(57)【要約】  本発明は、癌患者から単離した体液試料中において同定された反復因子（好ましくはＬＩＮＥ１）又はマルチコピー遺伝子（好ましくはＵ１ ＲＮＡ）のＤＮＡ断片化パターンの分析に基づいた、癌診断のための及び癌処置をモニタリンするための方法に関する。
2012521772.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）癌を有することが疑われる患者から単離した体液試料中の、８０〜５００ｂｐの４〜６つの断片によって示される反復因子又はマルチコピー遺伝子のＤＮＡ断片化パターンを決定する工程、
（ｂ）（ａ）において決定したＤＮＡ断片化パターンを、癌を患っていない患者から単離したリファレンス試料のＤＮＡ断片化パターンと比較する工程、
（ｃ）リファレンス試料と比較して、診断された患者から単離した試料中において異なって発現されている前記ＤＮＡ断片のレベルを決定する工程、
ここで、前記ＤＮＡ断片のレベルが、リファレンス試料のレベルと実質的に異なっている場合、診断された患者は、癌に患っている可能性があることを示す、
を含む、癌の診断法。
【請求項２】
前記ＤＮＡ断片化パターンが５つの断片によって示される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
第１断片が８０〜１６０ｂｐの範囲であり、第２断片が２００〜２２０ｂｐの範囲であり、第３断片が２４０〜２６０ｂｐの範囲であり、第４断片が３００〜３８０ｂｐの範囲であり、そして第５断片が４００〜５００ｂｐの範囲である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記反復因子がＬＩＮＥ１、ＳＩＮＥ１又はＬＴＲであり、そしてマルチコピー遺伝子がＵ１ＲＮＡである、請求項１〜３のいずれか記載の方法。
【請求項５】
前記反復因子がＬＩＮＥ１である、請求項１〜４のいずれか記載の方法。
【請求項６】
前記体液が血液、血清、血漿、尿、骨髄、腹水又は脳脊髄液である、請求項１〜５のいずれか記載の方法。
【請求項７】
前記体液が血清又は血漿である、請求項１〜６のいずれか記載の方法。
【請求項８】
癌が肝臓癌、乳癌、大腸癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌又は胃癌である、請求項１〜７のいずれか記載の方法。
【請求項９】
肝臓癌が原発性及び続発性の肝臓癌である、請求項１〜８のいずれか記載の方法。
【請求項１０】
原発性肝臓癌が肝細胞癌である、請求項１〜９のいずれか記載の方法。
【請求項１１】
（ａ）処置終了時にモニタリングした患者から単離した体液試料中の、８０〜５００ｂｐの４〜６つの断片によって示される反復因子又はマルチコピー遺伝子のＤＮＡ断片化パターンを決定する工程、
（ｂ）（ａ）において決定したＤＮＡ断片化パターンを、処置前の同じ個体から単離した対照試料のＤＮＡ断片化パターンと比較する工程、
（ｃ）対照試料と比較して、モニタリングし処置した患者から単離した試料中において異なって発現されている前記ＤＮＡ断片のレベルを決定する工程、
ここで、前記ＤＮＡ断片のレベルが、対照試料のＤＮＡ断片のレベルと実質的に異なっている場合、癌は、モニタリングした患者において、同じ患者から単離した対照試料においてよりもより進行した段階又はより進行していない段階である可能性があることを示すか、あるいはモニタリングした患者は癌処置に対してより応答性が低いか又はより応答性が高い可能性があることを示す、
を含む、癌に患いそして癌処置中である患者において疾病の進行又は後退をモニタリングする方法。
【請求項１２】
ＤＮＡ断片化パターンが５つの断片によって示される、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
第１断片が８０〜１６０ｂｐの範囲であり、第２断片が２００〜２２０ｂｐの範囲であり、第３断片が２４０〜２６０ｂｐの範囲であり、第４断片が３００〜３８０ｂｐの範囲であり、そして第５断片が４００〜５００ｂｐの範囲である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記反復因子がＬＩＮＥ１、ＳＩＮＥ１又はＬＴＲであり、そしてマルチコピー遺伝子がＵ１ ＲＮＡである、請求項１１〜１３のいずれか記載の方法。
【請求項１５】
前記反復因子がＬＩＮＥ１である、請求項１１〜１４のいずれか記載の方法。
【請求項１６】
前記体液が血液、血清、血漿、尿、骨髄、腹水又は脳脊髄液である、請求項１１〜１５のいずれか記載の方法。
【請求項１７】
前記体液が血清又は血漿である、請求項１１〜１６のいずれか記載の方法。
【請求項１８】
癌が肝臓癌、乳癌、大腸癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌又は胃癌である、請求項１１〜１７のいずれか記載の方法。
【請求項１９】
肝臓癌が原発性及び続発性の肝臓癌である、請求項１１〜１８のいずれか記載の方法。
【請求項２０】
原発性肝臓癌が肝細胞癌である、請求項１１〜１９のいずれか記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、体液試料中に同定された循環ＤＮＡの分析に、特に、反復因子又はマルチコピー遺伝子の特異的なＤＮＡ断片化パターンの分析に基づいた、癌診断のための及び癌処置のモニタリングのための方法に関する。
【０００２】
背景技術
低濃度（０．２〜２００ng/ml）で血清、血漿及び他の体液（すなわち尿、腹水など）中に存在する無細胞ゲノムＤＮＡ（いわゆる循環ＤＮＡと呼ばれる）は高度に分解されている（Wang, et al., 2003, Cancer Res., 63 (14): 3966-8）。腫瘍患者に由来する循環ＤＮＡにおけるマイクロサテライト不安定性及び腫瘍特異的突然変異（例えばｐ５３、Ｋ−ｒａｓ、ＥＧＦＲ）が成功裏に検出された時に（Sidransky, D. et al., 1991; Science, 252 (5006): 706-9; Kimura, H., et al., 2007, Br. J. Cancer, 97 (6): 778-84）、腫瘍組織を起源とするゲノムＤＮＡ（循環腫瘍ＤＮＡ）が、癌患者における循環ＤＮＡの一成分であることが明らかとなった（Sozzi, G. et al., 2001; Cancer Res., 61 (12): 4675-8; Diehl, F. et al., 2008; Nat. Med. 14 (9): 985-90, Epub 2007, July 31）。腫瘍患者における循環ＤＮＡレベルが、いくつかの生物学的過程、すなわち腫瘍サイズ（Sunami, E. et al., 2008, Ann. N Y Acad Sci. 1137: 171-4）並びに医学的介入（Chan, K.C.A. et al., 2008, Clin. Cancer Res., 14 (13): 4141-5）に関連することが判明した。これに沿って、ＷＯ２００６／１２８１９２においては、癌の診断、予後及び処置のための遊離循環ＤＮＡの使用が特許請求されている。
【０００３】
