(57)【要約】本発明は、沈殿形成及び／或いは懸濁液攪拌処理により、有機溶液中で糖タンパク質を処理する工程と、糖タンパク質に対し、ミリポア膜によるろ過を行う工程と、糖タンパク質に対し、イオン交換クロマトグラフィーを行う工程と、からなる群から選ばれた一つまたは順序が任意に交換可能な複数の工程を含む、糖タンパク質におけるウイルスを除去及び／或いは不活性化する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスを含有しない糖タンパク質。
【請求項２】
前記糖タンパク質が、１ｍｇ／ｍＬの濃度でのＰＣＲ法による検出では陰性となるように、ＨＩＶを含有することを特徴とする、請求項１に記載の糖タンパク質。
【請求項３】
前記糖タンパク質が、１ｍｇ／ｍＬの濃度でのＰＣＲ法による検出では陰性となるように、ＨＢＶを含有することを特徴とする、請求項１に記載の糖タンパク質。
【請求項４】
前記糖タンパク質が、１ｍｇ／ｍＬの濃度でのＰＣＲ法による検出では陰性となるように、ＨＣＶを含有することを特徴とする、請求項１に記載の糖タンパク質。
【請求項５】
前記糖タンパク質が、絨毛性ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、黄体ホルモン、閉経ゴナドトロピン、及びこれらの混合物からなる群から選ばれるものであることを特徴とする、請求項１に記載の糖タンパク質。
【請求項６】
前記絨毛性ゴナドトロピンが、ヒト絨毛性ゴナドトロピン又はその変異体であって、ヒト尿由来及び／或いは組換えのヒト絨毛性ゴナドトロピン又はその変異体から選ばれるものであリ、前記閉経ゴナドトロピンは、ヒト閉経ゴナドトロピン又はその変異体であって、ヒト尿由来及び／或いは組換えのヒト閉経ゴナドトロピン又はその変異体から選ばれるものであリ、前記卵胞刺激ホルモンは、ヒト卵胞刺激ホルモン又はその変異体であって、ヒト尿由来及び／或いは組換えのヒト卵胞刺激ホルモン又はその変異体から選ばれるものであリ、前記黄体ホルモンは、ヒト黄体ホルモン又はその変異体であって、ヒト尿由来及び／或いは組換えのヒト黄体ホルモン又はその変異体から選ばれるものであることを特徴とする、請求項５に記載の糖タンパク質。
【請求項７】
（ａ）糖タンパク質に対し、沈殿形成及び／或いは懸濁液攪拌処理から選ばれる有機溶液処理を行う工程と、
（ｂ）糖タンパク質に対し、ミリポア膜によるろ過を行う工程と、
（ｃ）糖タンパク質に対し、イオン交換クロマトグラフィーを行う工程と、
からなる群から選ばれた一つまたは複数の工程を、任意に交換可能な順序で含むことを特徴とする、糖タンパク質ホルモンにおけるウイルスを除去及び／或いは不活性化する方法。
【請求項８】
工程（ａ）における有機溶液が、３０−１００ｖ／ｖ％の有機溶媒／水溶液であることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記有機溶液が、７０−１００ｖ／ｖ％の有機溶媒／水溶液であることを特徴とする、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
前記有機溶液が、エタノール、メタノール、アセトン、及びジエチルエーテルから選ばれるものであることを特徴とする、請求項8に記載の方法。
【請求項１１】
前記有機溶液が、エタノール及びアセトンから選ばれるものであることを特徴とする、請求項8に記載の方法。
【請求項１２】
工程（ａ）では、前記糖タンパク質と有機溶液の重量：体積比を０．５−２グラム：１５−６０ミリリットルとすることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記糖タンパク質と有機溶液の重量：体積比を０．７−１．５グラム：２０−４０ミリリットルとすることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ａ）では、糖タンパク質を零下３O℃−３O℃で有機溶液にて０．５分−６時間処理することを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項１５】
工程（ａ）では、糖タンパク質を零下２O℃−２O℃で有機溶液にて１分−４時間処理することを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
工程（ｂ）では、前記ミリポア膜は、孔径が１０００  Ｄ以上の限外ろ過膜、孔径が１−１００ｎｍのウイルス除去膜、及び孔径が０．１−１μｍの細菌ろ過膜から選ばれるものであることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項１７】
工程（ｂ）では、前記ミリポア膜は、孔径が１０００００  Ｄ以上の限外ろ過膜、孔径が１０−８０ｎｍのウイルス除去膜、及び孔径が０．２−０．８μｍの細菌ろ過膜から選ばれるものであることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項１８】
工程（ｃ）では、前記イオン交換クロマトグラフィーはｐＨ５−１０の条件下で行われることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項１９】
工程（ｃ）では、前記イオン交換クロマトグラフィーはｐＨ６−８の条件下で行われることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１に記載の糖タンパク質と、薬学的に許容される担体と、を含むことを特徴とする、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオ医薬の分野に関し、特に不妊を治療するためのグリコシル化タンパク質におけるウイルスの除去／不活性化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
