(57)【要約】  本発明は、LIGHTポリペプチドと特異的に結合する抗原結合性ポリペプチド、またはその変異体もしくは誘導体に関する。本発明はまた、そのような抗体を作製する方法と、特に免疫性、炎症性および悪性の疾患もしくは症状（例えば、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、関節リウマチ、移植）の治療または診断において、そのような抗体を使用する方法に関する。【選択図】  図１
2012521216.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
LIGHTポリペプチドと特異的に結合する抗原結合性ポリペプチドであって、
(1) X1YX2X3X4 (配列番号18)［ここで、X1はアミノ酸D、S、TまたはNであり; X2はアミノ酸Y、LまたはWであり; X3はアミノ酸IまたはMであり; そしてX4はアミノ酸Y、H、EまたはNである］のアミノ酸配列を含むCDR-H1; 
(2) X5IX6PX7X8X9X10X11X12X13NX14X15FX16X17 (配列番号19)［ここで、X5はアミノ酸Y、M、VまたはWであり; X6はアミノ酸D、N、HまたはFであり; X7はアミノ酸Y、GまたはSであり; X8はアミノ酸N、S、TまたはDであり; X9はアミノ酸G、SまたはDであり; X10はアミノ酸G、D、EまたはIであり; X11はアミノ酸TまたはSであり; X12はアミノ酸KまたはRであり; X13はアミノ酸YまたはLであり; X14はアミノ酸QまたはEであり; X15はアミノ酸KまたはNであり; X16はアミノ酸K、IまたはRであり; そしてX17はアミノ酸G、AまたはDである］のアミノ酸配列を含むCDR-H2; ならびに
(3) (i)   WX18X19 (配列番号20); 
(ii)  X20X21X22X23X24X25X26X27X28 (配列番号21); および
(iii) X20X21X22X23X24X25X26X27X28AMDF (配列番号22)
［ここで、X18はアミノ酸DまたはNであり; X19はアミノ酸RまたはYであり; X20はアミノ酸E、TまたはGであり; X21はアミノ酸D、Sまたは Nであり; X22はアミノ酸YまたはGであり; X23はアミノ酸G、SまたはVであり; X24はアミノ酸I、SまたはWであり; X25はアミノ酸S、WまたはAであり; X26はアミノ酸T、FまたはMであり; X27はアミノ酸Y、PまたはDであり; そしてX28はアミノ酸SまたはYである］からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR-H3
を含むヒト化抗体重鎖可変領域を含む、上記抗原結合性ポリペプチド。
【請求項２】
LIGHTポリペプチドと特異的に結合する抗原結合性ポリペプチドであって、
(1) (i)   X29X30SX31X32X33X34X35X36X37X38 (配列番号38); 
(ii)  X29X30SX31X32X33X34X35X36X37X38X39X40X41X42 (配列番号39); および
(iii) X29X30SX31X32X33X34X35X36X37X38X39X40X41X42H (配列番号40)
［ここで、X29はアミノ酸KまたはRであり; X30はアミノ酸AまたはSであり; X31はアミノ酸QまたはKであり; X32はアミノ酸D、SまたはNであり; X33はアミノ酸V、IまたはLであり; X34はアミノ酸G、S、VまたはLであり; X35はアミノ酸T、NまたはHであり; X36はアミノ酸A、NまたはSであり; X37はアミノ酸V、L、NまたはGであり; X38はアミノ酸A、H、GまたはYであり; X39はアミノ酸NまたはTであり; X40はアミノ酸TまたはYであり; X41はアミノ酸YまたはMであり; X42はアミノ酸FまたはHである］からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR-L1;
(2) X43X44X45X46X47X48X49 (配列番号41)［ここで、X43はアミノ酸W、Y、KまたはIであり; X44はアミノ酸A、TまたはVであり; X45はアミノ酸SまたはYであり; X46はアミノ酸T、QまたはNであり; X47はアミノ酸R、SまたはLであり; X48はアミノ酸H、I、FまたはEであり; そしてX49はアミノ酸TまたはSである］のアミノ酸配列を含むCDR-L2; ならびに
(3) X50X51X52X53X54X55PX56T (配列番号42)［ここで、X50はアミノ酸QまたはSであり; X51はアミノ酸QまたはHであり; X52はアミノ酸SまたはYであり; X53はアミノ酸S、N、TまたはRであり; X54はアミノ酸S、R、HまたはEであり; X55はアミノ酸Y、W、VまたはLであり; そしてX56はアミノ酸LまたはYである］のアミノ酸配列を含むCDR-L3
を含むヒト化抗体軽鎖可変領域を含む、上記抗原結合性ポリペプチド。
【請求項３】
LIGHTポリペプチドと特異的に結合する抗原結合性ポリペプチドであって、
(a) (1) X1Y X2X3X4 (配列番号18)［ここで、X1はアミノ酸D、S、TまたはNであり; X2はアミノ酸Y、LまたはWであり; X3はアミノ酸IまたはMであり; そしてX4はアミノ酸Y、H、EまたはNである］のアミノ酸配列を含むCDR-H1; 
(2) X5IX6PX7X8X9X10X11X12X13NX14X15FX16X17 (配列番号19)［ここで、X5はアミノ酸Y、M、VまたはWであり; X6はアミノ酸D、N、HまたはFであり; X7はアミノ酸Y、GまたはSであり; X8はアミノ酸N、S、TまたはDであり; X9はアミノ酸G、SまたはDであり; X10はアミノ酸G、D、EまたはIであり; X11はアミノ酸TまたはSであり; X12はアミノ酸KまたはRであり; X13はアミノ酸YまたはLであり; X14はアミノ酸QまたはEであり; X15はアミノ酸KまたはNであり; X16はアミノ酸K、IまたはRであり; そしてX17はアミノ酸G、AまたはDである］のアミノ酸配列を含むCDR-H2; ならびに
(3) (i)   WX18X19 (配列番号20); 
(ii)  X20X21X22X23X24X25X26X27X28 (配列番号21); および
(iii) X20X21X22X23X24X25X26X27X28AMDF (配列番号22)
［ここで、X18はアミノ酸DまたはNであり; X19はアミノ酸RまたはYであり; X20はアミノ酸E、TまたはGであり; X21はアミノ酸D、Sまたは Nであり; X22はアミノ酸YまたはGであり; X23はアミノ酸G、SまたはVであり; X24はアミノ酸I、SまたはWであり; X25はアミノ酸S、WまたはAであり; X26はアミノ酸T、FまたはMであり; X27はアミノ酸Y、PまたはDであり; そしてX28はアミノ酸SまたはYである］からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR-H3
を含むヒト化抗体重鎖可変領域と；
(b) (1) (i)   X29X30SX31X32X33X34X35X36X37X38 (配列番号38); 
(ii)  X29X30SX31X32X33X34X35X36X37X38X39X40X41X42 (配列番号39); および
(iii) X29X30SX31X32X33X34X35X36X37X38X39X40X41X42H (配列番号40)
［ここで、X29はアミノ酸KまたはRであり; X30はアミノ酸AまたはSであり; X31はアミノ酸QまたはKであり; X32はアミノ酸D、SまたはNであり; X33はアミノ酸V、IまたはLであり; X34はアミノ酸G、S、VまたはLであり; X35はアミノ酸T、NまたはHであり; X36はアミノ酸A、NまたはSであり; X37はアミノ酸V、L、NまたはGであり; X38はアミノ酸A、H、GまたはYであり; X39はアミノ酸NまたはTであり; X40はアミノ酸TまたはYであり; X41はアミノ酸YまたはMであり; X42はアミノ酸FまたはHである］からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR-L1;
(2) X43X44X45X46X47X48X49 (配列番号41)［ここで、X43はアミノ酸W、Y、KまたはIであり; X44はアミノ酸A、TまたはVであり; X45はアミノ酸SまたはYであり; X46はアミノ酸T、QまたはNであり; X47はアミノ酸R、SまたはLであり; X48はアミノ酸H、I、FまたはEであり; そしてX49はアミノ酸TまたはSである］のアミノ酸配列を含むCDR-L2; ならびに
(3) X50X51X52X53X54X55PX56T (配列番号42)［ここで、X50はアミノ酸QまたはSであり; X51はアミノ酸QまたはHであり; X52はアミノ酸SまたはYであり; X53はアミノ酸S、N、TまたはRであり; X54はアミノ酸S、R、HまたはEであり; X55はアミノ酸Y、W、VまたはLであり; そしてX56はアミノ酸LまたはYである］のアミノ酸配列を含むCDR-L3
を含むヒト化抗体軽鎖可変領域と
を含む、上記抗原結合性ポリペプチド。
【請求項４】
(1) (i)   SSYIH (配列番号23); 
(ii)  DYYIY (配列番号26); 
(iii) TYLIE (配列番号29); 
(iv)  TYWMN (配列番号32); および
(v)   NYLIE (配列番号35)
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR-H1；
(2) (i)   WIFPGSDITKYNEKFKG (配列番号24); 
(ii)  YIDPYNGGTKYNQKFKD (配列番号27); 
(iii) VINPGTGETKYNENFRA (配列番号30); 
(iv)  MIHPSDSESRLNQKFID (配列番号33); および
(v)   VINPGSGDTKYNENFKG (配列番号36)
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR-H2；ならびに
(3) (i)   EDYGISTYSAMDF (配列番号25); 
(ii)  TSGSSWFPY (配列番号28); 
(iii) WDR (配列番号31); 
(iv)  GNYVWAMDY (配列番号34); および
(v)   WNY (配列番号37)
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR-H3
を含むヒト化抗体重鎖可変領域を含む、請求項1に記載の抗原結合性ポリペプチド。
【請求項５】
(1) (i)   KASQDVGTAVA (配列番号43); 
(ii)  RASQSISNNLH (配列番号46); 
(iii) RSSQNLVHSNGNTYFH (配列番号49); 
(iv)  RASKSVSTSGYTYMH (配列番号52); および
(v)   RSSQSLLHSNGNTYFH (配列番号55)
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR-L1；
(2) (i)   WASTRHT (配列番号44); 
(ii)  YTYQSIS (配列番号47); 
(iii) KVSNRFS (配列番号50); および
(iv)  ITSNLES (配列番号53)
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR-L2；ならびに
(3) (i)   QQYSSYPLT (配列番号45); 
(ii)  QQSNRWPLT (配列番号48); 
(iii) SQSTHVPYT (配列番号51); および
(iv)  QHSRELPYT (配列番号54) 
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR-L3
を含むヒト化抗体軽鎖可変領域を含む、請求項2に記載の抗原結合性ポリペプチド。
【請求項６】
(1) 前記CDR-H1がアミノ酸配列SYYIH (配列番号23)を含み;
(2) 前記CDR-H2がアミノ酸配列WIFPGSDITKYNEKFKG (配列番号24)を含み; そして
(3) 前記CDR-H3がアミノ酸配列EDYGISTYSAMDF (配列番号25)を含む、
請求項4に記載の抗原結合性ポリペプチド。
【請求項７】
(1) 前記CDR-L1がアミノ酸配列KASQDVGTAVA (配列番号43)を含み;
(2) 前記CDR-L2がアミノ酸配列WASTRHT (配列番号44)を含み; そして
(3) 前記CDR-L3がアミノ酸配列QQYSSYPLT (配列番号45)を含む、
請求項5に記載の抗原結合性ポリペプチド。
【請求項８】
(1) アミノ酸配列KASQDVGTAVA (配列番号43)を含むCDR-L1;
(2) アミノ酸配列WASTRHT (配列番号44)を含むCDR-L2; および
(3) アミノ酸配列QQYSSYPLT (配列番号45)を含むCDR-L3
を含むヒト化抗体軽鎖可変領域をさらに含む、請求項6に記載の抗原結合性ポリペプチド。
【請求項９】
ヒト化抗体重鎖可変領域が、以下のアミノ酸配列：
(1)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTX1YX2X3X4WVRQAPGQX'1LEWX'2GX5IX6PX7X8X9X10X11X12X13NX14X15FX16X17X'3X'4TX'5TX'6DX'7SX'8STX'9YMELSX'10LRSX'11 DTAVYYCARWX18X19WGQGTLVTVSS (配列番号1); 
(2)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTX1YX2X3X4WVRQAPGQX'1LEWX'2GX5IX6PX7X8X9X10X11X12X13NX14X15FX16X17X'3X'4TX'5TX'6DX'7SX'8STX'9YMELSX'10LRSX'11DTAVYYCARX20X21X22X23X24X25X26X27X28WGQGTLVTVSS (配列番号2); および
(3)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTX1YX2X3X4WVRQAPGQX'1LEWX'2GX5IX6PX7X8X9X10X11X12X13NX14X15FX16X17X'3X'4TX'5TX'6DX'7SX'8STX'9YMELSX'10LRSX'11DTAVYYCARX20X21X22X23X24X25X26X27X28AMDFWGQGTLVTVSS (配列番号3); 
［ここで、X1はアミノ酸D、S、TまたはNであり; X2はアミノ酸Y、LまたはWであり; X3はアミノ酸IまたはMであり; X4はアミノ酸Y、H、EまたはNであり; X5はアミノ酸Y、M、VまたはWであり; X6はアミノ酸D、N、HまたはFであり; X7はアミノ酸Y、GまたはSであり; X8はアミノ酸N、S、TまたはDであり; X9はアミノ酸G、SまたはDであり; X10はアミノ酸G、D、EまたはIであり; X11はアミノ酸TまたはSであり; X12はアミノ酸KまたはRであり; X13はアミノ酸YまたはLであり; X14はアミノ酸QまたはEであり; X15はアミノ酸KまたはNであり; X16はアミノ酸K、IまたはRであり; X17はアミノ酸G、AまたはDであり; X18はアミノ酸DまたはNであり; X19はアミノ酸RまたはYであり; X20はアミノ酸E、TまたはGであり; X21はアミノ酸D、SまたはNであり; X22はアミノ酸YまたはGであり; X23はアミノ酸G、SまたはVであり; X24はアミノ酸I、SまたはWであり; X25はアミノ酸S、WまたはAであり; X26はアミノ酸T、FまたはMであり; X27はアミノ酸Y、PまたはDであり; X28はアミノ酸SまたはYであり; 
さらにここで、X'1はアミノ酸RまたはGであり; X'2はアミノ酸MまたはIであり; X'3はアミノ酸KまたはRであり; X'4はアミノ酸VまたはAであり; X'5はアミノ酸M、LまたはIであり; X'6はアミノ酸VまたはRであり; X'7はアミノ酸TまたはKであり; X'8はアミノ酸A、IまたはTであり; X'9はアミノ酸VまたはAであり; X'10はアミノ酸RまたはSであり; そしてX'11はアミノ酸DまたはEである］
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の抗原結合性ポリペプチド。
【請求項１０】
ヒト化抗体重鎖可変領域が、以下のアミノ酸配列：
(a)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQRLEWMGWIFPGSDITKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREDYGISTYSAMDFWGQGTLVTVSS (配列番号4);
(b)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYIYWVRQAPGQGLEWIGYIDPYNGGTKYNQKFKDRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARTSGSSWFPYWGQGTLVTVSS (配列番号5);
(c)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYIYWVRQAPGQGLEWIGYIDPYNGGTKYNQKFKDKATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARTSGSSWFPYWGQGTLVTVSS (配列番号6);
(d)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYLIEWVRQAPGQGLEWMGVINPGTGETKYNENFRARVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARWDRWGQGTLVTVSS (配列番号7); および
(e)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYWMNWVRQAPGQGLEWMGMIHPSDSESRLNQKFIDRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGNYVWAMDYWGQGTLVTVSS (配列番号8)
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項9に記載の抗原結合性ポリペプチド。
【請求項１１】
ヒト化抗体軽鎖可変領域が、以下のアミノ酸配列：
(1)
X'12X'13X'14X'15TQX'16PX'17X'18X'19X'20X'21X'22X'23X'24X'25X'26X'27X'28X'29X'30CX29X30SX31X32X33X34X35X36X37X38WX'31X'32QX'33PX'34X'35X'36PX'37X'38LIX'39X43X44X45X46X47X48X49GX'40PX'41RFSGSGSGTX'42FTLX'43IX'44X'45X'46X'47X'48EDX'49X'50X'51YYCX50X51X52X53 X54X55PX56TFGQGTX'52VEIKR (配列番号9); 
(2)
X'12X'13X'14X'15TQX'16PX'17X'18X'19X'20X'21X'22X'23X'24X'25X'26X'27X'28X'29X'30CX29X30SX31X32X33X34X35X36X37X38X39X40X41X42WX'31X'32QX'33PX'34X'35X'36X'37X'38LIX'39X43X44X45X46X47X48X49GX'40PX'41RFSGSGSGTX'42FTLX'43IX'44X'45X'46X'47X'48ED X'49X'50X'51YYCX50X51X52X53X54X55PX56TFGQGTX'52VEIKR (配列番号10); および
(3)
X'12X'13X'14X'15TQX'16PX'17X'18X'19X'20X'21X'22X'23X'24X'25X'26X'27X'28X'29X'30CX29X30SX31X32X33X34X35X36X37X38X39X40X41X42HWX'31X'32QX'33PX'34X'35X'36X'37X'38LIX'39X43X44X45X46X47X48X49GX'40PX'41RFSGSGSGTX'42FTLX'43IX'44X'45X'46X'47X'48EDX'49X'50X'51YYCX50X51X52X53X54X55PX56TFGQGTX'52VEIKR (配列番号11)
［ここで、X29はアミノ酸KまたはRであり; X30はアミノ酸AまたはSであり; X31はアミノ酸QまたはKであり; X32はアミノ酸D、SまたはNであり; X33はアミノ酸V、IまたはLであり; X34はアミノ酸G、S、VまたはLであり; X35はアミノ酸T、NまたはHであり; X36はアミノ酸A、NまたはSであり; X37はアミノ酸V、L、NまたはGであり; X38はアミノ酸A、H、GまたはYであり; X39はアミノ酸NまたはTであり; X40はアミノ酸TまたはYであり; X41はアミノ酸YまたはMであり; X42はアミノ酸FまたはHであり; X43はアミノ酸W、Y、KまたはIであり; X44はアミノ酸A、TまたはVであり; X45はアミノ酸SまたはYであり; X46はアミノ酸T、QまたはNであり; X47はアミノ酸R、SまたはLであり; X48はアミノ酸H、I、FまたはEであり; X49はアミノ酸TまたはSであり; X50はアミノ酸QまたはSであり; X51はアミノ酸QまたはHであり; X52はアミノ酸SまたはYであり; X53はアミノ酸S、N、TまたはRであり; X54はアミノ酸S、R、HまたはEであり; X55はアミノ酸Y、W、VまたはLであり; X56はアミノ酸LまたはYであり; 
さらにここで、X'12はアミノ酸DまたはEであり; X'13はアミノ酸IまたはVであり; X'14はアミノ酸VまたはQであり; X'15はアミノ酸MまたはLであり; X'16はアミノ酸SまたはTであり; X'17はアミノ酸S、D、AまたはLであり; X'18はアミノ酸S、TまたはFであり; X'19はアミノ酸LまたはQであり; X'20はアミノ酸A、SまたはPであり; X'21はアミノ酸VまたはAであり; X'22はアミノ酸SまたはTであり; X'23はアミノ酸P、LまたはVであり; X'24はアミノ酸GまたはKであり; X'25はアミノ酸E、QまたはDであり; X'26はアミノ酸R、KまたはPであり; X'27はアミノ酸AまたはVであり; X'28はアミノ酸TまたはSであり; X'29はアミノ酸IまたはLであり; X'30はアミノ酸S、TまたはNであり; X'31はアミノ酸FまたはYであり; X'32はアミノ酸QまたはLであり; X'33はアミノ酸KまたはRであり; X'34はアミノ酸GまたはDであり; X'35はアミノ酸QまたはKであり; X'36はアミノ酸A、SまたはPであり; X'37はアミノ酸K、RまたはQであり; X'38はアミノ酸LまたはRであり; X'39はアミノ酸YまたはKであり; X'40はアミノ酸VまたはIであり; X'41はアミノ酸S、AまたはDであり; X'42はアミノ酸DまたはEであり; X'43はアミノ酸KまたはTであり; X'44はアミノ酸SまたはNであり; X'45はアミノ酸SまたはRであり; X'46はアミノ酸VまたはLであり; X'47はアミノ酸QまたはEであり; X'48はアミノ酸P、AまたはSであり; X'49はアミノ酸F、AまたはVであり; X'50はアミノ酸AまたはGであり; X'51はアミノ酸TまたはVであり; そしてX'52はアミノ酸RまたはKである］
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項2に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
ヒト化抗体軽鎖可変領域が、以下のアミノ酸配列：
(a)
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQDVGTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSYPLTFGQGTKVEIKR (配列番号12);
(b)
EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQSISNNLHWYQQKPDQSPKLLIKYTYQSISGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQSNRWPLTFGQGTKVEIKR (配列番号13);
(c)
EIVMTQSPATLSVSPGEKATLSCRASQSISNNLHWYQQKPGQAPRLLIYYTYQSISGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQSNRWPLTFGQGTRVEIKR (配列番号14);
(d)
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQNLVHSNGNTYFHWFQQRPGQSPRRLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPYTFGQGTKVEIKR (配列番号15);
(e)
DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQNLVHSNGNTYFHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPYTFGQGTKVEIKR (配列番号16); および
(f)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASKSVSTSGYTYMHWYQQKPGQPPKLLIYITSNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQHSRELPYTFGQGTKVEIKR (配列番号17)
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項11に記載の抗原結合性ポリペプチド。
【請求項１３】
請求項9〜10のいずれか一項に記載のヒト化重鎖と請求項11〜12のいずれか一項に記載のヒト化軽鎖を含む、LIGHTと特異的に結合する抗原結合性ポリペプチド。
【請求項１４】
抗原結合性ポリペプチドが抗体分子、Fabフラグメント、Fab'フラグメント、F(ab')2フラグメント、およびscFv分子からなる群より選択される、請求項1〜13のいずれか一項に記載の抗原結合性ポリペプチド。
【請求項１５】
(a)アミノ酸配列:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQRLEWMGWIFPGSDITKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREDYGISTYSAMDFWGQGTLVTVSS (配列番号4)
を含む重鎖可変領域と；
(b)アミノ酸配列：
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQDVGTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSYPLTFGQGTKVEIKR (配列番号12)
を含む軽鎖可変領域と
を含む、請求項14に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
前記抗体分子がヒト重鎖定常領域とヒト軽鎖定常領域を含む、請求項15に記載の抗原結合性ポリペプチド。
【請求項１７】
前記抗体分子がIgG分子である、請求項15〜16のいずれか一項に記載の抗原結合性ポリペプチド。
【請求項１８】
(a) 抗原結合性ポリペプチドがscFv分子である; または
(b) 抗原結合性ポリペプチドがscFv HSA融合分子である; または
(c) 抗原結合性ポリペプチドがFab HSA融合分子である、
請求項14に記載の抗原結合性ポリペプチド。
【請求項１９】
(a) 請求項18(a)のscFv分子が、(i) NH2-L-VH-X-VK-COOH および(ii) NH2-L-VK-X-VH-COOH［ここで、Lはリーダー配列であり、VHはヒト化抗体重鎖可変領域であり、Xは連結ポリペプチドであり、そしてVKはヒト化抗体軽鎖可変領域である］からなる群より選択される式を有するポリペプチドを含む；
(b) 請求項18(b)のscFv HSA融合分子のscFv部分がHSAのN末端に発現され、そのポリペプチドが、(i) NH2-L-VH-X-VK-HSA-COOH および(ii) NH2-L-VK-X-VH-HSA-COOH［ここで、Lはリーダー配列であり、VHはヒト化抗体重鎖可変領域であり、Xは連結ポリペプチドであり、HSAはヒト血清アルブミンであり、そしてVKはヒト化抗体軽鎖可変領域である］からなる群より選択される式を有する；
(c) 請求項18(b)のscFv HSA融合分子のscFv部分がHSAのC末端に発現され、そのポリペプチドが、(i) NH2-HSA-VH-X-VK-COOH および(ii) NH2-HSA-VK-X-VH-COOH［ここで、Lはリーダー配列であり、VHはヒト化抗体重鎖可変領域であり、Xは連結ポリペプチドであり、HSAはヒト血清アルブミンであり、そしてVKはヒト化抗体軽鎖可変領域である］からなる群より選択される式を有する；
(d) 請求項18(c)の抗原結合性ポリペプチドにおいて、Fab HSA融合分子の重鎖部分がHSAのNまたはC末端に発現され、そのポリペプチドが、(i) NH2-VH-CH1-HSA-COOH および(ii) NH2-HSA-VH-CH1-COOH［ここで、VHはヒト化抗体重鎖可変領域であり、CH1は重鎖定常ドメイン1であり、そしてHSAはヒト血清アルブミンである］からなる群より選択される式を有する；または
(e) 請求項18(c)の抗原結合性ポリペプチドにおいて、Fab HSA融合分子の軽鎖部分がHSAのNまたはC末端に発現され、そのポリペプチドが、(i) NH2-VK-CK-HSA-COOH および(ii) NH2-HSA-VK-CK-COOH［ここで、VKはヒト化抗体軽鎖可変領域であり、CKは軽鎖定常ドメインであり、そしてHSAはヒト血清アルブミンである］からなる群より選択される式を有する；
請求項18に記載の抗原結合性ポリペプチド。
【請求項２０】
治療薬または診断薬にコンジュゲートされた、請求項1〜19のいずれか一項に記載の抗原結合性ポリペプチド。
【請求項２１】
(a) 治療薬が細胞毒性薬、放射性標識、免疫調節剤、ホルモン、酵素、オリゴヌクレオチド、光活性治療薬、およびこれらの組合せからなる群より選択される；または
(b) 診断薬が放射性標識、光活性診断薬、超音波増強剤、および非放射性標識からなる群より選択される；
請求項20に記載の抗原結合性ポリペプチド。
【請求項２２】
(a) 前記ポリペプチドがLIGHTのアンタゴニストである；または
(b) 前記ポリペプチドがLIGHTのアゴニストではない；
請求項1〜21のいずれか一項に記載の抗原結合性ポリペプチド。
【請求項２３】
前記ポリペプチドが、好ましくは約108M-1〜約1010M-1のKdでLIGHTと結合する、請求項1〜22のいずれか一項に記載の抗原結合性ポリペプチド。
【請求項２４】
請求項1〜23のいずれか一項に記載の抗原結合性ポリペプチドおよび担体を含有する医薬組成物。
【請求項２５】
別の治療薬または診断薬をさらに含む、請求項24に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
請求項24または25に記載の組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、疾患または症状を治療または診断する方法であって、前記疾患または症状が、炎症性疾患もしくは症状、免疫性疾患もしくは症状、悪性疾患もしくは症状、自己免疫疾患、炎症性腸疾患(IBD)、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、関節炎、関節リウマチ、多発性硬化症、移植拒絶反応、移植片対宿主病(GVHD)、中枢神経系損傷、Th1介在性腸疾患、クローン病、乾癬、白血病、リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、アテローム性動脈硬化症、肺癌、大腸癌、および肝炎からなる群より選択される、上記方法。
【請求項２７】
請求項1〜23のいずれか一項に記載の抗原結合性ポリペプチドのいずれか1つをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２８】
請求項27に記載のポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーター配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２９】
請求項27または28に記載のポリヌクレオチドで形質転換されている、単離された細胞。
【請求項３０】
請求項27または28に記載のポリヌクレオチドによりコードされた抗原結合性ポリペプチドを生産する方法であって、
