【手続補正書】
【提出日】平成20年12月2日(2008.12.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式I：
2004516810.tif 000001
を有する化合物：
式中、
Bが、核酸塩基であり；
R1が、水素、水酸基または荷電基であり；
式IのR2が、水素または荷電基であり；
Xが、ヘテロ原子であり；
式Iの「y」が、0、2または3であってもよく；かつ
Fが、検出可能部分である。
【請求項２】
前記検出可能部分が、化学発光化合物、蛍光または蛍光発生色素、着色または発色色素、電気化学タグおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項1記載の化合物。
【請求項３】
yが2である、請求項1記載の化合物。
【請求項４】
前記検出可能部分が、化学発光化合物、蛍光発生色素、発色色素、電気化学タグおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項1記載の化合物。
【請求項５】
前記検出可能部分が、呈色、蛍光放射、化学発光、還元/酸化電位およびそれらの組み合わせからなる群より選択される特性によって検出可能である、請求項1記載の化合物。
【請求項６】
前記検出可能部分が、酵素活性化可能蛍光発生部分であり、かつフルオレセインジホスフェート、フルオレセイン 3'(6')-O-アルキル-6'(3')-リン酸、4-メチルウムベリフェリルリン酸、レゾルフィンリン酸、4-トリフルオロメチルウムベリフェリルリン酸、ウムベリフェリルリン酸、3-シアノウムベリフェリルリン酸、6,8-ジフルオロ-4-メチルウムベリフェリルリン酸、およびそれらの誘導体からなる群より選択される、請求項5記載の化合物。
【請求項７】
前記検出可能部分が、フルオレセイン、ローダミン、ボディピー（bodipy）、シアニン、アレキサ（Alexa）、ナフトフルオレセイン（Naphthofluorescein）、オレゴングリーン、クマリン、ダンシル、テキサスレッド、およびそれらの誘導体からなる群より選択される蛍光部分である、請求項5記載の化合物。
【請求項８】
前記糖部分が、リボシル、2'-デオキシリボシルおよび他の修飾糖からなる群から選択される、請求項1記載の化合物。
【請求項９】
前記核酸塩基が、ウラシル、チミン、シトシン、5-メチルシトシン、グアニン、7-デアザグアニン、ヒポキサンキン、7-デアザヒポキサンチン、アデニン、7-デアザアデニン、2,6-ジアミノプリン、およびそれらの類似体からなる群より選択される、請求項1記載の化合物。
【請求項１０】
核酸ポリメラーゼのための基質である、請求項1記載の化合物。
【請求項１１】
リン酸除去後の検出可能部分が、追加の化学的部分および/または酵素部分と相互作用し、シグナルを生成する、請求項1記載の化合物。
【請求項１２】
検出可能で前記検出可能種とは異なる追加の前記検出試薬が反応可能である、請求項11記載の化合物。
【請求項１３】
DNA配列の存在を検出するための方法であって、以下の段階を含む方法：
a)末端リン酸標識されたヌクレオチド存在下でDNAポリメラーゼ反応を行い、反応が標識されたポリリン酸の生成をもたらす段階；
b)標識された該ポリリン酸がリン酸転移酵素またはポリリン酸転移酵素と反応し、蛍光団部分を生成することを可能にする段階；および
c)該蛍光団部分の存在を検出する段階。
【請求項１４】
段階(a)がリン酸転移酵素またはポリリン酸転移酵素存在下で前記ポリメラーゼ反応を行う段階をさらに含む、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
段階(a)が別個の蛍光団部分を有する末端リン酸標識された2つまたはそれ以上のヌクレオチド存在下での前記ポリメラーゼ反応を行う段階をさらに含む、請求項13記載の方法。
【請求項１６】
前記蛍光団部分が、化学発光化合物、蛍光発生または蛍光色素、発色または着色色素、電気化学タグおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される酵素活性化可能標識である、請求項13記載の方法。
【請求項１７】
前記末端リン酸標識されたヌクレオチドが、式I：
