【手続補正書】
【提出日】平成21年1月21日(2009.1.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９４】
代表的に、リンカーは、ＰＣＲクローニングによって導入される。例えば、５アミノ酸のリンカー（Ｇ４Ｓ、配列番号１３６）をコードする合成オリゴヌクレオチドが、ＢｏＮＴ／Ａ−中和抗体ＶＨ遺伝子およびＢｏＮＴ／Ａ−中和抗体ＶＬ遺伝子をＰＣＲ増幅するために使用され得、次いでこれらの遺伝子は、ＢｏＮＴ／Ａ−中和ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）遺伝子を作製するために一緒にスプライシングされる。次いでこれらの遺伝子は、適切なベクター中にクローニングされ、発現され、そして当業者に周知の標準的な方法によって精製される。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８２】
（Ｂ．ベクターの構築）
ベクターｐＳＹＮ３を構築するために、１．５ｋｂのスタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）フラグメントを、プライマーＬＭＢ３（Ｍａｒｋｓら、（１９９１）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：９８５−９９１）、およびＥ−タグバック（ｔａｇｂａｃｋ）（５’−ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＴＴＡ  ＴＴＡ  ＡＴＧ  ＧＴＧ  ＡＴＧ  ＡＴＧ  ＧＴＧ  ＧＡＴ  ＧＡＣ  ＣＡＧ  ＣＣＧ  ＧＴＴ  ＣＣＡ  ＧＣＧ  Ｇ−３’、（配列番号１３７））を用いたＰＣＲを使用して、ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ．）から増幅した。上記ＤＮＡフラグメントを、ＳｆｉＩおよびＮｏｔｆを用いて設計し、ゲル濾過し、そしてＳｆｉＩおよびＮｏｔＩに
よって消化したｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅにライゲーションした。ライゲーションしたＤＮＡを、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＴＧｌ（Ｇｉｂｓｏｎ、（１９９１）Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｏｍｅ．Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｕ．Ｋ．）を形質転換するために使用し、そして正しい挿入物を含むクローンを、ＤＮＡ配列決定することによって同定した。得られたベクターは、ファージに提示されたｓｃＦｖを、Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズムにＣ末端Ｅエピトープタグ（その後にヘキサヒスチジンタグを伴う）を有するネイティブなｓｃＦｖとして分泌させるためのＳｆｉＩ−ＮｏｔＩフラグメントまたはＭｃｏｌ−ＮｏｔＩフラグメントとしてサブクローニングすることを可能にする。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【０３２９】
