(57)【要約】  本発明は、cLC52、RPL33及びcLC61からなる群から選択される発現エンハンサーをコードする組み換えヌクレオチド配列を含む真核宿主細胞、及び、目的タンパク質（ＰＯＩ）の生産方法におけるその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
cLC52、RPL33及びcLC61からなる群から選択される、発現エンハンサーをコードする組み換えヌクレオチド配列を含む真核宿主細胞。
【請求項２】
前記ヌクレオチド配列がＰ．パストリス（P. pastoris）に由来する請求項１記載の宿主細胞。
【請求項３】
真菌細胞、好ましくは酵母細胞、又は高等真核細胞、好ましくは哺乳類又は植物細胞である請求項１又は２記載の宿主細胞。
【請求項４】
酵母細胞がピキア属の細胞であり、特にＰ．パストリス（P. pastoris）の株の細胞である請求項３記載の宿主細胞。
【請求項５】
目的タンパク質（ＰＯＩ）をコードする目的遺伝子の導入のためのワイルドカード宿主細胞である請求項１から４のいずれか１項記載の宿主細胞。
【請求項６】
ＰＯＩをコードする組み換えヌクレオチド配列を含む生産者細胞であり、ＰＯＩを生産できる請求項１から４のいずれか１項記載の宿主細胞。
【請求項７】
−cLC52、RPL33及びcLC61からなる群から選択される、発現エンハンサーをコードする組み換えヌクレオチド配列、及び
−ＰＯＩをコードする目的遺伝子
を含むＰ．パストリス（P. pastoris）宿主細胞。
【請求項８】
真核宿主細胞中のＰＯＩの発現を増加させるための発現エンハンサーとしての、cLC52、RPL33及びcLC61からなる群から選択されるタンパク質をコードするヌクレオチド配列の使用。
【請求項９】
−請求項５記載の宿主細胞の提供、及び
−ＰＯＩをコードするヌクレオチド配列の導入
を含む請求項６記載の宿主細胞の生産方法。
【請求項１０】
−真核宿主細胞の提供、
−cLC52、RPL33及びcLC61の少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列の導入、及び
−ＰＯＩをコードするヌクレオチド配列の導入
を含む請求項６記載の宿主細胞の生産方法。
【請求項１１】
−請求項６記載の生産者宿主細胞の提供、
−細胞培養物中のＰＯＩ及び発現エンハンサーの共発現、及び
−前記細胞培養物からのＰＯＩの獲得
を含む、真核細胞中にＰＯＩを生産する方法。
【請求項１２】
前記ＰＯＩが、血清タンパク質、例えば免疫グロブリン又は血清アルブミン、酵素、ホルモン、シグナリング分子、マトリックスタンパク質、そのフラグメント又は誘導体からなる群から選択されるポリペプチドである請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記ＰＯＩが宿主細胞代謝産物の生産を媒介する請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
ＰＯＩをコードする組み換えヌクレオチド配列が、宿主細胞のゲノム中への組み込みのために又は宿主細胞中の自律複製のために適したプラスミドに提供される請求項１１又は１２記載の方法。
【請求項１５】
プラスミドが、宿主細胞からのＰＯＩの分泌を引き起こすのに有効な分泌リーダー配列及び／又は宿主細胞中のＰＯＩの発現を引き起こすのに有効なプロモーター配列を含む真核性発現ベクター、好ましくは酵母発現ベクターである請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
−ＰＯＩをコードする組み換えヌクレオチド配列、及び
−cLC52、RPL33及びcLC61からなる群から選択されるタンパク質をコードするヌクレオチド配列
を含む、請求項１０から１４のいずれか１項記載の方法における使用のための共過剰発現プラスミド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発現エンハンサーを含む真核性宿主細胞及び目的タンパク質（ＰＯＩ）を生産するための方法におけるその使用に関する。
【０００２】
成功したタンパク質分泌は、原核及び真核宿主両方を用いて確立されている。最も顕著な例は、バクテリア、例えば大腸菌（Escherichia coli）、酵母、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）又はハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、糸状菌（filamentous fungi）、例えばアワモリコウジカビ（Aspergillus awamori）又はトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）、又は哺乳類細胞、例えばＣＨＯ細胞である。幾つかのタンパク質の分泌が既に高い率で達成されている一方で、他の多くのタンパク質は比較的低いレベルで分泌されるだけである（Punt et al., 2002; Macauley-Patrick et al., 2005; Porro et al., 2005）。
【０００３】
組み換えタンパク質の分泌の改善のための１つのアプローチは、ランダム突然変異生成により為された（Archer et al., 1994; Lang and Looman, 1995）。この方法の主たる欠点は、ポジティブな結果が通常は他の株に移行されることができないことである。
【０００４】
真核生物、例えば酵母のこの分泌経路−タンパク質のフォールディング及びプロセッシング−は、多くの相互作用する参加者を伴って極めて複雑である。これらタンパク質の幾つかはタンパク質、例えばタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）に対して触媒作用を有し、他のものは、このタンパク質へ結合し、そして、これらが凝集することを妨げることによって（シャペロン、例えばＢｉＰ）、又はこのタンパク質の細胞外部への放出を分泌経路において後の工程において刺激することによって（ＳＳＯタンパク質）作用する。この相互依存性のために、１つの方法工程の速度（rate）を分泌経路において増加させることは、目的タンパク質（protein of interest）の分泌を自動的に増加させることにはならず、しかし代わりに、１以上の引き続く反応工程で速度の制限を生じ、このようにしてこの発現系のボトルネックを取り除かないでシフトだけさせる可能性がある。
【０００５】
幾つかの場合において、異種タンパク質の分泌プロセスは、ヘルパー因子と呼ばれる特定のタンパク質の共過剰発現（co-overexpression）により促進されることができることが示されている（Mattanovich et al., 2004）。
【０００６】
WO 2008/128701 A2は、BMH2, BFR2, C0g6, C0Y1 , CUP5, IMH 1 , KIN2, SEC31 , SSA4及びSSE1からなる群から選択される分泌ヘルパー因子を採用する、真核細胞からのＰＯＩの分泌を増加させるための発現系を説明する。この関連遺伝子は、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）のｃＤＮＡマイクロアレーから獲得された。
【０００７】
Gasser et al (Applied and Environmental Microbiology (2007) 6499-6507)は、酵母における異種タンパク質分泌を促進する新規因子のトランスクリプトミクスベースの同定を説明する。特定の分泌エンハンサーが、ＤＮＡマイクロアレーハイブリダイゼーション実験を用いて見出された。
【０００８】
ＰＤＩをコードする遺伝子及び異種ジスルフィド結合したタンパク質をコードする遺伝子の共発現は、 WO 93/25676において初めて異種タンパク質の生産を増加させる手段として示唆された。WO 93/25676は、アンチスタチン及びダニ抗凝固タンパク質の組み換え発現がＰＤＩとの共発現により増加させることができることを報告する。
【０００９】
WO 94/08012は、Ｈｓｐ７０シャペロンタンパク質、すなわち、KAR2及びBiP又はＰＤＩシャペロンタンパク質の発現を増加させることによる酵母中のタンパク質分泌の増加のための方法を提供する。
【００１０】
WO 03/057897は、シャペロンタンパク質GroEL, GRoES, Dnak, DnaJ, GRpe, CIpB及びこのホモログからなる群から選択されるタンパク質をコードする少なくとも２つの遺伝子を共発現することによる目的タンパク質の組み換え発現のための方法を提供する。
【００１１】
WO 2005/0617818及びWO 2006/067511は、２μｍベース発現プラスミドを使用することによる酵母中の所望の異種タンパク質の生産のための方法を提供する。１以上のシャペロンタンパク質及び１つの異種タンパク質の遺伝子が同じプラスミドで共発現される場合に異種タンパク質の生産が実質的に増加されることが実証された。
【００１２】
分泌経路を刺激するための別のアプローチは、フォールドされていないタンパク質応答（the unfolded protein response）（ＵＰＲ）を活性化させる転写因子ＨＡＣ１を過剰発現することである。転写分析は、３３０までの遺伝子がＨＡＣ１により調節され、このうち多くのものが分泌の機能的な群（functional group）又は分泌オルガネラ（例えば、ＥＲに常駐するシャペロン、フォルダーゼ、トランスロコン（Translocon）の構成要素）のバイオゲネシスに属することを明らかにした。
【００１３】
WO 01/72783は、高められたフォールドされていないタンパク質応答（ＵＰＲ）を誘発することにより真核細胞から分泌される異種タンパク質の量を増加させる方法を説明し、その際、このＵＰＲは、HAC1、PTC2及びIRE1からなる群から選択されるタンパク質の共発現により調整される。
【００１４】
これらアプローチが、確立されると、他の株にも移行され、他のタンパク質にも同様に使用されることができる一方で、これらは他のタンパク質の分泌を支持するこのようなタンパク質の機能に関する実際上の知識により制限される。
【００１５】
組み換えタンパク質の成功した高レベル分泌が数々の異なる工程、例えばフォールディング、ジスルフィド架橋形成、グリコシル化、細胞内輸送、又はこの細胞からの放出、で制限されてよいことが予期されることができる。これらプロセスの多くは未だ十分には理解されていない。このようなヘルパー機能は技術水準の現在の知識でもって予測することは、宿主生物の全ゲノムのＤＮＡ配列が入手可能になってさえ可能でない。
【００１６】
Wentz and Shusta (Appl. Environ. Microbiol. (2007) 73(4): 1189-1198)は、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharamyces cerevisiae）酵母表面ディスプレー遺伝子ライブラリーを、適した選択圧を用いて改善された分泌株を同定するために使用する。酵母ｃＤＮＡ促進ｓｃＴＣＲディスプレー（The yeast cDNAs enhancing scTCR display）はCCW12, SEDI, CWP2, RPP0であり、これは温度依存性であることが見出され、かつ、ERO1は単独の２０℃エンハンサー（a lone 20℃ enhancer）であることが見出された。
【００１７】
本発明の課題は、簡易かつ効率的に、真核細胞中、特にピキア属の酵母細胞中で分泌されたタンパク質の生産を増加させるための新規方法を提供することである。工業的生産方法において利用できるヘルパー因子の過剰発現により分泌されたタンパク質の増加した生産のための方法において使用されるべき新規遺伝子を提供することが望ましい。
【００１８】
本発明の更なる課題は、ＰＯＩの生産を増加させるための改善された特性を有する組み換え宿主細胞を提供することである。
【００１９】
この課題は、請求されるとおりの主題により解決される。
【００２０】
特に、本発明は、機能的に活性のあるこの変異体を含む、cLC52, RPL33, cLC61からなる群から選択される発現エンハンサーをコードする組み換えヌクレオチド配列を含む真核宿主細胞に関する。
【００２１】
本発明の宿主細胞は、Ｐ．パストリス（P. pastoris）に由来するヌクレオチド配列を好ましくは含む。
【００２２】
本発明による宿主細胞は好ましくは真菌細胞、より好ましくは酵母細胞、又は高等真核細胞、好ましくは哺乳類又は植物細胞である。
【００２３】
本発明の特定の一観点によれば、宿主細胞は、ピキア属の細胞であり、特にＰ．パストリス株の細胞である。
【００２４】
一観点において、本発明は、ＰＯＩをコードする目的遺伝子の導入のためのワイルドカード宿主細胞であるような宿主細胞に関する。
【００２５】
別の観点において、本発明は、ＰＯＩを生産することができる、ＰＯＩをコードする組み換えヌクレオチド配列を含む生産者細胞であるような宿主細胞に関する。
