(57)【要約】  本発明は、膵臓がんを含むがこれに限定されないがんの予後および治療ならびにチミジル酸シンターゼ阻害剤（例えば5-FU）治療に対する応答性を診断および提供する方法であって、H3K4me2、H3K9me2またはH3K18acからなる群から選択される変化したヒストン修飾パターンを有するがんを同定することを含む方法を提供する。【選択図】図３
2012524278.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
5-FUまたは他のチミジル酸シンターゼ阻害剤による治療に対するがん患者の応答を予測する方法であって、患者由来のがん組織サンプル中のH3K4me2、H3K9me2もしくはH3K18acまたはそれらの組合せについてのグローバルヒストン修飾レベルを測定することを含む、方法。
【請求項２】
低レベルのヒストン修飾の存在が、5-FUまたは他のチミジル酸シンターゼ阻害剤で治療したときのより不良な予後または生存率を示し、H3K4me2、H3K9me2またはH3K18acについての高いグローバルヒストン修飾レベルが、5-FUまたは他のチミジル酸シンターゼ阻害剤で治療したときのより良好な生存予後を示す、請求項１の方法であって、ここで高レベルと低レベルの間のカットオフは、既知の処置生存または予後のチミジル酸シンターゼ阻害剤処置した患者の比較群について観察されるグローバルヒストン修飾レベルの統計的分析に基づく、方法。
【請求項３】
患者がリンパ節転位陰性のがんを有するかもしくは５−フルオロウラシルを投与されている、請求項１の方法。
【請求項４】
ヒストン修飾H3K4me2、H3K9me2またはH3K18acの陽性腫瘍細胞染色を用いて患者を低または高染色として分類する、請求項１〜３のいずれか１項の方法であって、ここで、低染色分類がより不良な全体的生存の予後を支持する、方法。
【請求項５】
予後がH3K4me2およびH3K18ac両方のヒストン修飾レベルに基づく、請求項１〜３のいずれか１項の方法であって、ここで、H3K4me2およびH3K18ac両方についての低ヒストン修飾レベルがより低い生存可能性を予測する、方法。
【請求項６】
ヒストン修飾レベルが免疫細胞化学または免疫組織化学によって測定される、請求項４の方法。
【請求項７】
H3K4me2、H3K9me2およびH3K18acから選択されるヒストン修飾の２つまたは３つについてのヒストン修飾レベルが、予後を提供するために使用される、請求項１の方法。
【請求項８】
がんが膵臓がんである、請求項１の方法。
【請求項９】
分類がヒストンルール（histone rule）に基づく、請求項１の方法。
【請求項１０】
がんが腺がんである、請求項１〜９のいずれか１項の方法。
【請求項１１】
がんが低グレードまたは低ステージのがんである、請求項１０の方法。
【請求項１２】
ヒストン修飾について低いレベルと高いレベルを分けるカットオフが、H3K9dimeについて約≧３０％、H3K4me2について約＞６０％またはH3K18acについて約＞３５％染色である、請求項１〜１１のいずれか１項の方法。.
【請求項１３】
5-FUまたは他のがん治療に加えてヒストンデアセチラーゼ阻害剤の投与が有益ながん患者を同定する方法であって、患者の膵臓がん由来組織サンプル中のH3K18acヒストン修飾のレベルを測定することを含み、ここで、低レベルの修飾はヒストンデアセチラーゼ阻害剤が有益であることの指標であり、ここで、高レベルと低レベルの間のカットオフが、既知の生存または予後のがん患者の比較群について得られたH3K18acグローバルヒストン修飾レベルに基づく、方法。
【請求項１４】
5-FUおよび阻害剤が患者を処置するために選択され、患者がそのように処置されるかまたはそのように助言される、請求項１３の方法。
【請求項１５】
がんが低グレードまたは低ステージのがんである、請求項１３の方法。
【請求項１６】
膵臓がんを有する患者を処置する方法であって、
(a) H3K4me2、H3K9me2およびH3K18acからなる群から選択される修飾されたヒストンタンパク質と特異的に結合する抗体と患者由来のがん組織サンプルとを接触させ；そして
(b) 結果既知の比較集団について得られたレベルと比較して、組織サンプル中の修飾されたヒストンタンパク質のレベルを測定し；それによりがんについての予後を提供し；そして
(c) 予後が、がんが低下した生存を有する可能性またはチミジル酸シンターゼ阻害剤による処置に不応答性である可能性があることを示している場合、チミジル酸シンターゼ阻害剤以外のまたは当該阻害剤に加えて、より攻撃的な抗がん治療を投与すること
を含む、方法。
【請求項１７】
がんの再発の可能性を予測する、請求項１６の方法。
【請求項１８】
チミジル酸シンターゼ阻害剤が5-FUである、請求項１６の方法。
【請求項１９】
ゲムシタビンまたはチミジル酸シンターゼ阻害剤ではない薬物による治療が、チミジル酸シンターゼ阻害剤のみまたはチミジル酸シンターゼ阻害剤とロイコボリンによる治療よりも好ましいがん患者を同定する方法であって、患者のがん由来組織サンプル中のH3K18acヒストン修飾のレベルを測定することを含み、ここで、カットオフと比較して修飾のレベルが低いことがゲムシタビンまたは前記薬物による治療が好ましいことを示す、方法。
【請求項２０】
患者がゲムシタビンを投与される、請求項１９の方法。
【請求項２１】
チミジル酸シンターゼ阻害剤が5-FUである、請求項１９または２０の方法。
【請求項２２】
がんが膵臓がんである、請求項１９の方法。
【請求項２３】
カットオフが、既知の生存または予後のチミジル酸シンターゼ阻害剤処置がん患者の比較群について観察されるグローバルヒストン修飾レベルの統計的分析に基づく請求項１９の方法であって、ここで、カットオフが１年生存によって判断して、治療に対する応答において少なくとも２０％異なる２つの集団に比較群を区分する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００９年４月１４日に出願した米国仮出願61/169212、２００９年４月１４日に出願した米国仮出願61/169216および２００９年７月１３日に出願した米国仮出願61/225162の優先権の利益を主張し、それらの全体について、参照によりそれらの内容を本明細書に組み込む。
【０００２】
連邦政府が出資する研究開発に基づく発明の権利としての宣誓
本研究は、National Cancer Institute Early Detection Research Network (EDRN NCI CA-86366)からの認可およびHirshberg Foundation for Pancreatic Cancer Research, CURE Digestive Diseases Research Center (DK041301, NIH/NIDDK) およびNCI U10CA21661により設立されたRadiation Therapy Oncology Group Translational Research Programからの認可によって、部分的に政府に支援されており；政府は本発明のある権利を有する。
【０００３】
コンパクトディスクで提出した配列表、表またはコンピュータプログラムへの言及
なし
【０００４】
発明の分野
本発明は、がんの予後を予測しまたは患者がチミジル酸シンターゼ阻害剤による治療に対して応答する可能性を予測するための、グローバルヒストン修飾の使用に関する。
【背景技術】
【０００５】
発明の背景
膵臓腺がんは、極めて侵襲的で致命的ながんであり、それに対する治療選択肢は限られている。遺伝的事象と共に、腫瘍関連後成的変化は、膵臓がんの発生および進行における重要な決定要因であり(Maitra, A., Hruban, R.H., Annu Rev Pathol 3:157-88 (2008); Hezel et al., Genes Dev 20:1218-49 (2006))、有望なバイオマーカーおよび治療標的を示す。がんにおける後成的変化は、ＤＮＡメチル化および翻訳後ヒストン修飾におけるゲノム規模および遺伝子座特異的変化を含み、これらはクロマチン接近性および遺伝子活性に影響する(Bernstein et al., Cell 128:669-81 (2007); Ting et al., Genes Dev 20:3215-3231 (2006); Esteller, M., Nat Rev Genet 8:286-98 (2007))。
【０００６】
ヒストンアセチル化またはメチル化における遺伝子座特異的変化は、膵臓がんにおけるいくつかの重要な遺伝子の変化した発現と関連しており(Fitzgerald et al., Neoplasia 5:427-36 (2003); Fujii et al., J Biol Chem 283:17324-32 (2008); Kikuchi et al., Oncogene 21:2741-9 (2002); Kumagai et al., Int J Cancer 124:827-33 (2009))、一方で、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤によって細胞系を処置した後マイクロアレイで見られる遺伝子発現における広範な変化は、ヒストン修飾が膵臓がんにおける遺伝子発現の制御においてより広い役割を有しうることを示唆している(Kumagai et al., Int J Cancer 124:827-33 (2009); Sato et al., Cancer Res 63:3735-42 (2003))。
【０００７】
ヒストン修飾におけるがん関連ゲノム規模変化は、ゲノム、例えば遺伝子プロモーター、反復ＤＮＡ配列および他の異質染色質領域にわたるレベルおよび分布の変化を含む(Esteller, M., Nat Rev Genet 8:286-98 (2007))。最後に、腫瘍細胞核の免疫組織化学染色における細胞間の相違によって示されるように(Kurdistani, S.K., Br J がん 97:1-5 (2007))、所定の腫瘍にわたるヒストン修飾の細胞レベルにおける異種性は、がんエピゲノムを典型的に表す変化スペクトルに、さらなる複雑さの層を加える。
【０００８】
ヒストン修飾の異常は、がんを含むヒトの疾患において生じる。ヒストンの翻訳後修飾の異常は、がん細胞において個々のプロモーターでのみ生じることが示されており(Jacobson, et al., Curr. Opin. Genet. Dev. 9:175-84 (1999))、臨床結果と関連していない。これらの異常は、腫瘍形成に重要な役割を果たす個々の遺伝子の不適切な発現または抑制を導くヒストン修飾酵素の不適切なターゲティングによって、プロモーターで局在的に生じうる。しかし、多数の遺伝子が試験されたにもかかわらず、異なるがんにおいて局在、遺伝子標的化ヒストン修飾変化の類似性はほとんど報告されていない。ＤＮＡ反復配列に関連したヒストンの異常な修飾も報告されている。これらの異常は、血液学的悪性腫瘍および結直腸腺がんにおけるヒストンH4 K16AcおよびK20diMeのより低いレベルを含む。しかし、個々の遺伝子または反復ＤＮＡ要素でのこれらの変化はいずれも、臨床結果と関連していない。
【０００９】
非プロモーター領域を含むクロマチンの大きな領域にわたって生じることもあるリシン（Ｋ）およびアルギニン（Ｒ）のアセチル化およびメチル化のようなヒストン修飾は、グローバルヒストン修飾と呼ばれる(Vogelauer, et al., Nature 408:495-8 (2000))。上記の通り、ヒストンを修飾する酵素は、がんにおいて変化した活性を示す。例えば、p300ヒストンアセチルトランスフェラーゼのミスセンス変異およびp300遺伝子座でのヘテロ接合性の喪失は、結直腸がんおよび乳がんならびにグリア芽腫に関連する(Giles, et al., Trends. Genet. 14:178-83 (1998); Gayther, et al., Nat. Genet. 24:300-3 (2000); Muraoka, et al., Oncogene 12:1565-9 (1996))。ヒストン修飾酵素の変化した活性の結果は、腫瘍生物学に関与しうるいくつかの遺伝子の不適切な発現と関連している。例えば、p300は、前立腺がんの進行に潜在的に重要な役割を果たすアンドロゲンレセプタートランスアクチベーションに関与している(Debes, et al. Cancer Res. 63:7638-40 (2003))。
【００１０】
しかし、プロモーターを標的とすることに加え、これらの酵素はまた、見掛けの配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質とは独立して、ゲノムを通じてほとんどのヌクレオソームにも影響する(Vogelauer, et al., Nature 408:495-8 (2000); Reid, et al., Mol. Cell 6, 1297-307 (2000); Krebs, et al., Cell 102, 587-98 (2000))。さらに、ヒストン修飾酵素は、ヒストンサブタイプ間および各ヒストン内の個々の側鎖間で異なる高度の基質特異性を有する(Peterson, et al., Curr. Biol. 14, R546-51 (2004); Suka, et al., Mol. Cell 8:473-9 (2001))。したがって、個々の残基は、ヒストン修飾酵素の選択的であるが広範な活性を反映して、異なる程度に全体的に修飾される。
【００１１】
がん予後および治療のための改良されたマーカーが必要とされている。本発明はこれらの必要に応え、特定のヒストン修飾が膵臓および他のがんにおける有用な予後および予測バイオマーカーであるという我々の驚くべき発見に関する。これらのヒストン修飾の細胞レベルは、異なる後成的表現型および臨床結果を有する膵臓腺がん患者の従来認識されていなかったサブセットを定義し、5-FUおよび同様の化学治療の使用を含む臨床決定も通知する予後および予測バイオマーカーを示す。
【発明の概要】
【００１２】
発明の概要
一つの局面において、本発明は、膵臓がんを含むがこれに限定されないがんを有するヒト対象についての予後を提供する方法を提供する。本方法は、一般に、がんを有する個体由来の試験組織サンプルを接触させ；試験組織サンプル中のH3K4me2、H3K9me2またはH3K18acから選択される１、２またはそれ以上のヒストンタンパク質修飾を検出し、生存歴に従って分類された患者を代表する値とそれらを比較することを含む。典型的には、組織サンプルは組織生検である。ヒストン修飾H3K4me2、H3K9me2またはH3K18acのより低いレベルががん患者における減少した生存と有為に関連しているため、個体における修飾の同様の低いレベルの存在は、減少した生存時間または生存可能性の予後を導く。反対に、修飾のより高いレベルの存在は、増加した生存時間または生存可能性の予後を導く。好ましい態様において、個体は、予後マーカーが速やかに必要とされるカテゴリーである、進行していない疾患（すなわち低グレードまたは低ステージ）を有する。
【００１３】
別の局面において、本発明は、膵臓がんを含むがこれに限定されない低グレードのがんを有する個体を処置する方法であって、比較組織サンプル（既知の生存、治療または疾患結果を有するヒト）と比較して試験組織サンプル中のグローバルヒストン修飾レベルを決定するステップ、ならびに比較に基づいてヒストン修飾レベルががんが重度に進行するかまたは転移する可能性があることを示す場合、患者のグレードについて通常よりもより攻撃的ながん治療を投与することを含む方法を提供する。いくつかの態様において、このステップは、個体から試験または生検サンプルを得て、H3K4me2、H3K9me2およびH3K18acから選択される修飾されたヒストンタンパク質と特異的に結合する抗体またはアプタマーと個体由来の試験または生検サンプルを接触させること；そしてを含む。
【００１４】
別の局面において、本発明は、膵臓がんを含むがこれに限定されないがん患者の医学的処置に対する応答を評価する方法であって、処置前、処置コースの早期もしくは後期または処置を変更する前もしくは変更した後の患者から得た組織サンプルとの比較において試験組織サンプル中のヒストン修飾レベルを測定するステップを含む。いくつかの態様において、治療は、免疫療法、標的分子療法、後成的療法、化学療法または放射線照射もしくはアポトーシス後療法である。いくつかの態様において、試験または生検サンプルは患者から得られ、サンプルはH3K4me2、H3K9me2およびH3K18acから選択される修飾されたヒストンタンパク質と特異的に結合する抗体と接触させる。
【００１５】
別の局面において、本発明は、各々異なるヒストンタンパク質修飾体と結合する少なくとも２種の抗体を含むキットを提供する。いくつかの態様において、抗体は、H3K4me2、H3K9me2またはH3K18acからなる群から選択される。いくつかの態様において、抗体は、検出可能な部分で標識化されている。いくつかの態様において、キットは、マーカーとして使用したときこれらの抗体を検出するための試薬を提供する。いくつかの態様において、キットは、抗体を用いた組織の免疫組織化学的染色のためのさらなる試薬および／または指示書を提供する。いくつかの態様において、キットは、がんリスクまたは予後に関して得られた免疫組織化学的染色をどのように評価するかについての指示書をさらに含む。
【００１６】
したがって、本発明は、膵臓がんを含むがこれに限定されないがんを有する対象のまたはそれについての予後を与える方法であって、がん由来の組織サンプル中のH3K4me2、H3K9me2またはH3K18acのヒストン修飾レベルを測定することを含み、ここで、低レベルのヒストン修飾の存在が生存についての不良な予後を示し、H3K4me2、H3K9me2またはH3K18acの高ヒストン修飾レベルの存在が生存についてのより良好な予後を示す、方法を提供する。いくつかの態様において、対象はリンパ節転移陰性のがんを有するかまたは５−フルオロウラシルを投与されている。上記のいずれかの他の態様において、ヒストン修飾H3K4me2、H3K9me2またはH3K18acの陽性腫瘍細胞染色を用いて、低染色または高染色に患者を分類し、ここで低染色分類は不良な全体的生存の予後を支持する。さらに別の態様において、予後はH3K4me2およびH3K18ac両方の低ヒストン修飾レベルに基づく（最も不良な予後群は、修飾のいずれかまたは両方の低レベルとして定義される）。いくつかの態様において、H3K4me2およびH3K18ac両方の低ヒストン修飾レベルはより低い生存可能性を予測する。好ましい態様において、ヒストン修飾レベルは免疫細胞化学によって測定される。対象は、H3K4me2、H3K9me2およびH3K18acから選択されるヒストン修飾の染色割合のランクによって高または低リスクグループに分類できる。例えば、H3K9dime≧１０％、H3K4me2について＞６０％または＞３５％染色K18ac。
【００１７】
別の局面において、本発明は、5-FUまたは他のチミジル酸シンターゼ阻害剤がロイコボリン有りまたはなしでの処置である、膵臓がんまたは他のがんを有する対象の、5-FUまたはチミジル酸シンターゼ阻害剤療法（例えばラルチトレキセド、ペメトレキセド、ノラトレキセド、ZD9331およびGS7904L）に対する応答を予測する手段であって、ここで、予測は応答が既知である比較集団について測定された値と比較して低レベルのH3K4me2またはH3K18acの存在または非存在に基づく、手段を提供する。本方法において、低レベルの修飾は、より悪い疾患なしの生存を予測する。比較群は、修飾レベルおよび関連した生存結果に関して二分、連続的または離散的に分類できる。5-FUが処置であるがんは、結腸、直腸、頭頸部、乳房、卵巣のがん、および皮膚の基底細胞がんである。多くの場合、5-FUはロイコボリンとの組合せで使用される。
【００１８】
さらに別の局面において、本発明は、5-FUにヒストンデアセチラーゼ阻害剤を加えることが有益である、膵臓がん患者または標準の化学療法として5-FUもしくは他のチミジル酸シンターゼ阻害剤を用いている患者を同定する方法を提供する。本方法において、H3K18acヒストン修飾のレベルは、がん患者由来の組織サンプルにおいて測定する。低レベルの修飾（阻害剤なしでの5-Fuに対する修飾および応答プロファイルが既知である比較集団について測定された値との類似性に基づく）は、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤が治療法として有益であるかまたはさらに有益であることの指標である。したがって、本発明はまた、そのように同定された患者を阻害剤および所望により5-Fuもしくは本明細書に記載の他の処置で処置する方法を提供する。
【００１９】
