(57)【要約】  細胞侵入が可能である脂質粒子を使用して細胞コレステロールレベルを低下させる方法を提供する。そのような脂質粒子は、細胞コレステロールレベル増加に起因する又は細胞コレステロールレベル増加を随伴する疾患又は状態を処置又は予防するために、及びその複製を細胞コレステロールに依存するウイルスに起因する又は関連づけられる疾患又は状態を処置又は予防するために使用することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞侵入が可能な脂質粒子を含む組成物を、その必要がある被験体に投与することを含む、細胞コレステロールレベルを低下させる方法。
【請求項２】
前記脂質粒子が、少なくとも１つのホスファチジルエタノールアミン脂質又はその誘導体を含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記脂質粒子が、コレステリルヘミスクシナート脂質をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記脂質粒子が、ホスファチジルコリン脂質、ホスファチジルイノシトール脂質又はホスファチジルセリン脂質の少なくとも１つをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記脂質粒子が、ホスファチジルコリン脂質、ホスファチジルイノシトール脂質及びホスファチジルセリン脂質を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記脂質粒子が、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン脂質を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記脂質粒子が、ＰＥＧ−ＰＥ脂質を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記脂質粒子が、少なくとも１つの多不飽和脂質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記脂質粒子が、少なくとも１つの多不飽和ＰＥ脂質を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記不飽和ＰＥ脂質が、２２：６ ＰＥ脂質である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記脂質粒子が、少なくとも１つの多不飽和ＰＣ脂質を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記多不飽和ＰＥ脂質が、２２：６ ＰＣ脂質である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記脂質粒子が、２２：６ ＰＥ脂質、２２：６ ＰＣ脂質、ＰＩ脂質及びＰＳ脂質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記脂質粒子が、１８：１ ＰＥ脂質、１８：１ ＰＣ脂質、ＰＩ脂質及びＰＳ脂質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記被験体が、少なくとも１つの細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記投与前、前記少なくとも１つの細胞が、ウイルスに感染した少なくとも１つの細胞を含み、かつ、前記投与が、該感染細胞の感染能力を低下させる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ウイルスが、ＨＣＶウイルスである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記被験体が、温血動物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記被験体が、ヒトである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記投与が、細胞コレステロールレベル増加に起因する若しくは細胞コレステロールレベル増加を随伴する疾患又は状態の処置あるいは予防の少なくとも一方を生じさせる結果となる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記疾患又は状態が、アテローム性動脈硬化症又は冠動脈疾患である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記被験体が、免疫不全ウイルスに感染した被験体であり、かつ、前記アテローム性動脈硬化症又は冠動脈疾患が、免疫不全ウイルスに起因する又は関連づけられるものである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記投与が、複製を細胞内コレステロールに依存するウイルスに起因する若しくは関連づけられる疾患又は状態の処置あるいは予防を生じさせる結果となる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記ウイルスが、単純ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス、マウス白血病ウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオーマウイルス、エプスタイン・バーウイルス、セムリキ森林ウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、デングウイルス、麻疹ウイルス、ＨＩＶ、Ｃ型肝炎ウイルス及びＢ型肝炎ウイルスから選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記組成物が、前記脂質粒子内に封入された抗ウイルス薬をさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記投与が、皮下的に行われる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２７】
前記脂質粒子が、リポソームである、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００９年３月２７日出願の米国特許仮出願第６１／２０２，６９９号の優先権を主張するものであり、該仮出願は、その全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本出願は、一般に、治療薬としてそれら自体有用である又は薬物送達に使用することができる、脂質粒子、例えばリポソーム、薬物送達方法、及び特に、リポソームなどの脂質粒子を利用する薬物送達方法に関する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
細胞コレステロールレベルを低下させる方法は、細胞侵入が可能である脂質粒子、例えばリポソーム又はミセル、を含む組成物をその必要がある被験体に投与することを含む。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
【図１】ａ）メバロン酸経路及びイソプレノイド合成、並びにｂ）種々の細胞ターゲットに対する種々の治療薬の効果を示すものである。ＰＰ＝ピロリン酸、ＦＴＩ＝ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、ＧＧＴＩ＝ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ阻害剤、ＩＰＰ＝イソペンチルピロリン酸。
【図２】選択された脂質：Ａ）２２：６ ＰＥ、Ｂ）２２：６ ＰＣ、Ｃ）ＰＩ、Ｄ）ＰＳ、Ｅ）ＤＯＰＥ、Ｆ）ＣＨＥＭＳ、を図示するものである。
【図３】抗アクチン抗体と抗ＨＭＧＣＳ抗体の両方を使用する２２：６ ＥＲリポソーム処置、ＪＣ−１感染Ｈｕｈ７．５細胞（ＭＯＩ＝０．５）のウエスタンブロット分析の結果を提示するものである。
【図４】２２：６ ＰＥ：２２：６ ＰＣ：ＰＩ：ＰＳ処置、ＪＣ１感染Ｈｕｈ７．５細胞（ＭＯＩ＝０．５）からの遊離コレステロールと全コレステロールの両方についての定量結果を提示するものである。
【図５】２２：６リポソームで処置したＰＨＡ刺激ＰＢＭＣについての定量結果を提示するものである。
【図６】Ａ）１６日間の２２：６ ＥＲリポソームでのＪＣ−１感染Ｈｕｈ７．５細胞（ＭＯＩ＝０．０２）の処置に関するデータを提示するものであり、処置全体を通してのＨｕｈ７．５細胞におけるＪＣ−１  ＨＣＶｃｃ感染レベル。データは、２回の独立した実験から三重反復実験サンプルの平均を表す。  Ｂ）１６日間の２２：６ ＥＲリポソームでのＪＣ−１感染Ｈｕｈ７．５細胞（ＭＯＩ＝０．０２）の処置に関するデータを提示するものであり、ＪＣ−１  ＨＣＶｃｃ分泌。データは、２回の独立した実験から三重反復実験サンプルの平均を表す。  Ｃ）１６日間の２２：６ ＥＲリポソームでのＪＣ−１感染Ｈｕｈ７．５細胞（ＭＯＩ＝０．０２）の処置に関するデータを提示するものであり、分泌されたＪＣ−１  ＨＣＶｃｃ粒子の感染力。データは、２回の独立した実験から三重反復実験サンプルの平均を表す。  Ｄ）１６日間の２２：６ ＥＲリポソームでのＪＣ−１感染Ｈｕｈ７．５細胞（ＭＯＩ＝０．０２）の処置に関するデータを提示するものであり、細胞内の遊離コレステロールレベル。データは、２回の独立した実験から三重反復実験サンプルの平均を表す。  Ｅ）１６日間の２２：６ ＥＲリポソームでのＪＣ−１感染Ｈｕｈ７．５細胞（ＭＯＩ＝０．０２）の処置に関するデータを提示するものであり、細胞内のエステル化コレステロール。データは、２回の独立した実験から三重反復実験サンプルの平均を表す。
【図７】外因性コレステロール（１５μｇ／ｍＬ及び１５０μｇ／ｍＬのコレステロールの最終濃度）で処置した、２２：６ ＥＲリポソーム処置、ＰＥＧ化 ２２：６ ＥＲリポソーム処置及び未処置ＪＣ−１  ＨＣＶｃｃについての感染力データを提示するものである。
【図８】ＪＣ−１  ＨＣＶｃｃでの感染（ＭＯＩ−０．５）前、４日間、２２．６ ＥＲリポソームで処置した未感染Ｈｕｈ７．５細胞についての定量結果を提示するものである。
【図９】Ａ）２２：６ ＥＲリポソームでの４日の処置中のＨＩＶ−１の３つの遺伝的に異なる初代分離株（ＬＡＩ、９３ＵＧ０６７、及び９３ＲＷ０２４）の平均分泌を示すものである。  Ｂ）２２：６ ＥＲリポソーム処置ＰＢＭＣから分泌されたＨＩＶ−１の感染力を示すものである。
【図１０】無血清完全ＤＭＥＭ中で２４時間、リポタンパク質受容体の発現をアップレギュレート及びダウンレギュレートするために使用した薬物（それぞれＳＱ及び２５ＨＣ）の存在下でインキュベートした未感染Ｈｕｈ７．５細胞についての実験の結果を示すものである。
【図１１】Ｈｕｈ７．５細胞の１時間感染中のＨＣＶｃｃウイルスストックへの２２：６ ｐｕＥＲリポソームの添加についての実験結果を示すものである。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
用語の定義
特に別の指定がない限り、「ａ」又は「ａｎ」は、「１つ又はそれ以上」を意味する。
本明細書において用いる場合、用語「ウイルス感染（症）」は、ウイルスが健常細胞に侵入し、その細胞の再生機構を用いて増殖又は複製し、最終的に細胞を溶解し、その結果、細胞を死滅させ、ウイルス粒子を放出させ、及び新たに生産された後代ウイルスによる他の細胞の感染を生じさせる病態を記述するものである。一定の細胞による潜伏感染も、ウイルス感染の起こりうる結果である。
【０００６】
本明細書において用いる場合、用語「ウイルス感染（症）を処置又は予防すること」は、特定のウイルスの複製を阻害すること、ウイルス伝播を阻害すること、又はウイルスのその宿主におけるそれ自体の樹立を予防すること、及びウイルス感染に起因する疾患の症状を改善若しくは緩和することを意味する。ウイルス負荷量の低減、死亡率及び／又は罹患率の減少がある場合、その処置は治療的とみなされる。
【０００７】
用語「治療薬」は、生理的状態、例えばウイルス感染又はそれに起因する疾患、の処置を支援することができる薬剤、例えば分子又は化合物、を指す。
【０００８】
用語「リポソーム」は、通常は球状二重層構造である、二重層構造の脂質を含む粒子と定義することができる。用語「リポソーム」は、一枚膜リポソームと多重層リポソームの両方を包含する。本明細書において論ずるリポソームは、以下の略語によって表される１つ又はそれ以上の脂質を含むことがある：
ＣＨＥＭＳは、コレステリルヘミスクシナート脂質を表す。
ＤＯＰＥは、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン脂質を表す。
ＤＯＰＣは、ジオレオイルホスファチジルコリン脂質を表す。
ＰＥは、ホスファチジルエタノールアミン脂質又はその誘導体を表す。
ＰＥＧ−ＰＥは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とコンジュゲートしているＰＥ脂質を表す。ＰＥＧ−ＰＥの一例は、ポリエチレングリコール−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン脂質である。ＰＥＧのＰＥＧ成分の分子量は、様々であり得る。
Ｒｈ−ＰＥは、リサミンローダミンＢ−ホスファチジルエタノールアミン脂質を表す。
ＭＣＣ−ＰＥは、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［４−（ｐ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−カルボキサミド］脂質を表す。
ＰＩは、ホスファチジルイノシトール脂質を表す。
ＰＳは、ホスファチジルセリン脂質を表す。
用語「細胞内送達」は、リポソームから任意の細胞内区画への封入材料の送達を指す場合がある。
ＩＣ５０又はＩＣ９０（阻害濃度５０又は９０）は、それぞれ、ウイルス感染の５０％又は９０％低下を達成するために使用される治療薬の濃度を指す場合がある。
ＰＢＭＣは、末梢血単核細胞を表す。
ｓＣＤ４は、可溶性ＣＤ４分子を表す。「可溶性ＣＤ４」又は「ｓＣＤ４」又は「Ｄ１Ｄ２」は、通常の当業者に理解されているように、水溶液の状態である、及びＨＩＶ  Ｅｎｖの配座の変更により天然膜固着ＣＤ４の活性を模倣することができる、ＣＤ４分子、又はそのフラグメントを意図したものである。可溶性ＣＤ４の一例は、例えば、Salzwedel et al. J. Virol. 74:326 333, 2000 に記載されている２ドメイン可溶性ＣＤ４（ｓＣＤ４又はＤ１Ｄ２）である。
ＭＡｂは、モノクローナル抗体を表す。
ＤＮＪは、デオキシノジリマイシンを示す。
ＮＢ−ＤＮＪは、Ｎ−ブチルデオキシノジリマイシンを示す。
ＮＮ−ＤＮＪは、Ｎ−ノニルデオキシノジリマイシンを示す。
ＢＶＤＶは、ウシウイルス性下痢ウイルスを表す。
ＨＢＶは、Ｂ型肝炎ウイルスを表す。
ＨＣＶは、Ｃ型肝炎ウイルスを表す。
ＨＩＶは、ヒト免疫不全ウイルスを表す。
Ｎｃｐは、非細胞変性の、を表す。
Ｃｐは、細胞変性の、を表す。
