(57)【要約】  本発明は、グラム陰性菌、好ましくは腸球菌、大腸菌群、および大腸菌による感染症の予防的または治療的処置のための医薬品として使用するためラクトバチルス・ペントーサスの選択株に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号ＤＳＭ２１９８０で、ドイツ微生物細胞培養コレクションＧｍｂＨ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ；ＤＳＭＺ）に２００８年１１月１４日に寄託された、ラクトバチルス・ペントーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｅｎｔｏｓｕｓ）ＬＰＳ０１。
【請求項２】
医薬品として使用するための、受託番号ＤＳＭ２１９８０でＤＳＭＺに２００８年１１月１４日に寄託された、ラクトバチルス・ペントーサスＬＰＳ０１。
【請求項３】
グラム陰性菌、好ましくは腸球菌、大腸菌群、大腸菌による感染症の予防的または治療的処置のための、受託番号ＤＳＭ２１９８０でＤＳＭＺに２００８年１１月１４日に寄託された、ラクトバチルス・ペントーサスＬＰＳ０１。
【請求項４】
グラム陰性菌、好ましくは腸球菌、大腸菌群、大腸菌による再発性感染症の予防的または治療的処置のための、請求項３に記載のラクトバチルス・ペントーサスＬＰＳ０１。
【請求項５】
胃腸炎もしくは胃腸結腸炎の予防的または治療的処置のための、受託番号ＤＳＭ２１９８０でＤＳＭＺに２００８年１１月１４日に寄託された、ラクトバチルス・ペントーサスＬＰＳ０１。
【請求項６】
その後の脱水を伴う下痢性排泄、悪心、下痢、発熱および身体虚弱を伴う腹部痙攣の予防的または治療的処置のための、請求項５に記載のラクトバチルス・ペントーサスＬＰＳ０１。
【請求項７】
グラム陰性菌、好ましくは腸球菌、大腸菌群、大腸菌の存在と闘う、これを減少させる、もしくは阻害するための食事性組成物または医薬組成物を調製するための、請求項１に記載の株を含む組成物。
【請求項８】
グラム陰性菌、好ましくは腸球菌、大腸菌群、大腸菌による感染症の予防的または治療的処置のための医薬品として使用するための、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
グラム陰性菌、好ましくは腸球菌、大腸菌群、大腸菌による再発性感染症の予防的または治療的処置のための医薬品として使用するための、請求項７または８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
胃腸炎もしくは胃腸結腸炎の予防的または治療的処置のための、請求項７から９の少なくとも一項に記載の組成物。
【請求項１１】
その後の脱水を伴う下痢性排泄、悪心、下痢、発熱および身体虚弱を伴う腹部痙攣の予防的または治療的処置のための、請求項７から１０の少なくとも一項に記載の組成物。
【請求項１２】
乳製品を調製するための種培養に添加される技術的添加物として使用するための、請求項７に記載の食事性組成物。
【請求項１３】
ラクトバチルス・ペントーサスＤＳＭ番号２１９８０（ＬＰＳ０１）株と組み合わせて、ラクトバチルス・ラムノサスＤＳＭ番号２１９８１（ＬＲ０６）株および／またはラクトバチルス・ペントーサスＤＳＭ番号２１９８０（ＬＰＳ０１）株を含む、請求項７から１１の少なくとも一項に記載の組成物。
【請求項１４】
グラム陰性菌、好ましくは腸球菌、大腸菌群、大腸菌の存在と闘う、これを減少させる、または阻害するための医薬品を調製するための、請求項１に記載の株の使用。
【請求項１５】
グラム陰性菌、好ましくは腸球菌、大腸菌群、大腸菌による感染症を処置するための、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
乳製品を調製するための種培養に添加される技術的添加物を調製するための、請求項１に記載の株の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グラム陰性菌、好ましくは腸球菌、大腸菌群（Ｃｏｌｉｆｏｒｍｓ）、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）による感染症の予防的または治療的処置のための医薬品として使用するためのラクトバチルス・ペントーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｅｎｔｏｓｕｓ）の選択株に関する。
【０００２】
特に、本発明は、グラム陰性菌、好ましくは腸球菌、大腸菌群、および大腸菌の存在と闘う、これを減少させる、もしくは阻害するための食品または医薬組成物を調製するための、ラクトバチルス・ペントーサスの前記株を含む組成物に関する。
【０００３】
さらに、本発明は、特にグラム陰性菌、好ましくは腸球菌、大腸菌群、および大腸菌による感染症を処置するための、グラム陰性菌、好ましくは腸球菌、大腸菌群、および大腸菌の存在と闘う、これを減少させる、または阻害するための医薬品を調製するための、ラクトバチルス・ペントーサスの前記選択株の使用に関する。
