(57)【要約】  本発明は、新規なポリペプチド、および試験化合物の感作性のin vitro評価のためのその使用、試験化合物の感作性のin vitro評価のための方法、感作性の低減に適した化合物を選択するためのin vitro法、ならびにそのような方法を実施するためのキットに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験化合物の感作性のin vitro評価のための方法であって
ａ）試験化合物と、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６および１７の配列、ならびにその誘導体から選択される配列を含んでなる単離されたポリペプチドとを接触させる工程；
ｂ）前記試験化合物と前記ポリペプチドとの結合を測定する工程
を含んでなる、方法。
【請求項２】
前記試験化合物が皮膚に適用することができるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試験化合物が皮膚用または化粧品用組成物の、組成の一部を形成することができる、請求項１および２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
感作性を低減することができる化合物を選択するためのin vitro方法であって
ａ）感作性物質であると同定された化合物を、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６および１７の配列、ならびにその誘導体から選択される配列を含んでなる単離されたポリペプチド、および感作性を低減する候補化合物と接触させる工程；
ｂ）感作性物質であると同定された化合物と前記ポリペプチドとの結合を測定する工程
を含んでなる、方法。
【請求項５】
感作性物質であると同定された化合物が、ジフェニルシクロプロぺノン、没食子酸ラウリル、３−３−ジメチルアミノプロピルアミン、桂皮酸アルデヒド、シトラール、１，４−ヒドロキノン、グルタルアルデヒド、１，２−ベンズイソチアゾリン−３−オン、フェニルアセトアルデヒド、およびリリアールから選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２および１３の配列、ならびにその誘導体から選択される配列を含んでなる、単離されたポリペプチド。
【請求項７】
前記配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２および１３の配列が、そのＮ末端にアセチル基を有する、請求項６に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項８】
前記配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２および１３の配列が、そのＣ末端にアミンまたはアミド基を有する請求項６または７に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸の配列を含んでなる核酸。
【請求項１０】
請求項６〜８のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチドの、試験化合物の感作性のin vitro評価のための使用。
【請求項１１】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の試験化合物の感作性のin vitro評価のための方法を実施するためのキットであって、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６および１７の配列、ならびにその誘導体から選択される配列を含んでなる少なくとも１つの単離されたポリペプチドを含んでなる、キット。
【請求項１２】
請求項４または５に記載の感作性を低減することができる化合物を選択するための方法を実施するためのキットであって、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６および１７の配列、ならびにその誘導体から選択される配列を含んでなる少なくとも１つのポリペプチド、および感作性物質であると同定された少なくとも１つの化合物を含んでなる、キット。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
本発明は、新規なポリペプチド、および試験化合物の感作性のin vitro評価のためのその使用、試験化合物の感作性のin vitro評価のための方法、感作性を低減することのできる化合物を選択するためのin vitro評価法、ならびにそのような方法を実施するためのキットに関する。
【０００２】
香水および化粧品製造業は、その使用に関連してヒトおよびそれらの環境のための安全基準を満たすという制約の中で、競争力および効率性を維持し、定期的に新製品を出し続けなければならない。しかしながら、接触アレルギーは香料または化粧品の使用に関連する重大なリスクの一つである。
【０００３】
皮膚接触アレルギー（またはアトピー性皮膚炎）は、ヒトにおける公衆衛生上の重要な問題である。それは、重大な制約となる環境免疫毒性の発現を意味し、それらを引き起こす傾向がある製品を市場に出す際には、その影響を予想することが重要である。皮膚感作およびその結果として関連するアレルギーの発現は、第一にアレルゲン分子と表皮の特殊化した細胞である抗原提示細胞（ランゲルハンス細胞、樹状細胞）との相互作用、次いで第二に、これらの細胞とＣＤ４＋およびＣＤ８＋エフェクターＴリンパ球によるその提示の結果である。アレルギー反応および炎症反応の根底にあるのは後者である。それにもかかわらず、アレルゲン、特に、香水または化粧品中に存在する可能性のあるアレルゲンは小分子であり、直接認識されないかもしれない。その認識には、予め自己タンパク質と会合する必要がある。それゆえに、皮膚においてヘテロ二量体複合体が新しく形成され、その後近接する神経節でＴ細胞に提示される。従って、化学分子（香水または化粧品成分から構成される）の、この香水の使用者のタンパク質と結合する能力は、結果として生じる病的反応を誘発するために不可欠な前駆体である。
