(57)【要約】  本発明は、免疫応答を抗原に対するＴｈ１型応答に向けることを目的とする医薬組成物を調製するための、より具体的には、癌、感染症、およびアレルギーの予防および／または処置のためのサッカロマイセス・セレビシエのミトコンドリア核酸画分および前記抗原の使用に関する。相乗効果を有するアジュバント組成物、相乗効果を有するワクチン組成物、およびパーツキットも提供される。その個体の処置方法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫応答を抗原に対するＴｈ１型応答に向けることを目的とする医薬組成物の調製のための、サッカロマイセス・セレビシエのミトコンドリア核酸画分および抗原の使用であって、前記サッカロマイセス・セレビシエのミトコンドリア核酸画分が、
ａ）サッカロマイセス・セレビシエを、それらの増殖を可能にする培地で培養し、その後前記培養物を遠心分離する工程、
ｂ）工程ａ）で得られたサッカロマイセス・セレビシエのペレットを粉砕する工程、
ｃ）工程ｂ）で得られた混合物を遠心分離する工程、
ｄ）工程ｃ）で得られた上清を超遠心分離する工程、
ｅ）工程ｄ）で得られたペレットから核酸を抽出する工程、
ｆ）工程ｅ）で得られた上清から核酸画分を回収する工程
を含んでなる方法により調製される、使用。
【請求項２】
核酸が、リボ核酸（ＲＮＡ）である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
抗原が、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、感染性生物に特異的な抗原、およびアレルゲンに特異的な抗原からなる群から選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
抗原が、ペプチド、核酸、脂質、リポペプチド、およびサッカライドからなる群から選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
ＴＡＡが、ＭＵＣ−１である、請求項３に記載の使用。
【請求項６】
感染性生物に特異的な抗原が、ヒトパピローマウィルス（ＨＰＶ）に特異的な抗原、好ましくはＨＰＶ−１６および／またはＨＰＶ−１８に特異的な抗原、ならびにより好ましくはＨＰＶ−１６および／またはＨＰＶ−１８のＥ６初期コード領域、ＨＰＶ−１６および／またはＨＰＶ−１８のＥ７初期コード領域、ならびにそれらの一部または組合せからなる群から選択される抗原である、請求項３に記載の使用。
【請求項７】
抗原が、好ましくはプラスミドまたはウイルスベクターから選択されるベクターに含まれる、請求項１に記載の使用。
【請求項８】
ウイルスベクターが、ポックスウイルス、好ましくはワクシニアウイルス、およびより好ましくは修飾ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）、またはそれらの誘導体から得られる、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
ウイルスベクターが、アデノウイルス、アデノウイルス関連ウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アルファウイルス、または泡沫状ウイルス、またはそれらの誘導体から得られる、請求項７に記載の使用。
【請求項１０】
抗原が核酸である場合、ベクターが、抗原の発現に必要なエレメントを更に含んでなる、請求項７に記載の使用。
【請求項１１】
医薬組成物が、トランスフェクション効率、および／または前記サッカロマイセス・セレビシエのミトコンドリア核酸画分および／または抗原の安定性を向上させ、好ましくは、脂質、リポソーム、サブミクロンの水中油型エマルジョン、マイクロ粒子、ＩＳＣＯＭ、およびポリマーからなる群から選択される、１以上の作用剤を更に含んでなる、請求項１に記載の使用。
【請求項１２】
リポソームが、好ましくはジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）、およびリポソームアムホテリシンＢ、またはそれらの組合せから選択される陽イオン性リポソームである請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記組合せが、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）およびＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）である、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
癌、感染症、アレルギーおよび／または自己免疫障害の、予防および／または処置を目的とする医薬組成物を調製するための、請求項１に記載の使用。
【請求項１５】
（ｉ）  ａ）サッカロマイセス・セレビシエを、それらの増殖を可能にする培地で培養し、その後前記培養物を遠心分離する工程、
ｂ）工程ａ）で得られたサッカロマイセス・セレビシエのペレットを粉砕する工程、
ｃ）工程ｂ）で得られた混合物を遠心分離する工程、
ｄ）工程ｃ）で得られた上清を超遠心分離する工程、
ｅ）工程ｄ）で得られたペレットから核酸を抽出する工程、
ｆ）工程ｅ）で得られた上清から核酸画分を回収する工程
を含んでなる方法により調製されるサッカロマイセス・セレビシエのミトコンドリア核酸画分と、
（ｉｉ）リポソームアムホテリシンＢと
を含んでなる相乗効果を有するアジュバント組成物。
【請求項１６】
（ｉ）  ａ）サッカロマイセス・セレビシエを、それらの増殖を可能にする培地で培養し、その後前記培養物を遠心分離する工程、
ｂ）工程ａ）で得られたサッカロマイセス・セレビシエのペレットを粉砕する工程、
ｃ）工程ｂ）で得られた混合物を遠心分離する工程、
ｄ）工程ｃ）で得られた上清を超遠心分離する工程、
ｅ）工程ｄ）で得られたペレットから核酸を抽出する工程、
ｆ）工程ｅ）で得られた上清から核酸画分を回収する工程
を含んでなる方法により調製されるサッカロマイセス・セレビシエのミトコンドリア核酸画分と、
（ｉｉ）リポソームアムホテリシンＢと、
（ｉｉｉ）抗原と
を含んでなる相乗効果を有するワクチン組成物。
【請求項１７】
（ｉ）  ａ）サッカロマイセス・セレビシエを、それらの増殖を可能にする培地で培養し、その後前記培養物を遠心分離する工程、
ｂ）工程ａ）で得られたサッカロマイセス・セレビシエのペレットを粉砕する工程、
ｃ）工程ｂ）で得られた混合物を遠心分離する工程、
ｄ）工程ｃ）で得られた上清を超遠心分離する工程、
ｅ）工程ｄ）で得られたペレットから核酸を抽出する工程、
ｆ）工程ｅ）で得られた上清から核酸画分を回収する工程
を含んでなる方法により調製されるサッカロマイセス・セレビシエのミトコンドリア核酸画分と、
（ｉｉ）ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）およびＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）と
を含んでなる相乗効果を有するアジュバント組成物。
【請求項１８】
（ｉ）  ａ）サッカロマイセス・セレビシエを、それらの増殖を可能にする培地で培養し、その後前記培養物を遠心分離する工程、
ｂ）工程ａ）で得られたサッカロマイセス・セレビシエのペレットを粉砕する工程、
ｃ）工程ｂ）で得られた混合物を遠心分離する工程、
ｄ）工程ｃ）で得られた上清を超遠心分離する工程、
ｅ）工程ｄ）で得られたペレットから核酸を抽出する工程、
ｆ）工程ｅ）で得られた上清から核酸画分を回収する工程
を含んでなる方法により調製されるサッカロマイセス・セレビシエのミトコンドリア核酸画分と、
（ｉｉ）ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）およびＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）と、
（ｉｉｉ）抗原と
を含んでなる相乗効果を有するワクチン組成物。
【請求項１９】
少なくとも１つのサッカロマイセス・セレビシエのミトコンドリア核酸画分を含有する容器と、少なくとも１つの抗原を含有する容器と、前記成分の投与タイミングに関する説明書とを含んでなるパーツキット。
【請求項２０】
少なくとも１つのサッカロマイセス・セレビシエのミトコンドリア核酸画分を含有する容器と、少なくとも１つの抗原を含有する容器と、トランスフェクション効率および／またはサッカロマイセス・セレビシエミトコンドリア核酸画分および／または抗原の安定性を改善する少なくとも１つの作用剤を含有する容器と、前記成分の投与タイミングに関する説明書とを含んでなるパーツキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的にアジュバントに関する。特に、本発明は、免疫応答を特定の抗原に対するＴｈ１型応答に向けることを目的とする医薬組成物を調製するための、アジュバント効果を有するサッカロマイセス・セレビシエのミトコンドリア核酸画分の使用に関する。
【発明の背景】
【０００２】
長年、ワクチン接種技術は、本質的に、感染性生物に対する免疫応答を誘発させるために、抗原（例えば、タンパク質、死滅または弱毒化ウイルス）を動物に導入することに基づいていた。８０年代末以来、抗原をコードする核酸配列を含んでなるベクターを動物に導入することに基づく新しいワクチン接種技術が出現している。例えば、狂犬病糖タンパク質をコードする生菌ワクシニアウイルスは、西欧諸国において陸生狂犬病撲滅のために使用され、成功している（CLIQUET, et al. Elimination of terrestrial rabies in Western European countries. Developments in biologicals. 2004, vol.119, p.185-204）。核酸免疫化の主な利点は、コードされた抗原が、内因性および外因性経路の両方によりプロセスされ、ペプチドエピトープが、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩならびにクラスＩＩ複合体により提示されるため、細胞性免疫応答（ＣＤ４＋およびＤ８＋Ｔ細胞を含む）および体液性免疫応答の両方を誘導することができるということである（HAUPT, et al. The Potential of DNA Vaccination against Tumor-Associated Antigens for Antitumor Therapy. Experimental Biology and Medicine. 2002, vol.227, p.227-237）。
【０００３】
細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を効率的に誘発させることにより、核酸ワクチン接種による癌の予防的処置または治療処置への道が開かれた。多くの腫瘍細胞は、ＴＡＡ（腫瘍関連抗原の略）と呼ばれる特異的な抗原（群）を発現するが、これら抗原は、腫瘍の周辺では因子により下方制御される免疫系によってはあまり認識されない。ＴＡＡをコードする核酸を患者にワクチン接種することにより、免疫系が十分に有効な環境でのＴＡＡ発現がもたらされ、腫瘍細胞に対して特異的な免疫応答が誘発される。
【０００４】
しかしながら、ワクチン接種は、現在まで最も成功した介入保健政策であり続けているものの、感染症および癌は、世界中で依然として主要な死因のままである。ワクチン接種が有効な免疫を誘発できない主な理由は、所望の免疫応答を開始することが可能な適切なアジュバントが欠如しているからである。更に、ほとんどの従来アジュバントは、新世代ワクチンに望ましい安全性および効能に関する厳格な基準を満たさない、組成が不明確で複雑な物質である。
【０００５】
自然免疫を活性化することにより機能する新世代のアジュバントは、より安全でより強力なワクチンを開発する絶好の機会を提供する。トール様受容体（ＴＬＲ）のファミリーは、高度に保存された病原体発現分子を検出するための自然免疫系に極めて重要な役割を果たすと考えられる。感染の迅速な検出を可能にするために、ヒトで発現されることが現在知られている１０種類のＴＬＲの各々は、宿主細胞で発現されないかまたはそれらがＴＬＲに接触できない細胞区画に隔離されているかのいずれかである、あるタイプの病原体発現分子の存在下で刺激されるように進化したと考えられる。適切な病原体分子によるＴＬＲの活性化は、適切な免疫防御を開始するための「警告シグナル」として作用する。これらＴＬＲ活性化因子を単独で使用して、病原体または腫瘍細胞に対して誘発された自然免疫応答を高めることにも成功している。例えば、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）は、ワクチンアジュバントとして、ならびに癌、感染症、喘息、およびアレルギーの処置において有望な結果を示すＴＬＲ９アゴニストである。それらの１つであるＣＰＧ−７９０９は、単独療法としてならびに化学療法および免疫療法と組合せたアジュバントとして癌の処置用に開発された。この薬物は、幾つかの造血器腫瘍および固形腫瘍において第Ｉ相および第Ｉ相治験で試験されている（MURAD, et al. CPG-7909 (PF-3512676, ProMune): toll-like receptor-9 agonist in cancer therapy. Expert opinion on biological therapy. 2007, vol.7, no.8, p.1257-66）。
【０００６】
免疫応答の性質は、免疫化により刺激される抗原特異的リンパ球のプロファイルを反映する。リンパ球、特にＴ細胞は、異なるタイプの抗原により刺激され、異なるエフェクター機能を果たすことができる亜集団からなる。例えば、ウイルス感染では、ウイルス抗原は、感染細胞で合成され、ＭＨＣクラスＩ分子を介して提示され、ＣＤ８＋ＭＨＣクラスＩ限定ＣＴＬの刺激がもたらされる。対照的に、細胞外微生物抗原は、ＡＰＣにより取り込まれ、プロセスされ、優先的にＭＨＣクラスＩＩ分子を介して提示される。これにより、ＣＤ４＋、ＭＨＣクラスＩＩ限定ヘルパーＴ細胞が活性化され、抗体産生およびマクロファージ活性化がもたらされるが、ＣＴＬの発生は比較的非能率的である。ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の集団内でさえ、抗原刺激に応答して特徴的なサイトカインを産生するサブセットが存在する。ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞は、初めて抗原と遭遇した際に、主としてＴ細胞増殖因子、インターロイキン２（ＩＬ−２）を産生する。抗原刺激は、これら細胞が、サイトカインを産生するＴｈ０と呼ばれる集団に分化すること、その後サイトカイン産生およびエフェクター機能に関する比較的限定されたプロファイルを有するＴｈ１およびＴｈ２と呼ばれるサブセットに分化することを引き起こすこともある。Ｔｈ１細胞は、マクロファージを活性化するガンマインターフェロン（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン２（ＩＬ−２）を分泌し、細胞内微生物に対する細胞性免疫および遅延型過敏症反応の主要エフェクターである。Ｔｈ１細胞により刺激された抗体アイソタイプは、補体を活性化し、食作用のために抗原をオプソニン化するのに効果的である。従って、Ｔｈ１細胞は、食細胞媒介性宿主防御を引き起こす。細胞内微生物による感染は、微生物の食細胞性排除を促進するＴｈ１サブセットへのナイーブＴ細胞の分化を誘導する傾向がある。その一方で、Ｔｈ２細胞は、ＩｇＥ抗体産生を刺激するインターロイキン４（ＩＬ−４）、好酸球活性化因子であるインターロイキン−５、ならびにインターロイキン４（ＩＬ−４）と共に細胞性免疫を抑制するインターロイキン１０（ＩＬ−１０）およびインターロイキン−１３（ＩＬ−１３）を産生する。従って、Ｔｈ２細胞は、主として、ＩｇＥおよび好酸球により媒介される、例えばある種の蠕虫様寄生生物に対する食細胞非依存性宿主防御、ならびにマスト細胞および好塩基球のＩｇＥ依存性活性化によるアレルギー反応に関与する（ABBAS A. K. and al., Cellular and molecular Immunology, W. B. Saunders Co.）。
【０００７】
Winklerら(WINKLER, S., M. Willheim, K. Baier, et al. 1998. Reciprocal regulation of Th1- and Th2-cytokine-producing T cells during clearance of parasitemia in Plasmodium falciparum malaria, Infect. Immun. 66:6040- 6044.)は、無併発性熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）マラリア患者において、ヒト抗マラリア宿主防御における重要な分子としてのＩＦＮ−γの役割を示し、Winklerらは、熱帯熱マラリア原虫寄生体の排除におけるインターロイキン４（ＩＬ−４）の直接的関与を支持していない。更に、同じ所与の抗原の場合、抗体反応中に主要なアイソタイプへと向かわせるのは、アジュバントであることが示されている（TOELLNER K. -M. et al. J. Exp. Med. 1998, 187: 1193）。例えば、アルハイドロゲル等のアルミニウム塩は、マウスにおいて本質的にＴｈ２型応答を誘導し、ＩｇＧ１の形成またはＩｇＥの形成さえ促進することが知られおり（ALLISON A.C. In Vaccine design - The role of cytokine networks Vol. 293, 1-9 Plenum Press 1997）、これは、アレルギー体質を有する対象体で問題を起こす場合がある。
【０００８】
この点で、免疫応答を抗原に対するＴｈ１型応答に向けることが可能である利用可能なアジュバントの必要性が依然として存在する。
【発明の概要】
【０００９】
本出願者は、驚くべきことに、特定のサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のミトコンドリア核酸画分が、ＴＬＲ活性化因子であり、免疫応答を抗原に対するＴｈ１型応答に向けることが可能であることを見出した。
【００１０】
本出願の全体にわたって使用されているように、「Ｔｈ１型応答」とは、ガンマインターフェロン（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、および／またはインターロイキン１２（ＩＬ−１２）の産生を刺激するものを指す。
【００１１】
本出願の全体にわたって使用されているように、「１つ（ａ）」および「１つ（ａｎ）」は、明示されない限り、参照される成分または工程の「少なくとも１つ」、「少なくとも第１」、「１以上」または「複数」を意味するという意味で使用される。
【００１２】
本出願の全体にわたって使用されているように、「および／または」は、本明細書のどこで使用されていようとも、「および」、「または」、および「前記用語よりに接続されている要素の全てまたは任意の他の組合せ」の意味を含む。
【００１３】
本出願の全体にわたって使用されているように、「含んでなること」および「含んでなる」は、産物、組成物、および方法が、参照されている成分または工程を含むが、他を排除しないことを意味することが意図される。「から本質的になる」は、産物、組成物、および方法を定義するために使用される場合、あらゆる本質的に有意な他の成分または工程を除外することを意味するものとする。従って、列挙された成分から本質的になる組成物は、微量夾雑物および薬学的に許容される担体を除外しないことになる。「からなる」は、他の成分または工程の微量を超える要素を除外することを意味するものとする。
【００１４】
本発明は、免疫応答を抗原に対するＴｈ１型応答に向けることを目的とする医薬組成物の調製のための、サッカロマイセス・セレビシエのミトコンドリア核酸画分および前記抗原の使用であって、前記サッカロマイセス・セレビシエのミトコンドリア核酸画分が、