【００２６】
本発明は好ましくは、
−cLC52, RPL33及びcLC61からなる群から選択された発現エンハンサーをコードする組み換えヌクレオチド配列、
−ＰＯＩをコードする目的遺伝子
を含むＰ．パストリス宿主細胞を提供する。
【００２７】
機能的に活性のある変異体を含む、cLC52, RPL33 cLC61からなる群から選択されるタンパク質をコードするこのようなヌクレオチド配列は、好ましくは本発明により、真核宿主細胞中のＰＯＩの発現を増加させるための発現エンハンサーとして使用される。
【００２８】
本発明は更に、
−機能的に活性のある変異体を含む、cLC52, RPL33 cLC61からなる群から選択されるタンパク質をコードする組み換えヌクレオチド配列を含む本発明によるワイルドカード宿主細胞の提供、及び
−ＰＯＩをコードするヌクレオチド配列の導入
を含む生産者宿主細胞の生産方法を提供する。
【００２９】
代替的な実施態様によれば、生産者宿主細胞を生産するための方法は、次の工程
−真核宿主細胞の提供、
−機能的に活性のある変異体を含む、少なくとも１つのcLC52, RPL33 cLC61をコードするヌクレオチド配列の導入、及び
−ＰＯＩをコードするヌクレオチド配列の導入
を含む。
【００３０】
このようにして、本発明は、
−本発明による生産者宿主細胞を提供する工程、
−細胞培養物中でＰＯＩ及び発現エンハンサーを共発現させる工程、及び
−前記細胞培養物からＰＯＩを獲得する工程
を含む、真核細胞中にＰＯＩを生産する方法を提供する。
【００３１】
本発明の好ましい方法において、ＰＯＩはポリペプチド、好ましくは真核性ポリペプチドであり、これは血清タンパク質、例えば免疫グロブリン又は血清アルブミン、酵素、ホルモン、シグナリング分子、マトリックスタンパク質、そのフラグメント又は誘導体からなる群から選択される。
【００３２】
別の好ましい方法において、ＰＯＩは、宿主細胞の代謝産物の生産を媒介し、好ましくはＰＯＩは基質、酵素又は共因子であり、代謝産物は、この代謝産物の十分な収率を得るために宿主により生産される。
【００３３】
好ましくは、ＰＯＩをコードする組み換えヌクレオチド配列は、宿主細胞のゲノム中への組み込みのために、又は宿主細胞中の自律複製のために適したプラスミドに提供される。
【００３４】
更に好ましくは、このプラスミドは真核発現ベクター、好ましくは酵母発現ベクターであって宿主細胞からのＰＯＩの分泌を引き起こすために有効な分泌リーダー配列及び／又は宿主細胞中のＰＯＩの発現を引き起こすために有効なプロモーター配列を含むものである。
【００３５】
一観点において、本発明は、
−ＰＯＩをコードする組み換えヌクレオチド配列、及び
−機能的に活性のある変異体を含む、cLC52, RPL33 cLC61からなる群から選択されるタンパク質をコードするヌクレオチド配列
を含む、本発明の方法においての使用のための共過剰発現プラスミドに関する。
【００３６】
発明の詳細な説明
タンパク質の「生物学的に活性のあるフラグメント」又は「機能的に活性のあるフラグメント」は、完全長タンパク質と同様又はこれに匹敵する生物学的作用を発揮するタンパク質のフラグメントを意味するものである。この発現エンハンサーの機能的に活性のあるフラグメントは、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、いっそうより好ましくは少なくとも９０％、更にいっそう好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７％、９８％又は９９％の配列を含むポリペプチド又はヌクレオチド配列を生じる１以上の欠失による配列番号１〜４の発現エンハンサー由来であることにより特徴付けられる。配列同一性は以下説明するように決定されてよい。このようなフラグメントは、例えば１又は複数のアミノ−及びカルボキシ−末端欠失また同様に１又は複数の内部欠失により生産されてよい。好ましくはこのようなフラグメントは、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０、より好ましくは１、２、３、４又は５、いっそうより好ましくは１、２又は３、更にいっそう好ましくは１又は２、最も好ましくは１の欠失により得られる。
【００３７】
「誘導体」との用語は、１又は複数の化合物、例えばポリペプチド又はタンパク質、及び／又は融合化合物の任意の組み合わせを含み、前記融合タンパク質中ではこの化合物の任意の部分が１以上の他のポリペプチドに対して任意の部分で融合してよい。誘導体は、様々な化学技術により他の物質に対する会合又は結合により得られてもよく、これは例えば共有結合、静電相互作用、ジスルフィド結合その他である。この化合物に対して結合する他の物質は、脂質、炭水化物、核酸、有機及び無機分子、又はこの任意の組み合わせであってよい（例えば、PEG、プロドラッグ又は薬物）。「誘導体」との用語は、変異体を含んでもよく、非天然の又は化学的に改変されたアミノ酸を潜在的に含み、化合物のフラグメントも含んでもよい。cLC52, RPL33又はcLC61の用語は、機能的に等価な又は機能的に活性がある変異体であってよく、かつ／又は同様の又は改善された機能を有するその誘導体をも指すことが理解される。
【００３８】
本願で使用される場合に「発現ベクター」は、クローニングされた組み換えヌクレオチド配列の、すなわち、組み換え遺伝子の転写及び適した宿主生物中のそのｍＲＮＡの翻訳のために必要とされるＤＮＡ配列として定義される。このような発現ベクターは通常は、宿主細胞中に自律複製のための起源、選択可能なマーカー（例えば、アミノ酸合成遺伝子又は抗生物質、例えばゼオシン、カナマイシン、Ｇ４１８又はヒグロマイシンに対する耐性を付与する遺伝子）、数々の制限酵素開裂部位、適したプロモーター配列及び転写ターミネーターを含み、これら構成要素は一緒に操作可能に連結されている。
【００３９】
「真核宿主」との用語は、任意の真核細胞又は生物であって、ＰＯＩを発現するために培養されてよいものを意味する。この用語はヒトを含まないことも同様に理解される。
【００４０】
ポリペプチド又はヌクレオチド配列の「機能的に等価な変異体」又は「機能的に活性のある変異体」との用語は、本願で使用される場合には、配列内の又は配列の遠位末端の一方又は両方での１以上のアミノ酸又はヌクレオチドの挿入、欠失又は置換によるこの配列の改変から生じる配列を意味し、この改変はこの配列の活性に影響を及ぼさない（特に損なわない）。好ましい実施態様において、機能的に活性のある変異体ａ）は、ポリペプチド又はヌクレオチド配列の生物学的に活性のあるフラグメントであり、この機能的に活性のあるフラグメントは、このポリペプチド又はヌクレオチド配列の、配列の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、いっそう好ましくは少なくとも９０％、よりいっそう好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７％、９８％又は９９％を含む；ｂ）は、少なくとも１のアミノ酸置換、付加及び／又は欠失によるポリペプチド又はヌクレオチド配列に由来し、その際、この機能的に活性のある変異体は、このポリペプチド又はヌクレオチド配列に対する又はａ）において定義した機能的に活性のあるフラグメントに対する配列同一性少なくとも４０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７５％、いっそう好ましくは少なくとも９０％、よりいっそう好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７％、９８％又は９９％を有する；かつ／又はｃ）は、ポリペプチド又はヌクレオチド配列又はその機能的に活性のある変異体及び付加的にこのポリペプチド又はヌクレオチド配列に対して異種の少なくとも１のアミノ酸又はヌクレオチドからなり、好ましくはその際この機能的に活性のある変異体は、配列番号１、２、３又は４の任意の配列の任意の天然に生じる変異体に由来するか又は同一である。
【００４１】
機能的に活性のある変異体は、上述のとおりの配列を変更することにより得られてよく、かつ、この変異体が由来する配列番号１〜４の各配列により示されるものに類似の生物学的活性（組み換え細胞中のＰＯＩの発現を促進する能力を含む）を有することにより特徴付けられる。
【００４２】
この機能的に活性のある変異体は、ポリペプチド又はヌクレオチド配列中の配列変更により得られてよく、その際、この配列変更は、本発明の組み合わせにおいて使用される場合に、変更されていないポリペプチド又はヌクレオチド配列の機能を維持する。このような配列変更は、（保存的）置換、付加、欠失、突然変異及び挿入を含むが、これに限定されない。
【００４３】
このポリペプチド又はヌクレオチド配列の変異体は、（オリジナルでない）変異体を含む本発明の組成物の活性が、配列変更なしにポリペプチド又はヌクレオチド配列を含む（すなわち、オリジナルポリペプチド又はヌクレオチド配列）本発明の発現エンハンサーの活性の少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、いっそう好ましくは少なくとも７０％、よりいっそう好ましくは少なくとも８０％、特に少なくとも９０５、更に特に少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％である場合に、本願発明の文脈において機能的に活性がある。
【００４４】
本発明の好ましい一実施態様において、本発明のペプチドの機能的に活性のある変異体は、配列番号１〜４のポリペプチド又はヌクレオチド配列と実質的に同一であるが、このポリペプチド又はヌクレオチド配列からはそれぞれ、これが異なる株又は異なる種の相同性配列に由来する点で異なる。これらは天然に生じる変異体と呼ばれる。
【００４５】
しかし、「機能的に活性のある変異体」との用語は、天然に生じるアレル変異体、同様に、突然変異体又は任意の他の天然に生じない変異体を含む。この分野において知られているとおり、アレル変異体は、ポリペプチドの生物学的機能を実質的に変更しない、１以上のアミノ酸の置換、欠失又は付加を有することにより特徴付けられる（ポリ）ペプチドの代替形である。「生物学的機能」とは、機能が細胞の成長又生存のために必要でない場合にさえも天然に生ずる細胞中のポリペプチド又はヌクレオチド配列の機能を意味する。
【００４６】
好ましい一実施態様において、アミノ酸交換、欠失又は挿入による上で定義したポリヌクレオチド又はヌクレオチド配列に由来する機能的に活性のある変異体は、この活性を保存、又はより好ましくは改善してもよい。
【００４７】
保存的置換は、その側鎖及び化学的特性において関連するアミノ酸のファミリー内で生じるものである。このようなファミリーの例は、塩基性側鎖を有する、酸性側鎖を有する、非極性脂肪族側鎖を有する、非極性芳香族側鎖を有する、荷電してない極性側鎖を有する、小さい側鎖を有する、長い側鎖その他を有するアミノ酸である。
【００４８】
本発明の別の実施態様において、上で定義したポリペプチド又はヌクレオチド配列は、改変されたポリペプチド又はヌクレオチド配列と実質的に同じ活性（上でフラグメント及び変異体について定義したとおり）を有する、かつ任意の他の所望される特性を有する誘導体を生産するための種々の化学的技術により改変されてよい。
【００４９】
「遺伝子産物」又は「遺伝子の産物」との用語は、生化学的材料、ＲＮＡ又はタンパク質のいずれかであり、これは遺伝子、例えばcLC52, RPL33又はcLC61遺伝子の発現から生じる。
【００５０】
本願で使用される場合には、ポリペプチドの「ホモログ」又は「機能的ホモログ」は、その一次、二次又は三次構造において同じか又は保存された残基を相応する位置に有するポリペプチドを意味する。この用語は、相同性ポリペプチドをコードする２以上のヌクレオチド配列にも及ぶ。特に、相同性化合物は、通常は少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性を、完全長天然配列又はこの任意のフラグメントに関して有する。好ましくは、相同性化合物は、天然化合物又任意の他の具体的に定義された、完全長化合物のフラグメントに対して、少なくとも約５５％のアミノ酸配列同一性、好ましくは少なくとも約６０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約６５％のアミノ酸配列同一性、いっそう好ましくは少なくとも約７０％のアミノ酸配列同一性、よりいっそう好ましくは少なくとも約７５％のアミノ酸配列同一性、特に少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、更に特に少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有する。ヘルパー因子としての機能がこのようなホモログを用いて証明される場合には、このホモログは「機能的ホモログ」と呼ばれる。