a) 前記ポリヌクレオチドで形質転換された細胞を培養して、コードされた抗原結合性ポリペプチドを発現させること；および
b) そのように発現させた抗原結合性ポリペプチドを回収すること
を含む、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は2009年3月24日付け米国仮出願第61/202,661号の優先権の恩典を主張するものである。米国仮出願第61/202,661号の全内容を参照により本明細書に組み入れる。
【０００２】
本発明は、LIGHTポリペプチドと特異的に結合する抗原結合性ポリペプチド、ならびに前記ポリペプチドの作製方法および使用方法に関する。特に、本発明はLIGHTポリペプチドと特異的に結合するヒト化抗原結合性ポリペプチドに関する。抗原結合性ポリペプチドは免疫性、炎症性および悪性の疾患および症状、例えば、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、関節リウマチ、移植などの治療および診断に有用である。
【背景技術】
【０００３】
腫瘍壊死因子(TNF)と構造的に関連するタンパク質は総称してTNFスーパーファミリーと呼ばれている。TNFスーパーファミリーの一員であるLIGHTは、活性化T細胞と未成熟な樹状細胞に発現する(Tamada et al., J. Immunology. 2000)。LIGHTはII型膜貫通タンパク質であり、TNFスーパーファミリーのメンバー14 (TNFSF14)と称されており、また、TL5、LTg、CD258およびHVEMLとも呼ばれている。LIGHTはT共刺激分子であって、T細胞の増殖とサイトカインの産生を誘導する(Tamada K. et al., Nat. Med. 2000)。LIGHTはまた、単球および内皮細胞において炎症反応をも引き起こす(Otterdal et al., Blood 2006; Chang et al., J. Biomed. Sci. 2005)。
【０００４】
LIGHTは、異なる細胞型に発現する3つの明確に区別される受容体、すなわち、T細胞とB細胞に発現するヘルペスウイルス侵入メディエーター(herpes virus entry mediator: HVEM) (Kwon et al., J. Biol. Chem 1997)、間質細胞と非造血細胞に発現するリンホトキシンβ受容体(LTβR) (Ettinger et al., Curr Top Microbiol Immunol. 2000)、およびデコイ受容体3/TR6、に結合する。樹状細胞とT細胞の両方に発現するLIGHTはT細胞の増殖とサイトカインの産生を増強させる。rLIGHTは直接T細胞応答を共刺激することができる (Tamada K. et al., Nat. Med. 2000)。
【０００５】
さまざまな炎症および疾患状態におけるLIGHTの役割は、LIGHT欠損モデルおよびLIGHT過剰発現型トランスジェニック動物を用いる各種モデルによって実証されている。マウスでLIGHTを過剰に発現させると、結果的に、過剰に活性化した末梢T細胞の集団と、重症の自己免疫疾患の自然発生が生じる(Wang et al., J. Clin. Invest. 2001)。LIGHTの標的破壊は、Th1型免疫反応およびT細胞の共刺激活性化の異常を引き起こす (Scheu et al., J. Exp. Med. 2002; Xu et al. J. Immunol. 2007)。
【０００６】
T細胞に対するその強力な刺激活性化のため、LIGHTは慢性炎症の重要な成分である。したがって、LIGHTに対する抗体、特にLIGHTアンタゴニスト抗体は慢性炎症に関連する疾患の治療に有用であろう。そうした疾患には以下で説明する疾患が含まれるが、それらに限定されない。
【０００７】
腸管内菌叢に対する免疫反応の調節不全は炎症性腸疾患(IBD)の主な原因となる。IBDでは、その異常な免疫反応においてヘルパーT細胞が不可欠な役割を果たしている。特に、Th1細胞はクローン病に関係している。腸の炎症におけるLIGHTの重要な役割がいくつかの研究によって実証されている。LIGHTを過剰発現するトランスジェニックマウスは、T細胞介在性の自己免疫疾患にかかりやすく、LIGHTトランスジェニックマウスは重度のT細胞介在性腸炎症を呈して、大腸炎を発症する(Wang J. et al., J. Clin. Invest. 2004; Wang J. et al., J. Immunol 2005; Wang et al., J. Clin. Invest 2001; Shaikh et al., J. Immunol. 2001)。さらに、可溶性LTβR-FcによってLIGHTとその受容体との相互作用を遮断すると、TNBS誘発性大腸炎が軽減される(An, MM et al., Pharmacol. Res. 2005)。LIGHTは、ヒト染色体19p13.312-14上のIBD感受性遺伝子座と重なり合う領域に位置している(Rioux et al., Am. J. Hum. Genet. (2000); Bonen et al., Gastroenterology (2003))。
【０００８】
高レベルのLIGHTタンパク質は関節リウマチ(RA)の患者の滑液中に検出されている。例えば、「RA患者由来の滑膜線維芽細胞における組換えLIGHT誘発炎症性メディエーター」(Pierer et al., Rheumatology (2007); Kang et al., Arthritis & Rheumatism (2007))および「LIGHT-受容体相互作用のブロックはコラーゲン誘発関節炎の発症を予防する」(Fava et al., J. Immunol. (2003))を参照されたい。最後に、2007年11月に、Biogen IDEC社は、RA患者のための第IIa相臨床試験でのバミネルセプト(baminercept)(LTβR-Fc融合タンパク質)の使用を発表した（2007年11月9日付けのBiogen IDEC社の報道発表）。
【０００９】
LIGHTは肝炎の実験モデルにおいてアップレギュレートされる。LIGHTとLIGHT受容体の相互作用を、抗体または可溶性LTβRで処理することによりブロックすると、それは肝炎症を大幅に軽減し、かつ炎症性サイトカインの産生を低下させて、致死性の肝炎からマウスを保護した(Anand et al., J. Clin. Invest. (2006); An et al. Biol. Pharm. Bull. (2006))。
【００１０】
いくつかの研究は、LIGHT-受容体相互作用のブロックが移植片対宿主病(GVHD)を予防し、また、動物モデルにおいて移植片の生存を長引かせることを実証している(Xu et al., Blood (2007); Ye et al., J. Exp. Med. (2002); Fan et al., Transplantation (2007))。
【００１１】
上記の研究に加えて、LIGHT受容体(LTβRおよびHVEM)のブロックは、コラーゲン誘導関節炎(CIA)、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)(多発性硬化症(MS)の動物モデル)など、さまざまな動物モデルにおいて疾患の兆候を劇的に減少させる(Fava et al., J Immunol. (2003); Suen et al., J. Exp. Med. (1997))。LIGHTノックアウトマウスはさらにIL-12の産生が不十分であり、その結果、炎症性刺激に対するIFNγ介在性の抗原特異的Th1応答を発生する能力に欠けている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
こうして、当技術分野では、炎症性、悪性および自己免疫性の疾患および症状、例えば多発性硬化症、IBDおよびRA、ならびに先に記載したまたは当技術分野で知られた他の疾患を治療するために、LIGHTと特異的に結合する抗原結合性ポリペプチドおよびアンタゴニスト抗原結合性ポリペプチドを作製することが求められている。LIGHTと特異的に結合する抗原結合性ポリペプチドおよびアンタゴニスト抗原結合性ポリペプチドは、可溶性受容体の使用と比べて、以下のようないくつかの利点を有する：1) 抗体は、Fc融合タンパク質と比べて、血流中でより長い半減期を有する；2) 可溶性受容体と比べてLIGHTに対するより高い親和性をもつように抗体を設計できるので、抗体がより高い効力を有する；3) 抗体は、LIGHTに対する特異性のため、可溶性受容体のより安全な代替物である。LIGHTアンタゴニスト抗体はLIGHT介在シグナル伝達をブロックするだけであり、かくして、可溶性受容体による二次リンパ組織アーキテクチャの全身枯渇（最終的に免疫抑制を招くことがある）を引き起こすことなく、局所炎症プロセスを改善するだろう。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、炎症性疾患におけるLIGHTポリペプチドの役割に基づくものである。特に、本発明は、IFN-γやIL-8などの前炎症性サイトカインを刺激すると同時に、CD3共刺激Th17細胞によるIL-17産生の強力な刺激因子でもある、LIGHTの能力に基づくものである。LIGHTとIL-17産生との関連性は特に重要である。というのは、Th17細胞は、多発性硬化症(MS)、炎症性腸疾患(IBD)、関節リウマチ(RA)などの、すべての主な自己免疫疾患において持続的炎症と組織損傷を引き起こす炎症プロセスの重要な駆動要因であることが最近発見されたからである。
【００１４】
本発明は一般に、LIGHT（GenBankアクセッション番号AF036581参照、その全体を参照により本明細書に組み入れる）としても知られている、TNF様サイトカインTL5と特異的に結合する抗原結合性ポリペプチドに関する。特定の実施形態において、本発明の抗原結合性ポリペプチドはヒト化重鎖可変領域(VH)とヒト化軽鎖可変領域(VK)を含む。例えば、特定の実施形態では、本発明の抗原結合性ポリペプチドは、実質的に親モノクローナル抗体の抗原結合特異性（すなわち、相補性決定領域(CDR)）を保持しながら、ヒト抗体の軽鎖および重鎖可変領域のフレームワーク(FR)領域を含む。ヒト化重鎖可変領域および/またはヒト化軽鎖可変領域は、CDRを除いて、少なくとも約87％ヒト化され、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約98％、または少なくとも約100％ヒト化される。抗原結合性ポリペプチド分子はモノクローナル抗体ドナー（例えば、マウスモノクローナル抗体ドナー）から誘導され、そのモノクローナル抗体由来のCDR（例えば、マウスモノクローナルCDR）を含む。特定の実施形態では、本発明の抗原結合性ポリペプチドはLIGHT活性のアンタゴニストおよび/またはLIGHTとLIGHT受容体との相互作用のアンタゴニストである。
【００１５】
本発明の特定の実施形態は、
(1) X1Y X2X3X4 (配列番号18)［ここで、X1はアミノ酸D、S、TまたはNであり; X2はアミノ酸Y、LまたはWであり; X3はアミノ酸IまたはMであり; そしてX4はアミノ酸Y、H、EまたはNである］のアミノ酸配列を含むCDR-H1; 
(2) X5IX6PX7X8X9X10X11X12X13NX14X15FX16X17 (配列番号19)［ここで、X5はアミノ酸Y、M、VまたはWであり; X6はアミノ酸D、N、HまたはFであり; X7はアミノ酸Y、GまたはSであり; X8はアミノ酸N、S、TまたはDであり; X9はアミノ酸G、SまたはDであり; X10はアミノ酸G、D、EまたはIであり; X11はアミノ酸TまたはSであり; X12はアミノ酸KまたはRであり; X13はアミノ酸YまたはLであり; X14はアミノ酸QまたはEであり; X15はアミノ酸KまたはNであり; X16はアミノ酸K、IまたはRであり; そしてX17はアミノ酸G、AまたはDである］のアミノ酸配列を含むCDR-H2; ならびに
(3) (i) WX18X19 (配列番号20); (ii) X20X21X22X23X24X25X26X27X28 (配列番号21); および(iii) X20X21X22X23X24X25X26X27X28AMDF (配列番号22)［ここで、X18はアミノ酸DまたはNであり; X19はアミノ酸RまたはYであり; X20はアミノ酸E、TまたはGであり; X21はアミノ酸D、Sまたは Nであり; X22はアミノ酸YまたはGであり; X23はアミノ酸G、SまたはVであり; X24はアミノ酸I、SまたはWであり; X25はアミノ酸S、WまたはAであり; X26はアミノ酸T、FまたはMであり; X27はアミノ酸Y、PまたはDであり; そしてX28はアミノ酸SまたはYである］からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR-H3
を含むヒト化抗体重鎖可変領域を含む、LIGHTポリペプチドと特異的に結合する抗原結合性ポリペプチドを包含する。
【００１６】
本発明の特定の実施形態は、
(1) (i) X29X30SX31X32X33X34X35X36X37X38 (配列番号38); (ii) X29X30SX31X32X33X34X35X36X37X38X39X40X41X42 (配列番号39); および(iii) X29X30SX31X32X33X34X35X36X37X38X39X40X41X42H (配列番号40)［ここで、X29はアミノ酸KまたはRであり; X30はアミノ酸AまたはSであり; X31はアミノ酸QまたはKであり; X32はアミノ酸D、SまたはNであり; X33はアミノ酸V、IまたはLであり; X34はアミノ酸G、S、VまたはLであり; X35はアミノ酸T、NまたはHであり; X36はアミノ酸A、NまたはSであり; X37はアミノ酸V、L、NまたはGであり; X38はアミノ酸A、H、GまたはYであり; X39はアミノ酸NまたはTであり; X40はアミノ酸TまたはYであり; X41はアミノ酸YまたはMであり; X42はアミノ酸FまたはHである］からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR-L1;
(2) X43X44X45X46X47X48X49 (配列番号41)［ここで、X43はアミノ酸W、Y、KまたはIであり; X44はアミノ酸A、TまたはVであり; X45はアミノ酸SまたはYであり; X46はアミノ酸T、QまたはNであり; X47はアミノ酸R、SまたはLであり; X48はアミノ酸H、I、FまたはEであり; そしてX49はアミノ酸TまたはSである］のアミノ酸配列を含むCDR-L2; ならびに
(3) X50X51X52X53X54X55PX56T (配列番号42)［ここで、X50はアミノ酸QまたはSであり; X51はアミノ酸QまたはHであり; X52はアミノ酸SまたはYであり; X53はアミノ酸S、N、TまたはRであり; X54はアミノ酸S、R、HまたはEであり; X55はアミノ酸Y、W、VまたはLであり; そしてX56はアミノ酸LまたはYである］のアミノ酸配列を含むCDR-L3
を含むヒト化抗体軽鎖可変領域を含む、LIGHTポリペプチドと特異的に結合する抗原結合性ポリペプチドを包含する。
【００１７】
本発明の特定の実施形態は、
(1) X1Y X2X3X4 (配列番号18)［ここで、X1はアミノ酸D、S、TまたはNであり; X2はアミノ酸Y、LまたはWであり; X3はアミノ酸IまたはMであり; そしてX4はアミノ酸Y、H、EまたはNである］のアミノ酸配列を含むCDR-H1; 
(2) X5IX6PX7X8X9X10X11X12X13NX14X15FX16X17 (配列番号19)［ここで、X5はアミノ酸Y、M、VまたはWであり; X6はアミノ酸D、N、HまたはFであり; X7はアミノ酸Y、GまたはSであり; X8はアミノ酸N、S、TまたはDであり; X9はアミノ酸G、SまたはDであり; X10はアミノ酸G、D、EまたはIであり; X11はアミノ酸TまたはSであり; X12はアミノ酸KまたはRであり; X13はアミノ酸YまたはLであり; X14はアミノ酸QまたはEであり; X15はアミノ酸KまたはNであり; X16はアミノ酸K、IまたはRであり; そしてX17はアミノ酸G、AまたはDである］のアミノ酸配列を含むCDR-H2; ならびに
(3) (i) WX18X19 (配列番号20); (ii) X20X21X22X23X24X25X26X27X28 (配列番号21); および(iii) X20X21X22X23X24X25X26X27X28AMDF (配列番号22)［ここで、X18はアミノ酸DまたはNであり; X19はアミノ酸RまたはYであり; X20はアミノ酸E、TまたはGであり; X21はアミノ酸D、Sまたは Nであり; X22はアミノ酸YまたはGであり; X23はアミノ酸G、SまたはVであり; X24はアミノ酸I、SまたはWであり; X25はアミノ酸S、WまたはAであり; X26はアミノ酸T、FまたはMであり; X27はアミノ酸Y、PまたはDであり; そしてX28はアミノ酸SまたはYである］からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR-H3
を含むヒト化抗体重鎖可変領域と； 
(1) (i) X29X30SX31X32X33X34X35X36X37X38 (配列番号38); (ii) X29X30SX31X32X33X34 X35X36X37X38X39X40X41X42 (配列番号39); および(iii) X29X30SX31X32X33X34X35X36X37X38 X39X40X41X42H (配列番号40)［ここで、X29はアミノ酸KまたはRであり; X30はアミノ酸AまたはSであり; X31はアミノ酸QまたはKであり; X32はアミノ酸D、SまたはNであり; X33はアミノ酸V、IまたはLであり; X34はアミノ酸G、S、VまたはLであり; X35はアミノ酸T、NまたはHであり; X36はアミノ酸A、NまたはSであり; X37はアミノ酸V、L、NまたはGであり; X38はアミノ酸A、H、GまたはYであり; X39はアミノ酸NまたはTであり; X40はアミノ酸TまたはYであり; X41はアミノ酸YまたはMであり; X42はアミノ酸FまたはHである］からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR-L1;
(2) X43X44X45X46X47X48X49 (配列番号41)［ここで、X43はアミノ酸W、Y、KまたはIであり; X44はアミノ酸A、TまたはVであり; X45はアミノ酸SまたはYであり; X46はアミノ酸T、QまたはNであり; X47はアミノ酸R、SまたはLであり; X48はアミノ酸H、I、FまたはEであり; そしてX49はアミノ酸TまたはSである］のアミノ酸配列を含むCDR-L2; ならびに
(3) X50X51X52X53X54X55PX56T (配列番号42)［ここで、X50はアミノ酸QまたはSであり; X51はアミノ酸QまたはHであり; X52はアミノ酸SまたはYであり; X53はアミノ酸S、N、TまたはRであり; X54はアミノ酸S、R、HまたはEであり; X55はアミノ酸Y、W、VまたはLであり; そしてX56はアミノ酸LまたはYである］のアミノ酸配列を含むCDR-L3
を含むヒト化抗体軽鎖可変領域と
を含む、LIGHTポリペプチドと特異的に結合する抗原結合性ポリペプチドを包含する。
【００１８】
本発明の特定の実施形態は、
(1) (i) SSYIH (配列番号23); (ii) DYYIY (配列番号26); (iii) TYLIE (配列番号29); (iv) TYWMN (配列番号32); および(v) NYLIE (配列番号35)からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR-H1；
(2) (i) WIFPGSDITKYNEKFKG (配列番号24); (ii) YIDPYNGGTKYNQKFKD (配列番号27); (iii) VINPGTGETKYNENFRA (配列番号30); (iv) MIHPSDSESRLNQKFID (配列番号33); および(v) VINPGSGDTKYNENFKG (配列番号36)からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR-H2；ならびに
(3) (i) EDYGISTYSAMDF (配列番号25); (ii) TSGSSWFPY (配列番号28); (iii) WDR (配列番号31); (iv) GNYVWAMDY (配列番号34); および(v) WNY (配列番号37)からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR-H3
を含むヒト化抗体重鎖可変領域を含む、LIGHTポリペプチドと特異的に結合する抗原結合性ポリペプチドを包含する。
【００１９】
本発明の特定の実施形態は、
(1) (i) KASQDVGTAVA (配列番号43); (ii) RASQSISNNLH (配列番号46); (iii) RSSQNLVHSNGNTYFH (配列番号49); (iv) RASKSVSTSGYTYMH (配列番号52); および(v) RSSQSLLHSNGNTYFH (配列番号55)からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR-L1；
(2) (i) WASTRHT (配列番号44); (ii) YTYQSIS (配列番号47); (iii) KVSNRFS (配列番号50); および(iv) ITSNLES (配列番号53)からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR-L2；ならびに
(3) (i) QQYSSYPLT (配列番号45); (ii) QQSNRWPLT (配列番号48); (iii) SQSTHVPYT (配列番号51); および(iv) QHSRELPYT (配列番号54) からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR-L3
を含むヒト化抗体軽鎖可変領域を含む、LIGHTポリペプチドと特異的に結合する抗原結合性ポリペプチドを包含する。
【００２０】
本発明のさらなる実施形態は、(1) アミノ酸配列SYYIH (配列番号23)を含むCDR-H1；(2) アミノ酸配列WIFPGSDITKYNEKFKG (配列番号24)を含むCDR-H2；および(3) アミノ酸配列EDYGISTYSAMDF (配列番号25)を含むCDR-H3を含むヒト化抗体重鎖可変領域、ならびに/あるいは(1) アミノ酸配列KASQDVGTAVA (配列番号43)を含むCDR-L1；(2) アミノ酸配列WASTRHT (配列番号44)を含むCDR-L2；および(3) アミノ酸配列QQYSSYPLT (配列番号45)を含むCDR-L3を含むヒト化抗体軽鎖可変領域を含む、LIGHTポリペプチドと特異的に結合する抗原結合性ポリペプチドを包含する。
【００２１】
本発明の実施形態はさらに、以下のアミノ酸配列：
(1)QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTX1YX2X3X4WVRQAPGQX'1LEWX'2GX5IX6PX7X8X9X10X11X12X13NX14X15FX16X17X'3X'4TX'5TX'6DX'7SX'8STX'9YMELSX'10LRSX'11DTAVYYCARWX18X19WGQGTLVTVSS (配列番号1); 
(2)QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTX1YX2X3X4WVRQAPGQX'1LEWX'2GX5IX6PX7X8X9X10X11X12X13NX14X15FX16X17X'3X'4TX'5TX'6DX'7SX'8STX'9YMELSX'10LRSX'11DTAVYYCARX20X21X22X23X24X25X26X27X28WGQGTLVTVSS (配列番号2); および
(3)QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTX1YX2X3X4WVRQAPGQX'1LEWX'2GX5IX6PX7X8X9X10X11X12X13NX14X15FX16X17X'3X'4TX'5TX'6DX'7SX'8STX'9YMELSX'10LRSX'11DTAVYYCARX20X21X22X23X24X25X26X27X28AMDFWGQGTLVTVSS (配列番号3); 
［ここで、X1はアミノ酸D、S、TまたはNであり; X2はアミノ酸Y、LまたはWであり; X3はアミノ酸IまたはMであり; X4はアミノ酸Y、H、EまたはNであり; X5はアミノ酸Y、M、VまたはWであり; X6はアミノ酸D、N、HまたはFであり; X7はアミノ酸Y、GまたはSであり; X8はアミノ酸N、S、TまたはDであり; X9はアミノ酸G、SまたはDであり; X10はアミノ酸G、D、EまたはIであり; X11はアミノ酸TまたはSであり; X12はアミノ酸KまたはRであり; X13はアミノ酸YまたはLであり; X14はアミノ酸QまたはEであり; X15はアミノ酸KまたはNであり; X16はアミノ酸K、IまたはRであり; X17はアミノ酸G、AまたはDであり; X18はアミノ酸DまたはNであり; X19はアミノ酸RまたはYであり; X20はアミノ酸E、TまたはGであり; X21はアミノ酸D、SまたはNであり; X22はアミノ酸YまたはGであり; X23はアミノ酸G、SまたはVであり; X24はアミノ酸I、SまたはWであり; X25はアミノ酸S、WまたはAであり; X26はアミノ酸T、FまたはMであり; X27はアミノ酸Y、PまたはDであり; X28はアミノ酸SまたはYであり; さらにここで、X'1はアミノ酸RまたはGであり; X'2はアミノ酸MまたはIであり; X'3はアミノ酸KまたはRであり; X'4はアミノ酸VまたはAであり; X'5はアミノ酸M、LまたはIであり; X'6はアミノ酸VまたはRであり; X'7はアミノ酸TまたはKであり; X'8はアミノ酸A、IまたはTであり; X'9はアミノ酸VまたはAであり; X'10はアミノ酸RまたはSであり; そしてX'11はアミノ酸DまたはEである］
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むヒト化抗体重鎖可変領域を含む、LIGHTポリペプチドと特異的に結合する抗原結合性ポリペプチドをも包含する。
【００２２】
本発明の特定の実施形態は、以下のアミノ酸配列：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQRLEWMGWIFPGSDITKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREDYGISTYSAMDFWGQGTLVTVSS (配列番号4); 
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYIYWVRQAPGQGLEWIGYIDPYNGGTKYNQKFKDRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARTSGSSWFPYWGQGTLVTVSS (配列番号5); 
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYIYWVRQAPGQGLEWIGYIDPYNGGTKYNQKFKDKATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARTSGSSWFPYWGQGTLVTVSS (配列番号6); 
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYLIEWVRQAPGQGLEWMGVINPGTGETKYNENFRARVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARWDRWGQGTLVTVSS (配列番号7); および
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYWMNWVRQAPGQGLEWMGMIHPSDSESRLNQKFIDRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGNYVWAMDYWGQGTLVTVSS (配列番号8)
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むヒト化抗体重鎖可変領域を含む、LIGHTポリペプチドと特異的に結合する抗原結合性ポリペプチドを包含する。
【００２３】
本発明の特定の実施形態は、以下のアミノ酸配列：
(1)X'12X'13X'14X'15TQX'16PX'17X'18X'19X'20X'21X'22X'23X'24X'25X'26X'27X'28X'29X'30CX29X30SX31X32X33X34X35X36X37X38WX'31X'32QX'33PX'34X'35X'36PX'37X'38LIX'39X43X44X45X46X47X48X49GX'40PX'41RFSGSGSGTX'42FTLX'43IX'44X'45X'46X'47X'48EDX'49X'50X'51YYCX50X51X52X53 X54X55PX56TFGQGTX'52VEIKR (配列番号9); 
(2)X'12X'13X'14X'15TQX'16PX'17X'18X'19X'20X'21X'22X'23X'24X'25X'26X'27X'28X'29X'30CX29X30SX31X32X33X34X35X36X37X38X39X40X41X42WX'31X'32QX'33PX'34X'35X'36X'37X'38LIX'39X43X44X45X46X47X48X49GX'40PX'41RFSGSGSGTX'42FTLX'43IX'44X'45X'46X'47X'48EDX'49X'50X'51YYCX50X51X52X53X54X55PX56TFGQGTX'52VEIKR (配列番号10); および
(3)X'12X'13X'14X'15TQX'16PX'17X'18X'19X'20X'21X'22X'23X'24X'25X'26X'27X'28X'29X'30CX29X30SX31X32X33X34X35X36X37X38X39X40X41X42HWX'31X'32QX'33PX'34X'35X'36X'37X'38LIX'39X43X44X45X46X47X48X49GX'40PX'41RFSGSGSGTX'42FTLX'43IX'44X'45X'46X'47X'48EDX'49X'50X'51YYCX50X51X52X53X54X55PX56TFGQGTX'52VEIKR (配列番号11);
［ここで、X29はアミノ酸KまたはRであり; X30はアミノ酸AまたはSであり; X31はアミノ酸QまたはKであり; X32はアミノ酸D、SまたはNであり; X33はアミノ酸V、IまたはLであり; X34はアミノ酸G、S、VまたはLであり; X35はアミノ酸T、NまたはHであり; X36はアミノ酸A、NまたはSであり; X37はアミノ酸V、L、NまたはGであり; X38はアミノ酸A、H、GまたはYであり; X39はアミノ酸NまたはTであり; X40はアミノ酸TまたはYであり; X41はアミノ酸YまたはMであり; X42はアミノ酸FまたはHであり; X43はアミノ酸W、Y、KまたはIであり; X44はアミノ酸A、TまたはVであり; X45はアミノ酸SまたはYであり; X46はアミノ酸T、QまたはNであり; X47はアミノ酸R、SまたはLであり; X48はアミノ酸H、I、FまたはEであり; X49はアミノ酸TまたはSであり; X50はアミノ酸QまたはSであり; X51はアミノ酸QまたはHであり; X52はアミノ酸SまたはYであり; X53はアミノ酸S、N、TまたはRであり; X54はアミノ酸S、R、HまたはEであり; X55はアミノ酸Y、W、VまたはLであり; X56はアミノ酸LまたはYであり; さらにここで、X'12はアミノ酸DまたはEであり; X'13はアミノ酸IまたはVであり; X'14はアミノ酸VまたはQであり; X'15はアミノ酸MまたはLであり; X'16はアミノ酸SまたはTであり; X'17はアミノ酸S、D、AまたはLであり; X'18はアミノ酸S、TまたはFであり; X'19はアミノ酸LまたはQであり; X'20はアミノ酸A、SまたはPであり; X'21はアミノ酸VまたはAであり; X'22はアミノ酸SまたはTであり; X'23はアミノ酸P、LまたはVであり; X'24はアミノ酸GまたはKであり; X'25はアミノ酸E、QまたはDであり; X'26はアミノ酸R、KまたはPであり; X'27はアミノ酸AまたはVであり; X'28はアミノ酸TまたはSであり; X'29はアミノ酸IまたはLであり; X'30はアミノ酸S、TまたはNであり; X'31はアミノ酸FまたはYであり; X'32はアミノ酸QまたはLであり; X'33はアミノ酸KまたはRであり; X'34はアミノ酸GまたはDであり; X'35はアミノ酸QまたはKであり; X'36はアミノ酸A、SまたはPであり; X'37はアミノ酸K、RまたはQであり; X'38はアミノ酸LまたはRであり; X'39はアミノ酸YまたはKであり; X'40はアミノ酸VまたはIであり; X'41はアミノ酸S、AまたはDであり; X'42はアミノ酸DまたはEであり; X'43はアミノ酸KまたはTであり; X'44はアミノ酸SまたはNであり; X'45はアミノ酸SまたはRであり; X'46はアミノ酸VまたはLであり; X'47はアミノ酸QまたはEであり; X'48はアミノ酸P、AまたはSであり; X'49はアミノ酸F、AまたはVであり; X'50はアミノ酸AまたはGであり; X'51はアミノ酸TまたはVであり; そしてX'52はアミノ酸RまたはKである］
