(57)【要約】  クルクミン類似体およびその同じものを作る、および用いる方法を開示する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
図２ａ、図２ｂおよび図２ｃにおいて示されている、クルクミン類似体ＦＬＬＬ３１。
【請求項２】
図２、図２ｂおよび図２ｃにおいて示されている、クルクミン類似体ＦＬＬＬ３２。
【請求項３】
系列１のジアルキル化ジメトキシクルクミン類似体１ａ、２ａ、３ａ、４ａ、５ａ、６ａ、および系列２のジアルキル化ジメトキシクルクミン類似体１ｂ、２ｂ、３ｂ、４ｂ、５ｂ、６ｂを含む、図１９ｂにおいて示されている、クルクミン類似体。
【請求項４】
図１９ｃ−表３において示されている、クルクミン類似体。
【請求項５】
図１９ｄ−表４において示されている、クルクミン類似体７。
【請求項６】
図１９ｅ−スキーム１において示されている、クルクミン類似体８。
【請求項７】
図１９ｅ−スキーム１において示されているスキーム１を用いて合成すること、または系列２の類似体を合成することを含む、クルクミン類似体を作るための方法。
【請求項８】
図１９ｆ−スキーム２において示されている、クルクミン類似体１１。
【請求項９】
図１９ｆ−スキーム２において示されている、中間体クルクミン化合物９および１０。
【請求項１０】
図１９ｆ−スキーム２において示されているスキーム２の類似体または系列１の類似体を用いて合成することを含む、クルクミン類似体を作るための方法。
【請求項１１】
図１９ｇ−表５において示されている、クルクミン類似体ＦＬＬＬ１１、ＦＬＬＬ１２、ＦＬＬＬ１３、ＦＬＬＬ１４、ＦＬＬＬ２２、ＦＬＬＬ２３。
【請求項１２】
図２０において示されている芳香族置換基１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０を有する、クルクミン類似体。
【請求項１３】
図２１において示されているベンズアルデヒド芳香族置換基２１、２２、２３を有する、クルクミン類似体。
【請求項１４】
図２２において示されている、メトキシ（およびヒドロキシ）基のみを含むモノ−、ジ−、およびトリ−置換ベンズアルデヒド置換基を有する、クルクミン類似体。
【請求項１５】
図２３ａにおいて示されている、クルクミン類似体２４および２５。
【請求項１６】
図２３ａにおいて示されている、クルクミン類似体２８ａ、２８ｂ、２４、２５、２９ｂ。
【請求項１７】
図２３ｂにおいて示されているスキーム３を用いて合成することを含む、クルクミン類似体を作るための方法。
【請求項１８】
図２３ｃ−スキーム４において示されている、クルクミン類似体８。
【請求項１９】
図２３ｃにおいて示されているスキーム４を用いて合成することを含む、クルクミン類似体を作るための方法。
【請求項２０】
図２５ａにおいて示されているシクロヘキシル誘導体６ａを含む、クルクミン類似体。
【請求項２１】
図２６ａにおいて示されている、クルクミン類似体６ｂ、５ｂ、３２、３３、３４、３５。
【請求項２２】
図２６ｂにおいて示されている、クルクミン類似体。
【請求項２３】
図２６ｂにおいて示されているスキーム５を用いて合成することを含む、クルクミン類似体を作るための方法。
【請求項２４】
図２７ａにおいて示されている、クルクミン類似体３６、３７、３８、３９、４０。
【請求項２５】
図２７ｂ−スキーム６において示されている、中間体クルクミン化合物。
【請求項２６】
図２７ｂにおいて示されているスキーム６を用いて合成することを含む、クルクミン類似体を作るための方法。
【請求項２７】
図２８において示されている、クルクミン類似体４６、４７。
【請求項２８】
図２９ａにおいて示されている、クルクミン類似体４８、４９。
【請求項２９】
図２９ｂ−スキーム７において示されている、クルクミン類似体５０、５１。
【請求項３０】
図２９ｂ−スキーム７において示されている、中間体クルクミン化合物。
【請求項３１】
図２９ｃ−スキーム８において示されている、クルクミン類似体５２，５３。
【請求項３２】
図２９ｃにおいて示されているスキーム８を用いて合成することを含む、クルクミン類似体を作るための方法。
【請求項３３】
図２９ｄ−スキーム９において示されている、クルクミン類似体５４、５５、５６、５７。
【請求項３４】
図２９ｄ−スキーム９において示されている、中間体クルクミン化合物。
【請求項３５】
図２９において示されているスキーム９を用いて合成することを含む、クルクミン類似体を作るための方法。
【請求項３６】
図２９ｅにおいて示されている、クルクミン類似体５８。
【請求項３７】
図３３ｆにおいて示されている、クルクミン類似体５９。
【請求項３８】
前記の請求項のいずれか１項に記載の少なくとも１種類のクルクミン類似体の医薬組成物。
【請求項３９】
前記の請求項のいずれか１項に記載の少なくとも１種類のクルクミン類似体を投与することにより、それを必要とする対象においてＪＡＫおよびＳＴＡＴの１種類以上の活性を調節することを含む、癌に関連する疾患を処置する方法。
【請求項４０】
前記の請求項のいずれか１項に記載のクルクミン類似体の１種類以上を投与することを含む、それを必要とする対象においてＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達を阻害するための方法。
【請求項４１】
前記の請求項のいずれか１項に記載のクルクミン類似体の１種類以上を含む、化学療法的組成物。
【請求項４２】
前記の請求項のいずれか１項に記載のクルクミン類似体の１種類以上を含む、化学予防的組成物。
【請求項４３】
有効量の前記の請求項のいずれか１項に記載の少なくとも１種類のクルクミン化合物を含む組成物であって、その有効量の化合物が細胞中でＳＴＡＴ３のリン酸化を阻害することができる、前記組成物。
【請求項４４】
対象において癌を処置するための、または癌の発生もしくは再発を予防するための方法であって、以下：
その対象に有効量の前記の請求項のいずれか１項に記載の少なくとも１種類のクルクミン類似体化合物を投与する、
ことを含み、その有効量の化合物がその対象の特定の細胞中でＳＴＡＴ３リン酸化シグナル伝達経路を阻害することができる、前記方法。
【請求項４５】
異常なＳＴＡＴ３シグナル伝達を有する対象においてＳＴＡＴ３のリン酸化を阻害するための方法であって、以下の：
ｉ）その対象においてそのシグナル伝達が異常であるかどうかを決定し；そして
ｉｉ）その対象に、前記の請求項のいずれか１項に記載のＳＴＡＴ３のリン酸化を阻害するクルクミン化合物を投与する；
ことを含む、前記方法。
【請求項４６】
癌を処置または予防するための可能性のある療法剤のスクリーニングの方法であって、該方法は以下の工程：
ｉ）損なわれていないＳＴＡＴ３シグナル伝達経路を有する細胞を、候補分子と接触させ；
ｉｉ）ＳＴＡＴ３シグナル伝達経路の活性化の変化を監視し；
ｉｉｉ）その分子がＳＴＡＴ３シグナル伝達経路を阻害することができるかどうかを決定し；そして
ｉｖ）それがＳＴＡＴ３シグナル伝達経路を阻害することができると決定された場合、その分子を可能性のある療法剤として同定する；
を含む、前記方法。
【請求項４７】
前記の請求項のいずれか１項に記載のクルクミン類似体コンジュゲートおよび少なくとも１種類の医薬的に許容できるキャリヤーを含む、医薬組成物。
【請求項４８】
それを必要とする対象における癌、糖尿病、および炎症性疾患から選択される疾患の処置または予防の方法であって、該方法は以下：
その対象に療法上有効量の前記の請求項のいずれか１項に記載のクルクミン類似体コンジュゲートを投与する；
ことを含む、前記方法。
【請求項４９】
その疾患が癌である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
その疾患が乳癌である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
その疾患が膵臓癌である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
以下：
ｉ）ニワトリ胚の漿尿膜（ＣＡＭ）の下に、主要な脈管から離れた位置に癌細胞を移植し；
ｉｉ）そのＣＡＭを、許容される用量の試験している組成物で、その移植位置から遠位の領域において投与することにより処置し；
ｉｉｉ）移植の領域を取り囲むように切り取り、そして
ｉｖ）切り取られたＣＡＭを画像化する
ことを含む、中間的全身性インビボ異種移植系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明者: Pui-Kai Li, Chenglong Li, Jiayuh Lin, James R. Fuchs
関連出願への相互参照
[0001]  この出願は２００９年４月１５日に出願された米国仮出願一連番号６１／１６９，４４０の利益を主張し、その開示全体を特別に本明細書に援用する。
【０００２】
連邦政府により資金提供を受けた研究に関する記載
[0002]  この発明は国立衛生研究所により与えられた政府援助助成金番号Ｒ２１ＣＡ１３３６５２−０１を用いてなされなかった。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
配列リスト
[0003]  本出願はＥＦＳ−ｗｅｂを介して提出された配列リストを含み、それをそのまま本明細書に援用する。２０１０年４月１２日に作成されたＡＳＣＩＩコピーは６０４＿５０８０３＿ＳＥＱ＿ＬＩＳＴ＿０９００２．ｔｘｔと名付けられており、大きさは７７７バイトである。
【０００４】
技術分野及び発明の産業上利用可能性
[0004]  本発明は、癌に関連する疾患を検出、処置、特性付け、および診断するための組成物および方法に関する。より詳細には、本発明はクルクミン（ｃｕｒｃｕｍｉｎ）類似体およびその同じ物を作る、および用いる方法を提供する。
【背景技術】
【０００５】
[0005]  クルクミン、ｌ，７−ビス（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−ｌ，６−ヘプタジエン−３，５−ジオンは、ウコン（Ｃｕｒｃｕｍａ  ｌｏｎｇａ）の根茎から作られる食事用香辛料であるターメリック（ｔｕｒｍｅｒｉｃ）から単離された主要な生理活性化合物である。ターメリックは伝統的なインドの民間薬の主軸であり、それは多くの疾患、例えば糖尿病、肝臓疾患、リウマチ性関節炎、アテローム性動脈硬化症、感染症および癌の処置のために用いられてきた。クルクミンの療法的作用は、広い範囲の分子標的に対するそれの活性の結果であると考えられている。クルクミンの最も重要な観点の１つは、化学予防的および化学療法的特性の両方を有する、様々なタイプの癌に対するそれの有効性である。クルクミンはほとんど〜全く毒性を示さないことが報告されているが（ヒトにおいて約１０ｇ／日までの用量において用量制限毒性が無い）、クルクミンの有用性は乏しい生物学的利用能および乏しい選択性により制限されている。選択性の欠如は、クルクミンが相互作用することが知られている非常に多くの分子標的によるものである。これらには癌細胞の増殖と密接に関係するいくつかの標的、例えばＳＴＡＴ転写因子が含まれる。
【０００６】
[0006]  従って、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の阻害においてクルクミンよりも有効である有効組成物を有することは有用であろう。
