【手続補正書】
【提出日】平成21年4月27日(2009.4.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  標的核酸の遺伝子型決定または配列決定の方法であって、以
下の工程：
ｉ．単一分子配置において、固体支持体上に核酸ポリメラーゼまたは該標的核
酸を固定化する工程；
ｉｉ．該固体支持体を溶液と接触させる工程であって、該溶液は以下：
（ａ）該ポリメラーゼが固定化される場合は、標的核酸、または該標的核酸が
固定化される場合は、ポリメラーゼ；
（ｂ）配列決定される領域の下流の該標的核酸の領域を相補する、プライマー
核酸；
（ｃ）各々の型の塩基が、ホスフェート部分上に示差的に標識化されるヌクレ
オチド三リン酸［ＮＰＴ］であって、該標識が、該ポリメラーゼの伸長産物への
ＮＴＰの取り込みに際して、選択的に検出可能な固有のシグナルを提供するヌク
レオチド三リン酸［ＮＰＴ］、
を含む工程；
ｉｉｉ．該ポリメラーゼに、該プライマーを、連続的に伸長させ、ＮＴＰを取
り込ませて、該標的核酸に対する相補体を作製する工程；および
ｉｖ．該標識化ＮＴＰからの該固有のシグナルを検出することにより、該プラ
イマーの伸長を決定して、該標的核酸を遺伝子型決定または配列決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】  前記溶液が、少なくとも２つの異なる型のｄＮＴＰを含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】  前記ｄＮＴＰが、γホスフェートが前記ヌクレオチドから切
除される場合に、示差的に蛍光発光する蛍光標識を用いて該γホスフェート上に
標識化される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】  前記固体支持体の表面が、ポリメラーゼまたは標的ＤＮＡの
単一分子を各々が保有する位置のアレイを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】  前記ポリメラーゼが、固体支持体上へ個々の単一分子のアレ
イとして固定化される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】  前記標的ＤＮＡが、単一ヌクレオチド多型である、請求項１
に記載の方法。
【請求項７】  前記溶液が単一ｄＮＴＰを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】  前記検出が、標的ＤＮＡの配列を提供するための異なる型の
ｄＮＴＰの連続的な検出である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】  前記ＮＴＰが、γホスフェートおよび消光部分上に蛍光団で
標識化される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】  前記検出器が光学的読み取り装置である、請求項１に記載
の方法。
【請求項１１】  前記固体支持体に接触する前記溶液が前記固定化ポリメラ
ーゼまたは標的ＤＮＡを通過して流れる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】  前記標的核酸がデオキシヌクレオチド酸であり、前記ポリ
メラーゼが、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメ
ラーゼのいずれかであり、そして前記ＮＴＰがｄＮＴＰである、請求項１に記載
の方法。
【請求項１３】  前記標的核酸が二本鎖ＤＮＡであり、そして前記ポリメラ
ーゼがＲＮＡポリメラーゼであり、そして前記ＮＴＰがｒＮＴＰである、請求項
１に記載の方法。
【請求項１４】  標的核酸を遺伝子型決定または配列決定するためのシステ
ムであって、以下：
ｉ．単一分子配置において固定化核酸ポリメラーゼまたは該標的核酸を保有す
る表面を有する固体支持体；
ｉｉ．該表面に接触させるための溶液であって、以下：
（ａ）該ポリメラーゼが固定化される場合は、標的核酸、または該標的核酸が
固定化される場合は、ポリメラーゼ；
（ｂ）モル過剰のヌクレオチド三リン酸［ＮＴＰ］であって、各々の型のＮＴ
Ｐ塩基が、ホスフェート部分上に示差的に標識化され、そしてここで該標識が、
ポリメラーゼ伸長産物中への該ＮＴＰの取り込みに際して選択的に検出され得る
固有のシグナル提供する、モル過剰のヌクレオチド三リン酸［ＮＴＰ］を含む、
溶液
を備える、システム。
【請求項１５】  請求項１４に記載のシステムであって、ここで前記ポリメ
ラーゼがＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼであり、前記標的核酸がＤＮＡであり
、そして前記ＮＴＰがｄＮＴＰであり、該システムが、配列決定される領域の下
流で該標的核酸の領域に相補的であるプライマー核酸をさらに備える、システム
。
【請求項１６】  前記表面が、固定化ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを保
有する、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１７】  前記溶液が、少なくとも２つの異なる型のｄＮＴＰを含む
、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１８】  前記固体支持体の表面が、単一分子のポリメラーゼまたは
標的核酸を各々が保有する位置のアレイを備える、請求項１４に記載のシステム
。
【請求項１９】  前記固体支持体の表面が、単一分子のポリメラーゼを各々
が保有する位置のアレイを備える、請求項１４に記載のシステム。
【請求項２０】  γホスフェートが前記ヌクレオチドから切除される場合に
、前記ＮＴＰが、示差的に蛍光発光する蛍光標識を用いて、該γホスフェートに
標識化される、請求項１４に記載のシステム。
【請求項２１】  前記標的核酸がＤＮＡであり、そしてここで該ＤＮＡが、
野生型ＤＮＡ由来の単一ヌクレオチド多型を有する、請求項１４に記載のシステ
ム。
【請求項２２】  前記溶液が単一のｄＮＴＰを含む、請求項１４に記載のシ
ステム。
【請求項２３】  前記ポリメラーゼがＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼであ
り、前記標的核酸がＲＮＡであり、そして前記ＮＴＰがｄＮＴＰである、請求項
１４に記載のシステム。
【請求項２４】  前記ポリメラーゼがＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであ
り、前記標的核酸が二本鎖ＤＮＡであり、そして前記ＮＴＰがｒＮＴＰである、
請求項１４に記載のシステム。
【請求項２５】  光学的読み取り装置をさらに備える、請求項１４に記載の
システム。
【請求項２６】  請求項１４に記載のシステムであって、該システムは、電
極をさらに備え、該電極は、前記溶液の流れを、前記固定化ポリメラーゼまたは
標的核酸に接触させるために十分な、前記固体支持体を横切る電圧勾配を提供す
るように配置される、システム。
【請求項２７】  表面を有する固体支持体であって、該固体支持体は、表面
を有し、ここで該表面が、これに結合される核酸ポリメラーゼアレイを有し、こ
こで該アレイのメンバーがポリメラーゼの個々の分子からなる、固体支持体。
【請求項２８】  前記アレイのメンバーがアドレス指定されている、請求項
２５に記載の固体支持体。
【請求項２９】  前記ポリメラーゼがＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼであ
る、請求項２５に記載の固体支持体。
【請求項３０】  前記ポリメラーゼがＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであ
る、請求項２５に記載の固体支持体。
【請求項３１】複数の標的核酸分子を配列決定するための方法であって、該方法は、