ＥＲは、小胞体を表す。
ＣＨＯは、チャイニーズハムスター卵巣細胞を表す。
ＭＤＢＫは、メイディン・ダービー（Madin-Darby）ウシ腎細胞を表す。
ＰＣＲは、ポリメラーゼ連鎖反応を表す。
ＦＯＳは、遊離オリゴ糖を表す。
ＨＰＬＣは、高性能液体クロマトグラフィーを表す。
ＰＨＡは、フィトヘムアグルチニンを表す。
ＦＢＳは、ウシ胎仔血清を表す。
ＴＣＩＤ５０は、５０％組織培養感染用量を表す。
ＥＬＩＳＡは、酵素結合免疫吸着検定法を表す。
ＩｇＧは、免疫グロブリンを表す。
ＤＡＰＩは、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールを表す。
ＰＢＳは、リン酸緩衝食塩水を表す。
ＬＤは、脂肪滴を表す。
ＮＳは、非構造の、を表す。
「ＭＯＩ」は、感染の多重度を指す。
ＤＭＥＭは、ダルベッコ変性イーグル培地を指す。
【０００９】
関連文献
本開示は、参照により米国特許公開第２００８０１３８３５１号、同第２００９０２５２７８５号、及び同第２００３０１２４１６０号を全面的に組み込む。
【００１０】
マクロファージ及びコレステロール代謝：
肝細胞を除く他の細胞と同様に、マクロファージは、はっきり認識できるいかなる程度にもコレステロールを分解することができない。従って、細胞コレステロール含有量は、本質的にコレステロール取込みとコレステロール流出の間のバランスであり得る。細胞へのコレステロール送達の２つの主要メカニズムは、血漿低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の受容体媒介取込み、及び細胞内コレステロール生合成であり得る。コレステロール送達のこれら２つの主要径路のそれぞれが、コレステロール欠乏の場合に細胞の要求を完全に満たすことができ、及び両方が高度に調節され得る（Brown and Goldstein 1999、完全な引用文献については下のセクション「参考文献」を参照のこと）。しかし、炎症などの一部の病態生理学的状態では、高血漿ＬＤＬ濃度及び酸化ストレスが、修飾された、主として酸化された、ＬＤＬの形成をもたらすことがある（Steinberg, Parthasarathy et al. 1989）。修飾ＬＤＬは、マクロファージをはじめとする幾つかの細胞タイプにおいて発現されるスカベンジャー受容体（ＳＲ）と相互作用することができる。修飾リポタンパク質の取込みは、細胞コレステロールの含有量に応じて調節されず、マクロファージへの過剰なコレステロールの無制御送達を生じさせる結果となることがある（Hajjar and Haberland 1997、Dhaliwal and Steinbrecher 2000）。コレステロール流出増加により補償されないと、これは、コレステロールの蓄積及び脂質沈着泡沫細胞の形成、その後の動脈壁における脂肪条痕の発生（アテローム性動脈硬化症の進行の最初期段階）につながることがある。コレステロール沈着マクロファージは、アテローム性動脈硬化症の病理発生の他の事象、例えば炎症の永続化、平滑筋細胞の表現型修飾、及び細胞外マトリックスタンパク質の過剰生産、の引き金になる可能性も高いだろう（Lusis 2000）。コレステロール生合成及びＬＤＬ受容体発現をダウンレギュレートすることにより、コレステロールの過剰量を補償することができる。しかし、ＬＤＬ取込み及びコレステロール合成を減少させることにより修飾ＬＤＬによって送達されるコレステロールの重度の過剰量を補償する細胞の能力は制限されることがある。遊離コレステロールの過剰量を補償する２つの他のメカニズムは、コレステリルエステルの合成及びコレステロール流出であり得る。コレステリルエステル合成は一時的な緩和をもたらすことができるが、コレステリルエステルの連続生産は、細胞内脂肪滴の過剰蓄積につながることがある。コレステロールのマクロファージへの過剰負荷は、それらのアポトーシス及び壊死につながることがあり、それが後期アテローム性動脈硬化プラークの壊死及び石灰化コアの一因となる（Tabas 2002、Tabas 2002）。
【００１１】
細胞におけるコレステロール生合成のためのメバロン酸経路：
メバロン酸−イソプレノイド経路における第一段階は、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ（ＨＭＧＣＳ）の作用によるアセチル−ＣｏＡからのアセトアセチルＣｏＡ経由での３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル（ＨＭＧ）−ＣｏＡの合成を含む。ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧＣＲ）（自然界で最も高度に調節される酵素の１つ）は、ＨＭＧ−ＣｏＡのメバロン酸への変換を触媒することができる（Goldstein and Brown 1990）。スタチン及びビスホスホネートによるメバロン酸経路及び下流イソプレノイド生合成経路の合理的な治療操作が徹底的に研究され、様々な疾患における興味深い及び画期的な選択肢であることが判明した（Buhaescu and Izzedine 2007）。図１は、メバロン酸経路及びイソプレノイド生合成を提示するものである。一定の重量な治療薬のそれらの種々の細胞ターゲットに対する効果も表す。
【００１２】
コレステロール及びウイルス複製：
多数のウイルスは、それらの複製をコレステロールに依存し得る。そのようなウイルスとしては、ヘルペスウイルス科に属するウイルス、例えば、ＨＳＶ  １又はＨＳＶ  ２ウイルスであり得る単純ヘルペスウイルス（例えばItzhaki and Wozniak 2006参照）、及びエプスタイン・バーウイルス（例えば、Katzman and Longnecker 2003参照）；オルトミクソウイルス科に属するウイルス、例えば、インフルエンザウイルスＡ，インフルエンザウイルスＢ又はインフルエンザウイルスＣであり得るインフルエンザウイルス（例えば、Sun and Whittaker 2003参照）；レトロウイルス、例えば、マウス白血病ウイルス（例えば、Beer, Pedersen et al. 2005参照）、及びＨＩＶ  １又はＨＩＶ  ２ウイルスであり得るヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）（例えば、Manes, del Real et al. 2000、Campbell, Crowe et al. 2001参照）；ポックスウイルス科に属するウイルス、例えばワクシニアウイルス（例えば、Chung, Huang et al. 2005参照）；ポリオーマウイルス（例えば、Kaur, Gopalakrishna et al. 2004参照）；トガウイルス科に属するウイルス、例えばセムリキ森林ウイルス（例えば、Chatterjee, Eng et al. 2002参照）、フィロウイルス科に属するウイルス、例えばエボラウイルス（例えば、Empig and Goldsmith 2002参照）及びマールブルグウイルス（例えば、Bavari, Bosio et al. 2002参照）；フラビウイルス属に属するウイルス、例えばデングウイルス（例えば、Reyes-del Valle, Chavez-Salinas et al. 2005参照）、及びヘパシウイルス属に属するウイルス、例えばＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）（例えば、Aizaki, Morikawa et al. 2008参照）、を含む、フラビウイルス科に属するウイルス；パラミクソウイルス科に属するウイルス、例えば麻疹ウイルス（例えば、Manie, Debreyne et al. 2000参照）；並びにヘパドナウイルス科に属するウイルス、例えばＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）（例えば、Bremer, Bung et al. 2009参照）が挙げられるが、これらに限定されない。これらのウイルスのすべてが、マクロファージを感染させることができるとは限らず、このことは、コレステロール要求が、特定の細胞タイプの感染に限定されないことを示している。コレステロールが、エンベロープウイルスの膜の重要な成分であり得ることが広く認知されているにもかかわらず、驚くべきことに、何故及びどのようにコレステロールがウイルス複製に関与するのかについては殆ど知られていない。ウイルス複製におけるコレステロールの役割についての知識の大部分は、脂質ラフト（原形質膜のスフィンゴ脂質及びコレステロールに富むミクロドメイン）の機能に限定され得る。幾つかのエンベロープウイルス、例えばＨＩＶ（Campbell, Crowe et al. 2001）、エボラ及びマールブルグウイルス（Bavari, Bosio et al. 2002）、麻疹ウイルス（Vincent, Gerlier et al. 2000）及びインフルエンザウイルス（Scheiffele, Rietveld et al. 1999、Leser and Lamb 2005）、は、ウイルス構築のためのプラットフォームとしてラフト様ドメインを使用する場合がある。脂質ラフトは、ヘムアグルチニンが脂質ラフト内に集中しているという発見に基づき、インフルエンザウイルスについて提案されているように、ウイルス感染中に侵入点として用いられることもある（Takeda, Leser et al. 2003）。
【００１３】
ＨＩＶに対するコレステロール枯渇の効果：
ＨＩＶ複製に対するコレステロール枯渇の効果は、細胞コレステロール含有量及び／又はコレステロール生合成速度の変化に応じての細胞代謝の多彩な変化の結果として生ずる、間接的なものである場合もある。例えば、スタチンによるコレステロール生合成の阻害は、タンパク質プレニル化に関与するものを含めて、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの上流のすべての中間体の定常濃度を低下させ得る（Buhaescu and Izzedine 2007）。小型Ｇタンパク質のプレニル化の低下は、Ｒｈｏ−グアノシントリホスファターゼ（ＧＴＰａｓｅ）及びＲｈｏ−Ａ活性化の阻害をもたらし、その結果、ウイルス侵入低減が生ずることがある（del Real, Jimenez-Baranda et al. 2004）。加えて、スタチンは、コレステロール生合成に対するそれらの効果とは無関係に、ＨＩＶ感染を低減することができる多面発現性有益効果を有することがある。これらの効果は、接着分子の発現（Jain and Ridker 2005）又は内皮細胞及び白血球上での受容体−リガンドペア、例えばＩＣＡＭ−１とＬＦＡ−１、の相互作用（Nishibori, K. Takahashi et al. 2003）を阻害するスタチンの能力の結果として生ずる抗炎症特性を含むことがある。スタチンによるＩＣＡＭ−１とＬＦＡ−１の相互作用の阻害は、細胞へのＨＩＶ付着を減少させることができる（Giguere and Tremblay 2004）。ＨＩＶのライフサイクルにおけるコレステロールの役割は多くの研究により調査されている。宿主細胞からのＨＩＶ−１発芽が脂質ラフトで発生し、その結果、高いウイルスエンベロープのコレステロール：リン脂質モル比（＞１．０）が生ずる（Aloia, Tian et al. 1993、Nguyen and Hildreth 2000）。ラフトに対するこの親和性は、これらの膜ドメインと特異的に会合することができるＧａｇ前駆体によって決定され得る（Ono and Freed 2001、Ding, Derdowski et al. 2003、Holm, Weclewicz et al. 2003）。脂質−ラフト結合は、ＧａｇのＮ末端により媒介され得、Ｇａｇ−Ｇａｇ相互作用ドメインによって大きく強化され得る。細胞コレステロールの枯渇及びラフト数の減少は、顕著に及び特異的にＨＩＶ−１粒子生産を低下させ得る（Ono and Freed 2001）。
【００１４】
上で説明したＨＩＶ侵入に対するコレステロール低下薬の間接的効果に加えて、ＨＩＶについての侵入点としての脂質ラフトの役割が、幾つかの研究により提案されている。このモデルは、ＨＩＶ侵入部位でのＣＤ４（ＨＩＶ細胞受容体）とケモカイン受容体の共キャッピング（cocapping）現象に依存し（Alfano, Schmidtmayerova et al. 1999）、これもまたコレステロールに依存し得る（Nguyen, Giri et al. 2005）。Ｖｉａｒｄらによる研究（Viard, Parolini et al. 2002）は、コレステロール枯渇細胞が、ウイルス細胞融合に必要なＣＤ４及びＣＸＣＲ４（又はＣＣＲ５）のクラスターを形成できないことがあることを立証した。同様の観察がＭａｎｅｓら（Manes, del Real et al. 2000）によって報告されており、彼らは、ラフト会合ケモカイン受容体と共にＣＤ４−ｇｐ１２０複合体に結合する、ラフトのｇｐ１２０誘導 側方再構成（lateral reorganization）についての役割を提案した。しかし、後の報告により、ＣＤ４及びケモカイン受容体とラフトの会合が、ＨＩＶ感染に必要でないことがあることが立証された（Percherancier, Lagane et al. 2003、Popik and Alce 2004）。これらの発見の通常の予告記載は、それらの多くを、ＨＩＶ受容体を過剰発現する細胞を使用して行ったということであろう。そのような細胞は、初代細胞へのＨＩＶ侵入に必要不可欠であり得るケモカイン受容体からのシグナリングについて以前に立証されているように、多くの場合、初代細胞とは別様に挙動し得る（Alfano, Schmidtmayerova et al. 1999）。これらすべての論文が同意していることは、ターゲット細胞膜内のコレステロールに対するＨＩＶ侵入の依存性である。コレステロールの枯渇が、ラフト会合及びラフト排除ＣＤ４により媒介されるＨＩＶ侵入を阻害した（Popik and Alce 2004）からである。
【００１５】
ＨＩＶビリオンの感染力にとってのコレステロールの重要性は、ＭβＣＤなどのコレステロール捕捉薬でのＨＩＶ粒子の処置がウイルスを細胞侵入について無能にした実験により立証された（Campbell, Crowe et al. 2002、Guyader, Kiyokawa et al. 2002）。コレステロール枯渇ＨＩＶ−１ビリオンは、ビリオン脂質二重層の破壊を示すことができ（Campbell, Crowe et al. 2002）、しかも尚、正常なｇｐ１２０  Ｅｎｖレベルを呈示することができる（Guyader, Kiyokawa et al. 2002）。１つの研究は、ＭβＣＤがウイルス膜を透過性にし、その結果、Ｅｎｖ糖タンパク質の喪失を伴わずに成熟Ｇａｇタンパク質（カプシドマトリックス、及びｐ６）の喪失を生じさせることができることを立証した（Graham, Chertova et al. 2003）。電子顕微鏡により、コレステロール枯渇ビリオンのウイルス膜内の穴、及びウイルスコア構造の摂動が明らかにされた（Graham, Chertova et al. 2003）。
【００１６】
ＨＩＶ及びアテローム性動脈硬化症
