(57)【要約】  本発明は、腫瘍療法に関する。一態様では、本発明は、がんの治療において有用な標的結合部分及び毒素の複合体に関する。特に、毒素はアマトキシンであり、標的結合部分（例えば抗体）は腫瘍関連抗原、例えば上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）に指向性を有する。さらなる一態様では、本発明は、かかる標的結合部分毒素複合体を含む医薬組成物に、及びかかる医薬組成物の調製のためのかかる標的結合部分毒素複合体の使用に関する。本発明の標的結合部分毒素複合体及び医薬組成物は、がん、特に腺癌、例えば膵臓がん、胆管癌、乳がん及び結腸直腸がんの治療に有用である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者における膵臓がん、胆管癌又は結腸直腸がんの治療のための抗体毒素複合体であって、
（ｉ）上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）のエピトープと特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片、
（ｉｉ）アマトキシン、及び
（ｉｉｉ）任意にリンカーＬ１
を含む、抗体毒素複合体。
【請求項２】
抗体又はその抗原結合断片が、ダイアボディ、テトラボディ、ナノボディ、キメラ抗体、脱免疫化抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体から選択される、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
抗原結合断片が、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ、及びジスルフィド結合したＦｖ（ｄｓＦｖ）からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の複合体。
【請求項４】
ＥｐＣＡＭのエピトープがヒトＥｐＣＡＭのエピトープである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項５】
抗体又はその抗原結合断片が、
（ａ）ｈｕＨＥＡ１２５の重鎖のＣＤＲ３ドメイン（配列番号２２）、及び／又は
（ｂ）ｈｕＨＥＡ１２５の軽鎖のＣＤＲ３ドメイン（配列番号２５）
を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項６】
抗体又はその抗原結合断片が、
（ａ）ｈｕＨＥＡ１２５の重鎖のＣＤＲ２ドメイン（配列番号２１）、
（ｂ）ｈｕＨＥＡ１２５の重鎖のＣＤＲ１ドメイン（配列番号２０）、
（ｃ）ｈｕＨＥＡ１２５の軽鎖のＣＤＲ２ドメイン（配列番号２４）、及び
（ｄ）ｈｕＨＥＡ１２５の軽鎖のＣＤＲ１ドメイン（配列番号２３）
のうち１つ又は複数をさらに含む、請求項５に記載の複合体。
【請求項７】
抗体又はその抗原結合断片が、ｈｕＨＥＡ１２５のＶＨドメイン（配列番号３）、及び／又はｈｕＨＥＡ１２５のＶＬドメイン（配列番号１２）を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項８】
抗体又はその抗原結合断片が、
（ａ）ｈｕＨＥＡ１２５の膜結合型の重鎖（配列番号１）、若しくはｈｕＨＥＡ１２５の可溶型の重鎖（配列番号２）、及び／又は
（ｂ）ｈｕＨＥＡ１２５の軽鎖（配列番号１１）
を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項９】
アマトキシンが、α−アマニチン、β−アマニチン、γ−アマニチン、ε−アマニチン、アマニン、アマニンアミド、アマヌリン若しくはアマヌリン酸、又はその塩若しくは類縁体から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１０】
抗体毒素複合体であって、
（ｉ）上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）と特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片であって、
（ａ）ｈｕＨＥＡ１２５の重鎖であって、
（ａ１）配列番号１に記載の膜結合型の重鎖であって、
配列番号３に示されるような重鎖の可変ドメインＶＨが、ＶＨのフレームワーク領域に位置する０個〜１０個のアミノ酸置換、０個〜１０個のアミノ酸欠失、及び／又は０個〜１０個のアミノ酸付加を含み、
配列番号２６に示されるような重鎖の定常ドメインが、０個〜１０個のアミノ酸置換、０個〜１０個のアミノ酸欠失、及び／又は０個〜１０個のアミノ酸付加を含む、
膜結合型の重鎖、並びに
（ａ２）配列番号２に記載の可溶型の重鎖であって、
配列番号３に示されるような重鎖の可変ドメインＶＨが、ＶＨのフレームワーク領域に位置する０個〜１０個のアミノ酸置換、０個〜１０個のアミノ酸欠失、及び／又は０個〜１０個のアミノ酸付加を含み、
配列番号２７に示されるような重鎖の定常ドメインが、０個〜１０個のアミノ酸置換、０個〜１０個のアミノ酸欠失、及び／又は０個〜１０個のアミノ酸付加を含む、
可溶型の重鎖
からなる群から選択される、ｈｕＨＥＡ１２５の重鎖、並びに
（ｂ）配列番号１１に記載のｈｕＨＥＡ１２５の軽鎖であって、
配列番号１２に示されるような軽鎖の可変ドメインＶＬが、ＶＬのフレームワーク領域に位置する０個〜１０個のアミノ酸置換、０個〜１０個のアミノ酸欠失、及び／又は０個〜１０個のアミノ酸付加を含み、
配列番号２８に示されるような軽鎖の定常ドメインＣＬが、０個〜１０個のアミノ酸置換、０個〜１０個のアミノ酸欠失、及び／又は０個〜１０個のアミノ酸付加を含む、
ｈｕＨＥＡ１２５の軽鎖
を含む、抗体又はその抗原結合断片、
（ｉｉ）アマトキシン、並びに
（ｉｉｉ）任意にリンカーＬ２
を含む、抗体毒素複合体。
【請求項１１】
抗体又はその抗原結合断片が、キメラ抗体、脱免疫化抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体から選択される、請求項１０に記載の複合体。
【請求項１２】
抗原結合断片がＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｄからなる群から選択される、請求項１０又は１１に記載の複合体。
【請求項１３】
抗体がｈｕＨＥＡ１２５又はその抗原結合断片である、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１４】
アマトキシンが、α−アマニチン、β−アマニチン、γ−アマニチン、ε−アマニチン、アマニン、アマニンアミド、アマヌリン若しくはアマヌリン酸、又はその塩若しくは類縁体から選択される、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１５】
医療における使用のための請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１６】
患者におけるがんの治療のための請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の複合体であって、該がんが、膵臓がん、胆管癌、乳がん及び結腸直腸がんからなる群から選択される、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１７】
標的結合部分毒素複合体であって、
（ｉ）上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）のエピトープと特異的に結合する標的結合部分、
（ｉｉ）アマトキシン、及び
（ｉｉｉ）任意にリンカーＬ３
を含み、
該アマトキシンが、アマトキシンのアミノ酸３のδＣ原子を介して、該標的結合部分と、又は存在する場合該リンカーＬ３と連結される、
標的結合部分毒素複合体。
【請求項１８】
アマトキシンが、アマトキシンのアミノ酸３のδＣ原子と結合した酸素原子を介して、該標的結合部分と、又は存在する場合該リンカーＬ３と連結される、請求項１７に記載の標的結合部分毒素複合体。
【請求項１９】
アマトキシンが、エステル結合、エーテル結合又はウレタン結合を介して、該標的結合部分と、又は存在する場合該リンカーＬ３と連結される、請求項１７又は１８に記載の標的結合部分毒素複合体。
【請求項２０】
リンカーＬ３が存在し、該複合体が以下の構造：
（ｉ）アマトキシン−δＣ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｌ３−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−標的結合部分、
（ｉｉ）アマトキシン−δＣ−Ｏ−Ｌ３−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−標的結合部分、又は
（ｉｉｉ）アマトキシン−δＣ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｌ３−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−標的結合部分
のうちの１つを有する、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の標的結合部分毒素複合体。
【請求項２１】
標的結合部分が、該標的結合部分に存在するアミノ基を介して、該アマトキシンと、又は存在する場合該リンカーＬ３と連結される、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の標的結合部分毒素複合体。
【請求項２２】
アマトキシンが、α−アマニチン、β−アマニチン、γ−アマニチン、ε−アマニチン、アマニン、アマニンアミド、アマヌリン若しくはアマヌリン酸から、又はその塩若しくは類縁体から選択される、請求項１７〜２１のいずれか一項に記載の標的結合部分毒素複合体。
【請求項２３】
リンカーＬ３が、任意に置換されたアルキル基、ヘテロアルキル基、アルケニル基、ヘテロアルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキニル基、シクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アラルキル基又はヘテロアラルキル基である、請求項１７〜２２のいずれか一項に記載の標的結合部分毒素複合体。
【請求項２４】
リンカーＬ３がジスルフィド結合を含む、請求項１７〜２３のいずれか一項に記載の標的結合部分毒素複合体。
【請求項２５】
標的結合部分が、腫瘍細胞上に存在するエピトープと特異的に結合する、請求項１７〜２４のいずれか一項に記載の標的結合部分毒素複合体。
【請求項２６】
標的結合部分が、
（ｉ）抗体又はその抗原結合断片、
（ｉｉ）抗体様タンパク質、及び
（ｉｉｉ）核酸アプタマー
からなる群から選択される、請求項１７〜２５のいずれか一項に記載の標的結合部分毒素複合体。
【請求項２７】
抗体又はその抗原結合断片が、ダイアボディ、テトラボディ、ナノボディ、キメラ抗体、脱免疫化抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体から選択される、請求項２６に記載の標的結合部分毒素複合体。
【請求項２８】
抗原結合断片が、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ、及びジスルフィド結合したＦｖ（ｄｓＦｖ）からなる群から選択される、請求項２６又は２７に記載の標的結合部分毒素複合体。
【請求項２９】
抗体又はその抗原結合断片が、
（ａ）ｈｕＨＥＡ１２５の膜結合型の重鎖（配列番号１）、若しくはｈｕＨＥＡ１２５の可溶型の重鎖（配列番号２）、及び／又は
（ｂ）ｈｕＨＥＡ１２５の軽鎖（配列番号１１）
を含む、請求項２６又は２７に記載の標的結合部分毒素複合体。
【請求項３０】
医療における使用のための請求項１７〜２９のいずれか一項に記載の標的結合部分毒素複合体。
【請求項３１】
患者におけるがんの治療のための請求項１７〜３０のいずれか一項に記載の標的結合部分毒素複合体であって、該がんが、膵臓がん、胆管癌、乳がん、結腸直腸がん、肺がん、前立腺がん、卵巣がん、胃がん、腎臓がん、悪性黒色腫、白血病及び悪性リンパ腫からなる群から選択される、標的結合部分毒素複合体。
【請求項３２】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体毒素複合体、又は請求項１７〜２９のいずれか一項に記載の標的結合部分毒素複合体を含み、１つ又は複数の薬学的に許容可能な希釈剤、担体、賦形剤、充填剤、結合剤、滑剤、流動促進剤、崩壊剤、吸着剤、及び／又は保存料をさらに含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍療法に関する。一態様では、本発明は、がんの治療において有用な標的結合部分及び毒素の複合体に関する。特に、毒素はアマトキシンであり、標的結合部分（例えば抗体）は腫瘍関連抗原、例えば上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）に指向性を有する。さらなる一態様では、本発明は、かかる標的結合部分毒素複合体を含む医薬組成物に、及びかかる医薬組成物の調製のためのかかる標的結合部分毒素複合体の使用に関する。本発明の標的結合部分毒素複合体及び医薬組成物は、がん、特に腺癌、例えば膵臓がん、胆管癌、乳がん及び結腸直腸がんの治療に有用である。
【背景技術】
【０００２】
アマトキシン
アマトキシンは、８個のアミノ酸から構成される環状ペプチドである。アマトキシンは、タマゴテングダケ（Amanita phalloides）というキノコから単離することができ、又は合成により基本単位から調製することができる。アマトキシンは、哺乳動物細胞のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼＩＩを特異的に阻害し、それにより影響を受けた細胞の転写及びタンパク質生合成も特異的に阻害する。細胞における転写の阻害により、成長及び増殖の停止が引き起こされる。共有結合してはいないが、アマニチンとＲＮＡポリメラーゼＩＩとの間の複合体は非常に堅固である（ＫＤ＝３ｎＭ）。この酵素からのアマニチンの解離は、影響を受けた細胞の回復を起こりにくくする非常にゆっくりとしたプロセスである。転写の阻害があまりにも長く続くと、細胞はプログラム細胞死（アポトーシス）を被る。
【０００３】
上皮細胞接着分子
上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３２６）は、最も良く研究されているヒト腫瘍上の標的抗原の１つである（非特許文献１、非特許文献２）。上皮細胞接着分子は、見かけの分子量４０ｋＤａ、アミノ酸数３１４のＩ型膜糖タンパク質である（非特許文献３）。上皮細胞接着分子は大部分の腺癌において過剰発現する（非特許文献４、非特許文献５）。特に、ＥｐＣＡＭの発現は、リンパ節陽性乳がん、上皮性卵巣がん、胆管癌、膵臓腺癌及び扁平上皮細胞頭頚部がんにおいて増強される。ＥｐＣＡＭの発現の増大は、乳癌及び胆嚢癌における予後不良の指標となる（非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９）。重要なことには、ＥｐＣＡＭは、乳癌、結腸直腸癌及び膵臓癌において腫瘍開始細胞又はがん幹細胞により発現される（非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２）。
【０００４】
ＥｐＣＡＭ特異的モノクローナル抗体は、がん患者における希少な循環腫瘍細胞の検出のための診断ツールとして使用されている（非特許文献１３、非特許文献１４）。現在のところ、２種類〜３種類の改変抗ＥｐＣＡＭ抗体が臨床研究において調査されている。
【０００５】
アマトキシン及び抗体の複合体
本発明者らによる先の特許出願（特許文献１）（２００７年１１月２８日に公開された）は、β−アマニチンをアルブミンと、又はモノクローナル抗体ＨＥＡ１２５、ＯＫＴ３及びＰＡ−１と結合させた複合体を記載している。さらに、乳がん細胞（ＭＣＦ−７）、バーキットリンパ腫細胞（ラージ細胞）及びＴ−リンパ腫細胞（ジャーカット細胞）の増殖に対するこれらの複合体の阻害効果が研究された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】欧州特許第１８５９８１１号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Trzpis M., McLaughlin P.M., de Leij L.M., Harmsen M.C. Epithelial cell adhesion molecule: more than a carcinoma marker and adhesion molecule. Am. J. Pathol. 171(2), 386-395 (2007)
【非特許文献２】Baeuerle P.A. and Gires O. EpCAM (CD326) finding its role in cancer. Br. J. Cancer 96(3), 417-423 (2007)
【非特許文献３】Balzar M., Winter M.J., de Boer C.J., Litvinov S.V. The biology of the 17-1A antigen (Ep-CAM). J. Mol. Med. 77(10), 699-712 (1999)