近年、循環ＤＮＡの検出及び定量は、反復因子の分析によって改善された。反復配列はヒトゲノムの少なくとも５０％を占める。そうしたヒト反復配列の約９０％が転位因子に属する。長鎖散在反復配列（ＬＩＮＥｓ）は、そうしたトランスポゾン由来反復配列のスーパーファミリーの１つであり、そしてヒトゲノムの２０％を占める。３つのＬＩＮＥファミリー、すなわちＬＩＮＥ１、ＬＩＮＥ２及びＬＩＮＥ３がヒトゲノムにおいて見出されている。そうしたファミリーの中でＬＩＮＥ１（Ｌ１）だけが転位することができ、そして最も豊富である（ヒトＤＮＡの約１７％を占める）。完全長Ｌ１のサイズは約６．１ｋｂである。５００，０００個を超える配列が全ヒトゲノム中に存在する（Cordaux, R., 2008, Proc Natl Sci USA, 105 (49): 19033-4, Epub 2008, Dec 4）。癌の進行及び処置の診断、予測及びモニタリングにおけるメチル化又は非メチル化Ｌ１の使用がＷＯ２００８／１３４５９６に開示された。
【０００４】
しかしながら、特異性の欠如のために、循環ＤＮＡレベルは、癌診断のための有用な臨床マーカーではない。なぜなら、あまりにも多くの交絡する生物学的及び生理学的過程が、循環ＤＮＡレベルに影響を及ぼし、従って、癌診断におけるその臨床適用を妨害するようであるからである。循環ＤＮＡ試料中の循環腫瘍ＤＮＡの特異的検出を可能とする新たな方法が必要とされる。近年、Ellinger, J., et al.は、Journal of Urology, 2009, Jan, 181(1):363-71, Epub 2008, Nov 17において、１０６ｂｐ、１９３ｂｐ及び３８４ｂｐのアクチンβＤＮＡ断片を検出することによって、精巣癌患者における無細胞ＤＮＡの上昇したレベルを開示した。
【０００５】
本発明は、癌の早期診断、このような癌の再発の診断、及び対応する処置のモニタリングのための方法の感度及び特異性の有意な改善を提供する。
【０００６】
発明の要約
本発明は、
（ａ）癌を有することが疑われる患者から単離した体液試料中の、８０〜５００ｂｐの４〜６つの断片によって示される反復因子又はマルチコピー遺伝子のＤＮＡ断片化パターンを決定する工程、
（ｂ）（ａ）において決定したＤＮＡ断片化パターンを、リファレンス試料のＤＮＡ断片化パターンと比較する工程、
（ｃ）リファレンス試料と比較して、診断された患者から単離した試料中において異なって発現されている前記ＤＮＡ断片のレベルを決定する工程、
ここで、前記ＤＮＡ断片のレベルが、リファレンス試料のレベルと実質的に異なっている場合、診断された患者は、癌に患っている可能性があることを示す、
を含む、癌の診断法に関する。
【０００７】
さらに、本発明は、
（ａ）処置終了時にモニタリングした患者から単離した体液試料中の、８０〜５００ｂｐの４〜６つの断片によって示される反復因子又はマルチコピー遺伝子のＤＮＡ断片化パターンを決定する工程、
（ｂ）（ａ）において決定したＤＮＡ断片化パターンを、処置前の同じ個体から単離した対照試料のＤＮＡ断片化パターンと比較する工程、
（ｃ）対照試料と比較して、モニタリングし処置した患者から単離した試料中において異なって発現されている前記ＤＮＡ断片のレベルを決定する工程、
ここで、前記ＤＮＡ断片のレベルが、対照試料のＤＮＡ断片のレベルと実質的に異なっている場合、癌は、モニタリングした患者において、同じ患者から単離した対照試料においてよりもより進行した段階又はより進行していない段階である可能性があることを示すか、あるいはモニタリングした患者は癌処置に対してより応答性が低いか又はより応答性が高い可能性があることを示す、
を含む、癌に患いそして癌処置中である患者において疾病の進行又は後退をモニタリングする方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ】血清に由来するＤＮＡからの、アフタケア乳癌患者（ｎ＝１７、白丸、点線）及び疾病を有さない／健康な対照（ｎ＝１０、黒丸）の平均ＤＮＡ断片化パターンの決定。アフタケア患者の血清を、２回目の介入の前に採取し、ＤＮＡを単離しそしてプールする。全てのアフタケア乳癌患者は、血液サンプリングの数カ月後に脳又は肝臓に転移を発症するか、あるいは転移したことが疑われる。健康対照のＤＮＡを単離するがプールはしない。両方の群におけるＤＮＡ断片化を、実施例２に記載のようにＬＩＮＥ１特異的リアルタイムＰＣＲによって分析する。患者のＤＮＡ断片化パターンは、疾病を有さない／健康な対照群とは有意に異なる。約１５０〜約４００ｂｐのアンプリコン範囲では、ＤＮＡの相対量は、疾病を有さない／健康な対照と比較して有意に増加し、そしてこれは再発の診断のために使用すべきである。それ故、その範囲の５つ以上のＤＮＡ−アンプリコンを測定し、そしてこれをＤＮＡ断片化指数（ＤＦＩ）の計算のために使用することができる。Ｘ軸：ＤＮＡアンプリコンの長さ（ｂｐ）、Ｙ軸：正規化したＤＮＡアンプリコンのレベル。
【図１Ｂ】アフタケア大腸癌患者（ｎ＝２８、白丸、点線）及び健康対照（ｎ＝１０、黒丸）の平均ＤＮＡ断片化パターンの決定。アフタケア患者の血清を２回目の介入の前に採取する。全てのアフタケア大腸癌患者が、血液サンプリングの数カ月後に肝臓に転移を発症する。両方の群のＤＮＡを単離し、そして実施例４に記載のようにＬＩＮＥ１特異的リアルタイムＰＣＲによって分析する。患者のＤＮＡ断片化パターンは、疾病を有さない／健康な対照群とは有意に異なる。約１５０〜約４６０ｂｐのアンプリコン範囲では、ＤＮＡの相対量は、疾病を有さない／健康な対照と比較して増加し、そしてこれを再発を診断するために使用すべきである。それ故、その範囲の５つ以上のＤＮＡ−アンプリコンを測定し、そしてこれをＤＮＡ断片化指数（ＤＦＩ）の計算のために使用することができる。Ｘ軸：ＤＮＡアンプリコンの長さ（ｂｐ）、Ｙ軸：正規化したＤＮＡアンプリコンのレベル。
【図１Ｃ】肝臓の切除術を受けた肝転移を伴う大腸癌患者（ｎ＝３３、白丸、点線）及び健康対照（ｎ＝１０、黒丸）の平均ＤＮＡ断片化パターンの決定。癌患者の血清を肝臓切除日に採取する。両方の群のＤＮＡを単離し、そして実施例４に記載のようにＬＩＮＥ１特異的リアルタイムＰＣＲによって分析する。患者のＤＮＡ断片化パターンは、疾病を有さない／健康な対照群とは有意に異なる。約１５０〜約７８０ｂｐのアンプリコン範囲では、ＤＮＡの相対量は、特に約２５０ｂｐ及び６００ｂｐ以上において疾病を有さない／健康な対照と比較して増加している。それ故、１５０〜７８０ｂｐの範囲の５つ以上のＤＮＡ−アンプリコンを測定し、そしてこれをＤＮＡ断片化指数（ＤＦＩ）の計算のために使用することができる。しかしながら、１５０〜４６０ｂｐの範囲で十分であり、より広い範囲と同じ感度／特異性が得られる。Ｘ軸：ＤＮＡアンプリコンの長さ（ｂｐ）、Ｙ軸：正規化したＤＮＡアンプリコンのレベル。
【図２】新規肝細胞癌患者（ｎ＝１７、白丸、点線）及び肝硬変を患う対照患者（ｎ＝１２、黒丸）の平均ＤＮＡ断片化パターンの決定。両方の群のＤＮＡを単離し、そして実施例３に記載のようにＬＩＮＥ１特異的リアルタイムＰＣＲによって分析する。癌患者のＤＮＡ断片化パターンは、対照群とは有意に異なる。約１５０〜約４６３ｂｐのアンプリコン範囲では、ＤＮＡの相対量は、疾病を有する対照患者と比較して増加している。それ故、１５０〜４６０ｂｐの範囲の５つ以上のＤＮＡ−アンプリコンを測定し、そしてこれをＤＮＡ断片化指数（ＤＦＩ）の計算のために使用することができる。Ｘ軸：ＤＮＡアンプリコンの長さ（ｂｐ）、Ｙ軸：正規化したＤＮＡアンプリコンのレベル。
【図３】比較ＲＯＣプロット分析。ＤＦＩ（黒丸）及びαフェトタンパク質法（白丸、点線）に基づいたＨＣＣの診断。ＤＦＩは５つのＬＩＮＥ１断片（１４８、２０４、２４９、３２１及び４６３ｂｐ）の分析によって推定され、そして式［４．１］を使用することによってコンピューター計算される（詳細については実施例３を参照されたい）。ＤＦＩに基づいた（黒丸）診断法についてのＲＯＣプロット下面積は約０．８９であり、αフェトタンパク質（ＡＦＰ）に基づいた（白丸、点線）方法（すなわちＥＬＩＳＡ）についてのＲＯＣプロット下面積は約０．７５である。これらの結果は、ＨＣＣの診断について、ＡＦＰと比較してＤＮＡ断片化パターン分析の優位性を示す。Ｘ軸：偽陽性率（１−特異度）、Ｙ軸：真の陽性率（感度）。
