(57)【要約】【課題】本発明は、心不全および心臓組織における心筋梗塞後リモデリングのプロセスに関与するｍｉＲＮＡの同定に関する。【解決手段】心筋梗塞、心臓リモデリングおよび心不全の治療としての、これらの同定されたｍｉＲＮＡの調節が記載される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の心臓細胞において、表３〜６に列挙されている１または複数のｍｉＲＮＡの発現または活性を調節する工程を含む、その必要がある対象における心筋梗塞、心臓リモデリングまたは心不全を治療または予防する方法。
【請求項２】
１または複数のｍｉＲＮＡが、ｌｅｔ−７ファミリーメンバー、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１９９ａ、ｍｉＲ−１９９ｂ、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−１０ａ、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１４６ｂ、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−４９７、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−２０ｂ、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−３０ファミリーメンバー、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１５０およびｍｉＲ−２９ａ〜ｃからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
調節工程が、ｌｅｔ−７ファミリーメンバー、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１９９ａ、ｍｉＲ−１９９ｂ、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−１０ａ、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１４６ｂ、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−３０ファミリーメンバーおよびｍｉＲ−４９７からなる群から選択される１または複数のｍｉＲＮＡの阻害剤を対象に投与する工程を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
１または複数のｍｉＲＮＡの阻害剤がアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンタゴｍｉｒである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドが、前記１または複数のｍｉＲＮＡの成熟配列と少なくとも部分的に相補的な配列を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
アンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも１個の糖および／または骨格修飾を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドが約８〜約１８ヌクレオチド長である、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
調節工程が、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−２０ｂ、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２９ｂおよびｍｉＲ−２９ｃからなる群から選択される１または複数のｍｉＲＮＡのアゴニストを対象に投与する工程を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
１または複数のｍｉＲＮＡのアゴニストが、１または複数のｍｉＲＮＡの成熟配列を含むポリヌクレオチドである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
アゴニストが発現構築物から発現される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
阻害剤またはアゴニストが、静脈内投与または心臓組織への直接注射によって対象に投与される、請求項３または８に記載の方法。
【請求項１２】
前記阻害剤またはアゴニストが、経口、経皮、持続放出、制御放出、遅延放出、坐剤、カテーテルまたは舌下投与によって対象に投与される、請求項３または８に記載の方法。
【請求項１３】
第２の心臓療法を対象に投与する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記第２の療法が、β遮断薬、変力作用薬、利尿剤、ＡＣＥ−Ｉ、ＡＩＩアンタゴニスト、ＢＮＰ、Ｃａ＋＋遮断薬、エンドセリン受容体アンタゴニストまたはＨＤＡＣ阻害剤からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
梗塞域における線維症が１または複数のｍｉＲＮＡの調節後に減少する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
梗塞域におけるアポトーシスが１または複数のｍｉＲＮＡの調節後に減少する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
対象がヒトである、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２００９年５月２０日に出願された米国仮出願第６１／１７９，７７５号の利益を主張する。
【０００２】
政府援助に関する言明
本発明は、米国国立衛生研究所により与えられた助成金番号ＨＬ５３３５１−０６の下での助成金援助によりなされた。同政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、一般に、発生生物学、心臓病学、病理学および分子生物学の分野に関する。より特定すれば、本発明は、心筋梗塞後（MI後）の組織およびヒト心不全試料におけるｍｉＲＮＡ発現の改変に関する。制御されたｍｉＲＮＡの発現操作は、心筋梗塞および心不全の治療のための新しい治療上のアプローチを提供する。
【背景技術】
【０００４】
冠動脈疾患、心筋梗塞、うっ血性心不全および心肥大を含む心疾患およびその症状は、今日の米国における重大な健康リスクを明らかに示す。これらの疾患に罹患した患者を診断、治療およびサポートするための費用は数十億ドルにも及ぶ。心疾患の特に重篤な症状は心筋梗塞である。より一般的には心臓発作として知られている心筋梗塞（MI）は、心臓の一部への血液供給が途絶したときに生じる病状であり、これは不安定プラークの破裂によって起こることが最も多い。その結果生じる虚血または酸素不足は心臓組織の損傷および壊死の可能性をもたらす。これは、世界全体で男女共に主要な死亡原因である。米国単独では、冠動脈心疾患は死亡例５例につき１例の原因であり、約７，２００，０００名の男性および６，０００，０００名の女性が何らかの形の冠動脈心疾患を抱えて生きている。そのうち、毎年１，２００，０００名が初発または再発性の冠動脈発作を患い、その約４０％が発作のため死亡する。これは、およそ６５秒に１名のアメリカ人が冠動脈イベントで死亡していることを意味する。
【０００５】
心臓への血流障害が十分に長く続く場合、心臓細胞が壊死し、その部分にコラーゲン瘢痕が形成される虚血性カスケードが誘発される。最近の研究により、アポトーシスによる細胞死もまた、心筋梗塞に続く組織損傷のプロセスに役割を果たすことが示された。その結果、患者の心臓は回復不能な損傷を受ける。この瘢痕組織はまた、患者を生命に関わる可能性のある不整脈のリスクにさらし、破裂して破滅的な結末を伴う可能性のある心室瘤の形成をもたらすことがある。傷害を受けた心臓組織は、正常な心臓組織よりも緩慢に電気インパルスを伝導する。傷害を受けた組織と傷害を受けていない組織との間の伝導速度の差は、多くの致死性不整脈の原因であると考えられるリエントリーまたはフィードバックループを誘発し得る。心拍出量および血圧は危険レベルまで低下し、さらなる冠動脈虚血および梗塞巣の拡大をもたらし得る。
【０００６】
梗塞組織における直接的な影響に加えて、梗塞周囲の境界域における隣接組織は、遺伝子制御の改変によって誘発される病的なリモデリングを起こす。このリモデリングは、この領域におけるさらなる筋細胞減少、肥厚化およびさらなるコラーゲン沈着をもたらす。梗塞に続発して、心筋細胞肥大および間質性線維症の発症により、遠隔心筋が梗塞に応答する。このように、梗塞組織に対する損傷は、ＭＩと診断され臨床的に対処される時点までには恐らくほとんど回復不能となるが、ＭＩ後リモデリングによるさらなる変化は、治療的介入の可能性がより高いポイントを示す。しかし、現在、心疾患のこの側面に取り組むための既知の治療はない。
【０００７】
ＭＩ後リモデリングに関連する遺伝子発現およびシグナリング経路の変化は、傷害を受けた心臓の機能回復を可能にする治療標的の同定を目的として精力的に研究されてきた。近年、心肥大および心不全におけるマイクロＲＮＡの重要な役割が記載され、心疾患の新たな制御様式が指摘された。マイクロＲＮＡ（miRNA）は、それぞれのｍｉＲＮＡ遺伝子、タンパク質コード遺伝子のイントロン、または多くの場合複数の密接に関連するｍｉＲＮＡをコードするポリシストロニック転写産物に由来する、約１８〜約２５ヌクレオチド長の小分子非タンパク質コードＲＮＡである。Ｃａｒｒｉｎｇｔｏｎら（Science、301(5631)巻:336〜338頁、2003年）による総説を参照されたい。ｍｉＲＮＡは、その配列が完全に相補的である場合はその分解を促進することによって、あるいはその配列がミスマッチを含む場合は翻訳を抑制することによって、標的ｍＲＮＡのリプレッサーとして機能する。
【０００８】
ｍｉＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（pol II）またはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩにより転写され（pol III；Qiら（2006年）、Cellular & Molecular Immunology、第3巻、411〜419頁を参照されたい）、一次ｍｉＲＮＡ転写産物（プリmiRNA）と呼ばれ、一般に数千塩基の長さである。プリｍｉＲＮＡは、核内においてＲＮアーゼＤｒｏｓｈａにより約７０〜約１００ヌクレオチドのヘアピン形状の前駆体（プレmiRNA）へとプロセシングされる。細胞質への輸送後、ヘアピンプレｍｉＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒによりさらにプロセシングされて、二本鎖ｍｉＲＮＡをもたらす。次いで、成熟ｍｉＲＮＡ鎖は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（RISC）内に組み込まれ、そこで、塩基対相補性により、その標的ｍＲＮＡと会合する。ｍｉＲＮＡが、ｍＲＮＡ標的と完全に塩基対形成する比較的まれな場合において、ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡの分解を促進する。ｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡと不完全なヘテロ二重鎖を形成し、ｍＲＮＡの安定性を損なうか、またはｍＲＮＡの翻訳を阻害することがより一般的である。
【０００９】
マウスおよびヒトにおける少数の遺伝的研究に基づいて、ｍｉＲＮＡが実際に心臓のリモデリング、発達、コンダクタンスおよび収縮性に活発に関与していることが、次第に明らかになってきた（van RooijおよびOlson (2007) Journal of Clinical Investigation, Vol. 117(9):2369-2376において考察される）。心血管疾患に関与するｍｉＲＮＡの同定および特性評価は、心筋梗塞および心不全などの心血管疾患の治療のための新規な治療アプローチの開発に重要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、ヒトにおける心筋梗塞および心不全後の心臓組織において制御される数種類のｍｉＲＮＡの発見に一部基づく。これらの同定されたｍｉＲＮＡの調節は、心筋梗塞、心臓リモデリングおよび心不全を治療または予防するための新規の治療アプローチを提供する。したがって、本発明は、対象の心臓細胞において同定されたｍｉＲＮＡのうちの１または複数の発現または活性を調節する工程を含む、その必要がある対象において心筋梗塞、心臓リモデリングまたは心不全を治療または予防する方法を提供する。一実施形態において、１または複数のｍｉＲＮＡは、ｌｅｔ−７ファミリーメンバー、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１９９ａ、ｍｉＲ−１９９ｂ、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−１０ａ、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１４６ｂ、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−４９７、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−２０ｂ、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−３０ファミリーメンバー、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３４ｃ、ｍｉＲ−５７４、ｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−４９９、ｍｉＲ−１００、ｍｉＲ−３７８、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−３７９、ｍｉＲ−７６２、ｍｉＲ−３３５、ｍｉＲ−７１１、ｍｉＲ−１４９、ｍｉＲ−２１８、ｍｉＲ−１８１ａ〜ｄ、ｍｉＲ−２２およびｍｉＲ−１８５からなる群から選択される。
【００１１】
一実施形態において、本方法は、同定されたｍｉＲＮＡのうちの１または複数の阻害剤を対象に投与する工程を含む。例えば、阻害剤は、ｌｅｔ−７ファミリーメンバー、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１９９ａ、ｍｉＲ−１９９ｂ、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−ｌ０ａ、ｍｉＲ−ｌ０ｂ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１４６ｂ、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−３０ファミリーメンバーおよびｍｉＲ−４９７からなる群から選択されるｍｉＲＮＡの発現または活性の阻害剤とすることができる。１または複数のｍｉＲＮＡの阻害剤は、アンタゴｍｉｒ、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは阻害性ＲＮＡ分子を含むことができる。
【００１２】
別の一実施形態において、方法は、同定されたｍｉＲＮＡのうちの１または複数のアゴニストを対象に投与する工程を含む。一部の実施形態において、アゴニストは、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−２０ｂ、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２９ｂおよびｍｉＲ−２９ｃからなる群から選択されるｍｉＲＮＡの発現または活性を上昇させる。特定の実施形態において、１または複数のｍｉＲＮＡのアゴニストは、１または複数のｍｉＲＮＡの成熟配列を含むポリヌクレオチドである。アゴニストは、発現構築物からｉｎ  ｖｉｖｏで発現させることができる。
【００１３】
一部の実施形態において、方法は、β遮断薬、変力作用薬（inotrope）、利尿剤、ＡＣＥ−Ｉ、ＡＩＩアンタゴニスト、ＢＮＰ、Ｃａ＋＋遮断薬、エンドセリン受容体アンタゴニストまたはＨＤＡＣ阻害剤等、第２の心肥大療法を対象に投与する工程をさらに含むことができる。第２の療法は、ｍｉＲＮＡ調節薬（例えば、阻害剤またはアゴニスト）と同時に投与してもよく、あるいはｍｉＲＮＡ調節薬の前または後に投与してもよい。
【００１４】
次の図面は本明細書の一部を構成し、本発明の特定の態様をさらに明示するよう含まれている。本発明は、本明細書に示されている特定の実施形態の詳細な説明と併せてこれらの図面の１または複数を参照することにより、さらに良く理解できるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ＭＩに応答したｍｉＲＮＡプロファイリングを示す図である。Ａ．筋細胞肥大、進行中の筋細胞減少およびコラーゲン沈着を有するＭＩ後３日目の瘢痕形成を示す、心臓切片のＭａｓｓｏｎトリクローム染色。梗塞１４日後に、非梗塞領域において心肥大および間質性線維症を生じる薄く伸展した梗塞巣が存在する（I、梗塞巣；BZ、境界域；R、遠隔心筋）。Ｂ．ｍｉＲＮＡがＭＩに応答して非常に動的に制御されることを示すマイクロアレイ解析。初期梗塞治癒後であっても、ＭＩ後１４日目の境界域において１１個のｍｉＲが重複して上方制御され、一方１５個のｍｉＲが下方制御される。Ｃ．ＭＩ後３日目と１４日目両方の境界域領域において上方制御されるｍｉＲ（左パネル）および下方制御されるｍｉＲ（右パネル）の棒グラフ。Ｄ．リアルタイムＰＣＲ解析により、シャム手術した動物と比較した、ＭＩに応答したｍｉＲＮＡの制御を確認した（ｎ＝３〜４）。Ｅ．非不全心臓と比較した、ＭＩに応答したヒト心臓試料における示されたｍｉＲＮＡのリアルタイムＰＣＲ解析（ｎ＝５〜６）。Ｆ．３つの非不全ヒト心臓および５つのＭＩ後ヒト心臓におけるｍｉＲ−２１のノーザンブロット解析。
