(57)【要約】  本発明は、ナノ粒子を含む遺伝子運搬体に関する。より具体的には、(ａ)ナノ物質と、(ｂ)前記ナノ物質の表面と共有結合で連結された(covalently linked to)ユニバーサル結合パートナー(universal binding partner)としてのオリゴヌクレオチドと、(ｃ)(ｉ)前記結合パートナーに相補的な配列を含む結合カウンターパートナー(binding counter-partner)としての相補的オリゴヌクレオチド及び(ii)発現を減少させようとするターゲット遺伝子に相補的な配列を有する抑制分子(inhibitory molecule)または発現を誘導しようとするターゲット遺伝子の配列を有する誘導分子(inducing molecule)を含む運搬対象(cargo)と、を含む遺伝子運搬体に関する。本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドだけではなく、アプタマー、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム(ribozyme)、ＤＮＡｚｙｍｅ、ＰＮＡ、または遺伝子の配列を有したＤＮＡ及びＲＮＡを細胞内に容易に運搬できるシステムである。また、本発明は、商業的に利用する遺伝子伝達試薬よりターゲット遺伝子の発現をより効率的にノックダウンさせる。
2012503494.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(ａ)ナノ物質と、
(ｂ)前記ナノ物質の表面と共有結合で連結された(covalently linked to)ユニバーサル結合パートナー(universal binding partner)としてのオリゴヌクレオチドと、
(ｃ)(ｉ)前記結合パートナーに相補的な配列を含む結合カウンターパートナー(binding counter-partner)としての相補的オリゴヌクレオチド、(ii)発現を減少させようとするターゲット遺伝子に相補的な配列を有する抑制分子(inhibitory molecule)または発現させようとするターゲット遺伝子の配列を有する誘導分子(inducing molecule)を含む運搬対象(cargo)と、
を含む遺伝子運搬体(gene delivery system)。
【請求項２】
前記ナノ物質は、８〜１００ｎｍの大きさを有するナノ粒子であることを特徴とする、請求項１に記載の遺伝子運搬体。
【請求項３】
前記ナノ粒子は、金属ナノ粒子であることを特徴とする、請求項２に記載の遺伝子運搬体。
【請求項４】
前記ナノ粒子は、金ナノ粒子であることを特徴とする、請求項３に記載の遺伝子運搬体。
【請求項５】
前記ユニバーサル結合パートナーとしてのオリゴヌクレオチドは、末端にチオール基またはアミン基が結合されていることを特徴とする、請求項１に記載の遺伝子運搬体。
【請求項６】
前記ユニバーサル結合パートナーとしてのオリゴヌクレオチドは、非−ヒトヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の遺伝子運搬体。
【請求項７】
前記結合カウンターパートナーとしての相補的オリゴヌクレオチドは、３〜１００個のヌクレオチドから構成されたことを特徴とする、請求項１に記載の遺伝子運搬体。
【請求項８】
前記(ｃ)において、発現を減小させようとするターゲット遺伝子に相補的な配列を有する抑制分子は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム(ribozyme)、ＤＮＡｚｙｍｅまたはＰＮＡであることを特徴とする、請求項１に記載の遺伝子運搬体。
【請求項９】
前記(ｃ)において、発現させようとするターゲット遺伝子の配列を有する誘導分子は、ＲＮＡまたはＤＮＡであることを特徴とする、請求項１に記載の遺伝子運搬体。
【請求項１０】
(ａ)ナノ物質と、
(ｂ)前記ナノ物質の表面と共有結合で連結された(covalently linked to)ユニバーサル結合パートナー(universal binding partner)としてのオリゴヌクレオチドと、
(ｃ)(ｉ)前記結合パートナーに相補的な配列を含む結合カウンターパートナー(binding counter-partner)としての相補的オリゴヌクレオチド、(ii)発現を減少させようとするターゲット遺伝子に相補的な配列を有する抑制分子(inhibitory molecule)または発現させようとするターゲット遺伝子の配列を有する誘導分子(inducing molecule)を含む運搬対象(cargo)と、を含む遺伝子運搬体を細胞に接触させる段階を含むカーゴを細胞に運搬する方法。
【請求項１１】
前記ナノ物質は、８〜１００ｎｍの大きさを有するナノ粒子であることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ナノ粒子は、金属ナノ粒子であることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ナノ粒子は、金ナノ粒子であることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ユニバーサル結合パートナーとしてのオリゴヌクレオチドは、末端にチオール基またはアミン基が結合されていることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記ユニバーサル結合パートナーとしてのオリゴヌクレオチドは、非−ヒトヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記結合カウンターパートナーとしての相補的オリゴヌクレオチドは、３〜１００個のヌクレオチドから構成されたことを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記(ｃ)において、発現を減小させようとするターゲット遺伝子に相補的な配列を有する抑制分子は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム(ribozyme)、ＤＮＡｚｙｍｅまたはＰＮＡであることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
前記(ｃ)において、発現させようとするターゲット遺伝子の配列を有する誘導分子は、ＲＮＡまたはＤＮＡであることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、ナノ粒子を含む遺伝子運搬体に関する。
【０００２】
〔背景技術〕
先天性及び後天性原因による癌及び遺伝的疾患に対する臨床治療方法として、遺伝子治療が注目を浴びてきた。効率的な遺伝子伝達システムは、遺伝的疾患及び癌の臨床治療を焦点とするシステムであって、最近高い関心を浴びるようになった(1)。高い形質転換効率と蛋白質発現をさせるために、組換えウイルスを遺伝子キャリアとして利用することが研究初期の観点であった(2)。しかしながら、このようなシステムは、ウイルス由来の蛋白質が強力な免疫反応を発生させる決定的な限界により、ＦＤＡの承認を受けられなかった(3)。また、ウイルス伝達システムは、プロセスを拡大させる面で制限的である(4)。その結果、陽イオン性脂質、ポリマー、デンドリマー(dendrimer)及びペプチドのような数多い非ウイルス性遺伝子伝達システムが開発された(5)。しかしながら、非ウイルス性遺伝子伝達システムはその相当数が、細胞内・外の障害により、ウイルスシステムと比較して著しく形質転換効率が有意に減少された。したがって、多い研究者らは、安全且つ効率的なウイルス性伝達ベクターに焦点を合わせて研究をした。
【０００３】
最近、炭素ナノチューブ及び酸化鉄、シリカ及び金ナノ粒子(gold nanoparticles)を含むナノ粒子が、非ウイルス性遺伝子伝達システムの代案として広範囲に研究された(6)。金ナノ粒子は、生体不活性(bioinert)であり、非毒性(nontoxic)であって、容易に合成されて機能化され得るため、遺伝子伝達システムを開発するための魅力的な支持体(scaffold)である(7)。今まで、混合された単一層で保護された金ナノ粒子、ポリマーと金ナノ粒子のコンプレックス(complex)、二本鎖DNAで機能化された金ナノ粒子及び一本鎖DNAで機能化された金ナノ粒子を含む幾つかの遺伝子伝達システムが開発されてきた(8)。Mirkinらにより開発された、一本鎖DNAで機能化された金ナノ粒子は、効果的なアンチセンス及び遺伝子伝達システムであった(8f)。また、このようなナノ粒子は、リポフェクタミン(Lipofectamine)やサイトフェクチン(Cytofectin)により伝達されるアンチセンスDNAに比べ、細胞に対するさらに低い毒性、さらに高い遺伝子発現のノックダウン(knockdown)、ターゲットDNAに対する高い結合力及びヌクレアーゼに対する免疫力を示した。
【０００４】
しかしながら、このようなシステムは、ただ金ナノ粒子と共有結合で連結されたアンチセンスDNAのみを伝達することができて、個別的にそれぞれのターゲット遺伝子に対する合成及び時間的な消費と不便を有するプロセスが必要であった。
【０００５】
したがって、ターゲット遺伝子に対する特異的なアンチセンスDNAオリゴの合成が不要な任意のアンチセンスDNAオリゴを伝達できる遺伝子伝達システムに対する必要性が台頭されている。
【０００６】
本明細書全体にかけて多数の特許文献及び論文が参照されて、その引用が表示されている。引用された特許文献及び論文の開示内容は、その全体が本明細書に参照として取り込まれ、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
【０００７】
〔発明が解決しようとする課題〕
本発明者らは、正常細胞に影響を与えることなく、ターゲット遺伝子の発現を抑制できる物質(例えば、ターゲット遺伝子に特異的なオリゴアンチセンスDNAs)に対する効率的な遺伝子伝達システムを開発するために鋭意研究した。その結果、ナノ物質表面に共有結合によりユニバーサル結合パートナーを導入して、この結合パートナーに結合する結合カウンターパートナーに抑制分子または発現しようとするターゲット遺伝子の配列を有する誘導分子を結合させて新規な遺伝子伝達システムを開発して、この遺伝子伝達システムがターゲット分子の発現を非常に効率的に抑制させるか発現させることを究明することにより、本発明を完成した。
【０００８】
したがって、本発明の目的は、ナノ物質を含む遺伝子運搬体を提供することにある。
【０００９】
本発明の他の目的は、上述の遺伝子運搬体を細胞に接触させる段階を含むカーゴを細胞に運搬する方法を提供することにある。
【００１０】
本発明の他の目的及び利点は、発明の詳細な説明、請求の範囲及び図面により、さらに明確にされる。
【００１１】
本発明の一様態によると、本発明は、(ａ)ナノ物質と、(ｂ)前記ナノ物質の表面と共有結合で連結された(covalently linked to)ユニバーサル結合パートナー(universal binding partner)としてのオリゴヌクレオチドと、(ｃ)(ｉ)前記結合パートナーに相補的な配列を含む結合カウンターパートナー(binding counter-partner)としての相補的オリゴヌクレオチド及び(ii)発現を減少させようとするターゲット遺伝子に相補的な配列を有する抑制分子(inhibitory molecule)または発現させようとするターゲット遺伝子の配列を有する誘導分子(inducing molecule)を含む運搬対象(cargo)と、を含む遺伝子運搬体を提供する。
【００１２】
