(57)【要約】  本発明は、ヒトおよびカニクイザル両方の補体タンパク質Ｃ３ｂと結合する抗体およびその抗原結合フラグメント、ならびにその組成物および使用方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトまたはカニクイザル補体Ｃ３ｂタンパク質と特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントであって、抗体が100 pM以下のＫＤでヒトＣ３ｂと結合する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
250 pM以下のＫＤでカニクイザルＣ３ｂとも結合する、請求項１の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
10 pM以下のＫＤでヒトＣ３ｂと結合する、請求項１または２の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４】
2 pM以下のＫＤでヒトＣ３ｂと結合する、請求項１〜３のいずれか１項の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項５】
インビトロ溶血アッセイで測定したとき、65 nM以下のＩＣ５０でヒト副補体経路を阻害する、請求項１〜４のいずれか１項の単離された抗体。
【請求項６】
インビトロＣ３ｂ沈着で測定したとき、50 nM以下のＩＣ５０でヒト副補体経路を阻害する、請求項１〜５のいずれか１項の単離された抗体。
【請求項７】
補体膜侵襲複合体の沈着で測定したとき、5 nM以下のＩＣ５０でヒト副補体経路を阻害する、請求項１〜６のいずれか１項の単離された抗体。
【請求項８】
Ｃ３ａおよびＣ５ａの産生で測定したとき、100 nM以下のＩＣ５０でヒト副補体経路を阻害する、請求項１〜７のいずれか１項の単離された抗体。
【請求項９】
ヒトまたはカニクイザル補体Ｃ３ｂタンパク質と特異的に結合し、表１に記載の抗体と交差競合する、請求項１の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１０】
モノクローナル抗体である、請求項１〜９のいずれか１項の単離された抗体。
【請求項１１】
ヒトまたはヒト化抗体である、請求項１〜１０のいずれか１項の単離された抗体。
【請求項１２】
キメラ抗体である、請求項１〜１１のいずれか１項の単離された抗体。
【請求項１３】
一本鎖抗体である、請求項１〜１２のいずれか１項の単離された抗体。
【請求項１４】
ＦａｂフラグメントまたはＳｃＦｖフラグメントである、請求項１〜１３のいずれか１項の単離された抗体。
【請求項１５】
ＩｇＧアイソタイプである、請求項１〜１４のいずれか１項の単離された抗体。
【請求項１６】
各ヒトＶＨまたはＶＬ生殖系列配列由来の抗体フレームワークにアミノ酸が置換されているフレームワークを含む、請求項１〜１０のいずれか１項の単離された抗体。
【請求項１７】
Ｃ３との結合親和性よりも少なくとも1000倍大きな親和性でＣ３ｂと結合する、請求項１〜１６のいずれか１項の単離された抗体。
【請求項１８】
配列番号１、１５、２９、４３、５７、７１、８５、９９、１１３、１２７、１４１、１５５、１６９および１８３からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ１；配列番号２、１６、３０、４４、５８、７２、８６、１００、１１４、１２８、１４２、１５６、１７０および１８４からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ２；ならびに配列番号３、１７、３１、４５、５９、７３、８７、１０１、１１５、１２９、１４３、１５７、１７１および１８５からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ３を含み、補体タンパク質Ｃ３ｂと結合する、請求項１〜１７のいずれか１項の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１９】
配列番号４、１８、３２、４６、６０、７４、８８、１０２、１１６、１３０、１４４、１５８、１７２および１８６からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号５、１９、３３、４７、６１、７５、８９、１０３、１１７、１３１、１４５、１５９、１７３および１８７からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ２；ならびに配列番号６、２０、３４、４８、６２、７６、９０、１０４、１１８、１３２、１４６、１６０、１７４および１８８からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ３を含み、補体タンパク質Ｃ３ｂと結合する、請求項１〜１８のいずれか１項の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２０】
配列番号４、１８、３２、４６、６０、７４、８８、１０２、１１６、１３０、１４４、１５８、１７２および１８６からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号５、１９、３３、４７、６１、７５、８９、１０３、１１７、１３１、１４５、１５９、１７３および１８７からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ２；ならびに配列番号６、２０、３４、４８、６２、７６、９０、１０４、１１８、１３２、１４６、１６０、１７４および１８８からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ３をさらに含む、請求項１８の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２１】
配列番号７、２１、３５、４９、６３、７７、９１、１０５、１１９、１３３、１４７、１６１、１７５および１８９からなる群から選択される重鎖可変ドメイン配列ならびに配列番号８、２２、３６、５０、６４、７８、９２、１０６、１２０、１３４、１４８、１６２、１７６および１９０からなる群から選択される軽鎖可変ドメイン配列を含み、補体タンパク質Ｃ３ｂと結合する、請求項１〜２０のいずれか１項の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２２】
配列番号７、２１、３５、４９、６３、７７、９１、１０５、１１９、１３３、１４７、１６１、１７５および１８９からなる群から選択される配列と少なくとも９５％配列同一性を有する重鎖可変ドメインを含み、Ｃ３ｂと結合する、請求項１〜２１のいずれか１項の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２３】
配列番号８、２２、３６、５０、６４、７８、９２、１０６、１２０、１３４、１４８、１６２、１７６および１９０からなる群から選択される配列と少なくとも９５％配列同一性を有する軽鎖可変ドメインを含み、Ｃ３ｂと結合する、請求項１〜２２のいずれか１項の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２４】
配列番号８、２２、３６、５０、６４、７８、９２、１０６、１２０、１３４、１４８、１６２、１７６および１９０からなる群から選択される配列と少なくとも９５％配列同一性を有する軽鎖可変ドメインを含む、請求項２０２３の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２５】
配列番号９、２３、３７、５１、６５、７９、９３、１０７、１２１、１３５、１４９、１６３、１７７および１９１からなる群から選択される配列と少なくとも９５％配列同一性を有する重鎖を含み、Ｃ３ｂと結合する、請求項１〜２４のいずれか１項の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２６】
配列番号１０、２４、３８、５２、６６、８０、９４、１０８、１２２、１３６、１５０、１６４、１７８および１９２からなる群から選択される配列と少なくとも９５％配列同一性を有する軽鎖を含み、Ｃ３ｂと結合する、請求項１〜２５のいずれか１項の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２７】
配列番号１０、２４、３８、５２、６６、８０、９４、１０８、１２２、１３６、１５０、１６４、１７８および１９２からなる群から選択される配列と少なくとも９５％配列同一性を有する軽鎖をさらに含む、請求項２５の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２８】
請求項１〜２７のいずれか１項の単離された抗体またはその抗原結合フラグメントおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項２９】
配列番号７、２１、３５、４９、６３、７７、９１、１０５、１１９、１３３、１４７、１６１、１７５および１８９からなる群から選択される配列と少なくとも９５％配列同一性を有する重鎖可変ドメインを含むポリペプチドをコードする配列を含んでなる、単離された核酸。
【請求項３０】
配列番号８、２２、３６、５０、６４、７８、９２、１０６、１２０、１３４、１４８、１６２、１７６および１９０からなる群から選択される配列と少なくとも９５％配列同一性を有する軽鎖可変ドメインを含むポリペプチドをコードする配列を含んでなる、単離された核酸。
【請求項３１】
請求項２７または２８の核酸を含むベクター。
【請求項３２】
請求項１〜３１のいずれか１項の抗体またはその抗原結合フラグメントの重鎖をコードする組換えＤＮＡ配列および請求項１〜３１のいずれか１項の抗体またはその抗原結合フラグメントの軽鎖をコードする第二の組換えＤＮＡ配列を含む、単離された宿主細胞であって、前記ＤＮＡ配列がプロモーターと作動可能に連結しており、宿主細胞内で発現可能である、単離された宿主細胞。
【請求項３３】
抗体がヒトモノクローナル抗体である、請求項３０の単離された宿主細胞。
【請求項３４】
宿主細胞が非ヒト哺乳類細胞である、請求項３０の単離された宿主細胞。
【請求項３５】
加齢性黄斑変性を処置する方法であって、それを必要とする対象に有効量の請求項１〜２７の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む組成物を投与することを含む、方法。
【請求項３６】
対象がヒトである、請求項３３の方法。
【請求項３７】
対象の副補体経路を阻害する方法であって、それを必要とする対象に有効量の請求項１〜２７の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む組成物を投与することを含む、方法。
【請求項３８】
対象がヒトである、請求項３５の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）は進行性の疾患であり、６５歳以上のアメリカ人の視力喪失および失明の主たる原因である。ＡＭＤは一次的には網膜黄斑（判読または運転に必要とされる高い視力に関与する網膜の一部）に作用する。多くのＡＭＤ患者は、ドルーゼンと呼ばれる細胞外網膜沈着の存在によって特徴付けられる該疾患の初期段階を有する。ドルーゼンは細胞デブリ、炎症性メディエーターおよび細胞外マトリックス成分の細胞外網膜沈着である。ＡＭＤの後期段階は乾燥または湿潤形態として現れ、両方の場合は視力喪失と関連する。地図状萎縮としても知られる乾燥ＡＭＤは、眼底検査において、網膜色素上皮（ＲＰＥ）喪失の局所領域に対応する境界の明瞭な領域として現れる。湿潤ＡＭＤは、脈絡膜の新血管形成と関連しており、しばしば出血を伴いうる、ブルッフ膜の完全性喪失および網膜の血管成長を引き起こす。この漏出は網膜細胞に持続的損傷を与え、死亡させ、中心視に盲点を作り出す。
【背景技術】
【０００２】
先天性ヒト機構は補体経路からなる。補体経路は、化膿性細菌感染症に対する防御のために、先天性免疫と適応免疫を結び、免疫複合体および炎症性損傷の産物を処理するものとして作用する。補体は血漿および細胞表面におけるカスケード反応に関与する３０種以上のタンパク質の系である。補体系およびその補体成分は、多様な免疫プロセスに関与する。例えば、補体Ｃ５ｂ−９複合体（終末複合体または細胞膜傷害複合体（ＭＡＣ）とも称される）は、膜透過性損傷を誘導することによって細胞死において重要な役割を果たす。
【０００３】
近年の研究により、補体成分Ｃ３およびＣ５がＡＭＤ患者におけるドルーゼンの主たる構成物質であることが示されている（Mulling, R.F. et al. (2000) FASEB J 14, 835-46）。それらの存在ならびに細胞膜傷害複合体（ＭＡＣ）Ｃ５ｂ−９およびドルーゼンを覆っているＲＰＥ細胞における他の急性期応答タンパク質の存在は、補体活性化およびＭＡＣの形成を惹起しうるプロセスに関与すると推測されている（Johnson, L et al. (2001) Exp Eye Res 73, 887-896）。したがって、補体成分が先天性免疫の単なるメディエーター以上であることの証拠が増えつつある。
【０００４】
乾燥ＡＭＤの湿潤ＡＭＤへの進行を阻害するために、栄養学的介入が処方されている。現時点で、ＦＤＡが承認する湿潤ＡＭＤに対する処置は、光力学治療（ＰＤＴ）、抗ＶＥＧＦアプタマー、例えばペガプタニブ、および抗ＶＥＧＦ抗体、ラニビズマブを含む。これらの薬物または治療は、典型的には、既に実質的な視力喪失を有する患者に投与される。
【０００５】
現在の処置に代わるまたは補充する効果的なＡＭＤ処置を開発する必要がある。特に、視力喪失の早期検出、予防または回復を提供しうる処置が必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
発明の概要
本発明は、ヒトまたはカニクイザル補体Ｃ３ｂタンパク質と特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントであって、100 pM以下のＫＤでヒトＣ３ｂと結合し、そして200 pM以下のＫＤでカニクイザルＣ３ｂと結合する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。例えば、本明細書に記載の抗体または抗原結合フラグメントは、90 pM以下、80 pM以下、70 pM以下、60 pM以下、50 pM以下、40 pM以下、30 pM以下、好ましくは20、19、18、17、16、15、14、13、12または11 pM以下のＫＤでヒトＣ３ｂと結合しうる。好ましくは、本抗体またはその抗原結合フラグメントは、10 pM以下のＫＤでヒトＣ３ｂと結合する。例えば、本抗体またはその抗原結合フラグメントは、9 pM以下、8 pM以下、7 pM以下、6 pM以下、5 pM以下、4 pM以下、3 pM以下、2 pM以下または1 pM以下のＫＤでＣ３ｂと結合しうる。本明細書に記載の抗体または抗原結合フラグメントは、250 pM以下、240 pM以下、230 pM以下、220 pM以下、210 pM以下、200 pM以下、190 pM以下、180 pM以下、170 pM以下、160 pM以下、150 pM以下、140 pM以下、130 pM以下、120 pM以下、110 pM以下、100 pM以下、90 pM以下、80 pM以下、70 pM以下、60 pM以下、50 pM以下、40、39、38、37、36、35、34、33、32または31 pM以下、30 pM以下、20、19、18、17、16、15、14、13、12または11 pM以下、好ましくは10、9、8、7、6、5、4、3、2または1 pM以下のＫＤでカニクイザルＣ３ｂと結合しうる。
【０００７】
好ましくは、本明細書に記載の抗体の結合親和性は、溶液平衡滴定（solution equilibrium titration、ＳＥＴ）によって測定する。ＳＥＴの方法は当該技術分野において既知であり、下記にさらに詳細に記載する。
【０００８】
本発明の抗体は、副補体経路を阻害するために使用できる。例えば、本明細書に記載の抗体またはそのフラグメントは、インビトロ溶血アッセイで測定したとき、70 nM以下、好ましくは65 nM以下、好ましくは50 nM以下、好ましくは40 nM以下、30 nM以下もしくは20 nM以下、より好ましくは10 nM以下のＩＣ５０で副補体経路を阻害しうる。本明細書に記載の抗体またはそのフラグメントは、インビトロ溶血アッセイで測定したとき、 100 nM以下、好ましくは90 nM以下、好ましくは80 nM以下、好ましくは75 nM以下、より好ましくは70 nM以下のＩＣ５０でカニクイザルの副補体経路を阻害しうる。本明細書に記載の抗体またはそのフラグメントは、インビトロＣ３ｂ沈着で測定したとき、30 nM以下、25 nM以下、20 nM以下、好ましくは10 nM以下のＩＣ５０で副補体経路を阻害しうる。本明細書に記載の抗体またはそのフラグメントは、インビトロＣ３ｂ沈着で測定したとき、70 nM以下、50 nM以下、40 nM以下、好ましくは30 nM以下のＩＣ５０でカニクイザルの副補体経路を阻害しうる。
【０００９】
本明細書に記載の抗体またはそのフラグメントは、補体膜侵襲複合体の沈着で測定したとき、5 nM以下、好ましくは4 nM以下、3 nM以下、2 nM以下、より好ましくは1 nM以下のＩＣ５０で副補体経路を阻害しうる。本明細書に記載の抗体またはそのフラグメントは、補体膜侵襲複合体の沈着で測定したとき、20 nM以下、好ましくは19 nM以下、18 nM以下、17 nM以下、16 nM以下、15 nM以下、14 nM以下または13 nM以下、より好ましくは10 nM以下のＩＣ５０でカニクイザルの副補体経路を阻害しうる。
【００１０】
本明細書に記載の抗体またはそのフラグメントは、Ｃ３ａおよびＣ５ａの産生で測定したとき、100 nM以下、好ましくは90 nM以下、80 nM以下、70 nM以下、60 nM以下、50 nM以下、40 nM以下、30 nM以下または20 nM以下、より好ましくは10 nM以下のＩＣ５０で副補体経路を阻害しうる。
【００１１】
本発明に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントは、好ましくは、表１２に示すＦａｂの結合特性を有する。
【００１２】
本発明はまた、ヒトまたはカニクイザル補体Ｃ３ｂタンパク質と特異的に結合し、表１に記載の抗体と交差競合する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。
【００１３】
本明細書に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントは、モノクローナル抗体、ヒトもしくはヒト化抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆｖフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントまたはＳｃＦｖフラグメント、および／またはＩｇＧアイソタイプであってよい。
【００１４】
本発明の抗体は、各ヒトＶＨまたはＶＬ生殖系列配列からの抗体フレームワークにアミノ酸が置換されているフレームワークを含んでいてよい。
【００１５】
一つの局面において、本発明の抗体は、Ｃ３との結合親和性よりも少なくとも1000倍大きい親和性でＣ３ｂと結合する。
【００１６】
本発明は表１の抗体9556の重鎖および軽鎖配列を有する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。本発明は表１の抗体9611の重鎖および軽鎖配列を有する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。本発明は表１の抗体9612の重鎖および軽鎖配列を有する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。本発明はまた、表１の抗体9609の重鎖および軽鎖配列を有する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。本発明は表１の抗体9610の重鎖および軽鎖配列を有する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。本発明はさらに、表１の抗体9674の重鎖および軽鎖配列を有する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。本発明は表１の抗体9675の重鎖および軽鎖配列を有する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。本発明は表１の抗体9124の重鎖および軽鎖配列を有する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。本発明はまた、表１の抗体9397の重鎖および軽鎖配列を有する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。本発明はまた、表１の抗体9398の重鎖および軽鎖配列を有する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。本発明はさらに、表１の抗体9136の重鎖および軽鎖配列を有する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。本発明はまた、表１の抗体9141の重鎖および軽鎖配列を有する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。本発明はさらに、表１の抗体9373の重鎖および軽鎖配列を有する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。本発明はまた、表１の抗体9423の重鎖および軽鎖配列を有する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。
【００１７】
本発明は表１の抗体9556の重鎖および軽鎖配列を有する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。本発明は表１の抗体9611の重鎖および軽鎖配列を有する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。本発明は表１の抗体9612の重鎖および軽鎖配列を有する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。本発明はまた、表１の抗体9609の重鎖および軽鎖配列を有する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。本発明は表１の抗体9610の重鎖および軽鎖配列を有する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。本発明はさらに、表１の抗体9674の重鎖および軽鎖配列を有する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。本発明は表１の抗体9675の重鎖および軽鎖配列を有する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。本発明は表１の抗体9124の重鎖および軽鎖配列を有する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。本発明はまた、表１の抗体9397の重鎖および軽鎖配列を有する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。本発明はまた、表１の抗体9398の重鎖および軽鎖配列を有する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。本発明はさらに、表１の抗体9136の重鎖および軽鎖配列を有する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。本発明はまた、表１の抗体9141の重鎖および軽鎖配列を有する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。本発明はさらに、表１の抗体9373の重鎖および軽鎖配列を有する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。本発明はまた、表１の抗体9423の重鎖および軽鎖配列を有する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。
【００１８】
本発明はまた、配列番号１、１５、２９、４３、５７、７１、８５、９９、１１３、１２７、１４１、１５５、１６９および１８３からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ１；配列番号２、１６、３０、４４、５８、７２、８６、１００、１１４、１２８、１４２、１５６、１７０および１８４からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ２；ならびに配列番号３、１７、３１、４５、５９、７３、８７、１０１、１１５、１２９、１４３、１５７、１７１および１８５からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ３を含み、補体タンパク質Ｃ３ｂと結合する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。さらなる局面において、本単離された抗体またはその抗原結合フラグメントはさらに、配列番号４、１８、３２、４６、６０、７４、８８、１０２、１１６、１３０、１４４、１５８、１７２および１８６からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号５、１９、３３、４７、６１、７５、８９、１０３、１１７、１３１、１４５、１５９、１７３および１８７からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ２；ならびに配列番号６、２０、３４、４８、６２、７６、９０、１０４、１１８、１３２、１４６、１６０、１７４および１８８からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【００１９】
本発明はまた、配列番号４、１８、３２、４６、６０、７４、８８、１０２、１１６、１３０、１４４、１５８、１７２および１８６からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号５、１９、３３、４７、６１、７５、８９、１０３、１１７、１３１、１４５、１５９、１７３および１８７からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ２；ならびに配列番号６、２０、３４、４８、６２、７６、９０、１０４、１１８、１３２、１４６、１６０、１７４および１８８からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ３を含み、補体タンパク質Ｃ３ｂと結合する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。
【００２０】
本発明はまた、配列番号７、２１、３５、４９、６３、７７、９１、１０５、１１９、１３３、１４７、１６１、１７５および１８９からなる群から選択される重鎖可変ドメイン配列を含み、さらに配列番号８、２２、３６、５０、６４、７８、９２、１０６、１２０、１３４、１４８、１６２、１７６および１９０からなる群から選択される軽鎖可変ドメイン配列を含み、補体タンパク質Ｃ３ｂと結合する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。
【００２１】
本発明はまた、配列番号８、２２、３６、５０、６４、７８、９２、１０６、１２０、１３４、１４８、１６２、１７６および１９０からなる群から選択される軽鎖可変ドメイン配列を含み、補体タンパク質Ｃ３ｂと結合する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。
【００２２】
本発明はまた、配列番号７、２１、３５、４９、６３、７７、９１、１０５、１１９、１３３、１４７、１６１、１７５および１８９からなる群から選択される配列と少なくとも９５％配列同一性を有する重鎖可変ドメインを含み、Ｃ３ｂと結合する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。一つの局面において、該単離された抗体またはその抗原結合フラグメントはまた、配列番号８、２２、３６、５０、６４、７８、９２、１０６、１２０、１３４、１４８、１６２、１７６および１９０からなる群から選択される配列と少なくとも９５％配列同一性を有する軽鎖可変ドメインを含む。
【００２３】
本発明はまた、配列番号８、２２、３６、５０、６４、７８、９２、１０６、１２０、１３４、１４８、１６２、１７６および１９０からなる群から選択される配列と少なくとも９５％配列同一性を有する軽鎖可変ドメインを含み、Ｃ３ｂと結合する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。
【００２４】
本発明はさらに、配列番号９、２３、３７、５１、６５、７９、９３、１０７、１２１、１３５、１４９、１６３、１７７および１９１からなる群から選択される配列と少なくとも９５％配列同一性を有する重鎖を含み、Ｃ３ｂと結合する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。一つの局面において、該単離された抗体またはその抗原結合フラグメントはまた、配列番号１０、２４、３８、５２、６６、８０、９４、１０８、１２２、１３６、１５０、１６４、１７８および１９２からなる群から選択される配列と少なくとも９５％配列同一性を有する軽鎖を含む。
【００２５】
本発明はさらに、配列番号１０、２４、３８、５２、６６、８０、９４、１０８、１２２、１３６、１５０、１６４、１７８および１９２からなる群から選択される配列と少なくとも９５％配列同一性を有する軽鎖を含み、Ｃ３ｂと結合する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。
【００２６】
本発明はまた、本明細書に記載の抗体組成物および薬学的に許容される担体を含んでなる医薬組成物を含む。とりわけ、本発明は、表１の抗体またはその抗原結合フラグメント、例えば抗体9556、9611、9612、9609、9610、9674、9675、9124、9397、9398、9136、9141、9373または9423を含んでなる医薬組成物を含む。本発明はまた、表１の抗体またはその抗原結合フラグメントの２種以上の組合せを含んでなる医薬組成物を含む。
【００２７】
本発明はまた、配列番号７、２１、３５、４９、６３、７７、９１、１０５、１１９、１３３、１４７、１６１、１７５および１８９からなる群から選択される配列と少なくとも９５％配列同一性を有する重鎖可変ドメインを含むポリペプチドをコードする配列を含んでなる単離された核酸を含む。
【００２８】
本発明はまた、配列番号８、２２、３６、５０、６４、７８、９２、１０６、１２０、１３４、１４８、１６２、１７６および１９０からなる群から選択される配列と少なくとも９５％配列同一性を有する軽鎖可変ドメインを含むポリペプチドをコードする配列を含んでなる単離された核酸を含む。
【００２９】
一つの局面において、本発明はまた、本明細書に記載の核酸分子の１つ以上を含んでなるベクターを含む。
【００３０】
本発明はまた、上記抗体の重鎖をコードする組換えＤＮＡ配列および上記抗体の軽鎖をコードする第二の組換えＤＮＡ配列を含む単離された宿主細胞であって、前記ＤＮＡ配列がプロモーターと作動可能に連結しており、宿主細胞内で発現可能である、宿主細胞を含む。抗体はヒトモノクローナル抗体であってもよいと理解される。また、宿主細胞は非ヒト哺乳類細胞であると理解される。
【００３１】
本発明はさらに、加齢性黄斑変性を処置する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の本明細書に記載の抗体またはそのフラグメントを含む組成物を投与することを含む方法に関する。対象はヒトであると理解される。
【００３２】
本発明はまた、対象の副補体経路を阻害する方法であって、それを必要とする対象に有効量の本明細書に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む組成物を投与することを含む方法を提供する。対象はヒトであると理解される。
【００３３】
本発明はまた、Ｂ因子、Ｐ因子またはＨ因子とＣ３ｂの結合を阻害する方法であって、本明細書に記載の抗Ｃ３ｂ抗体またはそのフラグメントとＣ３ｂを接触させることを含む方法を提供する。
【００３４】
本発明はまた、Ｃ３コンバターゼ、Ｃ４コンバターゼおよびＣ３ｂ−Ｃ３ｂ二量体形成を阻害する方法であって、抗Ｃ３ｂ抗体またはそのフラグメントとＣ３ｂを接触させることを含む方法を提供する。
【００３５】
本発明はまた、配列番号１、２、３、４、５、６、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２９、３０、３１、３２、３３、３４、４３、４４、４５、４６、４７、４８、５７、５８、５９、６０、６１、６２、７１、７２、７３、７４、７５、７６、８５、８６、８７、８８、８９および９０からなる群から選択される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％および少なくとも９５％配列同一性を有する少なくとも１個の相補性決定領域（ＣＤＲ）配列を含み、補体タンパク質Ｃ３ｂと結合する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。
【００３６】
本発明はまた、配列番号１、２、３、１５、１６、１７、２９、３０、３１、４３、４４、４５、５７、５８、５９、７１、７２、７３、８５、８６および８７からなる群から選択少なくとも１つの重鎖ＣＤＲ配列を含み、Ｃ３ｂと結合する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。
【００３７】
本発明はまた、配列番号４、５、６、１８、１９、２０、３２、３３、３４、４６、４７、４８、６０、６１、６２、７４、７５、７６、８８、８９および９０からなる群から選択されるすくなくとも１つの軽鎖ＣＤＲ配列を含み、Ｃ３ｂと結合する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。
【００３８】
本発明はまた、配列番号１、１５、２９、４３、５７、７１および８５からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ１；配列番号２、１６、３０、４４、５８、７２および８６からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ２；ならびに配列番号３、１７、３１、４５、５９、７３および８７からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ３を含み、補体タンパク質Ｃ３ｂと結合する、単離された抗原結合ポリペプチドを含む。
【００３９】
本発明はさらに、配列番号４、１８、３２、４６、６０、７４および８８からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号５、１９、３３、４７、６１、７５および８９からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ２；ならびに配列番号６、２０、３４、４８、６２、７６および９０からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ３を含み、補体タンパク質Ｃ３ｂと結合する、抗原結合ポリペプチドを含む。
【００４０】
上記重鎖ＣＤＲ配列を含む抗原結合ポリペプチドに加えて、該抗原結合ポリペプチドはまた、配列番号４、１８、３２、４６、６０、７４および８８からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号５、１９、３３、４７、６１、７５および８９からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ２；ならびに配列番号６、２０、３４、４８、６２、７６および９０からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ３を含んでいてもよい。
【００４１】
本明細書に記載の抗原結合ポリペプチドは、好ましくは100 pM以下、好ましくは10 pM以下、好ましくは2 pM以下のＫＤでＣ３ｂと結合する。さらに、好ましくは、本抗原結合ポリペプチドは、ヒトおよびカニクイザルＣ３ｂの両方と結合する。
【００４２】
本発明はまた、Ｃ３ｂを調節する方法であって、それを必要とする対象に有効量の本明細書に記載の抗体、その抗原結合フラグメントまたは抗原結合ポリペプチドを投与することを含む方法を含む。
【００４３】
上記抗体またはその抗原結合フラグメントのいずれも、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであってよい。
【００４４】
定義
異なることが定義されていない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野における当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【００４５】
用語「抗体」は、本明細書において使用するとき、完全な抗体およびいずれかの抗原結合フラグメント（すなわち「抗原結合部分」）またはその一本鎖を含む。天然の「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互に結合した２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を少なくとも含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨと略す）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬと略す）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は１つのドメインＣＬを含む。ＶＨおよびＶＬ領域はさらに、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域と、当該領域を区分するより保存的なフレームワークと称される領域とに再分割できる。各ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなり、これらはアミノ末端からカルボキシ末端に次の順番：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４に並ぶ。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、宿主組織または因子、例えば免疫系の多様な細胞（例えばエフェクター細胞）および古典経路補体系の第一成分（Ｃｌｑ）と、免疫グロブリンの結合を仲介できる。
【００４６】
用語抗体の「抗原結合部分」は、本明細書において使用するとき、所定の抗原（例えばＣ３ｂ）と特異的に結合する能力を保持している、インタクトな抗体の１つ以上のフラグメントを意味する。抗体の抗原結合機能は、インタクトな抗体のフラグメントによって実施されうる。用語抗体の「抗原結合部分」に含まれる結合フラグメントの例は、Ｆａｂフラグメント、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１からなる一価フラグメント；Ｆ（ａｂ）２フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィド結合によって結合した２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント；ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；抗体の一本のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；ＶＨドメインまたはＶＬドメインからなるシングルドメイン抗体抗体（ｄＡｂ）フラグメント（Ward et al., 1989 Nature 341:544-546）；ならびに単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【００４７】
さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメインであるＶＬおよびＶＨは、別個の遺伝子によってコードされるが、組換え法を用いて、ＶＬおよびＶＨ領域が対になって一価分子を形成する１本のタンパク質鎖として作成可能な人工ペプチドリンカーによって、それらを一体としてもよい（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている。例えばBird et al., 1988 Science 242:423-426;およびHuston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883参照）。かかる一本鎖抗体は、抗体の１つ以上の「抗原結合部分」を含む。これらの抗体フラグメントは当業者に既知の常套の技術を用いて得られ、該フラグメントは、インタクトな抗体と同様に、有用性についてスクリーニングされる。
【００４８】
抗原結合部分はシングルドメイン抗体、マキシボディー、ミニボディー、イントラボディー、ディアボディー、トリアボディー、テトラボディー、ｖ−ＮＡＲおよびｂｉｓ−ｓｃＦｖに組み込んでもよい（例えば、Hollinger and Hudson, 2005, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136参照）。抗体の抗原結合部分は、フィブロネクチンタイプIII（Ｆｎ３）のようなポリペプチドに基づくスキャフォールドに移植してもよい（フィブロネクチンポリペプチドモノボディーについて開示する米国特許6,703,199参照）。
【００４９】
