(57)【要約】  本発明は、前立腺癌のワクチン予防又は治療に使用され得る、ヒト腫瘍関連抗原（TAA）前立腺発現新規遺伝子（NGEP）由来のヒト細胞溶解性Tリンパ球（CTL）エピトープを含むペプチド、並びに該ペプチドをコードする核酸、該核酸を含むベクター、該ペプチド、核酸、又はベクターを含む細胞、及びそれらの組成物を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
20以下のアミノ酸残基を有し、且つGLFDEYLEMV（配列番号：1）を含む、単離されたペプチド。
【請求項２】
ペプチドが配列番号：1からなる、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
20以下のアミノ酸残基を有し、且つLVWEEDLKL（配列番号：2）、WLLPAAVVGT（配列番号：3）、GLGGPPLPTL（配列番号：4）、IVFEHVVFSV（配列番号：5）、又はFLDNIRAAGL（配列番号：6）を含む、単離されたペプチド。
【請求項４】
ペプチドが、配列番号：2、配列番号：3、配列番号：4、配列番号：5、又は配列番号：6からなる、請求項３に記載のペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチドをコードする、単離された核酸。
【請求項６】
請求項５に記載の核酸を含むベクター。
【請求項７】
ベクターが、プラスミド、酵母、ポックスウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、アルファウイルス、バキュロウイルス、及びシンドビスウイルスからなる群より選択される、請求項６に記載のベクター。
【請求項８】
ベクターが、オルソポックス、ワクシニア、トリポックス、鶏痘、カプリポックス、及びスイポックスからなる群より選択されるポックスウイルスである、請求項７に記載のベクター。
【請求項９】
（i）請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチド、（ii）請求項５に記載の核酸、又は（iii）請求項６〜８のいずれか１項に記載のベクターを含む、単離された細胞。
【請求項１０】
宿主細胞がヒトである、請求項９に記載の細胞。
【請求項１１】
宿主細胞が抗原提示細胞又は腫瘍細胞である、請求項９又は１０に記載の細胞。
【請求項１２】
（a）（i）請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチド、（ii）請求項５に記載の核酸、（iii）請求項６〜８のいずれか１項に記載のベクター、又は（iv）請求項９〜１１のいずれか１項に記載の細胞、及び
（b）医薬的に許容され得る担体
を含む、組成物。
【請求項１３】
免疫賦活性／制御性分子をさらに含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
免疫賦活性／制御性分子が、インターロイキン（IL）-2、IL-6、IL-12、インターフェロン（IFN）-γ、腫瘍壊死因子（TNF）-α、B7.1、B7.2、ICAM-1、LFA-3、CD70、RANTES、G-CSF、OX-40L、41 BBL、抗CTLA-4、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
免疫賦活性／制御性分子が、（i）IL-12をコードし、キトサンと複合体化されたプラスミド及び（ii）キトサンと混合された組換えIL-12からなる群より選択される、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
化学療法剤、抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌剤、シクロホスファミド、又はそれらの組み合わせをさらに含む、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
アジュバントをさらに含む、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
アジュバントが、ミョウバン、アルミニウム塩、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、アルミニウムシリカ、リン酸カルシウム、不完全フロイントアジュバント、QS21、及びRIBI DETOXTMからなる群より選択される、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
アジュバントが、顆粒球単球コロニー刺激因子（GM-CSF）である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２０】
リポソームをさらに含む、請求項１２〜１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
治療上有効な量の、請求項１２〜２０のいずれか１項に記載の組成物を宿主に投与することを含む、宿主における前立腺癌に対する免疫反応を増強する方法であって、宿主における免疫反応が増強される、方法。
【請求項２２】
（a）宿主からリンパ球を得ること、
（b）請求項１２〜２０のいずれか１項に記載の組成物でリンパ球を刺激して細胞傷害性Tリンパ球を生成すること；及び
（c）細胞傷害性Tリンパ球に宿主を接触させること、
を含む、宿主における前立腺癌を阻害する方法であって、前立腺癌が阻害される、方法。
【請求項２３】
前立腺癌の細胞が前立腺発現新規遺伝子（NGEP）を発現する、請求項２１又は２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表
本明細書と同時に提出されたヌクレオチド／アミノ酸配列表は、本明細書においてその全体が参照により組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
前立腺癌は、合衆国の男性において最もありふれた癌の一つで、2008年には186,320の新規症例が見積もられており、男性の間の癌死亡の主な原因の一つで、2008年には約28,660の死亡が見積もられている（例えば、Jemal et al., CA Cancer J. Clin., 58: 71-96 (2008)を参照のこと）。近年のアンドロゲン除去療法及び化学療法の進歩にもかかわらず、転移性前立腺癌の根治治療は現在のところ存在しない。現在の治療では、アンドロゲン除去後に残るアンドロゲン非依存性前立腺癌細胞を完全に除去することはできない（例えば、Karnes et al., Curr. Pharm. Des., 12: 807-817 (2006)を参照のこと）。
【０００３】
前立腺癌治療の一つのアプローチは、単独での、又は標準的な根治的放射線療法又は化学療法と組み合わせた特異的免疫療法である（例えば、Arlen et al., Clin. Cancer Res., 12: 1260-1269 (2006)；及びGulley et al., Clin. Cancer Res., 11: 3353-3362 (2005)を参照のこと）。ここ数年において、いくつかの異なる前立腺癌ワクチンを用いた免疫療法が、様々な患者集団において臨床上有効である有望な証拠を示している（例えば、Schlom et al., Curr. Oncol., 14: 238-245 (2007)；及びHarada et al., Int. J. Clin. Oncol., 8: 193-199 (2003)を参照のこと）。正常な前立腺及び前立腺癌細胞の両方に発現する組織特異的な抗原が、前立腺癌特異的免疫療法の標的とされ得る。前立腺癌関連抗原は同定されている（例えば、Arlen et al., Expert Rev. Vaccines, 2: 483-493 (2003)；Ghosh et al., J. Cell Biochem., 91: 528-539 (2004)；Iavarone et al., Mol. Cancer Ther., 1: 329-335 (2002)；Jalkut et al., Curr .Opin. Urol., 12: 401-406 (2002)；Kiessling et al., Int. J. Cancer, 102: 390-397 (2002)；Likja et al., Nat. Rev. Cancer, 8: 268-278 (2008)；Peshwa et al., Prostate, 36: 129-138 (1998)；Slovin et al., Expert Opin. Ther. Targets, 9: 561-570 (2005)；Taira et al., Oncology (Williston Park), 21: 1003-1010 (2007)；及びYokokawa et al., Int. J. Cancer, 121: 595-605 (2007)を参照のこと）。しかしながら、これらの抗原のいくつかはある種の正常な組織にも発現している（例えば、Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 749-753 (1996)；及びReiter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 1735-1740 (1998)を参照のこと）。
