を阻害する方法であって、前記農作物の少なくとも一つの植物の少なくとも一部分に対して、前記少なくとも一つの植物においてエチレン応答を阻害するのに効果的な量の水溶性シクロプロピル−１−エニル−プロパン酸塩（ＷＳ−ＣＰＤ、式Ｉ）の溶液を適用する工程を含み、式中のＭが、ナトリウム（Ｎａ）、リチウム（Ｌｉ）、カリウム（Ｋ）、および、１／２カルシウム（Ｃａ）からなるグループから選択される方法を開示することにある。
【化１】
2012515197.tif 000003
【０００９】
Ｍがナトリウムである方法を開示することが、本願発明のさらなる目的である。
【００１０】
前記溶液が水溶液である方法を開示することが、本願発明のさらなる目的である。
【００１１】
前記溶液を適用する工程が、（ａ）前記少なくとも一つの植物と前記溶液との接触、（ｂ）前記溶液への前記少なくとも一つの植物の少なくとも一部分の浸漬、（ｃ）前記少なくとも一つの植物の少なくとも一部分に対する前記溶液の噴霧、（ｄ）前記少なくとも一つの植物に対する前記溶液の灌注、（ｅ）前記溶液を用いた前記少なくとも一つの植物の少なくとも一部分のブラッシング、および、（ｆ）これらの組み合わせ、からなるグループから選択された所定の技術によって前記溶液を適用する別の工程をさらに含む、方法を開示することが、本願発明のさらなる目的である。
【００１２】
前記エチレン応答が、老化、植物の葉柄の離脱、および、クロロフィル分解からなるグループから選択される、方法を開示することが、本願発明のさらなる目的である。
【００１３】
前記農作物が、穀物、マメ科植物、油脂生産植物、繊維生産植物、および、タバコからなるグループから選択される、方法を開示することが、本願発明のさらなる目的である。
【００１４】
前記穀物が、小麦、大麦、米、トウモロコシ（コーン）、および、オート麦からなるグループから選択される、方法を開示することが、本願発明のさらなる目的である。
【００１５】
前記マメ科植物が、大豆、エンドウ豆、落花生、および、豆類からなるグループから選択される、方法を開示することが、本願発明のさらなる目的である。
【００１６】
前記油脂生産植物が、ヒマワリ、ベニバナ、トウゴマ、亜麻、胡麻、エゴマ、および、菜種からなるグループから選択される、方法を開示することが、本願発明のさらなる目的である。
【００１７】
前記繊維生産植物が、綿花、および、麻からなるグループから選択される、方法を開示することが、本願発明のさらなる目的である。
【００１８】
前記エチレン応答の阻害が、（ａ）収穫量の増大、（ｂ）葉柄の離脱率の減少、（ｃ）葉のクロロフィル含量の分解率の減少、（ｄ）止め葉の老化の遅延、（ｅ）穂の緑色器官の老化の遅延、および、（ｆ）これらの組み合わせ、からなるグループから選択された差異によって明白となり、前記差異が、前記エチレン応答が阻害されていない植物と比較して測定される、方法を開示することが、本願発明のさらなる目的である。
【００１９】
界面活性ＷＳ−ＣＤＰ含有水溶液を得るに十分な量の界面活性剤を加える別の工程をさらに含む方法を開示することが、本願発明のさらなる目的である。
【００２０】
前記農作物の少なくとも一つの植物の少なくとも一部分に対して、前記少なくとも一つの植物の寿命を延ばすのに効果的な量の水溶性シクロプロピル−１−エニル−プロパン酸塩（ＷＳ−ＣＰＤ、式Ｉ）の溶液を適用する工程を含み、式中のＭが、ナトリウム（Ｎａ）、リチウム（Ｌｉ）、カリウム（Ｋ）、および、１／２カルシウム（Ｃａ）からなるグループから選択される、農作物の老化を遅延する方法を開示することが、本願発明のさらなる目的である。
【化２】
2012515197.tif 000004
【００２１】
Ｍがナトリウムである方法を開示することが、本願発明のさらなる目的である。
【００２２】
前記溶液が水溶液である方法を開示することが、本願発明のさらなる目的である。
【００２３】
前記農作物が、葉菜、香辛料生産植物、および、薬草からなるグループから選択される、方法を開示することが、本願発明のさらなる目的である。
【００２４】
前記溶液を適用する工程が、（ａ）前記少なくとも一つの植物と前記溶液との接触、（ｂ）前記溶液への前記少なくとも一つの植物の少なくとも一部分の浸漬、（ｃ）前記少なくとも一つの植物の少なくとも一部分に対する前記溶液の噴霧、（ｄ）前記少なくとも一つの植物に対する前記溶液の灌注、（ｅ）前記溶液を用いた前記少なくとも一つの植物の少なくとも一部分のブラッシング、および、（ｆ）これらの組み合わせ、からなるグループから選択された所定の技術によって前記溶液を適用する別の工程をさらに含む、方法を開示することが、本願発明のさらなる目的である。
【００２５】
前記農作物が、（ａ）穀物および穀類作物―小麦、オート麦、大麦、ライ麦、米、トウモロコシ、穀実用モロコシ、（ｂ）採種用マメ科植物―ピーナッツ、フィールドピー、ササゲ、大豆、ライマメ、緑豆、ヒヨコマメ、キマメ、ソラマメ、および、平豆、（ｃ）飼料作物―牧草、マメ科植物、アブラナ科植物、および、干し草、穀物飼料、家畜用飼料、貯蔵牧草、または、青草のために栽培および使用されるその他の作物、（ｄ）根菜作物―サツマイモ、および、キャッサバ、（ｅ）繊維作物―綿花、亜麻、カラムシ、ケナフ、および、麻、（ｆ）塊茎作物―ジャガイモ、（ｇ）糖料作物―甜菜、甘蔗、（ｈ）嗜好品作物―タバコ、並びに、（ｉ）油料作物―菜種／キャノーラ、ヒマワリ、ベニバナ、胡麻、亜麻仁、トウゴマ、および、エゴマからなるグループから選択される、方法を開示することが、本願発明のさらなる目的である。
【００２６】
農作物の収穫量を、特に、植物のエチレンに対する老化反応を抑制することによって、向上させる方法であって、少なくとも一つの植物の少なくとも一部分に対して、少なくとも一つの植物の寿命を延ばすのに効果的な量のＷＳ−ＣＰＤを適用することを含む方法を開示することが、本願発明のさらなる目的である。
【００２７】
農作物の落葉率を、特に、エチレンに対する植物の落葉反応を抑制することによって、減少させる方法であって、少なくとも一つの植物の少なくとも一部分に対して、少なくとも一つの植物の寿命を延ばすのに効果的な量のＷＳ−ＣＰＤを適用することを含む方法を開示することが、本願発明のさらなる目的である。
【００２８】
穀物（例えば、小麦、大麦、トウモロコシ、または、米）についての穀物収穫量の増大をもたらす「止め葉」や穂の緑色器官の老化を遅延させる方法であって、少なくとも一つの植物の少なくとも一部分に対して、少なくとも一つの穀物の寿命を延ばすのに効果的な量のＷＳ−ＣＰＤを適用する工程を含む方法を開示することが、本願発明のさらなる目的である。
【００２９】
葉菜（例えば、レタスやベビーレタス、キャベツ、ほうれん草、または、アメリカンセロリ）の老化を遅延させる方法であって、少なくとも一つの葉菜の少なくとも一部分に対して、少なくとも一つの葉菜の寿命を延ばすのに効果的な量のＷＳ−ＣＰＤを適用する工程を含む方法を開示することが、本願発明のさらなる目的である。
【００３０】
香辛料薬草の老化を遅延させる方法であって、少なくとも一つの薬草の少なくとも一部分に対して、少なくとも一つの薬草の寿命を延ばすのに効果的な量のＷＳ−ＣＰＤを適用する工程を含む方法を開示することが、本願発明のさらなる目的である。
【００３１】
挿し木の老化を遅延させる方法であって、少なくとも一つの植物の少なくとも一部分に対して、少なくとも一つの植物の寿命を延ばすのに効果的な量のＷＳ−ＣＰＤを適用する工程を含む方法を開示することが、本願発明のさらなる目的である。
【００３２】
農作物での葉のクロロフィル含量の分解率を、特に、エチレンに対する植物クロロフィル分解反応を抑制することによって、減少させる方法であって、少なくとも一つの植物の少なくとも一部分に対して、少なくとも一つの植物の寿命を延ばすのに効果的な量のＷＳ−ＣＰＤを適用することを含む方法を開示することが、本願発明のさらなる目的である。
【００３３】
溶液を適用する工程が、ＷＳ−ＣＰＤを含む水溶液中で、当該水溶液で、または、当該水溶液を用いて、少なくとも一つの植物の少なくとも一部分に対して、浸漬、噴霧、ブラッシング、または、灌注からなるグループから選択される技術によって実施される上記の任意の方法を開示することが、本願発明のさらなる目的である。