【００５１】
本願で使用される場合に「相同性ヌクレオチド配列」との用語は、そのヌクレオチド配列においてこの考慮されるヌクレオチド配列と関連するが同一でなく、かつ、実質的に同じ機能を発揮するヌクレオチド配列を指す。これらは、遺伝暗号の縮重のための変異を含むヌクレオチド組成中の変異をも包含することが意味され、その際、このヌクレオチド配列は実質的に同じ機能を発揮する。
【００５２】
「宿主細胞」又は「宿主細胞株」との用語は、このようなポリペプチドにより媒介されるポリペプチド又は代謝産物を生産するための組み換え遺伝子の発現のために使用される微生物を指す。増殖した、培養宿主細胞の宿主細胞クローンは、宿主細胞株であると一般的に理解される。生産宿主細胞株は、生産方法における遺伝子産物を獲得するためのバイオリアクター中での培養のために使用準備が整った細胞株であると一般的に理解される。
【００５３】
本願で使用される場合に「操作可能に連結」とは、単一核酸分子、例えばベクターでのヌクレオチド配列の会合であって、１以上のヌクレオチド配列の機能が前記核酸分子上に存在する少なくとも１の他のヌクレオチド配列により影響を及ぼされるような会合を指す。例えば、プロモーターは、コード配列の発現に影響を及ぼすことができる場合に、組み換え遺伝子のコード配列と操作可能に連結している。
【００５４】
「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、本願で同定されるポリペプチド配列に関して、必要な場合に、最大パーセント配列同一性を達成するために、配列をアラインメントしギャップ導入した後に、特定のポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義され、この配列同一性の一部として任意の保存的置換を考慮しない。当業者は、比較される配列の完全長にわたる最大アラインメントを達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含め、アラインメントを測定するための適当なパラメーターを決定することができる。
【００５５】
本願で使用される場合に「プラスミド」及び「ベクター」との用語とは、自律的に複製するヌクレオチド配列並びにゲノム組み込みヌクレオチド配列を含む。
【００５６】
「ポリペプチド」との用語は、タンパク質又はペプチドであって２以上のアミノ酸、典型的には少なくとも３、好ましくは少なくとも２０、より好ましくは少なくとも３０、より好ましくは少なくとも５０アミノ酸を含むものを指す。この用語は、高分子量ポリペプチド、例えばタンパク質も指す。以下、「ポリペプチド」及び「タンパク質」との用語が相互に交換可能に使用される。
【００５７】
「プロモーター」は本願で使用される場合に、コード配列又は機能的ＲＮＡの発現の制御をできるＤＮＡ配列を指す。プロモーター活性は、その転写効率により評価されてよい。これは、プロモーターからのｍＲＮＡ転写の量の測定により直接的に、例えばノーザンブロッティングにより決定されてよく、又はプロモーターから発現された遺伝子産物の量の測定により間接的に決定されてよい。
【００５８】
「目的タンパク質（ＰＯＩ）」との用語は、本願で使用される場合に、宿主細胞中に組み換え技術を利用して生産されるタンパク質を指す。より具体的には、このタンパク質は宿主細胞中で天然に生じないポリペプチド、すなわち異種タンパク質であるか、あるいは宿主細胞に対して天然、すなわち、宿主細胞に対して同種タンパク質のいずれかであってよく、しかし、例えば、ＰＯＩをコードする核酸配列を含む自己複製ベクターを用いたトランスフォーメーションにより、又は、ＰＯＩをコードする核酸配列の１以上のコピーを組み換え技術により宿主細胞のゲノム中に組み込んで、又は、ＰＯＩをコードする遺伝子の発現を制御する１以上の調節配列、例えばプロモーター配列の組み換え改変により、生産される。
【００５９】
「cLC52」との用語は、転写調節因子に対してホモロジーを有するＰ．パストリスのポリペプチドを意味するものである。Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）においては、cLC52に対する最高ホモロジーを有するタンパク質はNrg1及びNrg2であり、グルコース抑制を媒介する転写リプレッサーである。各外部ＩＤｓは次のものである：SGD YDR043C, SGD YBR066C。遺伝子アノテーションPIPA03435。
【００６０】
「RPL33」との用語は、Ｓ．セレビシエRPL33A及びRPL33B（大（６０Ｓ）リボソームサブユニットのリボソームタンパク質L37）に対するホモロジーを有する、ｒＲＮＡ遺伝子によりコードされるＰ．パストリスのポリペプチドを意味するものである。各外部ＩＤｓは次のものである：SGD YPL143W及びYDR234C。遺伝子アノテーションPIPA05837。
【００６１】
「cLC61」との用語は、ペプチダーゼに対して同種である遺伝子によりコードされるＰ．パストリスのポリペプチドを意味する。遺伝子アノテーションPIPA02482。
【００６２】
本願で使用される場合に「cLC52, RPL33又はcLC61」との用語は、遺伝子及び遺伝子産物について相互に交換可能に使用される。これらポリペプチドに対する配列情報は以下に与えられる。本発明の目的のためには、これら因子はヘルパー因子又は発現エンハンサーとも呼ばれる。この用語は、完全長タンパク質又はその機能的に活性のある変異体（生物学的に活性のあるフラグメント含む）、また同様に機能的ホモログを包含する。
【００６３】
タンパク質発現及び／又は分泌として使用されることができるこのような遺伝子及び遺伝子産物が得られることは意外であり、これはこれまでには機能的ヘルパー因子として特性決定されていない。この観点において、関連する遺伝子がcLC52、RPL33及びcLC61であることが見出され、これは共発現するとタンパク質生産におけるその収率を増加できる。これら遺伝子は、恐らくＰＯＩ発現及び／又は分泌に関連していなかっただろう機能を有する。
【００６４】
この関連する遺伝子のヘルパー機能を証明するために、広範な培養条件で成長させた様々な株のＰ．パストリス由来のｃＤＮＡライブラリーが、細胞表面上のモノクローナル抗体のＦａｂフラグメントをディスプレーするＰ．パストリスの株において共過剰発現された。免疫蛍光染色後増加した蛍光シグナルを有する株を、ハイスループット蛍光活性化細胞選別を使用して濃縮した。培養及び選別の複数回のラウンド後に、好ましくは増加したストリンジェンシーで複数回のラウンドの選別において濃縮して、例えば極めてストリンジェントな単一細胞モードで、遺伝子RPL33、cLC52及びcLC61が同定されることができ、これは表面ディスプレーされたＦａｂフラグメントの量に対してポジティブに作用し、これは以前に分泌経路に関連させられていない。このようなヘルパー因子は、慣用のＤＮＡマイクロアレー技術を用いて以前は同定されていない。
【００６５】
１以上の遺伝子の共発現は、ＰＯＩ発現に対してポジティブな影響を有し、このことは、バイオマス蓄積の減少さえも伴って生成物濃度の増加を生じる。これにより、より特異的な生成物収率が得られてよい。
【００６６】
実験手順のより詳細な説明は実施例１に見出されることができる。この同定された遺伝子をＰＣＲによりＰ．パストリスｃＤＮＡから増幅し、Ｐ．パストリス発現ベクター中にクローニングし、Ｐ．パストリスの株（表面ディスプレー又は分泌している）中にトランスフォーメーションし、これは、様々に異なるＰＯＩ（表面ディスプレーされるか又は分泌される）の高レベル生産に関して予備選択されている。表面ディスプレーされるか又は分泌される組み換えＰＯＩの量に対する共過剰発現した遺伝子の作用を見積もるために、本発明により得られるＰ．パストリス株を振盪フラスコ実験、流加培養又はケモスタット発酵において、ＰＯＩを発現だけする株との比較において、培養してよい。３つ全ての遺伝子が、共過剰発現研究において増加した細胞表面シグナルを生じる。特に、共過剰発現したcLC52は、分泌されたＰＯＩの量を顕著に増加させた。
【００６７】
本発明の好ましい実施態様によれば、組み換えヌクレオチド配列は、配列番号１であるcLC52遺伝子、又はこの機能的に活性のある変異体を含む。
【００６８】
本発明の別の好ましい実施態様によれば、組み換えヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号２及び３であるRPL33遺伝子、又はこの機能的に活性のある変異体を含む。
【００６９】
本発明の別の好ましい実施態様によれば、組み換えヌクレオチド配列は、配列番号４であるcLC61遺伝子、又はこの機能的に活性のある変異体を含む。
【００７０】
本発明のヘルパー因子により、本発明の方法は好ましくは、促進された発現による増加した生産だけでなく、真核細胞中のＰＯＩの増加した分泌にも関する。ＰＯＩの分泌の増加は、タンパク質分泌を増加させる前記タンパク質の共発現の存在又は非存在下でのその分泌収率の比較を基礎に決定される。
【００７１】
ＰＯＩは、任意の真核又は原核ポリペプチドであってよい。これは、天然に分泌されるタンパク質又は細胞内タンパク質、すなわち、天然に分泌されないタンパク質であってよい。本発明は、天然に分泌されるか又は天然に分泌されないタンパク質の機能的ホモログ、機能的に活性のある変異体、誘導体及び生物学的に活性のあるフラグメントの組み換え生産も提供する。機能的ホモログは、好ましくは同一又は相応し、配列の機能的特性を有する。
【００７２】
分泌されたＰＯＩは本願で示される場合に、生物薬剤学物質として適するタンパク質、例えば抗体又はフラグメント、成長因子、ホルモン、酵素、ワクチン、又は工業的適用において使用されることができるタンパク質、例えば酵素であってよいが、これに限定されない。
【００７３】
ＰＯＩは好ましくは異種組み換えポリペプチド又はタンパク質であり、これは有利には真核細胞、好ましくは酵母細胞において、好ましくは分泌タンパク質として生産されてよい。好ましく生産されるタンパク質の例は、免疫グロブリン、アプロチニン、組織因子経路阻害剤又は他のプロテアーゼ阻害剤、及びインスリン又はインスリン前駆体、インスリン類似体、成長ホルモン、インターロイキン、組織プラスミノゲンアクチベーター、形質転換成長因子ａ又はｂ、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）、ＧＲＰＰ、因子ＶＩＩ、因子ＶＩＩＩ、因子ＸＩＩＩ、血小板由来成長因子１、血清アルブミン、酵素、例えばリパーゼ又はプロテアーゼ、又はこれらのタンパク質の任意の１つの機能的類似体である。本願の文脈において、「機能的類似体」との用語は、天然タンパク質と同様の機能を有するポリペプチドを示すと意味される。ポリペプチドは天然タンパク質に構造上同様であってよく、かつ、１以上のアミノ酸を天然タンパク質のＣ及びＮ末端の一方又は両方又はこの側鎖に付加すること、天然のアミノ酸配列中の１又は数々の異なる部分で１以上のアミノ酸を置換すること、又は、１以上のアミノ酸を天然のタンパク質の一方又は両方の末端又はこのアミノ酸配列中の１又は複数の部位で欠失すること、天然のアミノ酸配列中の１以上の部位で１以上のアミノ酸を挿入すること、によって、天然タンパク質に由来してよい。このような改変は上述のタンパク質の幾つかについて良く知られている。
【００７４】
別の実施態様において、ＰＯＩは真核タンパク質又はその生物学的に活性のあるフラグメント、好ましくは免疫グロブリン又は免疫グロブリンフラグメント、例えばＦｃフラグメント又はＦａｂフラグメントである。最も好ましくはＰＯＩは、モノクローナル抗ＨＩＶ１抗体２Ｆ５のＦａｂフラグメントである。
【００７５】
ＰＯＩは、宿主細胞中に生物化学反応を、この生物化学反応又は幾つかの反応のカスケードの生成物（例えば、宿主細胞の代謝産物）を獲得する目的で提供する基質、酵素、阻害剤又はコファクターから選択されることもできる。例示的な生成物は、ビタミン、例えばリボフラビン、有機酸及びアルコールであってよく、これは、本発明によるＰＯＩの発現の後に増加した収率でもって獲得されることができる。
【００７６】
一般には、タンパク質を分泌する宿主細胞は、ＰＯＩの組み換え発現に適した任意の真核細胞であってよい。
【００７７】
本発明による宿主細胞として使用される好ましい酵母細胞の例は、サッカロミセス（Saccharomyces）属（例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae））、ピキア（Pichia）属（例えば、Ｐ．パストリス（P. pastoris）又はＰ．メタノリカ（P. methanolica））、コマガタエラ（Komagataella）属（Ｋ．パストリス（K pastoris）、Ｋ．シュードパストリス（K pseudopastoris）又はＫ．ファフィ（K phaffii））、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）又はクルイベロマイセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）を含むが、これに限定されない。
