【誤訳訂正書】
【提出日】平成20年11月11日(2008.11.11)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の標的核酸配列の存在を検出する方法であって、
(a)DNA二重鎖結合剤、
(b)核酸ポリメラーゼ、
(c)前記標的核酸が一本鎖の形にあるときに前記標的配列に対してハイブリダイズすることができ、標識を有するプローブに5' 末端で結合している増幅プライマーを含み、前記増幅プライマーと前記プローブとの前記結合が化学結合基によって仲介されている試薬、
の存在下に該試料に対して核酸増幅を行うステップであって、
標識した前記プローブが、増幅産物内の相補的領域に対してハイブリダイズすることができ、及び、該標識が該DNA二重鎖結合剤から蛍光を吸収し又は該DNA二重鎖結合剤に蛍光エネルギーを供与し得るステップ；及び、
前記試料の蛍光をモニタするステップ、
を含む、前記方法。
【請求項２】
(a)該標的核酸配列を含む疑いがある試料に、該DNA二重鎖結合剤と、該核酸ポリメラーゼと、該試薬とを添加するステップ；
(b)該プライマーが該標的核酸配列にハイブリダイズするとともに該プローブを含む増幅産物が形成される条件に前記試料を供するステップ；
(c)該標識したプローブが該増幅産物の相補的領域にハイブリダイズする条件に前記試料を供するステップ；及び
(d)ステップ(b)と(c)の少なくとも１つのステップの間に前記試料の蛍光をモニタするステップ、
を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該増幅産物が該プローブを含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
該DNA二重鎖結合剤が挿入色素である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
該DNA二重鎖結合剤が供与標識を含み、該プローブがその受容標識を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
該DNA二重鎖結合剤が受容標識を含み、該プローブがその供与標識を含んでいる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
該受容標識が固有の波長でエネルギーを放出する蛍光分子である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
該受容標識がローダミン色素又はCy5(登録商標)である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
該受容標識が蛍光を発しない受容体である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
該蛍光を発しない受容体がDABCYL(登録商標)、メチルレッド、QSY-7(登録商標)ジアリールローダミン色素及び6-(ジメチルアミノ)-2-［4-［4-(ジメチルアミノ)フェニル］-1,3-ブタジエニル］-1-エチルキノリニウムペルクロレートのいずれか１種より選ばれる、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
該増幅反応が該ポリメラーゼ鎖反応(PCR)を含む、請求項１〜10のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
該受容体分子が蛍光分子であり、該供与体分子と該受容体分子双方の蛍光がモニタされ、発光間の関係が計算される、請求項１〜８と請求項11のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
該試料からの蛍光シグナルを該増幅反応全体にモニタし、その結果を該試料中に存在している標的配列の量を定量するために用いる、請求項１〜12のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
該増幅反応が、標識したプローブに結合していない対応する追加の増幅プライマーの存在下に行われる、請求項１〜13のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
核酸増幅を検出する方法であって、
(a)核酸ポリメラーゼ、
(b)第一標識として働くDNA二重鎖結合剤、
(c) 前記標的核酸が一本鎖の形にあるときに標的配列に対してハイブリダイズすることができ且つ化学結合基によって第二標識を有するプローブに5' 末端で結合している増幅プライマーを含み、前記増幅プライマーと前記プローブとの前記結合が化学結合基によって仲介されている試薬、