2004516810.tif 000002
によって表されることができる、請求項13記載の方法：
式中、
Bが、核酸塩基であり；
R1が、水素、水酸基または荷電基であり；
式IのR2が、水素または荷電基であり；
Xが、ヘテロ原子であり；
式Iの「y」が、0、2または3であってもよく；かつ
Fが、検出可能部分である。
【請求項１８】
yが2である、請求項13記載の方法。
【請求項１９】
前記ポリメラーゼ反応における1つまたはそれ以上の追加の検出試薬を含む段階をさらに含む、請求項13記載の方法。
【請求項２０】
検出可能で前記蛍光団とは異なる追加の前記検出試薬が反応可能である、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
yが3である、請求項1記載の化合物。
【請求項２２】
yが3である、請求項17記載の方法。
【請求項２３】
Xが窒素、酸素および硫黄からなる群より選択されるヘテロ原子である、請求項1記載の化合物。
【請求項２４】
Xが窒素である、請求項23記載の化合物。
【請求項２５】
Xが窒素、酸素および硫黄からなる群より選択されるヘテロ原子である、請求項17記載の方法。
【請求項２６】
Xが窒素である、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
蛍光団部分が結合した末端リン酸を有し、第1の分子電荷が結合した無傷のNPプローブを含み、末端リン酸がリン酸蛍光団部分として切断されると、リン酸蛍光団部分が第2の分子電荷を保有し、第1の分子電荷と第2の分子電荷の差が少なくとも0.5である電荷スイッチリン酸ヌクレオチド(NP)プローブ。
【請求項２８】
無傷のNPプローブが正の分子電荷を有するか、または末端リン酸蛍光団部分が切断されると、該末端リン酸蛍光団部分が該無傷のNPプローブに対して正の分子電荷を保有する、請求項27記載の電荷スイッチNPプローブ。
【請求項２９】
電荷スイッチNPプローブがヌクレオチド三リン酸(NTP)であり、末端リン酸が、蛍光団部分が結合したピロリン酸である、請求項27記載の電荷スイッチNPプローブ。
【請求項３０】
無傷のNTPプローブが正の電荷を有する、請求項29記載の電荷スイッチNPプローブ。
【請求項３１】
末端リン酸がピロリン酸蛍光団部分として切断されると、ピロリン酸蛍光団部分が、無傷のNTPプローブに対して正の電荷を保有する、請求項29記載の電荷スイッチNPプローブ。
【請求項３２】
NTPプローブが、デオキシヌクレオチド三リン酸(dNTP)およびヌクレオチド三リン酸(NTP)からなる群より選択されるメンバーである、請求項29記載の電荷スイッチNPプローブ。
【請求項３３】
NTPプローブがデオキシヌクレオチド三リン酸(dNTP)である、請求項32記載の電荷スイッチNPプローブ。
【請求項３４】
デオキシヌクレオチド三リン酸(dNTP)が、デオキシアデノシン三リン酸、デオキシシトシン三リン酸、デオキシグアノシン三リン酸、デオキシチミジン三リン酸およびデオキシウリジン三リン酸からなる群より選択されるメンバーである、請求項33記載の電荷スイッチNPプローブ。
【請求項３５】
ヌクレオチド三リン酸(NTP)が、アデノシン三リン酸、シトシン三リン酸、グアノシン三リン酸およびウリジン三リン酸からなる群より選択されるメンバーである、請求項32記載の電荷スイッチNPプローブ。
【請求項３６】
蛍光団部分が、フルオレセイン、5-カルボキシフルオレセイン(FAM)、ローダミン、5-(2'-アミノエチル)アミノナフタレン-1-スルホン酸(EDANS)、アントラニルアミド、クマリン、テルビウムキレート誘導体、リアクティブレッド（Reactive Red）4、ボディピー色素およびシアニン色素からなる群より選択されるメンバーである、請求項27記載の電荷スイッチNPプローブ。
【請求項３７】
蛍光団部分が、リンカーを介して末端リン酸に結合されている、請求項29記載の電荷スイッチNPプローブ。
【請求項３８】
蛍光団リンカーが、炭素数約5〜約12個のアルキレン基である、請求項37記載の電荷スイッチNPプローブ。
【請求項３９】
リンカーが少なくとも1つの正の電荷を保有する、請求項37記載の電荷スイッチNPプローブ。
【請求項４０】
