(57)【要約】  本発明は、バイオテクノロジー、すなわち多能性幹細胞の製造に関する。本方法は、臍帯−胎盤複合体の細胞へのＲＮＡの導入を含み、ここで、ＲＮＡは多能性状態への細胞の移行をもたらす少なくとも１つの配列を有する。本方法は、多能性細胞を、体細胞変異を未だ獲得していない臍帯−胎盤複合体の細胞から効率的に製造することを可能とし、それにより腫瘍形成および再プログラム化の他の負の結果の確率を低減する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性状態への細胞の移行を確保する少なくとも１つの配列を有する核酸を哺乳動物細胞へ導入することによる多能性幹細胞の調製方法であって、前記方法において、哺乳動物の胎盤および臍帯の細胞が使用され、ＲＮＡが核酸として導入されることを特徴とする、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジー、特に哺乳動物の胎盤および臍帯の細胞からの多能性幹細胞の調製（preparing）に関する。「再プログラム化」の結果として調製される多能性幹細胞は、医薬および「再プログラム化」および「分化転換」において広く利用可能である。
【背景技術】
【０００２】
２００６年、Shinya Yamanakaの研究室（Kyoto, Japan）において、高分化型マウス細胞（線維芽細胞）に、４つの転写因子の遺伝子がレトロウイルスを用いて導入された（１）。１６日後、研究者らは、線維芽細胞がその形態を変化させ、培養中の細胞の挙動も変化することを発見した。セレクションの結果として、性質および特徴においてＥＳＣに似た細胞が残った。それらは、成体生物の細胞に分化することが可能であり、胚盤胞中に導入した後に動物の組織にコロニー形成することが可能であった。外観、性質および遺伝的ポートレート（genetic portrait）において、それらは天然の手段によって得られるＥＳＣと近かったが、同一ではなかったため、それらはｉＰＳ（induced pluripotency stem）細胞と呼ばれた。
【０００３】
２４の候補遺伝子の中でＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃ−ＭｙｃおよびＫｌｆ４の遺伝子の組合せが、最良の結果を与えた。Ｏｃｔ３／４およびＳｏｘ２の遺伝子は、胚発生の初期段階において機能する転写因子をコードし、それらは成体細胞においては働かない。Ｃ−Ｍｙｃ遺伝子も転写因子をコードするが、前の２つと異なり特異的ではなく、あらゆる細胞の細胞周期の調節および細胞分裂に関与し、癌原遺伝子である。最後の遺伝子Ｋｌｆ４もまた、特異的な時期または組織特異性はなく、転写因子をコードし、転写アクチベーターとして、およびリプレッサーとしての両方の役割を担っている可能性がある。しかしながら、その機能はほとんど知られていない。最初の２つの遺伝子は胚発生の初期段階に非常に特異的であるが、後の２つは腫瘍形成において重要な役割を担っている。
【０００４】
ｃ−Ｍｙｃ癌原遺伝子の使用は、得られた動物において、腫瘍形成頻度の増加につながり、起源細胞を得る手順の有効性は非常に低かった。
【０００５】
現在、ｉＰＳ細胞は、ヒトを含む多数の特殊化組織から調製されている。胚性および皮膚線維芽細胞以外に、神経細胞前駆体、腸管上皮細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、筋細胞、ケラチノサイト、肝細胞、基本（elementary）および他の細胞が、ｉＰＳに転換された（２）。
【０００６】
異なる研究室における同様の実験にも拘わらず、それらのうちで最も効率的なものは先駆的な遺伝系であり（１）、他のすべてはそれ程には効果的ではない。
