(57)【要約】  癌細胞の成長および／または増殖を阻害するための方法が提供される。この方法は、癌細胞を、ＥＲＫ２の結合のためのβインテグリンサブユニットの細胞質結合ドメインを提供するポリペプチドの有効量で処置して、その癌細胞の細胞活性化経路における、ＭＡＰキナーゼ以外の少なくとも１種のプロテインキナーゼを阻害する工程を含む。このポリペプチドによって阻害されるプロテインキナーゼは、ｃ−Ｒａｆ、ＭＥＫ１ならびにＳｒｃファミリー、ＰＩ３Ｋファミリー、ＰＫＢ／ＡＫＴファミリーおよびＰＫＣファミリーに属するキナーゼからなる群から選択され得る。癌の予防および処置のための方法もまた提供される。
2012518602.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌細胞の成長および／または増殖を阻害するための方法であって、
前記癌細胞の少なくとも１つの細胞活性化経路における、ＭＡＰキナーゼ以外の少なくとも１種のプロテインキナーゼを阻害するための少なくとも１種のインヒビターであって、ＥＲＫ２の結合のためのβインテグリンサブユニットの細胞質結合ドメインまたは前記結合ドメインのＥＲＫ２が結合する変異形態もしくは改変形態を提供するポリペプチドであるインヒビターを選択する工程と、
前記ポリペプチドの有効量で前記癌細胞を処置して前記プロテインキナーゼを阻害する工程と
を含む、方法。
【請求項２】
ＭＡＰキナーゼ以外の複数のプロテインキナーゼを阻害して、前記癌細胞における複数の前記細胞活性化経路を阻害するための請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記癌細胞を前記ポリペプチドで処置して、ｃ−Ｒａｆ、ＭＥＫ１ならびにＳｒｃファミリー、ＰＩ３Ｋファミリー、プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ／ＡＫＴ）ファミリーおよびプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）ファミリーに属するキナーゼからなる群より選択される少なくとも１種のプロテインキナーゼを阻害する工程を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記癌細胞を前記ポリペプチドで処置して、前記癌細胞における、Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＭＡＰＫ経路とは違った、またはその経路に加えて、他の細胞活性化経路の少なくとも１種のキナーゼを阻害する工程を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記癌細胞を前記ポリペプチドで処置して、ＰＩ３キナーゼ／ＡＫＴ経路ならびにＳｒｃおよび／またはＰＫＣキナーゼファミリーに属する１種以上のキナーゼを含む細胞活性化経路からなる群より選択される少なくとも１つの細胞活性化経路を阻害する工程を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記癌細胞を前記ポリペプチドで処置して、Ｓｒｃファミリー、ＰＫＢファミリーおよびＰＫＣファミリーに属するキナーゼからなる群より選択される１種以上のキナーゼを含む少なくとも１つの細胞活性化経路を阻害する工程を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記癌細胞を前記ポリペプチドで処置して、ｃ−Ｓｒｃ、ｃ−Ｙｅｓ、ｃ−Ｌｙｎ、ｃ−Ｆｙｎ、ＰＫＢβおよびＰＫＢγ、ＰＫＣα、ＰＫＣβＩ、ＰＫＣβＩＩおよびＰＫＣγからなる群より選択されるキナーゼを阻害する工程を含む、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
前記癌細胞を前記ポリペプチドで処置して、ｐ１１０βおよびｐ１１０δからなる群より選択される触媒サブユニットを含む少なくとも１種のＰＩ３キナーゼを阻害する工程を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記βインテグリンサブユニットの前記結合ドメインが、前記結合ドメインの両末端領域を互いに連結する、前記ＭＡＰキナーゼの結合に必須ではない介在アミノ酸リンカー配列を組み入れており、前記結合ドメインの前記両末端領域は、それぞれのアミノ酸配列によって規定される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、前記βインテグリンサブユニットの前記結合ドメインの変異形態もしくは改変形態を含み、前記結合ドメインと比較して、前記アミノ酸リンカー配列の１つ以上のアミノ酸が、前記ポリペプチドにおいて欠失しているおよび／または異なる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記結合ドメインと比較して、前記介在アミノ酸配列中のアミノ酸が全て、前記ポリペプチドにおいて欠失している、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記結合ドメインと比較して、前記結合ドメインの前記両末端領域のアミノ酸配列同一性が、前記ポリペプチドにおいて変化していない、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ポリペプチドが、前記ポリペプチドの前記癌細胞への進入を促進するための促進因子部分に連結される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ポリペプチドがデンドリマーによって提示され、前記癌細胞が前記デンドリマーで処置される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記デンドリマーが、前記ポリペプチドを８モノマー単位より多く提示する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記デンドリマーが、前記ポリペプチドを１０モノマー単位提示する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ポリペプチドが、プロテアーゼ分解に対してＮ末端および／またはＣ末端が保護されている、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ポリペプチドが、前記プロテアーゼ分解からの保護のために複数のエチレングリコール単位でペグ化されている、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ポリペプチドによって提示される、前記結合ドメインまたは前記結合ドメインの変異形態もしくは改変形態が、１つ以上のＤ−アミノ酸を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
哺乳動物における癌の予防または処置のための方法であって、前記哺乳動物に対する前記ポリペプチドの有効量で前記哺乳動物を処置する工程を含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
少なくとも１種のプロテインキナーゼの活性を阻害するための方法であって、前記プロテインキナーゼを、ＥＲＫ２の結合のためのβインテグリンサブユニットのＭＡＰキナーゼ細胞質結合ドメインまたは前記結合ドメインのＥＲＫ２が結合する変異形態もしくは改変形態を提供するポリペプチドと接触させる工程を含み、前記プロテインキナーゼは、ｃ−ＲＡＦ、ＭＥＫ１ならびにＳｒｃファミリー、ＰＩ３Ｋファミリー、ＰＫＢファミリーおよびＰＫＣファミリーに属するキナーゼからなる群より選択される、方法。
【請求項２２】
癌細胞における複数の細胞活性化経路を阻害するための方法であって、前記癌細胞を、ＥＲＫ２の結合のためのβインテグリンサブユニットのＭＡＰキナーゼ細胞質結合ドメインまたは前記結合ドメインのＥＲＫ２が結合する変異形態もしくは改変形態を提供する少なくとも１種のポリペプチドの有効量で処置する工程を含む、方法。
【請求項２３】
哺乳動物における癌の予防または処置のための方法であって、前記哺乳動物に、前記癌の癌細胞における複数の細胞活性化経路を阻害するための少なくとも１種のデンドリマーの有効量を投与する工程を含み、前記デンドリマーは、ＥＲＫ２の結合のためのβインテグリンサブユニットのＭＡＰキナーゼ細胞質結合ドメインまたは前記結合ドメインのＥＲＫ２が結合する変異形態もしくは改変形態を提供する少なくとも１種のポリペプチドを提示する、方法。
【請求項２４】
少なくとも１つの細胞活性化経路における、ＭＡＰキナーゼ以外の少なくとも１種のプロテインキナーゼを阻害し、それにより癌細胞の成長および／または増殖を阻害するための、ＥＲＫ２の結合のためのβインテグリンサブユニットのＭＡＰキナーゼ細胞質結合ドメインまたは前記結合ドメインのＥＲＫ２が結合する変異形態もしくは改変形態を提供するポリペプチド、あるいは前記癌細胞における前記ポリペプチドまたはその改変形態もしくは変異形態の発現のための核酸の使用。
【請求項２５】
少なくとも１つの細胞活性化経路における、ＭＡＰキナーゼ以外の少なくとも１種のプロテインキナーゼを阻害して癌細胞の成長および／または増殖を阻害するための医薬の製造における、ＥＲＫ２の結合のためのβインテグリンサブユニットのＭＡＰキナーゼ細胞質結合ドメインまたは前記結合ドメインのＥＲＫ２が結合する変異形態もしくは改変形態を提供するポリペプチド、あるいは前記癌細胞における前記ポリペプチドまたはその改変形態もしくは変異形態の発現のための核酸の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌細胞の成長および／または増殖の阻害に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌細胞の転移には、細胞外マトリックス足場を通る腫瘍細胞移動、基底膜の浸潤、循環腫瘍細胞の捕捉、腫瘍細胞の管外遊出、および転移部位における腫瘍細胞の増殖が関与する。一次腫瘍塊からの細胞の解離および細胞周囲環境の改変が、血管およびリンパ管中への腫瘍細胞の進入を助ける。大多数の悪性疾患を患う患者の運命を最終的に決定するのは、腫瘍細胞の潜在的な浸潤能力および転移能力である。したがって、腫瘍形成は、癌細胞が増殖し、周囲のマトリックスバリアを消化する能力を反映する、組織リモデリング過程と見なされ得る。これらの事象は、少なくともある程度、細胞接着分子およびマトリックス分解酵素によって調整されると考えられている。
【０００３】
癌細胞表面の細胞接着レセプタは、細胞増殖、移動、浸潤および転移を調整し得る複雑な細胞シグナル伝達に関与し、これらの事象に寄与するいくつかの接着分子のファミリー（インテグリン、カドヘリン、免疫グロブリンスーパーファミリー、ヒアルロン酸レセプタ、およびムチンを含む）が、これまでに同定されている。一般的に、これらの細胞表面分子が、細胞−細胞結合および細胞−マトリックス結合の両方を仲介し、後者は、腫瘍細胞の細胞外足場分子（例えば、コラーゲン、フィブロネクチンおよびラミニン）への付着を含む。
【０００４】
細胞接着分子の全てのファミリーのうち、最も良く特徴付けられているのは、インテグリンとして知られるファミリーである。インテグリンは、いくつもの基本的な過程（白血球動員、免疫活性化、血栓形成、創傷治癒、胚形成、ウイルス内在化および腫瘍形成を含む）に関与する。インテグリンは、細胞外マトリックス分子と細胞骨格成分の間で構造上および機能上の橋渡しを細胞に提供する、密接に関連するアルファ（α）鎖およびベータ（β）鎖から成る膜貫通糖タンパク質である。インテグリンファミリーは、１７種の異なるαサブユニットおよび８種のβサブユニットを包含し、そのαβの組み合わせは、３つのサブファミリーに組み込まれる。
【０００５】
β２の呼称で呼ばれる白血球インテグリンサブファミリーを除き、残りのインテグリンは、共通の鎖を共有することに基づいてβ１およびαｖと呼ばれる２つの主要なサブグループに分類される。
【０００６】
β１サブファミリーにおいて、β１鎖は、９つのα鎖メンバー（α１〜９）のうちのいずれか１つと組み、β１と会合するα鎖が、そのレセプタのマトリックス結合特異性を決定する。例えば、α２β１はコラーゲンおよびラミニンと結合し、α３β１はコラーゲン、ラミニンおよびフェブロネクチンと結合し、α５β１はフィブロネクチンと結合する。αｖレセプタサブファミリーにおいて、豊富な混交のαｖ鎖は、５つのβ鎖のうちのいずれか１つと組む。αｖインテグリンを特色付ける特徴は、それらが全て、それらが接着するマトリックス分子中に存在するアルギニン−グリシン−アスパルタート（ＲＧＤ）（配列番号１）配列を識別し、高親和性で結合することである。
【０００７】
インテグリンについての現在知られている像は、αおよびβサブユニットのＮ末端ドメインが一緒になって１つのリガンド結合頭部（ｌｉｇａｎｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｈｅａｄ）を形成するというものである。陽イオン結合ドメインを含むこの頭部は、両サブユニットに対応する２つの柄（ｓｔａｌｋ）によって、膜貫通部分に、したがって、２つの細胞質ドメインに連結される。βサブユニットは全て、アミノ酸レベルでかなりの類似性を示す。２１０ｋＤａであるより大きなβ４を例外として、全て、９０と１１０ｋＤａの間の分子量を有する。同様に、４８個を有するβ４を例外として、これらは全て、５６個の保存されたシステイン残基を含む。これらのシステインは、ジスルフィド結合によって内部連結されていると考えられている４つの反復パターン中に配される。αサブユニットは、１５０〜２００ｋＤａの範囲にわたる分子量を有する。これらはβ鎖よりも低い程度の類似性を示すが、全て、非反復ドメインを間に置いた７つの反復アミノ酸配列を含む。
【０００８】
βサブユニット細胞質ドメインは、インテグリンを細胞骨格と連結させるために必要とされる。多くの場合、この連結はフォーカルコンタクトへの局在化に反映され、α−アクチニン、テーリンおよびフォーカルアドヒージョンキナーゼ（ＦＡＫ）を含むシグナル伝達複合体の構築を引き起こすと考えられている。β１インテグリンのフォーカルコンタクト局在化に必要とされる少なくとも３つの異なる領域が、詳細に説明された（Ｒｅｓｚｋａ  ｅｔ  ａｌ，１９９２）。これらの領域は、β２、β３、β５、β６およびβ７インテグリンサブユニットの細胞質ドメインにおいても見出される保存配列を含んでいる。これら細胞質ドメイン間のシグナル伝達能に関する機能上の差異は、未だ確立されていない。
【０００９】
インテグリンβ６サブユニットは、αｖβ６ヘテロダイマーの一部として培養上皮細胞中に初めて同定され、αｖβ６複合体は、ヒト膵臓癌腫細胞においてアルギニン−グリシン−アスパルタート（ＲＧＤ）依存様式でフィブロネクチンと結合することが証明された（Ｓｈｅｐｐａｒｄ  ｅｔ  ａｌ，１９９０）。β６サブユニットは７８８個のアミノ酸から成り、他のインテグリンサブユニットβ１〜β５と３４〜５１％の配列相同性を共有する。β６サブユニットはまた、細胞外ドメインに９つの潜在的グリコシル化部位を含む（Ｓｈｅｐｐａｒｄ  ｅｔ  ａｌ，１９９０）。これらの細胞質ドメインは、インテグリンサブユニット間で高度に保存されている４１アミノ酸の領域および特有の１１アミノ酸のカルボキシ末端伸長領域から成るという点で、他のサブユニットと異なる。この１１アミノ酸の伸長領域は、フォーカルコンタクトへのβ６の局在化に必要でないことが示された。それどころか、その領域の除去はレセプタ局在化を強めるようである。しかしながら、フォーカルコンタクトへのβ１インテグリンの局在化に重要であると確認された３つの保存領域（Ｒｅｓｚｋａ  ｅｔ  ａｌ，１９９２）のいずれの除去も、フォーカルコンタクトへのβ６の動員を無くすことが示された（Ｃｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ，１９９４）。
【００１０】
インテグリンαｖβ６は、インビトロおよびインビボで結腸癌細胞の成長を増強することが以前に示されており（Ａｇｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ，１９９４）、この成長増強効果は、少なくともある程度、αｖβ６により媒介されるゼラチナーゼＢ分泌に起因する（Ａｇｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ，１９９９）。この上皮に限定されたインテグリンを癌においてとりわけ興味深くしてきたのは、それが正常上皮細胞では発現されないか非常に低いレベルで発現されるが、創傷治癒および腫瘍形成の間には特に腫瘍細胞島の浸潤縁で高度に発現される（Ｂｒｅｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ，１９９５；Ａｇｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ，１９９６）ことである。
【００１１】
インテグリンは、細胞膜を貫いてどちらの方向にもシグナルを伝達し得る。インテグリンの細胞外結合活性は、例えばインテグリン細胞質ドメインのリン酸化により細胞内部から調整され得るが（インサイドアウトシグナル伝達）、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の結合は、細胞内に伝達されるシグナルを誘発する（アウトサイドインシグナル伝達）。アウトサイドインシグナル伝達は、２つの記述上のカテゴリーに大きく分けられ得る。１つ目は、インテグリンの連結およびクラスター化が唯一の細胞外刺激である「直接的シグナル伝達」である。要するに、ＥＣＭタンパク質の接着が、細胞質チロシンキナーゼ（例えば、フォーカルアドヒージョンキナーゼＦＡＫ）およびセリン／スレオニンキナーゼ（例えば、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）カスケードにおけるセリン／スレオニンキナーゼ）を活性化し、脂質代謝（例えば、ホスファチジルイノシトール−４，５−二リン酸（Ｐ１Ｐ２）の合成）を刺激し得る。インテグリンシグナル伝達の２つ目のカテゴリーは、インテグリン媒介性の細胞接着が、他種のレセプタ（特にポリペプチド増殖因子により活性化される受容体型チロシンキナーゼ）により開始されるシグナル伝達事象を調節する「協同的シグナル伝達（ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ）」である。しかしながら、全ての場合において、インテグリン媒介性の接着が、細胞質ゾルまたは核への能率的なシグナルの伝達に必要とされるようである。
【００１２】
ＭＡＰキナーゼは、原形質膜における種々のレセプタ開始シグナル伝達事象の収束点として機能する。ＭＡＰキナーゼ経路の核となる構成単位は、ＭＡＰキナーゼがＭＡＰキナーゼキナーゼ（ＭＥＫ）によりリン酸化され、同様に、ＭＡＰキナーゼキナーゼがＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼ（例えば、Ｒａｆ−１）によりリン酸化される、３メンバープロテインキナーゼカスケードである。ＭＡＰキナーゼファミリーの１２メンバータンパク質には、チロシンおよびスレオニン残基のリン酸化により活性化される細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）があり（Ｂｏｕｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９１）、これは、既知の全てのＭＡＰキナーゼアイソフォームに共通する活性化の種類である。ＥＲＫ１／２（それぞれ４４ｋＤおよび４２ｋＤのＭＡＰキナーゼ）は、９０％のアミノ酸同一性を共有し、シグナル伝達経路の遍在する構成要素である（Ｂｏｕｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９１）。これらセリン／スレオニンキナーゼは、調整機能を有する多くのタンパク質（他のプロテインキナーゼ（例えば、ｐ９０ｒｓｋ）、細胞骨格タンパク質（例えば、微小管関連ホスホリパーゼＡ２）、上流調節因子（例えば、上皮成長因子レセプタおよびＲａｓ交換因子）および転写因子（例えば、ｃ−ｍｙｃおよびＥｌｋ−１）を含む）をリン酸化し、機能調節する。ＥＲＫは、成長促進事象において、特に細胞が利用し得る成長因子の濃度が限られている場合、主要な役割を果たす（Ｇｉａｎｃｏｔｔｉ  ａｎｄ  Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，１９９９）。
【００１３】
細胞膜にてチロシンキナーゼ受容体を介して活性化される２つの主要な成長シグナル伝達経路は、Ｒａｓ−Ｒａｆ−ＭＥＫ−ＭＡＰキナーゼ経路およびＰＩ３キナーゼ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路である。ＰＩ３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）は、Ｒａｓ癌原遺伝子との相互作用によっても活性化され得るが、Ｒａｓの関与とは無関係にも活性化され得、ＰＩ３Ｋ活性だけでも、栄養サポートがない状態で細胞生存を促進したり、毒性刺激によって誘導されるアポトーシスを阻止したりするのに十分である。したがって、ＰＩ３Ｋ活性は、受容体型チロシンキナーゼから生ずる並行する細胞生存／活性化経路を提供する。キナーゼシグナル伝達（細胞活性化）経路を概説する図を、図１に示す。この図に示されるように、ＭＡＰキナーゼおよびＡｋｔを経るシグナル伝達はまた、ＳｒｃチロシンキナーゼおよびプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）を介しても起こり得る。
【００１４】
