【手続補正書】
【提出日】平成21年5月28日(2009.5.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
メチル化特異的なデジタル核型分析(MSDK)ライブラリーを作製する方法であって、以下の段階を含む方法:
試験細胞のゲノムDNAの全部または一部を提供する段階;
DNAをメチル化感受性マッピング制限酵素(MMRE)に曝露して、複数の第1の断片を作出する段階;
親和性対の第1のメンバーを含む結合成分を、第1の断片のそれぞれの一方の末端にまたは両方の末端に結合させ、この結合によって複数の第2の断片をもたらす段階;
複数の第2の断片を断片化用の制限酵素(FRE)に曝露して、親和性対の第1のメンバーを一方の末端におよびFREの5'切断配列またはFREの3'切断配列を他方の末端にそれぞれが含んだ、複数の第3の断片を作出する段階;
複数の第3の断片を、複数の親和性対の第2のメンバーが結合されている不溶性基材と接触させ、該接触によってそれぞれが、不溶性基材に親和性対の第1および第2のメンバーを介して結合した第3の断片である、複数の結合した第3の断片をもたらす段階;
放出用の制限酵素(RRE)認識配列および、RREの認識配列の3'側に、FREの5'切断配列またはFREの3'切断配列のいずれかを含んだ放出用の成分を、結合した第3の断片の遊離末端に結合させ、この結合によってそれぞれが、(i) RREの認識配列を一方の末端に含んだ、ならびに(ii) 他方の末端の親和性対の第1のメンバーおよび親和性対の第2のメンバーを介して不溶性基材に結合した、複数の結合した第4の断片をもたらす段階; および
結合した第4の断片をRREに曝露し、この曝露によってそれぞれが、ゲノムDNAの複数の塩基対からなるMSDKタグおよび放出用の成分を含んだ、複数の第5の断片を含むMSDKライブラリーの、不溶性基材からの放出をもたらす段階。
【請求項２】
MSDKライブラリーを分析する方法であって、以下の段階を含む方法:
請求項1記載の方法によって作製されるMSDKライブラリーを提供する段階;
1つのタグ、複数のタグ、または全てのタグのヌクレオチド配列を同定する段階。
【請求項３】
タグの一部または全部の相対頻度を判定する段階をさらに含む、請求項2記載の方法。
【請求項４】
生体細胞を分類する方法であって、以下の段階を含む方法:
(a) 請求項3記載の方法を行い、それにより試験細胞に対する試験MSDKプロファイルを得る段階;
(b) 試験MSDKプロファイルを、1つまたは複数の対照の細胞型に対する別の対照MSDK発現プロファイルと比較する段階;
(c) 試験MSDKプロファイルに最も酷似している対照MSDKプロファイルを選択する段階; ならびに
(d) 段階(c)で選択された対照MSDKプロファイルの細胞型に適合する細胞型を試験細胞に割り当てる段階。
【請求項５】
試験および対照細胞が脊椎動物細胞である、請求項4記載の方法。
【請求項６】
試験および対照細胞が哺乳動物細胞である、請求項5記載の方法。
【請求項７】
試験および対照細胞がヒト細胞である、請求項6記載の方法。
【請求項８】
対照の細胞型が、対照の正常細胞および正常細胞と同じ組織の対照のがん細胞を含む、請求項6記載の方法。
【請求項９】
対照の正常細胞および対照のがん細胞が乳房細胞である、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
対照の正常細胞および対照のがん細胞が結腸、肺、前立腺、および膵臓からなる群より選択される組織のものである、請求項8記載の方法。
【請求項１１】
試験細胞が乳房細胞である、請求項8記載の方法。
【請求項１２】
試験細胞が結腸、肺、前立腺、および膵臓からなる群より選択される組織のものである、請求項8記載の方法。
【請求項１３】
対照の細胞型が単一組織のがんのうちの異なる部類の細胞を含む、請求項4記載の方法。
【請求項１４】
単一組織のがんのうちの異なる部類が非浸潤性乳管がん(DCIS)細胞および浸潤性乳がん細胞を含む、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
単一組織のがんのうちの異なる部類が、以下: 高悪性度DCIS細胞、中悪性度DCIS細胞; および低悪性度DCIS細胞の2つまたはそれ以上を含む、請求項13記載の方法。
