【手続補正書】
【提出日】平成22年10月6日(2010.10.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本態性高血圧症の素因を有する個体を同定する方法であって、
該個体からＤ１受容体を有しＧＲＫ４を発現する腎細胞を得て、
該細胞をアッセイして、該Ｄ１受容体の翻訳後修飾の程度を測定する（なお、該Ｄ１受容体の翻訳後修飾における変化が、正常血圧の個体から単離され、Ｄ１受容体を有しＧＲＫ４を発現する腎細胞におけるＤ１受容体の翻訳後修飾の程度と比較して、本態性高血圧症の素因の指標となる）、
ことを含む方法。
【請求項２】
該細胞を該Ｄ１受容体のパルミトイル化の程度についてアッセイする、請求項１の方法。
【請求項３】
該細胞を該Ｄ１受容体のリン酸化の程度についてアッセイする、請求項１の方法。
【請求項４】
該細胞を該Ｄ１受容体の過リン酸化についてアッセイする、請求項１の方法。
【請求項５】
該腎細胞が腎近位尿細管細胞または皮質集合管細胞である、請求項１の方法。
【請求項６】
ＧＲＫ４およびＧＲＫ４基質を含み、ＧＲＫ活性を測定する再構築システム。
【請求項７】
該ＧＲＫ４基質がＤ１受容体またはその機能的断片である、請求項６の再構築システム。
【請求項８】
該ＧＲＫ４および該ＧＲＫ４基質を発現する全細胞である、請求項７の再構築システム。
【請求項９】
該全細胞が、Ｄ１受容体をコードする第１異種性遺伝子および高血圧に関連のＧＲＫ４タンパク質をコードする第２異種性遺伝子でトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項８の再構築システム。
【請求項１０】
該ＧＲＫ４タンパク質が本態性高血圧症と関連している、請求項６の再構築システム。
【請求項１１】
高血圧に関連するＧＲＫ４タンパク質と、抗高血圧活性について分析する物質との相互作用において該ＧＲＫ４タンパク質の検出可能な立体配座的変化を提供する薬剤との複合体。
【請求項１２】
不死化ヒト腎近位尿細管細胞。
【請求項１３】
高血圧のヒトから得られる単離された精製腎近位尿細管細胞。
【請求項１４】
不死化された、請求項１３の高血圧のヒトから得られる単離された精製腎近位尿細管細胞。
【請求項１５】
腎細胞中で発現されるＧＲＫ４タンパク質をコードし、該ＧＲＫ４タンパク質を産生するトランスジーンを含有するニ倍性ゲノムを含むトランスジェニック動物（なお、該トランスジーンの発現によって、概トランスジェニック動物において発揮される本態性高血圧症の状態が、腎細胞が該ＧＲＫ４タンパク質を発現しない正常血圧の動物と比較される）。
【請求項１６】
該腎細胞が、該ＧＲＫ４タンパク質を発現しない腎細胞の正常血圧の動物に比して、低いナトリウム拒否能力を持つ、請求項１５のトランスジェニック動物。
【請求項１７】
げっ歯類である、請求項１５のトランスジェニック動物。
【請求項１８】
マウスである、請求項１５のトランスジェニック動物。
【請求項１９】
推定の抗高血圧剤を同定する方法であって、
少なくとも１つの候補薬剤を請求項６の再構築システムに加え、
ＧＲＫ４活性を検出する（該活性は推定の抗高血圧物質の指標である）、
ことを含む方法。
【請求項２０】
ＧＲＫ４活性を検出する該工程が、アデニレート・シクラーゼ活性を測定することを含む、請求項１９の方法。
【請求項２１】
ＧＲＫ４活性を検出する該工程が、リン酸塩を付加し得る基質およびリン酸塩源を該培地に加えて該基質のリン酸化を測定することを含む、請求項１９の方法。
【請求項２２】
推定の抗高血圧剤を同定する方法であって、
少なくとも１つの候補薬剤を請求項１１の複合体に接触せしめ、
該ＧＲＫ４の立体配座的変化が起きたかどうかを検出する（該活性は推定の降圧物質の指標である）、
ことを含む方法。
【請求項２３】
該検出が、分光測定、蛍光、核磁気共鳴、エバネセント波法または原子間力顕微鏡で行う、請求項２２の方法。
【請求項２４】
推定の抗高血圧剤を同定する方法であって、
少なくとも１つの候補薬剤を、高血圧動物から単離の、Ｄ１受容体およびＧＲＫ４を発現する不死化腎細胞に加え、
