(57)【要約】  本発明は、ポリウレタンウレア含有溶液を、細胞担体に塗布し、乾燥させる被覆細胞培養担体の製造方法に関する。該ポリウレタンウレアは、少なくとも１つのポリカーボネートポリオール成分、少なくとも１つのポリイソシアネート成分および少なくとも１つのジアミン成分を変換させることにより予め製造される。本発明は、該方法により得られる細胞培養担体、および幹細胞の体外培養のため、特に間充織幹細胞を培養するためのその使用に更に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被覆細胞培養担体の製造方法であって、ポリウレタンウレア含有溶液を、細胞担体に塗布し、および乾燥させ、該ポリウレタンウレアを、少なくとも１つのポリカーボネートポリオール成分、少なくとも１つのポリイソシアネート成分および少なくとも１つのジアミン成分を反応させることにより製造することを特徴とする、方法。
【請求項２】
ジアミン成分は、少なくとも１つのヒドロキシル基を有することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ポリカーボネートポリオール成分は、１．７〜２．３、好ましくは１．８〜２．２、特に好ましくは１．９〜２．１の数平均ヒドロキシル官能価を有することを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ポリカーボネートポリオール成分は、４００〜６０００ｇ／モル、好ましくは５００〜５０００ｇ／モル、特に６００〜３０００ｇ／モルの数平均分子量を有することを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ポリウレタンウレアは、１０００〜２０００００ｇ／モル、好ましくは５０００〜１０００００ｇ／モルの数平均分子量を有することを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ポリウレタンウレアの製造において、ポリオール成分を、更に共反応させることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ポリカーボネート成分の１モルを基準として０．０５〜２．０モル、好ましくは０．０５〜１．５モル、特に好ましくは０．１〜１．０モルのポリオール成分を反応させることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ポリオール成分は、６２〜５００ｇ／モル、好ましくは６２〜４００ｇ／モル、特に好ましくは６２〜２００ｇ／モルの数平均分子量を有することを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
ポリウレタンウレア成分の製造において、ポリカーボネート成分の１モルを基準として０．１〜３．０モル、好ましくは０．２〜２．８モル、特に好ましくは０．３〜２．５モルのジアミン成分を反応させることを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
ポリウレタンウレア成分の製造において、ポリカーボネート成分の１モルを基準として１．０〜５．０モル、好ましくは１．０〜４．５モル、特に好ましくは１．０〜４．０モルのポリイソシアネート成分を反応させることを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
溶液は、タンパク質、とりわけ細胞外基質のタンパク質を更に含有することを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかに記載の方法により得られる被覆細胞培養担体。
【請求項１３】
幹細胞の体外培養のための、とりわけ間充織幹細胞を培養するための、請求項１２に記載の細胞培養担体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリウレタンウレア含有溶液を、細胞担体に塗布し、および乾燥させる被覆細胞培養担体の製造方法に関する。本発明は、上記方法により得られる細胞培養担体、および幹細胞の体外培養のための、特に間充織幹細胞を培養するためのその使用に更に関する。
【背景技術】
【０００２】
間充織幹細胞は、異なった細胞種類、例えば骨芽細胞、軟骨細胞または含脂肪細胞等へ増殖または分化することができる（Ａ．Ｉ．ＣａｐｌａｎおよびＪ．Ｅ．Ｄｅｎｎｉｓ、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．９８、２００６年、第１０７６〜１０８４頁）。成人ドナーからの容易な分離可能性と対をなす間充織幹細胞の多能性は、これらの幹細胞を、再生医療用細胞のための理想的な源とする（Ｄ．Ｐ．ＬｅｎｎｏｎおよびＡ．Ｉ．Ｃａｐｌａｎ、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３４、２００６年、第１６０４〜１６０５頁）。このような使用の例は、軟骨または骨の再生または発作もしくは心筋梗塞を処置するための治療手段である（Ａ．Ｉ．ＣａｐｌａｎおよびＪ．Ｅ．Ｄｅｎｎｉｓ、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．９８、２００６年、第１０７６〜１０８４頁）。ヒト骨髄におけるこれらの間充織幹細胞の低い濃度のため、上記の幹細胞を、臨床使用前に体外（ｉｎ−ｖｉｔｒｏ）において培養および増殖させることが必要である（Ａ．Ｉ．ＣａｐｌａｎおよびＪ．Ｅ．Ｄｅｎｎｉｓ、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．９８、２００６年、第１０７６〜１０８４年、Ｄ．Ｌ．  ＪｏｎｅｓおよびＡ．Ｊ．Ｗａｇｅｒｓ、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９、２００８年、第１１〜２１頁）。しかしながら、これまでは、この場合、分化能が極めて頻繁に損なわれ、従って治療的有効性の減少が生じる（Ｓ．Ｊ．ＭｏｒｒｉｓｏｎおよびＡ．Ｃ．Ｓｐｒａｄｌｉｎｇ、Ｃｅｌｌ  １３２、第２００８年、第５９８〜６１１頁）。比較的長期間の培養中には、間充織幹細胞は、骨芽細胞の特性を頻繁に示し、従って、分化能は既に失われている（Ｂａｎｆｉ等、Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２８、２０００年、第７０７頁、Ｂａｘｔｅｒ等、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２２、２００４年、第６７５頁、Ｗａｇｎｅｒ等、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ３、２００８年、ｅ２２１８）。
【０００３】
極めて一般には、体外において間充織幹細胞を培養することが可能であることが望ましい。ここでは、培養は、細胞を早期分化させずに、従って幹細胞の潜在力を損なわずに進めるべきである。
【０００４】
この目的を達成するために確立された方法は、細胞外基質のタンパク質の使用である。この手順は、例えば出版物Ｘ．−Ｄ．Ｃｈｅｎ等、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２２  （１２）、２００７年、第１９４３〜１９５６年、およびＴ．Ｍａｔｓｕｂａｒａ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ３１３  （２００４年）、第５０３〜５０８頁に記載される。ここで用いられるタンパク質混合物は、プラスチック製細胞培養担体に適用される。被覆細胞培養担体上では、間充織幹細胞は、未被覆細胞培養担体と比べてより低い分化能の損失により増殖させることができる。
【０００５】
