(57)【要約】概日（ａｒｃａｄｉａｎ）リズムにおけるＡＭＰＫの役割およびこのようなリズムを調整する作用物質をスクリーニングする方法が開示される。このようなリズムを調整するために有用な組成物およびその使用も開示される。本開示は、代謝リズムまたは概日リズムの疾患または障害を決定する方法であって、ＣＲＹ１またはＣＲＹ２の安定性を、組織において２４時間周期の間に測定するステップを含み、正常または過剰ＡＴＰ濃度の存在下でのＣＲＹ１またはＣＲＹ２の長期間安定性の周期が、代謝リズムまたは概日リズムの疾患または障害を示す方法も提供する。
2012521198.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
代謝リズムまたは概日リズムの調整において用いるための作用物質を同定する方法であって、前記作用物質をＣｒｙ１またはＣｒｙ２タンパク質と接触させるステップと、Ｃｒｙ１またはＣｒｙ２をリン酸化または脱リン酸化する前記作用物質の能力を測定するステップとを含み、Ｃｒｙ１またはＣｒｙ２を改変する作用物質が、代謝リズムまたは概日リズムを調整するために有用な小分子作用物質である方法。
【請求項２】
前記作用物質が、Ｓ７１またはＳ２８０でのリン酸化に影響する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＡＭＰＫの活性の変化を測定するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記作用物質が、Ｃｒｙ１またはＣｒｙ２の安定性を低下させる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記作用物質が、安静状態を促進する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記作用物質が、ペプチド、ポリペプチド、抗体、抗体フラグメント、核酸および小分子からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記作用物質が、ＡＭＰＫアゴニストである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法により同定される作用物質であって、Ｃｒｙ１またはＣｒｙ２の安定性を低下させる作用物質を含む組成物。
【請求項９】
被験体を、請求項１に記載の方法により同定される作用物質であって、Ｃｒｙ１および／またはＣｒｙ２のリン酸化または脱リン酸化を促進する作用物質と接触させるステップを含む、代謝性または概日性の疾患または障害を治療する方法。
【請求項１０】
被験体における代謝障害および概日リズムの治療用の医薬品の調製において用いるための、クリプトクロム転写同時制御因子機能を調整する、請求項１に記載の方法により同定される作用物質の使用。
【請求項１１】
前記作用物質が、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）アルファ、ベータ（デルタ）およびガンマを調整する、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記作用物質が、ビグアナイド誘導体、ＡＩＣＡＲ、メトホルミンまたはその誘導体、フェンホルミンまたはその誘導体、レプチン、アディポネクチン、ＡＩＣＡＲ（５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミド）、ＺＭＰ、ＤＲＬ−１６５３６、ＢＧ８００化合物（Ｂｅｔａｇｅｎｏｎ）およびフラン−２−カルボン酸誘導体からなる群から選択されるＡＭＰＫアゴニストである、請求項１０に記載の使用。
【請求項１３】
前記被験体が哺乳類である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１４】
有効量が、単一用量または分割用量での１日あたり約０．５ｍｇ／ｋｇ〜１日あたり約１００ｍｇ／ｋｇである、請求項１０または１２に記載の使用。
【請求項１５】
前記作用物質が、経口投与、静脈内注射、筋肉内注射、硬膜外送達、頭蓋内、局所、眼内、坐剤または皮下注射用に製剤化される、請求項１０または１２に記載の使用。
【請求項１６】
ＣＲＹ１またはＣＲＹ２のリン酸化を調整するか、またはクリプトクロム転写同時制御因子機能を調整する作用物質と、少なくとも１つの他の概日リズム改変作用物質または代謝改変作用物質とを含む組成物。
【請求項１７】
前記少なくとも１つの他の概日リズム改変作用物質が、睡眠補助剤である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
ビグアナイド誘導体、ＡＩＣＡＲ、メトホルミンまたはその誘導体、フェンホルミンまたはその誘導体、レプチン、アディポネクチン、ＡＩＣＡＲ（５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミド）、ＺＭＰ、ＤＲＬ−１６５３６、ＢＧ８００化合物（Ｂｅｔａｇｅｎｏｎ）およびフラン−２−カルボン酸誘導体からなる群から選択されるＡＭＰＫアゴニストを含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
化合物が、経口投与、静脈内注射、筋肉内注射、硬膜外送達、局所、坐剤による、眼送達、頭蓋内送達または皮下注射用に製剤化される、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２０】
哺乳類における睡眠を調整する方法であって、哺乳類における概日リズムまたは代謝を調整するのに有効な量のＣＲＹ１またはＣＲＹ２を不安定化する作用物質を前記哺乳類に投与するステップを含む方法。
【請求項２１】
前記哺乳類がヒトである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記概日リズムが睡眠行動である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
被験体における概日リズムまたは睡眠を調整する作用物質を同定する方法であって、
（ａ）ＡＭＰＫまたはＬＫＢ１経路を備える試料を少なくとも１つの被検作用物質と接触させるステップと、
（ｂ）ＣＲＹ１またはＣＲＹ２経路の活性を、前記被検作用物質の存在下および非存在下で比較するステップであって、ＣＲＹ１またはＣＲＹ２の活性または安定性を変化させる被検作用物質が、概日リズム調整活性を有する作用物質を示すステップと
を含む方法。
【請求項２４】
細胞における概日サイクルまたは代謝サイクルを調整する作用物質を同定する方法であって、前記細胞を前記作用物質と接触させるステップであって、前記細胞が、Ｃｙｒ１またはＣｒｙ２を含むＡＭＰＫ経路またはＬＫＢ１経路を備えるステップと、Ｃｒｙ１およびＣｒｙ２活性に対する前記作用物質の影響を測定するステップであって、Ｃｒｙ１またはＣｒｙ２の活性の変化が、概日サイクルまたは代謝サイクルを調整できる作用物質を示すステップとを含む方法。
【請求項２５】
代謝リズムまたは概日リズムの疾患または障害を決定する方法であって、ＣＲＹ１またはＣＲＹ２の安定性を、組織において２４時間周期の間に測定するステップを含み、正常または過剰ＡＴＰ濃度の存在下でのＣＲＹ１またはＣＲＹ２の長期間安定性の周期が、代謝リズムまたは概日リズムの疾患または障害を示す方法。
【請求項２６】
安静および脂質異化反応を促進する方法であって、概日サイクルの夜間期の間にＡＭＰＫアゴニストを投与するステップを含み、前記ＡＭＰＫアゴニストが、ＣＲＹ１またはＣＲＹ２の安定性を低下させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本願は、２００９年３月２０日に出願された米国仮特許出願第６１／１６２，２１９号の利益を主張し、本明細書において参考として援用される。
【０００２】
（政府支援の認可）
本研究は、国立衛生研究所助成金番号ＤＫ０５７９７８、ＤＫ０６２４３４、ＣＡ１０４８３８、ＤＫ０８０４２５、およびＥＹ０１６８０７により支援された。合衆国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
本開示は、概日リズムを調整するためのＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）のアゴニストおよびアンタゴニストの使用に関する。より具体的には、本開示は、睡眠行動をスクリーニングし、調整するための組成物および方法を提供する。
【背景技術】
【０００４】
概日時計は、哺乳動物の組織における何千もの遺伝子のリズム性の転写を駆動することにより、行動プロセスおよび生理的プロセスを毎日の明暗サイクルに調和させる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本開示は、ＡＭＰＫが、転写リプレッサーＣＲＹ１およびＣＲＹ２をリン酸化し、それらのプロテアソーム分解を刺激することを証明する。さらに、本開示は、クリプトクロムが、哺乳動物概日時計におけるそれらの確立された機能に加えていくつかの核ホルモン受容体と結合し、その転写活性を調節することを証明する。本開示は、クリプトクロムタンパク質が、ＡＭＰＫ活性化薬物を用いる治療に対する転写応答の部分集合にとって必要であることも証明する。よって、クリプトクロムの薬理学的調整は、代謝障害の治療において有用である。
【０００６】
クリプトクロム転写同時制御因子機能を調整する小分子薬物の使用は、それらに限定されないが、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ＰＰＡＲアルファ、ベータ、デルタおよびガンマを含む確立された代謝的に重要な転写因子の転写活性をクリプトクロムが調節することが証明されているので、代謝障害の治療において有用である。クリプトクロムは、天然の小分子補助因子（触媒性補助因子であるフラビンアデニンジヌクレオチドまたはＦＡＤ、および集光性補助因子である５，１０−メテニルテトラヒドロフォリルポリグルタメートまたはＭＴＨＦ）と結合してそれにより調節されるので、クリプトクロムは、合成小分子による調節のための良好な標的である。
【０００７】
本開示は、エネルギーセンサであるＡＭＰＫが、ＣＲＹ１（そのリン酸化は、ＣＲＹ１−ＦＢＸＬ３相互作用およびＣＲＹ１のプロテアソーム分解を媒介する）中の２つのセリンを修飾することを証明する。つまり、ＣＲＹ１は、元来、光受容体として進化したが、翻訳後修飾により、これは重要なシグナル伝達メディエーターとなり得る。ｉｎ  ｖｉｖｏでのＡＭＰＫの遺伝子操作または薬理学的操作は、クリプトクロム安定性と概日リズムとを共に変更し、このことは、それにより栄養調節シグナルが哺乳動物末梢器官における概日時計をリセットできる新規な同調化機構を示唆する。
【０００８】
本開示は、ヒトのような哺乳動物被験体において概日リズムを改変するための方法および組成物を提供する。本開示は、ＡＭＰＫが、哺乳動物被験体の概日サイクルの間に、脳および体内の他の組織において修飾されることを証明する。１つの実施形態において、本開示は、被験体における概日リズムを調整するための医薬品の製造のための、ＡＭＰキナーゼアゴニストまたはアンタゴニストの使用を提供する。１つの実施形態において、ＡＭＰＫアゴニストは、ＡＩＣＡＲである。別の実施形態において、ＡＭＰＫアンタゴニストは、抗体もしくはコンパウンドＣまたはそれらの類似体もしくは誘導体である。さらに別の実施形態において、ＡＭＰＫアゴニストは、血液脳関門を通過することができる製剤または誘導化を含む。まださらなる実施形態において、ＡＭＰＫアゴニストは、経口投与、静脈内注射、筋肉内注射、硬膜外送達、頭蓋内または皮下注射用に製剤化される。
【０００９】
本開示は、概日リズムを改変する第２活性成分と組み合わせて製剤化されたＡＭＰＫアゴニストを含む組成物も提供する。１つの実施形態において、第２活性成分は、睡眠補助剤である。さらなる実施形態において、組成物は、経口投与、静脈内注射、筋肉内注射、硬膜外送達、頭蓋内送達または皮下注射用に製剤化される。
【００１０】
本開示は、哺乳類における睡眠を調整する方法であって、哺乳類における概日リズムを調整するのに有効な量のＡＭＰＫアゴニストまたはアンタゴニストを哺乳類に投与するステップを含む方法を提供する。
【００１１】
本開示は、被験体における概日リズムまたは睡眠を調整する作用物質を同定する方法であって、（ａ）ＡＭＰＫ経路を備える試料を少なくとも１つの被検作用物質と接触させるステップと、（ｂ）ＡＭＰＫまたはＡＭＰＫ経路の活性を、被検作用物質の存在下および非存在下で比較するステップであって、前記活性を変化させる被検作用物質が、概日リズム調整活性を有する作用物質を示すステップとを含む方法も提供する。
【００１２】
本開示は、代謝リズムまたは概日リズムの調整において用いるための作用物質を同定する方法であって、前記作用物質をＣｒｙ１またはＣｒｙ２タンパク質と接触させるステップと、Ｃｒｙ１もしくはＣｒｙ２をリン酸化もしくは脱リン酸化するか、またはＣｒｙ１もしくはＣｒｙ２の安定性もしくは発現を改変する前記作用物質の能力を測定するステップとを含み、Ｃｒｙ１またはＣｒｙ２を改変する作用物質が、代謝リズムまたは概日リズムを調整するために有用な作用物質である、方法も提供する。１つの実施形態において、作用物質は、Ｃｒｙ１またはＣｒｙ２の安定性を低下させる。
【００１３】
本開示は、上記の方法により同定される、Ｃｒｙ１またはＣｒｙ２の安定性を低下させる作用物質を含む組成物も提供する。
【００１４】
本開示は、代謝性または概日性の疾患または障害を治療する方法であって、被験体を、Ｃｒｙ１および／またはＣｒｙ２のリン酸化または脱リン酸化を促進する本開示の作用物質または組成物と接触させるステップを含む方法も提供する。１つの実施形態において、作用物質または組成物は、クリプトクロム転写同時制御因子機能を調整する。別の実施形態において、作用物質または組成物は、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）アルファ、ベータ（デルタ）およびガンマを調整する。さらに別の実施形態において、作用物質は、ビグアナイド誘導体、ＡＩＣＡＲ、メトホルミンまたはその誘導体、フェンホルミンまたはその誘導体、レプチン、アディポネクチン、ＡＩＣＡＲ（５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミド）、ＺＭＰ、ＤＲＬ−１６５３６、ＢＧ８００化合物（Ｂｅｔａｇｅｎｏｎ）およびフラン−２−カルボン酸誘導体からなる群から選択されるＡＭＰＫアゴニストである。
【００１５】
本開示は、代謝リズムまたは概日リズムの疾患または障害を決定する方法であって、ＣＲＹ１またはＣＲＹ２の安定性を、組織において２４時間周期の間に測定するステップを含み、正常または過剰ＡＴＰ濃度の存在下でのＣＲＹ１またはＣＲＹ２の長期間安定性の周期が、代謝リズムまたは概日リズムの疾患または障害を示す方法も提供する。１つの実施形態において、方法は、ｍＣＲＹ１のＳ７１またはＳ２８０を含むエピトープと特異的に結合する抗体を用いる。
【００１６】
本開示は、安静および脂質異化反応を促進する方法であって、概日サイクルの夜間期の間にＡＭＰＫアゴニストを投与するステップを含み、前記ＡＭＰＫアゴニストが、ＣＲＹ１またはＣＲＹ２の安定性を低下させる方法も提供する。
