【手続補正書】
【提出日】平成21年3月3日(2009.3.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（ＶＩＩＩ）：
【化８】
2008535945.tif 000001
（式中、
ｚは、１、２または３であり；
Ｔは、＞Ｃ＝Ｏまたは＞Ｓ（＝Ｏ）２であり；
Ｑは、−ＯＲ７１または−ＮＲ７２Ｒ７３であり；
Ｕは、−ＯＲ７４または−ＮＲ７５Ｒ７６であり；
各Ｒ６８およびＲ６５は、同じまたは異なり、独立して、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルキル、アリールまたは−ＣＨ２Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−ＣＨ２Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２であり；
各Ｒ６６およびＲ６７は、同じまたは異なり、独立して、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルキルまたはＬ−Ｒｘであり；
各Ｒ７０は、同じまたは異なり、独立して、水素、ハロゲン、アルキル、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）、−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２またはＬ−Ｒｘであり；
Ｒ６およびＲ７は、同じまたは異なり、独立して、Ｈ、アルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；あるいは
Ｒ６およびＲ７は結合し一緒になって、ヒ素と、Ｒ６およびＲ７が結合する２個の酸素原子とを含む５または６員環の複素環を形成し、ここで、−Ｒ６−Ｒ７−は、−［Ｃ（Ｒ８）２］Ｗ−（ｗは２または３）であり、各Ｒ８は、同じまたは異なり、独立して、水素、ヒドロキシ、シアノ、−ＯＣ（Ｏ）−アルキル、−ＯＣ（Ｏ）−アリール、アルキル、アリール、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、−ＣＨ２ＣＮ、−ＣＨ２ＳＯ２Ｍｅ、−ＣＨ２ＳＯ２Ｐｈであり、または隣接する炭素の２個のＲ８は、それらが結合する炭素と一緒になって、アリールまたはヘテロアリールを形成し、あるいは同じ炭素上の２個のＲ８はオキソを形成し；
各Ｒ７１およびＲ７４は、同じまたは異なり、独立して、水素、アルキルカルボニルまたはアリールカルボニルであり；
各Ｒ７２、Ｒ７３、Ｒ７５およびＲ７６は、同じまたは異なり、独立して、水素、アルキルまたはアリールであり；あるいは
Ｒ７１およびＲ６８は、これらが結合する炭素と一緒になって、５または６員環の複素環を形成し；あるいは
Ｒ７４およびＲ６５は、これらが結合する炭素と一緒になって、５または６員環の複素環を形成し；あるいは
Ｒ７２およびＲ６８は、これらが結合する炭素と一緒になって、５または６員環の複素環を形成し；あるいは
Ｒ７３およびＲ６６は、これらが結合する炭素と一緒になって、５または６員環の複素環を形成し；あるいは
Ｒ７５およびＲ６５は、これらが結合する炭素と一緒になって、５または６員環の複素環を形成し；あるいは
Ｒ７６およびＲ６７は、これらが結合する炭素と一緒になって、５または６員環の複素環を形成し；
Ｌは、一重共有結合またはＣ、Ｎ、ＯおよびＳからなる群から選択される１〜３０個の非水素原子を含む共有結合であり、一重、二重、三重の任意の結合、または芳香族炭素−炭素結合、炭素−窒素結合、窒素−窒素結合、炭素−酸素結合および炭素−硫黄結合から構成され；および
Ｒｘは、反応基であり、
ただし、Ｒ６５、Ｒ６６、Ｒ６７、Ｒ６８およびＲ７１の少なくとも１つは、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２であり、あるいは−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２を含む）
の化合物。
【請求項２】
式（ＶＩＩＩ）の色素で置換されているオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド結合体。
【請求項３】
