【誤訳訂正書】
【提出日】平成21年9月16日(2009.9.16)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】特許請求の範囲
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  因子ＩＸ／ＩＸａのＧｌａドメインと反応性のヒト抗体又は抗体断片であって、該抗体又は抗体断片が、
（ａ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３アミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む親抗体又は抗体断片であって、ＣＤＲ１のアミノ酸配列が、
配列番号：１０及び配列番号：２１からなる群から選択され；
ＣＤＲ２のアミノ酸配列が、
配列番号：１１、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０及び配列番号：２２からなる群から選択され；
ＣＤＲ３のアミノ酸配列が、
配列番号：１２、配列番号：１７、配列番号：１９及び配列番号：２３からなる群から選択される抗体又は抗体断片；
（ｂ）ヒト因子ＩＸ／ＩＸａのＧｌａドメインに対して少なくとも親抗体又は抗体断片の親和性を有する（ａ）の変異体；及び
（ｃ）ヒト因子ＩＸ／ＩＸａのＧｌａドメインの結合について親抗体と競合する（ａ）の変異体からなる群から選択される、組成物。
【請求項２】  重鎖可変領域が、配列番号：１０、配列番号：１１及び配列番号：１２を含む請求項１に記載の抗体組成物。
【請求項３】  重鎖可変領域が、配列番号：１０、配列番号：１６及び配列番号：１７を含む請求項１に記載の抗体組成物。
【請求項４】  重鎖可変領域が、配列番号：１０、配列番号：１８及び配列番号：１９を含む請求項１に記載の抗体組成物。
【請求項５】  重鎖可変領域が、配列番号：１０、配列番号：２０及び配列番号：１２を含む請求項１に記載の抗体組成物。
【請求項６】  重鎖可変領域が、配列番号：２１、配列番号：２２及び配列番号：２３を含む請求項１に記載の抗体組成物。
【請求項７】  親抗体又は抗体断片が、
ｌｃ-ＣＤＲ１、ｌｃ-ＣＤＲ２及びｌｃ-ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖（ｌｃ）可変ドメインをさらに含み、ｌｃ-ＣＤＲ１のアミノ酸配列が、
配列番号：１３及び配列番号：２４からなる群から選択され；
ｌｃ-ＣＤＲ２のアミノ酸配列が、
配列番号：１４及び配列番号：２５からなる群から選択され；
ｌｃ-ＣＤＲ３のアミノ酸配列が、
配列番号：１５及び配列番号：２６からなる群から選択される請求項１に記載の組成物。
【請求項８】  軽鎖可変領域が、配列番号：１３、配列番号：１４及び配列番号：１５を含む請求項７に記載の抗体組成物。
【請求項９】  軽鎖可変領域が、配列番号：２４、配列番号：２５及び配列番号：２６を含む請求項７に記載の抗体組成物。
【請求項１０】  重鎖可変領域が、配列番号：１０、配列番号：１１及び配列番号：１２を含み、軽鎖可変領域が、配列番号：１３、配列番号：１４及び配列番号：１５を含む請求項７に記載の抗体組成物。
【請求項１１】  重鎖可変領域が、配列番号：１０、配列番号：１６及び配列番号：１７を含み、軽鎖可変領域が、配列番号：１３、配列番号：１４及び配列番号：１５を含む請求項７に記載の抗体組成物。
【請求項１２】  重鎖可変領域が、配列番号：１０、配列番号：１８及び配列番号：１９を含み、軽鎖可変領域が、配列番号：１３、配列番号：１４及び配列番号：１５を含む請求項７に記載の抗体組成物。
【請求項１３】  重鎖可変領域が、配列番号：１０、配列番号：２０及び配列番号：１２を含み、軽鎖可変領域が、配列番号：１３、配列番号：１４及び配列番号：１５を含む請求項７に記載の抗体組成物。
【請求項１４】  重鎖可変領域が、配列番号：２１、配列番号：２２及び配列番号：２３を含み、軽鎖可変領域が、配列番号：２４、配列番号：２５及び配列番号：２６を含む請求項７に記載の抗体組成物。
【請求項１５】  請求項１に記載の抗体又は抗体断片をコードする単離された核酸。
【請求項１６】  請求項１５に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１７】  請求項１６に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１８】  請求項１７に記載の宿主細胞を核酸が発現される条件下で培養することを含んでなる抗体又は抗体断片の製造方法。
【請求項１９】  （ａ）容器；
（ｂ）前記容器上のラベル；及び
（ｃ）前記容器内に収容された請求項１に記載の抗体又は抗体断片を含む組成物を含んでなり、当該組成物が、凝血疾患の治療に有効であり、前記容器上の任意のラベルが当該組成物が凝固障害疾患の治療に使用できることを表示する製造品。