ａ）サッカロマイセス・セレビシエを、それらの増殖を可能にする培地で培養し、その後前記培養物を遠心分離する工程、
ｂ）工程ａ）で得られたサッカロマイセス・セレビシエのペレットを粉砕する工程、
ｃ）工程ｂ）で得られた混合物を遠心分離する工程、
ｄ）工程ｃ）で得られた上清を超遠心分離する工程、
ｅ）工程ｄ）で得られたペレットから核酸を抽出する工程、
ｆ）工程ｅ）で得られた上清から核酸画分を回収する工程
を含んでなる方法により調製される、使用に関する。
【発明の具体的説明】
【００１５】
サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓ．ｃ．）は、十分に記述されており（Meyen ex E.C. Hansen, 1883）、市販されている（例えば、Ｓ．ｃ．ＤＳＭ番号１３３３  ＡＴＣＣ９７６３；Ｓ．ｃ．ＤＳＭ番号７０４６４  ＮＣＹＣ１４１４；Ｓ．ｃ．ＤＳＭ番号２１５５  ＡＴＣＣ７７５４；Ｓ．ｃ．ＤＳＭ番号７０８６９；Ｓ．ｃ．ＤＳＭ番号７０４６１  ＮＣＹＣ１４１２；Ｓ．ｃ．ＡＨ１０９  クロンテック社製；Ｓ．ｃ．Ｙ１８７  クロンテック社製；Ｓ．ｃ．Ｗ３０３  バイオケム社製）。本発明の好ましい実施形態では、使用されるサッカロマイセス・セレビシエは、実施例１に記述されたサッカロマイセス・セレビシエＡＨ１０９（クロンテック社製）である。本発明の別の好ましい実施形態では、使用されるサッカロマイセス・セレビシエは、実施例１に記述されたサッカロマイセス・セレビシエＷ３０３（バイオケム社製）である。
【００１６】
工程ａ）のサッカロマイセス・セレビシエを培養する方法は、当業者に周知である（Guthrie, C. & Fink, G. R. (1991) Guide to yeast genetics and molecular biology - Methods in Enzymology (Academic Press, San Diego, CA) 194:1-932 Heslot, H. & Gaillardin, C, eds. (1992) Molecular Biology and Genetic Engineering of Yeasts, CRC Press, Inc.）。サッカロマイセス・セレビシエの増殖を可能にする培地は、十分に記述されており（例えば、培地１０１７  ＹＰＧ培地  ＤＳＭＺ；培地１８６  ＹＭ培地  ＤＳＭＺ；培地３９３  ＹＰＤ培地  ＤＳＭＺ）、幾つかは市販されている（例えば、ＹＰＤ培地  クロンテック社製）。サッカロマイセス・セレビシエの増殖を可能にする培地は、少なくとも酵母抽出物、ペプトン、およびグルコースを含んでなる。使用される培地は、例えばアミノ酸、ビタミン、塩、および／またはその他等の１以上の栄養素で補完されていてもよい。それらの幾つかは、市販されている（例えば、アデニンで補完されたＹＰＤ培地に対応するＹＰＤＡ培地  クロンテック社製）。例えば、栄養素、温度、および継続期間等の培養条件は、当業者に周知である（Guthrie, C. & Fink, G. R. (1991) Guide to yeast genetics and molecular biology - Methods in Enzymology (Academic Press, San Diego, CA) 194:1-932 Heslot, H. & Gaillardin, C, eds. (1992) Molecular Biology and Genetic Engineering of Yeasts, CRC Press, Inc.）。本発明の好ましい実施形態では、実施例１に記述された方法および条件が使用され、そこではサッカロマイセス・セレビシエＡＨ１０９またはＷ３０３が、２８℃〜３０℃の温度で、アデニン（１００μｇ／ｍｌ）で補完された、酵母抽出物（１％）、ペプトン（１％）、およびグルコース（２％）を含んでなる培地で培養される。
【００１７】
以前に得られたサッカロマイセス・セレビシエの培養物を遠心分離する工程ａ）は、サッカロマイセス・セレビシエを全てペレット化するのに好適な加速度下および期間で実施される。当業者であれば、どの程度の速度およびどの程度の継続期間が最も適切であるかを決定することができる。以前に得られたサッカロマイセス・セレビシエの培養物を遠心分離する工程ａ）は、実施例１に記述されているように、好ましくは３５００ｒｐｍの加速度下で少なくとも１５分間実施される。
【００１８】
工程ａ）で得られたサッカロマイセス・セレビシエのペレットを粉砕する工程ｂ）は、乳鉢および乳棒を使用する手作業での粉砕；好ましくは直径が０．１〜５ｍｍの、より好ましくは直径が０．７ｍｍのガラスビーズの存在下でのボルテックス（例えば、卓上型ボルテックスＴｏｐ  Ｍｉｘ９４３２３  Ｂｉｏｂｌｏｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｑｕｅ社製）を使用する粉砕；ボルテックスミキサー（例えば、Ｌａｂｎｅｔ社から市販されている）を使用する粉砕；ダウンス型ホモジナイザー（例えば、Ｋｏｎｔｅｓ社から市販されている）を使用した、Ｐｏｔｔｅｒ−Ｅｉｖｅｈｊｅｍ型ホモジナイザー（例えば、Ｋｏｎｔｅｓ社から市販されている）を使用した、またはＳＬＭ  Ａｍｉｎｃｏ社製フレンチプレスを使用した、液体に基づくホモジナイゼーションによる粉砕；ワーリングブレンダーポリトロン（例えば、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社から市販されている）を使用した機械的粉砕；ソニケーター（例えば、Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社；Ｍｉｓｏｎｉｘ社；ＧｉｅｎＭｉｌｌｓ社から市販されている）を使用した超音波処理による粉砕；または凍結／解凍による粉砕等の、当業者に周知の方法、手段、および任意のシステムまたは装置により実施することができる（例えば、RIEDER SE, Emr SD, Overview of subcellular fractionation procedures for the yeast Saccharomyces cerevisiae, Curr Protoc Cell Biol. 2001 May; Chapter 3:Unit 3.7.；RIEDER SE, Emr SD, Isolation of subcellular fractions from the yeast Saccharomyces cerevisiae, Curr Protoc Cell Biol. 2001 May; Chapter 3:Unit 3.8.；HARJU S, Fedosyuk H, Peterson KR., Rapid isolation of yeast genomic DNA: Bust n' Grab, BMC Biotechnol. 2004 Apr 21;4:8.）。工程ａ）で得られたサッカロマイセス・セレビシエのペレットを粉砕する工程ｂ）は、好ましくは４℃の温度で実施される。当業者であれば、特に、処理しようとする工程ａ）で得られたサッカロマイセス・セレビシエのペレットの初期量により、上記の粉砕方法のどれが最も適切であるかを決定することができる。更に、当業者であれば、例えば速度、継続期間等の、工程ｂ）の粉砕条件を決定することができる。本発明の好ましい実施形態では、工程ａ）で得られたサッカロマイセス・セレビシエのペレットを粉砕する工程ｂ）は、ガラスビーズの存在下でボルテックスを使用して粉砕することにより実施される。ガラスビーズは、好ましくは０．１〜５ｍｍの直径、より好ましくは０．７ｍｍの直径を有する。粉砕は、１サイクル当たり３０秒から２分間、より好ましくは１サイクル当たり１分間の継続期間で好ましくは１〜２０サイクル、より好ましくは５サイクルに基づき実施される。本発明のより好ましい実施形態では、工程ａ）で得られたサッカロマイセス・セレビシエのペレットを粉砕する工程ｂ）は、実施例１に記述されているように、ガラスビーズの存在下でボルテックスを使用して粉砕することにより実施され、該ガラスは、０．７ｍｍの直径を有し、粉砕は、１サイクル当たり１分間の継続時間の５サイクルに基づき実施される。 
【００１９】
工程ａ）で得られたサッカロマイセス・セレビシエのペレットの粉砕は、プロテアーゼ酵素の存在下で消化した後でもよい。本発明により好ましく使用されるプロテアーゼ酵素は、例えば、チモリアーゼおよびオキサリチカーゼ（oxalyticase）を含むがこれらに限定されない（エンドまたはエキソ）β−１，３−グリカナーゼまたは（エンドまたはエキソ）β−１，４−グリカナーゼ等の、酵母細胞壁に由来するβ−グリカナーゼである。本発明によると、反応条件、溶液のｐＨ、反応の温度および継続期間は、好ましくは、選択されたプロテアーゼ酵素（群）の活性に対する最適な条件に調整される。当業者であれば、これら条件を決定することができる（RIEDER SE, Emr SD, Overview of subcellular fractionation procedures for the yeast Saccharomyces cerevisiae, Curr Protoc Cell Biol. 2001 May; Chapter 3:Unit 3.7.；RIEDER SE, Emr SD, Isolation of subcellular fractions from the yeast Saccharomyces cerevisiae, Curr Protoc Cell Biol. 2001 May; Chapter 3:Unit 3.8.）。従って、本発明の別の好ましい実施形態では、工程ａ）で得られたサッカロマイセス・セレビシエのペレットを粉砕する工程ｂ）は、工程ａ）で得られたサッカロマイセス・セレビシエのペレットを、１以上のプロテアーゼ酵素、好ましくはチモリアーゼまたはオキサリチカーゼまたはそれらの組合せの存在下で消化した後である。
【００２０】
工程ｂ）で得られた混合物を遠心分離する工程ｃ）は、膜残屑ならびに核をペレット化するのに好適な加速度下および期間で実施される。当業者であれば、どの程度の速度およびどの程度の継続期間が最も適切であるかを決定することができる。工程ｂ）で得られた混合物を遠心分離する工程ｃ）は、実施例１に記述されているように、好ましくは４０００ｒｐｍの加速度下で１０分間実施される。工程ｂ）で得られた混合物を遠心分離する工程ｃ）は、好ましくは４℃の温度で実施される。
【００２１】
工程ｃ）で得られた上清を超遠心分離する工程ｄ）は、ミトコンドリアをペレット化するのに好適な加速度下および期間で実施される。当業者であれば、どの程度の速度およびどの程度の継続期間が最も適切であるかを決定することができる。工程ｃ）で得られた上清を超遠心分離する工程ｄ）は、実施例１に記述されているように、好ましくは３９０００ｒｐｍの加速度下で９０分間実施される。工程ｃ）で得られた上清を超遠心分離する工程ｄ）は、好ましくは、４℃の温度で実施される。
【００２２】
核酸を抽出するための方法は、当業者に周知である。工程ｄ）で得られたミトコンドリアを含んでなるペレットから核酸を抽出する工程ｅ）は、例えば、フェノール−ジクロロメタン抽出またはフェノール−クロロホルム抽出により実施することができる（例えば、CHOMCZYNSKI P. and Sacchi N. (1987), "Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction" Anal. Biochem. 162: 156-159）。本発明の好ましい実施形態では、工程ｄ）で得られたミトコンドリアを含んでなるペレットから核酸を抽出する工程ｅ）が、好ましくはフェノール−ジクロロメタン抽出により実施される、実施例１に記述された方法および条件が使用される。
【００２３】
工程ｅ）で得られた上清から核酸画分を回収する工程ｆ）は、当業者に周知のアルコール沈殿により実施される（例えば、HARJU S, Fedosyuk H, Peterson KR., Rapid isolation of yeast genomic DNA: Bust n' Grab, BMC Biotechnol. 2004 Apr 21 ;4:8）。本発明の好ましい実施形態では、工程ｅ）で得られた上清から核酸画分を回収する工程ｆ）がエタノール沈澱により実施される、実施例１に記述された方法および条件が使用される。
【００２４】
工程ｆ）で回収された核酸画分は、ミトコンドリアリボ核酸（ＲＮＡ）を含んでなる。実施例２（図１）に示されているように、サッカロマイセス・セレビシエのミトコンドリア核酸画分（つまり、ＮＡ画分；ＮＡ−Ｂ２画分）は、ＲＮＡｓｅ感受性である。実施例３（表３）に示されているように、サッカロマイセス・セレビシエのミトコンドリアの核酸画分（つまり、ＮＡ画分；ＮＡ−Ｂ２画分）の生物学的な特性は、ＲＮＡｓｅの存在下で消失する。
【００２５】
この点で、本発明のサッカロマイセス・セレビシエのミトコンドリア核酸画分に含まれる核酸は、好ましくはＲＮＡである。
【００２６】
本発明のサッカロマイセス・セレビシエのミトコンドリア核酸画分（つまり、ＮＡ画分；ＮＡ−Ｂ２画分）は、ヒトＴＬＲに結合することができる。当業者であれば、実施例３に記述されているようなもの等の当技術分野で利用可能な技術を使用することにより、ＴＬＲに結合する核酸の能力を決定することができる。本発明のより好ましい実施形態では、本発明のサッカロマイセス・セレビシエのミトコンドリア核酸画分は、実施例３に記述されているように、ヒトＴＬＲ３、ＴＬＲ４、およびＴＬＲ７に結合することができる。
【００２７】
本発明のサッカロマイセス・セレビシエのミトコンドリア核酸画分（つまり、ＮＡ画分；ＮＡ−Ｂ２画分）は、免疫応答を抗原に対するＴｈ１型応答に向けることを目的とする。より具体的には、本発明のサッカロマイセス・セレビシエのミトコンドリア核酸画分は、抗原に対するガンマインターフェロン（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、および／またはインターロイキン１２（ＩＬ−１２）の産生を誘導することを目的とする。当業者であれば、実施例４および実施例６に記述されているもの等の当技術分野で利用可能な技術を使用することにより、ガンマインターフェロン（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、およびインターロイキン１２（ＩＬ−１２）の産生を誘導する核酸の能力を決定することができる。本発明のより好ましい実施形態では、本発明のサッカロマイセス・セレビシエのミトコンドリア核酸画分は、以下のものの産生を誘導することを目的とする：
−  実施例４および実施例６に記述され、それぞれ図２および図４に示されるガンマインターフェロン（ＩＦＮ−γ）、
−  実施例６に記述されており、図５に示されているインターロイキン１２（ＩＬ−１２）。
【００２８】
実施例６に記述され、図６に示されるように、本発明のサッカロマイセス・セレビシエのミトコンドリア核酸画分は、アルファインターフェロン（ＩＦＮ−α）の産生を誘導する能力はない。
【００２９】
本出願の全体にわたって使用されているように、「抗原」は、宿主の免疫系を刺激して、体液性および／または細胞性の抗原特異的応答を作り出す１以上のエピトープを含有する分子を指す。この用語は、「免疫原」という用語と同義的に使用される。抗イディオタイプ抗体またはその断片等の抗体、および抗原または抗原決定基を模倣することができる合成ペプチドミモトープも、本明細書で使用される抗原の定義下にあるとみなされる。
【００３０】
本発明によると、抗原は、好ましくは、腫瘍関連抗原、感染性生物に特異的な抗原、およびアレルゲンに特異的な抗原からなる群から選択される。
【００３１】
本発明の第１の実施形態によると、抗原は腫瘍関連抗原である。本出願の全体にわたって使用されているように、「腫瘍関連抗原」（ＴＡＡ）は、同じ組織タイプの非腫瘍細胞よりも腫瘍細胞において高頻度または高密度で検出される分子を指す。ＴＡＡの例としては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：ＣＥＡ、ＭＡＲＴ−１、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＧＰ−１００、ＭＵＣ−１（例えば、国際公開第９２／０７０００号パンフレット；欧州特許第５５４３４４号明細書；米国特許第５，８６１、３８１号明細書；米国特許第６，０５４，４３８号明細書；国際公開第９８／０４７２７号パンフレット；国際公開第９８／３７０９５号パンフレットを参照）、ＭＵＣ−２、点突然変異ｒａｓ癌遺伝子、正常または点突然変異ｐ５３、過剰発現ｐ５３、ＣＡ−１２５、ＰＳＡ、Ｃ−ｅｒｂ／Ｂ２、ＢＲＣＡ  Ｉ、ＢＲＣＡ  ＩＩ、ＰＳＭＡ、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＴＡＧ７２、ＫＳＡ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ｂｃｒ−ａｂｌ、ｐａｘ３−ｆｋｈｒ、ｅｗｓ−ｆｌｉ−１、サバイビン、シンシチン（syncytin）（例えば、シンシチン−１、例えば、国際公開第９９／０２６９６号パンフレット；国際公開第２００７／０９０９６７号パンフレット；米国特許第６，３１２，９２１号明細書を参照）、メソテリン、およびＬＲＰ。これら分子の配列は、従来技術に記述されている。本発明の好ましい実施形態では、抗原は、ＴＡＡ  ＭＵＣ−１である。実施例５には、癌の処置を目的とする医薬組成物を調製するための、本発明のサッカロマイセス・セレビシエのミトコンドリア核酸画分（つまり、ＮＡ画分）およびＭＵＣ−１抗原の使用が記述されている。
【００３２】
本発明の別の実施形態によると、抗原は、感染性生物に特異的な抗原である。本出願の全体にわたって使用されているように、「感染性生物に特異的な抗原」は、ウイルス、バクテリア、真菌、または寄生生物に特異的な抗原を指す。
【００３３】
