(57)【要約】  本発明は角膜細胞、特に輪部角膜上皮幹細胞の増殖用基材としての塑性圧縮コラーゲンゲルの使用に関する。このような基材上で増殖させた細胞を培養して人工眼上皮を産生させ、眼毒性試験又は移植に使用することができる。
2012527283.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
人工眼上皮と塑性圧縮コラーゲンゲル基材を含む人工眼組織であって、角膜幹細胞又は角膜幹細胞を含有する組成物を塑性圧縮コラーゲンゲル基材上で培養する段階を含む方法により取得されるか又は取得可能であり、塑性圧縮コラーゲンゲル基材上に人工眼上皮を産生する角膜上皮細胞集団を提供するような条件下で前記細胞又は組成物を培養する前記人工眼組織。
【請求項２】
角膜幹細胞又は角膜幹細胞を含有する組成物を塑性圧縮コラーゲンゲル基材上で培養する段階を含む人工眼上皮の製造方法であって、基材上に人工眼上皮を産生する角膜上皮細胞集団を提供するような条件下で前記細胞又は組成物を培養する前記方法。
【請求項３】
その後、人工眼上皮を基材から分離する請求項２に記載の方法。
【請求項４】
その後、人工眼上皮をヒト組織の保存と防腐に適した培地に保存し、眼上皮を塑性圧縮コラーゲンゲル基材から分離するか又は分離せずに保存する請求項２に記載の方法。
【請求項５】
角膜幹細胞が輪部角膜上皮幹細胞、好ましくはヒト輪部角膜上皮幹細胞である請求項２から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
間質液中にコラーゲンフィブリルのマトリックスを含むコラーゲンゲルを準備した後に、
（ｉ）ゲルの表面もしくは縁部の一つ以上に圧縮力を加える方法；
（ｉｉ）ゲルの表面もしくは縁部の一つ以上に脱水力を加える方法；
（ｉｉｉ）１面もしくは２面にゲルを延伸する方法；又は
（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の１種以上の組合せ
によりゲルを塑性圧縮し、
場合により、
（ａ）ゲルの軸方向に一軸荷重を加える工程と、
（ｂ）前記荷重を除去する工程
からなる１サイクル以上の反復サイクルを圧縮後のゲルに実施する方法により、塑性圧縮コラーゲンゲル基材を製造する請求項２から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ゲルの表面又は縁部の一つ以上に間質液吸収材を付着させる方法と（ｉ）〜（ｉｖ）の１種以上を組合せる請求項６に記載の方法。
【請求項８】
塑性圧縮コラーゲンゲル基材が長さ１〜６０ｍｍ、好ましくは長さ２０〜４０ｍｍ及び／又は幅０．５〜６０ｍｍ、好ましくは幅２０〜４０ｍｍである請求項２から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
塑性圧縮コラーゲンゲル基材が厚さ１０〜１０００μｍ、好ましくは厚さ２０〜１００μｍである請求項２から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
塑性圧縮コラーゲンゲル基材におけるコラーゲンフィブリルが直径１０〜１００ｎｍであり、及び／又はフィブリルの間隔が１〜２００ｎｍである請求項２から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
塑性圧縮コラーゲンゲル基材のコラーゲン含有率が３〜４％である請求項２から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
圧縮コラーゲンゲルの少なくとも一つの表面にラミニン又は一つ以上のラミニンドメインをコートし、角膜幹細胞又は組成物をラミニン／ラミニンドメイン表面上で培養する請求項２から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
圧縮コラーゲンゲルが間質前駆細胞、好ましくは角膜線維芽細胞をゲル内に封入している請求項２から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
圧縮コラーゲンゲルにおけるコラーゲンが好ましくはリボフラビンとＵＶ照射を使用して架橋されている請求項２から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ゲル内への角膜幹細胞の内方増殖を防ぐ程度まで塑性圧縮コラーゲンゲルを圧縮する請求項２から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
塑性圧縮コラーゲンゲルが可撓性で非剛性である請求項２から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
その後、人工眼上皮を基材上に保持し、人工眼組織を形成する請求項２又は４から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
請求項２から１６のいずれか一項に記載の方法により取得されるか又は取得可能な人工眼上皮。
【請求項１９】
基底細胞の内側及び下側の基底膜成分と共に、ＣＫ３分化マーカーとＣＫ１４未分化マーカーの双方を発現する３〜７層の細胞層からなる連続重層化上皮を含み、好ましくは請求項２から１６のいずれか一項に記載の方法により取得されるか又は取得可能な人工眼上皮。
【請求項２０】
一部もしくは全基底細胞に半接着斑が存在しており、及び／又は一部もしくは全隣接上皮細胞が接着斑構造を介して相互に結合している請求項１８又は１９に記載の人工眼上皮。
【請求項２１】
請求項１７に記載の方法により取得されるか又は取得可能な人工眼組織。
【請求項２２】
（ｉ）請求項１８から２０のいずれか一項に記載の人工眼上皮と；
（ｉｉ）請求項２から１６のいずれか一項に記載の塑性圧縮コラーゲンゲル基材
を含む人工眼組織。
【請求項２３】
人工眼上皮又は人工眼組織に及ぼす試験化合物の効果を評価する方法であって、
（ａ）請求項１８から２０のいずれか一項に記載の人工眼上皮又は請求項２１もしくは２２に記載の人工眼組織を準備する段階と；
（ｂ）人工眼上皮又は人工眼組織を一定量の試験化合物と接触させる段階と；
（ｃ）人工眼上皮又は人工眼組織に及ぼす化合物の効果を評価する段階
を含む前記方法。
【請求項２４】
哺乳動物角膜に対する試験化合物の毒性の指示を提供するための請求項１８から２０のいずれか一項に記載の人工眼上皮又は請求項２１もしくは２２に記載の人工眼組織の使用。
【請求項２５】
人工角膜としての請求項１８から２０のいずれか一項に記載の人工眼上皮又は請求項２１もしくは２２に記載の人工眼組織の使用。
【請求項２６】
細胞の送達を必要とする組織への細胞送達剤としての請求項１８から２０のいずれか一項に記載の人工眼上皮又は請求項２１もしくは２２に記載の人工眼組織の使用。
【請求項２７】
（ａ）請求項１８から２０のいずれか一項に記載の人工眼上皮又は請求項２１もしくは２２に記載の人工眼組織を準備する段階と；
（ｂ）眼損傷を前記人工眼上皮又は人工眼組織と接触させる段階と；場合により
（ｃ）前記人工眼上皮又は人工眼組織を眼損傷の部位に固定する段階
を含む眼損傷の治療方法。
【請求項２８】
治療方法、好ましくは眼損傷の治療方法で使用するための請求項１８から２０のいずれか一項に記載の人工眼上皮又は請求項２１もしくは２２に記載の人工眼組織。
【請求項２９】
治療方法、好ましくは眼損傷の治療方法で使用するための組成物の製造における請求項１８から２０のいずれか一項に記載の人工眼上皮又は請求項２１もしくは２２に記載の人工眼組織の使用。
【請求項３０】
眼損傷が幹細胞機能を維持するために不十分な間質微小環境に関連するもの（例えば無虹彩症、角膜炎、神経栄養性角膜症及び慢性角膜輪部炎）；又は輪部幹細胞を破壊する外部因子に関連するもの（例えば化学もしくは熱傷害、スティーブンス・ジョンソン症候群、眼瘢痕性類天疱瘡、コンタクトレンズ使用又は広範な微生物感染症）である請求項２７に記載の方法、請求項２８に記載の人工眼上皮もしくは組織又は請求項２９に記載の使用。
【請求項３１】
（ａ）請求項１８から２０のいずれか一項に記載の人工眼上皮又は請求項２１もしくは２２に記載の人工眼組織を準備する段階と；
（ｂ）哺乳動物対象の角膜を前記人工眼上皮又は組織で置換する段階
を含む哺乳動物対象における角膜の置換方法。
【請求項３２】
外科処置方法で使用するための請求項１８から２０のいずれか一項に記載の人工眼上皮又は請求項２１もしくは２２に記載の人工眼組織であって、好ましくは哺乳動物対象の角膜を前記人工眼上皮又は組織で置換する前記人工眼上皮又は組織。
【請求項３３】
外科処置方法で使用するための組成物の製造における請求項１８から２０のいずれか一項に記載の人工眼上皮又は請求項２１もしくは２２に記載の人工眼組織の使用であって、好ましくは哺乳動物対象の角膜を前記人工眼上皮又は組織で置換する前記使用。
【請求項３４】
角膜細胞の増殖用基材としての塑性圧縮コラーゲンゲルの使用。
【請求項３５】
間質液中にコラーゲンフィブリルのマトリックスを含むコラーゲンゲルを準備した後に、
（ｉ）ゲルの表面もしくは縁部の一つ以上に圧縮力を加える方法；
（ｉｉ）ゲルの表面もしくは縁部の一つ以上に脱水力を加える方法；
（ｉｉｉ）１面もしくは２面にゲルを延伸する方法；又は
（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の１種以上の組合せ
によりゲルを塑性圧縮し、
場合により、
（ａ）ゲルの軸方向に一軸荷重を加える工程と、
（ｂ）前記荷重を除去する工程
からなる１サイクル以上の反復サイクルを圧縮後のゲルに実施する方法により、塑性圧縮コラーゲンゲル基材を製造する請求項３４に記載の使用。
【請求項３６】
ゲルの表面又は縁部の一つ以上に間質液吸収材を付着させる方法と（ｉ）〜（ｉｖ）の１種以上を組合せる請求項３５に記載の使用。
【請求項３７】
塑性圧縮コラーゲンゲル基材が長さ１〜６０ｍｍ、好ましくは長さ２０〜４０ｍｍであり、及び／又は幅０．５〜６０ｍｍ、好ましくは幅２０〜４０ｍｍである請求項３４から３６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３８】
塑性圧縮コラーゲンゲル基材が厚さ１０〜１０００μｍ、好ましくは厚さ２０〜１００μｍである請求項３４から３７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３９】
