(57)【要約】  本発明の目的は、細胞内にすでに存在しているレベルより過剰に、ポリヌクレオチド結合タンパク質を発現することができるベクターを含むワクチンアジュバントを提供することである。ポリヌクレオチド結合タンパク質の発現は、1型インターフェロンの発現を導く細胞内経路を開始する。1型インターフェロンの発現に合わせて、他のサイトカインは発現され、アジュバントと共に与えられたワクチン抗原に対する免疫反応は増強される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ワクチン抗原、及び
インターフェロン調節因子のアクチベータの存在する細胞レベルに加える量での、当該アクチベータ、
を含むワクチン組成物。
【請求項２】
前記ワクチン抗原が、ポリペプチド、タンパク質、多糖、ハプテン、糖化タンパク質、リポタンパク質、リポ多糖類、細胞、細胞抽出物、多糖複合体、脂質、糖脂質、及び糖類、からなる群から選択される、請求項1に記載のワクチン組成物。
【請求項３】
前記ワクチン抗原が、
発現したときにポリペプチドを産生するポリヌクレオチド、及び
発現したときにタンパク質を産生するポリヌクレオチド、
からなる群から選択される、請求項1に記載のワクチン組成物。
【請求項４】
前記のインターフェロン調節因子のアクチベータが、ポリペプチド及びタンパク質からなる群から選択される、請求項1に記載のワクチン組成物。
【請求項５】
前記のインターフェロン調節因子のアクチベータが、DAI、RIG-1、及びMda-5からなる群から選択される、請求項1に記載のワクチン組成物。
【請求項６】
前記のインターフェロン調節因子アクチベータが、
発現したときにポリペプチドを産生するポリヌクレオチドベクター、及び
発現したときにタンパク質を産生するポリヌクレオチドベクター、
からなる群から選択される、請求項1に記載のワクチン組成物。
【請求項７】
発現したときにタンパク質を産生する前記ポリヌクレオチドが、DAI、RIG-1、及びMda-5からなる群から選択される、請求項6に記載のワクチン組成物。
【請求項８】
前記ワクチン抗原を投与し、及び
前記インターフェロン調節因子のアクチベータを投与するステップ
を含む、ワクチン投与するための方法。
【請求項９】
前記ワクチン抗原、及び前記インターフェロン調節因子のアクチベータが同時に投与される、請求項8に記載のワクチン投与するための方法。
【請求項１０】
前記ワクチン抗原、及び前記インターフェロン調節因子のアクチベータが異なった時間に投与される、請求項8に記載のワクチン投与するための方法。
【請求項１１】
免疫調節物質の産生を導くポリヌクレオチド結合タンパク質を発現することができるポリヌクレオチドベクター、及び
医薬的に許容される担体、
を含むワクチンアジュバント組成物。
【請求項１２】
ワクチン抗原を発現することができるポリヌクレオチドベクター、及び
アクチベータの存在する細胞レベルに加える量での、インターフェロン調節因子のアクチベータを発現することができるポリヌクレオチドベクター、
を含むワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、一般的にワクチン組成物及び方法、より具体的には、ワクチン抗原及びアクチベータを含むワクチン組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、同時係属中である米国仮特許出願、Ljunberg、Lladser、及びKiesslingの、整理番号61/212,554、出願日2009年4月13日、細胞内ポリヌクレオチド結合タンパク質を発現するベクターのアジュバントとしての使用、に基づく優先権を主張する。
【０００３】
背景技術
遺伝的ワクチン投与は、小動物モデルにおいて、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)及び/又は抗体の産生と平行して、ウイルスチャレンジ、及び腫瘍拒絶に対して防御することができる免疫反応を誘導する[Holmgren et al 2006, Lindencrona et al 2004, Robinson et al 1993, Ulmer et al 1993, Vertuani et al 2004]。しかしながら、DNAワクチンは、それゆえ臨床試験では、強い免疫反応を引き起こすことに成功していない。
【０００４】
癌の能動免疫療法の開発は、加えて、弱い、腫瘍に関連する自己抗原に対する耐性を破壊する困難性によって、妨げられている。それゆえ、効率的な送達、及びアジュバントは、ヒトにおいて、成功するDNA免疫化のために要求される。
【０００５】
皮膚へのDNAワクチン投与は、皮膚は容易に利用でき、非常に多数の抗原提示細胞、例えばランゲルハンス細胞、を有するので、臨床的応用において魅力的な手法である。インビトロ皮内DNAエレクトロポレーションは、高い抗原発現を促進する効率的なプラスミド導入を許容し、特異的T細胞の高いレベルを誘導し、それゆえDNAワクチン投与の効率性を上昇させる[Roos et al 2006]。ルースは、癌ワクチンに対する免疫反応を増強させるためのエレクトロポレーションの使用を記述した。ルースはまた、癌ワクチン抗原に対する細胞内免疫を増強するPulseAgile（登録商標）と呼ばれる特定のパルス手順を記述した。それは、免疫反応をさらに後押しするアジュバントを有することが望ましい。
【０００６】
いくつかの組み換え型、及びサイトカイン、例えば、IL-2、GM-CSF、IL-12及びIL-15など、がコードされたプラスミドは、分子アジュバントとして用いられている[Barouch et al 2000, Rollman et al 2004, Sin et al 1999]。これらのサイトカインは、ワクチン投与部位で炎症反応を増加させることにより作用し、それゆえワクチン投与の部位の免疫細胞を動員し、プロフェッショナル抗原提示細胞、例えば、樹状細胞(DC)など、の成熟を促進する。一つのサイトカインは、免疫調節効果を有し；IL-12は、Th1型反応の強力なプロモーターであって、IL-15はメモリーCD8+T細胞の誘導に寄与する[Kutzler et al 2005]。
【０００７】
タンパク質の形態での組み換えサイトカインは、インビボにおいて有限の寿命を有する。このため、細胞で抗原が発現されているかなりの時間、サイトカインは同時に存在しない。抗原が存在しているかなりの時間、効果を増強されたその免疫が存在し得るように、サイトカインと同時に発現される分子アジュバントを有することは望ましい。
【０００８】
抗原がコードされたプラスミドとのDNAワクチン混合物で送達される、サイトカインがコードされたプラスミドは、同時発現の潜在力を有する。そのようなアジュバントがコードされたプラスミドは、抗原がコードされたプラスミドとの混合物で希釈されるので、投与量は減少し、アジュバントの発現の潜在力は減少する。その代わりに、強力な、構成的なプロモーターがプラスミドからのサイトカインの発現に用いられるので、サイトカインの過剰産生は可能である。最大の反応を同時に調節する一方で、サイトカインの産生を誘導する方法は望ましい。
【０００９】
サイトカインは、一斉に作用し、一つのサイトカイン遺伝子の転写の開始の上流の信号伝達経路を標的とすることが、望ましい。これは、パターン認識受容体(PRR)、様々な病原体により共有される一般的な構造を検出するために設計された進化保存的な受容体の様々な群、例えば、トール様受容体(TLR)など、を活性化することにより達成される。サルモネラ・チフィリウム由来の細菌のTLR5リガンドであるフラジェリンは、遺伝的ワクチンの薬効を高めるために用いられ、ワクチン投与をしたマウスにおいて致命的なインフルエンザチャレンジに対する保護を与えられた[Applequist et al 2005]。加えて、TLR9により認識される、細菌の低メチル化CpGを含むDNAは、期待できる結果とともに臨床試験を含む様々な研究で用いられている[Krieg et al 1995, Davis et al 1998, Hemmi et al 2000,Cooper et al 2004]。それらのトール様受容体のそれぞれは、一部の細胞、例えば、骨髄系細胞など、の細胞表面に存在する受容体である。DNAワクチン投与のために、例えば、細胞内に送達されるような、細胞質DNAと結合できる受容体を使用することが望ましい。
【００１０】
米国特許第6239116号明細書、及び第6406705号明細書は、それぞれ、アジュバント単独、又は他の非核酸アジュバントとともにアジュバントとして、非メチル化CpGジヌクレオチド(TLR9結合リガンド)を含むオリゴヌクレオチドの使用を記載する。アジュバントとして、ポリヌクレオチドの細胞内受容体を発現するベクターの使用は、記述されていない。
【００１１】
分子アジュバントとしてのTLRリガンドの使用は、分子アジュバントとして、他のPRRのリガンドを使用する可能性を立証する。細胞内DNAを認識するPRRがあると仮定する。興味深いことに、プラスミドDNAを導入後、筋細胞はI型インターフェロンの発現を上方制御し、MHCクラスI、及び共刺激分子の発現を上方制御した。さらに、それらは、TLR9に独立的に、しかしインターフェロン反応因子3(IRF3)に依存的な様態で、抗原特異的CD8+ T細胞を活性化した[Shirota et al 2007]。
【００１２】
しかしながら、分子アジュバント、例えば、前述のトール様受容体のリガンドなどは、それらが外部の細胞外膜上のトール様受容体と結合する細胞外環境において送達される。細胞外環境において、トール様受容体に対するリガンドは分解し、それゆえ抗原発現と同時に存在しない。抗原と同時に存在するアジュバントを有することが望ましい。
【００１３】
