(57)【要約】  本発明は、少なくとも１種類の正に荷電した合成の疎水性ポリマーと、少なくとも１種類の親水性ポリマーと、少なくとも１種類の可塑剤とを含む膜に関し、ここで、前記膜は、柔軟性があり且つ細胞接着、細胞増殖又は細胞分化のうちの少なくとも１つを補助することができる。本発明はさらに、細胞送達系、細胞成長表面及び足場を含むインプラント可能な装置の調製における本発明の膜の使用に関する。本発明はさらに、本発明の膜を適用して、欠損した組織領域における組織再生を促進する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種類の正に荷電した合成の疎水性ポリマーと、少なくとも１種類の親水性ポリマーと、少なくとも１種類の可塑剤とを含む膜であって、
柔軟性があり且つ細胞接着、細胞増殖及び細胞分化のうちの少なくとも１つを補助することのできる膜。
【請求項２】
少なくとも１種類の疎水性ポリマーがアクリルポリマーである、請求項１に記載の膜。
【請求項３】
少なくとも１種類の疎水性ポリマーが、少なくとも１個のアミン基によって置換されたメタクリレートコポリマーである、請求項２に記載の膜。
【請求項４】
少なくとも１種類の親水性ポリマーが、ヒドロキシルプロピルメチルセルロース、ヒドロキシルプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリビニルアルコール、多糖類、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、加工デンプン、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド及びゼラチンからなる群から選択される、請求項１〜３のいずれかに記載の膜。
【請求項５】
少なくとも１種類の可塑剤が、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、クエン酸トリエチル、クエン酸アセチルトリエチル、クエン酸トリブチル、クエン酸アセチルトリブチル、トリアセチン、セバシン酸ジブチル、フタル酸ジエチル、プロピレングリコール、メトキシエチレングリコール及びゼラチンからなる群から選択される、請求項１〜４のいずれかに記載の膜。
【請求項６】
少なくとも１種類の可塑剤が水溶性である、請求項１〜５のいずれかに記載の膜。
【請求項７】
少なくとも１種類の可塑剤及び少なくとも１種類の親水性ポリマーが幹細胞と適合可能である、請求項１に記載の膜。
【請求項８】
親水性ポリマーが、３００〜２０，０００の範囲のポリエチレングリコールである、請求項４に記載の膜。
【請求項９】
可塑剤が、３００〜２０，０００の範囲のポリエチレングリコールである、請求項５に記載の膜。
【請求項１０】
親水性ポリマー及び可塑剤の双方が、３００〜２０，０００の範囲のポリエチレングリコールである、請求項１〜９のいずれかに記載の膜。
【請求項１１】
少なくとも１種類の親水性ポリマーが、膜の約１％（ｗ／ｗ）〜３０％（ｗ／ｗ）の間の濃度で存在する、請求項１〜１０のいずれかに記載の膜。
【請求項１２】
少なくとも１種類の親水性ポリマーが、ヒドロキシルプロピルメチルセルロース、ヒドロキシルプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースからなる群から選択され、膜の約０．５％（ｗ／ｗ）〜２０％（ｗ／ｗ）の間の濃度である、請求項４に記載の膜。
【請求項１３】
膜が、少なくとも１種類の細胞をさらに含む、請求項１〜１２のいずれかに記載の膜。
【請求項１４】
細胞が、成体幹細胞、胚性幹細胞、多能性幹細胞、間葉系幹細胞、臍帯血細胞、骨芽細胞、軟骨芽細胞及びＣＤ１０５＋細胞からなる群から選択される、請求項１３に記載の膜。
【請求項１５】
幹細胞が自己由来の成体幹細胞である、請求項１４に記載の膜。
【請求項１６】
ＡＭＣＡと、３００〜２０，０００の範囲のポリエチレングリコールと、成体幹細胞とを含む、請求項１３に記載の膜。
【請求項１７】
サイトカイン、ホルモン、ビスホスホネート、カンナビノイド、ベータ遮断薬、骨誘導剤、成長因子、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤、薬剤及び抗生物質からなる群から選択される少なくとも１種類の活性剤をさらに含む、請求項１〜１６のいずれかに記載の膜。
【請求項１８】
活性剤が、スタチン、エストロゲン、アンドロゲン、プロプラノロール、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、インスリン様成長ホルモン、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、アレンドロネート、リセンドロネート及び副甲状腺ホルモンからなる群から選択される、請求項１７に記載の膜。
【請求項１９】
活性剤がシンバスタチン又はロバスタチンである、請求項１８に記載の膜。
【請求項２０】
膜が水和によって多孔質となることができ、且つその孔径が約０．１〜約５ミクロンの間である、請求項１〜１９のいずれかに記載の膜。
【請求項２１】
欠損した組織領域の組織再生用の三次元中空インプラントを調製するための、請求項１〜２０のいずれかに記載の膜の使用。
【請求項２２】
三次元中空インプラントが、管状インプラント、円筒状インプラント、円錐状インプラント又は平面状インプラントからなる群から選択される、請求項２１に記載の膜の使用。
【請求項２３】
組織が、靭帯、腱、軟骨、椎間板、歯及び骨から選択される、請求項２１又は２２に記載の使用。
【請求項２４】
請求項１〜２０のいずれかに記載の少なくとも１種類の膜を含む三次元中空インプラント。
【請求項２５】
膜がインプラントの表面を画定する、請求項２４に記載の三次元中空インプラント。
【請求項２６】
請求項１３〜１６のいずれかに記載の膜を含む細胞送達系。
【請求項２７】
請求項１〜１９のいずれかに記載の膜を含む細胞成長表面。
【請求項２８】
請求項１〜２０のいずれかに記載の膜によって実質的にコーティングされている足場。
【請求項２９】
欠損した組織領域における組織再生を促進する方法であって、請求項１〜２０のいずれかに記載の膜を提供するステップと、前記膜を前記組織欠損領域の近くにインプラントするステップとを含む方法。
【請求項３０】
組織が、靭帯、腱、軟骨、椎間板、歯及び骨から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
欠損した組織が、偽関節骨折、骨粗鬆症、歯周病又は歯周部の状態、溶骨性骨疾患、形成手術後、整形インプラント施術後、神経外科手術後、歯槽骨増生法、脊椎固定、脊椎骨折から選択される状態に起因する、請求項２９又は３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組織再生の分野、特に、細胞の接着、増殖及び分化を補助することのできる、ポリマーを主成分とする膜又は構築物を使用する骨再生の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨折の偽関節は、骨癒合せずに、骨折の治癒の全修復過程が停止した状態である(Gerstenfeld LC, Cullinane DM, Barnes GL, Graves DT, Einhorn TA. Fracture healing as a post-natal developmental process: molecular, spatial, and temporal aspects of its regulation. J Cell Biochem 2003;88(5):873-84、Megas P. Classification of non-union. Injury 2005;36 Suppl 4:S30-7、Crenshaw  H. Delayed union and non-union of fractures. St.Louis: CV Mosby; 1987. 2053-118 p)。偽関節は、骨折の３カ月後と６カ月後との間に、ラジオグラフィーで観察されていない、進行性の修復のないこととして説明することもできる(Megas P. Classification of non-union. Injury 2005;36 Suppl 4:S30-7、Hernigou P, Poignard A, Beaujean F, Rouard H. Percutaneous autologous bone-marrow grafting for nonunions. Influence of the number and concentration of progenitor cells. J Bone Joint Surg Am 2005;87(7):1430-7)。偽関節は、骨折領域における力学的環境又は生物学的環境が良くないことの結果として、又はこの２つの組合せの結果としてのいずれかで発生し得る(Megas P. Classification of non-union. Injury 2005;36 Suppl 4:S30-7)。こうした状態では、外科的な目標を達成するために自然に生じる量よりも多くの新しい骨を再生するために、処置又は天然の治癒機構の促進が必要とされる(Kraus KH, Kirker-Head C. Mesenchymal stem cells and bone regeneration. Vet Surg 2006;35(3):232-42、Cancedda R, Mastrogiacomo M, Bianchi G, Derubeis A, Muraglia A, Quarto R. Bone marrow stromal cells and their use in regenerating bone. Novartis Found Symp 2003;249:133-43; discussion 143-7, 170-4, 239-41、Cancedda R, Dozin B, Giannoni P, Quarto R. Tissue engineering and cell therapy of cartilage and bone. Matrix Biol 2003;22(1):81-91)。したがって、外傷を与えられた、損傷された、又は失われた骨の機能の修復又は再生のための新しい骨は、臨床的必要性の大きいものであり、骨組織工学は、骨を再生するための代替の戦略としてその重要性が認められてきている(Tsuchiya K, Mori T, Chen G, Ushida T, Tateishi T, Matsuno T, Sakamoto M, Umezawa A. Custom-shaping system for bone regeneration by seeding marrow stromal cells onto a web-like biodegradable hybrid sheet. Cell Tissue Res 2004;316(2):141-53)。