の存在下に標的ポリヌクレオチドに対して核酸増幅を行うステップであって、標識した前記プローブが、増幅産物の相補的領域に対してハイブリダイズすることができ、及び、該DNA二重鎖結合剤又は第二標識の一方が、前記供給分子から蛍光エネルギーを吸収することができる受容標識を含む該DNA二重鎖結合剤又は第二標識のもう一方に蛍光エネルギーを供与することができる供与標識を含み、前記プライマーが前記標的ポリヌクレオチドに対してハイブリダイズすることができるステップ；及び、
該増幅反応中に蛍光の変化をモニタするステップ、
を含む、前記方法。
【請求項１６】
該増幅が、DNA鎖内の該標的ヌクレオチド配列のみが増幅されるように設計されている一対のプライマーを用いて行われる、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
該プローブがRNAのスプライス領域か又はDNAのイントロンに特異的であるので、増幅したRNA又は増幅したDNAの１つだけが検出及び/又は定量される、請求項１〜16のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１８】
温度、電気化学電位、若しくは、酵素又は化学剤の存在からなる反応条件を求める方法であって、該反応条件が、プローブが試料中の相補的領域に対してハイブリダイズする条件、または、プローブ及び標的核酸によって形成される二重鎖が不安定化する条件であり、
(a)DNA二重鎖結合剤と、プローブに5' 末端で化学結合によって結合された増幅プライマーを含み、前記増幅プライマーと前記プローブとの前記結合が化学結合基によって仲介されており、且つ標識を更に含み、前記DNA二重鎖結合剤と該標識の一方が供与標識であり、もう一方が受容標識であり、該供与標識が該受容標識に蛍光エネルギーを供給することができる試薬との存在下に前記配列を増幅し、プローブ領域を組込んでいる増幅産物を形成するステップ、
(b)増幅産物をその該プローブ領域が該増幅産物の該相補的領域に対してハイブリダイズする条件に供するステップ、及び
(c)試料の蛍光をモニタするとともに該試料に対する該プローブ領域のハイブリダイゼーション又は該プローブ領域と該標的核酸配列間に形成される該二重鎖の不安定化の結果として蛍光が変化する反応条件を求めるステップ、
を含む、前記方法。
【請求項１９】
多型性及び/又は対立遺伝子変異を検出する方法であって、前記多型性又は変異を含むことが疑われる配列を請求項１〜16のいずれか１項に記載の方法を用いて増幅するステップと、該プローブ領域が該増幅産物内のその相補的配列から融解する温度を生成した該蛍光シグナルを用いて測定するステップと、それを多型性又は対立遺伝子変異の存在に関係づけるステップとを含む、前記方法。
【請求項２０】
請求項１〜19のいずれか１項に記載の方法において用いられるキットであって、増幅産物の領域に対してハイブリダイズすることができるプローブに5' 末端に結合される増幅プライマーを含み、前記増幅プライマーと前記プローブとの前記結合が化学結合基によって仲介されており、該プローブが供与標識と受容標識のどちらか一方として作用することができる第一標識を含む試薬と、第二標識が供与標識と受容標識のどちらか一方として作用することができる第二標識を含むDNA挿入剤とを含み、該第一標識と第二標識が供与体‐受容体対を形成する、前記キット。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００２】
蛍光PCR鎖特異的法は、増幅反応の進行をモニタするために追加の核酸反応成分を利用するものである。これらの方法は、検出の基準として蛍光エネルギー転移(FET)を用いることができる。１種以上の核酸プローブを蛍光分子で標識し、その一方がエネルギー供与体分子として作用することができ、もう一方がエネルギー受容体分子である。これらは、それぞれリポーター分子と消光分子としてしばしば知られる。供与体分子は、通常は蛍光発光波長を示す個々の光の波長で励起する。受容体分子は、この発光波長で励起し、種々の距離依存性エネルギー転移機序により供与体分子の発光エネルギーを受容し得る。起こり得る蛍光エネルギー転移の個々の例は、蛍光共鳴エネルギー転移又は“FRET”である。
一般に、受容体分子は密接に近接している(例えば、同じ分子、又は隣接分子について)供与体分子の発光エネルギーを受容する。FET又はFRET検出の基準は供与体発光波長の変化をモニタすることである。受容体が蛍光分子である場合、受容体発光波長をモニタすることができる。
２種類のFET又はFRETプローブが一般に用いられ、供与体を受容体から分離するために核酸プローブの加水分解を用いるものと、供与体分子と受容体分子の空間的関係を変えるためにハイブリダイゼーションを用いるものがある。