近年発見された、Z-DNA結合タンパク質1(ZBP1はまた、DLM-1として知られている)の機能は、それが二本鎖DNAの細胞質PRRとして作用することが明らかにされ、暫定的に、インターフェロン制御因子のDNA依存的アクチベータ(DAI)と呼ばれている[Takaoka et al 2007]。DAIのDNA刺激は、I型IFN産生、IL-6上方制御、及びケモカインC-X-C モチーフリガンド10(CXCL10)の分泌を導く。二つの生物化学的経路が含まれ、一つはIRF3活性化を介してもたらされ、一つはNF-κB活性化を介される[Kaiser et al.2008]。タカオカの公表物は、名称DAIの使用の最初である。彼らは、DAIがB型DNA(標準DNA)、及びZ-DNAと結合することを開示した。B-DNAは、標準のDNA構造であるので、これは、DAIが標準の二本鎖DNAと結合し得ることを意味する。B-DNAとのDAIの結合後、複合体は、一つの経路において、IRF3及びTBK1と相互作用する。これは、DAIではなくIRF3を含む複合体による1型インターフェロン遺伝子誘導を順々に導く。それゆえ、タカオカは、DAIとのB-DNAの結合は、選択されたサイトカインの調整された分泌をもたらす細胞内経路を開始することを明らかにした。このプロセスは、天然のDAIの機能であり、標準的な生理学的レベルを超えて、DAIの存在に起因しない。ワクチンに対する免疫反応を増大させるための、標準的な生理学的レベルを超えた、DAIの発現を増加させるための、細胞内発現ベクターの使用は、議論されていない。
【００１４】
DAI発現は、様々な組織；心臓、脾臓、肺、肝臓、腎臓、睾丸、で発見されており[Fu et al 1999]、それゆえ感染症の監視員としてのその関連性を強調する。DAIは、DNA依存的なIFA産生の活性剤のモデルである。DAIの3つのDNA結合ドメインは、細胞質DNAと直接相互作用し、DAIの多量体化をもたらす。これは、TBK1(タンク結合キナーゼ1)及びIRF3をDNA-DAI複合体に順々に動員する。このとき、DAIは、TBK1によりリン酸化され、それはTBK1及びIRFの動員を増幅する。IRF3は、続いてリン酸化により活性され、二量体化したIRF3は、I型インターフェロン転写及び放出を促進する複合体の一部となる[Wang et al 2008]。Kaiserらは、NF-κB活性化は、RIP-1及びRIP-3のリン酸化反応を介して、DAIによるポリヌクレオチド結合でおこり、それは順々にIκB阻害剤をリン酸化し、それゆえNF-κBを活性化し、炎症誘発性サイトカイン、例えばIL-6、及びTNF-α、及びCXCL10など、の発現を促進する、と報告している。
【００１５】
DAIは、DNAと結合する細胞質受容体だけではないだろう(2008年にタカオカに批評されている)。少なくとも、二つの一連の証拠が、その可能性を支えている。第一に、siRNAによるDAI発現の抑制は、I型インターフェロンの誘導の不完全な抑制をもたらしたTakaoka 2007)。第二に、DAIノックアウトマウスにおいて、自然免疫系は正常であり、I型インターフェロンを誘導する他の手段があることが示される。
【００１６】
上述の経路において記述されたTBK1は、DNAワクチンに対する自然及び獲得免疫反応のために必要不可欠である(Ishii 2008)。イシイは、DNAワクチンに対する正常な免疫反応は、TBK1の存在に依存し、この依存は、TLR9受容体結合の非存在下、及びDAI信号伝達の非存在下で起こることを明らかにした。
【００１７】
TBK1経路を活性化するさらなる手段は、二重鎖RNAのRIG-1との結合により開始されるPRP経路である(Yoneyama 2008)。この経路はまた、IRF−3のリン酸化反応、及び二量体化を、及び最終的にI型インターフェロンのゲノム発現を導く。PCT特許出願番号国際公開2008/08080091号は、アジュバントとしてRIG-1とに結合するリガンドの使用を記述する。この特許出願は、アジュバント送達のときに細胞質に存在する量を超えた量のRIG-1それ自身の発現を、記載していない。
【００１８】
米国特許7,001 ,718号明細書は、感染症の病原性を減少するZ-DNA結合タンパク質の使用を記述する。その特許において、Z-DNA結合タンパク質の阻害剤を発見するための方法は、開示されている。Z-DNA結合タンパク質を用いた抗感染薬を検出する/発見するための方法は、また開示されている。当該特許は、DAI(Z-DNA結合タンパク質)、又は他のDNA又はRNA結合タンパク質の、ワクチンに対する免疫反応を後押しすることができるワクチンアジュバントとしての使用は記載していない。
【００１９】
定義
アジュバント(Adjuvant)：ワクチンに対する免疫反応を増強する任意の物質。
抗原：免疫抗原、又は免疫系から反応を誘導する物質。
B-DNA：右巻きの螺旋形のねじれ、並びに主溝及び副溝を有する標準のDNA。
CpG：シトシンがグアニンに続かれるDNAの配列。pは、二つの分子と結合するリン酸を表す。CpGは真核細胞において、しばしばメチル化されており、原核細胞において、しばしば非メチル化されている。
CTL: 細胞傷害性Tリンパ球。
【００２０】
DAI：インターフェロン調節因子のDAN依存的アクチベータ。それはまた、Z-DNA結合タンパク質(ZBP1)、及びDLM-1として知られている。結合するZ-DNAに加え、DAIはまた、B-DNAと結合することが知られている。 
pDAI：DAIを発現することができるプラスミド。
DNA：デオキシリボ核酸。
発現ベクター：本発明のために、発現ベクターは、その細胞中に存在する任意のポリヌクレオチドであり、所望のタンパク質の産生をもたらす。これは、プロモーター及びエンハンサーにより制御される発現配列を伴うプラスミドを含む。それはまた、プロモーターフリー配列、例えば、細胞内に存在するメッセンジャーRNAなど、を含み、所望のタンパク質の産生をもたらす。
【００２１】
IFN-α/βR-/-：双方の対立遺伝子上で、インターフェロンα受容体、及びインターフェロンβ受容体陰性であるマウス。
IFN：インターフェロン。
IL：インターロイキン。
免疫調節物質：免疫系を感化する任意のタンパク質。サイトカイン及び、ケモカインは、免疫調節物質である。
IRF3：インターフェロン調節因子3。
IRF3-/-マウス：双方の対立遺伝子上で、インターフェロン調節因子3の発現が欠損しているマウス。
【００２２】
Mda-5又はMDA5：メラノーマ分化関連抗原5。
医薬的に許容される担体：導入のために、薬物やワクチンに懸濁される任意の物質。その物質は、固体の状態、液体の状態又は固体及び液体の混合である。
ポリヌクレオチド：RNA又はDNAの任意のポリマー。それは、一本鎖、又は二本鎖である。
PRR：パターン認識受容体。
Pulse Agile（登録商標）：1つ、2つ、又は3つの下記の特徴：(1)少なくとも3つの波形のうちの少なくとも2つが、お互いの波形の振幅(amplitude)と異なる(2)少なくとも3つの波形のうちの少なくとも2つが、お互いの波形の幅(width)と異なる(3)少なくとも3つの波形のうちの二つの最初の一組の間の最初の波形の間隔が、少なくとも3つの波形のうちの二つの二番目の一組の間の二番目の波形の間隔と異なる、を有する一連の少なくとも3つの波形。
【００２３】
RIG-1：レチノイン酸誘導遺伝子1タンパク質。
TBK1：タンク結合キナーゼ。それは、1型インターフェロン発現のレギュレーターの活性化を導くDAIの下流経路の分子の一つである。
TLR：トール様受容体。細胞外ロイシンリッチドメイン、並びにインターロイキン1受容体、及びショウジョウバエトールタンパク質と相同性を共有する細胞質ドメイン、により特徴付けられるパターン認識受容体のファミリー。病原体認識に続いて、トール様受容体は、様々な信号を変換する受容体タンパク質を動員し、活性化する(http://www.reference.md/files/D051/mD051193.html)。TLR9は、そのリガンドが、非メチル化CpGである受容体である。
Z-DNA：螺旋型のねじれが左であり、主溝及び副溝の間が少し異なる、DNAの一時的に現れる形態。
【発明の概要】
【００２４】
発明の概要
本発明の目的のために、過剰発現は、存在する細胞レベルに追加される量を発現することを意味する。
【００２５】
本発明は、新規分子アジュバントを用いた、免疫反応を増強するための方法及び生成物に関する。本発明は、一形態においては、対象における抗原特異的免疫反応を増強する方法として、有用である。本方法は、対象における免疫反応を誘導するために、アジュバント及びワクチン抗原の組み合わせを、対象に投与するステップを含む。本方法は、ポリヌクレオチドセンシング能力を有し、1型インターフェロンを含むサイトカインのゲノム転写の活性化を最終的に導く細胞内経路を活性化し得る、タンパク質を発現することができるRNA又はDNA発現ベクターを用いて、細胞にインビボで導入することを含む。ポリヌクレオチド結合タンパク質の発現は、このタンパク質の通常の細胞のレベルへの追加である。この新規プロセスは、抗原発現と同時に起こる一つのサイトカインの発現より幅広くなるサイトカイン発現をもたらす。
【００２６】
細胞のサイトカイン分泌を上方調節することができる細胞内タンパク質の重要な種類は、細胞質中で、ポリヌクレオチドと結合するそれらである。この機能を有する一部のタンパク質は、DNAと結合し、一部はRNAと結合する。これらのタンパク質の一つの目的は、細胞質中のウイルスのポリヌクレオチドを検出し、ウイルスの存在を細胞に警告することである。ポリヌクレオチドのその細胞質センサーとの結合は、IRF3依存的方法でI型インターフェロン産生、及び恐らくNF-κB依存的方法でIL-6上方調節することを導く生化学的経路を開始する。
【００２７】
この点において、本発明に従って、これらのタンパク質は、細胞中で過剰発現される時に、アジュバントとして、理想的な候補である。加えて、ワクチン抗原を発現するポリヌクレオチドベクター、及び細胞質中に残るワクチンアジュバントを発現するポリヌクレオチドベクターは、過剰発現されたポリヌクレオチド結合タンパク質と結合し、それゆえサイトカインの発現を誘導する細胞内経路が開始する複合体の一部となる。
【００２８】
本発明のアジュバントは、1型インターフェロンのDNA依存的アクチベータを発現することができるポリヌクレオチドベクターである。インターフェロンの一つのDNA依存的アクチベータは、3つの異なる名称、ZBP-1 (Z DNA結合タンパク質1)、DLM-1、及びDAI (インターフェロン調節因子のDNA依存的アクチベータ)により、知られている。このタンパク質の配列、及びDAIをコードする遺伝子は、国立医学図書館データベースで参照番号BC131706、又はGenBank でID NM_030776で見つけられる。本発明によれば、発現されたタンパク質の機能的活性を変更しないポリヌクレオチド配列への変更は、アジュバントとして発現されたタンパク質の使用を変更することなく行うことができる。
【００２９】