ＥＳＣ培養培地でのセレクションとともに、強力な変異原性の影響（ウイルス＋転写因子遺伝子＋癌遺伝子）は、いくつかの単一細胞がセレクションプロセスを乗り越えることを可能とする。初期研究において記録されたｉＰＳ細胞形成効率は、いくらかのベーシスポイント（some basis points）までであった。それは、「再プログラム化」クローンにおいて観察された広範なばらつきの理由にちがいない。かかる推論は、大部分と比較して性質において多能性幹細胞に近い細胞が、成体生物においても潜在的に存在し得るという考えを実際に支持する。
【０００７】
体細胞再プログラム化に用いるすべての既存の方法の不利益は、以下を含む：
１．多様なベクター（特にウイルスベクター）の一部としての遺伝子注入は、トランスジェニック細胞材料をもたらし、ここで遺伝子および遺伝子を含むベクターは、ゲノムの異なる部分に組み込まれるため、生物を改変し、将来的に腫瘍形成を含む望まれない結果をもたらし得る。ウイルスＤＮＡのゲノム中への取り込みによって生じる腫瘍形成以外に、細胞活動およびさらなる細胞分化のプロセスにおける導入遺伝子（ウイルスの一部として導入される遺伝子）の再活性化の顕著なリスクがある。これは、単一細胞の別の再プログラム化につながり、多能性特性を獲得する可能性がある。同時に、再プログラム化された細胞が、生物のすでに分化した細胞によって囲まれる場合、再プログラム化された細胞は他の組織になる可能性があり、それはchoristiasおよびhamartiasの出現につながるだろう。この不適切な組織の発生は、最終的に腫瘍の形成をもたらし得る。
【０００８】
ＤＮＡを用いる遺伝子組み換えは、ＤＮＡでコードされるタンパク質の産生効率に関連する様々な不利益を有する。第一に、ＲＮＡがＤＮＡ分子から合成されなければならない。ＲＮＡ合成は核において行われるため、ＤＮＡ分子は細胞質から核の中へ入らなければならない。ウイルスのものを除くＤＮＡ送達系の大部分は、ＤＮＡを細胞質中のみに送達し、その後ＤＮＡは時折核の中へ入るはずである。同時に、核へ入った正確な分子数は知られていないか、または標準的ではなく、実際に使用した場合に、ばらつきは有害な結果をもたらし得る。
【０００９】
第二に、細胞におけるＲＮＡ合成は、プロモーター（細胞の転写因子のエントリーを可能とする配列）を必要とする。異なるタイプの細胞は、異なる転写因子のセットを有し、細胞の核の中に導入したコンストラクションからの標準的な発現を可能にするプロモーター配列を選択することを困難にする。例えば、ＥＦ１アルファプロモーターは、線維芽細胞においては機能しない。ウイルスプロモーターＣＭＶ、ＲＳＶ、ＳＶ４０および他のものは、大部分の細胞で機能する最も普遍的なプロモーター配列であるが、異なる効率を有する。同時に、異なるタイプの細胞について標準的著作がなく、ウイルスゲノムの一部は、ＤＮＡに導入され、プロモーター配列が細胞のゲノム中に組み込まれた場合においては、腫瘍形成につながる可能性がある。
【００１０】
第三に、細胞の核において合成されたＲＮＡは、細胞質に移動しなければならない。ゲノム配列からの内在性ＲＮＡ合成の場合においては、分子はイントロンおよびＲＮＡの安定性、および細胞質中へのその方向性のある運搬を可能とする他の配列を保有する。導入遺伝子が使用される場合の大部分において、ＲＮＡはかかる配列を有さない。この事実のため、核から細胞質中へのＲＮＡ運搬の効率は低く、保護されていないＲＮＡ配列はリボヌクレアーゼによる加水分解に曝される。これは、顕著な効率低下および細胞質中でのタンパク質合成における標準化の欠如につながる。
【００１１】