本発明者らは、正常細胞に影響を与えることなく、ターゲット遺伝子の発現を抑制できる物質(例えば、ターゲット遺伝子に特異的なオリゴアンチセンスDNAs)に対する効率的な遺伝子伝達システムを開発するために鋭意研究して、その結果、ナノ物質表面に共有結合によりユニバーサル結合パートナーを導入して、この結合パートナーに結合する結合カウンターパートナーに抑制分子または発現しようとするターゲット遺伝子の配列を有する誘導分子(inducing molecule)を結合させて新規な遺伝子伝達システムを開発して、この遺伝子伝達システムがターゲット分子の発現を非常に効率的に抑制するか発現させることを確認した。
【００１３】
本発明の遺伝子運搬体は、(ａ)ナノ物質と、(ｂ)ユニバーサル結合パートナーとしてのオリゴヌクレオチドと、(ｃ)(ｉ)結合カウンターパートナーとしての相補的オリゴヌクレオチド及び(ii)発現を減少させようとするターゲット遺伝子に相補的な配列を有する抑制分子または発現させようとするターゲット遺伝子の配列を有する誘導分子を含む運搬対象(cargo)からなっている。
【００１４】
本発明の遺伝子運搬体の構成成分の一つである‘ナノ物質(Nano Materials)’は、好ましくは1〜100nm大きさを有する物質を意味する。本発明で使用されるナノ物質は、ナノ大きさを有する物質であれば、形態及び形は特に限定されない(例えば、粒子、チューブ、棒または正四面体のような形態)。
【００１５】
本発明の好ましい具現例によると、本発明で利用されるナノ物質は、ナノ粒子である。前記‘ナノ粒子’は、ナノ単位の直径、好ましくは、8-100nm、より好ましくは、10-50nm、最も好ましくは、12-14nmの直径を有する多様な物質の粒子を意味する。前記ナノ粒子は、ナノ大きさを有する粒子であれば特に制限はない。例えば、ナノカーボン、金属ナノ粒子、金属酸化物粒子、量子点(quantum dot)、高分子ラテックス、高分子ナノスフィアなどが挙げられる。金属粒子の具体例としては、Au, Ag, Pd, Pt, Cu, Ni, Co, Fe, Mn, Ru, Rh, Os, Irなどが挙げられる。金属酸化物粒子は、化学式MxOy(但し、Mは、金属、Oは、酸素、xとyは、整数を示す)で表される化合物を示し、例えば、Fe2O3, Ag2O, TiO2, SiO2などが挙げられる。
【００１６】
より好ましくは、本発明で利用されるナノ物質は、金属ナノ粒子を意味する。本明細書で用語‘金属ナノ粒子’は、ナノ単位の直径、好ましくは、8-100nm、より好ましくは、10-50nm、最も好ましくは、12-14nmの直径を有する金、銀、白金、パラジウム及び鉄などの金属粒子を含むが、これらに限定されず、単体が金属の性質を有するあらゆるナノ大きさの粒子を含む。このような小さい粒子大きさは、本発明のナノ粒子が目的の細胞(例えば、ヒト細胞)に浸透することを容易にし、細胞内に遺伝子運搬体の浸透を可能にする。結局、このような浸透容易性は、本発明の遺伝子運搬体のターゲット分子の発現を非常に効率的に抑制させることに寄与する。
【００１７】
本発明の最も好ましい具現例によると、本発明で利用されるナノ物質は、金ナノ粒子を意味する。金ナノ粒子は、安定した粒子の形態に製造することが容易であり、大きさの調節が容易で、マンガン、アルミニウム、カドミウム、鉛、水銀、コバルト、ニッケル、ベリリウムなどの重金属とは異なって、人体に無害であって、高い生体親和性を有する。
【００１８】
本発明で利用される金ナノ粒子は、例えば、以下のように製造できる：HAuCl4を金供給源として、クエン酸ナトリウムを還元剤としてHAuCl4を還元させて金ナノ粒子を製造する。この場合、金ナノ粒子の大きさは、添加するクエン酸を変えることにより調節が可能である。即ち、クエン酸の添加量を増加させるほど、核形成(nucleation)が多くなされるため、金ナノ粒子の大きさは減少する。
【００１９】
金ナノ粒子は、直径が100nm以上に大きくなる場合、ナノ粒子としての特性が消滅されるだけではなく、ナノ物質の特性がない金表面とチオール基などの作用基との結合は弱いため、金粒子を媒介として作用基とユニバーサル結合パートナー分子が結合された粒子は、製造し難い。したがって、本発明の金ナノ粒子の直径は、好ましくは、8-100nm、より好ましくは、10-50nm、最も好ましくは、12-14nmである。
【００２０】
本発明において、前記ユニバーサル結合パートナーとしてのオリゴヌクレオチドは、好ましくは、ナノ粒子に共有結合されるために、追加的な作用基性(functionality)を有する。前記追加的作用基性は、オリゴヌクレオチドの末端に位置する。
【００２１】
より好ましくは、ユニバーサル結合パートナーとしてのオリゴヌクレオチドは、末端にチオール基またはアミン基が結合されている。さらに好ましくは、前記追加的作用基性は、3'-末端に位置する。3'-末端の作用基に続いて5'-方向側に、好ましくはアルキル基、例えば、炭素数1-20のアルキル基(好ましくは、炭素数4-8のアルキル基)が位置する。
【００２２】
作用基性を付与する部位にユニバーサル結合パートナーが直接結合できるが、好ましくは、リンカー(またはスペーサー)が中間に介入する。前記リンカーは、ユニバーサル結合パートナーがナノ粒子に高い密度で結合できるようにし、且つ結合カウンターパートナーとの結合をより容易にする役割をする。前記リンカーとして適しているのは、オリゴヌクレオチドまたはポリエーテルであり、好ましくは、オリゴAヌクレオチド、オリゴTヌクレオチド、オリゴGヌクレオチドまたはオリゴCヌクレオチドである。
【００２３】
したがって、本発明の好ましい具現例によると、ユニバーサル結合パートナーは、「3’-SH(またはNH2)-リンカー-オリゴヌクレオチド-5’」構造を有して、より好ましくは、「3’-SH(またはNH2)-アルキル-リンカー-オリゴヌクレオチド-5’」構造を有する。
【００２４】
本発明の好ましい具現例によると、本発明で前記ユニバーサル結合パートナーとしてのオリゴヌクレオチドは、非-ヒトヌクレオチド配列を含み、より好ましくは、ウイルス、原核生物、菌類、海洋生物、植物、またはヒトを除いた動物由来であって、ヒト細胞には存在しないヌクレオチド配列を含む。例えば、ユニバーサル結合パートナーとしてのオリゴヌクレオチドは、GFP(green fluorescence protein)由来の配列、より好ましくは、GFP変異体、例えば、EGFP(enhanced green fluorescence protein)由来のヌクレオチド配列である。本発明は、非-ヒトヌクレオチド配列を利用して、ヒト細胞内に遺伝子運搬体が導入される場合、ヒト細胞に含まれている遺伝子発現に影響を及ぼさず、このような特徴により、ターゲット分子の発現のみを選択的に抑制させる効果を示す。
【００２５】
前記ユニバーサル結合パートナーとしてのオリゴヌクレオチドの長さは、特に制限されず、好ましくは、3-100個のヌクレオチドから構成されて、より好ましくは、10-50個であり、さらに好ましくは、15-30個であって、最も好ましくは、19-21個のヌクレオチドから構成される。
【００２６】
前記ユニバーサルオリゴヌクレオチドは、効能を増進させるために、一つ以上の塩基、糖または骨格(backbone)の位置で変形され得る(De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol., 5(3):343-55, 1995)。
【００２７】
本明細書において、用語‘結合カウンターパートナー’は、前記ユニバーサル結合パートナーと相補的な配列またはこれと混成化(hybridization)できるほど一定比率以上の相同性(homology)を有するオリゴヌクレオチドを意味する。
【００２８】
本発明の好ましい具現例によると、本発明において、前記結合カウントパートナーとしての相補的オリゴヌクレオチドは、3-100個のヌクレオチドから構成されて、より好ましくは、10-50個であり、さらに好ましくは、15-30個であって、最も好ましくは、19-21個のヌクレオチドから構成される。
【００２９】
本発明の明細書において、前記(ｃ)における表現‘ターゲット遺伝子発現の減少(Inhibition of target gene expression)”とは、ターゲット遺伝子で生成されたmRNA及び/または蛋白質の水準が除去または減少されたことを意味する。例えば、ターゲット遺伝子発現の減少は、mRNAの切断(cleavage)を通じて起こるRNA干渉(RNAi: RNA interference)現象による。
【００３０】
本発明の明細書において、表現‘発現を減少させようとするターゲット遺伝子’は、細胞(好ましくは、動物細胞、より好ましくはヒト細胞)内で発現を抑制しようとする遺伝子またはオリゴヌクレオチドを意味する。好ましくは、前記発現を減少させようとするターゲット遺伝子は、ヒト細胞内でまたは細胞外(例えば、ウイルスまたは細菌)で導入されて発現される癌誘発遺伝子(oncogene、例えば、c-myc, N-myc, L-myc, c-jun, jun-B, jun-D, c-fos, fos-B, ets-1, ets-2, myb, erbA, rel, ski, spi-1, evi-1, Ha-ras, Ki-ras, N-ras, erbB-1, erbB-2, erbB-2/neu, src, fms, mos, abl, ros, raf, yes, fps, trk, sis, p53, Adeno E1A, Polyoma large T, Papilloma E7, SV40 large T)、アポトーシス誘導遺伝子(例えば、カスファーゼ-8，カスファーゼ-9, Bcl-2, Mcl-1L)または免疫疾患関連遺伝子(例えば、IFN-γ, IL-8, TNF-α, IL-1)を意味するが、これに制限されない。また、前記ターゲット遺伝子またはオリゴヌクレオチドは、一本(single strand)また二本(double strand)ヌクレオチドを含む。
【００３１】
本発明の好ましい具現例によると、本発明は、癌及びアポトーシス関連遺伝子であるp53及びMcl-1L発現抑制において、非常に優れた効率を示す。
【００３２】
本発明で抑制分子は、前記(ｃ)結合カウンターパートナーと連結されており、遺伝子運搬体が細胞内に導入される場合、ターゲット遺伝子の発現を抑制させることにより、ターゲット遺伝子の活性を非常に効率的に抑制させる。
【００３３】
用語‘相補的または相補的な’は、100%相補的な場合だけではなく、ターゲット遺伝子の発現を抑制できる程度の不完全な相補性も包括する意味であって、好ましくは、90%の相補性、より好ましくは、98%の相補性、最も好ましくは、100%の相補性を意味する。本明細書で100%相補性を表現する場合は、‘完全相補的(completely complementary)’と記載する。
【００３４】
好ましくは、抑制分子は、抑制させようとするターゲット遺伝子の一部配列に相補的な配列を有する。遺伝子発現の抑制と関連して使用された本明細書の用語‘ターゲット遺伝子’は、発現させようとするターゲット遺伝子の調節配列及びCDS(コーディング配列)を意味する。例えば、抑制分子は、ターゲット遺伝子の調節配列(例えば、プロモーターまたはインハンサー)または調節配列の一部に相補的なヌクレオチド配列を有することができる。選択的に、抑制分子は、ターゲット遺伝子CDSの一部配列に相補的なヌクレオチド配列を含むことができる。また、抑制分子は、ターゲット遺伝子の調節配列の一部及びCDSの一部配列に相補的なヌクレオチド配列を含むことができる。
【００３５】
