【手続補正書】
【提出日】平成22年10月1日(2010.10.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の名称
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の名称】ビタミンＫエポキシド還元酵素複合体サブユニット１  ＶＫＯＲＣ１、クマリンおよびその誘導体の治療標的
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、クマリンおよびその誘導体の標的となる、新規ポリペプチド、ビタミンＫエポキシド還元酵素複合体サブユニット１（ＶＫＯＲＣ１）に関する。本発明はさらに、クマリン誘導体を同定する方法を提供し、ＶＫＯＲＣ１関連欠乏症、例えば、ワルファリン耐性と関連する配列異常を含むＶＫＯＲＣ１ポリペプチドおよびＶＫＯＲＣ１核酸であって、これらの欠乏症の診断に用いることが可能なＶＫＯＲＣ１ポリペプチドおよびＶＫＯＲＣ１核酸の特許も主張する。さらに、本発明は、げっ歯類の駆除に使用が可能なクマリン誘導体を同定する方法に関する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
（発明の要旨）
前述の目的を解決する試みにおいて、下記の群から選択されるポリペプチド配列を含む、または該配列から成るビタミンＫエポキシド還元酵素複合体サブユニット１（ＶＫＯＲＣ１）が提供される。
（ａ）配列番号１、１２、１７、２１、２５、および２７による配列からなる群から選択されるポリペプチド配列；
（ｂ）（ａ）に規定されるポリペプチド配列の、対立遺伝子のポリペプチド配列；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）に規定されるポリペプチド配列に対して少なくとも８０％の相同性を有し、ＶＫＯＲＣ１活性を有するポリペプチド配列；
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に定義され、ＶＫＯＲＣ１活性を有するポリペプチド配列のフラグメントのポリペプチド配列。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
さらに、本発明の別の局面によれば、ワルファリン耐性げっ歯類に対して毒物学的に有効なクマリン誘導体を同定する方法であって、
（Ｉ）ワルファリン耐性げっ歯動物を提供する工程；
（ＩＩ）該げっ歯動物に候補クマリン誘導体を投与する工程；
（ＩＩＩ）げっ歯動物に対する候補クマリン誘導体の毒性（候補クマリン誘導体毒性値）を決定する工程；
（ＩＶ）候補クマリン誘導体毒性値をコントロールクマリン毒性値と比較する工程；
（Ｖ）候補クマリン誘導体毒性値が、コントロールクマリン毒性値よりも有意に大きい場合、その候補クマリン誘導体を、げっ歯類殺作用において効果的なクマリン誘導体であると同定する工程、
を含む方法が提供される。
本発明の別の局面によれば、特定されたクマリン誘導体は、げっ歯類を殺すための組成物に含めることも可能である。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
哺乳動物における、クマリンおよびその誘導体の標的としてのビタミンＫエポキシド還元酵素複合体サブユニット１（ＶＫＯＲＣ１）であって、
（ａ）配列番号１、１２および１７に記載の配列からなる群から選択されるポリペプチド配列；
（ｂ）（ａ）に規定されるポリペプチド配列の、対立遺伝子のポリペプチド配列；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）に規定されるポリペプチド配列に対して少なくとも８０％の相同性を有し、ここで、該ポリペプチド配列がＶＫＯＲＣ１活性を有する、ポリペプチド配列；
（ｄ）ＶＫＯＲＣ１活性を有し、（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に規定されるポリペプチド配列のフラグメントのポリペプチド配列、
からなる群から選択されるポリペプチド配列を含む、ビタミンＫエポキシド還元酵素複合体サブユニット１（ＶＫＯＲＣ１）。
（項目２）