【非特許文献４】Winter M.J., Nagtegaal I.D., van Krieken J.H., Litvinov S.V. The epithelial cell adhesion molecule (Ep-CAM) as a morphoregulatory molecule is a tool in surgical pathology. Am. J. Pathol. 163(6), 2139-2148 (2003)
【非特許文献５】Went P.T., Lugli A., Meier S., Bundi M., Mirlacher M., Sauter G., Dirnhofer S. Frequent EpCam protein expression in human carcinomas. Hum. Pathol. 35(1), 122-128, 2004
【非特許文献６】Gastl G., Spizzo G., Obrist P., Duenser M., Mikuz G. Ep-CAM overexpression in breast cancer as a predictor of survival. Lancet 356(9246), 1981-1982 (2000)
【非特許文献７】Varga M., Obrist P., Schneeberger S., Muehlmann G., Felgel-Farnholz C., Fong D., Zitt M., Brunhuber T., Schaefer G., Gastl G., Spizzo G. Overexpression of epithelial cell adhesion molecule antigen in gallbladder carcinoma is an independent marker for poor survival. Clin. Cancer Res. 10(9), 3131-3136 (2004)
【非特許文献８】Spizzo G., Obrist P., Ensinger C., Theurl I., Duenser M., Ramoni A., Gunsilius E., Eibl G., Mikuz G., Gastl G. Prognostic significance of Ep-CAM AND Her-2/neu overexpression in invasive breast cancer. Int. J. Cancer 98(6), 883-888 (2002)
【非特許文献９】Spizzo G., Went P., Dirnhofer S., Obrist P., Simon R., Spichtin H., Maurer R., Metzger U., von Castelberg B., Bart R., Stopatschinskaya S., Koechli O.R., Haas P., Mross F., Zuber M., Dietrich H., Bischoff S., Mirlacher M., Sauter G., Gastl G. High Ep-CAM expression is associated with poor prognosis in node-positive breast cancer. Breast Cancer Res. Treat. 86(3), 207-213 (2004)
【非特許文献１０】Al-Hajj M., Wicha M.S., Benito-Hernandez A., Morrison S.J., Clarke M.F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100(7), 3983-3988 (2003)
【非特許文献１１】Dalerba P., Dylla S.J., Park I.K., Liu R., Wang X., Cho R.W., Hoey T., Gurney A., Huang E.H., Simeone D.M., Shelton A.A., Parmiani G., Castelli C., Clarke M.F. Phenotypic characterization of human colorectal cancer stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104(24), 10158-10163 (2007)
【非特許文献１２】Li C., Heidt D.G., Dalerba P., Burant C.F., Zhang L., Adsay V., Wicha M., Clarke M.F., Simeone D.M. Identification of pancreatic cancer stem cells. Cancer Res. 67(3), 1030-1037 (2007)
【非特許文献１３】Allard W.J., Matera J., Miller M.C., Repollet M., Connelly M.C., Rao C., Tibbe A.G., Uhr J.W., Terstappen L.W. Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases. Clin. Cancer Res. 10(20), 6897-6904 (2004)
【非特許文献１４】Nagrath S., Sequist L.V., Maheswaran S., Bell D.W., Irimia D., Ulkus L., Smith M.R., Kwak E.L., Digumarthy S., Muzikansky A., Ryan P., Balis U.J., Tompkins R.G., Haber D.A., Toner M. Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology. Nature 450(7173), 1235-1239 (2007)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従来技術には、非常に低い濃度で標的細胞又は標的組織に対してその毒性効果を発揮する標的結合部分毒素複合体に対する必要性が存在していた。さらに、従来技術には、他の種類の疾患の治療に対する、特に他の種類のがん、特に治療法に抵抗性を有するもの、又は実際の腫瘍療法にあまり応答しないものの治療に対する必要性が依然として存在していた。
【０００９】
本発明は、これらの及び他の必要性を満たす。例えば本発明者らは、本発明の基礎となる実験において、アマトキシン及び新たなキメラ抗体ｈｕＨＥＡ１２５を含む複合体が、従来技術に記載される複合体よりずっと低い濃度で腫瘍細胞の増殖を阻害することが可能であることを見出した。特に、アマトキシン及びキメラ抗体ｈｕＨＥＡ１２５を含む複合体は、従来技術の複合体を使用する場合に必要とされる濃度の約１００分の１の濃度でその阻害効果を発揮する。さらに、本発明者らは、アマトキシン及びＥｐＣＡＭ特異的抗体を含む複合体が、乳がん細胞の増殖を阻害することができるだけでなく、驚くべきことに膵臓腺癌細胞、結腸直腸がん細胞及び胆管癌細胞の増殖を阻害することも可能であることを発見した。さらに、本発明者らは、複合体のアマトキシン部分において特定の連結点を選択することにより、非常に低い濃度（２×１０−１２Ｍ〜２×１０−１１Ｍ前後のＩＣ５０）で標的細胞に対してその毒性活性を発揮し、その標的細胞に対して高度に特異的である非常に効果的な標的結合部分毒素複合体（特に抗体毒素複合体）がもたらされることを見出した。特定の理論に拘束されることを望むものではないが、この後者の利点は、アマトキシンが標的細胞の外側ではなく標的細胞の内側で標的結合部分アマトキシン複合体から効率的に放出されるという点で説明することができよう。
【００１０】
上の概説は必ずしも、本発明により解決される全ての課題を記載している訳ではない。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
第１の態様では、本発明は、患者における膵臓がん、胆管癌又は結腸直腸がんの治療のための抗体毒素複合体であって、（ｉ）上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）のエピトープと特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片、（ｉｉ）アマトキシン、及び（ｉｉｉ）任意にリンカーＬ１を含む、抗体毒素複合体に関する。
【００１２】
第２の態様では、本発明は、抗体毒素複合体であって、（ｉ）上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）と特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片であって、（ａ）ｈｕＨＥＡ１２５の重鎖であって、（ａ１）配列番号１に記載の膜結合型の重鎖であって、配列番号３に示されるような重鎖の可変ドメインＶＨが、ＶＨのフレームワーク領域に位置する０個〜１０個のアミノ酸置換、０個〜１０個のアミノ酸欠失、及び／又は０個〜１０個のアミノ酸付加を含み、配列番号２６に示されるような重鎖の定常ドメインが、０個〜１０個のアミノ酸置換、０個〜１０個のアミノ酸欠失、及び／又は０個〜１０個のアミノ酸付加を含む、膜結合型の重鎖、並びに（ａ２）配列番号２に記載の可溶型の重鎖であって、配列番号３に示されるような重鎖の可変ドメインＶＨが、ＶＨのフレームワーク領域に位置する０個〜１０個のアミノ酸置換、０個〜１０個のアミノ酸欠失、及び／又は０個〜１０個のアミノ酸付加を含み、配列番号２７に示されるような重鎖の定常ドメインが、０個〜１０個のアミノ酸置換、０個〜１０個のアミノ酸欠失、及び／又は０個〜１０個のアミノ酸付加を含む、可溶型の重鎖からなる群から選択される、ｈｕＨＥＡ１２５の重鎖、並びに（ｂ）配列番号１１に記載のｈｕＨＥＡ１２５の軽鎖であって、配列番号１２に示されるような軽鎖の可変ドメインＶＬが、ＶＬのフレームワーク領域に位置する０個〜１０個のアミノ酸置換、０個〜１０個のアミノ酸欠失、及び／又は０個〜１０個のアミノ酸付加を含み、配列番号２８に示されるような軽鎖の定常ドメインＣＬが、０個〜１０個のアミノ酸置換、０個〜１０個のアミノ酸欠失、及び／又は０個〜１０個のアミノ酸付加を含む、ｈｕＨＥＡ１２５の軽鎖を含む、抗体又はその抗原結合断片、（ｉｉ）アマトキシン、並びに（ｉｉｉ）任意にリンカーＬ２を含む、抗体毒素複合体に関する。
【００１３】
第３の態様では、本発明は、医療における使用のための第２の態様による抗体毒素複合体に関する。
【００１４】
第４の態様では、本発明は、患者におけるがんの治療のための第２の態様による抗体毒素複合体であって、該がんが、膵臓がん、胆管癌、乳がん及び結腸がんからなる群から選択される、抗体毒素複合体に関する。
【００１５】
第５の態様では、本発明は、標的結合部分毒素複合体であって、（ｉ）標的結合部分、（ｉｉ）アマトキシン、及び（ｉｉｉ）任意にリンカーＬ３を含み、アマトキシンが、アマトキシンのアミノ酸３のδＣ原子を介して、標的結合部分と、又は存在する場合リンカーＬ３と連結される、標的結合部分毒素複合体に関する。
【００１６】
第６の態様では、本発明は、医療における使用のための第５の態様による標的結合部分毒素複合体に関する。
【００１７】
第７の態様では、本発明は、患者におけるがんの治療のための第５の態様による標的結合部分毒素複合体であって、該がんが、膵臓がん、胆管癌、乳がん、結腸直腸がん、肺がん、前立腺がん、卵巣がん、胃がん、腎臓がん、悪性黒色腫、白血病及び悪性リンパ腫からなる群から選択される、標的結合部分毒素複合体に関する。
【００１８】
第８の態様では、本発明は、第１の態様若しくは第２の態様による抗体毒素複合体、又は第５の態様による標的結合部分毒素複合体を含み、１つ又は複数の薬学的に許容可能な希釈剤、担体、賦形剤、充填剤、結合剤、滑剤、流動促進剤、崩壊剤、吸着剤、及び／又は保存料をさらに含む医薬組成物に関する。
【００１９】
この本発明の概要は必ずしも、本発明の全ての特徴を記載している訳ではない。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】種々のアマトキシンの構造式を示す図である。太字の番号（１〜８）は、アマトキシンを形成する８個のアミノ酸の標準的な番号付けを示す。アミノ酸３における最も重要な炭素原子を、ギリシャ文字α、β、γ及びδを付して表示する。（置換された）トリプトファン（すなわちアミノ酸番号４）の側鎖の原子にも番号を示す（番号１’〜７’）。
【図２】結合競合分析による標的細胞に対するｈｕＨＥＡ１２５−Ａｍａ及びｈｕＨＥＡ１２５の結合親和性の比較を示す図である。ＥｐＣＡＭを発現するＣｏｌｏ２０５細胞を、固定量の直接ＦＩＴＣ標識したマウスＨＥＡ１２５抗体と共にインキュベートした。フローサイトメトリーにより標的細胞との結合を分析した。漸増量のｈｕＨＥＡ１２５−Ａｍａ又はｈｕＨＥＡ１２５による結合の競合により、標的抗原に対する非常に類似した親和性が明らかとなった。
【図３Ａ】間接的な免疫蛍光により検出されるＣａｐａｎ−１（ヒト膵臓腺癌）株上におけるＥｐＣＡＭ抗原の表面発現を示す図である。図の左側における灰色の影付きのヒストグラムは、対照抗体Ｘｏｌａｉｒ（登録商標）により得られた結果を示す。図の右側における白色の領域を有するヒストグラムは、抗体ｈｕＨＥＡ１２５により得られた結果を示す。
【図３Ｂ】間接的な免疫蛍光により検出されるＣｏｌｏ２０５（ヒト結腸腺癌）株上におけるＥｐＣＡＭ抗原の表面発現を示す図である。図の左側における灰色の影付きのヒストグラムは、対照抗体Ｘｏｌａｉｒ（登録商標）により得られた結果を示す。図の右側における白色の領域を有するヒストグラムは、抗体ｈｕＨＥＡ１２５により得られた結果を示す。
【図３Ｃ】間接的な免疫蛍光により検出されるＯＺ（ヒト胆管癌）株上におけるＥｐＣＡＭ抗原の表面発現を示す図である。図の左側における灰色の影付きのヒストグラムは、対照抗体Ｘｏｌａｉｒ（登録商標）により得られた結果を示す。図の右側における白色の領域を有するヒストグラムは、抗体ｈｕＨＥＡ１２５により得られた結果を示す。
【図３Ｄ】間接的な免疫蛍光により検出されるＭＣＦ−７（ヒト乳腺癌株）株上におけるＥｐＣＡＭ抗原の表面発現を示す図である。図の左側における灰色の影付きのヒストグラムは、対照抗体Ｘｏｌａｉｒ（登録商標）により得られた結果を示す。図の右側における白色の領域を有するヒストグラムは、抗体ｈｕＨＥＡ１２５により得られた結果を示す。
【図３Ｅ】間接的な免疫蛍光により検出されるＢｘＰＣ−３（ヒト膵臓腺癌）株上におけるＥｐＣＡＭ抗原の表面発現を示す図である。図の左側における灰色の影付きのヒストグラムは、対照抗体Ｘｏｌａｉｒ（登録商標）により得られた結果を示す。図の右側における白色の領域を有するヒストグラムは、抗体ｈｕＨＥＡ１２５により得られた結果を示す。
【図３Ｆ】間接的な免疫蛍光により検出されるＰＣ−３（ヒト前立腺腺癌）株上におけるＥｐＣＡＭ抗原の表面発現を示す図である。図の左側における灰色の影付きのヒストグラムは、対照抗体Ｘｏｌａｉｒ（登録商標）により得られた結果を示す。図の右側における白色の領域を有するヒストグラムは、抗体ｈｕＨＥＡ１２５により得られた結果を示す。
【図４】アマニチンと複合体形成した（Amanitin-armed）抗体ｈｕＨＥＡ１２５、アマニチンと複合体形成した対照抗体Ｘｏｌａｉｒ（登録商標）、及び遊離のアマニチンによりもたらされるＣａｐａｎ−１細胞の増殖の阻害の比較を示す図である。
【図５】アマニチンと複合体形成した抗体ｈｕＨＥＡ１２５、アマニチンと複合体形成した対照抗体Ｘｏｌａｉｒ（登録商標）、及び遊離のアマニチンによりもたらされるＣｏｌｏ２０５細胞の増殖の阻害の比較を示す図である。
【図６】アマニチンと複合体形成した抗体ｈｕＨＥＡ１２５、アマニチンと複合体形成した対照抗体Ｘｏｌａｉｒ（登録商標）、及び遊離のアマニチンによりもたらされるＭＣＦ−７細胞の増殖の阻害の比較を示す図である。
【図７】アマニチンと複合体形成した抗体ｈｕＨＥＡ１２５、アマニチンと複合体形成した対照抗体Ｘｏｌａｉｒ（登録商標）、及び遊離のアマニチンによりもたらされるＯＺ細胞の増殖の阻害の比較を示す図である。
【図８】比較のためのアマニチンと複合体形成した抗体ｈｕＨＥＡ１２５、及びアマニチンと複合体形成した対照抗体Ｘｏｌａｉｒ（登録商標）、及び遊離のアマニチンによりもたらされるＢｘＰＣ−３細胞の増殖の阻害を示す図である。
【図９】ｈｕＨＥＡ１２５−アマニチン処理後のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおけるＢｘＰＣ−３腫瘍異種移植片の成長阻害を示す図である。
【図１０】ｈｕＨＥＡ１２５−アマニチン処理後のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおけるＰＣ−３腫瘍異種移植片の成長阻害を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
定義
本発明を以下で詳細に記載する前に、本明細書中に記載する特定の方法論、プロトコル及び試薬は変動し得るので、本発明はこれらに限定されないことを理解すべきである。本明細書中で使用される専門用語が、特定の実施形態を記載するためのものにすぎず、添付した特許請求の範囲のみによって限定される本発明の範囲を限定することは意図されないことも理解すべきである。他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【００２２】
