【誤訳訂正書】
【提出日】平成21年7月27日(2009.7.27)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的基質特異性を有する配列特異的プロテアーゼを同定するための方法であって、下記工程：
（ａ）１個の第１プロテアーゼ変異体、又は、第１プロテアーゼ２個若しくはそれ以上の変異体若しくはキメラを含むプロテアーゼの集団を提供し、ここで前記第１プロテアーゼは第１ペプチド基質の特定のアミノ酸配列に対して基質特異性を有するものであり；
（ｂ）標的ペプチド基質と同一であるか、又は第１基質及び標的基質に関して中間的な特質を有するものであるが第１ペプチド基質内に存在しない少なくとも１個の特異的アミノ酸配列を含む１個又はそれ以上の第２基質に、前記プロテアーゼ集団を接触させ；及び、
（ｃ）第２基質内の前記特異的なアミノ酸配列を認識して加水分解するプロテアーゼを同定することを可能とする条件下で、工程(b)において提供された第２基質の前記特異的アミノ酸配列に対して特異性を有する工程(a)において提供されたプロテアーゼの集団から１個又はそれ以上のプロテアーゼ変異体を選択し、ここでプロテアーゼ活性のスクリーニングは、第２ペプチド以外のペプチドを過剰に添加し、それにより、競合物として添加したペプチドを使用することによって達成される；
を含む、前記方法。
【請求項２】
工程(c)は、第２基質内の前記特異的なアミノ酸配列１個を認識して加水分解するプロテアーゼを同定することを可能とする条件下で、工程(b)において提供された第２基質の前記特異的アミノ酸配列に対して特異性を有する工程(a)において提供されたプロテアーゼの集団から１個又はそれ以上のプロテアーゼ変異体を選択すること
である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程(c)における選択条件が下記：
（ｉ）低基質濃度下でプロテアーゼ活性をスクリーニングし、それにより、第２基質に対する親和性を増大させること、及び／又は
（ｉｉ）比較において２個又はそれ以上の基質を用いることによりプロテアーゼ活性をスクリーニングし、それにより酵素の選択性を増大させること、
をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
第２基質に対する特異性を有する１個又はそれ以上のプロテアーゼ変異体が同定されるまで工程(a)〜(c)を循環的に反復し、そして、１つのサイクルにおいて選択されたプロテアーゼ変異体をその後のサイクルにおける第１プロテアーゼとして使用し、そして、少なくとも１サイクル〜100サイクル未満で実施する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
１サイクル以上において１個の第２基質のみを使用し、ここで、第２基質は標的基質と同一である、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
異なる第２基質を使用し、ここで、第２基質は第１基質及び標的基質に関して中間的な特質を有するものであり、そして、最後のサイクルで使用される第２基質は標的基質と同一である、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
異なる第２基質を連続するサイクルにおいて使用し、そして、各第２基質は先に使用された第２基質及び標的基質に関して中間的な特質を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも１サイクルにおいて工程(b)〜(c)を異なる第２基質を並行して用いて実行し、そして、このような並行方式において単離されたプロテアーゼ変異体を組合わせ、次のサイクルにおいて第１プロテアーゼとして使用する、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
中間的基質の中間的特質が下記：
（ｉ）アミノ酸組成、
（ｉｉ）アミノ酸配列、
（ｉｉｉ）特定のアミノ酸配列内のアミノ酸残基の物理的及び／又は化学的特性、
（ｉｖ）これらのいずれかの組み合わせ、
に基づくものである、請求項６から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
特定のアミノ酸配列内のアミノ酸残基の物理的及び／又は化学的特性が、表面、体積、等電点、側鎖pKa、電荷、極性、疎水性よりなる群から選択される１個又はそれ以上の特性である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
特定のアミノ酸配列内のアミノ酸残基が置換されている点で第２基質は第１基質と異なる、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