【００３４】
農作物のエチレン応答を阻害する方法であって、界面活性ＷＳ−ＣＰＤ含有水溶液を生成するに十分な量の界面活性剤とＷＳ−ＣＰＤとを混合する工程をさらに含む方法を開示することが、本願発明のさらなる目的である。
【００３５】
式Ｉによって表される水溶性シクロプロピル−１−エニル−プロパン酸ナトリウム塩（ＷＳ−ＣＰＤ）を開示することが、本願発明のさらなる目的である。
【化３】
2012515197.tif 000005
【００３６】
（ａ）以下のピーク箇所（ＴＭＳに対するδ値）、分裂パターン、および、積分値：０．８８（ｓ，２Ｈ）、２．４２（ｔ，２Ｈ）、２．７５（ｔ，２Ｈ）、および、６．５２（ｓ，１Ｈ）を特徴とするメタノール溶液にて得られた１Ｈ−ＮＭＲスペクトル、（ｂ）以下のピーク箇所（ＴＭＳに対するδ値）：４．２７、２３．５８、３４．９０、９７．２１、１２０．１８、および、１８０．０６を特徴とするメタノール溶液にて得られた１３Ｃ｛１Ｈ｝−ＮＭＲスペクトル、ならびに、（ｃ）δ−２．４６ｐｐｍでのピークを特徴とするジュウテロメタノール溶液にて得られた２３Ｎａ｛１Ｈ｝−ＮＭＲスペクトルによって特徴付けられる水溶性シクロプロピル−１−エニル−プロパン酸ナトリウム塩（ＷＳ−ＣＰＤ）を開示することが、本願発明のさらなる目的である。
【００３７】
粉末の形態である場合に、（ａ）２θ＝１０．６°、１５．９４°、２８．４２°、４７．３°、および、５６．１６°であるピーク、および、（ｂ）２θ  〜  ２３°を中心とした幅広いピークからなるグループから選択される少なくとも一つのパターンを含むＸ線回折パターンによって特徴付けられる水溶性シクロプロピル−１−エニル−プロパン酸ナトリウム塩（ＷＳ−ＣＰＤ）を開示することが、本願発明のさらなる目的である。
【００３８】
水溶液の形態である場合に、浸漬、ブラッシング、噴霧、灌注、または、これらの組み合わせからなるグループから選択される手段によって植物の少なくとも一部分に対して適用されるＷＳ−ＣＰＤを開示することが、本願発明のさらなる目的である。
【００３９】
上記のように定義したＷＳ−ＣＰＤであって、界面活性水溶液の形態で提供されるＷＳ−ＣＰＤを開示することが、本願発明のさらなる目的である。
【００４０】
本明細書に添付した図面を参照しつつ、実施例を示すことにより、本願発明をさらに詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】エチレン（１０μＬ／Ｌ）で誘発した綿花の幼苗の葉の上偏生長において、ＷＳ−ＣＰＤを噴霧して前処理をした効果を示す図である。
【図２】エチレン（１０μＬ／Ｌ）で誘発した綿花の幼苗の葉の上偏生長において、ＷＳ−ＣＰＤを噴霧して前処理をした効果を示す図である。
【図３】エチレン（１０μＬ／Ｌ）で誘発した綿花の幼苗の葉の上偏生長において、ＷＳ−ＣＰＤを噴霧して前処理をした効果を示す図である。
【図４】エチレン（１０μＬ／Ｌ）で誘発した綿花の幼苗の葉の上偏生長において、ＷＳ−ＣＰＤを噴霧して前処理をした効果を示す図であり、葉柄と葉身との間の角度（度）で表現をしている。
【図５】エチレン（１０μＬ／Ｌ）で誘発した綿花の幼苗の葉の老化において、ＷＳ−ＣＰＤを噴霧して前処理をした効果を示す図である。
【図６】エチレン（１０μＬ／Ｌ）で誘発した綿花の幼苗の葉の葉身のクロロフィル含量の減少において、ＷＳ−ＣＰＤを噴霧して前処理をした効果を示す図である。
【図７】綿花の若木において葉の離脱を研究するための離脱モデル（外植体）である。
【図８】エチレン（１０μＬ／Ｌ）で誘発した綿花の若木の葉の外植体の離脱において、ＷＳ−ＣＰＤを噴霧して前処理をした効果を示す図である。
【図９】エチレン（１０μＬ／Ｌ）で誘発した異なる生育段階で切り取られた綿花の葉の老化を示す図である。
【図１０】異なる生育段階で切り取られた綿花の葉の、エチレン（１０μＬ／Ｌ）で誘発したクロロフィル含量の減少において、ＷＳ−ＣＰＤを噴霧して前処理をした効果を示す図である。
【図１１】老化した綿花植物において葉の離脱を研究するための離脱モデル（外植体）である。
【図１２】エチレン（１０μＬ／Ｌ）で誘発した成熟した綿花の葉の外植体の離脱において、ＷＳ−ＣＰＤを噴霧して前処理をした効果を示す図である。
【図１３】エチレン（１０μＬ／Ｌ）で誘発したタバコの葉の老化を示す図である。
【図１４】エチレン（１０μＬ／Ｌ）で誘発したタバコの葉の老化において、ＷＳ−ＣＰＤを噴霧して前処理をした効果を示す図である。
【図１５】空気を用いた対照のタバコの苗木の葉を示す図であって、タバコの苗木の先端部分の葉（１番の葉）から茎の根元部分の葉（８番の葉）を示している。
【図１６】エチレン（１０μＬ／Ｌ）で誘発したタバコの苗木の葉の老化を示す図であって、先端部分の葉（１番の葉）から茎の根元部分の葉（７番の葉）を示している。
【図１７】エチレン（１０μＬ／Ｌ）で誘発したタバコの葉の老化において、ＷＳ−ＣＰＤ（１４μｇ／ｍｌ）を噴霧して前処理をした効果を示す図であって、先端部分の葉（１番の葉）から茎の根元部分の葉（７番の葉）を示している。
【図１８】エチレン（１０μＬ／Ｌ）で誘発したタバコの葉の老化において、ＷＳ−ＣＰＤ（１２７μｇ／ｍｌ）を噴霧して前処理をした効果を示す図であって、先端部分の葉（１番の葉）から茎の根元部分の葉（６番の葉）を示している。
【図１９】エチレン（２０μＬ／Ｌ）で誘発したタバコの苗木の葉の老化において、ＷＳ−ＣＰＤを噴霧して前処理をした効果を示す図である。
【図２０】エチレン（２０μＬ／Ｌ）で誘発したタバコの苗木の葉の老化を示す図であって、先端部分の葉（１番の葉）から茎の根元部分の葉（６番の葉）を示している。
【図２１】エチレン（２０μＬ／Ｌ）で誘発したタバコの葉の老化において、ＷＳ−ＣＰＤ（１４μｇ／ｍｌ）を噴霧して前処理をした効果を示す図であって、先端部分の葉（１番の葉）から茎の根元部分の葉（６番の葉）を示している。
【図２２】エチレン（２０μＬ／Ｌ）で誘発したタバコの葉の老化において、ＷＳ−ＣＰＤ（４２μｇ／ｍｌ）を噴霧して前処理をした効果を示す図であって、先端部分の葉（１番の葉）から茎の根元部分の葉（６番の葉）を示している。
【図２３】エチレン（２０μＬ／Ｌ）で誘発したタバコの葉の老化において、ＷＳ−ＣＰＤ（１２７μｇ／ｍｌ）を噴霧して前処理をした効果を示す図であって、先端部分の葉（１番の葉）から茎の根元部分の葉（７番の葉）を示している。
【図２４】クロロフィルの定量のために採取したタバコの苗木の上葉（１〜３番の葉）と下葉（４〜６番の葉）を示す図である。
【図２５】エチレン（２０μＬ／Ｌ）で誘発したタバコの苗木の上葉および下葉でのクロロフィル含量の減少において、ＷＳ−ＣＰＤを噴霧して前処理をした効果を示す図である。
【図２６】発芽して１４日後の小麦の苗木（空気を用いた対照）を示す図である。
【図２７】小麦の苗木の３番目の葉の生長について、発芽して１４日後に、１０日目に１μＬ／Ｌのエチレンに曝した効果を示す図である。
【図２８】小麦の苗木の３番目の葉の生長について、発芽して１４日後に、１０日目に１０μＬ／Ｌのエチレンに曝した効果を示す図である。
【図２９】小麦の苗木の３番目の葉の生長について、発芽して１４日後に、１０日目に１００μＬ／Ｌのエチレンに曝した効果を示す図である。
【図３０】エチレン（１．６〜２０μＬ／Ｌ）で誘発した小麦の苗木の３番目の葉の重量増加の遅延において、発芽して１０日後に、ＷＳ−ＣＰＤ（４〜１０００μｇ／ｍｌ）を噴霧して前処理をした効果を示す図である。結果は、発芽して１４日後に記録をした。
【図３１】止め葉の上偏生長について、乳熟期Ｉの穂に対して、ＷＳ−ＣＰＤ（１５〜４１５μｇ／ｍｌ）を噴霧する前処理に続いて、エテフォン（商標）（７５０μＬ／Ｌ）で処理をした効果を示す図である。
【図３２】止め葉の上偏生長について、乳熟期Ｉの穂に対して、ＷＳ−ＣＰＤ（１５〜４１５μｇ／ｍｌ）を噴霧する前処理に続いて、エテフォン（商標）（７５０μＬ／Ｌ）で処理をした効果を示す図である。
【図３３】乳熟期Ｉの穂における、エテフォン（商標）（７５０μＬ／Ｌ）で誘発した葉Ｉおよび葉ＩＩの老化を示す図である。
【図３４】エテフォン（商標）（７５０μＬ／Ｌ）で誘発した葉Ｉおよび葉ＩＩの老化に対する、乳熟期Ｉの穂におけるＷＳ−ＣＰＤ（１５μｇ／ｍｌ）の前処理の効果を示す図である。