【図２】ＭＩ後の梗塞領域においてｍｉＲ−２９が下方制御されることを示す図である。Ａ．ｍｉＲＮＡの保存シード領域（５’末端のｂｐ２〜８）および３’末端における高レベルの配列保存を示す、ｍｉＲ−２９ファミリーメンバーの配列アライメント。Ｂ．複数の組織のノーザンブロット解析は、肺および腎臓において高い発現レベルで、全３種のｍｉＲ−２９メンバーの発現の広範な重複を示す。ｍｉＲ−２９メンバーのうち、ｍｉＲ−２９ｂが心臓において最も高度な発現を示した。Ｃ．ｍｉＲ−２９のリアルタイムＰＣＲ解析は、無血清培地（SF）中で維持、またはフェニレフリン（PE）で刺激した心筋細胞と比較して線維芽細胞においてこのｍｉＲが高度に発現されることを示した。Ｄ．ＭＩ後３日目の心臓組織のノーザンブロット解析は、シャム手術した動物と比較した、ＭＩに応答したｍｉＲ−２９の一貫した下方制御を示す。ｍｉＲ−２９の下方制御は、遠隔心筋よりも境界域において顕著である。Ｅ．リアルタイムＰＣＲ解析は、全ｍｉＲ−２９メンバーがＭＩに応答して制御されることを示す。下方制御はＭＩ後３日目の梗塞の境界域（BZ）において最も顕著であるが、初期梗塞治癒が起きていた場合、この下方制御は梗塞１４日後に依然として存在したままである。
【図３】ｍｉＲ−２９が細胞外マトリックスタンパク質の発現を制御することを示す図である。Ａ．主要線維症遺伝子の３’ＵＴＲ領域におけるｍｉＲ−２９の潜在的結合部位候補。Ｂ．ＭＩ後３日目の境界域と遠隔心筋の両方における予測標的遺伝子のリアルタイムＰＣＲ解析。ｍｉＲ−２９発現の減少は、コラーゲン（COL1A1、COL1A2およびCOL3A1）ならびにフィブリリン（FBN1）発現の上昇と相関する。エラスチン（ELN1）の有意な変化は観察されなかった。Ｃ．漸増量のｍｉＲ−２９ｂ−１／ｍｉＲ−２９ａクラスターでトランスフェクトしたＣＯＳ細胞のノーザンブロット解析は、ｍｉＲ−２９の効率的な過剰発現を示す。Ｄ．予測標的遺伝子の内在性ＵＴＲ配列を用いたルシフェラーゼ実験。ｍｉＲ−２９ｂ−１／ｍｉＲ−２９ａの発現はルシフェラーゼの発現を抑制するが、無関係のｍｉＲであるｍｉＲ−２０６が発現しても抑制は起こらない。
【図４】ｍｉＲ−２９の発現がＴＧＦβ応答性であることを示す図である。Ａ．リアルタイムＰＣＲ解析は、全３種のｍｉＲ−２９ファミリーメンバーがＴＧＦβに応答して線維芽細胞において下方制御されること示す。Ｂ．リアルタイムＰＣＲで判定された通り、ＢＮＰ発現の増加と一致してｍｉＲ−２０８変異動物においてｍｉＲ−２９発現が上方制御されていることを示すノーザン解析。
【図５】ｍｉＲ−２９の抑制が線維症をｉｎ  ｖｉｖｏ誘導することを示す図である。Ａ．アンチｍｉＲ−２９およびミスマッチ（mm）ｍｉＲ−２９オリゴヌクレオチドの化学構造。Ｂ．８０ｍｇ／ｋｇのアンチｍｉＲ−２９もしくはｍｍ  ｍｉＲ−２９のいずれか、または同等の容量の生理食塩水の静脈内注射に応答した３日後の組織特異的ノックダウンを示すノーザンブロット解析。Ｃ．肝臓抽出物のリアルタイムＰＣＲ解析は、ｍｉＲ−２９ノックダウンに応答したコラーゲン発現の顕著な増加を示す。この効果は、生理食塩水またはｍｍ  ｍｉＲ−２９注射後には見られなかった。Ｄ．２日連続で８０ｍｇ／ｋｇのアンチｍｉＲ−２９もしくはｍｍ  ｍｉＲ−２９オリゴヌクレオチドまたは同等の容量の生理食塩水を静脈内注射した３週間後に採取された組織のノーザンブロット解析。アンチｍｉＲ−２９の注射は、心臓、肝臓および腎臓における重度のｍｉＲ−２９ノックダウンをもたらすが、肺におけるｍｉＲ−２９レベルは影響を受けていない様子を示した。Ｅ．心臓抽出物のリアルタイムＰＣＲ解析は、ｍｉＲ−２９ノックダウンに応答した心臓のコラーゲン発現の増加を示す。Ｆ．ｍｉＲ−２９ｂ模擬治療２日後の線維芽細胞においてｍｉＲ−２９ｂ発現が増加したのに対し、ｍｉＲ−２９ａレベルは変化せず、ｍｉＲ−２９ｃレベルは微増であったことを示す、リアルタイムＰＣＲ解析。Ｇ．リアルタイムＰＣＲ解析で判定された通り、線維芽細胞におけるｍｉＲ−２９ｂの過剰発現はコラーゲン遺伝子の発現を抑制する。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、心筋梗塞後に制御されるｍｉＲＮＡサブセットの同定に一部基づく。特に、本発明者らは、心筋梗塞（MI）誘導３日後に梗塞領域の境界域において有意に制御された４０個のｍｉＲＮＡと、遠隔心筋において制御された２２個のｍｉＲＮＡを見出した。さらに、ＭＩ誘導２週間後に６９個のｍｉＲＮＡの発現は梗塞領域の境界域において変化し、一方４０個のｍｉＲＮＡは遠隔心筋において制御された。さらに本発明者らは、不全ヒト心臓の心臓組織において制御される、異なるが重複するｍｉＲＮＡサブセットを見出した。ヒト心不全患者の心臓組織において、３１個のｍｉＲＮＡは有意に上方制御されることが判明したが、一方４５個のｍｉＲＮＡは有意に下方制御された。制御されるｍｉＲＮＡにおける重複は、これらのｍｉＲＮＡが異なる心疾患プロセスに関与し、病状に積極的に影響を及ぼす可能性を示唆する。したがって、本発明は、対象の心臓細胞において表３〜６に列挙されている１または複数のｍｉＲＮＡの発現または活性を調節する工程を含む、その必要がある対象における心筋梗塞、心臓リモデリングまたは心不全を治療または予防する方法を提供する。特定の実施形態において、１または複数のｍｉＲＮＡは、ｌｅｔ−７ファミリーメンバー（例えば、let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f、let-7gおよびlet-7i）（配列番号１〜８）、ｍｉＲ−１５ｂ（配列番号９）、ｍｉＲ−２１（配列番号１０）、ｍｉＲ−１９９ａ（配列番号１１）、ｍｉＲ−１９９ｂ（配列番号１２〜１３）、ｍｉＲ−２１４（配列番号１４）、ｍｉＲ−１０ａ（配列番号１５）、ｍｉＲ−１０ｂ（配列番号１６）、ｍｉＲ−１６（配列番号１７）、ｍｉＲ−１４６ａ（配列番号１８）、ｍｉＲ−１４６ｂ（配列番号１９〜２０）、ｍｉＲ−２２１（配列番号２１）、ｍｉＲ−２２２（配列番号２２）、ｍｉＲ−４９７（配列番号２３）、ｍｉＲ−２０ａ（配列番号２４）、ｍｉＲ−２０ｂ（配列番号２５）、ｍｉＲ−９３（配列番号２６）、ｍｉＲ−１０１（配列番号２７）、ｍｉＲ−１２６（配列番号２８）、ｍｉＲ−３０ファミリーメンバー（例えば、miR-30a、miR-30b、miR-30c、miR-30dおよびmiR-30e）（配列番号２９〜３３）、ｍｉＲ−１４３（配列番号３４）、ｍｉＲ−１４５（配列番号３５）、ｍｉＲ−１５０（配列番号３６）、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃ（配列番号３７〜３９）、ｍｉＲ−３４ａ（配列番号４０）、ｍｉＲ−３４ｃ（配列番号４１〜４２）、ｍｉＲ−５７４（配列番号４３〜４４）、ｍｉＲ−４５１（配列番号４５）、ｍｉＲ−４９９（配列番号４６）、ｍｉＲ−１００（配列番号４７）、ｍｉＲ−３７８（配列番号４８）、ｍｉＲ−２４（配列番号４９）、ｍｉＲ−３７９（配列番号５０）、ｍｉＲ−７６２（配列番号５１）、ｍｉＲ−３３５（配列番号５２）、ｍｉＲ−７１１（配列番号５３）、ｍｉＲ−１４９（配列番号５４）、ｍｉＲ−２１８（配列番号５５）、ｍｉＲ−１８１ａ〜ｄ（配列番号５６〜５９）、ｍｉＲ−２２（配列番号６０）およびｍｉＲ−１８５（配列番号６１）からなる群から選択される。
【００１７】
本明細書において、用語「対象」または「患者」は、ヒトその他の霊長目（例えば、チンパンジーその他の類人猿およびサルの種）、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマ）、飼育哺乳動物（例えば、イヌおよびネコ）、実験動物（例えば、マウス、ラットおよびモルモット等、げっ歯類）ならびに鳥類（例えば、ニワトリ、シチメンチョウその他の家禽、アヒル、ガチョウその他等、飼育鳥、野鳥および狩猟鳥）を含む任意の脊椎動物を意味するが、これらに限定されるものではない。一部の実施形態において、対象は哺乳動物である。他の実施形態において、対象はヒトである。治療される対象がヒトであるこのような実施形態において、調節される１または複数のｍｉＲＮＡはヒトｍｉＲＮＡ配列である。
【００１８】
本明細書において、用語「調節する」は、ｍｉＲＮＡの生物活性の変化または改変を意味する。調節は、ｍｉＲＮＡの発現レベルの変化、ｍｉＲＮＡの結合特性（例えば、標的mRNAまたはRISC複合体の成分との）の変化またはｍｉＲＮＡに関連した生物学的もしくは機能的性質におけるその他の変化とすることができる。調節は、ｍｉＲＮＡの発現または機能の上昇であっても、あるいは低下であってもよい。用語「調節薬」は、上述の通りｍｉＲＮＡの発現または生物活性を変化または改変することのできる任意の分子または化合物を意味する。
【００１９】
一実施形態において、方法は、表３〜６に列挙されている１または複数のｍｉＲＮＡ（または対応するヒトmiRNA）の阻害剤を対象に投与する工程を含む。一部の実施形態において、阻害剤はプレｍｉＲＮＡまたはプリｍｉＲＮＡ配列を標的とする。他の実施形態において、阻害剤は成熟ｍｉＲＮＡ配列を標的とする。別の一実施形態において、阻害剤は、ｌｅｔ−７ファミリーメンバー（例えば、let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f、let-7gおよびlet-7i）（配列番号１〜８）、ｍｉＲ−１５ｂ（配列番号９）、ｍｉＲ−２１（配列番号１０）、ｍｉＲ−１９９ａ（配列番号１１）、ｍｉＲ−１９９ｂ（配列番号１２〜１３）、ｍｉＲ−２１４（配列番号１４）、ｍｉＲ−１０ａ（配列番号１５）、ｍｉＲ−ｌ０ｂ（配列番号１６）、ｍｉＲ−１６（配列番号１７）、ｍｉＲ−１４６ａ（配列番号１８）、ｍｉＲ−１４６ｂ（配列番号１９〜２０）、ｍｉＲ−２２１（配列番号２１）、ｍｉＲ−２２２（配列番号２２）、ｍｉＲ−４９７（配列番号２３）ならびにｍｉＲ−３０ファミリーメンバー（例えば、miR-30a、miR-30b、miR-30c、miR-30dおよびmiR-30e）（配列番号２９〜３３）からなる群から選択される１または複数の成熟ｍｉＲＮＡ配列の発現または活性の阻害剤である。
【００２０】
特定の実施形態において、１または複数のｍｉＲＮＡの阻害剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドまたはそれらの組合せを含むことができる。好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１種類の化学修飾（例えば、糖または骨格修飾）を有する。例えば、適切なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、二環式糖ヌクレオシド修飾（BSN）含有オリゴヌクレオチドとその相補的マイクロＲＮＡ標的鎖との間で形成された複合体に増強された熱安定性を付与する１または複数の「立体配座的に制限された」またはＢＳＮからなる。例えば、一実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１個の「ロックト核酸」を含む。ロックト核酸（LNA）は、リボース糖成分が「ロックされた」立体配座の２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレンリボヌクレオシド（構造Ａ）を含む。別の一実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１個の２’，４’−Ｃ−架橋２’デオキシリボヌクレオシド（CDNA、構造Ｂ）を含む。例えば、その両者共にその全体が本明細書の一部を構成するものとしてここに援用されている、米国特許第６，４０３，５６６号明細書およびＷａｎｇら（1999年）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、９巻：１１４７〜１１５０頁を参照されたい。さらに別の一実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、構造Ｃに示す構造を有する少なくとも１個の修飾ヌクレオシドを含む。１または複数のｍｉＲＮＡを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＢＳＮ（LNA、CDNA等）または他の修飾ヌクレオチドと、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドの組合せを含むことができる。
【００２１】
【化１】
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【００２２】
あるいは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、糖−リン酸骨格ではなくペプチドベースの骨格を含むペプチド核酸（PNA）を含むことができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドに対する他の修飾糖またはホスホジエステル修飾もまた企図される。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドが含み得る他の化学修飾として、２’−Ｏ−アルキル（例えば、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル）、２’−フルオロおよび４’チオ修飾等の糖修飾ならびに１または複数のホスホロチオエート、モルホリノまたはホスホノカルボン酸結合等の骨格修飾が挙げられるが、これらに限定されるものではない（例えば、その全体を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する米国特許第６，６９３，１８７号および第７，０６７，６４１号明細書を参照）。一実施形態において、１または複数のｍｉＲＮＡを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、各塩基に２’Ｏ−メチル糖修飾を含み、ホスホロチオエート結合によって結合する。アンチセンスオリゴヌクレオチド、特により短い長さのアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、１５ヌクレオチド未満）は、ＬＮＡ、二環式ヌクレオシド、ホスホノギ酸、２’Ｏ−アルキル修飾その他等（これらに限定されるものではない）、１または複数の親和性増強性修飾を含むことができる。一部の実施形態において、適切なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、中央に少なくとも１０デオキシリボヌクレオチドを有し５’および３’末端の両方に２’−Ｏ−メトキシエチル修飾リボヌクレオチドを含む、２’−Ｏ−メトキシエチル「ギャップマー（gapmer）」である。これらの「ギャップマー」は、ＲＮＡ標的のＲＮａｓｅＨ依存性分解機序を誘発することができる。その全体が本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する米国特許第６，８３８，２８３号明細書に記載されている修飾等、安定性を増強し有効性を改善するアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の修飾は本技術分野で既知のものであり、本発明の方法における使用に適している。例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏでの送達および安定性を促進するため、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、その３’末端においてコレステロール成分等のステロイド、ビタミン、脂肪酸、炭水化物すなわちグリコシド、ペプチドまたは他の小分子リガンドと結合していてもよい。
【００２３】
ｍｉＲＮＡの活性の抑制に有用な好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、約５〜約２５ヌクレオチド長、約１０〜約３０ヌクレオチド長、または約２０〜約２５ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、本明細書に記載されているｍｉＲＮＡの１または複数を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、約８〜約１８ヌクレオチド長であり、他の実施形態においては、約１２〜約１６ヌクレオチド長である。標的ｍｉＲＮＡと相補的な任意の８塩基長以上（すなわち、ｍｉＲＮＡの５’末端と相補的であり、標的ｍｉＲＮＡの完全に相補的な配列が続く任意のアンチｍｉＲ）が用いられてもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１または複数のｍｉＲＮＡの成熟ｍｉＲＮＡ配列と少なくとも部分的に相補的な配列を含むことができる。「部分的に相補的」は、標的ｍｉＲＮＡ配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％相補的な配列を意味する。一部の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的ｍｉＲＮＡ配列に対して少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％相補的な成熟ｍｉＲＮＡ配列と実質的に相補的とすることができる。一実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、成熟ｍｉＲＮＡ配列と１００％相補的な配列を含む。
