(57)【要約】  本発明は、ダイサー基質ｓｉＲＮＡ（ＤｓｉＲＮＡ）−ペプチドコンジュゲートの使用により標的ＲＮＡおよびタンパク質レベルを減少させるのに有用な化合物、組成物および方法に関する。【選択図】図１Ａ【特許請求の範囲】
【請求項１】
５’末端および３’末端を有する第一のオリゴヌクレオチド鎖と５’末端および３’末端を有する第二のオリゴヌクレオチド鎖とを含む単離二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）組成物であって、前記第一鎖と前記第二鎖が、少なくとも１６ヌクレオチド長かつ最大で５０ヌクレオチド長の長さを有し、前記ペプチドが前記ｄｓＲＮＡとコンジュゲートされており、かつ前記ｄｓＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートが標的と結合する単離二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）組成物。
【請求項２】
５’末端および３’末端を有する第一のオリゴヌクレオチド鎖と５’末端および３’末端を有する第二のオリゴヌクレオチド鎖とを含む単離二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）組成物であって、前記第一鎖と前記第二鎖が、少なくとも１６ヌクレオチド長かつ最大で５０ヌクレオチド長の長さを有し、前記ペプチドが前記ｄｓＲＮＡとコンジュゲートされており、前記ｄｓＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートが標的細胞により内部に取り入れられる単離二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）組成物。
【請求項３】
前記第一鎖および前記第二鎖が、少なくとも２５ヌクレオチドかつおよび最大で３５ヌクレオチド、少なくとも１９ヌクレオチドかつ最大で３５ヌクレオチド、少なくとも１９ヌクレオチドかつ最大で２４ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチドかつ最大で３０ヌクレオチド、少なくとも２６ヌクレオチドかつ最大で３０ヌクレオチドまたは少なくとも２１ヌクレオチドかつ最大で２３ヌクレオチドの長さを有する、請求項１または２に記載の単離組成物。
【請求項４】
前記第二鎖が３’末端にオーバーハングを含む、請求項１または２に記載の単離組成物。
【請求項５】
前記第一鎖が３’末端にオーバーハングを含む、請求項１または２に記載の単離組成物。
【請求項６】
前記第二鎖および前記第一鎖の少なくとも一方が３’末端にオーバーハングを含む、請求項１または２に記載の単離組成物。
【請求項７】
前記第一鎖および／または前記第二鎖の前記３’オーバーハングの前記ヌクレオチドが修飾ヌクレオチドを含む、請求項６に記載の単離組成物。
【請求項８】
前記３’オーバーハング（１つまたは複数）が１〜５ヌクレオチド長である、請求項６に記載の単離組成物。
【請求項９】
前記第一および前記第二鎖がそれぞれ同数のヌクレオチド残基からなる、請求項１または２に記載の単離組成物。
【請求項１０】
前記第一鎖の前記５’末端の最終残基と前記第二鎖の前記３’末端の最終残基がミスマッチ塩基対を形成している、請求項９に記載の単離組成物。
【請求項１１】
前記第一鎖の前記３’末端の最終残基と前記第二鎖の前記５’末端の最終残基がミスマッチ塩基対を形成している、請求項９に記載の単離組成物。
【請求項１２】
前記第一鎖の前記５’末端の最終残基および最後から２番目の残基と、前記第二鎖の前記３’末端の最終残基および最後から２番目の残基が２つのミスマッチ塩基対を形成している、請求項９に記載の単離組成物。
【請求項１３】
前記第一鎖の前記３’末端の最終残基および最後から２番目の残基と、前記第二鎖の前記５’末端の最終残基および最後から２番目の残基が２つのミスマッチ塩基対を形成している、請求項９に記載の単離組成物。
【請求項１４】
前記ペプチドが６〜１００個のアミノ酸を含む、請求項１または２に記載の単離組成物。
【請求項１５】
前記ペプチドが１０〜５０個のアミノ酸を含む、請求項１または２に記載の単離組成物。
【請求項１６】
前記ペプチドが１５〜３０個のアミノ酸を含む、請求項１または２に記載の単離組成物。
【請求項１７】
前記ペプチドが１０個のアミノ酸を含む、請求項１または２に記載の単離組成物。
【請求項１８】
前記ｄｓＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートが受容体と結合する、請求項１または２に記載の単離組成物。
【請求項１９】
前記ｄｓＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートがＬＤＬ受容体ファミリーの少なくとも１つのメンバーと結合する、請求項１または２に記載の単離組成物。
【請求項２０】
前記ペプチドがＰＡＲリガンドである、請求項１または２に記載の単離組成物。
【請求項２１】
前記ペプチドがＰＡＲ１リガンドである、請求項１または２に記載の単離組成物。
【請求項２２】
前記ペプチドが増殖因子リガンドである、請求項１または２に記載の単離組成物。
【請求項２３】
前記ペプチドがインスリンまたはインスリン様増殖因子リガンドである、請求項１または２に記載の単離組成物。
【請求項２４】
前記ペプチドがＩＧＦ−１リガンドである、請求項１または２に記載の単離組成物。
【請求項２５】
前記ペプチドがホルモンリガンドである、請求項１または２に記載の単離組成物。
【請求項２６】
前記ペプチドがＰＴＨリガンドである、請求項１または２に記載の単離組成物。
【請求項２７】
前記ペプチドがＰＴＨ−１リガンドである、請求項１または２に記載の単離組成物。
【請求項２８】
前記ｄｓＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートが受容体結合タンパク質と結合する、請求項１または２に記載の単離組成物。
【請求項２９】
前記ペプチドが安定なリンカーにより前記ｄｓＲＮＡとコンジュゲートされている、請求項１または２に記載の単離組成物。
【請求項３０】
前記安定なリンカーがホモ二官能性架橋剤を含む、請求項２９に記載の単離組成物。
【請求項３１】
前記安定なリンカーがヘテロ二官能性架橋剤を含む、請求項２９に記載の単離組成物。
【請求項３２】
前記安定なリンカーが三官能性架橋剤を含む、請求項２９に記載の単離組成物。
【請求項３３】
前記ペプチドが、切断可能なリンカーにより前記ｄｓＲＮＡとコンジュゲートされている、請求項１または２に記載の単離組成物。
【請求項３４】
前記切断可能なリンカーがジスルフィドリンカーを含む、請求項３３に記載の単離組成物。
【請求項３５】
前記ペプチドが、炭素リンカーにより前記ｄｓＲＮＡとコンジュゲートされている、請求項１または２に記載の単離組成物。
【請求項３６】
前記炭素リンカーが１８個以下の炭素を含む、請求項３５に記載の単離組成物。
【請求項３７】
前記炭素リンカーが６個の炭素を含む、請求項３５に記載の単離組成物。
【請求項３８】
前記ペプチドと前記ｄｓＲＮＡがリンカーなしでコンジュゲートされている、請求項１または２に記載の単離組成物。
【請求項３９】
前記ペプチドが前記ｄｓＲＮＡの前記第一鎖の３’末端とコンジュゲートされている、請求項１または２に記載の単離組成物。
【請求項４０】
前記ペプチドが前記ｄｓＲＮＡの前記第二鎖の３’末端とコンジュゲートされている、請求項１または２に記載の単離組成物。
【請求項４１】
前記ペプチドが前記ｄｓＲＮＡの第一鎖の５’末端とコンジュゲートされている、請求項１または２に記載の単離組成物。
【請求項４２】
前記ペプチドが前記ｄｓＲＮＡの前記第二鎖の５’末端とコンジュゲートされている、請求項１または２に記載の単離組成物。
【請求項４３】
前記ペプチドが、前記ｄｓＲＮＡの第一鎖の５’末端および前記第二鎖の５’末端とコンジュゲートされている、請求項１または２に記載の単離組成物。
【請求項４４】
前記ペプチドが、前記ｄｓＲＮＡの前記第一鎖の５’末端および前記第二鎖の前記３’末端とコンジュゲートされている、請求項１または２に記載の単離組成物。
【請求項４５】
前記ペプチドが、前記ｄｓＲＮＡの第一鎖の３’末端および前記第二鎖の３’末端とコンジュゲートされている、請求項１または２に記載の単離組成物。
【請求項４６】
前記ペプチドが、前記ｄｓＲＮＡの前記第一鎖の３’末端および前記第二鎖の前記５’末端とコンジュゲートされている、請求項１または２に記載の単離組成物。
【請求項４７】
少なくとも１つのペプチドが前記ｄｓＲＮＡの前記第一鎖と内側でコンジュゲートされている、請求項１または２に記載の単離組成物。
【請求項４８】
少なくとも１つのペプチドが前記ｄｓＲＮＡの前記第二鎖と内側でコンジュゲートされている、請求項１または２に記載の単離組成物。
【請求項４９】
少なくとも１つのペプチドが前記ｄｓＲＮＡの前記第一鎖と内側でコンジュゲートされ、かつ少なくとも１つのペプチドが前記ｄｓＲＮＡの前記第二鎖と内側でコンジュゲートされている、請求項１または２に記載の単離組成物。
【請求項５０】
少なくとも２つのペプチドが前記ｄｓＲＮＡとコンジュゲートされている、請求項１または２に記載の単離組成物。
【請求項５１】
前記少なくとも２つのペプチドが同一である、請求項５０に記載の単離組成物。
【請求項５２】
前記少なくとも２つのペプチドが同一でない、請求項５０に記載の単離組成物。
【請求項５３】
少なくとも１つの色素分子をさらに含み、前記色素分子が前記ｄｓＲＮＡおよび前記ペプチドの少なくとも一方とコンジュゲートされている、請求項１または２に記載の単離組成物。
【請求項５４】
前記色素分子が多環芳香族である、請求項５３に記載の単離組成物。
【請求項５５】
前記色素が蛍光色素である、請求項５３に記載の単離組成物。
【請求項５６】
治療剤をさらに含む、請求項１または２に記載の単離組成物。
【請求項５７】
前記治療剤が抗癌剤である、請求項５６に記載の単離組成物。
【請求項５８】
前記抗癌剤が、パクリタキセル、タモキシフェン、シスプラチン、ドキソルビシンおよびビンブラスチンからなる群より選択される、請求項５７に記載の単離組成物。
【請求項５９】
前記治療剤が代謝性の疾患または障害を治療するための薬物である、請求項５８に記載の組成物。
【請求項６０】
前記ペプチドが毒素の標的部分の一部を含む、請求項１または２に記載の単離組成物。
【請求項６１】
前記神経毒素がクロストリジウム毒素である、請求項６０の単離組成物。
【請求項６２】
少なくとも１つの送達ペプチドをさらに含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項６３】
前記ｄｓＲＮＡの第一のオリゴヌクレオチド鎖の３’末端における最初のヌクレオチド（１位）から始めて、１、２および／または３位が修飾ヌクレオチドで置換されている、請求項１または２に記載の単離組成物。
【請求項６４】
前記修飾ヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドである、請求項６０に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項６５】