【請求項１６】
対照の細胞型が以下: 肺がん細胞; 乳がん細胞; 結腸がん細胞; 前立腺がん細胞; および膵臓がん細胞の2つまたはそれ以上を含む、請求項6記載の方法。
【請求項１７】
対照の細胞型が、非がん組織から得られた上皮細胞および非がん組織から得られた筋上皮細胞を含む、請求項4記載の方法。
【請求項１８】
診断方法であって、以下の段階:
(a) 試験上皮細胞を提供する段階; 
(b) 1つまたは複数のC残基がCpG配列中のC残基である、試験細胞における遺伝子中の1つまたは複数のC残基のメチル化の程度を判定する段階; および
(c) 1つまたは複数の残基のメチル化の程度を、試験上皮細胞が得られた同じ型の組織である非がん性の組織から得られた対照の上皮細胞における対応する遺伝子中の対応する1つまたは複数のC残基のメチル化の程度と比較する段階を含み、
対照の上皮細胞と比較して試験上皮細胞における1つまたは複数のC残基のメチル化の程度の変化は、試験上皮細胞ががん細胞であるという徴候である、方法。
【請求項１９】
試験上皮細胞が乳房組織から得られ、遺伝子が表5に列挙されているMSDKタグによって同定されるものから選択される、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
試験上皮細胞が結腸組織から得られ、遺伝子が表2に列挙されているMSDKタグによって同定されるものから選択される、請求項18記載の方法。
【請求項２１】
メチル化の程度の変化が、より低いメチル化の程度である、請求項18記載の方法。
【請求項２２】
メチル化の程度の変化が、より高いメチル化の程度である、請求項18記載の方法。
【請求項２３】
メチル化の程度の変化が、遺伝子のプロモーター領域中である、請求項18記載の方法。
【請求項２４】
メチル化の程度の変化が、遺伝子のエクソン中または遺伝子のイントロン中である、請求項18記載の方法。
【請求項２５】
遺伝子がPRDM14およびZCCHC14からなる群より選択される、請求項19記載の方法。
【請求項２６】
遺伝子がLHX3、TCF7L1、およびLMX-1Aからなる群より選択される、請求項20記載の方法。
【請求項２７】
診断方法であって、以下の段階:
(a) 試験乳房組織から得られる試験筋上皮細胞または試験線維芽細胞を提供する段階;
(b) 1つまたは複数のC残基がCpG配列中のC残基である、試験細胞における遺伝子中の1つまたは複数のC残基のメチル化の程度を判定する段階; および
(c) 1つまたは複数の残基のメチル化の程度を、非がん性の乳房組織から得られた対照の筋上皮細胞または対照の線維芽細胞における対応する遺伝子中の対応する1つまたは複数のC残基のメチル化の程度と比較する段階を含み、
対照細胞と比較して試験細胞における1つまたは複数のC残基のメチル化の程度の変化は、試験乳房組織ががん組織であるという徴候である、方法。
【請求項２８】
試験細胞が筋上皮細胞であり、遺伝子が表10に列挙されているMSDKタグによって同定されるものから選択される、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
試験細胞が線維芽細胞であり、遺伝子が表7および8に列挙されているMSDKタグによって同定されるものから選択される、請求項27記載の方法。
【請求項３０】
メチル化の程度の変化が、より低いメチル化の程度である、請求項27記載の方法。
【請求項３１】
メチル化の程度の変化が、より高いメチル化の程度である、請求項27記載の方法。
【請求項３２】
メチル化の程度の変化が、遺伝子のプロモーター領域中である、請求項27記載の方法。
【請求項３３】
メチル化の程度の変化が、遺伝子のエクソン中または遺伝子のイントロン中である、請求項27記載の方法。
【請求項３４】
遺伝子がHOXD4、SLC9A3R1、およびCDC42EP5からなる群より選択される、請求項28記載の方法。
【請求項３５】
遺伝子がCxorf12である、請求項29記載の方法。
【請求項３６】
細胞が上皮細胞または筋上皮細胞である可能性を判定する方法であって、以下の段階:
(a) 試験細胞を提供する段階;
(b) 遺伝子が、表12に列挙されているMSDKタグによって同定されるものから選択され、1つまたは複数のC残基がCpG配列中のC残基である、試験細胞における遺伝子中の1つまたは複数のC残基のメチル化の程度を判定する段階; ならびに