補完的軽鎖ポリペプチドと一体となって抗原結合領域の対を形成する、タンデムＦｖセグメントの対（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む一本鎖分子に、抗原結合部分を組み込んでもよい（Zapata et al., 1995 Protein Eng. 8(10):1057-1062; および米国特許5,641,870）。
【００５０】
本明細書において使用するとき、用語「親和性」は、１つの抗原部位での抗体と抗原間の相互作用の強度を意味する。各抗原部位内で、抗体「アーム」の可変領域が弱い非共有結合力を介して、抗原と多数の部位で相互作用し；相互作用が多くなると、親和性が強くなる。
【００５１】
本明細書において使用するとき、用語「アビディティー」は、抗体−抗原複合体の全体的な安定性または強度の情報的尺度を意味する。それは３つの主な要因：抗体エピトープ親和性；抗原および抗体両方の結合価；および相互作用部分の構造配列によって制御される。究極的にはこれらの要因は抗体の特異性、すなわち特定の抗体が正確な抗原エピトープと結合する可能性を定義する。
【００５２】
用語「アミノ酸」は、天然アミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣物を意味する。天然アミノ酸は遺伝子コードによってコードされるもの、ならびに後に修飾されるそれらのアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γカルボキシグルタミン酸およびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸アナログは、天然アミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち水素、カルボキシル基、アミノ基およびＲ基と結合したα炭素を有する化合物、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを意味する。かかるアナログは、修飾されたＲ基（例えばノルロイシン）または修飾されたペプチド主鎖を有するが、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を保持している。アミノ酸模倣物は、アミノ酸の一般化学構造とは異なる構造を有するが、天然アミノ酸と同様に機能する化合物を意味する。
【００５３】
用語「結合特異性」は、本明細書において使用するとき、１つの抗原決定基のみと反応する、個々の抗体結合部位の能力を意味する。抗体結合部位は当該分子のＦａｂ部分に位置しており、重鎖および軽鎖の超可変領域から構成される。抗体の結合親和性は、１つの抗原決定基と抗体上の１つの結合部位の間の反応の強さである。抗原決定基と抗体の結合部位の間で作用する結合力と反発力の合計である。
【００５４】
２つの物質間の特異的結合は、少なくとも1 x 107 M-1、108 M-1、109 M-1、1010 M-1、1011 M-1、1012 M-1、1013 M-1の平衡定数（ＫＡ）を有する結合を意味する。抗体（例えばＣ３ｂ結合抗体）との「特異的（または選択的）結合」なる用語は、タンパク質および他の生物学的分子の異種集団中における同種抗原（例えばヒトＣ３ｂまたはカニクイザルＣ３ｂ）の存在の決定要因である結合反応を意味する。上記平衡定数に加えて、本発明のＣ３ｂ結合抗体はまた、典型的には、約1 x 10-2 s-1、1 x 10-3 s-1、1 x 10-4 s-1、1 x 10-4 s-1またはそれ以下の解離定数（Ｋｄ）を有し、非特異的抗原（例えばＣ３）との結合親和性よりも少なくとも10倍、好ましくは100倍、または1000倍またはそれ以上の親和性でＣ３ｂと結合する。用語「抗原を認識する抗体」および「抗原に特異的な抗体」は、本明細書において、用語「抗原と特異的に結合する抗体」と相互に交換可能なように使用される。
【００５５】
本明細書において使用するとき「新エピトープ」または-「新抗原」は、相互に交換可能なように使用され、Ｃ３のタンパク質溶解切断後にＣ３ｂ上に存在するタンパク質の抗原性部分である。これらの新エピトープは、切断されていないＣ３には接近できない。
【００５６】
用語「黄斑変性に関連した状態または障害」は、例えば網膜黄斑の細胞の増殖低下、網膜黄斑細胞（例えばＲＰＥ細胞）の増加した死亡もしくは再配列、正常な生物学的機能の喪失またはこれらの事象の組合せの結果として、網膜黄斑が変性しあるい機能不全となる多数の状態のいずれかを意味する。黄斑変性は正常な網膜黄斑の細胞および／または細胞外マトリックスの組織構造の完全性喪失、および／または網膜黄斑細胞の機能喪失をもたらす。黄斑変性関連障害の例は、ＡＭＤ、ノースカロライナ黄斑ジストロフィー、ソースビー眼底変性症、シュタルガルト病、パターンジストロフィー、ベスト病、ドミナントドルーゼン（dominant drusen）およびマラチアレベンティニーズ（Malattia leventinese）（ラジアルドルーゼン）を含む。該用語はまた、網膜黄斑の機能不全および／または変性の前または後に生じる黄斑外の変化も含む。したがって、用語「黄斑変性関連障害」はまた、網膜黄斑の完全性または機能を変化しあるいは損傷を与えるあらゆる状態（例えばＲＰＥまたはブルッフ膜への損傷）を広範に含む。例えば、該用語は、網膜剥離、脈絡網膜変性、網膜変性、視細胞変性、ＲＰＥ変性、ムコ多糖症、杆体錐体ジストロフィー、錐体杆体ジストロフィーおよび錐体変性を含む。
【００５７】
用語「補体成分」、「補体タンパク質」または「補体成分タンパク質」は、補体系の活性化に関与する分子を意味する。古典経路成分は、例えばＣ１ｑ、Ｃ１ｒ、Ｃ１ｓ、Ｃ４、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９およびＣ５ｂ−９複合体（膜侵襲複合体：ＭＡＣ）を含む。副経路成分は、例えば、Ｂ因子、Ｄ因子、プロパジン、ＨおよびＩを含む。
【００５８】
用語「調節」または「調節する」は、本明細書において相互に交換可能なように使用され、活性または生物学的プロセス（例えば補体プロセス）のアップレギュレーション（すなわち活性化または刺激（例えば刺激または増強による））およびダウンレギュレーション（すなわち阻害または抑制（例えば拮抗、低下または阻害による））の両方を意味する。「調節する」とは、プロセスのアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションの両方を記載する。ある刺激によってアップレギュレートされるプロセスは、刺激物質に対するアンタゴニストによって阻害されうる。逆に、ある修飾剤によってダウンレギュレートされるプロセスは、修飾剤に対するアゴニストによって阻害されうる。
【００５９】
用語「補体系関連分子」、「補体系分子」および「補体系関連タンパク質」は、相互に交換可能なように使用され、補体活性化および活性化した補体系によって仲介、応答または惹起される下流の細胞活性に関与する多様な分子を意味する。それらには補体系のイニシエーター（すなわち補体系の活性化を直接または間接に引き起こす分子）、補体活性化中に生産されまたは関与する分子（例えば補体タンパク質／酵素、例えばＣ３、Ｃ５、Ｃ５ｂ−９、Ｂ因子、Ｄ因子、ＭＡＳＰ−１およびＭＡＳＰ−２）、補体レセプターまたは阻害剤（例えばクラスタリン、ビトロネクチン、ＣＲ１またはＣＤ５９）および活性化された補体系によって制御または惹起される分子（例えば膜侵襲複合体阻害因子、ＭＡＣＩＦ；例えばSugita et al., J Biochem, 106:589-92, 1989参照）を含む。したがって、本明細書に記載の補体タンパク質に加えて、補体系関連分子はまた、例えばＣ３／Ｃ５コンバターゼレギュレーター（ＲＣＡ）、例えば補体レセプタータイプ１（ＣＲ１またはＣＤ３５とも称される）、補体レセプタータイプ２（ＣＲ２またはＣＤ２１とも称される）、補体調節タンパク質（ＭＣＰまたはＣＤ４６）およびＣ４ｂＢＰ；ＭＡＣレギュレーター、例えばビトロネクチン、クラスタリン（「ＳＰ４０，４０」とも称される）、ＣＲＰ、ＣＤ５９および同種制限因子（ＨＲＦ）；免疫グロブリン鎖、例えばＩｇκ、ＩｇλまたはＩｇγ；Ｃ１阻害剤；および他のタンパク質、例えばＣＲ３、ＣＲ４（ＣＤ１１ ｂ／１８）およびＤＡＦ（ＣＤ５５）を含む。
【００６０】
用語「補体系によって制御される細胞活性」は、Ｃ５ｂ−９侵襲複合体、血管透過性変化、平滑筋細胞の収縮および遊走、Ｔ細胞増殖、免疫粘着、樹状細胞、単球、顆粒球および血小板の凝集、好中球（ＰＭＮ）およびマクロファージの食作用、遊走および活性化によってもたらされる、細胞損傷を含む。
【００６１】
さらに、補体系の活性化は、補体系内の副産物によって寄与される炎症促進性応答増加をもたらす。補体系の活性化に関連した障害は、腎炎、喘息、再灌流障害、血液透析、リウマチ様関節炎、全身性狼瘡、乾癬、多発性硬化症、移植、アルツハイマー病、ａＨＵＳ、ＭＰＧＮ  ＩＩまたは他の補体仲介疾患のいずれかを含む。黄斑変性に関連した障害は、ＡＭＤ、ノースカロライナ黄斑ジストロフィー、ソースビー眼底変性症、シュタルガルト病、パターンジストロフィー、ベスト病、ドミナントドルーゼン（dominant drusen）およびマラチアレベンティニーズ（Malattia leventinese）（ラジアルドルーゼン）、網膜黄斑の機能不全および／または変性の前もしくは後に生じる網膜黄斑外変化、網膜剥離、脈絡網膜変性、網膜変性、視細胞変性、ＲＰＥ変性、ムコ多糖症、杆体錐体ジストロフィー、錐体杆体ジストロフィーおよび錐体変性を含む。
【００６２】
本明細書において使用するとき、用語「対象」はヒトまたは非ヒト動物を含む。
【００６３】
用語「非ヒト動物」は、全ての非ヒト脊椎動物、例えば哺乳類および非哺乳類動物、例えば非ヒト霊長類、げっ歯類、ウサギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、鳥類、両生類、爬虫類などを含む。
【００６４】
用語「キメラ抗体」は、(a)抗原結合部位（可変領域）が異なるまたは別のクラス、エフェクター機能および／または種の定常領域、あるいはキメラ抗体に新たな特性を与える完全に異なる分子、例えば酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬物等と結合されるように、定常領域またはその一部が変化、置換または交換されているか、あるいは(b)可変領域またはその一部が、異なるまたは変化した抗原特異性を有する可変領域で変化、置換または交換されている、抗体分子である。例えば、マウス抗体は、その定常領域をヒト免疫グロブリン由来の定常領域で置換して修飾してよい。ヒト定常領域での置換のため、キメラ抗体は、抗原を認識する特異性を保持しうるが、元のマウス抗体と比較して低下したヒト抗原性を有する。
【００６５】
用語「補体Ｃ３ｂタンパク質」または「Ｃ３ｂ」は、相互に交換可能なように使用され、異なる種のＣ３ｂタンパク質を意味する。例えばヒトＣ３ｂは配列番号１９７（Ａ鎖）および１９８（Ｂ鎖）に示す配列を有する。ヒトＣ３ｂはComplement Technology Inc. (Tyler, TX)から得られる。カニクイザルＣ３ｂは下記実施例に説明のとおりに製造できる。
【００６６】
用語「保存的に修飾された変異体」は、アミノ酸および核酸配列両方に適用する。具体的な核酸配列について、保存的に修飾された変異体は、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸またはアミノ酸配列をコードしないが本質的に同一の配列を意味する。遺伝子コードの縮重のため、多数の機能的に同一の核酸がいずれかの所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵは全てアミノ酸アラニンをコードする。したがって、コドンによってアラニンが特定されている全ての位置で、当該コドンは、コードされるポリペプチドを変化することなく記載の対応するコドンのいずれかに変化させてよい。かかる核酸変動は、「サイレント変動」であり、保存的に修飾された変異体の一種である。あるポリペプチドをコードする本明細書の全ての核酸配列は、当該核酸の全ての可能性のあるサイレント変動も記載する。当業者は、核酸における各コドン（メチオニンについての通常唯一のコドンであるＡＵＧおよびトリプトファンについての通常唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を修飾して、機能的に同一の分子を得ることができると理解する。したがって、あるポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変動は、記載の各配列において暗示される。
【００６７】
ポリペプチド配列について、「保存的に修飾された変異体」は、あるアミノ酸が化学的に類似するアミノ酸で置換される、ポリペプチドへの個々の置換、欠失および付加を含む。機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的置換表は、当該技術分野において周知である。かかる保存的に修飾された変異体は、多形変異体、種間ホモログおよび本発明のアレルに加えて、そしてそれらを除外しない。以下の８つの群は、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む：1) アラニン (A)、グリシン (G)； 2) アスパラギン酸 (D)、グルタミン酸 (E)； 3) アスパラギン (N)、グルタミン (Q)； 4) アルギニン (R)、リシン (K)； 5) イソロイシン (I)、ロイシン (L)、メチオニン (M)、バリン (V)； 6) フェニルアラニン (F)、チロシン (Y)、トリプトファン (W)； 7) セリン (S)、スレオニン (T)；および8) システイン (C)、メチオニン (M) （例えばCreighton, Proteins (1984)参照）。いくつかの態様において、用語「保存的配列修飾」は、当該アミノ酸配列を含む抗体の結合特性に顕著に影響しまたは変化させないアミノ酸修飾を意味するものとして使用する。
【００６８】
用語「交差阻止する」、「交差阻止された」および「交差阻止」は、本明細書において相互に交換可能なように使用され、標準的な競合結合アッセイにおいて他の抗体または結合剤とＣ３の結合を妨げる、抗体または他の結合剤の能力を意味する。
【００６９】
他の抗体または結合分子とＣ３の結合を妨げる抗体または他の結合剤の能力または程度、したがって本発明に従う交差阻止といえるかどうかは、標準的な競合結合アッセイを用いて決定できる。一つの好適なアッセイは、表面プラズモン共鳴技術を用いて相互作用の程度を測定可能なBiacore技術（例えばBIAcore 3000 装置 (Biacore, Uppsala, Sweden)の使用を含む）を含む。交差阻止を測定する別のアッセイは、ＥＬＩＳＡベースのアプローチを用いる。
【００７０】
用語「エピトープ」は、ある抗体と特異的に結合することができるタンパク質決定基を意味する。エピトープは通常、アミノ酸または糖側鎖のような分子の化学的に活性な表面基からなり、通常、特異的な三次元構造特性および特異的な電荷特性を有する。コンホメーション的および非コンホメーション的エピトープは、変性溶媒の存在下で前者との結合は失われるが、後者との結合は失われないことで区別される。
【００７１】
本明細書において使用するとき、ＩｇＧ抗体またはそのフラグメント（例えばＦａｂフラグメント）についての用語「高親和性」は、標的抗原について、10-8 M以下、10-9 M以下、10-10 M以下、10-11 M以下、10-12 M以下または10-13 M以下のＫＤを有する抗体を意味する。しかし、「高親和性」結合は、他の抗体アイソタイプについて変化しうる。例えば、ＩｇＭアイソタイプについての「高親和性」結合は、10-7 M以下または10-8 M以下のＫＤを有する抗体を意味する。一つの局面において、本明細書に記載の抗Ｃ３ｂ抗体またはその抗原結合フラグメントは、1nM以下、好ましくは200 pM以下、より好ましくは100 pM以下、さらに好ましくは10 pM以下のＫＤを有する。
【００７２】
用語「ヒト抗体」は、本明細書において使用するとき、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域の両方がヒト起源の配列に由来する可変領域を有する抗体を含む。さらに、抗体が定常領域を含む場合、定常領域もまたかかるヒト配列、例えばヒト生殖系列配列またはヒト生殖系列配列の変異型に由来する。本発明のヒト抗体は、ヒト配列によってコードされないアミノ酸残基（例えばインビトロでのランダムもしくは部位特異的突然変異またはインビボでの体細胞変異によって導入された変異）を含んでいてもよい。
【００７３】
用語「ヒトモノクローナル抗体」は、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域の両方がヒト配列に由来する、単一の結合特異性を示す抗体を意味する。
一つの態様において、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合したヒト重鎖トランスジーンおよび軽鎖トランスジーンを含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、例えばトランスジェニックマウスから得られたＢ細胞を含むハイブリドーマによって、作成される。
【００７４】
「ヒト化」抗体は、ヒトでの免疫原生が低いが非ヒト抗体の反応性を保持している、抗体である。これは例えば、非ヒトＣＤＲ領域を保持し、抗体の残りの部分（すなわち定常領域および可変領域のフレームワーク部分）をヒト対応物で置換して得られる。例えばMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855, 1984; Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92, 1988; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988; Padlan, Molec. Immun., 28:489-498, 1991; および Padlan, Molec. Immun., 31:169-217, 1994参照。ヒト改変技術の他の例は、US 5,766,886に記載のXoma技術を含むが、これらに限定されない。
【００７５】
本明細書において使用するとき、２個以上の核酸またはポリペプチド配列の関係における用語「同一性」または「同一性」％は、同一である２個以上の配列または部分配列を意味する。２個の配列が、比較窓にまたは指定領域にわたって、下記配列比較アルゴリズムの１つまたはマニュアルアラインメントおよび目視検査によって測定したとき、特定割合（すなわち特定の領域または特定しない場合全配列わたって、６０％同一性、所望により６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％同一性）の同一であるアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する場合、２個の配列が「実質的に同一」である。所望により、同一性は、少なくとも約５０ヌクレオチド（または１０アミノ酸）長、またはより１００〜５００または１０００以上ヌクレオチド（または２０、５０、２００またはそれ以上アミノ酸）長の領域にわたって存在する。
【００７６】
配列比較について、典型的には、一方の配列は試験配列を比較するための参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを用いるとき、試験および参照配列をコンピューターに入力し、必要であれば部分配列コーディネートを指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。好ましくは、デフォルトプログラムパラメーターを使用し、あるいは別のパラメーターを指定してもよい。次いで配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメーターに基づいて、参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。
【００７７】
「比較窓」は、本明細書において使用するとき、２０〜６００、通常約５０〜約２００、より通常約１００〜約１５０からなる群から選択される連続位置の数のいずれか１つのセグメントについての記載を含み、この配列が、２つの配列が最適にアラインメントされた後に同数の連続位置の参照配列と比較されうる。比較のための配列のアラインメント方法は当該技術分野において周知である。比較のための最適な配列アラインメントは、例えば Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)のローカルホモロジーアルゴリズム、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)のホモロジーアラインメントアルゴリズム、Pearson & Lipman, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA  85:2444 (1988)の同様の方法のサーチ、これらのアルゴリズムのコンピューター化実行（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI におけるGAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTA)、またはマニュアルアラインメントおよび視覚検査（例えば、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (Ringbou ed., 2003)参照）によって実施しうる。
【００７８】
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するのに好適なアルゴリズムの２つの例は、BLASTおよびBLAST 2.0アルゴリズムであり、これらはAltschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977)および Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)にそれぞれ記載されている。BLAST分析を行うためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)から公に入手可能である。このアルゴリズムは、クェリー配列内の長さがWの短いワードを特定することによって高スコアをもつ配列対（HSP）をまず初めに同定することを必要とする。前記は、データベース配列中の同じ長さを持つワードとアラインメントを実施したとき、一致するかまたは何らかの正の値をもつ閾値スコアTの条件を満たす。Tは近傍ワードスコア閾値と称される（Altschul (1990)上掲）。これらの最初の近傍ワードヒットはそれらを含むより長いHSPを見つけるための検索開始のシードとして機能する。前記ワードヒットは、累積アラインメントスコアが増加する限り各配列の両方向に沿って伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列についてはパラメーターM（一致残基対のための褒賞スコア、常に＞0）を用いて計算される。アミノ酸配列の場合、スコアリングマトリックスを用いて累積スコアが計算される。各方向のワードヒットの伸長は以下の場合に停止する：累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Xだけ下降したとき；累積スコアが、1つまたは2つ以上の負のスコアを与える残基アラインメントの累積のために0またはそれ以下になったとき；またはどちらかの配列の末端に達したとき。BLASTアルゴリズムパラメーターW、TおよびXは前記アラインメントの感度および速度を決定する。BLASTNプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとして11のワード長、10の期待値（E）、M=5、N=-4および両鎖の比較を用いる。アミノ酸配列の場合、BLASTPプログラムは、3のワード長および10の期待値（E）、およびBLOSUM62スコアリングマトリックス（Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)）アラインメント（B）50、期待値（E）10、M=5、N=-4および両鎖の比較を用いる。
【００７９】
BLASTアルゴリズムはまた、２個の配列の間の類似性の統計的分析を行う（例えばKarlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA  90:5873-5787, 1993参照）。BLASTアルゴリズムによって提供される類似性の一つの尺度は、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間に偶然生じるマッチによる可能性の指標を提供する、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、試験核酸と参照核酸の比較での最小合計確率が約0.2未満、より好ましくは約0.01未満、最も好ましくは約0.001未満である場合、核酸は参照配列と類似すると考えられる。
【００８０】
２個のアミノ酸配列間の同一性％は、ALIGNプログラム(version 2.0)に組み込まれており、PAM120ウェイト残基テーブル、ギャップ長ペナルティ１２およびギャップペナルティ４を用いる、E. Meyers and W. Millerのアルゴリズム(Comput. Appl. Biosci., 4:11-17, 1988)を用いて決定できる。さらに、２個のアミノ酸配列間の同一性％は、GCGソフトウェアパッケージのGAPプログラム（http://www.gcg.comで入手可能）に組み込まれており、Blossom 62 マトリックス またはPAM250 マトリックスならびにギャップウェイト１６、１４、１２、１０、８、６または４および長さウェイト１、２、３、４、５または６を用いて、Needleman and Wunsch (J. Mol, Biol. 48:444-453, 1970)アルゴリズムを用いて決定できる。
【００８１】
上記配列同一性のパーセンテージ以外に、２個の核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であることの別の指標は、下記の通り、第一核酸によってコードされるポリペプチドが第二核酸によってコードされるポリペプチドに対する抗体と免疫学的に交差反応性であることである。したがって、ポリペプチドは典型的に、例えば２個のペプチドが保存的置換のみで異なっている場合、第二のポリペプチドと実質的に同一である。２個の核酸配列が実質的に同一であることの別の指標は、下記の通り、２個の分子またはそれらの相補体がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。２個の核酸配列が実質的に同一であることのさらに別の指標は、当該配列を増幅するために同じプライマーが使用できることである。
【００８２】
「単離された抗体」は、本明細書において使用するとき、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を意味する（例えば、Ｃ３ｂと特異的に結合する単離された抗体は、Ｃ３ｂ以外の抗原と特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかし、Ｃ３ｂと特異的に結合する単離された抗体は、他の抗原と交差反応性を有していてもよい。さらに、単離された抗体は、他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まないこともある。
【００８３】
本明細書において使用するとき、「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によって提供される抗体クラス（例えばＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、例えばＩｇＧ１またはＩｇＧ４)を意味する。アイソタイプはまた、修飾が行われてＦｃ機能が変化している、例えばエフェクター機能またはＦｃレセプターとの結合が向上または低下している場合、これらのクラスの一つの修飾型も含む。
【００８４】
用語「Ｋａｓｓｏｃ」または「Ｋａ」は、本明細書において使用するとき、特定の抗体−抗原相互作用の会合速度を意味し、用語「Ｋｄｉｓ」または「Ｋｄ」は、本明細書において使用するとき、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を意味する。用語「ＫＤ」は、本明細書において使用するとき、ＫｄとＫａの比（すなわちＫｄ／Ｋａ）から得られる解離定数を意味し、モル濃度(M)で示される。抗体のＫＤ値は、当該技術分野で十分に確立された方法を用いて決定できる。抗体のＫＤを決定する方法は、表面プラズモン共鳴を用いるか、あるいはBiacore（登録商標）システムのようなバイオセンサーを用いる。
【００８５】
用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、本明細書において使用するとき、単一分子組成物の抗体分子の組成物を意味する。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性および親和性を示す。
【００８６】
用語「核酸」は、本明細書において用語「ポリヌクレオチド」と交換可能なように使用され、一本鎖または二本鎖形態のいずれかのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらのポリマーを意味する。該用語は、既知のヌクレオチドアナログまたは修飾された主鎖残基もしくは結合を含む、合成、天然および非天然核酸を含み、これは参照核酸と同様の結合特性を有し、参照ヌクレオチドと同様に代謝される。かかるアナログの例は、ホスホロチオエート、ホスホラミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を含むがこれらに限定されない。
【００８７】
異なることが示されていない限り、具体的な核酸配列は、明示的に示されているその配列とともに、その保存的に修飾された変異体（例えば縮重コドン置換）および相補的配列を黙示的に包含する。特に、以下に詳述するように、縮重コドン置換は１個以上の選択した（または全ての）コドンの３番目の位置が混合基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を作成することによって得られる（Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081, 1991; Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608, 1985;およびRossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98, 1994）。
【００８８】
用語「作動可能に連結」は、２個以上のポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ）セグメント間の機能的関係を意味する。典型的には、転写される配列と転写制御配列の機能的関係を意味する。例えば、プロモーターまたはエンハンサー配列が、適切な宿主細胞または発現系内でコード配列の転写を刺激または調節する場合、それはコード配列と作動可能に連結されている。一般に、転写される配列と作動可能に連結しているプロモーター転写制御配列は、転写される配列と物理的に連続しおり、すなわちそれらはシス作動性である。しかし、いくつかの転写制御配列、例えばエンハンサーは、転写が亢進されるコード配列と物理的に連続しあるいは近位に存在する必要がない。
【００８９】
本明細書において使用するとき、用語「最適化された」は、産生細胞または生物、一般に真核細胞、例えばピチカの細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはヒト細胞における生産に好ましいコドンを用いてアミノ酸配列をコードするようにヌクレオチド配列が変化していることを意味する。最適化されたヌクレオチド配列を操作して、「親」配列とも知られている出発ヌクレオチド配列によって本来コードされるアミノ酸配列を完全にまたは可能な限り保持させる。本明細書において、最適化された配列は、哺乳類細胞において好ましいコドンを有するように操作されるが；他の真核細胞においてこれらの配列の最適化された発現も本明細書において想定される。最適化されたヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列は、最適化とも称される。
【００９０】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は相互に交換可能なものとして本明細書において使用され、アミノ酸残基のポリマーを意味する。該用語は、１個以上のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工化学的模倣物であるアミノ酸ポリマーならびに天然アミノ酸ポリマーおよび非天然アミノ酸ポリマーに適用される。異なることが示されていない限り、特定のポリペプチド配列はまた、その保存的に修飾された変異体も黙示的に含む。
【００９１】
用語「組換えヒト抗体」は、本明細書において使用するとき、組換え手段によって製造、発現、作成または単離されるあらゆるヒト抗体、例えばヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックもしくはトランスクロモソーマルである動物（例えばマウス）またはそれから作成したハイブリドーマから単離した抗体、ヒト抗体を発現するように形質転換された宿主細胞、例えばトランスフェクトーマから単離した抗体、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離した抗体、ならびにヒト免疫グロブリン遺伝子配列の全部または一部の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む他のいずれかの手段によって製造、発現、作成または単離される抗体を含む。かかる組換えヒト抗体は、フレームワークおよびＣＤＲ領域がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する。しかし、ある態様において、かかる組換えヒト抗体は、インビトロ突然変異誘発（またはヒトＩｇ配列についてトランスジェニックな動物を用いるとき、インビボでの体細胞変異）に付すことができ、したがって、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨおよびＶＬ配列に由来し、関連するが、インビボでのヒト抗体生殖系列レパートリー中に天然には存在し得ない配列である。
【００９２】
用語「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）は、組換え発現ベクターが導入される細胞を意味する。かかる用語は、特定の対象細胞のみならず、かかる細胞の後代を意味すると理解されるべきである。変異または環境の影響によりある修飾が継代において生じうるため、かかる後代は実際には親細胞と同一ではない可能性があるが、本明細書において使用する用語「宿主細胞」の範囲になおも含める。
【００９３】
用語「対象」はヒトおよび非ヒト動物を含む。非ヒト動物は、全ての脊椎動物、例えば哺乳類および非哺乳類動物、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などを含む。注意書きがないかぎり、用語「患者」または「対象」は、本明細書において相互に交換可能なように使用される。
【００９４】
用語「処置」は、疾患（例えばＡＭＤ）の症状、合併症もしくは生物学的兆候の発生の予防もしくは遅延、症状の改善または疾患、状態もしくは障害のさらなる発生の停止もしくは阻害のための、組成物または抗体の投与を含む。処置は予防的（疾患の発症の予防もしくは遅延、または臨床もしくは不顕性症状の徴候の予防のため）または疾患発症後の症状の治療的抑制もしくは改善であってよい。
【００９５】
用語「ベクター」は、それと結合している別のポリヌクレオチドを輸送することができるポリヌクレオチド分子を意味する。ベクターの一つのタイプは「プラスミド」であり、これはさらなるＤＮＡセグメントを連結可能な環状二本鎖ＤＮＡループを意味する。別のタイプのベクターはウイルスベクター、例えばアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶまたはＡＡＶ２）であり、ウイルスゲノムにさらなるＤＮＡセグメントを連結可能である。あるベクターはそれが導入される宿主細胞内で自己複製可能である（例えば細菌性複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞に導入したとき宿主細胞のゲノムに組み込まれて宿主ゲノムと共に複製されうる。さらに、あるベクターは、それが作動可能に連結しているゲノムの発現を指示することができる。かかるベクターは「組み換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技術で有用な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態である。プラスミドが最も一般的に使用されるベクターの形態であるから、本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は相互に交換可能なように使用しうる。しかし、本発明は、同等の機能を有するウイルスベクター（例えば複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）のような発現ベクターのかかる他の形態を含む。
【００９６】
本明細書において使用するとき、用語「Ｃ３ｂ活性」は、Ｃ３ｂの産生の下流にある副補体経路の活性を意味し、例えばＣ３コンバターゼの活性、Ｃ５コンバターゼの活性を含むがこれらに限定されない。Ｃ３ｂ活性は、溶血アッセイ、Ｃ３ａおよびＣ５ａの産生を測定するアッセイ、Ｃ３ｂ沈着アッセイならびに膜侵襲複合体（ＭＡＣ）沈着アッセイのような本明細書に記載の、これらに限定されないアッセイを用いて測定できる。本明細書において使用するとき、「Ｃ３ｂ活性の変化」または「Ｃ３ｂ活性の調節」は、本明細書に記載のアッセイの一つ以上によるＣ３ｂ活性の測定結果であって、Ｃ３ｂ活性が関連するコントロールと比較して少なくとも１０％上昇または低下していることを意味する。例えば、本発明の抗体またはフラグメントの非存在下でのＣ３ｂの活性と比較して少なくとも１０％本発明の抗体またはフラグメントの存在下でＣ３ｂの活性が上昇または低下している場合、本発明の抗体または抗原結合フラグメントはＣ３ｂ活性を調節していると言える。
【００９７】
本明細書において使用するとき、用語「cyno」または「カニクイザル」は、カニクイザル（Macaca fascicularis）を意味する。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】Ｃ３ｂ抗体がＣ３に対して少なくとも１０００倍高い選択性でＣ３ｂと結合することを示す。
【図２】１０％ヒトまたはカニクイザル血清における溶血を阻害する抗Ｃ３ｂ抗体の能力の例を示す。
【図３】Ｃ３の分解産物としてのＣ３ｂの産生を阻害するＣ３ｂ抗体の能力の例を示す。
【図４】ＭＡＣの沈着を阻害するＣ３ｂ抗体の能力を示す例示的データを示す。
【図５】Ｃ３ａおよびＣ５ａの産生を阻害することによってＣ３ｂ抗体が副経路駆動補体活性化を阻止することを示す。
【図６Ａ】tick-overコンバターゼ酵素活性の阻害を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【図６Ｂ】図６ＡのゲルにおけるＣ３ｂ産生阻害の定量を示す。
【図６Ｃ】抗Ｃ３ｂ抗体が予め形成されたＣ３コンバターゼ酵素活性を阻害することを示す。
【図７】抗Ｃ３ｂ抗体がインビトロＣ５コンバターゼ酵素活性を阻害することを示す。
【図８Ａ】Ｃ３ｂ抗体によるＣ３ｂとＢ因子の結合の阻害を示す。
【図８Ｂ】Ｃ３ｂ抗体によるＣ３ｂとＰ因子の結合の阻害を示す。
【図８Ｃ】Ｃ３ｂ抗体によるＣ３ｂとＨ因子の結合の阻害を示す。
【図８Ｄ】Ｃ３ｂ抗体によるＣ３ｂ−Ｃ３ｂ二量体形成の阻害を示す。
【図９】Ｃ３ｄに対する抗体交差反応性アッセイの結果を示す。
【図１０】Ｃ５に対する抗体交差反応性アッセイの結果を示す。
【図１１】theＣ３ｂ抗体がｉＣ３ｂまたはＣ３ｃと結合するかを決定するために実施した結合アッセイの結果を示す。
【図１２Ａ】図１２は種交差反応性試験の結果を示す。図１２Ａはラット交差反応性を示す。
【図１２Ｂ】ウサギ交差反応性を示す。
【図１２Ｃ】ブタ交差反応性を示す。
【図１２Ｄ】マウス交差反応性を示す。
【図１２Ｅ】モルモット交差反応性を示す。
【図１２Ｆ】イヌ交差反応性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００９９】
詳細な説明
本発明は、一部で、ヒトおよびカニクイザルＣ３ｂの両方に特異的に結合する抗体分子の発見に基づく。本発明は、完全なＩｇＧ形態の抗体（例えば抗体 9556、9611、9612、9609、9610、9674および9675参照）およびＦａｂフラグメント（例えば抗体 9124、9397、9398、9136、9141、9373および9423参照）のようなその抗原結合フラグメントの両方に関する。
【０１００】
したがって、本発明は、補体Ｃ３ｂタンパク質（例えばヒトＣ３ｂ、カニクイザルＣ３ｂ）と特異的に結合する抗体、医薬組成物、製造方法ならびにかかる抗体および組成物の使用方法を提供する。
【０１０１】
Ｃ３ｂ抗体
本発明は、Ｃ３ｂ（例えばヒトＣ３ｂ、カニクイザルＣ３ｂ）と特異的に結合する抗体を提供する。いくつかの態様において、本発明は、ヒトおよびカニクイザルＣ３ｂの両方に特異的に結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、実施例に記載のとおり単離された、ヒトモノクローム抗体を含むが、これに限定されない。
【０１０２】
