【手続補正書】
【提出日】平成21年7月22日(2009.7.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トロンビン様酵素を含んでなる、幹細胞及び/又は前駆細胞の賦活剤。
【請求項２】
トロンビン様酵素がバトロキソビン、アンクロッド及びクロタラーゼからなる群より選ばれる、請求項１に記載の賦活剤。
【請求項３】
トロンビン様酵素がバトロキソビンである、請求項２に記載の賦活剤。
【請求項４】
トロンビン様酵素以外の活性物質一つ又は一つ以上を更に含んでなる、請求項１に記載の賦活剤。
【請求項５】
トロンビン様酵素以外の活性物質が、成長因子、サイトカイン、エストロゲン、脂質、スタチン、抗成長因子抗体、成長因子インヒビター、抗成長因子インヒビター抗体、及び抗サイトカイン抗体からなる群より選択される、請求項４に記載の賦活剤。
【請求項６】
幹細胞及び／又は前駆細胞が、再生医療に適用される細胞である、請求項１〜５の何れかに記載の賦活剤。
【請求項７】
幹細胞及び／又は前駆細胞が、自発的再生を利用する再生医療に適用される細胞である、請求項６に記載の賦活剤。
【請求項８】
幹細胞及び／又は前駆細胞が、皮膚系疾患、脳神経系疾患、循環器系疾患、消化器系疾患、呼吸器系疾患、泌尿器系疾患、運動器官系疾患、血管系疾患、内分泌系疾患及び眼科系疾患からなる群より選ばれる疾患の再生医療に適用される細胞である、請求項６又は７に記載の賦活剤。
【請求項９】
幹細胞及び／又は前駆細胞が、脳神経系疾患、循環器系疾患、皮膚系疾患及び血管系疾患からなる群より選ばれる疾患の再生医療に適用される細胞である、請求項８に記載の賦活剤。
【請求項１０】
幹細胞及び／又は前駆細胞が、内在性細胞、骨髄由来細胞及び血液由来細胞からなる群より選ばれる細胞である、請求項１〜９のいずれかに記載の賦活剤。
【請求項１１】
賦活化作用が、幹細胞及び／又は前駆細胞の増殖促進、遊走促進及び分化促進からなる群より選ばれる作用である、請求項１〜１０のいずれかに記載の賦活剤。
【請求項１２】
再生医療の適用となる傷害臓器及び／又は傷害組織の進行段階や損傷の程度に応じて、迅速かつ必要程度に作用することができる、請求項１〜１１のいずれかに記載の賦活剤。
【請求項１３】
持続的な賦活化作用を有する、請求項１２に記載の賦活剤。
【請求項１４】
副作用が少ない又は副作用がない、請求項１２又は１３に記載の賦活剤。
【請求項１５】
血管内皮前駆細胞及び／又は間葉幹細胞の遊走を促進する、請求項１に記載の賦活剤。
【請求項１６】
幹細胞及び／又は前駆細胞が、下肢深部静脈血栓症の再生医療に適用される細胞である、請求項１に記載の賦活剤。
【請求項１７】
血管内皮前駆細胞及び／又は間葉幹細胞の増殖及び／又は遊走を促進する、請求項１６に記載の賦活剤。
【請求項１８】
幹細胞及び／又は前駆細胞が、虚血性脳血管病の再生医療に適用される細胞である、請求項１に記載の賦活剤。
【請求項１９】
幹細胞及び／又は前駆細胞が、脳虚血再灌流傷害の再生医療に適用される細胞である、請求項１８に記載の賦活剤。
【請求項２０】
幹細胞及び／又は前駆細胞が、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞である、請求項１９に記載の賦活剤。
【請求項２１】
神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の増殖及び／又は遊走及び／又は分化を促進する、請求項２０に記載の賦活剤。
【請求項２２】
幹細胞及び/又は前駆細胞の賦活剤を製造するためのトロンビン様酵素の使用。
【請求項２３】
トロンビン様酵素がバトロキソビンである請求項２２に記載の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
バトロキソビンは、それ自体公知物質であり、日本特許出願公告第５７−１０７１８号公報（日本特許第１１１８１２９号）に記載の方法に従い調製可能である。又は東菱薬品工業株式会社（東京、日本）及びその子会社であるBeijing Tobishi Pharmaceutical Co., Ltd. （北京、中国）より容易に入手可能である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
前駆細胞とは、自己複製能及び分化能を有するが、最終的に分化する細胞の種類が既に決定している未分化細胞をいう。具体例としては、血管内皮前駆細胞（vascular endothelial progenitor cells, vascular EPCs）、神経前駆細胞や造血前駆細胞が挙げられる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
また、幹細胞及び前駆細胞における種類の識別は、各種幹細胞及び前駆細胞に固有のマーカー発現（例えば、神経幹細胞に対するネスチン（Nestin）の発現（Wiese，C. et al. Nestin expression―a property of multi-lineage progenitor cells? Cellular and Molecular Life Sciences, 61:2510-2522,2004）、血管内皮前駆細胞に対するCD34及びCD31の発現（Asahara T et al.: Isolation  of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science 275: 964-967,1997、及び、Shi Q et al.: Evidence for circulating bone marrow-derived endothelial cells. Blood 92(2):362-367,1998））に基づいて行うことができる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