本発明に従って、DAIアジュバントは、DAIを発現することができる発現ベクターの形態で、DNAワクチン抗原と共に投与される。一つ又はそれ以上のワクチン抗原を発現することができる、一つ又はそれ以上のDNAワクチン抗原発現ベクターは、DAIを発現することができる発現ベクターと混合される。本発明に従って、抗原及びDAIの双方を発現することができるベクターを含む発現ベクターの混合物は、インビボでそれらの全てのタンパク質を発現させる目的のために、生体組織に導入される。
【００３０】
本発明の他のアジュバントは、インターフェロンのRNA依存的アクチベータを発現することができるポリヌクレオチドベクターである。インターフェロンのRNA依存的アクチベータの例は、RIG-1及びMda-5である。これらのタンパク質の双方は、CARD(カスパーゼ動員ドメイン)タンパク質と呼ばれるタンパク質の群の一員である。代表的なRIG-1タンパク質、及びヌクレオチド配列は、GenBankにて、参照番号AF092922.1で見つけられる。代表的なMda-5タンパク質及びヌクレオチド配列は、GenBankにて、参照番号AF095844.1で見つけられる。
【００３１】
本発明に従って、RIG-1及びMda-5アジュバントは、RIG-1及びMda-5を過剰発現することができる発現ベクターの形態で、RNAワクチン抗原と共に投与される。一つ又はそれ以上のワクチン抗原を発現することができる、一つ又はそれ以上のDNA又はRNAワクチン抗原発現ベクターは、RIG-1及びMda-5を過剰発現することができる発現ベクターと混合される。抗原及び細胞質RNA結合タンパク質の双方を発現することができるベクターを含む。発現ベクターの混合物は、インビボにおいて、それらの全てのタンパク質を発現する目的のために、生体組織中で、細胞に送達される。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、DAIが自然免疫を活性化する先行技術機構を記載する。DAIは、二つの異なる信号伝達経路を介して、I型インターフェロン(IFN)、及び他の炎症誘発性サイトカインの産生を誘導することが記載されている細胞質DNAセンサーである。dsDANのDAIとの結合は、IFN-α、及びIFN-β標的遺伝子の発現を導く転写因子IRF3の後続的な又は連続的な活性化に伴う、TBK1の動員及びリン酸化を誘導する。もう一つの経路は、DAIのRIP-1(及びまたRIP3)との結合、及び転写因子NFκBの活性化を導くIκBのリン酸化反応、及びI型IFN、及び炎症誘発性遺伝子、例えば、IL-6及びTNF-αなど、の転写を含む。
【図２】図2は、pVAX発現ベクターへのDAI遺伝子の挿入を示す、pDAIのプラスミド地図である。
【図３】図3は、エレクトロポレーションにより送達されたpDAIアジュバントを注入したマウスの皮膚における、I型IFN mRNAレベルの迅速な上方制御を示す。
【図４】図4は、エレクトロポレーションにより送達されたpDAIアジュバントを注入したマウスの皮膚における、炎症誘発性mRNAレベルの上方制御を示す。
【図５】図5は、pDAI及びTRP2をコードするベクター(pTRP2)で共免疫化されたマウスは、pTRP2ベクター単独で免疫化されたマウスよりも、強いCLT反応を有することを示す。
【図６】図6は、pDAI及びpTRP2で免疫化されたマウスにおいて、CD8+T細胞は、細胞表面上で分解マーカーCD107を上方制御し、それゆえ、細胞毒性表現型を提示/有することを示す。
【図７】図7は、pDAI及びpTRP2で共免疫化されたIRF3-/-及びIFN-α/βR-/-マウスにおいて、CD8+T細胞反応の増強は、インターフェロン反応因子3(IRF3)及び、I型IFN効果に依存的であることを示す。
【図８】図8は、pDAI共免疫化は、マウスのTRP2に対する抗体反応を増加させることを示す。抗体は、TRP2遺伝子が導入された細胞と結合し、抗マウス抗IgG FITC結合抗体を用いたフローサイトメトリ分析により検出された。
【図９】図9は、pDAI及びpTRP2で共免疫化したマウスは、pTRP2のみ、又は対照動物と比較して、B16腫瘍細胞でのチャレンジに対する生存率が向上したことを示す。
【図１０】図10は、pDAI及びpTRP2で共免疫化されたマウスの向上した生存率は、I pTRP2と比較して、IRF3に依存的であることを示す。
【図１１】図11は、pDAI+pTRP2免疫化は、マウスの再チャレンジに対して長期の保護を誘導することを示す。
【図１２】図12は、自己免疫白斑の出現は、マウスがpDAIで共免疫化されると、pTRP2での免疫化後、早くなることを示す。
【図１３】図13は、pDAI及びサバイビンをコードするプラスミド(pSURV)で共免疫化されたマウスは、pSURV単独で免疫化されたマウスよりも、強いT細胞反応を有することを示す。
【図１４】図14は、マウスにおける、pSURVに対する、pDAIのアジュバント効果は、IRF3によってもたらされないが、しかしI型インターフェロンによってもたらされることを示す。
【図１５】図15は、pDAI及びpSURVで共免疫化されたマウスは、pSURVのみ又は対照動物と比較して、B16腫瘍細胞でのチャレンジに対する向上した生存率を有することを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
発明の詳細な説明
一部のワクチン抗原は、乏しい免疫原性を有する。そのような抗原の種類の例は、その抗原が天然のタンパク質に大変よく類似している腫瘍抗原である。本発明のアジュバントの、ワクチン抗原との同時発現は、1型インターフェロンを誘導するサイトカインの発現を誘導する。サイトカインは順々に、ワクチン抗原の存在により誘導された抗原特異的免疫反応を後押しする。
【００３４】
本発明は、新規分子アジュバントを用いた、免疫反応を増強する方法及び生成物に関する。本発明は、ある形態において、対象における抗原特異的免疫反応を増強する方法として、有用である。本方法は、対象における免疫反応を誘導するために、対象に、アジュバント及びワクチン抗体の組み合わせを投与するステップを含む。本方法は、ポリヌクレオチド(ssDNA、dsDNA、ssRNA、又はdsRNA)センシング能力を有し、1型インターフェロンを誘導するサイトカインのゲノム転写の活性化を最終的に導く細胞内経路を活性化し得る、タンパク質を発現することができるRNA又はDNA発現ベクターを、インビボで細胞に導入することを含む。他の免疫調節物質はまた、この経路の直接的な又は間接的な副生成物として、発現される。ポリヌクレオチド結合タンパク質の発現は、このタンパク質の標準の細胞レベルに加えられる。この新規プロセスは、抗原発現と同時に起こる一つのサイトカインの発現より幅広くなるサイトカイン発現をもたらす。
【００３５】
本発明のアジュバントは、1型インターフェロンのDNA依存的アクチベータを発現することができるポリヌクレオチドベクターである。インターフェロンの一つのDNA依存的アクチベータは、3つの異なる名称、ZBP-1(Z DNA結合タンパク質1)、DLM-1、及びDAI(インターフェロン調節因子のDNA依存的アクチベータ)、で知られている。そのタンパク質の配列、及びDAIをコードする遺伝子は、国立医学図書館データベースで、参照番号BC131706又はGenBank ID NM_030776で見つけられる。発現されたタンパク質の機能的活性を変更しないポリヌクレオチドの配列への変更は、アジュバントとして発現されたタンパク質の使用を変更することなくつくられるとが認められる。
【００３６】
このDAIアジュバントは、DAIを発現することができる発現ベクターの形態で、DANワクチン抗原と共に投与される。一つ又はそれ以上のDNAのワクチン抗原を発現することができる、一つ又はそれ以上のDNAワクチン抗原発現ベクターは、DAIを発現することができる発現ベクターと混合される。抗原及びDAIの双方を発現することができるベクターを含む発現ベクターの混合は、インビボでそれらのタンパク質の全てを発現する目的のために、生体組織中に導入される。
【００３７】
発明の他のアジュバントは、インターフェロンのRNA依存的アクチベータを発現することができるポリヌクレオチドベクターである。インターフェロンのRNA依存的アクチベータの例は、RIG-1及びMda-5である。これらのタンパク質の双方は、CARD(カスパーゼ動員ドメイン)タンパク質と呼ばれるタンパク質の一群の一員である。代表的なRIG-1タンパク質及びヌクレオチド配列は、GenBankで参照番号AF092922.1で見つけられる。代表的なMda-5タンパク質及びヌクレオチド配列は、GenBankで参照番号AF095844.1で見つけられる。
【００３８】
RIG-1及びMda-5アジュバントは、RIG-1及びMda-5を過剰発現させることができる発現ベクターの形態で、RNAワクチン抗原と共に投与される。一つ又はそれ以上のワクチン抗原を発現することができる、一つ又はそれ以上のDNA又はRNAワクチン抗原発現ベクターは、RIG-1及びMda-5を過剰発現することができる発現ベクターと混合される。抗原及び細胞質RNA結合タンパク質の双方を発現することができるベクターを含む発現ベクターの混合は、インビボでそれらのタンパク質の全てを発現する目的のために、生体組織中の細胞に送達される。
【００３９】
ワクチン抗原及びアジュバントを発現することができる発現ベクターの混合物は、多数の方法で送達され得る。一つの方法は、単に、そこでは組織への混合物の導入であり、一部の発現ベクターが細胞に入る。しかしながら、このプロセスは、大変効率的というわけではなく、他の方法が、効率性の向上するために用いられる。例は、エレクトロポレーション、遺伝子銃(biolistic)送達、及びソノポレーション(sonoporation)である。化学的方法は、陽イオン性脂質、陽イオン性ポリマー、ナノ粒子などである。制限されることのない例として用いられる、その他の送達を増強する方法論は存在する。
【００４０】
本発明のアジュバントと共に用いられた発現された抗原は、当該分野において、知られている任意の種類でよい。例えば、抗原は、ペプチド、ポリペプチド、糖タンパク質、膜貫通タンパク質、及び哺乳動物細胞で発現される任意の他のタンパク質からなる群から選択される。
【００４１】
本発明の他の実施形態は、アジュバントの分離投与である。例えば、アジュバントは、同一の又は近い部位に、特定のワクチンチャレンジの前後の1以上の日に投与される。