ＶＫＯＲＣ１核酸であって、
（ａ）項目１のＶＫＯＲＣ１ポリペプチドをコードする核酸配列；
（ｂ）配列番号２、１３および１８に記載の配列からなる群から選択される核酸配列；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）に規定される核酸配列に対してストリンジェントな条件の下にハイブリダイズする核酸配列であって、ここで、ＶＫＯＲＣ１活性を有するポリペプチドをコードする、核酸配列；
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に規定される核酸に対して、遺伝子コードの縮重がなければ、ハイブリダイズし得る核酸配列であって、ここで、該核酸配列がＶＫＯＲＣ１活性を有するポリペプチドをコードする、核酸配列；および、
（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）に規定される核酸配列のフラグメントであって、ここで、該フラグメントがＶＫＯＲＣ１活性を有するポリペプチドをコードするフラグメント、
からなる群から選択される核酸配列を含む、ＶＫＯＲＣ１核酸。
（項目３）
融合タンパクであって、
（ａ）項目１のＶＫＯＲＣ１ポリペプチド、または、項目２のＶＫＯＲＣ１核酸によってコードされるポリペプチド、および
（ｂ）異種部分
を含む、融合タンパク。
（項目４）
項目２のＶＫＯＲＣ１核酸を含むベクター。
（項目５）
前記ベクターが発現ベクターである、項目４のベクター。
（項目６）
前記ベクターがノックアウト遺伝子構築物である、項目４または５のベクター。
（項目７）
項目２のＶＫＯＲＣ１核酸、または項目４〜６のいずれか１項のベクターを含む、宿主細胞。
（項目８）
非ヒト胚性幹細胞である、項目７の宿主細胞。
（項目９）
項目８の宿主細胞を含む、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
（項目１０）
項目２のＶＫＯＲＣ１核酸に対する、ＤＮＡプローブまたはＲＮＡプローブ。
（項目１１）
項目２のＶＫＯＲＣ１核酸に対するＰＣＲプライマーであって、好ましくは、配列番号５３〜６９および７０に記載のＰＣＲプライマーからなる群から選択される、ＰＣＲプライマー。
（項目１２）
項目２のＶＫＯＲＣ１核酸に対する低分子干渉性ＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ）または短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であって、好ましくは、配列番号２９、３０、３３、３４、３７、３８、４１、４２、４５、４６、４９および５０からなる群から選択される、ｓｉＲＮＡ。
（項目１３）
項目２のＶＫＯＲＣ１核酸に対する、アンチセンスＲＮＡまたはアンチセンスＤＮＡ。
（項目１４）
項目１のＶＫＯＲＣ１ポリペプチドに対するＲＮＡアプタマーであって、該ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの活性に対して作用を及ぼす、ＲＮＡアプタマー。
（項目１５）
項目１のＶＫＯＲＣ１ポリペプチドを特異的に認識し、結合する、抗体またはそのフラグメント。
（項目１６）
ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドを生産する方法であって、
（Ｉ）項目２のＶＫＯＲＣ１核酸、または、項目４〜６のいずれか１項のＶＫＯＲＣ１核酸を含むベクターを導入された宿主細胞を提供する工程；
（ＩＩ）該宿主細胞において該ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドを発現する工程；
（ＩＩＩ）該宿主細胞から該ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドを単離する工程、
を包含する、方法。
（項目１７）
項目１のＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの活性に作用を及ぼすクマリン誘導体を同定する方法であって、