加水分解プローブは、TaqMan(登録商標)プローブとして市販されている。これらは、供与体分子と受容体分子で標識されるDNAオリゴヌクレオチドからなっている。プローブは、PCR産物の１つの鎖の特定の領域に結合するように設計されている。この鎖に対するPCRプライマーをアニールした後、Taq酵素は5' →3' ポリメラーゼ活性を有するDNAを伸長させる。Taq酵素は、5' →3' エキソヌクレアーゼ活性も示す。TaqMan(登録商標)プローブは、Taqエクステンションを開始することを妨げるリン酸化により3' 末端で保護される。TaqMan(登録商標)プローブが産物鎖に対してハイブリダイズする場合には、伸長しているTaq分子はプローブを加水分解することができ、検出の基準として供与体を受容体から遊離させる。この場合のシグナルは累積し、供与体と受容体の遊離分子の濃度は増幅反応の各サイクルと共に増大する。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００４】
２つのプローブ、又は２つの標識分子を含む分子ビーコン型のプローブの使用は、プロセスに関係するコストが増大する。更に、この方法にはかなり長く知られた配列の存在を必要とするので、特に相互に密接に接近して結合するのに十分長い２つのプローブが既知である。これは、有効なプローブを設計するために使用し得る生物における保存配列の長さがHIVウイルスのような比較的短いものである診断用においては問題となるものである。
更に、一対のプローブの使用には、より複雑な実験設計が必要である。例えば、プローブの融解物によって示されるシグナルは双方のプローブからの融解の関数である。小さな不適合又はプローブの一方がスプライス領域を横切って結合することを必要とする場合(例えば、イントロンの両側の配列がプローブ部位として用いることができる試料におけるDNAに匹敵するRNAを検出する)の実験により、もう一方のプローブが最初に融解する場合には不正確な結果が生じ得る。
同時係属国際出願第99/28500号には、具体的な標的核酸配列の存在を検出する方法であって、a)その試料に前記配列に特異的なプローブを付加するステップであって、該プローブがDNA二重鎖結合剤に蛍光を供与するか又はそれから蛍光エネルギーを吸収することができる部分をもっている、前記ステップと、b)その混合物を増幅反応に供するステップと、c)該標的配列に対して該プローブをハイブリダイズし、該試料からの該蛍光をモニタするステップとを含む、前記方法が記載されている。その場合、反応は前記試料の蛍光を測定することにより、プローブに対してハイブリダイズしかつDNA二重鎖結合剤とプローブの蛍光部分との間にFET又はFRETの相互作用を生じるより多くの産物が形成される反応の過程でこれが変わるので、モニタすることができる。
同時係属国際特許出願第PCT/GB99/00504号には、試料中の標的配列の量を定量するように適合することができる具体的な核酸配列の存在を検出する同様の分析が記載されている。この分析においては、増幅反応が一組のヌクレオチドを用いて行われ、少なくとも一方が蛍光的に標識されている。従って、増幅産物は蛍光標識がその中に組込まれている。反応は、増幅産物に対してハイブリダイズすることができ、且つ前記蛍光標識ヌクレオチドから蛍光を吸収することができるし、それに蛍光エネルギーを供与することもできる反応性分子を含むプローブの存在下に行われる。その場合、反応は、前記試料の蛍光を測定することにより、プローブに対してハイブリダイズし且つそれらの間でFET又はFRET相互作用を生じるより多くの産物が形成する反応の過程でこれが変わるので、モニタすることができる。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００５】
国際特許出願第01/11078号には、試料中の標的核酸配列の存在を検出する他の関連した方法が記載されている。この分析においては、第一段階で標的配列が一本鎖になるので、それに対して試薬のプライマー領域がハイブリダイズすることができる。従って、これにより、標識したヌクレオチドを含み且つ産物の下流領域に相補的な5' 末端の上流に標識したプローブ領域をもつ相補鎖を作成するために鎖のエクステンションを始めることができる。エクステンション相が完了すると、産物は鋳型鎖から溶融相中で分離されるので、一本鎖になる。この形での標識したプローブ領域はねじれるとともに産物鎖の相補的領域に対してハイブリダイズすることができ、そのときFET又はFRETによって蛍光エネルギーをもう一方の標識に供与することができる標識がそのようにするので、試料からの蛍光シグナルが変化する。シグナルのこの変化は、反応全体にモニタすることができ、増幅反応の進行がモニタされる。