【００４２】
本発明の他の実施形態は、発現ベクターにより発現された抗原以外の抗原を伴う、本発明のアジュバントを発現することができる発現ベクターの投与である。この実施形態のために、抗原は、ポリペプチド、タンパク質、多糖、ハプテン、糖化タンパク質、リポタンパク質、リポ多糖、細胞、細胞抽出物、多糖複合体、脂質、糖脂質、及び炭水化物からなる群から選択される。そのような抗原は、粗製物から高純度まで、精製の様々な形態で投与される。抗原は、天然産物、発酵産物、又は様々な種類の細胞で発現された組み換えDNA技術の生成物から単離される。抗原は、合成ペプチドでもよい。
【００４３】
本発明は、免疫反応の質及び量に作用するために用いられる。例えば、ウイルス性又は寄生性を含む多くの感染症に対する効果的な免疫反応は、しばしばTh-1型である。本発明のアジュバントを発現することができるベクターは、Th-1型免疫反応を促進するために用いられる。
【００４４】
用語「発現ベクター」は、抗原をコードするインサートに加え、必須要素、例えばプロモーター、プロモーターエンハンサ、及びポリアデニル化部位などのプラスミドDNAを含むが、これらに限定されない。用語「発現ベクター」は、DNA又はRNA型のウイルスを含むウイルスベクターを含んでよい。用語、発現ベクターはまた、メッセンジャーRNAを含んでよい。
【００４５】
ワクチンにおける、ワクチン抗体を伴う本発明の前述のアジュバントの包含は、追加成分、例えば賦形剤、医薬的に許容される担体、他のアジュバント、又は他の発現調節因子、例えばsiRNA、isRNA、又はオリゴヌクレオチドなど、の包含を限定しない。医薬的に許容される担体は、導入可能なワクチン、薬物、又は医薬を用いる使用のために、任意の物質的に好適でありうる。医薬的に許容される担体の非限定的な例は、水、PBS、ポリエチレンポリマー、ポリ塩化ビニルゲル、単糖、多糖、及び多数の他の物質を含む。
【００４６】
本発明の他の形態は、ワクチン抗原、及びインターフェロン調節因子のアクチベータの量を発現することができるポリヌクレオチドを含む、ワクチン組成物であり、ここで前記アクチベータの前記量は、アクチベータの存在する細胞レベルに加えられる。
【００４７】
一形態において、本発明は、インターフェロン発現のDNA依存的調節因子の過剰発現は、抗原に対する免疫反応を増強するという発見である。
【００４８】
本発明の好ましい実施形態は、アジュバントとしてDAIを発現することができるプラスミドの使用である。DAIを発現することができるプラスミドベクターは、そのような標準的な分子生物学的技術、及び参考によりその全体に組み込まれるMolecular Cloning：A Laboratory Manual第三版(CSHL Press)に記載されている技術、を用いて調製される。DAI発現ベクターは、哺乳動物細胞において、所望の抗原を発現することができるベクターと混合される。抗原の例は、感染症抗原、癌抗原、自己抗原、又は任意の他のタンパク質抗原を含む一覧から選択される。プラスミドは、医薬的に許容される担体と混合され、液体又は乾燥状態で保管される。DAIアジュバントを発現することができるプラスミド及びワクチン抗原の混合物の送達の好ましい方法は、エレクトロポレーションである。送達されるプラスミドのエレクトロポレーションのために、プラスミド混合物は、最初に皮膚に皮内注入され、又は同時にエレクトロポレーション電極で、挿入される。注入後、組織において既にされていない場合、エレクトロポレーション電極は、注入場所を測って挿入される。エレクトロポレーション電極の挿入後、パルス電場が適用される。好ましいパルス電場は、Pulse Agile（登録商標）電場である。具体的に、効果的なPulse Agile（登録商標）電場の例は、1125 V/cm、50μS 幅(第一パルスは200μSパルス間隔、及び第二パルスは50 mS間隔)の2つのパルス、に続く275 V/cm、10 mS幅、及び20 mSパルス間隔の8つのパルスである。記述したパルスを送達することができるエレクトロポレーションシステムは、Cyto Pulse Sciences Inc., Glen Burnie, Maryland, USA によりつくられたDerma Vax（登録商標）である。
【００４９】
マウスに対する、DAIを発現することができるプラスミドの送達を含む実験のために、マウスDAI遺伝子は、pVAXベクターにクローン化された。図2は、pVAX発現ベクターへの遺伝子挿入のプラスミド地図を示す。 
【００５０】
DAI遺伝子は、単離されたマウス脾臓細胞からクローン化された。全RNAは、RNeasy kit (Qiagen)を用いて単離された。cDNA合成は、50 ng(1μl)のランダムヘキサマープライマー、1μlの10 mM dNTP、及び11μlのRNAを用いて行われた。RNA/プライマー混合物は、65℃で5分間加熱された。氷上で冷却され、その後4μlの第一標準バッファ、1μl DTT、1μl RNase out、及び1μl Superscript III逆転写酵素を加えた。反応は、25℃で5分間、その後50℃で1時間行われた。酵素は70℃で15分間不活性化された。cDNAは、続いてDAI特異的プライマー：AGT CGA ATT CCC ACC ATG GCA GAA GCT CCT GTT GAC 及びAGT CGC GGC CGC TCA TTG CTT GCT CAG TCC TGTを用いたPCR反応に用いられた。10mMの1.25μlの各プライマーは、10μl Herculaseバッファ(Stratagene)、0.8μl 25 mM dNTP、33.7μl水、1μl Herculase 酵素と混合された。PCR反応は、95℃で加熱され、以下：95℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 90秒を35サイクル繰り返し、その後72℃ 7分、のように運転された。PCR反応は、1.5％アガロースゲル上で行われ、DAI(1.2 kDa)の大きさに対応するバンドを切り出して、Qiagen ゲル抽出スピンキットを用いて精製した。DAIは、続いて4μlのDAI PCR生成物、1μlのpCR-Bluntベクター、1μl 10Xリガーゼバッファ、3μlの水、及び1μlのInvitrogen T4 DNA リガーゼと混合することにより、カラーリングベクター、pCR-Blunt (invitrogen)にクローン化した。反応は、16℃で1時間行われ、2μlのライゲーション混合物は、その後50μlのコンピテント大腸菌を含むチューブに移され、42℃、90秒のヒートショックの前に、30分氷上に置かれた。形質転換は、450μlの周囲温度のSOC培地が添加される前に、氷上で2分間冷却され、形質転換された細菌は37℃で1時間培養され、100 μlの細胞は、前もって暖められたカナマイシンを含む(50μg/ml)アガープレートにプレーティングされ、37℃で一晩培養された。次に、コロニーは、プレートから摘み取られ、プラスミドDNAが抽出(Qiagen spin miniprep kit)される前に、LB培地中で37℃で一晩培養され、コロニーは、NotI及びEcoRI消化並びにアガロースゲル電気泳動により挿入が確認された。DAI(1.2 kb)の大きさに対応するNotI/EcoRI消化バンドは、切り出され、Qiagen ゲル抽出スピンキットを用いて精製された。精製されたDAI DNAは、その後NotI/EcoRIで消化され、上述のように精製されたpVAXベクターにクローン化された。ライゲーションは、1μlのpVAX DNA、及び4μlのDAI DNA、1μlのT4バッファ、3μlの水、並びに1μl T4 DNAリガーゼで、16℃で1時間行った。2μlのライゲーション混合物は、その後50μlのコンピテント大腸菌を含むチューブに移され、42℃、90秒のヒートショックの前に、30分氷上に置かれた。形質転換は、450μlの周囲温度のSOC培地は添加される前に、氷上で2分間冷却され、形質転換された細菌は37℃で1時間培養され、100μlの細胞は、前もって暖められたカナマイシンを含む(50μg/ml)アガープレートにプレーティングされ、37℃で一晩培養された。次に、コロニーは、プレートから摘み取られ、プラスミドDNAが抽出(Qiagen spin miniprep kit)される前に、LB培地中で37℃で一晩培養され、コロニーは、NotI及びXbal消化並びにアガロースゲル電気泳動により挿入が確認された。正しい制限パターン( 0.3、1.0及び3.5 kbのバンド)を有するクローンは、選択され、ベクター特異的プライマー(T7、TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG；及びBGH, TAG AAG GCA CAG TCG AGG)により配列が決定された。
【実施例】
【００５１】
実施例1
エレクトロポレーションにより送達されたpDAIアジュバントを注入されたマウスの皮膚のI型IFN mRNAレベルの上方制御(図3)。
【００５２】
C57BL/6マウスは、イソフルレンで麻酔され、PBS中40μgプラスミドDNAで、29ゲージのインスリングレードシリンジ(Micro-Fine U-100, BD Consumer Healthcare, Franklin Lakes, NJ, USA)を用いて尾の根元近くに2箇所(各20μg)皮内注入されて、1度免疫化された。すぐに、平行ニードルアレイ電極(4つの2mmピン2列、1.5 x 4 mm間隔) は、注入泡(bleb)の上に置かれ、電気パルス(2つの1125 V/cmパルス、続いて8つの275 V/cmパルス)は、Derma Vax（登録商標）皮内送達システム(Cyto Pulse Sciences, Inc)を用いて適用された。マウスは、40μg空ベクター(pVAX、n=6)、又は20μgDAIをコードするベクターに加えて20μgの空ベクター(pDAI、n=6)と共に注入された。DNAエレクトロポレーションから6又は24時間後、皮膚サンプルは、注入部位から取られ、2 mlのRNAlater RNA安定化試薬(Qiagen)中に４℃で保管された。全RNAは、RNeasy Mini Kit (Qiagen)を用いてマウスの皮膚から単離され、cDNAは、製造者の指示に従って、調製された(iScript cDNA synthesis kit; Bio- Rad; Hercules, CA)。メッセンジャーRNAレベルは、２ステップ循環プログラム(95℃で1分、続いて95℃で15秒、及び、62〜64℃で1分の40サイクル)を用いた、リアルタイム定量PCR(iQ SYBR Green Supermix; Bio-Rad, ABI7500; Applied Biosystems, Carlsbad, CA)により定量化した。IFN-α及びIFN-βの相対的な遺伝子発現は、L32ハウスキーピング遺伝子に対して、それぞれの対象の発現を標準化することにより決定した(*P<0.05、スチューデントのt検定)。エラーバーは、平均の標準偏差を表す。 