前記色素が、３４０ｎｍと１１００ｎｍとの間に励起を、４４０ｎｍと１１５０ｎｍとの間に最高蛍光発光を有する蛍光色素である請求項２記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
さらに、ＭＧＢ基を含む請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
前記ＭＧＢ基が極性アルソナート基で置換されている請求項４記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドが、分子標識、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（登録商標）プローブ、サンライズプローブ、立体配置的に補助されたプローブおよびＴａｑＭａｎＴＭプローブから選択されたプローブである請求項２に記載のオリゴヌクレオチド結合体。
【請求項７】
標的核酸を直接的に検出する方法であって、
式（ＶＩＩＩ）の１種以上の色素化合物に結合体化するオリゴヌクレオチドを含む色素標識オリゴヌクレオチドプローブを得るステップであって、該オリゴヌクレオチドは、さらに、１以上の極性アルソナート基で場合によっては置換されているＭＧＢを含むステップと；
色素標識オリゴヌクレオチドプローブを生物学的サンプルに添加するステップであって、該プローブは、該標的核酸に対して相補的または実質的に相補的であるステップと；
該プローブを、適切な条件下で充分な時間、該標的核酸とハイブリッド形成させるステップと；
該色素から放射された蛍光を検出するステップと；
を含む方法。
【請求項８】
式（ＶＩＩＩ）（式中、Ｒｘはホスホルアミダイト基である）でのいずれかの色素試薬を使用して、自動化合成でオリゴヌクレオチドを製造する方法であって、
ホスホルアミダイト方法を使用して、オリゴヌクレオチドの自動化合成を実施して、色素標識オリゴヌクレオチドを得るステップと；
該色素標識オリゴヌクレオチドの−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２を脱保護し、−ＡｓＯ３２−または−ＡｓＯ３Ｈ−から選択される負電荷極性基を有する色素標識オリゴヌクレオチドを得るステップと；
該色素標識オリゴヌクレオチドを反応媒体から単離するステップと；
を含む方法。
【請求項９】
さらに、前記オリゴヌクレオチド中のＭＧＢを結合体化するステップを含む請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記ＭＧＢが、アルソナート基で置換されている請求項９記載の方法。
【請求項１１】
ＴａｑＭａｎアッセイを使用して、実際の使用における標的配列の増幅を検出する方法であって、
式（ＩＶ）の消光物質色素に結合体化するオリゴヌクレオチドと、式（ＶＩＩＩ）の蛍光色素とを含む色素標識オリゴヌクレオチドプローブを得るステップであって、各色素は、１個以上の極性アルソナート基を有し、該プローブは、該蛍光色素が該消光物質色素によって消光されるようにする配置にあるステップと；
該色素標識オリゴヌクレオチドプローブをＰＣＲ反応媒体に添加するステップと；
該標的が存在する場合、該プローブを該標的とハイブリッド形成させ、該標的をＴａｑポリメラーゼによって切断するＰＣＲ温度サイクルを実行するステップと；
該蛍光シグナルを、該切断された色素からリアルタイムに読み取るステップと；
を含み、ここで、該式（ＩＶ）の消光物質色素が、
【化４】
2008535945.tif 000002
（式中、
各Ｒ３５は、同じまたは異なり、独立して、水素、ハロゲン、−ＮＯ２、−ＣＮ、−ＳＯ３−、アルコキシ、アミン、ジアルキルアミン、モノアルキルアミン、−Ｎ＝Ｎ−Ｒ３９、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２であり；
ｎは、１、２または３であり；
ｐは、１または２であり；
各Ｒ３６は、同じまたは異なり、独立して、水素、ハロゲン、−ＮＯ２、−ＣＮ、−ＳＯ３−、アルコキシ、アミン、ジアルキルアミン、モノアルキルアミン、−Ｎ＝Ｎ−Ｒ３９、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２であり；
Ｒ６およびＲ７は、同じまたは異なり、独立して、Ｈ、アルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；あるいは