これらの幹細胞の早期分化の防止と同時の幹細胞の増殖もまた、生物学的要因の目標付加により先行技術において得られる。例えばＡｎｓｅｌｌｅｍ等（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ９  （１１）、２００３年、第１４２３頁）は、体外培養において幹細胞の分化を妨げるために、「ソニックヘッジホッグ」またはＷｎｔタンパク質のようなモジュレーターの使用を記載する。特許出願ＷＯ２００６／００６１７１およびＷＯ２００６／０３０４４２、ならびに出版物ＰＮＡＳ、第１０３巻、（２００６年）、１１７０７は、同様の概念を記載する。
【０００６】
上記概念は、モジュレーターとしてのまたは表面層としての更なる物質を必要とする。しかしながら、これらの材料は、天然タンパク質であるので分離することが困難である。従って、分化の防止と同時の増殖を同じく可能とする代替策が望まれる。
【０００７】
再生医療の活性の分野のための比較的新しい取り組みは、インサイチュによる幹細胞の分化のための細胞培養担体それ自体の特定の設計である（Ｓ．Ｎｅｕｓｓ等、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２９、２００８年、第３０２〜３１３頁）。Ｎｅｕｓｓ等は、この目的のために異なった天然または人工ポリマーのライブラリーを研究するが、ここでは、タンパク質は、幹細胞培養を支持するために用いられない。
【０００８】
Ｊ．Ｍ．Ｃｕｒｒａｎ等、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２７、２００６年、第４７８３〜４７９３頁は、基材の表面品質が間充織幹細胞の分化に影響を及ぼす原則を記載する。異なった表面変性が間充織幹細胞の分化に影響を異なって及ぼすことが、変性ガラス表面上で示される。アミノ−およびチオ−含有ガラス表面は、間充織幹細胞の分化を促進させたが、対照ガラスおよびメチル変性ガラスは、表現型を維持した。しかしながら、化学試薬によりガラス表面を変性する方法は複雑である。さらに、何より、誘発剤を添加する場合、細胞の早期分化が変性表面上で生じる。
【０００９】
医療技術用途のためのおよび再生医療のための重要なポリマー種類は、ポリウレタンの種類である。これらは、構造を変化させるための、従って、定義された特性を設定するための大きな可能性を有する。幹細胞のためのマトリックスとしてのポリウレタンは通常、再生医療に用いられる。その例は、種々の出版物に記載される。
【００１０】
Ｈ．Ｌ．Ｐｒｉｔｃｈａｒｄ等、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２８、２００７年、第９３６〜９４６頁は、種々の基材上で、とりわけポリウレタン上での脂肪細胞から幹細胞の定着研究を記載する。フィブロネクチンによる被覆およびプラズマ活性化のような更なる手段のみが、充分な定着密度をもたらす。しかしながら、これらの手段は、更なる作業工程およびコストを意味する。
【００１１】
Ｃ．Ａｌｐｅｒｉｎ等、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２６、２００５年、第７３７７〜７３８６頁は、マウスからの胚幹細胞による定着によりポリウレタン上で心筋細胞を分化することを記載する。幹細胞は、目標とされた方法により９日以内に心筋細胞から分化される。しかしながら、幹細胞の分化を防止することは、該出版物の主題ではない。
【００１２】
Ｎｉｅｐｏｎｉｃｅ等、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２９、２００８年、第８２５〜８３３頁は、心臓欠陥用途のためのインプラントを製造するための生分解性ポリウレタン上での筋肉からの幹細胞の定着を記載する。定着は、更なる添加剤を用いず、純粋ポリウレタン上で進む。記載の方法を用いると、細胞は、早期の分化を伴わずに７日間、担体上で分化し得る。しかしながら、複雑な真空定着技術の使用が、充分な定着密度を得るために必要である。
【００１３】
先行技術では、幹細胞の充分に高い密度で容易に定着させることができる被覆細胞培養担体の、簡単に行い得る製造方法は、知られておらず、該方法は、幹細胞の素早い増殖を可能とし、その増殖中に幹細胞の早期分化を防止する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】国際公開第２００６／００６１７１号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００６／０３０４４２号パンフレット
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ａ．Ｉ．ＣａｐｌａｎおよびＪ．Ｅ．Ｄｅｎｎｉｓ、「Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．」、第９８巻、２００６年、第１０７６〜１０８４頁
【非特許文献２】Ｄ．Ｐ．ＬｅｎｎｏｎおよびＡ．Ｉ．Ｃａｐｌａｎ、「Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．」、第３４巻、２００６年、第１６０４〜１６０５頁
【非特許文献３】Ｄ．Ｌ．ＪｏｎｅｓおよびＡ．Ｊ．Ｗａｇｅｒｓ、「Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．」、第９巻、２００８年、第１１〜２１頁
【非特許文献４】Ｓ．Ｊ．ＭｏｒｒｉｓｏｎおよびＡ．Ｃ．Ｓｐｒａｄｌｉｎｇ、「Ｃｅｌｌ」、第１３２巻、第２００８年、第５９８〜６１１頁
【非特許文献５】Ｂａｎｆｉ、「Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ」、第２８巻、２０００年、第７０７頁
【非特許文献６】Ｂａｘｔｅｒ、「Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ」、第２２巻、２００４年、第６７５頁
【非特許文献７】Ｗａｇｎｅｒ、「ＰＬｏＳ  ＯＮＥ」、第３巻、２００８年、ｅ２２１８
【非特許文献８】Ａｎｓｅｌｌｅｍ、「Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ」、第９巻、第１１版、２００３年、第１４２３頁
【非特許文献９】「ＰＮＡＳ」、第１０３巻、２００６年、第１１７０７頁
【非特許文献１０】Ｓ．Ｎｅｕｓｓ、「Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ」、第２９頁、２００８年、第３０２〜３１３頁
【非特許文献１１】Ｊ．Ｍ．Ｃｕｒｒａｎ、「Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ」、第２７巻、２００６年、第４７８３〜４７９３頁
【非特許文献１２】Ｈ．Ｌ．Ｐｒｉｔｃｈａｒｄ、「Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ」、第２８巻、２００７年、第９３６〜９４６頁
【非特許文献１３】Ｃ．Ａｌｐｅｒｉｎ、「Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ」、第２６巻、２００５年、第７３７７〜７３８６頁
【非特許文献１４】Ｎｉｅｐｏｎｉｃｅ、「Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ」、第２９巻、２００８年、第８２５〜８３３頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
従って、本発明の目的は、上記要件を同程度に満たす細胞培養媒体が得られる上記種類の方法を提供することであった。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