さらに別の局面において、本発明は、5-FUにヒストンデアセチラーゼ阻害剤を加えることが有益である、標準の化学療法として５−フルオロウラシルを用いているがん（例えば結直腸がん、乳がん）患者を同定する方法を提供する。本方法において、H3K18acヒストン修飾のレベルは、がん患者由来の組織サンプルにおいて測定する。低レベルの修飾（阻害剤なしでの5-Fuに対する修飾および応答プロファイルが既知である比較集団について測定された値との類似性に基づく）は、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤がさらに有益であることの指標である。したがって、本発明はまた、そのように同定された患者を5-FUおよび阻害剤で処置する方法を提供する。
【００２０】
予後、同定、評価、処置、予測または測定を提供する上記局面のいずれかのさらなる態様において、ヒストン修飾H3K4me2、H3K9me2またはH3K18acの陽性腫瘍細胞染色を用いて、患者を低染色と高染色として分類し、ここで、低染色分類はより不良な全体的生存および／またはチミジル酸阻害剤非応答性を支持する。さらに別の態様において、予後はH3K4me2およびH3K18ac両方の低ヒストン修飾レベルに基づく（最も不良な予後群は、これらの修飾のいずれか１つまたは両方の低レベルとして定義される）。いくつかの態様において、H3K4me2およびH3K18ac両方の低ヒストン修飾レベルは、より低い生存可能性を予測する。好ましい態様において、ヒストン修飾レベルは免疫細胞化学によって測定する。対象はH3K4me2、H3K9me2およびH3K18acから選択されるヒストン修飾の染色率ランクによって高リスク群または低リスク群に分類される。いくつかの態様において、本発明は、ヒストン修飾パターンに基づいて治療に耐性であるかまたはより悪い結果もしくは予後（例えばより不良な全体的生存）を有する可能性があると同定された患者について、より攻撃的な治療の選択を提供する。
【００２１】
上記局面のいずれかのいくつかの態様において、H3K4me2、H3K9me2およびH3K18acから選択されるヒストン修飾の１、２または３つのヒストン修飾レベルを用いて、予後、同定、評価、処置、予測または測定を提供する。２つの修飾のみが選択されるような態様において、ヒストン修飾は、H3K4me2およびH3K9me2、H3K4me2およびH3K18acまたはH3K9me2およびH3K18acからなる群から選択されうる。いくつかの態様において、低修飾か高修飾かの分類は、ヒストンルール（histone rule）に基づく。比較群は、修飾レベルおよび関連した生存結果に関して二分、連続的または離散的に分類できる。
【００２２】
上記局面のいずれかについての上記態様のいずれかにおいて、患者はヒトであり、がんは腺がん、膵臓がん、乳がん、前立腺がん、肺がん、乳がん、結腸がん、直腸がん、食道がん、胆嚢がんまたは腎臓がんであってよい。上記のいずれかのいくつかの態様において、本方法は、がん治療の予後または選択を提供するのに有用なさらなる非重複予後情報を提供する。
【００２３】
いくつかの態様において、各腫瘍は、H3K4me2 （＜６０対≧６０％ランク）、H3K9me2（RTOG TMAについて＜３０対≧３０％ランクまたはUCLA Stage I/II TMAについて＜２５対≧２５％ランク）およびH3K18ac（＜３５対≧３５％ランク）を含む、細胞染色率の中央値に基づく％ランクに基づいて、低レベルまたは高レベル染色群に割り当てられる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】膵臓腺がんにおけるヒストン修飾の細胞異種性。(A) 低グレード（患者１）または高グレード（患者２）組織像の腫瘍由来の対物レンズ10x または 40x (挿入図)でのヒストン修飾についての代表的な免疫組織化学。陽性核染色を有する腫瘍細胞の指示したパーセンテージを示す腫瘍の分布が、(B) RTOG 9704または(C) UCLA Stage I/II TMAにおける各ヒストン修飾として示されている。
【００２５】
【図２】指示したヒストン修飾群に基づいたUCLA Stage I/II 膵臓がんTMAにおける全体的患者生存。Kaplan-Meierプロットにより、(A) H3K4me2、(B) H3K18ac、(C) H3K9me2および(D)低H3K4me2についておよび／またはH3K18ac対高H3K4me2およびH3K18acについての高レベル（実線）対低レベル（点線）ヒストン群についての生存可能性を可視化する。p値はLogランク試験による。
【００２６】
【図３】処置群に対する第一分類後の指示したヒストン修飾についてのRTOG 9704 TMAにおける全体的生存。患者はアジュバント化学療法に基づいて分類した（A〜B、５−フルオロウラシルまたはC〜D、ゲムシタビン）。Kaplan-Meierプロットを用いて、(A、C) H3K4me2 または(B、D) H3K9me2の高レベル（実線）対低レベル（点線）を有する患者の生存可能性を可視化した。p値はLogランク試験による。
【００２７】
【図４】原発性がん組織におけるヒストン修飾のレベルの細胞異種性。(A)肺腺がん（グレード２）および(B) 腎臓明細胞がん（グレード１）由来のがん組織の抗H3K18ac抗体による免疫組織化学的染色。褐色の核を有するがん細胞のパーセンテージは、所定の個体の各ヒストン修飾のグローバルレベルを決定する。倍率：左パネル10X、右パネル40X。(C)肺および(D) 腎臓由来がん組織におけるH3K4me2（黒棒）および H3K18ac（灰色棒）レベルについての患者の分布を示す。このグラフは、染色細胞のパーセント（ｘ軸）として、ヒストン修飾の指示したレベルを有する患者比（ｙ軸）を示す。
【００２８】
【図５】ヒストン修飾による異なるがんにおける臨床結果の予測。各がんのタイプについて、第一にH3K4me2およびH3K18acのレベルに基づいて患者を２つの群に割り当て、次いでそれらの臨床結果を比較した。Kaplan-Meirプロットを用いて(A) 肺(Logランク p=0.018、n=159) および (B) 腎臓 (Logランクp=0.028、n=192)における２つの群（グループ１、黒線；グループ２、赤線）の生存可能性を可視化する。挿入した表は、グレードに従った各群における患者の分布である。
【００２９】
【図６】H3K9me2の細胞レベルは前立腺がんおよび腎臓がんにおける臨床結果を予測する。(A) 前立腺 および(C) 腎臓由来のがん組織におけるH3K9me2のレベルについての患者の分布パターンを示す。このグラフは、染色細胞パーセント（ｘ軸）として、ヒストン修飾の指示されたレベルを有する患者比（ｙ軸）を示す。各がんのタイプについて、第一にH3K9me2のレベルに基づいて患者を２つの群に割り当て、次いでそれらの臨床結果を比較した（グループ１、H3K9me2＞１０％、黒線；グループ２、H3K9me2≦１０％、赤線）。。Kaplan-Meirプロットを用いて(A) 低グレード前立腺がん(Logランク p=0.0043、n=109) および (B) 全腎臓 (Logランクp=0.00092、n=359)における２つの群の生存可能性を可視化する。挿入した表は、グレードに従った各群における患者の分布である。
【００３０】
【図７】がん細胞系におけるヒストン修飾のレベルにおける細胞異種性。(A) LNCaPおよびPC3 前立腺がん細胞系におけるH3K9me2の免疫組織化学的試験。LNCaP細胞と比較して、より低いレベルのH3K9me2（青色の核）を有するPC3細胞の増加したパーセンテージに注意する。(B) LNCaPおよびPC3細胞から酸抽出したヒストンのH3K9me2レベルおよびローディングコントロールとしてのヒストンH3（修飾に無関係）についてのウェスタンブロット。三角は左から右へと増加したローディングを示す。
【００３１】
【図８】H3K9me2のグローバルレベルは反復ＤＮＡ要素でのそのレベルと相関する。(A) LNCaPおよびPC3におけるH3K9me2のChIPチップ分析。各列は、各々500bpの16個のフラグメントに分割される所定の遺伝子についてのアノテートされた転写開始部位（TSS）の、-5.5 〜 +2.5由来の領域を示す。8kbのプロモーター領域を横切るela結合パターンの類似性に基づいて、遺伝子をグループ分けする。色はChIPed ＤＮＡ(黄色)対核細胞からのインプット(青)の相対的富化または欠失を示す。(B) LNCaPおよびPC3細胞間の全プロモーターを横切る16個のフラグメントのそれぞれでの、H3K9me2レベルの相関。(C) 指示したＤＮＡ反復要素でのH3K9me2およびH3K18acのレベルのChIP定量的実時間ＰＣＲ分析。値はインプットのパーセンテージとして表す。エラーバーは３回の独立した実験の標準偏差を示す。ヒストンH3 ChIPをコントロールとして用いて、PC3細胞におけるより低い修飾レベルがヌクレオソーム損失によるものではないことを示した。
【００３２】
【図９】腎臓がんにおけるヒストン修飾の細胞パターン。(A) H3K4me2およびH3K18acに基づく細胞ヒストン修飾パターンは転移性疾患を有する患者の結果を予測しなかった(p=0.99、n=163)。(B) 低グレードカテゴリーの腎臓がん患者（グレード１および２、n=221）を、H3K4me2およびH3K18acのレベルに基づく２つの群に割り当てて、それらの臨床結果を比較した。Kaplan-Meirプロットを用いて２つの群の生存可能性を可視化する（グループ１、黒線；グループ２、赤線）(Logランク p=0.0055、HR=1.9、95% CI 1.2-3.1)。ヒストン修飾はグレード３および４の腎臓がんを有する患者の結果を予測しなかった（データは示さず）。
【００３３】
【図１０】H3K9me2の細胞パターンは腎臓がん予後を予測する。第一に腫瘍局在に基づいて腫瘍を分類した（局在対転移性疾患）。各層における患者を、H3K9me2のレベル（≦１０％ 染色、グループ２，赤および青線；＞１０％染色、グループ１、黒および緑線）に基づいて２つの群に割り当てて、それらの臨床結果を比較した。Kaplan-Meirプロットを用いて各層における２つのH3K9me2群の生存可能性を可視化する。局在化（黒および赤線）および転移性疾患（緑および青線）の両方で、より低いH3K9me2レベルはより不良な生存可能性を予測した。
【００３４】
【図１１】がん細胞系におけるヒストン修飾のレベルにおける細胞異種性。(A) LNCaPおよびPC3前立腺がん細胞系におけるH3K4me2およびH3K18acの免疫組織化学的試験。LNCaP細胞と比較して、より低いレベルのH3K9me2（オレンジの矢印で示す青色の核）を有するPC3細胞の増加したパーセンテージに注意する。染色の強度も(B) LNCaPおよびPC3細胞から酸抽出したヒストンのH3K4me2およびH3K18acレベルについてのウェスタンブロットである。三角は左から右へと増加したローディングを示す。
【００３５】
【図１２】ヒストン修飾は乳がんにおける予後を予測する。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
詳細な説明
ヒストン修飾の細胞パターンは、前立腺 (Seligson et al., Am J Pathol 174:1619-1628 (2009); Seligson et al., Nature 435:1262-6 (2005))、腎臓 (Seligson et al., Am J Pathol 174:1619-1628 (2009))、肺 (Seligson et al., Am J Pathol 174:1619-1628 (2009); Seligson et al., Nature 435:1262-6 (2005); Barlesi et al., J Clin Oncol 25:4358-64 (2007))、胃 (Park et al., Ann Surg Oncol 15:1968-76 (2008))および卵巣(Wei et al., Mol Carcinog 47:701-6 (2008))のがんを含む多様な腫瘍タイプについてのさらなる独立した予後情報を提供する。H3K27me3の低細胞レベルも、膵臓がんにおける不良な結果と関連していることが最近示された(Wei et al., Mol Carcinog 47:701-6 (2008))。しかし、ヒストン修飾の細胞レベルが特定の治療に対する応答を予測することは示されていない。２つの大きな膵臓腺がん患者コホート由来の組織マイクロアレイを用いて、我々は、H3K4me2、H3K9me2およびH3K18acを含む、膵臓がんにおいて従来試験されていない３つのヒストン修飾の細胞レベルを試験した。我々はこれらの修飾が膵臓がんにおいて極めて顕著であり、独立した予後因子であることを見出した。さらに、H3K4me2およびH3K9me2のより低い細胞レベルが、アジュバント 5-FU 化学療法を受けている患者についてより悪い生存結果を特異的に予測することを見出した。我々のデータはヒストン修飾の細胞レベルが膵臓がんの新たな予後マーカーであり、5-FUに対する応答を予測する助けとなることを示している。
【００３７】
ここで、我々は、低細胞ヒストン修飾レベルがアジュバント5-FU化学療法から生存利益をもたらされる可能性が低い膵臓がん患者を同定し、一方で高い細胞ヒストンレベルがアジュバントゲムシタビンまたは5-Fu化学療法のいずれかの使用から同様の生存利益をもたらされる患者を同定することを示した。我々は、細胞ヒストン修飾レベルが、切除した膵臓がんにおけるアジュバント５−フルオロウラシル化学療法に対する応答を予測可能であり、そして新たなアジュバント設定または進行性膵臓がんに対する潜在的な適用可能性を有する、バイオマーカーの新たなカテゴリーを示すと、結論する。より一般的に、細胞ヒストン修飾レベルは、５−フルオロウラシルが標準的な化学療法として用いられる他の悪性腫瘍（すなわち結直腸がんまたは乳がん）における5-FUまたは他のチミジル酸シンターゼ阻害剤に対する応答についての有用な予測バイオマーカーであると証明しうる。
【００３８】
別の局面において本発明は、低グレードまたは低ステージのがんを有する個体を処置する方法であって、個体が低グレードのがんを有するかを決定し、H3K4me2、H3K9me2およびH3K18acから選択される修飾されたヒストンタンパク質と特異的に結合する抗体と、個体由来の試験サンプルを接触させ；そしてコントロール組織サンプルと比較して試験組織サンプル中のグローバルヒストン修飾パターンを測定し、そしてグローバルヒストン修飾パターンががんが進行または転移する可能性を示す場合、患者により攻撃的ながん治療を投与することを含む方法を提供する。がんのグレードまたはステージの決定は、ヒストンタンパク質修飾パターンを決定する前または後であり得る。
【００３９】
さらに別の態様において、本発明は、がん組織の外科的切除の前、間または後または別のがん処置の前、間または後に採取された患者由来の組織サンプル中の、変化したグローバルヒストン修飾パターンに基づいて、より攻撃的または別のがん治療またはがん再発の監視の増強について患者を標的化する方法を提供する。変化したグローバルヒストン修飾パターンは本明細書に記載のとおりに測定できる。転移、再発または治療抵抗性のがんの増加したリスクを有するH3K4me2、H3K9me2およびH3K18acから選択されたグローバルヒストン修飾パターンが変化していると同定された患者は、さらに、免疫療法、化学療法および／または放射線照射での処置に基づくものからさらに選択されうる。
【００４０】
別の局面において、本発明は、医学的処置に対するがん患者の応答を評価する方法であって、H3K4me2、H3K9me2およびH3K18acから選択される修飾されたヒストンタンパク質と特異的に結合する抗体と、処置を受けている個体由来の試験組織サンプルを接触させ；そして試験組織サンプルにおいて、処置前または処置コースの初期もしくは後期、または処置を修正する前もしくは後の患者から得た組織サンプルとの比較において、H3K4me2、H3K9me2およびH3K18acから選択されるグローバルヒストン修飾パターンを測定することを含む方法を提供する。いくつかの態様において、治療はホルモンアブレーション両方または化学療法または放射線療法もしくはプロアポトーシス療法である。
【００４１】
別の局面において、本発明は、がんの予後を提供する方法であって、修飾されたヒストンタンパク質と特異的に結合する抗体とがんのリスクがあるかまたはがんを有することが知られている個体由来の試験組織サンプルを接触させ；そしてコントロール組織サンプルと比較して試験組織サンプル中のグローバルヒストン修飾パターンを測定し；変化したグローバルヒストン修飾パターンの同定により当該がんについての予後を提供する方法を提供する。いくつかの態様において、組織サンプルは腫瘍生検サンプルである。いくつかの態様において、がんまたは腫瘍は、前立腺、膀胱、腎臓、結腸または乳房のがんである。好ましい態様において、個体はあまり進行していない疾患（すなわち低グレードまたは低ステージ）、予後マーカーが速やかに必要とされるカテゴリーを有する。
【００４２】
別の局面において、本発明は、各々異なるヒストンタンパク質修飾体と結合する少なくとも２種の抗体を含むキットを提供する。いくつかの態様において、抗体はH3 K9 アセチル化、H3 K18 アセチル化、H4 K12 アセチル化、H3 K4 ジメチル化、H3 K9diMeおよびH4 R3 ジメチル化からなる群から選択される。いくつかの態様において、抗体は検出可能な部分で標識化されている。いくつかの態様において、キットは、抗体によって認識されるヒストンタンパク質修飾を有するヒストンタンパク質と結合したとき、抗体を検出するための試薬を提供する。他の態様において、キットは、がん転移または進行の増加または減少したリスクへと変化したヒストン修飾パターンに関する指示書を有する。他の態様において、キットはさらに、抗体を用いた免疫組織化学法に使用するための試薬を含む。
【００４３】
上記局面のいずれかのさらなる態様において、グローバルヒストン修飾は、H3 K9 アセチル化、H3 K18 アセチル化、H4 K12 アセチル化、H3 K4 ジメチル化、H3 K9ジメチル化およびH4 R3 ジメチル化からなる群の１つ以上から選択される。さらなる態様において、がんまたは腫瘍は、前立腺、膀胱、腎臓、結腸または乳房のがんである。がんは転移性のがんであってもよい。
【００４４】
上記局面のいずれかのいくつかの態様において、１、２、３、４つまたは少なくとも２もしくは３つの異なるヒストンタンパク質修飾のグローバルヒストン修飾パターンが検出される。さらなる態様において、少なくとも２つの異なるヒストンタンパク質修飾は、H3 K9 アセチル化、H3 K18 アセチル化、H4 K12 アセチル化、H3 K4 ジメチル化、H3 K9ジメチル化およびH4 R3 ジメチル化からなる群から選択される。いくつかの好ましい態様において、ヒストンタンパク質修飾は、H3 K4 ジメチル化およびH3K18 アセチル化である。他の態様において、ヒストンタンパク質は、H3およびH4ヒストンタンパク質のいずれかまたは両方のメチル化およびアセチル化から選択される。他の態様において、ヒストンタンパク質は、H2AおよびH2Bヒストンタンパク質のいずれかまたは両方のメチル化およびアセチル化から選択される。ヒストンタンパク質および個体は、好ましくはヒトである。
【００４５】
いくつかの態様において、がんを有するかまたはがんを有する疑いのある個体における変化したグローバルヒストン修飾パターンは、(a) がん細胞を有するかまたは有する疑いのある対象の一部から組織サンプルを得て；(b) サンプル中の１、２、３、４またはそれ以上のグローバルヒストン修飾を検出してグローバルヒストン修飾パターンを提供し、そして (c) 対象についてコントロールまたは正常グローバルヒストン修飾パターンとヒストン修飾パターンを比較して、変化したグローバルヒストン修飾パターンを同定することによって、測定される。さらなるかかる態様において、グローバルヒストン修飾は、目的のヒストンタンパク質修飾と特異的に結合する抗体を用いて検出される。抗体は、目的のヒストン修飾パターンに対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であってよい。いくつかの態様において、本方法はさらに、細胞を固定するステップおよび固定された細胞のグローバルヒストン修飾を検出するステップを含む。
【００４６】
さらなるかかる態様および上記局面のいずれかにおいて、一般に、免疫組織化学染色は、目的のヒストンタンパク質修飾と特異的に結合する抗体を用いる。抗体は、目的のヒストン修飾パターンに対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であってよい。抗体は検出可能なラベルで標識化されていてもよい（例えば放射線ラベルおよび酵素ラベル、蛍光ラベルまたは化学発光ラベル、あるいは分子タグ）。目的のヒストン修飾と結合したラベルは、オートラジオグラフィー、蛍光定量、発光定量またはホスホイメージ分析によって検出できる。好ましい態様において、グローバルヒストン修飾は、サンプル中の個々の固定された細胞の複数について検出され、免疫組織化学染色の強度および／または頻度を複数のそれぞれについて測定して、染色強度に従う細胞の頻度分布を目的の領域について得る。好ましくは、目的の領域はがんを示唆する異なる表現型を有する細胞に注目する。領域は、最も強力な染色（修飾ががんのリスク、グレードまたは進行と正の相関がある場合）または最も低い染色（修飾ががんのリスク、グレードまたは進行と負の相関がある場合）を有するサンプルの領域に従って、経験的に定義されうる。領域は、目的の領域内の染色パターンの妥当な測定が提供されるのに十分な予め決められたサイズであってよい。複数の領域をサンプリングして、組織サンプルのそれぞれから比較してもよい。