【０００４】
これまで、皮膚レベルでの感作分子の同定には動物が使用され、感作性物質との接触後に誘発される神経節リンパ球の増殖に基づくＬＬＮＡ（局所リンパ節試験）が開発された。この試験は経済協力開発機構（ＯＥＣＤ）による「テストガイドライン４２９」として採用されており、現在でもなお、感作性化学物質を決定するための参考試験とされている。
【０００５】
現在、新しいヨーロッパの制約では、動物を用いない方法の使用を課しており、そのために、新規な香水組成物がその感作特性によりヒトに対し危険性を示す傾向があるかどうかを判定するための代替法の開発が必要である。
【発明の概要】
【０００６】
驚くべきことに、発明者らは、皮膚に存在し、重要な相同配列を有するリポカリンファミリーの２つの酵素の配列が、アレルゲンとして振る舞う傾向のある化合物のin vitroでのスクリーニングを可能にすることを示した。これらの酵素は「好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン」（ＮＧＡＬ、リポカリン２とも呼ばれる）(SEO et al, Expression of neutrophil gelatinase-associated lipocalin in skin epidermis, J. Invest. Dermatol, 126, 510-412; 2006)、および「プロスタグランジンＤシンターゼ」（Ｌ−ＰＧＤＳ）(TAKEDA et al, Lipocalin-type prostaglandin D synthase as a melanocyte marker regulated by MTIF, BBRC, 339, 1098-1106; 2006)である。
【０００７】
ＮＧＡＬは、当初は９２ｋＤａの「好中球ゼラチナーゼ」（またはゼラチナーゼＢ，ＭＭＰ−９）と共有結合的に結合している２５ｋＤａのタンパク質として同定された。結晶学的解析では、この酵素の天然リガンドは様々な細菌の鉄シデロフォアであり、従って、静菌性に作用する。腎臓では、この酵素はネフロンの細胞中に鉄を送達することにより同じ役割を果たす。ＮＧＡＬは培養物中のケラチノサイト内のカルシウムにより誘導され、in situハイブリダイゼーションにより、ヒトおよびマウス皮膚中の、特に表皮（ケラチノサイト中のみ）および毛嚢中にその存在が確認されている。
【０００８】
Ｌ−ＰＧＤＳの、初期に説明された役割は、プロスタグランジンＨ２をプロスタグランジンＤ２へと異性化することであり、また、細胞外間隙の親油性タンパク質としても機能し、その既知のリガンドはビリルビン、レチンアルデヒドおよびレチノイン酸である。最近の研究では、ラットにおいてＬ−ＰＧＤＳはランゲルハンス細胞、メラノサイト、組織球およびマクロファージ中に存在することが示されている（しかしケラチノサイト中には存在しない）。
【０００９】
次に発明者らは、アレルゲンとして振る舞う傾向のある化合物の感作性のin vitro評価のための方法を開発するために、これらリポカリンまたはその誘導体の特定の配列を同定した。
【００１０】
従って、本発明は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２および１３の配列、ならびにこれらの誘導体から選択される配列を含んでなる単離されたポリペプチド、好ましくは、配列番号１、２、３および４の配列から選択される配列を含んでなる単離されたポリペプチド、さらにより優先的には、配列番号１の配列または配列番号３の配列を含んでなる単離されたポリペプチド、さらにより好ましくは、配列番号１の配列を含んでなる単離されたポリペプチドに関する。
【発明の具体的説明】
【００１１】
前記配列を以下に記載する。
【化１】
2012525131.tif 000002
ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４はリシン、オルニチン、ジアミノブチレートまたはジアミノプロピオネートから独立に選択され、好ましくは、リシンである。
【００１２】
有利には、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４のそれぞれの基は、リシンを表す。従って、有利には、配列番号１の配列において、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４はそれぞれリシン基を表し、従って以下の配列番号２０の配列
KACAKDELKEK（配列番号２０）
に相当する。
【００１３】
優先的には、配列番号２０の前記配列は、そのＣ末端にアミン基（ＮＨ２）を有する。
【００１４】
有利には、配列番号２の配列において、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４はそれぞれリシン基を表し、従って該配列は以下の配列番号２１：
KEKLEDKACAK（配列番号２１）
の配列に相当する。
【００１５】
有利には、配列番号３の配列において、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３はそれぞれリシン基を表し、従って該配列は以下の配列番号２２：
ECGKDELKEK（配列番号２２）
の配列に相当する。
【００１６】
有利には、配列番号４の配列において、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３はそれぞれリシン基を表し、従って該配列は以下の配列番号２３：
KEKLEDKGCE（配列番号２３）
の配列に相当する。
【００１７】
有利には、配列番号５の配列において、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３はそれぞれリシン基を表し、従って該配列は以下の配列番号２４：