【００５３】
【表１】
2012523456.tif 000002
【００５４】
結果を、図3に示す。1型インターフェロンは、DAIを発現することができるプラスミドを共にマウスの皮膚にトランスフェクションすることにより、著しく上方制御された。注入から6時間後、IFA-α及びIFN-βの上昇したレベルは、見られた。
【００５５】
実施例2
エレクトロポレーションにより送達されたpDAIアジュバントを共に注入されたマウスの皮膚の炎症誘発性mRNAレベルの上方制御(図4)。
【００５６】
C57BL/6マウスは、イソフルレンで麻酔され、PBS中40μgプラスミドDNAで、29ゲージのインスリングレードシリンジ(Micro-Fine U-100, BD Consumer Healthcare, Franklin Lakes, NJ, USA)を用いて尾の根元近くに2箇所(各20μg)皮内注入されて、1度免疫化された。すぐに、平行ニードルアレイ電極(4つの2mmピン2列、1.5 x 4 mm間隔) は、注入泡の上に置かれ、電気パルス(2つの1125 V/cmパルス、続いて8つの275 V/cmパルス)は、Derma Vax（登録商標）皮内送達システム(Cyto Pulse Sciences, Inc)を用いて適用された。マウスは、40μg空ベクター(pVAX、n=6)、又は20μgのDAIをコードするベクターに加えて20μgの空ベクター(pDAI、n=6)を注入された。DNAエレクトロポレーションから24時間後、皮膚サンプルは、注入部位から取られ、2 mlのRNAlater RNA安定化試薬(Qiagen)中に４℃で保管された。全RNAは、RNeasy Mini Kit (Qiagen)を用いてマウスの皮膚から単離され、cDNAは、製造者の指示に従って、調製された(iScript cDNA synthesis kit; Bio- Rad; Hercules, CA)。メッセンジャーRNAレベルは、２ステップ循環プログラム(95℃で1分、続いて95℃で15秒、及び、62〜64℃で1分の40サイクル)を用いた、リアルタイム定量PCR(iQ SYBR Green Supermix; Bio-Rad, ABI7500; Applied Biosystems, Carlsbad, CA)により定量化した。CIITA、CD80、IFN-γ、IL6、IL10、IL12、TNF-αの相対的な遺伝子発現は、L32ハウスキーピング遺伝子に対して、それぞれの対象の発現を標準化することにより決定した(*P<0.05、スチューデントのt検定)。エラーバーは、平均の標準偏差を表す。
【００５７】
【表２】
2012523456.tif 000003
【００５８】
結果を、図4に示す。IL-6及びTNFα mRNAの上昇したレベルは、処理から24時間後の、注入部位から取られた皮膚において顕著であった。それゆえ、皮膚細胞にエレクトロポレーションにより送達された、DAIを発現することができるプラスミドは、1型インターフェロン以外のサイトカインの二次的発現を誘導する。
【００５９】
実施例3
pDAI及びTRP2をコードするベクター(pTRP2)で共免疫化されたマウスは、pTRP2ベクター単独で免疫化されたマウスよりも、強いCTL反応を有する(図5)。
【００６０】
C57BL/6マウスは、イソフルレンで麻酔され、PBS中40μgプラスミドDNAで、29ゲージのインスリングレードシリンジ(Micro-Fine U-100, BD Consumer Healthcare, Franklin Lakes, NJ, USA)を用いて尾の根元近くに2箇所(各20μg)皮内注入されて、2度、2週間空けて、免疫化された。すぐに、平行ニードルアレイ電極(4つの2mmピン2列、1.5 x 4 mm間隔)は、注入泡の上に置かれ、電気パルス(2つの1125 V/cmパルス、続いて8つの275 V/cmパルス)は、Derma Vax（登録商標）皮内送達システム(Cyto Pulse Sciences, Inc)を用いて適用された。マウスは、20μgのDAIをコードするベクターに加えて20μgの空ベクター(pDAI、n=8)、20μgのヒトチロシン関連タンパク質2をコードするベクターに加えて20μgの空ベクター(pTRP2、n=8)、又は20μgのDAIをコードするベクターに加えて20μg pTRP2(pDAI+pTRP2、n=8)を注入され、2度目の免疫化から13日後、リンパ球は、次の通りに、末梢血から単離された。マウスは、尾から出血させられ、約300μlの血液が、100μlヘパリン溶液を含むチューブに回収された。赤血球は、1 mlの塩化アンモニウム(ACK)バッファ(1X Pharm Lyse BD)で、周囲温度で5分間を添加することにより溶解された。10〜12 mlの培地が加えられ、サンプルは400 gで5分間遠心分離された。上清は棄てられ、細胞沈殿物は、7 mlの完全細胞培養培地(RPMI1640、10％FBS、ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン/ストレプトマイシン、及び非-必須アミノ酸)に懸濁され、400 gで5分間遠心分離された。細胞沈殿物は、200μlの細胞培養培地に(細胞濃度が100μlあたり約500,000細胞となるように)再懸濁され、U底96ウェル細胞培養プレートに、ウェルあたり100μlずつ移された。完全培地中の、2.5μMの濃度の100μlのTRP2又は対照ペプチドは、各ウェルに添加された。37℃、5％ CO2でインキュベーションから2時間後、1：200で希釈された50μl GolgiPlug (BD)は各ウェルに添加された。
【００６１】
その後、インキュベーションは、37℃で6時間行われた。19μlの培地中の1μl Fc-block(BD)は、400 g、4℃、5分間での遠心分離により、細胞が回収される20分前にウェルごとに加えられた。細胞は、一度200μl PBS-1％FBSで洗浄され、19μlのPBS-1％FBS中の1μl PE結合抗マウスCD8抗体で染色された。染色は、暗所で、４℃、30分行われた。その後、細胞は、200μl PBS-1％FBSで2度洗浄され、遠心分離により回収された(400 g、4℃、5分)。100μlのCytofix/Cytoperm（登録商標）溶液(BD)で、暗所で、４℃、20分間固定化され、インターフェロンガンマ(IFN-γ)を染色する前に、その後1X Perm/Wash（登録商標）溶液(BD)で2度洗浄された。1μl抗マウスIFN-γFITC結合(BD)抗体を含む20μlのPerm/Wash（登録商標）溶液は、暗所で、４℃、30分間、細胞に添加された。その後細胞は、1X Perm/Wash（登録商標）溶液(1 ml/チューブにおいて染色のための洗浄)で2度洗浄され、フローサイトメトリ分析の前に、PBS-1％FBSに再懸濁された。
【００６２】
結果を図5示す。pDAIでのみ免疫化したマウスにおいて、CD8+T細胞は、TRP2ペプチドで刺激したときに、バックグラウンドIFN-γ産生のみを示し、pTRP2プラスミドで免疫化したマウスは、低いがしかし検出できる反応を有した。pDAI及びpTRP2で共免疫化されたマウスにおけるT細胞反応、すなわちCD8+T細胞は、著しく上昇した(*P<0.05、D'Agostino及びPearsonのオムニバス正規性検定、続いてスチューデントのt検定)。二つの独立した実験の一つの代表を示す。エラーバーは、平均の標準偏差を表す。
【００６３】
実施例4
pTRP2で免疫化されたマウスにおいて、CD8+T細胞は、細胞表面上で分解マーカーCD107を上方制御し、それゆえ、細胞毒性表現型を有する(図6)。
【００６４】
C57BL/6マウスは、イソフルレンで麻酔され、PBS中40μgプラスミドDNAで、29ゲージのインスリングレードシリンジ(Micro-Fine U-100, BD Consumer Healthcare, Franklin Lakes, NJ, USA)を用いて尾の根元近くに2箇所(各20μg)皮内注入されて、2度、2週間空けて、免疫化された。すぐに、平行ニードルアレイ電極(4つの2mmピン2列、1.5 x 4 mm間隔)は、注入泡の上に置かれ、電気パルス(2つの1125 V/cmパルス、続いて8つの275 V/cmパルス)は、Derma Vax（登録商標）皮内送達システム(Cyto Pulse Sciences, Inc)を用いて適用された。マウスは、20μgDAIをコードするベクターに加えて20μgの空ベクター(pDAI、n=9)、20μgヒトチロシン関連タンパク質2をコードするベクターに加えて20μgの空ベクター(pTRP2、n=9)、又は20μgのDAIをコードするベクターに加えて20μg pTRP2(pDAI+pTRP2、n=9)を注入された。2度目の免疫化から13日後、リンパ球は、次の通りに、末梢血から単離された。マウスは、尾から出血させられ、約300μlの血液が、100μlヘパリン溶液を含むチューブに回収された。赤血球は、1 mlの塩化アンモニウム(ACK)バッファ(1X Pharm Lyse BD)で、周囲温度で5分間を添加することにより溶解された。10〜12 mlの培地が加えられ、サンプルは400 gで5分間遠心分離された。上清は棄てられ、細胞沈殿物は7 mlの完全細胞培養培地(RPMI1640、10％FBS、ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン/ストレプトマイシン及び非-必須アミノ酸)に懸濁され、400 gで5分間遠心分離された。細胞沈殿物は、200μlの細胞培養培地に(細胞濃度が100μlあたり約500,000細胞となるように)再懸濁され、U底96ウェル細胞培養プレートに、ウェルごとに、100μl移された。2.5μMのTRP2又は対照ペプチド、及び1：100希釈の抗マウス抗CD107a FITC結合を含む100μlの培地は、ウェルごとに添加された。37℃、5％ CO2でインキュベーションから2時間後、1：200で希釈された50μl GolgiPlug(BD)はウェルごとに添加された。その後、インキュベーションは、37℃で6時間行われた。19μlの培地中の1μl Fc-block(BD)は、400 g、4℃、5分間での遠心分離により、細胞が回収される20分前にウェルごとに加えられた。細胞は、一度200μl PBS-1％FBSで洗浄され、19μlのPBS-1％FBS中の1μl PE結合抗マウスCD8抗体で染色された。染色は、暗所で、４℃、30分行われた。その後、細胞は、200μl PBS-1％FBSで2度洗浄され、遠心分離により回収された(400 g、4℃、5分)。100μlのCytofix/Cytoperm（登録商標）溶液(BD)で、暗所で、４℃、20分間固定化され、インターフェロンガンマ(IFN-γ)を染色する前に、それから1X Perm/Wash（登録商標）溶液(BD)で2度洗浄された。1μl抗マウスIFN-γAPC結合(BD)抗体を含む20μlのPerm/Wash（登録商標）溶液は、暗所で、４℃、30分間、細胞に添加された。その後、細胞は、1X Perm/Wash（登録商標）溶液(1 ml/チューブにおいて染色のための洗浄)で2度洗浄され、フローサイトメトリ分析の前に、PBS-1％FBSに再懸濁された。