【００７８】
最近の文献は、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）をコマガタエラ・パストリス（Komagataella pastoris）、コマガタエラ・ファフィ（Komagataella phaffii）及びコマガタエラ・シュードパストリス（Komagataella pseudopastoris）に区分し、名称を付け直している(Kurtzman, 2005)。この中で、ピキア・パストリスは、コマガタエラ・パストリス（Komagataella pastoris）、コマガタエラ・ファフィ（Komagataella phaffii）及びコマガタエラ・シュードパストリス（Komagataella pseudopastoris）の全てのために同義に使用される。
【００７９】
本発明により好ましく使用される酵母生産者生物は、培養すると、問題となっている異種タンパク質又はポリペプチドを大量に生産する任意の適した酵母生物であってよい。適した酵母生物の好ましい例は、酵母種サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロミセス・クルイベリ（Saccharomyces kluyveri）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、サッカロミセス・ウバラム（Saccharomyces uvarum）、クルイベロマイセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、ピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）、ピキア・クルイベリ（Pichia kluyveri）、ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）、カンジダ種（Candida sp.）、カンジダ・ウチリス（Candida utilis）、カンジダ・カカオイ（Candida cacaoi）、ゲオトリカム種（Geotrichum sp.）及びゲオトリカム・ファーメンタス（Geotrichum fermentans）から選択される株である。
【００８０】
最も好ましい酵母宿主細胞は、メチルトローフ酵母に、例えばピキア（Pichia）又はコマガタエラ（Komagataella）、例えばピキア・パストリス（Pichia pastoris）、又はコマガタエラ・パストリス（Komoagataella pastoris）、又はＫ．ファフィ（K. phaffii）、又はＫ．シュードパストリス（K. pseudopastoris）に由来する。宿主の例は、酵母、例えばＰ．パストリスを含む。Ｐ．パストリス株の例は、CBS 704 (=NRRL Y-1603 = DSMZ 70382)、CBS 2612 (=NRRL Y-7556)、CBS 7435 (=NRRL Y11430)、CBS 9173-9189及びDSMZ 70877 (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)を含み、Ｓ．セレビシエ株の例はW303、CEN. PK及びthe BY系列(EUROSCARF collection)を含む。上述の全ての株は、トランスフォーマントを生産し、かつ異種遺伝子を発現するために成功して使用されている。
【００８１】
一般に、目的タンパク質は本願で示される場合に、当業者にとって良く知られている組み換え発現の方法により生産されてよい。
【００８２】
本願で開示される方法は、さらに、ＰＯＩの発現を可能にする条件下で前記組み換え宿主細胞を培養することを含んでよいことが理解される。分泌された、組み換えにより生産されるＰＯＩは次いで、細胞培養培地から単離され、さらに、当業者に良く知られている技術により精製されてよい。
【００８３】
タンパク質分泌を増加させるタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、種々の供給源から得られてよい。本発明による組み換えヘルパーヌクレオチド配列（「ヘルパー遺伝子」とも呼ばれる）の起源は、好ましくは植物、昆虫、真菌又は細菌の種に、好ましくは酵母の種に、より好ましくは組み換え株を得るための宿主酵母株とは異なる酵母種に由来する。本発明による好ましいピキア宿主細胞、例えばＰ．パストリス宿主細胞は、好ましくはＳ．セレビシエ株又は生産宿主とは異なる他のＰ．パストリス株に由来する異種ヘルパー因子遺伝子を含む。別の特定の実施態様において本発明による宿主細胞は、宿主細胞と同じ株に由来するヘルパー因子遺伝子を有する組み換えヌクレオチド配列を含む。
【００８４】
本発明の特定の一実施態様によれば、ヘルパー遺伝子は好ましくは生産宿主細胞と同じ属の細胞供給源から得られている。例えば、本発明の発現ヘルパー因子の１つをコードするヌクレオチド配列は、酵母、例えばＳ．セレビシエ株に由来してよく、かつ、酵母、例えばＳ．セレビシエ生産者宿主細胞株中でＰＯＩと一緒にヘルパー因子を共発現するために使用されてよい。特定の好ましい一実施態様は、Ｐ．パストリス生産者宿主細胞株中でＰＯＩと一緒にヘルパー因子を共発現するための方法において使用されるためのＰ．パストリス由来のヘルパー因子をコードする組み換えヌクレオチド配列に関する。同種由来のヌクレオチド配列は、同じ属の宿主細胞中へのその組み込みを容易にし、このようにして、工業的製造プロセスにおいて増加した収率の可能性でもってＰＯＩの安定な生産を可能にする。また、他の適した酵母又は他の真菌からの又は他の生物、例えば脊椎動物からの機能的に等価なヌクレオチド配列が使用されることができる。
【００８５】
本発明の別の好ましい実施態様において、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）から特に真核細胞、好ましくは酵母細胞、最も好ましくはＰ．パストリスの株の細胞中のＰＯＩの分泌のエンハンサーとして単離されたヘルパー因子ヌクレオチド配列が使用される。
【００８６】
本発明によれば、ヘルパー因子遺伝子少なくとも１つを含む、かつ、ＰＯＩをコードする目的遺伝子を組み込む準備の整った本発明によるワイルドカード宿主細胞を提供することもできる。ワイルドカード細胞株（wildcard cell line）は、このようにして予備形成された宿主細胞株であり、これはその発現能力のために特徴付けられる。これは、例えば部位特異的なリコンビナーゼ媒介されたカセット交換を用いて、生物薬剤学の生産のための生産者細胞株（発現宿主細胞株とも呼ばれる）の作成のための革新的な「ワイルドカード」戦略に従う。このような新規宿主細胞は、ＧＯＩを、再現性のある、高度に効率的な生産細胞株を獲得するために、例えば予め定められたゲノム発現ホットスポット中へ数日のうちにクローニングすることを容易にする。
【００８７】
本発明によれば、ＰＯＩをコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結されたヘルパー因子遺伝子を含むＰ．パストリス宿主を提供することが好ましい。
【００８８】
好ましい実施態様によれば、本発明の方法は、宿主細胞のゲノム中への組み込みに適したプラスミド上に提供される、ＰＯＩをコードする組み換えヌクレオチド配列を、細胞につき単一コピー又は複数コピーで採用する。ＰＯＩをコードする組み換えヌクレオチド配列は、細胞につき単一コピー又は複数コピーで自律的に複製するプラスミド上に提供されてもよい。
【００８９】
代替的に、ＰＯＩをコードする組み換えヌクレオチド配列及びタンパク質分泌を増加させるタンパク質をコードする組み換えヌクレオチド配列は、同じプラスミド上に細胞につき単一コピー又は複数コピーで存在する。
【００９０】
本発明の好ましい方法は、真核発現ベクター、好ましくは酵母発現ベクターであるプラスミドを採用する。発現ベクターは、クローニングベクター、改変されたクローニングベクター及び特異的に設計されたプラスミドを含んでよいが、これに限定されない。本発明において使用される好ましい発現ベクターは、宿主細胞中の組み換え遺伝子の発現に適した任意の発現ベクターであってよく、かつ、宿主生物に依存して選択される。組み換え発現ベクターは、宿主生物のゲノム中への複製又は組み込みができる任意のベクターであってよく、これは宿主ベクターとも呼ばれ、例えば、本発明によるＤＮＡコンストラクトを保有する酵母ベクターである。酵母中の発現のための好ましい酵母発現ベクターは、属ハンゼヌラ、ピキア、カンジダ及びトルロプシスにより示されるメチロトローフ酵母からなる群から選択される。
【００９１】
本発明において、pPICZ、pGAPZ、pPIC9、pPICZalfa、pGAPZalfa、pPIC9K、pGAPHis又はpPUZZLE由来のプラスミドをベクターとして使用することが好ましい。
【００９２】
本発明の好ましい一実施態様において、組み換えヘルパー遺伝子、ＰＯＩ遺伝子又は組み換え宿主細胞は、関連する遺伝子をベクター中にライゲーションし、この遺伝子を保有する単一ベクターを構築することにより、又は別個の複数のベクターにヘルパー因子遺伝子及びＰＯＩ遺伝子をそれぞれ有するようにさせることにより得られる。これら遺伝子は、このようなベクターを用いて宿主細胞をトランスフォーメーションすることにより宿主細胞ゲノム中に安定に組み込まれることができる。この遺伝子によりコードされるポリペプチドは、このようにして適した媒体中に得られるトランスフォーマントを培養し、発現されたＰＯＩを培養物から単離し、そして、これを発現した生成物のために適した方法により、特に共発現したヘルパー因子からＰＯＩを分離するために適した方法により精製することにより組み換え宿主細胞株を用いて生産されることができる。
【００９３】
関連する遺伝子は、本発明の宿主細胞中に高度に発現されるように改変されることができる。遺伝子は、宿主中で最も頻繁に使用されるコドンと相関するように遺伝子配列を最適化することにより改変されることができる。例えば、遺伝子配列は、宿主中で高度に発現される遺伝子と一緒に使用されるコドンに応じて最適化されることができる。
【００９４】
真核宿主細胞中のＰＯＩ発現及び分泌のための幾つかの異なるアプローチが好まれる。真核生物を所望のタンパク質及びシグナルペプチドをコードするＤＮＡを宿す発現ベクターを用いてトランスフォーメーションし、このトランスフォーメーションした生物の培養物を準備し、この培養物を成長させ、この培養培地からタンパク質を回収することにより、タンパク質は発現され、プロセッシングされ、分泌される。シグナルペプチドは、所望のタンパク質自体のシグナルペプチド、異種シグナルペプチド又は天然及び異種シグナルペプチドのハイブリッドであってよい。本願の文脈において、「シグナルペプチド」との用語は、酵母中で発現される細胞外タンパク質の前駆体の形でＮ末端配列として存在するプレ配列を意味すると理解される。シグナルペプチドの機能は、小胞体に入るために異種タンパク質に分泌をさせることを可能にさせる。シグナルペプチドは、このプロセスの経過において通常は開裂される。シグナルペプチドは、タンパク質を生産する宿主細胞に対して異種又は同種であってよい。
【００９５】
好ましい一観点において、本発明は、発現ベクターが、宿主細胞からＰＯＩの分泌を引き起こすのに有効な分泌リーダー配列を含む方法に関する。発現ベクター中のこのような分泌リーダー配列の存在は、組み換え発現及び分泌のために意図されるＰＯＩが、天然に分泌されず、したがって天然の分泌リーダー配列を欠失するか、又はそのヌクレオチド配列がその天然の分泌リーダー配列なしにクローニングされているタンパク質である場合に必要とされる。この分泌リーダー配列は酵母供給源に、例えば酵母α−因子、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のＭＦα、又は酵母ホスファターゼに、哺乳類又は植物の供給源その他に由来してよい。適した分泌リーダー配列の選択は当業者には明白である。
【００９６】
代替的に、分泌リーダー配列は当業者に知られている慣用のクローニング技術により組み換え発現のために意図されるＰＯＩをコードするヌクレオチド配列に融合していることができる。好ましい実施態様において、ＰＯＩのヌクレオチド配列は分泌シグナル、すなわち、シグナルペプチドが開裂され、タンパク質が培地中に放出される分泌経路へタンパク質をターゲット化するペプチドに融合しており、例えばアルファ−因子、ＰＨＯ又はＡＧＡ−２である。
【００９７】
適した発現ベクターは、真核宿主細胞中で異種ポリペプチド又はタンパク質をコードするＤＮＡの発現に適した調節配列を含む。調節配列の例は、プロモーター、オペレーター、及びエンハンサー、リボソーム結合部位、及び、転写及び翻訳開始及び終了を制御する配列を含む。調節配列は、発現すべきＤＮＡ配列に操作可能に連結されていてよい。例えば、プロモーター配列は、このプロモーターがコード配列の転写を制御する場合に、コード配列に操作可能に連結されているといわれている。