本発明の明細書において、用語‘アンチセンスオリゴヌクレオチド’とは、特定mRNAの配列に相補的なヌクレオチド配列を含有しているDNAまたはRNAまたはこれらの誘導体を意味し、mRNA内の相補的な配列に結合して、mRNAの蛋白質への翻訳を阻害する特徴がある。本発明のアンチセンスヌクレオチド配列は、ターゲット遺伝子のmRNAに相補的で、ターゲット遺伝子のmRNAに結合できるDNAまたはRNA配列を意味し、ターゲット遺伝子のmRNAの翻訳、細胞質内への転位(translocation)、成熟(maturation)または他の全ての全体的な生物学的機能に対する必須的な活性を阻害することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドの長さは、6乃至100塩基であり、好ましくは、8乃至60塩基であって、より好ましくは、10乃至40塩基である。
【００３６】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、効能を増進させるために一つ以上の塩基、糖または骨格(backbone)の位置で変形され得る(De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol., 5(3):343-55, 1995)。オリゴヌクレオチド骨格は、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、単鎖アルキル、シクロアルキル、単鎖ヘテロアトミック、ヘテロシクリック糖間結合などに変形され得る。また、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一つ以上の置換された糖モイエティー(sugar moiety)を含むことができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、変形された塩基を含むことができる。変形された塩基には、ヒポキサンチン、６−メチルアデニン、5-meピリミジン(特に5-メチルシトシン)、５−ヒドロキシメチルシトシン(HMC)、グリコシルHMC、ゲントビオシルHMC、２−アミノアデニン、２−チオウラシル、２−チオチミン、５−ブロモウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、８−アザグアニン、７−デアザグアニン、Ｎ６(６−アミノヘキシル)アデニン、２，６−ジアミノフリンなどがある。
【００３７】
用語‘アプタマー(aptamer)’は、特定ターゲットに結合するオリゴヌクレオチド(一般に、RNA aptamer)を意味する。好ましくは、本発明の明細書における‘アプタマー’は、オリゴヌクレオチドアプタマー(例えば、RNA aptamer)を意味する。アプタマーの一般的な内容は、Bock LC et al., Nature 355(6360):564-6(1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8):426-30(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R . "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24):14272-7(1998)に詳細に開示されている。
【００３８】
用語‘siRNA’とは、特定mRNAの切断(cleavage)を通じてRNAi(RNA interference)現象を誘導できる短い二本鎖RNAを意味する。ターゲット遺伝子のmRNAと相同の配列を有するセンスRNA鎖と、これと相補的な配列を有するアンチセンスRNA鎖から構成される。siRNAは、ターゲット遺伝子の発現を抑制できるため、効率的な遺伝子ノックダウン方法として、または遺伝子治療(gene therapy)の方法として提供される。
【００３９】
siRNAは、RNA同士が対をなす二本鎖RNA部分が完全に対をなすものに限定されず、ミスマッチ(対応する塩基が相補的ではない)、バルジ(一方の鎖に対応する塩基がない)などにより、対をなさない部分が含まれ得る。全体長さは、10〜100塩基、好ましくは、15乃至80塩基、最も好ましくは、20乃至70塩基である。siRNA末端構造は、ターゲット遺伝子の発現をRNAi効果により抑制できるものであれば、平滑(blunt)末端あるいは粘着(cohesive)末端の両方とも可能である。粘着末端構造は、3末が端突出した構造と5末端側が突出した構造、両方とも可能である。突出する塩基数は、限定されない。例えば、塩基数は、1乃至8塩基、好ましくは、2乃至6塩基が可能である。本明細書において、siRNAの全長は、中央の二本鎖部分の長さと両末端の一本鎖突出を構成する長さとの合計で示した。また、siRNAは、ターゲット遺伝子の発現抑制効果を維持できる範囲で、例えば、一方の末端の突出部分に低分子RNA(例えば、tRNA, rRNA, ウイルスRNAのような天然のRNA分子または人工のRNA分子)を含むことができる。siRNA末端構造は、両側とも切断構造を有する必要はなく、二本鎖RNAの一方の末端部位がリンカーRNAにより接続されたステムループ状構造であってもよい。リンカーの長さは、ステム部分の対をなすに支障がない長さであれば特に限定されない。
【００４０】
本発明において、用語‘特異的’または‘特異的な’は、細胞内で他の遺伝子に影響を及ぼさず、ターゲット遺伝子のみを抑制する能力を意味する。本発明のsiRNAは、ターゲット遺伝子に特異的に作動するようにターゲット遺伝子またはターゲットヌクレオチドと相補的な配列を含むアンチセンスRNA鎖を有する。
【００４１】
用語‘shRNA’は、一本鎖であって、50-70個で構成されたヌクレオチドを意味し、in vivo上でステム-ループ(stem-loop)構造をなしている。5-10個のヌクレオチドのループ部位両側に相補的に19-29個のヌクレオチドの長いRNAが塩基対をなして二本鎖のステムを形成する。
【００４２】
用語‘miRNA(microRNA)’は、遺伝子発現を調節して、全長21-23個のヌクレオチドで構成された一本鎖RNA分子を意味する。miRNAは、細胞内で発現されないオリゴヌクレオチドであり、短いステム-ループ構造を有する。miRNAは、1または2以上のmRNA(messenger RNA)と全体または部分的に相同性を有して、前記mRNAと相補的な結合を通じてターゲット遺伝子発現を抑制させる。
【００４３】
用語‘リボザイム(ribozyme)’は、RNAの一種であって、特定なRNAの塩基配列を認識して、自体的にこれを切断する酵素のような機能を有したRNAである。リボザイムは、ターゲット伝令RNA鎖の相補的な塩基配列であって、特異性を有して結合する領域と、ターゲットRNAを切断する領域からなっている。
【００４４】
用語‘DNAzyme’は、酵素活性を有する一本鎖DNA分子であって、10-23ヌクレオチドから構成されたDNAzyme(10-23 DNAzyme)は、生理的に類似した条件下でRNA鎖を特定位置で切断する。10-23 DNAzymeは、塩基対をなさず、露出したあるフリン及びピリミジン間を切断する。10-23 DNA酵素(DNAzyme)は、15個の保存された塩基配列(5'-GGCTAGCTACAACGA-3')からなる酵素の活性部位(catalytic domain)及び上述の酵素の活性部位左右にRNA基質を認識する7-8個のDNA塩基配列からなる基質認識領域(RNA substrate binding domain)から構成される。
【００４５】
用語‘PNA(Peptide nucleic acid)’は、核酸と蛋白質の性質を両方とも有している分子であって、DNAまたはRNAと相補的に結合が可能な分子を意味する。PNAは、核酸塩基(nucleobase)がペプチド結合で連結された類似DNAであって、1999年に最初に報告された(文献[Nielsen PE, Egholm M, Berg RH, Buchardt O, "Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide", Science 1991, Vol. 254: pp1497-1500])。PNAは、自然界では発見されず、人工的に化学的な方法により合成される。PNAは、相補的な塩基配列の天然核酸と混成化(hybridization)反応を起こして、二本鎖を形成する。長さが同じ場合、PNA/DNA二本鎖は、DNA/DNA二本鎖より、PNA/RNA二本鎖は、DNA/RNA二本鎖より安定している。ペプチド基本骨格としては、N-(2-アミノエチル)グリシンがアミド結合により反復的に連結されたものが最もよく使用されて、この場合、ペプチド核酸の基本骨格(backbone)は、陰電荷を帯びる天然核酸の基本骨格とは違って電気的に中性である。PNAに存在する4個の核酸塩基は、空間的大きさと核酸塩基間の距離が天然核酸の場合とほぼ同じである。PNAは、化学的に天然核酸より安定しているだけではなく、核酸分解酵素(nuclease)や蛋白質分解酵素(protease)により分解されず、生物学的にも安定している。
【００４６】
本発明の好ましい具現例によると、本発明の前記(ｃ)で発現を減少させようとするターゲット遺伝子に相補的な配列を有する抑制分子は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー(aptamer), siRNA(small interfering RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA), リボザイム(ribozyme), DNAzymeまたはPNA(peptide nucleic acids)であり、より好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー, siRNA, shRNAまたはDNAzymeである。
【００４７】
本発明で発現を誘導しようとするターゲット遺伝子の配列を有する誘導分子は、前記(ｃ)結合カウンターパートナーと連結されており、遺伝子運搬体が細胞内に導入される場合、前記ターゲット遺伝子の発現を効率的に発現させる。
【００４８】
本発明の好ましい具現例によると、前記誘導分子は、RNAまたはDNA分子である。
【００４９】
本発明において、前記誘導分子は、好ましくは、ターゲット遺伝子を発現させるための(i)プロモーター及び(ii)前記プロモーターと作動的に連結された(operatively linked to)、発現させようとするターゲット遺伝子のCDS(coding sequence)を含む発現コンストラクト(expression construct)、より好ましくは(i)プロモーター、(ii)前記プロモーターと作動的に連結された(operatively linked to)、発現させようとするターゲット遺伝子のCDS(coding sequence)及び(iii)ポリアデニル化配列を含む発現コンストラクト(expression construct)である。
【００５０】
本明細書において、用語‘作動的に連結された’は、核酸発現調節配列(例えば、プロモーター、シグナル配列、または転写調節因子結合位置のアレイ)と他の核酸配列との間の機能的な結合を意味し、これにより、前記調節配列は、前記他の核酸配列の転写及び/または解読を調節するようになる。
【００５１】
誘導分子としての前記発現コンストラクトで利用可能なプロモーターは、TERTプロモーター, U6プロモーター, H1プロモーター, CMV(cytomegalo virus)プロモーター, アデノウイルス後期プロモーター, ワクチニアウイルス7.5Kプロモーター, SV40プロモーター, HSVのtk プロモーター, RSVプロモーター, EF1αプロモーター, メタロチオニンプロモーター, β-アクチンプロモーター, ヒトIL-2遺伝子のプロモーター, IFN遺伝子のプロモーター, ヒトIL-4遺伝子のプロモーター, ヒトリンフォトキシン遺伝子のプロモーター, ヒトGM-CSF遺伝子のプロモーター, inducibleプロモーター, 癌細胞特異的プロモーター(例えば、PSAプロモーター, PSMAプロモーター, CEAプロモーター, E2Fプロモーター及びAFPプロモーター)及び組織特異的プロモーター(例えば、アルブミンプロモーター)を含むが、これらに限定されるものではない。