該複数の標的核酸分子を、複数の型のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含む重合反応に供し、それぞれの標的核酸分子に相補的な伸長核酸鎖の集団を得る工程であって、ここで該標的核酸分子および／または核酸ポリメラーゼは支持体に付着されており、該ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログの少なくとも１つの型は、組み込みの間に放出されるヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ部分に結合された第一の原子タグまたは分子タグを含む、工程；および
組換え事象の時間順序を光学的に同定する工程であって、該組み込み事象のうちの少なくとも１つは、該タグ付けされたヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログの、該集団における少なくとも１つの伸長核酸鎖への組み込みに関し、ここで、タグ付けされたヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログに関する各事象は、該第一のタグの検出可能特性における変化によって特徴付けられる、方法。
【請求項３２】複数の標的核酸を配列決定するための方法であって、該方法は、
該複数の標的核酸分子を、複数の型のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログの存在下で重合反応に供し、それぞれの標的核酸分子に相補的な伸長核酸鎖の集団を得る工程であって、ここで該標的核酸分子および／または核酸ポリメラーゼは支持体に付着されており、少なくとも１つの型のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログは、組み込みの間に放出されるヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ部分に結合された第一の原子タグまたは分子タグを含む、工程；および
組み込み事象の時間順序を、リアルタイムまたはほぼリアルタイムで光学的に同定する工程であって、該組み込み事象のうちの少なくとも１つは、該タグ付けされたヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログの、該集団における少なくとも１つの伸長核酸鎖への組み込みに関し、ここで、タグ付けされたヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログに関する各事象は、該第一のタグの検出可能特性における変化によって特徴付けられる、方法。
【請求項３３】前記ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項３４】前記ポリメラーゼは、熱安定性ポリメラーゼまたは熱分解性ポリメラーゼである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】前記標的核酸分子は、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡへアピン、およびＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドからなる群より選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】前記ヌクレオチドアナログは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、ペプチドヌクレオチド、修飾ペプチドヌクレオチド、および修飾ホスフェート−糖骨格ヌクレオチドからなる群より選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】前記タグ付けされたヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ型はさらに、１つのさらなるタグまたは複数のさらなるタグを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】前記第一のタグは、発色体、蛍光部分、色素、および蛍光ナノ粒子からなる群より選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３９】前記さらなるタグまたは前記複数のさらなるタグは、塩基、糖部分、またはホスフェートにおいて前記ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログに付着される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】各ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログ型は第一のタグを含み、該第一のタグにより、該ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ型が前記同定工程の間識別可能になる、請求項３１に記載の方法。
【請求項４１】前記複数のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログのうちの３つまたはそれ未満が、異なるタグを有する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】異なる型の前記ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログが、同一のタグを有するが、該ヌクレオチドもしくはヌクレオチドアナログの異なる特性、および／または該タグの発光特性によって識別可能である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４３】同定する工程が、蛍光エネルギー移動のレベルにおける変化を検出することによって実施される、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項４４】前記同定する工程が、スペクトル波長判別、蛍光持続時間の測定および分離、蛍光団同定、バックグラウンド抑制、またはそれらの組み合わせによって実施される、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項４５】前記複数の標的核酸が、前記支持体に付着されている、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項４６】各標的核酸は、前記支持体に付着された別個のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされる、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項４７】前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記支持体に付着されている、請求項３３に記載の方法。
【請求項４８】前記同定する工程が、遊離ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログから生じるバックグラウンドノイズを減少することによって実施される、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項４９】前記タグは、前記ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログの末端ホスフェートに付着される、請求項３１に記載の方法。
【請求項５０】前記同定する工程は、前記ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログに付着された前記タグを検出することによって行われる、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】前記ポリメラーゼは３’から５’へのエキソヌクレオチド活性を欠く、請求項３３に記載の方法。