(57)【要約】  本発明は、ミトコンドリア機能関連状態の予防および／または治療処置のための組成物および方法に関する。種々の態様において、本発明は、エピカテキン、エピカテキン誘導体、カテキン、カテキン誘導体、ニコランジル、およびニコランジル誘導体からなる群より選択された１つまたは複数の化合物の、細胞中のミトコンドリア機能を刺激するために有効な量を投与することを含む。本明細書記載の方法と組成物は、永続的虚血または虚血／再灌流（ＩＲ）イベントの後の心臓の梗塞サイズの縮小または有害心臓リモデリングを遅らせ、弱め、防止する方法を提供し、また、障害性ミトコンドリア生合成の予防およびその結果の種々の疾患および状態における障害性ミトコンドリア発生の予防を支援することができ、また、すでに発生してしまった可能性のあるミトコンドリア欠乏に対する有効な治療を提供する。【選択図】図１６
2012524077.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の構造を有する（２Ｒ、３Ｒ）−２−（３、４−ジヒドロキシフェニル）−３、４−ジヒドロ−１（２Ｈ）−ベンゾピラン−３、５、７−トリオール（「エピカテキン」）の誘導体であって、
【化１】
2012524077.tif 000015
式中、
Ｒ１、Ｒ２、およびＲ４は、−ＯＨ、−Ｏ−Ｃ１−６直鎖または分岐鎖アルキル、−Ｏ−Ｃ１−１２アリルアルキル、−Ｃ１−６直鎖または分岐鎖アルキル、および−Ｃ１−１２アリルアルキルからなる群よりそれぞれ独立に選択され、前記各直鎖または分岐鎖アルキルまたはアリルアルキルは、０〜４鎖のヘテロ原子および任意選択として、ハロゲン、トリハロメチル、−Ｏ−Ｃ１−６アルキル、−ＮＯ２、−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＯＮＨ２、および−Ｃ（Ｏ）（ＯＲ６）からなる群より独立に選択された１つまたは複数の置換基を含み、Ｒ６はＨまたはＣ１−３アルキルであり（ただし、これは、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ４のうち少なくとも１つが−ＯＨでなく、さらに、Ｒ１およびＲ２がそれぞれ−ＯＨである場合、Ｒ４が−ＣＨ３または−Ｏ−ＣＨ３でないことが前提となる）；
2012524077.tif 000016
Ｒ３は−ＯＨ、または
【化２】
2012524077.tif 000017
であり；  さらに
Ｒ５は−Ｈまたは−ＯＨである誘導体、
または薬学的に許容可能なその塩。
【請求項２】
Ｒ１、Ｒ２、およびＲ４の内の２つが−ＯＨである請求項１記載の誘導体または薬学的に許容可能な塩。
【請求項３】
Ｒ１、Ｒ２、およびＲ４の内の少なくとも１つが−Ｏ−Ｃ１−６直鎖または分岐鎖アルキルである請求項１記載の誘導体または薬学的に許容可能な塩。
【請求項４】
Ｒ１、Ｒ２、およびＲ４の内の２つが−ＯＨである請求項３記載の誘導体または薬学的に許容可能な塩。
【請求項５】
【化３】
2012524077.tif 000018
, および
【化４】
2012524077.tif 000019
からなる群より選択された構造を有する請求項１記載の誘導体または薬学的に許容可能な塩。
【請求項６】
Ｒ３が−ＯＨおよびＲ５が−Ｈである請求項５記載の誘導体または薬学的に許容可能な塩。
【請求項７】
請求項１〜６の内の１項に記載の誘導体または薬学的に許容可能な塩および薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬品組成物。
【請求項８】
非経口経路投与用に処方された請求項７記載の医薬品組成物。
【請求項９】
ニコランジル、ニコランジル誘導体、テトラサイクリン抗生物質、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ阻害剤、ＡＤＰ受容体／Ｐ２Ｙ１２阻害剤、プロスタグランジン類似体、ＣＯＸ阻害剤、抗血小板薬、抗凝固薬、ヘパリン、直接作用型血液凝固第Ｘａ因子阻害薬、直接トロンビン（ＩＩ）阻害薬、および血管拡張剤からなる群より独立に選択された１つまたは複数の化合物をさらに含む請求項７記載の医薬品組成物。
【請求項１０】
動物の虚血状態もしくは虚血／再灌流状態の治療方法、または虚血状態もしくは虚血／再灌流状態のリスクがある動物の予防方法であって、前記動物に非経口または腸内経路により有効量の請求項１〜６の内の１項に記載の誘導体または薬学的に許容可能な塩を投与することを含む方法。
【請求項１１】
前記動物に請求項７〜９の内の１項に記載の医薬品組成物を投与することを含む請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記動物が哺乳類である請求項１０または１１記載の方法。
【請求項１３】
前記動物がヒトである請求項１０または１１記載の方法。
【請求項１４】
前記投与が非経口経路経由である請求項１０または１１記載の方法。
【請求項１５】
前記動物が急性の虚血または虚血／再潅流イベントの発症後４８時間以内、または急性虚血／再潅流イベントに対する医学的治療の提示後４８時間以内に請求項１〜６の内の１項に記載の誘導体または薬学的に許容可能な塩が投与される請求項１０または１１記載の方法。
【請求項１６】
前記誘導体または薬学的に許容可能な塩が、ニコランジル、ニコランジル誘導体、テトラサイクリン抗生物質、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ阻害剤、ＡＤＰ受容体／Ｐ２Ｙ１２阻害剤、プロスタグランジン類似体、ＣＯＸ阻害剤、抗血小板薬、抗凝固薬、ヘパリン、直接作用型血液凝固第Ｘａ因子阻害薬、直接トロンビン（ＩＩ）阻害薬、および血管拡張剤からなる群より独立に選択された１つまたは複数の化合物と一緒に投与される請求項１０記載の方法。
【請求項１７】
前記動物が、心筋梗塞、急性の虚血腎臓傷害、大動脈およびその分岐部疾患、および医療介入が原因の虚血傷害からなる群より選択された急性の虚血または虚血／再潅流イベントに罹っているか、罹る直近のリスクがある請求項１０または１１記載の方法。
【請求項１８】
前記虚血または虚血／再潅流イベントが急性の虚血または虚血／再潅流イベントである請求項１０〜１７記載の方法。
【請求項１９】
患者の虚血または虚血／再潅流（ＩＲ）状態を治療する方法であって、エピカテキン、その誘導体および薬学的に許容可能なその塩からなる群より選択された第１の化合物を、ニコランジル、ニコランジル誘導体、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ阻害剤、ＡＤＰ受容体／Ｐ２Ｙ１２阻害剤、プロスタグランジン類似体、ＣＯＸ阻害剤、抗血小板薬、抗凝固薬、ヘパリン；直接作用型血液凝固第Ｘａ因子阻害薬、直接トロンビン（ＩＩ）阻害薬、および血管拡張剤からなる群より独立に選択された１つまたは複数の第２の化合物と一緒に含む有効量の薬剤の組み合わせをそれを必要とする患者に投与することを含む方法。
【請求項２０】
前記虚血または虚血／再潅流（ＩＲ）状態が急性の虚血性イベントである請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記急性の虚血イベントが心筋梗塞である請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記急性の虚血イベントが急性のアンギナイベントである請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
前記急性の虚血イベントが急性の腎臓傷害である請求項２０記載の方法。
【請求項２４】
前記急性の虚血イベントが全体冠動脈閉塞である請求項２０記載の方法。
【請求項２５】
前記急性の虚血イベントが急性の脳卒中である請求項２０記載の方法。
【請求項２６】
前記急性の虚血イベントが心房細動である請求項２０記載の方法。
【請求項２７】
前記虚血または虚血／再潅流（ＩＲ）状態が一時的急性虚血を引き起こす医療介入の出来事である請求項１９記載の方法。
【請求項２８】
医療介入がＣＡＢＧ手術、心肺バイパスを伴う心臓手術、血管瘤修復、血管形成、および造影剤投与からなる群より選択される請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
前記薬剤の組み合わせが前記医療介入前の４８時間の間に、および前記医療介入後４８時間の間に投与される請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
前記１つまたは複数の第２の化合物が、エプチフィバチド、チロフィバン、アブシキシマブ、クロピドグレル、チクロピジン、プラスグレル、ブタプロスト、イロプロスト、トレプロスチニル、アスピリン、アロキシプリン、ジタゾール、クロリクロメン、ジピリダモール、インドブフェン、ピコタミド、トリフルサル、クマリン、１、３−インダンジオン抗凝固薬、ヘパリン、ビバリルジン、ニコランジル、フェノルドパム、ヒドララジン、ネシリチド、ニカルジピン、ニトログリセリン、およびニトロプルシドからなる群より選択された請求項１９記載の方法。
【請求項３１】
前記薬剤の組み合わせがさらに１つまたは複数のテトラサイクリン抗生物質を含む請求項１９記載の方法。
【請求項３２】
前記第１の化合物および前記１つまたは複数の第２の化合物が、それぞれ腸内投与経路で送達される請求項１９記載の方法。
【請求項３３】
前記第１の化合物および前記１つまたは複数の第２の化合物が、それぞれ非経口投与経路で送達される請求項１９記載の方法。
【請求項３４】
請求項１９記載の方法であって、前記エピカテキン誘導体が、構造
【化５】
2012524077.tif 000020
を有し、
式中、
Ｒ１、Ｒ２、およびＲ４はそれぞれ−ＯＨ、−Ｏ−Ｃ１−６直鎖または分岐鎖アルキル、−Ｏ−Ｃ１−１２アリルアルキル、−Ｃ１−６直鎖または分岐鎖アルキル、および−Ｃ１−１２アリルアルキルからなる群より独立に選択され、前記各直鎖または分岐鎖アルキルまたはアリルアルキルは、０〜４鎖ヘテロ原子および、任意選択で、ハロゲン、トリハロメチル、−Ｏ−Ｃ１−６アルキル、−ＮＯ２、−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＯＮＨ２、および−Ｃ（Ｏ）（ＯＲ６）からなる群より独立に選択された１つまたは複数の置換基を含み、Ｒ６はＨまたはＣ１−３アルキルであり（ただし、これは、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ４のうち少なくとも１つが−ＯＨでなく、さらに、Ｒ１およびＲ２がそれぞれ−ＯＨである場合、Ｒ４が−ＣＨ３または−Ｏ−ＣＨ３でないことが前提となる）；
2012524077.tif 000021
Ｒ３は−ＯＨまたは
【化６】
2012524077.tif 000022
であり；さらに
Ｒ５は−Ｈまたは−ＯＨである誘導体、
または薬学的に許容可能なその塩である方法。
【請求項３５】
血管拡張薬に対する耐性発現を減らす方法であって、エピカテキン、その誘導体および薬学的に許容可能なその塩からなる群より選択された第１の化合物と１つまたは複数の血管拡張剤を一緒に含む有効量の薬剤の組み合わせを、それを必要とする患者に投与することを含む方法。
【請求項３６】
前記１つまたは複数の血管拡張剤が、ニコランジル、ニコランジル誘導体、硝酸塩ドナー血管拡張剤、ＡＣＥ阻害剤、アンギオテンシン受容体遮断薬からなる群より独立に選択される請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
前記１つまたは複数の血管拡張剤がニコランジル、ニトロプルシドおよびニトログリセリンからなる群より選択される請求項３５記載の方法。
【請求項３８】
前記第１の化合物および前記１つまたは複数の血管拡張剤がそれぞれ腸内投与経路により送達される請求項３５記載の方法。
【請求項３９】
請求項３５記載の方法であって、前記エピカテキンの誘導体が構造
【化７】
2012524077.tif 000023
を有し、
式中、
Ｒ１、Ｒ２、およびＲ４はそれぞれ−ＯＨ、−Ｏ−Ｃ１−６直鎖または分岐鎖アルキル、−Ｏ−Ｃ１−１２アリルアルキル、−Ｃ１−６直鎖または分岐鎖アルキル、および−Ｃ１−１２アリルアルキルからなる群より独立に選択され、前記各直鎖または分岐鎖アルキルまたはアリルアルキルは、０〜４鎖ヘテロ原子および、任意選択で、ハロゲン、トリハロメチル、−Ｏ−Ｃ１−６アルキル、−ＮＯ２、−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＯＮＨ２、および−Ｃ（Ｏ）（ＯＲ６）からなる群より独立に選択された１つまたは複数の置換基を含み、Ｒ６はＨまたはＣ１−３アルキルであり（ただし、これは、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ４のうち少なくとも１つが−ＯＨでなく、さらに、Ｒ１およびＲ２がそれぞれ−ＯＨである場合、Ｒ４が−ＣＨ３または−Ｏ−ＣＨ３でないことが前提となる）；
2012524077.tif 000024
Ｒ３は−ＯＨまたは
【化８】
2012524077.tif 000025
であり；さらに
Ｒ５は−Ｈまたは−ＯＨである誘導体、
または薬学的に許容可能なその塩である方法。
【請求項４０】
細胞中のミトコンドリア機能を刺激する方法であって、エピカテキン、エピカテキン誘導体、カテキン、カテキン誘導体、ニコランジル、およびニコランジル誘導体からなる群より選択された１つまたは複数の化合物の前記細胞中のミトコンドリア機能を刺激するために有効な量を投与することを含む方法。
【請求項４１】
前記細胞中のミトコンドリア機能の前記刺激が、前記細胞中のミトコンドリア呼吸の刺激を含む請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
前記細胞中のミトコンドリア機能の前記刺激が、前記細胞中のミトコンドリア発生の刺激を含む請求項４０記載の方法。
【請求項４３】
前記投与が、少なくとも０．１μＭのカテキン、カテキン誘導体、エピカテキンまたはエピカテキン誘導体を前記細胞に投与することを含む請求項４０記載の方法。
【請求項４４】
前記少なくとも０．１μＭのカテキン、カテキン誘導体、エピカテキンまたはエピカテキン誘導体が、少なくとも３０分、１時間、３時間、１２時間、２４時間、または４８時間維持される請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
前記投与が、少なくとも１μＭのカテキン、カテキン誘導体、エピカテキンまたはエピカテキン誘導体を前記細胞に投与することを含む請求項４０記載の方法。
【請求項４６】
前記少なくとも１μＭのカテキン、カテキン誘導体、エピカテキンまたはエピカテキン誘導体が、３０分、１時間、３時間、１２時間、２４時間、または４８時間維持される請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
請求項４０記載の方法であって、前記エピカテキン誘導体が構造：
【化９】
2012524077.tif 000026
を有し；
式中、
Ｒ１、Ｒ２、およびＲ４はそれぞれ−ＯＨ、−Ｏ−Ｃ１−６直鎖または分岐鎖アルキル、−Ｏ−Ｃ１−１２アリルアルキル、−Ｃ１−６直鎖または分岐鎖アルキル、および−Ｃ１−１２アリルアルキルからなる群より独立に選択され、前記各直鎖または分岐鎖アルキルまたはアリルアルキルは、０〜４鎖ヘテロ原子および、任意選択で、ハロゲン、トリハロメチル、−Ｏ−Ｃ１−６アルキル、−ＮＯ２、−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＯＮＨ２、および−Ｃ（Ｏ）（ＯＲ６）からなる群より独立に選択された１つまたは複数の置換基を含み、Ｒ６はＨまたはＣ１−３アルキルであり（ただし、これは、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ４のうち少なくとも１つが−ＯＨでないことが前提となる）；
2012524077.tif 000027
Ｒ３は−ＯＨまたは
【化１０】
2012524077.tif 000028
であり；さらに
Ｒ５はＨまたはＯＨである誘導体、
または薬学的に許容可能なその塩である方法。
【請求項４８】
請求項４７記載の方法であって、前記エピカテキン誘導体が、
【化１１】
2012524077.tif 000029
、
【化１２】
2012524077.tif 000030
、および
【化１３】
2012524077.tif 000031
からなる群より選択された方法。
【請求項４９】
前記投与ステップが、エピカテキン、エピカテキン誘導体、カテキン、カテキン誘導体、ニコランジル、およびニコランジル誘導体からなる群より選択された１つまたは複数の化合物の前記動物の細胞中のミトコンドリア機能を刺激するために有効な量を動物に非経口または腸内経路により送達することを含む請求項４０記載の方法。
【請求項５０】
前記動物がヒトである請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
ミトコンドリア発生または生体エネルギー学的先天異常、食事障害、ビタミン欠乏、糖尿病、代謝性症候群、フリードライヒ運動失調症、肺高血圧症、慢性腎臓疾患、急性の腎臓傷害、高血圧症、痴呆、心不全、肥満症、インスリン耐性、ミトコンドリア機能低下を伴う筋肉状態、老化関連認知傷害、血管疾患、代謝性機能障害または神経変性、およびミトコンドリア機能低下を伴う神経学的状態からなる群より選択された１つまたは複数の状態に罹っているか、罹る直近のリスクがあるという診断に基づいた前記投与ステップのために前記動物が選択される請求項４９記載の方法。
【請求項５２】
前記動物が、前記動物の年齢に基づいて前記投与ステップのために選択される請求項４９記載の方法。
【請求項５３】
前記動物が、前記動物の活動状態に基づいて前記投与ステップのために選択される請求項４９記載の方法。
【請求項５４】
前記投与ステップが、少なくとも０．１μＭの前記化合物の前記動物の血漿中濃度を、少なくとも３０分、１時間、３時間、１２時間、２４時間、または４８時間維持するために有効な量のカテキン、カテキン誘導体、エピカテキンまたはエピカテキン誘導体を経口経路で送達することを含む請求項４９記載の方法。
【請求項５５】
少なくとも１μＭの前記化合物の前記動物の血漿中濃度を、少なくとも３０分、１時間、３時間、１２時間、２４時間、または４８時間維持するために有効な量のカテキン、カテキン誘導体、エピカテキンまたはエピカテキン誘導体を経口経路で送達することを含む請求項４９記載の方法。
【請求項５６】
動物中のミトコンドリア機能低下を伴う状態を治療する方法であって、エピカテキン、エピカテキン誘導体、カテキン、カテキン誘導体、ニコランジル、およびニコランジル誘導体からなる群より選択された１つまたは複数の化合物の前記動物の細胞中のミトコンドリア機能を刺激するために必要な量を非経口または腸内経路経由前記動物に送達することを含む方法。
【請求項５７】
ミトコンドリア機能低下をともなう前記状態が、ミトコンドリア発生または生体エネルギー学的先天異常、食事障害、ビタミン欠乏、糖尿病、代謝性症候群、フリードライヒ運動失調症、肺高血圧症、慢性腎臓疾患、急性の腎臓傷害、高血圧症、痴呆、心不全、肥満症、インスリン耐性、ミトコンドリア機能低下を伴う筋肉状態、老化関連認知障害、血管疾患、代謝性機能障害または神経変性、およびミトコンドリア機能を伴う神経学的状態からなる群より選択される請求項５６記載の方法。
【請求項５８】
ミトコンドリア機能低下を伴う前記状態が、前記動物の年齢および／または活動状態に関連している請求項５６記載の方法。
【請求項５９】
ミトコンドリア機能低下を伴う前記状態が、前記動物の栄養状態に関連している請求項５６記載の方法。
【請求項６０】
前記投与ステップが、カテキン、カテキン誘導体、エピカテキンまたはエピカテキン誘導体の少なくとも０．１μＭの前記化合物の前記動物の血漿中濃度を少なくとも３０分、１時間、３時間、１２時間、２４時間、または４８時間維持するために有効な量を経口経路経由で前記動物に投与することを含む請求項５６記載の方法。
【請求項６１】
カテキン、テキン誘導体、エピカテキンまたはエピカテキン誘導体の少なくとも１μＭの前記化合物の前記動物の血漿中濃度を少なくとも３０分、１時間、３時間、１２時間、２４時間、または４８時間維持するために有効な量を経口経路経由で前記動物に送達することを含む請求項５６記載の方法。
【請求項６２】
動物中の筋肉構造または機能を改善する方法であって、エピカテキン、エピカテキン誘導体、カテキン、カテキン誘導体、ニコランジル、およびニコランジル誘導体からなる群より選択された１つまたは複数の化合物の細胞中のミトコンドリア機能を刺激するために必要な量を前記動物に投与し、それにより前記動物の筋肉構造または機能を改善することを含む方法。
【請求項６３】
動物の運動に関連したミトコンドリア効果を改善する方法であって、エピカテキン、エピカテキン誘導体、カテキン、カテキン誘導体、ニコランジル、およびニコランジル誘導体からなる群より選択された１つまたは複数の化合物の細胞中のミトコンドリア機能を刺激するために有効な量を前記動物に投与し、それにより前記動物の運動に関連したミトコンドリア効果を改善することを含む方法。
【請求項６４】
動物の運動能力を強化する方法であって、エピカテキン、エピカテキン誘導体、カテキン、カテキン誘導体、ニコランジル、およびニコランジル誘導体からなる群より選択された１つまたは複数の化合物の細胞中のミトコンドリア機能を刺激するために有効な量を前記動物に投与し、それにより前記動物の動物能力を強化することを含む方法。
