【手続補正書】
【提出日】平成21年4月27日(2009.4.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂質分解活性の低減、脂肪消化の遅延、満腹ホルモンの増加、食欲の抑制、食物摂取の減少、および／または体重の低下のための、葉緑体またはチラコイドの少なくとも一つの細胞膜またはその部分を含む、組成物。
【請求項２】
前記細胞膜またはその部分は、植物、藻類、微生物から得られる、またはそれらの合成物もしくは混合物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記植物から得られる細胞膜またはその部分は、クローバ、アブラナ、サトウダイコン、タンポポ、シロイヌナズナ、トウモロコシ、タバコ、ヒマワリ、サラダ用生野菜、アカザ、ヤマホウレンソウ、ホウレンソウおよび草、またはその混合物から得られる請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記細胞膜はホウレンソウから得られる請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
細胞膜タンパク質の少なくとも膜貫通部分を含み、前記膜貫通部分は疎水性アミノ酸残基を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物は約１５から約２５までのアミノ酸残基を有する細胞膜疎水性ペプチドの少なくとも一つを含む先の請求項１〜５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物は同一のタンパク質または異なるタンパク質に由来する２つまたは複数の疎水性ペプチドを含む先の請求項１〜６のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
前記疎水性ペプチドは１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２４アミノ酸残基を有する先の請求項１〜７のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
前記疎水性ペプチドは、配列番号：１、配列番号：２または、配列番号：３またはその混合物である先の請求項１〜８のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
前記細胞膜またはその部分は０．１μｍから約５μｍのサイズ分布を有する先の請求項１〜９のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
前記疎水性ペプチドは約１から約５０の追加のアミノ酸残基で構成される先の請求項１〜１０のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２】
前記疎水性ペプチドはアミド化、エステル化、アシル化、アセチル化、ＰＥＧ化またはアルキル化によって修飾される先の請求項１〜１１のいずれかに記載の組成物。
【請求項１３】
前記組成物はさらに薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤または緩衝液を含む先の請求項１〜１２のいずれかに記載の組成物。
【請求項１４】
前記医薬組成物は、顆粒、粉末、錠剤、コーティング錠、（マイクロ）カプセル、シロップまたはエマルジョンである請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記組成物は食品組成物である請求項１〜１２のいずれかに記載の組成物。
【請求項１６】
前記組成物は固形、半固形、または液体の形態である請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記組成物は冷凍乾燥、噴霧乾燥、凍結乾燥される先行する請求項１〜１６のいずれかに記載の組成物。
【請求項１８】
前記組成物は、マーガリン、油、クリーム、牛乳、チーズ、ブリーチーズ、小麦粉、ジュース、清涼飲料または茶産物中の成分である請求項１５〜１７のいずれかに記載の組成物。
【請求項１９】
前記組成物が食欲を制御する先の請求項１〜１８のいずれかに記載の組成物。
【請求項２０】
疾患または障害のいずれかとしてのメタボリック症候群の治療のための請求項１〜１７のいずれかに記載の組成物。
【請求項２１】
肥満、高血圧症、動脈硬化症、痛風、１型および２型糖尿病、癌および異脂肪血症の治療のための請求項２０に記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
腸での脂肪消化中の重要な酵素は膵臓リパーゼである。肥満に抗する薬剤としてリパーゼ阻害剤（ゼニカル）を使用することは十分に確立されている（Sjostrom L. 他, Lancet 352: 167-172, 1998）。リパーゼ阻害剤は体重を減らすだけでなく、抗インシュリン性を改善する。したがって、このような知見は、脂肪に対する満腹感およびインシュリン感受性に対する腸の脂肪消化の役割に関する強力な証拠を提供する。このリパーゼ阻害剤の短所は、すべての型のリパーゼを阻害し、大きく損なわれた脂肪消化に起因して脂肪便症を生ずることである。したがって、副作用として脂肪便症(steatorrhea)をもたらさずに、より穏やかな方法で脂肪消化を遅らせる天然の化合物を開発することが最重要である。本願発明者は、脂肪消化を遅らせて、満腹ホルモンを増すことによって食欲を抑制し、血清トリグルセリドレベルを下げる、高い栄養価の天然の化合物を発見した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
用語「疎水性ペプチド」は、アルギニンおよびグルタミン酸のような荷電残基をともなう少数のアミノ酸と共に、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン(phenylalanine)、トリプトファン、メチオニン、グリシン、システインから成る群からの選択された、疎水性アミノ酸残基を少なくとも85%有するペプチドを意味する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
疎水性ペプチドは、自動化手順による合成を含む標準的な化学的手法によって合成されてもよい。一般に、ペプチドアナログは、結合剤としてHATU（N -[ジメチルアミノ-1H-1.2.3-トリアゾロ[4,5-B]ピリジン-1-イルメチレン]-N-メチルメタンアミニウムヘキサフルオロホスファートN-オキシド）またはHOAt-1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール等の他の結合剤による標準固相Fmoc保護方法に基づいて合成される。ペプチドは、適切な捕捉剤を含むトリフルオロ酢酸（側鎖官能基の脱保護もする）により固相樹脂から切断される。粗精製ペプチドは調製的逆相クロマトグラフィを使用してさらに精製される。分配クロマトグラフィ、ゲル濾過、ゲル電気泳動法またはイオン交換クロマトグラフィのような他の精製方法を使用してもよい。tBoc保護方法のような当該技術分野において公知である他の合成技術または異なる結合試薬または同種を使用して、同等のペプチドを生じさせることができる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
