【手続補正書】
【提出日】平成23年9月5日(2011.9.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
三重共鳴以上の多重核磁気共鳴法を用いた酵素活性測定用の基質プローブにおいて、
該基質プローブが酵素によって選択的に認識される酵素認識部位を含み、核スピンを持ち異なる共鳴周波数を有する少なくとも３つの核磁気共鳴活性核が連結した基が前記酵素認識部位に特異的に存在することを特徴とする基質プローブ。
【請求項２】
前記核磁気共鳴活性核が、1Ｈ、13Ｃおよび15Ｎから選択される請求項１に記載の基質プローブ。
【請求項３】
前記基質プローブが、２位炭素と３位炭素が13Ｃで標識されているピルビン酸、もしくはその塩であることを特徴とする請求項２に記載の基質プローブ。
【請求項４】
前記基質プローブがグルコースであり、前記グルコースの１位乃至６位の全ての炭素が13Ｃで標識され、１位乃至６位の炭素に結合する全ての水素原子７個が重水素化されていることを特徴とする請求項２に記載の基質プローブ。
【請求項５】
前記酵素が、解糖系酵素であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の基質プローブ。
【請求項６】
前記解糖系酵素が乳酸デヒドロゲナーゼであることを特徴とする請求項５に記載の基質プローブ。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれかに記載の基質プローブによる、三重共鳴以上の多重核磁気共鳴法を利用した酵素活性の測定方法であって、
活性状態の酵素による前記基質プローブの認識、あるいは、前記基質プローブの認識の後の化学反応に伴う基質プローブ由来の多重核磁気共鳴信号の変化を測定する工程を有することを特徴とする核磁気共鳴法による酵素活性の測定方法。
【請求項８】
前記多重核磁気共鳴法が、二重核磁気共鳴法と三重核磁気共鳴法の各パルス系列を用いて各核磁気共鳴信号を取得する工程と、これらの信号を組み合わせて解析する工程と、を少なくとも有することを特徴とする請求項７に記載の酵素活性の測定方法。
【請求項９】
基質プローブの存在を二重核磁気共鳴信号を用いて検出し、酵素反応を受けた該基質プローブを三重核磁気共鳴信号を用いて検出することで、前記基質プローブの存在量と前記酵素の活性とを測定する工程を有することを特徴とする請求項８に記載の酵素活性の測定方法。
【請求項１０】
請求項１乃至６のいずれかに記載の基質プローブによる多重核磁気共鳴イメージングを利用した酵素活性のイメージング方法であって、
活性状態の酵素による基質プローブの認識、あるいは、前記基質プローブの認識の後の化学反応に伴う基質プローブ由来の多重核磁気共鳴信号の変化を測定する工程と、
前記基質プローブの位置情報を取得する工程を有することを特徴とする酵素活性のイメージング方法。
【請求項１１】
前記多重核磁気共鳴イメージング法が、二重核磁気共鳴法と三重核磁気共鳴法の各パルス系列を用いて各核磁気共鳴信号を取得する工程と、これらの信号を組み合わせて解析する工程と、を有することを特徴とする請求項１０に記載の酵素活性のイメージング方法。
【請求項１２】
基質プローブの存在を二重核磁気共鳴信号を用いて検出し、酵素反応を受けた該基質プローブを三重核磁気共鳴信号を用いて検出することで、前記基質プローブの存在量と前記酵素の活性を測定する工程を有することを特徴とする請求項１１に記載の酵素活性のイメージング方法。
【請求項１３】
多重核磁気共鳴法を用いたプロテアーゼ活性測定用の基質ペプチドプローブにおいて、該基質ペプチドプローブが、活性状態のプロテアーゼによって選択的に認識され、切断されるプロテアーゼ切断部位を含み、核スピンを持ち異なる共鳴周波数を有する少なくとも３つの核磁気共鳴活性核が連結した基が前記プロテアーゼ切断部位に特異的に存在することを特徴とする基質ペプチドプローブ。
【請求項１４】