【０００３】
組織工学では、それが骨に適用されるにつれて、体重を支える骨を含む、骨格の大きな領域の再生に焦点が当てられてきている。骨は、以下の戦略を通して再生され得る：骨形成−細胞の移入；骨誘導−骨になるように細胞を誘導すること；骨伝導−骨形成細胞のための足場を提供すること；又は骨促進−組織を治癒又は再生する生物学的な又は力学的な環境を促進することによる、骨の治癒及び再生の促進。
【０００４】
力学的に安定な大きな領域の骨欠損を架橋するポリマーのポリ（Ｌ−ラクチド）管状膜は、網状骨の形成及び骨欠損の再構築を促進することが示された(Meinig RP, Rahn B, Perren SM, Gogolewski S. Bone regeneration with resorbable polymeric membranes: treatment of diaphyseal bone defects in the rabbit radius with poly(L-lactide) membrane. A pilot study. J Orthop Trauma 1996;10(3):178-90)。Mosheiff et al.は、骨欠損治療の試験のために、ウサギにおける重大な大きさの欠損のモデルを開発した。このモデルでは、ウサギ前腕に重大な大きさの欠損を生じさせる。重大な大きさの欠損とは、通常の状況において骨格によって架橋されない最も小さな骨内の創傷として定義される(Mosheiff R, Friedman A, Friedman M, Liebergall M. Quantification of guided regeneration of weight-bearing bones. Orthopedics 2003;26(8):789-94、Ito K, Nanba K, Murai S. Effects of bioabsorbable and non-resorbable barrier membranes on bone augmentation in rabbit calvaria. J Periodontol 1998;69(11):1229-37)。このモデルを使用して、我々のグループは、骨伝導によって、骨再生誘導（ＧＢＲ，guided bone regeneration）に膜を利用することに成功した(Mosheiff R, Friedman A, Friedman M, Liebergall M. Quantification of guided regeneration of weight-bearing bones. Orthopedics 2003;26(8):789-94、Nasser NJ, Friedman A, Friedman M, Moor E, Mosheiff R. Guided bone regeneration in the treatment of segmental diaphyseal defects: a comparison between resorbable and non-resorbable membranes. Injury 2005;36(12):1460-6)。
【０００５】
Gugala et al.は、多孔膜上で間葉系幹細胞（ＭＳＣ，mesenchymal stem cells）が均質に成長し、三次元原線維ネットワークを形成することを示した(Gugala Z, Gogolewski S. Differentiation, growth and activity of rat bone marrow stromal cells on resorbable poly(L/DL-lactide) membranes. Biomaterials 2004;25(12):2299-307)。
【０００６】
国際公開第２００５／１０７８２６号パンフレットには、生体適合性顆粒（例えば、バイオセラミックス）、生体適合性ポリマー及び可塑剤を含む成形可能な骨インプラントが開示されている。このインプラントは、開いた多孔質の足場又は複合マトリックスを形成してもよく、又は液体の若しくは可塑的に変形可能なインプラントとして投与されてもよい。
【０００７】
国際公開第２００４／０８４９６８号パンフレットには、分解可能な架橋ポリマーから調製されることが好ましい、組織の足場又は注射可能な製剤としての使用に適する多孔質のマトリックスが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２００５／１０７８２６号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００４／０８４９６８号パンフレット
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Gerstenfeld LC, Cullinane DM, Barnes GL, Graves DT, Einhorn TA. Fracture healing as a post-natal developmental process: molecular, spatial, and temporal aspects of its regulation. J Cell Biochem 2003;88(5):873-84
【非特許文献２】Megas P. Classification of non-union. Injury 2005;36 Suppl 4:S30-7
【非特許文献３】Crenshaw  H. Delayed union and non-union of fractures. St.Louis: CV Mosby; 1987. 2053-118 p
【非特許文献４】Hernigou P, Poignard A, Beaujean F, Rouard H. Percutaneous autologous bone-marrow grafting for nonunions. Influence of the number and concentration of progenitor cells. J Bone Joint Surg Am 2005;87(7):1430-7
【非特許文献５】Kraus KH, Kirker-Head C. Mesenchymal stem cells and bone regeneration. Vet Surg 2006;35(3):232-42
【非特許文献６】Cancedda R, Mastrogiacomo M, Bianchi G, Derubeis A, Muraglia A, Quarto R. Bone marrow stromal cells and their use in regenerating bone. Novartis Found Symp 2003;249:133-43; discussion 143-7, 170-4, 239-41
【非特許文献７】Cancedda R, Dozin B, Giannoni P, Quarto R. Tissue engineering and cell therapy of cartilage and bone. Matrix Biol 2003;22(1):81-91
【非特許文献８】Tsuchiya K, Mori T, Chen G, Ushida T, Tateishi T, Matsuno T, Sakamoto M, Umezawa A. Custom-shaping system for bone regeneration by seeding marrow stromal cells onto a web-like biodegradable hybrid sheet. Cell Tissue Res 2004;316(2):141-53
【非特許文献９】Meinig RP, Rahn B, Perren SM, Gogolewski S. Bone regeneration with resorbable polymeric membranes: treatment of diaphyseal bone defects in the rabbit radius with poly(L-lactide) membrane. A pilot study. J Orthop Trauma 1996;10(3):178-90
