【手続補正書】
【提出日】平成21年8月7日(2009.8.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ｉ）増幅される少なくとも１つの標的核酸の少なくとも１つの領域を同定および／または選択するステップと、ここで、領域が平均増幅効率（ＡＥ）よりも高いＡＥを有し、
（ＩＩ）同定および／または選択された領域にハイブリダイズすることができる少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを設計するステップと
を任意の順序で含む、核酸検出のための少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを設計する方法。
【請求項２】
選択される領域のＡＥが、フォワードプライマーｒｉが位置ｉに結合することができ、リバースプライマーｒｊが標的核酸の位置ｊに結合することができる確率である、増幅効率スコア（ＡＥＳ）として計算され、および｜ｉ−ｊ｜が、増幅されることが所望される標的核酸の領域である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
｜ｉ−ｊ｜が１００００ｂｐ以下である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（Ｉ）が、幾何学的増幅バイアスまたは標的核酸の各位置の効果を判定すること、および平均増幅効率（ＡＥ）よりも高いＡＥを有する領域として増幅される少なくとも１つの領域を選択することを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
選択される領域にハイブリダイズすることができる少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが、以下の基準：
（ａ）選択されたオリゴヌクレオチドは、４０％〜６０％のＣＧ含有量を有する；
（ｂ）オリゴヌクレオチドは、隣接モデルに基づいて計算される、最も高い自由エネルギーを有することによって選択される；
（ｃ）標的核酸ｖａおよびｖｂのオリゴヌクレオチドｓａおよびオリゴヌクレオチドｓｂサブストリングを仮定すると、ｓａはｓａと標的核酸ｖｂ由来の任意の長さｍのサブストリングｓｂとの間のハミング距離ならびに／またはｓａおよびオリゴヌクレオチドｓｂの最も長い共通するサブストリングに基づいて選択される；
（ｄ）標的核酸ｖａに特異的な長さｍの任意のオリゴヌクレオチドｓａについて、標的核酸と異なる核酸のいずれの領域ともいかなるヒットも有さない場合、オリゴヌクレオチドｓａが選択され、長さｍのオリゴヌクレオチドｓａが標的核酸と異なる核酸とヒットを有する場合、最も小さい最大アライメント長および／または最少の数のヒットを有する長さｍのオリゴヌクレオチドｓａが選択される；ならびに
（ｅ）標的核酸の位置ｉのオリゴヌクレオチドｐｉが、増幅された標的核酸の位置ｉにハイブリダイズすると予測される場合、ｐｉが選択される
の少なくとも１つに従って選択および設計される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
Ｐ（ｐｉ｜ｖａ）＞λであり、式中λが０．５であり、Ｐ（ｐｉ｜ｖａ）が、標的核酸ｖａの位置ｉのオリゴヌクレオチドｐｉが標的核酸ｖａの位置ｉにハイブリダイズする確率である場合、基準（ｅ）に基づいて、ｐｉが選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
【数１】
2009504153.tif 000001
であり、式中Ｘはｖａの全てのオリゴヌクレオチドの増幅効率スコア（ＡＥＳ）値を表す確率変数であり、ｋはｖａ中のオリゴヌクレオチドの数であり、ｃｉはＡＥＳ値がｘｉ以下であるオリゴヌクレオチドの数である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
（ｉ）少なくとも１つの生体試料を提供するステップと、
（ｉｉ）生体試料中に含まれる核酸を増幅するステップと、
（ｉｉｉ）生体試料中に標的核酸が存在する場合、少なくとも１つの標的核酸にハイブリダイズすることができる少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを提供するステップと、ここで請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法に従って前記オリゴヌクレオチドが設計および／または調製され、
（ｉｖ）前記オリゴヌクレオチドを増幅された核酸と接触させるステップおよび／または標的核酸にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを検出するステップと
を含む、少なくとも１つの標的核酸を検出する方法。
【請求項９】
前記増幅が、少なくとも１つのランダムフォワードプライマーおよび／または少なくとも１つのリバースランダムプライマーの存在下で行われる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
位置ｉに結合しているフォワードランダムプライマーおよび標的核酸ｖａの位置ｊに結合しているリバースランダムプライマーが、
【数２】
2009504153.tif 000002
の標的核酸ｖａの各位置ｉについての増幅効率スコア（ＡＥＳＩ）を有するプライマーの間で選択され、
式中、
【数３】