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むヒト化抗体軽鎖可変領域を含む、LIGHTポリペプチドと特異的に結合する抗原結合性ポリペプチドを包含する。
【００２４】
本発明の特定の実施形態はさらに、以下のアミノ酸配列：
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQDVGTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSYPLTFGQGTKVEIKR (配列番号12);
EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQSISNNLHWYQQKPDQSPKLLIKYTYQSISGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQSNRWPLTFGQGTKVEIKR (配列番号13);
EIVMTQSPATLSVSPGEKATLSCRASQSISNNLHWYQQKPGQAPRLLIYYTYQSISGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQSNRWPLTFGQGTRVEIKR (配列番号14);
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQNLVHSNGNTYFHWFQQRPGQSPRRLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPYTFGQGTKVEIKR (配列番号15);
DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQNLVHSNGNTYFHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPYTFGQGTKVEIKR (配列番号16); および
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASKSVSTSGYTYMHWYQQKPGQPPKLLIYITSNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQHSRELPYTFGQGTKVEIKR (配列番号17)
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むヒト化抗体軽鎖可変領域を含む、LIGHTポリペプチドと特異的に結合する抗原結合性ポリペプチドをも包含する。
【００２５】
本発明の特定の実施形態は、
(a)アミノ酸配列：QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQRLEWMGWIFPGSDITKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREDYGISTYSAMDFWGQGTLVTVSS (配列番号4)を含む重鎖可変領域、および
(b)アミノ酸配列：DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQDVGTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQP EDFATYYCQQYSSYPLTFGQGTKVEIKR (配列番号12)を含む軽鎖可変領域
を含む、LIGHTポリペプチドと特異的に結合する抗原結合性ポリペプチドを包含する。
【００２６】
本発明の特定の実施形態において、LIGHTポリペプチドと特異的に結合する抗原結合性ポリペプチドは、上記のヒト化重鎖またはヒト化軽鎖またはこれらの組合せのいずれかを含む。さらに、特定の実施形態において、本発明の抗原結合性ポリペプチドは、重鎖由来の上記CDR領域（すなわち、CDR-H1、CDR-H2もしくはCDR-H3）のうち1つ以上、または軽鎖由来の上記CDR領域（すなわち、CDR-L1、CDR-L2もしくはCDR-L3）のうち1つ以上、またはこれらの組合せを含む。
【００２７】
本発明の他の実施形態において、LIGHTポリペプチドと特異的に結合する抗原結合性ポリペプチドは、抗体分子またはそのフラグメント、例えばFabフラグメント、Fab'フラグメント、F(ab')2フラグメントもしくはscFv分子である。
【００２８】
特定の実施形態において、抗原結合性ポリペプチドは抗体分子である。抗体分子には、例えばヒト重鎖定常領域とヒト軽鎖定常領域に融合されたマウス重鎖可変領域とマウス軽鎖可変領域を含む、キメラ抗体が含まれる。他の実施形態では、抗原結合性ポリペプチドは、NH2-L-VH-X-VK-COOHおよびNH2-L-VK-X-VH-COOHからなる群より選択される式のポリペプチドを含むscFv分子であり、ここにおいて、Lはリーダー配列であり、VHはヒト化抗体重鎖可変領域であり、Xは連結ポリペプチドであり、そしてVKはヒト化抗体軽鎖可変領域である。さらなる実施形態では、scFv分子がヒト血清アルブミンポリペプチド(HSA)に融合または連結されて、scFV HSA融合分子を得る。scFv分子はHSAのN-またはC-末端に融合または連結される。他の実施形態では、抗原結合性ポリペプチドがFabフラグメントである。本発明のFabフラグメントはHSAに融合または連結することができる。Fabフラグメントの重鎖または軽鎖がHSAのN-またはC-末端に融合または連結される。
【００２９】
本発明の特定の実施形態は、治療薬または診断薬にコンジュゲート化または融合された抗原結合性ポリペプチドを包含する。例えば、治療薬は、細胞毒性薬、放射性標識、免疫調節剤、ホルモン、酵素、オリゴヌクレオチド、光活性治療薬およびこれらの組合せからなる群より選択される。診断薬の例としては、放射性標識、光活性診断薬、超音波増強剤または非放射性標識が挙げられる。
【００３０】
本発明の特定の実施形態はまた、本発明の抗原結合性ポリペプチドを含有する組成物ならびに前記ポリペプチドの作製方法をも包含する。さらに、本発明の実施形態は、本発明の抗原結合性ポリペプチドまたは組成物をそれが必要な患者に投与することを含む、炎症性、免疫性または悪性の疾患または症状を治療または診断する方法を包含する。他の実施形態において、本発明は、本発明の組成物を用いて疾患を治療する方法を包含し、かかる疾患としては、限定するものではないが、自己免疫疾患(例：紅斑性狼瘡)、炎症性腸疾患(IBD)、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、関節炎(例：関節リウマチ)、多発性硬化症、移植片対宿主病(GVHD)、移植拒絶反応、中枢神経系損傷、Th1介在性腸疾患(クローン病など)、乾癬、白血病またはリンパ腫(例：慢性リンパ球性白血病(CLL))、アテローム性動脈硬化症、肺癌および大腸癌(結腸癌)、ならびにウイルス感染症(肝炎など)が挙げられる。
【００３１】
特定の実施形態において、本発明は、上記の抗原結合性ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを包含する。ポリヌクレオチドはコードされたポリペプチドを適当な宿主細胞内で発現させるためのプロモーターに機能的に連結される。さらに、本発明の実施形態は、a)本発明の抗原結合性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドで形質転換された細胞を培養して、コードされたポリペプチドを発現させること；およびb)そのように発現させたポリペプチドを回収することを含む、本発明の抗原結合性ポリペプチドの生産方法を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図1は、フィコール密度勾配遠心法により血液から分離した末梢血リンパ球(PBL)からのTh1およびTh17細胞の分離を示す。単球を除いた後、Th1細胞については2μg/mL PHA＋IL-12および抗IL-4抗体と共に細胞を培養した。Th17細胞は、プレート結合抗CD3抗体＋可溶性抗CD28抗体またはIL-12＋IL-18を用いて37℃で2日間刺激した。細胞培養上清を回収し、IFN-γとIL-17の産生についてELISAで測定した。
【図２】図2は、LIGHTがTh17細胞においてIL-17産生をどのように誘導するかを示す。Th17細胞は、さまざまな濃度のLIGHTの存在下または不在下で、プレート結合抗CD3抗体を用いて37℃で2日間刺激した。細胞培養上清を回収し、IL-17産生をELISAにより測定した。
【図３】図3は、マウス抗LIGHTモノクローナル抗体10D11がLIGHT受容体へのLIGHTの結合をどのように阻害するかを示す。LIGHT受容体HVEM (TR2)、デコイ受容体3 (TR6)およびLTβRのFc融合体を、プロテインA捕捉を用いて96ウェルプレートにコーティングした。受容体へのLIGHT-ビオチン結合を、さまざまな濃度のLIGHT抗体の不在下または存在下で、ストレプトアビジン-HRPを用いて測定した。
【図４】図4は、マウス抗LIGHTモノクローナル抗体10D11が内皮細胞におけるLIGHT誘導IL-8産生をどのように阻害するかを示す。HUVEC細胞を96ウェルプレートにまいた。コンフルエントHUVEC細胞を、LIGHT抗体10D11および非中和対照19H9の不在下または存在下で、LIGHTを用いて5時間処理した。HUVECからのIL-8分泌をELISAにより測定した。
【図５Ａ】図5A〜Cは、種々の抗LIGHTマウスモノクローナル抗体がLIGHT誘発HT-29細胞アポトーシスをどのように阻害するかを示す。LIGHT/TL5は大腸癌細胞株HT-29において細胞死を誘導する。HT-29細胞の生死判別アッセイ(実施例2に記載)を用いて、LIGHT抗体の中和活性を測定した。HT-29細胞をIFN-γにより37℃で6時間前処理した。次に細胞を、さまざまな濃度の抗LIGHT抗体および対照抗体またはLTβR-Fcの不在下または存在下で、LIGHTと共に3日間培養した。細胞の生死はcell titer glo試薬(Promega社)により判定した。図5Aは、LIGHT誘発HT-29細胞アポトーシスを阻害するマウス抗LIGHTモノクローナル抗体10D11の能力を示す。
【図５Ｂ】図5Bは、ヒトLIGHT誘発HT-29細胞アポトーシスを阻害するマウス抗体5E10、13C7、14A10、14G8、15G4、7G5、18F1、2B12、16F12、18B1および10D11ABの能力を示す。
【図５Ｃ】図5Cは、カニクイザルLIGHT誘発HT-29細胞アポトーシスを阻害するマウス抗体5E10、13C7、14A10、14G8、15G4、7G5、18F1、2B12、16F12、18B1および10D11ABの能力を示す。
【図６Ａ】図6Aは、マウス抗LIGHT 10D11のVHドメインと、最も近縁のヒト生殖系列VH1-02とのアライメントを示す。このアライメントをテンプレートとして用いて、図6AにHum 10D11 VH＃1と特定された、ヒト化10D11 VHを作製した。
【図６Ｂ】図6Bは、マウス抗LIGHT 10D11のVHドメインと、CAI54212と特定された発現抗体VHドメイン(一部が図6AからのVH1-02生殖系列から誘導された)とのアライメントを示す。このアライメントをテンプレートとして用いて、図6BにHum 10D11 VH＃2と特定された、ヒト化10D11 VHを作製した。
【図６Ｃ】図6Cは、マウス抗LIGHT 10D11のVKドメインと、最も近縁のヒト生殖系列遺伝子A26とのアライメントを示す。このアライメントをテンプレートとして用いて、図6CにHum 10D11 VK＃1と特定された、ヒト化10D11 VKを作製した。
【図７】図7は、2つの異なるヒト化LIGHT抗体によるLIGHT誘発HT-29細胞アポトーシスの阻害を示す。HT-29細胞をIFN-γにより37℃で6時間前処理した。次に細胞を、さまざまな濃度のマウスおよびヒト化LIGHT抗体または対照抗体の不在下または存在下で、LIGHTと共に3日間培養した。細胞の生死はcell titer glo試薬(Promega社)により判定した。
【図８】図8は、完全ヒト化LIGHT抗体によるLIGHT誘発HT-29細胞アポトーシスの阻害を示す。HT-29細胞をIFN-γにより37℃で6時間前処理した。次に細胞を、さまざまな濃度のマウスおよびヒト化LIGHT抗体または対照抗体の不在下または存在下で、LIGHTと共に3日間培養した。細胞の生死はcell titer glo試薬(Promega社)により判定した。
【図９Ａ】図9Aは、対照抗体16H02と比較した、ヒト化抗体によるヒトLIGHT誘発HT-29細胞アポトーシスの阻害を示す。HT-29細胞をIFN-γにより37℃で6時間前処理した。次に細胞を、さまざまな濃度のマウスおよびヒト化LIGHT抗体または対照抗体の不在下または存在下で、LIGHTと共に3日間培養した。細胞の生死はcell titer glo試薬(Promega社)により判定した。
【図９Ｂ】図9Bは、対照抗体16H02と比較した、ヒト化抗体によるカニクイザルLIGHT誘発HT-29細胞アポトーシスの阻害を示す。HT-29細胞をIFN-γにより37℃で6時間前処理した。次に細胞を、さまざまな濃度のマウスおよびヒト化LIGHT抗体または対照抗体の不在下または存在下で、LIGHTと共に3日間培養した。細胞の生死はcell titer glo試薬(Promega社)により判定した。
【図１０Ａ】図10AおよびBは、活性化T細胞へのLIGHT抗体の結合を示す。Th1、Th2およびTh17細胞は、フィコール密度勾配遠心法により血液から分離した末梢血リンパ球(PBL)から生成させた。Th1およびTh17細胞は先に記載したとおりに生成させた(図1)。Th2細胞は、PBLを2μg/mLのPHA＋IL-4および抗IFN-α抗体と共に3日間培養することにより生成させた。3日後、細胞を5ng/mLのIL-12により維持した。細胞をホルボール12-ミリステート13-アセテート(PMA)およびイオノマイシン(Ionomycin)で24時間活性化させて、LIGHTの発現を誘導した。活性化T細胞へのLIGHT抗体の結合は、PEにコンジュゲート化したヤギ抗マウス結合抗体を用いるフローサイトメトリーによって確認した。図10Aは、活性化Th17細胞へのマウスLIGHT抗体の結合を示す。LIGHT抗体をTh17細胞と共に室温で40分間インキュベートした。マウスIgG1を陰性対照として用いる。
【図１０Ｂ】図10Bは、対照と比較した、Th1、Th17およびTh2活性化T細胞へのヒト化5E10抗体の結合を示す。極性T細胞をPMA/イオノマイシンで24時間活性化させた。ビオチン標識LIGHT抗体または対照抗体を細胞と共に室温で40分間インキュベートした。PBSで2回洗浄した後、活性化T細胞上に発現したLIGHTへの抗体結合を、PEにコンジュゲート化したストレプトアビジンを用いるフローサイトメトリーによって確認した。図面上の点線はヒト化LIGHT抗体の結合を示す。塗りつぶしは対照抗体の結合を示す。
【図１１Ａ】図11Aは、候補マウス抗LIGHT抗体(5E10、13C7、14G8および18B1)からの可変重鎖ドメインのアライメントを示す。図面中のボックスは各配列のCDRドメインを表す。
【図１１Ｂ】図11Bは、候補マウス抗LIGHT抗体(5E10、13C7、14G8および18B1)からの可変軽鎖ドメインのアライメントを示す。図面中のボックスは各配列のCDRドメインを表す。
【図１１Ｃ】図11Cは、マウス5E10可変重鎖VHと3種の最も近いヒト生殖系列可変重鎖ドメイン(VH)配列との配列アライメントを示す。
【図１１Ｄ】図11Cは、マウス5E10可変軽鎖VKと3種の最も近いヒト生殖系列可変軽鎖ドメイン(VK)配列との配列アライメントを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
好ましい実施形態の詳細な説明
定義
単数の構成要素はその構成要素の1つ以上を指すことに留意すべきであり、例えば、単数の抗原結合性ポリペプチドは1つ以上の抗原結合性ポリペプチドを表すと理解される。したがって、「1つ」、「1つ以上」および「少なくとも1つ」という語は本明細書では互換的に用いられる。
【００３４】
本明細書中で用いる「ポリペプチド」とは、単数形の「ポリペプチド」のみならず、複数形の「ポリペプチド」をも包含するものであり、アミド結合(ペプチド結合としても知られる)によって線状に連結されたモノマー(アミノ酸)から構成される分子を指す。「ポリペプチド」という語は2個以上のアミノ酸の鎖（単数または複数）を意味し、特定の長さの産物を指すものではない。かくして、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」または2個以上のアミノ酸の鎖（単数または複数）を指すために用いる他の用語は「ポリペプチド」の定義に含まれるものであり、「ポリペプチド」はこれらの用語のいずれかに代えて、つまり互換的に、使用することができる。さらに、用語「ポリペプチド」は、ポリペプチドの発現後修飾（例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護基/ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解による切断、または非天然アミノ酸による修飾を含むが、これらに限らない）の産物をも意味するものとする。ポリペプチドは天然の生物学的供給源に由来してもよいし、組換え技術によって生産されてもよいが、必ずしも指定された核酸配列から翻訳される必要はない。それは、化学合成を含めて、どのような方法で生成されてもよい。
【００３５】
「単離された」ポリペプチドまたはその断片、変異体もしくは誘導体とは、その天然環境に存在するものではないポリペプチドを意図している。特定の精製レベルは必要とされない。例えば、単離されたポリペプチドはその天然または自然環境から分離することができる。宿主細胞内で発現され、組換え的に生産されたポリペプチドおよびタンパク質は、本発明においては「単離された」とみなされ、また、いずれか適当な技法で分離された、分画された、または部分的もしくは実質的に精製された天然または組換えポリペプチドも同様である。
【００３６】
用語「ポリヌクレオチド」は、単数形の核酸のみならず、複数形の核酸をも包含するものであり、単離された核酸分子または構築物、例えばメッセンジャーRNA (mRNA)やプラスミドDNA (pDNA)を指す。ポリヌクレオチドは従来のリン酸ジエステル結合または非従来型の結合（例えば、ペプチド核酸(PNA)に見られるような、アミド結合）を含み得る。用語「核酸」は、ポリヌクレオチド中に存在するいずれか1つ以上の核酸セグメント、例えばDNAまたはRNA断片を指す。「単離された」核酸またはポリヌクレオチドとは、その天然環境から分離されている核酸分子、DNAまたはRNAを意図している。例えば、ベクター中に含まれる本発明の抗体をコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明においては単離されたとみなされる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例としては、異種宿主細胞内に保持された組換えポリヌクレオチドまたは溶液中の（部分的もしくは実質的に）精製されたポリヌクレオチドが含まれる。単離されたRNA分子には、本発明のポリヌクレオチドのin vivoまたはin vitro RNA転写産物が含まれる。さらに、本発明に係る単離されたポリヌクレオチドまたは核酸には、合成的に生成されたそのような分子が含まれる。さらに、ポリヌクレオチドまたは核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーターなどの調節エレメントであってもよいし、それを含むものでもよい。
【００３７】
本明細書中で用いる「コード領域」とは、アミノ酸に翻訳されるコドンから構成される核酸の部分である。「停止コドン」(TAG、TGAまたはTAA)はアミノ酸に翻訳されないが、コード領域の一部とみなすことができる。しかし、フランキング配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロンなどはコード領域の一部ではない。本発明の2つ以上のコード領域は、単一のポリヌクレオチド構築物（例えば、単一のベクター）中に、または別個のポリヌクレオチド構築物（例えば、別個の(異なる)ベクター）中に存在し得る。さらに、ベクターは単一のコード領域を含んでもよいし、2つ以上のコード領域を含んでもよく、例えば、単一のベクターが免疫グロブリン重鎖可変領域と免疫グロブリン軽鎖可変領域を別々にコードしてもよい。さらに、本発明のベクター、ポリヌクレオチドまたは核酸は、本発明の抗原結合性ポリペプチドまたはその変異体もしくは誘導体をコードする核酸に融合されたまたは融合されていない、異種コード領域をコードし得る。異種コード領域には、限定するものではないが、分泌シグナルペプチドまたは異種機能性ドメインのような、特殊化したエレメントまたはモチーフが含まれる。
【００３８】
特定の実施形態においては、ポリヌクレオチドまたは核酸がDNAである。DNAの場合には、ポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドは通常、1つ以上のコード領域と機能的に連結された、プロモーターおよび/または他の転写もしくは翻訳制御エレメントを含む。機能的に連結とは、遺伝子産物の発現を調節配列の影響下または制御下に置くような方法で、遺伝子産物（例えば、ポリペプチド）のコード領域が1つ以上の調節配列に連結される場合である。2つのDNA断片（例えば、ポリペプチドをコードする領域とそれに連結されたプロモーター）は、プロモーター機能の誘導が目的の遺伝子産物をコードするmRNAの転写をもたらす場合、ならびにこれら2つのDNA断片間の連結の性質が遺伝子産物の発現を指令する発現調節配列の能力を妨げないか、または転写されるDNAテンプレートの能力を妨げない場合に、「機能的に連結」されている。したがって、プロモーターがポリペプチドをコードする核酸の転写をもたらすことができたならば、プロモーター領域はその核酸と機能的に連結されていることになる。プロモーターは所定の細胞でのみDNAの実質的転写を指令する細胞特異的プロモーターであり得る。細胞特異的転写を指令するために、プロモーターのほかに、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー、転写終結シグナルなどの他の転写制御エレメントをポリヌクレオチドと機能的に連結してもよい。適当なプロモーターと他の転写制御領域を本明細書中で開示する。
【００３９】
さまざまな転写制御領域が当業者に知られている。それらには、限定するものではないが、脊椎動物細胞において機能する転写制御領域、例えば、サイトメガロウイルス（イントロンAと組み合わせた、前初期プロモーター）、シミアンウイルス40（初期プロモーター）、およびレトロウイルス（例えば、ラウス肉腫ウイルス）由来のプロモーターおよびエンハンサーセグメントが含まれるが、これらに限定されない。その他の転写制御領域には、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモンおよびウサギβ-グロビンのような脊椎動物遺伝子に由来するもの、ならびに真核細胞内での遺伝子発現を制御可能な他の配列が含まれる。さらなる適当な転写制御領域として、組織特異的プロモーターおよびエンハンサー、ならびにリンホカイン誘導性プロモーター（例えば、インターフェロンやインターロイキンにより誘導可能なプロモーター）などがある。
【００４０】
同様に、さまざまな翻訳制御エレメントが当業者に知られている。それらには、限定するものではないが、リボソーム結合部位、翻訳開始および終結コドン、ならびにピコルナウイルス由来のエレメント（特に、内部リボソーム侵入部位(IRES)、CITE配列とも呼ばれる）が含まれる。
【００４１】
他の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、例えばメッセンジャーRNA (mRNA)の形をした、RNAである。
【００４２】
本発明のポリヌクレオチドおよび核酸コード領域は、分泌またはシグナルペプチド（本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの分泌を指令する）をコードする別のコード領域に結合させることができる。シグナル仮説によれば、哺乳動物細胞から分泌されるタンパク質はシグナルペプチドまたは分泌リーダー配列をもっており、こうした配列は、ひとたび粗面小胞体で伸長しているタンパク質鎖の流出が開始されると、成熟タンパク質から切断される。当業者には理解されるように、脊椎動物細胞から分泌されるポリペプチドは一般に、ポリペプチドのN末端に融合されたシグナルペプチドをもっており、このシグナルペプチドは完全または「全長」ポリペプチドから切断されて、分泌型または「成熟」型のポリペプチドをもたらす。特定の実施形態では、天然のシグナルペプチド（例えば、免疫グロブリン重鎖または軽鎖シグナルペプチド）、またはそれに機能的に連結されたポリペプチドの分泌を指令する能力を保持するその配列の機能性誘導体が使用される。あるいはまた、異種の哺乳動物シグナルペプチドまたはその機能性誘導体を使用してもよい。例えば、野生型リーダー配列をヒト組織プラスミノーゲン活性化因子(TPA)またはマウスβ-グルクロニダーゼのリーダー配列と置き換えることが可能である。
【００４３】
本明細書中に記載する「抗体」または「抗体分子」とは、全長の（すなわち、天然に存在する、または通常の免疫グロブリン遺伝子断片組換え法により形成された）免疫グロブリン分子（例えば、IgG抗体）を指す。
【００４４】
本発明は、抗体、抗体もしくは抗原結合性フラグメント、その変異体または誘導体を含む、LIGHTに結合する特定の抗原結合性ポリペプチドを包含する。特に上記のようなフルサイズの抗体を指す場合を除き、用語「抗原結合性ポリペプチド」は、フルサイズの抗体のみならず、「抗原結合性フラグメント」、そのような抗体の変異体、類似体または誘導体、例えば、天然に存在する抗体もしくは免疫グロブリン分子、または改変された抗体分子、または抗体分子と同様の方法で抗原に結合するフラグメント（Fabフラグメント、scFv分子など）をも包含する。一本鎖抗体を含めて、抗体フラグメントは可変領域のみで構成されてもよいし、次の領域：ヒンジ領域、CH1、CH2およびCH3ドメインの全部もしくは一部との組合せで構成されてもよい。さらに本発明には、可変領域とヒンジ領域、CH1、CH2およびCH3ドメインとの任意の組合せを含む抗原結合性フラグメントも含まれる。
【００４５】
本明細書中で用いる「抗体フラグメント」または「抗原結合性フラグメント」とは、F(ab')2、F(ab)2、Fab'、Fab、Fv、scFvなどの抗体の一部を指す。構造に関係なく、抗体フラグメントは完全な抗体によって認識されるものと同じ抗原に結合する。用語「抗体フラグメント」には、アプタマー(aptamer)、スピーゲルマー(spiegelmer)およびダイアボディ(diabody)が含まれる。用語「抗体フラグメント」にはさらに、特定の抗原に結合して複合体を形成することによって抗体のようにふるまう合成タンパク質または遺伝工学的に作製されたタンパク質も含まれる。例えば、抗体フラグメントには以下のものが含まれる：可変領域からなる単離されたフラグメント、例えば重鎖と軽鎖の可変領域からなる「Fv」フラグメント、軽鎖と重鎖の可変領域がペプチドリンカーによって連結された組換え一本鎖ポリペプチド分子(「scFvタンパク質」)、scFvがHSAのNまたはC末端への融合体として発現されるscFv HSA融合ポリペプチド、VH-CH1またはVK-CKがHSAへの融合体として産生され、その後それぞれがそのコグネイトVK-CK軽鎖またはVH-CH1重鎖とフォールディングしてFab'を形成するFab' HSA融合ポリペプチド、ならびに超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位。
【００４６】
「抗原結合性ポリペプチド」と「免疫グロブリン」という用語は本明細書では互換的に使用される。抗原結合性ポリペプチドまたは免疫グロブリンは少なくとも重鎖の可変ドメインを含み、通常は少なくとも重鎖と軽鎖の可変ドメインを含む。脊椎動物系の基本的な免疫グロブリン構造は比較的よく理解されている。例えば、Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第2版, 1988)を参照されたい。
【００４７】
以下で詳細に説明するように、用語「抗原結合性ポリペプチド」は、生化学的に区別することができる、さまざまな幅広いクラスのポリペプチドを含む。当業者であれば、重鎖はガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロン(γ、μ、α、δ、ε)として分類され、それらの間にいくつかのサブクラス（例えば、γ1〜γ4）を含むことが理解されるだろう。この鎖の性質が抗体の「クラス」をそれぞれIgG、IgM、IgA、IgGまたはIgEとして決定するのである。免疫グロブリンサブクラス（アイソタイプ）、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgG5などはよく特徴づけられており、機能の特化(functional specialization)を付与することが知られている。これらのクラスおよびアイソタイプのそれぞれの修飾改変体は、本開示を考慮して当業者には容易に理解できるものであり、したがって、それらは本発明の範囲内である。すべての免疫グロブリンクラスは明らかに本発明の範囲内であり、以下の説明はおおむね免疫グロブリン分子のIgGクラスに関する。IgGに関して、標準的な免疫グロブリン分子は2本の同一の軽鎖ポリペプチド（分子量約23,000ダルトン）と2本の同一の重鎖ポリペプチド（分子量53,000〜70,000ダルトン）から構成される。典型的には、4本の鎖がジスルフィド結合で「Y」字型に結合され、その際、軽鎖は「Y」字の口から始まって可変領域まで続いて重鎖を支える。
【００４８】
軽鎖はカッパ(κ)またはラムダ(λ)のいずれかに分類される。各重鎖クラスはκ軽鎖またはλ軽鎖のいずれかと結合することができる。一般的に、軽鎖と重鎖は共有結合で互いに結合されており、2本の重鎖の「テイル」部分は、免疫グロブリンがハイブリドーマ、B細胞または遺伝子操作された宿主細胞により生成される場合、ジスルフィド共有結合または非共有結合で互いに結合される。重鎖では、アミノ酸配列がY字型のフォーク状端部のN末端から各鎖の底部のC末端まで続く。
【００４９】
軽鎖と重鎖は両方とも構造的および機能的相同性の領域に分割される。「定常」および「可変」という語は機能的に使用される。これに関連して、軽鎖部分の可変ドメイン(VK)および重鎖部分の可変ドメイン(VH)は抗原認識と特異性を決定することが理解されよう。反対に、軽鎖の定常ドメイン(CK)および重鎖の定常ドメイン(CH1、CH2またはCH3)は、分泌、経胎盤移動、Fc受容体結合、補体結合といった、重要な生物学的性質を付与する。慣例により、定常領域のドメインのナンバリングは、それらが抗体の抗原結合部位またはアミノ末端から遠くなるにつれて増加する。N末端部分は可変領域であり、C末端部分は定常領域である；実際には、CH3ドメインおよびCKドメインが重鎖と軽鎖のそれぞれのカルボキシ末端を構成する。
【００５０】
上に示したように、可変領域は、抗体が抗原上のエピトープを選択的に認識して、それと特異的に結合することを可能にする。すなわち、抗体のVKドメインおよびVHドメイン、または相補性決定領域(CDR)のサブセットが組み合わさって三次元の抗原結合部位を形成する。この四次抗体構造はYの各アームの端部に存在する抗原結合部位を形成する。具体的には、抗原結合部位はVH鎖とVK鎖のそれぞれに存在する3つのCDR（すなわち、CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3）によって規定される。ある場合、例えばラクダ科の動物種に由来するか、またはラクダ科免疫グロブリンに基づいて作製された、特定の免疫グロブリン分子の場合には、完全な免疫グロブリン分子が重鎖のみからなり、軽鎖が存在しない。例えば、Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993)を参照されたい。
【００５１】
天然に存在する抗体では、各抗原結合ドメインに存在する6つの「相補性決定領域」つまり「CDR」は、アミノ酸の短い、隣接していない配列であり、特に、抗体が水性環境中でその三次元構造をとるとき、抗原結合ドメインを形成するように配置されている。抗原結合ドメインに存在するアミノ酸の残部（「フレームワーク」領域と呼ばれる）は分子間変動が比較的少ない。フレームワーク領域は主にβシート構造をとり、そしてCDRはβシート構造に接続する（ある場合にはβシート構造の一部を構成する）ループを形成する。こうして、フレームワーク領域は、鎖間の非共有結合相互作用によってCDRを正しい方向に位置づけるための足場を形成するように働く。位置づけられたCDRによって形成される抗原結合ドメインは、免疫反応性の抗原上のエピトープに相補的な表面を定める。この相補的な表面は抗体とそのコグネイトエピトープとの非共有結合を促進する。CDRとフレームワーク領域をそれぞれ構成するアミノ酸は、すでに正確に定義されているので、当業者が所定の重鎖または軽鎖可変領域について容易に確認することができる（「Sequences of Proteins of Immunological Interest」, Kabat, E., et al., U.S. Department of Health and Human Services, (1983); および Chothia and Lesk, J. MoI. Biol., 196:901-917 (1987)を参照されたい；これらの文献の全内容を参照により本明細書に組み入れる）。