不妊を治療するための糖タンパク質は一連の構造が類似するものであり、絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、閉経ゴナドトロピン（ＨＭＧ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体ホルモン（LH）を含むが、そのうち、閉経ゴナドトロピンは卵胞刺激ホルモンと黄体ホルモンとを所定の比率（１：０．１−１）で含有する混合物である。
【０００３】
ＨＣＧ、FSHおよびLHは、いずれもα鎖とβ鎖の２つのサブユニットが非共有結合を介して結合したものであるが、それらのαサブユニットは全く同様で、９２のアミノ酸を含み、分子量が約１４５００  Ｄで、５２と７８番目のアミノ酸のアスパラギンがＮ−グリコシル化されるアミノ酸である。ＨＣＧのβサブユニットは、１４５−１４７のアミノ酸を含み、分子量が約２２２００−３９０００  Ｄで、１３と３０番目のアミノ酸のアスパラギンおよび１２１、１２７、１３２、１４５の位置がグリコシル化されるサイトである。ＦＳＨのβサブユニットは、１１１のアミノ酸で構成され、分子量が約１８０００  Ｄで、７と２４番目のアミノ酸のアスパラギンがN-グリコシル化されるアミノ酸である。ＬＨのβサブユニットは、１２１のアミノ酸で構成され、分子量が約１４８００  Ｄである。
【０００４】
ＨＣＧ、ＨＭＧ、ＦＳＨ、ＬＨは臨床で主に不妊治療及び体外からの生殖補助に用いられる。これらは特定な女性（妊娠期または閉経後）の尿から採取でき、DNA組換え技術によっても製造できる。
【０００５】
従来から、血液由来医薬品の生産プロセスには、熱処理、低ｐＨ処理、界面活性剤による処理などの、ウイルスに対応して除去／不活性化する複数の工程の組み合わせが含まれるが、これらのグリコシル化タンパク質の医薬品は熱や低ｐＨへの耐性が劣り、活性を喪失しやすいので、これらの工程は前記のグリコシル化タンパク質に対して完全に適用できるとは言えない。
【０００６】
ＩＣＨ  Ｑ５Ａバイオ製品ウイルス安全性評価の規格に準じて、プロセスに対しては、二つまたはそれ以上の工程の組み合わせが有するとともに少なくとも一つの工程のウイルス除去／不活性化率が１０４を超えるということが要求され、そうでないと、安全で効率的なウイルス除去／不活性化方法として認められない。
【０００７】
したがって、本分野では、安全で効率的な医薬品を得るように、不妊の治療に好適に適用することができるグリコシル化タンパク質におけるウイルスの除去／不活性化プロセスが切望されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は糖タンパク質におけるウイルスを除去及び／或いは不活性化する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の第一の態様は、ウイルスを含有しない糖タンパク質を提供する。
もう一つの好ましい例において、前記糖タンパク質は、１ｍｇ／ｍＬの濃度でのＰＣＲ法による検出では陰性となるように、ＨＩＶを含有する。
もう一つの好ましい例において、前記糖タンパク質は、１ｍｇ／ｍＬの濃度でのＰＣＲ法による検出では陰性となるように、ＨＢＶを含有する。
もう一つの好ましい例において、前記糖タンパク質は、１ｍｇ／ｍＬの濃度でのＰＣＲ法による検出では陰性となるように、ＨＣＶを含有する。
【００１０】
前記蛍光定量ＰＣＲ法は、溶解液や抽出液で試料における核酸（ＤＮＡやＲＮＡ）を抽出し、さらに核酸ポリメラーゼ連鎖反応により特異的なウイルス核酸配列を増幅し、蛍光発色にてウイルス力価を測定するものである。ＰＣＲ検出は、例えば杭州大和熱磁気電子株式会社の蛍光定量ＰＣＲ検出システムや、深センPGバイオテック株式会社のＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶ核酸増幅・蛍光定量検出キットなどの、本分野における通常の設備と試薬を使用して行うことができるが、これらに限定するものではない。
【００１１】
もう一つの好ましい例において、前記糖タンパク質は、絨毛性ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、黄体ホルモン、閉経ゴナドトロピン、及びこれらの混合物からなる群から選ばれるものである。
もう一つの好ましい例において、前記絨毛性ゴナドトロピンは、ヒト絨毛性ゴナドトロピン又はその変異体であって、ヒト尿由来及び／或いは組換えのヒト絨毛性ゴナドトロピン又はその変異体から選ばれるものであリ、前記閉経ゴナドトロピンは、ヒト閉経ゴナドトロピン又はその変異体であって、ヒト尿由来及び／或いは組換えのヒト閉経ゴナドトロピン又はその変異体から選ばれるものであリ、前記卵胞刺激ホルモンは、ヒト卵胞刺激ホルモン又はその変異体であって、ヒト尿由来及び／或いは組換えのヒト卵胞刺激ホルモン又はその変異体から選ばれるものであリ、前記黄体ホルモンは、ヒト黄体ホルモン又はその変異体であって、ヒト尿由来及び／或いは組換えのヒト黄体ホルモン又はその変異体から選ばれるものである。
【００１２】
本発明の第二の態様は、糖タンパク質ホルモンにおけるウイルスを除去及び／或いは不活性化する方法であって、
（ａ）糖タンパク質に対し、沈殿形成及び／或いは懸濁液攪拌処理から選ばれる有機溶液処理を行う工程と、
（ｂ）糖タンパク質に対し、ミリポア膜によるろ過を行う工程と、
