【手続補正書】
【提出日】平成21年3月26日(2009.3.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
関心のあるＤＮＡ分子を植物細胞または植物のゲノムに導入し、次いで該関心のあるＤＮＡ分子のサブ配列を除去するための方法であって、
ａ．前記植物細胞のゲノムに前記関心のあるＤＮＡ分子を導入し、その際前記関心のあるＤＮＡ分子は、同方向反復において配列された２つのＤＮＡ配列によりフランキングされた前記ＤＮＡ分子の前記サブ配列を含みそして、同方向反復において配置された前記２つのＤＮＡ配列の付近に、好ましくは間に位置したレアクリービング二本鎖ＤＮＡ切断誘導（ＤＳＢＩ）酵素のための少なくとも１つの認識部位を更に含み；
ｂ．前記関心のあるＤＮＡ分子が前記ゲノムに組み込まれている植物細胞を選択しそして該植物細胞から植物を再生させ；
ｃ．該植物をＤＳＢＩ酵素コードキメラ遺伝子を含む第２植物と交配させ、その際該キメラ遺伝子は、下記の作用的に連結されたＤＮＡセグメント：
ｉ．小胞子特異的プロモーター；
ｉｉ．前記認識部位を認識する二本鎖ＤＮＡ切断誘導酵素をコードするＤＮＡ領域；
ｉｉｉ．転写終結およびポリアデニル化領域；
を含み；
ｄ．前記関心のあるＤＮＡ分子および前記ＤＳＢＩ酵素コードキメラ遺伝子を含む子孫植物（Ｆ１植物）を選択し；
ｅ．該子孫植物を他の植物と交配させ、その際該子孫植物は花粉ドナーとして使用され；
ｆ．前記ＤＳＢＩ酵素コードキメラ遺伝子を含む子孫植物の集団（Ｆ２集団）を選択し；そして、
ｇ．前記ＤＮＡ分子のサブ配列が同方向反復において配置された前記２つのＤＮＡ配列間で相同的組換えにより欠失させられている子孫植物を選択する；
工程を含む方法。
【請求項２】
ｈ．前記ＤＮＡ分子の前記サブ配列が欠失している前記子孫植物を他の植物と交配させ；そして
ｉ．子孫植物（Ｆ３植物）の集団を得、そして前記レアクリービングＤＳＢＩ酵素コードキメラ遺伝子を含有していない植物を選択する、
工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記関心のあるＤＮＡ分子の前記サブ配列が選択可能なもしくはスクリーニング可能なマーカー遺伝子を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＤＳＢ誘導酵素が、
【表１】
2008534023.tif 000001
またはＺｎフィンガーＤＮＡ結合ドメインおよびＤＮＡ開裂ドメインを含むキメラエンドヌクレアーゼの群から選ばれるエンドヌクレアーゼである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＤＳＢ誘導酵素がＩ−ＳｃｅＩである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記二本鎖ＤＮＡ切断誘導酵素をコードする前記ＤＮＡ領域が、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド配列を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記小胞子特異的プロモーターが配列番号３のヌクレオチド配列またはその機能的フラグメントから選ばれるプロモーターフラグメントを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記関心のあるＤＮＡ分子の前記サブ配列が、前記ＤＳＢＩ酵素のための２つの認識部位によりフランキングされている、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＤＳＢＩ酵素コードキメラ遺伝子がヌクレオチド１９４１から３９１３までの配列番号６のヌクレオチド配列を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