【非特許文献１０】Mosheiff R, Friedman A, Friedman M, Liebergall M. Quantification of guided regeneration of weight-bearing bones. Orthopedics 2003;26(8):789-94
【非特許文献１１】Ito K, Nanba K, Murai S. Effects of bioabsorbable and non-resorbable barrier membranes on bone augmentation in rabbit calvaria. J Periodontol 1998;69(11):1229-37
【非特許文献１２】Nasser NJ, Friedman A, Friedman M, Moor E, Mosheiff R. Guided bone regeneration in the treatment of segmental diaphyseal defects: a comparison between resorbable and non-resorbable membranes. Injury 2005;36(12):1460-6
【非特許文献１３】Gugala Z, Gogolewski S. Differentiation, growth and activity of rat bone marrow stromal cells on resorbable poly(L/DL-lactide) membranes. Biomaterials 2004;25(12):2299-307
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、疎水性ポリマー及び親水性ポリマーの双方を含み、可塑剤をさらに含む、ポリマーを主成分とする新規な膜が、細胞の接着、増殖及び分化を補助することができ、したがって、例えば、大きな領域の骨欠損の治療において、組織再生を増強するために使用できるという発見に基づいている。本発明の膜は、細胞の成長、接着、分化、及び／又は増殖を促進する活性剤と一緒であってもよく、細胞の送達系として、並びに骨再生誘導のための装置として、いずれとしても働く。
【００１１】
特に、本発明は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ，polyethyleneglycol）をさらに含有する、ポリマーを主成分とする膜が、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の接着、分化、及び増殖を補助したという発見に基づいている。
【００１２】
したがって、本発明は、その態様のうちの１つにおいて、少なくとも１種類の正に荷電した合成の疎水性ポリマーと、少なくとも１種類の親水性ポリマーと、少なくとも１種類の可塑剤とを含有する膜を提供し、ここで、前記膜は、柔軟性があり且つ細胞接着、細胞増殖又は細胞分化のうちの少なくとも１つを補助することができる。
【００１３】
本明細書中で使用される場合、「膜」という用語は、典型的には、少なくとも１種類の正に荷電した合成の疎水性ポリマー、少なくとも１種類の親水性ポリマー及び少なくとも１種類の可塑剤を型に入れて流延することによって構築される、３０〜２００μｍの間の厚さを有する薄い（ほぼ二次元の）連続した均質の構築物に関する。
【００１４】
「正に荷電した合成の疎水性ポリマー」という用語は、ポリマーの正に荷電した又は部分的に正に荷電したモノマー群（又は前記モノマー上の置換基）から結果として生じる全体の平均で正の（表面）電荷を有する、合成によって生成された水に不溶性のポリマーに関する。
【００１５】
いくつかの実施形態において、少なくとも１種類の前記疎水性ポリマーはアクリルポリマーである。他の実施形態において、少なくとも１種類の前記疎水性ポリマーは、少なくとも１個のアミン基によって置換されたメタクリレートコポリマーである。「アミン基」という用語は、例えば、−ＮＨ３、第二級アミン、第三級アミン及びアンモニウム基などのあらゆるアミン基を包含するものである。特定の一実施形態では、前記ポリマーは、アンモニックメタクリレートコポリマーであり、より好ましくは、アンモニックメタクリレートコポリマーＡ型（例えば、AMCA Eudragit RLTM  Degussa社製  Germany）である。
【００１６】
本発明による疎水性ポリマーは、コポリマー、又は、例えば、疎水性ポリマーの少なくとも３０％が正電荷を有するものなど、正に荷電した疎水性ポリマーと正に荷電していない疎水性ポリマーとの混合物も包含すると理解されるべきである。こうした実施形態では、疎水性ポリマーの混合物が、ポリエチレン、ポリメタクリレート、ポリアミド−ナイロン、ポリエチレン酢酸ビニル、硝酸セルロース、シリコン、エチルセルロース及びこれらの任意の組合せをさらに含んでいてもよい。
【００１７】
本明細書中で使用される場合、「アミン基及びメタクリル基を有するポリマー」という用語は、アミン基で置換されているメタクリル基をモノマーとして有するポリマー並びにコポリマーに関する。こうしたポリマーの例は、例えば、Aggeliki I. et al Macromolecules, 35 (7), 2506-2513, 2002において、見出すことができる。
【００１８】
「親水性ポリマー」という用語は、体液（例えば、細胞外液、間質液、血漿、血液、又は唾液）のような水性媒体に溶解するポリマー（コポリマー及びポリマーの混合物を含む）を指す。こうしたポリマーは、水性媒体にさらされることにより膜に孔を生じることに留意されたい。
【００１９】
いくつかの実施形態において、少なくとも１種類の前記親水性ポリマーは、ヒドロキシルプロピルメチルセルロース、ヒドロキシルプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリビニルアルコール、多糖類、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、加工デンプン、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド及びゼラチンからなる群から選択される。
【００２０】
「可塑剤」という用語は、膜に柔軟性を与えることのできる化合物に関する。本発明に従って使用される可塑剤は、細胞に対して非毒性でなければならない。いくつかの特定の実施形態において、前記可塑剤は、幹細胞に対して非毒性である。
【００２１】
いくつかの実施形態において、少なくとも１種類の前記可塑剤は、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、クエン酸トリエチル、クエン酸アセチルトリエチル、クエン酸トリブチル、クエン酸アセチルトリブチル、トリアセチン、セバシン酸ジブチル、フタル酸ジエチル、プロピレングリコール、メトキシエチレングリコール及びゼラチンからなる群から選択される。
【００２２】
いくつかの実施形態において、本発明の膜は、少なくとも１種類の水溶性の可塑剤を含有する。水溶性可塑剤の非限定的なリストとしては、ＰＥＧ、クエン酸トリエチル、クエン酸アセチルトリエチル、クエン酸トリブチル、クエン酸アセチルトリブチル、トリアセチン、セバシン酸ジブチル、フタル酸ジエチル、プロピレングリコール、メトキシエチレングリコール及びゼラチンなどが挙げられる。
【００２３】
いくつかの実施形態において、前記の少なくとも１種類の可塑剤及び少なくとも１種類の親水性ポリマーは、幹細胞と適合可能である。
【００２４】
下記の実施例で実証するように、ＰＥＧは、幹細胞に非毒性であることが示された。したがって、膜に幹細胞が含まれている特定の一実施形態において、好ましい可塑剤及び／又は親水性ポリマーはＰＥＧである。
【００２５】
「ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）」という用語は、水性媒体に溶解するポリエチレングリコールポリマーを指す。いくつかの実施形態では、３００〜２０，０００の範囲のＰＥＧが本発明の膜に使用される。他の実施形態では、ＰＥＧ４００が本発明の膜に使用される。
【００２６】
いくつかの実施形態において、前記親水性ポリマーは、３００〜２０，０００の範囲のポリエチレングリコールである。他の実施形態において、前記可塑剤は、３００〜２０，０００の範囲のポリエチレングリコールである。さらに他の実施形態では、前記親水性ポリマー及び前記可塑剤の双方が、３００〜２０，０００の範囲のポリエチレングリコールである。
【００２７】
理論に拘束されることを望むものではないが、このような場合に、ＰＥＧは、膜において２つの機能を果たすようであり、すなわち、膜に柔軟性を与え、溶解に応じた孔生成を引き起こす。下記の実施例で示すように、多孔度（膜内の孔の数）は、膜内のＰＥＧ濃度によって増大する。さらに、多孔度の増加は、細胞接着の増大と相関している。
【００２８】
本発明の他の実施形態において、少なくとも１種類の前記親水性ポリマーは、膜の約０．５％重量／重量（ｗ／ｗ）〜３０％（ｗ／ｗ）の間の濃度で存在する。他の実施形態において、少なくとも１種類の前記親水性ポリマーは、膜の約１０％（ｗ／ｗ）〜約２５％（ｗ／ｗ）の間の濃度で存在する。
【００２９】
特定の一実施形態において、少なくとも１種類の前記親水性ポリマーは、ヒドロキシルプロピルメチルセルロース、ヒドロキシルプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースからなる群から選択され、膜の約０．５％（ｗ／ｗ）〜２０％（ｗ／ｗ）の間の濃度である。
【００３０】