本出願の全体にわたって使用されているように、「ウイルス」としては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：レトロウイルス科、ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）；カリシウイルス科（例えば、胃腸炎を引き起こす株）；トガウイルス科（例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；フラビウイルス科（例えば、デング熱ウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）；コロナウイルス科（例えば、コロナウイルス）；ラブドウイルス科（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；フィロウイルス科（例えば、エボラウイルス）；パラミクソウイルス科（例えば、パラインフルエンザウイルス、おたふくかぜウイルス、麻疹ウイルス、ＲＳウイルス）；オルトミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルス）；ブニヤウイルス科（例えば、ハンタンウイルス、ブニヤウイルス、フレボウイルス、およびナイロウイルス）；アレナウイルス科（出血熱ウイルス）；レオウイルス科（例えば、レオウイルス、オルビウイルス、およびロタウイルス）；ビルナウイルス科；ヘパドナウイルス科（Ｂ型肝炎ウイルス）；パルボウイルス科（パルボウイルス）；パポーバウイルス科（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）；アデノウイルス科（ほとんどのアデノウイルス）；ヘルペスウイルス科（ヘルペスシンプレックスウイルス（ＨＳＶ）１および２、帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス；ポックスウイルス科（痘瘡ウイルス、ワクチニアウイルス、ポックスウイルス）；およびイリドウイルス科（例えば、アフリカブタコレラウイルス）。ウイルス抗原としては、例えば、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、およびＥ型肝炎ウイルス、ＨＩＶ、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、帯状疱疹、パピローマウイルス、エプスタイン−バーウイルス、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、アデノウイルス、コクサッキーウイルス、ピコルナウイルス、ロタウイルス、ＲＳウイルス、ポックスウイルス、ライノウイルス、風疹ウイルス、パポウイルス（papovirus）、パルボウイルス、おたふくかぜウイルス、麻疹ウイルスに由来する抗原が挙げられる。既知のウイルス抗原の幾つかの非限定的な例には、以下のものが含まれる：ｔａｔ、ｎｅｆ、ｇｐ１２０若しくはｇｐ１６０、ｇｐ４０、ｐ２４、ｇａｇ、ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｒｅｖ、若しくはそれらの部分および／または組合せ等のＨＩＶ−１に特異的な抗原；ｇＨ、ｇＬ  ｇＭ  ｇＢ  ｇＣ  ｇＫ  ｇＥ、若しくはｇＤ、若しくはそれらの部分および／または組合せ等のヒトヘルペスウィルス由来の特異的な抗原、またはＨＳＶ１もしくはＨＳＶ２に由来するIＣＰ２７、ＩＣＰ４７、ＩＣＰ４、ＩＣＰ３６等の前初期タンパク質；ｇＢまたはその誘導体等のサイトメガロウイルス、特にヒトサイトメガロウイルスに由来する特異的な抗原；ｇｐ３５０またはその誘導体等のエプスタイン−バーウイルスに特異的な抗原；ｇｐｌ、１１、１１１、およびＩＥ６３等の帯状疱疹ウイルスに特異的な抗原；Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、またはＥ型肝炎ウイルス抗原（例えば、Ｈ���Ｖのｅｎｖタンパク質Ｅ１若しくはＥ２、コアタンパク質、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ、ＮＳ５ｂ、ｐ７、若しくはその部分および／または組合せ）等の肝炎ウイルスに特異的な抗原；ヒトパピローマウイルス（例えば、ＨＰＶ６、１１、１６、１８、例えば、Ｌ１、Ｌ２、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７、若しくはそれらの部分および／または組合せ）に特異的な抗原；ＲＳウイルス（例えば、ＦおよびＧタンパク質またはそれらの誘導体）、パラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、おたふくかぜウイルス、フラビウイルス（例えば、黄熱ウイルス、デング熱ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス）、またはインフルエンザウイルス細胞（例えば、ＨＡ、ＮＰ、ＮＡ、Ｍタンパク質、若しくはそれらの部分および／または組合せ）等の他のウイルス病原体に特異的な抗原。本発明は、特に、ｐ５３への結合が変更されるかまたは少なくとも著しく低減された任意のＨＰＶ  Ｅ６ポリペプチドの使用、および／またはＲｂへの結合が変更されるかまたは少なくとも著しく低減された任意のＨＰＶ  Ｅ７ポリペプチドの使用を包含する（MUNGER, et al. Complex formation of human papillomavirus E7 proteins with the retinoblastoma tumor suppressor gene product. The EMBO journal. 1989, vol.8, no.13, p.4099-105.；CROOK, et al. Degradation of p53 can be targeted by HPV E6 sequences distinct from those required for p53 binding and trans-activation. Cell. 1991, vol.67, no.3, p.547-56.；HECK, et al. Efficiency of binding the retinoblastoma protein correlates with the transforming capacity of the E7 oncoproteins of the human papillomaviruses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 1992, vol.89, no.10, p.4442-6.；PHELPS, et al. Structure-function analysis of the human papillomavirus type 16 E7 oncoprotein. Journal of Virology. 1992, vol.66, no.4, p.2418-27）。本発明の目的に好適な非発癌性ＨＰＶ−１６  Ｅ６変異体は、１１８位付近〜１２２位付近（＋１は、天然ＨＰＶ−１６  Ｅ６ポリペプチドの最初のメチオニン残基を表す）に位置する１以上のアミノ酸残基が欠失しており、残基１１８〜１２２の完全な欠失が特に好ましい（ＣＰＥＥＫ）。本発明の目的に好適な非発癌性ＨＰＶ−１６  Ｅ７変異体は、２１位付近〜２６位付近（＋１は、天然ＨＰＶ−１６  Ｅ７ポリペプチドの最初のメチオニン残基を表す）に位置する１以上のアミノ酸残基が欠失しており、残基２１〜２６の完全な欠失が特に好ましい（ＤＬＹＣＹＥ）。好ましい実施形態によると、本発明で使用される１以上のＨＰＶ−１６初期ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩ提示を向上させるように、および／または抗ＨＰＶ免疫を刺激するように更に修飾されている。ＨＰＶ  Ｅ６およびＥ７ポリペプチドは核タンパクであり、膜提示により、それらの治療効能を向上させることが可能であることが以前に示されている（例えば、国際公開第９９／０３８８５号パンフレットを参照）。従って、細胞膜にアンカーされるようにＨＰＶ初期ポリペプチド（複数可）の少なくとも１つを修飾することが望ましい場合がある。膜アンカーは、天然ポリペプチドが分泌配列（つまり、シグナルペプチド）を欠如している場合、ＨＰＶ初期ポリペプチドに膜アンカー配列を組み込むことにより容易に達成することができる。膜アンカーおよび分泌配列は、当技術分野で公知��ある。手短に言えば、分泌配列は、膜提示または分泌ポリペプチドのＮ末端に存在し、小胞体（ＥＲ）へのそれらの移行を開始させる。分泌配列は、通常、１５〜３５個の本質的に疎水性のアミノ酸を含んでなり、その後それらは、ＥＲに存在する特異的なエンドペプチダーゼにより取り除かれて、成熟ポリペプチドがもたらされる。膜アンカー配列は、通常、性質が高度に疎水性であり、細胞膜にポリペプチドをアンカーさせる役目を果たす（例えば、BRANDEN, et al. Introduction to protein structure. NY GARLAND, 1991. p.202-14を参照）。本発明の状況で使用することができる膜アンカーおよび分泌配列の選択肢は、莫大である。それらは、狂犬病糖タンパク質、ＨＩＶウイルスエンベロープ糖タンパク質、または麻疹ウイルスＦタンパク質等のそれを含んでなる任意の膜アンカーおよび／または分泌ポリペプチド（例えば、細胞性またはウイルス性ポリペプチド）から得てもよく、または合成であってもよい。本発明により使用される初期ＨＰＶ−１６ポリペプチドの各々に挿入されている膜アンカーおよび／または分泌配列は、由来が共通であってもよく、または異なっていてもよい。分泌配列の好ましい挿入部位は、翻訳開始用コドンの下流にあるＮ末端であり、膜係留配列の好ましい挿入部位は、例えば、終止コドンのすぐ上流のＣ末端である。本発明で使用されるＨＰＶ  Ｅ６ポリペプチドは、好ましくは、麻疹Ｆタンパク質の分泌および膜アンカーシグナルの挿入により修飾される。本発明で使用されるＨＰＶ  Ｅ７ポリペプチドは、好ましくは、狂犬病糖タンパク質の分泌および膜アンカーシグナルの挿入により修飾される。この点で、本発明の好ましい実施形態では、抗原は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に特異的な抗原、好ましくはＨＰＶ−１６および／またはＨＰＶ−１８に特異的な抗原、ならびにより好ましくはＨＰＶ−１６および／またはＨＰＶ−１８のＥ６初期コード領域、ＨＰＶ−１６および／またはＨＰＶ−１８のＥ７初期コード領域、ならびにそれらの一部または組合せからなる群から選択される抗原である。実施例４には、免疫応答をＨＰＶ１６  Ｅ７抗原に対するＴｈ１型応答に向けることを目的とする医薬組成物を調製するための、本発明のサッカロマイセス・セレビシエのミトコンドリア核酸画分（つまり、ＮＡ画分；ＮＡ−Ｂ２画分）およびＨＰＶ１６  Ｅ７抗原の使用が記述されている。
【００３４】
本出願の全体にわたって使用されているように、「バクテリア」には、グラム陽性菌およびグラム陰性菌が含まれる。グラム陽性細菌としては、これらに限定されないが、パスツレラ（Pasteurella）種、ブドウ球菌（Staphylococci）種、および連鎖球菌（Streptococcus）種が挙げられる。グラム陰性細菌としては、これらに限定されないが、大腸菌（Escherichia coli）、シュードモナス（Pseudomonas）種、およびサルモネラ（Salmonella）種が挙げられる。感染性バクテリアの特定の例としては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pyloris）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Borelia burgdorferi）、レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophilia）、マイコバクテリア（Mycobacteria）種（例えば、結核菌（M. tuberculosis）、Ｍ．アビウム（M. avium）、Ｍ．イントラセルラーレ（M. intracellular）、Ｍ．カンサシイ（M.kansaii）、Ｍ．ゴルドネ（M.gordonae））、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、リステリア菌（Listeria monocytogenes）、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）（Ａ群連鎖球菌）、ストレプトコッカス・アガラクティアエ（Streptococcus agalactiae）（Ｂ群連鎖球菌）、連鎖球菌属（Streptococcus）（緑色連鎖球菌（viridans group））、糞便連鎖球菌（Streptococcus faecalis）、ストレプトコッカス・ボビス（Streptococcus bovis）、連鎖球菌（嫌気性種）、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、病原性カンピロバクター（Campylobacter）種、エンテロコッカス（Enterococcus）種、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、炭疽菌（Bacillus antracis）、ジフテリア菌（corynebacterium diphtheriae）、コリネバクテリウム（corynebacterium）種、豚丹毒菌（Erysipelothrix rhusiopathiae）、ウェルチ菌（Clostridium perfringens）、破傷風菌（Clostridium tetani）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）、肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）、パスツレラ・マルトシダ（Pasturella multocida）、バクテロイデス（Bacteroides）種、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Fusobacterium nucleatum）、ストレプトバシラス・モニリフォルミス（Streptobacillus moniliformis）、梅毒トレポネーマ（Treponema pallidium）、フランベジアトレポネーマ（Treponema pertenue）、レプトスピラ（Leptospira）属、リケッチア（Rickettsia）属、およびイスラエル放線菌（Actinomyces israelii）。
【００３５】
本出願の全体にわたって使用されているように、「真菌」としては、これらに限定されないが、クリプトコックス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、ヒストプラスマ・カプスラーツム（Histoplasma capsulatum）、コクシジオイデス・イミチス（Coccidioides immitis）、ブラストミセス・デルマティティディス（Blastomyces dermatitidis）、クラミジア・トラコマティス（Chlamydia trachomatis）、およびカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）が挙げられる。
【００３６】
本出願の全体にわたって使用されているように、「寄生生物」としては、これらに限定されないが、以下の属が挙げられる：マラリア原虫属（Plasmodium）（例えば、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）、四日熱マラリア原虫（Plasmodium malariae）、マラリア原虫種（Plasmodium spp.）、卵形マラリア原虫（Plasmodium ovale）、または三日熱マラリア原虫（Plasmodium vivax））、バベシア属（Babesia）（例えば、バベシア・ミクロチ（Babesia microti）、バベシア種（Babesia spp.）、または多型バベシア（Babesia divergens））、リーシュマニア属（Leishmania）（例えば熱帯リーシュマニア（Leishmania tropica）、リーシュマニア種（Leishmania spp.）、ブラジル・リーシュマニア（Leishmania braziliensis）、またはドノバン・リーシュマニア（Leishmania donovani））、トリパノゾーマ属（Trypanosoma）（例えば、ガンビア・トリパノソーマ（Trypanosoma gambiense）、トリパノゾーマ種（Trypanosoma spp.）、アフリカ睡眠病を引き起こすローデシア・トリパノソーマ（Trypanosoma rhodesiense）、またはシャーガス病を引き起こすクルーズ・トリパノソーマ（Trypanosoma cruzi））、およびトキソプラズマ属（Toxoplasma）（例えば、トキソプラズマ・ゴンディ（Toxoplasma gondii））。
【００３７】
本出願の全体にわたって使用されているように、「アレルゲン」は、感受性対象体においてアレルギーまたは喘息反応を誘導し得る物質を指す。アレルゲンとしては、これらに限定されないが、花粉、昆虫毒、動物鱗屑埃（Animal dander dust）、真菌胞子、および薬物（例えば、ペニシリン）が挙げられる。天然、動物、および植物アレルゲンの例としては、これらに限定されないが、以下の属に特異的なタンパク質が挙げられる：イヌ属（イエイヌ（Canis familiaris））；チリダニ類（dermatophagoides）（例えば、コナヒョウヒダニ（Dermatophagoides farinae））；ネコ属（例えば、イエネコ（Felis domesticus））；ブタクサ属（例えば、ブタクサ（Ambrosia artemiisfolia））；ロリウム属（例えば、ペレニアルライグラス（Lolium perenne）またはイタリアンライグラス（Lolium multiflorum））；スギ属（例えば、スギ（Cryptomeria japonica））；アルテルナリア属（例えば、葉上生息菌（Alternaria alternata）；アルダー属（Alder）；ハンノキ属（Alnus）（例えば、アルヌス・グルティノサ（Alnus gultinoasa））；カバノキ属（Betula）（例えば、ベツラ・ベルコサ（Betula verrucosa））；コナラ属（Quercus ）（例えば、ケルクス・アルバ（Quercus alba））；オリーブ属（Olea）（例えば、オリーブ（Olea europa））；ヨモギ属（Artemisia）（例えば、アルテミシア・ブルガリス（Artemisia vulgaris））；オオバコ属（Plantago）（例えば、ヘラオオバコ（Plantago lanceolata））；ヒカゲミズ属（Parietaria）（例えば、パリエタリア・オフィチナリス（Parietaria officinalis）またはカベイラクサ（Parietaria judaica）);チャバネゴキブリ属（Blattella）（例えば、チャバネゴキブリ（Blattella germanica））；ミツバチ属（Apis）（例えば、アピス・ムルティフロルム（Apis multiflorum））；イトスギ属（Cupressus）（例えば、イタリアイトスギ（Cupressus sempervirens）、アリゾナイトスギ（Cupressus arizonica）、またはモントレーイトスギ（Cupressus macrocarpa）；ビャクシン属（Juniperus）（例えば、ジュニペラス・サビオノイデス（Juniperus sabinoides）、エンピツビャクシン（Juniperus virginiana）、セイヨウネズ（Juniperus communis）、またはジュニペラス・アシェイ（Juniperus ashei）；クロベ属（Thuya）（例えば、コノテガシワ（Thuya orientalis））；ヒノキ属（Chamaecyparis）（例えば、ヒノキ（Chamaecyparis obtusa））；ゴキブリ属（Periplaneta）（例えば、ワモンゴキブリ（Periplaneta americana））；カモジグサ属（Agropyron）（例えば、シバムギ（Agropyron repens））；ライムギ属（Secale）（例えば、ライムギ（Secale cereale））；コムギ属（Triticum）（例えば、コムギ（Triticum aestivum））；カモガヤ属（Dactylis）（例えば、カモガヤ（Dactylis glomerata））；ウシノケグサ属（Festuca）（例えば、ヒロハノウシノケグサ（Festuca elatior））；イチゴツナギ属（Poa）（例えば、ナガハグサ（Poa pratensis）またはコイチゴツナギ（Poa compressa））；カラスムギ属（Avena）（例えば、マカラスムギ（Avena sativa））；シラゲガヤ属（Holcus）（例えば、シラゲガヤ（Holcus lanatus））；ハルガヤ属（Anthoxanthum）（例えば、ハルガヤ（Anthoxanthum odoratum））；オオカニツリ属（Arrhenatherum）（例えば、オオカニツリ（Arrhenatherum elatius））；コヌカグサ属（Agrostis）（例えば、コヌカグサ（Agrostis alba））；アワガエリ属（Phleum）（例えば、オオアワガエリ（Phleum pratense））；クサヨシ属（Phalaris）（例えば、クサヨシ（Phalaris arundinacea））；スズメノヒエ属（Paspalum）（例えば、バヒアグラス（Paspalum notatum））；モロコシ属（Sorghum）（例えば、セイバンモロコシ（Sorghum halepensis））；およびスズメノチャヒキ属（Bromus）（例えば、コスズメノチャヒキ（Bromus inermis））。
【００３８】
