【手続補正書】
【提出日】平成23年8月1日(2011.8.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非げっ歯類脊椎動物被験体において喘息を処置または予防するための組成物であって、該被験体において喘息を処置または予防するためのＣｐＧ免疫刺激性核酸の有効量を含み、ここで、該被験体は、ＣｐＧ免疫刺激性核酸と同時に抗原を投与されない、組成物。
【請求項２】
被験体において喘息を処置または予防するための組成物であって、該被験体において喘息を処置または予防するためのＣｐＧ免疫刺激性核酸の有効量を含み、ここで、該組成物が、ＣｐＧ免疫刺激性核酸が経口投与されるように処方される、組成物。
【請求項３】
被験体においてアレルギーを処置または予防するための組成物であって、該被験体おいてアレルギーを処置または予防するためのＣｐＧ免疫刺激性核酸の有効量を含み、ここで、該アレルギーがアレルギー性喘息ではない、組成物。
【請求項４】
被験体が、ＣｐＧ免疫刺激性核酸と同時に外因性アレルゲンを投与されない、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
アレルギーが、湿疹、アレルギー性鼻炎またはコリーザ、枯草熱、気管支喘息、じんま疹または食物アレルギーである、請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
アレルギーが気管支喘息である、請求項３に記載の組成物。
【請求項７】
被験体において細胞障害性リンパ球応答を誘導するための組成物であって、該被験体において細胞障害性リンパ球応答を誘導するためのＣｐＧ免疫刺激性核酸の有効量を含む、組成物。
【請求項８】
ＣｐＧ免疫刺激性核酸が、ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
ＣｐＧ免疫刺激性核酸がＴＧＴＣＧＴＴＧＴＣＧＴＴＧＴＣＧＴＴＧＴＣＧＴＴまたはＴＣＧＴＣＧＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
ＣｐＧ免疫刺激性核酸が安定化される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
ＣｐＧ免疫刺激性核酸が、少なくとも１つのリン酸バックボーン修飾により安定化される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
ＣｐＧ免疫刺激性核酸が、経口、経皮、皮下、静脈内、非経口、腹腔内または鞘内に投与される、請求項１、３〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
被験体がヒトである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
被験体が、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、トリ、またはサルである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
ＣｐＧ免疫刺激性核酸が、ステロール、陽イオン脂質、ヴィロソーム、またはリポソームとともに処方される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
ＣｐＧ免疫刺激性核酸が、少なくとも以下の式：
５’Ｘ１Ｘ２ＣＧＸ３Ｘ４３’
を含む配列を有する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の組成物であって、ここで、Ｃは、非メチル化Ｃであり、Ｘ１Ｘ２およびＸ３Ｘ４はヌクレオチドであり、該核酸は８〜３０ヌクレオチドの長さである、組成物。
【請求項１７】
Ｘ１Ｘ２がＧｐＴ、ＧｐＧ、ＧｐＡ、ＡｐＴまたはＡｐＡであり；Ｘ３Ｘ４は、ＴｐＴまたはＣｐＴである、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
Ｘ１Ｘ２がＧｐＡであり、そしてＸ３Ｘ４がＴｐＴである、請求項１７に記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
【図１Ａ】図１Ａは、Ｔ細胞除去脾臓細胞培養物の、さまざまなＤＮＡ配列に反応する用量依存性ＩＬ−６産生をプロットしたグラフである。図１Ａは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡ（●）および子ウシ胸腺ＤＮＡ（■）配列およびＬＰＳ（大腸菌および子ウシ胸腺ＤＮＡの１０倍濃度）（◆）である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、Ｔ細胞除去脾臓細胞培養物の、さまざまなＤＮＡ配列に反応する用量依存性ＩＬ−６産生をプロットしたグラフである。図１Ｂは、コントロールホスホジエステルオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）、５’ＡＴＧＧＡＡＧＧＴＣＣＡＧＴＧＴＴＣＴＣ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１１４）（■）および２つのホスホジエステルＣｐＧ  ＯＤＮ、５’ＡＴＣＧＡＣＣＴＡＣＧＴＧＣＧＴＴＣＴＣ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２）（◆）および５’ＴＣＣＡＴＡＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３）（●）である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、Ｔ細胞除去脾臓細胞培養物の、さまざまなＤＮＡ配列に反応する用量依存性ＩＬ−６産生をプロットしたグラフである。