【図３５】エテフォン（商標）（７５０μＬ／Ｌ）で誘発した葉Ｉおよび葉ＩＩの老化に対する、乳熟期Ｉの穂におけるＷＳ−ＣＰＤ（４５μｇ／ｍｌ）の前処理の効果を示す図である。
【図３６】エテフォン（商標）（７５０μＬ／Ｌ）で誘発した葉Ｉおよび葉ＩＩの老化に対する、乳熟期Ｉの穂におけるＷＳ−ＣＰＤ（１３５μｇ／ｍｌ）の前処理の効果を示す図である。
【図３７】エテフォン（商標）（７５０μＬ／Ｌ）で誘発した葉Ｉおよび葉ＩＩの老化に対する、乳熟期Ｉの穂におけるＷＳ−ＣＰＤ（４５０μｇ／ｍｌ）の前処理の効果を示す図である。
【図３８】小麦の穂の器官の実物説明図である。
【図３９】葉Ｉおよび葉ＩＩのクロロフィル含量について、乳熟期Ｉの穂に対して、ＷＳ−ＣＰＤ（１２〜３１２μｇ／ｍｌ）を用いた前処理に続いて、エテフォン（商標）（２５０μＬ／Ｌ）で処理をした効果を示す図である。
【図４０】包頴および籾殻のクロロフィル含量について、乳熟期Ｉの穂に対して、ＷＳ−ＣＰＤ（１２〜３１２μｇ／ｍｌ）を用いた前処理に続いて、エテフォン（商標）（２５０μＬ／Ｌ）で処理をした効果を示す図である。
【図４１】葉Ｉおよび葉ＩＩのクロロフィル含量について、乳熟期Ｉの穂に対して、ＷＳ−ＣＰＤ（１５〜４１５μｇ／ｍｌ）を用いた前処理に続いて、エテフォン（商標）（７５０μＬ／Ｌ）で処理をした効果を示す図である。
【図４２】包頴および籾殻のクロロフィル含量について、乳熟期Ｉの穂に対して、ＷＳ−ＣＰＤ（１５〜４１５μｇ／ｍｌ）を用いた前処理に続いて、エテフォン（商標）（７５０μＬ／Ｌ）で処理をした効果を示す図である。
【図４３】葉Ｉおよび葉ＩＩのクロロフィル含量について、乳熟期ＩＩの穂に対して、ＷＳ−ＣＰＤ（１５〜４１５μｇ／ｍｌ）を用いた前処理に続いて、エテフォン（商標）（７５０μＬ／Ｌ）で処理をした効果を示す図である。
【図４４】包頴および籾殻のクロロフィル含量について、乳熟期ＩＩの穂に対して、ＷＳ−ＣＰＤ（１５〜４１５μｇ／ｍｌ）を用いた前処理に続いて、エテフォン（商標）（７５０μＬ／Ｌ）で処理をした効果を示す図である。
【図４５】（Ａ）粒重（ｍｇ）および（Ｂ）エチレン単独に対するパーセンテージについて、乳熟期Ｉの穂に対して、ＷＳ−ＣＰＤ（１５〜４１５μｇ／ｍｌ）を用いた前処理に続いて、エテフォン（商標）（７５０μＬ／Ｌ）で処理をした効果を示す図である。
【図４６】砂地で栽培した小麦の乳熟期ＩＩにおける、（Ａ）最も大きな１５粒の平均重量（ｍｇ）および（Ｂ）穂粒の収穫量の平均重量（ｍｇ）について、ＷＳ−ＣＰＤ（１５〜１３５μｇ／ｍｌ）を用いた前処理に続いて、エテフォン（商標）（７５０μＬ／Ｌ）で処理をした効果を示す図である。
【図４７】穂の粒重（エチレン単独に対するパーセンテージ）について、乳熟期Ｉの穂に対して、ＷＳ−ＣＰＤ（１５〜１３５μｇ／ｍｌ）を用いた前処理に続いて、エテフォン（商標）（７５０μＬ／Ｌ）で処理をした効果を示す図である。
【図４８】粒重の分布（穂粒の合計収穫量に対するパーセンテージ）について、乳熟期ＩＩの穂に対して、ＷＳ−ＣＰＤ（４５または１３５μｇ／ｍｌ）を用いた前処理に続いて、エテフォン（商標）（７５０μＬ／Ｌ）で処理をした効果を示す図である。
【図４９】砂地で栽培した小麦の成熟（乾燥）期において、（Ａ）最も大きな１５粒の平均重量（ｍｇ）および（Ｂ）穂粒の収穫量の平均重量（ｍｇ）についての、ＷＳ−ＣＰＤ（１２０μｇ／ｍｌ）を噴霧する回数の効果を示す図である。
【図５０】砂地で栽培した小麦の成熟（乾燥）期において、（Ａ）最も大きな１５個の穂粒の平均重量（ｍｇ）（未処理の小麦に対するパーセンテージとして示した）および（Ｂ）すべての穂粒の収穫量の平均重量（エチレン単独に対するパーセンテージとして示した）についての、ＷＳ−ＣＰＤ（１２０μｇ／ｍｌ）を噴霧する回数の効果を示す図である。
【図５１】砂地で栽培した小麦の粒重の分布（穂粒の合計収穫量に対するパーセンテージ）についての、（Ａ）乳熟期Ｉおよび（Ｂ）乳熟期ＩＩにおいて、ＷＳ−ＣＰＤ（１２０μｇ／ｍｌ）を一回噴霧して処理をした効果を示す図である。
【図５２】粒重の分布（穂粒の合計収穫量に対するパーセンテージ）についての、乳熟期ＩＩにおいて、ＷＳ−ＣＰＤ（１２０μｇ／ｍｌ）を（Ａ）２回噴霧、および（Ｂ）３回噴霧して処理をした効果を示す図である。植物は、砂地で栽培した。
【図５３】粒重の分布（穂粒の合計収穫量に対するパーセンテージ）についての、乳熟期ＩＩにおいて、ＷＳ−ＣＰＤ（１２０μｇ／ｍｌ）を４回噴霧して処理をした効果を示す図である。植物は、砂地で栽培した。
【図５４】（Ａ）平均粒重（ｍｇ）および（Ｂ）未処理の小麦に対するパーセンテージで示す、乳熟期ＩＩの穂に対してＷＳ−ＣＰＤ（１２０μｇ／ｍｌ）を用いて１回噴霧をして処理をした効果を示す図である。小麦は、泥炭を主成分とする土壌を収容した４５０ｍｌ容量の植木鉢で栽培した。
【図５５】粒重の分布（穂粒の合計収穫量に対するパーセンテージ）についての、乳熟期ＩＩにおいてＷＳ−ＣＰＤ（１２０μｇ／ｍｌ）を１回噴霧して前処理をした効果を示す図である。小麦は、泥炭を主成分とする土壌を収容した４５０ｍｌ容量の植木鉢で栽培した。
【図５６】ＷＳ−ＣＰＤの１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図５７】ＷＳ−ＣＰＤの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図５８】ＷＳ−ＣＰＤの２３Ｎａ  ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図５９】ＷＳ−ＣＰＤの質量スペクトルを示す図である。
【図６０】ＷＳ−ＣＰＤのＩＲスペクトルを示す図である。
【図６１】ＷＳ−ＣＰＤの紫外可視スペクトルを示す図である。
【図６２】ナトリウムＣＰＤの電位差滴定を示す図である。
【図６３】２５℃の水でのＷＳ−ＣＰＤの（〜４００ｍｇ／ｍｌまたはそれ以上の）完全溶解を示す図である。
【図６４】ＷＳ−ＣＰＤの高速液体クロマトグラフィー分析を示す図である。
【図６５】ＷＳ−ＣＰＤのＸ線回折パターンを示す図である。
【図６６】ＷＳ−ＣＰＤの分析の詳細を示す図である。
【図６７】実験計画およびデータ収集を示す図である。
【図６８】「乳熟」期Ｉから成熟期に至るまでの種子の生長の変遷を示す図である。
【図６９】一つの穂における平均種子数の増大と種子重量との間の関連性を示す図である。
【図７０】一つの穂における平均種子重量の増大と種子数との間の関連性を示す図である。
【図７１】機械的に脱穀分離した種子の収穫量（ｇ／プロット）についてのＷＳ−ＣＰＤの効果を示す図である。
【図７２】手作業の収穫による収穫量（ｇ／１００個の穂）についてのＷＳ−ＣＰＤの効果を示す図である。
【図７３】対照の植物において、機械的に脱穀した種子と手作業で分離した種子との間での種子重量の比較を示す図である。
【図７４】手作業で分離した種子の重量（ｍｇ／種子）についてのＷＳ−ＣＰＤの効果を示す図である。
【図７５】一つの穂における種子重量の分布についてのＷＳ−ＣＰＤの効果を示す図であって、「乳熟」期Ｉでの全穂数に対するパーセンテージで示してある。
【図７６】一つの穂における種子重量の分布についてのＷＳ−ＣＰＤの効果を示す図であって、「乳熟」期ＩＩでの全穂数に対するパーセンテージで示してある。
【図７７】一つの穂における種子重量の分布についてのＷＳ−ＣＰＤの効果を示す図であって、「乳熟」期ＩおよびＩＩでの全穂数に対するパーセンテージで示してある。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
本願発明は、農作物において利用可能であり、しかも、室温で固体を呈し、また、長期安定性を示し、そして、水溶性に富んだ性質を有する植物エチレン応答の阻害剤であるＷＳ−ＣＰＤを提供するための手段と方法を開示するものである。
【００４３】
本願発明を実施するために用いられるＷＳ−ＣＰＤは、以下の式Ｉによって定義される。
【化４】
2012515197.tif 000006
【００４４】
