(57)【要約】  本発明は、単一またはマルチ標的遺伝子を抑制するための１つのマルチ−シストロンｓｈＲＮＡに関し、より詳細には、マルチ−シストロンｓｈＲＮＡ発現カセット、前記マルチ−シストロンｓｈＲＮＡ発現カセットを含む発現ベクター、前記マルチ−シストロンｓｈＲＮＡ発現ベクターで形質導入された細胞、前記発現ベクターと伝達体との複合体、様々な標的遺伝子などを抑制する方法、及び前記発現ベクターを含む標的遺伝子抑制用組成物に関する。【選択図】  図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロモーター、及び前記プロモーターに作動可能に連結された標的遺伝子に特異的なｓｈＲＮＡ(低分子ヘアピン型ＲＮＡ；short hairpin RNA)をエンコードする２つ以上のポリヌクレオチド配列を含む、マルチ−シストロンｓｈＲＮＡ発現カセット。
【請求項２】
前記２つ以上のポリヌクレオチドは、１つの標的遺伝子の単一部位または互いに異なる部位に特異的なｓｈＲＮＡをエンコードするポリヌクレオチドである、請求項１に記載のマルチ−シストロンｓｈＲＮＡ発現カセット。
【請求項３】
前記２つ以上のポリヌクレオチドは、標的遺伝子が互いに異なる２つ以上の場合、各標的遺伝子で単一部位または互いに異なる部位に特異的なｓｈＲＮＡをエンコードするポリヌクレオチドである、請求項１に記載のマルチ−シストロンｓｈＲＮＡ発現カセット。
【請求項４】
前記２つ以上のポリヌクレオチドは、同一配列である、請求項１に記載のマルチ−シストロンｓｈＲＮＡ発現カセット。
【請求項５】
前記プロモーターは、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター及びＣＭＶプロモーターからなる群から選択される、請求項１に記載のマルチ−シストロンｓｈＲＮＡ発現カセット。
【請求項６】
前記標的遺伝子は、ＸＩＡＰ、Ａｋｔ、Ｂｃｌ−２及びＦａｓからなる群から選択されたものである、請求項１に記載のマルチ−シストロンｓｈＲＮＡ発現カセット。
【請求項７】
前記ｓｈＲＮＡは、配列番号１のマイクロＲＮＡｍｉｒ−３０由来である、請求項１に記載のマルチ−シストロンｓｈＲＮＡ発現カセット。
【請求項８】
請求項１〜７のうち、いずれか１項に記載のマルチ−シストロンｓｈＲＮＡ発現カセットを含む、発現ベクター。
【請求項９】
前記発現ベクターは、プラスミドである、請求項８に記載の発現ベクター。
【請求項１０】
前記発現ベクターは、レンチウイルス(lentivirus)、レトロウイルス(retrovirus)、アデノウイルス(adenovirus)、アデノウイルス−関連ウイルス(adeno-associated virus)、ヘルペスウイルス(herpes virus)及びトリポックスウイルス(avipox virus)ベクターからなる群から選択された、請求項８に記載の発現ベクター。
【請求項１１】
請求項８の発現ベクターで形質導入された細胞。
【請求項１２】
請求項８のベクターが細胞に導入されるために、前記ベクター、及びＰＥＧ(polyethylene glycol)、ＰＥＩ(polyethyleneimine)、キトサン、ＰＥＧ−キトサン、ＤＥＡＥ−デキストラン、核蛋白質、脂質及びペプチドからなる群から選択されたこれらの伝達体との複合体。
【請求項１３】
（ａ）請求項８の発現ベクターを製造する段階；及び
（ｂ）前記製造されたベクターを細胞に導入する段階を含む、前記細胞で多様な標的遺伝子を抑制する方法。
【請求項１４】
請求項８の発現ベクターを含む、標的遺伝子抑制用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単一またはマルチ標的遺伝子を抑制するための１つのマルチ−シストロンｓｈＲＮＡに関し、より詳細には、マルチ−シストロンｓｈＲＮＡ発現カセット、前記マルチ−シストロンｓｈＲＮＡ発現カセットを含む発現ベクター、前記マルチ−シストロンｓｈＲＮＡ発現ベクターで形質導入された細胞、前記発現ベクターと伝達体との複合体、様々な標的遺伝子などを抑制する方法、及び前記発現ベクターを含む標的遺伝子抑制用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡ干渉(RNA interference、 以下、“ＲＮＡｉ”という)は、標的遺伝子のｍＲＮＡと相同の配列を有するセンスＲＮＡと、これと相補的な配列を有するアンチセンスＲＮＡから構成される二本鎖ＲＮＡ(double-stranded RNA，ｄｓＲＮＡ)を細胞などに導入して選択的に標的遺伝子のｍＲＮＡ分解を誘導して標的遺伝子の発現を抑制できる現象である。ＲＮＡｉは、選択的に標的遺伝子の発現を抑制できるから、従来の非効率的な相同組換えによる遺伝子破壊法の代わりをする簡単な遺伝子ノックダウン(knock-down)方法または遺伝子治療の方法として相当な関心を集めており、遺伝子発現を抑制するために広く使われている。化学的に合成された短い干渉ＲＮＡ(short interfering RNA、以下、“ｓｉＲＮＡ”という)及びプロモーター依存的に発現する短いヘアピンＲＮＡ(short hairpin RNA、以下、“ｓｈＲＮＡ”という)は、いずれも生体外(in vitro)及び生体内(in vivo)で強力な遺伝子抑制(silencing)活性を示す。しかし、化学的に合成したｓｉＲＮＡと比較して見る時、プロモーター依存的ｓｈＲＮＡは、細胞及び全体有機体内で安定した発現、構成または誘導性発現、及び細胞類型−特異的発現を含んで多くの面において使用上の利点を有している。ｓｈＲＮＡは、次の２つの種類に分類することができる：第１世代及び第２世代のｓｈＲＮＡ(図１)。第１世代のｓｈＲＮＡは、化学的に合成したｓｉＲＮＡの単純模倣体(ｍｉｍｉｃ)である一方、第２世代のｓｈＲＮＡは、多様な有機体から発現される自然上のマイクロＲＮＡ由来として、さらに優れた機能性を見せる。第２世代のｓｈＲＮＡの構造的な特徴(図１)は、プロモーター及び標的ｓｈＲＮＡ塩基配列の選択をさらに柔軟にできるようにしてくれる。
【０００３】