【００６５】
結果を図6に示す。pTRP2およびpDAI+pTRP2で免疫化されたマウスからのCD8+T細胞は、平均蛍光強度(MFI)により測定されたように分解マーカーCD107の同様のレベルを発現し、それゆえ、細胞毒性表現型において違いを示さなかった(*P<0.05、スチューデントのt検定)。エラーバーは、平均の標準偏差を表す。
【００６６】
実施例5 
pDAI及びpTRP2で共免疫化されたマウスにおけるCD8+T細胞反応の増強は、インターフェロン反応因子3(IRF3)及び、I型IFN効果に依存的である(図7)。
【００６７】
IFN-α/βR-/-(群につきn=8)、及びIRF3-/- (群につきn=6)マウスは、イソフルレンで麻酔され、PBS中40μgプラスミドDNAで、29ゲージのインスリングレードシリンジ(Micro-Fine U-100, BD Consumer Healthcare, Franklin Lakes, NJ, USA)を用いて尾の根元近くに2箇所(各20μg)皮内注入されて、2度、2週間空けて、免疫化された。すぐに、平行ニードルアレイ電極(4つの2mmピン2列、1.5 x 4 mm間隔) は、注入泡の上に置かれ、電気パルス(2つの1125 V/cmパルス、続いて8つの275 V/cmパルス)は、Derma Vax（登録商標）皮内送達システム(Cyto Pulse Sciences, Inc)を用いて適用された。マウスは、40μg空ベクター(pVAX)、20μg DAIをコードするベクターに加えて20μgの空ベクター(pDAI)、20μg ヒトチロシン関連タンパク質2をコードするベクターに加えて20μgの空ベクター(pTRP2)、又は20μgのDAIをコードするベクターに加えて20μg pTRP2(pDAI+pTRP2)を注入された。2度目の免疫化から13日後、リンパ球は、次の通りに、末梢血から単離された。マウスは、尾から出血させられ、約300μlの血液が、100μlヘパリン溶液を含むチューブに回収された。赤血球は、1 mlの塩化アンモニウム(ACK)バッファ(1X Pharm Lyse BD)で、周囲温度で5分間を添加することにより溶解された。10〜12 mlの培地が加えられ、サンプルは400 gで5分間遠心分離された。上清は棄てられ、細胞沈殿物は7 mlの完全細胞培養培地(RPMI1640、10％FBS、ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン/ストレプトマイシン及び非-必須アミノ酸)に懸濁され、400 gで5分間遠心分離された。細胞沈殿物は、200μlの細胞培養培地に(細胞濃度が100μlあたり約500,000細胞となるように)再懸濁され、U底96ウェル細胞培養プレートに、ウェルあたり100μl、移された。完全培地中の、2.5μMの濃度の100μlのTRP2又は対照ペプチドは、ウェルごとに添加された。37℃、5％ CO2でインキュベーションから2時間後、1：200で希釈された50μl GolgiPlug (BD)はウェルごとに添加された。
【００６８】
その後、インキュベーションは、37℃で6時間行われた。19μlの培地中の1μl Fc-block(BD)は、400 g、4℃、5分間での遠心分離により、細胞が回収される20分前にウェルに加えられた。細胞は、一度200μl PBS-1％FBSで洗浄され、19μl のPBS-1％FBS中の1μl PE結合抗マウスCD8抗体で染色された。染色は、暗所で、４℃、30分行われた。その後、細胞は、200μl PBS-1％FBSで2度洗浄され、遠心分離により回収された(400 g、4℃、5分)。100μlのCytofix/Cytoperm（登録商標）溶液(BD)で、暗所で、４℃、20分間固定化され、インターフェロンガンマ(IFN-γ)を染色する前に、それから1X Perm/Wash（登録商標）溶液(BD)で2度洗浄された。1μl抗マウスIFN-γPE結合(BD抗体を含む20μlのPerm/Wash（登録商標）溶液は、暗所で、４℃、30分間、細胞に添加された。その後細胞は、1X Perm/Wash（登録商標）溶液(1 ml/チューブにおいて染色のための洗浄)で2度洗浄され、フローサイトメトリ分析の前に、PBS-1％FBSに再懸濁された。
【００６９】
結果を図7に示す。pDAIアジュバントに関するI型インターフェロン誘導の役割を調査するために、I型インターフェロン受容体及びインターフェロン反応因子3の欠損したマウスは、pDAI及びpTRP2によりワクチン投与された。DAIのアジュバント効果は、この抗原のDAIアジュバントのための無傷のI型信号伝達に依存を示すIFN-α/βR-/-において、損失した。このことは、IRF3-/-マウスにおけるDAIのアジュバント効果の損失により、さらに明確にされ、それはI型インターフェロン産生を導く一つの目立つDAI信号伝達の経路をノックアウトする(*P<0.05、スチューデントのt検定)。エラーバーは、平均の標準偏差を表す。
【００７０】
実施例6
pDAI共免疫化は、TRP2に対する抗体反応を増加させる。抗体は、TRP2遺伝子が注入された細胞と結合し、抗マウス抗IgG FITC結合抗体を用いたフローサイトメトリ分析により検出された(図8)。
【００７１】
C57BL/6マウスは、イソフルレンで麻酔され、PBS中40μgプラスミドDNAで、29ゲージのインスリングレードシリンジ(Micro-Fine U-100, BD Consumer Healthcare, Franklin Lakes, NJ, USA)を用いて尾の根元近くに2箇所(各20μg)皮内注入されて、2度、2週間空けて、免疫化された。すぐに、平行ニードルアレイ電極(4つの2mmピン2列、1.5 x 4 mm間隔) は、注入泡の上に置かれ、電気パルス(2つの1125 V/cmパルス、続いて8つの275 V/cmパルス)は、Derma Vax（登録商標）皮内送達システム(Cyto Pulse Sciences, Inc)を用いて適用された。マウスは、40μg空ベクター(pVAX)、20μg DAIをコードするベクターに加えて20μgの空ベクター(pDAI、n=9)、20μgヒトチロシン関連タンパク質2をコードするベクターに加えて20μg空ベクター(pTRP2、n=9)、又は20μgのDAIをコードするベクターに加えて20μg pTRP2ベクター(pDAI+pTRP2、n=9)を注入された。2度目の免疫化から13日後、リンパ球は、次の通りに、末梢血から単離された。マウスは、尾から出血させられ、約300μlの血液が、100μlヘパリン溶液を含むチューブに回収された。血液サンプルは、350 gで5分間遠心分離され、血漿は回収された。サンプルは、プールされ、連続的にPBS-1％FBSで2倍希釈ステップで、12.5から400倍の間に、希釈された。分析の4日前に、2,000,000約3,000,000個のHEK293細胞は、0.02％ゼラチンで被膜された10 cmのディッシュに、37℃、15分播かれた。細胞は、抗生物質なしで、10％FBSのDMEM中で一晩培養された。細胞は、PBSで洗浄され、6 mlのOpti-MEMが添加された。
【００７２】
その後、24μgのpTRP2は1.5 mlのOpti-MEMと混合され、平行して、60μlのLipofectamine 2000は、1.5 ml のOpti-MEMと混合された。トランスフェクション混合物は、混合の前に周囲温度で5分間インキュベートされ、続けて20分インキュベーションされた。トランスフェクション混合物は、その後細胞培養の上に滴らせ、20％FBSのDMEMを9 ml加える前に、細胞は37℃で3時間置かれた。3時間後、培地はDMEM 10％FBSに交換され、それらが上下のピペッティングにより回収される前に、細胞は37℃で48時間培養された。細胞は、PBSで2度洗浄され、400 gで5分間遠心分離され、それらは96ウェルプレートに細胞がプレートされる前に、PBS-1％FBSに再懸濁された。細胞は、350 gで2分間遠心分離され、培地は棄てられた。様々な希釈の20μlの血漿サンプルは、異なる細胞に加えられ、結合は37℃で1時間行われた。細胞は、PBS-1％FBSで2度洗浄され、1：20希釈の20μlの第二抗体(蛍光抗マウス免疫グロブリン)が加えられた。検出抗体は、上述のように細胞が2度洗浄される前に、4℃で20分間インキュベートされ、細胞は、200μl 4％パラホルムアルデヒドで再懸濁され、4℃で15分間固定化された。細胞は、上述のように再び洗浄され、400 gで5分間の遠心分離により回収され、PBS-1％FBSで2度洗浄され、200μlのPBS-1％FBSに再懸濁され、フローサイトメトリ分析まで、FACSチューブに移された。
【００７３】
結果を図8に示す。pDAI+pTRP2で共免疫化したマウスの血漿サンプルにおいて、pTRP2のみで免疫化したマウスと比較して、増加した反応の傾向があった。pDAI及びpVAX免疫化動物において、反応性はなかった。
【００７４】
実施例7