該細胞のドーパミン作動性シグナルの形質導入の変化を検出する（ドーパミン作動性シグナルの形質導入の変化は推定の抗高血活性の指標である）、
ことを含む方法。
【請求項２５】
推定の抗高血圧剤を同定する方法であって、
該薬剤を投与した請求項１５の第１トランスジェニック動物と、該薬剤を投与していない請求項１５の第２トランスジェニック動物との電解質出力を比較する（推定の抗高血圧剤の同定は、該第１トランスジェニック動物の電解質出力が該第２トランスジェニック動物に比して増加することでなされる）、
ことを含む方法。
【請求項２６】
ナトリウム利尿を増加する方法であって、本態性高血圧症の個体に、ＧＲＫ４と相互作用する薬剤を投与して、該個体におけるナトリウム利尿を増加することを含む方法。
【請求項２７】
該薬剤が、該高血圧個体の腎細胞におけるＧＲＫ４の発現を変化する、請求項２６の方法。
【請求項２８】
該薬剤が、ＧＲＫ４のｍＲＮＡまたはＤＮＡに結合するアンチセンスＲＮＡを含む、請求項２６の方法。
【請求項２９】
該薬剤が、ＧＲＫ４のｍＲＮＡまたはプレｍＲＮＡを開裂するリボチームを含む、請求項２６の方法。
【請求項３０】
該薬剤が、優性阻害変異ＤＮＡ分子を含む、請求項２６の方法。
【請求項３１】
該薬剤がＧＲＫ４タンパク質に結合する、請求項２６の方法。
【請求項３２】
インビトロおよびインビボでＧＲＫ４のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド。
【請求項３３】
アンチセンスＲＮＡ分子である、請求項３２のオリゴヌクレオチド。
【請求項３４】
優性阻害変異ＤＮＡ分子である、請求項３２のオリゴヌクレオチド。
【請求項３５】
ＧＲＫ４のｍＲＮＡまたはプレｍＲＮＡを開裂するリボチーム。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
２つのＤ１様受容体：各々げっ歯類のＤ１ＡおよびＤ１Ｂとして知られている。２つの付加的Ｄ１様受容体、Ｄ１ＣおよびＤ１Ｄは、非哺乳類において発現する。Ｄ１様受容体はアデニリルシクラーゼの刺激に関係している。Ｄ１Ａ受容体はまた、ホスホリパーゼＣ活性を刺激するが、アデニリルシクラーゼの刺激に対して補助的である。Ｄ１様受容体は、まだクローン化されてなく、百日咳毒素非感受性のＧタンパク質、Ｇｑを通してホスホリパーゼＣ(ＰＬＣ)に結合し、Ｄ１およびＤ５受容体とは異なるようである(Jose et al, Pharmac. Ther. 80:149-182(1998)。３つのＤ２様受容体は哺乳動物において発現する：Ｄ２、Ｄ３およびＤ４受容体である。Ｄ２様受容体はアデニリルシクラーゼおよびＣａ2+チャネルの阻害に関連する。Ｄ２およびＤ３受容体はＮＧ１０８−１５細胞における電位依存性カリウム電流を減少すると報告されているが、Ｄ２様受容体はまたＫ＋チャネルを刺激する。シナプス前神経に存在するＤ２およびＤ３受容体の両方がまた、ドーパミンおよびノルエピネフリン両方の放出を減少するのに役立ち得る。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
本発明の実際上の態様は、３つの基本的領域、つまり診断、薬剤の発見、治療に分類される。従って、本発明の第１の態様は、本態性高血圧にかかりやすい個体を同定する方法に関する。該方法は、個体から単離したＤ１受容体およびＧＲＫ４を発現する腎臓細胞のサンプルを用いて行い得る。該方法において、細胞をアッセイして、例えばリン酸化またはパルミトイル化などのＤ１受容体の翻訳後修飾の範囲を測定する。正常血圧者から単離した細胞に関する受容体の翻訳後修飾の変化は、本態性高血圧の素因を示唆している。別法として、ＧＲＫ遺伝子またはその断片を分析して、本態性高血圧に関連のＧＲＫ４を検出するために、核酸サンプルを個体から単離する。本発明において本態性高血圧に関連するとして同定した具体的な変異体には、次のものが含まれる：Ｒ６５Ｌ、Ａ１４２Ｖ、Ａ４８６Ｖ、２つ二重変異体Ｒ６５ＬとＡ４８６ＶおよびＲ６５ＬとＡ１４２Ｖおよび３重変異体Ｒ６５ＬとＡ１４２ＶとＡ４８６Ｖ。本態性高血圧に関連の他の変異体ＧＲＫ４をさらに同定することは、単に、本態性高血圧と診断された個体から単離したＧＲＫ４を分析し、ＧＲＫ４遺伝子の配列を分析することにより行い得る。さらに本発明において、非腎臓細胞におけるこれらのＧＲＫ４の発現により、これらの非腎臓細胞がドーパミン作動性シグナルを“適切に”（例えば、正常に）形質導入し得ないことが明らかになった。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