【００２４】
一部の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドはアンタゴｍｉｒである。「アンタゴｍｉｒ」とは、少なくとも１種類の成熟ｍｉＲＮＡ配列と少なくとも部分的に相補的である、一本鎖の化学修飾リボヌクレオチドのことである。アンタゴｍｉｒは、２’−Ｏ−メチル−糖修飾等、１または複数の修飾ヌクレオチドを含むことができる。一部の実施形態において、アンタゴｍｉｒは修飾ヌクレオチドのみを含む。アンタゴｍｉｒは、部分的なまたは完全なホスホロチオエート骨格を形成する１または複数のホスホロチオエート結合を含んでいてもよい。ｉｎ  ｖｉｖｏにおける送達および安定性を促進するため、アンタゴｍｉｒは、その３’末端においてコレステロールまたは他の成分と結合していてよい。１または複数のｍｉＲＮＡファミリーメンバーの抑制に適したアンタゴｍｉｒは、約１５〜約５０ヌクレオチド長、より好ましくは約１８〜約３０ヌクレオチド長、最も好ましくは約２０〜約２５ヌクレオチド長とすることができる。アンタゴｍｉｒは、成熟ｍｉＲＮＡ配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％相補的とすることができる。一部の実施形態において、アンタゴｍｉｒは、標的ポリヌクレオチド配列に対して少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％相補的な成熟ｍｉＲＮＡ配列と実質的に相補的とすることができる。他の実施形態において、アンタゴｍｉｒは、成熟ｍｉＲＮＡ配列と１００％相補的である。
【００２５】
別の一実施形態において、方法は、表３〜６に列挙されている１または複数のｍｉＲＮＡ（または対応するヒトmiRNA）のアゴニストを対象に投与する工程を含む。特定の実施形態において、アゴニストは、ｍｉＲ−２０ａ（配列番号２４）、ｍｉＲ−２０ｂ（配列番号２５）、ｍｉＲ−９３（配列番号２６）、ｍｉＲ−１０１（配列番号２７）、ｍｉＲ−１２６（配列番号２８）、ｍｉＲ−１４３（配列番号３４）、ｍｉＲ−１４５（配列番号３５）、ｍｉＲ−１５０（配列番号３６）、ｍｉＲ−２９ａ（配列番号３７）、ｍｉＲ−２９ｂ（配列番号３８）およびｍｉＲ−２９ｃ（配列番号３９）からなる群から選択される１または複数のｍｉＲＮＡのアゴニストである。
【００２６】
本明細書において、「アゴニスト」とは、標的ｍｉＲＮＡの発現または活性を増強する分子または化合物のことである。アゴニストは、ｍｉＲＮＡ配列をコードするポリヌクレオチドとすることができる。例えば、一実施形態において、１または複数のｍｉＲＮＡのアゴニストは、１または複数のｍｉＲＮＡの成熟配列を含むポリヌクレオチドである。別の一実施形態において、１または複数のｍｉＲＮＡのアゴニストは、１または複数のｍｉＲＮＡのプリｍｉＲＮＡまたはプレｍｉＲＮＡ配列を含むポリヌクレオチドとすることができる。成熟、プレｍｉＲＮＡまたはプリｍｉＲＮＡ配列を含むポリヌクレオチドは、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。ポリヌクレオチドは、ロックト核酸、ペプチド核酸、２’−Ｏ−アルキル（例えば、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル）、２’−フルオロおよび４’チオ修飾等の糖修飾ならびに１または複数のホスホロチオエート、モルホリノまたはホスホノカルボン酸結合等の骨格修飾等、１または複数の化学修飾を含むことができる。一部の実施形態において、１または複数のｍｉＲＮＡ配列を含むポリヌクレオチドは、コレステロール等のステロイド、ビタミン、脂肪酸、炭水化物すなわちグリコシド、ペプチドまたは別の小分子リガンドとコンジュゲートしている。特定の実施形態において、１または複数のｍｉＲＮＡのアゴニストは、１または複数のｍｉＲＮＡの機能を増加、追加または置換するよう作用する、ｍｉＲＮＡそのものとは別個の薬剤である。
【００２７】
本発明のｍｉＲＮＡの阻害剤およびアゴニストは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてベクターから発現させることができる。「ベクター」とは、対象核酸を細胞内部へと送達するのに用いうる物質の組成物である。直鎖ポリヌクレオチド、イオン化合物または両親媒性化合物と会合したポリヌクレオチド、プラスミド、およびウイルスが含まれるがこれらに限定されない多数のベクターが当技術分野で知られている。したがって、「ベクター」という用語は、自己複製型のプラスミドまたはウイルスを包含する。ウイルスベクターの例には、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが含まれるがこれらに限定されない。発現コンストラクトは、生細胞内で複製することもでき、合成することもできる。本出願の目的では、「発現コンストラクト」、「発現ベクター」、および「ベクター」は、互換的に用いられ、一般的で例示的な意味において本発明の適用を示すものであり、本発明を限定することを意図するものではない。
【００２８】
一実施形態において、１または複数のｍｉＲＮＡを発現する発現ベクターは、１または複数のｍｉＲＮＡの配列をコードするポリヌクレオチドに「作動的に連結された（operably linked）」プロモーターを含む。本明細書で用いられる「作動的に連結された」または「転写制御下にある」という語句は、プロモーターが、ポリヌクレオチドに対して、ＲＮＡポリメラーゼによる転写の開始および該ポリヌクレオチドの発現を制御するのに適正な位置および方向にあることを意味する。１または複数のｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、本明細書に記載された１または複数のｍｉＲＮＡの、一次マイクロＲＮＡ配列、前駆体マイクロＲＮＡ配列、成熟ｍｉＲＮＡ配列、またはスター（例えばマイナー）配列をコードしうる。１または複数のｍｉＲＮＡの配列を含むポリヌクレオチドは、約１８〜約２０００ヌクレオチド長、約７０〜約２００ヌクレオチド長、約２０〜約５０ヌクレオチド長、または約１８〜約２５ヌクレオチド長であってもよい。
【００２９】
１または複数のｍｉＲＮＡの阻害剤（たとえば、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびアンタゴｍｉｒ）はｉｎ  ｖｉｖｏでベクターから発現させることができる。例えば、一実施形態において、１または複数のｍｉＲＮＡの阻害剤を発現するための発現ベクターは、アンチセンスオリゴヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドと作動的に連結されたプロモーターを含み、ここで、発現したアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列は、１または複数のｍｉＲＮＡの成熟配列と少なくとも部分的に相補的である。
【００３０】
特定の実施形態において、対象のポリヌクレオチドをコードする核酸は、プロモーターの転写制御下にある。「プロモーター」とは、細胞の合成機構または導入された合成機構により認識され、遺伝子に特異的な転写を開始するのに必要とされるＤＮＡ配列を指す。本明細書において、プロモーターという用語は、ＲＮＡポリメラーゼＩ、ＩＩ、またはＩＩＩの開始部位の周囲にクラスター化した転写制御モジュール群を指すのに用いられる。
【００３１】
一部の実施形態では、ヒトサイトメガロウイルス（CMV）前初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス長末端反復、ラットインスリンプロモーター、およびグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼを用いて、対象のポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を得ることができる。発現レベルが所与の目的に十分である場合は、対象のポリヌクレオチド配列の発現を達成するための、当技術分野でよく知られる他のウイルスプロモーター、哺乳動物細胞プロモーター、または細菌ファージプロモーターの使用もまた意図される。
【００３２】
特性がよく知られたプロモーターを用いることにより、トランスフェクションまたは形質転換後における対象ポリヌクレオチドの発現レベルおよび発現パターンを最適化することができる。さらに、特異的な生理学的シグナルに応答して制御されるプロモーターの選択により、該ポリヌクレオチドの誘導発現も可能とすることができる。表１および２では、本発明の関連において、対象ポリヌクレオチド（例えば、本発明のｍｉＲＮＡのアゴニストまたは阻害剤）の発現を制御するのに用いうる複数の制御エレメントが一覧される。この一覧は、遺伝子発現の促進に関与する可能なすべてのエレメントの枚挙を意図するものではなく、単にこれらの例示を意図するものである。
【００３３】
以下は、発現コンストラクトにおいて対象ポリヌクレオチドと組み合わせて用いうるウイルスプロモーター、細胞プロモーター／エンハンサー、および誘導プロモーター／エンハンサーの一覧である（表１および表２）。加えて、ポリヌクレオチドの発現を駆動するには、任意のプロモーター／エンハンサーの組合せ（真核生物プロモーターデータベース：EPDBによる）もまた用いうるであろう。送達複合体またはさらなる遺伝子発現コンストラクトの一部として適切な細菌ポリメラーゼが提供される場合、真核細胞は、細胞質内における、特定の細菌プロモーターからの細胞質転写を支援しうる。
【００３４】
【表１−１】
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【００３５】
【表１−２】
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【００３６】
【表１−３】
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【００３７】
【表２】
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【００３８】
筋特異的プロモーター、またより特定すれば、心臓特異的プロモーターが特に興味深い。これらには、ミオシン軽鎖２プロモーター（Franzら、1994年；Kellyら、1995年）、アルファアクチンプロモーター（Mossら、1996年）、トロポニン１プロモーター（Bhavsarら、1996年）、Ｎａ＋／Ｃａ２＋交換プロモーター（Barnesら、1997年）、ジストロフィンプロモーター（Kimuraら、1997年）、アルファ７インテグリンプロモーター（ZioberおよびKramer、1996年）、脳ナトリウム利尿ペプチドプロモーター（LaPointeら、1996年）、およびアルファＢ−クリスタリン／低分子熱ショックタンパク質プロモーター（Gopal-Srivastava、1995年）、アルファミオシン重鎖プロモーター（Yamauchi-Takiharaら、1989年）、およびＡＮＦプロモーター（LaPointeら、1988年）が含まれる。
【００３９】
所望の場合は、ポリアデニル化シグナルを組み入れて、遺伝子転写産物の適正なポリアデニル化を実行することができる。ポリアデニル化シグナルの性質が本発明の実施を成功させるのに決定的であるとは考えられず、ヒト成長ホルモンのポリアデニル化シグナルおよびＳＶ４０のポリアデニル化シグナルなど、任意のこのような配列を用いることができる。ターミネーターもまた発現カセットのエレメントとして意図される。これらのエレメントは、メッセージレベルを増強し、該カセットから他の配列内へのリーディングを最小化するのに用いることができる。
【００４０】
本発明の特定の実施形態では、発現コンストラクト内にマーカーを組み入れることにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて本発明の核酸コンストラクトを含有する細胞を同定することができる。このようなマーカーによれば、細胞に同定可能な変化が付与され、発現コンストラクトを含有する細胞を容易に同定することが可能となろう。通常、薬剤選択マーカーの組み入れは、形質転換体のクローニングおよび選択を支援し、例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシン、およびヒスチジノールに対する耐性を付与する遺伝子が、有用な選択マーカーである。あるいは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（tk）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）などの酵素も用いることができる。免疫学的マーカーもまた用いることができる。それが遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現可能であるかまたは遺伝子産物をコードする核酸の指標となることが可能である限りにおいて、用いられる選択マーカーが重要であるとは考えられない。選択マーカーのさらなる例は、当業者によく知られている。
【００４１】
発現ベクターを細胞内に導入しうる多数の方法が存在する。本発明の特定の実施形態において、発現コンストラクトは、ウイルス、またはウイルスゲノムに由来する操作されたコンストラクトを含む。特定のウイルスが、受容体を介するエンドサイトーシスにより細胞に侵入し、宿主細胞ゲノム内に組み込まれ、安定的かつ効果的にウイルス遺伝子を発現する能力により、該ウイルスは、哺乳動物細胞内に外来遺伝子を導入するのに魅力的な候補物質となっている（Ridgeway、1988年；NicolasおよびRubenstein、1988年；BaichwalおよびSugden、1986年；Temin、1986年）。
【００４２】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける送達に好ましい方法の１つは、アデノウイルス発現ベクターの使用を伴う。「アデノウイルス発現ベクター」とは、（ａ）コンストラクトのパッケージングを支援し、（ｂ）その中にクローニングされたポリヌクレオチドを発現するのに十分なアデノウイルス配列を含有するコンストラクトを含むことを意味する。発現ベクターは、アデノウイルスの遺伝子操作形態を含む。３６ｋＢで直鎖の二本鎖ＤＮＡウイルスであるアデノウイルスの遺伝子構成についての知識により、アデノウイルスＤＮＡの大型断片に対する最大７ｋＢの外来配列による置換が可能となる（GrunhausおよびHorwitz、1992年）。アデノウイルスＤＮＡは、潜在的な遺伝毒性なしに、エピソーム的な形で複製されうるので、レトロウイルスとは対照的に、宿主細胞に対するアデノウイルス感染は、染色体の組込みを結果としてもたらさない。また、アデノウイルスは構造的にも安定的であり、大規模な増幅後においてもゲノムの再配列は検出されていない。アデノウイルスは、それらの細胞周期段階に関わらず、ほとんどすべての上皮細胞に感染しうる。
【００４３】
アデノウイルスは、そのゲノムサイズが中規模であり、操作が容易であり、力価が高く、標的細胞の範囲が広く、感染性が高度であるために、遺伝子導入ベクターとしての使用に特に適する。ウイルスゲノムの両端は、ウイルスＤＮＡの複製およびパッケージングに必要なシスエレメントである、１００〜２００塩基対の逆方向反復（ITR）を含有する。
【００４４】
アデノウイルスベクターが複製欠損型であるか、または少なくとも条件付き欠損型であるという要請以外のアデノウイルスベクターの性質は、本発明の実施の成功に決定的であると考えられない。アデノウイルスは、４２の既知の異なる血清型またはサブグループＡ〜Ｆのいずれかでありうる。本発明において用いられる条件付き複製欠損型アデノウイルスベクターを得るためには、サブグループＣの５型アデノウイルスが好ましい出発物質である。これは、５型アデノウイルスが、それについて多くの生化学的情報および遺伝学的情報が知られるヒトアデノウイルスであり、アデノウイルスをベクターとして用いる多くのコンストラクトに用いられてきた来歴を有するからである。
【００４５】
本発明による典型的なベクターは複製欠損型であり、アデノウイルスＥ１領域を有さない。したがって、Ｅ１コード配列が除去された位置に、対象遺伝子をコードするポリヌクレオチドを導入することが最も好都合である。しかし、アデノウイルス配列内におけるコンストラクトの挿入位置は、本発明にとってさほど重要ではない。対象遺伝子をコードするポリヌクレオチドはまた、Ｋａｒｌｓｓｏｎら（１９８６年）により説明される通り、Ｅ３置換ベクターにおいて欠失するＥ３領域の代わりに挿入することもでき、ヘルパー細胞株またはヘルパーウイルスがＥ４欠損を補完するＥ４領域に挿入することもできる。
【００４６】
アデノウイルスベクターは、真核生物の遺伝子発現（Levreroら、1991年；Gomez-Foixら、1992年）およびワクチン開発（GrunhausおよびHorwitz、1992年；GrahamおよびPrevec、1991年）において用いられている。近年では、動物試験により、組換えアデノウイルスを遺伝子治療に用いうることが示唆されている（Stratford-PerricaudetおよびPerricaudet、1991年；Stratford-Perricaudetら、1990年； Richら、1993年）。組換えアデノウイルスの異なる組織への投与についての試験には、気管内滴下（Rosenfeldら、1991年；Rosenfeldら、1992年）、筋肉注射（Ragotら、1993年）、末梢静脈内注射（HerzおよびGerard、1993年）、および脳内への定位接種（Le Gal La Salleら、1993年）が含まれる。
【００４７】
