(57)【要約】  本発明は、インジゴフィーラ・ヘテランタ（Ｉｎｄｉｇｏｆｅｒａ  ｈｅｔｅｒａｎｔｈａ）の抽出物を含むハーブ組成物に関する。また、本発明は、前記ハーブ組成物の調製方法に関する。さらに、本発明は、具体的には単純ヘルペスウイルスを原因とするウイルス感染の治療のための、前記ハーブ組成物の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物インジゴフィーラ・ヘテランタ（Ｉｎｄｉｇｏｆｅｒａ  ｈｅｔｅｒａｎｔｈａ）の植物全体又は１つ以上の部分を溶媒中で１：５〜１：４０重量／体積の比率で２〜２４時間、４０〜５０℃で撹拌し、
抽出物を濃縮し、及び任意に、前記抽出物を溶媒分配又はクロマトグラフィーにより濃縮する、ことにより調製される、
ことを特徴とする植物インジゴフィーラ・ヘテランタ（Ｉｎｄｉｇｏｆｅｒａ  ｈｅｔｅｒａｎｔｈａ）の植物全体又は１つ以上の部分から単離される抽出物。
【請求項２】
請求項１に記載の植物インジゴフィーラ・ヘテランタ（Ｉｎｄｉｇｏｆｅｒａ  ｈｅｔｅｒａｎｔｈａ）の植物全体又は１つ以上の部分から単離される抽出物の治療有効量を、単独で又は薬理学的に許容される担体と組み合わされて含む
ことを特徴とするハーブ組成物。
【請求項３】
請求項２に記載のハーブ組成物であって、
前記植物インジゴフィーラ・ヘテランタ（Ｉｎｄｉｇｏｆｅｒａ  ｈｅｔｅｒａｎｔｈａ）の抽出物は、前記植物の根から得られる
ことを特徴とするハーブ組成物。
【請求項４】
請求項２又は請求項３に記載のハーブ組成物であって、
前記ハーブ組成物は、植物インジゴフィーラ・ヘテランタ（Ｉｎｄｉｇｏｆｅｒａ  ｈｅｔｅｒａｎｔｈａ）の抽出物の治療有効量を含み、
（ａ）４０〜５０℃で２〜２４時間、溶媒中で１：５〜１：４０重量／体積の比率で溶媒中で撹拌することにより、前記植物インジゴフィーラ・ヘテランタ（Ｉｎｄｉｇｏｆｅｒａ  ｈｅｔｅｒａｎｔｈａ）の植物全体又は１つ以上の部分からの抽出物を調製する工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られた溶媒抽出物を濃縮する工程、
（ｃ）任意に、工程（ｂ）で得られた抽出物を高真空下（０．０１〜５ｍｍＨｇで乾燥する工程、
（ｄ）任意に、ポリアミド樹脂、ゼラチン／塩化ナトリウム溶液、ポリビニルピロリドン、カフェイン、酢酸鉛（ＩＩ）又は皮粉から選択される材料を使用して、工程（ｂ）又は工程（ｃ）で得られた抽出物を濃縮する工程、
（ｅ）任意に、溶媒分配又はクロマトグラフィーによって、工程（ｂ）、工程（ｃ）又は工程（ｄ）で得られた抽出物を濃縮する工程、及び、
（ｆ）任意に、工程（ｂ）、工程（ｃ）、工程（ｄ）又は工程（ｅ）の抽出物を薬理学的に許容される担体と混合する工程、を含む、
ことを特徴とするハーブ組成物の調製方法。
【請求項５】
請求項４に記載のハーブ組成物の調製方法であって、
前記植物インジゴフィーラ・ヘテランタ（Ｉｎｄｉｇｏｆｅｒａ  ｈｅｔｅｒａｎｔｈａ）の前記抽出物は、前記植物の根から得られる
ことを特徴とするハーブ組成物の調製方法。
【請求項６】
請求項４又は請求項５に記載のハーブ組成物の調製方法であって
前記植物インジゴフィーラ・ヘテランタ（Ｉｎｄｉｇｏｆｅｒａ  ｈｅｔｅｒａｎｔｈａ）を抽出するための前記溶媒は、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、アセトン、酢酸エチル、ジクロロメタン、水、又はこれらの混合物から選択される
ことを特徴とするハーブ組成物の調製方法。
【請求項７】
請求項６に記載のハーブ組成物の調製方法であって、
前記植物インジゴフィーラ・ヘテランタ（Ｉｎｄｉｇｏｆｅｒａ  ｈｅｔｅｒａｎｔｈａ）を抽出するための前記溶媒は、メタノール及び水、又はエタノール及び水の混合物である
ことを特徴とするハーブ組成物の調製方法。
【請求項８】
請求項４又は請求項５に記載のハーブ組成物の調製方法であって、
前記溶媒抽出物は濃縮前に濾過される
ことを特徴とするハーブ組成物の調製方法。
【請求項９】
請求項４又は請求項５に記載のハーブ組成物の調製方法であって、
前記溶媒抽出物の濃縮は、前記抽出物を得るために、（ｉ）３０〜５０℃の減圧下（１５０〜６００ｍｍＨｇ（２０，０００〜８０，０００Ｐａ））での蒸留、（ｉｉ）凍結乾燥、及び（ｉｉｉ）噴霧乾燥から選択される１つ以上の方法を用いることによって行われる
ことを特徴とするハーブ組成物の調製方法。
【請求項１０】
請求項４又は請求項５に記載のハーブ組成物の調製方法であって、
前記抽出物を濃縮するために用いられる材料は、ポリアミド樹脂である
ことを特徴とするハーブ組成物の調製方法。
【請求項１１】
請求項４又は請求項５に記載のハーブ組成物の調製方法であって、
溶媒分配により前記抽出物を濃縮するための溶媒は、水、石油エーテル、ジクロロメタン、クロロホルム、酢酸エチル、メタノール、アセトン、アセトニトリル、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、及びブタノール又はこれらの混合物から選択される
ことを特徴とするハーブ組成物の調製方法。
【請求項１２】
請求項２又は請求項３に記載のハーブ組成物であって、
前記ハーブ組成物は、経口投与又は局所投与用に処方される
ことを特徴とするハーブ組成物。
【請求項１３】
請求項１２に記載のハーブ組成物であって、
前記ハーブ組成物はクリーム、ゲル又は軟膏の形態で局所投与用に処方される
ことを特徴とするハーブ組成物。
【請求項１４】
請求項１３に記載のハーブ組成物であって、
前記ハーブ組成物は５％〜５０％（ｗ／ｗ）の前記抽出物を含む
ことを特徴とするハーブ組成物。
【請求項１５】
請求項２又は請求項３に記載のハーブ組成物において、
前記ハーブ組成物は、単独で又は薬理学的に許容される担体と組み合わされて、植物インジゴフィーラ・ヘテランタ（Ｉｎｄｉｇｏｆｅｒａ  ｈｅｔｅｒａｎｔｈａ）の抽出物の治療有効量を含み、
前記ハーブ組成物を必要とする患者に投与することを含む、
ことを特徴とするウイルス感染の治療方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の治療方法であって、
前記ウイルス感染はＨＳＶを原因とする
ことを特徴とする治療方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の治療方法であって、
前記ウイルス感染はＨＳＶ−２を原因とする
ことを特徴とする治療方法。
【請求項１８】
請求項２又は請求項３に記載のハーブ組成物において、
ウイルス感染の治療のための、前記ハーブ組成物の使用。
【請求項１９】
請求項１８に記載のハーブ組成物の使用であって、
ＨＳＶを原因とするウイルス感染の治療のための、前記ハーブ組成物の使用。
【請求項２０】
請求項１９に記載のハーブ組成物の使用であって、
ＨＳＶ−２を原因とするウイルス感染の治療のための、前記ハーブ組成物の使用。
【請求項２１】
ウイルス感染治療薬の製造のために、単独で又は薬理学的に許容される担体と組み合わせての前記植物インジゴフィーラ・ヘテランタ（Ｉｎｄｉｇｏｆｅｒａ  ｈｅｔｅｒａｎｔｈａ）の抽出物の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野]
本発明は、抗ウイルス活性を有する植物インジゴフィーラ・ヘテランタ（Ｉｎｄｉｇｏｆｅｒａ  ｈｅｔｅｒａｎｔｈａ）の抽出物を含むハーブ組成物に関する。また、本発明は、前記ハーブ組成物の調製方法に関する。さらに、本発明は、ウイルス感染、具体的には単純ヘルペスウイルスを原因とするウイルス感染の治療のための前記ハーブ組成物の使用に関する。
［発明の背景］
ウイルスは、多くの重篤なもしくは生命を害するヒト疾患の病因になる。なかでも特に関心を引いているのが、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）、単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、及びヒトヘルペスウイルス６、７及び８（ＨＨＶ−６、ＨＨＶ−７及びＨＨＶ−８）等のヘルペスウイルスである。
