【手続補正書】
【提出日】平成21年10月8日(2009.10.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）：
【化１】
2009511566.tif 000001
（式中：
−  Ｒ１は、４〜２０個の炭素原子の線状（linear）アルキル基を示し；
−  Ｙは、１〜５個の炭素原子の線状アルキレン基または式−Ｒ−Ｏ−Ｒ’−、−Ｒ−ＣＯ−Ｒ’−または−Ｒ−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ’―の基を示し、ここで、Ｒは、１〜３個の炭素原子の線状アルキレン基を示し、Ｒ’は、０〜３個の炭素原子の線状アルキレン基を示し、Ｙは、６または７位で二環物と連結し；
−  Ｚは、３または４個の炭素原子の線状アルキレン鎖を示し；
−  Ａは、酸素原子、硫黄原子または−ＮＨ−基、またはアミノアルキル基−ＮＲ”−を示し、ここで、Ｒ”は、１〜２０個の炭素原子のアルキル基を示し；
−  Ａｒは、６〜１４個の炭素原子からなる芳香族性の単環または多環、または芳香族ヘテロ環（前記ヘテロ環は、４、５または６個の炭素原子と、Ｎ、ＳおよびＯからなる群から選択される少なくとも１つのヘテロ原子とを含む）、縮合芳香族ヘテロ二環物（該ヘテロ二環物は、６〜９個の炭素原子と、Ｎ、ＳおよびＯの群から選択される少なくとも１つのヘテロ原子とからなる）を示し、；
−  Ｒ２およびＲ３は、同一または異なって、それぞれ、水素原子または１〜４個の炭素原子のアルキル基を示し、Ｒ２およびＲ３は、場合によっては、窒素原子を有する５〜６員環を形成し；
−  Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、同一または異なって、水素、線状アルキル基または１〜４個の炭素原子の線状オキシアルキル基を示す）
の化合物。
【請求項２】
Ａは、酸素原子、硫黄原子または−ＮＨ基を示す、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ａｒは、フェニル、ナフチル、フルフリル、ベンゾフルフリル、イソベンゾフルフリル、ピロリル、インドリル、イソインドリル、インドリジニル、チエニル、ベンゾチエニル、オキサゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、イミダゾリル、トリアゾリル、ピリジル、キノリル、イソキノリル、フタラジニル、ナフチリジニル、キノキサリニル、キナゾリニル、シンノリニル、プテリジニル、ピラジニル、ピリミジニル、プリニル、チエノ［３，２−ｂ］チオフェンからなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ａｒは、フェニル、ナフチル、フルフリル、ベンゾフルフリル、イソベンゾフルフリル、ピロリル、インドリル、イソインドリル、インドリジニル、チエニル、ベンゾチエニル、ピラジニル、ピリミジニルからなる群から選択される、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
Ａｒは、フェニルおよびチエニルからなる群から選択される、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
式（２）：
【化２】
2009511566.tif 000002
の請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
特定式（３）：
【化３】
2009511566.tif 000003
を有する請求項５に記載の化合物。
【請求項８】
特定式（４）：
【化４】
2009511566.tif 000004
を有する、請求項５に記載の化合物。
【請求項９】
請求項６に記載の化合物の調製方法であって、
−  ６−ブロモメチル−４’−（ジエチルアミノ）−３−ヒドロキシフラボンをドデシルメチルアミンと反応させて、対応する第三級アミン（４’−（ジエチルアミノ）−６−（ドデシル（メチル）アミノメチル）−３−ヒドロキシフラボン）を形成させる工程と、
−  プロパンスルトンと反応させて、式（２）の化合物を形成させる工程と
を包含する方法。
【請求項１０】
請求項７に記載の化合物の調製方法であって、
−  アルコキシド塩基の存在下に、Ｎ１−（４−アセチル−３−ヒドロキシフェニル）アセトアミドを５−ピペリジノ−２−チオフェンカルボアルデヒドと反応させ、次いで、過剰の過酸化水素およびアルコキシド塩基を添加して、Ｎ１−［３−ヒドロキシ−２−（５−ピペリジノ−２−チエニル）−７−クロモニル］アセトアミドを形成させる工程と、
−  Ｎ１−［３−ヒドロキシ−２−（５−ピペリジノ−２−チエニル）−７−クロモニル］アセトアミドを酸中で加水分解し、７−アミノ−３−ヒドロキシ−２−（５−ピペリジノ−２−チエニル）クロモンを与える工程と、
−  得られた物質をクロロアセチルクロリドと反応させて、Ｎ１−［３−ヒドロキシ−２−（５−ピペリジノ−２−チエニル）−７−クロモニル］−２−クロロアセトアミドを得る工程と、
−  得られた物質をドデシルメチルアミンと反応させて、対応する第三級アミン（Ｎ１−［３−ヒドロキシ−２−（５−ピペリジノ−２−チエニル）−７−クロモニル］−２−ドデシル（メチル）アミノアセトアミドを形成させる工程と、
−  プロパンスルトンと反応させて、式（３）の化合物を形成させる工程と
を包含する方法。
【請求項１１】
請求項８に記載の化合物の調製方法であって、
−  ３−メチル−２，４−ジヒドロキシアセトフェノンを塩基、好ましくは炭酸カリウムと反応させ、次いで、１−ブロモ−３−クロロプロパンを添加して、４−（３−クロロプロポキシ）−３−メチル−２−ヒドロキシアセトフェノンを形成させる工程と、
−  塩基（好ましくは炭酸カリウム）およびヨウ化物（好ましくはヨウ化カリウム）の存在下に、得られた物質をＮ−メチルドデシルアミンと反応させて、４−［３−（ドデシルメチルアミノ）−プロポキシ］−３−メチル−２−ヒドロキシアセトフェノンを形成させる工程と、
