(57)【要約】被験体においてＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（Ｍｔｂ）感染を検出するための方法を開示し、被験体は、小児、潜伏性Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染症に罹患している被験体である。また、本方法は、被験体における肺外Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染の検出も開示する。本方法には、Ｍｔｂポリペプチドを特異的に認識するＣＤ８＋Ｔ細胞の存在を検出することが含まれる。本方法には、生物学的試料中のＣＤ８＋Ｔ細胞の存在を検出するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイが含まれる。
2012503206.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト被験体においてＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを検出するための方法であって、
結核疾患に罹患していることが疑われるヒト小児またはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓによる潜在性感染を有することが疑われるヒト被験体からの生物学的試料から、ＣＤ８＋Ｔ細胞を単離する工程、
前記ＣＤ８＋Ｔ細胞を１つまたは複数のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍポリペプチドと接触させる工程、および
前記ＣＤ８＋Ｔ細胞が前記Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍポリペプチドを特異的に認識するかどうかを決定する工程を含み、ここで、前記Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍポリペプチドを特異的に認識するＴ細胞の存在により、前記被験体におけるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓが検出され、それにより、結核疾患に罹患しているとして前記小児を同定するか、またはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓによる潜在性感染を有するとして前記被験体を同定する、方法。
【請求項２】
前記小児が５歳未満であるか、または前記小児が５〜１０歳である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記小児が乳児である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記被験体がＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓによる潜在性感染を有することが疑われる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記小児が肺結核疾患に罹患していることが疑われる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記被験体または小児がＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの肺外感染症に罹患していることが疑われる、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
肺外感染症が、リンパ節炎、胸膜結核、骨関節結核、中枢神経系結核、腹部結核、粟粒結核、または結核性心外膜炎を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記被験体が思春期直前の被験体である、請求項６から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＣＤ８＋Ｔ細胞が前記Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍポリペプチドを特異的に認識するかどうかを決定する工程が、サイトカインの発現を測定することを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記サイトカインがインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＩＦＮ−γの発現を測定することを、ＩＦＮ−γと特異的に結合する抗体を用いて決定する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記１つまたは複数のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍポリペプチドが、
（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号３９もしくは配列番号６１として記載したアミノ酸配列のうちの１つ、または
（ｂ）主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩと特異的に結合する、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号３９もしくは配列番号６１として記載したアミノ酸配列のうちの少なくとも１つの少なくとも９〜２０個の連続したアミノ酸、および
（ｃ）配列番号３９〜８３として記載したアミノ酸配列のうちの１つ
として記載したアミノ酸配列を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記Ｍｙｏｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍポリペプチドが配列番号３９として記載したアミノ酸配列を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｍｙｏｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍポリペプチドが配列番号６１として記載したアミノ酸配列を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍポリペプチドが、配列番号３９として記載したアミノ酸配列の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩと特異的に結合する９〜２０個の連続したアミノ酸を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍポリペプチドが、配列番号６１として記載したアミノ酸配列の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩと特異的に結合する９〜２０個の連続したアミノ酸を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記生物学的試料が、血液、単離した末梢血単核細胞、単離した単核細胞、痰、肺生検材料、リンパ節生検材料、唾液、脳脊髄液または単離したＣＤ３＋Ｔ細胞である、請求項１から１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記ＣＤ８＋Ｔ細胞を前記Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍポリペプチドと共にｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養する、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに対する遅延型の過敏性反応を検出することをさらに含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記被験体からの試料におけるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍポリペプチドまたはポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドの存在を検出する工程をさらに含み、前記Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、または配列番号３９〜８３のうちの１つとして記載したアミノ酸配列のうちの１つとして記載したアミノ酸配列を含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍポリペプチドの存在を検出する工程を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍポリペプチドの存在を検出する工程が、前記Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍポリペプチドと特異的に結合する抗体の使用を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ポリヌクレオチドの存在を検出する工程を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記ポリヌクレオチドの存在を決定する工程がポリメラーゼ連鎖反応の使用を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
被験体においてＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍポリペプチドと特異的に結合するＣＤ８を発現するＴ細胞を検出する方法であって、前記被験体が、小児、潜伏性Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染症に罹患していることが疑われる被験体、または肺外Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染症に罹患していることが疑われる被験体であり、前記方法が、
（Ａ）前記被験体から単離した末梢血単核細胞を、
（１）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１もしくは配列番号１２、配列番号３９、配列番号６１または配列番号３９〜８３のうちの任意の１つとして記載したアミノ酸配列のうちの少なくとも１つの少なくとも９〜２０個の連続したアミノ酸を含むＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍポリペプチドであって、前記９〜２０個の連続したアミノ酸が主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩと特異的に結合する、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍポリペプチド
（２）ＨＬＡ重鎖ポリペプチドおよびβ２−ミクログロブリン、および
（３）ストレプトアビジン
を含み、標識されている、または標識されていない試薬と接触させる工程、ならびに
（Ｂ）前記末梢血単核細胞と結合した前記試薬の存在を検出し、それにより前記Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍポリペプチドと特異的に結合するＣＤ８を発現するＴ細胞を検出する工程
を含む、方法。
【請求項２６】
前記試薬と結合するＣＤ８＋Ｔ細胞の数を定量する工程をさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記試薬が標識されている、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記試薬が蛍光色素で標識されている、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記被験体が小児であり、前記Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍポリペプチドと特異的に結合するＣＤ８を発現するＴ細胞を検出する工程により、前記小児が肺結核疾患に罹患していることが示される、請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権主張
これは、２００８年９月２８日に出願された米国仮出願第６１／０９９，１６２号（これは、参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
政府の支援についての声明
この発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｔｈからの助成金第ＡＩ０５４４７４号および同第ＡＩ０７００２２号に従った米国政府の支援によってなされた。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。本発明はまた、ｔｈｅ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｖｅｔｅｒａｎｓ  Ａｆｆａｉｒｓからの支援によってもなされている。
【０００３】
分野
本出願は診断分野に関し、具体的には、被験体、特に小児においてＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｓｏｓｉｓ（Ｍｔｂ）感染を検出するための方法および／または潜在性感染を診断する方法に関する。
【０００４】
関連する主題
この出願は、２００６年３月１４日に出願された米国仮出願第６０／７８２，３６４号、および２００７年３月１４日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００６５３４号（これらは、両方とも参考として本明細書に援用される）の主題に関連する。
【背景技術】
【０００５】
背景
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａとは、宿主に感染した際に単球およびマクロファージのエンドソーム区画内で生存する、好気性の細胞内細菌生物の属である。ヒトのマイコバクテリア病には、結核（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓによって引き起こされる）、らい病（Ｍ．ｌｅｐｒａｅによって引き起こされる）、ベアンズデイル潰瘍（Ｍ．ｕｌｃｅｒａｎｓによって引き起こされる）、ならびにＭ．ｍａｒｉｎｕｍ、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ、Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ、Ｍ．ｓｚｕｌｇａｉ、Ｍ．ｘｅｎｏｐｉ、Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ、Ｍ．ｃｈｅｌｏｎｅｉ、Ｍ．ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｍおよびＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅによって引き起こされる様々な感染症が含まれる（Ｗｏｌｉｎｓｋｙ，  Ｅ．、第３７章、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：  Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第３版、Ｈａｒｐｅｒ  ＆  Ｒｏｗ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、１９８０年を参照）。
【０００６】
世界人口の３分の１がＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを保有しており、結核（ＴＢ）を発生する危険性にある。幼児は結核（ＴＢ）を発生する負荷を不釣合いに負っている。一旦感染すると、小児は成人よりもＴＢに対する感受性があるだけでなく、疾患の重篤な型を発生する可能性も高い。具体的には、感染後、９０％を超える免疫適格な成人は無症候性の潜伏性ＴＢ感染症（ＬＴＢＩ）を確立し、５〜１０％の疾患再活性化の生涯リスクを有する。一方、幼い乳児の大多数では、原発性Ｍｔｂ感染症は活動性ＴＢへと進行し、その後、活動性ＴＢに罹患している者のうちの相当な割合で、疾患はより重篤な型（例えば粟粒ＴＢ）へと進行する。ＴＢに対する感受性の増加に加え、進行性原発性感染症に罹患している小児は成人の肺再活性化疾患で一般的に見られる陽性の痰抗酸菌スメアを提示することがほとんどないことによって、小児における迅速な診断は複雑となる。疾患の進行は診断遅延の期間中に起こるため、初期検出が重要である。
【０００７】
免疫無防備状態の患者では、結核はほぼ対数的な速度で増加しており、多剤耐性株が出現している。さらに、以前は非病原性株とみなされていたマイコバクテリア株（例えばＭ．ａｖｉｕｍ）は、現在では免疫抑制されたＡＩＤＳ患者の主要な死亡要因となっている。さらに、現在のマイコバクテリアワクチンは不十分であるか（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ用のＢＣＧワクチンなど）、または提供されていない（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ用など）（非特許文献１、Ｕ．Ｓ．  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ、Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ、Ｔｈｅ  Ｃｏｎｔｉｎｕｉｎｇ  Ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ｏｆ  Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、６２〜６７頁、ＯＴＡ−Ｈ−５７４、Ｕ．Ｓ．  Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｏｆｆｉｃｅ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．Ｃ．、１９９３年）。
【０００８】
結核の伝播の阻害は、有効なワクチン接種および疾患の正確な初期診断を必要とする。現在、生細菌を用いたワクチン接種が保護免疫を誘導するための最も効率的な方法である。この目的のために用いられている最も一般的なＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓの非病原性株であるカルメット−ゲラン菌（ＢＣＧ）である。しかし、ＢＣＧの安全性および有効性には議論の余地があり、米国などの一部の国では一般大衆にワクチン接種をしない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｋａｕｆｍａｎｎ，Ｓ．、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｓｃｉ．（１９８７年）４巻：３２４〜３２８頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
結核の診断は、ツベルクリンＰＰＤ（精製タンパク質誘導体）への皮内曝露を含む皮膚試験を用いて一般的に達成する。抗原特異的Ｔ細胞応答が注射後の４８〜７２時間までに注射部位で測定可能な硬結をもたらし、これはマイコバクテリア抗原への曝露を示す。しかし、この試験の感度および特異性は理想的ではなく、ＢＣＧをワクチン接種した個体を感染した個体から区別することができない。さらに、これは小児またはＬＴＢＩの診断に特に有効というわけではない。したがって、当分野では、結核検出するため、特にＬＴＢＩを検出するため、および小児においてＴＢ感染症を診断するための、改善された診断方法の必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
概要
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（Ｍｔｂ）感染を診断する方法を本明細書中に開示する。一部の実施形態では、本方法は、潜伏性結核感染症（ＬＴＢＩ）を検出するおよび／または小児においてＭｔｂ感染を検出するために有用である。さらなる実施形態では、本方法は肺外感染症を検出するために有用である。本方法には、目的のＭｔｂポリペプチドに特異的に応答するＣＤ８＋Ｔ細胞を単離することおよびＣＤ８＋Ｔ細胞を検出することが含まれる。本方法には、それだけには限定されないがインターフェロン（ＩＦＮ）−γなどのサイトカインの発現の検出が含まれることができる。一部の実施形態では、本方法は、それだけには限定されないが小児において結核疾患を検出することなどにＥＳＡＴ−６および／またはＣＦＰ−１０ポリペプチドを利用する。
【００１２】
いくつかの実施形態では、被験体においてＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを検出するための方法を提供する。これらの方法は、肺結核疾患および／または肺外結核疾患を含めた結核疾患を検出するために使用することができる。これらの方法には、ＣＤ８＋Ｔ細胞などのＴ細胞を含む被験体からの生物学的試料を、１つもしくは複数のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍポリペプチド、または１つもしくは複数のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍポリペプチドを提示している抗原提示細胞と接触させることが含まれる。１つまたは複数のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍポリペプチドには、ＥＳＡＴ９およびＣＦＰ１０、またはその抗原性エピトープが含まれることができる。また、１つまたは複数のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍポリペプチドには、（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号３９もしくは配列番号６１として記載したアミノ酸配列のうちの１つ、または（ｂ）主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩと特異的に結合する、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号３９もしくは配列番号６１として記載したアミノ酸配列のうちの少なくとも１つの少なくとも９〜２０個の連続したアミノ酸、または配列番号３９〜８３として記載したアミノ酸配列のうちの１つとして記載したアミノ酸配列が含まれることもできる。Ｔ細胞がＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍポリペプチドを特異的に認識するかどうかを決定する。
【００１３】
さらなる実施形態では、本方法には、被験体に有効量のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍポリペプチドを皮膚内に、皮下または皮内で投与することも含まれる。Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍポリペプチドは、ＥＳＡＴ６もしくはＣＦＰ１０、またはその抗原性エピトープであることができる。Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍポリペプチドには、（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号３１もしくは配列番号６１として記載したアミノ酸配列のうちの１つ、または（ｂ）主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩと特異的に結合する、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号３９もしくは配列番号６１として記載したアミノ酸配列のうちの少なくとも１つの少なくとも９〜２０個の連続したアミノ酸、または配列番号３９〜８３として記載したアミノ酸配列のうちの１つとして記載したアミノ酸配列が含まれる。Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍポリペプチドを特異的に認識するＴ細胞の存在を被験体において検出する。
【００１４】
また、本方法には、被験体において遅延型の過敏性反応を検出することが含まれることができ、かつ／または特異的なＭｔｂポリペプチドおよびポリヌクレオチドを検出することが含まれることができる。開示したアッセイは個々にまたは組み合わせて使用することができる。Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染は潜伏性または活動性の感染症であることができる。
【００１５】
さらに、被験体においてＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ感染を検出するための試薬およびキットを記載する。
【００１６】
前述および他の特長および利点は、添付の図面を参照して進行する以下のいくつかの実施形態の詳細な説明から、より明白にあるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いた、ｅｘ  ｖｉｖｏのヒトエフェクター細胞頻度の決定を示す２つのグラフである。ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて、磁気ビーズで精製したＣＤ８＋Ｔ細胞を、Ｍｔｂに感染させた（Ｈ３７Ｒｖ、ＭＯＩ＝５０）またはＣＦＰ１０を表すペプチドプールでパルスした（５μｇ／ｍｌのそれぞれのペプチド、１５ｍｅｒ、１１個のアミノ酸が重複）のどちらかのＤＣ（２０，０００個／ウェル）と共に培養した。それぞれの応答するＴ細胞集団を２つ組の４つの異なる細胞濃度で試験した。抗原特異的Ｔ細胞のエフェクター細胞頻度を決定するために、それぞれの２つ組について、ウェルあたりのスポットの平均数をウェルあたりの応答細胞の数に対してプロットした。直線回帰分析を用いて直線の傾きを決定し、これは抗原特異的Ｔ細胞の頻度を表す。スポット数の二項式確率が実験および対照のアッセイで有意に異なる場合にアッセイを陽性とみなした（刺激されたＴ細胞応答の存在を反映）。
【図２】図２は、Ｍｔｂ感染に関連するＭｔｂ抗原に対するｅｘ  ｖｉｖｏのＣＤ８＋Ｔ細胞頻度を示すグラフの組である。上述のように（図１参照）、ｅｘ  ｖｉｖｏのＣＤ８＋Ｔ細胞頻度を決定するためには、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいてＭｔｂに感染させたまたは同族ペプチドプールでパルスした自己ＤＣをＣＤ８＋Ｔ細胞と共にインキュベーションした。Ｍｔｂ感染の証拠がない被験体、ＬＴＢＩに罹患している被験体、および活動性ＴＢに罹患している被験体（培養物により肺結核が確認）を評価した。「Ｍｔｂ感染」にはＬＴＢＩおよび活動性結核に罹患している者が含まれる。Ｐ＝＜０．０５の場合にＰ値を示す（ウィルコクソン／クラスカル−ワリス）。
【図３】図３ａ〜３ｄは、抗原性特異性およびＨＬＡ制限の定義を示すデジタル画像の組である（Ｔ細胞クローンＤ４６６  Ｄ６の特徴付け）。図３ａ〜３ｃに示す結果では、Ｔ細胞クローンＤ４６６  Ｄ６によって認識される抗原および最小エピトープを同定するために、Ｔ細胞（５０００個の細胞／ウェル）を自己ＬＣＬ（２０，０００個／ウェル）および５μｇ／ｍｌの抗原と共にインキュベーションした。１８時間の同時培養後にＩＦＮ−γをＥＬＩＳＰＯＴによって評価した。図３ａに提示する結果では、抗原は、１１個のアミノ酸（ａａ）が重複する１５個のアミノ酸のペプチドから構成される公知のＣＤ４＋抗原を表すペプチドプールからなっていた。図３ｂに提示する結果では、抗原は、一緒になってペプチドプールを構成する個々の１５個のアミノ酸のＣＦＰ１０ペプチドからなっていた。図３ｃに提示する結果では、抗原は、エピトープをさらにマッピングするために使用した、個々の入れ子状のＣＦＰ１０１〜１５ペプチド（１０個のアミノ酸、９個のアミノ酸または８個のアミノ酸）からなっていた。図３ｄに提示する結果では、１つまたは２つの対立遺伝子でＤ４６６に一致するＨＬＡ対立遺伝子を発現する、ＣＦＰ１０２〜１０（５μｇ／ｍｌ）でパルスしたＬＣＬ（２０，０００個／ウェル）をＡＰＣとして使用して、制限対立遺伝子を同定した。２時間後、細胞を洗浄し、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいてＴ細胞（５００個の細胞／ウェル）と共にインキュベーションした。
【図４】図４は、Ｄ４６６  Ｄ６の最小エピトープマッピングの確認を示す線グラフである。最小エピトープを確認するため、自己ＬＣＬ（２０，０００個／ウェル）を示した濃度のペプチドでパルスし、Ｔ細胞（１０００個の細胞／ウェル）と共に同時培養した。１８時間の同時培養後にＩＦＮ−γをＥＬＩＳＰＯＴによって評価した。それぞれの点は２つ組の決定の平均を表す。
【図５】図５は、ＣＦＰ１０の免疫優性パターンのプロファイリングを示す棒グラフの組である。エフェクター細胞頻度を決定するために、自己ＤＣ（２０，０００個／ウェル）を、それぞれの個々の１５ｍｅｒペプチド（５μｇ／ｍｌ）、ペプチドプール（ＰＰ、５μｇ／それぞれのペプチド）またはそれぞれのドナー（Ｄ４６６：ＣＦＰ１０２〜１１、Ｄ４８０：ＣＦＰ１０３〜１１、Ｄ４８１：ＣＦＰ１０７５〜８３、５μｇ／ｍｌ）に由来するＴ細胞クローンから決定した最小エピトープ（ＭＥ）でパルスし、２５０，０００個の磁気ビーズで精製したＣＤ８＋Ｔ細胞に対して試験した。１８時間の同時培養後にＩＦＮ−γの放出をＥＬＩＳＰＯＴによって評価した。それぞれの点は２つ組の決定の平均を表す。
【図６】図６は、最小エピトープのマッピングデータを要約するグラフの組である。最小エピトープを決定するために、自己ＬＣＬ（２０，０００個／ウェル）を示した濃度のペプチドでパルスし、Ｔ細胞（１０００個の細胞／ウェル）と共に同時培養した。１８時間の同時培養後にＩＦＮ−γをＥＬＩＳＰＯＴによって評価した。それぞれの点は２つ組の決定の平均を表す。
【図７】図７は、Ｄ５０４クローンの最小エピトープのマッピングを示す線グラフである。最小エピトープを決定するために、自己ＬＣＬ（２０，０００個／ウェル）をＴ細胞クローン（１，０００個の細胞／ウェル）および示した濃度のペプチドと共に同時培養した。１８時間の同時培養後にＩＦＮ−γをＥＬＩＳＰＯＴによって評価した。それぞれの点は２つ組の決定の平均を表す。
【図８】図８は、胸腔内（ＩＴ）ＴＢと比較した肺外（ＥＰ）ＴＢに罹患しているウガンダ人小児におけるＭｔｂに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示すグラフである。１０歳以下のウガンダ人小児において、インターフェロン（ＩＦＮ）−γ特異的ＥＬＩＳＰＯＴを用い、ＥＳＡＴ−６およびＣＦＰ−１０ペプチドを抗原源として用いてＭｔｂ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を測定した。小児はＥＰ（ｎ＝３５）またはＩＴのＴＢ（ｎ＝４３）のいずれかに罹患していた。ＴＢコホートは主に瘰癧（ｓｃｏｆｕｌａ）からなっていた（３０／３５人［８６％］）。結果は２５０，０００個のＣＤ４／ＣＤ５６枯渇末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）あたりのスポット形成単位（ＳＦＵ）として示す。決定は２つ組で行い、肯定応答は標準偏差が培地対照を２点超えるものとして定義した。
【図９】図９は、登録、被験体排除、ならびに実施および分析したＥＬＩＳＰＯＴを示す流れ図である。＊はＨＥ対ＣＰのＴＢの分析中に含まれる年齢群である。
【図１０】図１０は、１５歳までの接触させた健康な曝露した小児の、年齢層にわたるＣＤ８およびＣＤ４のＥＬＩＳＰＯＴ応答の比較を示すグラフである。バックグラウンドを超えるスポット形成単位を２５０，０００個のＴ細胞あたりで示す。最初の登録数を図９ａに示す。コクランアーミテージの傾向試験を行い、ＣＤ８  ＥＬＩＳＰＯＴではｐ＝０．０５５であり、ＰＢＭＣ  ＥＬＩＳＰＯＴではｐ＝０．２であった。
【図１１】図１１ａは、臨床研究群によって重層化した１０歳以下のウガンダ人小児における陽性ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの一部を示すグラフである。ＣＤ８およびＰＢＭＣのＴ細胞応答をＨＥおよび確認されたＴＢ（Ｃ−ＴＢ）部分群について示す。ＣＤ８アッセイでは、Ｃ−ＴＢに罹患している小児は陽性アッセイを有する可能性が有意に高かった（ｐ＝０．００１）［Ｃ−ＴＢの５８％（ＣＩ  ０．３７〜０．７７）と比較してＨＥ小児の２０％（ＣＩ  ０．０９〜０．３４）］。また、この発見はＣＰ−ＴＢをＨＥと比較した際にも注目された。同様に、ＰＢＭＣアッセイでは、陽性アッセイの割合はＣ−ＴＢ臨床的部分群でより高かった（ｐ＝０．０２）［Ｃ−ＴＢの６５％（ＣＩ  ０．４２〜０．８３）と比較してＨＥ小児の３７％（ＣＩ  ０．２４〜０．５０）が陽性アッセイを有していた］。ＣＤ８アッセイとは異なり、ＣＰ−ＴＢをＨＥと比較した際、陽性の割合はＨＥコホートと有意には異なっていなかった。図１１ｂは、臨床研究群および年齢によって重層化した１０歳以下のウガンダ人小児における陽性ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの割合のグラフである。５歳以下の小児におけるＣＤ８アッセイでは、確認されたＴＢに罹患している小児は、ＨＥと比較して陽性ＣＤ８  ＥＬＩＳＰＯＴを有する可能性が高かった（ｐ＝０．００９）［Ｃ−ＴＢの４７％（ＣＩ  ０．２４〜０．７１）と比較してＨＥ小児の１２％（ＣＩ  ０．０３〜０．３１）］。同様に、ＣＰ−ＴＢコホートをＨＥと比較した際、ＣＰ−ＴＢが有意に高い割合の陽性ＣＤ８アッセイを有していた。５歳以下の小児におけるＰＢＭＣアッセイと比較することによって、陽性アッセイは臨床研究群と関連しておらず［ＨＥ小児の３７％（ＣＩ  ０．２１〜０．５５）の一方でＣ−ＴＢの５６％（ＣＩ  ０．３０〜０．７８）］、これは比較にＣ−ＴＢまたはＣＰ−ＴＢを使用したかにかかわらず事実であった。５歳を超える小児では数が少なく、したがって、比較統計学は行わなかった。しかし、どちらのアッセイでもＣ−ＴＰに罹患している小児が高い割合で同定された［５歳未満の小児のＣＤ８アッセイでは、Ｃ−ＴＢの８６％（ＣＩ  ０．０．４２〜０．９９）と比較してＨＥの３０％（ＣＩ  ０．１１〜０．５４）が陽性アッセイを有していた］。５歳未満の小児におけるＣＤ４アッセイと比較することによって、ＨＥの３６％（ＣＩ  ０．１７〜０．５９）の一方で、Ｃ−ＴＢの１００％（ＣＩ  ０．４７〜１．０）が陽性アッセイを有していた。