（ｃ）糖タンパク質に対し、イオン交換クロマトグラフィーを行う工程と、
からなる群から選ばれた一つまたは複数の工程を、任意に交換可能な順序で含む方法を提供する。
【００１３】
もう一つの好ましい例において、前記糖タンパク質ホルモンは、絨毛性ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、黄体ホルモン、閉経ゴナドトロピン、及びこれらの混合物からなる群から選ばれるものである。
【００１４】
もう一つの好ましい例において、前記絨毛性ゴナドトロピンは、ヒト絨毛性ゴナドトロピン又はその変異体であって、ヒト尿由来及び／或いは組換えのヒト絨毛性ゴナドトロピン又はその変異体から選ばれるものである。前記閉経ゴナドトロピンは、ヒト閉経ゴナドトロピン又はその変異体であって、ヒト尿由来及び／或いは組換えのヒト閉経ゴナドトロピン又はその変異体から選ばれるものである。前記卵胞刺激ホルモンは、ヒト卵胞刺激ホルモン又はその変異体であって、ヒト尿由来及び／或いは組換えのヒト卵胞刺激ホルモン又はその変異体から選ばれるものである。前記黄体ホルモンは、ヒト黄体ホルモン又はその変異体であって、ヒト尿由来及び／或いは組換えのヒト黄体ホルモン又はその変異体から選ばれるものである。
【００１５】
もう一つの好ましい例において、工程（ａ）における有機溶液は３０−１００ｖ／ｖ％の有機溶媒／水溶液である。
もう一つの好ましい例において、前記有機溶液は７０−１００ｖ／ｖ％の有機溶媒／水溶液である。
もう一つの好ましい例において、前記有機溶液は、エタノール、メタノール、アセトン、及びジエチルエーテルから選ばれるものである。
【００１６】
もう一つの好ましい例において、前記有機溶液は、エタノール及びアセトンから選ばれるものである。
もう一つの好ましい例において、工程（ａ）では、前記糖タンパク質と有機溶液の重量：体積比を０．５−２グラム：１５−６０ミリリットルとする。
もう一つの好ましい例において、前記糖タンパク質と有機溶液の重量：体積比を０．７−１．５グラム：２０−４０ミリリットルとする。
もう一つの好ましい例において、工程（ａ）では、糖タンパク質を零下３O℃−３O℃で有機溶液にて０．５分−６時間処理する。
【００１７】
もう一つの好ましい例において、工程（ａ）では、糖タンパク質を零下20℃−20℃で有機溶液にて１分−4時間処理する。
もう一つの好ましい例において、工程（ｂ）では、前記ミリポア膜は、孔径が１０００  Ｄ以上の限外ろ過膜、孔径が１−１００ｎｍのウイルス除去膜、及び孔径が０．１−１μｍの細菌ろ過膜から選ばれるものである。
もう一つの好ましい例において、工程（ｂ）では、前記ミリポア膜は、孔径が１０００００  Ｄ以上の限外ろ過膜、孔径が１０−８０ｎｍのウイルス除去膜、及び孔径が０．２−０．８μｍの細菌ろ過膜から選ばれるものである。
【００１８】
もう一つの好ましい例において、工程（ｃ）では、前記イオン交換クロマトグラフィーはｐＨ５−１０の条件下で行われる。
もう一つの好ましい例において、工程（ｃ）では、前記イオン交換クロマトグラフィーはｐＨ６−８の条件下で行われる。
【００１９】
本発明の第三の態様は、本発明により提供されるウイルスを含有しない糖タンパク質と、薬学的に許容される担体と、を含む医薬組成物を提供する。
【００２０】
このように、本発明によれば、不妊の治療に好適に適用することができるグリコシル化タンパク質におけるウイルスの除去／不活性化プロセスが提供され、かつ安全で効率的な医薬品が得られた。
【００２１】
具体的な実施形態
従来技術にはタンパク質におけるウイルスを除去及び／或いは不活性化する方法がいくつかあるが、同様の方法でも、異なるタンパク質に対して、予想できない結果が出てしまい、逆効果が出ることもある。ある方法は、あるタンパク質に対しては実施可能であっても、具体的な実施条件が他のタンパク質に比べて大きな差がある。この事情に鑑み、発明者らは幅広く深く研究したところ、驚くことに、有機溶液処理、ミリポア膜ろ過およびイオン交換クロマトグラフィーのうちの一つ又は全ての工程を任意に組み合わせることで、グリコシル化タンパク質におけるウイルスを除去／不活性化するという目的を達成することができ、これにより、ウイルスは緩やかな条件で除去／不活性化されるとともに、目的物のグリコシル化タンパク質の活性は保存される、ことを見出した。この知見に基づき、発明者らは本発明を完成した。
【００２２】
探索している間に、発明者らは、エタノールやアセトンなどの有機溶媒による処理は、ウイルスに対しては不活性化作用があるが、ＨＣＧ、ＨＭＧ、ＦＳＨ、ＬＨの活性に対してはなんらの影響もない、ことを気付いた。さらに、適切なミリポア膜ろ過技術によれば、ウイルス粒子を阻止することができるだけでなく、目的物を膜に透過させることも可能で、目的物とウイルスを分離する目的を達成できる、ことも見出した。また、発明者らは、試験中で意外なことに、条件を適切に制御すれば、イオン交換クロマトグラフィーにより目的物を吸着することなくウイルスをイオン樹脂に吸着することができ、目的物からウイルスを除去する目的を達成できる、ことを見出した。
前記の三つの工程のうちの一つ又は複数の工程をを任意に組み合わせることで、ウイルスを効率的に除去／不活性化することができ、安全で信頼的な製品が得られる。
【００２３】
定義
本文に用いられるように、「糖タンパク質」および「グリコシル化タンパク質」は交換して用いられてもよいが、いずれも絨毛性ゴナドトロピン（chorionic gonadotropin, CG）、卵胞刺激ホルモン（follicule-stimulating hormone, FSH）、黄体ホルモン（luteotropic hormone, LH）、及び閉経ゴナドトロピン（human menopausal gonadotropin, HMG）からなる群から選ばれるものである。