【００１７】
本開示は、代謝リズムまたは概日リズムの障害を治療する方法であって、概日サイクルの安静周期の間にＡＭＰＫアゴニストを投与するステップを含む方法も提供する。
【００１８】
上記のおよびその他の特徴は、添付の図面を参照して進む以下のいくつかの実施形態の詳細な記載からより明確になる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１Ａ〜Ｅは、Ｓ７１またはＳ２８０のリン酸化が、ＦＢＸＬ３およびＰＥＲ２との相互作用を変更することによりｍＣＲＹ１を不安定化することを示す。（Ａ）記載される変異を有するＦｌａｇタグ付加ｍＣＲＹ１を発現するＡＤ２９３細胞を、１００μｇ／ｍｌのシクロヘキシミド（ＣＨＸ）で、記載される時間処理した。Ｆｌａｇ−ｍＣＲＹ１は、ウェスタンブロッティングにより検出した。β−アクチンについてのイムノブロットを、負荷対照（ｌｏａｄｉｎｇ  ｃｏｎｔｒｏｌ）として用いた。（Ｂ）ＣＬＯＣＫ、ＢＭＡＬ１、Ｐｅｒ１−ルシフェラーゼならびにｍＣＲＹ１の記載される量および対立遺伝子を発現するＡＤ２９３細胞を、トランスフェクションの４８時間後にルシフェラーゼ活性について調べた。（Ｃ）Ｆｌａｇ−ｍＣＲＹ１を、記載されるプラスミドを一過的に発現するＡＤ２９３細胞から免疫沈降させた。ＣＲＹ１と結合したＦＢＸＬ３は、ｖ５エピトープタグについてのイムノブロッティングにより検出した。（Ｄ）記載されるようにＦＢＸＬ３を同時発現するかまたはしない、ＣＬＯＣＫ、ＢＭＡＬ１、Ｐｅｒ１−ルシフェラーゼおよびｍＣＲＹ１の記載される対立遺伝子を一過的に発現するＡＤ２９３細胞を、トランスフェクションの４８時間後にルシフェラーゼ活性について調べた。＊＊ＡＡに対してｐ＜０．０１；＃＃  ＦＢＸＬ３を発現しない等価な試料に対してｐ＜０．０１。（Ｅ）Ｆｌａｇ−ｍＣＲＹ１を、ＰＥＲ２を同時発現するかまたはしない、ＣＲＹ１の記載される対立遺伝子を一過的に発現するＡＤ２９３細胞から免疫沈降させた。ＣＲＹ１と結合したＰＥＲ２は、イムノブロッティングにより検出した。
【図２】図２Ａ〜Ｇは、ＡＭＰＫが、Ｓｅｒ７１、Ｓｅｒ２８０リン酸化によりｍＣＲＹ１を不安定化することを示す。（Ａ）クリプトクロム概日転写リプレッサー（赤色のフォントでの種の名称）および青色光光受容体（青色のフォントでの種の名称）中のｍＣＲＹ１のＳ７１の周囲の領域の進化的保存を示す配列アラインメント。配列の上の強調した数字は、ＡＭＰキナーゼによるリン酸化のための標的セリンに対する、これらの位置での好まれるアミノ酸を示す。赤色は、酸性残基（Ｋ／Ｒ）への好みを示し、緑色は疎水性残基（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）への好みを示す。（Ｂ）上：ホスホペプチドの配列アラインメントであって、これらに対して、ｍＣＲＹ１−ｐＳ７１およびｍＡＣＣ１−ｐＳ７９に対する抗体を産生させた。下：抗ｍＣＲＹ１−ｐＳ７１抗体および抗ＡＣＣ１−ｐＳ７９抗体は共にＷＴを認識するが、ＡＤ２９３細胞から免疫沈降させたＳ７１Ａ  Ｆｌａｇ−ｍＣＲＹ１は認識しない。（Ｃ）抗ｍＣＲＹ１−ｐＳ７１を用いて、ＡＭＰＫα１（ＣＡα１）またはＡＭＰＫα２（ＣＡα２）の活性化対立遺伝子の非存在下または存在下で野生型ＣＲＹ１（ＷＴ）またはＣＲＹ１Ｓ７１Ａ（Ｓ７１Ａ）を一過的に発現するＡＤ２９３細胞から免疫沈降させたＦｌａｇ−ＣＲＹ１中のＳｅｒ７１のリン酸化を検出した。一過的に発現されたｍｙｃ−ＣＡα１およびｍｙｃ−ＣＡα２は、ｍｙｃエピトープタグに対して産生されたポリクローナルウサギ抗体と抗ウサギＡＦ４８８（緑色）とを用いて免疫染色した。核は、ＤＡＰＩ（青色）を用いて対比染色した。（Ｄ）野生型（ＷＴ）またはキナーゼ非機能性（ｋｉｎａｓｅ  ｄｅａｄ）（ＫＤ）ＬＫＢ１と共にＦｌａｇ−ＣＲＹ１を一過的に発現するＨｅＬａ細胞を、ビヒクル（−）または２ｍＭのＡＩＣＡＲ（＋）で２時間処理した。（Ｅ）Ｆｌａｇ−ｍＣＲＹ１の記載される対立遺伝子を一過的に発現するＡＤ２９３細胞を、２５ｍＭまたは０．５ｍＭのグルコースを含有する培地で処理した。（Ｆ）Ｆｌａｇタグ付加野生型ＣＲＹ１（ＷＴ）またはＣＲＹ１Ｓ７１Ａ／Ｓ２８０Ａ（ＡＡ）を安定的に発現する、対での野生型（ＡＭＰＫ＋／＋）およびａｍｐｋα１−／−；ａｍｐｋα２−／−（ＡＭＰＫ−／−）マウス胚線維芽細胞を、ビヒクル（−）または２ｍＭのＡＩＣＡＲ（＋）で２時間処理した。（Ｇ）（Ｆ）に記載されるＭＥＦを、１００μｇ／ｍｌのシクロヘキシミド（ＣＨＸ）で、記載される時間処理した。ＣＲＹ１は、（Ｄ〜Ｇ）におけるＦｌａｇエピトープについての免疫沈降およびイムノブロッティングにより検出した。
【図３】図３Ａ〜Ｄは、ＡＭＰＫシグナル伝達の破壊が、ＭＥＦにおける概日リズムを変更することを示す。（Ａ）同期化していない対での野生型（ＡＭＰＫ＋／＋）またはａｍｐｋα１−／−；ａｍｐｋα２−／−（ＡＭＰＫ−／−）マウス胚線維芽細胞を、５０％ウマ血清に２時間曝露することにより刺激し、その後、２５ｍＭグルコース、０．５ｍＭグルコースまたは１ｍＭのＡＩＣＡＲを補った２５ｍＭグルコースを含有する培地に移した。定量的ＰＣＲ分析を、刺激後の記載される時間に回収したｃＤＮＡ試料を用いて行った。データは、それぞれ３重で分析した２つの独立する実験の平均値を示す。（Ｂ）Ｂｍａｌ１−ルシフェラーゼを安定的に発現する線維芽細胞を、記載される量のグルコースを２ｍＭのＡＩＣＡＲと共にまたはなしで含有する培地中で培養した。ルシフェラーゼ活性の連続モニタリングの代表的な結果を示す。（ＣおよびＤ）（Ｂ）に記載するようにして行った実験からのＢｍａｌ１駆動型ルシフェラーゼ活性の概日周期（Ｃ）および振幅（Ｄ）の定量。（Ｃ）および（Ｄ）におけるデータは、条件あたり４つの試料についての平均値±標準偏差を表す。ＡＮＯＶＡ分析は、カテゴリー間での有意差を示した。＊＊シェッフェの事後分析において２５ｍＭのグルコースで培養した試料に対してＰ＜０．０１。
【図４】図４Ａ〜Ｃは、ＡＭＰＫ活性および核局在化が概日調節を受けることを示す。（Ａ）ホスホ−Ｒａｐｔｏｒ−Ｓ７９２（ｐＲａｐｔｏｒ）、Ｒａｐｔｏｒ、ホスホ−ＡＣＣ１−Ｓ７９（ｐＡＣＣ１）およびＡＣＣ１についてのイムノブロッティングを、記載される概日時間に回収したマウス肝臓から調製した全細胞溶解産物で行った。ブロットは、３回の独立した実験の代表である。（Ｂ）記載される概日時間に回収したマウス肝臓から調製したｃＤＮＡの定量的ＰＣＲ分析。各データ点は、それぞれ独特の動物から採取され、４重で分析した３つの試料の平均値±標準偏差を表す。（Ｃ）核抽出物を、記載される概日時間のそれぞれで２匹のマウスの肝臓から調製した。ＡＭＰＫα１、ＡＭＰＫα２、ＰＥＲ２、ＣＲＹ１およびＲＥＶＥＲＢαのタンパク質レベルを、イムノブロッティングにより分析した。記載される概日時間に回収した対での野生型（α１＋／＋）およびａｍｐｋα１−／−（α１−／−）または野生型（α２＋／＋）およびａｍｐｋα２−／−（α２−／−）マウスからの核抽出物を、抗体特異性についての対照として用いた。
【図５】図５Ａ〜Ｃは、ＡＭＰＫ活性化が、マウス肝臓におけるＣＲＹ安定性および概日リズムを変更することを示す。（Ａ）マウスに、生理食塩水または体重１ｋｇあたり５００ｍｇのＡＩＣＡＲを注射し、肝臓試料を１時間後のツァイトゲーバー時間（ＺＴ、光点灯後の時間）６またはＺＴ１８に回収した。内因性ＣＲＹ１を、肝臓核抽出物におけるイムノブロッティングにより検出した。ｎ．ｓ．は、試料負荷を評価するための非特異的バンドを示す。野生型（ＣＲＹ＋／＋）およびｃｒｙ１−／−；ｃｒｙ２−／−（ＣＲＹ−／−）マウスから回収した試料を、抗体特異性についての対照として用いた。データは、２つの独立した実験からの代表的な結果を表す。（Ｂ）ＬＫＢ１＋／＋およびＬＫＢ１ｆｌ／ｆｌマウスに、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現するアデノウイルス（Ａｄ−Ｃｒｅ）を尾静脈から注射した。Ａｄ−Ｃｒｅ注射の１〜２週間後に、マウスを定常的な暗所に移し、記載される概日時間に肝臓を回収した。ＣＲＹ１、ＰＥＲ２およびＲＥＶＥＲＢαをイムノブロッティングにより検出した。（Ｃ）（Ｂ）に記載される肝臓から調製したｃＤＮＡ試料を、ｄｂｐ、ｒｅｖｅｒｂα、ｃｒｙ１およびｐｅｒ２発現の定量的ＰＣＲ分析により分析した。全ての転写産物を、内部対照としてのｕ３６ｂ４に対して正規化した。各データ点は、４重で分析した３つの試料の平均値±標準偏差を表す。
【図６】図６は、ＡＭＰＫが、末梢時計の代謝同調化に寄与することを示す。マウスにおける末梢概日時計の代謝同調化におけるＡＭＰＫの役割を示すモデル。昼間、ＡＭＰＫの核局在化は、食物および循環グルコースの低減によるその可能性のある活性化と連係して増加する。活性核ＡＭＰＫは、クリプトクロムをリン酸化して、ＦＢＸＬ３とのその相互作用を増加し、プロテアソーム分解を導き、時計により制御される遺伝子（ｃｃｇ）の活性化をもたらす。夜間、核ＡＭＰＫ活性が低下することにより、クリプトクロムが核に蓄積し、ｃｃｇが抑制される。
【図７】図７Ａ〜Ｄは、ｍＣＲＹ１リン酸化部位の同定を示す。（Ａ）一過性にトランスフェクトしたＡＤ２９３細胞から精製されたＦｌａｇ−ｍＣＲＹ１を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより、リン酸化セリン、スレオニンおよびチロシン残基の存在について分析した。観察されたリン酸化を触媒すると予測されるキナーゼを、文献検索およびＳｃａｎｓｉｔｅプログラム（ｈｔｔｐ：（／／）ｓｃａｎｓｉｔｅ．ｍｉｔ．ｅｄｕ）との組合せを用いて予測した。配列保存を、ＭｅｇＡｌｉｇｎを用いて決定した。（Ｂ）ＣＲＹ１タンパク質の模式図の下のオレンジ色のバーの厚さは、タンパク質配列の各領域についてＬＣＭＳ／ＭＳにより観察されたペプチドの相対数を示す。（Ｃ）Ｂに示すペプチドのカバー範囲に基づく本発明者らのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析では観察可能でない場合があるＳｃａｎｓｉｔｅにより予測されるリン酸化部位。（Ｄ）記載される変異を有するＦｌａｇ−ｍＣＲＹ１を、１００μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドで記載される時間処理したＡＤ２９３細胞において発現させた。ＣＲＹ１タンパク質は、Ｆｌａｇタグについてのイムノブロットにより検出された。
【図８】図８は、ｍＣＲＹ１  Ｓ２８０配列保存を示す。ｍＣＲＹ１  Ｓ２８０は、保存されたＡＭＰＫ基質モチーフにより囲まれる。クリプトクロム概日転写リプレッサー（赤色フォントでの種の名称）および青色光光受容体（青色フォントでの種の名称）におけるｍＣＲＹ１のＳ２８０の周囲の領域の進化的保存を示す配列アラインメント。配列の上の強調した数字は、ＡＭＰキナーゼによるリン酸化についての標的セリンに対するこれらの位置での好まれるアミノ酸を示す。赤色は、示される位置での酸性残基（Ｋ／Ｒ）への好みを示し、緑色は疎水性残基（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）への好みを示す。
【図９】図９は、精製ＡＭＰＫが、ｍＣＲＹ１をｉｎ  ｖｉｔｒｏでリン酸化することを示す。ＡＤ２９３細胞から精製したＦｌａｇタグ付加ｍＣＲＹ１を、３０分間、＃３２Ｐ−ＡＴＰと、記載されるようにＡＭＰキナーゼおよび３００μＭのＡＭＰの非存在下または存在下でインキュベートした。ｍＣＲＹ１のリン酸化は、オートラジオグラフィにより検出した。合計ｍＣＲＹ１レベルを、Ｆｌａｇエピトープについてのイムノブロットにより決定した。精製ＡＭＰＫは、精製ｍＣＲＹ１を効率的にリン酸化し、このリン酸化は、ＡＭＰの存在により強く活性化され、このことにより、精製混合物中の関連するキナーゼが、他の関連キナーゼではなくＡＭＰＫであることが確認された。
【図１０】図１０Ａ〜Ｄは、ＡＭＰＫの破壊が、ＭＥＦにおける概日リズムを変更することを示す。３Ｔ３不死化マウス胚線維芽細胞（Ａ）または対での野生型（ＡＭＰＫ＋／＋）もしくはａｍｐｋα１−／−；ａｍｐｋα２−／−（ＡＭＰＫ−／−）線維芽細胞（Ｂ）を、５０％ウマ血清に２時間曝露することにより刺激し、その後、２５ｍＭグルコース（黒色の記号）、０．５ｍＭグルコース（灰色の記号）または１ｍＭのＡＩＣＡＲを補った２５ｍＭグルコース（赤色の記号）を含有する培地に移した。定量的ＰＣＲ分析を、刺激後の記載される時間に回収した溶解産物から調製したｃＤＮＡ試料を用いて行った。データは、それぞれ３重で分析した２または３つの独立する実験の平均値±標準偏差を表す。
【図１１】図１１は、ｍＣＲＹ１が核ホルモン受容体と相互作用することを示す。Ｆｌａｇタグ付加ｍＣＲＹ１を種々のｖ５タグ付加核ホルモン受容体と同時発現するＡＤ２９３細胞を溶解し、ｍＣＲＹ１を含有するタンパク質複合体を、Ｆｌａｇタグの免疫沈降により単離した。ｍＣＲＹ１含有タンパク質複合体中の個別の核ホルモン受容体の存在を、ｖ５タグについてのイムノブロットにより検出した（上）。免疫沈降複合体中のｍＣＲＹ１の量を、Ｆｌａｇタグについてのイムノブロットにより示す（中）。溶解産物中に存在するそれぞれの核ホルモン受容体の量を、免疫沈降前の溶解産物から採取した試料におけるｖ５タグのイムノブロットにより示す（下）。ＲＯＲａ、ｂ、ｇ（レチノイン酸受容体関連オーファン受容体ａ、ｂ、ｇ）、ＲＸＲａ、ｂ（レチノイドＸ受容体ａ、ｂ）、ＰＰＡＲｄ、ｇ（ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ｄ、ｇ）、ＶＤＲ（ビタミンＤ受容体）、ＰＸＲ（プレグナンＸ受容体）、ＣＡＲ（構成的アンドロスタン受容体）、ＥＲｂ（エストロゲン受容体ｂ）、ＥＲＲａ、ｂ、ｇ（エストロゲン関連受容体ａ、ｂ、ｇ）、ＧＲ（グルココルチコイド受容体）、ＭＲ（ミネラロコルチコイド受容体）、ＰＲ（プロゲステロン受容体）、ＡＲ（アンドロゲン受容体）。データは、２または３つの独立した実験の代表的な結果を表す。
【図１２】図１２は、クリプトクロムが、ＡＭＰＫ活性化に対するいくつかの転写応答にとって必要であることを示す。野生型（ＷＴ）またはＣｒｙ１−／−；Ｃｒｙ２−／−（ＣＲＹ−／−）マウスに、生理食塩水（黒色のバー）または体重１ｋｇあたり５００ｍｇのＡＩＣＡＲ（赤色のバー）を、午後６時に注射した。ｃＤＮＡを、４時間後の午後１０時に回収した肝臓から調製し、遺伝子発現を、Ｓｙｂｒ  ＧｒｅｅｎＥＲ化学を用いる定量的ＰＣＲにより分析した。Ｆａｓ（脂肪酸合成）を、Ｃｒｙ１およびＣｒｙ２遺伝子型に関係なくＡＩＣＡＲにより活性化される遺伝子の例として示す。Ｐｏｒ（ｐ４５０酸化還元酵素）を、そのＡＩＣＡＲにより誘導される活性化がクリプトクロムを必要とする遺伝子の例として示す。データは、条件あたり３〜５匹のマウスについての平均値±ｓ．ｅ．ｍ．を表す。
【図１３】図１３は、クリプトクロムの喪失が、マウスにおける代謝機能を変更することを示す。１０週齢の雄の野生型（ＷＴ、黒色のバー）およびＣｒｙ１−／−；Ｃｒｙ２−／−（ＣＲＹ−／−、灰色のバー）マウスの体重測定を行い、それらの安静時血中グルコースを、尾静脈の切れ目（ｎｉｃｋ）により午後１時に測定した。データは、遺伝子型あたり１０匹の動物についての平均値±ｓ．ｅ．ｍ．を表す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本明細書においてそうでないと特に記載しない限り、用いられる用語の定義は、薬学技術において用いられる標準的な定義である。明細書および添付の特許請求の範囲において用いる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないと明確に示さない限り、複数の引用物も含む。よって、例えば、「薬学的キャリア」への言及は、そのようなキャリアの２以上の混合物などを含む。
