【手続補正書】
【提出日】平成21年5月18日(2009.5.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えアデノウイルスベクターであって、配列番号１の配列を含む第一のアデノウイルス性配列、プロモーター配列、MCS、転写ターミネーター、配列番号２の配列を含む第二のアデノウイルス性配列、配列番号４の配列を含む第三のアデノウイルス性配列、細菌の複製起点ならびに抗生物質耐性遺伝子を包含し、配列番号２および配列番号４の配列は、原核細胞内で組換えアデノウイルス性シャトルプラスミドとアデノウイルス性骨格プラスミドとの間の相同組換えを起こさせさらにパッケージング細胞内でRCA不含アデノウイルスベクターを産生できる組換えプラスミドを生成させる配列を含むことを特徴とする、組換えアデノウイルスベクター。
【請求項２】
組換えアデノウイルスベクターであって、アデノウイルス血清型5型由来の1〜454番の配列を含む第一のアデノウイルス性配列、プロモーター配列、ポリリンカー、転写ターミネーター、アデノウイルス血清型5型由来の3511〜5796番の配列を含む第二のアデノウイルス性配列、34931〜35935番の配列を含む第三のアデノウイルス性配列、細菌の複製起点、ならびに抗生物質耐性遺伝子を包含し、該第二および第三のアデノウイルス性配列は、原核細胞内で組換えアデノウイルス性シャトルプラスミドとアデノウイルス性骨格プラスミドとの間で相同組換えを起こさせる配列を含むことを特徴とする、組換えアデノウイルスベクター。
【請求項３】
前記プロモーターは、サイトメガロウイルス（CMV）主要前初期プロモーター、シミアンウイルス40（SV40）プロモーター、β−アクチンプロモーター、アルブミンプロモーター、伸長因子1−α（EF1-α）プロモーター、PγKプロモーター、MFGプロモーターおよびラウス肉腫ウイルスプロモーターより成る群から選択されることを特徴とする請求項１または２記載の組換えアデノウイルスベクター。
【請求項４】
前記転写ターミネーターは、SV40ポリアデニル化シグナルを含む真核細胞性ポリアデニル化シグナルであることを特徴とする請求項１から３いずれか１項記載の組換えアデノウイルスベクター。
【請求項５】
前記細菌の複製起点は、PBR322の複製起点に由来することを特徴とする請求項１から４いずれか１項記載の組換えアデノウイルスベクター。
【請求項６】
前記抗生物質耐性遺伝子は、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ヒグロマイシン耐性遺伝子、ブレオマイシン耐性遺伝子およびゼオシン耐性遺伝子より成る群から選択されることを特徴とする請求項１から５いずれか１項記載の組換えアデノウイルスベクター。
【請求項７】
前記原核細胞は大腸菌（E.coli）であることを特徴とする請求項１から６いずれか１項記載の組換えアデノウイルスベクター。
【請求項８】
前記大腸菌（E.coli）はBJ5183株であることを特徴とする請求項７記載の組換えアデノウイルスベクター。
【請求項９】
前記ベクターはpAdHighであることを特徴とする請求項１または２記載の組換えアデノウイルスベクター。
【請求項１０】
複製コンピテントアデノウイルス（RCA）を実質的に含まない組換えアデノウイルスの作成法であって：
a．原核細胞内に第一のシャトルプラスミドと第二のシャトルプラスミドとを同時形質転換し、このとき、該第一のシャトルプラスミドは第一のアデノウイルス性配列および第一の抗生物質耐性遺伝子を包含し；該第二のシャトルプラスミドは、第一のシャトルプラスミド中に存在しない別のアデノウイルス性配列を含む第二のアデノウイルス性配列および第一の抗生物質耐性遺伝子とは別異の第二の抗生物質耐性遺伝子を包含しており、ここで、同時形質転換により、該第一および第二のシャトルプラスミド間で相同組換えが生じ、さらに、該第一および第二のシャトルプラスミド内の抗生物質耐性遺伝子を両者とも発現する原核細胞性形質転換体は、第一の組換えアデノウイルス性プラスミドを包含しており；
b．前記原核細胞から前記第一の組換えアデノウイルス性プラスミドを回収し：
c．前記第一の組換えアデノウイルス性プラスミドおよびアデノウイルス性骨格配列を別の原核細胞内に同時形質転換し、ここで、該原核細胞性形質転換体は、第二の組換えアデノウイルス性プラスミドを包含しており；
d．前記原核細胞から前記第二の組換えアデノウイルス性プラスミドを回収し；