本明細書で使用する「農作物」という用語は、一般名称であって、（園芸作物と定義されている）果実、野菜、および、花卉以外の大規模生産されるすべての農業作物とそれらの農学的分類に属するものを指す。より具体的には、農作物の用語は、（ａ）穀物および穀類作物―小麦、オート麦、大麦、ライ麦、米、トウモロコシ、穀実用モロコシ、（ｂ）採種用マメ科植物―ピーナッツ、フィールドピー、ササゲ、大豆、ライマメ、緑豆、ヒヨコマメ、キマメ、ソラマメ、および、平豆、（ｃ）飼料作物―牧草、マメ科植物、アブラナ科植物、および、干し草、穀物飼料、家畜用飼料、貯蔵牧草、または、青草のために栽培および使用されるその他の作物、（ｄ）根菜作物―サツマイモ、および、キャッサバ、（ｅ）繊維作物―綿花、亜麻、カラムシ、ケナフ、および、麻、（ｆ）塊茎作物―ジャガイモ、（ｇ）糖料作物―甜菜、甘蔗、（ｈ）嗜好品作物―タバコ、および、（ｉ）油料作物―菜種／キャノーラ、ヒマワリ、ベニバナ、胡麻、亜麻仁、トウゴマ、および、エゴマを指すものであるが、これらに限定されない。
【００４５】
本明細書で使用する「水溶液」という用語は、水を指すものである。このように定義はされているものの、ＷＳ−ＣＰＤは、粉末、錠剤、エアロゾル、乳濁液、懸濁液、水混和性溶液の形態、あるいは、ＷＳ−ＣＰＤを農作物に対して利用可能にすることができるその他の形態などの様々な実施態様で提供される。
【００４６】
モデル植物
【００４７】
この実験モデルは、（１）敏感で農業的に重要な植物の選択と、（２）「一般性」を示す標準的な生理学的システム、つまり、植物ホルモンに対する反応を含む。
【００４８】
このモデル調査のために代表的な実施例として選択した植物は、綿花（ゴシピウム  ヒルスタム  バルバデンセ  エル．（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ  Ｌ．））、タバコ（ニコチアナ  タバカム  バー．  「サムスン」（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ｖａｒ．  ’Ｓａｍｓｕｎ’））、および、小麦（トリティカム  ツルギダム  バー．  「グデラ」（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｔｕｒｇｉｄｕｍ  ｖａｒ．  ’Ｇｄｅｒａ’））であった。
【００４９】
このモデル調査では、４つの標準的な生理学的システムを採用した。
【００５０】
（１）離脱
これは、植物ホルモンの効果を研究するための高感度のモデルシステムである。エチレンは、離脱のプロセスを誘発するが、オーキシンは、そのプロセスを遅延させる。実験室にあっては、離脱箇所を含んだ植物器官の外植体を用いて実験系が構築される。エチレンに曝して離脱を誘発し、次いで、実験の最終段階にて、離脱した器官、通常は、葉身または葉柄のいずれかの数を計数し、そして、離脱の割合が算出されることとなる。果実の場合には、果実を支持する力の減少についての分析がされる。ＷＳ−ＣＰＤ（本明細書に開示したエチレン作用性アンタゴニスト）を綿花で試験する場合には、植物全体または外植体に対して、市販の０．１％キネティック（商標）を界面活性剤として含むリン酸緩衝液（１０〜２０ｍＭ、ｐＨ  ７．０）にこのアンタゴニストを溶解して得た溶液を噴霧して前処理を行い、そして、所定の時間、通常は、６〜２４時間かけて放置してインキュベーションを行う。次いで、これら植物または外植体を、さらに２４時間かけて、エチレンガス（５〜２０μｌ／ｌ）に対して曝す。そして、換気をした後に、これら植物または外植体を、制御された条件下で、所定の時間をかけてインキュベーションする。実験の最後に、離脱率が決定される。
【００５１】
（２）クロロフィル分解
これは、老化を研究するための標準的なモデルである。植物試料（植物全体、切除した葉、または、葉片）の前処理を行う。ＷＳ−ＣＰＤを、綿花、タバコ、および、小麦で試験する場合には、植物全体または外植体に対して、市販の０．１％キネティック（商標）を界面活性剤として含むリン酸緩衝液（１０〜２０ｍＭ、ｐＨ  ７．０）にこのアンタゴニストを溶解して得た溶液を噴霧して前処理を行い、そして、所定の時間、通常は、６〜２４時間かけて放置してインキュベーションを行う。次いで、これら植物または外植体を、さらに２４時間かけて、エチレンガス（１〜１００μｌ／ｌ）に対して曝すか、あるいは、エテフォン（商標）（小麦、２５０〜７５０μｌ／ｌ）を噴霧する。そして、換気をした後に、これら植物または外植体を、制御された条件下で、所定の時間をかけてインキュベーションする。実験の最後に、植物組織のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）抽出物を調製し、そして、分光光度分析法によって、ＤＭＳＯ抽出物でのクロロフィル含量が決定される。このクロロフィル含量は、生乾燥重量または表面積のいずかに基づいて報告される。
【００５２】
（３）上偏生長
これも、植物でのエチレン効果を研究するための古典的方法の一つである。エチレンが誘発した葉の上偏生長の程度は、葉柄と茎枝または葉身との間の角度の変化によって決定される。インタクトな植物に対してエチレンを曝した後に、直立状態に生育した葉を、下向きに曲げる。葉柄と茎との間の角度値（度）は、エチレンの効果を測定するために用いられる。ＷＳ−ＣＰＤを、綿花および小麦に関して試験する場合には、植物全体に対して、市販の０．１％キネティック（商標）を界面活性剤として含むリン酸緩衝液（１０〜２０ｍＭ、ｐＨ  ７．６）にこのアンタゴニストを溶解して得た溶液を噴霧して前処理を行い、そして、所定の時間、通常は、６〜２４時間かけて放置してインキュベーションを行う。次いで、これら植物を、さらに２４時間かけて、エチレンガス（綿花、５〜１０μｌ／ｌ）に対して曝すか、あるいは、エテフォン（商標）（小麦、２５０〜７５０μｌ／ｌ）を噴霧する。そして、換気をした後に、これら植物を、制御された条件下で、所定の時間をかけてインキュベーションする。上偏成長効果は、葉身と葉柄との間の下方屈曲（綿花、図１〜３）、または、葉身と茎との間の下方屈曲（小麦、図３１および３２）の度数を測定することによって表されることとなる。
【００５３】
（４）小麦粒収穫量
これは、内因性エチレンの生産を増大せしめて、老化を誘発する干ばつなどの環境ストレスに単子葉植物を曝した場合の効果を見るための一般的な試験法である。過剰な内因性エチレンまたは外因性エチレンは、穀物収穫量の減少を招く老化を促進することとなる。この研究では、乳熟期ＩおよびＩＩの穂が形成されるまで、インタクトな植物を温室で生育させた。０．１％キネティック（商標）を界面活性剤として含むリン酸緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ  ７．６）にＷＳ−ＣＰＤを溶解して得た溶液を、これら植物に対して噴霧した。
【００５４】
綿花の幼苗
【００５５】
上偏生長
３週齢の苗木（図１〜３）に対して、ＷＳ−ＣＰＤ（１０〜３００μｇ／ｍｌ）を噴霧した。２４時間後に、これらの苗木を、閉環境（湿度８５％、２２℃、標準蛍光灯）に移し、そして、さらに２４時間かけて、１０μｌ／ｌのエチレンガスに曝した。この処置の最終段階において、これらの苗木を、さらに２４時間かけて空気に曝した。葉柄の上偏生長に関するエチレン効果についての実証と、ＷＳ−ＣＰＤの完全な拮抗効果を、図２に示してある。ＷＳ−ＣＰＤは、エチレンが誘発した上偏生長に対して完全な拮抗作用を示しており、エチレン処理をした苗木は、実験期間中にわたって生育していた。１０μｇ／ｍｌおよび３０μｇ／ｍｌのＷＳ−ＣＰＤでさえもが（図２および図４の各々に記載のように）、エチレンが誘発した葉の上偏生長を完全に覆したということが明白である。
【００５６】
クロロフィル分解
３週齢の苗木に対して、１０〜３００μｇ／ｍｌのＷＳ−ＣＰＤを噴霧して、前処理をした。２４時間後に、葉の外植体を調製し（図２および図３）、これらを、閉環境（湿度８５％、２２℃、標準蛍光灯）に移し、そこで、さらに２４時間かけて、エチレン（１０μｌ／ｌ）に曝した。１０μｇ／ｍｌのＷＳ−ＣＰＤで前処理をしたところ、エチレンが誘発したクロロフィル分解に対して完全な拮抗作用を示した。処理を施した植物での葉の葉身に残存していたクロロフィル含量は、未処理の対照でのクロロフィル含量と同じであった（図５および図６）。３０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌで前処理を施した場合でも、未処理の対照と比較して、クロロフィル含量は、それぞれ、２０％および２８％増大していた（図６）。それより高濃度のＷＳ−ＣＰＤでは、あまり効果的ではなかった。
