(57)【要約】  本発明は、RNAオリゴヌクレオチド配列、あるいはサイクリンD1/TROP2キメラmRNAの発現をサイレンシングすることができるRNAまたはアナログ分子に転写されるRNAまたはアナログ分子に転写される配列、あるいは腫瘍の治療及び予防におけるその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サイクリンD1/TROP2キメラmRNAの発現をサイレンシングすることができるオリゴヌクレオチド配列(siRNA)であって、前記siRNAは、以下のサイクリンD1/TROP2連結配列
5’GAGAGAGAGAGAAAGGAGCCC 3’ (配列番号21)
を含むまたは有するサイクリンD1/TROP2キメラmRNAに相補的なリボヌクレオチド配列であることを特徴とする、オリゴヌクレオチド配列。
【請求項２】
siRNAがヘアピンである、請求項１に記載の配列。
【請求項３】
請求項１または２に記載の配列を含むベクター。
【請求項４】
請求項３に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項５】
薬学的に許容可能である1つ以上のアジュバント及び/または賦形剤と一緒に、活性成分として、請求項１もしくは２に記載の配列を含む、または請求項１もしくは２に記載の配列に存する、あるいは請求項３に記載のベクターを含む、または請求項３に記載のベクターベクターに存する、薬剤組成物。
【請求項６】
腫瘍の治療用または予防用の医薬を調製するための、請求項１または２に記載の配列、あるいは請求項３に記載のベクター、あるいは請求項５に記載の組成物の使用。
【請求項７】
腫瘍が、胃癌、結腸癌、乳癌、子宮内膜癌、卵巣癌、腎臓癌、及び肺癌からなる群より選択される、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
以下の配列を有する以下のPCRプライマー
(フォワード) 5’ CTGGCCGCAATGACCCCGCA 3’ (配列番号4)
(リバース) 5’ GGCGGAGGAACGCGGACCGG 3’(配列番号9)
(フォワード) 5’ GCGGGATCCAAGGGAAAGCTTCATTCT 3’ (配列番号5)
(リバース) 5’ GAGGCGCGGGGACTCGTCGG 3’ (配列番号10)
(フォワード) 5’ GCGGGATCCCCTTGTTGTTGGTTGTTT 3’(配列番号6)
好ましくは、
(フォワード) 5’ GCGGGATCCAAGGGAAAGCTTCATTCT 3’ (配列番号5)
(リバース) 5’ GAGGCGCGGGGACTCGTCGG 3’ (配列番号10)
を含む、または上記プライマーに存する、生物学的サンプル中のサイクリンD1/TROP2キメラをインビトロで検出及び定量するためのキット。
【請求項９】
リアルタイムPCR用の以下のプライマー
(フォワード) 5’ CTGGCCGCAATGACCCCGCA 3’ (配列番号4)
(リバース) 5’ GGCGGAGGAACGCGGACCGG 3’ (配列番号9)
(フォワード) 5’ GCGGGATCCAAGGGAAAGCTTCATTCT 3’ (配列番号5)
(リバース) 5’ GAGGCGCGGGGACTCGTCGG 3’ (配列番号10)
(フォワード) 5’ GCGGGATCCCCTTGTTGTTGGTTGTTT 3’ (配列番号6)
好ましくは、
(フォワード) 5’ GCGGGATCCAAGGGAAAGCTTCATTCT 3’ (配列番号:5)
(リバース) 5’ GAGGCGCGGGGACTCGTCGG 3’ (配列番号10)
を使用して、生物学的サンプル中のサイクリンD1/TROP2キメラをインビトロで検出及び定量するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キメラサイクリンD1/TROP2の発現を阻害するオリゴヌクレオチド配列、および医療分野におけるその使用に関する。特に本発明は、RNAオリゴヌクレオチド配列、あるいはサイクリンD1/TROP2キメラmRNAの発現をサイレンシングすることができるRNAまたはアナログ分子に転写される配列、ならびに腫瘍の治療及び予防におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
RNAの転写後成熟化は、タンパク質発現の制御において基本的な役割を有している。この成熟化における鍵となるイベントの一つは、メッセンジャーRNA(mRNA)の連続分子を形成するためのスプライシング、すなわちイントロン（ノンコーディング領域）の除去、ならびにエクソン（コーディング領域及び非翻訳末端）の融合のプロセスである。通常、ヒト遺伝子の約70%は異なるスプライシング[1]（すなわち成熟mRNAを形成するエクソンの選択におけるバリエーション）を行う。これにより、同一のヌクレオチド配列から異なるオープンリーディングフレーム(ORF)を生成すること、あるいは別のエクソンがRNAの5’および3’末端に非翻訳制御領域を含む場合、遺伝子発現の制御が可能となる。種々のタイプの配列を、スプライシングプロセスで使用することができ、最も一般的なものは、スプライシング装置により認識され、除去される可能性があるイントロン配列の開始および最後におけるジヌクレオチドGTおよびAGである。このプロセスの欠陥、例えばヌクレオチド制御配列またはスプライシング装置における突然変異、はしばしば発生し、多くの遺伝性疾患を引き起こす[2,3]。スプライシング欠陥はしばしばヒト腫瘍にも発見され、原因となる役割を有する可能性があり、腫瘍疾患のより高度な攻撃性に関連する可能性がある。
【０００３】
mRNA成熟もまた、2個の独立なRNA（トランスプライシング）のスプライシングを介して、DNAレベルで組換えを伴わない融合（キメラ）RNAを生成する可能性があり、この後者は、ヒト腫瘍にしばしば発見される欠失である。原生動物トリパノソーマでは、全mRNAは、共通のリーダー配列を有し、それはトランスプライシングプロセスに由来する[6]。同様のRNA成熟プロセスが、他の複数の種において記載され（[7]、およびその参照）、哺乳類のものを含む（[8]、およびその参照）。またトランスプライシングプロセスにおいて、種々の配列を利用して、分岐ボーダー(junction borders)をシグナル化することもできる[9-11]。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Johnson, J.M., et al., Genome-wide survey of human alternative pre-mRNA splicing with exon junction microarrays. Science, 2003. 302(5653): p. 2141-4
【非特許文献２】Stenson, P.D., et al., Human Gene Mutation Database (HGMD): 2003 update. Hum Mutat, 2003. 21(6): p. 577-81.