【００５２】
当技術分野で使用され、かつ/または容認される用語の定義が2つ以上ある場合、本明細書中で用いる用語の定義は、反対の明確な記載がない限り、すべてのそのような意味を含めるものとする。具体的な例としては、重鎖と軽鎖の両ポリペプチドの可変領域内に存在する非連続的な抗原結合部位を説明するための用語「相補性決定領域」(「CDR」)の使用がある。この特定の領域は、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services,「Sequences of Proteins of Immunological Interest」(1983)に、また、Chothia et al., J. MoI. Biol. 196:901-917 (1987)に記載されており、これらの文献の全内容を参照により本明細書に組み入れる。KabatおよびChothiaに従うCDRの定義は、相互に比較したとき、アミノ酸残基のオーバーラップまたはサブセットを含む。それにもかかわらず、いずれか一方の定義を適用して抗体またはその変異体のCDRに言及することは、本明細書中で定義され使用されるその用語の範囲内にあるものとする。上記の引用文献のそれぞれで定義されたCDRを包含する適切なアミノ酸残基を、比較として以下の表1に示してある。特定のCDRを包含する正確な残基番号は、そのCDRの配列とサイズによって変化する。当業者は、抗体の可変領域のアミノ酸配列が与えられると、どの残基が特定のCDRを構成するかを慣用的に決定することができる。
【表１】
2012521216.tif 000003
【００５３】
Kabatらはまた、どの抗体にも応用できる、可変ドメイン配列のためのナンバリングシステムを定義づけた。当業者であれば、配列以外のいかなる実験データにも依存せずに、任意の可変ドメイン配列に「Kabatナンバリング」のこのシステムを明確に割り当てることができる。本明細書中で用いる「Kabatナンバリング」とは、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services,「Sequence of Proteins of Immunological Interest」(1983)に記載されたナンバリングシステムを指す。
【００５４】
上記の表1に加えて、KabatのナンバリングシステムはCDR領域について次のように説明している：CDR-H1は、だいたいアミノ酸31（すなわち、最初のシステイン残基の約9残基の後）から始まり、約5〜7アミノ酸を含み、次のトリプトファン残基で終わる。CDR-H2は、CDR-H1の終了後、15番目の残基から始まり、約16〜19アミノ酸を含み、次のアルギニンまたはリシン残基で終わる。CDR-H3は、CDR-H2の終了後、約33番目のアミノ酸残基から始まり、3〜25アミノ酸を含み、配列W-G-X-G（ここで、Xは任意のアミノ酸）で終わる。CDR-L1は、だいたい残基24（すなわち、システイン残基の後）から始まり、約10〜17残基を含み、次のトリプトファン残基で終わる。CDR-L2は、CDR-L1の終了後、約16番目の残基から始まり、約7残基を含む。CDR-L3は、CDR-L2の終了後、約33番目の残基（すなわち、システイン残基の後）から始まり、約7〜11残基を含み、配列FまたはW-G-X-G（ここで、Xは任意のアミノ酸）で終わる。
【００５５】
本発明の抗原結合性ポリペプチド、その変異体または誘導体としては、限定するものではないが、ポリクローナル、モノクローナル、多重特異性、ヒト、ヒト化、霊長類化、またはキメラ抗体、一本鎖抗体、エピトープ結合性フラグメント、例えばFab、Fab'およびF(ab')2、Fd、Fvs、一本鎖Fvs (scFv)、一本鎖抗体、ジスルフィド結合Fv (sdFv)、VKドメインまたはVHドメインのいずれかを含むフラグメント、Fab発現ライブラリーにより産生されるフラグメント、および抗イディオタイプ(抗Id)抗体（例えば、本明細書中で開示するLIGHT抗体に対する抗Id抗体を含む）が挙げられる。scFv分子は当技術分野で知られており、例えば米国特許第5,892,019号に記載される。本発明の免疫グロブリンまたは抗体分子は免疫グロブリン分子のいずれのタイプ（例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgAおよびIgY）、クラス（例えば、IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAlおよびIgA2）またはサブクラスのものであってもよい。
【００５６】
本明細書に開示する抗原結合性ポリペプチドは、鳥類および哺乳類を含むあらゆる動物の起源からのものであり得る。好ましくは、抗体はヒト、マウス、ロバ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ラマ、ウマ、またはニワトリの抗体である。別の実施形態では、可変領域が軟骨魚類起源（例えば、サメ由来）であってもよい。
【００５７】
本明細書中で用いる「重鎖定常領域」には、免疫グロブリン重鎖に由来するアミノ酸配列が含まれる。重鎖定常領域を含むポリペプチドは次のドメインの少なくとも1つを含む：CH1ドメイン、ヒンジ（例えば、上部、中間、および/または下部ヒンジ領域）ドメイン、CH2ドメイン、CH3ドメイン、またはその変異体もしくは断片。例えば、本発明で用いる抗原結合性ポリペプチドは、CH1ドメインを含むポリペプチド鎖；CH1ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、およびCH2ドメインを含むポリペプチド鎖；CH1ドメインとCH3ドメインを含むポリペプチド鎖；CH1ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、およびCH3ドメインを含むポリペプチド鎖；またはCH1ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、CH2ドメイン、およびCH3ドメインを含むポリペプチド鎖で構成することができる。別の実施形態では、本発明のポリペプチドがCH3ドメインを含むポリペプチド鎖で構成される。さらに、本発明で用いる抗原結合性ポリペプチドは、CH2ドメインの少なくとも一部（例えば、CH2ドメインの全部または一部）を欠いてもよい。上述したように、重鎖定常領域は天然に存在する免疫グロブリン分子と異なるようにアミノ酸配列を改変しうることが当業者には理解されるだろう。
【００５８】
本明細書で開示する抗原結合性ポリペプチドの重鎖定常領域は、さまざまな免疫グロブリン分子に由来するものであってよい。例えば、ポリペプチドの重鎖定常領域はIgGl分子由来のCH1ドメインとIgG3分子由来のヒンジ領域を含む。別の例では、重鎖定常領域が、IgGl分子に一部由来しIgG3分子に一部由来するヒンジ領域を含む。別の例では、重鎖部分が、IgGl分子に一部由来しIgG4分子に一部由来するキメラヒンジを含む。
【００５９】
本明細書中で用いる「軽鎖定常領域」には、抗体軽鎖に由来するアミノ酸配列が含まれる。好ましくは、軽鎖定常領域は定常κドメインまたは定常λドメインの少なくとも1つを含む。
【００６０】
先に示したように、さまざまな免疫グロブリンクラスの定常領域のサブユニット構造および三次元配置はよく知られている。本明細書中で用いるとき、用語「VHドメイン」は免疫グロブリン重鎖のアミノ末端の可変ドメインを含み、用語「CH1ドメイン」は免疫グロブリン重鎖の最初の（最もアミノ末端側の）定常領域ドメインを含む。CH1ドメインはVHドメインに隣接しており、免疫グロブリン重鎖分子のヒンジ領域のアミノ末端側にある。
【００６１】
本明細書中で用いるとき、用語「CH2ドメイン」は、従来のナンバリングスキームを用いて、例えば抗体の約残基244から残基360まで延びる重鎖分子の部分を含む（残基244〜360、Kabatナンバリングシステム；および残基231〜340、EUナンバリングシステム；Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services,「Sequences of Proteins of Immunological Interest」(1983)参照）。CH2ドメインは、それが別のドメインと密接に対を形成しないという点で独特である。それどころか、インタクトの天然IgG分子の2つのCH2ドメイン間にN結合型の分岐糖鎖が介在している。また、CH3ドメインはCH2ドメインからIgG分子のC末端へと延びており、約108残基で構成されることも十分に立証されている。
【００６２】
本明細書中で用いるとき、用語「ヒンジ領域」には、CH1ドメインとCH2ドメインをつなぐ重鎖分子の部分が含まれる。このヒンジ領域は約25残基で構成され、柔軟性があるため、2つのN末端の抗原結合領域を独立して移動させることができる。ヒンジ領域は3つの明確に区別されるドメイン（すなわち、上部、中間および下部ヒンジドメイン）に分割することができる(Roux et al., J. Immunol 161:4083 (1998))。
【００６３】
本明細書中で用いる「ジスルフィド結合」は、2個の硫黄原子間に形成された共有結合を含む。アミノ酸のシステインはチオール基を含み、このチオール基は第2のチオール基とジスルフィド結合または橋を形成することができる。ほとんどの天然に存在するIgG分子では、CH1領域とCK領域がジスルフィド結合によって連結されており、また、2本の重鎖がKabatナンバリングシステムを用いて239と242に対応する位置（226または229位置、EUナンバリングシステム）で2つのジスルフィド結合によって連結されている。
【００６４】
本明細書中で用いる「キメラ抗体」とは、免疫反応性の領域または部位が第1の種から得られるまたは由来し、かつ定常領域（インタクトであっても、部分的であっても、本発明に従って改変されてもよい）が第2の種から得られる、あらゆる抗体を意味するものとする。好ましい実施形態では、標的結合領域または部位が非ヒト源（例えば、マウスまたは霊長類）に由来し、定常領域がヒト由来である。
【００６５】
本明細書中で用いる「ヒト化パーセント」は、ヒト化ドメインと生殖系列ドメインの間でフレームワークアミノ酸の相違（すなわち、非CDR相違）数を求めて、その数をアミノ酸の総数から減算し、次にそれをアミノ酸の総数で割って100を掛けることにより算出される。
【００６６】
「特異的に結合する」とは、一般的に、抗原結合性ポリペプチドがその抗原結合ドメインを介してエピトープに結合すること、そしてその結合が抗原結合ドメインとエピトープの間でいくらかの相補性を必要とすることを意味する。この定義によれば、抗原結合性ポリペプチドは、それが無作為の無関係なエピトープに結合するよりも容易に、その抗原結合ドメインを介してそのエピトープと結合するとき、エピトープと「特異的に結合する」といわれる。用語「特異性」は、ある抗原結合性ポリペプチドがあるエピトープと結合するときの相対的親和性を表すために本明細書中で用いられる。例えば、抗体「A」は、抗体「B」よりも特定のエピトープに対して高い特異性をもつとみなすことができ、また、抗体「A」は、関連エピトープ「D」に対するよりも高い特異性でエピトープ「C」に結合するということができる。
【００６７】
「優先的に結合する」とは、抗原結合性ポリペプチドが、関連した、同様の、相同の、または類似のエピトープと結合するよりも容易に、特定のエピトープと特異的に結合することを意味する。したがって、特定のエピトープと「優先的に結合する」抗原結合性ポリペプチドは、たとえそうした抗体が関連したエピトープと交差反応するとしても、その関連エピトープに比べて特定のエピトープと結合する可能性が高いと考えられる。
【００６８】
非限定的な例として、抗原結合性ポリペプチドが第2エピトープに対する抗原結合性ポリペプチドの解離定数(KD)よりも小さいKDで第1エピトープと結合するならば、その抗原結合性ポリペプチドは第1エピトープと優先的に結合するとみなされる。別の非限定的な例として、抗原結合性ポリペプチドが第2エピトープに対する抗原結合性ポリペプチドのKDに比べて少なくとも1桁小さい親和性で第1エピトープと結合するならば、その抗原結合性ポリペプチドは第1抗原と優先的に結合するとみなされる。別の非限定的な例として、抗原結合性ポリペプチドが第2エピトープに対する抗原結合性ポリペプチドのKDに比べて少なくとも2桁小さい親和性で第1エピトープと結合するならば、その抗原結合性ポリペプチドは第1エピトープと優先的に結合するとみなされる。
【００６９】
本発明の抗原結合性ポリペプチドまたはその変異体もしくは誘導体は、LIGHTポリペプチドに対するそれらの結合親和性に関して記載または特定することもできる。好ましい結合親和性には、5 x 10-2M、10-2M、5 x 10-3M、10-3M、5 x 10-4M、10-4M、5 x 10-5M、10-5M、5 x 10-6M、10-6M、5 x 10-7M、10-7M、5 x 10-8M、10-8M、5 x 10-9M、10-9M、5 x 10-10M、10-10M、5 x 10-11M、10-11M、5 x 10-12M、10-12M、5 x 10-13M、10-13M、5 x 10-14M、10-14M、5 x 10-15M、または10-15Mより小さい解離定数またはKDをもつものが含まれる。
【００７０】
別の非限定的な例として、抗原結合性ポリペプチドが第2エピトープに対する抗原結合性ポリペプチドのオフ速度(k(off))より小さいk(off)で第1エピトープと結合するならば、その抗原結合性ポリペプチドは第1エピトープと優先的に結合するとみなされる。別の非限定的な例として、抗原結合性ポリペプチドが第2エピトープに対する抗原結合性ポリペプチドのk(off)に比べて少なくとも1桁小さい親和性で第1エピトープと結合するならば、その抗原結合性ポリペプチドは第1エピトープと優先的に結合するとみなされる。別の非限定的な例として、抗原結合性ポリペプチドが第2エピトープに対する抗原結合性ポリペプチドのk(off)に比べて少なくとも2桁小さい親和性で第1エピトープと結合するならば、その抗原結合性ポリペプチドは第1エピトープと優先的に結合するとみなされる。
【００７１】
本明細書に開示する抗原結合性ポリペプチドまたはその変異体もしくは誘導体は、本明細書に開示する標的LIGHTポリペプチドまたはその断片もしくは変異体に、5 X 10-2sec-1、10-2sec-1、5 X 10-3sec-1または10-3sec-1以下のオフ速度(k(off))で結合するといえる。さらに好ましくは、本発明の抗原結合性ポリペプチドは、本明細書に開示する標的LIGHTポリペプチドまたはその断片もしくは変異体に、5 X 10-4sec-1、10-4sec-1、5 X 10-5sec-1、10-5sec-1、5 X 10-6sec-1、10-6sec-1、5 X 10-7sec-1または10-7sec-1以下のオフ速度(k(off))で結合するといえる。
【００７２】
本明細書に開示する抗原結合性ポリペプチドまたはその変異体もしくは誘導体は、本明細書に開示するLIGHT標的ポリペプチドまたはその断片もしくは変異体に、103M-1sec-1、5 X 103M-1sec-1、104M-1sec-1または5 X 104M-1sec-1以上のオン速度(k(on))で結合するといえる。さらに好ましくは、本発明の抗原結合性ポリペプチドは、本明細書に開示する標的LIGHTポリペプチドまたはその断片もしくは変異体に、105M-1sec-1、5 X 105M-1sec-1、106M-1sec-1、5 X 106M-1sec-1、107M-1sec-1または5 X 107M-1sec-1以上のオン速度(k(on))で結合するといえる。
【００７３】
抗原結合性ポリペプチドが、参照抗原結合性ポリペプチドと特定のエピトープとの結合をある程度ブロックする範囲において、それがそのエピトープと優先的に結合するならば、その抗原結合性ポリペプチドは、参照抗原結合性ポリペプチドと特定のエピトープとの結合を競合的に阻害するといえる。競合的阻害は、当技術分野で知られた方法、例えば競合ELISAアッセイにより測定することができる。抗原結合性ポリペプチドは、参照抗体と特定のエピトープとの結合を競合的に少なくとも90％、少なくとも80％、少なくとも70％、少なくとも60％、または少なくとも50％阻害するといえる。
【００７４】
本明細書中で用いる「親和性（アフィニティ）」とは、個々のエピトープと免疫グロブリン分子のCDRとの結合の強さの尺度を指す。例えば、Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第2版 1988) の27-28ページを参照されたい。本明細書中で用いる「結合力（アビディティ）」とは、抗原結合性ポリペプチドの集団と抗原との複合体の全体的な安定性、すなわち、免疫グロブリン混合物と抗原との機能的な結合強度を指す。例えば、前掲Harlowの29-34ページを参照されたい。結合力は、集団中の個々の抗原結合性ポリペプチドと特定のエピトープとの親和性と、さらに抗原結合性ポリペプチドおよび抗原の結合価数の両方に関係する。例えば、2価のモノクローナル抗体と、重合体のような高度反復エピトープ構造をもつ抗原との相互作用は、高い結合力の一つとなる。
【００７５】
本明細書中で用いる「改変(された)抗体」(engineered antibody)とは、重鎖および軽鎖のいずれか一方または両方の可変ドメインが、既知の特異性の抗体に由来する1つ以上のCDRの少なくとも部分置換によって改変され、また必要に応じて、フレームワーク領域の部分置換および配列の変更によって改変された抗体を指す。CDRはフレームワーク領域を誘導する抗体と同じクラスまたは同等のサブクラスの抗体に由来するものでもよいが、CDRは異なるクラスの抗体（好ましくは、異なる種からの抗体）に由来することが考えられる。既知の特異性の非ヒト抗体に由来する1つ以上の「ドナー」CDRがヒト重鎖または軽鎖フレームワーク領域にグラフトされた改変抗体を、本明細書では「ヒト化抗体」という。ある可変ドメインの抗原結合能を別の可変ドメインに移すために、全部のCDRをドナー可変領域からの完全なCDRで置き換える必要はない。それどころか、標的結合部位の活性を維持するのに必要な残基を移すことが必要であるにすぎない。例えば、米国特許第5,585,089号、第5,693,761号、第5,693,762号、および第6,180,370号に記載された説明が与えられれば、機能的な改変抗体またはヒト化抗体を得ることは、慣用の実験を行うことにより、または試行錯誤の試験により、十分に当業者の能力の範囲内であろう。
【００７６】
本明細書中で用いる「適切に折りたたまれたポリペプチド」という語は、そのポリペプチドを構成する機能性ドメインのすべてが明らかに活性であるポリペプチド（例えば、抗原結合性ポリペプチド）を含む。本明細書中で用いる「不適切に折りたたまれたポリペプチド」という語は、そのポリペプチドの機能性ドメインの少なくとも1つが活性でないポリペプチドを含む。ある実施形態において、適切に折りたたまれたポリペプチドは、少なくとも1つのジスルフィド結合によって連結されたポリペプチド鎖で構成される。
【００７７】
本明細書中で用いる「改変された」(engineered)という語は、合成手段（例えば、組換え法、in vitroペプチド合成、ペプチドの酵素的もしくは化学的カップリング、またはこれらの方法の組み合わせ）による核酸またはポリペプチド分子の操作を含む。
【００７８】
本明細書中で用いる「連結された」、「コンジュゲートされた」、「融合された」または「融合」という語は互換的に同じ意味で使用される。これらの語は、2つ以上の要素または成分を、化学的コンジュゲーションや組換え手段などの手段を問わずに、一緒につなぐことを意味する。「インフレーム融合」(in-frame fusion：同じ読み枠での融合)は、もとのオープンリーディングフレーム(ORF)の正しい翻訳読み枠を維持する方法で、2つ以上のポリヌクレオチドORFをつなぎ合わせて、連続した長いORFを形成することを意味する。したがって、組換え融合タンパク質は、もとのORFによってコードされるポリペプチドに相当する2つ以上のセグメントを含む単一のタンパク質である（通常、これらのセグメントは自然界ではそのように結合されていない）。リーディングフレームはこのように融合セグメント全体を通して連続しているが、これらのセグメントは、例えばインフレームリンカー配列によって、物理的または空間的に分離していてもよい。例えば、免疫グロブリン可変領域のCDRをコードするポリヌクレオチド類は同じ読み枠で融合させることができるが、少なくとも1つの免疫グロブリンフレームワーク領域または追加のCDR領域をコードするポリヌクレオチドによって分離されていてもよい（ただし、「融合された」CDRが連続ポリペプチドの一部として同時翻訳される必要がある）。
【００７９】
本明細書中で用いる「発現」または「発現する」とは、遺伝子が生化学物質、例えばRNAまたはポリペプチドを生成するプロセスを指す。このプロセスには、遺伝子のノックダウンならびに一過性発現および安定発現を含むがこれらに限定されない、細胞内の遺伝子の機能的存在のあらゆる発現が含まれる。それはメッセンジャーRNA (mRNA)、トランスファーRNA (tRNA)、小分子ヘアピンRNA (shRNA)、小分子干渉RNA (siRNA)または他のRNA産物への遺伝子の転写、ならびにそのようなmRNAのポリペプチドへの翻訳を含み、これらに限定されない。最終的な目的産物が生化学物質である場合、発現にはその生化学物質と任意の前駆物質の生成が含まれる。
【００８０】
本明細書中で用いる「治療する」または「治療」とは、治療処置と予防対策の両方を指し、その目的は、多発性硬化症の進行など、望ましくない生理的変化や障害を予防したり、遅くする（軽減する）ことである。有益なまたは望ましい臨床結果としては、検出できるかできないかにかかわらず、症状の緩和、疾患の程度の退縮、疾患の安定化された（すなわち、悪化しない）状態、疾患進行の遅延または減速、病状の改善または緩和、および寛解（部分的または全体的を問わず）が含まれるが、これらに限定されない。「治療」はまた、治療を受けていない場合に予想される生存に比べて、生存を延長することをも意味する。治療が必要な者には、疾患または障害にすでにかかっている患者だけでなく、疾患や障害にかかりやすい者、または疾患や障害を予防すべきである者が含まれる。
【００８１】
「被験体」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」とは、診断、予後判定または治療が望まれる、あらゆる被験体、特に哺乳動物被験体を意味する。哺乳動物被験体としては、ヒト、家庭用動物、家畜、ならびに動物園、運動競技または愛玩用の動物、例えばイヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシなどが挙げられる。
【００８２】
本明細書中で用いる「治療が必要な患者」または「治療が必要な被験体」のような語句には、例えば、検出のために、診断法のために、および/または治療のために使用される本発明の抗原結合性ポリペプチドまたは組成物の投与から利益を得るであろう被験体（例えば、哺乳動物被験体）が含まれる。
【００８３】
LIGHT抗体
LIGHT (GenBankアクセッション番号AF036581参照；その全体を参照により本明細書に組み入れる)として知られるTNF様サイトカインポリペプチドに特異的に結合する抗原結合性ポリペプチドが開示される。本発明の特定の抗原結合性ポリペプチドには、本明細書に記載のLIGHT抗体の相補性決定領域を含むヒト化重鎖ポリペプチド、ヒト化軽鎖ポリペプチド、ヒト化重鎖可変領域、ヒト化軽鎖可変領域、ならびにヒト化重鎖・軽鎖ポリペプチドが含まれる。特定の実施形態では、抗原結合性ポリペプチドはLIGHT活性および/またはLIGHTとLIGHT受容体との相互作用のアンタゴニストとして機能する。
【００８４】
例えば、本発明の特定の抗原結合性ポリペプチドは、親モノクローナル抗体の抗原結合特異性を実質的に保持しつつ、ヒト抗体の軽鎖および重鎖可変領域のフレームワーク(FR)領域を含む。ヒト化重鎖可変領域および/またはヒト化軽鎖可変領域は、相補性決定領域(CDR)を含めないで、少なくとも約87％ヒト化、少なくとも約88％ヒト化、少なくとも約89％ヒト化、少なくとも約90％ヒト化、少なくとも約91％ヒト化、少なくとも約92％ヒト化、少なくとも約93％ヒト化、少なくとも約94％ヒト化、少なくとも約95％ヒト化、少なくとも約96％ヒト化、少なくとも約97％ヒト化、少なくとも約98％ヒト化、少なくとも約99％ヒト化、または少なくとも約100％ヒト化される。
【００８５】
本発明の抗原結合性ポリペプチド分子には、限定するものではないが、ポリクローナル、モノクローナル、多重特異性、ヒト、ヒト化、キメラ、一本鎖抗体、Fabフラグメント、F(ab')フラグメント、および抗イディオタイプ(抗Id)抗体が含まれる。本発明の抗原結合性ポリペプチドにはさらに、限定するものではないが、Fab、Fab'およびF(ab')2、Fv、一本鎖Fv (scFV)、一本鎖抗体、ジスルフィド結合Fv (sdFv)、ならびに可変軽鎖または可変重鎖ドメインを含むフラグメントも含まれる。一本鎖抗体を含めて、本発明の抗原結合性ポリペプチドは可変領域のみで構成されてもよいし、可変領域を重鎖定常領域もしくは軽鎖定常領域、ヒンジ領域、CH1、CH2およびCH3ドメインの全部または一部と組み合わせて構成されてもよい。
【００８６】
本発明の抗原結合性ポリペプチドは、ヒト、マウス、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、ブタ、ラクダ、ウマ、ニワトリを含むあらゆる動物の起源に由来するものでよい。例えば、本発明の抗原結合性ポリペプチドはモノクローナル抗体ドナー（例えば、マウスモノクローナル抗体ドナー）に由来し、そのモノクローナル抗体からのCDR（例えば、マウスモノクローナルCDR）を含む。
【００８７】
特定の実施形態において、本発明は抗原結合性ポリペプチドまたはその変異体もしくは誘導体に関する。具体的には、本発明は、LIGHTポリペプチドと特異的に結合し、かつ以下の表2に記載するアミノ酸配列を含む(comprising)、から本質的になる(consisting essentially of)、またはからなる(consisting of)ヒト化重鎖可変領域を含む、から本質的になる、またはからなる抗原結合性ポリペプチドを包含する。
【表２】
2012521216.tif 000004
【００８８】
2012521216.tif 000005
【００８９】
2012521216.tif 000006
【００９０】
それぞれのヒト化重鎖可変領域のCDR領域は太字で示され、かつ下線が引いてある。
【００９１】
特定の実施形態において、本発明の抗原結合性ポリペプチドは、配列番号1; 配列番号2; 配列番号3; 配列番号4; 配列番号5; 配列番号6; 配列番号7; および配列番号8からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなるヒト化抗体重鎖可変領域に関する。具体的には、本発明の特定の抗原結合性ポリペプチドは、配列番号4のアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなる重鎖可変領域を含む、から本質的になる、またはからなる。
【００９２】
一実施形態において、本発明の抗原結合性ポリペプチドは、本明細書に記載の重鎖可変領域を完全な重鎖（すなわち、定常領域）と共に含む完全ヒト化LIGHT抗体に関する。
【００９３】
別の実施形態において、本発明は、CDR-H1、CDR-H2およびCDR-H3領域を含むヒト化重鎖可変領域を含む、から本質的になる、またはからなる、LIGHTポリペプチドに特異的に結合する抗原結合性ポリペプチドを提供する。特定の実施形態では、CDR領域が以下の表3に記載する配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなる。
【表３】
2012521216.tif 000007
【００９４】
2012521216.tif 000008
【００９５】
別の実施形態において、本発明は、CDR-H1、CDR-H2およびCDR-H3領域を含むヒト化重鎖可変領域を含む、から本質的になる、またはからなる、LIGHTポリペプチドに特異的に結合する抗原結合性ポリペプチドを提供する。特定の実施形態では、CDR-H1領域は、配列番号18; 配列番号23; 配列番号26; 配列番号29; 配列番号32; および配列番号35からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなる。特定の実施形態では、CDR-H2領域は、配列番号19; 配列番号24; 配列番号27; 配列番号30; 配列番号33; および配列番号36からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなる。特定の実施形態では、CDR-H3領域は、配列番号20; 配列番号21; 配列番号22; 配列番号25; 配列番号28; 配列番号31; 配列番号34; および配列番号37からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなる。
【００９６】
具体的な実施形態において、本発明は、配列番号23のアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなるCDR-H1領域と、配列番号24のアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなるCDR-H2領域と、配列番号25のアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなるCDR-H3領域とを含むヒト化重鎖可変領域を含む、から本質的になる、またはからなる、LIGHTポリペプチドに特異的に結合する抗原結合性ポリペプチドを包含する。
【００９７】
LIGHTポリペプチドに特異的に結合する抗原結合性ポリペプチドは、本明細書に開示するCDR重鎖領域のいずれかを任意の組み合わせで含むヒト化重鎖可変領域を含む、から本質的になる、またはからなるものであり得る。
【００９８】
本発明はさらに、以下の表4に記載する配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなるヒト化軽鎖可変領域を含む、から本質的になる、またはからなる、LIGHTポリペプチドに特異的に結合する抗原結合性ポリペプチドをも包含する。
【表４】
2012521216.tif 000009
【００９９】
2012521216.tif 000010
【０１００】
2012521216.tif 000011
【０１０１】
2012521216.tif 000012
【０１０２】
それぞれのヒト化軽鎖可変領域のCDR領域は太字で示され、かつ下線が引いてある。
【０１０３】
特定の実施形態において、本発明の抗原結合性ポリペプチドは、配列番号9; 配列番号10; 配列番号11; 配列番号12; 配列番号13; 配列番号14; 配列番号15; 配列番号16; および配列番号17からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなるヒト化抗体軽鎖可変領域に関する。具体的には、本発明の特定の抗原結合性ポリペプチドは、配列番号12のアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなる軽鎖可変領域を含む、から本質的になる、またはからなる。
【０１０４】
一実施形態において、本発明の抗原結合性ポリペプチドは、本明細書に記載の軽鎖可変領域を完全な軽鎖（すなわち、定常領域）と共に含む完全ヒト化LIGHT抗体に関する。
【０１０５】
別の実施形態において、本発明は、以下の表5に記載するCDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3領域を含むヒト化軽鎖可変領域を含む、から本質的になる、またはからなる、LIGHTポリペプチドに特異的に結合する抗原結合性ポリペプチドを提供する。
【表５】
2012521216.tif 000013
【０１０６】
2012521216.tif 000014
【０１０７】
別の実施形態において、本発明は、CDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3領域を含むヒト化軽鎖可変領域を含む、から本質的になる、またはからなる、LIGHTポリペプチドに特異的に結合する抗原結合性ポリペプチドを提供する。特定の実施形態では、CDR-L1領域は、配列番号38; 配列番号39; 配列番号40; 配列番号43; 配列番号46; 配列番号49; 配列番号52; および配列番号55からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなる。特定の実施形態では、CDR-L2領域は、配列番号41; 配列番号44; 配列番号47; 配列番号50; および配列番号53からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなる。特定の実施形態では、CDR-L3領域は、配列番号42; 配列番号45; 配列番号48; 配列番号51; および配列番号54からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなる。