【０００７】
[0007]  そのような組成物を用いて異なるタイプの癌に関連する疾患、例えば固形腫瘍および造血性の癌を処置する方法を有することも有用であろう。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
[0008]  第１観点において、本明細書の図において図式的に説明されているようなクルクミン類似体を本明細書において提供する。限定的では無い例には、ジアルキル化ジメトキシクルクミン類似体、芳香族置換基を有するクルクミン類似体；ベンズアルデヒド芳香族置換基を有するクルクミン類似体；メトキシ（およびヒドロキシ）基を含む、モノ−、ジ−、およびトリ−置換ベンズアルデヒド置換基を有するクルクミン類似体。
【０００９】
[0009]  別の観点において、本明細書の図において図式的に説明されているようなクルクミン類似体を合成するための方法を本明細書において提供する。
【００１０】
[0010]  別の観点において、医薬組成物、少なくとも１種類の本明細書で記述されるようなクルクミン類似体を本明細書において提供する。
【００１１】
[0011]  別の観点において、癌に関連する疾患を処置する方法であって、少なくとも１種類の本明細書で記述されるクルクミン類似体を投与することにより、それを必要とする対象においてＪＡＫおよびＳＴＡＴの１種類以上の活性を調節することを含む方法を本明細書において提供する。
【００１２】
[0012]  別の観点において、それを必要とする対象においてＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達を阻害するための方法であって、１種類以上の本明細書で記述されるクルクミン類似体を投与することを含む方法を本明細書において記述する。
【００１３】
[0013]  別の観点において、以下のことを含む、中間的全身性（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ）インビボ異種移植系を本明細書において提供する：ニワトリ胚の漿尿膜（ＣＡＭ）の直下に、主要な脈管から離れた位置に癌細胞を移植し；そのＣＡＭを、許容される用量の試験している組成物で、その移植位置から遠位の領域において投与することにより処置し；ある期間の後、移植の領域を取り囲むように切り取り、その切り取ったＣＡＭを画像化する。
【００１４】
[0014]  本発明の他の系、方法、特徴、および利点は下記の図面および詳細な記述を吟味すれば当業者に明らかになるであろう。全てのそのような追加の系、方法、特徴、および利点はこの記述内に含まれ、本発明の範囲内であり、付随する特許請求の範囲により保護されることを意図する。
【００１５】
[0015]  本特許または出願書類はカラーで制作された１個以上の図面および／または１枚以上の写真を含んでいてよい。カラーの図面（単数または複数）および／または写真（単数または複数）を有するこの特許または特許出願刊行物のコピーは、要求および必要な料金の支払いに応じて特許庁により提供されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】[0016]  図１−先行技術：ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の阻害剤。１−ペプチドおよびペプチド模倣性ＳＴＡＴ２  ＳＨ２二量体化阻害剤。２−小分子ＳＴＡＴ３  ＳＨ２二量体化阻害剤。３−ＪＡＫ２阻害剤。４−天然生成物由来の阻害剤。
【図２−１】[0017]  図２ａ：“ＦＬＬＬ３１”および“ＦＬＬＬ３２”と名付けられたクルクミン類似体の構造。
【図２−２】[0018]  図２：追加のクルクミン類似体の構造。
【図３】[0019]  図３：ＦＬＬＬ３１およびＦＬＬＬ３２はＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞においてＳＴＡＴ３のリン酸化を阻害し、アポトーシスを誘導する。細胞を２．５および５μＭのＦＬＬＬ３１およびＦＬＬＬ３２で２４時間処理した。その細胞の抽出物を、特異的な抗体を用いる免疫ブロッティングのために処理した。ＧＡＰＤＨをロードの対照として用いた。
【図４】[0020]  図４：ＦＬＬＬ３１およびＦＬＬＬ３２はＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌細胞においてＳＴＡＴ３のリン酸化を阻害し、アポトーシスを誘導する。細胞を２．５、５および１０μＭのクルクミン類似体で２４時間処理した。その細胞の抽出物を、特異的な抗体を用いる免疫ブロッティングのために処理した。ＧＡＰＤＨをロードの対照として用いた。
【図５】[0021]  図５：ＦＬＬＬ３１（１０μＭ）、ＦＬＬＬ３２（１０μＭ）およびクルクミン（１０μＭ）は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞においてＳＴＡＴ３のＤＮＡ結合活性を阻害する。細胞をその化合物またはＤＭＳＯ（対照）で２４時間処理した。その細胞の抽出物を、ＳＴＡＴ３  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｋｉｔを用いてＳＴＡＴ３結合活性に関して分析した。
【図６】[0022]  図６：ＦＬＬＬ３１およびＦＬＬＬ３２はＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞においてＳＴＡＴ３のＤＮＡ結合活性を阻害するが、ＳＴＡＴ１のＤＮＡ結合活性は阻害しない。細胞をＦＬＬＬ３１（１０μＭ）またはＤＭＳＯ（対照）で２４時間処理した。その細胞の抽出物を、ＳＴＡＴ３およびＳＴＡＴ１  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｋｉｔを用いてＳＴＡＴ３のＤＮＡ結合活性に関して分析した。
【図７】[0023]  図７ａ〜１１ｂ：ＦＬＬＬ３１（図７ａ）およびＦＬＬＬ３２（図７ｂ）は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞においてＳＴＡＴ３依存性の（ｄｅｐｅｎｅｎｄｔ）転写ルシフェラーゼ活性の用量依存性の阻害を示す。細胞をその化合物と共に２４時間培養し、その後ルシフェラーゼ活性の分析のために収集した。
【図８】[0024]  図８：ＦＬＬＬ３２（１０μＭ）はＭＤＡ−ＭＢ−４５３乳癌細胞においてＩＬ−６およびＩＮＦ−αによるＳＴＡＴ３のリン酸化の刺激を阻害した。ＦＬＬＬ３２はＭＤＡ−ＭＢ−４５３乳癌細胞においてＩＮＦ−αにおけるＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ２のリン酸化の刺激を阻害しなかった。細胞をＦＬＬＬ３２と共に２時間前保温し、その後ＩＬ−６およびＩＮＦ−αで０．５時間処理し、集めた。
【図９】[0025]  図９：ＦＬＬＬ３２はＢＸＰＣ−３膵臓癌細胞においてＳＴＡＴ３のリン酸化を阻害し、アポトーシスを誘導する。細胞を５および１０μＭのＦＬＬＬ３２で２４時間処理した。その細胞の抽出物を、特異的な抗体を用いる免疫ブロッティングのために処理した。ＧＡＰＤＨをロードの対照として用いた。
【図１０】[0026]  図１０：ＦＬＬＬ３２はＵ２６６多発性骨髄腫細胞においてＳＴＡＴ３のリン酸化を阻害し、アポトーシスを誘導する。細胞を２．５、５または１０μＭのＦＬＬＬ３２および／または５μＭのクルクミン類似体で２４時間処理した。その細胞の抽出物を、特異的な抗体を用いる免疫ブロッティングのために処理した。ＧＡＰＤＨをロードの対照として用いた。
【図１１】[0027]  図１１：ＦＬＬＬ３２およびＷＰ１０６６はＵ３７３ヒトグリア芽細胞腫細胞においてＳＴＡＴ３のリン酸化を阻害し、アポトーシスを誘導する。細胞を５μＭのＦＬＬＬ３２またはＷＰ１０６６で２４時間処理した。その細胞の抽出物を、特異的な抗体を用いる免疫ブロッティングのために処理した。ＧＡＰＤＨをロードの対照として用いた。
【図１２】[0028]  図１２：ＦＬＬＬ３１、ＦＬＬＬ３２、ＡＧ４９０、ＷＰ１０６６およびクルクミンのＪＡＫ２阻害活性。ＨＴＳｃａｎ  ＪＡＫ２キナーゼアッセイキットを用いてＪＡＫ２キナーゼアッセイを実施した。ＤＳＭＯと比較した統計的有意性（Ｐ＜０．０５）を（*）により示す。
【図１３】[0029]  図１３ａ：表１−ＦＬＬＬ３１およびＦＬＬＬ３２ならびに他のＪＡＫ２．ＳＴＡＴ３またはＳＴＡＴ３二量体化阻害剤の、活性化されたＳＴＡＴ３を発現するヒト乳癌（Ｂ）、膵臓癌（Ｐ）、グリア芽細胞腫（Ｇ）および多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞におけるＩＣ５０（μＭ）。 [0030]  図１３ｂ：ＦＬＬＬ３１、ＦＬＬＬ３２（５または１０μＭ）は、ｐ−ＳＴＡＴ３の持続的発現を有するＰＡＮＣ−１、ＢＸＰＣ−３およびＳＫ−ＢＲ細胞においてアポトーシスを誘導するが、非悪性ヒト膵管上皮細胞（ＨＰＤＥ）、正常ヒト乳房上皮細胞（ＨＭＥＣ）、および正常ヒト肺線維芽細胞（Ｗ−３８）においてアポトーシスを誘導しない。細胞を様々な濃度のＦＬＬＬ３１またはＦＬＬＬ３２で２４時間処理した。その細胞の抽出物を、特異的な抗体を用いる免疫ブロッティングのために処理した。ＧＡＰＤＨをロードの対照として用いた。
【図１４】[0031]  図１４：クルクミンのジケトン互変異性体のＪＡＫ２（左）およびＳＴＡＴ３タンパク質（右）との分子ドッキングモデル。
【図１５】[0032]  図１５ａ〜１５ｃ：ＦＬＬＬ３２のＣＡＭにおける血管分布および腫瘍増殖への作用。ヒトＭＤＡ−ＭＢ−２３１転移性乳癌細胞をニワトリ胚のＣＡＭ中に移植し、薬物を示した用量で腫瘍を移植した後の１および３日目に与え、移植後の４日目に腫瘍を画像化した。図１５ａ−異種移植した腫瘍（“ｔ”）の周囲の血管密度。図１５ｂ−相対的血管密度。図１５ｃ−異種移植片の相対的な腫瘍の大きさ。データは７〜８匹の別個の胚および２回の別々の実験からのものである。*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１、***Ｐ＜０．００１、Ｎｅｕｍａｎ−Ｋｅｕｌｓポストテストを用いた一元配置ＡＮＯＶＡによる。
【図１６】[0033]  図１６：クルクミンおよびＦＬＬＬ３２に関する予備的な薬物動態学的データ。マウスにＩＰ（５０ｍｇ／ｋｇ）またはＩＶ（２５ｍｇ／ｋｇ）でクルクミンまたはＦＬＬＬ３２（ＤＭＳＯ中１２．５ｍｇ／ｍｌ）を投与した。個々のマウスから２分および４時間の間のそれぞれの時点において血液を集め、親化合物の血漿濃度をＬＣＭＳＭＳにより測定した。線形範囲より下の決定された濃度（すなわち１０ｎＭより下）は示していない。
【図１７】[0034]  図１７：ＳＴＡＴ３濃度の関数としての蛍光性ｐ−Ｔｙｒペプチドの蛍光偏光（Ｆｌｕｏｒｅｓｃａｎｔ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）。
【図１８】[0035]  図１８ａ〜１８ｂ：ＪＡＫ２に結合するクルクミンの２種類の互変異性型の計算によるモデル（図１８ａ−ジケトン型；図１８ｂ−エノール型）。