上記の目的は、溶液に含まれるポリウレタンウレアを、少なくとも１つのポリカーボネートポリオール成分、少なくとも１つのポリイソシアネート成分および少なくとも１つのジアミン成分を反応させることにより製造する本発明により解決される。
【００１８】
本発明による方法により製造された細胞培養担体は、素早くかつ簡単に、とりわけ複雑な技術を用いる必要がなく、幹細胞の充分な密度で定着させることができる。細胞培養培地上での幹細胞の引き続きの素早い増殖の間に、望ましくない幹細胞の早期分化は起こらない。上記作用は、専らポリウレタンウレア被覆物のみによって、すなわち細胞培養担体の被覆物においてタンパク質または天然物質を更に使用することなく得られる。細胞培養担体上で増殖した幹細胞は、担体から取り出した後、必要な分化能をなお示し、例えば再生医療のために適切に使用することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明では、ポリウレタンウレアは、とりわけ、
（ａ）以下の一般構造：
【化１】
2012527868.tif 000002
で示される、少なくとも２つのウレタン基含有繰り返し単位、および
（ｂ）少なくとも１つのウレア基含有繰り返し単位：
【化２】
2012527868.tif 000003
を有するポリマー化合物である。
【００２０】
上記ポリウレタンウレアは、好ましくは実質的に直鎖分子であり、あまり好ましくはないが分枝であってもよい。実質的に直鎖分子とは、本発明では、軽微な架橋系を意味するが、基礎となるポリカーボネートポリオール成分はとりわけ１．７〜２．３、好ましくは１．８〜２．２、特に好ましくは１．９〜２．１の平均ヒドロキシル官能価を有する。
【００２１】
さらに、ポリカーボネートポリオール成分は、好ましくは４００〜６０００ｇ／モル、特に好ましくは５００〜５０００ｇ／モル、特に好ましくは６００〜３０００ｇ／モルのＯＨ価により規定された分子量を有してよい。このようなポリカーボネート成分は、カルボン酸誘導体、例えばジフェニルカーボネート、ジメチルカーボネートまたはホスゲン等と、ポリオール、好ましくはジオールとの反応により得られる。本発明において考慮されるジオールは、例えばエチレングリコール、１，２−および１，３−プロパンジオール、１，３−および１，４−ブタンジオール、１，６−ヘキサンジオール、１，８−オクタンジオール、ネオペンチルグリコール、１，４−ビスヒドロキシメチルシクロヘキサン、２−メチル−１，３−プロパンジオール、２，２，４−トリメチルペンタン−１，３−ジオール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコールまたはテトラエチレングリコール、ジプロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、ジブチレングリコール、ポリブチレングリコール、ビスフェノールＡ、テトラブロモビスフェノールＡ、およびラクトン変性ジオールである。
【００２２】
上記ポリカーボネートポリオールは、好ましくは４０〜１００重量％のヘキサンジオール、好ましくは１，６−ヘキサンジオールおよび／またはヘキサンジオール誘導体、好ましくは末端ＯＨ基の他にエーテル基またはエステル基をも有するヘキサンジオール誘導体（例えば１モルのヘキサンジオールと少なくとも１モル、好ましくは１〜２モルのカプロラクトンとの反応により、またはジへキシレングリコールまたはトリへキシレングリコールを形成するヘキサンジオール同士のエーテル化により得られた生成物）を含有する。ポリエーテルポリカーボネートジオールを使用することもできる。ヒドロキシルポリカーボネートは、実質的に直鎖であるべきである。しかしながら、これらは必要に応じて、多官能性成分、特に低分子量ポリオールの組み込みにより、僅かに分枝してよい。この目的に適した低分子量ポリオールは、例えばグリセロール、トリメチロールプロパン、ヘキサン−１，２，６−トリオール、ブタン−１，２，４−トリオール、トリメチロールプロパン、ペンタエリトリトール、キニトール、マンニトール、ソルビトール、メチルグリコシドまたは１，３，４，６−ジアンヒドロヘキシトールである。好ましくは、ヘキサン−１，６−ジオールおよび例えばブタン−１，４−ジオールのような変性作用を有するコジオールまたはε−カプロラクトンに基づくポリカーボネートである。好ましい実施態様では、ポリカーボネートポリオールは、ヘキサン−１，６−ジオール、ブタン−１，４−ジオールまたはその混合物に基づくポリカーボネートジオールを用いる。
【００２３】
さらに、ポリウレタンウレアは、少なくとも１つのポリイソシアネート成分由来の単位を含んでなる。
【００２４】
ポリイソシアネート成分として、１以上、好ましくは２以上の平均ＮＣＯ官能価を有する、当業者に既知の全ての芳香族、芳香脂肪族、脂肪族および脂環式イソシアネートを、それらがホスゲン法またはホスゲンフリー法のいずれで調製されたかどうかに関係なく、単独でまたは互いの所望の混合物として用いることができる。ポリイソシアネートは、イミノオキサジアジンジオン、イソシアヌレート、ウレトジオン、ウレタン、アロファネート、ビウレット、ウレア、オキサジアジントリオン、オキサゾリジノン、アシルウレアおよび／またはカルボジイミド構造を含んでもよい。該イソシアネートは、単独でまたは互いの所望の混合物として用いることができる。
【００２５】
好ましくは、脂肪族または脂環式から構成される群からのイソシアネートを用い、これらは、３〜３０個、好ましくは４〜２０個の炭素原子（含まれるＮＣＯ基を除く）の炭素骨格を含む。
【００２６】
脂肪族的および／または脂環式的に結合したＮＣＯ基を有する上記種類の特に好ましい化合物は、例えばビス（イソシアナトアルキル）エーテル、ビス−およびトリス−（イソシアナトアルキル）ベンゼン、−トルエンおよび−キシレン、プロパンジイソシアネート、ブタンジイソシアネート、ペンタンジイソシアネート、ヘキサンジイソシアネート（例えばヘキサメチレンジイソシアネート、ＨＤＩ）、ヘプタンジイソシアネート、オクタンジイソシアネート、ノナンジイソシアネート（例えば、一般に２，４，４−および２，２，４−異性体の混合物としてのトリメチル−ＨＤＩ（ＴＭＤＩ））、ノナントリイソシアネート（例えば４−イソシアナトメチル−１，８−オクタンジイソシアネート）、デカンジイソシアネート、デカントリイソシアネート、ウンデカンジイソシアネート、ウンデカントリイソシアネート、ドデカンジイソシアネート、ドデカントリイソシアネート、１，３−および１，４−ビス−（イソシアナトメチル）シクロヘキサン（Ｈ６ＸＤＩ）、３−イソシアナトメチル−３，５，５−トリメチルシクロヘキシルイソシアネート（イソホロンジイソシアネート、ＩＰＤＩ）、ビス（４−イソシアナトシクロヘキシル）メタン（Ｈ１２ＭＤＩ）またはビス（イソシアナトメチル）ノルボルナン（ＮＢＤＩ）である。
【００２７】
極めて特に好ましいのは、ヘキサメチレンジイソシアネート（ＨＤＩ）、トリメチル−ＨＤＩ（ＴＭＤＩ）、２−メチルペンタン−１，５−ジイソシアネート（ＭＰＤＩ）、イソホロンジイソシアネート（ＩＰＤＩ）、１，３−および１，４−ビス（イソシアナトメチル）シクロヘキサン（Ｈ６ＸＤＩ）、ビス（イソシアナトメチル）ノルボルナン（ＮＢＤＩ）、３（４）−イソシアネートメチル−１−メチルシクロヘキシルイソシアネート（ＩＭＣＩ）および／または４，４’−ビス−（イソシアナトシクロヘキシル）メタン（Ｈ１２ＭＤＩ）またはこれらのイソシアネートの混合物である。更なる例は、２を越えるＮＣＯ基を有するウレトジオン、イソシアヌレート、ウレタン、アロファネート、ビウレット、イミノオキサジアジンジオンおよび／またはオキサジアジントリオン構造を有する上記ジイソシアネートの誘導体である。
【００２８】
ポリウレタンウレアの製造におけるポリイソシアネート成分の量は、ポリカーボネート成分の１モルを基準として、好ましくは１．０〜５．０モル、特に好ましくは１．０〜４．５モル、特に１．０〜４．０モルである。