前記第一のオリゴヌクレオチド鎖および前記第二のオリゴヌクレオチド鎖の一方または両方が５’リン酸を含む、請求項１または２に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項６６】
前記第一鎖または前記第二鎖の少なくとも１つのヌクレオチドが修飾されている、請求項１または２に記載の単離組成物。
【請求項６７】
前記修飾ヌクレオチド残基が、２’−Ｏ−メチル、２’−メトキシエトキシ、２’−フルオロ、２’−アリル、２’−Ｏ−［２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル］、４’−チオ、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’−架橋、４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’−架橋、２’−ＬＮＡ、２’−アミノおよび２’−Ｏ−（Ｎ−メチルカルバマート）からなる群より選択される、請求項６６に記載の単離組成物。
【請求項６８】
前記ｄｓＲＮＡが、前記細胞中でダイサーにより内因的に切断される、請求項１または２に記載の単離組成物。
【請求項６９】
標的遺伝子の発現を減少させるのに十分な前記単離二本鎖核酸の量が、前記細胞環境中で１ナノモル以下、２００ピコモル以下、１００ピコモル以下、５０ピコモル以下、２０ピコモル以下および１０ピコモル以下からなる群より選択される、請求項１または２に記載の単離組成物。
【請求項７０】
前記第一鎖と前記第二鎖が化学的リンカーにより連結されている、請求項１または２に記載の単離組成物。
【請求項７１】
前記第一鎖の前記３’末端と前記第二鎖の前記５’末端が化学的リンカーにより連結されている、請求項１または２に記載の単離組成物。
【請求項７２】
前記第二鎖または前記第一鎖のヌクレオチドが、ダイサー切断の方向を指定する修飾ヌクレオチドで置換されている、請求項１または２に記載の単離組成物。
【請求項７３】
修飾ヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、非環状ヌクレオチド、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）、２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）のヌクレオチド一リン酸および２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）のヌクレオチド一リン酸、４−チオウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル、５−（３−アミノアリル）−ウラシル、２’−Ｏ−アルキルリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−アミノリボヌクレオチド、２’−フルオロリボヌクレオチドおよびロックト核酸からなる群より選択される、請求項１または２に記載の単離組成物。
【請求項７４】
リン酸骨格が、ホスホナート、ホスホロチオアートおよびホスホトリエステルからなる群より選択される、請求項１または２に記載の単離組成物。
【請求項７５】
前記第一鎖の前記３’末端の前記修飾ヌクレオチド残基が、デオキシリボヌクレオチド、非環状ヌクレオチドおよび蛍光分子からなる群より選択される、請求項１または２に記載の単離組成物。
【請求項７６】
前記第一鎖の前記ヌクレオチドの少なくとも１つと、前記第二鎖の前記ヌクレオチドの少なくとも１つがミスマッチ塩基対を形成している、請求項１または２に記載の単離組成物。
【請求項７７】
前記送達ペプチドが、配列番号１〜８９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項６２に記載の単離組成物。
【請求項７８】
前記組成物が医薬組成物である、請求項１または２に記載の単離組成物。
【請求項７９】
細胞中の標的遺伝子の発現を減少させるための方法であって、参照ｄｓＲＮＡと比べて細胞中の標的遺伝子の発現を減少させるのに効果的な量の請求項１または２に記載の前記単離組成物と細胞とを接触させることを含む方法。
リボヌクレオチドおよびロックト核酸からなる群より選択される、請求項１または２に記載の単離組成物。
【請求項８１】
動物における標的遺伝子の発現を減少させるための方法であって、参照ｄｓＲＮＡと比べて動物の細胞中の標的遺伝子の発現を減少させるのに効果的な量の請求項１または２に記載の前記単離組成物で動物を治療することを含む方法。
【請求項８２】
前記単離組成物が、適当な対照ｄｓＲＮＡと比べて増強された薬物動態を有する、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記ｄｓＲＮＡが、適当な対照ｄｓＲＮＡと比べて増強された薬力学を有する、請求項８１に記載の方法。
【請求項８４】
前記ｄｓＲＮＡが、適当な対照ｄｓＲＮＡと比べて減少した毒性を有する、請求項８１に記載の方法。
【請求項８５】
前記ｄｓＲＮＡが、適当な対照ｄｓＲＮＡと比べて増強された細胞内取り込みを有する、請求項８１に記載の方法。
【請求項８６】
被検体の細胞中の標的遺伝子発現を減少させるための医薬組成物であって、参照ｄｓＲＮＡと比べて細胞中の標的遺伝子の発現を減少させるのに効果的な量の請求項１または２に記載の前記単離組成物と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項８７】
請求項１〜７８のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートを合成する方法であって、前記ｄｓＮＡを化学的または酵素的に合成することを含む方法。
【請求項８８】
請求項１〜７８のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートと、その使用説明書とを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００９年６月３日に出願された米国特許仮出願第６１／１８３，８１５号および２００９年６月３日に出願された米国特許仮出願第６１／１８３，８１８号に関連し、かつ米国特許法第１１９条（ｅ）の下、これらに対する優先権を主張するものである。上記出願の全教示が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、ペプチド−ダイサー基質コンジュゲートおよびその使用法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ペプチドアプタマーの同定は、治療用分子の安全で効率的な送達の必要性を考慮すれば重要である。ペプチドアプタマーが記載されている（Ｂｅｌｄｈｏｅｎ，２００８，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ  ９：１２７６−１３２０；Ｍｏｓｃｈｏｓら，２００７，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎ  Ｖｏｌ．３５，ｐｔ４：８０７−８１０において概説されている）。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、ペプチドとコンジュゲートされている二本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）を含有する組成物およびそれらの調製法に関する。本発明のｄｓＲＮＡは、効率的な送達および標的化のために、ならびに長い阻害効果持続時間を任意に有する効率的かつ強力な阻害剤として作用するように、ペプチドとのコンジュゲーションにより最適化された構造を有する、二本鎖ＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）およびダイサー基質ｓｉＲＮＡ（「ＤｓｉＲＮＡ」）である。
【０００５】
本発明は、送達および標的化向上のためのｄｓＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートを提供する。
【０００６】
一実施形態では、本発明は、５’末端および３’末端を有する第一のオリゴヌクレオチド鎖と５’末端および３’末端を有する第二のオリゴヌクレオチド鎖とを含み、第一鎖および第二鎖が少なくとも１６ヌクレオチド長かつ最大で５０ヌクレオチド長の長さであるオリゴヌクレオチド鎖であり、ペプチドがｄｓＲＮＡとコンジュゲートされており、かつｄｓＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートが標的と結合する、単離二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）組成物を提供する。
【０００７】
別の実施形態では、本発明は、５’末端および３’末端を有する第一のオリゴヌクレオチド鎖と５’末端および３’末端を有する第二のオリゴヌクレオチド鎖とをふくみ、第一鎖および第二鎖が少なくとも１６ヌクレオチド長かつ最大で５０ヌクレオチド長の長さであるオリゴヌクレオチド鎖であり、ペプチドがｄｓＲＮＡとコンジュゲートされており、かつｄｓＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートが標的細胞により内部に取り入れられる、単離二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）組成物を提供する。
【０００８】
一態様では、第一鎖および第二鎖は、少なくとも２５かつ最大で３５ヌクレオチド、少なくとも１９かつ最大で３５ヌクレオチド、少なくとも１９かつ最大で２４ヌクレオチド、少なくとも２５かつ最大で３０ヌクレオチド、少なくとも２６かつ最大で３０ヌクレオチドまたは少なくとも２１かつ最大で２３ヌクレオチドの長さである。
【０００９】
別の態様では、第二鎖は３’末端にオーバーハングを含む。
【００１０】
別の態様では、第一鎖は３’末端にオーバーハングを含む。
【００１１】
別の態様では、第二鎖および第一鎖の少なくとも一方が、３’末端にオーバーハングを含む。
【００１２】
別の態様では、第一および／または第二鎖の３’オーバーハングのヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドである。
【００１３】
別の態様では３’オーバーハング（１つまたは複数）は１〜５ヌクレオチド長である。
【００１４】
別の態様では、第一および第二鎖はそれぞれ、同数のヌクレオチド残基からなる。
【００１５】
別の態様では、第一鎖の５’末端の最終残基と第二鎖の３’末端の最終残基が、ミスマッチ塩基対を形成する。
【００１６】
別の態様では、第一鎖の３’末端の最終残基と第二鎖の５’末端の最終残基が、ミスマッチ塩基対を形成する。
【００１７】
別の態様では、第一鎖の５’末端の最終残基および最後から２番目の残基と、第二鎖の３’末端の最終残基および最後から２番目の残基が、２つのミスマッチ塩基対を形成する。