【０００４】
従って、前立腺癌の治療のための新たなアプローチが望まれている。
【発明の概要】
【０００５】
発明の簡単な要約
本発明は、GLFDEYLEMV（配列番号：1）、LVWEEDLKL（配列番号：2）、WLLPAAVVGT（配列番号：3）、GLGGPPLPTL（配列番号：4）、IVFEHVVFSV（配列番号：5）、又はFLDNIRAAGL（配列番号：6）を含む、20以下のアミノ酸を有するペプチドを提供する。別の態様において、本発明は、該ペプチドをコードする核酸、該核酸を含むベクター、該ペプチド、核酸、又はベクターを含む細胞、及びそれらの組成物を提供する。
【０００６】
本発明はまた、治療上有効な量のペプチド、核酸、ベクター、又は細胞を含有する組成物を宿主に投与することを含む、宿主における前立腺癌に対する免疫反応を増強する方法であって、宿主における免疫反応が増強される方法も提供する。
【０００７】
本発明はさらに、（a）ペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物でリンパ球を刺激して細胞傷害性Tリンパ球を生成すること、及び（b）細胞傷害性Tリンパ球を宿主に投与することを含む、宿主における前立腺癌を阻害する方法であって、前立腺癌が阻害される方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ】図1Aは、種々のペプチドについてのHLA-A2/NGEP複合体の安定性を示すグラフである。ブレフェルジンA処理後の時間（時間）はx軸上にあり、複合体残存割合はy軸上にある。結果は、時間0での100%と比較したときの結合の相対的な割合で表されている。
【図１Ｂ】図1Bは、P703及びP215ペプチドの、種々のペプチド濃度でのHLA-A2分子への結合を示すグラフである。ペプチド濃度（μg/mL）はx軸上にあり、平均蛍光強度（MFI）はy軸上にある。陽性コントロールペプチドはMUC-1であり、陰性コントロールペプチドはCAP-7である。
【図１Ｃ】図1Cは、NGEP特異的T細胞株によるインターフェロン（IFN）−γ産生を示すグラフである。結果は、pg/mLで表されている。標準偏差はバーで示されている。
【図１Ｄ】図1Dは、NGEP特異的T細胞株、T-A-P703及びT-A-P215による、種々のペプチド濃度でのリンホタクチン産生を示すグラフである。ペプチド濃度（μg/mL）はx軸上にあり、リンホタクチン産生（pg/mL）はy軸上にある。標準偏差はバーで示されている。
【図２Ａ】図2Aは、IVS-3でのPE標識NGEP-P703/HLA-A*0201テトラマー及び抗CD8抗体でのT細胞染色による（1x106細胞/20μL）、T-A-P703細胞株（ペプチドP703を用いて作製された）におけるNGEP特異的CD8+T細胞の頻度を示すグラフである。表示されている割合は、CD8+ T細胞集団におけるテトラマー陽性NGEP特異的T細胞の割合である。
【図２Ｂ】図2Bは、IVS-3でのPE標識NGEP-P703/HLA-A*0201テトラマー及び抗CD8抗体でのT細胞染色による（1x106細胞/20μL）、T-B-P703細胞株（ペプチドP703を用いて作製された更なる細胞株）におけるNGEP特異的CD8+ T細胞の頻度を示すグラフである。表示されている割合は、CD8+T細胞集団におけるテトラマー陽性NGEP特異的T細胞の割合である。
【図２Ｃ】図2Cは、NGEP又はコントロールペプチド（CAP-7）でパルスされたC1RA-2に対するT-A-P703及びT-B-P703細胞株の細胞傷害活性を示すグラフである。エフェクター：ターゲット（E：T）比はx軸上に示されており、特異的溶解の割合はy軸上に示されている。標準偏差はバーで示されている。
【図２Ｄ】図2Dは、NGEP遺伝子（MCF7-pNGEP-L）でトランスフェクトされたMCF-7細胞に対するT-A-P703及びT-B-P703細胞株の細胞傷害活性を示すグラフである。トランスフェクトされていないMCF-7細胞株をコントロールとして用いた。E：T比はx軸上に示されており、特異的溶解の割合はy軸上に示されている。標準偏差はバーで示されている。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の詳細な説明
本発明は、ヒト腫瘍関連抗原（TAA）前立腺発現新規遺伝子（New Gene Expressed in Prostate：NGEP）由来のヒト細胞溶解性Tリンパ球（CTL）エピトープを含むペプチドを提供し、該ペプチドは、前立腺癌のワクチン予防又は治療に使用され得る。
【００１０】
TMEM16Gとしても公知であるNGEP遺伝子は、2番染色体の2q37.3に位置する。NGEP mRNAの2つのスプライシング型が存在する。小さい方の転写産物（NGEP-S）は179アミノ酸の細胞質タンパク質をコードし、大きい方の転写産物（NGEP-L）は、TMEM16タンパク質ファミリーのメンバーである933アミノ酸の多所性の膜タンパク質をコードする（例えば、Bera et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101: 3059-3064 (2004)を参照のこと）。NGEP-Lは、前立腺組織試料（正常、良性前立腺過形成、及び前立腺癌）に存在するが、他の腫瘍又は重要な正常組織には存在しない（例えば、上記Bera et al.、Das et al., Cancer Res, 67: 1594-1601 (2007)；及びDas et al., Cancer Res., 68: 6306-6312 (2008)を参照のこと）。
【００１１】
本発明のペプチドは、20以下（例えば、19以下、18以下、17以下、16以下、15以下、14以下、13以下、12以下、11以下、又は10以下）のアミノ酸残基を有し、GLFDEYLEMV（配列番号：1）のアミノ酸配列を含む。あるいは、本発明のペプチドは、20以下（例えば、19以下、18以下、17以下、16以下、15以下、14以下、13以下、12以下、11以下、又は10以下）のアミノ酸残基を有し、LVWEEDLKL（配列番号：2）、WLLPAAVVGT（配列番号：3）、GLGGPPLPTL（配列番号：4）、IVFEHVVFSV（配列番号：5）、又はFLDNIRAAGL（配列番号：6）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１２】
一つの実施態様において、本発明のペプチドは、配列番号：1のアミノ酸配列からなる。別の実施態様において、本発明のペプチドは、配列番号：2、配列番号：3、配列番号：4、配列番号：5、又は配列番号：6からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる。
【００１３】
本発明のペプチドは、NGEP（NGEP-S又はNGEP-L）タンパク質の20以下の連続するアミノ酸を含むNGEP（NGEP-S又はNGEP-L）タンパク質フラグメントであり得、該ペプチドは、配列番号：1、配列番号：2、配列番号：3、配列番号：4、配列番号：5、又は配列番号：6のアミノ酸配列を含む。NGEPタンパク質の更なるアミノ酸残基は、配列番号：1、配列番号：2、配列番号：3、配列番号：4、配列番号：5、又は配列番号：6のアミノ酸配列のいずれかの末端又は両方の末端に位置し得る。
【００１４】