【００５２】
前記発現コンストラクトで利用可能なポリアデニル化配列は、牛成長ホルモンターミネーター(Gimmi, E. R., et al., Nucleic Acids Res. 17:6983-6998(1989)), SV40由来ポリアデニル化配列(Schek, N, et al., Mol. Cell Biol. 12:5386-5393(1992)), HIV-1 polyA(Klasens, B. I. F., et al., Nucleic Acids Res. 26:1870-1876(1998)), β-グロビンpolyA(Gil, A., et al, Cell 49:399-406(1987)), HSV TK polyA(Cole, C. N. and T. P. Stacy, Mol. Cell. Biol. 5:2104-2113(1985))またはポリオマウイルスpolyA(Batt, D. B and G. G. Carmichael, Mol. Cell. Biol. 15:4783-4790(1995))を含むが、これらに限定されるものではない。
【００５３】
本発明の明細書において、表現‘発現させようとするターゲット遺伝子’は、細胞(好ましくは、動物細胞、より好ましくはヒト細胞)内で発現しようとする遺伝子またはオリゴヌクレオチドを意味する。好ましくは、前記発現させようとするターゲット遺伝子は、ヒトまたは外部由来の遺伝子(例えば、ルシフェラーゼ遺伝子)または治療学的トランス遺伝子(transgene)を含む。
【００５４】
好ましくは、前記治療学的トランス遺伝子は、腫瘍抑制因子遺伝子、抗原性遺伝子、細胞毒性遺伝子、細胞増殖抑制遺伝子、細胞死滅遺伝子及び抗-新生血管生成遺伝子を含む。
【００５５】
本発明の明細書において、用語‘治療学的トランス遺伝子(therapeutic transgene)’は、細胞内で発現されて、治療学的効果を示すヌクレオチド配列を意味し、腫瘍抑制因子遺伝子、抗原性遺伝子、細胞毒性遺伝子、細胞増殖抑制遺伝子、細胞死滅遺伝子及び抗-新生血管遺伝子などが含まれて、これに限定されるものではない。
【００５６】
本発明の明細書において、用語‘腫瘍抑制因子遺伝子(tumor suppressor gene)’は、標的細胞内で発現されて腫瘍表現型を抑制できるか、細胞死滅を誘導できるヌクレオチド配列を意味する。本発明の実施に有用な腫瘍抑制因子遺伝子には、p53遺伝子、APC遺伝子, DPC-4/Smad4遺伝子, BRCA-1遺伝子, BRCA-2遺伝子, WT-1遺伝子, 網膜芽細胞腫遺伝子(Lee et al., Nature, 1987, 329,642), MMAC-1遺伝子, 腺腫性ポリポーシスコイル蛋白質(adenomatouspolyposis coil protein)(米国特許公報5,783,666号), 欠損された結腸腫瘍(DCC)遺伝子, MMSC-2遺伝子, NF-1遺伝子, 染色体3p21.3に位置した鼻咽喉腫瘍抑制因子遺伝子(Cheng et al. Proc.Nat.Acad.Sci, 95:3042-3047(1998)), MTS1遺伝子, CDK4遺伝子, NF-1遺伝子, NF-2遺伝子及びVHL遺伝子が含まれる。
【００５７】
本発明の明細書において、‘抗原性遺伝子(antigenic gene)’は、標的細胞内で発現されて、免疫システムで認識できる細胞表面抗原性蛋白質を生産するヌクレオチド配列を意味する。このような抗原性遺伝子の例には、癌胎児性抗原(carcinoembryonic antigen, CEA)及びp53(Levine, A.,国際特許出願公開WO 94/02167号)が含まれる。免疫システムが容易に認識するようにするために、前記抗原性遺伝子をMHC第I型抗原に結合させることができる。
【００５８】
本発明の明細書において、用語‘細胞毒性遺伝子(cytotoxic gene)’は、細胞内で発現されて毒性効果を示すヌクレオチド配列を意味する。このような細胞毒性遺伝子の例には、シュードモナス外毒素(exotoxin)、リシン毒素、ジフテリア毒素などをコーディングするヌクレオチド配列が含まれる。
【００５９】
本発明の明細書において、用語‘細胞増殖抑制遺伝子(cytostatic gene)’は、細胞内で発現されて細胞周期途中に細胞周期を停止させるヌクレオチド配列を意味する。このような細胞増殖抑制遺伝子の例には、p21、網膜芽細胞腫遺伝子、E2F-Rb融合蛋白質遺伝子、サイクリン−従属性キナーゼ抑制因子をコーディングする遺伝子(例えば、p16, p15, p18及びp19)、成長中止特異性ホメオボックス(growth arrest specific homeobox: GAX)遺伝子(国際特許出願公開WO97/16459号及びWO96/30385号)などがあり、これに限定されるものではない。
【００６０】
本発明の明細書において、用語‘細胞死滅遺伝子(apoptotic gene)’は、発現されてプログラムされた細胞消滅を誘導するヌクレオチド配列を意味する。このような親-細胞死滅遺伝子の例には、p53,アデノウイルスE3-11.6K(Ad2及びAd5由来)またはアデノウイルスE3-10.5K(Ad由来)、アデノウイルスE4遺伝子、p53経路遺伝子及びカスパーゼをコーディングする遺伝子が含まれる。
【００６１】
本発明の明細書において、用語‘抗−新生血管生成遺伝子(anti-angiogenic gene)’は、発現されて抗-新生血管生成因子を細胞外に放出すヌクレオチド配列を意味する。抗-新生血管生成因子には、アンジオスタチン、Tie 2(PNAS , 95:8795-800 (1998))のような血管内皮成長因子(VEGF)の抑制因子、エンドスタチンなどが含まれる。
【００６２】
本発明は、多様な細胞に適用されて細胞内にカルゴを運搬することができる。例えば、本発明で利用できる細胞は、動物細胞、より好ましくは、哺乳動物細胞、さらに好ましくは、ヒト、マウス、ラット、牛、豚、馬、ウサギまたはヤギの細胞できる。また、本発明が適用できる細胞は、体細胞、生殖細胞、免疫細胞、胚芽幹細胞、成体幹細胞、iPCs(induced pluripotent stem cells)または前駆細胞に適用できる。また、本発明は、腫瘍細胞、癌細胞株及び初期培養細胞(primary cultured cells)に全て適用できる。
【００６３】
本発明の特徴及び利点を要約すると、以下のようである：
(ｉ)本発明は、ナノ粒子を含む遺伝子運搬体を提供する。より具体的には、(ａ)ナノ物質と、(ｂ)前記ナノ物質の表面と共有結合で連結された(covalently linked to)ユニバーサル結合パートナー(universal binding partner)としてのオリゴヌクレオチドと、(ｃ)(ｉ)前記結合パートナーに相補的な配列を含む結合カウンターパートナー(binding counter-partner)としての相補的オリゴヌクレオチド、(ii)発現を減少させようとするターゲット遺伝子に相補的な配列を有する抑制分子(inhibitory molecule)を含む運搬対象(cargo)を含む遺伝子運搬体を提供する。
【００６４】
(ii)本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドだけではなく、アプタマー、siRNA, shRNA, miRNA,リボザイム, DNAzyme, PNAまたは遺伝子を細胞内に容易に運搬できるシステムである。
【００６５】
(iii)また、本発明は、商業的に利用する遺伝子伝達試薬(例えば、Lipofectamine 2000)よりターゲット遺伝子の発現をより効率的にノック−ダウンさせる。
【００６６】
〔図面の簡単な説明〕
図1は、一本鎖DNAで機能化された金(Au)ナノ粒子−アンチセンスの概略図である。Au nanoparticle：金ナノ粒子；Antisense DNA：アンチセンス DNA；Target mRNA：ターゲットmRNA。
【００６７】
図2は、HeLa細胞の共焦点蛍光顕微鏡イメージである。パネルAは、DAPIで染色された細胞核であり、パネルBは、1.0nM AuNP GDS-Mcl1-1L-AS-FITCコンジュゲート(conjugates)に露出させたHeLa細胞であり、パネルCは、コンジュゲートがHeLa細胞に伝達されたイメージであって、パネルDは、A, B及びCのイメージをオーバーレイ(overlay)したイメージである。
【００６８】
図3は、HeLa細胞において、遺伝子ノックダウンに対するそれぞれの金NP-GDS-アンチセンスオリゴコンプレックス容量による反応を示した結果である。Percent knockdown：ノックダウンパーセントを意味する。
【００６９】
図4は、それぞれ異なる細胞株において、金NP-GDS-アンチセンスオリゴコンプレックスによる遺伝子発現のノックダウンに対する結果である。
【００７０】
図5は、インキュベーション時間の増加によるHeLa細胞において、AuNP-GDS-AS-Mcl-1コンジュゲートによるa-McL-1発現ノックダウン効率に対する結果である。
【００７１】
図6は、金ナノ粒子GDS上にAS DNAの数を示した結果である。パネルAは、FITC-アンチセンスオリゴヌクレオチドのカリブレーションキュアをした結果グラフであり、縦軸は、518nmで統一させた蛍光性を意味し、横軸は、FITC-アンチセンスDNAの濃度を意味する。パネルBは、金ナノ粒子GDS上にDNAの数を示したものであり、縦軸は、金ナノ粒子-FITC-アンチセンスDNA複合体の製造時、金ナノ粒子上に存在するFITC-DNAの数を意味し、横軸は、金ナノ粒子-FITC-アンチセンスDNA複合体の製造時、金ナノ粒子10nM当たり、混合するFITC-DNAの濃度を意味する。
【００７２】
図7aは、AuNP-αRNA Iにより伝達されたアンチセンスオリゴによるp53の発現をノックダウンさせた結果である。図7bは、p53の発現をノックダウンさせる時に使用された金ナノ粒子に結合されたAuNP-オリゴ及びアンチセンスオリゴの塩基配列を示したものである。
【００７３】
図8aは、AuNP-αGFPにより伝達されたsh RNAにいよるp53の発現をノックダウンさせた結果である。図8bは、p53の発現をノックダウンさせる時に使用された金ナノ粒子に結合されたAuNP-オリゴとp53 sh RNAの塩基配列(上)及びp53 sh RNAの合成過程(下)を示したものである。
【００７４】
図9aは、AuNP-αRNA Iにより伝達されたルシフェラーゼ遺伝子の発現を比較した結果である。図9bは、ナノ粒子表面と共有結合により連結された(covalently linked to)ユニバーサル結合パートナー(universal binding parter)としてのAuNP-αRNA Iのオリゴヌクレオチド、前記結合パートナーに相補的な配列を含む結合カウンターパートナー(binding counter-partner)としての相補的オリゴヌクレオチド及び重合酵素連鎖反応(PCR)を利用して合成されたSV40プロモーターとルシフェラーゼ遺伝子を示した塩基配列及び模式図である。図9cは、四つのオリゴとpGL3-Controlプラスミドを使用して3種のPCR DNAを合成した結果である。図9dは、pGL3-Controlプラスミドの模式図を示したものである。
【００７５】