−  塩基および過酸化物、好ましくは、それぞれナトリウムメトキシドおよび過酸化水素の存在下に、得られた物質を５−（１−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ））−２−チオフェンカルボアルデヒドと反応させて、２−（５−ジエチルアミノチオフェン−２−イル）−７−［３−（ドデシルメチルアミノ）−プロポキシ］−８−メチル−３−ヒドロキシクロモンを形成させる工程と、
−  プロパンスルトンと反応させて、式（４）の化合物を形成させる工程と
を包含する方法。
【請求項１２】
細胞形質膜の脂質非対称性、その表面電荷および／または形質膜の他の関連構造変化を研究するための蛍光プローブとしての、請求項１〜８のいずれか１つに記載の化合物の使用。
【請求項１３】
細胞膜の脂質組成の変化を検出するための、特に、前記膜のリーフレットの間の脂質分布の変化を検出するための蛍光性２バンドレシオメトリックプローブとしての、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
アポトーシス細胞を検出するための請求項１２または１３に記載の使用。
【請求項１５】
細胞アポトーシスの検出方法であって、
i）請求項１〜７のいずれか１つに記載の化合物を細胞と接触させる工程と、
ii）該細胞をインキュベートする工程と、
iii）細胞を洗浄する工程と、
iv）３５０〜５００ｎｍの励起波長においてプローブの蛍光発光スペクトルを観察することによってアポトーシス細胞を検出する工程と
を包含する方法。
【請求項１６】
細胞アポトーシスの度合いをアッセイする方法であって、ｉ）〜ｉｖ）の工程を包含する方法：
i）請求項１〜７のいずれか１つに記載の化合物を細胞と接触させる工程；
ii）該細胞をインキュベートする工程；
iii）該細胞を洗浄する工程；および
iv）（ａ）〜（ｃ）により細胞の膜組成の変化を検出する工程；
（ａ）３５０〜５００ｎｍの励起波長で前記化合物を射出させる（exit）ことによりアポトーシス細胞に挿入された化合物の発光スペクトルを集めること；
（ｂ）発光スペクトルにおいてＴ＊バンドおよびＮ＊バンドを選択すること；および
（ｃ）Ｔ＊バンドの強度をＮ＊バンドの強度で除算することによってアポトーシスの間の細胞形質膜の非対称性の喪失を定量すること。
【請求項１７】
請求項１〜８のいずれか１つに記載の化合物を含み、場合によっては、第二の試薬と接合させられた、アポトーシス細胞またはネクローシス細胞を検出および／または定量化および／または単離するためのキット。
【請求項１８】
第二の試薬は、ヨウ化プロピジウムである、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
アポトーシス細胞、ネクローシス細胞および生細胞を単離するためのサイトメトリー分析におけるプローブとしての、請求項１８に記載のキットの使用。
【請求項２０】
アポトーシスを誘導または調節する化合物のスクリーニング方法であって、
i）試験されるべき化合物／薬物を細胞と接触させる工程と、
ii）請求項１５に記載の細胞アポトーシスの検出方法または請求項１６に記載の細胞アポトーシスのアッセイ方法を適用する工程と、
iii）その結果をコントロールにより得られた結果と比較する工程と
を包含する方法。
【請求項２１】
細胞のアポトーシスを伴う患者の疾患の進行を追跡する方法であって、請求項１５または１６に記載の方法を患者のサンプルに適用する、方法。
【請求項２２】
前記疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、心不全および癌からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
本発明によるアリール基Ａｒの例は、フェニル、ナフチル、フルフリル、ベンゾフルフリル、イソベンゾフルフリル、ピロリル、インドリル、イソインドリル、インドリジニル、チエニル、ベンゾチエニル、オキサゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、イミダゾリル、トリアゾリル、ピリジル、キノリル、イソキノリル、フタラジニル、ナフチリジニル、キノキサリニル、キナゾリニル、シンノリニル、プテリジニル、ピラジニル、ピリミジニル、プリニル、チエノ［３，２−ｂ］チオフェンを含む。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
アポトーシスを検出するための提案される方法は、蛍光ラベリングされたアネキシンＶに基づく一般に用いられる方法と比較される以下の利点によって特徴付けられる：
１）本発明による化合物の使用による蛍光レシオメトリック測定により、プローブ濃度に依存しない絶対的な値が提供される；したがって、この技術は、より正確であり、アポトーシスのレベルの定量的な推定を可能にする；
２）合成有機分子をプローブとして用いることに基づいているため、この方法は簡単であり安価である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
本発明は、さらに、細胞のアポトーシスを検出する方法および／または細胞のアポトーシスの度合いをアッセイする方法を患者サンプルに適用することによって、細胞のアポトーシスを伴う、患者の疾患の進行を追跡する方法に関する。有利には、前記方法は、アルツハイマー病、パーキンソン病、心不全、癌等の疾患の進行を追跡するために用いられる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９１】
（実施例７）
プローブＴＣＮ１２Ｓの合成
４−（３−クロロプロポキシ）−３−メチル−２−ヒドロキシアセトフェノン
３−メチル−２，４−ジヒドロキシアセトフェノン（０．３ｇ）および炭酸カリウム（０．５ｇ）が、３０分間にわたってアセトン中で還流させられた。次いで、フラスコは冷却され、１−ブロモ−３−クロロ−プロパン（０．３ｍＬ）が加えられた。次いで、混合物は、２４時間にわたって還流させられた。生成物は、カラムクロマトグラフィーにより、溶出液として酢酸エチル／ヘプタン（ＥｔＯＡｃ／ヘプタン＝２０／８０）を用いて精製された。収率８２％。