【００４７】
上記局面のいずれかのいくつかの態様において、ヒストンタンパク質修飾は、H3 K9 アセチル化、H3 K18 アセチル化、H4 K12 アセチル化、H3 K4 ジメチル化、H3 K9ジメチル化およびH4 R3 ジメチル化からなる群の１つ以上から選択される。さらなる態様において、がんまたは腫瘍は前立腺、膀胱、腎臓、結腸または乳房のがんである。がんは転移性のがんであってもよい。いくつかの態様において、ヒストン修飾について高レベルの修飾についてのカットオフは、H3K9dimeについて約≧１０％、H3K4me2について約＞６０％またはH3K18acについて約＞３５％染色である。
【００４８】
上記局面のいずれかのいくつかの態様において、少なくとも２または３つの異なるヒストン修飾のグローバルヒストン修飾パターンが検出される。さらなる態様において、少なくとも２つの異なるヒストンタンパク質修飾は、H3 K9 アセチル化、H3 K18 アセチル化、H4 K12 アセチル化、H3 K4 ジメチル化、H3 K9ジメチル化およびH4 R3 ジメチル化からなる群から選択される。いくつかの好ましい態様において、ヒストンタンパク質修飾はH3 K4 ジメチル化およびH3K18 アセチル化である。他の態様において、ヒストンタンパク質は、H3およびH4ヒストンタンパク質のいずれかまたは両方のメチル化およびアセチル化から選択される。ヒストンタンパク質は好ましくはヒトである。いくつかの態様において、選択した修飾は、H3またはH4の修飾である。いくつかのさらなる態様において、選択した修飾はH3またはH4のメチル化および／またはアセチル化である。他の態様において、選択した修飾はH3またはH4のリン酸化またはユビキチン化（ubiquinylation）を含む。さらなる態様において、少なくとも２つの異なるヒストンタンパク質修飾は、H3 K9 アセチル化、H3 K18 アセチル化、H4 K12 アセチル化、H3 K4 メチル化、H3 K9 メチル化およびH4 R3 メチル化からなる群から選択される。グローバルヒストン修飾パターンの特徴付けは、測定される診断および予後値のものである変化したグローバルヒストン修飾を可能とする。
【００４９】
上記局面および態様のいずれかの他の態様において、本方法は、修飾を検出するために目的のヒストンタンパク質修飾と特異的に結合する抗体を使用する。抗体は目的のヒストン修飾パターンに対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であってよい。いくつかの態様において、複数のグローバルヒストン修飾パターンがサンプルについて測定される。特定の修飾について分析されるヒストンは、第一にサンプルから単離され、そして流動培地中で免疫化学的方法を用いて検出されうる。
【００５０】
いくつかの態様において、ヒストンタンパク質の総レベルに対する修飾されたヒストンタンパク質の比は、変化したグローバルヒストン修飾パターンに基づいた予測尺度を提供する。例えば、ヒストンタンパク質の修飾形態および未修飾形態を検出する抗体ならびに目的の修飾を有するヒストンを選択的に検出する抗体を用いて、サンプルを分析できる。細胞集団またはサンプルにおける２つの比が決定され、本発明の方法に使用できる変化したグローバルヒストンタンパク質修飾の予測比を確立するために正常細胞についての比と比較される。
【００５１】
いくつかの態様において、変化したグローバルヒストン修飾パターンは、がんまたは腫瘍が難治性であるか治療耐性であるか、あるいはより良好な予後（例えば増加した生存可能性（例えば６ヶ月、１年、２年、３年、４年、５年またはそれ以上の生存））または減少したがんの再発可能性または減少したがんの転移可能性；または5-FUを含むがこれに限定されないチミジル酸シンターゼ阻害剤での治療に正の応答を有する可能性を提供するかについての予測である。
【００５２】
上記のいずれかのいくつかの態様において、組織は酵素、摩砕または他の手段によって脱凝集されており、個々の細胞のグローバルヒストン修飾パターンは、本明細書に記載の抗体を用いた免疫蛍光染色、続くＦＡＣＳソートおよび／またはサンプルのグローバルヒストン修飾頻度の頻度分布を提供しうる細胞の計測および測定によって、特徴付けられる。かかる方法において、目的の特定細胞のソートおよび計測を促進するため、特定の細胞またはその表現型を同定する他の蛍光マーカーを用いることも有用であり得る。
【００５３】
本発明は、個々のヒストン修飾のグローバルレベルにおける変化ががんの存在および重要なことに臨床結果の予測と関連しているという我々の発見に関連している（WO 2006/119264および２００８年５月２９日に出願した米国特許出願11/912,429に対応する米国特許出願公開US20080248039（これは同じ譲受人に譲渡されている）参照。それらの全体に置いて、参照により本明細書に組み込む）。一次前立腺切除サンプルの免疫組織化学染色を通じて、ヒストンH3およびH4における５つの残基のヒストンアセチル化（Ac）およびジメチル化（diMe）について染色する細胞のパーセンテージを測定した。同様の修飾パターンを有するサンプルのグループ分けにより、低グレードの前立腺がんを有する患者から腫瘍再発の異なるリスクを有する２つの疾患サブタイプを同定した。これらのヒストン修飾パターンは、腫瘍ステージ、術前前立腺特異的抗原（PSA）レベルおよびカプセル浸潤とは独立した結果の予測因子であった。したがって、特定のヒストン修飾における広範な変化は、前立腺がんにおける新たな分子異種性を示し、がん患者によって示される広範な臨床動態の根拠をなす。続く研究では、本マーカーが肺がん、腎臓がん、乳がん、結腸がんおよび他のがんならびに前立腺がんについて有用なマーカーであることをさらに同定した。
【００５４】
この証拠は、がん細胞のバルクまたはグローバルヒストン修飾が臨床結果の予測であることを示す。かかる変化の機構的基礎は現在不明であるが、おそらく、多様なヒストン修飾酵素の変化した発現および／またはグローバル活性と関連している。２つまたはそれ以上の組合せにおいて、これらの変化は患者、特に低グレード前立腺がんを有する患者における腫瘍再発のリスクの指標であると証明された。ヒストンでの修飾の実質的な数を考慮すると、他の修飾部位のグローバルパターンについての情報は、高グレードカテゴリーのものを含む全患者のさらなる分類を助けるであろう。ヒストン修飾を調べるための多数の抗体のセットの利用能と組み合わせた免疫組織化学の有用性は、他の腫瘍および他のヒストン修飾パターンへのこのアプローチの適用を促進する。
【００５５】
したがって、一つの局面において、本発明は、がんを診断する方法であって、修飾されたヒストンタンパク質と特異的に結合する抗体とがんを有するリスクのあるまたはがんを有する疑いのある個体由来の試験組織サンプルを接触させて；そしてコントロール組織サンプルと比較して試験組織サンプルのグローバルヒストン修飾パターンを測定し、変化したグローバルヒストン修飾パターンの同定によってがんを診断することによる、方法を提供する。いくつかの態様において、がんまたは腫瘍は前立腺、膀胱、腎臓、結腸または乳房のがんである。好ましい態様において、個体はあまり進行していない疾患（すなわち低グレードまたは低ステージ）、診断マーカーが速やかに必要とされるカテゴリーを有する。グローバルヒストン修飾パターンは、標準的な免疫組織化学法に従って採点できる。
【００５６】
別の局面において、本発明は、低グレードまたは低ステージのがんを有する個体を処置する方法であって、個体が低グレードのがんを有するかを決定し、そして修飾されたヒストンタンパク質と特異的に結合する抗体と個体由来の試験組織サンプルを接触させ；そしてコントロール組織サンプルと比較して試験組織サンプルのグローバルヒストン修飾パターンを測定し、グローバルヒストン修飾パターンががんが進行または転移する可能性を示している場合、より攻撃的ながん治療を患者に投与することによる、方法を提供する。がんのグレードまたはステージの決定は、ヒストンタンパク質修飾を測定する前または後であり得る。
【００５７】
さらに別の態様において、本発明は、がん組織の外科的切除（例えば前立腺切除）の前、間または後または別のがん処置の前、間または後に採取された患者由来の組織サンプル中の、変化したグローバルヒストン修飾パターンに基づいて、より攻撃的または別のがん治療またはがん再発の監視の増強について患者を標的化する方法を提供する。変化したグローバルヒストン修飾パターンは本明細書に記載のとおりに測定できる。がんは例えば前立腺がん、卵巣がん、腎臓がん、肺がん、乳がん、結腸がん、白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫または肝細胞がんであってよい。好ましい態様において、がんは前立腺がんまたは膀胱がんである。転移、再発または治療耐性がんのリスクの増加と関連した変化したグローバルヒストン修飾パターンを有すると同定された患者は、所望により化学療法および／または放射線照射を補った、外因性または内因性ホルモンアブレーションでの処置のために、その基礎についてさらに選択されうる。前立腺がんの場合、ホルモンアブレーションはアンドロゲンアブレーションである（例えばフィナステライドおよび他の抗テストステロンまたは抗ＤＨＴ剤での処置）。
【００５８】
別の局面において、本発明は、医学的処置のためにがん患者の応答を評価する方法であって、修飾されたヒストンタンパク質と特異的に結合する抗体と処置を受けている個体由来の試験組織サンプルを接触させるステップ；および処置の前または処置コースの初期もしくは後期または処置を修正する前および後の患者から得た組織サンプルと比較して、試験組織サンプルのグローバルヒストン修飾パターンを測定するステップを含む、方法を提供する。いくつかの態様において、治療はホルモンアブレーション療法または化学療法または放射線療法またはプロアポトーシス療法である。
【００５９】
別の局面において、本発明は、がんについての予後を提供する方法であって、修飾されたヒストンタンパク質と特異的に結合する抗体とがんのリスクがあるかまたはがんを有することが知られている個体由来の試験組織サンプルを接触させ、コントロール組織サンプルと比較して試験組織サンプルのグローバルヒストン修飾パターンを測定し；変化したグローバルヒストン修飾パターンを同定することによってがんについての予後を提供することによる、方法を提供する。いくつかの態様において、組織サンプルは腫瘍生検サンプルである。いくつかの態様において、がんまたは腫瘍は、前立腺、膀胱、腎臓、結腸または乳房のがんである。好ましい態様において、個体はあまり進行していない疾患（すなわち低グレードまたは低ステージ）、予後マーカーが速やかに必要とされるカテゴリーを有する。
【００６０】
別の局面において、本発明は、各々ヒストンタンパク質修飾体と結合する少なくとも２種の抗体を含むキットを提供する。いくつかの態様において、抗体はH3 K9 アセチル化、H3 K18 アセチル化、H4 K12 アセチル化、H3 K4 ジメチル化、H3 K9diMeおよびH4 R3 ジメチル化からなる群から選択される。いくつかの態様において、抗体は検出可能な部分で標識化される。いくつかの態様において、キットは、抗体によって認識されるヒストンタンパク質修飾を有するヒストンタンパク質と結合する場合に抗体を検出する試薬を提供する。他の態様において、キットは、変化したグローバルヒストン修飾パターンをがん転移または進行の低下または増加したリスクと関連させる指示書を有する。他の態様において、キットは、抗体を用いた免疫組織化学方法に使用するための試薬をさらに含む。
【００６１】
上記局面のいずれかのさらなる態様において、グローバルヒストンタンパク質修飾は、H3 K9 アセチル化、H3 K18 アセチル化、H4 K12 アセチル化、H3 K4 ジメチル化、H3 K9ジメチル化およびH4 R3 ジメチル化からなる群の１つ以上から選択される。さらなる態様において、がんまたは腫瘍は、前立腺、膀胱、腎臓、結腸または乳房のがんである。がんは転移性のがんであってもよい。
【００６２】
上記局面のいずれかのいくつかの態様において、１、２、３、４つまたは少なくとも２または３つの異なるヒストンタンパク質修飾のグローバルヒストン修飾パターンが検出される。さらなる態様において、少なくとも２つの異なるヒストンタンパク質修飾は、H3 K9 アセチル化、H3 K18 アセチル化、H4 K12 アセチル化、H3 K4 ジメチル化、a H3 K9ジメチル化およびH4 R3 ジメチル化からなる群から選択される。いくつかの好ましい態様において、ヒストンタンパク質修飾は、H3 K4 ジメチル化およびH3K18 アセチル化である。他の態様において、ヒストンタンパク質は、H3およびH4ヒストンタンパク質のいずれかまたは両方のメチル化およびアセチル化から選択される。他の態様において、ヒストンタンパク質は、H2AおよびH2Bヒストンタンパク質のいずれかまたは両方のメチル化およびアセチル化から選択される。ヒストンタンパク質および個体は好ましくはヒトである。
【００６３】
いくつかの態様において、がんを有するかまたはがんを有する疑いのある個体における変化したヒストン修飾パターンは、(a) がん細胞を有するかまたは有する疑いのある対象の一部から組織サンプルを得て；(b) サンプル中の１、２、３、４またはそれ以上のグローバルヒストン修飾を検出してグローバルヒストン修飾パターンを提供し、そして (c) 対象についてコントロールまたは正常グローバルヒストン修飾パターンとヒストン修飾パターンを比較して、変化したグローバルヒストン修飾パターンを同定することによって、測定される。さらなるかかる態様において、グローバルヒストン修飾は、目的のヒストンタンパク質修飾と特異的に結合する抗体を用いて検出される。抗体は、目的のヒストン修飾パターンに対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であってよい。いくつかの態様において、本方法はさらに、細胞を固定するステップおよび固定された細胞のグローバルヒストン修飾を検出するステップを含む。
【００６４】
さらなるかかる態様および上記局面のいずれかにおいて、一般に、免疫組織化学染色は、目的のヒストンタンパク質修飾と特異的に結合する抗体を用いる。抗体は、目的のヒストン修飾パターンに対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であってよい。抗体は検出可能なラベルで標識化されていてもよい（例えば放射線ラベルおよび酵素ラベル、蛍光ラベルまたは化学発光ラベル、あるいは分子タグ）。目的のヒストン修飾と結合したラベルは、オートラジオグラフィー、蛍光定量、発光定量またはホスホイメージ分析によって検出できる。好ましい態様において、グローバルヒストン修飾は、サンプル中の個々の固定された細胞の複数について検出され、免疫組織化学染色の強度および／または頻度を複数のそれぞれについて測定して、染色強度に従う細胞の頻度分布を目的の領域について得る。好ましくは、目的の領域はがんを示唆する異なる表現型を有する細胞に注目する。領域は、最も強力な染色（修飾ががんのリスク、グレードまたは進行と正の相関がある場合）または最も低い染色（修飾ががんのリスク、グレードまたは進行と負の相関がある場合）を有するサンプルの領域に従って、経験的に定義されうる。領域は、目的の領域内の染色パターンの妥当な測定が提供されるのに十分な予め決められたサイズであってよい。複数の領域をサンプリングして、組織サンプルのそれぞれから比較してもよい。
【００６５】
上記局面のいずれかのいくつかの態様において、ヒストンタンパク質修飾は、H3 K9 アセチル化、H3 K18 アセチル化、H4 K12 アセチル化、H3 K4 ジメチル化、H3 K9ジメチル化およびH4 R3 ジメチル化からなる群の１つ以上から選択される。さらなる態様において、がんまたは腫瘍は前立腺、膀胱、腎臓、結腸または乳房のがんである。がんは転移性のがんであってもよい。
【００６６】
上記局面のいずれかのいくつかの態様において、少なくとも２または３つの異なるヒストン修飾のグローバルヒストン修飾パターンが検出される。さらなる態様において、少なくとも２つの異なるヒストンタンパク質修飾は、H3 K9 アセチル化、H3 K18 アセチル化、H4 K12 アセチル化、H3 K4 ジメチル化、H3 K9ジメチル化およびH4 R3 ジメチル化からなる群から選択される。いくつかの好ましい態様において、ヒストンタンパク質修飾はH3 K4 ジメチル化およびH3K18 アセチル化である。他の態様において、ヒストンタンパク質は、H3およびH4ヒストンタンパク質のいずれかまたは両方のメチル化およびアセチル化から選択される。ヒストンタンパク質は好ましくはヒトである。いくつかの態様において、選択した修飾は、H3またはH4の修飾である。いくつかのさらなる態様において、選択した修飾はH3またはH4のメチル化および／またはアセチル化である。他の態様において、選択した修飾はH3またはH4のリン酸化またはユビキチン化（ubiquinylation）を含む。さらなる態様において、少なくとも２つの異なるヒストンタンパク質修飾は、H3 K9 アセチル化、H3 K18 アセチル化、H4 K12 アセチル化、H3 K4 メチル化、H3 K9 メチル化およびH4 R3 メチル化からなる群から選択される。グローバルヒストン修飾パターンの特徴付けは、測定される診断および予後値のものである変化したグローバルヒストン修飾を可能とする。
【００６７】
いくつかの態様において、分析に使用するヒストン修飾は、がんの重症度、グレードまたは進行の可能性についてのそれらの変化したヒストン修飾パターンの予測能に従って選択される。いくつかの態様において、分析するヒストン修飾は、それ自体または第二、第三または第四ヒストン修飾パターンと組み合わせて変化したヒストン修飾パターンが、少なくとも1.5、2、3、4または5倍またはそれ以上、あるいは1.5〜3倍もしくは1.5〜4倍もしくは2〜5倍のオーダーで、より重度な結果またはがんのグレードまたは転移またはチミジル酸シンターゼ処置に対する不応答性の増加した可能性についての相対的リスクを提供するものである。
【００６８】
上記局面および態様のいずれかの他の態様において、本方法は、修飾を検出するための目的のヒストンタンパク質修飾体と特異的に結合する抗体を用いる。抗体は目的のヒストン修飾パターンに対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であってよい。いくつかの態様において、サンプルについて複数のグローバルヒストン修飾パターンが測定される。具体的な修飾について分析されるヒストンは、第一に、サンプルから単離され、流体培地中で免疫化学法を用いて検出されうる。
【００６９】
いくつかの態様において、ヒストンタンパク質の総レベルに対する修飾されたヒストンタンパク質の比は、変化したグローバルヒストン修飾パターンに基づいた予測尺度を提供する。例えば、ヒストンタンパク質の修飾形態および未修飾形態を検出する抗体ならびに目的の修飾を有するヒストンを選択的に検出する抗体を用いて、サンプルを分析できる。細胞集団またはサンプルにおける２つの比が決定され、本発明の方法に使用できる変化したグローバルヒストンタンパク質修飾の予測比を確立するために正常細胞についての比と比較される。
【００７０】
いくつかの態様において、変化したグローバルヒストン修飾パターンは、がんまたは腫瘍が処置または治療抵抗性であるかの予測である。
【００７１】
上記のいずれかのいくつかの態様において、ヒストンルールが適用され、ここで、約６０％以上のK4 diMe染色値を有するがん患者および患者はこれらのレベル未満である患者よりもより良好な予後を有する。いくつかの他の態様において、各々約３５％以上のK18 AcおよびK4 diMe染色値を有するがん患者は、これらのレベル未満の患者よりも良好な予後を有する。
【００７２】
上記のいずれかのいくつかの態様において、組織は血液であり、血球細胞について変化したグローバルヒストン修飾パターンが測定される。いくつかの態様において、サンプルは白血病またはリンパ腫を有する患者に由来し、変化したグローバルヒストン修飾パターンは、白血病またはリンパ腫細胞由来のパターンを含む。グローバルヒストン修飾パターンの検出は、細胞の免疫蛍光、続くＦＡＣＳソートおよび／または細胞の計測および測定を用いて行いうる。これらの方法は、サンプル中の目的の細胞についてのグローバルヒストン修飾頻度の頻度分布を提供できる。かかる方法において、白血病またはリンパ腫細胞のソートおよび計測を促進するため、具体的な細胞またはその表現型を同定する他の蛍光マーカーの使用も有用であり得る。