LYGRTKELTSELKENFIRFSKSLGLPEN（配列番号２４）
の配列に相当する。
【００１８】
有利には、配列番号６の配列において、Ｘ１およびＸ２はそれぞれリシン基を表し、従って該配列は以下の配列番号２５：
LYSRSQNPRAEVKEHFTTFAKSLGFTEE（配列番号２５）
の配列に相当する。
【００１９】
有利には、配列番号７の配列において、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４はそれぞれリシン基を表し、従って該配列は以下の配列番号２６：
LYGRTKELSPELKERFTFAKSLGLK（配列番号２６）
の配列に相当する。
【００２０】
有利には、配列番号８の配列において、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４はそれぞれリシン基を表し、従って該配列は以下の配列番号２７：
LYSRTQTLKDELKEKFTTFSKAQGLT(配列番号２７）
の配列に相当する。
【００２１】
有利には、配列番号９の配列において、Ｘ１はリシン基を表し、従って該配列は以下の配列番号２８：
RQNQCETK（配列番号２８）
の配列に相当する。
【００２２】
有利には、配列番号１０の配列において、Ｘ１はリシン基を表し、従って該配列は以下の配列番号２９：
TLYGRTKEL（配列番号２９）
の配列に相当する。
【００２３】
有利には、配列番号１１の配列において、Ｘ１、Ｘ２はそれぞれリシン基を表し、従って該配列は以下の配列番号３０：
KERFTRFAK（配列番号３０）
の配列に相当する。
【００２４】
有利には、配列番号１２の配列において、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３はそれぞれリシン基を表し、従って該配列は以下の配列番号３１：
KEKFTTFSK（配列番号３１）
の配列に相当する。
【００２５】
有利には、配列番号１３の配列において、Ｘ１はリシン基を表し、従って該配列は以下の配列番号３２：
LYGRTKELS（配列番号３２）
の配列に相当する。
【００２６】
有利には、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２および１３の配列は、そのＮ末端にアセチル基を有してよい。
【００２７】
有利には、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２および１３の配列は、そのＣ末端にアミン基（ＮＨ２）またはアミド基（ＣＯＮＨ２）を有してよい。好ましくは、配列番号１および配列番号３の配列は、そのＣ末端にアミンまたはアミド基を有する。
【００２８】
本発明の前記の単離されたポリペプチドは、Ｌ型またはＤ型であってよい。
好ましくは、本発明のポリペプチドの長さは、１００アミノ酸未満であり、好ましくは８０未満、さらにより好ましくは５０未満、さらにより好ましくは４０未満、最も好ましくは３０アミノ酸未満である。
【００２９】
「誘導体」とは、前記ポリペプチドの活性を改変しない１以上の配列突然変異を有するポリペプチド、特に、１以上のいわゆる「保存された」突然変異を有し、かつ該突然変異はシステインおよび／またはリシン残基のチオールのｐＫａ値に影響せず、ならびに／または配列番号１〜１３の配列の完全配列と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一性パーセンテージを有するポリペプチドをさすと理解すべきである。
【００３０】
「保存的突然変異」とは、塩基性アミノ酸残基の別の塩基性アミノ酸残基による置換、酸性アミノ酸残基の別の酸性アミノ酸残基による置換、中性アミノ酸残基の別の中性アミノ酸残基による置換、脂肪族アミノ酸残基の別の脂肪族もしくは芳香族アミノ酸残基による置換、芳香族アミノ酸残基の別の芳香族もしくは脂肪族アミノ酸残基による置換、アミドアミノ酸残基の別のアミドアミノ酸残基による置換、またはアルコールアミノ酸残基の別のアルコールアミノ酸残基による置換、から選択される突然変異をさすと理解すべきである。
【００３１】
アミノ酸配列間の「同一性パーセンテージ」とは、比較される２つの配列の間の同一アミノ酸のパーセンテージをさし、前記配列の最良アライメントで得られ、このパーセンテージは純粋に統計学的なものであり、２つの配列間の相違はそのアミノ酸配列中にランダムに分布していることをさすと理解すべきである。「最良アライメント」とは、同一性パーセンテージが最も高いアライメントを意味する。２つのアミノ酸配列間の配列の比較は、一般に、最良アライメントに従って予め整列させたこれらの配列を比較することにより行われ、この比較は、領域の類似性を同定および比較するための比較セグメントにおいて行われる。配列の最良アライメントは、手動の他、ＳＭＩＴＨおよびＷＡＴＥＲＭＡＮ(Ad. App. Math., vol.2, p.482, 1981)により開発されたグローバル・ホモロジー・アルゴリズムの使用によるか、ＮＥＤＤＬＥＭＡＮおよびＷＵＮＳＣＨ(J. Mol. Biol., vol.48, p.443, 1970)により開発された局所ホモロジー・アルゴリズムの使用によるか、ＰＥＡＲＳＯＮおよびＬＩＰＭＡＮ(Proc. Natl. Acd. Sci. USA, vol.85, p.2444, 1988)により開発されたものと類似の方法の使用によるか、このようなアルゴリズムを利用するソフトウエア(GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA, TFASTA, ”Wisconsin Genetics Software Package”, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI USA）、ＭＵＳＣＬＥマルチプル・アライメント・アルゴリズム(Edgar, Robert C., Nucleic Acids Research, vol. 32, p.1792, 2004)の使用によって行うことができる。最良の局所アライメントを得るには、好ましくはＢＬＡＳＴソフトウエアを、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスまたはＰＡＭ３０マトリックスとともに使用することができる。２つのアミノ酸配列間の同一性パーセンテージは、最適に整列されたこれら２つの配列を比較することにより決定され、これらのアミノ酸配列は、これらの２配列間の最適アライメントを得る