本発明では、他のウイルスベクターも発現コンストラクトとして用いることができる。牛痘ウイルス（Ridgeway、1988年；BaichwalおよびSugden、1986年；Couparら、1988年）、アデノ関連ウイルス（AAV）（Ridgeway、1988年；BaichwalおよびSugden、1986年；HermonatおよびMuzycska、1984年）、およびヘルペスウイルスなどのウイルスに由来するベクターを用いることができる。これらは、各種の哺乳動物細胞にとって魅力的な複数の特性を提供する（Friedmann、1989年；Ridgeway、1988年；BaichwalおよびSugden、1986年；Couparら、1988年；Horwichら、1990年）。
【００４８】
センスまたはアンチセンスの遺伝子コンストラクトの発現を実行するには、発現コンストラクトを細胞内に送達しなければならない。この送達は、細胞株を形質転換する実験室における手順の場合と同様にｉｎ  ｖｉｔｒｏで達成することもでき、特定の疾患状態を治療する場合と同様にｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで達成することもできる。送達の１つの機構は、発現コンストラクトが感染性ウイルス粒子内に封入されるウイルス感染を介する。
【００４９】
培養された哺乳動物細胞内へと発現コンストラクトを導入するための、複数の非ウイルス法もまた、本発明により意図されている。これらには、リン酸カルシウム沈殿（GrahamおよびVan Der Eb、1973年；ChenおよびOkayama、1987年；Rippeら、1990年）、ＤＥＡＥデキストラン（Gopal、1985年）、電気穿孔（Tur-Kaspaら、1986年；Porterら、1984年）、直接的なマイクロインジェクション（HarlandおよびWeintraub、1985年）、ＤＮＡを充填したリポソーム（NicolauおよびSene、1982年；Fraleyら、1979年）、およびリポフェクタミン−ＤＮＡ複合体、細胞の超音波処理（Fechheimer et al., 1987）、高速マイクロプロジェクタイルを用いる遺伝子照射（Yangら、1990年）、および受容体を介するトランスフェクション（WuおよびWu、1987年；WuおよびWu、1988年）が含まれる。これらの技法の一部は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにおける使用にうまく適合させることができる。
【００５０】
発現コンストラクトが細胞内に送達されたら、対象遺伝子をコードする核酸を異なる部位に配置し、発現させることができる。特定の実施形態において、該遺伝子をコードする核酸は、細胞ゲノム内に安定的に組み込むことができる。この組込みは、相同組換えにより同種の位置および方向でも可能であり（遺伝子置換）、無作為的で非特異的な位置に組み込むこともできる（遺伝子増強）。またさらなる実施形態において、核酸は、ＤＮＡの個別のエピソームセグメントとして細胞内に安定的に維持することもできる。このような核酸セグメントまたは「エピソーム」は、宿主細胞周期とは無関係に、またはこれと同期して、その維持および複製を可能とするのに十分な配列をコードする。発現コンストラクトを細胞へとどのようにして送達するか、また、該細胞のどこに核酸が保持されるかは、用いられる発現コンストラクトの種類に依存する。
【００５１】
本発明のさらに別の実施形態において、発現コンストラクトは、裸の組換えＤＮＡまたはプラスミドだけからなる場合がある。該コンストラクトの導入は、細胞膜を物理的または化学的に透過する、上記の方法のいずれかにより実施することができる。これは、特に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける導入に適用可能であるが、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける使用にも適用することができる。Ｄｕｂｅｎｓｋｙら（１９８４年）は、成体マウスおよび新生仔マウスの肝臓内および脾臓内へと、リン酸カルシウム沈殿物の形態でポリオーマウイルスＤＮＡを注射することに成功し、これにより、活発なウイルス複製および急速な感染が示された。ＢｅｎｖｅｎｉｓｔｙおよびＮｅｓｈｉｆ（１９８６年）もまた、リン酸カルシウムにより沈殿させたプラスミドの直接的な腹腔内注射の結果、形質転換遺伝子が発現することを示した。対象のポリヌクレオチドをコードするＤＮＡはまた、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいても同様の形で導入することができ、遺伝子産物を発現しうることが想定される。
【００５２】
裸のＤＮＡ発現コンストラクトを細胞内に導入するための、本発明のさらに別の実施形態は、粒子照射を伴う。この方法は、ＤＮＡでコーティングしたマイクロプロジェクタイルを、それらが細胞膜を穿通し、細胞を死滅させずにそれらに侵入することを可能とする高速まで加速させる能力に依存する（Kleinら、1987年）。微小粒子を加速させるための、複数のデバイスが開発されている。このようなデバイスの１つは、電流を発生させる高電圧放電を利用し、この電流により起動力がもたらされる（Yangら、1990年）。用いられるマイクロプロジェクタイルは、タングステンビーズまたは金ビーズなど、生物学的に不活性な物質からなっている。
【００５３】
ラットおよびマウスの肝臓組織、皮膚組織、および筋肉組織を包含する、選択された臓器がｉｎ  ｖｉｖｏで照射されている（Yangら、1990；Zeleninら、1991年）。これには、微粒子銃と標的臓器との間に介在する組織を除去するための、手術による組織または細胞の曝露、すなわち、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける処置を必要とする場合がある。また、この方法により対象の特定のポリヌクレオチドをコードするＤＮＡを送達することもでき、これもまた本発明により組み込まれる。
【００５４】
本発明のさらなる実施形態において、発現コンストラクトは、リポソーム内に封入することもできる。リポソームとは、リン脂質二重層膜および内部の水性媒体を特徴とする小胞構造である。多重膜リポソームは、水性媒体により分離される複数の脂質層を有する。それらは、リン脂質が過剰な水溶液中に懸濁すると自発的に形成される。脂質成分は、閉鎖構造の形成前に自己再編成を受け、水と脂質二重層間において溶解した溶質とを封入する（GhoshおよびBachhawat、1991年）。また、リポフェクタミン−ＤＮＡ複合体も意図される。
【００５５】
本発明の特定の実施形態において、リポソームは、センダイウイルス（HVJ）と複合させることができる。これは、細胞膜との融合を促進し、リポソームに封入されたＤＮＡの細胞への侵入を促進することが示されている（Kanedaら、1989年）。他の実施形態において、リポソームは、核内非ヒストン性染色体タンパク質（HMG-I）と複合させることもでき、これと共に用いることもできる（Katoら、1991年）。またさらなる実施形態において、リポソームは、ＨＶＪおよびＨＭＧ−Ｉの両方と複合させることもでき、これらと共に用いることもできる。このような発現コンストラクトは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおける核酸の導入および発現において用いられて成功しているので、本発明に適用可能である。ＤＮＡコンストラクトにおいて細菌プロモーターが用いられる場合、リポソーム内にはまた、適切な細菌ポリメラーゼも組み入れることが望ましい。
【００５６】
特定の遺伝子をコードする核酸を細胞内に送達するのに用いうる他の発現コンストラクトは、受容体を介する送達媒体（delivery vehicle）である。これらは、ほとんどすべての真核細胞内における、受容体を介するエンドサイトーシスによる高分子の選択的な取込みを利用する。細胞型に特異的な各種の受容体の分布のため、送達は高度に特異的である（WuおよびWu、1993年）。
【００５７】
受容体を介する遺伝子標的化媒体は一般に、２つの成分：細胞受容体特異的なリガンドおよびＤＮＡ結合剤からなる。受容体を介する遺伝子導入には、複数のリガンドが用いられている。最も広範に特徴づけられているリガンドは、アシアロ糖タンパク質（ASOR）（WuおよびWu、1987年）およびトランスフェリン（Wagnerら、1990年）である。近年では、ＡＳＯＲと同じ受容体を認識する合成ネオ糖タンパク質が遺伝子送達媒体として用いられており（Ferkolら、1993年；Peralesら、1994年）、上皮成長因子（EGF）もまた、遺伝子を扁平上皮細胞へと送達するのに用いられている（Myers、ＥＰＯ ０２７３０８５）。
【００５８】
特定の具体例において、ポリヌクレオチドを、カチオン脂質もしくは中性脂質と組み合わせて、または一緒になって中世電荷を与えるカチオン脂質とアニオン脂質の組み合わせと組み合わせて、投与することができる（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開０５００７１９６および国際公開０５０２６３７２を参照）。カチオン脂質の例には、リポフェクチン、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、およびＤＯＴＡＰが含まれるが、これらに限定されない。参照により具体的に組み込まれる国際公開００７１０９６は、遺伝子治療に有効に用いうるＤＯＴＡＰ：コレステロール製剤またはコレステロール誘導体製剤などの異なる製剤について説明している。他の開示もまた、ナノ粒子および投与法を包含する、異なる脂質製剤またはリポソーム製剤について論じており、これらには、それらが製剤と、核酸の投与および送達の他の関連する態様とについて開示する程度において参照により具体的に組み込まれる、米国特許公開第２００３０２０３８６５号、同第２００２０１５０６２６号、同第２００３００３２６１５号、および同第２００４００４８７８７号が含まれるがこれらに限定されない。粒子を形成するのに用いられる方法はまた、これらの態様に関して参照により組み込まれる、米国特許第５，８４４，１０７号、同第５，８７７，３０２号、同第６，００８，３３６号、同第６，０７７，８３５号、同第５，９７２，９０１号、同第６，２００，８０１号、および同第５，９７２，９００号においても開示されている。
【００５９】
特定の実施形態において、遺伝子導入は、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける条件下でより容易に実施することができる。ｅｘ  ｖｉｖｏにおける遺伝子治療とは、動物から細胞を単離し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて核酸を細胞内へと送達し、次いで、改変された細胞を動物内へと再び戻すことを指す。これは、手術による動物からの組織／臓器の摘出、または細胞および組織の初代培養物を伴う。
【００６０】
好ましくは、表３〜６に列記された１または複数のｍｉＲＮＡ（または対応するヒトｍｉＲＮＡ）の阻害剤またはアゴニストの投与は、心筋梗塞、心不全または心臓リモデリングの１または複数の症状の改善をもたらす。改善される１つまたは複数の症状は、例えば、運動能力の向上、心駆出量の増大、左室拡張終期圧の低下、肺毛細血管楔入圧の低下、心拍出量の増大、心臓指数の向上、肺動脈圧の低下、左室収縮終期径および左室拡張終期径の減少、左室壁応力および右室壁応力の低下、壁張力の低下、生活の質の向上、ならびに疾患に関連する罹患率および死亡率の低下であることができる。一実施形態において、心筋梗塞を患う対象の心臓細胞における１または複数のｍｉＲＮＡの調節は、心臓細胞の喪失を低減する（例えば、梗塞領域のアポトーシスを減少させる）ことにより、梗塞のサイズを低減することができる。別の実施形態において、心筋梗塞を患う対象の心臓細胞における１または複数のｍｉＲＮＡの調節は、梗塞領域の線維症を減少させることができる。さらに別の実施形態において、心筋梗塞を患う対象において、対象の心臓細胞における１または複数のｍｉＲＮＡの調節の後、心臓機能が安定化する。
【００６１】
本発明は、対象における梗塞巣周囲の心臓組織のＭＩ後リモデリングの治療および予防ならびにそれに続く心不全の発症における、同定されたｍｉＲＮＡのアゴニストおよび阻害剤の使用を企図する。治療計画は、最も早期の介入を探求しつつ臨床症状に応じて変化するであろう。しかし、ＭＩ後の少なくともある程度の期間にわたる長期の維持が、多くの環境において適切であると考えられる。保護効果を最大限に高めるために、ｍｉＲＮＡの調節薬で断続的に治療すること、または投与されるｍｉＲＮＡを変化させることも望ましいであろう。
【００６２】
別の実施形態において、ｍｉＲＮＡ機能または発現の調節薬を、他の治療モダリティーと組み合わせて使用することが想定される。したがって、上述のｍｉＲＮＡ療法に加えて、対象に対してより「標準的な」医薬的心臓治療法を提供し得る。他の療法の例は、非限定的に、いわゆる「β−ブロッカー」、抗高血圧剤、強心剤、血管拡張薬、ホルモンアンタゴニスト、変力調節薬、利尿薬、エンドセリン受容体アンタゴニスト、カルシウムチャネル遮断薬、ホスホジエステラーゼ阻害剤、ＡＣＥ阻害剤、アンギオテンシン２型アンタゴニストおよびサイトカイン遮断薬／阻害剤ならびにＨＤＡＣ阻害剤を含む。
【００６３】
組合せは、心臓細胞を、１または複数のｍｉＲＮＡ調節薬と第２の心臓療法を包含する単一の組成物または医薬製剤と接触させることによるか、または該細胞を２つの異なる組成物または製剤であって、１つの組成物が１または複数のｍｉＲＮＡ調節薬を包含し、他方が第２の心臓療法を包含する組成物または製剤と同時に接触させることにより達成することができる。あるいは、１または複数のｍｉＲＮＡの調節薬の投与は、数分間〜数週間の範囲の間隔で（１つまたは複数の）他の心臓作用物質の投与に先行または後続しうる。他の心臓作用物質および１または複数のｍｉＲＮＡ調節薬が対象に対して個別に適用される実施形態でならば一般に、該心臓作用物質および１または複数のｍｉＲＮＡ調節薬が、細胞に対して依然として有利な組合せ効果を及ぼしうるように、各送達時点の間で長時間が経過しないようにする。このような場合、２つの組成物を、互いに約１２〜２４時間以内、より好ましくは互いに６〜１２時間以内に投与することが典型的であり、約１２時間のみの遅延時間が最も好ましいことが意図される。しかし、一部の状況では、治療期間を顕著に延長することが望ましい場合もあり、この場合、各投与の間において、数日間（２、３、４、５、６、または７日間）〜数週間（１、２、３、４、５、６、７、または８週間）が経過する。
【００６４】
１または複数のｍｉＲＮＡの調節薬または他の心臓作用物質の複数回の投与が望ましいこともまた考えられる。この点では、各種の組合せを用いることができる。例示を目的として述べると、ｍｉＲＮＡの調節薬が「Ａ」であり、他の心臓作用物質が「Ｂ」である場合、合計投与回数３および４回に基づく以下の順列が例示的である。他の組合せも同様に意図される。
【化２】
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【００６５】
薬理学的治療薬および投与方法、用量等は、当業者にとって既知であり（例えば、関連部分において本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する「Physicians Desk Reference」、Klaassenの「The Pharmacological Basis of Therapeutics」、「Remington's Pharmaceutical Sciences」および「The Merck Index、第１１版」を参照）、本明細書における開示を考慮しつつ本発明と組み合わせることができる。治療されている対象の状態に応じて、多少の用量変動が必然的に生じるであろう。いずれの場合においても、投与の責任者は個々の対象に適した用量を決定し、このような個々の決定は当業者の技能の範囲内である。
【００６６】
本発明のｍｉＲＮＡ調節薬と組み合わせて用いることのできる薬理学的治療薬の非限定的な例として、抗高リポタンパク血症薬、抗動脈硬化剤、抗血栓剤／血栓素溶解剤、血液凝固剤、抗不整脈薬、降圧薬、昇圧薬、うっ血性心不全の治療薬、抗狭心症薬、抗菌薬またはそれらの組合せが挙げられる。
【００６７】
特定の実施形態において、本明細書において「抗高リポタンパク血症薬」として知られている、１または複数の血中脂質および／またはリポタンパク質の濃度を低下させる薬剤の投与は、特に、粥状動脈硬化および血管組織の肥厚または閉塞の治療において、本発明に係る心血管治療（例えば、miRNA調節薬）と組み合わされてよい。特定の実施形態において、抗高リポタンパク血症薬は、アリールオキシアルカン酸／フィブリン酸誘導体、樹脂／胆汁酸捕捉剤、ＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素阻害剤、ニコチン酸誘導体、甲状腺ホルモンもしくは甲状腺ホルモン類似体、種々の薬剤またはそれらの組合せを含むことができる。アリールオキシアルカン酸／フィブリン酸誘導体の非限定的な例として、ベクロブラート（beclobrate）、エンザフィブラート（enzafibrate）、ビニフィブラート（binifibrate）、シプロフィブラート（ciprofibrate）、クリノフィブラート（clinofibrate）、クロフィブラート（clofibrate）（アトロマイド（atromide）-S）、クロフィブリン酸、エトフィブラート（etofibrate）、フェノフィブラート（fenofibrate）、ゲムフィブロジル（ロピッド（lobid））、ニコフィブラート（nicofibrate）、ピリフィブラート（pirifibrate）、ロニフィブラート（ronifibrate）、シンフィブラート（simfibrate）およびテオフィブラート（theofibrate）が挙げられる。樹脂／胆汁酸捕捉剤の非限定的な例として、コレスチラミン（コーリーバル（cholybar）、クエストラン）、コレスチポール（コレスチド（colestid））およびポリデキシド（polidexide）が挙げられる。ＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素阻害剤の非限定的な例として、ロバスタチン（メバコール（mevacor））、プラバスタチン（プラバコール（pravochol））またはシンバスタチン（ゾコール（zocor））が挙げられる。ニコチン酸誘導体の非限定的な例として、ニコチン酸、アシピモックス（acepimox）、ニセリトロール、ニコクロナート（nicoclonate）、ニコモールおよびオキシニアシン酸（oxiniacic acid）が挙げられる。甲状腺ホルモンおよびその類似体の非限定