他の特定の一実施形態において、少なくとも１種類の前記親水性ポリマーはＰＥＧであり、膜の約１％（ｗ／ｗ）〜３０％（ｗ／ｗ）の間、又は約１０％（ｗ／ｗ）〜約２５％（ｗ／ｗ）の間、又は約１５％（ｗ／ｗ）の濃度である。
【００３１】
さらなる一実施形態において、本発明の膜は、少なくとも１種類の細胞をさらに含有する。いくつかの実施形態において、前記細胞は、成体幹細胞、胚性幹細胞、多能性幹細胞、間葉系幹細胞、臍帯血細胞、骨芽細胞、軟骨芽細胞及びＣＤ１０５＋細胞からなる群から選択される。他の実施形態において、前記幹細胞は、自己由来の成体幹細胞である。
【００３２】
多能性間葉系幹細胞は、骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、及び筋細胞などのいくつかの細胞系列になる能力を有する。
【００３３】
一実施形態において、本発明の膜は、ＡＭＣＡと、（可塑剤及び親水性ポリマーの双方が水性液体との接触により生体内原位置で孔を形成できるのに十分となる量の）３００〜２０，０００の範囲のポリエチレングリコールと、成体幹細胞とを含有する。
【００３４】
本明細書中で使用される場合、「細胞接着」という用語は、生存力を維持したままでの表面への細胞の結合／付着を指す。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、「細胞増殖」又は「細胞成長」という用語は、細胞数の再生及び増加、すなわち、細胞分裂を指す。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、「細胞分化」という用語は、専門化されていない細胞がより専門化された細胞型になる過程を指す。例えば、成体幹細胞は、組織修復時及び通常の細胞ターンオーバー時に、分裂して完全に分化した娘細胞を生じ、例えば、間葉系幹細胞は、骨芽細胞に分化し得る。
【００３７】
本発明の膜は、細胞接着、細胞増殖及び／又は細胞分化を補助することができる。
【００３８】
本発明による膜は、（ｉ）既存の組織との直接的な接着及び結合を起こす能力；（ii）細胞機能を促進する能力；（iii）新しい組織を形成するための足場又は鋳型を提供する能力；並びに（iv）組織再生を促進し、生理活性物質の担体として作用する能力などの性質を示す。
【００３９】
いくつかの実施形態において、本発明の膜は、組織再生を促進すること及び／又は前記膜のインプラント部位において必要とされる医薬的利点をもたらすことのできる少なくとも１種類の活性剤をさらに含有する。
【００４０】
他の実施形態において、本発明の膜は、少なくとも１種類の活性剤をさらに含有し、このとき、少なくとも１種類の前記活性剤は、サイトカイン、ホルモン、ビスホスホネート、カンナビノイド、ベータ遮断薬、骨誘導剤、成長因子、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤（スタチンなど）、薬剤及び抗生物質、並びにこれらのあらゆる組合せからなる群から選択される。
【００４１】
いくつかの実施形態において、前記活性剤は、スタチン、エストロゲン、アンドロゲン、プロプラノロール、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ，transforming growth factor）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ，bone morphogenetic protein，例えば、ＢＭＰ−２及びＢＭＰ−７など）、インスリン様成長ホルモン、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ，fibroblast growth factor）、アレンドロネート、リセンドロネート及び副甲状腺ホルモンからなる群から選択される。さらに他の実施形態において、前記活性剤は、シンバスタチン又はロバスタチンである。
【００４２】
シンバスタチンは、３−ヒドロキシ−３−メチル−グルタリル補酵素Ａ還元酵素阻害剤であるスタチンファミリーの一員であり、コレステロール低下薬として広範に使用される。スタチンは、同化作用及び抗異化作用（再吸収抑制）の機構によって骨質量を増加させ得る。
【００４３】
いくつかの実施形態において、前記活性剤は、制御放出性製剤中にある。
【００４４】
他の特定の一実施形態において、該膜は、ＡＭＣＡと、ＰＥＧと、少なくとも１種類の活性剤（例えば、シンバスタチン）とを含有する。
【００４５】
いくつかの実施形態において、本発明の膜は、水和によって多孔質となることができ（例えば、水和はインプラント部位で体液と接触することによって達成される）、このとき、その孔径は、約０．１〜約５ミクロンの間である。
【００４６】
いくつかの実施形態において、本発明の膜は、前記水溶性可塑剤の水和による、５ミクロン未満の大きさの少なくとも１個の孔を有していてもよい。他の実施形態において、前記孔径は、２ミクロン未満である。さらに他の実施形態において、前記孔径は、約０．１〜約５ミクロンの間である。
【００４７】
本明細書中で使用される場合、「水和」という用語は、本発明の膜を水溶液又は体液、例えば、間質液、血液、血漿、唾液にさらすことを指し、その結果として水溶性可塑剤が溶解することになる。
【００４８】
他の一態様において、本発明は、欠損した組織領域の組織再生用の三次元中空インプラントを調製するための、本発明の膜の使用を提供する。
【００４９】
本発明の膜は柔軟性があるので、膜を予め流延する若しくは再成形する又は熱にさらす必要なく、前記膜を使用した三次元インプラントを形成することが可能である。前記膜から構築される三次元構造は、インプラントの部位に適するいかなる種類の構造であってもよく、且つ前記インプラントを使用する領域によってインプラントの部位でさらに調整されてもよい。
【００５０】
いくつかの実施形態において、前記三次元中空インプラントは、管状インプラント、円筒状インプラント、円錐状インプラント又は平面状インプラントからなる群から選択される。
【００５１】
さらなる一実施形態において、本発明の膜又は本発明によって作製される三次元中空インプラントの使用によって再生される前記組織は、靭帯、腱、軟骨、椎間板、（歯、エナメル質、象牙質、セメント質、歯髄、歯周靭帯、歯槽骨、歯肉組織を含む）歯組織及び骨から選択される。
【００５２】
さらなる一態様において、本発明は、少なくとも１種類の本発明の膜を含有する三次元中空インプラントを提供する。一実施形態において、本発明の三次元中空インプラント中に含まれる本発明の膜は、インプラントの表面を定める。
【００５３】
他の一態様において、本発明は、本発明の膜を含有する細胞送達系を提供する。
【００５４】
さらに他の一態様において、本発明は、本発明の膜を含有する細胞成長表面を提供する。
【００５５】
本発明は、その態様のうちのもう１つにおいて、本発明の膜によって実質的にコーティングされた足場を提供する。
【００５６】
また、本発明は、本発明の膜によって実質的にコーティングされた顆粒物質も提供する。特定の実施形態において、この顆粒物質は、骨適合性セラミックス、例えば、カルシウムを主成分とするミネラルからなる。
【００５７】
本発明はさらに、以下のステップを含む、欠損した組織領域における組織再生を促進する方法を提供する：本発明の膜を提供するステップ；及び前記膜を前記組織欠損領域の近くにインプラントするステップ。いくつかの実施形態において、前記の欠損した組織は、偽関節骨折、骨粗鬆症、歯周病又は歯周部の状態、溶骨性骨疾患、形成手術後、整形インプラント施術後、神経外科手術後、歯槽骨増生法、脊椎固定、脊椎骨折から選択される状態に起因する。
【００５８】
本発明を理解するために且つそれが実際にどのように行われるかを知るために、非限定的な例のみとして、以下のことを示している添付の図面を参照しながら、これから実施形態を説明する。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１Ａ−１Ｆ】ポリスチレン組織培養ディッシュ上及びＡＭＣＡ膜上でのｈＭＳＣの接着の顕微鏡写真を示す図である。ＣＦＳＥ標識されたｈＭＳＣを、ポリスチレン組織培養ディッシュ上（Ａ〜Ｃ）又は膜上（Ｄ〜Ｆ）のいずれかに播種した。２４時間後、ＣＦＳＥ標識された細胞を共焦点顕微鏡法によって可視化した。それぞれの培養条件につき３枚の代表的な画像を示している。
【図２Ａ−２Ｆ】ＡＭＣＡ／ＰＥＧ膜上でのｈＭＳＣの接着の走査型電子顕微鏡写真を示す図である。ＰＥＧ４００を含有するＡＭＣＡ膜上にｈＭＳＣを播種した。２４時間の培養後、材料及び方法に記載のように細胞を固定し、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ，scanning electron microscopy）を使用して解析を行った。左から右の画像の倍率は、以下の通りである：上のパネル−×２００（図２Ａ）、×１０００（図２Ｂ）、×２０００（図２Ｃ）；×４０００（図２Ｄ）、×５０００（図２Ｅ）、×６０００（図２Ｆ）。
【図３Ａ−３Ｂ】ＣＦＳＥで標識したｈＭＳＣのフローサイトメトリー解析を示す図である。ＣＦＳＥを含有させた１×１０５個のｈＭＳＣを、１５％のＰＥＧ４００を含有するＡＭＣＡ膜（図３Ａ）又はポリスチレン組織培養ディッシュ（図３Ｂ）のいずれかの上で２４時間、４８時間、９６時間及び１４４時間培養した。表示している時点において、細胞を回収し、フローサイトメトリー解析を行った。ＣＦＳＥの減少は、細胞分裂を反映している。