【図１９−１】[0036]  図１９ａ：表２−クルクミンおよび類似体とＪＡＫ２およびＳＴＡＴ３に関する、予想される結合エネルギー。
【図１９−２】[0037]  図１９ｂ：ジアルキル化ジメトキシクルクミン類似体の系列１類似体および系列２類似体。
【図１９−３】[0038]  図１９ｃ：表３−予想される結合エネルギーのフェノール置換の作用。 [0039]  図１９ｄ：表４−様々なアルキル基の中央の結合角への影響。
【図１９−４】[0040]  図１９ｅ：スキーム１−系列２の類似体の合成。 [0041]  図１９ｆ：スキーム２−系列１の類似体の合成。
【図１９−５】[0042]  図１９ｇ：表５−モノケトンクルクミン誘導体の乳癌細胞（ＭＤＦ−７およびＭＤＡ−ＭＢ２３１）に対する抗増殖活性。ＭＣＦ−ＩＯＡ細胞（胸部上皮細胞）を“正常な”組織のモデルとして用いる。
【図２０】[0043]  図２０：ジアルキル化クルクミン誘導体に関する芳香族置換基の例。
【図２１】[0044]  図２１：類似体の合成に関するベンズアルデヒド類の例。
【図２２】[0045]  図２２：アナログの合成に有用であるメトキシ（およびヒドロキシ）基のみを含むモノ−、ジ−、およびトリ置換ベンズアルデヒド類の例。
【図２３】[0046]  図２３ａ：非対称ＪＡＫ２阻害剤２４および２５の例。 [0047]  図２３ｂ：スキーム３−ＪＡＫ２阻害剤としての非対称類似体の合成。 [0048]  図２３ｃ：スキーム４−メチルケトン２６ａのアシル化。
【図２４】[0049]  図２４：ＳＴＡＴ３のＳＨ２ドメインに関する重要な結合ポケット、または“ホットスポット”。
【図２５】[0050]  図２５ａ：クルクミンのシクロヘキシル誘導体６ａの構造。 [0051]  図２５ｂ：ＳＴＡＴ３のＳＨ２結合部位における６ａのドッキング。
【図２６】[0052]  図２６ａ：ＦＬＬＬ３２および類似体。ＬｏｇＰの値はＣｈｅｍＤｒａｗ  Ｕｌｔｒａ  １１．０を用いて計算した。 [0053]  図２６ｂ：スキーム５−化合物３２〜２５の合成に関する合成スキーム。
【図２７】[0054]  図２７ａ：ＳＴＡＴ３のＬｅｕ７０６部位を標的とした類似体。
【００１７】
[0055]  図２７ｂ：スキーム６−化合物３６の調製。
【図２８】[0056]  図２８：ＦＬＬＬ３１（Ｒ＝Ｍｅ）およびＦＬＬＬ３２（Ｒ−シクロヘキシル）のスルファメートおよびホスフェート類似体。
【図２９−１】[0057]  図２９ａ：スルファメートおよびホスフェート化合物。 [0058]  図２９ｂ：スキーム７−スルファメートおよびホスフェート誘導体の合成に関するモデル系の合成。
【図２９−２】[0059]  図２９ｃ：スキーム８−ＦＬＬＬ３１のスルファメートおよびホスフェート類似体の合成。 [0060]  図２９ｄ：スキーム９−１個の遊離のフェノールを含むＦＬＬＬ３２誘導体の合成。
【図２９−３】[0061]  図２９ｅ：化合物５８に関する類似体の例。 [0062]  図２９ｆ：化合物５９に関する類似体の例。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
[0063]  この開示全体を通して、様々な刊行物、特許および公開された特許明細書を、引用を確認することにより参照する。これらの刊行物、特許および公開された特許明細書の開示を、この発明が属する技術の現状をより完全に記述するために本開示の中に援用する。
【００１９】
[0064]  いくつかの小分子二量体化阻害剤を先行技術−図１において示す。ある阻害剤はククルビタシン（ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｉｎ）Ｑを含み、それはＳＴＡＴ３のリン酸化を阻害するが、実際の生化学的標的（単数または複数）はまだ不明であり、そのインジルビン誘導体であるＥ８０４はＳｒｃおよびＳＴＡＴ３の両方を阻害する。カテコールを含む合成分子ＡＧ−４９０は選択的なＪＡＫ２阻害剤であるが、それは乏しいインビボでの安定性を欠点としてもつ。いくつかの他のＪＡＫ２阻害剤には、ＷＰ１０６６、ＳＤ−１００８、ＳＤ−１０２９およびＴＧ１０１３４８が含まれる。そのポリフェノール類の全ての中で、クルクミンは化学予防および化学療法において最も広く研究された化合物である。
【００２０】
[0065]  クルクミンおよび腫瘍発生
[0066]  クルクミン、ｌ，７−ビス（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−ｌ，６−ヘプタジエン−３，５−ジオン（先行技術−図１）は、ウコン（Curcuma longa）の根茎から作られる食事用香辛料であるターメリックから単離された主要な生理活性化合物である。ターメリックは伝統的なインドの民間薬の主軸であり、それは多くの疾患、例えば糖尿病、肝臓疾患、リウマチ性関節炎、アテローム性動脈硬化症、感染症および癌の処置のために用いられてきた。クルクミンの療法的作用は、広い範囲の分子標的に対するそれの活性の結果であると考えられている。クルクミンの最も重要な観点の１つは、化学予防的および化学療法的特性の両方を有する、様々なタイプの癌に対するそれの有効性である。ほとんどの化学療法剤とは異なり、クルクミンはほとんど〜全く毒性を示さない（ヒトにおいて１０ｇ／日までの用量において用量制限毒性が無い）。不運にも、クルクミンの潜在的有用性は乏しい生物学的利用能および乏しい選択性によりいくらか制限されている。選択性の欠如は、クルクミンが相互作用することが知られている非常に多くの分子標的によるものである。
【００２１】
[0067]  クルクミンの療法的活性は部分的にはＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の阻害によるものであるという証拠が存在する。クルクミンはＪＡＫ２、Ｓｒｃ、Ｅｒｂ２、およびＥＧＦＲを阻害することが示されており、その全てがＳＴＡＴ３の活性化に関係していることが示されている。さらに、クルクミンはＢｃｌ−ｘＬ、サイクリンＤｌ、ＶＥＧＦ、およびＴＮＦの発現を下方制御することが示されており、その全てがＳＴＡＴ３により制御されることが知られている。いくつかの重要なＳＴＡＴ３の標的遺伝子が腫瘍の形成に関わっていることを示す証拠も存在する。
【００２２】
[0068]  本発明は、少なくとも部分的に、その中心部のジケトン部分の構造および生物学的活性への影響はその芳香族置換基の影響よりも重要であるという本発明者らの発見に基づいている。本発明における発明者らは、クルクミンによるＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達の阻害はそれの化学療法的および化学予防的特性において重要な役割を果たしていることも発見した。
【００２３】
[0069]  本発明者らは、クルクミンの２種類のジケトン類似体（ＦＬＬＬ３１およびＦＬＬＬ３２）を設計し、合成した。“ＦＬＬＬ３１”および“ＦＬＬＬ３２”と名付けられたその類似体（図２ａ）および図２ｂおよび図２ｃで示した追加の類似体は、ＪＡＫ２／ＳＴＡＴ３経路の特異的な阻害剤である。
【００２４】
[0070]  本発明は下記の実施例においてさらに定義され、ここで別途記載しない限り全ての部および百分率は重量によるものであり、度は摂氏である。これらの実施例は本発明の好ましい態様を示すが説明としてのみ与えられていることは理解されるべきである。上記の議論およびこれらの実施例から、当業者はこの発明の本質的な特徴を確かめることができ、その精神および範囲から逸脱すること無く本発明の様々な変更および修正を行ってそれを様々な用途および条件に適応させることができる。この明細書において参照される特許および非特許文献を含む全ての刊行物を特別に援用する。下記の実施例は本発明の特定の好ましい態様を説明することを意図するものであり、そのように明記されない限り、特許請求の範囲において定義される本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。従って、本発明の価値は本明細書の実施例への参照により理解することができる。
【実施例】
【００２５】
[0071]  実施例Ｉ
[0072]  ＦＬＬＬ３１およびＦＬＬＬ３２は構成的活性化型のＳＴＡＴ３を有する乳癌細胞においてＳＴＡＴ３のリン酸化を阻害する。
【００２６】
[0073]  発明者らは、ＦＬＬＬ３１およびＦＬＬＬ３２が、[チロシン残基７０５（Ｙ７０５）において]持続的にチロシンがリン酸化された、または活性化されたＳＴＡＴ３を発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌細胞においてＳＴＡＴ３のリン酸化を阻害するかどうかを調べた。ＦＬＬＬ３１およびＦＬＬＬ３２はＭＤＡ−ＭＢ−２３１（図３）およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８（図４）ヒト乳癌細胞株においてＳＴＡＴ３のリン酸化を阻害した。ＦＬＬＬ３１およびＦＬＬＬ３２はＥＲＫ１／２、ＰＫＣ−δ、ｍＴＯＲ、ｐ７０Ｓ６Ｋ、およびＡＫＴのリン酸化にはほとんど作用を有しない（図３および図４）。
【００２７】
[0074]  ＦＬＬＬ３１およびＦＬＬＬ３２によるＳＴＡＴ３のリン酸化の阻害は、カスパーゼ３の切断により証明されるアポトーシスの誘導と一致している。さらに、ＦＬＬＬ３１およびＦＬＬＬ３２は両方の乳癌細胞株においてＳＴＡＴ３の下流標的であるサイクリンＤ１の下方制御を引き起こす（図３および図４）。
【００２８】
[0075]  ＦＬＬＬ３１およびＦＬＬＬ３２によるＳＴＡＴ３のＤＮＡ結合およびＳＴＡＴ３依存性ルシフェラーゼ活性の阻害。
【００２９】
[0076]  ＦＬＬＬ３１およびＦＬＬＬ３２によるＳＴＡＴ３シグナル伝達の阻害を確かめるため、本発明者らはその化合物のＳＴＡＴ３のＤＮＡ結合および転写がＳＴＡＴ３に依存するルシフェラーゼ活性を阻害する能力を調べた。ＦＬＬＬ３１およびＦＬＬＬ３２は共に、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞において統計的に有意なＳＴＡＴ３のＤＮＡ結合活性の阻害を引き起こし、それはクルクミンよりも有意により強力であった（図５）。
【００３０】
[0077]  さらに、ＦＬＬＬ３１およびＦＬＬＬ３２は共に、ＳＴＡＴ３のＤＮＡ結合活性を阻害するがＳＴＡＴ１のＤＮＡ結合活性は阻害しない選択性を示した（図６）。
【００３１】
[0078]  それのリン酸化された、または活性化されたＳＴＡＴ３タンパク質の高い内在性レベルのため、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞が、チミジンキナーゼ最小レポーター中の７コピーのＳＴＡＴ３結合部位を特徴とするルシフェラーゼ構築物であるｐＬｕｃＴＫＳ３を安定に形質移入するために選択された。従って、ルシフェラーゼの発現はＳＴＡＴ３のリン酸化および活性化を条件とする。これらの安定に形質移入された細胞を、１〜１０μｍｏｌ／ＬのＦＬＬＬ３１およびＦＬＬＬ３２で２４時間処理した。ルシフェラーゼ活性をルミノメーターにより監視し、ＦＬＬＬ３１およびＦＬＬＬ３２で処理された細胞の発光を未処理の対照の発光と比較した。データの正規化の後、ＦＬＬＬ３１およびＦＬＬＬ３２は両方ともＳＴＡＴ３依存性のルシフェラーゼ活性の用量依存性の阻害を引き起こすことが示された（図７）。