【０００４】
最後に、本発明は、乳製品を調製するための種培養（ｓｔａｒｔｅｒ  ｃｕｌｔｕｒｅ）に添加するための技術的添加物を調製するための、ラクトバチルス・ペントーサスの前記選択株の使用に関する。
【背景技術】
【０００５】
大腸菌は、例えば、細菌性膀胱炎、胃腸炎、および胃腸結腸炎（ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｓ）などの多数の細菌感染症、時に重度の細菌感染症の原因でもある広範なグラム陰性菌の例であることが知られている。一般に、グラム陰性菌による感染症は、例えば、抗生物質などの薬物を使用して処置する。
【０００６】
しかしながら、一部のグラム陰性菌は時間と共に通常使用する薬物に対するある程度の耐性を獲得し、これにより薬物の使用および得られる結果が時に限定される。
【０００７】
さらに、一般的医療行為では、細菌感染症は、可能な限り有効な薬理療法に頼ることにより直ちに処置される。このアプローチは、通常、どの細菌が関与しており、その細菌が弱いのはどの抗生物質なのかを明らかにする微生物学的試験を待たずして採用される。
【０００８】
このように、感染症の原因であると考えられる細菌の科に最も有効であると考えられる既知の抗生物質を投与して、経験的に進める。
【０００９】
しかしながら、上記アプローチは、このような療法が問題の解決および結果としての回復をもたらすどうか前もって知ることなしに、相当量の薬物、例えば抗生物質を投与することを意味する。その上、周知のように、体にとってプラスの有用な細菌叢にも影響する抗生物質の投与に関連した、可能性のある副作用は見過ごすべきではない。
【００１０】
そのため、抗生物質を時に無差別に使用することから生じる欠点を克服するために、伝統的な薬物の代替としてまたはこれと組み合わせて使用することができる、グラム陰性菌による感染症の予防的または治療的処置のための療法を有することが望ましい。
【００１１】
微生物は、例えば、バクテリオシンの産生により調節されるものなどの一連の防御システムを活性化することができることが知られている。
【００１２】
「バクテリオシン」という用語は、グラム陽性菌およびグラム陰性菌の両方により産生され、産生株とは異なるがこれと密接に関連する細菌株に対する阻害作用を賦与するタンパク質性化合物を示すのに使用される。
【００１３】
バクテリオシンは、乳酸菌により産生されるタンパク質であり、著しい抗微生物活性を示し、それにより、バクテリオシンは、中でも臨床および技術／食品部門で大きな関心を呼び起こしてきた。
【００１４】
臨床部門での適用に関する限り、バクテリオシンは抗生物質の有効な代替に相当する。
【００１５】
食品部門では、バクテリオシンを、中毒、および例えば、乳製品中の食品基質の腐敗の原因である望ましくない細菌集団を制御し、抑制する生物的保存剤（ｂｉｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ）として使用することができる。
【００１６】
そのため、食品部門および医薬部門でのバクテリオシンの使用は、長期間いかなる交替もなく完全な安定性を維持し、その固有の感覚特性を維持する「高品質」製品として定義されるものの製造に使用するための、技術的に正しく有効な手段であり得る。
【００１７】
最終的に、抗菌性物質としてのバクテリオシンの有効な適用は、食事性プロバイオティクスとしてのバクテリオシン産生細菌培養液の使用を伴うであろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
したがって、グラム陰性菌、好ましくは腸球菌、大腸菌群、および大腸菌の存在と殺菌作用を通して闘う、および／または静菌作用を通してこれを減少させるもしくは阻害することができる乳酸菌株を同定し選択する必要性が依然として存在する。
【００１９】
特に、広いスペクトルのグラム陰性菌、好ましくは腸球菌、大腸菌群、および大腸菌と闘う、これを減少させる、または阻害することができ、それにより伝統的な抗生物質の全体的または部分的置換として、食品または医薬品部門で有効に使用することができる乳酸菌株を同定および選択する必要性が依然として存在する。
【００２０】
さらに、混合物中に含まれるまたは腸内の腸内細菌叢中に既に存在する他の細菌に対する阻害作用が、各々の選択株中に存在しないために、混合物中で共に使用することができる乳酸菌株を同定および選択する必要性が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
出願人は、上記必要性に適切に対応することができるラクトバチルス・ペントーサスの株を同定および選択した。
【００２２】
この理由のために、本発明の主題は、グラム陰性菌、好ましくは腸球菌、大腸菌群、および大腸菌による感染症の予防的または治療的処置のための医薬品として使用するための、ＤＳＭ番号２１９８０であり、ドイツのＤＳＭＺ研究所に寄託されたラクトバチルス・ペントーサスの株である。