植物のゲノムにおけるターゲットＤＮＡ配列を関心のあるＤＮＡ配列と交換するための方法であって、下記の工程：
ａ．植物の細胞のゲノムにおける予め選ばれた部位において第１二本鎖ＤＮＡ切断を誘導し、その際該予め選ばれた部位は、前記ターゲットＤＮＡ配列内に位置しているかまたは前記ターゲットＤＮＡ配列の付近に位置しており；
ｂ．関心のあるＤＮＡ分子を前記植物細胞に導入し、その際該ＤＮＡ分子は、
ｉ．前記ターゲットＤＮＡ配列をフランキングしそして好ましくは前記植物細胞のゲノムにおける前記予め選ばれた部位をフランキングしているＤＮＡ領域に対して少なくとも８０％配列相同性を有する２つのフランキングＤＮＡ領域の間に位置した前記関心のあるＤＮＡ配列；
ｉｉ．前記フランキングＤＮＡ領域の間に位置した選択可能なもしくはスクリーニング可能なマーカー遺伝子であって、同方向反復配列において位置した前記フランキングＤＮＡ領域の１つと、部分的フランキングＤＮＡ領域として示された前記フランキングＤＮＡ領域の前記１つの少なくとも一部の別のコピーとの間に更に位置している、選択可能なもしくはスクリーニング可能なマーカー遺伝子；
ｉｉｉ．同方向反復において位置した前記フランキングＤＮＡ領域の前記１つと前記部分的フランキングＤＮＡ領域との間に位置したＤＳＢＩ酵素のための認識部位；
を含み；
ｃ．前記選択可能なもしくはスクリーニング可能なマーカーを含む植物細胞の集団を選択し；
ｄ．前記選択可能なもしくはスクリーニング可能なマーカーが前記フランキングＤＮＡ領域を通じて相同的組換えにより導入されている植物細胞を選択し、そして該植物細胞から植物を再生させ：
ｅ．前記選択可能なマーカー遺伝子を含む前記再生された植物またはその子孫植物をＤＳＢＩ酵素コードキメラ遺伝子を含む植物と交配させ、その際該キメラ遺伝子は、下記の作用可能に連結されたＤＮＡセグメント：
ｉｖ．小胞子特異的プロモーター；
ｖ．前記関心のあるＤＮＡ内に位置した前記認識部位を認識する二本鎖ＤＮＡ切断誘導酵素をコードするＤＮＡ領域；
ｖｉ．転写終結およびポリアデニル化領域；
を含み；
ｆ．前記選択可能なもしくはスクリーニング可能なマーカー遺伝子および前記ＤＳＢＩ酵素コードキメラ遺伝子を含む子孫植物（Ｆ１植物）を選択し；
ｇ．前記子孫植物を他の植物と交配させ、その際該子孫植物は花粉ドナーとして使用され；
ｈ．前記ＤＳＢＩ酵素コードキメラ遺伝子を含む子孫植物の集団（Ｆ２集団）を選択し；そして、
ｉ．前記選択可能なもしくはスクリーニング可能なマーカー遺伝子が、前記フランキングＤＮＡ領域の前記１つと前記フランキングＤＮＡ領域の前記１つの一部を含む部分的フランキングＤＮＡ領域との間の相同的組換えにより欠失させられている子孫植物を選択する；
工程を含む方法。
【請求項１１】
前記予め選ばれた部位における前記第１二本鎖切断が、第１ＤＳＢＩ誘導酵素の導入により誘導され、その際前記第１ＤＳＢＩ誘導酵素は、前記関心のあるＤＮＡ内に位置したＤＳＢＩ誘導酵素のための前記認識部位を認識しない、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１ＤＳＢＩ酵素および前記関心のあるＤＮＡ内に位置した前記認識部位を認識する前記ＤＳＢＩ酵素が、
【表２】
2008534023.tif 000002
またはＺｎフィンガーＤＮＡ結合ドメインおよびＤＮＡ開裂ドメインを含むキメラエンドヌクレアーゼの群から選ばれる２つの異なるＤＳＢＩ酵素である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記関心のあるＤＮＡ内に位置したＤＳＢＩ誘導酵素のための前記認識部位を認識する前記ＤＳＢ誘導酵素がＩ−ＳｃｅＩである、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記二本鎖ＤＮＡ切断誘導酵素をコードする前記ＤＮＡ領域が、