【０００２】
単純ヘルペスは、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）を原因とするウイルス性疾患である。ＨＳＶ−１は、一般的に口唇ヘルペス（ｃｏｌｄ  ｓｏｒｅｓ）または単純ヘルペス（ｆｅｖｅｒ  ｂｌｉｓｔｅｒｓ）として知られる顔面ヘルペスと関連しており、一方、ＨＳＶ−２は、性器ヘルペスとより多く関連している。ＨＳＶを原因とする疾病は、免疫不全患者、特にＨＩＶ感染患者において重篤になる可能性がある。ＨＳＶは一次感染後、宿主に一生潜伏し続けるため、ＨＳＶ感染は終生感染と考えられている（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、２００２、１８６、Ｓ７１−Ｓ７７）。
【０００３】
抗ウイルス薬の中では、これまでのところアシクロビルが臨床使用で最も広く受け入れられてきた。アシクロビルは、グアニン類似体であり、ウイルスのＤＮＡポリメラーゼに干渉し、それによってウイルスＤＮＡ複製を阻害する（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗ、１９９４、７（１）、１−１３）。
【０００４】
アシクロビルは、ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２の治療に使用される。アシクロビルの成功により、１９８０年代初期に抗ＨＩＶ薬の創製が奨励され、臨床用として認可された最初の抗ＨＩＶ薬はアジドチミジン（ＡＺＴ）であった。１９９０年代中頃には、プロテアーゼ阻害剤の特異的な設計により、ウイルス複製に重要な役割を果たすウイルス酵素を標的化する新しい手法が促進された（Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、２００７、６、９４１）。
【０００５】
インジゴフィーラ・チンクトリア（Ｉｎｄｉｇｏｆｅｒａ  ｔｉｎｃｔｏｒｉａ）の植物全体のメタノール抽出物は、急性感染したＭＴ−４細胞中で複製するヒト免疫不全ウイルス１型（菌株ＨＴＬＶ−ＩＩＩBＬＡＩ）及びヒト免疫不全ウイルス２型（菌株ＬＡＶ−２ＲＯＤ）に対して活性であると報告されている（Ｈａｍｄａｒｄ  Ｍｅｄｉｃｕｓ、２０００、ｖｏｌ．４３（１）、５−７）。インジゴフィーラ・アスパラトイデス（Ｉｎｄｉｇｏｆｅｒａ  ａｓｐａｌａｔｈｏｉｄｅｓ）の茎のアルコール抽出物は、ＨＥＬ細胞培養（単純ヘルペスウイルス１型ＫＯＳ、単純ヘルペスウイルス２型Ｇ、ワクシニアウイルス、水疱性口内炎ウイルス、及び単純ヘルペスウイルス−ＴＫ  ＫＯＳ  ＡＣＶ）及びＨｅＬａ細胞培養（水疱性口内炎ウイルス、コクサッキーウイルスＢ４、及びＲＳウイルス）に対して活性であると報告されている（Ｐｈａｒｍａｃｏｇｎｏｓｙ  Ｍａｇａｚｉｎｅ、２００７、ｖｏｌ．３、１６３−１６６）。
【０００６】
ウイルス感染、具体的にヘルペス感染の予防及び治療のための有効な組成物及び方法が依然として求められている。ヘルペス感染の発生率及び重症度は、積極的な化学療法計画、臓器移植の拡大及びＨＩＶ感染発生率の上昇によって生じた免疫不全患者数の増加により、高くなった。
［発明の概要］
本発明は、植物インジゴフィーラ・ヘテランタ（Ｉｎｄｉｇｏｆｅｒａ  ｈｅｔｅｒａｎｔｈ）の抽出物の治療有効量を、単独で又は薬理学的に許容される担体と組み合わせて、含むハーブ組成物に関する。
【０００７】
また、本発明は、前記ハーブ組成物及び前記抽出物の調製方法に関する。
また、本発明は、前記ハーブ組成物の抗ウイルス活性に関する。
前記ハーブ組成物の抗ウイルス活性は、抗ＨＳＶ活性、具体的に抗ＨＳＶ−２活性である。
【０００８】
さらに、本発明は、前記ハーブ組成物の治療有効量を哺乳類に投与することを含む、哺乳類におけるウイルス感染の治療方法に関する。
また、本発明は、コンドームもしくは他のバリア装置を用いたウイルス感染予防のための前記ハーブ組成物の使用に関する。
【０００９】
本発明は、ウイルス感染の治療のための前記ハーブ組成物の使用を含む。
また、本発明は、ウイルス感染治療薬の製造のための、植物インジゴフィーラ・ヘテランタ（Ｉｎｄｉｇｏｆｅｒａ  ｈｅｔｅｒａｎｔｈａ）の抽出物の使用を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ベロ細胞株におけるＨＳＶ−２複製及び細胞生存率に対する実施例２の抽出物の効果。
【図２】ベロ細胞株におけるＨＳＶ−２複製及び細胞生存率に対する実施例５の抽出物の効果。
【図３】ベロ細胞株におけるＨＳＶ−２複製及び細胞生存率に対する実施例６の抽出物の効果。
【図４】ベロ細胞株におけるＨＳＶ−２複製及び細胞生存率に対する実施例７（ｄ）の抽出物の効果。
【図５Ａ】ＨＳＶ−２感染のマウス膣モデルに実施例１の抽出物を用いた治療効果の生存率プロット。
【図５Ｂ】ＨＳＶ−２感染のマウス膣モデルに実施例１の抽出物を用いた治療の膣外病変スコア。
【図６Ａ】ＨＳＶ−２感染のマウス膣モデルに製剤Ｉを用いた治療効果の生存率プロット。
【図６Ｂ】ＨＳＶ−２感染のマウス膣モデルに製剤Ｉを用いた治療の膣外病変スコア。
【図７Ａ】ＨＳＶ−２感染のマウス膣モデルに製剤ＩＩを用いた治療効果の生存率プロット。
【図７Ｂ】ＨＳＶ−２感染のマウス膣モデルに製剤ＩＩを用いた治療の膣外病変スコア。
【図８Ａ】ＨＳＶ−２感染のマウス膣モデルに製剤ＩＩＩを用いた治療効果の生存率プロット。
【図８Ｂ】ＨＳＶ−２感染のマウス膣モデルに製剤ＩＩＩを用いた治療の膣外病変スコア。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
［発明の詳細な説明］
本発明について詳述する前に、本発明は具体的な実施形態に限定されないことが理解されなければならない。また、本開示中で使用される用語は、単に具体的な実施形態の説明を目的としており、限定を意図しないことを理解すべきである。
【００１２】
本明細書及び特許請求の範囲において、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないこと示さなければ、複数の場合を含む。
別途定義されない限り、本開示中で使用される全ての技術用語及び化学用語は、本発明の属する分野の当業者が一般的に理解するのと同じ意味を有する。
【００１３】
本開示中で使用される「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、予防的（予防）治療を含む。
本開示中で使用される「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、対症療法を含む。
【００１４】
また、「インジゴフィーラ・ヘテランタ（Ｉｎｄｉｇｏｆｅｒａ  ｈｅｔｅｒａｎｔｈａ）」という用語は、「インジゴフィーラ・ゲラディアナ（Ｉｎｄｉｇｏｆｅｒａ  ｇｅｒａｒｄｉａｎａ）」等のような同義語を含む。
【００１５】
本開示中に記載される「抽出物」又は「単離された抽出物」は、植物インジゴフィーラ・ヘテランタ（Ｉｎｄｉｇｏｆｅｒａ  ｈｅｔｅｒａｎｔｈａ）中に存在する、又は植物インジゴフィーラ・ヘテランタ（Ｉｎｄｉｇｏｆｅｒａ  ｈｅｔｅｒａｎｔｈａ）から得られる化合物の混合物を意味する。このような化合物の混合物は、溶媒を使用して、植物インジゴフィーラ・ヘテランタ（Ｉｎｄｉｇｏｆｅｒａ  ｈｅｔｅｒａｎｔｈａ）の植物全体、又は根、小枝、茎、葉及び花序等のような植物の部分を抽出し、その後任意にさらに濃縮することによって得られる。
【００１６】
本開示中に記載される「ハーブ組成物」は、植物インジゴフィーラ・ヘテランタ（Ｉｎｄｉｇｏｆｅｒａ  ｈｅｔｅｒａｎｔｈａ）の抽出物の治療有効量を、単独で又はその抽出物と薬理学的に許容される担体と組み合わせて、含む組成物を意味する。
【００１７】
本開示中で使用される「治療有効量」という用語は、ウイルスの感染を予防するのに有効な植物インジゴフィーラ・ヘテランタ（Ｉｎｄｉｇｏｆｅｒａ  ｈｅｔｅｒａｎｔｈａ）の抽出物の量、及び／又はウイルス感染に関連して、又はウイルス感染を原因とする皮膚病変、ただれ、口唇ヘルペス、水ぶくれ、いぼ、しこり、隆起、吹き出物、発疹及び潰瘍の症状を緩和、治療及び／又は予防する等の所望の治療反応が得られる植物インジゴフィーラ・ヘテランタ（Ｉｎｄｉｇｏｆｅｒａ  ｈｅｔｅｒａｎｔｈａ）の抽出物の量、を意味する。