【００２３】
本発明のさらなる主題は、グラム陰性菌、好ましくは腸球菌、大腸菌群、および大腸菌の存在と闘う、これを減少させる、もしくは阻害するための食品または医薬組成物を調製するための、前記ラクトバチルス・ペントーサスＤＳＭ番号２１９８０を含む組成物である。
【００２４】
本発明のさらなる主題は、特にグラム陰性菌、好ましくは腸球菌、大腸菌群、および大腸菌による感染症を処置するための、グラム陰性菌、好ましくは腸球菌、大腸菌群、および大腸菌の存在と闘う、これを減少させる、または阻害するための医薬品を調製するための、前記ラクトバチルス・ペントーサスＤＳＭ番号２１９８０株の使用である。
【００２５】
本発明のさらなる主題は、乳製品を調製するための種培養に添加するための技術的添加物を調製するための、前記ラクトバチルス・ペントーサスＤＳＭ番号２１９８０株の使用である。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ラクトバチルス・ペントーサスＬＰＳ０１、ＤＳＭ２１９８０株による大腸菌ＡＴＣＣ８７３９の増殖阻害試験を示す図である。
【図２】ラクトバチルス・ペントーサスＬＰＳ０１、ＤＳＭ２１９８０株による大腸菌ＡＴＣＣ１０５３６の増殖阻害試験を示す図である。
【図３】ラクトバチルス・ペントーサスＬＰＳ０１、ＤＳＭ２１９８０株による大腸菌ＡＴＣＣ３５２１８の増殖阻害試験を示す図である。
【図４】ラクトバチルス・ペントーサスＬＰＳ０１、ＤＳＭ２１９８０株による大腸菌ＡＴＣＣ２５９２２の増殖阻害試験を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明の他の好ましい実施形態は、以下の詳細な説明から明らかとなるだろう。
【００２８】
表１は、一連の細菌株の大腸菌に対する阻害活性を試験した実験的試験を示す。表１では以下のように示される：（−）ハロー（ｈａｌｏ）無し（阻害無し）；（＋）１〜２ｍｍのハロー→（＊）スポット内に大腸菌の多数のコロニー；（＋＋）３〜５ｍｍのハロー→（＊＊）スポット内に大腸菌の少数のコロニー；（＋＋＋）５ｍｍを超えるハロー→（＊＊＊）大腸菌のコロニー無し（最大阻害）。
表２は、阻害試験を示す。
表３は、胃耐性試験を示す。
【００２９】
出願人は、当業者に既知のラクトバチルス単離技術を使用して、自然のサイロに入れて貯蔵したトウモロコシからラクトバチルス・ペントーサスの株を同定および選択した。
【００３０】
この株は、以下の書類番号：ラクトバチルス・ペントーサスＤＳＭ番号２１９８０（ＬＰＳ０１）で、Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃａｌ  Ｓ．ｐ．Ａ．、Ｎｏｖａｒａ−イタリアにより、２００８年１１月１４日にドイツのＤＳＭＺに寄託された。ＤＳＭ２１９８０株は、ブダペスト条約に従って寄託された。
【００３１】
好ましい実施形態では、ラクトバチルス・ペントーサスＤＳＭ番号２１９８０（ＬＰＳ０１）は、グラム陰性菌、好ましくは腸球菌、大腸菌群、および大腸菌による再発している（再発性）感染症の予防的または治療的処置のために必要とされる。
【００３２】
別の好ましい実施形態では、ラクトバチルス・ペントーサスＤＳＭ番号２１９８０（ＬＰＳ０１）は、胃腸炎もしくは胃腸結腸炎の予防的または治療的処置のため、好ましくは下痢性排泄（ｄｉａｒｒｈｅｉｃ  ｄｉｓｃｈａｒｇｅ）および結果としての脱水、悪心、下痢、発熱および身体虚弱を伴う腹部痙攣の予防的または治療的処置のために必要とされる。
【００３３】
選択および単離した株は、糖発酵プロファイル（ＡＰＩ  ５０  ＣＨＬ  ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）に基づいて特徴づけおよび分類した。種は、種特異的ＰＣＲ増幅により確認した（Ｔｏｒｒｉａｎｉ  Ｓ．、Ｆｅｌｉｓ  Ｇ．Ｅ．、Ｄｅｌｌａｇｌｉｏ  Ｆ．、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌ．ｐｅｎｔｏｓｕｓ、ａｎｄ  Ｌ．ｐａｒａｐｌａｎｔａｒｕｍ  ｂｙ  ｒｅｃＡ  Ｇｅｎｅ  Ｓｅｑｕｅｎｚｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  Ａｓｓａｙ  ｗｉｔｈ  ｒｅｃＡ  Ｇｅｎｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｐｒｉｍｅｒｓ．Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００１年８月；３４５０〜３４５４）。
【００３４】