【００３２】
[0079]  ＦＬＬＬ３２はＩＬ−６によるＳＴＡＴ３のリン酸化の刺激を阻害するが、ＩＦＮ−αによるＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ２のリン酸化の刺激は阻害しない
[0080]  ＩＬ−６はＳＴＡＴ３のリン酸化を誘導し、癌の発現において役割を果たしている可能性があるため、本発明者らはＦＬＬＬ３２がこの誘導を阻害するかどうかを調べた。ＩＬ−６はＳＴＡＴ３のリン酸化を刺激し、ＦＬＬＬ３２により阻害される（図８）。ＩＦＮ−αがＳＴＡＴ３のリン酸化を誘導し、ＦＬＬＬ３２により阻害されることも観察された。しかし、ＦＬＬＬ３２はＩＦＮ−αによるＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ２のリン酸化の誘導は阻害しない（図８）。これは、ＦＬＬＬ３２がＪＡＫ１またはＴＹＫ２を阻害しないことを間接的に示した。
【００３３】
[0081]  ＦＬＬＬ３２による非乳癌細胞株におけるＳＴＡＴ３のリン酸化の阻害
[0082]  我々は次に、ＦＬＬＬ３２が非乳癌細胞株ＢＸＰＣ−３（ヒト膵臓癌、図９）、Ｕ２６６（多発性骨髄腫、図１０）およびＵ３７３（ヒトグリア芽細胞腫、図１１）においてもＳＴＡＴ３のリン酸化を阻害するかどうかを調べた。３種類の細胞株は全て持続的に活性化されたＳＴＡＴ３を発現する。ＦＬＬＬ３２は３種類の細胞株全てにおいてＳＴＡＴ３のリン酸化を阻害し、アポトーシスを誘導した（図９〜１１）。それはＳＴＡＴ３の下流標的、例えばＥＲＫ１／２、サイクリンＤ１、Ｂｃｌ−２、およびサバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）も下方制御した（図９〜１１）。
【００３４】
[0083]  ＦＬＬＬ３１、ＦＬＬＬ３２、クルクミン、ＡＧ４９０およびＷＰ−１０６６のＪＡＫ２キナーゼへの阻害活性。
【００３５】
[0084]  ＪＡＫ２は、サイトカインシグナル伝達に応答するＳＴＡＴ３のチロシン残基７０５におけるリン酸化を仲介している。従って、我々はＦＬＬＬ３２がＪＡＫ２キナーゼ活性を直接阻害するのかどうかを調べた。ＦＬＬＬ３２はＦＬＬＬ３１およびクルクミンよりも強力にＪＡＫ２キナーゼ活性を阻害した（図１２）。また、ＦＬＬＬ３２は２種類の他の既知のＪＡＫ２阻害剤であるＷＰ１０６６およびＡＧ４９０よりも強力であった（図１２）。１０μＭにおいて、クルクミンはＪＡＫ２阻害を全く示さなかった。理論により束縛されることを望むわけでは無いが、本発明者らはここで、これらの結果がＦＬＬＬ３２によるＳＴＡＴ３のリン酸化の阻害を説明していると信じる。
【００３６】
[0085]  ＦＬＬＬ３２の、構成的活性化型のＳＴＡＴ３を有する癌細胞における、正常な細胞を上回る選択的細胞毒性。
【００３７】
[0086]  本発明者らはさらに、ＦＬＬＬ３２が持続性のＳＴＡＴ３のリン酸化を発現していない正常なヒト細胞においてもアポトーシスを誘導するかどうかを調べた。ＦＬＬＬ３２は正常ヒト膵管上皮細胞、正常ヒト肺線維芽細胞、または正常ヒト乳房上皮細胞では検出可能なアポトーシスを誘導しなかった。しかし、それはＰＡＮＣ−１およびＢＸＰＣ−３膵臓癌細胞ならびにＳＫ−ＢＲ−３乳癌細胞において（切断されたカスパーゼ３により証明される）アポトーシスを誘導した（図１３ａ）。
【００３８】
[0087]  ＦＬＬＬ３１、ＦＬＬＬ３２および他の既知のＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の阻害剤の抗増殖活性。
【００３９】
[0088]  本発明者らは、ＦＬＬＬ３１、ＦＬＬＬ３２両方の抗増殖活性も調べ、乳（ＳＵＭ−１５９、ＺＲ−７５−１）、膵（ＢＸＰＣ−３、ＨＰＡＣ、ＰＡＮＣ−１、ＳＷ１９９０）、グリア芽細胞腫（Ｕ３７３）および多発性骨髄腫（Ｕ２６６）を含む、ＳＴＡＴ３のリン酸化の上昇したレベルを有する８種類の癌細胞株の集団（ｐａｎｅｌ）に対して、それらをいくつかの既知のＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の阻害剤（ＷＰ１０６６、Ｓｔａｔｔｉｃ、Ｓ３１−２０１、ＳＤ１０２９およびＡＧ４９０）と比較した。ＦＬＬＬ３１およびＦＬＬＬ３２は共に他の阻害剤よりも強力であり、ＩＣ５０の値はμＭ以下の濃度である。ＦＬＬＬ３２はＦＬＬＬ３１よりもわずかに強力であるようである（図１３ｂ−表１）。
【００４０】
[0089]  クルクミンのジケトン互変異性体のＪＡＫ２（ＡＴＰ結合部位）およびＳＴＡＴ３（ＳＨ２ドメイン）との分子ドッキングの研究。
【００４１】
[0090]  クルクミンの１，３−ジケトン部分のＪＡＫ２およびＳＴＡＴ３への結合における役割を調べるため、分子ドッキングの研究を行った。図１４ａ〜１４ｂは、ジケト−クルクミンの曲がった（ｂｅｎｔ）結合方式を示す。ＪＡＫ２の結合（図１４ａ−左）に関して、その芳香族断片は左側においてＡＴＰのプリン環と競合し、他方において大部分が疎水性のポケットに結合する。加えて、その分子の中心部にあるカルボニル酸素の１個はＪＡＫ２のオキシアニオンホールと相互作用する。ＳＴＡＴ３のＳＨ２二量体化部位への結合に関して、その芳香族断片は同様に左側においてｐＴｙｒ７０５結合部位と競合し、右側において大部分が疎水性のサイドポケットに結合する（図１４ｂ−右）。赤い棒は、ＳＴＡＴ３の二量体化および活性化の間の他方のＳＨ２ドメインからのｐＴｙｒ７０５−Ｌｅｕ７０６ペプチド結合方式を示す。
【００４２】
[0091]  ＦＬＬＬ３２のニワトリ漿尿膜（ＣＡＭ）異種移植アッセイにおける血管分布および腫瘍増殖への作用。
【００４３】
[0092]  本発明者らは、ニワトリ胚の漿尿膜（ＣＡＭ）を用いた中間的全身性インビボ異種移植系を開発した。具体的には、５０μＬの不活性ヒト細胞外マトリックス（Ｈｕｍａｔｒｉｘ）中の、ＳＴＡＴ３を過剰発現することが示されているＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト転移性乳房腫瘍細胞（２５０，０００）を、１０日培養（ｄａｙ  ｏｆ  ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）（ＤＩ）ニワトリ胚のＣＡＭの直下に、主要な脈管から離れた位置に移植した。移植の１日後に、胚を最大耐用量（ＭＴＤ）（１１ＤＩの体重に基づく）の８０％のＦＬＬＬ３２（２５ｍｇ／ｋｇ）、またはドキソルビシン（２ｍｇ／ｋｇ）またはパクリタキセル（２ｍｇ／ｋｇ）で、移植位置から遠位の領域のＣＡＭの上にピペットで移すことにより全身的に処理した。移植の３日後に、ＣＡＭを４％パラホルムアルデヒド中０．１％トリトンＸ−１００を用いてインサイチュで２分間固定し、移植の領域を取り囲むように切り取り、４％パラホルムアルデヒドを含む６ウェルプレート中に固定して広げた。次いでこれらの切り取られたＣＡＭを明視野解剖顕微鏡上で６．２５×の倍率で画像化した（Ｗｉｌｄ  Ｍ４００  Ｐｈｏｔｏｍａｋｒｏｓｃｏｐ）。
【００４４】
[0093]  ２５ｍｇ／ｋｇのＦＬＬＬ３２は移植された腫瘍（図１５ａにおける“ｔ”）の周囲の無傷の（ｉｎｔａｃｔ）血管の数を低減させたが、一方でドキソルビシン処理もパクリタキセル処理も結果として腫瘍脈管密度の有意な変化を全くもたらさなかったことが分かった（図１５ａおよび図１５ｂ）。
【００４５】
[0094]  さらに、ＦＬＬＬ３２は結果としてＭＤＡ−ＭＢ−２３１の腫瘍体積の有意な低減をもたらしたが、一方でドキソルビシンまたはパクリタキセルは効果が無かった（図１５ｃ）。
【００４６】
[0095]  まとめると、これらのデータは、ＦＬＬＬ３２がＳＴＡＴ３を過剰発現する乳癌のＣＡＭ異種移植片に対して有意な抗腫瘍および抗血管新生作用を有することを示している。
【００４７】
[0096]  ＩＣＲマウスにおけるＦＬＬＬ３２の薬物動態。
【００４８】
[0097]  将来の決定的なＰＫ／ＰＤ研究のための全体的なＰＫ時間推移を見積もるため、ＦＬＬＬ３２およびクルクミンのＩＰおよびＩＶ用量両方を投与したＩＣＲマウスにおいて予備試験を行った。８〜１０週齢のオスのＩＣＲマウスに、ＤＭＳＯ中（１２．５ｍｇ／ｍｌ）のＦＬＬＬ３２またはクルクミンのどちらかをＩＰ（５０ｍｇ／ｋｇ）またはＩＶ（２５ｍｇ／ｋｇ）で投与した。２分および４時間の間の様々な時点においてマウスをイソフルラン麻酔下で心臓穿刺により失血させ、集めた血液試料から血漿を回収し、分析まで−７０℃で保管した。組織からのクルクミン誘導体の効率的な抽出の手順を開発するための後の研究のために、マウスの亜集団からの組織を集めて保管した。クルクミンおよびＦＬＬＬ３２をＬＣＭＳＭＳ分析により定量した。抽出した血漿試料（１００μＬ）を真空下で乾燥させ、次いで０．１％ギ酸を含む８０％アセトニトリル中で再構成した。注入した試料（２０μＬ）をＣ−１８カラム（５０×２．１ｍｍ、３μｍ）を通して、一定の０．４ｍＬ／分の流量で、それぞれ０．１％ギ酸を含む水およびアセトニトリル中の勾配で分離した。溶離された分析物を、Ｑｕａｎｔｕｍ  ＴＳＱ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｍａｘ上で、大気圧化学イオン化をポジティブモードで用いて、単一反応モニタリングにより検出した。クルクミン類似体を内部標準として用いて、分析物／ＩＳ比がマウスの血漿において生成された標準曲線による定量を可能にした。このアッセイに関して用いられた線形範囲は両方の化合物に関して１０ｎＭ〜１μＭであり、１μＭより上であると測定された試料は再度の分析のために希釈された。結果として得られたそれぞれの化合物および投与経路に関する濃度対時間のプロフィールを図１６に示す。
【００４９】
[0098]  また、理論により束縛されることを望むわけではないが、本発明における発明者らはここで、ＦＬＬＬ３２は、クルクミンのより低いＡＵＣおよびより急速な消失により示されるように（すなわち、クルクミンの濃度は定量に関する１０ｎＭのカットオフ値より下に下がった）、クルクミンと比較して増大した曝露および潜在的により長い半減期を有する可能性があると信じる。
【００５０】
[0099]  蛍光偏光（ＦＰ）アッセイの開発および最適化。
【００５１】
[00100]  分子ドッキングの研究は、ＦＬＬＬ３２がＳＴＡＴ３のＳＨ２ドメインに結合することができることを示した。
【００５２】
[00101]  加えて、本発明における発明者らは、蛍光偏光アッセイを用いてＦＬＬＬ３２および／またはその類似体化合物がＳＨ２ドメインに結合するかどうかを決定した。蛍光偏光の開発を確立した。簡潔には、そのアッセイは黒色３８４ウェルマイクロプレート（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、マサチューセッツ州ウォルサム）において、それぞれのウェルにおいて２５μＬの総体積で実施した。蛍光強度の値を５４０ｎｍの励起フィルターおよび５９０ｎｍの発光フィルターを用いて記録した。ＦＰの測定を、１００ｍｓの積分時間（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ）、５４５ｎｍの励起フィルターおよび６１０ｎｍの発光フィルターを設定することにより行った。
【００５３】