【００１８】
別の態様では、第一鎖の３’末端の最終残基および最後から２番目の残基と、第二鎖の５’末端の最終残基および最後から２番目の残基が、２つのミスマッチ塩基対を形成する。
【００１９】
別の態様では、ペプチドは６〜１００個のアミノ酸を含む。
【００２０】
別の態様では、ペプチドは１０〜５０個のアミノ酸を含む。
【００２１】
別の態様では、ペプチドは１５〜３０個のアミノ酸を含む。
【００２２】
別の態様では、ペプチドは１０個のアミノ酸を含む。
【００２３】
別の態様では、ｄｓＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートは受容体と結合する。
【００２４】
別の態様では、ｄｓＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートはＬＤＬ受容体ファミリーの少なくとも１つのメンバーと結合する。
【００２５】
別の態様では、ペプチドはＰＡＲリガンドである。
【００２６】
別の態様では、ペプチドはＰＡＲ１リガンドである。
【００２７】
別の態様では、ペプチドは増殖因子リガンドである。
【００２８】
別の態様では、ペプチドはインシュリンおよびインシュリン様増殖因子リガンドである。
【００２９】
別の態様では、ペプチドはＩＧＦ−１リガンドである。
【００３０】
別の態様では、ペプチドはホルモンリガンドである。
【００３１】
別の態様では、ペプチドはＰＴＨリガンドである。
【００３２】
別の態様では、ペプチドはＰＴＨ−１リガンドである。
【００３３】
別の態様では、ｄｓＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートは受容体結合タンパク質と結合する。
【００３４】
別の態様では、ペプチドは、安定なリンカーでｄｓＲＮＡとコンジュゲートされている。
【００３５】
別の態様では、安定なリンカーはホモ二官能性架橋剤を含む。
【００３６】
別の態様では、安定なリンカーはヘテロ二官能性架橋剤を含む。
【００３７】
別の態様では、安定なリンカーは三官能性架橋剤を含む。
【００３８】
別の態様では、ペプチドは、切断可能なリンカーでｄｓＲＮＡとコンジュゲートされている。
【００３９】
別の態様では、切断可能なリンカーはジスルフィドリンカーを含む。
【００４０】
別の態様では、ペプチドは、炭素リンカーでｄｓＲＮＡとコンジュゲートされている。
【００４１】
別の態様では、炭素リンカーは１８個以下の炭素を含む。
【００４２】
別の態様では、炭素リンカーは６個の炭素を含む。
【００４３】
別の態様では、ペプチドとｄｓＲＮＡは、リンカーなしでコンジュゲートされている。
【００４４】
別の態様では、ペプチドは、ｄｓＲＮＡの第一鎖の３’末端とコンジュゲートされている。
【００４５】
別の態様では、ペプチドは、ｄｓＲＮＡの第二鎖の３’末端とコンジュゲートされている。
【００４６】
別の態様では、ペプチドは、ｄｓＲＮＡの第一鎖の５’末端とコンジュゲートされている。
【００４７】
別の態様では、ペプチドは、ｄｓＲＮＡの第二鎖の５’末端とコンジュゲートされている。
【００４８】
別の態様では、ペプチドは、ｄｓＲＮＡの第一鎖の５’末端および第二鎖の５’末端とコンジュゲートされている。
【００４９】
別の態様では、ペプチドは、ｄｓＲＮＡの第一鎖の５’末端および第二鎖の３’末端とコンジュゲートされている。
【００５０】
別の態様では、ペプチドは、ｄｓＲＮＡの第一鎖の３’末端および第二鎖の３’末端とコンジュゲートされている。
【００５１】
別の態様では、ペプチドは、ｄｓＲＮＡの第一鎖の３’末端および第二鎖の前記５’末端とコンジュゲートされている。
【００５２】
別の態様では、少なくとも１つのペプチドが、ｄｓＲＮＡの第一鎖と内側でコンジュゲートされている。
【００５３】
別の態様では、少なくとも１つのペプチドが、ｄｓＲＮＡの第二鎖と内側でコンジュゲートされている。
【００５４】
別の態様では、少なくとも１つのペプチドがｄｓＲＮＡの第一鎖と内側でコンジュゲートされ、かつ少なくとも１つのペプチドがｄｓＲＮＡの第二鎖と内側でコンジュゲートされている。
【００５５】
別の態様では、少なくとも２つのペプチドがｄｓＲＮＡとコンジュゲートされている。
【００５６】
別の態様では、少なくとも２つのペプチドが同一である。
【００５７】
別の態様では、少なくとも２つのペプチドが同一ではない。
【００５８】
別の態様では、組成物は、少なくとも１つの色素分子をさらに含み、かつ色素分子は、ｄｓＲＮＡおよびペプチドの少なくとも一方とコンジュゲートされている。
【００５９】
別の態様では、色素分子は多環芳香族である。
【００６０】
別の態様では、色素は蛍光色素である。
【００６１】
別の態様では、組成物は治療剤をさらに含む。
【００６２】
別の態様では、治療剤は抗癌剤である。
【００６３】
別の態様では、抗癌剤は、パクリタキセル、タモキシフェン、シスプラチン、ドキソルビシンおよびビンブラスチンからなる群より選択される。
【００６４】
別の態様では、治療剤は代謝性疾患または障害を治療するための薬物である。
【００６５】
別の態様では、ペプチドは毒素の標的化部分の一部を含む。
【００６６】
別の態様では、神経毒はクロストリジウム神経毒である。
【００６７】
別の態様では、組成物は少なくとも１つの送達ペプチドをさらに含む。
【００６８】
別の態様では、ｄｓＲＮＡの第一オリゴヌクレオチド鎖の３’末端の最初のヌクレオチド（１位）から始めて１、２および／または３位が修飾ヌクレオチドで置換されている。
【００６９】
別の態様では、修飾ヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチドである。
【００７０】
別の態様では、第一および第二のオリゴヌクレオチド鎖の一方または両方が５’リン酸を含む。
【００７１】
別の態様では、第一または第二鎖の少なくとも１つのヌクレオチドが修飾されている。
【００７２】
別の態様では、修飾ヌクレオチド残基は、２’−Ｏ−メチル、２’−メトキシエトキシ、２’−フルオロ、２’−アリル、２’−Ｏ−［２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル］、４’−チオ、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’−架橋、４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’−架橋、２’−ＬＮＡ、２’−アミノおよび２’−Ｏ−（Ｎ−メチルカルバマートからなる群より選択される。
【００７３】
別の態様では、ｄｓＲＮＡがダイサーにより細胞内で内因的に切断される。
【００７４】
別の態様では、標的遺伝子の発現を減少させるのに十分な単離二本鎖核酸の量は、細胞の環境中で１ナノモル以下、２００ピコモル以下、１００ピコモル以下、５０ピコモル以下、２０ピコモル以下および１０ピコモル以下からなる群より選択される。
【００７５】
別の態様では、第一鎖と第二鎖が化学的リンカーにより連結されている。
【００７６】
別の態様では、第一鎖の３’末端と第二鎖の５’末端が化学的リンカーにより連結されている。
【００７７】
別の態様では、第二または第一鎖のヌクレオチドが、ダイサー切断の方向を指定する修飾ヌクレオチドで修飾されている。
【００７８】
別の態様では、単離組成物は、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、非環状ヌクレオチド、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）、２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）のヌクレオチド一リン酸、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）、および２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）のヌクレオチド一リン酸、４−チオウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル、５−（３−アミノアリル）−ウラシル、２’−Ｏ−アルキルリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−アミノリボヌクレオチド、２’−フルオロリボヌクレオチド、およびロックト核酸からなる群より選択される修飾ヌクレオチドを含む。
【００７９】
別の実施形態では、組成物は、ホスホナート、ホスホロチオアートおよびホスホトリエステルからなる群より選択されるリン酸骨格修飾を含む。
【００８０】
別の態様では、第一鎖の３’末端の修飾ヌクレオチド残基は、デオキシリボヌクレオチド、非環状ヌクレオチドおよび蛍光分子からなる群より選択される。
【００８１】
別の態様では、第一鎖の少なくとも１つのヌクレオチドと第二鎖の少なくとも１つのヌクレオチドがミスマッチ塩基対を形成する。
【００８２】
別の態様では、送達ペプチドは、配列番号１〜８９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。
【００８３】
別の態様では、組成物は医薬組成物である。
【００８４】
別の実施形態では、本発明は、細胞内での標的遺伝子発現を減少させるための方法を提供し、この方法は、参照ｄｓＲＮＡに比べて細胞内での標的遺伝子発現を減少させるのに効果的な量の本発明の単離組成物と細胞とを接触させることを含む。
【００８５】
別の実施形態では、本発明は、細胞増殖を阻害するのに十分な量の本発明の単離組成物と細胞とを接触させることを含む、細胞増殖を選択的に阻害するための方法を提供する。
【００８６】
別の実施形態では、本発明は、動物における標的遺伝子発現を減少させるための方法を提供し、この方法は、参照ｄｓＲＮＡに比べて動物細胞内での標的遺伝子発現を減少させるのに効果的な量の本発明の単離組成物で動物を治療することを含む。
【００８７】
一態様では、単離組成物は、適当な対照ｄｓＲＮＡに比べて増強された薬物動態を有する。
【００８８】
別の態様では、ｄｓＲＮＡは、適当な対照ｄｓＲＮＡに比べて増強された薬力学を有する。
【００８９】
別の態様では、ｄｓＲＮＡは、適当な対照ｄｓＲＮＡに比べて減少した毒性を有する。
【００９０】
別の態様では、ｄｓＲＮＡは、適当な対照ｄｓＲＮＡに比べて増強された細胞内取り
込みを有する。
【００９１】
別の実施形態では、本発明は、被検体の細胞内での標的遺伝子発現を減少させるための医薬組成物を提供し、この組成物は、参照ｄｓＲＮＡに比べて細胞内での標的遺伝子発現を減少させるのに効果的な量の本発明の単離組成物と薬学的に許容される担体とを含む。
【００９２】
別の実施形態では、本発明は、ｄｓＲＮＡを化学的または酵素的に合成することを含む、本発明のｄｓＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートの合成法を提供する。
【００９３】