【００９８】
プロモーターは、宿主細胞中で転写活性を示し、かつ、宿主に対して同種又は異種のいずれかであるタンパク質をコードする遺伝子に由来してよい任意のＤＮＡ配列であってよい。プロモーターは好ましくは、宿主細胞に対して異種であるタンパク質をコードする遺伝子に由来する。
【００９９】
更なる一観点において、本発明は、発現ベクターが、宿主細胞中のＰＯＩの発現を引き起こすのに有効なプロモーター配列を含む方法に関する。宿主細胞中の組み換えヌクレオチド配列の発現を可能にするには、発現ベクターは、組み換えヌクレオチド配列にコード配列の５′末端に隣接する機能的プロモーターを提供してよい。この転写は、これによって調節され、このプロモーター配列により開始される。
【０１００】
哺乳類宿主細胞を用いた使用のための適したプロモーター配列は、ウィルスのゲノムから得られたプロモーター、異種哺乳類プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、及びヒートショックプロテインプロモーターを含んでよいが、これに限定されない。
【０１０１】
酵母宿主細胞と一緒の使用のために更に適したプロモーター配列は、細胞中に高濃度で存在することが知られている代謝性酵素、例えば糖分解酵素、例えばトリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、ホスホグリセラートキナーゼ（ＰＧＫ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＤＰＨ）、アルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ）、ラクターゼ（ＬＡＣ）及びガラクトシダーゼ（ＧＡＬ）をコードする遺伝子から得られたプロモーターを含んでよいが、これに限定されない。
【０１０２】
適したプロモーターの好ましい例は、酵母プロモーターであり、これは酵母細胞中の遺伝子転写のためのプロモーターとして機能するＤＮＡ配列を含む。好ましい例は、Ｓ，セレビシエ（S. cerevisiae）MaI, TPI, CUP, ADH又はPGKプロモーター、又はＰ．パストリスグルコース−６−リン酸イソメラーゼプロモーター（ＰＰＧＩ）、３−ホスホグリセラートキナーゼプロモーター（ＰＰＧＫ）又はグリセロールアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼプロモーターＰＧＡＰ、アルコールオキシダーゼプロモーター（ＰＡＯＸ）、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼプロモーター（ＰＦＬＤ）、イソシトラートリアーゼプロモーター（ＰＩＣＬ）、翻訳伸長因子プロモーター（ＰＴＥＦ）、及び次のもののプロモーター：Ｐ．パストリスエノラーゼ１（ＰＥＮＯ１）、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＰＴＰＩ）、アルファ−ケトイソカプロアートデカルボキシラーゼ（ＰＴＨＩ）、リボソームサブユニットタンパク質（ＰＲＰＳ２、ＰＲＰＳ７、ＰＲＰＳ３１、ＰＲＰＬ１）、ヒートショックプロテインファミリーメンバー（ＰＳＳＡ１、ＰＨＳＰ９０、ＰＫＡＲ２）、６−ホスホグルコナートデヒドロゲナーゼ（ＰＧＮＤ１）、ホスホグリセラートムターゼ（ＰＧＰＭ１）、トランスケトラーゼ（ＰＴＫＬ１）、ホスファチジルイノシトールシンターゼ（ＰＰＩＳ１）、フェロ−Ｏ2−オキシドレダクターゼ（ＰＦＥＴ３）、高親和性イオンペルミアーゼ（ＰＦＴＲ１）、抑制性アルカリホスファターゼ（ＰＰＨＯ８）、Ｎ−ミリストイルトランスフェラーゼ（ＰＮＭＴ１）、フェロモン応答転写因子（ＰＭＣＭ １）、ユビキチン（ＰＵＢＩ４）、単鎖ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（ＰＲＡＤ２）及びミトコンドリア内膜の主要ＡＤＰ／ＡＴＰキャリアーのプロモーター（ＰＰＥＴ９）である。
【０１０３】
好ましい発現系においては、プロモーターは誘導的又は構成的プロモーターである。プロモーターは内因性プロモーター又は宿主細胞に対して異種であることができる。
【０１０４】
ヘルパー因子及び／又はＰＯＩをコードするＤＮＡ配列は、適したターミネーター配列、例えばＡＯＸ１（アルコールオキシダーゼ）ターミネーター、ＣＹＣ１（シトクロムｃ）ターミネーター、ＴＥＦ（翻訳伸長因子）ターミネーターに操作可能に連結されていてもよい。
【０１０５】
発現ベクターは、１以上の表現型により選択可能なマーカー、例えば抗生物質耐を付与するか又は自己栄養要求を供給するタンパク質をコードする遺伝子、及び、意図される宿主細胞により認識される複製起点を、宿主内の増幅を保証するために含んでよい。酵母ベクターは通常は、酵母プラスミドからの複製起点、自律複製配列（ＡＲＳ）、又は代替的に、宿主ゲノム中への組み込みに使用される配列、プロモーター領域、ポリアデニル化のための配列、転写終結のための配列、及び選択可能なマーカーを含む。
【０１０６】
例えばヘルパー因子及び／又はＰＯＩをコードする、ＤＮＡ配列、プロモーター及びターミネーターそれぞれをライゲーションするために、そして、組み込み又は宿主複製に必要な情報を含む適したベクター中にこれらを挿入するために使用される手順は、当業者によく知られており、例えばJ. Sambrook et al., "Molecular Cloning 2nd ed.", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)により説明される。
【０１０７】
ヘルパー因子遺伝子及び／又はＰＯＩを組み込みターゲットとして使用するベクターは、第１に、ヘルパー因子及び／又はＰＯＩをコードする全ＤＮＡ配列を含むＤＮＡコンストラクトを準備し、引き続きこのフラグメントを適した発現ベクター中に挿入することにより、又は、個々の要素のための遺伝情報を含むＤＮＡフラグメント、例えばシグナル、リーダー又は異種タンパク質を順番に挿入し、この後にライゲーションすることにより構築されてよいことが理解されるものである。
【０１０８】
マルチクローニング部位を有するベクターであるマルチクローニングベクターも本発明により使用されることができ、その際、所望の異種遺伝子が発現ベクターを提供するためにマルチクローニング部位で組み込まれることができる。発現ベクターは、異種遺伝子を保有するベクターであり、かつ、このような遺伝子によりコードされる異種化合物の発現に使用される。発現ベクター中では、プロモーターが異種化合物の遺伝子の上流に配置され、この遺伝子の発現を調節する。マルチクローニングベクターの場合には、異種化合物の遺伝子がマルチクローニング部位に導入されるために、このプロモーターはマルチクローニング部位の上流に配置される。
【０１０９】
本発明により組み換え宿主細胞を得るために提供されるＤＮＡコンストラクトは、確立された標準的方法、例えばホスホラミダイト方法により合成によって準備されてよい。ＤＮＡコンストラクトはゲノム又はｃＤＮＡ起源であってもよく、例えばゲノム又はｃＤＮＡライブラリーを準備し、本発明のポリペプチドの全て又は一部をコードするＤＮＡ配列を標準技術に一致して合成オリゴヌクレオチドを使用したハイブリダイゼーションによりスクリーニングすることにより得られてよい（Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratorv Manual, Cold Spring Harbor, 1989）。最後に、ＤＮＡコンストラクトは、混合した合成及びゲノム起源、混合した合成及びｃＤＮＡ又は混合したゲノム及びｃＤＮＡ起源であってよく、これは合成、ゲノム又はｃＤＮＡ起源のフラグメントを適したようにアニーリングすることにより準備され、このフラグメントは全ＤＮＡコンストラクトの様々な部分に相応し、標準的技術に一致する。
【０１１０】
本発明によるトランスフォーマントは、このようなベクターＤＮＡ、例えばプラスミドＤＮＡを宿主中に導入し、そして、ＰＯＩをヘルパー因子の存在下で過剰発現するトランスフォーマントを選択することにより得られることができる。宿主細胞は、外来ＤＮＡｓを組み込むことができるように真核細胞のトランスフォーメーションのために慣用される方法により処理され、これは例えば電気パルス法、プロトプラスト法、酢酸リチウム法及びこの改変した方法である。Ｐ．パストリス（P. pastoris）は好ましくは電気穿孔によりトランスフォーメーションされる。
【０１１１】
別の好ましい実施態様において、酵母発現ベクターは、例えば相同性組み換えによって、酵母ゲノム中に安定に組み込むことができる。
【０１１２】
細胞をヘルパー因子及び／又はＰＯＩ遺伝子でトランスフォーメーションすることにより得られる本発明によるトランスフォーマント宿主細胞は、好ましくは第１に異種タンパク質を発現する負荷なしに多数の細胞を効率的に成長させる条件下で培養されてよい。細胞株がＰＯＩ発現のために準備される場合には、培養技術は発現生成物を生産するため選択される。
【０１１３】
トランスフォーマントが誘導的刺激を用いて成長する場合には、プロモーターは、その制御下にある遺伝子の転写を指向させるために活性化されてよく、そしてＰＯＩは発現する。誘導的刺激を用いた成長条件下では、これは通常は通常条件下におけるよりもより遅く成長し、しかし、これは、前の段階において多数の細胞へと既に成長しており、この培養系は全体として多量の異種タンパク質を生産する。誘導的刺激は好ましくは熱、又はカドミウム、銅の添加、浸透圧増加剤、過酸化水素、エタノール、メタノール、メチルアミン又はこの類似物である。
【０１１４】
少なくとも１ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも１０ｇ／Ｌ細胞乾燥質量、好ましくは少なくとも５０ｇ／Ｌ細胞乾燥質量の細胞密度を獲得するための成長条件下で、本発明による宿主細胞株をバイオリアクター中で培養することが好ましい。このような収率の生体分子生産をパイロット又は工業規模で提供することが好ましい。
【０１１５】
ＰＯＩは好ましくは、少なくとも１ｍｇ／Ｌ、好ましくは少なくとも１０ｍｇ／Ｌ、好ましくは少なくとも１００ｍｇ／Ｌ、最も好ましくは少なくとも１ｇ／Ｌの収量を生産するための条件を採用して発現される。
【０１１６】
本発明によれば、意外なことに、バイオマスが少なく維持される場合にすら、高い収量でヘルパー因子及びＰＯＩを効率的に共発現することができる。このようにして、高い具体的収量は、これはｍｇＰＯＩ／ｇ乾燥バイオマスで測られるが、２〜２００、好ましくは１００〜２００、５００までの範囲においてパイロット及び工業規模においてこのようにして実現可能である。本発明による生産宿主の具体的生産性は、ヘルパー因子なしの生成物の発現に比較して、好ましくは少なくとも１．１倍、より好ましくは少なくとも１．５倍、少なくとも１．２倍又は少なくとも１．３倍の増加を提供し、幾つかの場合には２倍よりも多い増加が示されることができる。
【０１１７】
本発明の宿主細胞は好ましくは以下の試験によりその発現能又は収量について試験される：ＥＬＩＳＡ、活性アッセイ、ＨＰＬＣ、又は他の適した試験。
【０１１８】
好ましい発酵技術はバッチ、流加回分又は連続的培養である。
【０１１９】
好ましくは、酵母は無機培地中で適した炭素供給源と一緒に培養され、ビタミンカクテルを回避し、これによって、さらに単離プロセスを顕著に簡易化する。好ましい無機培地の一例は、利用可能な炭素供給源（例えば、グルコース、グリセロール又はメタノール）、マクロ構成要素を含有する塩（カリウム、マグネシウム、カルシウム、アンモニウム、クロライド、スルファート、ホスファート）及び微量元素（銅、ヨウ化物、マンガン、モリブデン酸塩、コバルト、亜鉛及び鉄塩、及びホウ酸）を含むものである。
【０１２０】
トランスフォーメーションした細胞をこの所望される組み換え化合物の発現を実施するのに適した条件下で培養し、これは、発現系及び発現されるタンパク質の性質に依存して、例えばタンパク質がシグナルペプチドに融合しているかどうかやタンパク質が溶解性又は膜結合しているかどうかに依存して、細胞又は培養培地から精製されることができる。当業者に理解されるとおり、培養条件は、宿主細胞のタイプ及び利用される特定の発現ベクターを含む因子に応じて変動するものである。
【０１２１】
所望される化合物が細胞から分泌される場合には、これは技術水準の技術を用いて培養培地から単離され、かつ精製されることができる。酵母細胞からの組み換え発現生成物の分泌は、一般に、精製プロセスを容易にすることを含む理由等から好ましい、というのも生成物は、酵母細胞が細胞内タンパク質を放出するために破砕される場合に生じるタンパク質の複雑な混合物からよりむしろ培養上清から回収されるからである。
【０１２２】