[00102]  全てのデータをミリ偏光単位（ｍｉｌｌｉｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｕｎｉｔ）で表す。そのｍＰの値は、等式
【００５４】
【化１】
2012524106.tif 000002
【００５５】
を用いて計算され、I II：平行発光強度の測定値、
【００５６】
【化２】
2012524106.tif 000003
【００５７】
：垂直発光強度の測定値である。飽和曲線を記録し、ここで蛍光標識されたペプチド（４ｎＭ）を増大する量の組み換えＳＴＡＴ３タンパク質で処理した。特異的な結合を結合したペプチドのシグナルへの寄与として定義し、それはｍＰ＝ｍＰｂ−ｍＰｆとして計算され、ここでｍＰｂおよびｍＰｆはそれぞれ結合した、および遊離のトレーサーの偏光値の値であり；ｍＰは特定のＳＴＡＴ３濃度に関する記録器の偏光値である。計算された解離定数（Ｋｄ）は１７２ｎＭであり（図１７）、それはｐＴｙｒペプチドおよびＳｔａｔのＳＨ２ドメインの間の結合親和性と整合している。[８３]。
【００５８】
[00103]  実施例ＩＩ
[00104]  ＪＡＫ２およびＳＴＡＴ３阻害剤としてのＦＬＬＬ３２に基づくクルクミン類似体の評価。
【００５９】
[00105]  クルクミンは新規の抗癌剤の開発のための優秀なリード化合物を提供する。その高度にモジュール式の（ｍｏｄｕｌａｒ）構造および合成が比較的容易であることは、ＪＡＫ２およびＳＴＡＴ３の活性に関するこの分子の構造−活性関係を調べるための、類似体化合物の高度に多様なライブラリーの迅速かつ系統的な調製および評価の両方を促進する。
【００６０】
[00106]  実施例ＩＩは、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の強力な阻害剤であることが示された（実施例Ｉ参照）ジアルキル化クルクミン類似体であるＦＬＬＬ３２中に見られる同じ構造モチーフを特徴とする誘導体の調製および評価に焦点を合わせる。
【００６１】
[00107]  クルクミンの誘導体は、ＪＡＫ２およびＳＴＡＴ３の活性に関して独立に、これらの標的に対してより大きな効力および特異性を得られるように最適化することができる。理論により束縛されることを望むわけでは無いが、本発明の発明者らはここで、単一のタンパク質標的に対する活性を向上するように設計された比較的小さな構造的修正でさえも最終的に結果として別のものに関する活性の減少をもたらす可能性があると信じる。
【００６２】
[00108]  １．１  ＪＡＫ２活性に関するクルクミン類似体の最適化。
【００６３】
[00109]  ＪＡＫ２活性への構造的変化の作用を示すために、クルクミンの骨格を修正した。このアプローチには、以下のことが含まれる：１）ジケトン互変異性型を強制し、ＪＡＫ２結合部位のポケット２と相互作用する４，４−ジアルキル化クルクミン誘導体の系列の合成、２）ＪＡＫ２のホスホチロシンポケットへの結合により効力および選択性を向上するような芳香環置換基の変種、ならびに３）ＪＡＫ２結合における第２の芳香環（およびその置換基）の重要性を評価するための、非対称な誘導体の合成。
【００６４】
[00110]  １．１．１．    ４，４−二置換クルクミン誘導体の合成。
【００６５】
[00111]  実施例Ｉにおいて論じたように、クルクミンの１，３−ジケトン部分のＪＡＫ２（およびＳＴＡＴ３）への結合における役割を調べるために分子ドッキングの研究を行った。クルクミンのケトおよびエノール型を両方用いた。興味深いことに、その２種類の互変異性型は類似の予測される結合エネルギーを示した。図１８ａは、ジケト−クルクミンのＪＡＫ２との曲がった結合方式を示す。その重要な結合相互作用は、左側における１つの芳香族断片のＡＴＰのプリン環との競合および他方における他方の芳香環の大部分が疎水性のポケット（ポケット２）への結合に由来する。加えて、その分子の中心部のカルボニル酸素の１個はＪＡＫ２のオキシアニオンホールと相互作用する。
【００６６】
[00112]  この初期のドッキングの研究の結果に基づいて、クルクミンのＣ−４位における二置換の高次構造的効果および立体効果を調べるために、第２の計算による研究を行った（図１９ａ−表２および図１９ｂ）。
【００６７】
[00113]  この対称的な類似体の系列は、２個の中心部のアルキル置換基の存在によってのみクルクミンと異なっている（系列１）。この置換はその化合物をジケトン互変異性型に効果的に固定し、エノール化の可能性を排除する。我々のドッキングの研究において、スピロ−シクロペンチルおよび−シクロヘキシル誘導体である５および６（図１９ｂ）は、ＪＡＫ２に分子レベルで最高の結合親和性を示す（図１９ａ−表２）。従って、クルクミンのエノール互変異性体はＪＡＫ２に十分に結合することが予想されるが、化合物５および６により示された予想される結合エネルギーの向上により、ケト互変異性体の誘導体が追求されるであろう。
【００６８】
[00114]  これらの場合の両方において、プリンに競合する芳香族結合およびカルボニルオキシアニオンホール相互作用に加えて、本発明の発明者はその疎水性のアルキル環（シクロペンチル−およびシクロヘキシル−）がＪＡＫ２のポケット２と都合よく相互作用すると信じる。これは、クルクミンのジケトン互変異性体がＪＡＫ／ＳＴＡＴ活性に関して重要であり、この骨格への慎重な改変は強力かつ選択的なＪＡＫ２阻害剤をもたらすことができるという証拠である。
【００６９】
[00115]  フェノール酸素上に追加のメチル置換基を有する別の系列の化合物を示す（系列２、図１９ｂ）。本発明者の計算によるモデルは、系列１で見られた自由なフェノールの水素結合相互作用はＪＡＫ２およびＳＴＡＴ３両方への結合に重要であることを示している（図１９ｃ−表３）。しかし、自由なフェノールを欠く様々なクルクミン類似体、特にジメトキシクルクミン（８、図１９ｅ−スキーム１）に関して観察された増大した効力は、増大した安定性および血漿中濃度の増大したレベルによるものである可能性がある。従って、芳香環の４位におけるヒドロキシル置換基は、特に中性〜塩基性のｐＨにおいて、これらのクルクミン様化合物の観察された可溶性および安定性の問題に著しく寄与している可能性がある。従って、例えば化合物６ｂのような自由なフェノールを有しないジメトキシクルクミンのアルキル化誘導体を含む系列２を調製することができる。
【００７０】
[00116]  これらの化合物の結合エネルギーは、水素結合の程度がより低いため、わずかにより低いことが予想されるが（すなわち６ｂ対６ａ、図１９ｃ−表３）、これらの化合物はより安定で膜透過性であると予想され、おそらくインビボでの活性の増大がもたらされる。
【００７１】
[00117]  ２つの系列のクルクミン類似体の合成は、小さいアルキル置換基（ジメチル１、シクロプロピル３）および立体的によりかさ高いがより親油性のアルキル置換基（ジ−ｎ−ブチル２、シクロヘキシル６）を用いてポケット２の性質を調べ、発明者の結合モデルを実証するために有用である。その様々なアルキル置換基は、その２個のカルボニル基の間の角度がこれらの基の性質により劇的に変化する（１０５．５°から１１５．６°へ）ため、分子の高次構造に測定可能な影響を有する（図１９ｄ−表４）。系列２のこれらの化合物の合成は、図２３ｅ−スキーム１に従って実行することができる。
【００７２】
[00118]  ジメトキシクルクミン（８）は、Ｖｅｎｋａｔｅｓｗａｒｌｕの手順に従って３，４−ジメトキシベンズアルデヒドと２，４−ペンタンジオンの縮合により調製されるであろう。適切なアルキル化剤の存在下での炭酸カリウムを用いた８の処理は、望まれる二置換反応に影響を及ぼすと予想される。ジヨードアルカン類を用いたアルキル化は、結果としてスピロ環状生成物の形成をもたらすはずである。
【００７３】
[00119]  実施例Ｉで言及したように、本発明者らはここで、この方法で誘導体ＦＬＬＬ３１（１ｂ、Ｒ＝メチル）およびＦＬＬＬ３２（６ｂ、シクロヘキシル）を調製した。興味深いことに、８から生成したエノラートのＯ−アルキル化も両方の場合において観察されたが、この生成物の収率は比較的低く（＜１０％）、カラムクロマトグラフィーにより容易に分離することができる。
【００７４】
[00120]  ４−ヒドロキシ、３−メトキシで置換された芳香環を含む系列１のメンバーの合成は困難であり、望まれるアルキル化反応に影響を及ぼすために適切な保護基の使用が必要である。しかし、本発明者らはここで、これらの化合物に適用可能な、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）保護基戦略を用いる合成経路を確立した（図１９−スキーム２）。この合成経路において、縮合条件を用いて調製したクルクミンを出発物質として利用することができる。ｔ−ブチルジカーボネートを用いるクルクミンの保護は、ビス保護された（ｂｉｓ−ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ）クルクミン誘導体９を与える。炭酸カリウムを塩基として用いるこの誘導体のアルキル化は、我々の予備的な結果に類似した二置換反応に影響を及ぼす。最後に、熱分解によるそのＢｏｃ保護基の除去は一般構造の望まれる類似体１１を与える。
【００７５】
[00121]  例えば、この手順は対応するシクロヘキシル誘導体６ａ（図１９ｂ）の合成にうまく適用された。ベンジルエーテルまたはシリルエーテル基を含む他の保護基を用いてそのフェノール類を保護／脱保護する最初の試みは、望まれる生成物を与えることができなかった。同様に、標準的なプロトン性の酸の条件の下でＢｏｃ保護基を除去する試みも、観察される生成物無しで出発物質の著しい分解をもたらした。
【００７６】
[00122]  １．１．２．  ジアルキル化クルクミン類似体の芳香族置換基のバリエーション。
【００７７】
[00123]  本発明における発明者らは、ここで、ＪＡＫ２に結合するクルクミンの計算によるモデルは、ホスホチロシンポケット中の芳香環上の置換基は結合能力において重要な役割を果たしていることを示していると信じる。理論により束縛されることを望むわけでは無いが、本発明における発明者らはここで、それらのポケットの分析は水素結合相互作用（水素結合の供与体および水素結合の受容体両方の相互作用）がこの結合能力への鍵である可能性があることを示していると信じる。
【００７８】
[00124]  加えて、単一のカルボニル部分のみを含む関連するクルクミン誘導体に関する本発明者の研究は、様々な芳香族置換基を有する誘導体はしばしば癌細胞に対する類似の抗増殖活性を示すが、“健康な”モデル細胞（例えばＭＣＦ−１０Ａ）への作用は劇的に異なり得ることを示している（図１９ｇ−表５）。
【００７９】
[00125]  従って、本明細書の節１．１．１において示した修飾（３−メトキシ−４−ヒドロキシおよび３，４−ジメトキシ）の範囲を超える芳香環置換基の修飾を用いて以下のことを調べることができる：１）ＪＡＫ２活性におけるその置換基の役割を調べる；および２）毒性を低減させるための、癌細胞に対するその薬物の選択性。
【００８０】