用語の「卵胞刺激ホルモン」および「ＦＳＨ」は交換して用いられてもよいが、いずれも精子や卵胞の生成を促進し、卵巣の発育を促進するホルモン又はその変異体を指す。これらは、天然の状況では下垂体前葉から分泌され、閉経後女性の尿からも採取でき、組換え技術によっても製造できる。本発明におけるＦＳＨは、例えば天然な産生や、組換え技術による獲得又は合成などの本分野で常用な方法のいずれかにより得ることができ、それにおける不純物はＬＨやＣＧを含む。本発明の一つの実施形態において、前記卵胞刺激ホルモンはヒト卵胞刺激ホルモン又はその変異体であり、ヒト尿由来の卵胞刺激ホルモン又は組換えヒト卵胞刺激ホルモンであることが好ましい。
【００２４】
本発明に適用できる、ＦＳＨを含有し、かつ不純物としてのＬＨ及び／或いはＣＧを含む原料は、なんらの前精製工程も経っていない原料、前精製工程を経って一部の不純物を除去した原料、又は前精製工程を経って基本的にＦＳＨ及び不純物としてのＬＨ及び／或いはＣＧしか含有しない原料であってもよい。
本発明にかかる方法によりＦＳＨを精製する前に、本分野における通常の方法により原料のＦＳＨを仮精製して、ＬＨとＣＧ以外の不純物を分離することが好ましい。
【００２５】
本文に用いられるように、用語の「黄体ホルモン」および「ＬＨ」は交換して用いられてもよいが、いずれもＦＳＨ含有原料を製造又は獲得する過程において混在する、天然ＬＨと同様又は類似の構造と機能を有するホルモンを指す。
同様に、用語の「絨毛性ゴナドトロピン」および「ＣＧ」は交換して用いられてもよいが、いずれもＦＳＨ含有原料を製造又は獲得する過程において混在する、天然ＣＧと同様又は類似の構造と機能を有するホルモンを指す。
【００２６】
本発明により提供されるタンパク質におけるウイルスを除去及び／或いは不活性化する方法は、糖タンパク質のほか、糖タンパク質と薬学的／食品学的に許容される担体とを含む糖タンパク質組成物にも適用することができる。
本文に用いられるように、用語の「薬学的に許容される」あるいは「食品学的に許容される」成分は、ヒト及び／或いは動物に適用して過度の副作用（例えば毒性、刺激やアレルギー反応）がないもので、即ち合理的なベネフィット／リスク比を持つものを指す。
【００２７】
本文に用いられる、用語の「薬学的に許容される担体」とは、治療剤の投与に使用される担体を指し、各種の賦形剤と希釈剤を含む。この用語は、それ自身が必要な活性成分ではなく、且つ使用後過度の毒性がない薬剤担体を示す。適切な担体は本分野の当業者に良く知られている。「レミントンの薬学」（Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Pub. Co.，N.J. 1991）には、薬学的に許容される賦形剤に係わる十分な検討が見られる。
【００２８】
前記の「薬学的に許容される担体」は、水、食塩水、グリセリン、エタノールなどの液体を含有してもよい。さらに、これらの担体には、充填剤、崩壊剤、滑沢剤、流動化剤、沸騰剤、湿潤剤や乳化剤、矯味剤、ｐＨ緩衝物質などの補助物質が存在してもよい。通常、これらの物質は無毒で、不活性で、かつ薬学的に許容される水性の担体媒体に配合してもよく、ただし、ｐHは通常約５−８、好ましくは約６−８である。
【００２９】
方法
本発明により提供される糖タンパク質におけるウイルスを除去及び／或いは不活性化する方法は一つまたは複数の工程からなり、複数の工程の順序が任意に組み合わせることができる。
前記工程は、有機溶液処理、ミリポア膜処理、及びイオン交換クロマトグラフィー処理である。
【００３０】
前記有機溶液処理は、糖タンパク質と有機溶液を混合して沈殿を形成させること或いは混合攪拌して懸濁液とすることで、ウイルスを不活性化するものである。混合温度は零下３０℃−３０℃で、好ましくは零下２０℃−２０℃であり、混合或いは混合攪拌の時間は０．５分−６時間で、好ましくは１分−４時間であり、糖タンパク質と有機溶液を混合するときの重量：体積比は０．５−２グラム：１５−６０ミリリットルで、好ましくは０．７−１．５グラム：２０−４０ミリリットルであり、前記有機溶液は３０−１００ｖ／ｖ％の有機溶媒／水溶液で、好ましくは７０−１００ｖ／ｖ％の有機溶媒／水溶液であり、前記有機溶媒は、エタノール、メタノール、アセトン、及びジエチルエーテルから選ばれるもので、好ましくはエタノール及びアセトンから選ばれるものである。
【００３１】
前記ミリポア膜処理は、糖タンパク質の濃度１５−６０ミリグラム／ミリリットル（好ましくは２０−４０ミリグラム／ミリリットル）の溶液をミリポア膜に透過させて、ウイルスを除去及び／或いは不活性化するものである。前記ミリポア膜は、孔径が１０００  Ｄ以上の限外ろ過膜、孔径が１−１００ｎｍのウイルス除去膜、及び孔径が０．１−１μｍの細菌ろ過膜から選ばれるもので、好ましくは孔径が１０００００  Ｄ以上の限外ろ過膜、孔径が１０−８０ｎｍのウイルス除去膜、及び孔径が０．３−０．８μｍの細菌ろ過膜から選ばれるものである。前記溶液は、ｐＨ６−１０で、好ましくはｐＨ７−９であり、例えばリン酸塩、酢酸塩またはＴｒｉｓ緩衝液である。
【００３２】