ために、参照配列に対しての付加または欠失を含み得る。同一性パーセンテージは、これらの２配列間で同一である位置の数を求め、この数を比較した位置の総数で割り、この数に１００をかけて計算される。
【００３２】
好ましい実施形態によれば、前記の単離されたポリペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２および１３の配列、ならびにその誘導体から選択される配列、好ましくは、配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４の配列、ならびにその誘導体から選択される配列、好ましくは、配列番号１および配列番号３の配列、さらにより好ましくは、配列番号１の配列から選択される配列からなる。
【００３３】
配列番号１の配列、さらにより好ましくは、配列番号２０の配列からなる単離されたポリペプチドは、その合成および精製が容易であり、優れた溶解性を有し、静電気発生がわずかであり、二量体化するのは極めてわずかであるために、取り扱いが容易で、このことは本発明の方法におけるその使用を容易にし、最終的には、単一反応段階で前記配列に固定されるアレルゲンの検出が可能になるために、特に好ましい。
【００３４】
別の態様によれば、本発明は、上記で定義されたポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなるヌクレオチド配列に関する。
【００３５】
本発明のヌクレオチド配列は、ＲＮＡまたはＤＮＡの形態、好ましくは、ＤＮＡの形態であり得る。
前記ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖の形態であり得る。
【００３６】
別の態様によれば、本発明は、
ａ）試験化合物と、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６および１７の配列、ならびにその誘導体から選択される配列を含んでなる単離されたポリペプチドとを接触させる工程；
ｂ）前記化合物と前記ポリペプチドとの結合(biding)を測定する工程
を含んでなる、試験化合物の感作性のin vitro評価のための方法に関する。
【００３７】
当然のことながら、該評価方法はex vivoで行うこともできる。
【００３８】
配列番号１４の配列は、ヒトリポカリン２のポリペプチド配列を表す。
【化２】
2012525131.tif 000003
【００３９】
配列番号１５の配列は、マウスリポカリン２のポリペプチド配列を表す。
【化３】
2012525131.tif 000004
【００４０】
配列番号１６の配列は、ヒトプロスタグランジンＤシンターゼのポリペプチド配列を表す。
【化４】
2012525131.tif 000005
【００４１】
配列番号１７の配列は、マウスプロスタグランジンＤシンターゼのポリペプチド配列を表す。
【化５】
2012525131.tif 000006
【００４２】
有利には、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７の配列の１以上のリシン残基は、オルニチン、ジアミノ酪酸、またはジアミノプロピオン酸により置換することができる。
【００４３】
好ましくは、単離されたポリペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２および１３の配列、ならびにその誘導体から選択される配列を含んでなる。
【００４４】
工程ｂ）において得られる任意の結合の測定は、所望により、試験化合物不在下または非感作性であることが公知の化合物、例えば、クロロベンゼン（Ｃｂｚ）もしくは乳酸（ＬＡ）などの存在下で行われた陰性対照、または前記ポリペプチドの公知のリガンドを用いて行われた陽性対照と比較することができる。
【００４５】
従って、本発明の前記方法はまた、試験化合物の感作性を判定する工程ｃ）を含み得る。結合のパーセンテージが高いほど、感作性は強い。
【００４６】
前記結合は、例えば、共有結合、水素結合、塩類結合、静電気結合またはファンデルワールス結合、ラジカルアタックなどであってよい。前記結合は好ましくは、共有結合である。
【００４７】
結合の測定は、当業者に周知のいずれの測定技術を用いて行われてもよい。例として、抗原、蛍光、酵素または放射能などの種類であり得る標識による結合測定、液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による分離、表面プラズモン共鳴技術の利用などを挙げることができる。
【００４８】
好ましい実施形態では、ポリペプチドは抗原マーカーに結合し、前記試験化合物と前記ポリペプチドの結合の測定は、前記抗原マーカーに向けられた検出可能な抗体により行う。
【００４９】
この抗原マーカーは当業者に公知のいずれの種類のマーカーであってもよく、特に、ポリヒスチジンアミノ酸（ポリＨｉｓ）の配列、ｃＭｙｃエレメント、Ｆｌａｇ、またはもしくはヘマグルチニンもしくはＶ５タンパク質の単離された配列であってよい。ポリＨｉｓ配列は、好ましくは、４〜６個のヒスチジン残基を含む。優先的には、抗原マーカーはポリヒスチジンアミノ酸（ポリＨｉｓ）の配列である。
【００５０】