【図１】図１は、ファージライブラリーを使用したインビトロ抗体産生のためのストラテジーを示す。ｍＲＮＡは、脾臓細胞から調製され、第１のｃＤＮＡ鎖が、調製され、そして抗体ＶＨ遺伝子および抗体ＶＬ遺伝子は、ＰＣＲによって増幅される。ＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子は、ｓｃＦｖ遺伝子のレパートリーを作製するためにＰＣＲを使用して１つにランダムにスプライシングされる。上記ｓｃＦｖ遺伝子レパートリーは、ファージミドベクター中にファージミドマイナーコートタンパク質（ｐＩＩＩ）をコードする遺伝子（ｇＩＩＩ）と一緒にインフレームでクローニングされる。得られたファージ抗体ライブラリー中の各ファージは、その表面上にｓｃＦｖ−ｐＩＩＩ融合タンパク質を発現し、そしてｓｃＦｖをコードする遺伝子を内部に含む。特異的抗原を結合するファージ抗体は、固定化された抗原に対するアフィニティークロマトグラフィーによって結合しないファージ抗体から分離され得る。単一のラウンドの選択は、その抗体の親和性に依存して、２０〜１０，０００の範囲の因数によって抗原結合ファージ抗体の数を増加させる。溶出したファージ抗体は、Ｅ．ｃｏｌｉに感染させる為に使用され、そのＥ．ｃｏｌｉは、次いで、次のラウンドの選択のためのさらなるファージ抗体を産生する。ラウンドを繰り返した選択は、本来１０億分の１未満の頻度で存在した抗原結合ファージ抗体の単離を可能にする。
【図２】図２のパネルＡおよびパネルＢは、ＢｏＮＴ／Ａ  ＨＣに結合するｓｃＦｖをエピトープマッピングするために使用される技術を例示するセンサーグラムを示す。エピトープマッピングは、対において研究されるｓｃＦｖを用いて、ＢＩＡｃｏｒｅにおける表面プラズモン共鳴を使用することによって行なわれた。各ｓｃＦｖは、上記ＢＩＡｃｏｒｅに注入され、そして飽和が達成されるまで、センサーチップ表面にカップリングされたＢｏＮＴ／Ａ  ＨＣに結合し得る。各ｓｃＦｖ単独についての結合された量（ＲＵ）は、上記２種のｓｃＦｖが、混合され、そして一緒に注入された場合に結合された量と比較された。点ａは、その後に注入の始まりが続くベースラインを示す。点ｂ１および点ｂ２は、最初の会合相を示す。点ｃ１および点ｃ２は、解離の始まりを示す。点ａと点ｃとの間のＲＵの差は、ＢｏＮＴ／Ａ  ＨＣに結合されたｓｃＦｖの量に等しい。パネルＡは、異なるエピトープを認識する２種のｓｃＦｖ（Ｃ２５およびＣ９）を示す。一緒に注入された２種のｓｃＦｖの結合された量（Ｃ９／Ｃ２５、点ｃ２）は、単独で注入されたその２種のｓｃＦｖ（ｃ１）の合計である。パネルＢは、エピトープを認識する２種のｓｃＦｖ  （Ｃ３９およびＣ２５）を示す。一緒に注入された２種のｓｃＦｖの結合された量（Ｃ２５／Ｃ３９；点ｃ）は、単独で注入されたその２種のｓｃＦｖ（ｃ）と同じである。点ｂ１と点ｃ１との間、点ｂ２と点ｃ２との間、および点ｂ１と点ｃとの間のＲＵの大きな差は、ｓｃＦｖと泳動緩衝液との間の屈折率の差に起因する。
【図３】図３は、マウス片側横隔膜モデルにおけるＢｏＮＴ／ＡのｓｃＦｖ中和の評価を示す。マウス片側横隔膜の電気刺激後に発生した単収縮張力は、２０のｐＭ  ＢｏＮＴ／Ａ（コントロール）、２０ｐＭのＢｏＮＴ／Ａ＋２０ｎＭのｓｃＦｖ  Ｓ２５、ｓｃＦｖ  Ｃ２５、ｓｃＦｖ  １Ｃ６、もしくはｓｃＦｖ  １Ｆ３（それぞれ、エピトープ１〜４を代表する）、または各２０ｎＭの最終濃度におけるＳ２５とＣ２５との組み合わせの添加前（−３０分〜０分）、および添加後に測定された。結果は、定常状態における単収縮張力（０分における）対時間の分数として表される。ｓｃＦｖ  １Ｃ６およびｓｃＦｖ  １Ｆ３が、５０％の単収縮減少までの時間を変化させないのに対して、ｓｃＦｖ  Ｃ２５およびｓｃＦｖ  Ｓ２５は、それを顕著に延長する。Ｓ２５とＣ２５との組み合わせは、Ｃ２５単独またはＳ２５単独と比較して、神経麻痺までの時間を顕著に延長した。
