(57)【要約】  本発明は、ビタミンＣ又はビタミンＣ類似体とともにＯＰＣなどの天然酸化防止剤によって安定化させた緑茶配合物に関する。本発明はまた、緑茶カテキンのバイオアベイラビリティを増大させるための、ＯＰＣとアスコルビン酸との混合物の使用に関する。本発明はまた、安定化させた緑茶製剤を含有する食品組成物、医薬組成物、又は化粧用組成物に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カテキンのバイオアベイラビリティを改善するための少なくとも１つのカテキンを含む組成物の調製における、プロシアニジンオリゴマー（ＯＰＣ）及びアスコルビン酸若しくはビタミンＣ類似体の混合物の使用。
【請求項２】
前記カテキンが、緑茶、野生植物の果実、特にベリー、ココア、豆、又はカテキンを含有する他の果実源に由来する、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記組成物が、食品、ペットフード製品、栄養組成物、栄養補助食品、食品サプリメント、化粧用組成物、又は医薬品である、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
前記食品が、完全栄養調合乳、酪農製品、冷蔵若しくは常温保存可能飲料、粉末飲料、ミネラルウォータ、液体ドリンク、スープ、健康補助食品、食事代替品、栄養バー、菓子、乳製品若しくは発酵乳製品、ヨーグルト、ミルクベース粉末、経腸栄養剤、幼児用調合乳、幼児用栄養製品、シリアル製品若しくはシリアル系発酵製品、アイスクリーム、チョコレート、コーヒー、又は料理用製品からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
前記食品サプリメントが、カプセル、ゼラチンカプセル、軟カプセル、錠剤、糖衣錠、丸薬、ペースト若しくはトローチ、ガム、飲用可能液剤若しくは乳剤、シロップ、又はゲルの形態で提供される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
前記組成物が、甘味料、安定剤、香味料及び着色剤の少なくとも１つをさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
前記化粧用組成物が、皮膚に関して活性な化合物をさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
前記カテキンの有効性を増大させるため、特に、皮膚健康を改善するため、循環器疾患、２型糖尿病、認知機能又は炎症の予防又は治療におけるプラス効果を得るため、又は体重の管理低減のための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
前記皮膚健康の改善が、特に、老化に対する皮膚の組織の保護、敏感な、乾燥した又は反応性の皮膚の予防又は治療である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
皮膚の密度又は張りを改善するための、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
前記組成物が、皮膚の光防護を増大させる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
前記組成物が、ヘスペレチンを、好ましくは、１日用量当たり１０ｎｇ〜１０００ｍｇの量でさらに含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１３】
少なくとも１つのカテキン、並びにプロシアニジンオリゴマー（ＯＰＣ）及びアスコルビン酸若しくはビタミンＣ類似体の混合物を含む組成物を供給するステップを含む、カテキンのバイオアベイラビリティを持続させる及び／又は改善させる方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ビタミンＣ又はビタミンＣ類似物とともにプロシアニジンオリゴマー（ＯＰＣ）などの天然酸化防止剤によって安定化させた緑茶製剤に関する。本発明はまた、緑茶カテキンのバイオアベイラビリティを増大させ、カテキンの有益な健康効果を最大化するための、複数のＯＰＣとアスコルビン酸との混合物の使用に関する。本発明はまた、安定化させた緑茶製剤を含有する食品、ペット用食品、食品サプリメント、医薬組成物、又は化粧用組成物に関する。
【０００２】
［発明の背景］
世界中で水に次いで最も一般的に摂取される飲料である緑茶は、いくつかの重要な健康上の恩恵をもたらす。これら恩恵を担っていると考えられる化合物は、ポリフェノール、及び特にカテキンである。
【０００３】
主要な緑茶ポリフェノール（フラバノン−３−オール）は、カテキン、すなわち（＋）−カテキン（Ｃ）、及びその立体異性体、並びに４つの誘導体、すなわち（−）−エピカテキン（ＥＣ）、（−）−エピガロカテキン（ＥＧＣ）、（−）−エピガロカテキン−３−ガラート（ＥＧＣｇ），（−）−エピカテキン−３−ガラート（ＥＣｇ）である。
【０００４】