【００７３】
上記のいずれかのいくつかの態様において、組織は酵素、摩砕または他の手段によって脱凝集されており、個々の細胞のグローバルヒストン修飾パターンは、本明細書に記載の抗体を用いた免疫蛍光染色、続くＦＡＣＳソートおよび／またはサンプルのグローバルヒストン修飾頻度の頻度分布を提供しうる細胞の計測および測定によって、特徴付けられる。かかる方法において、目的の特定細胞のソートおよび計測を促進するため、特定の細胞またはその表現型を同定する他の蛍光マーカーを用いることも有用であり得る。
【００７４】
いくつかの態様において、修飾の分析は、関係（ties）データセットについての対応するランクの最小値を割り当てるTIES=LOWオプションでSASシステム法RANKを用いたTMAデータセットに対する細胞染色の中央値パーセントに基づいて割り当てられたパーセントランク値（変位値）に従って、評価される。各腫瘍は、H3K4me2 （＜６０対≧６０％ランク）、H3K9me2（RTOG TMAについて＜３０対≧３０％ランクまたはUCLA Stage I/II TMAについて＜２５対≧２５％ランク）およびH3K18ac（＜３５対≧３５％ランク）(H3K9ac≧１０％)を含む、パーセントランクに基づいて、またはそれらの値の0.8〜1.2、0.9〜1.1または0.95〜1.05倍の範囲内で、低レベルまたは高レベル染色群に割り当てられる。細胞染色パーセンテージは、使用した染色方法に影響されうることが理解される。したがって、本発明のいくつかの態様において、パーセンテージは同じ方法で得られた場合、本明細書において得られたものと同等である。
【００７５】
チミジル酸シンターゼ阻害剤に対する患者の応答を予測するかまたは患者のがん治療を選択する方法であって、(a)修飾されたヒストンタンパク質と特異的に結合する抗体または免疫学的に活性なそのフラグメントもしくはアプタマーと、がんのリスクを有するかまたはがんを有することが知られている対象由来の試験組織サンプルを接触させるステップ；および(b) グローバルH3K4ジメチル化、H3K9ジメチル化および／またはH3K18アセチル化ヒストン修飾パターンを測定するステップを含む、方法。いくつかの態様において、組織サンプルは、膵臓、前立腺、膀胱、腎臓、卵巣、結腸または乳房のがんの腫瘍生検サンプルである。各腫瘍は、H3K4me2 （＜６０対≧６０％ランク）、H3K9me2（約＜３０または２５対≧３０または≧２５％ランク）および約H3K18ac（＜３５対≧３５％ランク）を含む、パーセントランクに基づいて、またはそれらの値の0.8〜1.2、0.9〜1.1または0.95〜1.05倍の範囲内で、低レベルまたは高レベル染色群に割り当てられる。細胞染色パーセンテージは、使用した染色方法に影響されうることが理解される。したがって、本発明のいくつかの態様において、パーセンテージは同じ方法で得られた場合、本明細書において得られたものと同等である。
【００７６】
定義
異なることが述べられていない限り、明細書および特許請求の範囲において使用される以下の用語は、以下に記載の意味を有する。明細書および特許請求の範囲において使用するとき、単数形「a」、「an」および「the」は、文脈が明らかに異なることを示していない限り、複数についての言及を含むことに注意されたい。
【００７７】
アミノ酸は、IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commissionに推奨される、一般に既知の３文字表記または１文字表記によって記載されている。
【００７８】
「グローバルヒストン修飾」は、プロモーター領域に制限されないが、非プロモーター領域を含むクロマチンの大きな領域を含むヒストンタンパク質修飾のパターンを意味する。グローバルヒストン修飾パターンは、目的のヒストン修飾と特異的に結合できる抗体、アプタマーおよび該抗体の免疫学的に活性なフラグメントを用いた免疫学的方法などを含む、当該技術分野において既知のいずれかの方法によって測定できる。免疫組織化学および免疫細胞学的方法は、修飾されたヒストンの検出またはグローバルヒストン修飾パターンおよび修飾についての細胞染色のパーセントを確立するための細胞の染色に使用できる。マススペクトルおよび電気化学的手法を用いてもよい。非抗体ベースのプロトコルを含む、ヒストン修飾のグローバルパターンを測定する全ての可能な方法が使用でき、組織ヒストンマーカー染色がヒストンマークの染色パターンと相関するある形態および表現型パターンに注意を引く場合に認識可能な後成的パターンの検出を提供するソフトウェアプログラムをこの方法に組み込んでよい。いくつかの例において、H3k9me2のような単一マーカーの場合、１０％＞＝をカットオフとして使用でき、それ以下のスコアは不良な予後を示し、二種混合方法を考慮してもよい。一般に、カットオフパーセンテージは、別の方法によって測定または検出したとき、同等の値を含む。好ましい態様において、カットオフ値は相対的生存率、予後または治療応答において実質的に群を二分するように確立される。例えば、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％の生存または治療応答生存の相対的可能性の差を提供するカットオフは、生存期間６ヶ月、１年、２年、３年、４年、５年、１０年またはそれ以上の生存期間について選択されうる。
【００７９】
「ヒストン」は染色体のＤＮＡ結合構造タンパク質を意味する。ヒストンはリシンおよびアルギニンのような正に荷電したアミノ酸を高い割合で有し、ＤＮＡ結合に関与する。ヒストンの５つの主なタイプは、２つのグループに属する：ヌクレオソームヒストンH2A、H2B、H3、H4；およびH1ヒストン。「修飾されたヒストンタンパク質」は、リシンアセチル化、リシンメチル化（モノ、ジおよびトリメチル化）、リシンユビキチン化、アルギニンメチル化（モノ、ジ、対称および非対称メチル化）、セリン／スレオニン／チロシンリン酸化を含むがこれらに限定されない化学修飾の１つ以上を有するヒストンタンパク質を意味する。
【００８０】
アミノ酸配列に関して、ヒストンH3は配列番号１および配列番号２のタンパク質（Swiss Prot Acc No: Q93081 (配列そのものについてその全体において参照により本明細書に組み込む)参照）および修飾されたヒストンタンパク質を含む天然に生じる変異体、ならびにそれと実質的に同一のタンパク質および特に上記配列の１位のＮ末端メチオニン残基を欠くもの（例えばＮ末端メチオニン残基の翻訳後欠失）を含む。修飾されたヒストンタンパク質は当該技術分野において周知である。例えば、好適なヒストンタンパク質修飾は、次に列挙したいずれか１つ以上を含みうるがこれらに限定されない。本発明に使用できるタンパク質修飾の例を次に示す。
潜在的修飾部位を有するヒストンタンパク質H3
Swiss Prot Acc No: Q93081 
【表１】
2012524278.tif 000003
選択されたヒストン修飾
【表２】
2012524278.tif 000004
【００８１】
上記表において、「Me」はメチル修飾、「Ac」はアセチル修飾、「P」または「phos」はリン酸化修飾、そして「Ub」はユビキチン化を意味する。Meが指示されている場合、それはモノ、ジまたはトリメチル化でありうる。２つの修飾が特定のタンパク質残基について記載されている場合、それらは二者択一の修飾であり得る。
【００８２】
表の残基位置は、配列番号１〜６の位置に関し、Ｎ末端メチオニンがない場合は番号をふり直す（すなわち、配列番号１〜６の残基位置から１を引く）。好ましい態様において、検出される配列番号１〜６のヒストンタンパク質は、Ｎ末端メチオニン残基を欠く。
【００８３】
本発明に使用するヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、ボリノスタット、FK228、PXD101、PCI-24781、ITF2357、MGCD0103、MS-275、バルプロ酸およびLBH589 (Tan et al., Journal of Hematology & Oncology 2010, 3:5)を含むがこれらに限定されない。したがって、阻害剤は(a) 有機ヒドロキサム酸 (例えばTrichostatin A (TSA)およびスベロイルアニリドビスヒドロキサミン (SAHA)) (b) 短鎖脂肪酸 (例えばブチレートおよびバルプロ酸(VPA))、(c)ベンズアミド (例えばMS-275)、(d) 環状テトラペプチド(例えばトラポキシン)、および(e) スルホンアミドアニリドであってよい。薬物はLBH589 (パノビノスタット)、PCI24781 (CRA-024781)、LAQ824 I、II、PXD101 (ベリノスタット)、ITF2357、SB939、JNJ-16241199 (R306465)、ｍ−カルボキシ桂皮酸ビスヒドロキサミド (CBHA)、スクリプタイド、オキサムフラチン、ピロキサミド、環状ヒドロキサム酸含有ペプチド(CHAP)、AN-9、OSU-HDAC42、ベンズアミド類 MS-275 (エンチノスタット)、MGCD0103、ピメリン酸ジフェニルアミド、M344、Ｎ−アセチルジナリン(CI-994)、環状テトラペプチドアピシジン、トラポキシン、HC-toxin、クラミドシン、デプシペプチド (FR901228またはFK228) (ロミデプシン)、スルホンアミドアニリド、Ｎ−２−アミノフェニル−３−［４−（４−メチルベンゼンスルホニルアミノ）−フェニル］−２−プロペンアミド、デプデシン、NDH-51およびKD5150を含む。
【００８４】
「免疫組織化学」は、細胞および組織切片のような生物学的サンプル中のタンパク質を検出するための抗体またはアプタマーの使用を意味する。本発明の検出方法は、例えば当該技術分野において既知の標準的な免疫組織化学技術を用いて実施できる(Gosling, Immunoassays: A Practical Approach, 2000, Oxford University Pressに概説)。検出は、例えば放射性同位体、蛍光標識、酵素もしくは当該技術分野において既知の他の検出可能なラベルのいずれかを有する一次抗体または二次抗体のラベリングによって実施される。染色強度による組織切片の可視的段階分けは当該技術分野において周知である。腫瘍および健常組織サンプル由来の標準コントロールは、サンプルおよび試薬間の変化についてのコントロールのため、当業者によって日常的に使用される。さらに、所望の標的（すなわちヒストン）に特異的な一次抗体を含まないネガティブコントロールは、コントロールとして日常的に使用される。Van Diest et al., Anal. Quant. Cytol. Histol. 18(5):351-4 (1996)は、不慣れな観察者であっても、数分の訓練で、免疫組織化学染色強度に基づく０〜４のスケールで乳がん切片を再現性よく段階分けできることを開示する。したがって、当業者は、スケール（例えば０〜４またはそれ以外）に基づいて、染色のパーセントに基づいてまたはポジティブもしくはネガティブの単純な決定に基づいて、サンプルを段階分けできる。免疫組織化学染色の方法は、明細書に例示されている。いくつかの態様において、指示した細胞染色のパーセントまたは程度が生じる組織サンプルの頻度は、各修飾について確認される。当業者はサンプルおよび試薬間の変化についてコントロールするための腫瘍および健常組織サンプル由来の標準コントロールの使用を理解する。さらに、所望の標的に特異的な一次抗体を含まないネガティブコントロールは、本願出願時点で、バックグラウンドについてコントロールするために日常的に使用されうる。免疫組織化学計測も当該技術分野において周知である。いくつかの態様において、免疫組織化学計測は、０〜４または１〜４の尺度に基づく。例えば、Van Diest et al., Anal. Quant. Cytol. Histol. 18(5):351-4 (1996)は、不慣れな観察者であっても、数分の訓練で、免疫組織化学染色強度に基づく０〜４のスケールで乳がん切片を再現性よく段階分けできることを開示する。当業者は抗体に代えてアプタマーをどのように本方法に適用するか、知っている。
【００８５】
「ラベル」または「検出可能な部分」は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的または他の物理的手段によって検出可能な組成物である。例えば、有用なラベルは、32P、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（例えばＥＬＩＳＡに一般に使用される）、ビオチン、ジゴキシゲニンまたはハプテンおよび例えばペプチドに放射性ラベルを取り込むことによって検出可能とすることができるかまたはペプチドと特異的に反応性の抗体を検出するために使用されるタンパク質を含む。ラベルは生体認識分子またはこれらの分子と結合するプローブに直接、当該技術分野において周知の常套の方法を用いて結合させることができる。複数標識化スキームは当該技術分野において既知であり、複数の結合アッセイを同時に実施することが可能となる。異なるラベルは、放射活性、酵素、化学発光、蛍光、量子ドットまたは他のものであり得る。抗体とラベルを共有または非共有結合させる方法は当業者に周知である。標識化抗体の使用によりタンパク質および修飾されたタンパク質を検出する方法も、当業者に周知である。
【００８６】
「がん」は、ヒトのがんおよび癌腫、肉腫、腺がん、リンパ腫、白血病などを意味し、固形腫瘍およびリンパ系のがん、腎臓、乳房、肺、腎臓、膀胱、結腸、卵巣、前立腺、膵臓、胃、脳、頭頸部、皮膚、子宮、睾丸、食道および肝臓のがんを含むがこれらに限定されず、そして非ホジキンリンパ腫、白血病および多発性骨髄腫を含むがこれらに限定されないリンパ腫を含む。好ましい態様において、がんは腺がん、膵臓がん、乳がん、前立腺がん、肺がんまたは腎臓がんである。本発明により予後および5-FU応答性を評価できる原発性または二次的悪性腫瘍を含むがんのタイプは、骨のがん、喉頭のがん、胆嚢がん、直腸がん、頭頸部がん、気管支がん、基底細胞癌腫、潰瘍性および乳頭タイプの両方の扁平細胞がん、転移性皮膚がん、骨肉腫、ユーイング肉腫、細網肉腫、骨髄腫、巨細胞腫瘍、小細胞肺がん、島細胞腫瘍、原発性脳腫瘍、急性および慢性リンパ腫および顆粒球腫瘍、毛細胞腫瘍、腺腫、過形成、髄様癌腫、褐色細胞腫、粘膜神経腫、子宮頸がん、神経芽腫、網膜芽腫、軟組織肉腫、悪性カルチノイド、横紋筋肉腫、カポジ肉腫、骨および他の肉腫、腎細胞腫瘍、多形グリア芽腫、悪性黒色腫、類表皮がんを含むが、これらに限定されない。
【００８７】
5-FU治療は、5-FUおよび5-FUのプロドラッグでの治療ならびに5-FUおよびそのプロドラッグ（例えばロイコボリン）での組合せ治療を含むが、これらに限定されない。
【００８８】
「生物学的サンプル」は、生検および剖検サンプルのような組織切片、ならびに組織学的目的のために採取された凍結切片を含む。組織、培養細胞、例えば初代培養、外植片および形質転換された細胞。一つの態様において、生物学的サンプルは、免疫組織化学のために調製された組織サンプルである。他の態様において、生物学的サンプルは、ハイスループットスクリーニングのための組織マイクロアレイ（TMA）として調製された組織サンプルである。生物学的サンプルは、典型的には、真核生物、最も好ましくはヒトまたは霊長類のような哺乳類、例えばチンパンジー、ウシ、イヌ、ネコ、げっ歯類、例えばモルモット、ラット、マウス、ウサギまたは鳥類、爬虫類または魚類から得られる。
【００８９】
「生検」は、診断または予後評価のために組織サンプルを採取するプロセスまたは組織標本それ自体を意味する。当該技術分野において既知のいずれかの生検技術は、本発明の診断および予後方法に適用できる。適用される生検技術は他の要因の中でもとりわけ評価する組織のタイプ、腫瘍のサイズおよびタイプに依存する。代表的な生検技術は、切除生検、切開生検、針生検、外科的生検および骨髄生検を含む。「切除生検」は、腫瘍塊全体とそれを取り囲む正常組織の少量のマージンの除去を意味する。「切開生検」は、腫瘍の断面直径を含む組織の楔（wedge）の除去を意味する。内視鏡検査または蛍光透視法によって行われる診断または予後は、腫瘍塊の「コア針生検」または腫瘍塊内由来の細胞の懸濁液を一般に得る「細針生検」を必要としうる。生検技術は、例えばHarrison’s Principles of Internal Medicine, Kasper, et al., eds., 16th ed., 2005, Chapter 70およびPart Vに記載されている。
【００９０】
「抗体」は免疫グロブリン遺伝子由来のフレームワーク領域またはそのフラグメントを含む、抗原と特異的に結合し、それを認識するポリペプチドを意味する。理解される免疫グロブリン遺伝子は、κ、λ、α、γ、δ、εおよびμ定常領域遺伝子ならびに種々の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。軽鎖はκまたはλとして分類される。重鎖はγ、μ、α、δまたはεとして分類され、これらは順に、免疫グロブリンクラスIgG、IgM、IgA、IgDおよびIgEをそれぞれ定義する。典型的には、抗体の抗原結合領域は結合特異性および親和性に最も重要である。
【００９１】
免疫グロブリン（抗体）構造単位の例は、テトラマーを含む。各テトラマーは、ポリペプチド鎖の２つの同一の対から成り、各対は１個の軽鎖（約25 kD）および１個の重鎖（約50〜70 kD）を有する。各鎖のＮ末端は、抗原認識に一次的に関与する約100〜110またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を定義する。用語可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）は、これらの軽鎖および重鎖をそれぞれ意味する。
【００９２】
抗体は、例えばインタクトな免疫グロブリンとしてまたは多様なペプチダーゼによる消化によって作成した十分に特徴付けられた多数のフラグメントとして存在する。したがって、例えばペプシンは抗体をヒンジ領域のジスルフィド結合の下で消化して、それ自体がジスルフィド結合によりＶＨ−ＣＨ１と結合した軽鎖であるＦａｂのダイマーである、Ｆ（ａｂ）’２を生産する。Ｆ（ａｂ）’２は緩やかな条件下で縮小されてヒンジ領域のジスルフィド結合が破壊され、それによってＦ（ａｂ）’２ダイマーがＦａｂ’モノマーに変換されうる。Ｆａｂ’モノマーは本質的に、ヒンジ領域の一部を有するＦａｂである。(Fundamental Immunology (Paul ed., 3d ed. 1993)参照）。多様な抗体フラグメントがインタクトな抗体の消化によって定義されるが、当業者はかかるフラグメントを化学的または組換えＤＮＡ技術を用いて新規に合成できることを理解する。したがって、用語抗体は、本明細書において使用するとき、全抗体の修飾によって作成したかあるいは組換えＤＮＡ方法（例えば一本鎖Ｆｖ）を用いて新規に合成したもの、またはファージディスプレーライブラリーを用いて同定したものも含む（例えばMcCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990)参照）。
【００９３】