本発明は、Ｃ３ｂタンパク質（例えばヒトおよび／またはカニクイザルＣ３ｂ）と特異的に結合する抗体であって、配列番号７、２１、３５、４９、６３、７７、９１、１０５、１１９、１３３、１４７、１６１、１７５および１８９のアミノ酸配列を有するＶＨドメインを含む抗体を提供する。本発明はまた、Ｃ３ｂタンパク質（例えばヒトおよび／またはカニクイザルＣ３ｂ）と特異的に結合する抗体であって、下記表１に列挙したＶＨ ＣＤＲのいずれか一つのアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲを含む抗体を提供する。特に、本発明は、Ｃ３ｂタンパク質（例えばヒトおよび／またはカニクイザルＣ３ｂ）と特異的に結合する抗体であって、下記表１に列挙したＶＨ ＣＤＲのいずれかのアミノ酸配列を有する１、２、３、４、５またはそれ以上のＶＨ ＣＤＲを含む（あるいはそれからなる）抗体を提供する。
【０１０３】
本発明は、Ｃ３ｂタンパク質（例えばヒトおよび／またはカニクイザルＣ３ｂ）と特異的に結合する抗体であって、配列番号８、２２、３６、５０、６４、７８、９２、１０６、１２０、１３４、１４８、１６２、１７６および１９０のアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含む抗体を提供する。本発明はまた、Ｃ３ｂタンパク質（例えばヒトおよび／またはカニクイザルＣ３ｂ）と特異的に結合する抗体であって、下記表１に列挙したＶＬ ＣＤＲのいずれか一つのアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲを含む抗体を提供する。特に、本発明は、Ｃ３ｂタンパク質（例えばヒトおよび／またはカニクイザルＣ３ｂ）と特異的に結合する抗体であって、下記表１に列挙したＶＬ ＣＤＲのいずれかのアミノ酸配列を有する１、２、３またはそれ以上のＶＬ ＣＤＲを含む（あるいはそれからなる）抗体を提供する。
【０１０４】
他の本発明の抗体は、ＣＤＲ領域において表１に記載の配列に示されているＣＤＲ領域と少なくとも６０、７０、８０、８５、９０または９５％同一性を有するが変異されているアミノ酸を含む。いくつかの態様において、表１に記載の配列に示されているＣＤＲ領域と比較した場合、ＣＤＲにおいて１、２、３、４または５アミノ酸以下が変異されている変異アミノ酸配列を含む。
【０１０５】
本発明はまた、Ｃ３ｂタンパク質（例えばヒトおよび／またはカニクイザルＣ３ｂ）のＶＨ、ＶＬ、全長重鎖および全長軽鎖と特異的に結合する抗体をコードする核酸配列も提供する。かかる核酸配列は、哺乳類細胞の発現について最適化されていてよい（例えば、表１は抗体9556、9611、9612、9609、9610、9674および9675、ならびにＦａｂフラグメント9124、9397、9398、9136、9141、9373および9423の重鎖および軽鎖について、最適化された核酸配列を示す）。
【０１０６】
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
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【表１−７】
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【表１−８】
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【表１−９】
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【表１−１０】
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【表１−１１】
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【表１−１２】
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【表１−１３】
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【表１−１４】
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【表１−１５】
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【表１−１６】
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【表１−１７】
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【表１−１８】
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【表１−１９】
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【表１−２０】
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【表１−２１】
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【表１−２２】
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【表１−２３】
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【表１−２４】
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【表１−２５】
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【０１０７】
他の本発明の抗体は、アミノ酸またはアミノ酸をコードする核酸が変異されているが、表１に記載の配列と少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０または９５％同一性を有するものを含む。いくつかの態様において、表１に記載の配列に示されている可変領域と比較した場合、可変領域において１、２、３、４または５以下のアミノ酸が変異されているが、実質的に同一の治療活性を保持している変異アミノ酸配列を含む。
【０１０８】
これらの抗体の各々はＣ３ｂと結合できるので、ＶＨ、ＶＬ、全長軽鎖および全長重鎖配列（アミノ酸配列およびアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）を「組み合わせて適合させ」て、他のＣ３ｂ結合性本発明の抗体を作成できる。かかる「組み合わせて適合させ」たＣ３ｂ結合抗体は、当該技術分野で既知の結合アッセイ（例えばＥＬＩＳＡおよび実施例に記載の他のアッセイ）を用いて試験してもよい。これらの鎖が組み合わせて適合されている場合、特定のＶＨ／ＶＬの対由来のＶＨ配列は、構造的に類似したＶＨ配列で置換されるべきである。同様に、特定の全長重鎖／全長軽鎖の対由来の全長重鎖配列は、構造的に類似した全長重鎖配列で置換されるべきである。同様に、特定のＶＨ／ＶＬの対由来のＶＬ配列は、構造的に類似したＶＬ配列で置換されるべきである。同様に、特定の全長重鎖／全長軽鎖の対由来の全長軽鎖配列は、構造的に類似した全長軽鎖配列で置換されるべきである。したがって、一つの局面において、本発明は、配列番号７、２１、３５、４９、６３、７７、９１、１０５、１１９、１３３、１４７、１６１、１７５および１８９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインならびに配列番号８、２２、３６、５０、６４、７８、９２、１０６、１２０、１３４、１４８、１６２、１７６および１９０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを有し、Ｃ３ｂ（例えばヒトおよび／またはカニクイザルＣ３ｂ）と特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合領域を提供する。
【０１０９】
別の局面において、本発明は、(i)配列番号９、２３、３７、５１、６５、７９、９３、１０７、１２１、１３５、１４９、１６３、１７７および１９１からなる群から選択される、哺乳類細胞における発現に最適化されたアミノ酸配列を含む全長重鎖ならびに配列番号１０、２４、３８、５２、６６、８０、９４、１０８、１２２、１３６、１５０、１６４、１７８および１９２からなる群から選択される、哺乳類細胞における発現に最適化されたアミノ酸配列を含む全長軽鎖を有する、単離されたモノクローナル抗体；または(ii)その抗原結合部分を含む機能的タンパク質を提供する。
【０１１０】
別の局面において、本発明は、表１に記載の重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３またはそれらの組合せを含むＣ３ｂ結合抗体を提供する。本抗体のＶＨ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号１、１５、２９、４３、５７、７１、８５、９９、１１３、１２７、１４１、１５５、１６９および１８３に示されている。本抗体のＶＨ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号２、１６、３０、４４、５８、７２、８６、１００、１１４、１２８、１４２、１５６、１７０および１８４に示されている。本抗体のＶＨ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号３、１７、３１、４５、５９、７３、８７、１０１、１１５、１２９、１４３、１５７、１７１および１８５に示されている。本抗体のＶＬ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号４、１８、３２、４６、６０、７４、８８、１０２、１１６、１３０、１４４、１５８、１７２および１８６に示されている。本抗体のＶＬ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号５、１９、３３、４７、６１、７５、８９、１０３、１１７、１３１、１４５、１５９、１７３および１８７に示されている。本抗体のＶＬ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号６、２０、３４、４８、６２、７６、９０、１０４、１１８、１３２、１４６、１６０、１７４および１８８に示されている。ＣＤＲ領域は、Kabat系を用いて描写される（Kabat, E. A., et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242）。
【０１１１】
これらの各抗体がＣ３ｂと結合でき、抗原結合特異性がＣＤＲ１、２および３領域によって一次的に与えられることに鑑みると、ＶＨ ＣＤＲ１、２および３配列ならびにＶＬ  ＣＤＲ１、２および３配列を「組み合わせて適合させ」てよい（すなわち異なる抗体由来のＣＤＲを組み合わせて適合させることができる）が、各抗体は、好ましくは、本発明の他のＣ３ｂ結合分子を作成するために、ＶＨ ＣＤＲ１、２および３ならびにＶＬ ＣＤＲ１、２および３を含む。かかる「組み合わせて適合させ」たＣ３ｂ結合抗体は、当該技術分野で既知の結合アッセイおよび実施例に記載のもの（例えばＥＬＩＳＡ）を用いて試験してもよい。ＶＨ ＣＤＲ配列が組み合わせて適合されている場合、特定のＶＨ配列由来のＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列は、構造的に類似したＣＤＲ配列で置換されるべきである。同様に、ＶＬ ＣＤＲ配列が組み合わせて適合されている場合、特定のＶＬ配列由来のＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列は、構造的に類似したＣＤＲ配列で置換されるべきである。１個以上のＶＨおよび／またはＶＬ ＣＤＲ領域配列を本発明のモノクローナル抗体について本明細書に示すＣＤＲ配列由来の構造的に類似した配列で置換することによって、新たなＶＨおよびＶＬ配列が作成できることを、当業者は容易に理解する。上記に加え、一つの態様において、本明細書に記載の抗体の抗原結合フラグメントは、ＶＨ ＣＤＲ１、２および３またはＶＬ ＣＤＲ１、２および３を含んでいてよく、ここで該フラグメントは、単一の可変ドメインとしてＣ３ｂと結合する。
【０１１２】
したがって、本発明は、配列番号１、１５、２９、４３、５７、７１、８５、９９、１１３、１２７、１４１、１５５、１６９および１８３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２、１６、３０、４４、５８、７２、８６、１００、１１４、１２８、１４２、１５６、１７０および１８４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号３、１７、３１、４５、５９、７３、８７、１０１、１１５、１２９、１４３、１５７、１７１および１８５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号４、１８、３２、４６、６０、７４、８８、１０２、１１６、１３０、１４４、１５８、１７２および１８６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号５、１９、３３、４７、６１、７５、８９、１０３、１１７、１３１、１４５、１５９、１７３および１８７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；ならびに配列番号６、２０、３４、４８、６２、７６、９０、１０４、１１８、１３２、１４６、１６０、１７４および１８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含み、Ｃ３ｂと特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合領域を提供する。
【０１１３】
本発明は、表１の抗体9556の重鎖および軽鎖配列を有する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。本発明は、表１の抗体9611の重鎖および軽鎖配列を有する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。本発明は、表１の抗体9612の重鎖および軽鎖配列を有する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。本発明は、表１の抗体9609の重鎖および軽鎖配列を有する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。本発明は、表１の抗体9610の重鎖および軽鎖配列を有する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。本発明は、表１の抗体9674の重鎖および軽鎖配列を有する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。本発明は、表１の抗体9675の重鎖および軽鎖配列を有する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。本発明は、表１の抗体9124の重鎖および軽鎖配列を有する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。本発明は、表１の抗体9397の重鎖および軽鎖配列を有する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。本発明は、表１の抗体9398の重鎖および軽鎖配列を有する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。本発明は、表１の抗体9136の重鎖および軽鎖配列を有する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。本発明は、表１の抗体9141の重鎖および軽鎖配列を有する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。本発明は、表１の抗体9373の重鎖および軽鎖配列を有する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。本発明は、表１の抗体9423の重鎖および軽鎖配列を有する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。
【０１１４】
具体的な態様において、配列番号１の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号３の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号４の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号５の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号６の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、Ｃ３ｂと特異的に結合する抗体。別の具体的な態様において、配列番号１５の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１６の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１７の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号１８の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１９の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号２０の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、Ｃ３ｂと特異的に結合する抗体。
【０１１５】
別の具体的な態様において、配列番号２９の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号３０の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号３１の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号３２の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号３３の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号３４の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、Ｃ３ｂと特異的に結合する抗体。別の具体的な態様において、配列番号４３の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号４４の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号４５の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号４６の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号４７の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号４８の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、Ｃ３ｂと特異的に結合する抗体。
【０１１６】
別の具体的な態様において、配列番号５７の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号５８の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号５９の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号６０の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号６１の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号６２の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、Ｃ３ｂと特異的に結合する抗体。別の具体的な態様において、配列番号７１の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号７２の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号７３の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号７４の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号７５の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号７６の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、Ｃ３ｂと特異的に結合する抗体。
【０１１７】
別の具体的な態様において、配列番号８５の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号８６の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号８７の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号８８の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号８９の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号９０の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、Ｃ３ｂと特異的に結合する抗体。
【０１１８】
ある態様において、Ｃ３ｂと特異的に結合する抗体は、表１に記載されている抗体である。好ましい態様において、Ｃ３ｂと結合する抗体は、抗体9556である。さらに好ましい態様において、Ｃ３ｂと結合する抗体は、抗体9610である。さらに好ましい態様において、Ｃ３ｂと結合する抗体は、抗体9674である。さらに好ましい態様において、Ｃ３ｂと結合する抗体は、抗体9675である。さらに好ましい態様において、Ｃ３ｂと結合する抗体は、抗体9609である。
【０１１９】
本明細書において使用するとき、抗体の可変領域または全長鎖がヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子を用いた系から得られている場合、該ヒト抗体は、特定の生殖系列配列の「産物」であるかまたはそれに「由来する」重鎖もしくは軽鎖可変領域または全長重鎖もしくは軽鎖を含む。かかる系はヒト免疫グロブリン遺伝子を担持するトランスジェニックマウスを目的の抗原で免役するか、あるいは目的の抗原でファージ上に提示されたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることを含む。ヒト生殖系列免疫グロブリン配列の「産物」であるかまたはそれに「由来する」ヒト抗体は、ヒト抗体のアミノ酸配列をヒト生殖系列免疫グロブリンのアミノ酸配列を比較して、ヒト抗体の配列と配列において最も近い（すなわち最大の同一性％）ヒト生殖系列免疫グロブリン配列を選択することによって、それ自体同定できる。ヒト生殖系列免疫グロブリン配列の「産物」であるかまたはそれに「由来する」ヒト抗体は、例えば天然に生じる体細胞変異または部位特異的突然変異の意図的導入のために、生殖系列配列と比較した場合、アミノ酸の相違を含んでいてよい。しかし、ＶＨまたはＶＬフレームワーク領域において、選択したヒト抗体は典型的には、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列とアミノ酸配列において少なくとも９０％の同一性を有し、他の種の生殖系列免疫グロブリンアミノ酸配列（例えばマウス生殖系列配列）と比較した場合、ヒトであるとヒト抗体を同定するアミノ酸残基を含む。ある場合において、ヒト抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と、アミノ酸配列において少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％もしくは少なくとも９５％、またはさらに少なくとも９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一でありうる。典型的には、組換えヒト抗体は、ＶＨまたはＶＬフレームワーク領域においてヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子でコードされるアミノ酸配列と１０以下のアミノ酸の相違を示す。ある場合において、ヒト抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と５以下、または４、３、２または１以下のアミノ酸の相違を示しうる。ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子の例は、下記可変ドメイン生殖系列フラグメントならびにDP47およびDPK9を含むが、これらに限定されない。
【０１２０】
相同抗体
さらに別の態様において、本発明は、表１に記載の配列と相同なアミノ酸配列であって、Ｃ３ｂタンパク質（例えばヒトおよび／またはカニクイザルＣ３ｂ）と結合し、表１に記載の抗体の所望の機能的特徴を保持している抗体を提供する。
【０１２１】
例えば、本発明は、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む単離されたモノクローナル抗体（またはその機能的抗原結合フラグメント）であって、重鎖可変ドメインが配列番号７、２１、３５、４９、６３、７７、９１、１０５、１１９、１３３、１４７、１６１、１７５および１８９からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み；軽鎖可変ドメインが配列番号８、２２、３６、５０、６４、７８、９２、１０６、１２０、１３４、１４８、１６２、１７６および１９０からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み；Ｃ３ｂ（例えばヒトおよび／またはカニクイザルＣ３ｂ）と特異的に結合し、溶血アッセイにおいて赤血球溶解を阻害しうる、抗体を提供する。具体例において、かかる抗体は、１０％ヒトまたはカニクイザル血清での溶血アッセイにおいて50 nM未満のＩＣ５０値を有する。
【０１２２】
他の態様において、ＶＨおよび／またはＶＬアミノ酸配列は、表１に記載の配列と５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であり得る。他の態様において、ＶＨおよび／またはＶＬアミノ酸配列は、１、２、３、４または５アミノ酸位置でのアミノ酸置換以外は同一であり得る。表１に記載のもののＶＨおよびＶＬ領域と高い（すなわち８０％以上）の同一性を有するＶＨおよびＶＬ領域を有する抗体は、配列番号７、２１、３５、４９、６３、７７、９１、１０５、１１９、１３３、１４７、１６１、１７５、１８９、８、２２、３６、５０、６４、７８、９２、１０６、１２０、１３４、１４８、１６２、１７６および１９０をコードする核酸分子のそれぞれの突然変異誘発（例えば部位特異的またはＰＣＲ介在突然変異誘発）によって得ることができ、次いで本明細書に記載の機能的アッセイを用いて保持している機能について、コードする変化された抗体を試験できる。
【０１２３】
他の態様において、全長重鎖および／または全長軽鎖アミノ酸配列は、表１に記載の配列と５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であり得る。配列番号９、２３、３７、５１、６５、７９、９３、１０７、１２１、１３５、１４９、１６３、１７７および１９１のいずれかの全長重鎖ならびに配列番号１０、２４、３８、５２、６６、８０、９４、１０８、１２２、１３６、１５０、１６４、１７８および１９２のいずれかの全長軽鎖と高い（すなわち８０％以上）の同一性を有する全長重鎖および全長軽鎖を有する抗体は、それぞれ、かかるポリペプチドをコードする核酸分子のそれぞれの突然変異誘発（例えば部位特異的またはＰＣＲ介在突然変異誘発）によって得ることができ、次いで本明細書に記載の機能的アッセイを用いて保持している機能について、コードする変化された抗体を試験できる。
【０１２４】
他の態様において、全長重鎖および／または全長軽鎖ヌクレオチド配列は、上記配列と６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であり得る。
【０１２５】
他の態様において、重鎖および／または軽鎖ヌクレオチド配列の可変領域は、上記配列と６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であり得る。
【０１２６】
本明細書において使用するとき、２つの配列間の同一性％は、２つの配列の最適なアラインメントのために導入することが必要なギャップ数、各ギャップ長を考慮に入れて、当該配列によって共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、同一性％＝同一位置の数／位置の総数×１００）。２つの配列間の配列の比較および同一性％の決定は、下記非限定的な例に記載のとおり、数学アルゴリズムを用いて実施しうる。
【０１２７】
さらにまたはあるいは、本発明のタンパク質配列はさらに、「クエリー配列」として用いて、公開データベースに対するサーチを実施し、例えば関連配列を同定できる。例えば、かかるサーチは、Altschul, et al., 1990 J.Mol. Biol. 215:403-10のＢＬＡＳＴプログラム（version 2.0）を用いて実施できる。
【０１２８】
保存的修飾を有する抗体
ある態様において、本発明の抗体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を有し、ここでこれらのＣＤＲ配列の一つ以上は、本明細書に記載の抗体に基づいて特定されるアミノ酸配列またはその保存的修飾を有し、そして本発明のＣ３ｂ結合性抗体の所望の機能的特徴を保持している。したがって、本発明は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域からなる単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであって：重鎖可変領域ＣＤＲ１アミノ酸配列が配列番号１、１５、２９、４３、５７、７１、８５、９９、１１３、１２７、１４１、１５５、１６９および１８３ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択され；重鎖可変領域ＣＤＲ２アミノ酸配列が配列番号２、１６、３０、４４、５８、７２、８６、１００、１１４、１２８、１４２、１５６、１７０および１８４ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択され；重鎖可変領域ＣＤＲ３アミノ酸配列が配列番号３、１７、３１、４５、５９、７３、８７、１０１、１１５、１２９、１４３、１５７、１７１および１８５ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択され；軽鎖可変領域ＣＤＲ１アミノ酸配列が配列番号４、１８、３２、４６、６０、７４、８８、１０２、１１６、１３０、１４４、１５８、１７２および１８６ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択され；軽鎖可変領域ＣＤＲ２アミノ酸配列が配列番号５、１９、３３、４７、６１、７５、８９、１０３、１１７、１３１、１４５、１５９、１７３および１８７ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択され；軽鎖可変領域ＣＤＲ３アミノ酸配列が配列番号６、２０、３４、４８、６２、７６、９０、１０４、１１８、１３２、１４６、１６０、１７４および１８８ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択され；Ｃ３ｂと特異的に結合し、本明細書に記載の溶血アッセイにおいて赤血球の溶解を阻害する、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【０１２９】
他の態様において、哺乳類細胞での発現に最適化された本発明の抗体は、全長重鎖配列および全長軽鎖配列を有し、ここでこれらの配列の一つ以上は、本明細書に記載の抗体に基づいて特定されるアミノ酸配列またはその保存的修飾を有し、そして本発明のＣ３ｂ結合性抗体の所望の機能的特徴を保持している。したがって、本発明は、全長重鎖および全長軽鎖からなる、哺乳類細胞での発現に最適化された、単離されたモノクローナル抗体であって：全長重鎖が配列番号９、２３、３７、５１、６５、７９、９３、１０７、１２１、１３５、１４９、１６３、１７７および１９１ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し；全長軽鎖が配列番号１０、２４、３８、５２、６６、８０、９４、１０８、１２２、１３６、１５０、１６４、１７８および１９２ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し；Ｃ３ｂ（例えばヒトおよび／またはカニクイザルＣ３ｂ）と特異的に結合し；本明細書に記載の溶血アッセイにおいて赤血球の溶解を阻害する、抗体を提供する。具体的な態様において、かかる抗体は、１０％ヒトまたはカニクイザル血清での溶血アッセイにおいて、50 nM未満のＩＣ５０値を有する。
【０１３０】
同じエピトープと結合する抗体
本発明は、表１に記載のＣ３ｂ結合抗体ど同じエピトープに結合する抗体を提供する。さらなる抗体は、したがって、Ｃ３ｂ結合アッセイにおいて他の本発明の抗体と交差競合する（例えば統計的に有為に競合的に結合を阻害する）能力に基づいて同定できる。Ｃ３ｂタンパク質（例えばヒトおよび／またはカニクイザルＣ３ｂ）と本発明の抗体の結合を阻害する試験抗体の能力は、試験抗体がＣ３ｂとの結合について当該抗体と競合しうることを示し；かかる抗体は、理論に縛られないが、それが競合する抗体とＣ３ｂタンパク質上の同じまたは関連する（例えば構造的に類似または空間的に近接した）エピトープと結合しうる。ある態様において、本発明の抗体とＣ３ｂ上の同じエピトープと結合する抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。かかるヒトモノクローナル抗体は、本明細書に記載のとおりに製造し、単離できる。本明細書において使用するとき、競合抗体が本発明の抗体のＣ３ｂ結合を、106 x KD以上の競合抗体濃度の競合抗体の存在下で、５０％以上阻害する場合に、該抗体は 結合について「競合」している。
【０１３１】
操作および修飾された抗体
本発明の抗体はさらに、修飾された抗体を設計するための出発物質として本明細書に示すＶＨおよび／またはＶＬ配列の一つ以上を有する抗体を用いて作成でき、この修飾された抗体は、出発抗体とは異なる特徴を有しうる。１個または両方の可変領域（すなわちＶＨおよび／またはＶＬ）、例えば１個以上のＣＤＲ領域および／または１個以上のフレームワーク領域における１個以上の残基を修飾することによって、抗体を操作できる。さらにまたはあるいは、例えば抗体のエフェクター機能を変化させるために、定常領域内の残基を修飾することによって抗体を操作してもよい。
【０１３２】
実施できる可変領域操作の一つのタイプが、ＣＤＲ移植である。抗体は、６個の重鎖および軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）に位置するアミノ酸残基によって主として標的抗原と相互作用する。このため、ＣＤＲ内のアミノ酸配列はＣＤＲ外の配列よりも個々の抗体間でより多様である。ＣＤＲ配列はほとんどの抗体−抗原相互作用に関与するため、異なる特徴を有する異なる抗体由来のフレームワーク配列に移植した特定の天然抗体由来のＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することによって、特定の天然抗体の特徴を模倣する組換え抗体を発現することができる（例えばRiechmann, L. et al., 1998 Nature 332:323-327; Jones, P. et al., 1986 Nature 321:522-525; Queen, C. et al., 1989 Proc. Natl. Acad., U.S.A. 86:10029-10033; Winterの米国特許5,225,539ならびにQueen et al.の米国特許5,530,101; 5,585,089; 5,693,762および6,180,370参照）。
【０１３３】
したがって、本発明の別の態様は、配列番号１、１５、２９、４３、５７、７１、８５、９９、１１３、１２７、１４１、１５５、１６９および１８３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１配列；配列番号２、１６、３０、４４、５８、７２、８６、１００、１１４、１２８、１４２、１５６、１７０および１８４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２配列；配列番号３、１７、３１、４５、５９、７３、８７、１０１、１１５、１２９、１４３、１５７、１７１および１８５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３配列をそれぞれ含む重鎖可変領域；ならびに配列番号４、１８、３２、４６、６０、７４、８８、１０２、１１６、１３０、１４４、１５８、１７２および１８６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１配列；配列番号５、１９、３３、４７、６１、７５、８９、１０３、１１７、１３１、１４５、１５９、１７３および１８７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２配列；および配列番号６、２０、３４、４８、６２、７６、９０、１０４、１１８、１３２、１４６、１６０、１７４および１８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３配列をそれぞれ含む軽鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。したがって、かかる抗体は、モノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬ ＣＤＲ配列を含むが、これらの抗体とは異なるフレームワーク配列を含みうる。
【０１３４】
かかるフレームワーク配列は、生殖系列抗体遺伝子配列を含む公開ＤＮＡデータベースまたは公表された文献から得られる。例えば、germline DNA配列s for ヒトheavy and 軽鎖可変領域遺伝子は、「VBase」ヒト生殖系列配列データベース（www.mrc- cpe.cam.ac.uk/vbaseでインターネット上で入手可能)、ならびにKabat, E. A., et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I. M., et al., 1992  J. fol. Biol. 227:776-798; およびCox, J. P. L. et al., 1994 Eur. J Immunol. 24:827-836において見出しうる（それらのそれぞれの内容は、参照により、明示的に本明細書に組み込む）。
【０１３５】
本発明の抗体に使用するためのフレームワーク配列の例は、選択した本発明の抗体によって使用されるフレームワーク配列、例えばコンセンサス配列および／または本発明のモノクローナル抗体によって使用されるフレームワーク配列と構造的に類似のものである。ＶＨ  ＣＤＲ１、２および３配列ならびにＶＬ  ＣＤＲ１、２および３配列は、フレームワーク配列が由来する生殖系列免疫グロブリン遺伝子において見られるものと同一の配列を有するフレームワーク領域に移植でき、あるいは該ＣＤＲ配列は、生殖系列配列と比較して１個以上の変異を含むフレームワーク領域に移植できる。例えば、ある例において、抗体の抗原結合能を維持または向上するためにフレームワーク領域内の残基を変異することが有益であることが見出されている（例えば、Queen et al.の米国特許5,530,101； 5,585,089； 5,693,762 および6,180,370参照）。本明細書に記載の抗体および抗原結合フラグメントを構築するスキャフォールドとして利用できるフレームワークは、VH1A、VH1B、VH3、Vk1、Vl2およびVk2を含むがこれらに限定されない。さらなるフレームワークは当該技術分野で既知であり、例えばワールドワイドウェブに基づくvBaseデータベースの（vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/index.php?&MMN_position=1:1）で見出しうる。
【０１３６】
別のタイプの可変領域修飾は、ＶＨおよび／またはＶＬ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３領域内のアミノ酸残基の変異によって、目的の抗体の１つ以上の結合特性（例えば親和性）を改善することであり、「親和性成熟」として知られる。部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ介在突然変異誘発を実施して変異を導入してよく、抗体結合または他の目的の機能的特徴に対する効果は、本明細書に記載し、実施例に提供するとおり、インビトロまたはインビボアッセイで評価しうる。保存的修飾（上記）を導入してもよい。突然変異はアミノ酸置換、付加または欠失でありうる。さらに、ＣＤＲ領域内の典型的には１、２、３、４または５以上の残基が変化される。
【０１３７】