ｓｉＲＮＡの場合、１つの標的遺伝子を抑制する時、単一位置に作用する単独ｓｉＲＮＡよりも多くの位置に作用するｓｉＲＮＡを混合した混合ｓｉＲＮＡ形態でさらに頻繁に使われる。これは、多くの位置に作用する混合ｓｉＲＮＡがより良い抑制活性を示し、多くの種類のｓｉＲＮＡを化学的合成で容易に製造することができるからである。また、互いに異なるマルチ遺伝子などを標的にする場合にも多くの標的遺伝子に作用する混合ｓｉＲＮＡを使用することによって、これらの多様な遺伝子を適切に抑制することができる。一方、プロモーター依存的ｓｈＲＮＡは、基本的にモノ−シストロン(mono-cistron)として使われ、ただ１つの標的遺伝子を抑制できるのみである。結果的に、プロモーター依存的ｓｈＲＮＡを用いて多様な標的遺伝子を抑制するためには、各標的遺伝子に対応するｓｈＲＮＡ発現構造体(expression construct)を標的遺伝子数だけ使わなければならない。従って、ただ１つのｓｈＲＮＡ発現構造体を使って多様な標的遺伝子を抑制できるならば、多様な発現構造体を使用することによって、引き起こされ得る等モル(equimolar)のｓｈＲＮＡ発現をすることができない問題、同一のプロモーターが繰り返して使用されることによって、これらの繰り返し配列での高い組換え頻度のような問題、特に、遺伝子治療剤のような治療剤形態への開発におけるｓｈＲＮＡ発現構造体の品質均質性問題などを画期的に改善することができるだろう。さらに、このような接近は、多様な標的遺伝子の機能分析を容易且つ早くすることができるようにする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明者は、１つのｓｈＲＮＡ発現構造体を用いて単一またはマルチ標的遺伝子を抑制する目的で第２世代のｓｈＲＮＡとして構造及びヌクレアーゼ(nuclease)切断部位の特徴がよく知られているＲＮＡであるｍｉｒ−３０由来のｓｈＲＮＡに注目した。本発明者は、ｍｉｒ−３０マイクロＲＮＡの構造的な特徴、特にもっとも重要に前記マイクロＲＮＡのリーダー塩基配列(leader sequence)と連関された構造的な柔軟性が多様なｓｈＲＮＡをコードするマルチ−シストロン(multi-cistron)転写体を発現することができるカセット(cassette)を生成できるようにするという仮説を立て、この仮説を立証するために鋭意努力を傾注した結果、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の目的は、プロモーター、及び前記プロモーターに作動可能に連結された標的遺伝子に特異的なｓｈＲＮＡ(低分子ヘアピン型ＲＮＡ；short hairpin RNA)をエンコードする２つ以上のポリヌクレオチド配列を含むマルチ−シストロンｓｈＲＮＡ発現カセットを提供することである。
【０００６】
本発明の他の目的は、前記発現カセットを含む発現ベクター、発現ベクターで形質導入された細胞、及び前記ベクターと伝達体との複合体を提供することである。
【０００７】
本発明の他の目的は、前記発現カセットを用いて抑制しようとする多様な標的遺伝子を抑制する方法を提供することである。
【０００８】
本発明の他の目的は、前記発現ベクターを含む標的遺伝子抑制用組成物を提供することである。
【発明の効果】
【０００９】
安定的に発現するマルチ−シストロンｓｈＲＮＡ発現構造体は、多様な標的遺伝子を抑制し、また、これは多様な標的遺伝子を抑制することによって出た結果を分析する強力なツールになり得る。マルチ−シストロンｓｈＲＮＡを発現させる細胞類型−特異的なプロモーターは、１つのまたは多様な標的遺伝子の細胞類型−特異的な抑制効果分析を容易にすることができ、治療的観点からマルチ−シストロンｓｈＲＮＡ発現構造体は、多様な標的遺伝子抑制を必要とするテーラーメード(tailored)治療用途として使用され得る。それゆえに、本発明のマルチ−シストロンｓｈＲＮＡ発現構造体は、多様な適用分野において多用途のツールを提供する効果を奏すると期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、ｓｉＲＮＡ、第１世代のｓｈＲＮＡ及び第２世代のｓｈＲＮＡの構造を比較したものである。化学的に合成したｓｉＲＮＡ及び２つの異なるｓｈＲＮＡの比較を図式化したものであり、ボックスで表示した部分と色が反転されたボックスで表示した部分のヌクレオチド鎖は、それぞれ標的遺伝子のセンス及びアンチセンス塩基配列を示す。第２世代のｓｈＲＮＡにおいて、丸で表現されたものは相応する転写体センス鎖の一番目のヌクレオチドである。ヌクレアーゼ切断部位は、ドローシャ(Drosha)で表示した線及びダイサー(Dicer)で表示した線で示した。
【図２】図２は、個別的なｓｈＲＮＡ発現構造体の機能を調査したものである。Ａ．ｍｉｒ−３０由来ｓｈＲＮＡ鋳型塩基配列を示す。ボックスで表示した部分及び色が反転されたボックスで表示した部分を除いた前記塩基配列は、すべてのｓｈＲＮＡ発現構造体の製造のための鋳型として通常的に使われる。Ｂ．ヒトＸＩＡＰ、Ａｋｔ及びＢｃｌ−２を抑制するために考案されたｓｈＲＮＡ塩基配列を示す。ボックスで表示した部分及び色が反転されたボックスで表示した部分のヌクレオチド鎖は、それぞれ標的遺伝子のセンス及びアンチセンス塩基配列を示す。Ｃ．アデノウイルス製造のためにシャトルベクターにクローニングする同族(cognate)のｓｈＲＮＡに相応する挿入ＤＮＡ塩基配列を図式化したものである。Ｄ．アデノウイルスの製造を図式化したものであって、ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスをＣｒｅ−ｌｏｘ組換えによって製造した。Ｅ．モノ−シストロンｓｈＲＮＡを発現するアデノウイルスの抑制活性を調査したものである。ＨＣＴ１１６細胞を対照群であるＡｄ−ｅｍｐｔｙウイルスまたはそれぞれのＡｄ−ｓｈＲＮＡで感染させた７２時間後に溶解した後、ウエスタンブロッティング分析を行った。β−アクチン(β-actin)のタンパク質水準を対照群として使用した。
【図３】図３は、マルチ−シストロンｓｈＲＮＡ発現ベクターによる遺伝子抑制を図式化したものである。Ａ．多様なｓｈＲＮＡを含むｐＡｄｌｏｘ（Ｋ）シャトルベクターを図式化したものである。Ｂ．マルチ−シストロンｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスの製造を図式化したものである。Ａｄ−ｍｕｌｔｉ＿ｓｈＲＮＡをＣｒｅ−ｌｏｘ組換えで製造した。Ｃ．マルチ−シストロンｓｈＲＮＡを発現するアデノウイルスの抑制活性を調査したものである。ＨＣＴ１１６細胞を対照群であるＡｄ−ｅｍｐｔｙウイルスまたはＡｄ−ｍｕｌｔｉ＿ｓｈＲＮＡで感染させた７２時間後に溶解した後、ウエスタンブロッティング分析を行った。β−アクチンのタンパク質水準を対照群として使用した。
【図４】図４は、１つのマルチ−シストロン転写体においてそれぞれの互いに異なるｓｈＲＮＡが生成される過程に対するモデルを図式化したものである。転写及びｓｈＲＮＡプロセシング(processing)が結合して起き、１つの転写体内に存在するそれぞれのｓｈＲＮＡ単位体が順次にプロセシングされる。一番目のｓｈＲＮＡが転写されると、独特の構造を形成し、前記ｓｈＲＮＡが主に核内に存在するヌクレアーゼであるドローシャによって切断される。このようにドローシャによって切断されたｓｈＲＮＡは細胞質に放出され、細胞質内のヌクレアーゼであるダイサーによって更に切断される。前記１つの完全なサイクルが連続的に繰り返して行われてマルチ−シストロン転写体にコードされているすべてのｓｈＲＮＡが生成される。