的な例として、エトロキサート（etoroxate）、チロプロープ酸（thyropropic acid）およびチロキシンが挙げられる。
【００６８】
種々の抗高リポタンパク血症薬の非限定的な例として、アシフラン（acifran）、アザコステロール、ベンフルオレックス、β−ベンザルブチルアミド、カルニチン、コンドロイチン硫酸、クロメストロン（clomestrone）、デタクストラン（detaxtran）、デキストラン硫酸ナトリウム、５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸、エリタデニン、フラザボール、メグルトール、メリナミド、ミタトリエンジオール（mytatrienediol）、オルニチン、γ−オリザノール、パンテチン、テトラ酢酸ペンタエリスリトール、α−フェニルブチルアミド（phenylbutyramide）、ピロザジル（pirozadil）、プロブコール（ロレルコ）、β−シトステロール、スルトシル酸（sultosilic acid）ピペラジン塩、チアデノール、トリパラノールおよびキセンブシン（xenbucin）が挙げられる。抗動脈硬化薬の非限定的な例として、ピリジノールカルバメートが挙げられる。
【００６９】
特定の実施形態において、血栓の除去または予防に有用な薬剤の投与は、特に、粥状動脈硬化および脈管構造（例えば、動脈）閉塞の治療において、ｍｉＲＮＡ調節薬の投与と組み合わせることができる。抗血栓剤および／または血栓素溶解剤の非限定的な例として、抗凝血剤、抗凝血剤アンタゴニスト、血小板凝集抑制薬、血栓溶解剤、血栓溶解剤アンタゴニストまたはそれらの組合せが挙げられる。特定の実施形態において、例えば、アスピリンおよびワルファリン（wafarin）（クマジン）等、経口投与することのできる抗血栓剤が好ましい。
【００７０】
一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡ調節薬は、１または複数の抗凝血剤と組み合わせることができる。抗凝血剤の非限定的な例として、アセノクマロール、アンクロッド、アニシンジオン、ブロミンジオン、クロリンジオン、クメタロール（coumetarol）、シクロクマロール（cyclocumarol）、デキストラン硫酸ナトリウム、ジクマロール、ジフェナジオン、エチルビスクムアセテート、エチリデンジクマロール、フルインジオン、ヘパリン、ヒルジン、リアポラート（lyapolate）ナトリウム、オキサジジオン（oxazidione）、ペントサンポリサルフェート、フェニンジオン、フェンプロクモン、ホスビチン、ピコタミド、チオクロマロールおよびワルファリンが挙げられる。
【００７１】
ｍｉＲＮＡ調節薬は、血小板凝集抑制薬および／または血栓溶解剤と組み合わせることができる。血小板凝集抑制薬の非限定的な例として、アスピリン、デキストラン、ジピリダモール（ペルサンチン）、ヘパリン、スルフィンピラノン（sulfinpyranone）（アンツラン（anturane））およびチクロピジン（チクリッド（ticlid））が挙げられる。血栓溶解剤の非限定的な例として、組織プラスミノーゲンアクチベーター（アクチバーゼ）、プラスミン、プロウロキナーゼ、ウロキナーゼ（アボキナーゼ）、ストレプトキナーゼ（ストレプターゼ（streptase））、アニストレプラーゼ／ＡＰＳＡＣ（エミナーゼ（eminase））が挙げられる。
【００７２】
患者が出血する、あるいは大量出血の可能性が高まる特定の実施形態において、血液凝固を増強し得る薬剤は、ｍｉＲＮＡ調節薬と組み合わせて用いることができる。血液凝固促進剤の非限定的な例として、血栓溶解剤アンタゴニストおよび抗凝血剤アンタゴニストが挙げられる。抗凝血剤アンタゴニストの非限定的な例として、プロタミンおよびビタミンＫ１が挙げられる。
【００７３】
ｍｉＲＮＡ調節薬と組み合わせることのできる血栓溶解剤アンタゴニストの非限定的な例として、アミノカプロン酸（amiocaproic acid）（アミカー（amicar））およびトラネキサム酸（アムスタット（amstat））が挙げられる。抗血栓剤の非限定的な例として、アナグレリド、アルガトロバン、シロスタゾール（cilstazol）、ダルトロバン（daltroban）、デフィブロチド、エノキサパリン、フラキシパリン（fraxiparine）、インドブフェン、ラモパラン（lamoparan）、オザグレル、ピコタミド、プラフィブリド（plafibride）、テデルパリン（tedelparin）、チクロピジンおよびトリフルサルが挙げられる。
【００７４】
特定の実施形態において、ｍｉＲＮＡ調節薬は、心血管状態の治療のための抗不整脈薬と組み合わせることができる。抗不整脈薬の非限定的な例として、クラスＩ抗不整脈薬（ナトリウムチャネル遮断薬）、クラスＩＩ抗不整脈薬（βアドレナリン遮断薬）、クラスＩＩＩ抗不整脈薬（再分極延長薬）、クラスＩＶ抗不整脈薬（カルシウムチャネル遮断薬）および種々の抗不整脈薬が挙げられる。
【００７５】
ナトリウムチャネル遮断薬は、クラスＩＡ、クラスＩＢおよびクラスＩＣ抗不整脈薬を含むが、これらに限定されるものではない。クラスＩＡ抗不整脈薬の非限定的な例として、ジソピラミド（disppyramide）（ノルペース）、プロカインアミド（プロネスチル（pronestyl））およびキニジン（キニデクス（quinidex））が挙げられる。クラスＩＢ抗不整脈薬の非限定的な例として、リドカイン（キシロカイン）、トカイニド（トノカード（tonocard））およびメキシレチン（メキシチール）が挙げられる。クラスＩＣ抗不整脈薬の非限定的な例として、エンカイニド（エンカイド（enkaid））およびフレカイニド（タンボコール）が挙げられる。
【００７６】
別名、β−アドレナリン遮断薬、β−アドレナリンアンタゴニストまたはクラスＩＩ抗不整脈薬として知られている例示的なβ遮断薬として、アセブトロール（セクトラール）、アルプレノロール、アモスラロール、アロチノロール、アテノロール、ベフノロール、ベタキソロール、ベバントロール、ビソプロロール、ボピンドロール、ブクモロール、ブフェトロール、ブフラロール、ブニトロロール、ブプラノロール、ブチドリン（butidrine）塩酸塩、ブトフィロロール（butofilolol）、カラゾロール（carazolol）、カルテオロール、カルベジロール、セリプロロール、セタモロール（cetamolol）、クロラノロール、ジレバロール、エパノロール、エスモロール（ブレビブロック）、インデノロール、ラベタロール、レボブノロール、メピンドロール、メチプラノロール、メトプロロール、モプロロール（moprolol）、ナドロール、ナドキソロール（nadoxolol）、ニフェナロール（nifenalol）、ニプラジロール、オクスプレノロール、ペンブトロール、ピンドロール、プラクトロール、プロネタロール（pronethalol）、プロパノロール（propanolol）（インデラル）、ソタロール（ベタペース（betapace））、スルフィナロール（sulfinalol）、タリノロール、テルタトロール、チモロール、トリプロロール（toliprolol）およびキシビノロール（xibinolol）が挙げられる。特定の実施形態において、β遮断薬は、アリールオキシプロパノールアミン誘導体を含む。アリールオキシプロパノールアミン誘導体の非限定的な例として、アセブトロール、アルプレノロール、アロチノロール、アテノロール、ベタキソロール、ベバントロール、ビソプロロール、ボピンドロール、ブニトロロール、ブトフィロロール、カラゾロール、カルテオロール、カルベジロール、セリプロロール、セタモロール、エパノロール、インデノロール、メピンドロール、メチプラノロール、メトプロロール、モプロロール、ナドロール、ニプラジロール、オクスプレノロール、ペンブトロール、ピンドロール、プロパノロール、タリノロール、テルタトロール、チモロールおよびトリプロロールが挙げられる。
【００７７】
クラスＩＩＩ抗不整脈薬の例として、アミオダロン（コーダロン（cordarone））およびソタロール（β-pace）等、再分極を延長する薬剤が挙げられる。カルシウムチャネル遮断薬としても知られているクラスＩＶ抗不整脈薬の非限定的な例として、アリールアルキルアミン（例えば、ベプリジル（bepridile）、ジルチアゼム、フェンジリン、ガロパミル、プレニラミン、テロジリン、ベラパミル）、ジヒドロピリジン誘導体（フェロジピン、イスラジピン、ニカルジピン、ニフェジピン、ニモジピン、ニソルジピン、ニトレンジピン）、ピペラジン（piperazinde）誘導体（例えば、シンナリジン、フルナリジン、リドフラジン）またはベンシクラン、エタフェノン、マグネシウム、ミベフラジルもしくはペルヘキシリン等、種々のカルシウムチャネル遮断薬が挙げられる。特定の実施形態において、カルシウムチャネル遮断薬は、長時間作用性ジヒドロピリジン（ニフェジピン型）カルシウムアンタゴニストを含む。
【００７８】
本発明のｍｉＲＮＡ調節薬と組み合わせることのできる種々の抗不整脈薬の適切な例として、アデノシン（アデノカード（adenocard））、ジゴキシン（ラノキシン（lanoxin））、アセカイニド、アジュマリン、アモプロキサン、アプリンジン、ブレチリウムトシレート、ブナフチン、ブトベンジン（butobendine）、カポベン酸（capobenic acid）、シフェンリン、ジソピラミド（disopyranide）、ヒドロキニジン、インデカイニド、臭化イプラトロピウム（ipatropium bromide）、リドカイン、ロラジミン、ロルカイニド、メオベンチン（meobentine）、モリシジン、ピルメノール、プラジュマリン、プロパフェノン、ピリノリン（pyrinoline）、キニジンポリガラクツロ酸、キニジン硫酸塩およびビキジル（viquidil）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７９】
本発明のさらに別の一実施形態において、ｍｉＲＮＡ調節薬は、降圧薬と組み合わせて投与することができる。降圧薬の非限定的な例として、交感神経遮断薬、α／β遮断薬、α遮断薬、抗アンジオテンシンＩＩ薬、β遮断薬、カルシウムチャネル遮断薬、血管拡張薬および種々の降圧薬が挙げられる。
【００８０】
α−アドレナリン遮断薬またはα−アドレナリンアンタゴニストとして知られているα遮断薬の非限定的な例として、アモスラロール、アロチノロール、ダピプラゾール、ドキサゾシン、エルゴロイドメシル酸塩、フェンスピリド、インドラミン、ラベタロール、ニセルゴリン、プラゾシン、テラゾシン、トラゾリン、トリマゾシンおよびヨヒンビンが挙げられる。特定の実施形態において、α遮断薬は、キナゾリン誘導体を含むことができる。キナゾリン誘導体の非限定的な例として、アルフゾシン、ブナゾシン、ドキサゾシン、プラゾシン、テラゾシンおよびトリマゾシンが挙げられる。特定の実施形態において、降圧薬は、αおよびβアドレナリンアンタゴニストの両方である。α／β遮断薬の非限定的な例は、ラベタロール（ノルモダイン（normodyne）、トランデート）を含む。
【００８１】
抗アンジオテンシンＩＩ薬の非限定的な例として、アンジオテンシン変換酵素阻害剤およびアンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニストが挙げられる。アンジオテンシン変換酵素阻害剤（ACE阻害剤）の非限定的な例として、アラセプリル、エナラプリル（バソテック（vasotec））、カプトプリル、シラザプリル、デラプリル、エナラプリラート、ホシノプリル、リシノプリル、モベルトプリル（moveltopril）、ペリンドプリル、キナプリルおよびラミプリルが挙げられる。アンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト、ＡＮＧ受容体遮断薬またはＡＮＧ−ＩＩ１型受容体遮断薬（ARBS）としても知られているアンジオテンシンＩＩ受容体遮断薬の非限定的な例として、アンジオカンデサルタン（angiocandesartan）、エプロサルタン、イルベサルタン、ロサルタンおよびバルサルタンが挙げられる。
【００８２】
交感神経遮断薬の非限定的な例として、中枢作用性交感神経遮断薬または末梢作用性交感神経遮断薬が挙げられる。中枢神経系（CNS）交感神経遮断薬としても知られている中枢作用性交感神経遮断薬の非限定的な例として、クロニジン（カタプレス）、グアナベンズ（ワイテンシン（wytensin））、グアンファシン（テネックス（tenex））およびメチルドパ（アルドメット）が挙げられる。末梢作用性交感神経遮断薬の非限定的な例として、神経節遮断薬、アドレナリン作動性ニューロン遮断薬、β−アドレナリン遮断薬またはα１−アドレナリン遮断薬が挙げられる。神経節遮断薬の非限定的な例として、メカミラミン（インバーシン（inversine））およびトリメタファン（アルフォナード（arfonad））が挙げられる。アドレナリン作動性ニューロン遮断薬の非限定的な例として、グアネチジン（イスメリン（ismelin））およびレセルピン（セルパシル（serpasil））が挙げられる。β−アドレナリン遮断薬の非限定的な例として、アセニトロール（acenitolol）（セクトラール）、アテノロール（テノーミン）、ベタキソロール（ケルロン（kerlone））、カルテオロール（カルトロール（cartrol））、ラベタロール（ノルモダイン、トランデート）、メトプロロール（ロプレッサー（lopressor））、ナダノール（nadanol）（コルガード（corgard））、ペンブトロール（レバトール（levatol））、ピンドロール（ビスケン（visken））、プロプラノロール（インデラル）およびチモロール（ブロカドレン（blocadren））が挙げられる。α１−アドレナリン遮断薬の非限定的な例として、プラゾシン（ミニプレス）、ドキサゾシン（doxazocin）（カルジュラ（cardura））およびテラゾシン（ハイトリン（hytrin））が挙げられる。
【００８３】
特定の実施形態において、心血管（cardiovasculator）治療薬は、本発明のｍｉＲＮＡ調節薬と同時投与することができる血管拡張薬（例えば、脳血管拡張薬、冠動脈血管拡張薬または末梢血管拡張薬）を含むことができる。特定の好ましい実施形態において、血管拡張薬は、冠動脈血管拡張薬を含む。冠動脈血管拡張薬の非限定的な例として、アモトリフェン（amotriphene）、ベンダゾール（bendazol）、ベンフロジルヘミスクシネート（benfurodil hemisuccinate）、ベンズヨーダロン、クロラシジン（chloracizine）、クロモナール、クロベンフロール（clobenfurol）、クロニトレート（clonitrate）、ジラゼプ、ジピリダモール、ドロプレニルアミン（droprenilamine）、エフロキサート、四硝酸エリスリチル（erythrityl tetranitrane）、エタフェノン、フェンジリン、フロレジル（floredil）、ガングレフェン（ganglefene）、ヘレストロール（herestrol）ビス（β−ジエチルアミノエチルエーテル）、ヘキソベンジン、イトラミントシレート、ケリン、リドフラジン（lidoflanine）、マンニトールヘキサニトラン（hexanitrane）、メジバジン（medibazine）、ニコルグリセリン（nicorglycerin）、四硝酸ペンタエリスリトール、ペントリニトロール（pentrinitrol）、ペルヘキシリン、ピメフィリン（pimefylline）、トラピジル、トリクロミル（tricromyl）、トリメタジジン、トロールニトラートリン酸塩およびビスナジンが挙げられる。
【００８４】
特定の実施形態において、血管拡張薬は、長期治療用血管拡張薬または高血圧緊急症血管拡張薬を含むことができる。長期治療血管拡張薬の非限定的な例として、ヒドララジン（アプレゾリン）およびミノキシジル（ロニテン（loniten））が挙げられる。高血圧緊急症血管拡張薬の非限定的な例として、ニトロプルシド（ニプリド（nipride））、ジアゾキシド（ヒペルスタット（hyperstat）ＩＶ）、ヒドララジン（アプレゾリン）、ミノキシジル（ロニテン）およびベラパミルが挙げられる。
【００８５】
種々の降圧薬の非限定的な例として、アジュマリン、γ−アミノ酪酸、ブフェニオド（bufeniode）、シクレタニン（cicletainine）、シクロシドミン（ciclosidomine）、クリプテナミンタンニン酸塩、フェノルドパム、フロセキナン、ケタンセリン、メブタメート、メカミラミン、メチルドパ、メチル４−ピリジルケトンチオセミカルバゾン、ムゾリミン、パルギリン、ペンピジン、ピナシジル、ピペロキサン、プリマペロン（primaperone）、プロトベラトリン、ラウバシン（raubasine）、レシメトール（rescimetol）、リルメニデン（rilmenidene）、サララシン、ニトロプルシドナトリウム（sodium  nitrorusside）、チクリナフェン、トリメタファンカンシラート（camsylate）、チロシナーゼおよびウラピジルが挙げられる。
【００８６】