【請求項２０】  請求項１に記載の抗体又は抗体断片を含む、哺乳動物における深部静脈血栓症、動脈血栓症、不安定アンギナ、心筋梗塞後、術後血栓症、冠動脈バイパス移植（ＣＡＢＧ）、経皮経管冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）、脳卒中、腫瘍増殖、浸潤又は転移、炎症、敗血性ショック、高血圧、ＡＲＤＳ、心房性細動、及びＤＩＣの治療のための医薬。
【請求項２１】  請求項１に記載の抗体又は抗体断片を含む医薬品組成物。
【請求項２２】  請求項１に記載の抗体又は抗体断片を含む、血栓溶解療法におけるアジュバント。
【請求項２３】  請求項１に記載の抗体又は抗体断片を含む抗血栓剤。
【請求項２４】  請求項１に記載の抗体又は抗体断片を含む抗血液凝固剤。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００２】
（関連する開示の説明）
因子ＩＸａはビタミンＫ依存性血漿セリンプロテアーゼであり、血液凝固の内因性及び外因性経路の両方に参画している。因子ＩＸａのＮＨ２末端４３アミノ酸（Ｇｌａドメイン）及びそのチモーゲン因子ＩＸはＧｌｕ残基のビタミンＫ依存性カルボキシル化によって形成される１２Ｇｌａ残基を含む。Ｇｌａドメインには２つの上皮増殖因子（ＥＧＦ）型ドメインが続き、次いでカルボキシ末端セリンプロテアーゼドメインが続く。
ＦＩＸ／ＦＩＸａのＧｌａドメインは、血管内皮細胞及び血小板上の高親和性結合部位との相互作用のための重要な構造決定因子を含む（Heimark等, (1983) Biochem. Biophys. Res. Commun. 111: 723-7331; Ahmad等, (1994) Biochem. 33: 12048-12055; Ryan等, (1989) J. Biol. Chem. 264: 20283-20287; Toomey等, (1992) Biochemistry 31: 1806-1808; Cheung等, (1992) J. Bio. Chem. 267: 20529-20531; Rawala-Sheikh等, (1992) Blood 79: 398-405; Cheung等, (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 11068-11073; Prokok等, (1996) Int. J. Pept. Res. 48: 281-285; Ahmad等, (1998) Biochemistry 37: 1671-1679）。Ｃａ＋＋及びＭｇ＋＋の存在下で、ＦＩＸ／ＦＩＸａＧｌａドメインは異なるコンホメーションをとる。凝血反応、例えばＦＸのＦＩＸ／ＦＩＸａ媒介活性化などは、活性化された血小板表面上で高効率で進行する（Ahmad及びWalsh (1994) Trends Cardiovasc. Med., 4: 271-277）。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００８】
抗体又は抗体断片を含む医薬品組成物は、血栓性又は凝固障害疾患又は障害の治療及び予防に使用することができ、例えば、ＦＩＸ／ＦＩＸａ媒介事象の阻害が示される哺乳動物の治療方法を含む。この方法は、本発明の医薬品組成物の治療的有効量を哺乳動物に投与することを含む。このような適応症は、深部静脈血栓症、動脈血栓症、不安定アンギナ、心筋梗塞後、術後血栓症、冠動脈バイパス移植（ＣＡＢＧ）、経皮経管冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）、脳卒中、腫瘍増殖、浸潤又は転移、炎症、敗血性ショック、高血圧、ＡＲＤＳ、心房性細動、及びＤＩＣを含む。また本発明の組成物は、血栓溶解療法におけるアジュバントとしても使用できる。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１１】
ＦＩＸ／ＦＩＸａ関連疾患または障害は、深部脈管血栓症、動脈血栓症、脳卒中、腫瘍転移、血栓溶解、動脈硬化症及び血管形成術後の再狭窄のような脈管病、炎症、敗血症ショック、毒血症、低血圧、成人呼吸困難症候群（ＡＲＤＳ）、汎発性血管内血液凝固（ＤＩＣ）及びその他の疾患のような急性および慢性の徴候を含むフィブリン形成に関連する慢性血栓塞栓性疾患または障害を意味する。