スコルピオンプローブシステムの使用を含む分析は、英国特許第2338301号とNucleic Acids Research, 2000, vol. 28, no. 19, 3752-3761に開示されている。スコルピンプローブシステムは、結合部分によってプローブ部分に結合したプライマー部分を含んでいる。プローブシステムは、供与部分と受容部分の双方を含んでいる。この分析においては、第一段階で標的配列を一本鎖にするのでプライマー部分は標的配列に対してハイブリダイズすることができる。従って、これにより、産物の下流領域に対して相補的である5' 末端の上流にプローブ部分をもつ相補鎖を作成する鎖のエクステンションを始めることができる。エクステンション相が完了すると、融解相の間に鋳型細胞から産物を分離するので、一本鎖になる。この形での標識したプローブ領域はねじれるとともに産物鎖の相補的領域に対してハイブリダイズすることができる。産物鎖の相補的領域に対してプローブ部分をハイブリダイズすると、供与部分と受容部分との間の空間的関係が変わるので、試料からの蛍光シグナルが変化する。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００６】
そこで、出願人は、代替的改良分析を見出した。
本発明は、試料中の標的核酸配列の存在を検出する方法であって、
(a)DNA二重鎖結合剤と、(b)核酸ポリメラーゼと、(c)一本鎖の形にあるときに前記標的配列に対してハイブリダイズすることができ且つ化学結合基によって標識を有するプローブに5' 末端で結合している増幅プライマーを含む試薬、との存在下に該試料に対して核酸増幅を行うステップであって、標識した前記プローブが前記標的核酸配列と同様の配列であり、但し、増幅産物内の相補的領域に対してハイブリダイズすることができ、及び、該標識が該DNA二重鎖結合剤から蛍光を吸収し又は該DNA二重鎖結合剤に蛍光エネルギーを供与し得るステップ；及び、前記試料の蛍光をモニタするステップ、を含む、上記方法を提供する。
本発明は、国際出願第01/11078号の従来技術より安価で簡便であり、驚くべきことに効果的である。本発明においては、DNA二重鎖結合剤は、非結合状態で反応混合物に添加され、その結合剤を国際出願第01/11078号のようにヌクレオチドか又は英国特許第2338301号のようにプローブシステムに結合する要求を不要にする。
本発明の分析においては、第一段階で標的配列を一本鎖にするので、試薬のプライマー領域はそれにハイブリダイズすることができる。従って、これにより、相補鎖を作成するために鎖のエクステンションを始めることができる。プライマー鎖は、産物の下流領域に相補的な5' 末端の下流に標識したプローブ領域を有する。DNA二重鎖結合材料(好ましくは挿入色素)は、そのように形成された二重鎖の中に入り込む。エクステンション相が完了すると、溶融相中にその鋳型細胞から産物が分離されるので、一本鎖になる。この形の標識したプローブ領域はねじれるとともに産物鎖の相補的領域に対してハイブリダイズすることができるので、産物のプローブ領域と相補的領域の間にDNA二重鎖結合剤が入り込む。DNA二重鎖結合剤とプローブ標識が相互に接近することにより、蛍光エネルギー(供与体)を受容部分にFET又はFRETによって供与することができる蛍光部分がそのようにするので、試料からの蛍光シグナルが変化する。このシグナルの変化は、増幅反応の進行をモニタするために反応全体にモニタすることができる。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００７】
増幅の第二段階と続いての段階においては、産物鎖はそれ自体エクステンション用鋳型鎖として作用することができる。しかしながら、前記プローブに相補的な配列が作製される前にプローブとプライマー間の化学結合がエクステンション反応を停止させる。従って、プローブ領域は一本鎖のままである。
本発明の方法は、
(a)標的核酸配列を含むことが疑われる試料にDNA二重鎖結合剤と、核酸ポリメラーゼと、試薬とを添加するステップと、
(b)プライマーが標的核酸配列に対してハイブリダイズしかつプローブを含む増幅産物が形成される条件に前記試料を供するステップと、
(c)標識したプローブが増幅産物の相補的領域に対してハイブリダイズする条件に前記試料を供するステップと、
(d)ステップ(b)とステップ(c)の少なくとも１つのステップの間、前記試料の蛍光をモニタするステップと
を含むことが好ましい。
必要とされる場合、標識したプローブ領域に結合していない対応する増幅プライマーが増幅反応中に存在してもよい。このプライマーは、結果として、用いられる検出装置の動的範囲にシグナルを仲介する働きをすることができる従来の非標識増幅産物を作製する。
プローブ/プライマーの複合構造の存在によって悪影響することがある反応効率を改善することができる。