第ＩＩ相および第ＩＩＩ相臨床試験に登録される化合物のうち、その副作用にもかかわらず、一定の有効性があればなんとか試験に合格するのはほんの１１％にすぎないと考えられている。これが、Ａｋｔ媒介性成長シグナル伝達を阻害するためのＰＩ３Ｋのインヒビターに集中的に焦点が当てられることにつながった。（Ｗｏｒｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，２００７）。ＰＩ３Ｋおよびそれらの脂質産物は、細胞外刺激の下流で生存を促進する。生存刺激は、一般に、固有のチロシンキナーゼ活性を有するか、チロシンキナーゼと間接的に結合されるか、または７回膜貫通型Ｇタンパク質共役受容体と結合される、膜貫通型受容体の連結を通じて細胞内シグナル伝達をもたらす。こうした受容体の活性化は、リガンド調節性のタンパク質−タンパク質相互作用の結果として、形質膜の内面へのＰＩ３Ｋアイソフォームの動員をもたらす（Ｄａｔｔａ  ｅｔ  ａｌ，１９９９）。
【００１５】
ＰＩ３Ｋのファミリーは、いくつかのサブグループに分けられ、そのうち、クラスＩ酵素は、４つのｐ１１０触媒サブユニット（α、β、δまたはγ）のうちの１つと複合体化したｐ８５アダプターサブユニットからなり、受容体型チロシンキナーゼおよび癌タンパク質と会合し得る（Ｚｈａｏ  ＆  Ｒｏｂｅｒｔｓ，２００６）。ＰＩ３Ｋγおよびδは主として造血組織において発現されるが、αおよびβは遍在的に発現される。
【００１６】
クラスＩＡのＰＩ３キナーゼ（α、βまたはδ）を癌遺伝子としてしっかりと確立した１９９０年代後半の発見は、ｐ１１０αが腫瘍形成性トリレトロウイルスにより捕捉され、これがｐ１１０αを癌遺伝子にしたという発見であった。それに続き、人為的に活性化された形態のｐ１１０αは、テロメラーゼ不死化ヒト上皮細胞において発現される場合に腫瘍形成を生じさせ得ることが分かった（Ｚｈａｏ  ＆  Ｒｏｂｅｒｔｓ，２００６において再検討された）。したがって、ｐ１１０αアイソフォームは、受容体型チロシンキナーゼおよび特定の癌遺伝子（例えば、Ｒａｓ）からのシグナルの多くを伝達する。さらに、ｐ１１０αをコードするＰＩＫ３ＣＡ遺伝子は、多くの最も一般的な癌の形態（結腸、乳房、前立腺、肝臓および脳の腫瘍を含む）において頻繁に突然変異する。
【００１７】
ＰＩ３Ｋの下流の多くの標的がアポトーシスの抑制に関係付けられてきたが、ＰＩ３Ｋによるｃ−Ａｋｔ活性化が、多くの死刺激によって誘導されるアポトーシスを阻止するのに十分であり、Ａｋｔ活性が、成長因子媒介性生存に必要とされる。Ａｋｔは、Ａｋｔのキナーゼ活性が成長因子（例えば、塩基性線維芽細胞成長因子およびＰＤＧＦ）により誘導されるということの実証により、シグナル伝達に最初に関係付けられた。現在、様々な多くの生理的刺激が、主としてＰＩ３キナーゼ依存的に、Ａｋｔ活性を誘導し得ることが知られている。そして今度は、Ａｋｔが、アポトーシスの調節に関与する複数の基質のリン酸化を通じて（例えば、Ｂｃｌ−２ホモログＢａｄおよびカスパーゼ−９のリン酸化を通じて）生存を調節する（Ｄａｔｔａ  ｅｔ  ａｌ，１９９９）。
【００１８】
興味深いことに、結腸癌は、動物モデルにおいて、新しい抗Ａｋｔ化合物であるＧＫ６９０６９３に対し、例えばＰＩ３キナーゼ／Ａｋｔ突然変異の頻度がはるかに高い乳癌ほどよく応答しない。結腸癌は、腫瘍の少なくとも２０％においてこれらのキナーゼの突然変異を有し、Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＢＲａｆについて、それよりはるかに高い突然変異発生率を有する。実際のところ、ＰＩ３キナーゼサブファミリーのｐ１１０αアイソフォームの突然変異は、子宮頚、乳房および結腸の癌において非常に一般的である（Ｐ．Ｗｏｒｋｍａｎ，ＨＲＭＩ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅでのプレゼンテーション，Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ，ＮＳＷ，２００８年９月）。
【００１９】
ＰＩ３Ｋβもまた、結腸癌細胞における新生ＤＮＡ合成に必要とされることが示された（Ｂｅｎｉｓｔａｎｔ  ｅｔ  ａｌ，２０００）。重要なことに、ｐ１１０αはインスリンシグナル伝達においても機能を果たすが、ｐ１１０βの阻害はインスリンシグナル伝達には影響しないようであり（Ｚｈａｏ  ＆  Ｒｏｂｅｒｔｓ，２００６）、このことが、ＰＩ３Ｋβを魅力的な標的にしている。
【００２０】
Ｓｒｃキナーゼは、様々な細胞内シグナル伝達経路を媒介する、細胞質の膜会合した非受容体型細胞内チロシンキナーゼである。Ｓｒｃキナーゼは、正常細胞遺伝子（ｃ−Ｓｒｃ）が突然変異し活性化されたバージョンである、ラウス肉腫ウイルス遺伝子（ｖ−Ｓｒｃ）の産物の細胞性ホモログである。このファミリーには９つのメンバーが存在し、そのうち、Ｓｒｃ、ＦｙｎおよびＹｅｓは、遍在的に発現され、Ｌｃｋ、Ｈｃｋ、Ｆｇｒ、ＬｙｎおよびＢｌｋは、主として造血細胞において、より組織限定的に発現される（Ａｂｒａｍ  ＣＬ  ＆  Ｃｏｕｒｔｎｅｉｄｇｅ  ＳＡ，２０００）。残りのＳｒｃファミリーメンバーは、それ自体のサブファミリーに属するＦｒｋである。Ｓｒｃチロシンキナーゼは、種々の腫瘍種（例えば、ヒト結腸腺癌（Ｗｉｎｄａｍ  ＴＣ  ｅｔ  ａｌ，２００２；Ｈａｉｅｒ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ，２００２），乳癌（Ｍｙｏｕｉ  Ａ  ｅｔ  ａｌ，２００３；Ｌｕ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ，２００３）、膵臓癌腫（Ｌｕｔｚ  ＭＰ  ｅｔ  ａｌ，１９９８）、および卵巣癌（Ｂｕｄｄ  ＲＪ  ｅｔ  ａｌ，１９９４；Ｗｅｉｎｅｒ  ＪＲ  ｅｔ  ａｌ，２００３））において過剰発現されることが知られている。Ｓｒｃファミリーメンバーは、増殖、移動、腫瘍接着および新脈管形成に関わる数多くのシグナル伝達経路に関与しており（Ｓａｔｏ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ，２００２）、多くの種類の受容体（受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）、インテグリン、およびＧタンパク質共役受容体を含む）からのシグナル伝達を媒介する（Ｈａｉｅｒ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ，２００２）。Ｓｒｃキナーゼを介してシグナル伝達するＲＴＫとしては、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）および線維芽細胞成長因子受容体が挙げられる（Ｂｒｏｗａｅｙｓ−Ｐｏｌｙ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ，２０００）。Ｓｒｃファミリーはまた、成長因子刺激性ＤＮＡ合成、特にＲＴＫ（例えば、血小板由来成長因子受容体およびＥＧＦＲ）に対する成長因子に必要とされるようである（Ｎａｎｊｕｎｄａｎ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ，２００３；Ｅｒｐｅｌ  Ｔ，１９９６）。
【００２１】
ｃ−Ｓｒｃチロシンキナーゼは、Ｓｒｃファミリーの原型メンバーであり、様々な細胞シグナル伝達事象に関与し、細胞増殖および分化の両方を調節する。ｃ−Ｓｒｃの阻害は、細胞成長および生存経路の活性化の減少と結び付いている。Ｓｒｃファミリーキナーゼは、Ｒａｓ−ＭＡＰＫ経路の内膜活性化（ｅｎｄｏｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）に必要とされ、そこで、それらはＰＬＣ−γ１をリン酸化し、活性化する。次いで、ＰＬＣ−γ１は、Ｒａｓグアニンヌクレオチド交換因子であるＲａｓＧＲＰ１を活性化し、それにより、Ｒａｓ活性化を促進する。
【００２２】
また、活性ｃ−Ｓｒｃキナーゼが卵巣癌細胞系の生存を促進するということ、およびｃ−Ｓｒｃキナーゼの阻害が他の化学療法剤（パクリタキセルおよびシスプラチン）に対して卵巣癌細胞を感作するということも実証されている（Ｐｅｎｇｅｔｎｚｅ  Ｙ，２００３）。他の癌種については、ｃ−Ｓｒｃキナーゼの阻害が、ヒト膵臓癌についての同所ヌードマウスモデルにおいて、原発性腫瘍成長および転移に対する有意な抗腫瘍活性をもたらすことが示された。
【００２３】
ｃ−Ｓｒｃの比活性の上昇が、正常結腸粘膜を基準として、＞８０％の結腸腺癌において認められる（Ｂｏｌｅｎ  ＪＢ  ｅｔ  ａｌ，１９８７）。ｃ−Ｓｒｃのさらなる増加が、原発腫瘍に比べて転移部において見られる。したがって、結腸腫瘍細胞の大半において、ｃ−Ｓｒｃは、構成的に活性である。近年では、ヒト結腸腫瘍のサブセットがｃ−Ｓｒｃ遺伝子に活性化突然変異を含むことが見出されたが（Ｉｒｂｙ  ＲＢ  ｅｔ  ａｌ，１９９９）、そのような突然変異は他の患者集団においては認められなかった。実際のところ、ｃ−Ｓｒｃの比活性の上昇は、低頻度の突然変異のせいであろうと（Ｉｒｂｙ  ＲＢ  ｅｔ  ａｌ，１９９９）、他の機序のせいであろうと（例えば、タンパク質／タンパク質会合の変化）、ほとんどの結腸腫瘍の特徴である。また、ｃ−Ｓｒｃ活性は、その疾患の各進行段階において増大し（Ｔａｌａｍｏｎｔｉ  ＭＳ  ｅｔ  ａｌ，１９９３；Ｔｅｒｍｕｌｅｎ  ＰＭ  ｅｔ  ａｌ，１９９３）、好ましくない臨床予後を余示する（Ａｌｌｇａｙｅｒ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ，２００２）ことも報告されており、ｃ−Ｓｒｃ活性化が成長および／または生存優位性を転移性結腸腫瘍細胞に付与することが示唆されている。活性化の機序に関わらず、ｃ−Ｓｒｃ活性化がヒト結腸癌細胞系の腫瘍形成の増大に寄与することを示唆する証拠はかなりある。
【００２４】
さらに、様々な生物学的特性および遺伝子変化を有する種々の結腸腫瘍細胞系を用いて、ｃ−Ｓｒｃの発現および活性がアノイキス（ａｎｏｉｋｉｓ）に対する耐性に対応することが示された。特に、ＳＷ４８０細胞（固有のｃ−Ｓｒｃ発現および活性が低い）のサブクローンにおける活性化されたｃ−Ｓｒｃの発現の強化は、アノイキスに対する耐性を増大し、一方、アンチセンスｃ−Ｓｒｃ発現ベクターでのトランスフェクションによるＨＴ２９結腸癌細胞（ｃ−Ｓｒｃ発現および活性が高い）におけるｃ−Ｓｒｃ発現の低減は、アノイキスに対する感受性を増大する（Ｗｉｎｄｈａｍ  ＴＣ  ｅｔ  ａｌ，２００２）。さらに、ｃ−Ｓｒｃ活性化は、一つには、アノイキスに対する解離細胞の感受性を低減するＡｋｔ媒介性生存経路を活性化することによって、結腸腫瘍の進行および転移に寄与し得ることが示唆された（Ｗｉｎｄｈａｍ  ＴＣ  ｅｔ  ａｌ，２００２）。それに対し、結腸腫瘍細胞においてｃ−Ｓｒｃ活性の増減に応じたＥＲＫ活性の変化はないことが報告されている（Ｗｉｎｄｈａｍ  ＴＣ  ｅｔ  ａｌ，２００２）。
【００２５】
乳癌において、ＥＲＫ／ＭＡＰＫ経路の活性化は、エストロゲン媒介性増殖にとって極めて重要なシグナル伝達事象であることが示された。エストロゲン誘導性ＥＲＫ活性化を阻害するハーセプチン（抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体）の能力と比べ、抗上皮成長因子受容体抗体はほとんど効果を有さない（Ｖｅｎｋａｔｅｓｈｗａｒ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ，２００２）。しかしながら、比較的特異的なＰＫＣδインヒビターであるロットレリンによるＰＫＣδ媒介性シグナル伝達の阻害が、エストロゲン誘導性ＥＲＫ活性化のほとんどを阻止することが示された（Ｖｅｎｋａｔｅｓｈｗａｒ  ｅｔ  ａｌ，２００２）。これは、癌細胞における「クロストーク」シグナル伝達の重要性を強調している。
【００２６】
ＰＫＣファミリーは、多くのセリン−スレオニンキナーゼからなり、それらの活性化因子に基づき３つのグループに分けられる。ＰＫＣアクチベーターが発癌プロモーターとして作用し得ることからＰＫＣは発癌と関連づけられ、ｐＫＣαおよびβイソ酵素（β１およびβ２）の活性化はしばしば悪性表現型と関連づけられてきた。実際のところ、骨髄性細胞において、ＰＫＣ過剰発現がＡｋｔ活性を刺激し、インターロイキン３の除去によって誘導されるアポトーシスを抑制することが示された（Ｗｅｉｑｕｎ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ，１９９９）。この研究者らはまた、ＰＩ３キナーゼ阻害が、ＡｋｔのＰＫＣ媒介性活性化を抑制することも実証した。
【００２７】
ＰＫＣは、例えば、アポトーシスタンパク質ファミリーのインヒビター（ＩＡＰ）を調節することが報告されている。ＩＡＰは、多くの異なる癌種（最も死亡率の高い癌種を含む）に関係付けられるプロアポトーシスカスパーゼ３、６および７と結合し、そのタンパク質分解活性を強力に阻害する。ＰＭＡ（ホルボールミリステートアセテート）誘導性ＩＡＰ発現は結腸癌細胞の一般的特徴であるようであり、ＰＭＡはＰＫＣδ活性を増大し、この酵素の阻止が、結腸癌細胞におけるＰＭＡによるＩＡＰ発現の増大を妨げることが示された（Ｗａｎｇ  Ｑ  ｅｔ  ａｌ）。これは、ヒト結腸癌細胞でのアポトーシスの防止におけるＰＫＣ依存性シグナル伝達の役割を示している。
【００２８】
ＰＫＣβアイソフォーム（βＩおよびβＩＩ）もまた、結腸癌の化学的予防にとって有効な標的であることが報告されており、ＰＫＣβの阻害は、ＭＥＫシグナル伝達の活性化によってもたらされるラット腸上皮細胞による浸潤を妨げる（Ｚｈａｎｇ  Ｊ，２００４）。同様に、ＰＫＣβＩＩのインヒビターは、プロ増殖性遺伝子（ｐｒｏ−ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｅ）の発現を阻害することにより、結腸癌マウスモデルにおける発癌イニシエーションおよび腫瘍プログレッションの両方を有意に低減することが示された（Ｆｉｅｌｄｓ  ＡＰ  ｅｔ  ａｌ，２００９）。ＰＫＣβＩＩはまた、腸上皮の増殖にも関係付けられてきた。例えば、恐らくはＡＰＣ／βカテニンシグナル伝達経路の活性化を介した、ＰＫＣβＩＩの結腸上皮細胞増殖および結腸発癌における直接的役割について、証拠が提供されている（Ｍｕｒｒａｙ  ＮＲ  ｅｔ  ａｌ，１９９９）。
【００２９】
ＥＧＦを過剰発現する浸潤性癌細胞は、浸潤および転移において主要な役割を果たす細胞移動のために、ＭＡＰＫ媒介性シグナル伝達の喪失をＰＫＣδシグナル伝達の活性化によって補う能力を有している（Ｋｒｕｇｅｒ  ＪＳ  ＆  Ｒｅｄｄｙ  ＫＢ，２００３）。この研究者らは、ＭＡＰＫおよびＰＫＣδシグナル伝達経路の阻害が、ＥＧＦＲを過剰発現するヒト乳癌細胞における細胞移動および浸潤を阻止するはずであることを示唆した。
【００３０】
セリン／スレオニンキナーゼＡｋｔ／ＰＫＢ経路は、細胞外（成長因子およびインスリン）および細胞内（受容体型チロシンキナーゼ、ＲａｓおよびＳｒｃ）癌遺伝子シグナルを伝達するための主要結節点（ｃａｒｄｉｎａｌ  ｎｏｄａｌ  ｐｏｉｎｔ）として機能する。さらに、Ａｋｔ（特に、構成的に活性化されたａｋｔ）の異所性発現は、細胞の腫瘍形成性形質転換およびトランスジェニックマウスにおける腫瘍形成、加えて化学療法耐性を誘導するのに十分である（Ｃｈｅｎｇ  ＪＱ  ｅｔ  ａｌ，２００５）。活性化されたＡｋｔは検出可能であり、多くの種類の癌の好ましくない予後の要因である（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ａｋｔ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｏｍｉｓｅ，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ，ａｎｄ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｐｉｔｆａｌｌｓ：Ｄｅｎｎｉｓ  ＰＡ，ＡＡＣＲ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ  Ｂｏｏｋ，２００８：２５−３５において再検討された）。Ａｋｔの全ての基質は未だ同定されておらず、「重要な基質」は細胞種特異的であり得る。したがって、Ａｋｔの個々の下流基質を阻害することは、Ａｋｔ調節性の生存または増殖に関わる主要基質を捕え損ね得る。
【００３１】
骨髄性前駆細胞におけるＰＫＣαによるアポトーシスの抑制がそれの内因性Ａｋｔを活性化する能力と相関があるという発見（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，１９９９）が、ＰＫＣ−Ａｋｔ「クロストーク」の証拠を提供する。Ａｋｔ３（ＰＫＢγ）は、エストロゲン受容体陰性乳癌およびアンドロゲン非感受性前立腺癌により特徴付けられるより侵襲性の高い臨床表現型に寄与し得ることが示唆されている（Ｎａｋａｔａｎｉ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ，１９９９）。遺伝子欠失または点突然変異によるＰＴＥＮの遺伝子不活化は、転移性前立腺癌においてはかなり一般的であり、結果として生じるＰＩ３ＫおよびＡｋｔの活性化が、癌処置において重要な治療機会を提供する（Ｍａｊｕｍｂｅｒ  ＰＫ  ＆  Ｓｅｌｌｅｒｓ  ＷＲ，２００５）。例えば、癌抑制遺伝子ＰＴＥＮを欠失する前立腺癌細胞系において、ＰＫＢγの基礎酵素活性が構成的に高められること、およびこれらの細胞における主要な活性ＰＫＢアイソフォームであることを示すことが分かっている（Ｎａｋａｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ，１９９９）。
【００３２】
ＰＫＢβ（Ａｋｔ２）は細胞生存に必須で、悪性形質転換において重要であると考えられており、ＰＩ３キナーゼおよびＡｋｔ２レベルの増加が、８０個の原発性乳癌腫のうち３２個で確認された（Ｓｕｎ  Ｍ，２００１）。また、この推定癌遺伝子Ａｋｔ２は、一部のヒト卵巣および膵臓癌腫においては増幅され、過剰発現されることも分かっている（Ｃｈｅｎｇ  ＪＱ  ｅｔ  ａｌ，１９９６）。
【００３３】
ＲＡＦセリン／スレオニンファミリーは、Ａ−ＲＡＦ、Ｂ−ＲＡＦおよびＣ−ＲＡＦ（ＲＡＦ−１）からなる。ヒト腫瘍におけるＢ−ｒａｆ突然変異の高い発生率と対照的に、ｃ−Ｒａｆ突然変異は、その低い基礎活性ゆえに稀にしか起こらない。しかしながら、ｃ−ＲＡＦのメラノーマ細胞増殖への関与を示すデータが、ｐａｎ特異的ＲＡＦ薬の方がＢ−Ｒａｆ特異的薬物よりもメラノーマに対して有効であろうことを示唆している（Ｓｅｂｏｌｔ−Ｌｅｏｐｏｌｄ  ＪＳ，２００８）。
【００３４】
癌治療において直面される課題は、複数の遺伝子欠陥を有する腫瘍に特異的なキナーゼに向けられた薬剤の使用をどのようにして最も効果的に最適化するかである。ＭＡＰＫ経路インヒビター（例えば、抗ＭＥＫ）は、恐らくより多様な腫瘍にわたって適用性を見出すであろう。しかしながら、ＲＡＳは、ＲＡＦだけでなく複数のエフェクターを介してシグナル伝達する。したがって、ＰＩ３キナーゼ／Ａｋｔ生存シグナル伝達経路のＲＡＳによる活性化は、ＭＡＰＫ活性化を遮断することから得られる治療的利益を少なくとも一部の腫瘍において減じ得る（Ｓｅｂｏｌｔ−Ｌｅｏｐｏｌｄ  ＪＳ，２００８）。例えば、ＰＩ３Ｋの活性化突然変異の共在がＫ−ＲＡＳ変異腫瘍のＭＥＫ／ＥＲＫシグナル伝達への依存を低減することが、実験により示されている（Ｓｅｂｏｌｔ−Ｌｅｏｐｏｌｄ（２００８）により再検討された）。ＰＩ３Ｋ経路における上流および下流の標的（ＰＩ３ＫおよびＡｋｔを含む）を標的とする薬剤は、ＭＥＫおよびＲＡＦインヒビターと組み合わせるための理に適った候補である。
【００３５】
近年、ＭＡＰキナーゼがインテグリンの細胞質ドメインと直接会合することが分かり、ＥＲＫ１／２の結合のためのβ３、β５およびβ６の結合ドメインが特性決定された（国際公開第２００１／０００６７７号パンフレットおよび国際公開第２００２／０５１９９３号パンフレット参照）。ＥＲＫ１／２の結合のためのβ２の結合ドメインもまた、国際公開第２００５／０３７３０８号パンフレットにおいて報告された。これらの特許出願は、ＭＡＰキナーゼにβインテグリン結合ドメインを提供するポリペプチドによる、βインテグリン−ＥＲＫ１／２結合相互作用の阻害が、癌細胞の成長を阻害し得ることを示す。国際特許出願ＰＣＴ／ＡＵ２００４／００１４１６号明細書は、βインテグリンサブユニットの発現がない状態での癌細胞の成長の阻害に関する。
【００３６】
癌の処置として異なる細胞シグナル伝達／活性化経路を標的化するための治療的アプローチとして、異なるキナーゼインヒビターを組み合わせることに主要な焦点が当てられてきた。しかしながら、これには個々の癌におけるキナーゼ突然変異の同定が、その癌の処置のためにキナーゼインヒビターの好適な組み合わせが選択されることを可能にするために必要となる。複数の細胞シグナル伝達／活性化経路を標的化してそれらの経路間の「クロストーク」を阻害する単剤は、癌の処置における大きな進歩となるであろう。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００３７】
本発明は、マイトジェン活性化プロテイン（ＭＡＰ）キナーゼファミリーの細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）にβインテグリンサブユニットの結合ドメインを提供する抗癌ポリペプチドが、ＭＡＰキナーゼファミリー以外の多くの異なる細胞活性化経路に関与するプロテインキナーゼ酵素の活性を阻害し得るという発見に関する。この驚くべき発見は、癌の予防または処置のために、癌細胞における複数の活性化経路の単一治療薬での阻害、およびそれによる、その経路間のクロスシグナル伝達（ｃｒｏｓｓ−ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ）もしくは「クロストーク」の阻害を提供する。より具体的には、この発見は、Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＭＡＰＫ経路に加えて１つ以上の細胞活性化経路の、異常なまたはアップレギュレートされた活性によりもたらされる癌細胞の成長および増殖の阻害を提供する。異なるクラスのキナーゼ、特にＲａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＭＡＰＫ経路以外の細胞活性化経路に関与するキナーゼの活性を阻害するための、ＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼのポリペプチドインヒビターの使用は、全く反直観的であり、当該技術分野における著しい進歩である。