塑性圧縮コラーゲンゲル基材におけるコラーゲンフィブリルが直径１０〜１００ｎｍであり、及び／又はフィブリルの間隔が１〜２００ｎｍである請求項３４から３８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４０】
塑性圧縮コラーゲンゲル基材のコラーゲン含有率が３〜４％である請求項３４から３９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４１】
コラーゲンゲルの少なくとも一つの表面にラミニンをコートする請求項３４から４０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４２】
コラーゲンゲルが好ましくはリボフラビン／ＵＶを使用して架橋されている請求項３４から４１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４３】
コラーゲン繊維が好ましくはＵＶ光を使用してリボフラビン処理により架橋されている塑性圧縮コラーゲンゲル。
【請求項４４】
ゲルが請求項２から１４のいずれか一項に記載のものである請求項４３に記載の塑性圧縮コラーゲンゲル。
【請求項４５】
人工眼上皮を増殖させるための基材としての請求項４３又は４４に記載の塑性圧縮コラーゲンゲルの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は角膜細胞、特に輪部角膜上皮幹細胞の増殖用基材としての塑性圧縮コラーゲンゲルの使用に関する。このような基材上で増殖させた細胞を培養して人工眼上皮又は人工角膜組織を産生させ、眼毒性試験又は移植に使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
商品化に先立ち、新規薬品や化粧品はこれらの新規薬品／化粧品の毒性を判定するためにドレイズウサギ眼刺激性試験等の眼毒性試験で試験する必要がある。眼は我々の日常環境に最も多く暴露され、化学的に感受性の末端器官であるため、この関連で使用されている。毎年何千羽ものウサギがこのような試験で使用されており、薬品や化粧品をウサギの目で試験するこの方法は過去５０年間に殆ど変化していない。だが、ドレイズウサギ眼試験は倫理的な理由のみならず、ウサギとヒトの眼には大きな違いがあるため、科学的な理由からも批判されている。しかし、ドレイズ試験の代用として現在受け入れられている非動物試験はなく、ヨーロッパ法制の差し迫る変化に伴い、このような代用の必要が増すと思われる。
【０００３】
動物モデルのインビトロ代用物の使用は臓器培養、ヒト細胞株及びヒトドナー組織を使用して従来検討されているが、これらのモデルの有効性は遺伝的不安定性、二次元組織培養の限界（上皮バリア機能をモデル化できない）、正常増殖及び分化の不足、種間の遺伝的多様性、並びに入手しにくさにより阻まれている。これらの理由から、三次元（３Ｄ）角膜モデルの必要性により、２種類の市販上皮モデル（ＳｋｉｎＥｔｈｉｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ及びＥｐｉＯｃｕｌａｒ，ＭａｔＴｅｋ  Ｃｏｒｐ）が眼刺激試験のインビトロ代用物として最近開発されている。ＳｋｉｎＥｔｈｉｃモデルは不死化ヒト角膜上皮細胞を使用しており（Ｄｏｕｃｅｔ，Ｏ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ，２００６．２０（４）：ｐ．４９９−５１２）、ＭａｔＴｅｋモデルは正常ケラチノサイトを使用している（Ｖａｎ  Ｇｏｅｔｈｅｍ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ，２００６．２０（１）：ｐ．１−１７）。これらのモデルはどちらも角膜様上皮構造を示すが、生理的基材を使用していないばかりか、角膜幹細胞が角膜上皮の機能維持に果たす重要な役割をモデル化していない。
【０００４】
角膜により生体内で提供される生理的基材に類似する角膜細胞の増殖用基材を提供する試みが行われている。羊膜、温度感受性ハイドロゲル、プラズマポリマーコート基材並びにコラーゲン、フィブリン及びフィブロネクチン／フィブリンゲルを含む多様な基材が試験されている。回収した角膜幹細胞の担体として羊膜、コラーゲンゲル及びコラーゲンシールドを比較すると、羊膜が最も優れた担体であることが判明した（Ｓｃｈｗａｂ，Ｉ．Ｒ．Ｔｒａｎｓ．Ａｍ．Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ．Ｓｏｃ．１９９９，９７：ｐ．８９１−９８６）。羊膜上で細胞を増殖させると、増殖、接着及び分化し易いため、それ以来、羊膜は標準角膜細胞基材として使用されている。羊膜は眼表面移植用角膜幹細胞の優れた臨床増殖用基材であることも分かっている（例えばＫｏｉｚｕｍｉ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．２０００；４１：２５０６−２５１３）。
【０００５】
しかし、羊膜は構造と化学組成の試料間及び試料内変動が大きく（Ｈｏｐｋｉｎｓｏｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．，２００６．４７（１０）：ｐ．４３１６−４３２２）、臨床使用前に必ずしも性状決定されない。最も重要な点として、基材としての羊膜は人工ポリマー構築物のスケーラビリティを欠く。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、羊膜以外の基材上で増殖させた輪部幹細胞から角膜上皮移植片構築物を生体外で作製する試みが行われている。角膜幹細胞を使用するインビトロ眼毒性試験に適切な基材は、（ｉ）幹細胞増殖を維持し、（ｉｉ）細胞重層化の確実な支持体を提供するという基本的要件を満たす必要がある。従って、本発明の１つの目的は、羊膜に似た組織加工性を示しながら、入手し易く、標準化し易い新規型の基材を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
１側面において、本発明は角膜細胞の増殖用基材としての塑性圧縮コラーゲンゲルの使用を提供する。
【０００８】
未圧縮コラーゲンゲルは間質液の周囲に連続足場を形成するコラーゲンフィブリルのマトリックスを含む。例えば、溶解したコラーゲンを希アルカリの添加により重合／凝集させ、架橋コラーゲンフィブリルのゲル化網目構造を形成することができる。フィブリルのゲル化網目構造は溶解したコラーゲン繊維の元の体積を維持し、間質液を保持する。このようなコラーゲンゲルの一般的な製造方法は当分野で周知である（例えばＷＯ２００６／００３４４２、ＷＯ２００７／０６０４５９及びＷＯ２００９／００４３５１）。
【０００９】
本願で使用する「塑性圧縮コラーゲンゲル」なる用語は、元の体積が外部圧縮／脱水処理により減少しており、元の間質液の一部又は大部分がゲルから除去されており、外部処理の停止後にコラーゲンゲルがその新しい（減少した）体積を維持しているようなコラーゲンゲルを意味する。塑性圧縮コラーゲンゲルは脱水されていると言うこともできる。
【００１０】
（その重量の４５倍の血液を吸収することが可能であると言われている）商標名Ｇｅｌｆｏａｍ（登録商標）として製造されているもの等の従来技術のコラーゲンゲルとは対照的に、本発明の塑性圧縮コラーゲンゲルは永久的に圧縮され、基本的に非吸収性である。この点で、「塑性圧縮」なる用語は圧縮がゲルの構造の永久的圧縮／変形をもたらすことを意味する。
【００１１】
本願に記載する塑性圧縮ゲルはガラス化されず（即ち剛性のガラス様材料となる程度まで乾燥されない）、非ガラス様であり、非剛性であり、可撓性である。本願で使用されるコラーゲンゲルは線維芽細胞及び／又はケラチノサイト等の生細胞をその構造内に封入することが可能である。
【００１２】
コラーゲンゲルで使用されるコラーゲンは任意のフィブリル形成コラーゲンとすることができる。フィブリル形成コラーゲンの例はＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｖ、ＶＩ、ＩＸ及びＸＩ型である。ゲルは単一型のコラーゲンから構成してもよいし、異なる型のコラーゲンの混合物でもよい。好ましくは、ゲルはＩ型コラーゲンを含むか又はそれから構成される。本発明の所定態様において、ゲルはコラーゲンフィブリルのみから又は実質的にコラーゲンフィブリルから構成され、即ちコラーゲンフィブリルはゲルにおける唯一又は実質的に唯一のポリマーである。
【００１３】
本発明の他の態様において、コラーゲンゲルは更に他の天然ポリマー、例えば絹、フィブロネクチン、エラスチン、キチン及び／又はセルロースを含むことができる。一般に、非コラーゲン天然ポリマーの量はゲルの５％未満、好ましくは４％未満、３％未満、２％未満又は１％未満（ｗｔ／ｗｔ）とする。同様の量の非天然ポリマー（例えばポリラクトン、ポリラクチド、ポリグリコン（ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｎｅ）、ポリカプリルラクトン及び／又はリン酸塩ガラス）もゲルに存在することができる。
【００１４】
間質液はコラーゲンフィブリルを溶解することができ、コラーゲンフィブリルをゲル化させることができる任意液体とすることができる。一般に、水性液体、例えば水性緩衝液又は細胞培養液である。
【００１５】
本発明の所定態様では、角膜細胞の接着性を改善するために、コラーゲンゲルの一つ以上の表面にラミニン又は一つ以上のラミニンドメインをコートする。細胞外マトリックス（ＥＣＭ）マルチドメイン三量体糖蛋白質であるラミニンは基底膜の主要な非コラーゲン成分であり、接着、増殖及び分化を助ける。ラミニンはマウスＥｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）腫瘍（ラミニン−１）から最初に単離された。ラミニン蛋白は動物組織における構造足場の構成成分である。ラミニンはエンタクチンとペルレカンを介してＩＶ型コラーゲンと会合し、インテグリン受容体、ジストログリカン糖蛋白複合体及びルーテル式血液型糖蛋白を介して細胞膜と結合する。
【００１６】
本願で使用する「ラミニンドメイン」なる用語は特に、α鎖のＲＧＤ配列とＩＫＶＡＶ配列、β鎖のＹＩＧＳＲ、及びγ鎖のＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩを包含する。
【００１７】