供与標識から蛍光を吸収することができる受容標識がこの機能を行う場合、供与体からの蛍光が低下する。この低下を検出することができ、これはプローブ領域の結合を意味する。
最も好ましくは、蛍光を吸収することができる標識(受容体)は、それ自体蛍光分子であり、固有の波長で蛍光を放出する。そのようなプローブには、ローダミン色素又はCy5が含まれる。この場合、供与標識と異なる波長を有する受容体分子からの蛍光の増加は、プローブの結合を意味する。また、受容体は蛍光を発しない(暗受容体)。そのような受容体には、DABCYL、メチルレッド、QSY-7ジアリールローダミン色素又は6-(ジメチルアミノ)-2-［4-［4-(ジメチルアミノ)フェニル］-1,3-ブタジエニル］-1-エチルキノリニウムペルクロレート(CAS No.181885-68-7)が含まれる。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００８】
適切には、DNA二重鎖結合剤は供与標識を含み、受容標識はプローブ上に与えられる。この場合、また、受容体が蛍光を発する場合には、このように標識した増幅産物の存在は、同じ産物鎖の下流領域に主として結合している、プローブ上の受容体分子からの蛍光をモニタすることにより検出することができる。この場合、増幅産物からのシグナルは、蛍光標識のバックグラウンドシグナルと、また、非特異的増幅産物とも区別することができる。また、DNA二重鎖結合剤は受容標識を含むことができ、プローブは供与標識を含んでいる。
本発明のシステムにおいては、一般インターカレーターシグナルの上昇(DNAが増幅した場合)と２つの蛍光部分が密接に近接している場合にだけ生じる配列特異的シグナル(即ち、プローブが増幅産物に対してハイブリダイズする場合)との間で区別される。配列特異的シグナルが標識した増幅産物によってのみ生成するという事実は、システムが多量のバックグラウンドDNAを含む反応混合物中の特定の標的配列を検出する点で非常に特異的であることを意味する。これは、非特異的増幅産物がプローブ領域に対してハイブリダイズしないので、測定シグナルに寄与しないためである。配列特異的シグナルに加えて一般インターカレーターシグナルを測定することは、有益なことである。一般インターカレーターシグナルは反応混合物中の増幅度に比例するので、増幅の効率又は遮断を示すために用いることができる。
この種類の分析は、安価な試薬を用いて行うことができる。単一の標識プローブは、受容体分子と供与体分子双方を含むものより経済的である。
増幅は、ポリメラーゼ鎖反応(PCR)又はリガーゼ鎖反応(LCR)、鎖置換分析(SDA)又はNASBAのような既知の増幅反応、好ましくはPCRを用いて適切に行われる。
好ましくは、供与部分と受容部分の双方の蛍光がモニタされ、発光間の関係が計算される。
プローブに沿った標識の位置は重要でないが、一般にプローブの末端領域に位置する。
１つを超える標識を試薬に用いることができるが、１つがより安価であるので好ましい。
FRETのようなFETのオーダーでは、供与部分の蛍光発光は受容部分より波長が短くなければならない。
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１０】
リンカーの形成に用いることができる化学剤と反応の種類の例は、例えば、国際出願第95/08642号に記載されている。特に、化学リンカーは、２つのポリヌクレオチド配列と、プライマーと、プローブとを共に結合する原子群を含んでいる。リンカーは、慣用的方法のいずれによってもそれぞれのポリヌクレオチド配列に結合することができる。
一般的に言えば、リンカーは、プローブとプローブの配列にそれぞれ結合することができること又は個々のヌクレオチドに結合してからプローブ又はプライマー配列が引き続き作成されることによって第一官能基と第二官能基を有する有機化合物から得られる。リンカーは、一般的にはヌクレオチドに結合しないように設計されている。
リンカーの合成は、例えば、S. Agrawal et al, Nucleic Acids Research, 1986, 14, 6227や国際出願第88/02004号(Applied Biosystems); J. L. Ruth & D. E. Bergstrom, J. Org. Chem., 1978, 43, 2870; D. E. Bergstrom & M. K. Ogawa, J. Amer. Chem. Soc., 1978, 10, 8106; C. F. Bigge, P. Kalaritis, J. R. Deck & M. P. Mertes, J. Amer. Chem. Soc., 1980, 102, 2033; 欧州特許出願第063,879号に詳述されている。プローブとプライマーを結合する化学結合基を有する試薬の構造と合成については、国際特許出願第01/11078号に詳述されている。