ＨＩＶ感染は、アテローム性動脈硬化症の発現のリスクの増加（Hsue, Lo et al. 2004、van Wijk, de Koning et al. 2006）及び冠動脈疾患（ＣＡＤ）のリスクの少なくとも３倍増加（Hsue and Waters 2005）を一貫して随伴し得る。この随伴は、以前は、もっぱら抗レトロウイルス療法の有害作用によるものとされていた。コレステロール代謝の多くの変化、例えば、ＬＤＬの上昇（El-Sadr, Mullin et al. 2005）及びＣＤ３６発現の誘導によるコレステロール取込み量増加（Allred, Smart et al. 2006）、は、抗レトロウイルス療法に起因し得る可能性が高い（Carpentier, Patterson et al. 2005）が、コレステロール代謝の変化への療法及びＨＩＶ感染それ自体の相対的寄与は、まだ確定されていない。予備的研究により、ＨＩＶ感染それ自体がＣＡＤのリスク増加に重要な役割を果たし得ることが指摘されることがある。ＨＩＶは、マクロファージを感染させ、これらの細胞内の逆コレステロール輸送を損なわせることがある。
【００１７】
マクロファージからのコレステロール流出の機能障害は、細胞内コレステロールの蓄積（Feng and Tabas 2002）並びに動物モデル（Aiello, Brees et al. 2002）及びヒト（Oram 2000）におけるアテローム性動脈硬化症の発現につながることがある。このプロセスは、脂質代謝異常を随伴するとき、特に迅速であり得る。抗レトロウイルス療法に起因する脂質代謝異常を随伴するとき、ＨＩＶへのマクロファージの感染は、マクロファージ内のコレステロールの蓄積、及びアテローム性動脈硬化症の迅速な発現を引き起こすことがあることが示唆され得る。
【００１８】
細胞コレステロール及びＨＣＶ：
ＨＣＶ感染は、哺乳動物コレステロール恒常性に極めて重大な役割を果たし得る、肝細胞に主として限定される（Chisari 2005）。コレステロールに富む原形質膜マイクロドメイン（すなわち脂質ラフト）への局在が、ＣＤ８１（Soldaini, Wack et al. 2003、Cherukuri, Shoham et al. 2004）及びＳＲ−ＢＩ（Rhainds, Bourgeois et al. 2004）（細胞へのＨＣＶ侵入に必要な２つの細胞受容体）の両方について立証されている。ＳＲ-ＢＩは、カベオラと呼ばれるコレステロールに富む原形質膜マイクロドメインと会合することができる（Babitt, Trigatti et al. 1997、Graf, Connell et al. 1999）。ＣＤ８１は、コレステロールと物理的に相互作用することが立証されている（Charrin, Manie et al. 2003）。細胞コレステロールに対するＨＣＶ感染の依存性は、現在、不明であるが、リポソームとのＨＣＶｐｐ融合は、ターゲット膜中のコレステロールの存在により強化され得る（Lavillette, Bartosch et al. 2006）。これらのデータは、原形質膜コレステロールがＨＣＶ侵入に必要とされ得ることを強く示唆し得る。ＨＣＶ感染が、ＣＤ８１とＳＲ−ＢＩとの協同的相互作用に依存し得ること、並びに細胞コレステロール含有量が、ことによるとＣＤ８１の細胞表面発現及び局在を調節することにより、ＨＣＶ侵入に対して有意な影響を及ぼし得ることは、立証されている（Kapadia, Barth et al. 2007）。
【００１９】
最近の研究により、ＨＣＶ感染及びビリオン成熟におけるコレステロール及びスフィンゴ脂質についての重要な役割が証明された。具体的に言うと、成熟ＨＣＶ粒子は、コレステロールが豊富であり得る（Aizaki, Morikawa et al. 2008）。ビリオン会合ＳＭのＨＣＶからの枯渇又は加水分解は、結果として感染力の喪失を生じさせる（Aizaki, Morikawa et al. 2008）。さらに、外因性コレステロールの追加は、感染力を回復させ得る。加えて、構造タンパク質の部分部分が、細胞内の脂質ラフト様膜構造に局在化される場合がある（Aizaki, Lee et al. 2004）。
【００２０】
開示
本発明者らは、脂質粒子であって、細胞侵入及び／又はその粒子の内部に封入された材料の細胞内送達が可能であり得る脂質粒子、例えばリポソーム、が、この経路に関与する第一の酵素の１つ、ＨＭＧＣＳ、をダウンレギュレートすることにより、コレステロール生合成を阻害することができることを発見した。
【００２１】
一部の実施形態において、前記脂質粒子は、少なくとも１つのＰＥ脂質及び／又はその誘導体を含有することがある。誘導体ＰＥ脂質の例としては、ＤＯＰＥ及びコンジュゲート化ＰＥ脂質が挙げられる。コンジュゲート化ＰＥ脂質としては、ポリエチレングリコールなどの親水性ポリマーとコンジュゲートしているＰＥ脂質、及び蛍光標識などの標識とコンジュゲートしているＰＥ脂質を挙げることができる。前記ＰＥ脂質は、モノ飽和されていることもあり、又は多飽和されていることもある。
【００２２】
一部の実施形態において、前記脂質粒子は、１つ又はそれ以上のＰＩ、ＰＳ、ＰＣ及びＣＨＥＭＳ脂質（これらのそれぞれが、モノ飽和されていることもあり、又は多飽和されていることもある）を含むことがある。
一部の実施形態において、前記脂質粒子は、ポリエチレングリコールなどの親水性ポリマーとコンジュゲートしている１つ又はそれ以上の脂質を含有することがある。前記親水性ポリマーの分子量は、様々であり得る。コンジュゲート化親水性ポリマーの使用は、脂質粒子のインビボ安定性及び循環時間を増すことができる。
【００２３】
一部の実施形態において、コレステロール阻害が可能である前記脂質粒子は、ＰＥ脂質及び／又はそれらの誘導体並びにＣＨＥＭＳ脂質を含有する脂質粒子、例えば、米国特許公開第２００８０１３８３５１号に開示されているｐＨ感受性リポソーム、であることがある。例えば、そのような脂質粒子は、モル比６：４若しくは６：３を有するＤＯＰＥ−ＣＨＥＭＳリポソーム、又はモル比６：３：０．１を有するＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ：ＰＥＧ−ＰＥである場合がある。
【００２４】
一部の実施形態において、コレステロール阻害が可能である脂質粒子は、ＰＥ脂質及び／又はそれらの誘導体並びにＰＩ及び／又はＰＳ脂質を含有する、脂質粒子であることがある。そのような脂質粒子の例としては、２００９年３月２５日に出願された米国特許出願第１２／４１０，７５０号に開示されているＥＲターゲッティングリポソームが挙げられる。一部の実施形態において、前記脂肪粒子は、ＰＥ、ＰＩ、ＰＳ及びＰＣ脂質（これらのそれぞれが、モノ飽和されていることもあり、又は多飽和されていることもある）を含む脂質粒子であることがある。
【００２５】
一部の実施形態において、コレステロール阻害が可能である脂質粒子は、多不飽和脂質粒子、すなわち、少なくとも１つの多不飽和脂質を含む脂質粒子、であることがある。本明細書において用いる場合、用語「多不飽和脂質」は、１つより多くの不飽和化学結合、例えば二重又は三重結合、をその疎水性テールに含有する脂質を指す。一部の実施形態において、多不飽和脂質は、２から８個又は３から７個又は４から６個の二重結合をその疎水性テール内に有する場合がある。多不飽和脂質粒子は、米国特許公開第２００９０２５２７８５号に開示されている。多不飽和脂質の例は、米国特許公開第２００９０２５２７８５号の図２Ａ〜Ｂ並びに図２２Ａ〜Ｄに提示されている。
【００２６】
ターゲッティング部分
一部の実施形態において、脂質粒子を含む組成物は、脂質粒子とコンジュゲートすることができる又は該粒子の脂質層若しくは二重層に介在させることができる、少なくとも１つのターゲッティング部分を含むことができる。一部の実施形態において、前記ターゲッティング部分は、ウイルスのエンベロープタンパク質のリガンドであることがある、リガンドであることがあり、又はウイルスのエンベロープタンパク質に対する抗体であることがある、抗体であることがある。そのような部分は、ウイルスに感染した細胞への粒子のターゲッティングに使用することができる。そのようなターゲッティング部分は、ウイルスに関連づけられる又は起因するウイルス感染症に対する免疫の殺菌を果たすために使用することもできる。一部の実施形態において、前記ターゲッティング部分は、ｇｐ１２０／ｇｐ４１ターゲッティング部分を含むことがある。そのような場合、前記脂質粒子を含む組成物は、ＨＩＶ−１感染の処置及び／又は予防に好ましいことがある。ｇｐ１２０／ｐｇ４１ターゲッティング部分は、ｓＣＤ４分子又はモノクローナル抗体、例えばＩｇＧ  ２Ｆ５若しくはＩｇＧ  ｂ１２抗体、を含む場合がある。一部の実施形態において、前記ターゲッティング部分は、Ｅ１又はＥ２ターゲッティング部分、例えばＨＣＶからのＥ１又はＥ２タンパク質、を含む場合がある。そのような場合、前記脂質粒子を含む組成物は、ＨＣＶ感染の処置及び／又は予防に好ましいことがある。一部の場合、ターゲッティング部分は、Ｅ１及び／又はＥ２タンパク質をターゲッティングすることができる分子、例えばこれらのタンパク質に対する特異的抗体、並びに細胞受容体の可溶性部分、例えば可溶性ＣＤ８１又はＳＲ−ＢＩ分子であることもある。
【００２７】
活性薬剤
一部の実施形態では、少なくとも１つの薬剤、例えば治療薬又はイメージング剤、を脂質粒子内に封入することができる。そのような薬剤は、例えば、水溶性分子、ペプチド又はアミノ酸であることがある。
【００２８】
一部の実施形態において、脂質粒子内に封入される薬剤は、α−グルコシダーゼ阻害剤である場合がある。一部の実施形態において、前記α−グルコシダーゼ阻害剤は、ＥＲα−グルコシダーゼＩ阻害剤又はＥＲα−グルコシダーゼＩＩ阻害剤であることがある、ＥＲα−グルコシダーゼ阻害剤である場合がある。一般に、そのウイルスエンベロープ糖タンパク質の正しいフォールディングをカルネキシン及び／又はカルレティキュリンとの相互作用に依存するいずれのウイルスも、ＥＲα−グルコシダーゼ阻害剤でターゲッティングすることができる。
【００２９】
アルファ−グルコシダーゼ阻害剤は、宿主アルファ−グルコシダーゼ酵素活性を、該薬剤の不在下での該アルファ−グルコシダーゼの酵素活性と比較して少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、若しくは少なくとも約９０％、又はそれ以上阻害する薬剤であることがある。用語「アルファ−グルコシダーゼ阻害剤」は、宿主アルファ−グルコシダーゼ活性を阻害する、自然に存在する薬剤と合成薬剤の両方を包含する。
【００３０】
適するアルファ−グルコシダーゼ阻害剤としては、デオキシノジリマイシン及びＮ−置換デオキシノジリマイシン、例えば、式Ｉの化合物：
【化１】
2012521981.tif 000003
（式中、Ｒ１は、置換又は非置換アルキル基（これらは、分岐アルキル基である場合もあり、又は直鎖アルキル基で場合もある）、置換又は非置換シクロアルキル基、置換又は非置換アリール基、置換又は非置換オキサアルキル基、置換又は非置換アリールアルキル、シクロアルキルアルキルから選択され、並びにＷ、Ｘ、Ｙ及びＺは、それぞれ独立して、水素、アルカノイル基、アロイル基、及びハロアルカノイル基から選択される）
及びそれらの医薬的に許容される塩、を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００３１】
一部の実施形態では、Ｒ１をＣ１−Ｃ２０アルキル基又はＣ３−Ｃ１２アルキル基から選択することができる。一部の実施形態では、Ｒ１をエチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ネオペンチル、イソペンチル、ｎ−ヘキシル、ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニル及びｎ−デシルから選択することができる。一部の実施形態において、Ｒ１は、ブチル又はノニルである場合がある。
【００３２】
一部の実施形態において、Ｒ１は、１から５個又は１から３個又は１から２個の酸素原子も含有し得る、Ｃ１−Ｃ２０アルキル基又はＣ３−Ｃ１２アルキル基である場合がある、オキサアルキル（oxalkyl）である場合がある。オキサアルキル（oxalkyl）基の例としては、−（ＣＨ２）２Ｏ（ＣＨ２）５ＣＨ３、−（ＣＨ２）２Ｏ（ＣＨ２）６ＣＨ３、−（ＣＨ２）６ＯＣＨ２ＣＨ３、及び−（ＣＨ２）２ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３が挙げられる。
【００３３】
一部の実施形態において、Ｒ１は、アリールアルキル基である場合がある。アリールアルキル基の例としては、Ｃ１−Ｃ１２−Ｐｈ基、例えばＣ３−Ｐｈ、Ｃ４−Ｐｈ、Ｃ５−Ｐｈ、Ｃ６−Ｐｈ及びＣ７−Ｐｈ、が挙げられる。
一部の実施形態において、前記式Ｉの化合物は、Ｎ−（ｎ−ヘキシル−）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール；Ｎ−（ｎ−ヘプチル−）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール；Ｎ−（ｎ−オクチル−）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール；Ｎ−（ｎ−オクチル−）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール，テトラブチラート；Ｎ−（ｎ−ノニル−）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール，テトラブチラート；Ｎ−（ｎ−デシル−）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール，テトラブチラート；Ｎ−（ｎ−ウンデシル−）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール，テトラブチラート；Ｎ−（ｎ−ノニル−）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール；Ｎ−（ｎ−デシル−）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール；Ｎ−（ｎ−ウンデシル−）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール；Ｎ−（ｎ−ドデシル−）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール；Ｎ−（２−エチルヘキシル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール；Ｎ−（４−エチルヘキシル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール；Ｎ−（５−メチルヘキシル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール；Ｎ−（３−プロピルヘキシル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール；Ｎ−（１−ペンチルペンチルヘキシル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール；Ｎ−（１−ブチルブチル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール；Ｎ−（７−メチルオクチル−）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール；Ｎ−（８−メチルノニル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール；Ｎ−（９−メチルデシル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール；Ｎ−（１０−メチルウンデシル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール；Ｎ−（６−シクロヘキシルヘキシル−）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール；Ｎ−（４−シクロヘキシルブチル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール；Ｎ−（２−シクロヘキシルエチル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール；Ｎ−（１−シクロヘキシルメチル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール；Ｎ−（１−フェニルメチル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール；Ｎ−（３−フェニルプロピル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール；Ｎ−（３−（４−メチル）−フェニルプロピル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール；Ｎ−（６−フェニルヘキシル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール；Ｎ−（ｎ−ノニル−）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール，テトラブチラート；Ｎ−（ｎ−デシル−）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール，テトラブチラート；Ｎ−（ｎ−ウンデシル−）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール，テトラブチラート；Ｎ−（ｎ−ドデシル−）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール，テトラブチラート；Ｎ−（２−エチルヘキシル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール，テトラブチラート；Ｎ−（４−エチルヘキシル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール，テトラブチラート；Ｎ−（５−メチルヘキシル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール，テトラブチラート；Ｎ−（３−プロピルヘキシル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール，テトラブチラート；Ｎ−（１−ペンチルペンチルヘキシル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール，テトラブチラート；Ｎ−（１−ブチルブチル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール，テトラブチラート；Ｎ−（７−メチルオクチル−）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール，テトラブチラート；Ｎ−（８−メチルノニル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール，テトラブチラート；Ｎ−（９−メチルデシル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール，テトラブチラート；Ｎ−（１０−メチルウンデシル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール，テトラブチラート；Ｎ−（６−シクロヘキシルヘキシル−）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール，テトラブチラート；Ｎ−（４−シクロヘキシルブチル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール，テトラブチラート；Ｎ−（２−シクロヘキシルエチル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール，テトラブチラート；Ｎ−（１−シクロヘキシルメチル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール，テトラブチラート；Ｎ−（１−フェニルメチル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール，テトラブチラート；Ｎ−（３−フェニルプロピル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール，テトラブチラート；Ｎ−（３−（４−メチル）−フェニルプロピル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール，テトラブチラート；Ｎ−（６−フェニルヘキシル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール，テトラブチラート；それらの医薬的に許容される塩；及びそれらの任意の２つ又はそれ以上の混合物から選択することができるが、それらに限定されない。Ｎ−置換デオキシノジリマイシンが有効であり得る疾患及び状態は、米国特許第４，８４９，４３０号、同第４，８７６，２６８号、同第５，４１１，９７０号、同第５，４７２，９６９号、同第５，６４３，８８８号、同第６，２２５，３２５号、同第６，４６５，４８７号、同第６，４６５，４８８号、同第６，５１５，０２８号、同第６，６８９，７５９号、同第６，８０９，０８３号、同第６，５８３，１５８号、同第６５８９，９６４号、同第６，５９９，９１９号、同第６，９１６，８２９号、同第７，１４１，５８２号；米国特許出願第１２／６５６，９９３号（２０１０年２月２２日出願）、同第１２／６５６，９９２号（２０１０年２月２２日出願）；米国特許仮出願第６１／２８２，５０７号（２０１０年２月２２日出願）、同第６１／２７２，２５３号（２００９年９月４日出願）、同第６１／２７２，２５２号（２００９年９月４日出願）、同第６１／１８６，６１４号（２００９年６月１２日出願）、同第６１／２８２，５０８号（２０１０年２月２２日出願）、同第６１／２７２，２５４号（２００９年９月４日出願）に開示されている。Ｎ−置換デオキシノジリマイシンが有効であり得る疾患及び状態としては、ＨＩＶ感染症；Ｃ型肝炎及びＢ型肝炎感染症を含む、肝炎感染症；テイ・サックス病、ゴーシェ病、クラッベ病及びファブリ病を含む、リソソーム脂質蓄積症；並びに嚢胞性線維症が挙げられるが、これらに限定されない。Ｎ−置換デオキシノジリマイシンが有効であり得る疾病及び状態としては、デングウイルスに起因する又は関連づけられるウイルス感染症；アレナウイルス科に属するもの、例えばピキンデウイルス又はフニンウイルス、に起因する又は関連づけられるウイルス感染症；ポックスウイルス科に属するもの、例えばワクシニアウイルス、に起因する又は関連づけられるウイルス感染症；フィロウイルス科に属するもの、例えばエボラウイルス及びマールブルグウイルス、に起因する又は関連づけられるウイルス感染症；ブニヤウイルス科に属するもの、例えばリフトバレー熱ウイルス、に起因する又は関連づけられるウイルス感染症；トガウイルス科に属するもの、例えばチクングニアウイルス及びベネズエラウマ脳炎ウイルス、に起因する又は関連づけられるウイルス感染症；オルソミクソウイルス科に属するもの、例えば、Ｈ１Ｎ１及びＨ３Ｎ２サブタイプを含めてインフルエンザＡウイルス、に起因する又は関連づけられるウイルス感染症も挙げられる。
【００３４】
一部の実施形態において、α−グルコシダーゼ阻害剤は、Ｎ−オキサアルキル化デオキシノジリマイシン又はＮ−アルキルオキシデオキシノジリマイシン、例えば、米国特許第４，６３９，４３６号に記載されているＮ−ヒドロキシエチルＤＮＪ（ミグリトール又はＧｌｙｓｅｔ（登録商標））、である場合がある。
【００３５】
一部の実施形態において、α−グルコシダーゼ阻害剤は、カスタノスペルミン及び／又はカスタノスペルミン誘導体、例えば、米国特許出願第２００６／０１９４８３５号に開示されている式（Ｉ）の化合物及びそれらの医薬的に許容される塩［６−Ｏ−ブタノイルカルタノスペルミン（セルゴシビル）を含む］、並びにＰＣＴ公開番号第０１０５４６９２号に開示されている式ＩＩの化合物及びそれらの医薬的に許容される塩、である場合がある。
【００３６】
カスタノスペルミン及びその誘導体が有効であり得る疾患及び状態は、米国特許第４，７９２，５５８号、同第４，８３７，２３７号、同第４，９２５，７９６号、同第４，９５２，５８５号、同第５，００４，７４６号、同第５，２１４，０５０号、同第５，２６４，３５６号、同第５，３８５，９１１号、同第５，６４３，８８８号、同第５，６９１，３４６号、同第５，７５０，６４８号、同第５，８３７，７０９号、同第５，９０８，８６７号、同第６，１３６，８２０号、同第６，５８３，１５８号、同第６，５８９，９６４号、同第６，６５６，９１２号、及び米国特許公開第２００２０００６９０９号、同第２００２０１８８０１１号、同第２００６００９３５７７号、同第２００６０１９４８３５号、同第２００８０１３１３９８号に開示されている。カスタノスペルミン及びその誘導体が有効であり得る疾患及び状態としては、ＨＩＶ感染症をはじめとするレトロウイルス感染症；脳性マラリア；Ｂ型肝炎及びＣ型肝炎感染症をはじめとする肝炎感染症；糖尿病；並びにリソソーム蓄積症が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３７】
一部の実施形態において、アルファグルコシダーゼ阻害剤は、アカルボーズ（Ｏ−４，６−ジデオキシ−４−［［（１Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−４，５，６−トリヒドロキシ−３−（ヒドロキシメチル）−２−シクロヘキセン−１−イル］アミノ］−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｏ−→−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｄ−グルコース）、又はＰｒｅｃｏｓｅ（登録商標）である場合がある。アカルボーズは、米国特許第４，９０４，７６９号に開示されている。一部の実施形態において、アルファグルコシダーゼ阻害剤は、アカルボーズの高精製形態（例えば、米国特許第４，９０４，７６９号参照）である場合がある。一部の実施形態において、リポソーム内に封入される薬剤は、イオンチャネル阻害剤である場合がある。一部の実施形態において、前記イオンチャネル阻害剤は、ＨＣＶ  ｐ７タンパク質の活性を阻害する薬剤である場合がある。イオンチャネル阻害剤及びそれらの同定方法は、米国特許公開第２００４／０１１０７９５号において詳述されている。適するイオンチャネル阻害剤としては、Ｎ−（７−オキサ−ノニル）−１，５，６−トリデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−ガラクシトール（Ｎ−７−オキサ−ノニル６−ＭｅＤＧＪ又はＵＴ２３１Ｂ）及びＮ−１０−オキサウンデシル−６−ＭｅＤＧＪをはじめとする、式Ｉの化合物及びそれらの医薬的に許容される塩が挙げられる。適するイオンチャネル阻害剤としては、Ｎ−ノニルデオキシノジリマイシン、Ｎ−ノニルデオキシガラクトノジリマイシン（N-nonyl deoxynogalactonojirimycin）及びＮ−オキサノニルデオキシノガラクトノジリマイシン（N-oxanonyl deoxynogalactonojirimycin）も挙げられるが、これらに限定されない。
【００３８】
一部の実施形態において、リポソーム内に封入される薬剤は、イミノ糖である場合がある。適するイミノ糖は、自然に存在するイミノ糖と合成イミノ糖の両方を含む。一部の実施形態において、前記イミノ糖は、デオキシノジリマイシン又はＮ−置換デオキシノジリマイシン誘導体である場合がある。適するＮ−置換デオキシノジリマイシン誘導体の例としては、本出願の式ＩＩの化合物、米国特許第６，５４５，０２１号の式Ｉの化合物、及びＮ−オキサアルキル化デオキシノジリマイシン、例えば米国特許第４，６３９，４３６号に記載されているＮ−ヒドロキシエチルＤＮＪ（ミグリトール又はＧｌｙｓｅｔ（登録商標））が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態において、前記イミノ糖は、カスタノスペルミン又はカルタノスペルミン誘導体である場合がある。適するカルタノスペルミン誘導体としては、米国特許出願第２００６／０１９４８３５号に開示されている式（Ｉ）の化合物及びそれらの医薬的に許容される塩、並びにＰＣＴ公開番号第０１０５４６９２号に開示されている式ＩＩの化合物及びそれらの医薬的に許容される塩が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３９】
一部の実施形態において、前記イミノ糖は、デオキシガラクトノジリマイシン（deocynogalactojirimycin）又はそのＮ−置換誘導体、例えばＰＣＴ公開番号第９９／２４４０１号及び第０１／１０４２９号に開示されているもの、である場合がある。適するＮ−置換デオキシガラクトノジリマイシン（N-substituted deoxynogalactojirimycin）誘導体としては、Ｎ−アルキル化デオキシガラクトノジリマイシン（N-alkylated deocxnogalactojirimycin）（Ｎ−アルキル−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−ガラクチトール）、例えば、Ｎ−ノニルデオキシガラクトノジリマイシン（N-nonyl deoxynogalactojirimycin）、及びＮ−オキサ−アルキル化デオキシガラクトノジリマイシン（N-oxa-alkylated deocynogalactojirimycin）（Ｎ−オキサ−アルキル−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−ガラクチトール）、例えば、Ｎ−７−オキサノニルデオキシガラクトノジリマイシン（N-7-oxynonyl deoxynogalactojirimycin）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４０】