【図４】図４は、ｍＡｂによるインビトロ毒素中和、ｍＡｂの対によるインビトロ毒素中和、およびオリゴクローナルＡｂによるインビトロ毒素中和を示す。５０％の単収縮減少までの時間は、単離されたマウス片側横隔膜において測定され、そして毒素のみのコントロール、単一のｍＡｂ（Ｃ２５、Ｓ２５、または３Ｄ１２）、ｍＡｂの対（Ｃ２５＋Ｓ２５、Ｃ２５＋３Ｄ１２、または３Ｄ１２＋Ｓ２５）、およびオリゴクローナルＡｂ（Ｃ２５＋３Ｄ１２＋Ｓ２５）について繰り返された。単一のｍＡｂは、毒素のみと比較して、神経麻痺までの時間を顕著に延長した。ｍＡｂの対は、単一のｍＡｂと比較して、神経麻痺までの時間を顕著に延長した。
【図５】図５Ａおよび図５Ｂは、ｍＡｂによるインビボ毒素中和（図５Ａ）およびｍＡｂの対によるインビボ毒素中和（図５Ｂ）を示す。５０マイクログラムの全Ａｂは、２０マウスＬＤ５０の毒素または１００マウスＬＤ５０の毒素と混合され、そしてｉ．ｐ．に注入された。死亡までの時間および生存するマウスの数が、決定された。単一のｍＡｂは、２０ＬＤ５０からの顕著な保護を示さなかった。１００ＬＤ５０によってチャレンジされた全てのマウスは、ｍＡｂの任意の対を与えた場合、生存した。
【図６】図６は、ｍＡｂによるインビボ毒素中和、ｍＡｂの対によるインビボ毒素中和、およびオリゴクローナルＡｂによるインビボ毒素中和を示す。インビボ毒素中和は、漸増性の毒素チャレンジ用量におけるｍＡｂ、ｍＡｂの対、およびオリゴクローナルＡｂについて決定された。単一のｍＡｂは、顕著な保護を示さなかった。対照的に、全てのｍＡｂ対は、少なくとも１００ＬＤ５０を中和し、最も強力な対（Ｃ２５＋３Ｄ１２）に対して１，５００ＬＤ５０の毒素によってチャレンジされたマウスの約５０％が、生存した。オリゴクローナルＡｂは、よりさらに強力であり、２０，０００ＬＤ５０の毒素によってチャレンジされたマウスの約５０％が、生存した。
【図７】図７は、抗体の溶液における平衡解離定数（Ｋｄ）を示す。単一のｍＡｂ  Ｃ２５およびｍＡｂ  ３Ｄ１２の溶液におけるＫｄは、漸増性のＢｏＮＴ  ＨＣ毒素の関数として存在する遊離のＡｂの量を測定することによって、フロー蛍光光度計において決定した。等モル量でＣ２５  ｍＡｂと３Ｄ１２  ｍＡｂとを組み合わせるで、Ｃ２５  Ｋｄが、１００倍より大きく減少した。第３のＡｂ（Ｓ２５）を加えることで、そのＫｄが、１８ｐＭまでさらに４倍減少した。
【図８】図８Ａおよび図８Ｂは、可溶性ｓｃＦｖ抗体のＥＬＩＳＡによる特徴付けを示す。アッセイは、ポリスチレンプレート上にコーティングされたそれぞれの示されたＢｏＮＴ血清型、ＢｏＮＴ／Ａ  ＨＣおよびＢｏＮＴ／Ａ  ＨＮを固定化することによって行なわれた。図８Ａ：細菌によって発現された、コーティングした抗原と反応性である免疫性ライブラリーに由来するｓｃＦｖ抗体は、ペルオキシダーゼ結合体化ｍＡｂ抗Ｅ抗体（１：２５００）を用いて検出された。図８Ｂ：細菌によって発現された、コーティングした抗原と反応性である非免疫性ライブラリーに由来するｓｃＦｖ抗体は、９Ｅ１０抗体（１：５００）を用い、次いでペルオキシダーゼ結合体化抗マウス−Ｆｃ抗体を用いて検出された。そのアッセイの結果は、タンパク質濃度に対して正規化されていない４０５ｎｍにおける吸光度として示される。
【図９】図９Ａおよび図９Ｂは、ＢｏＮＴ／Ａ  ＨＣに結合するｓｃＦｖのエピトープマッピングのセンサーグラムを示す。点「ａ」：注入の始まり、点「ｂ」：注入の終わり、および点「ｃ」：結合されたｓｃＦｖの量。点ｂと点ｃとの間のＲＵの差は、ｓｃＦｖと泳動緩衝液との間の屈折率の差に起因する。図９Ａ：ｓｃＦｖ  ３Ａ６およびｓｃＦｖ  ３Ｄ１２は、その２種のｓｃＦｖが混合された場合に結合されたＲＵが増加しないことによって示されるように、同じエピトープを認識する。図９Ｂ：ｓｃＦｖ  ２Ａ９およびｓｃＦｖ  ２Ａ１は、その２種のｓｃＦｖが混合された場合に結合されたＲＵのほぼ相加的な増加によって示されるように、異なるエピトープを認識する。