【図５】図５は、単一標的遺伝子を抑制するためのマルチ−シストロンｓｈＲＮＡ発現ベクターを構成することを図式化したものである。Ａ．マルチ−シストロンｓｈＲＮＡ発現構造体内のｓｈＲＮＡそれぞれが標的遺伝子の互いに異なる位置を作用点としていることを図式化したものである。Ｂ．マルチ−シストロンｓｈＲＮＡ発現ベクター内のｓｈＲＮＡそれぞれが標的遺伝子の互いに異なる位置を作用点としているもの(ＡＢＣ型)、または、同じ位置を作用点としているもの(ＡＡＡ、ＢＢＢ、ＣＣＣ型)を図式化したものである。
【図６】図６は、単一標的遺伝子に対してマルチ−シストロンｓｈＲＮＡを構成することを図式化したものであって、マルチ−シストロンマウスＦａｓ(mFas)ｓｈＲＮＡ発現ベクターによる遺伝子抑制を図式化したものである。Ａ．ｍＦａｓを抑制するために考案された各ｓｈＲＮＡ塩基配列を示す。ボックスで表示した部分及び色が反転されたボックスで表示した部分のヌクレオチド鎖は、それぞれ標的遺伝子のセンス及びアンチセンス塩基配列を示す。Ｂ．マルチ−シストロンｍＦａｓ ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスの製造を図式化したものである。Ａｄ−ｍｕｌｔｉ＿ｓｈＲＮＡ(Ｏ、Ｍ、Ｑ、Ｒ型)をＣｒｅ−ｌｏｘ組換えで製造した。Ｃ．マルチ−シストロンｓｈＲＮＡを発現するアデノウイルスの抑制活性を調査したものである。Ｈｅｐａ１−６細胞を対照群であるＡｄ−ｅｍｐｔｙウイルスまたはＡｄ−ｍｕｌｔｉ＿ｓｈＲＮＡ(Ｏ：ｍＦａｓ＃１−＃２−＃３)またはＡｄ−ｍｕｌｔｉ＿ｓｈＲＮＡ(Ｍ：ｍＦａｓ＃１−＃１−＃１)またはＡｄ−ｍｕｌｔｉ＿ｓｈＲＮＡ(Ｑ：ｍＦａｓ＃２−＃２−＃２)またはＡｄ−ｍｕｌｔｉ＿ｓｈＲＮＡ(Ｒ：ｍＦａｓ＃３−＃３−＃３)で感染させた７２時間後に溶解した後、ウエスタンブロッティング分析を行った。β−アクチンのタンパク質水準を対照群として使用した。Ｄ．モノ−シストロンｓｈＲＮＡを発現するアデノウイルスとマルチ−シストロンｓｈＲＮＡを発現するアデノウイルスとの抑制活性を比較したものである。Ｈｅｐａ１−６細胞を対照群であるＡｄ−ｍＦａｓ  ＃１ウイルスまたはＡｄ−ｍｕｌｔｉ＿ｓｈＲＮＡ(Ｏ：ｍＦａｓ＃１−＃２−＃３)またはＡｄ−ｍｕｌｔｉ＿ｓｈＲＮＡ(Ｍ：ｍＦａｓ＃１−＃１−＃１)で感染させた７２時間後に溶解した後、ウエスタンブロッティング分析を行った。β−アクチンのタンパク質水準を対照群として使用した。
【図７】図７は、単一またはマルチ標的遺伝子を抑制するためにマルチ−シストロンｓｈＲＮＡ発現ベクターを構成することを図式化したものである。Ａ．単一標的遺伝子を抑制するためにマルチ−シストロンｓｈＲＮＡ発現ベクターを構成することを図式化したものである。標的遺伝子上でｓｈＲＮＡの作用点位置は２箇所以上(Ａ（Ｎ）で表示)であり、各作用点に相応するｓｈＲＮＡは同一のもので２つ以上である(ａ１、ａ２などで表示)。Ｂ．マルチ標的遺伝子を同時に抑制するためにマルチ−シストロンｓｈＲＮＡ発現ベクターを構成することを図式化したものである。各標的遺伝子(Ｔａｒｇｅｔ（１）、Ｔａｒｇｅｔ（２）などで表示)上でｓｈＲＮＡの作用点位置は２箇所以上(Ａ（Ｎ）、Ｂ（Ｎ）などで表示)であり、各作用点に相応するｓｈＲＮＡは同一のもので２つ以上である(ａ１、ａ２などで表示)。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
前記目的を達成するための１つの態様として、本発明は、プロモーター、及び前記プロモーターに作動可能に連結された標的遺伝子に特異的なｓｈＲＮＡ(short hairpin RNA)をエンコードする２つ以上のポリヌクレオチド配列を含むマルチ−シストロンｓｈＲＮＡ発現カセットに関する。
【００１２】
本発明における用語“プロモーター”とは、ＲＮＡ重合酵素に対する結合部位を含み、プロモーターダウンストリーム(downstream)遺伝子のｍＲＮＡへの転写開始活性を有する、暗号化領域の上位(upstream)の非翻訳された核酸配列をいう。本発明の発現カセットにおいて、前記プロモーターはｓｈＲＮＡの発現を開始できるどんなプロモーターも可能である。具体的に、本発明のプロモーターとしては、すべての時間帯に常時的に目的遺伝子の発現を誘導するプロモーター(constitutive promoter)または特定の位置、時期に目的遺伝子の発現を誘導するプロモーター(inducible promoter)を使うことができ、その例としては、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、ＣＭＶ(cytomegalovirus)プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＡＧプロモーター(Hitoshi Niwa et al.，Gene，108:193-199，1991)、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター(Odell et al.，Nature 313:810-812，1985)、Ｒｓｙｎ７プロモーター(米国特許出願第０８／９９１，６０１号)、ライスアクチン(rice actin)プロモーター(McElroy et al.，Plant Cell 2:163-171，1990)、ユビキチンプロモーター(Christensen et al.，Plant Mol. Biol．12:619-632，1989)、ＡＬＳプロモーター(米国特許出願第０８／４０９，２９７)などがある。その他にも米国特許第５，６０８，１４９号；第５，６０８，１４４号、第５，６０４，１２１号、第５，５６９，５９７号、第５，４６６，７８５号、第５，３９９，６８０号、第５，２６８，４６３号及び第５，６０８，１４２号などに開示されたプロモーターなど当業者に自明な公知のすべてのプロモーターを使うことができ、これに制限されるのではない。好ましくは、本発明のプロモーターはＵ６プロモーター、ＨＩプロモーター、ＣＭＶプロモーターであることができ、本発明の好ましい１つの具現例によれば、ＣＭＶプロモーターを使うことができる。
【００１３】
本発明における用語“標的遺伝子”とは、抑制しようとする遺伝子を意味し、標的遺伝子に特異的なｓｈＲＮＡを発現させ、その標的遺伝子を抑制することができる。本発明における標的遺伝子は、ｓｈＲＮＡを介してその機能を抑制できるすべての遺伝子を含むが、好ましくはＸＩＡＰ(X-chromosme-linked inhibitor of apoptosis protein)、Ａｋｔ、Ｂｃｌ−２またはＦａｓが利用され得る。
【００１４】