この抗原マーカーを検出するために使用される抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであってよい。それらは、当業者に公知の従来の技術により製造されてよい。それらは、市販の抗体であってよい。これらには、ペンタ−Ｈｉｓ  ＨＲＰ抗体コンジュゲート（ＱＩＡＧＥＮ）、抗−６ｘ  Ｈｉｓ  Ａｃｅａｍ  ９１０８ウサギ抗体、−６ｘ  Ｈｉｓ  ＨＲＰ標識ウサギ抗体（セイヨウワサビ(raifort)ペルオキシダーゼ）Ａｂｃａｍ  １１８７、抗−５ｘ  Ｈｉｓ  Ｑｉａｇｅｎ  ３４６９８マウス抗体および抗−ポリ−Ｈｉｓ  Ｓｉｇｍａ  Ｈ−１０２９抗体を挙げることができる。
【００５１】
抗体は、当業者に公知の検出可能なマーカー、例えば酵素（例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ  ＨＲＰ）、放射性マーカー、蛍光剤、磁性粒子などと結合させることができる。優先的には、該抗体はＨＲＰ（セイヨウワサビペルオキシダーゼ）と結合させる。
【００５２】
任意の好適な技術、例えば、ウエスタンブロット、ドットブロットなどを用いて、免疫検出を行うことができる。
【００５３】
別の好ましい実施形態では、ポリペプチドは蛍光マーカーに結合し、前記試験化合物と前記ポリペプチドとの結合は、蛍光光度法により測定される。蛍光標識は直接または間接であってよく、蛍光団はポリペプチドに直接、または他のマーカーにより固定される。蛍光マーカーは、例えば、フルオレセイン、ＲＰＥ（Ｒ−フィコエリトリン）、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、ＡＰＣ（アロフィコシアニン）、シアニン、またはユウロピウムであってよい。
【００５４】
別の好ましい実施形態では、ポリペプチドは酵素マーカーに結合し、前記試験化合物と前記ポリペプチドとの結合の測定は、酵素反応時に用いられた基質によって、蛍光光度法、発光または比色定量法により行われる。
【００５５】
前記試験化合物と前記ポリペプチドとの結合の測定は特に、発色基質（ｐ−ニトロフェニルフォスフェートまたはｐＮＰＰ）、蛍光基質（フルオレセインジフォスフェートまたはＦＤＰ）、または発光基質（Ｌｕｍｉ−Ｐｈｏｓ（商標））により行うことができ、次に、相互作用の測定は、それぞれ４０５ｎｍにおける分光光度法、蛍光定量法（励起光：４８５ｎｍ；蛍光：５３５ｎｍ）、または発光により行うことができる。
【００５６】
ポリペプチドは、支持体に固定することができる。本発明の方法の実施のために優先的に使用される支持体は、プレート、ボール、またはチップである。
【００５７】
本発明の方法で使用されるポリペプチドは、当業者に公知の任意の技術、特に、人工的な合成、より詳しくは、固相合成により調製することができる。
【００５８】
試験化合物は、様々な特性、構造および起源の化合物、特に、生体化合物、化学化合物、合成化合物などであってよい。
【００５９】
試験化合物は、単離された形態または他の生成物との混合物の形態の、任意の生成物であってよい。試験化合物は、構造および／または組成物の観点から、または機能レベルの観点から定義されてよい。試験化合物は、例えば、単離された構造的に明らかな生成物、構造が明らかにされていない単離された生成物、公知の特徴づけられている生成物の混合物、または１以上の生成物を含んでなる組成物であってよい。１以上の化合物は、混合物で、または別々に試験してよい。
【００６０】
このような化合物は、例えば、化粧品または皮膚用生成物のサンプルであってよい。
試験化合物は、天然または合成起源であってよい。
【００６１】
本発明は、特に、多数の化合物の同定に適している。この単純で効果的なスクリーニングは、非常に短時間で行うことができる。記載されている方法は、特に、部分的に自動化されており、従って混合物の形態または単離された形態のいずれにおいても、様々な多数の化合物の効果的な同時スクリーニングを可能にする。
【００６２】
優先的には、本発明の方法は、ＨＴＳ（ハイスループットスクリーニング）、またはＭＴＳ（ミディアムスループットスクリーニング）において行う。
【００６３】
本発明の意味の範囲内において、「ポリペプチド」は、少なくとも２つのアミノ酸を含んでなる配列を意味し、「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という語は、差別せずに使用してよい。
【００６４】
「感作性」とは、哺乳類、好ましくは、ヒトと接触した場合に免疫学的反応を引き起こす試験化合物のリスクをさすと理解すべきである。従って、感作性とは、試験化合物との接触においてアレルギーを発症するリスクであると考えてよい。
【００６５】
好ましくは、前記試験化合物は皮膚に適用することができる。従って、感作性とは、皮膚アレルギーを発症するリスクに相当する。
【００６６】
好ましくは、前記試験化合物は、皮膚用または化粧品用組成物の、組成の一部を形成することができる。
【００６７】
好ましくは、本発明の方法は、試験化合物が接触アレルギーまたはアトピー性皮膚炎を引き起こす傾向があるかどうかを評価することを可能にする。
【００６８】
好ましくは、本発明の方法は、ｐＨが７．３〜９．３の間、さらにより好ましくは７．８〜８．８の間のバッファー溶液、特に好ましくはｐＨ８．３のバッファー溶液中で行う。
【００６９】
好ましくは、本発明の方法は２０℃〜４０℃の間、より好ましくは２５℃〜３５℃の間、さらにより好ましくは２８℃〜３２℃の間、最も好ましくは３０℃の温度で行う。
【００７０】
好ましくは、本発明の方法は暗所で行う。
【００７１】
好ましくは、本発明の方法の実施のために用いるポリペプチドの濃度は、０．２〜１．５ｍＭの間、さらにより好ましくは０．４〜１．２ｍＭの間、さらにより好ましくは１ｍＭである。
【００７２】
好ましくは、本発明の方法の実施のための試験化合物の濃度は、１〜１０ｍＭの間、さらにより好ましくは３〜７ｍＭの間、さらにより好ましくは４〜６ｍＭの間、最も好ましくは５ｍＭである。
【００７３】
本発明の特定の実施形態では、試験化合物は異なる配列を有するいくつかの単離されたポリペプチドと接触してよい。
【００７４】