【００２１】
また、「または」の使用は、そうでないと記載しない限り「および／または」を意味する。同様に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含み（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含み（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、交換可能であり、限定することを意図しない。
【００２２】
種々の実施形態の記載が「含み」の用語を用いる場合、いくつかの特定の場合において、実施形態を、「から本質的になる」または「からなる」の言葉を用いて代わりに記載できることを当業者が理解するとさらに理解される。
【００２３】
そうでないと明示しない限り、本明細書において用いられる全ての技術的および科学的用語は、本開示が属する当業者に通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるのと同様または等価ないずれの方法および試薬も、開示される方法および組成物の実施において用いることができるが、例示的な方法および材料をここで記載する。
【００２４】
本明細書において言及する全ての出版物は、本明細書の記載と関連して用いられる可能性があるその出版物に記載される方法を記載して開示する目的のために、全体が参照により本明細書に組み込まれる。上で論じた本文全体での出版物は、本開示の出願日に先んじるそれらの開示のためにのみ提供される。本明細書中のいずれも、本発明者らが、先の開示により、そのような開示に先行する権利が与えられないことを認めると解釈されない。
【００２５】
概日リズムは、限定されないが、睡眠サイクルの調整、エクササイズおよびカロリー低減に関連するエネルギー調整、ならびに摂食／栄養補給（ｎｏｕｒｉｓｈｍｅｎｔ）行動のような生理的プロセス、内分泌プロセスおよび行動プロセスの適切なタイミングを調和させることにより生物学的効率を最適化する。概日リズムは、少なくとも３つの要素を含有すると考えられる：（ａ）環境情報を概日ペースメーカー（時計）に中継する入力経路（複数可）；（ｂ）変動（ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎ）を生み出す概日ペースメーカー；および（ｃ）それを介してペースメーカーが種々の出力リズムを調節する出力経路（複数可）。
【００２６】
哺乳動物の視床下部視交叉上核（ＳＣＮ）は、行動リズムおよび生理的リズムを明暗サイクルに整合させる主要ペースメーカーとして作用する。当初、ＳＣＮは、哺乳類における自立性分子ペースメーカーの唯一の部位であると考えられていたが、その後、複数の論文が、このような分子時計がほぼ遍在的であることを示した。ＳＣＮ時計とは異なって、光非感受性末梢器官における概日時計は、摂食の毎日のリズムにより同調され、末梢組織が、毎日の食物消費を予期し、代謝プロセスのタイミングを最適化することを理論的に可能にする。いくつかの論文が、重要な代謝酵素の転写の調節および代謝生理における哺乳動物概日時計についての役割を支持している。
【００２７】
本明細書で用いる場合、「概日リズム」との用語は、約２４時間の過程にわたって生じる生理的および行動的パラメータにおける規則的な変動を意味することを意図する。このような活動は、睡眠サイクルおよび栄養補給サイクルなどを含む。
【００２８】
本明細書で用いる場合、概日リズムに関して用いる場合の「調整する」との用語は、動物の概日タイミングシステムにより調節される生理的機能、内分泌機能もしくは行動を変更すること、または概日リズム性を示す細胞機能を変更することを意味することを意図する。動物の概日タイミングシステムにより調節される例示的な生理機能は、体温、自律神経調節、代謝および睡眠覚醒サイクルを含む。例示的な代謝機能は、体重の増加または減少および体脂肪率の増加または減少を含む増量ならびに減量の制御、持久行動の改変、減量などを含む。動物の概日タイミングシステムにより調節される例示的な内分泌機能は、松果体のメラトニン分泌、ＡＣＴＨコルチゾール分泌、甲状腺刺激ホルモン分泌、成長ホルモン分泌、ニューロペプチドＹ分泌、セロトニン分泌、インスリン様成長因子Ｉ型分泌、副腎皮質刺激ホルモン分泌、プロラクチン分泌、ガンマ−アミノ酪酸分泌およびカテコールアミン分泌を含む。動物の概日タイミングシステムにより調節される例示的な行動は、運動（運動リズム）、精神的俊敏さ、記憶、感覚運動統合、摂食、ＲＥＭ睡眠、ＮＲＥＭ睡眠および情動を含む。
【００２９】
ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）は、系統発生全体でよく保存されている代謝シグナルの中心的なメディエーターとして認識されている。ＡＭＰＫは、触媒（α）サブユニットと２つの調節性（β、γ）サブユニットとを含むヘテロ３量体プロテインキナーゼである。これは、高いＡＭＰ／ＡＴＰ比率の存在下でＬＫＢ１により、または上昇した細胞内カルシウムの存在下でＣＡＭＫＫβによりリン酸化されると活性化される。生化学的研究および生物情報学的研究により、ＡＭＰＫによるリン酸化が起こりそうな最適アミノ酸配列の関係が確立されている。
【００３０】
ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）およびＡＭＰＫキナーゼ（ＡＭＰＫＫ）は、プロテインキナーゼカスケードと関連する。ＡＭＰＫカスケードは、燃料の生成および利用を細胞内で調節する。例えば、細胞での燃料が低い（例えばＡＭＰ濃度の増加）と、ＡＭＰＫ活性が増加する。一旦活性化されると、ＡＭＰＫは、ＡＴＰを保存するか、またはＡＴＰ生成の代替法を促進するように機能する。よって、その活性を調整することにより、エネルギー貯蔵の異化反応を増加でき、脂質含量を低減させてＡＴＰを増加させるか、または体を安静状態にして、ＡＴＰ使用を保存する。
【００３１】
ＡＭＰＫは、肝臓、脳および骨格筋を含むいくつかの組織において発現される。ＡＭＰＫの活性化は、肝臓の脂肪酸酸化およびケトン体生成を活性化し、コレステロール合成、脂肪生成およびトリグリセリド合成を阻害し、脂肪細胞の脂肪分解および脂肪生成を阻害し、骨格筋の脂肪酸酸化および筋肉グルコース摂取を刺激し、膵臓ベータ細胞によるインスリン分泌を調整することが示されている。
【００３２】
ＡＭＰＫの活性化は、ＡＭＰの濃度の増加により誘引できる。ＡＭＰＫのγサブユニットは、αサブユニット上に活性部位（Ｔｈｒ−１７２）を露出するように立体構造変化を受ける。ＡＭＰＫのγサブユニットの立体構造変化は、ＡＭＰの濃度が増加している場合に達成され得る。ＡＭＰの濃度の増加により、ＡＭＰＫのγサブユニットの立体構造変化が、このサブユニットにある２つのＢａｔｅｍａｎドメインを２つのＡＭＰが結合させることにより生じる。ＡＭＰのこの役割は、５−アミノ−４−イミダゾールカルボキサミドリボシド（ＡＩＣＡＲ）に由来するＡＭＰ類似体である５−アミノ−４−イミダゾールカルボキサミドリボチド（ＺＭＰ）によるＡＭＰＫ活性化を示す実験において証明される。同様に、ＡＭＰのアンタゴニストは、ＡＭＰＫによる下流のキナーゼの活性化を阻害する阻害抗体の使用を含む。
【００３３】
断眠（ＳＤ）は、神経活性を増加させる。持続性の神経活性は、細胞エネルギー充足率を減少させる（ＡＭＰレベルが増加し、ＡＴＰが減少する）。これは、次に、細胞エネルギーセンサＡＭＰＫにおける変化を引き起こす。上で論じたように、ＡＭＰＫは、ＡＴＰの保存を導くカスケードを含む種々のキナーゼカスケードを調整する。
【００３４】
ＣＬＯＣＫおよびＢＭＡＬ１は、ヘテロ２量体の形成により、概日リズムと関連する遺伝子の転写を誘導するポリペプチドである。典型的な概日サイクルの間に、分子機構は、２つの相互に連結された転写／翻訳フィードバックループを有する内部時計を形成する２つのサイクルの間で変動する。フィードバックループのポジティブアームは、塩基性ヘリックス−ループ−ヘリックス−ＰＡＳ（Ｐｅｒ−Ａｒｎｔ−Ｓｉｍ）ドメイン含有転写因子であるＣＬＯＣＫおよびＢＭＡＬ１により駆動される。ＣＬＯＣＫ／ＢＭＡＬ１ヘテロ２量体は、時計遺伝子であるクリプトクロム（Ｃｒｙ１およびＣｒｙ２）、ｐｅｒｉｏｄ（Ｐｅｒ１およびＰｅｒ２）、およびＲｅｖ−Ｅｒｂαの転写を活性化する。ＰＥＲおよびＣＲＹタンパク質は、核に移動し、そこでこれらはＣＬＯＣＫ／ＢＭＡＬ１と相互作用して転写を下方調節し、主要フィードバックループのネガティブアームを生成する。
【００３５】
上記の概日転写プログラムの堅固な変動は、コア時計タンパク質の翻訳後修飾を必要とする。３つの研究により、最近、Ｆボックスタンパク質ＦＢＸＬ３が、クリプトクロムのユビキチン化および分解のメディエーターとして同定された。Ｆボックスタンパク質がそれらの同族基質に結合することは、基質タンパク質中の１つ以上のアミノ酸のリン酸化により頻繁に調節されるが、このような調節の改変は、ＣＲＹ：ＦＢＸＬ３相互作用について記載されなかった。
【００３６】
時計タンパク質の翻訳後修飾（例えばリン酸化および脱リン酸化）は、タンパク質の局在化、分子間相互作用および安定性を決定し、よって、概日時計の周期を調節する。本開示は、この翻訳後調節が、ＡＭＰＫ活性により調整され得、よって、ＡＭＰＫアゴニストおよびアンタゴニストが、概日時計の調節において役割を有し得ることを証明する。
【００３７】
クリプトクロム（Ｃｒｙ１およびＣｒｙ２）は、ほとんどの植物において概日光受容体として機能する。クリプトクロムは、全ての組織において発現することが見出されている。しかし、発現は、網膜においてより高く、マウスおよびヒトの両方において網膜内層に限定される。脳において、Ｃｒｙ１はＳＣＮにおいて発現し、発現は、毎日の変動を示し、午後２時付近にピークになり、午前２時付近にその最低に達する。
【００３８】
ヒトのクリプトクロムは共に、Ｃｒｙ遺伝子を異所的に発現するＨｅＬａ細胞から、および組換えタンパク質としてＥ．ｃｏｌｉから精製されている。両方の供給源から単離されたタンパク質は、ＦＡＤおよびプテリンを含有する。
【００３９】
クリプトクロムは、光センサとして進化したが、これは、光非感受性組織においてさえ、コアとなる概日時計の重要な成分として保持されている。本開示は、ＡＭＰＫが、栄養シグナルを時計に変換するように、クリプトクロムに再度目的を持たせることを証明する。概日システムと代謝システムとの間の逆調節についての証拠は、過去１０年間で増加しており、出現している理論は、概日時計が、代謝プロセスの一時的な分離を可能にすることを示唆している。代謝シグナルは、哺乳動物の末梢器官において概日時計のタイミングを設定することが示されているが、このようなシグナルを伝達する分子機構は、まだ明らかになっていない。
【００４０】
本開示は、ＡＭＰＫによるクリプトクロムのリン酸化が、ＦＢＸＬ３との結合により分解を促進し、ＣＬＯＣＫ：ＢＭＡＬ１抑制を軽減することを証明する。このプロセスは、過剰グルコースにより抑制され、ＡＩＣＡＲのようなＡＭＰＫ活性化因子、およびａｍｐｋβ２調節性サブユニットの核移動により増強される。よって、本開示は、細胞内生物エネルギーの状態が、末梢組織における概日時計に直接影響を与えることができる新規な生化学的経路を提供する。
【００４１】
ＡＭＰＫの概日性活性化は、ＣＲＹ１のリン酸化を駆動し、そのＦＢＸＬ３媒介分解を刺激することにより、リズムの維持に寄与する。ＡＭＰＫは、ＣＲＹ１を２つのセリン残基（マウスＣＲＹ１においてＳ７１およびＳ２８０）上でリン酸化する。セリン７１および周囲の配列は、全ての光非依存性クリプトクロム転写リプレッサーに存在し、このことは、この経路が、光に曝露されない概日時計の代謝の同調化を可能にするように進化したことを示唆する。
【００４２】
ＡＭＰＫ活性は、グルコース利用力によりＬＫＢ１依存的な様式で調節されることができ、栄養利用力を変化させるか、またはＡＭＰＫ活性は、培養線維芽細胞における時計の振幅および周期を変更する。ｉｎ  ｖｉｖｏでは、ＡＭＰＫ基質であるＡＣＣ１およびＲａｐｔｏｒは、リン酸化の概日性の変化を示し、このことは、ＡＭＰＫの下流の細胞質経路および核での経路がリズム性に調節されることを示唆する。ＡＭＰＫが代謝プロセスの中心的な制御因子であることに鑑みて、これは、代謝の概日性の調節に重要な関わりを有する。遍在的または組織特異的な様式のいずれかでの概日時計機能の遺伝子的な変更は、摂食行動、体重、ランニング持久力およびグルコース恒常性を変化させ、これらはそれぞれ、ＡＭＰＫの操作によっても変更される。一括して、これらのデータは、ＡＭＰＫが、細胞レベルおよび生物全体レベルの両方での概日生理的調節の重要なメディエーターであり得るという考えを支持する。
【００４３】
興味深いことに、それぞれのＡＭＰＫサブユニットの転写、核局在化および活性化は、マウス肝細胞において概日リズムを示し、クリプトクロムタンパク質の量が最小の時間にピークになる。ａｍｐｋβ２転写は、堅固に概日性であり、真昼には夜より８倍高い。ＡＭＰＫβ２は、ＡＭＰＫの核局在化と、それに対応してＡＭＰＫα１のリズム性の核蓄積を駆動する。よって、ＡＭＰＫサブユニットは、概日時計の調節に寄与するだけでなく、それら自体も概日性の様式で転写調節される。
【００４４】
栄養状態と時計との連絡は複雑であり、付加的な経路がそれらの同調化にｉｎ  ｖｉｖｏで寄与する。２つの最近の研究は、ＳＩＲＴ１が、肝細胞においてリズム的に発現され、線維芽細胞における概日リズム性に寄与することを証明した。ＳＩＲＴ１は、ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ比率によるその脱アセチル化酵素活性の調節により概日時計の代謝同調化において役割を果たすと見られる。複数の論文が、種々の時計成分の調節におけるヘムの役割を示唆し、３価鉄および２価鉄ヘムによる異なる調節が、細胞酸化還元状態についての情報を概日時計に伝達することを示唆している。これらの機構の１もしくは複数、および／またはＳＣＮから発せられる昼間液性シグナルもしくはニューロンシグナルは、おそらく、ＬＫＢ１Ｌ／Ｌマウスの肝臓において観察された残存概日リズムに寄与する。
【００４５】
Ｆｂｘｌ３またはＬｋｂ１における変異は、ヒト腫瘍において頻繁に行われる。クリプトクロムのＬＫＢ１およびＡＭＰＫにより媒介されるリン酸化が、それらのＦＢＸＬ３により媒介される分解を刺激することの証明は、２つの腫瘍抑制因子がクリプトクロムの不安定化において協力することを示し、このことは、クリプトクロムの異常に高いレベルが、細胞周期調節解除（ｄｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）または腫瘍形成に寄与し得ることを示唆する。肝臓再生の概日性調節について記載した論文において、Ｍａｔｓｕｏおよび共同研究者らは、ｃｒｙ１−／−；ｃｒｙ２−／−マウスの肝臓が、野生型同腹子のものよりも遅く再生されたことを示し、このことは、ＣＲＹタンパク質が、細胞成長または増殖において刺激性の役割を果たすとの考えを支持する。ＣＲＹ：ＦＢＸＬ３相互作用を媒介するＬＫＢ１およびＡＭＰＫに依存するリン酸化部位の本明細書における同定は、これらの疑問を明確にする。