前記イオン交換クロマトグラフィー処理は、糖タンパク質の濃度１５−６０ミリグラム／ミリリットル（好ましくは２０−４０ミリグラム／ミリリットル）の溶液をイオン交換樹脂に透過させて、通常ウイルスは樹脂に吸着されるが、糖タンパク質は溶出液と共に溶出されることにより、ウイルスを除去及び／或いは不活性化するものである。前記溶液は、ｐＨ５−１０で、好ましくはｐＨ６−８であり、例えばリン酸塩、酢酸塩またはＴｒｉｓ緩衝液である。例えば弱アニオン交換樹脂、好ましくはＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘなどの本分野における通常のイオン交換樹脂を適用することができるが、これらに限定するものではない。
【００３３】
本発明にかかる方法により除去及び／或いは不活性化されるウイルスは本分野でよく知られるもので、例えばＨＩＶ、ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、豚パルボウイルスがあるが、これらに限定するものではない。
【００３４】
本発明で述べられた上述の特徴、或は実施例で述べられる特徴は、任意に組み合わせてもよい。本明細書で開示された全ての特徴は任意の組成物の様態と併用してもよく、明細書で開示された各特徴はいずれも、同様、同等或いは類似の目的を果たす代わりの特徴により置換されてもよい。したがって、特に説明しない限り、開示された特徴は、同等または類似の特徴の一般的なシリーズの一例に過ぎない。
【発明の効果】
【００３５】
本発明の主な利点は、以下の通りである。
１、本発明により提供される方法は安全で効率的である。
２、本発明により提供される方法は条件が緩やかで、産業的生産に好適に適用することができる。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
以下、具体的な実施例によって、さらに本発明を説明する。これらの実施例は本発明を説明するために用いるもので、本発明の範囲の制限にはならないと理解されるものである。以下の実施例に特に具体的な条件を説明しない実験方法は、例えばSambrookら、「Molecular Cloning - A Laboratory Manual」（New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）に記載される通常の条件、或いはメーカーの薦めの条件で行われる。特に説明しない限り、すべての百分率と部は重量基準である。
別途に定義しない限り、文中に使用されるすべての専門・科学用語は、本分野の熟練者によく知られる意味と同じである。また、記載される内容に類似或は同等の方法及び材料はいずれも本発明に使用することができる。文中に記載の好ましい実施形態及び材料は例示だけのためである。
本発明の実施例に用いられる検出用ウイルス、検出用セルライン、ウイルスの製造及び細胞毒性の検出方法は以下の通りである。
【００３７】
検出用ウイルス
検証実験に選択されて使用される指示ウイルスは異なる物理・化学特性を持ち、製品の汚染状況の解析に用いることができる。
ＨＩＶ−１はレトロウイルス（球状）で、レトロウイルス科に属する（直径８０−１００ｎｍ）。こんなレンチウイルスは熱と極端なｐＨに敏感で、油性溶剤と界面活性物質の作用で破壊される。ＨＩＶ−２のモデルウイルスとすることができる。このウイルスが許容細胞の中で増幅しかつ合胞体の形成を誘発するという特性により、検出を行う。
【００３８】
仮性狂犬病ウイルスは脂質エンベロープ型DNAウイルス（球状）で、ヘルペスウイルス科に属する。このウイルスは低いタンパク質濃度で熱に敏感で、極端なｐＨと油性溶剤に敏感である。このウイルスが許容細胞の中で増幅しかつ細胞変性を引き起こすという特性により、検出を行う。
【００３９】
牛ウイルス性下痢ウイルスは脂質エンベロープ型RNAウイルス（多球状）で、フラビウイルス科に属する（直径４０−６０ｎｍ）。こんな感染性ウイルスは、耐熱性が相対的に劣り、有機溶剤に敏感で、酸には安定でないが塩基には安定である。ＨＣＶのモデルウイルスとすることができる。このウイルスが許容細胞の中で増幅しかつ細胞変性を引き起こすという特性により、検出を行う。
【００４０】
豚パルボウイルスは非脂質エンベロープ型DNAウイルス（二十面体状）で、パルボウイルス科に属する（直径１８−２４ｎｍ）。こんなパルボウイルスは極端な強熱に耐えられ、油性溶剤中に安定で、相対的に酸性ｐHに耐えられる。パルボウイルスＢ１９のモデルウイルスとすることができる。このウイルスが許容細胞の中で増幅しかつ細胞変性を引き起こすという特性により、検出を行う。
【００４１】
ＨＡＶは非脂質エンベロープ型ウイルスで、ピコルナウイルス科に属する（直径２７ｎｍ）。このウイルスは相対的に熱安定性を持ち、有機溶剤とノニオン型界面活性物質に耐えられ、酸性ｐＨ条件で安定である。このウイルスが許容細胞の中で増幅しかつ細胞変性を引き起こすという特性により、検出を行う。
【００４２】
検出用セルライン
Ｃ８１６６（ヒト、ＣＯ４＋成人リンパ球）細胞は、ペニシリン（５０ｉｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）及び１０％牛胎児血清を含有し、かつグルタマックスI（Glutamax I）を補充したRPMI 1640培地で培養される。ウイルス解析中では、細胞が同様に上記培地で維持される。
【００４３】
ＣＲＦＫ（猫、腎臓由来、Felis catus）細胞は、ペニシリン（５０ｉｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、１％非必須アミノ酸及び１０％牛胎児血清を含有し、かつグルタマックスI（Glutamax I）を補充したEMEM培地で培養される。ウイルス解析中では、細胞が同様に上記培地で維持される。
【００４４】