好ましくは、ラミニンはＥｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍマウス肉腫基底膜に由来する。
【００１８】
ラミニン又はラミニンドメインは例えば１〜２μｇ／ｃｍ２の濃度で使用することができる。ラミニン又はラミニンドメインは圧縮前又は後にコラーゲンゲルに塗布することができる。角膜細胞を配置する表面のみにコートすることが好ましい。これは例えば（使用時の）コラーゲンゲルの上面とすることができる。
【００１９】
所定態様において、未圧縮コラーゲンゲルはゲル内に細胞を内包しなくてもよい。更に他の態様において、未圧縮コラーゲンゲルは１種以上の細胞を内包することができる。このような播種細胞の例としては、分化又は未分化形態の角膜線維芽細胞（ケラチノサイト）等の間質前駆細胞が挙げられる。好ましくは、これらの角膜線維芽細胞は周囲輪部又は輪部環を約０．０２％コラゲナーゼの存在下で約３７℃にて一晩インキュベートすることにより得られる。
【００２０】
このような細胞が存在する場合には、一般に、例えば重合／凝集前にコラーゲン溶液と混合することにより、圧縮（即ち脱水）前にコラーゲンゲルに播種する。
【００２１】
（ゲルに細胞を内包するか否かを問わずに）適切なゲル圧縮方法の例としては、
（ｉ）ゲルの表面もしくは縁部の一つ以上に圧縮力を加える方法；
（ｉｉ）ゲルの表面もしくは縁部の一つ以上に脱水力を加える方法；
（ｉｉｉ）１面もしくは２面（例えば長さ及び／又は幅）にゲルを延伸する方法；又は
（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の１種以上の組合せ
が挙げられる。
【００２２】
ゲルの表面又は縁部の一つ以上に間質液吸収材を直接付着させる（即ち接触させる）方法と上記方法の各々を組合せてもよい。
【００２３】
所定態様では、ゲルの表面又は縁部の一つ以上に圧縮力を加えることによりコラーゲンゲルの圧縮を生じさせておくことができる。圧縮力を加える間にゲルを拘束することが好ましい。ゲルの上面に圧縮力を加えることが好ましい。例えば、場合により間質液吸収材をゲルに付着させながら、ゲルの上面に荷重を加えることができる。荷重の量と圧縮時間は所望される圧縮レベルにより異なる。所定態様において、荷重は２０〜１００ｇ、好ましくは４０〜６０ｇ、最も好ましくは約５０ｇとする。所定態様において、圧縮時間は１０〜６００秒間、好ましくは２０〜４００秒間、最も好ましくは約５分間とする。
【００２４】
他の態様では、ゲルの一つ以上の表面又は縁部に脱水力を加えることによりコラーゲンゲルの圧縮を生じさせておくことができる。例えば、間質液吸収材をゲルの上面及び／又は下面に付着させることができる。このような液体吸収材の例としては、１枚以上のティッシュペーパー又は吸い取り紙が挙げられる。間質液吸収材を付着させる時間は所望される圧縮レベルにより異なる。
【００２５】
更に他の態様では、１面又は２面（例えば長さ及び／又は幅）にゲルを延伸することによりコラーゲンゲルの圧縮を生じさせておくことができる。このような延伸の効果は間質液の一部を排出させることであると考えられる。例えば、ゲルを第１の縁部から吊り下げ、第２の（例えば対向する）縁部に荷重を加えることができる。荷重はゲルを破壊せずに延伸することが可能な量とする。ゲルの異なる軸方向に異なる荷重を加えることができる。荷重を加える時間と荷重の量は所望される圧縮レベルにより異なる。好ましい１態様では、例えば荷重を加えるゲルの一方又は両方の縁部に間質液吸収材を配置することにより、荷重と同一軸に沿って間質液排出力ないし脱水力を加えることができる。
【００２６】
ゲルの圧縮の前又は後に、（ａ）一軸引張荷重を加える工程と、（ｂ）前記荷重を除去する工程からなる１サイクル以上の反復サイクルをゲルに実施することができる。荷重の負荷と解除からなるこのような反復サイクルは圧縮ゲル内でコラーゲンフィブリルが配向するように融合するのを強化すると考えられる（例えばＷＯ２００７／０６０４５９参照）。
【００２７】
圧縮コラーゲンゲルの他の製造方法も当分野で公知である（例えばＷＯ２００６／００３４４２、ＷＯ２００７／０６０４５９及びＷＯ２００９／００４３５１）。
【００２８】
外部圧縮／脱水処理下で、間質液は圧縮ゲルから永久的に除去される。得られたゲルは元の（未圧縮）ゲルに比較して体積が永久的に減少し、密度が増加し、強度が増加する。
【００２９】
例えばコラーゲンゲルの体積を少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％又は９９．９％減少させておくことができる。好ましくは、ゲルの体積は元の体積の０．１〜２．０％となる。
【００３０】
圧縮を行うために必要な時間は適用する外部処理により変動し得る。例えば、圧縮を２４時間未満、１２時間未満、６時間未満、３時間未満又は１時間未満実施することができる。他の態様では、圧縮を３０分未満、２０分未満、１０分未満、５分未満又は２分未満実施することができる。
【００３１】
ゲルから失われる間質液の量は元のゲルに含まれる量に対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％とすることができる。
【００３２】
移植用又は眼毒性試験用又は本願に開示する他の任意用途用の人工眼上皮を製造するために、塑性圧縮コラーゲンゲルは好ましくは長さ１〜６０ｍｍ、より好ましくは長さ２０〜４０ｍｍとする。また、幅０．５〜６０ｍｍ、好ましくは幅２０〜４０ｍｍとすることができる。
【００３３】
本発明の所定態様において、塑性圧縮コラーゲンゲルは厚さ５〜１００００μｍ、好ましくは１０〜１０００μｍ、より好ましくは厚さ２０〜１００μｍ、最も好ましくは厚さ約５０μｍのシート状である。
【００３４】
塑性圧縮コラーゲンゲルの組成は一般にコラーゲン３〜４％（好ましくは３．３〜３．５％、より好ましくはコラーゲン約３．４％）であり、残余は緩衝液からの水と塩類／糖類である。この残余のうち、水が一般に＞９９％を構成する。
【００３５】
圧縮コラーゲンゲルにおけるコラーゲンフィブリルの直径は好ましくは１０〜１００ｎｍである。圧縮コラーゲンゲルにおけるコラーゲンフィブリルの間隔は好ましくは１〜２００ｎｍである。これらのパラメータは以下の方法により測定することができる。コラーゲンゲルを２．５％グルタルアルデヒドのＰＢＳ溶液で室温にて１時間、次いで１％四酸化オスミウムで室温にて１時間固定した後、エタノール濃度を（１００％まで）上昇させて脱水し、次いで酸化プロピレンでガス処理した後、Ａｇａｒ  １００樹脂を６０℃で２４時間重合して包埋する。７０ｎｍ切片を切断し、クエン酸鉛と酢酸ウラニルで対比染色後、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で試験し、コラーゲンフィブリル直及び間隔を定量することができる。この方法によりコラーゲンフィブリルの配向、例えば高度（又は低度）配向を定性的に評価することもできる。
【００３６】
別の側面において、本発明は角膜細胞を増殖させるための基材としての塑性圧縮コラーゲンゲルの使用を提供する。
【００３７】
本発明は更に、角膜幹細胞又は角膜幹細胞を含有する組成物を塑性圧縮コラーゲンゲル基材上で培養する段階を含む人工眼上皮の製造方法であって、基材上に人工眼上皮を産生する角膜上皮細胞集団を提供するような条件下で前記細胞又は組成物を培養する方法も提供する。
【００３８】
本発明で使用される塑性圧縮ゲルは角膜細胞を増殖させるための基材を提供し、この基材は上皮なし角膜基質と形態的に類似する。細胞はこの基材の表面上で増殖し、このような細胞は基材の内側には全く又は基本的に全く増殖しない。塑性圧縮コラーゲンゲルの圧縮レベルは付着させた上皮細胞が圧縮ゲルの内側に内方増殖しないように選択される。
【００３９】
所定態様では、その後、人工眼上皮を基材から分離する。
【００４０】
本発明の他の態様では、人工眼上皮を塑性圧縮コラーゲンゲル基材上に保持し、前記基材を人工角膜基質として使用する。本願で使用する「人工角膜基質」なる用語は好ましくは本願に記載する塑性圧縮コラーゲンゲルを意味し、場合により角膜線維芽細胞及び／又はケラチノサイトを封入することができ、及び／又は場合により（好ましくはリボフラビン／ＵＶを使用して）架橋することができる。
【００４１】
所定態様では、人工眼上皮をその後、場合により人工眼上皮として使用するための説明書と共に、基材から分離するか又は分離せずにヒト組織の保存と防腐に適した培地、好ましくはコンドロイチン硫酸系保存培地、例えばＯｐｔｉｓｏｌ（登録商標）（Ｂａｕｓｃｈ  ＆  Ｌｏｍｂ）で保存する。
【００４２】
好ましくは、塑性圧縮コラーゲンゲル基材は本願に記載の方法により取得されるか又は取得可能である。
【００４３】
本発明は上記方法により取得されるか又は取得可能人工眼上皮も提供する。
【００４４】
本発明は更に基底細胞の内側及び下側の基底膜成分（例えばラミニン、インテグリン、半接着斑）と共に、ＣＫ３（サイトケラチン３）分化マーカーとＣＫ１４（サイトケラチン１４）未分化マーカーの双方を発現する３〜７層の細胞層からなる連続重層化上皮を含み、好ましくは本願に記載する方法により取得されるか又は取得可能な人工眼上皮も提供する。
【００４５】
人工眼上皮は好ましくは４５０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ）が０．００〜０．５０である。好ましくはケラチノサイトと人工眼上皮を包埋したラミニンコート塑性圧縮コラーゲンゲルはＯＤ（４５０ｎｍ）が０．０１〜０．１０、好ましくは約０．０７３である。
【００４６】
人工眼上皮内における接着斑及び半接着斑（夫々細胞−細胞及び細胞−基材接着複合体）の存在を使用し、その下のマトリックスとの組織一体性及び接着性を定量することができる。特に、本発明は一部もしくは全基底細胞に半接着斑が存在しており、及び／又は一部もしくは全隣接上皮細胞が接着斑構造を介して相互に結合している人工眼上皮に関する。
【００４７】
角膜幹細胞を含有する組成物は好ましくは輪部上皮細胞を含有しており、即ち角膜の縁部の輪部から取得可能な幹細胞と分化細胞の不均一混合物を含有する。換言するならば、角膜幹細胞を含有する組成物は角膜幹細胞とまだ完全には角膜上皮表現型に移行していない細胞の混合物を含有することができる。
【００４８】