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド配列を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記小胞子特異的プロモーターが配列番号３のヌクレオチド配列またはその機能的フラグメントから選ばれるプロモーターを含む、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＤＳＢＩコードキメラ遺伝子がヌクレオチド１９４１から３９１３までの配列番号６のヌクレオチド配列を含む、請求項１０〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜９のいずれか１つに記載の方法により得ることができる植物。
【請求項１８】
請求項１０〜１６のいずれか１項に記載の方法により得ることができる植物。
【請求項１９】
下記の作用可能に連結されたＤＮＡセグメント：
ｉ．小胞子特異的プロモーター；
ｉｉ．前記関心のあるＤＮＡ内に位置した前記認識部位を認識する二本鎖ＤＮＡ切断誘導酵素をコードするＤＮＡ領域；
ｉｉｉ．転写終結およびポリアデニル化領域；
を含むＤＳＢＩ酵素コードキメラ遺伝子を含む植物。
【請求項２０】
前記小胞子特異的プロモーターが配列番号３のヌクレオチド配列またはその機能的フラグメントから選ばれるプロモーターフラグメントを含む、請求項１９に記載の植物。
【請求項２１】
前記二本鎖ＤＮＡ切断誘導酵素をコードする前記ＤＮＡ領域が、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド配列を含む、請求項１９に記載の植物。
【請求項２２】
前記ＤＳＢＩ酵素コードキメラ遺伝子が、ヌクレオチド１９４１からヌクレオチド３９１３までの配列番号６のヌクレオチド配列を含む、請求項１９に記載の植物。
【請求項２３】
下記の作用可能に連結されたＤＮＡセグメント：
ｉ．小胞子特異的プロモーター；
ｉｉ．前記関心のあるＤＮＡ内に位置した前記認識部位を認識する二本鎖ＤＮＡ切断誘導酵素をコードするＤＮＡ領域；および
ｉｉｉ．転写終結およびポリアデニル化領域；
を含むキメラ遺伝子。
【請求項２４】
前記ＤＮＡ領域が、
【表３】
2008534023.tif 000003
またはＺｎフィンガーＤＮＡ結合ドメインおよびＤＮＡ開裂ドメインを含むキメラエンドヌクレアーゼから選ばれる二本鎖ＤＮＡ切断誘導酵素をコードする、請求項２３に記載のキメラ遺伝子。
【請求項２５】
配列番号１または配列番号２のヌクレオチド配列を含む請求項２３に記載のキメラ遺伝子。
【請求項２６】
前記小胞子特異的プロモーターが、配列番号３のヌクレオチド配列またはその機能的フラグメントからのプロモーターフラグメントを含む、請求項２３〜２５のいずれか１項に記載のキメラ遺伝子。
【請求項２７】
前記ターゲット配列内のまたはその付近の予め選ばれた部位における二本鎖切断の誘導により植物細胞のゲノム内のターゲットＤＮＡ配列を関心のあるＤＮＡ配列と交換するためのＤＮＡベクターであって、
ａ．前記ターゲットＤＮＡ配列をフランキングしそして前記予め選ばれた部位をフランキングしているＤＮＡ領域に対する少なくとも８０％配列相同性を有する２つのフランキングＤＮＡ領域間に位置する前記関心のあるＤＮＡ配列；
ｂ．前記フランキングＤＮＡ領域の間に位置した選択可能なもしくはスクリーニング可能なマーカー遺伝子であって、同方向反復において位置した、前記フランキングＤＮＡ領域の１つと前記フランキングＤＮＡ領域の前記１つの一部を含む部分的フランキングＤＮＡ領域との間に更に位置している選択可能なもしくはスクリーニング可能なマーカー遺伝子；および
ｃ．同方向反復において位置した前記フランキングＤＮＡ領域の前記１つと前記部分的フランキングＤＮＡ領域との間に位置したＤＳＢＩ酵素のための認識部位；
を含むＤＮＡベクター。