カテキンの量は、光、降雨、温度、養分利用性、葉齢、遺伝子の性質などの植物の代謝に影響を与える要因に依存して変化するが、その量は通常、生の緑茶葉乾燥物質の２０〜３０％を占める。カテキンは、緑茶の全ポリフェノール含有量の約８０％に相当する。カテキンは、緑茶を製造している間にはめったに破壊されることはないので、カテキンは、市販されている緑茶抽出物の主要部分となる。
【０００５】
緑茶カテキンは、反応性酸素種及び反応性窒素種の除去、遊離金属のキレート化、転写因子の阻害、及びリポキシゲナーゼ、シクロキシゲナーゼなどの酸化酵素の阻害を含む酸化防止活性にたびたび関係するいくつかの健康効果を示す。
【０００６】
ポリフェノールの健康効果は、摂取量及びポリフェノールのバイオアベイラビリティに依存している。しかしながら、ポリフェノールのバイオアベイラビリティは、乏しく、それは、生理的条件のもとでポリフェノール化合物の特別な不安定性と関係しているように思われる。
【０００７】
悪条件下で緑茶カテキンの安定性を増大させる可能性のある戦略の１つは、酸化防止剤によってカテキンを保護して酸素にさらされることで生ずる化学変化を防止することである。例えば、Ｒｏｄｅら（２００２）が示すところによると、水溶性酸化防止剤（ビタミンＣ）を組み込むことで、緑茶カテキンを乳剤中で安定化させたが、Ｒｏｄｅらがブチル化ヒドロキシトルエン、又はプロピルガラートなどの脂溶性酸化防止剤を使用した場合には、何ら効果を見出さなかった。実際に、４つのカテキン種の全部、特にＥｇＣ及びＥｇＣｇは、アスコルビン酸が存在する場合は安定化されることが判明したが、この保護は用量依存性である。アスコルビン酸のこの保護効果は長らく知られていたが、バイオアベイラビリティに対するその効果は確認されていない。実際に、Ｇ．Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｖｉｔａｍ．Ｎｕｔｒｉ  Ｒｅｓ．７７（３）２００７、２２４−２３５の中で、酸化防止剤（ビタミン及びカロテノイド）を加えることは、カテキンのようなポリフェノールのバイオアベイラビリティに対して何の効果もないことが最近示された。
【０００８】
したがって本発明の目的は、安定性を改善し、バイオアベイラビリティを増大させたカテキンを含有する製剤を提供することで、上記問題に対処することである。本発明の目的はまた、食品又はペットフード製品、栄養サプリメント又は食品サプリメント、化粧用調製物又は医薬用調製物における用途に使用できる増大したバイオアベイラビリティを有する緑茶製剤を提供することである。
【０００９】
［発明の概要］
したがって、本発明の第１の目的は、カテキン、特に緑茶カテキンのバイオアベイラビリティを増大させる製品を調製するための、プロシアニジンオリゴマー（ＯＰＣ）及びアスコルビック酸若しくはビタミンＣ類似体の混合物の使用を提供することである。
【００１０】
有利なことには、この組成物によって、カテキン内容物の改善された安定性及びバイオアベイラビリティがもたらされる。さらに、この組成物は、より良好なバイオアベイラビリティ及び安定性の形態で強化された栄養価を有する。この組成物は、直接使用してもよく、又は濃縮又は乾燥し粉末にして毎日摂取する食品用のいくつかの用途若しくは他の栄養用途のために使用してもよい。
【００１１】
本発明の別の目的は、本発明による製剤を含有する、食品、ペットフード、化粧用調製物、栄養サプリメント又は医薬用調製物を提供することである。
【００１２】
別の態様では、本発明は、ＯＰＣ及びアスコルビン酸の組合せを使用して、緑茶カテキンの安定性及びバイオアベイラビリティを増大させる方法を提供する。
【００１３】
別の目的は、皮膚健康の改善、特に皮膚の光防護、又は老化に対する皮膚組織の保護を対象とした、口腔用、化粧用又は医薬用の組成物を調製するための上記製剤の使用を提供することである。
【００１４】
他の別の目的は、体重管理、循環器疾患、２型糖尿病、認知機能又は炎症を対象とした、口腔用、局所用又は医薬用の組成物を調製するための上記製剤の使用を提供することである。
【００１５】
本発明は、消費者に、バイオアベイラビリティ及び生物学的効率が増大した緑茶カテキンに基づく改善された組成物を今や利用可能にする。
【００１６】
本発明を、添付図面に示した本発明の実施形態のいくつかを参照して、以下にさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ビタミンＣ及びＯＰＣ（ＩｎｄＥｎａ）の増加する各濃度の存在下、緑茶の５時間インキュベーションにおけるＥＧＣｇ安定性を示す図である。
【図２】０．２ｍＭのビタミンＣ、及びＯＰＣの増加する濃度の存在下、緑茶の５時間インキュベーションにおけるＥＧＣｇ安定性を示す図である。
【図３】緑茶カテキン投与に関する、臨床試験の設計を示す図である。
【図４】各々の治療Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤに関する血漿薬物動態のための血液採取を示す図である。
【００１８】
［発明の詳細な説明］
以下の説明内では、用語「緑茶カテキン」は、カテキン（Ｃ）、エピカテキン（ＥＣ）、ガロカテキン（ＧＣ）、ガロカテキンガラート（ＧＣＧ）、エピガロカテキン（ＥＧＣ）、エピカテキンガラート（ＥＣｇ）、エピガロカテキンガラート（ＥＧＣｇ）を意味すると理解する。