本発明のペプチドは、配列番号：1、配列番号：2、配列番号：3、配列番号：4、配列番号：5、又は配列番号：6のアミノ酸配列のC末端に11以下（例えば、10以下、9以下、8以下、7以下、6以下、5以下、4以下、3以下、2以下、1以下、又は0）のアミノ酸残基、及び／又は配列番号：1、配列番号：2、配列番号：3、配列番号：4、配列番号：5、又は配列番号：6のアミノ酸配列のN末端に11以下（例えば、10以下、9以下、8以下、7以下、6以下、5以下、4以下、3以下、2以下、1以下、又は0）のアミノ酸残基を含み得、本発明のペプチドは、合計で20以下のアミノ酸残基を有する。
【００１５】
ペプチドは、ペプチドの合成、又は適切なアミノ酸配列をコードする核酸の細胞内発現及び該細胞からのペプチドの回収等の任意の方法により調製することができる。このような方法の組み合わせもまた使用可能である。ペプチドのde novo合成方法及びペプチドの組換えによる作製方法は、当該技術分野において公知である（例えば、Chan et al., Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, Oxford University Press, Oxford, United Kingdom, 2005；Peptide and Protein Drug Analysis, ed. Reid, R., Marcel Dekker, Inc., 2000；Epitope Mapping, ed. Westwoood et al., Oxford University Press, Oxford, United Kingdom, 2000；Sambrook et al., Molecular Cloning:  A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY 2001；及びAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, NY, 1994を参照のこと）。
【００１６】
本発明はまた、ペプチドをコードする核酸も提供する。核酸はDNA又はRNAを含み得、1本鎖又は2本鎖であり得る。さらに、核酸は、ヌクレオチドのアナログ又は誘導体を含み得る（例えば、イノシン又はホスホロチオエート（phophorothioate）ヌクレオチド等）。核酸は、ペプチドを単独で、或いは融合タンパク質の一部としてコードし得る。ペプチドをコードする核酸は、該核酸と、該核酸を細胞に送達可能な、及び／又は該核酸を細胞内で発現可能なエレメントとを含むコンストラクトの一部として提供され得る。そのようなエレメントとしては、例えば、発現ベクター、プロモーター、並びに転写及び／又は翻訳配列が挙げられる。適切な発現ベクター、プロモーター、転写／翻訳配列、及び他のエレメント、並びにそのような核酸及びコンストラクトの調製方法は、当該技術分野において公知である（例えば、上記Sambrook et al.；及び上記Ausubel et al.を参照のこと）。
【００１７】
本発明はさらに、核酸を含むベクターも提供する。適切なベクターの例としては、プラスミド（例えば、DNAプラスミド）、酵母（例えば、サッカロマイセス）、及びウイルスベクター（ポックスウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、アルファウイルス、バキュロウイルス、及びシンドビスウイルス等）が挙げられる。ベクターがプラスミド（例えば、DNAプラスミド）である場合、プラスミドはキトサンと複合体化され得る。好ましくは、ベクターは、オルソポックス、トリポックス、鶏痘、アライグマポックス、ウサギポックス、カプリポックス（例えば、ヒツジポックス）、レポリポックス、及びスイポックス（例えば、豚痘）からなる群より選択されるポックスウイルスである。トリポックスウイルスの好ましい例としては、鶏痘、鳩痘、及びカナリア痘（ALVAC等）が挙げられる。オルソポックスウイルスの好ましい例としては、ワクシニア、改変ワクシニアアンカラ（MVA）、ワイス、NYVAC、TROYVAC、Dry-Vax、POXVAC-TC（Schering-Plough Corporation）、及びこれらの誘導体が挙げられる。例えば、ワイス株の誘導体としては、限定されないが、機能的なK1L遺伝子を欠失した誘導体が挙げられる。
【００１８】
ベクターが宿主（例えば、ヒト）への投与用である場合は、該ベクター（例えば、ポックスウイルス）は、標的細胞において低複製効率であることが好ましい（例えば、細胞当り約1以下の子孫、又はより好ましくは細胞当り約0.1以下の子孫が生成される）。複製効率は、標的細胞の感染後のウイルス力価を測定することにより実験的に容易に求めることができる。
【００１９】
ペプチドをコードする核酸に加え、ベクターはまた、一以上の免疫賦活性／制御性分子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、サイトカイン、又は免疫反応を増強し得る他の分子（例えば、更なる腫瘍関連抗原（前立腺特異的抗原（PSA）等））をコードする遺伝子（複数可）も含み得る。ペプチドをコードする核酸、並びに任意の他の外因性遺伝子（複数可）は、結果として得られる組換えウイルスのウイルス生存率に影響を及ぼさないベクター（例えば、ポックスウイルス）内の部位又は領域（挿入領域）の中に挿入されることが好ましい。そのような領域は、組換えウイルスのウイルス生存率に重大な影響を及ぼすことなく組換え体形成が可能な領域について、ウイルスDNAのセグメントを試験することにより容易に同定することができる。
【００２０】
チミジンキナーゼ（TK）遺伝子は、容易に使用できる挿入領域であり、多くのウイルスに存在している。特に、TK遺伝子は、全ての試験済みのポックスウイルスゲノム内に見出されている。更なる適切な挿入部位は、国際特許出願公報WO2005/048957に記載されている。例えば、鶏痘において、挿入領域としては、限定されないが、BamHI Jフラグメント、EcoRI-HindIIIフラグメント、BamHIフラグメント、EcoRV-HindIIIフラグメント、長鎖特異配列（long unique sequence：LUS）挿入部位（例えば、FPV006/FPV007及びFPV254/FPV255）、FP14挿入部位（FPV060/FPV061）及び43K挿入部位（FPV107/FPV108）が挙げられる。ワクシニアにおいて、挿入部位としては、限定されないが、44/45、49/50、及び124/125が挙げられる。
【００２１】
ベクターが、ペプチド及び／又は他の外因性遺伝子（複数可）をコードする核酸（例えば、一以上の免疫賦活性／制御性分子をコードする）を含む組換え鶏痘ウイルスである場合、ペプチドをコードする核酸は一の領域（例えば、FP14領域）に挿入され得、外因性遺伝子（複数可）は別の領域（例えば、BamHI J領域）に挿入され得る。
【００２２】
本発明のベクターは、適切なプロモーター及び制御性エレメント（転写制御性エレメント又はエンハンサー等）を含み得る。ベクターがポックスウイルスベクターである場合、ポックスウイルスプロモーターが使用され得る（限定されないが、ワクシニア7.5Kプロモーター、ワクシニア30Kプロモーター、ワクシニア40Kプロモーター、ワクシニアI3プロモーター、合成初期／後期（sE/L）プロモーター、7.5プロモーター、HHプロモーター、11Kプロモーター、及びPiプロモーターを含む）。プロモーターは、典型的には構成的プロモーターであり得るが、誘導性プロモーターも本発明のベクターに使用され得る。そのような誘導性の系は、遺伝子発現の制御を可能にする。
【００２３】
ペプチド、ペプチドをコードする核酸、又はベクターを含む細胞も本明細書において提供される。適切な細胞としては、原核及び真核細胞、例えば、哺乳動物細胞、酵母、真菌、及び細菌（E. coli等）が挙げられる。細胞は、研究若しくはペプチド産生に有用であるようにin vitroであり得、又はin vivoであり得る。細胞は、ペプチドでパルスされた抗原提示細胞であり得る。適切な抗原提示細胞としては、限定されないが、樹状細胞、Bリンパ球、単球、マクロファージ等が挙げられる。
【００２４】
ペプチド、核酸、ベクター、又は細胞は単離され得る。本明細書で用いられる用語「単離された」は、生物学的環境（例えば、細胞、組織、培養培地、体液等）から取り出された、或いは任意の程度まで他の方法で純度が増加された（例えば、合成培地から単離された）、化合物又は組成物を包含する。単離された化合物及び組成物は、従って、合成的であり得、又は天然に生成され得る。
【００２５】