【図１０】図１０Ａおよび図１０Ｂは、ＢｏＮＴ／Ａ  ＨＣドメインを標的とするｓｃＦｖ抗体の個々の効果および組み合わせた効果を示す。図１０Ａ：マウス片側横隔膜の電気刺激後に発生した単収縮張力は、２０ｐＭのＢｏＮＴ／Ａ（コントロール）、２０ｐＭのＢｏＮＴ／Ａ＋２０ｎＭのクラスターＩのメンバー（３Ｄ１２）、クラスターＩＩのメンバー（３Ｆ１０）、Ｃ２５またはＳ２５の添加前（−３０分〜０分）、および添加後に測定された。ｓｃＦｖ  ３Ｆ１０が、５０％の単収縮減少までの時間を変化させなかったのに対して、ｓｃＦｖ  Ｃ２５、ｓｃＦｖ  Ｓ２５またはｓｃＦｖ  ３Ｄ１２は、５０％の単収縮減少までの時間を顕著に延長する。図１０Ｂ：Ｃ２５と、Ｓ２５または３Ｄ１２（クラスターＩ）との組み合わせは、５０％の単収縮減少までの時間を顕著に延長する。
【図１１】図１１は、公開されたボツリヌス神経毒素遺伝子の系統樹を示す。その系統樹は、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩソフトウェアを使用して、公開されたクロストリジウム属の神経毒素遺伝子のＤＮＡ配列から構築された。
【図１２】図１２Ａおよび図１２Ｂは、ＢｏＮＴ／Ａ遺伝子配列の分析を示す。図１２Ａ：ＢｏＮＴ／Ａ遺伝子の系統樹は、２つのクラスター（Ａ１およびＡ２）を示す。図１２Ｂ：ＢｏＮＴ／Ａ１とＢｏＮＴ／Ａ２との間のアミノ酸側鎖の相違のモデル。ＢｏＮＴ／Ａ重鎖結合ドメインは、この図の上部における白色であり、青色の推定上のガングリオシド結合残基および赤色のガングリオシドを有する。重鎖トランスロケーションドメインは、橙色であり、そして軽鎖は、この図の下部における白色である。ＢｏＮＴ  Ａ１毒素とＢｏＮＴ  Ａ２毒素との間の側鎖の相違は、緑色で示される。
【図１３】図１３は、ＢｏＮＴ／Ｂ遺伝子配列の分析を示す。ＢｏＮＴ／Ｂ遺伝子の系統樹は、４つのクラスターを示す：ＢｏＮＴ／Ｂ１、ＢｏＮＴ／Ｂ２、非タンパク質分解性ＢｏＮＴ／Ｂ、および二価ＢｏＮＴ／Ｂ。クラスターの間の相違の％は、３．６％〜７．７％の範囲である。ＢｏＮＴ／Ａと同様に、最も大きい相違は、重鎖において見られる。
【図１４】図１４は、捕捉ＥＬＩＳＡによって決定された場合の、ＢｏＮＴ／Ａ１毒素およびＢｏＮＴ／Ａ２毒素に対するＢｏＮＴ／Ａ  ＨＣモノクローナル抗体（Ｃ２５、Ｂ４、Ｓ２５、および３Ｄ１２）の結合を示す。ウェルは、示されたｍＡｂによってコーティングされ、次いで純粋かまたは複合体のＢｏＮＴ／Ａ１またはＢｏＮＴ／Ａ２の濃度の変動が行なわれた。毒素結合は、ポリクローナルウマＢｏＮＴ／Ａ抗血清を使用して検出された。Ａ１毒素は、塗りつぶした四角によって示される；Ａ２毒素は、中抜きの円によって示される。純粋な毒素は、実線であり；毒素複合体は、破線である。
【図１５】図１５は、捕捉ＥＬＩＳＡによって決定された場合の、ＢｏＮＴ／Ａ１毒素およびＢｏＮＴ／Ａ２毒素に対する、ＢｏＮＴ／Ａトランスロケーションドメインおよび軽鎖モノクローナル抗体の結合を示す。方法は、図１４について記載される通りであった。
【図１６】図１６は、ｍＡｂ対のＢｏＮＴ／Ａ１毒素によってチャレンジされたマウスを保護する能力を示す。マウスＬＤ５０の範囲のＢｏＮＴ／Ａ１毒素複合体は、５０ｕｇの等モル比の示されたｍＡｂと混合され、そしてその混合物は、腹腔内に注射された。生存するマウスの数対チャレンジ用量が、示される。