2009504153.tif 000003
であり、Ｐｆ（ｉ）およびＰｒ（ｉ）は、それぞれ、フォワードプライマーおよびリバースプライマーとしてランダムプライマーｒｉがｖａの位置ｉに結合する確率であり、１００００ｂｐ以下であるＺは、増幅されることが所望されるｖａの領域である、請求項２〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記増幅が、フォワードおよびリバースプライマーを含み、フォワードおよびリバースプライマーのそれぞれが、５’−３’配向で、不変のプライマー頭部および可変のプライマー尾部を含み、かつ、少なくとも可変の尾部が、標的核酸ｖａの一部にハイブリダイズする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
検出される標的核酸が、生体試料の核酸にとって外因性の核酸である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
検出ステップ（ｉｖ）において、ｖａにハイブリダイズするプローブのシグナル強度の平均値が、ｖａに含まれないプローブの平均値よりも統計的に高く、それによって生体試料中のｖａの存在が示される、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
検出ステップ（ｉｖ）において、ｖａにハイブリダイズするプローブのシグナル強度の平均値が、ｖａに含まれないプローブの平均値よりも統計的に高いことを特徴とし、高いシグナル強度を有する検出方法において使用されるプローブの割合に対する、高いシグナル強度を有しｖａに含まれないプローブの割合の相対的差異を計算するステップをさらに含む請求項８〜１２のいずれか一項に記載の方法であって、プローブｖａのシグナル強度の密度分布が、ｖａに含まれないプローブのものよりも正に歪んでおり、それによって生体試料中のｖａの存在が示される方法。
【請求項１５】
検出ステップ（ｉｖ）において、生体試料中の少なくとも１つの標的核酸の存在が、０．１以下のｔ検定の値および／または０．０５以下のアンダーソン・ダーリン検定値および／または１．０以上の重み付きカルバック・ライブラー情報量の値によって示される、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
検出ステップ（ｉｖ）が、重み付きカルバック・ライブラー（ＷＫＬ）情報量スコア：
【数４】
2009504153.tif 000004
の分布を計算することによって、標的核酸ｖａについての各サインプローブセット（ＳＰＳ）におけるプローブのシグナル強度を評価することを含み、式中、Ｑａ（ｊ）は瓶ｂｊに見られるＰａにおけるプローブのシグナル強度の累積分布関数であり、
【数５】
2009504153.tif 000005
は瓶ｂｊに見られる
【数６】
2009504153.tif 000006
におけるプローブのシグナル強度の累積分布関数であり、Ｐａはウイルスｖａのプローブのセットであり、
【数７】
2009504153.tif 000007
である、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
標的核酸ｖａの非存在を表す各サインプローブセット（ＳＰＳ）が、正規分布したシグナル強度および／または５より小さい重み付きカルバック・ライブラー（ＷＫＬ）情報量スコアを有し、かつ、少なくとも１つの標的核酸ｖａの存在を表す各サインプローブセット（ＳＰＳ）が、正に歪んでいるシグナル強度分布および／または５より大きい重み付きカルバック・ライブラー（ＷＫＬ）情報量スコアを有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＷＫＬスコアの分布に関してアンダーソン・ダーリン検定を行うことをさらに含み、Ｐ＞０．０５の結果が、それによって標的核酸ｖａの非存在を示し、かつ、Ｐ＜０．０５の結果が、それによって標的核酸ｖａの存在を示す、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法により設計または調製された、少なくとも１つの標的核酸ｖａに対する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションを検出することを含み、ｖａにハイブリダイズするプローブのシグナル強度の平均値がｖａに含まれないプローブの平均値よりも統計的に高く、それによってｖａの存在が示される、少なくとも１つの標的核酸ｖａの存在を判定する方法。
【請求項２０】
ｖａにハイブリダイズするプローブのシグナル強度の平均値が、ｖａに含まれないプローブの平均値よりも統計的に高く、高いシグナル強度を有する検出方法において使用されるプローブの割合に対する、高いシグナル強度を有するｖａに含まれないプローブの割合の相対的差異を計算するステップをさらに含み、プローブｖａのシグナル強度の密度分布がｖａに含まれないプローブのものより正に歪んでおり、それによってｖａの存在が示される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
少なくとも１つの生体試料中の少なくとも１つの標的核酸の存在が、０．１以下のｔ検定の値および／または０．０５以下のアンダーソン・ダーリン検定値および／または１．０以上の重み付きカルバック・ライブラー情報量の値によって示される、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