【００２９】
本発明に必要なポリウレタンウレアは、少なくとも１つのジアミンに由来の単位を含み、末端鎖延長剤として働く。
【００３０】
適当なジアミン成分は、ジ−またはポリアミンならびにヒドラジド、例えばヒドラジン、エチレンジアミン、１，２−および１，３−ジアミノプロパン、１，４−ジアミノブタン、１，６−ジアミノヘキサン、イソホロンジアミン、２，２，４−トリメチルヘキサメチレンジアミンおよび２，４，４−トリメチルヘキサメチレンジアミンの異性体混合物、２−メチルペンタメチレンジアミン、ジエチレントリアミン、１，３−キシリレンジアミンおよび１，４−キシリレンジアミン、α，α，α’，α’−テトラメチル−１，３−および−１，４−キシリレンジアミンおよび４，４’−ジアミノジシクロヘキシルメタン、ジメチルエチレンジアミン、ヒドラジン、アジピン酸ジヒドラジド、１，４−ビス（アミノメチル）シクロヘキサン、４，４’−ジアミノ−３，３’−ジメチルジシクロヘキシルメタンおよび他の（Ｃ１〜Ｃ４）ジ−およびテトラアルキルジシクロヘキシルメタン、例えば４，４’−ジアミノ−３，５−ジエチル−３’，５’−ジイソプロピルジシクロヘキシルメタンである。
【００３１】
ポリウレタンウレアの製造では、ジアミン成分として、ＮＣＯ基と異なった反応性を有する活性水素を含む低分子量ジアミンも考慮される。これらは、例えば第１級アミノ基に加えて第２級アミノ基も含む化合物である。
【００３２】
このようなジアミノ成分の例は、第１級アミンおよび第２級アミン、例えば３−アミノ−１−メチルアミノプロパン、３−アミノ−１−エチルアミノプロパン、３−アミノ−１−シクロヘキシルアミノプロパン、３−アミノ−１−メチルアミノブタンである。
【００３３】
好ましい実施態様によれば、ジアミノ成分は、少なくとも１つの更なるヒドロキシル基を含む。ジアミノ成分は、第１級アミンおよび第２級アミンはいずれも含有してよく、両方のアミン型の混合物を含有してもよい。特に好ましい化合物のある例は、１，３−ジアミノ−２−プロパノールである。
【００３４】
ジアミノ成分の量は、ポリウレタンウレアの製造において、ポリカーボネート成分の１モルを基準として、好ましくは０．１〜３．０モル、特に好ましくは０．２〜２．８モル、とりわけ０．３〜２．５モルである。
【００３５】
更なる実施態様では、ポリウレタンウレアの製造では、ポリオール成分は、更に共反応（ｃｏ−ｒｅａｃｔｅｄ）させる。
【００３６】
ポリウレタンウレアの構築に用いるポリオール成分は、通常、ポリマー鎖の強化および／または分枝に影響を与える。ポリオール成分の分子量は、好ましくは６２〜５００ｇ／モル、特に好ましくは６２〜４００ｇ／モル、とりわけ６２〜２００ｇ／モルである。
【００３７】
適当なポリオール成分は、脂肪族基、脂環式基または芳香族基を含有してよい。本発明では、ポリオール成分の例としては、例えば１分子あたり約２０個までの炭素原子を有する低分子量ポリオール成分、例えばエチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１，４−ブタンジオール、１，３−ブチレングリコール、シクロヘキサンジオール、１，４−シクロヘキサンジメタノール、１，６−ヘキサンジオール、ネオペンチルグリコール、ヒドロキノンジヒドロキシエチルエーテル、ビスフェノールＡ（２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパン）、水素化ビスフェノールＡ（２，２−ビス（４−ヒドロキシシクロヘキシル）プロパン）、およびトリメチロールプロパン、グリセロールまたはペンタエリトリトール、並びにこれらのおよび必要に応じて他の低分子量ポリオールとの混合物が挙げられる。エステルジオール、例えばα−ヒドロキシブチル−ε−ヒドロキシカプロン酸エステル、ω−ヒドロキシヘキシル−γ−ヒドロキシ酪酸エステル、アジピン酸β−ヒドロキシエチルエステルまたはテレフタル酸ビス（β−ヒドロキシエチル）エステル等を用いてもよい。
【００３８】
ポリウレタンウレアの製造におけるポリオール成分の量は、ポリカーボネート成分の１モルを基準として、好ましくは０．０５〜２．０モル、特に好ましくは０．０５〜１．５モル、とりわけ０．１〜１．０モルである。
【００３９】
ポリイソシアネート成分とポリカーボネートポリオール成分およびジアミノ成分との反応は、反応性ヒドロキシルまたはアミン化合物と比べてややＮＣＯ過剰を維持しながら従来法により進める。目標粘度を達成することによる反応の終点では、活性イソシアネートの残渣がなお常に残存する。この残渣は、長いポリマー鎖との反応を起こさないためにブロックしなければならない。このような反応は、３次元架橋およびバッチのゲル化をもたらす。このような溶液の処理は、もはや可能ではない。
【００４０】
残存遊離ＮＣＯ基をブロックするために、これらは、ブロック成分と反応させることができる。これらのブロック成分は、例えばモノアミンのようなＮＣＯ基と反応性の単官能性化合物、とりわけモノ〜第２級アミンまたはモノアルコールから誘導される。本発明では、ブロック成分の例としては、例えばエタノール、ｎ−ブタノール、エチレングリコール、モノブチルエーテル、２−エチルヘキサノール、１−オクタノール、１−ドデカノール、１−ヘキサデカノール、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、ブチルアミン、オクチルアミン、ラウリルアミン、ステアリルアミン、イソノニルオキシプロピルアミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、ジプロピルアミン、ジブチルアミン、Ｎ−メチルアミノプロピルアミン、ジエチル（メチル）アミノプロピルアミン、モルホリン、ピペリジンおよびこれらの適当な置換誘導体が挙げられる。
【００４１】
ブロック成分は、ＮＣＯ過剰を破壊するために主に用いるので、必要な量は、ＮＣＯ過剰の量に実質的に依存し、一般的に規定することができない。
【００４２】
残存イソシアネート含有量をポリウレタンウレアの製造においてブロックする場合、これらはまた、鎖末端に位置し、およびこれらを停止する何れの場合にも構造成分としてモノマーを含む。
【００４３】
しかしながら、好ましくは、合成においては、更に添加されたブロック成分を用いる。その代わり、残存遊離イソシアネート基を、バッチ中に極めて高い濃度において存在する溶媒アルコールと反応させて末端ウレタンを形成させる。これにより、アルコールは、バッチを数時間室温にて放置または撹拌する間、なお残存するイソシアネート基をブロックする。
【００４４】
ウレア溶液を製造するために、ポリカーボネートポリオール成分、ポリイソシアネート成分およびジアミノ成分を、全てのヒドロキシル基が消費されるまで互いに溶融物中で、または溶液中で反応させる。次いで、溶媒を添加する。
【００４５】
反応に加わる個々の成分の間の化学両論は、上記量比から得られる。
【００４６】
反応は、好ましくは６０および１１０℃の間の温度、特に好ましくは７５〜１１０℃、とりわけ９０〜１１０℃の温度にて進めるが、１１０℃付近の温度が反応の速度のため好ましい。さらに高い温度も可能であるが、この場合、それぞれの場合において、用いる成分に応じて、分解過程および変色が得られたポリマー中において生じる虞がある。
【００４７】
イソシアネート添加反応を促進させるために、ポリウレタン化学において既知の触媒、例えばジブチル錫ジラウレートを用いることができる。しかしながら、好ましくは触媒を用いずに合成する。
【００４８】
イソシアネートおよびヒドロキシル基を有する全ての成分のプレポリマー場合には、溶融物中における反応が好ましいが、完全に反応した混合物の過度の粘度が生じる虞がある。この場合、溶媒を添加することが望ましい。しかしながら、約５０重量％を越える溶媒はできるだけ存在させるべきではなく、そうでなければ反応速度が著しく低下するからである。