【００３８】
したがって、大まかに述べると、１つ以上の形態の本発明は、癌細胞において複数の細胞活性化経路を阻害するための方法であって、ＥＲＫ２の結合のためのβインテグリンサブユニットのＭＡＰキナーゼ細胞質結合ドメインまたはその結合ドメインのＥＲＫ２が結合する変異形態もしくは改変形態を提供するポリペプチドの有効量で、癌細胞を処置する工程を含む方法に関する。
【００３９】
特に、本発明の１つの態様において、癌細胞の成長および／または増殖を阻害するための方法であって、
癌細胞の少なくとも１つの細胞活性経路における、ＭＡＰキナーゼ以外の少なくとも１種のプロテインキナーゼを阻害するためのインヒビターであって、ＥＲＫ２の結合のためのβインテグリンサブユニットのＭＡＰキナーゼ細胞質結合ドメインまたはその結合ドメインのＥＲＫ２が結合する変異形態もしくは改変形態を提供するポリペプチドであるインヒビターを選択する工程と、
そのポリペプチドの有効量で癌細胞を処置してそのプロテインキナーゼを阻害する工程と
を含む方法が提供される。
【００４０】
上記ポリペプチドによって阻害される１種もしくは複数種のプロテインキナーゼは、Ｓｒｃファミリー、ＰＩ３Ｋファミリー、プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ／ＡＫＴ）ファミリーおよびプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）ファミリーに属するキナーゼからなる群より選択され得る。驚いたことに、ｃ−ＲａｆおよびＭＥＫ１もまた、ＥＲＫ２の結合のためのβインテグリンサブユニットのＭＡＰキナーゼ細胞質結合ドメインを提供するポリペプチドによって阻害され得ることがさらに見出された。
【００４１】
したがって、本発明の別の態様において、少なくとも１種のプロテインキナーゼの活性を阻害するための方法であって、
そのプロテインキナーゼを阻害するためのインヒビターであって、ＥＲＫ２の結合のためのβインテグリンサブユニットのＭＡＰキナーゼ細胞質結合ドメインまたはその結合ドメインのＥＲＫ２が結合する変異形態もしくは改変形態を提供するポリペプチドであるインヒビターを選択する工程と、
標的キナーゼをそのポリペプチドの有効量と接触させてそのプロテインキナーゼを阻害する工程と
を包含し、このプロテインキナーゼは、ｃ−Ｒａｆ、ＭＥＫ１ならびにＳｒｃファミリー、ＰＩ３Ｋファミリー、プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ／ＡＫＴ）ファミリーおよびプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）ファミリーに属するキナーゼからなる群より選択される、方法が提供される。
【００４２】
本発明の別の態様において、少なくとも１種のプロテインキナーゼの活性を阻害するための方法であって、そのプロテインキナーゼを、ＥＲＫ２の結合のためのβインテグリンサブユニットのＭＡＰキナーゼ細胞質結合ドメインまたはその結合ドメインのＥＲＫ２が結合する変異形態もしくは改変形態を提供するポリペプチドと接触させる工程を含み、このプロテインキナーゼは、ｃ−ＲＡＦ、ＭＥＫ１ならびにＳｒｃファミリー、ＰＩ３Ｋファミリー、ＰＫＢファミリーおよびＰＫＣファミリーに属するキナーゼからなる群より選択される、方法が提供される。
【００４３】
本発明の別の態様において、癌細胞における複数の細胞活性化経路を阻害するための方法であって、その癌細胞を、ＥＲＫ２の結合のためのβインテグリンサブユニットのＭＡＰキナーゼ細胞質結合ドメインまたはその結合ドメインのＥＲＫ２が結合する変異形態もしくは改変形態を提供する少なくとも１種のポリペプチドの有効量で処置する工程を含む方法が提供される。
【００４４】
少なくとも一部の実施形態において、１種もしくは複数種の癌細胞が、上記ポリペプチドで、またはその細胞内で上記ポリペプチドを発現させてその細胞の処置をもたらすための核酸で、処置され得る。さらに、このポリペプチドまたは核酸は、デンドリマーによって提示されるか、またはその癌細胞の細胞質へのそのポリペプチドもしくは核酸の進入を促進するための別の形態の促進因子部分に連結され得、そのような実施形態は全て、本発明により明示的に含まれる。
【００４５】
そのようなものとして、本発明のさらに別の態様において、哺乳動物における癌の予防または処置のための方法であって、哺乳動物に、その癌の癌細胞における複数の細胞活性化経路を阻害するための少なくとも１種のデンドリマーの有効量を投与する工程を含み、そのデンドリマーは、ＥＲＫ２の結合のためのβインテグリンサブユニットのＭＡＰキナーゼ細胞質結合ドメインまたはその結合ドメインのＥＲＫ２が結合する変異形態もしくは改変形態を提供する少なくとも１種のポリペプチドを提示する、方法が提供される。
【００４６】
典型的に、上記デンドリマーおよび／またはポリペプチドは、少なくとも２種の異なるプロテインキナーゼの活性を阻害して、１種もしくは複数種の癌細胞における少なくとも２つの活性化経路を阻害するために投与される。
【００４７】
デンドリマーが投与される場合、このデンドリマーは、典型的に、上記ポリペプチドを８モノマー単位より多く提示する。
【００４８】
典型的に、βインテグリンサブユニットの結合ドメインは、その結合ドメインの両末端領域を互いに連結する介在アミノ酸リンカー配列を組み入れており、このリンカー配列は、ＥＲＫ２の結合に必須ではない。さらに、βインテグリンサブユニットの結合ドメインと比較して、このアミノ酸リンカー配列の１つ以上のアミノ酸が、上記ポリペプチドにおいて欠失しているおよび／または異なり得る。
【００４９】
典型的に、上記結合ドメインと比較して、介在アミノ酸配列中のアミノ酸が全て、上記ポリペプチドにおいて欠失している。
【００５０】
上記結合ドメインの両末端領域は、それぞれのアミノ酸配列によって規定され、典型的に、上記結合ドメインと比較して、結合ドメインの両末端領域のアミノ酸配列同一性は、上記ポリペプチドにおいて変化していない。
【００５１】
典型的に、βインテグリンサブユニットは、癌の癌細胞によって発現される。しかしながら、少なくとも一部の実施形態において、癌細胞は、本質的に、βインテグリンサブユニットを発現しない。
【００５２】
典型的に、上記デンドリマーまたはポリペプチドで癌細胞を処置して、その癌細胞における、Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＭＡＰＫ経路とは違った、またはその経路に加えて、他の細胞活性化経路の少なくとも１種のキナーゼを阻害する。
【００５３】
最も典型的には、上記デンドリマーまたはポリペプチドで細胞を処置して、その細胞におけるＲａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ活性化経路および少なくとも１つの他の細胞活性化経路を阻害する。
【００５４】
少なくとも一部の実施形態において、上記デンドリマーまたはポリペプチドで細胞を処置して、ＰＩ３キナーゼ／ＡＫＴ経路、ＰＩ３キナーゼ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路、ならびにＳｒｃ、ＰＫＢ／ＡＫＴおよび／またはＰＫＣキナーゼファミリーに属する１種以上のキナーゼが関与する細胞活性化経路からなる群より選択される１つ以上の細胞活性化経路を阻害する。
【００５５】
デンドリマーまたはポリペプチドによって阻害される１種もしくは複数種のＳｒｃキナーゼは、ｃ−Ｓｒｃ、ｃ−Ｌｙｎ、ｃ−Ｙｅｓおよびｃ−Ｆｙｎの群から選択される１種以上のキナーゼであり得る。
【００５６】
ＰＫＢは、ＡＫＴプロテインキナーゼファミリーとしても知られており、上記ポリペプチドによって阻害される１種もしくは複数種のＰＫＢキナーゼは、ＰＫＢα（ＡＫＴ１）、ＰＫＢβ（ＡＫＴ２）、およびＰＫＢγ（ＡＫＴ３）からなる群より選択される１種以上のキナーゼであり得る。
【００５７】
上記ポリペプチドによって阻害される１種もしくは複数種のＰＫＣキナーゼは、ＰＫＣα、ＰＫＣβＩ、ＰＫＣβＩＩ、ＰＫＣγおよびＰＫＣδからなる群より選択される１種以上のキナーゼであり得る。
【００５８】
ＰＩ３Ｋは、触媒サブユニット（例えば、ｐ１１０α、β、δまたはγ）と複合体化したアダプターサブユニット（例えば、ｐ８５）からなるＰＩ３キナーゼの群から選択され得る。一部の実施形態において、これらのキナーゼの混合物が、本明細書に記載される方法によって阻害され得る。
【００５９】
少なくとも一部の実施形態において、ポリペプチドは、ＲＳＫＡＫＷＱＴＧＴＮＰＬＹＲ（配列番号２）、ＲＡＲＡＫＷＤＴＡＮＮＰＬＹＫ（配列番号３）、ＲＳＲＡＲＹＥＭＡＳＮＰＬＹＲ（配列番号４）、ＫＥＫＬＫＳＱＷＮＮＤＮＰＬＦＫ（配列番号５）、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号６）、ＲＡＲＡＫＮＰＬＹＫ（配列番号７）、ＲＳＲＡＲＮＰＬＹＲ（配列番号８）、およびＫＥＫＬＫＮＰＬＦＫ（配列番号９）から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む、またはその群より選択されるアミノ酸配列から成る。
【００６０】
βインテグリンサブユニットは、通常β２、β３、β５およびβ６からなる群より選択され、最も一般的には、β６である。
【００６１】
βインテグリンサブユニットの結合ドメイン（またはその結合ドメインの変異形態もしくは改変形態）は、融合タンパク質に組み込まれ得、デンドリマーにおいて提示されようとされまいと、本発明は、本発明によって具現化される方法におけるそのような融合タンパク質の使用にまで明示的に拡張される。
【００６２】
デンドリマーは、本発明により具現化される方法における使用に適する任意のタイプであり得る。デンドリマーは、例えば、結合ドメイン（またはその改変形態もしくは変異形態）が連結された枝分かれ有機骨格（例えば、ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）、トリス（エチレンアミン）アンモニアまたはポリ（プロピレンイミン）（Ａｓｔｒａｍｏｌ（商標））により構成される骨格）を有し得る。他の形態において、デンドリマーは、ペプチドが連結された枝分かれ単位を構成するポリアミノ酸を組み入れた骨格を有し得る。少なくとも一部の実施形態において、デンドリマーは、ポリアミノ酸により構成される枝分かれ単位の骨格を有する。
【００６３】
典型的に、デンドリマーは、ペプチドが連結されたポリアミノ酸枝分かれ単位の複数の層／世代を有する。ポリアミノ酸枝分かれ単位は、通常、リジン残基により構成される。デンドリマーによって提示されるペプチドのそれぞれの単位は、ＥＲＫ２が結合するβインテグリンサブユニットの同じかまたは異なる結合ドメイン（またはその変異形態）を提供し得る。
【００６４】
典型的に、デンドリマーは、ペプチドのモノマーを提示する。デンドリマーはまた、デンドリマーの枝分かれ骨格を伸長させた開始核を有し得る。
【００６５】
用語「癌」とは、あらゆる種類の悪性の、無秩序な細胞増殖を意味する。癌は、上皮細胞癌、肉腫、リンパ腫および血球癌（白血病（例えば、骨髄性白血病、好酸球性白血病および顆粒球性白血病）を含む）から成る群より選択され得るが、これらに限定されない。白血球癌（例えば、白血病）の予防または処置については、インテグリンのβサブユニットは、発現が白血球に限定されるβ２であり得る（Ｈｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ，１９９２）。
【００６６】
また、少なくとも１つの細胞活性化経路における、ＭＡＰキナーゼ以外の少なくとも１種の標的タンパク質キナーゼを阻害し、それにより癌細胞の成長および／または増殖を阻害するための、ＥＲＫ２の結合のためのβインテグリンサブユニットのＭＡＰキナーゼ細胞質結合ドメインまたはその結合ドメインのＥＲＫ２が結合する変異形態もしくは改変形態を提供するポリペプチド、あるいはその癌細胞における当該ポリペプチドまたはその改変形態もしくは変異形態の発現のための核酸の使用が提供される。
【００６７】
さらに、少なくとも１つの細胞活性化経路における、ＭＡＰキナーゼ以外の少なくとも１種の標的プロテインキナーゼを阻害して癌細胞の成長および／または増殖を阻害するための医薬の製造における、ＥＲＫ２の結合のためのβインテグリンサブユニットのＭＡＰキナーゼ細胞質ＭＡＰキナーゼ結合ドメインまたはその結合ドメインのＥＲＫ２が結合する変異形態もしくは改変形態を提供するポリペプチド、あるいはその癌細胞における当該ポリペプチドまたはその改変形態もしくは変異形態の発現のための核酸の使用が提供される。
【００６８】
哺乳動物は、本発明の方法で処置し得る任意の哺乳動物であり得る。例えば、哺乳動物は、ウシ、ブタ、ヒツジもしくはウマ科のメンバー、実験用試験動物（例えば、マウス、ウサギ、モルモット）、ネコもしくはイヌ、または霊長類もしくはヒトであり得る。典型的に、哺乳動物はヒトである。
【００６９】
本発明の特徴および利点は、以下の非限定的な実施形態の詳細な説明からさらに明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】細胞活性化経路を図示する図である。
【図２】ペプチドデンドリマーの概略図である。
【図３】（ａ）８個のペプチドモノマーを組み入れた多抗原ペプチドデンドリマー（ＭＡＰ）の概略図を示している。（ｂ）Ｌｙｓ枝分かれ単位の数の増加が、表面アミノ基の数を増加させることを示している。
【図４】ペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号６）を１０ペプチドモノマー提示するペプチドデンドリマー（本明細書においてデンドリマーＤｅｎｄ１０−１０（４）と呼ばれる）の概略図である。
【図５】無細胞アッセイにおけるペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号４）によるｃ−Ｓｒｃチロシンキナーゼ活性の用量応答阻害を示すグラフである。
【図６】シスプラチンのみで処置されたＡ２７８０卵巣癌細胞と比較される、化学療法薬耐性ＡＤＤＰヒト卵巣癌腫細胞に対する、シスプラチンおよびペプチドＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号１０）（ＩＫ２）の単独および組み合わせでの有効性を示すグラフである。
【図７】（Ａ）ＡＤＤＰヒト卵巣癌細胞に対する、ペプチドＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号１０）（ＩＫ２）と組み合わせたオキサリプラチンの効果を示すグラフである。（Ｂ）ＡＤＤＰヒト卵巣癌細胞に対する、ペプチドＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号１０）（ＩＫ２）と組み合わせたオキサリプラチンの効果を示すグラフである。
【図８】ＡＤＤＰヒト卵巣癌細胞に対する、シスプラチンとペプチドＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号１０）（ＩＫ２）との間の相乗作用を示すグラフである。
【図９】ＨＴ２９ヒト結腸癌細胞に対する、シスプラチンとペプチドＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号１０）（ＩＫ２）との間の相乗作用を示すグラフである。
【図１０】ペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号６）を８モノマー単位提示するペプチドデンドリマーＤｅｎｄ８−１０（４）による、ＨＴ２９結腸癌細胞におけるＥＲＫ活性の用量依存的な阻害を示すグラフである。
【図１１】ペプチドが完全にＤ−アミノ酸からなりペグ化されているペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号６）を１０モノマー単位提示するペプチドデンドリマー（デンドリマーＤｅｎｄ１０−１０（４）ＤＰ）による、ヒト結腸癌細胞におけるアポトーシスの誘導を示すグラフである。
【図１２】ペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号６）を１０モノマー単位提示するデンドリマーＤｅｎｄ１０−１０（４）による、ＨＴ２９結腸癌細胞の増殖の阻害を示すグラフである。
【図１３】４８時間にわたって培養されたＨＴ２９ヒト結腸癌細胞の増殖に対する、デンドリマーＤｅｎｄ９−１０（４）およびＤｅｎｄ１２−１０（４）（それぞれ、ペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号６）を、９および１２モノマー提示する）の効果を示すグラフである。
【図１４】シスプラチン、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）および５−フルオロウラシル（５ＦＵ）と比較される、ＨＴ２９結腸癌細胞の増殖の阻害におけるデンドリマーＤｅｎｄ１０−１０（４）ＤＰ（改変（Ｍｏｄ．）ＩＫ２４８として識別される）の有効性を示すグラフである。
【図１５】ペプチドＲＡＲＡＫＮＰＬＹＫ（配列番号７）を８モノマー単位提示するペプチドデンドリマー（Ｄｅｎｄ８−β３）（中実の正方形）またはペプチドＲＳＲＡＲＮＰＬＹＲ（配列番号８）を８モノマー提示するペプチドデンドリマー（Ｄｅｎｄ８−β５）（中実の菱形）を用いたＨＴ２９結腸癌細胞の処置を示すグラフである。
【図１６】腫瘍内注射される場合の、ビヒクルのみのコントロール（中実の菱形）と比較される、デンドリマーＤｅｎｄ１０−１０（４）（ＩＫ２４８として識別される）（中実の正方形）によるＢＡＬＢ／ｃマウスモデルにおけるＨＴ２９結腸癌腫瘍成長の阻害を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００７１】
意外なことに、ＥＲＫ２の結合のためのβインテグリンサブユニットのＭＡＰキナーゼ細胞質結合ドメインを提供するペプチドは、ＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼのインヒビターであることに加え、ＳｒｃファミリーおよびＰＩ３Ｋファミリーに属するプロテインキナーゼ、ならびに他のプロテインキナーゼ（ｃ−ＲＡＦ、ＭＥＫ１、ＰＫＢファミリーに属するキナーゼ（例えば、ＰＫＢα、ＰＫＢβおよびＰＫＢγ）、およびプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）ファミリーに属するキナーゼ（例えば、ＰＫＣα、ＰＫＣβＩ、ＰＫＣβＩＩおよびＰＫＣδ）が挙げられるが、これらに限定されない）のインヒビターでもあることが見出された。
【００７２】
本明細書に記載される方法において使用されるポリペプチドは、ＥＲＫ２の結合のためのβインテグリンサブユニットのＭＡＰキナーゼ結合ドメインを提供し得る、または１つ以上のアミノ酸がその結合ドメインと異なり得る。このポリペプチドは、さらに、またはあるいは、その結合ドメインに隣接するβインテグリンサブユニットの領域の一方もしくは両方と１つ以上のアミノ酸が異なり得る。
【００７３】
用語「結合ドメイン」とは、ＭＡＰキナーゼとの結合の最適レベルを実質的に妥協しない、上記ＭＡＰキナーゼの結合に必要とされるβインテグリンサブユニットの連続したアミノ酸配列の最小長さを意味する（例えばＥＲK  １／２）。さらに、用語「結合ドメイン」は、自然に起こる変異体および多型対立遺伝子によってコードされる結合ドメインを包含する。
【００７４】
結合ドメインの「変異形態」という用語は、１つ以上のアミノ酸が、本質的に、ＭＡＰキナーゼによる結合に悪影響を及ぼすことなく、上記結合ドメインと異なるアミノ酸配列を意味し、単離または精製された天然のそのような配列を包含する。
【００７５】
用語「改変形態」とは、結合ドメインが、１つ以上のアミノ酸変化によって、本質的に、ＭＡＰキナーゼによる結合に悪影響を及ぼすことなく、改変されたアミノ酸配列を意味する。
【００７６】
本明細書において使用される場合、「ＭＡＰキナーゼ」とは、マイトジェン活性化プロテインキナーゼファミリーのメンバー（例えば、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２、ＪＮＫおよびｐ３８アイソフォーム）を意味し、ＭＡＰキナーゼキナーゼおよびＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼ酵素は除外する。
【００７７】
上記結合ドメインの変異形態および改変形態は、上記結合ドメインの誘導体およびペプチド擬態物を包含する。上記結合ドメインの変異形態または改変形態は、概して、２個以上の荷電したアミノ酸残基（各々独立して正または負に荷電している）を含み、典型的には、最低３個の正に荷電したアミノ酸（例えば、Ｈｉｓ、Ｌｙｓおよび／またはＡｒｇ）を含む。
【００７８】
典型的に、上記ポリペプチドは、１種もしくは複数種のプロテインキナーゼの直接的インヒビターである。すなわち、このポリペプチドは、このポリペプチドと１種もしくは複数種のキナーゼとの直接的相互作用を通じてその１種もしくは複数種のキナーゼの活性を阻害し得る。
【００７９】
典型的に、上記結合ドメインは、ＥＲＫ２の結合に必須ではない欠失させ得るいくつかの隣接する介在アミノ酸（すなわち、アミノ酸リンカー配列）によって互いに連結される両末端領域を有する。
【００８０】
本明細書に記載の発明により具現化されるデンドリマーまたは方法において有用なポリペプチド（例えば、その結合ドメインを組み入れているβインテグリンサブユニットの結合ドメインの改変形態）の提供は、上記結合ドメインの１つ以上のアミノ酸の付加、欠失および／または別の１つもしくは複数のアミノ酸での置換により達成され得る。アミノ酸の逆位およびアミノ酸配列の変更をもたらすあらゆるその他の変異変化もまた包含される。例えば、上記結合ドメインの非必須介在アミノ酸リンカー配列の１つ以上のアミノ酸を欠失させるか、別の１つもしくは複数のアミノ酸に置換（例えば、保存的アミノ酸置換）させ得る。そのような改変ポリペプチドは、変異を起こさせた核酸配列の発現により所望のアミノ酸変化が達成されるようにヌクレオチド変化を核酸配列に導入することによって、または、例えば、所望のアミノ酸変化を組み入れたアミノ酸配列を合成することによって調整され得る。その実現可能性は、十分に当業者の能力の範囲内である。