【図１２】図１２ａ〜１２ｄは、５歳以下の小児（１２Ａ）および５歳を超える小児（１２Ｃ）について、ＣＤ８  ＥＬＩＳＰＯＴの結果を事前に決定したカットオフを超えるスポット形成単位（ＳＦＵ）として示すグラフの組である。５歳以下および５歳を超える小児のＰＢＭＣ  ＥＬＩＳＰＯＴの結果を（１２Ｂ）および（１２Ｄ）に示す。ＣＰ−ＴＢまたはＣ−ＴＢに罹患しているウガンダ人５歳以下の小児は、ＣＤ８  Ｔ細胞ＥＬＩＳＰＯＴによって有意かつ頑強な応答を有していた一方で、健康な曝露した小児はこの応答を示さなかった（１２Ａ）。比較すると、ＨＥ接触ではＰＢＭＣ  ＥＬＩＳＰＯＴによる測定可能な応答が存在し、この応答はＣＰ−ＴＢまたはＣ−ＴＢに罹患している小児で規模に差異がなかった（１２Ｂ）。事前に定義したカットオフを用いて分類的に分析した場合、ＴＢが確認されたまたはその可能性がある５歳以下の小児は陽性ＣＤ８  ＥＬＩＳＰＯＴを有する可能性がより高い一方で（ｐ＝０．０１）、ＰＢＭＣ  ＥＬＩＳＰＯＴおよび臨床的部分群には分類上の関連が存在しなかった。５歳を超える小児では、ＣＤ８（ｎ＝７）およびＰＢＭＣ（ｎ＝５）のＣ−ＴＢ群の小児が少数であったため規模および分類上の統計的比較を行わなかったが、説明目的のためにＳＦＵを示す。５歳を超える年齢群では、ＨＥをＣＰ−ＴＢ群と比較すると、ＳＦＵの規模または分類上の分析による差異は存在しなかった（１２Ｃおよび１２Ｄ）。規模の統計的分析には２標本ウィルコクソン（ｗｉｌｘｏｃｏｎ）順位和検定を利用し、分類上の分析にはカイ二乗分析を行った。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
配列表
添付の配列表に記載する核酸およびアミノ酸配列は、米国特許法施行規則第１．８２２条に定義されているヌクレオチド塩基の標準の文字略記およびアミノ酸の３文字コードを用いて示す。それぞれの核酸配列の１本の鎖のみを示すが、示した鎖の任意の参照には相補鎖が含まれるとして理解される：
配列番号１〜１２は、Ｍｔｂポリペプチドのアミノ酸配列である
配列番号１３〜１４は、Ｍｔｂペプチドのアミノ酸である
配列番号１５〜２５は、Ｍｔｂポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドの核酸配列である
配列番号２６〜３８は、特異的なＭｔｂエピトープアミノ酸配列である
配列番号３９〜８３は、有用な特異的なＣＦＰ１０およびＥＳＡＴ６  Ｍｔｂポリペプチドのアミノ酸配列である
配列番号８４は、例示的なリンカーのアミノ酸配列である。
【００１９】
詳細な説明
被験体においてＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染を検出するための方法を開示する。被験体は小児またはＬＴＢＩに罹患している被験体である。本方法には、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（Ｍｔｂ）ポリペプチドを特異的に認識するＴ細胞、具体的にはＣＤ８＋Ｔ細胞の存在を検出することが含まれる。本方法には生物学的試料中の反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞の存在を検出するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイが含まれ、また、遅延型の過敏性反応を検出するｉｎ  ｖｉｖｏアッセイが含まれることもできる。これらの方法は、小児において肺結核疾患および肺外結核疾患を含めた結核疾患を検出するために有用である。また、これらの方法は、潜伏性結核感染症に罹患している成人において肺外結核疾患を検出するためにも有用である。
【００２０】
用語
別段に言及しない限りは、技術用語は慣用の使用法に従って使用する。分子生物学の一般的な用語の定義は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ、Ｇｅｎｅｓ  Ｖ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ出版、１９９４年（ＩＳＢＮ  ０−１９−８５４２８７−９）、Ｋｅｎｄｒｅｗら編、Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．出版、１９９４年（ＩＳＢＮ  ０−６３２−０２１８２−９）、およびＲｏｂｅｒｔ  Ａ．  Ｍｅｙｅｒｓ編、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｉｎｃ．出版、１９９５年（ＩＳＢＮ  １−５６０８１−５６９−８）中に見つけ得る。
【００２１】
本開示の様々な実施形態の検討を容易にするために、特定の用語の以下の説明を提供する。
【００２２】
アジュバント：抗原性を増強させるために使用するビヒクルである。アジュバントには、その上に抗原を吸着させる鉱物（ミョウバン、水酸化アルミニウム、もしくはホスフェート）の懸濁液、または抗原溶液を鉱物油（フロイント不完全アジュバント）中で乳化させ、場合によっては抗原性をさらに増強させるために（抗原の分解を阻害するおよび／もしくはマクロファージの流入を引き起こす）死滅したマイコバクテリアを包含させる（フロイント完全アジュバント）油中水乳濁液が含まれる。また、免疫賦活性オリゴヌクレオチド（ＣｐＧモチーフが含まれるものなど）もアジュバントとして使用することができる（例えば、米国特許第６，１９４，３８８号、米国特許第６，２０７，６４６号、米国特許第６，２１４，８０６号、米国特許第６，２１８，３７１号、米国特許第６，２３９，１１６号、米国特許第６，３３９，０６８号、米国特許第６，４０６，７０５号、および米国特許第６，４２９，１９９号を参照）。アジュバントには共刺激分子などの生体分子が含まれる（「生物学的アジュバント」）。例示的なアジュバントには、ＩＬ−２、ＲＡＮＴＥＳ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、Ｇ−ＣＳＦ、ＬＦＡ−３、ＣＤ７２、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＯＸ−４０Ｌおよび４１ＢＢＬが含まれる。
【００２３】
増幅：核酸分子（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ分子）の増幅とは、検体中の核酸分子のコピー数を増加させる技術の使用をいう。増幅の例はポリメラーゼ連鎖反応であり、被験体から収集した生物学的試料を、一対のオリゴヌクレオチドプライマーと、プライマーが試料中の核酸鋳型とハイブリダイズすることを可能にする条件下で接触させる。プライマーを適切な条件下で伸長させ、鋳型から解離させ、その後、再度アニーリングさせ、伸長させ、解離させて、核酸のコピー数を増幅する。増幅産物は、標準技術を用いた電気泳動、制限エンドヌクレアーゼ切断パターン、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションもしくはライゲーション、および／または核酸配列決定によって特徴付けることができる。増幅の他の例には、米国特許第５，７４４，３１１号に開示されている鎖置換増幅、米国特許第６，０３３，８８１号に開示されている非転写等温増幅、ＷＯ９０／０１０６９号に開示されている修復連鎖反応増幅、ＥＰ−Ａ−３２０  ３０８号に開示されているリガーゼ連鎖反応増幅、米国特許第５，４２７，９３０号に記載されているギャップ充填リガーゼ連鎖反応増幅、および米国特許第６，０２５，１３４号に記載されているＮＡＳＢＡ（商標）ＲＮＡ非転写増幅が含まれる。
【００２４】
抗原：動物内に注射または吸収される組成物を含めた、動物において抗体の産生またはＴ細胞応答を刺激することができる化合物、組成物、または物質である。抗原は、異種免疫原によって誘導されたものを含めた、特定の液性または細胞性免疫の産物と反応する。用語「抗原」には全ての関連する抗原性エピトープが含まれる。「エピトープ」または「抗原決定基」とは、Ｂおよび／またはＴ細胞が応答する抗原上の部位をいう。一実施形態では、Ｔ細胞は、エピトープがＭＨＣ分子と併せて提示された場合にエピトープに応答する。エピトープは、タンパク質の三次折り畳みと並置されている連続的なアミノ酸または非連続的なアミノ酸のどちらからも形成されることができる。連続的なアミノ酸から形成されたエピトープは、典型的には変性溶媒に曝露した際に保持される一方で、三次折り畳みによって形成されたエピトープは、典型的には変性溶媒で処理した際に失われた。エピトープには、典型的には、固有の空間的コンホメーションの少なくとも３個、より通常では少なくとも５個、約９個、または約８〜１０個のアミノ酸が含まれる。エピトープの空間的コンホメーションを決定する方法には、例えば、Ｘ線結晶構造解析および二次元核磁気共鳴が含まれる。
【００２５】
抗原は組織特異的抗原または疾患特異的抗原であることができる。組織特異的抗原は疾患特異的抗原でもあることができるため、これらの用語は排他的ではない。組織特異的抗原は、単一の組織などの限定された数の組織中で発現される。組織特異的抗原は、それだけには限定されないが前立腺および子宮組織の両方などの複数の生殖組織中で発現される抗原など、複数の組織によって発現され得る。疾患特異的抗原は疾患プロセスと同時に発現される。疾患特異的抗原の具体的な非限定的な例は、その発現が結核と相関するまたはそれに予測的である抗原である。疾患特異的抗原はＴ細胞またはＢ細胞によって認識される抗原であることができる。Ｍｔｂ特異的抗原はＭｔｂに特異的である。
【００２６】
抗体：免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性のある部分、すなわち、Ｍｔｂポリペプチドなどの抗原と特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含有する分子である。
【００２７】
天然に存在する抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ）には、ジスルフィド結合によって相互接続された４本のポリペプチド鎖、すなわち、２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖が含まれる。しかし、抗体の抗原結合機能は、天然に存在する抗体の断片によって行われる場合があることが示されている。したがって、これらの抗原結合断片も用語「抗体」によって指定されることを意図する。用語抗体内に包含される結合断片の具体的な非限定的な例には、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片、（ｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｉｉ）抗体の単一のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｉｖ）１つのＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ、３４１巻：５４４〜５４６頁、１９８９年）、（ｖ）単離した相補性決定領域（ＣＤＲ）、ならびに（ｖｉ）ヒンジ領域でジスルフィド橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片が含まれる。
【００２８】
免疫グロブリンおよびその特定の変異体は公知であり、その多くが組換え細胞培養物中で調製されている（例えば、米国特許第４，７４５，０５５号、米国特許第４，４４４，４８７号、ＷＯ８８／０３５６５号、ＥＰ２５６，６５４号、ＥＰ１２０，６９４号、ＥＰ１２５，０２３号、Ｆａｏｕｌｋｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２９８巻：２８６頁、１９８２年、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２３巻：７９３頁、１９７９年、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ａｎｎ  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２巻：２３９頁、１９８４年を参照）。
【００２９】
動物：生きた多細胞の脊椎動物の生物であり、例えば哺乳動物および鳥が含まれる分類である。用語哺乳動物にはヒトおよび非ヒト哺乳動物がどちらも含まれる。同様に、用語「被験体」にはヒトおよび獣医学的被験体がどちらも含まれる。「小児」とは約１８歳未満のヒト被験体である。一部の実施形態では、「幼児」とは約１〜約５歳のヒト被験体である。「年長児」とは約６〜約１２歳のヒト被験体である。「乳児」とは１歳未満のヒト被験体である。「ティーンエージャー」とは約１３〜約１８歳のヒト被験体である。「思春期前の被験体」は思春期を経験しておらず、一部の例では約１１歳未満のヒト被験体である。
【００３０】
抗原提示細胞（ＡＰＣ）：Ｔ細胞が活性化されるようにＴ細胞に抗原を提示することができる細胞である。樹状細胞とは一次免疫応答に関与している原理的な抗原提示細胞（ＡＰＣ）である。その主な機能は、組織中で抗原を得て、リンパ系器官へと遊走し、Ｔ細胞を活性化するために抗原を提示することである。
【００３１】
適切な成熟キューを受けた際、樹状細胞は、免疫応答の開始および発生を促進する迅速な形態学的および生理的な変化を受けるようにシグナルされる。これらには、とりわけ、抗原提示に関与する分子の上方制御、Ｔｈ１応答発生に重要なＩＬ−１２を含めた炎症誘発性サイトカインの産生、ならびに周辺のナイーブＴｈ細胞の分化、拡大、および遊走の駆動を支援するケモカインの分泌がある。総合すると、これらの上方制御された分子は、他の周辺リンパ球の活性化およびエフェクター機能を統合する樹状細胞の能力を促進し、最終的にはこれが宿主の保護をもたらす。
【００３２】
ｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）：内部の非コードセグメント（イントロン）および転写を決定する調節配列を欠くＤＮＡ片である。ｃＤＮＡは、細胞から抽出したメッセンジャーＲＮＡからの逆転写によって実験室内で合成される。
【００３３】
ＣＤ４：ＭＨＣクラスＩＩ分子との相互作用を媒介するＴ細胞表面タンパク質である第４分化クラスター因子である。ＣＤ４はＨＩＶ感染中におけるＴ細胞上のＨＩＶの一次受容体部位としても役割を果たす。ＣＤ４を発現する細胞は多くの場合ヘルパーＴ細胞である。
【００３４】
ＣＤ８：ＭＨＣクラスＩ分子との相互作用を媒介するＴ細胞表面タンパク質である第８分化クラスター因子である。ＣＤ８を発現する細胞は多くの場合細胞毒性があるＴ細胞である。「ＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性免疫」とは、抗原をＣＤ８＋Ｔ細胞に提示することによって実装される免疫応答である。
【００３５】
ｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）：内部の非コードセグメント（イントロン）および転写を決定する調節配列を欠くＤＮＡ片である。ｃＤＮＡは、細胞から抽出したメッセンジャーＲＮＡからの逆転写によって実験室内で合成される。
【００３６】
保存的変異体：「保存的」アミノ酸置換とは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍポリペプチドの活性または抗原性に実質的に影響を与えないまたは減少させない置換である。保存的置換の具体的な非限定的な例には以下の例が含まれる。
【００３７】
【化１】
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また、用語保存的変異には、置換されたポリペプチドに対して産生させた抗体も置換されていないポリペプチドと免疫反応するか、またはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ抗原などの置換されていないポリペプチドに対する免疫応答に類似の免疫応答を置換されたポリペプチドに対して生じさせることができる限りは、置換されていない親アミノ酸の代わりに置換されたアミノ酸を使用することも含まれる。したがって、一実施形態では、非保存的置換とは活性または抗原性を低下させるものである。
【００３８】
から本質的になる／からなる：ポリペプチドに関して、追加のアミノ酸残基がまったく含まれない場合に、指定したアミノ酸配列から本質的になるポリペプチドをいう。しかし、ポリペプチドには、標識（例えば、蛍光、放射性、もしくは固体粒子標識）、糖または脂質などの追加の非ペプチド構成要素が含まれることができる。指定したアミノ酸配列からなるポリペプチドには追加のアミノ酸残基がまったく含まれず、また、脂質、糖または標識などの追加の非ペプチド構成要素も含まれない。
【００３９】
接触させる：１つの薬剤を別の薬剤の存在下でインキュベーションするプロセスである。したがって、細胞を１つの薬剤と接触させる場合、薬剤と細胞が相互作用するために十分な期間、細胞を薬剤とインキュベーションする。
【００４０】
共刺激分子：ＴＣＲとペプチド−ＭＨＣとの会合により１つのシグナルがＴ細胞へと送達されるが、このシグナル単独ではＴ細胞を活性化するために不十分な場合がある。共刺激分子とは、そのリガンドと結合した際にＴ細胞が活性化されるために必要な第２のシグナルを送達する分子である。Ｔ細胞上の周知の共刺激分子はＣＤ２８であり、これはＢ７−１（ＣＤ８０としても知られる）またはＢ７−２（ＣＤ８６としても公知）のいずれかと結合する。さらなる共刺激分子はＢ７−３である。やはりＴ細胞を活性化するための第２のシグナルを提供するアクセサリー分子には、細胞内接着分子（ＩＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−２）、白血球機能関連抗原（ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−２およびＬＦＡ−３）が含まれる。インテグリンおよび腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーのメンバーも共刺激分子として役割を果たすことができる。
【００４１】
サイトカイン：リンパ球などの他の細胞の挙動に影響を与える細胞によって作製されるタンパク質である。一実施形態では、サイトカインはケモカイン、すなわち細胞輸送に影響を与える分子である。サイトカインの具体的な非限定的な例にはインターロイキン（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−２１など）、およびインターフェロン（ＩＦＮ）−γが含まれる。
【００４２】
縮重変異体：遺伝暗号の結果として縮重している配列が含まれる、Ｍｔｂポリペプチドのエピトープをコードしているポリヌクレオチドである。２０種の天然アミノ酸が存在し、そのほとんどが複数のコドンによって指定されている。したがって、ヌクレオチド配列によってコードされているＭｔｂポリペプチドのアミノ酸配列が変化していない限りは、全ての縮重ヌクレオチド配列が本開示中に含まれる。
【００４３】
樹状細胞（ＤＣ）：樹状細胞とは、一次免疫応答に関与する原理的な抗原提示細胞（ＡＰＣ）である。樹状細胞には形質細胞様樹状細胞および骨髄樹状細胞が含まれる。その主な機能は、組織中で抗原を得て、リンパ系器官へと遊走し、Ｔ細胞を活性化するために抗原を提示することである。未成熟の樹状細胞は骨髄中で生じ、未成熟細胞として末梢中に存在する。
【００４４】
診断的：それだけには限定されないが結核などの病理状態の存在または性質を同定することである。診断方法はその感度および特異性が異なる。診断的アッセイの「感度」とは、試験で陽性となる病気の個体のパーセンテージである（真陽性のパーセント）。診断的アッセイの「特異性」とは、１−偽陽性率であり、偽陽性率とは、試験で陽性となる疾患に罹患していない個体の割合として定義される。特定の診断方法は状態の決定的な診断を提供しない場合があるが、方法が診断を支援する陽性の指標を提供すれば十分である。「予後的」とは、結核などの病理状態の発生の確率（例えば重篤度）を予測することを意味する。
【００４５】
表示すること：ペプチド：抗原の複合体またはペプチドが第２の細胞、第２の細胞によって表示される分子、または可溶性因子に接近可能な、細胞の外表面上における、ペプチド：抗原の複合体、またはペプチドを局在化させるプロセスである。ペプチド、またはペプチド：抗原の複合体は、細胞の外表面上に存在し、かつ第２の細胞、第２の細胞によって表示される分子、または可溶性因子に接近可能な場合に、細胞によって「表示されている」。
【００４６】
エピトープ：抗原決定基である。これらは、抗原性である、すなわち特異的な免疫応答を誘発する、分子上の特定の化学基またはペプチド配列である。抗体はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍポリペプチドなどのポリペプチド上の特定の抗原性エピトープと特異的に結合する。
【００４７】
発現制御配列：それが作動可能に連結している異種核酸配列の発現を調節する核酸配列である。発現制御配列は、発現制御配列が核酸配列の転写および必要に応じて翻訳を制御および調節する場合に、核酸配列に作動可能に連結している。したがって、発現制御配列には、適切なプロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、タンパク質をコードしている遺伝子の前の開始コドン（すなわちＡＴＧ）、イントロンのスプライシングシグナル、ｍＲＮＡの妥当な翻訳を可能にするその遺伝子の正しい読み枠の維持、およびストップコドンが含まれる場合がある。用語「制御配列」とは、最低でもその存在が発現に影響を与えることができる構成要素が含まれることを意図し、また、その存在が有利である追加の構成要素、例えばリーダー配列および融合パートナー配列も含まれることができる。発現制御配列にはプロモーターが含まれることができる。
【００４８】
プロモーターとは、転写を指示するために十分な最小限の配列である。また、プロモーター依存性の遺伝子発現を、細胞種特異性、組織特異性、または外部シグナルもしくは薬剤による誘導可能について制御可能にするために十分なプロモーターエレメントも含まれ、そのようなエレメントは遺伝子の５’または３’領域中に位置し得る。構成的および誘導性プロモーターがどちらも含まれる（例えばＢｉｔｔｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１５３巻：５１６〜５４４頁、１９８７年を参照）。例えば、細菌系中でクローニングする場合、バクテリオファージラムダのｐＬ、ｐｌａｃ、ｐｔｒｐ、ｐｔａｃ（ｐｔｒｐ−ｌａｃハイブリッドプロモーター）などの誘導性プロモーターを使用し得る。一実施形態では、哺乳動物細胞系中でクローニングする場合、哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えばメタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例えば、レトロウイルス末端反復配列、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を使用することができる。組換えＤＮＡまたは合成技術によって産生したプロモーターも核酸配列の転写を提供するために使用し得る。一実施形態では、プロモーターはサイトメガロウイルスプロモーターである。
【００４９】
分画：試料を、試料の構成要素をそれだけには限定されないが大きさ、電荷、溶解度、または組成などの物理的または化学的特性に基づいて分離する条件または手順に供することである。分画手順の例には、それだけには限定されないが、選択的沈殿、有機抽出、サイズ排除透析またはクロマトグラフィー、例えばイオン交換クロマトグラフィーが含まれる。一実施形態では、画分はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍなどの生物の可溶性抽出物または有機抽出物である。
【００５０】
機能的に等価：本明細書中に記載のものと同じ結果をもたらす抗原のエピトープ中などの配列の変更である。そのような配列変更には、それだけには限定されないが、保存的置換、欠失、突然変異、フレームシフト、および挿入が含まれる場合がある。
【００５１】
異種：別の遺伝源または種に由来することである。Ｍｔｂポリペプチドに対して異種のポリペプチドは、Ｍｔｂポリペプチドをコードしない核酸に由来する。１つの具体的な非限定的な例では、Ｍｔｂポリペプチドからの９個の連続したアミノ酸、または最大でＭｔｂポリペプチドからの２０個の連続したアミノ酸、および異種アミノ酸配列を含むポリペプチドには、β−ガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質、およびアルブミン、Ｂ型肝炎表面抗原、または免疫グロブリンのアミノ酸配列が含まれる。一般に、目的のタンパク質と特異的に結合する抗体は異種タンパク質とは特異的に結合しない。
【００５２】
宿主細胞：ベクターをその中で増殖させてそのＤＮＡを発現させることができる細胞である。細胞は原核または真核であり得る。細胞はヒト細胞などの哺乳動物であることができる。また、この用語には目的の宿主細胞の任意の子孫も含まれる。複製中に起こる突然変異が存在し得るため、全ての子孫が親細胞と同一でない場合があることを理解されたい。しかし、用語「宿主細胞」を使用する場合にはそのような子孫が含まれる。
【００５３】
ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）：ヒト主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）の遺伝子名である。個々の座位をＨＬＡ−Ｅなどのように大文字で指定し、対立遺伝子をＨＬＡ−Ａ＊０２０１などのように数字で指定する。３つの主なＭＨＣクラスＩ遺伝子はＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、およびＨＬＡ−Ｃと呼ばれる。しかし、ＭＨＣクラスＩ遺伝子に関連する、β２ミクログロブリン関連細胞表面分子をコードしている遺伝子が多く存在する。これらの遺伝子の発現は組織分布および細胞上に発現される量がどちらも可変性であり、これらの遺伝子はＭＨＣクラスＩＢ遺伝子と呼ばれている。
【００５４】
免疫応答：Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、またはＴ細胞などの免疫系細胞の、刺激に対する応答である。一実施形態では、応答は特定の抗原に特異的である（「抗原特異的応答」）。一実施形態では、免疫応答は、Ｔｈ１、Ｔｈ２、またはＴｈ３応答などのＴ細胞応答である。別の実施形態では、免疫応答は抑制Ｔ細胞の応答である。
【００５５】
免疫原性ペプチド：ペプチドがＭＨＣ分子と結合して、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答などのＴ細胞応答、または免疫原性ペプチドが由来する抗原に対するＢ細胞応答（抗体産生など）が誘導されるように、対立遺伝子に特異的なモチーフまたは他の配列を含むペプチドである。さらなる例では、免疫原性ペプチドはＣＤ８＋Ｔ細胞からのサイトカインの産生を誘導する。
【００５６】
一実施形態では、免疫原性ペプチドは配列モチーフまたは当分野で公知のニューラルネットもしくは多項式決定などの他の方法を用いて同定する。典型的には、アルゴリズムを用いて、高い確率の特定の親和性での結合を与えるスコアを有し、かつ免疫原性となるものを選択するためのペプチド「結合閾値」を決定する。アルゴリズムは、特定の位置での特定のアミノ酸のＭＨＣ結合に対する効果、特定の位置での特定のアミノ酸の抗体結合に対する効果、またはモチーフ含有ペプチド中の特定の置換の結合に対する効果のいずれかに基づく。免疫原性ペプチドのコンテキスト内では、「保存された残基」とは、ペプチド中の特定の位置でランダム分布によって予測されるよりも有意に高い頻度で出現するものである。一実施形態では、保存された残基とは、ＭＨＣ構造が免疫原性ペプチドとの接触点を提供し得るものである。
【００５７】
また、免疫原性ペプチドは、特異的なＭＨＣタンパク質に対するその結合およびＭＨＣタンパク質のコンテキスト中で提示された際にＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激するその能力を測定することによっても同定することができる。一例では、免疫原性「Ｍｔｂペプチド」とは、一般に９〜２０個のアミノ酸の長さ、例えば約８〜１１残基の長さのＭｔｂタンパク質からの一連の連続的なアミノ酸残基である。９または１０個のアミノ酸残基の長さ、または最大で１２個のアミノ酸の長さの特異的な免疫原性ポリペプチドを本明細書中に開示する。
【００５８】
一般に、免疫原性Ｍｔｂポリペプチドは、被験体においてＢ細胞応答またはＴ細胞応答などの免疫応答を誘導するために使用することができる。一例では、免疫原性Ｍｔｂポリペプチドは、主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ分子と結合した際に、Ｍｔｂに対する細胞毒性があるＴリンパ球（ＣＴＬ）などのＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化する。合成ペプチドを用いたＣＴＬの誘導および当分野で公知のＣＴＬ細胞毒性アッセイには、本明細書中に参考として組み込まれている米国特許第５，６６２，９０７号を参照されたい。一例では、免疫原性ペプチドにはペプチドがＭＨＣ分子と結合して、免疫原性ペプチドが由来する抗原に対するＣＤ８＋応答が誘導されるように、対立遺伝子に特異的なモチーフまたは他の配列が含まれる。Ｍｔｂポリペプチドを特異的に認識するＣＤ８＋Ｔ細胞は、その特異的ポリペプチドに応答して活性化される、増殖する、および／またはサイトカインを分泌し、他の非関連のポリペプチドには応答しない。
【００５９】
免疫原性組成物：ＣＤ８＋Ｔ細胞応答などのＭｔｂに対する測定可能なＴ応答を誘導する、または測定可能なＢ細胞応答（Ｍｔｂポリペプチドと特異的に結合する抗体の産生など）を誘導する、免疫原性Ｍｔｂポリペプチドまたは免疫原性Ｍｔｂポリペプチドをコードしている核酸を含む組成物である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの使用では、免疫原性組成物は、単離した核酸、核酸が含まれるベクター／または免疫原性ペプチドからなることができる。ｉｎ  ｖｉｖｏの使用では、免疫原性組成物は、典型的には、核酸、核酸が含まれるベクター、およびまたは免疫原性ポリペプチドを、薬学的に許容される担体および／または他の薬剤中で含む。免疫原性組成物には、アジュバント、共刺激分子、または共刺激分子をコードしている核酸が任意選択で含まれることができる。Ｍｔｂポリペプチド、またはポリペプチドをコードしている核酸は、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導するその能力について容易に試験することができる。
【００６０】
疾患の阻害または処置：結核などの疾患を阻害することとは、疾患の完全な発生を阻害することをいう。いくつかの例では、疾患を阻害することとは、結核の症状を軽減させることをいう。「処置」とは、結核などの疾患または疾患に関連する病的状態の兆候または症状を寛解させる治療介入をいう。
【００６１】
インターフェロンガンマ（γ）：ＩＦＮ−γとは、１４６個のアミノ酸のサブユニットを有する二量体タンパク質である。このタンパク質は２つの部位でグリコシル化されており、ｐＩは８．３〜８．５である。ＩＦＮ−γは２３個のアミノ酸の分泌シグナル配列を含めた１６６個のアミノ酸の前駆タンパク質として合成される。生物活性のある２０および２５ｋＤａのタンパク質の２つの分子形態が記載されている。これらはどちらも２５位でグリコシル化されている。２５ｋＤａの形態は９７位でもグリコシル化されている。分子質量および電荷に関して天然のＩＦＮ−γで観察される差異は、可変性グリコシル化パターンが原因である。非変性条件下で観察される４０〜６０ｋＤａの形態はＩＦＮ−γの二量体および四量体である。ヒト遺伝子は約６ｋｂの長さを有する。これは４つのエクソンを含有し、第１２ｑ２４．１染色体にマッピングされる。
【００６２】
ＩＦＮ−γは、ＩＦＮ−γを産生する個々の細胞の検出を可能にするＥＬＳＡ試験などの感受性のある免疫アッセイによって検出することができる。微量のＩＦＮ−γは、Ｍｘタンパク質などのＩＦＮに誘導されるタンパク質を測定することによって間接的に検出することができる。また、ＩＰ−１０の合成の誘導もＩＦＮ−γ濃度を測定するために使用されている。さらに、２Ｄ９細胞におけるインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ活性の誘導を用いるアッセイなどのバイオアッセイを用いてＩＦＮ−γを検出することができる。ＩＦＮ−γの産生を用いてＴ細胞の活性化を評価することができ、例えば、ＨＬＡ−ＥによるＴ細胞の活性化によりＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ抗原が提示された。
【００６３】
単離した：「単離した」核酸は、核酸が天然に存在する生物の細胞中の他の核酸配列、すなわち、他の染色体ならびに染色体外のＤＮＡおよびＲＮＡから実質的に分離または精製されて取り出されている。したがって、用語「単離した」には、標準の核酸精製方法によって精製した核酸が包含される。また、この用語には宿主細胞中の組換え発現によって調製した核酸および化学合成核酸も包含される。
【００６４】
標識：別の分子の検出を容易にするためにその分子と直接または間接的にコンジュゲートしている、検出可能な化合物または組成物である。標識の具体的な非限定的な例には、蛍光タグ、酵素連結、および放射性同位元素が含まれる。
【００６５】