特定の実施形態において、降圧薬は、アリールエタノールアミン誘導体、ベンゾチアジアジン誘導体、Ｎ−カルボキシアルキル（ペプチド／ラクタム）誘導体、ジヒドロピリジン誘導体、グアニジン誘導体、ヒドラジン／フタラジン、イミダゾール誘導体、四級（quanternary）アンモニウム化合物、レセルピン誘導体またはスルホンアミド（suflonamide）誘導体を含むことができる。アリールエタノールアミン誘導体の非限定的な例として、アモスラロール、ブフラロール、ジレバロール、ラベタロール、プロネタロール、ソタロールおよびスルフィナロールが挙げられる。ベンゾチアジアジン誘導体の非限定的な例として、アルチジド（althizide）、ベンドロフルメサイアジド、ベンズサイアジド、ベンジルヒドロクロロチアジド、ブチアジド（buthiazide）、クロロチアジド、クロルサリドン、シクロペンチアジド、シクロチアジド、ジアゾキシド、エピチアジド、エチアジド、フェンキゾン、ヒドロクロロチジド（hydrochlorothizide）、ヒドロフルメチジド（hydroflumethizide）、メチクロチアジド、メチクラン、メトラゾン、パラフルチジド（paraflutizide）、ポリチジド（polythizide）、テトラクロルメチアジド（tetrachlormethiazide）およびトリクロルメチアジドが挙げられる。Ｎ−カルボキシアルキル（ペプチド／ラクタム）誘導体の非限定的な例として、アラセプリル、カプトプリル、シラザプリル、デラプリル、エナラプリル、エナラプリラート、ホシノプリル、リシノプリル、モベルチプリル（moveltipril）、ペリンドプリル、キナプリルおよびラミプリルが挙げられる。ジヒドロピリジン誘導体の非限定的な例として、アムロジピン、フェロジピン、イスラジピン、ニカルジピン、ニフェジピン、ニルバジピン、ニソルジピンおよびニトレンジピンが挙げられる。グアニジン誘導体の非限定的な例として、ベタニジン、デブリソキン、グアナベンズ、グアナクリン（guanacline）、グアナドレル、グアナゾジン、グアネチジン、グアンファシン、グアノクロール（guanochlor）、グアノキサベンズおよびグアノキサンが挙げられる。ヒドラジン／フタラジンの非限定的な例として、ブドララジン、カドララジン、ジヒドララジン、エンドララジン、ヒドラカルバジン（hydracarbazine）、ヒドララジン、フェニプラジン（pheniprazine）、ピルドララジン（pildralazine）およびトドララジンが挙げられる。イミダゾール誘導体の非限定的な例として、クロニジン、ロフェキシジン、フェントラミン、チアメニジン（tiamenidine）およびトロニジンが挙げられる。四級アンモニウム化合物の非限定的な例として、臭化アザメトニウム（azamethonium bromide）、塩化クロリソンダミン、ヘキサメトニウム、ペンタシニウムビス（メチル硫酸）、臭化ペンタメトニウム（pentamethonium bromide）、酒石酸ペントリニウム、塩化フェナクトロピニウム（phenactropinium chloride）およびトリメチジニウムメトスルファート（trimethidinium methosulfate）が挙げられる。レセルピン誘導体の非限定的な例として、ビエタセルピン、デセルピジン、レシナミン、レセルピンおよびシロシンゴピンが挙げられる。スルホンアミド誘導体の非限定的な例として、アンブシド（ambuside）、クロパミド、フロセミド、インダパミド、キネタゾン、トリパミドおよびキシパミドが挙げられる。
【００８７】
別の一実施形態において、本発明のｍｉＲＮＡ調節薬は、昇圧薬と同時投与することができる。昇圧薬は、一般に、外科的処置において起こり得るショックの際に血圧を上昇させるために用いられる。抗降圧薬としても知られている昇圧薬の非限定的な例として、アメジニウムメチル硫酸塩、アンジオテンシンアミド、ジメトフリン、ドパミン、エチフェルミン（etifelmin）、エチレフリン、ゲペフリン、メタラミノール、ミドドリン、ノルエピネフリン、フォレドリン（pholedrine）およびシネフリンが挙げられる。
【００８８】
特定の実施形態において、本発明のｍｉＲＮＡ調節薬は、うっ血性心不全に対する治療と組み合わせて投与することができる。うっ血性心不全の治療のための例示的な薬剤として、抗アンジオテンシンＩＩ薬、後負荷−前負荷軽減治療、利尿剤および変力薬が挙げられるが、これらに限定されるものではない。利尿剤の非限定的な例として、チアジドまたはベンゾチアジアジン誘導体（例えば、アルチアジド、ベンドロフルメチアジド（bendroflumethazide）、ベンズサイアジド、ベンジルヒドロクロロチアジド、ブチアジド、クロロチアジド、クロロチアジド、クロルサリドン、シクロペンチアジド、エピチアジド、エチアジド、エチアジド、フェンキゾン、ヒドロクロロチアジド、ヒドロフルメチアジドエチアジド、メチクロチアジド、メチクラン、メトラゾン、パラフルチジド、ポリチアジド、テトラクロロメチアジド（tetrachloromethiazide）、トリクロルメチアジド）、有機水銀（例えば、クロルメロドリン、メラルリド（meralluride）、メルカムファミド（mercamphamide）、メルカプトメリンナトリウム（mercaptomerin sodium）、メルクマリル酸（mercumallylic acid）、マーキュマチリンナトリウム（mercumatilin dodium）、塩化第一水銀、マーサリル）、プテリジン（例えば、フルテレン（furterene）、トリアムテレン）、プリン（例えば、アセフィリン、７−モルホリノメチルテオフィリン、パモブロム（pamobrom）、プロテオブロミン、テオブロミン）、アルドステロンアンタゴニスト（例えば、カンレノン、オレアンドリン（oleandrin）、スピロノラクトン）等のステロイド、スルホンアミド誘導体（例えば、アセタゾラミド、アンブシド（ambuside）、アゾセミド、ブメタニド、ブタゾールアミド、クロラミノフェナミド（chloraminophenamide）、クロフェナミド、クロパミド、クロレキソロン、ジフェニルメタン−４，４’−ジスルホンアミド、ジスルファミド、エトキシゾラミド、フロセミド、インダパミド、メフルシド、メタゾラミド、ピレタニド、キネタゾン、トラセミド、トリパミド、キシパミド）、ウラシル（例えば、アミノメトラジン（aminometradine）、アミ
ソメトラジン（amisometradine））、カリウム保持性アンタゴニスト（例えば、アミロライド、トリアムテレン）、またはアミノジン（aminozine）、アルブチン、クロラザニル（chlorazanil）、エタクリン酸、エトゾリン、ヒドラカルバジン、イソソルビド、マンニトール、メトカルコン（metochalcone）、ムゾリミン、ペルヘキシリン、チクルナフェン（ticrnafen）および尿素等の種々の利尿剤が挙げられる。
【００８９】
特定の実施形態において、アンジオテンシンアンタゴニストに耐性を示すことのできない患畜は、ヒドララジン（アプレゾリン）およびイソソルビドジニトラート（アイソーディル（isordil）、ソルビトレート（sorbitrate））をｍｉＲＮＡ調節薬と共に投与する等、併用療法により治療してよい。
【００９０】
本発明のｍｉＲＮＡ調節薬は、変力薬と組み合わせることができる。一部の実施形態において、変力薬は陽性変力薬である。強心剤としても知られている陽性変力薬の非限定的な例として、アセフィリン、アセチルジギトキシン、２−アミノ−４−ピコリン、アムリノン、ベンフロジルヘミスクシネート、ブクラデシン、セレベロシン（cerberosine）、カンホタミド（camphotamide）、コンバラトキシン（convallatoxin）、シマリン、デノパミン、デスラノシド、ジギタリン、ジギタリス、ジギトキシン、ジゴキシン、ドブタミン、ドパミン、ドペキサミン、エノキシモン、エリトロフレイン（erythrophleine）、フェナルコミン（fenalcomine）、ジタリン（gitalin）、ジトキシン（gitoxin）、グリコシアミン、ヘプタミノール、ヒドラスチニン（hydrastinine）、イボパミン、ラナトシド、メタミバム（metamivam）、ミルリノン、ネリホリン（nerifolin）、オレアンドリン、ウワバイン、オキシフェドリン、プレナルテロール、プロスシラリジン、レジブフォゲニン（resibufogenin）、シラレン（scillaren）、シラレニン（scillarenin）、ストロファンチン（strphanthin）、スルマゾール、テオブロミンおよびキサモテロールが挙げられる。
【００９１】
特別な実施形態において、変力薬は、強心配糖体、β−アドレナリンアゴニストまたはホスホジエステラーゼ阻害剤である。強心配糖体の非限定的な例として、ジゴキシン（ラノキシン）およびジギトキシン（クリストジギン（crystodigin））が挙げられる。β−アドレナリンアゴニストの非限定的な例として、アルブテロール、バンブテロール、ビトルテロール、カルブテロール、クレンブテロール、クロルプレナリン、デノパミン、ジオキセテドリン（dioxethedrine）、ドブタミン（ドブトレックス）、ドパミン（イントロピン（intropin））、ドペキサミン、エフェドリン、エタフェドリン（etafedrine）、エチルノルエピネフリン、フェノテロール、ホルモテロール、ヘキソプレナリン、イボパミン、イソエタリン、イソプロテレノール、マブテロール、メタプロテレノール、メトキシフェナミン、オキシフェドリン、ピルブテロール、プロカテロール、プロトキロール（protokylol）、レプロテロール、リミテロール、リトドリン、ソテレノール（soterenol）、テルブタリン、トレトキノール、ツロブテロールおよびキサモテロールが挙げられる。ホスホジエステラーゼ阻害剤の非限定的な例として、アムリノン（イノコール（inocor））が挙げられる。
【００９２】
抗狭心症薬は、有機硝酸塩、カルシウムチャネル遮断薬、β遮断薬およびそれらの組合せを含むことができる。
【００９３】
ニトロ血管拡張薬としても知られている有機硝酸塩の非限定的な例として、ニトログリセリン（ニトロビッド（nitro-bid）、ニトロスタット（nitrostat））、イソソルビドジニトラート（アイソーディル、ソルビトレート）および硝酸アミル（アスピロール（aspirol）、バポロール（vaporole））が挙げられる。
【００９４】
特定の実施形態において、本発明のｍｉＲＮＡ調節薬は、心血管疾患の治療のためのエンドセリンと同時投与される。エンドセリン（ET）は、心不全の発症に関与すると考えられる強力な生理学的および病態生理学的効果を有する２１アミノ酸ペプチドである。ＥＴの効果は、２クラスの細胞表面受容体との相互作用によって媒介される。Ａ型受容体（ET-A）は血管収縮および細胞増殖に関与し、一方Ｂ型受容体（ET-B）は内皮−細胞媒介血管拡張に関与し、アルドステロン等、他の神経ホルモンの放出に関与する。ＥＴ産生、またはその関連細胞を刺激する能力のいずれかを抑制することのできる薬物は、本技術分野で既知である。ＥＴの産生の抑制は、その前駆体から活性型ペプチドのプロセシングに関与する、エンドセリン変換酵素と呼ばれる酵素を遮断する薬剤の使用に関与する。細胞を刺激するＥＴの能力の抑制は、ＥＴとその受容体との相互作用を遮断する薬剤の使用に関与する。エンドセリン受容体アンタゴニスト（ERA）の非限定的な例として、ボセンタン、エンラセンタン（Enrasentan）、アンブリセンタン、ダルセンタン、テゾセンタン、アトラセンタン、アボセンタン（Avosentan）、クラゾセンタン、エドネンタン（Edonentan）、シタクスセンタン、ＴＢＣ３７１１、ＢＱ１２３およびＢＱ７８８が挙げられる。
【００９５】
特定の実施形態において、ｍｉＲＮＡ調節薬と組み合わせることのできる二次治療薬は、例えば、予防的、診断的またはステージ分類的な、根治的および対症的外科手術を含むある種の外科手術を含むことができる。外科手術、特に根治的外科手術は、本発明のｍｉＲＮＡ調節薬および１または複数の他の薬剤等、他の治療と併せて用いることができる。
【００９６】
血管および心血管の疾患および障害のためのこのような外科手術用治療薬は当業者によく知られており、生物に対する外科手術の実施、心血管機械的人工器官の提供、血管形成、冠動脈再灌流、カテーテルアブレーション、対象への植え込み型除細動器の提供、機械的循環補助またはそれらの組合せを含むことができるが、これらに限定されるものではない。本発明に用いることのできる機械的循環補助の非限定的な例は、大動脈内バルーンカウンターパルゼーション、左室補助装置またはそれらの組合せを含む。
【００９７】
臨床的な適用を意図する場合、表３〜６に同定される１または複数のｍｉＲＮＡの調節薬を含む医薬組成物は、意図される適用に適切な形態で調製される。一般に、これは、発熱物質およびヒトまたは動物に対して有害でありうる他の不純物を本質的に含まない組成物の調製を伴う。高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを包含する脂質ベースの系など、コロイド分散系を、マイクロＲＮＡ機能のオリゴヌクレオチド阻害剤またはｍｉＲＮＡアゴニスト（例えば、特定のｍｉＲＮＡを発現するコンストラクトまたはｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチド）のための送達担体として用いることができる。心筋組織および平滑筋組織などの組織に対して本発明の核酸を送達するのに適する市販の脂質エマルジョンには、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）ＩＩ、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）ＩＩＩ、Ｎｕｔｒｉｌｉｐｉｄ、および他の類似の脂質エマルジョンが含まれる。ｉｎ  ｖｉｖｏにおける送達担体として用いるのに好ましいコロイド系は、リポソーム（すなわち、人工膜小胞体）である。このような系の調製および使用は、当技術分野でよく知られている。例示的な製剤はまた、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第５，９８１，５０５号；同第６，２１７，９００号；同第６，３８３，５１２号；同第５，７８３，５６５号；同第７，２０２，２２７号；同第６，３７９，９６５号；同第６，１２７，１７０号；同第５，８３７，５３３号；同第６，７４７，０１４号；および国際公開０３／０９３４４９においても開示されている。
【００９８】
一般に、核酸、アゴニスト、阻害剤および送達担体を安定させ、標的細胞による取込みを可能とするのに適する塩および緩衝液を用いることが所望される。緩衝液はまた、組換え細胞が患者に導入される場合にも用いられる。本発明の水性組成物は、薬学的に許容される担体または水性媒体中において溶解または分散した有効量の作用物質を含む。「薬学的に許容される」または「薬理学的に許容される」という語句は、動物またはヒトに投与した場合に、有害反応、アレルギー性反応、または他の都合の悪い反応をもたらさない分子的実体および組成物を指す。本明細書で用いられる「薬学的に許容される担体」には、ヒトに対する投与に適する薬剤などの薬剤を製剤化するのに用いるのに許容される、溶媒、緩衝液、溶液、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。薬学的活性物質のためのこのような媒体および作用物質の使用は、当技術分野でよく知られている。従来の媒体または作用物質は本発明の有効成分に適合しない場合を除いて、治療組成物における使用が意図される。それらが該組成物のベクターまたは核酸を不活化しない場合は、補完的な有効成分もまた組成物中に組み込むことができる。
【００９９】
本発明の活性組成物は、従来の医薬調製物を包含する。本発明によるこれらの組成物の投与は、その経路を介して標的組織に達しうる限りにおいて、任意の一般的な経路を介しうる。これには、経口経路、鼻腔内経路、または口腔内経路が含まれる。あるいは、投与は、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射、または静脈内注射を介する場合もあり、心筋組織内への直接的な注射による場合もある。ｍｉＲＮＡの阻害剤またはアゴニストを含む医薬組成物はまた、カテーテルシステムを介して投与してもよく、心臓への治療薬の送達のために冠動脈循環を分離するシステムを介して投与することもできる。当技術分野では、心臓および冠動脈血管系へと治療薬を送達するための各種のカテーテルシステムが知られている。本発明において用いるのに適する、カテーテルベースの送達方法または冠動脈分離方法の一部の非限定的な例は、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第６，４１６，５１０号；米国特許第６，７１６，１９６号；米国特許第６，９５３，４６６号；国際公開２００５／０８２４４０；国際公開２００６／０８９３４０；米国特許公開第２００７／０２０３４４５号；米国特許公開第２００６／０１４８７４２号；および米国特許公開第２００７／００６０９０７号において開示されている。このような組成物ならば通常、前出に記載の通り、薬学的に許容される組成物として投与されるであろう。
【０１００】
活性化合物はまた、非経口投与も腹腔内投与も可能である。例示を目的として述べると、遊離塩基または薬理学的に許容される塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と、適切に混合された水中において調製することができる。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびこれらの混合物中、ならびに油中おいても調製することができる。保管および使用の通常の条件下において、これらの調製物は一般に、微生物の増殖を防止する防腐剤を含有する。
【０１０１】