【００４６】
哺乳動物クリプトクロムにおける他のリン酸化部位は、さらなる入力シグナルを概日時計へ媒介し得るが、本開示は、セリン７１および２８０のＡＭＰＫにより媒介されるリン酸化が、ＦＢＸＬ３とのその相互作用を増加することによりＣＲＹ１プロテアソーム分解を刺激することを証明する。さらに、グルコース欠損は、クリプトクロム安定性を低下させ、概日転写産物を変更し、培養細胞における概日周期の長さを増加させ、これらの効果はＡＭＰＫにより媒介される。さらに、マウスにおけるＡＭＰＫの遺伝子破壊は、クリプトクロム安定性および概日リズムを乱す。これらのデータはまとめて、ＡＭＰＫによるクリプトクロムリン酸化が、代謝シグナルによる末梢器官時計の同調化を可能にするように進化したことを証明する。
【００４７】
本開示は、睡眠または他の概日プロセスに影響するための、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）と結合するか、またはそうでなければそれを活性化もしくは不活性化する化合物（これらのいくつかは、糖尿病の治療のために現在用いられている）の使用を提供する。本開示は、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ活性の遺伝子操作または薬理学的操作が、培養細胞およびインタクトな動物の肝臓における概日リズムを変更することを証明する。本開示は、ＡＭＰキナーゼが、睡眠覚醒サイクルおよび他の生理的リズムのタイミングを支配するいわゆる「主要ペースメーカー」の場所である視交叉上核（ＳＣＮ）で発現されることも証明する。現在利用可能な療法は、血液脳関門を通過せず、よって、睡眠障害の調整のために有用でない。
【００４８】
ＡＭＰＫによる概日リズムの調節は、血液脳関門を通過するＡＭＰＫ調節因子が、概日リズムと関連する下流のキナーゼ活性を調節することにより、それに限定されないが不眠症を含む睡眠障害の治療に有用であることを示唆する。さらに、それらに限定されないが、ＣＬＯＣＫ、ＢＭＡＬ１、ＰＥＲならびにＣＲＹ−１および−２を含むある特定の概日ポリペプチドは、リン酸化および脱リン酸化により調節され、脳の外側の組織に存在する。よって、非神経組織においてＡＭＰＫ活性を調整することは、キナーゼカスケードにより概日リズムを設定し、最終的に下流のポリペプチドのリン酸化および脱リン酸化を調節するためにも重要であり得る。
【００４９】
さらに、本開示は、Ｃｒｙ１およびＣｒｙ２のリン酸化および脱リン酸化が、概日性の作用を有し、よって、睡眠状態およびエネルギー代謝の調整のための有用な標的であることを証明する。例えば、ＣＲＹ１のセリン７１および２８０のリン酸化または脱リン酸化を特異的に調整することにより、ＦＢＸＬ３とのその相互作用を増加させることによるプロテアソーム分解を促進できる。
【００５０】
ＡＭＰＫを活性化するいくつかの薬理学的作用物質は、糖尿病の治療のために現在臨床使用されており、いくつかの型の癌について臨床試験されている。
【００５１】
ＡＩＣＡＲのようなＡＭＰキナーゼアゴニストは、インスリン調節、糖尿病および肥満について研究されている。しかし、ＡＭＰキナーゼは、概日リズムや睡眠行動を調整すると以前に証明されていなかった。本開示は、ＡＭＰＫ活性を調整することが、概日リズムに関連するタンパク質の翻訳後修飾を含む下流のプロセスに対する作用を有し得ることを証明する。１つの実施形態において、本開示は、ＡＭＰＫアゴニストおよびアンタゴニストを用いて、被験体における概日リズムを調整できることを示す。例えば、ＡＭＰＫは、本開示により、ヘテロ２量体ＣＬＯＣＫ／ＢＭＡＬ１を活性化する転写の調整において役割を果たすことが証明される。
【００５２】
種々のＡＭＰＫアゴニストが、当該技術において公知である。このようなＡＭＰＫアゴニストを含む方法および組成物が、本明細書において提供される。このようなＡＭＰＫアゴニストの使用は、概日リズムを調整する方法をもたらすことができる。種々のＡＭＰＫアゴニストが本明細書に記載され、当該技術において公知である。１つの実施形態において、ＡＭＰＫアゴニストは、ＡＩＣＡＲ化合物を含む。本開示の方法において有用な他の化合物は、ビグアナイド誘導体、ＡＩＣＡＲの類似体（例えば米国特許第５，７７７，１００号（本明細書に参照により組み込まれる）に開示されるもの）およびＡＩＣＡＲのバイオアベイラビリティーを増加させるＡＩＣＡＲのプロドラッグまたは前駆体（例えば米国特許第５，０８２，８２９号（本明細書に参照により組み込まれる）に開示されるもの）を含み、これらは全て当業者に周知である。ＡＭＰＫの他の活性化因子は、Ｉｙｅｎｇａｒらへの米国特許出願公開第２００６０２８７３５６号（その開示は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるものを含む。従来公知のＡＭＰＫ活性化化合物は、上記のレプチン、アディポネクチンおよびメトホルミンに加えて、ＡＩＣＡＲ（５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミド）を含む。他のＡＭＰＫアゴニストは、それらに限定されないが、ＤＲＬ−１６５３６（Ｄｒ．Ｒｅｄｄｙ’ｓ／Ｐｅｒｌｅｃａｎ  Ｐｈａｒｍａ）、ＢＧ８００化合物（Ｂｅｔａｇｅｎｏｎ）、フラン−２−カルボン酸誘導体（Ｈａｎａｌｌ、ＫＲ；国際出願公開第ＷＯ／２００８／０１６２７８号（参照により本明細書に組み込まれる）も参照されたい）、Ａ−７６９６６２（Ａｂｂｏｔｔ）（構造Ｉ；Ｃｏｏｌら、Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂｏｌ．３巻：４０３〜４１６頁、２００６年も参照されたい）；国際公開第ＷＯ／２００６／０３３７０９号に記載されるようなＭｅｔａｂａｓｉｓにより開発中のＡＭＰＫアゴニスト；ＭＴ−３９シリーズの化合物（Ｍｅｒｃｕｒｙ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）；およびＴｒａｎｓＴｅｃｈ  Ｐｈａｒｍａにより開発中のＡＭＰＫアゴニストを含む。
【００５３】
【化１】
2012521198.tif 000003
例えば、ＡＩＣＡＲは、細胞に取り込まれ、ＡＭＰＫを活性化することが示されているＡＭＰ類似体であるＺＭＰに変換される。ＺＭＰは、細胞内ＡＭＰ模倣物として作用し、十分に高いレベルまで蓄積されると、ＡＭＰＫ活性を刺激できる（Ｃｏｒｔｏｎ，  Ｊ．  Ｍ．ら、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２２９巻：５５８頁（１９９５年））。しかし、ＺＭＰは、他の酵素の調節においてもＡＭＰ模倣物として作用し、よって、特異的ＡＭＰＫ活性化因子ではない（Ｍｕｓｉ，  Ｎ．およびＧｏｏｄｙｅａｒ，  Ｌ．  Ｊ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ−−Ｉｍｍｕｎｅ，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ２巻：１１９頁（２００２年））。
【００５４】
本開示は、ＡＭＰＫアゴニストまたはＡＭＰＫアンタゴニストのいずれかを用いることにより被験体における概日時計の特定のサイクルを刺激する方法を提供する。１つの実施形態において、ＡＭＰＫアゴニストを用いて、ＣＬＯＣＫ／ＢＭＡＬ１転写活性の増加と関連する概日サイクルを促進する。１つの実施形態において、ＡＭＰＫアゴニストは、エネルギー保存のシグナル伝達による睡眠効果を、対応するキナーゼカスケードを通して促進する。この方法は、被験体におけるエネルギー欠乏状態を刺激するのに十分な量のＡＭＰＫアゴニストを被験体に投与するステップを含む。「エネルギー欠乏状態」により、ＡＭＰＫのγサブユニットが立体構造変化を受ける状態のことをいう。睡眠効果を促進するとは、そのような効果が、被験体において、ＡＭＰＫアゴニストの非存在下で生じるよりも多く改善されることを意味する。
【００５５】
以下により詳細に記載するように、ＡＭＰＫアゴニストは、経口で、非経口で、筋肉内に、脈管内に、または任意の適切な経路により投与してよい。１つの実施形態において、ＡＭＰＫアゴニストは、硬膜外投与される。１つの実施形態において、ＡＭＰＫアゴニストは、血液脳関門の通過が促進されるように製剤化される。
【００５６】
本開示は、ＡＭＰＫ活性と拮抗することにより代謝および活性を「覚醒」または「活動」サイクルに設定する作用物質を投与するステップを含む、活動状態を促進する方法も提供する。１つの実施形態において、ＡＭＰＫアンタゴニストは、阻害抗体である。１つの実施形態において、ＡＭＰＫアンタゴニストは、コンパウンドＣ（ドルソモルフィン、６−［４−（２−ピペリジン−１−イル−エトキシ）−フェニル）］−３−ピリジン−４−イル−ピラゾロ［１，５−ａ］−ピリミジン）、それらの類似体、誘導体または塩のような小分子阻害物質である。
【００５７】
開示される方法は、限定されないが、薬学技術の当業者に周知の投与方法、投与量および製剤を含む、ＡＭＰＫアゴニスト単独、またはその製剤を受容する被験体における所望の概日サイクルの状態を誘導する所望の結果を有する他の概日調節剤もしくは睡眠補助剤との組合せでの任意の投与方法、投与量および／または製剤の使用を想定する。
【００５８】
本開示のＡＭＰＫアゴニストは、薬物の形態でヒトまたは動物に投与してよい。代わりに、ＡＭＰＫアゴニストは、ヒトまたは動物により消費されるように、多様な食品および飲料またはペットフードに組み込んでよい。ＡＭＰＫアゴニストは、一般的な食品もしくは飲料に用いてよいか、あるいは機能性食品もしくは飲料、疾患に罹患している被験体のための食品、または特定の健康用途のための食品（この食品（または飲料）は、それが生理機能を有することを記載したラベルを有する）；例えば睡眠補助剤に用いてよい。
【００５９】
ＡＭＰＫアゴニスト単独、または他の睡眠補助剤もしくは活性成分との組合せは、薬品、例えば、錠剤もしくは顆粒剤のような経口固体製品、または液剤もしくはシロップ剤のような経口液体製品に製剤化してよい。
【００６０】
開示される方法におけるＡＭＰＫアゴニストまたは製剤の投与の方式は、それらに限定されないが、くも膜下内（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ）、皮内、筋肉内、腹腔内（ｉｐ）、静脈内（ｉｖ）、皮下、鼻内、硬膜外、硬膜内、頭蓋内、脳室内および経口経路を含む。具体的な例において、ＡＭＰＫアゴニストは、経口投与される。ＡＭＰＫアゴニストの投与のための他の簡便な経路は、例えば、注入もしくはボーラス投与、局所、上皮もしくは皮膚粘膜層を通しての吸収（例えば口腔粘膜、直腸および腸粘膜など）、眼、鼻および経皮を含む。投与は、全身性または局所的であり得る。肺投与も（例えば吸入器またはネブライザにより）、例えばエアロゾル剤を含有する製剤を用いることにより、用いることができる。
【００６１】
いくつかの実施形態において、ＡＭＰＫアゴニストを投与またはＡＭＰＫアゴニストを局所的に投与することが望ましい場合がある。このことは、例えば、局所的もしくは領域的な注入または灌流、局所塗布（例えば創傷包帯材）、注射、カテーテル、坐剤またはインプラント（例えば、シアラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜または繊維のような、膜を含む多孔質、非多孔質またはゼラチン質の材料から形成されるインプラント）などにより達成してよい。
【００６２】
他の実施形態において、ポンプ（例えば移植されたミニポンプ）を用いてＡＭＰＫアゴニストまたは製剤を送達してよい（例えば、Ｌａｎｇｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９巻、１５２７頁、１９９０年；Ｓｅｆｔｏｎ  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｅｎｇ．  １４巻、２０１頁、１９８７年；Ｂｕｃｈｗａｌｄら、Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８巻、５０７頁、１９８０年；Ｓａｕｄｅｋら、Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３２１巻、５７４頁、１９８９年を参照されたい）。別の実施形態において、ＡＭＰＫアゴニストまたは製剤は、小胞、特にリポソームで送達される（例えば、Ｌａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９巻、１５２７頁、１９９０年；Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ中のＴｒｅａｔら、Ｌｏｐｅｚ−ＢｅｒｅｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ（編）、Ｌｉｓｓ，  Ｎ．  Ｙ．、３５３〜３６５頁、１９８９年を参照されたい）。
【００６３】
さらに別の方法実施形態において、ＡＭＰＫアゴニストは、制御放出製剤で送達できる。Ｌａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９巻、１５２７頁、１９９０年）による総説で論じられているもののような制御放出系が公知である。同様に、制御放出製剤において有用なポリマー材料が公知である（例えば、Ｒａｎｇｅｒら、Ｍａｃｒｏｍｏｌ．  ＳｃＬ  Ｒｅｖ．  Ｍａｃｒｏｍｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２３巻、６１頁、１９８３年；Ｌｅｖｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８巻、１９０頁、１９８５年；Ｄｕｒｉｎｇら、Ａｎｎ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  ２５巻、３５１頁、１９８９年；Ｈｏｗａｒｄら、Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．  ７１巻、１０５頁、１９８９年を参照されたい）。例えば、アゴニストは、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸とポリグリコール酸とのコポリマー、ポリイプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレート、およびヒドロゲルの架橋または両親媒性ブロックコポリマーを含む、化合物の制御放出を達成するのに有用なクラスの生分解性ポリマーと結合させてよい。
【００６４】