リンカー配列：リンカー配列とは、２つのポリペプチドドメインを共有結合するアミノ酸配列である。リンカー配列は、連結されたポリペプチドドメインに回転の自由を提供し、それにより妥当なドメインの折り畳みおよびＭＨＣへの提示を促進するために、本明細書中に開示したＭｔｂエピトープの間に含めることができる。例として、２つのＭｔｂドメインを含む組換えポリペプチド中で、リンカー配列をその間に提供することができ、例えばＭｔｂポリペプチド−リンカー−Ｍｔｂポリペプチドを含むポリペプチドである。一般に２〜２５個のアミノ酸の長さであるリンカー配列、は当分野で周知であり、それだけには限定されないが、Ｃｈａｕｄｈａｒｙら、Ｎａｔｕｒｅ、３３９巻：３９４〜３９７頁、１９８９年によって記載されているグリシン（４）−セリンスペーサー（ＧＧＧＧＳ（配列番号８４）×３）が含まれる。
【００６６】
リンパ球：身体の免疫防御に関与している白血球の一種である。２つの主なリンパ球種、すなわちＢ細胞およびＴ細胞が存在する。
【００６７】
哺乳動物：この用語にはヒトおよび非ヒト哺乳動物がどちらも含まれる。同様に、用語「患者」または「被験体」にはヒトおよび獣医学的被験体がどちらも含まれる。
【００６８】
マイコバクテリア：好気性の細胞内細菌生物の属。宿主を侵襲する際、これらの生物は単球およびマクロファージのエンドソーム区画内で生存する。ヒトのマイコバクテリア病には、結核（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓによって引き起こされる）、らい病（Ｍ．ｌｅｐｒａｅによって引き起こされる）、ベアンズデイル潰瘍（Ｍ．ｕｌｃｅｒａｎｓによって引き起こされる）、ならびにＭ．ｍａｒｉｎｕｍ、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ、Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ、Ｍ．ｓｚｕｌｇａｉ、Ｍ．ｘｅｎｏｐｉ、Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ、Ｍ．ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｍ、Ｍ．ｃｈｅｌｏｎｅｉ、およびＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕａｒｅによって引き起こされる場合がある他の感染症が含まれる。以前は非病原性であるとみなされていたＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株（Ｍ．ａｖｉｕｍなど）は、現在では免疫抑制されたＡＩＤＳ患者の主要な死亡要因であることが公知である。
【００６９】
マイコバクテリアに対する主な応答は細胞媒介性の過敏（ＤＴＨ）反応を含み、Ｔ細胞およびマクロファージが細胞内の死滅および生物の囲い込み（または封じ込み）（肉芽腫形成）において主要な役割を果たす。主要なＴ細胞応答は、マイコバクテリア（ｍｙｏｃｂａｃｔｅｒｉａｌ）熱ショックタンパク質および免疫優性抗原を認識するＣＤ４＋リンパ球を含む。
【００７０】
作動可能に連結した：第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的な関係性で配置されている場合に、第１の核酸配列は第２の核酸配列に作動可能に連結している。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現をもたらす場合に、プロモーターはコード配列に作動可能に連結している。一般に、作動可能に連結したＤＮＡ配列は連続的であり、２つのタンパク質コード領域を合わせることが必要な場合は、オープンリーディングフレームを整列させる。
【００７１】
ＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）：いかなる終止コドンも含まない、アミノ酸をコードしている一連のヌクレオチドトリプレット（コドン）である。これらの配列は、通常はポリペプチドへと翻訳可能である。
【００７２】
ペプチド修飾：Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍポリペプチドには本明細書中に記載のペプチドの合成実施形態が含まれる。さらに、これらのタンパク質の類似体（非ペプチド有機分子）、誘導体（開示したペプチド配列から開始して得られた化学的に官能化されたペプチド分子）および変異体（相同体）を、本明細書中に記載の方法で利用することができる。本発明それぞれのポリペプチドは、Ｌ−および／またはＤ−アミノ酸、天然に存在するまたは他のもののいずれかであり得るアミノ酸の配列からなる。
【００７３】
ペプチドを様々な化学技術によって修飾して、未修飾のペプチドと本質的に同じ活性を有し、任意選択で他の望ましい特性を有する誘導体を生成し得る。例えば、タンパク質のカルボン酸基を、カルボキシル末端であれ側鎖であれ、薬学的に許容される陽イオンの塩の形態で提供するか、またはエステル化してＣ１〜Ｃ１６エステルを形成するか、または式ＮＲ１Ｒ２のアミドへと変換するか［式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立してＨもしくはＣ１〜Ｃ１６アルキルである］、または合わせて５もしくは６員環の複素環を形成し得る。ペプチドのアミノ基は、アミノ末端であれ側鎖であれ、ＨＣｌ塩、ＨＢｒ塩、酢酸塩、安息香酸塩、トルエンスルホン酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩および他の有機塩などの薬学的に許容される酸付加塩の形態であるか、またはＣ１〜Ｃ１６アルキルもしくはジアルキルアミノへとさらに修飾するか、またはアミドへとさらに変換し得る。
【００７４】
ペプチド側鎖のヒドロキシル基は、十分に認識されている技術を用いてＣ１〜Ｃ１６アルコキシまたはＣ１〜Ｃ１６エステルへと変換し得る。ペプチド側鎖のフェニルおよびフェノール環は、フッ素、塩素、臭素もしくはヨウ素などの１つもしくは複数のハロゲン原子、Ｃ１〜Ｃ１６アルキル、Ｃ１〜Ｃ１６アルコキシ、カルボン酸およびそのエステル、またはそのようなカルボン酸のアミドで置換し得る。ペプチド側鎖のメチレン基は、相同的なＣ２〜Ｃ４アルキレンへと伸長することができる。チオールは、アセトアミド基などのいくつかの十分に認識されている保護基のうちの任意の１つで保護することができる。また、当業者には、安定性の増強をもたらす、構造にコンホメーションの束縛を選択および提供するための環状構造を本発明のペプチド内に導入する方法が理解されるであろう。
【００７５】
ペプチド模倣体および有機模倣体の実施形態が想定され、そのようなペプチドおよび有機模倣体の化学構成成分の三次元配置はペプチド主鎖および構成要素アミノ酸側鎖の三次元配置を模倣して、免疫応答を生じる測定可能または増強された能力を有するＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍポリペプチドのペプチドおよび有機模倣体がもたらされる。コンピュータモデリング用途では、ファルマコフォアは、生物活性の構造的要件の理想化された三次元定義である。ペプチドおよび有機模倣体は、最新のコンピュータモデリングソフトウェア（コンピュータ支援薬物設計すなわちＣＡＤＤを使用）を用いて、それぞれのファルマコフォアに当てはまるように設計することができる。ＣＡＤＤで使用する技術の説明には、Ｗａｌｔｅｒｓ、「Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ」、ＫｌｅｇｅｒｍａｎおよびＧｒｏｖｅｓ編、１９９３年、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｔｅｒｐｈａｒｍ  Ｐｒｅｓｓ：Ｂｕｆｆａｌｏ  Ｇｒｏｖｅ，  ＩＬ、１６５〜１７４頁およびＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、Ｍｕｎｓｏｎ編、１９９５年、第１０２章を参照されたい。また、そのような技術を用いて調製した模倣体も含まれる。
【００７６】
製薬または薬物：被験体に適切に投与した場合に所望の治療的または予防的効果を誘導することができる化学物質または組成物である。
【００７７】
薬学的に許容される担体：本明細書中に記載のポリペプチドおよび核酸で有用な薬学的に許容される担体は慣用のものである。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｅ．  Ｗ．  Ｍａｒｔｉｎ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ、第１５版（１９７５年）は、本明細書中に開示した融合タンパク質の薬学的な送達に適した組成物および配合物を記載している。
【００７８】
一般に、担体の性質は用いる特定の投与様式に依存する。例えば、非経口配合物は、通常、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、デキストロース水溶液、グリセロールなどの薬学的および生理的に許容される液体がビヒクルとして含まれる注射用の液体を含む。固体組成物（例えば、散剤、丸薬、錠剤、またはカプセルの形態）に関し、慣用の無毒性の固体担体には、例えば、製薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムが含まれることができる。生物学的に中性な担体に加えて、投与する医薬組成物は、湿潤剤または乳化剤、保存料、およびｐＨ緩衝剤、例えば酢酸ナトリウムまたはモノラウリン酸ソルビタンなどの少量の無毒性の補助物質を含有することができる。
【００７９】
ポリヌクレオチド：１００個を超えるヌクレオチドの長さの配列を含めた、直鎖状ヌクレオチド配列である。
【００８０】
ポリペプチド：長さまたは翻訳後修飾（例えばグリコシル化またはリン酸化）にかかわらず、任意のアミノ酸の鎖である。「ペプチド」とは１００個未満のアミノ酸の長さであるアミノ酸の鎖である。一実施形態では、「ペプチド」は、ポリペプチドの一部分、例えば、１００個を超えるアミノ酸の長さのポリペプチドの約１０、２０、３０、４０、５０、または１００個の連続的なアミノ酸である。
【００８１】
核酸配列の一部分：抗原をコードしている配列などの関連配列の少なくとも１０、２０、３０または４０個の連続的なヌクレオチドである。一部の例では、５０個以上のヌクレオチドからなる一部分を使用することが有利である。例えば、抗原の一部分（抗原性エピトープなど）を説明する場合、少なくとも１０、２０、３０、４０または５０個のヌクレオチド含む関連配列の一部分を一定の長さまで除去することが有利であり得る。
【００８２】
プローブおよびプライマー：核酸プローブおよびプライマーは、本発明によって提供される核酸に基づいて容易に調製し得る。プローブは、検出可能な標識またはレポーター分子と付着した単離した核酸を含む。典型的な標識には、放射性同位元素、リガンド、化学発光剤、および酵素が含まれる。標識方法および様々な目的に適した標識の選択の指導は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９８７年）に記述されている。
【００８３】
プライマーとは、短い核酸、好ましくは１５個以上のヌクレオチドの長さのＤＮＡオリゴヌクレオチドである。プライマーは、核酸ハイブリダイゼーションによって相補的な標的ＤＮＡ鎖とアニーリングしてプライマーと標的ＤＮＡ鎖との間のハイブリッドを形成し、その後、ＤＮＡポリメラーゼ酵素によって標的ＤＮＡ鎖に沿って伸長させ得る。プライマー対は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または当分野で公知の他の核酸酸増幅方法による核酸配列の増幅に使用することができる。
【００８４】
プローブおよびプライマーを調製および使用する方法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、第１〜３巻、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ、１９８９年およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎｅ  ＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇおよびＷｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８７年（定期的に改訂される）に記載されている。ＰＣＲプライマー対は、公知の配列から、例えばＰｒｉｍｅｒ（バージョン０．５（著作権）、１９９１年、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）などのその目的に意図されるコンピュータプログラムを用いることによって、誘導することができる。
【００８５】
疾患の予防または処置：疾患を「予防すること」とは、例えばＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓまたはＭ．ｌｅｐｒａｅの感染の危険性にあることが公知である人において、疾患の完全な発生を阻害することをいう。公知の素因を有する人の例は、結核を診断された人と同居している人、保健医療従事者、もしくは家族内の人、またはＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに曝露された人である。「活動性の感染症を予防すること」とは、潜在性感染が結核へと変換することを予防することをいう。
【００８６】
「処置」とは、結核などの疾患または病的状態の兆候または症状を、それが発生し始めた後に寛解させる治療介入をいう。
【００８７】
プロモーター：プロモーターとは、核酸の転写を指示する核酸制御配列のアレイである。プロモーターには、転写の開始部位付近に、ＩＩ型ポリメラーゼプロモーターの場合はＴＡＴＡエレメントなどの必要な核酸配列が含まれる。また、プロモーターには、転写の開始部位数千個の塩基対も離れて位置することができる遠位のエンハンサーまたはリプレッサーエレメントも任意選択で含まれる。プロモーターは構成的または誘導性プロモーターであることができる。プロモーターの具体的な非限定的な例はＨＣＭＶ  ＩＥプロモーターである。
【００８８】
精製した：用語「精製した」は、絶対的な純度を必要とせず、むしろ、これは相対的な用語として意図する。したがって、例えば精製した抗原調製物とは、抗原が、それが由来する細胞内環境中のタンパク質よりも純粋であるものである。典型的には、抗原の調製物は、抗原が調製物の全タンパク質含有量の少なくとも５０％を表すように精製する。しかし、特定の用途にはより高度に精製した調製物が必要であり得る。例えば、そのような用途には、抗原が全タンパク質含有量の少なくとも７５％または少なくとも９０％を構成する調製物を用い得る。一部の例では、精製した抗原は全タンパク質含有量の少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である。
【００８９】
組換え：組換え核酸またはポリペプチドとは、天然に存在しない配列を有する、または２つ以上のそうでなければ分離されている配列セグメントの人工的な組合せによって作製された配列を有するものである。この人工的な組合せは、多くの場合、化学合成によって、またはより一般的には単離した核酸のセグメントの人工的な操作によって、例えば遺伝子工学技術によって達成する。
【００９０】
配列同一性：アミノ酸配列間の類似度は配列間の類似度に関して表し、配列同一性とも呼ばれる。配列同一性はしばしば同一性（または類似度もしくは相同性）のパーセンテージに関して測定し、パーセンテージが高ければ高いほど２つの配列はより似ている。抗原ポリペプチドの変異体は、標準の方法を用いてアラインメントした場合に比較的高い度合の配列同一性を保有する。
【００９１】
比較のために配列をアラインメントする方法は当分野で周知である。Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９４年）は、配列アラインメント方法および相同性計算の詳細の考察を提示している。ＮＣＢＩ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０年）は、配列解析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘと連結して使用するために、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）およびインターネット上を含めたいくつかの供給源から利用可能である。これはＮＣＢＩのウェブサイトでアクセスすることができる。このプログラムを用いてどのように配列同一性を決定するかの説明および初期設定パラメータはＮＣＢＩのウェブサイトから入手可能である。
【００９２】
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍポリペプチドなどの抗原ポリペプチドの変異体は、典型的には、初期設定パラメータに設定したＮＣＢＩ  Ｂｌａｓｔ  ２．０、ギャップ付きｂｌａｓｔｐを用いて、完全長アラインメントにわたって計数して、ネイティブ抗原配列のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を保有することによって特徴付けられている。参照配列に対してさらに高い類似度を有するタンパク質は、この方法によって評価した場合に、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列同一性などの増加するパーセンテージ同一性を示す。配列全体未満を配列同一性について比較する場合、変異体は、典型的には１０〜２０個のアミノ酸の短いウィンドウにわたって少なくとも７５％の配列同一性を保有し、参照配列に対するその類似度に応じて少なくとも８５％または少なくとも９０％もしくは９５％の配列同一性を保有し得る。そのような短いウィンドウにわたって配列同一性を決定する方法はＮＣＢＩのウェブサイトに記載されている。また、ＭＨＣドメインポリペプチドの変異体はネイティブポリペプチドの生物活性を保持する。本発明の目的のために、その活性は、以下に詳述するように、変異体ドメインを適切なβ１α１またはα１α２ポリペプチド中に取り込ませ、生じるポリペプチドが抗原特異的Ｔ細胞増殖をｉｎ  ｖｉｔｒｏで阻害する脳力、またはＴ抑制細胞もしくはＩＬ−１０の発現を誘導する能力を決定することによって、好都合に評価する。
【００９３】
治療上活性のあるポリペプチド：臨床反応（例えば、免疫細胞の集団の増加、Ｍｔｂに対する細胞溶解活性の増加、または感染症の症状の測定可能な軽減）によって測定して、免疫応答の誘導を引き起こすＭｔｂのエピトープなどの薬剤である。また、治療上活性のある分子は核酸から作製することもできる。核酸に基づく治療上活性のある分子の例はＭｔｂエピトープをコードしている核酸配列であり、核酸配列はプロモーターなどの制御エレメントに作動可能に連結している。
【００９４】
一実施形態では、治療上有効な量のＭｔｂポリペプチドとは、免疫応答を生じさせるために使用する量である。いくつかの例では、「処置」とは、結核の兆候または症状を寛解させる治療介入をいう。
【００９５】
治療上有効な用量：進行を防止する、もしくは疾患の回帰を引き起こすために十分な、または疾患によって引き起こされた症状を緩和させることができる用量である。一実施形態では、治療上有効な用量とは、結核の進行を予防するまたはその症状を緩和させるために十分な用量である。
【００９６】
形質導入および形質転換：ウイルスまたはベクターは、核酸を細胞内に移した際に細胞を「形質導入」する。細胞ゲノム内への核酸の取り込みまたはエピソーム複製のいずれかによってＤＮＡが細胞によって安定に複製されるようになった際に、細胞は、細胞内に形質導入した核酸によって「形質転換」されている。本明細書中で使用する用語、形質転換には、ウイルスベクターを用いたトランスフェクション、プラスミドベクターを用いた形質転換、ならびに電気穿孔、リポフェクション、および粒子銃加速による裸ＤＮＡの導入を含めた、核酸分子をそのような細胞内に導入し得る全ての技術が包含される。
【００９７】
結核（ＴＢ）疾患：一般にＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染によって引き起こされる疾患である。結核疾患には肺および肺外結核疾患が含まれる。結核疾患とはＭｔｂ感染から生じる症候性状態である。
【００９８】
肺結核疾患とは、Ｍｔｂによって引き起こされる肺疾患である。Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌによれば、症状には、通常咳嗽が含まれ、喀血または痰の喀出、胸部疼痛、脱力感、体重減少、発熱、悪寒、および寝汗が含まれる場合がある。
【００９９】
Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの伝染は換気不良の閉鎖領域において風媒経路によって起こる。９０％を超える症例において、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染の後に免疫系はＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓからの疾患の発生を予防し、これは多くの場合活動性結核と呼ばれる。しかし、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの全てが死滅するわけではなく、したがって、小さな硬いカプセルが形成される。「原発性結核」とは、通常は小児において、最初の感染後に発生する疾患である。感染の初期の病巣は、肉芽腫性肺門リンパ節感染を伴った小さな胸膜下肉芽腫である。これらは一緒になってＧｈｏｎ複合体を構成する。ほとんど全ての症例においてこれらの肉芽腫は消散し、感染のさらなる伝播はない。「二次結核」とは、主に成人において、以前の感染の再活性化（または再感染）として、特に健康状態が低下した際に見られる。肉芽腫性炎症が、はるかにより病勢盛んであり、広まっている。典型的には、上肺葉が最も影響を受け、空洞化が起こる場合がある。「潜伏性」結核とは、それだけには限定されないがツベルクリン皮膚試験（ＴＳＴ）などの診断的アッセイによって検出することができる、個体において症状を生じない、個体におけるＭｔｂ感染である。「活動性」結核とは被験体における症候性のＭｔｂ感染である。
【０１００】
微視的に見ると、ＴＢ感染症で生じる炎症は肉芽腫性であり、類上皮マクロファージおよびラングハンス巨細胞が、リンパ球、形質細胞、場合によってはいくつかの多形核細胞、コラーゲンを有する線維芽細胞、および中心に特徴的な乾酪性壊死と共に存在する。炎症反応はＩＶ型過敏性反応によって媒介され、皮膚試験はこの反応に基づく。一部の例では、結核は、皮膚試験、抗酸染色、オーラミン染色、またはその組合せによって診断することができる。スクリーニングする最も一般的な検体は痰であるが、組織学的染色を組織または他の体液で行うこともできる。
【０１０１】
ＴＢはＨＩＶ感染症の頻繁な合併症である。ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染した被験体におけるＴＢ感染症は容易に伝播し、活動性疾患へと迅速に進行する場合がある。Ｍｔｂ感染が原因の肺疾患の具体的な症状には、慢性的な咳および喀血が含まれる。ＴＢ疾患の他の症状には、疲労、食欲不振、体重減少、発熱およびびっしょりの寝汗が含まれる。
【０１０２】
Ｍｔｂ感染は多くの場合は肺の感染症である。しかし、肺外への結核の内転移は、骨格結核、生殖器結核、尿路結核、中枢神経系（ＣＮＳ）結核、胃腸管系結核、副腎結核、瘰癧、および心臓結核を含めた特徴的なパターンを有するいくつかの珍しい発見の出現をもたらす場合がある。したがって、Ｍｔｂ感染は肺外であることもあり得る。一般的に、感染の肺外部位には、リンパ節、胸膜、および骨関節領域が含まれるが、任意の器官が関与することができる。肺外結核の診断は多くの場合分かりにくい。一般に、免疫抑制された小児および被験体が肺外Ｍｔｂ感染に感受性がある。
【０１０３】
リンパ節炎は最も一般的に起こる肺外結核の形態である。頸部腺症が最も一般的であるが、鼠径部、腋窩、腸間膜、縦隔、および乳房内の関与が全て記載されている。米国では胸膜結核（ｐｌｅｕｒａｌ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）が全結核症例の約５パーセントを占める。多くの場合、胸膜結核は、咳、胸膜炎性胸痛、発熱、または呼吸困難を伴う急性の病気である。骨関節結核（ｂｏｎｅ  ａｎｄ  ｊｏｉｎｔ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）は肺外結核の症例の３５パーセントまでを占める場合がある。骨格結核は、ほとんどの場合は脊椎に関与し、次いで体重支持関節の結核性関節炎および脊髄外結核性骨髄炎に関与する。中枢神経系結核（ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）には、結核性髄膜炎（最も一般的な提示）、頭蓋内結核腫、および脊髄結核性くも膜炎が含まれる。髄膜炎は、くも膜下空間内への上衣下結節の破裂後の激しい炎症から生じる。腹部結核（ａｂｄｏｍｉｎａｌ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）は、胃腸管、腹膜、腸間膜リンパ節、または尿生殖路に関与する場合がある。他の器官（例えば、肝臓、脾臓、副腎）が粟粒結核において通常影響を受ける。粟粒結核、結核性心外膜炎、および腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−アルファ）阻害剤に関連する結核が肺外結核のさらなる形態である。
【０１０４】
用語「粟粒」結核とは、結核の任意の進行性、播種性の形態をいい、この疾患は原発性内転移中または何年もの未処置の結核の後に起こる場合がある。粟粒疾患は、ＡＩＤＳおよび肺結核に罹患している患者の１０パーセント、ならびにＡＩＤＳおよび肺外結核に罹患している患者の３８パーセントで見られる。
【０１０５】
生物が第一選択薬物に耐性を有することが公知であるまたは強く疑われる場合以外は、６〜９カ月間のレジメン（２カ月間のイソニアジド、リファンピン、ピラジナミド、およびエタンブトール、次いで４〜７カ月間のイソニアジドおよびリファンピン）が肺外結核の全ての形態の初期治療として推奨される。
【０１０６】
ベクター：宿主細胞内に導入され、それにより形質転換された宿主細胞を生じさせる核酸分子である。ベクターには、複製起点などの、宿主細胞中でのその複製を可能にする核酸配列が含まれ得る。また、ベクターには１つまたは複数の選択マーカー遺伝子および当分野で公知の他の遺伝エレメントも含まれ得る。ベクターには、グラム陰性およびグラム陽性の細菌細胞中で発現させるためのプラスミドを含めたプラスミドベクターが含まれる。例示的なベクターには、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ中で発現させるためのものが含まれる。また、ベクターには、それだけには限定されないが、レトロウイルス、オルトポックス、アビポックス、鶏痘、カプリポックス、スイポックス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、アルファウイルス、バキュロウイルス、シンドビスウイルス、ワクシニアウイルスおよびポリオウイルスのベクターなどのウイルスベクターも含まれる。また、ベクターには、酵母細胞中で発現させるためのベクターも含まれる。
【０１０７】
別段に説明しない限りは、本明細書中で使用する全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する分野の技術者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。内容により明らかにそうでないと指示される場合以外は、単数形の用語「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には複数の指示対象が含まれる。同様に、内容により明らかにそうでないと指示される場合以外は、言葉「または」には「および」が含まれることを意図する。核酸またはポリペプチドについて与えた全ての塩基の大きさまたはアミノ酸の大きさ、および全ての分子量または分子質量の値は近似であり、説明のために提供することを理解されたい。本明細書中に記載のものに類似または均等な方法および材料を本開示の実施または試験に使用することができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。用語「含む」とは「含まれる」ことを意味する。本明細書中で引用する全ての出版物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参考として組み込まれている。矛盾する場合は、用語の説明を含めて本明細書が支配する。さらに、材料、方法、および実施例は例示的のみであり、限定することを意図しない。
【０１０８】
Ｍｔｂ感染を検出するための方法：Ｔ細胞の検出
小児および潜伏性結核感染症（ＬＴＢＩ）に罹患している被験体においてＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ感染を検出するための方法は本明細書中に開示されている。小児は、乳児、幼児、年長児、約５歳未満の小児、１０歳以下の小児、思春期前の小児またはティーンエージャーを含めた任意の小児であることができる。いくつかの例では、小児は１０歳以下、例えば７歳以下もしくは５歳以下、または５〜１０歳である。一部の実施形態では、小児はＴＢまたはＬＴＢＩに罹患している家庭内接触を有する。家庭内接触とは小児と同居している任意の個体である。他の実施形態では、被験体はＬＴＢＩに罹患していると疑われる任意の被験体である。一例では、ＬＴＢＩに罹患していると疑われる被験体は、Ｍｔｂ感染との家庭内接触を有する、または高い結核の発生率を有する国に旅行している。
【０１０９】
一実施形態では、本方法は、肺および／または肺外結核疾患を含めた結核疾患を検出するための方法である。結核疾患とはＭｔｂ感染から生じる症候性状態である。肺結核疾患とは肺炎（ｐｎｕｅｍｏｎｉａ）をもたらすＭｔｂによって引き起こされる疾患である。本明細書中では、小児などにおいて肺結核を検出するための方法を提供する。小児は、乳児、幼児、年長児、約５歳未満の小児、１０歳以下の小児、５〜１０歳の小児、思春期前の小児またはティーンエージャーを含めた任意の小児であることができる。また、小児は７歳以下、または６歳以下、または４〜１１歳であることができる。
【０１１０】
また、成人被験体または小児のいずれかにおいて結核の肺外感染症を検出するための方法も開示する。小児は、乳児、幼児、年長児、約５歳未満の小児、１０歳以下の小児、５〜１０歳の小児、思春期前の小児またはティーンエージャーを含めた任意の小児であることができる。また、小児は７歳以下、または６歳以下、または４〜１１歳であることもできる。他の例では、被験体は、遺伝子障害、免疫抑制治療、またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）などの免疫不全ウイルスの感染症の結果として免疫無防備状態である。
【０１１１】
肺外結核は、リンパ節炎、胸膜結核、骨関節結核、中枢神経系結核、腹部結核、粟粒結核、結核性心外膜炎、および腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−アルファ）阻害剤に関連する結核を含めた、疾患の任意の形態であることができる。本方法は、脊椎の骨格結核、体重支持関節の結核性関節炎、および脊髄外結核性骨髄炎を検出するために使用することができる。本方法は、結核性髄膜炎（最も一般的な提示）、頭蓋内結核腫、および脊髄結核性くも膜炎を含めた中枢神経系結核を診断するために使用することができる。また、本方法は、胃腸管、腹膜、腸間膜リンパ節、または尿生殖路の感染症などの腹部結核を診断するために使用することもできる。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ感染（および／または結核疾患）は、生物学的試料中のＣＤ８＋Ｔ細胞の存在に基づいて検出することができ、Ｔ細胞はＭｔｂポリペプチドと特異的に反応する。一例では、試料を、本明細書中に開示した１つまたは複数のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍポリペプチド、１つまたは複数のＭｔｂポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、および１つまたは複数のＭｔｂポリペプチドまたはＭＨＣと結合するその断片を発現するＡＰＣと共にインキュベーションする。ＣＤ８＋Ｔ細胞の特異的活性化の存在または非存在を検出する。ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化はＭｙｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ感染が存在することを示す。一例では、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化は、それだけには限定されないがインターフェロン−γなどのサイトカインの発現を測定することによって検出する。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、本方法にはＣＤ８＋Ｔ細胞を単離することが含まれる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞を含む生物学的試料を目的の被験体から得る。適切な生物学的試料には、それだけには限定されないが、血液試料、末梢血単核細胞、痰、唾液、脳脊髄液もしくは単離したＴ細胞（ＣＤ３＋Ｔ細胞など）の試料、リンパ節組織、肺組織、または他の組織試料が含まれる。
【０１１４】
検出方法においてペプチドを認識するＣＤ８＋Ｔ細胞は、一般に、ｉｎ  ｖｉｖｏで目的のＭｔｂポリペプチドに対して前感作されている。いくつかの実施形態では、これらの抗原を経験したＴ細胞は、一般に、１０６個に１個〜１０３個に１個の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の頻度で、抗原に曝露させた宿主の末梢血中に存在する。
【０１１５】