図10は、一本鎖DNA機能化された金ナノ粒子及びshRNAコンジュゲートを図式的に示した図面である。本研究で利用されたshRNA配列が示されている。
【００７６】
図11は、一本鎖DNA機能化された金ナノ粒子により運搬されたshRNAsの効果を示す結果である。図11aは、HEK293細胞において、AuNP・αEGFP・shRNA-p53コンジュゲートの投与量によるp53遺伝子のノックダウン程度を調べた結果である。HEK293細胞をAuNP・αEGFP・shRNA-p53コンジュゲートと反応し、処理24時間後に収得してウェスタンブロット分析を行った。図11bは、HEK293及びHeLa細胞において、AuNP・αEGFPにより運搬されたshRNA-p53のノックダウン効率を調べた結果である。細胞にAuNP・αEGFP・shRNA-p53コンジュゲートまたはshRNA-p53及びリポフェクタミンの混合物を処理して、24時間後に収得しウェスタンブロット分析を行った。図11cは、AuNP・αEGFP・shRNA-p53コンジュゲートによるp53遺伝子発現のノックダウン効果の持続を観察した結果である。HeLa細胞にAuNP・αEGFP・shRNA-p53コンジュゲートを処理して、指定された時間に収得してウェスタンブロット分析を行った。図11dは、HeLa細胞において、AuNP・αEGFP・shRNA-Mcl-1LコンジュゲートによるMcl-1L発現のノックダウンを調べた結果である。HeLa細胞にAuNP・αEGFP・shRNA-Mcl-1Lコンジュゲートを処理して、指定された時間に収得してウェスタンブロット分析を行った。図11eは、HeLa細胞において、AuNP・αEGFP・shRNA-p53コンジュゲートのp53 mRNAの正常状態(steady state)レベルに対する影響を調べた結果である。HeLa細胞にAuNP・αEGFP・shRNA-p53コンジュゲートを処理して、24時間後に収得し、総RNA抽出に利用した。分離されたRNAを利用して、半-定量的RT-PCRを行った。
【００７７】
図12は、HEK293細胞において、AuNP・RNA I・shRNA-Mcl-1LによるMcl-1L発現のノックダウンを調べた結果である。HEK293細胞にAuNP・RNA I・shRNA-Mcl-1Lコンジュゲートを処理して24時間後に収得し、ウェスタンブロット分析を行った。
【００７８】
図13は、DNAzyme-アニーリングされた金ナノ粒子の製造過程を示す図面である。図13aは、RNA-切断DNAzymeの一般的な配列をボックス内に表示している。DNAzymeは、RNAにおいてDNAzyme配列に相補的なプリン(R)及びピリミジン(Y)接合部位(junction)を切断する。これにより、DNAzymeの切断位置としてβ-カテニンの2208番目位置(Dz2208)が選択された。図13bは、GFPアンチセンスオリゴヌクレオチド-コンジュゲーションされた金ナノ粒子にアニーリングされたDNAzymeの活性機序を示す図式である。図13cは、GFPアンチセンスオリゴヌクレオチドにアニーリングされたDNAzymeの配列を示す。
【００７９】
図14は、DNAzyme-アニーリングされた金ナノ粒子が細胞においてターゲット遺伝子の発現を減少させることを示す結果である。図14aは、金ナノ粒子にアニーリングされたDNAzymeの程度を15%天然ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した結果である(参照：本文)。図14bは、GFP-発現細胞で金ナノ粒子にアニーリングされたDNAzymeをトランスフェクションした。トランスフェクション24時間後、細胞から放出される緑色蛍光を蛍光顕微鏡を利用して測定した。金ナノ粒子のトランスフェクション後、細胞内緑色蛍光が減少されたことが分かる。図14cは、Dz2208-アニーリングされた金ナノ粒子(1.0-10.0nM)でトランスフェクションされた大腸がん細胞株を溶解して、ウェスタンブロットアッセイを通じてβ−カテニン蛋白質発現を分析した。
【００８０】
〔発明を実施するための形態〕
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例に限定されないことは、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者にとっては自明なことであろう。
【００８１】
〔実施例〕
特に言及しない限り、固体/固体は、(重量/重量)％、固体/液体は、(重量/容量)％、そして液体/液体は、(容量/容量)％である。
【００８２】
（実験材料及び実験方法）
（一本鎖DNA機能化されたAuNP-shRNAコンジュゲートの製造）
アニリングバッファ(0.3M NaClを含む1×PBS)でAuNP・αGFPまたはAuNP・RNA I(10nM)をshRNAと10分間徐々にシェークして混合した後、10分間55℃で反応させて、約1時間4℃に冷却させた。生成されたコンジュゲートを12,000gで10分間ダウンさせた後、上澄み液を除去して、コンジュゲートペレットをDMEM培地で再懸濁した。上述の沈殿及び再懸濁段階を3回繰り返して行った。生成されたコンジュゲート(10nM)を最終濃度1nMになるように組織培養培地に添加した。
【００８３】
（shRNAのインビトロ合成）
製造者の指示にしたがって、MEGAshortscriptTM キット(Ambion, USA)を利用してT7プロモーター配列及び以後短いヘアーピン構造のp53及びMCL-1配列を含む合成オリゴヌクレオチドからshRNAを合成した。PCRを利用してオリゴヌクレオチドを増幅することにより、DNAテンプレートを製造した。AuNP・αGFPと混成化されるshRNA-p53及びshRNA-Mcl1の合成のために、sh-p53-テンプレート(5'-TAATACGACTCACTATAGGGACGGCAGCGTGCAGCTCGACTCCAGTGGTAATCTACTTCAAGAGAGTAGATTACCACTGGAGTCTT;下線の部位, T7プロモーター)及びsh-Mcl-1L-テンプレート-1(5'-TAATACGACTCACTATAGGGACGGCAGCGTGCAGCTCCCCCGGGACTGGCTAGTTAAACTTCAAGAGAGTTTAACTAGCCAGTCCCGTTTTTGGAAA-3';下線の部位、T7プロモーター)をそれぞれ利用した。AuNP・αRNA Iと混成化されるshRNA-Mcl1の合成のために、sh-Mcl-1L-テンプレート-2(5'-TAATACGACTCACTATAGGCTCTAGCAGAGCCGAGATCCCCGGGACTGGCTAGTTAAACTTCAAGAGAGTTTAACTAGCCAGTCCCGTTTTTGGAAA-3';下線の部位、T7プロモーター)。利用されたPCRプライマーは、T7-1(5'-TTAATACGACTCACTATAGG-3')及びsh-p53-R(5'-AAGACTCCAGTGGTAA-3')、shMCL-1-R(5'-TTACCAAAAACGGGACTGGCT-3')であった。合成されたshRNAsをillustraTM MicroSpinTM G-50 columns(GE; Little Chalfont, Buckingham shire, UK)を利用して精製した。
【００８４】
（ウェスタンブロット分析）
HEK293(4.5×105)またはHeLa(3.0×105)細胞を、金-ナノ粒子で機能化された短いヘアーピンRNAと6-ウェルディッシュで反応させた。細胞を10%プロテアーゼ抑制剤カクテル(Sigma)を含むNP-40溶解緩衝液(50mM Tris-HCl(pH 8.0), 0.15M NaCl及び1% NP-40)で溶解させた。定量的蛋白質分析のために、標準BSA溶液(Pierce, Rockford, IL, USA)を利用して、標準曲線を確立して、同量の総蛋白質を含む細胞溶解物を10%ポリアクリルアミドゲルで分離して、ニトロセルロース膜に移してウェスタンブロット分析を行った。抗-p53単一クローン抗体(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)及び抗-MCL1-Lポリクローナル抗体(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)を、それぞれp53及びMCL-1Lを検出するために利用した。
【００８５】
（半−定量的RT PCR）
総RNAを製造者の指示にしたがって、TRI Reagent（登録商標） Solution(Ambion)を利用して細胞株から抽出した。3μgの総RNAを、テンプレートとしてPrimScriptTM 1st-Strand cDNA合成キット(Takara; Otsu, Shiga, Japan)を使用してcDNA合成を行った。PCRは、2μlのRT反応物を含む総20μl容量で行った。PCR産物を2%アガロースゲルで分析した。利用されたプライマーは、次のようである: p53-F(正方向), 5'-AGCTTTGAGGTGCGTGTTTG-3'及びp53-R(逆方向), 5'-TCAGCTCTCGGAACATCTCG-3'; MCL-1L-F(正方向), 5'-TGGTCGGGGAATCTGGTAAT-3'及びMCL-1L-R(逆方向), 5'-GTAAGGTCTCCAGCGCCTTC-3';及びGAPDH-F(正方向), 5'-AGCCAAAAGGGTCATCATCTCT-3'及びGAPDH-R(逆方向), 5'-AGGGGCCATCCACAGTCTT-3'。
【００８６】
（DNAzyme-アニーリングされた金ナノ粒子の製造及びゲル-シフト分析）
β-カテニンmRNA-切断DNAzyme(図13に記載された配列)を製造して、これの5’-末端配列を、金ナノ粒子にコンジュゲーションされたGFPアンチセンスオリゴヌクレオチドにアニーリングするように考案した(図13)。DNAzymeをGFPアンチセンスオリゴヌクレオチド-コンジュゲーションされた金ナノ粒子にアニーリングするために、次の過程を行った。金ナノ粒子溶液(36.5nM)1mlを4℃で13,000rpmで40分間遠心分離した。上澄み液を除去して、ペレットを脱塩(saline-free)リン酸緩衝液(pH.7.5)に溶解された1% BSA溶液1mlと迅速に混合した。常温で30分間ペレット溶液を反応させた後、溶液を4℃で13,000rpmで40分間遠心分離した。金ナノ粒子を含むペレットを脱塩リン酸緩衝液(pH.7.5)300μlに再懸濁して120nMになるように製造した後、今後の利用のために4℃に保管した。上述のように製造されたBSA-保護された金ナノ粒子の多様な量(図14に示された濃度)とDNAzymeオリゴヌクレオチド(10μM)10μlを混合した。混合溶液に20mM MgCl2及びTris/HCl(20mM, pH7.5)を添加した。DNAzymeを金ナノ粒子にアニーリングするために、DNA-混合された溶液に95℃、2分間及び42℃、10分間熱を加えた後、常温に徐々に冷やした。このようにDNAzyme-アニーリングされた金ナノ粒子が製造された。金ナノ粒子にアニーリングするDNAzymeの量を15%天然(非変性)ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した。DNAzyme(10μM)の固定された量を、BSA-保護された金ナノ粒子の増加する量(0, 0.5, 1, 2, 4, 10及び15μl)と混合した。ゲルを2時間電気泳動して、EtBr(ethidium bromide)で染色した後、UV照射器(UV transilluminator)を利用してDNAを検出した(図14A)。
【００８７】
（細胞培養、オリゴヌクレオチドのトランスフェクション及び蛍光顕微鏡方法）