【００１８】
「薬理学的に許容される」により、担体、希釈剤、賦形剤、及び／又は塩は、その製剤の他の成分と適合可能でなければならず、又、そのレシピエントに有害でないことが意味される。
【００１９】
本開示中で使用される「薬理学的に許容される担体」という用語は、無毒性、不活性固体、半固体、希釈剤、カプセル化材料又は各種の製剤補助剤を意味する。薬理学的に許容される担体としての役割を果たすことができる物質の非限定的な例として、ラクトース、グルコース及びスクロース等のような糖類、トウモロコシデンプン及びジャガイモデンプン等のようなデンプン類、セルロース、及びカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース及びセルロースアセテート等のようなセルロース誘導体、麦芽、ゼラチン、タルク、及び、ラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウム等のようなその他の無毒性の適合可能な潤滑剤、及び、着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、香料添加剤、芳香剤、フェノリップ（ｐｈｅｎｏlｉｐ）、メチルパラベン及びブチルパラベン等のような防腐剤、抗酸化剤、油又は、蜜ろう、カルマウバ・ワックス（ｃａｒｍａｕｂａ  ｗａｘ）、硬ろう（ｈａｒｄ  ｗａｘ）、黄ろう及びセチルエステル等のようなワックス、乳化剤、パラフィン、ラノリンアルコール、白色ワセリン、黄色ワセリン、羊毛アルコール、ワセリン及び石油ワックス等のようなペトロラタム、プロピレングリコール、メチルグリコール及びメチルエチレングリコール等のようなグリコール類、カーポポールｃａｒｐｏｐｏｌ  ９７４Ｐ等のようなカルボマー類、セトステアリルアルコール等のようなポリオキシエチレンアルキルエーテル類、トリエタノールアミン等のような可塑剤、溶媒及び親水性ゲル化剤も、処方者の判断により、組成物中に含んでもよい。
【００２０】
植物インジゴフィーラ・ヘテランタ・ワリッチ・イーエックス・ブランディス（Ｉｎｄｉｇｏｆｅｒａ  ｈｅｔｅｒａｎｔｈａ  Ｗａｌｌｉｃｈ  ｅｘ  Ｂｒａｎｄｉｓ）は、インドのヒマラヤ山脈西部に一般に分布する種である。この種の植物全体、又は根、小枝、茎、葉及び花序等のような植物の部分を、インドのウッタラーカンドの山々から収集した。これらの採取したばかりの植物又は採取したばかりの植物の部分を乾燥した。分類学的評価のため、開花部及び結実部の押し葉標本を収集し、インドのムンバイに所在するピラマル・ライフ・サイエンシーズ・リミテッド（Ｐｉｒａｍａｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）の植物標本部門に預けた。形態学的特徴に基づき、標本をインジゴフィーラ・ゲラディアナ・ワリッチ・イーエックス・ベイカー（Ｉｎｄｉｇｏｆｅｒａ  ｇｅｒａｒｄｉａｎａ  Ｗａｌｌｉｃｈ  ｅｘ  Ｂａｋｅｒ）であると特定した。インジゴフィーラ・ゲラディアナ・ワリッチ・イーエックス・ベイカー（Ｉｎｄｉｇｏｆｅｒａ  ｇｅｒａｒｄｉａｎａ  Ｗａｌｌｉｃｈ  ｅｘ  Ｂａｋｅｒ）は、現在では分類学的に有効な種であるインジゴフィーラ・ヘテランタ・ワリッチ・イーエックス・ブランディス（Ｉｎｄｉｇｏｆｅｒａ  ｈｅｔｅｒａｎｔｈａ  Ｗａｌｌｉｃｈ  ｅｘ  Ｂｒａｎｄｉｓ）と同義語である（Ｆａｓｃｉｃｌｅｓ  ｏｆ  Ｆｌｏｒａ  ｏｆ  Ｉｎｄｉａ、Ｆａｓｃｉｃｌｅ  ２１、Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ−Ｐａｐｉｌｉｏｎｏｉｄｅａｅ：Ｔｒｉｂｅ−Ｉｎｄｉｇｏｆｅｒｅａｅ、１９９５、７６−７９）。本発明で入手及び使用される抽出物は、ヒマラヤ山脈西部で生育する植物インジゴフィーラ・ヘテランタ（Ｉｎｄｉｇｏｆｅｒａ  ｈｅｔｅｒａｎｔｈａ）から入手されるものに限定されず、任意の植物インジゴフィーラ・ヘテランタ（Ｉｎｄｉｇｏｆｅｒａ  ｈｅｔｅｒａｎｔｈａ）から抽出物を入手してもよい。
【００２１】
本発明は、植物インジゴフィーラ・ヘテランタ（Ｉｎｄｉｇｏｆｅｒａ  ｈｅｔｅｒａｎｔｈａ）の植物全体又は１つ以上の部分から単離された抽出物に関する。この抽出物は、溶媒中で撹拌し、抽出物を濃縮し、及び任意に溶媒分配又はクロマトグラフィーによって溶媒中の抽出物を濃縮することにより得られる。
【００２２】
さらに、本発明は、植物インジゴフィーラ・ヘテランタ（Ｉｎｄｉｇｏｆｅｒａ  ｈｅｔｅｒａｎｔｈａ）の植物全体又は１つ以上の部分の抽出物の治療有効量を単独で又は前記抽出物と薬理学的に許容される担体と組み合わせて含むハーブ組成物に関し、植物インジゴフィーラ・ヘテランタ（Ｉｎｄｉｇｏｆｅｒａ  ｈｅｔｅｒａｎｔｈａ）の植物全体又は１つ以上の部分の抽出物は、抽出物を溶媒中で植物インジゴフィーラ・ヘテランタ（Ｉｎｄｉｇｏｆｅｒａ  ｈｅｔｅｒａｎｔｈａ）の植物全体又は１つ以上の部分を撹拌し、濃縮し、及び任意に溶媒分配又はクロマトグラフィーによって濃縮することにより調製される。
【００２３】
また、本発明は、植物インジゴフィーラ・ヘテランタ（Ｉｎｄｉｇｏｆｅｒａ  ｈｅｔｅｒａｎｔｈａ）の抽出物を含むハーブ組成物の調製方法に関する。この調製方法は、以下の工程を含む。
【００２４】
（ａ）４０〜５０℃で２〜２４時間、１：５〜１：４０の重量／体積の比率で溶媒中で撹拌することにより、植物インジゴフィーラ・ヘテランタ（Ｉｎｄｉｇｏｆｅｒａ  ｈｅｔｅｒａｎｔｈａ）の植物全体又は１つ以上の部分からの抽出物を調製する工程
（ｂ）工程（ａ）で得られた溶媒抽出物を濃縮する工程
（ｃ）任意に、工程（ｂ）で得られた抽出物を高真空下（０．０１〜５ｍｍＨｇ）で乾燥する工程
（ｄ）任意に、ポリアミド樹脂、ゼラチン／塩化ナトリウム溶液、ポリビニルピロリドン、カフェイン、酢酸鉛（ＩＩ）又は皮粉から選択される材料を使用して、工程（ｂ）又は工程（ｃ）で得られた抽出物を濃縮する工程
（ｅ）任意に、溶媒分配又はクロマトグラフィーによって、工程（ｂ）、工程（ｃ）又は工程（ｄ）で得られた抽出物を濃縮する工程、及び
（ｆ）任意に、工程（ｂ）、工程（ｃ）、工程（ｄ）又は工程（ｅ）の抽出物を薬理学的に許容される担体と混合する工程
本発明の一態様において、植物インジゴフィーラ・ヘテランタ（Ｉｎｄｉｇｏｆｅｒａ  ｈｅｔｅｒａｎｔｈａ）の根の抽出物を含むハーブ組成物の調製方法は、以下の工程を含む：
（ａ）４０〜５０℃で２〜２４時間、１：５〜１：４０の重量／体積の比率で溶媒中で撹拌することにより、植物インジゴフィーラ・ヘテランタ（Ｉｎｄｉｇｏｆｅｒａ  ｈｅｔｅｒａｎｔｈａ）の根から抽出物を調製する工程
（ｂ）工程（ａ）で得られた溶媒抽出物を濃縮する工程
（ｃ）任意に、工程（ｂ）で得られた抽出物を高真空下（０．０１〜５ｍｍＨｇ）で乾燥する工程
（ｄ）任意に、ポリアミド樹脂、ゼラチン／塩化ナトリウム溶液、ポリビニルピロリドン、カフェイン、酢酸鉛（ＩＩ）又は皮粉から選択される材料を使用して、工程（ｂ）又は工程（ｃ）で得られた抽出物を濃縮する工程
（ｅ）任意に、溶媒分配又はクロマトグラフィーによって、工程（ｂ）、工程（ｃ）又は工程（ｄ）で得られた抽出物をさらに濃縮する工程、及び
（ｆ）任意に、工程（ｂ）、工程（ｃ）、工程（ｄ）又は工程（ｅ）で得られた抽出物を薬理学的に許容される担体と混合する工程
本発明の一態様において、植物インジゴフィーラ・ヘテランタ（Ｉｎｄｉｇｏｆｅｒａ  ｈｅｔｅｒａｎｔｈａ）の植物全体又は１つ以上の部分を抽出するための溶媒は、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、アセトン、酢酸エチル、ジクロロメタン、水、又はこれらの混合物から選択され、メタノールと水の混合物又はエタノールと水の混合物であると好ましい。
【００２５】
本発明の別の態様において、溶媒抽出物は濃縮前に濾過される。