図１Ｃは、コントロールホスホロチオエートＯＤＮ、５’ＧＣＴＡＧＡＴＧＴＴＡＧＣＧＴ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４）（■）および２つのホスホロチオエートＣｐＧ  ＯＤＮ、５’ＧＡＧＡＡＣＧＴＣＧＡＣＣＴＴＣＧＡＴ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：５）（◆）および５’ＧＣＡＴＧＡＣＧＴＴＧＡＧＣＴ３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：６）（●）である。データは３つ組の平均±標準偏差で表している。
【図２】図２は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＣｐＧ  ＤＮＡに誘導されるＩＬ−６産生を、注射後１−８時間で測定し、プロットしたグラフである。データは、２匹のマウスから得た血清の二重解析の平均を示している。ＢＡＬＢ／ｃマウス（２匹／群）に１００μｌのＰＢＳ（□）または２００μｇのＣｐＧホスホロチオエートＯＤＮ、５’ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：７）（■）またはＣｐＧを含まないホスホロチオエートＯＤＮ、５’ＴＣＣＡＴＧＡＧＣＴＴＣＣＴＧＡＧＴＣＴ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：８）（◆）を静脈内注射した。
【図３】図３は、ＢＡＬＢ／ｃマウス（２匹／群）に１００μｌのＰＢＳ、２００μｇのＣｐＧホスホロチオエートＯＤＮ、５’ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：７）またはＣｐＧを含まないホスホロチオエートＯＤＮ、５’ＴＣＣＡＴＧＡＧＣＴＴＣＣＴＧＡＧＴＣＴ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：８）を静脈内注射し、ｉｎ  ｖｉｖｏ刺激した後、さまざまな時点で、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応により測定した、肝臓、脾臓、および胸腺中のＩＬ−６  ｍＲＮＡ発現を示すオートラジオグラフである。
【図４Ａ】図４Ａは、ＣｐＧ誘導ＩｇＭ産生の抗ＩＬ−６による用量依存性阻害をプロットしたグラフである。ＤＢＡ／２マウス由来の牌臓Ｂ細胞を、示した濃度の中和抗ＩＬ−６（◆）またはアイソタイプコントロール抗体（●）の存在下で、ＣｐＧ  ＯＤＮ、５’ＴＣＣＡＡＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：９）で刺激し、そして培養上清中のＩｇＭレベルをＥＬＩＳＡにより測定した。ＣｐＧ  ＯＤＮの非存在下では、抗ＩＬ−６ＡｂはＩｇＭ分泌に影響を及ぼさなかった（■）。
【図４Ｂ】図４Ｂは、抗ＩＬ−６およびＣｐＧ  Ｓ−ＯＤＮ、５’ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：７）（◆）、または抗ＩＬ−６抗体のみ（■）と共に培養した、ＣｐＧ誘導脾臓Ｂ細胞の刺激指数をプロットしたグラフである。データは３つ組の平均±標準偏差を表している。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８７】
本発明の核酸配列は、例えば患者におけるサイトカイン産生を刺激する。サイトカインには、限定されるわけではないが、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびＧＭ−ＣＳＦが含まれる。典型的な配列には：ＴＣＣＡＴＧＴＣＧＣＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴ（ＳＥＱＩＤ  Ｎｏ：３７）、ＴＣＣＡＴＧＴＣＧＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３８）、およびＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４６）が含まれる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８９】
【化５】
2010150280.tif 000001
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９０】
【化６】
2010150280.tif 000002
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９２】
【化７】
2010150280.tif 000003
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１０】