【請求項６５】
動物の運動に呼応した筋肉の健康および機能を強化する方法であって、エピカテキン、エピカテキン誘導体、カテキン、カテキン誘導体、ニコランジル、およびニコランジル誘導体からなる群より選択された１つまたは複数の化合物の細胞中のミトコンドリア機能を刺激するために有効な量を前記動物に投与し、それにより前記動物の運動に呼応した筋肉の健康および機能を強化することを含む方法。
【請求項６６】
動物の運動が制限された臨床現場において筋肉の健康および機能を強化する方法であって、エピカテキン、エピカテキン誘導体、カテキン、カテキン誘導体、ニコランジル、およびニコランジル誘導体からなる群より選択された１つまたは複数の化合物の細胞中のミトコンドリア機能を刺激するために有効な量を前記動物に投与し、それにより前記動物の筋肉の健康および機能を強化することを含む方法。
【請求項６７】
動物の精力的な活動または精力的または持続的活動に関連した傷害からの筋肉の回復を促進する方法であって、エピカテキン、エピカテキン誘導体、カテキン、カテキン誘導体、ニコランジル、およびニコランジル誘導体からなる群より選択された１つまたは複数の化合物の細胞中のミトコンドリア機能を刺激するために有効な量を前記動物に投与し、それにより前記動物の筋肉の回復を促進することを含む方法。
【請求項６８】
前記投与が、少なくとも０．１μＭのカテキン、カテキン誘導体、エピカテキンまたはエピカテキン誘導体を前記細胞に投与することを含む請求項５６、６２、６３、６４、６５、６６、または６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
前記方法が、エピカテキン、エピカテキン誘導体、カテキン、またはカテキン誘導体からなる群より選択された他の化合物に対して少なくとも９０％純粋なエピカテキンまたはエピカテキン誘導体を投与することを含む請求項５６、６２、６３、６４、６５、６６、または６７記載の方法。
【請求項７０】
前記少なくとも０．１μＭのカテキン、カテキン誘導体、エピカテキンまたはエピカテキン誘導体が少なくとも３０分、１時間、３時間、１２時間、２４時間、または４８時間維持される請求項６８記載の方法。
【請求項７１】
前記少なくとも１μＭのカテキン、カテキン誘導体、エピカテキンまたはエピカテキン誘導体が少なくとも３０分、１時間、３時間、１２時間、２４時間、または４８時間維持される請求項７０記載の方法。
【請求項７２】
前記カテキン、カテキン誘導体、エピカテキンまたはエピカテキン誘導体が、少なくとも０．１μＭの前記動物の血漿中濃度を最初の１２時間の期間に少なくとも１回、および少なくとも０．１μＭの血漿中濃度を最初の１２時間の期間の直後の第２の１２時間の期間に少なくとも１回、および、任意選択で、１回または複数回の最初の１２時間と第２の１２時間に続く１２時間の期間で、達成する方式で送達される請求項６８記載の方法。
【請求項７３】
前記カテキン、カテキン誘導体、エピカテキンまたはエピカテキン誘導体が、少なくとも０．１μＭの前記動物の血漿中濃度を最初の２４時間の期間に少なくとも１回、および少なくとも０．１μＭの血漿中濃度を最初の２４時間の期間の直後の第２の２４時間の期間に少なくとも１回、および、任意選択で、１回または複数回の最初の２４時間と第２の２４時間に続く２４時間の期間で、達成する方式で送達される請求項６８記載の方法。
【請求項７４】
請求項６７に記載の方法であって、前記エピカテキン誘導体が構造：
【化１４】
2012524077.tif 000032
を有し、
式中、
Ｒ１、Ｒ２、およびＲ４はそれぞれ−ＯＨ、−Ｏ−Ｃ１−６直鎖または分岐鎖アルキル、−Ｏ−Ｃ１−１２アリルアルキル、−Ｃ１−６直鎖または分岐鎖アルキル、および−Ｃ１−１２アリルアルキルからなる群より独立に選択され、前記各直鎖または分岐鎖アルキルまたはアリルアルキルは、０〜４鎖ヘテロ原子および、任意選択で、ハロゲン、トリハロメチル、−Ｏ−Ｃ１−６アルキル、−ＮＯ２、−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＯＮＨ２、および−Ｃ（Ｏ）（ＯＲ６）からなる群より独立に選択された１つまたは複数の置換基を含み、Ｒ６はＨまたはＣ１−３アルキルであり（ただし、これは、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ４のうち少なくとも１つが−ＯＨでないことが前提となる）；
2012524077.tif 000033
Ｒ３は−ＯＨまたは
【化１５】
2012524077.tif 000034
であり；さらに
Ｒ５はＨまたはＯＨである誘導体、
または薬学的に許容可能なその塩である方法。
【請求項７５】
請求項７４記載の方法であって、前記エピカテキン誘導体が、
【化１６】
2012524077.tif 000035
、
【化１７】
2012524077.tif 000036
、および
【化１８】
2012524077.tif 000037
からなる群より選択された構造を有する方法。
【請求項７６】
エピカテキン、エピカテキン誘導体、カテキン、カテキン誘導体、ニコランジル、およびニコランジル誘導体からなる群より選択された１つまたは複数の化合物を非経口または腸内経路経由で動物に送達することを含む請求項６７記載の方法。
【請求項７７】
前記動物がヒトである請求項６７記載の方法。
【請求項７８】
前記カテキン、カテキン誘導体、エピカテキンまたはエピカテキン誘導体が、少なくとも０．１μＭの前記動物の血漿中濃度を最初の１２時間の期間に少なくとも１回、および少なくとも０．１μＭの血漿中濃度を最初の１２時間の期間の直後の第２の１２時間の期間に少なくとも１回、および、任意選択で、１回または複数回の最初の１２時間と第２の１２時間に続く１２時間の期間で、達成する方式で送達される請求項４０記載の方法。
【請求項７９】
前記カテキン、カテキン誘導体、エピカテキンまたはエピカテキン誘導体が、少なくとも０．１μＭの前記動物の血漿中濃度を最初の２４時間の期間に少なくとも１回、および少なくとも０．１μＭの血漿中濃度を最初の２４時間の期間の直後の第２の２４時間の期間に少なくとも１回、および、任意選択で、１回または複数回の最初の２４時間と第２の２４時間に続く２４時間の期間で、達成する方式で送達される請求項４０記載の方法。
【請求項８０】
前記投与ステップが、カテキン、カテキン誘導体、エピカテキンまたはエピカテキン誘導体をニコランジル、またはニコランジル誘導体と一緒に投与することを含む請求項４０、５６、６２、６３、６４、６５、６６、または６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８１】
前記投与ステップが、エピカテキンまたはエピカテキン誘導体をニコランジル、またはニコランジル誘導体と一緒に投与することを含む請求項８０記載の方法。
【請求項８２】
前記エピカテキンまたはエピカテキン誘導体が、ニコランジル、またはニコランジル誘導体と一緒に単一医薬品組成物として投与される請求項８１記載の方法。
【請求項８３】
エピカテキンまたはエピカテキン誘導体およびニコランジルまたはニコランジル誘導体を含む医薬品または栄養補助食品組成物。
【請求項８４】
エピカテキンまたはエピカテキン誘導体とニコランジルまたはニコランジル誘導体の混合物を含む医薬品または栄養補助食品組成物。
【請求項８５】
ミトコンドリア発生または生体エネルギー学的先天異常、食事障害、ビタミン欠乏、糖尿病、代謝性症候群、フリードライヒ運動失調症、肺高血圧症、慢性腎臓疾患、急性の腎臓傷害、高血圧症、痴呆、心不全、肥満症、インスリン耐性、ミトコンドリア機能低下を伴う筋肉状態、老化関連認知傷害、血管疾患、代謝性機能障害または神経変性、およびミトコンドリア機能低下を伴う神経学的状態からなる群より選択された１つまたは複数の状態の治療のためのエピカテキンまたはエピカテキン誘導体の使用；または
エピカテキンまたはエピカテキン誘導体をそれを必要とする患者に投与することを含むミトコンドリア発生または生体エネルギー学的先天異常、食事障害、ビタミン欠乏、糖尿病、代謝性症候群、フリードライヒ運動失調症、肺高血圧症、慢性腎臓疾患、急性の腎臓傷害、高血圧症、痴呆、心不全、肥満症、インスリン耐性、ミトコンドリア機能低下を伴う筋肉状態、老化関連認知傷害、血管疾患、代謝性機能障害または神経変性、およびミトコンドリア機能低下を伴う神経学的状態からなる群より選択された１つまたは複数の状態の治療方法；または
エピカテキンまたはエピカテキン誘導体をそれを必要とする患者に投与することを含むミトコンドリア発生または生体エネルギー学的機能障害のリスクがある動物の予防方法。
【請求項８６】
ミトコンドリア発生または生体エネルギー学的先天異常、食事障害、ビタミン欠乏、糖尿病、代謝性症候群、フリードライヒ運動失調症、肺高血圧症、慢性腎臓疾患、急性の腎臓傷害、高血圧症、痴呆、心不全、肥満症、インスリン耐性、ミトコンドリア機能低下を伴う筋肉状態、老化関連認知傷害、血管疾患、代謝性機能障害または神経変性、およびミトコンドリア機能低下を伴う神経学的状態からなる群より選択された１つまたは複数の状態の治療のためのエピカテキンまたはエピカテキン誘導体をニコランジルまたはニコランジル誘導体と組み合わせた使用；または
エピカテキンまたはエピカテキン誘導体をニコランジルまたはニコランジル誘導体と組み合わせてそれを必要とする患者に投与することを含むミトコンドリア発生または生体エネルギー学的先天異常、食事障害、ビタミン欠乏、糖尿病、代謝性症候群、フリードライヒ運動失調症、肺高血圧症、慢性腎臓疾患、急性の腎臓傷害、高血圧症、痴呆、心不全、肥満症、インスリン耐性、ミトコンドリア機能低下を伴う筋肉状態、老化関連認知傷害、血管疾患、代謝性機能障害または神経変性、およびミトコンドリア機能低下を伴う神経学的状態からなる群より選択された１つまたは複数の状態の治療方法；または
エピカテキンまたはエピカテキン誘導体をニコランジルまたはニコランジル誘導体と組み合わせてそれを必要とする患者に投与することを含むミトコンドリア発生または生体エネルギー学的機能障害のリスクがある動物の予防方法。
【請求項８７】
ミトコンドリア発生または生体エネルギー学的先天異常、食事障害、ビタミン欠乏、糖尿病、代謝性症候群、フリードライヒ運動失調症、肺高血圧症、慢性腎臓疾患、急性の腎臓傷害、高血圧症、痴呆、心不全、肥満症、インスリン耐性、ミトコンドリア機能低下を伴う筋肉状態、老化関連認知傷害、血管疾患、代謝性機能障害または神経変性、およびミトコンドリア機能低下を伴う神経学的状態からなる群より選択された１つまたは複数の状態の治療のためのニコランジルまたはニコランジル誘導体の使用；または
ニコランジルまたはニコランジル誘導体をそれを必要とする患者に投与することを含むミトコンドリア発生または生体エネルギー学的先天異常、食事障害、ビタミン欠乏、糖尿病、代謝性症候群、フリードライヒ運動失調症、肺高血圧症、慢性腎臓疾患、急性の腎臓傷害、高血圧症、痴呆、心不全、肥満症、インスリン耐性、ミトコンドリア機能低下を伴う筋肉状態、老化関連認知傷害、血管疾患、代謝性機能障害または神経変性、およびミトコンドリア機能低下を伴う神経学的状態からなる群より選択された１つまたは複数の状態の治療方法；または
ニコランジルまたはニコランジル誘導体をそれを必要とする患者に投与することを含むミトコンドリア発生または生体エネルギー学的機能障害のリスクがある動物の予防方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００９年４月１７日に出願された米国特許仮出願第６１／１７０、５５７号および２００９年９月１７日に出願された米国特許仮出願第６１／２４３、５０１号の優先権を主張し、各出願の、全ての表、図、および請求項を含めその全体が本願に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
本発明背景に関する以下の考察は、単に読者に対し本発明の理解を支援する目的で提供しているに過ぎず、本発明に先行技術を書き写し構成要素の一部とする意図はない。
【０００３】
本特許出願は、急性の障害の治療と予防、および慢性ミトコンドリア欠乏または機能不全の状態の予防または回復に関する。
【０００４】
虚血性器官傷害、および虚血／再潅流傷害の関連状態は、独立にまたは呼応して、種々の形の細胞死の引き金となりうるシグナル伝達分子および代謝性エフェクターの変化を伴う。これらには、細胞内のｐＨ、カルシウム、セラミド、フリーラジカル、低酸素およびアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）欠乏に関する変化が含まれる。全てのこら等の因子は、急性の細胞壊死の結果として大きく変化する可能性があるが、他方、特定の環境下のアポトーシス死での特異的エフェクターでもありうる。
【０００５】
心筋梗塞や脳卒中等の虚血状態の器官の機能劣化に対するアポトーシス細胞死および細胞壊死の寄与は、確立されている。心筋梗塞は、通常、心筋細胞壊死およびアポトーシスによる即時の心室機能低下を生ずる。また、これらの梗塞は、拡大して筋細胞および構造的イベント連鎖を誘発し、最終的に有害な心臓リモデリングを生ずる可能性がある。多くの場合、この進行性心筋梗塞の拡大と有害心室リモデリング（左室壁菲薄化、瘢痕組織形成）が心室機能劣化および心不全につながる。
【０００６】
虚血性腎性傷害は、従来より、閉塞性円柱形成、構造の崩壊、および著しい炎症反応に加えて尿細管細胞壊死に関連づけられてきた。より最近では、虚血性腎性傷害の間の重要な細胞死のモードとしてアポトーシスが登場した。心筋梗塞や脳卒中の状態における器官の機能劣化に対するアポトーシス細胞死の寄与は明らかであるが、アポトーシスによる尿細管細胞の脱落が糸球体濾過速度（ＧＦＲ）にどのように影響するかは十分明らかになっていない。それでも、最近の報告は、アポトーシスプログラムとの干渉が腎機能への保護作用につながることを示した。
【０００７】
アポトーシスおよび細胞壊死に関する状態の診断と治療にかなりの進歩があったにも拘わらず、当技術分野で、これらの状態の治療のための予防薬と治療薬に対する取り組みの必要性はいまだ残されている。
【０００８】
本明細書で使われる「ミトコンドリアの機能に関する状態」という用語は、なんらかの形でミトコンドリアから生じたまたはミトコンドリアの不全による障害を指す。このミトコンドリアは、生命を維持し成長を支えるために身体にとって必要な９０％を超えるエネルギーの創生に関与する細胞の中の特殊な区画である。ミトコンドリアの機能が損なわれると、細胞内で、生成されるエネルギーがより少なくなる。細胞傷害および最終的な細胞死がそれに続く。このような状態には、神経筋疾患症状（「ミトコンドリアミオパチー」と呼ばれることが多い）、真性糖尿病、多発性硬化症、亜急性硬化性全脳炎、痴呆、筋神経胃腸脳症（ｍｙｏｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ）、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、精神発達遅滞、難聴ならびに失明、肥満症、心不全、脳卒中、ループス、および関節リウマチを有する症状が含まれる。また、このような状態には運動に対する相対能力も含まれる。これには、例えば、体部位の固定化からの回復または単純に一般運動能力の改善が含まれる。
【０００９】
疾患は遺伝性であることが多く、ミトコンドリア細胞機能に非常に重要であるという理由で、ミトコンドリア病の影響は極めて多様であり、またミトコンドリア病は独特の特性を有する。特異的欠陥の度合いは、大きいものも小さいものもありうる。一部の小さな欠陥は、重篤な疾患や身体障害もなく、「運動不耐性」のみを引き起こす。欠陥は、ミトコンドリアの働きに影響を及ぼすことが多く、複数の組織に対しより激しく作用し、多臓器疾患の原因となる。欠陥ミトコンドリアが、筋肉、大脳、または神経に存在する場合、これらの細胞は、身体のほとんどの部位より多くのエネルギーを使うので、ミトコンドリア病は、通常、いっそうひどくなる。
【００１０】
研究は進行中であるが、治療オプションは現状限られている。しかし、ビタミンがしばしば処方されている。また最近、ピルビン酸塩が治療オプションとして提案されている。当技術分野で、これらの状態の治療のための予防薬および治療薬に対する取り組みの必要性は、いまだ残っている。
【発明の概要】
【００１１】
本発明の目的は、虚血が原因のアポトーシスおよび細胞壊死に関連した疾患と状態の予防および／または治療処置のための組成物および方法を提供することである。下記に記載の種々の態様では、本発明は、急性冠不全症候群の治療のための組成物および方法を提供する。これには、（限定されないが）心筋梗塞およびアンギナ；（限定されないが）腎臓傷害、腎臓虚血および大動脈とその分岐部の疾患を含む他の器官と組織中の急性虚血性イベント；（限定されないが）冠動脈バイパス術（ＣＡＢＧ）手術および血管瘤修復を含む医療介入により生じた損傷；および（限定されないが）真性糖尿病を含む代謝疾患、を含む。
【００１２】
本発明の別の目的は、ミトコンドリア機能に関する状態の予防および／または治療処置のための組成物および方法を提供することである。以下に記載の種々の態様では、本発明は、エピカテキン、エピカテキン誘導体、カテキン、カテキン誘導体、ニコランジル、およびニコランジル誘導体、からなる群より選択された１つまたは複数の化合物の細胞中のミトコンドリア機能を刺激するのに有効な量を投与することを含む。細胞中のミトコンドリア機能の刺激は、１つまたは複数のミトコンドリア呼吸およびミトコンドリア発生の刺激を含んでもよい。本明細書記載の方法および組成物は、障害性ミトコンドリア発生の予防、従って種々の疾患および状態における障害性ミトコンドリア発生の影響の予防に役立てることができ、また、すでに発生している可能性のあるミトコンドリア欠乏に対する効果的な治療を提供する。
【００１３】
第１の態様では、本発明は、患者の虚血または虚血／再灌流（ＩＲ）状態の治療方法に関する。これらの方法は、エピカテキン、その誘導体および薬学的に許容可能なその塩、最も好ましくは、虚血性疾患に効果のある１つまたは複数の薬剤との組み合わせ、からなる群より選択された薬剤を、これを必要としている患者に投与することを含む。
【００１４】
好ましい実施形態では、患者は、心筋梗塞の発生に基づいて選択される。その方法は、患者の心臓の梗塞サイズを減らし、および／または患者の有害心臓リモデリングを遅らせ、弱めまたは防ぐのが好ましい。
【００１５】
別の好ましい実施形態では、患者は、腎臓傷害の発生に基づいて選択される。その方法は、腎臓傷害から腎不全への進行を遅らせるのが好ましい。さらに別の好ましい実施形態では、患者は、全体冠動脈閉塞の発生に基づいて選択される。その方法は、患者の心臓の梗塞サイズを減らし、および／または患者の有害心臓リモデリングを遅らせ、弱め、または防ぐのが好ましい。
【００１６】
さらに別の好ましい実施形態では、患者は、急性の心筋虚血（例えば、アンギナ、またはＡＭＩ）の発生に基づいて選択される。その方法は、患者の血管拡張薬（例えば、ニコランジルまたはその誘導体）、および特に、ニコランジル、ニトロプルシドおよびニトログリセリン等の硝酸塩ドナー血管拡張剤、に対する耐性発現を減らせるのが好ましい。
【００１７】
またさらに別の好ましい実施形態では、患者は、脳卒中、大動脈瘤、心房細動の発生に基づいて選択される。
【００１８】
別の好ましい実施形態では、患者は、ＣＡＢＧ手術、血管瘤修復、血管形成、または患者への造影剤試薬投与、等の医療介入が引き起こした一過性急性虚血の発生に基づいて選択される。
【００１９】
本発明の特定の実施形態では、エピカテキン、または誘導体または薬学的に許容可能なその塩が、虚血性または虚血／再灌流イベントの治療に有用な１つまたは複数の添加の薬剤と共に患者に投与される。代表的な添加の薬剤には、下記からなる群より独立に選択された１つまたは複数の化合物が含まれる。
テトラサイクリン抗生物質（例えば、ドキシサイクリン）、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ阻害剤（例えば、エプチフィバチド、チロフィバン、アブシキシマブ）；ＡＤＰ受容体／Ｐ２Ｙ１２阻害剤（例えば、クロピドグレル、チクロピジン、プラスグレル）；プロスタグランジン類似体（例えば、ブタプロスト、イロプロスト、トレプロスチニル）；ＣＯＸ阻害剤（例えば、アスピリン、アロキシプリン）；他の抗血小板薬（例えば、ジタゾール、クロリクロメン、ジピリダモール、インドブフェン、ピコタミド、トリフルサル）；抗凝固薬（例えば、クマリン、１、３−インダンジオン誘導体）；ヘパリン；直接作用型血液凝固第Ｘａ因子阻害薬；直接トロンビン（ＩＩ）阻害薬（例えば、ビバリルジン）；および血管拡張剤（例えば、フェノルドパム、ヒドララジン、ネシリチド、ニコランジル、ニカルジピン、ニトログリセリン、ニトロプルシド）。このリストは、制限を意味するものではない。特に好ましい実施形態では、エピカテキン、または誘導体または薬学的に許容可能なその塩が、ドキシサイクリンのような１つまたは複数のテトラサイクリン抗生物質と共に投与される。
【００２０】
２つ以上の薬剤を同じ医薬品組成物中に入れて「一緒に投与」することが好ましいが、本明細書で使用されるこの語句に、このようにしなければならないこという意味をもたせる意図はない。むしろ、身体からの各医薬品のクリアランスのＴ１／２が少なくとも部分的に相互に重なり合えば２つ以上の医薬品は「一緒に投与」されたということである。例えば、第１の医薬品がクリアランスのＴ１／２が１時間で時間＝０に投与され、第２の医薬品がクリアランスのＴ１／２が１時間で時間＝４５分に投与される場合、この医薬品は一緒に投与されたと見なされる。逆に、第２の薬剤が時間＝２時間に投与される場合は、この医薬品は一緒に投与されたとは見なされない。