（Ｉ）増幅される少なくとも１つの標的核酸の少なくとも１つの領域を同定および／または選択する、ここで、前記領域が平均増幅効率（ＡＥ）よりも高いＡＥを有する、ならびに
（ＩＩ）同定および／または選択される領域にハイブリダイズすることができる少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを設計する
ように構成された、核酸検出のための少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを設計するための装置。
【請求項２３】
選択される領域のＡＥが、フォワードプライマーｒｉが位置ｉに結合することができ、リバースプライマーｒｊが標的核酸の位置ｊに結合することができる確率である、増幅効率スコア（ＡＥＳ）として計算され、および｜ｉ−ｊ｜が、増幅されることが所望される標的核酸の領域である、請求項２２に記載の装置。
【請求項２４】
｜ｉ−ｊ｜が１００００ｂｐ以下、１０００ｂｐ以下、または５００ｂｐ以下である、請求項２３に記載の装置。
【請求項２５】
ステップ（Ｉ）が、幾何学的増幅バイアスまたは標的核酸の各位置の効果を判定すること、および平均増幅効率（ＡＥ）よりも高いＡＥを有する領域として増幅される少なくとも１つの領域を選択することを含む、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２６】
選択される領域にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドが、以下の基準：
（ａ）選択されたオリゴヌクレオチドが、４０％〜６０％のＣＧ含有量を有する；
（ｂ）オリゴヌクレオチドが、隣接モデルに基づいて計算される最も高い自由エネルギーを有することによって選択される；
（ｃ）標的核酸ｖａおよびｖｂのオリゴヌクレオチドｓａおよびオリゴヌクレオチドｓｂサブストリングを仮定すると、ｓａがｓａと標的核酸ｖｂ由来の任意の長さｍのサブストリングｓｂとの間のハミング距離および／またはｓａおよびオリゴヌクレオチドｓｂの最も長い共通するサブストリングに基づいて選択される；
（ｄ）標的核酸ｖａに特異的な長さｍの任意のオリゴヌクレオチドｓａについて、標的核酸と異なる核酸のいずれの領域ともいかなるヒットも有さない場合、オリゴヌクレオチドｓａが選択され、長さｍのオリゴヌクレオチドｓａが標的核酸と異なる核酸とヒットを有する場合、最も小さい最大アライメント長および／または最少の数のヒットを有する長さｍのオリゴヌクレオチドｓａが選択される；ならびに
（ｅ）標的核酸の位置ｉの少なくとも１つのオリゴヌクレオチドｐｉが、増幅された標的核酸の位置ｉにハイブリダイズすると予測される場合に、ｐｉが選択される
の少なくとも１つに従って選択および／または設計される、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２７】
Ｐ（ｐｉ｜ｖａ）＞λであり、式中λが０．５であり、Ｐ（ｐｉ｜ｖａ）が、標的核酸ｖａの位置ｉのオリゴヌクレオチドｐｉが標的核酸ｖａの位置ｉにハイブリダイズする確率である場合に、基準（ｅ）に基づいて、ｐｉが選択される、請求項２６に記載の装置。
【請求項２８】
【数８】
2009504153.tif 000008
であり、式中Ｘはｖａの全てのオリゴヌクレオチドの増幅効率スコア（ＡＥＳ）値を表す確率変数であり、ｋはｖａ中のオリゴヌクレオチドの数であり、ｃｉはＡＥＳ値がｘｊ以下であるオリゴヌクレオチドの数である、請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２９】
（ｉ）少なくとも１つの生体試料を提供するステップと、
（ｉｉ）生体試料中に含まれる核酸を増幅するステップと、
（ｉｉｉ）生体試料中に標的核酸が存在する場合、少なくとも１つの標的核酸にハイブリダイズすることができる少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを提供するステップと、ここで前記オリゴヌクレオチドが、請求項２２〜２８のいずれか一項に記載の装置に従って構成されている装置に従って設計および／または調製され、
（ｉｖ）オリゴヌクレオチドを増幅された核酸と接触させる、および／または標的核酸にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを検出するステップと
のいずれか１つのステップを含む、少なくとも１つの標的核酸を検出するよう構成された装置。
【請求項３０】
増幅ステップが、少なくとも１つのランダムフォワードプライマーおよび／または少なくとも１つのリバースランダムプライマーの存在下で行われる、請求項２２〜２９のいずれか一項に記載の装置。
【請求項３１】
位置ｉに結合しているフォワードランダムプライマーおよび標的核酸ｖａの位置ｊに結合しているリバースランダムプライマーが、
【数９】
2009504153.tif 000009
の標的核酸ｖａの各位置ｉについての増幅効率スコア（ＡＥＳＩ）を有するプライマーの間で選択され、式中、
【数１０】
2009504153.tif 000010
であり、Ｐｆ（ｉ）およびＰｒ（ｉ）は、それぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして、ランダムプライマーｒｉがｖａの位置ｉに結合する確率であり、１００００ｂｐ以下であるＺは増幅されることが所望されるｖａの領域である、請求項２２〜３０のいずれか一項に記載の装置。