本願で使用する「角膜細胞」なる用語は動物（好ましくは哺乳動物）角膜から得られた細胞を意味する。好ましくは、細胞は角膜の輪部環、即ち結膜、虹彩及び中心角膜を除く角膜の外縁部から得られる。細胞は上皮細胞を含むか又は前記細胞から構成することができる。細胞は角膜幹細胞、好ましくは輪部角膜上皮幹細胞を含むか又は前記細胞から構成することができる。好ましくは、角膜幹細胞はヒト角膜幹細胞である。
【００４９】
ゲルの機械的特性を改善するために、圧縮前又は後に圧縮コラーゲンゲルにおけるコラーゲンを架橋することができる。好ましくは、架橋はリボフラビンとＵＶ（好ましくはＵＶＡ、最も好ましくは約３６５ｎｍ）を使用して実施される。例えば、架橋は圧縮ゲルをリボフラビン溶液（好ましくは１５〜２５％デキストラン溶液中０．０５〜０．２％リボフラビン）中で室温にて２０〜４０分間インキュベートすることにより実施することができる。その後、未使用リボフラビンが存在する場合には、例えばＰＢＳを使用してゲルから洗い流すことができる。このように処理されたコラーゲンゲルは未処理ゲルに比較して大きな荷重に耐えることができ、眼表面に移植した場合に縫合糸により良好に固定される。
【００５０】
本発明の所定態様において、架橋は１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）又は他の任意のカルボジイミド系もしくはスクシンイミド系架橋剤を使用して実施されない。
【００５１】
本発明の好ましい１態様では、（好ましくはリボフラビン／ＵＶを使用して架橋された）架橋塑性圧縮コラーゲンゲルを使用し、圧縮ゲルは細胞を封入していない。
【００５２】
本発明は更に、コラーゲン繊維が（好ましくはＵＶ光を使用して）リボフラビンを使用して架橋された塑性圧縮コラーゲンゲルと、人工眼上皮を増殖させることができる基材としての用途及び本願に開示する他の用途における前記ゲルの使用も提供する。好ましくは、塑性圧縮コラーゲンゲルは本願に開示する方法により製造されたものである。
【００５３】
前記組成物又は幹細胞は基材の表面に人工眼上皮を産生する角膜上皮細胞集団を提供するような条件下で培養される。このような条件は当分野で周知である（例えばＥｂａｔｏ  Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．１９８８；２９：１５３３−１５３７；ｄｅ  Ｐａｉｖａ  Ｃ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２００５；２３：６３−７３）。
【００５４】
本発明は更に本発明の人工眼上皮を含む人工眼組織と、本発明の方法により取得されるか又は取得可能な塑性圧縮コラーゲンゲル基材も提供し、人工眼上皮は塑性圧縮コラーゲンゲル基材の表面で増殖中であるか又は増殖していることが好ましい。
【００５５】
本発明は更に人工眼上皮又は人工眼組織に及ぼす試験化合物の効果を評価する方法であって、
（ａ）本発明の方法により取得されるか又は取得可能な人工眼上皮又は組織を準備する段階と；
（ｂ）人工眼上皮又は人工眼組織を一定量の試験化合物と接触させる段階と；
（ｃ）人工眼上皮又は人工眼組織に及ぼす化合物の効果を評価する段階
を含む方法も提供する。
【００５６】
化合物の効果は例えば任意分析、生化学、光学、顕微鏡又は他の手段により評価することができる。
【００５７】
所定態様において、評価する効果は人工眼上皮もしくは組織の光学特性の変化、又は人工眼上皮もしくは組織の透過性の変化である。例えば試験化合物の添加前後に前記変化を測定することができ、又は前記変化を対照と比較することができる。
【００５８】
他の態様では、人工眼上皮もしくは組織の組織学試験、又は前炎症メディエーターの産生の測定により化合物の効果を評価することができる。
【００５９】
本発明は更に哺乳動物角膜に対する試験化合物の毒性の指示を提供するための本発明の方法により取得されるか又は取得可能な人工眼上皮又は組織の使用も提供する。
【００６０】
他の態様において、本発明は角膜上皮の基礎／基本生物学、例えば増殖、分化、結合及び重層化の分子制御を研究するためのモデルを提供するための、本発明の方法により取得されるか又は取得可能な眼上皮又は組織の使用を提供する。
【００６１】
本発明は更に本発明の方法により取得されるか又は取得可能な人工眼上皮又は組織の人工角膜としての使用も提供する。
【００６２】
本発明は更に細胞の送達を必要とする組織への細胞組織剤としての本発明の方法により取得されるか又は取得可能な人工眼上皮又は組織の使用も提供する。
【００６３】
本発明は更に、
（ａ）本発明の方法により取得されるか又は取得可能な人工眼上皮又は組織を準備する段階と；
（ｂ）眼損傷を前記人工眼上皮又は組織と接触させる段階と；場合により
（ｃ）前記人工眼上皮又は組織を眼損傷部位に固定する段階
を含む眼損傷の治療方法も提供する。
【００６４】
治療することができる眼損傷としては、幹細胞機能を維持するために不十分な間質微小環境に関連するもの（例えば無虹彩症、角膜炎、神経栄養性角膜症及び慢性角膜輪部炎）；又は輪部幹細胞を破壊する外部因子に関連するもの（例えば化学もしくは熱傷害、スティーブンス・ジョンソン症候群、眼瘢痕性類天疱瘡、コンタクトレンズ使用又は広範な微生物感染症）が挙げられる。
【００６５】
本発明は更に治療方法、好ましくは上記のもの等の眼損傷の治療方法で使用するための上記方法により取得されるか又は取得可能な人工眼上皮又は組織も提供する。
【００６６】
本発明は更に治療方法、好ましくは上記のもの等の眼損傷の治療方法で使用するための組成物の製造における上記方法により取得されるか又は取得可能な人工眼上皮又は組織の使用も提供する。
【００６７】
本発明は更に、
（ａ）本発明の方法により取得されるか又は取得可能な人工眼上皮又は組織を準備する段階と；
（ｂ）哺乳動物対象の角膜を前記人工眼上皮又は組織で置換する段階
を含む哺乳動物対象における角膜置換方法も提供する。
【００６８】
本発明は更に、外科処置方法で使用するための上記方法により取得されるか又は取得可能な人工眼上皮又は組織も提供し、好ましくは哺乳動物対象の角膜を前記人工眼上皮又は組織で置換する。
【００６９】
本発明は更に、外科処置方法で使用するための組成物の製造における上記方法により取得されるか又は取得可能な人工眼上皮又は組織の使用も提供し、好ましくは哺乳動物対象の角膜を前記人工眼上皮又は組織で置換する。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】ウシ角膜基質の輪部に由来するケラチノサイトによる一次スフィア形成。夫々５日間（Ａ）、７日間（Ｂ）及び９日間（Ｃ）培養した代表的なスフィア。（Ｄ）：一次スフィアから分化した子孫。目盛線＝５０μｍ。
【００７１】
【図２】包埋されたケラチノサイトの生死染色。Ａ：７日間培養後に圧縮コラーゲンゲル内に包埋されたケラチノサイト。Ｂ：ケラチノサイトはその緑色染色により生存していると判断された。Ｃ：赤色染色を示す死んだケラチノサイトは検出されなかった。
【００７２】
【図３】３Ａ−Ｂ。ヒト角膜（図３Ａ）及び羊膜（図３Ｂ）の透過型電子顕微鏡写真（ＴＥＭ）。
【００７３】
【図４】４Ａ−Ｂ。羊膜のＸ線回折（図４Ａ）にＸ線回折パターン（図４Ｂ）を横断するトランセクトを示す。
【００７４】
【図５】各種足場の走査型電子顕微鏡写真。Ａ：圧縮コラーゲンゲル；Ｂ：上皮なし羊膜。
【００７５】
【図６】角膜上皮シートと正常ウシ角膜上皮の透過型電子顕微鏡画像。Ａ：基底細胞は半接着斑結合（矢印）により圧縮コラーゲン足場と良好に接着するようであった；Ｂ：正常ウシ角膜上皮における半接着斑結合（矢印）；Ｃ：隣接細胞は圧縮ゲル上で接着斑結合（矢印）を明白に示した；Ｄ：正常角膜上皮における接着斑結合（矢印）。目盛線：８００ｎｍ。
【００７６】
【図７】透明度の評価。Ａ：１本目（「コラーゲン」）ケラチノサイトを包埋したラミニンコート圧縮コラーゲンゲル；２本目（「ＡＭ」）上皮なし羊膜；３本目（「コラーゲン＋」）ＬＥＣを圧縮コラーゲンゲル上で増殖させた組合せ；４本目（「ＡＭ＋」）ＬＥＣを上皮なし羊膜上で増殖させた組合せ。組織を９６ウェルプレートに入れた。Ｂ：得られたＯＤ測定値。棒グラフは平均と標準偏差を示す。
【００７７】
【図８】図８Ａ−Ｃ。単離した輪部細胞の羊膜上への重層化。基礎培地で１１日間インキュベーション後の輪部小片からの増殖細胞（Ａ）と１４日後の懸濁細胞（Ｂ）。脱水コラーゲンシート上で増殖させた細胞は同等レベルの細胞密度と重層化を示す（Ｃ）。染色は細胞核を示す。
【００７８】
【図９】図９Ａ−Ｂ。１１日間培養後の角膜輪部細胞のＫ３（赤）及びＫ１４（緑）、ＤＡＰＩ（青）二重標識の２０倍顕微鏡写真。懸濁培養細胞（Ａ）と外植片培養細胞（Ｂ）。目盛線：１００μｍ。
【００７９】
【図１０】増殖させた輪部上皮細胞の免疫蛍光染色。Ａ：ケラチノサイトを包埋したラミニンコート圧縮コラーゲンゲル上のＬＥＣ（赤）のＣＫ３染色（緑）。Ｂ：上皮なし羊膜上のＬＥＣ（青）のＣＫ３染色（赤）。Ｃ：ケラチノサイトを包埋したラミニンコート圧縮コラーゲンゲル上のＬＥＣ（赤）のＣＫ１４（緑）染色。Ｄ：上皮なし羊膜上のＬＥＣ（青）のＣＫ１４（緑）染色。目盛線＝５０μｍ。
【００８０】
【図１１】ケラチノサイトを包埋したラミニンコート圧縮コラーゲンゲル（コラーゲン）と上皮なし羊膜（ＡＭ）上で培養したＬＥＣのＣＫ３（Ａ−「Ｋ３」）及びＣＫ１４（Ｂ−「Ｋ４」）発現のウェスタンブロッティング及びイムノブロッティング。
【００８１】
【図１２】ケラチノサイトを包埋したラミニンコート圧縮コラーゲンゲル（コラーゲン）と上皮なし羊膜（ＡＭ）上で培養したＬＥＣのＣＫ１２ｍＲＮＡ発現。
【００８２】
【図１３】コラーゲンゲルの塑性圧縮。Ａ：安定化した未圧縮コラーゲンゲル；Ｂ：安定化したコラーゲンゲルのＰＣ法を示す図；Ｃ：圧縮コラーゲンゲル。
【００８３】
【図１４】輪部上皮外方増殖。Ａ：未圧縮コラーゲンゲル上の外植片外方増殖；Ｂ：圧縮コラーゲンゲル上の外植片外方増殖；Ｃ：コラーゲン足場上の外植片外方増殖面積を示すグラフ。目盛線＝５０μｍ。
【００８４】
【図１５】各種足場の走査型電子顕微鏡写真。Ａ：未圧縮コラーゲンゲル；Ｂ：圧縮コラーゲンゲル；Ｃ：上皮なしウシ角膜基質。
【００８５】
【図１６】コラーゲンゲルと正常角膜上のＬＥＣの走査型電子顕微鏡。Ａ：未圧縮コラーゲンゲル上の細胞；Ｂ：圧縮コラーゲンゲル上の細胞；Ｃ：正常ウシ角膜上皮。
【００８６】
