(57)【要約】本発明は、細胞培養技術の分野に関する。本発明は、ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ発現カセットを含むベクターコンストラクトを含む産生宿主細胞系を記載する。それらの細胞系は、改善された増殖特徴及び高いＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ発現レベルを有する。本発明は、特に、ＤＳＭＺにナンバーＤＳＭ  ＡＣＣ２９８９（ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  ２．２０）及びＤＳＭ  ＡＣＣ２９９０（ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  ２．４１）の下で寄託されている２つの細胞系に関する。本発明は、さらに、そのような好ましい産生宿主細胞を生成する方法ならびにＤＳＭＺにナンバーＤＳＭ  ＡＣＣ２９８９（ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  ２．２０）及びＤＳＭ  ＡＣＣ２９９０（ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  ２．４１）の下で寄託されている２つの細胞系を使用してタンパク質を産生する方法に関する。
2012525826.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＳＭＺ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH）にナンバーＤＳＭ  ＡＣＣ２９８９（ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  ２．２０）の下で寄託されている細胞。
【請求項２】
ＤＳＭＺにナンバーＤＳＭ  ＡＣＣ２９９０（ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  ２．４１）の下で寄託されている細胞。
【請求項３】
細胞が、加えて、目的のタンパク質をコードする目的の遺伝子を含む少なくとも１つの２つめのベクターコンストラクトを含む、請求項１又は２記載の細胞。
【請求項４】
全てのベクターコンストラクトが細胞ゲノム中に安定的に組み込まれる、請求項３記載の細胞。
【請求項５】
請求項１〜４記載の細胞であって、該細胞が以下により特徴付けられる：
ａ）ゲノムＤＮＡを鋳型として使用する場合での特定のＰＣＲバンドパターン／フィンガープリント、それにより、２３７３bpのＰＣＲ産物が、配列番号２及び配列番号３のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して生成される、又は、
ｂ）ゲノムＤＮＡを鋳型として使用する場合での特定のＰＣＲバンドパターン／フィンガープリント、それにより、６６０bpのＰＣＲ産物（配列番号６）が、配列番号４及び配列番号５のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して生成される、又は、
ｃ）（ａ）のＣＥＲＴ特異的な２３７３bpのＰＣＲ産物と以下の制限酵素とのインキュベーションに起因する特定数のフラグメント及びフラグメントサイズ：
【表８】
2012525826.tif 000021
それにより、ＨｉｎｄＩＩＩを用いたインキュベーションが好ましい。
【請求項６】
ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ発現カセットが配列番号１からなる、請求項１〜５記載の細胞。  
【請求項７】
目的のタンパク質が、治療用タンパク質、好ましくは抗体又は抗体融合タンパク質である、請求項３〜６記載の細胞。
【請求項８】
宿主細胞系を生成するための方法であって、以下の工程により特徴付けられる：
ａ）親宿主細胞、好ましくはＣＨＯ又はＮＳＯ細胞を提供すること、
ｂ）ベクターコンストラクトを、ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ発現カセットを含む工程（ａ）の該親細胞中に導入すること、
ｃ）安定的にトランスフェクションされた細胞集団について選択すること、
ｄ）ＦＡＣＳベースの単一細胞クローニングによりモノクローナル細胞系を単離すること、
ｅ）以下について該モノクローナル細胞系をスクリーニングすること
ｉ）高レベルなＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ発現、
ｉｉ）シードストック培養中での最適な増殖、
ｉｉｉ）流加培養中での最適な増殖、
ｆ）工程（ｅ）のスクリーニング基準に従って工程（ｄ）の細胞クローンからモノクローナル細胞系を宿主細胞系として選択すること。
【請求項９】
宿主細胞系を生成するための方法であって、以下の工程により特徴付けられる：
ａ）親宿主細胞、好ましくはＣＨＯ又はＮＳＯ細胞を提供すること、
ｂ）ベクターコンストラクトを、ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ発現カセットを含む工程（ａ）の該親細胞中に導入すること、
ｃ）安定的にトランスフェクションされた細胞集団について選択すること、
ｄ）ＦＡＣＳベースの単一細胞クローニングにより細胞を単離すること、
ｅ）以下について該細胞をスクリーニングすること
ｉ）高レベルなＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ発現、
ｉｉ）シードストック培養中での最適な増殖、
ｉｉｉ）流加培養中での最適な増殖、
ｆ）宿主細胞としての使用のために工程（ｅ）のスクリーニング基準に従って単一クローン又は細胞のプールを選択すること。
【請求項１０】
工程（ｂ）のＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ発現カセットが配列番号１からなる、請求項８又は９記載の方法。
【請求項１１】
請求項３〜７のいずれか一項記載の細胞において目的の遺伝子によりコードされる目的のタンパク質を産生する方法であって、以下の工程により特徴付けられる：
ａ）請求項３〜７のいずれか一項記載の細胞を提供すること、
ｂ）少なくとも１つの目的の遺伝子の発現を可能にする条件下で細胞を培養すること。
【請求項１２】
方法がｃ）目的のタンパク質を収集する追加工程を含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
方法がｄ）目的のタンパク質を精製する追加工程を含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
以下により、ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ（配列番号１）についてトランスジーンである細胞を同定する方法：
ａ）ポリメラーゼ連鎖反応ＰＣＲを実施すること、
ｂ）ゲノムＤＮＡを鋳型として使用すること、及び
ｃ）配列番号２及び配列番号３を伴うオリゴヌクレオチドプライマーを使用すること、
それにより２３７３bpのＰＣＲ産物が生成される。
【請求項１５】
細胞を培養するための方法であって、以下を含む：
ａ）請求項１〜７のいずれか一項記載の細胞を提供すること、及び
ｂ）該細胞の増殖を可能にする条件下で該細胞を培養すること。
【請求項１６】
タンパク質の製造のための請求項１〜７のいずれか一項記載の細胞の使用。
【請求項１７】
請求項１又は２のいずれか一項記載の細胞、目的の遺伝子の発現のための発現ベクター、及び該細胞の培養のための細胞培養液を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
本発明は、細胞培養技術の分野、具体的には、セラミドトランスファータンパク質（ＣＥＲＴ）発現カセットを含むベクターコンストラクトを含む産生宿主細胞系に関する。それらの細胞系は、非トランスジェニック細胞系と比較して、改善された分泌特徴を有する。
【０００２】
背景
ヒト治療における使用のための生物医薬品についてのマーケットは、高速で成長を続けており、９００を超える生物医薬品が臨床試験において評価されており、推定売上は２０１０年で５００億である。長年にわたり、増加数の生物医薬品が、ヒトタンパク質を正確にプロセシングし、修飾するそれらの能力のため、哺乳動物細胞から産生される。哺乳動物細胞からの生物医薬品の成功裏の高収量産生が、このように、重大であり、プロセスにおいて使用される組換えモノクローナル細胞系の特徴に依存する。
【０００３】
大半の生物医薬品産物が、産生プロセスの間に細胞から分泌されるタンパク質であるため、産生細胞系の分泌輸送機構は、新規宿主細胞操作戦略のための別の興味深い標的である。
タンパク質分泌は、複雑な複数工程の機構である：細胞外空間又は外側細胞膜に輸送されることが運命付けられたタンパク質が、最初に、同時翻訳的に小胞体中に移入される。そこから、それらは脂質小胞中に充填され、ゴルジ装置に、最終的にはトランスゴルジネットワーク（ＴＧＮ）から細胞膜に輸送され、そこで、それらは培養液中に放出される。
【０００４】
多くの操作アプローチで、プロセス（例えば転写及び翻訳など）を駆動する分子ネットワークの増大する理解が用いられ、タンパク質産生におけるこれらの工程での収量を増加させてきた。しかし、任意の複数工程の産生プロセスについて、プロセス連鎖の初期工程の間にボトルネックを広げることは、恐らくは、さらに下流、特に翻訳後にボトルネックを作る。特定の閾値まで、産生細胞の特異的な産生性が、産物遺伝子転写のレベルと直線的に相関することが報告されている。ｍＲＮＡレベルでの産物発現のさらなる増強は、しかし、タンパク質合成、フォールディング、又は輸送機構の過負荷に導き、タンパク質産物の細胞内蓄積をもたらしうる。実際に、これは、現行の製造プロセスにおいて頻繁に観察されうる。
【０００５】
従って、組換えタンパク質産生のために宿主細胞の分泌能力を改善する必要がある。これは、翻訳後のボトルネック及びタンパク質産物の細胞内蓄積を予防するために、新規の転写増強技術との組み合わせで、及び、高力価プロセスにおいてさらにより重要になりうる。
【０００６】
しかし、翻訳後機構を標的化する以前のアプローチは成功しておらず、しかし、むしろ、試験において使用される細胞系もしくは産物又は初期の産生レベルに依存して、矛盾する結果に導いてきた：
−ＥＲ常在分子シャペロンＢｉＰ（結合タンパク質ＢｉＰ／ＧＲＰ７８）の過剰発現は、予想外に、低下した分泌をもたらした；
−酵素タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）の増強発現は、矛盾した結果を示した。
転写因子Ｘボックス結合タンパク質１（ＸＢＰ−１）を使用した分泌操作が、効果を有さない、又は、分泌を増強することが観察されたが、しかし、アポトーシス細胞死が同時に増加し、不安定な表現型に導き、ＸＢＰ−１高発現クローンの単離を予防した。
【０００７】
このように、現在、分泌輸送機構の標的化操作の途中には２つの主なハードルがある：基礎となる調節機構についての依然として限定された知識及び産生細胞の同時増殖阻害又はアポトーシス応答を予防する必要性。
【０００８】
発明の概要
本発明は、２つの特定の新規産生宿主細胞系ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  ２．２０及びＣＨＯ／ＣＥＲＴ  ２．４１を記載する。これらの２つの細胞系は、ＤＳＭＺにナンバーＤＳＭ  ＡＣＣ２９８９（ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  ２．２０）及びＤＳＭ  ＡＣＣ２９９０（ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  ２．４１）の下で寄託されており、組換えタンパク質産生のための理想的な宿主細胞系である。なぜなら、それらは、改善された分泌能力ならびに良好な増殖特徴を有するからである。
【０００９】
本発明者らは、最近、ステロイド産生急性調節関連脂質トランスファー（ＳＴＡＲＴ）ドメインファミリー、好ましくはセラミドトランスファータンパク質（ＣＥＲＴ）からのタンパク質の過剰発現による分泌操作が、分泌経路を介して真核細胞から輸送されるタンパク質の産生を効率的に改善するための方法を提供することを示している。Florin et al., 2009及び特許出願ＷＯ２００８／１０７３８８を参照のこと。それらは、本明細書により参照により組み入れられる。
【００１０】
ＣＥＲＴ（グッドパスチャー抗原結合タンパク質としても公知）は、小胞体（ＥＲ）でのその産生部位からゴルジ膜へのセラミドの非小胞送達のために必須である細胞質タンパク質であり、そこで、スフィンゴミエリン（ＳＭ）への変換が起こる（Hanada et al., 2003）。
本発明者らは、本明細書で、ＣＥＲＴ突然変異体Ｓ１３２Ａが、Ｓｅｒ→Ａｌａ点突然変異を持ち、タンパク質キナーゼＤによりもはやリン酸化されず、分泌を増強する際、野生型タンパク質よりも有意に効果的であることを実証することができた。
さらに、本発明者らは、本明細書で、ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ発現レベルがその分泌増強効果と相関することを示し、細胞中の異種ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａのレベルが高いほど、前記細胞の分泌能力が高いことを意味する（図２）。
ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ発現レベルと特異的な抗体産生性の間の相関を検討するために、本発明者らは、ＣＥＲＴ突然変異体の低発現レベルを伴う２つのクローン細胞系及び高発現レベルを伴う２つのクローン細胞系（細胞内ＦＡＣＳ染色におけるシグナル強度により判断する）を分析した（図２Ａ）。７日間の流加プロセスにおいて、偽トランスフェクションされたコントロール細胞系は、平均産生性１５pcdを示した（図２Ｂ）。低レベルのＣＥＲＴ  ＳＡ突然変異体を発現する細胞クローンの特異的な産生性が、わずかに上昇しただけであったのに対し、高レベルのＣＥＲＴ突然変異体を伴うそれらのクローンは、約２３pcdのＩｇＧ産物を分泌し、このように偽コントロールと比較して、明確に増加した特異的な産生性を示した（図２Ｂ）。これらのデータは、相関が、組換えタンパク質分泌に対するポジティブな効果とＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ過剰発現のレベルとの間に存在することを示す。