【表１】
2010150280.tif 000004
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１２】
【表２】
2010150280.tif 000005
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１６】
【表３】
2010150280.tif 000006
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１９】
【表４】
2010150280.tif 000007
マウス（２匹／群）に１００μｌのＰＢＳ、２００μｇの大腸菌ＤＮＡまたは子ウシ胸腺ＤＮＡ、または５００μｇのＣｐＧ  Ｓ−ＯＤＮまたはＣｐＧを含まないコントロールＳ−ＯＤＮを静脈注射した。マウスを注射２時間後に放血させ、そして各血清を１：１０希釈したものをＩＬ−６  ＥＬＩＳＡにより解析した。ＩＬ−６  ＥＬＩＳＡの感度限界は５ｐｇ／ｍｌであった。ＣｐＧ  Ｓ−ＯＤＮの配列は、５’ＧＣＡＴＧＡＣＧＴＴＧＡＧＣＴ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：６）であり、そして非刺激性Ｓ−ＯＤＮの配列は５’ＧＣＴＡＧＡＴＧＴＴＡＧＣＧＴ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４）である。配列４８にはＣｐＧがあるが、本明細書に説明されるように、刺激をもたらすには３’端に近すぎる。データは、２つ組の平均±ＳＤを表す。実験は少なくとも２回行い、同様な結果が得られた。
Ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＣｐＧモチーフによる刺激後のネズミＩＬ−６分泌の動態
Ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＣｐＧ  ＤＮＡによるＩＬ−６分泌誘導の動態を評価するため、ＢＡＬＢ／ｃマウスにＣｐＧ  Ｓ−ＯＤＮ、またはＣｐＧを含まないコントロールＳ−ＯＤＮを静脈注射した。ＣｐＧ  Ｓ−ＯＤＮ注射群では、血清ＩＬ−６レベルは１時間以内に有意に上昇し、そして２時間でピークに達し、およそ９ｎｇ／ｍｌのレベルとなった（図２）。血清中のＩＬ−６タンパク質は、４時間後、急速に減少し、そして刺激１２時間後には基底レベルに戻った。ＣｐＧ  ＤＮＡ刺激群と対照的に、非刺激性Ｓ−ＯＤＮまたはＰＢＳ注射群由来の血清中には、有意なＩＬ−６増加は見られなかった（図２）。
Ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＣｐＧモチーフにより誘導されるＩＬ−６  ｍＲＮＡ発現の組織分布および動態
図２に示されるように、血清ＩＬ−６レベルは、ＣｐＧ  ＤＮＡ刺激後に急速に増加する。この血清ＩＬ−６の起源で可能性がある組織およびＣｐＧ  ＤＮＡ刺激後のｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＩＬ−６遺伝子発現の動態を調べるため、ＢＡＬＢ／ｃマウスにＣｐＧまたはＣｐＧを含まないＳ−ＯＤＮを静脈注射し、そして肝臓、脾臓、胸腺、および骨髄から、刺激後さまざまな時点で、ＲＮＡを抽出した。図３Ａに示されるように、肝臓、脾臓、および胸腺におけるＩＬ−６  ｍＲＮＡレベルはＣｐＧ  Ｓ−ＯＤＮ注射後３０分以内に増加した。肝臓ＩＬ−６  ｍＲＮＡは、注射後２時間でピークに達し、そして急速に減少し、そして刺激後８時間で基底レベルに戻った（図３Ａ）。脾臓ＩＬ−６  ｍＲＮＡは、刺激後２時間でピークに達し、そしてその後次第に減少した（図３Ａ）。胸腺ＩＬ−６
ｍＲＮＡは、注射後１時間でピークに達し、そしてその後次第に減少した（図３Ａ）。骨髄におけるＩＬ−６  ｍＲＮＡはＣｐＧ  Ｓ−ＯＤＮ注射後１時間以内に有意に増加したが、その後、基底レベルに戻った。ＣｐＧ  Ｓ−ＯＤＮに反応し、肝臓、脾臓および胸腺は、骨髄よりもより実質的なＩＬ−６  ｍＲＮＡ発現増加を示した。
ＣｐＧ  ＤＮＡにより誘導されるネズミサイトカイン発現のパターン
Ｉｎ  ｖｉｖｏまたは全脾臓細胞において、以下のインターロイキン：ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、またはＩＬ−１０のタンパク質レベルに、最初の６時間以内に有意な増加は検出されなかった（Ｋｌｉｎｍａｎ，Ｄ．Ｍ．ら，（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：２８７９−２８８３）。しかし、ＴＮＦ−αレベルは３０分以内に増加し、そしてＩＬ−６レベルはＣｐＧ  ＯＤＮを注射されたマウスの血清において、２時間以内に著しく増加した。脾臓細胞からのＩＬ−１２およびインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）ｍＲＮＡ発現の増加もまた、最初の２時間以内に検出された。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２１】
【表５】
2010150280.tif 000008
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３６】
【表９】