本発明の別の態様において、抽出物を得るために、（ｉ）３０〜５０℃で減圧下（１５０〜６００ｍｍＨｇ）での蒸留、（ｉｉ）凍結乾燥、及び（ｉｉｉ）噴霧乾燥から選択される１つ以上の方法を用いて行われる。
【００２６】
本発明のさらに別の態様において、抽出物は、ポリアミド樹脂、ゼラチン／塩化ナトリウム溶液、ポリビニルピロリドン、カフェイン、酢酸鉛（ＩＩ）又は皮粉（皮から得られるコラーゲン材料）等のような材料用いて濃縮される。ポリアミド樹脂を、抽出物：ポリアミド樹脂比が１：３〜１：５になるように用いると好ましい。
【００２７】
本発明の別の態様において、抽出物を溶媒分配で濃縮するための溶媒は、水、石油エーテル、ジクロロメタン、クロロホルム、酢酸エチル、メタノール、アセトン、アセトニトリル、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、及びブタノール、又はこれらの混合物から選択される。
【００２８】
本発明の別の態様において、クロマトグラフィーによる抽出物の濃縮は、以下の方法の１つ以上により行われることができる。
順相クロマトグラフィー（アルミナ又はシリカゲルを使用）
逆相クロマトグラフィー（ジメチルオクタデシルシリルシリカゲル（ＲＰ−１８）又はジメチルオクチルシリルシリカゲル（ＲＰ−８）等のような逆相シリカゲルを使用）
ゲル浸透クロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０（登録商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、スウェーデン）、又はセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ：登録商標）Ｇ−１０及びＧ−２５等のような樹脂を使用）、又は
向流クロマトグラフィー（二相溶離システムを使用）
これらの技術は、繰り返して、単独で又は他と組み合わせて用いてもよい。
【００２９】
さらに、本発明は、植物インジゴフィーラ・ヘテランタ（Ｉｎｄｉｇｏｆｅｒａ  ｈｅｔｅｒａｎｔｈａ）の抽出物を含むハーブ組成物を、それを必要とする哺乳類に投与することを含む、ウイルス感染の治療方法に関する。
【００３０】
さらに、本発明は、具体的にＨＳＶ、さらに具体的にはＨＳＶ−２を原因とするウイルス感染の治療のための、ウイルス感染の治療方法に関する。この治療方法は、必要とする哺乳類に、植物インジゴフィーラ・ヘテランタ（Ｉｎｄｉｇｏｆｅｒａ  ｈｅｔｅｒａｎｔｈａ）の抽出物を含むハーブ組成物を投与することを含む。
【００３１】
本発明は、また、ウイルス感染の治療のための、具体的にＨＳＶ、さらに具体的にはＨＳＶ−２を原因とするウイルス感染の治療のための、植物インジゴフィーラ・ヘテランタ（Ｉｎｄｉｇｏｆｅｒａ  ｈｅｔｅｒａｎｔｈａ）の抽出物を含むハーブ組成物の使用に関する。
【００３２】
本発明は、また、ウイルス感染治療薬、さらに具体的にはＨＳＶを原因とするウイルス感染の治療薬を製造するための、インジゴフィーラ・ヘテランタ（Ｉｎｄｉｇｏｆｅｒａ  ｈｅｔｅｒａｎｔｈａ）の抽出物の使用に関する。
【００３３】
本発明の一態様において、治療対象となる哺乳類又は、植物インジゴフィーラ・ヘテランタ（Ｉｎｄｉｇｏｆｅｒａ  ｈｅｔｅｒａｎｔｈａ）の抽出物を含むハーブ組成物の使用の対象となる哺乳類は、ウイルス感染の診断を受けたヒトである。より具体的には、治療対象の哺乳類は、ＨＳＶ感染の診断を受けたヒトである。
【００３４】
本発明の別の態様において、治療対象の哺乳類は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染の診断を受け、ＨＳＶ−２との同時感染に対する予防的手段としてハーブ組成物を投与されるヒトである。
【００３５】
本発明のさらに別の態様において、治療対象の哺乳類は、性感染症（ＳＴＩ）に対する予防的手段としてハーブ組成物を投与されるヒトである。
本発明の一態様において、ウイルス感染の治療方法は、以下のような公知の投与経路、投与方法等による上述のハーブ組成物の投与を含む。
【００３６】
ハーブ組成物は、例えば丸剤、錠剤、コーティング錠、カプセル剤、顆粒剤、  液剤、エリキシル剤又はシロップの形態で、経口投与されることができる。
植物インジゴフィーラ・ヘテランタ（Ｉｎｄｉｇｏｆｅｒａ  ｈｅｔｅｒａｎｔｈａ）の抽出物は、従来のベースに混合されて、約５〜９９重量％の抽出物を含む経口剤を調製するために使用される。
【００３７】
ハーブ組成物は、局所投与又は経皮投与に用いることができる。本発明において有用なハーブ組成物は、皮膚に対する局所投与又は経皮投与、粘膜投与、又はコンドーム又は他のバリア装置との併用投与に適した剤型を含む。ハーブ組成物は、ローション、クリーム、ゲル、粘着剤、貼付剤、膣坐剤又はペッサリー、スプレー又は軟膏を含むがこれらに限定されない様々な製品タイプに調剤されることができる。
【００３８】
植物インジゴフィーラ・ヘテランタ（Ｉｎｄｉｇｏｆｅｒａ  ｈｅｔｅｒａｎｔｈａ）の抽出物は、従来のベースに混合されて、約５〜９９重量％、好ましくは５〜５０重量％の抽出物を含む局所用製剤又は経皮用製剤が調製される。
【００３９】
植物インジゴフィーラ・ヘテランタ（Ｉｎｄｉｇｏｆｅｒａ  ｈｅｔｅｒａｎｔｈａ）の抽出物は、患者に対して有毒になる又は重篤な副作用を引き起こすことがなく、特定の患者に対して所望の治療応答を達成するために有効な量で、本発明のハーブ組成物に存在する。選択される量は、適用される本発明の抽出物の活性、投与経路、投与時期、適用する具体的な組成物の排泄速度、治療期間、患者の年齢、性別、体重、症状、治療される患者の一般的な健康状態及びそれまでの治療暦、並びに医療分野で公知の要因等の様々な要因によって決まるだろう。
【００４０】
植物インジゴフィーラ・ヘテランタ（Ｉｎｄｉｇｏｆｅｒａ  ｈｅｔｅｒａｎｔｈａ）の抽出物の有効性は、次の実施例で詳細に説明される生物学的アッセイによって確立された。これらの実施例は、本開示では、単に例示することを目的として提供されるものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
［実施例］
実施例１
植物インジゴフィーラ・ヘテランタ（Ｉｎｄｉｇｏｆｅｒａ  ｈｅｔｅｒａｎｔｈａ）の根のメタノール抽出物の調製
採取したばかりのインジゴフィーラ・ヘテランタ（Ｉｎｄｉｇｏｆｅｒａ  ｈｅｔｅｒａｎｔｈａ）の根を乾燥し（３５０ｇ）、微粉砕した。４５℃に維持した水浴内に配置したステンレス製容器内で、一定に撹拌しながらこの荒く挽いた材料を３．５Ｌのメタノールに８時間浸した。抽出物を濾過し、残渣を室温で３．５Ｌのメタノールに１６時間浸漬し、濾過した。抽出物を合わせて、ロータリーエバポレーターを使って４５℃で５時間ライン真空下（約５００ｍｍＨｇ）濃縮し、スピードバック（Ｓｐｅｅｄ  Ｖａｃ：登録商標）プラス（Ｐｌｕｓ）（Ｓａｖａｎｔ、米国）を使って約４０〜５０℃で８時間乾燥し、２５．７８ｇの抽出物を得た。
抽出物の色は濃褐色で、抽出物は水に部分的に溶解する。
【００４１】
［実施例２］
植物インジゴフィーラ・ヘテランタ（Ｉｎｄｉｇｏｆｅｒａ  ｈｅｔｅｒａｎｔｈａ）の根の水抽出物の調製
採取したばかりのインジゴフィーラ・ヘテランタ（Ｉｎｄｉｇｏｆｅｒａ  ｈｅｔｅｒａｎｔｈａ）の根を乾燥し（１００ｇ）、微粉砕した。２Ｌ三角フラスコに微粉砕した根を入れて１０００ｍＬの水を加え、、４５℃で３時間ホットプレート上でマグネチックスターラーを使って一定に撹拌した。抽出物をライン真空下（約５００ｍｍＨｇ）で濾過した。フリーズ・ドライヤー（Ｆｒｅｅｚｅ  Ｄｒｙｅｒ）（Ｅｄｗａｒｄｓ、イタリア）を使ってこの濾液（８００ｍＬ）を８時間凍結乾燥し、６．５ｇの抽出物を得た。
抽出物の色は褐色である。
【００４２】
［実施例３］
実施例１の抽出物の濃縮
ボルテックススターラー及びソニケーターを用いて、実施例１の抽出物（１１２ｍｇ）を８ｍＬのメタノール中に溶解した。この抽出物に３００ｍｇのポリアミド６樹脂（Ｍａｃｈｅｒｅｙ  Ｎａｇｅｌ、ドイツ）を加え、ボルテックスし、４５分間放置して濾過した。スピードバック（Ｓｐｅｅｄ  Ｖａｃ：登録商標）プラス（Ｐｌｕｓ）（Ｓａｖａｎｔ、米国）を使って濾液を１２時間乾燥し、５４．６ｍｇの抽出物を得た。
