(57)【要約】本発明は、少なくとも一つの水溶性・求核性化合物を含む水溶液による処理によって膜を保護する方法、およびこの水溶液のマトリックスの保護のための使用に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つの水溶性・求核性化合物を含む水溶液による処理によって膜を保護する方法。
【請求項２】
膜を保護するための少なくとも一つの水溶性・求核性化合物を含む水溶液の使用。
【請求項３】
前記水溶性・求核性化合物が陰性荷電洗浄剤であるか、及び／又は少なくとも二つのOH基を持つ少なくとも一分子を有することを特徴とする請求項１に記載の方法及び／又は請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記のOH基がアルコール性OH基であることを特徴とする先行請求項のいずれかに記載の方法及び／又は使用。
【請求項５】
膜が核酸の固定のために使用されることを特徴とする先行請求項のいずれかに記載の方法及び／又は使用。
【請求項６】
前記方法が含浸のための方法であり、及び／又は、前記使用が含浸のための使用であることを特徴とする先行請求項のいずれかに記載の方法及び／又は使用。
【請求項７】
前記方法及び／又は前記使用が水溶液による処理の後に乾燥工程を含むことを特徴とする先行請求項のいずれかに記載の方法及び／又は使用。
【請求項８】
前記水溶性・求核性化合物が固体であることを特徴とする先行請求項のいずれかに記載の方法及び／又は使用。
【請求項９】
少なくとも二つのOH基を持つ少なくとも一分子を有する前記水溶性・求核性化合物が糖アルコールであることを特徴とする先行請求項のいずれかに記載の方法及び／又は使用。
【請求項１０】
少なくとも二つのOH基を持つ少なくとも一分子を有する、前記水溶性・求核性化合物が、ソルビトール、キシリトール、ラクチトール、スレイトール、エリスリトール、マンニトール、イソマルト、イノシトール、パルミチン酸塩、及び／又はクエン酸塩、又はそれらの混合物から選ばれることを特徴とする請求項９に記載の方法及び／又は使用。
【請求項１１】
陰性荷電洗浄剤は、脂肪性アルコール硫酸塩、より詳細には、ドデシル硫酸ナトリム（SDS）、及び／又は、アルキルベンゼンスルフォン酸、及び／又は、アルキルベンゼンスルフォネート、より詳細には、ドデシルベンゼンスルフォン酸ナトリウム、ベンゼンスルフォン酸、ドデシルベンゼンスルフォネート、ドデシルベンゼンスルフォン酸アンモニウム、及び／又はN-ラウロイルサルコシン、又はそれらの混合物を含む群から選ばれることを特徴とする先行請求項のいずれかに記載の方法及び／又は使用。
【請求項１２】
前記水溶液が、少なくとも一つの陰性荷電洗浄剤と、少なくとも二つのOH基を持つ少なくとも一分子を有する、少なくとも一つの水溶性・求核性化合物との、少なくとも一つの混合物を含むことを特徴とする先行請求項のいずれかに記載の方法及び／又は使用。
【請求項１３】
前記水溶液が、微生物の増殖を阻止する化合物を追加で含むことを特徴とする先行請求項のいずれかに記載の方法及び／又は使用。
【請求項１４】
前記の追加の化合物がアジ化ナトリウム、チメロサール、フェノール、ベンジルアルコール、及び／又はクレゾールを含む群から選ばれることを特徴とする請求項１３に記載の方法及び／又は使用。
【請求項１５】
前記処理が、≧1秒から≦60秒まで続くことを特徴とする先行請求項のいずれかに記載の方法及び／又は使用。
【請求項１６】
前記処理が、≧5℃から≦45℃の温度において行われることを特徴とする先行請求項のいずれかに記載の方法及び／又は使用。
【請求項１７】
前記処理が、≧4.5から≦9.5のｐＨにおいて行われることを特徴とする先行請求項のいずれかに記載の方法及び／又は使用。
【請求項１８】
前記水溶液が、≧0.5から≦20％の濃度であることを特徴とする先行請求項のいずれかに記載の方法及び／又は使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マトリックス、例えば膜、より詳細にはシリカ膜を保護するための方法及び使用に関する。本装置及び使用は、例えば、生化学、分子生物学、分子遺伝学、微生物学、医療診断学、又は法医学における用途に適している。