好ましくは、本明細書中で使用される用語は、"A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPACRecommendations)", Leuenberger, H.G.W, Nagel, B.and Koelbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerlandに記載されているように定義される。
【００２３】
以下の本明細書及び添付の特許請求の範囲を通じて、文脈上他に必要な場合以外は、「を含む（comprise）」という単語、並びに「を含む（comprises）」及び「を含む（comprising）」等の変化形は、記載された整数若しくは工程、又は整数若しくは工程の群を包含することを示唆するが、任意の他の整数若しくは工程、又は整数若しくは工程の群を除外することを示唆しないと理解される。
【００２４】
複数の文書が、本明細書の文章全体を通じて引用される。本明細書中で引用される文書（全ての特許、特許出願、科学的刊行物、製造業者の仕様書、取扱説明書、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号配列提出書（submissions）等を含む）の各々が、上記のものであるか又は下記のものであるかに関わらず、その全体が参照により本明細書に援用される。本明細書のどの記載も、本発明が従来の発明に基づくかかる開示に先行する権利を有しないことを認めるものと解釈すべきではない。
【００２５】
本明細書で使用する場合の「標的結合部分」という用語は、標的分子又は標的エピトープと特異的に結合することができる任意の分子又は分子の一部を表す。本願との関連では好ましい標的結合部分は、（ｉ）抗体又はその抗原結合断片、（ｉｉ）抗体様タンパク質、及び（ｉｉｉ）核酸アプタマーである。本発明における使用に好適な「標的結合部分」は、典型的には４００００Ｄａ（４０ｋＤａ）以上の分子質量を有する。
【００２６】
本願との関連ではそれぞれ「標的分子」及び「標的エピトープ」という用語は、標的結合部分が特異的に結合する抗原及び抗原のエピトープをそれぞれ表し、好ましくは標的分子は、腫瘍関連抗原、特に非腫瘍細胞の表面と比較して高い濃度で及び／又は異なる立体配置で１つ又は複数の腫瘍細胞型の表面上に存在する抗原又はエピトープである。好ましくは、上記抗原又は上記エピトープは、１つ又は複数の腫瘍細胞型の表面上に存在するが、非腫瘍細胞の表面上には存在しない。
【００２７】
本明細書で使用する場合の「抗体又はその抗原結合断片」という用語は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち抗原を免疫特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子を表す。例えば標的分子と、例えば標的タンパク質ＥｐＣＡＭと特異的に結合するファージディスプレイを含む技法により選択される免疫グロブリン様タンパク質も含まれる。本発明の免疫グロブリン分子は、任意のタイプ（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）のもの、又は免疫グロブリン分子のサブクラスであり得る。本発明における使用に好適な「抗体及びその抗原結合断片」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、一価抗体、二重特異性抗体、ヘテロ複合体抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化（特にＣＤＲ移植）抗体、脱免疫化（deimmunized）抗体又はキメラ抗体、一本鎖抗体（例えばｓｃＦｖ）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ発現ライブラリにより産生される断片、ダイアボディ（diabodies）又はテトラボディ（tetrabodies）（Holliger P. et al., 1993）、ナノボディ（nanobodies）、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）、及び上記のもののいずれかのエピトープ結合断片を含むがこれらに限定されない。
【００２８】
幾つかの実施形態では、抗原結合断片は本発明のヒト抗原結合抗体断片であり、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、ジスルフィド結合したＦｖ（ｄｓＦｖ）、並びにＶＬドメイン又はＶＨドメインを含む断片を含むがこれらに限定されない。一本鎖抗体を含む抗原結合抗体断片は、可変ドメイン（複数可）を単独で、又はヒンジ領域、ＣＬドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインの全体若しくは一部と組み合わせて含み得る。ヒンジ領域、ＣＬドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインと可変ドメイン（複数可）の任意の組合せも含む抗原結合断片も本発明に含まれる。
【００２９】
本発明において使用可能な抗体は、鳥及び哺乳動物を含む任意の動物起源由来であり得る。好ましくは、抗体は、ヒト、げっ歯類（例えばマウス及びラット）、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ又はニワトリの抗体である。抗体がヒト起源又はマウス起源のものであることが特に好ましい。本明細書で使用する場合の「ヒト抗体」は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、ヒト免疫グロブリンライブラリから単離された、又は１つ又は複数のヒト免疫グロブリンを遺伝子導入した内在性免疫グロブリンを発現しない動物（例えばKucherlapati &Jakobovitsによる米国特許第５９３９５９８号に記載されるような）由来の抗体を含む。
【００３０】
「抗体様タンパク質」という用語は、標的分子と特異的に結合するように改変された（例えばループの突然変異誘発により）タンパク質を表す。典型的には、かかる抗体様タンパク質は、両端でタンパク質骨格と結合した少なくとも１つの可変ペプチドループを含む。この二重の構造的制約により、抗体様タンパク質の結合親和性が抗体の結合親和性に匹敵するレベルまで大幅に増大する。可変ペプチドループの長さは典型的には、１０個〜２０個のアミノ酸からなる。骨格タンパク質は、良好な溶解特性を有する任意のタンパク質であり得る。好ましくは、骨格タンパク質は小さい球状タンパク質である。抗体様タンパク質は、アフィボディ（affibodies）、アンチカリン（anticalins）、及び設計されたアンキリン反復タンパク質（概説に関してはBinz et al. 2005を参照されたい）を含むがこれらに限定されない。抗体様タンパク質は、突然変異体の大規模ライブラリ由来のものであってもよく、例えば大規模ファージディスプレイライブラリから選択して（panned）もよく、正規の抗体と同様に単離してもよい。また、抗体様結合タンパク質を、球状タンパク質の表面露出残基のコンビナトリアル突然変異誘発により得ることができる。
【００３１】
「核酸アプタマー」という用語は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択の繰り返し又はＳＥＬＥＸ（試験管内進化法）により標的分子と結合するように改変された核酸分子を表す（概説に関してはBrody and Gold, 2000を参照されたい）。核酸アプタマーはＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子であり得る。アプタマーは、例えば修飾ヌクレオチド、例えば２’−フッ素−置換ピリミジンのように修飾を含有していてもよい。
【００３２】
「アマトキシン」という用語は、アマニタ（Amanita）属から単離され参考文献（Wieland, T. and Faulstich H., 1978）に記載されるような８個のアミノ酸から構成される全ての環状ペプチド、さらに全てのその化学的誘導体、さらに全てのその半合成類縁体、さらに天然化合物の主要構造（環状、８個のアミノ酸）に従って基本単位から構築される全てのその合成類縁体、さらにヒドロキシル化アミノ酸の代わりに非ヒドロキシル化アミノ酸を含有する全ての合成類縁体又は半合成類縁体、さらにスルフィド、スルホンにより、又は硫黄以外の原子、例えば炭素原子により（アマニチンのカルバアナログの場合のように）チオエーテルスルホキシド部分が置換された全ての合成類縁体又は半合成類縁体を含む。
【００３３】
機能的には、アマトキシンは、哺乳動物のＲＮＡポリメラーゼＩＩを阻害するペプチド又はデプシペプチドとして定義される。好ましいアマトキシンは、リンカー分子又はタンパク質、例えば抗体又は抗体断片と反応することができる官能基（例えばカルボキシル（carboxylic）基、アミノ基、ヒドロキシ基、チオール基又はチオール捕捉基）を有するものである。本発明の複合体に特に好適なアマトキシンは、図１に示されるようなα−アマニチン、β−アマニチン、γ−アマニチン、ε−アマニチン、アマニン（amanin）、アマニンアミド、アマヌリン及びアマヌリン酸（amanullinic acid）、並びにその塩、化学的誘導体、半合成類縁体及び合成類縁体である。本発明における使用のために特に好ましいアマトキシンは、α−アマニチン、β−アマニチン及びアマニンアミドである。
【００３４】
本明細書で使用する場合の或る化合物の「誘導体」は、該化合物に類似する化学構造を有するが、該化合物中には存在しない少なくとも１つの化学基を含有し、及び／又は該化合物中に存在する少なくとも１つの化学基を欠く化学種を表す。誘導体の比較対象となる化合物は、「親」化合物として知られる。典型的には、「誘導体」は、１つ又は複数の化学反応工程で親化合物から作製することができる。
【００３５】
本明細書で使用する場合の或る化合物の「類縁体」は、該化合物と構造的に関連するが同一ではなく、該化合物の少なくとも１つの活性を示す。類縁体の比較対象となる化合物は、「親」化合物として知られる。上で言及した活性は、別の化合物との結合活性、阻害活性、例えば酵素阻害活性、毒性効果、活性化活性、例えば酵素活性化活性を含むがこれらに限定されない。類縁体がかかる活性を親化合物と同程度示す必要はない。本願との関連内では、或る化合物が親化合物の活性の少なくとも１％（より好ましくは少なくとも５％、より好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％）の程度まで関連する活性を示す場合、該化合物は類縁体とみなされる。したがって、「アマトキシンの類縁体」は、本明細書で使用する場合、図１に示されるようなα−アマニチン、β−アマニチン、γ−アマニチン、ε−アマニチン、アマニン、アマニンアミド、アマヌリン及びアマヌリン酸のいずれか１つと構造的に関連し、α−アマニチン、β−アマニチン、γ−アマニチン、ε−アマニチン、アマニン、アマニンアミド、アマヌリン及びアマヌリン酸の少なくとも１つと比較して哺乳動物のＲＮＡポリメラーゼＩＩに対する少なくとも１％（より好ましくは少なくとも５％、より好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％）の阻害活性を示す化合物を表す。本発明における使用に好適な「アマトキシンの類縁体」はさらに、哺乳動物のＲＮＡポリメラーゼＩＩに対してα−アマニチン、β−アマニチン、γ−アマニチン、ε−アマニチン、アマニン、アマニンアミド、アマヌリン又はアマヌリン酸のいずれか１つより大きな阻害活性を示し得る。阻害活性は、５０％の阻害が生じる濃度（ＩＣ５０値）を決定することにより測定することができる。
【００３６】
本願との関連では「リンカー」は、例えば標的結合部分とアマトキシンとの間の立体的干渉を軽減させる（そうしなければＲＮＡポリメラーゼＩＩと相互作用するアマトキシンの能力が減少する可能性がある）ために、２つの構成要素の間の距離を増大させる分子を表す。リンカーは、標的結合部分が標的とする細胞中で特異的にアマトキシンの放出を促進することがあるため、別の目的に適う可能性がある。リンカー、好ましくは一方側におけるリンカーとアマトキシンとの間の結合、及びもう一方側におけるリンカーと抗体との間の結合が細胞の外側（例えば血液中）では生理学的条件下で安定であるが、細胞の内側で、特に標的細胞、例えばがん細胞又は免疫細胞の内側で切断され得ることが好ましい。この選択的な安定性をもたらすために、リンカーは、好ましくは例えばS. Fletcher, M. R. Jorgensens and A. D.Miller; Org. Lett. 2004, 6(23), pp 4245-4248に記載されるようなｐＨ感受性リンカーを生成するためにｐＨ感受性の、又は例えばL. DA Ibsen, Blood 2003, 102, 1458-65若しくはFranciscoJA, Cerreny CG, Meyer DL, Nat. Biotechnol2003, 21, 778-84に記載されるようなプロテアーゼ感受性リンカーを生成するためにプロテアーゼ感受性の官能基（functionalities）を含み得る。代替的には、標的結合部分とリンカーを連結する結合は、選択的な安定性をもたらし得る。好ましくはリンカーは、少なくとも１原子長の、好ましくは１原子長〜２０原子長（例えば１原子長、２原子長、３原子長、４原子長、５原子長、６原子長、７原子長、８原子長、９原子長、１０原子長、１１原子長、１２原子長、１３原子長、１４原子長、１５原子長、１６原子長、１７原子長、１８原子長、１９原子長又は２０原子長）の長さを有し、リンカーの一方側がアマトキシンと反応しており、もう一方側が標的結合部分と反応している。本発明との関連では、リンカーは好ましくは、任意に置換されたＣ１〜２０−アルキル基、Ｃ１〜２０−ヘテロアルキル基、Ｃ２〜２０−アルケニル基、Ｃ２〜２０−ヘテロアルケニル基、Ｃ２〜２０−アルキニル基、Ｃ２〜２０−ヘテロアルキニル基、シクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アラルキル基又はヘテロアラルキル基である。リンカーは、１つ又は複数の構造要素、例えばアミド部分、エステル部分、エーテル部分、チオエーテル部分、ジスルフィド部分、炭化水素部分等を含有し得る。リンカーは、これらの構造要素の２つ以上の組合せも含有し得る。これらの構造要素の各々が、リンカー中に２箇所以上、例えば２箇所、３箇所、４箇所、５箇所又は６箇所存在し得る。幾つかの実施形態では、リンカーは、ジスルフィド結合を含み得る。リンカーを、単一工程で又は２つ以上の後続の工程でアマトキシン及び標的結合部分と結合しなければならないことが理解される。そのために、その後リンカーとなるものは、好ましくは近位端及び遠位端に２つの基を保有し、該基は（ｉ）或る基、好ましくはアマトキシン若しくは標的結合ペプチド上の活性化された基と共有結合を形成することができる、又は（ｉｉ）アマトキシン上の基と共有結合を形成するために活性化される若しくは活性化され得る。したがって、リンカーが存在する場合、化学基がリンカーの遠位端及び近位端に存在し、これがかかる結合反応の結果、例えばエステル結合、エーテル結合、ウレタン結合、ペプチド結合等であることが好ましい。「リンカー」の存在は任意であり、すなわち毒素は、本発明の標的結合部分毒素複合体の幾つかの実施形態では、標的結合部分の残基と直接連結され得る。リンカーが、標的とする部分との結合を介して、好ましくはその末端で、直接連結されることが好ましい。標的結合部分が、例えばＡｓｐ残基、Ｇｌｕ残基、Ａｒｇ残基、Ｌｙｓ残基、Ｃｙｓ残基（ポリペプチド中に含まれ得る）の形態の遊離のアミノ基、遊離のカルボキシ基、又は遊離のスルフヒドリル基を含む場合、リンカーがかかる基と連結されることが好ましい。
【００３７】
本明細書で使用する場合、第１の化合物（例えば抗体）が第２の化合物（例えば抗原、例えば標的タンパク質）に対して１００μＭ以下、好ましくは５０μＭ以下、好ましくは３０μＭ以下、好ましくは２０μＭ以下、好ましくは１０μＭ以下、好ましくは５μＭ以下、より好ましくは１μＭ以下、より好ましくは９００ｎＭ以下、より好ましくは８００ｎＭ以下、より好ましくは７００ｎＭ以下、より好ましくは６００ｎＭ以下、より好ましくは５００ｎＭ以下、より好ましくは４００ｎＭ以下、より好ましくは３００ｎＭ以下、より好ましくは２００ｎＭ以下、さらにより好ましくは１００ｎＭ以下、さらにより好ましくは９０ｎＭ以下、さらにより好ましくは８０ｎＭ以下、さらにより好ましくは７０ｎＭ以下、さらにより好ましくは６０ｎＭ以下、さらにより好ましくは５０ｎＭ以下、さらにより好ましくは４０ｎＭ以下、さらにより好ましくは３０ｎＭ以下、さらにより好ましくは２０ｎＭ以下、さらにより好ましくは１０ｎＭ以下の解離定数ＫＤを有する場合、第１の化合物は上記第２の化合物と「特異的に結合する」と考える。
【００３８】
本明細書で使用する場合の「患者」は、本明細書に記載される標的結合部分毒素複合体による治療から利益を受け得る任意の哺乳動物又は鳥を意味する。好ましくは、「患者」は、実験動物（例えばマウス又はラット）、家畜動物（例えばモルモット、ウサギ、ロバ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ラクダ、ウマ、ネコ又はイヌを含む）、又は人間を含む霊長類からなる群から選択される。「患者」は人間であることが特に好ましい。
【００３９】