一部の実施形態において、前記イミノ糖は、式ＩＩの化合物：
【化２】
2012521981.tif 000004
（式中、Ｒは、置換若しくは非置換アルキル基、置換若しくは非置換シクロアルキル基、置換若しくは非置換ヘテロシクリル基、又は置換又は非置換オキサアルキル基から選択される）
をはじめとする（しかし、これらに限定されない）、Ｎ−置換１，５，６−トリデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−ガラクチトール（Ｎ−置換ＭｅＤＧＪ）である場合がある。一部の実施形態において、置換若しくは非置換アルキル基及び／又は置換若しくは非置換オキサアルキル基は、１から１６個の炭素原子、又は４から１２個の炭素原子、又は８から１０個の炭素原子を含む。一部の実施形態において、置換若しくは非置換アルキル基及び／又は置換若しくは非置換オキサアルキル基は、１から４個の酸素原子、及び他の実施形態では１から２個の酸素原子、を含む。他の実施形態において、置換若しくは非置換アルキル基及び／又は置換若しくは非置換オキサアルキル基は、１から１６個の炭素原子及び１から４個の酸素原子を含む。従って、一部の実施形態において、Ｒは、−（ＣＨ２）６ＯＣＨ３、−（ＣＨ２）６ＯＣＨ２ＣＨ３、−（ＣＨ２）６Ｏ（ＣＨ２）２ＣＨ３、−（ＣＨ２）６Ｏ（ＣＨ２）３ＣＨ３、−（ＣＨ２）２Ｏ（ＣＨ２）５ＣＨ３、−（ＣＨ２）２Ｏ（ＣＨ２）６ＣＨ３、及び−（ＣＨ２）２Ｏ（ＣＨ２）７ＣＨ３から選択されるが、これらに限定されない。Ｎ−置換ＭｅＤＧＪは、例えば、ＰＣＴ公開番号第０１／１０４２９号に開示されている。
【００４１】
一部の実施形態において、リポソーム内に封入される薬剤としては、式ＩＩＩを有する窒素含有化合物：
【化３】
2012521981.tif 000005
又はその医薬的に許容される塩である場合があり、この式中、
Ｒ１２は、アルキル、例えばＣ１−Ｃ２０、又はＣ１−Ｃ６、又はＣ７−Ｃ１２、又はＣ８−Ｃ１６、であり、及び１から５個又は１から３個又は１から２個の酸素原子も含有する場合があり、Ｒ１２は、オキサ置換アルキル誘導体である場合がある。オキサ置換アルキル誘導体の例としては、３−オキサノニル、３−オキサデシル、７−オキサノニル及び７−オキサデシルが挙げられる。
【００４２】
Ｒ２は、水素であり、Ｒ３は、カルボキシ、若しくはＣ１−Ｃ４アルコキシカルボニルであり、又はＲ２とＲ３が一緒に、
【化４】
2012521981.tif 000006
若しくは−（ＣＸＹ）ｎ−になり、この場合、ｎは、３又は４であり、それぞれのＸは、独立して、水素、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、Ｃ１−Ｃ４アルキルカルボキシ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、Ｃ１−Ｃ４ヒドロキシアルキル、Ｃ１−Ｃ６アシルオキシ、又はアロイルオキシであり、及びそれぞれのＹは、独立して、水素、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、Ｃ１−Ｃ４アルキルカルボキシ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、Ｃ１−Ｃ４ヒドロキシアルキル、Ｃ１−Ｃ６アシルオキシ、アロイルオキシであるか、削除され（すなわち、存在しない）；
Ｒ４は、水素であるか、削除され（すなわち、存在しない）；及び
Ｒ５は、水素、ヒドロキシ、アミノ、置換アミノ、カルボキシ、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキル、アリール、アラルキル、アルコキシ、ヒドロキシアルキル、アシルオキシ、若しくはアロイルオキシであり；又は
Ｒ３とＲ５が一緒にフェニルを形成し、及びＲ４は、削除される（すなわち、存在しない）。
【００４３】
一部の実施形態において、前記窒素含有化合物は、式：
【化５】
2012521981.tif 000007
（式中、Ｒ６−Ｒ１０のそれぞれは、独立して、水素、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、Ｃ１−Ｃ４アルキルカルボキシ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、Ｃ１−Ｃ４ヒドロキシアルキル、Ｃ１−Ｃ４アシルオキシ、及びアロイルオキシから成る群より選択され；並びにＲ１１は、水素又はＣ１−Ｃ６アルキルである）
を有する。
【００４４】
前記窒素含有化合物は、Ｎ−アルキル化ピペリジン、Ｎ−オキサ−アルキル化ピペリジン、Ｎ−アルキル化ピロリジン、Ｎ−オキサ−アルキル化ピロリジン、Ｎ−アルキル化フェニルアミン、Ｎ−オキサ−アルキル化フェニルアミン、Ｎ−アルキル化ピリジン、Ｎ−オキサ−アルキル化ピリジン、Ｎ−アルキル化ピロール、Ｎ−オキサ−アルキル化ピロール、Ｎ−アルキル化アミノ酸、又はＮ−オキサ−アルキル化アミノ酸である場合がある。一定の実施形態において、Ｎ−アルキル化ピペリジン、Ｎ−オキサ−アルキル化ピペリジン、Ｎ−アルキル化ピロリジン、又はＮ−オキサ−アルキル化ピロリジン化合物は、イミノ糖である場合がある。例えば、一部の実施形態において、前記窒素含有化合物は、式：
【化６】
2012521981.tif 000008
を有するＮ−アルキル−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−ガラクチトール（Ｎ−アルキル−ＤＧＪ）若しくはＮ−オキサ−アルキル−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−ガラクチトール（Ｎ−オキサ−アルキル−ＤＧＪ）又は式：
【化７】
2012521981.tif 000009
を有するＮ−アルキル−１，５，６−トリデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−ガラクチトール（Ｎ−アルキル−ＭｅＤＧＪ）若しくはＮ−オキサ−アルキル−１，５，６−トリデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−ガラクチトール（Ｎ−オキサ−アルキル−ＭｅＤＧＪ）である場合がある。本明細書において用いる場合、炭素原子数が別様に指定されていない限り、基は、以下の特徴を有する。アルキル基は、１から２０個の炭素原子を有し、及び線状であり又は分岐しており、置換されている又は非置換である。アルコキシ基は、１から１６個の炭素原子を有し、及び線状であり又は分岐しており、置換されている又は非置換である。アルコキシカルボニル基は、２から１６個の炭素原子を有するエステル基である。アルケニルオキシ基は、２から１６個の炭素原子、１から６個の二重結合を有し、及び線状であり又は分岐しており、置換されている又は非置換である。アルキニルオキシ基は、２から１６個の炭素原子、１から３個の三重結合を有し、及び線状であり又は分岐しており、置換されている又は非置換である。アリール基は、６から１４個の炭素原子（例えば、フェニル基）を有し、及び置換されている又は非置換である。アラルキルオキシ（例えば、ベンジルオキシ）及びアロイルオキシ（例えば、ベンゾイルオキシ）基は、７から１５個の炭素原子を有し、及び置換されている又は非置換である。
【００４５】
アミノ基は、第一級、第二級、第三級、又は第四級アミノ基（すなわち、置換アミノ基）である場合がある。アミノカルボニル基は、１から３２個の炭素原子を有するアミド基（例えば、置換アミド基）である。置換されている基は、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１−１０アルキル、Ｃ２１０アルケニル、Ｃ１−１０アシル、又はＣ１−１０アルコキシから成る群より選択される置換基を含む場合がある。
【００４６】
Ｎ−アルキル化アミノ酸は、Ｎ−アルキル化された自然に存在するアミノ酸、例えばＮ−アルキル化α−アミノ酸、である場合がある。自然に存在するアミノ酸は、２０の一般的なα−アミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｃｙｓ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、及びＰｒｏ）、並びに天然産物である他のアミノ酸、例えばノルロイシン、エチルグリシン、オルニチン、メチルブテニル−メチルトレオニン、及びフェニルグリシンのうちの１つである。アミノ酸側鎖（例えば、Ｒ５）の例としては、Ｈ（グリシン）、メチル（アラニン）、−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２（アスパラギン）、−ＣＨ２−ＳＨ（システイン）、及び−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３（トレオニン）が挙げられる。
【００４７】
アミノ（又はイミノ）化合物の還元アルキル化によって、Ｎ−アルキル化化合物を調製することができる。例えば、アミノ又はイミノ化合物を還元剤（例えば、シアノ水素化ホウ素ナトリウム）と共にアルデヒドに暴露して、そのアミンをＮ−アルキル化することができる。類似して、アミノ（又はイミノ）化合物の還元アルキル化によって、Ｎ−オキサ−アルキル化化合物を調製することができる。例えば、アミノ又はイミノ化合物を還元剤（例えば、シアノ水素化ホウ素ナトリウム）と共にオキサ−アルデヒドに暴露して、そのアミンをＮ−オキサ−アルキル化することができる。
【００４８】
前記窒素含有化合物は、１つ又はそれ以上の保護基を含む場合がある。様々な保護基が周知である。一般に、保護基の種類は重要でないが、但し、その化合物の他の位置に関する一切の後続の反応（単数又は複数）の条件に対して安定であること、及びその分子の残部に悪影響を及ぼすことなく適切な時点で除去することができることを条件とする。加えて、実質的な合成変換が完了した後、保護基を別のものに置換することができる。化合物が、本明細書に開示する化合物と、該開示化合物の１つ又はそれ以上の保護基が異なる保護基で置換されている点でしか異ならない場合、その化合物は、明らかに、本発明の範囲内である。さらなる例及び条件は、Greene, Protective Groups in Organic Chemistry, (1st Ed., 1981, Greene & Wuts, 2ndEd., 1991)において見つけられる。
【００４９】
前記窒素含有化合物を、例えば結晶化又はクロマトグラフ法によって、精製することができる。立体特異的アミノ又はイミノ化合物を出発原料として使用して、立体特異的に化合物を調製することができる。
【００５０】
長鎖Ｎ−アルキル化化合物の調製の際に出発原料として使用されるアミノ及びイミノ化合物は、市販されており（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、英国チェシア州Ｎｏｒｗｉｃｈ；Ｔｏｒｏｎｔｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、カナダ、オンタリオ州）、又は公知合成法によって調製することができる。例えば、前記化合物は、Ｎ−アルキル化イミノ糖化合物又はそれらのオキサ置換誘導体である場合がある。前記イミノ糖は、例えば、デオキシガラクトノジリマイシン（ＤＧＪ）、１−メチル−デオキシガラクトノジリマイシン（ＭｅＤＧＪ）、デオキシノジリマイシン（ＤＮＪ），アルトロスタチン、２Ｒ，５Ｒ−ジヒドロキシメチル−３Ｒ，４Ｒ−ジヒドロキシピロリジン（ＤＭＤＰ）、又はそれらの誘導体、エナンチオマー若しくは立体異性体である場合がある。
【００５１】
一部の実施形態において、前記脂質粒子内に封入される薬剤は、式ＩＶ又はＶの化合物：
【化８】
2012521981.tif 000010
であることがあり、これらの式中、Ｒは、
【化９】
2012521981.tif 000011
であり；Ｒ’は、
【化１０】
2012521981.tif 000012
であり；Ｒ１は、置換又は非置換アルキル基であり；Ｒ２は、置換又は非置換アルキル基であり；Ｗ１−４は、独立して、水素、置換若しくは非置換アルキル基、置換若しくは非置換ハロアルキル基、置換若しくは非置換アルカノイル基、置換若しくは非置換アロイル基、又は置換若しくは非置換ハロアルカノイル基から選択され；Ｘ１−５は、独立して、Ｈ、ＮＯ２、Ｎ３、又はＮＨ２から選択され；Ｙは、不在であり、又はカルボニル以外の置換若しくは非置換Ｃ１−アルキル基であり、Ｚは、結合又はＮＨから選択されるが、但し、Ｚが結合であるとき、Ｙが不在であること、及びＺがＮＨであるとき、Ｙが、カルボニル以外の置換若しくは非置換Ｃ１−アルキル基であることを条件とし；並びにＺ’は、結合又はＮＨである。式ＩＶ及びＶの化合物並びにそれらの合成方法は、例えば、米国特許公開番号ＵＳ２００７／０２７５９９８に開示されている。式ＩＶ及びＶの化合物の非限定的な例としては、Ｎ−（Ｎ’−｛４’アジド−２’−ニトロフェニル｝｝−６−アミノヘキシル｝−デオキシノジリマイシン（ＮＡＰ−ＤＮＪ）及びＮ−（Ｎ’−｛２，４−ジニトロフェニル｝｝−６−アミノヘキシル｝−デオキシノジリマイシン（ＮＤＰ−ＤＮＪ）が挙げられる。様々なイミノ糖化合物の合成が記載されている。例えば、ＤＮＪ誘導体を合成する方法は公知であり、例えば、米国特許第５，６２２，９７２号、同第５，４０１，６４５号、同第５，２００，５２３号、同第５，０４３，２７３号、同第４，９９４，５７２号、同第４，２４６，３４５号、同第４，２６６，０２５号、同第４，４０５，７１４号、及び同第４，８０６，６５０号に記載されている。他のイミノ糖誘導体を合成する方法は公知であり、例えば、米国特許第４，８６１，８９２号、同第４，８９４，３８８号、同第４，９１０，３１０号、同第４，９９６，３２９号、同第５，０１１，９２９号、同第５，０１３，８４２号、同第５，０１７，７０４号、同第５，５８０，８８４号、同第５，２８６，８７７号、及び同第５，１００，７９７号、並びにＰＣＴ公開番号第０１／１０４２９号に記載されている。２Ｒ，５Ｒ−ジヒドロキシメチル−３Ｒ，４Ｒ−ジヒドロキシピロリジン（ＤＭＤＰ）のエナンチオ特異的合成は、Ｆｌｅｅｔ及びＳｍｉｔｈ（Tetrahedron Lett. 26:1469-1472, 1985）により記載されている。
【００５２】
前記イメージング剤は、タグ付又は蛍光水性材料、例えばカルセイン、又は蛍光標識分子、例えばｓｉＲＮＡ、抗体若しくは他の小分子阻害剤である場合がある。タグ付親油性材料が細胞膜への組み込みのために脂質粒子に組み込まれる場合もある、例えば、細胞内のリポソームを可視化するために使用されるｒｈ−ＰＥ脂質、及び可視化又は精製のためのタグを有する他の類似した脂質。これには、蛍光部分若しくは可視化若しくは精製のための他のタグを有する、タグ付親油性タンパク質又は薬物も挙げることができる。
【００５３】