【背景技術】
【０００２】
マトリックス、より詳細には膜、例えばシリカ膜は、生化学、分子生物学、分子遺伝学、微生物学、医療診断学、又は法医学の分野に広く普及しており、通常、生体分子を精製／単離するために使用されている。頻繁に用いられる方法は、例えば、DNA又はRNAなどの核酸の単離における使用である。
【０００３】
この目的のため、単離すべきDNA及び／又はRNAを含むサンプルは、例えば、「カオトロピック」試薬の存在下に（精製）マトリックスに結合される。次いで、サンプルの他の構成成分は、すすぎ及び洗浄によって除去される。次いで、DNA又はRNAは放出され、分析される。
【０００４】
本出願人による組織内研究の一環として、現在では、いくつかのマトリックス、より詳細には、市販のマトリックスは、特にそれらが膜の形で存在する場合、場合によって、（保存）時間とともに核酸を結合する能力が低下するという問題を生じることが明らかになっている。これは、特に、それらのマトリックスが室温又はそれ以上の温度で保存される場合当てはまる。この問題は、4℃で保存することによって抑えることは可能であるが、それによって完全に阻止することはできない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、従来技術において明らかな、前述の欠点を少なくとも事実上克服することであって、より詳細には、広範囲の用途において、マトリックスを経年劣化から保護することが可能な方法及び使用を創出することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的は、本発明の請求項1に記載の方法によって達成される。このようにして、少なくとも一つの水溶性・求核性化合物を含む水溶液による処理によって膜を保護する方法が提案される。
【０００７】
上記目的は、同様に、本発明の請求項2に記載の使用によって達成される。このようにして、膜を保護するための少なくとも一つの水溶性・求核性化合物を含む水溶液の使用が提案される。
【０００８】
本発明の目的のために、マトリックスの、特に例えば膜の「経年劣化」という用語は、核酸が、カオトロピック条件下に、適切なマトリックスに結合する能力を失うことを意味するものと理解される。本発明者らは、この原因は、各種プラスチックの存在下に、又は、簡易集積型スピンカラムの形状において、マトリックスが長期保存されることによるものではないかと疑う。これは、プラスチック成分、例えば、可塑剤、又はその他の添加物及び／又はスチレン、又は短鎖脂肪族化合物の気体放出をもたらす可能性がある。極端な場合、この結果は、マトリックスの完全な疎水性を誘発し、これは、各種核酸処理プロトコールにおける収率の急激な低下と関連しうる。なぜなら、これらの気体放出がマトリックスの親水表面に結合する可能性は大いにあり得るからである。
【０００９】
本発明の目的のために、「核酸」という用語は、これらに限定されるものではないが、特に、天然の、好ましくは直鎖、分枝鎖、又は環状核酸、例えば、RNA、より詳細には、mRNA、1本鎖及び2本鎖ウィルスRNA、siRNA、miRNA、snRNA、tRNA、hnRNA、リボザイム、ゲノム、細菌、もしくはウィルスDNA（1本鎖及び2本鎖）、クロモソーム及びエピゾームDNA、遊離循環核酸など、合成又は修飾型核酸、例えば、プラスミド又はオリゴヌクレオチド、より詳細には、PCRに使用されるプライマー、プローブ、もしくは標準試薬、ジゴキシゲニン、ビオチン、もしくは蛍光染料で標識された核酸、又は、LNA（ロックド核酸）もしくはPNA（ペプチド核酸）と呼ばれるもの、を意味するものと理解される。
【００１０】
「マトリックス」という用語は、これらに限定されるものではないが、特に、生体分子、好ましくは核酸に対し可逆的に結合することが可能な固相を意味するものと理解される。本発明の目的のために、このような固相は好ましくは膜、特に好ましくはシリカ膜である。しかしながら、本発明の目的のためのマトリックスはさらに、フィルター材料であって、ミネラル成分、例えば、金属酸化物、より詳細には、アルミニウム酸化物、窒化物、カーバイド、より詳細には、シリコンカーバイドを有するフィルター材料、若しくは、緩やかな、又は緊密なパッキングを形成することが可能な親水性粒子を含む。