【００１１】
さらに、本発明者らは、驚くべきことに、選択された細胞クローンＣＨＯ／ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ  ２．２０及びＣＨＯ／ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ  ２．４１が、他のクローンよりも顕著に良好に、親ＣＨＯ野生型細胞系よりもさらに良好に増殖することを示す（図５Ａ及びＢ）。
【００１２】
良好な増殖特徴は、産生宿主細胞系のために特に重要である。なぜなら、低い増殖能力は、以下を起こすことにより、生物医薬品産生プロセスの複数の局面に対してネガティブな影響を有するからである：
・細胞の長期生成時間（それは、細胞系の開発において長期時系列をもたらす）
・単一細胞クローニング後のより低い効率及びその後のより遅い増殖
・スケールアップの間でのより長いタイムフレーム（特に、大スケールでの産生発酵槽のための接種の場合において）
・発酵槽運転当たりより低い産物収量。
【００１３】
このように、本発明により解決される特定の問題は、以下の両方を示すＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ操作宿主細胞系を作製することである：
・ＣＥＲＴ突然変異体Ｓ１３２Ａの高発現レベル、及び
・最適な細胞増殖。
【００１４】
本発明では、最適化された分泌及び良好な増殖特性を伴う２つのそのような操作ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ細胞系の生成を記載する。本発明において提供するモノクローナル細胞系は、組換えタンパク質産物の発現及び製造のための増強された産生能力を伴う最適化された宿主細胞システムとして特に有用である。
【００１５】
２つの細胞系を、ヒトＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａタンパク質をコードする発現コンストラクトを用いたＣＨＯ−ＤＧ４４宿主細胞系のトランスフェクション及び安定した細胞プールを生成するためのその後の選択により生成した。これらから、モノクローナル細胞系を、ＦＡＣＳベースの単一細胞クローニングにより得て、広範なスクリーニング及び特徴付けに供した。合計で、１００を上回るクローンが分析され、最終的に、２つのＣＨＯ／ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ細胞系２．２０及び２．４１を、以下に基づいて選択した：
・細胞内染色及びウエスタンブロッティングにより決定された高レベルのＣＥＲＴ発現
・シードストック培養における良好な増殖（生存率、倍加時間）ならびに
・工業的な産生プロセスを反映する流加培養中での最適な増殖（ピーク細胞密度、経時的な生細胞の積分（ＩＶＣ）、生存率）。
【００１６】
本発明において記載する細胞系は、ピューロマイシンだけを選択マーカーとして含むため、それらは、最も広く使用される選択及び増幅システムであるＤＨＦＲ、グルタミンシンセターゼ（ＧＳ）及びネオマイシン（Ｎｅｏ）と適合し、このように発現システムの設計における適応／変化を伴わず組換え抗体の発現のために使用することができる。
【００１７】
生成された１００を超えるＣＨＯ／ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａクローンから、本発明者らは、これらの基準に従って特に２つの新規モノクローナルＣＨＯ−ＤＧ４４由来細胞系（即ち、クローン２．２０及びクローン２．４１）を選択し、それらは、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH（ＤＳＭＺ）に寄託されている：
−細胞系は、本発明者らが「ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  ２．２０」と呼び、それは、ＤＳＭＺにナンバーＤＳＭ  ＡＣＣ２９８９の下で寄託されており、非常に高いＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ発現レベル及び非常に良好な増殖特徴を有し、それらは、親ＣＨＯ野生型細胞のものよりもさらにより良好である。
この細胞系は、細胞系での挿入ＤＮＡと細胞の隣接染色体ＤＮＡの間で接合フラグメントを同定することにより固有に記載することができる。例えば、細胞系のＤＮＡを１つ又は複数の制限酵素を用いて消化し、そのような接合フラグメントを、例えば、挿入ＤＮＡの適した標識フラグメントを使用したサザンブロット解析（ゲノム中の挿入部位を同定する特定のバンドパターンに導く）により同定する。そのような制限酵素は、例えば、以下に記載され、ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＫｐｎＩ、ＮｃｏＩ、ＮｄｅＩ、ＰｖｕＩＩ、ＳｐｅＩ、ＸｈｏＩ、ＡｖａＩＩ、ＢｓｔＸＩ、ＳａｌＩを含む。
−細胞系は、本発明者らが「ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  ２．４１」と呼び、それは、ＤＳＭＺにナンバーＤＳＭ  ＡＣＣ２９９０の下で寄託されており、非常に高いＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ発現レベル及び非常に良好な増殖特徴を有し、それらは、親ＣＨＯ野生型細胞のものよりもさらにより良好である。
この細胞系は、細胞系での挿入ＤＮＡと細胞の隣接染色体ＤＮＡの間で接合フラグメントを同定することにより固有に記載することができる。例えば、細胞系のＤＮＡを１つ又は複数の制限酵素を用いて消化し、そのような接合フラグメントを、例えば、挿入ＤＮＡの適した標識フラグメントを使用したサザンブロット解析（ゲノム中の挿入部位を同定する特定のバンドパターンに導く）により同定する。そのような制限酵素は、例えば、以下に記載され、ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＫｐｎＩ、ＮｃｏＩ、ＮｄｅＩ、ＰｖｕＩＩ、ＳｐｅＩ、ＸｈｏＩ、ＡｖａＩＩ、ＢｓｔＸＩ、ＳａｌＩを含む。
【００１８】
本発明には、このように、特に、ＤＳＭＺにナンバーＤＳＭ  ＡＣＣ２９８９の下で寄託されている細胞系及びＤＳＭＺにナンバーＤＳＭ  ＡＣＣ２９９０の下で寄託されている別の細胞系が記載される。本願の目的のために、これらの２つの細胞系は「conCERT（商標）」細胞系とも呼ばれる。
【００１９】
親ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞系と比較して、これらの２つの細胞系は、対応する発現プラスミドを用いたトランスフェクションに続く治療用タンパク質産物の増加した分泌速度ならびに良好な増殖特徴を示す。それらは、ＣＨＯ−ＤＧ４４宿主細胞系の利点（十分な特徴付け、ＦＤＡ承認済み、ウイルス負荷の低リスク、高い産生性、頑健性、トランスフェクション性、無血清培地中での浮遊での増殖）を、増強された分泌の新たな特性及び産生プロセスにおける最適化された性能と統合する。
【００２０】
本発明において例示的に記載される特定のconCERT（商標）細胞系は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター／エンハンサー領域に由来する上流調節配列（６００bp）、位置１３２に点突然変異（Ｓｅｒ１３２→Ａｌａ）を持つヒトＣＥＲＴ  ｃＤＮＡに融合されたＮ末端Ｆｌａｇエピトープタグ、停止コドン、及びポリアデニル化シグナルを含む３’非翻訳領域を含む、図１Ａ及びＢ（配列番号１）に描写するＦｌａｇタグ付きヒトＣＥＲＴ突然変異体Ｓ１３２Ａをコードする発現カセットを含む。
【００２１】
本発明において記載されるconCERT（商標）細胞系の生成のために使用されるベクターコンストラクトが図１Ｂに示されており、以下の機能的エレメントを含む：
−サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー／プロモーター、複数のクローニング部位（ＭＣＳ）、ポリアデニル化シグナル、
−ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ発現カセット、
−真核細胞においてピューロマイシンＮアセチルトランスフェラーゼを選択マーカーとしてコードする発現カセット、
−複製起点、及び
−細菌におけるアンピシリン耐性のためのベータ−ラクタマーゼ発現カセット。
【００２２】
conCERT（商標）細胞系中での抗体濃度は、安定的にトランスフェクションされた野生型細胞において測定された力価と比較して、有意により高く、平均差は１．５〜２．５倍の範囲である（図６）。このように、conCERT（商標）細胞系は、対照比較において、野生型ＣＨＯ細胞よりも有意により高い産物力価を生じる。これらのデータは、ＤＳＭＺにナンバーＤＳＭ  ＡＣＣ２９８９（ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  ２．２０）及びＤＳＭ  ＡＣＣ２９９０（ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  ２．４１）の下で寄託されているＣＨＯ／ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ細胞が、親ＤＧ４４細胞系と比較して、組換えタンパク質産生のための優れた宿主細胞であることを実証する。組換えタンパク質産生のための宿主細胞としてのconCERT（商標）細胞の具体的な例が、ＩｇＧ４及びＩｇＧ１サブタイプ抗体、Ｆｃ融合タンパク質、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、及びナノボディについて与えられる。しかし、conCERT（商標）細胞は、また、他のタンパク質、ポリペプチド、又はそのフラグメント、例えば酵素、サイトカイン、リンホカイン、構造分子、付着分子、受容体、及びその派生物もしくはフラグメントなど、ならびにアゴニスト又はアンタゴニストとしての役割を果たしうる及び／又は治療的又は診断的使用を有しうる他のポリペプチドの組換えタンパク質産生のための好ましい宿主細胞である。
【００２３】
本発明により提供される細胞系は、真核細胞に基づく産生プロセスにおいてタンパク質収量を増加させることができる。これによって、そのようなプロセスでの物品のコストが低下し、同時に、研究試験、診断、臨床試験、又は治療用タンパク質の市場供給のために必要とされる材料を生成するために産生する必要があるバッチの数が低下する。
本発明のconCERT（商標）細胞系は、さらに、薬物開発をスピードアップしうる。なぜなら、しばしば、前臨床試験のための十分量の材料の生成が、時系列に関する決定的なワーク・パッケージであるからである。
本発明の最適化されたconCERT（商標）細胞系を、診断目的、研究目的（標的同定、リード同定、リード最適化）、又は販売中のもしくは臨床開発中の治療用タンパク質の製造のいずれかのための１つ又はいくつかの特定のタンパク質の生成のために使用することができる。それらは、分泌又は膜結合タンパク質（例えば表面受容体、ＧＰＣＲ、メタロプロテイナーゼ、又は受容体キナーゼなど）を発現又は産生するために等しく適用可能であり、それらは、同じ分泌経路を共有し、脂質小胞中に等しく輸送される。タンパク質は、次に、研究目的のために使用することができ、それは、細胞表面受容体の機能を特徴付けることを目的とする（例、表面タンパク質の産生ならびにその後の精製、結晶化、及び／又は分析のため）。これは、新たなヒト薬物治療の開発のために決定的に重要である。なぜなら、細胞表面受容体は、薬物標的の優勢なクラスであるからである。さらに、それは、細胞表面受容体と会合する細胞内シグナル伝達複合体の試験又は同じもしくは別の細胞上での可溶性増殖因子とそれらの対応する受容体との相互作用により部分的に媒介される細胞間コミュニケーションの分析のために有利になりうる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
図の説明
【図１】図１：ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ発現コンストラクトの略図（Ａ）ＤＳＭＺにナンバーＤＳＭ  ＡＣＣ２９８９（ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  ２．２０）の下で寄託されている細胞系及びＤＳＭＺにナンバーＤＳＭ  ＡＣＣ２９９０（ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  ２．４１）細胞の下で寄託されている細胞系中に含まれるＦｌａｇ−ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ発現カセットの略図。ＣＭＶ＝サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期領域のエンハンサー／プロモーター；Ｆｌａｇ＝Flag（商標）エピトープタグ；ＣＥＲＴ−Ｓ１３２Ａ＝ヒトＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ突然変異体のｃＤＮＡ；Ｓｔｏｐ＝ＴＧＡ停止コドン；３’ＵＴＲ＝３’非翻訳領域。（Ｂ）本発明において記載されるＣＨＯ／ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ（conCERT（商標））細胞系を生成するためのＣＨＯ−ＤＧ４４細胞中にトランスフェクションされたベクターコンストラクトのマップ。プラスミドは内部で指定された「ｐＢＩＰ−１／Ｆｌａｇ−ＣＥＲＴ＿ＳＡ」であった。７６６０ｂｐのサイズを有する。黒矢印は、conCERT（商標）細胞系の同定のために適したオリゴヌクレオチドプライマーの結合位置を示す。ＣＭＶ＝サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期領域のエンハンサー／プロモーター、複数のクローニング部位が続く（示された酵素についての固有の認識部位により示される）；Ｆ１  ｏｒｉ＝細菌中の複製起点；ｂｌａ＝アンピシリン耐性のためのベータ−ラクタマーゼ遺伝子。