【非特許文献３】Buratti, E., M. Baralle, and F.E. Baralle, Defective splicing, disease and therapy: searching for master checkpoints in exon definition. Nucleic Acids Res, 2006. 34(12): p. 3494-510.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
サイクリンD1/TROPキメラが、発癌性の役割を果たしていることはよく知られている(37)。本発明の著者らは、コピーDNA(cDNA)シークエンシングおよびRNA保護実験（図２）により、腫瘍細胞系統MDF7およびOVCA-432において、サイクリンD1とTROP2の転写物の間の融合に由来するキメラmRNA（図１Ａ）の存在に関する知識を示し、さらに拡大した。サイクリンD1は、過剰発現すると腫瘍成長を刺激する可能性がある細胞周期制御分子である。サイクリンD1の過剰発現は、しばしばヒト腫瘍でみられ、一般的にDNAレベルの再構成によるものである。サイクリンD1過剰発現の第二の機構は、遺伝子増幅であり、それは、乳癌、頭部及び頚部癌、膀胱癌、卵巣癌および食道癌のようなヒトカルシノーマにおいてしばしば発生し[12, 13]、サイクリンD1遺伝子のコピー数の増大を引き起こす。第三の機構は、サイクリンD1遺伝子における逆位または欠失により、例えば副甲状腺腺腫において示され、これにより、mRNA自身の分解の誘導に関わる、3’非翻訳領域の大部分を欠失した、対応するmRNAのショートバージョンの転写物をもたらす[14]。それゆえこのmRNA（ショートサイクリン）は、全長バージョンよりも安定であり、癌遺伝子（癌を引き起こす遺伝子）となる[15-17]。これは、対応するサイクリンD1タンパク質における変化/突然変異を引き起こさないことに注目すべきである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
Trop-2（TACSTD2遺伝子）[18-21]は、細胞質カルシウムシグナルを伝達する膜貫通糖タンパク質であり[22]、上皮組織の細胞間および細胞基質間接着に関わる。Trop-2はまた、大多数のヒト癌で過剰発現しており[19, 23]、腫瘍成長の潜在的な刺激物である。この刺激能力は、Trop-2の細胞質領域におけるセリン303におけるタンパク質キナーゼC（PKC）リン酸化部位に依存し、PKCによる完全細胞質シグナリングに依存する[24]。
【０００７】
本願において単離されたサイクリンD1/TROP2キメラmRNA（キメラ）において、短縮形態のサイクリンD1を、TROP2の全長転写物と融合した。これらの要素は両方とも、通常の配列を有し、ヌクレオチド突然変異を伴わず、完全なコード配列を含む。キメラを発現する細胞系統の細胞蛍光分析とウェスタンブロッティングにより、キメラが、正常サイクリンD1とTrop-2タンパク質に対応する2個の独立なポリペプチドに翻訳されることが実験的に確認されている（図３）。
【０００８】
サイクリンD1遺伝子は腫瘍においてしばしば組み換えられているため、上述のように、単一の転写単位において、同一の染色体上で、サイクリンD1とTrop-2を一緒にするDNAレベルの再構成が存在するかを調査した。キメラを発現する細胞系統に実行したポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、サザンブロッティング、及び蛍光In Situハイブリダイゼーション(FISH)解析により、遺伝子レベルの転座及び組換えがないことが示された。それゆえ、サイクリンD1/TROP2キメラは、対応する遺伝子を独立に起源とするmRNA分子を連結するトランススプライシングイベントに由来する。連結の周囲の配列は、トランススプライシングで一般に使用されるものと異なるため、キメラを生成する機構は新規であり、特に腫瘍細胞における遺伝子発現の制御に重要である。
【０００９】
サイクリンD1/TROP2キメラの発癌潜在性に関して、サイクリンD1/TROP2キメラはヒト腫瘍由来の細胞系統から単離され、サイクリンD1とTROP2の両方が細胞増殖を引き起こす可能性があるため、キメラが細胞増殖を刺激することができるか否かを調査した（図５）。このために、突然変異RAS癌遺伝子とともにサイクリンD1/TROP2キメラを、新生ラットから採取されたBRK細胞に導入した。通常、これらの細胞は、培養中で限定的な寿命を有し、数カ月後に死滅するが、同じ振る舞いを、変異RASのみを発現するBRK細胞において観察した。反対に、サイクリンD1/TROP2キメラを変異RASに加えた場合、BRK細胞は、細胞培養プレート上と固体基質に接着しない（ソフトアガー中）で継続的に増殖することができるようになり、それは腫瘍形質転換に典型的に関わる[25-27]。さらに重要なことに、サイクリンD1/TROP2キメラにより形質転換したBRK細胞は、実験動物（無胸腺ヌードマウス）における腫瘍として増殖することができる。それゆえサイクリンD1/TROP2キメラは増殖を刺激することができるのみではなく、癌遺伝子として振る舞い、それを発現する細胞を腫瘍細胞に形質転換する。この形質転換能は、サイクリンD1mRNAの安定性よりおよそ90倍である、キメラmRNAのより大きい安定性に依存する。興味深いことに、キメラmRNAはまた前述のショートサイクリンよりもはるかに安定でもある。別の形質転換共因子は、Trop-2の追加実験により示される。
【００１０】
サイクリンD1/TROP2キメラは潜在的発癌性を示すため、本発明の著者らは、正常ヒト組織と、複数のタイプの腫瘍におけるその発現を試験した。種々の起源（胃、大腸、乳、子宮内膜、腎臓、肺、卵巣）の、40種の腫瘍を、キメラに特異的なプローブ及びオリゴヌクレオチドを伴うノーザンブロッティングおよび/またはcDNAのPCRにより解析した。解析により、サイクリンD1/TROP2キメラがしばしばヒト腫瘍で発現していることが示された（表１及び２）。
【００１１】
表１は、一連のヒト腫瘍における、TROP2及びサイクリンD1のmRNA、ならびにそれらのサイクリンD1/TROP2のmRNA融合体のレベルを示す。
【００１２】
【表１】
2012503483.tif 000002
【００１３】
表２は、サイクリンD1/TROP2キメラの発現について解析した腫瘍の、臨床病理学上の特性を示す。
【００１４】
【表２】
2012503483.tif 000003
【００１５】
顕著な例は、腸細胞型胃癌のものであり、それは解析した全ての場合においてサイクリンD1/TROP2キメラを発現する（5例中5例）。キメラの発現は、個々のクリンD1及びTROP2のmRNAの発現レベルにより決定されず、種々の腫瘍が、2つのmRNAをほとんど検出できない量で発現し（例えば胃癌）、一方他の腫瘍は両方のmRNAが非常に高い量で存在するもののキメラを発現しない（例えば乳癌）。このことにより、サイクリンD1/TROP2キメラの生成は、制御された現象であることが示唆される。