したがって、他の態様において、本発明は、配列番号１、１５、２９、４３、５７、７１、８５、９９、１１３、１２７、１４１、１５５、１６９および１８３からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号１、１５、２９、４３、５７、７１、８５、９９、１１３、１２７、１４１、１５５、１６９および１８３と比較して１、２、３、４または５個のアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列からなるＶＨ ＣＤＲ１領域；配列番号２、１６、３０、４４、５８、７２、８６、１００、１１４、１２８、１４２、１５６、１７０および１８４からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号２、１６、３０、４４、５８、７２、８６、１００、１１４、１２８、１４２、１５６、１７０および１８４と比較して１、２、３、４または５個のアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列からなるＶＨ ＣＤＲ２領域；配列番号３、１７、３１、４５、５９、７３、８７、１０１、１１５、１２９、１４３、１５７、１７１および１８５からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号３、１７、３１、４５、５９、７３、８７、１０１、１１５、１２９、１４３、１５７、１７１および１８５と比較して１、２、３、４または５個のアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列からなるＶＨ ＣＤＲ３領域を有する重鎖可変領域；ならびに配列番号４、１８、３２、４６、６０、７４、８８、１０２、１１６、１３０、１４４、１５８、１７２および１８６からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号４、１８、３２、４６、６０、７４、８８、１０２、１１６、１３０、１４４、１５８、１７２および１８６と比較して１、２、３、４または５個のアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列からなるＶＬ ＣＤＲ１領域；配列番号５、１９、３３、４７、６１、７５、８９、１０３、１１７、１３１、１４５、１５９、１７３および１８７からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号５、１９、３３、４７、６１、７５、８９、１０３、１１７、１３１、１４５、１５９、１７３および１８７と比較して１、２、３、４または５個のアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列からなるＶＬ ＣＤＲ２領域；ならびに配列番号６、２０、３４、４８、６２、７６、９０、１０４、１１８、１３２、１４６、１６０、１７４および１８８からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号６、２０、３４、４８、６２、７６、９０、１０４、１１８、１３２、１４６、１６０、１７４および１８８と比較して１、２、３、４または５個のアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列からなるＶＬ ＣＤＲ３領域からなる、単離されたＣ３ｂ結合モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【０１３８】
別のフレームワークまたはスキャフォールドへの抗原結合ドメインの移植
得られるポリペプチドが少なくとも１個のＣ３ｂと特異的に結合する結合領域を含む限り、広範な抗体／免疫グロブリンフレームワークまたはスキャフォールドが使用できる。かかるフレームワークまたはスキャフォールドは、ヒト免疫グロブリンまたはそのフラグメントの５つの主なイディオタイプを含み、好ましくはヒト化局面を有する、他の動物種の免疫グロブリンを含む。一本重鎖抗体、例えばラクダにおいて同定されたものは、この点において、特に興味深い。新たなフレームワーク、スキャフォールドおよびフラグメントは当業者によって発見および開発され続けている。
【０１３９】
一つの局面において、本発明は、本発明のＣＤＲを移植できる非免疫グロブリンスキャフォールドを用いた、非免疫グロブリンベースの抗体を作成することに関する。標的Ｃ３ｂタンパク質（例えばヒトおよび／またはカニクイザルＣ３ｂ）に特異的な結合領域を含む限り、既知または未来の非免疫グロブリンフレームワークおよびスキャフォールドが使用できる。既知の非免疫グロブリンフレームワークまたはスキャフォールドは、フィブロネクチン(Compound Therapeutics, Inc., Waltham, MA)、アンキリン(Molecular Partners AG, Zurich, Switzerland)、ドメイン抗体(Domantis, Ltd., Cambridge, MA, and Ablynx nv, Zwijnaarde, Belgium)、リポカリン(Pieris Proteolab AG, Freising, Germany)、小モジュラー免疫医薬(Trubion Pharmaceuticals Inc., Seattle, WA)、マキシボディー(Avidia, Inc., Mountain View, CA)、プロテインＡ(Affibody AG, Sweden)およびアフィリン（ガンマ結晶またはユビキチン）(Scil Proteins GmbH, Halle, Germany)を含むが、これらに限定されない。
【０１４０】
フィブロネクチンスキャフォールドは、フィブロネクチンタイプIIIドメイン（例えばフィブロネクチンタイプIIIの第１０モジュール（10 Fn3ドメイン））に基づく。フィブロネクチンタイプIIIドメインは、それら自体が互いをパックしてタンパク質のコアを形成する２個のベータシート間に分布する７または８個のベータ鎖を有し、さらにベータ鎖と互いに結合し、溶媒に曝されるループ（ＣＤＲに類似する）を含む。ベータシートサンドイッチの各端に、かかるループが少なくとも３個存在し、該端はベータ鎖の方向に垂直なタンパク質の境界である(US 6,818,418)。これらのフィブロネクチンベースのスキャフォールドは、免疫グロブリンではないが、全体的な折り畳みは、最も小さな機能的抗体フラグメントでありラクダおよびラマＩｇＧの全抗原認識ユニットを含む重鎖可変領域のものと極めて関連している。この構造のため、非免疫グロブリン抗体は、抗体のものと性質および親和性において類似する抗原結合特性を模倣する。これらのスキャフォールドは、インビボでの抗体の親和性成熟のプロセスと類似の、インビトロでのループランダム化およびシャッフル戦略に使用できる。これらのフィブロネクチンベース分子は、該分子のループ領域が標準的なクローニング技術を用いる本発明のＣＤＲで置換する場合に、スキャフォールドとして使用されうる。
【０１４１】
アンキリン技術は、異なる標的との結合のために使用しうる可変領域を保持するスキャフォールドとしてアンキリン由来反復モジュールを使用することに基づく。アンキリン反復モジュールは、２個の逆平衡のαヘリックスおよびβターンからなる３３アミノ酸のポリペプチドである。可変領域の結合は、多くの場合、リボソームディスプレイを用いて最適化される。
【０１４２】
アビマーは、ＬＲＰ−１のような、天然のＡドメイン含有タンパク質に由来する。これらのドメインはタンパク質間相互作用のために天然に用いられ、ヒトでは２５０種以上のタンパク質が構造的にＡドメインに基づいている。アビマーは、アミノ酸リンカーを介して結合した多数の「Ａドメイン」モノマー（２〜１０個）からなる。標的抗原に結合しうるアビマーは、例えば米国特許出願公開20040175756; 20050053973; 20050048512;および 20060008844に記載の方法論を用いて作成できる。
【０１４３】
Affibody親和性リガンドは、プロテインＡのＩｇＧ結合ドメインの１個のスキャフォールドに基づいた３ヘリックスバンドルからなる、小さく、単純なタンパク質である。プロテインＡは黄色ブドウ球菌の表面タンパク質である。このスキャフォールドドメインは５８アミノ酸からなり、その１３個がランダム化されて多数のリガンド変異体を有するAffibodyライブラリーを生じる（例えばUS 5,831,012参照）。Affibody分子は抗体を模倣し、それらは150 kDaの抗体の分子量と比較して、6 kDaの分子量を有する。その小さなサイズにもかかわらず、Affibody分子の結合部位は抗体のものと同様である。
【０１４４】
Anticalinsは、Pieris ProteoLab AG社によって開発された製品である。それらは、化学的に感受性または不溶性の化合物の生理的輸送または貯蔵に通常関与する広範なグループの小さく強固なタンパク質であるリポカリンに由来する。多様な天然リポカリンがヒト組織または体液中に生じる。タンパク質構造は免疫グロブリンに類似しており、強固なフレームワークの上端に超可変ループを有する。しかし、抗体またはその組換えフラグメントとは異なり、リポカリンは、単一免疫グロブリンドメインよりも僅かに大きな１６０〜１８０アミノ酸残基を有する単一ポリペプチド鎖からなる。結合ポケットを構成する４個のループのセットは、顕著な構造可塑性を示し、多様な側鎖に耐容性である。したがって、結合部位は、高い親和性および特異性で異なる形の所定の標的分子を認識するため、特許方法で再形成してよい。リポカリンファミリーの一つのタンパク質である、Pieris Brassicaeのビリン結合タンパク質（ＢＢＰ）は、４個のループのセットを変異させてアンチカリンを開発するために使用されている。アンチカリンについて記載する特許出願の一例は、PCT WO 199916873である。
【０１４５】
アフィリン分子は、タンパク質および低分子に対する特異的親和性について設計されている小さな非免疫グロブリンタンパク質である。新たなアフィリン分子は、各々異なるヒト由来スキャフォールドタンパク質に基づく２個のライブラリーから極めて速やかに選択しうる。アフィリン分子は免疫グロブリンタンパク質に対して何ら構造的相同性を示さない。現在２種のアフィリンスキャフォールドが使用されており、一方はヒトの構造的眼レンズタンパク質であるガンマ結晶であり、他方は「ユビキチン」スーパーファミリータンパク質である。いずれのヒトスキャフォールドも極めて小さく、高い温度安定性を示し、ｐＨ変化および変性剤にほぼ耐性である。この高い安定性は、主として該タンパク質の伸長ベータシート構造のためである。ガンマ結晶由来タンパク質の例はWO200104144に記載されており、「ユビキチン様」タンパク質の例はWO2004106368に記載されている。
【０１４６】
タンパク質エピトープ模倣物（ＰＥＭ）は、タンパク質間相互作用に関与する主な二次構造であるタンパク質のベータヘアピン二次構造を模倣した、中間サイズの環状ペプチド様分子（分子量1〜2 kDa）である。
【０１４７】
ヒトまたはヒト化抗体
本発明は、Ｃ３ｂタンパク質（例えばヒトおよび／またはカニクイザルＣ３ｂ）と特異的に結合する完全ヒト抗体を提供する。キメラまたはヒト化抗体と比較して、本発明のヒトＣ３ｂ結合抗体は、ヒト対象に投与したとき、さらに低下した抗原性を有する。
【０１４８】
ヒトＣ３ｂ結合抗体は、当該技術分野で既知の方法を用いて作成できる。例えば、非ヒト抗体を操作されたヒト抗体に変換するために使用されるヒト化技術。米国特許出願公開20050008625は、非ヒト抗体のものに対して同じ結合特性を維持しあるいはより良い結合特性を提供しながら、抗体中のヒト可変領域で非ヒト抗体可変領域を置換するためのインビボ法について記載している。この方法は、完全ヒト抗体による非ヒト参照抗体の可変領域のエピトープガイド置換に依存する。得られるヒト抗体は、一般に、参照非ヒト抗体と構造的に関連しないが、参照抗体と同じ抗原上の同じエピトープと結合する。簡潔には、試験抗体と抗原の結合に応答するレポーター系の存在下で、限定量の抗原との結合について、「コンペティター」と参照抗体（試験抗体）の多様なハイブリッドのライブラリーとの間の細胞における競合を設定することによって、連続エピトープガイド相補性置換アプローチが可能となる。コンペティターは参照抗体またはその誘導体、例えば一本鎖Ｆｖフラグメントであり得る。コンペティターはまた、参照抗体と同じエピトープと結合する抗体の天然または人工リガンドであってもよい。コンペティターに唯一要求されることは、それが参照抗体と同じエピトープと結合し、抗原結合について参照配列と競合することである。試験抗体は、非ヒト参照抗体と共通する１個の抗原結合Ｖ領域およびヒト抗体のレパートリーライブラリーのような多様な供給源からランダムに選択された他のＶ領域を有する。参照抗体と共通のＶ領域は、抗原上の同じエピトープに同じ方向で試験抗体を配置するガイドとして作用し、したがって選択は参照抗体に対して最も高い抗原結合忠実度に偏向している。
【０１４９】
多くのタイプのレポーター系を用いて、試験抗体と抗原間の所望の相互作用を検出できる。例えば、相補レポーターフラグメントは、抗原および試験抗体とそれぞれ結合して、試験抗体が抗原と結合する場合にのみフラグメント相補性によるレポーター活性化が生じる。試験抗体−および抗原−レポーターフラグメント融合体がコンペティターと共に発現される場合、レポーター活性化は、抗原に対する試験抗体の親和性と比例する、コンペティターと競合する試験抗体の能力に依存することとなる。他の使用できるレポーター系は、米国特許出願番号10/208,730（公開番号20030198971）に記載の再アクチベーターの自動阻害レポーター再活性化系（ＲＡＩＲ）、あるいは米国特許出願番号10/076,845（公開番号20030157579）に記載の競合活性化を含む。
【０１５０】
連続エピトープガイド相補性置換システムにより選択を行い、コンペティター、抗原およびレポーター成分とともに試験抗体を単独で発現する細胞を同定する。これらの細胞において、各試験抗体は、限定量の抗原との結合について、コンペティターと一対一で競合する。レポーターの活性は、試験抗体と結合する抗原の量に比例し、したがって抗原に対する試験抗体の親和性および試験抗体の安定性と比例する。試験抗体は、試験抗体として発現した場合の参照抗体の活性と比較したその活性に基づいてまず選択される。１回目の選択の結果は、「ハイブリッド」抗体のセットであり、これはそれぞれ、参照抗体由来の同じ非ヒトＶ領域およびライブラリー由来のヒトＶ領域を含み、そして参照抗体と同じ抗原上のエピトープと結合する。１回目で選択したハイブリッド抗体の１つ以上は、参照抗体のものと同等またはそれ以上の抗原に対する親和性を有する。
【０１５１】
第２のＶ領域置換ステップにおいて、第１段階で選択したヒトＶ領域は、同種ヒトＶ領域の多様なライブラリーによる残留非ヒト参照抗体Ｖ領域のヒト置換の選択のためのガイドとして使用される。１回目で選択したハイブリッド抗体は、２回目の選択のためのコンペティターとして使用してもよい。２回目の選択の結果は、参照抗体とは構造的に異なるが、同じ抗原との結合について参照抗体と競合する完全ヒト抗体のセットである。選択したヒト抗体のいくつかは、参照抗体と同じ抗原上の同じエピトープと結合する。これらの選択したヒト抗体のうち、１個以上が参照抗体のものと同等またはそれ以上の親和性で同じエピトープと結合する。
【０１５２】
上記のマウスまたはキメラＣ３ｂ結合抗体を参照抗体として使用する場合、この方法は、同じ結合特異性および同じまたはより良い結合親和性を有する、ヒトＣ３ｂと結合するヒト抗体を作成するために容易に使用できる。さらに、かかるヒトＣ３ｂ結合抗体は、通常ヒト抗体を製造している企業、例えばKaloBios, Inc.(Mountain View, CA)から商業的に入手してもよい。
【０１５３】
ラクダ抗体
ラマ種（Lama paccos、Lama glama および Lama vicugna）のような新世界メンバーを含むラクダおよびヒトコブラクダ（Camelus bactrianusおよびCalelus dromaderius）ファミリーのメンバーから得た抗体タンパク質は、サイズ、構造の複雑性およびヒトに対する抗原性について、特徴付けられている。天然に見出される哺乳類のこのファミリー由来の特定のＩｇＧ抗体は軽鎖を欠いており、したがって他の動物由来の抗体における２個の重鎖および２個の軽鎖を有する４鎖４級構造とは構造的に異なる。PCT/EP93/02214 (１９９４年３月３日公開のWO 94/04678)を参照されたい。
【０１５４】
ＶＨＨと同定される小さな１個の可変ドメインであるラクダ抗体の領域を遺伝子操作によって入手して、標的に高い親和性を有し、「ラクダナノ抗体」として知られる低分子量抗体由来タンパク質を得ることができる。１９９８年６月２日公開の米国特許第5,759,808参照；Stijlemans, B. et al., 2004 J Biol Chem 279: 1256-1261; Dumoulin, M. et al., 2003 Nature 424: 783-788; Pleschberger, M. et al. 2003 Bioconjugate Chem 14: 440-448; Cortez-Retamozo, V. et al. 2002 Int J Cancer 89: 456-62; および Lauwereys, M. et al. 1998 EMBO J 17: 3512-3520も参照されたい。ラクダ抗体および抗体フラグメントの操作されたライブラリーは、例えばAblynx, Ghent, Belgiumから商業的に入手可能である。非ヒト起源の他の抗体として、ラクダ抗体のアミノ酸配列を組換え的に変化させて、ヒト配列により似た配列を得てもよい。すなわち、ナノ抗体を「ヒト化」してよい。したがって、ヒトに対するラクダ抗体の天然の低抗原性をさらに低下させうる。
【０１５５】
ラクダ抗体はヒトＩｇＧ分子の約１０分の１の分子量を有し、該タンパク質はわずか数ナノメートルの物理系を有する。小さなサイズの一つの帰結は、より大きな抗体タンパク質には機能的に不可視の抗原部位に結合するというラクダ抗体の能力であり、すなわちラクダナノ抗体は、常套の免疫学的技術を用いると隠される抗原を検出する試薬として、そして可能性のある治療薬物として、有用である。したがって、小さなサイズのさらに別の帰結は、標的タンパク質の溝または小さな割れ目の特定の部位に結合することの結果として、阻害でき、したがって伝統的な抗体のものよりも伝統的な低分子量薬物の機能により似た能力を提供できることである。
【０１５６】
低分子量およびコンパクトなサイズは、さらに、極めて熱安定であり、極端なｐＨおよびタンパク分解に安定であり、そして低い抗原性をラクダナノ抗体にもたらす。別の帰結は、ラクダナノ抗体は循環系から組織に容易に移動することおよび血液脳関門を通過して神経組織に作用する障害を処置しうることである。ナノ抗体はさらに、薬物の血液脳関門通過を促進しうる。２００４年８月１９日公開の米国特許出願20040161738を参照されたい。ヒトへの低抗原性と組み合わさったこれらの特徴は、大きな治療ポテンシャルを示す。さらに、これらの分子は、大腸菌のような原核細胞において十分に発現され、バクテリオファージで融合タンパク質として発現され、そして機能的である。
【０１５７】
したがって、本発明の特徴は、Ｃ３ｂに高い親和性を有するラクダ抗体またはナノ抗体である。ここである態様において、ラクダ抗体またはナノ抗体は、ラクダ科動物において天然に生産され、すなわち他の抗体について本明細書に記載の技術を用いて、Ｃ３ｂまたはそのペプチドフラグメントでラクダを免疫して作成される。あるいは、Ｃ３ｂ結合ラクダナノ抗体を設計し、すなわち例えば本明細書の実施例に記載の標的としてＣ３ｂを用いるパニング法を用いて適切に変異誘発したラクダナノ抗体を提示する例えばファージディスプレイライブラリーから選択して作成する。操作されたナノ抗体は、４５分〜２週間の受容対象における半減期を有するようにさらに遺伝子操作によってカスタマイズしてもよい。具体的な態様において、ラクダ抗体またはナノ抗体は、例えばPCT/EP93/02214に記載のとおり、本発明のヒト抗体の重鎖または軽鎖のＣＤＲ配列をナノ抗体またはシングルドメイン抗体フレームワーク配列に挿入して得られる。
【０１５８】
二重特異的分子および多価抗体
別の局面において、本発明は、本発明のＣ３ｂ結合抗体またはそのフラグメントを含む二重特異的または多重特異的分子を特徴とする。本発明の抗体またはその抗原結合領域は、少なくとも２種の異なる結合部位または標的分子に結合する二重特異的分子を作成するために、別の機能的分子、例えば別のペプチドまたはタンパク質（例えばあるレセプターに対する別の抗体またはリガンド）に誘導体化または結合しうる。本発明の抗体は、実際に、２種以上の異なる結合部位および／標的分子に結合する多重特異的分子を作成するために、１個以上の他の機能的分子に誘導体化または結合させてもよく、かかる多重特異的分子も、本明細書において使用するとき、用語「二重特異的分子」に包含する。本発明の二重特異的分子を作成するために、本発明の抗体は、１個以上の結合分子、例えば別の抗体、抗体フラグメント、ペプチドまたは結合模倣物と機能的に（例えば化学的カップリング、遺伝的融合、非共有結合または他のものにより）結合して、二重特異的分子を得てよい。
【０１５９】
したがって、本発明は、少なくとも１個のＣ３ｂに対する第一の結合特異性および第二の標的エピトープに対する第二の結合特異性を含む二重特異的分子を含む。例えば、第二の標的エピトープは、第一の標的エピトープとは異なるＣ３ｂの別のエピトープである。
【０１６０】
さらに、二重特異的分子が多重特異的である本発明に関して、該分子はさらに、第一および第二の標的エピトープに加えて、第三の結合特異性を含んでいてもよい。
【０１６１】
一つの態様において、本発明の二重特異的分子は、結合特異性として、少なくとも１種の抗体またはその抗体フラグメント、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖまたは一本鎖Ｆｖを含む。本抗体はまた、軽鎖もしくは重鎖二量体またはそのいずれかの最小フラグメント、例えばＦｖまたはLadnerらの米国特許4,946,778に記載の一本鎖構築物であってもよい。
【０１６２】
ディアボディーは、ＶＨおよびＶＬドメインが同じ鎖上で２個のドメインを対にするには短すぎるリンカーによって結合された一本ポリペプチド鎖上で発現される二価の二重特異的分子である。ＶＨおよびＶＬドメインは別の鎖の相補的ドメインと対になって、２個の抗原結合部位を作る（例えばHolliger et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak et al., 1994 Structure 2:1121-1123参照）。ディアボディーは、同じ細胞内でＶＨＡ−ＶＬＢおよびＶＨＢ−ＶＬＡ（ＶＨ−ＶＬ立体配置）またはＶＬＡ−ＶＨＢおよびＶＬＢ−ＶＨＡ（ＶＬ−ＶＨ立体配置）の構造を有する２本のポリペプチド鎖を発現することで作成できる。そのほとんどは細菌中で可溶形態で発現できる。一本鎖ディアボディー（ｓｃＤｂ）は、約１５アミノ酸残基のリンカーでポリペプチド鎖を形成する２個のディアボディーを結合して作成される（Holliger and Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(3-4):128-30; Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2(1):21-36参照）。ｓｃＤｂは細菌中で可溶性の活性なモノマー形態で発現できる（Holliger and Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(34): 128-30; Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2(1):21-36; Pluckthun and Pack, 1997 Immunotechnology, 3(2): 83-105; Ridgway et al., 1996 Protein Eng., 9(7):617-21参照）。ディアボディーをＦｃと融合させて、「ジディアボディー」を作成してもよい（Lu et al., 2004 J. Biol. Chem., 279(4):2856-65参照）。
【０１６３】
本発明の二重特異的分子に使用できる他の抗体は、マウス、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体である。
【０１６４】
本発明の二重特異的分子は、当該技術分野において既知の方法を用いて、構成要素である結合特異性を複合して作成してもよい。例えば、二重特異的分子の各結合特異性は、別個に作成し、次いで互いに複合してよい。結合特異性がタンパク質またはペプチドであるとき、多様なカップリングまたは架橋剤が共有結合複合化のために使用できる。架橋剤の例は、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ−フェニルエネジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）およびスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−ｌ−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）を含む（例えばKarpovsky et al., 1984 J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648参照）。他の方法は、Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. No. 78,118-132; Brennan et al., 1985 Science 229:81-83および Glennie et al., 1987 J. Immunol. 139: 2367-2375に記載のものを含む。複合化剤はＳＡＴＡおよびスルホ−ＳＭＣＣであり、いずれもPierce Chemical Co. (Rockford, IL)から入手可能である。
【０１６５】
結合特異性が抗体であるとき、それは２個の重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルホヒドリル結合によって複合化してもよい。具体的な態様において、奇数、例えば１個のスルホヒドリル残基を含むようにヒンジ領域を修飾したのち、複合化する。
【０１６６】
あるいは、両方の結合特異性が同じベクター内でコードされ、同じ宿主細胞で発現されそして組み立てられてもよい。この方法は、二重特異的分子がｍＡｂ×ｍＡｂ、ｍＡｂ×Ｆａｂ、Ｆａｂ×Ｆ（ａｂ’）２またはリガンド×Ｆａｂの融合タンパク質である場合に特に有用である。本発明の二重特異的分子は、１個の単鎖抗体および結合決定因子を含む一本鎖分子であるか、あるいは２個の結合決定因子を含む一本鎖二重特異的分子であってよい。二重特異的分子は、少なくとも２個の一本鎖分子を含んでいてもよい。二重特異的分子を作成する方法は、例えば米国特許5,260,203; 米国特許5,455,030; 米国特許4,881,175; 米国特許5,132,405; 米国特許5,091,513; 米国特許5,476,786; 米国特許5,013,653; 米国特許5,258,498; および米国特許5,482,858に記載されている。
【０１６７】
二重特異的分子とその特異的標的との結合は、例えば酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＥＡ）、ＦＡＣＳ分析、バイオアッセイ（例えば沿右側阻害）またはウェスタンブロットアッセイによって確認できる。これらのアッセイはそれぞれ、一般に、目的の複合体に特異的な標識化された試薬（例えば抗体）を用いて、特定の目的のタンパク質−抗体複合体の存在を検出する。
【０１６８】
別の局面において、本発明は、Ｃ３ｂに結合する本発明の抗体の少なくとも２個の同一または異なる抗原結合部分を含む多価化合物を提供する。抗原結合部分は、タンパク質融合または共有もしくは非共有結合によって一体に結合されうる。あるいは、結合方法は、二重特異的分子について説明した。例えば本発明の抗体と本発明の抗体の定常領域、例えばＦｃまたはヒンジ領域に結合する抗体の架橋により、四価化合物が得られる。
【０１６９】
三量体形成ドメインは、例えばBorean特許EP 1 012 280B1に記載されている。五量体形成モジュールは、例えばPCT/EP97/05897に記載されている。
【０１７０】
延長された半減期を有する抗体
本発明は、インビボで延長された半減期を有する、Ｃ３ｂタンパク質と特異的に結合する抗体を提供する。
【０１７１】
多くの要因がインビボでのタンパク質の半減期に影響しうる。例えば、腎臓ろ過、肝臓における代謝、タンパク質分解酵素（プロテアーゼ）による分解および免疫応答（例えば抗体によるタンパク質中和ならびにマクロファージおよび樹状細胞による取り込み）。多様な戦略を用いて本発明の抗体の半減期を延長してよい。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ｒｅＣＯＤＥ  ＰＥＧ、抗体スキャフォールド、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、アルブミン結合リガンドおよび糖質障壁との化学的結合；アルブミン、ＩｇＧ、ＦｃＲｎのような血清タンパク質と結合するタンパク質との遺伝的融合および形質転換；ナノ抗体、Ｆａｂ、ＤＡＲＰｉｎ、アビマー、アフィボディーおよびアンチカリンのような血清タンパク質と結合する他の結合分子とのカップリング（遺伝的または化学的）；ｒＰＥＧ、アルブミン、アルブミンのドメイン、アルブミン結合タンパク質およびＦｃとの遺伝的融合；またはナノ担体、遅延放出製剤または医薬デバイスへの導入による。
【０１７２】
インビボでの抗体の血清循環を延長するため、多機能リンカーの存在下または非存在下で、不活性ポリマー分子、例えば高分子量ＰＥＧを本抗体またはそのフラグメントに、抗体のＮもしくはＣ末端またはリシン残基のεアミノ基とＰＥＧの部位特異的結合によって、結合してよい。抗体をペグ化するため、本抗体またはそのフラグメントは、典型的には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例えばＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体と、１個以上のＰＥＧ基が抗体または抗体フラグメントに結合するような条件下で、反応させる。ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子（または同様の反応性水溶性ポリマー）を用いたアシル化反応またはアルキル化反応によって実施できる。本明細書において使用するとき、用語「ポリエチレングリコール」は他のタンパク質を誘導体化するために使用されているあらゆる形態のＰＥＧ，、例えばモノ（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−もしくはアリールオキシ−ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール−マレイミドを含む。ある態様において、ペグ化される抗体は、非グリコシル化抗体である。生物学的活性の最小限の損失をもたらす直鎖または分枝鎖ポリマー誘導体化が使用される。複合化の程度は本抗体とＰＥＧ分子の適切な複合化を確保するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび質量分析によって密接にモニターできる。未反応のＰＥＧは、サイズ排除またはイオン交換クロマトグラフィーによって抗体−ＰＥＧ複合体から分離できる。ＰＥＧ誘導体化抗体は、当業者に周知の方法、例えば本明細書に記載のイムノアッセイを用いて、結合活性およびインビボでの効能を試験してよい。タンパク質をペグ化する方法は、当該技術分野において既知であり、本発明の抗体に適用できる。例えば、NishimuraらによるEP 0 154 316およびIshikawaらによるEP 0 401 384を参照されたい。
【０１７３】
他の修飾されたペグ化技術は、ｔＲＮＡシンセターゼおよびｔＲＮＡを含む再構成系を介して生合成タンパク質に化学的に特定された側鎖を導入する、再構成化学的直交操作技術（reconstituting chemically orthogonal directed engineering technology、ＲｅＣＯＤＥ  ＰＥＧ）を含む。この技術は、大腸菌、酵母および哺乳類細胞において３０個以上の新しいアミノ酸の取り込みを可能とする。ｔＲＮＡは非天然アミノ酸をアンバーコドンが位置する任意の位置で取り込み、アンバーを停止コドンから化学的に特定したアミノ酸の取り込みを伝達するものに変換する。
【０１７４】
組換えペグ化技術（ｒＰＥＧ）も血清半減期延長のために使用できる。この技術は、既存の医薬タンパク質の末尾に３００〜６００アミノ酸の構造不定のタンパク質を遺伝的に融合することを含む。かかる構造不定のタンパク質鎖の見掛けの分子量はその実際の分子量よりも約１５倍大きいため、該タンパク質の血清半減期は大きく延長される。化学的複合化および再精製を必要とする常套のＰＥＧ化とは違って、製造プロセスがかなり単純化され、産物が均一である。
【０１７５】
ポリシアル化がもう一つの技術であり、これは天然ポリマーポリシアル酸（ＰＳＡ）を用いて活性時間を延長し、治療ペプチドおよびタンパク質の安定性を改善する。ＰＳＡはシアル酸（糖）のポリマーである。タンパク質および治療ペプチド薬物送達に使用する場合、ポリシアル酸は、抱合により保護的な微小環境を提供する。これは循環中の治療タンパク質の活性時間を延長し、免疫系に認識されるのを防ぐ。ＰＳＡポリマーは人体において天然に見出される。これはある種の細菌によって採用されており、細胞壁を被覆するために数百万年にわたって進化させてきた。これらの天然ポリシアル化細菌は、分子擬態のために、体の防御システムの追跡を免れることができる。天然の究極のステルス技術であるＰＳＡは、かかる細菌から大量に、所定の物理的特徴で容易に製造できる。細菌のＰＳＡは、人体のＰＳＡと化学的に同一であるため、タンパク質と結合させても、完全に非免疫原性である。
【０１７６】
別の技術は抗体と結合したヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）誘導体の使用を含む。ＨＥＳはロウトウモロコシ（waxy maize）デンプン由来の修飾された天然ポリマーであり、体の酵素によって代謝できる。ＨＥＳ溶液は通常、不充分な血液量を代替し、血液のレオロジー特性を改善するために投与される。抗体のＨＥＳ化は、分子の安定性の上昇および腎クリアランスの低下によって循環半減期の延長を可能とし、増加した生物学的活性をもたらす。様々なパラメーター、例えばＨＥＳの分子量を変化させることで、広範なＨＥＳ抗体複合体を設計できる。
【０１７７】
延長されたインビボでの半減期を有する抗体は、ＩｇＧ定常ドメインまたはそのＦｃＲｎ結合フラグメント（好ましくはＦｃまたはヒンジＦｃドメインフラグメント）に１個以上のアミノ酸修飾（すなわち置換、挿入または欠失）を導入して作成してもよい。例えば国際公開WO 98/23289；国際公開WO 97/34631；および米国特許6,277,375を参照されたい。
【０１７８】
さらに、インビボでより安定であるかまたはインビボで延長された半減期を有する抗体または抗体フラグメントを作成するために、抗体をアルブミン（例えばヒト血清アルブミン：ＨＳＡ）と複合化してよい。この技術は当該技術分野で周知であり、例えば国際公開WO 93/15199、WO 93/15200およびWO 01/77137；欧州特許EP 413,622を参照されたい。さらに、上記二重特異的抗体の文脈において、本抗体の特異性は、本抗体の１個の結合ドメインがＣ３ｂと結合するが、本抗体の第２の結合ドメインが血清アルブミン、好ましくはＨＳＡと結合するように設計されうる。
【０１７９】
半減期を延長する戦略は、ナノ抗体、フィブロネクチンベースのバインダーおよびインビボでの半減期延長が望まれる他の抗体またはタンパク質において特に有用である。
【０１８０】
抗体複合体
本発明は、融合タンパク質を作成するための異種タンパク質またはポリペプチド（またはそのフラグメント、好ましくは少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００アミノ酸）と組換え的に融合または化学的に複合化（共有結合および非共有結合を含む）した、Ｃ３ｂタンパク質と特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを提供する。特に、本発明は、本明細書に記載の抗体の抗原結合フラグメント（例えばＦａｂフラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメント、ＶＨドメイン、ＶＨ ＣＤＲ、ＶＬドメインまたはＶＬ ＣＤＲ）および異種タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを含む融合タンパク質を提供する。タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドと抗体または抗体フラグメントを融合または複合化する方法は、当該技術分野で既知である。例えば米国特許5,336,603、5,622,929、5,359,046、5,349,053、5,447,851および5,112,946；欧州特許EP 307,434およびEP 367,166；国際公開WO 96/04388およびWO 91/06570； Ashkenazi et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10535-10539; Zheng et al., 1995, J. Immunol. 154:5590-5600;ならびにVil et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337- 11341を参照されたい。
【０１８１】
さらなる融合タンパク質は、遺伝子シャッフル、モチーフシャッフル、エキソンシャッフルおよび／またはコドンシャッフル（集合的にＤＮＡシャッフルと称する）の技術によって作成できる。ＤＮＡシャッフルは、本発明の抗体またはそのフラグメントの活性を変化するために使用できる（例えばより高い親和性および低い解離速度を有する抗体またはそのフラグメント）。一般に、米国特許5,605,793、5,811,238、5,830,721、5,834,252および5,837,458； Patten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33; Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16(2):76-82; Hansson, et al., 1999, J. Mol. Biol. 287:265-76; ならびに Lorenzo and Blasco, 1998, Biotechniques 24(2):308- 313を参照されたい（これらの特許および文献はそれぞれ、その全体について参照により本明細書に組み込む）。抗体もしくはそのフラグメントまたはコードされる抗体またはそのフラグメントは、組換え前に誤りがちなＰＣＲ、ランダムヌクレオチド挿入または他の方法によって、ランダム突然変異に供して変化させてもよい。Ｃ３ｂタンパク質と特異的に結合する抗体またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドは、１個以上の異種分子の１個以上の成分、モチーフ、セクション、部分、ドメイン、フラグメント等で組み換えてよい。
【０１８２】
さらに、本抗体またはそのフラグメントは、精製を促進するペプチドのようなマーカー配列と融合してもよい。好ましい態様において、マーカーアミノ酸配列は、ｐＱＥベクター(QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311)において提供されるタグのようなヘキサヒスチジンペプチドであり、とりわけ、それらの多くは商業的に入手可能である。Gentz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824に記載のとおり、例えばヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。精製に有用な他のペプチドタグは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する赤血球凝集素（ＨＡ）タグ（Wilson et al., 1984, Cell 37:767）および「フラッグ」タグを含むが、これらに限定されない。
【０１８３】
他の態様において、本発明の抗体またはそのフラグメントは、診断または検出剤と複合化される。かかる抗体は臨床的試験手法、例えば特定の治療の有効性の決定の一部として、疾患または障害の発生、発症、進行および／または重症度をモニタリングまたは予後診断するために有用であり得る。かかる診断および検出は下記検出物質と交代をカップリングして実施可能である：ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼ等を含むがこれらに限定されない多様な酵素；ストレプトアビジンビオチンおよびアビジン／ビオチンを含むがこれらに限定されない補欠分子族；ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンを含むがこれらに限定されない蛍光物質；ルミノールを含むがこれに限定されない発光物質；ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンを含むがこれらに限定されない生物発光物質；ヨウ素（131I、125I、123Iおよび121I）、炭素（14C）、硫黄（35S）、チタン（3H）、インジウム（115In、113In、112Inおよび111In）、テクネチウム（99Tc）、タリウム（201Ti）、ガリウム（68Ga、67Ga）、パラジウム（103Pd）、モリブデン（99Mo）、キセノン（133Xe）、フッ素（18F）、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Snおよび117Tinを含むがこれらに限定されない放射活性物質；ならびに多様な陽電子放出断層撮影に用いる陽電子放出物質および非放射性常磁性金属イオン。
【０１８４】