【図２】図２：ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ発現と分泌増強の相関（Ａ）ＩｇＧ産生細胞系中での異種ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ発現を、抗Ｆｌａｇ抗体を用いた細胞内標識により測定した。シグナル強度に基づき、クローン＃１−２を「低」（ライトグレードットバー）、クローン＃３−４を「高」ＣＥＲＴ−Ｓ１３２Ａ発現（縞模様のバー）を伴う細胞系として分類した。（Ｂ）流加培養における同じ細胞系での特異的な抗体産生性。全ての細胞系での産生性を、プロセスの間での３つの時間点で、ＩＶＣ（生細胞の積分）により割った産物濃度として算出した。
【図３】図３：ウエスタンブロッティングによるＣＥＲＴ発現の検出全細胞ライセートを１４のＣＨＯ／ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ細胞クローンから調製し、等量をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びFlag（商標）エピトープタグに対して産生された抗体を使用したその後の免疫学的検出に供した。多数の１４の細胞クローンをＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に表示する。個々の細胞系をそれらのクローンナンバーにより指定する。Ｍ＝分子量マーカー；（−）＝ネガティブコントロール（偽トランスフェクションされた細胞系からのライセート）；（＋）＝ポジティブコントロール。
【図４】図４：接種培養におけるＣＨＯ／ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ（conCERT（商標））細胞系の増殖特性接種培養の間での１５のＣＨＯ／ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ細胞クローンの増殖特徴。細胞を、細胞密度０．１５〜３×１０６個細胞/mlで維持し、２〜３日ごとに分割した。（Ａ）増殖速度に従った細胞系のランキング。（Ｂ）いくつかの継代にわたる生存率；ＤＳＭＺにアクセッションナンバーＤＳＭ  ＡＣＣ２９８９（ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ  ２．２０）及びＤＳＭ  ＡＣＣ２９９０（ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ  ２．４１）の下で寄託されている細胞系を実線により、全ての他のクローンを破線により示す。
【図５Ａ】図５：発酵の間でのモノクローナルＣＨＯ／ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ細胞系の増殖１５のモノクローナルな安定的にトランスフェクションされたＣＨＯ／ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ細胞クローンを、６日間にわたる流加発酵に供した。（Ａ）ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ細胞系及び親ＤＧ４４細胞の増殖プロファイル。ＤＳＭＺにアクセッションナンバーＤＳＭ  ＡＣＣ２９８９（ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  ２．２０）及びＤＳＭ  ＡＣＣ２９９０（ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  ２．４１）の下で寄託されている細胞系を実線により、全ての他のクローンを破線により示す。（Ｂ）６日間のプロセスにわたる全ての細胞系についての生細胞濃度の積分（ＩＶＣ）。本発明において選択されるＣＨＯ／ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ細胞系のＩＶＣを縞模様のバーにより示し、他のＣＨＯ／ＣＥＲＴ  Ｓ１３２ＡクローンのＩＶＣを黒バーにより提示し、親細胞のＩＶＣを斜線バー中に表す。
【図５Ｂ】図５：発酵の間でのモノクローナルＣＨＯ／ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ細胞系の増殖１５のモノクローナルな安定的にトランスフェクションされたＣＨＯ／ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ細胞クローンを、６日間にわたる流加発酵に供した。（Ａ）ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ細胞系及び親ＤＧ４４細胞の増殖プロファイルＤＳＭＺにアクセッションナンバーＤＳＭ  ＡＣＣ２９８９（ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  ２．２０）及びＤＳＭ  ＡＣＣ２９９０（ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  ２．４１）の下で寄託されている細胞系を実線により、全ての他のクローンを破線により示す。（Ｂ）６日間のプロセスにわたる全ての細胞系についての生細胞濃度の積分（ＩＶＣ）本発明において選択されるＣＨＯ／ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ細胞系のＩＶＣを縞模様のバーにより示し、他のＣＨＯ／ＣＥＲＴ  Ｓ１３２ＡクローンのＩＶＣを黒バーにより提示し、親細胞のＩＶＣを斜線バー中に表す。
【図６】図６：親ＣＨＯ  ＤＧ４４細胞系と比較した、ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ細胞から分泌された抗体力価／タンパク質産生の比較ＤＳＭＺにアクセッションナンバーＤＳＭ  ＡＣＣ２９８９（ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  ２．２０）及びＤＳＭ  ＡＣＣ２９９０（ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  ２．４１）の下で寄託されているconCERT（商標）細胞系ならびに親ＣＨＯ−ＤＧ４４宿主細胞系（Ｃｌａｓｓｉｃ）を、ヒトＩｇＧ１型モノクローナル抗体をコードする発現コンストラクトを用いてトランスフェクションする。遺伝子型当たり１０の最も高い発現細胞プールの抗体力価を、力価中央値及び２５〜７５%分位をボックスとして描写するボックスプロット中に提示する。エラーバーは標準偏差を示す。
【図７Ａ】図７：親ＣＨＯ  ＤＧ４４細胞系と比較した、ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ細胞から分泌された抗体力価／タンパク質産生の比較ＤＳＭＺにアクセッションナンバーＤＳＭ  ＡＣＣ２９８９（ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  ２．２０）及びＤＳＭ  ＡＣＣ２９９０（ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  ２．４１）の下で寄託されているconCERT（商標）細胞系ならびに親ＣＨＯ−ＤＧ４４宿主細胞系（Ｃｌａｓｓｉｃ）を、ヒトＩｇＧ４型モノクローナル抗体をコードする発現コンストラクトを用いてトランスフェクションする。遺伝子型当たり１０の最も高い発現細胞プールを選択する。（Ａ、Ｂ）各遺伝子型についての細胞プールから生成された１０の最も高い発現モノクローナル細胞系の特異的な産生性（Ａ）及び抗体力価（Ｂ）を、力価中央値及び２５〜７５%分位をボックスとして描写するボックスプロット中に提示する。エラーバーは標準偏差を示す。
【図７Ｂ】図７：親ＣＨＯ  ＤＧ４４細胞系と比較した、ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ細胞から分泌された抗体力価／タンパク質産生の比較ＤＳＭＺにアクセッションナンバーＤＳＭ  ＡＣＣ２９８９（ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  ２．２０）及びＤＳＭ  ＡＣＣ２９９０（ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  ２．４１）の下で寄託されているconCERT（商標）細胞系ならびに親ＣＨＯ−ＤＧ４４宿主細胞系（Ｃｌａｓｓｉｃ）を、ヒトＩｇＧ４型モノクローナル抗体をコードする発現コンストラクトを用いてトランスフェクションする。遺伝子型当たり１０の最も高い発現細胞プールを選択する。（Ａ、Ｂ）各遺伝子型についての細胞プールから生成された１０の最も高い発現モノクローナル細胞系の特異的な産生性（Ａ）及び抗体力価（Ｂ）を、力価中央値及び２５〜７５%分位をボックスとして描写するボックスプロット中に提示する。エラーバーは標準偏差を示す。
【００２５】
発明の詳細な説明
定義
一般的な実施態様「含む」又は「含まれる」は、より具体的な実施態様「からなる」を包含する。さらに、単数形及び複数形は限定的な方法で使用されない。
本発明の経過において使用する用語は、以下の意味を有する。
用語「ＣＥＲＴ」はセラミドトランスファータンパク質ＣＥＲＴを指し、それは、また、グッドパスチュア抗原結合タンパク質として公知である。ＣＥＲＴは、小胞体（ＥＲ）でのその産生部位からゴルジ膜へのセラミドの非小胞送達のために必須の細胞質タンパク質であり、そこでは、スフィンゴミエリン（ＳＭ）への変換が起こる（Hanada et al., 2003）。
用語「ＣＨＯ／ＣＥＲＴ」、「ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  ＳＡ」、「ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ」を互換的に使用する。さらに、細胞系の命名「ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  ２．２０」、「ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  ＳＡ  ２．２０」、「ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ  ２．２０」を互換的に使用し、それらの全てが同じ細胞系クローン２．２０（アクセッションナンバーＤＳＭＺ  ＤＳＭ  ＡＣＣ２９８９の下で寄託される）を記載する。細胞系の命名「ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  ２．４１」、「ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  ＳＡ  ２．４１」、「ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ  ２．４１」を互換的に使用し、それらの全てが同じ細胞系クローン２．４１（アクセッションナンバーＤＳＭＺ  ＤＳＭ  ＡＣＣ２９９０の下で寄託される）を記載する。
【００２６】
用語「派生物」は、一般的に、本発明の意図される使用を実現するために適した配列を含み、それは、配列が、細胞中での分泌輸送の増加を媒介することを意味する。
【００２７】
「宿主細胞」は、本発明の意味において、細胞、例えばハムスター細胞、好ましくはＢＨＫ２１、ＢＨＫ  ＴＫ−、ＣＨＯ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ  Ｂ１、及びＣＨＯ−ＤＧ４４細胞など又はそのような細胞系のいずれかの派生物／子孫である。特に好ましいのはＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｓ、及びＢＨＫ２１であり、さらにより好ましいのはＣＨＯ−ＤＧ４４及びＣＨＯ−ＤＵＫＸ細胞である。本発明のさらなる実施態様において、宿主細胞は、また、マウスミエローマ細胞、好ましくはＮＳ０細胞及びＳｐ２／０細胞又はそのような細胞系のいずれかの派生物／子孫を意味する。本発明の意味において使用することができるマウス細胞及びハムスター細胞の例を、また、表１にまとめる。しかし、そのような細胞の派生物／子孫、他の哺乳動物細胞（しかし、限定はされないが、ヒト、マウス、ラット、サル、及びトリ又は好ましくは齧歯類の細胞系を含む）、又は真核細胞（しかし、限定はされないが、酵母、昆虫、及び植物の細胞を含む）を、また、本発明の意味において、特に生物医薬品タンパク質の産生のために使用することができる。
【００２８】
【表１】
2012525826.tif 000003
【００２９】
宿主細胞が、無血清条件下で、場合により、動物由来の任意のタンパク質／ペプチドを含まない培地中で樹立され、適応され、完全に培養される場合に最も好ましい。商業的に利用可能な培地、例えばハムＦ１２（Sigma, Deisenhofen, Germany）、ＲＰＭＩ−１６４０（Sigma）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Sigma）、最小必須培地（ＭＥＭ；Sigma）、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ；Sigma）、ＣＤ−ＣＨＯ（Invitrogen, Carlsbad, CA）、CHO-S-Invtirogen）、無血清ＣＨＯ培地（Sigma）、及び無タンパク質ＣＨＯ培地（Sigma）などが、例示的で適切な栄養溶液である。培地のいずれかに、必要に応じて、種々の化合物を用いて添加してもよい。それらの例は、ホルモン及び／又は他の増殖因子（例えばインスリン、トランスフェリン、上皮増殖因子、インスリン様増殖因子など）、塩（例えば塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、リン酸など）、バッファー（例えばＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオシド（例えばアデノシン、チミジンなど）、グルタミン、グルコース又は他の等価のエネルギー供給源、抗生物質、微量元素である。任意の他の必要な添加剤が、また、当業者に公知でありうる適切な濃度で含まれてもよい。本発明において、無血清培地の使用が好ましいが、しかし、適量の血清が添加された培地も、宿主細胞の培養のために使用することができる。選択可能な遺伝子を発現する遺伝子改変細胞の増殖及び選択のために、適した選択薬剤を培養液に加える。