【００５７】
葉柄の離脱
３週齢のインタクトな苗木を、ＷＳ−ＣＰＤ（１０〜３００μｇ／ｍｌ）を用いて、上記した手順によって処理をした。標準的な処理手順の最終段階にて、茎と葉柄との間に離脱箇所を定めた外植体（図７）を、閉環境（湿度８５％、２２℃、標準蛍光灯）においてインキュベーションした。そうしたところ、予想通りに、エチレンは、葉柄の離脱率を増大していた。１０〜３０μｇ／ｍｌの濃度のＷＳ−ＣＰＤは、実験期間を通じて、離脱率を約２０％減少させており、また、３００μｇ／ｍｌのＷＳ−ＣＰＤで処理をした外植体の離脱率は、空気を用いた対照の処理群よりも小さかった。
【００５８】
成熟した綿花植物
【００５９】
クロロフィル分解
若幼の葉、未成熟の葉、および成熟した葉を有する若枝（６ヶ月齢）を、成熟した植物から収穫し、近隣の圃場で生育させ、そして、上記した手順によって処理をした。１０μｇ／ｍｌのＷＳ−ＣＰＤは、若幼の葉においてエチレンが誘発したクロロフィル分解に対して完全な拮抗作用を示したが（図９ａ）、高濃度（２７０μｇ／ｍｌ）の場合では、あまり効果的ではなかった（図１０ａ）。成熟した葉（図９ｃ）は、ＷＳ−ＣＰＤの拮抗効果に対する反応性が小さく、エチレンが誘発したクロロフィル分解を９５％阻害するためには、高濃度のＷＳ−ＣＰＤ（９０μｇ／ｍｌおよび２４０μｇ／ｍｌ）を必要としていた。それよりも高濃度（例えば、４８０μｇ／ｌ）の場合では、あまり効果的ではなかった（図１０ｂ）。
【００６０】
葉柄の離脱
上記した（クロロフィル分解を測定するための）手順によって得た若枝（６ヶ月齢）に対して、１０〜４８０μｇ／ｍｌのＷＳ−ＣＰＤを噴霧し、次いで、１０μｌ／ｌのエチレンに曝した。これらの若枝から調製した葉の外植体（図１１）を、閉環境（湿度８５％、２２℃、標準蛍光灯）においてインキュベーションした。１０μｇ／ｍｌおよび３０μｇ／ｍｌの用量で阻害剤を用いたところ、３日間のインキュベーションを終えた後に、離脱率は、２０％減少していた。引き続いて９０μｇ／ｍｌのＷＳ−ＣＰＤで処理をした場合の離脱率は、空気を用いた未処理の対照の離脱率よりも、わずかに小さかった。しかしながら、三つの濃度（１０、３０、および、９０μｇ／ｍｌ）のＷＳ−ＣＰＤで処理をしたすべての外植体は、５日目には、１００％の離脱率に到達していたが、高濃度（２４０〜４８０μｇ／ｍｌ）で処理をした外植体については、同じ期間において、５０％の離脱率にようやく届く状況であった（図１２）。
【００６１】
タバコの幼苗（発芽から６週間後）
【００６２】
葉の黄変
インタクトな苗木での老化プロセスの一部として、葉の葉身から緑色が徐々に抜けていき、そして、葉の色が、緑色から黄色へと変化する。この変化は、クロロフィル分析によって定量することができる。タバコの葉は、エチレンが誘発したクロロフィル分解に対して非常に敏感である。この感受性は、葉の成熟ともに増大する（図１３）。若幼の葉は、エチレンに対して抵抗性を示すが、エチレン処理を行った後でも、葉の緑色には何らの変化も示さない（図１３、１５、および、１６）。標準的な実験手順にしたがって、ＷＳ−ＣＰＤを噴霧して前処理を行い、その後、エチレン（１０μｌ／ｌ）に曝し、そして、制御された生育室（湿度８５％、２２℃、標準蛍光灯）において、さらにインキュベーションを行った。１４μｇ／ｍｌのＷＳ−ＣＰＤは、成熟した葉においてのみ、エチレンが誘発した老化に対して拮抗作用を示した（図１４〜１７）。１２７μｇ／ｍｌの濃度のＷＳ−ＣＰＤも、若幼の葉において、わずかながらも効果を示した（図１８）。エチレンの濃度を２０μｌ／ｌにまで増大させると、成熟した葉において、葉の黄変が増強されたが（図１９および図２０）、１４〜１２７μｇ／ｍｌのＷＳ−ＣＰＤで前処理を行った場合には、葉の黄変は顕著に阻害されていた（図２１〜図２３）。
【００６３】
クロロフィル分解
若幼の苗木が有する若幼の葉（上葉）と成熟した葉（下葉）の双方に関して、クロロフィル含量の決定を行った（図２４および図２５）。エチレンで処理をした若幼の葉には、緑色の脱色は目視では確認できなかったが（図２４）、空気で処理をした葉と比較して、それらのクロロフィル含量は１７％減少をしていた（図２５ａ）。成熟した葉では、エチレンは、クロロフィル含量を７２％減少させていた（図２５ａ）。１４μｇ／ｍｌのＷＳ−ＣＰＤを噴霧して前処理を行ったところ、若幼の葉と成熟した葉において、エチレンが誘発したクロロフィル分解は、完全に拮抗されていたが（図２５ａおよび図２５ｂ）、高濃度の場合では、あまり効果的ではなかった。
【００６４】
若幼の小麦苗木の栄養生長
【００６５】
発芽から１０日後に、最初の二枚の葉は、ほとんど生長しきって、葉の長さも最大になっていた。三枚目の葉は、その３日後に、葉の長さが最大となった（図２６）。この期間において、これら苗木に対して継続的にエチレン（１μｌ／ｌ）を曝したところ、三枚目の葉の長さは、空気を用いた対照にある同じ成熟した葉の長さと比較して、５０％長くなっていた（図２７）。１０μｌ／ｌおよび１００μｌ／ｌのエチレンを、これらの苗木に対して曝したところ、三枚目の葉の生長は、空気を用いた対照にある葉と比較して、それぞれ、５０〜３０％が阻害されていた（図２８および図２９）。さらに別の実験において、１．６〜２０μｌ／ｌのエチレンを、これらの苗木に対して曝したところ、三枚目の葉の生長は、それぞれ、２０〜３５％が阻害されていた。発芽から１０日後に、異なる濃度のＷＳ−ＣＰＤを噴霧して前処理を行い、そして、２４時間後に、これらの苗木に対して、エチレン  （１．６〜４０μｌ／ｌ）を、さらに二日間かけて曝したところ、低濃度のＷＳ−ＣＰＤ（４および４０μｇ／ｍｌ）だけが、三枚目の葉の生長についてのエチレンの阻害効果に対して拮抗作用を示し、そして、４０μｇ／ｍｌのＷＳ−ＣＰＤが、１．６μｌ／ｌのエチレンの阻害効果を、１００％拮抗する、ことが実証されていた（図３０）。
【００６６】
出穂した小麦の葉の上偏生長
【００６７】
出穂段階の後（発芽から６ヶ月後）に、小麦に対して、エテフォン（商標）（７５０μｌ／ｌ）を噴霧し、次いで、ＷＳ−ＣＰＤ（１５〜４１５μｇ／ｍｌ）を噴霧して前処理を行った。エテフォン（商標）処理に反応して、止め葉は、顕著な葉の上偏生長を示した。１３５および４１５μｇ／ｍｌで前処理を行ったところ、一部の止め葉において、エテフォン（商標）が誘発をした葉の上偏生長は認められなかった（図３１および図３２）。
【００６８】
小麦での葉の黄変およびクロロフィル分解
【００６９】
出穂期間の後、これら穀物は、光合成産物を蓄積していた。この穀物での生長過程は、二つの段階、すなわち、乳熟期ＩおよびＩＩと、それに続く、乾燥段階から構成されている。これらの段階にあっては、  乳熟期Ｉで止め葉と葉ＩＩでのクロロフィル含量が漸減しており、止め葉での２４５および２６０μｇ／１００ｍｇ（図３９）のクロロフィル含量が、それぞれ、乳熟期ＩＩでの１２０および１５０μｇ（図４３）へと漸減した。クロロフィルの漸減は、穂の包頴および籾殻でも検出がされており、乳熟期Ｉでの８０および１７０μｇ（図４０）が、それぞれ、乳熟期ＩＩでの４５および７０μｇ／１００ｍｇ（止め葉）へと漸減した（図４４）。
【００７０】
発芽から６．５月後に、乳熟期Ｉにある植物に対して、エテフォン（商標）（２５０および７５０μｌ／ｌ、それぞれを図３９および図４１に示した）を噴霧した。５〜６日後に、クロロフィル含量が顕著に減少し、止め葉で１６〜２１％、また、葉ＩＩで２１〜２２％の減少が認められた。１２〜６２μｇ／ｍＬのＷＳ−ＣＰＤを用いて前処理をしたところ、エテフォン（商標）が誘発したクロロフィルの減少が有意に減少し、これは止め葉（葉Ｉ）において主に認められ、また、葉ＩＩでも認められた。両方の実験において、ＷＳ−ＣＰＤで処理をした後のクロロフィル含量は、対照の植物と比較して、わずかに減少をしていた（図３９および図４１）。３１２μｇ／ｍｌの濃度にまで高めたＷＳ−ＣＰＤは、さらに効果的なものであって、２５０μｌ／ｌのエテフォン（商標）で処理をして誘発をした止め葉でのクロロフィル含量の減少に対しては、ほぼ完全な拮抗作用を示した（図３９Ａ）。４１５μｇ／ｍｌの濃度にまで高めたＷＳ−ＣＰＤについては、いずれのタイプの葉に対してもさほどの効果は認められず、エテフォン（商標）（７５０μｌ／ｌ、図４１）によって誘発されたクロロフィルの減少に対して僅かな拮抗作用を示すにすぎなかった。