「ＦＩＸ」なる用語は、天然発生哺乳動物因子ＩＸ又は以下に記載する組換えＩＸに対応するアミノ酸配列を持つポリペプチドを指すのに用いられる。天然発生ＦＩＸは、ヒト種並びに他の動物種、例えばウサギ、ラット、ブタ、非ヒト霊長類、馬、マウス、及びウシＦＩＸを含む（例えば、Yoshitake等, (1985) Biochemistry 24: 3736 (ヒト)参照）。哺乳動物因子ＩＸ／ＩＸａタンパク質のアミノ酸配列は、一般に知られているか、又は従来技術を通して入手可能である。ヒト、イヌ、マウス及びウサギＦＩＸの４３アミノ酸γ-カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）ドメインをＦＩＧ１に列挙した。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４４】
(ｉｉｉ)選択遺伝子成分
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選べるマーカーとも称される選択遺伝子を含む。この遺伝子は、選択的培地で増殖させた形質転換宿主細胞の生存又は増殖に必要なタンパク質をコードする。選択遺伝子を含むベクターと共に形質転換されていない宿主細胞は培地で生存しない。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(b)栄養要求性欠陥を補い、又は(c)例えばバシリに対する遺伝子コードＤ-アラニンラセマーゼのような複合培地から得られない重要な栄養素を供給する、タンパク質をコードする。
選択スキームの一例においては、宿主細胞の増殖を抑止する薬物が用いられる。異種性遺伝子で首尾よく形質転換した細胞は、抗薬物性を付与し、選択工程で生存するタンパク質を生産する。このような優性選択の例としては、薬物ネオマイシン［Southern等, J. Molec. Appl. Genet., 1：327(1982)］、ミコフェノール酸［Mulligan等, Science, 209：1422(1980)］又はハイグロマイシン［Sugden等, Mol. Cell. Biol., 5：410-413(1985)］が使用される。上述した３つの例は、真核生物のコントロール下で細菌遺伝子を用いて、適切な薬物Ｇ４１８又はネオマイシン(ジェネテシン)、ｘｇｐｔ(ミコフェノール酸)、又はハイグロマイシンにそれぞれ耐性を付与する。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４５】
哺乳動物細胞に適切な選べるマーカーの他の例は、ジヒドロフォレートデヒドロゲナーゼ（ＤＨＦＲ）あるいはチミジンキナーゼのように、抗体核酸を捕捉することのできる細胞成分を同定することのできるものである。哺乳動物細胞の形質転換細胞は、マーカーを捕捉することによって当該形質転換細胞のみが生存できるように独特に適応化された淘汰圧下に置かれる。淘汰圧は、培地中の選択剤の濃度が次第に変化する条件下で形質転換細胞を培養することにより課し、選択遺伝子と抗体をコードするＤＮＡの双方を増幅させる。増幅は、増殖に重要なタンパク質の生産に対する要求度が高い遺伝子が、組換え細胞の後の世代の染色体内に直列に反復されるプロセスである。増幅されたＤＮＡから増大した抗体量が合成される。
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子によって形質転換された細胞は、先ず、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメトトリキセート(Mtx)を含む培地において形質転換物の全てを培養することで同定される。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、Urlaub 等により, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:7216 (1980)に記載されているようにして調製され増殖されたＤＨＦＲ活性に欠陥のあるチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞系である。形質転換した細胞は次に高レベルのＭｔｘに接触させる。これによりＤＨＦＲ遺伝子の複数コピーが合成され、同時に、抗体をコードするＤＮＡのような発現ベクターを含む他のＤＮＡの複数コピーが作られる。この増幅方法は、もしＭｔｘに高度に耐性である変異体ＤＨＦＲ遺伝子が使用されたような場合には内在性ＤＨＦＲの存在にかかわらず、任意の他の適切な宿主、例えば、ＡＴＣＣ番号CCL61 CHO-K1を使用することができる(EP117,060)。あるいは、抗体をコードするＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲタンパク質、及びアミノグリコシド３'-ホスホトランスフェラーゼ(APH)のような他の選べるマーカーで形質転換あるいは同時形質転換した宿主細胞(特に、内在性ＤＨＦＲを含む野生型宿主)は、カナマイシン、ネオマイシンあるいはＧ４１８のようなアミノグリコシド抗生物質のような選べるマーカーの選択試薬を含む培地における細胞増殖により選択することができる。米国特許第4,965,199号を参照。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４６】