【００３０】
用語「タンパク質」を、アミノ酸残基配列又はポリペプチドと互換的に使用し、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。これらの用語は、また、しかし、限定はされないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、又はタンパク質プロセシングを含む反応を通じて翻訳後に修飾されるタンパク質を含む。改変及び変化、例えば、他のタンパク質への融合、アミノ酸配列の置換、欠失、又は挿入をポリペプチドの構造中に作製することができ、分子はその生物学的な機能活性を維持する。例えば、特定のアミノ酸配列の置換を、ポリペプチド又はその基礎となる核酸コード配列中に作製することができ、タンパク質を、同様の特性を伴い得ることができる。
【００３１】
用語「ポリペプチド」は、１０を上回るアミノ酸を伴う配列を意味する。用語「ペプチド」は、１０までのアミノ酸長の配列を意味する。
本発明は、生物医薬品ポリペプチド／タンパク質の産生のための宿主細胞を生成するために適する。本発明は、特に、増強された細胞産生性を示す細胞による、目的の多数の異なる遺伝子の高収量発現のために適する。
【００３２】
「目的の遺伝子」（ＧＯＩ）、「選択された配列」、又は「産物遺伝子」は、本明細書において同じ意味を有し、目的の産物又は「目的のタンパク質」（また、用語「所望の産物」により言及される）をコードする任意の長さのポリヌクレオチド配列を指す。選択された配列は、完全長遺伝子又は切断遺伝子、融合遺伝子又はタグ付き遺伝子でありうる、及び、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又はＤＮＡフラグメント、好ましくは、ｃＤＮＡでありうる。それは、天然配列、即ち、自然発生形態でありうる、又は、突然変異されうるもしくは別の方法で所望の通りに改変されうる。これらの改変は、選択された宿主細胞中でのコドン使用を最適化するためのコドン最適化、ヒト化、又はタギングを含む。選択された配列は、分泌ポリペプチド、細胞質ポリペプチド、核ポリペプチド、膜結合ポリペプチド、又は細胞表面ポリペプチドをコードしうる。
【００３３】
「目的のタンパク質」は、タンパク質、ポリペプチド、そのフラグメント、ペプチドを含み、その全てを、選択された宿主細胞において発現させることができる。所望のタンパク質は、例えば、抗体、酵素、サイトカイン、リンホカイン、接着分子、受容体、及びその派生物又はフラグメント、ならびに、アゴニストもしくはアンタゴニストとしての役割を果たしうる及び／又は治療的もしくは診断的使用を有しうる任意の他のポリペプチドでありうる。所望のタンパク質／ポリペプチドについての例も以下に与える。
より複雑な分子（例えばモノクローナル抗体など）の場合において、ＧＯＩは、２つの抗体鎖の１つ又は両方をコードする。
【００３４】
「目的の産物」は、また、アンチセンスＲＮＡでありうる。
【００３５】
「目的のタンパク質」又は「所望のタンパク質」は、上に言及するものである。特に、所望のタンパク質／ポリペプチド又は目的のタンパク質は、例えば、しかし、限定はされないが、インスリン、インスリン様増殖因子、ｈＧＨ、ｔＰＡ、サイトカイン、例えばインターロイキン（ＩＬ）など、例、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、インターフェロン（ＩＦＮ）アルファ、ＩＦＮベータ、ＩＦＮガンマ、ＩＦＮオメガ又はＩＦＮタウ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、例えばＴＮＦアルファ及びＴＮＦベータ、ＴＮＦガンマ、ＴＲＡＩＬ；Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−１、及びＶＥＧＦである。また、含まれるのは、エリスロポエチン又は任意の他のホルモン増殖因子の産生である。本発明の方法は、また、抗体又はそのフラグメントの産生のために有利に使用することができる。そのようなフラグメントは、例えば、Ｆａｂフラグメント（フラグメント抗原結合＝Ｆａｂ）を含む。Ｆａｂフラグメントは、隣接する定常領域により一緒に保持される両鎖の可変領域からなる。これらは、プロテアーゼ消化により（例、パパインを用いて）、従来の抗体から形成されうるが、しかし、類似のＦａｂフラグメントも一方で遺伝子操作により産生されうる。さらなる抗体フラグメントはＦ（ａｂ‘）２フラグメントを含み、それは、ペプシンを用いたタンパク質分解的切断により調製されうる。
【００３６】
目的のタンパク質は、好ましくは、培養液から分泌ポリペプチドとして回収される、又は、それは、分泌シグナルを伴わずに発現された場合、宿主細胞ライセートから回収することができる。目的のタンパク質を、他の組換えタンパク質及び宿主細胞タンパク質から、目的のタンパク質の実質的に均質な調製物が得られる方法で精製することが必要である。最初の工程として、細胞及び／又は粒状細胞片を培養液又はライセートから除去する。目的の産物を、その後、混入する可溶性タンパク質、ポリペプチド、及び核酸から、例えば、免疫親和性カラム又はイオン交換カラム上での分画、エタノール沈澱、逆相ＨＰＬＣ、セファデックスクロマトグラフィー、シリカ上又は陽イオン交換樹脂（例えばＤＥＡＥなど）上でのクロマトグラフィーにより精製する。一般的に、宿主細胞により異種性に発現されたタンパク質をどのように精製するのかを当業者に教示する方法は、当技術分野において周知である。
【００３７】
遺伝子操作方法を使用し、重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域だけからなる短縮した抗体フラグメントを産生することが可能である。これらは、Ｆｖフラグメント（Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｖａｒｉａｂｌｅ＝可変部分のフラグメント）と呼ばれる。これらのＦｖフラグメントは定常鎖のシステインによる２つの鎖の共有結合を欠くため、Ｆｖフラグメントはしばしば安定化される。重鎖の及び軽鎖の可変領域を、短いペプチドフラグメント（例、１０〜３０アミノ酸、好ましくは１５アミノ酸の）により連結することが有利である。この方法において、単一のペプチド鎖を得る（ＶＨ及びＶＬからなり、ペプチドリンカーにより連結されている）。この種類の抗体タンパク質は、単鎖Ｆｃ（ｓｃＦｖ）として公知である。この種類のｓｃＦｖ抗体タンパク質の例は、先行技術から公知である。
近年、種々の戦略が、ｓｃＦｖを多量体派生物として調製するために開発されてきた。これは、特に、改善された薬物動態及び体内分布特性を伴うならびに増加した結合アビディティーを伴う組換え抗体に導くことが意図される。ｓｃＦｖの多量体化を達成するために、ｓｃＦｖを、多量体化ドメインを伴う融合タンパク質として調製した。多量体化ドメインは、例えば、ＩｇＧのＣＨ３領域又はコイルドコイル構造（ヘリックス構造）、例えばロイシンジッパードメインなどでありうる。しかし、ｓｃＦｖのＶＨ／ＶＬ領域の間での相互作用を多量体化（例、ダイア、トリ、及びペンタボディ）のために使用する戦略もある。ダイアボディにより、当業者は二価ホモ二量体ｓｃＦｖ派生物を意味する。ｓｃＦｖ分子中のリンカーの５〜１０アミノ酸への短縮は、ホモ二量体化の形成に導き、それにおいて鎖内ＶＨ／ＶＬの重ね合わせが起こる。ダイアボディは、加えて、ジスルフィド架橋の取り込みにより安定化されうる。ダイアボディ−抗体タンパク質の例は、先行技術において公知である。
【００３８】
ミニボディにより、当業者は、二価のホモ二量体ｓｃＦｖ派生物を意味する。それは、免疫グロブリン、好ましくはＩｇＧ、最も好ましくはＩｇＧ１のＣＨ３領域を、二量体化領域（ヒンジ領域（例、また、ＩｇＧ１から）及びリンカー領域を介してｓｃＦｖに結合される）として含む融合タンパク質からなる。ミニボディ−抗体タンパク質の例は、先行技術において公知である。
【００３９】
トリアボディにより、当業者は、三価のホモ三量体ｓｃＦｖ派生物を意味する。ＶＨ−ＶＬがリンカー配列を伴わずに直接的に融合されるＳｃＦｖ派生物は、三量体の形成に導く。
【００４０】
当業者は、また、二、三、又は四価構造を有し、ｓｃＦｖに由来する、いわゆるミニ抗体に精通しうる。多量体化は、二、三、又は四量体コイルドコイル構造により行われる。
【００４１】
当業者は、また、ラマ又はラクダ科からの他の動物に由来する単鎖抗体の１つ又は複数の可変ドメインからなるポリペプチド分子に精通しうる。さらに、当業者は、そのようなラクダ抗体の派生物及びバリアントを知っている。そのような分子は、また、「ドメイン抗体」と呼ばれる。ドメイン抗体バリアントは、ペプチドリンカーにより共有結合的に結合されているそれらの可変ドメインのいくつかを含む。
【００４２】
血中半減期を増加させるために、ドメイン抗体を生成することができ、それは、ポリペプチド成分（例えば抗体Ｆｃ部分など）又は血清中に存在する別のタンパク質（例えばアルブミンなど）に融合される。
【００４３】
「スキャフォールドタンパク質」により、当業者は、遺伝子クローニングにより又は同時翻訳プロセスにより、別のタンパク質又は別の機能を有するタンパク質の部分と共役されるタンパク質の任意の機能的ドメインを意味する。
【００４４】
定義により、宿主細胞中に導入された任意の配列又は遺伝子は、宿主細胞に関して、「異種配列」又は「異種遺伝子」又は「トランスジーン」と呼ばれる（導入された配列又は遺伝子が、宿主細胞中の内因性配列又は遺伝子と同一の場合でさえ）。
【００４５】
「異種」タンパク質は、このように、異種配列から発現されるタンパク質である。用語「組換え」は、本発明の明細書を通して、特にタンパク質発現に関連して、用語「異種」と互換的に使用される。このように、「組換え」タンパク質は、異種配列から発現されるタンパク質である。
【００４６】
異種遺伝子配列を、標的細胞中に、「発現ベクター」、好ましくは真核生物の、及びさらにより好ましくは哺乳動物の発現ベクターを使用することにより導入することができる。ベクターを構築するために使用される方法は、当業者に周知であり、種々の刊行物中に記載されている。特に、適したベクターを構築するための技術（機能的成分、例えばプロモーター、エンハンサー、終結シグナル及びポリアデニル化シグナル、選択マーカー、複製起点、及びスプライシングシグナルなどの記載を含む）が、先行技術において概説されている。ベクターは、しかし、限定はされないが、プラスミドベクター、ファージミド、コスミド、人工／ミニ染色体（例、ＡＣＥ）、又はウイルスベクター（例えばバキュロウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペス単純ウイルス、レトロウイルス、バクテリオファージなど）を含みうる。真核生物発現ベクターは、典型的には、細菌中でのベクターの増殖を促進する原核生物配列（例えば複製起点及び細菌中での選択のための抗生物質耐性遺伝子など）も含みうる。種々の真核生物発現ベクター（ポリヌクレオチドを操作的に連結することができるクローニング部位を含む）が、当技術分野において周知であり、一部が、企業、例えばStratagene（La Jolla、CA）、Invitrogen（Carlsbad、CA）、Promega（Madison、WI）、又はBD Biosciences Clontech（Palo Alto、CA）などから商業的に利用可能である。
【００４７】
好ましい実施態様において、発現ベクターは、目的のペプチド／ポリペプチド／タンパク質をコードするヌクレオチド配列の転写及び翻訳のために必要な調節配列である少なくとも１つの核酸配列を含む。
【００４８】
用語「発現」は、本明細書で使用される通り、宿主細胞内での異種核酸配列の転写及び／又は翻訳を指す。宿主細胞中での目的の所望の産物／タンパク質の発現のレベルを、細胞中に存在する対応するｍＲＮＡの量、又は、本発明の実施例の通り、選択された配列によりコードされる目的の所望のポリペプチド／タンパク質の量のいすれかに基づいて決定してもよい。例えば、選択された配列から転写されたｍＲＮＡを、ノーザンブロットハイブリダイゼーション、リボヌクレアーゼＲＮＡ保護、細胞ＲＮＡに対するｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより、又はＰＣＲにより定量化することができる。選択された配列によりコードされるタンパク質を、種々の方法により、例えば、ＥＬＩＳＡにより、ウエスタンブロッティングにより、ラジオイムノアッセイにより、免疫沈降により、タンパク質の生物学的活性についてのアッセイにより、タンパク質の免疫染色それに続くＦＡＣＳ解析により、又は均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）アッセイにより定量化することができる。
【００４９】
ポリヌクレオチド又は発現ベクターを用いた真核生物宿主細胞の「トランスフェクション」は、遺伝子改変細胞又はトランスジェニック細胞をもたらし、当技術分野において周知の任意の方法により実施することができる。トランスフェクション方法は、しかし、限定はされないが、リポソーム媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム共沈殿、エレクトロポレーション、ポリカチオン（例えばＤＥＡＥデキストランなど）媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、ウイルス感染、及びマイクロインジェクションを含む。好ましくは、トランスフェクションは安定トランスフェクションである。特定の宿主細胞系及び型において最適なトランスフェクション頻度及び異種遺伝子の発現を提供するトランスフェクション方法が好ましい。適した方法を、ルーチン手順により決定することができる。安定トランスフェクタントのために、コンストラクトは、宿主細胞のゲノムもしくは人工染色体／ミニ染色体中に組み込まれる、又は、エピソームとして位置づけられ、宿主細胞内に安定的に維持される。
【００５０】
本発明の実行では、別に示さない場合、細胞生物学、分子生物学、細胞培養、免疫学などの従来技術を用い、それらは当業者の技術内にある。これらの技術は、本発明の文献中に完全に開示されている。
【００５１】
実施態様