（Ｉ）ＶＫＯＲＣ１核酸、または、該ＶＫＯＲＣ１核酸を含むベクターを導入された宿主細胞を提供する工程；
（ＩＩ）該宿主細胞において該ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドを発現する工程；
（ＩＩＩ）候補クマリン誘導体を投与する工程；
（ＩＶ）該ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの活性（候補活性値）を決定する工程；
（Ｖ）該候補活性値をコントロール活性値と比較する工程；および、
（ＶＩ）該候補活性値が該コントロール活性値と有意に異なる場合、該候補クマリン誘導体を、該ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの活性に対して作用を及ぼすクマリン誘導体であると同定する工程、
を包含する、方法。
（項目１８）
項目１７の方法であって、前記コントロール活性値は、
（Ａ）工程（Ｉ）に従って宿主細胞を提供する工程；
（Ｂ）該宿主細胞において前記ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドを発現する工程；および、
（Ｃ）該ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの活性（コントロール活性値）を決定する工程
を包含する方法によって決定される、方法。
（項目１９）
項目１７の方法であって、前記決定されたＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの活性は、ビタミンＫ２，３−エポキシドのビタミンＫキノンへのジチオスレイトール依存性変換であり、ここで、前記有意に異なる活性値は、前記コントロール活性値よりも有意に高い候補活性値である、方法。
（項目２０）
項目１７の方法であって、少なくとも１つのさらなる化合物が前記宿主細胞に導入され、該化合物は、ビタミンＫ、シトクロームＢ５、ならびにγ−グルタミル−カルボキシラーゼ、ミクロソームのエポキシデヒドロラーゼ、カルメニン、またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼをコードする核酸とからなる群から選択される、方法。
（項目２１）
ＶＫＯＲＣ１活性に対して発揮されるクマリン作用を伝えるＶＫＯＲＣ１ポリペプチド配列を決定する方法であって、
（Ｉ）少なくとも１つの配列異常を有する、項目１のＶＫＯＲＣ１ポリペプチドを発現する細胞を提供する工程；
（ＩＩ）クマリンまたはその誘導体を該細胞に投与する工程；
（ＩＩＩ）該ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの活性（配列異常活性値）を決定する工程；および、
（ＩＶ）該配列異常活性値を、コントロール配列活性値と比較する工程を包含し、
ここで、該コントロール配列活性値に対する、該配列異常活性値の有意な偏差は、該ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの配列異常が、該ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドに対して発揮されるクマリン作用を伝えることの指標である、方法。
（項目２２）
項目２１の方法であって、前記コントロール配列活性値は、
（Ｉ）項目１のＶＫＯＲＣ１ポリペプチドを発現する細胞を提供する工程；
（ＩＩ）クマリンまたはその誘導体を該細胞に投与する工程；および、
（ＩＩＩ）該ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの活性（コントロール配列活性値）を決定する工程
を包含する方法によって決定される、方法。
（項目２３）
項目２１の決定方法であって、前記決定された活性は、ビタミンＫ２，３−エポキシドのビタミンＫキノンへのジチオスレイトール依存性変換であり、ここで、前記有意に異なる値とは、前記コントロール配列活性値よりも有意に高い配列異常活性値である、方法。
（項目２４）