いかなる特定の作用理論にも拘束されるわけではないが、出願人の考えでは、ヒト被験者において腎欠陥は高血圧のなんらかの原因であり、ＧＲＫ４変異は特に、Ｄ１受容体の直接または間接のリガンド非依存性セリン過剰リン酸化を引き起こし、Ｇタンパク質/エフェクター複合体の結合をはずす。結果、ドーパミンのナトリウム利尿作用が低下され、腎臓がナトリウムと水分の適切な平衡を保てなくなり、ナトリウムの滞留と血圧の上昇をもたらす。特に、正常血圧の被験者からではなく、高血圧の被験者から得た近位尿細管は、ドーパミンＤ１受容体のアデニリルシクラーゼによる欠損結合を示す。欠損結合はＤ１受容体のリガンド非依存性リン酸化に関連する。出願人は、少なくとも６つの変異をキナーゼ型４(ＧＲＫ４)関連Ｇタンパク質に発見し、該遺伝子は高血圧の被験者におけるＤ１受容体のリガンド非依存性リン酸化を調節する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
ＧＲＫ４は初め、Ambrose, et al., Hum. Mol. Genet. 1:697-703(1993)において報告され、次いでPremont et al., J. Biol. Chem. 271(11):6403-6410(1996)においてより広範囲に特徴付けられた。Premontにおいて、ＧＲＫ４は精巣においてのみ非常に豊富で、ＧＲＫ４のｍＲＮＡは脳細胞および骨格筋肉においてわずかに存在すると報告されている。ＧＲＫ４遺伝子はプロモータ領域を除いて、約７５キロベース(ｋＤａ)に及び、１６エキソンから構成されている。ＧＲＫ４の最長型は、無傷のアミノおよびカルボキシル末端の選択的エキソン配列を有し、ＧＲＫ４アルファと呼ばれた。推測されるタンパク質配列は、予測分子量６６.５ｋＤａを有する５７８アミノ酸を含有する。次に短い型、ＧＲＫ４ベータは、コドンから構成されるアミノ酸末端の選択的エキソンのみを欠失し、分子量６２.５ｋＤａを有する５４６アミノ酸を含有する。ＧＲＫ４ガンマは、４６コドンであるカルボキシル末端の選択的エキソンのみを欠失するイソ形である。従って、このイソ形は５３２アミノ酸を含有し、予測分子量６１.２ｋＤａを有する。ＧＲＫ４ガンマは正式にはＧＲＫ４Ａと呼ばれていた。参照、Sallese et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 199:848-854(1994)。ＧＲＫ４デルタは予測分子量５７.６ｋＤａを有する５００アミノ酸を含有し、最短のイソ形である。ＧＲＫ４デルタは両方の選択的エキソンを欠失する。ＧＲＫデルタは初めＩＴ１１およびＧＲＫ４Ｂと呼ばれていた。参照、Sallese et al., 前出、およびAmbrose, et al., 前出。さらに最近、２つの付加的イソ形が発見された、つまり：エキソン１３および１５を欠失し、予測分子量５３.６ｋＤａを有する４８６アミノ酸を含有するＧＲＫ４イプシロンと、エキソン２、１３および１５を欠失し、予測分子量４９.９ｋＤａを有する４５４アミノ酸を含有するＧＲＫ４ゼータである。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
【表１】
2011036253.tif 000001
【表２】
2011036253.tif 000002
【表３】
2011036253.tif 000003
【表４】
2011036253.tif 000004
【表５】
2011036253.tif 000005
【表６】
2011036253.tif 000006
【表７】