【図４】ＨＣＣ（ｎ＝１７、左手側）患者及び肝硬変を有するリスクのある患者（ｎ＝１２、右手側）のＤＮＡ断片化指数を比較したボックスプロット図。観察された差異は統計学的に有意である（ｐ＝０．００４）。ＤＦＩは、５つのＬＩＮＥ１断片（１４８、２０４、２４９、３２１及び４６３ｂｐ）の相対レベルを記録した後に式［４．１］に従ってコンピューター計算される。１＝肝細胞癌（ＨＣＣ）を患う患者；２＝肝硬変を患う患者、Ｙ軸：ＤＦＩ（ｌｏｇスケール）。
【図５】肝臓切除日の肝転移を有する大腸癌患者（１、左手側）、肝転移の手術処置又は従来の処置の２４０日前までのアフタケア大腸癌患者（２、中央）、及び健康対照（３、右手側）のＤＮＡ断片化指数を比較したボックスプロット図。５つのＬＩＮＥ１断片（１４８、２０４、２４８、３２３及び４６３ｂｐ）をリアルタイムＰＣＲによって分析し、そしてＤＦＩを実施例４に記載のように式［４．１］に従ってコンピューター計算する。図は、疾病を有さない／健康な対照からの、癌患者の明確な判別を例証し、このことはカットオフ値の頑強な推測を可能とする（本実施例においては再発を診断するためのＤＦＩは２００超である）。Ｘ軸：１＝肝切除術を受けている肝転移を有する大腸癌患者；２＝肝転移処置前のアフタケア大腸癌患者；３＝疾病を有さない／健康な対照、Ｙ軸：ＤＦＩ（ｌｏｇスケール）。
【０００９】
詳細な説明
例えばリアルタイムＰＣＲによる反復ＤＮＡ因子（例えばＬＩＮＥ１、ＳＩＮＥ１、ＬＴＲ）又はマルチコピー遺伝子（例えばＵ１ＲＮＡ）に基づいた循環ＤＮＡのＤＮＡ断片化パターン（すなわち、異なるサイズのＤＮＡ断片の相対量）の詳細な分析は、癌診断のための及び癌処置をモニタリングするための改善された方法を示すことが今回意外なことに判明した。健康な患者、リスクのある患者及び癌患者のＤＮＡ断片化パターンは有意に異なり、それ故、感度の高い並びに特異的な癌診断及び処置モニタリングのために使用することができる（実施例１〜４参照）。
【００１０】
臨床的に有意な癌特異性を得るために、ＤＮＡ断片化パターンは、５０〜２０００塩基対、より好ましくは８０〜１２００塩基対、最も好ましくは８０〜５００塩基対の範囲の長さの、４〜６つの断片、より好ましくは４つ、最も好ましくは５つの断片によって示される。８０〜５００塩基対の最も好ましい範囲の５つの断片を、ＤＮＡパターンの決定のために使用する場合、試験したＤＮＡ断片の相対レベルの閾値（カットオフ）が、癌を診断するために使用される（ＤＮＡ断片の相対レベルは、試験したＤＮＡ断片の量と、試験する最も短いＤＮＡ断片の量の比によって定義される）。試験したＤＮＡ断片の相対レベルは、適切なアルゴリズムを使用してＤＮＡ断片化指数をコンピューター計算するためのベースである。５つの断片のＤＮＡ断片化パターンの場合、最適なサイズ範囲は、第１断片（Ａ）では８０〜１６０ｂｐ、第２断片（Ｂ’）では２００〜２２０ｂｐ、第３断片（Ｂ）では２４０〜２６０ｂｐ、第４（Ｂ”）断片では３００〜３８０ｂｐ、そして第５（Ｃ）断片では４００〜５００ｂｐである。例えば、Ａ＝１４８ｂｐ、Ｂ’＝２０４ｂｐ、Ｂ＝２４９ｂｐ、Ｂ”＝３２１及びＣ＝４６３ｂｐの場合、癌を診断するための閾値はＡ＝１（定義により）、Ｂ’≧０．５９、Ｂ≧０．４６、Ｂ”≧０．２９及びＣ≧０．１３である。同定された閾値は、癌の診断を示すＤＮＡ断片化パターンプロットの領域を規定する。
【００１１】
ＤＮＡ断片は、同じ遺伝子／反復因子に由来しても、異なる遺伝子（例えばＬＩＮＥ１、ＳＩＮＥ、ＬＩＮＥ２、Ｕ１ ＲＮＡなど）に由来してもよい。ＬＩＮＥ１の検出のためのＤＮＡ断片は、５０〜２０００塩基対、好ましくは８０〜１２００塩基対、最も好ましくは８０〜５００塩基対の範囲である。
【００１２】
全体として見ると、試料分析は、次の４つの工程で行なわれ得る。工程（１）循環ＤＮＡの単離、工程（２）単離ＤＮＡの定量、工程（３）リアルタイムＰＣＲによるＤＮＡ断片の定量、及び最後に工程（４）データ分析及びＤＮＡ断片化指数（ＤＦＩ）のコンピューター計算、実施例１の詳細なプロトコールを参照されたい。
【００１３】
本発明は、試験した患者が癌を患っているかどうかを決定するための方法を提供する。１つのこのような方法において、体液試料を診断しようとする患者から入手し、そして試料中の反復因子（群）及び／又はマルチコピー遺伝子のＤＮＡ断片のレベル、好ましくはＬＩＮＥ１のレベルを決定する。試料中のＬＩＮＥ１の断片化パターンのＤＮＡ断片のレベルを、リファレンス試料又はリファレンス試料のプールから得られた対照ＬＩＮＥ１ ＤＮＡ断片化パターンと比較し、そして比較の結果を使用して、被験体が癌を患っている可能性があるかどうかを決定する。リファレンス試料は、疾病を有さない被験体（健康個体）から得られた試料である。
【００１４】
本発明はまた、癌の進行及び処置をモニタリングする方法、並びに癌の転帰を予測するための方法も提供する。これらの方法は、モニタリングしようとする癌に患う患者から体液試料を入手し、試料中の反復因子（群）及び／又はマルチコピー遺伝子の断片のレベル、好ましくはＬＩＮＥ１ ＤＮＡ断片のレベルを決定し、そしてそれを、対応する癌に患う患者又は患者のプール由来の対照試料におけるＬＩＮＥ１ ＤＮＡ断片化パターンと比較することを含む。対照患者は、同じタイプの癌に患う異なる患者であっても、あるいは好ましくは、異なる時点、例えば異なる癌段階、又は癌処置（例えば手術又は化学療法）の前、最中若しくは後の同じ患者であってもよい。
【００１５】
当技術分野の最新技術と比較して、本発明による方法は、驚くべきことに、癌、特に原発性肝臓癌（例えば肝細胞癌）、原発性乳癌に由来する続発性肝臓癌、原発性結腸直腸癌、大腸癌、肺癌、乳癌、卵巣癌を診断する及び／又は癌の処置をモニタリングする改善され、維持され及び／又はより効果的な方法、並びに、癌（群）の再発をモニタリングする一般的な方法を提供する。
【００１６】
本明細書の前後に使用する一般的な用語は好ましくは、特記しない限り、本開示の脈絡内において以下の意味を有する。
【００１７】
「ＤＮＡ断片化パターン」という用語は、ＤＮＡ断片の分布を指す。ＤＮＡ断片は、５０〜２０００塩基対の間で長さ（すなわち塩基対の数）が異なる。ＤＮＡ断片化パターンを、種々の定量的及び半定量的な方法、特にＤＮＡ増幅（すなわちＰＣＲ、ＬＣＲ、ＩＭＤＡ）及びＤＮＡハイブリダイゼーション（すなわちアレイハイブリダイゼーション）によって評価することができるが、キャピラリー電気泳動によっても評価することができる。診断のために使用される最小のＤＮＡ断片化パターンは、長さの異なる少なくとも４つのＤＮＡ断片によって、しかし１５個以下の断片によって；好ましくは４〜６つの断片、より好ましくは４つの断片、最も好ましくは５つの断片によって示される。診断のための最小ＤＮＡ断片化パターンは、８０〜５００ｂｐのサイズのＤＮＡ断片を記録することによって評価される（図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ及び図２参照）。疾病陽性対照コホート及び臨床的に関連する疾病陰性対照コホートのＤＮＡ断片化パターンを記録する。２つのコホートの最適な識別のために、長さの異なる少なくとも４つのＤＮＡ断片、好ましくは４〜６つの断片、より好ましくは４つ、最も好ましくは５つの断片を比較する。
【００１８】