項目２１の方法であって、少なくとも１つのさらなる化合物が前記細胞に導入され、該化合物は、ビタミンＫ、シトクロームＢ５、ならびにγ−グルタミル−カルボキシラーゼ、ミクロソームのエポキシデヒドロラーゼ、カルメニン、またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼをコードする核酸とからなる群から選択される、方法。
（項目２５）
項目１のＶＫＯＲＣ１ポリペプチドであって、該ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの活性に対して作用を及ぼす、少なくとも１つの配列異常を含む、ＶＫＯＲＣ１ポリペプチド。
（項目２６）
項目２５のＶＫＯＲＣ１ポリペプチドであって、該ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドは、配列番号１または１２に記載のポリペプチドであり、かつ、前記配列異常は、Ｖ２９Ｌ、Ｖ４５Ａ、Ｒ５８Ｇ、Ｒ９８Ｗ、Ｌ１２８Ｒ，およびＹ１３９Ｃからなる群から選択される、ポリペプチド。
（項目２７）
ＶＫＯＲＣ１核酸であって、
（ａ）項目２５または２６のＶＫＯＲＣ１ポリペプチドをコードする核酸；
（ｂ）配列番号３、４、５、６、７、１４および９４に記載の配列からなる群から選択される核酸配列；および、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）に規定される核酸に対して、遺伝子コードの縮重がなければ、ハイブリダイズし得る核酸配列であって、ここで、該核酸配列が、項目２５または２６のポリペプチドをコードする、核酸配列、
からなる群から選択される、核酸。
（項目２８）
項目２７のＶＫＯＲＣ１核酸を含むベクター。
（項目２９）
項目２７のＶＫＯＲＣ１核酸に対するＤＮＡプローブまたはＲＮＡプローブ。
（項目３０）
項目２７のＶＫＯＲＣ１核酸に対するＰＣＲプライマー。
（項目３１）
項目２５または２６のＶＫＯＲＣ１ポリペプチドを特異的に認識し、結合する、抗体またはそのフラグメント。
（項目３２）
トランスジェニック非ヒト哺乳動物であって、項目２７のＶＫＯＲＣ１核酸、または項目２８に記載のベクターを含む幹細胞を含む、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
（項目３３）
項目２７のＶＫＯＲＣ１核酸、項目２９のＤＮＡプローブまたはＲＮＡプローブ、項目３０のＰＣＲプライマー、および項目３１の抗体からなる群から選択される化合物を含む、診断薬。
（項目３４）
患者においてＶＫＯＲＣ１関連欠乏症を診断する方法であって、
（Ｉ）該患者から得られたＤＮＡサンプルを増幅するか、または該患者から得られたＲＮＡサンプルを逆転写してＤＮＡとし、該ＤＮＡを増幅する工程；および、
（ＩＩ）工程（Ｉ）の増幅されたＤＮＡを分析し、項目１のＶＫＯＲＣ１ポリペプチドをコードする核酸配列において、または、該ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドのアミノ酸配列において少なくとも１つの配列異常を決定する工程を包含し、
ここで、該決定される配列異常は、該患者が、ＶＫＯＲＣ１関連欠乏症に罹患すること、好ましくはワルファリン耐性を患っていることの指標である、方法。
（項目３５）
項目３４の方法であって、前記増幅されたＤＮＡは、配列番号１に記載のＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの少なくとも部分配列をコードし、ここで、前記配列異常は、Ｖ２９Ｌ、Ｖ４５Ａ、Ｒ５８Ｇ、Ｒ９８Ｗ、Ｌ１２８ＲおよびＹ１３９Ｃからなる群から選択される、方法。
（項目３６）
項目３４の方法であって、前記増幅されたＤＮＡは、ＰＣＲベースの分析、制限消化分析、およびＤＮＡ配列決定分析からなる群から選択される技術によって分析される、方法。
（項目３７）
患者においてＶＫＯＲＣ１関連欠乏症を診断する方法であって、
（Ｉ）該患者からのサンプルを提供する工程；および、
（ＩＩ）項目３１の抗体を用いて、該サンプルにおいて配列異常を有するＶＫＯＲＣ１ポリペプチドを検出する工程を包含し、
ここで、決定される配列異常は、該患者が、ＶＫＯＲＣ１関連欠乏症に罹患することの指標である、方法。
（項目３８）