【０１０８】
具体的な実施形態において、本発明は、配列番号43のアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなるCDR-L1領域と、配列番号44のアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなるCDR-L2領域と、配列番号45のアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなるCDR-L3領域とを含むヒト化軽鎖可変領域を含む、から本質的になる、またはからなる、LIGHTポリペプチドに特異的に結合する抗原結合性ポリペプチドを包含する。
【０１０９】
LIGHTポリペプチドに特異的に結合する抗原結合性ポリペプチドは、本明細書に開示するCDR軽鎖領域のいずれかを含むヒト化軽鎖可変領域を含む、から本質的になる、またはからなるものであり得る。
【０１１０】
本発明の他の実施形態において、LIGHTポリペプチドに特異的に結合する抗原結合性ポリペプチドは、
i.    配列番号1 および 配列番号9;
ii.   配列番号2 および 配列番号10;
iii.  配列番号3 および 配列番号11;
iv.   配列番号4 および 配列番号12;
v.    配列番号5 および 配列番号13;
vi.   配列番号6 および 配列番号14;
vii.  配列番号7 および 配列番号15;
viii. 配列番号7 および 配列番号16;
ix.   配列番号8 および 配列番号17; ならびに
x.    これらの組合せ
からなる群より選択されるヒト化重鎖可変領域とヒト化軽鎖可変領域を含む、から本質的になる、またはからなる。
【０１１１】
本発明の他の実施形態において、LIGHTポリペプチドに特異的に結合する抗原結合性ポリペプチドは、
i.    配列番号18, 19, 20 および 配列番号38, 41, 42;
ii.   配列番号18, 19, 21 および 配列番号39, 41, 42;
iii.  配列番号18, 19, 22 および 配列番号40, 41, 42;
iv.   配列番号23, 24, 25 および 配列番号43, 44, 45;
v.    配列番号26, 27, 28 および 配列番号46, 47, 48;
vi.   配列番号29, 30, 31 および 配列番号49, 50, 51;
vii.  配列番号32, 33, 34 および 配列番号52, 53, 54;
viii. 配列番号35, 36, 37 および 配列番号55, 50, 51; ならびに
ix.   これらの組合せ
からなる群より選択されるCDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3を含む、から本質的になる、またはからなるヒト化重鎖可変領域とヒト化軽鎖可変領域を含む、から本質的になる、またはからなる。
【０１１２】
上記ポリペプチドのいずれも追加のポリペプチドをさらに含むことができ、例えば、コードされたポリペプチドの分泌を指令するシグナルペプチド、本明細書に記載する抗体定常領域、または本明細書に記載する他の異種ポリペプチドを含むことができる。
【０１１３】
当業者には理解されるように、本明細書に開示する抗原結合性ポリペプチドは、それらの起源となる天然の結合性ポリペプチドとはアミノ酸配列の点で異なるように修飾することができる。例えば、指定されたタンパク質に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は出発配列に類似していてよく、例えば、出発配列に対して一定の同一性パーセントを有し、例えば、それは出発配列と60％、70％、75％、80％、85％、90％、または95％同一であってよい。
【０１１４】
さらに、「非必須」アミノ酸領域に保存的置換または変化をもたらすヌクレオチドまたはアミノ酸の置換、欠失または挿入を行うことができる。例えば、指定されたタンパク質に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は、1つ以上の各アミノ酸の置換、挿入または欠失（例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20またはそれ以上の各アミノ酸の置換、挿入または欠失）を除いて、出発配列と同一であってよい。特定の実施形態では、指定されたタンパク質に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は、出発配列に対して1〜5、1〜10、1〜15、または1〜20の各アミノ酸の置換、挿入または欠失を有する。
【０１１５】
本発明の特定の抗原結合性ポリペプチドは、ヒトアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなる。しかし、特定の抗原結合性ポリペプチドは、別の哺乳動物種に由来する1つ以上の連続したアミノ酸を含んでもよい。例えば、本発明の抗原結合性ポリペプチドは、霊長類の重鎖部分、ヒンジ部、または抗原結合領域を含むことができる。特定の治療用途では、抗原結合性ポリペプチドまたはその抗原結合性フラグメント、変異体もしくは類似体は、その抗体が投与される動物において免疫原性を示さないように設計される。
【０１１６】
特定の実施形態において、抗原結合性ポリペプチドは、抗体とは通常結合していないアミノ酸配列または1つ以上の成分を含む。代表的な修飾は以下で詳しく説明される。例えば、本発明の一本鎖Fv抗体フラグメントは、柔軟性のリンカー配列を含んでもよく、また、機能性の成分（例えば、PEG、薬物、毒素、または標識）を付加するよう修飾されてもよい。
【０１１７】
本発明の抗原結合性ポリペプチドは、融合タンパク質を含む、から本質的になる、またはからなるものでもよい。融合タンパク質は、例えば、少なくとも1つの標的結合部位を含む免疫グロブリン抗原結合ドメインと、少なくとも1つの異種部分（すなわち、それとはもともと自然界で連結されていない部分）とを含むキメラ分子である。これらのアミノ酸配列は通常別々のタンパク質中に存在し、融合ポリペプチドとして一緒にまとまるか、あるいはそれらは通常同じタンパク質中に存在するが、融合ポリペプチドでは新しい配列に配置される。融合タンパク質は、例えば、化学合成により、またはペプチド領域が望ましい関係でコードされているポリヌクレオチドの生成と翻訳により、作製することができる。
【０１１８】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに適用される用語「異種」とは、そのポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、比較されている物質(entity)の残りの部分とは明確に異なる物質に由来することを意味する。例えば、本明細書中で用いるとき、本発明の抗原結合性ポリペプチド、その変異体または類似体に融合される「異種ポリペプチド」は、同じ種の非免疫グロブリンポリペプチド、または異なる種の免疫グロブリンポリペプチドもしくは非免疫グロブリンポリペプチドに由来するものである。
【０１１９】
本発明の抗原結合性ポリペプチド、その変異体または誘導体はさらに、そのN末端またはC末端で異種ポリペプチドに融合させることができ、また、ポリペプチドや他の組成物に化学的にコンジュゲート（共有結合および非共有結合によるコンジュゲーションを含む）することができる。例えば、LIGHTポリペプチドに特異的に結合するヒト化LIGHT抗原結合性ポリペプチドは、異種ポリペプチド、薬物、放射性核種、毒素などのエフェクター分子または検出アッセイで標識として有用な分子に融合またはコンジュゲートされる。例えば、PCT公開公報WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; 米国特許第5,314,995号; およびEP 396,387を参照されたい；これらの全内容を参照により本明細書に組み入れる。
【０１２０】
本発明の抗原結合性ポリペプチド、その変異体または誘導体には、修飾された誘導体、すなわち、共有結合が抗原結合性ポリペプチドのLIGHTポリペプチドへの結合を妨げないように任意のタイプの分子を抗体に共有結合させることによって修飾された誘導体が含まれる。例えば、限定するものではないが、抗原結合性ポリペプチドには、グリコシル化、アセチル化、ペグ(PEG)付加、リン酸化、アミド化、公知の保護基/ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解による切断、細胞性リガンドや他のタンパク質への連結などにより、修飾された抗体が含まれる。多数の化学的修飾のどれも、公知の技法（特異的な化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含むが、これらに限定されない）で実施することができる。さらに、抗原結合性ポリペプチドは1個以上の非古典的アミノ酸を含んでもよい。
【０１２１】
本発明の抗原結合性ポリペプチドまたはその変異体もしくは誘導体は、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合（すなわち、ペプチドイソスター）によって互いに連結されたアミノ酸から構成され、20種類の遺伝子コード化アミノ酸以外のアミノ酸を含んでもよい。本発明の抗原結合性ポリペプチドは、翻訳後プロセシングのような自然のプロセスで、または当技術分野で周知の化学的修飾方法で修飾することができる。そのような修飾は、基礎的な教科書や詳細なモノグラフに、さらには多数の研究文献に記載されている。修飾はどこでも生じる可能性があり、例えば、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、アミノもしくはカルボキシル末端を含むポリペプチドで、または糖鎖のような成分に起こりうる。同じタイプの修飾が本発明の所定の抗原結合性ポリペプチドのいくつかの部位に同じまたは異なる程度で存在しうることが理解されよう。また、所定の抗原結合性ポリペプチドが多くのタイプの修飾を含むことも可能である。抗原結合性ポリペプチドは、例えばユビキチン化の結果として、分岐していてもよいし、それらは分岐ありまたは分岐なしの環状であってもよい。環状、分岐状、および分岐した環状の抗原結合性ポリペプチドは、翻訳後の天然プロセスから生じることがあり、また、合成方法で作製することもできる。修飾としては以下の反応が挙げられる：アセチル化、アシル化、ADPリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、リピドまたはリピド誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋結合、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ-カルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、PEG付加、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、タンパク質へのアミノ酸のトランスファーRNA介在付加(例えば、アルギニン化)、およびユビキチン化。（例えば、Proteins - Structure And Molecular Properties, T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York 第2版, (1993); Posttranslational Covalent Modification Of Proteins, B. C. Johnson編, Academic Press, New York, pgs. 1-12 (1983); Seifter et al., Meth Enzymol 182:626-646 (1990); Rattan et al., Ann NY Acad Sci 663:48-62 (1992)を参照されたい）。
【０１２２】
本発明はまた、抗原結合性ポリペプチド、その変異体または誘導体と、異種ポリペプチドとを含む融合タンパク質を提供する。抗体が融合される異種ポリペプチドは、機能のために有用であるか、治療中の身体の特定部位へのターゲッティングのために有用である。一実施形態において、本発明の融合タンパク質は、本発明の抗原結合性ポリペプチドのいずれか1つ以上の重鎖可変領域のアミノ酸配列、または本発明の抗原結合性ポリペプチドもしくはその変異体のいずれか1つ以上の軽鎖可変領域のアミノ酸配列と、異種ポリペプチド配列とを有するポリペプチドを含む、から本質的になる、またはからなる。別の実施形態において、本明細書に開示する融合タンパク質は、本明細書に開示する抗原結合性ポリペプチド、その変異体もしくは誘導体のいずれか1つ、2つ、3つの可変重鎖CDRのアミノ酸配列、または本明細書に開示する抗原結合性ポリペプチド、その変異体もしくは誘導体のいずれか1つ、2つ、3つの可変軽鎖CDRのアミノ酸配列と、異種ポリペプチド配列とを有するポリペプチドを含む、から本質的になる、またはからなる。
【０１２３】
一実施形態において、融合タンパク質は、本発明の抗原結合性ポリペプチド、その誘導体もしくは変異体の可変重鎖CDRのアミノ酸配列と、異種ポリペプチド配列とを有するポリペプチドを含んでなり、その融合タンパク質がLIGHTポリペプチドに特異的に結合する。別の実施形態において、融合タンパク質は、本発明の抗原結合性ポリペプチドの少なくとも1つの重鎖可変領域のアミノ酸配列と、本発明の抗原結合性ポリペプチドまたはその誘導体もしくは変異体の少なくとも1つの軽鎖可変領域のアミノ酸配列と、異種ポリペプチド配列とを有するポリペプチドを含む。好ましくは、融合タンパク質の重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、LIGHTに特異的に結合する単一ソースの抗体（またはscFvもしくはFabフラグメント）に対応する。さらに別の実施形態において、本明細書に開示する融合タンパク質は、抗原結合性ポリペプチドのいずれか1つ、2つ、3つまたはそれ以上の可変重鎖CDRのアミノ酸配列と、抗原結合性ポリペプチドまたはその変異体もしくは誘導体のいずれか1つ、2つ、3つまたはそれ以上の可変軽鎖CDRのアミノ酸配列と、異種ポリペプチド配列とを有するポリペプチドを含む。好ましくは、2、3、4、5、6もしくはそれ以上の可変重鎖CDRまたは可変軽鎖CDRは本発明の単一ソースの抗体（またはscFvもしくはFabフラグメント）に対応する。これらの融合タンパク質をコードする核酸分子も本発明に包含される。
【０１２４】
文献に報告された融合タンパク質の例としては、以下の融合体が挙げられる：T細胞受容体の融合体(Gascoigne et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 54:2936-2940 (1987)); CD4の融合体(Capon et al., Nature 337:525-531 (1989); Traunecker et al., Nature 339:68-70 (1989); Zettmeissl et al., DNA Cell Biol. USA 9:347-353 (1990); およびByrn et al., Nature 344:667-670 (1990)); L-セレクチンの融合体(ホーミング受容体) (Watson et al., J. Cell. Biol. 110:2221-2229 (1990); およびWatson et al., Nature 349:164-167 (1991)); CD44の融合体(Aruffo et al., Cell (57:1303-1313 (1990)); CD28およびB7の融合体(Linsley et al., J. Exp. Med. 773:721-730 (1991)); CTLA-4の融合体(Lisley et al., J. Exp. Med. 174:561-569 (1991)); CD22の融合体(Stamenkovic et al., Cell 66: 1133-1144 (1991)); TNF受容体の融合体(Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 55:10535-10539 (1991); Lesslauer et al., Eur. J. Immunol. 27:2883-2886 (1991); およびPeppel et al., J. Exp. Med. 774:1483-1489 (1991)); ならびにIgE受容体aの融合体(Ridgway and Gorman, J. Cell. Biol. Vol. 115, Abstract No. 1448 (1991))。
【０１２５】
融合タンパク質は当技術分野で周知の方法を用いて作製することができる（米国特許第5,116,964号および第5,225,538号を参照されたい）。融合が行われる正確な部位は、融合タンパク質の分泌または結合特性を最適化するように経験的に選択することができる。その後、融合タンパク質をコードするDNAは発現のために宿主細胞にトランスフェクスされる。
【０１２６】
特定の実施形態において、本発明の抗原結合性ポリペプチドは一本鎖Fv分子(scFv)である。具体的には、本発明の特定のscFv分子は、NH2-L-VH-X-VK-COOHおよびNH2-L-VK-X-VH-COOH（式中、Lはリーダー配列であり、VHはヒト化抗体重鎖可変領域であり、Xは連結ポリペプチドであり、そしてVKはヒト化抗体軽鎖可変領域である）からなる群より選択される式を有するポリペプチドを含む、から本質的になる、またはからなる。
【０１２７】
他の実施形態において、本発明の抗原結合性ポリペプチドは、LIGHTポリペプチドに特異的に結合するscFv HSA融合分子を作製するために、一本鎖Fv分子(scFv)をヒト血清アルブミン(HSA)に融合させたものである。具体的な実施形態では、scFvがscFv HSA融合分子中でHSAのN末端に融合または連結される。他の実施形態では、scFvがscFv HSA融合分子中でHSAのC末端に融合または連結される。他の実施形態では、scFv HSA融合分子は、NH2-L-VH-X-VK-HSA-COOH; NH2-L-VK-X-VH-HSA-COOH; NH2-HSA-VH-X-VK-COOH; およびNH2-HSA-VK-X-VH-COOH（式中、Lはリーダー配列であり、VHはヒト化抗体重鎖可変領域であり、Xは連結ポリペプチドであり、HSAはヒト血清アルブミンであり、そしてVKはヒト化抗体軽鎖可変領域である）からなる群より選択される式を有する。
【０１２８】
特定の実施形態において、本発明の抗原結合性ポリペプチドはFabフラグメントである。他の実施形態では、本発明の抗原結合性ポリペプチドは、LIGHTポリペプチドに特異的に結合するFab HSA融合分子を作製するために、Fabフラグメントをヒト血清アルブミン(HSA)に融合または連結させたものである。具体的な実施形態では、Fabフラグメントの重鎖部分がFab HSA融合分子中でHSAのN末端もしくはC末端に融合または連結される。他の実施形態では、Fabフラグメントの軽鎖部分がFab HSA融合分子中でHSAのN末端もしくはC末端に融合または連結される。他の実施形態では、Fab HSA融合分子は、NH2-VH-CH1-HSA-COOH; NH2-HSA-VH-CH1-COOH; NH2-VK-CK-HSA-COOH; およびNH2-HSA-VK-CK-COOH（式中、VHはヒト化抗体重鎖可変領域であり、HSAはヒト血清アルブミンであり、VKはヒト化抗体軽鎖可変領域であり、CH1は重鎖定常ドメイン1であり、そしてCKは軽鎖定常ドメインである）からなる群より選択される式を有する。FabフラグメントまたはFab HSA融合分子の重鎖または軽鎖部分は、そのコグネイト対応物（例えば、本明細書に開示する抗原結合性ポリペプチドのヒト化重鎖可変領域またはヒト化軽鎖可変領域）とフォールディングして完全なFab-HSAまたはHSA-Fab融合分子をもたらす。
【０１２９】
他の実施形態において、本発明の抗原結合性ポリペプチドは保存的アミノ酸置換を含むことができる。
【０１３０】
「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が同様の側鎖をもつアミノ酸残基と置き換えられることである。同様の側鎖をもつアミノ酸残基のファミリーは当技術分野で定義されており、塩基性側鎖(例：リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例：アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例：グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例：アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、β-分岐側鎖(例：トレオニン、バリン、イソロイシン)、および芳香族側鎖(例：チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)が含まれる。したがって、免疫グロブリンポリペプチド中の非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基と置き換えることが好ましい。別の実施形態では、一連のアミノ酸を、側鎖ファミリーのメンバーの順序および/または組成の点で相違する、構造的に類似した一連のアミノ酸と置き換えることができる。
【０１３１】
治療薬または診断薬へのコンジュゲーション
具体的には、本発明の抗原結合性ポリペプチド、その変異体または誘導体は、治療薬、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生物学的応答調節剤、薬剤、またはPEGにコンジュゲートすることができる。
【０１３２】
本明細書に記載する抗原結合性ポリペプチドは治療薬にコンジュゲートまたは融合させることができ、そうした治療薬には、放射性標識、免疫調節剤、ホルモン、酵素、オリゴヌクレオチド、光活性治療薬または診断薬、細胞毒性薬(薬物でも毒素でもよい)、超音波増強剤、非放射性標識、それらの組合せ、および当技術分野で知られた他のそのような薬剤が含まれる。
【０１３３】
薬物には薬学的性質を保有するものが含まれ、抗有糸分裂剤、抗キナーゼ剤、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗生物質、アルカロイド、血管新生阻害剤、アポトーシス剤およびこれらの組合せからなる群より選択される。さらに特定すると、これらの薬物は以下の薬物からなる群より選択される：ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、アルキルスルホン酸塩、ニトロソ尿素、トリアゼン、葉酸類似体、COX-2阻害剤、ピリミジン類似体、プリン類似体、抗生物質、酵素、エピポドフィロトキシン、白金配位錯体、ビンカアルカロイド、置換尿素、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、アンタゴニスト、エンドスタチン、タキソール類、カンプトテシン類、アントラサイクリン類、タキサン類、およびそれらの類似体、ならびにそれらの組合せ。本発明に包含される毒素は、リシン、アブリン、アルファトキシン、サポリン、リボヌクレアーゼ(RNase)、例えばオンコナーゼ(onconase)、DNase I、ブドウ球菌エンテロトキシン-A、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン(gelonin)、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素、および緑膿菌内毒素からなる群より選択することができる。
【０１３４】
免疫調節剤は、サイトカイン、幹細胞増殖因子、リンホトキシン、造血因子、コロニー刺激因子(CSF)、インターフェロン(IFN)、エリスロポエチン、トロンボポエチン、およびそれらの組合せからなる群より選択することができる。特に有用なものは、リンホトキシン、例えば腫瘍壊死因子(TNF)、造血因子、例えばインターロイキン(IL)、コロニー刺激因子、例えば顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、インターフェロン、例えばインターフェロン-α、-βまたは-γ、および幹細胞増殖因子、例えば「S1因子」と呼ばれるものである。さらに特定すると、免疫調節剤としてIL-1、IL-2、IL-3、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、IL-21、インターフェロン-γ、TNF-α、またはそれらの組合せを挙げることができる。
【０１３５】
特定の実施形態において、本明細書に開示する抗原結合性ポリペプチドはターゲッティング成分をさらに含むことができる。ターゲッティング成分には、身体の特定部分（例えば、特定の炎症領域）への局在化を指令するタンパク質またはペプチドが含まれる。
【０１３６】
本明細書で述べるように、本発明の抗原結合性ポリペプチドまたはその変異体もしくは誘導体は、そのポリペプチドのin vivo半減期を引き延ばすために、または当技術分野で知られた方法を用いてイムノアッセイで使用するために、異種ポリペプチドに融合させることができる。例えば、一実施形態では、PEGを本発明のLIGHT抗体にコンジュゲートさせて、そのin vivo半減期を引き延ばすことができる。Leong, S.R., et al., Cytokine 16:106 (2001); Adv. in Drug Deliv. Rev. 54:531 (2002); または Weir et al., Biochem. Soc. Transactions 30:512 (2002)。
【０１３７】
さらに、本発明の抗原結合性ポリペプチドまたはその変異体もしくは誘導体は、それらの精製または検出を容易にするペプチドなどの、マーカー配列に融合させることができる。好ましい実施形態では、マーカーアミノ酸配列がヘキサヒスチジンペプチド（特に、pQEベクター(QIAGEN社, 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif., 91311)により提供されるタグ）であり、その多くは市販されている。Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 55:821-824 (1989)に記載されるように、例えば、ヘキサヒスチジンは融合タンパク質の簡便な精製を提供する。精製に有用な他のペプチドタグとしては、限定するものではないが、インフルエンザ血球凝集素タンパク質に由来する「HA」タグ(Wilson et al., Cell 37:161 (1984))および「flag」タグ(Brizzard et. al., Biotechniques 16(4): 730-735 (1994))が挙げられる。
【０１３８】
当業者には理解されるように、コンジュゲートはまた、コンジュゲートされる所定の物質に応じて、さまざまな方法を用いて組み立てることができる。例えば、ビオチンとのコンジュゲートは、結合ポリペプチドをビオチンの活性型エステル（ビオチンN-ヒドロキシスクシンイミドエステルなど）と反応させることによって、作製される。同様に、蛍光マーカーとのコンジュゲートは、カップリング剤（例えば、本明細書中に示したもの）の存在下で、またはイソチオシアネート（好ましくは、フルオレセイン-イソチオシアネート）との反応により、作製することができる。本発明の抗原結合性ポリペプチドまたはその断片、変異体もしくは誘導体のコンジュゲートは、類似した方法で作製される。
【０１３９】
本発明はさらに、診断薬または治療薬にコンジュゲート化された本発明の抗原結合性ポリペプチドまたはその変異体もしくは誘導体を包含する。コンジュゲート化ポリペプチドは、例えば所定の治療および/または予防レジメンの有効性を判定するための、臨床検査法の一環として、例えば疾患の発症または進行状況をモニタリングするために、診断上使用され得る。抗原結合性ポリペプチドまたはその断片、変異体もしくは誘導体を検出可能な物質にカップリングさせることによって、検出を促進することが可能である。検出可能な物質の例としては、各種の酵素、補欠分子族(prosthetic group)、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、ポジトロン放出金属（各種のポジトロン放出断層撮影法を用いる）、および非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。本発明において診断薬として使用するために抗体にコンジュゲートされ得る金属イオンについては、例えば、米国特許第4,741,900号を参照されたい。好適な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる；好適な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン/ビオチンおよびアビジン/ビオチンが挙げられる；好適な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロライド、またはフィコエリトリンが挙げられる；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられる；生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられる；好適な放射性物質の例としては、125I、131I、111Inまたは99Tcが挙げられる。
【０１４０】
抗原結合性ポリペプチドまたはその変異体もしくは誘導体はまた、それを化学発光化合物にカップリングさせることによって検出可能に標識することができる。化学発光により標識された抗原結合性ポリペプチドの存在はその後、化学反応の過程で生じる発光の存在を検出することによって確認される。特に有用な化学発光標識化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、セロマチック(theromatic)アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、およびシュウ酸エステルである。
【０１４１】
抗原結合性ポリペプチドまたはその変異体もしくは誘導体はまた、152Euまたはランタニド系列の他の金属などの蛍光放出金属を用いて、検出可能に標識することができる。これらの金属は、ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)またはエチレンジアミン四酢酸(EDTA)のような金属キレート基を用いて、抗体に結合させることができる。各種の成分を抗体にコンジュゲートする技術はよく知られており、例えば、以下の文献を参照されたい：Arnon et al.,「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy (癌治療における薬物のイムノターゲッティングのためのモノクローナル抗体)」, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al.(編), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. (1985); Hellstrom et al.,「Antibodies For Drug Delivery (ドラッグデリバリーのための抗体)」, Controlled Drug Delivery (第2版), Robinson et al.(編), Marcel Dekker, Inc., pp. 623-53 (1987); Thorpe,「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review (癌治療における細胞毒性薬の抗体キャリア：レビュー)」, Monoclonal Antibodies, 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al.(編), pp. 475-506 (1985); 「Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy (癌治療における放射性標識抗体の治療的使用の分析、結果および将来的展望)」, Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al.(編), Academic Press pp. 303-16 (1985); およびThorpe et al.,「The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates (抗体-毒素コンジュゲートの製造および細胞毒性作用)」, Immunol. Rev. (52:119-58 (1982))。
【０１４２】