【００１６】
大腸、腎臓、肺、膵臓、胎盤、前立腺、胃、子宮及び皮膚由来の、一連の正常ヒト組織に、並行して解析を実施した。非常に高い増殖速度とTrop-2発現レベルにより特徴づけられる皮膚ケラチノサイトのみを例外として、解析した正常組織の中には、キメラmRNAを発現するものはなかった。
【００１７】
サイクリンD1-TROP2キメラの潜在的発癌性、及びその腫瘍におけるほとんど排他的な発現から、キメラが、腫瘍学における適用のための重要な診断ツール及び治療標的となる。
【００１８】
キメラはmRNA融合体であるため、関連するゲノム部位の間のDNA組換えがないまま、キメラの検出方法を、DNAよりも、はるかにより不安定で、分解しやすい細胞/組織RNAから開始しなければならない。癌病理学の標準手順により、バッファー化したホルマリン中で固定し、パラフィン中に埋め込む腫瘍生検のアーカイブを、核酸の抽出用に使用することができる。これらのサンプルから抽出した核酸の品質は多様であり、さらなる解析に影響を及ぼす。
【００１９】
特異的な転写物の検出に関して、ノーザンブロッティング及びRNA保護のような研究室で使用される古典的な方法を、利用できる材料（ヒト組織）の量における厳密な制限により特徴づけられる、ミディアム/ハイスループット臨床設定に容易に転移することはできない。実際これらの方法は、大量の（数十μｇのオーダーの）完全RNA及び正確な最適化を必要とし、必要な検出感度を達成するために放射性同位体[32P]を使用する。
【００２０】
融合mRNAを発現する細胞/組織において、サイクリンD1及びTROP2に対応するDNA、個々のmRNA及びタンパク質は、どのようにも改変されない。さらに両方の分子は、正常組織に存在し、重要である。また、サイクリンD1/TROP2キメラが、低レベルの発現ですでに前発癌性作用を達成することも有名である。
【００２１】
それゆえ、上記詳述したことを考慮すると、高効率でサイクリンD1/TROP2キメラの発現を阻害し、キメラの発現を事実上ゼロに減少することができる方法であって、2個のサイクリンD1とTROP2のパートナーにそれぞれ効果が最小か効果がない、融合RNA分子に対して高度に特異的な方法に対する必要性が明確に存在する。さらに、高感度で、頑強で、定量的でかつ潜在的にハイスループットである可能性がある、サイクリンD1/TROP2キメラの存在を明らかにする検出方法を提供する必要性が存在する。
【００２２】
本発明の著者らはこの度、効果的で高度に特異的である、サイクリンD1/TROP2キメラの発現を阻害するための革新的なシステムを開発した。このために、本発明では、キメラの結合ポイントの配列を含むサイレンシングRNA(siRNA)を設計し、RNAサイレンシングの機構を開発した。ヘアピン構造にあるsiRNA (siRNA-CH)を含むオリゴヌクレオチドを、適切なベクター（プラスミドおよびレンチウイルスベクター）中にサブクローン化した。並行して、標的配列（1個はサイクリンD1由来の領域にあり、1個はTROP2由来の領域にある）に関して2個の突然変異ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド(siRNA-MM)もまた、合成してサブクローン化した。このsiRNA-MMは、標的配列に完全にはアニールせず、ネガティブコントロールとして使用した。各siRNAに相当するオリゴヌクレオチドペアの配列を、図１Ｃに示す。
【００２３】
siRNAを含むベクターを、キメラを発現する細胞に形質転換した。これらの細胞中のキメラのレベルを、以前に設定した方法（cDNAのリアルタイム定量PCR）で測定した。並行して、2個のパートナー、サイクリンD1とTROP2のRNAの発現レベル、ならびにコントロールとして28S rRNAの発現レベルも、同様の手順を使用して測定した。これらと同一の細胞において、成長速度も観察した（図１０）。サイクリンD1/TROP2キメラのサイレンシングは、極めて効率的で特異的であることが示された。キメラの発現は、特異的なsiRNAによってゼロまで減少し、一方、サイクリンD1とTROP2のレベルは変わらないままで、起源細胞のレベル（及び一般に使用される技術的対照、特に空ベクターで形質転換した細胞）と同じであった。サイクリンD1/TROP2キメラの発現阻害に伴い、細胞増殖もまた強力に阻害された。
【００２４】
さらに本発明の著者らは、細胞及び組織中におけるサイクリンD1/TROP2キメラの発現を検出することができるcDNAの定量PCRによる解析方法を開発している。キメラの結合点の周辺領域を増幅することができる、DNA合成用の一連の特異的プライマーを設計した。各プライマーペアのための反応条件（酵素、バッファー、アニール温度）を、キメラを発現する細胞より抽出した総RNAより調製したcDNAにおけるPCRにより最適化した。
【００２５】
PCR反応を、勾配サーモサイクラーで実行し、種々のアニール温度で並行して試験した。前期方法の感度を増大させるために、最初のラウンドで得られるフラグメントの内部の少なくとも一つのプライマーでPCR産物の再増幅も実行した。PCR反応の最終産物を、アガロースゲルに電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色した。予想される分子量の一本のバンドをシークエンス解析し、その配列をサイクリンD1/TROP2キメラの増幅に対して予想されるものと比較した。これにより、単一またはネスティドPCR反応において、使用する可能性がある、3つのプライマーペア、および関連する増幅条件を選択することができた：PRAD1.F3 及びT2.F5c (94 °C, 1分; 68 °C, 1分; 72 °C, 1分; 35サイクル)；PRAD1.F4及びT2.F5tris (94 °C, 1分; 59 °C, 1分; 72 °C, 1分; 35サイクル)；PRAD1.F5及びT2.F5tris (94 °C, 1分; 64 °C, 1分; 72 °C, 1分; 35サイクル)。これらのプライマーの配列を図１Ｂに示す。
【００２６】