特定の実施形態では、本発明の評価方法は競合試験であってよく、その際試験化合物は、感作性物質であると同定された化合物と競合する。感作性物質であると同定された前記化合物は、工程ａ）の前に、または工程ａ）と同時に、前記の単離されたポリペプチドと接触させてよい。このような実施形態は、試験化合物の感作性と、感作性物質であると同定された化合物との比較を可能にする。
【００７５】
別の態様によれば、本発明は、
ａ）感作性物質であると同定された化合物を、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６および１７の配列、ならびにその誘導体から選択される配列を含んでなる単離されたポリペプチド、および感作性を低減する候補化合物と接触させる工程；
ｂ）感作性物質であると同定された化合物と前記ポリペプチドとの結合を測定する工程
を含んでなる、感作性を低減することができる化合物を選択するためのin vitro方法に関する。
【００７６】
感作性を低減することができる化合物を選択するための前記方法は、試験化合物の感作性のin vitro評価のために従前に記載されたものと同じ条件下で行われてよい。
【００７７】
「感作性を低減することができる化合物」とは、感作性物質であると同定された化合物の感作性を低減することができる化合物をさすと理解すべきである。言い換えれば、「感作性を低減することができる化合物」という表現は、感作性物質であると同定された化合物の存在下で免疫学的反応を引き起こすリスクを軽減する化合物をさすと理解すべきである。「脱感作化合物」という語もまた、「感作性を低減することができる化合物」を定義するために使用することができる。
【００７８】
好ましくは、感作性物質であると同定された化合物の感作性を、前記脱感作化合物の不在下で観察された感作性に対して少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、好ましくは１００％低減することができる場合に、化合物は感作性を低減することができるものとする。
【００７９】
「感作性物質であると同定された化合物」とは、特に、本発明の方法により同定することができる化合物、すなわち、言い換えれば、アレルギー誘発性を有すると同定された化合物をさすと理解すべきである。
【００８０】
本発明の方法により同定することのできる化合物は、様々な特性、構造および起源の化合物、特に、生体化合物、化学化合物、合成化合物などであってよい。
【００８１】
好ましくは、感作性物質であると同定された化合物は、ジフェニルシクロプロぺノン（ＤＰＣＰ）、没食子酸ラウリル（ＬＧ）、３−３−ジメチルアミノプロピルアミン（３−ＤＭＡＰＡ）、桂皮酸アルデヒド（ＣＡ）、シトラール（Ｃａｌ）、１，４−ヒドロキノン（ＨＱ）、グルタルアルデヒド（ＧＡ）、１，２−ベンズイソチアゾリン−３−オン（Ｂｅｎ）、フェニルアセトアルデヒド（ＰＡ）、およびリリアール（Ｌｉ）、優先的にはジフェニルシクロプロぺノン、没食子酸ラウリル、１，４−ヒドロキノン、およびグルタルアルデヒド、特に好ましくはジフェニルシクロプロぺノンから選択される。
【００８２】
ジフェニルシクロプロぺノンは、極めて強い感作性物質である；没食子酸ラウリル、１，４−ヒドロキノン、およびグルタルアルデヒドは、強い感作性物質である；３−３ジメチルアミノプロピルアミン、桂皮酸アルデヒド、シトラール、１，２−ベンズイソチアゾリン−３−オン、およびフェニルアセトアルデヒドは、中等度の感作性物質であり、リリアールは弱い感作性物質である。
【００８３】
感作性を低減する候補化合物は、単離された形態または他の生成物との混合物の形態の、任意の生成物であってよい。感作性を低減する候補化合物は、構造および／または組成物の観点から、または機能レベルに関して定義されてよい。感作性を低減する候補化合物は、例えば、構造的に明らかな単離された生成物、構造が明らかにされていない単離された生成物、公知の特徴づけられている生成物の混合物、または１もしくは数個の生成物を含んでなる組成物であってよい。１または数個の化合物は、従って、混合物で、または別々に試験してよい。
【００８４】
試験化合物は、天然または合成起源であってよい。
【００８５】
候補化合物の結合を低減、または阻害する能力は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６および１７の配列、ならびにその誘導体から選択される少なくともひとつの配列を含んでなるポリペプチドの、前記候補化合物の存在下での、感作性物質であると同定された化合物との結合能を、前記ポリペプチドの、前記候補化合物の不在下での、前記感作性物質であると同定された化合物との結合能と比較することにより評価することができる。
【００８６】
従って、前記候補化合物の存在下で結合能の低下または阻害が観察された場合、このことより、前記候補化合物は感作性を低減することができる化合物であると結論づけることができる。
【００８７】
好ましくは、前記候補化合物は皮膚に使用することができ、化粧品または皮膚用組成物に使用してよい。
【００８８】
工程ａ）は、
ｉ）感作性物質であると同定された化合物と従前に定義された単離されたポリペプチドを予め接触させ、次いで、所望により、感作性物質であると同定された化合物と前記の単離されたポリペプチドとの結合を第１に測定し、次に単離されたポリペプチドと結合した感作性物質であると同定された化合物の感作性を低減する候補化合物と接触させること；
ｉｉ）感作性物質であると同定された化合物と感作性を低減する候補化合物を予め接触させ、次に従前に定義された単離されたポリペプチドを、感作性物質であると同定された化合物および感作性を低減する候補化合物と接触させること；または
ｉｉｉ）感作性物質であると同定された化合物、感作性を低減する候補化合物、および従前に定義された単離されたポリペプチドを、同時に接触させること
により行われる。
【００８９】