pDAI及びpTRP2で共免疫化したマウスは、pTRP2のみ、又は対照動物と比較して、B16腫瘍細胞でのチャレンジに対する生存率が向上したことを示す(図9)。
【００７５】
C57BL/6マウスは、イソフルレンで麻酔され、PBS中40μgプラスミドDNAで、29ゲージのインスリングレードシリンジ(Micro-Fine U-100, BD Consumer Healthcare, Franklin Lakes, NJ, USA)を用いて尾の根元近くに2箇所(各20μg)皮下注射により、2度、2週間空けて、免疫化された。すぐに、平行ニードルアレイ電極(4つの2mmピン2列、1.5 x 4 mm間隔) は、注入泡の上に置かれ、電気パルス(2つの1125 V/cmパルス、続いて8つの275 V/cmパルス)は、Derma Vax（登録商標）皮内送達システム(Cyto Pulse Sciences, Inc)を用いて適用された。マウスは、20μg DAIをコードするベクターに加えて20μgの空ベクター(pDAI、n=6)、20μgの空ベクターに加えて20μgヒトチロシン関連タンパク質2をコードするベクター(pTRP2、n=6)、又は20μg DAIをコードしたベクターに加えて20μgヒトチロシン関連タンパク質2をコードするベクター(pDAI+pTRP2、n=11)を注入された。2度目の免疫化から2週間後、マウスは、50,000 B16腫瘍細胞により脇への皮下注射によりチャレンジされた。腫瘍成長は、動物施設の職員により、1週間に2度、触診すること、及び腫瘍の大きさをキャリパーで測定すること、により観察された。動物は、腫瘍の大きさが、10x10x10 mmの大きさを超えたときに屠殺され、生存率は経時的に示された。
【００７６】
結果を図9に示す。CD8+T細胞において見られた、pTRP2に対するpDAIのアジュバント効果は、浸潤性メラノーマ腫瘍細胞株で腫瘍チャレンジに対する防御の高い程度(pTRP2免疫化群の50％と比較して82％)になった。腫瘍のないままでいるマウスは、実験の間中(チャレンジ後100日超)、健康を維持した。 
【００７７】
実施例8
pTRP2と比較してpDAI及びpTRP2で共免疫化されたマウスの向上した生存率は、IRF3に依存的する(図10)。
【００７８】
IRF3-/-マウス(C57BL/6バックグラウンド)は、イソフルレンで麻酔され、PBS中40μgプラスミドDNAで、29ゲージのインスリングレードシリンジ(Micro-Fine U-100, BD Consumer Healthcare, Franklin Lakes, NJ, USA)を用いて尾の根元近くに2箇所(各20μg)皮内注入されて、2度、2週間空けて、免疫化された。すぐに、平行ニードルアレイ電極(4つの2mmピン2列、1.5 x 4 mm間隔) は、注入泡の上に置かれ、電気パルス(2つの1125 V/cmパルス、続いて8つの275 V/cmパルス)は、Derma Vax（登録商標）皮内送達システム(Cyto Pulse Sciences, Inc)を用いて適用された。マウスは、40μgの空ベクター(pVAX、n=6)、20μg DAIをコードしたベクターに加えて20μgの空ベクター(pDAI、n=5)、20μgヒトチロシン関連タンパク質2をコードするベクターに加えて20μgの空ベクター(pTRP2、n=6)、又は20μg DAIをコードするベクターに加えて20μgの空ベクター(pDAI+pTRP2、n=6)を注入された。2度目の免疫化から2週間後、マウスは、50,000 B16腫瘍細胞で脇の皮下注射によりチャレンジされた。腫瘍成長は、動物施設職員により、1週間に2度、触診すること、及び腫瘍の大きさをキャリパーで測定すること、により観察された。動物は、腫瘍の大きさが、10x10x10 mmの大きさを超えたときに屠殺され、生存率は経時的に示された。
【００７９】
野生型C57BL/6において見られた腫瘍防御のpDAIのアジュバント効果は、浸潤性B16メラノーマ細胞でチャレンジされたIRF3-/-マウスにおいて観察されなかった(図10)。腫瘍のないままでいるマウスは、実験の間中(チャレンジ後100日超)、健康を維持した。
【００８０】
実施例9
pDAI+pTRP2免疫化は再チャレンジに対する長期の防御を誘導する(図11)。
【００８１】
29ゲージのインスリングレードシリンジ(Micro-Fine U-100, BD Consumer Healthcare, Franklin Lakes, NJ, USA)を用いて尾の根元近くに2箇所(各20μg)皮内注入されて、PBS中DNAで、2度、2週間空けて、免疫化された。すぐに、平行ニードルアレイ電極(4つの2mmピン2列、1.5 x 4 mm間隔)は、注入泡の上に置かれ、電気パルス(2つの1125 V/cmパルス、続いて8つの275 V/cmパルス)は、Derma Vax（登録商標）皮内送達システム(Cyto Pulse Sciences, Inc)を用いて適用された。マウスは、20μgヒトチロシン関連タンパク質2をコードするベクターに加えて20μgの空ベクター(pTRP2)、又は20μgのDAIをコードするベクターに加えて20μg pTRP2ベクター(pDAI+pTRP2)を注入された。2度目の免疫化から2週間後、マウスは、50,000 B16腫瘍細胞で脇に皮下注射することによりチャレンジされた。腫瘍成長は、動物施設職員により、1週間に2度、触診すること、及び腫瘍の大きさをキャリパーで測定すること、により観察された。動物は、腫瘍の大きさが、10x10x10 mmの大きさを超えたときに屠殺され、生存率は経時的に示された。50,000 B16腫瘍細胞による最初のチャレンジを生き延びたマウスは、pTRP2(n=10)、及びpTRP2+pDAI(n=9)で免疫化された群から集められた。これらのマウスは、ナイーブ対照(n=8)と共に、最初のチャレンジから3ヶ月後、B16腫瘍細胞の高い投与量(150,000)で、反対側(右脇)に再チャレンジを行った。腫瘍成長は、動物施設職員により、1週間に2度、触診すること、及び腫瘍の大きさをキャリパーで測定すること、により観察された。動物は、腫瘍の大きさが、10x10x10 mmの大きさを超えたときに屠殺され、生存率は経時的に示された。
【００８２】
図11は、CD8+T細胞において見られたpTRP2ワクチン投与に対するpDAIのアジュバント効果は、最初のチャレンジから3ヶ月後、浸潤性メラノーマ腫瘍細胞株の高投与量での腫瘍チャレンジに対して、防御の高い程度になったことを示した。腫瘍防御は、pTRP2免疫化及び、ナイーブマウスにおける0％と比較して、pDAI+pTRP2免疫化マウスにおいて、44％であった。腫瘍のないままでいるマウスは、実験の間中(チャレンジ後60日)、健康を維持した。
【００８３】
実施例10
自己免疫白斑の出現は、マウスがpDAIで共免疫化されたときに、pTRP2で免疫化後、早くなる(図12)。
【００８４】
C57BL/6マウスは、イソフルレンで麻酔され、PBS中40μgプラスミドDNAで、29ゲージのインスリングレードシリンジ(Micro-Fine U-100, BD Consumer Healthcare, Franklin Lakes, NJ, USA)を用いて尾の根元近くに2箇所(各20μg)皮内注入されて、2度、2週間空けて、免疫化された。すぐに、平行ニードルアレイ電極(4つの2mmピン2列、1.5 x 4 mm間隔)は、注入泡の上に置かれ、電気パルス(2つの1125 V/cmパルス、続いて8つの275 V/cmパルス)は、Derma Vax（登録商標）皮内送達システム(Cyto Pulse Sciences, Inc)を用いて適用された。マウスは、20μg DAIをコードするベクターに加えて20μgの空ベクター(pDAI、n=9)、20μgヒトチロシン関連タンパク質2をコードするベクターに加えて20μgの空ベクター(pTRP2、n=9)、又は20μgのDAIをコードするベクターに加えて20μg pTRP2(pDAI+pTRP2、n=9)を注入された。 
【００８５】
図12は、2度目の免疫化後、白斑は、ほとんどのTRP2免疫化動物に出現したことを示す。白斑は、メラニン産生細胞に対するCD8+T細胞が仲介される自己免疫反応である。メラニンは、マウスTRP2を発現する細胞によって産生され、それらの細胞を殺すことは、白斑をもたらす。最初に、白斑は免疫化の部位の周りに位置するが、時間を経て、白斑はマウスの全体にかけて広がる。ここで、我々は、DAIを伴って又は伴わずに、pTRP2でワクチン投与したマウスにおける白斑の出現を示した。DAIを伴って共免疫化したマウスにおいて、白斑は2度目の免疫化後すぐに現われ、それはDAI免疫化反応マウスにおける、CD8+T細胞反応の早い反応速度論、又はCD8+T細胞反応の高い重要性の表れである。
【００８６】
実施例11
pDAI及びサバイビンをコードするプラスミド(pSURV)で共免疫化されたマウスは、pSURV単独で免疫化されたマウスよりも、強いT細胞反応を有する(図13)。
【００８７】
C57BL/6マウスは、イソフルレンで麻酔され、PBS中40μgプラスミドDNAで、29ゲージのインスリングレードシリンジ(Micro-Fine U-100, BD Consumer Healthcare, Franklin Lakes, NJ, USA)を用いて尾の根元近くに2箇所(各20μg)皮内注入されて、2度、2週間空けて、免疫化された。すぐに、平行ニードルアレイ電極(4つの2mmピン2列、1.5 x 4 mm間隔)は、注入泡の上に置かれ、電気パルス(2つの1125 V/cmパルス、続いて8つの275 V/cmパルス)は、Derma Vax（登録商標）皮内送達システム(Cyto Pulse Sciences, Inc)を用いて適用された。マウスは、20μg DAIをコードするベクターに加えて20μgの空ベクター(pDAI、n=7)、20μg ヒトサバイビンをコードするベクターに加えて20μgの空ベクター(pSurv、n=8)、又は20μg のpDAI+20μgベクターpSurv(pDAI+pSurv、n=8)を注入された。2度目の免疫化から12日後、次の通りに、末梢血からリンパ球は単離された。マウスは、尾から出血させられ、約300μlの血液が、100μlヘパリン溶液を含むチューブに回収された。赤血球は、1 mlの塩化アンモニウム(ACK)バッファ(1X Pharm Lyse BD)で、周囲温度で5分間を添加することにより溶解された。10〜12 mlの培地が加えられ、サンプルは400 gで5分間遠心分離された。上清は棄てられ、細胞沈殿物は7 mlの完全細胞培養培地(RPMI1640、10％FBS、ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン/ストレプトマイシン及び非-必須アミノ酸)に懸濁され、400 gで5分間遠心分離された。細胞沈殿物は、300μlの細胞培地に再懸濁され、U底96ウェル細胞培養プレートに、ウェルあたり100μlが移された。完全培地中の、2.5μMの濃度の100μlのサバイビン(surviving)特異的ペプチドSurv20、Surv56又は対照ペプチドは、各ウェルに添加された。37℃、5％ CO2でインキュベーションから2時間後、1：200で希釈された50μl GolgiPlug (BD)は各ウェルに添加された。