本発明における用語“ｓｈＲＮＡ”とは、５０〜１００ヌクレオチドの長さを有する単一鎖のＲＮＡが細胞内でステム−ループ(stem-loop)構造をなし、５〜３０ヌクレオチドのループ(loop)部位両方へ相補的に１５〜５０ヌクレオチドの長いＲＮＡが塩基対をなして二本鎖のステム(stem)を形成し、ステム形成鎖のそれぞれの以前と以後に１〜５００ヌクレオチドを更に含む全体長さのＲＮＡをいう。ｓｈＲＮＡは、一般に細胞内でＲＮＡ重合酵素によって転写されて合成され、以後ｓｈＲＮＡは核内のドローシャによって切断され、このように切断されたｓｈＲＮＡは核から細胞質に放出され、細胞質内でダイサーによって更にループが切断され、ｓｉＲＮＡのように標的ｍＲＮＡに塩基配列特異的に結合して標的ｍＲＮＡを切って破壊することによって、標的ｍＲＮＡの発現を抑制する作用をする。本発明のｓｈＲＮＡをエンコードするポリヌクレオチドは、マイクロＲＮＡ由来の配列から製造することができ、このようなマイクロＲＮＡは種類に制限無く使うことができるが、好ましくはマイクロＲＮＡの一種類であるｍｉｒ−３０由来の配列を使うことができる。具体的に、本発明のｓｈＲＮＡをエンコードするポリヌクレオチドは、ｍｉｒ−３０由来のリーダー配列に抑制しようとする標的遺伝子のセンス鎖を連結して製造することができる。好ましくは、本発明のＸＩＡＰの発現抑制のためのｓｈＲＮＡは配列番号２のセンス鎖を有することができ、Ａｋｔの発現抑制のためのｓｈＲＮＡは配列番号３のセンス鎖を有することができ、Ｂｃｌ−２の発現抑制のためのｓｈＲＮＡは配列番号４のセンス鎖を有することができ、ｍＦａｓの発現抑制のためのｓｈＲＮＡは配列番号５、６または７のセンス鎖を有することができる。本発明のマルチ−シストロンｓｈＲＮＡによるＸＩＡＰ、Ａｋｔ、Ｂｃｌ−２の多重的及び同時的発現抑制は、実施例３の図３Ｃで確認した。また、本発明のマルチ−シストロンｓｈＲＮＡによるｍＦａｓの多重的及び同時的発現抑制は、実施例３の図６Ｃ及び６Ｄで確認した。
【００１５】
前記結果でノックダウンさせるために使用したマルチ−シストロンｓｈＲＮＡ発現構造体内の各ｓｈＲＮＡは、相応する標的遺伝子のｍＲＮＡに作用する。
【００１６】
本発明における前記標的遺伝子のｍＲＮＡに作用するｓｈＲＮＡの作用点位置は、１つの標的遺伝子の場合には、単一部位または互いに異なる部位であることができ、互いに異なる２つ以上の標的遺伝子の場合には、各標的遺伝子上で単一部位または互いに異なる部位であるかも知れない。本発明のマルチ−シストロンｓｈＲＮＡ発現カセットを用いて標的遺伝子を効率的に抑制するためには、好ましくは、単一標的遺伝子の場合、ｓｈＲＮＡの作用位置が互いに異なり、その数は２つ以上であり、各作用位置に相応するｓｈＲＮＡは、単一種類で２つ以上であればあるほど効率的である。互いに異なる２つ以上の(マルチ)標的遺伝子の場合にも単一標的遺伝子に対して適用したことを各標的遺伝子に同一に適用すれば、効率的に抑制することができる。
【００１７】
本発明における用語“作動可能に連結された(operablylinked)”は、１つの核酸断片が他の核酸断片と結合されると、通常的にこれらそれぞれの機能または発現が他の核酸断片の影響を受けるが、これらの核酸断片の多くの可能な結合組合せのうちで各断片がその機能を行うのにあって検出するほどの影響がない状態の結合を意味する。合わせて、本発明の発現カセットは、転写を調節するための任意の転写開始調節配列及び転写終結調節配列を更に含むことができる。作動可能な連結は、当該技術の分野におけるよく知られた遺伝子組換え技術を用いて製造することができ、部位−特異的ＤＮＡ切断及び連結は、当該技術の分野における一般に知られた酵素などを使用することができる。
【００１８】
本発明における用語“マルチ−シストロン(multi-cistronic)”は、１つのプロモーターに多重のシストロン、すなわち、単位遺伝子または単位ｓｈＲＮＡ発現体が複数個連結されたことを意味する。
【００１９】
本発明における用語“発現カセット”とは、プロモーターとマイクロＲＮＡとのリーダー塩基配列に標的遺伝子のセンス鎖(sense strand)と、アンチセンス鎖(anti-sense strand)とを含んでおり、その間にループを形成できる配列を含んでいるから、ｓｈＲＮＡを発現させ得る単位カセットを意味する。また、本発明における発現カセットは、発現構造体と混用され得る。好ましくは、ｓｈＲＮＡを発現させ得るカセットのバックボーン(backbone)は、マイクロＲＮＡであるｍｉｒ−３０由来の配列番号１のｓｈＲＮＡを鋳型にすることができる。
【００２０】
本発明の単一のマルチ−シストロンｓｈＲＮＡ発現カセットを製作するために、本発明者は具体的な実施例において、先ず、それぞれのｓｈＲＮＡの機能を調査した。本発明者は、配列番号１で定義されたｍｉｒ−３０由来の塩基配列(図２Ａ)を選択し、それからＰＣＲを介してヒトＸＩＡＰ(X-chromosome-linked inhibitor of apoptosis protein)、Ａｋｔ、またはＢｃｌ−２遺伝子を標的とするｓｈＲＮＡのＤＮＡ塩基配列を製造した(図２Ｂ)。本発明者は、これらのそれぞれの前記ＤＮＡ塩基配列をＣＭＶプロモーター駆動のシャトルベクター(shuttle vector)にクローニングした後(図２Ｃ)、それぞれＡｄ−ｓｈＸＩＡＰ、Ａｄ−ｓｈＡｋｔ及びＡｄ−ｓｈＢｃｌ−２と命名した相応するアデノウイルスを製造した(図２Ｄ)。本発明者は、前記の製造したアデノウイルスでＨＣＴ１１６細胞を感染させ、ＸＩＡＰ、Ａｋｔ、及びＢｃｌ−２タンパク質の発現水準を観察して前記アデノウイルスの抑制活性を評価した(図２Ｅ)。その結果、Ａｄ−ｓｈＸＩＡＰ、Ａｄ−ｓｈＡｋｔ及びＡｄ−ｓｈＢｃｌ−２は、相応するタンパク質の発現を抑制したが、対照群であるＡｄ−ｅｍｐｔｙは抑制できなかったし、これを介してそれぞれのｓｈＲＮＡ塩基配列が標的遺伝子の抑制に適切に行動したことを確認した。Ａｄ−ｓｈＸＩＡＰ、Ａｄ−ｓｈＡｋｔ及びＡｄ−ｓｈＢｃｌ−２の抑制活性を評価するために使われた他の細胞(Ｕ−３７３ＭＧ)においても類似した結果を得ることができた(データは提示せず)。
【００２１】
機能的に検証された前記ＤＮＡ塩基配列を用いて、本発明者はマルチ−シストロンｓｈＲＮＡ発現構造体を製造した(図３Ａ)。本発明者は、再びＡｄ−ｍｕｌｔｉ＿ｓｈＲＮＡと命名したアデノウイルスを製造し(図３Ｂ)、相応する標的遺伝子の抑制活性を評価した。Ａｄ−ｍｕｌｔｉ＿ｓｈＲＮＡは、効果的ながらまた同時に関連標的遺伝子の発現を抑制した(図３Ｃ)。一方、対照群であるＡｄ−ｅｍｐｔｙはそうではなかった。このような結果に基づいて、マルチ−シストロンｓｈＲＮＡをコードする１つの発現カセットの伝達が多様な標的遺伝子を抑制させるのに十分であるということが分かった。
【００２２】