別の実施形態では、本発明は、本発明のｄｓＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートとその使用説明書とを含むキットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１Ａ】本発明による有用なｄｓＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートの典型的な構造を表す図である。「Ｐ」＝本発明によるペプチド（Ａ−平滑末端−平滑末端）、（ＢおよびＣ−オーバーハング）、（ＤおよびＥ−非対称）および（ＦおよびＧ−ミスマッチ末端）。
【図１Ｂ】同上。
【図１Ｃ】同上。
【図１Ｄ】同上。
【図１Ｅ】同上。
【図１Ｆ】同上。
【図１Ｇ】同上。
【図２】本発明のＨＰＲＴ１−およびＫＲＡＳ−標的化ｄｓＲＮＡの典型的な配列を示す図である。下線部の残基は２’−Ｏ−メチル修飾の位置を示す。矢印はｄｓＲＮＡ内のダイサー酵素切断の予測部位を示し、破線は対応する標的ＲＮＡ配列内のＡｒｇｏｎａｕｔｅ２を介した切断の予測位置を示す。
【図３】本発明のペプチドコンジュゲートｄｓＲＮＡの典型的なペプチド配列を示す図である。ペプチドが結合した標的も記載されている。
【図４】本発明の典型的なＤｓｉＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートの模式図であり、番号２、３、５および６の各ＤｓｉＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートに関して、適切にコンジュゲートされた分子のサイズシフトがレーン２、３、５および６に示されている。模式図中の矢頭は、ＤｓｉＲＮＡおよびＤｓｉＲＮＡ−ペプチドコンジュゲート内の予測されるダイサー酵素切断部位を示す。
【図５】さらなる本発明の典型的なＤｓｉＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートの模式図であり、番号２および３のＤｓｉＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートに関して、適切にコンジュゲートされた分子のサイズシフトがレーン２および３に示されている。模式図中の矢頭は、ＤｓｉＲＮＡおよびＤｓｉＲＮＡ−ペプチドコンジュゲート内の予測されるダイサー酵素切断部位を示す。
【図６】さらなる本発明の典型的なＤｓｉＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートの模式図であり、番号２、３、４および５の各ＤｓｉＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートに関して、適切にコンジュゲートされた分子のサイズシフトがレーン２、３、４および５に示されている。模式図中の矢頭は、ＤｓｉＲＮＡおよびＤｓｉＲＮＡ−ペプチドコンジュゲート内の予測されるダイサー酵素切断部位を示す。
【図７】切断可能なペプチドコンジュゲートを含めた本発明の典型的なＤｓｉＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートの模式図であり、番号２、３、４および５の各ＤｓｉＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートに関して、適切にコンジュゲートされた分子のサイズシフトがレーン２、３、４および５に示されている。模式図中の矢頭は、ＤｓｉＲＮＡおよびＤｓｉＲＮＡ−ペプチドコンジュゲート内の予測されるダイサー酵素切断部位を示す。
【図８】本発明の典型的なＤｓｉＲＮＡ−環状ペプチドコンジュゲートの模式図であり、番号２のＤｓｉＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートに関して、適切にコンジュゲートされた分子を示すサイズシフトがレーン２に示されている。模式図中の矢頭は、ＤｓｉＲＮＡおよびＤｓｉＲＮＡ−ペプチドコンジュゲート内の予測されるダイサー酵素切断部位を示す。
【図９】本発明の典型的なＤｓｉＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートの模式図であり、ＤｓｉＲＮＡおよびＤｓｉＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートの両方に関するダイサープロセシングアッセイの結果を示す。
【図１０】トランスフェクトされたＤｓｉＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートが、インビトロでの効力を保持する効率的な遺伝子サイレンシング剤であったことを示すヒストグラムのデータを表す図である。トランスフェクションアッセイはＨｅＬａ細胞で行った。
【図１１】典型的なＤｓｉＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートの血清安定性を示す図であり、半減期が示されている。
【図１２】典型的なＤｓｉＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートが、トランスフェクション媒体の非存在下、インビトロでの標的遺伝子サイレンシング効果を示したことを示すヒストグラムのデータを表す図であり、ＤｓｉＲＮＡ−ペプチドコンジュゲート濃度の増加により送達の向上が観察された。アッセイはＨｅＬａ細胞で行った。
【図１３】典型的なＤｓｉＲＮＡおよびＤｓｉＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートが、トランスフェクション媒体の非存在下、インビトロでＨｅｐＧ２細胞内の標的遺伝子をノックダウンしたことを示すヒストグラムのデータを表す図である。ＤｓｉＲＮＡ、ＤｓｉＲＮＡ−ペプチドおよびペプチドは５μＭの濃度で投与した。
【図１４】典型的なＤｓｉＲＮＡおよびＤｓｉＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートが、トランスフェクション媒体の非存在下、インビトロでＨｅｐＧ２細胞内の標的遺伝子をノックダウンしたことを示すＩＣ５０曲線のデータを表す図である。試験薬剤の模式図も示す。
【発明を実施するための形態】
【００９５】
本発明は、標的へのｄｓＲＮＡの送達および／または生体内分布あるいは標的化を増強する、ならびにさらなる機能性を追加する、ならびに／あるいは例えば、そのような薬剤の薬物動態または薬力学を、本明細書に記載のペプチドを含まないｄｓＲＮＡ分子に比べて増強することができるペプチドを含む二本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）を含有する組成物に関する。本発明はまた、インビボまたはインビトロで遺伝子のレベルおよび／または発現を減少させることができるペプチドを含むｄｓＲＮＡの調製法にも関する。
【００９６】
本発明は、新規ｄｓＲＮＡペプチドコンジュゲートを提供する。
【００９７】
本発明はまた、特定組織に対してｄｓＲＮＡを標的化するための新規ｄｓＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートも提供する。本明細書に記載のペプチドによる標的化は、標的化ペプチドが、対象とする組織または腫瘍上の表面マーカーと高度に特異的に結合することを介して生じる。ペプチドのこの結合特異性により、当該技術分野で公知のｄｓＲＮＡ標的化の方法または薬剤に有利な高度に特異的、選択的かつ効率的な方法で、ｄｓＲＮＡを標的に対して標的化する能力の増大が本発明のｄｓＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートにもたらされる。
【００９８】
本発明は以下の利点をもたらす。本発明は、本発明のｄｓＲＮＡの送達を増強する送達ペプチドを提供する。本発明は、ほぼ中性または中性である送達ペプチドを提供する。例えば、陽イオン性ペプチドとコンジュゲートされた核酸。ＴＡＴ（Ｔａｔ４８−６０）、ペネトラチン（Ａｎｔｐ４３−５８、オリゴアルギニン（Ｒ８、Ｒ９）など）が当該技術分野で公知である。中性またはほぼ中性である本発明のペプチドとは異なり、陽イオン性ペプチドコンジュゲーションは、核酸の多価陰イオン性により特にｄｓＲＮＡコンジュゲーションには不利である。
【００９９】
本発明のペプチドはまた、当該技術分野で公知のペプチドよりも有利であるが、それは、ダイサー酵素が本発明のｄｓＲＮＡ−ペプチドをプロセシングして、ＲＩＳＣ経路におけるプロセシングに適したｓｉＲＮＡ分子を生じるため、本明細書に記載のペプチドを、切断可能なリンカーを介してｄｓＲＮＡと連結する必要はなく、安定なリンカーを介してｄｓＲＮＡとコンジュゲートすることができるからである。このことは、安定なリンカーの向上した安定性により、医薬組成物に特に有利である（切断可能なリンカーは、製造および／または保管中に切断されてその機能を喪失する場合がある）。
【０１００】
定義
本発明は、細胞内での標的遺伝子発現を減少させるための向上した組成物および方法を提供し、細胞内での標的遺伝子発現を減少させるのに効果的な量の単離ｄｓＲＮＡと標的とを接触させることを含む。本発明のｄｓＲＮＡ分子は、本明細書中で定義されるようにｄｓＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートを提供するためペプチドを含む。このペプチドは、あるパターンの修飾ヌクレオチドを含有しない、対応する長さのｄｓＲＮＡ剤と比べて、標的ＲＮＡへのｄｓＲＮＡの送達および／または生体内分布または標的化を増強し、かつ機能性、例えば、薬物動態または薬力学をさらに追加する。
【０１０１】
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明の属する分野の当業者により一般的に理解されている意味を有する。以下の参考文献は、本発明において使用される数多くの用語の一般的定義を当業者に提供する：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（第２版，１９９４）；Ｔｈｅ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ編，１９８８）；Ｔｈｅ  Ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，第５版，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒら（編），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）；およびＨａｌｅ  ＆  Ｍａｒｈａｍ，Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）。本明細書で使用される場合、以下の用語は、別途明記されない限り、以下でそれらのものとされる意味を有する。
【０１０２】