【００１１】
本発明の目的のためには、「固定」という用語は、これらに限定されるものではないが、特に、適切な固相における可逆的固定を意味するものと理解される。
【００１２】
「求核性」という用語は、陰性極性を有する分子（「求核剤」）が、分子の中の、陽性極性又は陽性電荷を有する原子を攻撃して共有結合を形成する能力を意味するものと理解される。典型的求核剤は、多くの場合、陰性電荷を帯びるか、又は、高エネルギー軌道において少なくとも一つの遊離電子ペアを有する。
【００１３】
好ましい実施態様では、本発明による水溶性・求核性化合物は、陰性荷電洗浄剤であり、及び／又は、少なくとも二つのOH基を有する、少なくとも一つの分子を有する。
【００１４】
本発明による方法及び／又は本発明による使用は、少なくとも一つの水溶性・求核性化合物を含む水溶液による処理を含む。なぜなら、このような化合物は、固相そのものと同様の化学的性質を有し、そのため、該固相の表面、例えば、シリカ膜表面を「模倣する」可能性がもっとも高いからである。
【００１５】
本発明の方法及び／又は使用の驚くべき作用の理由は、これまでのところ依然として不明のままである。しかしながら、本発明者らは、本発明の方法及び／又は使用は、マトリックスの経年劣化の原因である、プラスチック成分の、前述の気体放出の捕捉をもたらすのではないかと考える。本発明者らは、もしかすると、水溶性・求核性化合物は、プラスチック成分の気体放出に結合するのではないかと考える。このようにして、気体放出によって恐らくもっとも攻撃されるのは、マトリックスではなく、本発明による水溶性・求核性化合物となるのであろう。
【００１６】
このような方法及び／又は使用は、本発明の背景内の広範囲の用途について下記の利点の内の少なくとも一つを提供する：
−固相又はマトリックスは、簡単で、極めて速やかな操作によって保護される。なぜなら、その処理は、本発明による水溶液にマトリックスを単に漬けるだけだからである。
−本発明の方法及び／又は使用は、保護的（マトリックスの含浸）であることが好ましい、すなわち、マトリックスは保存前に含浸される。したがって、これは、エンドユーザーにおいてさらに追加の操作を要しないことを意味する。
−含浸は、マトリックスの側に一定の品質及び性能を保証する。
−本発明の背景内の多くの用途において、保護は、低温での保存を不要にできる程、完全である。
−その結果、用途における再現性は著明に増す。
【００１７】
本発明の好ましい実施態様では、マトリックスは親水性である。本発明の特に好ましい実施態様では、マトリックスは親水性膜である。「ブーム処理」(EP819696)は、シリカ膜を活用して、親水性膜に対する核酸結合の例を示す。核酸の選択的結合のために、サンプルは、カオトロピック物質、例えば、グアニジニウムチオシアネートを含む溶解バッファーにおいて溶解される。細胞が溶解されるだけでなく、タンパクも変性され、不活性化される。核酸は放出され、シリカ膜のOH基に結合する。次いで、サンプルの他の構成成分は洗浄によって除去することができる。最後に、DNA又はRNAを、その後の分析のために放出させることができる。
【００１８】
したがって、好ましい親水性膜は、特にシリカ膜、グラスファイバー・フィルター、クウォーツウール、又はグラスウールとしても知られるシリカ膜のほか、官能基を持っても、持たなくてもよいフィルター膜であって、天然又は合成有機ポリマー、例えば、再生セルロース、酢酸セルロース、ニトロセルロース、ポリアミド、又はポリ（エーテル）スルフォンから構成されるフィルター膜である。
【００１９】