【図１７】コラーゲン繊維、角膜上皮シート及び正常ウシ角膜上皮の透過型電子顕微鏡画像。Ａ−Ｃ：各種足場、即ち未圧縮コラーゲンゲル（Ａ）、圧縮コラーゲンゲル（Ｂ）及び正常ウシ角膜基質（Ｃ）に由来するコラーゲン繊維；Ｄ：基底細胞は未圧縮コラーゲンゲルとさほど良好に接着しない；Ｅ：基底細胞は半接着斑結合（矢印）により圧縮コラーゲン足場と良好に接着するようである；Ｆ：正常ウシ角膜上皮における半接着斑結合（矢印）；Ｇ：未圧縮ゲル上では細胞層間に大きな間隙（矢印）が目立つ；Ｈ：隣接細胞は圧縮ゲル上で接着斑結合（矢印）を明白に示す；Ｉ：正常角膜上皮における接着斑結合（矢印）。目盛線：（Ａ−Ｃ）１０μｍ；（Ｄ−Ｉ）１μｍ。
【００８７】
【図１８】コラーゲンゲルと正常ウシ角膜上皮上で増殖させた細胞の免疫染色。ヨウ化プロピジウム（赤）とＣＫ３（緑）。Ａ：細胞は未圧縮コラーゲンゲル上で増殖した；Ｂ：細胞は圧縮コラーゲンゲル上で増殖した；Ｃ：正常ウシ角膜上皮。目盛線＝５０μｍ。
【００８８】
【図１９】未処理（左）及びリボフラビン／ＵＶ処理後（右）の圧縮コラーゲンゲル。
【００８９】
【図２０】圧縮コラーゲンゲルの破壊応力を解析するために使用した装置。
【００９０】
【図２１】未処理（図２１Ａ）及びリボフラビン／ＵＶ処理後（図２１Ｂ）の圧縮コラーゲンゲルの時間に対する荷重増加の例。
【００９１】
【図２２】リボフラビン／ＵＶ処理したコラーゲンゲル上で増殖させた細胞の免疫染色。ヨウ化プロピジウム（赤）とＣＫ３（緑）。角膜輪部細胞はリボフラビン処理した圧縮コラーゲンゲル内で増殖することができる。
【００９２】
【図２３】ウサギの眼表面に移植した圧縮コラーゲンゲル（ラメラ移植片）。Ａ：一旦移植した圧縮コラーゲンゲルは縫合糸を有効に固定しない；Ｂ：リボフラビン処理した圧縮コラーゲンゲルはより良好に縫合・固定できるため、移植を改善することができる。
【発明を実施するための形態】
【００９３】
以下、実施例により本発明を更に説明するが、実施例中、特に指定しない限り、部及び百分率は重量に基づき、温度は摂氏である。当然のことながら、これらの実施例は本発明の好ましい態様を示すものであるが、例証に過ぎない。上記記載とこれらの実施例から、当業者は本発明の基本的な特徴を把握することができ、発明の趣旨と範囲内で、各種用途及び条件に適応するように本発明の種々の変更及び改変を行うことができる。従って、本願に提示及び記載するものに加えて本発明の種々の改変が以下の記載から当業者に想到されよう。このような改変も特許請求の範囲に含むものとする。本願に記載する各資料の開示は全体を本願に援用する。
【実施例１】
【００９４】
一次スフィア形成アッセイを使用したケラチノサイトの単離
現地食肉処理場（Ｃｈｉｔｙ卸売食肉処理場，Ｇｕｉｌｄｆｏｒｄ，ＵＫ）から死亡後２時間以内に正常ウシ眼球を入手し、４℃の実験室に輸送し、すぐに使用した。標準アイバンク技術を使用して角強膜を切離した。要約すると、角強膜組織をダルベッコ最小必須培地（ＤＭＥＭ，ＧＩＢＣＯ）で３回リンスした。中心角膜、余分な強膜、虹彩、角膜内皮、結膜及びテノン嚢を注意深く除去した後、残りの輪部周辺部を約２５ｍｍ２の小片に裁断した。次にこれらの小片から輪部基質ケラチノサイトと上皮細胞を単離した。輪部基質ケラチノサイト単離には、輪部周辺部の小片を０．０２％コラゲナーゼ（ＧＩＢＣＯ）の存在下で３７にて一晩インキュベートした。次に残りの輪部基質小片を採取し、０．２％  ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ，ＵＫ）で３７℃にて５分間処理後、２１ゲージ針で吸引し、シングルセルに分離した。遠心後、Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＫ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ，Ｓｉｇｍａ，ＵＫ）２０ｎｇ／ｍｌ、塩基性線維芽細胞増殖因子（Ｍａｒｙ  Ａｎｎ  Ｌｉｅｂｅｒｔ，Ｉｎｃ．，１４０  Ｈｕｇｕｅｎｏｔ  Ｓｔｒｅｅｔ，Ｎｅｗ  Ｒｏｃｈｅｌｌｅ，ＮＹ  １０８０１）（ｂＦＧＦ，Ｓｉｇｍａ，ＵＫ）４０ｎｇ／ｍｌ、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ、及びアンホテリシンＢ２５０ｎｇ／ｍｌをＤＭＥＭ／ハムＦ１２培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２，１：１）に添加した基礎培地に細胞を再懸濁した。スフィア形成アッセイを利用し、メチルセルロースゲルマトリックス（０．８％，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した基礎培地を使用してこれらの単離した輪部ケラチノサイトを培養した。生存細胞１０個／μｌの密度で６０ｍｍ培養皿２７に播種した。
【実施例２】
【００９５】
スフィアコロニーの分化
懸濁した輪部ケラチノサイトから７日間培養後に形成された一次スフィアを顕微鏡試験のために、ポリ−Ｌ−リジン（Ｓｉｇｍａ，ＵＫ）５０μｇ／ｍｌとフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ，ＵＫ）１０μｇ／ｍｌをコートしたガラスカバースリップに移した。輪部ケラチノサイトの分化を促進するために、１％胎仔ウシ血清を基礎培地に加え、７日間培養を続けた。得られた分化ケラチノサイトを０．２５％トリプシンと０．０２％  ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ，ＵＫ）で消化し、細胞２．０×１０５個の密度で基礎培地に再懸濁した。
【００９６】
輪部基質をシングルセルに分解して９日間培養すると、この期間中に細胞の生存可能なスフィアが増殖した。５日間、７日間、９日間培養した代表的なスフィアの写真を夫々図１Ａ、１Ｂ及び１Ｃに示す。各スフィアから分化した子孫は典型的な線維芽細胞様形態を示した（図１Ｄ）。
【実施例３】
【００９７】
無細胞コラーゲンゲルの形成
１モル水酸化ナトリウム（Ｍｅｒｃｋ，Ｌｅｉｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）０．５ｍＬを添加した１０倍濃度イーグル最小必須培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）１ｍＬで滅菌ラット尾Ｉ型コラーゲン（Ｆｉｒｓｔ  Ｌｉｎｋ  Ｌｔｄ．Ｗｅｓｔ  Ｍｉｄｌａｎｄｓ，ＵＫ）４ｍＬを中和することにより、従来記載されているように無細胞コラーゲンゲルを作製した（Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｆｕｎｃｔ．Ｍａｔｅｒ．，２００５，１５：１７６２−１７７０）。ゲルを長方形金型（３３ｍｍ×１３ｍｍ×４ｍｍ）に注入し、３７℃  ０．５％  ＣＯ２インキュベーターで３０分間硬化／安定化させた。硬化及びインキュベーション後、加圧とナイロンメッシュ層及び紙シートを使用する吸取法の併用によりゲルを圧縮した（Ｂｒｏｗｎらは更に金属ワイヤーメッシュも使用したが、これは使用しなかった）。ゲルの圧縮を行うために、ナイロンメッシュ１層（５０μｍメッシュサイズ）を吸収紙の二重層に重ね、コラーゲンゲルをナイロンメッシュに載せ、第２のナイロンメッシュを被せ、５０ｇ荷重を５分間室温で加え、２枚のナイロンメッシュ間に保護された平坦なコラーゲンシート（厚さ２０〜４０μｍ）を形成した。
【実施例４】
【００９８】
線維芽細胞を組込んだコラーゲンゲルの形成
新鮮な角膜組織又は線維芽細胞株から抽出した間質線維芽細胞のペレットを１０倍濃度イーグル最小必須培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）１ｍＬ中で滅菌ラット尾Ｉ型コラーゲン（Ｆｉｒｓｔ  Ｌｉｎｋ  Ｌｔｄ．Ｗｅｓｔ  Ｍｉｄｌａｎｄｓ，ＵＫ）４ｍに懸濁し、１モル水酸化ナトリウム（Ｍｅｒｃｋ，Ｌｅｉｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）０．５ｍＬで中和する。細胞を含むゲルを長方形金型（３３ｍｍ×１３ｍｍ×４ｍｍ）に注入し、３７℃  ０．５％  ＣＯ２インキュベーターで３０分間硬化／安定化させる。硬化及びインキュベーション後、加圧とナイロンメッシュ層及び濾紙シートを使用する吸取法の併用によりゲルを圧縮する。ゲルの圧縮を行うために、ナイロンメッシュ１層（５０μｍメッシュサイズ）を吸収紙の二重層に重ね、コラーゲンゲルをナイロンメッシュに載せ、第２のナイロンメッシュを被せ、５０ｇ荷重を５分間室温で加え、２枚のナイロンメッシュ間に保護された平坦なコラーゲンシート（厚さ２０〜４０μｍ）を形成する。
【実施例５】
【００９９】
コラーゲンゲルのラミニンコーティング
場合により、得られたケラチノサイト包埋圧縮コラーゲンゲルを次に６ウェルプレート（ｔｒａｎｓｗｅｌｌｓ，ｃｏｓｔａｒ）に移し、各ゲルにラミニン溶液（５０μｇ／ｍｌ，Ｓｉｇｍａ，ＵＫ）をコートし、３７℃で２時間インキュベートし、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄すると、その時点でコラーゲン足場はＬＥＣ増殖に使用可能な状態になった。
【実施例６】
【０１００】
ケラチノサイト生存アッセイ
ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ，ＵＫ）１０％、ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ，ＵＫ）０．５％、ＥＧＦ（Ｓｉｇｍａ，ＵＫ）１０ｎｇ／ｍｌ、インスリン（Ｓｉｇｍａ，ＵＫ）５ｍｇ／ｍｌ、ペニシリン１００ＩＵ／ｍｌ及びストレプトマイシン１００ｍｇ／ｍｌを添加したＤＭＥＭ／ハムＦ１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）培地で７日間培養後に生死二重染色キット（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｇｅｒｍａｎ）を使用して圧縮ゲル内に包埋されたケラチノサイトの生存を試験した。キットは細胞透過性緑色蛍光色素であるｃｙｔｏ−ｄｙｅを利用して生細胞を染色し、透過を生じる膜損傷がある場合にしか細胞に侵入することができない非透過性赤色蛍光色素であるヨウ化プロピジウム（ＰＩ）により死細胞を染色した。共焦点顕微鏡（ＬＥＩＣＡ  ＤＭＩＲＥ２，Ｇｅｒｍａｎ）を使用して生死ケラチノサイト比を検出した。
【０１０１】