その他の活性物質としては、VEGF、EGF、FGF、PDGF、NGF、HGF等の成長因子、G-CSF、GM-CSF、EPO等のサイトカイン、エストロゲン、脂質、スタチン(coenzyme A reductase inhibitor)、抗成長因子抗体、成長因子インヒビター、抗成長因子インヒビター抗体、抗サイトカイン抗体などが挙げられる（Takeyama K, Ohto H: PBSC mobilization. Transfus Apher Sci 31:233-243,2004、及び、Aicher A, Zeiher AM, Dimmeler S: Mobilizing endothelial progenitor cells. Hypertension 45:321-325,2005）。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７１】
実験方法
（１）ヒト臍帯血単核細胞の採取
正期産の正常妊娠を選択し、臍帯及び胎盤から抗凝固剤としてのヘパリン（20〜30U/ml）を用いて、40〜60mlの臍帯血を採取した。採取した臍帯血を6%  Hydroethylstarch （Becton Dickinson, NJ, USA）と5:1の比率で混合して30分間静置し、沈降した赤血球を除去した。次いで、上層の液体を採取して、リンパ球分離液（相対密度が1.077、Chinese Academy of Medical Sciences, Tianjin，China）と2:1の比率で懸濁し、460×g条件下で25分間遠心分離に付した。中間層の単核細胞を採取して、リン酸緩衝液（PBS）で２回洗浄したものを実験に供した。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８０】
尚、末梢血中に存在する細胞のうち、CD34陽性単核細胞に該当するのは血管内皮前駆細胞及び間葉幹細胞であることが知られている（Zhao Y et al.: A human peripheral blood monocyte-derived subset acts as pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 100: 2426-2431,2003）。したがって、本実施例で評価する末梢血中のCD34陽性単核細胞は血管内皮前駆細胞及び間葉幹細胞であるといえる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９６】
（４）下肢DVT患者における浮腫症状の改善
表６  下肢DVT患者の膝上及び膝下周径の変化（平均値±標準偏差，ｃｍ）
2009509914.tif 000001
**：P<0.01、Wilcoxon検定を用いて投薬前と比較した。
##：P<0.01、対応があるｔ検定を用いて投薬前と比較した。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０８】
（７）NeuN陽性細胞、GFAP陽性細胞及びBrdU陽性/GFAP陽性細胞の測定
各群30匹ずつのラットについて、モデル作製後5、6、12、13、19及び20日目に50mg/kg BrdUを腹腔内注射した。モデル作製後7、14及び21日目にラットを剖検して、凍結脳切片を作製した。SVZ領域におけるNeuN陽性細胞とグリア線維性酸性蛋白質（glial fibrillary acidic protein(GFAP)）陽性細胞の存在は免疫化学染色法で、BrdU陽性/GFAP陽性細胞の存在は二重免疫蛍光染色法で測定した。NeuNは神経幹細胞から分化した未成熟神経細胞に発現するマーカーであり、GFAPは神経幹細胞から分化したアストロサイトに発現するマーカーである。
NeuN陽性細胞の存在は、Chemicon社（Temecula, USA）のヤギ由来抗NeuNモノクローナル抗体を用いて測定した。GFAP陽性細胞の存在は、ヤギ由来の抗GFAPポリクローナル抗体（Sigma, Louis, USA）を用いて測定した。BrdU陽性/GFAP陽性細胞の存在は、一次抗体としてのマウス由来抗ラットBrdUモノクローナル抗体と二次抗体としてのRho標識ウサギ由来抗マウス抗体との組み合わせ、及び、一次抗体としてのヤギ由来の抗GFAPポリクローナル抗体と二次抗体としてのFITC標識ウサギ由来抗ヤギ抗体との組み合わせを用いた二重免疫蛍光染色法で測定した。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１２】
偽手術群では、神経機能の障害が観察されなかった。他の２群では、モデル作成後1日目と比べて術後21日目で神経機能の有意な回復が観察された（P<0.05）。
バトロキソビン投与群では、モデル群と比べて早い神経機能回復が観察された。特にモデル作成後7、8、9及び16日目のバトロキソビン投与群では、モデル群に対して有意な神経機能回復が観察された。
この結果は、バトロキソビンが、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を賦活化させ、障害を受けた神経機能の回復に貢献したことを示している。この賦活化作用は神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の増殖、遊走及び分化に対する促進作用であると考えられる。