核酸は、例えば、シリカ表面に対し、該シリカ膜のSi-OH基（シラノール基）との水素結合を介して結合する。プラスチック成分の前述の放出気体も、恐らくは、これらのSi-OH基に結合し、そのようにしてマトリックスの疎水性をもたらすと考えられる。Si-OH基を介してシリカ膜に結合する場合と同様、本発明による水溶性化合物も、その求核性に基づいて共有結合形成のための電子ペアを提供することが可能である。本発明者らは、本発明の水溶液による処理は、本発明による化合物が、マトリックス表面の代わりに、プラスチック成分の気体放出によって攻撃される結果をもたらすのではないかと考える。
【００２０】
本発明の好ましい実施態様では、本発明によるOH基は、アルコール性OH基である。古典的ルイス塩基としてのOH−は求核性である。それは、結合のために供給することが可能な自由電子ペアを有する。
【００２１】
本発明の好ましい実施態様では、膜は核酸の固定のために使用される。
【００２２】
好ましい実施態様では、本発明による方法は含浸のための方法であり、及び／又は、本発明による使用は含浸のための使用である。膜は、保存前に、本発明による水溶液によって処理され、その結果、前述の経年劣化から予防される。
【００２３】
さらに別の好ましい実施態様では、本発明による方法及び／又は本発明による使用は、水溶液による処理の後に乾燥工程を含む。この乾燥工程は、≧5℃から≦45℃の温度において行われることが好ましく、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、又は30℃の温度が好ましい。原理的には、温度範囲には上限も下限もないが、操作上の理由で45℃までの温度が好ましい。乾燥工程の持続時間は、好ましくは≧1秒と≦60分の間であるが、原理的には上限も下限もない。操作上又は製作上の理由から、1分、2分、3分、4分、又は最大5分の時間が好ましい。この乾燥工程は、操作上の理由で、例えば、スピンカラム集積前処理の場合、及び／又は保存上の理由で有利である。
【００２４】
好ましい実施態様では、本発明による水溶性・求核性化合物は固体である。したがって、本水溶性・求核性化合物は、乾燥工程後、使用時まで薄い含浸層としてマトリックス表面に留まることが可能である。さらに、本求核性化合物が水溶性であるために、この水溶性・求核性化合物を除去するための、別の洗浄工程は不要になる。なぜなら、この化合物は、核酸サンプルとの接触時に溶解され、したがって、核酸精製手順の通例の洗浄工程において除去することが可能だからである。
【００２５】
好ましい実施態様では、少なくとも二つのOH基を持つ少なくとも一分子を有する、本発明による水溶性・求核性化合物は糖アルコールである。特に好ましい実施態様では、少なくとも二つのOH基を持つ少なくとも一分子を有する、本発明による水溶性・求核性化合物は、ソルビトール、キシリトール、ラクチトール、スレイトール、エリスリトール、マンニトール、イソマルト、イノシトール、パルミチン酸塩、及び／又はクエン酸塩、又はそれらの混合物から選ばれる。
【００２６】
さらに別の特に好ましい実施態様では、本発明による水溶液は、少なくとも一つの陰性荷電洗浄剤と、少なくとも二つのOH基を持つ少なくとも一分子を有する、少なくとも一つの水溶性・求核性化合物との、少なくとも一つの混合物を含む。
【００２７】
さらに別の特に好ましい実施態様では、この陰性荷電洗浄剤は、脂肪性アルコール硫酸塩、より詳細には、ドデシル硫酸ナトリム（SDS）、及び／又は、アルキルベンゼンスルフォン酸、及び／又は、アルキルベンゼンスルフォネート、より詳細には、ドデシルベンゼンスルフォン酸ナトリウム、ベンゼンスルフォン酸、ドデシルベンゼンスルフォネート、ドデシルベンゼンスルフォン酸アンモニウム、及び／又はN-ラウロイルサルコシン（「サルコシル」）、又はそれらの混合物を含む群から選ばれる。
【００２８】
既に明らかにされたように、本発明による水溶性化合物は、その求核性のために、マトリックス表面を「模倣」できる確率がかなり高い。したがって、恐らくは、マトリックス表面ではなく、本発明による化合物の方が、プラスチック成分の気体放出による攻撃を受けている。
【００２９】
好ましい実施態様では、本発明による水溶液はさらに、微生物の増殖を阻止する化合物を含む。特に好ましくは、この化合物は、アジ化ナトリウム、チメロサール、フェノール、ベンジルアルコール、及び／又はクレゾールを含む群から選ばれる。