[00126]  商業的に入手できる、または容易に調製されるベンズアルデヒド類である３，５−ジメトキシベンズアルデヒド（２１）、３−ヒドロキシ−５−メトキシベンズアルデヒド（２２）、およびピペロナール（３，４−メチレンジオキシベンズアルデヒド、２３）（図２１）に由来する類似体の追加の系列（図２０）を用いて、異なる環置換パターンにより引き起こされる活性の変化をさらに決定することができる。これらのベンズアルデヒド類は、前の節において存在している芳香系の立体的および電子的環境にほんのわずかな撹乱（ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎｓ）しかなされないように選択された。化合物１２〜１７は、そのタンパク質との重要な水素結合相互作用に参加することができ；さらに、Ｃ−４からＣ−５位への環上の置換基の位置の変更は塩基性および酸化的条件の両方に対する安定性を増大させることができる。
【００８１】
[00127]  特定の態様において、クルクミンの反応性カテコールへの切断およびそれに続くオルト−キノンへの酸化は効力のある（ｏｐｅｒａｔｉｖｅ）代謝経路であると考えられるため、これは特に重要である。また、メトキシ（１２〜１４）およびヒドロキシル置換基（１５〜１７）のバリエーションは、ＪＡＫ２ポケットにおける水素結合の性質および重要性についてさらなる情報を提供するはずである。立体的な厳しさがより小さく疎水性がわずかに小さいアセタールへと拘束された（ｔｉｅｄ  ｂａｃｋ）メチル化フェノール類を有するピペロナール由来の化合物１８〜２０は、３，４−ジメトキシ置換化合物を直接模倣するように設計されている。
【００８２】
[00128]  これらの類似体の調製に関して、図１９ｅ−スキーム１における８に類似の基質に対して同様にそのアルキル化反応が行われるであろう。３，５−ジメトキシベンズアルデヒドまたはピペロナール由来の化合物には保護基は必要では無いであろう。しかし、３−ヒドロキシ−５−メトキシベンズアルデヒドはＢｏｃ誘導体として保護される必要があるであろう。この実施例におけるクルクミン骨格の中心部の炭素上の置換基は、ジメチル、シクロペンチル、およびシクロヘキシル基に限定されるであろう。シクロペンチルおよびシクロヘキシル置換化合物はこのスキームに従って作ることができる。また、そのドッキングの研究は、これらの化合物がポケット２との最高の結合相互作用を有することを示している（図１９ａ−表２）。例えば、１ａ、４ａ、５ａおよび６ａのような化合物が作られた。
【００８３】
[00129]  加えて、非環式置換基の作用を調べるために、ジメチル置換された誘導体も調製されるであろう。本発明における発明者らは、節１．１．１の結果は、より有効なＪＡＫ２または癌細胞に対するより大きな抗増殖活性を示す別のジアルキル基を示している可能性があると信じており、そのような置換基も意図される本発明の範囲内である。
【００８４】
[00130]  ＪＡＫ２のホスホチロシンポケットにおけるより都合のよい相互作用を有し、増大した効力をもたらす可能性のある環置換基を同定するために、計算による研究を行うこともできる。図２４において図説されているように、メトキシおよびヒドロキシ基のみを含むモノ−、ジ−、およびトリ置換ベンズアルデヒド類の数はかなり多い。
【００８５】
[00131]  これらのアルデヒド類に基づくクルクミン類似体の可能性のある組み合わせの全てを合成するよりもむしろ、計算による化学は本発明者らが化合物の重点的なライブラリーを調べ、どの誘導体を調製することができるかを決定することを可能にした。
【００８６】
[00132]  このアプローチは、他の構造的に多様だが商業的に入手できる、または容易に合成されるベンズアルデヒド類および複素芳香族化合物にも拡張されるであろう。次いでこのインシリコスクリーニングに由来するヒットしたもの（Ｈｉｔｓ）が、本明細書で記述した同じ合成戦略に従って合成されるであろう。
【００８７】
[00133]  １．１．３．  可能性のあるＪＡＫ２阻害剤としての非対称類似体の合成。
【００８８】
[00134]  クルクミンの２つの芳香環はそれぞれＪＡＫ２のホスホチロシンおよびヒンジ連結領域の両方の中に届くと予想される。これらの結合ポケットの両方における水素結合相互作用は活性に重要である可能性があり、またはそうではない可能性もある。実施例１．１．１および１．１．２で調製されたクルクミン誘導体の結合能力は実際にその骨組みの対称な性質によりプラスの影響を受けている可能性がある。
【００８９】
[00135]  この対称性はその類似体がその分子の相対的な配向に関わらずこれらのポケット内で効果的に水素結合することを可能にしている（すなわち、両方の芳香環が同等にうまく結合する）。この仮説を試験するため、クルクミン骨格の芳香環の内の１個（図２３の分子の右側）における置換を欠いている２種類の重要な類似体（２４および２５）を合成する。
【００９０】
[00136]  これらの誘導体の合成はメチルケトン２６ａまたは２６ｂのどちらかを用いて出発して実施された。これらのメチルケトン類は、対応するベンズアルデヒド類のＷｉｔｔｉｇオレフィン化により入手することができる。塩基を用いた処理の際のそのメチルケトンのエノラートの形成およびそれに続く酸塩化物２７を用いたアシル化は、クルクミン誘導体２８ａまたは２８ｂを与えた。それに続くこれらの生成物のアルキル化は、望まれる化合物２４またはＢｏｃ保護された誘導体２９ｂをそれぞれ与えた。２９ｂの加熱は結果としてＢｏｃ基の除去をもたらして２５を与えた。
【００９１】
[00137]  本発明における発明者らは最近、ケトン２６ａの酸塩化物３１との反応によるこのアシル化戦略（図２３ｃ−スキーム４）の実現可能性を調べた。この実施例において得られる生成物ジメトキシクルクミン（８）は、本発明者らにより合成された。精製の際、その反応の生成物は以前に調製された物質と同じであることが確認された。その反応の収率を増大させるため、これらの反応条件のさらなる最適化を実施することができる。
【００９２】
[00138]  特定の態様において、望まれる化合物の調製へのこのアシル化反応戦略の適用は困難であることが判明するであろうが、代わりの合成経路を用いることもできる。例えば、２，４−ペンタンジオンの３，４−二置換ベンズアルデヒドおよびベンズアルデヒド自体の両方との同時縮合は、クルクミン誘導体の混合物を与えることができる。これらの生成物のクロマトグラフィーによる分離は、望まれるクルクミン誘導体２８ａまたは２８ｂをその２種類の対応する対称なクルクミン誘導体と共に与えることができる。
【００９３】
[00139]  しかし、特定の態様において、より効率的な代替手段はベンズアルデヒド類の２，４−ペンタンジオンとの階段的な縮合の適用である可能性がある。
【００９４】
[00140]  １．２  ＳＴＡＴ３活性に関するクルクミン類似体の最適化。
【００９５】
[00141]  構造的変化のＳＴＡＴ３活性への作用を決定するためにクルクミンの骨格を修正することもできる。実施例Ｉにおいて示したように、ＪＡＫ２の研究（節１．１．１）に加えてクルクミンのＳＴＡＴ３への結合の計算的研究を開始した。
【００９６】
[00142]  しかし、ＪＡＫ２の結合の研究の結果に反して、ＳＴＡＴ３の結合部位において“曲がった”立体構造を取ることができるクルクミンのジケトン型のみが効率的に結合すると予想された。この結果は本発明者らを、増大した効力および選択性を提供する可能性のある、ＳＴＡＴ３のＳＨ２ドメインにおける３個の重要な“ホットスポット”の同定へと導いた：ｐＴｙｒ７０５部位、疎水性のサイドポケット、およびＬｅｕ７０６部位（図２４）。
【００９７】
[00143]  そのｐＴｙｒ７０５部位はＪＡＫ２のホスホチロシンポケットにかなり類似しており、これはその類似したＪＡＫ２ポケットを標的とするように設計された構造的修正はＳＴＡＴ３への結合にも適用可能である可能性があることを示している。ＳＴＡＴ３の活性に関して実施例１．１において調製された化合物のスクリーニングに加えて、ＳＴＡＴ３のＳＨ２ドメインの我々の計算によるモデルに基づいて効力を増大させるために、２つの追加の合成戦略も用いることができる：１）ＳＨ２ドメインの疎水性のポケットに結合すると予想されるシクロヘキシル部分の大きさおよび親油性のバリエーション、ならびに２）Ｌｅｕ７０６結合ポケットを標的とするように設計されたＦＬＬＬ３２の非対称な類似体の合成。
【００９８】
[00144]  １．２．１．  中心部のシクロヘキサン部分のバリエーション。
【００９９】
[00145]  ＦＬＬＬ３２（６ｂ）はＳＴＡＴ３阻害剤であり；ＳＴＡＴ３のＳＨ２ドメインに結合した密接に関連する６ａの計算によるモデルは、この部類の化合物に関する重要な相互作用を示している。
【０１００】
[00146]  本発明の発明者らはここで、図２５ａ〜２５ｂにおいて図説されているように、左の芳香環（ｐＴｙｒ７０５部位）、右の芳香環（Ｌｅｕ７０６部位）、およびシクロヘキシル環（疎水性のポケット）はＳＨ２ドメインの３つの“ホットスポット”全てに結合し、それは結果として増大したＳＴＡＴ３活性および選択性をもたらすことを信じる。
【０１０１】
[00147]  しかし、中心部のシクロヘキシル環の重要な役割にも関わらず、この特定の基の高度に疎水性の性質は、その可溶性特性に影響を及ぼすことにより、インビボでのその分子の有効性に負の影響を与える可能性がある。従って、ＦＬＬＬ３２の可溶性を改良するため、スピロ環状環を含む少数の類似の誘導体を調製することもできる。
【０１０２】
[00148]  その類似体（図２６ａ）は、中心部のスピロ環状環の大きさ（５ｂ、３２、および３３）および疎水性（３４および３５）のバリエーションによりジアルキル化類似体の系列（図１９、実施例１．１．１参照）を補完する（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ）ために設計されている。シクロペンタン誘導体５ｂは実施例目標１．１．１において記述されている。しかし、本発明者らは、この場合、小さな構造的変化（六員環から五員環へ）が予想されるｌｏｇＰ値に対してかなり大きな影響を有することも特筆する。本発明者らはここで、それはＳＴＡＴ３にＦＬＬＬ３２とほぼ同じ結合エネルギーで結合すると信じる。
【０１０３】
[00149]  シクロペンタン誘導体３３はわずかにより疎水性が低いが、立体的にはそれもＳＴＡＴ３の疎水性結合ポケットをふさぐことができるはずである。
【０１０４】
[00150]  最後に、そのポケットの全体的な大きさを決定するために、ジェミナルなジメチル置換基を含む化合物３２を合成することができる。化合物３４および３５における複素原子の導入は、その水溶性をより著しく増大させることができる。
【０１０５】
[00151]  化合物３５も、そのピペリジン窒素を最終的に癌細胞を選択的に標的とするように官能性をもたせることができるため、魅力的な化合物である。これらの化合物の合成は、図２６ｂ−スキーム５）において示されている置換反応を用いて成し遂げることができる。ジメトキシクルクミン（８）のアルキル化に必要な商業的に入手できるヨードエチルエーテルは購入することができ、一方で残りのアルキル化剤は確立された手順に従って合成することができる。
【０１０６】
[00152]  １．２．２．  Ｌｅｕ７０６部位を標的とする：ＦＬＬＬ３２の非対称な類似体。
【０１０７】
[00153]  ＳＴＡＴ３のＬｅｕ７０６部位を標的とすることにより、結合能力および選択性のさらなる向上を達成することができる。１つの芳香環の３位における比較的短いアルキル鎖（エチル＜プロピル＜イソブチル）の導入は、これらの分子のＳＴＡＴ３に関する効力および選択性に深い作用を有する可能性がある。