本明細書に開示する抗原結合性ポリペプチドはまた、光活性診断薬、または60〜4,000keVのエネルギーをもつ放射性標識、または非放射性標識を含むがこれらに限定されない、他の診断薬にコンジュゲートまたは融合させることができる。放射性標識は好ましくはγ-、β-、またはポジトロン-放出アイソトープであり、125I、131I、123I、124I、86Y、186Re、188Re、62Cu、64Cu、111In、67Ga、68Ga、99mTc、94mTc、18F、11C、13N、15O、76Brおよびそれらの組合せからなる群より選択される。診断薬には、例えばマンガン、鉄またはガドリニウムなどの造影剤を含めることもできる。
【０１４３】
抗原結合性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
本発明はさらに、本発明の抗原結合性ポリペプチドまたはその変異体もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドまたは核酸分子を提供する。
【０１４４】
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、LIGHTポリペプチドと特異的に結合し、かつ配列番号1; 配列番号2; 配列番号3; 配列番号4; 配列番号5; 配列番号6; 配列番号7; および配列番号8からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなるヒト化重鎖可変領域を含む、から本質的になる、またはからなる抗原結合性ポリペプチドをコードする。特に、本発明の特定のポリヌクレオチドは、LIGHTポリペプチドと特異的に結合し、かつ配列番号4のアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなるヒト化重鎖可変領域を含む、から本質的になる、またはからなる抗原結合性ポリペプチドをコードする。
【０１４５】
別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載の重鎖可変領域を完全な重鎖（すなわち、定常領域）と共に含む完全ヒト化LIGHT抗体をコードする。
【０１４６】
別の実施形態において、本発明は、CDR-H1、CDR-H2およびCDR-H3領域を含むヒト化重鎖可変領域を含む、から本質的になる、またはからなる、LIGHTポリペプチドと特異的に結合する抗原結合性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。特定の実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、配列番号18; 配列番号23; 配列番号26; 配列番号29; 配列番号32; および配列番号35からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなるCDR-H1領域をコードする。特定の実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、配列番号19; 配列番号24; 配列番号27; 配列番号30; 配列番号33; および配列番号36からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなるCDR-H2領域をコードする。特定の実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、配列番号20; 配列番号21; 配列番号22; 配列番号25; 配列番号28; 配列番号31; 配列番号34; および配列番号37からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなるCDR-H3領域をコードする。
【０１４７】
具体的な実施形態において、本発明は、配列番号23のアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなるCDR-H1領域と、配列番号24のアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなるCDR-H2領域と、配列番号25のアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなるCDR-H3領域とを含むヒト化重鎖可変領域を含む、から本質的になる、またはからなる、LIGHTポリペプチドと特異的に結合する抗原結合性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを包含する。
【０１４８】
本発明はさらに、LIGHTポリペプチドと特異的に結合し、かつ配列番号9; 配列番号10; 配列番号11; 配列番号12; 配列番号13; 配列番号14; 配列番号15; 配列番号16; および配列番号17からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなるヒト化軽鎖可変領域を含む、から本質的になる、またはからなる抗原結合性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを包含する。特に、本発明の特定のポリヌクレオチドは、LIGHTポリペプチドと特異的に結合し、かつ配列番号12のアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなるヒト化軽鎖可変領域を含む、から本質的になる、またはからなる抗原結合性ポリペプチドをコードする。
【０１４９】
別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載の軽鎖可変領域を完全な軽鎖（すなわち、定常領域）と共に含む完全ヒト化LIGHT抗体をコードする。
【０１５０】
別の実施形態において、本発明は、CDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3領域を含むヒト化軽鎖可変領域を含む、から本質的になる、またはからなる、LIGHTポリペプチドと特異的に結合する抗原結合性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。特定の実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、配列番号38; 配列番号39; 配列番号40; 配列番号43; 配列番号46; 配列番号49; 配列番号52; および配列番号55からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなるCDR-L1領域をコードする。特定の実施形態では、CDR-L2領域は、配列番号41; 配列番号44; 配列番号47; 配列番号50; および配列番号53からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなる。特定の実施形態では、CDR-L3領域は、配列番号42; 配列番号45; 配列番号48; 配列番号51; および配列番号54からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなる。
【０１５１】
具体的な実施形態において、本発明は、配列番号43のアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなるCDR-L1領域と、配列番号44のアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなるCDR-L2領域と、配列番号45のアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなるCDR-L3領域とを含むヒト化軽鎖可変領域を含む、から本質的になる、またはからなる、LIGHTポリペプチドと特異的に結合する抗原結合性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを包含する。
【０１５２】
本発明の他の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、
i.    配列番号1 および 配列番号9;
ii.   配列番号2 および 配列番号10;
iii.  配列番号3 および 配列番号11;
iv.   配列番号4 および 配列番号12;
v.    配列番号5 および 配列番号13;
vi.   配列番号6 および 配列番号14;
vii.  配列番号7 および 配列番号15;
viii. 配列番号7 および 配列番号16;
ix.   配列番号8 および 配列番号17; ならびに
x.    これらの組合せ
からなる群より選択されるヒト化重鎖可変領域とヒト化軽鎖可変領域を含む、から本質的になる、またはからなる、LIGHTポリペプチドと特異的に結合する抗原結合性ポリペプチドをコードする。
【０１５３】
本発明の他の実施形態は、
i.    配列番号18, 19, 20 および 配列番号38, 41, 42;
ii.   配列番号18, 19, 21 および 配列番号39, 41, 42;
iii.  配列番号18, 19, 22 および 配列番号40, 41, 42;
iv.   配列番号23, 24, 25 および 配列番号43, 44, 45;
v.    配列番号26, 27, 28 および 配列番号46, 47, 48;
vi.   配列番号29, 30, 31 および 配列番号49, 50, 51;
vii.  配列番号32, 33, 34 および 配列番号52, 53, 54;
viii. 配列番号35, 36, 37 および 配列番号55, 50, 51; ならびに
ix.   これらの組合せ
からなる群より選択されるCDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3を含む、から本質的になる、またはからなるヒト化重鎖可変領域とヒト化軽鎖可変領域を含む、から本質的になる、またはからなる、LIGHTポリペプチドと特異的に結合する抗原結合性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを包含する。
【０１５４】
本発明のポリヌクレオチドは、抗原結合性ポリペプチドまたはその変異体もしくは誘導体の重鎖および軽鎖可変領域の全体を、同一のポリヌクレオチド分子上に、または別々のポリヌクレオチド分子上にコードすることができる。さらに、本発明のポリヌクレオチドは、抗原結合性ポリペプチドまたはその変異体もしくは誘導体の重鎖および軽鎖可変領域の部分を、同一のポリヌクレオチド分子上に、または別々のポリヌクレオチド分子上にコードすることができる。
【０１５５】
抗原結合性ポリペプチドの作製方法
抗体または抗原結合性ポリペプチドの作製方法は当技術分野でよく知られており、本明細書中で説明される。特定の実施形態では、本発明の抗原結合性ポリペプチドの可変領域と定常領域の両方が完全にヒトである。完全ヒト抗体は、当技術分野で記載されかつ本明細書で説明される技術を用いて作製することができる。例えば、特定の抗原に対する完全ヒト抗体は、抗原投与に応答してそのような抗体を産生するように改変された（しかし、その内在性遺伝子座が無効にされた）トランスジェニック動物に抗原を投与することによって作製することができる。そのような抗体を作製するために使用できる代表的な技術は、米国特許第6,150,584号、第6,458,592号および第6,420,140号に記載されており、それらの全内容を参照により本明細書に組み入れる。
【０１５６】
特定の実施形態において、本発明の抗原結合性ポリペプチドまたはその変異体もしくは誘導体は、治療される動物（例えば、ヒト）において有害な免疫応答を誘発しないものである。一実施形態では、本発明の抗原結合性ポリペプチドまたはその変異体もしくは誘導体は、当技術分野で認められた技術を用いて、その免疫原性が低下するように改変される。例えば、抗体をヒト化、霊長類化、または脱免疫化することが可能であり、キメラ抗体を作製することもできる。こうしたタイプの抗体は、親抗体の抗原結合特性を保持するまたは実質的に保持するが、ヒトにおける免疫原性が低い非ヒト抗体（一般的には、マウスまたは霊長類抗体）から誘導される。これは、以下の方法を含めて、さまざまな方法で達成することができる：(a)非ヒト可変ドメイン全体をヒト定常領域にグラフトしてキメラ抗体を作製する方法；(b)1つ以上の非ヒト相補性決定領域(CDR)の少なくとも一部をヒトフレームワークおよび定常領域（重要なフレームワーク残基を保持するまたは保持しない）にグラフトする方法；または(c)非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置換によってヒト様セクションでそれらを「クローキング」(cloaking)する方法。こうした方法は、Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 57:6851-6855 (1984); Morrison et al., Adv. Immunol. 44:65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 25:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun. 31:169-217 (1994); ならびに米国特許第5,585,089号、第5,693,761号、第5,693,762号および第6,190,370号に開示されており、これらの文献の全内容を参照により本明細書に組み入れる。
【０１５７】
抗体の免疫原性を低下させるために脱免疫化を用いることも可能である。本明細書中で用いる「脱免疫化」(de-immunization)という語は、T細胞エピトープを変更するための抗体の改変を含む（例えば、国際出願公開公報WO/9852976 A1およびWO/0034317 A2を参照されたい）。例えば、出発抗体由来の可変重鎖配列および可変軽鎖配列を解析して、その配列内の相補性決定領域(CDR)と他のキー残基との関連でエピトープ位置を示す各V領域からヒトT細胞エピトープ「マップ」を作成する。そのT細胞エピトープマップから個々のT細胞エピトープを解析して、最終的な抗体の活性を変化させるリスクの低い代替アミノ酸置換を特定する。アミノ酸置換の組合せを含むさまざまな代替的可変重鎖および可変軽鎖配列を設計し、次にこれらの配列を各種の結合ポリペプチドに組み込む。通常は、12〜24の変異型抗体を作製して、結合および/または機能について試験する。次いで、変更された可変領域とヒト定常領域を含む完全重鎖/軽鎖遺伝子を発現ベクターにクローン化し、その後のプラスミドを全抗体の産生のために細胞株に導入する。その後、これらの抗体を適切な生化学的および生物学的アッセイで比較して、最適な変異体を同定する。
【０１５８】
モノクローナル抗体は、当技術分野で知られた多様な技術を用いて作製することができ、例えば、ハイブリドーマ法、組換え法、ファージディスプレイ法、またはこれらの組合せが用いられる。例えば、モノクローナル抗体はハイブリドーマ法を用いて作製することができ、そうしたハイブリドーマ法には、当技術分野で知られた方法、例えば、Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第2版. (1988); Hammerling et al., Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas Elsevier, N. Y., 563-681 (1981)に教示された方法が含まれる(前記文献の全内容を参照により本明細書に組み入れる)。本明細書中で用いる「モノクローナル抗体」はハイブリドーマ法により作製される抗体に限定されない。用語「モノクローナル抗体」とは、それが作られる方法ではなく、単一のクローン（真核生物クローン、原核生物クローン、またはファージクローンを含む）から誘導される抗体を意味する。したがって、用語「モノクローナル抗体」はハイブリドーマ法で作製される抗体に限らない。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマと組換えとファージディスプレイの技術の使用を含めて、当技術分野で知られたさまざまな方法を用いて作製することができる。
【０１５９】
本発明の抗原結合性ポリペプチドの結合特異性は、免疫沈降、ラジオイムノアッセイ(RIA)、または酵素免疫吸着測定法(ELISA)などのin vitroアッセイで確認することができる。
【０１６０】
また、一本鎖抗体の作製のために記載された技術(米国特許第4,694,778号; Bird, Science 242:423-442 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 55:5879- 5883 (1988); およびWard et al., Nature 334:544-554 (1989))は、本発明の一本鎖抗体を作製するために適応させることができる。一本鎖抗体は、Fv領域の重鎖フラグメントと軽鎖フラグメントを、アミノ酸ブリッジを介して連結して、一本鎖抗体とすることにより形成される。大腸菌(E. coli)内での機能性Fvフラグメントのアセンブリのための技術を用いてもよい(Skerra et al., Science 242: 1038-1041 (1988))。
【０１６１】
抗体フラグメント、例えばFabおよびF(ab')2フラグメントは、パパイン（Fabフラグメントを生成する）またはペプシン（F(ab')2フラグメントを生成する）などの酵素を用いる免疫グロブリン分子のタンパク質分解による切断を含む公知の方法により作製することができる。F(ab')2フラグメントは可変領域、軽鎖定常領域および重鎖のCH1ドメインを含む。
【０１６２】
一本鎖Fv (scFv)および抗体を作製するために使用できる技法の例としては、米国特許第4,946,778号および第5,258,498号; Huston et al., Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu et al., Proc. Natl. Sci. USA 90:1995-1999 (1993); ならびにSkerra et al., Science 240:1038-1040 (1988)に記載される方法などがある。ヒトでの抗体のin vivo使用およびin vitro検出法を含めて、いくつかの用途では、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体を用いることが好ましい。キメラ抗体は、抗体の異なる部分が異なる動物種に由来する分子であり、例えば、マウスモノクローナル抗体由来の可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域をもつ抗体である。キメラ抗体を作製する方法は当技術分野で知られている。例えば、Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et al., J. Immunol. Methods 125:191-202 (1989); 米国特許第5,807,715号; 第4,816,567号; および第4,816397号を参照されたい；それらの全内容を参照により本明細書に組み入れる。
【０１６３】
ヒト化抗体は、目的の抗原と結合する非ヒト種抗体由来の抗体分子であり、非ヒト種由来の1つ以上の相補性決定領域(CDR)とヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域をもつ。多くの場合、ヒトフレームワーク領域中のフレームワーク残基は、抗原結合性を変更する（好ましくは、改善する）ために、CDRドナー抗体からの対応する残基と置換される。こうしたフレームワーク置換は当技術分野でよく知られた方法によって確認することができ、例えば、抗原結合性にとって重要なフレームワーク残基を識別するためのCDRとフレームワーク残基の相互作用のモデリング、および特定位置の特異なフレームワーク残基を識別するための配列比較によって確認される（例えば、Queen et al., 米国特許第5,585,089号; Riechmann et al., Nature 332:323 (1988)を参照されたい；それらの全内容を参照により本明細書に組み入れる）。抗体は当技術分野で知られたさまざまな技法を用いてヒト化することができ、そうした技法として、例えば、CDR-グラフティング(EP 239,400; PCT公開公報WO 91/09967; 米国特許第5,225,539号; 第5,530,101号; および第5,585,089号)、ベニアリング(veneering)またはリサーフェシング(resurfacing) (EP 592,106; EP 519,596; Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska. et al., Proc. Natl. Sci. USA 91:969-973 (1994))、ならびにチェインシャフリング(chain shuffling) (米国特許第5,565,332号)があり、これらの全内容を参照により本明細書に組み入れる。
【０１６４】
完全ヒト抗体はヒト患者の治療にとって特に望ましいものである。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列から誘導された抗体ライブラリーを用いるファージディスプレイ法を含めて、当技術分野で知られたさまざまな方法により作製することができる。また、米国特許第4,444,887号および第4,716,111号; ならびにPCT公開公報WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735およびWO 91/10741を参照されたい; それぞれの全内容を参照により本明細書に組み入れる。
【０１６５】
ヒト抗体はまた、機能的な内在性免疫グロブリンを発現する能力がないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスを用いて産生させることも可能である。例えば、ヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体をマウス胚性幹細胞にランダムにまたは相同組換えによって導入する。あるいはまた、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子に加えて、ヒト可変領域、定常領域および多様性領域をマウス胚性幹細胞に導入してもよい。マウス重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の相同組換えによる導入とは別に、または導入と同時に、非機能性の状態にすることができる。特に、JH領域のホモ接合性欠失は内在性抗体の産生を妨げる。改変された胚性幹細胞を増殖させ、胚盤胞へのマイクロインジェクションを行ってキメラマウスを作製する。その後キメラマウスを繁殖させて、ヒト抗体を発現するホモ接合子孫を得る。そのトランスジェニックマウスを、所定の抗原（例えば、所望の標的ポリペプチドの全部または一部）を用いて通常の方法で免疫する。免疫したトランスジェニックマウスから、従来のハイブリドーマ技術を用いて、その抗原に対するモノクローナル抗体を得ることができる。トランスジェニックマウスにより保持されるヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、B細胞分化の間に再構成され、続いてクラススイッチと体細胞変異を受ける。したがって、こうした技術を用いて、治療に有用なIgG、IgA、IgMおよびIgE抗体を作製することが可能である。ヒト抗体を作製するためのこの技術の概要については、Lonberg and Huszar Int. Rev. Immunol. 73:65-93 (1995)を参照されたい。ヒト抗体とヒトモノクローナル抗体を作製するためのこの技術およびそのような抗体を作製するためのプロトコールの詳細な解説については、例えば、PCT公開公報WO 98/24893; WO 96/34096; WO 96/33735; 米国特許第5,413,923号; 第5,625,126号; 第5,633,425号; 第5,569,825号; 第5,661,016号; 第5,545,806号; 第5,814,318号; および第5,939,598号を参照されたい；それらの全内容を参照により本明細書に組み入れる。さらに、Abgeni
x社(Freemont, Calif.)およびGenPharm社(San Jose, Calif.)のような企業は、上記と同様の技術を用いて所定の抗原に対するヒト抗体を提供することに従事している。
【０１６６】
本発明のヒトまたは実質的にヒトの抗原結合性ポリペプチドの作製もまた、内在性免疫グロブリンを産生する能力がないトランスジェニック動物（例えば、マウス）において作製することができる（例えば、米国特許第6,075,181号、第5,939,598号、第5,591,669号および第5,589,369号を参照されたい；それぞれを参照により本明細書に組み入れる）。例えば、キメラな生殖細胞変異マウスにおける抗体重鎖連結領域(joining region)のホモ接合性欠失は、内在性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。そのような生殖細胞変異マウスにヒト免疫グロブリン遺伝子アレイを移入すると、結果的に、抗原投与後にヒト抗体の産生が生じる。SCIDマウスを用いてヒト抗体を生成させる別の好適な手段は、米国特許第5,811,524号に記載されており、それを参照により本明細書に組み入れる。これらのヒト抗体と関連する遺伝物質は、本明細書に記載するように単離され操作され得ることも理解されるだろう。
【０１６７】
所定のエピトープを認識する完全ヒト抗体はまた、「guided selection」(誘導された選択)と呼ばれる技術を用いて作製することができる。このアプローチでは、所定の非ヒトモノクローナル抗体（例えば、マウス抗体）を用いて、同じエピトープを認識する完全ヒト抗体の選択へと誘導する(Jespers et al., Bio/Technology 72:899-903 (1988))。さらに、米国特許第5,565,332号を参照されたい；その全内容を参照により本明細書に組み入れる。
【０１６８】
別の実施形態では、目的のモノクローナル抗体をコードするDNAが、従来の方法を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）容易に単離され、配列決定され得る。単離されてサブクローン化されたハイブリドーマ細胞は、そのようなDNAの好ましい供給源として役立つ。いったん単離されたら、そのDNAを発現ベクターに挿入し、次に大腸菌(E. coli)細胞、サルCOS細胞、チャイニーズ・ハムスター卵巣(CHO)細胞またはミエローマ細胞などの、さもなくば免疫グロブリンを産生しない原核または真核宿主細胞にトランスフェクトする。より具体的には、単離されたDNA（本明細書に記載するように合成であってもよい）を用いて、1995年1月25日付けのNewmanらの米国特許第5,658,570号（参照により本明細書に組み入れる）に記載されるように、抗体の製造のために定常および可変領域配列をクローン化する。本質的に、これは、所定の細胞からのRNAの抽出、cDNAへの変換、およびIg特異的プライマーを用いるPCRによる増幅を必要とする。この目的に適したプライマーも米国特許第5,658,570号に記載されている。以下で詳細に説明するように、目的の抗体を発現する形質転換細胞は、免疫グロブリンの臨床的および商業的な供給を提供するために、比較的多量に増殖させることができる。
【０１６９】
さらに、通常の組換えDNA法を用いて、本発明の抗原結合性ポリペプチドの1つ以上のCDRを、フレームワーク領域内に、例えば非ヒト抗体をヒト化するためにヒトフレームワーク領域に、挿入することができる。フレームワーク領域は天然のまたは共通のフレームワーク領域であってよく、好ましくはヒトフレームワーク領域である（ヒトフレームワーク領域のリストについては、例えば、Chothia et al., J. Mol. Biol. 278:457-479 (1998)を参照されたい）。好ましくは、フレームワーク領域とCDRを組み合わせて作製されたポリヌクレオチドは、目的のポリペプチド（例えば、LIGHT）の少なくとも1つのエピトープに特異的に結合する抗体をコードするものである。好ましくは、1つ以上のアミノ酸置換がフレームワーク領域内で行われ、そして好ましくは、そのアミノ酸置換は抗体のその抗原への結合を改善するものである。さらに、そうした方法を利用して、鎖内ジスルフィド結合に関与する1つ以上の可変領域システイン残基のアミノ酸置換または欠失を行い、1つ以上の鎖内ジスルフィド結合を欠く抗体分子を作製することができる。ポリヌクレオチドへのその他の改変は本発明によって包含され、当分野の技術の範囲内である。
【０１７０】
さらに、「キメラ抗体」の作製のために開発された技術を使用することができ(Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA:851-855 (1984); Neuberger et al., Nature 372:604-608 (1984); Takeda et al., Nature 314:452-454 (1985))、キメラ抗体は、適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子を、適切な生物学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子とつなぎ合わせることにより作製される。本明細書中で用いるキメラ抗体は、抗体の異なる部分が異なる動物種に由来する分子であり、例えば、マウスモノクローナル抗体由来の可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域をもつ抗体である。
【０１７１】
組換え抗体を作製するためのさらに別の非常に効率のよい手段は、Newman, Biotechnology 10: 1455-1460 (1992)に開示されている。具体的には、この技術は、サル可変ドメインとヒト定常領域を含む霊長類化抗体の作製をもたらす。この文献の全内容を参照により本明細書に組み入れる。さらに、この技術は同一出願人による米国特許第5,658,570号、第5,693,780号および第5,756,096号（それぞれを参照により本明細書に組み入れる）にも記載されている。
【０１７２】
また、当業者によく知られた技術を用いて、抗体産生細胞株を選択して培養することが可能である。そのような技術はさまざまな実験マニュアルおよび主要刊行物に説明されている。これに関して、以下で説明する本発明において用いるのに適した技術は、Current Protocols in Immunology, Coligan et al.編, Green Publishing Associates and Wiley-Interscience, John Wiley and Sons, New York (1991)（補足を含めて、その全内容を参照により本明細書に組み入れる）に記載されている。
【０１７３】
本明細書に開示する診断法および治療法に使用するための抗体は、抗体合成のための当技術分野で知られた方法により、特に化学合成により、または好ましくは、本明細書に記載するような組換え発現法により、生成することができる。
【０１７４】
さらに、当業者に公知の標準方法を用いて、本発明の抗原結合性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に変異を導入することができ、そうした方法として、限定するものではないが、アミノ酸の置換をもたらす部位特異的変異誘発法およびPCR介在変異誘発法がある。好ましくは、変異体（誘導体を含む）は、基準となる重鎖可変領域、CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、軽鎖可変領域、CDR-L1、CDR-L2またはCDR-L3に対して50未満のアミノ酸置換、40未満のアミノ酸置換、30未満のアミノ酸置換、25未満のアミノ酸置換、20未満のアミノ酸置換、15未満のアミノ酸置換、10未満のアミノ酸置換、5未満のアミノ酸置換、4未満のアミノ酸置換、3未満のアミノ酸置換、または2未満のアミノ酸置換をコードする。あるいはまた、変異は、飽和変異誘発などにより、コード配列の全部または一部に沿ってランダムに導入することができ、得られた変異体は生物学的活性についてスクリーニングされ、活性（例えば、LIGHTポリペプチドと結合する能力）を保持する変異体が同定される。
【０１７５】
例えば、抗体分子のフレームワーク領域に、またはCDR領域にのみ、変異を導入することが可能である。導入される変異は、サイレントまたは中立的ミスセンス変異であってよく、すなわち、抗体の抗原結合能にまったくまたはほとんど影響を及ぼさない変異である。これらのタイプの変異は、コドン使用頻度を最適化するために、またはハイブリドーマの抗体産生を改善するために有用である。これとは別に、非中立的ミスセンス変異は抗体の抗原結合能を変更することがある。ほとんどのサイレントおよび中立的ミスセンス変異の位置はフレームワーク領域に存在する可能性がある一方、大部分の非中立的ミスセンス変異の位置はCDRに存在する可能性があるが、これは絶対条件ではない。当業者は、抗原結合活性の変更なしまたは結合活性の変更（例えば、抗原結合活性の改善または抗体特異性の変化）といった、所望の特性を有する変異型分子を設計して、試験することができるだろう。変異誘発に続いて、コード化タンパク質を常法により発現させて、そのコード化タンパク質の機能的および/または生物学的活性（例えば、LIGHTポリペプチドの少なくとも1つのエピトープと免疫特異的に結合する能力）を、本明細書に記載の方法を用いて、または当技術分野で公知の方法を通常どおりに変更することによって、測定することができる。