大腸癌細胞株SW480をATCC(American Type Culture Collection; Manassas, VA, USA)から購入して、5% CO2 湿度調節された37℃培養器で10% FBS、120μgペニシリン/ml、及び200μgストレプトマイシン/mlが添加されたDMEM培地を利用して維持した。50-60%コンフルエンスを得るために、6×104 細胞を10%FBSを含む培地下で12-ウェルプレートにプレーティングした。製造者の指示にしたがって、リポフェクタミンTM 2000(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)を利用して細胞に緑色蛍光蛋白質(GFP)発現プラスミドDNAをトランスフェクションさせた。培養培地を入れ換えることにより、トランスフェクション試薬を完全に除去した。GFPプラスミドをトランスフェクションして24時間後、GFPアンチセンスオリゴヌクレオチド−変形された金ナノ粒子を利用してアンチセンスDNAzymeオリゴヌクレオチドのトランスフェクションを行った。DNAzymeの形質転換は、各オリゴヌクレオチドの所望の濃度を有する金ナノ粒子を利用して行った。DNAzyme-アニーリングされた金ナノ粒子のトランスフェクション24時間後、蛍光顕微鏡を利用して細胞から放出される緑色蛍光を測定した(図14B)。緑色蛍光をモニタリングした後、細胞を収得して溶解緩衝液(20mM Tris-HCl(pH 8.0), 0.1% NP-40, 20mM EDTA, 10%グリセロール及び10mM KCl)で破壊して、ウェスタンブロット分析を行った。
【００８８】
溶解された細胞蛋白質を10% SDS-PAGEで分離した後、ニトロセルロース膜(Whatman)に移した。膜を5%脱脂粉乳で遮断した後、抗-β-カテニン(1:500希釈; Santa Cruz Biotechnology)及び抗-β-アクチン(1:1000希釈; Sigma)でプローブした。洗浄した後、膜をホースラディッシュペロキシダーゼ-コンジュゲーションされた抗-マウスIgG抗体(1:3000希釈; Santa Cruz Biotechnology)と常温で1時間反応した。以後、ECL(enhanced chemiluminescence system; Intron Biotechnology, Seoul, Korea)を利用して検出した(図14C)。
【００８９】
（実施例１: AuNP GDS-Mcl-1L-ASコンジュゲートの製造）
本研究は、ターゲット遺伝子に特異的なアンチセンスDNAを積載及び伝達するためのフラットフォームとして、一本鎖DNAで機能化された金ナノ粒子(以下、‘金ナノ粒子遺伝子伝達システム(gold nanoparticle gene delivery system: AuNP GDS)’という)を利用する遺伝子伝達システムを開発した。
【００９０】
EGFP(enhanced green fluorescent protein)のコーディング部位(1198から1215まで塩基配列5'-GAGCTGCACGCTGCCGTC-3')に相補的な配列(抗-EGFPオリゴ)を有するオリゴヌクレオチド(5'-CTCGACGTGCGACGGCAG-3')を利用して、ヒト組織培養において、このような抗-EGFPオリゴは、他の遺伝子の発現を干渉することなく、効率的に細胞内に伝達されてEGFP発現を抑制させた。[9]チオール化された(thiolated)抗EGFPオリゴで水溶液上でHAuCl3をcitrateで還元する一般的な方法を通じて合成された13nm金ナノ粒子を機能化してAuNP GDSを製造した。[10]AuNP GDSが遺伝子伝達システムに利用できるかを検証するために、抗EGFPオリゴで機能化された金ナノ粒子を抗EGFPオリゴDNAの相補的な配列とMcl-1L(myeloid cell leukemia-1 long)遺伝子に特異的な配列を有したアンチセンスDNA(AuNP GDS-AS)とアニーリングさせた後、その結合されたコンジュゲートをHeLa細胞(Human Cervix Carcinoma,韓国細胞株銀行)に適用した。Mcl-1L遺伝子は、白血病細胞(leukemia cell)が分化する間、初期誘導遺伝子と明かされた抗-細胞死滅Bcl-2ファミリー蛋白質(anti-apoptotic Bcl-2 familly protein)を暗号化する遺伝子である。細胞内にアンチセンスオリゴの伝達を確認するために、3’末端にFITCで標識されたオリゴを利用してAuNP GDS-Mcl-1L-AS-FITCを製造した((株)COSMO GENETECH, Seoul, Korea)。アンチセンスMcl-1L DNAは、AuNP GDSに相補的な配列の次に、Mcl-1L mRNAの内部コーディング部位(576から595まで塩基配列(5'-TTGGCTTTGTGTCCTTGGCG-3')と相補的な20個のヌクレオチド配列を連続して含む[11]。
テストされた全ての細胞において、Mcl-1L-AS-FITCから出る蛍光光を蛍光顕微鏡分析を通じて確認して、AuNP GDS-Mcl-1L-AS-FITCは、優れた形質転換(transfection)効率を示した(図2)。一本鎖DNAで機能化された金ナノ粒子が細胞内に容易に入ることについては、既に報告された。しかしながら、本研究結果では、二本鎖DNA(20個の塩基対)を部分的に含むAuNP GDS-ASコンジュゲートがほぼ100%効率で細胞内に入ることを確認した。AuNP GDS-ASコンジュゲートは、アニーリングバッファ(0.3M NaClを含む1×PBS)で0.1または1μMアンチセンスオリゴヌクレオチドとAuNP GDSを徐々に混合した後、10分間55℃でアニーリングさせて、1時間室温までインキュベーションした。生成されたコンジュゲートをpH 7.4のPBS(Phosphate Buffer Saline)緩衝液で3回洗浄後、細胞に適用した。
【００９１】
（実施例2：アンチセンスオリゴのターゲット遺伝子発現に対するノック−ダウン検証）
その後、アンチセンスオリゴがターゲット遺伝子発現をノックダウンさせるかをテストした。AuNP GDS-Mcl-1L-AS コンジュゲートをHeLa細胞に適用して、ウェスタンブロット分析を利用し、MCL-1Lの定量を分析するために形質転換をさせた後、24時間培養して蛋白質サンプルを製造した。図3に示したように、AuNP GDS-Mcl-1L-ASコンジュゲートは、MCL-1Lアンチセンス濃度依存方式において、MCL-1L発現を効率的にノック-ダウンさせた。0.1μM Mcl-1L ASがリポソーム含有試薬(Lipofectamine 2000, Invitrogen)を使用して細胞内に伝達された時、ノック-ダウン効率は、AuNP GDS(9.8vs. 19.5%)よりさらに低く、このような結果は、AuNP GDSシステムが、アンチセンスDNAを運搬するにおいて、リポソーム含有試薬を利用することよりさらに効率的であることを意味する。
【００９２】
（実施例3：遺伝子伝達システムとしてのAuNP GDS検証）
遺伝子伝達システムとしてAuNP GDSを使用できるかどうかを検証するために、遺伝子をターゲットとする二つの追加的なアンチセンスだけではなく、他のヒト細胞株(HEK 293T, Human Embryonic Kidney 293T、韓国細胞株銀行)をテストした。
【００９３】
293T(4.5×105)またはHeLa(3.0×105)細胞を6-ウェルディッシュに、アンチセンスオリゴで機能化された金-ナノ粒子と共にインキュベーションした。10%プロテアーゼ抑制剤カクテル(Sigma)を含むNP-40溶解緩衝液(50mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.15M NaCl及び1% NP-40)で細胞溶解物を製造した。定量的蛋白質分析のために、標準BSA溶液(Pierce, Rockford, IL, USA)で標準曲線を確立して、標準蛋白質と同一な量が含まれている細胞溶解物をSDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)で測定した。分離された蛋白質をニトロセルロース膜(nitrocellulose membrane)に移してウェスタンブロットを行った。抗-MCL-1L及び抗-p53単一クローン抗体(全てSanta Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USAから購入)を利用してMCL-1Lとp53を検出した。
【００９４】
p53は、癌抑制子であって、DNA損傷後及びアポトーシス(apoptosis)において、細胞-サイクルの停止を維持するに重要な役割するとよく知られた転写因子である。[12] AuNP GDSに相補的な配列を含むp53遺伝子に対するアンチセンスDNAは、AS-p53-1[13]の場合、AuNP GDSに相補的な配列の次にp53(886番目から905番目塩基配列5'-CCCTGCTCCCCCCTGGCTCC-3')の内部コーディング領域が連結されており、AS-p53-2[14]の場合、AuNP GDSに相補的な配列の次に、p53の一番目のコドンの手前の6個の塩基対をカバーする領域と最初の4個の暗号コードンと相補的な20個のヌクレオチド配列が連結されている(5'-GGGCACCACCACACTATGTCGAA-3')。製造されたコンジュゲートをHeLa細胞または293T細胞と共にインキュベーションした。24時間インキュベーションした後、細胞を回収して、ターゲット蛋白質発現は、比較蛋白質としてGAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)を標準に定量した。三つのナノコンジュゲート(nanoconjugate)は、二つの異なるヒト細胞株において、ターゲット蛋白質の水準を効率的に減少させた(図4)。それだけではなく、AuNP GDSそれ自体がターゲット蛋白質または比較標準蛋白質の発現水準に影響を与えなかった。このようなデータは、AuNP GDSが一つのヒト細胞株以上において、ある任意の特定遺伝子に特異的なアンチセンスDNAに対する普遍的な遺伝子伝達システムとして使用できることを意味する。本研究者らは、Escherichia coli 内ColE1-タイププラスミドの複製と関連があるRNA I(13から30までの塩基)に係わるオリゴ配列を含む他のAuNP GDSをテストした。[15, 18] RNA Iの13から30番の間の配列と相補的な配列を含んだAS-p53-1アンチセンスDNAをAuNP GDSに結合させて、その結果物であるコンジュゲートをHeLa細胞または293T細胞とインキュベーションさせた。図4に示された類似した結果を得ることができた(図7)。
【００９５】
（実施例4:金ナノ粒子と結合されたDNAオリゴヌクレオチドの安定性検証）
金ナノ粒子と結合された一本及び二本鎖DNAオリゴヌクレオチドが、細胞内で非結合されたDNAまたはRNAオリゴヌクレオチドより相対的に著しく安定的であることが確認された。[16] このような安定性は、ヌクレアーゼ(nuclease)の酵素的活性を不活性化させることができる立体的妨害(steric hindrance)及び高い局所的塩の濃度によるものである。アンチセンス核酸(nucleic acid)として効果的であるためには、アンチセンス核酸の活性が細胞内で長いインキュベーション時間安定的に維持されなければならない。
【００９６】