【０１０８】
[00154]  イソブチル側鎖を含む化合物３６〜３８は、図２７ｂ−スキーム６において図説されている代表的な合成計画に従って調製することができる。化合物３９および４０を調製してこれらの化合物の相対的な活性を３６と直接比較することができる。
【０１０９】
[00155]  ３６の調製のための合成スキームを図２７ｂ−スキーム６において示す。商業的に入手できるイソ−バニリン（４１）のアルキル化およびそれに続くＷｉｔｔｉｇオレフィン化は、メチルケトン４３を与えることができる。
【０１１０】
[00156]  図２４ｃ−スキーム４（実施例１．１．３）に類似したこのケトンのアシル化およびその中心部の炭素のアルキル化は３６を与えることができる。
【０１１１】
[00157]  化合物３７〜４０を調製することができる。例えば、３７の調製は、前に論じたように、アシル化の工程に関してＢｏｃ保護された酸塩化物の使用およびそれに続くＢＯＣ脱保護を必要とするであろう。そのベンズアルデヒド類の２，４−ペンタンジオンとの段階的な縮合は、これらの分子の調製のための代わりの戦略として用いることができる（実施例１．１．３）。実施例１．１において行われたうまく行く構造的修正を、これらの非対称な類似体の設計の中に組み込むことができる。
【０１１２】
[00158]  １．３．  ＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害に関するクルクミンの薬理学的特性。
【０１１３】
[00159]  ＱｉｋＰｒｏｐ（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ  ＬＬＣ）を用いて、ＦＬＬＬ３１およびＦＬＬＬ３２のＡＤＭＥ／Ｔｏｘ特性を、タモキシフェン、レトロゾール、ゲムシタビンおよびドキソルビシンと一緒に計算した。それぞれの化合物に関して５０個の“薬らしさ（ｄｒｕｇ−ｌｉｋｅｎｅｓｓ）”のパラメーターを評価した。際立って、ＦＬＬＬ３１およびＦＬＬＬ３２化合物は両方とも高度に“薬らしい”特性を示す。
【０１１４】
[00160]  ＦＬＬＬ３１および３２に関する選択された最も重要な部分には、以下のことが含まれる：１）タモキシフェンおよびゲムシタビンに類似した代謝安定性；２）レトロゾールおよびゲムシタビンに類似した極性；３）タモキシフェンおよびドキソルビシンに類似した複合的なｌｏｇＰ値；４）ＨＥＲＧ  Ｋ＋チャンネルに関する予想されるＩＣ５０値はレトロゾールのＩＣ５０値に近く、タモキシフェンよりも優れている；５）予想されるＣａｃｏ−２およびＭＣＤＫ細胞透過性の値が優秀である（１，０００を超える）；６）予想される脳／血液分配係数が−１．８〜−０．８であり、それは優秀である；７）予想されるヒト血清アルブミンに対する結合の指数が０．４から０．８までの範囲であり、十分に−１．５〜１．５の推奨範囲内である；８）予想されるヒトの経口吸収百分率が９７％から１００％までの範囲である。全体的な指数に関して、ＦＬＬＬ３２はシルニジピン（Ｃｉｌｎｉｄｉｐｉｎｅ）、ピロザジル（Ｐｉｒｏｚａｄｉｌ）、ミベフラジル（Ｍｉｂｅｆｒａｄｉｌ）、ビニフィブラート（Ｂｉｎｉｆｉｂｒａｔｅ）およびクロベノシド（Ｃｌｏｂｅｎｏｓｉｄｅ）に８０％類似している。全般的に言えば、これはジアルキル化クルクミン類似体は理にかなった薬理学的特性を有している可能性があることを示している。
【０１１５】
[00161]  １．３．１  構造類似体−スルファメート類およびホスフェート類
[00162]  その化合物の経口での生物学的利用能および水溶性をそれぞれ改良するために、構造類似体の２つの部類であるスルファメート類およびホスフェート類（図２８）を合成することもできる。さらに、本発明の発明者らはここで、これらの構造的修正は特定の態様に置いてそのフェノール部分の安定性を向上するために有用であると信じる。エストラジオールを含む様々なステロイド類のスルファメート誘導体は増大した吸収を示しており、それは増大した活性をもたらす。
【０１１６】
[00163]  クルクミンＦＬＬＬ１のビス−スルファメート誘導体（４８、図２９）は、ＭＣＦ−７細胞に対する効力においてクルクミン自体と比較して４倍の増大を示す。類似のフェノール化合物における報告された成功に基づいて、他の可能性のある水可溶化基（ｗａｔｅｒ−ｓｏｌｕｂｉｌｉｚｉｎｇ  ｇｒｏｕｐｓ）の中からホスフェート誘導体が選択された。例えば、コンブレタスタチン（ｃｏｍｂｒｅｔａｓｔａｔｉｎ）のホスフェートの二ナトリウム塩であるＺｙｂｒｅｓｔａｔ（４９）は重要な可溶性および安定性の問題を克服して抗癌剤として第ＩＩＩ相臨床試験に進んでいる。
【０１１７】
[00164]  化合物５１はこれらの化合物の合成のためのモデルとして有用である。５１の合成は、３工程の手順を利用して達成された。クルクミンの１個のフェノール酸素のＢｏｃ誘導体としてのモノ保護（Ｍｏｎｏ−ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）は中程度の収率で成し遂げられた。炭酸カリウムの存在下での過剰量のヨードメタンによるこの生成物の処理は、結果として残りのフェノールのアルキル化および中心部の炭素のジアルキル化をもたらし、８５％の収率で５０を与えた。最後に、Ｂｏｃ基の熱分解による除去によるフェノールの脱保護は５１を与えた。５１の対応するスルファメート誘導体５２へのさらなる変換は、スルファモイルクロリドで処理すれば成し遂げることができる（図２９ｃ−スキーム８、式１）。
【０１１８】
[00165]  ５１のその二ナトリウムホスフェート誘導体５３への変換は、Ｐｅｔｔｉｔの手順に従って実施することができる（図３３ｃ−スキーム８、式２）。この場合、亜リン酸ジベンジルによる処理およびそれに続くヨウ化ナトリウムおよびクロロトリメチルシランを用いたベンジル保護基の除去は、その水溶性類似体を与えることができる。そのベンジル保護基を除去する試みが失敗する場合、Ｐｅｔｔｉｔにより利用された、類似のｔ−ブチルおよびトリメチルシリルエチル（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｌｙ  ｅｔｈｙｌ）（ＳＥＭ）誘導体を導入および脱保護する代わりの手順を用いることができる。
【０１１９】
[00166]  １．３．２  シクロヘキシルを含む誘導体
[00167]  対応するシクロヘキシルを含む誘導体の合成は、図２９ｄ−スキーム９において図説されているように実施することができる。
【０１２０】
[00168]  Ｂｏｃ保護されたクルクミン５４は、フェノール酸素上で選択的にメチル化することができる。ジアゾメタンはクルクミンのジメトキシクルクミンへの変換に有用である。この実施例では、そのメチル化を行うためにより安全なトリメチルシリル−ジアゾメタンを用いることができる。代わりの戦略は、同じ変換を達成するためにベンゼン中の硫酸ジメチルおよび炭酸カリウムを用いる。５５が手元にある場合、シクロヘキサン環を与えるためのアルキル化およびそれに続く脱保護を行うことができる。５７のスルファメートおよびホスフェート誘導体への変換は、図２９−スキーム８におけるジメチル化合物の変換に類似して成し遂げることができる。
【０１２１】
[00169]  １．３．３  追加の構造類似体
[00170]  図２９ｅは化合物５８に関する類似体の例を示す。図２９ｆは化合物５９に関する類似体の例を示す。
【０１２２】
[00171]  １．４．  ＪＡＫおよびＳＴＡＴ結合モデルの検証。
【０１２３】
[00172]  その新規の小分子のＪＡＫ２触媒ドメインおよびＳＴＡＴ３のＳＨ２ドメインとの物理的相互作用を評価した。
【０１２４】
[00173]  １．４．１．  ＳＨ２ドメインの精製。
【０１２５】
[00174]  完全長のマウスＳＴＡＴ３をＲＴ−ＰＣＲによりｐｃＤＮＡ３．１  ＣＴＧＦＰ  ＴＯＰＴＯ中に、製造業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により指示されるようにクローニングし、それを用いて大腸菌ＤＨ５を形質転換した。ＳＨ２ドメイン（Ｙ５７５−Ｃ６８７）のグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合物を生成するために、その完全長のプラスミドをＰＣＲの鋳型として、それぞれＢａｍＨ１およびＸｈｏ１制限部位を含む順方向プライマー５−ＧＴＡＣ−ＧＧＡＴＣＣ−ＴＡＴ  ＡＴＣ  ＴＴＧ  ＧＣＣ  ＣＴＴ  ＴＧＧ  ＡＡ［配列番号：１］および逆方向プライマー５−ＧＴＣＡ−ＣＴＣＧＡＧ−ＣＡＧ  ＴＡＣ  ＴＴＴ  ＣＣＡ  ＡＡＴ  ＧＣＣ  ＴＣ［配列番号：２］と共に用いた。
【０１２６】
[00175]  そのＰＣＲ産物およびｐＧＥＸ  ４Ｔ−３ベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）をＢａｍＨ１およびＸｈｏ１で消化し、ライゲーションしてＳＨ２ドメインのＣ末端をＧＳＴに融合させた。次いで大腸菌ＢＬ２１をＧＳＴ−ＳＴＡＴ３−ＳＨ２または空のｐＧＥＸ  ４Ｔ−３プラスミドで形質転換し、ＩＰＴＧで誘導した。細菌をＰＢＳ中で超音波処理し、１％トリトンｘ−１００で抽出し、そのタンパク質をＧＳＨ−セファロース上で精製し、ＧＳＴに関してウェスタンブロットした。本発明者らは予想される分子量のＧＳＴ−ＳＴＡＴ３−ＳＨ２（Ｙ５７５−Ｃ６８７）融合タンパク質（分子量４０ｋＤａ）を作製した（ウェスタンは示していない）。
【０１２７】
[00176]  １．４．２．  Ｊａｋ２触媒ドメインの精製。
【０１２８】
[00177]  その精製は公開された手順により行うことができる。ヒトＪＡＫ２のキナーゼドメイン（残基８３５〜１１３２）をｐＦａｓｔＢａｃの中にクローニングすることができ、それはそのタンパク質がＧＳＴ切断可能タグに融合されて発現されることを可能にする。ＪＡＫ２挿入断片を含む組み換えバクミドＤＮＡを単離し、Ｓｆ９昆虫細胞に形質移入することができる。その形質移入から得られたバキュロウイルスを用いて懸濁状態で２×１０６細胞／ｍＬの密度まで増殖した昆虫Ｓｆ９細胞を１０より大きい感染多重度で感染させ、感染の４８時間後に回収することができる。細胞を完全プロテアーゼ阻害剤混合物（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ドイツ、マンハイム）を補った２０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．５、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％ｔｈｅｓｉｔ、５％グリセロール、および１ｍＭ  ＤＴＴで構成される緩衝液中で再懸濁し、超音波処理により溶解し、４５０００ｇで１時間遠心分離することができる。その上清を濾過し、ＧＳＴ樹脂（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｘ、オーストラリア、ヴィクトリア）上に再循環させることができる。大量の（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ）洗浄の後、その融合タンパク質を溶離し、ＧＳＴ−ＪＡＫ２を含む画分を集めて２ｍＬに濃縮し、α−トロンビン（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）と共に４℃で一夜保温することができる。次いでそのタンパク質を２０ｍＭトリスｐＨ８．５、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、および１ｍＭ  ＤＴＴ中で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５ゲル濾過カラム（ＨｉＬｏａｄ  １６／６０）上にロードすることができる。結晶化試験のためにＪＡＫ２を集めて１０ｍｇ／ｍＬに濃縮することができる。次いでハンギングドロップ蒸気拡散法を用いて、２８％ポリエチレングリコール４０００、０．２Ｍ酢酸アンモニウム、および０．１ＭシトレートｐＨ６．０を含むリザーバー溶液で、２０℃において結晶を成長させることができる。