本発明は、本発明による１つ以上のペプチドとコンジュゲートされた１つ以上のｄｓＲＮＡ分子、およびこれらのｄｓＲＮＡ分子を用いて対象とするＲＮＡまたはコードされたタンパク質のレベルを調節する方法に関する。
【０１０３】
本発明のｄｓＲＮＡ−ペプチドは、ダイサーにより切断することができ、かつ標的ＲＮＡの発現を阻害することができる。
【０１０４】
本明細書で使用される「ペプチド」は、「送達ペプチド」および「標的化ペプチド」を包含する。
【０１０５】
本明細書で使用される「ペプチド」は、直鎖ペプチド、分岐ペプチドまたは環状ペプチドを意味する。
【０１０６】
本発明はさらに、所望の標的、例えば、細胞または細胞上もしくは細胞内受容体、所望の標的組織あるいは所望の標的細胞へｄｓＲＮＡを運搬するためのペプチドの使用に関する。
【０１０７】
本発明に従えば、所望の部位は、例えば、非限定的に脳、副腎または脳外のその他の部位（例えば、頭蓋外部位）、例えば腎臓、肝臓、膵臓、心臓、脾臓、胃腸（ＧＩ）管（例えば、胃、腸、結腸）、眼、肺、皮膚、脂肪、筋肉、リンパ節、骨髄、泌尿および生殖器系（卵巣、乳房、精巣、前立腺）、胎盤、血液細胞などならびにそれらの組合せであり得る。したがって、所望の標的部位は、脳、脳外の副腎またはその他の部位（例えば、頭蓋外部位）、例えば腎臓、肝臓、膵臓、心臓、脾臓、胃腸（ＧＩ）管（例えば、胃、腸、結腸）、眼、肺、皮膚、脂肪、筋肉、リンパ節、骨髄、泌尿および生殖器系（卵巣、乳房、精巣、前立腺）、胎盤、血液細胞などならびにそれらの組合せからなる群より選択される１つ以上の部位であり得る。
【０１０８】
「標的細胞」は、本明細書で定義される任意の細胞、例えば、脳、副腎または脳外のその他の部位（例えば、頭蓋外部位）、例えば腎臓、肝臓、膵臓、心臓、脾臓、胃腸（ＧＩ）管（例えば、胃、腸、結腸）、眼、肺、皮膚、脂肪、筋肉、リンパ節、骨髄、泌尿および生殖器系（卵巣、乳房、精巣、前立腺）、胎盤、血液細胞などならびにそれらの組合せを含むがこれらに限定されない、任意の器官に由来するか、またはそこに存在する細胞であり得る。
【０１０９】
本明細書で使用される「送達ペプチド」は、中性または実質的に中性であるペプチドを意味する。「実質的に中性」は、＋５以下、例えば、＋５、＋４、＋３、＋２、＋１またはゼロの正味荷電をもつことを意味する。
【０１１０】
本発明による「正味荷電」は、当該技術分野で公知の方法により決定される。例えば、本明細書で定義される正味荷電は、陽イオン性アミノ酸（リジン、アルギニン、ヒスチジン）の総数と陰イオン性アミノ酸（アスパラギン酸およびグルタミン酸）の総数の正味荷電を得ることにより決定される。
【０１１１】
本明細書で使用される「送達ペプチド」は、ペプチドが約＋５以下（例えば、＋５、＋４、＋３、＋２、＋１またはゼロ）の正味荷電をもつ少なくとも６個のアミノ酸を意味する。一態様では、ペプチドは６〜１００個のアミノ酸、例えば、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００個のアミノ酸であり、かつ約＋５以下の正味荷電をもつ。別の実施形態では、ペプチドは１０〜５０個のアミノ酸（例えば、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０個のアミノ酸）であり、かつ約＋５以下の正味荷電をもつ。別の実施形態では、ペプチドは１５〜３０個のアミノ酸（例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０個のアミノ酸）であり、かつ約＋５以下の正味荷電をもつ。
【０１１２】
本発明による「送達ペプチド」は、少なくとも６個のアミノ酸であり、かつ中性ペプチドであるペプチドを包含する。一態様では、ペプチドは６〜１００個のアミノ酸、例えば、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００個のアミノ酸であり、かつ正味荷電をもたない。別の実施形態では、ペプチドは１０〜５０個のアミノ酸（例えば、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０個のアミノ酸）であり、かつ正味荷電をもたない。別の実施形態では、ペプチドは１５〜３０個のアミノ酸（例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０個のアミノ酸）であり、かつ正味荷電をもたない。
【０１１３】
本発明による「送達ペプチド」はまた、少なくとも６個かつ１９個以下のアミノ酸であり、約＋５以下（例えば、＋５、＋４、＋３、＋２、＋１またはゼロ）の正味荷電をもつペプチドも意味する。
【０１１４】
本明細書で使用される「送達ペプチド」は、ペプチドが約＋５以下（例えば、＋５、＋４、＋３、＋２、＋１またはゼロ）の正味荷電をもち、かつペプチドが少なくとも１つの陰イオン性アミノ酸を有する、少なくとも６個のアミノ酸を意味する。一態様では、ペプチドは６〜１００個のアミノ酸、例えば、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００個のアミノ酸であり、かつ約＋４以下の正味荷電をもつ。別の実施形態では、ペプチドは１０〜５０個のアミノ酸（例えば、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０個のアミノ酸）であり、かつ約＋５以下の正味荷電をもつ。別の実施形態では、ペプチドは１５〜３０個のアミノ酸（例えば。１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０個のアミノ酸）であり、かつ約＋５以下の正味荷電をもつ。
【０１１５】
本明細書で使用される「少なくとも１つの陰イオン性アミノ酸」は、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）のうちの少なくとも１つを意味する。例えば、Ｘが任意のアミノ酸であるＸＸＸＥＸＸまたはＸＸＸＤＸＸまたはＸＸＤＸＥＸＸまたはＸＸＸＥＤＸＸにおいて、ペプチドは＋５以下の正味荷電をもつ。
【０１１６】
正味荷電をもたないペプチドは「中性ペプチド」を意味する。
【０１１７】
本明細書で使用される「中性ペプチド」は、中性ｐＨ（例えば、ｐＨ６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４または８．５）において約ゼロである正味荷電をもつ。
【０１１８】
「中性ペプチド」はまた、中性ｐＨにおいて約ゼロである正味荷電をもつ、および／または約ｐＨ７（例えば、ｐＨ６．６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４または８．５）の等電点（ｐＩ）をもつペプチドも包含する。
【０１１９】
正荷電アミノ酸はリジン（Ｌｙｓ、Ｋ）、アルギニン（Ａｒｇ，Ｒ）およびヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）である。負荷電アミノ酸はアスパラギン酸またはアスパラギン酸塩（Ａｓｐ、Ｄ）、グルタミン酸またはグルタミン酸塩（Ｇｌｕ、Ｅ）である。（参考文献：Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第３版，２０００，Ｄａｖｉｄ  Ｌ．ＮｅｌｓｏｎおよびＭｉｃｈａｅｌ  Ｍ．Ｃｏｘ編，Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）。
【０１２０】
本発明による「送達ペプチド」は、本発明のｄｓＲＮＡとコンジュゲートされている場合に、ｄｓＲＮＡを適切な標的ＲＮＡまで送達することができるアミノ酸配列である。
【０１２１】
「送達ペプチド」はまた、ｄｓＲＮＡがペプチドとコンジュゲートされている場合に、細胞膜を横断してｄｓＲＮＡを輸送することができるアミノ酸配列も意味する。
【０１２２】
本発明による有用な「送達ペプチド」は、ペプチドがｄｓＲＮＡとコンジュゲートされている場合、ペプチドとコンジュゲートされていないｄｓＲＮＡと比べて、標的細胞へのｄｓＲＮＡの内部移行を増加させる。
【０１２３】
本発明による有用な「送達ペプチド」は、ペプチドがｄｓＲＮＡとコンジュゲートされている場合、ペプチドとコンジュゲートされていないｄｓＲＮＡと比べて、標的ＲＮＡへのｄｓＲＮＡの送達を増加させる。
【０１２４】
本明細書で使用される「増加させる（する）」は、標的ＲＮＡへのペプチド−ｄｓＲＮＡの送達が、ペプチドとコンジュゲートされていないｄｓＲＮＡの送達の１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、４０、３５、４０、４５、５０、１００、１０００または１０，０００倍以上多いことを意味する。
【０１２５】
本明細書で使用される「増加させる（する）」は、標的へのペプチド−ｄｓＲＮＡの送達が、ペプチドとコンジュゲートされていないｄｓＲＮＡの送達よりも１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９９または１００％多いことを意味する。
【０１２６】
ｄｓＲＮＡ、ペプチドまたはｄｓＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートの「送達」は、後述の内部移行または取り込みアッセイにより評価される。
【０１２７】
別の実施形態では、本明細書で使用される「ペプチド」は、６〜１００個のアミノ酸、例えば、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００個のアミノ酸であり、かつ標的細胞と結合する「標的化ペプチド」を意味する。
【０１２８】
本発明による「標的化ペプチド」は、本明細書で定義されるようにｄｓＲＮＡとコンジュゲートされている場合に、標的または結合部位と特異的に結合する。
【０１２９】
本明細書で使用される「特異的に結合する」は、対象とする受容体への水素結合または静電引力を介することを意味する。
【０１３０】
一態様では、標的は受容体または受容体結合タンパク質である。
【０１３１】
一態様では、標的または結合部位または受容体は、細胞表面上にある。
【０１３２】
別の態様では、標的または結合部位または受容体は、内部、例えば細胞内（例えば、細胞質中、核内または核表面上）にある。
【０１３３】
別の態様では、標的または結合部位または受容体は、溶液中で裸である。
【０１３４】
「特異的結合」は、当該技術分野で公知のおよび本明細書で定義される結合アッセイにより判定される（例えば、米国特許出願公開第２００８００６４０９２号および同第２００９００４１７４号を参照されたい）。一実施形態では、特異的結合は、すべての受容体を一混合物中に存在させて、ｄｓＲＮＡ−送達ペプチドと所定の対応する受容体との結合を、ｄｓＲＮＡと他の受容体との結合と比較することにより判定される。本明細書で定義される、他の受容体と比較した所定の受容体との結合の増加は、特異的結合を示すものである。
【０１３５】
一実施形態では、特異的結合は、すべての細胞を一混合物中に存在させて、ｄｓＲＮＡ−送達ペプチドと所定の細胞との結合を、ｄｓＲＮＡと他の細胞との結合と比較することにより判定される。本明細書で定義される、他の細胞と比較した所定の細胞との結合の増加は、特異的結合を示すものである。