株は、ＰＦＧＥ（パルスフィールドゲル電気泳動）技術を使用して生物型に分けた（Ｔｙｎｋｋｅｎ  Ｓ．、Ｓａｔｏｋａｒｉ  Ｒ．、Ｓａａｒｅｌａ  Ｍ．、Ｍａｔｔｉｌａ−Ｓａｎｄｈｏｌｍ  Ｔ．、Ｓａｘｅｌｉｎ  Ｍ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  Ｒｉｂｏｔｙｐｉｎｇ、Ｒａｎｄｏｍｌｙ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、ａｎｄ  Ｐｕｌｓｅｄ−Ｆｉｅｌｄ  Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｔｙｐｉｎｇ  ｏｆ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  ａｎｄ  Ｌ．ｃａｓｅｉ  ｓｔｒａｉｎｓ．Ａｐｐｌ  Ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｍ  Ｍｉｃｒｏｂ．１９９９年９月；３９０８〜３９１４）。
【実施例】
【００３５】
出願人は、以下の大腸菌：ＡＴＣＣ３５２１８、ＡＴＣＣ１０５３６、ＡＴＣＣ８７３９、およびＡＴＣＣ２５９２２に直接接触して置いた上記ラクトバチルス・ペントーサスＤＳＭ番号２１９８０の抗大腸菌活性を試験した。
【００３６】
しかしながら、比較の結果を得るために、下記のように、プロバイオティクス乳酸菌の他の株も試験した。
【００３７】
１）ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＡＴＣＣ５３６０８、２種の市販の製品、すなわちＲｅｕｔｅｒｉｎ（Ｎｏｏｓ）およびＲｅｕｆｌｏｒ（Ｉｔａｌｃｈｉｍｉｃｉ）の単独の微生物成分として存在する。
【００３８】
１で言及した製品を、２種の製剤中に存在するＡＴＣＣ５３６０８株がグラム陰性菌に対して活性のバクテリオシン（ロイテリンと呼ばれる）を産生する能力が知られているため、標準陽性試料として分析に供した。
【００３９】
明らかに、２種の製品の製剤中に存在する添加剤のいかなる種類の直接作用も避けるために、最初に微生物ＡＴＣＣ５３６０８を単離し、次いで培養ブロス中で培養し、その後分析に供した。
【００４０】
２）ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＤＳＭ番号２１９８１（ＬＲ０６）、別の対象株として。
【００４１】
３）ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＣＮＣＭ  Ｉ−７８９（ＬＦ５）、膣カンジダに対して活性であり、このために、広い作用スペクトルを有する、バクテリオシンの産生における良い候補と考えられている。
【００４２】
４）ラクトバチルス・ラムノサスＧＧ、ＡＴＣＣ５３１０３、有効な腸の生着菌（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｃｏｌｏｎｉｓｅｒ）として世界で最もよく知られ、最も研究されたプロバイオティクスの１つである。
【００４３】
５）ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＭＧ  Ｐ−２１０２０、ＬＭＧ  Ｐ−２１０２１、ＬＭＧ  Ｐ−２１０２２、およびＬＭＧ  Ｐ−２１０２３。４種の上記株ＬＭＧ  Ｐ−２１０２０、ＬＭＧ  Ｐ−２１０２１、ＬＭＧ  Ｐ−２１０２２、およびＬＭＧ  Ｐ−２１０２３は、抗菌作用を有するバクテリオシン（プランタリシンと呼ばれる）を産生する能力を有する。本発明の株とラクトバチルス・プランタルムＬＭＧ  Ｐ−２１０２０、ＬＭＧ  Ｐ−２１０２１、ＬＭＧ  Ｐ−２１０２２、およびＬＭＧ  Ｐ−２１０２３の４株との間の比較は、操作条件が等しい状態で産生されたバクテリオシンの量を示すのに役立つ。
【００４４】
６）ラクトバチルス・カゼイ亜種パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ  ｓｕｂ．ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＬＰＣ０８、ＤＳＭ２１７１８、陰性標準試料として使用する。
【００４５】
７）ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＳＭ番号２１７１７（ＬＡ０２）、陰性標準試料として使用する。
【００４６】
８）ラクトバチルス・ラクチス亜種クレモリス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）ＤＳＭ番号１９０７２（ＮＳ０１）、広い作用スペクトルを有する（例えば、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）およびクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）に対して有効）バクテリオシンであるとして知られている、ナイシンの産生株として使用する。
【００４７】
９）ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＳＭ番号１８６１６（ＦＰ４）、陰性標準試料として使用する。