e．前記第二の組換えアデノウイルス性プラスミドを用いてPER.C6パッケージング細胞にトランスフェクトし；
f．PER.C6細胞から組換えアデノウイルスを回収し、このとき、該組換えアデノウイルスは実質的にRCAを含んでいない
工程を含むことを特徴とする作成法。
【請求項１１】
複製コンピテントアデノウイルス（RCA）を実質的に含まない組換えアデノウイルスの作成法であって：
a．１つもしくはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼを用いて第一および第二のシャトルプラスミドを消化し、このとき、該第一のシャトルプラスミドは第一のアデノウイルス性配列を包含し；該第二のシャトルプラスミドは、第一のシャトルプラスミド中に存在しない別のアデノウイルス性配列を包含し；
b．前記第二のシャトルプラスミドから前記の別のアデノウイルス性配列を含むフラグメントを切り出し：
c．前記の別のアデノウイルス性配列を含むフラグメントを前記第一のシャトルプラスミドに連結させて対フラグメントを置換して、第一の組換えアデノウイルス性プラスミドを得て；
d．前記第一の組換えアデノウイルス性プラスミドおよびアデノウイルス性骨格プラスミドを別の原核細胞に同時形質転換し、ここで、原核細胞性形質転換体は第二の組換えアデノウイルス性プラスミドを包含しており；
e．前記原核細胞から第二の組換えアデノウイルス性プラスミドを回収し；
f．前記第二の組換えアデノウイルス性プラスミドをPER.C6パッケージング細胞にトランスフェクトし；さらに、
g．細胞から組換えアデノウイルスを回収し、このとき、該組換えアデノウイルスは実質的にRCAを含まない；
工程を含むことを特徴とする作成法。
【請求項１２】
前記第一のシャトルプラスミドがpShuttle-CMVであることを特徴とする請求項１０または１１記載の作成法。
【請求項１３】
前記第二のシャトルプラスミドがpAdApt-Tcであることを特徴とする請求項１０から１２いずれか１項記載の作成法。
【請求項１４】
前記抗生物質耐性遺伝子は、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ヒグロマイシン耐性遺伝子、ブレオマイシン耐性遺伝子およびゼオシン耐性遺伝子より成る群から選択されることを特徴とする請求項１０から１３いずれか１項記載の作成法。
【請求項１５】
pShuttle-CMV内には存在しない別のアデノウイルス性配列は、アデノウイルス血清型5型由来の342〜454番のアデノウイルス性配列、およびアデノウイルス血清型5型由来の3511〜3533番のアデノウイルス性配列を含むことを特徴とする請求項１０から１４いずれか１項記載の作成法。
【請求項１６】
前記アデノウイルス性骨格プラスミドがpAdEasy1 であることを特徴とする請求項１０から１５いずれか１項記載の作成法。
【請求項１７】
前記原核細胞が大腸菌（E.coli）であることを特徴とする請求項１０から１６いずれか１項記載の作成法。
【請求項１８】
前記大腸菌（E.coli）がBJ5183株であることを特徴とする請求項１７記載の作成法。
【請求項１９】
請求項１０から１８いずれか１項記載の作成法に従って作成された組換えアデノウイルスベクター。
【請求項２０】
請求項１０から１８いずれか１項記載の作成法に従って作成された組換えアデノウイルス。
【請求項２１】
複製コンピテントアデノウイルス（RCA）を実質的に含まずかつ１つもしくはそれ以上の異種核酸を発現する組換えアデノウイルスを、薬剤学的に許容される賦形剤と混合して含有する免疫原性組成物。
【請求項２２】
RCAを実質的に含まないアデノウイルスが、アデノウイルス血清型5型（Ad5）であることを特徴とする請求項２１記載の組成物。
【請求項２３】
RCAを実質的に含まないアデノウイルスは、請求項１０から１８いずれか１項記載の作成法に従って作成されたものであることを特徴とする請求項２１記載の組成物。
【請求項２４】
アジュバントをさらに含有することを特徴とする請求項２１から２３いずれか１項記載の組成物。
【請求項２５】
前記１つもしくはそれ以上の異種核酸が、インフルエンザ遺伝子を含むことを特徴とする請求項２１から２４いずれか１項記載の組成物。
【請求項２６】
前記インフルエンザ遺伝子は、インフルエンザA、インフルエンザB、インフルエンザC、循環組換え体、ハイブリッド型、臨床単離株および野生単離株より成る群から選択されるインフルエンザ株由来のものであることを特徴とする請求項２５記載の組成物。