【００４９】
イソシアネートおよびヒドロキシル基を有する成分の反応の場合、該反応は、溶融物中において１時間から２４時間進めることができる。溶媒の少量の添加は、遅延をもたらすが、全反応時間は、前記時間内である。
【００５０】
反応の個々の成分の添加の順序は、上記順序と異なってよい。これは、特に、得られる被覆物の機械特性を変性すべき場合に有利なことがある。例えば全てのヒドロキシル基を有する成分を同時に反応させる場合、硬質セグメントおよび軟質セグメントの混合物が形成される。例えばポリオールをポリカーボネートポリオール成分の後に添加する場合、得られる被覆物の他の特性を伴うことができる規定のブロックが得られる。従って、本発明は、添加または個々の成分の反応の規定の順序に制限されない。
【００５１】
溶媒は、好ましくは、溶媒の完全な添加の場合に起こる反応を不必要に遅延させないために段階的に、例えば反応の開始時に添加する。さらに、反応の開始時に溶媒の含有量が高い場合、溶媒の種類に少なくとも共同決定（ｃｏ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ）される比較的低い温度が必要である。また、これにより反応の遅延が生じる。
【００５２】
目標粘度に達した後、なお残存するＮＣＯ残基は、単官能性脂肪族アミンによりブロックすることができる。好ましくは、なお残存するイソシアネート基は、溶媒混合物中に存在するアルコールとの反応によりブロックする。
【００５３】
ポリウレタンウレア溶液を製造するための溶媒として、全ての考えられる溶媒および溶媒混合物、例えばジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルアセトアミド、テトラメチルウレア、Ｎ−メチルピロリドン、トルエンのような芳香族溶媒、直鎖および環式のエステル、エーテル、ケトンおよびアルコール等が考慮される。エステルおよびケトンの例は、エチルアセテート、ブチルアセテート、アセトン、γ−ブチロラクトン、メチルエチルケトンおよびメチルイソブチルケトンである。
【００５４】
好ましいのは、アルコールとトルエンとの混合物である。トルエンと共に用いることができるアルコールの例は、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノールおよび１−メトキシ−２−プロパノールである。
【００５５】
通常、反応では、充分な溶媒を、約１０〜５０重量％濃度溶液、好ましくは約１５〜４５重量％濃度溶液、特に好ましくは約２０〜４０重量％濃度溶液が得られるように添加する。
【００５６】
ポリウレタンウレア溶液の固形分は、通常、１〜６０重量％、好ましくは１０〜４０重量％の範囲である。被覆実験のために、ポリウレタンウレア溶液を、被覆物の厚みが可変となるように設定するためにトルエン／アルコール混合物で所望の通り希釈することができる。
【００５７】
任意の所望の層厚み、例えば数百ｎｍから数百μｍ等が得られるが、本発明では、より大きな厚みおよびより小さな厚みも可能である。
【００５８】
さらに、ポリウレタンウレア溶液は、それぞれの求められている目的のために従来法による原料および添加剤を含んでよい。
【００５９】
更なる添加剤、例えば補助剤または顔料等を用いることもできる。さらに、必要に応じて、更なる他の添加剤、例えばグリップ助剤、染料、艶消剤、紫外線安定剤、光安定剤、親水化剤、疎水化剤および／またはフリーフロー助剤等を用いることができる。
【００６０】
ポリウレタンウレア溶液は、タンパク質を更に含有することができる。好ましくは、これらは、細胞外基質のタンパク質であってよい。
【００６１】
ポリウレタンウレア溶液の被覆物は、種々の方法により細胞培養担体に塗布することができる。適当な被覆技術は、例えばスキージ塗布法、印刷法、転写被覆法、噴霧法、スピンコート法または浸漬法である。
【００６２】
多くの種類の基材、例えばガラス、シリコンウェハー、金属、セラミックおよびプラスチック等を被覆することができる。好ましくは、ガラス、シリコンウェハー、プラスチックまたは金属製の細胞培養担体を被覆する。金属としては、例えば医療用のステンレス鋼またはニッケル−チタン合金が挙げられる。細胞培養担体を構成することができる多くのポリマー材料が考慮され、その例は、ポリアミド、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ酢酸ビニル、天然ゴムおよび合成ゴム、スチレンおよび不飽和化合物（例えばエチレン、ブチレンおよびイソプレン）のブロックコポリマー、ポリエチレン、またはポリエチレンとポリプロピレンとのコポリマー、シリコーン、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）およびポリウレタンである。細胞培養担体への本発明によるポリウレタンのより良好な接着のために、上記被覆材料の塗布前の基材として、他の更なる適当な被覆物を塗布することができる。特に好ましくは、細胞培養担体を製造するためのガラスまたはシリコンウェハーを被覆することである。
【００６３】
本発明による方法により製造された、特に間充織幹細胞を培養するための細胞培養担体の優位性は、以下に記載の実施例により示される。
【実施例】
【００６４】
実施例および比較例に記載の樹脂のＮＣＯ含有量は、ＤＩＮ  ＥＮ  ＩＳＯ  １１９０９に規定の滴定により決定した。
【００６５】
固形分は、ＤＩＮ  ＥＮ  ＩＳＯ  ３２５１に規定の通り決定した。ポリウレタン分散体の１ｇの量を、赤外線乾燥機により１１５℃（１５〜２０分）にて一定重量に乾燥させた。
【００６６】
特記のない限り、％により記載の量は、平均重量％とし、得られた水性分散体に関する。
【００６７】
粘度測定は、Ｆｉｒｍａ  Ａｎｔｏｎ  Ｐａａｒ  ＧｍｂＨ、Ｏｓｔｆｉｌｄｅｒｎ、ドイツからのＰｈｙｓｉｃｓ  ＭＣＲ  ５１  Ｒｈｅｏｍｅｔｅｒを用いて行った。
【００６８】
用いる物質および略称：
〔Ｄｅｓｍｏｐｈｅｎ  Ｃ２２００〕
Ｂａｙｅｒ  ＭａｔｅｒｉａｌＳｃｉｅｎｃｅ  ＡＧ、レーバークーゼン、独国
ポリカーボネートポリオール、ＯＨ価５６ｍｇＫＯＨ／ｇ、数平均分子量２０００ｇ／モル
【００６９】
〔ＰｏｌｙＴＨＦ  ２０００〕
Ｂａｙｅｒ  ＭａｔｅｒｉａｌＳｃｉｅｎｃｅ  ＡＧ、ルートヴィヒスハーフェン、独国
ポリテトラメチレングリコールポリオール、ＯＨ価５６ｍｇＫＯＨ／ｇ、数平均分子量２０００ｇ／モル
【００７０】
〔細胞株Ｃ３Ｈ１０Ｔ０．５〕
Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （ＡＴＴＣ）（マナッサス、バージニア州、米国、ＡＴＣＣ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＣＣＬ−２２６）から得られた間充織細胞株（マウス種）、クローン８
【００７１】
〔細胞株Ｃ２Ｃ１２〕
Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （ＡＴＴＣ）（マナッサス、バージニア州、米国、ＡＴＣＣ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＣＣＬ−２２６）から得られた多能性細胞株（マウス種）
【００７２】
〔ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）〕
Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ、ベルリン、独国
【００７３】
〔骨形態形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）〕