特に、リンカーは複数の形のエチレングリコール、例えば、ヘキサエチレングリコール(HEG)を含んでいる。そのようなリンカーは、構造-(CHOH-CHOH)n(ここで、nは１より大きい整数、例えば、１〜10、適切には６である。)を有するものである。
プローブとプライマーを結合するリンカー基を含むそのような試薬は、Oswel Research Products Ltd, 英国から入手することができる。
本発明の方法は、その用途が非常に広い。本方法は、以下に詳述されるように、試料中の標的核酸配列に関して定量データと定性データ双方を作成するために使用し得る。特に、本発明は定量的増幅を提供するだけでなく、更に又は或いは、二重鎖不安定化温度又は融点のような確認データを得るために使用し得る。
【誤訳訂正９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１２】
各サイクルの間、試料からの受容体標識の蛍光をモニタすることにより、増幅反応の進行を様々な方法でモニタすることができる。例えば、融解ピークによって得られるデータは、例えば、融解ピークの下の面積を計算し、このデータをサイクル数に対してプロットすることにより分析することができる。
蛍光は、既知の蛍光光度計を用いて適切にモニタされる。これらの、例えば、光電子倍増電圧の形のシグナルは、データプロセッサボードに送られ、各試料チューブに付随したスペクトルに変換される。複数のチューブ、例えば、96チューブを同時に評価することができる。このようにして反応全体に頻繁な間隔で、例えば、10分毎に１回データを集めることができる。
このようにして生成したスペクトルを、各シグナリング部分(即ち、DNA二重鎖結合剤及び/又はプローブ標識)の代表的なピークを形成するために、例えば、色素のような予め選択した蛍光部分の“適合部”を用いて分割することができる。各シグナルの強さの値を表し、必要な場合には、相互に商として表されるピークの下の面積を求めることができる。シグナルの強さ及び/又は比率の微分は、FET又はFRETの変化を反応によって又は温度のような異なる反応条件で記録されることを可能にする。上記の変化は、プローブと標的配列間の結合現象に関係する。微分ピークの下の面積の全体は、FET又はFRET効果の強さの値を計算することを可能にする。
これらのデータは、試料中に存在する標的核酸の量を定量する１つの手段を与える。
プライマー/標識したプローブ試薬は、溶液中に遊離していてもよく、固体支持体、例えば、産物を分離するのに有効な磁気ビーズのようなビーズの表面、又は表面プラズモン共鳴検出器の導波管や、例えば、DNAアレイのような検出装置の表面上に固定化されてもよい。選択は、調べられる具体的な分析の種類や用いられる具体的な検出手段に左右される。
【誤訳訂正１０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１４】
従って、本発明の好適実施態様は、核酸増幅を検出する方法であって、(a)核酸ポリメラーゼと、(b)DNA二重鎖結合剤と、(c)一本鎖の形にあるときに標的配列に対してハイブリダイズすることができ且つ化学結合基によって第二標識を有するプローブに5' 末端で結合している増幅プライマーを含む試薬、の存在下に該標的ポリヌクレオチドに対して核酸増幅を行うステップであって、標識した前記プローブが前記標的配列と同様の配列であり、但し、増幅産物の相補的領域に対してハイブリダイズすることができ、及び、該DNA二重鎖結合剤又は第二標識の一方が、前記供給分子から蛍光エネルギーを吸収することができる受容標識を含む該DNA二重鎖結合剤又は第二標識のもう一方に蛍光エネルギーを供与することができる供与標識を含み、前記プライマーが前記標的ポリヌクレオチドに対してハイブリダイズすることができるステップ；及び、該増幅反応中に蛍光の変化をモニタするステップ、を含む、前記方法を含む。
適切には、受容標識はそれ自体蛍光であり、固有の波長で蛍光エネルギーを放出する。
増幅は、当該技術において十分に理解されるようにDNA鎖内の標的ヌクレオチド配列のみが増幅されるように設計される一対のプライマーを用いて適切に行われる。核酸ポリメラーゼは、Taqポリメラーゼのような耐熱性ポリメラーゼが適切である。
増幅反応を行うことができる適切な条件は、当該技術において周知である。最適条件は、含まれる具体的なアンプリコン、用いられるプライマーの種類、用いられる酵素によってそれぞれの場合に変えることができる。最適条件は、当業者がそれぞれの場合に求めることができる。典型的な変性温度は約95℃であり、典型的なアニーリング温度は約55℃であり、エクステンション温度は約72℃である。