【図４】様々なＰＥＧ４００濃度で調製したＡＭＣＡ膜上でのｈＭＳＣの増殖を示しているグラフである。ＣＦＳＥを含有させたｈＭＳＣを、図３のように培養及び解析した。データは、異なる濃度のＰＥＧ４００を含有するＡＭＣＡ膜対ポリスチレン組織培養ディッシュ（対照）についてのＣＦＳＥの経時的な平均蛍光強度（ＭＦＩ，Mean Fluorescent Intensity）として示されている。ＭＦＩの減少は、経時的なＭＳＣの増殖の割合を表す。
【図５Ａ−５Ｃ】ＡＭＣＡ膜の走査型電子顕微鏡写真を示す図である。溶媒流延法を用いて膜を調製した。次いで、この膜を、ＳＥＭを使用して解析するか、又はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ，phosphate-buffered saline）に２４時間浸漬した後にＳＥＭによって解析した。（図５Ａ）：ＰＢＳに浸漬前の１５％ＰＥＧ４００膜−多孔性を示していない；（図５Ｂ）：ＰＢＳに浸漬後の５％ＰＥＧ含有膜−わずかに多孔性；（図５Ｃ）：ＰＢＳに浸漬後の１５％ＰＥＧ含有膜−多孔性。倍率：×５０００。
【図６Ａ−６Ｂ】ＡＭＣＡ膜上でのｈＭＳＣの分化を示す図である。１×１０５個のｈＭＳＣを、膜又はポリスチレン組織培養ディッシュのいずれかの上で培養した。３日後に細胞がコンフルエントに達したときに、アスコルビン酸（５０μｇ／ｍｌ）、デキサメタゾン（１０−８Ｍ）及びβ−グリセロリン酸（１０ｍＭ）入りの培地を含有する分化培地を添加し、週に２回、細胞に新しい分化培地を供給した。培養の１７日目に、７０％エタノールで細胞を固定し、アリザリンレッド染色を行った。（図６Ａ）：対照ポリスチレンディッシュ；（図６Ｂ）：１５％のＰＥＧ４００を含有するＡＭＣＡ膜。
【図７】平均仮骨面積によって骨再生を示しているグラフである。未治療の対照と比較して、ＡＭＣＡ膜でインプラントした骨における平均仮骨面積の増加を測定した。
【図８Ａ−８Ｂ】重大な大きさの欠損（１０ｍｍ）を両前肢に生じさせた６匹の雄ニュージーランドウサギにおいて、エチルセルロース膜及びシンバスタチンを制御可能に放出するエチルセルロース膜について観察される、経時的に変化する相対仮骨密度の定量的な解析（図８Ａ）及び経時的に変化する仮骨面積（図８Ｂ）を示しているグラフである。前肢に、シンバスタチンを含有するエチルセルロース（ＥＣ，Ethyl Cellulose）膜を挿入し、反対側の肢にはＥＣ膜を挿入した。較正は、Osirixソフトウェアを使用して行った。
【図９】ＥＣ膜での骨再生のマイクロＣＴを示す図である。この試験では、骨欠損は、治療されないままであった。この骨欠損は、偽関節状態にあった。矢印は、骨欠損領域を示す。
【図１０】シンバスタチンを含有するＥＣ膜での骨再生のマイクロＣＴ（computed tomography，コンピューター断層撮影）を示す図である。この試験では、骨欠損が治療され、この欠損の架橋に成功したことが示された。矢印は、骨欠損領域を示す。
【図１１Ａ−１１Ｂ】制御放出性シンバスタチンを添加した場合及び添加しない場合の、本発明のＡＭＣＡ膜の平均仮骨面積の増加を示しているグラフである。Ａ−ＡＭＣＡ膜＋シンバスタチンをインプラントした４週間後に得られた結果を示す。Ｂ−ＡＭＣＡ膜＋シンバスタチンをインプラントした８週間後に得られた結果を示す。
【図１２Ａ−１２Ｄ】（インビトロで測定された）本発明の膜からのシンバスタチンの放出に対する種々のパラメータの影響を示しているグラフである：シンバスタチン放出率に対するシンバスタチン濃度の影響（図１２Ａ）；シンバスタチン放出率に対する膜の厚さの影響（図１２Ｂ）；シンバスタチン放出率に対する可塑剤の影響（図１２Ｃ）；シンバスタチン放出率に対する可塑剤の種類の影響（図１２Ｄ）。
【図１３Ａ−１３Ｂ】ウサギの重大な大きさの欠損のモデルにおいて、ｈＭＳＣを運ぶＡＭＣＡ膜で達成される骨再生パラメータを示しているグラフである。図１３Ａは、仮骨面積の増加を示す。図１３Ｂは、膜をインプラントしてから８週間後の欠損の組織学的評価を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
本発明は、少なくとも３つの成分、すなわち、生理学的な条件下で生分解性ではなく正の表面電荷を有する合成の疎水性ポリマーである第１の成分、生理学的な条件下で生分解性である少なくとも１種類の親水性ポリマー、及び少なくとも１種類の可塑剤、からなる膜を提供する。理論に拘束されることを望むものではないが、これらの成分の組合せは、十分に柔軟性があるために多様な治療用途に適する三次元構造、例えば中空管、を生じることが可能な膜を生じる。さらに、（インビボ又はエキソビボで）液体にさらすことによって、該親水性ポリマーが少なくとも部分的に分解して膜が多孔性になり、したがって細胞の接着を可能にする。
【００６１】
細胞は、さらに以下で詳細に説明するように、本発明の膜上に播種されてもよい。
【００６２】
さらなる実施形態において、本発明の膜は、以下にさらに詳述するように、活性剤をさらに含んでいてもよい。
【００６３】
本発明の膜は、誘導された組織修復を可能にする基盤として並びに細胞送達系としての役割を果たすことができる。本発明の膜は、望ましくない細胞、血管及び軟組織／瘢痕組織の治療部位への浸潤を排除し、周辺組織から前記膜内に送達された細胞を分離し、且つ細胞及び因子が膜の内側の空間から周囲組織に漏出するのを防ぐためのバリアー膜としての役割も果たし得る。
【００６４】
本発明の膜は、それ自体として、例えば、細胞が送達される領域を覆うことによって使用されてもよいが、特定の実施形態において、送達される細胞を保持する三次元の装置（例えば、中空の管状装置）を形成するために使用されてもよく、又は組織をコーティングして送達される細胞を含有する足場を加工することもできる。
【００６５】
いくつかの実施形態において、本発明の膜は、望ましい三次元構造、例えば管状装置に折りたたまれる。この管状装置は、誘導された組織修復を可能にするため並びに骨欠損のような管状の欠損部位内に細胞を送達するための基盤として使用することができ、該膜は、送達された細胞及び装置内の成分を保持するために、且つ細胞、細胞外マトリックス及び血管が周囲組織から装置によって囲まれる空間内に浸潤するのを防ぐために使用することができる。
【００６６】
他の実施形態において、本発明の膜は、組織工学の足場をコーティングするために使用される。膜でコーティングされたこうした足場は、体内の部位に送達される細胞を保持することができる。この膜コーティングは、足場内に送達された細胞を周辺組織から分離し、細胞、及び可溶性因子が、足場内の空間から周囲組織に漏出するのを防ぐ。本発明の膜を用いた足場のコーティングは、細胞の接着を向上させて標的部位に送達される細胞の量を増加させることを可能にし得る。
【００６７】
さらに他の実施形態において、骨欠損した領域は、細胞及び可溶性因子が漏出するのを防ぐために、且つ軟組織が足場内に増殖するのを防ぐために、足場のインプラント後に本発明の膜で包まれてもよい。
【００６８】
「細胞送達」という用語は、治療目的で個体の体内の望ましい部位に細胞を導入することを指す。
【００６９】
本発明の膜は、すべての型の細胞、例えば幹細胞（成体幹細胞及び胚性幹細胞の双方）の播種に適している。他の実施形態において、細胞型は、以下の非限定的なリストから選択されてもよい：間葉（間質）系幹細胞、臍帯血細胞、骨芽細胞、軟骨芽細胞、又はＣＤ１０５＋細胞。本発明は、胚性由来の多能性幹細胞並びに多能性になるために再プログラムされた成体細胞の播種も包含する。これらの細胞は、自己由来、同種異系又は異種であってもよい。
【００７０】
いくつかの実施形態において、該細胞は、例えば骨髄又は脂肪組織から得られる、自己由来の成体幹細胞である。
【００７１】
細胞の播種は、いくつかの実施形態において、エキソビボで行われる。これらの細胞は、（例えば、中空の管状装置として形成された）膜上に又は本発明の膜によってコーティングされた（本明細書中で「足場」とも呼ばれる）組織工学マトリックス内に配置されてもよい。組織工学マトリックスの例は、生物学的物質又は合成ポリマーのいずれかから作製されたものである。
【００７２】
特定の実施形態において、本発明の膜、本発明の管状インプラント、又は本発明のコーティングされた足場は、エキソビボで播種された細胞と共に又はそれなしで、体内の望ましい部位に設置される。この部位は、典型的には、外傷、外科的介入、遺伝的過程又は疾患過程によって損傷されている、新しい組織を生じることが望まれる部位である。
【００７３】
いくつかの実施形態において、所望の部位は、成体幹細胞から組織を生じさせなければならない部位であり、いくつかの実施形態において、こうした部位は、靭帯、腱、軟骨、椎間板、歯組織又は骨組織であり、最も好ましくは骨組織である。
【００７４】
骨組織の生成は、例えば、偽関節骨折、骨粗鬆症、歯周病又は歯のインプラント施術、溶骨性骨疾患、形成手術後、整形インプラント施術後、頭蓋冠骨切除を伴う神経外科手術後のような状態において、歯槽骨増生法において、脊椎固定のために、且つ脊椎骨折において必要とされる。
【００７５】
腱／靭帯組織の生成は、例えば、外傷又は炎症性の状態による組織裂傷後に必要とされる。
【００７６】
軟骨組織の生成は、関節リウマチ、骨関節炎、外傷、癌の手術又は美容整形などの状態において必要とされる。
【００７７】
髄核及び線維輪を含む椎間板組織の生成は、髄核変性、線維輪裂傷、又は髄核摘出術若しくは椎間板切除術の後などの状態において必要とされる。
【００７８】
典型的には、該膜は、例えば中空管の形態で、インプラントによって望ましい部位に配置される。
【００７９】
特定の実施形態において、本発明の膜は、合成の疎水性の正に荷電したポリマーと、親水性ポリマーと、可塑剤と、活性剤とを含み、さらに細胞を播種される。
【００８０】
特定の一実施形態では、本発明の膜は、合成の疎水性の正に荷電したポリマーとＰＥＧとを含み、さらに幹細胞を播種される。