前記の結果に基づいて、１つのマルチ−シストロン転写体の発現によって多様な標的遺伝子の抑制のための新しいツールとして、本発明はマルチ−シストロンｓｈＲＮＡ発現カセットを提供する。配列番号１で定義されたｍｉｒ−３０由来ｓｈＲＮＡの切断部位及びこれらの部位に作用して実際的な切断作用をすると知られているドローシャ及びダイサーヌクレアーゼの細胞内位置である構造的な特徴に基づいて、本発明者は１つのマルチ−シストロン転写体から作られる互いに異なるｓｈＲＮＡを製造することができる過程に対するモデルを完成した(図４)。本発明のモデルが提示することは、ＲＮＡ重合酵素が一番目のｓｈＲＮＡ(ｓｈＸＩＡＰ)部位を転写して構造的にそれに相当するｓｈＲＮＡを生成し、二番目のｓｈＲＮＡが転写される間に、前記一番目のｓｈＲＮＡが核内のドローシャによって切断されることである。ドローシャによって切断されたｓｈＲＮＡは、細胞質に放出され、細胞質内でダイサーによって更に切断される。このようなサイクルは、最後のｓｈＲＮＡ(ｓｈＢｃｌ−２)に至るまで繰り返し的に行われる。このように連続的で秩序あるようにドローシャ及びダイサーヌクレアーゼによって切断されることによって、マルチ−シストロンｓｈＲＮＡを含む転写体は、縒れなく順次にｓｈＲＮＡを作り出し得るようになる。本発明者の前記モデルによるｓｈＲＮＡ発現カセットは、理論的には無制限的なｓｈＲＮＡ単位体を含むことができる。好ましくは、２つ以上のｓｈＲＮＡ単位体であり、より好ましくは、４つ以上のｓｈＲＮＡ単位体であり、最大発現ｓｈＲＮＡ単位体の数は、発現ベクターが安定的に発現をさせ得る最大容量及びサイズに相当する数だけである。
【００２３】
一般に、かなり多い遺伝子が個体間の差による遺伝子変異形態(polymorphism)で存在する。特に、癌細胞では突然変異を抑制し、再び突然変異が発生した時に治癒できる能力が深刻に弱化されて遺伝子の突然変異が頻発するように観察される。標的遺伝子の塩基配列にこのような変異が生じる場合は、ノックダウンのために使用されたｓｈＲＮＡがその抑制機能を喪失することができる。このようなｓｈＲＮＡの機能喪失を克服するためには、１つの標的遺伝子に対してｓｈＲＮＡの作用点として単一部位のみを対象にするよりも多重部位を対象にするのが必要である(図５Ａ)。このような場合、標的遺伝子の突然変異によってマルチ−シストロンｓｈＲＮＡ発現構造体内のどんなｓｈＲＮＡがその機能を行うことができない場合、同一発現構造体から発現されて他の部位に作用するｓｈＲＮＡによってその標的遺伝子は効果的に抑制され得る。また、１つの標的遺伝子をマルチ−シストロンｓｈＲＮＡで抑制する場合、各ｓｈＲＮＡがどのように構成されるかということも非常に重要であり得る。たとえ、１つの標的遺伝子を抑制する目的でその標的遺伝子に対して３つのｓｈＲＮＡ(Ａ、Ｂ、Ｃ、以下、“ＡＢＣ”という)でマルチ−シストロンｓｈＲＮＡ発現構造体を構成した場合(図５Ｂ)、Ａによって分解されて抑制される標的遺伝子のｍＲＮＡは、ＢとＣによっても同時に分解されて抑制され得るから実際的にはＡＡＡまたはＢＢＢまたはＣＣＣ型が抑制効率側面でＡＢＣ型よりも良いかも知れない。これを証明する目的で本発明者は、配列番号１で定義されたｍｉｒ−３０由来の塩基配列(図２Ａ)を選択し、ＰＣＲを介して配列番号５、配列番号６、配列番号７を含むマウスＦａｓ(mFas)を標的とするｓｈＲＮＡのＤＮＡ塩基配列を製造した(図６Ａ)。本発明者は、これらのそれぞれの前記ＤＮＡ塩基配列をＣＭＶプロモーター駆動のシャトルベクター(shuttle vector)にクローニングした後、それぞれＡｄ−ｍＦａｓ＃１、Ａｄ−ｍＦａｓ＃２及びＡｄ−ｍＦａｓ＃３と命名した相応するアデノウイルスを製造し、これらのアデノウイルスでＨｅｐａ１−６細胞を感染させた後、ｍＦａｓタンパク質の発現水準を観察して前記アデノウイルスの抑制活性を評価した。その結果、Ａｄ−ｍＦａｓ＃１、Ａｄ−ｍＦａｓ＃２及びＡｄ−ｍＦａｓ＃３は、相応するタンパク質の発現を抑制したが、対照群であるＡｄ−ｅｍｐｔｙは抑制できなかったし、これを介してそれぞれのｓｈＲＮＡ塩基配列が標的遺伝子の抑制に適切に行動したことを確認した(データは提示せず)。以後、機能的に検証された前記ｍＦａｓＤＮＡ塩基配列をＣＭＶプロモーター駆動のシャトルベクターにクローニングした後(図６Ｂ)、Ａｄ−ｍｕｌｔｉ＿ｓｈＲＮＡであるＯ、Ｍ、Ｑ、Ｒと命名した相応するアデノウイルスを再び製造して(図６Ｂ)Ｈｅｐａ１−６細胞を感染させ、ｍＦａｓタンパク質の発現水準を観察して前記アデノウイルスの抑制活性を評価した(図６Ｃ)。その結果、Ｍ、Ｑ、Ｒは、Ｏに比べて相応するタンパク質の発現をさらによく抑制した。この結果は、１つの標的遺伝子をマルチ−シストロンｓｈＲＮＡで抑制する場合、ＡＢＣ型を利用することよりもＡＡＡまたはＢＢＢまたはＣＣＣ型(図５)を利用するのがより良い抑制効果を得る可能性がある���とを明確に見せてくれる。さらに、Ａｄ−ｍＦａｓ＃１、Ａｄ−ｍＦａｓ＃２、Ａｄ−ｍＦａｓ＃３は、そのいずれもＡｄ−ｍｕｌｔｉ＿ｓｈＲＮＡであるＯ、Ｍ、Ｑ、Ｒと命名した相応するアデノウイルスのｍＦａｓタンパク質発現抑制力を凌駕することができなかった(図６Ｄ)。この結果は、単一標的遺伝子に対して１つのｓｈＲＮＡよりも作用点が互いに異なるｓｈＲＮＡで構成されたマルチ−シストロンｓｈＲＮＡを使用するのがより良い抑制効果を得ることができることを見せてくれる。
【００２４】
このような結果を全部総合した結果として、本発明者はマルチ−シストロンｓｈＲＮＡを用いて標的遺伝子発現を抑制するための最適の好ましい条件を見出すことができた。すなわち、単一標的遺伝子の場合(図７Ａ)は、ｓｈＲＮＡの作用位置が互いに異なり(Ａ（１）、Ａ（２）……Ａ（Ｎ）)、その数は２つ以上であるべきで、各作用位置に相応するｓｈＲＮＡは、単一種類(ａ１、ａ２……ａＮ)であってその数が２つ以上でなければならない。すなわち、各作用位置に相応するｓｈＲＮＡは、単一種類であって同一の配列であり得る。互いに異なるマルチ標的遺伝子の場合(図７Ｂ)には、前記単一標的遺伝子に対して適用したものを各標的遺伝子にそのまま適用すれば良い。
【００２５】
プロモーター駆動のｓｈＲＮＡは、細胞及び全体有機体内で安定的に発現され得る。単一標的遺伝子を抑制するという場合、単一標的遺伝子のそれぞれ異なる位置を各位置に多重的に作用する(図７Ａ)マルチ−シストロンｓｈＲＮＡの安定した発現は、モノ−シストロンｓｈＲＮＡよりその標的遺伝子をはるかに強力に抑制すると期待される。従って、１つの標的遺伝子を抑制するように考案されたマルチ−シストロンｓｈＲＮＡの全体有機体内での安定した発現は、機能的に遺伝子ノックアウト(knock-out)に比肩する価値はあるだろう。マルチ標的遺伝子を抑制する場合、マルチ−シストロンｓｈＲＮＡは、安定的に発現してこれらのマルチ標的遺伝子を抑制し、また、これは多様な遺伝子を抑制することによって出てきた結果を分析する強力なツールになり得る。マルチ−シストロンｓｈＲＮＡを発現させる細胞類型−特異的なプロモーターは、１つのまたは多様な標的遺伝子に対する細胞類型−特異的抑制効果分析を容易にするだろう。治療的観点から、マルチ−シストロンｓｈＲＮＡは、多様な標的遺伝子を抑制させることが必要なテーラーメード治療用途として使用され得るだろう。従って、本発明のマルチ−シストロンｓｈＲＮＡは、多様な適用の分野において、多用途のツールを提供する。