一部の実施形態において、封入される活性薬剤は、レトロウイルス薬であることがあり、このレトロウイルス薬は、例えば、ヌクレオシド逆転写酵素（ＲＴ）阻害剤、例えば（−）−２’−デオキシ−３’−チオシチジン−５’−三リン酸（３ＴＣ）；（−）−ｃｉｓ−５−フルオロ−１−［２−（ヒドロキシ−メチル）−［１，３−オキサチオラン−５−イル］シトシン（ＦＴＣ）；３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）及びジデオキシ−イノシン（ｄｄＩ）；非ヌクレオシドＲＴ阻害剤、例えばＮ１１−シクロプロピル−４−メチル−５，１１−ジヒドロ−６Ｈ−ジピリド［３，２−ｂ：２’３’−ｅ］−［１，４］ジアゼピン−６−オン（Ｎｅｖｉｐａｒｉｎｅ）、プロテアーゼ阻害剤、又はそれらの組み合わせであることがある。
【００５４】
介在部分
一部の実施形態において、前記脂質粒子は、その脂質層又は二重層に介在した１つ又はそれ以上の部分を含むことがある。介在部分の例としては、膜貫通型タンパク質、タンパク質脂質コンジュゲート、標識脂質、親油性化合物又はそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態において、前記介在部分は、脂質−ＰＥＧコンジュゲートを含むことがある。そのようなコンジュゲートは、脂質粒子のインビボ安定性を増大させることができ、及び／又はその循環時間を増加させることができる。一部の実施形態において、前記介在部分は、長いアルキル鎖のイミノ糖、例えば、Ｃ７−Ｃ１６アルキル若しくはオキサアルキル置換Ｎ−デオキシノジリマイシン（ＤＮＪ）又はＣ７−Ｃ１６アルキル若しくはオキサアルキル置換デオキシガラクトノジリマイシン（ＤＧＪ）を含むことがある。長いアルキル鎖のイミノ糖の非限定的な例としては、Ｎ−ノニルＤＮＪ及びＮ−ノニルＤＧＪが挙げられる。一部の実施形態において、前記介在部分は、蛍光体−脂質コンジュゲートを含むことがあり、このコンジュゲートは、脂質二重層粒子と接触している細胞のＥＲ膜を標識するために使用することができる。そのような標識は、真核細胞における生及び／又は固定細胞イメージングに有用であり得る。脂質粒子の使用により、結果として細胞のＥＲ膜に介在部分を送達することができる。
【００５５】
用途
コレステロール阻害が可能である脂質粒子は、コレステロールレベル増加に起因する又はコレステロールレベル増加を随伴する疾患又は状態の治療及び／又は予防に直接使用することができる。そのような疾患／状態の例としては、アテローム性動脈硬化症及び冠動脈疾患が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、コレステロール阻害が可能である脂質粒子を使用し、それにより、免疫不全ウイルスに感染した被験体（該被験体は、ＨＩＶに感染したヒトである場合がある）におけるコレステロールレベル増加に起因する又はコレステロールレベル増加を随伴するものを治療又は予防することができる。そのような被験体におけるコレステロールレベル増加は、感染症を生じさせる結果となることがある。免疫不全感染症は、細胞コレステロールの蓄積を随伴する場合があり、並びにその結果、アテローム性動脈硬化症及び／又はＣＡＤの発現をもたらす場合があるので、脂質粒子は、ターゲッティング分子により免疫不全ウイルス感染細胞をターゲットにすることができる。一定の実施形態において、前記脂質粒子は、１つ又はそれ以上の抗レトロウイルス薬を封入することができる。そのような脂質粒子は、その抗レトロウイルス薬を免疫不全ウイルス感染細胞に送達することができ、また同時に、細胞コレステロールのレベルを低下させて、アテローム性動脈硬化症及び／又はＣＡＤを予防することができる。
【００５６】
コレステロール阻害が可能である脂質粒子は、その複製をコレステロールに依存するウイルスに起因する又は関連づけられる疾患又は状態を治療及び／又は予防するために使用することができる。一定の場合、前記疾患又は状態は、ウイルス感染症であることがある。そのようなウイルスの例としては、単純ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス、マウス白血病ウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオーマウイルス、エプスタイン・バーウイルス、セムリキ森林ウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、デングウイルス、麻疹ウイルス、ＨＩＶ、Ｃ型肝炎ウイルス及びＢ型肝炎ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。ウイルスに起因する又は関連づけられる疾患又は状態に使用されるとき、前記脂質粒子は、それらのウイルスに対する１つ又はそれ以上の抗ウイルス薬を含有することができる。あるいは、前記脂質粒子は、ＨＣＶのようなウイルスの形態形成阻害剤として作用することにより、薬物又はプロドラッグとして直接使用することができる。
【００５７】
投与
前記脂質粒子を含む組成物を、被験体に、該被験体における細胞コレステロールを低下させる目的で、投与することができる。この投与前のコレステロールの初期レベルは、正常であることもあり、又は増加されていることもある。
【００５８】
一部の実施形態において、前記被験体は、細胞であることがある。脂質粒子を含む組成物は、マクロファージを含む、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、及びヒトヘパトーマ細胞株、例えばＨｕｈ７．５細胞、をはじめとする（しかし、これらに限定されない）様々な細胞タイプにおいて、細胞コレステロールレベルを低下させることができる。
【００５９】
場合によっては、前記細胞は、その複製をコレステロールに依存するウイルスである場合があるウイルスに感染した細胞であることがある。そのような場合、前記脂質粒子によるコレステロール阻害は、ウイルス複製の阻害、ウイルス構築及び分泌の阻害、ウイルスエンベロープ内のコレステロールレベルが減少した非感染ウイルス粒子の生産、及び／又はウイルス侵入のための細胞表面上の細胞受容体の誤局在をもたらすことがある。一部の実施形態では、前記脂質粒子を含む組成物を、温血動物、例えば哺乳動物又は鳥、に投与することができる。多くの場合、被験体は、ヒトでありうる。一部の実施形態では、前記脂質粒子を含む組成物を、静脈内注射によって投与することができる。さらに一部の実施形態では、前記脂質粒子を含む組成物を、静脈内注射以外の非経口経路、例えば、腹腔内、皮下、皮内、表皮内、筋肉内又は経皮経路、によって投与することができる。さらに一部の実施形態では、前記脂質粒子を含む組成物を、粘膜表面、例えば、眼球、鼻腔内、肺、腸管、直腸及び尿管表面、経由で投与することができる。脂質含有組成物、例えばリポソーム組成物、についての投与経路は、例えば、A. S. Ulrich, Biophysical Aspects of Using Liposomes as Delivery Vehicles, Bioscience Reports, Volume 22, Issue 2, Apr 2002, 129 - 150に開示されている。
【００６０】
一定の場合、脂質粒子の皮下注射が好ましいことがある。そのような投与は、マクロファージ内での脂質粒子の蓄積をもたらし、それによって、泡沫細胞の発生を予防すること及び従って早期のアテローム性動脈硬化症を予防することができるからである。以下の実施例によって本発明をさらに説明するが、いかなる点においても、本発明は以下の実施例に限定されない。
【００６１】
実施例
ターゲット細胞の細胞内区画への水溶性小分子の効率的なキャリアであるリポソームで処置した細胞のプロテオーム解析により、処置が、細胞コレステロール生合成に関与する重要な酵素、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル（ＨＭＧ）−ＣｏＡシンターゼ、のダウンレギュレーションをもたらすことを証明した。さらなる実験により、このダウンレギュレーションが、結果として、処置細胞内の（遊離しているものとエステル化されたもの両方の）コレステロールレベルを減少させることができることを証明した。早期のアテローム性動脈硬化症及び冠動脈疾患は、コレステロール沈着マクロファージである泡沫細胞の形成で始まるので、及びリポソームは、例えば皮下注射後、マクロファージ内に蓄積するため、リポソーム処置は、これらの疾患のための新しいターゲット指向型処置であるだろう。さらに、多くのウイルスが、正常細胞内コレステロールレベルから増加された細胞内コレステロールレベルに依存することは証明されているため、ターゲット細胞への抗ウイルス薬の効率的な送達に加えてのコレステロールレベル減少の併用は、新規の、さらに有効な抗ウイルス療法でありうる。
【００６２】
１．リポソーム調製
１．１．リポソーム調製のための方法論：
記載するすべてのアッセイのためにリポソームを新たに調製した。脂質のクロロホルム溶液をガラス管に入れ、窒素ガス流下で溶媒を蒸発させた。別様に述べない限り、１×ＰＢＳバッファー中でボルテックスにより脂質皮膜を５ｍＭの最終脂質濃度に水和した。得られた多層小胞を、Ｍｉｎｉ−Ｅｘｔｒｕｄｅｒ装置を使用して、１００ｎｍ 細孔径のポリカルボナートフィルターを通して、１１回押し出した。０．２２μｍフィルターユニットを使用して、リポソームを濾過滅菌した。図２Ａ〜Ｆは、これらの研究において使用した脂質：Ａ．２２：６ ＰＥ；Ｂ．２２：６ ＰＣ；Ｃ．ＰＩ；Ｄ．ＰＳ；Ｅ．ＤＯＰＥ；Ｆ．ＣＨＥＭＳ、を図示するものである。
【００６３】
２．多不飽和ＥＲリポソームで処置した細胞におけるＨＭＧ  ＣｏＡシンターゼ（ＨＭＧＣＳ）タンパク質の減少：
ｐＨ感受性リポソーム（すなわち、ＰＥ及びＣＨＭＥＳ脂質を含むがＰＩ及びＰＳ脂質を含有しないリポソーム）とＥＲリポソーム（すなわち、ＰＥ脂質とＰＩ又はＰＳ脂質の少なくとも一方とを含むリポソーム）の両方で５日間処置した細胞をプロテオーム解析のために使用して、細胞内のすべての検出可能タンパク質の増加又は減少を判定した。ｐＨ感受性リポソームとＥＲターゲッティングリポソーム両方の処置の結果として減少した１つのタンパク質は、酵素ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ（ＨＭＧＣＳ）であった。ＨＭＧＣＳは、アセチル−ＣｏＡからのアセトアセチルＣｏＡ経由でのＨＭＧ−ＣｏＡの合成であるメバロン酸−イソプレノイド経路における第一段階を触媒する。Ｈｕｈ７．５細胞の２２：６ 多不飽和（ｐｕ）ＥＲリポソーム処置が、この酵素の類似の低減をもたらすかどうかを判定するために、様々な濃度のリポソームで細胞を４日間処置した後、全細胞を溶解し、ウエスタンブロットにより分析してＨＭＧＣＳを特異的に同定した。
【００６４】
２．１．ウエスタンブロットによりＨＭＧＣＳ及びアクチンを同定するための方法論：
培地中の１μＭから１００μＭにわたる最終濃度のｐｕＥＲリポソーム（２２：６ ＰＥ：２２：６ ＰＣ：ＰＩ：ＰＳ、１．５：１．５：１：１）での処置後、Ｈｕｈ７．５細胞を１×ＰＢＳで２回洗浄し、１×ＰＢＳ／１％ Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００に再び浮遊させて１ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度にした。ＢＳＡ標準物質を使用するＢｒａｄｆｏｒｄ  Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によってタンパク質濃度を決定した。４〜１２％ ビス−トリスＮｕＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にウエルあたり１０μｇのタンパク質を負荷することによりＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、製造業者の推奨基準に従ってＮｕＰＡＧＥ  ＭＥＳ  ＳＤＳバッファーを使用して分離した。タンパク質をニトロセルロース膜に移し、製造業者のプロトコルに従って、ＷｅｓｔｅｒｎＢｒｅｅｚｅ（登録商標）抗ヤギＡＰ化学発光キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して１：１００に希釈した一次ヤギ抗ヒトＨＭＧＣｏＡシンターゼ及び抗ヒトアクチン抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）で免疫ブロットを行った。
【００６５】
２．２．ｐｕＥＲリポソーム処置でのＨＭＧＣＳのダウンレギュレーション：
主として１８：１ 脂質（１８：１ ＰＥ：１８：１ ＰＣ：ＰＩ：ＰＳ、１．５：１．７：１．５：０．３）から構成されるＥＲリポソームで証明されたように、２２：６ ＥＲリポソームでの処置も、用量依存様式でＨＭＧＣｏＡ−シンターゼの量を減少させた（図３）。
図３は、抗アクチン抗体と抗ＨＭＧＣＳ抗体の両方を使用した、２２：６ ＥＲリポソーム処置、ＪＣ−１感染Ｈｕｈ７．５細胞（ＭＯＩ＝５）のウエスタンブロット分析の結果を示すものである。細胞を様々な濃度の２２：６ ＥＲリポソームで４日間処置し、４日の時点で細胞を回収し、１％ Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／１×ＰＢＳに再び浮遊させることにより分解した。細胞溶解産物をタンパク質含有量についてアッセイし、ウエルあたり３０μｇの全タンパク質を負荷し、その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。単回実験からの代表画像を示す。この実験を独立して３回繰り返した。
【００６６】
３．ｐｕＥＲリポソームでの細胞の処置は、細胞コレステロールレベルを減少させる：
リポソーム処置が、細胞内のＨＭＧＣＳレベルを減少させることは証明されたので、これらの細胞内の遊離コレステロールレベルとエステル化コレステロールレベルの両方を判定するためのアッセイを行って、コレステロール生合成の阻害に関してこの阻害を定量した。全コレステロール及び遊離コレステロールレベルを２２：６ ＥＲリポソーム及び２２：６ ＰＥＧ−ＥＲリポソーム処置Ｈｕｈ７．５細胞において定量した。全コレステロール値と遊離コレステロール値の差を算出することにより、エステル化コレステロールを決定した。
【００６７】
３．１．細胞内の全及び遊離コレステロールレベルの定量方法：
処置後、Ｈｕｈ７．５細胞又はＰＢＭＣを１×ＰＢＳで２回洗浄し、１×ＰＢＳ／１％ Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００に再び浮遊させて１ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度にした。ＢＳＡ標準物質を使用するＢｒａｄｆｏｒｄ  Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によってタンパク質濃度を決定した。１０μｇ 全タンパク質に相当する細胞溶解産物を用いてコレステロールアッセイを行った。Ａｍｐｌｅｘ（登録商標）Ｒｅｄコレステロールアッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をその製造業者のプロトコルに従って使用して、コレステロールエステラーゼの存在下又は不在下いずれかで、全コレステロール及び遊離コレステロールレベルをそれぞれ定量した。