【００８１】
本明細書中で使用される場合、「細胞成長表面」という用語は、細胞成長に適するあらゆる人工表面、例えば、スライド、管又は細胞／組織培養ディッシュを指す。本発明に従って細胞成長表面をコーティングされた膜は、このことにより、細胞の接着、増殖及び／又は分化に適する特性を得る。
【００８２】
本発明は、柔軟性があり、ＭＳＣの接着、増殖及び分化を補助することのできる膜を提供する。こうした膜は、骨再生適用の治療として使用することができる。位置がずれた骨折の治癒及び骨欠損の再生は、局所的に存在する骨芽細胞の増殖のみに起因するわけではなく、前造骨細胞の動員、増殖、及び分化とも関係している。先に存在する骨芽細胞も関係し得るが、多分化能造骨細胞前駆体の分化は、骨の治癒及び仮骨の形成における主な初期事象である。これらの前駆体細胞の動員、確立、増殖、及び分化における失敗はすべて、癒合の遅延又は偽関節を導き得る。重大な大きさの骨欠損の治癒に関する問題点は多い。一般に、これらの問題点は、受容者の骨形成細胞の数及び／又は活性が、治癒できるようにするためには不十分であるという事実に起因する。
【００８３】
本発明の膜は、骨再生を誘導することができるだけでなく、新たに形成された骨における望ましくない血管新生を防ぐこともできる。該膜は、骨欠損の部位を結合組織及び瘢痕組織による浸潤から保護すること、骨形成細胞を誘導すること、並びに骨端及び骨髄から放出される可能性のあり得る骨形成成分を、膜によって囲まれる空間内に蓄えることを可能にすることもできる(Mosheiff R, Friedman A, Friedman M, Liebergall M. Quantification of guided regeneration of weight-bearing bones. Orthopedics 2003;26(8):789-94、Nasser NJ, Friedman A, Friedman M, Moor E, Mosheiff R. Guided bone regeneration in the treatment of segmental diaphyseal defects: a comparison between resorbable and non-resorbable membranes. Injury 2005;36(12):1460-6)。さらに、膜に結合させたＭＳＣを重大な大きさの欠損モデルの部位に配置することは、新しい骨組織の出発物質を提供するであろう。したがって、拡張されたエキソビボのＭＳＣと共にＧＢＲ膜をインプラントすることは、骨修復の結果を大きく改善し得る。
【００８４】
下記の実施例で示すように、数種類のポリマーを多様な可塑剤と抱合化して試験した。
【００８５】
一実施形態において、ＡＭＣＡ及び１５％のＰＥＧ４００から構成される膜は、ＭＳＣの良好な接着、増殖及び分化を補助することができた：（Ｉ）光学顕微鏡法、蛍光顕微鏡法及びＳＥＭによって判定されるように、ＭＳＣは、１５％のＰＥＧ４００を含有するＡＭＣＡ膜に接着した。（II）ＣＦＳＥ標識及びフローサイトメトリー解析によって判定されるように、ＭＳＣは、その増殖活性を維持する。（III）アリザリンレッド染色によって判定されるように、ＭＳＣは、その分化能力を維持していた。
【００８６】
１５％のＰＥＧ４００を含有するＡＭＣＡ膜は、ＭＳＣの骨芽細胞への分化を補助した。
【００８７】
材料及び方法
ポリマー：アンモニオメタクリレートコポリマーＡ型ＮＦ（ＡＭＣＡ，Ammonio Methacrylate Copolymer type A，Eudragit（登録商標）RL，Degussa社製，Germany）及びエチルセルロース（ＥＣ，Ethocel（登録商標）N100，Hercules社製，Wilmington，DL）。
【００８８】
可塑剤：ポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ４００，Merck社製，Germany）、グリセリルトリアセテート（トリアセチン、Fluka社製，Rehovot，Israel）、グリセリン（Frutarom社製，Israel）、クエン酸トリエチル（Fluka社製，Rehovot，Israel）、セバシン酸ジブチル（Fluka社製，Rehovot，Israel）、フタル酸ジブチル（Fluka社製，Rehovot，Israel）。
【００８９】
ポリマー膜の調製及び滅菌−Friedman M, Golomb G. New sustained release dosage form of chlorhexidine for dental use. I. Development and kinetics of release. J Periodontal Res 1982;17(3):323-8に開示されているような溶媒流延法を用いて膜を調製した。ポリマー膜を、ポリマー、可塑剤及びエタノール（Frutarom社製，Israel）からなる溶液からテフロン型（丸型プレート、内径９．６ｃｍ）に入れて流延し、この溶媒を一晩蒸発させた。膜の厚さは、１００±５μｍであった。
【００９０】
組織培養で使用する前に、膜をＰＢＳ（Biological Industries社製，Beit Haemek，Israel）に２４時間浸漬して、残っている可能性のあるエタノールを洗い出し、次いで、ＵＶ照射によって２時間滅菌した。
【００９１】
膜の特徴解析−走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）顕微鏡写真−１５％のＰＥＧ４００を含有するＡＭＣＡ膜を、カコジル酸緩衝液（０．１Ｍ；ｐＨ＝７．２）中、２％のグルタルアルデヒドで２時間固定した。次いで、これらの試料を、エタノール脱水系列を省いた空気乾燥法によって処理した（エタノールはＡＭＣＡを溶解する；したがって、これを試料調製から除かなければならない）。この過程は、１００％のフレオン１１３を通して達成された。該試料を激しく振盪し、フレオン相を急速に蒸発させた。該膜を、金でコーティングされた銅突出部に取り付け、次いで、FEI quanta 200において３０ＫＶの加速電圧で調査した。
【００９２】
細胞の回収及び培養−ｈＭＳＣは、Hadassah医療センターHelsinki倫理委員会の承認の下でインフォームドコンセントに従って、人工股関節全置換術を受けている患者から除去された骨組織から得た。
【００９３】
これらのｈＭＳＣを、Krampera M, Glennie S, Dyson J, Scott D, Laylor R, Simpson E, Dazzi F. Bone marrow mesenchymal stem cells inhibit the response of naive and memory antigen-specific T cells to their cognate peptide. Blood 2003;101(9):3722-9、及びDjouad F, Plence P, Bony C, Tropel P, Apparailly F, Sany J, Noel D, Jorgensen C. Immunosuppressive effect of mesenchymal stem cells favors tumor growth in allogeneic animals. Blood 2003;102(10):3837-44に記載されているように、骨髄に存在している他の細胞からプラスチック接着によって分離し、次いで、組織培養条件下で培養した。これらの細胞を、１０％の熱失活させたウシ胎仔血清、２ｍＭのグルタミン、及びペニシリン／ストレプトマイシン（Biological Industries社製，Beit-Haemek，Israel）で補った、低グルコースのダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ，Dulbecco's Modified Eagle Medium）中で維持した。初代培養物は、通常１２〜１６日間維持し、次いで、トリプシン処理によって解離させて二次培養した（Barry FP, Murphy JM. Mesenchymal stem cells: clinical applications and biological characterization. Int J Biochem Cell Biol 2004;36(4):568-84）。３〜４日毎に培地を交換した。
【００９４】
ＭＳＣの膜への接着−ＭＳＣを標識するために、ＭＳＣを、５−カルボキシフルオレセインジアセトキシメチルエステル（ＢＣＥＣＦ／ＡＭ又はＣＦＳＥ；５μｇ／ｍＬ；Calbiochem社製）を含有するＰＢＳに再懸濁して（１０７細胞／ｍｌ）、３７℃で１０分間インキュベートし、次いで、これらの細胞を３回洗浄した。細胞を、ＰＢＳで湿らせた滅菌した膜上で、１５０μｌの培地中に１５×１０４細胞で培養し、３７℃で６時間インキュベートした。その後、３ｍｌの培地を添加した。細胞を、播種の２４時間後に、蛍光顕微鏡によって検査した。細胞接着試験における膜の陽性対照として、組織培養ポリスチレンディッシュを使用した。
【００９５】
ＣＦＳＥに基づく増殖アッセイ−細胞分裂試験のために、ＭＳＣを、３’−Ｏ−アセチル−２’，７’−ビス（カルボキシエチル）−４又は５−カルボキシフルオレセインジアセトキシメチルエステル（ＢＣＥＣＦ／ＡＭ又はＣＦＳＥ；５μｇ／ｍＬ；Calbiochem社製）を含有するＰＢＳに再懸濁して（１０７細胞／ｍｌ）、３７℃で１０分間インキュベートし、３回洗浄した。次いで、ＣＦＳＥ標識された細胞を、上記のように、膜上又は組織培養ディッシュ上に播種した。表示の各時点で、細胞を回収し、Cell Questソフトウェアを使用してFACSCalibureフローサイトメーター（Becton Dickinson社製）上で解析されるように、ＣＦＳＥ蛍光が徐々に減少していくことによって細胞の増殖を可視化した。