【００２１】
本発明の医薬品組成物の投与経路には、非経口および腸内経路が含まれる。好ましい腸内投与経路には、口による送達（経口）、鼻、直腸、および腟経路が含まれる。好ましい非経口投与経路には、静脈内、筋肉内、皮下、および腹腔内経路が含まれる。１つ以上の医薬品組成物が投与される場合は、それぞれが同じ経路で投与される必要はない。特に好ましい実施形態では、エピカテキン、または誘導体または薬学的に許容可能なその塩は、ドキシサイクリンのような１つまたは複数のテトラサイクリン抗生物質と一緒に投与され、最も好ましいのは単一の医薬品組成物の形で静脈内に投与される。
【００２２】
好ましくは、本発明の医薬品組成物は、「有効量」を投与される。この用語は以下で定義される。明示的またはその他の方法で別に指示がなければ、「有効量」は、状態を回復させるのに十分な最小限の量、または状態の最適または最大の改善を生ずる量に限定されない。２つ以上の医薬品を一緒に投与する場合には、このうちの１つの医薬品の有効量は、それ自体に含まれるものもしくはそれ自体の有効量ではなく、添加の医薬品と一緒に使った場合の有効量になるであろう。
【００２３】
特定の実施形態では、本発明の医薬品組成物は、虚血性または虚血／再潅流イベント発症の４８時間以内に、または医学治療提示の４８時間以内に投与される。イベントの発症は患者の自己申告、またはいくつかのイベント発生の客観的尺度により確認できる。
【００２４】
心臓に関連する虚血性イベントの場合には、好ましい客観的尺度としては、１つまたは複数の心臓マーカー（例えば、ＣＫ−ＭＢ、ミオグロビン、心筋トロポニンＩ、心筋トロポニンＴ、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、等）の増加；連続したＥＣＧ追跡での変化；および血管造影結果が含まれる。
【００２５】
腎臓に関連する虚血性イベントの場合には、好ましい客観的尺度には、Ｂｅｌｌｏｍｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ．８（４）：Ｒ２０４−１２、２００４、によって定義されたものが含まれ、この文献は、参照によってその全体が組み込まれる。本文献では、以下の層別化した急性腎臓傷害患者の分類を提案している：「リスク（Ｒｉｓｋ）」：血清クレアチニンのベースラインから１．５倍の増加または６時間の尿産生が＜０．５ｍｌ／ｋｇ体重；「傷害（Ｉｎｊｕｒｙ）」：血清クレアチニンのベースラインから２．０倍の増加または１２時間の尿産生が＜０．５ｍｌ／ｋｇ体重；「不全（Ｆａｉｌｕｒｅ）」：血清クレアチニンのベースラインから３．０倍の増加またはクレアチニン＞３５５μｍｏｌ／ｌ（４４を超える上昇を伴う）または２４時間の尿産生が０．３ｍｌ／ｋｇ体重未満。
【００２６】
好ましい実施形態では、本発明の医薬品組成物は、虚血性または虚血／再潅流イベント発症、または患者の訴えから２４時間以内に投与され、より好ましくは１２時間以内に、最も好ましくは６時間以内に投与される。
【００２７】
関連態様では、本発明は、急性の虚血性または虚血／再灌流（ＩＲ）イベントの治療のための医薬品組成物に関する。この組成物は、有効量のエピカテキン、または誘導体または薬学的に許容可能なその塩、および虚血性または虚血／再灌流イベント治療に有用な１つまたは複数の添加の薬剤を含む。特に好ましい実施形態では、医薬品組成物は、エピカテキン、または誘導体または薬学的に許容可能なその塩、および１つまたは複数のテトラサイクリン抗生物質、最も好ましくは、ドキシサイクリンを含む。静脈内送達用に処方した組成物が最も好ましい。
【００２８】
別の態様では、本発明は、患者の傷害心臓組織中の幹細胞の移動、播種、増殖、分化および生存を促進または維持する方法に関し、エピカテキン、その誘導体および薬学的に許容可能なその塩からなる群より選択された薬剤をこれを必要とする患者に投与することを含み、任意選択として、虚血性または虚血／再灌流イベントの治療に有効な１つまたは複数の薬剤と一緒に投与することを含む。
【００２９】
さらに別の態様では、本発明は、患者の代謝疾患を治療する方法に関する。これらの方法は、エピカテキン、その誘導体および薬学的に許容可能なその塩からなる群より選択された薬剤をこれを必要とする患者に投与することを含む。好ましい実施形態では、患者は、糖尿病の発生に基づいて選択される。この方法が患者の血糖レベルを下げることが好ましい。
【００３０】
別の態様では、本発明は、エピカテキンの特定の誘導体に関する。これらは、本明細書記載の方法中に用途を見つけてもよく、または医薬品化合物として単独で使用してもよい。
【００３１】
本明細書で使われる用語の「エピカテキン誘導体」は、環状構造およびエピカテキン自体の３Ｒ（−）立体化学を保持し、１つまたは複数のエピカテキンに対する置換基を含む任意の化合物を指す。特定の天然エピカテキン誘導体は既知で、（−）−エピガロカテキン（ＥＧＣ）、（−）−エピカテキン−３−ガリウム酸塩（ＥＣＧ）および（−）−エピガロカテキン−３−ガリウム酸塩（ＥＧＣＧ）等がある。また、この用語は、患者に投与した場合にエピカテキンまたはその誘導体を放出する結合分子またはプロドラッグを含む。このような結合分子には、例えば、加水分解性残存基により結合したエピカテキンおよびニコランジルを含んでもよい。同様に、本明細書で使われる用語の「カテキン誘導体」は、環状構造およびカテキン自体の３Ｒ（＋）立体化学を保持し、１つまたは複数のカテキンに対する置換基を含む任意の化合物を指す。
【００３２】
好ましいエピカテキン誘導体は下記の構造を有し、
【化１】
2012524077.tif 000003
式中、
Ｒ１、Ｒ２、およびＲ４は−ＯＨ、−Ｏ−Ｃ１−６直鎖または分岐鎖アルキル、−Ｏ−Ｃ１−１２アリルアルキル、−Ｃ１−６直鎖または分岐鎖アルキル、および−Ｃ１−１２アリルアルキルからなる群よりそれぞれ独立に選択され、ここで前記各直鎖または分岐鎖アルキルまたはアリルアルキルが０〜４鎖ヘテロ原子を含み、また任意選択としてハロゲン、トリハロメチル、−Ｏ−Ｃ１−６アルキル、−ＮＯ２、−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＯＮＨ２、および−Ｃ（Ｏ）（ＯＲ６）からなる群より独立に選択された１つまたは複数のさらなる置換基を含み、ここでＲ６はＨまたはＣ１−３アルキルであり（ただし、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ４のうちの少なくとも１つは−ＯＨでないことが前提であり、また、Ｒ１およびＲ２がそれぞれ−ＯＨである場合は、Ｒ４は−ＣＨ３または−Ｏ−ＣＨ３ではないことが前提となる）；
Ｒ３は−ＯＨまたは
【化２】
2012524077.tif 000004
であり；さらに
Ｒ５は−Ｈまたは−ＯＨである誘導体、
または薬学的に許容可能なその塩である。
【００３３】
このような誘導体または薬学的に許容可能なその塩の特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ４の内の２つが−ＯＨである。さらに他の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ４の内の少なくとも１つが−Ｏ−Ｃ１−６直鎖または分岐鎖アルキルである。
【００３４】
特に好ましいエピカテキン誘導体には、下記の群から選択された構造を有する誘導体が含まれる。
【化３】
2012524077.tif 000005
、および
【化４】
2012524077.tif 000006
【００３５】
このような誘導体は、本明細書記載の誘導体または薬学的に許容可能な塩および薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬品組成物として処方してもよい。これらは非経口または腸内投与経路用に処方してもよい。
【００３６】
特定の実施形態では、このような医薬品組成物はさらに、テトラサイクリン抗生物質、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ阻害剤、ＡＤＰ受容体／Ｐ２Ｙ１２阻害剤、プロスタグランジン類似体、ＣＯＸ阻害剤、抗血小板薬、抗凝固薬、ヘパリン、直接作用型血液凝固第Ｘａ因子阻害薬、直接トロンビン（ＩＩ）阻害薬、および血管拡張剤（例えば、ニコランジルまたはその誘導体）からなる群より独立に選択された１つまたは複数の化合物を含む。
【００３７】
前述のように、本発明の別の目的は、ミトコンドリア機能に関連する状態の予防のおよび／または治療処置のための組成物および方法を提供することである。第１の態様では、本発明は、エピカテキン、エピカテキン誘導体、カテキン、カテキン誘導体、ニコランジル、およびニコランジル誘導体からなる群より選択された、細胞のミトコンドリア機能を刺激するのに有効な量の１つまたは複数の化合物を投与することを含む。
【００３８】
細胞中のミトコンドリア機能の刺激は、１つまたは複数のミトコンドリア呼吸およびミトコンドリア発生の刺激を含んでもよい。本明細書記載の方法および組成物は障害性ミトコンドリア発生の予防、およびこの結果として、種々の疾患および状態（慢性と急性両方の）における障害性ミトコンドリア発生の影響の予防に対する支援を可能とし、またすでに発生したミトコンドリア欠乏に対する効果的治療を提供する。
【００３９】
特定の実施形態では、化合物の投与は、少なくとも０．１μＭのカテキン、カテキン誘導体、エピカテキンまたはエピカテキン誘導体、少なくとも０．２５μＭのカテキン、カテキン誘導体、エピカテキンまたはエピカテキン誘導体、少なくとも０．５μＭのカテキン、カテキン誘導体、エピカテキンまたはエピカテキン誘導体、および少なくとも１μＭのカテキン、カテキン誘導体、エピカテキンまたはエピカテキン誘導体の細胞への投与を含む。種々の実施形態では、少なくとも所望の濃度は、少なくとも３０分、１時間、３時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、またはそれ以上維持される。種々の他の実施形態では、少なくとも所望の濃度は、少なくとも２４時間、４８時間、７２時間、１週、１ヶ月、またはそれ以上の期間の１２時間毎に少なくとも１回；または少なくとも４８時間、７２時間、１週間、１ヶ月、またはそれ以上の期間の２４時間毎に少なくとも１回、実現される。所望の濃度を所望の時間維持するために、複数の用量の１つまたは複数の化合物を用いてもよい。投薬間隔を、各対象化合物の身体からのクリアランスのＴ１／２に基づいて決定してもよい。
【００４０】
エピカテキン、エピカテキン誘導体、カテキン、カテキン誘導体、ニコランジル、およびニコランジル誘導体からなる群より選択された１つまたは複数の化合物の、動物の細胞のミトコンドリア機能を刺激するのに有効な量を非経口または腸内経路により前記動物に送達することができる。好ましい腸内投与経路には、口からの送達（経口）、鼻、直腸、および腟経路が含まれる。好ましい非経口投与経路には、静脈内、筋肉内、皮下、および腹腔内経路が含まれる。２つ以上の化合物を投与する場合、それぞれを同じ経路で投与する必要はない。
【００４１】
好ましくは、本発明の化合物は、「有効量」を投与される。この用語は以下で定義される。明示的またはその他の方法で特に指示がなければ、「有効量」は、状態を回復させるのに必要な最小量または状態の最適または最大改善を生ずる量に限定されない。２つ以上の化合物を一緒に投与する場合には、この化合物の１つの有効量はそれ自身に含まれる物質の、またはそれ自身の有効量ではなく、添加の化合物を一緒に使った場合の有効量となるであろう。
【００４２】
エピカテキン、エピカテキン誘導体、カテキン、またはカテキン誘導体の送達を含む方法では、選択された化合物は、エピカテキン、エピカテキン誘導体、カテキン、またはカテキン誘導体からなる群より選択された他の化合物に対して少なくとも９０％純粋であることが好ましい。例えば、化合物がエピカテキンの場合は、多くても１０％のエピカテキン誘導体、カテキン、およびカテキン誘導体の混入があるのみである。さらに好ましくは、選択したエピカテキン、エピカテキン誘導体、カテキン、またはカテキン誘導体は、エピカテキン、エピカテキン誘導体、カテキン、またはカテキン誘導体からなる群より選択された他の化合物に対し少なくとも９５％純粋である。しかし、このことは、実質的な濃度のニコランジルまたはニコランジル誘導体との組み合わせを排除するものではないことに留意すべきである。従って、特定の実施形態では、エピカテキン、エピカテキン誘導体、カテキン、またはカテキン誘導体は、本方法において、ニコランジルまたはニコランジル誘導体との組み合わせで送達される。これらは、単一の医薬品組成物として提供されるのが好ましい。
【００４３】
動物がミトコンドリア機能低下を伴う１つまたは複数の状態を患っているか、または患う直近のリスクを有するという診断に基づいて、エピカテキン、エピカテキン誘導体、カテキン、カテキン誘導体、ニコランジル、およびニコランジル誘導体からなる群より選択された１つまたは複数の化合物の、ミトコンドリア機能を刺激するのに有効な量を投与する目的で、前記動物を選択してもよい。上述のように、このような状態には、ミトコンドリア代謝の先天異常、皮膚の老化（例えば、光曝露による）、栄養またはビタミン欠乏、ミトコンドリアミオパチー、真性糖尿病、インスリン耐性、メタボリックシンドローム、フリードライヒ運動失調症、肺高血圧症、慢性腎臓疾患、急性腎臓傷害、高血圧症、多発性硬化症、亜急性硬化性全脳炎、痴呆または他の老化関連認知障害状態、血管疾患、代謝性機能障害または神経変性（例えば、アルツハイマー病）、筋神経胃腸脳症（筋神経原性胃腸脳症）、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、精神発達遅滞、難聴および失明、肥満症、心不全、脳卒中、ループス、および関節リウマチを含んでもよい。
【００４４】
運動能力を高めたいという要求に基づいて、エピカテキン、エピカテキン誘導体、カテキン、カテキン誘導体、ニコランジル、およびニコランジル誘導体からなる群より選択された１つまたは複数の化合物の、ミトコンドリア機能を刺激するのに有効な量を投与する目的で、動物を選択してもよい。これには、例えば、身体部位の固定化からの回復、または単純に一般運動能力の改善が含まれる。さらに、動物を、その動物の年齢、活動状態、または栄養状態（例えば、患者が完全静脈栄養、調整粉乳、等を受けている）に基づいて選択してもよい。このリストは、制限を意味するものではない。
【００４５】
従って、種々の実施形態では、本発明は、筋肉構造または機能を改善する方法；運動に関連するミトコンドリア効果を改善する方法；年齢、不活発、食事、または上述の疾患や状態のいずれかにより制限された人の運動能力を強化する方法；運動に応答する筋肉の健康および機能の強化方法；傷害、不活発、肥満症、または前述の疾患および状態のいずれかによるかどうかに基づいて、運動が制限された臨床現場での筋肉の健康および機能の強化方法；および／または活発な活動からの、または活発なもしくは持続的活動に関連した傷害からの筋肉の回復を促進する方法を提供する。それぞれのケースで、この方法は、エピカテキン、エピカテキン誘導体、カテキン、カテキン誘導体、ニコランジル、およびニコランジル誘導体からなる群より選択された１つまたは複数の化合物の、細胞のミトコンドリア機能を刺激するのに有効な量を投与することを含む。
【００４６】
好ましい実施形態では、本発明は、カテキン、カテキン誘導体、エピカテキンまたはエピカテキン誘導体を、少なくとも１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、またはそれ以上の時間の間、少なくとも０．１μＭの動物中の前記化合物の血漿中濃度を維持するのに有効な量で経口経路により送達することを含む。様々な態様では、その方法は、前記動物の前記化合物の少なくとも１μＭの血漿中濃度を少なくとも２４時間またはそれ以上の間維持する。別の好ましい実施形態では、この請求発明は、カテキン、カテキン誘導体、エピカテキンまたはエピカテキン誘導体を、少なくとも２４時間、４８時間、７２時間、１週間、１ヶ月、またはそれ以上の期間の間で少なくとも１２時間毎に１回は少なくとも０．１μＭの血漿中濃度を達成するのに有効な量で経口経路により投与することを含む。さらに別の好ましい実施形態では、この請求発明は、カテキン、カテキン誘導体、エピカテキンまたはエピカテキン誘導体を、少なくとも４８時間、７２時間、１週間、１ヶ月、またはそれ以上の期間の間で少なくとも２４時間毎に１回は少なくとも０．１μＭの血漿中濃度を達成するのに有効な量で経口経路により投与することを含む。これらの実施形態では、その方法は、前に列挙したそれぞれの期間で少なくとも１μＭの血漿中濃度を維持または達成するのが最も好ましい。
【００４７】
関連の態様では、本発明は、動物のミトコンドリア機能低下を伴う状態の治療に関する。これらの方法は、エピカテキン、エピカテキン誘導体、カテキン、カテキン誘導体、ニコランジル、およびニコランジル誘導体からなる群より選択された１つまたは複数の化合物の、前記動物の細胞中のミトコンドリア機能を刺激するのに有効な量を非経口または腸内経路により動物に送達することを含む。
【００４８】
特定の実施形態では、前述の方法は、有効量のエピカテキンまたはエピカテキン誘導体を送達することを含む。好ましいエピカテキン誘導体は、以下の構造を有し、
【化５】
2012524077.tif 000007
式中、
Ｒ１、Ｒ２、およびＲ４はそれぞれ−ＯＨ、−Ｏ−Ｃ１−６直鎖または分岐鎖アルキル、−Ｏ−Ｃ１−１２アリルアルキル、−Ｃ１−６直鎖または分岐鎖アルキル、および−Ｃ１−１２アリルアルキルからなる群より独立に選択され、各前記直鎖または分岐鎖アルキルまたはアリルアルキルは、０〜４鎖ヘテロ原子、および任意選択として、ハロゲン、トリハロメチル、−Ｏ−Ｃ１−６アルキル、−ＮＯ２、−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＯＮＨ２、および−Ｃ（Ｏ）（ＯＲ６）からなる群より独立に選択された１つまたは複数の置換基を含み、ここでＲ６はＨまたはＣ１−３アルキルであり（ただし、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ４のうちの少なくとも１つは−ＯＨでないことが前提であり、また、Ｒ１およびＲ２がそれぞれ−ＯＨである場合は、Ｒ４は−ＣＨ３または−Ｏ−ＣＨ３ではないことが前提となる）、
2012524077.tif 000008
Ｒ３は−ＯＨまたは
【化６】
2012524077.tif 000009
であり；さらに
Ｒ５は−Ｈまたは−ＯＨである誘導体、
または薬学的に許容可能なその塩である。
【００４９】
このような誘導体または薬学的に許容可能な塩の特定の実施形態では、Ｒ１，Ｒ２，およびＲ４の内の２つは−ＯＨである。さらに他の実施形態では、Ｒ１，Ｒ２，およびＲ４のうちの少なくとも１つは−Ｏ−Ｃ１−６直鎖または分岐鎖アルキルである。
【００５０】
特に好ましいエピカテキン誘導体には、
【化７】
2012524077.tif 000010
、および
【化８】
2012524077.tif 000011
からなる群から選択された構造を有する誘導体が含まれる。
【００５１】
本明細書で使われる用語の「ニコランジル誘導体」は、Ｎ−［２−（ニトロキシ）エチル］−３−ピリジンカルボキサミド（ニコランジル）のＮ−エチルＣ−２ニトロキシ成分を保持し、ニコランジルに対して１つまたは複数の置換基を含む任意の化合物を指す。例には、Ｂｏｓｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．８：１７２７−３２、２０００；およびＳａｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｕｎｙｎ  Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇｓ  Ａｒｃｈ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３４４：５８９−９５、１９９１で開示されたものが含まれる。また、この用語には、患者に投与すると、ニコランジルまたはその誘導体を放出する結合分子またはプロドラッグが含まれる。このような結合分子には、例えば、加水分解性残存基により結合したエピカテキンおよびニコランジルが含まれてもよい。
【００５２】
上記で考察した化合物および誘導体は、本明細書記載の誘導体または薬学的に許容可能な塩および薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬品組成物として処方することもできる。これらは、非経口または腸内投与経路用として処方してもよい。上記で考察した化合物および誘導体は、後述の栄養補助食品組成物として処方してもよい。 
【００５３】
本開示の１つまたは複数の詳細な実施形態は、以下の付随する図および記述により説明される。本開示の他の特徴、目的、および効果については、その記述と図、および請求項から明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】ミトコンドリア気孔開口のエピカテキンおよびその種々の誘導体型による抑制を示す図である。