本発明によると、抗原は、好ましくは、ペプチド、核酸（例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはそれらのハイブリッド）、脂質、リポペプチド、およびサッカライド（例えば、オリゴサッカライドまたはポリサッカライド）からなる群から選択される。また、抗原は、腫瘍関連抗原、感染性生物に特異的な抗原、またはアレルゲンに特異的な抗原からなる群から選択される抗原に対するＴｈ１型応答に、免疫応答を特異的に向かわせることが可能な任意の化合物であってもよい。
【００３９】
本発明の好ましい実施形態によると、抗原は、ベクターに含まれる。本発明によると、ベクターは、好ましくはプラスミドまたはウイルスベクターから選択される。
【００４０】
プラスミドに関しては、例えば、ｐＢＲ３２２（ギブコＢＲＬ社製）、ｐＵＣ（ギブコＢＲＬ社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン社製）、ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４（インビトロジェン社製）、またはｐＰｏｌｙ（LATHE, et al. Plasmid and bacteriophage vectors for excision of intact inserts. Gene. 1987, vol.57, no.2-3, p.193-201.）から得られるプラスミドを起想することが可能である。一般的な様式で、プラスミドは、当業者に公知であり、多くのプラスミドは市販されており（例えば、以前に言及したプラスミド等）、遺伝子操作技術を使用してそれらを修飾または構築することも可能である。好ましくは、本発明の状況で使用されるプラスミドは、産生用細胞および／または宿主細胞で複製が開始されることを保証する複製起点を含有する（例えば、大腸菌で産生することを目的とするプラスミド用には、ＣｏｌＥ１起点が選択され、プラスミドが哺乳動物宿主細胞で自己複製されるべきことが望ましい場合、ｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ１系が選択されるであろう。LUPTON, et al. Mapping genetic elements of Epstein-Barr virus that facilitate extrachromosomal persistence of Epstein-Barr virus-derived plasmids in human cells. Molecular and cellular biology. 1985, vol.5, no.10, p.2533-42.；YATES, et al. Stable replication of plasmids derived from Epstein-Barr virus in various mammalian cells. Nature. 1985, vol.313, no.6005, p.812-5.）。プラスミドは、トランスフェクション細胞の選択または特定を可能にする選択遺伝子を更に含んでなることができる（栄養素要求性突然変異の補完、抗生物質等に対する耐性をコードする遺伝子等）。当然、プラスミドは、所与の細胞中でのその維持および／またはその安定性を向上させる更なる要素を含有することができる（モノマー形態でのプラスミドの維持を容易にするｃｅｒ配列（SUMMERS, et al. Multimerization of high copy number plasmids causes instability: ColE1 encodes a determinant essential for plasmid monomerization and stability. Cell. 1984, vol.36, no.4, p.1097-103.、細胞ゲノムに組み込むための配列）。
【００４１】
ウイルスベクターに関しては、例えば、ポックスウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アルファウイルス、泡沫状ウイルス、またはアデノウイルス関連ウイルスから得られるウイルスベクターを起想することが可能である。複製可能なウイルスベクターまたは複製欠損性のウイルスベクターを使用することが可能である。「複製可能なウイルスベクター」は、いかなるトランス補完性が存在しない場合でも宿主細胞中で複製することが可能なウイルスベクターを指す。「複製欠損性ウイルスベクター」は、ある形態のトランス補完性がないと、宿主細胞中で複製することができないウイルスベクターを指す。統合されないベクターの使用が更に好ましいであろう。この点で、アデノウイルスベクターおよびポックスウイルスから得られるベクターが、本発明を実施するのに非常に特に好適である。
【００４２】
本発明の好ましい実施形態では、ウイルスベクターは、ポックスウイルス、好ましくはワクシニアウイルス（ＶＶ）およびより好ましくは改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）、またはそれらの誘導体から得られる。「誘導体」は、寄託された菌株と本質的に同じ複製特徴を示すが、そのゲノムの１以上の部分に差異を示すウイルスを指す。
【００４３】
本出願の全体にわたって使用されているように、「ワクシニアウイルス」（ＶＶ）としては、これらに限定されないが、以下のものが含まれる：ＶＶ株Ｄａｉｒｅｎ  Ｉ、ＩＨＤ−Ｊ、Ｌ−ＩＰＶ、ＬＣ１６Ｍ８、ＬＣ１６ＭＯ、Ｌｉｓｔｅｒ、ＬＩＶＰ、Ｔａｓｈｋｅｎｔ、ＷＲ６５−１６、Ｗｙｅｔｈ、Ａｎｋａｒａ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｔｉａｎ  Ｔａｎ、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ（ＷＲ）、ならびに、例えば欠陥Ｆ２Ｌ遺伝子を含んでなるＶＶ（国際公開第２００９／０６５５４７号パンフレットを参照）、および欠陥Ｉ４Ｌおよび／またはＦ４Ｌ遺伝子を含んでなるＶＶ（国際公開第２００９／０６５５４６号パンフレットを参照）等のそれらの誘導体。ＶＶは、大型二本鎖ＤＮＡゲノム（１８７キロベースペア）を含有しており、感染細胞の細胞質中で複製するＤＮＡウイルスの唯一の既知ファミリーのメンバーである。ＶＶは、欧州特許第８３２８６号明細書に詳述されている。ＶＶ株Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎのゲノムは、マッピングおよび配列決定されている（Goebel et al., 1990, Virol. 179, 247-266 and 517-563；Johnson et al., 1993, Virol. 196, 381-401）。
【００４４】
本出願全体にわたって使用されているように、「改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）」は、ＶＶのＡｎｋａｒａ株のＣＥＦ（ＣＶＡ）を５１６回連続継代することにより生成された高度に弱毒化されたＶＶウイルス（Mayr, A., et al. Infection 3, 6-14, 1975）およびその誘導体を指す。ＭＶＡウイルスは、以前に、寄託機関Ｎ６０２Ｉ−７２１の下でＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）に寄託された。ＭＶＡベクターおよびそのようなベクターを生成する方法は、欧州公開第８３２８６号公報および欧州公開第２０６９２０号公報に、国際公開第０７／１４７５２８号パンフレットに、およびSUTTER, et al. Nonreplicating vaccinia vector efficiently expresses recombinant genes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 1992, vol.89, no.22, p.10847-51に詳述されている。ＭＶＡのゲノムは、マッピングおよび配列決定されている（Antoine et al., 1998, Virol. 244, 365-396）。より好ましい実施形態によると、抗原は、ＭＶＡベクターの欠失Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、およびＶｌ、更により好ましくは欠失ＩＩＩに挿入することができる（MEYER, et al. Mapping of deletions in the genome of the highly attenuated vaccinia virus MVA and their influence on virulence. The Journal of general virology. 1991 , vol.72, no.Pt5, p.1031-8；SUTTER, et al. A recombinant vector derived from the host range-restricted and highly attenuated MVA strain of vaccinia virus stimulates protective immunity in mice to influenza virus. Vaccine. 1994, vol.12, no.11, p.1032-40.）。実施例５には、癌の治療を目的とする医薬組成物を調製するための、本発明のサッカロマイセス・セレビシエのミトコンドリア核酸画分（すなわち、ＮＡ画分）およびＭＵＣ−１抗原の使用が記述されており、そこではＭＵＣ−１抗原は、ＭＶＡベクターに含まれる。
【００４５】
本発明の別の好ましい実施形態では、ウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノウイルス関連ウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アルファウイルス、若しくは泡沫状ウイルス、またはそれらの誘導体から得られる。
【００４６】
本発明により使用されるアデノウイルスベクターは、好ましくは、ベクターが宿主生物または環境内で増殖することを回避するために、複製に不可欠であり、かつ、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４、およびＬ１−Ｌ５領域から選択される少なくとも１つの領域の全てまたは一部を欠如したアデノウイルスベクターである。Ｅ１領域の欠失が好ましい。しかしながら、それは、欠損した必須機能が、補完細胞株および／またはヘルパーウイルスによりトランスで補完される程度に、特に、Ｅ２、Ｅ４、および／またはＬ１−Ｌ５領域の全てまたは一部に影響を及ぼす他の改変（群）−／欠失（群）と組合せることができる。この点で、最先端の第二世代ベクターを使用することが可能である（例えば、国際公開第９４／２８１５２号パンフレットおよび国際公開第９７／０４１１９号パンフレットを参照）。例示として、Ｅ１領域およびＥ４転写ユニットの大部分の欠失は、特に非常に有利である。クローニング能力を増加させるために、アデノウイルスベクターは、非必須Ｅ３領域の全てまたは一部を更に欠如していてもよい。別の代案によると、キャプシド形成にとって不可欠な配列、すなわち５’および３’ＩＴＲ（逆方向末端反復）およびキャプシド形成領域を保持する最小アデノウイルスベクターを使用することが可能である。種々のアデノウイルスベクター、およびそれらを調製するための技術は公知である（例えば、GRAHAM, et al. Methods in molecular biology. Edited by MURREY. The human press inc, 1991. p.109-128を参照）。本発明によるアデノウイルスベクターの由来は、種の観点および血清型の観点の両方で異なっていてもよい。ベクターは、ヒトまたは動物（イヌ、トリ、ウシ、マウス、ヒツジ、ブタ、サル等）由来のアデノウイルスのゲノムから、または少なくとも２つの異なる由来のアデノウイルスゲノム断片を含んでなるハイブリッドから得ることができる。より具体的には、イヌ由来のＣＡＶ−ＩまたはＣＡＶ−２アデノウイルス、トリ由来のＤＡＶアデノウイルス、またはウシの由来のＢａｄタイプ３アデノウイルスに言及することができる（ZAKHARCHUK, et al. Physical mapping and homology studies of egg drop syndrome (EDS-76) adenovirus DNA. Archives of virology. 1993, vol.128, no.1-2, p.171-6.；SPIBEY, et al. Molecular cloning and restriction endonuclease mapping of two strains of canine adenovirus type 2. The Journal of general virology. 1989, vol.70, no.Pt 1, p.165-72；JOUVENNE, et al. Cloning, physical mapping and cross-hybridization of the canine adenovirus types 1 and 2 genomes. Gene. 1987, vol.60, no.1 , p.21-8；MITTAL, et al. Development of a bovine adenovirus type 3-based expression vector. The Journal of general virology. 1995, vol.76, no.Pt 1, p.93-102.）。しかしながら、好ましくは、血清型Ｃアデノウイルス、特にタイプ２または５血清型Ｃアデノウイルスから得られるヒト由来のアデノウイルスベクターが好ましいであろう。複製可能なアデノウイルスベクターを、本発明により使用することもできる。これら複製可能なアデノウイルスベクターは、当業者に周知である。これらの中でも、ＯＮＹＸ−０１５ウイルス（BISCHOFF, et al. An adenovirus mutant that replicates selectively in p53-deficient human tumor cells. Science. 1996, vol.274, no.5286, p.373-6；HEISE, et al. An adenovirus E1A mutant that demonstrates potent and selective systemic anti-tumoral efficacy. Nature Medicine. 2000, vol.6, no.10, p.1134-9；国際公開第９４／１８９９２���パンフレット）のように、５５ｋＤのｐ５３阻害因子をコードするＥ１ｂ領域に欠失のあるアデノウイルスベクターが特に好ましい。従って、このウイルスは、ｐ５３欠損の腫瘍性細胞に選択的に感染させ、死滅させるために使用することができる。当業者であれば、確立している技術により、アデノウイルス５または他のウイルスのｐ５３阻害因子遺伝子を突然変異させ、および破壊することもできる。Ｅ１Ａ  Ｒｂ結合領域に欠失のあるアデノウイルスベクターを、本発明で使用することもできる。例えば、Ｅ１Ａ領域に２４塩基対の欠失を保持する突然変異アデノウイルスであるＤｅｌｔａ２４ウイルスである（FUEYO, et al. A mutant oncolytic adenovirus targeting the Rb pathway produces anti-glioma effect in vivo. Oncogene. 2000, vol.19, no.1, p.2-12.）。Ｄｅｌｔａ２４は、Ｒｂ結合領域に欠失を有しており、Ｒｂと結合しない。従って、突然変異ウイルスの複製は、正常細胞ではＲｂにより阻害される。しかしながら、Ｒｂが不活化され、細胞が腫瘍性になると、Ｄｅｌｔａ２４は、もはや阻害されない。その代わり、突然変異ウイルスは効率的に複製し、Ｒｂ欠損細胞を溶解する。本発明によるアデノウイルスベクターは、ライゲーションもしくは相同組換え（例えば、国際公開第９６／１７０７０号パンフレットを参照）、またはそうでなければ補完細胞株での組換えにより、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）でイン・ビトロで産生することができる。
【００４７】
レトロウイルスは、分裂細胞に対する感染特性、およびほとんどの場合は分裂細胞への組み込み特性を有し、この点に関して、癌関連使用に特に適切である。本発明による組換えレトロウイルスは、一般的に、ＬＴＲ配列、キャプシド形成領域、およびレトロウイルスＬＴＲまたは下記に記述されているもの等の内部プロモーターの制御下に配置されている本発明によるヌクレオチド配列を含有する。組換えレトロウイルスは、任意の由来（マウス、霊長類、ネコ、ヒト等）のレトロウイルス、特にＭoＭｕＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）、ＭＶＳ（マウス肉腫ウイルス）、またはフレンドマウスレトロウイルス（Ｆｂ２９）から得ることができる。それは、ウイルス粒子を構成するのに必要であるウイルスポリペプチドｇａｇ、ｐｏｌ、および／またはｅｎｖをトランスで供給することができるキャプシド形成細胞株中で増殖する。そのような細胞株は、文献に記述されている（ＰＡ３１７、Ｐｓｉ  ＣＲＩＰ  ＧＰ＋Ａｍ−１２等）。本発明によるレトロウイルスベクターは、米国特許第５７４７３２３号公報に記述されるように、特にＬＴＲにおける改変（該プロモーター領域の真核生物のプロモーターへの置換）またはキャプシド形成領域における改変（異種性キャプシド形成領域、例えばＶＬ３Ｏタイプとの置換）を含有することができる。
【００４８】