癌被験体のＤＮＡ断片化パターンは、臨床コホートと比較した場合にＤＮＡ断片化パターンの差異（１つのリファレンス試料又はいくつかのリファレンス試料におけるＤＮＡ断片化パターンの分析によって得られる）が、統計学的に有意（すなわちｐ≦０．０５）である場合、「実質的に異なる」と捉えられる。統計学的有意は、各患者／健康被験体についての平均ＤＮＡ断片化指数及びその標準偏差をコンピューター計算し、そして標準的な統計学的方法（すなわちスチューデントｔ検定など）を使用して２つ以上の群（すなわち癌ｖｓ対照）のＤＦＩを比較することによって分析される。２つの試料の平均ＤＮＡ断片化指数の差異は、前記差異が、これらの２つの試料の平均標準偏差の少なくとも２倍である場合に、明解に異なると解釈される。
【００１９】
「反復因子」（「反復配列」としても知られる）という用語は、特定のＤＮＡ部分配列が少なくとも４回繰り返されている配列を定義する。反復因子は、ヒトゲノムの少なくとも５０％を占める。（１）縦列反復（すなわちマイクロサテライト）及び（２）転位因子（すなわち短鎖及び長鎖散在反復配列：ＳＩＮＥｓ及びＬＩＮＥｓ）という２種類のこのような因子が包含され、後者は、全ヒト反復配列の９０％を占める。３つのＬＩＮＥファミリー、すなわちＬＩＮＥ１、ＬＩＮＥ２及びＬＩＮＥ３がヒトゲノムの２０％を占める。それらのファミリーの中でＬＩＮＥ１（Ｌ１）だけが転位することができ、そして最も豊富である（ヒトＤＮＡの約１７％を占める）。
【００２０】
「マルチコピー遺伝子」という用語は、およそ少なくとも８コピー数を有する遺伝子配列、例えばＵ１ ＲＮＡに関する。
【００２１】
「体液」という用語は、細胞性ＤＮＡ又は細胞（例えば癌細胞）が存在し得る任意の体液（血液、血清、血漿、尿、骨髄、脳脊髄液、腹水（peritoneal fluid）／胸水、胸水滲出液、リンパ液、脊髄液、腹水（ascite）、漿液、痰、涙液、便、唾液及び尿を含むがそれらに限定されない）を指す。体液試料を、当技術分野において公知の方法のいずれかを使用して患者から得ることができる。
【００２２】
「試料」という用語は、前記に定義した「体液」を含む生体材料を指す。試料は、「侵襲的」又は「非侵襲的」方法を含む方法を用いて患者又は別の患者から単離することができる。侵襲的方法は当業者には一般的に公知であり、そして例えば、穿刺による、開放された身体からの試料の手術的取り出しによる、又は内視鏡機器による、試料の単離を含む。最小限に侵襲的及び非侵襲的方法は当業者には公知である。「最小限に侵襲的な」手法という用語は、好ましくは麻酔を必要とせず、医院又はクリニックで慣用的に行なうことができ、そして痛くないか又は名目上痛いだけのいずれかである、患者の試料材料を得るための一般的に公知の方法を指す。最小限に侵襲的な手法の最も一般的な例は静脈穿刺である。好ましくは「非侵襲的」方法は、口、耳、鼻、直腸、尿道及び開放創などの天然に存在する身体の開口部以外の開口部を通して、患者又は被験体の身体を貫通又は開放することを必要としない。
【００２３】
「リファレンス試料」という用語は、癌について診断される患者から単離された所与の試料中の本発明による異なるＤＮＡ断片化パターンを評価するための適切な対照として作用する試料を指し；このような適切なリファレンス試料の選択は、一般的に当業者には公知である。リファレンス試料の例としては、同じ患者の疾病を有さない臓器若しくは組織若しくは細胞（群）若しくは体液から、又は別の被験体から単離された試料が挙げられ、前記の疾病を有さない臓器若しくは組織若しくは細胞（群）若しくは体液は、組織又は細胞、血液、又は前記した試料からなる群より選択される。疾病を有する患者から単離された試料のＤＮＡ断片化パターンのレベルの比較のために、リファレンス試料はまた、異なる患者の疾病を有さない臓器又は組織又は細胞（群）から単離された試料を含み得、疾病を有さない組織又は細胞（群）は、前記に列挙した試料群から選択される。さらに、リファレンスは、好ましくは患者の年齢及び性別に一致した、健康ドナーからの試料を含み得る。
【００２４】
「対照試料」という用語は、癌についてモニタリングする患者から単離された所与の試料中の本発明による異なるＤＮＡ断片化パターンを評価するための適切な陽性対照として作用する試料を指し；このような適切な対照試料の選択は、一般的に当業者には公知である。対照試料の例としては、同じ患者の（異なる時点の）疾病を有する臓器若しくは組織若しくは細胞（群）若しくは体液から、又は別の被験体から単離された試料が挙げられ、前記の疾病を有する臓器若しくは組織若しくは細胞（群）若しくは体液は、組織又は細胞、血液又は前記した試料からなる群より選択される。疾病を有する患者から単離された試料中のＤＮＡ断片化パターンのレベルの比較のために、対照試料はまた、異なる患者の疾病を有する臓器又は組織又は細胞（群）から単離された試料を含み得、疾病を有する組織又は細胞（群）は、前記に列挙した試料群から選択される。さらに、対照は、好ましくは患者の年齢及び性別に一致した、疾病を有するドナーからの試料を含み得る。
【００２５】
本明細書において使用する「患者」は、死亡又は生存している霊長類（特に高等霊長類）、ヒツジ、イヌ、げっ歯類（例えばマウス又はラット）、モルモット、ヤギ、ブタ、ネコ、ウサギ及びウシなどの全ての哺乳動物を含む、ヒト又は動物を指す。好ましい態様において、被験体はヒトである。別の態様において、被験体は実験動物又は疾病モデルとして適している動物である。患者は、本発明に従って疾患に関する分析、予防策、療法及び／又は診断を受ける、癌、好ましくは肝臓癌（肝細胞癌）、続発性肝臓癌、乳癌、大腸癌、肺癌、前立腺癌、胃癌、卵巣癌を患い、癌を発症するリスクに関連した群も含む（すなわち、肝硬変を患う患者、癌を発症する遺伝子的素因を有する患者、及びアフタケア患者）。
【００２６】
本明細書において使用する「癌」は、コントロール不能な細胞分裂、及び浸潤を通しての隣接組織への直接的な増殖、又は転移による遠隔部位への移入のいずれかによりこれらの細胞が広がる能力によって特徴付けられる、疾病又は疾患を指す。癌の例としては、細胞癌、腺腫、リンパ腫、白血病、肉腫、中皮腫、神経膠腫、胚細胞腫、絨毛癌、前立腺癌、肺癌、乳癌、結腸直腸癌、胃腸癌、膀胱癌、膵臓癌、子宮内膜癌、卵巣癌、メラノーマ、脳癌、精巣癌、腎臓癌、皮膚癌、甲状腺癌、頭頸部癌、肝臓癌（原発性（すなわち肝細胞癌）及び続発性肝臓癌を含む）、食道癌、胃癌、腸癌、大腸癌、直腸癌、骨髄腫、神経芽細胞腫及び網膜芽細胞腫が挙げられるがそれらに限定されない。さらに、癌という用語は、原発性及び続発性の腫瘍部位を含む。好ましくは、癌は原発性及び続発性の肝臓癌、結腸直腸癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、卵巣癌、胃癌、膀胱癌及び腎臓癌である。
【００２７】
本発明の意味内の「肝臓癌」という用語は、肝臓の細胞癌、好ましくは肝細胞癌（ＨＣＣ）、任意の臓器（例えば大腸、乳房）から派生した肝臓への転移、胆管細胞癌を含み、組織の上皮細胞成分が形質転換されて、当業者に一般的には公知である標準的な診断手法に従って同定された悪性腫瘍が生じている。好ましくは、ＨＣＣはさらに、記載した疾患のサブタイプ、好ましくは細胞内タンパク質性封入体によって特徴付けられる肝臓癌、肝細胞脂肪症によって特徴付けられるＨＣＣ、及び線維層板型ＨＣＣを含む。例えば、前癌病変、例えば、増加した肝細胞の細胞サイズ（「大細胞」の変化）によって特徴付けられるもの、及び減少した肝細胞の細胞サイズ（「小細胞」の変化）並びにマクロ再生（過形成）結節によって特徴付けられるものも含まれる(Anthony, P. in MacSween et al, eds. Pathology of the Liver. 2001, Churchill Livingstone, Edinburgh)。本発明の意味内の「本発明による疾患」という用語は、前記に定義したような癌、例えば肝臓癌、好ましくはＨＣＣを包含する。