リンカーが少なくとも2つの正の電荷を保有する、請求項37記載の電荷スイッチNPプローブ。
【請求項４１】
リン酸ヌクレオチドプローブのリン酸部分の少なくとも1つは、対陽イオンが結合したイオン化酸素原子を有する、請求項27記載の電荷スイッチNPプローブ。
【請求項４２】
対陽イオンが金属イオンである、請求項41記載の電荷スイッチNPプローブ。
【請求項４３】
金属イオンが、Mg++、Mn++、K+およびNa+からなる群より選択される、請求項42記載の電荷スイッチNPプローブ。
【請求項４４】
蛍光団部分がボディピー TRである、請求項37記載の電荷スイッチNPプローブ。
【請求項４５】
第1の分子電荷と第2の分子電荷との差が、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9および4.0からなる群より選択される、請求項27記載の電荷スイッチNPプローブ。
【請求項４６】
第1の分子電荷と第2の分子電荷との差が、pH 7.0における純水において算出される、請求項27記載の電荷スイッチNPプローブ。
【請求項４７】
電荷スイッチプローブが、図6A〜Dの化合物50、51、52、53、54、55、56、57、58、59および60からなる群より選択される、請求項27記載の電荷スイッチNPプローブ。
【請求項４８】
検出可能な部分を有する標識リン酸ヌクレオチドを、試料流動体中に放出された荷電した検出可能な部分を分離するための方法であって、
a)単一分子構成の固相支持体に、核酸ポリメラーゼまたは標的核酸を含む複合体を固定する段階と、
b)複合体に、ポリメラーゼが固定されている場合には標的核酸または標的核酸が固定されている場合にはポリメラーゼ、該標的核酸の一領域と相補的であるプライマー核酸および検出可能な部分を有する電荷スイッチリン酸ヌクレオチド（NP）プローブを含む試料流動体を接触させる段階であって、電荷スイッチリン酸ヌクレオチド（NP）がプライマー核酸に組み込まれると検出可能な部分が荷電した検出可能な部分として放出される段階と、
c)試料流動体にエネルギー場を適用し、それによって荷電した検出可能な部分から標識NPを分離する段階と
を含む方法。
【請求項４９】
電荷スイッチリン酸ヌクレオチド(NP)が標識ヌクレオチド三リン酸(NTP)である、請求項48に記載の方法。
【請求項５０】
検出可能な部分を有する標識ヌクレオチド三リン酸(NTP)が、検出可能な部分が結合したγ-リン酸を有するNTPである、請求項49に記載の方法。
【請求項５１】
荷電した検出可能な部分が放出された場合、蛍光団部分が結合したピロリン酸を含む、請求項49記載の方法。
【請求項５２】
標識NTPが、ポリメラーゼを使用して標的核酸にハイブリダイゼーションした核酸プライマーに組み込まれ、それによって検出可能な部分が結合したγ-リン酸を放出する、請求項50記載の方法。
【請求項５３】
標的核酸が、プライマーを形成する自己相補領域を含む、請求項52記載の方法。
【請求項５４】
放出後の検出可能な部分の電荷が、検出可能な部分が結合した標識リン酸ヌクレオチド(NP)とは異なる、請求項48記載の方法。
【請求項５５】
検出可能な部分の電荷が組み込まれていない標識NPより正である、請求項54記載の方法。
【請求項５６】
結合した検出可能な部分の電荷が、組み込まれていない蛍光標識NPと比較して符号が反対である、請求項54記載の方法。
【請求項５７】
d)測定装置を用いて検出可能な部分を測定する段階を
さらに含む、請求項48記載の方法。
【請求項５８】
測定装置が、電荷結合素子(CCD)カメラ、フォトダイオード、ビデオチップ、電流メータ、電圧メータおよび光ファイバセンサの色素含浸ポリマーコーティングからなる群より選択される、請求項57記載の方法。
【請求項５９】
検出がCCDカメラによる、請求項58記載の方法。
【請求項６０】
検出がフォトダイオードによる、請求項58記載の方法。
【請求項６１】
リン酸の検出可能部分から無傷のNPプローブを分離するための分析方法であって、
a)検出可能な部分が結合した無傷のNPプローブを含む試料を提供する段階であって、無傷のNPプローブが酵素的に切断されると、無傷のNPプローブの分子電荷とは異なる分子電荷を保有するリン酸の検出可能な部分を形成する段階と、