2010150280.tif 000009
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５５】
【表１４】
2010150280.tif 000010
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８６】
以下の実施例１２に詳細に記載されるように、非メチル化ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド（すなわち、ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ；ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１０）は、ネズミ喘息モデルにおいて、炎症性細胞浸潤および好酸球増加症の発展を防ぐが、コントロールオリゴヌクレオチド（ＴＣＣＡＴＧＡＧＣＴＴＣＣＴＧＡＧＴＣＴ；ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：８）は防がない。さらに、好酸球性炎症は、Ｔｈ２反応の抑制およびＴｈ１反応の誘導と関連していた。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０７】
ＲＴ−ＰＣＲ。ＩＬ−６に対する、センスプライマー、アンチセンスプライマー、および内部オリゴヌクレオチドプローブを、公表された配列を用いて合成した（Ｍｏｎｔｏｇｏｍｅｒｙ，Ｒ．Ａ．およびＭ．Ｓ．Ｄａｌｌｍａｎ（１９９１），Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｆｅｔａｌ  ｔｈｙｍｉｃ  ｏｎｔｏｇｅｎｙ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）１４７：５５４）。ｃＤＮＡ合成およびＩＬ−６ＰＣＲは、Ｐｅｒｋｉｎ．Ｅｌｍｅｒ  Ｃｏｒｐ．（カリフォルニア州ヘイワード）からのＲＴ−ＰＣＲ試薬を用い実質的にＭｏｎｔｏｇｏｍｅｒｙおよびＤａｌｌｍａｎに記載されるように行った（Ｍｏｎｔｏｇｏｍｅｒｙ，Ｒ．Ａ．およびＭ．Ｓ．Ｄａｌｌｍａｎ（１９９１），Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｆｅｔａｌｔｈｙｍｉｃ  ｏｎｔｏｇｅｎｙ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）１４７：５５４）。試料は３０サイクルの増幅の後、ゲル電気泳動をしその後、非ブロット（ｕｎｂｌｏｔ）解析（Ｓｔｏｙｅ，Ｊ．Ｐ．ら，（１９９１）ＤＮＡ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｄｒｉｅｄ  ｇｅｌｓ  ｗｉｔｈ  ｆｒａｇｍｅｎｔｅｄ  ｐｒｏｂｅｓ：ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｏｖｅｒ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３：１２３）により解析した。簡潔には、ゲルを室温で、変性緩衝液（０．０５Ｍ  ＮａＯＨ，１．５Ｍ  ＮａＣｌ）中で３０分ハイブリダイズし、その後再生緩衝液（１．５Ｍ  ＮａＣｌ，１Ｍ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ８）中で３０分インキュベーションし、そして再蒸留水中で３０分洗浄した。ゲルを乾燥し、そして１０μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション緩衝液（５Ｘ  ＳＳＰＥ，０．１％ＳＤＳ）中で４７℃で２時間プレハイブリダイズさせた。ゲルを２ｘ１０６ｃｐｍ／ｍｌのＩＬ−６に対するｇ−［３２Ｐ］ＡＴＰ末端標識内部オリゴヌクレオチドプローブ（５’ＣＡＴＴＴＣＣＡＣＧＡＴＴＴＣＣＣＡ３’；ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１１６）と４７℃で一晩ハイブリダイズし、室温で４回洗浄し（２Ｘ  ＳＳＣ，０．２％ＳＤＳ）、そしてオートラジオグラフを行った。結果は図３に示した。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１４】
【化８】
2010150280.tif 000011
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２１】
免疫化マウスをその後、非メチル化ＣｐＧモチーフを含む（すなわちＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ；ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１０）または含まない（すなわちコントロール、ＴＣＣＡＴＧＡＧＣＴＴＣＣＴＧＡＧＴＣＴ；ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：８）オリゴヌクレオチドで処理した（２００μｌの生理食塩水中に３０μｇ、ｉ．Ｐ．注射による）。可溶性ＳＥＡ（２５μｌの生理食塩水中に１０μｇ）を鼻腔内点滴注入により第１４日および第２１日に投与した。生理食塩水をコントロールとして用いた。