【図２】Ｉ／Ｒ誘導心筋損傷によりアルギナーゼ酵素活性（値）が約５倍の増加を生ずることを示す実施例３の結果である。（−）−エピカテキン（１ｍｇ／Ｋｇ）を使った前処理（１０日）によりアルギナーゼ活性の大きな減少が誘導された。
【図３】エピカテキン（ＥＰＩ）処理ヒト冠状動脈内皮細胞（ＨＣＡＥＣ）において、細胞内Ｃａ２＋の増加が一酸化窒素産生の増加と相関が無いことを示す実施例４の結果である。一酸化窒素産生および細胞内Ｃａ２＋は、ＢＫまたはＥＰＩの濃度を増加させて処理したＨＣＡＥＣ中で、別々に測定された。ＢＫ処理したＨＣＡＥＣで、一酸化窒素産生は、高濃度側では細胞内カルシウム増加を反映した。１０ｎＭ以上のＥＰＩ濃度で処理したＨＣＡＥＣは、細胞内カルシウム増加を上回る一酸化窒素産生を示した。
【図４】ＨＣＡＥＣのＥＰＩおよびＢＫ処理が細胞内のＣａ２＋濃度増加につながることを示す実施例４の蛍光測定結果である。［１モル／Ｌ］ＥＰＩおよび［１モル／Ｌ］ＢＫで処理したＨＣＡＥＣは、細胞内Ｃａ２＋の増加を示した。細胞内のＣａ２＋の無いＨＣＡＥＣは、ＥＰＩおよびＢＫ処理にも関わらず、蛍光増加を示さなかった。
【図５】一酸化窒素（ＮＯ）産生がＣａ２＋の無いＥＰＩで処理したＨＣＡＥＣで観察されたことを示す実施例４の結果である。約２５％のＮＯ産生が［１モル／Ｌ］ＥＰＩで処理したＣａ２＋の無いＨＣＡＥＣ中で認められ、細胞内Ｃａ２＋が無い場合は完全に抑止されたＢＫ処理とは著しい対照を示した。［１モル／Ｌ］ＢＫ処理では２％のＮＯ産生であり、他方、［１モル／Ｌ］ＥＰＩでは２５％の産生であった。
【図６】Ｃａ２＋非存在下、Ｓｅｒ−１１７７、６３３および６１５リン酸化を経由して、内皮の一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）を活性化することを示す実施例４の結果である。基底ｅＮＯＳリン酸化全体に対するセリン残基の相対的リン酸化は、［１モル／Ｌ］ＥＰＩ処理ＨＣＡＥＣで増加した。Ｓｅｒ−１１７７のリン酸化は、対照に対するリン酸化に比べ１００％増加し、Ｓｅｒ−６３３では７５％およびＳｅｒ−６１５では６５％増加した。Ｔｈｒ−４９５リン酸化に対しては変化が認められなかった。
【図７】ｅＮＯＳが、Ｃａｖｅｏｌｉｎ−１（Ｃａｖ−１）から離脱しないで、Ｃａ２＋の無いＨＣＡＥＣ中のＥＰＩにより活性化されることを示す実施例４の結果である。総タンパク質量ＥＰＩまたはＢＫ処理ＨＣＡＥＣ由来の総タンパク質量は沈殿したＣａｖ−１またはｅＮＯＳ抗体であった。ｅＮＯＳ残基、ｅＮＯＳおよびＣａｖ−１に対して免疫沈降相でウェスタンブロットを行った。対照ＨＣＡＥＣのｅＮＯＳでは、活性化も無く、Ｃａｖ−１からの離脱も無かった。ＢＫ処理では、Ｓｅｒ−１１７７、Ｓｅｒ−６３３およびＳｅｒ−６１５のリン酸化状態の観察結果からは、ｅＮＯＳの活性化は認められなかった。また、ｅＮＯＳはＣａｖ−１から離脱もしなかった。
【図８】上清相のウェスタンブロットを示す実施例４の結果である。対照、ＥＰＩとＢＫ処理ＨＣＡＥＣ、上澄み中には、ｅＮＯＳ残基、ｅＮＯＳおよびＣａｖ−１は無視できる程度しか存在していなかった。
【図９】ｅＮＯＳが、対照中の場合と同様に、ＥＰＩまたはＢＫで処理したＣａ２＋の無いＨＣＡＥＣ中でカルモデュリン−１（ＣａＭ１）と結合しないことを示す実施例４の結果である。ＨＣＡＥＣを溶解し、ｅＮＯＳ抗体で沈殿させた。上清相はＣａＭ１発現のみを示し、ｅＮＯＳの発現は示さなかった。
【図１０−１５】ｅＮＯＳがＥＰＩにより活性化され、Ｃａ２＋の無いＨＣＡＥＣ中のカベオラ／脂質ラフトに相当する細胞性低密度相中に残ることを示す実施例４の結果である。ＨＣＡＥＣからの総タンパク質抽出物をショ糖勾配中に配置した。４５、３５％、境界および５％のショ糖勾配をｅＮＯＳ残基、ｅＮＯＳ、Ｃａｖ−１、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）およびガングリオシドＭ１（ＧＭ１）の検出に用いた。図１０：Ｃａ２＋存在下の対照ＨＣＡＥＣでは、低ショ糖密度画分中にＣａｖ−１およびＧＭ１と共に不活性ｅＮＯＳが認められた。図１１：正常Ｃａ２＋の存在下、ＴｆＲの存在からもわかるように、ＢＫ処理ＨＣＡＥＣでは、高ショ糖密度画分中に活性化ｅＮＯＳが認められた。図１２：正常Ｃａ２＋存在下のＨＣＡＥＣのＥＰＩ処理によりｅＮＯＳを活性化され、高ショ糖密度画分に集められた。図１３：Ｃａ２＋の無い対照ＨＣＡＥＣは低ショ糖密度画分中に不活性ｅＮＯＳを含んでいた。図１４：ＢＫはＣａ２＋の無いＨＣＡＥＣ中でｅＮＯＳを活性化できず、また高ショ糖密度画分に移動させることができない。図１５：ＥＰＩは、Ｃａ２＋の無いＨＣＡＥＣ中でｅＮＯＳを活性化したがショ糖密度画分へ移動させることはなかった。
【図１６】６ＡＣＡ−ＥＰＩの合成方法を示す図である。
【図１７】Ｄｘ−ＥＰＩのＩＶ適用による誘導ＩＡ／ＡＡＲ減少（％）の観察結果を示す図である。
【図１８】Ｃ２Ｃ１２細胞における内生呼吸速度に対するエピカテキンの効果を示す図である。ＯＣＲ＝酸素消費速度（ピコモルＯ２／分／３ｘ１０４細胞）（平均±ＳＤ）。
【図１９】０．１、０．５または１マイクロモルエピカテキンで４８時間処理したＣ２Ｃ２筋芽細胞の内生、状態４（静止）、および脱共役剤誘発呼吸の酸素消費速度（ＯＣＲ）を示す図である。Ａ．状態４を誘導するためにオリゴマイシンおよび脱共役剤誘発呼吸を誘導するためにＦＣＣＰを添加した場合の時間対速度のグラフ。Ｂ．同実験からの平均速度の棒グラフ。データは平均値±ＳＤ（ｎ＝３〜４）。
【図２０】ミトコンドリア電子伝達系タンパク質のレベルに対するエピカテキンの効果を示す図である。１μＭのエピカテキンまたはカテキンで４８時間処理したＣ２Ｃ１２細胞のウェスタンブロットを、モノクローナル抗体電子伝達系タンパク質の混合物で探索した。
【図２１】ニコランジルおよびエピカテキン処理により生じたヒト骨格筋細胞の初代培養を使って、内生、状態４（静止）、および脱共役剤誘発呼吸の酸素消費速度（ＯＣＲ）を示す図である。
【図２２】ニコランジルおよびエピカテキン、およびこれらの組み合わせの、ヒト骨格筋細胞の初代培養を使った脱共役剤誘発呼吸の酸素消費速度（ＯＣＲ）に対する効果比較を示した図である。
【図２３】ヒト骨格筋細胞の初代培養を使った内生、状態４（静止）、および脱共役剤誘発呼吸の酸素消費速度（ＯＣＲ）に対するニコランジルおよびエピカテキンによるミトコンドリア気孔の開口の効果比較を示した図である。
【図２４】ミトコンドリア気孔の開口に対するエピカテキンの効果を示す図である。
【図２５−２７】実施例１０の結果を示す図である。図２５は、ＥＰＩ、ＮＩＣＯおよびＥＰＩ＋ＮＩＣＯ（それぞれの用量の０．５）のミトコンドリア膨化に対する効果を示す；図２６は、いくつかのＥＰＩ＋ＮＩＣＯの組み合わせにより非常に低い濃度で相乗的効果を示す解析結果を示す；また、図２７は、ＮＩＣＯ（Ｙ軸、［Ｍ］）とＥＰＩ（Ｘ軸、［Ｍ］）の組み合わせのイソボログラフ解析で、直線から外れた位置の円マーカーによる添加効果が相乗効果を示している。
【図２８】心筋虚血／再灌流（ＩＲ）傷害のラットモデルを使った、梗塞サイズに対する（−）−エピカテキン（Ｅｐｉ）および／またはニコランジル（Ｎｉｃｏ）処理の効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
発明の詳細な説明
本明細書で特に他に指示がなければ、使われている用語の定義は、薬学の分野で使われる標準的な定義である。本明細書と添付の請求項で使われているように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈的に別義が指示されていなければ、複数の対照を含む。従って、例えば、「ａ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｃａｒｒｉｅｒ（医薬キャリア）」への言及は、２つ以上のこのようなキャリアの混合物を含む、等。
【００５６】
また、「または（ｏｒ）」の使用は、他に定めがなければ、「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」を意味する。同様に、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｉｎｃｌｕｄｅ」、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」、および「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」は置き替え可能であり、制限する意図はない。
【００５７】
さらに、種々の実施形態の記述で「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の用語を使用している場合は、当業者ならいくつかの具体的な例では、実施形態で代わりに「本質的に〜から構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」または「〜から構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」の語を使って記述できるとわかるであろうことが理解されるべきである。
【００５８】
特に断らなければ、本明細書で使われる全ての技術科学的用語は、本開示の属する当業者に通常理解されているのと同じ意味を有する。本明細書の記載と類似または等しい任意の方法と試薬が本開示方法と組成物の実現のために使用できるが、代表的な方法と材料を次に記載する。
【００５９】
本明細書に記載の全ての出版物は、本明細書の説明と関連して使うことが可能な、該出版物に記載されている方法論を記載し開示する目的で、参照により全体が本明細書に組み込まれる。前述の考察および文章全体中の出版物は、本開示の出願日前のそれらの開示の目的のみで提供されている。本明細書中のいずれの事項も、先行開示の理由で発明者がこのような開示に先行する権利を有さないことを認めると解釈されるべきではない。
【００６０】
虚血および再灌流は、生理学的に異なるイベントであり、必ずしも同時に起こる必要はない。虚血は、通常、血栓または塞栓による器官に対する血液の欠乏を意味し、再潅流障害は、閉塞または狭窄が除去された場合に生ずるから、潜在的梗塞サイズおよび虚血／再潅流イベント中の有害リモデリングを減らすことが可能でありまた望ましいことである。本開示は、虚血性および／または再潅流障害を抑制するために有用な方法と組成物を提供し、これには、例えば、虚血の間に、あるいは虚血後で、再灌流が起こる前に、あるいは虚血後の再灌流のときに、エピカテキンを投与することが含まれる。エピカテキン、その誘導体または薬学的に許容可能なその塩が、虚血／再潅流イベントの間に、前に、または後で投与される方法が本明細書で開示されている。
【００６１】
血液と酸素が不足している組織は虚血性壊死または梗塞を受けて永久組織損傷を生ずることが多い。心臓虚血はしばしば「アンギナ」、「心臓疾患」、または「心臓発作」と呼ばれ、また、脳虚血はしばしば「脳卒中」と呼ばれる。心臓および脳虚血の両方は血液と酸素の流量減少から生じ、ある程度の脳損傷、心臓組織への損傷、またはその両方が続いて起こることが多い。血流および酸素負荷の減少は、動脈閉塞、血管破裂、発生奇形、粘度または他の血液の質の変化、または身体外傷の結果である可能性がある。糖尿病は、虚血のリスク因子である。従って、本開示の方法および組成物は、糖尿病患者の虚血のリスクを予防または抑制する、または虚血傷害が原因の損傷を抑制または減らすために使用可能である。これには、心臓および大脳虚血傷害に加えて視力喪失および潰瘍を生じている虚血を含んでもよい。
【００６２】
特定の血管領域への血流の減少は、局所虚血として、脳全体への血流減少は全虚血として知られている。血液不足、およびその結果の酸素およびグルコース不足の場合、脳組織は、虚血性壊死または梗塞を起こす可能性がある。このような細胞退化および死亡の根底にあると思われる代謝性イベントには、ＡＴＰ欠乏によるエネルギー不足；細胞アシドーシス；グルタメート放出；カルシウムイオン流入；膜りん脂質分解の刺激およびその結果の遊離脂肪酸蓄積；およびフリーラジカル生成が挙げられる。
【００６３】
脊髄損傷は、脊髄カラム外傷の最も重篤な合併症であり、また、胸部および胸腹部動脈瘤治療のための大動脈手術の重篤な合併症でもある（Ｋｏｕｃｈｏｕｋｏｓ、Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．９９：６５９−６６４、（１９９０））。米国特許第５、６４８、３３１号に記載されているように、脊髄は、大動脈の血流遮断の間の虚血に最も敏感な器官であり、ここで生じた傷害が不全対麻痺または対麻痺を起こす可能性がある。脊髄虚血および対麻痺は、進行して、約１１パーセント（１１％）の患者で選択的下行性胸部および胸腹部血管瘤修復を起こし、約４０パーセント（４０％）近くが緊急修復を起こす（Ｃｒａｗｆｏｒｄ、Ｊ．Ｖａｓ．Ｓｕｒｇ．３：３８９−４０２、（１９８６））。
【００６４】
心筋虚血は、心臓筋肉が適切な血液供給を受けず、その結果、必要なレベルの酸素と栄養素が不足している場合に発生する。心筋虚血の共通の原因は、アテローム性動脈硬化で、これは心臓筋肉に血流を供給する血管（冠動脈）中の妨害物の原因になる。うっ血性心不全（ＣＨＦ）は、また、心筋梗塞を生ずる可能性がある。
【００６５】
腸管に影響を与える虚血性イベントは、多くの患者の死亡率と罹患率における主要な役割を演ずる。米国特許第６、１９１、１０９号に記載されているように、小腸の虚血傷害は粘膜破壊、細菌移行および穿孔につながる。
【００６６】
加齢黄斑変性（ＡＭＤ）は米国、その他における６５才以上の人の視力障害および失明の主要原因である。網膜の酸化障害がＡＭＤの発病に関与している可能性がある。
【００６７】
活性酸素種（ＲＯＳ）（フリーラジカルとも呼ばれる）には、一重項酸素化合物の中で、超酸化物陰イオン（Ｏ２−）、一酸化窒素（ＮＯ）、およびヒドロキシルラジカルが挙げられる。ミトコンドリアは、特にＲＯＳによる損傷の影響を受けやすい。これらは、ミトコンドリア呼吸鎖により連続的に生成されるのがその理由である。細胞が、器官虚血および再灌流、紫外線暴露および他の形の照射等の種々のストレスを経験した場合、ＲＯＳの産生は増加する。Ｒｅｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５４：４１０−４２４；Ｓａｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．Ｍｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１０１：２５９−２６８；Ｇｅｂｉｃｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３３８：６２９−６３６。ＲＯＳは、また、脳卒中、外傷性頭部損傷および脊髄損傷により引き起こされるものを含む脳虚血に応答して作られる。さらに、代謝が増加するか身体が極度の運動に曝された場合、内在性抗酸化剤系が打ち負かされ、フリーラジカル損傷が起こる可能性がある。フリーラジカルは、毒素による肝臓傷害を含む一部の毒素および健康に害のある状態に関連する組織損傷の原因になると報告されている。Ｏｂａｔａ（１９９７）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４９：７２４−７３０；Ｂｒｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３１：１７３−１９６；Ｒｉｚｚｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｚｅｎｔｒａｌｂｌ．Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｍｅｄ．４１：８１−９０；Ｌｅｃａｎｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ  ９：５５９−６６３。
【００６８】
本開示は、哺乳類患者の虚血状態の症状の治療および／または改善の方法を提供し、この方法は、患者に有効量のエピカテキンまたはエピカテキン誘導体を単独または虚血状態に対する効果を有する１つまたは複数の薬剤と組み合わせて投与することを含む。また、本開示は、哺乳類患者の虚血状態の症状の治療および／または改善の方法を提供し、この方法は、患者に有効量のエピカテキンまたはエピカテキン誘導体を単独または虚血状態に対する効果を有する１つまたは複数の薬剤と組み合わせて投与すること、および前記投与により前記虚血状態に関連する組織損傷を減らすことを含む。一部の実施形態では、虚血状態は、脳虚血；腸管虚血；脊髄虚血；心臓血管虚血；心筋梗塞関連心筋虚血；ＣＨＦ関連心筋虚血、加齢性黄斑変性症（ＡＭＥ）関連虚血；肝臓虚血；腎臓／腎臓虚血；皮膚虚血；血管収縮誘導組織虚血；持続勃起症および勃起不全の結果としての陰茎虚血；血栓塞栓性疾患関連虚血；毛細血管疾患関連虚血；および糖尿病性潰瘍関連虚血、壊疽状態、外傷後症候群、心拍停止蘇生、低温症、末梢神経損傷または神経障害、からなる群より選択される。一部の実施形態では、組織虚血状態は、脳虚血である。さらなる実施形態では、患者に対し、１ｋｇの前記哺乳類患者の体重あたり約１〜約１０００ｍｇの範囲でエピカテキンまたはエピカテキン誘導体を投与する。さらなる実施形態では、患者に対し、１ｋｇの前記哺乳類患者の体重あたり約１〜約５０ｍｇの範囲でエピカテキンまたはエピカテキン誘導体を投与する。
【００６９】
「虚血」または「虚血性」または「虚血状態」は、病理学的起原を有する医学上のイベントを指すか、または患者に施された外科的処置を指し、組織領域への循環が妨害またはブロックされており、血管痙攣または脳虚血での一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）のような一過性であるか、または脳虚血での塞栓閉塞のように永続的である。罹患した領域は、虚血性イベントの結果として、酸素と栄養素が不足している。この不足が梗塞または罹患した領域の損傷につながる。本開示は、脳虚血；腸管虚血；脊髄虚血；心臓血管虚血；ＣＨＦ関連虚血、肝臓虚血；腎臓虚血；皮膚虚血；レイノー疾患の結果等の血管収縮誘導組織虚血持続勃起症の結果としての陰茎；虚血；および血栓塞栓性疾患関連虚血；例えば、糖尿病および脈管炎等の毛細血管疾患；糖尿病性潰瘍；壊疽状態；外傷後症候群；心拍停止蘇生；および末梢神経損傷と神経障害；および例えば、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）眼の健康問題関連虚血を含むその他の虚血を包含する。虚血は、例えば、脳卒中、心拍停止、傷害または内部出血による重度の失血および正常な血流を乱す他の類似の状態の間に脳で発生する。虚血は、例えば、アテローム性動脈硬化およびＣＨＦの結果として心筋組織で起こる。また、浮腫により生じた圧力が組織内の動脈と静脈を圧迫してつぶし、その結果血液を組織内に運ぶ能力を低下させるために、組織への外傷の後に発生する可能性がある。脳虚血は、また、マクロまたはミクロ塞栓の結果として起こる可能性があり、例えば、心肺バイパス手術の後に起こる可能性がある。加齢黄斑変性は、虚血状態の結果としての網膜への酸化傷害に関連する可能性がある。本明細書で使われる「非心血管性」虚血状態は、特別に心肺系または循環系の虚血状態を排除することを意味する。本明細書で使われる「非脳」虚血状態は、特別に脳の虚血状態を排除することを意味する。
【００７０】
「脳虚血」または「脳虚血性」または「脳虚血状態」は、病理学的起原を有する医学上のイベントを指すか、または患者に施された外科的処置を指し、脳領域への循環が妨害またはブロックされており、血管痙攣または脳虚血での一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）のような一過性であるか、または塞栓閉塞のように永続的である。罹患した領域は、虚血性イベントの結果として、酸素と栄養素が不足している。この不足が梗塞または罹患した領域の損傷につながる。虚血は、例えば、血栓塞栓性卒中、出血性卒中、脳血管痙攣、頭部外傷、心拍停止、傷害または内部出血による重度の失血および正常な血流を乱す他の類似の状態の間に脳で発生する。また、浮腫により生じた圧力が脳内の動脈と静脈を圧迫してつぶし、その結果血液を脳内に運ぶ能力を低下させるために、頭部外傷の後に発生する可能性がある。脳虚血は、また、マクロまたはミクロ塞栓の結果として起こる可能性があり、例えば、心肺バイパス手術の後に起こる可能性がある。
【００７１】
「急性虚血」または「急性虚血イベント」は、進行中である慢性イベントの対語として突然発症があるイベントを指す。
【００７２】
一態様では、本開示の方法は、例えば、脳梗塞による脳虚血状態による傷害の進展のリスクがある哺乳類患者の神経細胞の損傷防止に関する。神経細胞の損傷を減らす方法は、そうしないと発生したであろう傷害の改善または減少によって、脳虚血状態に関連したまたはそれによる脳傷害の程度および／または重症度を最小化することに関する。本開示は、虚血性、低酸素性／無酸素性、または出血性のイベントによる可能性がある細胞死および／または組織浮腫の存在および／または認知障害および／または脳梗塞を含む神経細胞損傷に対する予防的治療を提供する。この方法は、急性または慢性の医学状態に関連またはこれから生じた神経細胞損傷のリスクのある患者を対象にしている。このような状態は患者に対し計画された医学または外科療法（例えば、血管形成）の結果として、または脳卒中または重度の失血等の緊急医学状態の結果として、生ずる可能性がある。患者を脳虚血状態に関連する神経細胞損傷のリスク状態に置く他の状態には、アテローム性動脈硬化、既往脳卒中または一過性脳虚血発作、真性糖尿病、高血圧症、高コレステロール血症、喫煙歴、等の脳梗塞を招く可能性が増えると考えられている脳卒中に対する遺伝性素因または状態が含まれる。また、統合失調症、てんかん、神経変性障害、アルツハイマー病およびハンチントン病を含んでもよい。脳卒中の犠牲者の診断および／または病理学的キャラクタリゼーションにより、数多くの追加の医学状態が特定され、内科および神経医学の開業医に広く知られている脳卒中となっている。
