【手続補正書】
【提出日】平成20年12月26日(2008.12.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サイレンシングに関して機能的多様性を有するRYMVのP1タンパク質のようなサイレンシングサプレッサーをエンコードする遺伝子の使用であって、
望みの興味の遺伝子を過剰発現またはサイレンシングさせる機能を有する植物ウイルスベクターを構築するための有効性のレベルを有する遺伝子の選択を包含する、使用。
【請求項２】
P1タンパク質を選択するためのRYMV分離株から単離されたP1タンパク質の使用であって、種々のP1、より特定的には、Tz3、Tz8、Mg1、BF1、CI63が35Sプロモーターの下流でクローニングされ、PTGSについての所与レベルの活性のために、
−  適切なプロモーター、例えばRYMV 35Sプロモーターの下流で機能的多様性を有するサイレンシングサプレッサータンパク質をエンコードする遺伝子をクローニングすること；
−  微粒子銃によってイネの葉上にサプレッサータンパク質をエンコードする種々の発現カセットを接種すること；
−  L2、4およびL10系統等の系統上にRYMVウイルスを機械的に接種すること；
−  所与の分離株、例えばマダガスカル分離株に対するポリクローナル抗体を用いるDAS-ELISAによってウイルス量をアッセイすること；
−  組織化学アッセイによってβ−グルコロニダーゼをエンコードするレポーター遺伝子（GUS）の発現の回復を視覚化すること；
−  GUSの酵素活性をアッセイすることによってレポーター遺伝子の発現の回復を定量すること；
−  ノーザンブロッティングによってsiRNA（PTGSの証拠）を検出すること、および
−  興味の遺伝子の過剰発現またはサイレンシングのいずれかに必要とされる活性のレベルを有するＰ１タンパク質を選択すること
を包含する技術を用いる、方法。
【請求項３】
P1タンパク質の選択のために、種々のP1、より特定的には、Tz3、Tz8、Mg1、BF1、CI63が、35Sプロモーターの下流でクローニングされることを特徴とする請求項２に記載の使用。
【請求項４】
PTGS抑制の高レベルの有効性を得るためにCI63またはTz3のP1タンパク質を使用することを特徴とする請求項３に記載の使用。
【請求項５】
PTGSについての中程度レベルの有効性のTz8のP1タンパク質およびPTGS抑制における低レベルの有効性のためのMg1またはBF1のP1タンパク質を使用することを特徴とする請求項３に記載の使用。
【請求項６】
興味の遺伝子の発現またはサイレンシングのためのウイルスベクターであって、
RYMVゲノムから生じさせられ、RYMVのP1タンパク質をエンコードする遺伝子を含むことを特徴とする、ベクター。
【請求項７】
RYMVゲノムから生じさせられ、サイレンシングサプレッサーとしての機能的多様性を発現するP1タンパク質をエンコードする遺伝子を含み、この遺伝子は、P1タンパク質をエンコードするRYMVゲノムの遺伝子を置き換えることを特徴とする請求項６に記載のベクター。
【請求項８】
サイズにおいて７００ｂｐ未満の、過剰発現させられるべきまたは消滅させられるべき興味の遺伝子の挿入物を含有するウイルス発現ベクターであることを特徴とする請求項７に記載のベクター。
【請求項９】
サイズにおいて５０ｂｐ未満の挿入物を含有するVIGSベクターであり、ウイルスゲノム中の挿入物の配向にかかわりなく、そのターゲットは、挿入物のmRNAであることを特徴とする請求項６に記載のベクター。
【請求項１０】
RYMV増幅システムを用いる挿入物のサイズが７００ｂｐ超であることを特徴とする請求項８または９に記載のベクター。
【請求項１１】
請求項７〜１０のいずれか１つに記載のベクターであって、
−  PCR増幅；
−  消化；
−  ライゲーション；および
−  コンピテント細菌の軽質転換
の工程を包含するプロトコルに従って得られることを特徴とするベクター。