【０１２９】
[00178]  １．４．３．  Ｊａｋ２／阻害剤およびＳＨ２／阻害剤複合体の結晶構造。
【０１３０】
[00179]  精製されたＪＡＫ２およびＳＴＡＴ３のＳＨ２タンパク質を、文献において公開された結晶を生じた集中スクリーニング条件または疎行列（ｓｐａｒｓｅ  ｍａｔｒｉｘ）スクリーニングのどちらかにより結晶化することができる。阻害剤は未変性の（ｎａｔｉｖｅ）結晶の中にしみ込ませるか、または未変性のタンパク質と共結晶化させるかのどちらであることもできる。その構造は、Ｊａｋ２またはＳＨ２のアポ構造をプローブとして用いる分子置換により解明することができる。
【０１３１】
[00180]  他の実施例との相互関係。
【０１３２】
[00181]  図３０において示されているように、実施例ＩＩで合成された類似体を、本明細書の実施例ＩＩＩにおいて記述されるように、向上した効力、阻害のＪＡＫ／ＳＴＡＴ３特異性、細胞致死、および抗血管新生活性に関して試験することができ、細胞培養において活性であることが分かったそれらの化合物をヒト腫瘍異種移植モデルに供する（ｔａｋｅｎ  ｏｎ）ことができる。さらに、実施例ＩＩで合成された化合物を、本明細書の実施例ＩＶにおいて記述されるように、向上したＰＤおよびＰＫパラメーターに関して試験することができる。
【０１３３】
[00182]  実施例ＩＩＩ
[00183]  本発明における発明者らはここで、親化合物ＦＬＬＬ３２はＣＡＭ中に移植されたＳＴＡＴ３を過剰発現する乳癌細胞であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１の血管密度を低減させることを示した（図１５ｂ）。従って、理論により束縛されることを望むわけではないが、本発明における発明者らはここで、選択的ＦＬＬＬ３２類似体はＶＥＧＦにより仲介される血管新生において重要な抗血管新生活性を有するであろうと信じる。
【０１３４】
[00184]  ＶＥＧＦに仲介される血管新生の漿尿膜（ＣＡＭ）アッセイ。
【０１３５】
[00185]  ＣＡＭアッセイは抗血管新生剤に関する標準的なアッセイである。このアッセイにおいて、精製したＶＥＧＦを高度に血管新生化されたＣＡＭに局所的に添加して血管新生を誘導する。次いでその膜の同じ局所的な領域に阻害剤を添加し、培養期間の後、そのＣＡＭの処理された領域の血管密度を算出する。これらの試験において用いられたＣＡＭアッセイは改変された。このアッセイにおいて、繁殖可能なレグホン種のニワトリの卵を、ほとんどの脈管形成が停止し、血管の形成が主に血管新生による時期である、１０日培養まで成長させる。次いで血管新生促進因子であるヒトＶＥＧＦ−１６５（１００ｎｇ）を３ｍｍの微生物試験円盤に飽和するまで添加し、その卵の上面に小さな穴を開けることによりＣＡＭの上に置く。抗血管新生化合物をＶＥＧＦ／ｂＦＧＦの８時間後に同じ微生物試験円盤に飽和状態で添加し、胚をさらに４０時間培養させる。４８時間後、ＣＡＭを０．０５％トリトンＸ−１００を含む４％パラホルムアルデヒドで灌流し、処理した領域を取り囲むように切り取り、再度４％パラホルムアルデヒド中で固定し、パラホルムアルデヒド中のペトリ皿の上に置き、解剖顕微鏡およびＣＣＤ画像化システム（Ｒｅｔｉｇａ、バーナビー、バンクーバー）を用いてデジタル化された画像を得る。次いでデジタルのＣＡＭ画像に１×１ｃｍの格子を加え、５〜７個の格子の内部の血管の平均数を血管分布の尺度として計数する。ＳＵ５４１６を抗血管新生活性の陽性対照として用いる。データをｂＦＧＦ／ＶＥＧＦを与えられたＣＡＭのパーセントとしてグラフにし、２〜３回の別個の試験（ｎ＝５〜１１）から、Ｐｒｉｓｍ３．０ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）によるＳ字形用量反応関係分析を用いて、ＩＣ５０の値を見積もる。
【０１３６】
[00186]  ＣＡＭ異種移植アッセイ。
【０１３７】
[00187]  上記のＣＡＭアッセイのこの変形において、１０ＤＩのニワトリ胚に２５０，０００個のＭＤＡ−ＭＢ−４３５転移性乳癌細胞をＣＡＭの直下に、比較的無血管な（すなわち大きい血管から離れている）領域に移植する。次いで腫瘍移植の１日後に化合物をｍｇ／ｋｇ基準で全身循環の中に、ＣＡＭの上に直接ピペットで移す。移植の３日後に、上記の本来のＣＡＭアッセイにおけるようにＣＡＭを固定し、腫瘍を取り囲むように切り取り、上記の本来のＣＡＭアッセイにおいて記述されているように画像化する。さらに、固定したＣＡＭを血管新生のマーカーであるＶＥＧＦ、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９に対して免疫組織化学的に染色することができる。
【０１３８】
[00188]  また、理論により束縛されることを望むわけではないが、本発明における発明者らはここで、ＦＬＬＬ３２の新規類似体はＳＴＡＴ３のリン酸化の上昇したレベルを有する乳癌細胞株において強力かつ選択的な活性を示すであろうと信じる。
【０１３９】
[00189]  実施例ＩＶ
[00190]  クルクミン類似体阻害剤の薬物動態、代謝、および用量設定試験。
【０１４０】
[00191]  背景：クルクミンの薬物動態および代謝：
[00192]  クルクミンは、アルキル鎖の還元ならびに芳香族ヒドロキシル基のグルクロン酸化および硫酸化を受ける。これは、いずれの経路により投与された場合でもクルクミンの低い生物学的利用能に寄与する。経口投与は、親化合物の代謝および乏しい腸吸収の両方により、特に低い。放射標識されたクルクミンを用いた研究は、ラットにおいて経口用量のおおよそ６０％が吸収されることを示し、この百分率は１０〜４００ｍｇ／ｋｇの用量で一定のままであった。吸収された物質の大部分は腸壁で代謝され、それは結果としてクルクミンの低い全身曝露をもたらす。同様に、グルクロン酸化および硫酸化された代謝産物を尿中で見出すことができるが、親化合物は尿中で見出されない。
【０１４１】
[00193]  新規阻害剤の薬物動態、代謝、および用量設定試験。
【０１４２】
[00194]  クルクミンは急速に代謝され、そうしてそのインビボでの曝露を制限する。実施例ＩＩにおいて記述したＦＬＬＬ３２類似体はケト型を維持しており、エノール型への互変異性化およびクルクミンの代謝的変換に関する主な経路である芳香族ヒドロキシル基のメチル化を妨げる（グルクロン酸化、硫酸化および還元は完全に妨げられる、または妨害されるであろう。
【０１４３】
[00195]  従って、本発明者はここで、ＦＬＬＬ３２類似体の向上した生物学的利用能および組織吸収が存在し、そうしてインビボでの療法的濃度の達成が可能になるであろうと信じる。この向上した性質は、他のＪＡＫ２／ＳＴＡＴ３阻害剤およびクルクミンと比較して活性および有効性を増大させるであろう。
【０１４４】
[00196]  それぞれの化合物に関して、経口およびＩＰ投与経路による生物学的利用能、ＰＫの用量依存性、インビボでの分布および代謝（インビトロでの代謝を含む）、ならびにそれぞれの阻害剤の全般的な性質についての情報を含む、詳細なＰＫデータを生成することができる。集合的に、このデータは担腫瘍マウスにおける有効性の決定のための最適化された投与計画のモデリングおよび合理的な設計を可能にする。
【０１４５】
[00197]  本発明者らのアプローチは、長期有効性試験において最大耐用量を利用する典型的なアプローチとは大きく異なることは特筆すべきである。これらのアプローチはしばしば事前のＰＫの知識無しで適用され、そうして最適以下の投与スケジュールの選択または乏しいＰＫ特性を有する化合物の継続した開発および評価の機会を増大させる。加えて、しばしば単一の投与計画を用いて多数の化合物が比較される。これらの化合物の間でＰＫが異なる場合、その比較は間違った結論をもたらす可能性がある。対照的に、本発明者らのアプローチはＰＫの関係を完全に特性付け、それぞれの化合物の有効性の決定に関して最大および許容可能な曝露が達成されることを保証する。
【０１４６】
[00198]  本発明は様々な、および好ましい態様に関連して記述されたが、当業者は、本発明の本質的な範囲から逸脱すること無く様々な変更がなされてよくその要素を均等物で置換してよいことを理解するべきである。加えて、個々の状況または材料を本発明の教示に適応させるために、本発明の本質的な範囲から逸脱すること無く多くの修正がなされてよい。
【０１４７】
[00199]  従って、本発明はこの発明を実行するために考えられた本明細書で開示した特定の態様に限定されず、本発明は特許請求の範囲内に入る全ての態様を含むことを意図する。
【０１４８】
[00200]  本発明を明らかにする、または本発明の実施に関する追加の詳細を提供するために本明細書で用いられている刊行物および他の資料を本明細書に援用し、便宜のためにそれらを下記の参考文献一覧において提供する。
【０１４９】
[00201]  本明細書で列挙された文書のいずれの引用も、前述のもののいずれかが関係する先行技術であるという自認として意図するものでは無い。これらの文書の全ての日付に関する記載または内容に関する表現は出願者に利用可能な情報に基づくものであって、これらの文書の日付または内容の正確さに関する自認を構成するものでは全く無い。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図１９−３】
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【図１９−４】
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【図１９−５】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９−１】
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【図２９−２】
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【図２９−３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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