【００１９】
第１の目的によれば、カテキンを含有する製剤の使用に関わる。この製剤は、緑茶カテキンのバイオアベイラビリティを増大させるために、プロシアニジンオリゴマー（ＯＰＣ）とアスコルビン酸との混合物を含む。
【００２０】
実際に、生理的条件下でいくつかの分子を検査すると、カテキンを含有する製剤にＯＰＣ及びアスコルビン酸（ビタミンＣ）又はビタミンＣ類似体（フラネオールなど）を加えることにより、驚くべきことには、上記カテキンのバイオアベイラビリティの有意な改善が見込まれることが判明した。
【００２１】
好ましい実施形態では、カテキンは緑茶に由来する。代替として他のカテキン源、例えば、野生植物の果実、特にベリー（クランベリー、ブラックベリー、ブルーベリー、エルダーベリー、ナナカマドの実、チョークベリー、マルメロなど）、ココア、豆又は果実を使用してもよい。
【００２２】
緑茶（又は、他の植物源）は、生の、濃縮した、又は乾燥した材料、例えば、風乾若しくは凍結乾燥材料の形態で使用してもよい。組成物中のカテキンの量は、上記製剤の用途に左右されよう。好ましい実施形態では、カテキンは、特に緑茶抽出物の形態では１〜５０％の間の含有量でもよく、最も好ましくは５〜３０％でもよい。
【００２３】
ＯＰＣは、ブドウ源であることが好ましい。好ましい実施形態では、例えば、ＯＰＣは松の樹皮又はブドウの種子から入手できる。ＯＰＣ源として知られているものばかりでなく、代替としてココア及び野イチゴ抽出物もＯＰＣ源として使用することもできる。
【００２４】
プロシアニジンオリゴマー及びアスコルビン酸は、カテキンに、カテキンのバイオアベイラビリティを少なくとも改善し、及び／又はカテキンを投与することによって治療又は防止できる障害の症状を軽減若しくは阻止するのに十分な量で加えられる。このことを実現するのに適合した量を、「治療有効量」として定義する。この目的に有効な量は、患者の疾患の重症度、並びに／又は体重及び全般的な状態など、当業者に周知のいくつかの要因に左右されよう。予防的な適用では、本発明による組成物は、特定の障害に罹りやすい、或いはその危険性のある患者に投与される。この特定の障害は、疾患を発症する危険性を少なくとも部分的に軽減するのに十分な量のヘスペレチンを投与することによって治療又は防止できるものである。このような量は、「予防有効量」と定義される。さらに、正確な量は、患者の健康状態や体重などの患者特有のいくつかの要因に依存する。
【００２５】
好ましい実施形態では、組成物は、ブドウ種子抽出物中で６０〜９９％に変動し得るＯＰＣ含有量に依存して、１〜８０％、好ましくは１０〜４０％のブドウ種子抽出物を含有する。アスコルビン酸又はビタミンＣ類似体は、（緑茶抽出物に対して）０．１〜１５％、最も好ましくは１〜６％の量で存在してもよい。
【００２６】
別の様態によると、本発明は、食材、食品サプリメント、ペットフード製品、化粧用調製物、又は医薬用調製物における、上記の製剤を含む口腔組成物に関する。
【００２７】
好ましい実施形態では、上記組成物は、人が摂取する食品組成物を補完する。この食品組成物は、完全栄養調合乳、酪農製品、冷蔵若しくは常温保存可能飲料、粉末飲料、ミネラルウォータ若しくは精製水、液体ドリンク、スープ、健康補助食品、食事代替品、栄養バー、菓子、乳製品若しくは発酵乳製品、ヨーグルト、ミルクベース粉末、経腸栄養剤、幼児用調合乳、幼児用栄養製品、シリアル製品若しくはシリアル系発酵製品、アイスクリーム、チョコレート、コーヒー、マヨネーズ、トマトピューレ、若しくはサラダドレッシングなどの料理用製品、又はペットフードであってもよい。
【００２８】
摂取については、口腔用組成物、特に食品サプリメントの多くの実施形態が可能である。こうしたものは、糖衣錠、丸薬、ペースト、ガム、ゼラチンカプセル、ゲル、乳剤、錠剤、カプセル、又は飲用に適した液剤若しくは乳剤を製造する通常の方法により配合され、次いで、これらは、水、又は他の任意の周知の手段で直接摂取できる。
【００２９】
上記の製剤は、食品サプリメント若しくは栄養強化食品の他の任意の形態、例えばフードバー、又は圧縮若しくは非圧縮粉末に組み込んでもよい。これらを調製する方法は、常識である。
【００３０】
食品組成物又は食品サプリメントは、甘味料、安定剤、酸化防止剤、添加剤、香味料、又は着色剤を含んでもよい。この組成物は、アミノ酸、脂肪酸、ビタミン、ミネラル、カロテノイド、ポリフェノールなどの合成又は天然生物活性成分を含んでもよく、こうした成分は、低温殺菌及び／又は乾燥の前に、乾式混合又は湿式混合のいずれかによって前記組成物に加えることができる。
【００３１】
ある実施形態によると、本発明の組成物を化粧用に使うこともできる。「化粧用途」とは、人間又はペットの皮膚、毛、及び／又は髪の美的側面又は快適さを改善し得る非治療的な使用を意味する。
【００３２】
化粧用に使用する場合、本発明の食品組成物又は食品サプリメントは、上述の食品組成物又は食品サプリメントのいかなる形態をとってもよい。それは、健康補助食品の形態であることが好ましく、液剤、噴霧液、錠剤、カプセル、ゼラチンカプセル、トローチ、粉末、ゲル、乳剤などの液体又は乾燥形態でもよい。それは、カプセルの形態であることがさらに好ましい。化粧用サプリメントは、皮膚に関して活性な化合物をさらに含むことができる。