項目３７の方法であって、前記サンプルは、免疫組織化学的検出、イムノブロッティング、好ましくはウェスタンブロッティング、およびＥＬＩＳＡからなる群から選択される技術によって分析される、方法。
（項目３９）
少なくとも１つの配列異常を有するＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの活性に対して抑制作用を及ぼすクマリン誘導体を同定する方法であって、
（Ｉ）項目２５または２６に記載のＶＫＯＲＣ１ポリペプチド、好ましくは、配列番号３、４、５、６、７、１４および９４からなる群から選択される配列によってコードされるポリペプチドを発現する細胞を提供する工程；
（ＩＩ）候補クマリン誘導体を該細胞に投与する工程；
（ＩＩＩ）該ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの活性（配列異常活性値）を決定する工程；および、
（ＩＶ）該配列異常活性値を、コントロール配列活性値と比較する工程、
（Ｖ）該候補クマリン誘導体の投与が、該コントロール配列活性値よりも有意に低い配列異常活性値をもたらす場合、該候補クマリン誘導体を、ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの活性に対して抑制作用を及ぼすクマリン誘導体として同定する工程、
を包含する、方法。
（項目４０）
ワルファリン耐性げっ歯動物において毒物学的に有効なクマリン誘導体を同定する方法であって、
（Ｉ）ワルファリン耐性げっ歯動物を提供する工程；
（ＩＩ）該げっ歯動物に候補クマリン誘導体を投与する工程；
（ＩＩＩ）該げっ歯動物に対する該候補クマリン誘導体の毒性（候補クマリン誘導体毒性値）を決定する工程；
（ＩＶ）該候補クマリン誘導体毒性値をコントロールクマリン毒性値と比較する工程；
（Ｖ）該候補クマリン誘導体毒性値が、該コントロールクマリン毒性値よりも有意に大きい場合、該候補クマリン誘導体を、毒物学的に有効なクマリン誘導体であると同定する工程、
を包含する、方法。
（項目４１）
項目４０の方法であって、ワルファリン耐性げっ歯動物は、項目１のＶＫＯＲＣ１ポリペプチドについてトランスジェニックなげっ歯動物であり、該ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドは、ワルファリン耐性を引き起こす少なくとも１つの配列異常を含む、好ましくは、配列番号１４に記載の配列によってコードされるポリペプチドを含む、方法。
（項目４２）
項目４０の方法であって、ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドは、配列番号１２に記載のポリペプチドであり、かつ、配列異常は、Ｖ２９Ｌ（８５Ｇ＞Ｔ）、Ｖ４５Ａ（１３４Ｔ＞Ｃ）、Ｒ５８Ｇ（１７２Ａ＞Ｇ）、Ｒ９８Ｗ（２９２Ｃ＞Ｔ）、およびＬ１２８Ｒ（３８３Ｔ＞Ｇ）、およびＹ１３９Ｃ（４１６Ａ＞Ｇ）からなる群から選択される、方法。
（項目４３）
げっ歯類を殺す組成物であって、項目３９〜４１のいずれか１項に記載の方法によって同定されたクマリン誘導体のげっ歯類を殺すのに有効な量を含む、組成物。
（項目４４）
配列番号８８〜９１に記載のＰＣＲプライマーの使用であって、ラットから得たサンプルにおいて、該ラットがワルファリン耐性遺伝子型を有するか否かを決定するための、使用。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
【図１】図１は、ヒト、ラット、およびマウスにおけるＶＫＯＲＣ１遺伝子座位を含む遺伝子マップにおける３ｃＭの候補間隔の比較を示す。ヒト染色体１６のイディオグラムが示される。ファミリー１および２のホモ接合体領域は、ほぼ２５Ｍｂに相当する１６ｐ１１．２から１６ｑ１３まで延びる。図の右側に、マウスとラット染色体の相同部位がある。１６ｐ１１．２および１６ｑ１２．１の合成遺伝子が、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ（ＭＭＵ）およびＲａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ（ＲＮＯ）の対応する相同遺伝子と共に描かれている。