酵母中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である［Stinchcomb等, Nature, 282：39(1979)；Kingman等, Gene, 7：141(1979)；Tschemper等, Gene, 10：157(1980)］。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ番号44076あるいはＰＥＰ４-１のようなトリプトファン内で増殖する能力に欠ける酵母の突然変異株に対する選択マーカーを提供する［Jones, (1979) Genetics, 85:12］。酵母宿主細胞ゲノムにｔｒｐ１破壊が存在することは、トリプトファンの不存在下における増殖による形質転換を検出するための有効な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２欠陥酵母株(ATCC 20,622あるいは 38,626)は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する既知のプラスミドによって補完される。
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４９】
酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、３-ホスホグリセラートキナーゼ［Hitzeman 等 (1980), J. Biol. Chem., 255:2073］又は他の糖分解酵素［Hess 等 (1968), J. Adv. Enzyme Reg., 7:149; Holland (1978), Biochemistry, 17：4900］、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
他の酵母プロモーターとしては、増殖条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母の発現に好適に用いられるベクターとプロモータはEP 73,657に更に記載されている。また酵母エンハンサーも酵母プロモーターと共に好適に用いられる。
【誤訳訂正９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００６１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００６１】
本発明の抗体ポリペプチドを生成るために用いられる原核細胞は、前掲のSambrook等により一般的に記載されているような適切な培地で培養される。
本発明の抗体の産生に用いられる哺乳動物の宿主細胞は種々の培地において培養することができる。ハム(Ham)のＦ１０(シグマ)、最小必須培地(「ＭＥＭ」,シグマ)、ＲＰＭＩ-１６４０(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル培地(「DMEM」,シグマ)等の市販の培地は宿主細胞の培養に適している。さらに、それらの開示を全て参考として取り入れるHam及びWallance (1979), Meth. Enz. 58: 44, Barnes及びSato (1980), Anal. Biochem. 102: 255, 米国特許第4,767,704号；米国特許第4,657,866号；米国特許第4,927,762号；又は米国特許第4,560,655号；WO 87/00195；又は米国特許Re. 30,985号に記載された全ての培地は、宿主細胞の培養培地として使用できる。これらの培地はいずれも、ホルモン及び／又は他の増殖因子(例えばインシュリン、トランスフェリン、又は表皮増殖因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオシド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、ゲンタマイシン(商品名)薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等は、発現のために選ばれた宿主細胞について以前から用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
この明細書において言及される宿主細胞は、インビトロ培養中の細胞並びに宿主動物内の細胞を包含する。
【誤訳訂正１０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００６４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００６４】