【００６８】
３．２．ｐｕＥＲ及びＰＥＧ化ｐｕＥＲリポソームでの処置後のＨｕｈ７．５細胞とＰＢＭＣの両方における全及び遊離コレステロールレベルの定量：
２２：６ ＥＲリポソーム及び２２：６ ＰＥＧ−ＥＲリポソーム処置Ｈｕｈ７．５細胞における全コレステロール及び遊離コレステロールレベルを定量した。全コレステロール値と遊離コレステロール値の差を算出することにより、エステル化コレステロールを決定した。結果は、全コレステロールレベルの用量依存的減少（図４）と、ＰＥＧ−ＥＲリポソーム処置が非ＰＥＧ化組成物と同様の効果を有することを明示しており、これは、ＰＥＧ化が、ＥＲリポソームによるコレステロール生合成の阻害に影響を及ぼさないことを明示している。全コレステロールレベルは、５０μＭ ２２：６ ＥＲリポソーム処置サンプルにおいて未処置の対照と比較して有意に低下される（５６％、ＳＤ＝２．７％）。この減少の大部分は、細胞内のエステル化コレステロールレベル（未処置値の７５％、ＳＤ＝１．１％）に比べて低い遊離コレステロールレベル（未処置値の４７％、ＳＤ＝２．５％）のためであり得る。
【００６９】
図４は、２２：６ ＰＥ：２２：６ ＰＣ：ＰＩ：ＰＳ処置、ＪＣ１感染Ｈｕｈ７．５細胞（ＭＯＩ＝０．５）からの遊離コレステロールと全コレステロール両方の定量結果を示すものである。２２：６ ＥＲリポソームのＰＥＧ化バージョンを含めて、様々な濃度のリポソームで４日間、細胞を処置した。インキュベーション後、細胞を回収し、１％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００／１×ＰＢＳで分解し、１０μｇの各サンプルを、コレステロールエステラーゼの存在下と不在下の両方でのコレステロールアッセイに使用して、細胞内の全コレステロールと遊離コレステロールの両方をそれぞれ定量した。
【００７０】
それら２つの値の差としてエステル化コレステロールを算出した。結果は、３回の独立した実験からの三重反復実験サンプルの平均（及びＳＤ）を表す。データを未処置対照（１００％）に対して提示し、この値からの有意差を＊（Ｐ＜０．０５）又は＊＊（Ｐ＜０．００１）で示す。
【００７１】
フィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）刺激ＰＢＭＣを２２：６ ＥＲリポソームと共にインキュベートし、４日のインキュベーション後、遊離コレステロールレベルとエステル化コレステロールレベルの両方を定量した。図５において証明されるように、未処置ＰＢＭＣは、７８％（ＳＤ＝５．９％）遊離コレステロール及び２２％（ＳＤ＝３．８％）エステル化コレステロールを含有する。５０μＭ ２２：６ ＥＲリポソームでの処置は、２８％（ＳＤ＝６．５％）の細胞コレステロールの総合的減少をもたらした。遊離コレステロールレベルは、有意に３３％（ＳＤ＝６．３％、ｐ＜０．００１）低下されたが、この濃度では未処置対照と比較して有意なエステル化コレステロール減少はなかった。ＰＥＧ化２２：６ ＥＲリポソームも遊離コレステロールレベルを２９％（ＳＤ＝３．９、ｐ＜０．００１）減少させて、エステル化コレステロールレベルに対する有意な効果はなかった。
【００７２】
図５は、２２：６ ＥＲリポソームで４日間処置したＰＨＡ刺激ＰＢＭＣについての実験結果を証明するものである。その後、細胞を回収し、１％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００／１×ＰＢＳへ再び浮遊させて分解し、１０μｇの各サンプルを、コレステロールエステラーゼの存在下と不在下の両方でのコレステロールアッセイに使用して、細胞内の全コレステロールと遊離コレステロールの両方をそれぞれ定量した。それら２つの値の差としてエステル化コレステロールを算出した。データは、３回の独立した実験からの三重反復実験品の平均及びＳＤを表す。すべての値を未処置対照（１００％）に対する百分率として示し、この値からの有意差を＊（Ｐ＜０．０５）又は＊＊（Ｐ＜０．００１）で示す。
【００７３】
４．細胞内コレステロール減少は、ＨＣＶに対して抗ウイルス効果を有する：
ＨＣＶは、効率的なウイルス複製を細胞コレステロールレベルに依存することが証明されている。加えて、ＥＲリポソームは、細胞受容体についてのウイルスとの競合により、ＨＣＶに対して抗ウイルス性であることが証明されている。ＨＣＶに対するｐｕＥＲリポソームとＰＥＧ化ｐｕＥＲリポソームの複合抗ウイルス活性をモニターするために、リポソームの存在下で１６日間（４ラウンドの４日処置）、ウイルスを培養した。細胞におけるウイルス感染、並びに処置全体にわたってのウイルス分泌及び分泌されたビリオンの感染力を定量することにより、抗ウイルス活性をモニターした。処置細胞内の細胞コレステロールレベルも測定した。
【００７４】
４．１．ＨＣＶ細胞培養並びにウイルス感染及び分泌の定量についての方法論：
ＪＣ−１  ＨＣＶ細胞培養（ＨＣＶｃｃ）：記載するすべてのアッセイにおいて、既知感染力価（フォーカス形成単位（ｆｆｕ）／ｍＬ）のウイルスストックを使用して天然Ｈｕｈ７．５細胞を感染させた。リポソーム処置アッセイのために、ＪＣ１感染Ｈｕｈ７．５細胞を、リポソームを伴う又は伴わない完全ＤＭＥＭ／１０％ ＦＢＳ中、３×１０５ 細胞／ウエルの密度で、ウエルあたり２ｍＬの総容量で６ウエルプレートに接種し、４日、インキュベートしておいた。インキュベーション後、ＨＣＶ  ＲＮＡ定量のために上清を回収した。細胞を１×ＰＢＳで１回洗浄し、０．５％ トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ）中で剥離させ、カウントし、さらなる分析に先立ち−２０℃で凍結した。多継代でのアッセイのために、トリパンブルーで細胞をカウントした後、もう１ラウンドの上記の処置のために３×１０５細胞を６ウエルプレートに再接種した。
【００７５】
ＲＴ−ＰＣＲによるＨＣＶの定量：ＱＩＡＧＥＮ  ＱＩＡａｍｐ（登録商標）Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｉｔｏｎ  Ｋｉｔを製造業者のプロトコルに従って使用する、５００μＬの上清から抽出したウイルスＲＮＡでの定量的ＰＣＲにより、ウイルス分泌分析を行った。Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（登録商標）濃縮装置（１０，０００ＫＤａ ＭＷカットオフ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、５００μＬの上清を、先ず、１４０μＬに濃縮した。先ず、プライマーＲＣ２１（５’−ＣＴＣＣＣＧＧＧＧＣＡＣＴＣＧＣＡＡＧＣ−３’）での逆転写酵素反応（ＴａｑＭａｎ（登録商標）、ＡＢＩ）を用いる単離されたＲＮＡのｃＤＮＡへの変換、続いて、ＳｙＢｒ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  ｍｉｘ（ＱＩＡＧＥＮ）並びにＨＣＶ  ｃＤＮＡに対するＲＣ２１及びＲＣ１プライマー（５’−ＡＴＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡＧＴＡ−３’）両方を使用する実時間ＰＣＲにより、分泌されたウイルスＲＮＡの定量を行った。ＨＣＶ  ＪＣ−１  ｃＤＮＡの系列希釈物で構成された標準曲線に比べてＨＣＶ転写産物レベルを決定した。
【００７６】
４．２．ウイルス感染力を測定するためのＨＣＶコア免疫蛍光検査：
処置したＪＣ−１感染Ｈｕｈ７．５細胞の上清中の分泌ＨＣＶビリオンの感染力を、天然Ｈｕｈ７．５細胞を感染させることによって判定した。天然Ｈｕｈ７．５細胞を４８ウエルプレートに５×１０４細胞／ウエルの密度で接種し、一晩放置して付着させた後、培地の２００μＬのサンプル上清で置換した。上清を１時間放置して天然Ｈｕｈ７．５細胞を感染させた後、細胞を１×ＰＢＳで２回洗浄し、その後、２日間、５００μＬ 完全ＤＭＥＭ／１０％ ＦＣＳ中でインキュベートした。２日のインキュベーションの後、細胞を１×ＰＢＳで２回洗浄し、メタノール／アセトン（１：１、容量／容量）中で１０分間固定し、１×ＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０中で２回洗浄した。その後、３μｇ／ｍＬ マウス抗ＨＣＶコア抗体（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓ）を含有する１×ＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０中で細胞を１時間インキュベートし、１×ＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０で２回洗浄し、１×ＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０／１：１０００ ＦＩＴＣ標識抗マウス二次抗体（Ｓｉｇｍａ）中で１時間インキュベートし、さらに２回洗浄し、ＤＡＰＩで染色した。Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ２０００−Ｕ顕微鏡で蛍光画像を撮影した。そのアッセイにおける細胞の総数（ＤＡＰＩ染色によって検出）で割ったＨＣＶに感染した細胞の総数（抗ＨＣＶ抗体によって検出）をカウントすることにより、感染細胞の百分率を算出する。
【００７７】
４．３．ｐｕＥＲ及びＰＥＧ化ｐｕＥＲリポソームでのＨＣＶｃｃ感染Ｈｕｈ７．５細胞の長期処置：
ＪＣ−１  ＨＣＶｃｃ感染Ｈｕｈ７．５細胞を、１６日の期間にわたってＥＲリポソームで処置した（４ラウンドの処置）。４日ごとに、処置剤を含有する新たな培地に細胞を継代させ、細胞におけるウイルス感染、ＨＣＶｃｃ分泌、及び分泌粒子の感染力を定量した。細胞をＭＯＩ＝０．０２で感染させ、細胞における感染レベルが（コアタンパク質免疫蛍光検査によって判定して）全細胞の３０％〜４０％に達したら、処置を開始した。図６ａは、２２：６ ＥＲリポソームの異なる処置剤での１６日の処置期間にわたっての細胞におけるＨＣＶｃｃ感染レベルを示すものである。すべてのリポソーム処置剤が、Ｈｕｈ７．５細胞内でのウイルス感染の拡大を防止し、及びたった４日の処置後に感染細胞の総数の用量依存的減少をもたらした。５０μＭ ２２：６ ＥＲリポソームでの１６日処置の後、培養物において感染細胞は観察されなかった。１６日の処置全体にわたってのＨＣＶ分泌の結果（図６ｂ）は、ＨＣＶ分泌が未処置サンプルと比較して用量依存様式で減少される、類似したパターンを明示した。単一処置ラウンド後、２２：６ ＥＲリポソームは、５０μＭの濃度でＨＣＶ分泌を有意に２７％（ＳＤ＝１１．３％）減少させることが証明され；５０μＭ ２２：６ ＰＥＧ−ＥＲリポソーム処置で類似した減少が観察された（２３％、ＳＤ＝６．６％）。５０μＭ ２２：６ ＥＲリポソーム処置細胞からの第１６日の上清は、ＲＴ−ＰＣＲにより定量したとき、未処置サンプルと比較して１％未満のＨＣＶ  ＲＮＡを含有した。本発明は、いずれの理論による制限も受けないが、この結果は、この時点では感染が除去されていなかったかもしれない（ＲＮＡレベルは、バックグラウンドレベルより有意に高かった）が、リポソーム処置は、ウイルス分泌を二桁より大きく首尾よく減少させたことを示唆し得る。分泌ウイルス粒子の感染力を各継代で判定した。結果を図６ｃに提示する。ＥＲリポソームの最大効果は、５０μＭ ２２：６ ＥＲリポソームでの第１６日の処置によりゼロに（又は一切の検出可能限界より下に）低減されたウイルス感染力に対するものであった。しかし、わずか単一処置ラウンドの後、５０μＭ ２２：６ ＥＲリポソームは、ＨＣＶ感染力を９１％（ＳＤ＝２．２％）減少させた。試験した最低濃度、１μＭ、の２２：６ ＥＲリポソームでさえ、感染力を５２％（ＳＤ＝５．３％）減少させた。これは、ＥＲリポソームがウイルス感染力の強力な阻害剤であることを示唆している。
【００７８】
処置期間全体にわたって、処置したＨｕｈ７．５細胞内の遊離コレステロール及びエステル化コレステロールのレベルも定量した（それぞれ、図６ｄ及び６ｅ）。興味深いことに、遊離コレステロールレベルは、わずか１ラウンドの処置後に低下されるが、このレベルは、後続のラウンドにおいてさらに有意には減少しない。その代り、第４日から第１２日の処置においてエステル化コレステロールの用量依存的漸減が観察された。その第１２日の時点で、すべての処置においてレベルがプラトーに達するようである。未処置細胞における遊離：エステル化コレステロールの標準比率は、これらのアッセイによって検出して、おおよそ２：１であり、及び５０μＭ ２２：６ ＥＲリポソーム処置は、第４日の処置によってこの比を１．３：１ほどもの低さに低下させるが、すべての処置サンプルにおいて第１２日までに２：１比に戻る。
【００７９】
図６Ａ−Ｅは、１６日間の２２：６ ＥＲリポソームでのＪＣ−１感染Ｈｕｈ７．５細胞（ＭＯＩ＝０．０２）の処置についての実験結果を示すものである。（Ａ）処置全体を通してのＨｕｈ７．５細胞におけるＪＣ−１  ＨＣＶｃｃ感染レベル。（Ｂ）ＪＣ−１  ＨＣＶｃｃ分泌。（Ｃ）分泌されたＪＣ−１  ＨＣＶｃｃ粒子の感染力。（Ｄ）細胞内の遊離コレステロールレベル。（Ｅ）細胞内のエステル化コレステロール。データは、２回の独立した実験からの三重反復実験サンプルの平均を表す。高レベルのビリオン会合コレステロールがウイルス感染力に必要とされることは以前に立証されている（Aizaki, Morikawa et al. 2008）。従って、ＥＲリポソーム処置の結果としてのウイルス感染力の減少は、分泌された粒子のウイルス膜内のコレステロール低減の結果であり得る。この可能性を試験するために、５０μＭ ２２：６ ＥＲリポソーム処置、５０μＭ ２２：６ ＰＥＧ−ＥＲリポソーム処置及び未処置細胞から分泌されたＨＣＶｃｃを、ウイルス感染力を回復させる試みで遊離コレステロールと共にインキュベートした。
【００８０】
４．４．ＨＣＶｃｃと遊離コレステロールのインキュベーションについての方法論：
４日のインキュベーション期間の後、未処置及び５０μＭ リポソーム処置Ｈｕｈ７．５細胞から分泌されたＨＣＶｃｃ粒子のＲＮＡを、前に説明したようにＲＴ−ＰＣＲによって定量した。
【００８１】
完全ＤＭＥＭ／１０％ ＦＢＳ中での希釈によりサンプルを最低濃度に正規化した。以前に記載されている（Aizaki, Morikawa et al. 2008）ように１時間、３７℃で遊離コレステロール（Ｓｉｇｍａ）と共にＨＣＶｃｃをインキュベートし、上で説明したようなＨＣＶコアタンパク質免疫蛍光感染度アッセイのためにそれを使用して天然Ｈｕｈ７．５細胞を感染させた。
【００８２】
４．５．ｐｕＥＲ及びＰＥＧ化ｐｕＥＲリポソーム処置ＨＣＶｃｃと遊離コレステロールのインキュベーションに付随する結果：