本発明は、ＤＳＭＺ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH）にナンバーＤＳＭ  ＡＣＣ２９８９（ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  ２．２０）の下で寄託されている細胞に関する。本発明は、細胞／細胞系に関し、その代表的なものがＤＳＭＺにナンバーＤＳＭ  ＡＣＣ２９８９（ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  ２．２０）の下で寄託されている。この細胞系は、細胞系の細胞の挿入ＤＮＡと隣接染色体ＤＮＡの間で接合フラグメントを同定することにより、固有に記載することができる。例えば、細胞系のＤＮＡを１つ又は複数の制限酵素を用いて消化し、そのような接合フラグメントを、例えば、挿入ＤＮＡの適した標識フラグメントを使用したサザンブロット解析（ゲノム中の挿入部位を同定する特定のバンドパターンに導く）により同定する。そのような制限酵素は、例えば、以下に記載され、ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＫｐｎＩ、ＮｃｏＩ、ＮｄｅＩ、ＰｖｕＩＩ、ＳｐｅＩ、ＸｈｏＩ、ＡｖａＩＩ、ＢｓｔＸＩ、ＳａｌＩを含む。
【００５２】
本発明は、さらに、ＤＳＭＺにナンバーＤＳＭ  ＡＣＣ２９９０（ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  ２．４１）の下で寄託されている細胞に関する。本発明は、細胞／細胞系に関し、その代表的なものがＤＳＭＺにナンバーＤＳＭ  ＡＣＣ２９９０（ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  ２．４１）の下で寄託されている。この細胞系は、細胞系での挿入ＤＮＡと細胞の隣接染色体ＤＮＡの間で接合フラグメントを同定することにより固有に記載することができる。例えば、細胞系のＤＮＡを１つ又は複数の制限酵素を用いて消化し、そのような接合フラグメントを、例えば、挿入ＤＮＡの適した標識フラグメントを使用したサザンブロット解析（ゲノム中の挿入部位を同定する特定のバンドパターンに導く）により同定する。そのような制限酵素は、例えば、以下に記載され、ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＫｐｎＩ、ＮｃｏＩ、ＮｄｅＩ、ＰｖｕＩＩ、ＳｐｅＩ、ＸｈｏＩ、ＡｖａＩＩ、ＢｓｔＸＩ、ＳａｌＩを含む。
【００５３】
本発明の特定の実施態様において、発明の細胞（ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  ２．２０又はＣＨＯ／ＣＥＲＴ  ２．４１）は、加えて、目的のタンパク質をコードする目的の遺伝子を含む少なくとも１つの２つめのベクターコンストラクトを含む。前記細胞は、好ましくは、加えて、目的のタンパク質をコードする目的の遺伝子ならびに選択及び／又は増幅マーカーを含む少なくとも１つの２つめのベクターコンストラクトを含む。２つめのベクターコンストラクト上の前記の選択及び／又は増幅マーカーは、好ましくは、グルタミンシンセターゼ（ＧＳ）又はジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、最も好ましくはＤＨＦＲである。
本発明のさらなる好ましい実施態様において、全てのベクターコンストラクトが細胞ゲノム中に安定的に組み込まれる。
【００５４】
本発明のさらなる好ましい実施態様において、前記細胞は以下により特徴付けられる：
ゲノムＤＮＡを鋳型として使用する場合での特定のＰＣＲバンドパターン／フィンガープリント、それにより、２３７３bpのＰＣＲ産物が、配列番号２及び配列番号３のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して生成される、又は、
ゲノムＤＮＡを鋳型として使用する場合での特定のＰＣＲバンドパターン／フィンガープリント、それにより、６６０bpのＰＣＲ産物（配列番号６）が、配列番号４及び配列番号５のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して生成される、又は、
（ａ）のＣＥＲＴ特異的な２３７３bpのＰＣＲ産物と以下の制限酵素とのインキュベーションに起因する特定数のフラグメント及びフラグメントサイズ：
【表２】
2012525826.tif 000004
それにより、ＨｉｎｄＩＩＩを用いたインキュベーションが好ましい。
【００５５】
本発明の好ましい実施態様において、前記細胞は、ＣＥＲＴ特異的な２３７３bpのＰＣＲ産物（ゲノムＤＮＡを鋳型としてならびに配列番号２及び配列番号３のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して生成される）の以下の制限酵素とのインキュベーションに起因する上の表に従ったサイズを伴う２つの特定のフラグメントにより特徴付けられる：ＥｃｏＲＶ、ＫｐｎＩ、ＮｃｏＩ、ＮｄｅＩ、ＰｖｕＩＩ、ＳｐｅＩ、ＸｈｏＩ。
本発明の最も好ましい実施態様において、前記細胞は、ＣＥＲＴ特異的な２３７３bpのＰＣＲ産物（ゲノムＤＮＡを鋳型としてならびに配列番号２及び配列番号３のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して生成される）の制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとのインキュベーションに起因するサイズ２１７６bp及び１９７bpをそれぞれ伴う２つの特定のフラグメントにより特徴付けられる。
【００５６】
本発明の特定の実施態様において、ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ発現カセットは配列番号１からなる。
【００５７】
本発明のさらなる特定の実施態様において、目的のタンパク質は、治療用タンパク質、好ましくは抗体又は抗体融合タンパク質である。
【００５８】
本発明は、さらに、以下の工程により特徴付けられる宿主細胞系を生成するための方法に関する：
（ａ）親宿主細胞、好ましくはＣＨＯ又はＮＳＯ細胞、最も好ましくはＣＨＯ  ＤＧ４４細胞を提供すること、
（ｂ）ベクターコンストラクトを、ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ発現カセットを含む工程（ａ）の前記細胞中に導入すること、
（ｃ）安定的にトランスフェクションされた細胞集団について選択すること、
（ｄ）ＦＡＣＳベースの単一細胞クローニングによりモノクローナル細胞系を単離すること、
（ｅ）以下についてスクリーニングすること
−高レベルなＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ発現、
−シードストック培養中での最適な増殖、
−流加培養中での最適な増殖、
（ｆ）工程（ｅ）のスクリーニング基準に従って工程（ｄ）の細胞クローンからモノクローナル細胞系を選択すること。
【００５９】
本発明は、さらに、以下の工程により特徴付けられる宿主細胞系を生成するための方法に関する：
ａ）親宿主細胞、好ましくはＣＨＯ又はＮＳＯ細胞を提供すること、
ｂ）ベクターコンストラクトを、ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ発現カセットを含む工程（ａ）の前記親宿主細胞中に導入すること、
ｃ）安定的にトランスフェクションされた細胞集団について選択すること、
ｄ）ＦＡＣＳベースの単一細胞クローニングによりモノクローナル細胞系を単離すること、
ｅ）以下について前記モノクローナル細胞系をスクリーニングすること
ｉ）高レベルなＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ発現、
ｉｉ）シードストック培養中での最適な増殖、
ｉｉｉ）流加培養中での最適な増殖、
工程（ｅ）のスクリーニング基準に従って工程（ｄ）の細胞クローンからモノクローナル細胞系を宿主細胞系として選択すること。
【００６０】
本発明は、さらに、以下の工程により特徴付けられる宿主細胞系を生成するための方法に関する：
ａ）親宿主細胞、好ましくはＣＨＯ又はＮＳＯ細胞を提供すること、
ｂ）ベクターコンストラクトを、ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ発現カセットを含む工程（ａ）の前記親細胞中に導入すること、
ｃ）安定的にトランスフェクションされた細胞集団について選択すること、
ｄ）ＦＡＣＳベースの単一細胞クローニングにより細胞を単離すること、
ｅ）以下について前記細胞をスクリーニングすること
ｉ）高レベルなＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ発現、
ｉｉ）シードストック培養中での最適な増殖、
ｉｉｉ）流加培養中での最適な増殖、
ｆ）宿主細胞としての使用のために工程（ｅ）のスクリーニング基準に従って単一クローン又は細胞のプールを選択すること。
好ましくは、工程（ａ）の前記親宿主細胞は、上に記載される定義下の宿主細胞である。好ましくは、工程（ａ）の前記親宿主細胞は、齧歯類細胞、例えばマウス又はハムスター細胞など、最も好ましくはＣＨＯ  ＤＧ４４細胞である。
好ましくは、工程（ｂ）の前記ベクターコンストラクトは、図１Ｂに描写する以下の機能的エレメントを含む：
−サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー／プロモーター、
−複数のクローニング部位（ＭＣＳ）、−ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ発現カセット、
−真核細胞中での選択マーカーとしてピューロマイシンＮアセチルトランスフェラーゼをコードする発現カセット、
−ポリアデニル化シグナル、
−複製起点、
−細菌中でのアンピシリン耐性のためのベータ−ラクタマーゼ発現カセット。
シードストック培養物を、工程（ｅ）ｉｉ）において最適な増殖についてスクリーニングするための具体的な基準は、生存率、倍加時間である。
流加培養物を、工程（ｅ）ｉｉｉ）において最適な増殖についてスクリーニングするための具体的な基準は、ピーク細胞密度、経時的な生細胞の積分（ＩＶＣ）、生存率である。
流加培養中での前記スクリーニング基準は、特に有意である。なぜなら、それらは、工業的な産生プロセスにおける環境条件を反映するからである。
好ましい方法において、工程（ｂ）のＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ発現カセットは配列番号１からなる。
【００６１】
本発明は、さらに、上に記載する細胞において目的の遺伝子によりコードされる目的のタンパク質を産生する方法に関し、以下の工程により特徴付けられる：ａ）上に記載する細胞を提供すること、ｂ）少なくとも１つの目的の遺伝子の発現を可能にする条件下で細胞を培養すること。特定の実施態様において、方法は、ｃ）目的のタンパク質を収集する追加工程を含む。さらなる特定の実施態様において、方法は、ｄ）目的のタンパク質を精製する別の追加工程を含む。
【００６２】
本発明は、さらに、上に記載する細胞において目的の遺伝子によりコードされる目的のタンパク質を産生する方法に関し、以下の工程により特徴付けられる：ａ）上に記載する細胞を提供すること、ｂ）細胞の増殖及び少なくとも１つの目的の遺伝子の発現を可能にする条件下で細胞を培養すること。特定の実施態様において、方法は、ｃ）目的のタンパク質を収集する追加工程を含む。さらなる特定の実施態様において、方法は、ｄ）目的のタンパク質を精製する別の追加工程を含む。
【００６３】
本発明は、以下の工程により特徴付けられる発明の細胞において目的の遺伝子によりコードされる目的のタンパク質を産生する方法に関する：
（ａ）発明の細胞を提供すること、
（ｂ）細胞の増殖及び目的の少なくとも１つの遺伝子の発現を可能にする条件下で前記細胞を培養すること、
（ｃ）目的のタンパク質を収集すること、及び
（ｄ）目的のタンパク質を精製すること。
好ましい産生方法において、宿主細胞は、目的の遺伝子についての選択及び／又は増幅マーカーとして、グルタミンシンセターゼ（ＧＳ）又はＤＨＦＲ、好ましくはＤＨＦＲを含む。
【００６４】
本発明は、さらに、以下により、ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ（配列番号１）についてトランスジーンである細胞を同定する方法に関する：
（ａ）ポリメラーゼ連鎖反応ＰＣＲを実施すること、
（ｂ）ゲノムＤＮＡを鋳型として使用すること、及び
（ｃ）配列番号２及び配列番号３を伴うオリゴヌクレオチドプライマーを使用すること、
それにより２３７３bpのＰＣＲ産物が生成される。
【００６５】
場合により、前記細胞は、さらに、ＣＥＲＴ特異的な２３７３bpのＰＣＲ産物と以下の制限酵素とのインキュベーションに起因する特定数のフラグメント及びフラグメントサイズにより特徴付けられる：
【表３】
2012525826.tif 000005
【００６６】
本発明は、具体的には、ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ（配列番号１）についてトランスジーンである細胞を、ゲノムＤＮＡを鋳型として使用するＰＣＲにより同定／特徴付ける方法に関し、それにより２３７３bpのＰＣＲ産物が、配列番号２及び配列番号３のオリゴヌクレオチドプライマーを使用する場合に生成される。
【００６７】
本発明は、さらに、ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ（配列番号１）についてトランスジーンである細胞を、ゲノムＤＮＡを鋳型として使用するＰＣＲにより同定／特徴付ける方法に関し、それにより２３７３bpのＰＣＲ産物が、配列番号２及び配列番号３のオリゴヌクレオチドプライマーを使用する場合に生成され、それにより、前記細胞は、ＣＥＲＴ特異的な２３７３bpのＰＣＲ産物と以下の制限酵素とのインキュベーションに起因する特定数のフラグメント及びフラグメントサイズにより特徴付けられる：
【表４】
2012525826.tif 000006
【００６８】