包埋されたケラチノサイトを７日間培養したが、この間にコラーゲンゲルはその寸法がさほど変化しなかった。ゲル内の細胞を生死二重染色で処理し、共焦点顕微鏡により試験した（図２Ａ）。ゲル内の種々の深度に焦点を当てることにより、細胞は依然として生存可能であり（図２Ｂ）、死細胞は認められない（図２Ｃ）ことが検出され、ケラチノサイトをコラーゲンゲル内に封入した後に圧縮してもこの期間中に細胞生存能に影響しないと判断された。
【実施例７】
【０１０２】
角膜、羊膜及びコラーゲンゲルの構造詳細
ヒト角膜及び羊膜を透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で解析した処、コラーゲン繊維直径、間隔及び／又は配向の点で構造の類似性が判明した（図３，Ａ及びＢ）。羊膜のＸ線回折の結果、フィブリル直径４３ｎｍ、フィブリル間隔４６ｎｍであり、フィブリル組織化を示した（図４）。
【実施例８】
【０１０３】
輪部細胞からの細胞懸濁液の調製
輪部上皮細胞単離のために輪部環構造を維持しながら、角膜の外縁部の輪部環を結膜、虹彩及び中心角膜から切離した。輪部環を長さ約１ｃｍの数個の小片に裁断し、ＤＭＥＭ，ＦＭ１２（１：１）培地（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉ，Ｕ．Ｋ．）、抗生物質５０μｇ／ｍｌ、ＦＢＳ  ５％、ジメチルスルホキシド０．５％、ヒト上皮増殖因子２ｎｇ／ｍｌ、インスリン５μｇ／ｍｌ、Ｂ２７サプリメント培地（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉ，Ｕ．Ｋ．）を含有する基礎培地中、０．０２％  ＩＡ型コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の存在下、加湿５％二酸化炭素及び９５％空気、３７℃の雰囲気下で３７℃にて１２時間インキュベートした。
【０１０４】
酵素の存在下でインキュベートした輪部小片から先細ピンセットで上皮シートを剥離し、０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡを加えた１５ｍｌ管に移し、３７℃で１０〜１５分間インキュベートし、最後に２１ゲージ針で撹拌することによりシングルセルに解離した。ＦＢＳを添加した基礎培地を加えることによりトリプシン／ＥＤＴＡを除去した後、室温にて１０００ｒｐｍで５分間の遠心を数回実施した。細胞を基礎培地に再懸濁し、コラーゲンゲル又は羊膜に播種した。
【実施例９】
【０１０５】
輪部幹細胞を含む外植片の作製
輪部環構造を各々５ｍｍ×５ｍｍ平方の小片８〜１０個に均等に裁断し、最後に下部の輪部基質（基質の厚さの約３分の２）も注意深く除去した。輪部小片を滅菌ＰＢＳで３回洗浄後、ペニシリン／ストレプトマイシン抗生物質溶液（Ｇｉｂｃｏ）で３分間リンスした。上皮側を上にして角膜輪部小片をシャーレに入れ、基礎培地に浸した。輪部小片を加湿５％二酸化炭素及び９５％空気の雰囲気下で３７℃にて２〜３日間インキュベートした。輪部上皮細胞がシャーレ上で輪部外植片の縁部に沿って遊走しているのを（倒立光学顕微鏡により）確認できたら、「健康」であり、更に培養するのに適しているとみなした。このような輪部小片をプラスチック皿から注意深く取り出し、蓋付き６ウェルプレート内の培養インサートにより静かに基材（コラーゲンゲル又は羊膜）に移した。
【実施例１０】
【０１０６】
圧縮コラーゲンゲル及び上皮なし羊膜上の輪部上皮細胞の増殖
羊膜（ＡＭ）を滅菌ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄後、３７℃にて３０分間０．２５％トリプシン処理した。インキュベーション後、膜上の上皮細胞をスクレーパで掻き取った。次に、基底膜表面を上に向けて無細胞ＡＭを６個のトランスウェルに移した。ケラチノサイトを包埋したラミニンコート圧縮コラーゲンゲルと上皮なしＡＭに単離したＬＳＣを１０６個／ｍｌの密度で播種した。１４日後に、培地液面を下げることにより、増殖させたＬＥＣを更に７日間空気に暴露した。３週間インキュベーション後に、複数の細胞層をもつ角膜上皮膜を更に試験に供した。
【実施例１１】
【０１０７】
電子顕微鏡解析
圧縮コラーゲンゲルと上皮なしＡＭの表面を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）により試験した。圧縮コラーゲンゲル上で増殖させたＬＥＣを透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）により試験した。全試料を２．５％（ｖ／ｖ）グルタルアルデヒドで固定し、ＰＢＳで１０分間３回洗浄し、１％四酸化オスミウム水溶液で２時間後固定した。次に試料をＰＢＳで更に３回洗浄後、段階的エタノール系列（５０％、７０％、９０％及び１００％）に通した。ＳＥＭでは、試料をヘキサメチルジシラザンに２０分間移し、風乾した。次にこれらの試料をアルミニウムスタブにマウントし、金をスパッターコートした後、ＳＥＭ（ＦＥＩ  Ｑｕａｎｔａ  ＦＥＧ  ６００，ＵＫ）を使用して試験した。ＴＥＭでは、脱水した試料をエポキシ樹脂（Ａｇａｒ  １００；Ａｇａｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｌｔｄ．，Ｓｔａｎｓｔｅｄ，ＵＫ）で包埋した。超薄（７０ｎｍ）切片を銅グリッド上で採取し、酢酸ウラニルと１％ホスホタングステン酸で１時間染色後、レイノルズ法のクエン酸鉛で２０分間染色した後、透過型電子顕微鏡（Ｐｈｉｌｉｐｓ  ＣＭ２０，Ｈｏｌｌａｎｄ）を使用して試験した。
【０１０８】
圧縮ゲル（図５Ａ）内のコラーゲン繊維のＳＥＭ解析によると、稠密・均質であり、上皮なしＡＭ（図５Ｂ）と同様の形態及び構造であると思われた。
【０１０９】
ＴＥＭ解析によると、圧縮ゲル上で増殖させたＬＥＣは正常角膜上皮（図６Ｂ）と同様に基底細胞に半接着斑形成（図６Ａ）を示すことから、明確な基底膜層を生じることが判明した。更に、隣接細胞はやはり正常角膜上皮（図６Ｄ）で認められると同様に、接着斑構造を介して相互に結合していた（図６Ｃ）。
【実施例１２】
【０１１０】
透明度の評価
ＬＥＣ増殖前後の圧縮コラーゲンゲルと上皮なしＡＭの透明度を評価するために、得られた角膜構築物をトレフィンで直径３．５ｍｍの小片に裁断し、９６ウェル培養プレートのウェルに１個ずつ入れた。Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｅｌｘ８００ＵＶ，ＵＫ）を使用して組織光学密度（ＯＤ）を測定した。
【０１１１】
圧縮コラーゲンゲルと上皮なしＡＭ上で増殖させたＬＥＣの透明度の比較を容易にするように光学密度（４５０ｎｍのＯＤ）測定を行った（図７Ａ）。ケラチノサイトを包埋したラミニンコート圧縮コラーゲンゲル（０．００３±０．００１）と上皮なしＡＭ（０．００３±０．００１）からのＯＤ値は非常に低く、相互間に有意差はなかった（Ｐ＞０．０５）。各々増殖させたＬＥＣを添加後にケラチノサイトを包埋したラミニンコート圧縮コラーゲンゲルと上皮なしＡＭから測定したＯＤ値は夫々０．０７３±０．００３及び０．０７２±０．００３であり、相互間に有意差はなかった（Ｐ＞０．０５）（図７Ｂ）。
【実施例１３】
【０１１２】
コラーゲンゲル又は羊膜上への輪部細胞の重層化
核（ＤＡＰＩ）染色は輪部外植片（図８Ａ）と輪部懸濁培地（図８Ｂ）を使用して増殖させた１０〜１４日間培養後の細胞間の角膜輪部細胞の重層化の程度を示した。培養した輪部細胞の重層化は１０〜１４日間培養後に３〜６層であった。脱水（塑性圧縮）コラーゲンゲル上で増殖させた輪部細胞でも同等レベルまでの重層化が認められた（図８Ｃ）。
【実施例１４】
【０１１３】
免疫化学分析
圧縮コラーゲンゲルと上皮なしＡＭ上でＬＥＣ増殖後に得られた角膜構築物を免疫蛍光顕微鏡により試験した。角膜構築物をＯＣＴ（ＴｉｓｓｕｅＴｅｋ）で包埋し、液体窒素で凍結後、凍結切片を作成した。免疫化学分析前に、０．４％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有する５０ｍＭトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ；ｐＨ７．２）中、５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用して各切片（厚さ１０μｍ）を６０分間室温にてブロックした。次に０．４％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有する１％ＢＳＡ／ＴＢＳで希釈したサイトケラチン（ＣＫ）３（５０倍；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，ＵＫ）とＣＫ１４（１００倍，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，ＵＫ）に対する一次抗体の存在下で切片を４℃にて一晩インキュベートした。ＦＩＴＣ標識二次抗体（５０倍，Ｓｉｇｍａ，ＵＫ）を室温で１時間使用した。切片をヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ，ＵＫ）で共染色し、蛍光顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｍｅｄｉｔｅｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で観察した。
【実施例１５】
【０１１４】
培養輪部細胞内のＫ１４及びＫ３発現
懸濁した輪部上皮細胞は基底層細胞内で強いＫ１４発現（未分化細胞のマーカー）を示し、エアリフト前にＣＫ３（分化細胞のマーカー）陰性であった（図９Ａ）。３〜４層の厚い基底細胞が緊密な細胞空間配置を示し、細胞間空間は殆どなかった。細胞核は高い核／細胞質比を示した。有棘層細胞は平坦になる傾向が強く、細胞境界が明確であり、これらの細胞はＣＫ１４陰性であると同時にＣＫ３陰性であった。
【０１１５】
同一条件下の輪部外植片培養細胞もＣＫ１４陽性染色を示し（図９Ｂ）、ＣＫ３も外植片培養細胞内で陰性又は非常に弱い染色であった。懸濁培養細胞と異なり、全細胞層（３〜４層）にＣＫ４陽性細胞が認められ、最上層の有棘層上の一部の個々の細胞にも認められた。これらの全細胞は核／細胞質比が大きく、非常に緊密であった。
【０１１６】