５０μＭ ２２：６ ＥＲリポソーム処置、５０μＭ ２２：６ ＰＥＧ−ＥＲリポソーム処置及び未処置細胞から分泌されたＨＣＶｃｃを、ＲＴ−ＰＣＲによって定量し、２×１０４ ＲＮＡ コピー／ｍＬに正規化した。正規化したウイルス上清を、以前に記載されている（Aizaki, Morikawa et al. 2008）ように１時間、３７℃で、１５μｇ／ｍＬ若しくは１５０μｇ／ｍＬいずれかの最終濃度のコレステロールと共にプレインキュベートし又は未処置のまま放置し、その後、天然Ｈｕｈ７．５細胞を感染させるために使用した。
【００８３】
図７に示すように、すべてのＨＣＶｃｃ上清は、外因性コレステロール共にプレインキュベートしたとき、感染力の増加を明示したが、１５μｇ／ｍＬのコレステロールの濃度で、ＥＲリポソーム処置細胞からのＨＣＶｃｃは、未処置ＨＣＶｃｃと比較してウイルス感染力のより大きな増加をもたらした（それぞれ、無コレステロール対照の２８２％及び１３８％）。ＥＲリポソーム処置ＨＣＶｃｃへの外因性コレステロールの添加は、ウイルス感染力の有意な百分率を回復させたが、それらのレベルは、未処置ビリオンで観察されたものに匹敵しなかった。これは、ＥＲリポソーム処置細胞から分泌されるＨＣＶｃｃ粒子内にウイルス感染力を低減するさらなる欠陥がことによると存在する場合があることを示唆し得る。図７は、外因性コレステロール（１５μｇ／ｍＬ及び１５０μｇ／ｍＬの最終濃度のコレステロール）で処置した、２２：６ ＥＲリポソーム処置、ＰＥＧ化２２：６ ＥＲリポソーム処置及び未処置ＪＣ−１  ＨＣＶｃｃの感染力を示すものである。リポソームの存在下での４日のインキュベーションからウイルスサンプルを採取し、最低ＪＣ−１  ＲＮＡ濃度（定量的ＰＣＲによって決定）に正規化し、３７℃で１時間、コレステロールで前処置した。コレステロールの添加後、ウイルスサンプルを使用して天然Ｈｕｈ７．５細胞を感染させ、前に説明したようにこれらのサンプルの感染力を定量した。結果は、３回の独立した実験からの三重反復実験サンプルの平均（及びＳＤ）を表す。
【００８４】
細胞コレステロールレベルの減少が、細胞を感染させるＨＣＶｃｃの能力を低下させることも、研究により証明されている（Aizaki, Morikawa et al. 2008）。この効果は、原形質膜への局在（ＨＣＶ感染に必要とされ得るプロセス（Kapadia, Barth et al. 2007））のためにＣＤ８１とＳＲ−ＢＩ（ＨＣＶの２つの主要細胞受容体）の両方が脂質ラフトの形態でのコレステロールを必要すること（Soldaini, Wack et al. 2003；Cherukuri, Shoham et al. 2004; Rhainds, Bourgeois et al. 2004）に起因し得る可能性が高い。ＥＲリポソームが、細胞コレステロールレベルを減少させることによってＨＣＶｃｃ感染を予防することができるかどうかを調査するために、天然Ｈｕｈ７．５細胞を２２：６ ＥＲリポソームと共に４日間、前処置した後、未処置ＪＣ−１  ＨＣＶｃｃに感染させた。
【００８５】
４．６．ｐｕＥＲ及びＰＥＧ化ｐｕＥＲリポソームでのＨｕｈ７．５細胞の前処置及びＨＣＶｃｃでの感染に付随する結果：
図８は、ＥＲリポソーム前処置が、天然細胞を感染させるＨＣＶｃｃの能力の用量依存的減少を生じさせる結果となることを確証するものであり；最大効果は、５０μＭ ２２：６ ＥＲリポソーム処置で見られ、ウイルス感染力が８９％（ＳＤ＝１．９％）減少された。図８は、ＪＣ−１  ＨＣＶｃｃでの感染（ＭＯＩ＝０．５）前に４日間、２２：６ ＥＲリポソームで処置した未感染Ｈｕｈ７．５細胞についての実験の結果を示すものである。前に説明したようにウイルス感染力を定量した。結果は、３回の独立した実験からの三重反復実験サンプルの平均（及びＳＤ）を表す。データを未処置対照（１００％）に対して提示し、この値からの有意差を＊（Ｐ＜０．０５）又は＊＊（Ｐ＜０．００１）で示す。
【００８６】
５．細胞内コレステロール減少はＨＩＶに対する抗ウイルス効果を有する：
ＨＩＶが、適正な構築及び感染力をそれぞれ細胞コレステロール（脂質ラフト）及びウイルス会合コレステロールに依存することも証明されている。ＥＲリポソームがＨＩＶ−１抗ウイルス物質として作用できるかどうかを調査するために、ＰＢＭＣを３つのＨＩＶ−１初代分離株（ＬＡＩ、９３ＵＧ０６７、及び９３ＲＷ０２４）にＴＣＩＤ５０＝１００で感染させ、感染後４日間、ｐｕＥＲ及びＰＥＧ化ｐｕＥＲリポソームでの処置を続けた。ＨＩＶ分泌及び感染力をｐ２４  ＥＬＩＳＡにより細胞上清から定量した。
【００８７】
５．１．ｐｕＥＲ及びＰＥＧ化ｐｕＥＲリポソームでの処置後にＨＩＶ分泌及び感染力を定量するための方法論：
ＨＩＶ−１初代分離株細胞培養：細胞を感染させるために、４×１０５ＰＨＡ活性化ＰＢＭＣ及び１００ ＴＣＩＤ５０（組織培養感染用量５０％）の初代分離株ストックを９６ウエルプレートの各ウエルに添加した。１６時間のオーバーナイトインキュベーション後、細胞を完全ＲＰＭＩ培地で３回洗浄し、リポソームを伴う又は伴わない完全ＲＰＭＩ／ＩＬ２に再び浮遊させた。第５日に、細胞から分泌されたＨＩＶビリオンを含有する上清を回収し、それぞれについてのｐ２４濃度をｐ２４捕捉ＥＬＩＳＡによって定量した。
【００８８】
定量的ｐ２４ＥＬＩＳＡ：ｐ２４分析前にＨＩＶサンプルを１％ Ｅｍｐｉｇｅｎ（容量／容量）で不活性化した。抗ｐ２４  Ｄ７３２０抗体（Ａａｌｔｏ  Ｂｉｏｒｅａｇｅｎｔｓ、英国ダブリン）を使用してｐ２４を定量するためのＥＬＩＳＡを行って処置済上清からｐ２４を捕捉し、抗ｐ２４二次抗体［ＢＣ１０７１−ＡＰ（Ａａｌｔｏ  Ｂｉｏｒｅａｇｅｎｔｓ）］をその製造業者のプロトコルに従って使用して検出した。ＡＭＰＡＫ（商標）ＥＬＩＳＡキット（Ｄａｋｏ、英国イーリー）をその製造業者のプロトコルに従って使用して、アルカリホスファターゼ活性を測定した。組換えｐ２４タンパク質（Ａａｌｔｏ  Ｂｉｏｒｅａｇｅｎｔｓ）を使用してサンプルを標準化した。
【００８９】
ＨＩＶ感染力アッセイ：リポソームで処置したＰＢＭＣから分泌されたＨＩＶビリオンの感染力を、リポソーム処置細胞から分泌されたＨＩＶビリオンを含有する上清を使用して判定した。すべての上清を完全ＲＰＭＩ／ＩＬ２中１０ｎｇ／ｍＬの最終ｐ２４濃度に希釈し、５ｎｇ／ｍＬの最終ｐ２４濃度のために、１００μＬを、同じく１００μＬの培地中の、４×１０５ＰＨＡ活性化ＰＢＭＣに添加し、一晩、インキュベートしておいた。翌日、細胞を、説明したように洗浄し、２００μＬの新たなＲＰＭＩ／ＩＬ２に再び浮遊させ、４日間、インキュベートしておき、その後、上清を回収し、捕捉ＥＬＩＳＡによってｐ２４含有量についてアッセイした。
【００９０】
５．２．ｐｕＥＲ及びＰＥＧ化ｐｕＥＲリポソームでのＨＩＶ−１感染ＰＢＭＣの処置に付随する結果：
４日の処置後にｐ２４  ＥＬＩＳＡにより細胞上清からＨＩＶ分泌を定量した。結果は、ＨＩＶ分泌と分泌粒子の感染力の両方に関して用量依存的減少を明示した（それぞれ、図９ａ及び９ｂ）。ＨＣＶｃｃで証明されたように、抗ウイルス活性についての主要メカニズムは、感染性ビリオンの形成を減少させることによるようであり得る：５０μＭ ２２：６ ＥＲリポソーム処置で分泌ＨＩＶの感染力の５０％（ＳＤ＝４．６％）減少が観察されたのに対して、ウイルス分泌は２２％（ＳＤ＝４．６％）しか減少されなかった。
【００９１】
図９Ａは、２２：６ ＥＲリポソームでの４日の処置中のＨＩＶ−１の３つの遺伝的に異なる初代分離株（ＬＡＩ、９３ＵＧ０６７、及び９３ＲＷ０２４）の平均分泌を示すものである。捕捉ＥＬＩＳＡを使用してＨＩＶ−１  ｐ２４マトリックスタンパク質を定量することにより、ＨＩＶ−１分泌を測定した。図９Ｂは、２２：６ ＥＲリポソーム処置ＰＢＭＣから分泌されたＨＩＶ−１の感染力を示すものである。分泌されたビリオンの感染力を、その上清を使用して天然ＰＢＭＣを感染させること、その後、ｐ２４ＥＬＩＳＡを使用して感染後の分泌をモニターすることによって判定した。データは、３回の独立した実験の三重反復実験品の平均及びＳＤを表す。すべての値を未処置対照（１００％）に対しての百分率として示し、この値からの有意差を＊（Ｐ＜０．０５）又は＊＊（Ｐ＜０．００１）で示す。
【００９２】
６．多不飽和ＥＲリポソームは、細胞表面リポタンパク質受容体への結合についてＨＣＶｃｃと競合する：
低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬｒ）は、ＶＬＤＬ由来リポタンパク質粒子のカルトリン媒介エンドサイトーシスにより、コレステロールが細胞に侵入する主要経路を制御することができる、膜糖タンパク質である。ＬＤＬｒはまた、ＨＣＶ粒子がリポタンパク質と会合する、及び培養細胞によるウイルス粒子の取込みがＬＤＬｒの発現と相関するという発見に基づき、候補ＨＣＶ受容体である。リポソームが、細胞への取込みにＬＤＬｒを用いるかどうかを見るために、Ｈｕｈ７細胞におけるＬＤＬｒの発現をアップ及びダウンレギュレートすることが証明されている薬物（それぞれ、スクアレスタチン及び２５−ヒドロキシコレステロール）を使用して、ＪＣ−１  ＨＣＶｃｃ感染の存在下でＨｕｈ７．５細胞へのＥＲリポソーム取込みに対する一切の効果を観察した。
【００９３】
６．１．Ｈｕｈ７．５細胞におけるＬＤＬｒ発現をアップ及びダウンレギュレートする薬物の存在下でリポソーム取込みをモニターするための方法論：
米国特許公開第２００９０２５２７８５号に記載されているようにリポソームを調製し、１％（全モル）のｒｈ−ＰＥを、細胞へのそれらの取込みをモニターするために含めた。ＪＣ−１感染（ＭＯＩ＝０．５）又は未感染Ｈｕｈ７．５細胞を、２ｍＬの完全ＤＭＥＭ／１０％ ＦＣＳ培地中、３×１０５ 細胞／ウエルの密度で、６ウエルプレートに接種した。無血清完全ＤＭＥＭ中で２４時間、細胞を１μｍ及び１０μｍ スクアレスタチン（ＳＱ、Ｓｉｇｍａ）又は２５−ヒドロキシコレステロール（２５−ＨＣ、Ｓｉｇｍａ）で前処置した又はしなかった。２４時間のプレインキュベーション後、ｒｈ標識リポソームを５０μＭの最終脂質濃度まで添加し、さらに２４時間、インキュベートしておいた。インキュベーション時間の後、細胞を１×ＰＢＳで２回洗浄し、剥離させ、カウントし、２００μＬ １×ＰＢＳ／１％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００に再び浮遊させ、その後、９６ウエルプレートに移して分光蛍光計でλｅｘ＝５５０ｎｍ、λｅｍ＝５９０ｎｍで読み取った。
【００９４】
６．２．スクアレスタチン及び２５−ヒドロキシコレステロールの存在下でのＨｕｈ７．５細胞へのリポソーム取込みの結果：
ＳＱ又は２５ＨＣ（両方について１０μＭ及び１μＭの最終濃度）いずれかの存在下で２４時間細胞を培養した後、ローダミン標識２２：６ ＥＲリポソームを２４時間にわたって添加した。１０μＭ ２５−ＨＣでの細胞の処置は、リポソーム取込みの６９％（ＳＤ＝４．９％）減少をもたらしたのに対して、１０μｍ ＳＱは、リポソーム取込みを１１７％（ＳＤ＝１０．７％）に有意に増加させた。これは、Ｈｕｈ７．５細胞へのＥＲリポソームの取込みについてのＬＤＬｒに対する依存性を明示している（図１０）。
【００９５】
図１０は、無血清完全ＤＭＥＭ中で２４時間、リポタンパク質受容体の発現をアップレギュレート又はダウンレギュレートするために使用した薬物（それぞれ、ＳＱ及び２５−ＨＣ）の存在下でインキュベートした未感染Ｈｕｈ７．５細胞についての実験の結果を示すものである。その後、脂質二重層に関して１％ ｒｈ−ＰＥで標識した２２：６ ＥＲリポソーム（５０μＭの最終脂質濃度）を細胞に添加し、さらに２４時間、インキュベートしておいた。その後、細胞を回収し、カウントし、ｒｈ−ＰＥ蛍光をλｅｘ＝５５０ｎｍ、λｅｍ＝５９０ｎｍで測定した。すべてのデータは、３回の独立した実験からの三重反復実験品の平均及びＳＤを表す。データを未処置対照（１００％）に対して提示し、この値からの有意差を＊（Ｐ＜０．０５）又は＊＊（Ｐ＜０．００１）で示す。
【００９６】
ＨＣＶは、ＬＤＬｒを細胞受容体として使用すると考えることができるので、ＥＲリポソームもＨＣＶｃｃの感染力を、内在化に必要な細胞受容体について該ウイルスと直接競合することにより、低減することができる。この仮説を試験するために、２２：６ ＥＲリポソームをＪＣ−１  ＨＣＶｃｃと混合し、天然Ｈｕｈ７．５細胞を感染させるために使用した。結果は、ＥＲリポソームが、５μＭより高い脂質濃度を用いたとき、Ｈｕｈ７．５のＨＣＶｃｃ感染を５０％より大きく中和することができることを明示している（図１１）。最高効果は、５０μＭの最終濃度まで添加したＥＲリポソームで見られ、ウイルス感染力を８７％（ＳＤ＝２．９％）減少させた。感染のために天然細胞に添加する前にウイルス及びリポソームを１時間、プレインキュベートして、この実験を繰り返した。結果は、提示したものと事実上同一である（データを示さない）。本発明は、いずれの理論による制限も受けないが、この結果は、リポソームがＨＣＶｃｃ粒子と直接相互作用するのではなく、細胞受容体とのみ相互作用することを示唆し得る。図１１は、Ｈｕｈ７．５細胞の１時間の感染中のＨＣＶｃｃウイルスストックへの２２：６ ｐｕＥＲリポソームの添加についての実験の結果を示すものである。リポソームをウイルスストックに様々な濃度で添加し、天然Ｈｕｈ７．５細胞を感染させるために使用した。ＨＣＶコアタンパク質免疫蛍光アッセイを用いて２日のインキュベーション期間後の感染細胞数を定量することにより、ＨＣＶｃｃ感染を中和するｐｕＥＲリポソームの能力をモニターした。すべてのデータは、３回の独立した実験からの三重反復実験品の平均及びＳＤを表す。データを未処置対照（１００％）に対して提示し、この値からの有意差を＊（Ｐ＜０．０５）又は＊＊（Ｐ＜０．００１）で示す。
【００９７】
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【００９８】
上述したことは、特定の好ましい実施形態を指すが、本発明を限定しないことは理解されるだろう。通常の当業者は、開示した実施形態に様々な修飾を加えることができること、及びそのような修飾は本発明の範囲内であると解釈されることを認識するであろう。本明細書において引用した出版物、特許出願及び特許のすべては、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【配列表フリーテキスト】
【００９９】
配列番号１：合成プライマー
配列番号２：合成プライマー
【図１】
2012521981.tif 000013
【図２】
2012521981.tif 000014
【図３】
2012521981.tif 000015
【図４】
2012521981.tif 000016
【図５】
2012521981.tif 000017
【図６】
2012521981.tif 000018
【図７】
2012521981.tif 000019
【図８】
2012521981.tif 000020
【図９】
2012521981.tif 000021
【図１０】
2012521981.tif 000022
【図１１】
2012521981.tif 000023
【配列表】
2012521981000001.app
【国際調査報告】
2012521981.tif 000024
2012521981.tif 000025