2011036253.tif 000007
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
【表８】
2011036253.tif 000008
* GenBank Accession #U33153からU33168
ＧＲＫ４対立遺伝子は、クローン化対立遺伝子または増幅断片のヌクレオチド配列を決定し、それを正常対立遺伝子のヌクレオチド配列と比較することにより、正常対立遺伝子と異なる核酸配列の存在に関して試験する。他の既知の方法は、活性化対立遺伝子の存在の確認について、より完全であるが、まだ幾分は間接的な試験を提供する。これらの方法は、一本鎖確認分析(ＳＳＣＡ)、変性勾配ゲル電気泳動(ＤＧＧＥ)、ＲＮａｓｅ保護アッセイ、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド(ＡＳＯ)、E. coli mutSタンパク質のようなヌクレオチドミスマッチを認識するタンパク質の使用、および対立遺伝子特異的ＰＣＲを含む。これらの方法は、Orita et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2766-2770 (1989); Sheffield et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:232-236 (1989); Finkelstein et al., Genomics 7:167-172 (1990)およびKinszler et al., Science 251:1366-1370 (1991); Conner et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 80:278-282 (1983); Modrich, Ann. Rev. Genet. 25:229-253 (1991); およびRano & Kidd, Nucl. Acids Res. 17:8392 (1989)に各々記載されている。対立遺伝子特異的ＰＣＲに関して、その３'末端で特定のＧＲＫ４変異にハイブリダイズするプライマーを使用する。ＧＲＫ４変異が存在しない場合、増幅産物は検出されない。増幅産物の検出は、ＥＰＡ０３３２４３５に記載のように、Amplification Refractory Mutation System (ARMS)により行い得る。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
ＰＣＲの使用により増幅されているＧＲＫ４遺伝子のＤＮＡ配列は、また対立遺伝子特異的プローブを使用してスクリーニングし得る。これらのプローブは核酸オリゴマーであって、既知の変異を担持する各々ＧＲＫ４遺伝子配列の領域を含む。例えば、一つのオリゴマーは約３０ヌクレオチド長であり得、ＧＲＫ４遺伝子配列の部分に対応する。このような対立特異的遺伝子プローブの１組を使用することにより、ＰＣＲ増幅生産物をスクリーニングし、ＧＲＫ４遺伝子における先に同定された変異の存在を同定する。対立遺伝子特異的プローブと増幅ＧＲＫ４配列とのハイブリダイゼーションは、例えば、ナイロンフィルター上で行うことができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下での特定のプローブへのハイブリダイゼーションは、ＤＮＡサンプル中の対立遺伝子特異的プローブと同じ変異の存在を示す。このような対立遺伝子特異的の例は、表３に示す。
【表９】
2011036253.tif 000009
＊ＧＲＫ４、GenBank Accession # U33054に基づく
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