Ｒ６およびＲ７は結合し一緒になって、ヒ素と、Ｒ６およびＲ７が結合する２個の酸素原子とを含む５または６員環の複素環を形成し、ここで、−Ｒ６−Ｒ７−は、−［Ｃ（Ｒ８）２］Ｗ−（ｗは２または３）であり、各Ｒ８は、同じまたは異なり、独立して、水素、ヒドロキシ、シアノ、−ＯＣ（Ｏ）−アルキル、−ＯＣ（Ｏ）−アリール、アルキル、アリール、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、−ＣＨ２ＣＮ、−ＣＨ２ＳＯ２Ｍｅ、−ＣＨ２ＳＯ２Ｐｈであり、または隣接する炭素の２個のＲ８は、それらが結合する炭素と一緒になって、アリールまたはヘテロアリールを形成し、あるいは同じ炭素の２個のＲ８はオキソを形成し；
Ｒ３７およびＲ３８は、同じまたは異なり、独立して、水素、アルキル、アラルキル、アリールまたは−Ｌ−Ｒｘであり；
Ｒ３９は、場合によっては、１個以上の−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２で置換されるアリールまたはヘテロアリールであり；
Ｌは、一重共有結合またはＣ、Ｎ、ＯおよびＳからなる群から選択される１〜３０個の非水素原子を含む共有結合であり、一重、二重、三重の任意の結合、または芳香族炭素−炭素結合、炭素−窒素結合、窒素−窒素結合、炭素−酸素結合および炭素−硫黄結合から構成され；および
Ｒｘは、反応基であり、
ただし、Ｒ３５およびＲ３６の少なくとも１個は、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２である）
である、
方法。
【請求項１２】
分子標識アッセイを使用して、実際の使用における標的配列の増幅を検出する方法であって、
式（ＩＶ）の消光物質色素に結合体化するオリゴヌクレオチドと、式（ＶＩＩＩ）の蛍光色素とを含む色素標識オリゴヌクレオチドプローブを得るステップであって、各色素は、１個以上の極性アルソナート基を有し、該プローブは、該蛍光色素が該消光物質色素によって消光されるようにする配置にあるステップと；
該色素標識オリゴヌクレオチドプローブをＰＣＲ反応媒体に添加するステップと；
該標的が存在する場合、該プローブを該標的とハイブリッド形成させ、それによって該蛍光色素と該消光物質色素とを離すＰＣＲ温度サイクルを実行するステップと；
該蛍光シグナルを、該消光していない蛍光色素からリアルタイムに読み取るステップと；を含み、ここで、該式（ＩＶ）の消光物質色素が、
【化４】
2008535945.tif 000003
（式中、
各Ｒ３５は、同じまたは異なり、独立して、水素、ハロゲン、−ＮＯ２、−ＣＮ、−ＳＯ３−、アルコキシ、アミン、ジアルキルアミン、モノアルキルアミン、−Ｎ＝Ｎ−Ｒ３９、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２であり；
ｎは、１、２または３であり；
ｐは、１または２であり；
各Ｒ３６は、同じまたは異なり、独立して、水素、ハロゲン、−ＮＯ２、−ＣＮ、−ＳＯ３−、アルコキシ、アミン、ジアルキルアミン、モノアルキルアミン、−Ｎ＝Ｎ−Ｒ３９、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２であり；
Ｒ６およびＲ７は、同じまたは異なり、独立して、Ｈ、アルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；あるいは
Ｒ６およびＲ７は結合し一緒になって、ヒ素と、Ｒ６およびＲ７が結合する２個の酸素原子とを含む５または６員環の複素環を形成し、ここで、−Ｒ６−Ｒ７−は、−［Ｃ（Ｒ８）２］Ｗ−（ｗは２または３）であり、各Ｒ８は、同じまたは異なり、独立して、水素、ヒドロキシ、シアノ、−ＯＣ（Ｏ）−アルキル、−ＯＣ（Ｏ）−アリール、アルキル、アリール、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、−ＣＨ２ＣＮ、−ＣＨ２ＳＯ２Ｍｅ、−ＣＨ２ＳＯ２Ｐｈであり、または隣接する炭素の２個のＲ８は、それらが結合する炭素と一緒になって、アリールまたはヘテロアリールを形成し、あるいは同じ炭素の２個のＲ８はオキソを形成し；
Ｒ３７およびＲ３８は、同じまたは異なり、独立して、水素、アルキル、アラルキル、アリールまたは−Ｌ−Ｒｘであり；