ペプチド、核酸、ベクター、又は細胞は、該ペプチド、核酸、ベクター、又は細胞と担体（例えば、医薬的に、又は生理学的に許容され得る担体）とを含む組成物（例えば、医薬組成物）として製剤化され得る。さらに、本発明のペプチド、核酸、ベクター、細胞、又は組成物は、単独で、又は医薬製剤の一部として、本明細書に記載された方法に使用され得る。
【００２６】
組成物（例えば、医薬組成物）は、一よりも多い本発明のペプチド、核酸、ベクター、又は細胞又は組成物を含み得る。或いは、又はさらに、組成物は、一以上の他の医薬的に活性な剤又は薬剤を含み得る。医薬組成物での使用に適切であり得るそのような他の医薬的に活性な剤又は薬剤の例としては、抗癌剤（例えば、化学療法剤）、抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌剤、シクロホスファミド、及びこれらの組み合わせが挙げられる。適切な抗癌剤としては、限定されないが、アルキル化剤、ナイトロジェンマスタード、葉酸拮抗剤、プリン拮抗剤、ピリミジン拮抗剤、紡錘体毒、トポイソメラーゼ阻害剤、アポトーシス誘発剤、血管新生阻害剤、ポドフィロトキシン、ニトロソウレア、シスプラチン、カルボプラチン、インターフェロン、アスパラギナーゼ（asparginase）、タモキシフェン、ロイプロリド、フルタミド、メゲストロール、マイトマイシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、イリノテカン、タキソール、ゲルダナマイシン（例えば、17-AAG）、並びに当該技術分野において公知の種々の抗癌ペプチド及び抗体が挙げられる。
【００２７】
担体は、慣習的に使用される任意のものであり得、生理化学的な考慮事項（溶解性、及び活性化合物（複数可）との反応性の欠如等）及び投与経路によってのみ限定される。本明細書に記載の医薬的に許容され得る担体（例えば、ベヒクル、アジュバント、賦形剤、及び希釈剤）は当業者に周知であり、公に容易に入手可能である。医薬的に許容され得る担体は、活性剤（複数可）に対し化学的に不活性であるものであり、使用条件下で有害な副作用も毒性も有さないものであることが好ましい。
【００２８】
担体の選択は、本発明の特定のペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物、及び使用される他の活性剤若しくは薬剤によって、並びにペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物を投与するために使用される特定の方法によってある程度決定される。
【００２９】
組成物は、さらに、又は代わりに、一以上の免疫賦活性／制御性分子を含み得る。任意の適切な免疫賦活性／制御性分子が使用され得る（インターロイキン（IL）-2、IL-6、IL-12、インターフェロン（IFN）-γ、腫瘍壊死因子（TNF）-α、B7.1、B7.2、ICAM-1、LFA-3、CD70、RANTES、G-CSF、OX-40L、41 BBL、抗CTLA-4、及びこれらの組み合わせ等）。好ましくは、組成物はB7.1、ICAM-1、及びLFA-3（TRICOMとも称される）の組み合わせを含む。一以上の免疫賦活性／制御性分子は、一以上の免疫賦活性／制御性分子をコードする核酸を含むベクター（例えば、組換えウイルスベクター（ポックスウイルスベクター等））の形態で投与され得る。例えば、一以上の免疫賦活性／制御性分子（例えば、IL-12）は、キトサンを伴う、又は伴わないDNAプラスミドの形態で投与され得る。或いは、一以上の免疫賦活性／制御性分子は、タンパク質（例えば、組換えタンパク質）（キトサンと混合されたタンパク質（例えば、組換えIL-12）等）として投与され得る。
【００３０】
本発明の一つの実施態様において、組成物は、本発明のペプチドをコードする核酸を含む第一の組換えポックスウイルスベクターと、B7.1、ICAM-1、及びLFA-3をコードする核酸を含む第二のポックスウイルスベクターとを含む。別の実施態様において、本発明のペプチドをコードする核酸、並びにB7.1、ICAM-1、及びLFA-3をコードする核酸は、同一の組換えポックスウイルスベクター内にある。
【００３１】
本発明は、治療上有効な量の、ペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物を宿主に投与することを含む、宿主におけるNGEP発現癌（例えば、前立腺癌）に対する免疫反応を増強する方法であって、宿主における免疫反応が増強される方法を提供する。本発明のペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物は、NGEP発現癌（例えば、前立腺癌）の発達を、特にそのような癌の発達のリスクが他の者よりも高い個体において予防するために、或いはNGEP発現癌（例えば、前立腺癌）に罹患している患者を治療するために使用され得る。本発明のペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物は、任意のステージのNGEP発現癌（例えば、ステージI〜IVの前立腺癌）を有する患者を治療するために使用され得る。
【００３２】
ペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物は、任意の方法により宿主に投与され得る。例えば、ペプチド、又はペプチドをコードする核酸（例えば、ベクターとして）は、任意の種々の技術（本明細書に記載されているように、核酸の送達及び発現を可能にするコンストラクトの一部としての、ペプチド、核酸、又は核酸を含む組成物に細胞を接触させる等）により、細胞（例えば、宿主内の）の中に導入され得る。細胞内に核酸を導入及び発現する具体的なプロトコールは、当該技術分野において公知である（例えば、上記Sambrook et al. (eds.)；及び上記Ausubel et al.を参照のこと）。
【００３３】
ペプチド、核酸、ベクター、細胞、及び組成物を宿主に投与する適切な方法は、当該技術分野において公知である。宿主は、任意の適切な宿主（例えば、哺乳動物（例えば、げっ歯類（マウス、ラット、ハムスター、又はモルモット等）、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマ、霊長類、又はヒト）であり得る。
【００３４】
例えば、ペプチド、核酸、又はベクター（例えば、組換えポックスウイルス）は、腫瘍細胞をex vivoでペプチド、核酸、又はベクターに曝露することにより、或いはペプチド、核酸、又はベクターを宿主内に注射することにより宿主に投与され得る。ペプチド、核酸、ベクター（例えば、組換えポックスウイルス）若しくはベクターの組み合わせ、細胞、及び組成物は、癌病変若しくは腫瘍への直接的な注射により、又は局所適用（例えば、医薬的に許容され得る担体と共に）により直接的に投与（例えば、局所投与）され得る。
【００３５】
ペプチド、核酸、ベクター、細胞、若しくはそれらの組成物は、単独で、又はアジュバントと組み合わせて、リポソームの中に組み込んで（例えば、米国特許第5,643,599号、第5,464,630号、第5,059,421号、及び第4,885,172号に記載されている）、サイトカイン、生体応答調節剤（例えば、インターフェロン、インターロイキン-2（IL-2）、及びコロニー刺激因子（CSF、GM-CSF、及びG-CSF））、若しくは免疫反応を増強することが公知である他の試薬と共に、投与され得る。
【００３６】
適切なアジュバントの例としては、ミョウバン、アルミニウム塩、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、アルミニウムシリカ、リン酸カルシウム、不完全フロイントアジュバント、QS21、及びRIBI DETOXTMが挙げられる。
【００３７】
本発明で用いらるのに特に好ましいアジュバントはGM-CSFである。GM-CSFは、樹状細胞による抗原のプロセシング及び提示を増強するので、有効なワクチンアジュバントであることが示されている。実験的及び臨床的研究は、組換えGM-CSFが種々の免疫原に向けられた宿主免疫をブーストし得ることを示唆している。
【００３８】