したがって、本研究者らは、HeLa細胞において、三日以上ターゲット蛋白質発現のノックアウト水準程度を測定することにより、AuNP GDS-ASのインキュベーション時間-依存的効率性を測定した。三日間のインキュベーション後、293T細胞において、MCL-1Lに対するノック−ダウン効率は、57.8%から51.3 %に多少減少された反面、HeLaにおいて、p53に対するノック-ダウン効率は、55.8%から50.0%に減少した(図5)。このような結果は、AuNP GDSにより伝達されたアンチセンスDNAs活性の約90%がヒト細胞で三日間維持されたことを意味する。
【００９７】
（実施例5: AuNP GDS上でAS DNAの数の決定）
アニーリングバッファ(0.3M NaClを含む1xPBS)において、0.1または1μM FITC-アンチセンスオリゴヌクレオチドとAuNP GDSを10分間徐々に混合した後、10分間55℃でインキュベーションさせて、1時間室温で冷却させた。生成されたコンジュゲートを4℃で20分間10,000gで遠心分離した。AuNP GDS上にFITC-アンチセンスオリゴヌクレオチドのローディング(loading)は、FITC-アンチセンスオリゴヌクレオチドのカリブレーションキュアー(calibrations cure)を利用して、カップリング反応後、上澄み液(supernatant)の蛍光を測定して評価した(図6)。
【００９８】
（実施例6: 多様なAu GDS濃度における細胞生存能力の測定）
0, 1, 5または10nM 金ナノ粒子-抗GFPでHeLa細胞を形質転換させた後、48時間インキュベーションした。トリパンブルー(trypan blue)で死滅した細胞を染色した後、生存する細胞数を計算した。
【００９９】
結論的に、本研究者らは、一本鎖DNAで機能化された金ナノ粒子(AuNP GDS)が正常細胞生理に影響を及ぼすことなく、特定遺伝子に特異的なオリゴアンチセンスDNAsを遺伝子伝達システムとして利用できることを明かした。一般に、リポソーム形成または正常細胞過程を維持するために、数百個のmRNAsの安定性の制御を必要とするRISC(RNA-induced silencing complex)を利用して、ターゲットmRNA分解に使用するRNAに基づくノックダウンシステムを基礎とする遺伝子伝達システム[17]と比較し、AuNP GDSシステムにより伝達されるオリゴアンチセンスDNAsは、ターゲット遺伝子発意のノックダウンのための細胞的な装置を必要としないか、省くことができて、これは、mRNA-アンチセンスDNAデュープレックス(duplex)による翻訳過程抑制と関連があると推測される。したがって、AuNP GDSシステムにより伝達されたオリゴアンチセンスDNAは、正常細胞プロセスを邪魔することなく、ターゲット遺伝子発現のみをノックダウンさせる。AuNP GDS-アンチセンスコンジュゲートは、効果的にターゲット蛋白質発現をノックダウンさせるだけではなく、ターゲット蛋白質発現のノックダウン程度においても、商業的に有用な遺伝子伝達試薬(Lipofectamine 2000)より効率的である。また、AuNP GDSにより伝達されたアンチセンスDNAsは、三日間活性が維持された。総合的に、AuNP GDSが立派な遺伝子伝達システムであることを、本研究結果を通じて照明したのである。本システムは、siRNA, リボザイム(ribozyme), PNA(peptide nucleotide acid)伝達をするに非常に容易である(図8)。
【０１００】
（実施例7:金ナノ粒子にshRNA伝達及びターゲット遺伝子の発現阻害検証）
shRNAがターゲット遺伝子発現をノックダウンさせるかをテストした。siRNAは、ターゲット遺伝子の発現を抑制する効率的な遺伝子ノックダウン方法である。sh-p53-1[18]の場合、AuNP GDSに相補的な配列の次に、p53コーディング領域に相補的な塩基配列(5'-GACUCCAGUGGUAAUCUACUUCAAGAGAGUAGAUUACCACUGGAGUCUU-3')が連結されている。p53 sh RNAの合成過程は、図8Cに示した。T7プロモーターシーケンスの後ろ部分に抗EGFPオリゴシーケンスとループ構造を形成するp53に相補的なシーケンスを有したPCR DNAを合成して、これを鋳型としてMEGAshortscript TM Kit(Ambion,THE RNA COMPANY)を利用してsh-p53を自体製作した。アンチセンスオリゴと同じ方法でAuNP GDS-sh-p53-1コンジュゲートを製作し、293T細胞に適用した。ウェスタンブロット分析を利用して、p53の定量を分析するために形質転換をさせた後、24時間培養して蛋白質サンプルを製造した。図8aに示したように、AuNP GDS-sh-p53コンジュゲートは、結合したsh-p53アンチセンスの濃度に依存的にp53の発現を効率的にノックダウンさせた。
【０１０１】
（実施例8：金ナノ粒子に遺伝子伝達検証）
金ナノ粒子遺伝子伝達システム(AuNP GDS)を利用して、抗RNA I配列を含んでいる二本鎖DNAの細胞内に伝達が可能であるかをテストした。細胞内で伝達された遺伝子の活性を測定するために、発光酵素であるルシフェラーゼ遺伝子を使用した。図9に示されたように、pGL3-controlプラスミドを鋳型としてルシフェラーゼ遺伝子(塩基配列2431-2450)とSV40プロモーターを含んだPCR DNAを製作するために、それに相補的なヌクレオチド配列を有するプライマーと293T細胞で複製可能な起源のSV40プロモーター及び抗RNA I配列を有するプライマーを利用して連鎖重合酵素反応(PCR, Polymerase Chain Reaction)を行った。製作されたPCR DNAに5'末端と3'末端に抗RNA Iの配列を有する一本鎖DNAを作るために、それぞれのプライマーの5'部分に存在する抗RNA I配列の次にC6リンカーを含めた。PCR反応を通じて獲得した三つの生成物(5',3'-抗RNA I-Luc., 5’-抗RNA I-Luc.,3’-抗RNA I-Luc)をAuNP-GDSにコンジュゲーションさせた。まず、AuNPとの相補的な結合を容易にするために、それぞれの生成物を95℃で5分間変性させた後、アニーリングバッファ(0.3M NaClを含む1xPBS)でAuNP GDSと共に10分間55℃でインキュベーションさせて、1時間室温で冷却させた。次の過程は、アンチセンスオリゴAuNP GDS製作過程と同一である。製作されたAuNP GDS-Luc(ルシフェラーゼ遺伝子)を293T細胞に適用させた。ルシフェラーゼ遺伝子を細胞内で発現させた後、細胞を回収して活性を測定した(Luciferase Assay Kit, PROMEGA)。ルシフェラーゼ発光酵素は、基質である活性ルシフェリン(Luciferin)との酸化還元作用により光を発するようになる。図9aに示したように、5’に抗RNA Iヌクレオチド塩基配列を有した生成物(5’-抗RNA I-Luc)が活性を示した。AuNP-GDSを利用して二本鎖DNA遺伝子の細胞内の伝達も容易であることを確認した。
【０１０２】
（実施例9:一本鎖DNA機能化された金ナノ粒子(AuNP)の製造）
Rosiら[15]により開発された一本鎖DNA機能化された金ナノ粒子は、ヒト細胞にアンチセンスDNAを効果的に運搬し、結果的にターゲット遺伝子の発現をノックダウンさせると明かされた。また、このような機能化された金ナノ粒子は、リポソーム含有試薬により運搬されたアンチセンスDNAより低い細胞毒性を示した。それぞれターゲット遺伝子(gene of interest)を個別的に合成する必要がある、共有結合を通じて金ナノ粒子にクロス結合された(cross-linked)アンチセンスDNAを運搬できるシステムの不具合を克服するために、本発明者らは、一本鎖DNA機能化されたAuNPを、ターゲット遺伝子に特異的な小さいヘアーピンRNA(shRNA)の運搬のための普遍的な運搬体に利用できるかどうかをテストした。本発明者らは、EGFPのコーディング部位(1198から1215までの塩基)に相補的な配列(αEGFPオリゴ)を有するDNAオリゴヌクレオチド(oligo)を利用したが、このようなαEGFPオリゴは、ヒト組織培養において、他の遺伝子の発現を干渉することなく、効率的に細胞内に伝達されて、EGFP発現を抑制させた[15]。AuNP・αEGFPオリゴ複合体は、チオール化されたαEGFPオリゴを有する13nm金ナノ粒子を機能化して製造した[16]。
【０１０３】
（実施例10: AuNP・αEGFPオリゴ複合体によるshRNAsの運搬効果）
p53遺伝子に特異的なshRNAをインビトロで合成し、共有結合を通じてAuNPにクロス結合されたαEGFPオリゴにアニーリングした後、これにより生成されたコンジュゲートをHEK293細胞に処理した。p53遺伝子に対するshRNA(shRNA-p53)は、αEGFPオリゴに相補的な配列を含み、これに67個のヌクレオチド配列が結合されて、このshRNAは、ヘアーピンを形成する(図10)。ヘアーピンは、短い干渉RNAとして機能し、9個のヌクレオチドで構成されたループにより連結された(flanked)p53の内部コーディング部位(895から931までの塩基配列)に相応する逆方向(inverted direct)反復配列を含む[17]。AuNP・αEGFP・shRNA-p53コンジュゲートをHEK293細胞に処理して、ウェスタンブロット分析を利用して、p53を量的に分析するために24時間形質転換させた後、蛋白質試料を抽出した。図11Aから分かるように、AuNP・αEGFP・shRNA-p53コンジュゲートは、shRNA-p53濃度依存的にp53蛋白質の発現を効果的にノックダウンさせた。50nM以上の濃度でshRNA-p53を処理することにより、p53蛋白質の発現を90%以上抑制させた。リポソーム含有試薬を利用してshRNA-p53が細胞内に運搬された場合、ノックダウン効率が、AuNP・αEGFPを利用した場合と類似であった(図11B)。本発明者らは、また他のヒト細胞株であるHeLa細胞株において、AuNP・αEGFPにアニーリングされたshRNA-p53のトランスフェクションをテストし、HEK293細胞と類似した結果を得た(図11B)。このような結果は、AuNP・αEGFP-媒介のshRNAの運搬が特定細胞株に局限されるものではないことを意味する。
【０１０４】
shRNAとして効果的であるためには、活性が細胞内で長い反応時間(prolonged incubation time)安定に維持される必要がある。このような理由で、本発明者らは、多様な時間間隔でHeLa細胞におけるp53蛋白質発現のノックダウンレベル程度を測定することにより、AuNP・αEGFP・shRNA-p53の反応時間-依存的効率を調べた。2-4時間反応した場合、ノックダウン効率が0-21.0%に少し増加して、12-24時間反応した場合、97%以上に著しく増加した(図11C)。また、48時間反応させた場合は、35.5%まで減少した。このような結果は、AuNP・αEGFPにより運搬されたshRNAの活性がヒト細胞において24時間大部分維持されることを示す。
【０１０５】
一般的な遺伝子運搬システムとしてAuNP・αEGFPの機能を調べるために、本発明者らは、抗-apoptotic Bcl-2ファミリー蛋白質をコーディングするMcl-1L(myeloid cell leukemia-1 long)遺伝子をターゲットする追加的なshRNAをテストした。Mcl-1L遺伝子に対するshRNA(shRNA-Mcl-1L)は、αEGFPオリゴに相補的な配列を含み、これに78個のヌクレオチド配列が結合されて、このshRNAは、ヘアーピンを形成する(図10)。ヘアーピンは、9個のヌクレオチドで構成されたループにより連結されたMcl-1Lの内部コーディング部位(906から925までの塩基配列)に相応する逆方向反復配列を含む[18]。今後、AuNP・αEGFP・shRNA-Mcl-1LコンジュゲートをHeLa細胞に処理した。24時間反応した後、細胞を収得して、ウェスタンブロット分析を利用してターゲット蛋白質の発現を定量した。上述のナノコンジュゲートは、HeLa細胞において、MCL-1L蛋白質のレベルを効果的に減少させた(図11D)。