【００８１】
さらに、本明細書に記載される改変結合ドメインまたはポリペプチドは、遺伝暗号によってコードされない１つもしくは複数のアミノ酸、またはアミノ酸アナログを組み入れ得る。例えば、Ｌ−アミノ酸ではなくＤ−アミノ酸が利用され得る。実際、本発明の実施形態において有用なペプチドは、部分的または完全にＤ−アミノ酸から成り得る。Ｄ−ペプチドは、当該技術分野において周知の技術を用いた化学合成により生成され得る。したがって、一部の実施形態において、ペプチドが、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸またはＬ−およびＤ−アミノ酸の混合物を含み得る。Ｄ−アミノ酸を含むペプチドの合成は、当該技術分野において知られるように、ペプチダーゼ活性（例えばエンドペプチダーゼ）を阻害し得、それにより、対応するＬ−ペプチドと比較して、ペプチドのインビボでの安定性を向上させ、半減期を増大させ得る。
【００８２】
同様に、ポリペプチド／ペプチドのＮ末端またはＣ末端は、インビボでの分解（例えば、ペプチダーゼによる）から保護する、またはインビボでの分解を阻害するために改変され得る。例えば、ポリペプチドのＣ末端は、ペプチダーゼによる分解から保護するためにアミド化され得る。あるいは、本明細書に記載されるポリペプチドのＮ末端またはＣ末端はまた、インビボでのプロテアーゼによる分解に対する抵抗性をより低くする、または腎臓を介した循環からのそれらのクリアランスを阻害するために複数のエチレングリコールモノマー単位によってペグ化され得る。ポリペプチド／ペプチドのペグ化の方法は当該技術分野において周知であり、そのような方法の全てが明示的に含まれる。典型的に、本発明により具現化される方法において用いられるペグ化ポリペプチドは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の２個以上のモノマー単位、一般的には、ＰＥＧの約２個〜約１１個のモノマー（すなわち、（ＰＥＧ）ｎであり、ｎは２〜１１に相当する）に連結される。最も一般的には、ｎは２である。
【００８３】
アミノ酸の置換は、保存的または非保存的なアミノ酸置換を含み得る。保存的アミノ酸置換とは、あるアミノ酸残基を、類似の立体化学特性（例えば、構造、荷電、酸性または塩基性特性）を有し、結合ドメインの結合活性に実質的に悪影響を及ぼさない別のアミノ酸と置き換えることを意味する。例えば、極性アミノ酸は別の極性アミノ酸と置換され得、保存的アミノ酸変化は当業者に周知である。
【００８４】
本明細書に記載されるアミノ酸配列間の配列同一性は、それらの配列が比較のために最適にアラインメントされた時の、配列中の各位置におけるアミノ酸を比較することによって決定され得る。これらの配列は、ある位置のアミノ酸が同じアミノ酸残基であれば、その位置において同じであると見なされる。配列のアラインメントは、任意の適切なプログラムまたはアルゴリズムを用いて（例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０）による）実施され得る。コンピュータ援用の配列アラインメントは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．１（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）の一部であるＧＡＰなどの標準的なソフトウェアプログラムを用い、ギャップ作製ペナルティを５０、ギャップ伸長ペナルティを３とするデフォルトスコアリングマトリックスを用いて好都合に実施され得る。比較のための配列のアラインメントの他の方法（例えば、これらに限定されないが、Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８０）のアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）のアルゴリズム、そうしたアルゴリズムのコンピュータへの実装（ｃｏｍｐｕｔｅｒｉｚｅｄ  ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）（例えば、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＢＬＡＳＴ）、ならびにマニュアルアラインメントおよび検査による）もまた、周知である。
【００８５】
典型的に、本明細書に記載されるデンドリマーにおいて有用なポリペプチドは、βインテグリンサブユニットと、少なくとも約４０％、より一般的には少なくとも約５０％、６０％または７０％以上、最も好ましくは少なくとも約８０％、９０％または９５％配列同一性以上の全アミノ酸配列同一性を有する。βインテグリンサブユニットの結合ドメインとの配列同一性は、これら２つの配列間の全アミノ酸配列同一性より大きくなり得、一般的には少なくとも約６０％、７０％または８０％より大きく、より一般的には少なくとも約９０％または９５％以上である。しかしながら、ポリペプチドの全配列同一性または上記結合ドメインとのポリペプチドの配列同一性は、上記で具体的に述べた個々の値内の任意の特定の値または範囲であり得る。例えば、ポリペプチドのアミノ酸配列同一性は、少なくとも６６％または７５％以上であり得、そうした配列同一性および範囲の全てが、本発明に明示的に包含される。
【００８６】
本発明により具現化される方法において有用なポリペプチドの誘導体は、親分子の開裂環化によって、および／または溶解性、親油性特性を改善して細胞による取込み、安定性もしくは生物学的半減期、細胞毒性の低下をいっそう良くするような、または、例えばその後の検出などのためのラベルとして機能する、１つ以上の更なる部分との連結によって提供され得る。誘導体はまた、翻訳後または合成後改変（例えば、炭水化物部分の連結）または構造改変をもたらすような化学反応（例えば、アミノ酸残基のアルキル化もしくはアセチル化、または化学結合の形成を伴う他の変化）の結果としても得られ得る。
【００８７】
用語「ポリペプチド」は、本明細書においてペプチドと相互交換可能に使用される。例えば、ペプチド因子（例えば、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号６）およびＫＥＫＬＫＮＰＬＦＫ（配列番号９））は、用語ポリペプチドの範囲内に入ると理解される。
【００８８】
ペプチドデンドリマーは、本発明の方法における使用に特に適している。本発明の少なくとも一部の実施形態におけるペプチドデンドリマーは、ポリアミノ酸の枝分かれした骨格（典型的にはリジン枝分かれ単位）に連結させたポリペプチドインヒビターを複数単位提示する。デンドリマーは、典型的に、アミノ酸枝分かれ単位を少なくとも３層／世代有しており、ポリペプチドインヒビターの単位はアミノ酸枝分かれ単位の最外層／世代に連結されるため、デンドリマーはポリペプチドを８単位より多く提示する。モノマー単位のポリペプチドが好ましいが、他の実施形態においては、デンドリマーのポリアミノ酸枝分かれ単位に連結させた多単位のポリペプチド（マルチマー）（例えば、（ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ）ｎ（（配列番号６）ｎ）であり、ｎは、このポリペプチドの反復回数（典型的に１〜３）である）を組み入れたデンドリマーが利用され得る。したがって、デンドリマーにより提示されるポリペプチドの単位は、ポリペプチドのモノマー単位、マルチマー単位、ならびに／またはモノマーおよびマルチマー単位の混合物であり得る。
【００８９】
抗癌ポリペプチドは、デンドリマーの骨格を構成するポリアミノ酸枝分かれ単位の最外層／世代に結合されるか、またはデンドリマーのポリアミノ酸枝分かれ単位上に合成により構築され得る。より具体的には、本発明により具現化される１つ以上の方法において有用なデンドリマーの合成は、分岐合成法または収束合成法により達成され得る。
【００９０】
分岐法は、固相合成により固体支持体上に連続操作で逐次的にデンドリマーが構築される直接的なアプローチである。逐次的合成は、デンドリマーの枝分かれ開始核の合成、それに続くポリペプチドインヒビターの合成を連続的に含む。分岐法は、三官能性酸（例えば、ポリアミノ酸）の骨格を有するデンドリマーの合成に特に適している。そのような固相合成法は、２箇所が保護されたリジンを用いて多レベルのリジンの枝分かれ骨格を生成する場合のリジン枝分かれ単位の合成に最も好まれる方法である。リジンのジアミノの性質が、各レベルのリジンの追加毎にポリペプチドインヒビターを直接合成させ得る部位の数を効果的に倍加させる。
【００９１】
収束法は、ポリペプチドおよび枝分かれ開始核単位が別個に調製され、次いで互いに連結される、間接的なモジュール的アプローチである。デンドリマーの収束合成において用いられる枝分かれ骨格を有する開始核単位は市販されており、典型的に、有機アミノ化合物（例えば、ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）、トリス（エチレンアミン）アンモニアまたはポリ（プロピレンイミン）（Ａｓｔｒａｍｏｌ（商標）））から構成され、通常それに、別個に調製されたインヒビターを共有結合させる。
【００９２】
本明細書に記載されるポリペプチドが連結され得る適切なペプチドデンドリマー骨格、およびペプチドデンドリマーを提供するための方法は、例えば、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ，２００５；Ｓａｄｌｅｒ  ａｎｄ  Ｔａｍ，２００２；およびＣｌｏｎｉｎｇｅｒ，２００２に記載されており、それらの全内容が、参照により完全に本明細書に援用される。本発明の実施形態における使用に適した種類のペプチドデンドリマーの例が、図２および図３（Ｓａｄｌｅｒ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｔａｍ，Ｊ．Ｐ．，２００２）および図４に概略的に図示される。好適なデンドリマーは、同時係属中の国際特許出願ＰＣＴ／ＡＵ２００９／０００２０１号明細書にも記載されており、その内容は、相互参照により完全に本明細書に援用される。
【００９３】
本発明により具現化される方法において用いられるデンドリマーは、典型的にはポリペプチドを８単位より多く（例えば、９、１０または１２単位）提示する。ポリペプチド単位は、通常全て同じであるが、本明細書に記載されるポリペプチドの混合物もまた用いられ得る。例えば、ポリペプチドの単位の半分は、ＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼにβ６インテグリンサブユニットの結合ドメインを提供し得るが、ポリペプチドの残りの単位は、β５インテグリンサブユニットの結合ドメイン（またはこれらの結合ドメインの変異形態もしくは改変形態）を提示する。しかしながら、異なる抗癌ポリペプチド因子の比率もまた、異なり得ることが理解される。本発明により具現化される方法において用いられるデンドリマーによって提示されるペプチドはまた、典型的に、タンパク質分解からＮ−末端またはＣ−末端が保護されている（例えば、アミド生成、ペグ化（すなわち、ＰＥＧ単位の付加）などによる）。ポリペプチドのペグ化などの方法は当業者の能力の範囲内であり、そのような方法の全てが明示的に含まれる。
【００９４】
典型的に、本発明の実施形態に従うデンドリマーにおいて提示されるポリペプチドは、約６０アミノ酸以下の長さを有する。一般的に、ポリペプチドは５より大きなアミノ酸長を有し、通常、最大約５０までのアミノ酸長、４０、３５、３０、２５、２０または１５アミノ酸長である。ある形態において、このポリペプチドは、６、７、８、９または１０アミノ酸から約１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２５アミノ酸までの範囲の長さを有し得る。しかしながら、本明細書に記載されるデンドリマーにおける使用に適する上記で特定された特定の長さおよび長さ範囲の範囲内の全ての特定の長さおよび長さ範囲のポリペプチドが明示的に包含されることが理解される（例えば、１３もしくは１４アミノ酸、または１０〜１５、１０〜２０、または１０〜２２アミノ酸など）。
【００９５】
ＭＡＰキナーゼＥＲＫ２に対するβインテグリンサブユニットβ２、β３、β５およびβ６の結合ドメインは、国際公開第２００１／０００６７７号パンフレットおよび国際公開第２００２／０５１９９３号パンフレットに記載されている。ＥＲＫ２に対するβ２インテグリンサブユニットの結合ドメインは、国際公開第２００５／０３７３０８号パンフレットに記載されている。これらの国際特許出願の全ての開示が、参照により完全に、本明細書に明示的に援用される。特に、βインテグリンサブユニットのＭＡＰキナーゼへの結合を阻害するための更なるポリペプチド因子であって、本明細書に記載されるデンドリマーへの組み入れに適したポリペプチド因子もまた、結合ドメインの位置決定および特徴付けの方法に加え、これらの出願に記載されている。
【００９６】
より具体的には、結合ドメインは、ＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼに対するβインテグリンサブユニットの細胞質結合ドメインのそれぞれの重複するペプチドフラグメントの能力を評価することにより位置特定され得る。次いで、結合ドメインを構成する特定のアミノ酸配列が、漸次小さくしていくペプチドフラグメントを利用して決定され得る。この目的のために、試験ペプチドが、より大きなペプチドフラグメントのＮ末端およびＣ末端の片方または両方からの１つもしくは複数のアミノ酸の欠失を伴って所望の長さに容易に合成され、ＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼと結合するそれらの能力について試験される。このプロセスは、実測された最適結合レベルを実質的に妥協しない、ＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼと結合し得る最短のペプチドが同定されるまで繰り返される。
【００９７】
ＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼ−βインテグリン相互作用において本質的な役割を果たすアミノ酸の同定は、上記配列の１つ以上のアミノ酸を欠失させたかまたは１つもしくは複数の異なるアミノ酸と置換させたさらに合成された試験ペプチドを用いて、ペプチドの結合能力に対する効果を決定することにより達成され得る。典型的に、置換変異誘発は、アミノ酸配列の選択されたアミノ酸とアラニンまたは他の中性荷電アミノ酸との置換を含む。
【００９８】
β６インテグリンサブユニットについてのヌクレオチドおよびアミノ酸配列データは、例えば、Ｓｈｅｐｐａｒｄ  ｅｔ  ａｌ，１９９０に見出される。ＥＲＫ１およびＥＲＫ２は、高い全アミノ酸配列同一性を有しており、ＥＲＫ１は、β６に対する結合部位を提供するＥＲＫ２の２６マーアミノ酸配列と約９６％の配列同一性を有する（国際公開第２００２／０５１９９３号パンフレット参照）。ＥＲＫ２についてのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、例えば、Ｂｏｕｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９１に見出される。そうした公開データの参照は、本明細書に記載されるデンドリマーにおいて有用なポリペプチドの容易な設計、およびそのポリペプチドをコードする対応する核酸配列の提供を可能にする。
【００９９】
ポリペプチドまたは他の因子を結合に必要とされる三次元構造に拘束するために、ポリペプチドまたは他の因子は、側鎖構造を用いるか、またはジスルフィド架橋を形成するシステイン残基を組み入れることにより合成され得る。また、ポリペプチドまたは他の因子は、環化されると剛性が増し、それによりインビボでの安定性を提供し得る。種々のそのような方法が、当該技術分野において知られている。
【０１００】
上記のように、本発明により具現化される方法において有用なポリペプチドは、βインテグリンサブユニットの結合ドメイン、または結合ドメインの介在アミノ酸配列のＭＡＰキナーゼの結合に必須ではない１つ以上のアミノ酸を欠失させたその変異形態もしくは改変形態を含み得る、あるいはβインテグリンサブユニットの結合ドメイン、または結合ドメインの介在アミノ酸配列のＭＡＰキナーゼの結合に必須ではない１つ以上のアミノ酸を欠失させたその変異形態もしくは改変形態から成り得る。１例として、β６の結合ドメインは、アミノ酸配列ＲＳＫＡＫＷＱＴＧＴＮＰＬＹＲ（配列番号２）を含む。しかしながら、介在アミノ酸配列ＷＱＴＧＴ（配列番号１１）はＭＡＰキナーゼＥＲＫ２の結合に必須ではない。すなわち、配列ＷＱＴＧＴ（配列番号１１）を欠失させたとしても、アミノ酸配列ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号６）を有するペプチドは、依然としてＥＲＫ２により結合される。同様に、ＥＲＫ２に対するβ２、β３およびβ５の結合ドメインは、それぞれＫＥＫＬＫＳＱＷＮＮＤＮＰＬＦＫ（配列番号５）、ＲＡＲＡＫＷＤＴＡＮＮＰＬＹＫ（配列番号３）およびＲＳＲＡＲＹＥＭＡＳＮＰＬＹＲ（配列番号４）により与えられる。これらの配列からの介在配列ＳＱＷＮＮＤ（配列番号１２）、ＷＤＴＡＮ（配列番号１３）およびＹＥＭＡＳ（配列番号１４）の欠失は、１０マーペプチドＫＥＫＬＫＮＰＬＦＫ（配列番号９）、ＲＡＲＡＫＮＰＬＹＫ（配列番号７）およびＲＳＲＡＲＮＰＬＹＲ（配列番号８）を生じ、これらは全て、依然としてＥＲＫ２に結合する。容易に決定され得るように、ペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号６）は、ペプチドＲＳＲＡＲＮＰＬＹＲ（配列番号８）と８０％の配列同一性を有し、そしてＲＡＲＡＫＮＰＬＹＫ（配列番号７）と７０％の配列同一性を有する。同様に、ペプチドＲＳＲＡＲＮＰＬＹＲ（配列番号８）は、ペプチドＲＡＲＡＫＮＰＬＹＫ（配列番号７）と７０％の配列同一性を有する。
【０１０１】
β２、β３およびβ５ならびにβ６の結合ドメインのアラインメントの結果として、コンセンサス配列（ｃｏｎｃｅｎｓｕｓ  ｓｃｈｅｍｅ）Ｒ／ＫｘＲ／ＫｘＲ／Ｋ−ｘｘｘｘｘＮＰＬＹ／ＦＲ／Ｋ（ここで、Ｒ／Ｋはアルギニンまたはリジンのいずれかであり、Ｙ／Ｆはチロシンまたはフェニルアラニンのいずれかであり、ｘは任意のアミノ酸であり得、「−」（すなわちダッシュ）は必須ではない欠失され得るアミノ酸である）が得られ、本発明によって具現化される方法または本明細書に記載されるデンドリマーに利用されるポリペプチドは、このコンセンサス配列により表され得るか、このコンセンサス配列を含み得る。「−」により示されるアミノ酸は、セリン残基であり得るが、別のアミノ酸（例えば、スレオニン、チロシン、アスパラギンまたはグルタミン）であってもよい。典型的に、ポリペプチドは、Ｒ／ＫｘＲ／Ｋ?Ｒ／Ｋ−ｘｘ?ｘ?ＮＰＬＹ／ＦＲ／Ｋ（ここで、各?は、独立して、疎水性アミノ酸、またはセリン、チロシンおよびスレオニンからなる群より選択されるアミノ酸である）により表されるアミノ酸配列を有する。疎水性アミノ酸は非極性アミノ酸であり、例として、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびフェニルアラニンが挙げられる。−ｘｘｘｘｘにより示される介在アミノ酸配列全体（またはその配列のアミノ酸のうちの１つ以上）もまた、ポリペプチドが配列Ｒ／ＫｘＲ／ＫｘＲ／ＫＮＰＬＹ／ＦＲ／Ｋを含むか、または配列Ｒ／ＫｘＲ／ＫｘＲ／ＫＮＰＬＹ／ＦＲ／Ｋからなるように欠失させ得る。
【０１０２】
本明細書に記載されるようなポリペプチド、融合タンパク質などの細胞内送達を達成する別の方法は、外側の細胞／形質膜を横切っての細胞の細胞質へのポリペプチドの進入または輸送を促進するための「促進因子部分」（例えば、エネルギー依存的に細胞膜を横切って積荷分子を送達する能力を有するキャリアペプチド）を使用することである。当該技術分野において公知のキャリアペプチドとしては、ペネトラチン（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ）およびその変異体もしくはフラグメント、ヒト免疫不全ウイルスＴａｔ由来ペプチド、トランスポータン（ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ）由来ペプチド、ならびにシグナルペプチドが挙げられる。
【０１０３】
特に好適なシグナルペプチドは、米国特許第５，８０７，７４６号明細書に記載されており、その明細書の内容は完全に本明細書に援用される。アミノ酸配列ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡ（配列番号１５）もしくはＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ（配列番号１６）からなる、またはそのアミノ酸配列を組み入れた、カポジ線維芽細胞成長因子（Ｋ−ＦＧＦ）のシグナルペプチドが好ましい。本発明の方法において使用されるシグナルペプチドは完全なシグナルペプチドである必要はなく、外側の細胞膜を通過して、結合されたペプチドもしくは他の薬剤の細胞の細胞質への送達をもたらす能力を保持するそのフラグメントまたは改変もしくは変異形態などが利用され得る。
【０１０４】
カチオン性ペプチドもまた、高分子（例えば、ＤＮＡ）を生細胞内に移動させるのに成功裏に使用されてきており、また、１５マーアルギニンペプチドが、癌細胞系における緑色蛍光タンパク質をコードするＤＮＡおよびβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の発現をもたらすための好ましいアミノ酸残基数であることが報告されている（Ｃｈｏｉ  ＨＳ  ｅｔ  ａｌ，２００６；Ｋｉｍ  ＨＨ  ｅｔ  ａｌ，２００３）。本発明は、標的癌細胞への本発明に従うＥＲＫ２の結合のためのβインテグリンサブユニットの結合ドメインを提供するポリペプチドの進入、またはその細胞内での当該ポリペプチドの発現のための当該ポリペプチドをコードするＤＮＡの進入を促進するための促進因子部分としての、そのようなカチオン性ペプチドの使用にまで拡張される。