本発明によると、ベクターは、抗原が核酸である場合は、前記抗原の発現に必要なエレメントを更に含んでなる。発現に必要な要素は、核酸配列がＲＮＡに転写され、ｍＲＮＡがポリペプチドに翻訳されることを可能にする全ての要素からなっていてもよい。これら要素は、特に、調節可能であってもよくまたは構成的であってもよいプロモーターを含んでなる。当然、プロモーターは、選択されるベクターおよび宿主細胞に適したものである。言及することができる例は、以下のものである：ＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）、ＭＴ（メタロチオネイン；MCIVOR. Human purine nucleoside phosphorylase and adenosine deaminase: gene transfer into cultured cells and murine hematopoietic stem cells by using recombinant amphotropic retroviruses. Molecular and cellular biology. 1987, vol.7, no.2, p.838-46.）、α−１アンチトリプシン、ＣＦＴＲ、サーファクタント、免疫グロブリン、アクチン（TABIN, et al. Adaptation of a retrovirus as a eucaryotic vector transmitting the herpes simplex virus thymidine kinase gene. Molecular and cellular biology, 1982, vol.2, no.4, p.426-36.）、およびＳＲα（TAKEBE, et al. SR alpha promoter: an efficient and versatile mammalian cDNA expression system composed of the simian virus 40 early promoter and the R-U5 segment of human T-cell leukemia virus type 1 long terminal repeat. Molecular and cellular biology. 1988, vol.8, no.1, p.466-72.）遺伝子の真核生物プロモーター、ＳＶ４０ウイルス（サルウイルス）の初期プロモーター、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）のＬＴＲ、ＨＳＶ−Ｉ  ＴＫプロモーター、ＣＭＶウイルス(サイトメガロウイルス)の初期プロモーター、ワクシニアウイルスのｐ７．５Ｋ  ｐＨ５Ｒ、ｐＫ１Ｌ、ｐ２８、ｐ１１プロモーター、ならびにＥ１ＡおよびＭＬＰアデノウイルスプロモーター。また、プロモーターは、腫瘍または癌細胞における発現を刺激するプロモーターであってもよい。特に、乳癌および前立腺癌で過剰発現されるＭＵＣ−Ｉ遺伝子（CHEN, et al., Breast cancer selective gene expression and therapy mediated by recombinant adenoviruses containing the DF3/MUC1 promoter. The Journal of clinical investigation. 1995, vol.96, no.6, p.2775-82.）、結腸癌で過剰発現されるＣＥＡ(癌胎児性抗原の略)遺伝子（SCHREWE, et al. Cloning of the complete gene for carcinoembryonic antigen: analysis of its promoter indicates a region conveying cell type-specific expression. Molecular and cellular biology. 1990, vol.10, no.6, p.2738-48.）、メラノーマで過剰発現されるチロシナーゼ遺伝子（VILE, et al. Use of tissue-specific expression of the herpes simplex virus thymidine kinase gene to inhibit growth of established murine melanomas following direct intratumoral injection of DNA. Cancer res., 1993, vol.53, no.17, p.3860-4.）、乳癌および膵臓癌で過剰発現されるＥＲＢＢ−２遺伝子（HARRIS, et al Gene therapy for cancer using tumour-specific prodrug activation. Gene therapy. 1994, vol.1, no.3, p.170-5.）、および肝臓癌で過剰発現されるα−フェトプロテイン遺伝子（KANAI, et al. In vivo gene therapy for alpha-fetoprotein-producing hepatocellular carcinoma by adenovirus-mediated transfer of cytosine deaminase gene. Cancer res., 1997, vol.57, no.3, p.461-5.）のプロモーターを挙げることができる。サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期プロモーターが、特に非常に好ましい。しかしながら、ワクシニアウイルスに由来するベクター（例えば、ＭＶＡベクター）が使用される場合、チミジンキナーゼ７．５Ｋ遺伝子のプロモーターが、特に好ましい。更に、必要なエレメント���は、本発明によるヌクレオチド配列の宿主細胞での発現またはその維持を向上させる更なる要素が含まれていてもよく、イントロン配列、分泌シグナル配列、核局在化配列、ＩＲＥＳタイプの翻訳再開始の内部部位、転写終結ポリＡ配列、トリパータイトリーダー（tripartite leader）、および複製起点を、特に挙げることができる。これら要素は、当業者に公知である。
【００４９】
本発明による医薬組成物（ならびにより具体的にはアジュバント組成物およびワクチン組成物）は、トランスフェクション効率、および／または、サッカロマイセス・セレビシエのミトコンドリア核酸画分および／または抗原の安定性を向上させる１以上の作用剤を更に含んでなることができる。前記作用剤は、好ましくは、脂質、リポソーム、サブミクロンの水中油型エマルジョン、マイクロ粒子、ＩＳＣＯＭ、およびポリマーからなる群から選択される。組成物の種々の成分は、幅広い比率で存在することができる。例えば、本発明のサッカロマイセス・セレビシエのミトコンドリア核酸画分と、トランスフェクション効率、および／または、サッカロマイセス・セレビシエミトコンドリア核酸画分および／または抗原の安定性を向上させる作用剤とは、約１：２００〜２００：１、好ましくは約１：１００〜１００：１、より好ましくは約１：５０〜５０：１、更により好ましくは約１：１０〜１０：１、更により好ましくは約１：３〜３：１、および最も好ましくは約１：１の比率（容積／容積（ｖ／ｖ）および／または重量／重量（ｗ／ｗ））で使用することができる。
【００５０】
本出願の全体にわたって使用されているように、「脂質」は、中性、双性イオン性、陰イオン性、および／または陽イオン性脂質を含んでなる。脂質としては、これらに限定されないが、リン脂質（例えば、天然または合成ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、またはホスファチジルセリン）、グリセリド（例えば、ジグリセリドまたはトリグリセリド）、コレステロール、セラミド、またはセレブロシドが挙げられる。好ましい脂質は、陽イオン性脂質である。種々の陽イオン性脂質は、当技術分野で公知であり、幾つかは市販されている（例えば、BALASUBRAMANIAM et al. (1996) Gene Ther., 3:163-172；GAO and HUANG (1995) Gene Ther., 2:7110-7122；米国特許第４，８９７，３５５号公報；欧州特許第９０１４６３号公報、およびより好ましくはｐｃＴＧ９０）。本発明の好ましい実施形態では、脂質は、陽イオン性脂質であり、より好ましくは欧州特許第９０１４６３号公報に記述された陽イオン性脂質であり、更により好ましくは欧州特許第９０１４６３号公報に記述されたｐｃＴＧ９０である。本発明のサッカロマイセス・セレビシエのミトコンドリア核酸画分および脂質は、約１：２００〜２００：１、好ましくは約１：１００〜１００：１、より好ましくは約１：５０〜５０：１、更により好ましくは約１：１０〜１０：１、更により好ましくは約１：３〜３：１、および最も好ましくは約１：１の比率（容積／容積（ｖ／ｖ）および／または重量／重量（ｗ／ｗ））で使用することができる。  
【００５１】
本出願の全体にわたって使用されているように、「リポソーム」は、非脂質成分（例えば、ステアリルアミン等）と随意に組合せた脂質を通常含む成分で形成された二分子膜に囲まれた小胞を指す。リポソームを形成するために使用されるリポソーム形成成分としては、中性、双性イオン性、陰イオン性、および／または陽イオン性脂質を挙げることができる。好ましいリポソームは、陽イオン性リポソームである。陽イオン性リポソームは、当業者が入手可能な文献に広く記述されており、幾つかは市販されている（例えば、FELGNER, et al. Cationic liposome mediated transfection. Proceedings of the Western Pharmacology Society. 1989, vol.32, p.115-21.；HODGSON, et al. Virosomes: cationic liposomes enhance retroviral transduction. Nature biotechnology. 1996, vol.14, no.3, p.339-42.；REMY, et al. Gene transfer with a series of lipophilic DNA-binding molecules. Bioconjugate chemistry. 1994, vol.5, no.6, p.647-54）。陽イオン性リポソーム（本出願の全体にわたって使用されているような）としては、これらに限定されないが、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）、１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ビス（ヘキサデシロキシ）−３−トリメチルアミノプロパン（ＢｉｓＨＯＰ）、３［ベータ］［Ｎ−（Ｎ’Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバミル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、またはリポソームアムホテリシンＢ（Ｇｉｌｅａｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社からＡｍｂｉｓｏｍｅ（商標）の商標名で市販されている）が挙げられる。本発明の好ましい実施形態では、リポソームは、陽イオン性リポソームであり、より好ましくは、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）、およびリポソームアムホテリシンＢ、またはそれらの組合せから選択される。本発明のサッカロマイセス・セレビシエのミトコンドリア核酸画分およびリポソームは、約１：２００〜２００：１、好ましくは約１：１００〜１００：１、より好ましくは約１：５０〜５０：１、更により好ましくは約１：１０〜１０：１、更により好ましくは約１：３〜３：１、および最も好ましくは約１：１の比率（容積／容積（ｖ／ｖ）、および／または、重量／重量（ｗ／ｗ））で使用することができる。
【００５２】
リポソームアムホテリシンＢは、例えばＡｍｂｉｓｏｍｅ（商標）の商標名で市販されている（Ｇｉｌｅａｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）。本発明の好ましい実施形態によると、サッカロマイセス・セレビシエのミトコンドリアの核酸画分（つまりＮＡ−Ｂ２画分）およびＡｍｂｉｓｏｍｅ（商標）は、実施例２に記述されているように、好ましくは、約１：３〜１：１（容積／容積）；１：１００（重量／重量）の比率で使用される。
【００５３】
本発明による陽イオン性リポソームの好ましい組合せは、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）およびＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）である。１：１（重量／重量）の比率のジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）およびＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、カタログ番号１８２９２−０１１またはカタログ番号１８２９２−０３７）の商標名で市販されている。本発明の好ましい実施形態によると、サッカロマイセス・セレビシエのミトコンドリアの核酸画分（つまり、ＮＡ画分；ＮＡ−Ｂ２画分）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）は、実施例１（ＮＡ画分）および実施例２（ＮＡ−Ｂ２画分）に記述されているように、好ましくは約１：１（容積／容積および／または重量／重量）の比率である。本発明による別の好ましい組合せは、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）、およびリポソームアムホテリシンＢである。当業者であれば、本発明のサッカロマイセス・セレビシエのミトコンドリア核酸画分、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）、およびリポソームアムホテリシンＢ間の比率はどれが最も適切であるかを決定することができる。
【００５４】
本出願の全体にわたって使用されているように、「サブミクロンの水中油型エマルジョン」は、無毒で代謝可能な油類および市販の乳化剤を含んでなる。無毒で代謝可能な油類としては、これらに限定されないが、植物油、魚油、動物油、または合成的に調製された油が挙げられる。市販の乳化剤としては、これらに限定されないが、ソルビタンに基づく非イオン性界面活性剤（例えば、ソルビタントリオレエートまたはポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）または例えばラウリル、アセチル、ステアリル、およびオレイルアルコールに由来するポリオキシエチレン脂肪酸エーテルが挙げられる。サブミクロンの水中油型エマルジョンは、当業者が入手可能な文献に広く記述されている（例えば、国際公開第９０／１４８３７号パンフレット；TAMILVANAN S., Oil-in-water lipid emulsions: implications for parenteral and ocular delivering systems, Prog Lipid Res. 2004 Nov;43(6):489-533）。本発明のサッカロマイセス・セレビシエのミトコンドリア核酸画分およびサブミクロンの水中油型エマルジョンは、約１：２００〜２００：１、好ましくは約１：１００〜１００：１、より好ましくは約１：５０〜５０：１、更により好ましくは約１：１０〜１０：１、更により好ましくは約１：３〜３：１、および最も好ましくは約１：１の比率（容積／容積（ｖ／ｖ）および／または重量／重量（ｗ／ｗ））で使用することができる。
【００５５】
本出願の全体にわたって使用されているように、「マイクロ粒子」は、限定ではないが、ポリ（α−ヒドロキシ酸）（例えば、ポリ（ラクチド）またはポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド））、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリビニルアルコール、およびエチレン酢酸ビニル等の、滅菌可能な無毒で生分解性の物質から形成される、直径が約１００ｎｍ〜約１５０μｍの粒子を指す。マイクロ粒子は、当業者が入手可能な文献に広く記述されている（例えば、RAVI KUMAR M. N. V., Nano and microparticles as controlled grud delivery devices, J. Pharm. Pharmaceut. Sci 3(2):234-258, 2000；国際公開第０７／０８４４１８号パンフレット）。本発明のサッカロマイセス・セレビシエのミトコンドリア核酸画分およびマイクロ粒子は、約１：２００〜２００：１、好ましくは約１：１００〜１００：１、より好ましくは約１：５０〜５０：１、更により好ましくは約１：１０〜１０：１、更により好ましくは約１：３〜３：１、および最も好ましくは約１：１の比率（容積／容積（ｖ／ｖ）および／または重量／重量（ｗ／ｗ））で使用することができる。
【００５６】
本出願の全体にわたって使用されているように、「ＩＳＣＯＭ」は、トリテルペノイドサポニン（特に、Ｑｕｉｌ  Ａ）等のグリコシドと疎水性領域を含有する抗原との間で形成される免疫原性複合体を指す。ＩＳＣＯＭは、当業者が入手可能な文献に広く記述されている（例えば、BARR I. J. and GRAHAM F. M., "ISCOMs (immunostimulating complexes): The first decade", Immunology and Cell Biology (1996) 74, 8-25；国際公開第９２０６７１０号パンフレット）。本発明のサッカロマイセス・セレビシエのミトコンドリア核酸画分およびＩＳＣＯＭは、約１：２００〜２００：１、好ましくは約１：１００〜１００：１、より好ましくは約１：５０〜５０：１、更により好ましくは約１：１０〜１０：１、更により好ましくは約１：３〜３：１、および最も好ましくは約１：１の比率（容積／容積（ｖ／ｖ）および／または重量／重量（ｗ／ｗ））で使用することができる。
【００５７】
本出願の全体にわたって使用されているように、「ポリマー」としては、これらに限定されないが、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、スペルミン、およびスペルミジンが挙げられる。本発明のサッカロマイセス・セレビシエミのトコンドリア核酸画分およびポリマーは、約１：２００〜２００：１、好ましくは約１：１００〜１００：１、より好ましくは約１：５０〜５０：１、更により好ましくは約１：１０〜１０：１、更により好ましくは約１：３〜３：１、および最も好ましくは約１：１の比率（容積／容積（ｖ／ｖ）および／または重量／重量（ｗ／ｗ））で使用することができる。
【００５８】
本出願者は、驚くべきことに、リポソームアムホテリシンＢ（つまり、Ａｍｂｉｓｏｍｅ（商標））と同時に投与された本発明のサッカロマイセス・セレビシエのミトコンドリア核酸画分（つまり、ＮＡ画分；ＮＡ−Ｂ２画分）が、本発明のサッカロマイセス・セレビシエのミトコンドリア核酸画分（つまり、ＮＡ画分；ＮＡ−Ｂ２画分）単独投与およびリポソームアムホテリシンＢ（つまり、Ａｍｂｉｓｏｍｅ（商標））単独投与から得られた応答と比較して、Ｔｈ１型応答（つまり、ガンマインターフェロン（ＩＦＮ−γ）：インターロイキン２（ＩＬ−２）および／またはインターロイキン１２（ＩＬ−１２）の産生）を統計的に有意に増加させ、本発明のサッカロマイセス・セレビシエのミトコンドリア核酸画分（つまり、ＮＡ画分；ＮＡ−Ｂ２画分）単独投与から生じる応答が、リポソームアムホテリシンＢ（つまり、Ａｍｂｉｓｏｍｅ（商標））単独投与から生じる応答より高いことを見出した。そのような効果は、（本出願の全体にわたって使用されているように）「相乗効果」と同義的に呼ばれる。ＮＡ−Ｂ２画分およびリポソームアムホテリシンＢ（つまり、Ａｍｂｉｓｏｍｅ（商標））の同時の投与から生じる相乗効果は、実施例６に記述されており、図４（ガンマインターフェロン（ＩＦＮ−γ））および図５（インターロイキン１２（ＩＬ−１２））に示されている。
【００５９】
この点で、本発明は、
（ｉ）ａ）サッカロマイセス・セレビシエを、それらの増殖を可能にする培地で培養し、その後前記培養物を遠心分離する工程、
ｂ）工程ａ）で得られたサッカロマイセス・セレビシエのペレットを粉砕する工程、
ｃ）工程ｂ）で得られた混合物を遠心分離する工程、
ｄ）工程ｃ）で得られた上清を超遠心分離する工程、
ｅ）工程ｄ）で得られたペレットから核酸を抽出する工程、
ｆ）工程ｅ）で得られた上清から該核酸画分を回収する工程を含んでなる方法により調製されるサッカロマイセス・セレビシエのミトコンドリア核酸画分、および
（ｉｉ）リポソームアムホテリシンＢ
を含んでなる相乗効果を有するアジュバント組成物にも関する。
【００６０】
この点で、本発明は、
（ｉ）ａ）サッカロマイセス・セレビシエを、それらの増殖を可能にする培地で培養し、その後前記培養物を遠心分離する工程、
ｂ）工程ａ）で得られたサッカロマイセス・セレビシエのペレットを粉砕する工程、
ｃ）工程ｂ）で得られた混合物を遠心分離する工程、
ｄ）工程ｃ）で得られた上清を超遠心分離する工程、
ｅ）工程ｄ）で得られたペレットから核酸を抽出する工程、
ｆ）工程ｅ）で得られた上清から該核酸画分を回収する工程を含んでなる方法により調製されるサッカロマイセス・セレビシエのミトコンドリア核酸画分、
（ｉｉ）リポソームアムホテリシンＢ、および
（ｉｉｉ）抗原
を含んでなる相乗効果を有するワクチン組成物にも関する。
【００６１】