(c) 1つまたは複数の残基のメチル化の程度を、対照の筋上皮細胞における対応する遺伝子中の対応する1つまたは複数のC残基のメチル化の程度とおよび対照の上皮細胞における対応する遺伝子中の対応する1つまたは複数のC残基のメチル化の程度と比較する段階を含み、
試験細胞は、(i) 試験サンプルにおけるメチル化の程度が対照の筋上皮細胞におけるメチル化の程度にいっそう酷似しているなら、筋上皮細胞である可能性がいっそう高く; または(ii) 試験サンプルにおけるメチル化の程度が対照の上皮細胞におけるメチル化の程度にいっそう酷似しているなら、上皮細胞である可能性がいっそう高い、方法。
【請求項３７】
遺伝子がLOC389333およびCDC42EP5からなる群より選択される、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
診断方法であって、以下の段階:
(a) 試験組織から試験細胞を提供する段階;
(b) 1つまたは複数のC残基がCpG配列中のC残基である、試験細胞におけるPRDM14遺伝子中の1つまたは複数のC残基のメチル化の程度を判定する段階; および
(c) 1つまたは複数の残基のメチル化の程度を、試験細胞と同じ組織の非がん組織から得られた対照細胞におけるPRDM14遺伝子中の対応する1つまたは複数のC残基のメチル化の程度と比較する段階を含み、対照細胞と比較して試験細胞における1つまたは複数のC残基のメチル化の程度の変化は、試験細胞ががん細胞であるという徴候である、方法。
【請求項３９】
メチル化の程度の変化が、より低いメチル化の程度である、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
メチル化の程度の変化が、より高いメチル化の程度である、請求項38記載の方法。
【請求項４１】
メチル化の程度の変化が、遺伝子のプロモーター領域中である、請求項38記載の方法。
【請求項４２】
メチル化の程度の変化が、遺伝子のエクソン中または遺伝子のイントロン中である、請求項38記載の方法。
【請求項４３】
試験および対照細胞が乳房細胞である、請求項38記載の方法。
【請求項４４】
試験および対照細胞が結腸、肺、前立腺、および膵臓からなる群より選択される組織のものである、請求項38記載の方法。
【請求項４５】
細胞が幹細胞、分化内腔上皮細胞または筋上皮細胞である可能性を判定する方法であって、以下の段階:
(a) 試験細胞を提供する段階;
(b) 遺伝子が、表15または16に列挙されているMSDKタグによって同定されるものから選択され、1つまたは複数のC残基がCpG配列中のC残基である、試験細胞における遺伝子中の1つまたは複数のC残基のメチル化の程度を判定する段階; ならびに
(c) 1つまたは複数の残基のメチル化の程度を、対照の幹細胞における対応する遺伝子中の対応する1つまたは複数のC残基のメチル化の程度と、対照の幹細胞における対応する遺伝子中の対応する1つまたは複数のC残基のメチル化の程度と、および対照の分化内腔上皮細胞における対応する遺伝子中の対応する1つまたは複数のC残基のメチル化の程度と、および対照の筋上皮細胞における対応する遺伝子中の対応する1つまたは複数のC残基のメチル化の程度と比較する段階を含み、試験細胞は、(i) 試験細胞におけるメチル化の程度が対照の幹細胞におけるメチル化の程度にいっそう酷似しているなら、幹細胞である可能性がいっそう高く; (ii) 試験細胞におけるメチル化の程度が対照の分化内腔上皮細胞におけるメチル化の程度にいっそう酷似しているなら、分化内腔上皮細胞である可能性がいっそう高く; または(iii) 試験細胞におけるメチル化の程度が対照の筋上皮細胞におけるメチル化の程度にいっそう酷似しているなら、筋上皮細胞である可能性がいっそう高い、方法。
【請求項４６】
C残基が、遺伝子のプロモーター領域中である、請求項45記載の方法。
【請求項４７】
C残基が、遺伝子のエクソン中または遺伝子のイントロン中である、請求項45記載の方法。
【請求項４８】
遺伝子がSOX13、SLC9A3R1、FNDC1、FOXC1、PACAP、DDN、CDC42EP5、LHX1、およびHOXA10からなる群より選択される、請求項45記載の方法。