２．生物の個体の発生（ontogenesis：個体発生）の間、細胞は全能性（接合体）、多能性（内部細胞塊、インビトロにおける胚性幹細胞）、および最終分化（特殊化組織（specialized tissues））を経験する。生物の特殊化組織およびこれら組織の血管新生を補助する局所の幹細胞は、有限期間内で存在する。老化プロセスの後、生物の死が生じる。老化プロセスは、細胞における生物学的な「ごみ」（分解不能なタンパク質、脂質など）および遺伝学的な「ごみ」（個体発生の過程で蓄積した変異）の蓄積を含む、さまざまな範囲の細胞内現象と関係する。したがって、個体発生の間、成体生物の細胞は老化プロセスを引き起こし、生物の死につながる不可逆的な変化を蓄積する。成体生物における細胞の遺伝的プログラムは、核移植を用いる再プログラム化（Wilmut）および遺伝子を用いる遺伝的再プログラム化（Weintraub, Yamanaka）を含むさまざまな方法によって変化させることができる。
【００１２】
しかしながら、これらの場合において、再プログラム化は、すでに不可逆的な変化が蓄積したゲノムおよび細胞において行われる。さらに、治療におけるかかる物質の使用は有害な結果、早期老化、死、または最良でも腫瘍形成をもたらし得る。加えて、再プログラム化に必要な哺乳動物およびヒトの細胞は、時に利用可能ではなく、さらに検体採取は通常は侵襲的である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、内皮細胞培養物を示した図である。
【図２】図２は、選択した体細胞多能性幹細胞のコロニーを示した図である。
【図３】図３は、ｍＴｅＳＲ培地での選択した体細胞多能性幹細胞のコロニーを示した図である。
【図４】図４は、誘導された多能性を有する細胞の核型を示した図である。
【図５】図５は、（Ａ）８日目の胚様体、（Ｂ〜Ｄ）１４日目の胚様体の免疫組織学的分析、（Ｅ、Ｆ）奇形腫のヘマトキシリン・エオシン染色を示した図である。
【図６】図６は、神経上皮を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の開示
行われた研究の結果、多能性幹細胞は、哺乳動物の胎盤および臍帯の細胞から、これらに細胞の多能性状態への移行を可能とする配列を含むＲＮＡを注入することによって効率よく調製され得ることがわかった。
【００１５】
体細胞再プログラム化の提案された方法は、インビトロ転写系（すなわち、細胞外）において得られたＲＮＡの細胞内への注入に基づく。そうするために、例えば、ＳＰ６、Ｔ７、Ｔ３および他の安全な原核生物のプロモーター配列、およびそれぞれのポリメラーゼ（ＳＰ６、Ｔ７、Ｔ３）が使用される。インビトロで合成されるＲＮＡは、細胞の中へ導入される前に、外来性タンパク質および外来性ＤＮＡから最新のイオン交換クロマトグラフィー法で精製される。インビトロで得られるＲＮＡ量は、ミリグラムで、およびグラムでも測定され得る一方で、インビトロ転写系は標準化され得る。後者の場合、タンパク質をコードし、インビトロまたはインビボで哺乳動物の細胞中に入り得る分子に対し、正確にＲＮＡ量を計算することが可能である。例えば、デンドリマーなどの化学物質による化学的トランスフェクション、例えば、リポソームなどの脂質およびタンパク質による生物学的トランスフェクション、例えば、エレクトロポレーションなどの電気機械的トランスフェクションなどの方法がある。
【００１６】
加えて、ＲＮＡは、細菌の一部として、カチオンおよびアニオンポリマー、リポソーム複合体、電場への暴露、不活性粒子、または細胞中へ核酸を導入するのに適用可能な他の方法により導入され得る。この場合、ＲＮＡは核へ向かうことなく、および分解することなく、細胞質中へ入る。したがって、細胞質中で、それぞれのタンパク質の合成に直ちに関与し得る。合成に関与するＲＮＡ量は、正確に計算され得る。細胞中のＲＮＡ分子の平均半減期は、最大で数時間（３〜６）であり、注入された分子は、ＤＮＡ合成に関与し得る配列を欠く。したがって、ＲＮＡが注入された場合、細胞は遺伝子レベルで改変されず、細胞のゲノムは変化せず、細胞は腫瘍形成を引き起こし得るウイルスの遺伝的要素を獲得しない。加えて、分子が核の中へ入るため、ＲＮＡ合成のため、およびＲＮＡを細胞質へ戻す輸送のための余分な時間は必要としないうえ、注入したＲＮＡの量を標準化することができる。