本発明はさらに、治療物質と複合化した抗体またはそのフラグメントを含む。抗体またはそのフラグメントは、治療物質、例えば細胞傷害剤、例えば細胞分裂阻害剤もしくは細胞破壊剤、治療剤または放射性金属イオン、例えばアルファエミッターと複合化してよい。細胞傷害剤は、細胞に有害なあらゆる物質を含む。
【０１８５】
さらに、抗体またはそのフラグメントは、所定の生物学的応答を修飾する治療物質または薬物と複合化してもよい。治療物質または薬物は、伝統的な化学治療剤に限定されない。例えば薬物は、所望の生物学的活性を有するタンパク質、ペプチドまたはポリペプチドであってよい。かかるタンパク質は、例えば、毒素、例えばアブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、コレラ毒素またはジフテリア毒素；タンパク質、例えば腫瘍壊死因子、αインターフェロン、βインターフェロン、神経増殖因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノーゲンアクチベーター、アポトーシス剤、抗血管形成剤；または生物学的応答修飾物質、例えばリンホカインを含みうる。
【０１８６】
さらにまた、抗体は、放射性金属イオン、例えばアルファエミッター、例えば213Biまたは131In、131LU、131Y、131Ho、131Smを含むがこれらに限定されない放射性金属イオンとポリペプチドの複合化に有用な大環状キレート剤のような治療物質と複合化してもよい。ある態様において、大環状キレート剤は、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）であり、これはリンカー分子を介して本抗体と結合しうる。かかるリンカー分子は当該技術分野で一般に既知でありDenardo et al., 1998, Clin Cancer Res. 4(10):2483-90; Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10(4):553-7; および Zimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol. 26(8):943-50に記載されている（各々全体につき参照により本明細書に組み込む）。
【０１８７】
抗体に治療分子を複合化する技術は周知であり、例えばArnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”, in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985)および Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58を参照されたい。
【０１８８】
抗体は個体支持体に結合していてもよく、これはイムノアッセイまたは標的抗原の精製にとりわけ有用である。かかる個体支持体は、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、塩化ポリビニルまたはポリプロピレンを含むが、これらに限定されない。
【０１８９】
本発明の抗体の製造方法
抗体をコードする核酸
本発明は、上記Ｃ３ｂ結合抗体鎖のセグメントまたはドメインを含むポリペプチドをコードする、実質的に精製された核酸分子を提供する。本発明の核酸のいくつかは、配列番号７、２１、３５、４９、６３、７７、９１、１０５、１１９、１３３、１４７、１６１、１７５および１８９に示される重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列、および／または配列番号８、２２、３６、５０、６４、７８、９２、１０６、１２０、１３４、１４８、１６２、１７６に示される軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む。具体的な態様において、核酸分子は、表１に同定されたものである。他の本発明の核酸分子のいくつかは、表１に同定されたもののヌクレオチド配列と実質的に（例えば少なくとも６５、８０％、９５％または９９％）同一であるヌクレオチド配列を含む。適切な発言ベクターから発現される場合、これらのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、Ｃ３ｂ抗原結合能を示しうる。
【０１９０】
上記Ｃ３ｂ結合抗体の重鎖または軽鎖由来の少なくとも１個のＣＤＲ領域、通常３個全てのＣＤＲ領域をコードするポリヌクレオチドも、本発明において提供する。他のポリヌクレオチドどのいくつかは、上記Ｃ３ｂ結合抗体の重鎖および／または軽鎖の可変領域の全てまたは実質的に全てをコードする。コードの縮重のため、多様な核酸配列が各免疫グロブリンアミノ酸配列をコードする。
【０１９１】
本発明の核酸分子は、抗体の可変領域お呼び定常領域の両方をコードしてもよい。本発明の核酸配列のいくつかは、配列番号９、２３、３７、５１、６５、７９、９３、１０７、１２１、１３５、１４９、１６３、１７７および１９１に記載の成熟重鎖配列と実質的に（例えば少なくとも８０％、９０％または９９％）同一の成熟重鎖配列をコードするヌクレオチドを含む。他の核酸配列のいくつかは、配列番号１０、２４、３８、５２、６６、８０、９４、１０８、１２２、１３６、１５０、１６４、１７８および１９２に記載の成熟軽鎖配列と実質的に（例えば少なくとも８０％、９０％または９９％）同一の成熟軽鎖配列をコードするヌクレオチドを含む。
【０１９２】
ポリヌクレオチド配列は、新規固相ＤＮＡ合成あるいはＣ３ｂ結合抗体またはその結合フラグメントをコードする既存の配列（例えば下記実施例に記載の配列）のＰＣＲ突然変異誘発によって作成できる。核酸の直接化学合成は、当該技術分野で既知の方法、例えばNarang et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:90のホスホトリエステル法；Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109, 1979のホスホジエステル法；Beaucage et al., Tetra. Lett., 22:1859, 1981のジエチルホスホラミダイト法；および米国特許4,458,066の固体支持法によって実施しうる。ＰＣＲによるポリヌクレオチド配列への変異の導入は、例えばPCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H.A. Erlich (Ed.), Freeman Press, NY, NY, 1992; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al. (Ed.), Academic Press, San Diego, CA, 1990; Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19:967, 1991;およびEckert et al., PCR Methods and Applications 1:17, 1991に記載のとおりに実施できる。
【０１９３】
上記Ｃ３ｂ結合抗体を製造するための発現ベクターおよび宿主細胞も本発明において提供される。Ｃ３ｂ結合抗体鎖または結合フラグメントをコードするポリヌクレオチドを発現するため、多様な発現ベクターが使用できる。哺乳類宿主細胞において抗体を製造するため、ウイルス性および非ウイルス性発現ベクターのいずれをも使用できる。非ウイルス性ベクターおよび系は、プラスミド、典型的にはタンパク質もしくはＲＮＡを発現するための発現カセットを有する、エピソームベクターおよびヒト人工染色体（例えばHarrington et al., Nat Genet 15:345, 1997参照）を含む。例えば、Ｃ３ｂ結合ポリヌクレオチおよびポリペプチドの哺乳類（例えばヒト）細胞での発現に有用な非ウイルス性ベクターは、pThioHis A、B & C、pcDNA3.1/His、pEBVHis A、B & C、(Invitrogen, San Diego, CA)、MPSVベクターおよび他のタンパク質を発現するために当該技術分野で既知の多様な他のベクターを含む。有用なウイルス性ベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ＳＶ４０に基づくベクター、パピローマウイルス、HBP Epstein Barrウイルス、ワクシニアウイルスベクターおよびSemliki Forestウイルス（ＳＦＶ）を含む。Brent et al., supra; Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807, 1995;およびRosenfeld et al., Cell 68:143, 1992を参照されたい。
【０１９４】
発現ベクターの選択は、ベクターを発現させようとする意図する宿主細胞に依存する。典型的には、発現ベクターは、Ｃ３ｂ結合抗体鎖またはフラグメントをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結しているプロモーターおよび他の制御配列（例えばエンハンサー）を含む。いくつかの態様において、誘導性プロモーターを用いて、誘導条件下以外での挿入配列の発現を防止する。誘導性プロモーターは、例えばアラビノース、lacZ、メタロチオネインプロモーターまたは熱ショックプロモーターを含む。形質転換された生物の培養は、発現産物が宿主細胞によってより耐容性である配列をコードするために集団に圧力を加えることなしに、非誘導性条件下で拡大されうる。プロモーターに加えて、Ｃ３ｂ結合抗体またはフラグメントの効果的な発現のために、他の制御要素も必要または望まれる。これらの要素は典型的には、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接リボソーム結合部位または他の配列を含む。さらに、発現の効率は、使用する細胞系に適切なエンハンサーを含めることで向上しうる（例えばScharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20:125, 1994;およびBittner et al., Meth. Enzymol., 153:516, 1987参照）。例えば、ＳＶ４０エンハンサーまたはＣＭＶエンハンサーを使用して、哺乳類宿主細胞における発現を増加させうる。
【０１９５】
発現ベクターは、挿入したＣ３ｂ結合抗体配列によってコードされるポリペプチドとの融合タンパク質を形成する挿入シグナル配列位置も提供しうる。非常に多くの場合、挿入したＣ３ｂ結合抗体配列は、ベクターに含まれる前にシグナル配列と連結される。Ｃ３ｂ結合抗体軽鎖および重鎖可変ドメインをコードする配列を受け取るために使用されるベクターは、定常領域またはその一部をコードすることもある。かかるベクターは定常領域を有する融合タンパク質として可変領域の発現が可能であり、それによりインタクトな抗体またはそのフラグメントの製造を導く。典型的には、かかる定常領域はヒトである。
【０１９６】
Ｃ３ｂ結合抗体鎖を有し、そして発現する宿主細胞は、原核または真核細胞であってよい。大腸菌は、本発明のポリヌクレオチドをクローニングおよび発現するのに有用な原核宿主の一つである。使用に適した他の微生物宿主は、桿菌、例えば枯草菌（Bacillus subtilis）、および他の腸内細菌、例えばサルモネラ属（Salmonella）、セラチア属（Serratia）および多様なシュードモナス属（Pseudomonas）を含む。これらの原核宿主において、典型的には宿主細胞に適合性の発現制御配列（例えば複製起点）を含む発現ベクターも作成できる。さらに、任意の数の多様な周知のプロモーター、例えばラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、ベータラクトースプロモーター系またはファージラムダ由来のプロモーター系が存在している。プロモーターは典型的には、所望によりオペレーター配列で、発現を制御し、転写および翻訳を開始し完了するためのリボソーム結合部位などを有する。酵母のような他の微生物は、本発明のＣ３ｂ結合ポリペプチドを発現するために使用できる。バキュロウイルスベクターと組み合わせた昆虫細胞も使用できる。
【０１９７】
いくつかの好ましい態様において、哺乳類宿主細胞を使用して本発明のＣ３ｂ結合ポリペプチドを発現し、製造する。例えば、それは内因性免疫グロブリン遺伝子を発現するハイブリドーマ細胞系（例えば実施例に記載の1D6.C9 骨髄腫ハイブリドーマクローン）または異種発現ベクターを有する哺乳類細胞系（例えば以下に例示するSP2/0 骨髄腫細胞）であってよい。これらはあらゆる通常の不死でないかあるいは通常もしくは異常な不死動物またはヒト細胞系を含む。例えば、インタクトな免疫グロブリンを分泌できる多数の好適な宿主細胞系、例えばＣＨＯ細胞系、多様なＣｏｓ細胞系、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞系、形質転換Ｂ細胞およびハイブリドーマが開発されている。ポリペプチドを発現するための哺乳類組織細胞培養の使用は、一般に、例えばWinnacker, FROM GENES TO CLONES, VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987に記載されている。哺乳類宿主細胞のための発現ベクターは、発現制御配列、例えば複製起点、プロモーターおよびエンハンサー（例えばQueen, et al., Immunol. Rev. 89:49-68, 1986参照）ならびに必要なプロセッシング情報部位、例えばリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライシング部位、ポリアデニル化部位および転写終止配列を含みうる。これらの発現ベクターは、通常、哺乳類遺伝子または哺乳類ウイルス由来のプロモーターを含む。好適なプロモーターは、構造性、細胞タイプ特異的、ステージ特異的、そして／または調節可能もしくは制御可能でありうる。有用なプロモーターは、メタロチオネインプロモーター、構造性アデノウイルス後期プロモーター、デキサメタゾン誘導性ＭＭＴＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＭＲＰ polIIIプロモーター、構造性ＭＰＳＶプロモーター、テトラサイクリン誘導性ＣＭＶプロモーター（例えばヒト初期ＣＭＶプロモーター）、構造性ＣＭＶプロモーターおよび当該技術分野で既知のプロモーターとエンハンサーの組合せを含むが、これらに限定されない。
【０１９８】
目的のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを導入する方法は、細胞宿主のタイプに依存して変化する。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションは一般に、原核細胞について利用されるが、一方で、リン酸カルシウム処置またはエレクトロポレーションは他の細胞宿主に使用できる（一般に、Sambrook, et al., supra参照）。他の方法は、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム処置、リポソーム介在形質転換、インジェクションおよびマイクロインジェクション、弾道法、ビロソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン：核酸複合体、裸ＤＮＡ、人工ビリオン、ヘルペスウイルス構造タンパク質ＶＰ２２との融合体（Elliot and O'Hare, Cell 88:223, 1997）、ＤＮＡの薬剤向上取り込みおよびエクスビボ形質導入、組換えタンパク質の長期間高収率生産のために、安定な発現がしばしば望まれる。例えば、Ｃ３ｂ結合抗体鎖または結合フラグメントを安定的に発現する細胞系は、ウイルス性複製起点または異種発現要素および選択マーカー遺伝子を含む本発明の発現ベクターを用いて製造できる。ベクターの導入後、富化培地中で細胞を１〜２日間増殖させた後、選択培地に移す。選択マーカーの目的は、選択に対する耐性を与えることであり、その存在が選択培地中で導入した配列の発現に成功している細胞の増殖を可能とする。耐性の安定にトランスフェクトされた細胞は、細胞タイプに適切な組織培養技術を用いて増殖できる。
【０１９９】
本発明のモノクローナル抗体の作成
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、常套のモノクローナル抗体方法論、例えばKohler and Milstein, 1975 Nature 256: 495の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技術を含む多様な技術によって作成できる。モノクローナル抗体を作成するための多くの技術、例えばＢリンパ球のウイルス性または発がん性形質転換が使用できる。
【０２００】
ハイブリドーマを作成するための動物系は、マウス系である。マウスにおけるハイブリドーマ作成は、十分に確立された方法である。融合体についての免疫化プロトコルおよび免疫した脾細胞の単離のための技術は、当該技術分野で既知である。融合パートナー（例えばマウス骨髄腫細胞）および融合手法も既知である。
【０２０１】
本発明のキメラまたはヒト化抗体は、上記の通りに製造したマウスモノクローナル抗体の配列に基づいて作成できる。重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡは、目的のマウスハイブリドーマから得られ、非マウス（例えばヒト）免疫グロブリン配列を含むように、標準的な分子生物学の技術を用いて操作できる。例えばキメラ抗体を作成するために、当該技術分野で既知の方法を用いて、マウス可変領域をヒト定常領域と連結させることができる（例えばCabilly et al.の米国特許4,816,567参照）。ヒト化抗体を作成するために、当該技術分野で既知の方法を用いて、マウスＣＤＲ領域を一フレームワークに挿入できる。例えばWinterの米国特許5225539およびQueen et al.の米国特許5530101； 5585089；5693762および6180370を参照されたい。
【０２０２】
ある態様において、本発明の抗体はヒトモノクローナル抗体である。かかるＣ３ｂに対するヒトモノクローナル抗体は、マウス系よりもヒト免疫系の一部を担持するトランスジェニックまたはトランスクロモソームマウスを用いて作成できる。これらのトランスジェニックおよびトランスクロモソームマウスは、それぞれＨｕＭＡｂマウスおよびＫＭマウスと本明細書において称するマウスを含み、集合的に、「ヒトＩｇマウス」と称する。
【０２０３】
ＨｕＭＡｂマウス（登録商標）(Medarex, Inc.)は、内因性μおよびκ鎖遺伝子座を不活性化する標的突然変異と共に、再配列されていないヒト重鎖（μおよびγ）およびκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子小座を含む（例えばLonberg, et al., 1994 Nature 368(6474): 856-859参照）。したがって、マウスはマウスＩｇＭまたはκの低下した発現を示し、免疫化に応答して、導入したヒト重鎖および軽鎖トランスジーンがクラススイッチおよび体細胞変異を起こして、高い親和性のヒトＩｇＧκモノクローナルを作成する（Lonberg, N. et al., 1994 supra; reviewed in Lonberg, N., 1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D., 1995 Intern. Rev. Immunol.13: 65-93およびHarding, F. and Lonberg, N., 1995 Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546）。ＨｕＭＡｂマウスの作成および使用ならびにかかるマウスによって担持されるゲノム修飾は、Taylor, L. et al., 1992 Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et at., 1993 International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3720-3724; Choi et al., 1993 Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al., 1993 EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al., 1994 J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al., 1994 International Immunology 579-591;およびFishwild, D. et al., 1996 Nature Biotechnology 14: 845-851にさらに説明されており、それらの全体について、その全内容を参照により本明細書に組み込む。さらに、Lonbergと Kayの米国特許5,545,806； 5,569,825； 5,625,126； 5,633,425； 5,789,650； 5,877,397； 5,661,016； 5,814,318； 5,874,299；および5,770,429；Surani et al.の米国特許5,545,807；Lonbergと KayのＰＣＴ公開公報WO 92103918、WO 93/12227、WO 94/25585、WO 97113852、WO 98/24884およびWO 99/45962；ならびにKorman et al.のＰＣＴ公開公報WO 01/14424を参照されたい。
【０２０４】
他の態様において、本発明のヒト抗体は、ヒト重鎖トランスジーンおよびヒト軽鎖トランスクロモソームを担持するマウスのようなトランスジーンおよびトランスクロモソーム上にヒト免疫グロブリン配列を担持するマウスを用いて、産生できる。かかるマウスは、本明細書において「ＫＭマウス」と称し、Ishida et al.のＰＣＴ公開公報WO 02/43478に詳細に記載されている。
【０２０５】
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する別のトランスジェニック動物系が当該技術分野で利用可能であり、本発明のＣ３ｂ結合抗体の産生に使用できる。例えば、Xenomouse(Abgenix, Inc.)と称される別のトランスジェニック系が使用できる。かかるマウスは、例えばKucherlapati et al.の米国特許5,939,598； 6,075,181； 6,114,598； 6、150,584および6,162,963に記載されている。
【０２０６】
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する別のトランスクロモソーム動物系が当該技術分野で利用可能であり、本発明のＣ３ｂ結合抗体の産生に使用できる。例えば、「ＴＣマウス」と称されるヒト重鎖トランスクロモソームおよびヒト軽鎖トランスクロモソームの両方を担持するマウスが使用でき、かかるマウスはTomizuka et al., 2000 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727に記載されている。さらに、ヒト重鎖および軽鎖トランスクロモソームを担持するウシが当該技術分野で既知であり（Kuroiwa et al., 2002 Nature Biotechnology 20:889-894）、本発明のＣ３ｂ結合抗体の産生に使用できる。
【０２０７】
本発明のヒトモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子のスクリーニングライブラリーのファージディスプレイ法を用いて作成してもよい。ヒト抗体を単離するためのかかるファージディスプレイ法は、当該技術分野で確立されており、下記実施例に記載されている。例えばLadner et al.の米国特許5,223,409； 5,403,484および5,571,698；Dower et al.の米国特許5,427,908および5,580,717；McCafferty et al.の米国特許5,969,108および6,172,197 ；Griffiths et al.の米国特許5,885,793； 6,521,404； 6,544,731； 6,555,313； 6,582,915および6,593,081を参照されたい。
【０２０８】
本発明のヒトモノクローナル抗体はまた、ヒト抗体応答が免疫化によって作成されうるようにヒト免疫細胞が再構築されているＳＣＩＤマウスを用いて作成できる。かかるマウスは、例えばWilson et al.の米国特許5,476,996および5,698,767に記載されている。
【０２０９】
フレームワークまたはＦｃ操作
操作された本発明の抗体は、例えば抗体の特性を改善するために、ＶＨおよび／またはＶＬ内のフレームワーク残基に修飾が施されているものを含む。典型的には、かかるフレームワーク修飾は、抗体の免疫原性を低下させるために行われる。例えば一つのアプローチは、１個以上のフレームワーク残基を対応する生殖系列配列に「戻し突然変異」することである。より具体的には、体細胞突然変異を起こした抗体が、その抗体が由来する生殖系列配列とは異なるフレームワーク残基を含みう。かかる残基は、抗体フレームワーク配列と該抗体が由来する生殖系列配列を比較することで同定できる。フレームワーク領域配列をその生殖系列立体配置に戻すため、体細胞突然変異は、例えば部位特異的突然変異誘発による生殖系列配列への「戻し変異」であり得る。かかる「戻し突然変異」された抗体も、本発明に含まれる。
【０２１０】
別のタイプのフレームワーク修飾は、フレームワーク領域内または１個以上のＣＤＲ領域内でのＴ細胞エピトープを除去する突然変異を含み、それによって抗体の潜在的な免疫原性を低下させる。このアプローチは「脱免疫化」とも称され、Carr et al.の米国特許公開20030153043に詳細に記載されている。
【０２１１】
フレームワークまたはＣＤＲ領域内で行われる修飾に加えてまたはそれとは別に、本発明の抗体は、典型的には抗体の１個以上の機能的特徴、例えば血清半減期、補体結合、Ｆｃレセプター結合および／または抗原依存的細胞傷害性を変化するために、Ｆｃ領域内の修飾を含むように操作してよい。さらに、本発明の抗体は、化学的に修飾（例えば１個以上の化学的部分を抗体に取り付けることができる）するかまたはそのグリコシル化を変化し、再度抗体の１個以上の機能的特徴を変化するために、修飾してもよい。これらの態様は各々以下にさらに詳細に記載する。Ｆｃ領域での残基の番号は、KabatのＥＵインデックスのものである。
【０２１２】
一つの態様において、ＣＨ１のヒンジ領域は、ヒンジ領域内のシステイン残基数が変化、例えば増加または減少するように修飾される。このアプローチはBodmer et al.の米国特許5,677,425にさらに記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域内のシステイン残基数を変化して、例えば、軽鎖と重鎖の会合を促進し、あるいは抗体の安定性を上昇もしくは低下する。
【０２１３】
他の態様において、抗体のＦｃヒンジ領域は、抗体の生物学的半減期を低下させるために変異させる。より具体的には、抗体が天然のＦｃヒンジドメインＳｐＡ結合と比べて欠損したブドウ球菌（Staphylococcyl）プロテインＡ（ＳｐＡ）結合を有するように、１個以上のアミノ酸変異がＦｃヒンジフラグメントのＣＨ２−ＣＨ３ドメイン界面領域に導入される。このアプローチは、Ward et al.の米国特許6,165,745にさらに記載されている。
【０２１４】
他の態様において、抗体を修飾してその生物学的半減期を上昇させる。多様なアプローチが可能である。例えば、Wardの米国特許6,277,375に記載のとおり、下記変異の１つ以上を導入できる：T252L、T254S、T256F。あるいは、生物学的半減期を上昇させるために、Presta et al.の米国特許5,869,046および6,121,022に記載のとおり、ＣＨ１またはＣＬ領域内で抗体を変化させて、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２個のループから得たサルベージレセプター結合エピトープを含める。
【０２１５】
さらに別の態様において、少なくとも１個のアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置換してＦｃ領域を変化させて、抗体のエフェクター機能を変化させる。例えば、１個以上のアミノ酸を異なるアミノ酸残基で置換して、抗体がエフェクターリガンドについて変化した親和性を有するが親抗体の抗原結合能を保持するようにできる。親和性が変化されるエフェクターリガンドは、例えばＦｃレセプターまたは補体のＣ１成分であってよい。このアプローチは、Winter et al.の米国特許5,624,821および5,648,260にさらに詳細に記載されている。
【０２１６】
他の態様において、アミノ酸残基から選択される１個以上のアミノ酸は、抗体が変化したＣ１ｑ結合および／または低下もしくは消滅した補体依存的細胞傷害性（ＣＤＣ）を有するように、異なるアミノ酸残基で置換されていてよい。このアプローチはIdusogie et al.の米国特許6,194,551にさらに詳細に記載されている。
【０２１７】
他の態様において、１個以上のアミノ酸残基が変化されて、それによって抗体の補体を固定化する能力を変化させる。このアプローチは、Bodmer et al.のＰＣＴ公開公報WO 94/29351にさらに詳細に記載されている。
【０２１８】
さらに別の態様において、Ｆｃ領域は、１個以上のアミノ酸を修飾して、抗体の抗体依存的細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を仲介する能力を向上しおよび／またはＦｃγレセプターに対する抗体の親和性を向上させるために、修飾される。このアプローチはPrestaのＰＣＴ公開公報WO 00/42072にさらに詳細に記載されている。さらに、ＦｃγＲｌ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃＲｎに対するヒトＩｇＧ１上の結合部位がマッピングされており、改善された結合を有する変異体が記載されている（Shields, R.L. et al., 2001 J. Biol. Chen. 276:6591-6604参照）。
【０２１９】
さらに別の態様において、抗体のグリコシル化が修飾される。例えば、非グリコシル化抗体を作成する（すなわち抗体がグリコシル化を欠く）。グリコシル化は、例えば抗体の「抗原」に対する親和性を上昇させるために変化されうる。かかる糖修飾は、例えば、抗体配列内の１個以上のグリコシル化部位を変化することによって実施できる。例えば、１個以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位の削除をもたらし、それによってこの部位でのグリコシル化を削除する、１個以上のアミノ酸置換が行われうる。かかる非グリコシル化は、抗体の抗原に対する親和性を上昇させることがある。かかるアプローチは、Co et al.の米国特許5,714,350および6,350,861にさらに詳細に記載されている。
【０２２０】
さらにまたはあるいは、グリコシル化のタイプが変化した抗体、例えばフコシル残基の量が減少している低フコシル化抗体または増加した二分ＧｌｃＮａｃ構造を有する抗体を作成できる。かかる変化したグリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能を増加することが示されている。かかる糖修飾は、例えば、別のグリコシル化機構を有する宿主細胞において抗体を発現することによって、実施しうる。別のグリコシル化機構を有する細胞は、当該技術分野において記載されており、本発明の組換え抗体を発現し、それによって変化したグリコシル化を有する抗体を産生する宿主細胞として使用できる。例えば、Hang et al.のEP 1,176,195は、細胞系で発現される抗体が低フコシル化を示すように、フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子が機能的に破壊されている細胞系を記載している。PrestaによるＰＣＴ公開公報WO 03/035835は、Ａｓｎ（２９７）結合糖にフコースを結合させる能力が低下し、また宿主細胞において発現される抗体の低フコシル化をもたらすＣＨＯ細胞系変異体であるＬｅｃｌ３細胞を記載している（Shields, R.L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740も参照）。UmanaらによるＰＣＴ公開公報WO 99/54342は、細胞系で発現される抗体が増加した二分ＧｌｃＮａｃ構造を示し、該抗体の増加したＡＤＣＣ活性をもたらすように、糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ（例えばベータ（１，４））−ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎｔＩＩＩ））を発現するように操作された細胞系を記載している（Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176-180も参照）。
【０２２１】
改変された抗体を操作する方法
上記の通り、本明細書に示すＶＨおよびＶＬ配列または全長重鎖および軽鎖配列を有するＣ３ｂ結合抗体を用いて、全長重鎖および／または軽鎖配列、ＶＨおよび／またはＶＬ配列、またはそれに結合した定常領域を修飾して、新たなＣ３ｂ結合抗体を作成できる。したがって、本発明の別の局面において、本発明のＣ３ｂ結合抗体の構造的特徴を用いて、本発明の抗体の少なくとも１個の機能的特徴、例えばヒトＣ３ｂとの結合およびＣ３ｂの１個以上の機能的特徴の阻害（例えば溶血アッセイにおける赤血球溶解の阻害）を保持する、構造的に関連したＣ３ｂ結合抗体を作成する。
【０２２２】
例えば、本発明の抗体またはその変異体の１個以上のＣＤＲ領域を既知のフレームワーク領域および／または他のＣＤＲと組換え的に結合して、上記の通り、本発明のさらなる組換え操作されたＣ３ｂ結合抗体を作成できる。他のタイプの修飾は、前のセクションに記載のものを含む。操作方法の出発物質は、本明細書で提供されるＶＨおよび／またはＶＬ配列の１個以上またはそのＣＤＲ配列の１個以上である。操作された抗体を作成するためには、本明細書で提供されるＶＨおよび／またはＶＬ配列の１個以上またはそのＣＤＲ配列の１個以上を有する抗体を実際に作成する（すなわちタンパク質として発現する）必要はない。むしろ、配列に含まれる情報を出発物質として用いて、元の配列に由来する「第二世代」配列を作成し、当該「第二世代」配列が調製され、タンパク質として発現される。
【０２２３】
したがって、他の態様において、本発明は、配列番号１、１５、２９、４３、５７、７１、８５、９９、１１３、１２７、１４１、１５５、１６９および１８３からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号２、１６、３０、４４、５８、７２、８６、１００、１１４、１２８、１４２、１５６、１７０および１８４からなる群から選択されるＣＤＲ２配列、および／または配列番号３、１７、３１、４５、５９、７３、８７、１０１、１１５、１２９、１４３、１５７、１７１および１８５からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を有する重鎖可変領域抗体配列；ならびに配列番号４、１８、３２、４６、６０、７４、８８、１０２、１１６、１３０、１４４、１５８、１７２および１８６からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号５、１９、３３、４７、６１、７５、８９、１０３、１１７、１３１、１４５、１５９、１７３および１８７からなる群から選択されるＣＤＲ２配列、および／または配列番号６、２０、３４、４８、６２、７６、９０、１０４、１１８、１３２、１４６、１６０、１７４および１８８からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を有する軽鎖可変領域抗体配列からなるＣ３ｂ結合抗体を作成する方法であって；重鎖可変領域抗体配列および／または軽鎖可変領域抗体配列内の少なくとも１個のアミノ酸残基を変化させて、少なくとも１個の変化した抗体配列を作成し；そして変化した抗体配列をタンパク質として発現させる、方法を提供する。
【０２２４】
したがって、他の態様において、本発明は、配列番号９、２３、３７、５１、６５、７９、９３、１０７、１２１、１３５、１４９、１６３、１７７および１９１からなる群から選択される配列を有する全長重鎖抗体配列；ならびに配列番号１０、２４、３８、５２、６６、８０、９４、１０８、１２２、１３６、１５０、１６４、１７８および１９２からなる群から選択される配列を有する全長軽鎖抗体配列からなる、哺乳類細胞における発現に最適化されたＣ３ｂ結合抗体を作成する方法であって；全長重鎖抗体配列および／または全長軽鎖抗体配列内の少なくとも１個のアミノ酸残基を変化させて、少なくとも１個の変化した抗体配列を作成し；そして変化した抗体配列をタンパク質として発現させる、方法を提供する。
【０２２５】
変化した抗体配列は、固定されたＣＤＲ３配列またはUS20050255552に記載の最小必須結合決定部分およびＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列の多様性を有する抗体ライブラリーをスクリーニングして、作成してもよい。スクリーニングは、抗体ライブラリーから抗体をスクリーニングするための適切なスクリーニング技術のいずれか、例えばファージディスプレイ技術に従って、実施できる。
【０２２６】
標準的な分子生物学技術を用いて、変化した抗体配列を作成し、発現させることができる。変化した抗体配列によってコードされる抗体は、本明細書に記載のＣ３ｂ結合抗体の１個、数個または全ての機能的特性を保持するものであり、ここで該機能的特性は、ヒトおよび／またはカニクイザルＣ３ｂとの特異的結合；および溶血アッセイにおける赤血球溶解の阻害を含むがこれらに限定されない。
【０２２７】
変化した抗体の機能的特性は、当該技術分野において利用可能でありそして／または本明細書に記載の標準的なアッセイ、例えば実施例に記載のもの（例えばＥＬＩＳＡ）を用いて、評価できる。
【０２２８】
本発明の抗体を操作する方法のある態様において、Ｃ３ｂ結合抗体コーディング配列の全部または一部にわたってランダムにまたは選択的に変異を挿入でき、そして得られた修飾Ｃ３ｂ結合抗体は、結合活性および／または本明細書に記載の他の機能的特性についてスクリーニングされうる。変異方法は当該技術分野において記載されている。例えば、ShortによるＰＣＴ公開公報WO 02/092780は、飽和突然変異誘発、合成ライゲーションアセンブリまたはそれらの組合せを用いた抗体変異体の作成およびスクリーニング法を記載している。あるいは、LazarらによるＰＣＴ公開公報WO 03/074679は、抗体の物理化学的特性を最適化するための計算スクリーニング法を用いる方法を記載している。
【０２２９】
本発明の抗体の特徴付け
本発明の抗体は多様な機能的アッセイによって特徴付けられる。例えば、溶血アッセイにおける赤血球溶解を阻害するその能力、Ｃ３ｂタンパク質（例えばヒトおよび／またはカニクイザルＣ３ｂ）との親和性、Ｃ３ａまたはＣ５ａ産生を阻害する能力、、Ｃ３ｂ沈着を阻害する能力、エピトープ結合、タンパク質分解に対する耐性、および完全カスケードを阻止する能力、例えばＭＡＣ形成を阻害する能力によって、特徴付けられる。
【０２３０】
補体系分子の存在および補体系の活性化を測定するために多様な方法が使用できる（例えば米国特許6,087,120；およびNewell et al., J Lab Clin Med, 100:437-44, 1982参照）。例えば、補体活性は、(i) 赤血球の補体介在溶解（溶血）の阻害；(ii) Ｃ３またはＣ５切断を阻害する能力の測定；および(iii) 副経路介在溶血の阻害によって、モニターできる。
【０２３１】
２つの最も一般に使用される技術は、溶血アッセイ（例えばBaatrup et al., Ann Rheum Dis, 51:892-7, 1992参照）および免疫学的アッセイ（例えばAuda et al., Rheumatol Int, 10:185-9, 1990参照）である。溶血技術は、古典経路または副経路における全配列の機能的能力を測定する。免疫学的技術は、特定の補体成分または分裂産物のタンパク質濃度を測定する。本発明の方法において補体活性化を検出しあるいは補体成分の活性化を測定するために使用できる他のアッセイは、例えば、Ｔ細胞増殖アッセイ（Chain et al., J Immunol Methods, 99:221-8, 1987）および遅延タイプ過敏性（ＤＴＨ）アッセイ（Forstrom et al., 1983, Nature 303:627-629; Hallidayet al., 1982, in Assessment of Immune Status by the Leukocyte Adherence Inhibition Test, Academic, New York pp. 1-26; Koppi et al., 1982, Cell. Immunol. 66:394-406;および米国特許5,843,449）を含む。
【０２３２】
溶血技術において、全ての補体成分が存在し、機能的である必要がある。したがって、溶血技術は補体系の機能的完全性および欠損の両方をスクリーニングできる（例えばDijk et al., J Immunol Methods 36: 29-39, 1980; Minh et al., Clin Lab Haematol. 5:23-34 1983; およびTanaka et al., J Immunol 86: 161-170, 1986参照）。古典経路の機能的能力を測定するために、ヘモリシン（ヒツジ赤血球に対するウサギＩｇＧ）で被覆したヒツジ赤血球またはウサギ抗ニワトリ抗体で感作されたニワトリ赤血球が、標的細胞（感作細胞）として使用される。これらのＡｇ−Ａｂ複合体は、成分が機能的であり適切な濃度で存在する場合、古典経路を活性化し、標的細胞の溶解をもたらす。副経路の機能的能力を測定するため、ウサギ赤血球を標的細胞として使用する（例えば米国特許6,087,120参照）。