GM-CSFは、ウイルスベクター（例えば、ポックスウイルスベクター）を用いて、又は医薬製剤中の単離されたタンパク質として投与され得る。GM-CSFは、ペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物の最初の投与の前、その間、又はその後に宿主に投与されて、宿主における抗原特異的な免疫反応を増強することができる。例えば、組換えGM-CSFタンパク質は、ペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物によるワクチン接種のそれぞれの日に、及びその後に続く3日間のそれぞれで（即ち、合計で4日間）宿主に投与され得る。GM-CSFの任意の適切な用量が使用され得る。例えば、1日当り50〜500μg（例えば、100μg、200μg、300μg、400μg、及びそれらの範囲）の組換えGM-CSFが投与され得る。GM-CSFは、任意の適切な方法（例えば、皮下）により投与され得、好ましくは、ペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物による宿主のワクチン接種部位、又はその近くに投与される。
【００３９】
一つの実施態様において、本発明のペプチドは、ペプチドの免疫原性を増強するために、ヘルパーペプチド又は大型担体分子にコンジュゲートされ得る。これらの分子としては、限定されないが、インフルエンザペプチド、破傷風トキソイド、破傷風トキソイドCD4エピトープ、緑膿菌外毒素A、ポリ-L-リジン、リピッドテール（lipid tail）、小胞体（ER）シグナル配列等が挙げられる。
【００４０】
本発明のペプチドはまた、当該技術分野で容認された方法を用いて免疫グロブリン分子にコンジュゲートされ得る。免疫グロブリン分子は、腫瘍細胞上には存在するが正常細胞上には不存在又は非常に少量である表面レセプターに特異的であり得る。免疫グロブリンはまた、特定の組織（例えば、前立腺組織）にも特異的であり得る。このようなペプチド−免疫グロブリンコンジュゲートは、特定の組織及び／又は細胞へのペプチドの標的化を可能とする。
【００４１】
ペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物は、NGEP特異的な免疫反応、好ましくは細胞性免疫反応の発生に有効な量が宿主（例えば、哺乳動物（ヒト等））に投与される。ペプチド、核酸、ベクター、又は細胞の免疫原としての有効性は、当該技術分野において公知であるin vivo又はin vitroのパラメーターにより決定され得る。これらのパラメーターとしては、抗原特異的な細胞傷害性アッセイ、NGEP又はNGEPエピトープを発現する腫瘍の退縮、NGEP又はNGEPエピトープを発現する癌細胞の阻害、サイトカインの産生等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００４２】
ペプチド、核酸、ベクター、若しくは細胞、又はそれらの組成物の任意の適切な用量が宿主に投与され得る。適切な用量は、宿主の年齢、体重、身長、性別、全身医学的状態、既往歴、疾患進行、及び腫瘍量のような要因に依存して異なり、臨床医により決定され得る。例えば、ペプチドは、宿主（例えば、哺乳動物（ヒト等））のワクチン接種当り約0.05 mgから約10 mg（例えば、0.1 mg、0.5 mg、1 mg、2 mg、3 mg、4 mg、5 mg、6 mg、7 mg、8 mg、9 mg、及びそれらの範囲)、好ましくはワクチン接種当り約0.1 mgから約5 mgの用量で投与され得る。何回かの服用（例えば、1、2、3、4、5、6、又はそれ以上）が提供され得る（例えば、数週間又は数ヶ月間にわたり）。一つの実施態様において、服用は3ヶ月間にわたって毎月提供される。
【００４３】
ベクターがウイルスベクターである場合、より低い又はより高い用量が宿主に投与され得るが、適切な用量は、約1 x 105から約1 x 1012（例えば、1 x 106、1 x 107、1 x 108、1 x 109、1 x 1010、1 x 1011、及びそれらの範囲）のプラーク形成単位（pfu）を含み得る。例えば、約2 x 108pfuが投与され得る（例えば、約0.5 mLの容量で）。
【００４４】
本発明の細胞（例えば、細胞傷害性T細胞）は、1注射当り約1 x 105と2 x 1011との間（例えば、1 x 106、1 x 107、1 x 108、1 x 109、1 x 1010、及びそれらの範囲）の細胞の用量で宿主に投与され得る。細胞は、例えば、1から3（例えば、2）回の注射で投与され得る。細胞の投与に加えて、宿主は、生体応答調節剤（インターロイキン-2（IL-2）等）が投与され得る。投与されるべき細胞が細胞傷害性T細胞である場合は、細胞傷害性T細胞の投与は、細胞傷害性T細胞を刺激してin vivoのT細胞数をさらに増加させるために、ペプチド、核酸、ベクター、又はそれらの組成物の投与の前に行われ得る。
【００４５】
本発明は、有効量の本発明のペプチド、核酸、又はベクターを、単独で、又は一以上の免疫賦活性／制御性分子及び／若しくはアジュバントと組み合わせて、又はリポソーム製剤内で用いてリンパ球を刺激することにより、ペプチド特異的な細胞傷害性Tリンパ球をin vivo又はin vitroで生成する方法を提供する。リンパ球は、任意の適切な供給源（例えば、末梢血、腫瘍組織、リンパ節、及び浸出液（胸水又は腹水等））由来のリンパ球であり得る。
【００４６】
NGEPペプチド特異的な細胞傷害性Tリンパ球は、NGEPに免疫反応を示す。好ましくは、細胞傷害性Tリンパ球は、腫瘍細胞及び癌の発生を阻害し、並びにNGEP若しくはそのエピトープを発現する腫瘍細胞の成長を阻害し、又は殺傷する。細胞傷害性Tリンパ球は、抗原特異的であることに加えて、MHCクラスI拘束性であり得る。一つの実施態様において、細胞傷害性Tリンパ球は、MHCクラスI HLA-A2拘束性である。細胞傷害性Tリンパ球は、好ましくはCD8+表現型を有する。
【００４７】
一つの実施態様において、リンパ球は、宿主から取り出されて、細胞傷害性Tリンパ球を生成するために、ペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物でex vivoで刺激される。細胞傷害性Tリンパ球は、前立腺癌に対する免疫反応を増強するために宿主に投与され得、これにより前立腺癌を阻害する。従って、本発明は、（a）リンパ球を得ること（例えば、宿主から）、（b）ペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物でリンパ球を刺激して細胞傷害性Tリンパ球を生成すること、及び（c）細胞傷害性Tリンパ球を宿主に投与することを含む、宿主における前立腺癌を阻害する方法であって、前立腺癌が阻害される方法を提供する。
【００４８】
別の実施態様において、宿主内のリンパ球が、ペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物を宿主に投与することにより刺激されて細胞傷害性Tリンパ球を生成し、この細胞傷害性Tリンパ球は前立腺癌に対する免疫反応を増強し、これにより前立腺癌を阻害する。
【００４９】
本発明は、抗原刺激及び追加免疫のプロトコールを含む。特に、プロトコールは、本発明のペプチド及び任意に一以上の免疫賦活性／制御性分子をコードする一以上の組換えポックスウイルスベクターを含む組成物での最初の「抗原刺激」と、その後に続く、本発明のペプチド又は本発明のペプチド及び任意に一以上の免疫賦活性／制御性分子をコードする一以上のポックスウイルスベクターを含む組成物での一回又は好ましくは複数回の「追加免疫」とを含む。
【００５０】
最初の抗原刺激ワクチン接種は、一以上のポックスウイルスベクターを含み得る。一つの実施態様において、単一のポックスウイルスベクターが、本発明のペプチド及び一以上の免疫賦活性／制御性分子の送達に使用される。別の実施態様において、二以上のポックスウイルスベクターが、抗原刺激ワクチン接種に含まれ、それらは一回の注射において同時に投与される。
【００５１】
追加免疫ワクチン接種もまた、一以上のポックスウイルスベクターを含み得る。一つの実施態様において、単一のポックスウイルスベクターが、追加免疫ワクチン接種の本発明のペプチド及び一以上の免疫賦活性／制御性分子の送達に使用される。別の実施態様において、二以上のポックスウイルスベクターが、追加免疫ワクチン接種に含まれ、それらは一回の注射において同時に投与される。
【００５２】
様々な時間間隔での接種について、様々なセットの治療分子を保有するポックスウイルスベクターを用いた異種性の抗原刺激／追加免疫プロトコールを提供するために、種々のポックスウイルスが使用され得る。例えば、一つの異種性の抗原刺激／追加免疫の組み合わせにおいて、第一のオルソポックスベクター組成物が抗原刺激に使用され、第二のトリポックスベクター組成物が追加免疫に使用される。