本明細書で使用する場合、或る疾患又は障害に関する「を治療する（treat）」、「を治療すること（treating）」又は「治療（treatment）」は、（ａ）該障害の重症度を低減すること、（ｂ）治療される該障害（複数可）に特徴的な症状の発症を制限又は予防すること、（ｃ）治療される該障害（複数可）に特徴的な症状の悪化を阻止すること、（ｄ）該障害（複数可）を過去に有していた患者における該障害（複数可）の再発を制限又は予防すること、及び（ｅ）過去に該障害（複数可）の症状を示した患者における症状の再発を制限又は予防することのうち１つ又は複数を達成することを意味する。
【００４０】
本明細書で使用する場合の「を投与すること（administering）」は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの投与、及びｅｘ  ｖｉｖｏでの組織（例えば静脈移植片）への直接の投与を含む。
【００４１】
「有効量」は、意図した目的を達成するのに十分な治療剤の量である。所定の治療剤の有効量は、薬剤の性質、投与経路、治療剤の投与対象の動物の大きさ及び種、並びに投与目的等の因子により変動し得る。各々の個別のケースにおける有効量は、当該技術分野において確立された方法に従って当業者が経験的に決定することができる。
【００４２】
「薬学的に許容可能な」は、連邦政府若しくは州政府の監督官庁により承認されていること、又は米国薬局方、若しくは動物における、より具体的にはヒトにおける使用のための他の一般的に認められた薬局方にリストされていることを意味する。
【００４３】
本発明の実施形態
本発明をここでさらに記載する。以下の節では本発明の種々の態様をより詳細に規定する。そのようにして規定した各態様は、反対の内容が明示されない限り、任意の他の態様（単数又は複数）と組み合わせることができる。特に、好ましい又は有利であるとして示した任意の特徴を、好ましい又は有利であるとして示した任意の他の特徴（単数又は複数）と組み合わせることができる。
【００４４】
第１の態様では、本発明は、患者における膵臓がん、胆管癌又は結腸直腸がんの治療のための抗体毒素複合体であって、（ｉ）上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）のエピトープと特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片、（ｉｉ）アマトキシン、及び（ｉｉｉ）任意にリンカーを含む、抗体毒素複合体に関する。
【００４５】
第１の態様の好ましい一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、ダイアボディ、テトラボディ、ナノボディ、キメラ抗体、脱免疫化抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体から選択される。第１の態様の好ましい一実施形態では、抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ、及びジスルフィド結合したＦｖ（ｄｓＦｖ）からなる群から選択される。
【００４６】
好ましい一実施形態では、ＥｐＣＡＭのエピトープは、ヒトＥｐＣＡＭのエピトープである。
【００４７】
第１の態様の好ましい一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、（ａ）ｈｕＨＥＡ１２５の重鎖のＣＤＲ３ドメイン（配列番号２２）、及び／又は（ｂ）ｈｕＨＥＡ１２５の軽鎖のＣＤＲ３ドメイン（配列番号２５）を含む。特に好ましい一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号２２及び配列番号２５に示されるようなこれらのＣＤＲ３ドメインの両方を含む。好ましくは、抗体又はその抗原結合断片は、（ａ）ｈｕＨＥＡ１２５の重鎖のＣＤＲ２ドメイン（配列番号２１）、（ｂ）ｈｕＨＥＡ１２５の重鎖のＣＤＲ１ドメイン（配列番号２０）、（ｃ）ｈｕＨＥＡ１２５の軽鎖のＣＤＲ２ドメイン（配列番号２４）、及び（ｄ）ｈｕＨＥＡ１２５の軽鎖のＣＤＲ１ドメイン（配列番号２３）のうち１つ又は複数をさらに含む。好ましい一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、ｈｕＨＥＡ１２５の重鎖のＣＤＲ３ドメイン（配列番号２２）、ＣＤＲ２ドメイン（配列番号２１）及びＣＤＲ１ドメイン（配列番号２０）を含む。好ましい一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、ｈｕＨＥＡ１２５の軽鎖のＣＤＲ３ドメイン（配列番号２５）、ＣＤＲ２ドメイン（配列番号２４）及びＣＤＲ１ドメイン（配列番号２３）を含む。特に好ましい一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、重鎖及び軽鎖のＣＤＲ３ドメイン、ＣＤＲ２ドメイン及びＣＤＲ１ドメインを含み、すなわち抗体又はその抗原結合断片は、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５に示されるようなアミノ酸配列を含む。
【００４８】
第１の態様の好ましい一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、ｈｕＨＥＡ１２５の重鎖の可変ドメイン（＝ＶＨ）（配列番号３）、及び／又はｈｕＨＥＡ１２５の軽鎖の可変ドメイン（＝ＶＬ）（配列番号１２）を含む。特に好ましい一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、ｈｕＨＥＡ１２５のＶＨドメイン（配列番号３）及びＶＬドメイン（配列番号１２）の両方を含む。
【００４９】
第１の態様の好ましい一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、ｈｕＨＥＡ１２５の重鎖（可溶型、配列番号２）、及び／又はｈｕＨＥＡ１２５の軽鎖（配列番号１１）を含む。一実施形態では、ｈｕＨＥＡ１２５の重鎖、及び／又はｈｕＨＥＡ１２５の軽鎖は各々、最大２０個（例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個又は２０個）のアミノ酸置換、アミノ酸欠失又はアミノ酸付加を互いに独立して含み、これらのアミノ酸置換、アミノ酸欠失又はアミノ酸付加は、重鎖の定常ドメインに、及び／又は軽鎖の定常ドメインに、及び／又は重鎖の可変ドメインのフレームワーク領域に、及び／又は軽鎖の可変ドメインのフレームワーク領域に位置し得る。特に好ましい一実施形態では、抗体は２つのｈｕＨＥＡ１２５の重鎖（配列番号２）、及び２つのｈｕＨＥＡ１２５の軽鎖（配列番号１１）を含む完全ＩｇＧ抗体であり、１つの重鎖はジスルフィド結合を介して１つの軽鎖と連結されており、重鎖は１つ又は２つ（好ましくは２つ）のジスルフィド結合により互いに連結されている。
【００５０】
第１の態様の好ましい一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、ｈｕＨＥＡ１２５の重鎖（膜結合型、配列番号１）、及び／又はｈｕＨＥＡ１２５の軽鎖（配列番号１１）を含む。一実施形態では、ｈｕＨＥＡ１２５の重鎖、及び／又はｈｕＨＥＡ１２５の軽鎖は各々、最大２０個（例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個又は２０個）のアミノ酸置換、アミノ酸欠失又はアミノ酸付加を互いに独立して含み、これらのアミノ酸置換、アミノ酸欠失又はアミノ酸付加は、重鎖の定常ドメインに、及び／又は軽鎖の定常ドメインに、及び／又は重鎖の可変ドメインのフレームワーク領域に、及び／又は軽鎖の可変ドメインのフレームワーク領域に位置し得る。特に好ましい一実施形態では、抗体は２つのｈｕＨＥＡ１２５の重鎖（配列番号１）、及び２つのｈｕＨＥＡ１２５の軽鎖（配列番号１１）を含む完全ＩｇＧ抗体であり、１つの重鎖はジスルフィド結合を介して１つの軽鎖と連結されており、重鎖は１つ又は２つ（好ましくは２つ）のジスルフィド結合により互いに連結されている。
【００５１】
第１の態様の好ましい一実施形態では、アマトキシンは、α−アマニチン、β−アマニチン、γ−アマニチン、ε−アマニチン、アマニン、アマニンアミド、アマヌリン及びアマヌリン酸（全て図１に示される）、並びにその塩、化学的誘導体、半合成類縁体及び合成類縁体から選択される。特に好ましいアマトキシンは、α−アマニチン、β−アマニチン及びアマニンアミド、並びにその塩、化学的誘導体、半合成類縁体及び合成類縁体である。
【００５２】
第１の態様の好ましい一実施形態では、アマトキシンは、アマトキシンのアミノ酸３のδＣ原子を介して、抗体と、又は存在する場合リンカーＬ１と連結される（図１を参照されたい）。本発明において使用可能な好ましいアマトキシンでは、上記アミノ酸３は、イソロイシン、γ−ヒドロキシ−イソロイシン又はγ，δ−ジヒドロキシ−イソロイシンである。
【００５３】
第１の態様の好ましい実施形態では、アマトキシンは、アマトキシンのアミノ酸３のδＣ原子と結合した酸素原子を介して、抗体と、又は存在する場合リンカーＬ１と連結される。アマトキシンが、エステル結合、エーテル結合又はウレタン結合を介して、抗体と、又は存在する場合リンカーＬ１と連結されることがさらに好ましい。これらの実施形態では、アミノ酸３がγ，δ−ジヒドロキシ−イソロイシンであることが好ましい。
【００５４】
第１の態様の好ましい実施形態では、抗体は、該抗体に存在するアミノ基を介して、アマトキシンと、又は存在する場合リンカーＬ１と連結される。
【００５５】
第１の態様の好ましい一実施形態では、リンカーＬ１は、任意に置換されたアルキル基、ヘテロアルキル基、アルケニル基、ヘテロアルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキニル基、シクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アラルキル基又はヘテロアラルキル基である。第１の態様のさらに好ましい実施形態では、リンカーＬ１は、ジスルフィド結合を含む。
【００５６】
第２の態様では、本発明は、抗体毒素複合体であって、（ｉ）上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）と特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片であって、（ａ）ｈｕＨＥＡ１２５の重鎖であって、（ａ１）配列番号１に記載の膜結合型の重鎖であって、配列番号３に示されるような重鎖の可変ドメインＶＨが、ＶＨのフレームワーク領域に位置する０個〜１０個（例えば０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個）のアミノ酸置換、０個〜１０個（例えば０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個）のアミノ酸欠失、及び／又は０個〜１０個（例えば０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個）のアミノ酸付加を含み、配列番号２６に示されるような重鎖の定常ドメインが、０個〜１０個（例えば０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個）のアミノ酸置換、０個〜１０個（例えば０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個）のアミノ酸欠失、及び／又は０個〜１０個（例えば０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個）のアミノ酸付加を含む、膜結合型の重鎖、並びに（ａ２）配列番号２に記載の可溶型の重鎖であって、配列番号３に示されるような重鎖の可変ドメインＶＨが、ＶＨのフレームワーク領域に位置する０個〜１０個（例えば０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個）のアミノ酸置換、０個〜１０個（例えば０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個）のアミノ酸欠失、及び／又は０個〜１０個（例えば０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個）のアミノ酸付加を含み、配列番号２７に示されるような重鎖の定常ドメインが、０個〜１０個（例えば０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個）のアミノ酸置換、０個〜１０個（例えば０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個）のアミノ酸欠失、及び／又は０個〜１０個（例えば０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個）のアミノ酸付加を含む、可溶型の重鎖からなる群から選択される、ｈｕＨＥＡ１２５の重鎖、並びに（ｂ）配列番号１１に記載のｈｕＨＥＡ１２５の軽鎖であって、配列番号１２に示されるような軽鎖の可変ドメインＶＬが、ＶＬのフレームワーク領域に位置する０個〜１０個（例えば０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個）のアミノ酸置換、０個〜１０個（例えば０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個）のアミノ酸欠失、及び／又は０個〜１０個（例えば０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個）のアミノ酸付加を含み、配列番号２８に示されるような軽鎖の定常ドメインＣＬが、０個〜１０個（例えば０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個）のアミノ酸置換、０個〜１０個（例えば０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個）のアミノ酸欠失、及び／又は０個〜１０個（例えば０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個）のアミノ酸付加を含む、ｈｕＨＥＡ１２５の軽鎖を含む、抗体又はその抗原結合断片、（ｉｉ）アマトキシン、並びに（ｉｉｉ）任意にリンカーを含む、抗体毒素複合体に関する。
【００５７】
第２の態様の好ましい一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、（ａ）ｈｕＨＥＡ１２５の重鎖であって、（ａ１）配列番号１に記載の膜結合型の重鎖であって、配列番号３に示されるような重鎖の可変ドメインＶＨが、ＶＨのフレームワーク領域に位置する０個〜１０個（例えば０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個）のアミノ酸置換、０個〜１０個（例えば０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個）のアミノ酸欠失、及び／又は０個〜１０個（例えば０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個）のアミノ酸付加を含む、膜結合型の重鎖、並びに（ａ２）配列番号２に記載の可溶型の重鎖であって、配列番号３に示されるような重鎖の可変ドメインＶＨが、ＶＨのフレームワーク領域に位置する０個〜１０個（例えば０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個）のアミノ酸置換、０個〜１０個（例えば０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個）のアミノ酸欠失、及び／又は０個〜１０個（例えば０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個）のアミノ酸付加を含む、可溶型の重鎖からなる群から選択される、ｈｕＨＥＡ１２５の重鎖、並びに（ｂ）配列番号１１に記載のｈｕＨＥＡ１２５の軽鎖であって、配列番号１２に示されるような軽鎖の可変ドメインＶＬが、ＶＬのフレームワーク領域に位置する０個〜１０個（例えば０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個）のアミノ酸置換、０個〜１０個（例えば０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個）のアミノ酸欠失、及び／又は０個〜１０個（例えば０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個）のアミノ酸付加を含む、ｈｕＨＥＡ１２５の軽鎖を含む。
【００５８】