【図１７Ａ】図１７Ａおよび図１７Ｂは、ｍＡｂトリプレットのＢｏＮＴ／Ａ１毒素またはＢｏＮＴ／Ａ２毒素によってチャレンジされたマウスを保護する能力を示す。マウスＬＤ５０の範囲のＢｏＮＴ／Ａ１毒素複合体（図１７Ａ）またはＢｏＮＴ／Ａ２毒素複合体（図１７Ｂ）は、５０ｕｇの等モル比の示されたｍＡｂと混合され、そしてその混合物は、腹腔内に注射された。生存するマウスの数対チャレンジ用量が、示される。
【図１７Ｂ】図１７Ａおよび図１７Ｂは、ｍＡｂトリプレットのＢｏＮＴ／Ａ１毒素またはＢｏＮＴ／Ａ２毒素によってチャレンジされたマウスを保護する能力を示す。マウスＬＤ５０の範囲のＢｏＮＴ／Ａ１毒素複合体（図１７Ａ）またはＢｏＮＴ／Ａ２毒素複合体（図１７Ｂ）は、５０ｕｇの等モル比の示されたｍＡｂと混合され、そしてその混合物は、腹腔内に注射された。生存するマウスの数対チャレンジ用量が、示される。
【図１８】図１８。変異され、そして選択された抗体についての配列（ＨＵ−Ｃ２５（配列番号４）、ＡＲ１（配列番号５）、ＡＲ２（配列番号６）、ＡＲ３（配列番号７）、ＡＲ４（配列番号８）、ＣＲ１（配列番号９））。ダッシュは、保存された残基を示す。文字は、変異された残基を示す。
【図１９Ａ】図１９Ａおよび図１９Ｂ。変異され、そして選択された抗体についての配列。図１９Ａ：３Ｄ１２（配列番号１０）、およびＲＡＺ１（配列番号１１））．図１９Ｂ：ＩＮＧ１（配列番号１２）、１Ｄ１１（配列番号１３）、２Ｇ１１（配列番号１４）、５Ｇ４（配列番号１５）、ＩＮＧ２（配列番号１６）。ダッシュは、保存された残基を示す。文字は、変異された残基を示す。
【図１９Ｂ】図１９Ａおよび図１９Ｂ。変異され、そして選択された抗体についての配列。図１９Ａ：３Ｄ１２（配列番号１０）、およびＲＡＺ１（配列番号１１））．図１９Ｂ：ＩＮＧ１（配列番号１２）、１Ｄ１１（配列番号１３）、２Ｇ１１（配列番号１４）、５Ｇ４（配列番号１５）、ＩＮＧ２（配列番号１６）。ダッシュは、保存された残基を示す。文字は、変異された残基を示す。
【図２０】図２０Ａおよび図２０Ｂは、ＨｕＣ２５（図２０Ａ）および３Ｄ１２（図２０Ｂ）ｓｃＦｖの酵母ディスプレイを使用した親和性の成熟のために使用されたスキームを示す。
【図２１−１】図２１Ａ〜図２１Ｄは、野生型の親和性および酵母が提示した親和性が成熟したｓｃＦｖの親和性を示す。図２１Ａ：Ｈｕ  Ｃ２５およびＡＲ１；図２１Ｂ：ＡＲ１およびＡＲ２；図２１Ｃ：ＡＲ２およびＡＲ４；図２１Ｄ：３Ｄ１２およびＲＡＺ１。
【図２１−２】図２１Ａ〜図２１Ｄは、野生型の親和性および酵母が提示した親和性が成熟したｓｃＦｖの親和性を示す。図２１Ａ：Ｈｕ  Ｃ２５およびＡＲ１；図２１Ｂ：ＡＲ１およびＡＲ２；図２１Ｃ：ＡＲ２およびＡＲ４；図２１Ｄ：３Ｄ１２およびＲＡＺ１。
【図２２】図２２は、野生型抗体および親和性が成熟した抗体を使用したフローサイトメトリーによるＢｏＮＴ／Ａの検出を示す。
【図２３】図２３Ａおよび図２３Ｂは、野生型および親和性が成熟した抗体によるＢｏＮＴ／Ａの中和の効力を示す。図２３Ａ：１００マウスＬＤ５０チャレンジ。図２３Ｂ：２００マウスＬＤ５０チャレンジ。
【図２４】図２４Ａ、図２４Ｂは、野生型抗体と親和性が成熟した抗体との対によるＢｏＮＴ／Ａの中和の効力を示す。図２４Ａ：５００マウスＬＤ５０チャレンジ。図２４Ｂ：５０００マウスＬＤ５０チャレンジ。
【図２５】図２５は、抗体の組み合わせによるＢｏＮＴ／Ａ２の中和を示す。
【図２６】図２６は、Ｈｕ−Ｃ２５系統の抗体（ＨＵ−Ｃ２５（配列番号１７）、ＡＲ１（配列番号１８）、ＡＲ２（配列番号１９）、ＡＲ３（配列番号２０）、ＡＲ４（配列番号２１）、ＣＲ１（配列番号２２）、およびＣＲ２（配列番号２３））のアライメントを示す。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2008528060000001.app