【００８８】
その後、インキュベーションは、37℃で6時間行われた。19μlの培地中の1μl Fc-block(BD)は、400 g、4℃、5分間での遠心分離によって細胞が回収される20分前に、ウェルに加えられた。細胞は、一度200μl PBS-1％FBSで洗浄され、19 μlのPBS-1％FBS中の1μl PE結合抗マウスCD8抗体で染色された。染色は、暗所で、４℃、30分行われた。その後、細胞は、200μl PBS-1％FBSで2度洗浄され、遠心分離(400 g、4℃、5分)により回収された。細胞は、100μlのCytofix/Cytoperm（登録商標）溶液(BD)で、暗所で、４℃、20分間固定化され、インターフェロンガンマ(IFN-γ)を染色する前に、それから1X Perm/Wash（登録商標）溶液(BD)で2度洗浄された。1μl抗マウスIFN-γFITC結合(BD)抗体、及び1μl抗マウスIL-2 APC結合(BD)を含む20μlのPerm/Wash（登録商標）溶液は、暗所で、４℃、30分間、細胞に添加された。その後、細胞は、1X Perm/Wash（登録商標）溶液(1 ml/チューブにおいて染色のための洗浄)で2度洗浄され、フローサイトメトリ分析の前に、PBS-1％FBSに再懸濁された。
【００８９】
pDAIで免疫化されたマウスにおいて、CD8+T細胞は、二つのサバイビン由来ペプチドでの刺激したときに、バックグラウンドIFN-γ産生のみ示し、pSURVプラスミドで免疫化したマウスは、CD8+T細胞の約1％のIFN-γ産生に反応した(図13)。マウスがpSURV及びpDAIで共免疫化されたときに、この割合は、6％まで著しく上昇した(双方のペプチドについてp<0.002、マンホイットニーU検定)。IL-2反応は、双方の群において低くかったが、しかしpDAI+pSURVの群においては著しく増加した(双方のペプチドについてp<0.003、マンホイットニーU検定)。二つの独立した実験の一つの代表を示す。エラーバーは、平均の標準偏差を表す。
【００９０】
実施例12
pSURVに対するpDAIのアジュバント効果は、I型インターフェロンによって仲介されない(図14)。
【００９１】
IFN-α/βR-/-マウス(群につきn=7)及びIRF3-/- mice(群につきn=8)は、イソフルレンで麻酔され、PBS中40μgプラスミドDNAで、29ゲージのインスリングレードシリンジ(Micro-Fine U-100, BD Consumer Healthcare, Franklin Lakes, NJ, USA)を用いて尾の根元近くに2箇所(各20μg)皮内注入されて、2度、2週間空けて、免疫化された。すぐに、平行ニードルアレイ電極(4つの2mmピン2列、1.5 x 4 mm間隔) は、注入泡の上に置かれ、電気パルス(2つの1125 V/cmパルス、続いて8つの275 V/cmパルス)は、Derma Vax（登録商標）皮内送達システム(Cyto Pulse Sciences, Inc)を用いて適用された。マウスは、20μg DAIをコードするベクターに加えて20μgの空ベクター(pDAI)、20μgヒトサバイビンををコードするベクターに加えて20μgの空ベクター(pSurv)、又は20μgのpDAI+20μgベクターpSurv(pDAI+pSurv)を注入された。2度目の免疫化から12日後、次の通りに、末梢血からリンパ球は単離された。マウスは、尾から出血させられ、約300μlの血液が、100μlヘパリン溶液を含むチューブに回収された。赤血球は、1 mlの塩化アンモニウム(ACK)バッファ(1X Pharm Lyse BD)で、周囲温度で5分間を添加することにより溶解された。10〜12 mlの培地が加えられ、サンプルは400 gで5分間遠心分離された。上清は棄てられ、細胞沈殿物は7 mlの完全細胞培養培地(RPMI1640、10％FBS、ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン/ストレプトマイシン及び非-必須アミノ酸)に懸濁され、400 gで5分間遠心分離された。細胞沈殿物は、300μlの細胞培養培地に再懸濁され、U底96ウェル細胞培養プレートに、ウェルあたり100μlが、移された。完全培地中の、2.5μMの濃度の100μlのサバイビン(surviving)特異的ペプチドSurv20、Surv56又は対照ペプチドは、各ウェルに添加された。37℃、5％ CO2でのインキュベーションから2時間後、1：200で希釈された50μl GolgiPlug (BD)は各ウェルに添加された。 
【００９２】
その後、インキュベーションは、37℃で6時間行われた。19μlの培地中の1μl Fc-block(BD)は、400 g、4℃、5分間での遠心分離によって細胞が回収される20分前に、ウェルに加えられた。細胞は、一度200μl PBS-1％FBSで洗浄され、19μlのPBS-1％FBS中の1μl PE結合抗マウスCD8抗体で染色された。染色は、暗所で、４℃、30分行われた。その後、細胞は、200μl PBS-1％FBSで2度洗浄され、遠心分離により回収された(400 g、4℃、5分)。100μlのCytofix/Cytoperm（登録商標）溶液(BD)で、暗所で、４℃、20分間固定化され、インターフェロンガンマ(IFN-γ)を染色する前に、それから1X Perm/Wash（登録商標）溶液(BD)で2度洗浄された。1μl抗マウスIFN-γFITC結合(BD)抗体、及び1μl抗マウスIL-2 APC結合(BD)を含む20μlのPerm/Wash（登録商標）溶液は、暗所で、４℃、30分間、細胞に添加された。その後細胞は、1X Perm/Wash（登録商標）溶液(1 ml/チューブにおいて染色のための洗浄)で2度洗浄され、フローサイトメトリ分析の前に、PBS-1％FBSに再懸濁された。
【００９３】
pDAIアジュバント性(adjuvanticity)におけるI型インターフェロン誘導の役割の調査のために、我々は、I型インターフェロン受容体、及びインターフェロン反応因子3の欠損したマウスを、pDAI及びpSurvで免疫化した。全ての反応は、IFN-α/βR-/-マウスにおいて低かったが、しかしそこにはまだ小さいが、しかし顕著なDAIのアジュバント効果があった(p<0.05、ステューデントのt検定)(図14)。この結果は、IRF3-/-マウスにおいて、そのDAIのアジュバント効果は健在であり、顕著であることが、さらに強調された(p<=0.01)。この抗原のために、DAIのアジュバント効果は、それゆえ、I型インターフェロン反応に独立していると見られる。エラーバーは、平均の標準偏差を示す。
【００９４】
実施例13
pDAI及びpSURVで共免疫化されたマウスは、pSURVのみ又は対照動物と比較して、B16腫瘍細胞でのチャレンジに対する向上した生存率を有する(図15)。
【００９５】
C57BL/6マウスは、イソフルレンで麻酔され、PBS中40μgプラスミドDNAで、29ゲージのインスリングレードシリンジ(Micro-Fine U-100, BD Consumer Healthcare, Franklin Lakes, NJ, USA)を用いて尾の根元近くに2箇所(各20μg)皮内注入されて、2度、2週間空けて、免疫化された。すぐに、平行ニードルアレイ電極(4つの2mmピン2列、1.5 x 4 mm間隔) は、注入泡の上に置かれ、電気パルス(2つの1125 V/cmパルス、続いて8つの275 V/cmパルス)は、Derma Vax（登録商標）皮内送達システム(Cyto Pulse Sciences, Inc)を用いて適用された。マウスは、20μgDAIをコードするベクターに加えて20μgの空ベクター(pDAI、n=8)、20μgの空ベクター20μgに加えてヒトサバイビンをコードするベクター(pSURV、n=9)、又は20μgのDAIをコードするベクターに加えてヒトサバイビンをコードするベクター(pDAI+ pSURV、n=5)を注入された。2度目の免疫化から1週間後、マウスは、100,000個のB16腫瘍細胞が脇に皮下注射によりチャレンジされた。腫瘍成長は、動物施設職員により、1週間に2度、触診すること、及び腫瘍の大きさをキャリパーで測定すること、により観察された。動物は、腫瘍の大きさが、10x10x10 mmの大きさを超えたときに屠殺され、生存率は経時的に示された。
【００９６】
CD8+T細胞で見られたpSURVへのpDAIのアジュバント効果は、浸潤性メラノーマ腫瘍細胞株での腫瘍チャレンジに対する防御(pSURVのみ免疫化群の22％と比較して40％)の高い程度に変わった(図15)。腫瘍のないままでいるマウスは、実験の間中(チャレンジ後100日)、健康を維持した。
【００９７】
本発明の先に記載された記述は、当業者が、その最良の態様であると現在考えられるものをつくり、使用することを可能にする一方で、当業者は変更、組み合わせ、並びにその具体的な実施形態、方法、及び実施例と同等のものの存在を理解し、認めるだろう。従って、本発明は、上述の実施形態、方法、及び実施例により制限されるべきではないが、本発明の範囲及び趣旨内の全ての実施形態及び方法によって制限される。
【００９８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年1月11日(2012.1.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2012523456000001.app
【国際調査報告】
2012523456.tif 000019
2012523456.tif 000020