【００５３】
ポックスウイルスベクターの投与スケジュールは、典型的に、追加免疫ベクターの繰り返し投与を含む。追加免疫ベクターは、任意の適切な長さの時間（例えば、合計で少なくとも5〜15の追加免疫ワクチン接種について6〜12週間）にわたり、任意の適切な期間（例えば、2〜4週間毎）で1〜3回（例えば、1、2、又は3回）投与され得る。例えば、プロトコールは、定期的な（例えば、毎月の）間隔でのワクシニアの3投与と、その後に続く、定期的な間隔（例えば、毎月）での鶏痘の複数投与とを含み得る。特定の実施態様において、宿主は、抗原刺激ベクターでの一回のワクチン接種、次いで2週間毎に追加免疫ベクターで6回の追加免疫、その後続いて4週間毎に追加免疫ベクターを受け、疾患の進行に応じた期間、追加免疫ベクターが続く。
【００５４】
本発明はさらに、少なくとも第一の組換えポックスウイルス（そのゲノム又はその一部に本発明のペプチドをコードする核酸を組み込んでいる）を医薬的に許容され得る担体中に有するキットを提供する。第一の組換えポックスウイルスは、一以上の免疫賦活性／制御性分子をコードする一以上の遺伝子も含み得る。第一の組換えポックスウイルスに加えて、キットは、一以上の免疫賦活性／制御性分子をコードする一以上の遺伝子を含む第二の組換えポックスウイルスを、医薬的に許容され得る担体中に有し得る。キットはさらに、容器、注射針、及び該キットの使用方法についての指示書を提供する。別の実施態様において、キットはさらに、アジュバント（GM-CSF等）及び／又は市販されているアジュバントの該キットの構成品との使用についての指示書を提供する。
【００５５】
ペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物は、種々の経路により宿主に投与され得る（限定されないが、皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、静脈内、及び腫瘍内が含まれる）。複数の投与が行われる場合、該投与は宿主内の一以上の部位で行われ得る。
【００５６】
ペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物の投与は「予防的」又は「治療的」であり得る。予防的に提供される場合、ペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物は、宿主が発症しやすい腫瘍に対して宿主の免疫系を戦わせるために腫瘍形成の前に提供される。例えば、遺伝性の癌感受性を有する宿主は、このような予防的な免疫化で処置される患者の好ましい群である。ペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物の予防的投与は、NGEP発現癌（例えば、前立腺癌）を阻害、改善、又は遅延する。治療的に投与される場合、ペプチド、核酸、ベクター、細胞又はそれらの組成物は、NGEP発現癌（例えば、前立腺癌）の診断時又は診断後に提供される。
【００５７】
宿主がNGEP発現癌（例えば、前立腺癌）又は転移性癌と既に診断されている場合は、ペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物は、化学療法又は放射線療法等の他の治療的処置と併せて投与され得る。
【００５８】
好ましい実施態様において、ペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物の宿主への投与は、本発明のペプチド及び、任意に、同時に投与された一以上の免疫賦活性／制御性分子を発現する宿主細胞をもたらす。本発明のペプチド（即ち、NGEP抗原）は、感染宿主細胞の細胞表面に発現し得る。一以上の免疫賦活性／制御性分子は細胞表面に発現し得るか、或いは宿主細胞により活発に分泌され得る。NGEP抗原及び免疫賦活性／制御性分子の両方の発現は、特異的T細胞に対して必要なMHC制限ペプチド、並びに抗原の認識及び抗原特異的T細胞の増幅又はクローン性増殖を助けるためのT細胞への適切なシグナルを提供する。全体的な結果としては免疫系の上方制御である。好ましくは、免疫反応の上方制御は、前立腺癌細胞の殺傷又は成長阻害が可能である抗原特異的なTヘルパーリンパ球及び／又は細胞傷害性リンパ球の増加である。
【００５９】
本発明の方法のために、種々の適切な医薬組成物の製剤が存在する。以下の、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、及び腹腔内投与のための製剤は例示的であり、決して限定的ではない。当業者は、本発明のペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物を投与するこれらの経路が公知であり、一よりも多い経路が特定の化合物を投与するために使用され得るが、特定の経路が別の経路よりも即時的で有効な反応を提供し得ることを理解するであろう。
【００６０】
本発明に従う好適な製剤の中には、注射可能な製剤がある。注射可能な組成物に効果的な医薬的担体の要件は、当業者に周知である（例えば、Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J.B. Lippincott Company, Philadelphia, PA, Banker and Chalmers, eds., pages 238-250 (1982)、及びASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel, 4th ed., pages 622-630 (1986)を参照のこと）。
【００６１】
非経口投与に適切な製剤としては、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及び製剤を意図されたレシピエントの血液と等張にする溶質を含み得る水性及び非水性の等張滅菌注射液、並びに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、及び保存剤を含み得る水性及び非水性の滅菌懸濁液が挙げられる。ペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物は、医薬的担体における生理学的に許容され得る希釈剤（滅菌液又は液体混合物等）の中で投与され得、これには、水、生理食塩水、デキストロース及び関連する糖の水溶液、アルコール（エタノール、イソプロパノール、又はヘキサデシルアルコール等）、グリコール（プロピレングリコール又はポリエチレングリコール等）、ジメチルスルホキシド、グリセロールケタール（2,2-ジメチル-1,3-ジオキソラン-4-メタノール等）、エーテル（ポリ（エチレングリコール）400等）、油、脂肪酸、脂肪酸エステル若しくはグリセリド、又はアセチル化脂肪酸グリセリドが、医薬的に許容され得る界面活性剤（石鹸又は洗剤等）、懸濁化剤（ペクチン、カルボマー、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、又はカルボキシメチルセルロース等）、又は乳化剤及び他の医薬的アジュバントの添加を伴って、或いは伴わずに含まれる。
【００６２】
非経口製剤に使用可能な油としては、石油、動物油、植物油、及び合成油が挙げられる。油の具体例としては、ピーナッツ、大豆、ゴマ、綿実、コーン、オリーブ、ワセリン、及びミネラルが挙げられる。非経口製剤に使用される適切な脂肪酸としては、オレイン酸、ステアリン酸、及びイソステアリン酸が挙げられる。エチルオレエート及びイソプロピルミリステートは、適切な脂肪酸エステルの例である。
【００６３】
非経口製剤における使用に適切な石鹸としては、脂肪酸アルカリ金属、アンモニウム、及びトリエタノールアミンの塩が挙げられ、適切な洗剤としては、（a）カチオン性洗剤（例えば、ジメチルジアルキルアンモニウムハライド、及びアルキルピリジニウムハライド等）、（b）アニオン性洗剤（例えば、アルキル、アリル、及びオレフィンスルホネート、アルキル、オレフィン、エーテル、及びモノグリセリドサルフェート、並びにスルホサクシネート等）、（c）ノニオン性洗剤（例えば、脂肪アミンオキサイド、脂肪酸アルカノールアミド、及びポリオキシエチレンポリプロピレンコポリマー等）、（d）両性洗剤（例えば、アルキル-b-アミノプロピオネート、及び2-アルキル-イミダゾリン第四級アンモニウム塩等）、及び（e）これらの混合物が挙げられる。