【００２８】
本発明の意味内の「処置」という用語は、本発明による疾患から患者を好ましくは治癒する及び／又は一過性に、短期に（数時間から数日間の次数で）、長期に（数週間、数か月間又は数年間の次数で）若しくは永久的に、疾患に関連した１つ以上の症状、好ましくは３つの症状、より好ましくは５つの症状、最も好ましくは疾患に関連した１０個の症状に関して患者の病的容態を改善させる処置を指し、全体的な効果が対照患者と比較して症状の有意な改善である限り、病的容態の改善は、大きさが一定、増加、減少、連続的に変化又は振動性であり得る。
【００２９】
「多かれ少なかれ進行した病期」及び「多かれ少なかれ応答性」という用語は、異なるタイプの癌の多種多様な臨床学的及び病理学的特徴を反映した、ＵＩＣＣ／国際対がん連合：ＴＮＭ病期分類（http://www.uicc.org/index.php?option=com_content&task=view&id=14275&Itemid=197）又はＡＪＣＣ／対がん米国合同委員会：癌病期分類マニュアル／２０１０年１月１日刊行の現行の第７版（http://www.cancerstaging.org）によって提供されるような臨床的病期分類基準によって定義される。どちらの病期分類システムも従来技術において周知であり、そして臨床腫瘍学において慣用的に行なわれている。患者の有意な応答性は、原発性腫瘍及び存在する場合には続発性（転移）腫瘍のサイズの５％、より好ましくは１０〜１５％の減少、又は前記の病期分類システムによる最初の病期分類の変化による減少を含む。
【００３０】
ＬＩＮＥ１ ＤＮＡは、被験体において「細胞性」又は「無細胞性」ＤＮＡのいずれかとして存在し得る。「無細胞性ＤＮＡ」は、細胞外の被験体の体液中に存在するＤＮＡ又はこのようなＤＮＡの単離形態を指す。「細胞性ＤＮＡ」は、細胞内に存在するか、又は細胞から単離されたＤＮＡを指す。
【００３１】
体液試料から無細胞性ＤＮＡを抽出するための方法は当技術分野において周知である（Clausen, F.B. et al., 2007, Prenatal Diagn. 27 (1): 6-10; Ahmad, N.N. et al., 1995, J Med Genet, 32 (2): 129-30）。一般的には、体液試料中の無細胞性ＤＮＡは、遠心沈降によって細胞から分離され、アルコール中で沈降させ、そして水溶液中に溶解される。体液試料から細胞性ＤＮＡを抽出するための方法も当技術分野において周知である（Sambrook, J. and Russel, D.W., 2001, Preparation and analysis of eukaryotic genomic DNA. In: Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Volume 1, 3rd edition, pp 6.1- 6.32, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York）。典型的には、細胞を洗浄剤で溶解する。細胞溶解後、タンパク質を種々のプロテアーゼを使用してＤＮＡから除去する。その後、ＤＮＡをフェノールを用いて抽出し、アルコール中で沈降させ、そして水溶液中に溶解する。その後、体液から得られた循環ＤＮＡ中の、反復因子（群）及び／又はマルチコピー遺伝子（群）、好ましくはＬＩＮＥ１ ＤＮＡの存在を、当技術分野において周知の方法のいずれかを使用することによって検出する。このような方法は、ＤＮＡ増幅法（例えばＰＣＲ、ＬＣＲ及び等温多置換増幅）、サザンブロット、ＤＮＡシークエンス、アレイハイブリダイゼーション及びキャピラリー電気泳動を含むがそれらに限定されない。
【００３２】
本発明は、
（ａ）癌を有することが疑われる患者から単離された体液試料中の、８０〜５００ｂｐの４〜６つの断片によって示される反復因子又はマルチコピー遺伝子のＤＮＡ断片化パターンを決定する工程、
（ｂ）（ａ）において決定したＤＮＡ断片化パターンを、リファレンス試料のＤＮＡ断片化パターンと比較する工程、
（ｃ）リファレンス試料と比較して、診断された患者から単離された試料中において異なって発現されている前記ＤＮＡ断片のレベルを決定する工程、
ここで、前記ＤＮＡ断片のレベルが、リファレンス試料のレベルと実質的に異なっている場合、診断された患者は、癌を患っている可能性があることを示す、
を含む、癌の診断法に関する。
【００３３】
さらに、本発明は、
（ａ）処置終了時にモニタリングした患者から単離した体液試料中の、８０〜５００ｂｐの４〜６つの断片によって示される反復因子又はマルチコピー遺伝子のＤＮＡ断片化パターンを決定する工程、
（ｂ）（ａ）において決定したＤＮＡ断片化パターンを、処置前の同じ個体から単離した対照試料のＤＮＡ断片化パターンと比較する工程、
（ｃ）対照試料と比較して、モニタリングし処置した患者から単離した試料中において異なって発現されている前記ＤＮＡ断片のレベルを決定する工程、
ここで、前記ＤＮＡ断片のレベルが、対照試料のＤＮＡ断片のレベルと実質的に異なっている場合、癌は、モニタリングした患者において、同じ患者から単離した対照試料においてよりもより進行した段階又はより進行していない段階である可能性があることを示すか、あるいはモニタリングした患者は癌処置に対してより応答性が低いか又はより応答性が高い可能性があることを示す、
を含む、癌に患いそして癌処置中である患者において疾病の進行又は後退をモニタリングする方法に関する。
【００３４】
本発明による方法の１つの好ましい態様において、ＤＮＡ断片化パターンは５つの断片によって示される。本発明のさらに好ましい態様において、５つの断片によって示されるＤＮＡ断片化パターンは、８０〜１６０ｂｐの範囲の第１断片、２００〜２２０ｂｐの範囲の第２断片、２４０〜２６０ｂｐの範囲の第３断片、３００〜３８０ｂｐの範囲の第４断片、及び４００〜５００ｂｐの範囲の第５断片を含む。
【００３５】
反復因子の好ましい態様の１つは、ＬＩＮＥ１、ＳＩＮＥ１又はＬＴＲであり、そしてマルチコピー遺伝子のそれはＵ１ ＲＮＡである。反復因子の最も好ましい態様はＬＩＮＥ１である。
【００３６】
別の好ましい態様において、体液は血液、血清、血漿、尿、骨髄、腹水又は脳脊髄液である。特に好ましい態様において、体液は血清又は血漿である。
【００３７】
癌の好ましい態様は、肝臓癌、乳癌、大腸癌、結腸直腸癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌又は胃癌である。肝臓癌のさらに好ましい態様は、原発性又は続発性の肝臓癌である。肝臓癌の最も好ましい態様は肝細胞癌（ＨＣＣ）である。
【００３８】
本発明の組成物、方法及び過程に種々の変更を行なうことができることが当業者には明らかであろう。従って、本発明は、このような改変及び変形を、それらが特許請求の範囲及びその均等物に該当するならば、網羅するものとする。本明細書において引用した全ての刊行物は、その全体が参照として組み入れられる。
【００３９】
本発明を、本発明の好ましい態様及び特徴を示す図面及び実施例の助けを借りて、以下においてさらに説明するが、本発明はそれに限定されない。
【００４０】
実施例
実施例１：試料分析及びＤＮＡ断片パターン選択の方法