マウス（Ｗａｒ）およびラット（Ｒｗ）におけるワルファリン耐性表現型の座位は、１６ｐ１１．２に相同な領域にマップされる。ＭＭＵ：Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ；ＲＮＯ：Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ；ＰＲＫＣＢ１；Ｐｒｋｃｂ；ＩＬ４Ｒ：インターロイキン４受容体（ヒトにおける）；Ｉｌ４ｒａ：インターロイキン４受容体（マウスにおける）；Ｉｌ４ｒ：インターロイキン４受容体（ラットにおける）；ＳＰＳ２：セレノフォスフェート合成酵素（ヒト）；Ｓｐｓ２：セレノフォスフェート合成酵素（マウス／ラット）；ＨＵＭＭＬＣ２Ｂ：ミオシン軽鎖２（ヒト）；Ｍｙｌｐｆ：ミオシン軽鎖２（マウス）；Ｍｙｌ２：ミオシン軽鎖２（ラット）；ＳＰＮ：シアロフォリン（ヒト）；Ｓｐｎ：シアロフォリン（マウス／ラット）
【図２】図２は、ヒトのビタミンＫ依存性凝固因子２（ＶＫＣＦＤ２）およびワルファリン耐性（ＷＲ）患者におけるＶＫＯＲＣ１突然変異を示す。図の上方部分は、二つのＶＫＣＦＤ２家系におけるＲ９８Ｗ突然変異の分離を示し、コントロール（右）と比べた場合のホモ接合の突然変異体（左）のエレクトロフェログラムを示す。図の下方部分は、４人のＷＲ患者（８５Ｇ＞Ｔ、１３４Ｔ＞Ｃ、１７２Ａ＞Ｇ、３８３Ｔ＞Ｇ）およびＲｗラット（４１６Ａ＞Ｇ）のヘテロ接合の突然変異を示す。
【図３】図３は、ＶＫＯＲＣ１および、ＶＫＯＲＣ１様タンパク１（ＶＫＯＲＣ１Ｌ１）ポリペプチド同士の配列アラインメントを示す。このアラインメントは、ＣＬＵＳＴＡＬＷおよびＰＲＥＴＴＹＢＯＸによって作成した。ヒト（ｈＶＫＯＲＣ１）、マウス（ｍＶＫＯＲＣ１）、およびラットＶＫＯＲＣ１（ｒＶＫＯＲＣ１）、および、ＶＫＯＲＣ１Ｌ１ポリペプチド、すなわち、ヒト（ｈＶＫＯＲＣ１Ｌ１）、マウス（ｍＶＫＯＲＣ１Ｌ１）、およびＦｕｇｕ  ｒｕｂｒｉｐｅｓ（ｆＶＫＯＲＣ１Ｌ１）のＶＫＯＲＣ１Ｌ１は、両タンパク群内において約８４％の配列同一性を分かち有し、両タンパク群間において約５０％の同一性を分かち持っている。ｘＶＫＯＲＣ１は、Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ（アフリカツメガエル）のＶＫＯＲＣ１ポリペプチド配列を示し、ｆＶＫＯＲＣ１は、Ｆｕｇｕ  ｒｕｂｒｉｐｅｓ（トラフグ）のＶＫＯＲＣ１ポリペプチド配列を示し、ａＶＫＯＲＣ１は、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｇａｍｂｉａｅ（ハマダラカ）のＶＫＯＲＣ１ポリペプチド配列を示す。ツリー分析によって、Ｆｕｇｕ  ｒｕｂｒｉｐｅｓ、Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ、およびＡｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｇａｍｂｉａｅのタンパクは、適当な群にまとめることを可能にする。予測された膜貫通ドメインの位置に下線を付けている。ＷＲ患者において突然変異を示した残基２９、４５、５８、および１２８は、全ての動物種において保存されていた。ＶＫＣＦＤ２患者において突然変異を示した９８位置におけるアルギニンは、ヒト、ラット、およびマウスにおいて保存されている（プラス符号）。
【図４】図４は、ヒトの胎児および成人組織におけるＶＫＯＲＣ１のノーザンブロット分析を示す。上のブロットは、成人組織のノーザンブロットを示し、一方、下のブロットは、胎児組織のノーザンブロットを示す。さらに詳細については実施例４を参照されたい。サイズ２．４、４．４、７．５、および９．５ＫＢのフラグメントによる線は、分子量マーカーを示し、全ての可視的バンドのサイズの推定を可能とする。
【図５】図５は、ＶＫＯＲＣ１の細胞内局在を示す。さらに詳細については、実施例６を参照されたい。このために、ＣＯＳ−７細胞を一過性にＶＫＯＲＣ１構築物でトランスフェクトし、それぞれ、抗カルネキシン（赤：左側カラム）、および、抗ＧＦＰまたは抗ｍｙｃ（緑：中央カラム）で染色した。二重染色細胞の合体させた図を右側カラムに示す。両ＶＫＯＲＣ１構築物とも（ＧＦＰまたはｍｙｃ標識）、ＥＲ特異的カルネキシン染色と共通局在を示す。コントロール構築物（ｐＥＧＦＰ−Ｎ１）は、原形質全体に渡って拡散的な染色パターンを示す。