【誤訳訂正１１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１６】
或いは又は更に、本発明の方法は、配列の特性を求めるためのハイブリダイゼーション分析に使用し得る。従って、他の態様においては、本発明は、核酸配列の特性を求める方法であって、(a)DNA二重鎖結合剤と、その標的配列の領域と同様である配列を含むプローブに5' 末端で化学結合によって結合された増幅プライマーを含み且つ標識を更に含み、前記DNA二重鎖結合剤と該標識の一方が供与標識であり、もう一方が受容標識であり、該供与標識が該受容標識に蛍光エネルギーを供給することができる試薬との存在下に前記配列を増幅し、プローブ領域を組込んでいる増幅産物を形成するステップと、(b)増幅産物をその該プローブ領域が該増幅産物の該相補的領域に対してハイブリダイズする条件に供するステップと、(c)試料の蛍光をモニタするとともに該試料に対する該プローブ領域のハイブリダイゼーション又は該プローブ領域と該標的核酸配列間に形成される該二重鎖の不安定化の結果として蛍光が変化する前記配列の特性の具体的な反応条件を求めるステップとを含む、前記方法を提供する。
適切な反応条件としては、温度、電気化学、又は具体的な酵素又は化学剤の存在に対する応答が含まれる。これらの性質が変わるにつれて蛍光の変化をモニタすることにより、配列の正確な種類に特有の情報を得ることができる。例えば、温度の場合には、加熱の結果として試料中の配列からプローブが分離する温度を求めることができる。これは、全般的な診断において多型性及び/又は対立遺伝子変化を、例えば、検出、所望される場合には定量するするのに非常に有効であり得る。“多型性”とは、配列に、特に本来起こることができる転位、転換、挿入、欠失又は逆位が含まれる。
融解のヒステリシスは、標的配列が唯一の塩基対によって変化する場合には異なる。従って、例えば、試料が単一の対立遺伝子変異体だけを含む場合、プローブ領域の融解温度は他の唯一の対立遺伝子変異体を含む試料中に見られるものと異なる。双方の対立遺伝子変異体を含む試料は、対立遺伝子変異体のそれぞれに対応する２つの融点を示す。
従って、本発明の他の実施態様においては、多型性及び/又は対立遺伝子変異を検出する方法は、前記多型性又は変異を含むことが疑われる配列を本発明の方法を用いて増幅するステップと、該プローブ領域が該増幅産物内のその相補的配列から融解する温度を生成した該蛍光シグナルを用いて測定するステップと、それを多型性又は対立遺伝子変異の存在に関係づけるステップとを含んでいる。
【誤訳訂正１２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１７】
同様の問題は、電気化学的性質についても、ある種の酵素又は化学剤の存在するときにも適用される。標識したプローブは、電気化学電位を印加することができる固体表面上に固定化することができる。標的配列の下流は、配列の正確な種類によっては具体的な電気化学値においてプローブに結合するか又はプローブから再瞬間標識される。
更に、プローブハイブリダイゼーションの速度論は、標的配列濃度を絶対的な事項で定量することを可能にする。試料からの蛍光の変化は、試料に対するプローブ領域のハイブリダイゼーション率を計算することを可能にすることができる。ハイブリダイゼーション率の増加は、試料中に存在する標的配列の量に関係する。増幅反応が進行するにつれて標的配列の濃度が増大するので、プローブ領域のハイブリダイゼーションは更に急速に起こる。従って、このパラメータは定量化の基準として用いることができる。このデータ処理の方式は、情報を与えるためにシグナルの強さに直接依存しないという点で有効である。
本発明の他の実施態様においては、本発明の方法において用いられるキットであって、標的配列に特異的なプローブに化学結合によって5' 末端に結合される増幅プライマーを含み、該プローブが供与標識と受容標識のどちらか一方として作用することができる第一標識を含む試薬と、第二標識が供与標識と受容標識のどちらか一方として作用することができる第二標識を含んでいるDNA挿入剤とを含み、該第一標識と第二標識が供与体‐受容体対を形成する、前記キットである。
所望される場合には、プローブはビーズ、例えば、磁気ビーズのような支持体、又は消散波検出装置の導波管のような検出器に用いられる支持体に固定化することができる。キットの他の潜在的成分には、DNAポリメラーゼのような増幅反応に用いられる試薬が含まれる。
非蛍光受容体分子の使用は、同時係属特許出願第PCT/GB99/0504号に記載される分析に用いることができる。
ここで、添付の概略図を参照する実施例によって本発明を特に記載する。