角膜上皮細胞の特異的マーカーとして使用されることが多いＣＫ３は圧縮コラーゲンゲル（図１０Ａ）と上皮なしＡＭ（図１０Ｂ）のどちらで増殖させたＬＥＣでも表面細胞層で強く発現された。別の角膜上皮マーカーであるＣＫ１４（推定前駆細胞マーカー）は圧縮コラーゲンゲル（図１０Ｃ）と上皮なしＡＭ（図１０Ｄ）のどちらで増殖させたＬＥＣでも全細胞層で発現されることが判明した。
【実施例１６】
【０１１７】
ウェスタンブロッティング
ケラチノサイトを包埋した圧縮コラーゲン足場と皮なしＡＭ上で増殖させたＬＥＣに由来する蛋白質（各条件で蛋白質合計４μｇ；変形ローリー法を使用して推算）を１０％ゲルで一次元ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分離した。蛋白質をポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜に転写し、１倍トリス緩衝生理食塩水−Ｔｗｅｅｎ（ＴＢＳ−Ｔ）（２０ｍＭトリス塩基，０．１４Ｍ  ＮａＣｌ，０．１％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０；ｐＨ７．６）に溶解した５％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳の存在下でインキュベートすることにより膜との非特異的結合をブロックした。２％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳を１倍ＴＢＳ−Ｔに溶解した溶液で希釈した抗ＣＫ３一次抗体（１μｇｍｌ−１）及び抗ＣＫ１４一次抗体（１μｇｍｌ−１）の存在下で膜を４℃にて一晩インキュベートした。ブロットを１倍ＴＢＳ−Ｔで４５分間洗浄後、マウス共役二次抗体（６０００倍希釈）の存在下で室温にて２時間インキュベートした。増幅化学発光システムを使用して蛋白質をＸ線フィルムで検出した。
【０１１８】
どちらの足場（圧縮コラーゲンと上皮なしＡＭ）上で培養したＬＥＣでもＣＫ３蛋白質発現が認められ、ＣＫ３は上皮なしＡＭ上で培養したＬＥＣよりも圧縮コラーゲン基材上で培養したＬＥＣのほうが強く発現された。ＣＫ１４蛋白質もどちらの足場上で培養したＬＥＣでも認められ、２種類の足場の間に発現レベルの識別可能な差はなかった（図１１）。
【実施例１７】
【０１１９】
リアルタイム定量的ＰＣＲ
ＴＲＩ試薬（Ｓｉｇｍａ，Ｐｏｏｌｅ，ＵＫ）を製造業者のプロトコルに従って使用し、ケラチノサイトを包埋したラミニンコート圧縮コラーゲン足場と上皮なしＡＭ上の両方で培養したＬＥＣから全ＲＮＡを単離した。全ＲＮＡを分光計（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＵＫ）により定量し、ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ  Ｈ  Ｍｉｎｕｓ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ，ＵＫ）を製造業者のプロトコルに従って使用し、ＲＮＡ  １ｎｇを逆転写した。オーダーメードＰｅｒｆｅｃｔＰｒｏｂｅアッセイ（ＰｒｉｍｅｒＤｅｓｉｇｎ，ＵＫ）を使用してケラチン１２（アクセション番号：ＸＭ＿００１２５５４６１）遺伝子発現を定量した。２Ｘ  ｑＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Ｐｒｉｍｅｒｄｅｓｉｇｎ，ＵＫ）１０μｌ、再構成したパーフェクトプローブプライマー／プローブミックス（Ｐｒｉｍｅｒｄｅｓｉｇｎ，ＵＫ）１μｌ、ＰＣＲグレード水（Ｐｒｉｍｅｒｄｅｓｉｇｎ，ＵＫ）４μｌ及びｃＤＮＡ（元の濃度の１０倍希釈）５μｌで最終反応容量２０μｌとなるように、各反応を３回ずつ実施した。非鋳型対照も試験した。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，ＵＫ）で９６ウェルプレート（Ｆｉｓｈｅｒ，ＵＫ）上でリアルタイム反応を実施した。
【０１２０】
Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌを使用して（対応のない）スチューデントのｔ検定を実施し、ＯＤとリアルタイムＰＣＲデータを解析した。３回の独立した実験の平均と平均の標準誤差として結果を表し、Ｐ値≦０．０５を有意とみなした。
【０１２１】
ＣＫ１２は（その対応物であるＣＫ３と同様に）分化角膜上皮細胞のマーカーである。ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨを対照として使用したリアルタイムＰＣＲの結果、ケラチノサイトを包埋したラミニンコート圧縮コラーゲンゲル上で増殖させたＬＥＣにおけるＣＫ１２  ｍＲＮＡ発現レベル（１．１８±０．０９）は上皮なしＡＭ上で増殖させたＬＥＣ（１．００±０．０７）よりもやや高いことが判明した。この差は有意でないことが分かった（Ｐ＞０．０５）（図１２）。
【実施例１８】
【０１２２】
コラーゲンゲル上の輪部上皮外方増殖
上記のように無細胞コラーゲンゲルを作製した。インキュベーターで３０分間硬化後、コラーゲンゲルが良好に形成され（図１３Ａ）、加圧とナイロンメッシュ層及び紙シートを使用する吸取法の併用により圧縮ゲルから液体を排出した（図１３Ｂ）。圧縮コラーゲンゲルは稠密で機械的強度が高く、透明度が高かった（図１３Ｃ）。
【０１２３】
コラーゲンゲル上の輪部上皮外方増殖
輪部外植片から角膜上皮細胞を増殖させた。前段階である単離段階から残存している無傷の輪部周辺部を小片（約２×２ｍｍ）に裁断し、上皮側を上にして２個の小片を圧縮コラーゲンゲルと未圧縮コラーゲンゲルの表面に直接載せ、上記のような細胞培養培地で培養した。細胞を倒立顕微鏡で観察しながら組織培養プレートの上面に外方増殖面積を記録した。３日目、６日目及び９日目に総外方増殖面積を正確に記録し、測定し、定量分析した。
【０１２４】
Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌを使用して（対応のない）スチューデントのｔ検定を実施し、未圧縮コラーゲンゲルと圧縮コラーゲンゲル上のＬＳＣ外方増殖を比較した。３回の独立した実験の平均と平均の標準誤差として結果を表し、Ｐ値≦０．０５を有意とみなした。
【０１２５】
３日後に、ＬＥＣは未圧縮コラーゲンゲル（図１４Ａ）と圧縮（図１４Ｂ）コラーゲンゲルのどちらに載せた外植片からも外方増殖し、外方増殖内の細胞は小さく規則的であることが認められた。外方増殖面積を記録し、３日目、５日目、７日目及び９日目に未圧縮コラーゲンゲル（１４．１±０．４；３５．７±１．２；６３．０±２．４；１１７．５±５．１；ｍｍ２）上と圧縮コラーゲンゲル（１２．３±０．４；４１．４±１．３；５７．１±３．２；１４７．２±４．８；ｍｍ２）上で夫々測定した。上皮外方増殖面積の定量分析によると、どちらのゲル型でも同等の指数的増殖であった（Ｐ＞０．０５）（図１４Ｃ）。
【０１２６】
コラーゲンゲル上でのＬＳＣ懸濁液のエクスビボ増殖
滅菌条件下で未圧縮コラーゲンゲルと圧縮コラーゲンゲルを滅菌ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄後、トランスウェルインサート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＵＫ）の底に置いた。単離したＬＥＣの１００μｌ懸濁液を細胞１０６個／ｍｌの密度で各ゲルに播種した。細胞を上記のような培地で２週間培養後、培地液面を下げることにより７日間空気に暴露した。培養物の表面とちょうど一致するように培地液面を下げ、培地で表面を湿潤させ、組織構築物がその先端面で湿潤状態に維持されるようにすることが重要であった。３週間インキュベーション後に、複数の細胞層をもつ角膜上皮構築物を試験に供した。
【０１２７】
電子顕微鏡解析
ＬＥＣ増殖前後の圧縮コラーゲンゲル及び未圧縮コラーゲンゲルとコラゲナーゼ消化後の輪部環を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）と透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）により試験した。試料を２．５％（ｖ／ｖ）グルタルアルデヒドで固定し、ＰＢＳで１０分間３回洗浄し、１％四酸化オスミウム水溶液で２時間後固定した。次に試料をＰＢＳで更に３回洗浄後、段階的エタノール系列（５０％、７０％、９０％及び１００％）に通した。ＳＥＭでは、試料をヘキサメチルジシラザンに２０分間移し、風乾した。次にこれらの試料をアルミニウムスタブにマウントし、金をスパッターコートした後、ＳＥＭ（ＦＥＩ  Ｑｕａｎｔａ  ＦＥＧ  ６００，ＵＫ）を使用して試験した。ＴＥＭでは、脱水した試料をエポキシ樹脂（Ａｇａｒ  １００；Ａｇａｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｌｔｄ．，Ｓｔａｎｓｔｅｄ，ＵＫ）で包埋した。超薄（７０ｎｍ）切片を銅グリッド上で採取し、酢酸ウラニルと１％ホスホタングステン酸で１時間染色後、レイノルズ法のクエン酸鉛で２０分間染色した後、透過型電子顕微鏡（Ｐｈｉｌｉｐｓ  ＣＭ２０，Ｈｏｌｌａｎｄ）を使用して試験した。
【０１２８】
コラーゲンゲルのＳＥＭ解析によると、未圧縮ゲル内のコラーゲン繊維は非常に緩く配置されている（図１５Ａ）が、圧縮ゲル内のコラーゲン繊維は稠密・均一であり（図１５Ｂ）、上皮なし角膜基質（図１５Ｃ）と同様の形態であると思われた。相対細孔寸法（コラーゲン繊維間の間隙）を比較すると、圧縮ゲルは上皮なし基質と同等であり、未圧縮ゲルよりも著しく小さく、一定した細孔寸法であった。
【０１２９】
異なる足場上のＬＥＣ分布の走査型電子顕微鏡解析
ＬＥＣは未圧縮コラーゲンゲル上と圧縮コラーゲンゲル上のどちらでも増殖することが認められた。未圧縮ゲル上の細胞のＳＥＭ画像によると、細胞は不均一に分布しており、細胞形状は不規則であった（図１６Ａ）が、圧縮ゲル上の細胞の画像は正常ウシ角膜上の上皮（図１６Ｃ）で見られると同様に、細胞が均等に分布し、形状と寸法が均一であることを明白に示した（図１６Ｂ）。
【０１３０】
異なる足場上のＬＥＣの構造の透過型電子顕微鏡解析