目的の被験体、例えば、それだけには限定されないが、乳児、幼児、年長児、５〜１０歳の小児、５歳未満の小児、１０歳未満の小児、ティーンエージャー、ＴＢもしくはＬＴＢＩに罹患している個体と同居している小児、ＬＴＢＩが疑われる任意の被験体、または肺疾患などの結核疾患に罹患していることが疑われる被験体からＴ細胞を単離することができる。また、Ｔ細胞は、小児、思春期前および成人の被験体を含めた、肺外Ｍｔｂ感染に罹患していることが疑われる任意の被験体から単離することもできる。Ｔ細胞はルーチン技術（末梢血リンパ球のＦｉｃｏｌｌ／Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離によって、または蛍光活性化細胞分取によってなど）によって単離することができる。一実施形態では、アッセイで使用するＴ細胞は未加工もしくは希釈した試料の形態であるか、または新しく単離したＴ細胞の形態（新しく単離した単核細胞（ＭＣ）もしくは末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の形態などであり、これらは、方法で使用する前に培養されていないようにｅｘ  ｖｉｖｏで直接使用する。しかし、Ｔ細胞を使用前に、例えばペプチドのうちの１つまたは複数、および一般に外因性成長促進サイトカインの存在下で培養することができる。培養中、ペプチドは典型的にはＡＰＣなどの細胞の表面上に提示される。Ｔ細胞の前培養は方法の感度の増加をもたらし得る。したがって、Ｔ細胞を短期細胞系などの細胞系へと変換することができる。
【０１１６】
ＣＤ８などの細胞表面マーカーの存在または非存在を決定する方法は当分野で周知である。典型的には、マーカーに特異的に向けられた標識抗体を用いて細胞集団を同定する。抗体は、それだけには限定されないが、酵素、磁気ビーズ、コロイド状磁気ビーズ、ハプテン、蛍光色素、金属化合物、放射性化合物または薬物を含めた他の化合物とコンジュゲートさせることができる。抗体とコンジュゲートさせることができる酵素には、それだけには限定されないが、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ウレアーゼおよびβ−ガラクトシダーゼが含まれる。抗体とコンジュゲートさせることができる蛍光色素には、それだけには限定されないが、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、フィコエリスリン、アロフィコシアニンおよびテキサスレッドが含まれる。抗体とコンジュゲートさせることができるさらなる蛍光色素には、Ｈａｕｇｌａｎｄ，  Ｒ．  Ｐ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ：  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（１９９２〜１９９４年）を参照されたい。抗体とコンジュゲートさせることができる金属化合物には、それだけには限定されないが、フェリチン、コロイド金、および特にコロイド状超常磁性ビーズが含まれる。抗体とコンジュゲートさせることができるハプテンには、それだけには限定されないが、ビオチン、ジゴキシゲニン、オキサザロン（ｏｘａｚｏｌｏｎｅ）、およびニトロフェノールが含まれる。抗体とコンジュゲートさせるまたは抗体内に取り込ませることができる放射性化合物は当分野で公知であり、それだけには限定されないが、テクネチウム９９ｍ（９９Ｔｃ）、１２５Ｉならびにそれだけには限定されないが１４Ｃ、３Ｈおよび３５Ｓを含めた任意の放射性核種を含むアミノ酸が含まれる。
【０１１７】
蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）を使用して、細胞を適切に標識した抗体と接触させることによってＣＤ８を発現する細胞を分別することができる。一実施形態では、追加の抗体およびＦＡＣＳ分別をさらに使用して、実質的に精製したＣＤ８＋ＣＤ３＋細胞の集団を生成するか、または検出可能なレベルのＣＤ４もしくはＣＤ５６を発現しない細胞を精製することができる。
【０１１８】
ＦＡＣＳでは、細胞を分離または分別するために、他のより洗練された検出のレベルの中で、とりわけ、複数の色チャネル、小角および鈍角の光分散検出チャネル、ならびにインピーダンスチャネルを用いる。所望の細胞の生存度に有害でない限りは、任意のＦＡＣＳ技術を用い得る。（ＦＡＣＳの例示的な方法には、本明細書中に参考として組み込まれている米国特許第５，０６１，６２０号を参照されたい）。同様に、ＣＤ３を発現するがＣＤ５６またはＣＤ４を発現しないＣＤ８＋細胞などのＣＤ８＋細胞を実質的に精製するためにＦＡＣＳを使用することができる。
【０１１９】
しかし、所望の細胞集団を精製および単離するために異なる有効性の他の技術を用い得る。用いる分離技術は、収集する細胞の画分の生存度の保持を最大限にするものであるべきである。もちろん、用いる特定の技術は、分離の効率、方法の細胞毒性、分離の容易さおよび速度、ならびに必要な装置および／または技術的技能に依存する。
【０１２０】
分離手順には、モノクローナル抗体と結合させたまたは補体と併せて使用する、抗体でコーティングした磁気ビーズ、アフィニティークロマトグラフィー、細胞毒性剤を用いた磁気分離、ならびに固体マトリックスに付着したモノクローナル抗体を利用する「パニング」または別の好都合な技術が含まれ得る。磁気ビーズならびにアガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、中空繊維膜およびプラスチック製ペトリ皿などの他の固体マトリックスに付着した抗体は、直接分離を可能にする。抗体によって結合された細胞は、単に固体担体を細胞懸濁液から物理的に分離することによって、細胞懸濁液から除去することができる。細胞および固相連結抗体のインキュベーションの正確な条件および期間は、用いるシステムに特異的ないくつかの要因に依存する。しかし、適切な条件の選択は十分に当分野の技術範囲内にある。
【０１２１】
その後、目的のマーカーを発現する細胞（ＣＤ８など）が固相連結抗体と結合するために十分な時間をおいた後、結合していない細胞を生理的緩衝液で溶出させるまたは洗い流すことができる。その後、結合した細胞を、主に用いる固相および抗体の性質に応じた任意の適切な方法によって固相から分離する。
【０１２２】
抗体をビオチンとコンジュゲートさせてもよく、これはその後に支持体と結合したアビジンもしくはストレプトアビジンを用いて除去することでき、または、蛍光色素とコンジュゲートさせてもよく、これは蛍光活性化細胞分取器（ＦＡＣＳ）と共に用いて細胞分離を可能にすることができる（上記参照）。ＣＤ８細胞は、最初にＣＤ３の細胞表面発現によって他の細胞から分離し得る。１つの具体的な非限定的な例では、ＣＤ３＋細胞は磁気ビーズ分離によって陽性選択し、磁気ビーズをＣＤ３反応性モノクローナル抗体でコーティングする。その後、ＣＤ３＋細胞を磁気ビーズから除去する。
【０１２３】
磁気ビーズからのＣＤ３＋細胞の放出は、培養放出または他の方法によって達成することができる。その後、単離したＣＤ３＋細胞の純度を、例えば所望される場合は、ＦＡＣＳＣＡＮ（登録商標）フローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で確認する。一実施形態では、磁気ビーズから放出された細胞集団のＦＡＣＳ分別などのさらなる精製ステップを行う。
【０１２４】
一実施形態では、複数の系列特異的マーカー、例えば、Ｂ２２０、ＣＤ４、ＣＤ４５、ＣＤ５、またはＣＤ５６を発現しない細胞集団を最初に分離するために、磁気ビーズ分離を使用する。さらに、１つまたは複数のＢ細胞またはマクロファージ系列特異的マーカーを発現しない細胞を分離するために、パニングを使用することができる（パニング方法には、本明細書中に参考として組み込まれているＳｍａｌｌら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３；１６７巻（１〜２号）：１０３〜７頁、１９９４年を参照されたい）。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、単離した後、ＣＤ８＋Ｔ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで２〜９日間、例えば約４日間、３７℃で、ＭｔｂポリペプチドまたはＭＨＣと結合するその断片と共にインキュベーションする。いくつかの例では、ＭｔｂポリペプチドまたはＭＨＣと結合するその断片が含まれる（例えば、約５、約１０、約１５、または約２０μｇ／ｍｌなどの約５〜約２５μｇ／ｍｌの濃度で）。いくつかの例では、対照として、Ｔ細胞試料の別のアリコートをＭｔｂポリペプチドの非存在下でインキュベーションすることができる。また、複数のＭｔｂポリペプチドを利用することもできる。
【０１２６】
一実施形態では、単核細胞（ＭＣ）を試料から分離する。ＭＣにはＴ細胞および抗原提示細胞（ＡＰＣ）が含まれる。したがって、本方法では、分離したＭＣ中に存在するＡＰＣはペプチドをＴ細胞に提示することができる。別の実施形態では、Ｔ細胞のみ、例えばＣＤ８＋Ｔ細胞のみを試料から精製することができる。
【０１２７】
本方法で使用するＡＰＣは、その表面上にＭＨＣクラスＩ分子を有する任意の細胞であり得る。これは、Ｂ細胞、樹状細胞またはマクロファージなどの特殊化した抗原提示細胞であってもそうでなくてもよい。本方法で使用するＡＰＣは、Ｔ細胞と同じ宿主由来であり得る。一般に、ＡＰＣはペプチドをＴ細胞に提示することができる。ＡＰＣは新しく単離したｅｘ  ｖｉｖｏ細胞または細胞系由来の細胞などの培養細胞であることができる。ＡＰＣは同種または自己であることができる。
【０１２８】
目的の被験体からの試料に由来するＴ細胞は、関連パネルを試験することを意図する、全てのＭｔｂポリペプチド（またはＭｔｂポリペプチドのプール、または特異的なＭｔｂポリペプチド）を用いたアッセイに入れることができるか、またはＴ細胞を分割し、そのそれぞれがペプチドのうちの１つまたは複数を含有する別のアッセイに入れることができる。一実施形態では、配列番号１〜１２、配列番号３９もしくは配列番号６１として記載したアミノ酸配列を有するポリペプチドのうちの１つもしくは複数、またはＭＨＣと結合する、これらのポリペプチドのうちの１つもしくは複数の断片を利用する。さらなる実施形態では、ポリペプチドのうちの１つまたは複数はＥＳＡＴ６またはＣＦＰ１０であるが、任意のＭｔｂポリペプチドを利用することができる。有用なさらなるペプチドを配列番号３９〜８３に記載する。本明細書中に開示した任意のＭｔｂペプチドのうちの２つ以上を、これらのポリペプチドを認識するＴ細胞の同時、別々または連続的な使用に使用することができる。本明細書中に開示したＭｔｂポリペプチドのうちの任意のもののさらなる組合せを利用することができる。Ｍｔｂポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｄｉｅ）のプールも有用である。
【０１２９】
一実施形態では、Ｔ細胞の非存在下で１つまたは複数のペプチド（複数可）を提示細胞に提供する。その後、この細胞を、典型的にはその表面上にペプチドを提示させた後に、被験体から単離したＴ細胞に提供する。
【０１３０】
ペプチドを細胞と接触させる期間は、ペプチドの認識を決定するために使用する方法に応じて変動する。典型的には、１０５〜１０７個、例えば約５×１０５〜１０６個のＴ細胞をそれぞれのアッセイに加える。ペプチドをアッセイに直接加える場合、その濃度は、典型的には約１０−１〜約１０３μｇ／ｍｌ、例えば約０．５〜約５０μｇ／ｍｌまたは約１〜約１０μｇ／ｍｌである。Ｔ細胞をペプチドと共にインキュベーションする時間の流さは、約４〜約２４時間、例えば約６〜約１６時間、または約１２時間であることができる。
【０１３１】
ＣＤ８＋Ｔ細胞などのＴ細胞によるペプチドの特異的認識の決定は、ペプチドとＴ細胞との結合を測定することによって行うことができる。典型的には、ペプチドと結合するＴ細胞は、この結合に基づいて、例えば蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）技術を用いて（上記参照）分別することができる。ペプチドを用いて分別された細胞の頻度が対照値を超える場合に、ペプチドを認識するＴ細胞の存在の検出が起こると考えられる。
【０１３２】
また、Ｔ細胞がペプチドを認識するかどうかの決定は、ペプチドの存在下におけるＴ細胞の状態の変化を検出すること、またはＴ細胞がペプチドと結合するかどうかを決定することによっても行うことができる。状態の変化は、一般に、Ｔ細胞受容体がペプチドと結合した後に、Ｔ細胞の抗原特異的機能的活性によって引き起こされる。一般に、Ｔ細胞受容体と結合する際、ペプチドはＭＨＣクラスＩ分子と結合し、これは、ＰＢＭＣまたは抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上に存在し得る。
【０１３３】
Ｔ細胞の活性化は当業者に公知の任意の手段によって検出することができる。一例では、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化は細胞溶解活性を評価することによって検出する。別の例では、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化は増殖によって検出する。いくつかの例では、感染していない被験体よりも少なくとも２倍高い増殖レベルおよび／または少なくとも２０％高い細胞溶解活性レベルが、目的の被験体、例えば小児、ＬＴＢＩに罹患している被験体におけるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ感染の存在を示す。さらなる例では、感染していない被験体よりも少なくとも２倍高い増殖レベルおよび／または少なくとも２０％高い細胞溶解活性レベルが、被験体が肺外結核疾患および／または肺結核疾患に罹患していることを示す。被験体は小児などの目的の任意の被験体であることができる。
【０１３４】
Ｔ細胞の状態の変化は、サイトカイン、例えばインターフェロン（ＩＦＮ）−γ、ＩＬ−２またはＴＮＦ−αなどの、Ｔ細胞からの物質の分泌の開始または増加であり得る。一例では、この物質は、特異的結合剤と結合させ、その後、特異的結合剤／物質の複合体の存在を測定することによって検出することができる。特異的結合剤は、典型的には、サイトカインなどの物質と結合する、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体などの抗体である。サイトカインに対する抗体は市販されているか、または標準技術を用いて作製することができる。
【０１３５】
典型的には、抗体などの特異的結合剤を固体担体上に固定する。サイトカインを結合させた後、固体担体を任意選択で洗い流して、抗体と特異的に結合していない材料を除去することができる。抗体／サイトカインの複合体は、標識で標識した（直接または間接的に）抗体などの、複合体と結合する第２の結合剤を使用することによって検出することができる。一般に、第２の薬剤は、第１の薬剤と結合する部位とは異なる部位で、物質と結合する。
【０１３６】
いくつかの例では、第２の結合剤は、検出可能な標識によって直接または間接的に標識した第３の薬剤によって検出することができる。例えば、第２の薬剤にはビオチンが含まれていてよく、これにより、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）を含む第３の薬剤および標識、例えば酵素的、放射性または蛍光の標識による検出が可能となる。
【０１３７】
一実施形態では、検出システムは、どちらも本明細書中に参考として組み込まれている、ＰＣＴ公開ＷＯ９８／２３９６０号または米国特許公開第２００５／０２０８５９４号に記載されているアッセイなどのＥＬＩＳＰＯＴアッセイである。一例では、Ｔ細胞から分泌されたＩＦＮ−γは、固体担体上に固定されている第１のＩＦＮγ特異的抗体によって結合される。その後、結合したＩＦＮ−γを、検出可能な標識で標識された第２のＩＦＮ−γ特異的抗体を用いて検出する。ＭＡＢＴＥＣＨ（商標）（Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）などの例示的な標識抗体が市販されている。例示的なＥＬＩＳＰＯＴアッセイを以下の実施例セクションに記載する。検出方法はサイトカインの発現を検出するための任意の他の方法であることができ、例えば、本明細書中に参考として組み込まれている欧州公開特許出願ＥＰ１８６７９８８号を参照されたい。
【０１３８】
また、測定することができるＴ細胞の状態の変化は、Ｔ細胞による物質の取り込み、例えばチミジンの取り込みの増加でもあり得る。また、状態の変化は、Ｔ細胞の大きさの増加、またはＴ細胞の増殖、またはＴ細胞上の細胞表面マーカーの変化によっても測定することができる。
【０１３９】
本明細書中に開示したＭｔｂポリペプチドと特異的に結合するＣＤ８発現細胞（ＣＤ８＋）を検出するための試薬を本明細書中に提供する。これらの試薬は、四量体ＭＨＣクラスＩ／免疫原性ＴＡＲＰポリペプチドの複合体である。これらの四量体複合体には、ＭＨＣクラスＩと特異的に結合する９〜２０個のアミノ酸の長さのポリペプチドなどのＭｔｂポリペプチドが含まれる。
【０１４０】
四量体ＭＨＣクラスＩ／ペプチドの複合体は、当分野で周知の方法を用いて合成することができる（本明細書中に参考として組み込まれているＡｌｔｍａｎｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７４巻：９４頁、１９９６年）。具体的な非限定的な一例では、精製したＨＬＡ重鎖ポリペプチドおよびβ２−ミクログロブリン（β２ｍ）を原核発現系によって合成することができる。有用な発現系の具体的な非限定的な一例はｐＥＴ系である（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）。重鎖は、膜貫通およびサイトゾルのテイルの欠失ならびにビオチンタンパク質リガーゼ（Ｂｉｒ−Ａ）酵素的ビオチン化部位を含有する配列のＣＯＯＨ末端付加によって修飾されている。その後、重鎖、β２ｍ、およびペプチドが再度折り畳まれる。再度折り畳まれた生成物は当分野で公知の任意の手段によって単離し、その後、Ｂｉｒ−Ａによってビオチン標識することができる。その後、ビオチン標識した生成物をストレプトアビジンと接触させることによって四量体が生成される。
【０１４１】
一実施形態では、ストレプトアビジンを標識する。適切な標識には、それだけには限定されないが、酵素、磁気ビーズ、コロイド状磁気ビーズ、ハプテン、蛍光色素、金属化合物、放射性化合物または薬物が含まれる。ストレプトアビジンとコンジュゲートさせることができる酵素には、それだけには限定されないが、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ウレアーゼおよびβ−ガラクトシダーゼが含まれる。ストレプトアビジンとコンジュゲートさせることができる蛍光色素には、それだけには限定されないが、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、フィコエリスリン、アロフィコシアニンおよびテキサスレッドが含まれる。ストレプトアビジンとコンジュゲートさせることができるさらなる蛍光色素には、Ｈａｕｇｌａｎｄ，  Ｒ．  Ｐ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ：  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（１９９２〜１９９４年）を参照されたい。ストレプトアビジンとコンジュゲートさせることができる金属化合物には、それだけには限定されないが、フェリチン、コロイド金、および特にコロイド状超常磁性ビーズが含まれる。ストレプトアビジンとコンジュゲートさせることができるハプテンには、それだけには限定されないが、ビオチン、ジゴキシゲニン、オキサザロン、およびニトロフェノールが含まれる。ストレプトアビジンとコンジュゲートさせることができる放射性化合物は当分野で公知であり、それだけには限定されないが、テクネチウム９９ｍ（９９Ｔｃ）、１２５Ｉならびにそれだけには限定されないが１４Ｃ、３Ｈおよび３５Ｓを含めた任意の放射性核種を含むアミノ酸が含まれる。一般に、蛍光色素で標識したストレプトアビジンを本明細書中に開示した方法で利用する。
【０１４２】
一実施形態では、Ｍｔｂポリペプチドを特異的に認識するＴ細胞が含まれる細胞の懸濁液を生成し、懸濁液中で細胞を四量体と反応させる。一実施形態では、これらの試薬を用いて細胞を標識し、その後、これらを蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）によって分析する。ＦＡＣＳの機械では、細胞を分離または分別するために、他のより洗練された検出のレベルの中で、とりわけ、複数の色チャネル、小角および鈍角の光分散検出チャネル、ならびにインピーダンスチャネルを用いる。所望の細胞の検出に有害でない限りは、任意のＦＡＣＳ技術を用いることができる。（ＦＡＣＳの例示的な方法には、本明細書中に参考として組み込まれている米国特許第５，０６１，６２０号を参照されたい）。
【０１４３】
Ｍｔｂ感染を検出するための方法：皮膚試験の確認
別の態様では、上記開示したＣＤ８＋Ｔ細胞を使用する方法に加えて、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ感染、特に結核の診断を確認するために、皮膚試験を用いて確認試験を行う。「皮膚試験」とは、上述の１つまたは複数のポリペプチドの皮内注射などの皮膚内投与の後に遅延型の過敏（ＤＴＨ）反応（硬結、腫脹、発赤または皮膚炎など）を測定する、患者に直接行う任意のアッセイである。そのような注射は、ツベルクリンシリンジまたは１ｍｌシリンジなどの、ポリペプチドまたは複数のポリペプチドを患者の真皮細胞と接触させるために十分な任意の適切な装置を用いて達成することができる。いくつかの例では、注射後少なくとも４８時間、例えば注射後約４８〜約７２時間の間に反応を測定する。
【０１４４】
ＤＴＨ反応とは、試験抗原（Ｍｔｂポリペプチド、ＭＨＣと結合するその断片、またはその融合タンパク質）に事前に曝露している被験体でより大きい、細胞媒介性の免疫応答である。応答は、定規を使用することなど、視覚的に測定することができる。いくつかの例では、直径約０．５ｃｍを超える、例えば直径約１．０ｃｍを超える応答が肯定応答であり、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ感染の指標である。
【０１４５】
Ｍｔｂポリペプチドは、皮膚試験で使用するためにポリペプチドおよび生理的に許容される担体を含有する医薬組成物として配合することができる。これらの組成物は、典型的には、Ｍｔｂポリペプチド（またはＭＨＣと結合するその断片もしくはその融合タンパク質）のうちの１つまたは複数を、０．１ｍｌの体積中に約１μｇ〜約１００μｇ、例えば約１０μｇ〜約５０μｇの範囲の量で含有する。医薬組成物中で用いる担体は、フェノールおよび／またはＴＷＥＥＮ８０（商標）などの適切な保存料を含む生理食塩水であることができる。
【０１４６】
一般に、皮膚試験で用いるポリペプチドは、反応期間の間注射部位に留まるように、十分な大きさである。いくつかの例では、少なくとも９個のアミノ酸の長さのポリペプチドが十分である。理論に束縛されずに、ポリペプチドは注射の数時間以内にマクロファージによって分解されて、Ｔ細胞への提示が可能となる。そのようなポリペプチドは、上記開示した配列および／または他の免疫原性もしくは非免疫原性配列のうちの１つまたは複数の反復を含有することができる。
【０１４７】
したがって、Ｔ細胞によるペプチドの認識の決定をｉｎ  ｖｉｖｏで測定することができる。いくつかの例では、ペプチドを個体に投与し、その後、ペプチドの認識を示す応答を測定し得る。一実施形態では、ペプチドを、典型的にはマントー試験に類似の様式で皮内投与する。ペプチドは表皮投与することができる。ペプチドは典型的には注射など針によって投与するが、弾道的などの他の方法、例えば核酸を送達するために使用されている弾道的技術によって投与することができる。公開ＥＰＣ出願ＥＰ−Ａ−０６９３１１９号は、ペプチドを投与するために典型的に使用することができる技術を記載している。いくつかの例では、０．００１〜１０００μｇ、例えば０．０１〜１００μｇまたは０．１〜１０μｇのペプチドを投与する。あるいは、ｉｎ  ｖｉｖｏでペプチドを提供することができる薬剤を投与することができる。したがって、ポリペプチドを発現することができるポリヌクレオチドを投与することができる。ポリヌクレオチドは、典型的には以下に記載するポリヌクレオチドの特徴のうちの任意のものを有する。ポリペプチドはポリヌクレオチドからｉｎ  ｖｉｖｏで発現され、ｉｎ  ｖｉｖｏでのペプチドの認識を測定し得る。典型的には、０．００１〜１０００μｇ、例えば０．０１〜１００μｇまたは０．１〜１０μｇのポリヌクレオチドを投与する。
【０１４８】
Ｍｔｂ感染を検出するための方法：確認試験、抗体の検出
別の態様では、上記開示したＣＤ８＋Ｔ細胞を使用する方法に加えて、対照と比較した、生物学的試料中（それだけには限定されないが、全血、痰、血清、血漿、唾液、または脳脊髄液など）のポリペプチド（複数可）に対する抗体の存在または非存在を決定するためのアッセイにおいて、１つまたは複数のポリペプチド（複数可）を用いた確認試験を行う。そのような抗体の存在はマイコバクテリア抗原に対する以前の感作を示し、これは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ感染、特に結核の指標であり得る。
【０１４９】
複数のポリペプチドを用いる実施形態では、ポリペプチドは相補的であることができ、１つの構成要素のポリペプチドが試料中の感染を検出し、感染は別の構成要素のポリペプチドによっては検出されない）。相補的ポリペプチドは、一般に、それぞれのポリペプチドを個々に使用して、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに感染していることが公知である一連の患者から得た血清試料を評価することによって、同定し得る。どの試料がそれぞれのポリペプチドで陽性として正しく同定されたかを決定した後、試験した試料のほとんどまたは全てで感染を検出することができる２つ以上のポリペプチドの組合せを配合し得る。相補的ポリペプチドは診断的試験の感度を改善させるために有用である。したがって、上述のＭｔｂポリペプチドのうちの複数をアッセイに含めることができる。Ｍｔｂ由来のさらなるポリペプチド（本明細書中に記載していないもの）を任意選択でアッセイに含めることができる。
【０１５０】
試料中の抗体を検出するために使用できる様々なアッセイ様式が存在する（例えば、本明細書中に参考として組み込まれているＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８年）を参照されたい）。一般に、患者におけるＭｔｂ感染の存在または非存在は、（ａ）患者から得た生物学的試料を１つまたは複数のＭｔｂポリペプチドと接触させること、（ｂ）試料中の、ポリペプチド（複数可）と結合する抗体の存在（または非存在）を検出すること、ならびに（ｃ）抗体のレベルを対照と比較すること、によって決定し得る。対照は、事前に決定されたカットオフ値などの標準の値であることができる。対照は、Ｍｔｂに感染していることが公知の被験体中の抗体の量、または、Ｍｔｂに感染していないことが公知の被験体中の、ポリペプチド（複数可）と特異的に結合する抗体の量であることができる。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、アッセイは固体担体上に固定したポリペプチドの使用を含む。目的のポリペプチド（複数可）と特異的に結合する抗体は、固体担体と結合する。その後、検出可能な標識が含まれる検出試薬を用いて結合した抗体を検出することができる。適切な検出試薬には抗体／ポリペプチドの複合体と結合する標識抗体が含まれる。また、適切な検出試薬には、抗体ポリペプチド複合体と結合する第２の標識されていない抗体および第２の抗体と特異的に結合する第３の抗体も含まれる。また、適切な検出試薬には、レポーター基で標識された結合していないポリペプチドも含まれる（半競合的アッセイなど）。
【０１５２】
あるいは、競合的アッセイを利用してもよく、レポーター基で標識した目的のポリペプチドと結合する抗体を試料と共にインキュベーションする。インキュベーション後、抗原を試料とインキュベーションした後に抗体を固定された抗原と結合させる。試料の構成要素が標識抗体と固定されたポリペプチドとの結合を阻害する程度が、試料と固定されたポリペプチドとの反応性の指標である。
【０１５３】
本明細書中に開示したアッセイで使用する固体担体は、抗原が付着し得る任意の固体材料であることができる。例えば、固体担体はマイクロタイタープレートの試験ウェルまたはニトロセルロースもしくは他の適切な膜であることができる。あるいは、固体担体は、ビーズまたはディスク、例えば、ガラス、ガラス繊維、ラテックスまたはポリスチレンもしくはポリ塩化ビニルなどのプラスチック材料であり得る。また、支持体は、例えば米国特許第５，３５９，６８１号に開示されているものなどの、磁気粒子または光ファイバーセンサーであることもできる。
【０１５４】
ポリペプチドは様々な技術を用いて固体担体と結合させることができる。ポリペプチドの結合は、吸着などの非共有会合、または抗原と支持体上の官能基との間の直接連結もしくは架橋結合剤を介した連結などの共有付着によって達成することができる。
【０１５５】
吸着による結合には、結合は、１つまたは複数のＭｔｂポリペプチド（複数可）（一般に緩衝液中）を固体担体と、適切な時間の間接触させることによって達成することができる。結合の接触時間は、典型的には約１時間〜１日である。一般に、結合は、ポリスチレンまたはポリ塩化ビニルの固体担体を、約１０ｎｇ〜約１μｇ、例えば約１００ｎｇの抗原の範囲の、一定量の１つまたは複数のＭｔｂポリペプチド（複数可）と接触させることによって達成する。
【０１５６】
目的のＭｔｂポリペプチド（複数可）と固体担体との共有付着は、一般に、支持体を、支持体とポリペプチド上のヒドロキシルまたはアミノ基などの官能基との両方と反応する二官能性試薬と反応させることによって達成することができる。例えば、Ｍｔｂポリペプチドは、ベンゾキノンを用いて、または支持体上のアルデヒド基とポリペプチド上のアミンおよび活性水素との縮合によって、適切なポリマーコーティングを有する支持体と結合させることができる（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃａｔａｌｏｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、Ａ１２〜Ａ１３頁、１９９１年）。
【０１５７】
特定の実施形態では、アッセイは酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）である。このアッセイは、最初に、目的のポリペプチドと特異的に結合する試料中に存在する抗体が固定されたポリペプチドと結合するような様式で、固体担体（マイクロタイタープレートのウェル中など）上に固定したポリペプチド抗原を試料と接触させることによって行うことができる。その後、結合していない試料を除去し、固定された抗体−ポリペプチドの複合体と結合することができる検出試薬を加える。具体的な検出試薬に適した方法を用いて、結合したままの検出試薬の量を決定する。例えば、検出方法は、蛍光または酵素活性の存在を検出することができる。
【０１５８】
一部の実施形態では、ポリペプチドを支持体上に固定する。典型的には、支持体上の残りのタンパク質結合部位は全て遮断する。任意の適切な遮断剤を用いて結合していないタンパク質結合部位を遮断することができ、例えば、ウシ血清アルブミンまたはＴＷＥＥＮ２０（商標）を用いることができる。その後、固定されたポリペプチドを試料と共にインキュベーションし、抗体を抗原と結合させる。インキュベーション前に試料を適切な希釈剤、例えばリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などの緩衝液で希釈することができる。一般に、適切な接触時間（インキュベーション時間）は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに感染した試料中の抗体の存在を検出するために十分な時間である。１つの具体的な非限定的な例では、接触時間は、結合した抗体および結合していない抗体の間の平衡で達成される結合レベルの少なくとも９５％を達成するために十分である。平衡に達するために必要な時間は、経時的に起こる結合レベルをアッセイすることによって決定することができる。室温では、約３０分間のインキュベーション時間が一般に十分である。
【０１５９】
その後、固体担体を０．１％のＴＷＥＥＮ２０（商標）を含有するＰＢＳなどの適切な緩衝液で洗浄することによって、結合していない試料を除去することができる。その後、検出試薬を固体担体に加えることができる。検出試薬は、固定された抗体−ポリペプチドの複合体と結合し、検出することができる任意の化合物であることができる。いくつかの実施形態では、検出試薬は標識とコンジュゲートした結合剤（例えば、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、免疫グロブリン、レクチンまたは遊離抗原など）を含有する。有用な標識には、酵素（西洋ワサビペルオキシダーゼなど）、基質、補因子、阻害剤、色素、放射性核種、発光性基、蛍光基およびビオチンが含まれる。結合剤と標識とのコンジュゲーションは当分野で公知の方法を用いて達成することができる。コンジュゲートした結合剤は市販されている（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆ．、およびＰｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．からのものなど）。
【０１６０】
検出試薬は、結合した抗体を検出するために十分な時間の間、固定された抗体−ポリペプチドの複合体と共にインキュベーションする。適切な時間は、一般に、製造者の指示から、または一定期間の間に起こる結合のレベルをアッセイすることによって決定し得る。その後、結合していない検出試薬を除去し、標識を用いて結合した検出試薬を検出する。放射性標識には、シンチレーション計数またはオートラジオグラフィー方法を検出に使用することができる。分光学的方法を使用して、標識として使用した色素、発光性基および蛍光基を検出し得る。ビオチンは、放射性標識、蛍光標識または酵素的標識などの様々な標識とカップリングさせたアビジンを用いて検出することができる。酵素的標識は、基質を加え（一般に特定の期間の間）、次いで反応生成物の分光学的または他の分析によって検出することができる。
【０１６１】