これは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株（Ｄｉｂｏｔｅｒｍｉｎ  ａｌｆａ）中で製造されたヒト組み換え骨形態形成タンパク質−２（ｒｈＢＭＰ−２）である。
【００７４】
〔ＩＳＴ＋〕
ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ハイデルブルグ、独国
組成：
インスリン  ６．２５μｇ／ｍｌ
トランスフェリン  ６．２５  μｇ／ｍｌ
亜セレン酸  ６．２５  ｎｇ／ｍｌ
ウシ血清アルブミン  １．２５  ｍｇ／ｍｌ
リノール酸  ５．３５  μｇ／ｍｌ
【００７５】
〔イーグル基礎培地（ＢＭＥ）（１×）〕
Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスルーエ、独国、目録番号４１０１０
Ｌ−グルタミンを含まないアール塩を含有する液体
【００７６】
〔ダルベッコ変法イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）（１×）、液体（高グルコース）〕
Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスルーエ、独国、目録番号３１９６６
製品関連仕様：
グルコース：  高グルコース含有量（４５００ｍｇ／Ｌ）
グルタミン：  ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）−Ｉ
ＨＥＰＥＳ緩衝液：  ＨＥＰＥＳなし
ナトリウムピルビン酸塩添加物：  ナトリウムピルビン酸塩１１０ｍｇ／Ｌ
【００７７】
〔ダルベッコ変法イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）（１×）、液体（低グルコース）〕
Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスルーエ、独国、目録番号２１８８５
製品関連仕様：
グルコース：  高グルコース含有量（１０００ｍｇ／Ｌ）
グルタミン：  ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）−Ｉ
ＨＥＰＥＳ緩衝液：  ＨＥＰＥＳなし
ナトリウムピルビン酸塩添加物：  ナトリウムピルビン酸塩１１０ｍｇ／Ｌ
【００７８】
〔Ｇｌｕｔａｍａｘ（商標）  ２００ｍＭ〕
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスルーエ、独国、目録番号３５０５００３８
２ｍＭ最終濃度を得るためにイーグル基礎媒体へ添加
【００７９】
〔リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）〕
Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ、ベルリン、独国
【００８０】
〔Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ〕
Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスルーエ、独国
【００８１】
更なる成分は、ＤＭＥＭ（上記の２種類の培地へ適用）であり、ＢＭＥは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎにて見られず、製造者仕様ではない。
【００８２】
Ｔｅｃｈｎｏ  Ｐｌａｓｔｉｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（ＴＰＰ）（トラサジンゲン、スイス）からの組織培養ポリスチレン（ＴＰＳ）からできたマイクロタイタープレートを用いた。
【００８３】
実施例１：
１１０℃にて、５００ｇのＤｅｓｍｏｐｈｅｎ  Ｃ  ２２００、１０４．６ｇのイソホロンジイソシアネートおよび１２６．６ｇのトルエンを、２．５％の一定ＮＣＯ含有量まで反応させた。該混合物を冷却し、５００ｇのトルエンおよび３７７．８ｇのイソプロパノールで希釈した。室温にて、３０８．４ｇの１−メトキシ−２−プロパノール中に溶解した３４．７ｇの４，４’−ジアミノジシクロヘキシルメタンの溶液を添加した。分子量の構成が完了し、および所望の粘度範囲に達した後、該混合物を、残存イソシアネート含有量をイソプロパノールまたは１−メトキシ−２−プロパノールでブロックするために終夜室温にて放置した。これにより、２２℃にて２１２００ｍＰａｓの粘度を有する１９５２ｇのトルエン／イソプロパノール／１−メトキシ−２−プロパノール中で３３．４％濃度ポリウレタンウレア溶液が製造された。
【００８４】
実施例２：
１１０℃にて、３００ｇのＤｅｓｍｏｐｈｅｎ  Ｃ  ２２００、１１．２ｇの１，２−ドデカンジオール（９０％純度）、１０４．６ｇのイソホロンジイソシアネートおよび８０．０ｇのトルエンを、４．５％の一定ＮＣＯ含有量まで反応させた。該混合物を冷却し、３５０．０ｇのトルエンおよび３５０．０ｇのイソプロパノールで希釈した。室温にて、３５３．９ｇの１−メトキシ−２−プロパノール中に溶解させた５２．５ｇの４，４’−ジアミノジシクロヘキシルメタンの溶液を添加した。分子量の構成が完了し、および所望の粘度範囲に達した後、該混合物を、残存イソシアネート含有量をイソプロパノールまたは１−メトキシ−２−プロパノールでブロックするために終夜室温にて放置した。これにより、２２℃にて２５０００ｍＰａｓの粘度を有する１６０２ｇのトルエン／イソプロパノール／１−メトキシ−２−プロパノール中での３５．８％濃度ポリウレタンウレア溶液が製造された。
【００８５】
実施例３：
１１０℃にて、４００ｇのＤｅｓｍｏｐｈｅｎ  Ｃ  ２２００、１０４．６ｇのイソホロンジイソシアネートおよび１２６．６ｇのトルエンを、３．６％の一定ＮＣＯ含有量まで反応させた。該混合物を冷却し、４２２．４ｇのトルエンおよび３７７．８ｇのイソプロパノールで希釈した。室温にて、３５７．７ｇの１−メトキシ−２−プロパノール中に溶解させた２２．９ｇの１，３−ジアミノ−２−プロパノールの溶液を添加した。分子量の構成が完了し、および所望の粘度範囲に達した後、該混合物を、残存イソシアネート含有量をイソプロパノールまたは１−メトキシ−２−プロパノールでブロックするために終夜室温にて放置した。これにより、２２℃にて３７０００ｍＰａｓの粘度を有する１８１２ｇのトルエン／イソプロパノール／１−メトキシ−２−プロパノール中での３０．５％濃度ポリウレタンウレア溶液が製造された。
【００８６】
実施例４：
１１０℃にて、３２０ｇのＤｅｓｍｏｐｈｅｎ  Ｃ  ２２００、１０４．６ｇのイソホロンジイソシアネートおよび１２６．６ｇのトルエンを、４．７％の一定ＮＣＯ含有量まで反応させた。該混合物を冷却し、３６０ｇのトルエンおよび３７７．８ｇのイソプロパノールで希釈した。室温にて、３６９．６ｇの１−メトキシ−２−プロパノール中に溶解させた２６．４ｇの１，３−ジアミノ−２−プロパノールの溶液を添加した。分子量の構成が完了し、および所望の粘度範囲に達した後、該混合物を、残存イソシアネート含有量をイソプロパノールまたは１−メトキシ−２−プロパノールでブロックするために４時間更に撹拌した。これにより、２２℃にて４１０００ｍＰａｓの粘度を有する１６８５ｇのトルエン／イソプロパノール／１−メトキシ−２−プロパノール中での２７．２％濃度ポリウレタンウレア溶液が製造された。
【００８７】
実施例５（比較）：