b)試料にエネルギー場を提供し、それによって該無傷のNPプローブからリン酸の検出可能な部分を分離する段階と
を含む方法。
【請求項６２】
検出可能な部分を有するNPプローブが標識ヌクレオチド三リン酸(NTP)である、請求項61記載の方法。
【請求項６３】
ポリメラーゼを用いて標的核酸を配列決定する方法であって、
a)単一分子構成の固相支持体に、核酸ポリメラーゼまたは標的核酸を含む複合体を固定する段階と、
b)複合体に、ポリメラーゼが固定されている場合には標的核酸または標的核酸が固定されている場合にはポリメラーゼ、配列決定対象の領域の該標的核酸の一領域と相補的であるプライマー核酸および検出可能な部分を有する標識リン酸ヌクレオチドを含む試料流動体を接触させる段階であって、NPがプライマー核酸に組み込まれると検出可能な部分が荷電した検出可能な部分として放出され、固相支持体が、流入部と流出部を有するフローセルに接続されている段階と、
c)試料流動体にエネルギー場を適用する段階と
d)荷電した検出可能な部分を検出し、それによって該標的核酸を配列決定する段階と
を含む方法。
【請求項６４】
検出可能なリン酸ヌクレオチドが、検出可能な部分が結合したγ-リン酸を有する標識ヌクレオチド三リン酸(NTP)である、請求項63記載の方法。
【請求項６５】
NPが、ポリメラーゼを使用して標的核酸にハイブリダイゼーションしたプライマー鎖に組み込まれ、それによって検出可能な部分が結合したγ-リン酸を放出する、請求項63記載の方法。
【請求項６６】
エネルギー場が電場である、請求項63記載の方法。
【請求項６７】
電場が横方向に適用される第1の電場であり、第2の電場が軸方向に適用される、請求項66記載の方法。
【請求項６８】
蛍光団部分が結合したγ-リン酸の電荷が、組み込まれていない蛍光標識NTPより大きい、請求項63記載の方法。
【請求項６９】
蛍光団部分が結合したγ-リン酸の電荷が、組み込まれていない蛍光標識NTPより小さい、請求項63記載の方法。
【請求項７０】
蛍光団部分が結合したγ-リン酸の電荷が、組み込まれていない蛍光標識NTPと比較して符号が反対である、請求項63記載の方法。
【請求項７１】
検出が電荷結合素子(CCD)カメラによる、請求項63記載の方法。
【請求項７２】
検出が、光ファイバセンサの色素含浸ポリマーコーティングによる、請求項63記載の方法。
【請求項７３】
検出が遮断電流による、請求項63記載の方法。
【請求項７４】
検出がフォトダイオードによる、請求項63記載の方法。
【請求項７５】
リン酸の検出可能な部分から無傷のNPプローブを分離する方法であって、
a)検出可能な部分が結合した無傷のNPプローブを含む試料を提供する段階であって、無傷のNPプローブが酵素的に切断されると、該無傷のNPプローブの分子電荷とは異なる分子電荷を保有するリン酸の検出可能な部分を形成する段階と、
b)試料にエネルギー場を適用し、それによって該無傷のNPプローブからリン酸の検出可能な部分を分離する段階と
を含む方法。
【請求項７６】
無傷のNPプローブが、末端のリン酸に検出可能な部分を有する電荷スイッチリン酸ヌクレオチドプローブである、請求項75記載の方法。
【請求項７７】
無傷の電荷スイッチリン酸ヌクレオチド(NP)プローブを同定するための方法であって、
a)無傷の電荷スイッチNPプローブを含む試料に酵素を接触させて、リン酸の検出可能な部分を形成する段階と、
b)試料に電場を適用する段階であって、リン酸の検出可能な部分は、該無傷の電荷スイッチNPプローブと異なる電極に移動する段階と
を含む方法。
【請求項７８】
酵素が、DNAポリメラーゼ、DNA依存RNAポリメラーゼ、逆転写酵素、ホスホジエステラーゼおよびホスファターゼからなる群より選択される、請求項77記載の方法。
【請求項７９】
無傷の電荷スイッチリン酸ヌクレオチド(NP)プローブが酵素的に切断されると、リン酸の検出可能な部分を形成し、リン酸の検出可能な部分が一方の電極に移動し、無傷の電荷スイッチNPプローブが他方の電極に移動する、無傷の電荷スイッチNPプローブ。
【請求項８０】
無傷のNPプローブが正の分子電荷を有するか、またはリン酸の検出可能な部分が切断されると、該リン酸の検出可能な部分が該無傷のNPプローブに対して正の分子電荷を保有する、請求項79記載の無傷の電荷スイッチNPプローブ。