【００７３】
別の態様では、本開示の方法は、心臓血管の虚血状態、例えば、心筋梗塞またはＣＨＦによる傷害の進展のリスクがある哺乳類患者の心筋損傷の防止に関する。心筋損傷を減らす方法は、そうしないと発生したであろう傷害の改善または減少によって、心筋虚血状態に関連またはこれによる心臓傷害の程度および／また重症度を最小化することに関する。本開示は、虚血性、低酸素性／無酸素性、または出血性のイベントによる可能性がある細胞死および／または心筋浮腫の存在および／または心筋梗塞を含む神経細胞損傷に対する予防的治療を提供する。この方法は、急性または慢性の医学状態に関連またはこれから生じた心筋損傷のリスクのある患者を対象にしている。このような状態は患者に対し計画された医学または外科療法（例えば、血管形成）の結果として、または心筋梗塞または重度の失血等の緊急医学状態の結果として、生ずる可能性がある。患者を心筋虚血状態に関連した心筋損傷のリスク状態に置く他の状態には、アテローム性動脈硬化、ＣＨＦ、既往脳卒中または一過性脳虚血発作、真性糖尿病、高血圧症、高コレステロール血症、喫煙歴、等の心筋梗塞を招く可能性が増えると考えられている心筋梗塞に対する遺伝性素因または状態が含まれる。
【００７４】
本明細書で使われる語句の「有害心臓リモデリング」は、左および右心室および／または右および左心房への傷害後の心臓のサイズ、形、および関連機能の変化を指す。傷害は、通常、急性心筋梗塞（例えば、経壁またはＳＴ部分上昇型梗塞、等）または誘導傷害（例えば、心臓手術のような）によるが、心臓の圧力または容量の過負荷（歪みという形で）の増加につながる多くの原因からくる可能性もある。心臓リモデリングには、肥大、心筋の菲薄化、心筋の瘢痕形成、心筋の萎縮症、心不全の進行およびこれらの組み合わせが含まれる。慢性高血圧症、川崎病、心内シャントを伴う先天性心臓疾患、および心臓弁膜症は、リモデリングにつながる可能性がある。さらに、リモデリングは、冠動脈バイパス手術、心臓移植および左心補助循環装置（ＬＶＡＤ）のような機械的な支持装置適用に由来する可能性もある。
【００７５】
本明細書で使われている「心筋梗塞サイズ減少」は、治療を受けていない対照患者の心筋梗塞サイズと比較して、本発明の組成物で治療した患者における心筋梗塞サイズの減少を指す。開示の方法では、「減少」は、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、または、さらに５０％の内のいずれか１つの心筋梗塞サイズの減少を指してもよい。あるいは、「減少」は、６０％、７０％または８０％の内のいずれか１つの心筋梗塞サイズの減少を指してもよい。
【００７６】
当業者には既知であるように、心筋の変化、特に心筋梗塞サイズの測定は、心エコー検査、心臓ＭＲＩ、心臓ＣＴ、および心臓核スキャン等の画像処理技術を使って行うことができる。さらに、トロポニン、ＣＫ−ＭＢ（クレアチンキナーゼｍｂ）、およびＣＰＫ（クレアチンホスホキナーゼ）を含む１つまたは複数のバイオマーカーの上昇が、死んだまたは瀕死の心筋を表すことが知られている。また、バイオマーカーのＢＮＰ（Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド）が心臓リモデリングのマーカーとして使用可能であるという証拠もある。
【００７７】
本明細書で使われる「好ましい心臓リモデリング」は、心室サイズ、形、機能および心臓への傷害後に発生する心室壁厚減少および瘢痕の予防の保存を指す。
【００７８】
本明細書で使われる「心房細動」および「心房粗動」は、それぞれ不整脈を指し、この場合、心房は効果的に心室に協調して拍動せず、心拍出量の減少を伴うことが多い。
【００７９】
心臓組織に関連して本明細書で使われる「誘導傷害」は、冠状動脈バイパス手術、心臓移植および左心補助循環装置（ＬＶＡＤ）のような機械的な支持装置の適用（これに限定されないが）を含む心臓手術から生ずる損傷等の心筋傷害を指す。
【００８０】
本明細書で使われる「虚血／再潅流イベント」には、心筋虚血、心筋の再灌流、くも膜下出血、虚血性脳卒中（大脳血栓症、大脳塞栓症、および心房細動から生じた脳卒中を含む）、出血性卒中（動脈瘤および動静脈奇形から生じた脳卒中を含む）、および一過性脳虚血発作、人工心肺を冠動脈バイパス、および移植用器官の保存等に使う心臓手術、等（これに限定されないが）が含まれる。
【００８１】
本明細書で使われる「虚血／再潅流傷害」は、虚血の期間の後に組織に対し血液供給が復帰する場合に生ずる組織への損傷を指す。血液からの酸素と栄養素の供給が無いと、循環の復帰により、正常な機能の復帰よりむしろ酸化ストレスの誘導により炎症と酸化傷害を生ずる条件を作り出す。
【００８２】
カテキンは植物ガム中で発見されたポリフェノール性抗酸化剤である。カテキンはフラボノイドで、さらに詳細には、フラバン−３−オールである。カテキンおよびエピカテキンはエピマーで、（−）−エピカテキンおよび（＋）−カテキンがあり、天然に見出された最も一般的な光学的異性体である。
【００８３】
カテキンは、新茶葉中に乾燥重量の約２５％含まれるが、全含量は、茶の変種および成長条件により大きく変動する。
【００８４】
カテキンまたはフラバノールは、茶およびブドウ中に見出され、例えば、単量体フラバン−３−オールカテキン、エピカテキン、ガロカテキン、エピガロカテキン、およびエピカテキン３−Ｏ−ガリウム酸塩が含まれる。虚血／再潅流イベントのリスクのある固体は、予防的の意味で無期限に、エピカテキン、その薬学的に許容可能な塩、またはその誘導体を服用することにより将来のイベントで壊死のリスクを減らすことができる。多くの虚血／再潅流イベントは、実際のイベントに先行する早期の警告症状を有し、これは患者が速やかな治療を求めることを可能にすることもわかっている。
【００８５】
将来の虚血／再潅流イベントが原因の傷害があるにしても、本発明の組成物の予防的投与により梗塞サイズおよび有害リモデリングを減らせるはずであることが考慮されている。例えば、本発明の組成物を虚血／再潅流イベントの少なくとも３０分前に患者に投与することを含む、それを必要とする患者の潜在的梗塞サイズおよび有害リモデリングを減らす方法が本発明で開示されている。虚血／再潅流イベントの１５、３０分、１、２、６、１２、２４時間、２、３日、１、または２週間前、または任意の時点で本発明の組成物を投与する方法が本明細書で開示されている。
【００８６】
虚血／再潅流イベント切迫した梗塞または虚血イベントに気付かない患者で起こる可能性がある。このような固体では、潜在的な梗塞サイズおよび有害リモデリングを減らす必要がある。従って、本明細書に開示の方法は、虚血／再潅流イベントに続く潜在的梗塞サイズおよび有害リモデリングを減らすために使用可能である。
【００８７】
さらに別の実施形態では、本発明の組成物は、テトラサイクリンまたはその誘導体の投与の前に、後に、または同時に投与される。代表的テトラサイクリン誘導体には、以下のものが含まれるが、これに限定されない：クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、リメサイクリン、メクロサイクリン、メタサイクリン、ミノサイクリン、クロルテトラサイクリン、サンサイクリン、ケロカルジン、アピシクリン；クロモサイクリン、グアメシクリン、メグルサイクリン、メフィルサイクリン、ペニメピサイクリン、ピパサイクリン、エタモサイクリン、ペニモサイクリンおよびロリテトラサイクリン。さらに、化学的に変性したテトラサイクリンも本開示の方法および組成物として使用可能である。化学的に変性したテトラサイクリン（ＣＭＴ）の例には、下記が含まれる：
【化９】
2012524077.tif 000012
【００８８】
本明細書に記載のように、本発明の組成物は、再潅流／血栓溶解試薬（例えば、ｔＰＡまたは他の再灌流試薬）を含んでもよい。代表的血栓溶解薬試薬には、アルテプラーゼ、テネクテプラーゼ、レテプラーゼ、ストレプターゼ、アボキナーゼ、パミテプラーゼ、ナテプラーゼ、デスモテプラ−ゼ、デュテプラーゼ、モンテプラーゼ、レテプラーゼ、ラノテプラーゼ、マイクロプラスミン、Ｂａｔ−ｔＰＡ、ＢＢ−１０１５３、およびこれらの内の任意の組み合わせが含まれる。代表的ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストには、３−ａｌｐｈａ−オール−５−ｂｅｔａ−プレグナン−２０−オンヘミスクシナート（ＡＢＨＳ）、ケタミン、メマンチン、デキストロメトルファン、デキストロルファン、および臭化水素酸デキストロメトルファンが含まれる。
【００８９】
エピカテキンまたは誘導体またはその塩は、心臓患者に通常使われている他の試薬、と組み合わせて本明細書に開示のように処方でき、またはそうでない場合はその存在を作り出す、もしくは増やすことができる。心臓患者に通常使われている他の試薬には、これに限定されないが、ＡＣＥ阻害剤、ベータブロッカー、利尿薬、血栓溶解剤、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニスト、スピントラップ試薬およびアスピリンが含まれる。さらに、エピカテキンは、リスベラトロールおよびビタミンＥ（これに限定されないが）を含む他の天然試薬と共に処方可能である。エピカテキンは、また、タンパク質、ビタミン、ミネラル、抗酸化剤、等（これに限定されないが）を含む健康な固体に投与される他の試薬と共に処方可能である。
【００９０】
また、本開示は、哺乳類患者のミトコンドリア機能に関連した状態の予防および／または治療、および／または症状を改善する方法を提供し、エピカテキン、エピカテキン誘導体、ニコランジル、およびニコランジル誘導体からなる群より選択された有効量の１つまたは複数の化合物を患者に投与することを含む。
【００９１】
ミトコンドリア機能に関連する状態のリスクのある固体は、エピカテキン、カテキン、ニコランジル、または薬学的に許容可能な塩、またはその誘導体を予防的な意味で無期限に摂取することにより将来のイベントでの壊死のリスクを減らすことができる。ミトコンドリア機能に関連する現象があるイベントでは、本発明の組成物の予防的投与によりこのような状態からの症状を減らすことができることが考慮されている。 
【００９２】
エピカテキン、カテキン、ニコランジル、または誘導体またはその塩は、他の試薬、と組み合わせて本明細書に開示のように処方でき、またはそうでない場合はその存在を作り出す、もしくは増やすことができる。他の試薬には、これに限定されないが、ＡＣＥ阻害剤、ベータブロッカー、利尿薬、血栓溶解剤、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニスト、スピントラップ試薬およびアスピリンが含まれる。さらに、エピカテキンは、リスベラトロールおよびビタミンＥ（これに限定されないが）を含む他の天然試薬と共に処方可能である。エピカテキンは、また、タンパク質、ビタミン、ミネラル、抗酸化剤、等（これに限定されないが）を含む健康な固体に投与される他の試薬と共に処方可能である。
【００９３】
本明細書で開示された実施形態または態様の内のいずれか１つの変形では、エピカテキン、その誘導体および薬学的に許容可能なその塩からなる群より選択された薬剤が投与される。本明細書で開示された実施形態または態様の内のいずれかの別の変形では、エピカテキンまたは薬学的に許容可能なその塩が投与される。本明細書に開示された手段により投与されたエピカテキン、その誘導体またはその塩は、任意の多様な濃度、他の成分または試薬との組み合わせ、温度または他の目的の適用に最も合った状態であってもよい。
【００９４】
本開示の化合物は、約０．１ｍｇ／ｋｇ／用量〜約１００ｍｇ／ｋｇ／用量、あるいは約０．３ｍｇ／ｋｇ／用量〜約３０ｍｇ／ｋｇ／用量の１日総量で経口投与される。別の実施形態では、用量範囲は、約０．５〜約１０ｍｇ／ｋｇ／日である。あるいは、約０．５〜約１ｍｇ／ｋｇ／日投与される。通常、一日あたり約２５ｍｇと約１グラムの間で投与できる；あるいは、約２５ｍｇと約２００ｍｇの間で投与できる。有効成分の放出速度を調節するための徐放性調製の使用が好ましいと思われる。都合に合わせ、用量を多くの分割用量として投与してもよい。下記の考察のように化合物を静脈内に投与する場合には、このような割合は容易に維持できる。
【００９５】
本開示の目的のために、化合物を経口、非経口、吸入噴霧、局所、または直腸を含む種々の手段で薬学的に許容可能なキャリア、アジュバントおよび賦形剤を含む製剤として投与可能である。本明細書で使われる用語の非経口には、これに限定されないが、種々の注入技術を伴った皮下、静脈内、筋肉内、動脈内、皮内、髄腔内および硬膜外注射が挙げられる。本明細書で使われる動脈内および静脈内注射には、カテーテル経由投与が含まれる。冠内ステントおよび冠内リザーバー経由投与も意図されている。本明細書で使われる用語の経口には、これに限定されないが、舌下および頬側が含まれる。経口投与には、飲料、エネルギーバー、ならびに丸薬製剤が含まれる。
【００９６】
有効成分含有医薬品組成物は、目的の投与方法に合った任意の剤形にすることができる。経口使用の目的に使う場合は、例えば、錠剤、トローチ、ロゼンジ、水性またはオイル懸濁液、分散可能粉末または粒剤、乳剤、ハードまたはソフトカプセル剤、シロップ剤またはエリキシル剤を調整可能である。経口使用の目的の組成物は、医薬品組成物の製造技術として既知の任意の方法に従って調整可能で、このような組成物は、美味な調合製剤を得るために甘味料、調味料、着色料および保存剤を含む１つまたは複数の試薬を含んでもよい。錠剤の製造に合った無毒の薬学的に許容可能な賦形剤との混合剤として有効成分を含む錠剤は、許容できる。これらの賦形剤は、例えば、カルシウムまたはナトリウム炭酸塩、ラクトース、カルシウムまたはナトリウムリン酸塩等の不活性の希釈剤；トウモロコシデンプン、またはアルギン酸等の造粒および崩壊剤；デンプン、ゼラチンまたはアラビアゴム等の結合剤；およびステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸または滑石等の潤滑剤であってもよい。錠剤は、無コートでも、消化管での崩壊と吸収を遅らせ、それにより長期間の持続作用を提供するためのマイクロカプセル化を含む既知の技術でコートしてもよい。例えば、単独またはワックスと一緒のモノステアリン酸グリセリンまたはグリセリルジステアラート等の時間遅らせる材料を採用してもよい。
【００９７】
また、経口使用の製剤は、ハードゼラチンカプセル剤としてもよく、この場合、有効成分は不活性の固体希釈剤、例えば、リン酸カルシウムまたはカオリンと混合され、あるいは、ソフトゼラチンカプセル剤としてもよく、この場合、有効成分は水またはオイル媒質、例えば、ピーナッツオイル、流動パラフィンまたはオリーブ油等と混合される。
【００９８】
本開示の水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に適した賦形剤と混合した有効成分を含む。このような賦形剤には、懸濁剤、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムアルギナート、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴムおよびアラビアゴム、および分散または湿潤剤、例えば、天然ホスファチド（例えば、レシチン）、アルキレン酸化物と脂肪酸の縮合物（例えば、ステアリン酸ポリオキシエチレン）、エチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合物（例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール）、エチレンオキシドと脂肪酸由来の部分エステルとの縮合物、およびヘキシトール無水物（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート）が含まれる。また、水性懸濁液は、１つまたは複数の防腐剤、例えば、エチルまたはｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾアート、１つまたは複数の着色料、１つまたは複数の調味料および１つまたは複数の甘味料、例えば、ショ糖またはサッカリンを含んでもよい。
【００９９】
オイル懸濁液は、有効成分を植物油、例えば、ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油またはヤシ油、またはミネラルオイル、例えば、流動パラフィン、に懸濁させて処方してもよい。経口懸濁液は、糊料、例えば、蜜ろう、固形パラフィンまたはセチルアルコールを含んでもよい。前述のような甘味料および調味料を添加し美味な経口剤にしてもよい。これらの組成物は、アスコルビン酸等の抗酸化剤を添加して保存可能である。
【０１００】
水添加による水性懸濁液調製に適した本開示の分散可能粉末および粒剤は、有効成分を分散または湿潤剤、懸濁剤、および１つまたは複数の防腐剤と混合して提供される。適切な分散または湿潤剤および懸濁剤は先に開示したものにより例示している。添加の賦形剤、例えば、スイートニング、調味料および着色料を入れてもよい。
【０１０１】
また、本開示の医薬品組成物は、水中油型乳剤の形であってもよい。油相は、植物油、例えば、オリーブ油またはラッカセイ油、ミネラルオイル、例えば、流動パラフィン、またはこれらの混合物であってもよい。適切な乳化剤には、天然ゴム、例えば、アラビアゴムおよびトラガカントゴム、天然ホスファチド、例えば、大豆レクチン、エステルまたは脂肪酸由来部分エステルおよびヘキシトール無水物、例えば、ソルビタンオレイン酸モノエステル、およびこれらの部分エステルとエチレンオキシドの縮合物、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート、が含まれる。また、乳剤には、甘味料と調味料を含んでもよい。
【０１０２】
シロップ剤およびエリキシル剤は、甘味料、例えば、グリセリン、ソルビトールまたはショ糖と共に処方してもよい。このような製剤は粘滑剤、防腐剤、調味料または着色料を含んでもよい。
【０１０３】
本開示の医薬品組成物は、無菌注射可能製剤の形、例えば、無菌の注射可能な水性または油性の懸濁液の形であってもよい。この懸濁液は、これらの適切な分散剤または湿潤剤および上述の懸濁剤を使って既知の技術に従って処方可能である。また、無菌の注射可能製剤は、無菌の注射可能溶液または無毒の非経口的に受容可能な希釈剤または溶媒中の、例えば、１、３−ブタンジオール溶液、中の懸濁液であってもよく、または、凍結乾燥粉末として調製されてもよい。受容可能賦形剤および溶剤の中で、採用可能なものは、水、リンゲル液および等張性塩化ナトリウム溶液である。さらに、無菌の不揮発性油を便宜的に溶媒または懸濁剤として採用可能である。この目的のために、任意の無刺激性不揮発性油を採用可能で、これには、合成のモノまたはジグリセリドが含まれる。さらに、オレイン酸等の脂肪酸も同様に注射剤の調製に使われる。
【０１０４】
キャリア材料と組み合わせて単一剤形を作る有効成分の量は、治療される宿主および特定の投与モードに依存して変わる。例えば、ヒトへの経口投与用徐放製剤は、０．０７〜１．７ｍｍｏｌ（約２０〜５００ｍｇ）の活物質化合物を適切な賦形剤および都合のよい量のキャリア材料（全体組成物の約５〜約９５％）と一緒に含んでもよい。医薬品組成物は、投与時にはかりやすい量で提供できるように調製することが好ましい。
【０１０５】
上述のように、経口投与に適した本開示の製剤は、例えば、それぞれ所定量の有効成分を含むカプセル剤、カシェ剤または錠剤のような離散性単位として；粉剤または粒剤として；水性または非水性液体中の溶液または懸濁剤として、または水中油型液体乳剤または油中水型液体乳剤として提供されてもよい。有効成分は、また、巨丸剤、舐剤またはペーストとして投与してもよい。
【０１０６】
錠剤は圧縮または成形により作られ、任意選択として１つまたは複数の補助成分を混合してもよい。圧縮錠剤は、適切な機械を使って粉剤または粒剤等の易流動性形態の有効成分を、任意選択としてバインダー（例えば、ポビドン、ゼラチン、ヒドロキシプロピルエチルセルロース）、潤滑剤、不活性の希釈剤、防腐剤、崩壊剤（例えば、ナトリウムデンプングリコラート、架橋ポビドン、架橋カルボキシルメチルセルロースナトリウム）、界面活性剤または分散剤、と混合して、圧縮成形して調製される。成形錠剤は、適切な機械を使って不活性の液体希釈剤で湿潤した粉末にした化合物の混合物を成形して作ることができる。錠剤は、任意選択で、コーティングまたは刻印してもよく、また、有効成分の緩徐または徐放を提供するために、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロースを種々の割合で使用して所望の放出プロファイルを得るよう処方してもよい。錠剤は、任意選択で、胃ではなく腸の領域で放出するように腸溶コーティングをしてもよい。このことは、酸加水分解を受けやすい式１の化合物に対しては特に好都合である。
【０１０７】