試料中の抗Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ抗体の存在または非存在を決定するために、固体担体と結合した標識から検出されたシグナルを一般に対照と比較する。一実施形態では、対照は、固定された抗原を感染していない患者からの試料と共にインキュベーションした場合に得られる平均シグナルなどの標準の値である。一般に、標準偏差が対照を２または３点超えるシグナルを生じる試料が、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ感染について陽性であるとみなされる。別の実施形態では、対照値はＳａｃｋｅｔｔら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｂａｓｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｌｉｔｔｌｅ  Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、１０６〜１０７頁（１９８５年）の方法による受信者動作曲線を用いて決定する。手短に述べると、本実施形態では、対照値は、診断的試験結果のそれぞれの可能な対照値に対応する、真陽性率（感度）および偽陽性率（１００％の特異性）の対のプロットから決定する。最大面積を囲むプロット上の対照値が最も正確なカットオフ値であり、この方法によって決定してカットオフ値よりも高いシグナルを生じる試料が陽性であるとみなされる。あるいは、カットオフ値をシフトして偽陽性率を最小限にし得る、または偽陰性率を最小限にし得る。一般に、この方法によって決定してカットオフ値よりも高いシグナルを生じる試料が結核について陽性であるとみなされる。
【０１６２】
関連実施形態では、急速流動または条片の試験様式でアッセイを行い、抗原を、それだけには限定されないがニトロセルロースなどの膜上に固定する。流動試験では、試料が膜を通過する際に試料内の抗体が固定されたポリペプチドと結合する。検出試薬を含有する溶液が膜を通って流れる際に検出試薬（例えばタンパク質Ａ−コロイド金）が抗体−ポリペプチドの複合体と結合する。結合した検出試薬の検出は上述のように行うことができる。
【０１６３】
条片試験様式の一例では、ポリペプチドが結合した膜の一端を、試料を含有する溶液に浸す。試料は膜に沿って検出試薬を含有する領域を通って固定されたポリペプチドの領域へと遊走する。ポリペプチドでの検出試薬の濃縮は、試料中の抗Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ抗体の存在を示す。典型的には、その部位での検出試薬の濃縮は、視覚的に読み取ることができる線などのパターンを生じる。そのようなパターンが存在しないことは陰性結果を示す。一般に、膜上に固定するポリペプチドの量は、生物学的試料が酵素連結免疫吸着（ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂａｎｔ）アッセイ（ＥＬＩＳＡ）において陽性シグナルを生じるために十分な抗体のレベルを含有する場合に、視覚的に識別可能なパターンが生じるように選択する。いくつかの実施形態では、膜上に固定するポリペプチドの量は、約２５ｎｇ〜約１μｇ、例えば約５０ｎｇ〜約５００ｎｇの範囲である。そのような試験は、典型的には非常に少ない体積の患者の血清または血液で行うことができる。
【０１６４】
Ｍｔｂ感染を検出するための方法：ポリヌクレオチドの検出の確認試験
別の態様では、上記開示したＣＤ８＋Ｔ細胞を使用する方法に加えて、生物学的試料中のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍポリペプチドをコードしているｍＲＮＡの存在、非存在、またはレベルを検出することによって、確認試験を行う。いくつかの例では、ノーザンブロットまたはドットブロットアッセイなどのハイブリダイゼーションアッセイを利用する。さらなる例では、ＰＣＲに基づくアッセイを利用する。
【０１６５】
ｍＲＮＡ抽出の一般方法は当分野で周知であり、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９７年）を含めた分子生物学の標準の教科書に開示されている。パラフィン包埋組織からＲＮＡを抽出する方法は、例えば、ＲｕｐｐおよびＬｏｃｋｅｒ、Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．、５６巻：Ａ６７頁（１９８７年）、ならびにＤｅ  Ａｎｄｒｅｓら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１８巻：４２０４４頁（１９９５年）に開示されている。特に、ＲＮＡ単離は、ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）などの商業的製造者からの精製キット、緩衝液セットおよびプロテアーゼを用いて、製造者の指示に従って行うことができる。例えば、培養細胞（被験体から得たものなど）からの全ＲＮＡを、ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ＲＮｅａｓｙミニカラムを用いて単離することができる。他の市販のＲＮＡ単離キットにはＭＡＳＴＥＲＰＵＲＥ（登録商標）、完全ＤＮＡおよびＲＮＡ精製キット（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）、Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、ならびにパラフィンブロックＲＮＡ単離キット（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．）が含まれる。組織試料からの全ＲＮＡはＲＮＡ  Ｓｔａｔ−６０（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ）を用いて単離することができる。生物学的試料から調製したＲＮＡは、例えば塩化セシウム密度勾配遠心分離によって単離することができる。
【０１６６】
ｍＲＮＡを定量する方法は当分野で周知である。一例では、この方法は逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を利用する。一般に、ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現プロファイリングの最初のステップはＲＮＡ鋳型をｃＤＮＡへと逆転写することであり、次いでＰＣＲ反応においてそれを指数関数的に増幅させる。２つの最も一般的に使用される逆転写酵素は、トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴ）およびモロニーネズミ白血病ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴ）である。逆転写ステップは、発現プロファイリングの状況および目的に応じて、典型的には特異的プライマー、ランダム六量体、またはオリゴ−ｄＴプライマーを用いて刺激する。例えば、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＲＮＡ  ＰＣＲキット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）を用いて、製造者の指示に従って抽出したＲＮＡを、逆転写することができる。その後、誘導したｃＤＮＡを続くＰＣＲ反応で鋳型として使用することができる。
【０１６７】
ＰＣＲステップでは様々な熱安定性のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用することができるが、典型的には、５’−３’ヌクレアーゼ活性を有するが３’−５’校正エンドヌクレアーゼ活性を欠くＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いる。したがって、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲでは、典型的には、ＴａｑまたはＴｔｈポリメラーゼの５’−ヌクレアーゼ活性を利用して、その標的単位複製配列と結合したハイブリダイゼーションプローブを加水分解するが、等価な５’ヌクレアーゼ活性を有する任意の酵素を使用することができる。２つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲ反応に典型的な単位複製配列を作製する。２つのＰＣＲプライマーの間に位置するヌクレオチド配列を検出するために、第３のオリゴヌクレオチドまたはプローブを設計する。プローブはＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ酵素によって伸長不可能であり、レポーター蛍光色素および消光蛍光色素で標識されている。２つの色素がプローブ上でそうであるように近くに位置する場合に、レポーター色素からの全てのレーザー誘導発光は消光色素によって消光される。増幅反応中、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ酵素はプローブを鋳型依存性の様式で切断する。生じるプローブ断片は溶液中で解離し、放出されたレポーター色素からのシグナルは第２のフルオロフォアの消光効果を受けない。合成されるそれぞれの新しい分子についてレポーター色素の１つの分子が遊離し、消光されていないレポーター色素の検出により、データの定量的解釈の基礎がもたらされる。
【０１６８】
ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ＲＴ−ＰＣＲは、例えば、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００（登録商標）配列検出システム（商標）（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）、またはＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）などの市販の装置を用いて行うことができる。一実施形態では、５’ヌクレアーゼ手順はＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００（登録商標）配列検出システム（登録商標）などのリアルタイム定量的ＰＣＲ装置上で実行する。このシステムには、熱サイクラー、レーザー、電荷結合素子（ＣＣＤ）、カメラおよびコンピュータが含まれる。このシステムは、９６ウェル様式中、熱サイクラー上で試料を増幅する。増幅中、レーザー誘導蛍光シグナルを光ファイバーケーブルによって９６個のウェル全てからリアルタイムで収集し、ＣＣＤで検出する。このシステムには、装置を実行し、データを分析するためのソフトウェアが含まれる。
【０１６９】
一部の例では、５’−ヌクレアーゼアッセイのデータは、当初はＣｔ、すなわち閾値サイクルとして表す。上述のように、蛍光値を各サイクル中に記録し、増幅反応のその時点までに増幅された生成物の量を表す。蛍光シグナルが統計的に有意であるとして最初に記録される点が閾値サイクル（Ｃｔ）である。
【０１７０】
誤差および試料間のばらつきの効果を最小限にするために、内部標準を用いてＲＴ−ＰＣＲを行うことができる。理想的な内部標準は様々な組織間にわたって一定レベルで発現され、実験的処置によって影響を受けない。遺伝子発現のパターンを正規化するために最も頻繁に使用されるＲＮＡは、ハウスキーピング遺伝子グリセルアルデヒド−３−ホスフェート−デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、ベータ−アクチン、および１８ＳリボソームＲＮＡのｍＲＮＡである。
【０１７１】
ＲＴ−ＰＣＲ技術のより最近の変化はリアルタイム定量的ＰＣＲであり、これは、ＰＣＲ産物の蓄積を、二重標識した蛍光発生（ｆｌｕｏｒｉｇｅｎｉｃ）プローブ（すなわちＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブ）を介して測定する。リアルタイムＰＣＲは、それぞれの標的配列の内部競合相手を正規化に使用する定量的競合的ＰＣＲとも、試料内に含有される正規化遺伝子またはＲＴ−ＰＣＲのハウスキーピング遺伝子を用いた定量的比較ＰＣＲとも適合性がある（Ｈｅｌｄら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、６巻：９８６〜９９４頁、１９９６年を参照）。また、定量的ＰＣＲは、その開示が本明細書中に参考として組み込まれている米国特許第５，５３８，８４８号にも記載されている。関連するプローブおよび定量的増幅手順は、その開示が本明細書中に参考として組み込まれている米国特許第５，７１６，７８４号および米国特許第５，７２３，５９１号に記載されている。マイクロタイタープレートで定量的ＰＣＲを実施するための機器は、ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、８５０  Ｌｉｎｃｏｌｎ  Ｃｅｎｔｒｅ  Ｄｒｉｖｅ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．９４４０４から、商標ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００の下で入手可能である。
【０１７２】
ｍＲＮＡの単離、精製、プライマーの伸長および増幅を含めた、固定したパラフィン包埋組織をＲＮＡ源として使用する、遺伝子発現を定量するための代表的なプロトコールのステップは、様々な公開学術論文中に示されている（Ｇｏｄｆｒｅｙら、Ｊ．  Ｍｏｌｅｃ．  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、２巻：８４〜９１頁、２０００年、Ｋ．  Ｓｐｅｃｈｔら、Ａｍ．  Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ．、１５８巻：４１９〜２９頁、２００１年を参照）。手短に述べると、代表的なプロセスは、パラフィン包埋組織試料の厚さ約１０μｍの切片を切断することから始まる。その後、ＲＮＡを抽出し、タンパク質およびＤＮＡを除去する。ＲＮＡ濃度を分析した後、必要な場合はＲＮＡ修復および／または増幅のステップを含めることができ、遺伝子特異的プロモーターを用いてＲＮＡを逆転写し、次いでＲＴ−ＰＣＲを行う。
【０１７３】
代替の定量的核酸増幅手順が、本明細書中に参考として組み込まれている米国特許第５，２１９，７２７号に記載されている。この手順では、標的配列および内部標準の核酸セグメントを同時に増幅することによって試料中の標的配列の量を決定する。それぞれのセグメントからの増幅されたＤＮＡの量を決定し、検量線と比較しして、増幅前に試料中に存在していた標的核酸セグメントの量を決定する。
【０１７４】
本方法の一部の実施形態では、「ハウスキーピング」遺伝子の発現または「内部対照」も評価することができる。これらの用語には、その存在がサイトカインのｍＲＮＡレベルの評価を可能にする、任意の構成的または全体的に発現される遺伝子が含まれることを意味する。そのような評価は、遺伝子転写の全体的な構成的レベルの決定およびＲＮＡ回収の変動の制御を含む。
【０１７５】
感染症の進行および／または治療の有効性の監視
いくつかの実施形態では、本明細書中に開示した診断方法を用いて、小児、またはＬＴＢＩに罹患している被験体などにおけるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ感染の進行を監視する。本実施形態では、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ感染を診断するための上述のアッセイを経時的に行ってもよく、ＣＤ８＋Ｔ細胞の反応性の変化を測定する。例えば、アッセイは、約１２、２４、３６、４８、６０または７２時間ごとに、指定した期間、例えば数カ月または数週間にわたって行い、その後、必要に応じて行うことができる。
【０１７６】
一般に、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ感染は、ＩＦＮ−γなどのサイトカインの発現を用いて検出されるものなどのＣＤ８＋Ｔ細胞の反応性が経時的に増加する患者において進行している。対照的に、ＣＤ８＋Ｔ細胞の反応性が一定に保たれるまたは経時的に減少する場合は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ感染は進行していない。このようにして、小児またはＬＴＢＩに罹患している被験体などにおいて、特定の治療レジメンの有効性を評価することができる。
【０１７７】
一実施形態では、Ｍｔｂポリペプチドを特異的に認識するＣＤ８＋Ｔ細胞および／またはＣＤ４＋Ｔ細胞などのＴ細胞の存在を、小児などの被験体で評価する。被験体に治療的プロトコールを投与する。その後、Ｍｔｂポリペプチドを特異的に認識するＴ細胞の存在を評価する。治療的プロトコールを投与する前のＭｔｂポリペプチドを特異的に認識するＣＤ８＋Ｔ細胞の量と比較した、Ｍｔｂポリペプチドを特異的に認識するＣＤ８＋Ｔ細胞の量の減少または変化がないことは、それぞれ、治療的プロトコールが有効でないことを示す。治療的プロトコールを投与する前のＭｔｂポリペプチドを特異的に認識するＣＤ８＋Ｔ細胞の量と比較した、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＭｔｂポリペプチドを特異的に認識するものの量の増加は、治療的プロトコールが有効であることを示す。ＣＤ４＋細胞も測定することができる。
【０１７８】
上述のアッセイのうちの任意のものについて、感度を改善させるために、複数のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍマーカーを所定の試料内でアッセイし得ることに注意されたい。本明細書中に開示したアッセイは組み合わせて使用できることが明らかであろう。したがって、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍポリペプチドの組、およびアッセイの組合せが、最適な感度および特異性のためとなる場合がある。
【０１７９】
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍポリペプチド
いくつかのＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍポリペプチドを用いてＴ細胞応答などのＭｔｂに対する免疫応答を誘導できることが、本明細書中に開示されている。Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍポリペプチドを、ＭｔｂなどのＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに感染した被験体を同定するための診断的アッセイに使用することができる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、以下として記載したアミノ酸配列を含むまたはそれからなる：
【０１８０】
【化２】
2012503206.tif 000004
（配列番号１、式中、Ｘ１はＡまたはＴであり、Ｘ２はＴまたはＡであり、Ｘ３は任意のアミノ酸、例えばＱまたはアミノ酸なしである）  。
【０１８１】
いくつかの例では、ポリペプチドは、以下として記載したアミノ酸配列を含む、それから本質的になるまたはそれからなる：
【０１８２】
【化３】
2012503206.tif 000005
（配列番号２）（本明細書中に参考として組み込まれている、２００７年３月１日に入手可能なＴＵＢＥＲＣＵＬＩＳＴ番号Ｒｖ１０３８ｃも参照、ＥｓｘＪ、ＥＳ６＿２、ＴＢ１１．０、ＱＩＬＳＳとして公知）
【０１８３】
【化４】
2012503206.tif 000006
（配列番号３、本明細書中に参考として組み込まれている、２００７年３月１日に入手可能なＴＵＢＥＲＣＵＬＩＳＴ番号Ｒｖ１１９７、ＥｓｘＫ、ＥＳ６＿３、ＴＢ１１．０、ＱＩＬＳＳとしても公知）
【０１８４】
【化５】
2012503206.tif 000007
（配列番号４、本明細書中に参考として組み込まれている、２００７年３月１日に入手可能なＴＵＢＥＲＣＵＬＩＳＴ番号Ｒｖ１９９２、ＥｓｘＭ、ＴＢ１１．０、ＱＩＬＳＳとして公知。
【０１８５】
【化６】
2012503206.tif 000008
（配列番号５、本明細書中に参考として組み込まれている、２００７年３月１日に入手可能なＴＵＢＥＲＣＵＬＩＳＴ番号Ｒｖ２３４７ｃ、ＥｓｘＰ、ＥＳ６＿７、ＱＩＬＳＳとしても公知）
【０１８６】
【化７】
2012503206.tif 000009
（配列番号６、本明細書中に参考として組み込まれている、２００７年３月１日に入手可能なＴＵＢＥＲＣＵＬＩＳＴ番号Ｒｖ３６２０ｃ、ＥｓｘＷ、ＥＳ６＿１０、ＱＩＬＳＳとしても公知）。
【０１８７】
さらなる実施形態では、ポリペプチドは、以下として記載したアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる：
【０１８８】
【化８】
2012503206.tif 000010
（配列番号７、本明細書中に参考として組み込まれている、２００７年３月１日に入手可能なＴＵＢＥＲＣＵＬＩＳＴ番号Ｒｖ１０８８、ＰＥ９としても公知）。
【０１８９】
【化９−１】
2012503206.tif 000011
【０１９０】
【化９−２】
2012503206.tif 000012
（配列番号８、本明細書中に参考として組み込まれている、２００７年３月１日に入手可能なＴＵＢＥＲＣＵＬＩＳＴ番号Ｒｖ２４８７、ＰＥ＿ＰＧＲＳ４２としても公知）
【０１９１】
【化１０】
2012503206.tif 000013
（配列番号９、本明細書中に参考として組み込まれている、２００７年３月１日に入手可能なＴＵＢＥＲＣＵＬＩＳＴ番号Ｒｖ１８６０、Ａｐａ、ｍｏｄＤ、ｍｐｔ３２としても公知）
【０１９２】
【化１１】
2012503206.tif 000014
（配列番号１０、本明細書中に参考として組み込まれている、２００７年３月１日に入手可能なＴＵＢＥＲＣＵＬＩＳＴ番号Ｒｖ１２７３ｃ）。
【０１９３】
【化１２】
2012503206.tif 000015
（配列番号１１、本明細書中に参考として組み込まれている、２００７年３月１日に入手可能なＴＵＢＥＲＣＵＬＩＳＴ番号Ｒｖ０１５９ｃ、ＰＥ３またはＰＥとしても公知）。
【０１９４】
【化１３−１】
2012503206.tif 000016
【０１９５】
【化１３−２】
2012503206.tif 000017
【０１９６】
【化１３−３】
2012503206.tif 000018
（配列番号１２、本明細書中に参考として組み込まれている、２００７年３月１日に入手可能なＴＵＢＥＲＣＵＬＩＳＴ番号３３５０ｃ、ＰＰＥ５６またはＰＰＥとしても公知。
【０１９７】
さらなる実施形態では、Ｍｔｂポリペプチドは、ＥＳＡＴ−６を含む、それから本質的になる、またはそれからなる：
ＭＴＥＱＱＷＮＦＡＧＩＥＡＡＡＳＡＩＱＧＮＶＴＳＩＨＳＬＬＤＥＧＫＱＳＬＴＫＬＡＡＷＧＧＧＳＧＳＥＡＹＱＧＶＱＱＫＷＤＡＴＡＴＥＬＮＮＡＬＱＮＬＡＲＴＩＳＥＡＧＱＡＭＡＳＴＥＧＮＶＴＧＭＦＡ
（配列番号３９）。
【０１９８】
有用なペプチド：
ＭＴＥＱＱＷＮＦＡＧＩＥＡＡＡ            配列番号４０
ＱＷＮＦＡＧＩＥＡＡＡＳＡＩＱ            配列番号４１
ＡＧＩＥＡＡＡＳＡＩＱＧＮＶＴ            配列番号４２
ＡＡＡＳＡＩＱＧＮＶＴＳＩＨＳ            配列番号４３
ＡＩＱＧＮＶＴＳＩＨＳＬＬＤＥ            配列番号４４
ＮＶＴＳＩＨＳＬＬＤＥＧＫＱＳ            配列番号４５
ＩＨＳＬＬＤＥＧＫＱＳＬＴＫＬ            配列番号４６
ＬＤＥＧＫＱＳＬＴＫＬＡＡＡＷＧ          配列番号４７
ＫＱＳＬＴＫＬＡＡＡＷＧＧＳＧ            配列番号４８
ＴＫＬＡＡＡＷＧＧＳＧＳＥＡＹ            配列番号４９
ＡＡＷＧＧＳＧＳＥＡＹＱＧＶＱ            配列番号５０
ＧＳＧＳＥＡＹＱＧＶＱＱＫＷＤ            配列番号５１
ＥＡＹＱＧＶＱＱＫＷＤＡＴＡＴ            配列番号５２
ＧＶＱＱＫＷＤＡＴＡＴＥＬＮＮ            配列番号５３
ＫＷＤＡＴＡＴＥＬＮＮＡＬＱＮ            配列番号５４
ＴＡＴＥＬＮＮＡＬＱＮＬＡＲＴ            配列番号５５
ＬＮＮＡＬＱＮＬＡＲＴＩＳＥＡ            配列番号５６
ＬＱＮＬＡＲＴＩＳＥＡＧＱＡＭ            配列番号５７
ＡＲＴＩＳＥＡＧＱＡＭＡＳＴＥ            配列番号５８
ＳＥＡＧＱＡＭＡＳＴＥＧＮＶＴ            配列番号５９
ＱＡＭＡＳＴＥＧＮＶＴＧＭＦＡ            配列番号６０  。
【０１９９】
他の実施形態では、Ｍｔｂポリペプチドは、ＣＦＰ−１０を含む、それから本質的になる、またはそれからなる：
ＭＡＥＭＫＴＤＡＡＴＬＡＱＥＡＧＮＦＥＲＩＳＧＤＬＫＴＱＩＤＱＶＥＳＴＡＧＳＬＱＧＱＷＲＧＡＡＧＴＡＡＱＡＡＶＶＲＦＱＥＡＡＮＫＱＫＱＥＬＤＥＩＳＴＮＩＲＱＡＧＶＱＹＳＲＡＤＥＥＱＱＱＡＬＳＳＱＭＧ
（配列番号６１）。
【０２００】
有用なペプチド：
ＭＡＥＭＫＴＤＡＡＴＬＡＱＥＡ            配列番号６２
ＫＴＤＡＡＴＬＡＱＥＡＧＮＦＥ            配列番号６３
ＡＴＬＡＱＥＡＧＮＦＥＲＩＳＧ            配列番号６４
ＱＥＡＧＮＦＥＲＩＳＧＤＬＫＴ            配列番号６５
ＮＦＥＲＩＳＧＤＬＫＴＱＩＤＱ            配列番号６６
ＩＳＧＤＬＫＴＱＩＤＱＶＥＳＴ            配列番号６７
ＬＫＴＱＩＤＱＶＥＳＴＡＧＳＬ            配列番号６８
ＩＤＱＶＥＳＴＡＧＳＬＱＧＱＷ            配列番号６９
ＥＳＴＡＧＳＬＱＧＱＷＲＧＡＡ            配列番号７０
ＧＳＬＱＧＱＷＲＧＡＡＧＴＡＡ            配列番号７１
ＧＱＷＲＧＡＡＧＴＡＡＱＡＡＶ            配列番号７２
ＧＡＡＧＴＡＡＱＡＡＶＶＲＦＱ            配列番号７３
ＴＡＡＱＡＡＶＶＲＦＱＥＡＡＮ            配列番号７４
ＡＡＶＶＲＦＱＥＡＡＮＫＱＫＱ            配列番号７５
ＲＦＱＥＡＡＮＫＱＫＱＥＬＤＥ            配列番号７６
ＡＡＮＫＱＫＱＥＬＤＥＩＳＴＮ            配列番号７７
ＱＫＱＥＬＤＥＩＳＴＮＩＲＱＡ            配列番号７８
ＬＤＥＩＳＴＮＩＲＱＡＧＶＱＹ            配列番号７９
ＳＴＮＩＲＱＡＧＶＱＹＳＲＡＤ            配列番号８０
ＲＱＡＧＶＱＹＳＲＡＤＥＥＱＱ            配列番号８１
ＶＱＹＳＲＡＤＥＥＱＱＱＡＬＳ            配列番号８２
ＲＡＤＥＥＱＱＱＡＬＳＳＱＭＧ            配列番号８３  。
【０２０１】
有用なさらなるＭｔｂポリペプチドは、その全体が本明細書中に参考として組み込まれている米国公開特許出願第２００５／０２０８５９４号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００５／０９０９９８８号、米国公開特許出願第２００３／０１４７８９７号、米国公開特許出願第２００４／０１１５１２１１号、米国公開特許出願第２００５／０２７２１０４号、米国公開特許出願第２００６／００２４３３２号、米国公開特許出願第２００６／０１１５８４７号、米国公開特許出願第２００７／０００９５４７号、米国公開特許出願第２００７／０１８４０７３に開示されている。複数のＭｔｂポリペプチドを使用することができる。いくつかの実施形態では、ＥＳＡＴ−６（配列番号３９）および／またはＣＦＰ−１０（配列番号６１）を本明細書中に開示した方法で利用する。
【０２０２】
別の実施形態では、本明細書中に開示した方法で有用なＭｔｂポリペプチドは、配列番号１〜１２または３９〜８３のうちの１つに記載の１つのアミノ酸配列に少なくとも７５％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％相同的な配列を有する。例えば、ポリペプチドは、配列番号１〜１２または３９〜８３に記載のアミノ酸配列のうちの１つと少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％相同的なアミノ酸配列を有することができる。例示的な配列は、インターネットで容易に入手可能なコンピュータプログラムおよび本明細書中に記載のアミノ酸配列を用いて得ることができる。一例では、ポリペプチドは、Ｍｔｂエピトープと特異的に結合する抗体との結合などの、Ｍｔｂタンパク質の機能を保持する。
【０２０３】
Ｍｔｂポリペプチドの一次アミノ酸配列の軽微な修飾は、本明細書中に記載の修飾していない対応物ポリペプチドと比較して、実質的に等価な活性を有するペプチドをもたらし得る。そのような修飾は、部位特異的突然変異誘発によるものなどの計画的なものであってよく、または自発的なものであってもよい。これらの修飾によって生成される全てのポリペプチドが本明細書中に含まれる。したがって、Ｍｔｂポリペプチドの具体的な非限定的な例はＭｔｂポリペプチドの保存的変異体である。保存的置換の表を本明細書中に提供する。配列番号１〜１２および３９〜８３に示すアミノ酸配列の置換をこの表に基づいて行うことができる。いくつかの実施形態では、最大で１個、最大で２個、最大で３個、最大で４個、または最大で５個の保存的置換をＭｔｂポリペプチド内に導入する。
【０２０４】
Ｍｔｂに対する免疫応答を検出するために使用できるＭｔｂポリペプチドを本明細書中に開示する。これらのペプチドには、上述のＭｔｂポリペプチドの少なくとも９個のアミノ酸、例えば９〜２０個のアミノ酸の連続したアミノ酸が含まれる、またはそれからなる。具体的な非限定的な例は、上述のＭｔｂポリペプチドのうちの１つの１２、１１、１０個のアミノ酸、または９個の連続したアミノ酸である。これらの例では、Ｍｔｂポリペプチドには、配列番号１〜１２、配列番号３９および／または配列番号６１として記載した完全長アミノ酸配列は含まれない。
【０２０５】
Ｍｔｂポリペプチドからの９〜１２個の連続したアミノ酸が含まれる単離したポリペプチドを開示し、単離したポリペプチドは、ＱＴＶＥＤＥＡＲＲＭＷ（配列番号１３）として記載したアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは９、１０または１１個のアミノ酸の長さである。さらなる実施形態では、ポリペプチドは配列番号１３として記載したアミノ酸配列からなる。Ｍｔｂポリペプチドからの９〜１２個の連続したアミノ酸が含まれる単離したポリペプチドを開示し、単離したポリペプチドは、ＶＳＡＡＩＡＧＬＦ（配列番号１４）として記載したアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは９、１０または１１個のアミノ酸の長さである。さらなる実施形態では、ポリペプチドは配列番号１４として記載したアミノ酸配列からなる。
【０２０６】
さらなる実施形態では、ポリペプチドは９〜１２個の連続したアミノ酸の長さであり、配列番号４０〜６０または配列番号６５〜８３として記載したアミノ酸配列のうちの１つを含む、それから本質的になる、またはそれからなる。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、単離したＭｔｂポリペプチドは融合タンパク質中に含まれる。したがって、融合タンパク質には、Ｍｔｂポリペプチド（上記参照）および第２の異種部分、例えば、Ｍｔｂポリペプチドと共有結合したｍｙｃ  タンパク質、酵素または担体（肝炎担体タンパク質もしくはウシ血清アルブミンなど）が含まれることができる。いくつかの例では、ＭＨＣクラスＩと結合する配列番号１〜１４、配列番号３９もしくは配列番号６１として記載したアミノ酸配列のうちの１つの９〜１２個のアミノ酸からなるポリペプチドを、担体と共有結合させる。さらなる例では、配列番号１〜１４のうちの１つとして記載したアミノ酸配列のうちの１つからなる、または配列番号４０〜６０もしくは６５〜８３として記載したアミノ酸配列のうちの１つからなるポリペプチドを、担体と共有結合させる。
【０２０８】
さらなる例では、ポリペプチドは融合タンパク質であることができ、Ｍｔｂに対する異種配列（配列番号１に含まれない少なくとも９個のアミノ酸の長さのアミノ酸配列など）が含まれることもできる。したがって、いくつかの具体的な非限定的な例では、免疫原性ペプチドは融合ポリペプチドである、例えば、ポリペプチドには６個の連続したヒスチジン残基、β−ガラクトシダーゼアミノ酸配列、または免疫グロブリンアミノ酸配列が含まれる。また、ポリペプチドは担体と共有結合させることもできる。さらなる実施形態では、タンパク質はＭｔｂポリペプチドからなる。
【０２０９】
ポリペプチドには、本明細書中に開示したＭｔｂポリペプチドのうちの１つまたは複数の反復が任意選択で含まれる場合がある。１つの具体的な非限定的な例では、ポリペプチドには、上述のＭｔｂポリペプチドのうちの１つの２、３、４、５、または１０個までの反復が含まれる。あるいは、複数のポリペプチドを融合ポリペプチドに含めることができる。したがって、いくつかの例では、ポリペプチドには、配列番号１〜１４および／または配列番号３９〜８３として記載したアミノ酸配列のうちの少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５または少なくとも６個が含まれることができる。Ｍｔｂポリペプチドの間にリンカー配列を任意選択で含めることができる。
【０２１０】
本明細書中に開示したＭｔｂポリペプチドは、標準の方法によって化学合成できるか、または組換えによって産生することができる。ポリペプチド産生の例示的なプロセスはＬｕら、Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ．、４２９巻：３１〜３５頁、１９９８年に記載されている。また、これらは調製用クロマトグラフィーおよび免疫学的分離を含めた方法によって単離することもできる。
【０２１１】
所望する場合は、ポリペプチドを新生技術によって化学合成することもできる。１つのそのようなプロセスはＷ．  Ｌｕら、Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ．、４２９巻：３１〜３５頁、１９９８年に記載されている。また、ポリペプチドは、分子遺伝学技術を用いて、例えば、Ｍｔｂまたはそのエピトープをコードしている核酸を発現ベクター内に挿入し、発現ベクターを宿主細胞内に導入し、ポリペプチドを単離することによっても産生することができる（以下参照）。
【０２１２】