【０２３３】
抗体のＭＡＣ（膜侵襲複合体）形成を阻害する能力を試験するため、ＭＡＣ沈着アッセイが実施できる。簡潔には、副経路を活性化するためにザイモサンを使用でき、古典経路を活性化するためにＩｇＭを使用できる。Ｆａｂをヒト血清と共にプレインキュベートし、ザイモサンまたはＩｇＭで予め被覆したプレートに加える。ＭＡＣ沈着の阻害率は、各サンプルについて、ベースライン（ＥＤＴＡ処理ヒト血清）およびポジティブコントロール（ヒト血清）に対して計算できる。
【０２３４】
本発明の抗体の副経路における補体タンパク質Ｃ３を阻害する能力を試験することは、ザイモサン上に沈着したＣ３崩壊産物Ｃ３ｂの生成を測定することである。Ｃ３ｂ沈着を測定する具体的な方法は、下記実施例に詳述する。
【０２３５】
抗体のＣ５崩壊産物Ｃ５ａの生成を阻害する能力は、例えば、US Biologicsから入手可能なマウス抗ヒトＣ５ａ−ｄｅｓ−Ａｒｇ抗体のような、特定の抗Ｃ５ａ抗体を用いたＥＬＩＳＡアッセイによって測定できる。
【０２３６】
Ｃ３ｂと結合する抗体の能力は、目的の抗体を直接ラベルして検出でき、あるいは該抗体はラベルされていなくてもよく、当該技術分野で既知の多様なサンドイッチアッセイ形式を用いて間接的に検出できる。
【０２３７】
いくつかの態様において、本発明のＣ３ｂ結合抗体は、参照Ｃ３ｂ結合抗体とＣ３ｂポリペプチドの結合を阻止しまたはそれと競合する。これは上記完全ヒトＣ３ｂ結合抗体であってよい。これはまた、参照抗体と同じエピトープと結合する他のマウス、キメラまたはヒト化Ｃ３ｂ結合抗体であってもよい。参照抗体結合を阻止しまたはそれと競合する能力は、試験Ｃ３ｂ結合抗体が参照抗体によって定義されるものと同じまたは類似のエピトープと、あるいは参照Ｃ３ｂ結合抗体が結合するエピトープと十分に近接しているエピトープと結合することを示す。かかる抗体は、参照抗体について同定された有利な特性を共有している可能性が特に高い。参照抗体を阻止しまたはそれと競合する能力は、例えば競合結合アッセイによって測定できる。競合結合アッセイにより、試験抗体は、共通の抗原、例えばＣ３ｂポリペプチドと参照抗体の特異的結合を阻害する能力について試験される。過剰の試験抗体が実質的に参照抗体の結合を阻害する場合、試験抗体は抗原との特異的結合について参照抗体と競合する。実質的阻害は、試験抗体が参照抗体の特異的結合を通常少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％または９０％低下させることを意味する。
【０２３８】
Ｃ３ｂタンパク質との結合について、参照Ｃ３ｂ結合抗体とのＣ３ｂ結合抗体の競合を評価するために使用できる多数の既知の競合結合アッセイが存在する。例えば、固相直接または間接ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相直接または間接酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242-253, 1983参照）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614-3619, 1986参照）；固相直接標識化アッセイ、固相直接標識化サンドイッチアッセイ（Harlow & Lane, supra参照）；Ｉ−１２５ラベルを用いた固相直接ラベルＲＩＡ（Morel et al., Molec. Immunol. 25:7-15, 1988参照）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（Cheung et al., Virology 176:546-552, 1990）；および直接標識化ＲＩＡ（Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77-82, 1990）を含む。典型的には、かかるアッセイは、固体表面と結合した精製抗体または未標識化試験Ｃ３ｂ結合抗体および標識化参照抗体のいずれかを有する細胞の使用を含む。競合阻害は試験抗体の存在下での固体表面または細胞と結合したラベルの量を測定して測定される。通常、試験抗体は過剰に存在する。競合アッセイによって同定された抗体（競合抗体）は、参照抗体と同じエピトープと結合する抗体および参照抗体が結合するエピトープと立体障害が起こる程度に十分に近接している隣接エピトープと結合する抗体を含む。
【０２３９】
選択したＣ３ｂ結合モノクローナル抗体が固有のエピトープと結合するかを決定するため、商業的に入手可能な試薬（例えばPierce, Rockford, ILからの試薬）を用いて各抗体をビオチニル化できる。未標識モノクローナル抗体およびビオチニル化モノクローナル抗体を用いた競合試験は、Ｃ３ｂポリペプチド被覆ＥＬＩＳＡプレートを用いて実施できる。ビオチニル化ＭＡｂ結合は、ストレプ−アビジン−アルカリホスファターゼプローブで検出できる。精製されたＣ３ｂ結合抗体のアイソタイプを決定するため、アイソタイプＥＬＩＳＡを実施してよい。例えば、マイクロタイタープレートのウェルを1 μg/mlの抗ヒトＩｇＧで、４℃で一夜被覆しうる。１％のＢＳＡでブロックした後、プレートを1 μg/ml以下のモノクローナルＣ３ｂ結合抗体または精製したアイソタイプコントロールと、周囲温度で１〜２時間反応させる。次いでウェルをヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＭ特異的アルカリホスファターゼ複合化プローブと反応させうる。次いでプレートを現像し、分析して、精製した抗体のアイソタイプを決定できる。
【０２４０】
モノクローナルＣ３ｂ結合抗体とＣ３ｂポリペプチドを発現する生きた細胞の結合を示すため、フローサイトトリーが使用できる。簡潔には、0.1％のＢＳＡおよび１０％の胎児ウシ血清を含むＰＢＳ中の多様な濃度のＣ３ｂ結合抗体とＣ３ｂを発現する細胞系（標準的な成長条件下で増殖する）を混合し、３７℃で１時間インキュベートできる。洗浄後、細胞を一次抗体染色と同じ条件下でフルオレセイン標識化抗ヒトＩｇＧ抗体と反応させる。１個の細胞を通過させる光および側面散乱特性を用いるＦＡＣＳｃａｎによってサンプルを分析できる。蛍光顕微鏡を用いる別のアッセイを、フローサイトメトリーアッセイに加えてまたはそれと代えて使用してもよい。細胞は、上記の通り正確に染色でき、蛍光顕微鏡で試験できる。この方法は、個々の細胞の可視化が可能であるが、抗原の密度に依存する感受性が消えうる。
【０２４１】
本発明のＣ３ｂ結合抗体はさらに、ウェスタンブロッティングによってＣ３ｂポリペプチドまたは抗原性フラグメントとの反応性について試験できる。簡潔には、精製したＣ３ｂポリペプチドもしくは融合タンパク質またはＣ３ｂを発現する細胞由来の細胞抽出物を調製し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動に供することができる。電気泳動後、分離した抗原をニトロセルロース膜に移し、１０％胎児ウシ血清でブロックし、試験モノクローナル抗体で探索する。ヒトＩｇＧ結合は、抗ヒトＩｇＧアルカリホスファターゼを用いて検出でき、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質錠（Sigma Chem. Co., St. Louis, MO）で現像できる。
機能的アッセイの例は、下記実施例にも記載されている。
【０２４２】
予防的および治療的使用
本発明は、上昇した補体活性に関連した疾患または障害を、それを必要とする対象に有効量の本発明の抗体を投与することによって処置する方法を提供する。具体的な態様において本発明は、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）を処置する方法であって、それを必要とする対象に有効量の本発明の抗体を投与することによる方法を提供する。
【０２４３】
本発明の抗体は特に、乾燥ＡＭＤから湿潤ＡＭＤへの進行防止、地図状萎縮の進行遅延および／または予防、網膜黄斑浮腫の処置または予防、ならびに乾燥ＡＭＤ進行による失われた視力の改善のために、使用できる。
【０２４４】
いくつかの態様において、本発明は、補体関連疾患または障害を処置する方法であって、それを必要とする対象に有効量の本発明の抗体を投与することによる方法を提供する。既知の補体関連疾患または障害の例は、次のものを含む：神経学的障害、多発性硬化症、卒中、ギラン・バレー症候群、外傷性脳損傷、パーキンソン病、不適切または望ましくない補体活性化の障害、人工透析合併症、超急性同種移植片拒絶反応、異種移植片拒絶、ＩＬ−２治療中のインターロイキン２誘導性毒性、炎症性障害、自己免疫疾患の炎症、クローン病、成人呼吸窮迫症候群、火傷または凍傷を含む熱傷害、虚血後再灌流状態、心筋梗塞、バルーン血管形成、心肺バイパスまたは腎バイパスにおけるポンプ後症候群、人工透析、腎虚血、皮膚腺再構築後の腸間膜動脈再灌流、感染性疾患または敗血症、免疫複合体障害および自己免疫疾患、リウマチ様関節炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ＳＬＥ腎炎、増殖性腎炎、溶血性貧血および重症筋無力症。さらに、他の既知の補体関連疾患は、肺疾患および傷害、例えば以下のものである：呼吸困難、喀血、ＡＲＤＳ、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺気腫、肺塞栓および梗塞、肺炎、繊維形成塵疾患、不活性塵および無機物（例えばシリコン、炭塵、ベリリウムおよびアスベスト）、肺線維症、有機物塵疾患、化学的傷害（刺激性のガスおよび化合物、例えば塩素、ホスゲン、二酸化硫黄、硫化水素、二酸化窒素、アンモニアおよび塩酸による）、煙傷害、熱傷害（例えば火傷、凍傷）、喘息、アレルギー、気管支収縮、過敏症、間質性肺炎、寄生虫疾患、グッドパスチャー症候群、肺性脈管炎および免疫複合体関連炎症。
【０２４５】
具体的な態様において、本発明は、補体関連疾患または障害を処置する方法であって、それを必要とする対象に有効量の本発明の抗体を投与することによる方法を提供し、ここで、疾患または障害は、喘息、関節炎（例えばリウマチ様関節炎）、自己免疫性心臓疾患、多発性硬化症、炎症性腸疾患、虚血−再灌流傷害、バラック・シモンズ（Barraquer-Simons）症候群、人工透析、全身性狼瘡、エリテマトーデス、乾癬、多発性硬化症、移植、中枢神経系の疾患、例えばアルツハイマー病および他の神経変性状態、ａＨＵＳ、糸球体腎炎、類天疱瘡またはＭＰＧＮ  ＩＩである。
【０２４６】
具体的な態様において、本発明は、糸球体腎炎を処置する方法であって、それを必要とする対象に有効量の本発明の抗体を投与することによる方法を提供する。糸球体腎炎の症状は、次のものを含むがそれらに限定されない：タンパク尿；低下した糸球体ろ過率（ＧＦＲ）；高血圧および浮腫をもたらす水貯留を導く血清電解質荷電、例えば高窒素血症（尿毒症、過剰な血中尿素窒素--ＢＵＮ）および塩貯留；血尿および赤血球円柱を含む異常な尿沈殿物；低アルブミン血症；高脂血症；および脂肪尿。具体的な態様において、本発明は、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）を処置する方法であって、それを必要とする対象に有効量の本発明の抗体を含む組成物を投与することによる方法を提供する。
【０２４７】
具体的な態様において、本発明は、体外循環に関連した免疫および止血系の機能不全を低減する方法であって、それを必要とする対象に有効量の本発明の抗体を含む組成物を投与することによる方法を提供する。本発明の抗体は、患者の血管から、導管（補体活性化、血小板活性化、白血球活性化または血小板−白血球接着の少なくとも１つを引き起こしうる物質を含む管腔側を有する）を通じ、患者の血管に戻る患者血液の循環を含むいずれかの手法において使用できる。かかる手法は、あらゆる形態のＥＣＣならびに患者の血液循環への人工もしくは外来臓器、組織または血管の導入を含む手法を含むが、これらに限定されない。
【０２４８】
本発明の治療剤で処置される対象は、黄斑変性に関連した状態を処置する既知の方法、例えば米国特許6,218,368に記載の抗生物質処置での他の治療剤を投与されてもよい。他の処置において、シクロスポリンのような免疫抑制剤は、免疫応答を抑制できる薬物である。これらの薬物は細胞傷害剤、コルチコステロイド、非ステロイド抗炎症性薬物（ＮＳＡＩＤ）、特異的Ｔリンパ球免疫抑制剤およびその抗体またはフラグメントを含む（Physicians' Desk Reference, 53rd edition, Medical Economics Company Inc., Montvale, N.J. (1999)参照）。免疫抑制処置は、典型的には、１週間、１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月または１年の期間にわたって間隔をあけて継続される。ある患者では、処置は患者の残りの人生にわたって投与される。
【０２４９】
本発明の治療剤が別の薬剤と共に投与される場合、それら２つは任意の順序で逐次的にまたは同時に投与できる。いくつかの局面において、本発明の抗体は、第二薬剤（例えばベルテポルフィン）も投与されている対象に投与される。他の局面において、結合分子は、外科処置と組み合わせて投与される。
【０２５０】
Ｃ３ｂ結合抗体との組合せ処置に好適な薬物は、補体成分の活性を調節できることが当該技術分野で既知の物質を含む（例えば、米国特許5,808,109参照）。他の薬物は、補体仲介活性を減少することが報告されている。かかる薬物は次のものを含む：アミノ酸（Takada, Y. et al. Immunology 1978, 34, 509）；ホスホン酸エステル（Becker, L. Biochem. Biophy. Acta 1967, 147, 289）；ポリアニオン系物質（Conrow, R. B. et al. J. Med. Chem. 1980, 23, 242）；フッ化スルホニル（Hansch, C.; Yoshimoto, M. J. Med. Chem. 1974, 17, 1160およびその引用文献）；ポリヌクレオチド（DeClercq, P. F. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1975, 67, 255）；ピマル酸（Glovsky, M. M. et al. J. Immunol. 1969, 102, 1）；ポルフィン系（Lapidus, M. and Tomasco, J. Immunopharmacol. 1981, 3, 137）；多様な抗炎症剤（Burge, J. J. et al. J. Immunol. 1978, 120, 1625）；フェノール類（Muller-Eberhard, H. J. 1978, in Molecular Basis of Biological Degradative Processes, Berlin, R. D. et al., eds. Academic Press, New York, p. 65）；およびベンズアミジン類（Vogt, W. et al Immunology 1979, 36, 138）。これらの薬物のいくつかは、プロテアーゼおよびエステラーゼの一般的阻害によって機能する。他のものは、補体系の特に中間段階のいずれかに特異的ではないが、むしろ、補体活性化の１以上の段階を阻害する。後者の化合物の例は、ベンズアミジン類を含み、これはＣ１、Ｃ４およびＣ３ｂ利用を阻止する（例えばVogt et al. Immunol. 1979, 36, 138参照）。
【０２５１】
補体成分の活性を阻害しうることが当該技術分野で知られているさらなる薬物は、スタキボトリス（Stachybotrys）属由来の真菌代謝産物であるＫ−７６である（Corey et al., J. Amer. Chem. Soc. 104: 5551, 1982）。Ｋ−７６およびＫ−７６ＣＯＯＨはいずれも、Ｃ３ｂ段階で主として補体を阻害すること（Hong et al., J. Immunol. 122: 2418, 1979; Miyazaki et al., Microbiol. Immunol. 24: 1091, 1980）、そして正常なヒト補体由来の走化性因子の生成を予防することが示されている（Bumpers et al., Lab. Clinc. Med. 102: 421, 1983）。高濃度のＫ−７６またはＫ−７６ＣＯＯＨで、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ６、Ｃ７およびＣ９とそれらそれぞれの先行する中間体の反応の阻害が示されることがある。Ｋ−７６またはＫ−７６ＣＯＯＨはまた、補体のアクチベーター系におけるＣ３ｂを阻害することも報告されている（Hong et al., J. Immunol. 127: 104-108, 1981）。本発明の方法の実施のための他の好適な薬物は、グリセオフルビン（Weinberg, in Principles of Medicinal Chemistry, 2d Ed., Foye, W. O., ed., Lea & Febiger, Philadelphia, Pa., p. 813, 1981）、イソパナリン（Djura et al., Aust. J. Chem.36: 1057, 1983）およびSiphonodictyon coralli-phagumの代謝物（Sullivan et al., Tetrahedron 37: 979, 1981）を含む。
【０２５２】
2011-503024
組合せ療法レジメンは、相加的であってよく、あるいは相乗的な結果（例えば２種の薬物の組合せ使用について予期される以上の補体系活性の低下）であってもよい。いくつかの態様において、本発明は、本発明のＣ３ｂ結合抗体と抗血管形成剤、例えば抗ＶＥＧＦとによる、ＡＭＤまたは上記他の補体関連疾患を予防および／または処置するための組合せ治療を提供する。
【０２５３】
診断的使用
一つの局面において、本発明は、生物学的サンプル（例えば血液、血清、細胞、組織）または疾患もしくは障害に罹患しているかまたはＡＭＤに関連した障害を発症するリスクを有する個体由来のサンプルにおける、Ｃ３ｂタンパク質および／または核酸発現並びにＣ３ｂタンパク質機能を測定するための、診断アッセイを含む。
【０２５４】
診断アッセイ、例えば競合アッセイは、共通の結合パートナー上の限られた数の結合部位について試験サンプルと分析物が競合するラベルアナログ（トレーサー）の能力に依存する。結合パートナーは一般に、競合の前または後に非可溶化され、次いで結合パートナーに結合しているトレーサーおよび分析物を結合していないトレーサーおよび分析物から分離する。この分離は傾斜法（結合パートナーが予め非可溶化された場合）または遠心分離法（競合反応後に結合パートナーを沈殿させる場合）によって実施される。試験サンプル分析物の量は、マーカー物質の量によって測定したとき、結合したトレーサーの量に反比例する。既知量の分析物で用量応答曲線を作成し、試験結果と比較して、試験サンプル中に存在する分析物の量を定量的に決定する。これらのアッセイは、検出マーカーとして酵素が使用される場合にはＥＬＩＳＡと呼ばれる得。この形態のアッセイにおいて、抗体とＣ３ｂ結合抗体間の競合的結合は、血清サンプル中の抗体、より具体的には血清サンプル中の中和抗体の物差しである結合Ｃ３ｂタンパク質、好ましくは本発明のＣ３ｂエピトープをもたらす。
【０２５５】
このアッセイの重要な利点は、測定が抗体を直接中和することで行われることである（すなわち、Ｃ３ｂタンパク質、特にエピトープの結合と干渉するもの）。かかるアッセイ、特にＥＬＩＳＡ試験の形態のアッセイは、臨床的環境および通常の血液スクリーニングにかなり利用される。
【０２５６】
免疫学的技術は、例えば、補体成分の分解産物を検出するために、種々の補体成分（例えば、Ｃ３、Ｃ４およびＣ５）の異なるエピトープに対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を使用する（例えば、Hugli et al., Immunoassays Clinical Laboratory Techniques 443-460, 1980; Gorski et al., J Immunol Meth 47: 61-73, 1981; Linder et al., J Immunol Meth 47: 49-59, 1981;およびBurger et al., J Immunol 141: 553-558, 1988参照）。次に、既知の濃度の標識化分解産物と競合する分解産物と抗体の結合を測定することができる。種々のアッセイ、例えば、放射性免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡおよび放射拡散(radial diffusion)アッセイを補体分解産物を検出するために利用できる。
【０２５７】
免疫学的技術は、黄斑変性関連障害を有するか、または有さない試験対象およびコントロール対象からの血液中における分解産物形成の測定を可能にするために、補体活性化を検出するような高い感度を提供する。したがって、本発明のいくつかの方法において、黄斑変性症と関連する障害の診断は試験対象からの血漿中の補体成分の可溶性分解産物の定量を介する異常補体活性化の測定により得られる。測定は、例えば、Chenoweth et al., N Engl J Med 304: 497-502, 1981;およびBhakdi et al., Biochim Biophys Acta 737: 343-372, 1983において記載されているとおりに実施することができる。好ましくは、インビボで形成された補体活性化のみを測定する。これは補体系の阻害剤を含む培地中で対象からの生物学的サンプル（例えば、血清）を回収し、次にサンプル中の補体活性化（例えば、分解産物の定量）を測定することにより成し遂げることができる。
【０２５８】
目の疾患または障害と関連する障害を有する患者の臨床診断またはモニタリングにおいて、正常対象からの対応する生物学的サンプルにおけるレベルと比較した補体タンパク質の検出は、黄斑変性と関連する障害を有する患者の指標である。
【０２５９】
インビボ診断またはイメージングはUS2006/0067935に記載されている。簡潔には、これらの方法は一般に、非侵襲的な方法により検出可能であるマーカーまたは標識に作動可能に結合した診断的に有効量のＣ３ｂ結合分子を患者に投与するか、または導入することを含む。抗体−マーカー複合体は眼内に局在し、補体タンパク質に結合するために十分な時間を許容される。次に、患者を検出デバイスに暴露して検出可能マーカーを同定し、患者の眼内のＣ３ｂ結合分子の局在の像を形成する。Ｃ３ｂ結合抗体または抗原結合フラグメントの存在は抗体−マーカーが眼の構成成分に結合するかどうかを同定することにより検出する。ＡＭＤ疾患を有さない正常な個体と比較して、選択された補体タンパク質またはそれらの組合せにおける増加したレベルの検出は、黄斑変性と関連する障害に罹患しやすいこと、および／または障害の発症の指標である。本発明のこれらの局面は、また、眼のイメージング方法ならびに組合せた血管形成診断および処置方法における使用について好ましい。
【０２６０】
本発明はまた、診断アッセイ、予後アッセイ、薬理ゲノミクスおよび臨床試験のモニタリングにおいて予後（予測）目的で使用され、それによって個体を予防的に処置する予測医薬の分野に関する。
【０２６１】
本発明はまた、個体が補体系活性の脱制御に関連した障害を発症するリスクを有するかどうかを決定するための予後（予測）アッセイを提供する。例えば、Ｃ３ｂ遺伝子における変異が生物学的サンプルにおいてアッセイされうる。かかるアッセイは、予後または予測目的のために使用され、それによってＣ３ｂタンパク質、核酸発現または活性によって特徴付けられるかまたはそれに関連した障害の発症前に、予防的に処置できる。
【０２６２】
本発明の別の局面は、個体におけるＣ３ｂ核酸発現またはＣ３ｂタンパク質活性を測定するための方法であって、それによってその個体に適切な治療または予防薬を選択する方法を提供する（本明細書において「薬理ゲノミクス」と称する）。薬理ゲノミクスは、個体の遺伝子タイプ（例えば特定の薬物に応答する個体の能力を測定するために試験した個体の遺伝子タイプ）に基づいて、個体の治療または予防処置のための薬物（例えば薬剤）を選択できる。
本発明のさらに別の局面は、臨床試験におけるＣ３ｂタンパク質の発現または活性に対する薬物（例えば薬剤）の影響をモニタリングすることに関する。
【０２６３】
医薬組成物
本発明は、薬学的に許容される担体と共に製剤された、Ｃ３ｂ結合抗体（インタクトまたは結合フラグメント）を含む医薬組成物を提供する。かかる組成物はさらに、補体関連疾患（例えばＡＭＤ）の処置または予防に好適な１種以上の他の治療剤を含んでいてもよい。薬学的に許容される担体は組成物を向上または安定化し、あるいは組成物の製造を容易にするために使用できる。薬学的に許容される担体は、溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤など、生理的に適合性のものを含む。
【０２６４】
本発明の医薬組成物は、当該技術分野において既知の多様な方法によって投与できる。投与経路および／または形態は、望まれる結果に依存して変化する。投与は、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下または標的部位の近くへの投与が好まれる。具体的な態様において、本発明の抗体は、目に硝子体内投与できるように製剤される。薬学的に許容される担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経腸、脊髄または上皮投与（例えば注射または輸液による）に好適であるべきである。投与経路に依存して、活性化合物、すなわち抗体、二重特異的および多重特異的分子は、酸および該化合物を不活性化しうる他の天然条件から化合物を保護するために物質でコーティングされていてよい。
【０２６５】
組成物は滅菌された流体であるべきである。適切な流動性は、例えばレシチンのようなコーティング剤を用いて、分散剤の場合には必要な粒子サイズを維持して、そして界面活性剤を使用して、維持できる。多くの場合、等張化剤、例えば糖、ポリアルコール、例えばマンニトールおよびソルビトールならびに塩化ナトリウムを組成物中に含めることが好ましい。注射用組成物の長期吸収は、組成物に吸収を遅延する物質、例えばモノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチンを封ｋめることによって達成できる。
【０２６６】
本発明の医薬組成物は、当該技術分野において周知かつ日常的に実施されている方法に従って製造できる。例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., 20th ed., 2000; および Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照されたい。医薬組成物は好ましくは、ＧＭＰ条件下で製造される。典型的には、治療上有効用量または有効用量のＣ３ｂ結合抗体を本発明の医薬組成物に使用する。Ｃ３ｂ結合抗体は、当業者に既知の常套の方法によって薬学的に許容される投与形態に製剤される。投与レジメンは、最適な所望の応答（例えば治療応答）を提供するように調節される。例えば、単回ボーラスを投与してよく、複数回分活用量を経時的にとうよしてよく、あるいは投与量を治療状況の緊急性によって示されるとおりに比例的に減少もしくは増加してよい。投与の簡便さおよび投与量の均一性のために、単位投与形態に非経腸組成物を製剤することが特に有利である。単位投与形態は、本明細書において使用するとき、処置する対象の１回投与量に適合する物理的に分離した単位を意味し；各単位は、必要とされる医薬担体と関連して所望の治療効果を奏するように計算された活性化合物の所定量を含む。
【０２６７】
本発明の医薬組成物中の有効成分の実際の投与レベルは、具体的な患者、組成物および投与形態について、患者に毒性なく所望の治療応答を達成するのに有効な有効成分の量を得られるように変化してよい。選択される投与レベルは、使用する具体的な本発明の組成物の活性、またはそのエステル、塩もしくはアミド、投与経路、投与時間、使用する具体的な化合物の排出速度、処置期間、他の薬剤、使用する具体的な組成物と組み合わせて使用する化合物および／または物質、処置する患者の年齢、性別、体重、状態、一般的健康および薬歴などの要因を含む、多様な薬物動力学的要因に依存する。
【０２６８】
医師または獣医は、所望の治療効果を達成するために必要とされるレベルよりも低い医薬組成物中で使用される本発明の抗体の用量で開始し、所望の効果が得られるまで用量を漸増してよい。一般に、本明細書に記載のアレルギー性炎症性障害の処置のために、本発明の組成物の有効用量は、投与方法、標的部位、患者の生理的状態、患者がヒトか動物か、他の投与医薬および処置が予防か治療かを含む、多くの多様な要因に依存して変化する。処置用量は、安全性および有効性を最適化するために滴定することが必要である。抗体の全身投与について、投与量は、約0.0001〜100 mg/kg体重、より通常0.01〜15 mg/kg体重の範囲である。例示的処置レジメンは、２週間に１回または１ヶ月に１回または３〜６ヶ月に１回の全身投与を必要とする。抗体の硝子体内投与について、投与量は、約0.0001〜約10 mgの範囲である。例示的処置レジメンは、２週間に１回または１ヶ月に１回または３〜６ヶ月に１回の全身投与を必要とする。
【０２６９】
抗体は通常、複数回投与される。１回の投与間の間隔は、１週間、１ヶ月または１年であり得る。間隔は、患者におけるＣ３ｂ結合抗体の測定した血中レベルによって示されるとおりに、不規則であってもよい。全身投与のいくつかの方法において、投与量は、血漿抗体濃度が1〜1000 μg/ml、いくつかの方法においては25〜500 μg/mlとなるように調節される。あるいは、抗体は徐放製剤として投与されてもよく、この場合にはより少ない投与頻度が必要となる。投与量および頻度は、患者における抗体の半減期に依存して変化する。一般に、ヒト化抗体はキメラ抗体および非ヒト抗体よりも長い半減期を示す。投与量および頻度は、処置が予防的であるか治療的であるかに依存して変化しうる。予防的適用において、相対的に低い用量が相対的に少ない頻度間隔で長期にわたって投与される。患者は残りの人生にわたって処置を受け続けることもある。治療適用において、疾患の進行が低下または終了するまで、好ましくは患者が疾患の症状の部分的または完全な寛解を示すまで、相対的に高い用量で相対的に短い間隔が必要となることがある。その後、患者は予防的レジメンを投与されてもよい。
【実施例】
【０２７０】
実施例
下記実施例は、本発明をさらに説明するために提供するが、その範囲を限定しない。本発明の他の変形は、当業者には極めて明らかであり、特許請求の範囲に包含される。
【０２７１】
実施例１：抗原の製造および品質管理
ビオチニル化Ｃ３ｂの生成
Pierceのラベリング剤を用いて、２０倍モル過剰のビオチニル化試薬で、精製したＣ３ｂをビオチニル化した。ビオチニル化は室温で行い、0.5ml Zeba Spin Desalting Columnsを用いて非結合ビオチンを分離した。EZ-Link NHS-LC-LC-Biotinを用いてＣ３ｂのリシン残基を標識化し、EZ-Link Maleimide-PEG2-Biotinを用いてシステイン残基を標識化した。ビオチニル化の程度は、ＨＡＢＡアッセイおよびＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて定量した。Ｃ３上のチオエステル結合形成に関与する１個のシステインのビオチニル化は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳで確認した。
【０２７２】
アガロースビーズと結合したＣ３ｂの生成
Amersham Biosciences（17-0851-01）のPD-10 Desaltingカラムを用いて、精製したＣ３ｂ（Quidel A413、lot 903726）をCoupling Buffer（50mM Tris、5mM EDTA-Na、pH 8.5）にバッファー交換した。SulfoLink Coupling Gel（Pierce 20401）および他の試薬全ては、室温に平衡化した。SulfoLink Coupling Gelを４ゲルベッド体積のCoupling Bufferで平衡化し、遠心分離し、上清を除去した。次いでバッファー交換したＣ３ｂタンパク質溶液を沈殿し、平衡化したSulfoLink Coupling Gelに加えた。混合物を室温で１５分間振盪し、次いで混合せずに３０分間静置した。次いで、複合化したＣ３ｂ−カップリングゲルを３ゲルベッド体積のCoupling Bufferで洗浄した。その後、１ゲルベッド体積のQuenching Reagent（Coupling Buffer中50mM L-Cyteine-HCL (44889)）をＣ３ｂ−カップリングゲルに加え、室温で１５分間振盪した。１５分後、複合化したＣ３ｂ−カップリングゲルを混合せずに室温で３０分間静置した。複合化したＣ３ｂ−カップリングゲルを少なくとも６ゲルベッド体積の洗浄液（1M NaCl）で洗浄し、次いで２ゲルベッド体積の脱気したStorage Buffer（0.05%のアジドナトリウムを含むリン酸緩衝化食塩水）で洗浄した。最終段階は、１ゲルベッド体積のStorage Bufferを推定ゲルベッド体積1mg/mlのタンパク質に加えることである。
【０２７３】
Ｃ３ｂ−SulfoLink Coupling Gelタンパク質濃度測定
下記量のＣ３ｂを低下条件（reduced condition）下で４〜１２％の変性タンパク質ゲルで実行した：2μg、1.5μg、1μg、0.75μg、0.5μgおよび0.25μg。これらのレーンの次に、2μl、4μlおよび8μlの５０％ビーズ懸濁液（Ｃ３ｂ−Coupling Gel）も低下条件下でロードした。アルファ鎖がビーズと共有結合するため、それはタンパク質ゲル上には現れず、したがってタンパク質濃度は、ベータ鎖を比較して測定した。1μlのカップリングゲルに対して約1μgのＣ３ｂが存在し、したがってカップリング効率９０％以上が達成されたと推定した。
【０２７４】
SulfoLink Coupling Gelでの活性Ｃ３ｂ率の計算
４つのコントロールを４種の異なる濃度のＢ因子で設定し（0.122μM、0.244μM、0.367μM および0.489μM）、可溶性Ｃ３ｂの濃度を固定し（４つ全てについて0.294μM）、Ｄ因子の濃度を固定した（４つ全てについて0.47μM）。Ｐ因子はこれらのコントロール反応から除外する。反応を３７℃で１５分間インキュベートした。この時点で、全コントロールサンプルを４Ｘサンプルバッファーに速やかに加え、９５℃で１０分間置いて、4〜12% Bis-Tris Protein Gelで後で実行した。Ｃ３ｂ−結合ビーズは1 mgベッド体積あたり約1 mgのＣ３ｂの濃度であった。下記７つの反応は、0.294μMで固定濃度の結合Ｃ３ｂビーズ、2.68μMで固定のＰ因子、および0.95μMで固定のＤ因子からなる。Ｂ因子の濃度は次の通りであった：0.367μM、0.489μM、0.978μM、1.467μM、1.955μM、2.933μM、および3.910μM。これら７つの反応について、Ｄ因子以外の全てを３７℃で３０分間インキュベートした。この３０分間インキュベーション後、0.95 μMのＤ因子を加え、反応を２分間インキュベートした。この時点で、全サンプルを４Ｘサンプルバッファーに速やかに加え、低下条件下で4-12% Bis-Trisゲルで実行した。データを分析する時、Ｂｂバンドを全レーンにおいて比較する。
【０２７５】
ビーズ−Ｃ３ｂ安定性
Ｃ３ｂ−SulfoLink Couplingゲル複合化後、ビーズを遠心分離し、100%グリセロール中に緩やかに再懸濁した（最終グリセロール濃度を50%とする）。次いでビーズを数回の凍結解凍（３回まで）のために−８０℃に置いた。次いでビーズを氷上で解凍し、15mlコニカルチューブに移した。５カラム体積の１ Ｘ ＰＢＳを加えてビーズを再懸濁した。これを850gで５分間遠心分離した。１０カラム体積の１ Ｘ ＰＢＳで２回追加洗浄を完了した。最終工程は、最終５０％スラリー溶液につき１ Ｘ ＰＢＳでビーズを再懸濁することであった。各凍結解凍は、Ｂｂ生成について試験した：3μM Ｂ因子、0.5μM Ｄ因子、1μMのＣ３ｂ−ビーズおよび5mM MgClの１時間インキュベーションおよび完全なＢｂ生成探索。これに加え、Ｂｂ生成を介する数週間の−８０℃での貯蔵後、凍結ビーズを試験した。
【０２７６】
カニクイザルＣ３の精製およびカニクイザルＣ３ｂの生成
カニクイザル血漿をAlphagenesis（Yemassee, SC）から購入した。50mlの血漿をＰＢＳ、10mM ＥＤＴＡおよび２個の完全カクテル阻害錠剤（Roche）で200 mlに希釈した。４０％PEG6000を溶液にゆっくりと加えて最終濃度４％とし、４℃でさらに３０分間緩やかに撹拌した。17,500rpmで２０分間遠心分離して沈殿を除去した。PEG6000を上清に再度加えて最終濃度12.5％とし、４℃で３０分間撹拌した。175,000rpmで２０分間遠心分離した後上清を捨てた。50mlの１ Ｘ ＰＢＳ、10mM ＥＤＴＡバッファーにペレットを再溶解し、Ｃ３含有溶液を15ml Protein G（GE）カラムに２回通してカニクイザルＩｇＧを除去した。プロテインＧカラムからのフロースルーを4L 20mM Tris pH 8.0、10mM EDTAで一夜透析した。一方、20ml MonoQカラム（GE）を0.5M NaOH、次いで水および大量の20mM Tris pH8.0および10mM ＥＤＴＡでカラムベースラインがクリアーになり平衡化するまで洗浄した。次いで透析した溶液を流速0.8ml/分のATKA 100（GE）によるMonoQカラムにロードした。ロード後、１０カラム体積の20mM Tris pH 8.0および10mM ＥＤＴＡでベースラインが安定になるまで洗浄した。２０カラム体積の0〜500 mMの直線グラジエントのＮａＣｌでタンパク質をカラムから溶出し、4ml/チューブでフラクションを回収した。フラクションについて非低下および低下条件下でＣ３タンパク質ピークをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって同定した。Ｃ３をさらにウェスタンブロットおよびＭＳペプチドマッピング分析によって確認した。８５％純粋Ｃ３フラクションをプールし、2660セファクリル300ゲルろ過カラム（GE）でＰＢＳバッファーを用いてさらに精製した。Ｃ３ピークフラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＭＳ分析によって再度確認した。純粋なフラクションをプールし、ミリポアコンセントレーターによって約1mg/mlに濃縮し、アリコートに分けて、後の使用のために−８０℃の冷凍庫で貯蔵した。
【０２７７】
カニクイザルＣ３をＰＢＳバッファーで500ug/mlに希釈した。ＰＢＳバッファー中0.4μM fB（Comptech）、0.05μM fD（CompTech）および5mM MgCl2を加えることでＣ３は完全にＣ３ｂに変換され、室温で３０分間インキュベートした。次いでＣ３ｂを2660 Sephacryl 300ゲルろ過カラムによって精製した。Ｃ３ｂ含有ピークフラクションをミリポアコンセントレーターによって濃縮してプールした。カニクイザルＣ３ｂの活性をＣ３コンバターゼアッセイで試験した。タンパク質は、ヒトＣ３ｂ（CompTech）と同等のＢｂ生成活性を示した。
【０２７８】
補体因子および市販抗体による結合によるＣ３ｂ試薬の品質制御
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）結合（エピトープ保存）
ビオチニル化Ｃ３ｂ分子をＥＬＩＳＡにおいて非ビオチニル化Ｃ３ｂと比較して、商業的に入手可能な抗体によって認識されるＣ３ｂエピトープの保存を評価した。
【０２７９】
Maxisorpプレートをコーティングバッファー（ビカルボネート、pH 9.5-9.8）中2 μg/mlの商業的に入手可能な抗Ｃ３または抗Ｃ３ｂ抗体で100μl/ウェルで被覆し、４℃で一夜インキュベートした。ＰＢＳＴで３回洗浄後、プレートを300 μl/ウェルの希釈剤（Synblock, AbD Serotec）で室温で２時間ブロックした。ブロック溶液を吸引後、希釈剤で希釈した100μlのＣ３ｂ（+/- ビオチン）サンプルを室温で１時間インキュベートした。希釈液（ポリＨＲＰ希釈剤）で1:5000に希釈した100μl/ウェルのStrep-ＨＲＰ（ポリＨＲＰストレプトアビジン）またはＨＲＰ複合化抗Ｃ３抗体を３０分間加えた。ＰＢＳＴで４回洗浄後、100μl/ウェルのＴＭＢ基質（Ultra TMB基質溶液）を５〜１０分間加えた。50μl/ウェルの停止液（2N H2SO4）で反応を停止した。吸光度を読み取り（A450-A570）、SoftMax Proを用いてデータを分析した。
【０２８０】
補体因子および市販の抗体による結合
アガロースビーズに固定したＣ３ｂを、市販の抗体および補体因子タンパク質と結合する能力について試験した。
【０２８１】
4 μlのＣ３ｂビーズスラリー（〜1μgのＣ３ｂに対応）を各チューブに加えた。ビーズを100μl 希釈剤に再懸濁した。次いで、抗体または補体因子タンパク質を含む希釈剤でチューブ中総体積を200μlとした。チューブを室温で１時間振盪し、次いで希釈剤で１回洗浄した。ビーズスラリーをミニカラムに適用し、２回以上洗浄した。残りの液体を速やかに遠心分離した（1,200Gで１分間）。カラムにつなぎ、希釈剤中の二次抗体500μl （1:5000）または抗補体因子Ａｂを加えた。室温で１時間インキュベートし、次いで希釈剤で４回洗浄した。[補体因子について、上記工程を二次抗体で反復した]。残りの液体を速やかに遠心分離した（1,200Gで１分間）。カラムにつなぎ、次いで100μlのＴＭＢ基質を加えた。液体を速やかに新しいチューブへと遠心分離した（1,200Gで１分間）。溶液を９６ウェルプレートに移した。50μl/ウェルの停止液（2N H2SO4）で反応を停止した。吸光度を読み取り（A450-A570）、SoftMax Proを用いてデータを分析した。
【０２８２】
実施例２．HuCAL GOLD（登録商標）ライブラリーからのＣ３ｂ特異的抗体の生成
抗体変異体タンパク質の供給源として商業的に入手可能なファージディスプレイライブラリーであるMorphosys HuCAL GOLD（登録商標）ライブラリーを用いて、高い結合親和性を有するクローンの選択によって抗Ｃ３ｂ抗体を生成した。HuCAL GOLD（登録商標）ライブラリーは、６つのＣＤＲの全てが適切な変異によって多様化されており、Ｆａｂとファージ表面の結合にCysDisplay（商標）技術が使用されているＦａｂライブラリー（Knappik et al., 2000）である（例えばWO01/05950参照）。