第２の態様の好ましい一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、（ａ）ｈｕＨＥＡ１２５の重鎖であって、（ａ１）配列番号１に記載の膜結合型の重鎖であって、配列番号３に示されるような重鎖の可変ドメインＶＨが、ＶＨのフレームワーク領域に位置する０個〜１０個（例えば０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個）のアミノ酸置換、アミノ酸欠失及び／又はアミノ酸付加を含み、配列番号２６に示されるような重鎖の定常ドメインが、０個〜１０個（例えば０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個）のアミノ酸置換、アミノ酸欠失及び／又はアミノ酸付加を含む、膜結合型の重鎖、並びに（ａ２）配列番号２に記載の可溶型の重鎖であって、配列番号３に示されるような重鎖の可変ドメインＶＨが、ＶＨのフレームワーク領域に位置する０個〜１０個（例えば０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個）のアミノ酸置換、アミノ酸欠失及び／又はアミノ酸付加を含み、配列番号２７に示されるような重鎖の定常ドメインが、０個〜１０個（例えば０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個）のアミノ酸置換、アミノ酸欠失及び／又はアミノ酸付加を含む、可溶型の重鎖からなる群から選択される、ｈｕＨＥＡ１２５の重鎖、並びに（ｂ）配列番号１１に記載のｈｕＨＥＡ１２５の軽鎖であって、配列番号１２に示されるような軽鎖の可変ドメインＶＬが、ＶＬのフレームワーク領域に位置する０個〜１０個（例えば０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個）のアミノ酸置換、アミノ酸欠失及び／又はアミノ酸付加を含み、配列番号２８に示されるような軽鎖の定常ドメインＣＬが、０個〜１０個（例えば０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個）のアミノ酸置換、アミノ酸欠失及び／又はアミノ酸付加を含む、ｈｕＨＥＡ１２５の軽鎖を含む。
【００５９】
第２の態様の好ましい一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、（ａ）ｈｕＨＥＡ１２５の重鎖であって、（ａ１）配列番号１に記載の膜結合型の重鎖であって、配列番号３に示されるような重鎖の可変ドメインＶＨが、ＶＨのフレームワーク領域に位置する０個〜１０個（例えば０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個）のアミノ酸置換を含み、配列番号２６に示されるような重鎖の定常ドメインが、０個〜１０個（例えば０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個）のアミノ酸置換を含む、膜結合型の重鎖、及び（ａ２）配列番号２に記載の可溶型の重鎖であって、配列番号３に示されるような重鎖の可変ドメインＶＨが、ＶＨのフレームワーク領域に位置する０個〜１０個（例えば０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個）のアミノ酸置換を含み、配列番号２７に示されるような重鎖の定常ドメインが、０個〜１０個（例えば０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個）のアミノ酸置換を含む、可溶型の重鎖からなる群から選択される、ｈｕＨＥＡ１２５の重鎖、並びに（ｂ）配列番号１１に記載のｈｕＨＥＡ１２５の軽鎖であって、配列番号１２に示されるような軽鎖の可変ドメインＶＬが、ＶＬのフレームワーク領域に位置する０個〜１０個（例えば０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個）のアミノ酸置換を含み、配列番号２８に示されるような軽鎖の定常ドメインＣＬが、０個〜１０個（例えば０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個）のアミノ酸置換を含む、ｈｕＨＥＡ１２５の軽鎖を含む。
【００６０】
第２の態様の好ましい一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、（ａ）ｈｕＨＥＡ１２５の重鎖であって、（ａ１）配列番号１に記載の膜結合型の重鎖、及び（ａ２）配列番号２に記載の可溶型の重鎖からなる群から選択される、ｈｕＨＥＡ１２５の重鎖、並びに（ｂ）配列番号１１に記載のｈｕＨＥＡ１２５の軽鎖を含む。
【００６１】
第２の態様の好ましい一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、キメラ抗体、脱免疫化抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体から選択される。第２の態様の好ましい一実施形態では、抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｄからなる群から選択される。
【００６２】
第２の態様の好ましい一実施形態では、抗体は、ｈｕＨＥＡ１２５又はその抗原結合断片である。
【００６３】
第２の態様の好ましい一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、ヒトＥｐＣＡＭと特異的に結合する。
【００６４】
第２の態様の好ましい一実施形態では、アマトキシンは、α−アマニチン、β−アマニチン、γ−アマニチン、ε−アマニチン、アマニン、アマニンアミド、アマヌリン及びアマヌリン酸（全て図１に示される）、並びにその塩、化学的誘導体、半合成類縁体及び合成類縁体から選択される。特に好ましいアマトキシンは、α−アマニチン、β−アマニチン及びアマニンアミド、並びにその塩、化学的誘導体、半合成類縁体及び合成類縁体である。
【００６５】
第２の態様の好ましい一実施形態では、アマトキシンは、アマトキシンのアミノ酸３のδＣ原子を介して、抗体と、又は存在する場合リンカーＬ２と連結される（図１を参照されたい）。本発明において使用可能な好ましいアマトキシンでは、上記アミノ酸３は、イソロイシン、γ−ヒドロキシ−イソロイシン又はγ，δ−ジヒドロキシ−イソロイシンである。
【００６６】
第２の態様の好ましい実施形態では、アマトキシンは、アマトキシンのアミノ酸３のδＣ原子と結合した酸素原子を介して、抗体と、又は存在する場合リンカーＬ２と連結される。アマトキシンが、エステル結合、エーテル結合又はウレタン結合を介して、抗体と、又は存在する場合リンカーＬ２と連結されることがさらに好ましい。これらの実施形態では、アミノ酸３がγ，δ−ジヒドロキシ−イソロイシンであることが好ましい。
【００６７】
第２の態様の好ましい実施形態では、抗体は、該抗体に存在するアミノ基を介して、アマトキシンと、又は存在する場合リンカーＬ２と連結される。
【００６８】
第２の態様の好ましい一実施形態では、リンカーＬ２は、任意に置換されたアルキル基、ヘテロアルキル基、アルケニル基、ヘテロアルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキニル基、シクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アラルキル基又はヘテロアラルキル基である。第２の態様のさらに好ましい実施形態では、リンカーＬ２は、ジスルフィド結合を含む。
【００６９】
第３の態様では、本発明は、医療における使用のための第２の態様の複合体に関する。
【００７０】
第４の態様では、本発明は、患者におけるがんの治療のための第２の態様の複合体であって、該がんが、膵臓がん、胆管癌、乳がん及び結腸直腸がんからなる群から選択される、複合体に関する。
【００７１】
第５の態様では、本発明は、患者におけるがんの治療用の医薬組成物の調製のための第２の態様の複合体であって、該がんが、膵臓がん、胆管癌、乳がん及び結腸直腸がんからなる群から選択される、複合体に関する。
【００７２】
第５の態様では、本発明は、標的結合部分毒素複合体であって、（ｉ）標的結合部分、（ｉｉ）アマトキシン、及び（ｉｉｉ）任意にリンカーＬ３を含み、アマトキシンが、アマトキシンのアミノ酸３、好ましくはアマトキシンのアミノ酸３のδＣ原子を介して、標的結合部分と、又は存在する場合リンカーＬ３と連結される、標的結合部分毒素複合体に関する（図１を参照されたい）。本発明において使用可能な好ましいアマトキシンでは、上記アミノ酸３は、イソロイシン、γ−ヒドロキシ−イソロイシン又はγ，δ−ジヒドロキシ−イソロイシンである。
【００７３】
第５の態様の好ましい一実施形態では、アマトキシンは、アマトキシンのアミノ酸３のδＣ原子と結合した酸素原子を介して、標的結合部分と、又は存在する場合リンカーＬ３と連結される。アマトキシンが、エステル結合、好ましくはアマトキシン−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｌ３−標的結合部分若しくはアマトキシン−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−標的結合部分、より好ましくはアマトキシン−δＣ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｌ３−標的結合部分若しくはアマトキシン−δＣ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−標的結合部分、最も好ましくはアマトキシン−δＣＨ２−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｌ３−標的結合部分若しくはアマトキシン−δＣＨ２−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−標的結合部分の形態のエステル結合、エーテル結合、好ましくはアマトキシン−Ｏ−Ｌ３−標的結合部分若しくはアマトキシン−Ｏ−標的結合部分、好ましくはアマトキシン−δＣ−Ｏ−Ｌ３−標的結合部分若しくはアマトキシン−δＣ−Ｏ−標的結合部分、より好ましくはアマトキシン−δＣＨ２−Ｏ−Ｌ３−標的結合部分若しくはアマトキシン−δＣＨ２−Ｏ−標的結合部分の形態のエーテル結合、又はウレタン結合、好ましくはアマトキシン−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｌ３−標的結合部分若しくはアマトキシン−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−標的結合部分、好ましくはアマトキシン−δＣ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｌ３−標的結合部分若しくはアマトキシン−δＣ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−標的結合部分、すなわちアマトキシン−δＣＨ２−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｌ３−標的結合部分若しくはアマトキシン−δＣＨ２−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−標的結合部分の形態のウレタン結合を介して、標的結合部分と、又は存在する場合リンカーＬ３と連結されることがさらに好ましい。これらの実施形態では、アミノ酸３がγ，δ−ジヒドロキシ−イソロイシンであることが好ましい。
【００７４】
第５の態様の好ましい実施形態では、リンカーＬ３が存在し、複合体が以下の構造：（ｉ）アマトキシン−δＣ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｌ３−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−標的結合部分、（ｉｉ）アマトキシン−δＣ−Ｏ−Ｌ３−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−標的結合部分、又は（ｉｉｉ）アマトキシン−δＣ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｌ３−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−標的結合部分、好ましくは（ｉ）アマトキシン−δＣＨ２−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｌ３−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−標的結合部分、（ｉｉ）アマトキシン−δＣＨ２−Ｏ−Ｌ３−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−標的結合部分、又は（ｉｉｉ）アマトキシン−δＣＨ２−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｌ３−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−標的結合部分のうちの１つを有する。
【００７５】
第５の態様の好ましい一実施形態では、標的結合部分は、該標的結合部分に存在するアミノ基を介して、アマトキシンと、又は存在する場合リンカーＬ３と連結される。
【００７６】
第５の態様の好ましい一実施形態では、アマトキシンは、α−アマニチン、β−アマニチン、γ−アマニチン、ε−アマニチン、アマニン、アマニンアミド、アマヌリン又はアマヌリン酸（全て図１に示される）、並びにその塩、化学的誘導体、半合成類縁体及び合成類縁体から選択される。特に好ましいアマトキシンは、α−アマニチン、β−アマニチン及びアマニンアミド、並びにその塩、化学的誘導体、半合成類縁体及び合成類縁体である。
【００７７】
第５の態様の好ましい一実施形態では、リンカーＬ３は、任意に置換されたアルキル基、ヘテロアルキル基、アルケニル基、ヘテロアルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキニル基、シクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アラルキル基又はヘテロアラルキル基である。第５の態様のさらに好ましい実施形態では、リンカーＬ３は、ジスルフィド結合を含む。
【００７８】
第５の態様の好ましい一実施形態では、標的結合部分は、腫瘍細胞上に存在するエピトープと特異的に結合する。標的結合部分が上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）のエピトープと特異的に結合することが特に好ましい。
【００７９】
第５の態様の好ましい一実施形態では、標的結合部分は、（ｉ）抗体又はその抗原結合断片、（ｉｉ）抗体様タンパク質、及び（ｉｉｉ）核酸アプタマーからなる群から選択される。好ましい一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、ダイアボディ、テトラボディ、ナノボディ、キメラ抗体、脱免疫化抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体から選択される。好ましい一実施形態では、抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ、及びジスルフィド結合したＦｖ（ｄｓＦｖ）からなる群から選択される。好ましい一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、（ａ）ｈｕＨＥＡ１２５の膜結合型の重鎖（配列番号１）、若しくはｈｕＨＥＡ１２５の可溶型の重鎖（配列番号２）、及び／又は（ｂ）ｈｕＨＥＡ１２５の軽鎖（配列番号１１）を含む。
【００８０】
第６の態様では、本発明は、医療における使用のための第５の態様による標的結合部分毒素複合体に関する。
【００８１】
第７の態様では、本発明は、患者におけるがんの治療のための第５の態様による標的結合部分毒素複合体であって、該がんが、膵臓がん、胆管癌、乳がん、結腸直腸がん、肺がん、前立腺がん、卵巣がん、胃がん、腎臓がん、悪性黒色腫、白血病及び悪性リンパ腫からなる群から選択される、標的結合部分毒素複合体に関する。
【００８２】
第８の態様では、本発明は、第１の態様の若しくは第２の態様の抗体毒素複合体、又は第５の態様による標的結合部分毒素複合体を含み、１つ又は複数の薬学的に許容可能な希釈剤、担体、賦形剤、充填剤、結合剤、滑剤、流動促進剤、崩壊剤、吸着剤、及び／又は保存料をさらに含む医薬組成物に関する。
【００８３】
第５の実施形態〜第７の実施形態の標的結合部分は、好ましい実施形態では、タンパク質、特に抗体である。タンパク質、特に抗体は、アマトキシンの結合を可能にする幾つかのアミノ酸を含んでいるであろう。好ましいアミノ酸は、遊離のアミノ基、ヒドロキシ基又はカルボニル基を有するものであり、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ及びＳｅｒを含む。したがって、２個以上のアマトキシン分子を１個のタンパク質分子と結合することが可能である。１分子当たりのアマトキシン数の増大により、毒性も増大する。したがって、好ましい一実施形態では、第１の実施形態〜第４の実施形態の抗体及び第５の実施形態〜第７の実施形態の標的結合部分対アマトキシンの比は、タンパク質１分子対アマトキシン１分子〜１５分子、好ましくは１分子、２分子、３分子、４分子、５分子、６分子、７分子、８分子、９分子、１０分子、１１分子、１２分子、１３分子、１４分子又は１５分子である。二量体ＩｇＧのような二量体の場合において比を算出する目的では、二量体は１分子とみなす。標的結合部分がタンパク質ではない場合であっても、同様の比が好ましい。
【００８４】