【０１３６】
「特異的結合」は、ｄｓＲＮＡ−ペプチドと溶液中の裸の受容体との結合を判定することによりインビトロで、またはｄｓＲＮＡ−ペプチドと細胞との結合を判定することによりインビボで判定される。
【０１３７】
本明細書で使用される「受容体」は、細胞表面受容体、溶液中の裸の受容体および細胞内部、例えば細胞質、核中または核表面上にある受容体を包含する。
【０１３８】
本明細書で使用される「受容体結合タンパク質」は意味する。
【０１３９】
本明細書で使用される「標的化ペプチド」は、ｄｓＲＮＡとコンジュゲートされている場合に細胞膜を横断すること、本発明によるｄｓＲＮＡとコンジュゲートされている場合に細胞膜を横断してｄｓＲＮＡを輸送すること、およびｄｓＲＮＡとコンジュゲートされている場合にリガンドに対する受容体、例えば細胞表面受容体と結合することのうち少なくとも１つのことが可能である。
【０１４０】
一態様では、「標的化ペプチド」は、転移ドメインまたはその一部、例えば神経毒の転移ドメインとコンジュゲートされている。
【０１４１】
本明細書で使用される転移ドメインは、タンパク質の透過および／または内部移行を促進するアミノ酸配列を指す。
【０１４２】
本明細書で使用される「その一部」は、記載された機能、例えば、細胞内移行の指示または細胞表面結合、例えば本明細書で定義されるような細胞表面受容体結合の促進を維持するのに十分なアミノ酸配列を意味する。「その一部」はまた、完全なアミノ酸配列の１％以上、例えば、１、５、１０、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または９９％も意味する。
【０１４３】
一態様では、標的化ペプチドは内部移行（例えば、直接的な透過による、またはエンドソーム形成を必要とし、受容体介在性エンドサイトーシスとも呼ばれるエンドサイトーシス経路による）が可能である。
【０１４４】
ｄｓＲＮＡ、ペプチドまたはｄｓＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートの「結合」は、リガンド結合アッセイにより評価される。
【０１４５】
一実施形態では、対応する受容体に対するペプチドまたはｄｓＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートの結合親和性は、約１００μＭである。別の実施形態では、対応する受容体に対するペプチドまたはｄｓＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートの結合親和性は、約１μＭである。別の実施形態では、対応する受容体に対するペプチドまたはｄｓＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートの結合親和性は、約１００ｎＭである。別の実施形態では、対応する受容体に対するペプチドまたはｄｓＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートの結合親和性は、約１０ｎＭである。別の実施形態では、対応する受容体に対するペプチドまたはｄｓＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートの結合親和性は、約５ｎＭである。別の実施形態では、対応する受容体に対するペプチドまたはｄｓＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートの結合親和性は、約１ｎＭである。別の実施形態では、対応する受容体に対するペプチドまたはｄｓＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートの結合親和性は、約０．１ｎＭ以下である（Ｇａｕｇｕｉｎら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００８；２８３：２６０４−２６１３；Ｇｒｕｐｐｉｎｇら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １９９７；１３８（１０）：４０６４−４０６８；ならびにＳｔｏｎｅ，ＣｈｅｒｖｉｎおよびＫｒａｎｚ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２００９；１２６（２）：１６５−７６）。
【０１４６】
一実施形態では、「標的化ペプチド」は、標的細胞と結合する６〜１００個のアミノ酸、例えば、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００個のアミノ酸を意味し、かつそれは対象とするアミノ酸配列、例えば標的ペプチドのアミノ酸配列の一部を含む。
【０１４７】
本発明による有用なペプチドは、ペプチドがｄｓＲＮＡとコンジュゲートされている場合、ペプチドとコンジュゲートされていないｄｓＲＮＡと比べて、細胞に対するｄｓＲＮＡの標的化を増大させる。
【０１４８】
本明細書で使用される「増大（増加）させる」は、細胞に対するペプチド−ｄｓＲＮＡコンジュゲートの標的化が、ペプチドとコンジュゲートされていないｄｓＲＮＡの標的化の１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、４０、３５、４０、４５、５０、１００、１０００または１０，０００倍以上高いことを意味する。
【０１４９】
本明細書で使用される「増大（増加）させる」は、細胞に対するペプチド−ｄｓＲＮＡコンジュゲートの標的化が、ペプチドとコンジュゲートされていないｄｓＲＮＡの標的化よりも１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９９または１００％高いことを意味する。
【０１５０】
本明細書で使用される「増大（増加）させる」は、以下に定義されるような細胞に対するペプチド−ｄｓＲＮＡコンジュゲートの標的化が、ペプチドとコンジュゲートされていない、後述のアッセイでのＩＣ５０により判定される同レベルの結合、会合または内部移行を達成するために必要とされる、同一のｄｓＲＮＡの量または用量と比べて、より少ないｄｓＲＮＡ（低用量のｄｓＲＮＡ）を必要とすることを意味する。例えば、インビボまたはインビトロで測定される、ＲＮＡ／遺伝子発現の５０％減少を達成するために必要なｄｓＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートのＩＣ５０は、ペプチドとコンジュゲートされていない同一のｄｓＲＮＡと比べて減少している（例えば、Ｈｅｆｎｅｒら，Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｔｅｃｈ．２００８  Ｓｅｐ：１９（４）２３１−２３７；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ．２００６  Ｍａｙ  ４：４４１（７０８９）：１１１−１１４；Ｄｕｒｃａｎら，Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ．２００８  Ｊｕｌ−Ａｕｇ；５（４）：５５９−５６６；Ｈｅｉｄｅｌら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２００７  Ａｐｒ  ３：１０４（１４）：５７１５−５７２１を参照されたい）。
【０１５１】
本明細書で使用される「減少している」は、ｄｓＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートのＩＣ５０が、ペプチドとコンジュゲートされていない同一のｄｓＲＮＡのＩＣ５０の１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、４０、３５、４０、４５、５０、１００、１０００または１０，０００倍以上低いことを意味する。
【０１５２】
本明細書で使用される「減少した」は、ｄｓＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートのＩＣ５０が、ペプチドとコンジュゲートされていない同一のｄｓＲＮＡのＩＣ５０の１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９９または１００％低いことを意味する。
【０１５３】
一実施形態では、結合係数Ｋｄにより表される、ｄｓＲＮＡ単独と比べたｄｓＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートの標的化の増加は約２５％である。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡ単独と比べたｄｓＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートの標的化の増加は約１００％である、すなわち、ｄｓＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートは、ｄｓＲＮＡ単独と比べて約２倍の結合親和性増加（すなわち、Ｋｄの減少）を示す。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートは、ｄｓＲＮＡ単独と比べて約５倍の結合親和性増加を示す。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートは、ｄｓｉＲＮＡ単独と比べて約１０倍の結合親和性増加を示す。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートは、ｄｓＲＮＡ単独と比べて約１００倍の結合親和性増加を示す。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートは、ｄｓＲＮＡ単独と比べて約１，０００倍以上の結合親和性増加を示す。
【０１５４】
「結合」は、当該技術分野で公知のまたは本明細書で定義される結合アッセイにより判定される。一実施形態では、結合は、ｄｓＲＮＡ−送達ペプチドと所定の受容体との結合を判定することにより判定される。
【０１５５】
別の実施形態では、結合は、すべての細胞を一混合物中に存在させて、ｄｓＲＮＡ−送達ペプチドと所定の細胞との結合を判定することにより判定される。
【０１５６】
「結合」は、ｄｓＲＮＡ−ペプチドと溶液中の裸の受容体との結合を判定することによりインビトロで、またはｄｓＲＮＡ−ペプチドと細胞との結合を判定することによりインビボで判定される。
【０１５７】
本明細書で使用される「標的化」は、受容体の混合物中において、ｄｓＲＮＡペプチドコンジュゲートが別の受容体と比べて、対象とする受容体と優先的または特異的に結合または会合または内部移行することを意味する。本明細書で使用される「標的化」は、細胞の混合物中において、ｄｓＲＮＡペプチドコンジュゲートが細胞上の別の受容体と比べて、細胞上の対象とする受容体と優先的または特異的に結合または会合または内部移行することを意味する。本明細書で使用される「標的化」は、細胞の混合物中において、ｄｓＲＮＡペプチドコンジュゲートが別の細胞と比べて、ある細胞と優先的または特異的に結合または会合または内部移行することを意味する。すなわち、本発明による「標的化」は、インビトロおよびインビボの両方で判定または測定される。