【０２８３】
HuCAL GOLD（登録商標）ファージ抗体は、１２個の別個のサブライブラリーとして提供される：ＶＨ１κ、ＶＨ１λ、ＶＨ２κ、ＶＨ２λ、ＶＨ３κ、ＶＨ３λ、ＶＨ４κ、ＶＨ４λ、ＶＨ５κ、ＶＨ５λ、ＶＨ６κ、ＶＨ６λ。１２個のサブライブラリーは、具体的な実験の要求に従って、任意の組合せでプールできる。Ｃ３ｂと結合する抗体の選択のために、３つの庫となるパニング戦略を提供した：
a）ファージ−抗体複合体をストレプトアビジン磁性ビーズで捕捉する、ビオチニル化ヒトＣ３ｂによる溶液パニング、
b）Ｃ３ｂをアガロースビーズに結合させる、ビーズ利用パニングおよび
c）担体タンパク質と結合したペプチドでの選択回を、全長Ｃ３ｂでの選択回と変化させる、ディファレンシャルペプチドパニング（アガロースビーズとの結合のビオチニル化）。
【０２８４】
ファージレスキュー、ファージ増幅および精製
34μg/ml クロラムフェニコールおよび１％グルコースを含む2xYT培地（2xYT-CG）中でHuCAL GOLD（登録商標）ライブラリーを増幅した。0.5のOD600nmでのVCSM13ヘルパーファージで感染後（撹拌なしで３７℃で３０分間；250 rpmで撹拌しながら３７℃で３０分間）、細胞を遠心分離し（4120 g；５分；４℃）、2xYT/34μg/ml クロラムフェニコール/ 50 μg/ml カナマイシン/ 0.25mM IPTGに再懸濁し、２２℃で一夜増殖した。上清からファージをＰＥＧ沈殿させ、ＰＢＳ／２０％グリセロールに再懸濁し、−８０℃で保存した。２回のパニング間のファージ増幅は、次の通りに行った：対数期の中間部で、大腸菌ＴＧ１細胞を溶解したファージに感染させ、１％のグルコースおよび34μg/mlのクロラムフェニコールを補ったＬＢ寒天（LB-CGプレート）に播種した。３０℃で一夜インキュベートした後、ＴＧ１コロニーを寒天プレートから掻き取り、0.5のOD600nmに達するまで2xYT-CGに播種した。。VCSM13ヘルパーファージを上記の通り感染のために加えた。
【０２８５】
溶液パニング
このパニング戦略に使用した抗原は、ビオチニル化Ｃ３ｂである。ビオチニル化Ｃ３ｂの２種の異なるビオチニル化変異体が存在する。一方の変異体では、ビオチンがＣ３ｂのシステイン残基と結合したマレイミド−ＰＥＧ−リンカーを介してＣ３ｂと結合している。この変異体は以下Ｃ３ｂ-システイン-ビオチンと称する。他方の変異体に置いて、ビオチンはＣ３ｂの３つの異なるリシン残基と結合したスルホ−ＮＨＳ−ＬＣＬＣ−リンカーを介してＣ３ｂと結合している。この変異体を以下Ｃ３ｂ-リシン-ビオチンと称する。この２種の異なる変異体は、リンカー分子と結合するファージを選択しないために、選択回で変更する。
【０２８６】
ストレプトアビジン磁性ビーズ（Dynabeads M-280；Dynal）をＰＢＳで１回洗浄し、Chemiblockerで室温で２時間ブロックした。ＰＢＳ希釈ファージもChemiblockerでローテーター上、室温で１〜２時間ブロックした。ブロックしたファージをブロックしたストレプトアビジン磁性ビーズに対して２回、３０分間予備吸着させた。ファージ上清を新しい2 ml反応チューブに移し、ヒトビオチニル化Ｃ３ｂを加え、混合物を室温、ローテーター上で１〜２時間インキュベートした。100μlのブロックしたストレプトアビジン磁性ビーズを各パニングプールに加え、ローテーター上で２０分間インキュベートした。ビーズを粒子セパレーター（Dynal MPC-E）で約２．５分間回収し、溶液を注意深く除去した。
【０２８７】
次いでローテーターを用いてビーズをＰＢＳＴで７回洗浄し、ＰＢＳでさらに３回洗浄した。各チューブに10mM Tris/HCl pH 8中200μlの20mM ＤＴＴを加え、１０分間インキュベートして、Dynabeadsからファージを溶出させた。磁性粒子セパレーターによってDynabeadsを除去し、0.6-0.8のOD600nmに増殖させた大腸菌TG-1培養14 mlに上清を加えた。培養を50 mlプラスチックチューブ中、撹拌なし、３７℃で４５分間インキュベートした。4120 x gで５分間遠心分離した後、細菌ペレットを各々800μlの2xYT培地に再懸濁し、3xYT-CG寒天プレートに播種し、３７℃で一夜インキュベートした。コロニーをプレートから掻き取り、ファージをレスキューし、本明細書に記載のとおりに増幅した。２回目および３回目の選択は、１回目の選択と同じ方法で実施した。
【０２８８】
Ｃ３ｂ特異的ファージを選択するため、Ｃ３タンパク質による複数の異なるブロックアプローチを多様なサブプールに適用した。一般に、Chemiblockerでファージをブロックする時に精製Ｃ３またはＣ３含有血清を加え、ローテーター上で１〜２時間インキュベートした。したがって、Ｃ３ｂとの接触が行われる場合、潜在的にＣ３ｂ／Ｃ３交差反応性のファージは既に抗原と結合しており、Ｃ３ｂ特異的ファージのみが選択されるはずである。パニング1812.1について、精製Ｃ３を１０倍のモル過剰で加えた（初回のみ）。パニング1889のサブプール１〜６について、ブロックを適用しなかった。サブプール７〜１２について、ヒト血清を用いた多様なブロック条件を全三回の選択において適用した。サブプール７および８について、希釈なしのヒト血清を加えて、Ｃ３ｂに対してＣ３の約７０倍モル過剰を得た。血清因子がＣ３ｂを分解する可能性について心配したため、プロテイナーゼ阻害剤を加えた（Pefabloc SC, Roche、最終濃度4mM）。サブプール９〜１２について、希釈したヒト血清を加えてＣ３ｂに対してＣ３の約２倍モル過剰を得た。サブプール１１および１２はプロテイナーゼ阻害剤を含み、プール１１および１２では阻害剤を加えなかった。
【０２８９】
ビーズ利用パニング
ビーズ利用パニングに用いた抗原はスルホリンクアガロースビーズと結合したＣ３ｂであった。ブロックしたビーズへのファージの予備吸着に使用したビーズは、システインでアガロースビーズ（SulfoLink Coupling Gel）を処理してMorphoSysによって製造され（SulfoLink Immobilization Trial Kitから）、それはビーズ上の全ての可能性のある結合部位をブロックする。
【０２９０】
ＰＢＳ希釈ファージをChemiblockerで、ローテーター上、室温で１〜２時間ブロックした。ブロックしたアガロースビーズに対して、ブロックしたファージを３０分間、２回予備吸着した。ファージ上清を新しいブロック2 ml反応チューブに移し、ヒトＣ３ｂと結合したアガロースビーズを加え、混合物をローテーター上、室温で１〜２時間インキュベートした。アガロースビーズをテーブルトップ遠心分離（1000g、１分）で遠心分離して回収し、上清を捨てた。緩やかに1 mlの洗浄液に再懸濁し、洗浄バッファー中でインキュベートし、遠心分離で回収することにより、ペレットを繰り返し洗浄した。
【０２９１】
10mM Tris/HCl pH 8中20mMのＤＴＴ200 μlを各チューブに加え、１０分間インキュベートして、アガロースビーズからファージの溶出させた。ビーズを遠心分離でペレットにして、0.6〜0.8のOD600nmに増殖した大腸菌TG-1培養14 mlに上清を加えた。ファージ感染のため、培養を50 mlプラスチックチューブ中、撹拌なし、３７℃で４５分間インキュベートした。4120 x gで５分間遠心分離した後、細菌ペレットを各々800μlの2xYT培地に再懸濁し、3xYT-CG寒天プレートに播種し、３７℃で一夜インキュベートした。コロニーをプレートから掻き取り、ファージをレスキューし、本明細書に記載のとおりに増幅した。２回目および３回目の選択は、１回目の選択と同じ方法で実施した。
【０２９２】
アガロースビーズのペレットは見ることが難しく、上清の場合容易に溶解する。したがって、ペレットを見ることができるように、少なくとも25μlのビーズを用いると決めた。これは比較的高い抗原濃度をもたらし、これは異なる体積を用いたため全サブプールについて初回では異なっている。初回のサブプールにおけるＣ３ｂ濃度は、およそ次の通りであった：サブプール1820.1で189nM、サブプール1820.2で128nM、サブプール1820.3で257nM、サブプール1820.4で98nM、サブプール1820.5および1820.6で66nM。２回目の選択では、Ｃ３ｂ濃度は、サブプール1820.1-3について112nM、サブプール1820.4-6について57nMであった。３回目の選択では、Ｃ３ｂ濃度は全サブプールで57nMであった。
【０２９３】
精製したＣ３を加えて、初回のサブプール1820.4-6について最終濃度約475 nMとして、Ｃ３によるブロックを適用した。
【０２９４】
ディファレンシャルペプチドパニング
ディファレンシャルペプチドパニングに用いた抗原は、Ｃ３ｂ上の異なるエピトープを代表するペプチドであった。これらのペプチドは、Ｃ３ｂとＣ３の表面曝露残基を比較するタンパク質構造分析においてＣ３ｂ特異的と同定された。２種の異なる担体タンパク質、ＢＳＡおよびトランスフェリンとの結合は、上記の通りMorphoSysによって実施した。２種の異なる担体タンパク質は、担体タンパク質と結合するファージを選択しないために、選択回の間で変更されなければならない。さらに、正しく折りたたまれた全長Ｃ３ｂと選択したファージの結合を確保するため、全長Ｃ３ｂでの選択回とペプチドでの選択回を変更した。
【０２９５】
ペプチドパニングにおける実際のパニング手法は、Maxisorpプレートと結合した、抗原としてペプチド結合担体タンパク質を用いた固相パニングである。Maxisorpプレート（F96 Nunc-Immunoplate）の好適な数のウェル（予備ブロックしたファージの体積に基づく）を、ＰＢＳ中50μg/mlの濃度のペプチドと結合した担体タンパク質300μlで被覆した。プレートを密封し、４℃で一夜インキュベートした。
【０２９６】
被覆したウェルを400μlのＰＢＳで２回洗浄し、350μlのＰＢＳ／５％ミルク粉末で、マイクロタイタープレートシェーカー上、室温で２時間ブロックした。ファージをＰＢＳＴ／５％ミルク粉末および最終濃度0.5％（v/v）の未結合担体タンパク質で、ローテーター上、室温で２時間ブロックした。ブロックの後、被覆したウェルを400μlのＰＢＳで２回洗浄した。各被覆したウェルに300μlの予備ブロックしたファージを加え、シェーカー上、室温で２時間インキュベートした。400μlのＰＢＳＴを数回加えて洗浄し、次いでＰＢＳで数回洗浄した（詳細については表８および１０参照）。
【０２９７】
ウェルあたり10mM Tris/HCl pH 8中300μlの20mM ＤＴＴを加え、１０分間インキュベートして、プレートからファージを溶出させた。大腸菌TG-1 14 mlにＤＴＴファージ溶出物を加え、これを2YT培地中、３７℃で0.6-0.8のOD600nmに増殖させて、ファージ感染のために50 mlプラスチックチューブ中、撹拌なし、３７℃で４５分間インキュベートした。4120 x gで５分間遠心分離した後、細菌ペレットを各々600μlの2xYT培地に再懸濁し、3xYT-CG寒天プレートに播種し、３７℃で一夜インキュベートした。コロニーをプレートから掻き取り、ファージをレスキューし、本明細書に記載のとおりに増幅した。
【０２９８】
パニング1849について、初回および３回目の選択は、上記の通り実施したペプチドパニングであった。２回目は、僅かに変更を加えた本明細書に記載のアガロースビーズと結合したＣ３ｂに基づく選択であった：ファージ予備吸着に用いたアガロースビーズ上の結合部位は、システインに代えてミルク粉末を用いてブロックし、またファージは上記の通りＰＢＳＴ／５％ミルク粉末で予備ブロックした。パニング1883について、初回および３回目の選択は、本明細書に記載のとおりに実施したビオチニル化Ｃ３ｂを用いた溶液パニングであった。２回目は上記ペプチドパニングであった（本項）。
【０２９９】
パニング結果
３回のパニング後に選択したクローンを発現ベクターにサブクローニングし、次いでＣ３ｂまたは選択に使用したペプチドのいずれかとの結合についてスクリーニングした。バックグラウンドレベルに対して少なくとも２倍の結合シグナルを示したクローンを一次ヒットと考えた。
【０３００】
第一溶液パニング1812の結果を、Neutravidinプレート上でビオチニル化Ｃ３ｂとの結合についてスクリーニングして、５３１の一次ヒットを得た。Ｃ３ｂスクリーニングと並行して実施したビオチニル化Ｃ３でのスクリーニングによって、７８個のクローンを同定し、これらはＣ３よりもＣ３ｂに対してより強いシグナルを示した。７８個のクローンの配列分析により、２７個のユニーク配列が示され、その１９個を固定し、精製できた。これらのクローンの小集団のみが捕捉ＥＬＩＳＡでカニクイザルＣ３ｂと交差反応性を示した。カニクイザル交差反応性Ｃ３ｂ新規抗体は、本発明の抗体の望ましい特質として同定され、Ｃ３ｂ新規結合分子はカニクイザル交差反応性について特異的に選択された。カニクイザルＣ３ｂタンパク質はカニクイザル血漿から精製し、純粋なカニクイザルＣ３ｂタンパク質をヒトＣ３ｂと共に抗原として、スクリーニングプロセスにおいて用いた。カニクイザルは優れた非ヒト霊長類の安全／tox種である。カニクイザルに対するＣ３ｂ新抗体の能力および親和性は、ヒトの５〜１０倍であることが望まれた。この基準は、カニクイザルにおけるＣ３ｂ濃縮の明確な阻害を達成するために選択され、したがってＣ３ｂ濃縮の明白な阻害によって引き起こされる潜在的毒性を評価できる。スクリーニング段階で、カニクイザル交差反応性がないかまたは弱いために多くのクローンが廃棄された。より多くのカニクイザル交差クローンを同定するために、パニング1812の再スクリーニングを実施した。再スクリーニングについて、１７８個のクローンを選択し、これらはプレートでＣ３ｂに対する顕著な結合を示し（バックグラウンドの少なくとも５倍）、以前は配列決定されなかった。１７８個中３８個は、カニクイザルＣ３ｂとの結合を示し、さらにＣ３カウンタースクリーニングを行った。３８個中１０個のクローンがカウンタースクリーニングを通過し、１個の新しいユニーククローンを得て、これを精製した。
【０３０１】
スルホヒドリルプレートを用いたＥＬＩＳＡを、ビーズ利用パニング1820のスクリーニングに使用した。７９の一次ヒットのうち49が、Ｃ３よりもＣ３ｂに対してより強いシグナルを示した。これらを配列決定して１３個のユニーク配列を得て、その１９個を固定し、精製できた。
【０３０２】
ディファレンシャルペプチドパニング1849由来のマイクロ発現Ｆａｂを、各選択において用いたペプチドとの結合についてスクリーニングした。ペプチドと結合した担体タンパク質をＥＬＩＳＡにおいて直接被覆抗原として用いた。２９４４の一次ヒットのうち５６６を同定したが、２２の一次ヒットのみがバックグラウンドの少なくとも５倍を示した。これら２２個のクローンおよびバックグラウンドの５倍近くを示した３２個の追加クローンについて、全長Ｃ３ｂとの結合について確認するためにさらにスクリーニングを行った。５４個のクローンのうち全長Ｃ３ｂとの結合を示すものはなかった。
【０３０３】
先のディファレンシャルペプチドパニングとは異なり、全長Ｃ３ｂでの２回選択およびペプチドでの１回のみの選択を、ディファレンシャルペプチドパニング1883において実施した。パニング1883の結果を、捕捉ＥＬＩＳＡにおけるＣ３ｂとの結合についてスクリーニングした。４４１６個のクローンのスクリーニングにより４９７一次ヒットを得た。バックグラウンドの少なくとも５倍の結合シグナルを示した２７５一次ヒットについて、カウンタースクリーニングをさらに行った。カウンタースクリーニングを通過した１８３個のクローンを配列決定して９個のユニーククローンを得た。７個のユニーククローンを固定し、精製できた。
【０３０４】
二次溶液パニング1889の結果を、捕捉ＥＬＩＳＡにおけるＣ３ｂとの結合についてスクリーニングして、４４１６の一次ヒットのうち２８７８を得た。ほとんどの一次ヒットは（2469 / 2878）バックグラウンドの少なくとも５倍の結合シグナルを示した。ディファレントパニングサブプール由来の異なるシグナル強度を有する３９６個の代表的クローンをカウンタースクリーニングに付すと決定した。３９６個のクローンのうち１５８個がカウンタースクリーニングを通過し、配列決定して１４個のユニーク配列を得て、最終的に１１個の精製されたＦａｂを得た。興味深いクローンを取り逃さないように、バックグラウンドの少なくとも５倍のＣ３ｂ結合シグナルを有する残りのクローンであって、カウンタースクリーニングに付さなかったもの（2073/2469）を、カニクイザルＣ３ｂとの結合について試験した。得られた１２９個のカニクイザル交差反応性クローンをＣ３ｂ対Ｃ３特異性についてスクリーニングした。２５個のクローンがＣ３結合に対してＣ３ｂ特異性を示し、最終的に４個の新しいユニーク配列を得た。４個のクローンのうち３個を固定し、精製できた。
【０３０５】
エピトープビニング（bining）
キット（ECL Proteinビオチニル化Module, GE）を用いて製造業者の指示書に従って精製したＦａｂををビオチニル化した。Zeba Desalt Spin Column （Pierce）を通過させてビオチニル化Ｆａｂを未結合ビオチンから精製した。ビオチニル化ＦａｂのヒトＣ３ｂとの結合活性を、捕捉ＥＬＩＳＡにおいて非ビオチニル化前駆体と直接比較して試験した（本明細書に記載）。結合活性がビオチニル化によって影響されなかったＦａｂのみを次に進めた。
【０３０６】
エピトープビニング（binning）は競合ＥＬＩＳＡによって実施した。使用した捕捉抗体はＣ３ｂのサブドメインである、Ｃ３ｄタンパク質ウサギポリクローナル抗ヒトＣ３ｄ抗体（Abcam）に対する抗体である。MaxisorpプレートのウェルをＰＢＳで2μg/mlに希釈した捕捉抗体で満たした。プレートを密封し、４℃で一夜インキュベートした。
【０３０７】
翌日、ＰＢＳＴ／５％ミルク粉末を加えてプレートの残りの結合部位をブロックした。プレートを室温で１時間インキュベートし、次いでＰＢＳＴで２回洗浄した。ＰＢＳＴ／0.5％ミルク粉末に希釈した最終濃度2.5μg/mlのＣ３ｂを加えた。室温で１時間プレートをインキュベートし、次いでＰＢＳＴで２回洗浄した。
【０３０８】
同時に、全てＰＢＳで希釈した、最終濃度2.5μg/mlのＣ３ｂ、ビオチニル化Ｆａｂおよび非ビオチニル化Ｆａｂ（ビオチニル化Ｆａｂに対して１００倍モル過剰）をウェルに加えた。プレートを室温で１時間インキュベートし、次いでＰＢＳＴで２回洗浄した。
【０３０９】
ビオチニル化Ｆａｂの検出のために、ＡＰ−複合化ストレプトアビジン（Zymed）を加え、プレートを室温で１時間インキュベートし、次いでＴＢＳＴで５回洗浄した。蛍光発生基質AttoPhosを製造業者の指示書に従って用いた。Tecan GENios Proプレートリーダーを用いて蛍光を測定した。
【０３１０】
エピトープビニングを上記の通り競合ＥＬＩＳＡによって実施した。ビオチニル化Ｆａｂと非ビオチニル化Ｆａｂ（１００倍過剰）の混合物をヒトＣ３ｂに加えた。ビオチンラベルを検出した。ネガティブコントロールFab MOR03207について得たシグナルを１００％の値として設定した。阻害を１００％シグナルとの関係でランク付けした。
【０３１１】
６個のエピトープ群を同定した（下記表に要約する）。グループＢとＣおよびグループＤとＥは、部分的に重複したエピトープを共有する。
【０３１２】
表２：エピトープ群の概要
【表２】
2012525829.tif 000027
【０３１３】
実施例３．親和性成熟および最適化
親和性成熟ライブラリーの作製
選択した抗体フラグメントの親和性および生物学的活性を上昇させるために、トリヌクレオチド標的突然変異誘発（Virnekas et al., 1994）を用いて、フレームワーク領域を一定に保ったまま、カセット突然変異誘発によってＬ−ＣＤＲ３およびＨ−ＣＤＲ２領域を並行して最適化した。親和性成熟のためのクローニングの前に、XbaI/EcoRIを介して全親Ｆａｂフラグメントを対応する発現ベクター（pMORPH(登録商標)X9_FH）からCysDisplay(商標)ベクターpMORPH(登録商標)25_LHCに移した。Ｈ−ＣＤＲ２最適化についてのライブラリークローニングと干渉する１個のBssHII部位の除去によって、HuCAL GOLD(登録商標)ディスプレイベクターpMORPH(登録商標)23_LHCからpMORPH(登録商標)25_LHCを作成した。
【０３１４】
親ＦａｂのＬ−ＣＤＲ３を最適化するため、Ｌ−ＣＤＲ３、フレームワーク４および軽鎖の定常領域（405 bp）をBpiI/SphIで除去し、フレームワーク４および定常ドメインと共に多様化したＬ−ＣＤＲ３のレパートリーで弛緩した。約1.5μgのＦａｂベクターフラグメントを３〜５倍モル過剰の多様化Ｌ−ＣＤＲ３を担持する挿入フラグメントでライゲートした。二次ライブラリーセットにおいて、Ｈ−ＣＤＲ２（XhoI/BssHII）を多様化し、一方で結合フレームワーク領域を一定に保った。クローニング効率をモニターするため、多様化したＨ−ＣＤＲ２カセットをクローン化する前に親Ｈ−ＣＤＲ２をダミーで置換した。
【０３１５】
ライブラリーのライゲーション混合物を4 mlの大腸菌TOP10F細胞（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）にエレクトロポレーションして、108〜109の独立コロニーを得た。このライブラリーサイズは、理論上の多様性のカバー度を補償した。ライブラリーの増幅は本明細書に記載のとおりに実施した。品質制御のため、単一のクローンをランダムに取り出して配列決定した。
【０３１６】
親和性成熟パニングのためのファージの調製
34μg/ml クロラムフェニコールおよび１％グルコースを含む2xYT培地（2xYT-CG）中でHuCAL（登録商標）成熟ライブラリーを増幅した。After 感染 with helper phage at an 0.5のOD600nmでVCSM13ヘルパーファージで感染後（撹拌なし、３７℃で３０分；250rpmで撹拌下、３７℃で３０分間）、細胞を回収し（4120 x g；５分；４℃）、2xYT/ 34μg/ml クロラムフェニコール/ 50μg/ml カナマイシン/ 0.25mM IPTGに再懸濁し、２２℃で一夜増殖した。上清からファージを２回ＰＥＧ沈殿し、ＰＢＳ中に再懸濁し、下記成熟パニングに用いた。
【０３１７】
（a）成熟パニング
成熟に用いた選択手法は、上記溶液パニングであった。パニングストリンジェンシーを増加させ、改善されたオフレートのため、抗原濃度を低下し、延長された洗浄条件（２４時間まで）を適用した。一夜洗浄工程を４℃で実施し、全ての他の洗浄工程を室温で実施した。
【０３１８】
親和性成熟のための候補の選択
一次パニング由来Ｆａｂを多様なアッセイで特徴付けた。下記基準に従い、それらを潜在的成熟候補としてランク付けし、グループ分けした：
・Ｃ３との結合に対するＣ３ｂの結合の選択性
・溶血アッセイにおける能力
・Ｃ３ｂおよびＭＡＣ沈着アッセイにおける能力
・作用形態
・エピトープビン
・親和性
８個の一次抗体を成熟に付し、したがって以下これらを「親」抗体と称する。
【０３１９】
親抗体MOR08035、8598および8599は一次パニング後に見出したＦａｂの最大の群に属する。それらはエピトープビンＤのメンバーであり、機能的アッセイにおいて活性を示し、Ｃ３およびＣ５コンバターゼを阻害する。Ｂ因子とＣ３ｂの結合はこれらの抗体によって強く阻害され、因子Ｈとの結合を弱い程度で阻害する。
【０３２０】
親抗体MOR08552は同じ特徴を示すが、わずかに異なるエピトープ（ビンＣ）を有する。
【０３２１】
MOR08672およびMOR08675はいずれもエピトープビンＤに属する。それらは因子Ｈの結合を十分に阻害するが、他の因子の結合の弱い阻害のみを示す。それらは上記抗体とは異なるメカニズムを介して作用しうる。また、他の因子による競合の欠如が、より低い親和性と同じ達成される能力をもたらしうる。この議論は特にMOR08675に適用してよく、これは妥当な能力を示すがそのＣ３ｂに対する親和性は本当に低い。
【０３２２】
MOR08555はエピトープグループＣのメンバーであり、MOR08305グループと類似の特徴を有するが、Ｃ５コンバターゼを阻害しない。
【０３２３】
MOR08653はエピトープビンＢに属し、これは部分的にビンＣと重複する。機能的アッセイにおけるその存在は、試験した全てのメカニズムの阻害をもたらす：Ｐ因子、Ｂ因子およびＨ因子の結合、Ｃ３ｂダイマー形成の阻害ならびにＣ３およびＣ５コンバターゼの阻害。
【０３２４】
パニングプールの組成における柔軟性を維持できるように、各親から成熟ライブラリーを別個に構築した。後の時点でプールを統合した。各親抗体について、その抗体によって示される阻害の主たるメカニズムに従って、標的ＫＤ値を定義した。MOR08598とMOR08653ならびにMOR08555とMOR08599は、各々２つのプールに統合した。各プール内で抗体は類似の抗原との親和性を示し、十分に発現され、同じ標的ＫＤを有し、重複エピトープを共有しない。
【０３２５】
親和性成熟のためのライブラリー
親和成熟をＬＣＤＲ３およびＨＣＤＲ２カセットの並行交換によって実施した。トリヌクレオチド指定カセット突然変異誘発によってＣＤＲ配列を最適化した。発現ベクターpMORPH(登録商標)x9_Fab_MHからＦａｂフラグメントをファージミドベクターpMORPH(登録商標)25にクローン化した。
【０３２６】
１６種の異なる親和性成熟ライブラリー（各親抗体について、ＬＣＤＲ３ひとつおよびＨＣＤＲ３ライブラリーひとつ）を標準クローニング法および多様化クローンのエレクトロコンピテント大腸菌TOP10F'細胞（Invitrogen）への形質転換によって作製した。ライブラリーサイズは良好であり、5x108〜4x109の範囲であった。ランダムに取り出したクローンの配列決定は、１００％の多様性を示した。親結合分子は取り出したクローンからは見つからなかった。最後に全１６種のライブラリーのファージを別個に調製した。
【０３２７】
親和性成熟のためのパニング戦略
ＨＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３ライブラリーを選択の間別個のままにした。８個の親のうち４個をリードとして処理した；他の４個の親は各々２つのプールにアレンジされた。作製した親和性成熟ライブラリーからレスキューされた約1012個のファージを、成熟パニングに付した。
【０３２８】
各ファージプールを用いた溶液パニングを、ビオチニル化抗原を用い、ヒトおよびカニクイザルＣ３ｂ間で変更して、実施した。パニングストリンジェンシーを増加させ、改善されたオフレートを選択するために、抗原濃度を抗原濃度を低下し、延長された洗浄条件（２４時間まで）を適用した。パニングおよび洗浄条件を上に要約する。成熟パニングの後、富化ファージミドプールをpMORPH(登録商標)x9_MH発現ベクターにサブクローニングした。
【０３２９】
親和性スクリーニングおよび成熟パニング結果
全パニング由来の合計２４６４個のクローンを、ヒトＣ３ｂに対する改善された親和性のための細菌溶解物としてスクリーニングした。一次親和性は溶液平衡滴定（ＳＥＴ）で見積もった。親クローンと比較して親和性において認められると見積もられたクローンを一次ヒットと考えた。
【０３３０】
各パニングサブプールから一次ヒットを得て、8305-ＬＣＤＲ３ライブラリー（これに関しては６５一次ヒットのうち最もよかった１７を配列決定した）を除く全一次ヒットを配列決定した。配列決定した２６１一次ヒットのうち、合計１７３個のユニーク配列を同定した。MOR08598を除く全親Ｆａｂ由来の誘導体を同定できた。ＨＣＤＲ２成熟誘導体は親MOR08552およびMOR08599から同定されなかった。
【０３３１】
タンパク質精製のための親和性最適化Ｆａｂの選択
ユニークプライマリーヒットをマイクロウェル培養プレートに取り、Ｆａｂのマイクロ発現に用いた。捕捉ＥＬＩＳＡにおけるヒトＣ３ｂ、カニクイザルＣ３ｂとの結合、捕捉ＥＬＩＳＡにおけるカウンター標的Ｃ３ｄおよびＣ５に対する交差反応性の確認ならびにカウンタースクリーニングの実施のための二次スクリーニング試験において、Ｆａｂ溶解物を用いた。狙いは各親からの約１２の誘導体を大規模に発現し、精製することであった。１２以上の誘導体が二次スクリーニングを通過する場合には、タンパク質精製のための選択は配列可変性に基づいた。以下の段落で各パニングサブプールについての選択プロセスを詳述する。
【０３３２】
親MOR08305からＨＣＤＲ２において成熟した２３個のユニーククローンおよびＬＣＤＲ３において成熟した１１個のクローンが同定された。21/23のＨＣＤＲ２成熟クローンがカウンタースクリーニングを通過し、18/21がヒトＣ３ｂと十分に結合した。しかし1/18のクローンのみがカニクイザルＣ３ｂとの良好な結合を示した。このクローン（MOR09124）を大規模精製のために選択した。さらに５個のクローンを配列可変性に従って大規模精製のために選択した。精製はMOR09122についてうまくいかなかった。3/11のＬＣＤＲ３成熟クローンはカウンタースクリーニングを通過しなかったが、ヒトＣ３ｂに対する高い結合シグナルが低い親和性を意味し、次に血清における残存結合を導くであろうため、2/3を大規模精製に含めた（MOR09130および9131）。精製はMOR09132についてうまくいかなかった。
【０３３３】
親8552から１６個のＬＣＤＲ３成熟誘導体が同定された。7/16の誘導体が上記と同様の基準に従って大規模精製のために選択された。しかし精製はそれらの全てについて失敗した。したがって、残りの９個の誘導体全てを大規模精製に付した。精製は2/9についてのみ成功した（MOR09308および9313）。
【０３３４】
親MOR08555からＨＣＤＲ２および３において成熟した１個のユニーククローンおよびＬＣＤＲ３において成熟した３個のクローンが同定された。合計で４個の誘導体のみが存在したので、それらの全てについて、二次スクリーニングでの動きとは無関係に、精製することとした。
【０３３５】
親MOR08599からＬＣＤＲ３において成熟した２５個のユニーククローンが同定された。それらのほとんどは、二次スクリーニングで実施した全ての試験において十分に実施した。大規模精製のためのクローンの選択は、配列可変性に基づいた。
【０３３６】
親MOR08653からＨＣＤＲ２において成熟した２５個のユニーククローンおよびＬＣＤＲ３において成熟した１０個のユニーククローンが同定された。各サブセットの１個のみがカウンタースクリーニングで十分に実施した。これらのクローン（MOR09198および9202）を進めた。他のクローンの選択は配列可変性に基づいた。
【０３３７】
親MOR08672からＨＣＤＲ２において成熟した５個のユニーククローンおよびＬＣＤＲ３において成熟した２９個のユニーククローンが同定された。ＨＣＤＲ２成熟クローンの1/5のみがカウンタースクリーニングを通過し、進んだ（MOR09139）。２個のさらなるＨＣＤＲ２成熟クローンを選択した。精製はMOR09137についてのみ成功した。ＬＣＤＲ３成熟クローンのほとんどは二次スクリーニングで十分に実施した。これらのクローンの選択は配列可変性に基づいた。
【０３３８】
親MOR08675からＨＣＤＲ２において成熟した７個のユニーククローンおよびＬＣＤＲ３において成熟した１７個のユニーククローンが同定された。ＨＣＤＲ２成熟の1/7のみがヒトおよびカニクイザルＣ３ｂとの弱い結合のみを示し、除外した。残りの６個のクローンのうち３個のみが潜在的グリコシル化部位を含まず、大規模精製に進んだ。潜在的グリコシル化部位を含む２個のさらなるクローンを選択に含めた。ＬＣＤＲ３成熟クローンのほとんどは二次スクリーニングで十分に実施した。これらのクローンの選択は、配列可変性に基づいた。
【０３３９】
さらに進める親和性最適化Ｆａｂの選択
示されていない親和性最適化Ｆａｂの特徴に関するデータ（例えば結合親和性、溶血の阻害、Ｃ３ｂ沈着の阻害）を含む前のセクションに示した利用可能なデータ全てを総覧した後、最良のＦａｂをさらに進めるべく選択した。選択は２２個の成熟Ｆａｂからなり、これらは４個の異なる親抗体に由来する。表５は選択したＦａｂの重要な特徴を要約する。
【０３４０】
表５：さらに進めるべく選択した２２個の成熟Ｆａｂの重要な特徴
【表３】
2012525829.tif 000028
【０３４１】
最適化ＦａｂのＩｇＧ変換およびＩｇＧレベルのクロスクローニング
所望のプロファイルを有する全８個の親Ｆａｂ、数個の成熟Ｆａｂおよび数個の成熟修復（潜在的グリコシル化部位を除去した）ＦａｂをヒトＩｇＧ形式にサブクローニングした。
【０３４２】
細胞を軽鎖および重鎖構築物の組合せでトランスフェクトして、ＩｇＧレベルでのクロスクローニングを達成する。MOR09124は同定された唯一のＨＣＤＲ２成熟クローンであるため、MOR09124の重鎖が他の成熟ファミリーメンバーの軽鎖と組み合わされたそれぞれのファミリー（MOR08305誘導体）についてのみクロスクローニングが可能であった。クロスクローンは新たなＭＯＲ番号を与えられ、表８にまとめられている。
【０３４３】
表８：クロスクローン抗体のＭＯＲ番号。
【表４】
2012525829.tif 000029
【０３４４】
上記親和性成熟Ｆａｂ、修復Ｆａｂ（グリコシル化部位を除去）およびクロスクローンＦａｂの、Fab9124、9397、9398、9136、9141、9373および9423の結合特性を、本明細書に記載の方法に従って決定した。表９はこれらのＦａｂについての結合親和性、機能的能力および補体因子結合の阻害を要約する。
【０３４５】
表９
【表５】
2012525829.tif 000030
【０３４６】
表８に要約されているＦａｂの結合親和性および機能的特性を測定するために使用される方法は、以下に詳述する。表８のデータから分かるとおり、本発明のＦａｂフラグメントは、100 pM以下、多くの場合10 pM以下の親和性でヒトおよびカニクイザルＣ３ｂ両方と結合できる。さらに、Ｆａｂフラグメントは、100 nM以下、多くの場合50 nM以下のＩＣ５０でヒトおよびカニクイザルＣ３ｂ両方に対する機能的能力を示す。
【０３４７】
実施例４．ＩｇＧ形態Ｃ３ｂ結合分子の作製および特徴付け
ＩｇＧの生殖系列化
ｐＭ２発現ベクター内の軽鎖および重鎖の免疫グロブリン可変領域をコードする領域を生殖系列化して、生殖系列化配列にマッチさせ、哺乳類細胞での発現に不適なコドンを避け、隠れたスプライシング部位を避けるためにGeneart（Geneart AG, Regensburg, Germany）で最適化した。末端のＱがピログルタミンを形成する可能性があるため、全重鎖のＮ末端ＱＶＱをＥＶＱに変えた。各親ファミリーから抗体を生殖系列化／最適化のためｎ選択した。簡潔には、以下のとおりに抗体を生殖系列化し、ＩｇＧ形態で発現した。
【０３４８】
ＩｇＧへの変換
全長免疫グロブリンを発現するため、Ｆａｂ重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインフラグメントをＦａｂ発現ベクターからＩｇＧ１発現ベクターにサブクローニングした。ＶＨドメインのpMORPH(登録商標)2_h_IgG1AAへのサブクローニングのために制限酵素MfeIおよびBlpIを用い、ここで２３４および２３５位のロイシンはアラニンに変異されてＦｃＲγ結合が抑制され、エフェクター機能が弱められている。ＶＬドメインフラグメントのpMORPH(登録商標)2_h_IgκへのサブクローニングはEcoRVおよびBsiWI部位を介して行い、一方でpMORPH(登録商標)2_h_Igλ2へのサブクローニングはEcoRVおよびHpaIを用いて行った。
【０３４９】
ヒトＩｇＧの一過性発現および精製
真核生物HKB11およびHEK293細胞を比１：１のＩｇＧ重鎖および軽鎖発現ベクターＤＮＡでトランスフェクトした。細胞培養上清をトランスフェクション後３〜７日で回収し、標準プロテインＡ親和性クロマトグラフィー（MabSelect SURE, GE Healthcare）に付した。異なることが記載されていない場合、1 x Dulbcecco ＰＢＳ（pH 7.2, Invitrogen）へのバッファー交換を行い、サンプルを滅菌ろ過した（0.2μm）。ＩｇＧの純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、またはAgilent BioAnalyzerを用いて、そして未変性状態でＨＰ−ＳＥＣによって、変性、低下および非低下条件下で分析した。
【０３５０】
生殖系列化抗体に新しいMOR番号を表１０に示すとおり与えた。
表１０：生殖系列化抗体のMOR番号。
【表６】
2012525829.tif 000031
【０３５１】
これらのうち、生殖系列化抗体9556、9611、9612、9609、9610、9674および9675をさらに特徴付けた。
【０３５２】
親和性測定
Ｃ３ｂ新規抗体は、Ｃ３ｂ分子上の新エピトープと結合して補体活性化を阻止する。Ｃ３ｂ上の新エピトープはまた、血漿中の他の豊富な補体タンパク質、例えば副経路を介して補体活性化を制御するＨ因子、Ｂ因子およびＰ因子の結合部位でもある。したがってＣ３ｂ新規抗体は、これらの豊富な補体タンパク質と競合してこれらの補体タンパク質とＣ３ｂの結合を効果的にブロックするために、高い親和性を有しているべきである。高い親和性は低い治療用量を達成するために必要とされる。例えば、血漿中のＨ因子の濃度が約3μMであり、Ｈ因子とＣ３ｂの結合親和性（Ｋｄ）が〜30 nMであり；Ｈ因子濃度がそのＫｄよりも１００倍高い。Ｃ３ｂ新規抗体がＣ３ｂとの結合についてＨ因子と競合する場合、Ｃ３ｂとＨ因子の結合を５０％阻害するためには10 pM KdのＣ３ｂ新規抗体の1 nM濃度（Ｋｄの100倍の抗体濃度）が必要である。したがって、10 pM以下のＫｄのＣ３ｂ新規抗体は、適切な治療抗体用量で副経路補体活性化の効果的なブロックを達成する。したがって、本発明の抗体分子は、65 pM以下、好ましくは10 pM以下の高い親和性を有するものが選択される。例えば、本発明の抗体分子は、9、8、7、6、5、4、3または2 pM以下のＣ３ｂ結合親和性（すなわち2 pM未満の高い親和性）を有するものを選択する。
【０３５３】
Ｃ３ｂ結合についての生殖系列化ＩｇＧ抗体の親和性は、以下のとおりBiacoreおよび溶液平衡滴定（ＳＥＴ）により測定した。
【０３５４】
Biacore測定
CM5センサーチップ（GE Healthcare, BR-1005-30）を２５℃で用いるBIAcore T100（GE Healthcare）で、Biacore動態実験を行った。移動バッファーはHBS-EP（+）（GE Healthcare, BR-1001-88）であった。簡潔には、下記の段階を実施して結合親和性を測定した。
【０３５５】
・抗Ｃ３ｄ ＩｇＧ固定センサーチップの調製：ウサギ抗Ｃ３ｄポリクローナル抗体（Abcam, ab-15981）（アセテート pH5.0 カップリングバッファー（GE Healthcare, BR-1003-51）中50μg/ml）を、供給業者の指示書（GE Healthcare, BR-1000-50）に従ったアミノカップリング法を用いて、10μl/分の流速で６００秒間、CM5チップ上で２種の異なるフローセル（Fc1および2）と結合した。最終工程レベルは＞7000RUである。
【０３５６】
・第２フローセルでのＣ３ｂの捕捉：移動バッファー中1μg/mlのＣ３ｂを第２フローセル（Fc2）に10μl/分で打ち込み、Ｆａｂについて〜70RUまたはＩｇＧ動態解析について〜20RUの捕捉レベルに達した。
【０３５７】
・両フローセルへの異なる濃度の抗Ｃ３ｂ ＦａｂまたはＩｇＧの打ち込み：両フローセル（Fc1および2）に60μl/分で２４０秒間、抗Ｃ３ｂ溶液（移動バッファー中0.3125nM〜10nM；1:2連続希釈）を打ち込む。
【０３５８】
・解離：両フローセルに60μl/分でHBS-EP（+）移動バッファーを打ち込んで、Ｃ３ｂと抗Ｃ３ｂ Ｆａｂ／ＩｇＧ間の解離をモニターする。5nMおよび2.5MのＦａｂ／ＩｇＧ濃度については２４００秒、別の5nM Ｆａｂ／ＩｇＧ濃度を含む他の全ての濃度について３００秒で、解離時間を設定した。
【０３５９】
・再生：両フローセルで、流速60μl/分で４０秒間、グリシン-HCl pH1.6（グリシン-HCl pH1.5およびグリシン pH2.0から調製, GE Healthcare）＋0.05% P20界面活性剤（GE Healthcare, BR-1000-54）で２回、各サイクルの終わりで、再生を実施した。
【０３６０】
・動態解析：Rmax値を局所的にフィットするBIAevaluation 1.1ソフトウェアで1:1結合モデルを適用して、動力学的速度定数を得た。
【０３６１】
Biacore結合導体測定の結果を下記表１１に示す。示されているとおり、本明細書に記載の抗体は、典型的には10 pM以下、多くの場合5 pM以下のＫＤ値で、ヒトＣ３ｂに高い結合親和性を示す。これらの抗体はカニクイザルＣ３ｂとも極めて高い親和性を示す（200 pM未満の結合親和性）。
【０３６２】
表１１
【表７】
2012525829.tif 000032
【０３６３】
ＳＥＴ測定
溶液平衡滴定（ＳＥＴ）によるＫＤ測定のために、抗体タンパク質のモノマー分画を用いた（少なくとも９０％モノマー含量、分析的ＳＥＣによる分析；ＦａｂについてSuperdex75 （Amersham Pharmacia）またはＩｇＧについてTosoh G3000SWXL （Tosoh Bioscience））。
【０３６４】
溶液中親和性測定は基本的には文献に記載のとおりに行った（Friguet et al. 305-19）。ＳＥＴ法の感受性および正確性を改善するため、古典的ＥＬＩＳＡからＥＣＬベースの技術に移した（Haenel et al., 2005）。
【０３６５】
1 mg/mlのヤギ抗ヒト（Ｆａｂ）２フラグメント特異的抗体（Dianova）をMSD Sulfo-TAG(商標)NHS-Ester（Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD, USA）で、製造業者の指示書に従って、標識化した。
【０３６６】
ポリプロピレンマイクロタイタープレートおよびアッセイバッファーとして0.5% ＢＳＡおよび0.02% Tween 20を含むＰＢＳ pH 7.4中で、実験を実施した。未標識化ヒトＣ３ｂまたはカニクイザルＣ３ｂを、予測ＫＤよりも少なくとも１０倍高い開始濃度の２ｎ連続希釈した。抗原を含まないウェルを用いてBmax値を測定し；アッセイバッファーを含むウェルを用いてバックグラウンドを測定した。例えば10 pM Ｆａｂ（最終体積60 μL中の最終濃度）を加えた後、混合物を室温で一夜インキュベートした。適用したＦａｂ濃度は予測ＫＤと同等または低かった。