抽出物の色は琥珀色で、抽出物は水に部分的に溶解する。
【００４３】
［実施例４］
実施例３の抽出物の濃縮
実施例３の抽出物（５ｇ、実施例３によって調製された）を室温（２５℃）で１００ｍＬの水：メタノール（９：１）混合液中で懸濁し、３００ｍＬ（１００ｍＬ×３）の石油エーテルで超音波処理と分配を３回連続して行った。
上記工程から得られた水層を３００ｍＬ（１００ｍＬ×３）のクロロホルムで３回連続して分配した。
上記工程から得られた水層を３００ｍＬ（１００ｍＬ×３）の酢酸エチルで３回連続して分配した。
上記工程から得られた最終的な水層を、ライン真空下（約５００ｍｍＨｇ）のロータリーエバポレーターで濃縮し、その後凍結乾燥し、１．１９ｇの淡褐色の抽出物を得た。
【００４４】
［実施例５］
植物インジゴフィーラ・ヘテランタ（Ｉｎｄｉｇｏｆｅｒａ  ｈｅｔｅｒａｎｔｈａの根の含水アルコール（メタノール：水）抽出物の調製
インジゴフィーラ・ヘテランタ（Ｉｎｄｉｇｏｆｅｒａ  ｈｅｔｅｒａｎｔｈａ）の根を乾燥し（２００ｇ）、微粉砕し、４０±５℃に維持された水浴中で３時間一定に撹拌しながら１．６Ｌのメタノール：水（１：１）中に浸した。抽出物を濾過し、残渣を１．６Ｌのメタノール：水（１：１）中に浸し、同じプロセスをさらに２回繰り返した。抽出物を合わし、ロータリーエバポレーターを使用して４５℃でライン真空（約５００ｍｍＨｇ）下で濃縮し、スピードバック（Ｓｐｅｅｄ  Ｖａｃ：登録商標）プラス（Ｐｌｕｓ）（Ｓａｖａｎｔ、米国）を使用して乾燥し、２８．９７ｇの抽出物を得た。
抽出物の色は濃褐色である。
【００４５】
［実施例６］
植物インジゴフィーラ・ヘテランタ（Ｉｎｄｉｇｏｆｅｒａ  ｈｅｔｅｒａｎｔｈａの根の含水アルコール（エタノール：水）抽出物の調製
インジゴフィーラ・ヘテランタ（Ｉｎｄｉｇｏｆｅｒａ  ｈｅｔｅｒａｎｔｈａ）の根を乾燥して（２００ｇ）、微粉砕し、４０±５℃に維持した水浴中で３時間一定に撹拌しながら１．６Ｌのエタノール：水（１：１）中に浸した。抽出物を濾過し、残渣を１．６Ｌのエタノール：水（１：１）中に浸し、同じプロセスをさらに２回繰り返した。抽出物を合わし、ロータリーエバポレーターを使って４５℃でライン真空下（約５００ｍｍＨｇ）で濃縮し、スピードバック（Ｓｐｅｅｄ  Ｖａｃ：登録商標）プラス（Ｐｌｕｓ）（Ｓａｖａｎｔ、米国）を使って乾燥し、２９．８９ｇの抽出物を得た。
抽出物の色は濃褐色である。
【００４６】
［実施例７］
実施例１の抽出物の濃縮
（ａ）室温（２５℃）で実施例１の抽出物（１５０ｇ）を２Ｌの水中で懸濁し、超音波処理した。抽出物を濾過し、水性濾液を得た。フリーズ・ドライヤー（Ｆｒｅｅｚｅ  Ｄｒｙｅｒ）（Ｅｄｗａｒｄｓ、イタリア）を使って残渣（３７．０５ｇ）を凍結乾燥した。
（ｂ）工程（ａ）で収集した水性濾液を３００ｍＬ（１００ｍＬ×３）のクロロホルムで連続して３回分配し、水層及びクロロホルム層を得た。このクロロホルム層を４５℃で減圧下濃縮し、０．４２５ｇのクロロホルム画分を得た。
（ｃ）工程（ｂ）から得られた水層を３００ｍＬ（１００ｍＬ×３）の酢酸エチルで連続して３回分配し、水層及び酢酸エチル層を得た。この酢酸エチル層を４５℃で減圧下で濃縮し、３．７３７ｇの酢酸エチル画分を得た。
（ｄ）工程（ｃ）から得られた水層を減圧下で濃縮して凍結乾燥し、８９ｇの水性画分［実施例７（ｄ）］を得た。
（ｅ）工程（ｄ）から得られた１ｇの乾燥した水性画分を５０ｍＬの酢酸エチルを用いて１時間還流し、濾過した。濃縮後、０．０５３ｇの酢酸エチル濾液及び０．８５３ｇの酢酸エチル残渣［実施例７（ｅ）］を得た。
【００４７】
［実施例８］
植物インジゴフィーラ・ヘテランタ（Ｉｎｄｉｇｏｆｅｒａ  ｈｅｔｅｒａｎｔｈａ）の根からの実施例５の抽出物、実施例６の抽出物及び実施例７（ｄ）の抽出物の製剤の調製
クリームの調製のための一般的手順
必要量の成分６（表１、表２及び表３を参照）を適切なガラス／ステンレス製容器に加えた。この容器に成分１を加え、メカニカルスターラーを使って溶解／分散した。温度は６０〜７５℃に維持した。この溶液に一定に撹拌しながら成分４及び５を加えた。成分２及び３を融解し、一定に撹拌しながら前記容器に加えた。温度は緩やかに室温（２５℃）に下げた。
【００４８】
【表１】
2012503644.tif 000002
【００４９】
【表２】
2012503644.tif 000003
【００５０】
【表３】
2012503644.tif 000004
【００５１】
［実施例９］
実施例１の抽出物の製剤の調製
ゲルの調製のための一般的手順
秤量した量の成分２（表４を参照）を温水中で溶解した。この容器に成分１を加え、メカニカルスターラーを使って溶解／分散した。得られた溶液を室温まで冷却し、撹拌しながら成分３を数滴加え、透明のゲルを得た。
【００５２】
【表４】
2012503644.tif 000005
【００５３】
ｑｓ：十分な量
［生物学的評価］
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗ウイルスアッセイ
［実施例１０］
ウイルスストックの調製
使用材料：
・細胞株：ベロ（アフリカミドリザルの腎臓細胞株の腎臓上皮細胞−
Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
（ＡＴＣＣ）＃ＣＣＬ−８１）
・ウイルス：ＨＳＶ−２（ＡＴＣＣ株ＶＲ−７３４及び国立ウイルス研究所（Ｐｕｎｅ、インド）の臨床株Ｎｏ．７５３１６７
・培地：ダルベッコ改変イーグル培地
（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ、米国、Ｃａｔ．Ｎｏ．：１２４３０）
・血清：ウシ胎仔血清
（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ、米国、Ｃａｔ．Ｎｏ．：１６０００−０４４）
・トリプシン−ＥＤＴＡ溶液：０．２５％トリプシン−エチレンジアミン四酢酸（トリプシン−ＥＤＴＡ、Ｇｉｂｃｏ、米国、Ｃａｔ．Ｎｏ．：２５２００）
・標準成分：アシクロビル（Ｍｅｄｉｃｏｒｐ、Ｈｙｄｅｒａｂａｄ、インド）
・プラスチックウエア：細胞培養フラスコ２５ｃｍ2
（Ｎｕｎｃ、米国、Ｃａｔ．Ｎｏ．：１５６３６７）
：組織培養フラスコ７５ｃｍ2
（Ｎｕｎｃ、米国、Ｃａｔ．Ｎｏ．：１５６４９９）
：遠心管１５ｍＬ
（Ｎｕｎｃ、米国、Ｃａｔ．Ｎｏ．：３６６０６０）
：遠心管５０ｍＬ
（Ｎｕｎｃ、米国、Ｃａｔ．Ｎｏ．：３７３６８７）
：平底９６ウエルプレート
（Ｎｕｎｃ、米国、Ｃａｔ．Ｎｏ．：１６７００８）
・染料：クリスタルバイオレット（Ｓｉｇｍａ、米国、Ｃａｔ．Ｎｏ．：
Ｃ３８８６−２５Ｇ）
・抗生物質−抗真菌剤混合物（Ｇｉｂｃｏ、米国、Ｃａｔ．Ｎｏ．：１５２４０）
［工程１］
細胞株の維持
「Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００５，６７，２４−３０」で報告されているように細胞株の維持を実施した。
【００５４】
ＡＴＣＣから得られたベロ細胞株は、正常な大人のアフリカミドリザルの腎臓に由来する。この細胞株は、完全増殖培地中で、即ち１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及び１×抗生物質−抗真菌剤混合液を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、増殖させた。継代培養のために、細胞単層を有するＴ−２５組織培養フラスコを選択した。フラスコからＤＭＥＭを取り除き、トリプシン阻害剤を含む血清の全ての痕跡を除去するために無血清ＤＭＥＭで簡単にリンスした。１ｍＬのトリプシン−ＥＤＴＡ溶液をフラスコに加え、細胞単層が分散するまで（通常３〜５分間以内）倒立顕微鏡で観察した。直ちに、１４ｍＬの完全増殖培地を加え、緩やかなピペット操作で細胞を吸引した。３つの異なるＴ−２５細胞培養フラスコにそれぞれ５ｍＬの細胞懸濁液を加え、１：３の継代培養比を得た。これらのフラスコは、５％ＣＯ2で３７℃に維持された.