【００２６】
また１つの態様として、本発明は、プロモーター、及び前記プロモーターに作動可能に連結された標的遺伝子に特異的なｓｈＲＮＡをエンコードする２つ以上のポリヌクレオチド配列を含むマルチ−シストロンｓｈＲＮＡ発現カセットを含む発現ベクターに関する。マルチ−シストロンｓｈＲＮＡ発現カセットは、前記で説明した通りである。
【００２７】
前記マルチ−シストロンｓｈＲＮＡ発現構造体は細胞内に導入され得るが、このために前記マルチ−シストロンｓｈＲＮＡ発現構造体は細胞内への効率的な導入を可能にする伝達体内に含まれた形態であり得る。前記伝達体は、好ましくはベクターであり、ベクターはウイルスベクターまたは非ウイルスベクターのいずれも使用可能である。ウイルスベクター (viral vector)として、例えば、レンチウイルス(lentivirus)、レトロウイルス(retrovirus)、アデノウイルス(adenovirus)、アデノウイルス−関連ウイルス(adeno-associated virus)、ヘルペスウイルス(herpes virus)またはトリポックスウイルス(avipox virus)ベクターなどを使うことができ、好ましくはアデノウイルスであるが、これに制限されるものではない。非ウイルスベクターとして、例えば、プラスミド形態を挙げることができる。本発明の好ましい１つの具現例によれば、シャトルベクターであるｐＡｄｌｏｘ（Ｋ）を使用した。
【００２８】
前記マルチ−シストロンｓｈＲＮＡ発現構造体は、またＰＥＧ(polyethylene glycol)、ＰＥＩ(polyethyleneimine)、キトサン、ＰＥＧ−キトサン、ＤＥＡＥ−デキストラン、核蛋白質、脂質、ペプチドなどと多様な複合体形態で細胞内へ導入され得るが、このために前記マルチ−シストロンｓｈＲＮＡ発現構造体は、細胞内への効率的な導入を可能にするこれらの複合体の主要構成成分である伝達体内に含まれた形態であり得る。
【００２９】
また、前記ベクターは、選別マーカーを更に含むのが好ましい。本発明における用語“選別マーカー(selection marker)”とは、マルチ−シストロンｓｈＲＮＡ発現構造体が導入されて形質転換された細胞の選別を容易にするためのものである。本発明のベクターで使用できる選別マーカーとしては、ベクターの導入可否を容易に検出または測定できる遺伝子ならば、特に限定されないが、代表的に薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性または表面タンパク質の発現のような選択可能表現型を付与するマーカーなど、例えば、ＧＦＰ(緑色蛍光タンパク質)、ピューロマイシン(puromycin)、ネオマイシン(Neomycin：Ｎｅｏ)、ハイグロマイシン(hygromycin：Ｈｙｇ)、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ(histidinoldehydrogenase gene：ｈｉｓＤ)またはグアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(guanine phosphosribosyltransferase：Ｇｐｔ)などがあり、好ましくは、ＧＦＰ(緑色蛍光タンパク質)、ネオマイシンまたはピューロマイシンマーカーを使うことができる。
【００３０】
また１つの態様として、本発明は、前記発現ベクターで形質導入された細胞に関する。
【００３１】
本発明における用語“導入”は、形質感染(transfection)または形質導入(transduction)によって外来ＤＮＡを細胞に流入させることを意味する。形質感染は、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法、ＤＥＡＥ−デキストラン−媒介形質感染法、ポリブレン−媒介形質感染法、電気衝撃法、微細注射法、リポソーム融合法、リポフェクタミン及び原形質体融合法などの当分野に公知された多くの方法によって行われることができる。また、形質導入は、感染(infection)を手段としてウイルス粒子を使用して目的物を細胞内へ伝達させることを意味する。好ましくは、形質導入はＰＥＧ、キトサン、ＰＥＧ−キトサン、ＤＥＡＥ−デキストラン、核蛋白質、脂質またはペプチドとの複合体からなる伝達体を介して行われることができる。
【００３２】
前記発現ベクターを細胞内に導入させて形質導入された細胞は、治療的観点からは、抑制させようとする遺伝子を選択的に抑制させるマルチ−シストロンｓｈＲＮＡ発現構造体を導入させて個人別テーラーメード治療療法として使用し得るようになる。
【００３３】
また、細胞類型−特異的なプロモーターを選択する場合、１つまたは多様な標的遺伝子の細胞類型−特異的な抑制効果分析を容易にして、前記形質導入された細胞を細胞−類型特異的な抑制効果分析モデルとして利用することができる。
【００３４】
また１つの態様として、本発明は、前記ベクターを細胞内に導入するためのＰＥＧ、ＰＥＩ、キトサン、ＰＥＧ−キトサン、ＤＥＡＥ−デキストラン、核蛋白質、脂質及びペプチドからなる群から選択されたこれらの伝達体との複合体に関する。
【００３５】
また１つの態様として、本発明は、（ａ）前記マルチ−シストロンｓｈＲＮＡ発現カセットを含む発現ベクターを製造する段階；及び（ｂ）前記製造されたベクターを細胞に導入する段階を含む多様な標的遺伝子などを抑制する方法に関する。
【００３６】
また１つの態様として、本発明は、前記で説明したプロモーター、及び前記プロモーターに作動可能に連結された２つ以上のポリヌクレオチド配列を含むマルチ−シストロンｓｈＲＮＡ発現ベクターを含む標的遺伝子抑制用組成物に関する。
【００３７】
前記標的遺伝子抑制用組成物は、薬学的に許容可能な担体を更に含むことができ、担体と共に製剤化され得る。本発明における用語、“薬学的に許容可能な担体”とは、生物体を刺激せず投与化合物の生物学的活性及び特性を阻害しない担体または希釈剤をいう。液状溶液で製剤化される組成物において、許容される薬剤学的担体としては、滅菌及び生体に適合したものであって、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、アルブミン注射溶液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール及びこれらの成分のうち、１成分以上を混合して使うことができ、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び滑剤を付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができる。