【００３０】
本発明の水溶液による処理は、好ましくは、≧1秒から≦60秒まで続く。原理的には、処理の持続時間は上限を持たないが、多くの用途において、5分よりも長い処理は、結合能において実質的な改善をもたらさないことが見出されている。したがって、処理の好ましい持続時間は、1分、2分、3分、4分、最大5分である。
【００３１】
さらに、本発明の水溶液による処理は、≧5℃から≦45℃の温度において行われることが好ましく、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、又は30℃の温度が好ましい。原理的には、温度範囲には上限も下限もないが、操作上の理由で45℃までの温度が好ましい。
【００３２】
さらに、本発明の水溶液のpHは、好ましくは≧4.5から≦9.5、特に好ましくは≧6から≦8、さらに特に好ましくは約7である。言い換えると、本発明の水溶液のpHは、本質的に中性であることがもっとも好ましい。
【００３３】
さらに、本発明の水溶液は、好ましくは、≧0.5から≦20％の濃度、特に好ましくは≧1から≦10%の濃度、及びさらに特に好ましくは≧1から≦5%の濃度である。
【００３４】
上に記述され、例示実施態様において主張され、記載される、本発明にしたがって使用される成分は、そのサイズ、形状、材料選択、及び技術概念において、何れの特定の例外的条件に拘束されるものではなく、したがって、応用分野において公知の選択基準は制限無く適用することができる。
【００３５】
本発明の主題に関する、さらに別の詳細、特色、及び利点は、従属請求項、さらには、例として挙げられる、下記の説明、添付の図面、及び、例示の実施態様、すなわち、本発明の複数の可能な実施態様及び使用が具体的に示される実施態様から明白であろう。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】膜の経年劣化を誘発するための実験セットアップを示す。
【図２】本発明にしたがって前処理したシリカ膜、及び比較例の、プラスミドDNA結合能力のグラフを示す。
【図３】様々の濃度のソルビトール又はSDSによって前処理したシリカ膜、及び比較例の、プラスミドDNA結合能力のグラフを示す。
【図４】本発明にしたがって前処理したシリカ膜、及び比較例の、RNA結合能力のグラフを示す。
【図５】様々の濃度のソルビトール又はSDSによって前処理したシリカ膜、及び比較例の、RNA結合能力のグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
本発明は、下記の例示実施態様によって具体的に説明されるが、ただしこれらに限定されてはならない。
【実施例】
【００３８】
下記の手順が用いられた：
例１
シリカ膜ディスク（GF51, Pall）をパンチで切り出し、それぞれを、対応物質の水溶液に浸した。対応物質（使用された）は後述する。浸漬は、室温、すなわち約20℃において5分間行った。次に、この膜ディスクを短時間乾燥し、比較的多数のフリット（Vyon Fポリエチレン、Koepp）の存在下に50℃でインキュベートした。このインキュベーションは、膜ディスクの経年劣化を誘発した。インキュベーションは、7日間（図2及び図4）又は3週間（図3及び図5）続いた。この目的のための実験セットアップを図1に示す。閉じられたビーカー（1）に多数のフリット（3）を充たす。次に、処理済み膜ディスク（2）を含む、開放されたアルミニウムボートがフリットの上に置かれる。
【００３９】
次に、膜ディスクは、試験（結合能力に関する）前、Miniスピンカラムに直接登載した（セットアップは下から上に：フリット／1 x GF51膜／クランプ・リング）。
【００４０】
DNA試験の場合、10μgのpUC21プラスミドを、500μlのバッファーPB（QIAGEN）に溶解し、カラムに印加し、膜を介して遠心した。その次に、700μlのバッファーPE（QIAGEN）によって洗浄し、乾燥遠心し、200 mlのバッファーEB（QIAGEN）によって溶出した。この溶出物を、260 nmにおいて光学的に測定した。