抗体、例えば組換えモノクローナルまたはポリクローナル抗体の製造のために、当該技術分野において既知の多くの技術を使用できる（例えば、Kohler & Milstein, Nature 256:495-497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4: 72 (1983); Cole et al., pp. 77-96 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985); Coligan, Current Protocols in Immunology (1991); Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988);および Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2d ed. 1986)参照)。目的の抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子は細胞からクローン化でき、例えばモノクローナル抗体をコードする遺伝子はハイブリドーマからクローニングでき、組換えモノクローナル抗体を作成するために使用される。モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子ライブラリーも、ハイブリドーマまたは血漿細胞から作成できる。重鎖および軽鎖遺伝子のランダム組合せ産物は、異なる抗原特異性を有する抗体の巨大なプールを作成する（例えばKuby, Immunology (3rd ed. 1997)参照）。一本鎖抗体または組換え抗体の作製技術は（米国特許4,946,778、米国特許4,816,567）、本発明のポリペプチドに対する抗体を作成するために適用できる。また、トランスジェニックマウスまたは他の哺乳類のような他の生物を用いて、ヒト化またはヒト抗体を発現させてもよい（例えば米国特許5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016、Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368:856-859 (1994); Morrison, Nature 368:812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14:826 (1996);およびLonberg & Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)参照）。あるいは、ファージディスプレー技術を用いて、選択した抗原と特異的に結合する抗体およびヘテロマーＦａｂフラグメントを同定してもよい（例えば、McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990); Marks et al., Biotechnology 10:779-783 (1992)参照）。抗体は多重特異性すなわち異なる２種の抗原を認識できるものとしてもよい（例えばWO 93/08829、Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659 (1991); および Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986)参照）。抗体はまた、異種複合体、例えば２つが共有結合した抗体または免疫毒素であってもよい（例えば、米国特許4,676,980、WO 91/00360; WO 92/200373;およびEP 03089参照）。
【００９４】
非ヒト抗体をヒト化または霊長類化する方法は、当該技術分野において周知である。一般に、ヒト化抗体は非ヒト原からそれに導入された１個以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば輸入可変ドメインから典型的にはとられる、輸入残基と称される。ヒト化は、本質的にはWinterらの方法に従って（例えばJones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988) および Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)参照）、ヒト抗体の対応配列についてげっ歯類の複数のＣＤＲまたはＣＤＲ配列を置換して、実施できる。したがって、かかるヒト化抗体はキメラ抗体（米国特許4,816,567）であり、ここで実質的にインタクトなヒト可変ドメインより少ないものが非ヒト種由来の対応配列で置換されている。実際上、ヒト化抗体は典型的には、いくつかのＣＤＲ残基およびおそらくいくつかのＦＲ残基がげっ歯類抗体における同様の部位由来の残基によって置換されているヒト抗体である。
【００９５】
「キメラ抗体」は、(a) 抗原結合部位（可変領域）が異なるまたは変化したクラス、エフェクター機能および／または種またはキメラ抗体に新たな特性を与える全く異なる分子、例えば酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬物等が結合するように定常領域またはその一部が変化、置換または交換されているか；あるいは(b) 可変領域またはその一部が、異なるまたは変化した抗原特異性を有する可変領域で変化、置換または交換されている、抗体分子である。
【００９６】
グローバルヒストン修飾パターンに基づいて患者が5-FUまたはチミジル酸シンターゼ阻害剤に耐性であるかまたは不良な生存予測を有する場合に使用される処置は、dhfr経路に影響を与える薬物、ホルモン療法、免疫療法、ＲＮＡｉ両方、放射線療法、栄養補助療法、「瞑想」療法、細胞エネルギー代謝に影響を与え、そして／または低レベルの修飾から高レベルの修飾にヒストン修飾のグローバルパターンをシフトさせることに寄与する薬物を含み、私はこれが細胞ヒストン修飾の低レベルから高レベルへのシフトに影響するあらゆる薬物に対する応答予測を説明する全て包含する方法であり得ると考える。
【００９７】
ヒストン修飾パターンが5-FUまたは他のチミジル酸シンターゼ阻害剤に応答性でない可能性があることを示す対象は、5-FUまたはチミジル酸シンターゼ阻害剤に加えてまたはそれとは別の治療、例えば限定されないが別の化学療法剤、免疫療法、放射線療法、アンチセンス療法、ＲＮＡｉ療法、ホルモン療法、dhfr経路に影響する薬物および代謝拮抗療法（例えば葉酸阻害剤、メトトレキセート）、タキサン（例えばパクリタキセル、タキソール）、アブラキサン、キナーゼ阻害剤、特にc-met、MEK、Apo2L/TRAIL、EGFRの阻害剤（ＥＧＦＲの内部および外部ドメイン両方の阻害剤）、抗VEGF療法および抗IGF1RおよびIGF2R療法によって処置しうる。さらに、栄養補助療法または細胞エネルギー代謝に影響を与えるいずれかの治療法および／または低レベルの修飾から高レベルの修飾にヒストン修飾のグローバルパターンをシフトさせる薬物が投与される。グローバルヒストン修飾がより不良な予後を有すると示す対象は、上記治療のいずれか１つまたは組合せを含む、より攻撃的な処置を投与してもよい。
【００９８】
一つの態様において、抗体は、「エフェクター」部分と結合される。エフェクター部分は放射活性ラベルまたは蛍光ラベルのような標識部分を含むがこれらに限定されない任意の数の分子あるいは治療部分であってよい。一つの局面において、抗体は、タンパク質の活性を調節する。
【００９９】
用語抗体と「特異的（または選択的）に結合する」または「特異的（または選択的）に免疫応答性」なる用語は、タンパク質またはペプチドについて記載する場合、タンパク質の存在下、しばしばタンパク質および他の生体分子の異種集団中で測定される結合反応を意味する。したがって、所望のイムノアッセイ条件下で、特定の抗体はバックグラウンドの少なくとも２倍、典型的にはバックグラウンドの１０〜１００倍以上、特定のタンパク質と結合する。かかる条件下での抗体の特異的結合は、特定のタンパク質についての特異性について選択される抗体を必要とする。例えば、ポリクローナル抗体は、選択した抗原に特異的に免疫反応性であり、他のタンパク質にはそうでないポリクローナル抗体のみを得るために、選択できる。この選択は、他の分子と交差反応する抗体を取り除くことによって行いうる。多様なイムノアッセイフォーマットを用いて、特定のタンパク質と特異的に免疫応答性の抗体を選択できる。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイは、タンパク質と特異的に免疫応答性の抗体を選択するために日常的に使用されている（例えば、イムノアッセイフォーマットおよび特異的免疫反応性を決定するために使用できる条件の説明について、Harlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual (1998)参照）。
【０１００】
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈における用語「同一性」またはパーセント「同一性」は、下記デフォルトパラメーターでBLASTまたはBLAST 2.0配列比較アルゴリズムまたはマニュアルアラインメントおよび視覚検査によって測定したとき（例えばNCBIのウェブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/等参照）、同じであるかまたは具体的な割合の同じであるアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する２つ以上の配列または部分配列を意味する（すなわち、比較窓または指定領域にわたって最大の対応を比較およびアラインメントしたとき、特定の領域にわたって約６０％同一性、好ましくは６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の同一性）。この定義はまた、欠失および／または付加ならびに置換を有する配列を含む。下記の通り、好ましいアルゴリズムはギャップなどを計上できる。好ましくは、少なくとも約２５アミノ酸またはヌクレオチド長、より好ましくは５０〜１００アミノ酸またはヌクレオチド長の領域にわたって、同一性が存在する。
【０１０１】
配列比較について、典型的には、一方の配列は試験配列を比較するための参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを用いるとき、試験および参照配列をコンピューターに入力し、必要であれば部分配列コーディネートを指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。好ましくは、デフォルトプログラムパラメーターを使用し、あるいは別のパラメーターを指定してもよい。次いで配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメーターに基づいて、参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。
【０１０２】
「比較窓」は、本明細書において使用するとき、20〜600、通常約50〜約200、より通常約100〜約150からなる群から選択される連続位置の数のいずれか１つのセグメントについての記載を含み、この配列が、２つの配列が最適にアラインメントされた後に同数の連続位置の参照配列と比較されうる。比較のための配列のアラインメント方法は当該技術分野において周知である。比較のための最適な配列アラインメントは、例えば Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)のローカルホモロジーアルゴリズム、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)のホモロジーアラインメントアルゴリズム、Pearson & Lipman, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA  85:2444 (1988)の同様の方法のサーチ、これらのアルゴリズムのコンピューター化実行（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI におけるGAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTA)、またはマニュアルアラインメントおよび視覚検査（例えば、Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995 supplement)参照）によって実施しうる。
【０１０３】
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するのに好適なアルゴリズムの好ましい例は、BLASTおよびBLAST 2.0アルゴリズムであり、これらはAltschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977)および Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)にそれぞれ記載されている。BLASTおよびBLAST 2.0は、本発明の核酸およびタンパク質のパーセント配列同一性を決定するために、本明細書に記載のパラメーターで使用される。BLAST分析を行うためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)から公に入手可能である。このアルゴリズムは、クェリー配列内の長さがWの短いワードを特定することによって高スコアをもつ配列対（HSP）をまず初めに同定することを必要とする。前記は、データベース配列中の同じ長さを持つワードとアラインメントを実施したとき、一致するかまたは何らかの正の値をもつ閾値スコアTの条件を満たす。Tは近傍ワードスコア閾値と称される（Altschul (1990)上掲）。これらの最初の近傍ワードヒットはそれらを含むより長いHSPを見つけるための検索開始のシードとして機能する。前記ワードヒットは、累積アラインメントスコアが増加する限り各配列の両方向に沿って伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列についてはパラメーターM（一致残基対のための褒賞スコア、常に＞0）を用いて計算される。アミノ酸配列の場合、スコアリングマトリックスを用いて累積スコアが計算される。各方向のワードヒットの伸長は以下の場合に停止する：累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Xだけ下降したとき；累積スコアが、1つまたは2つ以上の負のスコアを与える残基アラインメントの累積のために0またはそれ以下になったとき；またはどちらかの配列の末端に達したとき。BLASTアルゴリズムパラメーターW、TおよびXは前記アラインメントの感度および速度を決定する。BLASTNプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとして11のワード長、10の期待値（E）、M=5、N=-4および両鎖の比較を用いる。アミノ酸配列の場合、BLASTPプログラムは、3のワード長および10の期待値（E）、およびBLOSUM62スコアリングマトリックス（Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)）アラインメント（B）50、期待値（E）10、M=5、N=-4および両鎖の比較を用いる。
【０１０４】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は相互に交換可能なものとして本明細書において使用され、アミノ酸残基のポリマーを意味する。該用語は、１個以上のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工化学的模倣物であるアミノ酸ポリマーならびに天然アミノ酸ポリマーおよび非天然アミノ酸ポリマーに適用される。
【０１０５】
用語「アミノ酸」は、天然および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣物を意味する。天然アミノ酸は、遺伝子コードによってコードされるものならびに後で修飾されるアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γカルボキシグルタミン酸およびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸アナログは、天然アミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち水素、カルボキシル基、アミノ基およびＲ基と結合したα炭素を有する化合物、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを意味する。かかるアナログは、修飾されたＲ基（例えばノルロイシン）または修飾されたペプチド主鎖を有するが、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を保持している。アミノ酸模倣物は、アミノ酸の一般化学構造とは異なる構造を有するが、天然アミノ酸と同様に機能する化合物を意味する。
【実施例１】
【０１０６】
実施例
下記実施例を説明のために提供するが、請求項の発明を限定しない。
【０１０７】
実施例１．膵臓腺がんにおける３つのヒストン修飾の予後および予測値。
【０１０８】
方法：RTOG 9704由来の１９５人の患者のコホート、複数施設フェーズIIIアジュバントゲムシタビン対５−フルオロウラシル（5-FU）を含むランダム化処置臨床試験およびUCLA Medical CenterからのステージIまたはIIのがんの１４０人の患者のコホートを含む、２つの大きな膵臓腺がんコホート由来の組織マイクロアレイ（TMA）を試験した。３つのヒストン修飾(H3K4me2、H3K9me2およびH3K18ac)について、免疫組織化学を実施した。ヒストン修飾のポジティブ腫瘍細胞染色を用いて、患者を低染色群および高染色群に分類し、これを臨床病理学的パラメーターおよび臨床結果の尺度と関係させた。
【０１０９】
結果：H3K4me2、H3K9me2 or H3K18acの低細胞レベルは各々、単変量および多変量モデルにおいて不良な生存の有為かつ独立した予兆であり、H3K4me2および／またはH3K18acの低レベルと組み合わせると、UCLA ステージ I/II TMAにおいて、最も不良な全体的生存を予測した（ハザード比 [HR]、2.54; 95% 信頼区間 [CI]、1.53-4.22; P= 0.0003)。サブグループ分析において、ヒストンレベルは、RTOG 9704において、リンパ節転移陰性がんを有する患者またはアジュバント5-FUを投与されているがゲムシタビンを投与されていない患者のみ、生存を予測した。
【０１１０】
膵臓腺がん患者および組織マイクロアレイ。患者から得られた膵臓腺がんの２２９症例からなるRTOG 9704膵臓がん組織マイクロアレイ(TMA)を、放射線化学療法の前後に、５−フルオロウラシル(5-FU)とゲムシタビンを比較するRTOG 9704フェーズIIIランダム化術後アジュバント処置臨床試験に組み込んだ(Regine et al., Jama 299:1019-26 (2008))。RTOG 9704において、放射線感受性増強剤として5-FU輸液を含む放射線化学療法の前１ヶ月およびその後３ヶ月の期間にわたって、アジュバント化学療法（5-FUまたはゲムシタビン）を全患者に投与した。処置スケジュールならびに毒性、全体的生存および無疾患生存を含むフォローアップ臨床情報のような臨床病理学的要因は患者組み込みの一部として回収した。UCLAステージI/II 膵臓がんTMAは、UCLA Department of Pathology and Laboratory Medicine の記録からのAJCCステージ IまたはII 膵臓腺がんの１４０症例からなり、これは1987年〜2005年の間にUCLA Medical Centerで腫瘍の完全な肉眼切除を行った患者を代表する。全研究は適切な治験審査委員会の許可を得て行った。
【０１１１】
免疫組織化学。DAKO Envision System (Carpenteria、CA)を用いて、既報(Seligson et al., Am J Pathol 174:1619-1628 (2009)) のとおりに、全抗体について、標準的二段階間接IHC染色法を用いた。1:800のH3K9me2 (Upstate/Millipore, Billerica, MA)、1:200のH3K18ac (Upstate)および1:800のH3K4me2 (Abcam, Cambridge, MA)を含む、一次ウサギ抗ヒストンポリクローナル抗体を室温で６０分間適用した。一次抗体なしでの同様の方法により、コントロール染色を実施した。陽性核染色を有する腫瘍細胞のパーセンテージの半定量的評価（範囲０〜１００％）を、全ての臨床病理学的および結果変数について盲検化した３人の病理学者(D.D.、N.D.またはA.M.)の２人によって独立して実施した。各患者の腫瘍について、３つの代表的0.6 mmコア(RTOG 9704 TMA)または２つの代表的1.0 mm直径コア(UCLA ステージI/II TMA)を計測し、細胞染色の中央値パーセントを計算するために用い、両病理学者からの全スコアを含めた。
【０１１２】
統計的分析。特定のヒストンカットオフは、前立腺、肺および腎臓を含む多様なタイプの癌腫を有する患者のサブセットにおける生存を予測することが既に示されている(Seligson et al., Am J Pathol 174:1619-1628 (2009); Seligson et al., Nature 435:1262-6 (2005))。標準化し、両方の膵臓がんTMAにこれらの同じカットオフを適用するために、関係（ties）データ値についての対応するランクの最小値を割り当てるTIES=LOWオプションでSASシステム法RANKを用いたTMAデータセットに対する細胞染色の中央値パーセントに基づいて、各腫瘍にパーセントランク値（変位値）を割り当てた。次いでH3K4me2（＜６０対≧６０％ランク）、H3K9me2（RTOG TMAについて＜３０対≧３０％ランクまたはUCLAステージI/II TMAについて＜２５対≧２５％ランク）およびH3K18ac（＜３５対≧３５％ランク）を含むそのパーセントランクに基づいて、各腫瘍を、低または高レベル染色群に割り当てた。生存見積もりは、Kaplan-Meier法を用いて作成して可視化し、そしてlogランク試験を用いて生存曲線を比較した。多変量Cox比例ハザードモデルを用いて、統計的独立性および多数の予測の有意性を試験した。全体的生存時間はランダム化の日(RTOG 9704 TMA)または手術の日(UCLAステージI/II TMA)から何らかの原因による死亡またはフォローアップの最終日まで測定した。無疾患生存時間はRTOG 9704についてのみ測定し、Iランダム化の日から、局所もしくは限局性疾患再発、遠位疾患、第二の原発または何らかの原因による死亡と定義される最初の無疾患失敗事象の日まで測定した。