本出願者は、驚くべきことに、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）およびＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）（つまりＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））と同時に投与された本発明のサッカロマイセス・セレビシエのミトコンドリア核酸画分（つまり、ＮＡ画分；ＮＡ−Ｂ２画分）が、本発明のサッカロマイセス・セレビシエのミトコンドリア核酸画分（つまり、ＮＡ画分；ＮＡ−Ｂ２画分）単独投与およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）およびＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）（つまりＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））単独投与から得られた応答と比較して、Ｔｈ１型応答（つまり、ガンマインターフェロン（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、および／またはインターロイキン１２（ＩＬ−１２）の産生）を統計的に有意に増加させることを見出し、本発明のサッカロマイセス・セレビシエのミトコンドリア核酸画分（つまり、ＮＡ画分；ＮＡ−Ｂ２画分）単独投与から生じる応答が、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）およびＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）（つまりＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））単独投与から生じる応答より高いことも見出した。そのような効果は、（本出願の全体にわたって使用されているように）「相乗効果」と同義的に呼ばれる。ＮＡ−Ｂ２画分、ならびにジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）およびＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）（つまり、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））の同時投与から生じる相乗効果は、実施例６に記述されており、図５（インターロイキン１２（ＩＬ−１２））に示されている。
【００６２】
この点で、本発明は、
（ｉ）ａ）サッカロマイセス・セレビシエを、それらの増殖を可能にする培地で培養し、その後前記培養物を遠心分離する工程、
ｂ）工程ａ）で得られたサッカロマイセス・セレビシエのペレットを粉砕する工程、
ｃ）工程ｂ）で得られた混合物を遠心分離する工程、
ｄ）工程ｃ）で得られた上清を超遠心分離する工程、
ｅ）工程ｄ）で得られたペレットから核酸を抽出する工程、
ｆ）工程ｅ）で得られた上清から該核酸画分を回収する工程を含んでなる方法により調製されるサッカロマイセス・セレビシエのミトコンドリア核酸画分、および
（ｉｉ）ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）およびＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）
を含んでなる相乗効果を有するアジュバント組成物にも関する。
【００６３】
この点で、本発明は、
（ｉ）ａ）サッカロマイセス・セレビシエを、それらの増殖を可能にする培地で培養し、その後前記培養物を遠心分離する工程、
ｂ）工程ａ）で得られたサッカロマイセス・セレビシエのペレットを粉砕する工程、
ｃ）工程ｂ）で得られた混合物を遠心分離する工程、
ｄ）工程ｃ）で得られた上清を超遠心分離する工程、
ｅ）工程ｄ）で得られたペレットから核酸を抽出する工程、
ｆ）工程ｅ）で得られた上清から該核酸画分を回収する工程を含んでなる方法により調製されるサッカロマイセス・セレビシエのミトコンドリア核酸画分、
（ｉｉ）ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）およびＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）；および
（ｉｉｉ）抗原
を含んでなる相乗効果を有するワクチン組成物にも関する。
【００６４】
本発明は、パーツキット（kit of part）にも関する。キットは、全ての成分（つまり、本発明のサッカロマイセス・セレビシエのミトコンドリア核酸画分；抗原；トランスフェクション効率、および／または、サッカロマイセス・セレビシエミトコンドリア核酸画分および／または抗原の安定性を向上させる作用剤）を一緒に収納する単一容器であってもよく、またはブリスター包装等の、個々の用量の成分を収容する複数の容器であってもよい。キットは、異なる成分の投与タイミングに関する説明書も有する。説明書により、対象体は、適切な時点で成分を摂取するように指図されるであろう。例えば、成分の送達に適切な時点は、症状が生じる際であってもよい。あるいは、成分の投与に適切な時点は、毎月または年１回等の定期的スケジュールであってもよい。異なる成分は、同時に投与されてもよく、またはそれらが時間的に十分に接近して投与されて相乗効果的な免疫応答をもたらす限り、別々に投与されてもよい。
【００６５】
第１の好ましい実施形態によると、パーツキットは、少なくとも１つの本発明のサッカロマイセス・セレビシエのミトコンドリア核酸画分を含有する容器、および少なくとも１つの抗原を含有する容器並びに前記成分の投与タイミングに関する説明書を含んでなる。
【００６６】
別の好ましい実施形態によると、パーツキットは、少なくとも１つの本発明のサッカロマイセス・セレビシエのミトコンドリア核酸画分を含有する容器と、少なくとも１つの抗原を含有する容器と、トランスフェクション効率、および／または、サッカロマイセス・セレビシエのミトコンドリア核酸画分および／または抗原の安定性を向上させる少なくとも１つの作用剤（前記作用剤は、より好ましくはリポソームアムホテリシンＢおよび／またはジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）およびＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）である）を含有する容器と、前記成分の投与タイミングに関する説明書とを含んでなる。
【００６７】
本発明のサッカロマイセス・セレビシエのミトコンドリア核酸画分は、例えば、癌、感染症、アレルギー、および／または自己免疫障害等の当業者に公知の任意の疾患に対して哺乳動物を予防および／または治療することを目的とする医薬組成物（ならびにより具体的にはアジュバント組成物およびワクチン組成物）の調製に使用することができる。
【００６８】
「癌」、「新生物」、「腫瘍」、および「カルシノーマ」という用語は、本明細書では、比較的自律的な増殖を示し、そのため細胞増殖の著しい制御不能を特徴とする異常な増殖表現型を示す細胞を表わすために、同義的に使用される。一般的に、本出願における予防または治療の目的細胞としては、前癌性細胞（例えば、良性細胞）、悪性細胞、前転移性細胞、転移性細胞、および非転移性細胞が挙げられる。「癌」（本出願の全体にわたって使用されているような）としては、これらに限定されないが、肺癌（例えば、小細胞肺カルシノーマおよび非小細胞肺）、気管支癌、食道癌、咽頭癌、頭頸部癌（例えば、喉頭癌、口唇癌、鼻腔および副鼻腔癌、ならびに咽喉癌）、口腔癌（例えば、舌癌）、胃癌（gastric cancer）（例えば、胃癌(stomach cancer)）、腸癌、消化管癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、肛門癌、肝臓癌、膵臓癌、尿路癌、膀胱癌、甲状腺癌、腎臓癌、カルシノーマ、腺癌、皮膚癌（例えば、メラノーマ）、眼癌（例えば、網膜芽細胞腫）、脳癌（例えば、神経膠腫、髄芽細胞腫、および大脳星状細胞腫）、中枢神経系癌、リンパ腫（例えば、皮膚Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、ホジキン症候群、および非ホジキンリンパ腫）、骨癌、白血病、乳癌、生殖路癌、子宮頚癌（例えば、子宮頚部上皮内腫瘍）、子宮癌（例えば、子宮内膜癌）、卵巣癌、膣癌、外陰癌、前立腺癌、精巣癌が挙げられる。「癌」は、これらに限定されないが、パピローマウイルス誘発性カルシノーマ、ヘルペスウイルス誘発性腫瘍、ＥＢＶ誘発性Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ型肝炎誘発性腫瘍、ＨＴＬＶ−１誘発性リンパ腫、およびＨＴＬＶ−２誘発性リンパ腫を含むウイルス誘発性腫瘍をも指す。本発明の好ましい実施形態では、本発明のサッカロマイセス・セレビシエのミトコンドリア核酸画分は、実施例５に記述されているように、腎臓癌に対して哺乳動物を予防および／または治療することを目的とする医薬組成物の調製に使用することができる。
【００６９】
本出願の全体にわたって使用されているように、「感染症」は、感染性生物により引き起こされるあらゆる疾患を指す。感染性生物としては、これらに限定されないが、ウイルス（例えば、一本鎖ＲＮＡウイルス、一本鎖ＤＮＡウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、またはヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ））、寄生生物（例えば、マラリア原虫種、リーシュマニア属種、住血吸虫種、トリパノゾーマ種等の原生動物および後生動物病原体）、細菌（例えば、マイコバクテリア、特に結核菌、サルモネラ、連鎖球菌、大腸菌、またはブドウ球菌）、真菌（例えば、カンジダ種またはアスペルギルス種）、ニューモシスティス・カリニ（Pneumocystis carinii）、およびプリオンが挙げられる。本発明の好ましい実施形態では、本発明のサッカロマイセス・セレビシエのミトコンドリア核酸画分は、実施例４に記述されているように、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に対して哺乳動物を予防および／または治療することを目的とした医薬組成物の調製に使用することができる。
【００７０】
本出願の全体にわたって使用されているように、「アレルギー」は、アレルゲン、例えば本発明により以前に言及されたアレルゲン等により引き起こされるあらゆるアレルギーを指す。
【００７１】
本出願の全体にわたって使用されているように、「自己免疫障害」は、２つの一般的なタイプ：「全身性自己免疫疾患」（つまり、多数の器官または組織を損傷する障害）および「局所的自己免疫疾患」（つまり、単一の器官または組織のみを損傷する障害）に分類することができる。しかしながら、局所的自己免疫疾患の影響は、他の体内器官および系に間接的に影響を及ぼすことにより全身性であり得る。「全身性自己免疫疾患」としては、これらに限定されないが、関節、ならびに恐らくは肺および皮膚を冒す場合がある関節リウマチ；皮膚、関節、腎臓、心臓、脳、赤血球、および他の組織および器官を冒す場合がある全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を含む狼瘡；皮膚、腸、および肺を冒す場合がある強皮症；唾液腺、涙腺、および関節を冒す場合があるシェーグレン症候群；肺および腎臓を冒す場合があるグッドパスチャー症候群；洞、肺、および腎臓を冒す場合があるヴェーゲナー肉芽腫症；大型筋肉群を冒す場合があるリウマチ性多発性筋痛、および頭頸部の動脈を冒す場合がある側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎が挙げられる。「局所的自己免疫疾患」としては、これらに限定されないが、ランゲルハンス島を冒す１型糖尿病；甲状腺を冒す橋本甲状腺炎およびグレーブス病；胃腸管を冒すセリアック病、クローン病、および潰瘍性大腸炎；中枢神経系を冒す多発性硬化症（ＭＳ）およびギラン‐バレー症候群；副腎を冒すアジソン病；肝臓を冒す原発性胆汁性硬化症、硬化性胆管炎、および自己免疫性肝炎；ならびに指、足指、鼻、耳を冒す指虚血現象が挙げられる。
【００７２】
本発明のサッカロマイセス・セレビシエのミトコンドリア核酸画分を含んでなる医薬組成物（ならびにより具体的にはアジュバント組成物およびワクチン組成物）は、薬学的に許容される担体を更に含んでなることができる。薬学的に許容される担体は、好ましくは等張性、低張性、または弱高張性であり、例えばスクロース溶液等のように比較的低いイオン強度を有する。更に、そのような担体は、任意の溶媒、または非発熱性滅菌水等の水性もしくは部分的に水性の液体を含有することができる。加えて、医薬組成物のｐＨは、イン・ビボ使用の必要条件を満たすように調整および緩衝化される。医薬組成物（ならびにより具体的にはアジュバント組成物およびワクチン組成物）は、薬学的に許容される希釈剤、アジュバント、または賦形剤、ならびに可溶化剤、安定化剤、および保存剤を含むこともできる。注射可能な投与の場合、水溶液、非水溶液、または等張性溶液中の製剤が好ましい。医薬組成物は、液体形態または適切な希釈剤で使用時に再構成することができる乾燥形態（粉末および凍結乾燥物等）の単回用量または複数用量で提供することができる。
【００７３】
本発明は、哺乳動物において免疫応答を抗原に対するＴｈ１型応答に向ける方法であって、抗原および本発明による方法により調製されたサッカロマイセス・セレビシエのミトコンドリア核酸画分を該哺乳動物に投与することを含んでなる方法も提供する。１つの実施形態では、本方法は、抗原および本発明のサッカロマイセス・セレビシエのミトコンドリア核酸画分の同時投与を含んでなる。あるいは、本方法は、抗原および本発明のサッカロマイセス・セレビシエのミトコンドリア核酸画分の順次投与を含んでなる。本明細書で使用されるように、「順次」という用語は、成分が、ある時間の枠内で対象体に次々と投与されることを意味する。従って順次投与により、１つの成分が、他の成分の投与後の数分または数時間程度以内に投与されてもよい。例えば、実施例５には、癌の治療を目的とする医薬組成物を調製するための、本発明サッカロマイセス・セレビシエのミトコンドリア核酸画分（つまり、ＮＡ画分）およびＭＵＣ−１抗原の使用が記述されており、そこではサッカロマイセス・セレビシエのミトコンドリア核酸画分（つまり、ＮＡ画分）は、ＭＵＣ−１抗原の１時間後に注射される。
【００７４】
本発明の医薬組成物（ならびにより具体的にはアジュバント組成物およびワクチン組成物）を投与すること、より具体的には前記組成物の様々な成分（つまり、本発明のサッカロマイセス・セレビシエのミトコンドリアの核酸画分；抗原；トランスフェクション効率、および／または、サッカロマイセス・セレビシエのミトコンドリア核酸画分および／または抗原の安定性を向上させる作用剤）を投与することは、当業者に公知な任意の手段により達成することができる。好ましい投与経路としては、これらに限定されないが、皮内、皮下、経口、非経口、筋肉内、鼻腔内、腫瘍内、舌下、気管内、吸入、眼内、膣、および直腸内が挙げられる。好ましい実施形態によると、本発明の医薬組成物（ならびにより具体的にはアジュバント組成物およびワクチン組成物）およびより具体的には前記組成物の成分は、皮下または皮内に送達される。本発明の更により好ましい実施形態によると、抗原および本発明のサッカロマイセス・セレビシエのミトコンドリア核酸画分は、同じ部位に投与される。例えば、実施例５には、癌の治療を目的とする医薬組成物を調製するための、本発明サッカロマイセス・セレビシエミトコンドリア核酸画分（つまり、ＮＡ画分）およびＭＵＣ−１抗原の使用が記述されており、そこではサッカロマイセス・セレビシエのミトコンドリア核酸画分（つまり、ＮＡ画分）およびＭＵＣ−１抗原は、同じ部位に皮下投与される。
【００７５】
投与は、単回用量で行ってもよく、またはある時間的な間隔をおいた後で１回または数回繰り返される用量で行ってもよい。望ましくは、医薬組成物およびより具体的には前記医薬組成物の成分は、１週間間隔で１〜１０回投与される。例えば、実施例５には、癌の治療を目的とする医薬組成物を調製するための、本発明サッカロマイセス・セレビシエのミトコンドリア核酸画分（つまり、ＮＡ画分）およびＭＵＣ−１抗原の使用が記述されており、そこではサッカロマイセス・セレビシエのミトコンドリア核酸画分（つまり、ＮＡ画分）およびＭＵＣ−１抗原は、１週間間隔で３回投与される。
【００７６】
また抗原の投与用量は異なるはずであり、種々のパラメーター、特に投与方法；使用される医薬組成物；宿主生物の年齢、健康、および体重；症状の性質および程度；併用治療の種類；治療の頻度；および／または予防もしくは治療の必要性の関数として適合させることができる。治療に適切な用量を決定するために必要な計算の更なる精密化は、関連する状況に照らして、開業医により日常的に行われる。
【００７７】
一般的な指針として、ＭＶＡを含んでなる組成物に好適な用量は、約１０４〜１０１０ｐｆｕ（プラーク形成単位）、望ましくは約１０５〜１０８ｐｆｕの範囲であるが、アデノウイルスを含んでなる組成物は、約１０５〜１０１３ｉｕ（感染単位）、望ましくは約１０７〜１０１２ｉｕの範囲である。ベクタープラスミドに基づく組成物は、１０μｇ〜２０ｍｇ、有利には１００μｇ〜２ｍｇの用量で投与することができる。本発明の好ましい実施形態では、医薬組成物は、５  １０５ｐｆｕ〜５  １０７ｐｆｕのＭＶＡベクターを含んでなる用量（複数可）で投与される。例えば、実施例５には、癌の治療を目的とする医薬組成物を調製するための、本発明のサッカロマイセス・セレビシエのミトコンドリア核酸画分（つまり、ＮＡ画分）およびＭＵＣ−１抗原の使用が記述されており、そこではＭＶＡベクターに含まれてなるＭＵＣ−１抗原は、５  １０７ｐｆｕで投与される。
【００７８】
本発明による使用、方法、アジュバント組成物、ワクチン組成物、またはパーツキットが、癌の治療を目的とする場合、本発明の使用、方法、アジュバント組成物、ワクチン組成物、またはパーツキットは、１つまたは複数の従来治療法（例えば、放射線照射、化学療法、および／または外科手術）と共に実施することができる。複数の治療方法の使用は、より広範な介入を患者に提供する。１つの実施形態では、本発明の方法は、外科的介入の前であってもよく、または後であってもよい。別の実施形態では、本発明の方法は、放射線療法（例えば、ガンマ線照射）の前であってもよく、または後であってもよい。当業者であれば、適切な放射線療法プロトコールおよび使用することができるパラメーターを容易に処方することができる（例えば、PEREZ. Principles and practice of radiation oncology. 2nd edition. LIPPINCOTT, 1992.；当業者であれば容易に明白であるはずの適切な応用および改変を使用して）。
【００７９】
更に、本発明は、化学療法剤による化学療法の治療を受けている癌患者の治療を向上させるための方法であって、上記で開示されている方法を共に用いて前記患者を併用治療することを含んでなる方法に関する。
【００８０】
更に、本発明は、細胞毒薬物または放射線療法の細胞毒有効性を向上させる方法であって、上記で開示されている方法を共に用いて、そのような治療を必要とする患者を併用治療することを含んでなる方法に関する。
【００８１】
本発明による使用、方法、アジュバント組成物、ワクチン組成物、またはパーツキットが、感染症の治療を目的とする場合、本発明の使用、方法、アジュバント組成物、ワクチン組成物、またはパーツキットは、抗生物質、抗真菌化合物、抗寄生虫化合物、および／または抗ウイルス化合物等の別の治療用化合物の使用と共に実施することができる。
【００８２】
更に、本発明は、抗生物質、抗真菌剤、抗寄生虫剤、および／または抗ウイルス剤の治療効能を向上させる方法であって、上記で開示されている方法を共に用いて、そのような治療を必要とする患者を併用治療することを含んでなる方法に関する。
【００８３】