【００４１】
シリカ膜の「回収率」は表1及び図2に見出すことができる。各事例において示されるものは、入手直後の膜ディスク、未処理膜ディスク、及び、ソルビトール、NaCl、SDS、又は、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（CTAB）によって前処理された膜ディスクの結合能力である。
【００４２】
【表１】
2012527990.tif 000003
【００４３】
結果は、未処理膜は、疎水性が高く、その結合能力を事実上失ったことを示した。NaCl、又は陽イオン性洗浄剤CTABによる処理もまた全く改善をもたらさなかった。
【００４４】
本発明にしたがってソルビトール及び／又はSDSによって前処理された膜は、驚くべきことに、その結合能を保持し、経年劣化作用を示さなかった。
【００４５】
別の実験で（図2には示さず）、PEG 600及びPEG 4000も同様に試験した。両物質とも、膜は、未処理膜とは違って親水性を維持したが、にも拘わらず、保存後結合能の改善を示さなかった。
【００４６】
様々の濃度（1%、5%、又は10%）のソルビトール又はSDSによって前処理したシリカ膜の結合能を、表2及び図3において見出すことができる。
【００４７】
【表２】
2012527990.tif 000004
【００４８】
結果は、未処理膜ディスク、及び水に浸した膜ディスクは、事実上完全にその結合能力を失ったことを示した。これに反し、ソルビトール又はSDS含浸膜は全て、保存されなかった参照試料の範囲内であった。
【００４９】
例２
シリカ膜ディスクは、実施例1の記述の通りに前処理し、Miniスピンカラムに登載した。
【００５０】
試験では、調製物当たり5 x 105のHeLa細胞を、350μlのバッファーRLTにおいてホモジェナイズし、同量の70%強度のエタノールと混合し、調製済みスピンカラムに適用し、膜を介して遠心した。スピンカラムは、標準的RNeasy手順（QIAGEN RNeasy Miniハンドブック；プロトコール：スピン技術による動物細胞からの全体RNAの精製）にしたがって処理した。溶出は、30μlのRNアーゼ非含有水において実施した。溶出物は、260 nmにおいて光学的に測定した。
【００５１】
シリカ膜の「回収率」は表3及び図4に見出すことができる。各例において示されるものは、標準的RNeasyカラム（QIAGEN）、入手直後のシリカ膜、未処理シリカ膜、及び、ソルビトール、NaCl、SDS、又は、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（CTAB）によって前処理されたシリカ膜のRNA結合能力である。
【００５２】
【表３】
2012527990.tif 000005
【００５３】
驚くべきことに、実施例1の場合と同様、本発明にしたがってSDS及び／又はソルビトールによって処理された膜は、本実施例においても、経年劣化作用をまったく示さなかった。
【００５４】
これに対し、NaClによる処理は、目立った改善をまったく示さず、CTABによる処理は、収率の著明な低下をもたらした。
【００５５】
様々の濃度（1%、5%、又は10%）のソルビトール又はSDSによって前処理したシリカ膜のRNA結合能を、表4及び図5において見出すことができる。
【００５６】
【表４】
2012527990.tif 000006
【００５７】
本発明にしたがってソルビトール及び／又はSDSに浸した膜は全て、保存されなかった参照膜の範囲内にあった。
【図１】
2012527990.tif 000007
【図２】
2012527990.tif 000008
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
2012527990.tif 000012
2012527990.tif 000013
2012527990.tif 000014
2012527990.tif 000015
2012527990.tif 000016
2012527990.tif 000017