【０１０５】
本発明はまた、少なくとも一部の実施形態において、「ダブルヒット（ｄｏｕｂｌｅ  ｈｉｔ）」戦略として、上記結合ドメインを提供するポリペプチド（ペグ化されているかまたはペグ化されていないものであり得る）または当該ポリペプチドをコードするＤＮＡを複数単位提示するデンドリマーに、そのポリペプチドまたはＤＮＡの標的癌細胞内への送達／さらなる進入支援のために、１種もしくは複数種のカチオン性ペプチド（例えば、１５マーアルギニンペプチド）を（例えば、リジン結合を介して）連結することにまで拡張される。
【０１０６】
キャリアペプチドの代わりに、促進因子部分は、選択された抗癌ペプチドの細胞膜の通過が促進されるようにそのペプチドの細胞膜溶性（ｃｅｌｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）を向上させる、脂質部分または他の非ペプチド部分であり得る。この脂質部分は、例えば、トリグリセリド（混合トリグリセリドを包含する）から選択され得る。脂肪酸（特に、Ｃ１６〜Ｃ２０脂肪酸）もまた、使用され得る。典型的に、脂肪酸は飽和脂肪酸であり、最も一般的にはステアリン酸である。本発明は、いずれのそのような非ペプチド促進因子分子の使用にも限定されず、所望の細胞膜溶性を付与し、かつ生理学的に許容可能であるあらゆる分子が使用され得る。
【０１０７】
本明細書に記載される、ＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼのためのβインテグリンサブユニットの結合ドメイン（またはその結合ドメインの変異形態もしくは改変形態）を提示するポリペプチドは、任意の従来公知の方法で促進因子部分に連結され得る。例えば、このポリペプチドは、ペプチド結合により、または架橋試薬を使用して非ペプチド共有結合により、アミノ酸リンカー配列を介してキャリアペプチドに直接連結され得る。さらに、化学ライゲーション法が、キャリアペプチドまたはリンカー配列のカルボキシ末端アミノ酸と、ＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼのためのβインテグリンサブユニットの結合ドメインを含む、またはその結合ドメインからなるペプチドとの間に共有結合を作るために使用され得る。
【０１０８】
本明細書に記載される、癌細胞へのポリペプチド、核酸もしくはデンドリマーの標的化または送達は、標的化部分（例えば、リガンド（例えば、その癌細胞によって発現される受容体と結合するリガンド）または結合ペプチド、抗体もしくはその結合フラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）２フラグメント））を、促進因子部分に、または直接そのデンドリマー、ポリペプチドなどに連結することにより達成され得る。１つのアプローチは、促進因子部分−ペプチド複合体と、細胞外インテグリンドメインを標的化するインテグリン受容体標的化ペプチドとを連結することを用いる。例えば、配列ＤＬＸＸＬ（配列番号１７）を有するペプチドが、β６インテグリンサブユニットの細胞外ドメインを標的化するために使用され得る。β６の発現がマトリックスメタロプロテイナーゼ−９（ＭＭＰ−９）による細胞表面における有効なタンパク質分解を増大させる（Ａｇｒｅｚ  ＭＶ  ｅｔ  ａｌ，１９９９）ことから、こうした標的化アプローチには、標的化部分とキャリアとの間にＭＭＰ−９切断部位を遺伝子工学で作って、キャリア−薬剤複合体のインターナリゼーションを促進することが含まれる。別の例として、αＶβ６インテグリンに対するリガンド認識モチーフＲＴＤＬＤＳＬＲＴＹＴＬ（配列番号１８）が、遺伝子工学で作られたＭＭＰ−９切断部位と一緒に、またはその切断部位なしに、促進因子部分−ペプチド複合体を標的細胞の表面に送達するために使用され得る。
【０１０９】
本発明の方法における癌細胞への標的化はまた、当該技術分野において公知であるようなＥＧＦ受容体に特異的な抗体または結合ペプチドを、上記ポリペプチドまたはデンドリマーに（例えば、図４に図示されたデンドリマーの先端のリジン（Ｌｙｓ）残基などに）連結することによっても達成され得る。細胞内への取り込みは、数多くの機序を介して（カテプシンを多く含むリソソームを介してを含む）起こり得、使用される標的化部分は、ポリペプチドまたはデンドリマーを放出して細胞の処置をもたらすためのカテプシン切断部位を含み得る。全てのそのような方法、デンドリマーおよびポリペプチドが、本発明により明示的に含まれる。さらに、βインテグリンサブユニットの結合ドメイン（および／またはその結合ドメインの変異形態もしくは改変形態）を提供するポリペプチドはまた、（そのポリペプチドがデンドリマーに含まれていようといまいと）上記のようにペグ化され得る。
【０１１０】
別のアプローチとして、リポソーム、ゴースト細菌細胞、カベオスフィア（ｃａｖｅｏｓｐｈｅｒｅ）、合成ポリマー剤、超遠心機で分離したナノ粒子および他の無核ナノ粒子（例えば、正常な細菌細胞分裂を制御する遺伝子を不活性化した結果として生成される（Ｄｅ  Ｂｏｅｒ  Ｐ．Ａ．，１９８９））に、本明細書に記載されるデンドリマーまたはポリペプチドが積荷され、癌細胞への積荷の（例えば、上記のような双特異性抗体、標的化ペプチドなどでの、ミニ細胞、カベオスフィアまたはナノ粒子の標識化による）標的化送達に使用され得る（例えば、ＭａｃＤｉａｒｍｉｄ，ＪＡ，２００７も参照）。そうしたミニ細胞などは、注射用、またはデンドリマーを胃の酸性環境を通過させて小腸を介して放出および吸収させるための経口摂取用に処方され得る。
【０１１１】
さらに別のアプローチは、本明細書に記載されるＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼのためのβインテグリンサブユニットの結合ドメイン（またはその結合ドメインの変異形態もしくは改変形態）を提示するポリペプチドをコードする核酸を、癌細胞にその核酸を送達してその細胞内でポリペプチドを発現させるために、上記のようなミニ細胞に積荷することである。ミニ細胞の代替法として、カベオスフィア、バクテリオファージ、細菌エンベロープ、組換えベクター、および他の従来のナノテクノロジー送達法が、標的細胞内への核酸インサートの送達に使用され得る。癌細胞におけるポリペプチドの発現のための核酸（例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡインサート）を組み入れた、任意の好適なベクター（プラスミドを包含する）が利用され得る。この発現ベクターは、ゲノムＤＮＡへの核酸の組込みのための異種または同種組換え事象に向けて設計され得、典型的には、挿入核酸配列が機能可能に連結された転写調節制御配列を含む。「機能可能に連結された」とは、核酸インサートが、インサートのリーディングフレームを変更しないようにして、挿入配列の転写を可能にするための転写調節制御配列に連結されていることを意味する。そのような転写調節制御配列は、転写を開始するためのＲＮＡポリメラーゼの結合を促進するためのプロモーター、転写されたｍＲＮＡへのリボソームの結合を可能にするための発現制御エレメント、およびプロモーター活性を調節するためのエンハンサーを含む。
【０１１２】
本明細書に記載されるβインテグリンサブユニットのためのＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼの結合ドメインと結合するポリペプチドを組み入れた融合タンパク質の使用もまた、本発明により明示的に提供される。ポリペプチドおよび融合タンパク質などは、従来の組み換え技術を用いて化学的に合成または生成され得る。融合タンパク質をコードする核酸は、例えば、所望のアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチドをコードする別個のＤＮＡフラグメントを、平滑末端およびオリゴヌクレオチドリンカー、適宜付着末端（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ  ｔｅｒｍｉｎｕｓ）を与えるような消化、付着末端（ｃｏｈｅｓｉｖｅ  ｅｎｄ）の連結を採用することによって繋ぐことにより提供され得る。代替的に、ＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅が、後に互いに連結され得る相補的な末端を有するアンプリコンを生じさせるプライマーを用いて利用され得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＵＳＡ，Ｖｏｌ．１  ａｎｄ  ２，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９２；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ（１９９８）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照）。また、被験体への投与のためにポリペプチドおよび融合タンパク質をインビトロで発現させ、細胞培養物から精製してもよいし、ポリペプチドまたは融合タンパク質のインビトロまたはインビボ発現のためにそのポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする核酸を細胞にトランスフェクトしてもよい。核酸は、典型的に、最初はクローニングベクターに導入され、宿主細胞において増幅され、その後、核酸が摘出され、細胞のトランスフェクションに適した発現ベクター内に組み込まれる。本明細書に記載のデンドリマーにおいて有用なポリペプチドのクローニング、発現および精製の方法もまた、当業者の能力の範囲内である。
【０１１３】
本発明により具現化される方法における使用のためのポリペプチドまたはデンドリマーの毒性プロファイルは、細胞形態の評価、トリパンブルー排除、アポトーシスの評価および細胞増殖試験（例えば、細胞計数、３Ｈ−チミジン摂取およびＭＴＴアッセイ）によって、細胞に対して試験され得る。
【０１１４】
本明細書に記載されるポリペプチド（例えば、デンドリマー形態のものを含む）は、アンチセンス治療と、または１種以上の従来の抗癌化合物もしくは薬物と共投与され得る。「共投与される」とは、同じ処方物中で、または同じもしくは異なる経路による２種の異なる処方物中での同時投与、あるいは、それにより１種もしくは複数種のポリペプチドおよび薬物が部分的に重なる治療ウィンドウにわたってそれらの効果を発揮する、同じもしくは異なる経路による逐次投与を意味する。
【０１１５】
本発明の１つ以上の実施形態に従って使用され得る従来の化学療法薬は、金属および非金属ベースの薬物からなる群より選択され得る。金属錯体は、有機、無機もしくは混合の、リガンド配位化合物またはキレートであり得る。遷移金属錯体としては、例えば、白金、パラジウム、銅、亜鉛、ロジウムおよびルテニウムの錯体が挙げられる。白金ベースの化学療法薬の例としては、シスプラチン（ｃｉｓ−ジアンミンジクロロ白金（ＩＩ））、オキサリプラチン、（［Ｐｔ（１）キサルト（１Ｒ），（２Ｒ）−ジアミノシクロヘキサン］（［Ｐｔ（１）ｘａｌｔｏ（１Ｒ），（２Ｒ）−ｄｉａｍｉｎｏｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ］）錯体）、カルボプラチン（ｃｉｓ−ジアンミン（１，１−シクロブタンジカルボキシラト）白金（ＩＩ））、およびブレオマイシンが挙げられる。さらなる金属錯体については、例えば、米国特許第４，１７７，２６３号明細書および国際公開第０２／０６６４３５号パンフレットに記載されている。
【０１１６】
非金属化学療法薬の例としては、パクリタキセル、グリバック（Ｇｌｅｅｖａｃ）、ドセタキセル、タキソール、５−フルオロウラシル、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン（オンコビン）、ビンブラスチン、ビンデシン、カンプロテシン（Ｃａｍｐｌｏｔｈｅｃｉｎ）、ゲムシタビン、アドリアマイシン、およびトポイソメラーゼインヒビター（例えば、イリノテカン（ＣＰＴ−１１））が挙げられる。したがって、本明細書に記載されるペプチドは、そうした従来の抗癌薬または他の薬物のうちの１種以上と共投与され得る。
【０１１７】
特に、薬剤耐性癌が処置される場合は、上記デンドリマーまたはポリペプチドは、その癌の細胞がさもなければそれに対して耐性を有する化学療法薬と組み合わせて、または一緒に、哺乳動物に共投与され得る。例えば、Ｓｒｃチロシンキナーゼの阻害は、薬物感受性卵巣癌細胞において化学療法剤（例えば、シスプラチン）の細胞傷害性を高めること、および薬剤耐性細胞における感受性を回復することが示された。
【０１１８】
正常細胞において、ｃ−Ｓｒｃは、多くの分子内相互作用により、不活性なコンホメーションで維持される。構成的な触媒活性を示す変異ｃ−Ｓｒｃが結腸癌および子宮内膜癌の小サブセットにおいて報告されているが（Ｉｓｈｉｚａｗａｒ，Ｒ  ａｎｄ  Ｐａｒｓｏｎｓ，Ｓ．Ｊ（２００４）により再検討された）、癌原遺伝子ｃ−Ｓｒｃは、ヒト癌においては稀にしか突然変異しない。より一般的には、この非受容体型チロシンキナーゼは高タンパク質レベルを示し、非常に多くの種類のヒト癌において、野生型ｃ−Ｓｒｃの活性の増加が見られる。これは、ｃ−Ｓｒｃと多くの膜結合型受容体および細胞因子（例えば、成長因子受容体、インテグリン、ステロイドホルモン受容体、Ｇタンパク質受容体、フォーカルアドヒージョンキナーゼ（ＦＡＫ）および他のアダプタータンパク質）との間の相互作用から生ずる（Ｉｓｈｉｚａｗａｒ  ａｎｄ  Ｐａｒｓｏｎｓ，（２００４）により再検討された）。こうした物理的相互作用の結果として、ｃ−Ｓｒｃは、一過性に活性化された状態になり、下流標的をリン酸化する。
【０１１９】
細胞質の膜会合した非受容体型チロシンキナーゼのＳｒｃファミリーは、ＭＡＰキナーゼの、したがってＥＲＫ活性化の、上流にある。標的（例えば）のｃ−Ｓｒｃによるリン酸化は一方向に起こり、上記したｃ−Ｓｒｃと形質膜付近の多くの膜結合型受容体および細胞因子との間の相互作用により開始される。そのため、ｃ−ＳｒｃおよびＳｒｃファミリーメンバーは、多様な細胞種における癌進行のあらゆる段階（イニシエーションから転移）を調節する多様なシグナル伝達経路の重要な媒介物質である。
【０１２０】
Ｓｒｃ癌タンパク質は極めて強力であり、細胞培養において迅速な悪性転換をもたらし、活性化されたＳｒｃタンパク質は、多くのヒト上皮悪性腫瘍（特に、乳癌および結腸癌）において過剰発現される。活性化されたＳｒｃは、多くのエフェクター（すなわち、ＧＴＰアーゼＲｈｏおよび非定形プロテインキナーゼＣ）を介して細胞浸潤を誘導する。さらに、Ｓｒｃにより悪性転換された細胞において見出される主要な変化の１つは、それが外部成長因子のない状態で増殖し得ることである。転写因子Ｍｙｃが、Ｓｒｃの細胞に無秩序な細胞増殖を起こさせる能力を媒介するのに重要であるようである。
【０１２１】
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質（例えば、フィブロネクチンおよびコラーゲン）への細胞接着は、インテグリン受容体とＥＣＭリガンドとの結合によってもたらされる。インテグリンの関与は、フォーカルアドヒージョンキナーゼ（ＦＡＫ）のチロシンリン酸化および活性化に依存する応答である、Ｓｒｃファミリーキナーゼ（ＳＦＫ）およびＥＲＫ１／２の活性化をはじめとする、多くの細胞内シグナル伝達事象をもたらす（Ｍｉｒａｎｔｉ  ＣＫ  ＆  Ｂｒｕｇｇｅ  ＪＳ，２００２）。さらに、異常なインテグリン機能および／またはフォーカルアドヒージョンキナーゼの過剰発現は、フォーカルアドヒージョン複合体におけるＳｒｃ活性化をもたらして、細胞生存に寄与し、また、一部の細胞種の（主としてＲａｓ経路を介する）増殖に寄与する経路を活性化する（Ｓｕｍｍｙ  ＆  Ｇａｌｌｉｃｋ，２００６）。インテグリンとｃ−Ｓｒｃとの間には、機能的相互作用が認められている（Ｈｕｖｅｎｅｅｒｓ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ，２００７）。
【０１２２】
本発明に従って処置される癌は、典型的に、本発明によって具現化されるデンドリマーまたはポリペプチドによって阻害されるキナーゼのうちの１種以上のキナーゼの、アップレギュレートされた活性を示す。例えば、この癌は、「Ｓｒｃ」癌または「ＰＩ３Ｋ」癌であり得る。さらに、少なくとも一部の実施形態において、癌は、薬剤耐性癌（すなわち、１種以上の他の抗癌薬に耐性の癌（例えば、多剤耐性癌））であり得る。特に、本発明の実施形態に従うデンドリマーまたはペプチドによるｃ−Ｓｒｃおよび／または１種以上の他のＳｒｃファミリーキナーゼの阻害は、薬剤耐性癌をさもなければその癌はそれに対して耐性を有する１種もしくは複数種の従来の化学療法薬に対してより感受性にし得るか、または、その他の場合はその癌を感作し得る。
【０１２３】
用語「Ｓｒｃ癌」とは、ｃ−Ｓｒｃおよび／または１種以上の他のＳｒｃファミリーキナーゼの異常なかつ／もしくは高いレベルの発現または活性化から生じる、あるいはそのような発現または活性化に関連する癌を意味する。同様に、用語「Ｓｒｃ癌細胞」とは、ｃ−Ｓｒｃおよび／または１種以上の他のＳｒｃファミリーキナーゼの異常なかつ／もしくは高いレベルの発現または活性化から生じる、あるいはそのような発現または活性化に関連する癌細胞を意味する。活性化されたＳｒｃキナーゼの異常なもしくは高度な発現は、ｃ−Ｓｒｃの変異型（そのタンパク質の構成的活性化を引き起こす１つもしくは複数の突然変異）の発現から、あるいは、例えば、ｃ−Ｓｒｃと隣接する膜結合型受容体および／または細胞因子との相互作用の結果として生じ得る。この場合、膜結合型受容体または細胞因子は、（例えば、その受容体または細胞因子における突然変異の結果として）構成的に活性化され得る。
【０１２４】
同様に、用語「ＰＩ３キナーゼまたはＰＫＣ癌」とは、ＰＩ３キナーゼまたはＰＫＣファミリーに属するキナーゼの異常なもしくは高いレベルの発現および／または活性化から生じる、あるいはそのような発現および／または活性化に関連する癌を意味する。さらに、用語「ＰＩ３キナーゼ癌細胞」および「ＰＫＣ癌細胞」とは、ＰＩ３キナーゼまたはＰＫＣファミリーに属するキナーゼの異常なかつ／もしくは高いレベルの発現および／または活性化から生じる、あるいはそのような発現および／または活性化に関連する癌細胞を意味する。ＰＩ３キナーゼまたはＰＫＣファミリーに属するキナーゼの異常なもしくは高度な発現および／または活性化は、ＰＩ３ＫまたはＰＫＣファミリーに属するキナーゼの変異型（そのキナーゼの構成的活性化を引き起こす１つもしくは複数の突然変異）の発現から、あるいは、例えば、ＰＩ３キナーゼまたはＰＫＣファミリーメンバーと１種もしくは複数種の細胞受容体および／または因子との相互作用の結果として生じ得る。
【０１２５】
本発明の方法により処置される癌は、例えば、癌腫、肉腫、リンパ腫、充実性腫瘍、頭頸部癌、血球癌、白血病、骨髄性白血病、好酸球性白血病、顆粒球性白血病、ならびに肝臓、舌、唾液腺、歯肉、口の床および他の部分、口腔咽頭、鼻咽頭、下咽頭および他の口腔、食道、胃腸管、胃、小腸、十二指腸、結腸、結腸直腸、直腸、胆嚢、膵臓、喉頭、気管、気管支、肺（非小細胞性肺癌を包含する）、乳房、子宮、頸部、卵巣、膣、外陰部、前立腺、精巣、陰茎、膀胱、腎臓、甲状腺、骨髄、ならびに皮膚（黒色種を包含する）の癌からなる群より選択され得る。典型的に、癌は上皮癌であり、最も一般的には非皮膚癌である。最も一般的には、癌は、肺癌、結腸癌、膵臓癌、乳癌、結腸腺癌および卵巣癌からなる群より選択される。
【０１２６】
意図された被験体への投与のために、使用されるポリペプチドが、典型的に、薬学的に許容可能なキャリアおよび／または賦形剤を含む薬学的組成物に処方される。ポリペプチドは、経口的に、静脈内に、非経口的に、直腸内に、皮下に、注入により、局所的に（例えば、皮膚癌の処置において）、筋肉内に、腹腔内に、鼻腔内に、および適切と考えられる任意の他の経路により投与され得る。薬学的組成物は、例えば、液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、クリーム剤、摂取可能な錠剤、カプセル剤、丸剤、坐剤、散剤、トローチ剤、エリキシル剤の形態、または選択された投与経路に適した他の形態にあり得る。
【０１２７】
特に、本発明により具現化される薬学的組成物は、水剤を包含する。注射可能な組成物は、注射可能性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する範囲の流動性を有し、典型的に、製造後の保管に与えられた所定の期間の間、常態では安定している。さらに、薬学的に許容可能なキャリアとしては、任意の適切な従来知られている溶媒、分散媒、生理食塩剤または液、等張剤または液、および界面活性剤が挙げられる。適切な分散媒は、例えば、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングルコールなど）、植物油およびそれらの混合物のうちの１種以上を含有し得る。
【０１２８】
経口投与用には、任意の経口的に許容可能なキャリアが用いられ得る。特に、ポリペプチドは、不活性な賦形剤、同化可能な食用キャリアと一緒に処方されてもよいし、硬殻または軟殻ゼラチンカプセル中に封入されてもよい。
【０１２９】
内用または外用のクリーム剤、ローション剤または軟膏剤を形成するために、従来用いられている局所的に許容可能なキャリアが用いられ得る。そのような組成物は、処置されることになる部位に直接適用されてもよいし、その組成物を滲み込ませた包帯剤を介して適用されてもよい。
【０１３０】