１１０℃にて、４００ｇのＰｏｌｙＴＨＦ  ２０００、１０４．６ｇのイソホロンジイソシアネートおよび１２６．６ｇのトルエンを、３．６％の一定ＮＣＯ含有量まで反応させた。該混合物を冷却し、４２２．４ｇのトルエンおよび３７７．８ｇのイソプロパノールで希釈した。室温にて、３２７．５ｇの１−メトキシ−２−プロパノール中に溶解させた４８．４ｇの４，４’−ジアミノジシクロヘキシルメタンの溶液を添加した。分子量の構成が完了し、および所望の粘度範囲に達した後、該混合物を、残存イソシアネート含有量をイソプロパノールまたは１−メトキシ−２−プロパノールでブロックするために終夜放置した。これにより、２２℃にて２７８００ｍＰａｓの粘度を有する１８０７ｇのトルエン／イソプロパノール／１−メトキシ−２−プロパノール中での３０．９％濃度ポリウレタンウレア溶液が製造された。
【００８８】
実施例６ａ−ｅ：
ポリウレタン溶液で被覆することによる細胞培養担体の製造
被覆物を、スピンコーターを用いて２５×２５ｍｍサイズのガラス製顕微鏡スライド上に作製した。このために顕微鏡用スライドをスピンコーターの試料ディスク上へクランプし、約０．５〜１ｍＬの有機５％濃度ポリウレタン溶液で均質に被覆した。全ての有機ポリウレタン溶液を、６５重量％トルエンおよび３５重量％イソプロパノール（２：１）の溶媒混合物で５重量％のポリマー含有量にまで希釈した。試料ディスクを、１分当たり３０００回転にて１２０秒間回転させることにより、２時間６０にて乾燥させた均質の被覆物を得た。得られたポリウレタン被覆物を、細胞培養実験に用いるために室温にて５０ｋＧｙの線量にてガンマ線消毒した。
【００８９】
【表１】
2012527868.tif 000004
【００９０】
実施例７：
固有ＰＵ表面上に成長した細胞の調査
ａ）多能性細胞株Ｃ２Ｃ１２の細胞培養のための一般手順
多能性細胞Ｃ２Ｃ１２マウス細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有するＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）において２〜３日間３７℃にて５％二酸化炭素を含有する湿った雰囲気中で培養した。細胞を、約８５％カバーで継代培養し、ＰＢＳで２回フラッシュし、次いで培養表面から細胞を分離するために５分間トリプシン−ＥＤＴＡで処理した。次いで、該細胞を、ＤＭＥＭ中に取り込み、遠心分離し、７００細胞／ｃｍ２の細胞密度にてカバーした。
【００９１】
増殖の調査のために、細胞を同じく、約７００細胞／ｍＬの密度にて実施例６ａ〜ｅの固有ポリウレタン基材上に培養した。対照のために、ポリスチレン（組織培養ポリスチレン、（ＴＣＰ））およびガラスを、同じ細胞密度にて定着させた。３７℃にて５％二酸化炭素を含有する湿った雰囲気中で２４時間後、ミトコンドリア吸収作用を、製造業者の手順に従ってＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅにより決定した（該方法のために、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９９７年、２０４、２０５を参照）。このために、規定の時点にて、１５％Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅを、細胞培養に添加し、該培養は、４時間３７℃にて培養した。細胞培養培地をピペットで取り、薄めずに光学密度を５７０および６３０ｎｍの波長にて計測した（Ｔｅｃａｎ  Ｇｅｎｉｏｓ  Ｍｉｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ）。細胞呼吸によるＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅの反応を示すために、代謝Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅおよび未使用Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅの吸収比を形成した。計測工学密度は、相対単位として評価した。
【００９２】
新しい細胞培養培地を、更なる調査のために細胞培養に添加した。細胞濃度の調査を、上記の方法により、それぞれの更なる日数、繰り返した。
【００９３】
ｂ）間充織細胞株Ｃ３Ｈ１０Ｔ０．５の間充織細胞株の細胞培養のための一般手順
間充織マウスＣ３Ｈ１０Ｔ０．５幹細胞を、Ｇｌｕｔａｍａｘおよびイーグル塩を含有し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）で強化されたイーグル基礎培地中で培養した。細胞を、５％二酸化炭素の添加により湿気雰囲気中で保持した。細胞を、約７０％カバーで継代培養し、多能性Ｃ２Ｃ１２細胞について実施例７ａに記載の通り、２×１０３細胞／ｃｍ２の濃度にてカバーした。低い被覆密度を、接触阻止および細胞変異体の選択を防止するために選択した。
【００９４】
増殖の調査のために、実施例６ａ〜ｅの固有ポリウレタン基材を、約７００細胞／ｃｍ２の密度にて細胞により定着させた。対照のために、ポリスチレン（組織培養ポリスチレン、（ＴＣＰ））およびガラスを、同じ細胞密度にて定着させた。３７℃にて２４時間後、ミトコンドリア吸収を、製造業者の手順に従って実施例７ａに記載の通りＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅにより決定した。
【００９５】
ｃ）Ｃ２Ｃ１２での結果
【００９６】
【表２】
2012527868.tif 000005
【００９７】
実施例６ａ、６ｂおよび６ｃの本発明による被覆物は、先行する従来法による組織培養ポリスチレン上の成長に相当する成長を可能とする。これに対し、実施例６ｅの比較被覆物は、細胞株の成長を可能とせず、従って、培養担体として使用することができない。
【００９８】
【表３】
2012527868.tif 000006
【００９９】
実施例６ａ、６ｂおよび６ｃの被覆物は、先行する従来法による組織培養ポリスチレン上での成長に相当する成長を可能とする。これに対し、実施例６ｅにおける比較被覆物は、細胞株の成長を可能とせず、従って、培養担体として使用することができない。
【０１００】
更なる実験系列では、６ｄ被覆物上でのＣ３Ｈ１０Ｔ０．５細胞の成長は、組織培養ポリスチレン上での細胞成長に相当する。
【０１０１】
【表４】
2012527868.tif 000007
【０１０２】
実施例６ｄの本発明による被覆物は、先行する従来法による組織培養ポリスチレン上での成長に相当する成長を可能とする。
【０１０３】
表３および４の成長実験は、異なった日数について行った。これらの実験のそれぞれは、初期標準、ここでは組織培養ポリスチレン（ＴＣＰ）を要する。異なった実験間での成長曲線の絶対値は、互いに直接比較することができない。しかしながら、両方の実験の初期標準への関係は、成長が実施例６ａ、６ｂおよび６ｃの被覆物上および実施例６ｄの被覆物上のいずれでも標準ＴＣＰに相当する結果を与えることを完全に明らかとする。
【０１０４】
実施例８：
分化を伴わないＣ３Ｈ１０Ｔ０．５細胞株の細胞成長
ａ）一般手順：
間充織マウスＣ３Ｈ１０Ｔ０．５マウス幹細胞を、Ｇｌｕｔａｍａｘおよびイーグル塩を含有し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）で強化されたイーグル基礎培地中で培養した。細胞を、５％二酸化炭素の添加により湿気雰囲気中で保持した。細胞を、約７０％カバーで継代培養し、２×１０３細胞／ｃｍ２の濃度にてカバーした。これらの低い被覆密度は、接触阻止および細胞変異体の選択を防止するために選択した。
【０１０５】