特定のアミノ酸配列中のアミノ酸残基が、１〜５個のアミノ酸残基である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法であって、第２基質が、前記基質の加水分解の検出を可能にする官能基を担持しており、前記官能基は下記：
（ｉ）ペプチドの加水分解によりスペクトル特性が変化する１個又はそれ以上の蛍光団又は発色団であって、これにより、スペクトル特性の変化の測定によりスクリーニングを実施するもの；又は、
（ｉｉ）蛍光特性により識別可能であり、第２基質の両端に結合している２個の蛍光団であって、これにより、１μＭ未満の蛍光団濃度において共焦点蛍光スペクトル分析によりスクリーニングを実施するもの；又は、
（ｉｉｉ）蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)対を形成し、第２基質の両端に結合している２個の蛍光団であって、これにより、２個の蛍光団の間のエネルギー移動の低下の測定によりスクリーニングを実施するもの；又は、
（ｉｖ）第２基質にフランキングする第１及び第２の自己蛍光タンパク質であって、これにより、１μＭ未満の基質濃度における共焦点蛍光スペクトル分析によりスクリーニングを実施するもの；又は、
（ｖ）第２基質の両端に結合した蛍光団及びクエンチャー分子であって、これにより、蛍光団のクエンチングの減少の測定によりスクリーニングを実施するもの；又は、
（ｖｉ）第２基質の両端に結合した蛍光団又は発色団及び結合部分であって、これにより特異的結合相手への結合部分の結合の測定によりスクリーニングを実施するもの；又は、
（ｖｉｉ）第２基質の両端に結合した放射標識及び結合部分であって、これにより、シンチレーションプロキシミティー試験の使用によりスクリーニングを実施するもの；又は、
（ｖｉｉｉ）これらのいずれかの組み合わせ、
である、前記方法。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法であって、
（ｉ）ランダム核酸突然変異誘発、カセット突然変異誘発、部位飽和突然変異誘発、部位特異的又はランダム挿入及び／又は欠失突然変異誘発、相同的インビトロ組換え、相同的インビボ組換え、非相同的組換え又はこれらの組み合わせによりプロテアーゼの集団が得られ；及び／又は、
（ｉｉ）プロテアーゼの集団の発現は宿主細胞の使用により行われるか、又は、無細胞タンパク質発現系の使用により行われ、及び／又は、
（ｉｉｉ）プロテアーゼの遺伝子型及び表現型のカップリングが試料の区画化を可能とする試料キャリアの使用により達成され、そして、試料キャリアへの遺伝子型の分布が表現型の十分な分化を可能にする区画当たりの多重度において行われる、前記方法。
【請求項１５】
宿主細胞が、細菌、酵母、昆虫、ウイルス又は哺乳類起源のものである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１から１５のいずれかに記載の方法であって、第１プロテアーゼがセリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ及びメタロプロテアーゼよりなるプロテアーゼ群から選択される、前記方法。
【請求項１７】
第１プロテアーゼが、パパイン、ブロメライン、トリプシン、ペプシン、キモトリプシン、サブチリシン、SET、ヒトエラスターゼ、カテプシン、キマーゼ、サッカロマイコプシス・フィブリゲラPEP I、カリクレイン、ウロキナーゼ、サーモリシン、コラゲナーゼ、シュードモナス・アエルギノーサ エラスターゼ、TEVプロテアーゼ、HIV-1プロテアーゼ、BAR1プロテアーゼ、第Xa因子、トロンビン、組織型プラスミノーゲン活性化物質、Kex2プロテアーゼ、TVMV−プロテアーゼ、RSVプロテアーゼ、MuLVプロテアーゼ、MPMVプロテアーゼ、MMTVプロテアーゼ、BLVプロテアーゼ、EIAVプロテアーゼ、SIVmacプロテアーゼよりなるプロテアーゼ群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
標的プロテアーゼが組織型プラスミノーゲン活性化物質と類似の特異性を有し、そして、標的基質CPGR↓VVGGを切断する、請求項１から１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
標的プロテアーゼが組織型プラスミノーゲン活性化物質と類似の特異性を有し、そして、標的基質CPGR↓VVGGを切断する、請求項６から１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
出発プロテアーゼがS. cerevisiae由来のBAR1プロテアーゼである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
出発プロテアーゼがS. cerevisiae由来のBAR1プロテアーゼであり、以下：
（ｉ）WLGLVPGG
（ｉｉ）WLGQVPGG
（ｉｉｉ）WLGRVPGG
（ｉｖ）WLGRVVGG
（ｖ）CPGRVVGG
の第２／中間的基質を利用する、請求項２０に記載の方法。