全体として見ると、試料分析及び断片パターン選択は、次の５つの工程で行なわれる。工程（１）循環ＤＮＡの単離、工程（２）単離ＤＮＡの定量、工程（３）リアルタイムＰＣＲによるＤＮＡ断片の定量、工程（４）データ評価及び断片パターン選択、及び最後に工程（５）ＤＮＡ断片化指数（ＤＦＩ）のコンピューター計算。
【００４１】
工程（１）：循環ＤＮＡの単離
循環ＤＮＡを、製造業者の指示に従って（Qiagen kit manual、第３版、２００７年３月、page 23-25）、Qiagen MinEluteウイルスバキュームキット（製造番号57714, Qiagen, Hilden, Germany）を使用して、１〜２．５mlの凍結（−２０℃）又は新鮮な血清試料から単離する。凍結した血漿試料（２〜２．５ml）を製造業者の指示に従って（Qiagen kit manual、第３版、２００７年２月、page 19-22）、Qiagen MinEluteウイルススピンキット（製造番号57704, Qiagen, Hilden, Germany）を使用して処理する。
【００４２】
工程（２）：単離ＤＮＡの定量
２０μlまでの全容量中に存在する単離ＤＮＡを、製造業者の指示に従って（改訂版２００５年１２月２０日/MP07581）、PicoGreenアッセイ（製造番号P11496, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）を使用して定量する。標準曲線は、１mlあたり１〜１００ngのヒトゲノムＤＮＡの範囲である（Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）。
【００４３】
工程（３）：リアルタイムＰＣＲによるＤＮＡ断片の定量
リアルタイムＰＣＲによるその後の試料分析のために、１反応あたり０．０２ng〜０．１ngの単離した循環ＤＮＡを分析する。異なる長さの４つ以上の反復遺伝子断片を平行して別々のリアルタイムＰＣＲ反応によって分析する。各反応のための条件は以下の通りである：プライマー（表１及び２参照）濃度は各５０nM、及び２×SYBR-Greenマスターミックス（Applied Biosystem, Foster City, CA, USA）を使用して２５μlの最終反応容量。試料を「７３００リアルタイムＰＣＲシステム」（Applied Biosystem, Foster City, CA, USA）で２段階モード（表３参照）で４０サイクル回す。ヒトゲノムＤＮＡ（Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）を、分析する各反復遺伝子断片の相対的ＤＮＡ定量のための標準として使用する。
【００４４】
工程（４）：データ評価及び断片パターン選択
各々の個々の患者についての各々の試験した遺伝子断片のレベルを、試験した最も短い遺伝子断片に正規化する。異なる患者又はリスク群を比較するために、各々のアンプリコンサイズ及び各群に対する正規化した遺伝子断片の平均レベル及びその標準偏差を評価する。ＤＮＡ断片化パターンを得るために、平均の正規化したＤＮＡアンプリコンレベルを、アンプリコンサイズに対してプロットする（図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ及び２参照）。対象の各々の指標についてＤＮＡ断片化パターンを、臨床的に関連した対照コホートと比較する（図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ及び２参照）。臨床的に関連した対照コホートは、診断アッセイによって識別されなければならない臨床亜群を示す（例えば肝硬変ｖｓＨＣＣ、大腸癌／大腸癌再発ｖｓ健康）。肝細胞癌、転移性乳癌及び転移性大腸癌の疾病群のＤＮＡ断片化パターンは、臨床的に関連した対照群からの有意な逸脱を示す。しかしながら、指標及び臨床的に関連した対照群に依存して、ＤＮＡ断片化パターン曲線の異なる特徴（すなわち、曲線の勾配、曲線下面積の差異及び変化）を、最適な差別化のために選択しなければならない。
【００４５】
実施例３及び図２に示したように、アンプリコンサイズ１４９〜４６３ｂｐのＨＣＣ患者のＤＮＡ断片化パターン曲線の勾配は、肝硬変患者のパターンとは有意に異なる。それ故、アンプリコンサイズ１４９〜４６３ｂｐの領域が、ＨＣＣを診断するためのＤＮＡ断片パターンの選択のために選択される。
【００４６】
類似の領域が、乳癌及び乳癌再発（実施例２、図１Ａ参照）並びに大腸癌及び大腸癌再発（実施例４、図１Ｂ及び１Ｃ参照）の診断のために選択される。疾病を有する患者と対照ドナーとの比較は、ＤＮＡ断片化パターンの有意な差異を示す。それ故、最適な診断（高い感度及び特異性）は、単一の識別子を使用することよりもむしろ、観察された差異の組合せによって得られる。この利点は、高度に進行した疾病よりもむしろ、初期又は微小残存病変状態を診断しなければならない場合に重要である。
【００４７】
工程（５）：ＤＮＡ断片化指数（ＤＦＩ）のコンピューター計算
患者及び対照の最適な識別のために、ＤＮＡ断片化パターン曲線下面積をコンピューター計算し得るか、又は経験的アルゴリズムを使用して１つの数値によってＤＮＡ断片化を特徴づけ得る。このようなＤＮＡ断片化指数（ＤＦＩ）をさらに使用することにより、疾病を有する患者と対照患者とを比較し、そして癌を診断するための閾値レベル（カットオフレベル）を定義し、処置応答並びに疾病の進行をモニタリングする。
【００４８】
経験的アルゴリズムにおいては、曲線下面積並びに遺伝子断片／アンプリコンの正規化レベルの比及び差異を使用して、ＤＮＡ断片化指数（ＤＦＩ）をコンピューター計算する。ＤＦＩの計算のために使用されるＤＮＡ断片は、比較する臨床関連群（すなわち疾病群ｖｓ対照群）のＤＮＡ断片化パターンから選択される。ＨＣＣを診断するための例においては、１４８〜４６３ｂｐの範囲の断片を選択する（実施例３参照）。３つの断片についてのＤＦＩを、式［１］に従ってコンピューター計算する。
ＤＦＩ３＝Ｆ(Ｂ)正規化/Ｆ(Ａ)正規化×Ｆ(Ｂ)正規化/Ｆ(Ｃ)正規化×(Ｆ(Ｂ)正規化−Ｆ(Ｃ)正規化）  ［１］
【００４９】
４つの断片については式［２］を使用し、そしてより多くの断片については一般式［３］を使用する。
ＤＦＩ４＝Ｆ(Ｂ)正規化/Ｆ(Ａ)正規化×Ｆ(Ｄ)正規化/Ｆ(Ａ)正規化×Ｆ(Ｂ)正規化/Ｆ(Ｃ)正規化×Ｆ(Ｄ)正規化/Ｆ(Ｃ)正規化×(Ｆ(Ｂ)正規化−Ｆ(Ｃ)正規化)×(Ｆ(Ｄ)正規化−Ｆ(Ｃ)正規化)    [２]
【数１】
2012521772.tif 000003
説明文：
ＤＦＩｎ：ｎ個の断片を使用して計算したＤＮＡ断片化指数
Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄは、Ａ＜Ｂ＜Ｃ＜Ｄの順で４つの異なるアンプリコンサイズを示す。
Ｆ（Ａ）、Ｆ（Ｂ）、Ｆ（Ｃ）、Ｆ（Ｄ）、Ｆ（Ｘ）：体液１mlあたり、それぞれ断片Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＸの相対濃度
Ｆ（Ａ）正規化：Ｆ（Ａ）に正規化したＦ（Ａ）、すなわち１
Ｆ（Ｂ）正規化、Ｆ（Ｃ）正規化、Ｆ（Ｄ）正規化：それぞれＦ（Ａ）に正規化したＦ（Ｂ）、Ｆ（Ｃ）及びＦ（Ｄ）
Ｘ１、Ｘ２、・・・Ｘｎは、Ｘ１＜Ｘ２＜・・・＜Ｘｎの順で異なるアンプリコンサイズを示す。
Ｆ（Ｘ）正規化：Ｆ（Ｘ１）に正規化したＦ（Ｘ）：Ｘ１は最も短いＤＮＡ断片である
【００５０】