【００３３】
有益な効果を得るために個人が摂取する製剤、又は食品組成物若しくは食品サプリメントの量も、個人の大きさ、タイプ、及び年齢に左右されよう。
【００３４】
別の実施形態では、医薬組成物を予防及び／又は治療処置のために投与できる。治療用途では、疾患及び合併症の症状を治癒、又は少なくとも部分的に阻止するのに十分な量の組成物を、以下で説明するような疾患を既に患っている患者に投与する。このことを実現するのに適合した量を、「治療有効量」として定義する。このために有効な量は、患者の疾患の重症度と、体重及び全般的な状態に左右されよう。予防的な適用では、本発明による組成物を、特定の疾患に罹りやすい、或いはその危険性がある患者に投与する。このような量は、「予防有効量」と定義される。予防的使用では、正確な量は、患者の健康状態及び体重にやはり依存する。
【００３５】
本発明の化合物は、医薬として許容できる担体と共に投与することが好ましく、担体の性質は、投与方式、例えば、経腸、経口又は局所（眼を含む）ルートにより異なる。所望の製剤は、例えば、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、でんぷん、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムを含む様々な賦形剤を使用して作ることができる。この組成物は、錠剤、カプセル、丸薬、液剤、懸濁液、シロップ、乾燥経口サプリメント、湿潤経口サプリメントであってもよい。
【００３６】
当業者であれば、対象とする組織、例えば、皮膚、結腸、胃、眼、腎臓又は肝臓を活性な化合物の標的とするために、投与経路を考慮に入れて、自身の知識に基づき、適切な構成要素及び生薬形態を選択することは理解されよう。
【００３７】
本発明は、上記製剤の局所的化粧用途にも関する。この製剤を、例えば、ローション、シャンプー、クリーム、日焼け防止、日焼け用クリーム、アンチエイジングクリーム、及び／又は軟膏に製剤化してもよい。局所的に使用可能なこの組成物は、例えばＣＴＦＡ作のＣｏｓｍｅｔｉｃ  ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎに記載されているものなどの、化粧品に使用できる脂肪又は油をさらに含む。化粧的に活性な他の成分を添加することもできる。組成物は、構造化剤及び乳化剤をさらに含む。他の賦形剤、着色剤、香料、又は乳白剤を組成物に加えることもできる。本化粧用製品が、当業者が周知の様々な成分の混合物を含んで、上記物質が早く皮膚へ浸透することを確実にし、保存中のその分解を防止することは理解されよう。
【００３８】
本発明のコンセプトが、現在使われている医薬品を補助する補助療法としても同様に適用し得ることは理解されよう。本発明の化合物は、食品材料とともに容易に投与できるので、多量の前記物質を含有する特別な臨床用食品を適用し得る。添付してある特許請求の範囲とともに本明細書を読むと、当業者が、本明細書に述べた具体的な実施形態に対し、様々の異なった代替形態を想像することは明らかであろう。
【００３９】
本発明の製品は、カテキンの有効性を増大させるために使用してもよい。カテキンは、例えば、皮膚健康を改善し、循環器疾患、２型糖尿病、認識機能、又は炎症の防止又は治療にプラス効果を有することが知られている。カテキンは、体重の管理低減にも使うことができる。したがって、本発明の口腔用組成物は、皮膚健康の改善、特に皮膚の光防護、又は老化に対する皮膚組織の保護のために使用できる。例えば、皮膚の老化を遅らせるのにも使用できる。口腔用組成物は、敏感な、乾燥した、若しくは反応性の皮膚の防止又は治療に、又は皮膚の密度若しくは張りの改善にも有用となり得る。
【００４０】
人間又はペットの皮膚に対する本発明による組成物の効果は、最小紅班線量（ＭＥＤ）、測色、経表皮水分喪失量、ＤＮＡ修復、インターロイキン及びプロテオグリカン産生の測定量、又はコラーゲナーゼ活性、バリア機能、若しくは細胞再生を含む従来の方法を使用して測定することができる。
【００４１】
本発明を、以下で説明する非限定の実施例を用いてさらに例示する。
【実施例】
【００４２】
実施例１：緑茶カテキンの安定性試験
材料及び方法
市販の緑茶抽出物（即席緑茶ＴＣＴＧ）をＣｈｏｌａｄｉ工場（Ｃｈｅｒａｍｂａｄｉ、Ｉｎｄｉａ）から入手した。抽出物を９０℃で緑葉から水抽出し、その後噴霧乾燥することによって調製した。２つのバッチを使用した。バッチのカテキンのプロファイルを表Ｉに報告する。
【００４３】
【表１】
2012528125.tif 000002
【００４４】
様々な品質のブドウ種子ＯＰＣ（プロシアニジンオリゴマー）を、Ｇｒａｖｉｎｏｌ製品シリーズに関してはＩｎｄｅｎａ（Ｍｉｌａｎ、Ｉｔａｒｙ）、キッコーマン（Ｎｏｄａ−Ｃｉｔｙ、Ｊａｐａｎ）から、及びＶｉｔａｆｌａｖａｎ  ５０に関してはＤＲＴ（Ｄａｘ、Ｆｒａｎｃｅ）から受領した。松樹皮ＯＰＣ（Ｏｌｉｇｏｐｉｎ）は、ＤＲＴ（Ｄａｘ、Ｆｒａｎｃｅ）から贈られた。
【００４５】