【０１５８】
「標的化」はまた、細胞上の適切な結合部位への本発明の「ペプチド」の輸送または送達を意味し、例えば、ペプチドがリガンドである場合、標的化は、そのリガンドに対する適切な受容体、結合または接着タンパク質へのペプチドの送達を意味する。
【０１５９】
本発明によるペプチドは、本発明のｄｓＲＮＡの第一鎖の５’もしくは３’末端または第二鎖の５’もしくは３’末端と、あるいは第一鎖の５’末端および第二鎖の５’末端と、第一鎖の５’末端および第二鎖の３’末端と、第一鎖の３’末端および第二鎖の５’末端と、あるいは第一鎖の３’末端および第二鎖の３’末端と結合し得る。
【０１６０】
本発明によるペプチドはまた、例えば、アミノ酸残基上の特定の官能基（例えば、Ｃｙｓ上の−ＳＨ基またはＬｙｓ上のアミノ基）を介して、第一および／または第二鎖と内部でも結合し得る。
【０１６１】
一態様では、２つ以上のペプチド、例えば、二量体、三量体または多数のペプチドがｄｓＲＮＡと結合している。
【０１６２】
本明細書で使用される「二量体」は、任意の構造的配向で、例えば、カルボキシ末端およびアミノ末端を介して直線的に、または各ペプチドのアミノ酸の間の共有結合を介して並行に互いにコンジュゲートされ、かつ２つのペプチドのうちの１つがｄｓＲＮＡともコンジュゲートされている２つペプチドを意味する。二量体はまた、各ペプチドがｄｓＲＮＡ上の固有の部位とコンジュゲートされている２つのペプチドも意味する。
【０１６３】
本明細書で使用される「三量体」は、互いにコンジュゲートされ、３つのペプチドのうちの１つがｄｓＲＮＡとコンジュゲートされている３つペプチドを意味する。三量体はまた、各ペプチドがｄｓＲＮＡ上の固有の部位とコンジュゲートされている３つのペプチドも意味する。三量体はまた、３つのペプチドのうちの２つが互いにコンジュゲートされ、その２つのペプチドのうちの１つがｄｓＲＮＡともコンジュゲートされ、かつ第三のペプチドがｄｓＲＮＡ上の固有の部位とコンジュゲートされている３つのペプチドも意味する。
【０１６４】
本明細書で使用される「多数」は、２つ以上のペプチド、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれを超えるペプチドを意味する。本発明は、ペプチドが同じまたは異なる配列である複数のペプチドとコンジュゲートされたｄｓＲＮＡを提供する。一実施形態では、多数のペプチドは、１つ以上の送達ペプチドおよび１つ以上の標的化ペプチドを意味する。
【０１６５】
「ペプチド」という用語は、互いにペプチド結合した限られた数の隣接するアミノ酸を包含し、またペプチドが天然に存在する分子または合成物（すなわち、天然に存在する分子またはその化学的／物理的に修飾されたバリアント）のいずれであるかにかかわらず、ペプチド標的、例えば、細胞または細胞上の受容体へのｄｓＲＮＡの送達および／またはそれとの結合が可能である、本明細書で定義されるような標的化または送達ペプチドを含む。
【０１６６】
本明細書で使用される「ペプチド」は、天然に存在するタンパク質に由来し得る。
【０１６７】
本明細書で使用される「ペプチド」は、異なるタンパク質ドメインを含み得る（例えば、キメラペプチド）。
【０１６８】
本明細書で使用される「ペプチド」は、特定のアミノ酸配列の構造機能関係に基づいて設計された合成ペプチドであってよく、必ずしも天然配列と相同性を有するとは限らない。
【０１６９】
本発明のペプチドは本発明のｄｓＲＮＡとコンジュゲートされている。
【０１７０】
本明細書で使用される「コンジュゲートされている」は、当該技術分野で公知の任意の共有または非共有結合を介して結合していることを意味する。
【０１７１】
本発明のペプチドは、ペプチド中の任意のアミノ酸残基を介して、例えば、Ｃ末端のＣ末端アミノ酸がＣ末端アミノ酸のカルボキシル基を介して、もしくはＮ末端のＮ末端アミノ酸がＮ末端アミノ酸のα−アミノ基を介して本発明のｄｓＲＮＡと、またはアミノ酸残基上の特定の官能基（例えば、Ｃｙｓ上の−ＳＨ基またはＬｙｓ上のアミノ基）とコンジュゲートされ得る。
【０１７２】
本発明のペプチドは、ペプチド配列内部の任意のアミノ酸残基を介して、例えば、ペプチド配列中間部のリジン残基のアミノ基を介して、本発明のｄｓＲＮＡとコンジュゲートされ得る。
【０１７３】
本発明のペプチドは、ゼロ距離リンカー、ホモ二官能性リンカー、ヘテロ二官能性リンカーまたは三官能性リンカーを含むがこれらに限定されない安定な共有結合を介して、本発明のｄｓＲＮＡとコンジュゲートされ得る（参考文献：Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９６．Ｇｒｅｇ  Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．；Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ，１９９１．Ｓｈａｎ  Ｓ．Ｗｏｎｇ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ）。
【０１７４】
本明細書で使用される「ゼロ距離リンカー」は、反応物（例えば、ｄｓＲＮＡ上の反応基と、アミノ酸側鎖上の反応基、末端アミノ酸残基の遊離アミノおよびカルボキシル基のようなペプチド上の官能基など）が凝縮してリンカーなしでコンジュゲート分子を形成する反応によるコンジュゲーションを意味する。「ゼロ距離リンカー」は、例えば、ペプチドの末端反応物をｄｓＲＮＡの末端反応物と反応させることにより形成される。ゼロ距離リンカーの例としては、ジスルフィド、アミド、エステル、チオエステルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７５】
本明細書で使用される「ホモ二官能性リンカー」は、２つの同様な官能基を有するリンカーによるコンジュゲーションを意味する。ホモ二官能性リンカーの例としては、アミノ指向性、カルボキシル指向性、スルフィドリル指向性などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７６】
本明細書で使用される「ヘテロ二官能性リンカー」は、異なる特異性の２つの異なる官能基を有するリンカーによるコンジュゲーションを意味する。ヘテロ二官能性リンカーの例としては、アミノおよびスルフィドリル指向性、アミノおよびカルボキシル指向性、カルボキシルおよびスルフィドリル指向性などの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７７】
本明細書で使用される「三官能性リンカー」は、３つの反応性官能基を有するリンカーによるコンジュゲーションを意味する。三官能性リンカーの例としては、４−アジド−２−ニトロフェニルビオシチン−４−ニトロフェニルエステル（ＡＢＮＰ）、スルホスクシンイミジル−２−［６−（ビオチンアミド）−２−（ｐ−アジドベンズアミド）ヘキサノアミド］エチル−１，３’−ジチオプロピオナート（スルホ−ＳＢＥＤ）、その他のビオシチン系分子などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７８】
本発明によるペプチドはまた、限定されるわけではないがジスルフィド、エステル、グリコール、ジアゾおよびスルホンリンカーを含めた切断可能なリンカーを介して、ｄｓＲＮＡとコンジュゲートされ得る。
【０１７９】
本発明によるペプチドは、炭素リンカー、例えば、１個以上の炭素、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５個またはそれを超える炭素である炭素リンカーによりｄｓＲＮＡとコンジュゲートされ得る。
【０１８０】
本発明によるペプチドは、補欠分子族を用いてｄｓＲＮＡとコンジュゲートされ得る。補欠分子族としては、金属イオン、ポルフィリン類、補酵素およびその他の非ペプチジル部分、例えば炭水化物またはオリゴ糖が挙げられるが、これらに限定されない（Ｗｏｎｇ，Ｓ．Ｓ．（１９９１），Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ）。
【０１８１】
一実施形態では、ペプチドとｄｓＲＮＡは、融合構築物として発現することによりコンジュゲートされ得る。
【０１８２】
「ペプチド」は、当業者に公知である任意の従来の化学コンジュゲーション技術によりｄｓＲＮＡと結合され得る。これに関しては、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（１９９６），Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  ＰｒｅｓｓおよびＷｏｎｇ，Ｓ．Ｓ．（１９９１），Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓを参照する。
【０１８３】
「ペプチド」は、イオン相互作用を介してｄｓＲＮＡと非共有結合的にコンジュゲートされ得る。
【０１８４】
本明細書で使用される「ペプチド−ｄｓＲＮＡコンジュゲート」は、限定されるわけではないが本明細書に記載の結合／コンジュゲーショ法を含めた方法により、ｄｓＲＮＡとコンジュゲートされたペプチドを意味する。
【０１８５】
一態様では、ペプチド−ｄｓＲＮＡコンジュゲートは、１つ以上の色素分子をさらに含む。
【０１８６】
本明細書で使用される「色素分子」としては、多環芳香族色素または蛍光色素、例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）（例えば、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７など）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８７】
一態様では、ペプチド−ｄｓＲＮＡコンジュゲートは、本明細書で定義される送達ペプチドをさらに含む。
【０１８８】