【００７１】
２５０μｌ／ｌおよび７５０μｌ／ｌのエテフォンで、同じ植物を処理したところ、籾殻でのクロロフィル含量は、それぞれ、３３％および２８％が減少し、顕著な減量を示した（図４０Ａおよび図４２Ａ）。包頴でのクロロフィル含量は、上記した濃度のエテフォン（商標）を用いて、それぞれ、１０％および４０％が減少した（図４０Ｂおよび図４２Ｂ）。葉の事例と同様に、ＷＳ−ＣＰＤ（６２μｇ／ｍｌ）による前処理は、包頴および籾殻においてエテフォン（商標）（２５０μｌ／ｌ）により誘発されたクロロフィル分解を完全に覆し、むしろ、処理を施していない対照の植物でのクロロフィル含量よりも増大したクロロフィル含量（それぞれ、６０％および１０％の増大）を有していた（図４０Ａおよび４０Ｂ）。ＷＳ−ＣＰＤ（４５μｇ／ｍｌ）は、エテフォン（商標）（７５０μｌ／ｌ）が誘発をした籾殻のクロロフィル含量の減少に対して顕著な拮抗作用を示したが（図４２Ｂ）、包頴ではさほど効果的ではなかった（図４２Ａ）。
【００７２】
発芽から７ヶ月が経過して、最終段階に到達して乳熟期ＩＩに至ってもなお、この穀物は柔らかであった。この段階において、未処理の葉でのクロロフィル含量は、約５０％の減少を示しており（図４３）、また、これらの葉は、止め葉および葉ＩＩのクロロフィル含量について、それぞれ、３３％および４７％の減少を誘発するエテフォン（商標）（７５０μｌ／ｌ）に対して、より感受性になっていた（図４３）。クロロフィル分解についてのエテフォン（商標）（７５０μｌ／ｌ）に対する包頴および籾殻の感受性は、葉の感受性よりもずっと小さく、対照の未処理の穂と比較しても、１２％だけ小さいにすぎない。エテフォン（商標）（７５０μｌ／ｌ）で処理をした葉でのクロロフィルの力価を減少させるものと考えられていたＷＳ−ＣＰＤ（１５〜１３５μｇ／ｌ）を植物に噴霧して前処理をしたが、効果的ではなかった（図４３）。この場合、処理をした穂−籾殻でのクロロフィルの力価を、有意でなく３％だけ減少させるものであった（図４３）。
【００７３】
乳熟期における穀物（乾燥種子）重量
【００７４】
発芽から６〜７ヶ月が経過した後に、乳熟期ＩおよびＩＩの双方における（砂地で生育した）穀物の生重量は、８０ｍｇ／穀粒に至っており、両者に大差はなかった。エテフォン（商標）（７５０μｌ／ｌ）は、粒重を、４％（乳熟期Ｉ）および１８％（乳熟期ＩＩ）減少させていた（それぞれ、図４５および図４６に記載してある）。乳熟期Ｉにおいて、エテフォン（商標）で誘発をした葉のクロロフィルの分解に対して顕著な拮抗作用を示したＷＳ−ＣＰＤ（１３５μｇ／ｍｌ）を用いて前処理をしたところ（図４１）、双方の乳熟期において、エテフォン（商標）で誘発をした粒重の減少に歯止めがかかった（図４５〜図４７）。
【００７５】
粒重を生重量に基づいて表している図４５〜図４７に記載のデータから、乳熟期ＩおよびＩＩでの、ＷＳ−ＣＰＤが、エテフォン（商標）の効果に対して拮抗作用を示すことによって、穀物収穫量が、それぞれ、約５％および約１６％増大していたことは明らかである。粒重分布（収穫した穂粒の総数に対するパーセンテージとして表したもの）を算出し、そして、エテフォン（商標）で処理をした植物について得た粒重分布と比較した場合にも、同じことが明らかとなっている。このデータ（図４８）は、粒重の顕著な増大が、ほぼすべての大きさの穀物において認められたこと、そして、そのことは、空気を用いた対照の植物で認められた現象に似通っている、ことを明確に示している。
【００７６】
エテフォン（商標）がもたらす粒重の減少を回避する上で、８０〜１８０μｇ／ｍｌのＷＳ−ＣＰＤが最良の結果をもたらすことを示した上記実験にしたがって、自然条件下で生育させた小麦の穀物収穫量に関する効果を検証するために、１２０μｇ／ｍｌの濃度のＷＳ−ＣＰＤを選択した。この実験では、砂地の温室で生育させた小麦を用いた。粒重は、収穫時、つまり、乾燥段階において決定をした。穂が直立した後に、乳熟期Ｉに移行した時点から、各グループの小麦に対して、処置間隔として８〜１０日の期間を開けながら、ＷＳ−ＣＰＤ（１２０μｇ／ｍｌ）を、一度、二度、三度、および、四度の回数で噴霧をした。
【００７７】
収穫時に、小麦の穂を乾燥したところ（発芽から７ヶ月後）、粒重は、約５０％減少しており、また、その最終乾燥重量は、３８〜４１ｍｇ／穀粒であった（図４９）。乳熟期ＩにおいてＷＳ−ＣＰＤを一回だけ噴霧をした後であっても、全収穫量は、約１８％増大しており（図５０Ｂ）、そして、一ヶ月後に、乳熟期ＩＩにおいて処理を施した場合に、一回の噴霧をした後の全収穫量は、約２０％増大していたことが明らかとなった。乳熟期ＩＩの後に、噴霧を繰り返した場合に利点を見い出すことはできず（図５０Ｂ）、また、対照との比較（図５０Ａと図５０Ｂとの比較）において、上記応答にあっては、最も大きな１５個の穀粒の平均重量と、すべての穂粒の平均重量との間に差異は認められなかった。
【００７８】
対照の植物での粒重分布に照らして、各々の重量（ｍｇ／穀粒）に基づいて粒重分布（穀物の総数に対するパーセンテージとして表したもの）を計算した場合に、乾燥穀物の重量（すなわち、収穫量）が２０％増大していること、特に、乳熟期ＩＩにＷＳ−ＣＰＤを一度噴霧した後の増大が顕著であることも明らかである。このデータは、ほとんどすべての大きさの穀物において、粒重の顕著な増大があったことを明確に示している（図５１〜図５３）。処理を施した植物の穂では、３５ｍｇ／穀粒に満たない穀物は認められなかったが、処理を施していない穂では、３０％以上の穀粒が、その重量を下回っていた（図５１〜図５３）。
【００７９】
他の実験では、小麦を、泥炭を主成分とする土壌を収容した４５０ｍｌ容量の植木鉢で栽培した。発芽から７ヶ月後の乳熟期ＩＩにおいて、これら植物に対して、ＷＳ−ＣＰＤ（１２０μｌ／ｌ）を、一度、噴霧をした。これらの結果は、未処理の対照の植物での穀物重量よりも、穀物収穫量が１５％増大していることを示す上記結果とも符合していた（図５４）。粒重分布（穀物の総数に対するパーセンテージとして表したもの）を算出し、そして、対照の植物について得た粒重分布と比較した場合にも、このことが明らかとなっている。このデータは、粒重の顕著な増大が、ほぼすべての大きさの穀物において認められたことを改めて明確に示している（図５５）。
【００８０】
ＷＳ−ＣＰＤの特徴
【００８１】
ＷＳ−ＣＰＤは、式Ｉで表される分子構造を有している。その構造は、ＮＭＲ分光法と陰イオン質量分析法によって、確認が行われている。
【化５】
2012515197.tif 000007
【００８２】
メタノール中のＷＳ−ＣＰＤの１３Ｃ｛１Ｈ｝、１Ｈ、および２３Ｎａ｛１Ｈ｝−ＮＭＲスペクトルを、図５６〜図５８に示している。ＷＳ−ＣＰＤの１３Ｃ｛１Ｈ｝ＮＭＲスペクトルでの６個のピークは、δｃ  ４．２７  （Ｃ６）、２３．５８  （Ｃ２）、３４．９０  （Ｃ３）、９７．２１  （Ｃ５）、１２０．１８  （Ｃ４）、および、１８０．０６  （Ｃｌ）として表されている。１Ｈ  ＮＭＲでは、４個のピークが認められている（図５７）。ピーク位置（δＨ）、断片、および、割り当ては、次の通りである。０．８８（ｓ，  ２Ｈ，  Ｃ６）；  ２．４２  （ｔ，  ２Ｈ，  Ｃ２）；  ２．７５  （ｔ，  ２Ｈ，  Ｃ３）；  および、６．５２  （ｓ，  １Ｈ，  Ｃ５）。図５８に示した２３Ｎａ｛１Ｈ｝−ＮＭＲスペクトルは、δＮａに、−２．４６ｐｐｍの一つのシグナルを示しており、このことは、分子Ｉが、一つのタイプのナトリウム原子であることを確認するものである。
【００８３】
ＷＳ−ＣＰＤ（負モード）の質量スペクトルを、図５９に示してある。二つの主要なピークが観察されており、一方のものは、ｍ／ｚ  ＝  １１１．０（Ｃ６Ｈ７Ｏ２−）にて、また、他方は、ｍ／ｚ  ＝  ２４４．８（Ｃ６Ｈ７Ｏ２−・ＮａＣ６Ｈ７Ｏ２）において出現していた。