本明細書に記載される薬学的組成物はまた、インビボおよび／または局所投与に適した１種以上の保存剤（例えば、パラベン類、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、およびチメロサールも含み得る。また、組成物の長時間にわたる吸収が、吸収を遅延させるための薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）の、組成物における使用によりもたらされ得る。ポリペプチドを含有する錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル剤などはまた、以下のうちの１つ以上を含有し得る：結合剤（例えば、トラガカントゴム、アラビアゴム、トウモロコシデンプンまたはゼラチン）；崩壊剤（例えば、トウモロコシデンプン、バレイショデンプンまたはアルギン酸）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム）；甘味剤（例えば、ショ糖、乳糖またはサッカリン）；および着香料。
【０１３１】
薬学的組成物における上記のような成分および媒質の使用は周知である。デンドリマーと不適合である範囲のあらゆる従来の媒質または成分を除き、本明細書に記載される治療および予防用の組成物における従来の媒質または成分の使用が包含される。
【０１３２】
投与を容易にし、投与量を均一にするための単位剤形に非経口用組成物を処方することが、特に好ましい。本明細書で用いられる単位剤形は、処置されようとする被験体に対するまとまった投薬量として適する物理的に別個の単位であって、各単位が、所望の治療または予防効果を生ずるように計算された所定量の活性薬剤を、用いられる適切なキャリアと一緒に含むものを意味すると見なされるべきである。単位剤形が、例えば、カプセル剤、錠剤または丸剤である場合、投薬単位の物理的形状を違った風に改変するため、または個体への投与を容易にするために、種々の成分がコーティングとして用いられ得る（例えば、シェラック、糖または両方）。
【０１３３】
薬学的組成物は、概して少なくとも約１重量％のポリペプチドを含有する。当然この割合は変更され得、好都合に組成物または製剤の約５％〜約８０％（ｗ／ｗ）の間であり得る。理解されるように、組成物中のポリペプチドの量は、企図される投与経路を考慮し、適切な有効投薬量が被験体に送達されるというようなものである。本発明により具現化される好ましい経口用組成物は、約０．１μｇと１５ｇの間のポリペプチドを含有する。
【０１３４】
ポリペプチドの投薬量は数多くの要素によって決まり、その要素として、ポリペプチドが予防用途のために投与されることになるのか、それとも治療用途のために投与されることになるのか、ポリペプチドの投与が意図される状態、状態の重症度、被験体の年齢、および関連する要素（個体の体重および認められた法則に従って医師または看護人（ａｔｔｅｎｄａｎｔ）により判断され得るような総合的な健康状態を含む）が挙げられる。例えば、低投薬量が初期に投与され、その後、個体の応答の評価に従い各投与において増加され得る。同じく、投与頻度も同様に、すなわち各投薬間の個体の応答を継続的にモニタリングすること、また、必要に応じ、投与頻度を増加する、あるいは投与頻度を減少することによって決定され得る。
【０１３５】
典型的に、ポリペプチドは、本発明の方法に従って、個体の体重１ｋｇ当たり最大約１００ｍｇまで、より一般的には体重１ｋｇ当たり最大約５０ｍｇまでの範囲、最も一般的には体重１ｋｇ当たり約５ｍｇ〜４０ｍｇの範囲内の投薬量のポリペプチドを提供するように投与される。少なくとも一部の実施形態において、ポリペプチドは、体重１ｋｇ当たり約５〜２５ｍｇの範囲、一般的には約５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇの範囲、より一般的には１０ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇの範囲内の投薬量のポリペプチドを提供するように投与される。デンドリマー形態で経口的に投与される場合、１日に最大約２０ｇまで（例えば、１日に各々５ｇのデンドリマーを含む４経口用量）のデンドリマーが投与され得る。
【０１３６】
静脈内経路に関して、特に好適な経路は、注射により血管内に入れ、特定の器官中の処置されることになる腫瘍または癌に供給する経路である。特に、ポリペプチド、デンドリマー、融合タンパク質などは、任意の適切な注入または灌流法により、隔離された器官、四肢および組織内に送達され得る。ポリペプチドはまた、腔（例えば、胸膜腔または腹膜腔など）内に送達されてもよいし、腫瘍組織内に直接注入されてもよい。本発明の組成物において有用な、好適な薬学的に許容可能なキャリアおよび処方物は、例えば、当業者に周知のハンドブックおよびテキスト（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，１９９５）」）に見出され得、その内容は、参照により完全に本明細書に援用される。
【実施例】
【０１３７】
以下に、いくつかの非限定的な実施例を参照して、本発明を説明する。
【０１３８】
実施例１：ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号４）によるｃ−Ｓｒｃの阻害
ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲペプチド（５０μＭ）（配列番号４）（１０（４）と称される）を、ＭＡＰキナーゼＥＲＫ２、細胞性Ｓｒｃチロシンキナーゼ（ｃ−Ｓｒｃ）ならびにチロシンキナーゼＬｙｎおよびＹｅｓ（等活性濃度）に対する阻害活性についてアッセイした。各キナーゼについてのアッセイ条件は次のとおりであった（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｄｕｎｄｅｅ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）。
【０１３９】
１．キナーゼ活性アッセイ
１．１  ｃ−Ｓｒｃ
最終反応容量２５μＬ中、ｃ−ＳＲＣ（ｈ）（５〜１０ｍＵ）を、８ｍＭ  ＭＯＰＳ  ｐＨ７．０、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、２５０μＭ  ＫＶＥＫＩＧＥＧＴＹＧＶＶＹＫ（配列番号１９）（Ｃｄｃ２ペプチド）、１０ｍＭ酢酸Ｍｇおよび［γ−３３Ｐ−ＡＴＰ］（比活性およそ５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ、必要に応じた濃度）と共にインキュベートする。ＭｇＡＴＰ混合物の添加により反応を開始する。室温で４０分間のインキュベーション後、５μＬの３％リン酸溶液の添加により反応を停止する。次いで、１０μＬのその反応物をＰ３０フィルターマット上にスポットし、７５ｍＭリン酸で５分間３回洗浄し、メタノールで１回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数を行う。
【０１４０】
１．２  ＥＲＫ２
最終反応容量２５μＬ中、ヒトＥＲＫ２（５〜１０ｍＵ）を、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．０２ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．３３ｍｇ／ｍＬ  ミエリン塩基性タンパク質、１０ｍＭ酢酸Ｍｇおよび［γ−３３Ｐ−ＡＴＰ］（比活性およそ５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ、必要に応じた濃度）と共にインキュベートする。ＭｇＡＴＰ混合物の添加により反応を開始する。室温で４０分間のインキュベーション後、５μＬの３％リン酸溶液の添加により反応を停止する。次いで、１０μＬのその反応物をＰ３０フィルターマット上にスポットし、７５ｍＭリン酸で５分間３回洗浄し、メタノールで１回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数を行う。
【０１４１】
１．３  Ｌｙｎ
最終反応容量２５μＬ中、ヒトＬｙｎを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝剤ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、１％メルカプトエタノール、０．１ｍｇ／ｍＬポリ（Ｇｌｕ、Ｔｙｒ）４：１、１０ｍＭ酢酸Ｍｇおよび［γ−３３Ｐ−ＡＴＰ］（比活性およそ５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）中のＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲペプチド（配列番号６）と共にインキュベートする。実施例１．１に記載のｃ−Ｓｒｃについて記載されたプロトコールに従って、ＭｇＡＴＰ混合物の添加により反応を開始し、室温で４０分間インキュベートした後、反応を停止し、シンチレーション計数を行うことによりキナーゼ活性を評価した。
【０１４２】
１．４  Ｙｅｓ
最終反応容量２５μＬ中、ヒトＹｅｓを、８ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝剤ｐＨ７．０、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１ｍｇ／ｍＬポリ（Ｇｌｕ、Ｔｙｒ）４：１、１０ｍＭ酢酸Ｍｇおよび［γ−３３Ｐ−ＡＴＰ］（比活性およそ５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）中のＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲペプチド（配列番号６）と共にインキュベートする。この場合も実施例１．１においてｃ−Ｓｒｃについて記載されたプロトコールに従って、ＭｇＡＴＰ混合物の添加により反応を開始し、室温で４０分間インキュベートした後、反応を停止し、シンチレーション計数を行うことによりキナーゼ活性を評価する。
【０１４３】
１．５  結果
結果を、コントロール（ペプチドインヒビターがない状態で活性化ｃ−Ｓｒｃおよび基質のみ）に対する活性百分率として表した。ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲペプチド（配列番号６）（１０（４）ペプチド）は、ｃ−Ｓｒｃの活性（コントロールに対しておよそ５７％の活性）を著しく阻害した。ＬｙｎおよびＹｅｓ活性の、比較的低いレベルの阻害が認められた。ペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号４）によるｃ−Ｓｒｃの用量依存性阻害を図５に示す。
【０１４４】
実施例２：ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号６）によるＰＩ３キナーゼの阻害
ペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号６）を１０モノマー単位提示する図４に示された種類のペプチドデンドリマーを、ＥＲＫ２ならびにＰＩ３ＫのＰＩ３ＫβおよびＰＩ３Ｋγに対する阻害活性についてアッセイした。このデンドリマーを、本明細書において、デンドリマーＩＫ２４８Ｂ（またはＤｅｎｄ１０  １０（４））と呼ぶ。処置プロトコールは下記のとおりであった（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｄｕｎｄｅｅ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）。
【０１４５】
２．キナーゼ活性アッセイ
２．１  ＥＲＫ２
ＥＲＫ２の活性を、実施例１．２に記載したとおりにアッセイした。
【０１４６】
２．２  ＰＩ３Ｋ
最終反応容量２０μＬ中、試験ＰＩ３Ｋを、１０μＭホスファチジルイノシトール−４，５−ビスリン酸およびＭｇＡＴＰを含有するアッセイ緩衝剤中でインキュベートする。ＭｇＡＴＰ混合物の添加により反応を開始する。室温で３０分間のインキュベーション後、ＥＤＴＡおよびビオチン化ホスファチジルイノシトール−３，４，５−トリスリン酸を含有する５μＬの停止溶液の添加により反応を停止する。最後に、５μＬの検出緩衝剤（ユーロピウム標識化抗ＧＳＴモノクローナル抗体、ＧＳＴタグ化ＧＲＰ１  ＰＨドメインおよびストレプトアビジン−アロフィコシアニンを含有する）を加える。次いで、試験プレートを時間分解蛍光モードで読み取り、均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）シグナルを、式ＨＴＲＦ＝１００００×（Ｅｍ６６５ｎｍ／Ｅｍ６２０ｎｍ）に従って決定する。
【０１４７】
２．３  結果
結果を、コントロール（デンドリマーがない状態におけるＰＩ３ＫまたはＥＲＫ２）に対する活性百分率として表した。最終濃度５０μＭで、デンドリマーＤｅｎｄ１０−１０（４）は、コントロール細胞に対して４７％活性までＥＲＫ２を阻害し、一方、ＰＩＫ３βおよびＰＩＫ３γは、このデンドリマーにより、コントロールに対して８３％および１１％活性まで阻害された。
【０１４８】
デンドリマーのＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲペプチド（配列番号６）がそのＣ末端にて２つのエチレングリコール単位でビペグ化され（ｂｉｐｅｇｙｌａｔｅｄ）かつ完全にＤ−アミノ酸からなった（本明細書において、デンドリマーＤｅｎｄ１０Ｄ−１０（４）ＤＰとして識別される）別の試験において、ＰＩ３Ｋβの活性は、このデンドリマーによってほぼ完全に阻害された（およそ９２％の阻害；最終濃度２０μＭ）。
【０１４９】
実施例３：さらなるキナーゼの阻害
実施例２．３に記載されたペプチドデンドリマーＤｅｎｄ１０−１０（４）ＤＰの、さらなるキナーゼ酵素の活性を阻害する能力を評価した。β５インテグリン由来ペプチドＲＳＲＡＲＮＰＬＹＲ（配列番号８）を１０モノマー単位提示する図４に示された種類のさらなるデンドリマー（Ｄｅｎｄ１０β５）の、ＥＲＫ２およびＭＥＫ１を阻害する能力もまた評価した。使用された処置プロトコールを以下に示す（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｄｕｎｄｅｅ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）。
【０１５０】
３．１  ｃ−ＲＡＦ（ｈ）
最終反応容量２５μＬ中、ｃ−ＲＡＦ（ｈ）（５〜１０ｍＵ）を、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．０２ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．６６ｍｇ／ｍＬミエリン塩基性タンパク質、１０ｍＭ酢酸Ｍｇおよび［γ−３３Ｐ−ＡＴＰ］（比活性およそ５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ、必要に応じた濃度）と共にインキュベートする。ＭｇＡＴＰ混合物の添加により反応を開始する。室温で４０分間のインキュベーション後、５μＬの３％リン酸溶液の添加により反応を停止する。次いで、１０μＬのその反応物をＰ３０フィルターマット上にスポットし、７５ｍＭリン酸で５分間３回洗浄し、メタノールで１回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数を行う。
【０１５１】
３．２  ＥＲＫ２（ｈ）
ＥＲＫ２の活性を、実施例１．２に記載したとおりにアッセイした。
【０１５２】
３．３  ＭＥＫ１（ｈ）
最終反応容量２５μＬ中、ＭＥＫ１（ｈ）（１〜５ｍＵ）を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．２ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％メルカプトエタノール、０．０１％Ｂｒｉｊ−３５、１μＭ不活性ＥＲＫ２（ｍ）、１０ｍＭ酢酸Ｍｇおよび冷ＡＴＰ（必要に応じた濃度）と共にインキュベートする。ＭｇＡＴＰの添加により反応を開始する。室温で４０分間のインキュベーション後、５μＬのこのインキュベーション混合物を使用して、ＥＲＫ２（ｍ）アッセイを開始する。
【０１５３】
３．４  ＰＫＢキナーゼ（ｈ）
最終反応容量２５μＬ中、ＰＫＢ（ｈ）（５〜１０ｍＵ）を、８ｍＭ  ＭＯＰＳ  ｐＨ７．０、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、３０μＭ  ＧＲＰＲＴＳＳＦＡＥＧＫＫ（配列番号２６）、１０ｍＭ酢酸Ｍｇおよび［γ−３３Ｐ−ＡＴＰ］（比活性およそ５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ、必要に応じた濃度）と共にインキュベートする。ＭｇＡＴＰ混合物の添加により反応を開始する。室温で４０分間のインキュベーション後、５μＬの３％リン酸溶液の添加により反応を停止する。次いで、１０μＬのその反応混合物をＰ３０フィルターマット上にスポットし、７５ｍＭリン酸で５分間３回洗浄し、メタノールで１回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数を行う。
【０１５４】
３．５  ＰＫＣキナーゼ（ｈ）
最終反応容量２５μＬ中、ＰＫＣキナーゼ（ｈ）（５〜１０ｍＵ）を、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．０３％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（０．１ｍＭ）、０．１ｍｇ／ｍＬホスファチジルセリン、１０μｇ／ｍＬジアシルグリセロール、０．１ｍｇ／ｍＬヒストンＨ１または５０μＭのペプチドＥＲＭＲＰＲＫＲＱＧＳＶＲＲＲＶ（配列番号２０）、１０ｍＭ酢酸Ｍｇおよび［γ−３３Ｐ−ＡＴＰ］（比活性およそ５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ、必要に応じた濃度）と共にインキュベートする。ＭｇＡＴＰ混合物の添加により反応を開始する。室温で４０分間のインキュベーション後、５μＬの３％リン酸溶液の添加により反応を停止する。次いで、１０μＬのその反応物をＰ３０フィルターマット上にスポットし、７５ｍＭリン酸で５分間３回洗浄し、メタノールで１回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数を行う。
【０１５５】
３．６  結果
結果を、以下の表１に示す。
【０１５６】
【表１】
2012518602.tif 000003
【０１５７】
表１から分かるように、ｃ−ＲＡＦ、ＥＲＫ２、ＭＥＫ１、ＰＫＢβ、ＰＫＢγ、ＰＫＣα、ＰＫＣβＩおよびＰＫＣβＩＩの活性の実質的な阻害が、２０μＭの濃度のペプチドデンドリマーＤｅｎｄ１０−１０（４）ＤＰによって得られた。ペプチドデンドリマーＤｅｎｄ１０β５（２０μＭ）もまた、ＥＲＫ２およびＭＥＫ１の両方の活性を阻害することが分かった（それぞれ、９６％および９２％の阻害）。
【０１５８】
実施例４：デンドリマーＤｅｎｄ１０−１０（４）ＤＰによるキナーゼ活性の阻害
用量応答試験において、デンドリマーＤｅｎｄ１０−１０（４）ＤＰ（実施例２．３参照）の増加濃度での表２に列記されたキナーゼの活性の阻害を、実施例１〜３に記載された処置プロトコールを使用して評価した。表に示されるように、キナーゼ活性の阻害は、試験された全ての濃度のデンドリマーによって得られた。全てのキナーゼについてのＩＣ５０パーセント活性阻害は、０．２５〜２．０μＭの範囲にあった。表２に示された結果は、コントロールに対する阻害百分率である。１μＭデンドリマーＤｅｎｄ１０−１０（４）についての比較用量結果も示す。
【０１５９】
【表２】
2012518602.tif 000004
【０１６０】
実施例１に記載された処置プロトコールを使用した別の試験において、コントロールに対してｃ−Ｌｙｎ（９６％）およびｃ−Ｙｅｓ（９９％）の活性の実質的に完全な阻害が、２０μＭの濃度のＤｅｎｄ１０−１０（４）ＤＰデンドリマーによって得られた。それに対し、実施例１に記載されるように、ｃ−Ｓｒｃと比べて比較的低いレベルのこれらのキナーゼの活性の阻害しか、ペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号６）単独によっては得られなかった（図５も参照）。
【０１６１】
ペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号６）単独と比較したｃ−Ｓｒｃ活性の阻害の何らの増加もデンドリマーＤｅｎｄ１０−１０（４）ＤＰによって得られなかったが、５０μＭの濃度のペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号６）によってはＭＥＫ１のごく僅かな阻害が得られたのに対し、当該デンドリマーによってはこのキナーゼの著しい阻害が得られる（例えば表２参照）。
【０１６２】
それに対し、２０μＭの濃度のデンドリマーＤｅｎｄ１０−１０（４）ＤＰは、ｍＴＯＲ、ＪＮＫまたはＦＡＫの活性に対して何らの効果も有していなかった（データは示さず）。
【０１６３】
実施例５：インテグリンβ２、β３、β５およびβ６ベースのペプチドによるｃ−Ｓｒｃの阻害
表３に列記されたペプチドについてのコントロールに対するｃ−Ｓｒｃ阻害百分率の比較を、実施例１．１に記載されたプロトコールを利用して行った。全てのペプチドを、５０μＭの濃度で試験した。
【０１６４】
【表３】
2012518602.tif 000005
【０１６５】
部分シグナルペプチドＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡ（配列番号１５）に連結される場合、ペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号６）、ＫＥＫＬＫＮＰＬＦＫ（配列番号９）、ＲＡＲＡＫＮＰＬＹＫ（配列番号７）およびＲＳＲＡＲＮＰＬＹＲ（配列番号８）についてのｃ−Ｓｒｃ活性の阻害は、７１％〜８４％の範囲まで増加した。ＥＲＫ２のためのβ６結合ドメイン（ＲＳＫＡＫＷＱＴＧＴＮＰＬＹＲ（配列番号２））の介在アミノ酸リンカー配列ＷＱＴＧＴ（配列番号１１）については、阻害活性は何ら認められなかった。同様に、β６結合ドメインの両末端領域を規定する５マーペプチドＲＳＫＡＫ（配列番号２１）およびＮＰＬＹＲ（配列番号２２）のｃ−Ｓｒｃ阻害活性は、ごく僅かに認められたか、または何ら認められなかった。