ＮＢＬ−１（牛、腎臓由来、Bos taurus）細胞は、ペニシリン（５０ｉｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）及び５％馬血清を含有し、かつグルタマックスI（Glutamax I）を補充したEMEM培培地で培養される。ウイルス解析中では、細胞が同様に上記培地で維持される。
【００４５】
ＳＴ（豚、睾丸由来）細胞は、ペニシリン（５０ｉｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）及び１０％牛胎児血清を含有し、かつグルタマックスI（Glutamax I）を補充したDMEM培地で培養される。ウイルス解析中では、細胞が同様に上記培地で維持されるが、牛胎児血清の濃度が２％と低減される。
【００４６】
ＦＲｈＫ−４（アカゲザル、腎臓由来、Macaca mulatta）細胞は、ペニシリン（５０ｉｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）及び１０％牛胎児血清を含有し、かつグルタマックスI（Glutamax I）を補充したDMEM培地で培養される。ウイルス解析中では、細胞が同様な培地で維持されるが、牛胎児血清の濃度が２％と低減される。
【００４７】
ウイルスの製造
ＨＩＶ−１はＣ８１６６細胞を感染させることで製造される。細胞を感染した後、３−５日培養し、上澄みを収集する。
仮性狂犬病ウイルスは単層培養ＣＲＦＫ細胞に感染して製造される。細胞に感染した後、顕著な細胞変性現象を認めたまで培養する。感染された細胞を無菌条件で凍結・融解して溶解し、遠心し、最後に上澄みを収集する。
牛ウイルス性下痢ウイルスは単層培養NBL-1細胞に感染して製造される。細胞に感染した後、顕著な細胞変性現象を認めたまで培養する。感染された細胞を無菌条件で凍結・融解して溶解し、遠心し、最後に上澄みを収集する。
【００４８】
豚パルボウイルスは単層培養ＳＴ細胞に感染して製造される。細胞に感染した後、顕著な細胞変性現象を認めたまで培養する。感染された細胞を無菌条件で凍結・融解して溶解し、遠心し、最後に上澄みを収集する。
ＨＡＶは単層培養ＦＲｈＫ−４細胞に感染して製造される。細胞に感染した後、顕著な細胞変性現象を認めたまで培養する。感染された細胞を無菌条件で凍結・融解して溶解し、遠心し、最後に上澄みを収集する。
ＨＩＶ−１は、合胞体形成の測定により力価を確定する。仮性狂犬病ウイルス、牛ウイルス性下痢ウイルス、豚パルボウイルスは、いずれもＴＣＩＤ５０の測定により力価を確定する。
【００４９】
細胞毒性の検出
ウイルスを加える前に、サンプルを維持用培地に置いておき、そのセルラインに対する毒性を検出する。検出用セルラインはＣ８１６６、ＣＲＦＫ、ＮＢＬ−１、ＳＴ及びＦＲｈＫ−４細胞である。
維持用培地を用いて、検出されるサンプルを１倍から２４３倍まで、３倍ずつ希釈する。セルラインごとに対して、サンプルを含まず、維持用培地のみを含む陰性対照を設ける。ＣＲＦＫ、ＮＢＬ−１、ＳＴ及びＦＲｈＫ−４セルラインについては、検出されるサンプルと陰性対照を検出用細胞に接種した後、３７℃、５％ＣＯ２の湿潤環境で約９０分培養し、そして接種物を取り除き、リン酸緩衝液で細胞培養プレートを洗浄し、ウェルごとに維持用培地を加える。Ｃ８１６６セルラインについては、検出されるサンプルと陰性対照を浮遊細胞に接種した後、３７℃、５％ＣＯ２の湿潤環境で培養する。
【００５０】
その後、細胞を３７℃、５％ＣＯ２の湿潤環境で適切な時間培養する。Ｃ８１６６細胞は、１１日間の培養が、ＣＲＦＫ細胞は、製造工程１におけるサンプルを検出する場合には１３日間の培養が、製造工程３におけるサンプルを検出する場合には８日間の培養が、ＮＢＬ−１細胞は、製造工程１におけるサンプルを検出する場合には１０日間の培養が、製造工程３におけるサンプルを検出する場合には８日間の培養が、ＳＴ細胞は、８日間の培養が、ＦＲｈＫ−４細胞は、製造工程２におけるサンプルを検出する場合には１８日間の培養が、製造工程３におけるサンプルを検出する場合には１９日間の培養が、必要となる。この期間に顕微鏡で細胞変性現象を認める。
【００５１】
下記実施例におけるタンパク質の生物的力価または生物的活性の測定方法は、中国薬局方２００５版のウロキナーゼ項目に記載の触媒活性測定方法及び付録ＸＩＩ  Ｍ、ＸＩＩ  Ｎ、ＸＩＩ  Ｅの方法に準じて測定される。
【実施例１】
【００５２】
ＨＣＧ粗製品（上海天偉生物製薬株式会社から購入）１ｇに−２０℃±２℃の無水エタノールを３０ｍｌ加え、均一に混合して懸濁液を（初期サンプルとして）得て、懸濁液の体積を計測した。初期サンプルを１２℃±２℃に保持し、攪拌しながら、ＨＩＶ−１、仮性狂犬病ウイルス、牛ウイルス性下痢ウイルスをそれぞれ２ｍｌ加え、ウイルス種ごとに平行に２群（ＡおよびＢ）とした。均一に混合した後、サンプルを２ｍｌ取って細胞を感染し、ウイルスの初期添加量を測定した（この時点を時間の零点とした）。ウイルスを加えた溶液を同様に１２℃±２℃に保持し、攪拌を３時間続けた。そして、サンプルを２ｍｌ取り、細胞を感染し、ウイルスの感染率を測定した。
【００５３】
ウイルス不活性化の結果
2012503596.tif 000002
【００５４】
ＨＣＧの生物的力価の結果
2012503596.tif 000003
結果から明らかなように、３種の脂質エンベロープウイルスはいずれも、ウイルス降下量が１０５以上で、かつＨＣＧ生物的力価は殆ど喪失しなかったことから、該工程はＨＣＧの製造の安全を保障し、脂質エンベロープウイルスによる汚染を防止することに重要な役割を果たしたと考えられる。
【実施例２】
【００５５】