フラネオール（４−ヒドロキシ−２，５−ジメチル−３（２Ｈ）−フラノン）、ホモフラネオール、フラネオールメチルエーテル、及びノルフラネオールをＧｉｖａｕｄａｎ（ＤｕｂＥｎｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から購入した。ビタミンＣ、マルトール、システイン、及びメタ亜硫酸水素塩は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｂｕｃｈｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）からのものであった。
【００４６】
ステアロイル乳酸ナトリウム（ＳＳＬ）及びジアセチル酒石酸モノグリセリドエステル（Ｄａｔｅｍ）は、Ｄａｎｉｓｃｏ（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）からのものであった。
【００４７】
リン酸二水素ナトリウム一水和物、及びリン酸水素二ナトリウム二水和物は、Ｍｅｒｃｋ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）からのものである。
【００４８】
ＨＰＬＣ較正に使用したカテキン標準は、Ｅｘｔｒａｓｙｎｔｈｅｓｅ（Ｇｅｎａｙ、Ｆｒａｎｃｅ）から入手した。
【００４９】
次の方法に従ってサンプルを調製した。要約すると、各サンプルを酢酸（３０％最終濃度）で３０分間処理後、１０％アセトニトリル、０．５ｍｇ／ｍＬ  ＥＤＴＡ、及び０．５  ｍｇ／ｍＬアスコルビン酸を含有する水溶液に加えた。混合物を１４０００×ｇで３０分間遠心分離機にかけて、上澄みをＨＰＬＣで分析した。このプロトコルに従うと、すべてのカテキンを完全に回収することが可能になる。
【００５０】
緑茶カテキンは、ＩＳＯ  ＦＤＩＳ  １４５０２−２法に基づく分析方法を用いて、逆相ＨＰＬＣで決定した。ＨＰＬＣシステムは、紫外線可視フォトダイオードアレイ及び蛍光検出器を装備した１１００シリーズ  Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ（Ｇｅｎｅｖａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用した。蛍光発光（励起：２８０ｎｍ；発光：３１０ｎｍ）によって検出されたカテキン及びエピカテキンを除き、２８０．４ｎｍにおけるＵＶ吸収によってカテキンを検出された。サンプル（１０μｌ）をＺｏｒｂａｘ  ＲＸ−Ｃ１８カラム（４．６ｍｍ内径×２５０ｍｍ長さ、Ａｇｉｌｅｎｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で分離した。室温で表ＩＩに報告された勾配を使用して分離した。流量は１．０ｍＬ／ｍｉｎであった。
【００５１】
【表２】
2012528125.tif 000003
【００５２】
緑茶カテキン（Ｃ、ＥＣ、ＥｇＣ、ＥｇＣｇ、ＥＣｇ）のサンプル濃度を対応する較正曲線を基準にして算出し、初期値（時間０のサンプル）の％として報告した。緑茶サンプルに内在するカフェインは、選択したアッセイ条件の下では安定であるので、そのカフェインをすべての計算で内部標準として使用した。したがって、生の緑茶抽出物中に見出されたカフェイン濃度を、データの正規化に使用した。
【００５３】
緑茶及び酸化防止剤又は対応する製剤は、ｐＨ７．４（Ｎａ−Ｐｉ、１００ｍＭ）のバッファー中に分散させ、標準化された条件（開口容器内、３７℃で一定の撹拌）の下で２４時間までアッセイした。確定した時間間隔で、個々の一定分量を回収し、ＨＰＬＣ注入用サンプルを上述のように調製した。
【００５４】
結果
ビタミンＣによる緑茶カテキンの安定化
ビタミンＣは、強力な酸化防止剤であり、緑茶に加えるとカテキンの分解を防止することが知られている。カテキンの保護を達成するために必要なビタミンＣの最低濃度の見解を得るために、ビタミンＣの増加していく量を含有する緑茶抽出物を２４時間までインキュベートした。この試験の目的は、生理的条件下でカテキンの保護を最大にすることなので、腸内に見出し得ると思われる条件、すなわち、３７℃でｐＨ７．４と同等になるようにインキュベーションパラメータを選択した。
【００５５】
【表３】
2012528125.tif 000004
【００５６】
以前の調査から既に知られているように、ＥｇＣ及びＥｇＣｇは、最も不安定なカテキンであり、ＥｇＣ及びＥｇＣｇは、非保護の緑茶抽出物中で２ｈインキュベーション後には既に大部分が分解した（表ＩＩＩ）。他の実験結果では、濃度０．２ｍＭのアスコルビン酸は、少なくとも２ｈのインキュベーションで既に一定の保護を発揮することを示していたが、選択した濃度では、ビタミンＣの有意な効果が、濃度０．５ｍＭでのみに見られた（データ表示せず）。２ｈにおける最大保護は、１ｍＭ以上のビタミンＣ濃度で得られるが、６ｈにわたる安定化では、２．５ｍＭでのみプラトーに達している。他のカテキンは、選択した条件ではより安定しており、６ｈ後も、ビタミンＣなしのサンプル中に、その一部をなお検出できた。
【００５７】