【請求項１２】
発現ベクターは、
−  インビトロ転写；
−  転写物を有するプロトプラストの調製およびエレクトロポレーション；
−  エレクトロポレーション３〜７日後の挿入物の視覚化；
−  同じタイミングによるＲＮＡの抽出；および
−  RT-PCRによる挿入された遺伝子の複製および安定性の確証
の工程を包含するプロトコルに従って確証されることを特徴とする請求項１１に記載のベクター。
【請求項１３】
VIGSベクターは、
−  インビトロ転写；
−  転写物を有する、RYMVに対する可変の抵抗度を有する種々のイネ種および遺伝子組換え系統の機械的な接種；
−  サイレンシング表現型の視覚化による表現型の特徴化；および
−  全RNAの抽出、低分子量RNAのポリアクリルアミドゲルのノーザンブロッティング、およびVIGSによってターゲットにされた遺伝子に特異的なsiRNAの検出による分子の特徴化
の工程を包含するプロトコルに従って確証されることを特徴とする請求項１０に記載のベクター。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
VIGSベクターは、特に、
−  インビトロの転写；
−  転写物を有する、RYMVに対して可変の抵抗度を有する種々のイネ種および形質転換系統の機械的な接種；
−  サイレンシング表現型の視覚化による表現型の特徴化；および
−  全RNAの抽出、低分子量RNAのポリアクリルアミドゲルのノーザンブロッティングおよびVIGSによりターゲットにされた遺伝子に特異的なsiRNAの検出による分子の特徴化
の工程を包含するプロトコルに従って確証される。
このように、本発明は、RYMVゲノムへの外因性遺伝子の挿入のための、それらを過剰発現させるかまたはそれらをサイレンシングさせることを目的とする非常に興味のあるツールを提供する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７７】
（６ｂ）アルカリ性融解によるA.tumefaciensプラスミドDNAの調製
アグロバクテリウムは、１０ｍｌの選択LB培地に接種され、３０時間にわたって（あるいは用いられた株に応じてそれ以上にわたって）２８℃で攪拌しながら（２２５ｒｐｍ）培養される。１５分間にわたる４０００ｒｐｍでの細胞の遠心分離後に得られる細菌ペレット状物が、５０ｍＭのトリス、１０ｍＭのEDTA、１００μｇ／ｍｌのRNアーゼＡおよび５ｍｇ／ｍｌのリゾチームの１００μｌに再懸濁させられる。５分間にわたる氷中でのインキュベーションの後、２００μｌの融解バッファが加えられる（２００ｍＭのNaOH、１％  ｗ／ｖのSDS）。細菌壁融解は、４分間にわたって４℃で行われる。最後に、２００μＬの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）が加えられ、混合物は、４℃で１０分間にわたって１３０００ｒｐｍの遠心分離にかけられる。上澄に含まれるDNAは、フェノール−クロロホルムによる２回の精製工程の後に、エタノール（１／１０（ｖ／ｖ）の３Ｍ  NaAc；ｐＨ５．５、２倍容積の１００％エタノール）により３０分間にわたって−２０℃で沈殿させられる。沈殿させられたDNAは、４℃での４５分間にわたる１５０００ｇの遠心分離によってペレット状にされる。７０％エタノールによる洗浄工程の後、ＤＮＡペレット状物は、６０μｌの１Ｍ  トリス−HCl（ｐＨ８）に溶出させられる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８８】
（３ｄ）RT-PCR RNA分析
線形にされた組換え型ベクターに対応する残留DNAテンプレート（すなわち、インビトロ転写の終了時）の増幅からのバイアスを排除するために、DNアーゼ処理がRNAについて行われる。処理の有効性は、PCR増幅の終了時に２μｌのDNアーゼ処理されたＲＮＡについて、組換え体の確証のために用いられたプライマーと同じプライマーを用いて評価される。