用語「アジュバント」は、ペプチドの生物学的作用を増すために製剤に加えられた任意の化合物を意味する。アジュバントは異なる陰イオンをともなう、亜鉛塩、銅塩または銀塩の一つまたは複数であってもよく、例えば、フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物、チオシアン酸塩(thiocyanate)、亜硫酸塩、水酸化物、リン酸塩、炭酸塩、乳酸塩、グリコール酸塩、クエン酸塩、ホウ酸塩、酒石酸塩、および異なるアシル組成物の酢酸塩であるが、これらに限定されない。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
賦形剤は、炭水化物、ポリマー、脂質および無機物の一つまたは複数であってもよい。炭水化物の例はラクトース、ショ糖、マンニトールおよびシクロデキストリンを含み、例えば組成物に凍結乾燥の促進のために加えられる。ポリマーの例は、デンプン、セルロースエーテル、セルロースカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、アルギン酸塩、カラギーナン、ヒアルロン酸およびその誘導体、ポリアクリル酸、ポリスルホン酸塩、ポリエチレングリコール(polyethyleneglycol)／ポリエチレンオキシド、ポリエチレンオキシド／ポリプロピレンオキシド共重合体、異なる加水分解度のポリビニルアルコール／ポリ酢酸ビニル、およびポリビニルピロリドンであり、異なる分子量のすべてのものは、生体接着が行なわれるようにするために、または化学的分解および蛋白質分解から脂質を保護するために、例えば粘度調節のために、組成物に加えられる。脂質の例は脂肪酸である、リン脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、およびトリグリセリド、セラミド、スフィンゴ脂質および糖脂質、異なるアシル鎖長および飽和度のすべてのもの、卵レシチン、ダイズレシチン、水素化した卵およびダイズレシチンであり、ポリマーのための理由に類似する理由で組成物に加えられる。無機物の例はタルク、酸化マグネシウム、酸化亜鉛および酸化チタンであり、液体の蓄積の減少または都合のよい色素特性のような利点を得るために組成物に加えられる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
膜および膜蛋白質の調製
Danielsson 他 Biochim Biophys Acta 1608, 53-61 (2004) に記載されているように、リパーゼ分析で使用するためのチラコイドを単離した。食品調製のために、チラコイドを以下のように単離した：葉を破砕器でホモジネートし、ナイロンメッシュ（20μm）の4層を通して濾過した。チラコイドを集めるために、濾液を5000gで10分間、遠心分離機にかけた。これらを水中での再懸濁によって洗浄し、前のように再度遠心分離機にかけた。脂質抽出： 40mLクロロホルム／メタノールと混合した4mlのチラコイド懸濁液（3.8mgクロロフィル／mL）を、氷上で1時間インキュベートした。4000gで10分間の遠心分離後、ペレットの第2回目の抽出を行い、前のように遠心分離機にかけた。ペレットを空気中で乾燥し、水溶性蛋白質を取り除くために、チラコイド単離に使用した緩衝液溶液10 mLによって氷上で抽出した。混合物を4000gで10分間の遠心分離機にかけ、ペレットを集めた。これを「膜蛋白質画分」と命名する（図1）。トリプシン処理は、チラコイドを、300μgトリプシン（III型Sigma）／mgクロロフィルにより、20mMリン酸塩緩衝液（pH 7.4）中で37℃、45分間のインキュベーションにより行なった。トリプシンを阻害するために1mMフェニルメチルスルホニルフルオライド（PMSF）を加えた後に、チラコイドを900gで10分間の遠心分離によって集めた。上記 (Danielsson et al. Biochem Biophys Acta 1608, 53-61 (2004)) のようにクロロフィルを測定し、Bradford (Bradford, M. M.. Anal Biochem 72,248-54 (1976) にしたがい蛋白質を測定した。Andersson, B. & Albertsson, P.-A. J. Cliromatogr. 890, 131-141 （1981）に記載されているようにして、集光性複合体II（LHCII）を調製した。（Petit, P. X., Edman, P., Gardestrom, P. & Ericson, I. Biochim Biophys Acta 890, 377-386 （1987））にしたがって、バレイショ塊茎からミトコンドリアを調製した。 （Kjellbom, P. & Larsson, C. Physiol Plant 62, 501-509 （1984））にしたがって、ホウレンソウ葉から細胞膜を調製した。 （Norling, B., Zak, E., Andersson, B. & Pakrasi, H. FEBS Lett 436, 189-92 （1998））にしたがって、シネコシスティス(Synechocystis)から膜を調製した。 （Wang, H., Franke, C. C, Nordlund, S. & Noren, A. FEMS Microbiol Lett 253: 273-279 （2005））にしたがって、ロドスピリルム・ルブルムから色素胞を調製した。 （Wang, H., Franke, C. C, Nordlund, S. & Noren, A. FEMS Microbiol Lett 253: 273-279 （2005））にしたがって、使用前に、0.5MNaCl、25mMトリス-HCl、pH 7.8で洗浄、続いてトリス緩衝液単独で2回洗液して、表在性水溶性蛋白質を取り除いた。 （Althage, M. 他 Biochim Biophys Acta 1659, 73-82 （2004））にしたがって、大腸菌からトランスヒドロゲナーゼを調製した。 （Romanowska, E. & Albertsson, P.-Å. Plant Cell Physiol 35, 557-568 （1994））にしたがって、ホウレンソウ葉からシトクロムb6fを調製した。