アッセイサンプルにアスコルビン酸を加えると、安定性が、用量依存的に有意に改善した。興味深いことに、ビタミンＣで安定化した緑茶（＞１ｍＭ）において、カテキン（Ｃ）の量がインキュベーション中に着実に増加して、２４ｈ後に初期値の１７５％に達した。Ｃのこの時間依存的発生は、詳細に調査しなかったが、カテキンには、エピマー化し易いものもあることはよく知られている。別のカテキン種のＣへの連続的エピマー化、及びアスコルビン酸濃度の増大によるＣの分解の遅延は、経時的なＣの増加に対する１つの説明になり得よう。
【００５８】
ビタミンＣは、カテキン保護用の効率的な酸化防止剤であることが判明した。腸内吸収は、２〜３ｈ後に完了すると仮定すると、濃度＞０．２ｍＭは、既に最大保護に達するのに十分である。
【００５９】
プロシアニジンオリゴマー（ＯＰＣ）＋ビタミンＣによる緑茶カテキンの安定性に対する効果
ＯＰＣが豊富な抽出物は、カテキンのオリゴマー又はポリマー含有量、及びこれらの化合物に起因する酸化防止活性によって特徴づけられる。しかしながら、原料及び抽出用工程に依存して相当量のモノマーが、これら調製物中にまだ存在する。実際に、ＯＰＣが豊富な抽出物は、緑茶抽出物中にも存在する２つのカテキン種、つまりカテキン及びエピカテキンを少なくとも含有することが知られている。緑茶にこれら抽出物を加えると、混合物のカテキンのプロファイルが有意に変化すると思われるので、カテキンモノマーのプロファイルに関する選択されたＯＰＣ抽出物の特性決定を実施した。
【００６０】
分析結果から、Ｃ及びＥＣが、ＯＰＣ調製物中に見出される支配的なカテキン種であり、量は、全サンプル量の１％〜２０％（ｗ／ｗ）の間で変化していることが確認された（表ＩＶ）。ＥｇＣは抽出物中に存在しなかった。さらに、ＥｇＣｇが、Ｉｎｄｅｎａブドウ種子ＯＰＣ、及びＯｌｉｇｏｐｉｎ松樹皮ＯＰＣ中で少量見出された。ＥＣｇが、これら両抽出物中、及びＶｉｔａｆｌａｖａｎのサンプル中で観察された。これら３つのサンプルはすべて、カテキンモノマーが特に豊富であった。
【００６１】
【表４】
2012528125.tif 000005
【００６２】
次いで、緑茶カテキンの安定性に対する効果を種々のＯＰＣ／ビタミンＣ混合物について測定した。ビタミンＣのみの保護と比較すると、ＯＰＣ抽出物との組合せのほとんどが、２及び５ｈ後に、ＥｇＣ及びＥｇＣｇの良好な保持率を示すことが（表Ｖ）に示された。
【００６３】
さらなる最適化試験のために、ＩｎｄｅｎａのＯＰＣ調製物を保持した。
【００６４】
【表５】
2012528125.tif 000006
【００６５】
カテキン安定性に対するＯＰＣ＋ビタミンＣの用量応答
ビタミンＣ対ＯＰＣの比率をカテキン保護目的で最適化するために、ビタミンＣの異なる３つの濃度（０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、及び０．３ｍＭ）を含有する緑茶を、５ｈまでの間、ＯＰＣの増加していく量と共にインキュベートした。強い不安定性のために、ＥｇＣｇをマーカー化合物として選択して、保護効率を評価した。これまでに観察したように、インキュベート済みサンプルにＯＰＣを加えると、ビタミンのみを有する対照と比較したＥｇＣｇの安定性は有意に増大した（図１）。ＯＰＣの保護効果は、明らかに用量依存的であり、ビタミンＣの初期濃度の増大とともに上昇した。この増大は、しかし直線的ではなかった。５倍高いＯＰＣ用量は、５倍高い保護とならなかった。ＯＰＣ添加の効果は、ビタミンＣの最低濃度でより顕著であったが、この場合の全体的保護はより低く、約５０％のＥｇＣｇ保持率に過ぎない結果となった。
【００６６】
ブドウ種子カテキンがカテキンプロファイル全体に与える影響を可能な限り低減するために、０．０２５％〜０．１％の間の範囲のＯＰＣを０．２ｍＭビタミンＣと一緒に加えて安定性テストを実施した。５ｈのインキュベーション後に、緑茶中のＥｇＣｇ保護は、用量依存的であることを示し、０．１％ＯＰＣにおいて最大４０％に達した（図２）。観察した増大は、直線的ではなく、特に、０．０５％濃度のＯＰＣにおいて、ＥｇＣｇ保護は、０．１％ＯＰＣで観察した保護の７５％に既に相当していた。最終的に、０．２ｍＭビタミンＣと０．０５％ＯＰＣを組み合わせたこの製剤を、カテキン保護全体とＯＰＣ含有量低減との間の良好な妥協策として選択した。カテキンのバイオアベイラビリティを改善するビタミンＣ／ＯＰＣの効果を評価するために、この製剤を臨床試験でテストした。
【００６７】
実施例２：バイオアベイラビリティの試験
材料及び方法
対象
ＮＲＣで採用した２２〜４６歳の範囲の１２人の男性を、試験に参加させた。志願者たちは、医学的な質問に答え、医者の診察を受けた後に、健康であるとの宣言を受けた。医薬品、ビタミン・ミネラルのサプリメントは、試験期間中は、許可されなかった。対象全員が、非喫煙者であった。菜食主義者、完全菜食主義者、及び週に３カップを超える茶（ハーブ茶を含む全タイプ）を規則的に摂取する者、又はチョコレートを含有する製品を含めて、チョコレートを週に２００ｇ摂取する者は、試験から除外された。対象は、試験の目的を十分に知らされ、書面の同意書が与えられた。試験のプロトコルは、ローザンヌのＣＨＵＶの倫理委員会によって承認されていた。
【００６８】