【００１７】
他の多能性幹細胞の調製方法と異なり、本方法は、細胞の多能性状態への移行を可能とする（ＲＮＡの部分としての）特定の配列を含む、哺乳動物の胎盤および臍帯の細胞を使用する。
【００１８】
哺乳動物（ヒト）が生まれる場合、胎盤および臍帯はそこから分離される。胎盤および臍帯は、例えば、線維芽細胞、ケラチノサイト、内皮細胞（endotheliocyte）、造血性および間葉系細胞のさまざまな細胞集団を含み、これらは単離し、増殖させ、および保存することができる。これら細胞は生物における最も若い細胞であり、それらは環境に一度も曝されておらず、この段階では侵襲なしに得ることができる。したがって、胎盤および臍帯に含まれるすべてのタイプの細胞が最も利用可能であり、個体発生の過程において獲得する欠損を最小セット有するため、個々の再プログラム化において最も安全である。胎盤および臍帯から選択されるすべての細胞は、これらを多能性状態にシフトさせるために、特定の組成のリボ核酸の導入に使用することができる。
【００１９】
タンパク質であるＯｃｔ４（ＰＯＵ５Ｆ１）、Ｓｏｘ２、ＨＮＦ３ｂ、ＰＤＸ１、ＨＮＦ６、ｎｇｎ３、ＰＡＸ４、ＮＫＸ２．２、ＦｏｘＢ３、ＨＮＦ４ａ、Ｎｋｘ２．５、Ｎｋｘ２．２、Ｎｋｘ６．１およびＮｋｘ、Ｐａｘ４、Ｋｌｆ４、Ｎｇｎ３、Ｐｄｘ１、Ｍａｆａの他のファミリーまたは培養特性の必要な変化を起こす他のものに対応する再プログラム化因子は、多能性状態への細胞の移行を可能とする配列として使用することができる。それらは、同時にまたは１回に付き１つずつ、ＲＮＡの一部として細胞中に導入することができる。
【００２０】
したがって、本発明は、次の必須の特徴によって特徴付けることができる。「多能性状態への細胞の移行を確保する（ensure）少なくとも１つの配列を有する核酸を哺乳動物細胞に導入することによる多能性幹細胞の調製方法であって、この方法において胎盤および臍帯の細胞が使用され、ＲＮＡが核酸として導入されることを特徴とする、前記方法。」
【００２１】
さらなる使用のために、かかる方法で得られた多能性幹細胞は、哺乳動物およびヒトの胚性幹細胞の成育を維持する培地（KnockOut DMEM、血清代替物、mTeSRまたは他のもの）を用いて、支持細胞層の非存在下または存在下において、２〜６日で選択することができる。必要な細胞表現型を調製するため、筋肉細胞、例えば、心筋細胞、インシュリン産生細胞などの分泌細胞、肝細胞などのフィルター細胞（filter cells）、神経細胞、グリア細胞、および他のものの成長を維持する培地を使用することができる。多能性幹細胞がこれら培地で培養される場合は、必要な表現型の細胞は、１０〜２０日で形成される。得られたタイプの細胞は、それらの量を増やすためにインビトロで増殖させることができる。特定量の細胞は、疾患治療および物質スクリーニングにおけるさらなる用途のために使用することができる。
【００２２】
発明の態様
発明の態様の可能性は、続く例によって支持される。
【００２３】
例１
ヒト臍帯から分離した内皮細胞を、以下を含む特定の培地組成物中で培養した：アルファＭＥＭ、２０％ＦＢＳ、非必須アミノ酸、ヒドロコルチゾン−１０−６Ｍ、ＩＧＦ−５ｎｇ／ｍｌ、ｂＦＧＦ−５ｎｇ／ｍｌ、ＶＥＧＦ−１０ｎｇ／ｍｌ、ＥＧＦ−５ｎｇ／ｍｌ（図１）。
【００２４】
インビトロ合成したＲＮＡによる内皮細胞培養物のトランスフェクションは、第２〜第３継代培養時に行った。製造者のガイドラインに従って、Turbofect（Fermentas）試薬を送達のために使用した。タンパク質Ｏｃｔ４（ＰＯＵ５Ｆ１）、Ｓｏｘ２、およびＫｌｆ４に対応する配列を含むＲＮＡを使用した。トランスフェクションは、３日間毎日行った。最後のトランスフェクションから６日後、０．１％ゼラチン（Merck）で被覆され、フィーダーとして不活性化したマウスの胚性線維芽細胞を含む他の皿へ細胞を移動した。使用した培養培地の組成は、以下のとおりであった：８０％KnockOut DMEM、２０％ＦＢＳ（ＥＳグレード）、グルタミン−１ｍＭ、１％非必須アミノ酸、ペニシリン−５０ユニット／ｍｌ、ストレプトマイシン−５０μｇ／ｍｌ（すべてInvitrogen）、β−メルカプトエタノール−０．１ｍＭ（Sigma）。