【０１６６】
実施例６：ｃ−Ｓｒｃチロシンキナーゼインヒビターペプチドと組み合わせたシスプラチンまたはオキサリプラチンでのＡＤＤＰ薬剤耐性卵巣癌細胞の処置
６．１  細胞増殖（ＭＴＴ）アッセイ
トリプシン処理した生細胞の単細胞懸濁液を、熱失活されたウシ胎仔血清（ＦＣＳ）で補足された１００μＬの容量の適切な培地中（例えば、１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ、１％Ｌ−グルタミン、２％（ｖ／ｖ）Ｈｅｐｅｓおよび抗生物質を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ））、１ウェル当たり２×１０３細胞の密度で９６ウェル組織培養プレートに播種した。試験することになるペプチドデンドリマーの各濃度に対し、３つで１組のウェルを調製した。非処理細胞または培地のみを含む追加のサンプルウェルを各処理プレートに設け、参照コントロールとして並行して処理した。処理していない細胞および培地のみのウェルのゼロ時のプレートを同時に調製し、処理プレートへのキナーゼインヒビター（すなわちポリペプチドまたはデンドリマー）の添加の際に、このプレートに対してＭＴＴアッセイを実施した。試験デンドリマーの添加前に、全てのプレートを２４時間にわたり培養した。
【０１６７】
ＭＴＴ溶液を調製するために、１００ｍｇのＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾリル−２）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）（Ｃａｔ＃．Ｍ−１２８，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ．）を、ｐＨ７．４の２０ｍＬのＰＢＳと混合する。結果として生じる溶液を濾過滅菌（０．２μＭ  シリンジフィルター）し、光から保護された状態で、使用するまで４℃にて保管する。ＭＴＴ基質が増殖細胞中で開裂し、水に不溶性の塩を生じる。塩結晶の可溶化後、着色生成物が生成され、これを測定することにより培養細胞の増殖活性を定量し得る。
【０１６８】
適切な濃度のキナーゼインヒビターを、新たに調製した１ｍＭ  滅菌倍液の細胞培養培地中への希釈により、１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳを含む最終ウェル容量が２００μＬとなるように調製した。その際に、ＭＴＴの添加によりゼロ−プレートを処理した。細胞培養をさらに２４〜４８時間にわたり継続した後、２０μＬのＰＢＳ中ＭＴＴ（５ｍｇ／ｍＬ、０．２μｍ  フィルター滅菌）を添加した。ＭＴＴ細胞増殖アッセイは細胞増殖速度を測定し、また、細胞生存率が妥協される場合には、このアッセイは細胞生存率の相対的な減少を示す。ＭＴＴの存在下での３時間のインキュベーション（空気中５％ＣＯ２、３７℃）後、プレートを４５０ｇで５分間遠心分離機にかけ、上清を静かに吸引して除去し、沈殿させたテトラゾリウム塩を、１５０μＬ  ＤＭＳＯ：グリシン（０．１Ｍ  グリシン、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ１０．５）（６：１（ｖ／ｖ））溶液中に再懸濁させた。プレートを静かにボルテックスして結晶質の可溶化を完了させ、吸光度を、マイクロプレートリーダーを用いて５５０ｎｍで読み取った。試料データを処理して、非処理コントロールと比較した処理試料の相対的な増殖を決定した。
【０１６９】
６．２  シスプラチンに対するＡＤＤＰ卵巣癌細胞の感作
ＡＤＤＰヒト卵巣癌腫細胞系に対するシスプラチンおよびペプチドＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号１０）（ＩＫ２）の単独および組み合わせでの有効性を、上記のＭＴＴアッセイを用いて評価した。このＡＤＤＰ細胞系は、誘導されたシスプラチン耐性を有しており（Ｌｕ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ，１９８８）、シスプラチンに感受性のＡ２７８０卵巣癌細胞系に由来する。その結果を図６に示す。図から分かるように、シスプラチンと組み合わせたＩＫ２ペプチドは、シスプラチン単独またはＩＫ２ペプチド単独と比較して、ＡＤＤＰ癌細胞の成長の高レベルの阻害をもたらした。細胞成長の阻害は、ＩＫ２ペプチドの濃度が増加するにつれて増加した。これは、このペプチドが、シスプラチンでの処置に対してＡＤＤＰ細胞を感作することを示している。シスプラチン感受性卵巣癌細胞系Ａ２７８０に対するシスプラチンの効果もこの図に示す。
【０１７０】
予想されるように、シスプラチンに対してＡ２７８０細胞系は高度に感受性であったが、それよりも実質的に小さい、シスプラチンによるＡＤＤＰ細胞系の成長の阻害が認められた。シスプラチン単独と比較して、ＩＫ２と組み合わせたシスプラチンによるＡＤＤＰ細胞の成長のより大きな阻害が、利用されたＩＫ２ペプチドの全ての濃度において認められた。
【０１７１】
６．３  オキサリプラチンに対するＡＤＤＰ卵巣癌細胞の感作
オキサリプラチンおよびＩＫ２ペプチドの単独または組み合わせでＡＤＤＰ卵巣癌細胞を処置し、この場合も、癌細胞の成長の阻害を上記のＭＴＴアッセイを利用して評価した。シスプラチンを利用して得られた結果と同様に、オキサリプラチンと組み合わせたＩＫ２ペプチドは、オキサリプラチン単独またはＩＫ２ペプチド単独と比較して、ＡＤＤＰ癌細胞の成長の高レベルの阻害をもたらした。この場合もまた、ＡＤＤＰ細胞の成長の阻害は、ＩＫ２ペプチドの濃度が増加するにつれて増加した。
【０１７２】
別の試験において、オキサリプラチンならびに５μＭおよび１０μＭ  ＩＫ２ペプチドの単独または組み合わせで、ＡＤＤＰ卵巣癌細胞を処置した。その結果を図７Ａおよび７Ｂに示す。観測された５μＭまたは１０μＭ  ＩＫ２ペプチドと組み合わせたオキサリプラチンによって得られた阻害は、オキサリプラチンおよびＩＫ２の算出された相加効果よりも大きかった。これは、オキサリプラチンとＩＫ２ペプチドとの組み合わせによって相乗的な結果が達成されたことを示している。
【０１７３】
図８は、シスプラチンおよびＩＫ２の算出された相加効果と比較した、シスプラチンと３０μＭ  ＩＫ２ペプチドとの間のＡＤＤＰシスプラチン耐性卵巣癌細胞に対する相乗効果を示している。図９により示されるように、シスプラチンおよびＩＫ２の算出された相加効果と比較して、シスプラチンと３０μＭ  ＩＫ２ペプチドとの間のＨＴ２９ヒト結腸癌細胞に対する相乗効果も見出された。相乗効果は、ＡＤＤＰ細胞に対し、シスプラチンと組み合わせた２０μＭ  ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号６）でも得られた（７２時間の培養）（データは示さず）。
【０１７４】
実施例７：ペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号６）を提示するペプチドデンドリマーで処置されたＨＴ２９ヒト結腸腺癌細胞におけるホスホ−ＥＲＫ１／２レベル
７．１  細胞培養および処置条件
ペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号６）を８（本明細書において、Ｄｅｎｄ８−１０（４）として識別される）または１０（Ｄｅｎｄ１０−１０（４））モノマー単位提示するリジン枝分かれ単位を含む図４に図示された種類のペプチドデンドリマーを利用した。
【０１７５】
ＨＴ２９細胞を、０．５％トリプシンＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて採取し、２００μＬ培地中の５０００細胞を、透明なＮＵＮＣ組織培養処理済み９６ウェルプレート（ＮＵＮＣ）の各ウェルに塗布した。細胞を、１０％（ｖ／ｖ）熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＣＳ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１％（ｖ／ｖ）Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および２％（ｖ／ｖ）１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に播種した。次いで、細胞を一晩中３７℃にてインキュベートした。
【０１７６】
翌日、この増殖培地を１％（ｖ／ｖ）Ｌ−グルタミンおよび２％（ｖ／ｖ）１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液を補充したＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（無血清培地（ＳＦＭ））１００μＬと交換し、プレートをさらに２４時間にわたり３７℃にてインキュベートした。
【０１７７】
デンドリマーをＳＦＭ中で再構成させ、所望の濃度を１００μＬのＳＦＭ中でプレートに加えて各ウェルの総容量を２００μＬとした。コントロールウェル（ペプチドなし）には、ＳＦＭのみを加えた。次いで、このアッセイプレートを４時間にわたり３７℃にてインキュベートした。細胞を血清による刺激に供した試験において、２２μＬのＦＣＳ（最終濃度１０％（ｖ／ｖ））を３７℃での最後の１０分間ウェルに加えた。コントロールウェルにはＳＦＭのみ（２２μＬ）を加えた。
【０１７８】
ホスホ−ＥＲＫレベルを、製造業者の指示に従いＡｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ  ＦＡＣＥ  ＥＲＫ１／２  ＥＬＩＳＡキット（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，ＷＡ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を利用して、ＥＬＩＳＡにより評価した。簡潔に述べると、培地を交換し、細胞をＰＢＳ中４％ホルムアルデヒドで固定し、抗体ブロッキング緩衝剤（供給される）との１時間のインキュベーション後、一次ホスホ−ＥＲＫ抗体を加え、このプレートを一晩中４℃にてインキュベートした。抗体希釈緩衝剤のみを、一次抗体を含まないコントロール試験ウェルに加えた。翌日、ＨＲＰ結合二次抗体を全てのウェルに１時間加えた後、プレートを展開し、Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＥＸマイクロプレートリーダー（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＫ）を用いて４５０ｎｍでの吸光度を測定した。
【０１７９】
７．２  血清刺激によるＥＲＫ１／２活性化のデンドリマーペプチドによる阻害
血清飢餓ＨＴ２９結腸癌細胞においてＭＡＰキナーゼ活性が１０％熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）の添加により著しく増加することが、以前に報告されている（Ａｈｍｅｄ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００２；２１：１３７０−１３８０）。本試験において、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号６）を８モノマー単位提示するデンドリマー（Ｄｅｎｄ８−１０（４）と称される）の、血清刺激によるＨＴ２９細胞におけるＥＲＫ１／２活性化を阻害する能力を調べた。図１０に示されるように、４時間にわたりこの細胞をデンドリマーに暴露した後ＦＣＳを最後の３０分間添加すると、用量依存的にＥＲＫ１／２活性化が破壊された。同様の結果が、デンドリマーＤｅｎｄ１０−１０（４）（ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号６）を１０モノマー単位提示するデンドリマー）について認められた（データは示さず）。
【０１８０】
さらに、Ｄｅｎｄ８−１０（４）の存在下で、皮膚線維芽細胞についてのＦＣＳ刺激によるＥＲＫ１／２活性のはるかに小さい阻害と比較して、ＨＴ２９細胞のＦＣＳ刺激によるホスホ−ＥＲＫ１／２レベルが著しく低下した（データは示さず）。これにより、正常細胞と比べた癌細胞に対するデンドリマーの実質的な選択性を示された。別の試験において、同じ種類ではあるがＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号６）ペプチドのスクランブルさせた形態を８モノマー単位提示するデンドリマーは、スクランブルさせていないモノマーペプチドを提示するＤｅｎｄ８−１０（４）デンドリマーと比べ、ＨＴ２９結腸癌細胞におけるＦＣＳ刺激によるＥＲＫ１／２活性化の阻害に比較的効果がなかった（データは示さず）。
【０１８１】
実施例８：無細胞系におけるＥＲＫ２およびＳｒｃファミリーキナーゼの活性に対するペプチドデンドリマーの効果
ヒトｃ−Ｓｒｃ、ｃ−Ｙｅｓおよびｃ−Ｌｙｎの活性を、実施例１に記載したように評価した。ｃ−Ｆｙｎの活性は、次のように評価した。最終反応容量２５μＬ中、Ｆｙｎ（ｈ）（５〜１０ｍＵ）を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、２５０μＭ  ＫＶＥＫＩＧＥＧＴＹＧＶＶＹＫ（配列番号１９）（Ｃｄｃ２ペプチド）、１０ｍＭ  酢酸Ｍｇおよび［γ−３３Ｐ−ＡＴＰ］（比活性およそ５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ、必要に応じた濃度）とともにインキュベートする。ＭｇＡＴＰ混合物の添加により反応を開始する。室温で４０分間のインキュベーション後、５μＬの３％リン酸溶液の添加により反応を停止する。次いで、１０μＬのその反応物をＰ３０フィルターマット上にスポットし、７５ｍＭリン酸で５分間３回洗浄し、メタノールで１回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーション計数を行う。
【０１８２】
表４に示されるように、デンドリマーＤｅｎｄ１０−１０（４）（ペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号６）を１０モノマー単位提示する）のｃ−Ｓｒｃ活性の阻害は５７％のレベルに達し、そしてＥＲＫ活性の阻害は５３％のレベルに達することが分かった。しかしながら、驚いたことに、ｃ−Ｓｒｃ活性は、デンドリマーＤｅｎｄ８−１０（４）（ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号６）を８モノマー単位提示する）により、コントロールの３０５％（コントロール値の３倍）まで刺激された。ｃ−Ｓｒｃ活性のこの刺激は、Ｄｅｎｄ８−１０（４）デンドリマーによるＥＲＫ２活性の著しい阻害と同時に起こった（表４）。
【０１８３】
【表４】
2012518602.tif 000006
【０１８４】
ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号６）ペプチドが２つのエチレングリコール単位でペグ化されかつそのペプチドのアミノ酸残基が完全にＤ−アミノ酸異性体に置換されたデンドリマー（デンドリマーＤｅｎｄ１０−１０（４）ＤＰと称される）を使用した場合、このデンドリマー（２０μＭの濃度）のＥＲＫ２活性の阻害は３７％のレベルに達し、そしてｃ−Ｓｒｃの阻害は４１％のレベルに達することが分かった。しかしながら、デンドリマーＤｅｎｄ１０−１０（４）ＤＰの同じ濃度で、ｃ−Ｌｙｎおよびｃ−Ｙｅｓ活性の阻害は、それぞれコントロールレベルの９６％および９９％のレベルにまで達したが、ｃ−Ｆｙｎの活性の阻害は１６％のレベルにとどまった。
【０１８５】
さらに、ＥＲＫ２のためのβ５インテグリンサブユニットの細胞質結合ドメインに由来するペプチドＲＳＲＡＲＮＰＬＹＲ（配列番号８）を提示する以外はＤｅｎｄ１０−１０（４）ＤＰと同じであるデンドリマー（２０μＭの濃度）のｃ−Ｓｒｃ活性の阻害は４０％のレベルに達し、そしてＥＲＫ２活性の阻害は９６％のレベルに達した。それに対し、ペプチドＲＳＲＡＲＮＰＬＹＲ（配列番号８）モノマー単独（５０μＭの濃度）によっては、コントロールに対してかなり低いレベル（４％）のＥＲＫ２活性の阻害しか得られなかった。
【０１８６】
実施例９：ＥＲＫ／ｃ−Ｓｒｃ細胞接着アッセイ
ｃ−Ｓｒｃ癌タンパク質は、細胞培養において迅速な悪性転換をもたらすのに極めて有効であり、多くのヒト上皮悪性腫瘍（特に乳癌、膵臓癌および結腸癌）において過剰発現され、活性化される。活性化されたｃ−Ｓｒｃは、多くのエフェクター（すなわち、ＧＴＰアーゼＲｈｏおよび非定形プロテインキナーゼＣ）を介して細胞浸潤を誘導する。さらに、ｃ−Ｓｒｃにより悪性転換された細胞において見出される主要な変化の１つは、それが外部成長因子のない状態で増殖し得ることである。例えば結腸癌細胞における高Ｓｒｃ活性がもたらす結果の１つは、Ｅカドヘリン会合による細胞−細胞接触の崩壊である。Ｅカドヘリンの局在化および細胞−細胞接触における機能を抑制するＳｒｃの能力は、膜突起の先端でのＳｒｃ誘導性のインテグリン接着複合体構築に依存する（Ａｖｉｚｉｅｎｙｔｅ，Ｅ．，（２００２））。
【０１８７】
９．１  方法
実験ウェルを、１００μＬのフィブロネクチン（１〜１０μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）または１００μＬの１％ＢＳＡ（ネガティブコントロール、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）でコーティングした。次いで、プレートを、１時間にわたり３７℃にてインキュベータした後、１００μＬのＰＢＳで洗浄した。次いで、非特異的結合をブロックするために、１００μＬの１％ＢＳＡを、各ウェルに３０分間加えた（３７°）。ＨＴ２９ヒト結腸癌細胞を、０．５％トリプシン−ＥＤＴＡを用いて採取し、５０，０００細胞を、各空のウェルに、１００μＬの無血清培地（ＳＦＭ；１％（ｖ／ｖ）Ｌ−グルタミンおよび２％（ｖ／ｖ）１Ｍ  ＨＥＰＥＳ溶液を補充したＤＭＥＭ）中で播種した。次いで、ＰＰ２（最終濃度５μＭ、特異的ｃ−Ｓｒｃインヒビター、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むまたは含まない１００μＬのＳＦＭを、各ウェルに加えた。プレートを２００ｒｐｍで５分間遠心分離機にかけ、次いで、１時間にわたり３７℃にてインキュベートした。それらの細胞群中のホスホ−ＥＲＫ１／２レベルを、基本的に実施例７．１に記載したとおり、ＥＬＩＳＡ（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆアッセイキット、Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）により評価した。
【０１８８】
９．２  結果
ＨＴ２９細胞中のホスホ−ＥＲＫ１／２のレベルの増加は、血清刺激がない状態において、フィブロネクチンのレベルの増加と相関していた。しかしながら、ｃ−ＳｒｃインヒビターＰＰ２は、処置群の全てにおいて、コントロール細胞と比較して、ホスホ−ＥＲＫレベルを顕著に減少させた（結果は示さず）。
【０１８９】
実施例１０：ＥＲＫ／ＰＩ３Ｋ細胞接着アッセイ
ＨＴ２９ヒト結腸癌細胞における細胞接着媒介性のＥＲＫ活性化に対するＰＩ３ＫインヒビターＷｏｒｔｍａｎｎｉｎ（最終濃度０．２５μＭ）の効果を評価するための試験を試みた。ホスホ−ＥＲＫ１／２レベルを、ＥＲＫ活性化の指標として、実質的に実施例７．１に記載したとおりに測定した。ＨＴ２９細胞中のホスホ−ＥＲＫ１／２のレベル増加は、ＨＴ２９細胞の血清刺激がない状態において、フィブロネクチンのレベル増加と相関していた。ＰＩ３ＫインヒビターＷｏｒｔｍａｎｎｉｎ（０．２５μＭ）は、細胞接着媒介性のＥＲＫ活性化を効果的に約５５％低減した。
【０１９０】
実施例１１：ＨＴ−２９ヒト腺癌細胞におけるアポトーシスの誘導
実施例２．３に記載されたペプチドデンドリマーＤｅｎｄ１０−１０（４）ＤＰの、ＨＴ−２９ヒト結腸癌細胞においてアポトーシスを誘導する能力を評価した。この試験に使用されたプロトコールを以下に記載し、その結果を図１１に示す。
【０１９１】
１１．１  材料
ＲＰＭＩ  １６４０細胞培養培地、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、ＰＢＳおよびＨＢＳＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ，Ｍｔ  Ｗａｖｅｒｌｅｙ，ＶＩＣ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）。ペニシリン−ストレプトマイシンおよびトリパンブルー（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃａｓｔｌｅ  Ｈｉｌｌ，ＮＳＷ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）。ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｎｏｒｔｈ  Ｒｙｄｅ，ＮＳＷ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）。ＦＩＴＣ  Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｎｏｒｔｈ  Ｒｙｄｅ，ＮＳＷ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）。
【０１９２】
１１．２  細胞系
ヒト結腸直腸腺癌細胞系ＨＴ−２９は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）から供給された。
【０１９３】
１１．３  細胞生成