試験の設計
試験の概略図を図３に示す。この試験は、二重盲検クロスオーバー設計であった。テストされた製品は、緑茶抽出物、ＴＣＴＧ（ＣＷＳ．０８）、Ｃｈｏｌａｄｉ（Ｎｅｓｔｌｅ、Ｉｎｄｉａ）で生産され、Ｇｉｖａｕｄａｎによって供給された緑茶葉の水性抽出物であった。この緑茶抽出物を試験の中で４つの異なる処置に使用した。
【００６９】
４つの処置は、
緑茶抽出物（ＧＴ）粉末（１人当たり１ｇ）
ブドウ種子抽出物、及びビタミンＣを有する緑茶抽出物粉末（ＧＴＣＶ）（緑茶抽出物１ｇ、ブドウ種子抽出物０．５ｇ、及びビタミンＣ  ０．０３５ｇを含有する１人当たり製剤１．５３５ｇ）
ここではさらに記載していない他の２つの製剤を有する緑茶抽出物粉末
である。
【００７０】
４つの試験された製品は、製品コードＡ、Ｂ、Ｃ及びＤとラベル表示された。４つの異なる処置剤は、ゼラチンのカプセルに封入して、朝食後２ｈにミネラルの少ない水３００ｍｌで経口投与した。処置剤１つ当たり１ｇの緑茶抽出物が対象に与えられた。抽出物中のカテキン組成を表６に示す。
【００７１】
【表６】
2012528125.tif 000007
【００７２】
１つの処置剤を受け取る２日前に、対象は、アルコール、フラボノイド豊富食品及びドリンク、茶製品、ハーブ茶、チョコレート製品、コーヒー製品、ブドウジュース、並びに１日当たり２５０ｍｌ超のその他の果実ジュースを摂取しないよう依頼された。対象の食事は、実験の前１日、及び実験の当日は標準化された。その日対象はメタボリックユニットに空腹で来て、メタボリックユニットで、カテキンなしの軽い朝食を取った。カテーテルを右腕又は左腕に取り付けて、下記の間隔で８時間にわたり採血が繰り返しできるようにした。朝食後の２時間に、対象は、無作為に４つの処置剤Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤの１つを受け入れた。血液サンプルを、処置剤吸収から０、３０、６０、９０、１２０、１８０、２４０、３６０、及び４８０分後に採取した。カテーテルによる障害の防止のために、２５０ｍｌの生理学的血清（ＮａＣｌ  ０．９％）をカテーテルを介して６時間注入した。血液をサンプリングする前に、２ｍｌの液体をカテーテルから除去し、ＮａＣｌによる血液サンプルの汚染を回避した。対象は、メタボリックユニットで昼食をとった。夕食には標準化された食事が出される。翌日朝、空腹時の血液サンプルを採取して、薬物動態を完了した。
【００７３】
サンプルの処理及び分析
血漿を得るために採血後直ちに、各血液サンプルを３５００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離機にかけた。このチューブから得た血漿をＥＤＴＡ、及びビタミンＣと混合させた。次いで、サンプルを分析まで−８０℃で凍結した。分析は、次のプロトコルに従って外部の研究所（Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＬＬＣ、Ｎｏｒｔｏｎ、ＭＡ、米国）で実施した。要約すれば、解凍した血漿をＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ５４１７Ｒの中で遠心分離機にかけた（１４０００ｒｐｍ、５分、４℃）。２００μｌの血漿を、次いで、１２μｌの１０％アスコルビン酸−４０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４−０．１％ＥＤＴＡ、２０μｌの５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．４）、内部標準として２０μｌの１．０μｇ／ｍｌカテキンガラート（ＣＧ）、大腸菌由来の５００ユニットのＸ−Ａ型β−ｄ−グルクロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）、及びアワビ由来の４ユニットの８型スルファターゼ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ）と混合した。混合物を３７℃で４５分間インキュベートした。２ｍｌの酢酸エチルを加えた後に、２０分間激しく振盪し、４℃、２０００×ｇで５分間遠心分離機にかけることで反応を停止した。上澄みをきれいなチューブに移して酢酸エチル抽出を繰り返した。１０μｌの０．０２％アスコルビン酸：０．００５％ＥＤＴＡをプールした上澄み分画に加えて、混合させるためによくボルテックスした。上澄みを窒素と共に室温で２時間蒸発させ乾燥させた。サンプルを２００μｌのメタノール：水（１：２、ｖｏｌ）中で再溶解し、よくボルテックスし、１０分間超音波で処理し、遠心分離機にかけた（１４０００ｒｐｍ、５分、４℃）。２０μｌの上澄みをＨＰＬＣシステムに注入した。ＨＰＬＣ−電気化学検出（ＥＣＤ）システムは、ＥＳＡ  Ｍｏｄｅｌ  ５８２溶液分注システム、ＥＳＡ  Ｍｏｄｅｌ  ５４２自動サンプラ、ＣｏｕｌＡｒｒａｙＷｉｎソフトウェア１．