【００６４】
保存剤及び緩衝剤が使用され得る。注射部位での刺激を最小化又は除去するために、このような組成物は、約12から約17の親水−親油バランス（HLB）を有する一以上のノニオン性界面活性剤を含み得る。このような製剤における界面活性剤の量は、典型的に約5重量%から約15重量%の範囲である。適切な界面活性剤としては、ポリエチレンソルビタン脂肪酸エステル（ソルビタンモノオレエート等）、及びプロピレンオキサイドのプロピレングリコールとの縮合により形成される疎水性ベースを有するエチレンオキサイドの高分子量付加物が挙げられる。
【００６５】
非経口製剤は、単回用量又は複数回用量の密封容器（アンプル及びバイアル等）内に存在し得、注射のため使用直前に滅菌液体賦形剤（例えば、水）の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保管され得る。即席の注射溶液及び懸濁液が、滅菌粉末、顆粒、及び錠剤から調製され得る。
【実施例】
【００６６】
以下の実施例はさらに本発明を説明するが、当然、その範囲を決して限定しないものとして解釈されるべきである。
【００６７】
実施例1
本実施例は、NGEPのCTLエピトープの決定を実証する。
【００６８】
HLA-A2結合ペプチドのコンセンサスモチーフについて、ヒトNGEPタンパク質の一次アミノ酸配列を解析した。7個の9-merペプチド及び5個の10-merペプチドが同定された（表1を参照のこと）。95%よりも高い純度のNGEPペプチドをAmerican Peptide Inc.（Sunnyvale, CA）が合成した。コントロールとして機能するMUC-1及びCAP-7ペプチドは、95%よりも高い純度のものをBiosynthesis（Lewisville, TX）が合成した。
【００６９】
NGEPペプチドのHLA-A2分子への結合は、フローサイトメトリーによって示されるように、T2細胞上のHLA-A2発現の制御により評価した。T2細胞結合アッセイは3回繰り返した。その結果を表1に示す。T2結合値は、平均蛍光強度で示されている。括弧内の値は、ネガティブコントロール（CAP-7ペプチド）と比較したときの増加倍数である。
【００７０】
【表１】
2012523847.tif 000002
【００７１】
P703ペプチドはHLA-A2分子への結合について最も良い効率を示したが（ネガティブコントロールよりも6.4倍高い）、他のペプチドも高レベルの結合を示した。
【００７２】
ペプチド-MHC複合体の安定性を調べるため、同定されたペプチドのうち数種（25μg/mLの濃度）をT2細胞と一晩インキュベートした。未結合のペプチドを洗浄して除去し、ブレフェルジンAの添加により、新しいクラスI分子の細胞表面への送達をブロックした。その後、細胞を、平均蛍光強度の程度によって示されるように、種々の時点でのペプチド-HLA-A2複合体の存在について分析した。試験したペプチドのうち、P703-HLA-A2複合体が最も安定的な複合体を示した（図1Aを参照のこと）。P703ペプチドはまた、様々なペプチド濃度で、P215ペプチド及びポジティブコントロールよりも高いレベルでT2細胞に結合することも判明した（図1Bを参照のこと）。
【００７３】
本発明のペプチドの免疫原性を調べるため、特異的CTLをin vitroで誘発する能力を評価した。局所再発前立腺癌を有する患者（患者A）の末梢血単核球（PBMC）を用いて、P703及びP215ペプチドに対するT細胞株を作製した。P703及びP215ペプチドを用いて作製されたT細胞株は、それぞれT-A-P703及びT-A-P215として表記した。これらのT細胞株の特異性を評価するため、対応するNGEP及びコントロールペプチドをパルスした放射線照射された自己樹状細胞（DC）を用いてIFN-γ放出アッセイを行った（図1Cを参照のこと）。T-A-P703細胞株は、T-A-P215細胞株と比較して、高レベルのIFN-γを産生した。コントロールHIV gagペプチドを用いた場合、IFN-γは産生されなかった。
【００７４】
ペプチド特異的なT細胞は、アゴニストペプチドでの刺激後、高レベルのケモカインリンホタクチンを産生することが以前に示されている。T-A-P703細胞株は、種々の濃度のそれぞれの対応するペプチドでパルスされた自己DCで刺激すると、T-A-P215細胞株よりも高いレベルのリンホタクチンを産生した（図1Dを参照のこと）。
【００７５】
実施例2
本実施例は、前立腺癌細胞を阻害する本発明のペプチドの能力を実証する。
【００７６】
転移性前立腺癌を有する患者（患者B）のPBMCからP703ペプチドを用いてT細胞株を確立し、それゆえこの細胞株をT-B-P703として表記した。T-A-P703と同様に、T-B-P703は、ペプチド特異的な刺激に反応して高レベルのIFN-γを産生し（876.5 pg/mL）、コントロールHIV gagペプチドを用いた場合はIFN-γは検出不能なレベルであった。
【００７７】
T-A-P703及びT-B-P703の両細胞株におけるNGEP特異的CD8+T細胞の頻度を調べるため、NGEP特異的P703/HLA-A*0201テトラマー及び抗CD8抗体を使用した。図2A〜Bに示されるように、T-A-P703 T細胞株において、より高い頻度のNGEP特異的CD8+T細胞が生成された（95.2%）。
【００７８】
その後、両細胞株を、6時間のCTLアッセイにて、ペプチドでパルスされたHLA-A2+標的に対する細胞傷害活性について試験した（図2Cを参照のこと）。T-A-P703細胞株は、P703ペプチドでパルスされたC1RA2細胞を、様々なエフェクター：ターゲット（E：T）細胞比においてT-B-P703細胞株よりも高い効率で特異的に溶解した。
【００７９】
P703ペプチドに対して生じたこれらのT細胞株が、全長のプロセシングされたNGEP-Lを内因的に発現する標的細胞を殺傷可能かどうかを調べるため、NGEP-L遺伝子でトランスフェクトされたMCF-7腫瘍細胞（HLA-A2+、NGEP+）と、ネガティブコントロールとしてトランスフェクトされていないMCF-7細胞（HLA-A2+、NGEP-）とを用いてCTLアッセイを行った（図2Dを参照のこと）。その結果、T-A-P703細胞は、NGEP-L遺伝子を内因的に発現する腫瘍細胞を特異的に殺傷できることが示された。
【００８０】
実施例3
本実施例は、前立腺癌患者におけるNGEPの免疫原性を実証する。
【００８１】
前立腺癌患者がNGEP-P703エピトープを認識するかどうかを調べるため、転移性前立腺癌を有する4名の患者からのPBMC及び4名の健常ドナーからのPBMCを、NGEP-P703テトラマーに反応性を示すCD8+T細胞の存在について分析した。T細胞（5x105）を、10μlのPE標識NGEP-P703/HLA-A*0201テトラマー及び抗CD8抗体で染色した。テトラマーPE標識HIV gag（SLYNTVATL（配列番号：15））/HLA-A*0201をネガティブコントロールとして使用した。その結果（PBMC中のテトラマー陽性細胞の割合で表されている）を表2に示す。
【００８２】
転移性前立腺癌を有する4名の患者のうちの3名（即ち、患者2、3、及び4）が、健常ドナーと比較して、より高い頻度のNGEP-P703特異的CD8+T細胞を有した（表2を参照のこと）。
【００８３】
その後、これらの同じ4名の前立腺癌患者を、PSAベースのワクチン（PSA/TRICOM）を月に一回のサイクルで6回受けた後でテトラマー結合について分析した。4名の患者からのPBMCは全て、ワクチン接種前と比較して、ワクチン接種後はより高いテトラマー結合を示した（表2を参照のこと）。
【００８４】
【表２】
2012523847.tif 000003
【００８５】
これらの結果は、ワクチン治療の結果としてNGEPエピトープの交差提示の証拠を提供し、さらに前立腺癌患者におけるNGEPの免疫原性の証拠を提供する。
【００８６】
更なる4名の転移性前立腺癌を有する患者を、PSA/TRICOMでのワクチン接種前後に、PBMCにおけるPSA特異的及びNGEP特異的T細胞の生成について、IFN産生のELISPOTアッセイを用いて分析した。4名の患者はいずれもワクチン接種前はPSA特異的T細胞がネガティブであったが、4名の患者のうちの3名は、ワクチン接種後にPSA特異的T細胞が増加した（表3を参照のこと）。
【００８７】
【表３】