分泌されたタンパク質は一般に、Ｎ末端シグナル又はリーダーペプチドを有する前駆体として初期に発現される。シグナルペプチドは一般に正に荷電したＮ末端を有し、この後に疎水性コアが続き、この後に、シグナルペプチダーゼとして知られる酵素のための認識部位が続く。この酵素はトランスロケーションの間にタンパク質からシグナルペプチドを開裂する。このタンパク質は小胞体からゴルジ装置へと輸送され、次いで、タンパク質の性質に依存して分泌経路における数々の経路の１つが続く。このタンパク質は培養培地中へと分泌されるか又は例えば細胞表面に維持されてよい。細胞外、膜内外及び細胞質ドメインを含む特定のレセプターは、細胞表面に維持されてよいタンパク質の例であり、細胞外ドメインだけが細胞の外側に位置する。
【０１２３】
培養されたトランスフォーマント細胞は、超音波又は機械により、酵素又は化学処理により破砕されてもよく、このようにして所望のＰＯＩを含む細胞抽出物を得、ここからＰＯＩは単離及び精製される。
【０１２４】
組み換えポリペプチド又はタンパク質生成物を得るための単離及び精製方法、方法、例えば溶解性の相違を利用する方法、例えば塩析及び溶媒沈降、分子量の相違を利用する方法、例えば限外濾過及びゲル電気泳動、電荷の相違を利用する方法、例えばイオン交換クロマトグラフィ、特異的親和性を利用する方法、例えばアフィニティクロマトグラフィ、疎水性の相違を利用する方法、例えば逆相高性能液体クロマトグラフィ、及び等電点の相違を利用する方法、例えば等電点電気泳動が使用されてよい。具体的精製工程は好ましくは、共発現され、かつ、ＰＯＩ調製物を汚染する任意のヘルパー因子を分離するために利用される。
【０１２５】
単離されかつ精製されたＰＯＩは、慣用方法、例えばウェスタンブロット又はその活性のアッセイにより同定されることができる。精製された化合物の構造は、アミノ酸分析、アミノ末端分析、一次構造分析等により定義されてよい。この化合物が大量にかつ高度な精製レベルにおいて得ることができることが好ましく、このようにして、製薬学的組成物における活性成分としての使用のために必要な要求を満たす。
【０１２６】
本発明の好ましい宿主細胞株は、ヘルパー因子及びＰＯＩ遺伝子の組み込みを維持し、発現レベルは、約２０回の培養世代、好ましくは少なくとも３０回の培養世代、より好ましくは少なくとも約４０回の培養世代、最も好ましくは約５０回の培養世代後にさえ、高いままであり、例えば少なくともμｇのレベルである。この組み換え宿主細胞は意外なまでに安定であり、このことは、産業的規模のタンパク質生産のために使用される場合に大きな利点である。
【０１２７】
本発明は更に詳細に以下実施例において説明され、このことは、請求されるとおりの発明の範囲を如何なる意味合いでも限定することを意図しない。
【０１２８】
実施例
例１：
ａ）表面上にFab 2F5をディスプレーするＰ．パストリス株の構築
Fab 2F5発現カセットの作成のために、全軽鎖遺伝子（vL及びcL）及び重鎖遺伝子のvH及びcH1領域をヒト化したIgGI mAbを含むpRC/RSVからＰＣＲにより増幅した（Kunert et al., 1998, 2000）。非テンプレートコード制限部位（Non template codes restriction sites）をオリゴヌクレオチドプライマーを使用することに付加した（第１表）。
【０１２９】
第１表：Fab 2F5重鎖及び軽鎖のＰＣＲ増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマー
【表１】
2012527227.tif 000002
【０１３０】
軽鎖フラグメントを改変したバージョンのpGAPalfaA (Invitrogen)のEcoRI及びSacll部位中にライゲーション導入し、ここではAvrll制限部位が部位指向的突然変異作成によりNdel部位に変更され、この結果、２つの発現カセットを含むプラスミドの引き続く線状化が可能になった。
【０１３１】
重鎖フラグメントをアルファ−アグルチニンフラグメントを有する改変されたバージョンのpGAPZalfaAのEcoRI部位中に挿入した（アルファ−アグルチニンフラグメントを、ＰＣＲによってプライマーAgg-EcorRI#1（配列番号９）及びAgg-Xbal#2（配列番号１０）（第２表）を使用してＳ．セレビシエゲノムＤＮＡから増幅し、pGAPZalfaAのEcoRI及びXbal部位中にクローニング導入した）。
【０１３２】
第２表：Ｓ．セレビシエのためのアルファ−アグルチニンのＰＣＲ増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマー
【表２】
2012527227.tif 000003
【０１３３】
１つのベクター上の両方のFab鎖のための発現カセットを組み合わせるプラスミドを、BgIII及びBamHIを用いた軽鎖ベクターの二重消化、及び、アルファ−アグルチニンフラグメントへと融合した重鎖フラグメントの発現カセットの単一コピーを既に含むそれぞれのベクター（pGAPZαA）の特有のBgIII部位中へのこの発現カセットの引き続く挿入により生産した。
【０１３４】
Ｐ．パストリス中にジェネティシン（G418）耐性を付与するプラスミドを作成するために、Sh ble遺伝子（Fab 2F5軽鎖及び重鎖アルファアグルチニン融合体を有するプラスミドpGAPZalfaA（pGAPZalfaA-LC-HCaAggl）のゼオシン（Zeocin商標は、CAYLAの商品名）への耐性を付与する）を、pFA6KanMX4 (Longtine et.al.1998)のkanMX4カセットからのTn903 kanR遺伝子によって置換した。この交換を、Tn903 kanR遺伝子（pFA6kanMX4カット、Ncol及びSealを有する）をNcol及びEcoRVで消化したpGAPZalfaA-LC-HCalfaAgglのプラスミド骨格中にクローニング導入することによって実施した。
【０１３５】
この生じるプラスミドをAvrllを用いてＰ．パストリスSMD1168 (Invitrogen)中への電気トランスフォーメーション前に線状化した。
【０１３６】
Ｐ．パストリスの表面上の抗体フラグメントFab 2F5のディスプレーを確実にするために、免疫蛍光染色細胞（抗ヒトカッパ軽鎖FITCコンジュゲート；Sigma-Aldrich F3761）のフローサイトメトリー分析を実施し、高生産（ディスプレー）株を選択した。
【０１３７】
ｂ）Ｐ．パストリスｃＤＮＡライブラリーの共過剰発現に適したプラスミドpLlBの構築
第１の工程においてpLIBを作成するためにpGAPZB (Invitrogen)のマルチクローニング部位（MCS）を、人工オリゴヌクレオチド（アニーリングした５′リン酸化オリゴヌクレオチドMCS#1（配列番号１１）及びMCS#2（配列番号１２）、（第３表）、pGAPZBのEcoRI及びNotlの間の付加的な制限部位BstAPI(A)、Pacl及びBstAPI(B)をコードする）を挿入することにより改変した。制限部位BsIAPI(A)及びBstAPI(B)は、比較的粘着性の末端をSfil(A) / Sfil(B)と形成するように設計されている。第２の工程において、当初のＧＡＰプロモーターを、付加的な２つのｂｐを位置２３８（メガプライマー法によりＰＣＲを用いて増幅；オリゴヌクレオチドプライマー、第４表参照のこと）に有する改変されたＧＡＰプロモーターのＰＣＲフラグメントで、これをBgIII及びEcoRIの間にクローニング導入することにより置き換えた。これら２つのｂｐの挿入は、新規のSfil制限部位を生じた。
【０１３８】
第３表：マルチクローニング部位のためのオリゴヌクレオチド
【表３】
2012527227.tif 000004
【０１３９】
第４表：Ｓ．セレビシエのためのアルファ−アグルチニンのＰＣＲ増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマー
【表４】
2012527227.tif 000005
【０１４０】
別の工程において、生じるプラスミドのpGAP(Sfil)MCSmodのAOX1転写ターミネーター及びゼオシン耐性カセットを、プラスミドpPuzzle_ZeoR_Pgap_eGFP_AOXTT (Gasser et.al. 2008)からのＳ．セレビシエ−ゼオシン耐性カセットフラグメントのCYC1転写ターミネーターに対して変更した。相同組み換えを介した遺伝子置換事象（2F5Fab重鎖及び／又は2F5Fab軽鎖の発現カセットのノックアウト）を回避するために、ゼオシン耐性カセットの方向をKpnlを用いた制限酵素消化及び再ライゲーションにより変更した。
【０１４１】
pPuzzle_ZeoR_Pgap_eGFP_AOXTT（reverse）を、BamHI（この後にクレノウポリメラーゼを用いた処理が続く）及びBssSIで消化した。正確なサイズのＤＮＡフラグメントを、プラスミドpGAP(Sfil)MCSmod（Agelで消化し、クレノウで処理し、BssSIで消化した）中にクローニングした。生じるプラスミドをpLIBと呼んだ。
【０１４２】
ｃ）ｃＤＮＡ共発現ライブラリーの構築：
ｃＤＮＡ合成を、様々な環境的条件（改変した培養パラメーター：温度、ｐH、異なる炭素及び窒素供給源；複合的かつ最小限の塩媒体、ヒートショック）下で成長した様々な株のＰ．パストリスのポリＡＲＮＡプールから開始して、SMART Creator cDNA Library Construction Kit (Clontech)のプロトコルに応じて、ｃＤＮＡ−ＰＣＲフラグメントのクローニングの工程まで実施した。ｃＤＮＡが提供されたプラスミド中にクローニングされる代わりに、この生じるｃＤＮＡ−ＰＣＲフラグメントをプラスミドpLIB（例１、工程ｂ）中にクローニングし、これは、この研究のために特別に設計及び構築されている（ｃＤＮＡライブラリーをＰＣＲにより増幅し、SfIIで消化し、かつ、BstAPI及びアルカリホスファターゼ処理したpLIB中にクローニング）。電気トランスフォーメーションを介した大腸菌のトランスフォーメーションは、１×１０6個々のクローンを生じた。このクローニング手順の効率を、制限酵素分析により確認した。
【０１４３】
生じるプラスミドライブラリー（相同組み換えを介してゲノム中への組み込みのためSfilで線状化）を、細胞の表面上に抗体フラグメントFab2F5をディスプレーするＰ．パストリスの予備選択された株をトランスフォーメーションするために使用した（例１、工程ａ）。最適化されたトランスフォーメーション手順は、ゼオシンを含むＹＰＤ寒天上に１．２×１０6個々のクローンを有するＰ．パストリスｃＤＮＡ共発現ライブラリーを生じた。全てのコロニーをＹＰＤ培地を使用してプレートから剥がしとった。生じる細胞懸濁液を、６００ｎｍで０．１の出発光学密度を有する発現培地を接種するために使用した（条件：１０ｍｌのＢＭ培地を有する１００ｍｌの振盪フラスコ培養、１リットルあたり：１０ｇの酵母抽出物、１０ｇのペプトン、１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．０、１３．４ｇの酵母窒素供給源、硫酸アンモニウムあり、０．４ｍｇビオチン）。細胞を２８℃及び１８０ｒｐｍで成長させ、中間対数相（OD600 8-15）を生じた。約１０7個の細胞を、ＢＳＡを含むＰＢＳ中で抗ヒト−カッパ−軽鎖FITCコンジュゲートで免疫蛍光染色し（Sigma-Aldrich F3761、希釈１：１００）、３秒間の超音波処理後にこれらを蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）のために使用した。ＦＡＣＳをＦＡＣＳCalibur (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA)で実施した。ＦＡＣＳのために２つのゲートを定義しなくてはならなかった。ゲート１は、ドットプロットFSC vs. SSCで定義され、細胞と細胞残渣を区別するために使用された。ゲート２は、ドットプロットFL1 vs. FSCで設計され、最高のFL1シグナルを有するゲート１の細胞だけを回収するようにした。両方のゲートに属する事象（細胞）だけ選別し、細胞濃縮器中で回収した。選別した事象ｖｓ．選別してない事象（第５表）の比を、移動ゲート２を介して制御した。この選別した細胞の回収を液状ＢＭ培地中で実施した。全ての回収した細胞を新規発現培養を接種するために使用し、中間対数相へと上述の条件下で再度成長させた。
【０１４４】
この手順を４回繰り返し、この結果、全５回の逐次的ラウンドの選別を実施した。
【０１４５】
第５表：選別ラウンド
【表５】
2012527227.tif 000006
【０１４６】