本明細書中に開示したＭｔｂポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドも提供する。例示的な核酸配列を以下に記載する：
ＥＳＸＪ（ＥＳＡＴ−６様タンパク質２）
【０２１３】
【化１４】
2012503206.tif 000019
（配列番号１５）
ＥＳＸＫ（ＥＳＡＴ−６様タンパク質３）
【０２１４】
【化１５】
2012503206.tif 000020
（配列番号１６）
ＥＳＸＭ（ＥＳＡＴ−６様タンパク質ＥＳＸＭ）
【０２１５】
【化１６】
2012503206.tif 000021
（配列番号１７）
ＥＳＸＰ（ＥＳＡＴ−６様タンパク質７）
【０２１６】
【化１７】
2012503206.tif 000022
（配列番号１８）
ＥＳＸＷ（ＥＳＡＴ−６様タンパク質１０）
【０２１７】
【化１８】
2012503206.tif 000023
（配列番号１９）
ＰＥ９（ＰＥファミリータンパク質）
【０２１８】
【化１９】
2012503206.tif 000024
（配列番号２０）
ＰＥ＿ＰＧＲＳ４２（ＰＥ−ＰＧＲＳファミリータンパク質）
【０２１９】
【化２０−１】
2012503206.tif 000025
【０２２０】
【化２０−２】
2012503206.tif 000026
（配列番号２１）
Ｒｖ１８６０（フィブロネクチン付着タンパク質）
【０２２１】
【化２１】
2012503206.tif 000027
（配列番号２２）
Ｒｖ１２７３ｃ（可能性のある薬物輸送膜貫通ＡＴＰ結合タンパク質ＡＢＣトランスポーター）
【０２２２】
【化２２−１】
2012503206.tif 000028
【０２２３】
【化２２−２】
2012503206.tif 000029
（配列番号２３）
Ｒｖ０１５９ｃ（ＰＥファミリータンパク質）
【０２２４】
【化２３】
2012503206.tif 000030
（配列番号２４）
Ｒｖ３３５０ｃ（ＰＰＥファミリータンパク質）
【０２２５】
【化２４−１】
2012503206.tif 000031
【０２２６】
【化２４−２】
2012503206.tif 000032
【０２２７】
【化２４−３】
2012503206.tif 000033
【０２２８】
【化２４−４】
2012503206.tif 000034
【０２２９】
【化２４−５】
2012503206.tif 000035
（配列番号２５）
これらのポリヌクレオチドには、目的のポリペプチドをコードしているＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびＲＮＡ配列が含まれる。コード配列中のサイレント突然変異は遺伝暗号の縮重（すなわち冗長）から生じ、複数のコドンが同じアミノ酸残基をコードしている場合がある。したがって、例えば、ロイシンはＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡ、ＣＴＧ、ＴＴＡ、またはＴＴＧによってコードされることができ、セリンはＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴ、またはＡＧＣによってコードされることができ、アスパラギンはＡＡＴまたはＡＡＣによってコードされることができ、アスパラギン酸はＧＡＴまたはＧＡＣによってコードされることができ、システインはＴＧＴまたはＴＧＣによってコードされることができ、アラニンはＧＣＴ、ＧＣＣ、ＧＣＡ、またはＧＣＧによってコードされることができ、グルタミンはＣＡＡまたはＣＡＧによってコードされることができ、チロシンはＴＡＴまたはＴＡＣによってコードされることができ、イソロイシンはＡＴＴ、ＡＴＣ、またはＡＴＡによってコードされることができる。標準の遺伝暗号を示す表は様々な提供源に見つけることができる（例えば、Ｌ．  Ｓｔｒｙｅｒ、１９８８年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３版、Ｗ．Ｈ．  ５  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、ＮＹ）。
【０２３０】
Ｍｔｂポリペプチドをコードしている核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写に基づく増幅系（ＴＡＳ）、自立配列複製系（３ＳＲ）およびＱβレプリカーゼ増幅系（ＱＢ）などのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法によってクローニングまたは増幅することができる。例えば、タンパク質をコードしているポリヌクレオチドは、分子のＤＮＡ配列に基づくプライマーを用いたｃＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応によって単離することができる。広範なクローニングおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ増幅方法が当業者に周知である。ＰＣＲ方法は、例えば、米国特許第４，６８３，１９５号、Ｍｕｌｌｉｓら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．  Ｑｕａｎｔ．  Ｂｉｏｌ．、５１巻：２６３頁、１９８７年、およびＥｒｌｉｃｈ編、ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、１９８９年）に記載されている。また、ポリヌクレオチドは、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーを、所望のポリヌクレオチドの配列から選択されたプローブを用いて、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でスクリーニングすることによっても単離することができる。
【０２３１】
Ｍｔｂポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドには、ベクター内で自己複製するプラスミドもしくはウイルスまたは原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡ内に組み込まれる、あるいは他の配列とは独立した別の分子（ｃＤＮＡなど）として存在する、組換えＤＮＡが含まれる。本発明のヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはいずれかのヌクレオチドの修飾された型であることができる。この用語にはＤＮＡの一本鎖および二本鎖の形態が含まれる。
【０２３２】
一実施形態では、ベクターは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓなどの酵母中での発現に使用する。構成的プロモーター形質膜Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅ（ＰＭＡ１）、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ＰＧＫ１）、アルコール脱水素酵素−１（ＡＤＨ１）、および多面発現薬剤耐性ポンプ（ＰＤＲ５）などのいくつかのプロモーターは、酵母発現系において有用であることが公知である。さらに、ＧＡＬ１−１０（ガラクトースによって誘導される）、ＰＨＯ５（低い細胞外無機ホスフェートによって誘導される）、およびタンデム熱ショックＨＳＥエレメント（３７℃までの温度上昇によって誘導される）などの多くの誘導性プロモーターが有用である。滴定可能な誘導因子に応答して可変性の発現を指示するプロモーターには、メチオニン応答性のＭＥＴ３およびＭＥＴ２５プロモーターならびに銅依存性ＣＵＰ１プロモーターが含まれる。これらのプロモーターのうちの任意のものを複数コピー（２μ）または単一コピー（ＣＥＮ）のプラスミド内にクローニングして、発現レベルにさらなる制御レベルを与え得る。プラスミドには、酵母中での選択のための栄養マーカー（ＵＲＡ３、ＡＤＥ３、ＨＩＳ１など）ならびに細菌中での増殖のための抗生物質耐性（ＡＭＰ）を含めることができる。ｐＫＬＡＣ１などの、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ上で発現させるためのプラスミドは公知である。したがって、一例では、細菌中で増殖させた後、細菌形質転換に類似の方法によってプラスミドを対応する酵母栄養要求体内に導入することができる。
【０２３３】
Ｍｔｂポリペプチドは様々な酵母株中で発現させることができる。例えば、７つの多面発現薬剤耐性トランスポーター、ＹＯＲ１、ＳＮＱ２、ＰＤＲ５、ＹＣＦ１、ＰＤＲ１０、ＰＤＲ１１、およびＰＤＲ１５を、その活性化転写因子、ＰＤＲ１およびＰＤＲ３と一緒に、酵母宿主細胞中で同時に欠失させ、生じる株は薬物に感受性となる。エルゴステロール生合成を欠くｅｒｇ６突然変異体などの、形質膜の脂質組成が改変された酵母株を利用することもできる。タンパク質分解に対する感受性が高いタンパク質は、他の液胞加水分解酵素の活性化を制御する、主要液胞エンドペプチダーゼＰｅｐ４を欠く酵母中で発現させることができる。対応するヌル突然変異体が生存不能である場合は、温度感受性（ｔｓ）対立遺伝子を保有する株における異種発現を用いることができる。
【０２３４】
また、本明細書中に開示したＭｔｂポリペプチドをコードしているウイルスベクターを調製することもできる。ポリオーマ、ＳＶ４０（Ｍａｄｚａｋら、１９９２年、Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．、７３巻：１５３３〜１５３６頁）、アデノウイルス（Ｂｅｒｋｎｅｒ、１９９２年、Ｃｕｒ．  Ｔｏｐ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５８巻：３９〜６頁、Ｂｅｒｌｉｎｅｒら、１９８８年、Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６巻：６１６〜６２９頁、Ｇｏｒｚｉｇｌｉａら、１９９２年、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、６６巻：４４０７〜４４１２頁、Ｑｕａｎｔｉｎら、１９９２年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｄ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８９巻：２５８１〜２５８４頁、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９２年、Ｃｅｌｌ、６８巻：１４３〜１５５頁、Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎら、１９９２年、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２０巻：２２３３〜２２３９頁、Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔら、１９９０年、Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、１巻：２４１〜２５６頁）、ワクシニアウイルス（Ｍａｃｋｅｔｔら、１９９２年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２４巻：４９５〜４９９頁）、アデノ関連ウイルス（Ｍｕｚｙｃｚｋａ、１９９２年、Ｃｕｒｒ．  Ｔｏｐ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５８巻：９１〜１２３頁、Ｏｎら、１９９０年、Ｇｅｎｅ、８９巻：２７９〜２８２頁）、ＨＳＶおよびＥＢＶを含めたヘルペスウイルス（Ｍａｒｇｏｌｓｋｅｅ、１９９２年、Ｃｕｒｒ．  Ｔｏｐ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５８巻：６７〜９０頁、Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９２年、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、６６巻：２９５２〜２９６５頁、Ｆｉｎｋら、１９９２年、Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、３巻：１１〜１９頁、Ｂｒｅａｋｆｉｅｌｄら、１９８７年、Ｍｏｌ．  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．、１巻：３３７〜３７１頁、Ｆｒｅｓｓｅら、１９９０年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、４０巻：２１８９〜２１９９頁）、シンドビスウイルス（Ｈ．  Ｈｅｒｗｅｉｊｅｒら、１９９５年、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、６巻：１１６１〜１１６７頁、米国特許第５，０９１，３０９号および米国特許第５，２２１７，８７９号）、アルファウイルス（Ｓ．  Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ、１９９３年、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１１巻：１８〜２２頁、Ｉ．  Ｆｒｏｌｏｖら、１９９６年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９３巻：１１３７１〜１１３７７頁）、ならびにトリ（Ｂｒａｎｄｙｏｐａｄｈｙａｙら、１９８４年、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、４巻：７４９〜７５４頁、Ｐｅｔｒｏｐｏｕｐｌｏｓら、１９９２年、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、６６巻：３３９１〜３３９７頁）、ネズミ（Ｍｉｌｌｅｒ、１９９２年、Ｃｕｒｒ．  Ｔｏｐ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５８巻：１〜２４頁、Ｍｉｌｌｅｒら、１９８５年、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、５巻：４３１〜４３７頁、Ｓｏｒｇｅら、１９８４年、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、４巻：１７３０〜１７３７頁、Ｍａｎｎら、１９８５年、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、５４巻：４０１〜４０７頁）、およびヒト（Ｐａｇｅら、１９９０年��Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、６４巻：５３７０〜５２７６頁、Ｂｕｃｈｓｃｈａｌｃｈｅｒら、１９９２年、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、６６巻：２７３１〜２７３９頁）起源のレトロウイルスを含めた、いくつかのウイルスベクターが構築されている。バキュロウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病（ｍｕｌｔｉｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ）ウイルス、ＡｃＭＮＰＶ）ベクターも当分野で公知であり、商業的供給源から入手し得る（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｍｅｒｉｄｅｎ，Ｃｏｎｎ．、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．など）。
【０２３５】
Ｍｔｂポリペプチドをコードするポックスウイルスベクターなどのウイルスベクターには、Ｍｔｂポリペプチドをコードしている核酸配列と作動可能に連結している少なくとも１つの発現制御エレメントが含まれる。発現制御エレメントは、核酸配列の発現を制御および調節するためにウイルスベクター中に挿入する。これらのベクターで有用な発現制御エレメントの例には、それだけには限定されないが、ｌａｃ系、ファージラムダのオペレーターおよびプロモーター領域、酵母プロモーターおよびポリオーマ、アデノウイルス、レトロウイルスまたはＳＶ４０由来のプロモーターが含まれる。さらなる作動用エレメントには、それだけには限定されないが、リーダー配列、終止コドン、ポリアデニル化シグナルならびに宿主系においてＭｔｂポリペプチドをコードしている核酸配列の適切な転写および続く翻訳に必要な任意の他の配列が含まれる。発現ベクターは、宿主系における核酸配列を含有する発現ベクターの転移および続く複製に必要なさらなるエレメントを含有することができる。そのようなエレメントの例には、それだけには限定されないが、複製起点および選択マーカーが含まれる。さらに、当業者には、そのようなベクターは慣用方法を用いて容易に構築され（Ａｕｓｕｂｅｌら、（１９８７年）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．）、市販されていることが理解されよう。
【０２３６】
ＭｔｂポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列は、適切な宿主細胞内へのＤＮＡ転移によってｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現させることができる。細胞は原核または真核であり得る。また、この用語には目的の宿主細胞の任意の子孫も含まれる。複製中に起こる突然変異が存在し得るため、全ての子孫が親細胞と同一でない場合があることは理解されよう。安定に転移させる方法、すなわち、外来ＤＮＡを宿主内に維持させ続ける方法は、当分野で公知である。
【０２３７】
上述のように、Ｍｔｂポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列は、発現制御配列に作動可能に連結させることができる。コード配列に作動可能に連結している発現制御配列は、コード配列の発現が発現制御配列と適合性のある条件下で達成されるようにライゲーションされている。発現制御配列には、それだけには限定されないが、適切なプロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、タンパク質をコードしている遺伝子の前の開始コドン（すなわちＡＴＧ）、イントロンのスプライシングシグナル、ｍＲＮＡの妥当な翻訳を可能にするその遺伝子の正しい読み枠の維持、およびストップコドンが含まれる。
【０２３８】
宿主細胞には微生物、酵母、昆虫および哺乳動物の宿主細胞が含まれることができる。真核またはウイルスの配列を有するＤＮＡ配列を原核生物中で発現させる方法は当分野で周知である。適切な宿主細胞の非限定的な例には、細菌、古細菌、昆虫、真菌（例えば酵母）、ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓなど）、植物、および動物細胞（例えば、ヒトなどの哺乳動物細胞）が含まれる。有用な例示的な細胞には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、ＳＦ９細胞、Ｃ１２９細胞、２９３細胞、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、ならびに不死化哺乳動物骨髄およびリンパ球の細胞系が含まれる。培養中の哺乳動物細胞を増殖させる技術は周知である（ＪａｋｏｂｙおよびＰａｓｔａｎ編、１９７９年、Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第５８巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．、Ｈａｒｃｏｕｒｔ  Ｂｒａｃｅ  Ｊｏｖａｎｏｖｉｃｈ、Ｎ．Ｙ．を参照）。一般的に使用されている哺乳動物宿主細胞系の例は、ＶＥＲＯおよびＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、ならびにＷＩ３８、ＢＨＫ、およびＣＯＳ細胞系であるが、より高い発現、望ましいグリコシル化パターン、または他の特長を提供するように設計された細胞などの細胞系を使用してもよい。上述のように、ポリエチレングリコール形質転換、プロトプラスト形質転換および遺伝子銃などの酵母細胞を形質転換させる技術も当分野で公知である（ＧｉｅｔｚおよびＷｏｏｄｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、３５０巻：８７〜９６頁、２００２年を参照）。
【０２３９】
組換えＤＮＡを用いた宿主細胞の形質転換は当業者に周知の慣用技術によって実施することができる。宿主がそれだけには限定されないがＥ．ｃｏｌｉなどの原核である場合、ＤＮＡ取り込みが可能なコンピテント細胞は、対数増殖期後に収集し、続いて当分野で周知の手順を用いてＣａＣｌ２方法によって処理した細胞から調製することができる。あるいは、ＭｇＣｌ２またはＲｂＣｌを使用することができる。また、所望する場合は宿主細胞のプロトプラストを形成した後に、または電気穿孔によっても形質転換を行うことができる。
【０２４０】
宿主が真核生物である場合、リン酸カルシウム共沈殿、微量注入などの慣用の機械的手順、電気穿孔、リポソームに包んだプラスミドの挿入、またはウイルスベクターなどの、ＤＮＡのトランスフェクション方法を使用することができる。また、Ｍｔｂポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列、および単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子などの選択可能な表現型をコードしている第２の外来ＤＮＡ分子を用いて、真核細胞を同時形質転換させることもできる。別の方法は、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）またはウシパピローマウイルスなどの真核ウイルスベクターを使用して、真核細胞を一過的に感染させるまたは形質転換させてタンパク質を発現させることである（例えば、Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｇｌｕｚｍａｎ編、１９８２年を参照）。
【０２４１】
本開示のポリペプチドで使用するために適した数々の他のアッセイプロトコールが存在する。上記説明は例示的であることのみを意図する。
【０２４２】
本開示は以下の非限定的な例によって例示する。
【実施例】
【０２４３】
多くの感染症に関して、ＣＤ８応答のレパートリーは、抗原がＭＨＣ−Ｉプロセシング経路に進入し、ペプチドおよび／または非ペプチド抗原がＭＨＣ−Ｉ分子に結合し、これらの構造がＴ細胞によって認識されることにより形作られる。最後に、病原体特異的Ｔ細胞の比較的限定されたサブセットが出現する。いくつもの一般に認識されるＣＤ４  Ｍｔｂ抗原が記載されているが（Ｒｅｅｄら、Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃｔ  ７巻：９２２〜９３１頁、２００５年）（ＥＳＡＴ−６、ＣＦＰ１０、Ａｇ８５など）、驚いたことに、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞によって認識される一般的なＭｔｂ抗原についてはほとんど公知でない。同定されているＣＤ８エピトープの大部分は、ＭＨＣクラスＩａ分子に対する親和性の高い結合に対して選択されたＭｔｂペプチドを試験することによって定義された（大抵の場合、ＨＬＡ−Ａ２（例えば、Ｌａｌｖａｎｉ、Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃｔ  ７巻；９２２〜９３１頁、１９９８年）を参照されたい）。しかし、これらのほとんど全てにおいて、Ｍｔｂ感染個体におけるこれらのＴ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの頻度は低い、または検出不可能であり、これらの特異性が、免疫優性応答を表していない可能性があることが示唆されている。その一方、Ｔ細胞を使用して、選択されたＭｔｂ抗原に含有されるエピトープを定義した限られた事例では、高いｅｘ  ｖｉｖｏでの頻度が実証され（Ｌｅｗｉｎｓｏｈｎら、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  １６６巻：８４３〜８４８頁、２００２年を参照されたい）、Ｔ細胞を中心にした手法によって、免疫優性エピトープを同定することができることが示唆されている。さらに、良好なＣＤ４抗原を表している一部のＭｔｂ抗原（ＣＦＰ１０、ＥＳＡＴ−６、Ａｇ８５、およびＭｔｂ３９）に対するＣＤ８  Ｔ細胞応答が、Ｍｔｂに感染している人間において高頻度で検出されている。したがって、いくつかの公知のＣＤ４  Ｍｔｂ抗原を表しているオーバーラップした合成ペプチドの限定ライブラリーを使用して、活動性結核（ＴＢ）を有する人間および潜伏結核感染（ＬＴＢＩ）を有する人間、ならびに感染していない被験体におけるこれらの抗原に対するＣＤ８応答の大きさを決定した。さらに、Ｍｔｂ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンのパネルを利用して、これらの抗原内部の認識される最小エピトープを定義し、ｅｘ  ｖｉｖｏにおけるＭｔｂ特異的ＣＤ８応答に対するこれらの新規エピトープの寄与について決定した。
【０２４４】
（実施例１）
材料と方法
ヒト被験体
感染していない個体を、ツベルクリン皮膚検査（ＴＳＴ）陰性であり、Ｍｔｂ感染の公知の危険因子を持たない健康な個体と定義した。ＬＴＢＩを有する個体を、ＴＳＴ陽性であり、活動性ＴＢの症状および徴候がない健康な人間と定義した。全ての活動性ＴＢ症例において、肺ＴＢがその郡の結核管理者によって診断され、痰の培養物がＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓｓについて陽性であることによって確認された。静脈穿刺またはアフェレーシスによって得られた全血から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。
【０２４５】
培地および試薬
培地は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）、５×１０−５Ｍの２ＭＥ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、および２ｍＭのグルタミン（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を補充したＲＰＭＩ  １６４０からなった。Ｍｔｂ応答性Ｔ細胞クローンを増殖させアッセイするために、ＲＰＭＩ  １６４０に１０％ヒト血清を補充した。Ｍｔｂ株Ｈ３７ＲｖをＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手し、前述の通り調製した（Ｌｅｗｉｎｓｏｈｎら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６５巻：９２５〜９３０頁、２０００年）。ペプチドはＧｅｎｅｍｅｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｉｎｃ（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）によって合成された。Ｍｔｂタンパク質を表している、１１個のアミノ酸（ａａ）がオーバーラップした１５ｍｅｒからなる合成ペプチドプールが、有力なＣＤ４抗原であることが実証された。ＣＦＰ−１０（Ｂｅｒｔｈｅｔら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４４巻：３１９５〜３２０３頁、１９９８年；Ｄｉｌｌｏｎら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３８巻：３２８５〜３２９０頁、２０００年）、ＥＳＡＴ−６（Ｓｏｒｅｎｓｏｎら、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６３巻：１７１０〜１７１７頁、１９９５年）、Ｍｔｂ３９ａ（２つのプール、ＡおよびＢ、参照）（Ｄｉｌｌｏｎら、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６７巻：２９４１〜２９５０頁、１９９９年）、Ｍｔｂ８．４（Ｃｏｌｅｒら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６１巻：２３５６〜２３６４頁、１９９８年）、Ｍｔｂ９．９（Ａｌｄｅｒｓｏｎら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９１巻：５５１〜５６０頁、２０００年）、（Ｃｏｌｅｒら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６１巻：２３５６〜２３６４頁、１９９８年）、Ｍｔｂ９．９（Ａｌｄｅｒｓｏｎら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９１巻：５５１〜５６０頁、２０００年）、ＥｓｘＧ（Ｒｏｓｅｎｋｒａｎｄｓら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２１巻：３７４０〜３７５６頁、２００２年）、１９ｋＤａ抗原（Ｃｏｌｌｉｎｓら、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １３６巻：１４２９〜１４３６頁、１９９０年）、抗原８５ｂ（Ｂｏｒｒｅｍａｎｓら、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ５７巻：３１２３〜３１３０頁、１９８９年）（２つのプール、ＡおよびＢ、参照）を表しているペプチドプールを合成した。ペプチドをＤＭＳＯに再懸濁し、プール内の各ペプチドの濃度が１ｍｇ／ｍｌになるように、最大５０個のペプチドを１つのプール内にまとめた。ペプチドプールを−８０℃で保管した。
【０２４６】
細胞系およびＴ細胞クローン
ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞系、ＬＣＬを、９Ｂ５−８細胞系（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）からの上清を使用して生成したか、またはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｄｏｎｏｒ  Ｐｒｏｇｒａｍ（ＮＭＤＰ；Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から入手した。ＬＣＬを、前述の通り連続的に継代することによって維持した（Ｈｅｉｎｚｅｌら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９６巻：１４７３〜１４８１頁、２００２年）。前述の通り、ＡＰＣとしてＭｔｂ感染ＤＣを使用し、限界希釈クローニング法を使用して、ＬＴＢＩまたは活動性結核を有する個体からＭｔｂ特異的Ｔ細胞クローンを単離した（Ｌｅｗｉｎｓｏｈｎら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６５巻：９２５〜９３０頁、２０００年）。簡単に述べると、製造者（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ  ＣＡ）の説明書に従って、ＣＤ４抗体でコーティングしたビーズを使用した負の選択、次いでＣＤ８抗体でコーティングした磁気ビーズを使用した正の選択を用いて、またはフローサイトメトリーによって、ＰＢＭＣからＣＤ８＋Ｔ細胞を単離した。この場合、ＣＤ４−ＰＥ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｃａｔ＃５５５３４７）陰性細胞、ＣＤ８−ＡＰＣ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｃａｔ＃５５５３６９）陽性細胞（純度＞９９％）をＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ  ＬＳＲ  ＩＩで選別した。種々の濃度のＴ細胞を、１×１０５個の、下記の通り生成した照射自己Ｍｔｂ感染ＤＣおよびｒＩＬ−２（５ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、１０％ヒト血清を補充したＲＰＭＩ  １６４０  ２００μｌからなる細胞培養培地に播種した。１０〜１４日の間に増殖を示したウェルを、ＥＬＩＳＰＯＴおよびＡＰＣ供給源としてＭｔｂ感染ＤＣを使用して、Ｍｔｂ特異性について評価した。Ｍｔｂ特異性を保持しているＴ細胞を、ＦＡＣＳによって、αβＴ細胞受容体の発現およびＣＤ８の発現についてさらに表現型決定し、下記の通り拡大させた。Ｂｅｃｋｍａｎ  ＣｏｕｌｔｅｒからのＩＯＴｅｓｔ  Ｂｅｔａ  Ｍａｒｋ  Ｋｉｔを使用してＶβの利用を決定した。
【０２４７】
Ｔ細胞クローンの拡大
ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンを拡大させるために、抗ＣＤ３ｍＡｂ刺激を用いた急速拡大プロトコールを前述の通り使用した（Ｈｅｉｎｚｅｌら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９６巻：１４７３〜１４８１頁、２００２年）。
【０２４８】
末梢血ＤＣの生成および感染
単核細胞由来のＤＣを調製した（Ｈｅｉｎｚｅｌら、上記；  Ｒｏｍａｎｉら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８０巻：８３〜９３頁、１９９４年）。Ｍｔｂ感染ＤＣを生成するために、細胞（１×１０６）を、Ｍｔｂの存在下で一晩培養した（感染多重度［ＭＯＩ］＝５０：１）。１８時間後、細胞を回収し、ＲＰＭＩ／１０％ヒト血清に再懸濁した。
【０２４９】
ＭＨＣ結合アッセイ