【００４８】
標的株は、凍結乾燥形態で、少なくとも１×１０８ＣＦＵ／ｇの量を有する、大腸菌：ＡＴＣＣ３５２１８、ＡＴＣＣ１０５３６、ＡＴＣＣ８７３９、およびＡＴＣＣ２５９２２により表す。
【００４９】
大腸菌の各々の株を、生理溶液（ＮａＣｌ  ０．８％）１ｍｌで元に戻し、寒天化ＬａｐｔＧ培地１２〜１５ｍｌを含むペトリ皿当たり１００μｌの割合で使用した。ＬａｐｔＧ培養ブロス１リットルは、Ｂａｃｔｏ  Ｐｅｐｔｏｎ１５ｇ、Ｂａｃｔｏ  Ｔｒｙｐｔｏｎｅ１０ｇ、グルコース１０ｇ、酵母エキス１０ｇ、Ｔｗｅｅｎ８０  １ｇ、１０００ｍｌの蒸留水を含み、ｐＨ６．５〜６．６である。固相の（寒天化した）培地については、Ｂａｃｔｏ  Ａｇａｒ１５ｇを添加する。
【００５０】
両培地（ブロスおよび寒天）を、１２１℃／１５分で滅菌する（Ｆｏｎｔ  Ｄｅ  Ｖａｌｄｅｚ，Ｇ，およびｃｏｌｌ．：Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｍｅｄｉｕｍ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｊｕｒｅｄ  ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｄ  ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｂａｃｔｅｒｉａ  Ｍｉｌｃｈｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔ  ４０（９）５１８〜５２０（１９８５））。ペトリ皿に、熱い寒天化ＬａｐｔＧ培地を調製し、層流フード下で凝固させた。その後、標的株１００μｌを、滅菌スパチュラ（ｓｐａｔｕｌａ）を使用してＬａｐｔＧ培地の表面上に均等に分配した。インキュベートする前に、このように調製したペトリ皿を層流フード（ｌａｍｉｎａｒ  ｆｌｏｗ  ｈｏｏｄ）下で乾燥させた。阻害分析の結果を表１に示す。
【００５１】
ラクトバチルスは液体ＭＲＳ培地（ブロス）およびＬａｐｔＧブロス中で培養し、一方、ラクトコッカスは液体Ｍ１７培地（ブロス）およびＬａｐｔＧブロス中で培養した。
【００５２】
培地の成分および組成は当業者に知られている。
【００５３】
全ての細菌は、母培養（ｍｏｔｈｅｒ  ｃｕｌｔｕｒｅ）から始めて、１％の割合で播種し、恒温槽中３７℃で１６〜１８時間インキュベートした。
【００５４】
インキュベーションの最後で、ブロス培地の最終ｐＨ値を測定した（表１中の列参照）。
【００５５】
前記酸性度が、大腸菌増殖の阻害の原因である唯一のパラメータではないことを立証することが望ましいので、個々の細菌により産生される乳酸の量を決定することが重要である。
【００５６】
インキュベーションの最後で、各々のブロス培地の一定分量を５０００ｒｐｍ／５分で遠心分離して、枯渇したブロス培地（ｅｘｈａｕｓｔｅｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｂｒｏｔｈ）および細胞のペレットを得た。枯渇したブロス培地も、孔径０．２２μｍのシリンジフィルターを使用して濾過し、試験に供した。その後、細胞ペレットを滅菌水で一度洗浄して、培地の残留物を除去した。次いで、洗浄した細胞ペレットを生理溶液に再懸濁して、ＭｃＦａｒｌａｎｄスケールに基づく０．５の濁度となるようにした。この値は、全試験細菌について等しい細胞の初期量から開始することを可能にする。
【００５７】
阻害分析の前に、ＬａｐｔＧ寒天培地上に標的株を準備したペトリ皿の底に、試験に供するそれぞれのスポットの位置をつける。
【００５８】
各々の細菌ブロス培地１０μｌを、標的株を播種した皿の表面上にスポットする。
【００５９】
以下も分析に供する：
ａ）洗浄した細菌懸濁液。表１のデータ（洗浄した細胞の列参照）は、バクテリオシンの産生が試験細菌の複製代謝中に起こることを示している。これは、本発明に関するＤＳＭ２１９８０株が、大腸菌の増殖を阻害する、これと闘う、および／または減少させることができることを示している。そのため、いったん元に戻し、基礎代謝を行う条件にある凍結乾燥ＤＳＭ２１９８０株は、大腸菌の増殖を阻害する、これと闘う、および／または減少させることができる。
ｂ）種々の細菌から得られる枯渇したブロス培地。表１のデータ（濾過したブロスの列参照）は、どれだけ多くのバクテリオシンがブロス培地中に存在するかを示す。これは、バクテリオシンが外因性で、活性であり、大腸菌を阻害するのに十分な量存在することを示す。
ｃ）ブロス培地の最終ｐＨに近いｐＨ（３．９〜４．５）に達するまで乳酸を添加することにより酸性化したブロス培地ＭＲＳ、Ｍ１７、およびＬａｐｔＧ。表１のデータ（下４行参照）は、大腸菌の阻害作用は、主としてバクテリオシンの産生のためであり、培地のｐＨのためではないことを示している。
ｄ）滅菌水
【００６０】
このように調製した皿をサーモスタット中で３７℃／２４時間インキュベートする。
【００６１】