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【００８８】
興味深いことに、PSA特異的T細胞の増加を示す3名の患者（即ち、患者5、6、及び7）は、NGEP特異的T細胞の増加も示した。これらをまとめると（表2及び3を参照のこと）、これらの研究は、8名の前立腺癌患者のうちの6名（即ち、患者2、3、4、5、6、及び7）におけるNGEPの免疫原性を実証している。
【００８９】
本明細書で引用された刊行物、特許出願、及び特許を含む全ての参考文献は、各参考文献が参考として援用されると個々に、且つ具体的に示され、且つ本明細書にその全体が記載されているのと同程度まで、本明細書において参考として援用される。
【００９０】
本発明の説明の文脈において（特に、以下の特許請求の範囲の文脈において）、用語「a」及び「an」及び「the」及び同様の指示語の使用は、本明細書で違うように記載されていなければ、又は、文脈によって明確に否定されなければ、単数と複数の両方を包含するように解釈されるべきである。用語「含有する（comprising）」、「有する（having）」、「含む（including）」及び「含む（containing）」は、違うように記載されていなければ、オープンエンドの用語（即ち、「・・を含むが、・・に限定されない」ことを意味する）として解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の記載は、本明細書で違うように記載されていなければ、その範囲内の各々の分離した値へ個々に言及することの略記方法として役立つことが単に意図され、各々の分離した値は、それが本明細書に個々に記載されているかのように本明細書に含まれるものである。本明細書で記載される方法の全ては、本明細書で違うように記載されていなければ、又は、文脈によって明確に否定されなければ、任意の適切な順序で行うことができる。本明細書で提供される任意の、及び全ての例、又は例示的言葉（例えば、「等の」）の使用は、本発明をより明瞭にすることが単に意図され、違うように特許請求されていなければ、本発明の範囲を制限するものではない。本明細書の如何なる言葉も、本発明の実施に必須なものとして特許請求されていない要素を示すものとして解釈されるべきではない。
【００９１】
本発明を実施するための本発明者らが知っている最良の形態を含む、本発明の好適な実施態様を本明細書で記載する。上記説明を読めば、それらの好適な実施態様のバリエーションが当業者に明白となるであろう。本発明者らは、当業者が適宜このようなバリエーションを用いることを予測し、本発明者らは、本発明が、本明細書に具体的に記載されたものとは異なるように実施されることを意図する。それ故、本発明は、適用法によって許されるように、本明細書に添付された特許請求の範囲に記載の主題の全ての改変及び均等物を含むものである。更に、本明細書で違うように記載されていないか、または文脈によって違うように明瞭に否定されていなければ、その全ての可能なバリエーション中の上記要素の任意の組み合わせが本発明に包含される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年12月21日(2011.12.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
20以下のアミノ酸残基を有し、且つGLFDEYLEMV（配列番号：1）を含む、単離されたペプチド。
【請求項２】
ペプチドが配列番号：1からなる、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
20以下のアミノ酸残基を有し、且つLVWEEDLKL（配列番号：2）、WLLPAAVVGT（配列番号：3）、GLGGPPLPTL（配列番号：4）、IVFEHVVFSV（配列番号：5）、又はFLDNIRAAGL（配列番号：6）を含む、単離されたペプチド。
【請求項４】
ペプチドが、配列番号：2、配列番号：3、配列番号：4、配列番号：5、又は配列番号：6からなる、請求項３に記載のペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチドをコードする、単離された核酸。
【請求項６】
請求項５に記載の核酸を含むベクター。
【請求項７】
ベクターが、プラスミド、酵母、ポックスウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、アルファウイルス、バキュロウイルス、及びシンドビスウイルスからなる群より選択される、請求項６に記載のベクター。
【請求項８】
ベクターが、オルソポックス、ワクシニア、トリポックス、鶏痘、カプリポックス、及びスイポックスからなる群より選択されるポックスウイルスである、請求項７に記載のベクター。
【請求項９】
（i）請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチド、（ii）請求項５に記載の核酸、又は（iii）請求項６〜８のいずれか１項に記載のベクターを含む、単離された細胞。
【請求項１０】
宿主細胞がヒトである、請求項９に記載の細胞。
【請求項１１】
宿主細胞が抗原提示細胞又は腫瘍細胞である、請求項９又は１０に記載の細胞。
【請求項１２】
（a）（i）請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチド、（ii）請求項５に記載の核酸、（iii）請求項６〜８のいずれか１項に記載のベクター、又は（iv）請求項９〜１１のいずれか１項に記載の細胞、及び
（b）医薬的に許容され得る担体
を含む、組成物。
【請求項１３】
免疫賦活性／制御性分子をさらに含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
免疫賦活性／制御性分子が、インターロイキン（IL）-2、IL-6、IL-12、インターフェロン（IFN）-γ、腫瘍壊死因子（TNF）-α、B7.1、B7.2、ICAM-1、LFA-3、CD70、RANTES、G-CSF、OX-40L、41 BBL、抗CTLA-4、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
免疫賦活性／制御性分子が、（i）IL-12をコードし、キトサンと複合体化されたプラスミド及び（ii）キトサンと混合された組換えIL-12からなる群より選択される、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
化学療法剤、抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌剤、シクロホスファミド、又はそれらの組み合わせをさらに含む、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
アジュバントをさらに含む、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
アジュバントが、ミョウバン、アルミニウム塩、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、アルミニウムシリカ、リン酸カルシウム、不完全フロイントアジュバント、QS21、及びRIBI DETOXTMからなる群より選択される、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
アジュバントが、顆粒球単球コロニー刺激因子（GM-CSF）である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２０】
リポソームをさらに含む、請求項１２〜１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
宿主における前立腺癌に対する免疫反応を増強するための、請求項１２〜２０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２】
宿主における前立腺癌を阻害するための、請求項１２〜２０のいずれか１項に記載の組成物でリンパ球を刺激することにより生成された細胞傷害性Tリンパ球を含む、組成物。
【請求項２３】
前立腺癌の細胞が前立腺発現新規遺伝子（NGEP）を発現する、請求項２１又は２２に記載の組成物。
【国際調査報告】
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