特に大腸癌及び乳癌のためであるが、しかしＨＣＣのような他の癌のためでもある、代替的なより特殊な計算は、少なくとも５つのＤＮＡ断片の分析に基づく。ここで１３０〜３６０ｂｐ（「領域１３０〜３６０」）又は１３０ｂｐ〜４３０ｂｐ（「領域１３０〜４３０」）のアンプリコン範囲のＤＮＡ断片化プロット下面積（例えばグラフ積分により評価）；これにそれぞれ２３０〜２７０（Ｆ（Ｂ）正規化）及び４３０〜４７０（Ｆ（Ｃ）正規化）のアンプリコン断片の比を乗じる（式４参照）。曲線下面積の評価のために、少なくとも４つの異なるアンプリコンサイズを試験すべきである（Ａ、Ｂ、Ｂ’及びＢ”）。
【００５１】
試験した断片についてのサイズの順は以下の通りである：Ａ＜Ｂ’＜Ｂ＜Ｂ”＜Ｃ。
【００５２】
各断片についての最適なサイズ範囲は以下の通りである：
Ａ＝８０〜１６０ｂｐ
Ｂ’＝２００〜２２０ｂｐ
Ｂ＝２４０〜２６０ｂｐ
Ｂ”＝３００〜３８０ｂｐ
Ｃ＝４００〜５００ｂｐ
領域＝領域（１３０〜３６０）又は領域（１３０〜４３０）
ＤＦＩ領域＝領域×Ｆ（Ｂ）正規化／Ｆ（Ｃ）正規化        [４]
【００５３】
要約すると、最適なＤＦＩの計算のための断片は、疾病陽性コホートと臨床関連の疾病陰性対照コホートとを比較することによって、ＤＮＡ断片化パターンを記録した後に選択される（正規化されたＤＮＡアンプリコンレベルｖｓＤＮＡアンプリコンサイズのプロットを参照）。
【００５４】
癌患者のＤＮＡ断片化パターンは、臨床関連対照コホートとは有意に異なることが判明する（図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ及び図２参照）。癌患者診断のための最小ＤＮＡ断片化パターンは、３つのＤＮＡ断片を記録する：
１）Ｆ（Ａ）：８０〜１５０ｂｐの長さの短いＤＮＡ断片
２）Ｆ（Ｂ）：２００〜２７０ｂｐの長さのＤＮＡ断片
３）Ｆ（Ｃ）：３６０〜５００ｂｐの長さのＤＮＡ断片
【００５５】
より特異的かつ感度の高い癌の診断法及び／モニタリング法のために、３つを超える断片を使用し、すなわち２００〜４００ｂｐの追加の断片を選択する（実施例３及び４参照）。４つ以上の（好ましくは５つの）断片を使用する方法は、２つ又は３つだけの断片を使用する方法よりも優れている（図５参照）。
【００５６】
一般的に、ＤＮＡ断片化パターン及び続いてＤＦＩを、ＳＩＮＥ、Ｕ１ＲＮＡ、β−アクチン又は他の反復因子又はマルチコピー遺伝子を使用することによっても決定することができる。そうするために、同じ範囲のアンプリコンサイズを網羅するプライマーを設計する。しかしながら、プライマー設計に因るアンプリコンサイズの僅かな変動（例えば±１５ｂｐ）は無視できる。
【００５７】
【表１】
2012521772.tif 000004
【００５８】
【表２】
2012521772.tif 000005
【００５９】
【表３】
2012521772.tif 000006
【００６０】
実施例２：ＤＮＡ断片化分析による転移性乳癌の再発診断
健康ドナー（ｎ＝１７）及び種々の臨床段階の転移性乳癌を有する患者のプール（ｎ＝１０）のＤＮＡ断片化パターンを記録する（実施例１）。示したｂｐ長を有するＬＩＮＥ１断片を分析し（表２参照）、正規化し、そしてプロットする（図１Ｂ参照）。プールした乳癌血清のＤＮＡ断片化パターン（図１Ａ参照）は、健康対照と比較して、２００〜４００ｂｐのＤＮＡ断片の増加したレベルを示す。
【００６１】
ＤＮＡ断片化指数（ＤＦＩ）を、式［２］（ＬＩＮＥ１−Ｂ、ＬＩＮＥ１−Ｃ、ＬＩＮＥ１−Ｅ及びＬＩＮＥ１−Ｆを使用して、表２参照）並びに式［４］（ＬＩＮＥ１−Ｂ、ＬＩＮＥ１−Ｃ、ＬＩＮＥ１−Ｄ、ＬＩＮＥ１−Ｅ及びＬＩＮＥ１−Ｆを使用して、表２参照）に従って各患者／プールについてコンピューター計算する。
【００６２】
健康対照についての平均ＤＦＩ４（式［２］）は０．０２±０．０１であり、これに対して乳癌プールについては０．６４であり；従って、約０．１の見込みカットオフを示す。
【００６３】
式［４］を使用して類似の結果が得られる。１４８〜３２３ｂｐの領域についての平均ＤＦＩ領域をコンピューター計算し、そしてこれはそれぞれ疾病を有さない／健康な対照及び乳癌プールについて１４６±７７及び３００．５である。見込みカットオフは約２００であり得る。１４８〜４６３ｂｐの領域についての平均ＤＦＩ領域のコンピューター計算により、それぞれ疾病を有さない／健康な対照及び乳癌プールについて１９３±８２及び４４９が得られる。この結果は、従来技術において公知の方法と比較した場合に、癌（例えば転移性乳癌）の有意に改善された識別／診断を実証する。
【００６４】
特徴的なアンプリコン比の算入によってさらなる改善を行ない得る。図１Ａに観察されるように、アンプリコン１４８〜４６３ｂｐの疾病を有さない／健康な対照曲線の勾配は、転移性乳癌よりも速く減少する。式［４］の改変により式［４．１］を導き得る：
ＤＦＩ領域＝領域(１４８〜４６３)×Ｆ(Ｂ)正規化/Ｆ(Ｃ)正規化×Ｆ(Ｂ’)正規化/Ｆ(Ａ)正規化×Ｆ(Ｂ”）正規化/Ｆ(Ｃ)正規化                                        ［４．１］
Ａ＝ＬＩＮＥ１−Ｂ
Ｂ＝ＬＩＮＥ１−Ｄ
Ｂ’＝ＬＩＮＥ１−Ｃ
Ｂ”＝ＬＩＮＥ１−Ｅ
Ｃ＝ＬＩＮＥ１−Ｆ
【００６５】
さらに、式［４．１］を使用することによって、平均ＤＦＩ領域は、それぞれ疾病を有さない／健康な対照及び乳癌プールについて６３±２２及び８５５であるとコンピューター計算される。（転移性）乳癌を診断するためのＤＦＩ領域のカットオフは約１５０であると示唆される。疾病群の曲線特徴の算入は、２つのコホートの識別力を段階的に改善させる。２４７ｂｐ／１１５ｂｐのＡｌｕ断片比を使用した報告された２断片に基づく分析と比較して（Umetani, N. et al., 2006, Clin Chem. 52(6): 1062-9）、有意な差異が得られるが（健康対照＝０．４６±０．１２ｖｓ乳癌プールについての０．６５）、診断有用性に欠ける。
【００６６】
１４９ｂｐ〜４６３ｂｐの範囲の５つのＤＮＡ断片を分析する利点は明らかに、２つ、３つ及び４つの断片を超える優位性を示す。このような５つのＤＮＡ断片の分析は、特に微小残存病変の臨床状況における、癌診断、早期診断及び早期再発検出の有意な改善を示す。
【００６７】
実施例３：ＤＮＡ断片化分析による肝細胞癌の診断
肝硬変を有する患者（リスクのある患者）及びＨＣＣを有する患者のＤＮＡ断片化パターンを、実施例１に示したように記録する。示したサイズを有するＬＩＮＥ１断片を分析し（表２参照）、正規化し、そしてプロットする（図２参照）。図２は、肝硬変を患うリスクのある患者と比較した、ＨＣＣ患者のＤＮＡ断片化パターンの有意に異なる曲線を示す。それ故、ＨＣＣの診断は、１４８〜７８３ｂｐの指定した範囲の、しかし少なくとも１４８〜４６３ｂｐのＤＮＡ断片化パターンを記録し、そして肝硬変及び／又は慢性Ｃ型肝炎を有する患者のＤＮＡ断片化パターンと比較することによって行なうことができる。ＨＣＣ患者のＤＮＡ断片化パターンは、２０４〜４６３ｂｐの対照群とは最も有意に異なる。
【００６８】
ＤＦＩのコンピューター計算は、式［１］、［２］及び［４．１］に従って実施される。患者と対照群との間の差異を規定するＬＩＮＥ１パターンを最も高い感度及び特異性で最適化するために、ＤＮＡ断片化指数のコンピューター計算は、１４８〜４６３ｂｐの領域に焦点を当てる。データを表４及び５に要約する。ＲＯＣプロット曲線下面積は、２〜５つのＬＩＮＥ１断片にかけて増加し（表４参照）、さらに患者と対照群との間の９５％信頼区間は、４つ及び５つのＬＩＮＥ１断片を実行した場合により良好に分離し（表５参照）、それ故、カットオフ値は、これらの診断試験においてより明瞭になる。４つ及び５つの断片に基づいた診断アッセイについての見込みカットオフは、２つの重複していない信頼区間の間に定義され得る（すなわち、それぞれ、４つ及び５つの断片に基づいた試験について０．９及び１９６．０）。これは、２つ及び３つの断片に基づいた試験では不可能である（表５参照）。なぜなら、信頼区間が重複しているからである。