【請求項８１】
電荷スイッチNPプローブがヌクレオチド三リン酸(NTP)であり、リン酸の検出可能な部分が、蛍光団部分が結合したピロリン酸である、請求項79記載の無傷の電荷スイッチNPプローブ。
【請求項８２】
無傷のNTPプローブが正の電荷を有する、請求項79記載の無傷の電荷スイッチNPプローブ。
【請求項８３】
リン酸の検出可能な部分がピロリン酸蛍光団部分として切断されると、ピロリン酸蛍光団部分が、無傷のNTPプローブに対して正の電荷を保有する、請求項81記載の無傷の電荷スイッチNPプローブ。
【請求項８４】
NTPプローブが、デオキシヌクレオチド三リン酸(dNTP)およびヌクレオチド三リン酸(NTP)からなる群より選択されるメンバーである、請求項79記載の無傷の電荷スイッチNPプローブ。
【請求項８５】
NTPプローブがデオキシヌクレオチド三リン酸(dNTP)である、請求項84記載の無傷の電荷スイッチNPプローブ。
【請求項８６】
デオキシヌクレオチド三リン酸(dNTP)が、デオキシアデノシン三リン酸、デオキシシトシン三リン酸、デオキシグアノシン三リン酸、デオキシチミジン三リン酸およびデオキシウリジン三リン酸からなる群より選択されるメンバーである、請求項85記載の無傷の電荷スイッチNPプローブ。
【請求項８７】
ヌクレオチド三リン酸(NTP)が、アデノシン三リン酸、シトシン三リン酸、グアノシン三リン酸およびウリジン三リン酸からなる群より選択されるメンバーである、請求項84記載の無傷の電荷スイッチNPプローブ。
【請求項８８】
蛍光団部分が、リンカーを介して末端リン酸に結合している、請求項81記載の無傷の電荷スイッチNPプローブ。
【請求項８９】
蛍光団リンカーが、炭素数約5〜約12個のアルキレン基である、請求項88記載の無傷の電荷スイッチNPプローブ。
【請求項９０】
核酸を配列決定するための方法であって、
標的核酸、プライマー鎖、ポリメラーゼおよび複数のNPプローブを提供する段階と、
複数のNPプローブの標的依存的重合を可能にする条件下において標的核酸、配列プライマー、ポリメラーゼ、複数のNPプローブをフローセル中で混合して、それによって重合産物を提供する段階と、
エネルギー場によってフローセル中の重合産物を分離して、該標的核酸の配列を提供する段階と
を含む方法。
【請求項９１】
複数のNPプローブの重合が複数のリン酸の検出可能な部分を形成する、請求項90記載の方法。
【請求項９２】
複数のNPプローブが、ポリメラーゼを使用して標的核酸にハイブリダイゼーションしたプライマー鎖に組み込まれ、それによって検出可能な部分が結合したγ-リン酸を放出する、請求項90記載の方法。
【請求項９３】
エネルギー場が電場である、請求項90記載の方法。
【請求項９４】
電場が横方向に適用される第1の電場であり、第2の電場が軸方向に適用される、請求項93記載の方法。
【請求項９５】
核酸を配列決定するための方法であって、
標的核酸、ポリメラーゼプライミング部分、ポリメラーゼおよび複数の無傷のNPプローブを提供する段階と、
複数のNPプローブの標的依存的重合を可能にし、複数のリン酸の検出可能な部分の時間配列を提供することができる条件下において標的核酸、ポリメラーゼプライミング部分、ポリメラーゼおよび複数のNPプローブを混合する段階と、
電荷によって、複数のリン酸の検出可能な部分を該複数の無傷のNPプローブから分離する段階と、
該複数のリン酸の検出可能な部分を経時的に検出して、該標的核酸の配列を提供する段階と
を含む方法。
【請求項９６】
プライマー部分がヘアピンループである、請求項95記載の方法。
【請求項９７】
複数のリン酸の検出可能な部分が、PPi-Dye、末端リン酸の蛍光団部分、検出可能な部分、荷電基、電気的に活性な基、レポーター基およびそれらの組み合わせからなる群より独立に選択される、請求項95記載の方法。
【請求項９８】
リン酸の蛍光団部分が、1色配列決定、2色配列決定、3色配列決定、4色配列決定およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるメンバーに使用される、請求項97記載の方法。
【請求項９９】
ポリメラーゼが単一の分子構成で固定されている、請求項95記載の方法。