利用したＭＨＣ−ペプチド結合アッセイにより、ペプチドリガンドの、精製ＭＨＣ分子への放射標識したペプチドの結合を阻害する能力が測定され、その詳細は他に記載されている（Ｓｉｄｎｅｙら、１９９９年、ＵＮＩＴ１８．３  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ＭＨＣ／ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｂｙ  ｇｅｌ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ．  Ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．  Ｃｏｌｉｇａｎら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．、１９９６年）。簡単に述べると、精製ＭＨＣ分子、試験ペプチド、および放射標識したプローブペプチドを、ヒトＢ２ミクログロブリンおよびプロテアーゼ阻害剤のカクテルの存在下、室温でインキュベートした。２日間インキュベートした後、Ｗ６／３２抗体（抗ＨＬＡ  Ａ、抗ＨＬＡ  Ｂ、および抗ＨＬＡ  Ｃ）またはＢ１２３．２（抗ＨＬＡ  Ｂ、抗ＨＬＡ  Ｃおよび多少の抗ＨＬＡ  Ａ）でコーティングしたプレート上でＭＨＣ／ペプチド複合体を捕獲することにより、放射標識したペプチドの、対応するＭＨＣクラスＩ分子への結合を決定し、マイクロシンチレーションカウンターを使用して分当たりの結合数（ｃｐｍ）を測定した。競合アッセイのために、放射標識したペプチドの結合を５０％阻害したペプチドの濃度を算出した。ペプチドは、一般には、１００，０００倍の用量範囲を包含する６つの異なる濃度で、３連以上の独立したアッセイで試験した。使用した条件下、［標識］＜［ＭＨＣ］およびＩＣ５０≧［ＭＨＣ］で、測定されたＩＣ５０値は、真のＫｄ値の妥当な近似値である。
【０２５０】
ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイを前述の通り行った（Ｂｅｃｋｍａｎら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５７巻：２７９５〜２８０３頁、１９９６年）。Ｍｔｂの感染またはＭｔｂ抗原に応答した、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの頻度を決定するために、レスポンダーＴ細胞の供給源として磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｒｎ  ＣＡ）を使用し、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞をＰＢＭＣから正に選択し、４つの異なる細胞濃度において２連で試験した。自己ＤＣ（細胞２０，０００個／ウェル）をＡＰＣとして使用し、ＤＣを、Ｍｔｂに感染させるかまたはペプチドプール（各ペプチドの最終濃度５μｇ／ｍｌ）でパルス処理し、次いでアッセイに加えた。Ｔ細胞クローンを使用したアッセイのために、Ｔ細胞（細胞１０００個／ウェルまたは細胞５０００個／ウェル）を、抗原の存在下または非存在下で自己ＬＣＬ（細胞２０，０００個／ウェル）と共にインキュベートした。
【０２５１】
データ分析
抗原特異的Ｔ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏにおける頻度を決定するために、２連のそれぞれについてウェル当たりのスポットの平均数を、ウェル当たりのレスポンダー細胞数と対照してプロットした。直線回帰分析を使用して、抗原特異的Ｔ細胞の頻度を表す直線の勾配を決定した。アッセイは、スポット数についての二項確率（Ｌｅｗｉｎｓｈｏｎら、Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃｔ  ８巻：２５８７〜２５９８頁、２００６年）が実験アッセイと対照アッセイによって有意に異なる場合、陽性である、すなわち、刺激されたＴ細胞応答の存在を反映しているとみなされる。群間のｅｘ  ｖｉｖｏにおけるＴ細胞の頻度の差異を決定するために、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ／Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ分析を使用した。
【０２５２】
（実施例２）
免疫優性Ｍｔｂ特異的ＣＤ８＋抗原の定義
免疫優性Ｍｔｂ特異的ＣＤ８＋抗原を定義するため、およびこれらの応答がＭｔｂの感染に起因するか否かを決定するために、感染していないドナー、ＬＴＢＩを有するドナー、または活動性のＭｔｂ感染ドナーからのＣＤ８＋Ｔ細胞を使用した。応答を、直接ｅｘ  ｖｉｖｏで、またはＭｔｂ感染自己ＤＣに対する限界希釈クローニングによって得られたＣＤ８＋Ｔ細胞クローン（Ｌｅｗｉｎｓｏｈｎら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６５巻：９２５〜９３０頁、２０００年）を使用して決定した。優性ＣＤ４＋Ｍｔｂ抗原についてほとんど公知であるので、それらの一般的に認識される抗原のパネルをさらなる評価のために選択した。それらは、Ｍｔｂ３９、ＣＦＰ１０、およびＭｔｂ８．４、Ｍｔｂ９．９、ＥＳＡＴ−６、Ａｇ８５ｂ、１９ｋＤａ、およびＥｓｘＧであった。予測されたＨＬＡ結合特異性のペプチドを使用することによって導入されるバイアスを避けるために、オーバーラップペプチドを合成して（１５ａａ、１１ａａがオーバーラップ）目的のタンパク質を表した（Ｌｅｗｉｎｓｈｏｎら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６６巻：４３９〜４４６頁、２００１年）。
【０２５３】
ＣＤ８＋Ｔ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏにおけるエフェクター細胞の頻度を正確に決定するために、直線回帰分析を使用した。図１に示したように、磁気ビーズで精製したＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて、ＣＤ８＋Ｔ細胞の数の範囲にわたる、ペプチドでパルス処理したＤＣと対照して試験した。アッセイ陽性を下記の通りに決定し、陽性の場合、直線回帰を使用して抗原特異的頻度を決定した。
【０２５４】
感染していない被験体（ｎ＝１４）、ＬＴＢＩを有する被験体（ｎ＝２０）および活動性ＴＢを有する被験体（ｎ＝１２）を、Ｍｔｂ  ＣＤ４＋Ｔ細胞抗原のパネル、ならびにＭｔｂ感染ＤＣに対するＣＤ８＋応答について評価した。試験した全ての被験体が、Ｍｔｂ感染ＤＣに対して強いＣＤ８＋Ｔ細胞応答を有し、その大きさはＬＴＢＩを有する個体よりも活動性ＴＢを有する個体の方が大きかった（ｐ＝０．０１；図２、表１）。しかし、Ｍｔｂ抗原のパネルに対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、感染していない個体とＭｔｂ感染個体との間の統計的有意な差異が、応答の大きさ（図２）およびアッセイ陽性の割合（表１）の両方について、１０個の抗原のうち７個に見られたので、ほとんどＭｔｂに感染した個体でのみ見られた。
【０２５５】
【表１】
2012503206.tif 000036
しかし、活動性ＴＢを有する個体とＬＴＢＩを有する個体との間のＣＤ８＋Ｔ細胞応答の差異は、有意な差異ではなかった。試験した抗原の多くに対する強力なＣＤ８＋Ｔ細胞応答が観察されたが、強力なＭｔｂ誘導性ＣＤ８＋Ｔ細胞応答があった数個体の被験体が、試験した抗原の多くに対して実証可能な応答を有さなかったことにも同様に注目すべきである。
【０２５６】
これらのｅｘ  ｖｉｖｏにおける頻度のデータは、いくつもの公知のＭｔｂ抗原に対する高頻度の応答の存在を実証しているが、制限対立遺伝子、最小エピトープ、または目的の遺伝子内部の順位制については明らかにしていない。この問題に取り組むため、Ｍｔｂ感染ＤＣを使用したヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の限界希釈クローニングを行い（Ｌｅｗｉｎｓｏｈｎら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６６巻：４３９〜４４６頁、２００１年を参照されたい）、古典的なＨＬＡ制限ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンと非古典的なＨＬＡ制限ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンの両方のパネルを生成した。公知のＣＤ４＋抗原を表しているペプチドプールを使用して、クローンの半分超においてＨＬＡ−Ｉａ制限クローンの抗原特異性を定義することができる（表ＩＩ）。
【０２５７】
【表２】
2012503206.tif 000037
この手法は、活動性ＴＢを有する被験体から得た単一の代表的なクローン、Ｄ４６６  Ｄ６に関して詳細に実証されている。図３Ａに示したように、ペプチドプールのパネルでパルス処理した自己ＤＣと対照してこのクローンを試験することにより、抗原特異性がＣＦＰ１０であると明確に定義された。次いでこのクローンを、ＣＦＰ１０プールを含む１５ｍｅｒのペプチドのそれぞれと対照して試験し、その結果、エピトープがＣＦＰ１０１〜１５の中に含有されていることが明らかになった（図３Ｂ）。次いで、可能性のある、８ａａペプチド、９ａａペプチド、１０ａａペプチドおよび１１ａａペプチドのそれぞれを合成し、応答性について試験し、その結果、ａａ２〜１１間の抗原活性が明らかになった（図３Ｃ）。同様に、各クローンを、少なくとも１種のＨＬＡ型をドナーと共有しているリンパ芽球様細胞系（ＬＣＬ）と対照して試験した（図３Ｄ）。Ｂ４５０１およびＣ１６０１を共有する自己ＬＣＬおよびＩＨＷ９０５８ＬＣＬによってクローンにエピトープが提示され、Ｂ４５０１とＣ１６０１の両方が可能性のある制限対立遺伝子であると同定された。しかし、Ｃ１６０１＋Ｄ４３３ＬＣＬによってエピトープは提示されず、Ｃ１６０１は候補制限対立遺伝子として排除される。したがって、Ｄ４６６  Ｄ６は、ＨＬＡ−Ｂ４５０１によって制限される。図４で実証しているように、妥当と思われるエピトープそれぞれを、広範な濃度範囲にわたって試験することにより、Ｄ４６６  Ｄ６について最小エピトープはＣＦＰ１０２〜１０であると定義された。最小エピトープの割り当てを支持する実験データが、補足的な図において各クローンにたいしてもたらされている。抗原特異性、最小エピトープ、およびＨＬＡ制限対立遺伝子の要約を表ＩＩＩに示す。予想外に、１つを除いた全てのＴ細胞クローンがＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子によって制限された。さらに、観察されたこれらの大部分は長さが９ａａであった。
【０２５８】
【表３】
2012503206.tif 000038
個々のＣＤ８＋Ｔ細胞クローンのそれぞれを、Ｍｔｂ感染ＤＣの増殖に基づいて得たので、抗原および同定されたエピトープがｅｘ  ｖｉｖｏにおける免疫優性エピトープを反映しているか否かを決定した。第１に、応答が高頻度でもたらされたかどうかを決定するため、第２に、抗原に対する全応答のどのくらいの割合がエピトープによって構成されているかを決定するための、２つの独立した手法を進めた。ｅｘ  ｖｉｖｏにおけるエフェクター細胞の頻度を決定するために、図１に記載のように、Ｔ細胞クローンを単離したドナーから得た、自己ＤＣおよび磁気ビーズで精製したＣＤ８＋Ｔ細胞を使用して各エピトープを試験した。エフェクター細胞の頻度についての要約を表ＩＩＩに示す。大部分について、エピトープは高頻度の応答を反映し、したがって、Ｍｔｂへの曝露によって刺激された応答であるとみなすことができる。特に、４個体のドナーから単離されたＴ細胞がＣＦＰ１０を認識した。定義されたエピトープが、目的の抗原に対する全応答の相当な割合を反映したかどうかを決定するために、利用可能な末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を十分に有するドナー３個体からの、磁気ビーズで精製したＣＤ８＋Ｔ細胞を、個々の１５ｍｅｒペプチド、ペプチドプール、および最小エピトープを表しているペプチドのそれぞれに対する応答性について試験した。図５で実証しているように、最小エピトープ、最小エピトープを含有する１５ｍｅｒペプチド（単数または複数）、およびペプチドプールに対するｅｘ  ｖｉｖｏにおける頻度は著しく調和した。これらのデータにより、各ドナーに対して、順位性が明らかに確立されており、元のクローンに反映されていることが示唆された。最後に、表ＩＩＩに示したように、特異性が同一である娘クローンが頻繁に同定され、結果は免疫順位性に基づいて予測される。ＴＣＲ  Ｖベータ染色を使用して娘クローン間のクローン関連性を確認した。興味深いことに、２つの場合で、２つの別個のクローンによって同一の最小エピトープおよびＨＬＡ制限が表された（表ＩＩＩ）。
【０２５９】
Ｍｔｂに対するヒトＣＤ８＋Ｔ細胞応答についての多くの研究はＨＬＡ予測アルゴリズムを使用することに頼っているため、各ペプチドが定義された際に、エピトープがこれらの手法で予測されたか否か問われた。これらのエピトープの多くは、強力に順位付けされなかった。このことは、これらのアルゴリズムが使用された時点でのその限界を強調し得る。この問題に実験的に取り組むために、最小エピトープの定義の過程で合成された各ペプチドについてのＩＣ５０を、ヒトＨＬＡ分子のパネルと対照して決定した。表ＩＩＩに示したのは、同族の制限対立遺伝子を持つ最小エピトープについてのＩＣ５０である。データにより、Ｔ細胞のエピトープがＨＬＡに親和的に結合することが実証され、Ｔ細胞のエピトープのデータとＨＬＡ結合性のデータとが高度に一致することが示されている。
【０２６０】
データにより、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答が、Ｍｔｂに感染した人間において、ワクシニア、インフルエンザ、およびＣＭＶなどの多くの一般的なウイルスに感染した後に見られる応答に匹敵する頻度でもたらされることが実証された。マッピングされたエピトープの１つを除いた全てがＨＬＡ−Ｂ分子によって制限された。データにより、エピトープを同定するためのＴ細胞による手法を使用することにより、Ｍｔｂに感染したヒトにおいて優性エピトープを定義することができることが示唆される。
【０２６１】
（実施例３）
ゲノムペプチドライブラリーと対照したＴ細胞クローンのスクリーニング
公知のＭｔｂ抗原のペプチドプール（Ｒｖ３８７５、Ｒｖ３８７４、Ｒｖ１８８６ｃ、Ｒｖ０２８７、Ｒｖ３７６３、Ｒｖ１１７４ｃ、Ｒｖ１１９６、Ｒｖ１７９３、Ｒｖ２３４６ｃ、Ｒｖ１０３７ｃ、Ｒｖ３６１９ｃおよびＲｖ１１９８）の１つを認識しなかった古典的な制限Ｔ細胞クローンおよび非古典的な制限Ｔ細胞クローン（上記の表ＩＩを参照されたい）を、ゲノムペプチドライブラリーと対照してスクリーニングした。このペプチドライブラリーは、３８９個の遺伝子を表しており、Ｍｔｂゲノムのおよそ１０％を表している。ペプチドは、１５ｍｅｒであり、各遺伝子産物に対して１１個がオーバーラップしている。各ペプチド５０ｎｍｏｌを個々に合成し、次いで９６ウェル型中ペプチド５０個のプール７７７個にプールした（プレート９個）。９個のプレートそれぞれに、空のウェル５つおよび関係のないペプチドプール、ＳＩＶ  ｇａｇのウェル１つを含めた。ゲノムペプチドライブラリーと対照してクローンをスクリーニングするために、まずクローンを拡大させ、Ｍｔｂ感染ＤＣと対照して試験して、この特定の拡大した各クローンが、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて強いＭｔｂ特異的シグナルをもたらすことを確実にした。次いで、最大６つのＴ細胞クローンをプールした。スクリーニングするために、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて、Ｔ細胞クローン（細胞５，０００個／ウェルの各クローン）、自己ＤＣ（細胞２０，０００個／ウェル）、ＩＬ−２（０．５ｎｇ／ｍｌ）およびペプチドプール（５ｕｇ／ｍｌ、個々のペプチド）を、３７℃で一晩インキュベートした。ペプチド抗原を有するウェル当たり５０００個のＴ細胞クローンが圧倒的に陽性の応答をもたらしたので、プールごとに１回のみ技術的な反復を行い、最終的な結果に至った。Ｄ５０４からの６つの古典的なクローンがゲノムペプチドライブラリーと対照してスクリーニングされ、新規エピトープの発見が導かれた。このエピトープは、ＥｓｘＪ、ＥｓｘＷ、ＥｓｘＫおよびＥｓｘＰを含む４つのタンパク質のファミリーからのものであった。これらのタンパク質は９８％の相同性を共有し、３つのアミノ酸のみが異なる。このファミリーには５番目のメンバー、ＥｓｘＭ（Ｒｖ１７９２）があるが、これはゲノムペプチドライブラリーには含めなかった。
【０２６２】
クローンを、これらのペプチドプールについて個々の１５ｍｅｒと対照してスクリーニングした。６つの古典的なクローン全てがＥｓｘＪ２１〜３５を認識した。これは、このファミリーの他の４つのメンバーと同一であるＥｓｘＪの領域である。次に、この１５ｍｅｒから９ｍｅｒ、１０ｍｅｒおよび１１ｍｅｒのペプチドを作製し、各クローンと対照してスクリーニングした。最小エピトープはＥｓｘＪ２４〜３４であることが決定された。さらに、ＨＬＡ制限はＢ５７０１であることがわかった。
【０２６３】
（実施例４）
ゲノムペプチドライブラリーと対照したＴ細胞クローンの追加スクリーニング
Ｄ４３２Ｂからの古典的なクローン１１個を、上記のゲノムペプチドライブラリーと対照してスクリーニングした。２つのクローンについて抗原が決定され、それにより２つの新規エピトープ、ＰＥ＿ＰＧＲＳ４２４７〜５５およびＰＥ９５３〜６７の同定が導かれた。一方のクローンについての最小エピトープはＰＥ＿ＰＧＲＳ４２４７〜５５であることが決定され、ＨＬＡ制限はＢ３５１４であることがわかった。他方のクローンについての最小エピトープはまだ決定されていないが、ＰＥ９５３〜６７１５ｍｅｒに含有されている。このクローンについてのＨＬＡ制限はＢ３９０５であることがわかった。
【０２６４】
【表４】
2012503206.tif 000039
（実施例５）
ゲノムペプチドライブラリーと対照したｅｘ  ｖｉｖｏＣＤ８＋Ｔ細胞のスクリーニング
ＬＴＢＩドナー、Ｄ６１０（ＳＥ  Ａｓｉａｎ）からのＣＤ８＋Ｔ細胞を、上記のゲノムペプチドライブラリーと対照してスクリーニングした。ゲノムペプチドライブラリーの各プレートを、２連で、スクリーニングごとに全部で１８個のＥＬＩＳＰＯＴプレートについてスクリーニングした。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、磁気ビーズ分離を使用したＣＤ８＋選択によって、凍結保存されたＰＢＭＣから調製した。生じた細胞集団は、≧９６％のＣＤ８＋Ｔ細胞を含有した。ＣＤ８＋Ｔ細胞（細胞２５０，０００個／ウェル）、自己ＤＣ（細胞２０，０００個／ウェル）、およびＩＬ−２（０．５ｎｇ／ｍｌ）を、ＥＬＩＳＰＯＴプレート中のペプチド（最終的に５ｕｇ／ｍｌ、個々のペプチド）に加えた。各プレートに５つの培地対照ウェルを含めた。各プレートについて、これら５つのウェルの平均をそのプレートの各ウェルから引いてプレート間を標準化した。次いで、各プレートに対する技術的な反復をそれぞれスコア化した。培地ウェルの平均より少ないスポット形成単位（ＳＦＵ）が、１０以上であり、ＳＦＵが培地の平均の２倍以上であった場合に、ウェルが陽性であるとスコア化した（Ｈｕｄｇｅｎｓら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８８巻：１９〜３４頁、２００４年）。このドナーは、ＥｓｘＪ、ＥｓｘＷ、ＥｓｘＫおよびＥｓｘＰを含有する４つのペプチドのウェルに応答した。次いで、ＣＤ８＋Ｔ細胞を、これらのペプチドプールからの１５ｍｅｒそれぞれと対照してスクリーニングし、上記の実施例３に記載した、ＥｓｘＪ、ＥｓｘＷ、ＥｓｘＫおよびＥｓｘＰの同じ領域、ＥｓｘＪ２１〜３５のみに応答することがわかった。
【０２６５】
追加のドナー７個体を、ゲノムペプチドライブラリーと対照してスクリーニングした。上位１０の応答について表７に記載している。黄色で強調した４つのペプチドプールはただ１つの遺伝子からのペプチドを含有する。これらの４つの遺伝子は４つの新規エピトープを含有する。
【０２６６】
【表５】
2012503206.tif 000040
（実施例６）
小児においてＴＢを診断するためのＣＤ８＋Ｔ細胞の使用
この結果は、小児においてＴＢを診断するためのＣＤ８＋Ｔ細胞の使用の、予想外の感受性および特異性を実証している。
【０２６７】
方法
参加者および手順：
参加者を、ウガンダのカンパラの別々の募集場所から２つの臨床研究群に登録した。健康な曝露（ＨＥ）群について、成人の保菌容疑者家庭の小児（＜１５歳）を、ウガンダのカンパラにおける前向きコホート研究に登録されたＡＦＢスメア陽性、培養で確認された肺結核ＴＢで評価した。簡単に述べると、成人の家族の一員がＴＢのケアを求めた後に募集が行われた。研究への参加時に、詳細な人口統計的情報および臨床情報を、標準化された形式で収集し、活動性ＴＢの症状についての標準化されたスクリーニングアンケートを施し、理学的検査および前胸部Ｘ線撮影（ＣＸＲ）を行った。研究の登録時に全ての小児について体重および身長を記録した。個体の肥満度指数（ＢＭＩ）をＷＨＯの小児成長基準と比較することによって栄養状態を決定し、ＢＭＩのＺスコアが３以下であるものを重篤な栄養不良と定義した。５単位の精製ツベルクリン（Ｐａｓｔｅｕｒ  Ｍｅｒｉｅｕｘ  Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ，Ｓｗｉｆｔｗａｔｅｒ，ＰＡ）を用い、マントゥー法でツベルクリン皮膚検査（ＴＳＴ）を行った。検査は看護師または訓練された医療従事者によって施され、設置の４８〜７２時間以内に読み取った。ＷＨＯ基準（ＷＨＯ２００６）を使用して検査陽性について定義し、重篤な栄養不良の小児については硬化が５ｍｍを超えることを陽性とみなし、残りの小児については硬化が１０ｍｍを超えることを陽性とみなした。ＴＳＴの結果は、研究への参加者全員について得られた。１８カ月を超えた全ての小児に対して、ＥＬＩＳＡによってＨＩＶ検査を行った；１８カ月未満の小児については、生物学上の親がＨＩＶ陽性であるとわかった場合にのみＨＩＶ検査を行った。登録時または観察期間の６〜２４カ月の間に活動性ＴＢに関わる症状がある小児に、研究者の医師による、反復ＣＸＲおよびマイコバクテリアのスメアおよび少なくとも１つの胃の吸引試料の培養を含めた、完全な臨床的かつ診断的な評価を受けさせた。検体を常法によって処理し、蛍光染色を行ってＡＦＢを検出し、Ｌｏｅｗｅｎｓｔｅｉｎ−Ｊｅｎｓｅｎ培地ならびにＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ７Ｈ９ブロスで培養した。全てのマイコバクテリア培養物を、ＡＦＢの増殖について８週間モニタリングした。微生物学者は、参加者のＴＢ分類およびＴＳＴ検査の結果について目隠しされた。６カ月後に活動性ＴＢを発生しなかった小児のみを含めた。ＴＢの前歴がある、もしくは現在ＴＢである小児、または免疫抑制性の小児（コルチコステロイドを受けているまたはＨＩＶを有する）は除外した。書面のインフォームドコンセントを得た。
【０２６８】
確証＋推定（ＣＰ）ＴＢ群について、確証ＴＢまたは推定ＴＢのいずれかについてのＷＨＯ基準（表１；ＷＨＯ１９８３）を満たす急性の病気の小児（≦１０歳）を登録した。ＴＢの症状および徴候で入院した小児（ＴＢの疑い、ＷＨＯ１９８３）を、完全な臨床的評価、ＣＸＲ、ＴＳＴ、および、２歳より上の場合はＨＩＶ酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）または、１８カ月未満の場合はＨＩＶポリメーラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で評価した。ＴＳＴを行い、ＨＥ小児について正確に解釈した。この評価の結果に基づいて、推定ＴＢの基準を満たす小児を登録した。詳細な人口統計的情報および臨床的情報を標準化された形式で前向きに収集し、生存している小児を、研究者の医師による２カ月の経過観察訪問時に評価した。正確に、ＨＥ小児に関して、小児の体重および身長を記録し、栄養状態を評価した。登録された小児にマイコバクテリアのスメアを行い、１つの誘導された痰試料を培養した。一部の例では、病理および／またはマイコバクテリアのスメアおよび培養のために、リンパ節の吸引物を得た。２カ月の経過観察に基づいて、小児に、確証ＴＢである、推定ＴＢである、またはＴＢでないという最終的な指定を受けさせた。ＴＢを有さなかった小児を分析から除外した。ＴＢの分類を割り当てる研究者は、ＥＬＩＳＰＯＴ試験の結果について目隠しされた。研究に登録する前に、各小児の親または保護者から、現地語の書面でインフォームドコンセントを得た。
【０２６９】
全ての小児について、研究への登録時、ＴＳＴ設置前に１〜２ｃｃ／ｋｇ（最大２０ｃｃ）を採血した。標準の方法によって末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離し、凍結保存した。
【０２７０】
培地および試薬：
培地は、１０％ヒト血清、５×１０−５Ｍの２ＭＥ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、および２ｍＭのグルタミン（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を補充したＲＰＭＩ  １６４０からなった。ペプチドはＧｅｎｅｍｅｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓによって合成された。Ｍｔｂ特異的タンパク質、ＣＦＰ−１０およびＥＳＡＴ−６を表している１１個のアミノ酸（ａａ）がオーバーラップした、１５ｍｅｒからなる単一の合成ペプチドプールを合成した。ペプチドをＤＭＳＯに再懸濁し、プール内の各ペプチドの濃度が１ｍｇ／ｍｌになるように、４３個のペプチドを１つのプール内にまとめた。ペプチドプールを８℃で保管した。
【０２７１】
ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイ：
前述の通り（２）一晩のＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行った。アッセイは、凍結保存されたＰＢＭＣに対して行った。ＰＢＭＣの調製、凍結保存、およびＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、ウガンダ、カンパラにあるＪｏｉｎｔ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ  （ＪＣＲＣ）の免疫学研究室において、ＴＢＲＵ主催の下行われた。ＥＳＡＴ−６／ＣＦＰ−１０特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度を決定するために、全ＰＢＭＣを応答性Ｔ細胞の供給源として使用した。ＥＳＡＴ−６／ＣＦＰ−１０特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を決定するために、ＣＤ４磁気ビーズとＣＤ５６磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）の組合せを使用してＰＢＭＣから負の選択をされたＣＤ８＋Ｔ細胞を応答性Ｔ細胞の供給源として使用した。ペプチドでパルス処理した単核細胞由来の樹状細胞（ＤＣ）は、ｅｘ  ｖｉｖｏにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞エフェクターを列挙するための最も感受性の高い抗原提示細胞であることがわかっているが（３）、ＤＣを生成するために十分なＰＢＭＣが必要とされる。これらの研究について、入手可能な血液の量がこの手法の妨げとなる。結果として、磁気ビーズ除去を使用して、内在性単核細胞を抗原提示細胞として使用できるようにした。予備実験において、ＣＤ４の除去により、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞が同時に除去されることによって排除され得る高いバックグラウンドが生じた。ＤＣを使用することと直接比較すると、この方法は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の列挙においておよそ８０％効率がよい。フローサイトメトリー分析により、ＣＤ４の混入率は＜２％、およびＣＤ８の純度は＞８５％であることが明らかになった。残りの細胞は、主に単核細胞、そしてＢ細胞で構成されている。ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴを、細胞２５０，０００個／ウェルのＰＢＭＣ（ＣＤ４＋Ｔ細胞のアッセイ）またはＣＤ４／ＣＤ５６が除去されたＰＢＭＣ（ＣＤ８＋Ｔ細胞のアッセイ）、および抗原の供給源としてペプチドプール（各ペプチドの最終的な濃度は５μｇ／ｍｌ）を使用して行った。各アッセイに、陰性対照および陽性対照を含め、それらはそれぞれ、抗原無しの細胞または抗原無しだが植物性血球凝集素（ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔａｎｉｎ）（ＰＨＡ、１０１ｇ／ｍｌ；ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を含めた細胞のいずれかを含有するウェルからなった。全ての決定を２連で行った。一部の例では、抗原を含まない（培地）対照について３連で行った。
【０２７２】
抗原特異的Ｔ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏにおける頻度を決定するために、２連のそれぞれについて、ウェル当たりのスポット形成単位（ＳＦＵ）の平均数を決定し、培地対照におけるＳＦＵの平均数と比較した。技術的な反復間のウェルからウェルの変動性を説明するために、培地対照の標準偏差を算出した。抗原特異的応答が、少なくとも２つの、バックグラウンド対照を超える標準偏差であるものをＥＬＩＳＰＯＴアッセイ陽性と定義した。この基準を満たす場合、バックグラウンドを引いて抗原特異的応答を決定した。ウェル当たり≧３０ＳＦＵをＰＨＡ応答陽性と定義した。
【０２７３】
研究計画および統計分析：
ベースラインの採血からＣＤ４＋Ｔ細胞応答およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答を比較して横断的研究を行い、２つの臨床研究群、ＣＰ−ＴＢの小児またはＨＥ小児を比較した。第１の分析において、ＨＥ研究群についてＣＰ−ＴＢ群とは独立して試験し、Ｍｔｂ特異的Ｔ細胞応答の発生に対する年齢の影響を研究した。この分析のために、≦１５歳の小児全てについて試験した。次に、ＣＰ−ＴＢ研究群とＨＥ研究群を比較するために、ＣＰ−ＴＢ研究群は年齢が≦１０になるように募集されたので、コホート内の元々の年齢差異を調整するために、ＨＥ群から≦１０歳の小児のみを選択した。
【０２７４】
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイのデータ（ＳＦＵ）をエクセル（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  ＣＯＲＰ，Ｒｅｄｍｏｎｄ，ＷＡ，ＵＳＡ）からＳＡＳデータファイルにインポートし、全ての分析をＳＡＳバージョン９．１（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ，Ｃａｒｙ，ＮＣ，ＵＳＡ）を使用して行った。連続変数に対してスチューデントのｔ検定、およびカテゴリー変数に対してカイ二乗（または指示がある場合フィッシャー抽出）を使用して、ＨＥおよびＣＰ−ＴＢおよび確証ＴＢ（Ｃ−ＴＢ）の間のベースライン一変量比較を行った。同様に、臨床研究群によるＥＬＩＳＰＯＴアッセイ陽性の頻度のカテゴリー比較を、カイ二乗検定を用いて評価した。連続変数に対してノンパラメトリック分析（ウィルコクソン順位和）を使用してバックグラウンドを超えるＳＦＵを比較した。感受性を、ＣＰ−ＴＢ群またはＣ−ＴＢ群単独からのアッセイ陽性の数割る解釈可能なアッセイの総数として算出した。特異性を、ＨＥ群におけるアッセイ陰性の数割る解釈可能なアッセイの総数として算出した。
【０２７５】
ＣＰ−ＴＢに関する因子を研究するために、いくつかのモデルを評価して、潜在的交絡変数を調整しながら臨床研究群との関連に対するＥＬＩＳＰＯＴアッセイ陽性の影響力を研究した。この点において、ＣＰ−ＴＢ臨床研究群であること対ＨＥであることのオッズを、ＣＤ８のＥＬＩＳＰＯＴアッセイ、ＣＤ４のＥＬＩＳＰＯＴアッセイ、年齢（０〜５歳、５〜１０歳）、栄養状態（ＢＭＩ）、およびＴＳＴの結果によって説明してモデリングした。まず、ＣＤ８のＥＬＩＳＰＯＴおよびＣＤ４のＥＬＩＳＰＯＴの単独の予測値を下記のモデルにおいて試験した：（１）対数オッズ（臨床研究群）＝α＋β１（＋ＣＤ８ＥＬＩＳＰＯＴ／−ＣＤ８ＥＬＩＳＰＯＴ）＋β２（年齢）＋β３（ＺＢＭＩ）＋β４（ＴＳＴ）；（２）対数オッズ（臨床研究群）＝α＋β１（＋ＣＤ４ＥＬＩＳＰＯＴ／−ＣＤ４ＥＬＩＳＰＯＴ）＋β２（年齢）＋β３（ＺＢＭＩ）＋β４（ＴＳＴ）。どちらのモデルにおいても、参照の臨床研究群はＨＥ群であった。ＣＤ８のＥＬＩＳＰＯＴアッセイおよびＣＤ４のＥＬＩＳＰＯＴアッセイの予測値を同じモデルで評価した。この点において、下記のモデル：対数オッズ（臨床研究群）＝α＋β１（ＣＤ８ＥＬＩＳＰＯＴ）＋β２（ＣＤ４ＥＬＩＳＰＯＴ）＋β３（年齢）＋β４（ＺＢＭＩ）＋β５（ＴＳＴ）が適合し、参照の臨床研究群はまたＨＥ群であった。次いで、全てのモデルに対して逆向きロジスティック回帰を行ってモデルの適合を増加させた。
【０２７６】
結果
ＨＥの小児における、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答に対する年齢の影響を研究するために、≦１５歳の保菌容疑者家庭の小児１２９人（図９ａ）を評価した。ベースラインの登録から６カ月以内にＴＢを発症した小児２０人およびＨＩＶ陽性であることがわかった小児５人を除外に含めた。したがって、≦１５歳の保菌容疑者家庭１０４人に対してＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行い、最終的な分析には９８個のＰＢＭＣのＥＬＩＳＰＯＴアッセイおよび７９個のＣＤ８のＥＬＩＳＰＯＴアッセイが含まれた。ＨＥコホートとＣＰ−ＴＢコホート（≦１０歳）間のＣＤ４＋Ｔ細胞応答とＣＤ８＋Ｔ細胞応答を比較するために、≦１０歳であるＨＥの小児からのＥＬＩＳＰＯＴアッセイのデータのみを含めた。ＨＥの小児６２人に対して行ったＥＬＩＳＰＯＴアッセイをこの比較分析のために含めた（図９ａ）。ＣＰ−ＴＢ群に関して、ＴＢの疑いのあるＨＩＶ陰性の小児１０１人（表ＶＩ）を適格性について評価した。これらのうち、確証ＴＢまたは推定ＴＢの小児９６人を登録し、ＣＤ４のＥＬＩＳＰＯＴおよびＣＤ８のＥＬＩＳＰＯＴを行い、それぞれ、８２個のＰＢＭＣのＥＬＩＳＰＯＴアッセイおよび８７個のＣＤ８のＥＬＩＳＰＯＴアッセイが解釈可能であり、最終的な分析に含めた（図９ｂ）。健康なＴＢ曝露小児、確証ＴＢおよび推定ＴＢの小児、および確証ＴＢの小児の間で、解釈可能な試料の数に有意な差はなかった。