【図６−１】図６は、ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓのＶＫＯＲＣ１に対するｓｉＲＮＡおよび、例えば、ｓｉＬｅｎｔＧｅｎｅ（商標）Ｕ６カセットＲＮＡ干渉システムを用いてｓｉＲＮＡを発現させる際に使用が可能な、これらｓｉＲＮＡをコードするプライマーのリストを示す。
【図６−２】図６は、ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓのＶＫＯＲＣ１に対するｓｉＲＮＡおよび、例えば、ｓｉＬｅｎｔＧｅｎｅ（商標）Ｕ６カセットＲＮＡ干渉システムを用いてｓｉＲＮＡを発現させる際に使用が可能な、これらｓｉＲＮＡをコードするプライマーのリストを示す。
【図７】図７は、ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓのビタミンＫエポキシド還元酵素複合体サブユニット１（Ｈｓ＿ＶＫＯＲＣ１）のコード配列におけるｓｉＲＮＡ標的の位置を示す。該位置は明るい灰色で示す。二つの可能なｓｉＲＮＡ標的の一部となる領域は、より暗い灰色で示す。２個以上の可能なｓｉＲＮＡ配列を含む領域は、さらに暗い灰色で示す。
【図８】図８は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓのＶＫＯＲＣ１およびＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓのＶＫＯＲＣ１Ｌ１増幅のための、ＰＣＲプライマー配列およびＰＣＲ条件のリストを示す。
【図９−１】図９は、配列、およびそれぞれの配列番号のリストを示す。
【図９−２】図９は、配列、およびそれぞれの配列番号のリストを示す。
【図９−３】図９は、配列、およびそれぞれの配列番号のリストを示す。
【図９−４】図９は、配列、およびそれぞれの配列番号のリストを示す。
【図９−５】図９は、配列、およびそれぞれの配列番号のリストを示す。
【図９−６】図９は、配列、およびそれぞれの配列番号のリストを示す。
【図１０】図１０は、ＶＫＯＲＣ１  ｃＤＮＡによってトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞のＶＫＯＲ活性を示す。数値は、ビタミンＫキノンに変換されたビタミンＫエポキシドのパーセント（産物／残留基質＋産物）として表される。野生型ＶＫＯＲＣ１活性も、ワルファリンに対する感受性によって規定される（抑制されないものと比べると、８０μＭワルファリンにおいて４．３％の残留活性）。ワルファリン耐性をもたらす突然変異Ｙ１３９ＣおよびＶ２９Ｌは、それぞれ、８０μＭワルファリンにおいて６９および１１％残留活性を示す）。試験は全て二重に行った。トランスフェクトされない細胞および擬似トランスフェクト細胞は、１．４９％および０．９６％の活性を示し、１０μＭワルファリンによって＞９０％抑制された。詳細については実施例７を参照されたい。
【図１１】図１１は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓのビタミンＫエポキシド還元酵素複合体サブユニット１のアミノ酸配列（ＨＳ＿ＶＫＯＲＣ１：配列番号１）を示す。
【図１２】図１２は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓのビタミンＫエポキシド還元酵素複合体サブユニット１の核酸のコード配列（ＨＳ＿ＶＫＯＲＣ１：配列番号２）を示す。
【図１３】図１３は、試験ラットがワルファリン耐性を有するかどうかを決めるために行ったＡＲＭＳ−ＰＣＲ実験の結果を示す。野生型ラットは、１２３ｂｐにおいてバンドを示した（プローブ番号３３５１、３１３３、３１３７、３１４２、４７２４、４６８４、３１３８、３１６２）。突然変異（プローブ番号４７０１）に対してホモ接合のラットは、１０１ｂｐにおいてバンドを示した。最後に、ヘテロ接合の突然変異を有するラット（プローブ番号３０６６、３３５０、３３５２、３３５４、３１３９、３１４０、４７５４、３１４６、３１４８、３１４９）は、２本のバンド、一本は１０１において、もう一本は１２３ｂｐにおいて示した。詳細は実施例９を参照されたい。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