前記方法の好ましい実施態様において、前記細胞は、ＣＥＲＴ特異的な２３７３bpのＰＣＲ産物（ゲノムＤＮＡを鋳型としてならびに配列番号２及び配列番号３のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して生成される）の以下の制限酵素とのインキュベーションに起因する上の表に従ったサイズを伴う２つの特定のフラグメントにより特徴付けられる：ＥｃｏＲＶ、ＫｐｎＩ、ＮｃｏＩ、ＮｄｅＩ、ＰｖｕＩＩ、ＳｐｅＩ、ＸｈｏＩ。
前記方法の最も好ましい実施態様において、前記細胞は、ＣＥＲＴ特異的な２３７３bpのＰＣＲ産物（ゲノムＤＮＡを鋳型としてならびに配列番号２及び配列番号３のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して生成される）の制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとのインキュベーションに起因するサイズ２１７６bp及び１９７bpをそれぞれ伴う２つの特定のフラグメントにより特徴付けられる。
【００６９】
さらなる実施態様において、ＤＳＭＺ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH）にナンバーＤＳＭ  ＡＣＣ２９８９（ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  ２．２０）の下で寄託されている細胞は、特定の制限消化により又は特定のＰＣＲバンドパターンにより特徴付けられ（ゲノムＤＮＡを使用した場合）、それにより、そのようなアッセイは、クローンＤＳＭ  ＡＣＣ２９８９（ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  ２．２０）中のＣＥＲＴトランスジーン／ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ発現カセットのゲノム組み込み部位について特異的である固有のフィンガープリントを生成する。細胞系ＤＳＭ  ＡＣＣ２９８９（ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  ２．２０）は、接合フラグメントにより固有に記載される／特徴付けられる。細胞系ＤＳＭ  ＡＣＣ２９８９（ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  ２．２０）は、挿入ＤＮＡ（＝ＣＥＲＴトランスジーン／ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ発現カセット）と隣接染色体ＤＮＡの間の接合フラグメントにより固有に記載され／特徴付けられ、それにより、細胞系のＤＮＡ（好ましくは、ゲノムＤＮＡ）が、１つ又は複数の制限酵素（例えばＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＫｐｎＩ、ＮｃｏＩ、ＮｄｅＩ、ＰｖｕＩＩ、ＳｐｅＩ、ＸｈｏＩ、ＡｖａＩＩ、ＢｓｔＸＩ、ＳａｌＩなど）を用いて消化され、前記の接合フラグメントが、例えば、サザンブロット解析あるいは１つ又は複数の適した、場合により標識されたＤＮＡフラグメントを使用したＰＣＲにより同定される。このＤＮＡフラグメントは、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９８９（ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  ２．２０）のゲノム中のＣＥＲＴトランスジーン／ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ発現カセットの固有の挿入部位を特徴付ける特定のバンドパターン又はフィンガープリントを呈する。
【００７０】
さらなる実施態様において、ＤＳＭＺ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH）にナンバーＤＳＭ  ＡＣＣ２９９０（ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  ２．４１）の下で寄託されている細胞は、特定の制限消化により又は特定のＰＣＲバンドパターンにより特徴付けられ（ゲノムＤＮＡを使用した場合）、それにより、そのようなアッセイは、クローンＤＳＭ  ＡＣＣ２９９０（ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  ２．４１）中のＣＥＲＴトランスジーン／ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ発現カセットのゲノム組み込み部位について特異的である固有のフィンガープリントを生成する。細胞系ＤＳＭ  ＡＣＣ２９９０（ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  ２．４１）は、接合フラグメントにより固有に記載される／特徴付けられる。細胞系ＤＳＭ  ＡＣＣ２９９０（ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  ２．４１）は、挿入ＤＮＡ（＝ＣＥＲＴトランスジーン／ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ発現カセット）と隣接染色体ＤＮＡの間の接合フラグメントにより固有に記載され／特徴付けられ、それにより、細胞系のＤＮＡ（好ましくは、ゲノムＤＮＡ）が、１つ又は複数の制限酵素（例えばＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＫｐｎＩ、ＮｃｏＩ、ＮｄｅＩ、ＰｖｕＩＩ、ＳｐｅＩ、ＸｈｏＩ、ＡｖａＩＩ、ＢｓｔＸＩ、ＳａｌＩなど）を用いて消化され、前記の接合フラグメントが、例えば、サザンブロット解析あるいは１つ又は複数の適した、場合により標識されたＤＮＡフラグメントを使用したＰＣＲにより同定される。このＤＮＡフラグメントは、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９９０（ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  ２．４１）のゲノム中のＣＥＲＴトランスジーン／ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ発現カセットの固有の挿入部位を特徴付ける特定のバンドパターン又はフィンガープリントを呈する。
【００７１】
本発明は、さらに、ａ）請求項１〜７のいずれか一項記載の細胞を提供すること及びｂ）前記細胞の増殖を可能にする条件下で前記細胞を培養することを含む、細胞を培養するための方法に関する。前記方法の特定の実施態様において、細胞は、加えて、目的のタンパク質をコードする目的の遺伝子を含む少なくとも１つの（２つめの／追加の）ベクターコンストラクトを含む。好ましい実施態様において、前記方法は、加えて、目的のタンパク質を収集することを含む。別の好ましい実施態様において、前記方法は、さらに、目的のタンパク質を精製することを含む。
本発明は、さらに、タンパク質の製造のための発明の細胞（ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  ２．２０＝ＤＳＭ  ＡＣＣ２９８９又はＣＨＯ／ＣＥＲＴ  ２．４１＝ＤＳＭ  ＡＣＣ２９９０）の使用に関する。
さらに、本発明は、培地中に発明の細胞を含むリアクター／発酵容器に関する。
本発明は、また、発明の細胞、目的の遺伝子の発現のための発現ベクター、及び前記細胞の培養のための細胞培養液を含むキットに関する。本発明の特定の実施態様において、前記キットは発明の細胞を含み、それは、加えて、目的のタンパク質をコードする目的の遺伝子を含む少なくとも１つの（２つめの）ベクターコンストラクトを含み、それにより、前記細胞を培地中で培養し、それによってリアクター／発酵容器中での前記細胞の増殖を可能にする。
【００７２】
本発明は、さらに、ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ発現カセットを含む細胞に関し、それにおいて前記細胞は以下により特徴付けられる：
ｆ）ゲノムＤＮＡを鋳型として使用する場合での特定のＰＣＲバンドパターン／フィンガープリント、それにより、２３７３bpのＰＣＲ産物が、配列番号２及び配列番号３のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して生成される、又は、
ｇ）ゲノムＤＮＡを鋳型として使用する場合での特定のＰＣＲバンドパターン／フィンガープリント、それにより、６６０bpのＰＣＲ産物（配列番号６）が、配列番号４及び配列番号５のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して生成される、又は、
ｈ）（ａ）のＣＥＲＴ特異的な２３７３bpのＰＣＲ産物と以下の制限酵素とのインキュベーションに起因する特定数のフラグメント及びフラグメントサイズ：
【表５】
2012525826.tif 000007
【００７３】
特定の実施態様において、ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ発現カセットは配列番号１からなる。好ましくは、前記細胞はＣＨＯ細胞又はＮＳＯ細胞である。
好ましい実施態様において、前記細胞は、ＤＳＭＺ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH）にナンバーＤＳＭ  ＡＣＣ２９８９（ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  ２．２０）の下で寄託される。
さらなる好ましい実施態様において、前記細胞は、ＤＳＭＺにナンバーＤＳＭ  ＡＣＣ２９９０（ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  ２．４１）の下で寄託される。
【００７４】
実施例
材料及び方法
細胞培養
産生及び開発スケールで使用される全ての細胞系を、インキュベーター（Thermo, Germany）中の表面エアレーションＴフラスコ（Nunc, Denmark）又は振盪フラスコ（Nunc, Denmark）中の連続シードストック培養において、温度３７℃で及び５%  ＣＯ２を含む大気中で維持する。シードストック培養物を、２〜３日ごとに播種密度１−３Ｅ５個細胞/mLで継代培養する。細胞濃度を、全ての培養物中で、血球計を使用することにより決定する。生存率をトリパンブルー色素排除方法により評価する。
【００７５】
流加培養
細胞を、３ｘ１０５個細胞/mlで、１２５ml振盪フラスコ中に、３０mlのＢＩ専売産生培地（抗生物質又はＭＴＸ（Sigma-Aldrich, Germany）を伴わない）中に播種する。培養物を１２０rpmで３７℃及び５%  ＣＯ２（続く３日目に２%に低下させる）において撹拌する。ＢＩ専売フィード溶液を毎日加え、ｐＨを、必要に応じてＮａＣＯ３を使用してｐＨ  ７．０に調整する。細胞密度及び生存率を、トリパンブルー色素排除方法により、自動ＣＥＤＥＸ細胞定量化システム（Innovatis）を使用して決定する。
【００７６】
細胞内ＦＡＣＳ染色及びウエスタンブロッティングによるＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ発現の検出
細胞内染色のために、１×１０６個細胞を、ＰＢＳ中の１%パラホルムアルデヒド中で２０分間固定し、０．０５%  Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ中で透過処理する。その後に、細胞を１%  ＢＳＡ／ＰＢＳ中に再浮遊させ、抗Ｆｌａｇ  Ｍ２モノクローナルマウス抗体（Sigma）及びAlexa488標識ヤギ抗マウス抗体（Invitrogen）を使用して染色する。蛍光シグナルをフローサイトメトリー（FACScalibur, Coulter）により定量的に解析する。ウエスタンブロッティング用の全細胞抽出物を、ＮＰ４０緩衝液［１%（ｖ／ｖ）ＮＰ４０、５０mM  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ  ７．９、１５０mM  ＮａＣｌ、１mM  ＥＤＴＡ、５mM  ＥＧＴＡ、２５mM  ＮａＦ、及び４０μL/mL完全プロテアーゼ阻害剤溶液（Roche）］中での１５分間にわたる氷上での５×１０６個細胞の溶解により調整する。ライセートを、１６，０００ｘｇで１０分間にわたる遠心分離により取り除き、サンプル中のタンパク質濃度を、ＢＣＡ１アッセイキット（Sigma）を使用して決定する。ウエスタンブロット解析のために、等量のタンパク質を、ＭＯＰＳ緩衝液を用いて、ＮｕＰＡＧＥ  １０%  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Invitrogen）上で、製造者のプロトコールに従って分離する。タンパク質を、ＰＶＤＦメンブレン（Millipore）上に、トランスファー緩衝液を使用し、XCell IIブロットモジュール（Invitrogen）を使用してトランスファーする。１時間にわたる室温でのブロッキング薬剤（Invitrogen）を用いたブロッキング後、メンブレンを、抗Flag M2抗体（Sigma）を用いてプローブする。タンパク質を、ペルオキシダーゼ共役二次抗体を用いて、ECL Plus化学発光検出システム（Amersham Pharmacia）を使用して可視化する。
【００７７】
抗体産生細胞の生成
ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞ならびにconCERT（商標）細胞系を、ＩｇＧ１型抗体の重鎖及び軽鎖をコードする発現プラスミドを用いて安定的にトランスフェクションする。選択的条件下でのその後の培養により、安定的にトランスフェクションされたＩｇＧ産生細胞集団を、ＤＧ４４親細胞系及びconCERT（商標）細胞の両方から生成する。細胞プールを、さらに、２〜３日ごとの継代培養を伴う標準的なストック培養計画に従って培養する。
【００７８】
ＥＬＩＳＡによる組換え産物濃度の決定
ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞及びＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ突然変異体を発現するように操作されたconCERT（商標）細胞系に由来するＩｇＧ産生細胞における組換え抗体産生を評価するために、細胞上清からのサンプルを、標準的な接種培養から、３回連続の継代について各継代の終わりに回収する。産物濃度を、次に、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）により分析する。分泌されたモノクローナル抗体産物の濃度を、ヒトＦｃフラグメント（Jackson Immuno Research Laboratories）及びヒトカッパ軽鎖（Sigma）に対するＨＲＰコンジュゲーションされた抗体を使用して測定する。
【００７９】
単一細胞選別
「FACS Vantage」（Becton Dickinson）フローサイトメーター（パルスプロセシング、ソート増強モジュール、及び自動細胞沈着ユニットを備える）を、分析及び細胞選別のために使用する。前方及び側方散乱（ＦＳＣ／ＳＳＣ）のドットプロット上で、ゲートを単一の生細胞の周辺に設定する。選別された細胞を、２００μL増殖培地を含む９６ウェルマイクロタイタープレート中に、１ウェル当たり１個の細胞で、自動細胞沈着ユニットを用いて沈着させる。
【００８０】
核酸単離及びＲＴ−ＰＣＲ
増殖中の細胞からのゲノムＤＮＡ及び全ＲＮＡを、TRIzol（登録商標）（Invitrogen, Germany）を使用し、製造者の指示に従って単離する。ＲＮＡを、次に、ＤＮａｓｅ  Ｉを用いて３０分間にわたり３７℃で処理する。第１鎖ｃＤＮＡ合成を、Cloned AMV First-Strand cDNA Synthesis Kit（Invitrogen, Germany）を使用して行う。３μgの全ＲＮＡ及びオリゴ（ｄＴ）オリゴヌクレオチドを用いて開始する。ヒトＣＥＲＴ転写物の定量的レベルを、Absolute（商標）QPCR SYBR（登録商標）Green Fluorescein Mix（ABgene, Surrey, UK）及びMyIQ Real Time Detectionソフトウェア（BioRad, Germany）により制御されるサーマルサイクラーを使用したリアルタイムＰＣＲにより決定する。
【００８１】
conCERT（商標）細胞の同定のための固有の増幅物を、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用したゲノムＤＮＡ上でのＰＣＲにより検出する：
ＣＭＶセンス：
【化１】
2012525826.tif 000008
及び
ターミネーターアンチセンス：
【化２】
2012525826.tif 000009
ＤＮＡ又はｍＲＮＡのいずれかを鋳型として使用し、ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ発現を、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲにより検出する：
【化３】
2012525826.tif 000010
及び
【化４】
2012525826.tif 000011
（６６０bpのＰＣＲ産物（配列番号６）をもたらす）。
【００８２】
実施例：ＣＨＯＰＰＥＲ（登録商標）細胞の生成＆特徴付け
実施例１：ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ細胞系の特徴付け及び固有の同定
ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ細胞系（本明細書において「conCERT（商標）」細胞系とも呼ぶ）は、一般的に、ヒトＣＥＲＴ突然変異体Ｓ１３２Ａの異種発現を伴う細胞として記載することができる。
【００８３】
本発明において記載されるＣＨＯ／ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ細胞系は、図１Ａに描写される以下を含むＣＥＲＴ発現カセットを含む：ＣＭＶエンハンサー／プロモーターに由来する上流調節配列（０．６kb）、セリン１３２をアラニンに変化させる突然変異を伴うヒトＣＥＲＴ遺伝子（ＧｅｎｅＩＤ  １００８７）のコード領域（配列番号１）に先行するFlag（商標）エピトープタグ；ＴＧＡ停止コドン及びポリアデニル化シグナルを含む０．５kbの３’非翻訳領域。
【００８４】
本発明において記載されるＣＨＯ／ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ細胞系の生成のために使用されるベクターコンストラクトを図１Ｂに示し、以下の機能的エレメントを含む：
・サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー／プロモーター
・Flag（商標）タグ付きＣＥＲＴ−ＳＡをコードする発現カセット
・ウシ成長ホルモンからのポリアデニル化シグナル（ｂＧＨ  ｐＡ）
・ピューロマイシン耐性のための発現カセット
・複製起点
・細菌中でのアンピシリン耐性のためのベータ−ラクタマーゼ発現カセット
【００８５】
ＤＳＭＺにナンバーＤＳＭ  ＡＣＣ２９８９（ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  ２．２０）及びＤＳＭ  ＡＣＣ２９９０（ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  ２．４１）の下で寄託されている２つのＣＨＯ／ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ細胞系は、それらのゲノム中に安定的に組み込まれたＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ発現コンストラクトを含む。
【００８６】
このコンストラクトを含むＣＨＯ／ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ細胞系、例えばＤＳＭＺにナンバーＤＳＭ  ＡＣＣ２９８９（ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  ２．２０）の下で寄託されている細胞系及びＤＳＭＺにナンバーＤＳＭ  ＡＣＣ２９９０（ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  ２．４１）の下で寄託されている細胞系などは、ゲノムＤＮＡでのＰＣＲにより同定することができる。特定組のオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号２及び３）は、このＰＣＲ反応において２３７３ｂｐサイズの異なるシグナルを産生し、それによって、上に記載するＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ発現コンストラクトを用いてトランスフェクションされなかった細胞からＣＨＯ／ＣＥＲＴ細胞を検出し、このように同定することができる。プライマーの結合位置及び方向を図１Ｂに描写する（矢印）。
【００８７】
ＣＭＶセンス：
【化５】
2012525826.tif 000012
ターミネーターアンチセンス：
【化６】
2012525826.tif 000013
【００８８】
２３７３  ＰＣＲフラグメントを、制限酵素を用いて消化する場合、制限フラグメントのパターンがもたらされる（表１にまとめる通り）。
【００８９】
【表６】
2012525826.tif 000014
【００９０】
ＤＮＡ又はｍＲＮＡのいずれかを鋳型として使用し、conCERT細胞系中でのＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ発現を、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用したＰＣＲにより検出することもできる：ＣＥＲＴ−ｆｏｒ：
【化７】
2012525826.tif 000015
及びＣＥＲＴ−ｒｅｖ：
【化８】
2012525826.tif 000016
（以下の配列（配列番号６）を伴う６６０bpのＰＣＲ産物をもたらす）：
【化９】
2012525826.tif 000017
【００９１】
本発明において記載されるＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ細胞系ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ  ２．２０及び２．４１は、さらに、Flag（商標）エピトープタグ（例、抗Flag M2モノクローナルマウス抗体（Sigma））又はヒトＣＥＲＴタンパク質（例、ＣＥＲＴ／ＧＰＢＰ抗体、クローンBL2222, Bethyl Laboratories, Inc.）のいずれかに対して産生された抗体を使用したウエスタンブロットによるＦｌａｇ−ＣＥＲＴ−Ｓ１３２Ａ融合タンパク質の異種発現により同定することができる。両方の抗体が、ハムスターＣＥＲＴタンパク質と交差反応するわけではない。従って、ＣＥＲＴ特異的シグナルがＣＨＯ／ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ細胞中だけで検出されうるのに対し、このシグナルは、ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ発現コンストラクトを含まないＣＨＯ細胞系中には存在しない。ＣＥＲＴ発現カセットを保有するベクターコンストラクトは、ピューロマイシン耐性遺伝子も含む。ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ細胞は、従って、培養液中の５〜１０μg/mlピューロマイシンの存在において増殖することができる。
【００９２】
本発明において記載されるＣＨＯ／ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ細胞系は、ＤＳＭＺにナンバーＤＳＭ  ＡＣＣ２９８９（ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  ２．２０）及びＤＳＭ  ＡＣＣ２９９０（ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  ２．４１）の下で寄託されており、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞系の派生物である。故に、それらは、増殖及び生存のために培養培地中に添加剤ヒポキサンチン及びチミジン（ＨＴ添加）を等しく必要とする。
【００９３】
実施例２：安定的にトランスフェクションされたＣＨＯ／ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ細胞プールの生成
本発明において記載されるＣＨＯ／ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ細胞系を生成するために、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞［Urlaub et al., Cell 33, 1983］を、Ｎ末端Flag（商標）エピトープタグに融合されたヒトＣＥＲＴタンパク質の突然変異体バリアント（ＣＥＲＴ  Ｓｅｒ１３２→Ａｌａ、本明細書において「ＣＥＲＴ−Ｓ１３２Ａ」とも呼ばれる）についての発現カセットを保有する発現コンストラクトを用いてトランスフェクションする（図１）。
【００９４】
タンパク質コード領域は以下の配列を有する（配列番号１；配列が５’−３’方向で与えられる；開始コドン及び停止コドンに下線を引き、ボールド文字である。Flag（商標）タグコード領域に下線を引き、ＣＥＲＴコード領域をイタリックで表す；Ｓｅｒ１３２→Ａｌａに変化させる突然変異コドンを下線及びボールド文字によりマークする）：
【００９５】
【化１０】
2012525826.tif 000018
2012525826.tif 000019
【００９６】
安定的にトランスフェクションされた細胞プールを、抗生物質ピューロマイシンの存在における選択により生成する。結果として得られる安定な細胞プール中でのＣＥＲＴ−Ｓ１３２Ａトランスジーンの発現を、Flag（商標）タグ又はＣＥＲＴ−Ｓ１３２Ａタンパク質自体のいずれかに対して産生された抗体を使用したウエスタンブロットにより確認する。
【００９７】
細胞の産生性はＣＥＲＴレベルと相関するため、最も高いＣＥＲＴ−Ｓ１３２Ａ発現レベルを伴う細胞プールを、その後の単一細胞クローニングのために選択する。
【００９８】
実施例３：モノクローナルＣＨＯ／ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ細胞系の生成及びスクリーニング