開示される方法は、アゴニスト（複数可）を送達して所望の結果を達成するＡＭＰＫアゴニストの任意の剤形またはその製剤の使用を意図する。剤形は、一般的に公知であり、例えばＡｌｌｅｎら、Ａｎｓｅｌ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、第８版、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  ＰＡ：  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、２００５年、全７３８頁を含む多様な参考書で教示されている。開示される方法で用いるための剤形は、それらに限定されないが、固体剤形および固体改変放出薬物送達系（例えば散剤および顆粒剤、カプセル剤ならびに／または錠剤）；半固体剤形および経皮系（例えば軟膏剤、クリームおよび／またはゲル）；経皮薬物送達系；薬学的挿入物（例えば坐剤および／または挿入物（ｉｎｓｅｒｔ））；液体剤形（例えば液剤および分散系）；ならびに／または滅菌剤形および送達系（例えば非経口製剤（ｐａｒｅｎｔｅｒａｌｓ）および／または生物製剤（ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ））を含む。具体的な例示的剤形は、エアロゾル（定量噴霧（ｍｅｔｅｒｅｄ  ｄｏｓｅ）、粉末、溶液および／または噴霧剤なしを含む）；ビーズ；カプセル（従来の、制御送達、制御放出、腸溶被覆および／または持続放出を含む）；キャプレット；濃縮物；クリーム；結晶；ディスク（持続放出を含む）；点滴剤；エリキシル；乳剤；フォーム；ゲル（ゼリーおよび／または制御放出を含む）；小球；顆粒剤；ガム；インプラント；吸入薬；注射剤；挿入物（徐放（ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ）を含む）；リポソーム；液体（制御放出を含む）；ローション；ロゼンジ；定量噴霧（例えばポンプ）；ミスト；うがい薬；噴霧化用溶液；眼用の系；油；軟膏；膣坐剤（ｏｖｕｌｅ）；粉末（パケット、発泡剤（ｅｆｆｅｒｖｅｓｃｅｎｔ）、懸濁用粉末、懸濁持続放出用粉末および／または溶液用粉末）；ペレット；ペースト；液剤（長時間作用性および／または再構成されたものを含む）；細片；坐剤（持続放出を含む）；懸濁剤（レンテ、ウルトラレンテ（ｕｌｔｒｅ  ｌｅｎｔｅ）、再構成されたものを含む）；シロップ（持続放出を含む）；錠剤（咀嚼、舌下、持続放出、制御放出、遅延作用、遅延放出、腸溶被覆、発泡剤、フィルム被覆、即時溶解、緩慢放出を含む）；経皮系；チンキ；および／またはカシェ剤を含む。典型的には、剤形は、ＡＭＰＫアゴニストを含む少なくとも１つの薬学的活性成分の有効量（例えば治療有効量）と、薬学的に許容される賦形剤および／または他の成分（例えば１つ以上の他の活性成分）との製剤である。薬物製剤化の目的は、被験体に活性成分（例えばＡＭＰＫアゴニストまたはＡＭＰＫアンタゴニスト）を適切に投与することである。製剤は、投与の方式に適するものである。「薬学的に許容される」との用語は、連邦政府もしくは州政府の規制機関により承認されたか、または米国薬局方もしくは他の一般的に認識されている動物およびより具体的にはヒトにおける使用についての薬局方に列挙されていることを意味する。例示的な製剤において用いるための賦形剤は、例えば、１つ以上の以下のものを含む：結合剤、増量剤（ｆｉｌｌｅｒ）、崩壊剤、滑沢剤、コーティング、甘味料、香料、着色料、防腐剤、希釈剤、アジュバントおよび／またはビヒクル。賦形剤が、一括して、具体的な剤形の全重量（および／または容量）の約５％〜９５％を構成するいくつかの場合がある。
【００６５】
薬学的賦形剤は、例えば、水および／またはピーナツ油、大豆油、鉱油、ごま油のような石油、動物油、植物油または合成起源のものなどを含む油のような滅菌液体であり得る。水は、製剤を静脈内投与する場合の例示的なキャリアである。生理食塩水、血漿媒体、デキストロース水溶液およびグリセロール溶液を、特に注射用溶液用の液体キャリアとして用いることもできる。経口製剤は、それらに限定されないが、薬学的グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含み得る。非経口の薬学的賦形剤のより完全な説明は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第１９版、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  ＰＡ：  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、１９９５年、第９５章に見出すことができる。賦形剤は、例えば、浸透圧を調整するための薬学的に許容される塩、シクロデキストリンのような脂質キャリア、血清アルブミンのようなタンパク質、メチルセルロースのような親水性作用物質、界面活性剤、緩衝剤、防腐剤なども含んでよい。薬学的賦形剤の他の例は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ，  ｇｌｙｃｏｌ）、水、エタノールなどを含む。所望により、製剤は、少量の湿潤剤もしくは乳化剤またはｐＨ緩衝剤も含有できる。
【００６６】
経口投与を含むいくつかの実施形態において、ＡＭＰＫアゴニストの経口投与量は、通常、１日あたり体重１ｋｇあたり約０．００１ｍｇ（ｍｇ／ｋｇ／日）〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日、例えば約０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である（そうでないと記載しない限り、活性成分の量は、遊離の酸または遊離の塩基であり得る中性分子に基づく）。例えば、８０ｋｇの被験体は、約０．０８ｍｇ／日〜８ｇ／日、例えば約０．８ｍｇ／日〜８００ｍｇ／日を受容する。１日１回の投与のための適切に調製された医薬品は、よって、０．０８ｍｇ〜８ｇ、例えば０．８ｍｇ〜８００ｍｇを含有する。いくつかの場合において、ＡＭＰＫアゴニストまたはアンタゴニストを含む製剤は、１日２回、３回または４回の分割用量で投与してよい。１日２回の投与のために、上記のような適切に調製された医薬品は、０．０４ｍｇ〜４ｇ、例えば０．４ｍｇ〜４００ｍｇを含有する。上記の範囲外の投与量が必要となる場合があり得る。１日あたり０．０８ｍｇ〜８ｇの範囲で与えられ得る１日投与量の例は、０．１ｍｇ、０．５ｍｇ、１ｍｇ、２．５ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、２５ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、８００ｍｇ、１ｇ、２ｇ、４ｇおよび８ｇを含む。これらの量は、１日に１回より多く投与する場合は、より少ない用量に分けることができる（例えば、薬物を１日２回摂取する場合は、各投与において半分の量）。
【００６７】
注射による投与（例えば静脈内または皮下注射）を含むいくつかの方法実施形態において、被験体は、ほぼ上記の量で活性成分を送達する注射量を受容する。量は、消化系を回避する注射薬物形態に起因する送達効率の差を考慮して調整してよい。このような量は、いくつかの適切な方法、例えば１回の長期間または１日に数回の間での低濃度で高容量の活性成分、短期間、例えば１日１回の間での高濃度で低容量の活性成分で投与してよい。典型的には、約０．０１〜１．０ｍｇ／ｍｌの間の、例えば０．１ｍｇ／ｍｌ、０．３ｍｇ／ｍｌまたは０．６ｍｇ／ｍｌなどの活性成分の濃度を含有する従来の静脈内製剤を調製し、上記の１日あたりの量に等しい１日あたりの量で投与してよい。例えば、０．５ｍｇ／ｍｌの活性成分の濃度を有する静脈内製剤を１日２回８ｍｌ受容する８０ｋｇの被験体は、１日あたり８ｍｇの活性成分を受容する。
【００６８】
他の方法実施形態において、ＡＭＰＫアゴニストまたはアンタゴニスト（またはその製剤）は、治療期間を通してほぼ同じ用量、漸増用量計画または負荷用量計画（例えば負荷用量が維持用量の約２〜５倍である）で投与できる。いくつかの実施形態において、用量は、使用期間の間に、組成物を受容する被験体の状態、組成物に対する見かけの応答および／または当業者により判断される他の因子に基づいて変動する。いくつかの実施形態において、例えば慢性不眠症または睡眠覚醒サイクル障害を管理するために、ＡＭＰＫアゴニストまたはアンタゴニストの長期間の投与が意図される。
【００６９】
本開示は、ＡＭＰＫ活性化または阻害を測定することによる、概日リズムを調整する作用物質のスクリーニング方法も提供する。概日リズムを調整する化合物をスクリーニングするための本開示の方法は、ＡＭＰＫ経路を備える細胞、組織または被験体（例えば動物）を提供するステップと、前記被験体を、概日リズム調整活性を有すると推測される作用物質と接触させるステップと、ＡＭＰＫ活性に対する作用を、直接、または下流のキナーゼ活性により測定するステップとを含む。被検作用物質は、概日リズム機能の少なくとも１つの観察可能な指標を有し、かつＡＭＰＫを発現する細胞調製物、組織、器官、生物または動物に対して提供することができる。概日リズムを調整する作用物質の能力は、概日リズム機能の徴候を示す多様な動物種、ならびにそのような動物から得られる器官、組織および細胞、およびそれらに由来する細胞調製物で試験できる。ＡＭＰＫ活性を調整する作用物質は、次いで、推定概日リズム調整活性を有する作用物質として同定できる。
【００７０】
多様なｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニング方法が、概日リズムを調整する化合物を同定するための本開示の方法において提供されるアンタゴニストまたはアゴニストを同定するために有用である。ＡＭＰＫを調整する化合物の能力は、例えば、ＡＭＰＫと結合してＡＭＰＫを活性化もしくは不活性化するか、下流のキナーゼ活性を遮断するか、リン酸化および脱リン酸化を調整するか（例えばＣｒｙ１またはＣｒｙ２のリン酸化、脱リン酸化）、またはＡＭＰＫにより生成される予め決定されたシグナルを調整する化合物の能力により示され得る。よって、シグナル伝達および結合アッセイを用いて、概日リズムを調整する化合物を同定するための本開示の方法において提供されるＡＭＰＫのアンタゴニストまたはアゴニストを同定できる。
【００７１】
「作用物質」は、目的または結果を達成するために有用である、任意の物質または物質の任意の組合せ、例えば、ＡＭＰＫ活性化カスケードと関連するタンパク質活性を調整するために有用であり（例えばＡＭＰＫ依存性リン酸化事象）、またはタンパク質−タンパク質相互作用もしくはＡＴＰ代謝を改変するかまたはそれに影響するために有用である物質あるいは物質の組合せである。
【００７２】
例示的な作用物質は、それらに限定されないが、それらに限定されないがランダムペプチドライブラリーのメンバー（例えば、Ｌａｍら、Ｎａｔｕｒｅ、３５４巻：８２〜８４頁、１９９１年；Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５４巻：８４〜８６頁、１９９１年を参照されたい）を含む例えば可溶性ペプチドのようなペプチド、ならびにＤおよび／またはＬ立体配置のアミノ酸で作製されたコンビナトリアル化学由来分子ライブラリー、ホスホペプチド（それらに限定されないが、ランダムまたは部分的に縮重された、定向ホスホペプチドライブラリーのメンバーを含む；例えば、Ｓｏｎｇｙａｎｇら、Ｃｅｌｌ、７２巻：７６７〜７７８頁、１９９３年を参照されたい）、抗体（それらに限定されないが、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、抗イディオタイプ、キメラまたは単鎖抗体、ならびにＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦａｂ発現ライブラリーフラグメント、およびそれらのエピトープ結合フラグメントを含む）、有機または無機の小分子（例えば、いわゆる天然生成物または化学コンビナトリアルライブラリーのメンバー）、分子複合体（例えばタンパク質複合体）、あるいは核酸を含む。
【００７３】
本開示の方法において有用なライブラリー（例えばコンビナトリアル化学ライブラリー）は、それらに限定されないが、ペプチドライブラリー（例えば米国特許第５，０１０，１７５号；Ｆｕｒｋａ、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｅｐｔ．  Ｐｒｏｔ．  Ｒｅｓ．、３７巻：４８７〜４９３頁、１９９１年；Ｈｏｕｇｈｔｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５４巻：８４〜８８頁、１９９１年；ＰＣＴ公報第ＷＯ９１／１９７３５号を参照されたい）、コードされたペプチド（例えばＰＣＴ公報第ＷＯ９３／２０２４２号）、ランダムバイオオリゴマー（例えばＰＣＴ公報第ＷＯ９２／０００９１号）、ベンゾジアゼピン（例えば米国特許第５，２８８，５１４号）、ヒダントイン、ベンゾジアゼピンおよびジペプチドのようなダイバーソマー（ｄｉｖｅｒｓｏｍｅｒ）（Ｈｏｂｂｓら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９０巻：６９０９〜６９１３頁、１９９３年）、ビニローグ（ｖｉｎｙｌｏｇｏｕｓ）ポリペプチド（Ｈａｇｉｈａｒａら、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ、１１４巻：６５６８頁、１９９２年）、グルコース足場を有する非ペプチド性ペプチド模倣物（Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｎら、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ、１１４巻：９２１７〜９２１８頁、１９９２年）、小化合物ライブラリーの類似した有機合成（Ｃｈｅｎら、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ、１１６巻：２６６１頁、１９９４年）、オリゴカルバメート（Ｃｈｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６１巻：１３０３頁、１００３年）および／またはペプチジルホスホネート（Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．、５９巻：６５８頁、１９９４年）、核酸ライブラリー（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎ．  Ｙ．、１９８９年；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｎ．  Ｙ．、１９８９年を参照されたい）、ペプチド核酸ライブラリー（例えば米国特許第５，５３９，０８３号を参照されたい）、抗体ライブラリー（例えばＶａｕｇｈｎら、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１４巻：３０９〜３１４頁、１９９６年；ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９６／１０２８７号を参照されたい）、炭水化物ライブラリー（例えばＬｉａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７４巻：１５２０〜１５２２頁、１９９６年；米国特許第５，５９３，８５３号を参照されたい）、有機小分子ライブラリー（例えばベンゾジアゼピン、Ｂａｕｍ、Ｃ＆ＥＮ、１月１８日、３３頁、１９９３年；イソプレノイド、米国特許第５，５６９，５８８号；チアゾリジオノンおよびメタチアゾン、米国特許第５，５４９，９７４号；ピロリジン、米国特許第５，５２５，７３５号および第５，５１９，１３４号；モルホリノ化合物、米国特許第５，５０６，３３７号；ベンゾジアゼピン、第５，２８８，５１４号を参照されたい）などを含む。