【請求項２７】
前記インフルエンザ遺伝子は、インフルエンザ血球凝集素遺伝子、インフルエンザマトリックス遺伝子、インフルエンザノイラミニダーゼ遺伝子およびインフルエンザ核タンパク質遺伝子より成る群から選択されることを特徴とする請求項２５または２６記載の組成物。
【請求項２８】
インフルエンザへの免疫応答を誘起するための組成物である、請求項２５から２７いずれか１項記載の組成物。
【請求項２９】
RCAを実質的に含まない組換えアデノウイルス内で１つもしくはそれ以上の異種核酸を発現させる方法であって：
a．１つもしくはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼを用いて請求項１から９および１９いずれか１項記載の組換えアデノウイルスベクターを消化することによってそれらのアデノウイルスベクターを直線化し；
b．１つもしくはそれ以上の異種核酸を前記アデノウイルスベクター内に連結させるが、このとき、１つもしくはそれ以上の該異種核酸は、機能発揮できるようにプロモーターに連結されており；
c．該アデノウイルスベクターを哺乳類パッケージング細胞内にトランスフェクトし；さらに、
d．１つもしくはそれ以上の異種核酸を発現する組換えアデノウイルスを該哺乳類パッケージング細胞から回収する
工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３０】
１つもしくはそれ以上の前記異種核酸が、インフルエンザ遺伝子を含むことを特徴とする請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
前記インフルエンザ遺伝子は、インフルエンザ赤血球凝集素遺伝子、インフルエンザマトリックス遺伝子、インフルエンザノイラミニダーゼ遺伝子およびインフルエンザ核タンパク質遺伝子より成る群から選択されることを特徴とする請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
前記インフルエンザ遺伝子は、インフルエンザA、インフルエンザB、インフルエンザC、循環組換え体、ハイブリッド型、臨床単離株および野生単離株より成る群から選択されるインフルエンザ株由来であることを特徴とする請求項３０または３１記載の方法。
【請求項３３】
所望の細胞内に１つもしくはそれ以上の異種核酸を導入し発現させる方法であって、複製コンピテントアデノウイルス（RCA）を実質的に含まない組換えアデノウイルスであって１つもしくはそれ以上の異種核酸を発現するものを細胞と接触させ、さらに、１つもしくはそれ以上の該異種核酸を発現するのに十分な条件下において、細胞を培養しまたは動物(ヒトを除く)を飼育することを特徴とする方法。
【請求項３４】
前記細胞はヒト細胞であることを特徴とする請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記アデノウイルスは、アデノウイルス血清型5型（Ad5）由来であることを特徴とする請求項３３または３４記載の方法。
【請求項３６】
１つもしくはそれ以上の前記異種核酸がインフルエンザ遺伝子を含むことを特徴とする請求項３３から３５いずれか１項記載の方法。
【請求項３７】
前記インフルエンザ遺伝子は、インフルエンザ赤血球凝集素遺伝子、インフルエンザマトリックス遺伝子、インフルエンザノイラミニダーゼ遺伝子およびインフルエンザ核タンパク質遺伝子より成る群から選択されることを特徴とする請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
前記インフルエンザ遺伝子は、インフルエンザA、インフルエンザB、インフルエンザC、循環組換え体、ハイブリッド型、臨床単離株および野生単離株より成る群から選択されるインフルエンザ株由来であることを特徴とする請求項３６または３７記載の方法。
【請求項３９】
請求項１記載の組換えアデノウイルスベクター、アデノウイルス骨格プラスミドおよび大腸菌（E.coli）BJ5183細胞を含むキット。
【請求項４０】
前記組換えアデノウイルス性シャトルプラスミドは、pAdHighまたはその誘導体であることを特徴とする請求項３９記載のキット。
【請求項４１】
前記アデノウイルス骨格プラスミドはpAdEasy1であることを特徴とする請求項３９または４０記載のキット。