Ｒ３９は、場合によっては、１個以上の−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２で置換されるアリールまたはヘテロアリールであり；
Ｌは、一重共有結合またはＣ、Ｎ、ＯおよびＳからなる群から選択される１〜３０個の非水素原子を含む共有結合であり、一重、二重、三重の任意の結合、または芳香族炭素−炭素結合、炭素−窒素結合、窒素−窒素結合、炭素−酸素結合および炭素−硫黄結合から構成され；および
Ｒｘは、反応基であり、
ただし、Ｒ３５およびＲ３６の少なくとも１個は、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２である）
である、
方法。
【請求項１３】
Ｓｃｏｒｐｉｏｎプローブアッセイを使用して、実際の使用における標的配列の増幅を検出する方法であって、
プライマーと、式（ＩＶ）の消光物質色素に結合体化するオリゴヌクレオチドと、式（ＶＩＩＩ）の蛍光色素とを含む色素標識オリゴヌクレオチドプローブを得るステップであって、各色素は、１個以上の極性アルソナート基を有し、該プローブは、該蛍光色素が該消光物質色素によって消光されるようにする配置にあるステップと
該色素標識オリゴヌクレオチドプローブをＰＣＲ反応媒体に添加するステップと；
該プライマーを標的ＤＮＡとハイブリッド形成させ、それによって、標的ＤＮＡ上の該プローブを延長するＰＣＲ温度サイクルを実行するステップと；
該延長されたプローブを熱変性し、該消光物質色素を切り離すステップと；
該延長されたプローブを冷却し、内部再配列を可能にし、標的特異的方法で該蛍光色素に蛍光発光させるステップと；
該蛍光シグナルを該蛍光色素からリアルタイムに読み取るステップと；
を含み、ここで、該式（ＩＶ）の消光物質色素が、
【化４】
2008535945.tif 000004
（式中、
各Ｒ３５は、同じまたは異なり、独立して、水素、ハロゲン、−ＮＯ２、−ＣＮ、−ＳＯ３−、アルコキシ、アミン、ジアルキルアミン、モノアルキルアミン、−Ｎ＝Ｎ−Ｒ３９、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２であり；
ｎは、１、２または３であり；
ｐは、１または２であり；
各Ｒ３６は、同じまたは異なり、独立して、水素、ハロゲン、−ＮＯ２、−ＣＮ、−ＳＯ３−、アルコキシ、アミン、ジアルキルアミン、モノアルキルアミン、−Ｎ＝Ｎ−Ｒ３９、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２であり；
Ｒ６およびＲ７は、同じまたは異なり、独立して、Ｈ、アルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；あるいは
Ｒ６およびＲ７は結合し一緒になって、ヒ素と、Ｒ６およびＲ７が結合する２個の酸素原子とを含む５または６員環の複素環を形成し、ここで、−Ｒ６−Ｒ７−は、−［Ｃ（Ｒ８）２］Ｗ−（ｗは２または３）であり、各Ｒ８は、同じまたは異なり、独立して、水素、ヒドロキシ、シアノ、−ＯＣ（Ｏ）−アルキル、−ＯＣ（Ｏ）−アリール、アルキル、アリール、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、−ＣＨ２ＣＮ、−ＣＨ２ＳＯ２Ｍｅ、−ＣＨ２ＳＯ２Ｐｈであり、または隣接する炭素の２個のＲ８は、それらが結合する炭素と一緒になって、アリールまたはヘテロアリールを形成し、あるいは同じ炭素の２個のＲ８はオキソを形成し；
Ｒ３７およびＲ３８は、同じまたは異なり、独立して、水素、アルキル、アラルキル、アリールまたは−Ｌ−Ｒｘであり；
Ｒ３９は、場合によっては、１個以上の−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２で置換されるアリールまたはヘテロアリールであり；
Ｌは、一重共有結合またはＣ、Ｎ、ＯおよびＳからなる群から選択される１〜３０個の非水素原子を含む共有結合であり、一重、二重、三重の任意の結合、または芳香族炭素−炭素結合、炭素−窒素結合、窒素−窒素結合、炭素−酸素結合および炭素−硫黄結合から構成され；および
Ｒｘは、反応基であり、
ただし、Ｒ３５およびＲ３６の少なくとも１個は、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２である）
である、
方法。