残基が欠失され、挿入され、又は置換された抗体変異体は、その変異によってしばしば惹起される実質的な特性変化を考慮に入れて、同様にして回収される。例えば、他のタンパク質又はポリペプチド、例えば細菌性もしくはウイルス性抗原と抗体との融合体の調製は精製を容易にし；抗原に対する抗体を含む免疫親和性カラムを、融合ポリペプチドを吸着するために使用することができる。ウサギポリクローナル抗-抗体カラムなどの免疫親和性カラムは、それを少なくとも１つの残りの免疫エピトープに結合することにより抗体変異体を吸着させるのに用いることができる。あるいは、当業者に知られた手段によって、（好ましくは）ＡＦＦＩ-ゲル１０（Bio-Rad, Richmond, CA）等の固定化樹脂にカップリングした精製ＦＩＸＧｌａドメイン-ＩｇＧを用いたアフィニティクロマトグラフィーにより、抗体を精製してもよい。フェニルメチルスルホニルフロリド(PMSF)のようなプロテアーゼインヒビターもまた精製の間のタンパク分解を阻害するのに有用であり、偶発的な汚染物質の増殖を防止するために抗生物質を含めることができる。天然抗体に適切な精製方法は、組換え細胞培養の発現の際における抗体又はその変異体の特性の変化の原因となる改変が必要となることは、当業者であれば理解するであろう。
【誤訳訂正１１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００６５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００６５】
用途
ここに開示した抗体は、ＦＩＸａ依存性アッセイでの凝固の阻害においてＦＩＸａによる又はＴＦ-ＦＶＩＩａによるＦＩＸからＦＩＸａへの活性化の阻害についてのインビトロ診断アッセイに有用である。
本発明の組成物は、限定するものではないが、血栓溶解療法と組み合わせた動脈再血栓症を含むＦＩＸａ媒介疾患又は障害の治療及び予防で使用できる。ＦＩＸは、深部脈管血栓症、動脈血栓症、脳卒中、ＤＩＣ、敗血性ショック、心肺バイパス手術、成人呼吸困難症候群、先天性血管浮腫、並びに腫瘍増殖及び転移を含む種々の臨床的容体において重要な役割を果たすことが示唆されている。従って、ＦＩＸの阻害薬は、炎症及び／又は血栓症疾患の調節において重要な役割を果たしうる。
よって本発明は、ヒトにおけるＦＩＸ／ＦＩＸａ媒介事象を抑制する方法を包含し、その方法は、本発明の抗体組成物の治療的有効量を必要とする患者に投与することを含んでなる。本発明の抗体分子の治療的有効量は、所望の効果を達成するように予め決定される。治療に用いられる量は治療対象、投与経路および処置すべき病状に応じて変化する。従って、投与すべき用量は存在するＦＩＸ／ＦＩＸａに結合して不活性な複合体を形成し、処置される患者において血液凝固を低下させるのに十分な量である。
【誤訳訂正１２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００７４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００７４】
実施例２
方法
バイオパンニング方法−１０１０ｓｃＦｖの大きなライブラリ（Cambridge Antibody Technology, Cambridgeshire, UK）（Vaughan等 (1996) Nature Biotechnology 14: 309-314）を、２ラウンドのビオチニル化ペプチドに対する富化を通してパンニングした。親和性推進選択（Hawkins等 (1992), J. Mol. Biol. 226: 889-896）を、続く各ラウンドのパンニングの抗原量を減少させることにより実施した（ラウンド１及び２は、各々100nM及び10nM）。Ｇｌａペプチドの正しい配置を確実にするために、特に断らない限り、パンニング方法及び続く全てのアッセイ中に塩化カルシウム（2mM）を全ての溶液に添加した。各選択について、3%の脱脂乳、0.1%のTWEEN及び2mMのＣａＣｌ２を添加したＴＢＳ（ＭＴＢＳＴ／Ｃａ）の1mlでブロックした約１０１２の滴定単位のファージを、ビオチニル化ペプチドとともに室温（ＲＴ）で1時間インキュベートした。ＭＴＢＳ中でブロックしたストレプトアビジン-抱合ビーズ（DYNABEADS, Dynal, Oslo Norway）を、ファージ-ビオチニル化抗原混合物にＲＴで15分間添加した。DYNABEADSの300μlの容積をラウンド１に使用し、ラウンド２では100μlに減少させた。DYNABEADSを各々以下の溶液：ＴＢＳＴ／Ｃａ、ＭＴＢＳＴ／Ｃａ、及びＴＢＳ／Ｃａで、DYNAL MPC (磁気粒子濃縮剤）を用いて３回洗浄した。結合したファージを、4MのＭｇＣｌ２、1mMのテトラ-エチルアミン（ＴＥＡ）、及び100mMのＨＣｌで順番に溶離した。各溶離は室温で5分間実施し、溶離した画分を50mMのトリス-ＨＣｌ、pH7.5で中和した。各ラウンドのパンニング後に回収したファージを細菌性サプレッサ株ＴＧ１で増殖させた。