ＨＴ−２９細胞を、１０％ｖ／ｖ熱不活化（ＦＣＳ）および５０ＩＵ／ｍＬペニシリン−ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ  １６４０細胞培養培地で培養した。全ての細胞を、９５％空気／５％ＣＯ２が供給される加湿細胞培養インキュベータで３７℃にて増殖させた。本試験で用いられた細胞は、３継代後に使用された。
【０１９４】
１１．４  細胞播種
細胞をトリプシン処理により採取し、ＨＢＳＳで２回洗浄し、トリパンブルー染色法を用いて計数した。次いで、この細胞を、１×１０６細胞／ｍＬの濃度となるように、適切な培養培地に再懸濁させた。１ｍＬ容量のこの細胞希釈物を、６ウェルプレートのうちの３ウェルに加えた。このプレートに、細胞を１時間の間付着させた。
【０１９５】
１１．５  化合物の処方
ペプチドデンドリマーＤｅｎｄ１０−１０（４）ＤＰを、１５０μＭの濃度を与えるように、ＰＢＳに再懸濁させた。６７μＬ容量のこの希釈物を１ｍＬの細胞培養培地中の１×１０６個のＨＴ−２９細胞に加えて、１０μＭの最終濃度を得た。また、スタウロスポリンを、１ｍＭの濃度を与えるように、ＤＭＳＯに再懸濁させた。１０μＬのこの希釈物を１ｍＬの細胞培養培地中の１×１０６個の細胞に加えて、１０μＭの最終濃度を得た。
【０１９６】
１１．６  アポトーシスアッセイ
１×１０６個のＨＴ−２９細胞を、９５％空気／５％ＣＯ２が供給される加湿細胞培養インキュベータにおいて、Ｄｅｎｄ１０−１０（４）ＤＰまたはスタウロスポリン（ポジティブコントロール）の存在下で、４時間にわたり３７℃にてインキュベートした。次いで、細胞をトリプシン処理により採取し、冷リン酸緩衝化生理食塩水液（ＰＢＳ）で２回洗浄し、次いで１×結合緩衝剤に再懸濁させた。１×１０５個の細胞を含有する１００μＬの細胞懸濁液を、５ｍＬプラスチック管に移した。５μＬ容量のＦＩＴＣアネキシンＶおよび５μＬのプロピジウムヨウ素（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｎｅ）（ＰＩ）を各管に加え、１５分間室温にて暗闇でインキュベートした。ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターを用いたＦＡＣＳ分析に先立って、４００μＬの１×結合緩衝剤を各管に加えた。非染色細胞、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖのみで染色された細胞、およびＰＩのみで染色された細胞の３つのコントロールも分析した。データを、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖポジティブのみ（ＰＩポジティブ細胞を除く）、ＰＩポジティブ（全体）またはＡｎｎｅｘｉｎ  ＶおよびＰＩポジティブ（二重染色）である細胞の百分率として示した。
【０１９７】
１１．７  結果
図１１に示されるように、非処置コントロール群と比較して、かなりのレベルのアポトーシスが、ペプチドデンドリマーＤｅｎｄ１０−１０（４）ＤＰで処置したＨＴ−２９細胞において認められた。類似したレベルのアポトーシスが、スタウロスポリンまたはペプチドデンドリマー処置群間で認められた。
【０１９８】
実施例１２：免疫蛍光試験
１０％ＦＣＳ、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン−ストレプトマイシン、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウムを補充したＲＰＭＩ細胞培養培地中に懸濁させたＨＴ２９結腸癌細胞を、３５ｍｍ  Ｆｌｕｏｒｏｄｉｓｈに播種し、９５％空気／５％ＣＯ２中で３７℃にてインキュベートした。２４時間の培養後、１０μＬのＦＩＴＣ複合体化Ｄｅｎｄ１０−１０（４）ＤＰデンドリマー（実施例２．３参照）（Ｄｅｎｄ１０−１０（４）ＤＰ−ＦＩＴＣ）（リン酸緩衝化生理食塩水液に再懸濁された）または１０μＬのＦＩＴＣのみ（ＤＭＳＯに再懸濁された）を、別個のディッシュに１ディッシュ当たり１μＭの最終化合物濃度を与えるようにして加えた。処置されたディッシュを、さらに１時間にわたり３７℃にてインキュベートし、細胞にＨｏｅｃｈｓｔ核染色剤３３２５８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加え、２０分後に２．５μｇ／ｍＬの最終濃度で画像化した。
【０１９９】
共焦点顕微鏡法を、Ｎｉｋｏｎ  Ｅ−２０００倒立顕微鏡および３種の固体レーザー線（Ｓａｐｐｈｉｒｅ  ４８８ｎｍ、Ｃｏｍｐａｓｓ  ５３２ｎｍ、およびＣｏｍｐａｓｓ  ４０５ｎｍ）を備えたＮｉｋｏｎ  Ｃ１−Ｚレーザー走査共焦点系を用いて行った。Ｎｉｋｏｎ  ６０×水浸対物レンズ（ＮＡ＝１．２）を使用した。試料を、２つの別個のチャネル（光電子増倍管（ＰＭＴ））を用いて画像化した。緑色蛍光をＡｒ４８８レーザー線で励起し、発光を、ＢＡ４９５−５２０ｎｍ狭帯域フィルターを通してＰＭＴ１で観測した。ＤＡＰＩをＵＶ４０５ｎｍレーザー線で励起し、発光を、ＢＡ４１０−４６５狭帯域フィルターを通してＰＭＴ２で観測した。ＰＭＴ１およびＰＭＴ２からの信号を、Ｎｉｋｏｎ  Ｃ１−Ｚソフトウェアでマージした。
【０２００】
共焦点顕微鏡法は、ＦＩＴＣのみに暴露された細胞については細胞の蛍光が無いのと対照的に、ＦＩＴＣ複合体化デンドリマーが、１時間の化合物暴露後に、細胞膜、細胞質内、および核内に位置することを示した。
【０２０１】
実施例１３：ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号６）を４または８モノマー単位含むペプチドデンドリマーによるＨＴ２９結腸癌細胞の増殖の阻害
ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号６）を４（Ｄｅｎｄ４−１０（４））または８（本明細書において、デンドリマーＤｅｎｄ８−１０（４）と呼ばれる。実施例７．１参照）モノマー単位含む図４に示された種類のペプチドデンドリマーが、実施例６．１に記載されたＭＴＴアッセイによって評価すると、ＨＴ２９結腸癌細胞の増殖を阻害することが分かった。特に、Ｄｅｎｄ８−１０（４）は、当該ポリペプチドを４モノマー含むペプチドデンドリマーと比べて、細胞成長／増殖を阻害するのに実質的により効果的であることが分かった（２４時間のインキュベーション期間）。
【０２０２】
別の試験において、Ｄｅｎｄ１０−１０（４）ＤＰデンドリマーはまた、ＭＫＮ４５胃癌腫細胞（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｅｗ  ｓｏｕｔｈ  Ｗａｌｅｓ，Ｓｙｄｎｅｙ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）、ＭＣＦ−７乳癌細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ  ＶＡ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）から入手された乳腺癌細胞）およびＤＵ１４５前立腺癌細胞の成長／増殖も阻害した。この試験においては、これらの細胞を、デンドリマーの存在下で４８時間にわたりインキュベートした。細胞系を、５％ＣＯ２を含む湿潤雰囲気中、３７℃にて維持した。細胞を、０．０５％トリプシンおよび０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む溶液を用い、コンフルエントになる前の密度で継代培養した。
【０２０３】
実施例１４：種々の薬剤で処理されたＨＴ２９ヒト結腸癌細胞におけるホスホ−ＥＲＫ  １／２レベル
ＨＴ２９癌細胞の細胞質ゾル中への血漿細胞膜を超えてのポリペプチドの進入を促進するための異なるペプチド促進因子部分と連結させたポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号６）を含む種々の薬剤と比較される上に記載されたペプチドデンドリマーＤｅｎｄ８−１０（４）の、ＨＴ２９癌細胞中のＥＲＫ  １／２の成長因子媒介性（すなわち、ＦＣＳにより刺激された）活性化の阻害における有効性を評価した。５μＭ（Ｄｅｎｄ８−１０（４））またはポリペプチド−促進因子部分薬剤での１時間にわたる処理（いずれも、５μＭ、同じ継続時間）後の細胞におけるホスホ−ＥＲＫ  １／２レベルを、基本的に実施例７．１に記載されるとおりに測定した。利用した促進因子部分は、シグナルペプチドフラグメントＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡ（配列番号１５）、ＴＡＴ−ＧペプチドＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＧ（配列番号２３）、改変貫通配列Ｔｒ−Ｐｅｎ  ＲＲＱＫＷＫＫＧ（配列番号２４）、および貫通ペプチドＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＣＳ−ＳＣ（配列番号２５）（ここで、Ｓ−Ｓは、隣接するシステイン残基間のジスルフィド架橋を示している）であった。
【０２０４】
１時間の時点での、ＨＴ２９細胞におけるデンドリマーＤｅｎｄ  ８−１０（４）およびポリペプチド−促進因子部分による活性ホスホ−ＥＲＫ  １／２のパーセント阻害を示す。分かるように、Ｄｅｎｄ８−１０（４）デンドリマーは、最も近いレベルの阻害を発揮した試験薬剤（すなわち、ＴＡＴ−Ｇ  ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号６）ポリペプチド）よりも少なくとも３０％大きな阻害を示した。４時間で、５μＭ  Ｄｅｎｄ８−１０（４）は、ポリペプチド−促進因子部分による相対的に低いレベルの阻害（データは示されていない）と比べ、活性ホスホ−ＥＲＫ  １／２の約９５％阻害を示した。
【０２０５】
実施例１５：ＨＴ２９ヒト腺癌細胞における増殖阻害
ＨＴ２９細胞を、選択されたデンドリマーの存在下で４８時間にわたって培養し、細胞の増殖を、基本的に実施例６．１に記載されるとおりにＭＴＴアッセイにより評価した。結果を、コントロール細胞（デンドリマーで処理されない）に対するパーセント増殖として計算した。
【０２０６】
１５．１  デンドリマーＤｅｎｄ  １０−１０（４）による増殖阻害
ＨＴ２９細胞をペプチドデンドリマーＤｅｎｄ  １０−１０（４）で処理した。その結果を図１２に示す。図から分かるように、デンドリマーにより細胞の増殖が阻害された。
【０２０７】
１５．２  デンドリマーのサイズ
ペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号６）を９（Ｄｅｎｄ９−１０（４））または１２（Ｄｅｎｄ１２−１０（４））モノマー単位提示する図４に示された種類のデンドリマーを、ＨＴ２９細胞の増殖を阻害する能力について評価した。図１３に示されるように、Ｄｅｎｄ１２−１０（４）の方が、Ｄｅｎｄ９−１０（４）よりも、細胞増殖の阻害において有効であった。デンドリマーＤｅｎｄ１０−１０（４）（ペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号６）を１０モノマー単位提示する）と比較すると、Ｄｅｎｄ１２−１０（４）は、ＩＣ５０値に僅かな改善（１．８μＭに対して１μＭ）を示したが、全滅に必要とされるデンドリマー濃度の増加は全く得られなかった（すなわち、Ｄｅｎｄ１２−１０（４）およびＤｅｎｄ１０−１０（４）の両方について１０μＭ）。さらには、デンドリマーＤｅｎｄ１０−１０（４）は、デンドリマーＤｅｎｄ８−１０（４）（ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲペプチド（配列番号６）を８モノマー単位提示する）よりも有効であった（それぞれ、１．８μＭおよび５μＭのＩＣ５０）。
【０２０８】
１５．３  Ｄ−アミノ酸からなるペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号６）の使用
ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲペプチド（配列番号６）のモノマー単位が完全にＤ−アミノ酸からなり、それらのＮ末端にて２つのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）単位でペグ化されたペプチドデンドリマーＤｅｎｄ１０−１０（４）（Ｄｅｎｄ１０−１０（４）ＤＰとして識別される）の、ヒトＨＴ２９細胞の増殖の阻害における有効性を、シスプラチン、イリノネクチン（ｉｒｉｎｏｎｅｃｔｉｎ）（ＣＰＴ−１１）および５−フルオロウラシル（５ＦＵ）と比較した。細胞の増殖を、ＭＴＴアッセイによって評価した。その結果を図１４に示す。図から分かるように、Ｄｅｎｄ１０−１０（４）ＤＰデンドリマー（改変ＩＫ２４８として識別される）は、シスプラチンのみ、ＣＰＴ−１１のみ、および５ＦＵのみと比べて、実質的により大きな細胞増殖阻害をもたらした。
【０２０９】
別の試験において、Ｄｅｎｄ１０−１０（４）ＤＰデンドリマーへのＨＬ６０白血病細胞の暴露は、ＭＴＴアッセイによって分析すると、２μＭのＩＣ５０で細胞増殖の阻害をもたらした（データは示さず）。
【０２１０】
実施例１６：ＲＡＲＡＫＮＰＬＹＫ（配列番号７）またはＲＳＲＡＲＮＰＬＹＲ（配列番号８）を提示するペプチドデンドリマーでのＨＴ２９結腸癌細胞の処置
Ｈ２９結腸癌細胞を、β３ベースの１０マーペプチドＲＡＲＡＫＮＰＬＹＫ（配列番号７）（Ｄｅｎｄ８−β３）またはβ５ベースのペプチドＲＳＲＡＲＮＰＬＹＲ（配列番号８）（Ｄｅｎｄ８−β５として識別される）を８モノマー単位提示する図４に図示された種類のペプチドデンドリマーで処置した。試験細胞を４８時間にわたってデンドリマーに暴露し、細胞の増殖を、基本的に上記実施例６．１に記載したとおり、ＭＴＴアッセイを用いて評価した。吸光度を、マイクロタイタープレートリーダーを用いて５５０ｎｍで読み取り、試験細胞の増殖の阻害百分率を、非処置コントロール細胞に対して計算した。結果を図１５に示す。図から分かるように、デンドリマーＤｅｎｄ８−β３およびＤｅｎｄ８−β５の両方が、ＨＴ２９癌細胞の増殖を阻害したが、Ｄｅｎｄ８−β５の方がより有効であった。
【０２１１】
別の試験において、完全にＤ−アミノ酸からなるβ５由来ペプチドＲＳＲＡＲＮＰＬＹＲ（配列番号８）を１０モノマー単位提示する上記の種類のペプチドデンドリマーは、３００ｎＭのＩＣ５０でＨＴ２９結腸癌細胞の増殖を阻害した（ＭＴＴアッセイ）。このデンドリマーはまた、１μＭの濃度で、表６に示されるように、様々なキナーゼの活性を（コントロールと比べて）阻害することも示された。
【０２１２】
【表５】
2012518602.tif 000007
【０２１３】
実施例１７：マウスモデルにおける腫瘍成長の阻害
１７．１  材料
ＨＴ−２９ヒト結腸直腸腺癌細胞の培養のための試薬を以下の供給業者から入手した：ＲＰＭＩ  １６４０細胞培養培地、ＦＢＳおよびＨＢＳＳをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ（Ｍｔ  Ｗａｖｅｒｌｅｙ，ＶＩＣ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から入手；ペニシリン−ストレプトマイシン、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）およびトリパンブルーをＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｃａｓｔｌｅ  Ｈｉｌｌ，ＮＳＷ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から入手。
【０２１４】
１７．２  腫瘍細胞生成
ＨＴ２９ヒト結腸直腸腺癌細胞を、１０％（ｖ／ｖ）の熱失活されたＦＣＳおよび５０ＩＵ／ｍＬペニシリン−ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ  １６４０細胞培養培地で培養した。細胞をトリプシン処理により採取し、ＨＢＳＳで２回洗浄し、計数した。次いで、最終濃度が２×１０７細胞／ｍＬとなるように細胞をＨＢＳＳに再懸濁した。
【０２１５】
１７．３  試験系
種：マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）
株：ＢＡＬＢ／ｃ  ｎｕ／ｎｕ
供給者：Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ａｄｅｌａｉｄｅ（Ｗａｉｔｅ  Ｃａｍｐｕｓ，Ｕｒｒｂｒａｅ，ＳＡ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）
試験における動物の総数：雌２０匹
試験群数：２群（１試験群、１コントロール群）
１群当たりのマウス数：１０匹
体重範囲：処置開始時２０．６１〜２５．２７ｇ（平均２２．２７ｇ）
週齢範囲：処置開始時１０〜１２週
【０２１６】
１７．４  腫瘍接種
接種前に、注射部位（背右脇）の皮膚にアルコールを塗った。動物の右肩直下の皮下空間に皮膚を通して針を挿入し、１００μＬの細胞（２×１０６細胞）を吐出させた。マウスの処置は、ＨＴ２９細胞接種の９日後に開始し、平均腫瘍体積は６８ｍｍ３（平均変動性６．１％）であった。
【０２１７】
１７．５  体重および腫瘍測定
体重および腫瘍寸法（長さおよび直径）を、全ての動物について処置の初日（０日目）に測定し、次いで週に３回（試験の終了日（２４日目）を含む）測定した。
【０２１８】
１７．６  投与
試験の０日目に、マウスを体重に基づき無作為抽出し、２つの１０匹のマウスから成る群に分けた。ペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号６）を１０モノマー単位提示するペプチドデンドリマーＤｅｎｄ  １０−１０（４）（実施例２参照）を、本試験に用いた。ビヒクルコントロール（リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ））およびＤｅｎｄ  １０−１０（４）デンドリマー（２０ｍｇ／ｋｇ）の各々を、０日目に開始し、１日１回、５日間連続して腫瘍内注射により投与した。
【０２１９】
ビヒクルコントロールおよびＤｅｎｄ  １０−１０（４）デンドリマーを、２１ｇのマウスに基づき４．７６２ｍＬ／ｋｇ（１００μＬ）の投与容量で投与した。投薬の直前に各動物の体重を測定した。各マウスに投与される投与溶液の容量を個々の体重に基づいて計算し、調節した。
【０２２０】
１７．７  試料収集および計算
死後に全てのマウスから腫瘍を摘出し、計量した。腫瘍体積を次の方程式を用いて計算した。
Ｖ（ｍｍ３）＝長さ×直径２×π／６
【０２２１】
腫瘍の変動性を次の方程式を用いて計算した。
変動性（％）＝（標準誤差腫瘍体積／腫瘍体積平均）×１００
【０２２２】
ΔＴ／ΔＣ（％）を次の方程式を用いて計算した。
ΔＴ／ΔＣ％＝（Δ体積処置／Δ体積コントロール）×１００
式中、Δ＝０日目から最終測定日または対象の指定日までの体積変化
【０２２３】
１７．８  統計的計算
全ての統計的計算を、ＳｉｇｍａＳｔａｔ  ３．０（ＳＰＳＳ  Ａｕｓｔｒａｌａｓｉａ，Ｎｏｒｔｈ  Ｓｙｄｎｅｙ，ＮＳＷ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を用いて実施した。二標本ｔ検定を用いて、０日目と４日目の間および０日目と試験終了日の間の処置群内の体重変化の有意性を決定した。一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を、本試験の最後に全てのマウスにおいて測定された腫瘍体積に対して実施した。データに有意差が見出された場合は、全対多重比較法（ホルム−サイダック（Ｈｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ）法）を実施した。二標本ｔ検定を用いて、ビヒクルコントロールおよびＤｅｎｄ１０  １０（４）処置群についての腫瘍重量データ間の有意差を証明した。０．０５未満のｐ値は有意と見なされた。
【０２２４】
１７．９  結果
【０２２５】
【表６】
2012518602.tif 000008
【０２２６】
図１６により明確に示されるように、腫瘍成長は、ビヒクルのみのコントロール（中実の菱形）と比較して、デンドリマーＤｅｎｄ１０−１０（４）（中実の正方形、図１６においてＩＫ２４８として識別される）により著しく阻害された。特に、５日目〜１５日目の間に、コントロール群に比べ、処置群において腫瘍の成長が顕著に遅くなった。試験の終了時のコントロール群における平均腫瘍重量は、Ｄｅｎｄ１０−１０（４）処置群についての０．４３７ｇ±０．０７２（標準誤差）と比較して０．９６２ｇ±０．１２４（標準誤差）であり、高度に有意な結果であった（Ｐ≦０．００３）。
【０２２７】
多数の好ましい実施形態が記載されたが、本発明から逸脱することなく数多くのさらなる実施形態が提供され得ることが当業者により理解される。したがって、記載された本実施形態は、あらゆる点で、説明のためのものと見なされるべきであり、限定するものと見なされるべきではない。
【０２２８】
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６１．Ｚｈａｏ  ＆  Ｒｏｂｅｒｔｓ，  ＰＩ３  Ｋｉｎａｓｅｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ：Ｆｒｏｍ  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ａｒｔｉｆａｃｔ  ｔｏ  Ｌｅａｄｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔａｒｇｅｔ；Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＳＴＫＥ  ２００６（３６５），  ｐｅ５２  （ＩＳＳＮ  １５２５−８８８２）．
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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