インキュベーションの最後で、バクテリオシンが存在する領域を除いて、皿全体中に標的株の均一な増殖があるだろう。データを表１に示す。
【００６２】
表１に示す結果の確認として、ラクトバチルス・ペントーサスＬＰＳ０１、ＤＳＭ２１９８０株による大腸菌の増殖阻害の試験に関して実際の例を以下に示す。
【００６３】
以下に示す４つの画像（図１〜４）において、以下のことに気づくだろう：
−  寒天化ＬａｐｔＧ培地を含むペトリ皿は、その表面上にばらまかれた標的大腸菌株の一部を含んでいた。
−  記号および黒線は、種々の種類の試験試料に関係するセクター（ｓｅｃｔｏｒ）の範囲を定める。
−  「スポット」は、各々の試験試料１０μｌからなる。完全なブロス培地からなる試料の場合、スポットは、皿の残りの部分と比較してより不透明に見え、細菌の増殖が起こったことを示していることが指摘されよう。
−  阻害ハロー、バクテリオシンの作用のために標的株が増殖しなかった、各々の皿のセクター１−２−３−４−５に存在する暗い部分は、バクテリオシンの量に正比例する。
【００６４】
種々のセクターを以下に説明する：
セクター１：ラクトバチルス・ペントーサスＬＰＳ０１、ＤＳＭ２１９８０株の完全ブロス培地（細胞プラスＬａｐｔＧ培地）による阻害の効果。
セクター２：ラクトバチルス・ペントーサスＬＰＳ０１、ＤＳＭ２１９８０株自体を増殖させた後のこの株の濾過ブロスによる阻害の効果。
バクテリオシンは細胞により分泌されるので、産生されるバクテリオシンが外因性であることを濃いハローの存在から推論することができる。産生されるバクテリオシンは、培養ブロス中で活性のままである。
セクター３：ラクトバチルス・ラムノサスＤＳＭ番号２１９８１（ＬＲ０６）株の完全ブロス培地（細胞プラスＬａｐｔＧ培地）による阻害の効果。
セクター４：ラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ５３６０８株の完全ブロス培地（細胞プラスＬａｐｔＧ培地）による阻害の効果。
セクター５：標的に及ぼす作用が、培地（培養ブロス）の酸性度によってのみ決定される可能性を除外するために、０．１Ｎソーダを添加してｐＨを６．８に中和した後の、ラクトバチルス・ペントーサスＤＳＭ２１９８０（ＬＰＳ０１）株が増殖した濾過ＬａｐｔＧブロスによる阻害の効果。
セクター６：ＬａｐｔＧ培養ブロスそれ自体としての阻害の効果。この場合、培養ブロスは阻害作用を有する成分を有さないので、ハローの形成は観察されない。
【００６５】
４つの画像は、そのたびに同じ操作条件下であるが異なる大腸菌を使用して行った試験に関する：大腸菌ＡＴＣＣ８７３９（図１）、ＡＴＣＣ１０５３６（図２）、ＡＴＣＣ３５２１８（図３）、およびＡＴＣＣ２５９２２（図４）。
【００６６】
上記試験に基づいて、ラクトバチルス・ペントーサスＤＳＭ番号２１９８０（ＬＰＳ０１）株は、大量のより有効なバクテリオシンを産生する能力により、全ての大腸菌株ＡＴＣＣ８７３９、ＡＴＣＣ１０５３６、ＡＴＣＣ３５２１８、およびＡＴＣＣ２５９２２に対して優れた阻害能力を示したと推論することができる。
【００６７】
上に報告された結果に基づいて、ラクトバチルス・ペントーサスＤＳＭ番号２１９８０（ＬＰＳ０１）株は、全４種の試験大腸菌株の増殖と闘い、これを阻害し、および減少させることができるので、幅広いスペクトルの作用を有すると推論することができる。
【００６８】
さらに、表１および図１〜４に示す結果に基づいて、ラクトバチルス・ペントーサスＤＳＭ番号２１９８０（ＬＰＳ０１）株は、グラム陰性菌、好ましくは腸球菌、大腸菌群、および大腸菌の存在と殺菌作用を通して闘う、および／または静菌作用を通してこれを減少させるもしくは阻害することができると推論することができる。
【００６９】
さらに、出願人は、個々に取得した他のプロバイオティクス株、すなわち、ラクトバチルス・ラムノサスＤＳＭ番号２１９８１（ＬＲ０６）株およびラクトバチルス・プランタルム番号ＬＭＧ  Ｐ−２１０２１（ＬＰ０１）株に対して、本発明に関するラクトバチルス・ペントーサスＤＳＭ番号２１９８０（ＬＰＳ０１）株を試験した。この試験は、ラクトバチルス・ペントーサスＤＳＭ番号２１９８０（ＬＰＳ０１）株によるバクテリオシンの産生が、バクテリオシンの存在のためにその増殖中に他の細菌ラクトバチルス・ラムノサスＤＳＭ番号２１９８１（ＬＲ０６）およびラクトバチルス・プランタルム番号ＬＭＧ  Ｐ−２１０２１（ＬＰ０１）を何らかの方法で阻害するかどうかを確かめる目的を有していた。
【００７０】
したがって、ラクトバチルス・ラムノサスＤＳＭ番号２１９８１（ＬＲ０６）株およびラクトバチルス・プランタルム番号ＬＭＧ  Ｐ−２１０２１（ＬＰ０１）株を、上記分析と全く同じように、病原大腸菌と交配（ｃｒｏｓｓｅｄ）させる試験を行った。
【００７１】
使用株ラクトバチルス・ペントーサスＤＳＭ番号２１９８０（ＬＰＳ０１）；ラクトバチルス・ラムノサスＤＳＭ番号２１９８１（ＬＲ０６）およびラクトバチルス・プランタルム番号ＬＭＧ  Ｐ−２１０２１（ＬＰ０１）に関するデータを表２に示す。