第８の態様の医薬組成物を、全身的に投与される医薬品の形態で使用することができることが特に好ましい。これらは、特に注射剤及び注入剤を含む非経口剤を含む。注射剤は、アンプルの形態で、又はいわゆる即用可能な（ready-for-use）注射剤、例えば即用可能な注射器若しくは使い捨ての注射器として、及びこれに加えて複数回の抜取りを行うための穿刺用フラスコ中に製剤化される。注射剤の投与は、皮下（s.c.）、筋肉内（i.m.）、静脈内（i.v.）又は皮内（i.c.）の適用の形態であり得る。特に、結晶の懸濁液、溶液、ナノ粒子又はコロイド分散系（例えばハイドロゾルのような）としてそれぞれ好適な注射製剤を製造することが可能である。
【００８５】
注射用製剤はさらに、水性等張希釈剤を用いて溶解又は分散させることができる濃縮物として製造することができる。注入剤を、等張溶液、脂肪性エマルション、リポソーム製剤及びマイクロエマルションの形態で調製することもできる。注射剤と同様に、注入製剤を、希釈用濃縮物の形態で調製することもできる。注射用製剤を、例えばミニポンプにより、入院療法及び通院療法の両方において持続性注入剤の形態で適用することもできる。
【００８６】
例えばアルブミン、血漿、増量剤、界面活性物質、有機希釈剤、ｐＨ調整物質（pH-influencing substances）、錯体形成物質若しくは高分子物質を、特にタンパク質若しくは高分子に対する本発明の標的結合部分毒素複合体の吸着に影響を与えるための物質として、非経口薬剤配合物に添加することが可能であり、又は本発明の標的結合部分毒素複合体の吸着を低減させる目的で、注射機器のような材料、若しくは包装用材料、例えばプラスチック若しくはガラスにこれらを添加することもできる。
【００８７】
本発明の標的結合部分毒素複合体を、非経口剤におけるマイクロキャリア又はナノ粒子と、例えば、ポリ（メタ）アクリレート、ポリラクテート、ポリグリコレート、ポリアミノ酸又はポリエーテルウレタンに基づく微分散粒子等と結合させることができる。本発明の標的結合部分毒素複合体をそれぞれ微分散形態、分散形態及び懸濁形態で導入する場合、例えば「複数単位原理（multiple unit principle）」に基づき持続性製剤として、又は本発明の標的結合部分毒素複合体を製剤中に、例えば錠剤若しくは棒剤（rod）（その後埋め込まれる）中に封入する場合、医薬品中の結晶の懸濁液として若しくは「単一単位原理」に基づき、非経口製剤を変更することもできる。単一単位製剤及び複数単位製剤のこれらの埋め込み剤又は持続性医薬品は多くの場合、いわゆる生分解性高分子、例えば乳酸及びグリコール酸のポリエステル、ポリエーテルウレタン、ポリアミノ酸、ポリ（メタ）アクリレート、又は多糖等からなる。
【００８８】
非経口剤として製剤化される本発明の医薬組成物の製造時に添加される補助剤及び担体は、好ましくは滅菌水（aqua sterilisata(sterilized water)）、ｐＨ値調整物質、例えば有機酸若しくは無機酸若しくは有機塩基若しくは無機塩基及びそれらの塩等、ｐＨ値調整用の緩衝物質、等張化用の物質、例えば塩化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、グルコース及びフルクトース等、それぞれテンシド（tensides）及び界面活性剤、並びに乳化剤、例えばポリオキシエチレンソルビタンの脂肪酸の部分エステル（例えばＴｗｅｅｎ（登録商標））、若しくは例えばポリオキシエチレンの脂肪酸エステル（例えばＣｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標））等、脂肪油、例えば落花生油、大豆油若しくはヒマシ油等、脂肪酸の合成エステル、例えばオレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル及び中性油（例えばＭｉｇｌｙｏｌ（登録商標））等、並びに高分子補助剤、例えばゼラチン、デキストラン、ポリビニルピロリドン等、有機溶媒の溶解度を増大させる添加剤、例えばプロピレングリコール、エタノール、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、プロピレングリコール等、又は錯体形成物質、例えばシトレート及び尿素等、保存料、例えば安息香酸ヒドロキシプロピルエステル及びメチルエステル、ベンジルアルコール等、抗酸化剤、例えば亜硫酸ナトリウム等、並びに安定化剤、例えばＥＤＴＡ等である。
【００８９】
好ましい一実施形態において懸濁液として本発明の医薬組成物を製剤化する場合、本発明の標的結合部分毒素複合体の硬化を防止するための増粘剤、又はテンシド、及び堆積物の再懸濁能を確保するための高分子電解質、及び／又は錯体形成剤、例えばＥＤＴＡ等を添加する。様々な高分子との活性成分の複合体を得ることも可能である。かかる高分子の例は、ポリエチレングリコール、ポリスチロール、カルボキシメチルセルロース、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（登録商標）又はポリエチレングリコールソルビット脂肪酸エステルである。本発明の標的結合部分毒素複合体を、包接化合物（例えばシクロデキストリンによる）の形態で液体製剤中に組み込むこともできる。特定の実施形態では、分散剤を、さらなる補助剤として添加することができる。凍結乾燥物の製造のために、足場剤（scaffolding agents）、例えばマンニット、デキストラン、サッカロース、ヒトアルブミン、ラクトース、ＰＶＰ、又は様々なゼラチンを使用することができる。
【００９０】
さらなる一態様では、本発明は、それを必要とする患者において膵臓がん、胆管癌又は結腸直腸がんを治療する方法であって、第１の態様において規定されるような抗体毒素複合体を有効量該患者に投与することを含む、方法に関する。
【００９１】
さらなる一態様では、本発明は、それを必要とする患者において膵臓がん、胆管癌、乳がん又は結腸直腸がんを治療する方法であって、第３の態様において規定されるような抗体毒素複合体を有効量該患者に投与することを含む、方法に関する。
【００９２】
さらなる一態様では、本発明は、それを必要とする患者において膵臓がん、胆管癌、乳がん又は結腸直腸がんを治療する方法であって、第５の態様において規定されるような標的結合部分毒素複合体を有効量該患者に投与することを含む、方法に関する。
【実施例】
【００９３】
以下で、非限定的な実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。
【００９４】
実施例１：抗体ｈｕＨＥＡ１２５と抗体毒素複合体アマニチン−ｈｕＨＥＡ１２５との間の標的細胞に対する結合親和性の比較
１．１  キメラ抗体ｈｕＨＥＡ１２５
数年前に、本発明者らは、抗ＥｐＣＡＭマウスモノクローナル抗体ＨＥＡ１２５を分泌するハイブリドーマ細胞株を樹立した（Moldenhauer etal., 1987、Momburg et al., 1987）。分子生物学的技法を使用して、このハイブリドーマ株を再構築して、ヒトカッパ定常軽鎖及びヒトＩｇＧ１定常重鎖と連結した（hooked up）マウス可変ドメインからなるキメラ型の抗体を作製した。得られた抗体ｈｕＨＥＡ１２５は、高親和性（Ｋｄ＝２．２×１０−９Ｍ）及び高特異性でＥｐＣＡＭを発現する細胞と結合する。ｈｕＨＥＡ１２５免疫グロブリンの遺伝子配列及びアミノ酸配列を以下に示す：
【００９５】
ｈｕＨＥＡ１２５重鎖
ペプチド配列  重鎖、膜結合型（ＩＧＨＶ／ＩＧＨＤ／ＩＧＨＪ／ＩＧＨＧ１；ＩＧＨＧ１に下線を付す）（配列番号１）：
EVKLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFDFSRFWMTWVRQAPGKGLEWIGEINLDSSTINYTPSLKDKFIISRDNAKNTLFLQMSKVRSEDTALYYCSRGISMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGLQLDETCAEAQDGELDGLWTTITIFISLFLLSVCYSAAVTLFKVKWIFSSVVELKQTLVPEYKNMIGQAP
【００９６】
ペプチド配列  重鎖、分泌型（配列番号２）：
EVKLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFDFSRFWMTWVRQAPGKGLEWIGEINLDSSTINYTPSLKDKFIISRDNAKNTLFLQMSKVRSEDTALYYCSRGISMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
【００９７】
ペプチド配列（ＩＧＨＶ／ＩＧＨＤ／ＩＧＨＪ＝ＶＨドメイン；フレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４に下線を付す）（配列番号３）：
EVKLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFDFSRFWMTWVRQAPGKGLEWIGEINLDSSTINYTPSLKDKFIISRDNAKNTLFLQMSKVRSEDTALYYCSRGISMDYWGQGTSVTVSS
【００９８】
核酸配列（ＩＭＧＴ命名法に従い注釈される、ＩＧＨＶ／ＩＧＨＤ／ＩＧＨＪ；ＩＧＨＤに下線を付す；ＩＧＨＪに二重下線を付す）：
【表１】
2012523383.tif 000003
【００９９】
ｈｕＨＥＡ１２５軽鎖
ペプチド配列  軽鎖（ＩＧＫＶ／ＩＧＫＪ／ＩＧＫＣ；ＩＧＫＣに下線を付す）（配列番号１１）：
DILLTQSPAILSVSPGERVSFSCRASQSIGISLHWYQQRPSDSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQSNIWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【０１００】
ペプチド配列（ＩＧＫＶ／ＩＧＫＪ＝ＶＬドメイン；フレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４に下線を付す）（配列番号１２）：
DILLTQSPAILSVSPGERVSFSCRASQSIGISLHWYQQRPSDSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQSNIWPTTFGAGTKLELK
【０１０１】
核酸配列（ＩＭＧＴ命名法に従い注釈される、ＩＧＫＶ／ＩＧＫＪ；ＩＧＫＶに下線を付す；ＩＧＫＪに二重下線を付す）：
【表２】
2012523383.tif 000004
【０１０２】
１．２  対照抗体Ｘｏｌａｉｒ（登録商標）
対照抗体Ｘｏｌａｉｒ（登録商標）（オマリズマブ、ヒトＩｇＥ免疫グロブリンに指向性を有するヒトＩｇＧ１抗体）は、Novartis（Germany）により製造されたものである。
【０１０３】
１．３  α−アマニチン抗体複合体の合成
１．３．１  α−アマニチン−グルタレートの合成
Ｐ４Ｏ１０で真空乾燥した３．０ｍｇ（３．３μｍｏｌ）のα−アマニチンを、０．２５ｍｌの乾燥ピリジンに溶解し、０．１ｍｌのピリジン中の０．９ｍｇ（７９μｍｏｌ）のグルタル酸無水物と、暗所にて室温で２４時間反応させた。ペプチドを、７ｍｌの乾燥ジエチルエーテルの添加により沈殿させ、遠心分離し、固体を再度ジエチルエーテルで洗浄し、遠心分離した。
【０１０４】
この反応により、Ｒ１＝−ＯＨ（図１における）がＲ１＝−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）３−ＣＯＯＨにより置き換えられたα−アマニチン誘導体が得られる。
【０１０５】
１．３．２  α−アマニチン−グルタル酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミデートの合成
３．４ｍｇのα−アマニチングルタレート（３．３μｍｏｌ）を０．０５ｍｌの乾燥ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、０．０１ｍｌのＤＭＦに溶解した２．４ｍｇ（７等量）のＮ−ヒドロキシ−スクシンイミドを添加した。０．０１ｍｌのＤＭＦ中の１．２ｍｇのジシクロヘキシルカルボジイミドの添加後、反応を室温で１６時間進行させた。形成した結晶と溶液を分離し、４ｍｌの乾燥ジエチルエーテルの添加によりペプチドを沈殿させた。遠心分離後、ペレットをさらに４ｍｌのエーテルで洗浄し、遠心分離した。固体を０．１ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解し、直ちに抗体溶液との反応に使用した。
【０１０６】
１．３．３  α−アマニチン−グルタレート−ｈｕＨＥＡ１２５の合成
３．０ｍｇのα−アマニチン−グルタル酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミデートの溶液０．１ｍｌを、５ｍｌのＰＢＳ中の１０ｍｇのｈｕ−ＨＥＡ１２５抗体に添加し、暗所にて５℃でゆっくりと回転させながら反応させた。１６時間後、溶液をＰＢＳで平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５カラム（１２０×１．５ｃｍ）にアプライし、タンパク質画分を収集した。アマニチン負荷量を、アマトキシンに関するモル吸光係数１３，５００ｃｍ−１Ｍ−１を使用して、同濃度の未反応（native）抗体を含有するブランクに対するタンパク質溶液の３１０ｎｍでの吸光度の差異から分光光度的に決定した。この調製物のα−アマニチン：ＩｇＧ比は、約８であった。
【０１０７】
１．４  結合競合分析
アマニチン−ｈｕＨＥＡ１２５複合体対複合体形成していないｈｕＨＥＡ１２５抗体の結合を、フローサイトメトリーにより競合実験において分析した。α−アマニチン−ｈｕＨＥＡ１２５複合体を、１．３．１節〜１．３．３節において上で記載されるように合成した。
【０１０８】
Ｃｏｌｏ２０５標的細胞（結腸がん転移）を、ＦＡＣＳ緩衝液（１％の熱失活させたウシ胎児血清及び０．１％のアジ化ナトリウムを有するダルベッコＰＢＳ）で２回洗浄し、細胞の数を数え、１ｍｌ当たりの細胞数２×１０７個に調整した。５０μｌの細胞懸濁液を、５０μｌ／ウェルのＦＩＴＣ標識したｈｕＨＥＡ１２５抗体をピペット添加した９６ウェルＵ底マイクロタイタープレートの各ウェルに加えた。４００μｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ（最終希釈液）の範囲のアマニチン−ｈｕＨＥＡ１２５又はｈｕＨＥＡ１２５の段階希釈液を、５０μｌ／ウェルの容量で三連で添加し、氷上で１時間インキュベートした。その後、プレートを遠心分離し（２０００ｒｐｍで２分）、上清を細胞から除去した。細胞を１５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、再度遠心分離した。遠心分離による２回の洗浄工程の後、細胞を１００μｌ／ウェルのヨウ化プロピジウム溶液（ＦＡＣＳ緩衝液中１μｇ／ｍｌ）中に移し、死細胞を判別した。分析を、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを使用するＦＡＣＳｃａｎサイトメーター（Becton and Dickinson（Heidelberg, Germany））で行った。
【０１０９】
図２に示されるように、漸増量のｈｕＨＥＡ１２５−アマニチン複合体又は非改変ｈｕＨＥＡ１２５抗体による標的細胞に対する結合の競合により、競合する抗体又は抗体複合体の１０ｎｇ／ｍｌ〜４００μｇ／ｍｌの全濃度範囲にわたる同程度の結合強度が明らかとなった。したがって、複合体形成手順は、標的細胞に対するｈｕＨＥＡ１２５−アマニチンの親和性を顕著には変化させない。
【０１１０】
実施例２：間接的な免疫蛍光により検出される様々な癌細胞株上におけるＥｐＣＡＭ抗原の表面発現
初めに、細胞株Ｃａｐａｎ−１、Ｃｏｌｏ２０５、ＯＺ、ＭＣＦ−７、ＢｘＰＣ−３及びＰＣ−３を、ｈｕＨＥＡ１２５又はＸｏｌａｉｒ（登録商標）と共にインキュベートした。洗浄後、一次抗体の結合を、第２工程の試薬としてのＦＩＴＣ標識したヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）のＦ（ａｂ’）２により可視化した。結果を、図３Ａ（Ｃａｐａｎ−１）、図３Ｂ（Ｃｏｌｏ２０５）、図３Ｃ（ＯＺ）、図３Ｄ（ＭＣＦ−７）、図３Ｅ（ＢｘＰＣ−３）及び図３Ｆ（ＰＣ−３）に示す。各図の左側における灰色の影付きのヒストグラムは、対照抗体Ｘｏｌａｉｒ（登録商標）により得られた結果を示す。各図の右側における白色の領域を有するヒストグラムは、抗体ｈｕＨＥＡ１２５により得られた結果を示す。
【０１１１】
実施例３：アマニチン及びアマニチン／抗体複合体による癌細胞増殖阻害の誘導
３．１  癌細胞株
以下の癌細胞株を成長阻害研究のために使用した：
Ｃａｐａｎ−１、ＢｘＰＣ−３  ヒト膵臓腺癌
ＭＣＦ−７                    ヒト乳腺癌
Ｃｏｌｏ２０５                ヒト結腸がん転移
ＯＺ                          ヒト胆管癌
ＰＣ−３                      ヒト前立腺腺癌
【０１１２】
３．２  増殖阻害アッセイ