前記核磁気共鳴活性核が、1Ｈ、13Ｃおよび15Ｎから選択されることを特徴とする請求項１３に記載の基質ペプチドプローブ。 
【請求項１５】
前記基質ペプチドプローブが、一般式（１）で示される構造を有するオリゴペプチドであることを特徴とする請求項１３または１４に記載の基質ペプチドプローブ。
【化１】
2009077710.tif 000001
（一般式（１）中、Ｒは互いに異なっていても良いアミノ酸側鎖を示し、矢印は前記プロテアーゼ切断部位を示す。）
【請求項１６】
前記基質ペプチドプローブのアミノ酸配列がGly-Pro-Leu-Gly-Val-Arg-Gly-Lys（配列番号１）であり、Ｎ末端側から４番目のGlyのアミノ酸骨格の１位炭素および２位炭素が13Ｃで標識され、Ｎ末端側から５番目のValのアミノ酸骨格の窒素が15Ｎで標識されていることを特徴とする請求項１５に記載の基質ペプチドプローブ。
【請求項１７】
前記プロテアーゼがマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）であることを特徴とする請求項１３乃至１６のいずれかに記載の基質ペプチドプローブ。
【請求項１８】
前記プロテアーゼがマトリックスメタロプロテアーゼ２（ＭＭＰ２）であることを特徴とする請求項１７に記載の基質ペプチドプローブ。
【請求項１９】
請求項１３乃至１８のいずれかに記載の基質ペプチドプローブによる多重核磁気共鳴法を利用したプロテアーゼ活性の測定方法であって、
活性状態のプロテアーゼによる前記基質ペプチドプローブの切断に伴う多重核磁気共鳴信号の変化を測定する工程を有することを特徴とする核磁気共鳴法によるプロテアーゼ活性の測定方法。 
【請求項２０】
前記多重核磁気共鳴法が、二重核磁気共鳴法と三重核磁気共鳴法の各パルス系列を用いて各核磁気共鳴信号を取得する工程と、これらの信号を組み合わせて解析する工程と、を少なくとも有することを特徴とする請求項１９に記載のプロテアーゼ活性の測定方法。
【請求項２１】
基質ペプチドプローブの存在を二重核磁気共鳴信号を用いて検出し、該基質ペプチドプローブがプロテアーゼによって切断された後の物質を三重核磁気共鳴信号を用いて検出することで、前記基質ペプチドプローブの存在量と前記プロテアーゼの活性とを測定することを特徴とする請求項２０に記載のプロテアーゼ活性の測定方法。
【請求項２２】
請求項１３乃至１８のいずれかに記載の基質ペプチドプローブによる多重核磁気共鳴イメージングを利用したプロテアーゼ活性のイメージング方法であって、
活性状態のプロテアーゼによる基質プローブの切断に伴う多重核磁気共鳴信号の変化を測定する工程と、
前記基質ペプチドプローブの位置情報を取得する工程を有することを特徴とするプロテアーゼ活性のイメージング方法。
【請求項２３】
前記多重核磁気共鳴イメージング法が、二重核磁気共鳴法と三重核磁気共鳴法の各パルス系列を用いて各核磁気共鳴信号を取得する工程と、これらの信号を組み合わせて解析する工程と、を有することを特徴とする請求項２２に記載のプロテアーゼ活性のイメージング方法。
【請求項２４】
基質プローブの存在を二重核磁気共鳴信号を用いて検出し、該基質ペプチドプローブがプロテアーゼによって切断された後の物質を三重核磁気共鳴信号で検出することで、前記基質プローブの存在量と前記プロテアーゼの活性を測定する工程を有することを特徴とする請求項２３に記載のプロテアーゼ活性のイメージング方法。
【請求項２５】
下記の式（６）、（７）のいずれかで表される化合物、あるいは、Gly-Pro-Leu-Gly-Val-Arg-Gly-Lys（配列番号１）で表され、Ｎ末端側から４番目のGlyのアミノ酸骨格の１位炭素および２位炭素が13Ｃで標識され、Ｎ末端側から５番目のValのアミノ酸骨格の窒素が15Ｎで標識されている化合物。
【化２】
2009077710.tif 000002
【化３】
2009077710.tif 000003