【００７２】
表２中、ハローが存在しない（阻害無し）ことが（−）で示されている。表２から分かるように、他の交配プロバイオティクス細菌に対する阻害能力を示した細菌はなかった。
【００７３】
ラクトバチルス・ペントーサスＤＳＭ番号２１９８０（ＬＰＳ０１）株は、他のプロバイオティクス細菌株または有益な細菌叢に干渉しない。
【００７４】
本発明の好ましい実施形態は、グラム陰性菌、好ましくは腸球菌、大腸菌群、および大腸菌による感染症の予防的または治療的処置のための医薬品として使用するためのラクトバチルス・ペントーサスＤＳＭ番号２１９８０（ＬＰＳ０１）株を含む組成物に関する。
【００７５】
本発明の別の好ましい実施形態は、グラム陰性菌、好ましくは腸球菌、大腸菌群、および大腸菌による再発している感染症（再発性感染症）の予防的または治療的処置のための医薬品として使用するための組成物に関する。
【００７６】
好ましくは、前記組成物は、胃腸炎もしくは胃腸結腸炎の予防的または治療的処置のために必要とされる。さらに好ましくは、前記組成物は、下痢性排泄および結果としての脱水、悪心、下痢、発熱および身体虚弱を伴う腹部痙攣の予防的または治療的処置のために必要とされる。
【００７７】
上記組成物において、ラクトバチルス・ペントーサスＤＳＭ番号２１９８０（ＬＰＳ０１）株は、生きていても死んでいてもよく、あるいは、その細胞性成分が存在していてもよい。
【００７８】
好ましい実施形態では、生菌または死菌の形のラクトバチルス・ペントーサスＤＳＭ番号２１９８０（ＬＰＳ０１）株、あるいはその細胞性成分を使用して、乳業における技術的添加物として、有効な用途を有する食事性組成物を調製することができる。前記食事性組成物は、乳製品を調製するための種培養に添加される。
【００７９】
好ましい実施形態では、上記組成物はまた、ラクトバチルス・ペントーサスＤＳＭ番号２１９８０（ＬＰＳ０１）株と共に、ラクトバチルス・ラムノサスＤＳＭ番号２１９８１（ＬＲ０６）株および／またはラクトバチルス・ペントーサスＤＳＭ番号２１９８０（ＬＰＳ０１）株を含んでもよい。
【００８０】
組成物は、組成物の総重量に対して１×１０６〜１×１０１１ＣＦＵ／ｇ、好ましくは１×１０８〜１×１０１０ＣＦＵ／ｇの量の、生菌もしくは死菌としてのラクトバチルス・ペントーサスＤＳＭ番号２１９８０（ＬＰＳ０１）株、またはその細胞性成分を含む。
【００８１】
好ましい実施形態では、上記組成物は、１×１０６〜１×１０１１ＣＦＵ／用量、好ましくは１×１０８〜１×１０１０ＣＦＵ／用量の量の、生菌もしくは死菌としての株、またはその細胞性成分含む。用量は、例えば、１ｇ、３ｇ、５ｇ、および１０ｇであってよい。
【００８２】
組成物はまた、食事および医薬品の観点から許容される添加物および共製剤化剤（ｃｏ−ｆｏｒｍｕｌａｎｔ）を含むことができる。
【００８３】
組成物は、ビタミン、例えば、葉酸、ビタミンＢ１２、リボフラビン、ピリドキサールリン酸、ビタミンＥ、およびアスコルビン酸；抗酸化剤、例えば、ポリフェノール、フラバノイド、プロアントシアニジン、およびカテキン；アミノ酸、例えば、グルタミンおよびメチオニン；鉱物、例えば、セレン、銅、マグネシウム、および亜鉛；好ましくは乾燥抽出物の形の植物起源の活性物質、例えば、クランベリー、エキナセア、グレープフルーツ種子抽出物、トクサ、クマコケモモ、ローズマリー、およびプロポリスを含むことができる。
【００８４】
好ましい実施形態では、組成物はまた、少なくとも１種の、組成物の総重量に対して１〜３０重量％、好ましくは５〜２０重量％の量の、プレバイオティクス特性（ｐｒｅｂｉｏｔｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）を有する物質を含む。
【００８５】
前記プレバイオティクス物質は、フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）、キシロオリゴ糖（ＸＯＳ）、ガラクトオリゴ糖、イヌリン、アラビノガラクタン、およびグルコオリゴ糖を含む。
【００８６】
好ましい実施形態では、ラクトバチルス・ペントーサスＤＳＭ番号２１９８０（ＬＰＳ０１）株は、抗大腸菌バクテリオシンの刺激を介して大規模にバクテリオシンを産生するよう誘導される。上記大規模産生から得られたバクテリオシンを抽出して、本発明のバクテリオシンとして得る。グラム陰性菌、好ましくは腸球菌、大腸菌群、および大腸菌の存在と（殺菌作用によって）闘う、および／または（静菌作用によって）これを減少させるもしくは阻害するために、後者を、上記組成物中で使用することができる。
【００８７】
さらに、ラクトバチルス・ペントーサスＤＳＭ番号２１９８０（ＬＰＳ０１）株が、腸壁でコロニー形成するのに十分な多数腸に到達する能力を評価するために、胃耐性試験を設定した。この試験は、当技術分野で既知であり、添付のリストの参考文献（参考文献１〜５）で言及される方法に従って行った。ヒト由来のプランタルム科に属する株であり、腸でコロニー形成することができるので、ラクトバチルス・プランタルムＤＳＭ９８４３株を陽性標準とみなして、試験を設定した。さらに、よく研究されており、よく特徴づけられているプロバイオティクスラクトバチルスであるので、ラクトバチルス・ラムノサスＡＴＣＣ５３１０３（ＬＧＧ）株を試験した。データを表３に示す。