好ましくは、単離されたポリペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２および１３の配列、ならびにその誘導体から選択される配列を含んでなる。
【００９０】
本発明はまた、本発明の試験化合物の感作性のin vitro評価のための方法を実施するための、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６および１７の配列、ならびにその誘導体から選択される少なくとも１つの単離されたポリペプチドを含んでなるキットに関する。
【００９１】
好ましくは、前記の単離されたポリペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２および１３の配列、ならびにその誘導体、好ましくは配列番号１、２、３、４の配列、さらにより好ましくは配列番号１および配列番号３の配列から選択される配列を含んでなる。
【００９２】
別の態様によれば、本発明はまた、感作性を低減することができる化合物を選択するために本発明の方法を実施するためのキットに関し、前記キットは配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６および１７の配列、ならびにその誘導体から選択される配列を含んでなる少なくとも１つのポリペプチド、および感作性物質であると同定された少なくとも１つの化合物を含んでなる。
【００９３】
好ましくは、感作性物質であると同定された化合物は、ジフェニルシクロプロぺノン、没食子酸ラウリル、３−３−ジメチルアミノプロピルアミン、桂皮酸アルデヒド、シトラール、１，４−ヒドロキノン、グルタルアルデヒド、１，２−ベンズイソチアゾリン−３−オン、フェニルアセトアルデヒドおよびリリアールから、優先的にはジフェニルシクロプロぺノン、没食子酸ラウリル、１，４−ヒドロキノンおよびグルタルアルデヒドから、特に好ましくは、ジフェニルシクロプロペノンから選択される。
【００９４】
好ましくは、前記の単離されたポリペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２および１３の配列、ならびにその誘導体、優先的には配列番号１、２、３、４の配列、さらにより好ましくは配列番号１および配列番号３の配列から選択される配列を含んでなる。
【００９５】
別の態様によれば、本発明は、試験化合物の感作性のin vitro評価のための、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６および１７の配列、ならびにその誘導体から選択される配列を含んでなるポリペプチドの使用に関する。
【００９６】
好ましくは、前記の単離されたポリペプチドは配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２および１３の配列、ならびにその誘導体、優先的には配列番号１、２、３、４の配列、さらにより優先的には配列番号１および配列番号３の配列から選択される配列を含んでなる。
【実施例】
【００９７】
実施例１
０．５ｍＭのポリペプチドおよび５ｍＭの試験化合物の試験を以下の条件下で行う。
【００９８】
４０μｌのペプチド溶液（１００ｍＭ酢酸アンモニウムバッファー中１．２５ｍＭ保存溶液、ｐＨ１０．２、および配列番号１８、配列番号７の配列のポリペプチド（ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４はそれぞれリシンを表す）、または配列番号８の配列のポリペプチド（ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４はそれぞれリシンを表す））、３５μｌの１００ｍＭ酢酸アンモニウムバッファー溶液（ｐＨ１０．２）、２０μｌのアセトニトリル、および５μｌの試験溶液（アセトニトリルまたは５０％アセトニトリル、５０％ＤＭＳＯ混合物中１００ｍＭ保存溶液）を含む反応混合物を調製した後、攪拌した。
【００９９】
リポカリン誘導体ではない配列番号１８の配列を陽性対照として使用した。この配列は、以下に示す配列に相当する。
Ac-RFAAKAA-NH2（配列番号１８）
【０１００】
次に、反応混合物を３０℃にて４時間、暗所でインキュベートした。
【０１０１】
次に、ＨＰＬＣ分析を、バッファーＢ（アセトニトリル＋０．０８％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ））の１０％から４５％の勾配で２０分間行った（バッファーＡ：水＋０．１％ＴＦＡ）、速度１ｍｌ／分。検出は、２３０ｎｍにてＵＶ下で行った。
【０１０２】
アレルゲンを含まない対照は、４０μｌのバッファー溶液で構成された。
【０１０３】
合成試薬（Ｆｍｏｃアミノ酸、合成樹脂）は、ＩＲＩＳ  ＢＩＯＴＥＣＨ（Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手し、有機溶媒はＳＤＳ／ＣＡＲＬＯ  ＥＲＢＡ（Ｆｒａｎｃｅ）から入手し、アセトニトリルはＦＩＳＨＥＲ  ＢＩＯＢＬＯＣＫ（Ｆｒａｎｃｅ）から入手した。
【０１０４】
結果を表１に示す。
【表１】
2012525131.tif 000007
【０１０５】
同様の結果が、配列番号７の配列および配列番号８の配列において、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４がリシン、オルニチン、ジアミノ酪酸、またはジアミノプロピオン酸から独立に選択され、少なくとも１つのＸ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４はリシンではない場合に、観察された。
【０１０６】
試験した３つの配列に対して強い感作能を有する没食子酸ラウリルの高い固定パーセンテージ、配列番号７の配列に対して中等度の、ならびに配列番号８および配列番号１８の配列に対して中等度の感作能を有する桂皮酸アルデヒドの高い固定パーセンテージが観察された。
【０１０７】
実施例２