ＨＭＧ粗製品（上海天偉生物製薬株式会社より提供）１ｇに−２０℃±２℃の無水エタノールを３０ｍｌ加え、均一に混合して懸濁液を（初期サンプルとして）得て、懸濁液の体積を計測した。初期サンプルを１２℃±２℃に保持し、攪拌しながら、ＨＩＶ−１、仮性狂犬病ウイルス、牛ウイルス性下痢ウイルスをそれぞれ２ｍｌ加え、ウイルス種ごとに平行に２群（ＡおよびＢ）とした。均一に混合した後、サンプルを２ｍｌ取って細胞を感染し、ウイルスの初期添加量を測定した（この時点を時間の零点とした）。ウイルスを加えた溶液を同様に１２℃±２℃に保持し、攪拌を３時間続けた。そして、サンプルを２ｍｌ取り、細胞を感染し、ウイルスの感染率を測定した。
【００５６】
ウイルス不活性化の結果
2012503596.tif 000004
【００５７】
ＨＭＧの生物的力価の結果
2012503596.tif 000005
【００５８】
結果から明らかなように、３種の脂質エンベロープウイルスはいずれも、ウイルス降下量が１０５以上で、かつＨＭＧ生物的力価は殆ど喪失しなかったことから、該工程はＨＭＧの製造の安全を保障し、脂質エンベロープウイルスによる汚染を防止することに重要な役割を果たしたと考えられる。
【００５９】
対照例
ウロキナーゼ粗製品（上海天偉生物製薬株式会社から購入）１ｇに−２０℃±２℃の無水エタノールを３０ｍｌ加え、均一に混合して懸濁液を（初期サンプルとして）得て、懸濁液の体積を計測した。サンプルを１２℃±２℃に保持し、攪拌を３時間続けた。そしてサンプルを取り、ウロキナーゼ活性の変動を測定した。
【００６０】
ウロキナーゼ活性の測定結果
2012503596.tif 000006
結果から明らかなように、類似なエタノールによる処理方法はウロキナーゼのようなタンパク質に対し不活性化作用を有し、適用することができない。
【実施例３】
【００６１】
ｐＨ７．８±０．１のリン酸緩衝液５０ｍｌを１２℃±２℃に冷却し、１ｇのDEAE Sephadex A-50に加えた。樹脂を充分に膨潤させるように、溶液を１２℃±２℃に少なくとも１５時間保持した。膨潤した樹脂懸濁液をＸＫ１６カラムに充填し、最終ベッド体積を１５ｍｌとした。蠕動ポンプの配管にｐＨ７．０±０．１の酢酸ナトリウム緩衝液を充満させ、カラムに接続した。流速が０．１７−０．１８ｍｌ／分であるように、カラム体積の少なくとも５倍（７５ｍｌ）の上記緩衝液で平衡化した。必要により、カラムの流出口で流速を測定し、ポンプの速度を調整して流速を制御してもよい。溶出液のｐＨが流入口における緩衝液のｐＨと同一になるまで、溶出液を収集しそのｐＨを計測した。ローディング用サンプルの用意ができるまで、蠕動ポンプを停止させ、カラムの流出口を閉じた。
【００６２】
１２℃±２℃の平衡化緩衝液（酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０±０．１）２０ｍｌに、攪拌しながらＨＣＧ粗製品（上海天偉生物製薬株式会社より提供）６００ｍｇを加えた。ＨＣＧが充分に溶解することを確保するように、サンプルを１２℃±２℃で適切な時間攪拌し続けた。その後、該当溶解したサンプルのｐＨ及び電気伝導率を計測し、平衡化緩衝液にふさわしくない場合は、酢酸で調節することができる。初期サンプルの体積を計測した。初期サンプルを１２℃±２℃に保持し、攪拌しながら、豚パルボウイルス及びＨＡＶをそれぞれ１ｍｌ加え、ウイルス種ごとに平行に２群とした。均一に混合した後、サンプルを１ｍｌ取り、ウイルスの初期添加量を測定した。
【００６３】
流入配管をサンプル液に浸入し、それに液体を充満させ、蠕動ポンプを起動した。ウイルスを加えたサンプルは、０．１７−０．１８ｍｌ／分の流速でカラムにロードした。プレカラム体積が７ｍｌになるとき、収集を開始した。ローディングが終了した後、流速が０．１０−０．１１ｍｌ／分であるように、平衡化緩衝液でカラムを洗浄した。４３ｍｌの流出液を収集した場合、これを収集液とした。サンプルを１ｍｌ取り、ウイルスの感染率を測定した。
【００６４】
ウイルス除去の結果
2012503596.tif 000007
【００６５】
結果から明らかなように、豚パルボウイルスは、ウイルス降下量が１０６超えであり、好ましい。ＨＡＶは、ウイルス降下量がそれぞれ、３．２８  ｌｏｇ１０と２．９０  ｌｏｇ１０であった。よって、該工程はＨＣＧの製造の安全性を向上させ、非脂質エンベロープウイルスによる汚染を防止することに相当な役割を果たしたと考えられる。
【実施例４】
【００６６】
サンプルをＨＭＧ粗製品（上海天偉生物製薬株式会社より提供）６００ｍｇに変更した以外、他の工程は実施例３と同様にした。
ウイルス除去の結果
2012503596.tif 000008
【００６７】
結果から明らかなように、豚パルボウイルスは、ウイルス降下量が104超えであり、好ましい。ＨＡＶウイルスは、ウイルス降下量がそれぞれ、２．３５  ｌｏｇ１０と３．００  ｌｏｇ１０であった。よって、該工程はＨＭＧの製造の安全性を向上させ、非脂質エンベロープウイルスによる汚染を防止することに相当な役割を果たしたと考えられる。
【００６８】
対照例
平衡化液をｐＨ４．５±０．１の酢酸ナトリウム緩衝液に変更した以外、サンプル及び工程はいずれも実施例３と同様にした。
ウイルス除去の結果
2012503596.tif 000009
【００６９】
結果から明らかなように、豚パルボウイルス及びＨＡＶは、ウイルス降下量が１  ｌｏｇ１０程度或いは１  ｌｏｇ１０未満であったことから、ｐＨがｐＨ４．５±０．１の平衡化液の条件下では、該工程はＨＭＧの製造の安全性を向上させ、非脂質エンベロープウイルスによる汚染を防止することに殆ど寄与しなかったと考えられる。
【実施例５】
【００７０】