【０３６７】
ＰＢＳ中0.05 μg/mlのヒトＣ３ｂ（30 μL/ウェル）で標準ＭＳＤプレートを一夜被覆し、ＰＢＳ中の３％ＢＳＡで１時間ブロックした。アッセイバッファーでプレートを洗浄した後、平衡化したサンプルをそれらのプレートに移し（30 μL/ウェル）、２０分間インキュベートした。洗浄後、30 μL/ウェルのMSD-Sulfo-tag標識化検出抗体（ヤギ抗ヒト（Ｆａｂ）２）を最終希釈1:1500でＭＳＤプレートに加え、室温、Eppendorfシェーカー（700 rpm）上で３０分間インキュベートした。
【０３６８】
プレートを洗浄し、界面活性剤を含む30 μL/ウェルのMSD Read Buffer Tを加えた後、Sector Imager 6000 （Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD, USA）を用いて、電気化学発光シグナルを検出した。
【０３６９】
カスタマイズしたフィッティングモデルを適用したXLfit（IDBS）ソフトウェアで、データを評価した。Ｆａｂ分子のＫＤ決定のために、下記フィットモデルを用いた（Haenel et al., 2005による。Abraham et al., 1996により改変した）：
【数１】
2012525829.tif 000033
[Fab]t: 適用した総Ｆａｂ濃度
x: 適用した総可溶性抗原濃度（結合部位）
Bmax: 抗原なしでのＦａｂの最大シグナル
KD: 親和性
【０３７０】
原理的には同じプロトコルを適用してＩｇＧ分子のＫＤ値を決定したが、以下の違いがる：Ｆａｂ分子に代えて完全ＩｇＧ分子を連続希釈抗原に加えて、室温で一夜平衡化した。次いで、サンプルを上記の通り試験した。
【０３７１】
データ評価、すなわちＩｇＧ分子のＫＤ決定のため、ＩｇＧについての下記フィットモデルを用いた（Piehler et al., 1997により改変した）：
【数２】
2012525829.tif 000034
[IgG]: 適用した総ＩｇＧ濃度
x: 適用した総可溶性抗原濃度（結合部位）
Bmax: 抗原なしでのＩｇＧの最大シグナル
KD: 親和性
【０３７２】
特に示さないが、ＳＥＴデータにより、本明細書に記載の抗体が10 pM以下、多くの場合5 pM以下の範囲の結合親和性で、高いヒトＣ３ｂ結合親和性を有することが確認される。同様に、本明細書に記載の抗体は、高い親和性、典型的には200 pM以下のＫＤで、カニクイザルＣ３ｂと結合する。
【０３７３】
Ｃ３ｂ抗体はＣ３に対する顕著な結合選択性を示す
Ｃ３ｂ前駆体であるＣ３に対してＣ３ｂとの結合に選択的であるかを決定するため、Ｃ３ｂ抗体を試験した。簡潔には、下記段階を実施してＣ３ｂに対する結合選択性を測定した。100μl/ウェルのカルボネートバッファー中2μg/mlの抗Ｃ３ｄウサギモノクローナル（abcam 17453）でMaxisorpプレートNunc（442404）を被覆する。プレートを密封し、４℃で一夜インキュベートする。プレートを吸引し、ＰＢＳ/0.5% Tween 20で２回洗浄する。プレートを希釈剤（ＰＢＳ、4% BSA Fraction V（Fisher ICN16006980）、0.1% Tween 20 （Sigma P1379）、0.1% Triton X-100 （Sigma P234729））でブロックし、室温で２時間または４℃で一夜インキュベートする。次いでＰＢＳ/0.5% Tween 20で１回プレートを洗浄する。精製したＣ３ｂ（complement technologies A114 lot 21）およびＣ３（complement technologies A113c）を1μg/mlで希釈剤で希釈し、100μl/ウェルで播種する。室温で１時間インキュベートする。次いでＰＢＳ/0.5% Tween 20で３回洗浄する。希釈剤でＦａｂを100nMおよび後の希釈（またはより高い濃度）で希釈し、100μl/ウェルで播種する。室温で１時間インキュベートする。プレートをＰＢＳ/0.5% Tween 20で３回洗浄する。希釈剤中1:400の100μl/ウェルの抗ヒスチジン-HRPモノクローナル検出抗体を加え、室温で１時間インキュベートする。ＰＢＳ/0.5% Tween 20で４回洗浄する。100μlのＴＭＢ基質（Pierce 34028）を加え、室温で５分までインキュベートする。各ウェルに50μlの停止液（２Ｎ硫酸）を加え、プレートを450nmで読み取り、570nmでのプラスティックリーディングのために補正する。
【０３７４】
図１に示すとおり、Ｃ３ｂ抗体はＣ３結合に対して選択的である。本抗体はＣ３結合に対して１０００倍以上Ｃ３ｂ結合選択性を達成した。図１は抗体9556の結合選択性の例を示すが、１０００倍の結合選択性は、本明細書に記載の７種のＩｇＧ Ｃ３ｂ抗体によって保持される特徴である。
【０３７５】
Ｃ３ｂ抗体は副補体経路を阻害する
抗Ｃ３ｂ抗体が副補体経路を阻害することを示すために、下記アッセイを実施した。
【０３７６】
溶血アッセイ
溶血アッセイは、補体活性化について試験し、抗ヒトＣ３ｂ ｍＡｂおよびＦａｂ分子の補体系による赤血球（ＲＢＣ）の溶解を阻止する能力を評価するために使用されている、基本的な機能的アッセイである（Evans et al. (1995). In vitro and in vivo inhibition of complement activity by a single-chain Fv fragment recognizing human C5. Mol Immunol 32, 1183-1195; Thomas et al. (1996). Inhibition of complement activity by humanized anti-C5 antibody and single-chain Fv. Mol Immunol 33, 1389-1401; Rinder et al. (1995). Blockade of C5a and C5b-9 generation inhibits leukocyte and platelet activation during extracorporeal circulation. J Clin Invest 96, 1564-1572）。簡潔には、古典経路アッセイのために、感作された赤血球を血清中に存在する補体タンパク質による溶解の標的として用いる。このアッセイは、高親和性抗ヒトＣ３ｂ ｍＡｂの特徴付けおよびスクリーニングのためのものである。
【０３７７】
この方法はRinder et al., (1995)およびThomas et al., (1996)から採用した。
【０３７８】
試薬：
ウサギ赤血球（Ｒｂ ＲＢＣ）−Lampire, Cat# 7246408
ヒト血清−Novartis Blood Research Program；またはカニクイザル血清−Alpha Genesis
ゼラチンベロナールバッファー（ＧＶＢ）−Boston BioProducts, Cat# IBB-300
ＥＧＴＡ−Boston BioProducts, Cat# BM-151
ＭｇＣｌ２
Ｕ底９６ウェルプレート−Corning, Cat# 3795
平底９６ウェルプレート−Corning, Cat# 3370
NP-40−Sigma, Cat# 74385
【０３７９】
プロトコル:
1. Ｒｂ ＲＢＣを洗浄し、GVB/EGTA/Mg++中8.33e7細胞/mlに調節する
2. ＧＶＢで希釈した抗体50μlを９６ウェル丸底プレートのウェルに加える；抗体は所望の最終濃度の２倍濃度であるべきである。
3. ＥＧＴＡおよびＭｇ++を含むＧＶＢで希釈した血清50μlを加える。
a. コントロールウェルを調製する：血清＋0nM抗体、０％溶解コントロール（バッファーのみ）、100％溶解コントロール（0.1％ NP-40）および血清、バッファー、およびNP-40ブランク。
b. １０％血清に対して抗体を試験する場合、10mM ＥＧＴＡおよび5mM Ｍｇ++（最終）を用いる；５０％血清に対して抗体を試験する場合、15〜30mM ＥＧＴＡ、5mM Ｍｇ++（最終）を用いる。
4. 室温で３０分間インキュベートする。
5. Ｒｂ ＲＢＣ３０μlをサンプルおよびコントロールウェルに加える；バッファー30μlをブランクウェルに加える。３７℃で３０分間インキュベートする。
6. 2000rpmで５分間、プレートを遠心分離する。
7. 上清を回収し、平底プレートに移す。
8. OD415およびOD570を読み取る。溶血％を計算する：
【数３】
2012525829.tif 000035
【０３８０】
図２は抗Ｃ３ｂ抗体の１０％ヒトまたはカニクイザル血清中で溶血を阻害する能力の例を示す。本明細書に記載の各Ｃ３ｂ抗体は、50 nM以下のＩＣ５０で溶血を阻害した。
【０３８１】
反対に、古典的補体系の活性化を試験するために感作した赤血球を用いてアッセイを行った場合、本明細書に記載の抗Ｃ３ｂ抗体は、古典的補体系を活性化しないことが見出された（データは示さず）。
【０３８２】
Ｃ３ｂ沈着アッセイ
副経路における補体Ｃ３に対する阻害活性を測定する一つの方法は、ザイモサンに沈着するその分解産物Ｃ３ｂを測定することである。ＥＬＩＳＡベースのアッセイを下記段階に従って実施した：カルボネートバッファー、pH 9.6（Pierce Cat# 28382）中1mg/mlのZymosan A（Sigma Z4250）25μlを、Maxisorp 384ウェルＥＬＩＳＡプレート（Nunc 464718）に４℃で一夜被覆する。翌日、ザイモサン被覆プレートを吸引し、100μl／ウェルのＥＬＩＳＡブロックバッファー、Synblock（AbD Serotec BUFO34C）で室温で２時間ブロックする。別の反応において、ゼラチンベロナールバッファー（Boston Bioproducts IBB320-10mM Barbital、145mM NaCl、0.1% ゼラチン、0.5mM MgCl2、10mM EGTA）で連続希釈した阻害剤を、1mM ＭｇＣｌ２および10mM ＥＧＴＡの最終反応濃度でＭｇＣｌ２およびＥＧＴＡを補った１０％血清に加える。ポジティブコントロールは阻害剤を含まず、ネガティブコントロールは25mM ＥＤＴＡを含む。室温で３０分間インキュベートして混合物を平衡に達させる。ブロックバッファーを除去するため、プレートを吸引し、ＴＢＳ/0.05% Tween-20で１回洗浄する。阻害剤またはコントロールを含む25μl／ウェルの１０％血清をプレートに加え、３７℃で３０分間インキュベートする（ザイモサンでのＣ３ｂ沈着の直線範囲内であるタイムコースによって予め決定した）。３０分間インキュベート後、TBS/0.05% Tween-20でプレートを３回洗浄する。ザイモサンでのＣ３ｂ沈着を検出するため、製造業者に従って、2％ＢＳＡ Fraction V（Fisher Cat# ICN 16006980）、0.1％ Tween 20（Sigma Cat# P1379）および0.1％ TritonX-100（Sigma Cat# P234729）を含むＰＢＳで希釈した25μl／ウェルのニワトリ抗ヒトＣ３−ＨＲＰ複合化ポリクローナル抗体（Immunology Consultants Laboratory, Inc. Cat# CC3-80P-1）をプレートに加え、室温で１時間インキュベートする。その後、TBS/0.05% Tween-20でプレートを３回洗浄し、次いで25μlのUltra TMB Substrate Solution（Pierce Cat#34028.）を加える。ウェル内の溶液が青くなった時点で、2N 硫酸15μlで反応を停止する。Spectromaxを用いて、570nmでプラスティックプレートについて補正して、450nmでプレートを読み取る（OD 450-570nm読み取り）。ザイモサンでのＣ３ｂ沈着のパーセンテージを次の式を用いて計算する： 
【数４】
2012525829.tif 000036
【０３８３】
図３はＣ３ｂ抗体のＣ３分解産物としてのＣ３ｂの生産を阻害する能力の例を示す。試験した各抗体は、少なくとも10 nM以下のＩＣ５０でＣ３ｂ沈着を阻害することが示された。
【０３８４】
ＭＡＣ沈着アッセイ
Ｃ３ｂ抗体の副補体経路を阻害する機能的能力を測定するための別のアッセイは、該抗体のＣ３ｂのプロセッシングの下流である膜侵襲複合体（ＭＡＣ）生産を阻害する能力を測定することである。簡潔には、カルボネートバッファー、pH 9.5中1 mg/mlのZymosan A（Sigma）をプレートに被覆して副経路を活性化した。ＦａｂおよびＩｇＧをそれぞれ血清とともにプレインキュベートし（2% 血清、5mM MgCl2、10mM EDTA）、次いでプレートに加え、室温で一夜インキュベートした。ＴＢＳＴでプレートを３回洗浄した後、抗C5b-9-ALP（Diatec）と共に１時間インキュベーション、次いでＴＢＳＴで３回洗浄および2mM ＭｇＣｌ２を補った４−メチルウンベリフェリルホスフェート（Fisher）と共に３０分間インキュベーションによって、ＭＡＣを検出した。  Reaction was stopped with 0.2M ＥＤＴＡで反応を停止し、プレートを励起＝355nm 、放出＝460nmで読み取った。ベースライン（ＥＤＴＡ処理ヒト血清）およびポジティブコントロール（ヒト血清）に対するＭＡＣ沈着の阻害を各サンプルについて計算し、PRISMでＩＣ５０曲線を作製するために用いた。
【０３８５】
図４はＣ３ｂ抗体のＭＡＣ沈着を阻害する能力を示す例示的データを示しており、したがって、本抗体が副補体経路を阻害することを示している。特に、本抗体は、5 nM以下のＩＣ５０でＭＡＣ沈着を阻害した。
【０３８６】
Ｃ３ａおよびＣ５ａ産生の阻害
Ｃ３ｂ抗体の副補体経路を阻害する能力を測定するために使用できる別のアッセイは、いずれも副経路においてＣ３ｂの下流活性化産物であるＣ３ａおよびＣ５ａの産生を測定することである。
【０３８７】
簡潔には、C5a-des-Arg ＥＬＩＳＡは、溶血アッセイにおいて阻害的であった抗体がＣ５のＣ５ａおよびＣ５ｂへの切断も阻害することを確認するため、溶血の間にＣ５ａ産生を測定するべく、本願発明者らによって開発された。
【０３８８】
コーティングバッファー（ビカルボネートpH 9.5-9.8）中 1μg/mlの100μl/ウェルのマウス抗ヒトC5a-des-Arg（US Biologics）でMaxisorpプレートを被覆し、４℃で一夜インキュベートした。ＰＢＳＴで３回洗浄後、プレートを300μl/ウェルの希釈剤（Synblock, AbD Serotec）で室温で２時間ブロックした。ブロック液を吸引後、希釈剤で希釈した100μlのサンプルまたは標準を室温で１時間インキュベートした。標準は次の通りに調製した：出発は20ng/ml標準（rC5a-des-Arg）で、1:4連続希釈を７点曲線のために調製した。溶血アッセイのサンプルを希釈剤で1:5に希釈した（溶血アッセイ上清はＣ５ａ ＥＬＩＳＡで使用するまで−８０℃で保存するべきである）。プレート間で、ＰＢＳＴで３回プレートを洗浄した。
【０３８９】
希釈剤で希釈した100μl/ウェルの0.4μg/mlの検出抗体（ビオチン−ヤギ抗ヒトｃ５ａ, R&D Systems）を加え、室温で１時間インキュベートした後、ＨＲＰ希釈剤（ポリＨＲＰ希釈剤）で1:5000に希釈した100μl/ウェルの Strep-HRP（ポリＨＲＰストレプトアビジン）を３０分間加えた。ＰＢＳＴで４回洗浄した後、100μl/ウェルのＴＭＢ基質（Ultra TMB基質溶液）を５〜１０分間加えた。50μl/ウェルの停止液（2N H2SO4）で反応を停止した。吸光度を読み取り（A450-A570）、SoftMax Proを用いてデータを分析した。
【０３９０】
同様に、C3a-des-Arg ＥＬＩＳＡは、溶血アッセイにおいて阻害的であった抗体がＣ３のＣ３ａおよびＣ３ｂへの切断も阻害することを確認するため、溶血の間にＣ３ａ産生を測定するべく、本願発明者らによって開発された。
【０３９１】
コーティングバッファー（ビカルボネートpH 9.5-9.8）中 1μg/mlの100μl/ウェルのマウス抗ヒトC3a-des-Arg（US Biologics）でMaxisorpプレートを被覆し、４℃で一夜インキュベートした。ＰＢＳＴで３回洗浄後、プレートを300μl/ウェルの希釈剤（Synblock, AbD Serotec）で室温で２時間ブロックした。ブロック液を吸引後、希釈剤で希釈した100μlのサンプルまたは標準を室温で１時間インキュベートした。標準は次の通りに調製した：出発は1 μg/ml標準（rC3a-des-Arg）で、1:3連続希釈を８点曲線のために調製した。溶血アッセイのサンプルを希釈剤で1:5に希釈した（溶血アッセイ上清はＣ５ａ ＥＬＩＳＡで使用するまで−８０℃で保存するべきである）。プレート間で、ＰＢＳＴで３回プレートを洗浄した。
【０３９２】
希釈剤で希釈した100μl/ウェルの10 μg/mlの検出抗体（ビオチン−マウス抗ヒトｃ３ａ, R&D Systems）を加え、室温で１時間インキュベートした後、ＨＲＰ希釈剤（ポリＨＲＰ希釈剤）で1:5000に希釈した100μl/ウェルの Strep-HRP（ポリＨＲＰストレプトアビジン）を３０分間加えた。ＰＢＳＴで４回洗浄した後、100μl/ウェルのＴＭＢ基質（Ultra TMB基質溶液）を５〜１０分間加えた。50μl/ウェルの停止液（2N H2SO4）で反応を停止した。吸光度を読み取り（A450-A570）、SoftMax Proを用いてデータを分析した。
【０３９３】
図５に示すとおり、Ｃ３ｂ抗体はＣ３ａおよびＣ５ａの産生を阻害することにより副経路駆動補体活性化を阻止できた。より具体的には、本明細書に記載のＣ３ｂ抗体は、Ｃ３ａおよびＣ５ａ産生の阻害によって測定した場合、50 nM以下のＩＣ５０で副経路を阻害する。
【０３９４】
Ｃ３ｂ抗体はインビトロＣ３コンバターゼ酵素活性を阻害する
Ｃ３水空転（Tick-over）コンバターゼゲルベースアッセイ
このアッセイにおいて、Ｆａｂ／ＩｇＧをＣ３を含む１０％Ｃ３水と共にプレインキュベートして、Ｄ因子およびＢ因子を加えるときにＣ３水空転を介してコンバターゼ活性を測定する。タンパク質試薬を下記最終濃度で用いる：続く希釈で天然Ｂ因子（100nM）、Ｄ因子（40nM）、Ｃ３（400nM）、ＭｇＣｌ（5mM）およびＦａｂ／ＩｇＧ 1000nM。９６ウェルポリプロピレンプレートにおいて、多様な希釈でＦａｂ／ＩｇＧを加える（ＰＢＳコントロールサンプルを含む）。これにＣ３を加え、室温で１時間インキュベートする。次いで１ｘＰＢＳ中Ｂ因子、Ｄ因子およびＭｇＣｌの原液混合物を調製する。１時間インキュベーション後、適量の反応混合物を各ウェル中のＦａｂ／ＩｇＧ−Ｃ３に加える。速やかに０時点を取り、４Ｘサンプルバッファーを加え、９５℃に置く。コンバターゼ反応物を室温で１５分間インキュベートさせる。次いで最終時点を取り、４Ｘサンプルバッファーを加え、９５℃に置く。各サンプルについて全体積を４−１２％ Bis-Tris Gelで、低下条件下で実行する。（Ｄ因子を除いた別の反応においても０時点を作成できる）。
【０３９５】
Ｃ３ｂゲルベースコンバターゼアッセイ
このアッセイは、Ｃ３ｂと共にＦａｂ／ＩｇＧをプレインキュベートするように設計される。インキュベーション後、これをＣ３反応混合物に加えてコンバターゼ活性を確認する。タンパク質試薬を下記最終濃度で用いる：続く希釈で天然Ｃ３ｂ（32nM）、天然Ｂ因子（100nM）、Ｄ因子（40nM）、Ｃ３（400nM）、ＭｇＣｌ（5mM）およびＦａｂ／ＩｇＧ 1000nM。９６ウェルポリプロピレンプレートにおいて、多様な希釈で適量のＦａｂ／ＩｇＧを加える（ＰＢＳコントロールサンプルを含む）。これにウェルあたり適量のＣ３ｂを加える。３７℃で１時間インキュベートする。次いで１ｘＰＢＳ中Ｂ因子、Ｄ因子およびＭｇＣｌの原液混合物を調製する。１時間インキュベーション後、Ｃ３を原液混合物に加え、速やかに適量の反応混合物を各ウェル中のＦａｂ／ＩｇＧ−Ｃ３に加える。速やかに０時点を取り、４Ｘサンプルバッファーを加え、９５℃に置く。コンバターゼ反応物を室温で１５分間インキュベートさせる。次いで最終時点を取り、４Ｘサンプルバッファーを加え、９５℃に置く。各サンプルについて全体積を４−１２％ Bis-Tris Gelで、低下条件下で実行する。（Ｄ因子を除いた別の反応においても０時点を作成できる）。
【０３９６】
実行したＣ３コンバターゼゲルベースアッセイ
このアッセイは、Ｃ３ｂ、Ｂ因子変異体およびＤ因子を用いて安定なコンバターゼが生成されるように、設計される。これにＦａｂ／ＩｇＧを加え、インキュベートさせる。次いでＴｃを加え、分析のためにサンプルをとる。Ｃ３ｂはコンバターゼを形成できない。タンパク質試薬を下記最終濃度で用いた：続く希釈で天然Ｃ３ｂ（32nM）、Ｂ因子変異体（16nM）、Ｄ因子（40nM）、Ｃ３（400nM）、ＭｇＣｌ（5mM）およびＦａｂ／ＩｇＧ 1000nM。９６ウェルポリプロピレンプレートにおいて、Ｃ３ｂ、Ｂ因子、Ｄ因子およびＭｇＣｌを加え、３７℃で１０分間インキュベートする。次いで多様な希釈でＦａｂ／ＩｇＧ（ＰＢＳコントロール）を加え、３７℃で２０分間インキュベートする。次いでＣ３を加え、室温で１５分間インキュベートする。速やかに０時点を取り、４Ｘサンプルバッファーを加え、９５℃に置く。コンバターゼ反応を室温で１５分間インキュベートさせる。次いで最終時点を取り、４Ｘサンプルバッファーを加え、９５℃に置く。各サンプルについて全体積を４−１２％ Bis-Tris Gelで、低下条件下で実行する。（Ｄ因子を除いた別の反応においても０時点を作成できる）。
【０３９７】
図６に示すとおり、Ｃ３ｂ抗体は副経路インビトロＣ３コンバターゼ酵素活性を阻害する。図６Ａは空転（tick-over）コンバターゼ酵素活性を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。図６Ｂは６ＡのゲルにおけるＣ３ｂ生成の阻害の定量を示す。図６Ｃは抗Ｃ３ｂ抗体が予め形成されたＣ３コンバターゼ酵素活性を阻害することを示す。
【０３９８】
Ｃ３ｂ抗体はインビトロＣ５コンバターゼ酵素活性を阻害する
さらに抗Ｃ３ｂ抗体の副補体経路を阻害する能力を特徴付けるために、本抗体のＣ５コンバターゼの活性化を阻害する能力を試験した。簡潔には、精製したＣ３およびトリプシン（Sigma）と共に室温で１０分間インキュベーションして、Zymosan A（Sigma）にＣ３ｂを沈着した。ザイモサンを遠心分離し、上清を除去し、精製したＣ３、ｆＢ、ｆＤおよびＮｉＣｌ２を加えてＣ３ｂを増幅した。ザイモサン上のＣ３ｂの所望の密度が達成されるまで増幅段階を反復した。
【０３９９】
Ｆａｂ／ＩｇＧをZymosan-C3bと共に室温で４５分間プレインキュベートした。精製したタンパク質を加えた（Complement Tech）：Ｃ５（100nM）、Ｃ６（100nM）、ｆＢ（500nM）、ｆＤ（160nM）および5mM ＮｉＣｌ２。反応を３７℃で５分間インキュベートし、氷冷ＧＶＢ＋10mM ＥＤＴＡへの1:10希釈によって停止した。反応産物をchRBC（8E7/ml）および２％ ヒト血清に加え、３７℃で３０分間インキュベートする溶血アッセイを用いて、Ｃ５ｂＣ６レベルを定量した。細胞を2000rpmで５分間遠心分離し、上清をA415/A570で読み取った。精製したＣ５ｂＣ６タンパク質（Complement Tech）を標準曲線として用いた。
【０４００】
図７に示すとおり、Ｃ３ｂ抗体は副経路インビトロＣ５コンバターゼ酵素活性を阻害した。
【０４０１】
Ｃ３ｂ抗体によるＣ３ｂと補体因子の結合のブロック
下記実験を行って、抗Ｃ３ｂ抗体のＣ３ｂと副補体経路のメンバー間の相互作用を阻害する能力を測定し、したがって本抗体が副補体経路を阻害する潜在的なメカニズムを示した。簡潔には、AminoLink Reductant（Pierce）を用いて精製したＣ３ｂおよびｆＰを非複合化アクセプターまたはドナービーズ（PerkinElmer）と、室温で４８時間インキュベーションして、複合化した。Carboxymethocylamine Hemihydrochloride（Aldrich）を用いてビーズをクエンチし、13000 rpmで遠心分離し、0.1M ＴＢＳＴで３回洗浄して精製した。２０倍モル過剰のNHS-Chromogenicビオチン（Pierce）と共に室温で３０分間インキュベートして、精製したｆＢ（D24G/N260D）およびｆＨをビオチニル化して、Zeba 0.5ml脱塩カラム（Pierce）を用いて精製した。
【０４０２】
Ｃ３ｂ−Ｃ３ｂおよびＣ３ｂ−ｆＰ近接性のため、ＦａｂまたはＩｇＧをそれぞれ、Ｃ３ｂ-Acceptorビーズ（20μg/ml）と共に室温で６０分間プレインキュベートした。次いでＣ３ｂ−DonorビーズまたはｆＰ−Donorビーズ（20μg/ml）を加え、プレートを室温で一夜インキュベートした後読み取った。Ｃ３ｂ−ｆＢおよびＣ３ｂ−ｆＨ近接性のため、抗体をＣ３ｂ−Acceptorビーズ（20μg/ml）と共に室温で６０分間プレインキュベートした。次いでビオチニル化ｆＢ（D24G/N260D）またはｆＨを加え、室温で６０分間インキュベートした。次いでＳＡ−Donorビーズを加え（20μg/ml）、プレートを室温で一夜インキュベートした後読み取った。プレートはBMG Pherastar（励起＝680、放出＝520-620）で読み取った。
【０４０３】
図８に示すとおり、Ｃ３ｂ抗体は複数の補体因子とＣ３ｂの結合をブロックする。図に見られるとおり、抗Ｃ３ｂ抗体は異なる作用機序を用いて副補体経路をブロックする。図８ＡはＣ３ｂ抗体によるＢ因子とＣ３ｂの結合の阻害を示す。図８ＢはＣ３ｂ抗体によるＰ因子とＣ３ｂの結合の阻害を示す。図８ＣはＣ３ｂ抗体によるＨ因子とＣ３ｂの結合の阻害を示す。図８ＤはＣ３ｂ抗体によるＣ３ｂ−Ｃ３ｂ二量体形成の阻害を示す。
【０４０４】
Ｃ３ｂ抗体はヒトＣ３ｄまたはヒトＣ５と交差反応しない
ヒトＣ３ｄおよびＣ５との交差反応性について、抗Ｃ３ｂ抗体を試験した。
【０４０５】
ヒトＣ３ｂ、ヒトＣ３ｄまたはカニクイザルＣ３ｂとの結合について試験したＥＬＩＳＡに用いた捕捉抗体は、Ｃ３ｂのサブドメインであるＣ３ｄタンパク質ウサギポリクローナル抗ヒトＣ３ｄ抗体（Abcam）に対する抗体である。MaxisorpプレートのウェルをＰＢＳで2μg/mlに希釈した捕捉抗体で満たした。プレートを密封し、４℃で一夜インキュベートした。ＦａｂとＣ５の結合を試験するため、捕捉抗体は、最終濃度5μg/mlで使用した抗Ｃ５抗体（US Biologicals）であった。
【０４０６】
翌日、ＰＢＳＴ／５％ミルク粉末を加えてプレートの残りの結合部位をブロックした。プレートを室温で１時間インキュベートし、次いでＰＢＳＴで２回洗浄した。ＰＢＳＴ／０．５％ミルク粉末で最終濃度2.5μg/mlに希釈したＣ３ｂを加えた。プレートを室温で１時間インキュベートし、次いでＰＢＳＴで３回洗浄した。Ｆａｂの連続希釈を行い、次いでブロックしたプレートに加えた。プレートを室温で１〜２時間インキュベートし、次いでＰＢＳＴで３回洗浄した。
【０４０７】
Ｆａｂの検出のため、抗ＨＩＳ ＡＰ複合化抗体（Invitrogen, 46-0284）を加え、プレートを室温で１時間インキュベートし、次いでＴＢＳＴで５回洗浄した。蛍光基質AttoPhosを製造業者の指示書に従って使用した。蛍光をTecan GENios Proプレートリーダーで測定した。
【０４０８】
Ｃ３ｄおよびＣ５についてのこれらの実験の結果を、それぞれ図９および１０に示す。示すとおり、Ｃ３ｂ抗体はＣ３ｄまたはＣ５のいずれとも結合しない。
【０４０９】
Ｃ３ｂ抗体はｉＣ３ｂおよびＣ３ｃを同等に十分に認識する
本明細書に記載の抗Ｃ３ｂ抗体が補体系成分ｉＣ３ｂおよびＣ３ｃと結合するかを決定するため、下記段階を実施した：ｉＣ３ｂ（complement Technologies A115）、Ｃ３ｄ（complement Technologies A117）またはＣ３ｃ（complement Technologies A116）をカルボネートバッファー中2μg/mlで、Coat MaxisorpプレートNunc（442404）に１００μl/ウェルで直接加える。プレートを密封し、４℃で一夜インキュベートする。プレートを吸引し、ＰＢＳ/0.5% Tween 20で３回洗浄する。希釈剤（ＰＢＳ、4% BSA Fraction V（Fisher ICN16006980）、0.1% Tween 20（Sigma P1379）、0.1% Triton X-100（Sigma P234729））でプレートをブロックし、室温で２時間または４℃で一夜インキュベートする。次いでプレートをＰＢＳ/0.5% Tween 20で１回洗浄する。希釈剤でＦａｂを100nMおよび続く希釈（または必要によりより高い濃度）に希釈し、100μl/ウェルで播種する。室温で１時間インキュベートする。ＰＢＳ/0.5% Tween 20で３回洗浄する。希釈剤中1:400の100μl/ウェルの抗Histidine-ＨＲＰ モノクローナル検出抗体を加え、室温で１時間インキュベートする。次いでＰＢＳ/0.5% Tween 20で４回洗浄する。100μlのＴＭＢ基質（Pierce 34028）を加え、室温で５分までインキュベートする。各ウェルに50μlの停止液（2N 硫酸）を加え、プレートを450nmで読み取り、プラスチックリーディングについて570nmで補正する。
【０４１０】
図１１に示すとおり、Ｃ３ｂ抗体はｉＣ３ｂおよびＣ３ｃ両方と交差反応する。
【０４１１】
種間交差反応
ヒトおよびカニクイザルに加えて、本明細書に記載の抗Ｃ３ｂ抗体が他の種由来のＣ３ｂと結合するかを決定するため、上記の通り溶血アッセイを実施した。各々の種に用いた血清濃度は次の通りである：１０％ラット血清；２０％ウサギ血清；１０％ブタ血清；２０％マウス血清；１０％モルモット血清；および１０％イヌ血清。図１２に示すとおり、Ｃ３ｂ抗体はラット、ウサギ、ブタ、マウスおよびモルモットを含む多様な種と交差反応できた。
【０４１２】
Ｆａｂ形態Ｃ３ｂ新規結合分子
上記全ＩｇＧ形態抗Ｃ３ｂ抗体に加えて、同じ可変ドメインを用いてＦａｂ形態の抗原結合フラグメントを構築した。抗Ｃ３ｂ Ｆａｂを評価して、上記の方法に従ってそれらの結合特性を決定した。表１１はＦａｂのサブセットについての結合親和性、機能的能力および補体因子結合の阻害を総覧する。
【０４１３】
表１２
【表８】
2012525829.tif 000037
【０４１４】
本発明の態様
本発明は次の態様を含むが、それらに限定されない：
１．  ヒトまたはカニクイザル補体Ｃ３ｂタンパク質と特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントであって、抗体が100 pM以下のＫＤでヒトＣ３ｂと結合する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
２．  250 pM以下のＫＤでカニクイザルＣ３ｂとも結合する、上段の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
３．  10 pM以下のＫＤでヒトＣ３ｂと結合する、上段のいずれかの単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
４．  2 pM以下のＫＤでヒトＣ３ｂと結合する、上段のいずれかの単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
５．  インビトロ溶血アッセイで測定したとき、65 nM以下のＩＣ５０でヒト副補体経路を阻害する、上段のいずれかの単離された抗体。
６．  インビトロＣ３ｂ沈着で測定したとき、50 nM以下のＩＣ５０でヒト副補体経路を阻害する、上段のいずれかの単離された抗体。
７．  補体膜侵襲複合体の沈着で測定したとき、5 nM以下のＩＣ５０でヒト副補体経路を阻害する、上段のいずれかの単離された抗体。
８．  Ｃ３ａおよびＣ５ａの産生で測定したとき、100 nM以下のＩＣ５０でヒト副補体経路を阻害する、上段のいずれかの単離された抗体。
９．  ヒトまたはカニクイザル補体Ｃ３ｂタンパク質と特異的に結合し、表１に記載の抗体と交差競合する、上段のいずれかの抗体またはその抗原結合フラグメント。
１０．  モノクローナル抗体である、上段のいずれかの単離された抗体。
１１．  ヒトまたはヒト化抗体である、上段のいずれかの単離された抗体。
１２．  キメラ抗体である、上段のいずれかの単離された抗体。
１３．  一本鎖抗体である、上段のいずれかの単離された抗体。
１４．  ＦａｂフラグメントまたはＳｃＦｖフラグメントである、上段のいずれかの単離された抗体。
１５．  ＩｇＧアイソタイプである、上段のいずれかの単離された抗体。
１６．  各ヒトＶＨまたはＶＬ生殖系列配列由来の抗体フレームワークにアミノ酸が置換されているフレームワークを含む、上段のいずれかの単離された抗体。
１７．  Ｃ３との結合親和性よりも少なくとも1000倍大きな親和性でＣ３ｂと結合する、上段のいずれかの単離された抗体。
１８．  配列番号１、１５、２９、４３、５７、７１、８５、９９、１１３、１２７、１４１、１５５、１６９および１８３からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ１；配列番号２、１６、３０、４４、５８、７２、８６、１００、１１４、１２８、１４２、１５６、１７０および１８４からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ２；ならびに配列番号３、１７、３１、４５、５９、７３、８７、１０１、１１５、１２９、１４３、１５７、１７１および１８５からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ３を含み、補体タンパク質Ｃ３ｂと結合する、上段のいずれかの単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
１９．  配列番号４、１８、３２、４６、６０、７４、８８、１０２、１１６、１３０、１４４、１５８、１７２および１８６からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号５、１９、３３、４７、６１、７５、８９、１０３、１１７、１３１、１４５、１５９、１７３および１８７からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ２；ならびに配列番号６、２０、３４、４８、６２、７６、９０、１０４、１１８、１３２、１４６、１６０、１７４および１８８からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ３を含み、補体タンパク質Ｃ３ｂと結合する、上段のいずれかの単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
２０．  配列番号４、１８、３２、４６、６０、７４、８８、１０２、１１６、１３０、１４４、１５８、１７２および１８６からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号５、１９、３３、４７、６１、７５、８９、１０３、１１７、１３１、１４５、１５９、１７３および１８７からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ２；ならびに配列番号６、２０、３４、４８、６２、７６、９０、１０４、１１８、１３２、１４６、１６０、１７４および１８８からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ３をさらに含む、上段の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
２１．  配列番号７、２１、３５、４９、６３、７７、９１、１０５、１１９、１３３、１４７、１６１、１７５および１８９からなる群から選択される重鎖可変ドメイン配列ならびに配列番号８、２２、３６、５０、６４、７８、９２、１０６、１２０、１３４、１４８、１６２、１７６および１９０からなる群から選択される軽鎖可変ドメイン配列を含み、補体タンパク質Ｃ３ｂと結合する、上段のいずれかの単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
２２．  配列番号７、２１、３５、４９、６３、７７、９１、１０５、１１９、１３３、１４７、１６１、１７５および１８９からなる群から選択される配列と少なくとも９５％配列同一性を有する重鎖可変ドメインを含み、Ｃ３ｂと結合する、上段のいずれかの単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
２３．  配列番号８、２２、３６、５０、６４、７８、９２、１０６、１２０、１３４、１４８、１６２、１７６および１９０からなる群から選択される配列と少なくとも９５％配列同一性を有する軽鎖可変ドメインを含み、Ｃ３ｂと結合する、上段のいずれかの単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
２４．  配列番号８、２２、３６、５０、６４、７８、９２、１０６、１２０、１３４、１４８、１６２、１７６および１９０からなる群から選択される配列と少なくとも９５％配列同一性を有する軽鎖可変ドメインを含む、上段の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
２５．  配列番号９、２３、３７、５１、６５、７９、９３、１０７、１２１、１３５、１４９、１６３、１７７および１９１からなる群から選択される配列と少なくとも９５％配列同一性を有する重鎖を含み、Ｃ３ｂと結合する、上段のいずれかの単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
２６．  配列番号１０、２４、３８、５２、６６、８０、９４、１０８、１２２、１３６、１５０、１６４、１７８および１９２からなる群から選択される配列と少なくとも９５％配列同一性を有する軽鎖を含み、Ｃ３ｂと結合する、上段のいずれかの単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
２７．  配列番号１０、２４、３８、５２、６６、８０、９４、１０８、１２２、１３６、１５０、１６４、１７８および１９２からなる群から選択される配列と少なくとも９５％配列同一性を有する軽鎖をさらに含む、上段の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
２８．  上段のいずれかの単離された抗体またはその抗原結合フラグメントおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
２９．  配列番号７、２１、３５、４９、６３、７７、９１、１０５、１１９、１３３、１４７、１６１、１７５および１８９からなる群から選択される配列と少なくとも９５％配列同一性を有する重鎖可変ドメインを含むポリペプチドをコードする配列を含んでなる、単離された核酸。
３０．  配列番号８、２２、３６、５０、６４、７８、９２、１０６、１２０、１３４、１４８、１６２、１７６および１９０からなる群から選択される配列と少なくとも９５％配列同一性を有する軽鎖可変ドメインを含むポリペプチドをコードする配列を含んでなる、単離された核酸。
３１．  上段の核酸を含むベクター。
３２．  上段のいずれかの抗体またはその抗原結合フラグメントの重鎖をコードする組換えＤＮＡ配列および上段のいずれかの抗体またはその抗原結合フラグメントの軽鎖をコードする第二の組換えＤＮＡ配列を含む、単離された宿主細胞であって、前記ＤＮＡ配列がプロモーターと作動可能に連結しており、宿主細胞内で発現可能である、単離された宿主細胞。
３３．  抗体がヒトモノクローナル抗体である、上段の単離された宿主細胞。
３４．  宿主細胞が非ヒト哺乳類細胞である、上段の２つの単離された宿主細胞。
３５．  加齢性黄斑変性を処置する方法であって、それを必要とする対象に有効量の上段の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む組成物を投与することを含む、方法。
３６．  対象がヒトである、上段の方法。
３７．  対象の副補体経路を阻害する方法であって、それを必要とする対象に有効量の上段の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む組成物を投与することを含む、方法。
３８．  対象がヒトである、上段の方法。
【０４１５】
本明細書に記載の全ての特許、特許出願および文献は、それらの全体について、参照により本明細書に組み込む。本発明はその好ましい態様について具体的に示され、説明されているが、多様な変形および詳細が特許請求の範囲に含まれる本発明の範囲から離れることなく行われうることを当業者は理解する。
【図１】
2012525829.tif 000038
【図２】
2012525829.tif 000039
【図３】
2012525829.tif 000040
【図４】
2012525829.tif 000041
【図５】
2012525829.tif 000042
【図６Ａ】
2012525829.tif 000043
【図６Ｂ】
2012525829.tif 000044
【図６Ｃ】
2012525829.tif 000045
【図７】
2012525829.tif 000046
【図８Ａ】
2012525829.tif 000047
【図８Ｂ】
2012525829.tif 000048
【図８Ｃ】
2012525829.tif 000049
【図８Ｄ】
2012525829.tif 000050
【図９】
2012525829.tif 000051
【図１０】
2012525829.tif 000052
【図１１】
2012525829.tif 000053
【図１２Ａ】
2012525829.tif 000054
【図１２Ｂ】
2012525829.tif 000055
【図１２Ｃ】
2012525829.tif 000056
【図１２Ｄ】
2012525829.tif 000057
【図１２Ｅ】
2012525829.tif 000058
【図１２Ｆ】
2012525829.tif 000059
【配列表】
2012525829000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成23年12月15日(2011.12.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2012525829000001.app
【国際調査報告】
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