発現、染色及び選別の５回目のラウンド後に、全ての選別した細胞をＹＰＤ寒天（１リットルあたり：１０ｇの酵母抽出物、２０ｇのペプトン、２０ｇのグルコース、２５ｍｇのゼオシン、５００ｍｇのＧ４１８スルファート）上に播種した。単一クローンを個別化するために、レプリカ平板法の１回のラウンド後に、これらの単一コロニーを発現培地を接種するために使用し、中間対数相へと再度成長させた。各個々のクローンからの細胞のアリコートを免疫蛍光染色のために使用し、この後、フローサイトメトリー分析した。フローサイトメトリー分析を、ＦＡＣＳCalibur (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA)で実施した。この試料を、４８８ｎｍで空冷したアルゴン−イオンレーザーを用いて励起させ、その一方でこの蛍光放出を585/21バンドパスフィルターを介して測定した。
【０１４７】
全てのデータを対数モードで獲得した。閾値設定を調節し、細胞残渣をデータ獲得から排除した。１００００個の細胞を各試料のために測定した。データ分析を後でFCSExpress V3及びMS Excel Softwareを用いて実施した。免疫蛍光染色されかつ表面ディスプレーした抗体フラグメント2F5Fabの蛍光放出を、比FL1/FSCの計算により、細胞サイズに対して標準化した。各個々のクローンについて測定した全１００００個の細胞のFL1/FSC比の相乗平均を計算し、同種遺伝子を共過剰発現しないコントロール株のFL1/FSC比の相乗平均に比較した。（空のpLIBプラスミドでトランスフォーメーションしたＰ．パストリス2F5Fabディスプレー株）。促進された2F5Fab細胞表面シグナルを有する株を、ゲノムＤＮＡの調製のために使用した（DNeasy Blood and Tissue Kit, Qiagen 69504）。共過剰発現した同種遺伝子の同定を、pLIB特異的オリゴヌクレオチドプライマー（GAPLibamp （配列番号１６）及びShble3out（配列番号１７）、第６表）を用いたＰＣＲ増幅及びＰＣＲ産物の配列決定により実施した。
【０１４８】
第６表：共過剰発現した遺伝子のＰＣＲ増幅及び配列決定のためのオリゴヌクレオチドプライマー
【表６】
2012527227.tif 000007
【０１４９】
配列をＰ．パストリスゲノム配列、Ｓ．セレビシエゲノムデータベース及びＮＣＢＩデータベースに対してブラストした。第５回目の選別ラウンドのアウトプットから、Ｐ．パストリスの３つのオープンリーディングフレームが同定されることができた。
【０１５０】
RPPA12105 Ｐ．パストリスIG-66. 機能的アノテーションなし;予備的にcLC52 (ｃＤＮＡライブラリークローン52)としてアノテーションされる
コード配列（配列番号１）：
2012527227.tif 000008
RPPA10316 Ｐ．パストリスIG-66アノテーション;Ｓ．セレビシエに対するホモロジーによりRPL33A
コード配列（配列番号２）：
2012527227.tif 000009
イントロンを含むゲノム配列（配列番号３）：
2012527227.tif 000010
RPPA09410 Ｐ．パストリスIG-66 アノテーションなし(作業名cLC61 ｃＤＮＡライブラリークローン61)
コード配列（配列番号４）：
2012527227.tif 000011
【０１５１】
同定されたオープンリーディングフレームをpLIB cDNA-ライブラリーから特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅した（第７表）。Ｐ．パストリスコザック配列（GCC）を、開始コドン（ATG）直前に挿入した。非テンプレートコードされた制限部位Sbfl及びSfilを、相応するフォワード及びバックワードプライマーを用いて付加した。制限酵素Sbfl及びSfilでの処理後に、正確なサイズのＰＣＲ産物をpPuzzle_ZeoR_Pgap_eGFP_AOXTTプラスミド（Gasser et.al. 2008）中にクローニング導入し、eGFPのオープンリーディングフレームを置き換えた（Sbfl及びSfilで消化、その後に、アルカリホスファターゼを用いた処理）。生じるプラスミド（pPZ-RPL; pPZ-cLC52, pPZ-cLC61）及び空のpPuzzle_ZeoR_Pgap_AOXTTを、Asclでの制限消化後に2F5FabをディスプレーするＰ．パストリスSMD1168をトランスフォーメーションするために使用した。レプリカ平板法の１回のラウンド後に、単一クローンを個別化するために、単一コロニーをＹＰＤ培地上の予備培養物に接種するために使用した。約２０時間にわたる２８℃で１８０ｒｐｍでのインキュベーション後に、これらの予備培養物をＯＤ６００＝０．１を有する発現培養物を接種するために使用した。発現培養物のアリコート（２８℃、１８０ｒｐｍで中間対数相に成長）を、免疫蛍光染色及びフローサイトメトリー分析のために使用した。様々な株の発現レベルを、FL1/FSC比の相乗平均の計算により比較した（第８表）。
【０１５２】
第７表：同定された遺伝子のＰＣＲ増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマー
【表７】
2012527227.tif 000012
【０１５３】
第８表：発現レベル
【表８】
2012527227.tif 000013
【０１５４】
例２：組み換えヒトトリプシノゲン（rhTRP）を過剰発現するＰ．パストリスの株中の新規ヘルパー因子遺伝子の共過剰発現
ａ）共過剰発現プラスミドの構築
ゼオシンに対する耐性を確認するベクターからの既に異種のタンパク質を発現する株中のＰ．パストリスの同種遺伝子の共発現に適したプラスミドを作成するために（例２、工程ｂ参照のこと）、第１の工程においてKanMX4カセット（Ｐ．パストリス中のジェネティシン耐性を確認する）をpFA6kanMX4プラスミドからＰＣＲにより増幅した（Longtine et.al.1998）。Kpnlのための制限部位を、特異的オリゴヌクレオチドプライマーKanR#1（配列番号２４）及びKanR#2（配列番号２５）を使用して付加した（第９表）。Kpnl処理したＰＣＲフラグメントを、ゼオシン耐性カセットの代わりにpPuzzle ZeoR Pgap eGFP AOXTTの両方のKpnl部位の間にクローニングした（Gasser et.al. 2008）。生じるプラスミドをpPkanRと呼んだ。
【０１５５】
第９表：
【表９】
2012527227.tif 000014
【０１５６】
共過剰発明のために全目的遺伝子（例１参照）をＰＣＲを介してＰ．パストリスｃＤＮＡライブラリーから増幅させた。非テンプレートコードされたＰ．パストリスコザック配列及びSbfl及びSfilのための制限部位を、それぞれのフォワード及びバックワードオリゴヌクレオチドプライマーを使用して付加した（第７表）。Sbfl及びSfil処理されたＰＣＲ産物をpPKanR中にクローニングした（Sbfl及びSfil消化し、アルカリホスファターゼで処理）。新規の共過剰発現プラスミドpPKanR-RPL, pPKanR-cLC52及びpPKanR-cLC61をE.coli Top10 (Invitrogen)中にトランスフォーメーションした。制限エンドヌクレアーゼ消化及び配列決定を、この構築されたプラスミドの正確な同一性を確認するため実施した。
【０１５７】
ｂ）組み換えヒトトリプシノゲン及び新規ヘルパー因子遺伝子を共発現するＰ．パストリス株の構築
例２の工程ａ）に説明されるクローニング手順から得られるプラスミドpPKanR-RPL, pPKanR-cLC52及びpPKanR-cLC61を、ＧＡＰプロモーターの制御下で組み換えヒトトリプシノゲンの高レベル発現について予備選択されたＰ．パストリスの株をトランスフォーメーションするために使用した（Hohenblum et.at 2004）。選択は、トリプシノゲン遺伝子についてのゼオシン耐性及びヘルパー因子遺伝子についてのジェネティシン耐性を基礎とする。
【０１５８】
共過剰発現したヘルパー因子遺伝子の作用を評価するために、トリプシノゲン発現株もヘルパー因子遺伝子無しにpPkanRプラスミドでトランスフォーメーションした。
【０１５９】
ｃ）振盪フラスコ培養中のトランスフォーメーションしたＰ．パストリス株の培養
１０ｇ／ｌのグリセロールを含む５ｍｌのＹＰ培地（１０ｇ／ｌの酵母抽出物、２０ｇ／ｌのペプトン）を、例３の工程ａ）からのＰ．パストリス株の単一コロニーで接種し、一晩２８℃で成長させた。これら培養物のアリコート（０．１の終ＯＤ６００に相応）を、２０ｇ／Ｌのグルコースを補った発現培養培地１２．５ｍｌ（１リットルにつき：１０ｇの酵母抽出物、１０ｇのマメペプトン、１０．２ｇの（ＮＨ4）2ＰＯ4、１．２４ｇのＫＣｌ、０．１ｇのＣａＣｌ2、ｐＨ５．０にＨＣｌを用いて調節）に移し、１００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ中で強力な振盪で２８℃で６０ｈにわたりインキュベーションした。同じ量の基質を繰り返し４回１２時間毎に、細胞を２５００×ｇの１０分間の室温での遠心分離により回収し、分析のために調製する前に添加した（１ｍｌの細胞懸濁物の細胞質量を測定することによるバイオマス決定、培養上清中のトリプシノゲン定量化のための酵素活性アッセイ）。
【０１６０】
ｄ）rhTRPの定量による新規ヘルパー因子の共過剰発現の作用の評価
Ｐ．パストリス培養物上清の脱塩を、小さい予備充填したサイズ排除クロマトグラフィカラム（Disposable PD-10 Desalting Columns 17-0851 -01 ; GE Healthcare）を使用して実施した。２．５ｍｌの上清をカラムに設け、３．５ｍｌの溶出緩衝液（１ｍＭ  ＨＣｌ）で溶出させた。溶出後に７０μｌの２Ｍ  ＣａＣｌ2溶液を添加した。不活性なトリプシノゲンを活性のあるトリプシンに変換するために３００μｌの脱塩した上清（＋ＣａＣｌ2）を６９０μｌの活性化緩衝液（５０ｍＭ  ＴＲＩＳ／ＨＣｌ  ｐＨ８．６；４０ｍＭ  ＣａＣｌ2、０．１５ｇ／Ｌ  エンテロキナーゼ、豚小腸由来、Sigma-Aldrich E0632）と混合し、２時間３７℃でインキュベーションした。１６５μｌの活性化混合物を１０００μｌのＮα−ｐ−トシル−Ｌ−アルギニン−メチル−エステル−ヒドロクロリド（ＴＡＭＥ）溶液と混合し、これは溶解緩衝液（５０ｍＭ  ＴＲＩＳ／ＨＣｌ  ｐＨ８．１；４０ｍＭ  ＣａＣｌ2）中に溶解したＴＡＭＥ（Sigma-Aldtrich T4626）４４６ｍｇ／Ｌを含有し、２４７ｎｍでの吸収キネティックを分光光度計中で５分間の時間にわたり測定した。必要な場合には、活性化したトリプシン溶液を希釈緩衝液で希釈して、この方法の線形範囲（ΔＡ247／分＜０．３）にヒットさせた。１ｇ／Ｌのトリプシン濃度はΔＡ247／分＝０．１０１に相応する。
【０１６１】
このデータの評価は、PpcLC52, PpRPL33A及びPpcLC61の共過剰発現は、分泌された組み換えヒトトリプシノゲンの量に著しいポジティブな作用を有したことを示す（第１０表）。
【０１６２】
例３：抗ＨＩＶ抗体2F5のＦａｂフラグメントを発現するＰ．パストリス株中の新規ヘルパー因子PpcLC52の共過剰発現
ａ）モノクローナル抗ＨＩＶ抗体2F5のＦａｂフラグメントを分泌するＰ．パストリス株SMD 1168の構築
１つのベクター上に両方のFab鎖について発現カセットを組み合わせるプラスミドを、軽鎖ベクターをBgIII及びBamHIで二重消化し、引き続き、重鎖フラグメントの発現カセットの単一コピーを既に含むベクターpGAPZalfaAの特有のBamHI中に挿入することにより、生産した。次いでプラスミドを、P．パストリス中への電気トランスフォーメーション前にAvrllで線状化した。
【０１６３】
全ての構築された発現カセットを、GAP forw/AOX3' backw (Invitrogen)を用いたＤＮＡ配列決定により確認した。
【０１６４】
この生じるプラスミドを、Ndelでの制限消化後にＰ．パストリスSMD1168 (Invitrogen)をトランスフォーメーションするために使用した。トランスフォーマントを、ゼオシン耐性について選択し、モノクローナル抗ＨＩＶ１抗体２Ｆ５のFabフラグメントの高レベル発現についてスクリーニングした。
【０１６５】
ｂ）2F5 Fab及びヘルパー因子PpcLC52を共過剰発現するＰ．パストリス株の構築
例３  工程ａ）において得たＰ．パストリス株のトランスフォーメーションを、例２  工程ａ）のプラスミドpKanR-cLC52を用いて実施し、これはAsclで線状化されている。このプラスミドを、電気トランスフォーメーションにより細胞中に導入した。このトランスフォーメーションした細胞を、２０ｇ／Ｌグルコース及び５００ｍｇ／Ｌジェネティシンを含むＹＰ寒天上で培養した。コントロールとして、2F5 Fab発現株もまた、ヘルパー因子遺伝子なしにpPkanRプラスミドを用いてトランスフォーメーションした。
【０１６６】
ｃ）振盪フラスコ培養中のトランスフォーメーションしたＰ．パストリスの培養