有効かつ特異的にキメラを増幅することができる（単一バンドが存在する）、プライマーペアPRAD1.F4/T2.F5trisを、キメラを発現する細胞から調製したcDNAにおいて、Sybrグリーンの存在下でリアルタイム定量PCRで順次試験した。増幅サイクルは以下の通りである：94 °C, 30秒; 60 °C, 30秒; 72 °C, 30秒; 45サイクル。反応中の蛍光発光を測定し、PCR産物の解離曲線を、各反応の最後に描画した（図９）。50%のPCR産物が解離する温度で、単一のピークの存在により、反応の特異性が確認された。それゆえ、リアルタイム定量PCR解析が、少量の材料（1μgの総RNA）より出発する、細胞及び組織におけるサイクリンD1/TROP2キメラの存在を特異的に検出し、定量化することができる解析方法であることが証明された。サイクリンD1/TROP2キメラを解明するための、ホルマリン固定とは異なる別の方法が、回収後すぐに組織を急速冷凍し、その後低温(-80°C)で保存することにより示されており、この方法はすでに専用のコレクションセンターで使用することができる。さらに本明細書に記載の手順は、例えばサンプルと反応のアセンブリを保護するためのロボットステーションを使用するミディアム-ハイスループット設定に容易に移転される。この目的のためのロボットは、すでに市販されている（TECAN, Switzerland）。
【００２７】
この診断技術を開発するために実行した試験の重要な結果は、サイクリンの結合領域を特異的に増幅することができるプライマー配列の評価であった。
【００２８】
それゆえ、本発明の特異的な実施態様は、サイクリンD1/TROP2キメラmRNAの発現をサイレンシングできるオリゴヌクレオチド配列(siRNA)またはアナログ分子であり、そのようなsiRNAは、以下のサイクリンD1/TROP2連結配列を含むまたは有するサイクリンD1/TROP2キメラmRNAに相補的なリボヌクレオチド配列である。好ましくは、siRNAはヘアピンである。
【００２９】
さらに本発明の別の実施態様は、上述の配列を含むベクターと、前記ベクターを含む宿主細胞である。
【００３０】
さらなる本発明の実施態様は、薬学的に許容可能である1つ以上のアジュバントおよび/または賦形剤と一緒に、活性成分として上述の配列を含むもしくは上述の配列に存する、または上述のベクターを含むもしくは上述のベクターに存する、薬剤組成物である。
【００３１】
本発明の別の実施態様は、例えば、胃癌、大腸癌、乳癌、子宮内膜癌、卵巣癌、腎臓癌、および肺癌のような腫瘍を治療又は予防するための医薬を調製するための、上述の配列またはベクターまたは組成物の使用である。
【００３２】
さらなる本発明の実施態様は、以下の配列を有する以下のPCRプライマーを含む、または存する、生物学的サンプル中のサイクリンD1/TROP2キメラをインビトロで検出または定量するためのキットにより示される：
(フォワード) 5’ CTGGCCGCAATGACCCCGCA 3’ (配列番号4)
(リバース) 5’ GGCGGAGGAACGCGGACCGG 3’(配列番号9)
(フォワード)5’ GCGGGATCCAAGGGAAAGCTTCATTCT 3’ (配列番号5)
(リバース) 5’ GAGGCGCGGGGACTCGTCGG 3’ (配列番号10)
(フォワード) 5’ GCGGGATCCCCTTGTTGTTGGTTGTTT 3’(配列番号6)
好ましくは、
(フォワード) 5’ GCGGGATCCAAGGGAAAGCTTCATTCT 3’ (配列番号5)
(リバース) 5’ GAGGCGCGGGGACTCGTCGG 3’ (配列番号10)。
【００３３】
さらなる本発明の別の実施態様は、リアルタイムPCR用の以下のPCRプライマーを使用して、生物学的サンプル中のサイクリンD1/TROP2キメラをインビトロで検出または定量するための方法である：
(フォワード) 5’ CTGGCCGCAATGACCCCGCA 3’ (配列番号4)
(リバース) 5’ GGCGGAGGAACGCGGACCGG 3’ (配列番号9)
(フォワード) 5’ GCGGGATCCAAGGGAAAGCTTCATTCT 3’ (配列番号5)
(リバース) 5’ GAGGCGCGGGGACTCGTCGG 3'(配列番号10)
(フォワード) 5’ GCGGGATCCCCTTGTTGTTGGTTGTTT 3’ (配列番号6)
好ましくは、
(フォワード) 5' GCGGGATCCAAGGGAAAGCTTCATTCT 3’ (配列番号:5)
(リバース) 5’ GAGGCGCGGGGACTCGTCGG 3’ (配列番号10)。
【００３４】
本発明はここで、図面の図を特に参照して、それに制限されないが複数の好ましい実施態様による事例及び実施例により記載されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１−１】本発明の主題を形成する主配列を示す。（Ａ）サイクリンD1/TROP2融合体の配列。垂直バーにより、サイクリンD1とTROP2の間の連結点がマークされる。
【図１−２】本発明の主題を形成する主配列を示す。（Ｂ）定量PCRにより、サイクリンD1/TROP2キメラmRNAを測定するために使用するプライマー。（Ｃ）サイクリンD1-TROP2キメラmRNAの発現をサイレンシングすることができるsiRNA、またはコントロールとして使用する無効なsiRNAに転写される配列。
【図２】ヒト癌細胞系統にサイクリンD1-TROP2キメラmRNAの発現を示す。（Ａ）RNA保護。ヒト細胞系統MCF7（乳癌由来）、OVCA-432（卵巣癌由来）、及びL細胞（マウスフィブロブラストーマ−ネガティブコントロール）から抽出したRNAを、サイクリンD1/TROP2キメラの連結に相当する[32P]標識アンチセンスRNAプローブにハイブリダイズさせた。その後RNAを一本鎖のみを切断し、ハイブリダイズしたRNAを切断しない特異的なRNaseで消化し、ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。バンドは、プローブに相補的であり、二重鎖ハイブリッドを形成するmRNAに対応し、それゆえRNaseから保護されている。矢印は、サイクリンD1/TROP2キメラに相当するバンドであり、矢頭はTROP2及びサイクリンD1のmRNAに相当するバンドを示す。消化したプローブ：細胞由来のDNAを有さない、ネガティブコントロール。（Ｂ）RT-PCR。示された細胞系統から合成したcDNAを、サイクリンD1/TROP2キメラの連結点の上流と下流のプライマーで増幅した。PCR産物を、アガロースゲルで電気泳動し、サイクリンD1及びTROP2に特異的な2つの[32P]標識プローブでサザンブロッティングにより解析した。矢印は、サイクリンD1/TROP2キメラに相当するバンドを示す。L/TROP2：ヒトTROP2で形質転換したL細胞。Mix：サイクリンD1を発現するがTROP2を発現しないヒト細胞系統Ovcar-3由来のRNAと混合した、ヒトTROP2で形質転換したL細胞由来のRNA。このサンプル中にバンドがないことは、細胞因子がない場合、2個の転写物が単に同時に存在することは、キメラmRNAの生成に十分ではないことを示す。
【図３】サイクリンD1-TROP2キメラmRNA由来のサイクリンD1及びTROP2の発現を示す。（Ａ）サイクリンD1/TROP2キメラで形質転換したBRK細胞を、蛍光抗Trop-2抗体で染色し、フローサイトメトリーで解析した。（Ｂ）これらの形質転換体由来のタンパク質抽出物を、抗サイクリンD1抗体でウェスタンブロットにより解析した。ショートサイクリンで形質転換した、または形質転換していない、コントロールBRK細胞を、並行して解析した。