別の実施形態では、本発明の使用、方法、アジュバント組成物、ワクチン組成物、またはパーツキットは、１以上の初回刺激組成物（群）および１以上の追加免疫組成物（群）の順次投与を含んでなるプライムブースト治療法により実施される。典型的には、初回刺激および追加免疫組成物には、少なくとも１つの共通した抗原性ドメインを含んでなるかまたはコードする異なる媒体が使用される。初回刺激組成物が、最初に宿主生物に投与され、その後追加免疫組成物が、１日〜１２か月の範囲の期間後に同じ宿主生物に順次投与される。本発明の方法は、初回刺激組成物を１〜１０回順次投与し、その後追加免疫組成物１〜１０回順次投与することを含んでなる場合がある。望ましくは、注射間隔は、１週間〜６か月程度である。更に、初回刺激および追加免疫組成物は、同じ投与経路または異なる投与経路により同じ部位または別の部位に投与することができる。 
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】図１は、ＲＮＡｓｅＡ処理を施したまたは施さなかった、１×ＴＡＥ（Ｔｒｉｓ−酢酸−ＥＤＴＡ）緩衝液中のアガロースゲル（１％）でのＮＡ画分、ＮＡ−Ｂ１画分、およびＮＡ−Ｂ２画分を示す図である。
【図２】図２は、ＮＡ画分（２５μｇ）またはＮＡ−Ｂ２画分（０．４μｇ）とＨＰＶ１６Ｅ７抗原（１０μｇ）の皮下注射（０日目；７日目および１４日目）から生じるイン・ビボＥＬＩＳｐｏｔガンマインターフェロン（ＩＦＮ−γ）を示す図である。
【図３】図３は、３．１０５個のＲｅｎＣａ−ＭＵＣ−１細胞を皮下注射（１日目）したＢ６Ｄ２マウスの腫瘍容積に対する、ＭＵＣ１抗原およびｈＩＬ−２を発現する５．１０７ｐｆｕのＭＶＡ菌株（ＭＶＡ９９３１）、および（その１時間後に）ＮＡ画分（５０μｇ）を皮下投与（４日目、１１日目、および１８日目）した効果を示す図である。Ｎａ＋Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）（５０μｇ＋５０μｇ）の腫瘍内（Ｉ．Ｔ．）投与（４日目、１１日目、および１８日目）の効果。腫瘍容積は、週二回測定した。
【図４】図４は、ＮＡ−Ｂ２画分（０．４μｇまたは１．２μｇ）、Ａｍｂｉｓｏｍｅ（商標）（１２０μｇ）、またはＮＡ−Ｂ２＋Ａｍｂｉｓｏｍｅ（商標）（０．４μｇ＋１２０μｇまたは１．２μｇ＋１２０μｇ）で処理したヒト未熟単球由来樹状細胞（ｍｏＤＣ）におけるガンマインターフェロン（ＩＦＮ−γ）の誘導を示す図である。
【図５】図５は、ＮＡ−Ｂ２画分（０．２μｇ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）（１０μｇ）、Ａｍｂｉｓｏｍｅ（商標）（８０μｇ、１２０μｇ、または１６０μｇ）、ＮＡ−Ｂ２＋Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）（０．２μｇ＋１０μｇ）、およびＮＡ−Ｂ２＋Ａｍｂｉｓｏｍｅ（商標）（０．２μｇ＋１２０μｇ）で処理したヒト未熟ｍｏＤＣにおけるインターロイキン１２（ＩＬ−１２）の誘導を示す図である。
【図６】図６は、ＮＡ−Ｂ２画分（０．４μｇまたは１．２μｇ）、Ａｍｂｉｓｏｍｅ（商標）（１２０μｇまたは２４０μｇ）、およびＮＡ−Ｂ２＋Ａｍｂｉｓｏｍｅ（商標）（０．４μｇ＋１２０μｇ、０．４μｇ＋２４０μｇ、１．２μｇ＋１２０μｇ、または１．２μｇ＋２４０μｇ）で処理したヒト未熟ｍｏＤＣにおけるアルファインターフェロン（ＩＦＮ−α）の誘導を示す図である。
【実施例】
【００８５】
本発明を例示するために、以下の実施例が提供されている。実施例は、いかなる点でも本発明の範囲を限定することを意図していない。
【００８６】
実施例１：サッカロマイセス・セレビシエのミトコンドリア核酸画分（ＮＡ画分）の調製。
【００８７】
一定量の凍結サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓ．ｃ．）ＡＨ１０９（クロンテック社製）を、１％酵母抽出物、１％バクトペプトン、２％グルコース、２％寒天（ＢＤ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、および１００μｇ／ｍｌアデニン（Ｆｌｕｋａ社製  ０１８３０−５Ｇ）で構成されるＹＰＧプレートに播種した。２８°〜３０℃で２日間増殖させた一定量のＳ．ｃ．ＡＨ１０９をスパチュラで取り出し、１００ｍｌの液体ＹＰＧ／アデニン培地に接種し、それを５００ｍｌバイアルに注いだ。２８℃で撹拌（２００ｒｐｍ）しながら一晩インキュベーションした後、１５ｍｌのこの前培養物を、５００ｍｌのＹＰＧ／アデニン培地を含有する６つの２０００ｍｌバイアルにそれぞれ移した。これら培養物（合計で３リットル）を、２８℃で撹拌（２００ｒｐｍ）しながら一晩インキュベートした。６００ｎｍで測定された光学濃度（ＯＤ６００）が２＋／−０．５の時に、培養物を、４℃で１５分間３５００ｒｐｍで遠心分離した（Ｓｏｒｖａｌｌ社製遠心機、５００ｍｌチューブ）。
【００８８】
細胞ペレットを、蒸留水、例えば３リットルの培養物からのペレット当たり１リットルの蒸留水で１回洗浄した。遠心分離した後（Ｓｏｒｖａｌｌ社製、４℃で１５分間、３５００ｒｐｍ）、その結果生じた懸濁液のＯＤ６００が約１００になるように、細胞ペレットをＰＢＳに溶解した（例えば、３リットルの培養物からの細胞ペレットを、４０ｍｌのＰＢＳに溶解した）。この工程から、試料を常に冷却（４℃）し続け、３０ｍｌの前記細胞懸濁液を、１２５ｍｌポリエチレンテレフタレートグリコール（ＰＥＴＧ）フラスコに移し、３０ｍｌの滅菌ガラスビーズ（直径０．７ｍｍ）と混合した。混合物を、最高速度で１分間、氷上での１分間インキュベーションと交互させて、５回ボルテックスした（卓上型ボルテックスＴＯＰ  ＭＩＸ９４３２３  ＢＩＯＢＬＯＣＫ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｑｕｅ社製）。ガラスビーズの吸引を回避するために青色１０００μｌ青色チップで延長された５ｍｌガラスピペットを使用して、細胞溶解産物を回収し、ガラスビーズをすすぐために使用した１０ｍｌのＰＢＳと共に５０ｍｌ遠心分離チューブ（コーニング社製）に移した。
【００８９】
細胞溶解産物を、４℃で１０分間４０００ｒｐｍで遠心分離し（Ｓｏｒｖａｌｌ社製）、膜残屑および核をペレット化した。
【００９０】
得られた上清を、１２ｍｌチューブでＳＷ４０ローターを用いて、４℃で９０分間３９０００ｒｐｍ（１０５０００ｇ）で超遠心分離して、ミトコンドリアをペレット化した。ペレットを、冷却ＰＢＳに溶解した（例えば、元々は９リットルだったＳ．ｃ．培養物から得られたペレットを、１００ｍｌのＰＢＳに溶解した）。その結果生じたミトコンドリア画分を、ＳＮと称する。
【００９１】
得られたＳＮ画分をフェノールで処理して、タンパク質および脂質から核酸を抽出した。それに、等容積のＴｒｉｓ緩衝化フェノール（Ａｍｒｅｓｃｏ社製）を添加して懸濁液にし、室温（ＲＴ）で１分間最高速度でボルテックスし、遠心分離した（例えば、Ｈａｒｅｕｓ社製遠心機を用いて、５０ｍｌファルコンチューブを、室温で１０分間５０００ｒｐｍで遠心分離した）。水性上部相を単離し、新しいチューブに移した。フェノール抽出を３回繰り返した。３回のフェノール抽出後に回収された水性上部相を、その後ジクロロメタン（ｐ．Ａ．；メルク社製）で２回抽出し、等容積のジクロロメタンを添加し、混合物を室温で３０秒間ボルテックスし、遠心分離した（例えば、Ｈｅｒｅａｕｓ社製遠心機を用いて、５０ｍｌファルコンチューブを室温で１０分間５０００ｒｐｍで遠心分離した）。水相を回収し、ジクロロメタン処理を繰り返した。
【００９２】
核酸を、単離された上清からエタノール沈澱により回収した：上清容積の１／１０の３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５、および２容積のエタノール（無水）を添加した。４℃で一晩インキュベーションした後、溶液を遠心分離した（例えば、Ｈａｒｅａｕｓ社製遠心機を用いて、５０ｍｌファルコンチューブを４℃で２０分間）。ペレットを、７０％冷却エタノールで洗浄した。完全に乾燥する前に、ペレットをＴＥ  ｐＨ７．５に溶解した｛例えば、工程ｄ）で得られた１００ｍｌ懸濁液に由来するペレットを、２０〜２５ｍｌのＴＥ  ｐＨ７．５に溶解し、その結果、２６０ｎｍの光学濃度による測定で、約１μｇ／μｌの核酸濃度がもたらされた｝。その結果生じたミトコンドリア核酸画分をＮＡ画分と称した。
【００９３】
９リットルのＳ．ｃ．培養物から開始した、サッカロマイセス・セレビシエの核酸画分（つまり、ＮＡ画分）の大規模調製を、上述の方法により独立して３回実施した。３つの調製物は、同等の特徴をもたらした。ＬＡＬアッセイにより３つの調製物の全てで測定されたエンドトキシンレベルは、同等であり、低かった（０．５〜０．７ＥＵ／ｍｌ）。
【００９４】
Ｓ．ｃ．Ｗ３０３（Ｂｉｏｃｈｅｍ社製）から開始した、サッカロマイセス・セレビシエの核酸画分（つまり、ＮＡ画分）の調製も実施した。
【００９５】
ＮＡ画分−Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）（以下の実施例において試験されることになる）を生成するために、ＮＡ画分（１μｇ／μｌ）を、１：１（容積：容積および重量：重量）の比率でＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）（１μｇ／μｌ；インビトロジェン社製、カタログ番号１８２９２−０１１またはカタログ番号１８２９２−０３７）と混合した。
【００９６】
実施例２：ＮＡ画分からのミトコンドリアＲＮＡ（ＮＡ−Ｂ２画分）の単離。
【００９７】
実施例１に記述されている方法により調製されたＮＡ画分を、１×ＴＡＥ（Ｔｒｉｓ−アセテート−ＥＤＴＡ）緩衝液中１％アガロースゲルに流した。
【００９８】
図１に示されている結果は、ＤＮＡマーカーであるラムダ−ＨｉｎｄＩＩＩ／ＰｈｉＸ１７４−ＨａｅＩＩＩ（図１ではＭと記されている）と比較して、以下の３つの群の核酸を明白に識別することができることを示す：
（１）２０Ｋｂｐ付近に移動する明瞭なバンド、これをＮＡ−Ｂ１画分と称する；
（２）４Ｋｂｐ付近に移動する明瞭なバンド、これをＮＡ−Ｂ２画分と称する；および
（３）１０００〜約１００ｂｐの間に移動する分子のスミア、これをＮＡ−小型画分と称する。
【００９９】
その後、ＮＡ−Ｂ１画分、ＮＡ−Ｂ２画分、およびＮＡ−小型画分の精製は、低照度ＵＶおよびメスを使用して、それぞれのバンドまたはバンド群をアガロースゲルから切り出すことにより実現した。切り出したアガロース片を、「二重チューブ構造体」（＝加熱した針で底部に穴を開け、フィルターとして機能する綿で栓をした０．５ｍｌチューブを、蓋を切り取った２ｍｌチューブに挿入した）に移し、−６０℃未満で凍結し、卓上型遠心分離機を用いて、室温で１５分間５０００ｒｐｍで遠心分離し（物質が完全に解凍されるまで）、その後１４０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。下段チューブに回収された溶液を、新しいチューブに移した。核酸を、実施例１に記述されているように、酢酸ナトリウムおよびエタノールを使用して沈殿させた。ペレットを、ＴＥ  ｐＨ７．５に溶解した。典型的には、アガロースゲルに流した３ｍｇのＮＡ画分から開始して、〜８μｇのＮＡ−Ｂ２画分を回収し、典型的には、ＴＥ  ｐＨ７．５に溶解して２０ｎｇ／μｌの濃度にした。
【０１００】
その後、ＮＡ画分、ＮＡ−Ｂ１画分、およびＮＡ−Ｂ２画分を、ＲＮＡｓｅＡ処理（１００ｍｇ／ｍｌ：キアゲン社製）を施してまたは施さないで、１×ＴＡＥ（Ｔｒｉｓ−アセテート−ＥＤＴＡ）緩衝液中１％アガロースゲルに流した。
【０１０１】
図１に示されている結果は、以下のことを示している：
（１）  ＮＡ−Ｂ１画分は、ＨａｅｌＩＩ感受性、ＲＮＡｓｅＡ非感受性であることが判明し、ＮＡ−Ｂ１画分がＤＮＡであることが実証された；
（２）ＮＡ−Ｂ２画分およびＮＡ−小型画分は、ＨａｅｌＩＩ非感受性、ＲＮＡｓｅＡ感受性であり、これらの分子がＲＮＡであることが実証された。
【０１０２】
Ｓ．ｃ．ＡＨ１０９（クロンテック社製）から得られた画分およびＳ．ｃ．Ｗ３０３（Ｂｉｏｃｈｅｍ社製）から得られた画分で、同じ結果が得られた。
【０１０３】
ＮＡ−Ｂ２画分−Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）（以下の実施例において試験されることになる）を生成するために、ＮＡ−Ｂ２画分（２０ｎｇ／μｌ）を、１：１（容積：容積）の比率でＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）（１μｇ／μｌ；インビトロジェン社製、カタログ番号１８２９２−０１１またはカタログ番号１８２９２−０３７）と混合した。
【０１０４】
ＮＡ−Ｂ２画分−Ａｍｂｉｓｏｍｅ（商標）（以下の実施例で試験されることになる）を生成するために、ＮＡ−Ｂ２画分（２０ｎｇ／μｌ）を、１：１または１：３（容積：容積）の比率でＡｍｂｉｓｏｍｅ（商標）（４μｇ／μｌ；Ｇｉｌｅａｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）と混合した。
【０１０５】
実施例３：ＮＡ画分およびＮＡ−Ｂ２画分が、ヒトＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）を刺激する能力。
【０１０６】
細胞：ヒト胎児由来腎臓細胞２９３（ＨＥＫ）を、１つまたは２つのヒト由来Ｔｏｌｌ様受容体（ｈＴＬＲ）の構成的発現を可能にするプラスミドで安定的にトランスフェクションした。その結果生じた細胞株２９３／ｈＴＬＲ２−ＣＤ１４、２９３／ｈＴＬＲ３、２９３／ｈＴＬＲ４−ＭＤ２−ＣＤ１４、２９３／ｈＴＬＲ５、２９３／ｈＴＬＲ２／６、２９３／ｈＴＬＲ７、２９３／ｈＴＬＲ８、および２９３／ｈＴＬＲ９は、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社（サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）から購入した。細胞株は全て、１０％ウシ胎仔血清、４０μｇ／ｍｌゲンタマイシン、２ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（シグマ社製）、および１×非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、ギブコ社製）で補完されたダルベッコ最少イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、ブラスチシジンＳ（１０μｇ／ｍｌ、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社製）の存在下で培養した。２９３／ｈＴＬＲ２−ＣＤ１４および２９３／ｈＴＬＲ４−ＭＤ２−ＣＤ１４の場合、ヒグロマイシンＢを１００μｇ／ｍｌの濃度になるように添加した。８つの細胞株は全て、ＮＦ−ｋＢ誘導可能レポータープラスミドであるｐＮｉＦｔｙ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社製）で安定的にトランスフェクションした。ｐＮｉＦｔｙは、５つのＮＦ−ｋＢ部位および近位ＥＬＡＭプロモーターを組合せた遺伝子操作ＥＬＡＭ１プロモーターの制御下にホタルルシフェラーゼ遺伝子をコードしている。安定発現株を、１００μｇ／ｍｌゼオシン（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社製）の存在下で選択した。出現したクローン「ｈＴＬＲｘ−ｌｕｃ」を、それぞれの対照ＴＬＲリガンドに対するＥＣ５０および誘導倍数で特徴付けた。最も低いＥＣ５０および高い誘導倍数、ならびに良好な／許容される増殖挙動を示すクローンを選択した。確保されたクローンおよびそれらの特徴は、表１に列挙されている。
【０１０７】
【表１】
2012515146.tif 000002
【０１０８】
対照細胞株２９３−ｌｕｃ−２−８（２９３−ｌｕｃ）：ＨＥＫ−２９３細胞を、ＮＦ−ｋＢ誘導可能レポータープラスミドｐＮｉＦｔｙ２で安定的にトランスフェクションした。安定発現株を、１００μｇ／ｍｌゼオシン（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社製）の存在下で選択した。陽性クローン２９３−ｌｕｃ−２をサブクローンし、クローン２９３−ｌｕｃ−２−８を確保した。この対照細胞株は、ＮＦ−ｋＢ経路のＴＬＲ非依存性刺激の対照用に生成した。
【０１０９】
ＲＴ−ＰＣＲ実験は、細胞株が全て、ＲＬＨファミリー（ＫＲ０８００１  ｐ７５、Renee Brandely、２００８年１０月）のメンバーであるｒｉｇ−Ｉ（レチノイン酸誘導可能遺伝子１）およびｍｄａ−５（メラノーマ分化抗原５）メッセージに陽性であることを示した（データ省略）。加えて、細胞株が全て、供給業者によりＭＤＡ−５リガンドと記述され、調合されたＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）「ｐｏｌｙＩＣＬｙｏＶｅｃ」（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社製）により刺激することができた。この結果は、全ての細胞株（ＴＬＲおよび対照細胞株）でＭＤＡ−５が機能的であること示唆する。
【０１１０】
イン・ビトロにおけるＴＬＲ試験−方法：２％ウシ胎仔血清、４０μｇ／ｍｌゲンタマイシン、２ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（シグマ社製）、および１×ＭＥＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、ギブコ社製）で補完されたＤＭＥＭで希釈した細胞を、９６穴プレートに播種した。翌日、ＮＡ画分（原液：１ｍｇ／ｍｌ）を、単独でまたはＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）と組合せてのいずれかで（実施例１に記述されているように）、１６μｇ／ｍｌの濃度およびその３倍系列希釈で添加した。陽性対照として、細胞株を、明確な量のそれぞれの基準リガンドで刺激した。刺激した１日（１８〜２０時間）後、１２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．８、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＤＴＴ、および５％トリトンＸ−１００を含有する１００μｌ緩衝液に細胞を溶解した。１０μｌ溶解産物中のホタルルシフェラーゼ活性は、５０μｌルシフェラーゼ顕色緩衝液（１×ルシフェラーゼ顕色緩衝液：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．８、１．０７ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．７ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、３３．３ｍＭ  ＤＴＴ、４７０μＭルシフェリン、５３０μＭ  ＡＴＰ、および２７０μＭ  補酵素Ａ）を添加した後、フラッシュルミネセンスの測定を１秒間にわたって積分することにより定量化した（ＬＢ９６  Ｐ  Ｍｉｃｒｏｌｕｍａｔ、ベルトールド社製）。その結果生じた相対発光量（ＲＬＵ）を、対照リガンドと比較した誘導のパーセントとして表し、シグモイド型用量応答用の数式を使用して、Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ４ソフトウェアで分析した（ＥＣ５０の決定）。
【０１１１】
イン・ビトロにおけるＴＬＲ試験  第１：ＮＡ画分の２つの独立したバッチ（ロット１：０．６ＥＵ／ｍｌ；ロット２：０．７７ＥＵ／ｍｌ）を、単独でまたはＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）と組合せてのいずれかで、ＴＬＲ細胞株および対照細胞株に対して、以前に記述されている方法により試験した。それぞれの対照リガンド（表１を参照）で観察されたもののパーセントで表された最大活性化は、表２に示されている。
【０１１２】
【表２】
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【０１１３】
図２に示されている結果は、以下のことを示している：