口中への局所投与に適した製剤には、風味をつけた基剤、通常はショ糖およびアラビアゴムまたはトラガント、中に有効成分を含むロゼンジ；不活性基剤、例えば、ゼラチンおよびグリセリン、またはショ糖およびアラビアゴム中に有効成分を含むパステル剤；および適切な液体キャリア中に有効成分を含む口腔洗浄薬、が含まれる。
【０１０８】
直腸投与用製剤は、例えば、ココアバターまたはサリチル酸塩を含む適切な基剤と共に坐薬として提供してもよい。
【０１０９】
腟投与用に適切な製剤は、有効成分に添加して当技術分野で適切な賦形剤とされている既知のキャリアを含むペッサリー、タンポン、クリーム剤、ゲル、パスタ剤、泡剤またはスプレー製剤として提供してもよい。
【０１１０】
非経口投与用に適した製剤には、対象レシピエントの血液と等張性の製剤を与える抗酸化剤、緩衝液、静菌薬および溶質を含んでもよい水性および非水性の等張性無菌注射剤溶液；および懸濁剤および糊料を含んでもよい水性および非水性の無菌の懸濁液、を含む。製剤は、単位用量または多用量シール容器、例えば、アンプルおよびバイアル、に入れて提供してもよく、また、無菌の液体キャリア、例えば、注射剤用の水、を使用直前に添加すればよいように凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）した状態で貯蔵してもよい。注射剤溶液と懸濁液は、前に記載したような無菌の粉剤、粒剤および錠剤から調製してもよい。 
【０１１１】
本明細書で使われる薬学的に許容可能な塩には、これに限定されないが、酢酸塩、ピリジン、アンモニウム、ピペラジン、ジエチルアミン、ニコチン酸アミド、ギ酸、尿素、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、リチウム、ケイ皮酸、メチルアミノ、メタンスルホン酸、ピクリン酸、酒石酸、トリエチルアミノ、ジメチルアミノ、およびトリス（ヒドキシメチル）アミノメタン、が含まれる。さらなる薬学的に許容可能な塩は当業者に既知である。
【０１１２】
同様に、エピカテキン誘導体は、当業者には既知である。このような誘導体には、これに限定されないが、エピガロカテキン、エピカテキン−３−ガリウム酸塩、およびエピガロカテキン−３−ガリウム酸塩、が含まれる。
【０１１３】
本明細書に使われる、用語の「虚血傷害軽減量」または「有効量」は、虚血による組織損傷を減少させるのに有効なエピカテキンまたは誘導体またはその塩を含む組成物の量を意味する。全身的に投与するための有効量は、患者の体重に依存する。通常、全身投与の有効量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇであるが、例えば、年齢および患者（例えば、ヒト等の哺乳類）の体重、治療を要求する正確な状態およびその重症度、投与経路、を含む多くの因子に依存し、最終的には、担当医または獣医の裁量に委ねられことになる。
【０１１４】
また、本発明の組成物は、栄養補助食品組成物として処方してもよい。本明細書で使われる用語の「栄養補助食品組成物」は、食品、食糧、栄養補助食品、栄養補助剤または食品または食糧用の補助剤組成物を指し、外因的に添加されたカテキンおよび／またはエピカテキンを含む。このような組成物の製剤と投与技術の詳細については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、薬学の科学と実践、第２１版（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ）およびＮｉｅｌｌｏｕｄとＭａｒｔｉ−Ｍｅｓｔｒｅｓ、医薬乳剤および懸濁液：第２版（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ、ＮｅｗＹｏｒｋ）に記載がある。
【０１１５】
本明細書で使われる用語の食品は、ヒトまたは動物の消費に適した任意の食物または飼料を指す。食品は、調製され、パッケージ化された食物（例えば、マヨネーズ、サラダドレッシング、パン、穀物バー、飲料、等）または動物の飼料（例えば、押し出しペレット状の動物の飼料、粗配合飼料またはペットフード組成物）であってもよい。本明細書で使われる用語の食糧は、ヒトまたは動物の消費用に合った任意の物質を指す。
【０１１６】
食品または食糧は、例えば、非アルコール性およびアルコール性飲料等の飲料ならびに飲料水および流動食に添加される液状製剤である。非アルコール性飲料は、例えば、ソフトドリンク、スポーツ飲料、例えば、オレンジジュース、アップルジュースおよびグレープ果汁等の果汁；リモナーデ剤、茶、ニアウオーター飲料およびミルク、および例えば、ヨーグルト飲料等の他の乳飲料、およびダイエット飲料である。別の実施形態では、食品または食糧は、固体または半固体食物を指し、本発明による組成物を含む。これらの形態には、これに限定されないが、ケーキやクッキー等の焼き菓子、プディング、乳製品、舐剤、スナック食品、または冷凍菓子またはノベルティー（例えば、アイスクリーム、ミルクセーキ）、調理冷凍食品、キャンディ、スナック製品（例えば、チップ）、スープのような流動食、スプレッド、ソース、サラダドレッシング、加工肉製品、チーズ、ヨーグルトおよび任意の他の脂肪やオイル含有食物、および食品原料（例えば、小麦粉）、が含まれる。
【０１１７】
ペットフード組成物を含む動物の飼料には、好都合にも、必要な食事要件を満たすことを目的とする食物、ならびにおやつ（例えば、ドッグビスケット）または他の食物サプリメントが含まれる。本発明による組成物を含む動物の飼料は、乾燥組成物（例えば、粗挽きの穀物）、やや湿った組成物、湿った組成物、またはこれらの任意の混合物の形態であってもよい。あるいは、またはさらに動物の飼料は、例えば、グレイビーのような補助剤、飲料水、ヨーグルト、粉末、懸濁液、かむ菓子、おやつ（例えば、ビスケット）または他の任意の送達形態である。
【０１１８】
用語の栄養補助食品は、単一または複数の用量単位にパッケージ化された、ヒトまたは動物の食事の補給のための少量の化合物を指す。栄養補助食品は通常大きな量のカロリーを与えないが、他の微量栄養素（例えば、ビタミンまたはミネラル）を含むことができる。用語の食品または食糧は、また、機能食品およびヒトの消費用に包装済みの加工食品を含む。
【０１１９】
用語の栄養補助剤は、カロリー源と組み合わせた栄養補助食品を含む組成物を指す。一部の実施形態では、栄養補助剤は、食事代用品またはサプリメント（例えば、栄養剤またはエネルギーバーまたは栄養剤飲料または濃縮ジュース）である。
【０１２０】
本発明の栄養補助食品は、任意の適切なフォーマットで送達可能である。好ましい実施形態では、栄養補助食品は、経口送達用に処方された。本発明の栄養補助食品の成分は、経口消費用として受容可能な賦形剤および／またはキャリア中に含入された。キャリアの実際の形態、従って、栄養補助食品自体の形態は重要ではない。キャリアは、液体、ゲル、ジェルカプセル、カプセル、粉剤、固形錠剤（コートありまたはなし）、茶、等であってもよい。栄養補助食品は、好ましくは、錠剤またはカプセルの形で、また、最も好ましくは、硬カプセルの形である。適切な賦形剤および／またはキャリアには、マルトデキストリン、カルシウム炭酸塩、リン酸二カルシウム、リン酸三カルシウム、微結晶性セルロース、デキストロース、米粉、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、クロスカルメロースナトリウム、ナトリウムデンプングリコラート、クロスポビドン、ショ糖、植物ガム、ラクトース、メチルセルロース、ポビドン、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、等（これらの混合物を含む）が含まれる。好ましいキャリアには、カルシウム炭酸塩、ステアリン酸マグネシウム、マルトデキストリン、およびこれらの混合物、が含まれる。種々の成分および賦形剤および／またはキャリアは、通常の技術を使って混合され、所望の形に成形される。本発明の錠剤またはカプセルは、ｐＨ値約６．０〜７．０で溶解する腸溶コーティングでコートしてもよい。小腸中で溶解し、胃では溶解しない適切な腸溶コーティングは、酢酸フタル酸セルロースのコーティングである。
【０１２１】
他の実施形態では、栄養補助食品は、消費者が食物または飲料に添加するのに適した粉末または液体として提供される。例えば、一部の実施形態では、、栄養補助食品は、例えば、飲料に混合して使用する、またはプディング、トッピング、ソース、ピューレ、調理済みシリアル、またはサラダドレッシング等の半固体食物中に攪拌混入するために、例えば、または、別の方法で、例えば、消費直前に開けるために蓋をしてある食物または飲料容器に入っている食物または栄養補助食品に添加して使用するために、粉末の形で固体に投与してもよい。栄養補助食品によって食事に添加するカロリー数を制限することが望ましい場合は、特に、栄養補助食品は、１つまたは複数の不活性の成分を含んでもよい。例えば、本発明の栄養補助食品は、任意選択の成分を含んでもよく、これには、例えば、ハーブ、ビタミン、ミネラル、エンハンサー、着色剤、甘味料、香料、不活性の成分、等が挙げられる。
【０１２２】
一部の実施形態では、栄養補助食品は、さらに、ビタミンおよびミネラルを含み、これには、限定されないが、リン酸カルシウムまたは酢酸塩、三塩基性の；二塩基性カリウムリン酸塩；マグネシウム硫酸塩または酸化物；塩（塩化ナトリウム）；塩化カリウムまたは酢酸塩；アスコルビン酸；オルトリン酸第二鉄；ナイアシンアミド；亜鉛硫酸塩または酸化物；パントテン酸カルシウム；銅グルコン酸塩；リボフラビン；ベータ−カロチン；ピリドキシン塩酸塩；硝酸チアミン；葉酸酸；ビオチン；クロム塩化物またはピコリン酸塩；カリウムヨウ化物；ナトリウムセレン酸塩；ナトリウムモリブデン酸塩；フィロキノン；ビタミンＤ３；シアノコバラミン；亜セレン酸ナトリウム；銅硫酸塩；ビタミンＡ；ビタミンＣ；イノシトール；カリウムヨウ化物が挙げられる。適切なビタミンとミネラルの投与量は、例えば、Ｕ．Ｓ．ＲＤＡガイドラインを調べることで知ることができる。
【０１２３】
他の実施形態では、本発明は、本発明による組成物を含む栄養補助剤（例えば、エネルギーバーまたは食事代用品バーまたは飲料）を提供する。栄養補助剤は、食事またはスナック代用品として使用でき、通常栄養カロリーを供給する。栄養補助剤は、炭水化物、タンパク質、および脂肪をバランス良く供給することが好ましい。栄養補助剤は、さらに、炭水化物、単純鎖長、中鎖長または多糖、またはこれらの組み合わせを含んでもよい。単糖は、望ましい嗜好特性によって選択してもよい。未調理コーンスターチは、複合体炭水化物の一例である。その高分子量構造を維持することを望む場合は、調理されないか、熱処理されない食物製剤もしくはその一部中にのみに含めるべきである。その理由は、熱により複合体炭水化物が単純炭水化物（単糖類または二糖類）に分解されるからである。一実施形態では、栄養補助剤は、３つのレベルの鎖長（単純鎖長、中鎖長および複合体；例えば、ショ糖、マルトデキストリン、および未調理コーンスターチ）の炭水化物原料の組み合わせを含む。
【０１２４】
本発明の栄養補助剤に組み込まれるべきタンパク質ソースは、栄養製剤に使われる任意の適切なタンパク質であってもよく、乳清タンパク、乳清タンパク濃縮物、ホエーパウダ、卵、大豆粉、豆乳大豆タンパク質、大豆タンパク質単離物、カゼイン塩（例えば、ナトリウムカゼイン塩、ナトリウムカルシウムカゼイン塩、カルシウムカゼイン塩、カリウムカゼイン塩）、動物および植物タンパク質および水解物またはこれらの混合物を含んでもよい。タンパク質ソースを選択する場合は、タンパク質の生物学的価値を第１に考慮すべきであり、最高の生物学的価値は、カゼイン塩、乳清、ラクトアルブミン、卵アルブミンおよび全卵タンパク質に見出すことができる。好ましい実施形態では、タンパク質は、乳清タンパク質濃縮物およびカルシウムカゼイン塩の組み合わせである。これらのタンパク質は、高い生物学的価値を有する；すなわち、これらは高い比率の必須アミノ酸を有している。健康と疾患における現代栄養学、第８版、Ｌｅａ＆Ｆｅｂｉｇｅｒ、１９８６、特にボリューム１、ページ３０〜３２を参照。栄養補助剤は、また、他のビタミン、ミネラル、抗酸化剤、繊維および他の栄養補助食品（例えば、タンパク質、アミノ酸、コリン、レシチン）のうちの１つまたはこれらの組み合わせ、等の他の成分を含んでもよい。これらの成分のうちの１つまたはいくつかの選択は、処方、設計、消費者の選択および末端ユーザーの問題である。本発明の栄養補助食品に添加されるこれらの成分の量は、当業者には容易にわかることである。このような量に対するガイダンスは、Ｕ．Ｓ．ＲＤＡ「小児および成人向け用量」により得ることができる。さらなる添加可能なビタミンおよびミネラルには、これに限定されないが、リン酸カルシウムまたは酢酸塩、三塩基性の；カリウム二塩基性リン酸塩；マグネシウム硫酸塩または酸化物；塩（塩化ナトリウム）；塩化カリウムまたは酢酸塩；アスコルビン酸；オルトリン酸第二鉄；ナイアシンアミド；亜鉛硫酸塩または酸化物；パントテン酸カルシウム；銅グルコン酸塩；リボフラビン；ベータ−カロチン；ピリドキシン塩酸塩；硝酸チアミン；葉酸酸；ビオチン；クロム塩化物またはピコリン酸塩；カリウムヨウ化物；ナトリウムセレン酸塩；ナトリウムモリブデン酸塩；フィロキノン；ビタミンＤ３；シアノコバラミン；亜セレン酸ナトリウム；銅硫酸塩；ビタミンＡ；ビタミンＣ；イノシトール；カリウムヨウ化物が含まれる。
【０１２５】
栄養補助剤は、種々の形態および種々の生産方法で供給されうる。好ましい実施形態では、食物バーを製造するために、液体成分が調製される；乾燥成分をミキサー中の液体成分に添加し、生地相になるまで混合する；生地をエクストルーダーに投入し、押し出す；押し出された生地を適切な賦形剤長さに切断する；次に製品を冷却する。バーは、本明細書に具体的に列挙した成分に添加して、他の栄養剤および充填剤を入れて味を強めてもよい。
【０１２６】
栄養補助剤の処理または製造のために、本明細書記載の成分に、他の成分、例えば、充填剤、乳化剤、防腐剤、等を添加することができることは、当業者には理解される。
【０１２７】
さらに、着香料、着色料、香辛料、ナッツ、等を栄養補助食品組成物に組み込むことができる。調味料は、風味をつけた抽出物、揮発性油、チョコレート調味料、ピーナッツバター調味料、クッキーのくず、クリスプライス、バニラまたは任意の市販調味料、の形態であってもよい。有用な調味料の例には、これに限定されないが、純粋なアニス抽出物、模造バナナ抽出物、模造サクランボ抽出物、チョコレート抽出物、純粋なレモン抽出物、純粋なオレンジ抽出物、純粋なペパーミント抽出物、模造パイナップル抽出物、模造ラム抽出物、模造イチゴ抽出物、または純粋なバニラ抽出物；または揮発性油、例えば、メリッサ油、ベイ油、ベルガモット油、セダー油、くるみ油、チェリー油、ケイ皮油、チョウジ油、またはペパーミントオイル；ピーナッツバター、チョコレート調味料、バニラクッキーくず、バタースコッチキャンディーまたはタフィー、が含まれる。一実施形態では、栄養補助食品はココアまたはチョコレートを含む。
【０１２８】
乳化剤を、栄養補助食品組成物の安定性のために添加してもよい。適切な乳化剤の例には、これに限定されないが、レシチン（例えば、卵または大豆由来の）、および／またはモノおよびジグリセリドが含まれる。他の乳化剤は、当業者には容易に理解され、適切な乳化剤の選択は、ある程度、製剤と最終製品に依存するであろう。また、防腐剤を添加して栄養補助剤の製品保存可能期間を延長してもよい。ソルビン酸カリウム、ソルビン酸ナトリウム、カリウムベンゾアート、ナトリウムベンゾアートまたはカルシウム２ナトリウムＥＤＴＡ、等の防腐剤を使うのが好ましい。
【０１２９】
上述の炭水化物に添加して、栄養補助食品組成物は、天然または人工の（好ましくは低カロリー）甘味料、例えば、糖類、シクラメート、アスパルタミン、アスパルテーム、アセサルフェームＫ、および／またはソルビトールを含んでもよい。栄養補助剤が、過体重または肥満の固体、または高血糖の傾向があるタイプＩＩ糖尿病の固体に使われることが意図されている場合には、このような人工甘味料が望ましい。
【０１３０】
さらに、マルチビタミンおよびミネラル補助剤を、本発明の栄養補助食品組成物に添加して、一部の食事では欠けている適切な量の必須栄養素を得てもよい。マルチビタミンおよびミネラル補助剤は、ライフスタイルパターンによる栄養損失および不足に対する疾患予防および保護にとって有用である可能性がある。
【０１３１】
カテキンおよび／またはエピカテキンの投与量と割合および栄養補助食品経由で投与される添加の構成成分は、未知の因子、例えば、特定の組成物およびその投与モードと経路の生理的な特性；年齢、レシピエントの健康と重量；症状の性質と程度；併用療法の種類；治療頻度；および栄養補助食品組成物の処方に関する、正常な試験、または通常の考察のできる分野の専門家により決定される所望の効果、に依存して変化するであろう。
【０１３２】
しかしながら、任意の特定の患者に対する具体的用量レベルは、採用された具体的化合物の作用、年齢、体重、総体的な健康、治療される固体の性と食事；投与時間と経路；排出速度；前に投与したことがある他の薬剤；および治療している特定の患者の重症度、等の当業者にはわかっている種々の因子に依存していることは理解されるであろう。
【０１３３】
実施例
実施例１
エピカテキンのメチル化によって、主にその４つのフェノール基の類似した反応性が原因で少なくとも４つの異なる生成物が得られる。 
【化１０】
2012524077.tif 000013
【０１３４】
一般的なメチル化反応は、Ｄｏｎｏｖａｎ、Ｌ．Ｒ．、ｅｔ  ａｌ「（＋）カテキン、（−）エピカテキンおよびその３´および４´Ｏ−メチル化類似体の分析、高感度法の比較」Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ、７２６（１９９９）：２７７−２８３、から採用した。無水Ｋ２ＣＯ３（０．７ｇ）、（ＣＨ３）２ＳＯ４（０．４４ｍＬ）およびエピカテキン（１ｇ）をＨ２Ｏ（５０ｍＬ）およびアセトン（５０ｍＬ）の混合物中へ攪拌しながら添加した。密封フラスコ中、室温で３時間反応を行った。アセトンを減圧下の回転蒸発により除去した。反応生成物を、酢酸エチル（５０ｍＬＸ２）で抽出した。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４の各位置での−Ｏ−メチル化誘導体を含むこの反応の生成物を分取クロマトグラフィーで分離し精製した。
【０１３５】
実施例２
ミトコンドリアがカルシウム過負荷に曝された場合、ミトコンドリア気孔の開口の防止と虚血傷害からの組織の保護の間には相関があることがわかっている。ミトコンドリア膜透過性遷移孔（ＭＰＴＰ）の開口は、カルシウムの添加により誘導されたミトコンドリア膨化の測定により評価できる。（Ｂｅｒｎａｒｄｉ  Ｐ、Ｋｒａｕｓｋｏｐｆ  Ａ．、Ｂａｓｓｏ  Ｅ．、ｅｔ  ａｌ．標的患者に対するインビトロアーティファクトからのミトコンドリア膜透過性遷移。ＦＥＢＳ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２７３：２０７７−９９、２００６）。ミトコンドリア膨化は、開口したカルシウム誘導ＭＰＴＰを介したミトコンドリアへの水および電解質流入の結果である。この現象は、５３５〜５４０ｎｍの光透過率の増加（濁度の減少または５３５ｎｍの吸光度の減少）を引き起こす（Ｚｏｒａｔｔｉ  Ｍａｎｄ  Ｓｚａｂｏ  Ｉ．ミトコンドリア膜透過性遷移、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃ  ａｃｔａ  １２４１：１３９−１７６、１９９５）。
【０１３６】
ミトコンドリアを雄スプレーグドーリーラット（２５０−３００ｇ体重）の心臓から調製し、そのタンパク質内容物を測定した。ミトコンドリアを７０ｍＭショ糖／２１０ｍＭマンニトール／１０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．２中に懸濁させた。２５ｏＣ、１．０ｍｇタンパク質／ｍｌの条件、および３００ｍｏｓｍの全体浸透力を付与するため１０ｍＭスクシナート（Ｎａ＋）、１．０ｎｍｏｌ／ｍｇロテノンのタンパク質、３ｍＭヘペス（Ｎａ＋）、ｐＨ７．４、＋マンニトール／ショ糖（３：１モル比）を含む培地を用いてインキュベーションを行った。ミトコンドリア膨化を分光光度計を用いて５４０ｎｍ、スプリットビームモードでモニターした。スウェリングを光吸光度損失として記録した。光吸光度損失記録値の最大値を１００％に正規化した。
【０１３７】
図１に、種々のメチル化エピカテキン誘導体のミトコンドリア気孔の開口に対する効果を示す。各１μＭの−Ｏ−メチル化誘導体（実施例１のＲ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４の各位置に対応した）の存在下で得られた結果を、それぞれ中実の三角形、白抜きの三角形、白抜きの正方形、および中実の正方形、で示す。対照比較のために、化合物なし（中実の円）および１μＭ非誘導体化エピカテキン（白抜きの円）から得られた結果も示した。次の表はこれらの実験の要約である。
【表１】
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【０１３８】
これらの結果から、Ｒ１位置での誘導体化が最大の効力増加を与え、他方、Ｒ４位置での誘導体化は効力を減らすことがこのアッセイで観察される。しかし、培養中のヒト冠状動脈内皮細胞（ＨＣＡＥＣ）中において、Ｒ４−Ｏ−ＣＨ３誘導体のＮＯ産生を刺激する能力は、エピカテキンに比べ約４６％大きいことが測定された。