【００８４】
ＩＲスペクトル（図６０）、紫外可視スペクトル（図６１）、および、電位差滴定（図６２）の結果のいずれもが、上記したＷＳ−ＣＰＤの構造と符合するものであった。Ｃ１でのＷＳ−ＣＰＤのＩＲピークは、１７７３ｃｍ−１であり、また、ＩＲでのＣ＝Ｏストレッチのピークと紫外可視ピークは、λｍａｘ２０６ｎｍである。
【００８５】
ＷＳ−ＣＰＤは、２５℃の水に対して高溶解性（≧４００ｍｇ／ｍｌ）を示す（図６３）。加熱をすると、２６５〜２７０℃から分解が始まるが、溶融はしない。図６４に示したＨＰＬＣ分析結果は、ＷＳ−ＣＰＤが、単一の純物質として生成されていることを、さらに実証している。
【００８６】
室温下では、ＷＳ−ＣＰＤのｐＫａは、４．５よりも大きい。よって、通常の使用条件下、例えば、ｐＨ７．６〜７．８の条件下にあっては、９９％以上の化合物が、アニオン型で存在している。図６５を参照すると、そこには、乳棒と擂り鉢で粉砕し、そして、バックグラウンドの無いシリコンディスクの浅い窪みに置かれたＷＳ−ＣＰＤ粉末のＸ線回折パターンが記載されている。このＸ線回折パターンは、リガク社のＵｌｔｉｍａシールド管シータ−シータ回折計を用いて得たものであって、この機器は、１．６ｋＷの電力レベル、０．０２°のステップサイズ、１０〜６０°の角度範囲、および、０．５°／分の露光速度で稼動する。このＸ線回折パターンの分析は、ジェード８プログラム（ＭＤＩ社）を用いて実施した。この回折パターンから、粉体物質は均質なものではなく、むしろ、構造的に相異なる三つの物質、つまり、非晶形、低品質の結晶形、および、結晶形の物質が混在していることがうかがえる。非晶形物質の存在は、２θ〜２３°に出現する顕著な回折ピークによって表されている。この幅広いピークに重ね合わさっているものは、幾つかの明瞭なピークあって、これらは、結晶形の存在を指し示すものである。これらのピークは、２θ＝１０．６°、１５．９４°、２８．４２°、４７．３°、および、５６．１６°において出現する。１６．５°−１９°、４２°−４６°の間にあるその他の回折ピークは、５つの明確なピークよりも有意に幅広であるが、幅広い回折ピークよりもずっと狭小であるので、これは、低品質の結晶形の存在を示している。結晶形の有用な微結晶サイズは、シェラーの式を用いて算出され、そして、３００〜７００Åの範囲であることが判明している。結晶形の規則性が保たれていないと、その微結晶サイズは、さらに小さくなる。上記粉末に含まれる三つの形態の相対量を定量したところ、不純物は認められなかった。以下の体積分率が測定された。非晶形が、５７．５％、低品質の結晶形が、３９．５％、それに、結晶形が、３％であった。用意された物質が、その他の物質よりも大きな平均原子番号を有している限りは、その体積分率は、本明細書に示したものよりも小さくなるであろう。
【００８７】
図６６を参照すると、そこには、ＷＳ−ＣＰＤ産物の化学分析の試験成績表が記載されている。ＷＳ−ＣＰＤの分析は、イスラエルのレホボトに所在するＤ−パーム・イノベイティブ・バイオファーマシューティカルズ社によって実施された。
【００８８】
小麦におけるＷＳ−ＣＰＤの効果を、野外実験を通じてさらに研究を行った。その野外実験では、前記した温室実験で得た結果が確認され、また、これら野外実験の条件下では、最も効果的な処理方法が乳熟期Ｉでの一回の噴霧であること、さらに、機械的に脱穀して分離をすることで、正味の収穫量が約１５±２．６％から約５〜６％にまで減少することが明らかとなった。
【００８９】
小麦を用いた野外実験
【００９０】
植物試料および実験計画
２００８年１２月に、イスラエルのベトダガンに所在する農業研究機関の火山センターの農場にある粘度成分をやや多く含んだ土壌に、冬小麦（トリティカム  エストキシバン、  バー．  ガリル（Ｔｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｘｖｗｎ，  ｖａｒ．  Ｇａｌｉｌ））を播いた。１０月〜３月までの冬期の雨量は、５１５ｍｍであった。干ばつに遭遇せずに、農作物は生育した。これら植物に対して、２度の殺虫剤の噴霧、すなわち、「チュネックス」（１リットル／エーカー）を１１月に、そして、「オロ  ターボ」（２００  ｇ／エーカー）を１２月に噴霧をした。２００９年３月中旬に、実験を開始した。６個のブロックを無作為に選択し、そして、各ブロックを、それぞれ２平方メーターの４つの処理区画に分けた（図６７Ａの右欄と左欄）。未処理植物の２メーター幅の区画を、ブロック間の境界線と定めた（図６７Ａの中央欄）。以下の処理を実施した。１．対照、２．「乳熟」期ＩでのＷＳ−ＣＰＤの噴霧（２００９年３月３０日）、３．「乳熟」期ＩＩでのＷＳ−ＣＰＤの噴霧（２００９年４月１７日）、４．上記した連続する２度のＷＳ−ＣＰＤの噴霧（２００９年３月３０日および２００９年４月１７日）。
【００９１】
処理
ＷＳ−ＣＰＤ処理溶液は、１２０μｇ／ｍｌのＷＳ−ＣＰＤを含む１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ  ７．６）と０．１％の「キネティック」界面活性剤とを含んでいた。携帯式噴霧器（ＡＣＬ−７、英国）を用いて、噴霧（約０．８リットル／２平方メートル）を行った。対照には、ＷＳ−ＣＰＤを含んでいない処理溶液を噴霧した。この噴霧は、「止め葉」の下にある二番目の葉から、その上の穂全体を覆うように、つまり、植物の上部を処理溶液が覆うように作業がされる。
【００９２】
種子の発生の確認
「乳熟」期Ｉから種子の完成に至るまでの種子の発生の経過を見るために、境界区画から２００個の穂の集団を採取した。２００９年３月３０日（「乳熟」期Ｉ）、２００９年４月１７日（「乳熟」期ＩＩ）、および、２００９年５月１９日（完成種子）に、試料を採取した。これらの穂を実験室に持ち込み、オーブン（６０℃）にて、完全に乾燥するまで、加熱を続けた。乾燥を終えた後に、各穂から種子を分離して、計数を行い、そして、各穂での平均種子重量を決定するために、それらの重量を記録した。処理ごとに同じ平均種子重量を有する穂の数を、穂の総数に対するパーセンテージとして示した。
【００９３】
収穫
種子が完全に形成されるに至った本実験の最終段階（２００９年５月１９日）で、六つのすべてのグループから穂を収穫し、計数を行い、そして、温室内のテーブル上に置いて、そこで、１２日間かけて、完全に乾燥させた（図６７Ｂ）。
【００９４】
手作業での種子の分離
収穫を終えた後に、乾燥した１００個の穂を無作為に採取し、各区画（ｎ＝６）に分けた。穂ごとに種子を分離し（図６７Ｃおよび図６７Ｄ）、計数を行い、そして、それらの重量を決定した。各々の穂についての平均種子重量を算出するために、各々の穂が有する種子重量を、一つの穂が有する種子の数で割った。処理方法別に同じ平均種子重量を有する穂の数を、穂の総数に対するパーセンテージとして表した。
【００９５】
機械的脱穀による種子の分離
各実験区画に残存している乾燥した穂を計数し、次いで、それらの包頴および籾殻から機械的に脱穀して分離を行い（クルトペルツ社、ドイツ）、そして、それらの乾燥重量を記録した（ｇ／区画）。機械的脱穀を行った対照と手作業による分離を行った対照との間での収穫量を比較するために、各方法で得た２００個の種子を無作為に採取した。
【００９６】
種子の発生の確認
穂から手作業で分離をした後に、自然に成熟する間における未処理の植物での種子重量の分布（図６８）は、「乳熟」期Ｉと「乳熟」期ＩＩとの間、それに、「乳熟」期ＩＩと成熟期との間において、すべての種子サイズにおいて、顕著な種子重量の増大があったことを示していた。「乳熟」期Ｉと「乳熟」期ＩＩとの間で、平均種子重量は、４１％の増大が認められており、そして、「乳熟」期ＩＩと成熟期との間では２９％の増大であった。
【００９７】
一つの穂における種子重量と種子数
未処理の植物から無作為に収穫された２２０個の穂を保有する未処理区画において、「乳熟期ＩＩ」に記録がされた種子数（種子数／穂）と種子重量（ｍｇ／種子／穂）との関連を検討したところ、種子数／穂については、（種子数／穂の最大値に対する種子数／穂の最小値の比率を算出したところ）約３．７５倍の増大が認められたが、平均種子重量／穂については、約１．５倍の変化しか認められなかった（図６９）。このような関連性は、平均種子重量／穂の増大と種子数／穂との関連性についての試験をした場合にも、顕著に認められた。これらデータは、種子数の顕著な増大が、種子重量の顕著な減少とは付随的に関連するものではない、ことを明確に示していた（図７０）。