【００７４】
開示されるスクリーニング方法のために有用なライブラリーは、それらに限定されないが、空間的に整列させたマルチピンペプチド合成（Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、８１巻（１３号）：３９９８〜４００２頁、１９８４年）、「ティーバッグ」ペプチド合成（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、８２巻（１５号）：５１３１〜５１３５頁、１９８５年）、ファージディスプレイ（ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９巻：３８６〜３９０頁、１９９０年）、スポットまたはディスク合成（Ｄｉｔｔｒｉｃｈら、Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．、８巻（１７号）：２３５１〜２３５６頁、１９９８年）、あるいはビーズ上での分割および混合固相合成（Ｆｕｒｋａら、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｅｐｔ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．、３７巻（６号）：４８７〜４９３頁、１９９１年；Ｌａｍら、Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｖ．、９７巻（２号）：４１１〜４４８頁、１９９７年）を含む多様な方法で生成できる。ライブラリーは、種々の数の構成成分（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）（メンバー）、例えば約１００メンバーまで、例えば約１０００メンバーまで、例えば約５０００メンバーまで、例えば約１０，０００メンバーまで、例えば約１００，０００メンバーまで、例えば約５００，０００メンバーまでまたは５００，０００メンバーより多くさえ含んでよい。
【００７５】
１つの実施形態において、ハイスループットスクリーニング法は、多数の可能性のある治療化合物（例えば、ＡＭＰＫタンパク質−タンパク質相互作用の影響因子）を含有するコンビナトリアル化学またはペプチドライブラリーを提供するステップを含む。このようなコンビナトリアルライブラリーを、次いで、本明細書に記載されるような１つ以上のアッセイでスクリーニングして、所望の特徴的な活性を示す（例えばＡＭＰＫタンパク質−タンパク質相互作用を増加または減少させる）ライブラリーメンバー（特に化学種またはサブクラス）を同定する。このようにして同定された化合物は、通常の「リード化合物」として用い得るか、またはそれら自体を可能性のあるもしくは実際の治療剤として用いることができる。いくつかの場合において、候補作用物質のプールを同定し、さらにスクリーニングして、どの個別の作用物質または集合的な作用物質のより小さいプールが所望の活性を有するか決定してよい。ＡＭＰＫ相互作用またはプロセスのＡＭＰ依存性リン酸化に影響する（例えば増加または減少させる）作用物質は、被験体において概日リズム（例えば睡眠行動）を調整する効果を有する場合があり、よって、同定することが望まれる。
【００７６】
本明細書に記載されるスクリーニング法において、組織試料、単離細胞、単離ポリペプチドおよび／または被検作用物質は、ハイスループットスクリーニングに適する様式で提示できる。例えば、１または複数の単離組織試料、単離細胞または単離ポリペプチドを、マイクロタイタープレートのウェルに入れ、１または複数の被検作用物質をマイクロタイタープレートのウェルに加えることができる。代わりに、１または複数の被検作用物質を、マイクロタイタープレートのウェル（溶液でまたはプレート表面に接着した）のようなハイスループットフォーマットで提示でき、１または複数の単離組織試料、単離細胞および／または単離ポリペプチドと、組織試料もしくは単離細胞もしくは所望のポリペプチド機能および／または構造物を少なくとも維持する条件下で接触させる。被検作用物質は、組織試料、単離細胞または単離ポリペプチドに、組織もしくは細胞に致死的でなく、ポリペプチド構造物および／または機能に有害な影響を与えない任意の濃度で加えることができる。異なる被検作用物質は、異なる有効濃度を有することが予想される。よって、いくつかの方法において、被検作用物質濃度の範囲を試験することが有利である。
【００７７】
タンパク質リン酸化を検出するための方法は、従来からあり（例えばＧｌｏｆｆｋｅ、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ、１６巻（１９号）：５２頁、２００２年；Ｓｃｒｅａｔｏｎら、Ｃｅｌｌ、１１９巻：６１〜７４頁、２００４年を参照されたい）、検出キットは、多様な商業的供給源から入手可能である（例えばＵｐｓｔａｔｅ（Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｓｖｉｌｌｅ、ＶＡ、ＵＳＡ）、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）、Ｍａｒｌｉｇｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｉｊａｍｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡ）、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を参照されたい）。簡単に述べると、リン酸化タンパク質は、ゲル中のリン酸化タンパク質に特異的な染色を用いて検出できる。代わりに、リン酸化タンパク質に特異的な抗体を作製できるか、または商業的に入手できる。リン酸化タンパク質に特異的な抗体は、なかでも、ビーズに繋留されているか（特定の色のサインを有するビーズを含む）、またはＥＬＩＳＡもしくはウェスタンブロットアッセイにおいて用いることができる。
【００７８】
特定の方法において、ポリペプチドのリン酸化は、このような翻訳後修飾が検出可能に測定される場合、またはこのような翻訳後修飾が対照測定（例えば被検作用物質を加える前の同じ試験系、または被検作用物質の非存在下での同様の試験系、またはＡＭＰＫの非存在下での同様の試験系）よりも少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも１００％または少なくとも２５０％高い場合に、増加している。
【００７９】
ＡＭＰＫサブユニット（例えばＡＭＰＫα１および／またはＡＭＰＫα２）の基本型のアミノ酸配列（および基本型のＡＭＰＫサブユニット（例えばＡＭＰＫα１および／またはＡＭＰＫα２）をコードする核酸配列）は、周知である。例示的なＡＭＰＫα１アミノ酸配列および対応する核酸配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿２０６９０７．３（ＧＩ：９４５５７２９８）（アミノ酸配列および核酸配列を含むＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ転写産物バリアント２  ＲＥＦＳＥＱ）；ＮＭ＿００６２５１．５（ＧＩ：９４５５７３００）（アミノ酸および核酸配列を含むＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ転写産物バリアント１  ＲＥＦＳＥＱ）；ＮＭ＿００１０１３３６７．３（ＧＩ：９４６８１０６０）（アミノ酸および核酸配列を含むＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ＲＥＦＳＥＱ）；ＮＭＪ）０１０３９６０３．１（ＧＩ：８８８５３８４４）（アミノ酸および核酸配列を含むＧａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ  ＲＥＦＳＥＱ）；およびＮＭ＿０１９１４２．１（ＧＩ：１１８６２９７９ＸＲａＪｆＷＳアミノ酸配列および核酸配列を含むｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ＲＥＦＳＥＱ）に記載される。例示的なＡＭＰＫα２アミノ酸配列および対応する核酸配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００６２５２．２（ＧＩ：４６８７７０６７）（アミノ酸配列および核酸配列を含むＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＲＥＦＳＥＱ）；ＮＭ＿１７８１４３．１（ＧＩ：５４７９２０８５）（アミノ酸配列および核酸配列を含むＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ＲＥＦＳＥＱ）；ＮＭ＿００１０３９６０５．１（ＧＩ：８８８５３８５０）（アミノ酸配列および核酸配列を含むＧａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ  ＲＥＦＳＥＱ）；およびＮＭ＿２１４２６６．１（ＧＩ：４７５２３５９７）（アミノ酸配列および核酸配列を含むＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ＲＥＦＳＥＱ）に記載される。
【００８０】
いくつかの方法実施形態において、ＡＭＰＫサブユニットのホモログまたは機能的バリアントは、基本型のＡＭＰＫα１および／またはＡＭＰＫα２ポリペプチドと少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性、例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿２０６９０７．３；ＮＭ＿００６２５１．５；ＮＭＪ）０１０１３３６７．３；ＮＭ＿００１０３９６０３．１；ＮＭ＿０１９１４２．１；ＮＭ＿００６２５２．２；ＮＭ＿１７８１４３．１；ＮＭ＿００１０３９６０５．１；またはＮＭ＿２１４２６６．１に記載されるアミノ酸配列と、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を共有する。他の方法実施形態において、ＡＭＰＫサブユニットのホモログまたは機能的バリアントは、基本型のＡＭＰＫα１および／またはＡＭＰＫα２ポリペプチドと比較して１つ以上の保存的アミノ酸置換、例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿２０６９０７．３；ＮＭ＿００６２５１．５；ＮＭ＿００１０１３３６７．３；ＮＭ＿００１０３９６０３．１；ＮＭ＿０１９１４２．１；ＮＭ＿００６２５２．２；ＮＭ＿１７８１４３．１；ＮＭ＿００１０３９６０５．１；またはＮＭ＿２１４２６６．１に記載されるアミノ酸配列と比較して、３以下、５以下、１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、４０以下または５０以下の保存的アミノ酸の変化を有する。例示的な保存的アミノ酸置換は、本明細書において先に記載した。
【００８１】
いくつかの方法実施形態は、ＡＭＰＫまたはそのサブユニット（例えばＡＭＰＫα１および／またはＡＭＰＫα２）の機能的フラグメントを含む。ＡＭＰＫまたはそのサブユニット（例えばＡＭＰＫα１および／またはＡＭＰＫα２）の機能的フラグメントは、例えばその約２０、約３０、約４０、約５０、約７５、約１００、約１５０または約２００連続アミノ酸残基を含む、全長もしくはインタクトなＡＭＰＫポリペプチド複合体またはそのサブユニット（例えばＡＭＰＫα１および／またはＡＭＰＫα２）の任意の部分であり得るが、ただし、フラグメントが、対象とする少なくとも１つのＡＭＰＫ（またはＡＭＰＫα１および／もしくはＡＭＰＫα２）機能を保持することを条件とする。ＡＭＰＫ経路におけるポリペプチド間のタンパク質−タンパク質相互作用は、少なくともＡＭＰＫαサブユニット（例えばＡＭＰＫα１および／またはＡＭＰＫα２）を含むと考えられる。
【００８２】
「単離」生体成分（例えばポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは細胞）は、混合試料（例えば細胞または組織の抽出物）中の他の生体成分から分けて精製されている。例えば、「単離」ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドが存在していた細胞（例えば組換えポリペプチドまたはポリヌクレオチドについての発現宿主細胞）の他の成分から分けられたポリペプチドまたはポリヌクレオチドである。
【００８３】
「精製された」との用語は、試料から１つ以上の無関係の成分を除去することをいう。例えば、組換えポリペプチドを宿主細胞において発現させる場合、ポリペプチドは、例えば、宿主細胞タンパク質を除去し、それにより試料中の組換えポリペプチドの割合が増加することにより精製される。同様に、組換えポリヌクレオチドが宿主細胞中に存在する場合、ポリヌクレオチドは、例えば、宿主細胞ポリヌクレオチドを除去し、それにより試料中の組換えポリヌクレオチドの割合が増加することにより精製される。
【００８４】
単離ポリペプチドまたは核酸分子は、典型的には、試料の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または９９％（ｗ／ｗまたはｗ／ｖ）超をさらに含む。
【００８５】
ポリペプチドおよび核酸分子は、当該技術において一般的に公知であり本明細書に記載される方法により単離される。ポリペプチドまたは核酸分子の純度は、ポリペプチドについてポリアクリルアミドゲル電気泳動、または核酸分子についてアガロースゲル電気泳動のようないくつかの周知の方法により決定してよい。
【００８６】
２つの核酸配列間または２つのアミノ酸配列間の類似性は、これらの配列間で共有される配列同一性のレベルの点で表される。配列同一性は、典型的には、パーセント同一性に関して表される。パーセンテージが高いほど、２つの配列はより類似する。
【００８７】