【０１３９】
実施例３
内皮の機能不全が虚血再灌流（Ｉ／Ｒ）後の毛細血管傷害および低潅流を引き起こす機序の１つとして、提案されてきた。Ｌ−アルギニンの利用可能性が、一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）による細胞一酸化窒素（ＮＯ）産生の律速因子となる可能性がある。Ｌ−アルギニンを基質としてＮＯＳと共有しているアルギナーゼは、限られた基質獲得のために争い、そのために血管内皮中のＮＯＳの活性を調節する可能性がある。増加したアルギナーゼ活性は、ＮＯレベルと関連があり、アルギナーゼ活性の抑制が内皮依存性血管緊張低下を改善すると報告されている。我々は、ラットを用いて（−）−エピカテキン（ＥＰＩ）が虚血再灌流（Ｉ／Ｒ）心筋障害を減らし、培養中のヒト冠血管内皮細胞中のＮＯ合成を刺激することができることを示した。
【０１４０】
他の研究者は、アルギナーゼの活性を増加させることによりＩ／ＲがＮＯ媒介冠小動脈拡張を抑制することを示した（１）。心臓組織のアルギナーゼ活性上昇レベルは、ＩＲの臨床的発症と関連づけられてきた（２〜３）。我々は、ＩＲ誘導アルギナーゼ活性増加はエピカテキンによって防止できると仮定した。この仮説をテストするため、Ｉ／Ｒ傷害ラットモデルを使って、ＥＰＩ（１ｍｇ／Ｋｇ）前処理（１０日間）の心筋のアルギナーゼに対する効果を調査した。
【０１４１】
ラット心筋のＩ／Ｒモデル実現の一般的方法については、文献（４、５）で詳述されている。心筋虚血の全体時間は４５分であった。１）シャム；２）シャム＋ＥＰＩ（１０日間、１ｍｇ／Ｋｇ；経管栄養）；３）Ｉ／Ｒおよび４）Ｉ／Ｒ＋ＥＰＩ（１０日間、１ｍｇ／Ｋｇ；経管栄養）から心臓を摘出した。左心室の組織（０．１２０ｇ）を２５ｍＭトリス塩酸の０．５ｍｌ、０．１％トリトンＸ−１００、５ｍＭ  ＰＭＳＦで溶解した。溶解液を４℃で３０分（１２０００ｒｐｍ）遠心分離し、沈殿物を除去した。２５μＬの上清を２５μＬの緩衝液（２５ｍＭトリス塩酸および５ｍＭ  ＭｎＣｌ２（ｐＨ７．４））に添加した。次に、細胞懸濁液を５６℃で１０分間加熱することによりアルギナーゼを活性化した。２５μＬの活性化した溶解液を２５μＬの０．５ＭＬ−アルギニン（ｐＨ９．７）と共に、３７℃で６０分インキュベートして、Ｌ−アルギニンの加水分解を行った。４００μＬの酸性混合物（Ｈ２ＳＯ４、Ｈ３ＰＯ４、およびＨ２Ｏ；１：３：７ｖ／ｖ）で反応を停止した。２５μＬの９％α−イソニトロソプロピオフェノン（１００％エタノールに溶解）を添加して１００℃で４５分加熱後、アルギナーゼ活性を定量するため、尿素を５４５ｎｍで測定した。結果は、Ｉ／Ｒ誘導心筋の損傷により、アルギナーゼ酵素活性の約５倍の増加が生じたことを示している（図２）。（−）−エピカテキン（１ｍｇ／Ｋｇ）の前処理（１０日間）は、アルギナーゼ活性の大きな増加を誘導した（図２）。Ｉ／Ｒは、左心室の心筋のアルギナーゼ活性を増加させる。ＥＰＩによる前処理はこの増加をＩ／Ｒ後４８時間抑制する。ＥＰＩ誘導心臓保護は、アルギナーゼの抑制を介したＮＯＳに対するＬ−アルギニンの利用可能性の増加に関係している可能性がある。
【０１４２】
参考文献
１．ＯＳｃｈｎｏｒｒ、ＴＢｒｏｓｓｅｔｔｅ、ＴＹ．Ｍｏｍｍａ、ＰＫｌｅｉｎｂｏｎｇａｒｄ、ＣＬ．Ｋｅｅｎ、ＨＳｃｈｒｏｅｔｅｒ、ＨＳｉｅｓ．ココアフラバノールはインビトロでヒト内皮細胞及びインビボで赤血球における血管アルギナーゼ活性を弱める、Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ４７６：２１１−２１５、２００８．
２．Ｍｏｒｒｉｓ  ＳＭ  Ｊｒ、Ｋｅｐｋａ−Ｌｅｎｈａｒｔ  Ｄ、Ｃｈｅｎ  ＬＣ．マウスマクロファージ細胞におけるアルギナーゼおよび誘導型一酸化窒素シンターゼの分別制御、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ２７５：Ｅ７４０−Ｅ７４７、１９９８．
３．ＸｕｅＧ、Ｘｉａｎｇｂｉｎ  Ｘ、ＳｏＢｅｌｍａｄａｎｉ、ＹＰａｒｋ、Ｚ  Ｔａｎｇ、Ａ．Ｍ．Ｆｅｌｄｍａｎ、Ｗ  Ｍ．Ｃｈｉｌｉａｎ、Ｃ  Ｚｈａｎｇ、虚血／再潅流傷害におけるアルギナーゼ上方制御による内皮の機能不全に対するＴＮＦ−αの寄与、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ．；２７：１２６９−１２７５、２００７
４．Ｇｏ  ＹａｍａｚａｋｉＫ、ＤＲｏｍｅｒｏ−Ｐｅｒｅｚ、ＭＢａｒｒａｚａ−Ｈｉｄａｌｇｏ、Ｍ  Ｃｒｕｚ、Ｍ  Ｒｉｖａｓ、Ｂ  Ｃｏｒｔｅｚ−Ｇｏｍｅｚ、Ｇ  Ｃｅｂａｌｌｏｓ、ａｎｄ  Ｆ  Ｖｉｌｌａｒｒｅａｌ．心筋虚血再灌流障害に与える（−）−エピカテキンの短期および長期的効果、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２９５：Ｈ７６１−Ｈ７６７、２００８
５．ＫＧ  Ｙａｍａｚａｋｉ、Ｐ  Ｒ  Ｔａｕｂ、Ｍ  Ｂａｒｒａｚａ−Ｈｉｄａｌｇｏ、Ｍ  Ｍ  Ｒｉｖａｓ、Ａ  Ｃ  Ｚａｍｂｏｎ、Ｇ．Ｃｅｂａｌｌｏｓ、Ｆ  Ｊ  Ｖｉｌｌａｒｒｅａｌ．永久的冠動脈閉塞後の心筋梗塞サイズおよび左心室リモデリングに与える（−）−エピカテキンの効果、Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ  Ｉｎ  Ｐｒｅｓｓ、２０１０．
【０１４３】
実施例４
ｅＮＯＳによるＮＯ産生に関しては広範に研究され、ｅＮＯＳ活性化は、Ｃａ２＋依存性およびＣａ２＋非依存性の両方あり得ることが広く受け入れられている。ＢＫ、およびアセチルコリンを含む大抵の体液性リガンドは、Ｃａ２＋／カルモデュリン（Ｃａ２＋−ＣａＭ）複合体（ＹｏｎｇＢｏｏ）を形成する細胞内（［Ｃａ２＋］ｉ）のレベルを上げることによりｅＮＯＳ活性を刺激する。一方、流体せん断応力等の機械的な力および伸張は、Ｃａ２＋非依存性機序によるＮＯ産生を刺激する（ＹｏｎｇＢｏｏ）。さらに、ｅＮＯＳは、カベオリン１（Ｃａｖ−１）および熱衝撃タンパク質９０（ＨＳＰ９０）等の他の陽性および陰性タンパク質修飾物質との相互作用により調節されることが示されている（２０、４１）。基底状態では、大部分のｅＮＯＳは、カベオラ中に抑え込まれたその酵素作用によりＣａｖ−１に結合しているように見える（２７、３３）。このｅＮＯＳの持続的抑制は、Ｃａ２＋動員性アゴニストに呼応してｅＮＯＳに結合しているＣａｖ−１をＣａ２＋／ＣａＭ結合で置換することにより解放することができる（２７）。
【０１４４】
これらの修飾物質の他に、重要な調節の部位でのｅＮＯＳのリン酸化は、いくつかの生理的な刺激に呼応した酵素活性の調節に重要な役割を果たしている（３、１３、１７、２３、３５）。ｅＮＯＳのＳｅｒ１１７７、Ｓｅｒ６３３およびＳｅｒ６１５（ヒト配列）のリン酸化は、酵素の活動亢進と関係しており（１９、３２）、一方、ｅＮＯＳのＴｈｒ４９５のリン酸化は、酵素活性の減少化に必須の役割をすることが示されている（８、２３、３５、３６）。
【０１４５】
興味深いことに、我々のヒト内皮細胞に対するＥＰＩ誘導効果を解析した過去の研究で、ｅＮＯＳ活性に対するブラジキニン誘導効果を完全にブロックする（すなわち、ＰＬＣ抑制）細胞内経路の薬理学的抑制の下でさえ、ＥＰＩは、少なくとも部分的には（約３０％）、ＮＯ産生を誘導できることを示している。これらの結果は、Ｃａ２＋非依存的方式でｅＮＯＳ活性を増加させる可能性があることを示唆している。我々は、フラボノイドＥＰＩは、細胞内のカルシウム濃度の増加とは関係なく、またカベオラからの分離とは関係なく、ｅＮＯＳを活性化する、という仮説を立てた。
【０１４６】
ＨＣＡＥＣおよびＨＣＡＥＣの成長培地をＣｅｌｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｉｎｃ．から購入した。ＥＰＩ、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤混合物、カフェイン、ＥＧＴＡおよびコレラ毒素サブユニットＢ（ＣＴＢ）ペルオキシダーゼ複合体をＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから入手した。Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｅＮＯＳＳｅｒ−１１７７、ｐｈｏｓｐｈｏ−ｅＮＯＳＳｅｒ−６３３、ｅＮＯＳ、Ｃａｖ−１一次抗体、正常なウサギＩｇＧ対照、およびＨＲＰ−複合二次抗体をＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手した。Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｅＮＯＳＴｈｒ−４９５、ＣａＭＩ、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＣａＭＩ、トランスフェリン受容体一次抗体をＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから、ｐｈｏｓｐｈｏ−ｅＮＯＳＳｅｒ−６１５抗体をＭｉｌｌｉｐｏｒｅから、カルシウム緑ＴＭ２をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手した。また、ＢＫをＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手した。亜硝酸塩／硝酸塩蛍光定量アッセイキットをＣａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌから購入した。
【０１４７】
細胞培養
１４、４０および６０年齢の健康な雄由来のＨＣＡＥＣを５％ＣＯ２および９５％Ｏ２かつ加湿雰囲気中、３７℃のＨＣＡＥＣ成長培地中で維持した。処理は、通常、集密細胞培養に適用した。
【０１４８】
［Ｃａ２＋］ｉ測定 
ＨＣＡＥＣ培養物をトリプシン処理し、ＨＣＡＥＣ成長培地に再懸濁した。１ｍｌの細胞懸濁液（３Ｘ１０５細胞／ｍｌ）を２４ウエルディッシュプレート中の各ウエルに置き、細胞を付着させ、２４時間静置した。活性の定常状態に細胞を維持するために、実験の２４時間前に、ＤＭＥＭ＋０．５％ＦＢＳでインキュベートした。フェノールレッドまたはＦＢＳを入れないで細胞をＭ−１９９でインキュベートし、実験の６時間前に２００ｍＭグルタミンを補充した。１）正常量のカルシウム、および２）カルシウム不足の、ＨＣＡＥＣの２つの実験群を作った。次に続くＥＰＩまたはＢＫ処理のために、各群を細区画した。ＨＣＡＥＣに対し、Ｃａ２＋またはフェノールレッドの入っていないＥｐｉｌｉｆｅ培地で洗浄して（３Ｘ５分）カルシウムを除去し、１ｍＭ  ＥＧＴＡおよび１ｍＭカフェインを補充した。細胞を通常のＭＯＰＳ−Ｋｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ溶液（Ｋｒｅｂｓ１）（（ｍＭ単位）１３７ＮａＣｌ、６ＫＣｌ、１．８ＣａＣｌ２、１．２ＮａＨ２ＰＯ４、１．２ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ、５デキストロース、２ナトリウムピルビン酸塩、および１０ＭＯＰＳで構成される）またはＣａ２＋不含Ｋｒｅｂｓ（Ｋｒｅｂｓ２）で洗浄した。細胞を、それぞれのＫｒｅｂｓで希釈した５００μｌの３μＭカルシウム緑ＴＭ２と共に３７℃で２時間インキュベートした。細胞を洗浄し、５００μｌのＫｒｅｂｓ１またはＫｒｅｂｓ２（適用が可能な方をどちらか）を加えた（３Ｘ１分）。細胞を１時間静置し、次に、プレートをＳｙｎｅｒｇｙ  ＨＴ蛍光光度計（ＢｉｏＴｅｋ）に挿入した。ＥＰＩまたはＢＫ［０．１ｎＭ〜１μＭ］が自動的に細胞プレートに適用され、細胞内カルシウム濃度［Ｃａ２＋］ｉの用量−応答増加の関係がそれぞれ５０３ｎｍと５３６ｎｍの励起および発光波長で測定された。
【０１４９】
ＮＯ測定
ＮＯレベルを、市販キットおよび蛍光光度計（ＦＬｘ８００Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＩＮＣ）を使って、それぞれ３６０ｎｍと４３０ｎｍの励起および発光波長で測定した。ＥＰＩを水およびＤＭＳＯ中のＢＫで希釈した（水またはＤＭＳＯは、対照細胞用の賦形剤として使用した）。ＥＰＩおよびＢＫ誘導ＮＯ用量応答曲線を得た。この実験のために、細胞を［０．１ｎｍｏｌ／Ｌ−１μｍｏｌ／Ｌ］ＥＰＩのどちらかで処理し、培地試料を１０分の時点（ＮＯ応答のピーク時間）で集めた。
【０１５０】
イムノブロッティング
１０ｃｍのディッシュ上に成長させた細胞を、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤混合物を加え、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＰＭＳＦ、２ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｎａ３ＶＯ４および１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＦを補充した５０μｌの溶解緩衝液（１％トリトンＸ−１００、２０ｍｍｏｌ／Ｌトリス、ＮａＣｌ  １４０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ２、０．１％ＳＤＳ）で均質化した。ホモジネートをインスリンシリンジ（５Ｘ）を通過させ、４℃で３０分間超音波処理後、１０分間遠心分離した（１２、０００Ｘｇ）。全蛋白含量を上澄みで測定した。全体で４０μｇのタンパク質を５または１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに負荷し、電子伝達をさせて、ブロッキング溶液（５％脱脂粉乳のＴＢＳ＋０．１％ツイーン２０［ＴＢＳ−Ｔ］溶液）中で１時間インキュベートし、続いて、室温で３時間または４℃で一晩、一次抗体と共にインキュベートした。一次抗体を通常の方法によりＴＢＳ−Ｔ＋５％ウシ血清アルブミンで１：１０００または１：２０００に希釈した。メンブレンをＴＢＳ−Ｔで洗浄し（３Ｘ５分）、ブロッキング溶液で１：１０、０００に希釈したＨＲＰ複合二次抗体の存在下、室温で１時間インキュベートした。メンブレンを再度ＴＢＳ−Ｔで洗浄し（３Ｘ）、ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ検出キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ−ＧＥ）を使って免疫ブロットを行った。バンド強度をディジタル定量した。
【０１５１】
免疫沈降
細胞を５０μｌの非変性抽出緩衝液（０．５％、トリトンＸ−１００、５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸ｐＨ７．４；０．１５ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ；０．５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ）に溶解し、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤混合物、さらに１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＰＭＳＦ、２ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｎａ３ＶＯ４および１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＦを補充した。ホモジネートを氷上で１０分間インキュベートしインスリンシリンジを通過させた（５Ｘ）。ホモジネートを振盪を加えながら氷上で１０分間インキュベートし、４℃、１２、０００ｘｇで遠心分離した（１０ｍｉｎ）。全体で０．５ｍｇのタンパク質を１μｇの正常なウサギのＩｇＧ対照および２０μｌ  ｐｒｏｔ−Ｇ−アガロースを添加して、４℃で３０分の混合に続けて、４℃、１２、０００ｘｇで１０分間遠心処理して事前浄化（ｐｒｅ−ｃｌｅａｒｅｄ）した。上清を回収し、ゆるやかな撹拌下、３μｇの免疫沈降抗体と共に４℃でインキュベートした（抗Ｃａｖ−１または抗ＣａＭＩで３ｈ）。２０μｌのタンパク質Ｇ−セファロースを添加し、この混合物を４℃で３時間浸透を加えながらインキュベートした。免疫沈降混合物を４℃、１２、０００ｘｇで１５分間遠心分離した後、上清を回収し４℃で貯蔵した。ペレットを抽出緩衝液を使って４℃、１２、０００ｘｇで１５分間洗浄した（３Ｘ）。免疫沈降したタンパク質をペレットにし、上清中に残ったものをイムノブロッティングのために５または１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに負荷した。免疫共沈降を各免疫沈降抗体を使って少なくとも３回行った。
【０１５２】
洗剤耐性膜（ＤＲＭ）の単離
洗剤耐性膜（脂質ラフトおよびカベオラ）の単離を以前の記載のように行った（２８、３３）。簡単に述べれば：約４．５Ｘ１０６細胞を３００μｌの０．０５％トリトンＸ−１００、およびプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含む冷ＴＮＥ緩衝液（２０ｍＭ  トリス、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）に溶解した。溶解液を３７５μｌの８０％ショ糖のＴＮＥ−トリトンＸ−１００緩衝液溶液と混合し、超遠心分離機チューブ（カタログ番号３４７３５６；Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）に移した。４５％ショ糖中に入れた細胞溶解液に１ｍｌの３５％ショ糖のＴＮＥトリトンＸ−１００緩衝液溶液をゆるやかに上に重ねて入れ、この後者の画分に４００μｌの５％ショ糖のＴＮＥ−トリトンＸ−１００緩衝液溶液を上に重ねて入れた。試料をＯｐｔｉｍａ  ＴＬＸ超遠心分離機とＴＬＳ５５ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使って４℃、１７０、０００ｘｇで１６時間遠心分離した。遠心分離後、８つの２５０μｌ画分を集めた（トップから底まで）。
【０１５３】
５μｌの各ショ糖勾配画分をＰＶＤＦメンブレン上に置いた。液滴を乾燥させ、ＰＶＤＦメンブレンを室温で１時間、ブロッキング溶液中でインキュベートした。次に、ＰＶＤＦメンブレンをブロッキング溶液による１：２０００ＣＴ−Ｂ−ＨＲＰ希釈液と共にインキュベートした。メンブレンをＥＣＬ  Ｐｌｕｓ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−ＧＥ）を使って現像した。
【０１５４】
データ分析
特に断らない限り、少なくとも３回の実験を行った（各３回繰り返して）。統計的分析をｔ検定またはＰ＜０．０５の分散分析を使って行った。
【０１５５】
結果
細胞内Ｃａ２＋（［Ｃａ２＋ｉ］）不足内皮細胞におけるＮＯ産生を記述している既存文献に基づいて、測定ＮＯ合成およびＨＣＡＥＣ中の［Ｃａ２＋］ｉの増加の測定を行った（図３）。細胞をＥＰＩおよびＢＫの濃度を０（対照）〜１μＭに増加させて処理した。ＮＯ産生および［Ｃａ２＋］ｉは、ＥＰＩとＢＫ両方の処理濃度が１μＭで最大レベルに達した。興味深いことには、細胞がＢＫで処理された場合は、［Ｃａ２＋］ｉの増加に平行にＮＯ合成の増加が続くが、細胞がＥＰＩで処理された場合には、ＮＯ産生と［Ｃａ２＋］ｉ間の関係は平行ではなく、ＮＯ産生比率は、［Ｃａ２＋］ｉの増加より大きい。言い換えれば、ＮＯ／［Ｃａ２＋］ｉの比率はＢＫ誘導効果の場合よりもＥＰＩ誘導効果の場合が大きい。このことは、１０ｎＭ〜１μＭで特に明らかである。この結果は、ｅＮＯＳの活性化は、ＥＰＩ処理ＨＣＡＥＣにおいて、一部はＣａ２＋非依存性であることを示唆している。
【０１５６】
内皮細胞では、特異的受容体の活性化を介したＢＫは、細胞内カルシウム動力学のよく知られた誘導因子であり、それ故ｅＮＯＳ活性化因子である。そのため、ＥＰＩに対する特異的受容体は今まで報告がなく、ｅＮＯＳの活性化因子の１つであるＥＰＩの潜在能力がＨＣＡＥＣ中の［Ｃａ２＋］ｉの増加につながるかについて試験するのは興味のあることである。ＢＫのようにＥＰＩは細胞内のカルシウム津入来学を誘導するが、ＥＰＩはＢＫに比べ低いレベルでそれを行う（図４）。カフェインおよびＥＧＴＡ添加（３Ｘ、Ｃａ２＋不含緩衝液中）によりＨＣＡＥＣから［Ｃａ２＋］ｉを取り除いた後、ＢＫおよびＥＰＩ刺激は［Ｃａ２＋］ｉの増加を誘発せず、ＨＣＡＥＣから［Ｃａ２＋］ｉを取り除くことに関してこの技術の有効性を示した（図４）。我々はこの［Ｃａ２＋］ｉ除去技術の有効性を示したとき、すぐに種々の状態下でＮＯ産生の測定を行った。予想通り、ＢＫとＥＰＩは両方ともＮＯ合成につながった。にもかかわらず、Ｃａ２＋のない状態では、ＢＫ単独誘導ＮＯ合成が完全に抑止された；他方、ＥＰＩ処理ＨＣＡＥＣは、Ｃａ２＋不足にもかかわらず、ＮＯ産生可能である（正常なカルシウム状態下の合成量の約３０％（図５））。
【０１５７】
Ｓｅｒ−１１７７、Ｓｅｒ−６３３、Ｓｅｒ−６１５およびＴｈｒ−４９５のリン酸化状態は、ｅＮＯＳ活性の尺度である。従って、Ｃａ２＋のない状態でｅＮＯＳ活性化を評価するために、我々はＥＰＩ処理ＨＣＡＥＣ中のこれらの残基のリン酸化を測定した（図６）。リン酸化状態の変化（活性化）は、残基Ｓｅｒ−１１７７、Ｓｅｒ−６３３およびＳｅｒ−６１５でのみ観察された。これらセリンは対照ＨＣＡＥＣに比べ著しくリン酸化された。これらの結果に反して、Ｔｈｒ−４９５のリン酸化（不活性化）状態は変化せず、Ｃａ２＋依存性を示した。これらの結果は、Ｃａ２＋のない状態下のｅＮＯＳ活性化は、Ｓｅｒ−１１７７、Ｓｅｒ−６３３、Ｓｅｒ−６１５のリン酸化の変化により媒介されるが、Ｔｈｒ−４９５関してはそのようにはならないことを示唆している。従って、Ｃａ２＋のない状態で観察されたＮＯ合成は、これらの残基のリン酸化に起因するとみることができる。