アマニチン−ＩｇＧ複合体による細胞成長の阻害を、［３Ｈ］−チミジンの取り込みにより決定した。完全培地（１０％の熱失活させたＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、及び１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを添加したＲＰＭＩ１６４０）中における２×１０−５Ｍ〜６×１０−１３Ｍの範囲のアマニチン−ｈｕＨＥＡ１２５、アマニチン−Ｘｏｌａｉｒ、及び遊離のアマニチンの段階希釈液を、９６ウェル平底組織培養マイクロタイタープレートのウェルにおける１００μｌの容量で三連で調製した。細胞を、１ｍｌ当たり２×１０４個の密度、１ウェル当たり５０μｌの容量で添加した。プレートを、加湿雰囲気中、３７℃及び５％ＣＯ２下で７２時間又は９６時間インキュベートした。アッセイ終了の２０時間前に、１μＣｉの［３Ｈ］−チミジンを添加した。その後、プレートをＴｏｍｔｅｃセルハーベスターにより処理し、取り込まれた放射活性を液体シンチレーション計測（Ｗａｌｌａｃ  Ｂｅｔａｐｌａｔｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（PerkinElmer Life and Analytical Sciences））により決定し、ｃｐｍで表した。
【０１１３】
膵臓癌細胞株Ｃａｐａｎ−１の場合には、ｈｕＨＥＡ１２５−アマニチン免疫毒素は、図４に示されるように１×１０−１１Ｍ〜３×１０−１０Ｍのアマニチン濃度で成長停止を誘導した。
【０１１４】
結腸がん細胞株Ｃｏｌｏ２０５の場合には、ｈｕＨＥＡ１２５−アマニチン免疫毒素は、図５に示されるように１×１０−１２Ｍ〜４×１０−１１Ｍのアマニチン濃度で成長停止を誘導した。
【０１１５】
乳がん細胞株ＭＣＦ−７の場合には、ｈｕＨＥＡ１２５−アマニチン免疫毒素は、図６に示されるように１×１０−１２Ｍ〜１×１０−１１Ｍのアマニチン濃度で成長停止を誘導した。
【０１１６】
胆管癌細胞株ＯＺの場合には、ｈｕＨＥＡ１２５−アマニチン免疫毒素は、図７に示されるように１×１０−１１Ｍ〜６×１０−１０Ｍのアマニチン濃度で成長停止を誘導した。
【０１１７】
膵臓細胞株ＢｘＰＣ−３の場合には、ｈｕＨＥＡ１２５−アマニチン免疫毒素は、図８に示されるように２×１０−１１Ｍ〜６×１０−１０Ｍのアマニチン濃度で成長停止を誘導した。
【０１１８】
実施例４：２つの異種移植マウス腫瘍モデルを使用するアマニチン／抗体複合体によるｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍の成長の阻害
５週齢〜６週齢の免疫不全ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを全実験に使用した。ＢｘＰＣ−３膵臓腫瘍細胞又はＰＣ−３前立腺腫瘍細胞（１００μｌ  ＰＢＳ中５×１０６個）を、マウスの右側腹部の皮下に移植した。１０日後、ＢｘＰＣ−３腫瘍が３０ｍｍ３〜８０ｍｍ３の体積に到達し、ＰＣ−３腫瘍が４０ｍｍ３〜１９０ｍｍ３の体積に到達した時に、処理を開始した。動物に、対照ｈｕＨＥＡ１２５モノクローナル抗体を１５ｍｇ／ｋｇの用量で、又はｈｕＨＥＡ１２５−アマニチン複合体（ｈｕＨＥＡ１２５−Ａｍａ）を５０μｇ／ｋｇのアマニチンの用量で投与した。抗体及び複合体は、単回腹腔内注射剤として投与した。
【０１１９】
腫瘍の成長を、処理の開始後１６日間モニタリングした。３日に１回、ノギスを使用して外側から腫瘍サイズを測定した。式：Ｖ＝π／６×ａ×ｂ×ｃ（式中、ａ、ｂ及びｃは三次元における直径である）に従って腫瘍体積を算出した。データを、抗体投与時からの相対的な腫瘍サイズ／体積の増大として表す。
【０１２０】
５０μｇ／ｋｇのアマニチンの用量でのｈｕＨＥＡ１２５−Ａｍａの投与は、ＢｘＰＣ−３腫瘍を保有するマウスで耐容性が良好であった（ｎ＝６）。マウスの体重の減少も、肝酵素の上昇も起こらなかった（実験の最終日に血清中のＬＤＨ、ＡＬＴ、ＡＳＴ及びＡＰを測定した）。腫瘍の成長は、この用量の複合体により強く阻害された。全てのマウスが処理に応答し、腫瘍体積は複合体の投与後７日目から劇的に消失した。１６日目の経過観察の終了時に、腫瘍は５０％のマウスにおいて完全に根絶された。対照的に、複合体形成していないｈｕＨＥＡ１２５モノクローナル抗体を投与された対照マウスでは、腫瘍体積はおよそ８８０％増大した（図９）。
【０１２１】
ＰＣ−３腫瘍を保有するマウスの場合には、５０μｇ／ｋｇのアマニチンの用量のｈｕＨＥＡ１２５−Ａｍａは耐容性が良好であった。マウスの体重の減少は観察されなかった。腫瘍の成長はこの用量の複合体により大幅に遅延化した。ｈｕＨＥＡ１２５−Ａｍａ投与の１０日後、腫瘍体積は、処理の開始時の腫瘍体積と同様であった。対照的に、複合体形成していないｈｕＨＥＡ１２５モノクローナル抗体を投与された対照マウスでは、腫瘍体積はおよそ５５０％増大した。実験は、対照群の腫瘍サイズが大きいために処理後１０日目で終了した（図１０）。
【０１２２】
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【０１２３】
配列リスト−フリーテキストの情報
配列番号１：キメラ抗体ｈｕＨＥＡ１２５、重鎖、膜結合型
配列番号２：キメラ抗体ｈｕＨＥＡ１２５、重鎖、分泌型
配列番号３：キメラ抗体ｈｕＨＥＡ１２５、重鎖、ＶＨドメイン
配列番号４：キメラ抗体ｈｕＨＥＡ１２５、重鎖、ＦＲ１セグメント
配列番号５：キメラ抗体ｈｕＨＥＡ１２５、重鎖、ＣＤＲ１セグメント
配列番号６：キメラ抗体ｈｕＨＥＡ１２５、重鎖、ＦＲ２セグメント
配列番号７：キメラ抗体ｈｕＨＥＡ１２５、重鎖、ＣＤＲ２セグメント
配列番号８：キメラ抗体ｈｕＨＥＡ１２５、重鎖、ＦＲ３セグメント
配列番号９：キメラ抗体ｈｕＨＥＡ１２５、重鎖、ＣＤＲ３セグメント
配列番号１０：キメラ抗体ｈｕＨＥＡ１２５、重鎖、ＦＲ４セグメント
配列番号１１：キメラ抗体ｈｕＨＥＡ１２５、軽鎖
配列番号１２：キメラ抗体ｈｕＨＥＡ１２５、軽鎖、ＶＬドメイン
配列番号１３：キメラ抗体ｈｕＨＥＡ１２５、軽鎖、ＦＲ１セグメント
配列番号１４：キメラ抗体ｈｕＨＥＡ１２５、軽鎖、ＣＤＲ１セグメント
配列番号１５：キメラ抗体ｈｕＨＥＡ１２５、軽鎖、ＦＲ２セグメント
配列番号１６：キメラ抗体ｈｕＨＥＡ１２５、軽鎖、ＣＤＲ２セグメント
配列番号１７：キメラ抗体ｈｕＨＥＡ１２５、軽鎖、ＦＲ３セグメント
配列番号１８：キメラ抗体ｈｕＨＥＡ１２５、軽鎖、ＣＤＲ３セグメント
配列番号１９：キメラ抗体ｈｕＨＥＡ１２５、軽鎖、ＦＲ４セグメント
配列番号２０：キメラ抗体ｈｕＨＥＡ１２５、重鎖、ＣＤＲ１ドメイン
配列番号２１：キメラ抗体ｈｕＨＥＡ１２５、重鎖、ＣＤＲ２ドメイン
配列番号２２：キメラ抗体ｈｕＨＥＡ１２５、重鎖、ＣＤＲ３ドメイン
配列番号２３：キメラ抗体ｈｕＨＥＡ１２５、軽鎖、ＣＤＲ１ドメイン
配列番号２４：キメラ抗体ｈｕＨＥＡ１２５、軽鎖、ＣＤＲ２ドメイン
配列番号２５：キメラ抗体ｈｕＨＥＡ１２５、軽鎖、ＣＤＲ３ドメイン
配列番号２６：キメラ抗体ｈｕＨＥＡ１２５、重鎖、定常ドメイン、膜結合型
配列番号２７：キメラ抗体ｈｕＨＥＡ１２５、重鎖、定常ドメイン、分泌型
配列番号２８：キメラ抗体ｈｕＨＥＡ１２５、軽鎖、定常ドメイン
【図１】
2012523383.tif 000005
【図２】
2012523383.tif 000006
【図３Ａ】
2012523383.tif 000007
【図３Ｂ】
2012523383.tif 000008
【図３Ｃ】
2012523383.tif 000009
【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
2012523383.tif 000011
【図３Ｆ】
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【図４】
2012523383.tif 000013
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2012523383.tif 000017
【図９】
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【図１０】
2012523383.tif 000019
【配列表】
2012523383000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成23年2月4日(2011.2.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者における膵臓がん、胆管癌又は結腸直腸がんの治療のための抗体毒素複合体であって、
（ｉ）上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）のエピトープと特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片、
（ｉｉ）アマトキシン、及び
（ｉｉｉ）任意にリンカーＬ１
を含む、抗体毒素複合体。
【請求項２】
抗体又はその抗原結合断片が、ダイアボディ、テトラボディ、ナノボディ、キメラ抗体、脱免疫化抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体から選択される、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
抗原結合断片が、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ、及びジスルフィド結合したＦｖ（ｄｓＦｖ）からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の複合体。
【請求項４】
ＥｐＣＡＭのエピトープがヒトＥｐＣＡＭのエピトープである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項５】
抗体又はその抗原結合断片が、
（ａ）ｈｕＨＥＡ１２５の重鎖のＣＤＲ３ドメイン（配列番号２２）、及び／又は
（ｂ）ｈｕＨＥＡ１２５の軽鎖のＣＤＲ３ドメイン（配列番号２５）
を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項６】
抗体又はその抗原結合断片が、
（ａ）ｈｕＨＥＡ１２５の重鎖のＣＤＲ２ドメイン（配列番号２１）、
（ｂ）ｈｕＨＥＡ１２５の重鎖のＣＤＲ１ドメイン（配列番号２０）、
（ｃ）ｈｕＨＥＡ１２５の軽鎖のＣＤＲ２ドメイン（配列番号２４）、及び
（ｄ）ｈｕＨＥＡ１２５の軽鎖のＣＤＲ１ドメイン（配列番号２３）
のうち１つ又は複数をさらに含む、請求項５に記載の複合体。
【請求項７】
抗体又はその抗原結合断片が、ｈｕＨＥＡ１２５のＶＨドメイン（配列番号３）、及び／又はｈｕＨＥＡ１２５のＶＬドメイン（配列番号１２）を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項８】
抗体又はその抗原結合断片が、
（ａ）ｈｕＨＥＡ１２５の膜結合型の重鎖（配列番号１）、若しくはｈｕＨＥＡ１２５の可溶型の重鎖（配列番号２）、及び／又は
（ｂ）ｈｕＨＥＡ１２５の軽鎖（配列番号１１）
を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項９】
アマトキシンが、α−アマニチン、β−アマニチン、γ−アマニチン、ε−アマニチン、アマニン、アマニンアミド、アマヌリン若しくはアマヌリン酸、又はその塩若しくは類縁体から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１０】
抗体毒素複合体であって、
（ｉ）上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）と特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片であって、
（ａ）ｈｕＨＥＡ１２５の重鎖であって、
（ａ１）配列番号１に記載の膜結合型の重鎖であって、
配列番号３に示されるような重鎖の可変ドメインＶＨが、ＶＨのフレームワーク領域に位置する０個〜１０個のアミノ酸置換、０個〜１０個のアミノ酸欠失、及び／又は０個〜１０個のアミノ酸付加を含み、
配列番号２６に示されるような重鎖の定常ドメインが、０個〜１０個のアミノ酸置換、０個〜１０個のアミノ酸欠失、及び／又は０個〜１０個のアミノ酸付加を含む、
膜結合型の重鎖、並びに
（ａ２）配列番号２に記載の可溶型の重鎖であって、
配列番号３に示されるような重鎖の可変ドメインＶＨが、ＶＨのフレームワーク領域に位置する０個〜１０個のアミノ酸置換、０個〜１０個のアミノ酸欠失、及び／又は０個〜１０個のアミノ酸付加を含み、
配列番号２７に示されるような重鎖の定常ドメインが、０個〜１０個のアミノ酸置換、０個〜１０個のアミノ酸欠失、及び／又は０個〜１０個のアミノ酸付加を含む、
可溶型の重鎖
からなる群から選択される、ｈｕＨＥＡ１２５の重鎖、並びに
（ｂ）配列番号１１に記載のｈｕＨＥＡ１２５の軽鎖であって、
配列番号１２に示されるような軽鎖の可変ドメインＶＬが、ＶＬのフレームワーク領域に位置する０個〜１０個のアミノ酸置換、０個〜１０個のアミノ酸欠失、及び／又は０個〜１０個のアミノ酸付加を含み、
配列番号２８に示されるような軽鎖の定常ドメインＣＬが、０個〜１０個のアミノ酸置換、０個〜１０個のアミノ酸欠失、及び／又は０個〜１０個のアミノ酸付加を含む、
ｈｕＨＥＡ１２５の軽鎖
を含む、抗体又はその抗原結合断片、
（ｉｉ）アマトキシン、並びに
（ｉｉｉ）任意にリンカーＬ２
を含む、抗体毒素複合体。
【請求項１１】
抗体又はその抗原結合断片が、キメラ抗体、脱免疫化抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体から選択される、請求項１０に記載の複合体。
【請求項１２】
抗原結合断片がＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｄからなる群から選択される、請求項１０又は１１に記載の複合体。
【請求項１３】
抗体がｈｕＨＥＡ１２５又はその抗原結合断片である、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１４】
アマトキシンが、α−アマニチン、β−アマニチン、γ−アマニチン、ε−アマニチン、アマニン、アマニンアミド、アマヌリン若しくはアマヌリン酸、又はその塩若しくは類縁体から選択される、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１５】
医療における使用のための請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１６】
患者におけるがんの治療のための請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の複合体であって、該がんが、膵臓がん、胆管癌、乳がん及び結腸直腸がんからなる群から選択される、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１７】
標的結合部分毒素複合体であって、
（ｉ）上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）のエピトープと特異的に結合する標的結合部分、
（ｉｉ）アマトキシン、及び
（ｉｉｉ）任意にリンカーＬ３
を含み、
該アマトキシンが、アマトキシンのアミノ酸３のδＣ原子を介して、該標的結合部分と、又は存在する場合該リンカーＬ３と連結され、かつ該標的結合部分が抗体又はその抗原結合断片である、
標的結合部分毒素複合体。
【請求項１８】
アマトキシンが、アマトキシンのアミノ酸３のδＣ原子と結合した酸素原子を介して、該標的結合部分と、又は存在する場合該リンカーＬ３と連結される、請求項１７に記載の標的結合部分毒素複合体。
【請求項１９】
アマトキシンが、エステル結合、エーテル結合又はウレタン結合を介して、該標的結合部分と、又は存在する場合該リンカーＬ３と連結される、請求項１７又は１８に記載の標的結合部分毒素複合体。
【請求項２０】
リンカーＬ３が存在し、該複合体が以下の構造：
（ｉ）アマトキシン−δＣ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｌ３−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−標的結合部分、
（ｉｉ）アマトキシン−δＣ−Ｏ−Ｌ３−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−標的結合部分、又は
（ｉｉｉ）アマトキシン−δＣ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｌ３−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−標的結合部分
のうちの１つを有する、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の標的結合部分毒素複合体。
【請求項２１】
標的結合部分が、該標的結合部分に存在するアミノ基を介して、該アマトキシンと、又は存在する場合該リンカーＬ３と連結される、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の標的結合部分毒素複合体。
【請求項２２】
アマトキシンが、α−アマニチン、β−アマニチン、γ−アマニチン、ε−アマニチン、アマニン、アマニンアミド、アマヌリン若しくはアマヌリン酸から、又はその塩若しくは類縁体から選択される、請求項１７〜２１のいずれか一項に記載の標的結合部分毒素複合体。
【請求項２３】
リンカーＬ３が、任意に置換されたアルキル基、ヘテロアルキル基、アルケニル基、ヘテロアルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキニル基、シクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アラルキル基又はヘテロアラルキル基である、請求項１７〜２２のいずれか一項に記載の標的結合部分毒素複合体。