［工程２］
ウイルス（ＨＳＶ−２）の増殖
「Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００５，６７，２４−３０」に報告されているようにウイルスの増殖を実施した。
【００５５】
性器感染症のヒト由来の市販の菌株ＨＳＶ−２をＡＴＣＣから入手した（ＡＴＣＣ  ＶＲ−７３４、ウイルス力価１０5.75  ＴＣＩＤ50／０．２ｍＬ）。ＨＳＶ−２の増殖のため、標的細胞としてベロ細胞株を使用した。ウイルス感染のため、（工程１で得られた）ベロ細胞の２４〜４８時間が経過した８０〜９０％融合性単層を有するＴ−７５組織培養フラスコを選択した。感染当日、１０3.1  ＴＣＩＤ50／０．２ｍＬに相当する本来の力価のＨＳＶ−２接種材料１ｍＬをベロ細胞に接種し、ウイルス吸着のため３７℃で３０分間培養した。培養後、１０ｍＬの維持培地（２％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ）をフラスコに加え、５％ＣＯ2で４８時間、細胞単層が完全に破壊されるまで３７℃で培養した。細胞変性効果（ＣＰＥ）を調べるため、顕微鏡を使って毎日２回フラスコを観察した。ＣＰＥは、ウイルスを原因とする細胞の円形化及び拡大並びに融合細胞及び封入体形成等の細胞形態学的変化である。４８時間の培養後、細胞を完全に破壊してウイルスを培地に放出するため、フラスコに対して凍結融解サイクルを２〜３回繰り返した。遠心分離（１０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）により細胞片を除去し、ウイルスストックであるその上清を一定分量で、−８０℃で保管した。以下の手法でウイルスストックの力価を決定した。
【００５６】
［工程３（Ａ）］
ＣＰＥアッセイによるウイルス力価の決定
本アッセイは「Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．、２００６、１２：４０７８−４０８１」に報告されているように実施された。
【００５７】
ＣＰＥアッセイでウイルス力価を決定し、組織培養感染量５０（ＴＣＩＤ50）として表した。（工程１で得られた）ベロ細胞を９６ウェルプレートに密度２×１０4細胞／１００μＬ／ウェルで播種し、培養密度８０〜９０％になるように３７℃で５％ＣＯ2で２４時間培養した。維持培地（２％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ）中で、（工程２で得られた）ウイルスストックの段階希釈を行った（１０-1〜１０-8）。培養プレートから増殖培地を除去し、ウイルスの希釈液各１００μＬを使ってベロ細胞を感染させた。維持培地のみを有するベロ細胞を対照細胞とした。感染後、４８時間ＣＯ2インキュベーターで３７℃、培養プレートをインキュベートした。４８時間の培養後、ウイルス希釈液を播種したウェル中でＣＰＥを倒立顕微鏡で検証した。対照ウイルスが最大ＣＰＥを示した時点で、培地を除去し、感染した単層を固定し、ホルマリン（１０％）及びクリスタルバイオレット（１％）を含む溶液を使って３０分間染色した。３０分後、染料を吸引して取り除き、余分な染料が全て洗い出されるまで蒸留水でプレートをリンスした。一晩プレートを放置して乾燥させた。「Ａｍ．Ｊ．Ｈｙｇ．，１９３８，２７，４９３−４９７」の記載に従ってウイルス力価（ＴＣＩＤ50）を算出した。ＴＣＩＤ50は、接種した培養物の５０％にＣＰＥが生じる用量を表す。
結果：本実験におけるＴＣＩＤ50の数値は、３．９８×１０6であった。
【００５８】
［工程３（Ｂ）］
プラークアッセイによるウイルス力価の決定
本アッセイ「Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．,２００５，６７（１）：２４−３０」に報告されているように実施された。
【００５９】
さらに、プラークアッセイでもウイルス力価を決定し、１ｍＬ当りプラーク形成単位（ｐｆｕ／ｍＬ）として表した。（工程１で得られた）ベロ細胞をトリプシン処理し、カウントし、２４ウェルプレート中に密度２×１０5細胞／ｍＬ／ウェルで撒き、８０〜９０％培養密度となるように、５％ＣＯ2で２４時間３７℃で培養した。（工程２で得られたウイルスストックから）ウイルスの１０-2〜１０-7の段階希釈液を、維持培地（２％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ）を使って調製した。プレートから増殖培地を除去し、細胞が除去されないように気をつけながらウイルスの希釈液各０．２ｍＬを各ウェルに加えた。１５分毎に振盪しながら、５％ＣＯ2で１時間、感染した単層を３７℃で培養した。培養の終了後、１％ＣＭＣを１ｍＬずつ各ウェルに加え、プレートを４８時間培養した。その後、細胞を固定し、ホルマリン（１０％）とクリスタルバイオレット（１％）を含む溶液で３０分間染色した。３０分が経過した後、染料を吸引して取り除き、余分な染料が全て洗い出されるまでプレートを蒸留水でリンスした。これらのプレートは、一晩放置して乾燥させた。プラークをカウントし、１ｍＬ当りのプラーク形成単位（ｐｆｕ／ｍＬ）で表されるウイルス力価を見積もった。
ウイルス力価＝（生成プラーク数×ウイルスの希釈×接種材料量）
結果：プラークアッセイによって決定されたウイルス力価は１．４×１０7ｐｆｕ／ｍＬであった。
【００６０】
［実施例１１］
ＣＰＥ阻害アッセイにより一次抗ウイルススクリーニング試験を行った。
方法Ａ：ＣＰＥ阻害アッセイ−クリスタルバイオレット染色方法
アッセイは、ウイルス複製サイクルの任意の段階で作用する薬剤（この場合、抽出物）を検出するために設計された。このアッセイは「Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．，２００４，１２０：２４−２９」に報告されているように実施された。
【００６１】
（実施例１０の工程１で得られた）ベロ細胞を９６ウェルプレート中で密度１×１０4細胞／ウェルで増殖させ、ＣＯ2インキュベーター内で２４時間、３７℃で培養し、単層を形成させた。実施例１の抽出物、実施例２の抽出物、実施例３の抽出物、実施例５の抽出物及び実施例７（ｅ）の抽出物を、５０μｇ／ｍＬ又は１００μｇ／ｍＬのいずれかの濃度、又は両方の濃度（２％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで抽出物のＤＭＳＯストック２０ｍｇ／ｍＬを５０μｇ／ｍＬ又は１００μｇ／ｍＬに希釈した）で最終培養量が２００μＬ／ウェルとなるように加え、試験した。適切なコントロールは、ベロ細胞のみ（対照細胞）、ウイルス（対照ウイルス）を有するベロ細胞、及びウイルスと標準成分アシクロビルを有するベロ細胞等が含まれる。アシクロビルを２５μｇ／ｍＬ、３．１２５μｇ／ｍＬ、１．５６μｇ／ｍＬ、０．７８μｇ／ｍＬ及び０．３９μｇ／ｍＬの濃度で検査した（２％ＦＢＳを含むＤＭＥＭでアシクロビルのＤＭＳＯストック２０ｍｇ／ｍＬを１００μｇ／ｍＬに希釈した）。１時間後、実施例１０の工程２で得られたウイルスストックを使って、１ウェル当り感染多重度（ｍｏｉ）が１００  ＴＣＩＤ50のウイルス量を細胞に感染させた。維持培地（２％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ）で、感染した細胞をさらに４８時間培養した。対照ウイルスが最大ＣＰＥを示した時点で、培地を吸引し、細胞を１％クリスタルバイオレット溶液で３０分間染色した。染色溶液を吸引して取り除き、余分な染料が全て洗い出されるまで蒸留水でプレートをリンスした。プレートを２４時間放置して乾燥させた。プラークを染色した後、ＣＰＥを視覚的に評価し、さらに顕微鏡で評価し、コントロールと比較したＣＰＥ阻害の割合に従って等級化した。得られた結果を表５に示す。