【０１５８】
Ｃａ２＋が存在する場合、ｅＮＯＳは活性化され、Ｃａｖｅｏｌｉｎ−１（Ｃａｖ−１）から離脱する。Ｃａ２＋のない状態でＥＰＩ処理したＨＣＡＥＣでｅＮＯＳ活性化を観察したので、我々はこの状態下でも離脱したのかどうかを調査することにした。Ｃａｖ−１を、対照、Ｃａ２＋のない状態下でのＥＰＩおよびＢＫ処理ＨＣＡＥＣ中で免疫沈降した。免疫沈降した相（ＩＰ）を、次にｅＮＯＳ残基と全体ｅＮＯＳおよびＣａｖ−１のウェスタンブロット分析に使用した（図７）。ＥＰＩとＢＫ処理細胞ならびに対照細胞中のｅＮＯＳはＣａｖ−１から離脱しなかった。このことは、ｅＮＯＳをカベオラから離脱させるにはＣａ２＋が必要であることを示唆している。Ｃａ２＋が無い場合は、ｅＮＯＳ残基中のリン酸化の変化も、そのＣａｖ−１からの離脱も誘発しないので、ＢＫ処理ＨＣＡＥＣは対照の状態に類似している（図４Ａ）。比較すると、ＥＰＩ処理ＨＣＡＥＣのＩＰ相は、Ｃａｖ−１から解離することなく、Ｓｅｒ−１１７７、Ｓｅｒ−６３３およびＳｅｒ−６１５の著しいリン酸化を示し、またＴｈｒ−４９５リン酸化の変化は観察されなかったが、これは、離脱がｅＮＯＳ活性化に必要でないことを示している。ＩＰの上清（ＳＮ）相に対するＷＢでは、ｅＮＯＳも、Ｓｅｒ−１１７７、Ｓｅｒ−６３３およびＳｅｒ−６１５のリン酸化も示されず、ｅＮＯＳが処理後もまだカベオラに結合していることを示している（図８）。さらに、細胞処理後、ｅＮＯＳおよびＣａＭ間の会合が認められず、この状態では、ＣａＭは必ずしもｅＮＯＳ活性化に必要ではないことを示している（図９）。
【０１５９】
生理的非誘導状態下のｅＮＯＳは、膜脂質ラフトおよびカベオラ中に局在化している。ＨＣＡＥＣ中でＣａ２＋のない状態下のｅＮＯＳ局在化をさらに調べるために、４５−３５−境界（ＩＦ）−５％ショ糖勾配で細胞成分分画を作成した。これら細胞成分分画のそれぞれを、全体ｅＮＯＳ、Ｓｅｒ−１１７７、Ｓｅｒ−６３３、Ｓｅｒ−６１５およびＴｈｒ−４９５のリン酸化を測定するために使用した。さらに、Ｃａｖ−１が低密度画分中に認められ、一方ＴｆＲは高密度画分側へ移行しているので、Ｃａｖ−１およびトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に対する抗体を対照として使った（図１０）。対照中では、ＨＣＡＥＣ、Ｓｅｒ−１１７７、Ｓｅｒ−６３３およびＳｅｒ−６１５はリン酸化されなかったが、一方、Ｔｈｒ−４９５はリン酸化され、ｅＮＯＳの不活性を示した。ｅＮＯＳは、Ｃａｖ−１と共に低密度ショ糖画分中に認められ、一方、ＴｆＲは４５％ショ糖画分中に含まれていた（図１１）。ＢＫ処理ＨＣＡＥのショ糖勾配は、Ｓｅｒ−１１７７、Ｓｅｒ−６３３およびＳｅｒ−６１５のリン酸化ならびにＴｈｒ−４９５の脱リン酸化、ｅＮＯＳ活性化の特徴を示した。ｅＮＯＳは、ほとんど３５％ショ糖画分中に認められ、それの低密度膜脂質から細胞質への移行を示唆している（図１２）。ＢＫと同様に、ＥＰＩ処理ＨＣＡＥＣのショ糖勾配は、Ｓｅｒ−１１７７、Ｓｅｒ−６３３およびＳｅｒ−６１５のリン酸化およびＴｈｒ−４９５の脱リン酸化により証明されるｅＮＯＳの活性化を示した。さらに、ｅＮＯＳは、ＴｆＲと共に、より高密度ショ糖画分、４５〜３５％に局在化していた。異なる細胞成分分画ショ糖勾配に関してｅＮＯＳの活性および位置を観察するとすぐ、Ｃａ２＋を除く同じ刺激の実験を繰り返した。従って、この新しい一連の実験では、細胞はＣａ２＋不足であった。
【０１６０】
対照ＨＣＡＥＣは、ショ糖勾配の低密度領域に局在化した不活性ｅＮＯＳを示した（図１３）。Ｃａ２＋のないＢＫ処理ＨＣＡＥＣは、Ｓｅｒ−１１７７、Ｓｅｒ−６３３およびＳｅｒ−６１５のリン酸化またはＴｈｒ−４９５の脱リン酸化を示さず、ｅＮＯＳの不活性化を証明した。さらに、ｅＮＯＳは、より高密度ショ糖画分に移行せず、Ｃａｖ−１と共に５％ショ糖領域中に認められた（図１４）。この結果はＣａ２＋経由で作用を示すという我々の以前の実験と一致する。ＨＣＡＥＣのＣａ２＋のない状態下のＥＰＩ処理は、我々の以前の実験で認められるように、ｅＮＯＳの活性化につながった。この実験の重要な結果は、活性化したｅＮＯＳが低密度ショ糖画分（ＩＦ〜５％）に局在化し、Ｓｅｒ−１１７７、Ｓｅｒ−６３３およびＳｅｒ−６１５残基がリン酸化されたことである（図１５）。これらの結果は、膜脂質の低密度領域から移動することなくｅＮＯＳが活性化されることを示している。
【０１６１】
ＥＰＩは、新しい、カルシウム非依存的様式でｅＮＯＳを活性化でき、この効果は、カベオラ（ｃａｖ−１）からの酵素の離脱を必要とせず、またカルモデュリンと無関係である。ＥＰＩは、また、ｅＮＯＳタンパク質レベルを約４０％程度増加させ、また処理後４８時間、ミトコンドリア発生を誘導する。このように、独特の効果が、ＥＰＩの心臓保護作用の原因の一部である可能性がある。ＥＰＩは、内皮細胞ミトコンドリア発生の効果的な誘導因子として期待できる。この作用が及ぶ範囲内で、ＥＰＩは、内皮のミトコンドリアが調節的役割をするＤＭ等の疾患の有害血管作用を回復させることができる。
【０１６２】
実施例５
梗塞サイズに対する（−）−エピカテキン（ＥＰＩ）のアクセスを制限する効果を心筋虚血再灌流（ＩＲ）傷害のラットモデルを使って血管内腔に対象を限って測定した。この目的のために、高分子（約２７０ＫＤａ）デキストランＥＰＩ（Ｄｘ−ＥＰＩ）複合体を合成した。ＥＰＩの自由拡散を防ぐことにより、内皮でのＥＰＩ誘導効果のみを評価する。
【０１６３】
６ＡＣＡ−ＥＰＩの合成をいくつかの化学のステップを通して行ったが、これを図１６にまとめた。Ｄｘ−ＥＰＩを６−アミノカプロン酸（６ＡＣＡ：６原子）をＥＰＩとデキストラン間のスペーサーアームとして使用し、高分子デキストランのＥＰＩ相互作用分子への立体効果を減らして、合成した。６ＡＣＡのアミノ基は、化学的に保護され、そのカルボニルとＥＰＩを反応させエステル結合を生成する。次に、アミノ基を脱保護し、活性化したデキストランに結合させた。次に、得られたシッフ塩基を還元し安定な化合物を形成する。
【０１６４】
ラット心筋のＩＲモデルを実現する一般的な方法は、他で詳述している。心筋虚血の全体時間は４５分であった。Ｄｘ−ＥＰＩ（３ｍｇ／ｋｇ）を食塩水溶液中で混合し、頸静脈経由でＩＶ投与した。対照動物は、デキストラン食塩水溶液注射を受けた。梗塞サイズをＩＲ後４８時間で定型手順により調査した。
【０１６５】
得られた生成物は１ｍｇの高分子複合体当たり約０．２５４ｍｇのＥＰＩを含んでいた。ＩＲ試験では、３ｍｇ複合体／ｋｇラット（ＥＰＩ含有物ベースで０．７６３ｍｇ／ｋｇ）を使った。Ｄｘ−ＥＰＩのＩＶ投与結果を図１７にまとめた。結果から、内皮細胞との相互作用（Ｄｘ−ＥＰＩは元々自由に拡散できないため）がＥＰＩ誘導心臓保護効果の主要エフェクターである可能性があることが示唆される。高分子複合体に適用されたＥＰＩの量は約０．７６３ｍｇ／ｋｇで、これは、遊離ＥＰＩが、有意な心臓保護効果を誘導するのに必要な１０ｍｇ／ｋｇに比べ、少ないＥＰＩ量である。
【０１６６】
実施例６
ミトコンドリア呼吸は、ミトコンドリア機能の全体的マーカーであると考えられ、ミトコンドリア機能改善のマーカーと考えられる酸素消費速度（ＯＣＲ）の増加を伴う。ＸＦ２４  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｆｌｕｘ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）は、蛍光ベースの技術を用いて２４−ウエルプレート中の細胞単層上の培地中のＯ２とｐＨレベルを同時にモニターし、ミトコンドリア呼吸および解糖作用を測定して細胞エネルギーの生理的変化を定量する。Ｏ２消費とｐＨの両方の測定により、細胞質での解糖作用ＡＴＰ産生およびミトコンドリアによる酸化的リン酸化の間の動的相互作用を決定するための細胞エネルギーおよび能力のさらなる包括的な評価が可能になる。
【０１６７】
ＸＦ２４アナライザーを使って、Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞中の内生呼吸速度に対する２．５〜２０μＭの用量でのエピカテキンの効果を調べた。培養した細胞をエピカテキンで４８時間処理し、トリプシンで採取して、１０ｍＭグルコース、１０ｍＭピルビン酸塩、および２ｍＭグルタミンを含むＤＭＥＭ中のＣｅｌｌ−Ｔａｋ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でコートしたＸＦ２４プレートの各ウエルに３０、０００細胞を添加した。次に、プレートを８００ｘｇで５分間遠心分離し、ＸＦ２４アナライザーに移した。
【０１６８】
図１８はエピカテキンがＣ２Ｃ１２細胞の内生呼吸速度を増加させることを用量依存性の表現方式で示す。電子顕微鏡では、電子伝達鎖およびＡＴＰアーゼから構成される酸化的リン酸化経路があるクリステ膜の統計的に有意な増加があるように見え、対照細胞に比較してエピカテキン処理細胞のさらに大きなＡＴＰ生成の可能性を示している。この形態学的変化は、Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｘ２４アナライザーを使って評価した改善ミトコンドリア機能と関連する。
【０１６９】
実施例７
測定した内生呼吸速度は、エネルギー利用速度、エネルギー産生、およびミトコンドリア脱共役の間のネットバランスを反映している。続いて、ＡＴＰシンターゼを阻害するため１μＭのオリゴマイシンを添加して、静止（状態４）呼吸を誘導する。状態４呼吸は、主に内部ミトコンドリア膜を通過する陽子リーク速度によって測定される。次に、最大呼吸を、３００ｎＭのＦＣＣＰ（酸化的リン酸化の化学的脱共役剤）を添加して評価した。インタクト細胞では、この速度は基質酸化の最大速度および電子輸送鎖活性を反映している。最大速度の増加は、酸化酵素の調節または発現レベル、電子輸送鎖構成成分、または全体ミトコンドリア質量の変化を反映することができる。後者は、細胞中のミトコンドリアの全体質量に影響される。対照として、非ミトコンドリアのＯ２消費を、呼吸鎖を完全に遮断するために１００ｎＭロテノンおよび１００ｎＭミキソチアゾールを添加後に測定した。
【０１７０】
図１９に示されるように、０．１および１．０μＭの間の濃度のエピカテキンが内生速度、状態４（静止）、および脱共役剤刺激呼吸を誘発した。約５μＭを超える濃度で、エピカテキンは概して全ての呼吸速度に対し抑制的であった（データはなし）。これらのデータは、エピカテキンがゆるやかな脱共役を誘導し、また、基質酸化の最大速度、電子伝達律速成分のレベル、または細胞中のミトコンドリアの全体質量を増やしていることを示唆している。
【０１７１】
図２１に示すように、これらの結果は、ヒト骨格筋細胞（「ＨＳＫＭ細胞」）の初代培養を使って確認された。ＸＦ２４プレートに細胞３０、０００／ウエルで蒔いて、通常培地中で指示濃度のエピカテキン（パネルＡの最上位ラインに配置；最下位ラインに対照を配置）で処理した。インタクト細胞の呼吸を１０ｍＭグルコース、１０ｍＭピルビン酸塩、および２ｍＭグルタミンを含む非緩衝ＤＥＭ中で測定した。パネルＡで、内生呼吸をＨＳＫＭ細胞で測定し、続いて１μＭオリゴマイシンを添加して状態４（静止）呼吸（「Ａ」に示した）、次に３００ｎＭＦＣＣＰ（化学的脱共役剤）を添加後（「Ｂ」に示した）、最大速度を測定した。次に、ロテノンとミキソチアゾール（それぞれ１００ｎＭ）を添加して非ミトコンドリア酸素消費を評価した。パネルＢで、エピカテキンおよびニコランジルに対する用量反応実験をＨＳＫＭ細胞を用いて４８時間行い、最大呼吸速度を、３００ｎＭのＦＣＣＰを添加して測定した。パネルＢおよび図２３に示すように、ニコランジルおよびカテキンは、このアッセイでは、それぞれミトコンドリア機能の刺激に活性である。図２２に示すように、エピカテキンおよびニコランジルの効果は、互いに相乗的である。
【０１７２】
実施例８
細胞溶解液のウェスタンブロットを使ってミトコンドリアのレベルを評価し、呼吸改善がミトコンドリア発生促進によるのかどうかを判定した。１μＭのカテキンまたはエピカテキンで４８時間処理したＣ２Ｃ１２細胞を電子伝達鎖タンパク質（ＭｉｔｏＳｃｉｅｎｃｅｓ  ＭＳ６０１）に対するモノクローナル抗体混合物で探索した。図２０に示したように、エピカテキンまたはカテキン処理は、明らかに複合体Ｉの２０ｋＤａサブユニットの発現レベルを増加させ、また、複合体ＩＩＩおよびＩＶ成分の極めて少量の増加を誘導した可能性もある。
【０１７３】
実施例９
ミトコンドリアをカルシウム過負荷下に曝した場合、ミトコンドリア気孔の開口防止が、虚血傷害からの組織の保護に関連することがわかっている。ミトコンドリア膜透過性遷移孔（ＭＰＴＰ）の開口は、カルシウムの添加によるミトコンドリア膨化誘導の測定により評価可能である（Ｂｅｒｎａｒｄｉ  Ｐ、Ｋｒａｕｓｋｏｐｆ  Ａ．、Ｂａｓｓｏ  Ｅ．、ｅｔ  ａｌ．、疾患標的に対するインビトロアーティファクトからのミトコンドリア膜透過性遷移、ＦＥＢＳＪｏｕｒｎａｌ２７３：２０７７−９９、２００６）。ミトコンドリア膨化は、カルシウム誘導開口ＭＰＴＰ経由ミトコンドリアへの水と電解質の流入の結果である。この現象は、５３５〜５４０ｎｍでの光透過率の増加（濁度の減少または５３５ｎｍでの吸光度の減少）を誘導する（Ｚｏｒａｔｔｉ  Ｍ  ａｎｄ  Ｓｚａｂｏ  Ｉ、ミトコンドリア膜透過性遷移、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃ  ａｃｔａ  １２４１：１３９−１７６、１９９５）。
【０１７４】
ミトコンドリアを、雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（２５０〜３００ｇ体重）の心臓から調製し、そのタンパク質内容物を測定した。ミトコンドリアを７０ｍＭショ糖／２１０ｍＭマンニトール／１０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．２中に懸濁させた。インキュベーションを、１０ｍＭスクシナート（Ｎａ＋）、１．０ｎｍｏｌ／ｍｇロテノンのタンパク質、３ｍＭヘペス（Ｎａ＋）、ｐＨ７．４、およびマンニトール／ショ糖（３：１モル比）を含み３００ｍｏｓｍの全体浸透力を付与する培地中で１．０ｍｇのタンパク質／ｍＬと共に２５℃で行った。ミトコンドリア膨化を、スプリットビームモードで操作される分光光度計を使い５４０ｎｍでモニターした。スウェリングを光吸光度損失として記録した。記録した光吸光度損失の最大値＝１００％に正規化した。
【０１７５】
図２４は、エピカテキンの濃度増加に対するミトコンドリア気孔の開口の抑制を示す。エピカテキンの３Ｒ（−）立体化学が欠如しているカテキンは、ミトコンドリア機能の刺激には活性であっても、ミトコンドリア気孔の開口抑制には活性がない。従って、エピカテキン等の３Ｒ（−）カテキンは、請求項の方法中のカテキン、およびその誘導体に比べて追加の利点を示す。ｍなた、エピカテキンが、梗塞サイズを減らす能力、およびＨＣＡＥＣ細胞中のＮＯ産生を刺激する能力でカテキンより優れていることは注目に値する。このため、立体化学と置換パターンの組み合わせがカテキンの生物学的機能で重要な役割を有する可能性がある。
【０１７６】
実施例１０
高カルシウム誘導ミトコンドリア膨化（損傷）に対する（−）−エピカテキン（ＥＰＩ）およびニコランジル（ＮＩＣＯ）の同時処理の効果を測定するため、カルシウム誘導ミトコンドリア損傷（膨化）に対するＥＰＩまたはＮＩＣＯおよびＥＰＩ＋ＮＩＣＯ保護効果を、光学密度（ＯＤ、光吸光度）の変化をモニタリングすることにより評価した：雄ラット由来の心臓を摘出し、秤量した。左心室を溶液Ａ（ショ糖２Ｍ、ＥＤＴＡ０．０１Ｍ、ヘペス０．５Ｍ：ｐＨ＝７．４）中に（０．１ｇ／ｍＬ）入れ均質化し、（８００ｘｇ）、４℃で１０分遠心分離した後、上清を（８０００ｘｇ）、４℃で１０分遠心分離してペレットを溶液Ｂ（ショ糖２Ｍ、ＥＤＴＡ０．０１Ｍ、トリス０．５Ｍ−Ｈ２ＰＯ４−５０ｍＭ：ｐＨ＝７．４）中に再懸濁し、（１００００ｘｇ）、４℃で１０分遠心分離した。ペレットを１０ｍＬの溶液Ｃ（ショ糖２Ｍ、ＥＤＴＡ０．０１Ｍ、トリス０．５Ｍ−Ｈ２ＰＯ４−５０ｍＭ、スクシナート１Ｍ：ｐＨ＝７．４）中に再懸濁した。次に３３μＭのＣａＣｌ２を添加してミトコンドリア損傷（膨化）を誘導し、５３５ｎｍの吸光度変化を測定して連続的に３０分間モニターした。
【０１７７】
ＥＰＩおよびＮＩＣＯ処理のミトコンドリア膨化に対する用量応答効果を調査した。最大効果の３０、４０および５０％での有効量（ＥＤ）を、ミカエリスメンテン（Ｍ−Ｎ）および確率的（プロビット）分析を使って測定した。ＥＤ３０ＥＰＩおよびＮＩＣＯの効果を別々に、また、各化合物の混合物の理論的効果（効果の３０パーセントに等しい）を測定し、そのデータを使ってイソボログラフ解析を行った。これらの結果を図２５〜２７に示す。ここで示したように、ＥＰＩおよびＮＩＣＯはカルシウム誘導ミトコンドリア損傷を制限することができる。イソボログラフ解析の結果が示すように、同時処理が強力な相乗的効果をもたらす。
【０１７８】
実施例１１
生理的な機能に対するエピカテキンとニコランジルの組み合わせの効果をさらに明らかにするために、ラットの心筋のＩ／Ｒモデルを再度使用した。この目的は、低用量の化合物を単独または組み合わせて投与した場合の梗塞サイズに対する効果をＩ／Ｒ後２４時間のコースで反復（２または３回）投与した場合について比較することであった。
【０１７９】
ラット心筋のＩＲモデルを実現する一般的な方法は本明細書に記載されている。心筋虚血の全体時間は４５分であった。処置は、合計で１、２または３回の投与により行った。初期用量を再灌流の前に１５分間投与し、次に再灌流後１２時間目（２ｘおよび３ｘ投与の場合）、さらに２４時間目（３ｘ投与の場合）に投与した。Ｅｐｉ（０．５ｍｇ／ｋｇ）および／またはＮｉｃｏ（３３ｆｘｇ／ｋｇ）を水中で混合し、頸静脈経由ＩＶ投与した。対照動物には、水注射剤のみ投与した。梗塞サイズをＩＲの４８時間後に定型手順により調べた。
【０１８０】
結果を図２８に示す。パネルＡは、Ｅｐｉおよび／またはＮｉｃｏの単一投与で得られた結果を示す；パネルＢは、組み合わせの２ｘ投与で得られた結果を示す；また、パネルＣは、Ｅｐｉおよび／またはＮｉｃｏの３ｘ投与で得られた結果を示す。結果はＮｉｃｏ単独で梗塞サイズを有意に３７％減らすことができることを示す。Ｅｐｉは単独で梗塞をサイズわずか２７％減らすが、これは有意ではない。両薬剤の組み合わせでは対照に対してより高い有意性を有する５４％減少が得られる。このように、反復低用量Ｎｉｃｏ＋Ｅｐｉ投与は、副作用と毒性を最小化できる潜在的に有用な治療アルゴリズムとなるものである。
【０１８１】
これまで本発明について、当業者がこれを作り使用するために十分に詳細に記載ならびに例証してきたが、様々な代替事項、修正事項、および改良事項は本発明の趣旨と範囲を逸脱しないことは明らかである。本明細書で提供された実施例は、好ましい実施形態の代表例であり、本発明の範囲の制限を意図するものではない。それらの修正や他の使用が当業者には発生するであろう。これらの修正事項は本発明の趣旨の範囲に包含され、また、請求項の範囲にて定められる。
【０１８２】
本発明の範囲と趣旨を離れることなく、本明細書に開示の本発明に対して様々な置換および修正を行うことが可能であることは当業者には容易に明らかとなろう。
【０１８３】
明細書中で記載された全特許と出版物は当業者のレベルを指し示すものである。全特許と出版物は、あたかも各個別の出版物が具体的に、またそれぞれに参照によって組み込まれるのを指示されている場合と同程度に、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１８４】
本明細書で説明されている本発明は、本明細書に具体的に開示されていない任意の要素または制限がない場合には、適切に実現可能である。従って、例えば、本明細書中の各実施例で、用語の「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「本質的に〜より成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」および「〜より成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」の内のいずれかは、他の２つの用語の内のどちらかと置換可能である。採用されている用語と表現は、説明のための用語として使用され、制限のためのものではなく、また、このような用語と表現またはその一部の使用において、示され、記載された任意の特性の等価物を排除する意図はなく、種々の修正は、本発明の請求項の範囲で可能であることが認識される。従って、本発明は好ましい実施形態ならびに任意選択の特徴により具体的に開示されているが、本明細書記載の概念の修正および変更は当業者に依存し、このようは修正と変更は添付請求項により定められた本発明の範囲内であると理解される。
【０１８５】
他の実施形態は以下の請求項により明らかになる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【国際調査報告】
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