【０１０６】
本発明者らは、AuNP・αEGFP・shRNA-p53で処理されたHeLa細胞において、p53 mRNAの正常状態(steady-state)レベルを測定した。半-定量的RT-PCRを利用して測定されたp53 mRNAのレベルは、非-処理された細胞の35%以下レベルに減少した(図11E)。このような結果に基づいて、本発明者らは、AuNP・αEGFP媒介の遺伝子発現のノックダウンがターゲットmRNAの速い分解を招来すると結論付けた。
【０１０７】
（実施例11:一本鎖DNA機能化されたAuNPによるshRNA運搬の効率上においてDNAオリゴ配列の効果）
また、本研究者らは、Escherichia coli 内ColE1-タイププラスミドの複製のためのアンチセンスRNAであるRNA Iの一部配列(AuNP・RNA I)を含むオリゴヌクレオチド(オリゴ)を含む一本鎖DNA機能化されたAuNPをテストした[19]。RNA Iオリゴの配列に相補的な配列を有することを除いては、図11Eに記載された実験に利用されたshRNA-Mcl-1Lと類似したshRNAをAuNP・RNA Iにアニーリングして、その結果生成されたコンジュゲートをHEK293細胞と反応させた。図11Eに示されたのと類似した結果が得られた(図12)。
【０１０８】
結論的に、本発明者らは、一本鎖DNA機能化された金ナノ粒子が、目的遺伝子に特異的なshRNAのための遺伝子運搬システムに利用できることを確認した。AuNP・αEGFP-shRNAコンジュゲートは、ターゲット蛋白質の発現を効果的にノックダウンさせるだけではなく、ターゲット蛋白質発現のノックダウン程度の側面で商業的に有用な遺伝子転移試薬として非常に効果的であった。まとめてみると、本発明者らの結果は、一本鎖DNA機能化された金ナノ粒子がshRNAのための非常に優れた遺伝子運搬システムであることを照明する。
【０１０９】
以上、本発明の特定の部分を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとっては、このような具体的な記述はただ望ましい具現例に過ぎなく、これに本発明の範囲が限定されないことは明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物により定義されると言える。
【０１１０】
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【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】一本鎖DNAで機能化された金(Au)ナノ粒子−アンチセンスの概略図である。
【図２】HeLa細胞の共焦点蛍光顕微鏡イメージである。
【図３】HeLa細胞において、遺伝子ノックダウンに対するそれぞれの金NP-GDS-アンチセンスオリゴコンプレックス容量による反応を示した結果である。
【図４】それぞれ異なる細胞株において、金NP-GDS-アンチセンスオリゴコンプレックスによる遺伝子発現のノックダウンに対する結果である。
【図５】インキュベーション時間の増加によるHeLa細胞において、AuNP-GDS-AS-Mcl-1コンジュゲートによるa-McL-1発現ノックダウン効率に対する結果である。
【図６】金ナノ粒子GDS上にAS DNAの数を示した結果である。
【図７ａ】AuNP-αRNA Iにより伝達されたアンチセンスオリゴによるp53の発現をノックダウンさせた結果である。
【図７ｂ】p53の発現をノックダウンさせる時に使用された金ナノ粒子に結合されたAuNP-オリゴ及びアンチセンスオリゴの塩基配列を示したものである。
【図８ａ】AuNP-αGFPにより伝達されたsh RNAにいよるp53の発現をノックダウンさせた結果である。
【図８ｂ】p53の発現をノックダウンさせる時に使用された金ナノ粒子に結合されたAuNP-オリゴとp53 sh RNAの塩基配列を示したものである。
【図８ｃ】p53の発現をノックダウンさせる時に使用された金ナノ粒子に結合されたAuNP-オリゴとp53 sh RNAの合成過程を示したものである。
【図９ａ】AuNP-αRNA Iにより伝達されたルシフェラーゼ遺伝子の発現を比較した結果である。
【図９ｂ】ナノ粒子表面と共有結合により連結された(covalently linked to)ユニバーサル結合パートナー(universal binding parter)としてのAuNP-αRNA Iのオリゴヌクレオチド、前記結合パートナーに相補的な配列を含む結合カウンターパートナー(binding counter-partner)としての相補的オリゴヌクレオチド及び重合酵素連鎖反応(PCR)を利用して合成されたSV40プロモーターとルシフェラーゼ遺伝子を示した塩基配列及び模式図である。
【図９ｃ】四つのオリゴとpGL3-Controlプラスミドを使用して3種のPCR DNAを合成した結果である。
【図９ｄ】pGL3-Controlプラスミドの模式図を示したものである。
【図１０】一本鎖DNA機能化された金ナノ粒子及びshRNAコンジュゲートを図式的に示した図面である。
【図１１ａ】HEK293細胞において、AuNP・αEGFP・shRNA-p53コンジュゲートの投与量によるp53遺伝子のノックダウン程度を調べた結果である。
【図１１ｂ】HEK293及びHeLa細胞において、AuNP・αEGFPにより運搬されたshRNA-p53のノックダウン効率を調べた結果である。
【図１１ｃ】AuNP・αEGFP・shRNA-p53コンジュゲートによるp53遺伝子発現のノックダウン効果の持続を観察した結果である。
【図１１ｄ】HeLa細胞において、AuNP・αEGFP・shRNA-Mcl-1LコンジュゲートによるMcl-1L発現のノックダウンを調べた結果である。
【図１１ｅ】HeLa細胞において、AuNP・αEGFP・shRNA-p53コンジュゲートのp53 mRNAの正常状態(steady state)レベルに対する影響を調べた結果である。
【図１２】HEK293細胞において、AuNP・RNA I・shRNA-Mcl-1LによるMcl-1L発現のノックダウンを調べた結果である。
【図１３ａ】RNA-切断DNAzymeの一般的な配列をボックス内に表示している。
【図１３ｂ】GFPアンチセンスオリゴヌクレオチド-コンジュゲーションされた金ナノ粒子にアニーリングされたDNAzymeの活性機序を示す図式である。
【図１３ｃ】GFPアンチセンスオリゴヌクレオチドにアニーリングされたDNAzymeの配列を示す。
【図１４ａ】金ナノ粒子にアニーリングされたDNAzymeの程度を15%天然ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した結果である。
【図１４ｂ】GFP-発現細胞で金ナノ粒子にアニーリングされたDNAzymeをトランスフェクションした結果を示す。
【図１４ｃ】Dz2208-アニーリングされた金ナノ粒子(1.0-10.0nM)でトランスフェクションされた大腸がん細胞株を溶解して、ウェスタンブロットアッセイを通じてβ−カテニン蛋白質発現を分析した結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図８ｃ】
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【図８ｄ】
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【図９ａ】
2012503494.tif 000015
【図９ｂ】
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【図９ｃ】
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【図９ｄ】
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【図１０】
2012503494.tif 000019
【図１１ａ】
2012503494.tif 000020
【図１１ｂ】
2012503494.tif 000021
【図１１ｃ】
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【図１１ｄ】
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【図１１ｅ】
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【図１２】
2012503494.tif 000025
【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１３ｃ】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１４ｃ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年8月27日(2010.8.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(ａ)ナノ物質と、
(ｂ)前記ナノ物質の表面と共有結合で連結された(covalently linked to)ユニバーサル結合パートナー(universal binding partner)としてのオリゴヌクレオチドと、
(ｃ)(ｉ)前記結合パートナーに相補的な配列を含む結合カウンターパートナー(binding counter-partner)としての相補的オリゴヌクレオチド、(ii)発現を減少させようとするターゲット遺伝子に相補的な配列を有する抑制分子(inhibitory molecule)または発現させようとするターゲット遺伝子の配列を有する誘導分子(inducing molecule)を含む運搬対象(cargo)と、
を含む遺伝子運搬体(gene delivery system)。
【請求項２】
前記ナノ物質は、８〜１００ｎｍの大きさを有するナノ粒子であることを特徴とする、請求項１に記載の遺伝子運搬体。
【請求項３】
前記ナノ粒子は、金属ナノ粒子であることを特徴とする、請求項２に記載の遺伝子運搬体。
【請求項４】
前記ナノ粒子は、金ナノ粒子であることを特徴とする、請求項３に記載の遺伝子運搬体。
【請求項５】
前記ユニバーサル結合パートナーとしてのオリゴヌクレオチドは、末端にチオール基またはアミン基が結合されていることを特徴とする、請求項１に記載の遺伝子運搬体。
【請求項６】
前記ユニバーサル結合パートナーとしてのオリゴヌクレオチドは、非−ヒトヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の遺伝子運搬体。
【請求項７】
前記結合カウンターパートナーとしての相補的オリゴヌクレオチドは、３〜１００個のヌクレオチドから構成されたことを特徴とする、請求項１に記載の遺伝子運搬体。
【請求項８】
前記(ｃ)において、発現を減小させようとするターゲット遺伝子に相補的な配列を有する抑制分子は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム(ribozyme)、ＤＮＡｚｙｍｅまたはＰＮＡであることを特徴とする、請求項１に記載の遺伝子運搬体。
【請求項９】
前記(ｃ)において、発現させようとするターゲット遺伝子の配列を有する誘導分子は、ＲＮＡまたはＤＮＡであることを特徴とする、請求項１に記載の遺伝子運搬体。
【国際調査報告】
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