ＧＲＫ４のｍＲＮＡ発現の変化は、当分野で既知の方法で検出できる。これらは、ノーザンブロット分析、ＰＣＲ増幅およびＲＮａｓｅ保護を含む。減少したｍＲＮＡ発現は、野生型ＧＲＫ４遺伝子の変化を示す。野生型ＧＲＫ４遺伝子の変化は、また野生型ＧＲＫ４遺伝子の変化に関するスクリーニングにより検出できる。例えば、ＧＲＫ４に免疫反応性のモノクローナル抗体は、組織のスクリーニングに使用できる。同源抗原の欠失は、ＧＲＫ４遺伝子変異を示す。変異対立遺伝子に特異的な抗体は、また変異ＧＲＫ４遺伝子生産物の検出にも使用する。このような免疫学的アッセイは、当分野で既知の簡便な形態で行うことができる。これらは、ウエスタンブロット、免疫組織学的アッセイおよびＥＬＩＳＡアッセイを含む。変化したＧＲＫ４を検出する任意の手段を野生型ＧＲＫ４遺伝子の変化の検出に使用できる。変異ＧＲＫ４遺伝子産物の発見は、野生型ＧＲＫ４遺伝子の変化を示す。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
出願人は、上記の６個のＧＲＫ４変異体以外のＧＲＫ４変異体が、本態性高血圧症に関連することを推測する。このような変異体のインビトロでの同定は、変異体挿入のＤ１受容体含有細胞がドーパミン作動性シグナルを伝達し得なくする変異体の能力を測定することによりなされる。このことは、ドーパミン受容体がＧタンパク質ユニットの活性化をしないか、またはナトリウム輸送体を阻害するために必要な細胞質性二次メッセンジャーの産生をしないことを意味する。ドーパミン作動性シグナルを形質導入できないことは、特に、Ｄ１受容体／アデニリルサイクラーゼ(ＡＣ)またはＧタンパク質結合欠陥、および上記のタイプの翻訳後修飾でとりわけ明白である。これらの減少の測定は、ドーパミンまたはそのアゴニストの刺激に対する能力：(ａ)アデニリルサイクラーゼ活性またはｃＡＮＰ産生または活性化タンパク質キナーゼＡ、(ｂ)活性化ホスホリパーゼＣまたは活性化タンパク質キナーゼＣ、(ｃ)ホスホリパーゼＡ２活性および(ｄ)Ｇ−タンパク質活性またはナトリウム／水素交換体またはナトリウム／カリウムＡＴＰａｓｅのようなナトリウム輸送タンパク質の阻害の測定で行える。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
抗高血圧症特性を有すると推定される物質または薬剤は、物質または薬剤のＧＲＫ４システムへの添加によるＧＲＫ４の立体配座または活性の変化の測定により同定し得る。ＧＲＫ４活性は、アデニリルシクラーゼ活性の測定のように間接的に、または培養に添加したリン酸化可能な物質のリン酸化の程度の測定のように直接的に測定し得る。ＧＲＫ４活性化または不活性化変異体、例えば、各々ＧＲＫ４活性の増加またはＧＲＫ４活性の減少を導くＧＲＫ４の変異体または多形性は興味深い。ＧＲＫ４活性の変化は、Ｄ１受容体により例示されるＧタンパク質結合受容体の機能の変化を導くことができる。ＧＲＫ４は、レニン−アンギオテンシン系、カリクレイン−キニン、エンドセリン、房および脳のナトリウム排泄増加性ペプチド、セロトニン、バソプレッシン、カルシウム検出受容体および上皮ナトリウムチャンネルのような本態性高血圧症に関与する他のタンパク質の機能を調節し得る。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
合成アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズし、所望の効果、例えば、ｍＲＮＡ分子の翻訳の遮断を発揮するのに十分な長さでなければならない。しかし、相対的に小さいオリゴヌクレオチドを使用するのが有利である。なぜなら、それらは、細胞にインビボでより効率的に取りこまれ、より多い数のアンチセンスオリゴヌクレオチドが標的ｍＲＮＡの位置に送達されるようである。好ましくは、十分な特異性を達するために、アンチセンスオリゴヌクレオチドは少なくとも１５ヌクレオチド長、好ましくは２０ヌクレオチド長でなければならない。好ましいアンチセンスは、５'ＣＡＣ  ＧＡＴ  ＧＴＴ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＣＴＣ  ＣＡＴ３'（配列番号３３）(塩基２５５−２７５に相補的)および５'ＣＴＣ  ＣＡＴ  ＧＴＣ  ＣＴＧ  ＧＣＧ  ＣＣＧ３'（配列番号３４）（塩基２４３−２６０に相補的)である。