注射用の使用またはカテーテル送達に適する医薬形態には、例えば、無菌の水溶液または分散液、および無菌の注射用溶液または注射用分散液を即時調製するための無菌粉末が含まれる。一般に、これらの調製物は無菌であり、容易な注射可能性が存在する程度において流体である。調製物は、製造条件および保管条件の下において安定であり、細菌および真菌など、微生物の汚染作用に対して保護されるべきである。適切な溶媒または分散媒は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体のポリエチレングリコールなど）、これらの適切な混合物、および植物油を含有しうる。適正な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散液の場合は必要とされる粒子サイズの維持により、また界面活性剤の使用により維持することができる。微生物作用の防止は、各種の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによりもたらすことができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを組み入れることが好ましいであろう。注射用組成物の長時間吸収は、組成物中における吸収を遅延させる作用物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によりもたらすことができる。
【０１０２】
無菌の注射用溶液は、所望の他の任意の成分（例えば、上記で列挙された）と共に、活性化合物を適切な量で溶媒内へと組み込んだ後で、濾過による滅菌を行うことにより調製することができる。一般に、分散液は、基本的な分散媒、また例えば、上記で列挙した通りの他の所望の成分を含有する無菌の媒体内へと、各種の無菌の有効成分を組み込むことにより調製することができる。無菌の注射用溶液を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法には、（１つまたは複数の）有効成分に、あらかじめ無菌で濾過されたそれらの溶液に由来する任意のさらなる所望の成分を添加した粉末をもたらす、真空乾燥法および凍結乾燥法が含まれる。
【０１０３】
本発明の組成物は一般に、中性または塩の形態で製剤化することができる。薬学的に許容される塩には、例えば、無機酸（例えば、塩酸またはリン酸）または有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデリン酸など）に由来する酸添加塩（タンパク質の遊離アミノ基により形成される）が含まれる。タンパク質の遊離カルボキシル基により形成される塩はまた、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化鉄）に由来する場合もあり、有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなど）に由来する場合もある。
【０１０４】
製剤化されたら、溶液は、投与製剤に適合する形で、かつ治療的に有効であるような量で投与することが好ましい。製剤は、注射用溶液、薬剤放出カプセルなど、各種の形態において容易に投与することができる。水溶液中における非経口投与の場合、例えば一般には、溶液を適する形で緩衝し、例えば、まず十分な生理食塩水またはグルコースにより希釈液を等張とする。このような水溶液は、例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、および腹腔内投与に用いることができる。特に、本開示に照らすと、当業者に知られる通り、無菌の水性媒体を用いることが好ましい。例示を目的として述べると、１回の用量は、等張ＮａＣｌ溶液１ｍｌ中に溶解させてから、皮下注入液１０００ｍｌに添加することも、提起される注入部位に注射することもできる（例えば、「Remington's Pharmaceutical Sciences」、第15版、1035〜1038および1570〜1580頁を参照されたい）。治療される対象の状態に応じて、用量には何らかの変化が必然的に生じる。投与責任者は、いずれにせよ、個々の対象に適切な用量を決定する。さらに、ヒトへの投与の場合、調製物は、ＦＤＡの生物学的製剤事務局基準により要請される無菌性、発熱物質性、一般的な安全性、および純度の基準を満たすものとする。
【０１０５】
本明細書において、用語「心不全」は、心臓の血液を送り出す能力を低下させる任意の状態を意味するよう広く用いられている。その結果、うっ血および浮腫が組織に生じる。最も頻繁には、心不全は、冠動脈血流の低下によって生じる心筋の収縮性の低下に起因する。しかし、心臓弁の損傷、ビタミン欠乏症および原発性心筋疾患等、多くの他の要因も心不全の原因となり得る。心不全の正確な生理学的機序は完全には分かっていないが、心不全は一般に、交感神経、副交感神経および圧受容器応答等、数種類の心臓自律神経的性質の障害に関与すると考えられている。語句「心不全の症状」は、心不全に関連する研究上の知見を含む、息切れ、圧痕性浮腫、圧痛を伴う肝臓肥大、頸静脈充血、肺ラ音その他等、心不全に関連するあらゆる後遺症を包含するよう広く用いられている。
【０１０６】
用語「治療」またはその文法的な同義語は、心不全の症候（すなわち、心臓の血液を送り出す能力）の改善および／または回復を包含する。心臓の「生理学的機能の改善」は、本明細書に記載されている測定値（例えば、駆出率、短縮率、左室内法、心拍数の測定値等）のいずれかと共に、動物生存における任意の効果を用いて評価することができる。
【０１０７】
本明細書において、用語「心肥大」は、成体の心筋細胞が肥大成長によるストレスに応答するプロセスを意味する。このような成長は、細胞分裂なしで細胞サイズ増加、細胞内に追加的に筋節が集合して力発生を最大化すること、および胎児心臓の遺伝子プログラムの活性化によって特徴付けられる。心肥大は多くの場合、罹患率および死亡率のリスク増加に関連し、したがって心肥大の分子機序の理解を目的とする研究は、ヒトの健康に重大な影響を及ぼす。
【０１０８】
用語「心筋梗塞」またはＭＩは、心筋の酸素供給と需要との間の不均衡に起因する心筋壊死の急速な発症であり、これは多くの場合、冠血管において血栓形成するプラーク破裂によって生じ、心筋の一部への急性の血液供給低下をもたらす。多くのＭＩ事象は、「無症候性」か、または臨床的に認識されないが、その場合もこの定義に包含される。循環における心臓マーカーの出現は一般に心筋壊死を示唆し、診断の有用な補助である。このようなマーカーは、ＳＴ上昇ＭＩ（STEMI）、非ＳＴ上昇ＭＩ（NSTEMI）および不安定狭心症を含む。
【０１０９】
本明細書で論じられる任意の実施形態は、本発明の任意の方法または組成物との関連で実装しうることが意図され、またこの逆も意図される。さらに、本発明の組成物およびキットは、本発明の方法を達成するのに用いることができる。本出願の全体において、「約」という用語は、ある値が、該値を決定するのに用いられるデバイスまたは方法についての誤差の標準偏差を包含することを示すのに用いられる。特許請求の範囲における「または」という用語は、代替物のみを指すことが明示的に示されるか、または代替物が相互に除外的でない限り、「および／または」を意味するように用いられるが、本開示は、代替物のみ、ならびに「および／または」を指す定義を支持する。
【０１１０】
本明細書および（１つまたは複数の）請求項において用いられる「含む（comprising）」（ならびに「comprise」および「comprises」など、「comprising」の任意の形態）、「有する（having）」（ならびに「have」および「has」など、「having」の任意の形態）、「包含する（including）」（ならびに「includes」および「include」など、「includingの任意の形態）、または「含有する（containing）」（ならびに「contains」および「contain」など、「containing」の任意の形態）という語は、包含的またはオープンエンドであり、列挙されていないさらなる要素または方法の工程を除外しない。
【０１１１】
本発明を、限定的に解釈されるべきでない以下のさらなる実施例によってさらに例示する。当業者は、開示される具体的な実施形態において、多数の変更を行うことができ、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果がなおも得られることを、本開示に照らして理解されたい。
【実施例】
【０１１２】
（実施例１）心筋梗塞後リモデリングにおいて制御されるマイクロＲＮＡの同定
心筋梗塞後（MI後）リモデリングにおいて、左心室は、大まかに２領域に分けることができる。すなわち、（ａ）梗塞領域および（ｂ）遠隔心筋である。広範囲の線維症および筋細胞減少は、梗塞治癒における心筋リモデリングの初期段階の主要な特徴であるが、心筋細胞肥大および間質性線維症は、ＭＩ後の非梗塞心筋において発生する（図１Ａ）。ＭＩ後リモデリングに関与するｍｉＲＮＡを同定するための努力の一環において、左前下行枝（LAD）の閉塞によってＭＩを誘導し、ＭＩ後３日目と１４日目のマウス心臓における梗塞領域の境界域と非梗塞（遠隔）心筋の両方におけるｍｉＲＮＡ発現プロファイルを、シャム手術した動物のｍｉＲＮＡ発現プロファイルと比較した（図１Ｂ〜Ｃならびに表３および４）。マイクロアレイに示されている５６９個の各ｍｉＲＮＡのうち、４０個のｍｉＲＮＡがＭＩ誘導３日後の梗塞領域の境界域において有意に制御され、１７個のｍｉＲＮＡは２倍以上の発現上昇を示し、２３個のｍｉＲＮＡは２倍以上の発現低下を示した。さらに、遠隔心筋において２２個のｍｉＲＮＡが変化した様子を示し、１２個のｍｉＲＮＡは２倍以上の発現上昇を示し、１０個のｍｉＲＮＡは２倍以上の発現低下を示した（表３および４）。ＭＩの２週間後、６９個のｍｉＲＮＡは梗塞領域の境界域において２倍を超えて制御され、一方４０個のｍｉＲＮＡは遠隔心筋において２倍を超える変化を示した（表３および４）。ｍｉＲＮＡ特異的プローブを用いたリアルタイムＰＣＲ解析により、アレイのデータを確認した（図１Ｄ）。
【０１１３】
【表３−１】
2012527478.tif 000008
【０１１４】
【表３−２】
2012527478.tif 000009
【０１１５】
【表４−１】
2012527478.tif 000010
【０１１６】
【表４−２】
2012527478.tif 000011
【０１１７】
これらの同定されたｍｉＲＮＡのヒト心臓における制御を調べるため、心臓移植を受けた患者から採取した梗塞領域境界域由来の心臓組織を得た。リアルタイムＰＣＲ解析により、マウスＭＩモデルにおいて制御されるｍｉＲＮＡのうち、数個がヒト心臓において同様に制御されたことを確認した。例えば、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２１４およびｍｉＲ−２２３は、梗塞巣の境界域において著しい発現上昇を示したが、一方ｍｉＲ−２９ｂおよびｍｉＲ−１４９の発現は、有意に下方制御されていた（図１Ｅ）。ｍｉＲ−２１のノーザンブロット解析は、リアルタイムの発現データを立証した（図１Ｆ）。これらの結果は、虚血に応答した心臓リモデリングにおいて制御されるｍｉＲＮＡの集合を明らかにする。
【０１１８】
具体的な方法
外科的処置。成体のＣ５７／ＢＬ６雄マウスを２．４％イソフルランで麻酔し、加温パッド（３７℃）上に仰臥位で置いた。動物に１９Ｇスタンプ針を挿管し、ＭｉｎｉＶｅｎｔマウス人工呼吸器（Hugo Sachs Elektronik、ドイツ；心拍出量２５０μｌ、呼吸数毎分２１０呼吸）を用いて室内の空気で人工呼吸した。第４肋骨と第５肋骨との間を左開胸することにより、左前下行枝（LAD）を顕微鏡下で可視化し、６−０プロレン（prolene）縫合を用いて結紮した。解剖顕微鏡（Leica）下で目視検査して、閉塞した遠位心筋の変色により限局性虚血を確認した。シャム手術した動物は、ＬＡＤ動脈を閉塞する以外は同じ手順を受けた。
【０１１９】
組織学的解析およびＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション。組織学検査用の組織をＫｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｈｅｉｔ溶液中でインキュベートし、４％パラホルムアルデヒド中で固定し、切片化し、ヘマトキシリン−エオシン（H&E）およびＭａｓｓｏｎのトリクローム染色で処理、または標準的な技法によるｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行った（Sheltonら、2000年）。
【０１２０】
ｍｉＲＮＡのマイクロアレイ。サービス会社（LC Sciences）を利用してマイクロアレイアッセイを行った。全ＲＮＡ試料１０μｇからアッセイを開始し、ＹＭ−１００  Ｍｉｃｒｏｃｏｎ遠心フィルター（Millipore製）を用いて試料をサイズ分画し、単離された低分子ＲＮＡ（＜３００ｎｔ）を、ポリ（Ａ）ポリメラーゼを用いてポリ（Ａ）テールにより３’伸長した。次に、その後の蛍光色素染色のため、オリゴヌクレオチドタグをポリ（Ａ）テールにライゲーションした。二重試料実験において、２種のＲＮＡ試料に対し２種類の異なるタグを用いた。微小循環ポンプを用いてμＰａｒａｆｌｏマイクロ流体チップ上で一晩ハイブリダイゼーションを行った（Atactic Technologies）（Gaoら、2004年）。マイクロ流体チップにおいて、各検出プローブは、標的マイクロＲＮＡ（miRBaseウェブサイトより）または他のＲＮＡ（対照またはユーザーが規定した配列）と相補的な化学修飾ヌクレオチドコードセグメントと、該コードセグメントを基質から離して伸長するためのポリエチレングリコールスペーサーセグメントからなる。検出プローブは、ＰＧＲ（光生成試薬）化学を用いたｉｎ  ｓｉｔｕ合成によって作製される。ハイブリダイゼーションの融解温度は、検出プローブの化学修飾を考慮してバランスを取った。ハイブリダイゼーションは、２５％ホルムアミドを含む６×ＳＳＰＥバッファー（０．９０Ｍ  ＮａＣｌ、６０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、６ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ６．８）１００μＬを用いて３４℃で行った。ＲＮＡハイブリダイゼーションの後、タグとコンジュゲートするＣｙ３およびＣｙ５色素を、色素染色のためマイクロ流体チップを通して循環させた。レーザースキャナ（GenePix 4000B、Molecular Device）を用いて蛍光画像を取得し、Ａｒｒａｙ−Ｐｒｏ画像解析ソフトウェア（Media Cybernetics）を用いてデジタル化した。先ずバックグラウンドを差し引き、次にＬＯＷＥＳＳフィルター（局所加重回帰）（Bolstadら、2003年）を用いてシグナルを正規化することによりデータを解析した。二色実験のため、２セットの検出シグナル比（ｌｏｇ２変換、平衡化）およびｔ検定のｐ値を算出した。示差的に検出されるシグナルは、ｐ値が０．０１未満のシグナルである。
【０１２１】
ＲＴ−ＰＣＲおよびリアルタイム解析。ｍｉＲＮＡレベルを検出するため、ＴａｑｍａｎマイクロＲＮＡ逆転写酵素キット（Applied Biosystems、ABI）を用いて、メーカーの推奨に従ってＲＴ−ＰＣＲを行った。ＲＮＡ５ｎｇを用いてｍｉＲＮＡ特異的プライマーによりｃＤＮＡを作製し、その後ｍｉＲＮＡ特異的Ｔａｑｍａｎプローブにより対象ｍｉＲＮＡの発現レベルを検出した。ランダムヘキサマープライマー（Invitrogen）によるＲＮＡ試料のＲＴ−ＰＣＲの後、ＡＢＩから購入したＴａｑｍａｎプローブを用い、ＰＣＲか定量的リアルタイムＰＣＲのいずれかにより遺伝子サブセットの発現を解析した。
【０１２２】
ノーザンブロット解析。Ｔｒｉｚｏｌ試薬（GibcoIBRL）を用いて、マウスおよびヒトの心臓組織試料または単離筋細胞から全ＲＮＡを単離した。心筋梗塞に罹患していると診断された匿名のヒトの境界域の領域の心臓組織試料を得た。ノーザン用のゲルをエチジウムブロマイドで染色することにより、ローディング量が等しいことを確認した。以前に記載された通り（van Rooijら、2006年）、マイクロＲＮＡを検出するためのノーザンブロットを行った。Ｕ６プローブはローディング対照として用いた。
【０１２３】
（実施例２）ヒト心不全において制御されるマイクロＲＮＡの同定
ヒト心不全においていずれのｍｉＲＮＡが制御されるか決定するため、健康な心臓組織と特発性拡張型心筋症（IDC）に罹患した患者の心臓組織の両方からＲＮＡを単離し、ｍｉＲＮＡのマイクロアレイを行った。測定した全７１１個のｍｉＲＮＡのうち、３１個が有意に上方制御され（表５）、一方４５個のｍｉＲＮＡが有意に下方制御される（表６）ことが判明した。
【０１２４】
上方制御されるｍｉＲＮＡのうち、マウスの心肥大およびリモデリングにおいて制御されることを本出願人らが以前に見出した数個のｍｉＲＮＡ（例えば、miR-214、miR-21、miR-195、miR-15b、miR-199a、miR-26aならびにmiR-23aおよびb）が同定された。上方制御されるｍｉＲＮＡにおけるこの重複は、これらのｍｉＲＮＡが心臓の異なる疾患プロセスに関与し、病状に積極的に影響を与える可能性を示唆する。興味深いことに、罹患試料において有意に誘導される他のｍｉＲＮＡも数個存在し、これらは疾患に積極的に関与し得る（表５）。例えば、ｌｅｔ−７ファミリー全メンバーの上方制御が観察された。
【０１２５】
【表５】
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【０１２６】
下方制御されるｍｉＲＮＡのうち、マウスの心肥大およびリモデリングにおいて制御されることを以前に見出した数個のｍｉＲＮＡが同定された。例えば、ヒト心不全試料においてｍｉＲ−２９ファミリー全３種のメンバー（miR-29a、miR-29bおよびmiR-29c）は下方制御された。ヒト心不全試料において同様に下方制御されるｍｉＲ−１０１は、近年、マウスにおいて心筋梗塞後に下方制御されることが確認された。ｍｉＲ−１３３およびｍｉＲ−１は、ヒト試料において両者共に下方制御され、これらのｍｉＲＮＡは両者共に、マウスの心肥大およびリモデリングモデルにおいて下方制御されることが報告されている（van Rooijら、（2008年）Trends in Genetics、24（4）巻: 159〜166頁において概説されている）。制御されるｍｉＲＮＡにおけるこの重複は、心疾患におけるこれらの同定されたｍｉＲＮＡの有望な役割を暗示する（表６）。興味深いことに、ｍｉＲ−３０ファミリー全５種のメンバー（miR-30a、miR-30b、miR-30c、miR-30dおよびmiR-30e）はヒト心不全試料において下方制御された。