【００３８】
本発明の前記発現ベクター及び薬学的に許容可能な担体を含む標的遺伝子抑制用組成物は、これを有効成分として含むいかなる剤形でも適用可能であり、経口用または非経口用剤形で製造することができる。本発明の薬学的剤形は、口腔(oral)、直腸(rectal)、鼻腔(nasal)、局所(topical；頬及び舌下を含む）、皮下、腟(vaginal)または非経口(parenteral；筋肉内、皮下及び静脈内を含む)投与に適当なものまたは吸入(inhalation)または注入(insufflation)による投与に適当な形態を含む。
【００３９】
本発明の組成物を有効成分として含む経口投与用剤形としては、例えば、錠剤、トローチ剤、ロゼンジ、水溶性または油性懸濁液、調剤粉末または顆粒、エマルジョン、ハードまたはソフトカプセル、シロップまたはエリキシル剤に製剤化することができる。錠剤及びカプセルなどの剤形に製剤化するために、ラクトース、サッカロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アミロペクチン、セルロースまたはゼラチンのような結合剤、リン酸二カルシウムのような賦形剤、トウモロコシ澱粉またはサツマイモ澱粉のような崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリルフマル酸ナトリウムまたはポリエチレングリコールワックスのような潤滑油を含むことができ、カプセル剤形の場合、前記言及した物質の他にも脂肪油のような液体担体を更に含むことができる。
【００４０】
本発明の組成物を有効成分として含む非経口投与用剤形としては、皮下注射、静脈注射または筋肉内注射などの注射用形態、坐剤注入方式または呼吸器を介して吸入ができるようにするエアロゾル剤などスプレー用に製剤化することができる。注射用剤形に製剤化するためには、本発明の組成物を安定剤または緩衝剤とともに水で混合して溶液または懸濁液に製造し、これをアンプルまたはバイアルの単位投与用に製剤化することができる。坐剤に注入するためには、カカオバターまたは他のグリセリドなど通常の坐薬ベースを含む坐薬または体療浣腸剤のような直腸投与用組成物に製剤化することができる。エアロゾル剤などのスプレー用に剤型化する場合、水分散された濃縮物または湿潤粉末が分散されるように推進剤などが添加剤とともに配合され得る。
【００４１】
本発明の標的遺伝子抑制用組成物、すなわち、マルチ−シストロンｓｈＲＮＡ発現ベクターは、前記発現ベクターを発現する細胞であり得る。前記細胞は、前記標的遺伝子抑制用マルチ−シストロンｓｈＲＮＡ発現ベクターを一時的(transient)または安定的に(stable)発現するものであり得る。
【００４２】
以下、実施例を介して本発明をより詳細に説明するようにする。これらの実施例は単に本発明を例示するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されると解釈されはしない。
【実施例】
【００４３】
実施例１：ｓｈＲＮＡ発現構造体の製造及びこれに相応するアデノウイルスの製造
ヒトＸＩＡＰ、Ａｋｔ、Ｂｃｌ−２及びマウスＦａｓ(mFas)に対するｓｈＲＮＡにそれぞれ相応するＤＮＡ塩基配列をオーバーラッピング−ＰＣＲ(overlapping-PCR)で製造した。センスまたはアンチセンスｓｈＲＮＡ塩基配列を含むＤＮＡ鋳型を化学的に合成し、他の制限酵素部位を含む通常のプライマーセットを用いてＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ生成物を制限酵素で切断し、アデノウイルス生産のためのシャトルベクターであるｐＡｄｌｏｘ（Ｋ）の相応する部位にクローニングをした。挿入した塩基配列はヌクレオチド配列分析で確認した。
【００４４】
Ｅ１／Ｅ３−重複欠失複製−不全のアデノウイルス(E1/E3-doubly deleted replication-incompetent adenovirus)を Jeong，M．et al．PLoS ONE 4，E4545(2009)に開示された方法によってＣｒｅ−ｌｏｘ組換えで製造した。アデノウイルスをアデノウイルス精製キットであるＡｄ Ｅｚ−Ｐｒｅｐ(Genememed，Seoul，Korea)を用いて精製した。
【００４５】
その結果、配列番号１のｍｉｒ−３０由来の塩基配列(図２Ａ)を基にしたヒトＸＩＡＰ、Ａｋｔ、Ｂｃｌ−２(図２Ｂ)またはｍＦａｓ遺伝子を抑制するｓｈＲＮＡのＤＮＡ塩基配列を製造した(図６Ａ)。本発明者は、これらのそれぞれの前記ＤＮＡ塩基配列をＣＭＶプロモーター駆動のシャトルベクター (shuttle vector)にクローニングした後(ＸＩＡＰ、Ａｋｔ、Ｂｃｌ−２の場合：図２Ｃ、ｍＦａｓの場合はデータ提示せず)、それぞれＡｄ−ｓｈＸＩＡＰ、Ａｄ−ｓｈＡｋｔ及びＡｄ−ｓｈＢｃｌ−２と命名した相応するアデノウイルスを製造した(図２Ｄ)。
【００４６】
また、機能的に検証された前記ＤＮＡ塩基配列を用いてマルチ−シストロンｓｈＲＮＡ発現構造体を製造した(図３Ａ、図６Ａ)。これを用いて本発明者は再びＡｄ−ｍｕｌｔｉ＿ｓｈＲＮＡと命名したアデノウイルスを製造した(図３Ｂ、図６Ｂ)。
【００４７】
実施例２：細胞培養
ＨＣＴ１１６、Ｕ３７３−ＭＧまたはＨｅｐａ１−６細胞をＡＴＣＣ(American Type Culture Collection)(Rockville，MD)で購買してそれぞれＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ(ＨＣＴ１１６)及びＤＭＥＭ(Ｕ３７３−ＭＧ及びＨｅｐａ１−６)培地を用いて培養した。
【００４８】
実施例３：ウエスタンブロッティング分析及び標的遺伝子抑制確認
それぞれのｓｈＲＮＡ及びマルチ−シストロンｓｈＲＮＡ発現構造体の発現抑制能を確認するために、本発明者はＨＣＴ１１６、Ｕ３７３−ＭＧまたはＨｅｐａ１−６細胞を前記実施例１で製造したアデノウイルスで感染させた後、それぞれの標的遺伝子発現様相を観察した。
【００４９】
ＨＣＴ１１６、Ｕ３７３−ＭＧまたはＨｅｐａ１−６細胞をアデノウイルスとともに４時間培養した。新鮮な培養培地に交替した後、細胞を７２時間さらに培養した。細胞などを修得してＲＩＰＡ緩衝溶液で溶解させた後、ウエスタンブロッティングを行った。このためにＸＩＡＰ検出用抗体(＃２０４５，Cell signallingTechnology)、Ａｋｔ検出用抗体(ＬＦ−ＰＡ０１６６，Ab Frontier)、Ｂｃｌ−２検出用抗体(ｓｃ−４９２，Santa Cruz Biotechnology)、ｍＦａｓ検出用抗体(６１０１９７，BD Pharmingen)及びβ−アクチン検出用抗体(ＬＦ−ＰＡ００６６，Ab Frontier)を使用した。