造骨分化を抑制するためのポリウレタン被覆物の能力を調査するために、細胞を、ＢＭＰ−２（骨形成タンパク質）の存在下で培養した。条件は、実施例７ｂに記載の条件と同じであるが、但し、ＢＭＰ−２を、細胞培養培地に更に添加する。さらに、鉱化の促進のために、２００μＭアスコルビン酸および１０ｍＭグリセロールリン酸塩を更に添加した。ＢＭＰ−２は、造骨分化を誘導するための既知の剤である。このために、Ｃ３Ｈ１０Ｔ０．５間充織幹細胞を、完全培地において１．２５×１０４細胞／ｃｍ２の濃度にて、５００ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ−２の実施例６ｄの固有ポリウレタン被覆物上へ添加してカバーした。対照として、同じ細胞培養を、理想的な実験条件下でＴＣＰおよびガラス上で行った。骨芽細胞を形成するために幹細胞の分化の間、酵素アルカリ性白血球ホスファターゼの含有量を、分化の程度の指標として用いた。ＡＬＰを決定するために、細胞を培養から取り出し、ＰＢＳで洗浄し、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の１体積％の添加で凍結することにより溶解させた。
【０１０６】
アルカリ性白血球ホスファターゼを決定するための試薬を、５ｍＬの１６ｍＭｐ−ニトロフェノールホスフェートおよび２０μＬの１Ｍ水性ＭｇＣｌ２溶液を、５ｍＬナトリウムホウ酸塩−ナトリウム水酸化物緩衝液へ９．８のｐＨで添加することにより製造した。
【０１０７】
３７℃にて、５０μＬの細胞溶解物を、２００μＬの上記組成物の試薬により培養し、次いで色形成反応を、４１０ｎｍにて連続的に行った。ＡＬＰの活性は、単位タンパク質のｍｍｏｌ／分／ｍｇでの特定のＡＬＰ活性を得るためにＡＬＰＰｉｅｒｃｅからのＢＣＡアッセイにより全タンパク質含有量へ標準化した。対照のために、区別化されていない細胞を、記載の１．２５×１０４細胞／ｃｍ２の密度にてＡＬＰ活性について調査した。
【０１０８】
ｂ）結果
【０１０９】
【表５】
2012527868.tif 000008
【０１１０】
アルカリ性白血球ホスファターゼの活性は、実施例６ｄのポリウレタンフィルム上での細胞培養後に組織培養ポリスチレン上またはガラス上での培養後の活性より顕著に低い。体外培養において、ポリウレタンフィルム上では、細胞の早期分化があまり起こらず、これは、組織培養ポリスチレンのような先行する従来法による材料またはガラスと比べて、有利である。
【０１１１】
【表６】
2012527868.tif 000009
【０１１２】
ＡＬＰの活性は、実施例６ｄのポリウレタンフィルム上での細胞培養後に組織培養ポリスチレン上またはガラス上での培養後の活性より顕著に低い。誘発剤ＢＭＰ−２を添加することにより、間充織細胞培養の分化は、先行する従来法による細胞培養担体ポリスチレンまたはガラス上で顕著に増加する（相当する値について表５および６を参照）。本発明によるポリウレタンフィルム上では、体外培養中に、誘発剤の存在にも拘わらず、細胞の早期分化の増加は起こらない。
【０１１３】
実施例９：
実施例６ｄの固有ＰＵ被覆物について分化を伴わないヒト間充織幹細胞の細胞成長
ａ）ヒト幹細胞の一般手順：
ヒト間充織幹細胞を、Ｏｓｗａｌｄ等、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、２００４年、第２２巻、第３７７〜３８４頁の手順に従って健康なドナーの骨髄から単離した。細胞は、腸骨稜から穿刺によりドナーから取り出した。穿刺細胞混合物から、単核細胞を、密度勾配遠心分離法により赤血球を除去することにより単離した。単核細胞は、間充織幹細胞が基材へ接着するように細胞培養瓶中に設置する。細胞培養は、１ｇ／Ｌのグルコースおよび１０体積％のウシ胎仔血清の含有量でのＤＭＥＭから構成される。細胞は、３７℃にて５％の二酸化炭素の含有量を有する水蒸気により飽和した雰囲気中で培養した。培養時間は、ドナーに依存するが、前述の場合には２週間であった。
【０１１４】
残存赤血球は、７２時間後洗浄した。残りの間充織幹細胞は、細胞培養中に増殖する。収穫後、細胞は、表現型的に特性化され、分化挙動を決定する。
【０１１５】
細胞を、約８０％の被覆度にて最大５代継代について継代培養した。得られた細胞により、実施例６ｄのポリウレタン被覆物上を１×１０４細胞／ｃｍ２の細胞密度にてカバーした。対照のために、同じ細胞培養により、ＴＣＰ上およびガラス上でカバーした。
【０１１６】
ヒト間充織幹細胞を実施例７ａの通り培養した。
【０１１７】
造骨分化を、ＤＭＥＭにおいて、実施例６ｄのポリウレタンフィルム上への種まきによる１０体積％ＦＢＳおよびヒト組み換え型ＢＭＰ−２（２００ｎｇ／ｍＬ）の添加により、２００μＭアスコルビン酸および１０ｍＭグリセロールホスフェートの更なる添加により調査した。該方法は、ヒト間充織幹細胞の場合に、細胞培養を、ウシ胎仔血清を添加することなく第４日に更に行うことを除いて、実施例８の方法と同じである。対照として、細胞を、ＴＣＰおよびガラス上へ蒔いた。４日に、培地を、ＩＴＳ＋（インスリン６．２５ｍｇ／ｍＬ、トランスフェリン６．２５ｍｇ／ｍＬ、亜セレン酸６．２５μｇ／ｍＬ、ウシ血清アルブミン０．１２５ｇ／ｍＬおよびリノール酸５．３５ｍｇ／ｍＬの添加培地）を含有するＤＭＥＭに変更し、これに新しいＢＭＰ−２を添加した。造骨分化を上昇させるためのアルカリ性白血球ホスファターゼの活性を、実施例８の手順に従って決定した。
【０１１８】
さらに、細胞の分化のための第２指標として、細胞の最大鉱化を、Ｊ．Ｊａｄｌｏｗｉｅｃ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００４年、第２７９巻、第５３３２３〜５３３３０頁におけるような、Ａｌｉｚａｒｉｎ  Ｓで染色することにより決定した。この目的のために、細胞を、特定の時点で取り出し、０．５ｍＬＰＢＳで洗浄し、−２０℃にて１時間０．５ｍＬのエタノール（水中に７０重量％）で固定した。次いで、該細胞は、０．５ｍＬの２回蒸留水で洗浄し、アンモニアで４．２のｐＨに調節した０．５ｍＬの４０ｎＭアリザリン水溶液で染色した。過剰のアリザリンを、水で洗浄することにより除去した。形成された骨芽細胞の混合物中に結合した染料を、２時間、室温で３００μＬの１０重量％濃度塩化ヘキサデシルピリジニウム水溶液中で株化細胞を培養することにより溶解し、この溶液の光学密度を５７０ｎｍにて決定した。
【０１１９】
ｂ）ヒト間充織幹細胞のための結果
【０１２０】
【表７】
2012527868.tif 000010
【０１２１】
アルカリ性白血球ホスファターゼの活性は、実施例６ｄのポリウレタンフィルム上での細胞培養後に組織培養ポリスチレン上またはガラス上での同一の細胞の培養後の活性より顕著に低い。体外培養の場合には、細胞の早期分化はポリウレタンフィルム上であまり起こらず、これは、組織培養ポリスチレンまたはガラスのような先行する従来法による材料と比べて、有利である。
【０１２２】
【表８】
2012527868.tif 000011
【０１２３】
ＢＭＰ−２を誘発剤として添加する場合、従来法による細胞培養担体ポリスチレンおよびガラスでは、幹細胞の著しい早期の造骨分化が観察される。これに対し、本発明によるポリウレタンフィルムは、望ましくない早期分化は極めて軽微にのみ示す。アルカリ性ホスファターゼの活性の絶対値は、ＢＭＰ−２の添加を伴わないアルカリ性ホスファターゼの活性の絶対値より大きくない（表７参照）。
【０１２４】
【表９】
2012527868.tif 000012
【０１２５】
アリザリンによる染色は、アルカリ性白血球ホスファターゼの活性の検出と同様に、細胞培養培地としての本発明によるポリウレタンフィルムが、誘発剤ＢＭＰ−２の存在下で、ヒト間充織幹細胞の早期の望ましくない分化を、従来法による細胞培養担体ポリスチレンおよびガラスより実質的に自然に引き起こさないことを示す。
【０１２６】
本発明による細胞培養担体上で増殖された幹細胞は、担体から取り出された後、必要な分化能をなお示し、例えば再生医療について対応して用いることができる。
【国際調査報告】
2012527868.tif 000013
2012527868.tif 000014
2012527868.tif 000015
2012527868.tif 000016
2012527868.tif 000017
2012527868.tif 000018