【図４】サイクリンD1及びTROP2遺伝子の間の組換えの欠損を示す。（Ａ）mRNA構造。サイクリンD1/TROP2キメラmRNA、ならびにサイクリンD1及びTROP2遺伝子の対応する領域の制限酵素マップ。垂直バー：キメラにおけるサイクリンD1及びTROP2の間の連結点。星：2個の野生型遺伝子における対応する部位。図の最下段に、サザンブロッティングに使用したプローブの部位を示す。（Ｂ）ゲノム構造。OVCA-432細胞(OVCA)及び正常ヒトリンパ球（末梢血リンパ球、PBL）から抽出し、Pst IまたはHind III制限酵素で消化し、サイクリンD1またはTROP2のいずれかに特異的なプローブとハイブリダイズさせたDNAのサザンブロット解析。分子量マーカーの位置を左に示す。キメラmRNAがDNA融合体を起源とするのであれば、OVCA-432 DNAのサザンブロット解析により、サイクリンD1及びTROP2の両方のプローブと同じ分子量を有するバンドが明らかにされる。（Ｃ）FISH解析。OVCA-432及びMCF-7細胞、並びにコントロールPBLの核を、サイクリンD1及びTROP2のプローブとハイブリダイズさせた。矢頭はサイクリンD1とのハイブリダイゼーションを示し、矢印はTROP2とのハイブリダイゼーションを示す。OVCA-432細胞は、細胞あたり3から4コピーのサイクリンD1、ならびに2コピーのTROP2を有する。MCF-7細胞は、細胞あたり4コピーのサイクリンD1、ならびに2コピーのTROP2を有する。解析した全ての場合において、2個の遺伝子のハイブリダイゼーションは重ならない。キメラmRNAがDNA融合体を起源とするのであれば、2個の遺伝子由来のシグナルは、キメラを発現する細胞に置いて重なるであろう。
【図５】サイクリンD1/TROP2キメラの潜在的発癌性を示す。（Ａ）変異RAS癌遺伝子と一緒にサイクリンD1/TROP2キメラで形質転換したBRK細胞。キメラの低レベルの発現（左、上）は、細胞増殖を誘導する。キメラを発現しないコントロールBRK細胞（ベクター及び形質転換なし）は、休止している。矢印は、増殖している集団（左、上）、または丸く、屈折正の形態を有する単独の休止細胞を示す。より高いレベルのキメラの発現（右）により、BRK細胞は培養物中で連続的に生育することができるようになる。活発に増殖するBRK細胞の3つの異なる形態を示す：分散した細胞、類樹皮細胞、及び線維芽細胞様細胞。画像は、40倍で撮影した位相差顕微鏡像である。（Ｂ）変異RAS癌遺伝子と一緒に、ショートサイクリンまたはサイクリンD1/TROP2キメラで形質転換したBRK細胞の増殖により形成されるソフトアガロースコロニー。非形質転換BRK細胞を、ネガティブコントロールとして使用した。（Ｃ）変異RAS癌遺伝子と一緒に、ショートサイクリンまたはサイクリンD1/TROP2キメラで形質転換したBRK細胞により、無胸腺ヌードマウスで生成した腫瘍の増殖曲線。各曲線は1個の腫瘍に相当する。（Ｄ）組織病理学解析にかけた場合、これらの腫瘍は、偽カプセルの存在下で、多型線維肉腫様の外観および紡錘状細胞の柵を有し、高い細胞濃度を有することが発見された。
【図６】サイクリンD1/TROP2キメラmRNAの安定性を示す。変異RAS癌遺伝子と一緒に、サイクリンD1/TROP2キメラ、サイクリンD1またはショートサイクリンで形質転換したBRK細胞を、時間0でアクチノマイシンD（RNA新規合成のインヒビター）で処理した。対応するmRNAを抽出し、処理の最初と異なる時間で放射性サイクリンD1プローブ（インセット）でノザンブロットで定量化した。値を、標準化し（時間0の量を100%に等しいとする）、プロットした。これにより、mRNAの安定性の直接測定である、各RNAの半減期(t1/2)、すなわち細胞に存在するmRNAの量を、新規合成がない状態で50%減少させるためにかかる時間を算出することが可能となる。サイクリンD1/TROP2キメラmRNAの半減期は23時間であり、一方サイクリンD1のmRNAの半減期は15時間であり、ショートサイクリンの半減期は5時間であった。
【図７】ヒト腫瘍によるサイクリンD1/TROP2キメラmRNAの発現を示す。（Ａ）卵巣腫瘍。（上）キメラに特異的なプライマーで実行する、cDNAからのPCRのサザンブロット解析。（中、下）（25° PCR増幅サイクルを示す）PCRにより測定したサイクリンD1及びTROP2のmRNAの発現レベル。（Ｂ）cDNAに実行したPCRにより測定した、腫瘍及び細胞系統によるサイクリンD1/TROP2キメラの発現。35°サイクルのPCR産物を、アガロースゲルに電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色した。コントロールとして、同じサンプルで28S rRNAを定量した。（Ｃ）結合領域に対応する放射性プローブでノーザンブロットにより測定した、ヒト腫瘍におけるサイクリンD1/TROP2キメラの発現。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションにより、キメラmRNAならびに個々の転写物に対応するmRNAを検出する。各腫瘍の起源の組織を示す。番号は表１のとおりである。Endomet.：子宮内膜。記号＋及び−は、キメラmRNAの不在または存在を示す。
【図８】サイクリンD1/TROP2キメラの発現について解析した、ヒト腫瘍の組織病理を示す。パネル１から７：胃の腺癌（１、２、４から６：小腸タイプ、３、７分散）、パネル１および２：炎症性浸潤を伴う適度な分化物；３：神経周囲の新生物浸潤物。パネル８から１５：結腸直腸の腺癌；８、１０から１３：適度に分化した腺癌；炎症性浸潤を伴う正常な小腸腺窩（１３、下）；９：ほとんど分化しない腺癌。パネル１６から２１：管状浸潤乳腺癌：１８、２１：適度に分化した腺癌；１６、１７、１９：あまり分化していない形態；２０：管状形成物からさらに分化した形態。パネル２２および２３：子宮内膜腺癌；２２：壊死領域を有するほとんど分化しない腫瘍。パネル２４から２６：腎臓腺癌；２４、２６：同型の腫瘍細胞を伴う腎臓好酸性顆粒細胞腫；２５：清澄な細胞腎臓腺癌。パネル２７：よく分化したうろこ状の細胞肺腺癌（下）正常に重なる線毛粘膜（上）。パネル２８から３２：卵巣癌腫；２８、３１、３２：顕著なストロマ成分を有する一連の嚢胞腺癌；２８（上右）に、砂粒体が見える；３１はほとんど分化しない、３２は適度に分化する；２９：よく分化した粘膜癌腫；３０：類内膜型。サイクリンD1/TROP2キメラを発現する腫瘍を、＊で示す。20倍の倍率で撮影したパネル４、５、１３、２５、２９、３０を除いて、写真を40倍の倍率で撮影した。