（発明の詳細な説明）
新規クマリン誘導体の開発の必要性、クマリンおよびその誘導体の標的の特定の必要性に応えるために、ビタミンＫエポキシド還元酵素複合体サブユニット１（ＶＫＯＲＣ１）をクローニングした。この遺伝子は、今まで知られていない５１２６ｂｐのゲノム領域に及び、１６３個のアミノ酸から成るタンパクをコードする３個のエキソンを含んでいた。トポロジー分析から、少なくとも２個の膜貫通ドメインを有する、疎水性の高いタンパクであることが示唆される。これは、ＶＫＯＲＣ１複合体の活性がＥＲ膜に局在するという既知の事実、および、ＶＫＯＲＣ１構築物によってトランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞の免疫蛍光染色データ（図５）とも一致する。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
本発明の一つの局面では、下記からなる群から選択されるポリペプチド配列を含む、または、好ましくは該配列から成るビタミンＫエポキシド還元酵素複合体サブユニット１（ＶＫＯＲＣ１）が提供される。
（ａ）配列番号１、１２、１７、２１、２５、および２７による配列からなる群から選択されるポリペプチド配列；
（ｂ）（ａ）に規定されるポリペプチド配列の、対立遺伝子のポリペプチド配列；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）に規定されるポリペプチド配列に対して少なくとも８０％の相同性を有し、ＶＫＯＲＣ１活性を有するポリペプチド配列；
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に定義され、ＶＫＯＲＣ１活性を有するポリペプチド配列のフラグメントのポリペプチド配列。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１８】
驚くべきことに、調査した全てのＶＫＣＦＤ２およびＷＲ被験者において、機能不明の遺伝子にミスセンス突然変異が認められた（図２）。この遺伝子（ＩＭＡＧＥ３４５５２００）は、５１２６ｂｐのゲノム領域に広がっており、１６３個のアミノ酸から成るタンパクをコードする３個のエキソンを含む。これを、ビタミンＫエポキシド還元酵素複合体サブユニット１（ＶＫＯＲＣ１）と名づけた。無関係のＶＫＣＦＤ２患者、および同様の病気を有する兄弟達のいずれも第３エキソン（２９２Ｃ＞Ｔ）に同じホモ接合の点突然変異を抱えているが、一方、両親はヘテロ接合であることが判明した。この突然変異は、アミノ酸残基９８において、アルギニンがトリプトファンによって置換されたことによって生じたものである（Ｒ９８Ｗ）。この家系はドイツおよびレバノン起源を有する。突然変異遺伝子周辺のホモ接合体領域におけるハプロタイプは、両家系で異なっており、独立した突然変異事象であることを示している。ＷＲ患者では、３種の異なるヘテロ接合の突然変異が、バリンのロイシンによる置換（患者Ｃ：Ｖ２９Ｌ）、アルギニンのグリシンによる置換（患者Ｄ：Ｒ５８Ｇ）、および、ロイシンのアルギニンとの交換（患者Ｅ：Ｌ１２８Ｒ）をもたらすことが判明した。このＲ５８Ｇ突然変異は、指標患者Ｄの二人の同病兄弟も共有している。このミスセンス突然変異は、３８４本のコントロール染色体には存在しなかった。コントロール染色体の配列決定を行うことによって、二つの、非同義的一塩基多型（Ｃ４３Ｃ；Ｌ１２０Ｌ）が明らかにされた。
【手続補正９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１１】
2011013231.tif 000001
【手続補正１０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１２】
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