比較のために配列を整列させる方法は、当該技術において周知である。種々のプログラムおよびアラインメントアルゴリズムが、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．２巻：４８２頁、１９８１年；ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．４８巻：４４３頁、１９７０年；ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  ＳｃＬ  ＵＳＡ８５巻：２４４４頁、１９８８年；ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ、Ｇｅｎｅ７３巻：２３７〜２４４頁、１９８８年；ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ、ＣＡＢＩＯＳ５巻：１５１〜１５３頁、１９８９年；Ｃｏｒｐｅｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ１６巻：１０８８１〜１０８９０頁、１９８８年；Ｈｕａｎｇら、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ８巻：１５５〜１６５頁、１９９２年；Ｐｅａｒｓｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ２４巻：３０７〜３３１頁、１９９４年；Ｔａｔｉａｎａら（１９９９年）、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｌｅｔｔ．、１７４巻：２４７〜２５０頁、１９９９年に記載されている。Ａｌｔｓｃｈｕｌらは、配列アラインメント法および相同性算出について詳細な考察を示している（Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．２１５巻：４０３〜４１０頁、１９９０年）。国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ（商標）、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．２１５巻：４０３〜４１０頁、１９９０年）は、ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘの配列分析プログラムと関連して用いるために、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）およびインターネット上を含む種々の供給源から利用可能である。このプログラムを用いてどのようにして配列同一性を決定するかについての記載は、インターネット上で、ＢＬＡＳＴ（商標）についてのヘルプ部分から利用可能である。
【００８８】
約３０アミノ酸より大きいアミノ酸配列の比較のために、ＢＬＡＳＴ（商標）（Ｂｌａｓｔｐ）プログラムの「Ｂｌａｓｔ２配列」機能を、デフォルトパラメータ（ギャップ開始コスト［デフォルト＝５］；ギャップ伸長コスト［デフォルト＝２］；ミスマッチペナルティ［デフォルト＝−３］；マッチ報酬［デフォルト＝１］；期待値（Ｅ）［デフォルト＝１０．０］；ワードサイズ［デフォルト＝３］；１行の記載の数（Ｖ）［デフォルト＝１００］；表示するアラインメントの数（Ｂ）［デフォルト＝１００］）に設定されたデフォルトＢＬＯＳＵＭ６２行列を用いて行う。短いペプチド（３０アミノ酸くらいより少ない）を整列させる場合、アラインメントは、デフォルトパラメータ（開始ギャップ９、伸長ギャップ１ペナルティ）に設定されたＰＡＭ３０行列を用いるＢｌａｓｔ２配列機能を用いて行う。参照配列に対してさらにより大きい類似性を有するタンパク質は、この方法により評価する場合に、パーセント同一性の増加を示す。
【００８９】
核酸配列の比較のために、ＢＬＡＳＴ（商標）（Ｂｌａｓｔｎ）プログラムの「Ｂｌａｓｔ２配列」機能を、デフォルトパラメータ（ギャップ開始コスト［デフォルト＝１１］；ギャップ伸長コスト［デフォルト＝１］；期待値（Ｅ）［デフォルト＝１０．０］；ワードサイズ［デフォルト＝１１］；１行の記載の数（Ｖ）［デフォルト＝１００］；表示するアラインメントの数（Ｂ）［デフォルト＝１００］）に設定されたデフォルトＢＬＯＳＵＭ６２行列を用いて行う。参照配列に対してさらにより大きい類似性を有する核酸配列は、この方法により評価する場合に、パーセント同一性の増加を示す。
【００９０】
特異的結合とは、一方の結合パートナー（例えば結合剤）と他方の結合パートナー（例えば標的）との間の特定の相互作用のことをいう。このような相互作用は、結合パートナー間（またはより頻繁には、各結合パートナーの特定の領域または部分間）の１または典型的にはそれより多い非共有結合により媒介される。非特異的結合部位とは対照的に、特異的結合部位は、飽和可能である。よって、特異的結合を特徴づける１つの例示的な方法は、特異的結合曲線による。特異的結合曲線は、例えば、一定量の一方の結合パートナーと結合した他方の結合パートナー（第１結合パートナー）の量を、第１結合パートナーの濃度の関数として示す。第１結合パートナーの濃度がこれらの条件下で増加すると、結合した第１結合パートナーの量が飽和する。非特異的結合部位とはまた別に対照的に、互いの直接の会合（例えばタンパク質−タンパク質相互作用）に関与する特異的結合パートナーは、このような会合（例えばタンパク質複合体）から、過剰量のいずれかの特異的結合パートナーにより競合的に除去（または置換）され得る。このような競合アッセイ（または置換アッセイ）は、当該技術において周知である。
【００９１】
本開示は、概日リズムおよび睡眠行動をもたらすために有用な作用物質を同定する方法および作用物質も提供する。
【実施例】
【００９２】
以下の実施例は、ある特定の特徴および／または実施形態を例示するために提供される。これらの実施例は、記載される特定の特徴または実施形態に本発明を限定すると解釈されない。
【００９３】
（実施例１）
ＣＲＹ１−Ｓ７１またはＣＲＹ１−Ｓ２８０のリン酸化は、ＣＲＹ１：ＦＢＸＬ３相互作用を増加させる。末梢時計のリセットにおける機構としての翻訳後修飾の役割を調べるために、質量分析および生物情報学分析の組合せを用いて、調節されたリン酸化の部位であると予測されるｍＣＲＹ１およびｍＣＲＹ２中の８つのセリンまたはスレオニン残基を同定した。リン酸化し得ない変異体（ｎｏｎ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔａｂｌｅ  ｍｕｔａｎｔ）をそれぞれについて作製し、セリン７１のアラニンへの変異がｍＣＲＹ１を安定化するが、残りの変異は安定性に対してほとんどまたは全く効果を有さないことが分かった（図７）。
【００９４】
セリン７１に影響するＣＲＹ１安定化変異は、ＡＭＰＫによりリン酸化された最適配列によく順応するので、特に興味が持たれる。哺乳動物クリプトクロムは、ｍＣＲＹ１の２８０位に別のセリンを含有し、これも、ＡＭＰＫ基質モチーフによく順応する（図８）。セリン７１またはセリン２８０のいずれかをリン酸化し得ないアミノ酸（アラニン）に変異させることは、ｍＣＲＹ１を安定化するために十分であったが、セリン７１またはセリン２８０のいずれかをホスホ模倣アミノ酸（アスパルテート）に変異することは、ｍＣＲＹ１を不安定化するのに十分であり、これらの両方の残基を一緒に変異させると、安定性に対する影響が増加した（図１）。両方の場合において、全ての光非感受性昆虫クリプトクロムおよび高等生物において進化的に保存されているセリン７１（図２）の変異は、Ｓ２８０の変異よりも強い効果を有した（図１Ａ）。Ｓ７１およびＳ２８０の両方のアスパラギン酸へのホスホ模倣変異を有するｍＣＲＹ１は、イムノブロットにより検出できなかった。セリン７１および／またはセリン２８０でリン酸化されているｍＣＲＹ１の安定性の低下と一致して、これらの部位のホスホ模倣変異体は、ＣＬＯＣＫ：ＢＭＡＬ１転写活性のより効果が低いリプレッサーでもあった（図１Ｂ）。クリプトクロムは、元来、植物において青色光光受容体として同定され、後に、動物の概日時計の成分として認識された。多くの昆虫が、クリプトクロムのそれぞれの型のうちの１つを発現する：露光により分解される青色光光受容体（「１型」）および概日転写調節に関与するが、光により誘導される不安定化に対して感受性でない転写リプレッサー（「２型」）。昆虫「２型」クリプトクロムタンパク質は、それらの哺乳動物での対応物と同様に、一昼夜の経過のうちで変動し、このことは、それらの安定化が、非光（ｎｏｎ−ｌｉｇｈｔ）シグナルにより、ＦＢＸＬ３（そのオルソログは昆虫に存在する（ＧｅｎＢａｎｋ参照番号ＸＭ＿００１１２０５３３．１））が関与する保存された機構をおそらく用いて調節されるはずであることを示す。
【００９５】
セリン７１および２８０のリン酸化を模倣する変異を有するｍＣＲＹ１変異体の不安定性が、ＦＢＸＬ３との相互作用の増加を反映するかを決定するために、ｖ５タグ付加ＦＢＸＬ３を有するＦｌａｇタグ付加野生型または変異体ｍＣＲＹ１を発現させ、それらの結合親和性を、Ｆｌａｇタグ付加ｍＣＲＹ１の免疫沈降と、その後のｖ５タグ付加ＦＢＸＬ３のイムノブロットにより分析した。Ｓ７１またはＳ２８０のいずれかのアスパラギン酸への変異は、ＦＢＸＬ３へのｍＣＲＹ１の結合親和性を増加させ（図１Ｃ）、このことは、これらの部位のリン酸化が、ｍＣＲＹ１とＦＢＸＬ３との間の相互作用の増加を媒介することを示唆した。２重変異体は不安定すぎて、ＦＢＸＬ３とのその相互作用を生化学的に決定できなかった。
【００９６】
これらの変異体を、同時トランスフェクトしたＣＬＯＣＫおよびＢＭＡＬ１の転写活性を抑制する能力について試験した場合、ＣＲＹ１のリン酸化し得ないＡＡ変異体は、効果的なリプレッサーであることが示され、この抑制は、ＦＢＸＬ３の同時トランスフェクションによって変更されなかった。予測されたように、２重ホスホ模倣物ＣＲＹ１  ＤＤは、ＣＬＯＣＫ：ＢＭＡＬ１活性のより効果が低い阻害物質であり、これは、この変異体のより低い安定性を反映し得る。ＣＲＹ１  ＡＡ抑制に対するＦＢＸＬ３媒介の作用の欠如とは対照的に、ＣＬＯＣＫ：ＢＭＡＬ１駆動型転写を抑制するＣＲＹ１  ＤＤの弱い能力は、ＦＢＸＬ３の同時発現により喪失した（図１Ｄ）。
【００９７】
Ｓ７１、Ｓ２８０およびＳ２８１変異の影響を、ｍＣＲＹ１とその公知の結合パートナーであるＰＥＲ２との相互作用に対して調べた。セリン７１のホスホ模倣変異（Ｓ７１Ｄ）は、ＣＲＹ１とＰＥＲ２との間の相互作用を遮断したが、Ｓ２８０Ｄ変異体はＰＥＲ２結合を保持し、調べた他の変異体も同様であった（図１Ｅ）。この差は、ＣＲＹ１  Ｓ２８０Ｄを上回るＣＲＹ１  Ｓ７１Ｄの分解の増進が一因であり得る。よって、Ｓ７１Ｄ変異体は、ＰＥＲ２との結合の減少と、ＦＢＸＬ３との結合の増加を示し、これらはそれぞれＣＲＹ１を不安定化すると予想され、これらは一緒にＣＲＹ１  Ｓ７１Ｄの観察された不安定性の原因であると見られる。
【００９８】
ＡＭＰＫは、リン酸化依存性クリプトクロム分解を媒介する。ｍＣＲＹ１のセリン７１の周囲の配列の関係は、これが、近くの好ましい配列特異性（標的セリンに対して−４位および−３位での正に荷電された残基、ならびに−５位および＋４位での疎水性残基）だけでなく、標的セリンに対して−１６位および−９位での好ましい遠位ロイシン残基さえ含み、ＡＭＰＫによるリン酸化の優れた候補であることを示唆する（図２Ａ）。Ｓ２８０の周囲のアミノ酸配列の関係も、近傍の好ましい配列特異性に従ってＡＭＰＫリン酸化を示唆する（図８）。
【００９９】
ホスホ特異抗体を、ｍＣＲＹ１  Ｓ７１の配列の関係を周囲に有するホスホセリンを含有するペプチド抗原に対して作製し、この抗体を用いて、外因的に発現させた野生型ｍＣＲＹ１のリン酸化を観察したが、リン酸化し得ないＳ７１Ａ変異体では観察されなかった（図２Ｂ）。ｍＣＲＹ１のセリン７１の周囲の配列は、アセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ１（ＡＣＣ１）のセリン７９の周囲のものと類似し、これは、ＡＭＰＫの最もよく研究された基質の１つである（図２Ｂ）。実際に、セリン７９でリン酸化されたＡＣＣ１の残基７３〜８５に相当するペプチドに対して産生された抗体は、野生型ｍＣＲＹ１を検出できたが、セリン７１をアラニンに置き換える変異を有するｍＣＲＹ１は検出できず（図２Ｂ）、このことは、ｍＣＲＹ１のセリン７１が、ｉｎ  ｖｉｖｏでリン酸化されることができることのさらなる証拠を提供し、このリン酸化事象がＡＭＰＫにより媒介され得ることをさらに示唆する。ＡＭＰＫａ２触媒ドメインの構成的に活性な変異体（ＣＡａ２）をｍＣＲＹ１と発現させた場合、セリン７１のリン酸化の増加（図２Ｃ）が観察され、このことにより、ＡＭＰＫがＣＲＹ１をｉｎ  ｖｉｖｏにてセリン７１上でリン酸化できることが確認された。ＡＭＰＫａ１の構成的に活性な変異体（ＣＡａ１）は、核から排除されたが、セリン７１のリン酸化を認識可能には増加しなかった（図２Ｃ）。ＡＭＰＫは、精製された成分を用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイにおいて、ｍＣＲＹ１を直接リン酸化することもできた（図９）。
【０１００】
内因性ＡＭＰＫの活性化は、クリプトクロムを不安定化する。いくつかの相補的ストラテジーを用いて、Ｓ７１およびＳ２８０のリン酸化ならびにｍＣＲＹ１の不安定化に対する内因性ＡＭＰＫの寄与を分析した。ＨｅＬａ細胞は、ＡＭＰＫ活性化キナーゼＬＫＢ１のプロモーターのメチル化によるエネルギーストレスに応答して、内因性ＡＭＰＫの活性化を低減する。野生型（ＷＴ）ＬＫＢ１の導入は、外因的に発現されるｍＣＲＹ１のレベルを低減させ、不活性（ＫＤ）ＬＫＢ１の導入では低減させなかった。この低減は、ＡＭＰＫ活性化ＡＭＰ模倣ＡＩＣＡＲを、ＷＴ  ＬＫＢ１の存在下に加えることにより増強し、ＫＤ変異体の存在下では増強しなかった（図２Ｄ）。同様に、グルコース欠損によるＡＤ２９３細胞におけるＡＭＰＫの活性化は、トランスフェクトした野生型ｍＣＲＹ１（ＷＴ）発現を低減させ、予測されるＡＭＰＫリン酸化部位を欠く変異体ｍＣＲＹ１（ＡＡ）ではそうではなかった（図２Ｅ）。
【０１０１】
クリプトクロム安定性の調節におけるＡＭＰＫの役割をさらに調べるために、遺伝子的に野生型（ＷＴ）またはＡＭＰＫの触媒サブユニットについてヌル（ａｍｐｋａ１−／−；ａｍｐｋａ２−／−）（ＡＭＰＫ−／−）であるマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）を用いた。ｆｌａｇタグ付加野生型（ＷＴ）または２重リン酸化し得ない（ＡＡ）のｍＣＲＹ１をこれらの細胞において安定的に発現するレトロウイルスを用いて、ＡＡ  ＣＲＹ１ではなく野生型が、野生型細胞においてのみＡＭＰＫアゴニストＡＩＣＡＲを用いる処理により急速に分解されることを示した。機能的ＡＭＰＫの非存在下では、ＡＩＣＡＲは、ＷＴまたはＡＡ  ＣＲＹ１のいずれに対しても作用を有さなかった（図２Ｆ）。Ｓ７１およびＳ２８０のＡＭＰＫリン酸化によるＣＲＹ１安定性の調節は、これらの細胞を４時間の過程のＡＭＰＫ活性化ＡＩＣＡＲの存在下でのシクロヘキシミド処理に供することによりさらに確認された（図２Ｇ）。ＡＩＣＡＲ処理は、野生型の安定性の低減をもたらしたが、ＣＲＹ１のリン酸化し得ない変異体の安定性の低減はもたらさなかった。
【０１０２】
ＡＭＰＫは、線維芽細胞における概日リズムの代謝的変更に寄与する。概日時計リセットのための摂食由来シグナルの重要性、グルコース利用力によるＡＭＰＫの調節、およびクリプトクロム不安定化におけるＡＭＰＫの役割についての蓄積している証拠に鑑みて、ＡＭＰＫ発現およびグルコース利用力の影響を、線維芽細胞における概日リズム性に対して調べた。野生型線維芽細胞を、制限されたグルコースを含有する培地で培養した場合、概日性ｒｅｖｅｒｂαおよびｄｂｐ発現の振幅は、著しく増進され（図３Ａおよび図１０）、これは、グルコース欠損がＡＭＰＫを活性化し、ＣＲＹ安定性を低減させるモデル（これは、ＣＬＯＣＫ：ＢＭＡＬ１標的であるｒｅｖｅｒｂαおよびｄｂｐの脱抑制を導く）と一致した。予想されたように、培養培地にＡＩＣＡＲを加えることは、グルコース欠損の効果を模倣した。目ざましいことに、グルコース欠損もＡＩＣＡＲ処理も、ＡＭＰＫを欠くＭＥＦ（ａｍｐｋα１−／−；ａｍｐｋα２−／−、「ＡＭＰＫ−／−」）におけるｒｅｖｅｒｂαおよびｄｂｐの発現に影響せず（図３Ａおよび図１０）、このことは、線維芽細胞概日リズムに対するグルコース制限の影響が、ＡＭＰＫにより媒介されることを示した。