【図９】定量PCR反応の特異性解析を示す。Sybrグリーンの存在下におけるPCR反応により、サイクリンD1/TROP2キメラ、TROP2およびサイクリンD1に対して得られた増幅産物を、解離プロフィールについて解析した。温度の上昇に伴う蛍光の減少を記録した（グラフは、このタイプの解析に対して通常可視化されるように、ｙ軸上に減少の導関数を示す）。各反応物に対して、特徴的な温度における単一のピークが存在することは、単一で特異的なPCR産物の存在を示す。
【図１０】サイクリンD1/TROP2キメラmRNAのRNAサイレンシングによる、癌細胞の増殖阻害を示す。（Ａ）キメラをサイレンシングするための特異的siRNAを発現するベクターで形質転換したMCF7腫瘍細胞の増殖曲線（太線）。（空ベクターで形質転換した）コントロールMCF7を、同時に測定した（細線）。バーは、各点の細胞数の平均の標準誤差に相当する。（Ｂ）PCR反応により生成する二重鎖DNAに結合すると蛍光性となる染料のSybrグリーンの存在下で、リアルタイム定量PCRにより測定される、キメラを標的とするsiRNAで形質転換したMCF7細胞における、サイクリンD1、TROP2およびサイクリンD1/TROP2キメラのmRNAレベル。キメラを標的とするsiRNA（◆）、または空ベクター（×）の形質転換体から調製したcDNAのPCR増幅サイクルの増大に対する蛍光発光の強度を示す。内部定量標準として、28SリボソームRNAレベルを使用した。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
実施例１：サイクリンD1/TROP2キメラの発現を阻害することができるオリゴヌクレオチド配列と、サイクリンD1/TROP2キメラの発現を検出するための方法の設定を目的とする実験
材料と方法
培養細胞。OVCA-432、Ovcar-3およびMCF-7細胞系統を、RPMI 1640培地(GibcoBRL, Paisley, Scotland)中で培養した。L細胞系統を、DMEM中で維持した。培地を、10%ウシ胎仔血清(GibcoBRL, Paisley, Scotland)で補填した。BRK細胞を、[16]に記載の8日齢Sprague-Dawleyラットの腎臓から調製した。正常リンパ球（末梢血リンパ球、PBL）を、濃度勾配(Ficoll-Hypaque)にかけたヘパリン化血液の遠心により取得した。外科的手術の直後、タイプIVコラーゲナーゼで処理して、皮膚生検（2例）からケラチノサイトを取得した。
【００３７】
トランスフェクション。トランスフェクションを、[32]に記載のとおり、またはリポフェクション(Gibco-BRL, USA)により実行した。
【００３８】
培養における細胞増殖の測定。サイクリンD1/TROP2キメラに特異的なsiRNA、またはコントロールとしての空ベクターでトランスフェクトしたMCF-7細胞を、96ウェル（各実験点に6個の重複ウェル）で4 x 103細胞/ウェルの濃度で播種した。各時間点に対する細胞数を、[33]に記載のとおり、クリスタルバイオレットで染色して定量した。
【００３９】
ソフトアガロースにおける増殖。ソフトアガロースにおける形質転換BRK細胞の増殖を、[34]に記載のとおり、測定した。簡単には、3x104、7x104または105BRK形質転換体を、3.5 cm直径ディッシュにそれぞれ播種した。増殖細胞を始原とする可視コロニーを、メチレンブルーで染色後、毎週スコア化した。
【００４０】
In vivoモデル：無胸腺ヌードマウスにおける異種移植。サイクリンD1/TROP2キメラまたはショートサイクリン（プラス変異RAS）により形質転換したBRK細胞を、8週齢C57/B16ヌードマウス（群あたり10マウス）に皮下注射した。全ての群で、[35]に本質的に示されるように、毎週腫瘍増殖を測定した。
【００４１】
動物及びそのケアに関する手順は、国(D.L. No.116, G.U., Suppl. 40, Feb.18, 1992; circolare No. 8, G.U., July, 1994)及び国際(EEC Council Directive 86/609, OJ L 358. 1, Dec.12, 1987; Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, United States National Research Council, 1996)法およびポリシーを遵守して、施設のガイドラインに従って実行した。
【００４２】
統計解析。in-vitro形質転換アッセイの異なる実験群のにおける複数の病巣の間にある差異の統計的有意性を、χ２検定およびスチューデントt-検定によりアッセイした。異なる腫瘍の組織タイプによりキメラの発現差異のパーセンテージの統計的有意差を、フィッシャーの抽出試験により検査した。
【００４３】
プラスミド。pBJI-neoベクターは、M. Davis博士 (Stanford University, CA)により提供された。pUHD tet-off発現ベクター[36]は、H. Bujard博士により供給された。サイクリンD1とRc/CMVベクター[16]を含むpPL-8及びpD1-1プラスミドは、P. Hinds博士 (Harvard University, MA)により提供された。
【００４４】
全長サイクリンD1-TROP2ハイブリッドメッセージを、pPL-8由来のEco RI/Hind IIIセグメントと、CDM8ベクター中のキメラDNAを含むHind III/Xba Iセグメントとを合成することにより構築した[37]。全長サイクリンD1のcDNAを、ショートサイクリンのcDNAを含むpPL-8中に、pD1-1 (Hind III/Hind IIIセグメント)由来のサイクリンD1遺伝子の完全3’UTを挿入することにより合成した。
【００４５】
変異型または野生型Ha-RAS遺伝子を、全長ゲノム構築物として利用し、その内因性プロモーター(pUC-EJ及びpUC-EC)によりドライブした[16]。
【００４６】
TROP2、全長サイクリンD1、ショートサイクリン、およびサイクリンD1/TROP2キメラを全て、pBJI-neo（HTLV-1プロモーターでドライブする発現）[38]、pRC（CMVプロモーター）[16]、pUHD （tetO-CMVキメラプロモーター）[36]、またはpEYFP（CMVプロモーター）(Clontech, Palo Alto, CA)で発現した。
【００４７】
DNAシークエンシング。DNAシークエンシングを、サンガー法[39]で実行した。Genetics Computer Groupプログラムパッケージ[40]で、DNA配列を解析した。
【００４８】
サザン及びノザンブロット解析。核酸（DNA及びRNA）を抽出し、[39]に記載されるように解析した。制限酵素を、New England Biolabs (Beverly, MA)より購入した。核酸をトランスファーするフィルターを、[41]に記載されるように標識した、TROP2またはサイクリンD1のcDNA放射性プローブと高ストリンジェンシーでハイブリダイズした。