【０１７６】
本発明の抗原結合性ポリペプチド、その変異体または誘導体を得るために、単離された遺伝物質を操作した後、本発明の抗原結合性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、一般に、宿主細胞（希望する量の抗原結合性ポリペプチドを産生させるために用いられる）に導入するための発現ベクターに挿入される。
【０１７７】
抗原結合性ポリペプチド、その誘導体または変異体（例えば、本明細書に記載する標的分子(例えば、LIGHT)に結合する抗体の重鎖または軽鎖）の組換え発現には、その抗原結合性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築が必要である。いったん本発明の抗原結合性ポリペプチドまたは抗原結合性ポリペプチドの重鎖もしくは軽鎖、またはその一部（好ましくは、重鎖または軽鎖可変ドメインを含む）をコードするポリヌクレオチドが得られたら、当技術分野で周知の方法を用いて組換えDNA法により抗体分子産生用のベクターを構築することができる。こうして、抗体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを発現させることによるタンパク質の調製方法が本明細書に記載される。当業者に周知の方法を用いて、抗体をコードする配列と適切な転写および翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、例えば、in vitro組換えDNA法、合成法、およびin vivo遺伝子組換え法が含まれる。したがって、本発明は、プロモーターに機能的に連結された、本発明の抗体分子、またはその重鎖もしくは軽鎖、または重鎖もしくは軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供する。そのようなベクターには抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列が含まれており（例えば、PCT公開公報WO 86/05807; PCT公開公報WO 89/01036; および米国特許第5,122,464号参照）、重鎖または軽鎖の全体を発現させるためのそうしたベクターに、抗体の可変ドメインをクローン化することができる。
【０１７８】
宿主細胞は、本発明の2つの発現ベクター（第1のベクターが重鎖由来のポリペプチドをコードし、第2のベクターが軽鎖由来のポリペプチドをコードする）で同時にトランスフェクトすることができる。これら2つのベクターは、重鎖および軽鎖ポリペプチドの等しい発現を可能にする同一の選択マーカーを含むことができる。あるいはまた、重鎖および軽鎖の両ポリペプチドをコードする単一のベクターを用いることもできる。そのような場合には、過剰な、毒性の、遊離した重鎖を避けるために、軽鎖を重鎖の前に配置することが有利である(Proudfoot, Nature 322:52 (1986); Kohler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2197 (1980))。重鎖および軽鎖のコード配列はcDNAであっても、ゲノムDNAであってもよい。
【０１７９】
本明細書中で用いる「ベクター」または「発現ベクター」という語は、目的の遺伝子を宿主細胞に導入して発現させるための運搬体として本発明に従って用いられるベクターを意味する。当業者には知られているように、そうしたベクターはプラスミド、ファージ、ウイルスおよびレトロウイルスからなる群より容易に選択することができる。一般的に、本発明に適合するベクターは、選択マーカー、目的遺伝子のクローニングを容易にする適切な制限部位、ならびに真核もしくは原核細胞に侵入する能力および/または細胞内で複製する能力を備えているだろう。
【０１８０】
本発明の目的のために、多数の発現ベクター系を使用することができる。例えば、1つのクラスのベクターは、ウシ乳頭腫ウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス(RSV、MMTVもしくはMOMLV)、またはSV40ウイルスなどの動物ウイルスに由来するDNAエレメントを利用する。その他は、内部リボソーム結合部位を有するポリシストロン性発現系の使用を含む。さらに、DNAを染色体に組み込んでいる細胞は、トランスフェクトされた宿主細胞の選択を可能にする1つ以上のマーカーを導入することによって、選択することができる。マーカーは栄養要求性宿主への原栄養性、殺生物剤耐性（例えば、抗生物質）、または銅などの重金属への抵抗性を与えることができる。選択マーカー遺伝子は、発現されるDNA配列に直接連結されてもよいし、または同時形質転換によって同じ細胞に導入されてもよい。mRNAの最適な合成のため、追加のエレメントが必要になることがある。こうしたエレメントには、シグナル配列、スプライスシグナル、ならびに転写プロモーター、エンハンサー、および終結シグナルが含まれる。
【０１８１】
特に好ましい実施形態では、クローン化された可変領域遺伝子が、上記のような重鎖および軽鎖定常領域遺伝子（好ましくはヒト）と共に発現ベクターに挿入される。真核細胞内で発現を引き出すことができる発現ベクターはいずれも本発明で使用することができる。適当なベクターの例としては、限定するものではないが、プラスミドpcDNA3、pHCMV/Zeo、pCR3.1、pEF I/His、pEMD/GS、pRc/HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER-HCMV、pUB6/V5-His、pVAXl、およびpZeoSV2 (Invitrogen社(San Diego, CA)から入手可能)、ならびにプラスミドpCI (Promega社(Madison, WI)から入手可能)が挙げられる。一般的に、多数の形質転換細胞を、適切に高レベルの免疫グロブリン重鎖および軽鎖を発現するものについてスクリーニングすることは日常的な実験であり、例えばロボットシステムで実施することができる。ベクター系は米国特許第5,736,137号および第5,658,570号にも教示されており、それぞれの全内容を参照により本明細書に組み入れる。この系は高い発現レベル、例えば＞30pg/細胞/日を提供する。他の代表的なベクター系は例えば米国特許第6,413,777号に開示されている。
【０１８２】
他の好ましい実施形態では、本発明の抗原結合性ポリペプチド、その変異体または誘導体は、ポリシストロン性構築物を用いて、例えば2002年11月18日付け米国特許出願公開第2003-0157641 Al号（その全内容を本明細書に組み入れる）に開示されるものを用いて、発現させることができる。こうした新規発現系では、対象となる多数の遺伝子産物（例えば、抗体の重鎖および軽鎖）が単一のポリシストロン性構築物から産生される。これらの系は有利には、真核宿主細胞において比較的高レベルの抗原結合性ポリペプチドを与えるために、内部リボソーム侵入部位(IRES)を使用する。適合性IRES配列は米国特許第6,193,980号（これも本明細書に組み入れる）に開示されている。当業者は、こうした発現系が本出願で開示するあらゆる抗原結合性ポリペプチドを効率よく産生させるために使用できることを理解するだろう。
【０１８３】
より一般的には、いったん抗原結合性ポリペプチドのモノマーサブユニットをコードするDNA配列またはベクターが作製されたら、その発現ベクターは適切な宿主細胞に導入される。宿主細胞へのプラスミドの導入は、当業者によく知られた各種の技術によって達成することができる。それらには、限定するものではないが、トランスフェクション（電気泳動およびエレクトロポレーションを含む）、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈降、エンベロープDNAとの細胞融合、マイクロインジェクション、および完全ウイルスによる感染が含まれる。Ridgway, A. A. G.「Mammalian Expression Vectors」(哺乳類発現ベクター) Vectors, Rodriguez and Denhardt編, Butterworths, Boston, Mass., Chapter 24.2, pp. 470- 472 (1988)を参照されたい。典型的には、宿主へのプラスミドの導入はエレクトロポレーションにより行われる。発現構築物を保有する宿主細胞は軽鎖および重鎖の産生に適する条件下で生育させ、重鎖および/または軽鎖タンパク質の合成についてアッセイする。代表的なアッセイ技術には、酵素免疫吸着測定法(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)、蛍光活性化セルソーター解析(FACS)、免疫組織化学などが含まれる。
【０１８４】
発現ベクターは従来技術により宿主細胞に移入され、その後、トランスフェクトされた細胞を従来技術で培養して、本明細書に記載の方法で使用するための抗体を産生させる。かくして、本発明は、異種プロモーターに機能的に連結された、本発明の抗体またはその重鎖もしくは軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を包含する。二本鎖抗体の発現に好適な実施形態では、重鎖と軽鎖の両方をコードするベクターを、以下で詳述するように、全免疫グロブリン分子の発現のための宿主細胞内で共発現させることができる。
【０１８５】
本明細書中で用いる「宿主細胞」とは、組換えDNA法を用いて構築された、少なくとも1つの異種遺伝子をコードするベクターを保有する細胞を意味する。組換え宿主からの抗体の分離方法の説明において、用語「細胞」および「細胞培養物」は、他に明確に特定されない限り、抗体の供給源を示すために互換的に用いられる。言い換えれば、「細胞」からのポリペプチドの回収は、遠心した全細胞からの回収、または培地と浮遊細胞の両方を含む細胞培養物からの回収のいずれかを意味する。
【０１８６】
抗原結合性ポリペプチドを発現させるために、さまざまな宿主-発現ベクター系を利用することができる。そのような宿主-発現系は運搬体（これにより目的のコード配列が産生され、続いて精製される）に相当するが、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換またはトランスフェクトされたときには、本発明の抗原結合性ポリペプチドをin situで発現し得る細胞にも相当する。それらには、限定するものではないが、以下の微生物が含まれる：抗体コード配列を含む組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNAもしくはコスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌(例えば、大腸菌、枯草菌)；抗体コード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母(例えば、サッカロミセス属(Saccharomyces)、ピチア属(Pichia))；抗体コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター(例えば、バキュロウイルス)に感染した昆虫細胞系；抗体コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)、タバコモザイクウイルス(TMV))に感染した、もしくは抗体コード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター(例えば、Tiプラスミド)で形質転換された植物細胞系；または哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター(例えば、メタロチオネインプロモーター)もしくは哺乳動物ウイルス由来のプロモーター(例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター)を含む組換え発現構築物を保有する哺乳動物細胞系(例えば、COS、CHO、BLK、293、3T3細胞)。好ましくは、大腸菌のような細菌細胞、より好ましくは、真核細胞、特に全組換え抗体分子発現用の真核細胞が、組換え抗体分子の発現のために使用される。例えば、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要前初期遺伝子プロモーターエレメントを含むベクターなどのベクターと組み合わせた、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞(CHO)などの哺乳動物細胞は、抗体のための有効な発現ベクターである(Foecking et al., Gene 5:101 (1986); Cockett et al., Bio/Technology 8:2 (1990))。
【０１８７】
タンパク質の発現のために用いる宿主細胞株は多くの場合哺乳動物由来のものである；当業者は、発現される目的の遺伝子産物に最も適している特定の宿主細胞株を優先的に決定する能力があると考えられる。代表的な宿主細胞株には、限定するものではないが、以下のものが含まれる：CHO (チャイニーズ・ハムスター卵巣)、DG44およびDUXBII (チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞株、DHFRマイナス)、HELA (ヒト子宮頸癌)、CVI (サル腎細胞株)、COS (SV40 T抗原をもつCVIの誘導体)、VERY、BHK (ベビーハムスター腎臓)、MDCK、293、WI38、R1610 (チャイニーズ・ハムスター線維芽細胞)、BALBC/3T3 (マウス線維芽細胞)、HAK (ハムスター腎細胞株)、SP2/0 (マウス骨髄腫)、P3x63-Ag3.653 (マウス骨髄腫)、BFA-Ic IBPT (ウシ内皮細胞)、RAJI (ヒトリンパ球)および293 (ヒト腎臓)。宿主細胞株は一般的に、商業サービス、アメリカン・ティッシュ・カルチャー・コレクション(American Tissue Culture Collection)から、または発表された文献から入手可能である。
【０１８８】
さらに、宿主細胞株は、挿入配列の発現を調節する細胞株、または遺伝子産物を希望する特定の方法で修飾およびプロセシングする細胞株を選択することができる。タンパク質産物のそのような修飾（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、切断）はタンパク質の機能にとって重要であり得る。種々の宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングと修飾のための特徴的かつ特異的なメカニズムを備えている。発現された外来タンパク質の正しい修飾とプロセシングを確実にするために、適切な細胞株または宿主系が選択される。そのために、一次転写産物の適正なプロセシング、グリコシル化、および遺伝子産物のリン酸化の細胞機構をもつ真核宿主細胞が使用される。
【０１８９】
組換えタンパク質の長期的な高収量での生産のためには、安定した発現が好ましい。例えば、抗体分子を安定に発現する細胞株を遺伝子工学的に作製することが可能である。ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを用いるよりも、適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）により制御されるDNAと選択マーカーを用いて、宿主細胞を形質転換することができる。外来DNAの導入後、遺伝子操作された細胞を富栄養培地で1〜2日間増殖させ、その後選択培地に切り替える。組換えプラスミド中の選択マーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞がその染色体にプラスミドを安定的に組み込みかつ増殖して細胞増殖巣を形成することを可能にする。その後、増殖巣をクローン化して細胞株へと増やすことができる。この方法は、本発明の抗原結合性ポリペプチドを安定に発現する細胞株を作製するために有利に使用される。
【０１９０】
多くの選択系が用いられ、限定するものではないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(Wigler et al., Cell 11:223 (1977))、ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202 (1992))、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Lowy et al., Cell 22:817 1980)遺伝子がそれぞれtk-、hgprt-またはaprt-細胞において用いられる。さらに、代謝拮抗物質耐性を以下の遺伝子の選択の基礎として用いることができる：dhfr、メトトレキセートに対する耐性を付与する(Wigler et al., Natl. Acad. Sci. USA 77:357 (1980); O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 78:1527 (1981)); gpt、ミコフェノール酸に対する耐性を付与する(Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci USA 78:2072 (1981)); neo、アミノグリコシドG-418に対する耐性を付与する(Wu and Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991)); およびhygro、ハイグロマイシンに対する耐性を付与する(Santerre et al., Gene 30:147 (1984))。組換えDNA技術の分野で広く知られた、使用できる方法は、Ausubel et al. (編), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); Dracopoli et al. (編), Current Prolocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994)の第12および13章; Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150:1 (1981)に記載されており、これらの全内容を参照により本明細書に組み入れる。
【０１９１】
抗原結合性ポリペプチドの発現レベルは、ベクターの増幅により高めることができる（概説については、Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning (DNAクローニングにおける哺乳動物細胞中のクローン化遺伝子の発現のための遺伝子増幅に基づくベクターの使用), Academic Press, New York, Vol. 3. (1987)を参照されたい)。抗体を発現するベクター系のマーカーが増幅可能である場合に、宿主細胞の培養物中に存在する阻害剤のレベルを増加させると、マーカー遺伝子のコピー数が増加する。増幅された領域は抗体遺伝子と関連しているので、抗体の産生もまた増加することになる(Grouse et al., Mol. Cell. Biol. 3:257 (1983))。
【０１９２】
本発明の抗原結合性ポリペプチドまたはその変異体もしくは誘導体をコードする遺伝子は、細菌、酵母、植物細胞などの非哺乳動物細胞においても発現させることができる。核酸を容易に取り込む細菌には、腸内細菌科（enterobacteriaceae）のメンバー、例えば大腸菌またはサルモネラ属の菌株；バシラス科（Baclillaceae）、例えば枯草菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌属（Pneumococcus）；連鎖球菌属（Streptococcus）、およびインフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)が含まれる。さらに、細菌内で発現させた場合、異種ポリペプチドは通常、封入体の一部になることが理解されるだろう。異種ポリペプチドは、単離・精製してから、機能性分子の構造に組み立てる必要がある。
【０１９３】
細菌系では、発現される抗体分子の使用目的に応じて、いくつかの発現ベクターを有利に選択することができる。例えば、抗体分子の医薬組成物を得るために、そのようなタンパク質を大量に生産しようとする場合は、容易に精製される融合タンパク質産物の高レベル発現を指令するベクターが望ましい。そのようなベクターとして、限定するものではないが、以下のベクターが挙げられる：大腸菌発現ベクターpUR278 (Ruther et al., EMBO J. 2: 1791 (1983))、この場合には、融合タンパク質が産生されるように、抗体のコード配列がlacZコード領域と同じ読み枠でベクターに個々にライゲートされる；pINベクター(Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res. 73:3101-3109 (1985); Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 24:5503-5509 (1989))；および同様のベクター。また、pGEXベクターも、外来ポリペプチドをグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として発現させるために用いられる。一般に、そうした融合タンパク質は可溶性であり、担体グルタチオン-アガロースビーズへの吸着・結合と、その後の遊離グルタチオンの存在下での溶出によって溶解細胞から簡単に精製することができる。このpGEXベクターは、クローン化標的遺伝子産物がGST部分から放出されるように、トロンビンまたは第Xa因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計されている。
【０１９４】
原核生物に加えて、真核微生物を用いることもできる。サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)つまり普通のパン酵母は、真核微生物の中でも最も広く用いられているが、いくつかの他の菌株、例えばピチア・パストリス(Pichia pastoris)も一般に入手可能である。
【０１９５】
サッカロミセスでの発現の場合は、例えばプラスミドYRp7 (Stinchcomb et al., Nature 252:39 (1979); Kingsman et al., Gene 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene 10:157 (1980))が一般に用いられる。このプラスミドは、トリプトファン中で増殖する能力を欠く酵母の変異株、例えばATCC番号44076またはPEP4-1 (Jones, Genetics 85:12 (1977))に対する選択マーカーを提供するtrpl遺伝子をすでに含んでいる。その後、酵母宿主細胞のゲノムの特徴としてのtrpl障害の存在は、トリプトファンの非存在下で増殖させることによって形質転換を検出するための有効な環境を提供する。
【０１９６】
昆虫系では、オートグラファ・カリフォルニカ(Autographa californica)核多角体病ウイルス(AcNPV)が外来遺伝子を発現させるためのベクターとして一般に用いられる。このウイルスはスポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda：ヨトウガ)細胞内で増殖する。抗体のコード配列をウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）に個々にクローン化し、AcNPVプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に置くことができる。
【０１９７】
いったん本発明の抗原結合性ポリペプチドが組換えにより発現されたら、それは免疫グロブリン分子の精製のための当技術分野で公知の方法によって精製され、例えば、クロマトグラフィー（例：イオン交換、アフィニティー(特にプロテインA後の特異的抗原に対するアフィニティーによる)、およびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差、またはタンパク質精製のための他の標準方法により精製することができる。また、本発明の抗体の親和性を高めるための好ましい方法は、2001年11月14日付けのZaudererらによるUS 2002-0123057 Alに開示されている。
【０１９８】
治療および診断方法
本明細書に記載したように、本発明の抗原結合性ポリペプチド、その変異体または誘導体は、炎症性、免疫性または悪性の疾患または症状と関連した特定の治療および診断方法において使用される。具体的には、本発明の特定の抗原結合性ポリペプチドはLIGHT活性のアンタゴニストであり得る。例えば、特定の抗原結合性ポリペプチドは、T細胞の刺激、前炎症性サイトカイン(IFN-γ、IL-8など)の刺激、ならびにCD3およびTh17細胞によるIL-17産生の刺激といった、LIGHT活性のアンタゴニストである。さらに、本発明のLIGHT抗原結合性ポリペプチドは、LTβ受容体、HVEM受容体およびデコイ受容体3/TR6、ならびにLIGHTが結合する他の受容体に結合するLIGHTの能力を妨げることができる。
【０１９９】
本発明はさらに、抗原結合性ポリペプチドをベースとした治療方法に関し、その方法は、本明細書に記載する1つ以上の疾患または症状を治療するために、動物、哺乳動物、ヒトなどの患者に本発明の抗原結合性ポリペプチドを投与することを含む。本発明の治療用化合物には、限定するものではないが、本発明の抗原結合性ポリペプチド（本明細書に記載のその変異体および誘導体を含む）、ならびに本発明の抗原結合性ポリペプチド（本明細書に記載のその変異体および誘導体を含む）をコードする核酸またはポリヌクレオチドが含まれる。
【０２００】
本発明の抗原結合性ポリペプチドは、以下のような免疫性もしくは炎症性の疾患、障害、またはそのような疾患や障害と関連した症状などの、本明細書に記載の疾患、障害または症状のいずれかを含むがそれらに限定されない疾患、障害または症状を治療する、抑制する、または予防するために用いられる：例えば、限定するものではないが、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性新生児血小板減少症、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性血球減少症、溶血性貧血、抗リン脂質症候群、皮膚炎、アレルギー性脳脊髄炎、心筋炎、再発性多発性軟骨炎、リウマチ性心疾患、糸球体腎炎(例：IgAネフロパシー)、多発性硬化症、神経炎、ブドウ膜眼炎、多腺性内分泌障害、紫斑病(例：ヘノッホ・シェーンライン紫斑病)、ライター病、スティッフ・マン(Stiff-Man)症候群、自己免疫性肺炎症、ギランバレー症候群、インスリン依存性糖尿病、および自己免疫性炎症性眼、自己免疫性甲状腺炎、甲状腺機能低下症(すなわち、橋本甲状腺炎)、全身性エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、天疱瘡、受容体自己免疫(receptor autoimmunity)、例えば、(a)グレーヴス病、(b)重症筋無力症、および(c)インスリン抵抗性、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少性紫斑病、関節リウマチ、抗コラーゲン抗体を伴う強皮症、混合性結合組織病、多発性-皮膚筋炎、悪性貧血、特発性アジソン病、不妊症、糸球体腎炎、例えば原発性糸球体腎炎およびIgAネフロパシー、水疱性類天疱瘡、シェーグレン症候群、糖尿病、およびアドレナリン作動薬耐性(喘息または嚢胞性線維症を伴うアドレナリン作動薬耐性を含む)、慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、他の内分泌腺障害、白斑、血管炎、MI(心筋梗塞)後、開心後症候群、蕁麻疹、アトピー性皮膚炎、喘息、炎症性筋疾患、ならびに他の炎症性、肉芽腫性、退行性、および萎縮性障害、ならびに免疫不全またはそのような疾患や障害と関連した症状、例えば、限定するものではないが、重症複合免疫不全(SCID)-X染色体性、SCID-常染色体性、アデノシンデアミナーゼ欠損症(ADA欠損症)、X染色体性無ガンマグロブリン血症(XLA)、ブルトン病(Bruton's disease)、先天性無ガンマグロブリン血症、X染色体性乳児無ガンマグロブリン血症、後天性無ガンマグロブリン血症、成人発症無ガンマグロブリン血症、晩発生無ガンマグロブリン血症、異ガンマグロブリン血症、低ガンマグロブリン血症、一過性乳児低ガンマグロブリン血症、不特定低ガンマグロブリン血症、無ガンマグロブリン血症、分類不能型免疫不全症(common variable immunodeficiency: CVID)(後天性)、ウィスコット・アルドリッチ症候群(Wiskott-Aldrich Syndrome: WAS)、高IgMを伴うX染色体性免疫不全症、高IgMを伴う非X染色体性免疫不全症、選択的IgA欠損症、IgGサブクラス欠損症(IgA欠損を伴うまたは伴わない)、正常または上昇Igを伴う抗体欠乏症、胸腺腫を伴う免疫不全、Ig重鎖欠損症、κ鎖欠損症、B細胞リンパ増殖性障害(BLPD)、選択的IgM免疫不全症、劣性無ガンマグロブリン血症(スイス型)、細網異形成症(reticular dysgenesis)、新生児好中球減少症、重症先天性白血球減少症、胸腺リンパ形成不全症-免疫不全を伴う無形成症または異形成症、血管拡張性失調症、短肢矮小発育症、X染色体性リンパ増殖症候群(XLP)、ネゼロフ(Nezelof)症候群-Igを伴う複合免疫不全症、プリンヌクレオシ��ホスホリラーゼ欠損症(PNP)、MHCクラスII欠損症(裸リンパ球症候群)、重症複合免疫不全症、ディジョージ症候群(DiGeorge anomaly)、胸腺低形成症、慢性皮膚粘膜カンジダ症、ナチュラルキラー細胞欠損症、特発性CD4+T細胞減少症、および主要T細胞欠損を伴う免疫不全。
【０２０１】
本発明の抗原結合性ポリペプチドはまた、以下のような疾患、障害または症状を治療する、抑制する、または予防するために用いることができる：悪性疾患、障害、またはそのような疾患や障害と関連した症状、例えば細胞の生存増加またはアポトーシスの抑制と関連した疾患、例えば癌（濾胞性リンパ腫、p53変異を伴う癌、およびホルモン依存性腫瘍、例えば、限定するものではないが、大腸癌（結腸癌）、心臓腫瘍、膵臓癌、黒色腫、網膜芽腫、グリア芽腫、肺癌、腸癌、精巣癌、胃癌、神経芽腫、粘液腫、筋腫、リンパ腫、内皮腫、骨芽細胞腫、骨巨細胞腫、骨肉腫、軟骨肉腫、腺腫、乳癌、前立腺癌、カポジ肉腫、および卵巣癌など）；自己免疫疾患（多発性硬化症、シェーグレン症候群、グレーヴス病、橋本甲状腺炎、自己免疫性糖尿病、胆汁性肝硬変、ベーチェット病、クローン病、多発性筋炎、全身性エリテマトーデスおよび免疫関連糸球体腎炎、自己免疫性胃炎、自己免疫性血小板減少性紫斑病、および関節リウマチなど）；ならびにウイルス感染(ヘルペスウイルス、ポックスウイルスおよびアデノウイルスなど)、炎症、移植片対宿主病(急性および/または慢性)、急性の移植片拒絶、および慢性の移植片拒絶。本発明の抗原結合性ポリペプチド、その変異体または誘導体は、癌（特に、上で挙げたものまたは次の段落で挙げるもの）の増殖、進行および/または転移を抑制するために用いられる。
【０２０２】
本発明の抗原結合性ポリペプチド、その変異体または誘導体を用いて治療、予防、診断および/または予後判定することができる、細胞の生存増加と関連したさらなる疾患または症状には、限定するものではないが、以下の悪性疾患と関連障害の進行および/または転移が含まれる：白血病（急性白血病(例：急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、および赤白血病を含む))および慢性白血病(例：慢性骨髄性(顆粒球性)白血病および慢性リンパ球性白血病)を含む）、真性多血症、リンパ腫(例：ホジキン病および非ホジキン病)、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病、ならびに固形腫瘍、例えば、限定するものではないが、肉腫および癌、例えば線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊椎腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、大腸癌（結腸癌）、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮性癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽腫および網膜芽腫。
【０２０３】