（１）ｈＴＬＲ３、４、および７におけるＮＡ画分で、活性化が観察される（ロット１ならびにロット２）；
（２）ＮＡ単独で観察された活性化は、ＮＡをＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）と混合すると、強力に増加する（ロット１ならびにロット２）；
（３）Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）単独、または１：１（重量：重量）の比率でニシン精子ＤＮＡ（１μｇ／ｍｌ；シグマ社製）と混合したＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）は、いずれの細胞株も活性化しなかった。
【０１１４】
イン・ビトロにおけるＴＬＲ試験  第２：Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）を添加する前にＲＮＡｓｅＡ（１００ｍｇ／ｍｌ；キアゲン社製）で処理したＮＡ−Ｂ１画分、ＮＡ−Ｂ２画分（１．３ＥＵ／ｍｌ）、およびＮＡ画分（０．７ＥＵ／ｍｌ）を、ＴＬＲ細胞株および対照細胞株に対して、以前に記述されている方法により試験した。結果は、表３に示されている。
【０１１５】
【表３】
2012515146.tif 000004
【０１１６】
図３に示されている結果は、以下のことを示している：
（１）  ＮＡ画分およびＮＡ−Ｂ２画分は同様に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）無しでも、２９３−ｌｕｃを含む試験細胞株を刺激し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）があればより強く刺激する；
（２）ＮＡ画分およびＮＡ−Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）による刺激は両方とも、ＮＡ画分をＲＮａｓｅＡで前処理した後で消失した。これは、活性分子がＲＮＡであることを実証する。
（３）ＮＡ−Ｂ２画分およびＮＡ−Ｂ２−Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）による刺激は両方とも、ＮＡ−Ｂ２画分をＲＮａｓｅＡで前処理した後で消失した。これは、活性分子がＲＮＡであることを実証する。
（４）ＮＡ−Ｂ１画分は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）を有する場合もまたは有していない場合も、ＴＬＲ細胞株を活性化しない；
（５）Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）単独では効果を示さない。
【０１１７】
ＡＨ１１９（クロンテック社製）に由来するＮＡ−Ｂ２で得られたＨＥＫ−２９３−ＴＬＲ細胞株の活性化に関する結果は、Ｓ．ｃ．系統Ｗ３０３（Ｂｉｏｃｈｅｍ社製）に由来するＮＡ−Ｂ２で得られた結果と同等である。
【０１１８】
実施例４：免疫応答をＨＰＶ１６  Ｅ７抗原に対するＴｈ１型応答に向けることを目的とする医薬組成物を調製するための、ＮＡ画分またはＮＡ−Ｂ２画分およびＨＰＶ１６  Ｅ７抗原の使用。
【０１１９】
動物モデル：ＳＰＦ健常雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、チャールズ・リバー社（レ・ゾンサン、フランス）から取得した。動物は、到着時に６週齢だった。実験の開始時では、マウスは７週齢だった。動物は、毎時最低１１回の空気交換を提供するように空調が施された一匹だけの単一の部屋に収容した。温度および相対湿度の範囲は、それぞれ２０℃〜２４℃および４０〜７０％であった。照明は、１２時間の明期および１２時間の暗期のサイクルをもたらすように自動的に制御した。特定病原体未感染状態を、歩哨動物を定期的に対照とすることにより検査した。研究の全体にわたって、動物は、滅菌食タイプＲＭ１（Ｄｉｅｔｅｘ  Ｆｒａｎｃｅ社製、サングラシアン）を自由摂取した。滅菌水を、ボトルにより自由摂取させた。
【０１２０】
イン・ビボにおけるＥＬＩＳｐｏｔガンマインターフェロン（ＩＦＮ−γ）：
【０１２１】
ＩＦＮ−γ  ＥＬＩｓｐｏｔアッセイは、イン・ビボで初回刺激したＴ細胞が、特定のペプチドを用いてイン・ビトロで再刺激した際にＩＦＮ−γを分泌する能力を測定するための機能性試験である。
【０１２２】
表４に記述されている調製物を、動物に１週間間隔で３回（０日目；７日目；１４日目）（尾部の根元に）皮下注射した。
【０１２３】
【表４】
2012515146.tif 000005
【０１２４】
その後、最後の注射をした７日後に動物を犠牲し、それらの脾細胞を使用して、再刺激の際にＩＦＮ−γを分泌するＲ９Ｆ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を測定した。
【０１２５】
ＥＬＩＳｐｏｔプレートを、滅菌ＤＰＢＳで２．５μｇ／ｍｌに希釈されたラット抗マウスＩＦＮ−γモノクローナル抗体（１００μｌ／ウエル；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製、参照番号：５５１２１６）でコーティングした。その後プレートにカバーをかけ、室温で一晩か、または３７℃で４時間か、または４℃で２４時間のいずれかでインキュベートした。その後、滅菌ＰＢＳ（２００μｌ／ウエル）で５回の洗浄を実施した。その後プレートを、２００μｌ／ウエルの完全培地を用いて３７℃で１時間ブロッッキングした。
【０１２６】
実験用のリンパ球を調製するために、５ｍｌの完全培地（ＲＰＭＩ；ＦＢＳ１０％；４０μｇ／ｍｌゲンタマイシン；２ｍＭグルタミン；５×１０−５Ｍ  ｂ−メルカプトエタノール）を、６穴プレートの各ウエルに入れた。同じ群のマウスからの脾臓を、６穴培養プレートのウエル中のセルストレーナー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製；参照番号３５２３６０）に貯溜した。脾臓を注射器ピストンで粉砕し、セルストレーナーを廃棄した。脾細胞を５ｍｌの完全培地で収集し、その後氷上の１５ｍｌファルコンチューブに移した。その後４００×ｇで３分間、室温（２２℃）での遠心分離を実施した。細胞を、８ｍｌの完全培地に室温で再懸濁した。８ｍｌのリンパ球または脾細胞懸濁物を、４ｍｌのＬｙｍｐｈｏｌｙｔｅ（商標）−Ｍ分離細胞培地（ＴＥＢＵ  ＢＩＯ社製、参照番号：ＣＬ５０３１）上に置いた。その後１５００×ｇで２０分間、室温（２２℃）での遠心分離を実施した。リンパ球を収集し、叩いて、１０ｍｌのＲＰＭＩ最少培地で３回すすいだ。遠心分離（４００×ｇで３分間）を、すすぎ工程の各々の間に実施し、上清を廃棄した。その後リンパ球を、２ｍｌのＲＢＣ溶解緩衝剤（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製；参照番号５５５８９９）に再懸濁した。溶解溶液を添加した直後に各チューブを穏やかにボルテックスし、その後１５分間室温でインキュベートした。その後４００×ｇで３分間の遠心分離を実施し、上清を廃棄した。細胞を１０ｍｌの完全培地で洗浄し、その後４００×ｇで３分間遠心分離した。上清を廃棄した。６ｍｌ（ペレットの大きさに依存する）の完全培地に細胞を再懸濁した後、細胞を、Ｍａｌａｓｓｅｚ  ｃｅｌｌ上で計数し、細胞濃度を、完全培地で１ｍｌ当たり１×１０７細胞に調整した。
【０１２７】
ＥＬＩＳｐｏｔアッセイそれ自体は、以下の通りに実施する：２〜４μｇ／ｍｌの目的ペプチド（つまり、ＨＰＶ１６Ｅ７ペプチド抗原）を有するまたは有しない１００μｌの完全培地を、各ウエル添加した。１００μｌの細胞懸濁液を添加した。５％ＣＯ２中、３７℃で２０時間インキュベーションした後、Ｈ２Ｏ洗浄緩衝液（ＰＢＳ、１％ＰＢＳ）で洗浄工程を２回実施し、その後ＰＢＳ洗浄緩衝液での洗浄工程を５回実施した（軽く叩いて乾燥させた）。ビオチン化ラット抗マウスＩＦＮ−γモノクローナル抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製、参照番号：５５４４１０）を、抗体混合緩衝液で４μｇ／ｍｌに希釈し、１００μｌ／ウエルで分注した。プレートを、暗所で２時間室温でインキュベートした。ＰＢＳ洗浄緩衝液（ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）での洗浄工程を５回実施した（軽く叩いて乾燥させた）。その後、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼを、抗体混合緩衝液で希釈した（１／１０００）。１００μｌ／ウエルで添加し、暗所で１時間室温でインキュベートした。ＰＢＳ洗浄緩衝液での洗浄工程を５回実施し、その後ＰＢＳでの洗浄工程を２回実施した（軽く叩いて乾燥させた）。その後、１００μｌ／ウエルのＢＣＩＰ／ＮＢＴ（シグマ社製；参照番号Ｂ５６５５）を添加し、青色スポットが発色するまで（最高２分間）、室温でインキュベートした。水でよくすすいだ後（軽く叩いて乾燥させた）、ＥＬＩＳｐｏｔ読取器でＥＬＩＳｐｏｔプレートの分析を実施した。視覚的な品質管理（スキャンとプレートとの比較）を各ウエルに対して実施し、コンピューターからもたらされた計数が実際の画像と一致することを保証した（考え得るアーティファクトの排除）。生データをヒストグラムグラフに変換した。結果は、各三重重複測定毎の、１×１０６個のリンパ球当たりのスポット形成単位（ｓｆｕ）の数（平均）として表されている。カットオフは、非再刺激ウエルを使用し、式：［平均（非再刺激ウエル）］＋［２×ＳＤ（非再刺激ウエル）］を使用して決定した。非特異的なバックグラウンドレベルは、無関係なＩ８Ｌペプチド（ＨＰＶ１６Ｅ１）を用いた再刺激により明らかにする。
【０１２８】
図２に示されている結果は、以下のことを示す：
（１）ＨＰＶ１６Ｅ７を注射した際には、ＩＦＮ−γを分泌するＲ９Ｆ特異的（ＨＰＶ１６Ｅ７タンパク質）Ｔ細胞は存在しない；
（２）ＨＰＶ１６Ｅ７タンパク質にＮＡ画分（２５μｇ）またはＮＡ−Ｂ２画分（０．４μｇ）を添加した後では、ＩＦＮ−γを分泌するＲ９Ｆ特異的細胞のレベルは顕著である。ＮＡ画分およびＮＡ−Ｂ２画分には、再刺激の際にＴｈ１サイトカインＩＦＮ−γを分泌することができる循環ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度増加を顕著にもたらすアジュバント能力が賦与されている。
【０１２９】
実施例５：癌の治療を目的とする医薬組成物を調製するためのＮＡ画分およびＭＵＣ−１抗原の使用。
【０１３０】
各ベクター構築体の名称および簡単な説明（表５を参照）。
【０１３１】
【表５】
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【０１３２】
使用した動物モデルは、実施例３に記述したように、ＳＰＦ健常雌Ｂ６Ｄ２マウスであった。
【０１３３】
ＲｅｎＣａ−ＭＵＣ−１腫瘍細胞：ＲｅｎＣａは、実験的マウス腎臓癌モデルである（Chakrabarty A. et al. Anticancer Res. 1994; 14:373-378；Salup R. et al. Cancer Res 1986 46: 3358-3363）。ＲｅｎＣａ−ＭＵＣ−１細胞を、ＭＵＣ−１ペプチドを発現するプラスミドのトランスフェクション後に得た。そのような細胞は、それらの表面にＭＵＣ１抗原を発現した。ＲｅｎＣａ−ＭＵＣ−１細胞を、１０％不活化ウシ胎仔血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、０．０４ｇ／ｌ  ゲンタマイシン、および０．６ｍｇ／ｍｌ  ヒグロマイシンを含有するＤＭＥＭ中で培養した。
【０１３４】
免疫化：免疫療法実験の場合、１日目に、Ｂ６Ｄ２雌マウスを、３．１０５個のＲｅｎＣａ−ＭＵＣ−１細胞を用いて右側腹の皮下に投与した。マウスを、媒体単独（緩衝液）、５．１０７ｐｆｕのＭＶＡ−ヌル（ＭＶＡＮ３３）、ＮＡ画分（５０μｇ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）（５０μｇ；インビトロジェン社製、カタログ番号１８２９２−０１１またはカタログ番号１８２９２−０３７）、Ｎａ＋Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）（５０μｇ＋５０μｇ）、単独、またはＮＡ画分（５０μｇ）もしくはＮＡ＋Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）（５０μｇ＋５０μｇ）と組合せたＭＵＣ１およびｈｌＬ−２を発現する５．１０７ｐｆｕのＭＶＡ株（ＭＶＡ９９３１）を、４日目、１１日目、および１８日目に、３回皮下処置した（１群当たり１３匹のマウス）。マウスを、４日目、１１日目、および１８日目に、Ｎａ＋Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）（５０μｇ＋５０μｇ）のみで３回腫瘍内処置した。注射スキーム：ＭＶＡ９９３１を最初に注射した；１時間後にＮＡ画分またはＮＡ＋Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）を同じ部位に注射した。マウスの生存をモニターした。また、カリパスを使用して、腫瘍容積を週２回モニターした。腫瘍サイズが直径２５ｍｍより大きくなった時、マウスを道義的理由で安楽死させた。
【０１３５】
統計：カプラン−マイヤー生存曲線を、Ｓｔａｓｔｉｓｔｉｃａ  ７．１ソフトウェア（ＳｔａｔＳｏｆｔ社製）を使用して、ログランク検定により分析し、特定の対比較を行った。Ｐ＜０．０５を、統計的に有意であるとみなした。
【０１３６】
図３に示されている結果は、未処置対照と比較して、ＮＡ画分（５０μｇ）またはＮａ＋Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）（５０μｇ＋５０μｇ）と組合せたＭＶＡＴＧ９９３１が、２０日目（ｐ：０．００７７５２）および２５日目（ｐ：０．０２３０４６）に、腫瘍増殖に対して統計学的に有意な効果を示したことを示している。
【０１３７】
実施例６：ＮＡ−Ｂ２画分、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）、Ａｍｂｉｓｏｍｅ（商標）、ＮＡ−Ｂ２＋Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）、および／またはＮＡ−Ｂ２＋Ａｍｂｉｓｏｍｅ（商標）で処理されたヒト未熟単球由来樹状細胞（ｍｏＤＣ）におけるサイトカイン  ガンマインターフェロン（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、およびアルファインターフェロン（ＩＦＮ−α）の誘導。
【０１３８】
細胞培養：健常志願者に由来する洗い分けされたヒト単球を、Ｅｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔ  Ｆｒａｎｃａｉｓ  ｄｕ  Ｓａｎｇ−Ａｌｓａｃｅ（ＥＦＳ）から取得した。凍結細胞を、１×１０６細胞／ｍｌの濃度で、１０％不活化ウシ胎仔血清、４０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（シグマ社製）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（シグマ社製）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（シグマ社製、Ｓ８６３６）、および１×非必須アミノ酸（ＭＥＭ  ＮＥＡＡ、ギブコ社製）で補完されたＲＰＭＩ（ギブコ社製）の培養に入れた。洗い分けされた単球の樹状細胞（ｍｏＤＣ）への分化を誘導するために、サイトカインＧＭ−ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、およびＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍｌ）（ペプロテック社製）を添加した。３日後、細胞を計数し、遠心分離し、１×１０６細胞／ｍｌの密度で新しい補完培地に入れた。２×１０６細胞を、１２ウェルプレート（２ｍｌ／ウエル）に播種した。更に２〜３日後、未熟ｍｏＤＣとみなされた細胞を、下記に示されているように感染させおよび／または刺激した。
【０１３９】
刺激：ＮＡ−Ｂ２画分、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）（インビトロジェン社製、カタログ番号１８２９２−０１１またはカタログ番号１８２９２−０３７）、およびＡｍｂｉｓｏｍｅ（商標）（ギリアドサイエンシズ社製）を、ｍｏＤＣに添加した。１６〜２０時間後、細胞を遠心分離し、上清を−２０℃で保管し、ＥＬＩＳＡで分析した。
【０１４０】
Ｅｌｉｓａによるサイトカインの検出：１６〜２０時間刺激した後、Ｂｅｎｄｅｒ  Ｍｅｄ  Ｓｙｓｔｅｍ社から市販されているＥＬＩＳＡキットを使用して、サイトカイン産生量を測定した（ＩＦＮγ、ＩＬ１２（ｐ７０）、およびＩＦＮα）。ＥＬＩＳＡアッセイを、製造業者のプロトコールに従って実施した。サイトカイン濃度を、既知量の組換えサイトカインを使用して得られた検量線により測定した。
【０１４１】
結果：
【０１４２】
ガンマインターフェロン（ＩＦＮ−γ）：図４に示されているように、ガンマインターフェロン発現は、ＮＡ−Ｂ２画分単独（０．４μｇまたは１．２μｇ）およびＡｍｂｉｓｏｍｅ（商標）単独（１２０μｇ）により誘導されたが、ＮＡ−Ｂ２画分１．２μｇでヒト未熟ｍｏＤＣを処理することにより得られたガンマインターフェロン発現レベルは、Ａｍｂｉｓｏｍｅ（商標）１２０μｇでヒト未熟ｍｏＤＣを処理することにより得られたガンマインターフェロン発現レベルより高い。更に、まとめると、ＮＡ−Ｂ２画分およびＡｍｂｉｓｏｍｅ（商標）（０．４μｇ＋１２０μｇまたは１．２μｇ＋１２０μｇ）は、相乗効果的様式でガンマインターフェロン発現を増加させる。
【０１４３】
インターロイキン１２（ＩＬ−１２）：図５に示されているように、ＮＡ−Ｂ２画分０．２μｇで処理されたヒト未熟ｍｏＤＣは、ＩＬ−１２をわずかに産生するが、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎｅ（商標）１０μｇまたはＡｍｂｉｓｏｍｅ（商標）８０μｇ、１２０μｇ、もしくは１６０μｇで処理されたヒト未熟ｍｏＤＣは、ＩＬ−１２を分泌しない。ヒト未熟ｍｏＤＣｓに添加されたＮＡ−Ｂ２＋Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）の組合せ（０．２μｇ＋１０μｇ）およびＮＡ−Ｂ２＋Ａｍｂｉｓｏｍｅ（商標）の組合せ（０．２μｇ＋１２０μｇ）は、ＩＬ−１２の分泌を明らかに刺激する（相乗効果）。
【０１４４】
アルファインターフェロン（ＩＦＮ−α）：図６に示されているように、ＮＡ−Ｂ２画分単独（０．４μｇまたは１．２μｇ）、Ａｍｂｉｓｏｍｅ（商標）単独（１２０μｇ）、およびＮＡ−Ｂ２＋Ａｍｂｉｓｏｍｅ（商標）の組合せ（０．４μｇ＋１２０μｇまたは１．２μｇ＋１２０μｇ）は、αインターフェロン（ＩＦＮ−α）を誘導しない。
【０１４５】
上記の明細書で引用された文書（例えば、特許、特許出願、出版物）は全て、参照により本明細書に組込まれる。当業者であれば、本発明の範囲および趣旨から逸脱しない本発明の種々の改変および変異は明白であろう。本発明は特定の好ましい実施形態に関して記述されているが、請求されている本発明は、そのような特定の実施形態に過度に限定されるべきでないことが理解されるべきである。実際、当業者に明白である、本発明を実施するための記述されている方法の種々の改変は、添付の特許請求の範囲内にあることが意図されている。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図１】
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【国際調査報告】
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