【０１１３】
膵臓腺がんTMAにおける細胞ヒストン修飾レベル。２つの異なる膵臓腺がんTMAにおいて修飾されたヒストン残基に特異的な抗体を用いた免疫組織化学によって、H3K4me2、H3K9me2およびH3K18acの細胞レベルを試験した。試験した最初のTMAは、フルオロウラシル放射線化学療法、次いで膵臓腺がんの完全肉眼切除と組み合わせたゲムシタビン対フルオロウラシルアジュバント化学療法を比較する、RTOG 9704、フェーズIII多施設ランダム化対照臨床試験に組み込まれた患者からなる(Regine et al., Jama 299:1019-26 (2008))。TMAにおける元の229人の未処置切除腫瘍から、フルオロウラシル処置群の103人の患者およびゲムシタビン処置群の91人（またはH3K9me2について92人）を含む195人が免疫組織化学的評価のために腫瘍の存在を診断された。第二のTMAは、UCLA Medical Centerでの完全肉眼外科的切除を受けたAJCCステージIまたはII膵臓腺がんを有する１４０人の患者からなる。３つのヒストン修飾のそれぞれについての代表的染色を図１に示す。核染色の不存在は、その細胞における体積減少を示しており、したがってヒストン修飾の細胞異種性を評価する。腫瘍は３つのヒストン修飾のそれぞれについての細胞染色０〜１００％の範囲を有し、H3K4me2およびH3K18acについて、全体的に高い細胞染色％に歪み、H3K9me2は全体的に低い細胞染色％にゆがんだ（図１）。
【０１１４】
前立腺、肺および腎臓のがんにおける以前の研究は、ヒストンルールを同定およびバリデートした。これは各ヒストン修飾のパーセントランク染色に基づいて患者を高および低リスク群に分類する分類指標である(Seligson et al., Am J Pathol 174:1619-1628 (2009); Seligson et al., Nature 435:1262-6 (2005))（かかるルールの開示について、参照により本明細書に具体的に取り込む）。我々の２つの膵臓がんTMAのそれぞれについて、我々はこの同じヒストンルールを用いて、患者を低または高染色群に分類した。２種以上のヒストン修飾の組合せも用いて、患者群を分類した。RTOG 9704 TMAにおけるベースライン臨床病理学的パラメーターとヒストン群状態に統計的に有為な関係は見出されなかったが、低H3K4me2とリンパ節転移陰性状態(N0)は統計的に有為に達した（p = 0.051、Chi-二乗試験;データは示さず）。同様に、UCLAステージI/II TMAにおけるベースラインパラメーターとヒストン群に有為な関係は見出されなかったが、低H3K4me2と低病理学的Ｔステージには極めて有為な関係が見出された（p = 0.007、Chi二乗試験;データは示さず）。両方のTMAにおいて低H3K4me2はより不良な予後と関連していたが（下記参照）、N0状態(RTOG 9704 TMA)または低病理学的Ｔステージ(UCLAステージI/II TMA)は、逆説的に、より良好な予後と関連していた。これらのデータは、臨床結果を予測する確立された病理学的ステージングパラメーターから患者ヒストン群が分離されることを示している。
【０１１５】
ヒストン修飾レベルは膵臓がんにおける生存を予測する。多変量比例ハザード分析によって、RTOG 9704 TMAにおいて、低H3K4me2（＜６０％ランク）または低H3K9me2（＜３０％ランク）はより不良な全体的および無疾患生存の有為かつ独立した予測因子であったが、低H3K18ac（＜３５％ランク）はより不良な無疾患の有為な予測因子であり、より不良な全体的生存の傾向を示した（表１）。Kaplan-Meier生存曲線は、H3K4me2またはH3K9me2の低レベルとより不良な全体的生存との間の有為な関連を可視化した（データは示さず）。２種以上のヒストン修飾の組合せを用いて患者をグループ分けすることもでき、組み合わせた低レベルヒストン群が再びより不良な全体的および無疾患生存の有為かつ独立した予測因子であった（表１）。これらのデータは、細胞ヒストン修飾レベルがRTOG 9704膵臓がんコホートにおける強い予後マーカーであることを示している。
【０１１６】
RTOG 9704 TMAの結果を独立してバリデートするため、UCLAステージI/II 膵臓がんTMAにおいてヒストン群を別個に試験した。H3K4me2およびH3K18acについて低レベル群は、多変量Cox回帰分析によって、UCLAステージI/II TMAにおけるより不良な全体的生存の有為かつ独立した予測因子であったが、低レベルH3K9me2はより不良な全体的生存の傾向を示した（表２）。Kaplan-Meier生存曲線は、低対高H3K4me2 (1.68年、95% CI 1.02-2.33対3.66年、95% CI 1.84-5.49; P = 0.0003)、低対高 H3K9me2 (1.68年、95% CI 0.74-2.61対2.39年、95% CI 1.76-3.03; P = 0.039) および低対高H3K18ac (1.56年、95% CI 1.25-1.86対2.74年、95% CI 2.04-3.43; P = 0.006)を含む、各低ヒストン群について有為に減少した生存時間中央値を確認した（図２）。組み合わされた低H3K4me2 および／または低H3K18ac対高H3K4me2 および高H3K18acは、Kaplan-Meier生存分析(logランク試験、p = 0.00002、図２)で測定したことろ、生存時間の中央値1.70年 (95% CI 1.20-2.20) 対＞5年(信頼区間は決定できず)について、多変量比例ハザード分析によって、生存の最も高度に有為かつ独立した予測因子であった（表２）。したがって、UCLAステージI/II膵臓がんコホートは、RTOGコホートからの知見をバリデートし、細胞ヒストン修飾が肉眼切除膵臓腺がんの有為かつ独立した予測因子であることを示す。
【０１１７】
ヒストン修飾はリンパ節転移陰性膵臓がんにおける予後を予測する。腫瘍ステージ、リンパ節関与または組織学的グレードは、膵臓がんにおける重要な予測因子である(Garcea  et al., Jop 9:99-132 (2008))。しかし、これらの有用な臨床病理学的グループ内であっても、広範な生存結果がなおも存在する。ヒストン群がさらに患者を異なる予後群に分類できるかを決定するため、我々はＴステージ、Ｎステージまたは組織学的グレードに基づいて患者を第一層別化した後、ヒストンレベルのサブグループ分析を行った。ヒストン群は、UCLAステージI/II TMAにおけるリンパ節陰性膵臓がんを有する患者についてより不良な全体的生存の有為かつ独立した予測因子であり、H3K4me2および／またはH3K18acの低レベルによって定義される患者群について最も有為(HR = 5.00、95% CI 2.25 − 11.1; p=0.00007)であった。反対に、ヒストン群はリンパ節転移陽性膵臓がんを有する患者のサブセットについて、生存の違いを区別しなかった（データは示さず）。驚くべきことに、この結果はまたRTOG 9704 TMAにおいてもバリデートされた。H3K4me2、H3K18acまたは両者の組合せは多変量Cox回帰分析によって測定したとき、リンパ節転移陰性膵臓がんにおいて全体的生存の有為な予測因子であったが、リンパ節転移陽性ではそうではなかった（データは示さず）。これらの知見は、細胞ヒストンレベルがリンパ節転移陰性膵臓がんについての予後マーカーとして最も有用であり得ることを示している。
【０１１８】
ヒストン修飾レベルはアジュバント5-FU化学療法に対する応答を予測する。我々は次に、RTOG 9704においてヒストンレベルが5-FUまたはゲムシタビンアジュバント化学療法に対する応答を予測しうるかを試験した。まず、ヒストン群に基づいて患者を層別化し、Kaplan-Meier生存分析を行ってアジュバント処置を比較した。高レベルヒストンサブグループの各々について、ゲムシタビンまたは5-FUアジュバント化学療法のいずれかを投与された患者についての全体的または無疾患生存に有意な差は見られなかった（データは示さず）。反対に、低H3K4me2サブグループまたは低H3K18acサブグループについて、5-FU対ゲムシタビン投与患者についてのより不良な無疾患生存が存在し（logランク試験、それぞれp=0.014およびp=0.015）、低H3K4me2サブグループにおいて5-FU対ゲムシタビンについてより不良な全体的生存の有意でない傾向が存在した（データは示さず）。次に、我々はアジュバント療法に基づいて患者を層別化し、Kaplan-Meier生存分析を行って、低対高ヒストン群のそれぞれを比較した。低レベルのH3K4me2またはH3K9me2は、5-FU投与患者のサブグループにおいてより不良な全体的生存と有為に関連していたが、ゲムシタビン投与患者のサブグループでは関連していなかった（図３）。単変量ハザードモデルも、低レベルのH3K4me2、H3K9me2またはH3K18acが5-FU投与患者のサブグループにおいてより不良な全体的および無疾患生存と関連していたが、ゲムシタビン投与患者のサブグループでは関連していなかったことを示した（データは示さず）。これらの結果は、低ヒストンレベルが5-FUアジュバント療法から利益を受ける可能性が低い膵臓がん患者を同定することを示している。
【０１１９】
考察。我々は、２つの大きな膵臓腺がん患者コホートにおける複数のヒストン修飾を分析し、ヒストン修飾の細胞パターンが確立された臨床病理学的基準を超えるさらなる予後および予測情報を提供することを見出した。H3K27me316について既に公表した結果と同様に、我々は、H3K4me2、H3K9me2またはH3K18acの低下した細胞レベルと膵臓腺がんのより不良な予後の間に有為な関連性を見出した。我々の本研究および他のがんにおける研究(Seligson et al., Am J Pathol 174:1619-1628 (2009); Seligson et al., Nature 435:1262-6 (2005))は、予後マーカーとしての細胞ヒストン修飾レベルの広範な適用可能性を強調し、細胞ヒストンレベルを検出するための標準化された免疫組織化学的手法がさらなる、重複しない予後情報を提供しうることを示唆している。
【０１２０】
生存は、腫瘍グレード、ステージまたはリンパ節転移状態のような臨床病理学的基準によって層別化された患者のサブセット内であってもなお、膵臓腺がんを有する患者について、広く変化する。両方の我々のTMAデータセットにおいて、ヒストンレベルは、リンパ節転移陰性膵臓がんを有する患者のサブセットについての予後であった。これは、ヒストン修飾の予後値が低Gleasonスコア前立腺癌13、低ステージ肺がん(Seligson et al., Am J Pathol 174:1619-1628 (2009))および局在化腎臓がん(Seligsonet al., Am J Pathol 174:1619-1628 (2009))を含む低侵襲性または初期ステージがんに概ね限定されたという従来の報告と一致する。したがって、細胞ヒストンレベルは、通常の臨床病理学的基準グレード分けおよびステージ分け情報と組み合わせて用いたとき、バイオマーカーとして最も好適である。
【０１２１】
正常対がん細胞を比較するゲノム全体のプロファイリング試験は、活動性または抑制性のヒストンマーカーと変化した遺伝子発現の間の動的な相互作用を示す(Ke et al., PLoS ONE 4:e4687 (2009))。特定の遺伝子座でのヒストン修飾の変化は予測可能に遺伝子発現を変化しうるが、複数のヒストン修飾のレベルのグローバルな変化の結果は、転写活性に対するそれらの潜在的に対立する機能的効果およびがんゲノムを通じるそれらの分布の我々の理解不足のため、予測がより困難である。これまで試験したほぼ全てのヒストン修飾の減少したレベルがより不良な予後と関連していたが、これらの同じヒストン修飾は、転写活性化(例えばH3K4me2およびH3K18ac)または転写サイレンシング(H3K27me3、H3K9me2)と可変的に関連される(Esteller, M., Nat Rev Genet 8:286-98 (2007))。一つの可能な説明は、がんにおけるグローバルＤＮＡ低メチル化(Eden et al., Science 300:455 (2003))と同様に、ヒストン修飾における大部分の低下はゲノムの不安定性を導きうるというものである。この仮説を支えるものとして、H3K9me2レベルにおいて大きく異なった前立腺がん細胞系は、反復ＤＮＡ要素でほぼ排他的にH3K9me2分布を変化するが、遺伝子プロモーターではそうではないことが示されている(Seligson et al., Am J Pathol 174:1619-1628 (2009))。同様にがん細胞におけるH4K16acおよびH4K20me3のグローバル損失は、ＤＮＡ低メチル化と組み合わせて反復要素で一次的に生じることが示されている(Fraga, et al.: Nat Genet 37:391-400 (2005))。実験的には、ヒストンメチルトランスフェラーゼG9aのノックダウンによるH3K9me2レベルの低下は、がん細胞系において、染色体不安定を誘導するが、遺伝子発現にはほとんど影響しないことが示されている(Kondo et al., PLoS ONE 3:e2037 (2008))。ヒストン修飾のグローバル分布およびより臨床的に侵襲性の膵臓がんのサブセットにおけるそれらの低下したラベルを裏付ける理由を決定するためのさらなる研究、ならびにゲノム不安定および遺伝子転写に対する変化したヒストン修飾レベルの直接的影響を確立する研究が必要である。
【０１２２】
切除された膵臓がんにおけるアジュバント化学療法についての現在のアプローチは、ゲムシタビンが改善された生存利益を提供するというコンセンサスを含め、一次的に、ゲムシタビンと5-FUの選択を含む (Ueno H.K., T., J Hepatobiliary Pancreat Surg 15:468-472 (2008))。しかし、注目すべきことに、RTOG 9704は、フルオロウラシルを利用した放射線化学療法の設定において、アジュバント5-FUを超える非統計的に有為な生存利益を提供すると結論し(Regine et al., Jama 299:1019-26 (2008))、この知見は処置決定をより良く特徴付けることができる予測バイオマーカーの必要を強調する。このような目的で、集積されたデータは、薬物輸送または代謝の１つ以上のメディエーターのレベルががんにおけるゲムシタビン24-27または5-FU28化学療法に対する応答の予測に有用であり得ることを示唆している。ここで、我々のデータは、細胞ヒストン修飾レベルが5-FUに対する応答を予測するための新規クラスのバイオマーカーであることを示している。より低いH3K18acレベルが5-FUに対するより低い応答と関連しているという我々の観察に留意して、特定のヒストンデアセチラーゼ阻害剤(H3K18acのグローバルレベルの上昇のために作用する)は、がん細胞系において細胞傷害性および増殖阻害効果を上昇させる5-FUとの相乗効果で作用することが示されている(Lee et al., Mol Cancer Ther 5:3085-95 (2006); Tumber et al., Cancer Chemother Pharmacol 60:275-83 (2007))。これは少なくとも部分的には、5-Fu化学療法に対する耐性と関連しているチミジル酸シンターゼのレベルの低下であると思われる(Lee et al., Mol Cancer Ther 5:3085-95 (2006); Fazzone et al., Int J Cancer Epub (PMID: 19384949) (2009))。ひいては、H3K18acの細胞レベルは、患者が5-FU化学療法にHDAC阻害剤の添加によって利益を受ける可能性があるかを同定するのに有用であり得る。
【０１２３】
ここで、我々は、低細胞ヒストン修飾レベルがアジュバント5-Fu化学療法から生存利益を受ける可能性の低い膵臓がん患者を同定し、高細胞ヒストンレベルがアジュバントゲムシタビンまたは5-FU化学療法のいずれかの使用から同様の生存利益を受ける患者を同定することを示した。我々は、細胞ヒストン修飾レベルが切除した膵臓がんにおけるアジュバント５−フルオロウラシル化学療法に対する応答性を予測しうる、新たなアジュバント設定または進行性膵臓がんに潜在的に適用可能な、新規カテゴリーのバイオマーカーであると結論する。より一般には、細胞ヒストン修飾レベルはまた、標準的な化学療法として５−フルオロウラシルが使用される他の悪性腫瘍（すなわち結直腸または乳房のがん）における有用な予測バイオマーカーをも提供しうる。
【０１２４】
実施例２：ヒストン修飾のグローバルレベルは様々ながんにおける予後を予測する。
この実施例は、２００９年４月１４日に出願した優先権出願たる米国仮出願61/169212およびSeligson  et al., The American Journal of Pathology, Vol. 174, No. 5:1619-28, May 2009に見られる内容を開示し、それらの全体についてここに参照により本明細書に組み込む。
【０１２５】
がん細胞は、個々の遺伝子および全体的に個々の細胞における１個の核のレベルで、ヒストン修飾パターンにおける変化を示す。我々は既に、ヒストンH3リシン4ジメチル化(H3K4me2)およびH3K18アセチル化(ac)のより低いグローバル／細胞レベルが前立腺がん再発のより高いリスクを予測することを示した。ここで、我々は、H3K4me2およびH3K18acの細胞レベルが肺がんおよび腎臓がん患者における臨床結果も予測し、より低いレベルが両方のがんにおいて有為に不良な生存可能性を予測することを示す。我々はまた、遺伝子活性および抑制の両方に関連する修飾であるH3K9me2のより低い細胞レベルが、前立腺がんおよび腎臓がんにおけるより不良な結果の予後でもあることを示す。ヒストン修飾の予測能は、腫瘍特異的臨床病理学的変数である、増殖マーカーKi67またはp53腫瘍サプレッサー変異から独立している。クロマチン免疫沈降実験により、より侵襲性のがん細胞系におけるヒストン修飾のより低い細胞レベルはＤＮＡ反復要素での修飾のより低いレベルと関連しているが、ゲノム全体の遺伝子プロモーターとは関連していないことが示された。我々の結果は、ヒストン修飾のより低いグローバルレベルがより侵襲的ながん表現型の予測であることを示唆しており、異なる腫瘍起源の腺がんの予後後成的パターンにおける驚くべき共有性を示す。
【０１２６】
がんは、遺伝的および後成的変化の疾患である。後成的は、ＤＮＡメチル化およびヒストン修飾の相互に関連したプロセス、ヒトのがんで共通して生じる異常を含む(Baylin, S.B., Ohm, J.E., Nat Rev Cancer 6:107-116 (2006); Feinberg, A.P., Tycko, B., Nat Rev Cancer, 4:143-153 (2004); Jones, P.A., Baylin, S.B., Cell 128:683-692 (2007))。ヒストン修飾の場合において、これらの異常は、ヒストン修飾酵素の不適切なターゲティングによって遺伝子プロモーターで局所的に生じ、腫瘍形成に重要な役割を果たす個々の遺伝子の不適切な発現または抑制を導きうる。例えば、E2F転写因子はその標的遺伝子に腫瘍サプレッサー網膜芽腫タンパク質（Rb）を補充する。次にRbはHDAC1を補充し、これはサイクリンＥのような腫瘍生物学に重要な役割を有する遺伝子の転写サイレンシングを導く(Brehm  et al., Nature 391:597-601 (1998); Hake et al., Br J Cancer 90:761-769 (2004))。H4K16ac および H4K20me3のより低いレベルを含むＤＮＡ反復配列に関連したヒストンの異常な修飾はまた、血液学的悪性腫瘍および結直腸腺がんにおいても報告されている(Fraga et al., Nat Genet 37:391-400 (2005))。さらに、原発性腫瘍組織の免疫染色によってグローバルレベルで試験した場合、個々の腫瘍核は変化したレベルのヒストン修飾を示し、細胞レベルでの後成的異種性のさらなる層を生じる(Seligson et al., Nature 435:1262-1266 (2005))。したがって、腫瘍細胞は、個々のプロモーター、反復要素および全体的に１個の核のレベルで、ヒストン修飾の異常なパターンを含みうる。