本発明の抗原結合性ポリペプチド、その変異体または誘導体を用いて治療、予防、診断および/または予後判定することができる、アポトーシスの増加と関連した疾患としては、限定するものではないが、以下の疾患が挙げられる：AIDS; 神経変性疾患(例：アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、網膜色素変性症、小脳変性症および脳腫瘍または以前の関連疾患); 自己免疫疾患(例：多発性硬化症、シェーグレン症候群、グレーヴス病、橋本甲状腺炎、自己免疫性糖尿病、胆汁性肝硬変、ベーチェット病、クローン病、多発性筋炎、全身性エリテマトーデス、免疫関連糸球体腎炎、自己免疫性胃炎、血小板減少性紫斑病、および関節リウマチ)、骨髄異形成症候群(例：再生不良性貧血)、移植片対宿主病(急性および/または慢性)、虚血性障害(例：心筋梗塞、脳卒中および再灌流障害が原因で起こるもの)、肝障害または肝臓病(例：肝炎関連肝障害、肝硬変、虚血/再灌流障害、胆汁うっ滞(胆管損傷)および肝癌); 毒素誘発性肝疾患(例：アルコールが原因で起こるもの)、敗血症性ショック、潰瘍性大腸炎、悪液質および拒食症。
【０２０４】
本発明の抗原結合性ポリペプチドが治療または診断方法で有益とされる疾患、障害または症状の具体例としては、限定するものではないが、以下のものが挙げられる：自己免疫疾患、炎症性腸疾患(IBD)、慢性閉塞性肺疾患(COPD)；関節炎；関節リウマチ；多発性硬化症；移植拒絶反応；移植片対宿主病(GVHD)；中枢神経系損傷；Th1介在性腸疾患；クローン病；乾癬；白血病；リンパ腫；慢性リンパ球性白血病；アテローム性動脈硬化症；肺癌；大腸癌（結腸癌）；および肝炎。
【０２０５】
個々の患者に対する具体的な用量および治療レジメンはさまざまな要因に依存し、例えば、用いる特定の抗原結合性ポリペプチド、その変異体もしくは誘導体、患者の年齢、体重、全体的な健康状態、性別および食事、投与時刻、排泄速度、薬物の組合せ、ならびに治療対象の特定の疾患の重症度に左右される。医療従事者によるそうした要因の判断は当分野の通常の技術の範囲内である。その量は、治療しようとする個々の患者、投与経路、製剤の種類、用いる化合物の特性、疾患の重症度、および所望の効果にも左右される。使用量は当技術分野で周知の薬理学的および薬物動態学的原則によって決定することができる。
【０２０６】
本発明の抗原結合性ポリペプチド、その変異体もしくは誘導体の投与方法としては、限定するものではないが、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および経口経路が挙げられる。抗原結合性ポリペプチドまたは組成物は、便利な経路で、例えば注入またはボーラス注射により、上皮または皮膚粘膜内層（例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜など）からの吸収により、投与することができ、また、他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与することもできる。したがって、本発明の抗原結合性ポリペプチドを含む医薬組成物は、経口的に、経直腸的に、非経口的に、脳槽内に(intracisternally)、膣内に、腹腔内に、局所的に（粉末、軟膏、点滴剤または経皮パッチとして）、バッカル錠として、または経口もしくは鼻腔スプレーとして投与することができる。
【０２０７】
本明細書中で用いる用語「非経口」とは、静脈内、筋内、腹腔内、胸骨内、脳槽内、皮下および関節内注射および注入を含む投与方式を指す。
【０２０８】
投与は全身投与または局所投与とすることができる。さらに、本発明の医薬化合物または組成物は、脳室内およびくも膜下への注入を含む適切な経路で中枢神経系に導入することが望ましい場合がある；脳室内注入は、例えばオマヤレザバー(Ommaya reservoir)などのレザバーに取り付けられた、脳室内カテーテルによって促進される。また、肺投与も、例えば、吸入器またはネブライザーとエアロゾル化剤を含む製剤を用いることにより、利用することができる。
【０２０９】
本発明の抗原結合性ポリペプチドまたは組成物は、治療が必要な個所に局所的に投与することが望ましい場合がある；これは、例えば、限定するものではないが、手術中の局所注入、局所適用（例えば、手術後の創傷包帯との併用）、注射、カテーテル、座剤、またはインプラントによって達成することができ、前記インプラントは、シリコンゴム膜などの膜または繊維を含めて、多孔性、非多孔性、またはゼラチン様の材料で構成される。本発明の抗体を含めて、タンパク質を投与する場合は、タンパク質が吸収しない材料を使用するように注意する必要がある。
【０２１０】
別の実施形態において、抗原結合性ポリペプチドまたは組成物はベシクル（小胞体）、特にリポソームで送達することができる(Langer, 1990, Science 249:1527-1533; Treat et al., Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer (感染症と癌の治療におけるリポソーム), Lopez-Berestein and Fidler(編), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, 同上, pp. 317-327を参照されたい; 一般的には同書を参照されたい)。
【０２１１】
さらに別の実施形態において、抗原結合性ポリペプチドまたは組成物は放出制御系で送達することができる。一実施形態では、ポンプが使用される(Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574を参照されたい)。別の実施形態では、ポリマー材料が用いられる(Medical Applications of Controlled Release (放出制御の医学的応用), Langer and Wise(編), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance (制御された薬物のバイオアベイラビリティ、薬物製品のデザインと性能) Smolen and Ball(編), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, J., 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61を参照されたい; さらに、Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105も参照されたい)。さらに別の実施形態では、放出制御系を治療標的（すなわち脳）の近くに配置することができ、したがって、全身用量の一部しか必要としない(例えば、Goodson, Medical Applications of Controlled Release (放出制御の医学的応用), 上掲, vol. 2, pp. 115-138 (1984)を参照されたい)。他の放出制御系は、Langer (1990, Science 249:1527-1533)によるレビューで説明されている。
【０２１２】
本発明の組成物がタンパク質をコードする核酸またはポリヌクレオチドを含有する特定の実施形態において、核酸は、そのコード化タンパク質の発現を促進するために、その核酸を適切な核酸発現ベクターの一部として構築し、それが細胞内に取り込まれるように投与することにより、in vivo投与することができる。そうした投与は、例えば、レトロウイルスベクターの使用(米国特許第4,980,286号参照)、または直接注入、または微粒子銃の使用(例えば、遺伝子銃; Biolistic, Dupont)、または脂質もしくは細胞表面受容体もしくはトランスフェクション試薬によるコーティング、または核内に入ることが知られているホメオボックス様ペプチドにそれを結合させて投与する(例えば、Joliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868参照)など、によって行うことができる。あるいはまた、核酸は、細胞内に導入し、相同組換えによって、発現のために宿主細胞のDNA内に組み込むことが可能である。
【０２１３】
炎症性、免疫性または悪性の疾患、障害または症状の治療、抑制および予防に有効な本発明の抗原結合性ポリペプチドの量は、標準的な臨床技術によって決定することができる。さらに、最適な投与量範囲の特定に役立てるために、場合によりin vitroアッセイを用いることもできる。製剤中で使用する正確な用量もまた、投与経路と、疾患、障害または症状の重症度によって変化し、医師の判断と各患者の状況に応じて決定されるべきである。有効な用量はin vitroまたは動物モデル試験系から得られた用量反応曲線から外挿されてもよい。
【０２１４】
一般的な命題として、本発明の抗原結合性ポリペプチドの患者への投与量は、典型的には0.1mg/kg〜100mg/kg患者体重、0.1mg/kg〜20mg/kg患者体重、または1mg/kg〜10mg/kg患者体重である。一般的に、ヒト抗体は、外来ポリペプチドに対する免疫反応により、他の動物種由来の抗体よりも、ヒト体内で長い半減期を有する。したがって、多くの場合、ヒト抗体のより低い投与量およびより少ない投与回数が可能である。さらに、本発明の抗体の投与量と投与回数は、例えば脂質化のような修飾によって、抗体の吸収と組織透過性（例えば、脳への透過性）を高めることで減らすことができる。
【０２１５】
関節リウマチの治療においては、本発明の抗原結合性ポリペプチドの投与方式として、皮内、皮下および関節内注射および注入が含まれる。1回あたり関節内または皮内に投与される抗原結合性ポリペプチドは約0.1mg/kg〜約100mg/kg患者体重の範囲である。
【０２１６】
本発明の組成物は、単独でまたは他の治療薬（例えば、共刺激分子）との併用で投与することができる。本発明の組成物と併用投与できる治療薬としては、限定するものではないが、TNFファミリーの他のメンバー、化学療法剤、抗生物質、ステロイド系および非ステロイド系抗炎症剤、従来の免疫療法剤、サイトカインおよび/または成長因子が挙げられる。併用薬は同時に（例えば、混合物として）、別々に（しかし、同時にまたは一斉に）、あるいは順番に投与することができる。これは、併用薬が治療混合物として一緒に投与される提示方法と、併用薬が別々に、しかし同時に（例えば、同じ個体に別々の静脈ラインを通じて）投与される方法とを含む。「併用」投与はさらに、化合物または薬剤の1つが最初に投与され、続いて2番目が投与される、別々の投与を含む。したがって、実際には、それらの治療薬は同じ時点でまたは異なる時点で個体に投与される。ほとんどの場合、治療薬が異なる時点で個体に投与されるとき、一般にそれらの薬剤は、それらの治療効果が、一時期、重なるような方法で投与される。当業者であれば、診断、モニタリングまたは治療目的のために本発明の抗原結合性ポリペプチドをいかに使用すべきかを理解しているだろう。
【０２１７】
本発明の抗原結合性ポリペプチド、その変異体または誘導体の投与を含む炎症性、免疫性または悪性の疾患、障害または症状を治療する方法は一般的に、ヒトに使用する前に、所望の治療または予防活性についてin vitroで試験され、その後、許容される動物モデルを用いてin vivoで試験される。トランスジェニック動物をはじめとする、適切な動物モデルが当業者によく知られている。例えば、本明細書に記載の抗原結合性ポリペプチドの治療上の有用性を実証するin vitroアッセイには、抗原結合性ポリペプチドが細胞株または患者の組織サンプルに及ぼす効果が含まれる。抗原結合性ポリペプチドが細胞株および/または組織サンプルに及ぼす効果は、本明細書の他の個所に開示するアッセイなどの、当業者に公知の技術を利用して測定することができる。本発明によると、特定の抗原結合性ポリペプチドの投与が示唆されるかどうかを判断するために使用できるin vitroアッセイには、in vitro細胞培養アッセイが含まれ、このアッセイでは、患者の組織サンプルを培養下で増殖させて化合物にさらすか、さもなくば組織サンプルに化合物を投与し、その化合物が組織サンプルに及ぼす効果を観察する。
【０２１８】
組成物
さまざまな送達系が知られており、本発明の抗原結合性ポリペプチドまたは本発明の抗原結合性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを投与するために使用することができ、例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセルへの封入、化合物を発現できる組換え細胞、受容体介在エンドサイトーシス(例えば、Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432参照)、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての核酸の構築などが用いられる。
【０２１９】
さらなる実施形態において、本発明の組成物は抗ウイルス剤、抗菌剤もしくは抗生物質、または抗真菌剤と組み合わせて投与される。当技術分野で公知のこうした薬剤はいずれも、本発明の組成物の中に入れて投与することができる。
【０２２０】
さらなる実施形態において、本発明の組成物は単独で、または抗炎症剤との併用で投与される。本発明の組成物と共に投与される抗炎症剤としては、限定するものではないが、グルココルチコイドおよび非ステロイド系抗炎症剤、アミノアリールカルボン酸誘導体、アリール酢酸誘導体、アリール酪酸誘導体、アリールカルボン酸、アリールプロピオン酸誘導体、ピラゾール類、ピラゾロン類、サリチル酸誘導体、チアジンカルボキサミド類、e-アセトアミドカプロン酸、S-アデノシルメチオニン、3-アミノ-4-ヒドロキシ酪酸、アミキセトリン(amixetrine)、ベンダザック(bendazac)、ベンジダミン(benzydamine)、ブコローム(bucolome)、ジフェンピラミド(difenpiramide)、ジタゾール(ditazol)、エモルファゾン(emorfazone)、グアイアズレン(guaiazulene)、ナブメトン(nabumetone)、ニメスリド(nimesulide)、オルゴテイン(orgotein)、オキサセプロール(oxaceprol)、パラニリン(paranyline)、ペリソキサール(perisoxal)、ピフォキシム(pifoxime)、プロカゾン(proquazone)、プロキサゾール(proxazole)、およびテニダップ(tenidap)が挙げられる。
【０２２１】
別の実施形態において、本発明の組成物は化学療法剤との併用で投与される。本発明の組成物と共に投与される化学療法剤としては、限定するものではないが、抗生物質誘導体(例：ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、およびダクチノマイシン)；抗エストロゲン剤(例：タモキシフェン)；代謝拮抗物質(例：フルオロウラシル、5-FU、メトトレキセート、フロキシウリジン、インターフェロンα-2b、グルタミン酸、プリカマイシン、メルカプトプリン、および6-チオグアニン)；細胞毒性剤(例：カルムスチン、
BCNU、ロムスチン、CCNU、シトシンアラビノシド、シクロホスファミド、エストラムスチン、ヒドロキシ尿素、プロカルバジン、マイトマイシン、ブスルファン、シスプラチン、および硫酸ビンクリスチン)；ホルモン(例：メドロキシプロゲステロン、エストラムスチンリン酸エステルナトリウム、エチニルエストラジオール、エストラジオール、酢酸メゲストロール、メチルテストステロン、2リン酸ジエチルスチルベストロール、クロロトリアニセン、およびテストラクトン)；ナイトロジェンマスタード誘導体(例：メルファラン、クロラムブシル、メクロレタミン(ナイトロジェンマスタード)およびチオテパ)；ステロイドおよび組合せ(例：ベタメタゾンリン酸エステルナトリウム)；ならびにその他(例：ジカルバジン、アスパラギナーゼ、ミトタン、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンブラスチン、およびエトポシド)が挙げられる。
【０２２２】
さらなる実施形態において、本発明の組成物はサイトカインとの併用で投与される。本発明の組成物と共に投与されるサイトカインとしては、限定するものではないが、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、抗CD40、CD40L、およびTNF-αが挙げられる。
【０２２３】
さらなる実施形態において、本発明の組成物は他の治療または予防レジメン、例えば放射線療法、と組み合わせて投与することができる。
【０２２４】
さらに、本発明は医薬組成物を提供する。そうした組成物は、治療に有効な量の抗原結合性ポリペプチドと、製薬上許容される担体を含有する。特定の実施形態において、用語「製薬上許容される」は、動物、特にヒトへの使用が連邦政府もしくは州政府の規制当局によって承認されているもの、または米国薬局方や他の一般的に認められた薬局方に記載されているものを意味する。さらに、「製薬上許容される担体」は一般に、無毒性の固体、半固体もしくは液体の充填剤、希釈剤、カプセル化材料、またはあらゆる種類の処方助剤である。
【０２２５】
用語「担体」は、希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを指し、これらと一緒に治療薬が投与される。そのような製薬上の担体は、水や油などの無菌の液体（石油、動物、植物または合成起源のものを含む）、例えば、ラッカセイ油、ダイズ油、鉱物油、ゴマ油などであってよい。医薬組成物が静脈内に投与される場合には、水が好ましい担体である。食塩水およびブドウ糖とグリセロールの水溶液も、特に注射剤の、液状担体として使用される。好適な製薬上の賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、コムギ粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物はまた、必要に応じて、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、または酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩などのpH緩衝剤を含んでもよい。さらに、抗菌剤、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベン；酸化防止剤、例えばアスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸；および張度調整剤、例えば塩化ナトリウムまたはデキストロースも想定される。これらの組成物は溶液剤、懸濁液剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉剤、持続放出製剤などの形をとることができる。組成物は、トリグリセリドのような従来の結合剤および担体を用いて、座剤としても処方される。経口製剤には、標準的な担体、例えば医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含めてもよい。適当な製薬上の担体の例は、E. W. MartinによるRemington's Pharmaceutical Sciences (参照により本明細書に組み入れる)に記載されている。そのような組成物は、患者へ適切に投与するための剤形を提供するために、適当な量の担体と共に、治療に有効な量の抗原結合性ポリペプチド（好ましくは、精製形態）を含有する。製剤は投与方式に適合させるべきである。非経口製剤はアンプル、使い捨て注射器、またはガラスもしくはプラスチック製の複数回用量のバイアルの中に封入することができる。
【０２２６】
好ましい実施形態において、本組成物は、ヒトへの静脈内投与に適した医薬組成物として、通常の手順に従って製剤化される。一般的に、静脈内投与用の組成物は、無菌の等張水性緩衝液中に溶解した溶液である。必要に応じて、組成物は可溶化剤と、注射部位の痛みを和らげるリグノカインなどの局所麻酔薬を含んでもよい。一般に、諸成分は別々に供給されるか、または単位剤形として一緒に混合され、例えば、活性薬剤の量を示すアンプルまたは小袋(sachette)などの密閉容器に入れた凍結乾燥粉末または水不含の濃縮物として提供される。組成物が点滴により投与される場合には、それを、医薬グレードの滅菌水または生理食塩水を含む点滴ボトルと共に投薬することができる。組成物が注射により投与される場合には、投与前に諸成分を混合するように、注射用の滅菌水または生理食塩水のアンプルを提供することができる。
【０２２７】
本発明の化合物は中性または塩形態として製剤化することができる。製薬上許容される塩には、陰イオンを用いて形成されるもの、例えば、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから誘導されるもの、および陽イオンを用いて形成されるもの、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、鉄の水酸化物、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導されるものが含まれる。
【実施例１】
【０２２８】
ハイブリドーマ法を用いて抗LIGHT抗体を作製する方法
BALB/cマウスを組換えLIGHTタンパク質（細胞外ドメイン断片アミノ酸Leu Ile GluからPhe Met Valまで；Genbankアクセッション番号AF036581)で免疫した。一般的な手順で、50mlの完全フロイントアジュバント(Sigma社, St. Louis, MO)中の10mgのタンパク質をマウスに皮下注射した。不完全フロイントアジュバントで2〜4回の追加の注射を2週間間隔で実施し、続いてPBSで最終ブーストを実施した。これとは別に、注射をフットパッドに行ってもよい。最終接種の3日後、マウスを犠牲にして、脾臓または膝窩リンパ節を採取した。融合のために脾臓またはリンパ節からリンパ球を分離した。リンパ球をP3X63Ag8.653形質細胞腫細胞と、リンパ球対形質細胞腫細胞5：1の比で、融合剤としてPEG/DMSO (Sigma社)を用いて融合させた。融合後、細胞を選択HAT培地に再懸濁させ、96ウェルプレートに1ウェルあたり106個の細胞を播種した。HAT選択を生き残ったハイブリドーマからの上清は、LIGHT結合抗体の存在について、直接結合ELISAによりスクリーニングした。LIGHT結合抗体を分泌するハイブリドーマを同定し、それらの上清を、3種の既知の受容体HVEM、LTβRおよびDcR3へのLIGHTの結合を阻害する抗体について、ELISAでさらにスクリーニングした。その後、LIGHT結合の阻害について陽性と同定されたハイブリドーマは、LIGHTが介在するHT-29細胞死滅の阻害についてスクリーニングして、LIGHTアンタゴニスト抗体を同定した。
【０２２９】
マウスモノクローナル抗体のパネルを作成し、結合アッセイと、HVEM、LTβRおよびデコイDcR3受容体へのLIGHT結合の阻害に基づいて、ヒト化のためにリードマウス抗体（例えば、10D11、5E10、13C7、14G8および18B1）を選択した（図3）。例えば、マウス10D11抗体の結合データを以下の表6に示す。
【表６】
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【０２３０】
ハイブリドーマ細胞株からのマウス抗LIGHT VHおよびVKドメインのクローニングおよび配列決定
ハイブリドーマ細胞をペレット化し、PBSで3回洗浄し、Trizol試薬(Invitrogen社, カタログ番号15596-026)を用いてメーカーのプロトコールに従いRNAを抽出した。全RNAを、5'RACEキット(Rapid Amplification of cDNA Ends, Invitrogen社, カタログ番号18374-058)を用いてメーカーのプロトコールに従いcDNAに変換した。簡単に説明すると、RNAをランダムヘキサマープライマーRandom N6にライゲートし、superscript II RNAase Hネガティブ逆転写酵素を用いて第一鎖cDNAを作製した。そのcDNAを、キットに備わっているGlassMaxスピンカートリッジを用いて精製し、次にdCTPの存在下でTdT（ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ）と反応させて、cDNAに5'末端でC塩基対を付加した。dCテイルを付加したcDNAは、dCテイルに特異的なアンカープライマーと、遺伝子特異的プライマー（VHの場合はマウス定常重鎖1(CH1)中の、そしてVKの場合は定常κ(CK)中の、高度に保存されたDNA配列にハイブリダイズするプライマー）を用いてPCR増幅した。得られたPCR産物は、インタクトのVHまたはVKドメインに対応する正しいサイズについてゲル電気泳動で分析し、その後精製して、TOPO TAベクター(Invitrogen社, Carlsbad, CA, カタログ番号K4575-01)にメーカーのプロトコールに従いライゲートした。細菌への形質転換後、正しいサイズの挿入物を含むクローンからDNAを調製し、そのDNA配列を、Big Dyeターミネーターシークエンシング反応ミックス(Applied Biosystems社, パーツ番号4336699)と3700 ABI/Prism DNAアナライザーをメーカーのプロトコールに従って用いて決定した。
【０２３１】
抗体のヒト化戦略
抗LIGHT抗体をヒト化することの1つの目標は、もとの結合親和性および特異性の90〜100％を保持する、70〜100％ヒト化された可変重鎖(VH)ドメインと可変軽鎖(VK)ドメインを得ることであった。
【０２３２】
ヒト化はCDRグラフティングと構造解析と可変領域のリサーフェシング(resurfacing)によって実施した(Jones et al., NATURE (1986) May 29-Jun. 4;321(6069):522-5; Roguska et al., PROTEIN ENGINEERING, 1996, 9(10):895-904; およびStudnicka et al., Humanizing Mouse Antibody Frameworks While Preserving 3-D Structure (三次元構造を保ったままマウス抗体フレームワークをヒト化する). PROTEIN ENGINEERING, 1994, Vol.7, pg 805を参照されたい)。一次抗体配列および三次元構造データを利用して、結合親和性と特異性を保持するために必要とされるフレームワークのキー残基を特定した。NCBIが提供しているウェブサイト「Blast for Ig sequences」を用いて、この研究で使用したマウスVHおよびVK領域に最もマッチする配列を識別した。ヒト生殖系列VHおよびVK遺伝子がマウスVHおよびVK配列に最もマッチするものとして選択された。あるいはまた、天然に発現されたヒト抗体レパートリーからの配列を、単独でまたは最もマッチするヒト生殖系列遺伝子と組み合わせて、ヒト化のためのテンプレートとして用いてもよい。
【０２３３】
マウス抗LIGHT抗体の可変重鎖および軽鎖可変領域を、最も近いヒト生殖系列遺伝子または発現された遺伝子のレパートリーとアライメントした後、各位置のアミノ酸を、結合性および免疫原性に対する潜在的影響について検討した。この情報を用いて、各位置の変異に対して低い、中程度、または高いリスク値を割り当てた。
【０２３４】
例えば、ヒト化抗体10D11、5E10、14G8および18B1を構築する際には、ほとんどの位置を、低、中、高リスクを問わず、同時に変異させて、最終ヒト化抗体を作製した。
【０２３５】
マウス抗LIGHT抗体のヒト化
マウス抗LIGHT抗体は、前述のようにして得られた結合データと配列データに基づいて同定した。これらの抗体由来のVHおよびVKドメインのアミノ酸配列を、現在利用可能な公共データベース(すなわち、NCBIのBLAST for IgG、およびMRCのV-base)を使用して、ヒト生殖系列VHおよびVKドメインとアライメントした。マウス配列がヒト生殖系列と異なっていたフレームワークの位置で、反復プロセスを用いてそのマウスフレームワークを変換または変異させ、それが対応するヒト生殖系列フレームワークにマッチするようにした。結合親和性が特定のフレームワーク変異のため失われる場合には、こうした損失を補うために、VHとVKの両方の特定のCDRアミノ酸残基を、チロシンや他の適切なアミノ酸との置き換えによって変異（すなわち、親和性成熟）させることができる。親和性成熟したヒト化マウスVHおよびVKドメインは、オーバーラップする合成DNAオリゴヌクレオチドのパネルを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応法により生成することができる。本明細書に記載するとおりにヒト化されたマウス抗LIGHTモノクローナル抗体の可変重鎖および可変軽鎖ドメインのアミノ酸配列を以下の表7および表8に示す。可変ドメインのCDR部分には下線が引いてある。
【表７】
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【０２３６】
【表８】
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【０２３７】
合成遺伝子の設計プロセスの一環として、コドン最適化戦略を採用した。遺伝子発現のために哺乳動物細胞で優先的に利用される各アミノ酸のトリプレットコードを、VHおよびVKの各位置に組み込んだ。次に、合成VHおよびVKドメインを特殊な哺乳動物発現ベクターにクローン化したが、これらの発現べクターは、完全ヒトIgG1、G4またはカッパ抗体バックボーンの状況下で対応するVHおよびVKドメインの発現を可能にするものである。ヒト化抗体の小規模生産は、IgG1またはG4構築物をカッパ構築物と共に293F細胞にリポフェクタミン(lipofectamine)(Invitrogen社, Carlsbad, CA)でメーカーのプロトコールに従い同時トランスフェクションすることにより達成した。一過性のトランスフェクションからの上清はプロテインAまたはGレジンを通過させ、IgGを細胞ベースのアッセイで試験するために均質になるまで精製した。
【０２３８】
本明細書に記載するとおりに作製された代表的なヒト化マウス抗LIGHTモノクローナル抗体の可変重鎖および可変軽鎖ドメインのアミノ酸配列は、表2および表4にすでに記載してある。
【実施例２】
【０２３９】
本実施例では、LIGHTによって誘発されるHT-29細胞死滅の阻害を測定するためのアッセイ手順を説明するが、これはHT-29細胞においてアポトーシスを誘発するLIGHTの活性に基づくものである。HT-29細胞をトリプシン処理により剥離させ、RPMI 10％FBS培地で2回洗浄し、1×106個/mLの細胞をRPMI 1％FBS培地中に再懸濁した。100ng/mLのIFN-γを用いて37℃で6時間、細胞を前処理した。40g/mLで開始して、さまざまな濃度の(4X)5倍連続希釈LIGHT抗体、LTβR-Fcおよび対照-Fcを調製した。25μLの4X試薬を96ウェルプレートに3通りずつ移し、25μLの400ng/mL (4X)LIGHTを加えて、室温で15分インキュベートした。カニクイザルLIGHTだけでなくヒトLIGHTも別の実験で使用した。例えば、図9AおよびBを参照されたい。50μLの1×106個/mLのHT-29細胞(IFN-γと共にプレインキュベートしたもの)を加えて、細胞培養インキュベーター内で72時間培養した。100μLのcell titer glo試薬(Promega社)を加えることによって細胞の生存率を測定した。発光をVictor2蛍光光度計(Perkin-Elmer社, Waltham, MA)で読み取った。各種の抗LIGHT抗体と共にこのアッセイを使用して得られた結果を図5A〜C、9Aおよび9Bに示す。
【実施例３】
【０２４０】
本実施例では、活性化T細胞の表面に発現されたLIGHTへのLIGHT抗体の結合をフローサイトメトリーで測定するためのアッセイ手順を説明する。極性Th1、Th2およびTh17細胞を、50ng/mLのPMAと0.5μg/mLのイオノマイシンを用いて37℃で一晩活性化した。100万個の活性化T細胞を5mL FACSチューブに移し、1200rpmで5分間遠心した。細胞ペレットをFACS染色バッファー中に再懸濁し、抗LIGHT抗体または対照抗体と室温で40分間インキュベートした。2mLのPBSで2回洗浄した後、細胞をPEコンジュゲート化二次試薬と共に1時間インキュベートした。細胞を2mLのPBSで3回洗浄し、0.5mLのPBS中に再懸濁してフローサイトメトリーにより解析した。このアッセイを使用して得られた結果を図10AおよびBに示す。
【０２４１】
本発明は、本発明の個々の態様の1つの例示として記載された特定の実施形態によって範囲が限定されるものではなく、機能的に均等の組成物または方法はどれも本発明の範囲に含まれる。さまざまな修飾および変更を、本発明の精神または範囲から逸脱することなく、本発明の方法および組成物においてなし得ることが、当業者には明らかであろう。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲およびその均等物の範囲に入るという条件で、そうした修飾および変更をカバーするものである。
【０２４２】
本明細書中に挙げたすべての刊行物および特許出願は、個々の刊行物または特許出願が参照により組み込まれることを具体的かつ個別に示されたかのように、同程度に参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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