【請求項２４】
リンカーＬ３がジスルフィド結合を含む、請求項１７〜２３のいずれか一項に記載の標的結合部分毒素複合体。
【請求項２５】
標的結合部分が、腫瘍細胞上に存在するエピトープと特異的に結合する、請求項１７〜２４のいずれか一項に記載の標的結合部分毒素複合体。
【請求項２６】
抗体又はその抗原結合断片が、ダイアボディ、テトラボディ、ナノボディ、キメラ抗体、脱免疫化抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体から選択される、請求項１７に記載の標的結合部分毒素複合体。
【請求項２７】
抗原結合断片が、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ、及びジスルフィド結合したＦｖ（ｄｓＦｖ）からなる群から選択される、請求項１７又は２６に記載の標的結合部分毒素複合体。
【請求項２８】
抗体又はその抗原結合断片が、
（ａ）ｈｕＨＥＡ１２５の膜結合型の重鎖（配列番号１）、若しくはｈｕＨＥＡ１２５の可溶型の重鎖（配列番号２）、及び／又は
（ｂ）ｈｕＨＥＡ１２５の軽鎖（配列番号１１）
を含む、請求項１７又は２６に記載の標的結合部分毒素複合体。
【請求項２９】
医療における使用のための請求項１７〜２８のいずれか一項に記載の標的結合部分毒素複合体。
【請求項３０】
患者におけるがんの治療のための請求項１７〜２９のいずれか一項に記載の標的結合部分毒素複合体であって、該がんが、膵臓がん、胆管癌、乳がん、結腸直腸がん、肺がん、前立腺がん、卵巣がん、胃がん、腎臓がん、悪性黒色腫、白血病及び悪性リンパ腫からなる群から選択される、標的結合部分毒素複合体。
【請求項３１】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体毒素複合体、又は請求項１７〜２８のいずれか一項に記載の標的結合部分毒素複合体を含み、１つ又は複数の薬学的に許容可能な希釈剤、担体、賦形剤、充填剤、結合剤、滑剤、流動促進剤、崩壊剤、吸着剤、及び／又は保存料をさらに含む医薬組成物。
【手続補正書】
【提出日】平成23年12月1日(2011.12.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者における膵臓がん、胆管癌又は結腸直腸がんの治療のための抗体毒素複合体であって、
（ｉ）上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）のエピトープと特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片、
（ｉｉ）アマトキシン、及び
（ｉｉｉ）任意にリンカーＬ１
を含む、抗体毒素複合体。
【請求項２】
抗体又はその抗原結合断片が、ダイアボディ、テトラボディ、ナノボディ、キメラ抗体、脱免疫化抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体から選択される、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
抗原結合断片が、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ、及びジスルフィド結合したＦｖ（ｄｓＦｖ）からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の複合体。
【請求項４】
ＥｐＣＡＭのエピトープがヒトＥｐＣＡＭのエピトープである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項５】
抗体又はその抗原結合断片が、
（ａ）ｈｕＨＥＡ１２５の重鎖のＣＤＲ３ドメイン（配列番号２２）、及び／又は
（ｂ）ｈｕＨＥＡ１２５の軽鎖のＣＤＲ３ドメイン（配列番号２５）
を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項６】
抗体又はその抗原結合断片が、
（ａ）ｈｕＨＥＡ１２５の重鎖のＣＤＲ２ドメイン（配列番号２１）、
（ｂ）ｈｕＨＥＡ１２５の重鎖のＣＤＲ１ドメイン（配列番号２０）、
（ｃ）ｈｕＨＥＡ１２５の軽鎖のＣＤＲ２ドメイン（配列番号２４）、及び
（ｄ）ｈｕＨＥＡ１２５の軽鎖のＣＤＲ１ドメイン（配列番号２３）
のうち１つ又は複数をさらに含む、請求項５に記載の複合体。
【請求項７】
抗体又はその抗原結合断片が、ｈｕＨＥＡ１２５のＶＨドメイン（配列番号３）、及び／又はｈｕＨＥＡ１２５のＶＬドメイン（配列番号１２）を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項８】
抗体又はその抗原結合断片が、
（ａ）ｈｕＨＥＡ１２５の膜結合型の重鎖（配列番号１）、若しくはｈｕＨＥＡ１２５の可溶型の重鎖（配列番号２）、及び／又は
（ｂ）ｈｕＨＥＡ１２５の軽鎖（配列番号１１）
を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項９】
アマトキシンが、α−アマニチン、β−アマニチン、γ−アマニチン、ε−アマニチン、アマニン、アマニンアミド、アマヌリン若しくはアマヌリン酸、又はその塩から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１０】
抗体毒素複合体であって、
（ｉ）上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）と特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片であって、
（ａ）ｈｕＨＥＡ１２５の重鎖であって、
（ａ１）配列番号１に記載の膜結合型の重鎖であって、
配列番号３に示されるような重鎖の可変ドメインＶＨが、ＶＨのフレームワーク領域に位置する０個〜１０個のアミノ酸置換、０個〜１０個のアミノ酸欠失、及び／又は０個〜１０個のアミノ酸付加を含み、
配列番号２６に示されるような重鎖の定常ドメインが、０個〜１０個のアミノ酸置換、０個〜１０個のアミノ酸欠失、及び／又は０個〜１０個のアミノ酸付加を含む、
膜結合型の重鎖、並びに
（ａ２）配列番号２に記載の可溶型の重鎖であって、
配列番号３に示されるような重鎖の可変ドメインＶＨが、ＶＨのフレームワーク領域に位置する０個〜１０個のアミノ酸置換、０個〜１０個のアミノ酸欠失、及び／又は０個〜１０個のアミノ酸付加を含み、
配列番号２７に示されるような重鎖の定常ドメインが、０個〜１０個のアミノ酸置換、０個〜１０個のアミノ酸欠失、及び／又は０個〜１０個のアミノ酸付加を含む、
可溶型の重鎖
からなる群から選択される、ｈｕＨＥＡ１２５の重鎖、並びに
（ｂ）配列番号１１に記載のｈｕＨＥＡ１２５の軽鎖であって、
配列番号１２に示されるような軽鎖の可変ドメインＶＬが、ＶＬのフレームワーク領域に位置する０個〜１０個のアミノ酸置換、０個〜１０個のアミノ酸欠失、及び／又は０個〜１０個のアミノ酸付加を含み、
配列番号２８に示されるような軽鎖の定常ドメインＣＬが、０個〜１０個のアミノ酸置換、０個〜１０個のアミノ酸欠失、及び／又は０個〜１０個のアミノ酸付加を含む、
ｈｕＨＥＡ１２５の軽鎖
を含む、抗体又はその抗原結合断片、
（ｉｉ）アマトキシン、並びに
（ｉｉｉ）任意にリンカーＬ２
を含む、抗体毒素複合体。
【請求項１１】
抗体又はその抗原結合断片が、キメラ抗体、脱免疫化抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体から選択される、請求項１０に記載の複合体。
【請求項１２】
抗原結合断片がＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｄからなる群から選択される、請求項１０又は１１に記載の複合体。
【請求項１３】
抗体がｈｕＨＥＡ１２５又はその抗原結合断片である、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１４】
アマトキシンが、α−アマニチン、β−アマニチン、γ−アマニチン、ε−アマニチン、アマニン、アマニンアミド、アマヌリン若しくはアマヌリン酸、又はその塩から選択される、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１５】
医療における使用のための請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１６】
患者におけるがんの治療のための請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の複合体であって、該がんが、膵臓がん、胆管癌、乳がん及び結腸直腸がんからなる群から選択される、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１７】
標的結合部分毒素複合体であって、
（ｉ）上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）のエピトープと特異的に結合する標的結合部分、
（ｉｉ）アマトキシン、及び
（ｉｉｉ）任意にリンカーＬ３
を含み、
該アマトキシンが、アマトキシンのアミノ酸３のδＣ原子を介して、該標的結合部分と、又は存在する場合該リンカーＬ３と連結され、かつ該標的結合部分が抗体又はその抗原結合断片である、
標的結合部分毒素複合体。
【請求項１８】
アマトキシンが、アマトキシンのアミノ酸３のδＣ原子と結合した酸素原子を介して、該標的結合部分と、又は存在する場合該リンカーＬ３と連結される、請求項１７に記載の標的結合部分毒素複合体。
【請求項１９】
アマトキシンが、エステル結合、エーテル結合又はウレタン結合を介して、該標的結合部分と、又は存在する場合該リンカーＬ３と連結される、請求項１７又は１８に記載の標的結合部分毒素複合体。
【請求項２０】
リンカーＬ３が存在し、該複合体が以下の構造：
（ｉ）アマトキシン−δＣ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｌ３−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−標的結合部分、
（ｉｉ）アマトキシン−δＣ−Ｏ−Ｌ３−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−標的結合部分、又は
（ｉｉｉ）アマトキシン−δＣ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｌ３−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−標的結合部分
のうちの１つを有する、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の標的結合部分毒素複合体。
【請求項２１】
標的結合部分が、該標的結合部分に存在するアミノ基を介して、該アマトキシンと、又は存在する場合該リンカーＬ３と連結される、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の標的結合部分毒素複合体。
【請求項２２】
アマトキシンが、α−アマニチン、β−アマニチン、γ−アマニチン、ε−アマニチン、アマニン、アマニンアミド、アマヌリン若しくはアマヌリン酸から、又はその塩から選択される、請求項１７〜２１のいずれか一項に記載の標的結合部分毒素複合体。
【請求項２３】
リンカーＬ３が、アルキル基、ヘテロアルキル基、アルケニル基、ヘテロアルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキニル基、シクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アラルキル基又はヘテロアラルキル基である、請求項１７〜２２のいずれか一項に記載の標的結合部分毒素複合体。
【請求項２４】
リンカーＬ３がジスルフィド結合を含む、請求項１７〜２３のいずれか一項に記載の標的結合部分毒素複合体。
【請求項２５】
標的結合部分が、腫瘍細胞上に存在するエピトープと特異的に結合する、請求項１７〜２４のいずれか一項に記載の標的結合部分毒素複合体。
【請求項２６】
抗体又はその抗原結合断片が、ダイアボディ、テトラボディ、ナノボディ、キメラ抗体、脱免疫化抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体から選択される、請求項１７に記載の標的結合部分毒素複合体。
【請求項２７】
抗原結合断片が、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ、及びジスルフィド結合したＦｖ（ｄｓＦｖ）からなる群から選択される、請求項１７又は２６に記載の標的結合部分毒素複合体。
【請求項２８】
抗体又はその抗原結合断片が、
（ａ）ｈｕＨＥＡ１２５の膜結合型の重鎖（配列番号１）、若しくはｈｕＨＥＡ１２５の可溶型の重鎖（配列番号２）、及び／又は
（ｂ）ｈｕＨＥＡ１２５の軽鎖（配列番号１１）
を含む、請求項１７又は２６に記載の標的結合部分毒素複合体。
【請求項２９】
医療における使用のための請求項１７〜２８のいずれか一項に記載の標的結合部分毒素複合体。
【請求項３０】
患者におけるがんの治療のための請求項１７〜２９のいずれか一項に記載の標的結合部分毒素複合体であって、該がんが、膵臓がん、胆管癌、乳がん、結腸直腸がん、肺がん、前立腺がん、卵巣がん、胃がん、腎臓がん、悪性黒色腫、白血病及び悪性リンパ腫からなる群から選択される、標的結合部分毒素複合体。
【請求項３１】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体毒素複合体、又は請求項１７〜２８のいずれか一項に記載の標的結合部分毒素複合体を含み、１つ又は複数の薬学的に許容可能な希釈剤、担体、賦形剤、充填剤、結合剤、滑剤、流動促進剤、崩壊剤、吸着剤、及び／又は保存料をさらに含む医薬組成物。
【手続補正書】
【提出日】平成24年7月18日(2012.7.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）のエピトープと特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片、
（ｉｉ）アマトキシン、及び
（ｉｉｉ）任意にリンカーＬ１
を含む抗体毒素複合体を有効成分として含む、膵臓がん、胆管癌又は結腸直腸がん用治療剤。
【請求項２】
抗体又はその抗原結合断片が、ダイアボディ、テトラボディ、ナノボディ、キメラ抗体、脱免疫化抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体から選択される、請求項１に記載の治療剤。
【請求項３】
抗原結合断片が、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ、及びジスルフィド結合したＦｖ（ｄｓＦｖ）からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の治療剤。
【請求項４】
ＥｐＣＡＭのエピトープがヒトＥｐＣＡＭのエピトープである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の治療剤。
【請求項５】
抗体又はその抗原結合断片が、
（ａ）ｈｕＨＥＡ１２５の重鎖のＣＤＲ３ドメイン（配列番号２２）、及び／又は
（ｂ）ｈｕＨＥＡ１２５の軽鎖のＣＤＲ３ドメイン（配列番号２５）
を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の治療剤。
【請求項６】
抗体又はその抗原結合断片が、
（ａ）ｈｕＨＥＡ１２５の重鎖のＣＤＲ２ドメイン（配列番号２１）、
（ｂ）ｈｕＨＥＡ１２５の重鎖のＣＤＲ１ドメイン（配列番号２０）、
（ｃ）ｈｕＨＥＡ１２５の軽鎖のＣＤＲ２ドメイン（配列番号２４）、及び
（ｄ）ｈｕＨＥＡ１２５の軽鎖のＣＤＲ１ドメイン（配列番号２３）
のうち１つ又は複数をさらに含む、請求項５に記載の治療剤。
【請求項７】
抗体又はその抗原結合断片が、ｈｕＨＥＡ１２５のＶＨドメイン（配列番号３）、及び／又はｈｕＨＥＡ１２５のＶＬドメイン（配列番号１２）を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の治療剤。
【請求項８】
抗体又はその抗原結合断片が、
（ａ）ｈｕＨＥＡ１２５の膜結合型の重鎖（配列番号１）、若しくはｈｕＨＥＡ１２５の可溶型の重鎖（配列番号２）、及び／又は
（ｂ）ｈｕＨＥＡ１２５の軽鎖（配列番号１１）
を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の治療剤。
【請求項９】
アマトキシンが、α−アマニチン、β−アマニチン、γ−アマニチン、ε−アマニチン、アマニン、アマニンアミド、アマヌリン若しくはアマヌリン酸、又はその塩から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の治療剤。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の治療剤を含み、１つ又は複数の薬学的に許容可能な希釈剤、担体、賦形剤、充填剤、結合剤、滑剤、流動促進剤、崩壊剤、吸着剤、及び／又は保存料をさらに含む医薬組成物。
【国際調査報告】
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