【０１２７】
【表６】
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【０１２８】
これらのデータは、ｍｉＲがヒト心不全のプロセスにおいて制御され、積極的に関与することを示す。これらの同定されたｍｉＲＮＡの操作は、治療法開発のためのいくつかの独自の機会を提起する。
【０１２９】
（実施例３）ＭＩ後のｍｉＲ−２９発現の下方制御
ＭＩ後に制御されるｍｉＲのうち、ｍｉＲ−２９ファミリー全３種のメンバーがＭＩに応答して下方制御された。このｍｉＲＮＡファミリーは、２個のバイシストロニックｍｉＲＮＡクラスターから発現する３種のメンバーからなる。ｍｉＲ−２９ｂ−１はｍｉＲ−２９ａと同時発現し、一方ｍｉＲ−２９ｂの第２のコピー（miR-29b-2）はｍｉＲ−２９ｃと同時発現する。全ファミリーメンバーは保存シード領域を共有し、ｍｉＲ−２９ａおよびｍｉＲ−２９ｃは、ｍｉＲ−２９ｂ配列とは１塩基のみが異なる（図２Ａ）。複数のマウス組織のノーザン解析は、全３種のｍｉＲ−２９ファミリーメンバーにおいて、肺および肝臓において最大の発現を有する類似の発現パターンを示した。３種のメンバーのうち、ｍｉＲ−２９ｂは心臓で最も顕著であると考えられる（図２Ｂ）。心筋細胞および線維芽細胞を単離することによって、本発明者らは、ｍｉＲ−２９が線維芽細胞集団において優先的に発現することを見出した。ｍｉＲ−２９ファミリーメンバーの発現レベルは、無血清培地（SF）中に維持、または肥大症アゴニストのフェニレフリン（PE）で刺激した心筋細胞における発現レベルよりも、心臓の線維芽細胞において５〜１２倍高かった（図２Ｃ）。
【０１３０】
４体の異なる動物における、梗塞部位の境界域と遠隔心筋の両方におけるｍｉＲ−２９ｂ発現のノーザン解析は、ＭＩに応答した非常に一貫した発現低下を立証した。ベースラインレベルおよび遠隔心筋における発現と比較すると、ｍｉＲ−２９ｂのレベルは、ＭＩ後３日目の梗塞部位において一貫して下方制御された（図２Ｄ）。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析により、ＭＩ後３日以内にｍｉＲ−２９ファミリー全３種のメンバーが発現低下することをさらに確認した。しかし、梗塞が治癒し、二次リモデリングが進行中である場合、ｍｉＲ−２９の発現は、１４日目までに梗塞巣に隣接する領域（例えば、境界域）において低下し続けていた（図２Ｅ）。
【０１３１】
（実施例４）ｍｉＲ−２９は線維症遺伝子の発現を制御する
ＭＩ後の心臓におけるｍｉＲ−２９ａ〜ｃの可能性のある機能の定義を始めるために、本発明者らは、計算による予測を利用してｍｉＲ−２９ａ〜ｃ標的候補を同定した。Ｔａｒｇｅｔｓｃａｎ予測ウェブサイトは、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの標的候補として、コラーゲン、メタロペプチダーゼおよびインテグリンをコードする予想外に多くの線維症関連ｍＲＮＡを示した（ワールドワイドウェブのtargetscan.org）。ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの下方制御が心臓の線維症を制御し得るか決定するため、本発明者らは、心臓におけるＥＣＭ産生と関連付けられる予測標的に注目した。エラスチン（ELN）、フィブリリン１（FBN1）、Ｉα１およびα２型コラーゲン（COL1A1、COL1A2）ならびにＩＩＩα１型コラーゲン（COL3A1）の全てが、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの１または複数の保存シード配列候補を含む（図３Ａ）。
【０１３２】
ｍｉＲＮＡは、その標的ｍＲＮＡの定常状態レベルおよび翻訳を下方制御できるため、本発明者らは、予測されるｍｉＲ−２９ａ〜ｃ  ｍＲＮＡ標的の発現を解析した。心臓の線維症のこれらの主要制御遺伝子のＭＩ後３日目の心臓試料におけるリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析は、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２、ＣＯＬ３Ａ１およびＦＢＮ１の発現上昇と相関する梗塞領域におけるｍｉＲ−２９ａ〜ｃの特異的下方制御を示した。対照的に、ＥＬＮは境界域において変化を示さず、さらに遠隔心筋における上昇を示した（図３Ｂ）。
【０１３３】
ＣＭＶ駆動型発現プラスミドを用いた予測ｍｉＲ−２９ａ〜ｃ標的の３’−ＵＴＲを含むルシフェラーゼ発現プラスミドにより、本発明者らは、ＣＯＳ細胞においてｍｉＲ−２９ｂ−１およびｍｉＲ−２９ａを過剰発現させた（図３Ｃ）。ＣＭＶが駆動するｍｉＲ−２９ｂ−１／ｍｉＲ−２９ａ量の増加は、ルシフェラーゼ活性の用量依存的低下をもたらしたが、同等量のｍｉＲ−２０６（対照miRNA）では効果がなかった（図３Ｄ）。これらの結果は、これらのｍＲＮＡがｍｉＲ−２９ａ〜ｃによる抑制標的であるという結論を支持する。
【０１３４】
具体的な方法
細胞培養、トランスフェクションおよびルシフェラーゼアッセイ。ｍｉＲ−２９ｂ−１およびｍｉＲ−２９ａコード領域を包含する１７９３ｂｐのゲノムフラグメントをＰＣＲにより増幅し、ｐＣＭＶ６にライゲーションした。ｍｉＲ−２９結合部位（複数可）を包含するマウス３’ＵＴＲのゲノムフラグメントをＰＣＲ増幅し、ホタルルシフェラーゼ（f-luc）レポーター構築物（pMIR-REPORTTM、Ambion）にライゲーションした。ＣＯＳ細胞をメーカーの取扱説明書に従いＦｕｇｅｎｅ６（Stratagene）でトランスフェクトした。相当する量のｃＤＮＡインサートなし発現ベクターを添加することにより、ウェル当たりのＤＮＡ総量を一定に保った。トランスフェクション４８時間後に、ルシフェラーゼアッセイキット（Promega）を用いて細胞抽出物のルシフェラーゼ発現をアッセイした。相対的なプロモーター活性は、細胞抽出物中のβ−ガラクトシダーゼ発現に対して正規化された発光相対単位として表す。
【０１３５】
（実施例５）心臓の線維芽細胞におけるｍｉＲ−２９の制御
心臓の線維症は、通常不全心臓において観察されるリモデリングプロセスの主要な側面である。線維芽細胞の増殖および細胞外マトリックス成分の沈着増加は、心筋硬直および拡張機能障害をもたらす。トランスフォーミング増殖因子β（TGFβ）は、心臓におけるコラーゲンの生成および沈着に主要な役割を果たし、線維芽細胞の筋線維芽細胞への形質転換を誘導することを示した（BorderおよびNoble、1994年）。ＴＧＦβに曝露した心臓の線維芽細胞のリアルタイムＰＣＲ解析により、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの発現低下が明らかになり、これは、ＭＩ後のｍｉＲ−２９ａ〜ｃ低下がＴＧＦβ制御されている可能性を示唆する（図４Ａ）。興味深いことに、ナトリウム利尿ペプチド様Ｂ型のナトリウム利尿ペプチド（BNP）は、線維症および筋線維芽細胞転換に関連するＴＧＦβ制御型遺伝子発現を抑制することを示した（Kapounら、2004年）。この観点において、本発明者らは、心臓特異的ｍｉＲＮＡのｍｉＲ−２０８を欠損するマウスが、心臓の線維症およびリモデリングに対して抵抗性であり、ベースラインにおけるＢＮＰの発現上昇を示したことを以前に報告した（van Rooijら、2007年）。ＢＮＰはＴＧＦβの効果と拮抗することが知られているため、本発明者らは、これらのマウスにおけるＢＮＰのレベル上昇が、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの発現を増強し得ると仮定した。実際に、ノーザン解析は、ｍｉＲ−２０８の除去によるｍｉＲ−２９ａ〜ｃ発現の用量依存的上昇を示し、これはＢＮＰの発現レベル上昇と一致した（図４Ｂ）。これらのデータは、少なくとも部分的に、心筋細胞によって分泌されるＢＮＰによって抑制され得るｍｉＲ−２９ａ〜ｃのレベルを低下させることによって、線維芽細胞においてＴＧＦβがコラーゲン関連遺伝子の発現を誘導することを示した。
【０１３６】
具体的な方法
以前に記載した通りに（SimpsonおよびSavion、1982年）心臓の線維芽細胞（CF）を単離した。すなわち、麻酔した１〜２日齢の新生仔Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Harlan Sprague Dawley、インディアナ州インディアナポリス）から心臓を切除し、刻み、パンクレアチン０．１％で消化した。細胞をｐｒｉｍａｒｉａプレートに２時間蒔き、消化組織の心筋細胞画分を含む培地を除去した。心臓の線維芽細胞は付着して、心筋細胞より迅速に増殖した。この性質は、第１の継代後に実質的に純粋な線維芽細胞培養物をもたらし、これは、差次的なプレーティングおよび顕微鏡による評価を繰り返すことによって確認された。継代のため０．０５％トリプシンで細胞を剥離し、継代２〜４において培養実験を行った。１０％熱失活ＦＢＳおよび抗生物質（ペニシリンおよびストレプトマイシン）を含む高グルコース（４．５ｇｍ／Ｌ）ダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）において細胞を培養した。培地をＬ−アスコルビン酸（１０μｇ／μｌ）を含有する低血清（２％ＦＢＳ）に交換し、１０ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦβ１を４８時間投与することによって、筋線維芽細胞分化を誘導した。
【０１３７】
（実施例６）ｍｉＲ−２９のｉｎ  ｖｉｖｏノックダウンは線維症およびコラーゲン遺伝子の発現を誘導する
コラーゲン発現の負の制御因子としてのｍｉＲ−２９ａ〜ｃの潜在的な役割をさらに調査するため、本発明者らは、ｍｉＲ−２９ｂの成熟ｍｉＲＮＡ配列と相補的なコレステロール修飾オリゴヌクレオチド（アンチmiR-29b）と、陰性対照として生理食塩水か４塩基ミスマッチを含むオリゴヌクレオチド（ミスマッチmiR-29b）のいずれかを用いてｍｉＲ−２９ｂをｉｎ  ｖｉｖｏでノックダウンした（図５Ａ）。アンチｍｉＲ−２９ｂ（８０ｍｇ／ｋｇ）の尾静脈注射を１回行って３日後、本発明者らは、検査した全組織においてｍｉＲ−２９ｂ発現の大幅な減少を観察した（図５Ｂ）。対照的に、同等の用量のミスマッチｍｉＲ−２９ｂアンチセンスオリゴヌクレオチドは、生理食塩水対照と比べてｍｉＲ−２９ｂ発現レベルに効果がなかった。アンチｍｉＲとミスマッチで治療した動物の間でプレｍｉＲＮＡのレベルが同等のままであるため、アンチｍｉＲ−２９ｂによるノックダウンは、成熟ｍｉＲＮＡ特異的であると考えられる。肝臓および腎臓におけるノックダウンは完全であると考えられるが、低レベルのｍｉＲ−２９ｂが心臓および肺において依然として検出可能であった（図５Ｂ）。リアルタイムＰＣＲ解析は、ｍｉＲ−２９ｂノックダウンが肝臓特異的なコラーゲン遺伝子の発現誘導に十分であるが、ミスマッチ対照においてはこの効果がなかったことを示した（図５Ｃ）。
【０１３８】
心臓のｍｉＲ−２９ｂノックダウンを増強するため、本発明者らは、オリゴヌクレオチド８０ｍｇ／ｋｇを２日連続で静脈内注射し、３週間後に材料を採取した。ノーザン解析は、ミスマッチｍｉＲ−２９ｂの注射後に観察された発現レベルと比べて、アンチｍｉＲ−２９ｂに応答した腎臓および肝臓におけるｍｉＲ−２９ｂの完全なノックダウンを示した（図５Ｄ）。心臓のｍｉＲ−２９ｂレベルも大幅に低下したが、肺におけるｍｉＲ−２９ｂの発現はアンチｍｉＲ−２９ｂによって影響を受けていない様子が示される（図５Ｄ）。心臓におけるコラーゲン発現は、ｍｉＲ−２９ｂ抑制に応答して上昇した（図５Ｅ）。総合すると、これらのデータは、ｍｉＲ−２９ｂがｉｎ  ｖｉｖｏにおいてコラーゲン遺伝子発現の負の制御因子として機能し、これにより心臓および肝臓におけるコラーゲン沈着および線維症に影響を及ぼすことを示す。
【０１３９】
具体的な方法
合成オリゴヌクレオチド治療によるＩｎ  ｖｉｖｏ  ｍｉＲ−２９ｂ抑制。成熟ｍｉＲ−２９ｂと相補的な配列を含む化学修飾オリゴヌクレオチド（アンチｍｉＲ−２９ｂ）を用いてｍｉＲ−２９ｂ活性を抑制した。全ヌクレオシドは２’−ＯＭｅ修飾され、５’末端の２塩基および３’末端の４塩基はホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含み、分子はヒドロキシプロリノール（hydroxyprolinol）リンカーを介して結合した３’コレステロールを含んでいた。８週齢のＣ５７ＢＬ／６雄マウスに、用量８０ｍｇ／ｋｇ体重のアンチｍｉＲ−２９ｂもしくはミスマッチｍｉＲ−２９ｂのいずれか、または同等の容量の生理食塩水を尾静脈注射により投与した。治療３日後または３週間後のいずれかに組織を採取した。
【０１４０】
（実施例７）ｍｉＲ−２９模倣物によるコラーゲン発現の下方制御
ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの過剰発現がコラーゲン発現を低下させ得るか決定するため、本発明者らは線維芽細胞をｍｉＲ−２９ｂ模倣物に曝露した。線維芽細胞培養物におけるｍｉＲ−２９ｂ発現のレベルは、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物曝露３日後に４００倍も上昇した（図５Ｆ）。ｍｉＲ−２９ｂ模倣物によってｍｉＲ−２９ａ発現は影響を受けず、ｍｉＲ−２９ｃ発現はごく僅かしか上昇しなかった（図５Ｆ）。リアルタイムＰＣＲ解析は、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物に応答してコラーゲン遺伝子の発現が低下したことを示した（図５Ｇ）。しかし、コラーゲン発現低下の程度はｍｉＲ−２９ｂ発現上昇と比べて僅かであり、これはｍｉＲ−２９ａ〜ｃレベルだけがコラーゲンレベルの決定要因ではないことを示唆する。
【０１４１】
具体的な方法
合成オリゴヌクレオチド治療によるｉｎ  ｖｉｖｏ  ｍｉＲ−２９ｂ増強。ｍｉＲ−２９ｂ模倣物は、ガイドおよびパッセンジャー鎖からなる二本鎖構築物である。ガイド鎖は、各ピリミジン残基に２’−Ｆヌクレオシド、２個の３’末端ホスホロチオエート結合を含み、５’末端が化学的にリン酸化されている。パッセンジャー鎖は、２個の５’末端２’−ＯＭｅ残基および２個の３’末端ホスホロチオエート結合を含む。コレステロールは、ヒドロキシプロリノールリンカーによってパッセンジャー鎖の３’末端と結合する。８週齢のＣ５７ＢＬ／６雄マウスに、用量８０ｍｇ／ｋｇ体重のｍｉＲ−２９ｂ模倣物または同等の容量の生理食塩水を尾静脈注射により投与した。治療３日後または３週間後のいずれかに組織を採取した。
【０１４２】
本明細書で論じられ引用されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。本明細書において開示および特許請求されるすべての組成物および方法は、本開示に照らして不適切な実験なしに作製および実施することができる。本発明の組成物および方法を好ましい実施形態との関連で説明してきたが、本発明の概念、趣旨、および範囲から逸脱しない限りにおいて、本明細書に記載の組成物および方法に対して、また、該方法の工程または一連の工程において、変更を適用しうることは当業者に明らかであろう。より具体的に述べると、同じであるかまたは類似の結果が達成される場合、化学的にも生理学的にも関連する特定の作用物質により、本明細書に記載の作用物質を置換しうることは明らかであろう。当業者に明らかな、このような類似の置換および変更のすべては、添付される特許請求の範囲により規定される本発明の趣旨、範囲、および概念の内にあるものとみなされる。
【０１４３】
配列表
【表７−１】
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【表７−２】
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【０１４４】
参照文献
以下の参照文献は、本明細書の記載を補足するための例示的手順または他の詳細を提供する範囲において、参照により本明細書中に具体的に組み込まれる。
【化３】
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【化４】
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【化５】
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【化６】
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【化７】
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【化８】
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【化９】
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【化１０】
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【化１１】
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【化１２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
2012527478000001.app
【国際調査報告】
2012527478.tif 000031