【０２７７】
【表６】
2012503206.tif 000041
臨床研究群に登録された全ての小児（ＨＥ（≦１０歳）およびＣＰ−ＴＢ）の臨床特性および比較を表ＶＩＩに示す。
【０２７８】
表ＶＩＩ．ＨＥ研究群およびＣＰ−ＴＢ研究群のベースラインの特性
連続変数に対して報告したｐ値は、スチューデントのｔ検定（ζ）Ｓａｔｔｅｒｔｈｗａｉｔｅ不等分散を使用して算出した。カテゴリーデータ（ＴＳＴおよび性別）に対するｐ値は、カイ二乗法を使用して算出した。
【０２７９】
【表７】
2012503206.tif 000042
ＣＰ−ＴＢの小児は、ＨＥコホートよりも栄養不良がひどく（ｐ＜０．００１）、わずかに年齢が下であった（０．０１）。ＴＳＴ陽性の頻度はＨＥの小児とＣＰ−ＴＢの小児のどちらでも同等であった。確証ＴＢ（Ｃ−ＴＢ）の小児は、ＨＥの小児（ｐ＜０．００１）および推定ＴＢの小児（Ｐ−ＴＢ、ｐ＝０．０１）よりも栄養不良がひどかったが、年齢、性別、またはＴＳＴの結果は、ＨＥの小児またはＰ−ＴＢの小児と差異がなかった。ＨＥ臨床研究群（≦１０歳）およびＣＰ−ＴＢ臨床研究群に登録された、ＥＬＩＳＰＯＴの結果が解釈可能な小児のみのベースラインの臨床特性（年齢、性別、ＢＭＩ、およびＴＳＴの状態）は、登録された全小児のベースラインの臨床特性と異ならなかった。
【０２８０】
まず、小児における経時的なＭｔｂ特異的Ｔ細胞応答の獲得を比較するために、ＨＥコホートにおいてＭｔｂ特異的Ｔ細胞応答の大きさを分析し、＜５歳の小児と５≦１５歳の小児を比較した。どちらの年齢群においても強いＣＤ４＋Ｔ細胞応答が観察されたのに対して、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、年長の小児に比べて＜５歳の小児では低下した（ｐ＝０．０５５、図１０）。これらのデータにより、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答が、年少の小児では不十分であることが実証された。
【０２８１】
次に、Ｍｔｂ特異的Ｔ細胞応答を、ＨＥの小児とＴＢの小児との間で比較した。ＨＥコホートに比べ、確証ＴＢの小児（Ｃ−ＴＢコホート、ｐ＝０．００１、図３ａ）および全てのＴＢの小児（ＣＰ−ＴＢコホート、ｐ＝０．００８）ではＣＤ８のＥＬＩＳＰＯＴアッセイ陽性の割合が多かった。ＣＤ４（ＰＢＭＣ）のＥＬＩＳＰＯＴアッセイ陽性の割合は、ＨＥコホートよりもＣ−ＴＢコホートで多かったが（ｐ＝０．０２、図３ａ）、ＣＰ−ＴＢコホートとＨＥコホートでは同等であった（ｐ＝０．１４）。次いで、ＨＥコホート、Ｃ−ＴＢコホートおよびＣＰ−ＴＢコホートを、年齢による階層ごとに比較した。全ての小児からのアッセイ結果と同様に、ＨＥの小児と５歳未満のＴＢの小児だけを比較した場合、ＣＤ８のＥＬＩＳＰＯＴアッセイ陽性の割合は、確証ＴＢの小児（Ｃ−ＴＢコホート、ｐ＝０．００９、図１１ｂ）および全てのＴＢの小児（ＣＰ−ＴＢコホート）で多かった。しかし、＜５歳の小児のみを考慮した場合、ＣＤ４（ＰＢＭＣ）のＥＬＩＳＰＯＴアッセイ陽性の割合は、全てのコホート間で同等であった（図１１ｂ）。５≦１０歳の小児の間で、ＣＤ８のＥＬＩＳＰＯＴアッセイ陽性およびＣＤ４（ＰＢＭＣ）のＥＬＩＳＰＯＴアッセイ陽性の割合は、ＨＥコホートに比べてＣＰ−ＴＢコホートで多かったが、Ｃ−ＴＢコホートとＨＥコホートでは同等であった。
【０２８２】
ＴＢを同定するためのＣＤ４のＥＬＩＳＰＯＴアッセイおよびＣＤ８のＥＬＩＳＰＯＴアッセイの試験性能の評価は、コホートのサイズが小さいことにより制限されたが、感受性および特異性を算出するために、それぞれ、ＴＢコホートの最も信頼できる基準としてＣ−ＴＢ、およびＨＥコホートを使用してＥＬＩＳＰＯＴアッセイ陽性の感受性および特異性の予備分析を行った。≦５歳の小児において、ＣＤ４のＥＬＩＳＰＯＴアッセイおよびＣＤ８のＥＬＩＳＰＯＴアッセイの感受性は同等であった（それぞれ、Ｃ−ＴＢ（ＣＩ  ０．３０〜０．７８）５６％、およびＣ−ＴＢ（ＣＩ  ０．２４〜０．７１）４７％）。しかし、ＣＤ８のＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、ＣＤ４のＥＬＩＳＰＯＴアッセイよりも特異的であった（それぞれ、８８％ＣＩ  ０．６８〜０．９７、および６２％ＣＩ  ０．４４〜０．７８）。
【０２８３】
５＞１０歳の小児において、ＣＤ４のＥＬＩＳＰＯＴアッセイおよびＣＤ８のＥＬＩＳＰＯＴアッセイの感受性および特異性は同様であった（感受性、ＣＤ４  １００％（ＣＩ  ０．４７〜１．０）］、ＣＤ８、８６％［（ＣＩ  ０．０．４２〜０．９９）］；特異性、ＣＤ４  ６３％［ＣＩ  ０．４０〜０．８２］、ＣＤ８  ７０％［ＣＩ  ０．４５〜０．８８］）。次いで、どの変数が、年齢階層を渡ってＥＬＩＳＰＯＴの陽性または陰性に影響および／または交絡し得るかが問われた。ロジスティック回帰分析を行ってＣＰ−ＴＢに関連する共変量をモデリングし、ＣＤ８のＥＬＩＳＰＯＴおよびＣＤ４のＥＬＩＳＰＯＴ、年齢、栄養状態（Ｚスコア／ＢＭＩ）、およびベースラインのＴＳＴの状態を含めた。最初の２つのモデルについて、ＣＤ８のＥＬＩＳＰＯＴ陽性およびＣＤ４のＥＬＩＳＰＯＴ陽性に対する共変量を独立にモデリングし、次いで第３の反復の表ＶＩＩＩで一緒にした。
【０２８４】
【表８】
2012503206.tif 000043
表ＶＩＩＩ：ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果の多変量ロジスティック回帰分析
＊確証ＴＢまたは推定ＴＢを有する対数オッズを、モデル１〜３に示した種々の共変量によってモデリングした。モデル１において、確証ＴＢまたは推定ＴＢを有するオッズは、ＣＤ８のＥＬＩＳＰＯＴが陽性の小児において３．８倍高かった（Ｈｏｓｍｅｒ  Ｌｅｍｅｓｈｏｗの適合度０．０７）。対照的に、モデル２に示したように、ＣＤ４のＥＬＩＳＰＯＴは、確証ＴＢまたは推定ＴＢを有することに関連しなかった（Ｈｏｓｍｅｒ  Ｌｅｍｅｓｈｏｗの適合度ｐ＝０．１５）。ＣＤ８のＥＬＩＳＰＯＴおよびＣＤ４のＥＬＩＳＰＯＴに対する共変量を両方含めたモデル３において、確証ＴＢまたは推定ＴＢを有するオッズは、そのモデルにおいて他の共変量について調整したＣＤ８のＥＬＩＳＰＯＴが陽性の小児において４．７倍高かった（Ｈｏｓｍｅｒ  Ｌｅｍｅｓｈｏｗの適合度０．２１）。
【０２８５】
ＣＤ８  Ｔ細胞のＥＬＩＳＰＯＴが陽性の小児のＣＰ−ＴＢを有するオッズは、年齢、ＢＭＩ、およびベースラインのＴＳＴで調整した健康な曝露された小児のＣＰ−ＴＢを有するオッズと比べて３．８倍高かった（ｐ＝０．００４）。比較すると、ＣＤ４のＥＬＩＳＰＯＴが陽性の小児の、ＣＰ−ＴＢを有するオッズは高くなかった。ＣＤ８のＥＬＩＳＰＯＴの共変量とＣＤ４のＥＬＩＳＰＯＴの共変量の両方を含めたモデルにおいて、ＣＤ８のＥＬＩＳＰＯＴ陽性の存在は、ＣＤ４のＥＬＩＳＰＯＴの結果で調整したＣＰ−ＴＢを有することと有意に関連した。モデルの適合を増加させるために、逆向きロジスティック回帰を利用した。このモデルでは、ＣＤ８のＥＬＩＳＰＯＴが陽性の誰かが確証ＴＢまたは推定ＴＢを有するオッズは、年齢のみで調整した健康な曝露群の誰かが確証ＴＢまたは推定ＴＢを有するオッズの４．６倍（ＣＩ  １．８〜１２．１）であった（ｐ＝０．００２）。ＣＤ４  Ｔ細胞のＥＬＩＳＰＯＴは、全体のモデルの適合を増大させず、逆向き反復選択プロセスにおいてＢＭＩおよびＴＳＴの状態と共に排除された（Ｈｏｓｍｅｒ  Ｌｅｍｅｓｈｏｗの適合度ｐ＝０．６８）。
【０２８６】
臨床研究群間のＣＤ８＋Ｔ細胞応答およびＣＤ４＋Ｔ細胞応答の大きさ（図１２）。≦５歳の小児について、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の大きさは、ＴＢの小児（ＣＰ−ＴＢ、ｐ＝０．０１；Ｃ−ＴＢ、ｐ＝０．００９）において大きかったが、一方、ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＰＢＭＣ）応答は、臨床群間で同等であった。同様に、５≦１０歳の小児について、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答およびＣＤ４＋Ｔ細胞応答の大きさは、ＨＥコホート、ＣＰ−ＴＢコホート、およびＣ−ＴＢコホート間で同等であった。
【０２８７】
（実施例６）
肺外ＴＢの診断
肺外結核の診断は特に難易度が高い。ＥＳＡＴ−６およびＣＦＰ−１０に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答について、ウガンダの肺外結核の小児において研究した。肺外ＴＢの小児において、ＣＤ８のＥＬＩＳＰＯＴアッセイは５１％が陽性であった。また、肺外ＴＢの小児におけるＣＤ８＋Ｔ細胞応答の大きさは、胸腔内ＴＢの小児におけるＣＤ８＋Ｔ細胞応答の大きさに相当した（図８）。したがって、肺外ＴＢを診断するためにＣＤ８  Ｔ細胞に基づいた試験を使用することができる。
【０２８８】
（実施例７）
大規模確認臨床試験
Ａ．研究への参加者
入院した＜５歳の小児を臨床試験に登録する。年長の小児およびＨＩＶに感染している小児は研究から除外する。研究計画は、（ｎ＝８０の推定ＴＢ＋確証ＴＢ；ｎ＝〜２０の確証ＴＢ）の小児のコホートとＴＢではない下気道感染症（ＬＲＴＩｎｏｔＴＢ）の小児のコホート（ｎ＝５０）を比較するためのものである。小児におけるＴＢを暫定的に診断するためのＷＨＯガイドラインを使用して胸腔内ＴＢの初期の割り当てを行い、推定胸腔内ＴＢの小児を登録する。これらのガイドラインの要約は表１に示す。具体的には、臨床歴、ＴＳＴおよびＣＸＲの結果を使用して推定ＴＢの暫定的な診断を行う。追加の算入基準として、１カ月未満のＴＢの治療を含める。登録した２カ月後、抗ＴＢ治療に対する応答および他の診断の除外、ならびにＭｔｂ培養の結果を含めた臨床的な経過観察を使用して確証ＴＢ、推定ＴＢ、またはＴＢではないことの最終的な割り当てを行う。２カ月の経過観察で割り当てられた、確証ＴＢまたは推定ＴＢを有する小児を、胸腔内ＴＢ群全体の中に保持する。２カ月の時点でＴＢを有さない小児は分析から除外する。診断は、ＴＢ症例の＜４０％の培養によって確認することができるため、Ｍｔｂ培養による確認を研究に算入する必要はない。しかし、データ分析のために、確証ＴＢ（培養によって確認された胸腔内ＴＢ）の胸腔内ＴＢコホートのサブセットは、ＬＲＴＩｎｏｔＴＢコホートとの一次比較を表す。ＬＲＴＩｎｏｔＴＢコホート群は、異常なＣＸＲならびに肺炎と対応する症状および徴候によって定義されるＬＲＴＩの小児として定義される。さらに、このコホートは、表において定義した通りＴＢの疑いを有してはならない。
【０２８９】
【表９】
2012503206.tif 000044
ＬＲＴＩｎｏｔＴＢコホートについて、胸腔内ＴＢコホートと同じ臨床的な研究室実験を行う。胸腔内ＴＢコホートのように、２カ月の臨床的な経過観察を使用して、ＬＲＴＩｎｏｔＴＢの最終的な割り当てを行う。これらの小児のいずれかにおいてＭｔｂ培養が予想外に陽性である場合、そのときはそれらの小児をＬＲＴＩｎｏｔＴＢ群についての分析から除外する。
【０２９０】
提案した研究のために、小児について、誰が＜５歳でＬＲＴＩの症状および徴候を有するかを同定する。履歴および身体検査を行い、ＣＸＲを得、ＨＩＶスクリーニングの結果を調査する。ＨＩＶ  ＥＬＩＳＡの結果が陽性である＜１８カ月の小児については、感染を確認するためにＨＩＶ  ＰＣＲ試験が必要である。ＨＩＶの血清学的検査が陰性である全ての小児、およびＨＩＶ  ＥＬＩＳＡが陽性であるがＨＩＶ  ＰＣＲが陰性である＜１８カ月の小児をこの研究に含めることができる。ＨＩＶの血清学的検査が陽性である小児は、ＨＩＶ  ＰＣＲ試験が利用可能でないまたはＨＩＶ  ＰＣＲ試験が陽性である＜１８カ月の小児を含め、研究から除外する。上記で定義した胸腔内ＴＢまたはＬＲＴＩｎｏｔＴＢの基準を満たす、ＨＩＶに感染していない＜５歳の小児を登録する。全ての被験体について、ＴＳＴ設置およびＡＦＢスメアのための痰の誘導および培養を行う。ＴＳＴは、精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ、５ＴＵ、Ｔｕｂｅｒｓｏｌ；Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｃａｎａｄａ）およびマントゥー法を使用して行う。ＡＦＢスメアのための痰の誘導および培養を行う。登録時に被験体の血液採取をし、＞２５×１０６個のＰＢＭＣを単離して抗原の組合せ５種全てについての研究を完了する。２カ月の時点で、被験体を経過観察研究来診のために呼び戻す。この来診において、被験体の暫定的な履歴および検査結果を調査する。この時点で、この研究コホート（胸腔内ＴＢおよびＬＲＴＩｎｏｔＴＢ）に対する最終的な割り当てを行う。
【０２９１】
Ｂ．人口統計データ、臨床データ、および免疫学的データについてのデータ管理
この研究では、ＣＷＲＵ  ＴＢＲＵデータ管理インフラまたは他の類似のデータ管理プログラムを使用する。例えば、ＴＥＬＥｆｏｒｍ（商標）Ｖ５  Ｅｌｉｔｅ  ソフトウェア（Ｃａｒｄｉｆｆ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ  Ｍａｒｃｏｓ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用することができ、これにより遠く離れた場所からの自動データ入力がもたらされる。簡単に述べると、ウガンダのデータ管理者によって、データの収集フォームが展開され、ＴＥＬＥｆｏｒｍ（商標）ソフトウェアを有するインターフェイスにフォーマットされる。患者に遭遇した後、データフォームのコピーの一方は臨床カルテに置かれ、他方のフォームはオンサイトデータセンターに送られ、そこで複数頁のＴＩＦ（タグイメージファイル形式）画像ファイルにスキャンされる。これらのファイルは、圧縮され保存される。ＴＩＦデータファイルは、次いで既定の電子テンプレートに従ってフォームを並べてデータを記録するＴＥＬＥｆｏｒｍ（商標）プログラムに読み込まれ、次いで、データはデータベース管理システム内に移動される。電子データベースに入ると、データは標準プログラムの使用により編集および浄化されて、欠落したデータおよび範囲外の値にフラグがたてられる。データセンターから形式的な質問が発せられ、オンサイトのデータ管理者がその質問を解決し、データベースを修正し、変更を記録する。電子データは、例えば毎日のようにバックアップされる。
【０２９２】
この研究に関する人口統計的特性および臨床的特性としては、年齢、性別、疾患の明細、ＨＩＶについての血清の状態、ＢＣＧワクチン接種状況、年齢に対する体重、および年齢に対する身長、ＴＳＴの結果、およびＭｔｂ培養の結果に属する特性が挙げられる。さらに、登録された全ての小児について、栄養についての評価を行い、年齢に対する体重および身長に対してＺ値を算出する。最後に、データベースで使用するために、各被験体に唯一の識別番号を割り当てる。
【０２９３】
Ｃ．胸腔内ＴＢの小児およびＬＴＢＩｎｏｔＴＢの小児におけるＭｔｂ抗原ＣＤ８＋Ｔ細胞の存在
ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイならびに抗原提示細胞（ＡＰＣ）の供給源としてＣＤ４およびＣＤ５６が除去されたＰＢＭＣならびに反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞を使用して、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を測定する。具体的には、冷凍保存されたＰＢＭＣに対してＣＤ８のＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行う。ペプチドでパルス処理したＤＣは、ｅｘ  ｖｉｖｏでＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発するための最も感受性が高く特異的な方法であるが、ＤＣを生成するために十分なＰＢＭＣおよび高度に精製されたＣＤ８＋Ｔ細胞を必要とする。これらの研究のために、入手可能な血液の量および長期培養（ＤＣ）を行う能力は限られている。代替の手法は、ＣＤ４＋Ｔ細胞を除去し、ＡＰＣとして自己の単核細胞を使用することである。予備実験において、ＰＢＭＣのＣＤ４の除去により、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞の除去によって排除され得る高バックグラウンドが生じた。ＤＣの使用と直接比較すると、この方法は、抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞を列挙することにおいておよそ８０％効率がよい。したがって、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を測定するために、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいてＣＤ４  ＣＤ５６細胞が除去されたＰＢＭＣ磁気ビーズ（細胞２５０，０００個／ウェル）を使用する。２つの抗原の組合せを表している合成ペプチドプール（１１個のアミノ酸がオーバーラップした１５ｍｅｒ）を抗原の供給源として使用する。２つの抗原の組合せは、ＣＦＰ１０／ＥＳＡＴ６、ＣＦＰ１０／ＥｓｘＪ、ＣＦＰ１０／ＰＰＥ５１、ＣＦＰ１０／ＣＦＰＦ、ＣＦＰ１０／ＰＰＥ１５の組合せについて４３ペプチド、５０ペプチド、７２ペプチド、７２ペプチド、および７２ペプチドによって表される。結果として、ＣＤ８抗原の組合せ５種に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、わずか１０００万個の凍結保存されたＰＢＭＣを使用することで定義され、全血は１〜５ｍｌ必要である。注目すべきは、乳児の血液からは、全血１ｍｌ当たり１０００万個ものＰＢＭＣが得られるのに対して、年長の小児および成人からの血液から得られるＰＢＭＣは１ｍｌ当たり１００万〜２００万個であるので、年下の小児に対して必要な血液の方が少量である。アッセイは、実験ウェル中のＳＦＵ引く対照（培地）ウェル中のＳＦＵが、対照ウェルの標準偏差の２倍を超える場合に陽性であるとみなす。次に応答の大きさをＳＦＵ／細胞２５０，０００個として表示する。磁気ビーズ除去の効率の対照として、ＣＤ４に対する細胞表面染色およびフローサイトメトリーでの分析により、ＣＤ４＋Ｔ細胞の混入のパーセンテージを決定する。ＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージが５％を上回った場合、いずれのＥＬＩＳＰＯＴアッセイも無効とみなす。
【０２９４】
Ｄ．胸腔内ＴＢの小児およびＬＴＢＩｎｏｔＴＢの小児においてＭｔｂ抗原ＣＤ４＋Ｔ細胞は存在するか？コホート間で比較して、アッセイ陽性の頻度および陽性応答の大きさはどうか？
ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を比較するために、Ｍｔｂ抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答の測定として、応答性ＣＤ４＋Ｔ細胞の供給源としてＣＤ８＋Ｔ細胞が除去されたＰＢＭＣ、およびＡＰＣとして残りの細胞を使用してＣＤ４＋のＥＬＩＳＰＯＴを行う。これは、ＰＢＭＣ、ＥＳＡＴ６／ＣＦＰ１０ペプチド、およびＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用するＴ−ｓｐｏｔ（登録商標）ＴＢに非常に類似したアッセイである。ＣＤ４＋Ｔ細胞および単核細胞／ＡＰＣ両方の供給源として、凍結保存された、ＣＤ８細胞が除去されたＰＢＭＣ磁気ビーズ（細胞２５０，０００個／ウェル）を使用してＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴを行う。抗原の供給源としてＣＤ８のアッセイのために使用したものと同じ合成ペプチドプールを使用する。抗原の組合せ５種に対するＣＤ４＋Ｔ細胞応答は、わずか３００万個の凍結保存されたＰＢＭＣを使用して定義することができる。アッセイは、実験ウェル中のＳＦＵ引く対照（培地）ウェル中のＳＦＵが、対照ウェルの標準偏差の２倍を超える場合に陽性であるとみなす。次に応答の大きさをＳＦＵ／細胞２５０，０００個として表示する。磁気ビーズ除去の効率の対照として、ＣＤ８に対する細胞表面染色およびフローサイトメトリーでの分析により、ＣＤ８＋Ｔ細胞の混入のパーセンテージを決定する。ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージが５％を上回った場合、いずれのＥＬＩＳＰＯＴアッセイも無効とみなす。
【０２９５】
Ｅ．胸腔内ＴＢの小児およびＬＴＢＩｎｏｔＴＢの小児における陽性のＴＳＴ結果
ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を比較するために、上記の通り標準の方法を使用してＴＳＴを行う。ＷＨＯの基準を使用して、重篤な栄養不良の小児（Ｚスコア＞−３）については硬化が≧５ｍｍであること、残りの小児については硬化が≧１０ｍｍであることを、ＴＳＴ陽性と定義する。
【０２９６】
Ｆ．統計的考察：２つの抗原の組合せの感受性および特異性ならびに３つのＭｔｂ抗原の組合せ研究（ＳＡ２）に使用する２つの組合せの選択
プライマリーエンドポイントは、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答、およびＴＳＴの結果である。ＣＤ８＋Ｔ細胞応答およびＣＤ４＋Ｔ細胞応答は、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用したＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞によって測定する。プライマリーエンドポイントは、バックグラウンドを調整したＥＬＩＳＰＯＴの数値として定義される持続的な応答である。バックグラウンドを調整したＥＬＩＳＰＯＴの数値は、本発明者らの研究室で以前確立された基準（ＣＤ８抗原発見プログラム）に従って定義する。ＴＳＴの結果は、バイナリーエンドポイントとしてのみ分析する。
【０２９７】
プライマリーエンドポイントのために、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線法を利用し、診断精度の尺度としてＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を見積もる。抗原の組合せそれぞれについて、ＡＵＣが５０％よりも有意に大きいかどうか、すなわち、任意の診断的な有用性のエビデンスがあるかどうかを試験する。同程度の特異性を維持する間に高い感受性がもたらされるのに応じて、バックグラウンドを調整したＥＬＩＳＰＯＴの数値に対して最適なカットオフポイントを決定する。下記の主要な比較についてＲＯＣ分析を行う：培養で確認された胸腔内ＴＢ対ＬＲＴＩｎｏｔＴＢおよび全胸腔内ＴＢ（推定ＴＢ＋確証ＴＢ）対ＬＲＴＩｎｏｔＴＢ。さらに、ＬＴＢＩを有するＬＲＴＩｎｏｔＴＢを、ＴＳＴ陽性のＬＲＴＩｎｏｔＴＢコホート内の被験体として定義する。次に、下記の副次的な比較についてＲＯＣ分析を行う：培養で確認された胸腔内ＴＢ対ＬＴＢＩを有するＬＲＴＩｎｏｔＴＢ、および全胸腔内ＴＢ（推定ＴＢ＋確証ＴＢ）対ＬＴＢＩを有するＬＲＴＩｎｏｔＴＢ。転帰として疾患の状態、および共変量として抗原応答の結果（および任意の他の潜在的な交絡因子）を用いてロジスティック回帰モデリングを行う。抗原応答は、二値の共変量および連続的な共変量のどちらとしても評価することができる。参照の組合せおよび他の組合せの追加は一度に１つに含めて、それによって予測が有意に改善されたかどうかを評価する。さらに、段階的な手順を行って、疾患の転帰を予測する独立した抗原の組合せの最適な組を選択することができる。これらの分析の結果を、主要な基準と対照して考察する。
【０２９８】
試料サイズが８０の全胸腔内ＴＢ（推定ＴＢ＋確証ＴＢ）および試料サイズが５０のＬＲＴＩｎｏｔＴＢにより、８４％の力および５％の有意水準で、ＡＵＣにおける検出を１５％向上させることができる（５０％から６５％まで）。試料サイズが２０の培養で確認された胸腔内ＴＢおよび試料サイズが５０のＬＲＴＩｎｏｔＴＢにより、７７％の力および５％の有意水準で、ＡＵＣにおける検出を２０％向上させることができる（５０％から７０％まで）。１５〜２０％の向上は、上記で示した予備的なデータと一致する。
【０２９９】
結果：本明細書で同定した抗原の組合せ（ＥＳＡＴ６／ＣＦＰ１０）は、胸腔内ＴＢ群において同様の結果を有し、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、およびＴＳＴについてのアッセイ陽性がおよそ５０％である。ＬＲＴＩｎｏｔＴＢコホートにおいて、これらの抗原に対してＣＤ８＋Ｔ細胞応答は検出されない。他の４種の抗原の組合せは、ＣＦＰ１０に加えて第２の免疫優性ＣＤ８抗原を含有するので、胸腔内ＴＢ群において、ＣＦＰ１０／ＥＳＡＴ６と比較して他のＣＦＰ１０／Ｍｔｂ抗原の組合せに対してＣＤ８＋Ｔ細胞アッセイで頻度の増加が観察された。ＬＲＴＩｎｏｔＴＢ群において試験された抗原の組合せのいずれに対してもＣＤ８＋Ｔ細胞応答は検出されない。全ての抗原の組合せに対するＣＤ４＋Ｔ細胞のアッセイ、およびＴＳＴはこの群のおよそ３０％で陽性である。培養で確認された胸腔内ＴＢにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞応答陽性およびＣＤ４＋Ｔ細胞応答陽性は、胸腔内ＴＢコホート全体と比較して同様または高い割合である。
【０３００】
（実施例８）
動物モデル
結核の調査において、疾患の種々の態様をモデリングするためにマウスモデルが広範に使用されている。マウスは、静脈内、腹腔内および気管を含めた種々の経路によって感染させることができる。経路の１つは、呼吸器感染させるための微生物のエアロゾル化である。マウスをチャンバー内でエアロゾルに曝露させる（全身を弱らせるまたは鼻部のみの感染）。発明の用量は、ネブライザー内のＭｔｂ濃度または曝露時間を操作することによって変化させることができる。エアロゾルによる、約５０コロニー形成単位（ＣＦＵ）などの低用量の感染により、肺内の細菌数がゆっくり着実に増加し、一般に４週間のうちにピークに達し、これは肺内のＴ細胞の数のピークと一致する。初期は、感染の急性期であると考えられる。感染の後に、縦隔リンパ節に細菌が伝播する。Ｔ細胞の刺激は一般に２〜３週間の間に検出できる。約４週間後、細菌数は安定化し、進行が遅い病理応答がある。このシステムは、活動性感染をモデリングするために使用するものである。
【０３０１】
目的の組成物の、動物モデルにおいて感染を予防する能力を、本明細書に記載の方法を使用して評価することができる。生物学的試料中のＭｔｂポリペプチドに応答しているＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞の数などのＴ細胞応答を測定することにより、目的の組成物の有効性をモニタリングすることができる。これらのアッセイのために、一方を有するＴ細胞を少なくとも１つのＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍポリペプチド、および１つまたは複数のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍポリペプチドを提示している抗原提示細胞と接触させる。Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍポリペプチドは、（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１もしくは配列番号１２として記載したアミノ酸配列のうちの１つ、または（ｂ）主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩと特異的に結合する、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１もしくは配列番号１２として記載したアミノ酸配列のうちの少なくとも１つの少なくとも９〜１２個の連続したアミノ酸として記載したアミノ酸配列を含む。Ｔ細胞がＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍポリペプチドを特異的に認識するかどうかを決定する。Ｍｔｂポリペプチドを特異的に認識するＴ細胞の数が増加することにより、その組成物が有効であることが示される。
【０３０２】
代表的な動物モデルを以下に記載する（追加のプロトコールのために、参照により本明細書に組み込まれた、Ｒｅｐｉｑｕｅら、Ｉｎｆｅｃ．  Ｉｍｍｕｎ．  ７０巻：３３１８〜３３２３頁、２００２年も参照されたい）。
【０３０３】
Ａ．短期のマウスモデル：
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、適切なプロトコールに従って組成物でワクチン接種し、次いで４〜６週間安静にさせる。免疫されたマウスを病原性Ｍ．  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの低用量のエアロゾル（５０〜１００ＣＦＵ）を用いて感染させ、攻撃の３０日後の生存桿菌数を評価することによって防御について評価する。
【０３０４】
マウスの肺および脾臓をホモジナイズし、７Ｈ１１寒天プレート上に段階的な１０倍希釈でプレーティングすることによって生菌を計数する。プレートを最大２１日間インキュベートし、組織当たりのコロニー形成単位の数を決定する。
【０３０５】
ＢＣＧでワクチン接種したマウスは、ＰＢＳで処置したマウスと比較すると、肺および脾臓においておよそ１Ｌｏｇ１０防御する。
【０３０６】
生物学的試料は、目的の組成物を投与する前および目的の組成物を投与した後に得る。あるいは、生物学的試料は、ビヒクルで処置した動物から、および目的の組成物で処置した動物から得る。本明細書で開示したＭｔｂポリペプチドに結合するＴ細胞の数が増加することにより、その組成物が有効であることが示される。
【０３０７】
Ｂ．短期のモルモットモデル
非近交系のハートレイ系モルモットを、１つまたは複数のＭｔｂポリペプチド、またはこれらの１つまたは複数のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組成物でワクチン接種し、次いで８〜１０週間安静にさせる。免役されたモルモットを、病原性Ｍ．  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの低用量のエアロゾル（１０〜３０ＣＦＵ）を用いて感染させ、攻撃の３０日後の生存桿菌の数を評価することによって防御について評価する。
【０３０８】
モルモットの肺および脾臓をホモジナイズし、７Ｈ１１寒天プレート上に段階的な１０倍希釈でプレーティングすることによって生菌を計数する。プレートを最大２１日間インキュベートし、組織当たりのコロニー形成単位の数を決定する。組織学的分析のために肺および脾臓のセグメントも取り出す。
【０３０９】
ＢＣＧでワクチン接種したモルモットは、ＰＢＳで処置したモルモットと比較すると、肺および脾臓においておよそ２〜３Ｌｏｇ１０防御する。さらに、ＢＣＧでワクチン接種したモルモットは、ワクチン接種していない動物と比較すると、明確な肉芽腫を有する。
【０３１０】
生物学的試料は、目的の組成物を投与する前および目的の組成物を投与した後に得る。あるいは、生物学的試料は、ビヒクルで処置した動物から、および目的の組成物で処置した動物から得る。本明細書で開示したＭｔｂポリペプチドに結合するＴ細胞の数が増加することにより、その組成物が有効であることが示される。
【０３１１】
Ｃ．長期のモルモットモデル
モルモットモデルはマウスモデルと類似しているが、この実験は無期限生存型であり、２年もの間続く可能性がある。モルモットは、活動性結核（ＴＢ）を有するヒトと同様の「古典的な」肉芽腫を発生し、肺組織の壊死が進行するにつれて、ヒトと同様に体重が失われ始め、ＴＢが原因で死ぬ。肺および脾臓におけるコロニー形成単位の数を評価することができる。組織学的試験も行って肺の合併症および組織破壊の程度を決定することができる。モルモットに低用量エアロゾルを曝露させた後、微生物の数は、最初の３週間の間に連続的に増加し、次いでプラトーが慢性的状態になる。感染の後期の間、肺内の細菌負荷量が増加し、これは病的状況の悪化に関連付けられる。処置をしないと、感染したモルモットの肺において、ＣＤ４  Ｔ細胞とＣＤ８  Ｔ細胞の両方が同時に上昇する。
【０３１２】
非近交系のハートレイ系モルモットを、適切なプロトコールに従って実験ワクチンを用いてワクチン接種し、次いで８〜１０週間安静にさせる。免疫されたモルモットを、次いで病原性Ｍ．  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの低用量のエアロゾル（１０〜３０ＣＦＵ）を用いて感染させる。モルモットを、週１回計量し、疾患の徴候（呼吸が増加することおよび成長できないことなど）について毎日モニタリングする。ワクチン接種していないモルモットは、攻撃後２０〜２５週間で感染によって死亡するが、一方ＢＣＧでワクチン接種したモルモットは、攻撃後５０〜５５週間生存する。
【０３１３】
死体解剖時に、肺および脾臓を、ＣＦＵの数および病態の程度について評価する。実験組成物の相対的な防御をＢＣＧでワクチン接種した動物と比較する。
【０３１４】
生物学的試料は、目的の組成物を投与する前および目的の組成物を投与した後に得る。あるいは、生物学的試料は、ビヒクルで処置した動物から、および目的の組成物で処置した動物から得る。本明細書で開示したＭｔｂポリペプチドに結合するＴ細胞の数が増加することにより、その組成物が有効であることが示される。
【０３１５】
記載した方法または組成物の厳密な詳細は、記載した発明の精神からはずれることなく変更または改変されてよいことは明らかである。本発明者らは、下記の請求項の範囲および精神に入るそのような改変および変更全てについて特許請求する。
【図１】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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