未圧縮コラーゲンゲル内のコラーゲン繊維は緩く、直径が一定していない（図１７Ａ）が、圧縮ゲル内の線維は稠密で直径の変動が少なく、より規則的であった（図１７Ｂ）。圧縮ゲル内のコラーゲン繊維は未圧縮足場に由来する繊維よりもウシ角膜に由来する正常間質繊維（図１７Ｃ）とよく似ていた。ＴＥＭ解析によると、未圧縮コラーゲンゲル上に播種したＬＥＣは細胞マトリックス結合も実質的な基底膜層も形成しないことが分かった（図１７Ｄ）。他方、圧縮ゲル上で増殖させたＬＥＣは正常角膜上皮（図１７Ｆ）で見られると同様に、明確な基底膜層を生じ、基底細胞に半接着斑形成を示した（図１７Ｅ）。未圧縮コラーゲンゲル上には複数の細胞層が形成されたが、これらの細胞間には大きな間隙が存在し、細胞間結合は不良であることが分かった（図１７Ｇ）。圧縮ゲル上で隣接細胞はやはり正常角膜上皮（図１７Ｉ）と同様に接着斑構造を介して相互に結合していた（図１７Ｈ）。
【０１３１】
免疫組織化学分析
コラーゲンゲル上でＬＥＣ増殖後に得られた角膜構築物を免疫蛍光法により試験した。０．４％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有する５０ｍＭトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ；ｐＨ７．２）中、６０分間室温にて凍結切片（厚さ１０μｍ）を５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で処理した。次に０．４％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有する１％ＢＳＡのＴＢＳ溶液で希釈したサイトケラチン（ＣＫ）３（５０倍；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，ＵＫ）とＣＫ１４（１００倍，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，ＵＫ）に対する一次抗体の存在下で切片を４℃にて一晩インキュベートした。ＦＩＴＣ標識二次抗体（Ｓｉｇｍａ，ＵＫ）を使用した。切片をヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ，ＵＫ）で共染色し、蛍光顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｍｅｄｉｔｅｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で観察した。
【０１３２】
ＬＥＣはどちらの型のコラーゲン足場上でも増殖及び重層化するのに成功したが、圧縮ゲル（図１８Ｂ）上のほうが未圧縮ゲル（図１８Ａ）上よりも多くの細胞層を形成するため、圧縮群のほうが正常角膜上皮（図１８Ｃ）と似ていることが分かった。ヨウ化プロピジウム（赤）で染色した組織切片は圧縮群よりも未圧縮群内のほうが核間距離が著しく長いことを明白に示した。未圧縮、圧縮及び正常ウシ基質上のｍｍ２当たりの細胞密度は夫々０．４１、０．７２、０．８１であった。分化角膜上皮細胞の特異的マーカーとして使用されることが多いＣＫ３（緑）は正常角膜上皮（図１８Ｃ）と同様に未圧縮コラーゲンゲル（図１８Ａ）及び圧縮コラーゲンゲル（図１８Ｂ）上で増殖させた表面上皮細胞で検出された。
【実施例１９】
【０１３３】
毒性試験
十分に性状決定されている眼表面毒素と新規ナノ粒子を使用して人工眼上皮が眼毒性を正確に測定する能力を上皮バリア機能、細胞生存能及び形態について評価する。
【０１３４】
眼刺激能について薬品を分類するＥＣＥＴＯＣデータバンク（ＥＣＥＴＯＣ，Ｅｙｅ  Ｉｒｒｉｔａｔｉｏｎ：ＥＣＥＴＯＣ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ．１９９８，Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ，ＥＣＥＴＯＣ，Ｂｒｕｓｓｅｌｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ，ｐ．２３６）から選択した試験薬品を一連の眼刺激性（即ち無刺激、低度、中度、重度）に割り当てる。液体試料濃度は歴史的インビボドレイズ試験記録に従って希釈用に脱イオン水を使用し、０．３％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の陽性対照を使用する。種々の暴露時間（１０分、２０分、３０分及び６０分）にわたり、試験材料を上皮培養物の表面に直接添加する（液体／懸濁液１００μｌ又は固体／粉末１００ｍｇ）。粒径１０〜２０ｎｍの金ナノ粒子を０．１ｎＭ、０．５ｎＭ及び１ｎＭの濃度で角膜等価物の表面に２４時間、４８時間及び７２時間滴下することによりナノ粒子毒性を評価する。各金ナノ粒子の周囲にコロナ層を形成する感熱性ブロックコポリマーであるポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）と共役した金ナノ粒子とペグ化金ナノ粒子も細胞及び組織毒性について評価する。誘導された細胞毒性（細胞増殖の変化）を常用のＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）比色アッセイ（Ｍｏｓｍａｎｎ，Ｔ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９８３．６５（１−２）：ｐ．５５−６３）により定量し、生存率百分率を計算する。毒性の定性的測定は細胞表面破裂の頻度及び程度と、細胞の微細な襞状構造及び微絨毛の外観を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で評価することにより行う。角膜上皮の相対損傷を分類し易くするために、従来開発されている数値評価システムを使用する（Ｂｕｒｓｔｅｉｎ，Ｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．，１９８０．１９（３）：ｐ．３０８−３１３）。他の毒性測定としては、トリパンブルー排除細胞生存率アッセイと、ストレス、毒性及びＤＮＡ損傷関連遺伝子に対するＰＣＲアレーが挙げられる。ナノ金粒子局在及び検証用としてＸ線微量分析法（ＥＤＡＸ）も挙げられる。
【０１３５】
ＥＣＥＴＯＣデータベースに報告されているような角膜に及ぼす影響を定量する採点システムであるインビボ修正最大平均スコア（ＭＭＡＳ）とインビトロ幹細胞アッセイの実施可能性の関係を調べることによりモデルの予測性を評価する。ＥＣＥＴＯＣ報告以外に、他の（インターネット）インビボデータソース（Ｔｏｘｎｅｔ，（ｈｔｔｐ：／／ｔｏｘｎｅｔ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）：毒性、危険薬品及び関連領域に関するデータベース群）と他の代替試験モデル（例えばウシ摘出角膜の混濁及び透過性試験（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｃｏｒｎｅａｌ  Ｏｐａｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｔｅｓｔ）；ナメクジ粘膜刺激試験（Ｓｌｕｇ  Ｍｕｃｏｓａｌ  Ｉｒｒｉｔａｔｉｏｎ  ｔｅｓｔ）；市販上皮モデル）で得られる結果も角膜幹細胞モデル最終妥当性評価に含まれる。
【０１３６】
上記実施例で使用した羊膜はクイーン・メアリーズ病院（ＵＫ）とノッティンガム大学（ＵＫ）を通して匿名女性ドナーから入手した。ノッティンガム大学から許可を得た。ヒト角膜はロイヤル・バークシャー病院（ＵＫ）を通して匿名ドナーから入手した。角膜細胞の使用については地域倫理委員会の承認を得た。
【実施例２０】
【０１３７】
圧縮コラーゲンゲルのリボフラビン／ＵＶ架橋
圧縮コラーゲンゲルの機械的性質を改善するために、リボフラビンとＵＶを使用してこれらのゲルにおけるコラーゲン繊維を架橋した。基本的方法はＷｏｌｌｅｎｓａｋ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  １３５，Ｉｓｓｕｅ  ５，Ｍａｙ  ２００３，ｐａｇｅｓ  ６２０−６２７）に記載されている。基本的に、圧縮コラーゲンゲルを０．１％リボフラビン溶液（２０％デキストラン溶液１０ｍＬ中リボフラビン１０ｍｇ）中で３０分間室温にてインキュベートした。コラーゲンゲルとＵＶＡランプの間に５ｃｍの距離をおいて３６５ｎｍで３０分間照射を行った。次にゲルをＰＢＳで洗浄し、未使用リボフラビンを除去した。
【０１３８】
８個の圧縮ゲルに関するデータを以下に示す。他の情報を図１９〜２１に示す。
【０１３９】
【表１】
2012527283.tif 000003
【０１４０】
角膜上皮細胞の特異的マーカーとして使用されることが多いＣＫ３は圧縮コラーゲンゲル（図１０Ａ）と上皮なしＡＭ（図１０Ｂ）上で増殖させたＬＥＣと同様にリボフラビン／ＵＶ処理した圧縮コラーゲンゲル（図２２）上で増殖させたＬＥＣの表面細胞層でも強く発現された。
【実施例２１】
【０１４１】
圧縮コラーゲンゲル及びリボフラビン／ＵＶ処理した圧縮コラーゲンゲルの移植の臨床評価
角膜移植用としての圧縮コラーゲンゲルの適性を評価するために、圧縮コラーゲンゲル（図２３Ａ）とリボフラビン／ＵＶ処理したコラーゲンゲル（図２３Ｂ）を損傷したウサギ角膜に縫合した。ウサギ角膜は予めその眼表面、即ち角膜上皮細胞層とその下の基質（コラーゲンマトリックス）の一部を外科的に除去しておいた。リボフラビン／ＵＶ処理したコラーゲンゲルはその機械的強度の増加（実施例２０）により、より良好に固定することができ、より完成度の高い移植片が得られた。
【図１】
2012527283.tif 000004
【図２】
2012527283.tif 000005
【図３】
2012527283.tif 000006
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2012527283.tif 000013
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
2012527283.tif 000017
【図１５】
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【図１６】
2012527283.tif 000019
【図１７】
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【図１８】
2012527283.tif 000021
【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【国際調査報告】
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