【００９６】
膜上でのＭＳＣの分化−上記のように、ＭＳＣを該膜上又は対照としてセンターウェル器官培養ディッシュ（Falcon社製）上に播種した。ＭＳＣがコンフルエントになり次第、培地にアスコルビン酸（５０μｇ／ｍｌ）、デキサメタゾン（１０−８Ｍ）及びβ−グリセロリン酸（１０ｍＭ）を補った。１７日間、週に２回培地を交換し、その後、下記のように、膜及びディッシュをアリザリンレッドで染色した。
【００９７】
アリザリンレッド染色−蒸留水中の２％アリザリンレッドのストック溶液を、ＮａＯＨでｐＨ４．２に調整して、０．２２μｍのフィルターに通した。センターウェル器官培養ディッシュ中の培養物を、１５０ｍＭのＮａＣｌで３回すすぎ、氷冷した７０％エタノール中で固定して、蒸留水ですすぎ、１ウェルにつき５００μｌのアリザリンレッドストックを用いて室温で１０分間染色した。個々のウェルを蒸留水で５回すすいだ；蒸留水での６回目の最終的な洗浄を１５分間行った（Halvorsen YD, Franklin D, Bond AL, Hitt DC, Auchter C, Boskey AL, Paschalis EP, Wilkison WO, Gimble JM. Extracellular matrix mineralization and osteoblast gene expression by human adipose tissue-derived stromal cells. Tissue Eng 2001;7(6):729-41）。膜は、その正電荷のために、負に荷電したセンターウェル器官培養ディッシュよりもアリザリンレッド染色剤に対してより高い親和性を有し、したがって、蒸留水ですすいでも染色剤が膜から十分に除去されなかった。バックグラウンドを減少させるために、０．０２ＭのＨＣｌを用いて膜上で１回すすぎを行った。次いで、顕微鏡写真を得た。
【実施例１】
【００９８】
本発明の膜を使用する細胞接着
種々の膜を、細胞の付着及び増殖を補助するそれらの能力について試験した。試験したこれらの膜は、そのポリマー及び可塑剤の種類が異なっていた。いくつかの可塑剤、すなわち、グリセリン、ポリエチレングリコール、クエン酸トリエチル、セバシン酸ジブチル、フタル酸ジブチル、トリアセチンを試験した。試験した可塑剤は、疎水性又は親水性であり、膜に柔軟性を与えるために添加された。ＭＳＣを、上記のように、滅菌された膜上に播種した。
【００９９】
ＥＣ膜：ＭＳＣ細胞は、すべてのＥＣ膜の製剤にほとんど接着を示さず、細胞凝集はわずかであった。種々の可塑剤は、細胞接着又は細胞形状のいずれに対する影響も有さなかった。対照として、ポリ−ｌ−リシンでコーティングされた膜を使用した。ポリ−ｌ−リシンは、高度に正に荷電したアミノ酸鎖であり、培養において細胞接着を促進するためのコーティング剤として一般に使用される。細胞は、ポリ−ｌ−リシンでコーティングされたＥＣ膜に単層スピンドル形状で接着し、それゆえに、ＥＣは、それ自体では、細胞接着を補助しないことが結論づけられた。しかし、ＥＣはポリ−ｌ−リシンの存在下で非毒性であることが見出された。
【０１００】
ＡＭＣＡ膜：細胞接着試験は、本明細書中で上記に開示した種々の可塑剤［１５％］と混合したアンモニオメタクリレートコポリマーＡ型（ＡＭＣＡ，Eudragit RL（商標），Degussa社製，Germany）［８５％］を用いて行った。
【０１０１】
ＭＳＣは、種々の可塑剤で調製されたＡＭＣＡ膜にスピンドル単層形状でよく接着した（図１Ｄ〜Ｆ）。ＡＭＣＡ膜上での細胞の広がりは、細胞接着の陽性対照として使用したポリスチレンディッシュ上での広がりと同様であった（図１Ａ〜Ｃ）。広がっていく様式は、細胞がよく生きていることを示す。
【０１０２】
ＳＥＭを使用して、細胞接着をさらに解析した。図２に示したように、ＡＭＣＡ膜上の細胞は、平らで単層スピンドル形状であった。さらに、より高い倍率において、細胞の足が膜に付着した状態で、細胞−膜相互作用が認められた（図２、Ｄ〜Ｆ）。そのうえ、細胞表面からの多数の空胞の放出が観察され、細胞の機能性が示された。ヒト並びにウサギＭＳＣの双方を使用して、同様な結果が得られた。
【実施例２】
【０１０３】
本発明の膜を使用する細胞増殖
細胞分裂の蛍光マーカーであるＣＦＳＥ及びフローサイトメトリー解析を使用して、ＭＳＣの増殖能力を試験した。この方法は、フルオレセインに関する色素であるＣＦＳＥに基づき、これは、娘細胞間で著しい忠実度で分配され、分離した８〜１０世代をインビトロ及びインビボの双方で同定することを可能にする。この技術は、増殖動態及び分化についての複雑な情報を収集することを可能にする。この技術に従って、個々の細胞に、細胞の細胞質に不可逆的に結合する蛍光ＣＦＳＥ色素でタグを付ける。細胞が分裂するにつれて、これらの蛍光は、各世代に従って半減し、存在するすべての単一細胞の増殖履歴を経時的に監視することを可能にする（Lyons AB. Analysing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of CFSE dye dilution. J Immunol Methods 2000;243(1-2):147-54を参照されたい）。
【０１０４】
ＭＳＣは、対照として使用した組織培養ディッシュ上でのそれらの増殖能力（図３Ａ）と比較して、割合はいくらか低下していたが、ＡＭＣＡ及びＰＥＧ４００の膜上で増殖した（図３Ｂ）（しかし、他の可塑剤では、増殖は検出されなかった；データは示していない）。
【０１０５】
次いで、ＭＳＣの増殖率を、異なる濃度のＰＥＧ４００（１０％、１５％、２０％及び２５％ｗ／ｗ）を含有する膜上で経時的に試験した。ＭＳＣの増殖の割合は、平均蛍光強度値（ＭＦＩ）に反比例する（図４）。この解析により、１５％のＰＥＧ４００及び２０％のＰＥＧ４００を含有する膜は、ポリスチレンの対照にかなり近く、他の濃度のＰＥＧは、結果としてより高い又はより低い増殖率となることが明らかにされた。
【０１０６】
さらに、１５％及び５％のＰＥＧ４００を含有するＡＭＣＡ膜を、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を使用して特徴付けした。ＰＢＳに浸漬する前及び後に、膜を観察した（図５）。残留したエタノールを洗い出すために、膜を、それぞれのＭＳＣ播種の前に２４時間、ＰＢＳに浸漬したことに留意されたい。ＰＥＧ４００は水に可溶性であり且つしたがって孔を生じるので、ＰＢＳに浸漬した後にのみ、膜の表面上に孔が観察された（図５Ｂ〜Ｃ）。双方の濃度のＰＥＧ４００において、ＳＥＭ画像は、０．１８μｍの平均孔径を有する多孔性表面を示した。孔の分布は、異なるＰＥＧ４００濃度に直接関連していた。
【実施例３】
【０１０７】
本発明の膜を使用する細胞分化
前述のように分化培地を添加した。次いで、膜及びディッシュをアリザリンレッドで染色した。（図６Ａ及び６Ｂ）。アリザリンレッドは、二価の陽イオンに不可逆的に結合し、カルシウムに対して特に高い親和性を有する。カルシウムは、骨芽細胞から分泌され、細胞外マトリックスの生成の一部として膜上に沈着する。したがって、カルシウムの存在は、骨芽細胞中にカルシウムを分泌しないＭＳＣからの分化を示す。図６は、ＡＭＣＡ膜上で培養したＭＳＣも、ポリスチレン対照で培養したＭＳＣも双方とも、骨芽細胞に分化して細胞外マトリックスを形成したことを示す。この発見は、１５％のＰＥＧ４００を含有するＡＭＣＡ膜がＭＳＣの分化を補助すること及び膜に接着後のＭＳＣがそれらの幹細胞の形質を維持していることを確証するものである。
【実施例４】
【０１０８】
本発明の膜を使用するインビボでの骨再生試験
試験群：前肢に橈骨領域の両側の中央骨幹切除術（長さ１ｃｍ）を受けた体重３．８〜４．４ｋｇの５匹の雄ニュージーランドウサギ。管状ＡＭＣＡ膜を左前肢にインプラントし（治療される骨切断）、右肢を対照として用いた（未治療の骨切断）。
【０１０９】
治癒過程の評価：ラジオグラフィーによる評価−手術の２、４、６及び８週間後に、前肢の側面のラジオグラフを得た。再生治癒過程中の骨欠損の標準化された測定値を得るために、両前肢の真側面のラジオグラフを標準条件（４２ｋＶ、２ｍａｓ）で行った。OsiriX医療用画像化ソフトウェアを使用してラジオグラフを検査し、新しい骨の面積及び密度を評価した。
【０１１０】
測定したパラメータ：
−（骨ギャップ欠損の周辺及び内部に認められる）再生された骨組織の総面積。骨の長さのばらつきによって可能性のある偏りを排除するために、肘頭突起の最も狭い領域の直径を標準参照として使用してデータ較正を行った。各試料において、この直径を１０ｍｍとして定めた。
−ギャップ欠損において新たに再生された骨の相対密度。分割した領域をアウトライン化し、その密度を測定した。各前肢において、肘頭突起の中央の骨密度を、較正のために、参照値として、測定した。この肘頭突起の密度を、試料ごとに１００％と定めた（Mosheiff R, Friedman A, Friedman M, Liebergall M. Quantification of guided regeneration of weight-bearing bones. Orthopedics 2003;26(8):789-94を参照されたい）。
【０１１１】