【０１２７】
がん患者において、臨床結果予測は一般に、腫瘍負荷および広がりの程度、ならびに組織学的タイプおよび患者人口統計学によって提供されるさらなる情報に基づく。しかし、同様の腫瘍特徴を有するがん患者は、なおも疾患の過程および結果において異種性を示す。したがって、標的化療法および患者ケアの個人化の開発のための、同様の臨床結果を有する患者の正確な亜分類が必要とされている(Ludwig, J.A., Weinstein, J.N., Nat Rev Cancer 5:845-856 (2005))。この点に関して、分子バイオマーカーは、異なる臨床結果を有するがん患者のサブタイプを区別し、我々の予後可能性を拡大するのに有用である。多様なバイオマーカーの中でも、分子フィンガープリント(Golub et al., Science 286:531-537 (1999))として個々または特に群での遺伝子の発現分析は、リンパ腫(Alizadeh et al., Nature 403:503-511 (2000))および乳がん(Perouet al., Nature 406:747-752 (2000); Sorlie et al., Proc Natl Acad Sci U S A 98:10869-10874 (2001); Sotiriou et al., Proc Natl Acad Sci U S A 100:10393-10398 (2003))のような多様ながんにおける差異を有する疾患サブタイプを同定するために広く使用されている。遺伝子発現と同様に、特定遺伝子のＤＮＡメチル化も、特に処置に対する応答性を予測するための、バイオマーカーとして使用されている(Esteller, M., Curr Opin Oncol 17:55-60 (2005))。例えば神経膠腫において、MGMT (O6-メチルグアニン-DNA メチルトランスフェラーゼ)プロモーター領域のメチル化状態は、アルキル化剤に対する応答性または耐性と関連している(Esteller et al., N Engl J Med 343:1350-1354 (2000))。
【０１２８】
我々は既に、ヒストン修飾の細胞（例えばグローバルまたはバルク）レベルにおける異種性が、組織標本におけるがん細胞の全核のレベルで免疫組織化学（IHC）によって検出可能であることを示した(Seligson et al., Nature 435:1262-1266 (2005))。個々の患者由来の前立腺がん組織において、悪性細胞はヒストン修飾の異種レベルを示す。細胞染色パーセントとして定量化されるヒストン修飾のレベルにおける相違の程度は、患者間で相違する。これらの差は、前立腺がんの場合、原発性腫瘍の除去後の腫瘍再発のリスクを予測する後成的パターンを形成する。我々が前立腺がんにおいて試験した５つの修飾のうち、H3K4me2およびH3K18acは、最も予後の情報に富むことが証明された。これら２つの修飾の細胞パターンは、標準的な臨床病理学的変数によって区別されなかった異なる臨床結果を有する患者の２つのグループを十分に区別した(Seligson et al., Nature 435:1262-1266 (2005))。一般に、H3K4me2およびH3K18acの低細胞レベルを有する（すなわち、低下した細胞染色％）は、２つの修飾のより高いレベルを有する患者と比較して、腫瘍再発の有為に増加したリスクを有するより不良な予後を有していた。これらの知見は、細胞後成的異種性とがん患者における臨床動態の新たな連絡を示した。
【０１２９】
ヒストンおよびそれらの修飾が一様に存在していることを考慮すれば、前立腺がんにおける我々の結果は、ヒストン修飾パターンが他のがんタイプにおける予後のマーカーとして使用しうる可能性を提起した。さらに、ヒストン修飾の予後有用性は、これまで試験した修飾に限定されない可能性もある。他のヒストン修飾は、改善されたまたは補完的予後能を提供しうる。遺伝子発現予測に関して、１つ以上の遺伝子の発現は、臨床結果の予想であり得るが、多くの場合、予測遺伝子の同一性は異なるがんにおいて異なる。この理論を後成的に延長し、異なるヒストン修飾が異なるがんにおける予後を予測すると予期する。しかし、我々はここで、前立腺がんにおいて最も情報をもたらす同じ２つのヒストン修飾H3K4me2およびH3K18acのより低い細胞レベルが、他の腺がん（すなわち腺上皮のがん）、すなわち肺および腎臓のがんにおける低下した生存可能性を有する患者を区別するという証拠を提供する。我々は我々の元の試験7とは別の３つの修飾のレベルを試験しなかった。しかし、我々は、遺伝子活性および抑制に関連する別のヒストン修飾H3K9me2の細胞レベルが、それ自体、臨床結果の強力な予測因子であり、より低いレベルが前立腺がんおよび腎臓がんにおいて不良な結果を予測することを示す。原発性組織と一致して、我々は、前立腺がん細胞系はまた、ヒストン修飾の異なる細胞レベルを示すことを示す。がん細胞系における全体的差異は、反復ＤＮＡ要素でのヒストン修飾レベルの変化と関連しており、プロモーター領域ではあまりそうではない。我々の知見は、ヒストン修飾の細胞レベルが異なる組織起源の腺がんにおける臨床結果の一般的予測因子であり得ること；そしてヒストン修飾のグローバル損失がより侵襲性のがん表現型と関連しうることを示唆している。
【０１３０】
サンプル採取および組織マイクロアレイ(TMA)。UCLA施設内治験審査委員会の承認後、ヒト肺、腎臓および前立腺由来の良性および腫瘍組織のホルマリン固定パラフィン包埋標本を、1984〜2002に起こった外科症例からDepartment of Pathologyから得た。TMA構築後に得られた臨床データにサンプル採取を盲検化した。少なくとも３つの腫瘍組織コア生検直径0.6 mmを選択した各パラフィン包埋サンプルの形態学的に代表的な領域から取り、既報の通りアレイした(Seligson, D.B., Biomarkers 10 Suppl 1:S77-82 (2005))。American Joint Committee on Cancer (AJCC)およびInternational Union Against Cancer (UICC) 悪性腫瘍の腫瘍−リンパ節−転移（ＴＮＭ）分類に従って、全組織タイプについて腫瘍をステージ分けした。Ｔステージは外科病理学から決定し、ＮおよびＭステージは術後病理、臨床および／またはＸ線データによって決定した。
【０１３１】
肺および腎臓がんについて試験した試験の終点は、疾患特異的死亡であった。月単位での生存時間は、疾患診断または手術から死亡までの期間であった（それぞれ肺および腎臓）。最後のフォローアップで生存していた患者または疾患のためではなく死亡した患者は、最後のフォローアップで打ち切った。未知の原因による死亡は、肺がんについて打ち切り；全原因が腎臓がん患者については知られていた。前立腺がんについての終点は、0.2 ng/ml異常の術後血清PSAとして定義される疾患再発であった。再発を有さなかった患者は、最後のフォローアップで打ち切った。Eastern Cooperative Oncology Group活動指標(ECOG PS)は腎臓がんおよび肺がんについての初発症状で決定した。
【０１３２】
肺がん患者。肺がんのWorld Health Organization(WHO)組織学的分類を用いた。肺がんTMAは285人の患者サンプルを含み、そのうち262人(92%)は臨床的に情報価値があった。262症例のうち257症例(98%)は、H3K18ac およびH3K4me2についても情報価値があった。腺がんは細気管支肺胞性成分を有する腫瘍を含んだ。AJCC Cancer Staging Manualに従って肺腫瘍をグレード分けした。このコホートの肺がん患者の年齢中央値は６７歳であり（範囲 41〜87歳）、男性：女性比率は1:1.4であった。腫瘍サイズの中央値は、2.5 cmであった。このコホートにおけるフォローアップ中央値は、59.0月であった（1.0〜229月の範囲）。
【０１３３】
腎臓がん患者。悪性腫瘍の1997 UICC/AJCC分類に従って、腎臓がんの病理的腫瘍サブタイプ分けを行った。腎臓腫瘍は腎細胞がんを有する患者の根治的または部分的腎摘出から得られた。TMAの379症例のうち373症例(98%)は、臨床的に情報価値があり、さらに359症例(96%)はH3K18ac、H3K4me2およびH3K9me2についても情報価値があった。この限局コホートの腎臓がん患者の年齢中央値は６３．５歳であり（範囲 27〜88歳）、男性：女性比率は1.9:1であった。腫瘍サイズの中央値は、4.5 cmであった。このコホートにおけるフォローアップ中央値は、43.1月であった（0.0〜142月の範囲）。
【０１３４】
前立腺がん患者。前立腺がんは全て、「腺がん、常套、他に特定されない」組織学的タイプであった。根治的恥骨後式前立腺摘除術を行ったTMA上の226人の前立腺がん患者から、212人は臨床的に情報価値があり、その185人(87%)は、H3K9me2についても情報価値があった。Gleason Scoreシステム（Gleason Sumと同等）を用いて前立腺グレード分けを行った；我々のコホートにおいて「低グレード」はGleason Score 2-6のケースを含む。このコホートの前立腺がん患者の年齢中央値は６４歳であった（範囲 46〜75歳）。このコホートにおけるフォローアップ中央値は、60.0月であった（2.0〜120月の範囲）。
【０１３５】
免疫組織化学(IHC)およびウェスタンブロット。DAKO Envision Systemを用いて、既報(Seligson, D.B., Biomakers 10 Suppl 1:S77-82 (2005))のとおりに、全抗体について、標準的二段階間接IHC染色法を用いた。一次ウサギ抗ヒストンポリクローナル抗体を室温で６０分間適用した−肺TMAについて、1:300希釈のH3K18ac (Suka et al., Mol Cell 8:473-479 (2001))および1:600希釈のH3K4me2 (Upstate)；腎臓TMAについて、1:400のH3K18ac、1:50のH3K9me2 (Abcam) および1:800希釈H3K4me2；前立腺TMAについて、1:100のH3K9me2；および細胞系IHCについて、原液から1:100希釈のH3K9me2。ポリクローナルウサギ抗-H3 (Abcam)を5 μg/mlで用いた。モノクローナル抗-Ki-67 MIB-1 (7.5 μg/ml) および抗ヒトp53 DO-7(15 μg/ml) (Dako)をKi67およびp53検出のためにそれぞれ用いた。20〜40症例を含む試験TMAを用いて、我々は、各組織タイプの染色範囲に置いて最大変動が観察されるように各抗体の濃度を最適化した。Harrisヘマトキシリンで切片を対比染色した。ネガティブコントロールは、一次抗体を含めずに染色した同一のアレイ切片であった。ウェスタン分析のため、ヒストンをPC3（前立腺がんの骨転移：ATCC）およびLNCaP（前立腺がんのリンパ節転移；ATCC）細胞系から酸抽出し、標準的なウェスタンブロットに供した。
【０１３６】
全組織についての免疫組織化学の計測。全臨床病理学的変数について盲検化した病理学者によって、TMAに対する抗体染色の半定量的評価を行った。２人の病理学者は全TMAを計測したが、がんセットあたり１人であった(肺TMA-V.M.、腎臓および前立腺TMA-H.Y.)。臨床病理設定において概して最も一般的な免疫染色法であり、我々のアプローチを現在の病理研究所に容易に適用可能となるため、我々はIHCおよび半定量的分析を選択してデータセットを作成した。がん様上皮組織のみを計測し、最初の術後の原発腫瘍細胞のみを試験に含めた。所定の組織スポットを計測するためのより低い許容限界は、１０細胞であった。しかし、腫瘍スポットのほとんどで、１００〜１０００細胞が存在し、ほとんどの場合、腫瘍は標的組織を含む１個以上のスポットで代表された（症例あたりの平均マーカー−情報価値のある原発性腫瘍組織スポット= 腎臓について3.1、肺について2.4そして前立腺について3.0）。がん標本における正常上皮、間葉細胞または浸潤性炎症細胞および転移は、計測から除外した。ポジティブ核発現の頻度（範囲0〜100％）を核TMAスポットについて「ラベリングインデックス」法を用いて計測した。各症例について１つの代表的染色を作成するため、各症例内での各腫瘍スポットから細胞陽性率を集積し、各データセットにおける患者のパーセントランクを決定するために用いた。
【０１３７】
統計的分析。順序変数がグループ間で異なるかを試験するため、我々はノンパラメトリック多群比較試験であるKruskal-Wallis試験を用いた。生存分布を可視化するため、我々はKaplan-Meierプロットを用いた。多変数Cox比例ハザードモデルを用いて、複数の予測因子の統計的独立性および有意性を試験した。スケール化Schoenfeld残差（scaled Schoenfeld residual）を用いて比例ハザード推定を試験した。カテゴリー化されたヒストン発現グループ分けが患者層で異なるかを試験するため、Fisherの直接検定を用いた。Logランク試験を用いて、生存分布間の差異を試験した。ｐ値＜0.05を有為とした。
【０１３８】
クロマチン免疫沈降(ChIP)およびマイクロアレイハイブリダイゼーション。ChIPを本質的に記載のとおりに行った(Wang et al., Mol Cell 17:683-694 (2005))。簡潔には、細胞の増殖培養物にホルムアルデヒドを３７℃で１０分間加えた。PBS洗浄後、架橋した細胞cをプレートから掻き取り、プロテアーゼ阻害剤(Roche)を含む1 mlのPBSで洗浄した。細胞を溶解し、氷上で１０分間インキュベートし、すぐに超音波処理した。抗H3K9me2またはH3K18ac抗体での免疫沈降のために100 μlの溶解液を用いて、10 μlの溶解液はインプットとして用いた。６５℃架橋の一夜回復後、ChIPedおよびインプットサンプルをRNase Aで、３７℃で３０分間処理し、次いでQiagen Qiaquick PCR精製キットを用いて精製した。WGAキット(Sigma)を用いて10 ngの各IPおよびINP DNAを増幅した。Bioprime Labelingキット(Invitrogen)を用いて、2 μgの増幅された物質をCy3またはCy5(PerkinElmer)で標識化した。ＤＮＡを35 μlのランダムプライミング溶液(Invitrogen Bioprime Kit)と混合して最終体積75 μlとし、５分間沸騰させ、氷水浴で５分間、速やかに冷却した。標識化反応を60UのKlenow、dNTP(0.12 mM dATP、dGTP および dTTP および 0.06 mM dCTP)、それぞれインプットおよびChIPed DNAとして1.28 mMのCy3 およびCy5で完了させ、３７℃で３時間インキュベートした。Qiagen Qiaquick PCR精製キットで標識化したＤＮＡを精製し、Nanodropで取り込みを測定した。ヒトプロモーターアレイ(Agilent-G4489A)へのハイブリダイゼーション、洗浄および走査を、製造業者の指示書に従って実施した。Agilent DNA Microarrayスキャナーを用いてアレイを走査した。データ抽出及び分析は、Agilent Feature Extractionソフトウェア(バージョン9.1.3.1)およびChip Analyticsソフトウェア(バージョン1.2)を用いて実施した。プローブシグナルはLowess正規化により正規化した。
【０１３９】
がん組織の免疫染色による細胞ヒストン修飾の検出。患者から得られた組織におけるヒストン修飾の細胞レベルを測定するため、細胞中の特定の抗原の存在を検出する方法であるIHCと、多数の組織サンプルのハイスループット分析のためのTissue Microarrays (TMA)(Seligson, D.B., Biomakers 10 Suppl 1:S77-82 (2005); Kononen et al., Nat Med 4:844-847 (1998))を組み合わせた。(Liu et al., J Biopharm Stat 14:671-685 (2004))。H3K4me2、H3K9me2およびH3K18acのレベルを、肺、腎臓および前立腺のがんのTMA上でこれらの修飾された残基を特異的に認識する抗体(Seligson et al., Nature 435:1262-1266 (2005); Suka  et al., Mol Cell 8:473-479 (2001))を用いて、分析した。各アレイにおけるこれらのがんの選択および患者数は、完全フォローアップ臨床データを有する標本の利用能に基づいた。ここで、ヒストン修飾のグローバルレベルは、所定の抗体で陽性染色された各組織サンプル内のがん細胞のパーセンテージを意味する。この計測システムは、現在広い範囲の病理学研究施設での臨床的使用におけるバイオマーカーについて日常的かつ広範囲に使用されている。図４Ａ〜Ｂは、抗H3K18ac抗体で染色した肺（図４Ａ）および腎臓（図４Ｂ）の代表的がん組織である（対物レンズ: 10X 左パネル; 40X 右パネル）。褐色の核を有する細胞は陽性染色されており、腫瘍組織内のそのパーセンテージが決定される。ヒストン修飾抗体による染色の欠如は、未修飾ヒストンH3を認識する抗H3抗体が本質的に全細胞を陽性染色するため、それらそれぞれの抗原の到達しにくさのためではありそうにない（データは示さず）。染色されなかった細胞は、ある遺伝子座で修飾を含むが、それらのレベルはIHCの検出限界未満であり、バルクヒストン修飾がこれらの細胞では顕著に低下していることを示す。
【０１４０】
ヒストン修飾レベルに基づく患者のグループ分け。ヒストン修飾が臨床結果をよそくするかを決定するため、まず、グレードまたはステージのような臨床組織学的特徴に基づいて患者を広いカテゴリーに層別化した。この初期層別化の原理は、グレードおよびステージが結果の強力な予測因子であることである(Ludwig, J.A., Weinstein, J.N., Nat Rev Cancer 5:845-856 (2005))。グレードは腫瘍分化の組織学的尺度である。ステージは腫瘍サイズおよびその元のサイズを超える広がりの尺度である。一般に、高グレードおよびステージは、より不良な結果と関連している。しかし、同等のグレードおよびステージのがんの中でも、分子異種性および異なる臨床結果を有する患者のサブタイプが存在する(Ludwig, J.A., Weinstein, J.N., Nat Rev Cancer 5:845-856 (2005))。したがって、グレードおよびステージを超えてより臨床的に密接した群に患者をさらに分類する予後バイオマーカーが必要とされる。グレードおよびステージ層別化の後、特異的ヒストン修飾パターン、略して「ヒストンパターン」に従って、各カテゴリー由来の患者を２つの群に割り当てた。このヒストンパターンは、最初は、臨床結果を予測するH3K4me2およびH3K18ac染色の細胞レベルに基づく前立腺がん患者の教師なしクラスタリングに由来した。我々は現在の試験ではこれら２つの就職について新たなカットオフ値を探索しなかった。ヒストンパターンは、H3K4me2およびH3K18acのより低いレベルを有する患者が、より高いレベルを有するものよりも不良な予後を有することを予測した。肺および腎臓の各がんにおいて患者にヒストンパターンを適用した後、２つの得られた群が有為に異なる臨床結果を有することを試験した。
【０１４１】
ヒストン修飾は肺がんにおける生存可能性を予測する。H3K4me2およびH3K18acについての染色の分布を評価するため、各修飾について指示した細胞染色パーセンテージ（ｘ軸）が観察された組織サンプルの頻度（ｙ軸）をプロットした（図４Ｃ）。H3K4me2染色は広い分布を示したが、H3K18ac染色はより高い細胞染色パーセントに向かって非対称であった（図４Ｃ）。ヒストン修飾パターンが肺がんにおいて臨床的に情報価値があるかを決定するために、我々は第一に、患者をステージ１から４まで分類した（データは示さず）。次いで前立腺がんから同定した予測ヒストン修飾パターンにしたがって、患者を２つの群に割り当てた。高レベルのH3K4me2およびH3K18acを有する腫瘍をグループ１に割り当てて（すなわちH3K4me2＞６０％またはH3K4me2およびH3K18ac＞３５％染色）；低レベルの修飾を有する残りの腫瘍をグループ２に割り当てた。ステージ１肺腺がん(n=159)において、我々は、より低いヒストン就職の細胞レベルを有するグループ２の患者（赤線、図５Ａ）がグループ１のもの（黒線、図５Ａ）と比較して有為に低い１５年生存可能性を有することを見出した(Logランク p=0.018、ハザード比(HR)=2.19、95%CI=1.13-4.27)。２つの群の間で、性別または手術時年齢に差はなかったが、グレード分布に統計的に有意な差が存在した(p=0.0026)。逆説的に、グレード分布の差は、より不良な結果を有するグループ２の患者におけるより多くの低グレード腫瘍の存在のためであった(図５Ａ、挿入表）。ステージ２(n=42)、３(n=40)および４(n=16)において、臨床結果に置いて有意な差を有するサブグループを検出しなかった。したがって、前立腺がんにおける同じ予後ヒストン修飾パターンは、ステージ１肺腺がんにおける診断マーカーとして利用できる。