【００６２】
【表５】
2012503644.tif 000006
【００６３】
等級化は以下の形式に従う：
＋      ＣＰＥ阻害１１〜２５％      ＋＋      ＣＰＥ阻害２６〜５０％
＋＋＋  ＣＰＥ阻害５１〜７５％      ＋＋＋＋  ＣＰＥ阻害７６〜１００％
方法Ｂ：ＣＰＥ阻害アッセイ−ＭＴＴ方法
本アッセイは、ウイルス複製サイクルの任意の段階で作用する薬剤（この場合、抽出物）を検出するために設計された。本アッセイは「Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，２００６，１２：４０７８−４０８１」に報告されているようにを実施された。
ＣＰＥ阻害アッセイ−染色方法に関しては、クリスタルバイオレットで細胞の染色せずに３−（４，５−ジメチルチアゾル−２イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイを実施したことを除き、実施例１１の方法Ａと同様の方法でこのアッセイを行った。即ち、９６ウェル平底プレートでベロ細胞（実施例１０の工程１で得られた）を、実施例１の抽出物、実施例３の抽出物又はアシクロビルを含む維持培地（２％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ）で１時間処理した。その後、１００  ＴＣＩＤ50のｍｏｉで、細胞にウイルス（実施例１０の工程２で得られたウイルスストックを使用）を感染させた。３７℃で４８時間培養した後、ＭＴＴアッセイにより生存細胞を測定した（９６ウェルプレートＥＬＩＳＡリーダーを用いて５７０ｎｍでの吸光度を測定した）。以下の式に従って抗ウイルス活性を決定した。
【００６４】
【数１】
2012503644.tif 000007
【００６５】
式中、
（ＯＤT）HSV：ＨＳＶ感染細胞中の抽出物／化合物の濃度で測定した吸光度
（ＯＤC）HSV：対照の未処理のＨＳＶ感染細胞に対して測定された吸光度に関する
（ＯＤC）mock：対照の未処理の模倣感染細胞に対して測定された吸光度に関する
結果：実施例１の抽出物及び実施例３の抽出物は、ＨＳＶ−２に対して抗ウイルス活性を示した。
【００６６】
［実施例１２］
ＣＰＥ阻害アッセイ−ＭＴＴ方法。
実施例１１の方法Ｂと同様の方法で本アッセイを実施した。
【００６７】
本アッセイで評価した抽出物は以下のとおりである。
（ｉ）    実施例２の抽出物
（ｉｉ）  実施例５の抽出物
（ｉｉｉ）実施例６の抽出物
（ｉｖ）  実施例７（ｄ）の抽出物
６．２５〜４００μｇ／ｍＬの範囲の濃度のサンプルを試験した。
【００６８】
結果：実施例２の抽出物、実施例５の抽出物、実施例６の抽出物及び実施例７（ｄ）の抽出物それぞれのの結果を、図１、図２、図３及び図４に示す。
結論：
図１：実施例２の抽出物は、ＨＳＶ−２に対する抗ウイルス活性を示した。実施例２の抽出物は、抗ウイルス活性を示す濃度ではベロ細胞の生存率に影響を与えなかった。
図２：実施例５の抽出物は、ＨＳＶ−２に対する抗ウイルス活性を示した。実施例５の抽出物は、抗ウイルス活性を示す濃度ではベロ細胞の生存率に影響を与えなかった。
図３：実施例６の抽出物は、ＨＳＶ−２に対する抗ウイルス活性を示した。実施例６の抽出物は、抗ウイルス活性を示す濃度ではベロ細胞の生存率に影響を与えなかった。
図４：実施例７（ｄ）の抽出物は、ＨＳＶ−２に対する抗ウイルス活性を示した。実施例７（ｄ）の抽出物は、抗ウイルス活性を示す濃度ではベロ細胞の生存率に影響を与えなかった。
【００６９】
［実施例１３］
細胞毒性アッセイ
本アッセイは、「Ｗｏｒｌｄ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，２００６，１２：４０７８−４０８１」に報告されているように実施された。
【００７０】
毒性分析は、観察された任意の抗ウイルス効果は細胞生存率への一般的効果に起因するものであるか否かを評価するために行われた。毒性分析のためにベロ細胞（実施例１０の工程１で得られた）を９６ウェルプレートで培養し、ウイルスを添加しない抗ウイルス評価と同じスケジュールに従って抽出物で処理した。ＭＴＴ色素を使って生存細胞を試験した。実施例３の抽出物の毒性効果は、各植物抽出物の不在時に観察された生存細胞と対比した植物抽出物の存在時の生存細胞の減少の割合（％）として算出した。以下の式を使用した。
【００７１】
【数２】
2012503644.tif 000008
【００７２】
式中、Ａは、ＥＬＩＳＡリーダーで測定した吸光度である。
上記データより、５０％細胞毒性濃度を算出した（ＣＣ50）。
治療指数とも呼ばれる選択指数（ＳＩ）をＣＣ50とＩＣ50の比率として評価し、得られた結果を表６に示している。実施例３の抽出物が、その毒性レベルを超える十分な抗ウイルス活性を有するか否かを判断するため、ＣＣ50／ＩＣ50によりＳＩを算出した。
【００７３】
本研究では、＞５のＳＩ値を有効なハーブ／植物抽出物として考えた。
【００７４】
【表６】
2012503644.tif 000009
【００７５】
＊実施例１１方法Ｂから得られたＩＣ50値。
ｉｎ  ｖｉｖｏ抗ウイルスアッセイ
実験に使用した動物は、ＣＰＣＳＥＡ（Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅＰｕｒｐｏｓｅ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｓｕｐｅｒｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｏｎ  Ａｎｉｍａｌｓ）（Ｔａｍｉｌ  Ｎａｄｕ、インド）が発行した有効なガイドラインに従って飼育された。実験動物を使う手順は、ピラマル・ライフ・サイエンシーズ・リミテッド（Ｇｏｒｅｇａｏｎ、Ｍｕｍｂａｉ、インド）の実験動物倫理委員会（ＩＡＥＣ：Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認された。
【００７６】
［実施例１４］
ＨＳＶ−２感染のマウス膣モデル
本アッセイは「Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００６，６９：７７−８５」の報告に従って実施された。
【００７７】
生後８週間で体重１８〜２０ｇのメスのＢＡＬＢ／ｃマウスを用いて、ウイルス（実施例１０の工程２のウイルスストックを使用）を膣内（ＩＶＡＧ）接種（腔内接種）した。ＩＶＡＧ接種の５日前に、マウスの上背に２９ゲージ注射針で２ｍｇのプロゲステロン（Ｄｅｐｏ−Ｐｒｏｖｅｒａ（登録商標）；Ｐｆｉｚｅｒ、ベルギー）を皮下（ＳＣ）注射した。接種の当日に、腹腔内注射によってケタミン（１５０ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）でマウスに麻酔を行った。マイクロピペットを使って、合計２０μＬのＤＭＥＭ中５×１０3ｐｆｕのウイルスをマウスに対して膣内接種した。ＩＶＡＧ接種してから３０分後に、プラセボ（リン酸緩衝食塩水、ＰＢＳ）、実施例３の抽出物（ＰＢＳ中１２５ｍｇ／ｋｇ）、実施例４の抽出物（ＰＢＳ中３００ｍｇ／ｋｇ）及びポジティブコントロール（ＰＢＳ中７５ｍｇ／ｋｇアシクロビル）を使って、動物の治療を開始した。各グループに１０匹の動物が割り当てられた。１日３回４時間の治療間隔で５日間動物の治療を行った。マイクロピペットを使って、上記サンプルの２０μＬを膣円蓋に注入した。