【００４９】
サイクリンD1とTROP2の間の結合にわたる307bpのプローブを利用して、腫瘍中のキメラを解析した。このプローブは、サイクリンD1の123塩基と、TROP2の5’末端の183塩基[18]を含み、プライマーPRAD1.F4 / T2.F5bisでキメラをPCR増幅することにより取得された。前記プローブを、プローブそれ自身を生成するために使用する特異的プライマーでランダムプライマーを置換することにより修飾する[41]に記載される手順を使用して放射性[32P]で標識した。0.5 M Na2PO4、7% SDS中、58-62°Cでフィルターをハイブリダイズし、50 mM Na2PO4、1% SDS中室温で洗浄した。アニーリング温度がより高くなり、1時間に1回の洗浄によりキメラメッセージのみを解析するよう利用すると、TROP2及びサイクリンD1のmRNAもまた、より低い温度でアニールすることが明らかになった。
【００５０】
ウェスタンブロット解析。ウェスタンブロット解析を、[19]に記載されるように実行した。簡単には、細胞溶解物を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)で変性して解析し、ニトロセルロースフィルターにトランスファーした。フィルターを、室温で1時間、抗ヒトTROP2または抗サイクリンD1ポリクローナル抗体とインキュベートした。抗体結合を、ペルオキシダーゼと接合した抗ウサギ二次抗体(Calbiochem, La Jolla, CA)を使用する化学発光(ECL; Amersham, Aylesbury, UK)により解明した。
【００５１】
PCR解析。RNAを、Trizol (Invitrogen)で培養中の細胞から、または[42]に記載されているように、回収後すぐに凍結し、その後液体窒素中で粉砕した組織から抽出した。総RNAまたはポリA+RNAを、標準プロトコル(Pharmacia)に従って、対応するcDNAに逆転写し、PCRにより解析した（9700 PCR thermocycler, Perkin-Elmer, Foster City, CA; Mastercycler - Gradient, Eppendorf, Hamburg, Germany）[39]。PCR反応用の2個のプライマーを、以下の群のそれぞれから選択した：
フォワード（サイクリンD1に相補的）
PRAD1.F2, CCCAGCTGCCCAGGAAGAGC (配列番号3)  
PRAD1.F3, CTGGCCGCAATGACCCCGCA (配列番号4); 
PRAD1.F4, GCGGGATCCAAGGGAAAGCTTCATTCT (配列番号5); 
PRAD1.F5, GCGGGATCCCCTTGTTGTTGGTTGTTT (配列番号6)。
Reverse: (complementary to TROP2): 
リバース（TROP2に相補的）
T2.F4bis, ATCGTTGTCCACGAGCGCGT (配列番号7); 
T2.F5bis, TTGGTGGGACACGTGCAGTT (配列番号8); 
T2.F5c, GGCGGAGGAACGCGGACCGG (配列番号9); 
T2.F5tris, GAGGCGCGGGGACTCGTCGG (配列番号10)。
PCR反応を、キメラ上の200bpの間隔にある種々のプライマー対を使用して実行し、TROP2の5’領域と、サイクリンD1-TROP2連結にわたる領域との両方が、使用するプライマー対に関わらず、おそらく安定な二次構造がこの領域に存在するために、増幅することが困難である。実際、増幅効率は、高アニール温度(68-72°C)、ならびに特異的な試薬、例えば、「Perfect Match」(Stratagene, California)及びAmplitaq Gold (Applied Biosystems, California)を有する反応バッファー、または「Failsafe」キット(Epicentre, Madison, WI)に含まれるTaqポリメラーゼを有する、同キットからのバッファーHまたはI中の10%ジメチルスルホキシドを使用して改善する。これらの後者の試薬で最良の結果が得られ、その後連続する全てのPCR増幅に使用した。
【００５２】
プライマー対PRAD1.F4/T2.F5trisを伴うPCR増幅（94°C、1分; 59°C、1分; 72°C、1分; 35サイクル）により、効率的に腫瘍中のキメラmRNAの存在が解明された。逆に、細胞系統由来のキメラの増幅には、2つの連続PCR反応が必要であった：プライマー対PRAD1.F3/T2.F5c（94°C、1分; 68°C、1分; 72°C、1分; 35サイクル）を使用する第一の増幅、それに続く、プライマー対PRAD1.F4/T2.F5tris、上記のサイクル条件を伴うPCR産物の再増幅。
【００５３】
サイクリンD1のmRNAを、[43]に記載されているように、プライマーSUF (フォワード, 5' ACAAACAGATCATCCGCAAACAC 3' (配列番号11))及びSUR (リバース, 5' TGTTGGGGCTCCTCAGGTTC 3' (配列番号12))で解明した。TROP2のmRNAを、プライマー対T2.R3quad (フォワード, GCAGGACAACTGCACGTGTC (配列番号13))及びT2.F4bis (リバース, ATCGTTGTCCACGAGCGCGT (配列番号7))で解明した。PCR反応を、20, 25, 30及び35サイクル後停止し、その産物をエチジウムブロマイド-アガロースゲルで解析したリボソーム28S rRNAを、内部対照として同時に、プライマー28SF (フォワード, 5' TTGAAAATCCGGGGGAGAG 3' (配列番号14))及び28SR (リバース, 5' ACATTGTTCCAACATGCCAG 3' (配列番号15))で増幅した[44]。
【００５４】
OVCA-432およびMCF-7細胞由来のゲノムDNAを、キメラの連結点をまたぐ2個のプライマー対により解析し、サイクリンD1及びTROP2部位の間の組換え可能性を検出した。使用したプライマーは以下である：T2.R2t、フォワード、GACTGCCTCCGGGCCTGCCA (配列番号16); T2.R2IV、フォワード、TCCTTTGCTCTTTCCCCCTT (配列番号17); リバースとしてT2.F5c及びT2.F5tris。
【００５５】
サイクリンD1-TROP2キメラの増幅を、再現可能な方法で、100以上の異なる実験における7個の独立なOVCA-432のcDNA、および40以上の実験における3個の独立なMCF-7のcDNAから取得した。全てのPCR産物は、予想された配列を有していた。対照L細胞、または反応チューブにおいて、DNA合成前にサイクリンD1のRNAをTROP2のRNAと混合した再構成実験では、キメラは生成しなかった。RNase保護とノーザンブロット解析と併せて、これは、キメラが実験のアーティファクトに由来するものではないことを示す。