【００８８】
表３は、３７℃で異なる接触時間（５分、３０分、および６０分）後の、２つの異なる種類の人工胃液および人工膵臓分泌液に対するプロバイオティクス株の生存率を示す。
【００８９】
胆汁酸塩もしくはヒト胆汁を添加したまたはしていない培地中で増殖するコロニーの数を比較することにより、胆汁分泌に対する生存率の結果が得られた。
【００９０】
表３に提供されるデータに基づいて、ラクトバチルス・ペントーサスＤＳＭ番号２１９８０（ＬＰＳ０１）株は、標準株ラクトバチルス・プランタルムＤＳＭ番号９８４３の生存率に完全に匹敵した、胃十二指腸通過時（ｇａｓｔｒｏｄｕｏｄｅｎａｌ  ｔｒａｎｓｉｔ）の優れた生存率を示すと推論することができる。そのため、ラクトバチルス・ペントーサスＤＳＭ番号２１９８０（ＬＰＳ０１）株は、胃腸障壁を通過し、腸管でコロニー形成することができる。
【００９１】
表１、図１〜４、表２、および表３に提供されるデータは、グラム陰性菌による感染症の予防的または治療的処置における、伝統的な抗生物質の全体的または部分的置換としての、食品または医薬品部門におけるラクトバチルス・ペントーサスＤＳＭ番号２１９８０（ＬＰＳ０１）株の使用をサポートする。
【００９２】
（参考文献）
1. Human gastric juice -Met. Int. 006 (DAS)
Reference: Del Piano M., Morelli L., Strozzi GP., Allesina S., Barba M., Deidda F., Lorenzini P., Ballare M., Montino F., Orsello M., Sartori M., Garello E., Carmagnola S., Pagliarulo M., Capurso S.: Probiotics: from research to consumer.Dig Liver Dis. 2006 Dec;38 Suppl 2:S248-55. Review.
2. Artificial gastric juice - Met. Int. 022 (DAS)
Reference: Charteris WP. et al. Development and application of an in vitro methodology to determine the transit tolerance of potentially probiotic Lactobacillus and Bifidobacterium species in the upper human gastrointestinal tract. J Appl Microbiol. 1998 May;84 (5):759-68.
3. Simulated pancreatic juice - Met. Int. 023 (DAS)
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4. Human bile - Met. Int. 024 (DAS)
Reference: Del Plano M., Morelli L., Strozzi GP., Allesina S., Barba M., Deidda F., Lorenzini P., Ballare M., Montino F., Orsello M., Sartori M., Garello E., Carmagnola S., Pagliarulo M., S. Capurso: Probiotics: from research to consumer.Dig Liver Dis. 2006 Dec;38 Suppl 2:S248-55. Review.
5. Bile Salts - Met. Int. 024 (DAS)
Reference: Charteris WP. et al. Development and application of an in vitro methodology to determine the transit tolerance of potentially probiotic Lactobacillus and Bifidobacterium species in the upper human gastrointestinal tract. J Appl Microbiol. 1998 May;84 (5):759-68.
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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