【００９８】
図６７を参照すると、そこには、実験計画とデータ収集が示されている。Ａ．６個のブロックを無作為に選択し、そして、各ブロックを、それぞれ２平方メーターの４つの処理区画に分けた（右欄と左欄）。２メーター幅の区画を、ブロック間の境界線と定めた（中央欄）。Ｂ．各植物（区画）が個別に回収され、計数が行われ、そして、温室内のテーブル上に置かれて、そこで、１２日間かけて、完全に乾燥させた。Ｃ．手作業での分離のための準備が整った穂。Ｄ．穂、包頴、および、籾殻からの種子の分離。
【００９９】
図６８を参照すると、そこには、「乳熟」期Ｉから成熟期に至る間の種子の生育動態が示されている。各生育段階にある同じ平均種子重量（ｍｇ／種子）を有する２００個の穂が有している種子数を計数し、そして、全穂数に対するパーセンテージとして表した。
【０１００】
図６９を参照すると、そこには、平均種子数／穂の増大と種子重量との関連性が示されている。この関連性とは、未処理区画において、「乳熟期ＩＩ」に記録がされた種子数／穂の増大と種子重量（ｍｇ／種子）との間の関連性である。
【０１０１】
図７０を参照すると、そこには、平均種子重量／穂の増大と種子数の増大との関連性が示されている。この関連性とは、未処理区画において、「乳熟期ＩＩ」に記録がされた種子重量／穂の増大とその種子数との間の関連性である。
【０１０２】
図７１を参照すると、そこには、機械的に脱穀および分離した種子の収穫量（ｇ／区画）に関するＷＳ−ＣＰＤの効果が示されている。出穂した後に、植物を無作為に６つのグループに分け、そして、二つの種子の発生期；ａ．「乳熟」期Ｉ（２００９年３月３０日）とｂ．「乳熟」期ＩＩ（２００９年４月１７日）；および、ｃ．乳熟期ＩおよびＩＩ（２００９年３月３０日および２００９年４月１７日）にて、ＷＳ−ＣＰＤ（１２０μｇ／ｍｌ；リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ  ７．６、１０ｍＭ；「キネティック」、０．１％）を植物に対して噴霧した。対照には、ＷＳ−ＣＰＤを含まない処理溶液を噴霧した。（Ａ）区画あたりの穂の総数は、収穫時に計数をした。（Ｂ）機械的に脱穀および分離した種子の区画あたりの種子重量。（Ｃ）ＷＳ−ＣＰＤで処理をした植物の収穫量であって、対照に対するパーセンテージとして表している。
【０１０３】
図７２を参照すると、そこには、手作業で収穫を行った際の収穫量（ｇ／１００個の穂）に関するＷＳ−ＣＰＤの効果が示されている。（Ａ）収穫重量／１００個の穂。（Ｂ）収穫重量／１００個の穂であって、対照に対するパーセンテージとして表している。
【０１０４】
図７３を参照すると、そこでは、機械的に脱穀をした対照の種子と手作業で分離をした対照の種子との間での種子重量の比較を示している。
【０１０５】
図７４を参照すると、そこには、手作業で分離をした種子の重量（ｇ／種子）に関するＷＳ−ＣＰＤの効果が示されている。（Ａ）種子重量。（Ｂ）種子重量であって、対照に対するパーセンテージとして表している。
【０１０６】
図７５を参照すると、そこには、種子重量／穂の分布に関するＷＳ−ＣＰＤの効果が示されており、「乳熟」期Ｉにあるすべての穂に対するパーセンテージとして表している。同じ種子重量（ｍｇ）を有する１００個の穂に含まれる穂数を計数し、そして、全穂数に対するパーセンテージとして表した。
【０１０７】
図７６を参照すると、そこには、種子重量／穂の分布に関するＷＳ−ＣＰＤの効果が示されており、「乳熟」期ＩＩにあるすべての穂に対するパーセンテージとして表している。同じ平均種子重量（ｍｇ）を有する１００個の穂に含まれる穂数を計数し、そして、全穂数に対するパーセンテージとして表した。
【０１０８】
最後に、図７７を参照すると、そこには、種子重量／穂の分布に関するＷＳ−ＣＰＤの効果が示されており、「乳熟」期Ｉおよび「乳熟」期ＩＩにあるすべての穂に対するパーセンテージとして表している。同じ平均種子重量（ｍｇ）を有する１００個の穂に含まれる穂数を計数し、そして、全穂数に対するパーセンテージとして表した。
【０１０９】
収穫量に関するＷＳ−ＣＰＤの効果
ＷＳ−ＣＰＤによるこの効果は、ａ）各実験区画での収穫量（ｇ／区画）を算出し、そして、ｂ）各実験区画から無作為に選択をした１００個の穂の乾燥収穫重量（ｇ／１００個の穂）を算出する、という二つの方法によって研究がされている。そのデータを示す。
【０１１０】
「乳熟」期Ｉまたは「乳熟」期ＩＩにおいて、ＷＳ−ＣＰＤを噴霧した区画の間での全穂数（３６０〜４５０個の穂／区画）についての統計的ばらつきが比較的に大きい（ＳＥ  約±１０％）にもかかわらず（図７１Ａ）、穂から機械的脱穀によって分離をした種子の収穫量（図７１Ｂ）は、未処理の対照（図７１Ｃ）と比較して、それぞれ、約５％および約８％増大していた。「乳熟」期Ｉ＋ＩＩにおいて、二回にわたってＷＳ−ＣＰＤを噴霧してはみたものの、二つの「乳熟」期の各々に一回の噴霧を行った場合よりも有利な効果は認められなかった。
【０１１１】
各処理において、手作業で分離をした１００個の穂の収穫量を記録したところ（図７２Ａ）、「乳熟」期ＩでＷＳ−ＣＰＤを噴霧することで、対照と比較して、約１５±２．６％もの顕著な収穫量の増大が認められた（図７２Ｂ、ｇ／１００個の穂）が、「乳熟」期ＩＩで噴霧をした場合には、収穫量の増大は、わずか約８％に止まっていた。「乳熟」期Ｉ＋ＩＩにおいて、二回にわたって噴霧してはみたものの、「乳熟」期Ｉに一回だけの噴霧を行った場合よりも、有利な効果は認められなかった（図７２Ａおよび図７２Ｂ）。上述のデータは、ＷＳ−ＣＰＤで処理をした植物の収穫量の増大が、手作業で分離した種子と比較すると、機械的脱穀によって分離した種子よりも小さかったことを示している。機械的脱穀分離装置の強風によって小さな種子が巻き上げられてしまい、それらを損失することに起因して、異なる結果を得るに至っている。この結論は、機械的に脱穀・分離した種子の平均種子重量が、手作業で分離をした種子の平均種子重量よりも大きかったことに基づくものである（図７３）。
【０１１２】
ＷＳ−ＣＰＤで処理をした植物の収穫量の増大は、平均種子重量の増大に起因するものであった（図７４Ａ）。「乳熟」期Ｉで一度の噴霧を行ったところ、種子重量は、約１５％増大していた（図７４Ｂ）。後に、「乳熟」期ＩＩでも噴霧を行い、そして、二度の噴霧とした場合でも、同様の結果しか得られなかった。このことは、重量／１００個の穂として収穫量を計算しても（図７２Ａ）、あるいは、平均重量に基づいて収穫量を計算しても（図７４Ａ）、「乳熟」期Ｉ＋ＩＩにおいて、二回にわたって噴霧してみたところで、「乳熟」期Ｉに一度だけ噴霧を行った場合よりも有利な効果は認められなかった、ということを明示する証拠となっている。
【０１１３】
成熟期での種子重量の分布
収穫量の増大に関するＷＳ−ＣＰＤの効果をさらに評価するために、「乳熟」期Ｉ（図７５）、「乳熟」期ＩＩ（図７６）、および、両方の段階（図７７）での処理について、種子重量に対する種子数の分布を算出した。得られた分布曲線は、所定の重量の種子の種子数に関するＷＳ−ＣＰＤの効果を示すものであって、試験を行った全穂数に対するパーセンテージとして表した。処理をした植物から得たすべての種子は、各計量群での種子数に関係なく、対照の植物から得たすべての種子よりも重かった。換言すれば、最軽量の種子群から最重量の種子群に至るまで、ＷＳ−ＣＰＤを噴霧して処理をした穂から得られた種子は、対照の穂から得た種子よりも常に顕著に重かった（図７３および図７４）。さらに、二度の噴霧を行って得られる結果が、一度目または二度目の噴霧のいずれかを行った後に得られる結果と非常に近似していたことも明白である（図７７）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【国際調査報告】
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