【００２５】
１７日後、ヒト胚性細胞によって形成されるものと同一のコロニーが形成された（図２）。
コロニー形成は、胚性幹細胞の成育を維持する別の培地、例えばｍＴｅＳＲにおいても生じた（図３）。
これら細胞は、ＳＳＰＣ（selected somatic pluripotent stem cells；選択された体細胞性多能性幹細胞）と呼ぶことができる。
【００２６】
ＳＳＰＣの調製の効率は、０．００１％を超える。得られた細胞集団は、特定の条件下で培養し、および増殖させることができる。同時に、それらは初期細胞に対応する通常の表現型を保持するが（図４）、それら表現型および性質は変化する。Ｏｃｔ４（ＰＯＵ５Ｆ１）、Ｓｏｘ２、およびＫｌｆ４の配列の使用は、ヒト胚性幹細胞の特徴である、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１−６０のマーカーの出現、Ｎａｎｏｇ、ＦｏｘＤ３および他の遺伝子の発現をもたらす。
【００２７】
得られた細胞は、免疫組織適合性複合体の第１および第２のクラスを含む、それらの遺伝子型の初期のものに対応する。得られた多能性幹細胞は、胚様体の形成によって支持される、すべての三胚葉の組織を形成し得る（図５Ａ）。胚様体は、中胚葉（図５Ｂ ＣＤ１０５（緑）およびＭＯＣ−３１（赤）に対する抗体染色）、内胚葉（図５Ｄ アルファ−フェトプロテインに対する抗体染色）、外胚葉（図５Ｃ デスミンに対する抗体染色）の三胚葉、および奇形腫（図５Ｅ、Ｆ 奇形腫（terat）のヘマトキシリン・エオシン染色）の細胞を含む。
【産業上の利用可能性】
【００２８】
したがって、内皮から得られた細胞は多能性であり、全タイプの哺乳動物（ヒト）の組織の調製に使用し得る。例えば、図６は、ＳＳＰＣから得られた神経膠細胞を実証する。内皮、心筋細胞、肝細胞、ベータ細胞、ケラチノサイト、感覚神経細胞、色素細胞および哺乳生物の他の細胞を含む、異なる特殊化の細胞もまた得ることができる。かかる細胞は、初期内皮細胞のソースとして使用する生物と遺伝的に同一である。
【００２９】
本発明の例は、多能性幹細胞調製の特定の事例のみを実証する。
提案する方法は、胎盤および臍帯の「若い」細胞から多能性幹細胞を効率的に調製することを可能とし、これは腫瘍形成のリスクおよび再プログラム化の他の有害な影響を低減するものである。
【００３０】
文献
1.  Takahashi K Yamanaka S, Induction of Pluripotent Stem Cells  from Mouse Embryonic and Adult  Fibroblast Cultures by Defined Factors 2006, Cell, 126, 663-676
2. Wernig, M., Lengner, C.J., Hanna, J., Lodato, M.A., Steine, E., Foreman, R.,Staerk, J., Markoulaki, S., and Jaenisch, R. (2008a). A drug-inducible transgenic system for direct reprogramming of multiple somatic cell types. Nat. Biotechnol. 26, 916-924.
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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