結果：図７は、試験の全体にわたる（第２〜８週）、平均仮骨面積（ｍｍ２）によって表される骨再生を示す。試験の第２週において、対照群で形成された平均仮骨面積は、ＡＭＣＡ膜で治療した群のものよりも大きかった。これは、術部に血腫又は血餅が形成されたためである可能性がある。この部位を膜で囲んだときには、膜がその領域を隔離し、したがって、血腫の分解が遅れた。しかし、試験の第４週からは、ＡＭＣＡ膜で治療された肢に形成された仮骨平均面積は、対照のものよりも少し大きかった（１４４．８ｍｍ２対１１４．５ｍｍ２）。この傾向は、ＡＭＣＡ膜で治療した肢と対照の肢との間の平均仮骨面積の差を広げながら、第６週及び第８週においても続いた。第８週に、（ＡＭＣＡ膜及び対照で治療された）２本の肢に形成された仮骨の面積の平均間の差は、そのピークに達し、１４３．９１ｍｍ２であった（下記の表１を参照されたい）。しかし、この差は、インビボの試験でよく起こるように、この予備的な試験の試料の規模が小さく（ｎ＝５）且つ結果のばらつきが大きいために、統計的に有意ではない。
【０１１２】
【表１】
2012515014.tif 000002
【実施例５】
【０１１３】
シンバスタチンをさらに含む本発明のＥＣ膜を使用するインビボでの骨再生試験
６匹の雄ニュージーランドウサギにおいて、重大な大きさの欠損（１０ｍｍ）を両前肢に生じさせた。１本の前肢に、シンバスタチンを含有するＥＣ膜を挿入し、反対側の肢には、活性剤を含有しないＥＣ膜を挿入した。仮骨密度及び仮骨面積を測定し、Osirixソフトウェアを使用して較正した。図８Ａ及び８Ｂは、ラジオグラフの定量的な解析を示す。
【０１１４】
図９は、ＥＣ膜での骨再生のマイクロＣＴを示す。この試験では、骨欠損は、治療されないままであった。この骨欠損は、偽関節状態にある。矢印は、骨欠損領域を示す。
【０１１５】
図１０は、シンバスタチンを含有するＥＣ膜での骨再生のマイクロＣＴを示す。矢印は、骨欠損領域を示す。
【０１１６】
この試験では、骨欠損は治療され、この欠損の架橋に成功したことは明白である。
【実施例６】
【０１１７】
シンバスタチンをさらに含む本発明のＡＭＣＡ膜を使用するインビボでの骨再生試験
ウサギモデル：橈骨に１ｃｍの重大な大きさの骨欠損を生じさせた。５匹のウサギをシンバスタチン制御放出性ＡＭＣＡ膜で治療し、他の５匹をいかなる活性成分も含まないＡＭＣＡ膜で治療した。
【０１１８】
膜：
シンバスタチンを含むＡＭＣＡ膜：
−シンバスタチン２０％ｗ／ｗ−０．３６ｇ
−ＡＭＣＡ（eudragit RL）７０％ｗ／ｗ−１．２６ｇ
−ＰＥＧ４００  １０％ｗ／ｗ−０．１８ｇ
−膜の厚さは、１８０マイクロメートルであった。
対照ＡＭＣＡ膜：
−ＡＭＣＡ（eudragit RL）９０％ｗ／ｗ−１．６２ｇ
−ＰＥＧ４００  １０％ｗ／ｗ−０．１８ｇ
−膜の厚さは、１８０マイクロメートルであった。
【０１１９】
図１１は、シンバスタチン制御放出性ＡＭＣＡ膜で治療した欠損部位に形成された有意により大きい仮骨面積（Wilcoxonの順位和検定）、並びに術後の最初の２週間における仮骨成長速度の増加を示す−臨床的な観点から重要であり得る。
【実施例７】
【０１２０】
様々な本発明の膜からのシンバスタチンのインビトロでの放出率
本発明の膜からのシンバスタチン放出に対する多様なパラメータの影響をインビトロで以下のように測定した：
【０１２１】
シンバスタチン放出率に対するシンバスタチン濃度の影響を図１２Ａに示している；試験した膜の組成は、以下の通りであった：
【０１２２】
【表２】
2012515014.tif 000003
【０１２３】
シンバスタチン放出率に対する膜の厚さの影響を図１２Ｂに示している；試験した膜の組成は、以下の通りであった：
【０１２４】
【表３】
2012515014.tif 000004
【０１２５】
シンバスタチン放出率に対する可塑剤の影響を図１２Ｃに示している；試験した膜の組成は、以下の通りであった：
【０１２６】
【表４】
2012515014.tif 000005
【０１２７】
シンバスタチン放出率に対する可塑剤の種類の影響を図１２Ｄに示している。
【実施例８】
【０１２８】
ｈＭＳＣを含むＡＭＣＡ膜を用いた骨再生
ウサギモデル：橈骨に１ｃｍの重大な大きさの骨欠損を生じさせた。２匹のウサギを、１本の前腕には、ｈＭＳＣを運ぶＡＭＣＡ膜で、もう１本の前腕には、ｈＭＳＣなしのＡＭＣＡ膜で治療した。
【０１２９】
膜の特性：
−ＡＭＣＡ（eudragit RL）８５％ｗ／ｗ−１．５１２ｇ
−ＰＥＧ４００  １５％ｗ／ｗ−０．２６６ｇ
膜の厚さは、１８０マイクロメートルであった。
【０１３０】
図１３Ａは、実施した骨における仮骨領域の発達を示す。図１３Ｂに示したように、術後８週間における、欠損した骨領域の多様な部分の組織学的なスコアは、ｈＭＳＣを運ぶＡＭＣＡ膜でインプラントされた骨において、より高かった。
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20. Aggeliki I. et al Macromolecules, 35 (7), 2506 -2513, 2002
【図１】
2012515014.tif 000006
【図２】
2012515014.tif 000007
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2012515014.tif 000012
【図８】
2012515014.tif 000013
【図９】
2012515014.tif 000014
【図１０】
2012515014.tif 000015
【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
2012515014.tif 000017
【図１２ＡＢ】
2012515014.tif 000018
【図１２ＣＤ】
2012515014.tif 000019
【図１３】
2012515014.tif 000020
【手続補正書】
【提出日】平成23年10月4日(2011.10.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種類の正に荷電した合成の疎水性ポリマーと、少なくとも１種類の親水性ポリマーと、３００〜２０，０００の範囲のポリエチレングリコールである少なくとも１種類の可塑剤とを含む膜であって、
柔軟性があり且つ細胞接着、細胞増殖及び細胞分化のうちの少なくとも１つを補助することのできる膜。
【請求項２】
少なくとも１種類の正に荷電した合成の疎水性ポリマーと、少なくとも１種類の親水性ポリマーと、少なくとも１種類の可塑剤とを含む膜であって、
−  前記正に荷電した合成の疎水性ポリマーが、アンモニオメタクリレートコポリマーＡ型ＮＦ（ＡＭＣＡ）であり、
−  前記可塑剤が、３００〜２０，０００の範囲のポリエチレングリコールであり、且つ
−  前記膜が、柔軟性があり且つ細胞接着、細胞増殖及び細胞分化のうちの少なくとも１つを補助することのできる、
膜。
【請求項３】
親水性ポリマー及び可塑剤の双方が、３００〜２０，０００の範囲のポリエチレングリコールである、請求項１又は２に記載の膜。
【請求項４】
親水性ポリマー及び可塑剤の双方がポリエチレングリコール４００である、請求項１〜３のいずれかに記載の膜。
【請求項５】
ポリエチレングリコール４００が、５％、１０％、１５％、２０％、又は２５％ｗ／ｗの濃度で存在する、請求項４のいずれかに記載の膜。
【請求項６】
少なくとも１種類の親水性ポリマーが、膜の１％（ｗ／ｗ）〜３０％（ｗ／ｗ）の間の濃度で存在する、請求項１〜４のいずれかに記載の膜。
【請求項７】
少なくとも１種類の細胞をさらに含む、請求項１〜６のいずれかに記載の膜。
【請求項８】
細胞が、成体幹細胞、胚性幹細胞、多能性幹細胞、間葉系幹細胞、臍帯血細胞、骨芽細胞、軟骨芽細胞及びＣＤ１０５＋細胞からなる群から選択される、請求項７に記載の膜。
【請求項９】
幹細胞が自己由来の成体幹細胞である、請求項８に記載の膜。
【請求項１０】
サイトカイン、ホルモン、ビスホスホネート、カンナビノイド、ベータ遮断薬、骨誘導剤、成長因子、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤、薬剤及び抗生物質からなる群から選択される少なくとも１種類の活性剤をさらに含む、請求項１〜９のいずれかに記載の膜。
【請求項１１】
活性剤が、スタチン、エストロゲン、アンドロゲン、プロプラノロール、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、インスリン様成長ホルモン、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、アレンドロネート、リセンドロネート及び副甲状腺ホルモンからなる群から選択される、請求項１０に記載の膜。
【請求項１２】
活性剤がシンバスタチン又はロバスタチンである、請求項１１に記載の膜。
【請求項１３】
水和によって多孔質となることができ、且つその孔径が０．１〜５ミクロンの間である、請求項１〜１２のいずれかに記載の膜。
【請求項１４】
欠損した組織領域の組織再生用の三次元中空インプラントであって、少なくとも１種類の正に荷電した合成の疎水性ポリマーと、少なくとも１種類の親水性ポリマーと、少なくとも１種類の可塑剤とを含み、柔軟性があり且つ細胞接着、細胞増殖及び細胞分化のうちの少なくとも１つを補助することのできる膜から調製され、
前記組織が、靭帯、腱、軟骨、椎間板、歯及び骨から選択される、三次元中空インプラント。
【請求項１５】
管状インプラント、円筒状インプラント、円錐状インプラント又は平面状インプラントからなる群から選択される、請求項１４に記載の三次元中空インプラント。
【国際調査報告】
2012515014.tif 000021
2012515014.tif 000022
2012515014.tif 000023