０．５ｍＭの配列番号２９の配列のポリペプチドおよび５ｍＭの試験化合物の試験を、実施例１に記載されたものと同じプロトコールに従って行った。
【０１０８】
リポカリン誘導体ではない配列番号１９の配列を陽性対照として使用した。この配列は、以下に示す配列に相当する。
Ac-RFAACAA-NH2（配列番号１９）
使用したバッファーは、１００ｍＭのＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３であった。
【０１０９】
【表２】
2012525131.tif 000008
【０１１０】
実施例３
２倍の０．５ｍＭの配列番号１９および配列番号８の配列のポリペプチド（ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４はそれぞれリシンを表す）、および５ｍＭの試験化合物の試験を、実施例１に記載されたものと同じプロトコールに従って行った。
使用したバッファーは、１００ｍＭのＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、ｐＨ９．２、およびｐＨ８．８であった。
【０１１１】
結果を表３に示す。
【表３】
2012525131.tif 000009
【０１１２】
「固定」という語は、固定はされているが定量できなかったことを示す。
ｎ／ａ：同一の保持時間では固定が測定できない。
【０１１３】
ｐＨ８．３で、より良い結果が得られることが観察される。
【０１１４】
同様の結果が、配列番号８の配列において、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４がリシン、オルニチン、ジアミノ酪酸、またはジアミノプロピオネートから独立に選択され、少なくとも１つのＸ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４はリシンではない場合に、観察された。
【０１１５】
実施例４
２倍の０．５ｍＭの配列番号１９および配列番号８の配列のポリペプチド（ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４はそれぞれリシンを表す）、および５ｍＭの試験化合物の試験を、実施例１に記載されたものと同じプロトコールに従って行った。
【０１１６】
使用したバッファーは、１００ｍＭのＴＲＩＳ−ＨＣｌであった。
【０１１７】
結果を表４に示す。
【表４】
2012525131.tif 000010
【０１１８】
同様の結果が、配列番号８の配列において、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４がリシン、オルニチン、ジアミノ酪酸、またはジアミノプロピオネートから独立に選択され、少なくとも１つのＸ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４はリシンではない場合に、観察された。
【０１１９】
実施例５
２倍の０．５ｍＭの配列番号１９および配列番号１（ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４はそれぞれリシンを表し、そのＣ末端にＮＨ２基を有する）および配列番号８（ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４はそれぞれリシンを表す）の配列のポリペプチド、ならびに５ｍＭの試験化合物の試験を、実施例１に記載されたものと同じプロトコールに従って行った。
【０１２０】
使用したバッファーは、１００ｍＭのＴＲＩＳ−ＨＣｌであった。
【０１２１】
結果を表５に示す。
【表５】
2012525131.tif 000011
【０１２２】
同様の結果が、配列番号１の配列または配列番号８の配列において、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４がリシン、オルニチン、ジアミノ酪酸、またはジアミノプロピオネートから独立に選択され、少なくとも１つのＸ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４はリシンではない場合に、観察された。
【０１２３】
注目すべきは、配列番号１の試験の場合、シグナルが乱れ、８２〜８３％固定を超える測定が妨げられたことである。これらの値は結果として最小値を表している。
【０１２４】
配列番号１の配列を用いて行われた一連の測定の間、没食子酸ラウリルおよびフェニルアセトアルデヒドは非常に著しく沈殿し、従ってこのことは得られた中間的な結果を説明している。
【０１２５】
ポリペプチドとアレルゲンである桂皮酸アルデヒドおよび１，２−ベンズイソチアゾリン−３−オンの共溶出が観察された。
【０１２６】
結果は、配列番号1の配列のポリペプチドが、配列番号１９および配列番号８の２つの配列のポリペプチドの使用と同様の結果を得ることを可能にする一方で、以下に示す利点を有することを示している。
・１１残基という短いペプチドで、合成および精製が容易。
・二量体化が弱い。
・優れた溶解性、取り扱いが容易である（静電気の発生はわずかである）。
・ユニークな試験および条件である。
・システインにより固定されたアレルゲンおよびリシンにより固定されたアレルゲンの両方を検出することができる。
【配列表】
2012525131000001.app
【国際調査報告】
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2012525131.tif 000014
2012525131.tif 000015
2012525131.tif 000016
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2012525131.tif 000018
2012525131.tif 000019
2012525131.tif 000020
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