【００７８】
動物は、接種後（ＰＩ）２１日間、毎日生存及び膣外疾患の徴候について評価された。以下の５ポイントスケールとしても知られている確立された病変スコアスケールを使って、ウイルス性疾患の重症度（疾患の膣外徴候）を定量化した。
０：明らかな感染は認められない
１：膣外組織の分散した僅かな丘疹と微かな赤み
２：膣外組織の分散した僅かな丘疹、潰瘍、及び／又は痂皮及び／又は腫脹及び赤み
３：周囲組織への伸展を伴う膣外組織の多数の融合した潰瘍／痂皮、中等度の腫脹及び赤み
４：周囲組織への伸展を伴い膣外組織の重度の赤み及び腫脹を伴う潰瘍化、及び、後肢麻痺
５：周囲組織への伸展を伴う膣外組織の重度の潰瘍化、体重減少、後肢麻痺及び死亡
観察：
１．プラセボで治療したグループ：
（ａ）５日目に膣外感染の初期兆候が生じた。
（ｂ）１１日目に全てのマウスが死亡した。
２．アシクロビルで治療したグループ：
（ａ）膣外疾患の兆候を示したマウスは確認されなかった。
（ｂ）実験中に死亡したマウスは確認されなかった。
３．実施例３の抽出物で治療したグループ：
（ａ）１２５ｍｇ／ｋｇの実施例３の抽出物で治療したマウスは、実験期間中を通してウイルス誘導の膣外疾患の特徴的兆候を示さなかった。
（ｂ）１２５ｍｇ／ｋｇの実施例３の抽出物で治療したマウスは、１００％の生存率を示した。
４．実施例４の抽出物で治療したグループ：
（ａ）３００ｍｇ／ｋｇの実施例４の抽出物で治療した１０匹のうち９匹のマウスは、実験期間中を通してウイルス誘導の膣外疾患の特徴的兆候を示さなかった。１匹のマウスが、５日目にＨＳＶ誘導の膣外疾患の特徴的兆候を示した。しかしながら、このマウスは１９日目までに臨床的に回復した。
（ｂ）３００ｍｇ／ｋｇの実施例４の抽出物で治療したマウスは、１００％の生存率を示した。
【００７９】
結果：実施例３の抽出物及び実施例４の抽出物は、ＨＳＶ−２感染のマウス膣モデルにおいて抗ウイルス活性を示した。
［実施例１５］
ＨＳＶ−２感染のマウス膣モデル
本アッセイ実施例１４に以下に記載されたように修正して実施された。
（ｉ）実施例１４の５×１０3ｐｆｕの代わりに、２×１０4ｐｆｕのウイルスをマウスに膣内接種した。
（ｉｉ）実施例１４の動物の膣円蓋への抽出物の注射の代わりに、製剤（製剤Ｉ、製剤ＩＩ及び製剤ＩＩＩ）の局所投与により、評価を行った。
（ｉｉｉ）１つ以上の動物のグループを調査した：マウスにウイルスを接種したが治療しなかった「感染対照グループ」。このグループを使って、疾患の経緯を監視し、プラセボが疾患を持つ動物への影響を示すかどうか、感染対照グループの結果を「プラセボ治療グループ」と比較した。
（ｉｖ）評価するアシクロビルの用量は、実施例１４の体重１ｋｇ当り７５ｍｇの代わりに、体重１ｋｇ当り２２５ｍｇであった。
【００８０】
以下の抽出物及び製剤を評価した。
（ａ）実施例１の抽出物
（ｂ）製剤Ｉ
（ｃ）製剤ＩＩ
（ｄ）製剤ＩＩＩ
動物へのサンプル投与
実施例１の抽出物（ＰＢＳ中に溶解）を膣円蓋にマイクロピペットで注射した。製剤Ｉ、製剤ＩＩ及び製剤ＩＩＩを１日３回、５日間局所（２５ｍｇ）投与した。動物の評価において、２５ｍｇの製剤ＩＢ、ＩＩＢ又はＩＩＩＢは３７５ｍｇ／ｋｇの用量に相当し、２５ｍｇの製剤ＩＣ、ＩＩＣ又はＩＩＩＣは７５０ｍｇ／ｋｇの用量に相当し、２５ｍｇの製剤ＩＤ、ＩＩＤ及びＩＩＩＤは１５００ｍｇ／ｋｇの用量に相当する。
【００８１】
注目される観察結果は以下のとおりである。
１．実施例１の抽出物の評価：
ａ．    プラセボ治療グループ：５日目に膣外感染の初期兆候が現れ、動物の全死亡率が観察された。
ｂ．    アシクロビル治療グループ：膣外疾患を示すマウスは確認されなかった。動物は１００％生存率を示した。
ｃ．実施例１の抽出物治療グループ：
（ｉ）用量３７５ｍｇ／ｋｇの抽出物で治療した動物：５日目に膣外感染の初期兆候が現れ、生き残った動物は全て２１日目までに臨床的に回復した。これらの動物の生存率は３０％であった。
（ｉｉ）用量７５０ｍｇ／ｋｇの抽出物で治療した動物：５日目に膣外感染の初期兆候が現れ、２１日目で本調査が終了するまでこの兆候は継続した。これらの動物の生存率は５０％であった。
（ｉｉｉ）用量１５００ｍｇ／ｋｇの抽出物で治療した動物：５日目に膣外感染の初期兆候が現れ、生き残った動物は全て２１日目までに臨床的に回復した。これらの動物の生存率は４０％であった。
上記結果を図５Ａ及び図５Ｂに示す。
【００８２】
２．製剤Ｉの評価：
ａ．プラセボ治療グループ：７日目に膣外感染の初期兆候が現れ、動物の全ての死亡が観察された。
ｂ．感染対照グループ：７日目に膣外感染の初期兆候が現れ、動物の全ての死亡が観察された。
ｃ．アシクロビル治療グループ：膣外疾患を示すマウスは確認されなかった。動物は１００％生存率を示した。
ｄ．製剤Ｉ治療グループ：
（ｉ）用量３７５ｍｇ／ｋｇの抽出物で治療した動物：１３日目に膣外感染の初期兆候が現れ、２１日目に本調査が終了するまでこの兆候は継続した。これらの動物の生存率は１００％であった。
（ｉｉ）用量７５０ｍｇ／ｋｇの抽出物で治療した動物：８日目に膣外感染の初期兆候が現れ、２１日目に本調査が終了するまでこの兆候は継続した。これらの動物の生存率は８７．５％であった。
（ｉｉｉ）用量１５００ｍｇ／ｋｇの抽出物で治療した動物：膣外疾患を示すマウスは確認されなかった。これらの動物の生存率は１００％であった。
上記結果を図６Ａ及び図６Ｂに示す。
【００８３】
３．製剤ＩＩの評価：
ａ．プラセボ治療グループ：９日目に膣外感染の初期兆候が現れ、動物の全ての死亡が観察された。
ｂ．感染対照グループ：９日目に膣外感染の初期兆候が現れ、動物の全ての死亡率が観察された。
ｃ．アシクロビル治療グループ：１８日目に膣外疾患が現れ、２１日目まで継続した。動物は１００％生存率を示した。
ｄ．製剤ＩＩ治療グループ：
（ｉ）用量７５０ｍｇ／ｋｇの抽出物で治療した動物：１１日目に膣外感染の初期兆候が現れ、２１日目まで継続した。動物は９０％生存率を示した。
（ｉｉ）用量１５００ｍｇ／ｋｇの抽出物で治療した動物：１４日目に膣外感染の初期兆候が現れ、２１日目まで継続した。動物は１００％生存率を示した。
上記結果を図７Ａ及び図７Ｂに示す。
【００８４】
４．製剤ＩＩＩの評価：
ｅ．プラセボ治療グループ：８日目に膣外感染の初期兆候が現れ、動物の全ての死亡が観察された。
ｆ．感染対照グループ：８日目に膣外感染の初期兆候が現れ、動物の全ての死亡が観察された。
ｇ．アシクロビル治療グループ：膣外疾患を示すマウスは確認されなかった。動物は１００％生存率を示した。
ｈ．製剤ＩＩＩ治療グループ：
（ｉ）用量３７５ｍｇ／ｋｇの抽出物で治療した動物：８日目に膣外感染の初期兆候が現れ、２１日目に本調査が終了するまでこの兆候は継続した。これらの動物の生存率は１００％であった。
（ｉｉ）用量７５０ｍｇ／ｋｇの抽出物で治療した動物：動物は調査期間中を通して膣外疾患のいかなる兆候も示さなかった。これらの動物の生存率は１００％であった。
（ｉｉｉ）用量１５００ｍｇ／ｋｇの抽出物で治療した動物：動物は調査期間中を通して膣外疾患のいかなる兆候も示さなかった。これらの動物の生存率は８０％であった。
上記結果を図８Ａ及び図８Ｂに示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【国際調査報告】
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