【００５０】
その結果、Ａｄ−ｓｈＸＩＡＰ、Ａｄ−ｓｈＡｋｔ、Ａｄ−ｓｈＢｃｌ−２、Ａｄ−ｍＦａｓ＃１、Ａｄ−ｍＦａｓ＃２及びＡｄ−ｍＦａｓ＃３は、相応するタンパク質の発現を抑制したが(図２Ｅ、Ａｄ−ｍＦａｓはデータを提示せず)、対照群であるＡｄ−ｅｍｐｔｙは抑制できなかったし、これを介してそれぞれのｓｈＲＮＡ塩基配列が標的遺伝子の抑制に適切に行動したことを確認した。
【００５１】
また、Ａｄ−ｍｕｌｔｉ＿ｓｈＲＮＡは、効果的ながらまた同時に相応する標的遺伝子の発現を抑制した(図３Ｃ、図６Ｃ)。一方、対照群であるＡｄ−ｅｍｐｔｙはそうではなかった。本発明者らの前記結果などは、明白にマルチ−シストロンｓｈＲＮＡをコードする１つの発現カセットの伝達が多様な標的遺伝子を抑制させるのに十分であるということを立証する。
【００５２】
合わせて、単一標的遺伝子を抑制するように製作されたｍＦａｓ抑制用Ａｄ−ｍｕｌｔｉ＿ｓｈＲＮＡの場合、前記標的遺伝子内の互いに異なる部位を抑制するように製作したＡｄ−ｍｕｌｔｉ＿ｓｈＲＮＡ(Ｏ：ｍＦａｓ＃１−＃２−＃３)の場合より、同一部位を抑制する同一配列が３つ含まれたＡｄ−ｍｕｌｔｉ＿ｓｈＲＮＡ(Ｍ：ｍＦａｓ＃１−＃１−＃１)、Ａｄ−ｍｕｌｔｉ＿ｓｈＲＮＡ(Ｑ：ｍＦａｓ＃２−＃２−＃２)及びＡｄ−ｍｕｌｔｉ＿ｓｈＲＮＡ(Ｒ：ｍＦａｓ＃３−＃３−＃３)の場合、ｍＦａｓをさらに効率的に抑制する結果を示し(図６Ｃ)、Ａｄ−ｍＦａｓ＃１と比較する時、さらに明らかな抑制能を示した(図６Ｄ)。
【００５３】
前記のような結果は、１つのマルチ−シストロンｓｈＲＮＡ内に同一部位に作用する同一配列を有するｓｈＲＮＡを複数個含む本発明の方法を使用する場合、はるかに効果的に標的遺伝子発現を抑制できることを立証する結果である。
【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年1月26日(2012.1.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロモーター、及び前記プロモーターに作動可能に連結された、第１のｓｈＲＮＡエンコード領域、第２のｓｈＲＮＡエンコード領域………第ｎのｓｈＲＮＡエンコード領域(ｎは２以上の整数)を含むマルチ−シストロンｓｈＲＮＡ発現カセットであって、
前記ｓｈＲＮＡエンコード領域の各々は、
ドローシャ(Drosha)によって切断される部位をエンコードするドローシャ切断第１の領域と、
ｓｈＲＮＡ形成領域と、
ドローシャ(Drosha)によって切断される部位をエンコードするドローシャ切断第２の領域とを含み、
前記ｓｈＲＮＡ形成領域は、
標的遺伝子の全部または一部のセンス配列をエンコードするセンス鎖領域と、
ダイサー(Dicer)によって切断されるループ(loop)配列をエンコードするループ領域と、
標的遺伝子の全部または一部のセンス配列と相補的なアンチセンス配列をエンコードするアンチセンス鎖領域とを含み、
前記ドローシャ切断第１の領域と、前記ドローシャ切断第２の領域と、ループ領域とは、マイクロＲＮＡをエンコードする配列由来である、マルチ−シストロンｓｈＲＮＡ発現カセット。
【請求項２】
前記プロモーターに最も近い第１のｓｈＲＮＡエンコード領域が転写された後、そのダウンストリームに位置した第２のｓｈＲＮＡエンコード領域が転写される間に、前記第１のｓｈＲＮＡエンコード領域の転写体が核内のドローシャによって切断されて第１のｓｈＲＮＡが生成される、請求項１に記載のマルチ−シストロンｓｈＲＮＡ発現カセット。
【請求項３】
前記ｓｈＲＮＡの各々は、１つの標的遺伝子の単一部位または互いに異なる部位に特異的なｓｈＲＮＡである、請求項１に記載のマルチ−シストロンｓｈＲＮＡ発現カセット。
【請求項４】
前記ｓｈＲＮＡの各々は、標的遺伝子が互いに異なる２つ以上の場合、各標的遺伝子で単一部位または互いに異なる部位に特異的なｓｈＲＮＡである、請求項１に記載のマルチ−シストロンｓｈＲＮＡ発現カセット。
【請求項５】
前記ｓｈＲＮＡの各々は、１つの標的遺伝子の 互いに異なる部位に特異的であるか、互いに異なる２つ以上の標的遺伝子の 各標的遺伝子で単一部位または互いに異なる部位に特異的であり、各部位に特異的なｓｈＲＮＡは、同一の配列を有する２つ以上のｓｈＲＮＡを含む、請求項１に記載のマルチ−シストロンｓｈＲＮＡ発現カセット。
【請求項６】
前記プロモーターは、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター及びＣＭＶプロモーターからなる群から選択される、請求項１に記載のマルチ−シストロンｓｈＲＮＡ発現カセット。
【請求項７】
前記標的遺伝子は、ＸＩＡＰ、Ａｋｔ、Ｂｃｌ−２及びＦａｓからなる群から選択された少なくとも１つ以上である、請求項１に記載のマルチ−シストロンｓｈＲＮＡ発現カセット。
【請求項８】
前記標的遺伝子は、ＸＩＡＰ、Ａｋｔ及びＢｃｌ−２である、請求項１に記載のマルチ−シストロンｓｈＲＮＡ発現カセット。
【請求項９】
前記ドローシャ切断第１の領域と、前記ドローシャ切断第２の領域と、前記ループ領域とは、配列番号１のマイクロＲＮＡｍｉｒ−３０をエンコードする配列由来である、請求項１に記載のマルチ−シストロンｓｈＲＮＡ発現カセット。
【請求項１０】
請求項１〜９のうち、いずれか１項に記載のマルチ−シストロンｓｈＲＮＡ発現カセットを含む、発現ベクター。
【請求項１１】
前記発現ベクターは、プラスミドである、請求項１０に記載の発現ベクター。
【請求項１２】
前記発現ベクターは、レンチウイルス(lentivirus)、レトロウイルス(retrovirus)、アデノウイルス(adenovirus)、アデノウイルス−関連ウイルス(adeno-associated virus)、ヘルペスウイルス(herpes virus)及びトリポックスウイルス(avipox virus)ベクターからなる群から選択された、請求項１０に記載の発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１０の発現ベクターで形質導入された細胞。
【請求項１４】
請求項１０の発現ベクター、及びＰＥＧ(polyethylene glycol)、ＰＥＩ(polyethyleneimine)、キトサン、ＰＥＧ−キトサン、ＤＥＡＥ−デキストラン、核蛋白質、脂質及びペプチドからなる群から選択された伝達体との複合体。
【請求項１５】
標的遺伝子抑制用薬学的組成物の製造に使用するための請求項１０の発現ベクターの用途。
【請求項１６】
請求項１０の発現ベクターを含む、標的遺伝子抑制用薬学的組成物。
【国際調査報告】
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