１２を組み込んだＥＳＡ  ５６００  ＣｏｕｌＡｒｒｒａｙ電気化学検出器（ＥＳＡ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ、米国）、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＣＨ−３０カラムヒータ、Ｃ１８  Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘガードカラム、  ４．０ｍｍＬ×３．０ｍｍ、及びＳＵＰＥＬＣＯ  Ａｓｃｅｎｔｉｓ  ＲＰ−Ａｍｉｄｅカラム１５ｃｍ×４．６ｍｍ内径、５μｍ粒子から構成されていた。標準フラバノール溶液、及び内部標準（カテキンガラート）をメタノール及び水（１：２、ｖｏｌ）溶液中で調製し、−７０℃で保存した。カラムを、流量１ｍＬ／分、７０％バッファーＡ（４０ｍＭリン酸一アンモニウム、ｐＨをリン酸で３．０に調整する）及び３０％バッファーＢ（４０ｍＭリン酸一アンモニウム５０％／Ｌ：５０％アセトニトリル／Ｌ、ｐＨをリン酸で３．０に調整する）で開始し、３５℃で溶出させた。１分後、勾配を直線的に７０％バッファーＡ及び３０％バッファーＢから１０％バッファーＡ及び９０％バッファーＢ（１〜１０分）、７０％Ａ／３０％Ｂ（１０〜１２分）に変化させた。溶離液を、−３０、１００、２３０、４００ｍＶに電位を設定してＨＰＬＣ−電気化学検出でモニターした。主要なチャネルは２３０ｍＶであった。
【００７４】
結果：
エピガロカテキン−３ガラートの血漿バイオアベイラビリティ
エピガロカテキン−３ガラート（ＥＧＣＧ）に関しては、定量化の限界は、０．００５μｇ／ｍＬであった。異なる処置剤に由来するエピガロカテキン−３ガラートの動態パラメータを、表７に示す。
【００７５】
【表７】
2012528125.tif 000008
【００７６】
ブドウ種子抽出物及びビタミンＣを緑茶抽出物に加えると、ＥＧＣｇのＡＵＣ及びＣｍａｘをそれぞれ２７．５及び２０．５％だけ増加させた。Ｔｍａｘは、混合物によって影響されなかった。
【００７７】
ＡＵＣ（２２ｈ−ｉｎｆ．）が、３０％ＡＵＣ（０ｈ−ｉｎｆ）より小さい場合は、ＡＵＣ（０ｈ−ｉｎｆ）及びＴ１／２を考慮に入れることができる。異なる処置剤に由来するエピガロカテキン−３ガラートのＡＵＣ（０ｈ−ｉｎｆ．）及びＴ１／２を表８に示す。
【００７８】
【表８】
2012528125.tif 000009
【００７９】
緑茶にブドウ種子抽出物及びビタミンＣを混合させたときに、緑茶抽出物（ＧＴ）のみを摂取したときと比較すると、エピガロカテキン−３ガラートの外挿された動態曲線の平均ＡＵＣは、２６％だけ増加する。Ｔ１／２も２１％だけ増加した。
【００８０】
エピカテキン−３−ガラートの血漿バイオアベイラビリティ
エピカテキン−３−ガラートに関しては、定量化の限界は、０．００５μｇ／ｍＬであった。異なる処置剤に由来するエピカテキン−３−ガラートの動態パラメータを、表９に示す。
【００８１】
【表９】
2012528125.tif 000010
【００８２】
ブドウ種子抽出物及びビタミンＣを緑茶抽出物とともに同時摂取すると、ＥＣｇのＡＵＣ、Ｃｍａｘ、及びＴｍａｘは、それぞれ４２．５、２６、及び４７％だけ増加した。ＡＵＣ（２２ｈ−ｉｎｆ．）が、３０％ＡＵＣ（０ｈ−ｉｎｆ）より小さい場合は、ＡＵＣ（０ｈ−ｉｎｆ）及びＴ１／２を考慮に入れてもよい。対象の大部分は、ＡＵＣ（２２ｈ−ｉｎｆ．）＞３０％ＡＵＣ（０ｈ−ｉｎｆ．）である。したがって外挿は実施できない。
【００８３】
エピガロカテキンの血漿バイオアベイラビリティ
エピガロカテキンに関しては、定量化の限界は、０．００５μｇ／ｍＬであった。
異なる処置剤に由来するエピガロカテキンの動態パラメータを、表１０に示す。
【００８４】
【表１０】
2012528125.tif 000011
【００８５】
ブドウ種子抽出物及びビタミンＣを緑茶抽出物とともに同時摂取すると、ＥＧＣのＡＵＣ、及びＣｍａｘは、それぞれ３．９、及び１８．５％だけ増加した。Ｔｍａｘは、混合物によって影響されなかった。
【００８６】
ＡＵＣ（２２ｈ−ｉｎｆ．）が、３０％ＡＵＣ（０ｈ−ｉｎｆ）より小さい場合は、ＡＵＣ（０ｈ−ｉｎｆ）及びＴ１／２を考慮に入れてもよい。異なる処置剤に由来するエピガロカテキンのＡＵＣ（０ｈ−ｉｎｆ）及びＴ１／２を表１１に示す。
【００８７】
【表１１】
2012528125.tif 000012
【００８８】
ＡＵＣを外挿したときに動態パラメータは増加しない。
【００８９】
エピカテキン及びカテキンの血漿バイオアベイラビリティ
ブドウ種子抽出物がカテキン及びエピカテキン全体の２４．３％を含有していたので、エピカテキンとカテキンを比較することはできなかった。
【００９０】
結論：
緑茶抽出物の主となるカテキン（ＥＧＣｇ）のバイオアベイラビリティは、ビタミンＣ及びブドウ種子抽出物の混合物と同時摂取すると、増大することが示された。ＥＣｇについても同じ観察がなされた。
【図１】
2012528125.tif 000013
【図２】
2012528125.tif 000014
【図３】
2012528125.tif 000015
【図４】
2012528125.tif 000016
【国際調査報告】
2012528125.tif 000017
2012528125.tif 000018
2012528125.tif 000019