Ｐａｌｌ  Ｕｌｔｉｐｏｒ  ＶＦ  ＤＶ２０フィルターを用意した。２０ｍｌの無菌超純水を用いて、最大圧３０ｐｓｉの条件下でフィルターを充分に湿潤させた。ｐＨ７．０±０．１の酢酸アンモニウム溶液２０ｍｌに、攪拌しながらＨＣＧ粗製品（上海天偉生物製薬株式会社より提供）６００ｍｇを溶解させ、サンプルの体積を計測した。サンプルに攪拌しながら各種のウイルスを１ｍｌずつ加え、ウイルス種ごとに平行に２群とした。均一に混合した後、サンプルを１ｍｌ取り、ウイルスの初期添加量を測定した。ウイルスを加えたサンプルを０．２μｍのフィルターでろ過した。サンプルを１ｍｌ取り、ウイルスの感染率を測定した。余分のサンプルを最大圧３０ｐｓｉの条件下で湿潤されたＰａｌｌ  ＶＦ  ＤＶ  ２０フィルターでろ過した。ろ過液を別の容器に収集した。最大圧３０ｐｓｉ（２０７０ｍｂａ）の条件下で、ｐＨ７．０±０．１の酢酸アンモニウム緩衝液でフィルターを洗浄した。ろ過液の体積を計測し、かつサンプルを１ｍｌ取り、ウイルスの感染率を測定した。
【００７１】
ウイルス除去の結果
2012503596.tif 000010
【００７２】
結果から明らかなように、５種のウイルスも降下量がいずれも104以上であったことから、該工程はＨＣＧの製造の安全を保障し、脂質エンベロープウイルスと非脂質エンベロープウイルスによる汚染を防止することに重要な役割を果たしたと考えられる。
【実施例６】
【００７３】
サンプルをＨＭＧ粗製品（上海天偉生物製薬株式会社より提供）４００ｍｇに変更した以外、他の工程は実施例５と同様にした。
【００７４】
ウイルス除去の結果
2012503596.tif 000011
【００７５】
結果から明らかなように、５種のウイルスも降下量がいずれも104以上であったことから、該工程はＨＣＧの製造の安全を保障し、脂質エンベロープウイルスと非脂質エンベロープウイルスによる汚染を防止することに重要な役割を果たしたと考えられる。
【実施例７】
【００７６】
ＨＣＧ凍結乾燥注射剤の製造
１瓶につきＨＣＧを１０００  ＩＵ含有するようにＨＣＧ凍結乾燥注射剤を１００００瓶製造するための典型的な例は以下の通りであった。
実施例１、３、５の三つの工程で、いずれの工程でもエキストラなウイルスを導入しないように処理されたＨＣＧ精製品を、算出された所定の量（単位は生物的力価）で注射用パイロジェンフリー水１００ｍＬに溶解させ、必要とすればＨＣｌ或いはＮａＯＨでｐＨを７．０±０．２に調節し、０．２２μｍのフィルターで無菌ろ過した。
【００７７】
マンニトール３００ｇとＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ  １０．９ｇを注射用パイロジェンフリー水３Ｌに溶解させ、ＮａＯＨでｐＨを７．０±０．２に調節し、０．２２μｍのフィルターで無菌ろ過した。その後、前記ＨＣＧ溶液に加え、注射用パイロジェンフリー水で７．０Ｌに定容し、均一に混合した。
前記溶液を１瓶につき０．７０ｍＬの量でアンプルに分注し、凍結乾燥した。
得られたアンプルにおいては、１瓶あたりにＨＣＧが１０００  ＩＵ、マンニトールが３０ｍｇ含まれた。
【実施例８】
【００７８】
ＨＭＧ凍結乾燥注射剤の製造
１瓶につきＦＳＨを７５  ＩＵ、ＬＨを７５  ＩＵ含有するようにＨＭＧ凍結乾燥注射剤を１００００瓶製造するための典型的な例は以下の通りであった。
実施例２、６の二つの工程で、いずれの工程でもエキストラなウイルスを導入しないように処理されたＨＭＧ精製品を、算出された所定の量（単位は生物的力価）で注射用パイロジェンフリー水１００ｍＬに溶解させ、必要とすればＨＣｌ或いはＮａＯＨでｐＨを６．５±０．２に調節し、０．２２μｍのフィルターで無菌ろ過した。
【００７９】
ラクトース１００ｇを注射用パイロジェンフリー水２Ｌに溶解させ、必要とすればＨＣｌ或いはＮａＯＨでｐＨを６．５±０．２に調節し、０．２２μｍのフィルターで無菌ろ過した。その後、前記ＨＭＧ溶液に加え、注射用パイロジェンフリー水で７．５Ｌに定容し、均一に混合した。
前記溶液を１瓶につき０．７５ｍＬの量でアンプルに分注し、凍結乾燥した。
得られたアンプルにおいては、１瓶あたりにＦＳＨが７５  ＩＵ、ＬＨが７５  ＩＵ、ラクトースが１０ｍｇ含まれた。
【実施例９】
【００８０】
ＦＳＨ凍結乾燥注射剤の製造
１瓶につきＦＳＨを７５  ＩＵ含有するようにＦＳＨ凍結乾燥注射剤を１００００瓶製造するための典型的な例は以下の通りであった。
実施例２、４、６の二つの工程で、いずれの工程でもエキストラなウイルスを導入しないように処理されたＦＳＨ精製品を、算出された所定の量（単位は生物的力価）で注射用パイロジェンフリー水５０ｍＬに溶解させ、必要とすればＨＣｌ或いはＮａＯＨでｐＨを６．５±０．２に調節し、０．２２μｍのフィルターで無菌ろ過した。
【００８１】
ラクトース１００ｇを注射用パイロジェンフリー水２Ｌに溶解させ、必要とすればＨＣｌ或いはＮａＯＨでｐＨを６．５±０．２に調節し、０．２２μｍのフィルターで無菌ろ過した。その後、前記ＦＳＨ溶液に加え、注射用パイロジェンフリー水で７．５Ｌに定容し、均一に混合した。
前記溶液を１瓶につき０．７５ｍＬの量でアンプルに分注し、凍結乾燥した。
得られたアンプルにおいては、１瓶あたりにＦＳＨが７５  ＩＵ、ラクトースが１０ｍｇ含まれた。
【００８２】
各文献がそれぞれ単独に引用されるように、本発明に係るすべての文献は本出願で参考として引用する。また、本発明の上記の内容を読み終わった後、この分野の技術者が本発明を各種の変動や修正をすることができるが、それらの等価の様態のものは本発明の請求の範囲に含まれることが理解されるべきである。
【国際調査報告】
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