ＣＥＲＴ−Ｓ１３２Ａを過剰発現する安定的にトランスフェクションされた細胞プールを、ＦＡＣＳベースの単一細胞クローニングに供し、モノクローナルconCERT（商標）細胞系を生成する。ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａクローンを、次に、２つのパラメータに関して広範にスクリーニングする：ａ）高レベルのＣＥＲＴ−Ｓ１３２Ａ発現、ｂ）接種培養及び流加プロセスの両方における最適な細胞増殖特性。第１回の選択中に、ＣＥＲＴ−Ｓ１３２Ａ発現を、＞１００のＣＨＯ／ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａクローンにおいて、細胞内染色により評価する。これらから、最も高いレベルの細胞内ＣＥＲＴ−Ｓ１３２Ａを伴う１５のクローンを、増殖及びさらなる解析のために選択する。１５の選択されたＣＨＯ／ＣＥＲＴ  Ｓ１３２ＡクローンにおけるＣＥＲＴ−Ｓ１３２Ａ発現を、さらに、抗Flag（商標）抗体を使用したウエスタンブロットにより評価する（図３）。ＣＥＲＴ−ＳＡ突然変異体の過剰発現は、クローン１．１５、２．２０、２．３１、２．４１、２．６５、２．６７、３．１１、及び３．３１において最も高い。工業的な産生宿主細胞系について、シードストック培養ならびに無血清の化学的に定義された培地中での流加プロセスの両方における良好な増殖特徴が、非常に重要である。従って、ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａクローンを、標準的な工業的接種計画に従って培養し、倍加時間及び生存率を評価した。図４は、増殖速度（Ａ）及びいくつかの培養継代にわたるその生存率（Ｂ）に従った１５のＣＨＯ／ＣＥＲＴクローンのランキングを示す。２つの細胞系ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ  ２．２０（ＤＳＭＺにナンバーＤＳＭ  ＡＣＣ２９８９の下で寄託されている）及びＣＨＯ／ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ  ２．４１（ＤＳＭＺにナンバーＤＳＭ  ＡＣＣ２９９０の下で寄託されている）は、最も高い倍加時間を伴う４つのクローンの内にあり、生存率８０〜１００%を示す（図５Ａ）。次に、ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ細胞クローンの増殖を、振盪フラスコ中での流加発酵（生物医薬品産生プロセスについての小規模モデルを表す）において検討する。図５Ａに示す通り、全てのＣＨＯ／ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａクローンが、増加する細胞濃度により特徴付けられる初期増殖期を伴う通常の増殖プロファイルを示し、それは、次に、プラトーに達し、その後に発酵の終わりに向かって減少する。しかし、ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａクローンの性能は、初期段階における増殖スピードならびに最高細胞密度に関して変動する。これは、産生プロセスにわたる生細胞の全積分（ＩＶＣ）における差に言い換えられる（図５Ｂ）。全ての解析されたＣＨＯ／ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ細胞系から、クローン１．１３、２．２０、及び２．４１が、最も高いＩＶＣを示し、それは、親ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞系と比較してさらにより高い（図５Ｂ）。しかし、クローン１．１３は低いＣＥＲＴ−Ｓ１３２Ａ発現だけを示し、従って、除外される。従って、本発明において記載される２つの細胞系ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  ２．２０（ＤＳＭＺにナンバーＤＳＭ  ＡＣＣ２９８９の下で寄託されている）及びＣＨＯ／ＣＥＲＴ  ２．４１（ＤＳＭＺにナンバーＤＳＭ  ＡＣＣ２９９０の下で寄託されている）が、高レベルのＣＥＲＴ−ＳＡ発現ならびに優れた増殖特性を伴う細胞として選択される。両方の細胞系が、組換えタンパク質の産生のための最適化された宿主細胞系として理想的な候補である。
【００９９】
実施例４：ＧＳシステムを使用した組換えタンパク質産生のための宿主細胞としてのＣＨＯ／ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ細胞
ＤＳＭＺにナンバーＤＳＭ  ＡＣＣ２９８９（ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  ２．２０）及びＤＳＭ  ＡＣＣ２９９０（ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  ２．４１）の下で寄託されている細胞は、組換えタンパク質産生のための理想的な宿主細胞である。なぜなら、それらは、改善された分泌能力ならびに良好な増殖特徴を有するからである。親ＤＧ４４細胞系として、それらはｄｈｆｒ欠損であり、そのため生物医薬品工業における組換えタンパク質のための最も広く使用される発現システム、即ち、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）に適合する。それらは、さらに、グルタミンシンセターゼ（ＧＳ）選択／増幅システムならびに他の一般的に使用される選択戦略（例えばネオマイシン、ブレオマイシン、ハイグロマイシン、及びゼオジン（ｚｅｏｚｉｎｅ）など）に適合する。
【０１００】
実施例５：組換えＩｇＧ１抗体産生のための宿主細胞としてのＣＨＯ／ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ細胞
それらの優れた特性を実証するために、本発明において記載されるconCERT（商標）細胞ならびに親ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞系を、ヒトモノクローナルＩｇＧ１型抗体をコードする発現コンストラクトを用いてトランスフェクションする。安定的なＩｇＧ産生細胞集団を、ＨＴ添加を伴わない無血清の化学的に定義された培地中での抗生物質Ｇ４１８の存在における選択により生成する。その後、それらを、標準的な工業的細胞系開発プログラムの部分として、メトトレキサート（ＭＴＸ）を使用した遺伝子増幅に供した。結果として得られる安定的な細胞プールを、次に、振盪フラスコ中の流加発酵プロセスに供する。１０日後、培養物を収集し、上清中のＩｇＧ濃度をＥＬＩＳＡにより決定する。図６に示す通り、親ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞に由来する１０の最も高い産生プールでの収集力価の中央値は、conCERT（商標）細胞系に由来する産生細胞と比較して顕著に低い。さらに、ＤＧ４４抗体産生細胞の２５〜７５%幅が４００mg/L未満であるのに対し、それは、  ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ  ＩｇＧ産生細胞において＞４００から１g/L近辺までの範囲である。このように、ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ細胞からの産生細胞プールを用いて得られた収集力価は、親細胞系に由来する産生細胞プールと比較して約２倍高い。
これらのデータは、ＤＳＭＺにナンバーＤＳＭ  ＡＣＣ２９８９（ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  ２．２０）及びＤＳＭ  ＡＣＣ２９９０（ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  ２．４１）の下で寄託されているＣＨＯ／ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ細胞が、親ＤＧ４４細胞系と比較して、組換えタンパク質産生のための優れた宿主細胞であることを実証する。
【０１０１】
実施例６：ＩｇＧ４抗体の組換え産生のための宿主細胞としてのＣＨＯ／ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ細胞
それらの優れた特性を実証するために、本発明において記載されるconCERT（商標）細胞ならびに親ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞系を、ヒトモノクローナルＩｇＧ４型抗体をコードする発現コンストラクトを用いてトランスフェクションする。安定的なＩｇＧ産生細胞集団を、ＨＴ添加を伴わない無血清の化学的に定義された培地中での抗生物質Ｇ４１８の存在における選択により生成する。その後、それらを、標準的な工業的細胞系開発プログラムの部分として、メトトレキサート（ＭＴＸ）を使用した遺伝子増幅に供した。結果として得られる安定的な細胞プールを、次に、振盪フラスコ中の流加発酵プロセスに供する。１０日後、培養物を収集し、上清中のＩｇＧ濃度をＥＬＩＳＡにより決定する。
親ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞に由来する１０の最も高い産生プールでの収集力価の中央値は、conCERT（商標）細胞系に由来する産生細胞と比較して顕著に低い。さらに、ＤＧ４４抗体産生細胞の２５〜７５%幅が４００mg/L未満であるのに対し、それは、  ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ  ＩｇＧ産生細胞において＞４００から１g/L近辺までの範囲である。このように、ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ細胞からの産生細胞プールを用いて得られた収集力価は、親細胞系に由来する産生細胞プールと比較して約２倍高い。
【０１０２】
生物医薬品製造では、ｃＧＭＰ産生における使用のためのモノクローナル細胞系の生成が必要とされる。従って、次の工程において、細胞クローンを、最も高く発現する遺伝的に異種の細胞プールから生成する。各遺伝子型の１０の最も高く発現する組換えクローンの性能を、その後に、接種培養中でならびに流加プロセス中で、上に記載する通りに分析する。また、モノクローナル細胞系のレベルで、conCERT（商標）細胞系から生じるＩｇＧ４産生クローンは、有意に高い特異的な産生性を示す（図７Ａ−ＤＧ４４細胞（Ｃｌａｓｓｉｃ）に由来する１０の上位クローンと比較した、ＩｇＧ４型抗体について組換えであるＣＨＯ／ＣＥＲＴ  ２．２０及び２．４１（conCERT（商標））からの１０の最も高く発現するモノクローナル細胞系）。さらに、これは、流加プロセス中でconCERT（商標）細胞を用いて達成されるより高い全ＩｇＧ４力価と言い換えられる（図７Ｂ）。
例は、ＤＳＭＺにナンバーＤＳＭ  ＡＣＣ２９８９（ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  ２．２０）及びＤＳＭ  ＡＣＣ２９９０（ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  ２．４１）の下で寄託されているＣＨＯ／ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａ細胞が、親ＤＧ４４細胞系と比較して、組換えタンパク質産生のための優れた宿主細胞であることを示す。
【０１０３】
実施例７：conCERT（商標）細胞系からのＦＣ融合タンパク質の増加した生物医薬品タンパク質産生
ＤＳＭＺにナンバーＤＳＭ  ＡＣＣ２９８９（ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  ２．２０）及びＤＳＭ  ＡＣＣ２９９０（ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  ２．４１）の下で寄託されているconCERT（商標）細胞及びＣＨＯ  ＤＧ  ４４細胞を、Ｆｃ融合タンパク質（ＩｇＧ抗体のＦｃ部分に共有結合的に連結された治療的に活性である（ポリ）ペプチドを意味する）をコードするベクターを目的の遺伝子として用いてトランスフェクションする。選択後、上清を、４回のその後の継代の期間にわたる全ての安定細胞プールのシードストック培養から取り、産物力価をＥＬＩＳＡにより決定し、細胞の平均数により割り、特異的な産生性を算出する。比較において、産物力価は、Ｆｃ融合タンパク質を発現するＤＧ４４由来細胞と比較して、conCERT（商標）宿主細胞から生成された産生細胞において顕著に高い。
また、流加培養において、conCERT（商標）由来細胞は、融合タンパク質の有意に増加した産生性ならびに収集時でのより高い力価を有する。
これは、細胞系開発におけるconCERT（商標）宿主細胞の使用によって、連続培養中での又はバイオリアクターバッチ培養もしくは流加培養中での増強された特異的な産生能力ならびにより高い力価を伴う産生細胞系の生成が可能になることを実証する。
【０１０４】
実施例８：conCERT（商標）細胞系は、単鎖ＦＶ（ｓｃＦｖ）分子及びドメイン抗体の生物医薬品産生のための優れた宿主細胞を表す。
ＤＳＭＺにナンバーＤＳＭ  ＡＣＣ２９８９（ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  ２．２０）及びＤＳＭ  ＡＣＣ２９９０（ＣＨＯ／ＣＥＲＴ  ２．４１）の下で寄託されているconCERT（商標）細胞及びＣＨＯ  ＤＧ  ４４細胞を、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）又はドメイン抗体（ラマ又はラクダ科からの他の動物に由来する単鎖抗体の可変領域の１つ又は複数のドメインを含む）をコードするベクターを目的の遺伝子として用いてトランスフェクションする。選択後、上清を、４回のその後の継代の期間にわたる全ての安定細胞プールのシードストック培養から取り、産物力価をＥＬＩＳＡにより決定し、細胞の平均数により割り、特異的な産生性を算出する。比較において、産物力価は、ｓｃＦｖタンパク質又はドメイン抗体を発現するＤＧ４４由来細胞と比較して、conCERT（商標）宿主細胞から生成された産生細胞において顕著に高い。
また、流加培養において、conCERT（商標）由来細胞は、融合タンパク質の有意に増加した産生性ならびに収集時でのより高い力価を有する。
これは、細胞系開発におけるconCERT（商標）宿主細胞の使用によって、連続培養中での又はバイオリアクターバッチ培養もしくは流加培養中での増強された特異的な産生能力ならびにより高い力価を伴う産生細胞系の生成が可能になることを実証する。
【０１０５】
配列表
配列番号１  Ｆｌａｇ−ＣＥＲＴ−ＳＡコード領域（プライマーＣＭＶセンス（配列番号２）及びターミネーターアンチセンス（配列番号３）を使用して生成される２３７３ｂｐフラグメント）
配列番号２  プライマーＣＭＶセンス
配列番号３  プライマーターミネーターアンチセンス
配列番号４  プライマーＣＥＲＴ−ｆｏｒ
配列番号５  プライマーＣＥＲＴ−ｒｅｖ
配列番号６  ＣＥＲＴ−ｆｏｒ（配列番号４）及びＣＥＲＴ−ｒｅｖ（配列番号５）を用いて得られる６６０bpのＰＣＲ産物
【０１０６】
【表７】
2012525826.tif 000020
【図１（Ａ）】
2012525826.tif 000022
【図１（Ｂ）】
2012525826.tif 000023
【図３】
2012525826.tif 000024
【図２】
2012525826.tif 000025
【図４】
2012525826.tif 000026
【図５Ａ】
2012525826.tif 000027
【図５Ｂ】
2012525826.tif 000028
【図６】
2012525826.tif 000029
【図７Ａ】
2012525826.tif 000030
【図７Ｂ】
2012525826.tif 000031
【配列表】
2012525826000001.app
【国際調査報告】
2012525826.tif 000032
2012525826.tif 000033
2012525826.tif 000034