【請求項３２】
増幅ステップが、フォワードおよびリバースプライマーを含み、フォワードおよびリバースプライマーのそれぞれが、５’−３’配向で、不変のプライマー頭部および可変のプライマー尾部を含み、少なくとも可変の尾部は、標的核酸ｖａの一部にハイブリダイズする、請求項２２〜３１のいずれか一項に記載の装置。
【請求項３３】
検出される標的核酸が、生体試料の核酸にとって外因性である少なくとも１つの核酸である、請求項２２〜３２のいずれか一項に記載の装置。
【請求項３４】
少なくとも１つのプローブを配置する少なくとも１つの不溶性支持体を含む、請求項２２〜３３のいずれか一項に記載の装置。
【請求項３５】
検出ステップ（ｉｖ）において、ｖａにハイブリダイズするプローブのシグナル強度の平均値が、ｖａに含まれないプローブの平均値よりも統計的に高く、それによって生体試料中のｖａの存在が示される、請求項２９〜３４のいずれか一項に記載の装置。
【請求項３６】
検出ステップ（ｉｖ）において、ｖａにハイブリダイズするプローブのシグナル強度の平均値が、ｖａに含まれないプローブの平均値よりも統計的に高いことを特徴とし、高いシグナル強度を有する検出方法において使用されるプローブの割合に対する、高いシグナル強度を有するｖａに含まれないプローブの割合の相対的差異を計算するステップをさらに含むよう構成された請求項２９〜３４のいずれか一項に記載の装置であって、プローブｖａのシグナル強度の密度分布がｖａに含まれないプローブのものよりも正に歪んでおり、それによって生体試料中のｖａの存在が示される、装置。
【請求項３７】
検出ステップ（ｉｖ）において、生体試料中の標的核酸の存在が、０．１以下のｔ検定の値および／または０．０５以下のアンダーソン・ダーリン検定値および／または１．０の重み付きカルバック・ライブラー情報量の値によって示される、請求項２９〜３４のいずれか一項に記載の装置。
【請求項３８】
検出ステップ（ｉｖ）が、重み付きカルバック・ライブラー（ＷＫＬ）情報量スコアの分布：
【数１１】
2009504153.tif 000011
を計算することによって、標的核酸についての各サインプローブセット（ＳＰＳ）におけるプローブのシグナル強度を評価することを含み、式中Ｑａ（ｊ）は瓶ｂｊに見られるＰａにおけるプローブのシグナル強度の累積分布関数であり、
【数１２】
2009504153.tif 000012
は瓶ｂｊに見られる
【数１３】
2009504153.tif 000013
におけるプローブのシグナル強度の累積分布関数であり、Ｐａはウイルスｖａのプローブのセットであり、
【数１４】
2009504153.tif 000014
である、請求項２９〜３４のいずれか一項に記載の装置。
【請求項３９】
標的核酸の非存在を表す各サインプローブセット（ＳＰＳ）が、正規分布したシグナル強度および／または５より小さい重み付きカルバック・ライブラー（ＷＫＬ）情報量スコアを有し、かつ、少なくとも１つの標的核酸の存在を表す各サインプローブセット（ＳＰＳ）が、正に歪んでいるシグナル強度分布および／または５より大きい重み付きカルバック・ライブラー（ＷＫＬ）情報量スコアを有する、請求項３８に記載の装置。
【請求項４０】
ＷＫＬスコアの分布に関してアンダーソン・ダーリン検定を行うことをさらに含み、Ｐ＞０．０５の結果が、それによって標的核酸の非存在を示し、かつ、Ｐ＜０．０５の結果が、それによって標的核酸の存在を示す、請求項３８または３９に記載の装置。
【請求項４１】
少なくとも１つの電子記憶媒体上で構成が記憶される、請求項２２〜４０のいずれか一項に記載の装置。
【請求項４２】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法を行うよう構成された、コンピュータプログラム製品。
【請求項４３】
少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを設計するためおよび／または少なくとも１つの標的核酸を検出するために、ＷＫＬ情報量スコアおよび／またはアンダーソン・ダーリン検定を判定するよう構成されたソフトウエアを含むコンピュータプログラム製品であって、ＷＫＬ、アンダーソン・ダーリン検定、オリゴヌクレオチドプローブの設計、オリゴヌクレオチドプライマーの設計、および／または標的核酸の検出が、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法に従って定義される、コンピュータプログラム製品。
【請求項４４】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法を行うよう構成されたソフトウエアを含む、取り外し可能な電子記憶媒体。
【請求項４５】
少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを設計するため、オリゴヌクレオチドプライマーを設計するため、および／または少なくとも１つの標的核酸を検出するために、ＷＫＬ情報量スコアおよび／またはアンダーソン・ダーリン検定を判定するよう構成されたソフトウエアを含む、取り外し可能な電子記憶媒体であって、ＷＫＬ、アンダーソン・ダーリン検定、オリゴヌクレオチドプローブの設計、オリゴヌクレオチドプライマーの設計、および／または標的核酸の検出が、請求項１〜２１のいずれか一項に従って定義される、取り外し可能な電子記憶媒体。