【０１４２】
ヒストンパターンは、肺がんにおける独立した予測因子である。どのようにしてヒストン修飾を肺がんにおける他の既知のバイオマーカーと比較するかを決定するため、過剰発現したときにステージ１腺がんにおける不良な患者結果と有為に関連しているp53について陽性染色する細胞のパーセンテージを試験した(Maddau et al., Am J Clin Pathol 125:425-431 (2006))。p53発現レベルは２つのヒストン群で異なっており、より低い発現の群はより不良な予後を有し、グループ１で32.1％、グループ２で19.7％の平均陽性率であった(p=0.033)。そうすると、ヒストンパターンによって予測される不良な予後は、増加したp53変異の発生のためではない。さらに、グループ１および２において、30および25％の患者がそれぞれ０以上の腫瘍細胞分裂像数（mitotic count）を有しており(p=0.64)、このことは、ヒストンパターンによる予後診断が増加した増殖速度のためではないことを示唆している。最後に、グレード、腫瘍細胞分裂像数、p53、患者のパフォーマンス状態(ECOG)を含む多変量Coxモデルにおいて、ヒストングループ分けは、結果の顕著な予測因子であった（表２）。したがって、ヒストン修飾パターンは、肺腺がんにおける臨床結果の独立した予測因子である。
【０１４３】
ヒストン修飾は腎臓がんにおける生存可能性を予測する。腎臓がんにおいて、９０〜１００％染色を示す＜１０％の標本でH3K4me2およびH3K18acの両方について染色レベルの広い分布が存在した（図４Ｄ）。上記と同様のヒストンパターン（すなわち、H3K4me2およびH3K18acそれぞれについて＞６０％または＞３５％染色）を限局性腎臓腫瘍を有する患者(n=192;データは示さず)に適用したところ、それらの生存可能性が有為に異なる２つの患者群を同定した（図５Ｂ）。低レベルの両修飾を有する患者（グループ２）は、より高いヒストン修飾レベルを有するもの（グループ１）よりも有為に不良な１年生存可能性を有していた(Logランク p=0.028、HR=2.22、95%CI=1.07-4.62)。性別、手術時年齢、グレードまたはステージについて２つのグループの患者の分布に差はなかった（図５Ｂ挿入表）。転移性疾患を有する患者において(n=163)、異なる臨床結果を有するサブグループは検出されなかった（図９Ａ参照）。患者をグレードのみに基づいて層別化した場合、ヒストンパターンは、グレード１および２において有為に異なる生存可能性を有する２つのグループを区別したが、グレード３および４のがんは区別しなかった（データは示さず）。したがって、前立腺がんおよび肺がんと同様、限局性腎臓腺がんにおいて、より低いレベルの同じ２種のヒストン修飾は不良な臨床結果を予測する。
【０１４４】
ヒストンパターンは腎臓がんにおける独立した予測因子である。どのようにしてヒストン修飾を腎臓がんにおける他の既知のマーカーと比較するかを決定するため、増殖のマーカーであるKi67およびp53について陽性染色される細胞のパーセンテージを試験した。Ki67またはp53の増加した発現は、腎臓腺がんにおける不良な患者結果と有為に関連していることは既に示された(Shvarts et al., J Urol 173:725-728 (2005); Visapaa et al., Urology 61:845-850 (2003))。中央値Ki67発現レベルは２つのヒストン群において本質的に同じであり、グループ１において５％、グループ２において５％(p=0.50)であったが、このことは、ヒストングループ分けがそれらの増殖状態のためではないことを示している。p53発現レベルは２つのヒストン群において異なっており、より低い平均発現の群はより不良な予後を有していた。（グループ１において7.3%、グループ２において3.2%、(p=0.0002)）。そうすると、ヒストン修飾によって予測される不良な予後は、p53変異の増加した発生率のためではない。グレード、Ki67およびp53を含む多変量Coxモデルにおいて、ヒストングループ分けは結果の有為な予測因子であり続けた（表２）が、ECOGパフォーマンス状態も含めたときはそうではなかった。したがって、ヒストン修飾パターンは、グレード、増殖速度およびp53発現とは独立した、限局性腎臓がんにおける結果の予測因子である。
【０１４５】
H3K9me2の細胞レベルは前立腺がんおよび腎臓がんにおける臨床結果を予測する。H3K4me2およびH3K18acはいずれも、遺伝子活性と関連した修飾である。我々は次に、遺伝子抑制および活性両方ならびにヘテロクロマチンに関連する修飾であるH3K9me2のより低いレベルも、がんの不良な予後を予測するかを検討した。我々は、他の修飾が試験された同じ前立腺がんおよび腎臓がんTMAにおいて、H3K9me2細胞レベルを測定した。前立腺がんおよび腎臓がん標本両方における染色の分布は、０〜１００％染色にわたる広いパターンを示した（図６Ａおよび６Ｃ）。前立腺がんにおいて、H3K9me2の細胞レベルは高いGleasonスコア腫瘍を有する患者(スコア≧7; n=76)について予測的ではなかった。しかし、低いGleasonスコアの腫瘍(スコア＜7、n=109)について、連続非二分変数としてのH3K9me2のレベルは、腫瘍再発と有為に関連していた(Cox回帰 p=0.0037)。次いで我々は、Rpartツリー（Rpart tree）を用いて、H3K9me2の高レベルと低レベルに患者を二分する最適なH3K9me2レベルのカットポイントを決定した。図６Ｂに示すとおり、≦１０％ H3K9me2染色を有する患者（グループ２；赤線）は、＞１０％染色を有する患者と比較して、より高い腫瘍再発リスクを示した(Cox比例ハザードp=0.0043、HR=3.25、95% CI 1.38-7.63)。H3K9me2による予後診断は、低Gleasonスコア群内の腫瘍グレード（図６Ｂ挿入）、ステージ、術前PSAおよびカプセル浸潤とは独立していた（表２）。
【０１４６】
我々は次に、より低いH3K9me2レベルが腎臓がん患者におけるより不良な予後をも予測するかを決定した。実際、連続非二分変数としてのH3K9me2レベルは、全腎臓がん患者(Cox回帰 p=0.028、n=359)および限局性がんを有する患者(Cox回帰 p=0.026、n=189)における生存可能性と有為に関係していた。前立腺がん、腎臓がん患者と同じ≦１０％H3K9me2染色のカットポイント（グループ２；赤線）の使用は、＞１０％染色を有する患者と比較して有為に減少した生存可能性を示した(Cox比例ハザード p=0.00092、HR=1.7、95% CI 1.3-2.4; 図６Ｄ)。これは全患者および限局性または転移性疾患層でも当てはまった（図１０参照）。グレード、Ki67、p53および／または腫瘍局在化を含む多変量Coxモデルにおいて、H3K9me2レベルは結果の有為な予測因子であり続けた（表２）。併せて考えると、我々のデータは、より低いH3K9me2細胞レベルも前立腺がんおよび腎臓がんにおける不良な予後を予測することを示している。
【０１４７】
ヒストン修飾のグローバルレベルにおける変化は反復ＤＮＡ要素でのそれらのレベルと関連する。ヒストン修飾の細胞パターンがどのように分子レベルでの個々のプロモーターをマップするかを決定するため、我々は、原発性腫瘍での観察のためのモデルとして、２つの前立腺がん細胞系を同定した。我々は、表現型的により侵襲性のがん細胞系は一般により低いヒストン修飾レベルを含むと予測した。これは実際にLNCaPおよびPC3前立腺がん細胞系において妥当した。前立腺がんの骨転移由来のPC3細胞系は、リンパ節転移の単離形態であるLNCaP系よりもより侵襲性であると考えられる。図７Ａは抗H3K9me2抗体によるLNCaPおよびPC3細胞の免疫組織化学的染色を示す。より侵襲性のPC3細胞は、LNCaP細胞と比較して、低下したH3K9me2レベルを含んでいた。酸抽出ヒストンのウェスタンブロットにより、IHC結果が確認された（図７Ｂ）。PC3細胞はまた、LNCaP細胞と比較してより低いH3K18acおよびH3K4me2レベルを示した（図１１参照）。
【０１４８】
次に我々は、LNCaP細胞とPC3細胞との間の全プロモーターゲノムでのH3K9me2分布を比較するため、ChIP-チップ（マイクロアレイと組み合わせたクロマチン免疫沈降）実験を行った（図８Ａ）。各細胞系について、抗H3K9me2抗体でChIPed ＤＮＡを全ゲノムＤＮＡと比較した（インプット）。各プロモーターの註釈転写開始部位（TSS）について-5.5 kb 〜 +2.5 kbの平均領域をカバーする17,054個のプロモーターを含む、Agilent Human Promoter Arrayを使用した。各遺伝子についてのデータは、図８Ａの欄として示される１６個の500-bpフラグメントを作成するように標準化した。我々は、LNCaPおよびPC3細胞におけるH3K9me2の分布が、全プロモーターゲノムにわたるそれぞれの位置での高い相関の程度と極めて類似していた（図８Ｂ）。そうすると、LNCaP細胞およびPC3細胞の間の総H3K9me2レベルの差は、遺伝子プロモーターでのグローバル変化のためではない可能性がある。
【０１４９】
我々は次に、PC3細胞におけるヒストン修飾のより低いグローバルレベルが反復ＤＮＡ要素での低下したレベルのためであるかを検討した。合計でヒトゲノムの〜７０％を含むこれらのＤＮＡ要素は、顕著にＤＮＡ脱メチル化されており、あるがんではより低いH4K16acおよびH4K20me3レベルを有する(Fraga et al., Nat Genet 37:391-400 (2005))。我々は上記と同じChIPed ＤＮＡを用い、次いで定量的実時間ＰＣＲ(qRT-PCR)により多様なＤＮＡ反復要素でのH3K9me2レベルを試験した（図８Ｃ）。コピー数の変動を避けるため、各反復ＤＮＡ要素について、反復および非反復ＤＮＡ要素の境界で領域を試験した。図８Ｃに示すとおり、PC3細胞は、末端動原体型染色体(NBL2)およびセントロメア近傍不随体（juxtacentromeric satellite）２(Sat2)ＤＮＡ配列において見られるタンデム1.4 kb要素であるサブテロメア反復要素(D4Z4)でのより低いH3K9me2レベルを示した。より低いH3K9me2レベルは、ヒストン損失のためではなかった（図８Ｃ）。H3K18acはまた、D4Z4およびNBL2要素でもより低いレベルを示した。これらの結果は、より侵襲性のがんにおけるヒストン修飾のグローバル損失は、ＤＮＡ反復要素でのより低い修飾レベルと相関していることを示す。
【０１５０】
我々は、既に報告した前立腺がんに加えて(Seligson et al., Nature 435:1262-1266 (2005))、がん組織における同じヒストン修飾のグローバルレベルが肺および腎臓の異なる腺がんにおいて疾患結果を予測することの証拠を提供した。一般に、各がんにおいて、H3K4me2およびH3K18acについて陽性染色されるがん細胞のより低いパーセンテージを有する患者は、より高いパーセンテージを有するものよりもより不良な予後を有する。興味深いことに、H3K9me2の細胞レベルも疾患結果と関連しており、より低いレベルは前立腺がんおよび腎臓がんにおけるより不良な予後を予測する（肺がんコホートについてH3K9me2は未だ試験していない）。したがって、我々のデータから現れる一般像は、ヒストン修飾のより低い細胞レベルがより不良な臨床結果と関連しているというものである。興味深いことに、ヒストン修飾レベルは互いに正の相関を有しており、これは１種のヒストン修飾の損失が一般に患者における他の修飾の喪失と関連していることを示唆している（表３参照）。他の研究所は、さらに別の修飾および非小細胞肺がん(Barlesi et al., J Clin Oncol 25:4358-4364 (2007))、ならびに乳房、卵巣および膵臓のがん(Wei et al., Mol Carcinog 47:701-706 (2008))を含む他のがんについて、ヒストン修飾の予後能をバリデートし、延長している。このヒストン修飾パターンの全体的適用可能性は、今日存在するほとんどの予後マーカーとは異なっている。ヒストン修飾の予後能は、増殖速度ならびに肺がんにおけるp53発現および腎臓がんにおけるp53およびKi67発現のようなあるバイオマーカーを含む臨床病理学的変数から独立している。したがって、ヒストン修飾の細胞パターンは、がん患者の臨床動態の予測のための現在の予後マーカーと重複しないさらなる情報を加える。
【０１５１】
がんにおけるヒストン修飾の分析は、典型的には、個々の遺伝子プロモーターのような特定の遺伝子座に注目しており、下流遺伝子の発現に対する結果的な効果を有するヒストン修飾の局所撹乱を明らかにする。この考えをLNCaPと比較して〜５０％低いH3K9me2を含むPC3細胞に拡大し、我々は、驚くべきことに、２つの細胞系からのChIP-chipデータが互いに本質的に類似していることを見出した。これはヒストン修飾のグローバルレベルにおける差が遺伝子プロモーターでの変化から生じていない可能性を示唆する。しかし、３つのＤＮＡ反復要素のChIP分析は、PC3対LNCaP細胞において低下したH3K9me2レベルを示した。ヒストン修飾のグローバルレベルと遺伝子プロモーターではなく反復要素でのそれらのレベルとの間のかかる相関は、他のがんについて既に示された(Fraga et al., Nat Genet 37:391-400 (2005))。ＤＮＡ反復要素は〜６０〜７０％のゲノム配列を含む(Li et al., Nature 409:847-849 (2001))ため、これらの領域でのヒストン修飾のレベルは、両方のがん細胞系および原発性がん組織において観察されるグローバルな差を説明しうる。
【０１５２】
反復要素はがんにおいて、ＤＮＡで脱メチル化されており、ゲノム不安定性に寄与しうる(Feinberg, A.P., Tycko, B., Nat Rev Cancer, 4:143-153 (2004))。我々のデータおよび他のデータ(Fraga et al., Nat Genet 37:391-400 (2005))は、反復要素がそれらの関連ヒストンでも脱メチル化および／または脱アセチル化されていることを示唆する。この反復要素でのヒストンの「脱修飾」の生物学的結果は不明確であるが、ヒストン修飾のより低いグローバルレベルが不良な予後を予測するため、より侵襲性の表現型と関連している可能性がある。反復要素でヒストン修飾に影響を与える制御メカニズムはあまり理解されていないが、遺伝子変異、発現変化および／または翻訳後制御を介したヒストン修飾酵素の不適切なターゲティング、変化した発現および／または活性のためでありうる(Esteller, M., Br J Cancer 94:179-183 (2006))。ヒストン修飾は全て可逆性であるため、ヒストン修飾因子の１セット、例えばHDACの増加した活性は、ヒストン修飾の全体的な状態を変化して、グローバルレベルで検出可能な変化を引き起こしうる(Kurdistani, S.K., Br J Cancer 97:1-5 (2007))。これらのヒストン修飾因子のいくつかは、ＤＮＡ反復要素に優先的に影響を与えうる。これは哺乳類タンパク質については示されていないが、酵母におけるHos3 HDACは、リボソームＤＮＡ反復を優先的に脱アセチル化する(Robyr et al., Cell 109:437-446 (2002))。
【０１５３】
潜在的に関連した試験において、我々は、アデノウイルスe1aのようなウイルス性発がんタンパク質が、ゲノムのほとんどとは離れて、そして細胞複製およびしたがってウイルス生産を補助する遺伝子の制限されているが生物学的に関連したセットにそれらを制限する、特異的ヒストン修飾因子の全ゲノムにわたる再分布を通じて、ヒト細胞におけるヒストン修飾のグローバルパターンを変化させうることを示した(Ferrari et al., Science 321:1086-1088 (2008); Horwitz et al., Science 321:1084-1085 (2008))。e1a発がんタンパク質の場合におけるように、原発性がんにおけるＤＮＡ反復要素でのヒストン修飾の損失は、これらの領域から離れてこれを生じる細胞に利点を与える遺伝子のより小さなセットへとHATおよびHMTの再分布も反映しうる。メカニズムが何であれ、ほとんどまたは全く検出可能なヒストン修飾がない細胞が１個の前駆細胞（すなわちクローン）または組織内の異なる腫瘍細胞における並行ヒストン修飾損失に由来するかどうかが、決定されるままである。
【０１５４】
ヒストン修飾による予後診断は、後成的治療の示唆を有しうる。一つの可能性は、低レベルのH3K4me2、H3K18acおよび／またはH3K9me2を有する不良な結果を有する患者は、高レベルのヒストン修飾を有するものよりもHDAC阻害剤からより多くの利益を受けうるということである。不良結果群は多様な後成的治療法の異なるレジメンを必要としうるということもできる(Egger et al., Nature 429:457-463 (2004); Minucci et al., Nat Rev Cancer 6:38-51 (2006))。症例が何であれ、我々のアプローチの単純さおよび頑健性は、同様の臨床結果を有するがん患者のサブセットを同定する標準的かつ効果的な後成的アッセイの開発を促進するであろう。
【０１５５】
実施例３．ヒストン修飾は乳がんにおける生存可能性を予測する。
【０１５６】
ヒストン修飾パターンが乳がんにおいて臨床的に情報価値があるかを決定するため、我々は、グレード１および２の乳がんを有する患者(n=33)にヒストンパターンを適用した。ヒストンパターンは腫瘍再発の有為に異なるリスクを有する２つの患者群を同定した。グループ１（すなわちH3K4me2およびK18acについてそれぞれ＞６０または＞３５％染色）において患者は、＜１％の８年腫瘍再発リスクを有するが、グループ２のものは、３０％の再発リスクを有する(Logランク p=0.006)。２つの群の間で、グレード、ステージ、エストロゲンおよびプロゲステロンレセプター状態に有為な差はない。分裂指数が乳がんグレード分けシステムに組み込まれる３つのパラメーターの１つであるため、ヒストングループ分けは、分裂指数、したがって増殖速度からも独立している。過剰発現が乳がんにおける不良な結果と関連しているがん原遺伝子であるHER-2も、２つのヒストン群において有為な差を示さなかった：Her2はグループ１の患者15/24で、グループ２の患者2/9で過剰発現される(p=0.057)。したがって、前立腺、肺および腎臓のがんにおけるように、ヒストン修飾のグローバルレベルは、乳房腺がんにおける予後マーカーとして利用できる。
【０１５７】
本明細書に記載の実施例および態様は、説明のみを目的としており、その範囲内での多様な修飾または変形が提案されることが当業者には理解され、本願および特許請求の範囲の精神および範囲に含まれる。本明細書で言及した全ての文献、特許および特許出願は、それらの全体について、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込む。
【０１５８】
【表３】
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【表４−１】
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【表４−２】
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【表５】
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各表に示したのはがんについての全臨床フォローアップおよびヒストンマーカーインフォマティブ症例にわたる症例−レベルヒト相関であり、平均陽性細胞％で示した。
【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年12月15日(2011.12.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８２】
表の残基位置は、配列番号１〜２の位置に関し、Ｎ末端メチオニンがない場合は番号をふり直す（すなわち、配列番号１〜２の残基位置から１を引く）。好ましい態様において、検出される配列番号１〜２のヒストンタンパク質は、Ｎ末端メチオニン残基を欠く。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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