【誤訳訂正１３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００９０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００９０】
実施例８
抗-ＩＸ／ＩＸａの投与は、凝固又は出血パラメータに影響することなく、損傷頸動脈における還流変化を防止する。
方法
ロイシンジッパー１０Ｃ１２Ｆ(ａｂ')２抗体の産生及び精製。クローン１０Ｃ１２の可変重鎖及び軽鎖をコードするｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅し、当量重鎖（Ｆｄ'）及び軽鎖（ラムダ）定常領域（Carter等 (1992) Bio/Technology 10:163-167）並びに定常重鎖配列の３'末端に付加されたロイシンジッパー配列（Kostelny等 (1992), J. Immunol. 148: 1547-1553）の両方を含む発現ベクターにサブクローニングした。このベクターを、株Ｗ３１１０から誘導された大腸菌Ｋ１２株３３Ｂ６（fhuA phoA-delta-E15delta(argF-lac)169 deoC2 degP41(deltaPstI-kanR) IN(rrnDrrnE)1 ilvG2096）中で発現させた。細胞を、通気した60リットル発酵器において、最初に12mg/lのテトラサイクリン、12g/lの消化カゼイン、5mMのグルコース、47mMの(ＮＨ４)２ＳＯ４、250mMのＦｅＣｌ３、及び各40mMのＺｎＳＯ４、ＭｎＳＯ２、ＣｕＳＯ４、ＣｏＣｌ２、Ｈ３ＢＯ３、及びＮａＭｏＯ４を含む媒体中で30℃において46時間増殖させた。発酵は、アンモニア：ロイシン（モル比35:1）の自動化供給を受けてpHを7.0に維持され、グルコースで最高速度に調節されて酢酸塩の蓄積を防止した。操作条件は、3mmol/l-分での酸素供給に十分であった。発現は、リン酸塩飢餓により誘発した。最終細胞密度は160ＯＤ５５０であった。回収した大腸菌細胞ペレットは、-70℃で凍結保存した。凍結ペレットを木槌で小片に破砕し、5容量の20mMのＭＥＳ(２-｛Ｎ-モルホリノ｝エタン-スルホン酸)／2Mの尿素／5mMのＥＤＴＡ／0.25MのＮａＣｌ、pH5.0（抽出バッファー）と、ウルトラツラクス(ultraturax)組織ホモジナイザーを用いて均質な懸濁物になるまで混合した。次いで細胞懸濁物をホモジナイザー（Model 15M, Gaulin Corp. Everett, MA）に通して細胞を破壊した。混合物のｐＨを6NのＨＣｌで3.5に調節することにより抽出物を透明化し、6000xgで20分間遠心分離した。上清のｐＨをＮａＯＨを用いて再度調節した。上清を、4部の20mMのＭＥＳ／2Mの尿素、pH5.0で希釈してクロマトグラフィー用の条件付けをし、0.2ミクロンフィルター（Millipore Corp., Bedford, MA）を通して濾過し、希釈バッファーで平衡化したＳＰ-セファロース急速カチオン交換樹脂に適用した。カラムを同じバッファー、次いで20mMのＭＥＳ、pH5.0で入念に洗浄した。カラムを、20mMのＭＥＳ中の0.5MのＮａＣｌ及び1MのＮａＣｌを用いて２段階で溶離した。１０Ｃ１２ロイシンジッパーＦ(ａｂ')２を、1MのＮａＣｌ／20mMのＭＥＳ分画中で回収した。ＳＰ-セファロースプールを、プロテインＧ−セファロース急速カラムに多数サイクルで負荷した。カラムを20mMのＴｒｉｓ／0.5MのＮａＣｌ、pH7.5で平衡化して洗浄した。溶離は0.1Mの酢酸／0.15MのＮａＣｌ、pH3.0で行い、各サイクル後に20mMのＴｒｉｓ／2MのグアニジンＨＣｌ、pH7.5でカラムを再生した。合わせたプロテインＧプールを、YM30膜を具備するアミコン撹拌細胞システム（Amicon Inc., Beverly, MA）を用いて約20倍に濃縮した。濃縮したプールを、20mMのＮａＰＯ４／0.15MのＮａＣｌ、pH7.0で走らせたセファデックスＧ２５を用いてバッファー交換した。Ｇ２５プールを、20mMのＮａＰＯ４／0.15MのＮａＣｌ、pH7.0中でＱ-セファロース急速カラムに通しでエンドトキシンを除去した。最終的なプールは、12.5EU/mgのタンパク質を含み、0.22ミクロンフィルターを通した。
全ての実験についての対照抗体として、抗ネウロツリンロイシンジッパーＦ(ａｂ')２抗体（ＮＴＮ）を使用した。また、この抗体を大腸菌で産生させ、プロテインＧ急速カラムで精製した。ロイシンジッパー対照Ｆ(ａｂ')２及びロイシンジッパー１０Ｃ１２Ｆ(ａｂ')２は、単に抗-ネウロツリン抗体（ＮＴＮ）及び１０Ｃ１２抗体と称する。両方の抗体の分子量は100,000と計算された。