【００６９】
ＲＯＣプロット（Altman, D.G. and Bland, J.M., 1994, Diagnostic tests 3: receiver operating characteristic plots, BMJ 309, 188; Zweig, M.H. and Campbell, G., 1993, Clin Chem. 39(4): 561-77）を実施して（図３参照）、ＨＣＣの標準的な分子的診断であるαフェトタンパク質（ＡＦＰ）分析と比較して、ＤＮＡ断片化分析の優位性を示す。ＡＦＰについてのＲＯＣプロット下面積は０．７５±０．０９であり、これはＤＮＡ断片化パターンに基づいた診断が、どれだけ多くのＬＩＮＥ１断片を使用するかに関係なく優れていることを示す（表４参照）。またボックスプロット分析によって（図４）、ＤＮＡ断片化パターン分析による癌（すなわちＨＣＣ）患者及びリスクのある患者（すなわち硬変）の差異は明瞭となる。
【００７０】
全体として見ると、ＨＣＣ患者のＤＮＡ断片化は、肝硬変を患う患者の対照コホートとは有意に異なる（図２参照）。ＡＦＰ分析と比較しての診断ツールとしてのＤＮＡ断片化パターン分析の優位性、及びマルチＤＮＡ断片分析による改善を明瞭に認識することができる。さらに、ＤＮＡ断片分析に基づいたＤＦＩをコンピューター計算する可能性がいくらか存在する。最適なアルゴリズムは、適切な断片比と相対的な断片レベルの差異を組み合わせることによって、ＤＮＡ断片化パターンの勾配の差異（すなわち符号及び大きさ）及び変化（すなわち屈曲点）を示し得る。一般式［３］（式［１］及び［２］は、それぞれ２つ及び３つのＤＮＡ断片のために、一般式［３］から導かれる）並びに式［４］及び［４．１］は、このようなアルゴリズムの例として示される。慢性Ｃ型又はＢ型肝炎を患うリスクのある患者においてＨＣＣを診断するための診断試験の使用を拡大するために、これらの群のＤＮＡ断片化パターンを記録し、そして実施例１及び２に示したように分析する。原則的には、肝硬変を患うリスクのある患者においてＨＣＣを診断するために使用したのと同じＬＩＮＥ１断片を、慢性Ｃ型又はＢ型肝炎を患うリスクのある患者においてＨＣＣを診断するために使用し得る。
【００７１】
【表４】
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【００７２】
【表５】
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【００７３】
実施例４：ＤＮＡ断片化分析による転移性大腸癌の再発診断
健康ドナー（ｎ＝１０）、肝臓切除術を受けた転移性大腸癌を有する患者（ｎ＝３３）並びに大腸癌を有するアフタケア患者（ｎ＝２８）のＤＮＡ断片化パターンを記録する（実施例１に示したように）。１４８〜７８３ｂｐのアンプリコン長を有するＬＩＮＥ１断片（表２参照）をリアルタイムＰＣＲによって定量し、正規化し、プロットし、そして最後にＤＮＡ断片化指数（ＤＦＩ）をコンピューター計算する。
【００７４】
健康ドナーの血清由来のＤＮＡ断片化パターンを、２つの異なる時点及び異なる臨床段階における大腸癌患者の血清由来ＤＮＡ断片化パターンと比較する：
（１）肝臓切除術を受けた肝転移を有する患者−採血の時点：肝臓手術時（群１と名付ける）
（２）結腸直腸癌を有するアフタケア患者−採血の時点は肝転移の手術又は保存的処置の前（群２と名付ける）。
【００７５】
図１Ｃにおいて、疾病を有さない／健康な対照ｖｓ群１のＤＮＡ断片化パターンを示す。断片化パターンは有意に異なる。約２５０ｂｐにおける最大及び６００ｂｐより長いＤＮＡ断片の増加が、癌患者の断片化パターンにおいて優位を占める（図１Ｃ参照）。有意により少ない腫瘍負荷を有するアフタケア患者（群２）のＤＮＡ断片化パターンは、約２５０ｂｐにおける最大が減少して弱いショルダーとなるようなＤＮＡ断片化パターン曲線を形成している（図１Ｂ参照）。それ故、ＤＮＡ断片化に基づいた遠隔腫瘍再発の感度の高い診断は、１４８〜４６３ｂｐのＤＮＡ断片化パターンを考慮に入れて、２つのパターン間の差異を蓄積しなければならない。
【００７６】
式［４．１］を使用して両方の大腸癌群についてのＤＮＡ断片化指数（ＤＦＩ）をコンピューター計算する。従って、疾病を有さない／健康な対照群に基づいた、疾病を有さない被験体についてのＤＦＩ閾値は、約１００であると評価される。２００のＤＦＩはすでに再発を示す可能性がある。図６のボックスプロットは、群１患者及び群２患者及び疾病を有さない／健康な対照のＤＦＩ（式［４．１］）を比較する。両方の患者群を、健康な対照群から最適に分離することができる。観察された差異は統計学的に有意である。両方の臨床状況において、方法の感度及び特異性は１００％である（ＲＯＣプロットは示さず）。これらの結果は、開発された方法が、早期診断を行なうために、再発診断について癌患者（すなわち大腸癌、乳癌、前立腺癌、肺癌など）をモニタリングするのに適切であることを示す。また、この方法を、新たな処置に対する腫瘍応答の代用マーカーとしても使用することができる。実施例３においてすでに示したように、診断法はまた、原発性腫瘍の診断のためのマーカーとして使用することができる。
【００７７】
マルチ断片分析の優位性を表６に示す。表６において２つの断片に基づいた指数（Umetani et al. 2006, J. Clin. Oncol. 24 (26): 4270-6）を、式［４．１］に従って５つの断片に基づいたＤＦＩと比較する。群２及び疾病を有さない／健康な対照についての指数をコンピューター計算し、そして最後にＲＯＣプロット下面積を評価する（疾病ｖｓ疾病を有さない／健康な対照を比較）。高い感度及び特異性はまた、５つの断片に基づいたアッセイが、本研究で試験したよりもさらにより早く患者を同定することができたことを示す（群２の患者の血液試料は、肝臓切除術又は従来の処置の２４０日前までに得られる）。実施例３においてすでに示したように、強力なカットオフ値の選択は、２つ、３つ又は４つの断片に基づいたアッセイと比較して、５つの断片に基づいたアッセイによって改善される。
【００７８】
【表６】
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【００７９】
実施例５：ＤＮＡ断片化分析によって癌処置の療法応答を代用
抗癌処置の前及び終了時における癌患者の血清由来ＤＮＡ断片化パターンを三重に記録する。続いて両時点における試料から平均ＤＮＡ断片化指数及びその標準偏差を計算する。両時点の試料の平均ＤＮＡ断片化指数を互いに比較する。平均標準偏差の２倍を超える平均ＤＮＡ断片化指数の差異は、明解に異なると解釈される。ＤＮＡ断片化指数が処置後に明解に増加する場合、患者は非応答者として分類される。応答者は、処置終了時におけるＤＮＡ断片化指数の明解な減少によって特徴付けられる。明解に異ならないＤＮＡ断片化指数の差異は無変化を示し、そして安定している疾病として解釈することができる。処置応答のための代用としてのＤＮＡ断片化指数の使用の臨床的検証は、ＤＮＡ断片化指数から得られた分類と、臨床成績及び／又は腫瘍画像撮影データとの相関によって得ることができる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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