【０１０３】
Ｂｍａｌ１プロモーターは、ＲＥＶＥＲＢαにより抑制される。よって、グルコース利用力の低減が概日リズムに与える影響を、Ｂｍａｌ１プロモーターの制御下でルシフェラーゼを安定的に発現する線維芽細胞を用いて調べた。標準的（高グルコース）培養条件下では、Ｂｍａｌ１−ルシフェラーゼの発現の高振幅概日リズムが、２５．３時間の周期で観察された（図３Ｂ、Ｃ）。培地中のグルコース量の低下は、概日周期を３０．７時間まで増加させた。Ｂｍａｌ１−ルシフェラーゼ発現細胞を、ＡＩＣＡＲを補った高グルコース培地で培養した場合、概日周期は、低グルコースで観察されたものと同様であり、グルコース欠損の概日性の影響が、ＡＭＰＫにより媒介されるという考えを補強した。制限されたグルコース条件のもとで観察されたＲＥＶＥＲＢαの発現の増加は、Ｂｍａｌ１を含むＲＥＶＥＲＢαにより抑制される遺伝子の発現の低下をもたらすと予想される。実際に、グルコース濃度の低下またはＡＩＣＡＲ処理のいずれかによるＡＭＰＫの活性化は、Ｂｍａｌ１−ルシフェラーゼ発現の振幅を低下させた（図３Ｄ）。これらの結果はまとめて、培養線維芽細胞の概日リズムが、グルコース利用力の変更を担い、これらの効果が、ＡＭＰＫ誘導リン酸化により媒介されることを示す。
【０１０４】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのＡＭＰＫの概日性の調節。ＡＭＰＫの日周期性調節を調べるために、ＡＭＰＫ転写、局在化および基質リン酸化を、インタクトな動物の末梢器官において調べた。全ての実験は、標準的な明暗サイクルへの同調化の後に定常的な暗所に維持した動物を用いて行って、観察された効果が、外部の環境における変化に対する日周期性の応答よりもむしろ概日性であることを確実にした。
【０１０５】
調べた両方のＡＭＰＫ基質、ＡＣＣ１−Ｓｅｒ７９およびＲａｐｔｏｒ−Ｓｅｒ７９２のリン酸化は、主体的な昼において夜よりも再現可能により高く（図４Ａ）、ネガティブフィードバックタンパク質が不安定な昼の時間にほぼ対応し、これは、リズム性のＡＭＰＫ活性化が分解に寄与するモデルと一致した。マウス肝臓におけるＡＭＰＫの概日性の調節を探索する一方、最小限の核クリプトクロムタンパク質の時間と一致するピーク発現（図４Ｃ）を有する調節性ａｍｐｋβ２サブユニットの堅固な概日性の発現（図４Ｂ）。ＡＭＰＫβ２は、ＡＭＰＫ複合体の核局在化を駆動すると報告されているが、ＡＭＰＫβ１含有複合体は、形質膜を標的にする。よって、ａｍｐｋβ２の概日転写は、変動するＡＭＰＫβ２が、ＡＭＰＫα１およびＡＭＰＫα２の核局在化を日周期性に調節することを示唆する。この仮説を試験するために、概日サイクル全体にわたって回収した肝臓核（ｌｉｖｅｒ  ｎｕｃｌｅｕｓ）におけるＡＭＰＫα１およびＡＭＰＫα２のタンパク質レベルを測定し（図４Ｃ）、ａｍｐｋβ２発現と同期してピークになる核ＡＭＰＫα１のリズム性を観察した。ＡＭＰＫα２は、核局在化シグナルを含有し、核に常に存在した。ＡＭＰＫα１核局在化がピークになる時間は、肝臓核における最小ＣＲＹ１タンパク質の時間でもあり、このことは、ＡＭＰＫの核へのリズム性の移入が、ＡＭＰＫ媒介リン酸化およびクリプトクロムの分解に寄与し得ることを示唆する。
【０１０６】
ＡＭＰＫは、概日時計をｉｎ  ｖｉｖｏにて変更する。マウスにおいてＡＭＰＫα１およびＡＭＰＫα２の両方を遺伝子欠失させることにより、早期の胚致死性が導かれる。よって、肝臓概日時計におけるＡＭＰＫの役割をさらに調べるために、概日タンパク質および転写産物を、明暗サイクルへの同調化の後に定常的な暗所で飼育した対照マウス（ＬＫＢ１＋／＋）または肝細胞におけるｌｋｂ１が喪失した同腹子（ＬＫＢ１Ｌ／Ｌ）の肝臓において２４時間にわたって調べた。ｌｋｂ１の肝臓特異的欠失は、この器官におけるＡＭＰＫ活性化を廃止し、概日サイクル全体で、特に、変更されていないマウスにおいてＡＭＰＫが最も活性であることが見出された昼間の時間中に、肝臓核に存在するＣＲＹ１およびＣＲＹ２タンパク質の量を著しく増加させた（図５Ｂ）。この増加は、昼光に対応する期間におけるＲＥＶＥＲＢα発現の減少（図５Ｂ）および概日サイクルを通しての概日転写産物の振幅の減少（図５Ｃ）と関連した。よって、ＡＭＰＫシグナル伝達のｉｎ  ｖｉｖｏにおける喪失は、クリプトクロムを安定化し、概日リズムを混乱させ、光非依存性末梢概日時計についての同期化の機構を確立する。
【０１０７】
材料および方法
細胞および細胞培養物  −  ＡＭＰＫ＋／＋およびＡＭＰＫ−／−マウス胚線維芽細胞は、Ｂｅｎｏｉｔ  Ｖｉｏｌｌｅｔ博士からの贈物であった。ＨｅＬａ細胞およびＡＤ２９３細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から購入した。３Ｔ３不死化ＭＥＦは、以前に記載された。そうでないと記載しない限り、細胞は、１０％ウシ胎仔血清、ペニシリンおよびストレプトマイシンを補った完全ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃａｔ＃１１９９５またはｃａｔ＃１１９６５）で、５％ＣＯ２に維持した３７℃インキュベータ中で成長させた。グルコース濃度を操作した実験において、細胞は、グルタミン、非必須アミノ酸、ペニシリン、ストレプトマイシンおよび記載される量のＤ−グルコースを補った最小ＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ  ｃａｔ＃Ｄ５０３０）、またはペニシリン、ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミンおよび記載される量のＤ−グルコースを補ったグルコース非含有ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃａｔ＃１１９６６）で成長させた。０．５ｍＭグルコースを用いる実験は、浸透圧の影響を制御するためにＤ−マンニトールを補った。細胞刺激は、５０％ウマ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃａｔ＃２６０５０）を含む完全ＤＭＥＭを用いて行い、以前に記載されたようにして行った。
【０１０８】
プラスミドおよびトランスフェクション  −  ｐＤＯＮＲ２２１およびｐｃＤＮＡ３．１／ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。ｐｃＤＮＡ３−２ｘＦｌａｇ−ｍＣＲＹ１（ＷＴ）およびｐｃＤＮＡ３−ＰＥＲ２は、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｗｅｉｔｚ博士からの贈物であった。ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６−Ｆｂｘｌ３は、Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入し、ＦＢＸＬ３は、ｐｃＤＮＡ３．１／ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯ中に、標準的なプロトコルによりクローニングした。ｆｌａｇ−ＬＫＢ１、ｍｙｃ−ＡＭＰＫａ１およびｍｙｃ−ＡＭＰＫａ２構築物は、以前に記載され、構成的に活性な対立遺伝子（ＣＡａ１およびＣＡａ２）は、残基Ｔ３１２の後に停止コドンを挿入することにより作製した。全ての変異は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ部位特異的変異誘発プロトコルを用いて作製した。トランスフェクションは、ＦｕＧｅｎｅ  ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて行った。
【０１０９】
ウイルスおよび安定細胞株の作製  −  ＡＤ２９３細胞にｐＬＸＳＰ３ｐｕｒｏ発現クローンをｐＣＬ−Ａｍｐｈｏと共にトランスフェクトしてウイルスを生成した。トランスフェクションの４８時間後にウイルス上清を回収し、０．４５μｍフィルターでろ過し、６μｇ／ｍｌポリブレンを添加し、親細胞株に加えた。４時間後に、さらなる培地を加えてポリブレンを３μｇ／ｍｌ未満に希釈した。ウイルス形質導入の４８時間後に、感染細胞を、１〜５μｇ／ｍｌピューロマイシンを含有する選択培地中に分配した。選択培地は、選択が完了するまで２〜３日毎に置き換えた。
【０１１０】
質量分析  −  Ｆｌａｇ−ｍＣＲＹ１をトランスフェクトしたＡＤ２９３細胞を、１０μＭのＭＧ１３２で６時間処理し、１％のＴｘ−１００を含有する緩衝液中で溶解させた。Ｆｌａｇ−ｍＣＲＹ１を、Ｍ２−アガロース（Ｓｉｇｍａ）上で精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより夾雑物から分けた。クーマシー染色されたバンドを切り出し、ＨＰＬＣグレードの５０％アセトニトリル中で２回すすぎ、Ｂｅｔｈ  Ｉｓｒａｅｌ  Ｄｅａｃｏｎｅｓｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ質量分析施設に送付した。
【０１１１】
タンパク質抽出物の調製、免疫沈降およびイムノブロッティング  −  全細胞抽出物は、以前に記載されたように１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有する溶解緩衝液中で調製し、肝臓核抽出物を、ＮＵＮ手順により調製した。用いた抗体は、Ｓｉｇｍａからの抗Ｆｌａｇ  Ｍ２アガロース、抗ｖ５アガロース、抗Ｆｌａｇポリクローナル、抗ｖ５ポリクローナルおよび抗βアクチン；Ａｌｐｈａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌからのＣＲＹ１１Ａ、ＣＲＹ２１ＡおよびＰＥＲ２１Ａ；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからの抗ホスホＡＣＣ１（Ｓ７９）、抗ＡＣＣ１、抗ホスホ−ＡＭＰＫａ、抗ホスホ−Ｒａｐｔｏｒ、抗Ｒａｐｔｏｒおよび抗ＲＥＶＥＲＢａ；Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｏｌｏｇｙからの抗ＡＭＰＫａ１および抗ＡＭＰＫａ２；ならびにＭｉｌｌｉｐｏｒｅと共同で作製したホスホ−ＣＲＹ１（Ｓ７１）および周囲の残基を含有するホスホペプチドに対して産生されたポリクローナル抗血清であった。
【０１１２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏリン酸化アッセイ  −  Ｆｌａｇ−ｍＣＲＹ１を、トランスフェクトしたＡＤ２９３細胞から精製し、３２Ｐ−ＡＴＰおよび精製ＡＭＰＫ（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから）と、３００μＭのＡＭＰの存在下または非存在下で３０分間室温にて組み合わせた。反応混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロースに移した。ホスホイメージャーによる放射活性の視覚化の後に、ニトロセルロースをＦｌａｇタグについてイムノブロットした。
【０１１３】
リアルタイム生物発光モニタリング  −  Ｂｍａｌ１プロモーター駆動型ルシフェラーゼを安定的に発現するヒト骨肉腫Ｕ２ＯＳレポーター細胞株は、記載されている。２×１０４細胞を３５ｍｍディッシュに播種し、１０％血清を補ったＤＭＥＭ中で集密まで３日間にわたって成長させた。集密細胞を、５０％ウマ血清で２時間刺激し、次いで、０．１％透析血清および上記のように種々の量のグルコースを含有する培地に移した。生物発光を、Ａｃｔｉｍｅｔｒｉｃｓ，Ｉｎｃ．からのＬｕｍｉＣｙｃｌｅ装置により連続的に記録した。
【０１１４】
遺伝子発現  −  ＲＮＡを、肝臓または培養線維芽細胞から、ＴｒｉｚｏｌでまたはＱｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ精製システムを用いて抽出した。ｃＤＮＡは、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて調製し、遺伝子発現について、ＳＹＢＲグリーン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはＴａｑＭａｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）化学のいずれかを用いる定量的リアルタイムＰＣＲを用いて分析した。プライマー配列は、要請に応じて入手可能である。
【０１１５】
マウス  −  ＬＫＢ１ｆｌ／ｆｌマウスは、Ｒｏｎａｌｄ  Ｄｅ  Ｐｉｎｈｏ博士からの贈物であり、Ｃｒｙ１−／−；Ｃｒｙ２−／−マウスは、Ａｚｉｚ  Ｓａｎｃａｒ博士からの贈物であった。Ｃｒｅリコンビナーゼを発現するアデノウイルスは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｏｗａ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｃｏｒｅ施設からであった。全ての動物の世話および処置は、動物の世話および使用についてのＳａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅガイドラインに準拠した。
【０１１６】
本開示は、ｍＣＲＹ１が、実際に、今まで調べた４７の核ホルモン受容体のうち２０と相互作用し、ＰＰＡＲｄと特に良好に相互作用することを証明する（図１１）。さらに、生理食塩水またはＡＭＰＫ活性化薬物であるＡＩＣＡＲを注射した野生型およびクリプトクロム欠損マウスの肝臓における遺伝子発現は、クリプトクロムが、遺伝子のサブセットのＡＩＣＡＲにより誘導される活性化に必要であることを証明する（図１２）。さらに、マウスにおけるＣｒｙ１およびＣｒｙ２の両方の遺伝子破壊の代謝生理に対する影響を調べる。データは、Ｃｒｙ１−／−；Ｃｒｙ２−／−マウスが、野生型対照よりも著しく低い体重と、著しく低減された安静時血中グルコースとを有することを示す（図１３）。一括して、これらのデータは、哺乳動物のクリプトクロムが、細胞のエネルギー状態の以前には認識されていなかったセンサとして機能すること、これらが生物のエネルギー恒常性において役割を果たすこと、およびクリプトクロムの薬理学的調整が、代謝障害の治療に有用であり得ることを示唆する。
【０１１７】
本開示は、具体的な実施形態に重点をおいて記載しているが、具体的な実施形態の変形を用いることができることが当業者に明らかであり、本開示を、本明細書に具体的に記載する以外の別な方法で行うことができることを意図する。よって、本開示は、以下の特許請求の範囲により定義される本開示の精神および範囲内に包含される全ての改変を含む。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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