【００５６】
定量PCR。示された細胞系統由来の総RNAを、製造者の説明書に従ってTrizol (Invitrogen)で抽出した。9個の正常ヒト組織（それぞれ、少なくとも2つの個体からプールした）を、BD Biosciences-Clontech (Palo Alto, Ca)より購入し、逆転写(RT)によるcDNA合成の前に、DNAse I (Ambion)処理にかけた。1μｇの総RNAを、標準プロトコルに従って ImProm-II Reverse Transcriptase enzyme (Promega)で実行した各RT反応に使用した。各反応で得られた実際のcDNA量を、溶液中にエチジウムブロマイドを添加した後の蛍光発光により定量した[45]。定量リアルタイムPCR反応を、製造者の説明書に従って蛍光染料SYBRグリーン (Power Sybr Green PCR Master Mix, Applied Biosystems)の存在下でABI-PRISM 7900HT Sequence Detection System (PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)を使用して実行した。使用するプライマーは、前のPCR反応に効率的で特異的であるように最適化しておいた。定量的増幅のために、各プライマーの濃度を200nM、最終反応用量を30μlに最適化した。28S rRNAを内部標準として使用した。使用したプライマーは、キメラ用にPRAD1.F4及びT2.F5tris；TROP2用にT2.R3quad及びT2.F4bis；サイクリンD1用にSUF及びSUR [43]；28S rRNA用に28SF及び28SR [44]であった。各増幅の最後に、増幅産物の解離曲線をチェックし、増幅反応の特異性を確認した。
【００５７】
RNAse保護。RNAse保護解析を、OVCA-432, MCF-7及びL細胞由来のポリA+ mRNAを使用して実行した。サイクリンD1/TROP2のcDNAのHind III-Not Iセグメントに相当する一本鎖RNAプローブを、in vitroで[32P]-UTP (Promega Corporation, Madison, WI)の存在下で転写した。そのようにして得られた放射性プローブを、55°Cで一晩、20μgの各細胞系統のポリA+ mRNAとアニールさせた。その後RNAを製造者の説明書(Ambion Inc., Austin, TX)に従ってRNAse A及びT1で消化し、5%ポリアクリルアミドゲルに電気泳動した。
【００５８】
FISH解析。OVCA-432及びMCF-7細胞、ならびに対照正常リンパ球を、TROP2及びサイクリンD1に特異的な15 kb長のゲノムプローブを使用して、2色FISH解析[21]により解析した。両方のプローブを、TROP2用にジゴキシゲニン-dUTP、サイクリンD1用にビオチン-dUTPを使用して標識した[39]。標識プローブを共通のヒトDNAと混合し、実験環境下で腫瘍細胞系統の核にハイブリダイズさせた。TROP2のハイブリダイゼーションを、緑色フルオロフォアに接合した抗ジゴキシゲニン抗体で解析し、サイクリンD1のハイブリダイゼーションを、赤色フルオロフォアに接合したアビジンで解析した。
【００５９】
RNAサイレンシング。[28]に記載されたように、pSUPERベクターにクローン化された、サイクリンD1/TROP2キメラのmRNAの連結点に特異的な、サイレンシングRNA(siRNA)[46]に転写される配列を利用して、キメラmRNAのサイレンシングを実行した。サイレンシング配列及びその対照を有するプラスミドを、以下の手順でMCF7細胞にトランスフェクトした：各測定に6個の複製を伴って、ウェルにつき4000個の細胞で、96ウェルに細胞を播種した；播種の4時間後、製造者の説明書に従って、100μlのDMEM中で、ウェルあたり250 ngのDNAと0.25μlのLipofectamine 2000 (Invitrogen)で細胞をトランスフェクトした；細胞数の最初の測定を、トランスフェクトの8時間後に実行し、その後示された時間に実行した。
【００６０】
免疫蛍光解析。細胞を、[18]に記載されたように、抗Trop-2抗体162-46.2及びT16で染色した。抗ヒトサイクリンD1ポリクローナル抗体は、Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA)から供給された。蛍光解析を、フローサイトメトリー(Vantage, Becton Dickinson, Sunnyvale, CA)で実行した。
【００６１】
腫瘍の免疫病理及び免疫解剖解析。ヒト癌の標本を、外科手術後すぐに液体窒素中で即時凍結し、-80°Cで保存した。腫瘍は、ステージ、グレード、増殖細胞(KI-67)の画分、倍数性、血管新生 (CD34)、ならびにp53、Her-2及びBcl-2の発現により特徴づけられた[47]。腫瘍のステージはTNMまたはFIGOシステム[47]により分類され、ここでTは腫瘍直径（T1からT4で増大）、Nはリンパ節浸潤（N0からN2）、及びMは離れた部位への転移分散（M0からM1）を示す。正常及び新生物組織の免疫解剖解析を、5ミクロン厚のセクションで、[47]に記載されているように実行した。内因性ペルオキシダーゼ活性を、3% H2O2で5分間インキュベーションすることによりブロックした。その後セクションを、適切なビオチン化抗体と30分間インキュベートし、アビジン−ペルオキシダーゼと、色原としてジアミノベンジジン(diamminobenzidine)(DAKO, Glostrup, Denmark)とによって抗体への結合を解明した：アビジンはビオチンと結合し、ペルオキシダーゼは、ジアミノベンジジンと反応して着色化合物を形成する。
（参考資料）
2012503483.tif 000004
2012503483.tif 000005
2012503483.tif 000006
【図１−１】
2012503483.tif 000007
【図８】
2012503483.tif 000008
【図１−２】
2012503483.tif 000009
【図２】
2012503483.tif 000010
【図３】
2012503483.tif 000011
【図４】
2012503483.tif 000012
【図５】
2012503483.tif 000013
【図６】
2012503483.tif 000014
【図７】
2012503483.tif 000015
【図９】
2012503483.tif 000016
【図１０】
2012503483.tif 000017
【配列表】
2012503483000001.app
【国際調査報告】
2012503483.tif 000018
2012503483.tif 000019
2012503483.tif 000020