１０ｇ／ｌのグリセロールを含む５ｍｌのＹＰ培地（１０ｇ／ｌの酵母抽出物、２０ｇ／ｌのペプトン）を、例３  工程ｂ）からのＰ．パストリストランスフォーマントの単一コロニーで接種し、一晩２８℃で成長させた。これら培養物のアリコート（終ＯＤ６００＝０．１に相応）を、２０ｇ／Ｌのグルコースを補った発現培養培地１０ｍｌ（１リットルにつき：１０ｇの酵母抽出物、１０ｇのペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．０、１３．４ｇの酵母窒素塩基、硫酸アンモニウムを有する、０．４ｍｇビオチン）に移し、１００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ中で強力な振盪で２８℃で４８ｈにわたりインキュベーションした。同じ量の基質を繰り返し３回１２時間毎に、細胞を２５００×ｇの５分間の室温での遠心分離により回収し、分析のために調製する前に添加した（１ｍｌの細胞懸濁物の細胞質量を測定することによるバイオマス決定、培養上清中のFab定量化のためのELISA）。
【０１６７】
ｄ）2F5Fabの定量化による共発現ヘルパー因子の作用の評価
分泌された組み換えにより発現した2F5 Fabの量を決定するために、９６ウェルマイクロタイタープレート（MaxiSorb, Nunc, デンマーク）を、抗ヒトＩｇＧ（Fab 特異的）で一晩ＲＴでコーティングし（Sigma-Aldrich I5260; 1 :1000、PBS中, pH 7.4）、これは工程ｄ）からの2F5 Fabを分泌するＰ．パストリス培養物の連続的に希釈された上清（PBS/Tween20 (0.1 %) + 2 % BSA中、１：５０の希釈で開始）が適用され、ＲＴで２ｈインキュベーションされる前であった。IgG (Rockland)のヒトFabフラグメントを、開始濃度２００ｎｇ／ｍｌで標準タンパク質として使用した。各インキュベーション工程後に、このプレートを３回、０．１％Tween 20含有ＰＢＳ（ｐＨ７．４に調節）を用いて洗浄した。二次抗体としての抗ヒトカッパ軽鎖−ＡＰコンジュゲート（Sigma-Aldrich A-3813  １：１０００、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ＋２％ＢＳＡ中）１００μｌを各ウェルに添加し、１ｈＲＴでインキュベーションした。洗浄後に、プレートをｐＮＰＰ、１ｍｇ／ｍｌのｐ−ニトロフェニルホスファートで検出緩衝液（０．１Ｎ  Ｎａ2ＣＯ3／ＮａＨＣＯ3  ｐＨ９．６）中で染色し、４０５ｎｍ（参照波長６２０ｎｍ）で読み取った。このデータを第１０表中にまとめる。
【０１６８】
例４：
ａ）組み換えブタトリプシノゲンを過剰発現するＰ．パストリス株の構築
組み換えブタトリプシノゲン（ｒｐＴＲＰ）の発現のためにコドン最適化した人工遺伝子を合成した（Geneart Germany）。ＤＮＡ合成の間にＰ．パストリスコザック配列（ＧＣＣは、開始コドンＡＴＧの直前である）、Ｓ．セレビシエ交配因子α分泌リーダー配列、及び、制限酵素Sbfl及びSfilのための部位、オープンリーディングフレームに隣接、を添加した。ｒｐＴＲＰ遺伝子のコード配列（コザック配列に隣接）を、配送されたプラスミドからSbfl及びSfilを用いて切断し、Sbfl, Sfil及びアルカリホスファターゼ処理したプラスミドpPuzzle_ZeoR_Pgap_eGFP_AOXTT (Gasser et.at 2008)中にクローニング導入し、これはｅＧＦＰ遺伝子のオープンリーディングフレームを置き換える。ライゲーションしたプラスミドを大腸菌TOP10 (Invitrogen)中にトランスフォーメーションし、ゼオシン含有ＬＢ寒天上にまいた。制限エンドヌクレアーゼ分析を、プラスミドpPZ_Pgap_rpTRP_AOXTTの正確な同一性を確認するために実施した。Asclでの線状化後に、このベクターをＰ．パストリス株X33 (Invitrogen)をトランスフォーメーションするために使用し、かつ、ゼオシン及びグルコース含有ＹＰ寒天上にまいた。
【０１６９】
ｂ）ｒｐＴＲＰ及び新規ヘルパー因子遺伝子PpcLC52を共過剰発現するＰ．パストリス株の構築
例２ａ）に説明したクローニング手順から得られたプラスミドpPKanR-cLC52を、例４ａ）に説明するとおりのＧＡＰプロモーターの制御下でｒｐＴＲＰの高レベル発現について予備選択したＰ．パストリス株をトランスフォーメーションするために使用した。選択は、rpTRP遺伝子についてのゼオシン耐性及びヘルパー因子遺伝子についてのジェネティシン耐性を基礎とした。rpTRP  トリプシノゲン発現株の発現に対する共過剰発現したヘルパー因子遺伝子の作用を評価するために、ヘルパー因子遺伝子無しにpPkanRプラスミドでもトランスフォーメーションした。
【０１７０】
ｃ）振盪フラスコ培養中のトランスフォーメーションしたＰ．パストリス株の培養
例３  工程ｂ）から得られたＰ．パストリス株の培養を、少しの改変を加えて例２  工程ｃ）に説明するとおりに実施した。湿潤細胞質量の測定の代わりに、１０ｍｌの細胞懸濁物の酵母乾燥材料を、バイオマスの生産量を決定するために指定した。
【０１７１】
ｄ）rhTRPの定量によるヘルパー因子の共過剰発現の作用の評価
組み換えブタトリプシノゲンの量の決定を、組み換えヒトトリプシノゲンについて例３工程ｄ）に説明されるとおりに実施した。このデータを第１０表中にまとめる。
【０１７２】
第１０表
【表１０】
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【０１７３】
例５：発酵培養物中のブタトリプシノゲン及びPpcLC52を共過剰発現するＰ．パストリス株の培養
Ｐ．パストリスのバッチ発酵
発酵をバイオリアクター中で実施し、これは、工業的生産のためのパイロットスケールであり、全容積５．０ｌ（Minifors, Infors, スイス）を有し、コンピューターベースのプロセス制御システムを備える。この培地は次のとおりである：
ビオチン（Sigma）及びＨ2ＳＯ4（Merck Eurolab）を除き、ＰＴＭ1トレース塩ストック溶液（PTM1 trace salts stock solution）のための全ての化学薬品はRiedel-de Haenからである。
【０１７４】
ＰＴＭ１トレース塩ストック溶液は１リットルあたり次のものを含有した。
【表１１】
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【０１７５】
バッチ培地は１リットルにつき次のものを含有した：２．０ｇ／Ｌ  クエン酸×Ｈ2Ｏ、１２．６ｇ（ＮＨ4）2ＨＰＯ4、０．０２２ｇ  ＣａＣｌ2×２Ｈ2Ｏ、０．９ｇ  ＫＣｌ、０．５ｇ  ＭｇＳＯ4×７Ｈ2Ｏ、４０ｇ  グリセロール、４．６ｍｌ  ＰＴＭ１トレース塩ストック溶液及び０．４ｍｇＤ−ビオチン。このｐＨを２５％ＨＣｌを用いて５．０に調節した。
【０１７６】
溶解した酸素濃度を、撹拌機速度を６００〜１２５０ｒｐｍに制御することにより、２０％超の飽和に維持した。エアレーション速度は１２０Ｌ*ｈ-1空気であった。この温度は２５℃であり、ｐＨをＮＨ3（２５％）を用いて制御した。発酵を開始する前に、このバッチ培地のｐＨを５．０に設定した。
【０１７７】
約２４〜３０ｈのバッチ相は、約２０ｇｌ-1の乾燥バイオマス濃度を導いた。フィード培地中でグルコース（組成はフィード戦略に依存する、工程ｂ）、工程ｃ）及び工程ｄ）参照のこと）は炭素供給源として働く。このｐＨはバッチの間に５．０であり、発酵を通じて５．０に維持した。
【０１７８】
試料を、グリセロールバッチ相の終わりに、フィード相の間及び／又は終了時に取り出した。細胞懸濁物１０ｍｌを遠心分離して、培養上清から細胞を分離し、次いで細胞ペレットを水で洗浄し、細胞乾燥質量（ＹＤＭ）を決定するために１０５℃で２４ｈ乾燥させた。この上清を−２０℃で凍結させ、トリプシノゲンアッセイまで維持する（ヒトトリプシノゲンについて工程ｃ）例３で説明のとおり）。
【０１７９】
ａ）株
組み換えブタトリプシノゲン及びPpcLC52を共過剰発現する、例４  工程ｂ）から得られた株、及び、「野生型」株を、ＹＰＧ（１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２０ｇ／Ｌペプトン、１０ｇ／Ｌグリセロール）に対して予備培養物を接種するために使用した。予備培養物を２８℃で２４ｈ振盪しつつインキュベーションした。複雑な培地成分を除去するために細胞を１５００×ｇで１０分にわたり遠心分離により回収し、バッチ培地中に再懸濁した。生じる細胞懸濁物を、６００ｎｍでの開始光学密度１．０で初期バッチ相を接種するために使用した。
【０１８０】
ｂ）rpTRP及びPpcLC52を共過剰発現するＰ．パストリス株のケモスタット発酵
初期バッチ相（バッチ培地容積１．７５リットル）の後に、発酵をケモスタットモードにおいて特定の成長速度μ＝０．１及びバイオマス濃度（酵母乾燥質量）２５ｇ／Ｌで運転させた。フィード培地流れ（１．０ｇ／Ｌ  クエン酸×Ｈ2Ｏ；４．４ｇ／Ｌ  （ＮＨ4）2ＨＰＯ4、０．０１ｇ／Ｌ  ＣａＣｌ2×２Ｈ2Ｏ、１．７ｇ／Ｌ  ＫＣｌ、０．７ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ4×７Ｈ2Ｏ、５５ｇ／Ｌ  グルコース×Ｈ2Ｏ、１．６ｍＬ  ＰＴＭ１トレース塩ストック溶液及び０．４ｍｇ／Ｌ  Ｄ−ビオチン；ｐＨを２５％ＨＣｌを用いて５．０に調節）及び細胞懸濁回収物流れを１７５ｇ／ｈに設定した。空気の流れを一定に１２０Ｌ／ｈに維持した。試料をバッチ相の終わりに、かつ５回の容積変更の後に取り出した（５０ｈ供給）。
【０１８１】
単一の炭素供給源としてのグルコース及び特異的成長速度０．１ｈ-1を有する定常状態条件で、PpcLC52共過剰発現株の生成物濃度及び特異的生産性は、コントロール株に比較して１．４倍より高かった。
【０１８２】
ｃ）線形供給（linear feeding）と一緒でのrpTRP及びPpcLC52を共過剰発現するＰ．パストリス株の流加培養発酵
初期バッチ相（バッチ培地容積１．６リットル）後に、この発酵を線形供給プロファイルでもって流加培養モードにおいて運転させた。フィード培地流れ（０．２８ｇ／Ｌ  ＣａＣｌ2×２Ｈ2Ｏ、８．４ｇ／Ｌ  ＫＣｌ  ５．２ｇ  ＭｇＳＯ4×７Ｈ2Ｏ、４６４ｇ／Ｌグルコール×Ｈ2Ｏ、１０．０ｍＬ  ＰＴＭ１トレース塩ストック溶液及び０．４ｍｇ／Ｌ  Ｄ−ビオチン）を１７．５ｇ／ｈに設定した。空気の流れを一定に１２０Ｌ／ｈに維持した。試料をバッチ相後、供給期間の間２４時間毎及び供給の終了時に取り出した（１００ｈ）。
【０１８３】
PpcLC52を共過剰発現する株（rpTRP_cLC52）及び非共過剰発現株（rpTRP_wt）の比較は、バイオマスの等しい（線形）の蓄積を示した。rpTRP_cLC52株の平均特異的生産性は１．３倍より高く、そして、rpTRP_cLC52で蓄積した全生成物量は１．２倍より高く、これはrpTRP_コントロールに比較してである。
【０１８４】
ｃ）一定の特異的成長速度μ＝０．１ｈ-1を有するブタトリプシノゲン及びPpcLC52を共過剰発現するＰ．パストリス株の流加培養発酵
初期バッチ相（バッチ培地容積１．４リットル）後に、この発酵を指数関数供給プロファイルでもって流加培養モードにおいて運転させた。フィード培地流れ（０．２８ｇ／Ｌ  ＣａＣｌ2×２Ｈ2Ｏ、８．４ｇ／Ｌ  ＫＣｌ、５．２ｇ  ＭｇＳＯ4×７Ｈ2Ｏ、４６４ｇ／Ｌ  グルコース×Ｈ2Ｏ、１０．０ｍＬ  ＰＴＭ１トレース塩ストック溶液及び０．４ｍｇ／Ｌ  Ｄ−ビオチン）を、ＰＩＤコントローラーにより、μ＝０．１ｈ-1の一定の特異的成長速度に維持するために調節した。この溶解した酸素濃度を、撹拌機速度を６００〜１２５０ｒｐｍにかつ空気流れ１２０〜５００Ｌ*ｈ-1に制御することにより２０％飽和に維持した。リアクターの酸素輸送速度の制限のために、このプロセスは１６ｈの供給後の酸素制限において運転した。試料をバッチ相後、供給期間の間に６回及び供給の終了時に取り出した（約２５ｈ）。
【０１８５】
PpcLC52を共過剰発現する株（rpTRP_cLC52）及び非共過剰発現株（rpTRP_wt）の比較は、バイオマスの等しい蓄積を示した。PpcLC52を共過剰発現する株の全生成物量（細胞フリー培養容積*生成物濃度）は、コントロール株に比較して流加培養相の終了時に１．２倍より高かった。rpTRP_cLC52株の特異的生産性は２．２倍より高かった。
【０１８６】
例６：ワイルドカード株の構築：
例２  工程ａ）に説明されるクローニング手順から得られるプラスミドpPKanR-RPL, pPKanR-cLC52及びpPKanR-cLC61を、ＰＯＩを発現しないＰ．パストリスの株をトランスフォーメーションするために使用した。選択は、ヘルパー因子遺伝子についてのジェネティシン耐性を基礎とする。これらトランスフォーメーションした株はさらに、ＰＯＩｓについて改善された生産株として使用されることができる。
【０１８７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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