一態様では、ペプチド−ｄｓＲＮＡコンジュゲートは、治療剤、例えば、抗癌剤または代謝性疾患もしくは障害を治療する薬剤をさらに含む。抗癌剤としては、抗ウイルス剤（Ｆｉｕｍｅら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９８３；１５３（１）：６−１０）、シスプラチン（Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ  Ｓら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．２００８；１９（１）：３９−４９）、ドキソルビシン（Ｇｕａｎ  Ｈら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．２００８；１９（９）：１８１３−２１）、パクリタキセル（Ｄｕｂｉｋｏｖｓｋａｙａ  ＥＡら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２００８；１０５（３４）：１２１２８−３３，Ｒｅｇｉｎａ（「ｅ」にウムラウトあり）Ａら，Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００８；１５５（２）：１８５−９７）、タモキシフェン（Ｒｉｃｋｅｒｔら，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２００７；８（１１）：３６０８−３６１２）およびビンブラスチン（ＤｅＦｅｏ−Ｊｏｎｅｓ  Ｄら，Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．２００２；１（７）：４５１−４５９）が挙げられるが、これらに限定されない。ペプチド−ｄｓＲＮＡコンジュゲートと共に治療剤を含む組成物は、分子量、モルベースでまたは実際の重量ベースで、薬剤／コンジュゲートをそれぞれ１：１０，０００〜１：１〜１０，０００：１；例えば、１：５０００〜５０００：１、１：１０００〜１０００：１、１：１００〜１００：１、１：１０〜１０：１の比で含み得る。
【０１８９】
「ペプチド−ｄｓＲＮＡコンジュゲート」は、前記ペプチドおよび前記ｄｓＲＮＡが共にその機能を保持している分子を指す。
【０１９０】
本明細書で使用される「減少している」、例えば、ｄｓＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートの作用発現の減少またはｄｓＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートの送達速度の減少は、ペプチドとコンジュゲートされていない同一のｄｓＲＮＡの作用発現または送達速度の１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、４０、３５、４０、４５、５０、１００、１０００または１０，０００倍以上低いことを意味する。
【０１９１】
本明細書で使用される「減少している」、例えば、ｄｓＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートの作用発現の減少またはｄｓＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートの送達速度の減少は、ペプチドとコンジュゲートされていない同一のｄｓＲＮＡの作用発現または送達速度よりも１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９９または１００％低いことを意味する。
【０１９２】
本明細書で使用される「作用発現」は、インビトロ（例えば、細胞へまたは組織培地への）またはインビボ（例えば、ヒトまたは動物（例えば、マウスまたはラット）被検体への）でのｄｓＲＮＡの投与と、標的ＲＮＡへのｄｓＲＮＡの到達との間の時間を意味する。
【０１９３】
本明細書で使用される「送達速度」は、ｄｓＲＮＡの投与後にｄｓＲＮＡが標的ＲＮＡに到達するのに必要な時間を意味する。
【０１９４】
本明細書で使用される「作用持続時間」は、ｄｓＲＮＡが標的ＲＮＡの発現を阻害する間の時間を意味する。
【０１９５】
本明細書で使用される「対照」または「参照」、例えば対照ｄｓＲＮＡは、特定の標的ＲＮＡに対して特異的なｄｓＲＮＡ（試験ｄｓＲＮＡ）に匹敵する長さであるが、特定の標的ＲＮＡに対して特異的ではないｄｓＲＮＡを意味する。対照ＲＮＡは、対象とする標的に対して特異的なｄｓＲＮＡと同一ではないヌクレオチド配列を有する。対照、例えば対照ペプチドは、長さおよび電荷の１つ以上において匹敵するが、標的ＲＮＡに対して特異的なｄｓＲＮＡとコンジュゲートされたペプチド（試験ペプチド）のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するペプチドを意味する。対照、例えば対照ｄｓＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートは、ｄｓＲＮＡが、特定の標的ＲＮＡに対して特異的なｄｓＲＮＡに匹敵する長さであるが、特定の標的ＲＮＡに対して特異的ではないｄｓＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートを意味する。対照ｄｓＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートはまた、ペプチドが長さおよび電荷の１つ以上において匹敵するが、標的ＲＮＡに対して特異的なｄｓＲＮＡとコンジュゲートされたペプチドのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するｄｓＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートも意味する。対照ｄｓＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートはまた、ペプチドが長さおよび電荷の１つ以上において匹敵するが、標的ＲＮＡに対して特異的なｄｓＲＮＡとコンジュゲートされたペプチドのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有し、かつｄｓＲＮＡが特定の標的ＲＮＡに対して特異的なｄｓＲＮＡに匹敵する長さであるが、特定の標的ＲＮＡに対して特異的ではないｄｓＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートも意味する。
【０１９６】
本明細書で使用される試験ペプチドまたは試験ｄｓＲＮＡは、本発明に従って標的ＲＮＡの発現を減少させるコンジュゲートを含む、ペプチドまたはｄｓＲＮＡを意味する。試験ｄｓＲＮＡは、本発明に従って標的ＲＮＡの発現を減少させるｄｓＲＮＡを意味する。「試験」ｄｓＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートは、試験ペプチドとコンジュゲートされた試験ｄｓＲＮＡを含む。
【０１９７】
本明細書で使用される「核酸」という用語は、一本または二本鎖形態のデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドおよびそれらのポリマーを指す。この用語は、既知のヌクレオチド類似体または修飾骨格残基または連結を含有する核酸であって、合成、天然および非天然であり、参照核酸と同様の結合特性を有し、かつ参照ヌクレオチドと同様の方法で代謝される核酸を包含する。このような類似体の例としては、ホスホロチオアート、ホスホルアミダート、メチルホスホナート、キラル−メチルホスホナート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が非限定的に挙げられる。
【０１９８】
本明細書で使用される「ヌクレオチド」は、当該技術分野で公知の天然塩基（標準）および修飾塩基を有するものを包含することが当該技術分野において認められているように使用される。このような塩基は一般に、ヌクレオチド糖部分の１’位に位置している。ヌクレオチドは一般に、塩基、糖およびリン酸基を含む。ヌクレオチドは修飾されていないもの、あるいは糖、リン酸および／または塩基部分で修飾されているもの（互換的にヌクレオチド類似体、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、非標準ヌクレオチドなどとも呼ばれる；例えば、すべて参照により本明細書に組み込まれる、ＵｓｍａｎおよびＭｃＳｗｉｇｇｅｎ，同上；Ｅｃｋｓｔｅｉｎら，国際ＰＣＴ公開第９２／０７０６５号；Ｕｓｍａｎら，国際ＰＣＴ公開第９３／１５１８７号；ＵｈｌｍａｎおよびＰｅｙｍａｎ，同上を参照されたい）であり得る。当該技術分野で公知の修飾核酸塩基にはいくつかの例があり、Ｌｉｍｂａｃｈら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：２１８３，１９９４）により要約されている。核酸分子内に導入することができるいくつかの塩基修飾の非限定的な例としては、ヒポキサンチン、プリン、ピリジン−４−オン、ピリジン−２−オン、フェニル、プソイドウラシル、２，４，６−トリメトキシベンゼン、３−メチルウラシル、ジヒドロウリジン、ナフチル、アミノフェニル、５−アルキルシチジン（例えば、５−メチルシチジン）、５−アルキルウリジン（例えば、リボチミジン）、５−ハロウリジン（例えば、５−ブロモウリジン）または６−アザピリミジンまたは６−アルキルピリミジン（例えば、６−メチルウリジン）、プロピンなどが挙げられる（Ｂｕｒｇｉｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：１４０９０，１９９６；ＵｈｌｍａｎおよびＰｅｙｍａｎ，同上）。この意味で「修飾塩基」は、１’位のアデニン、グアニン、シトシンおよびウラシルまたはそれらの等価物以外のヌクレオチド塩基を意味する。
【０１９９】
本明細書で使用される「修飾ヌクレオチド」は、ヌクレオシド、核酸塩基、ペントース環またはリン酸基に対する１つ以上の修飾を有するヌクレオチドを指す。例えば、修飾ヌクレオチドは、アデノシン一リン酸、グアノシン一リン酸、ウリジン一リン酸およびシチジン一リン酸を含有するリボヌクレオチド、ならびにデオキシアデノシン一リン酸、デオキシグアノシン一リン酸、デオキシチミジン一リン酸およびデオキシシチジン一リン酸を含有するデオキシリボヌクレオチドは除外する。修飾は、メチルトランスフェラーゼのようなヌクレオチドを修飾する酵素による修飾の結果得られる天然に存在するものを包含する。修飾ヌクレオチドはまた、合成または非天然のヌクレオチドも包含する。ヌクレオチドにおける合成または非天然の修飾としては、２’修飾、例えば、２’−Ｏ−メチル、２’−メトキシエトキシ、２’−フルオロ、２’−アリル、２’−Ｏ−［２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル］、４’−チオ、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’−架橋、４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’−架橋、２’−ＬＮＡおよび２’−Ｏ−（Ｎ−メチルカルバマート）を有するもの、または塩基類似体を含むものが挙げられる。本開示で記載されている２’−修飾ヌクレオチドに関連して、「アミノ」は２’−ＮＨ２または２’−Ｏ−ＮＨ２を意味し、これらは修飾または非修飾であり得る。このような修飾群は、例えば、Ｅｃｋｓｔｅｉｎら，米国特許第５，６７２，６９５号およびＭａｔｕｌｉｃ−Ａｄａｍｉｃら，米国特許第６，２４８，８７８号に記載されている。
【０２００】
本開示の核酸分子に関して、修飾はこれらの物質上で、ｄｓＲＮＡの一方または両方の鎖にパターンで存在し得る。本明細書で使用される「交互位置」は、ｄｓＲＮＡ鎖の定められた長さにわたり、ヌクレオチドが１つ置きに修飾ヌクレオチドであるか、または各修飾ヌクレオチドの間に非修飾ヌクレオチド（例えば、非修飾リボヌクレオチド）が存在するパターンを指す（例えば、５’−ＭＮＭＮＭＮ−３’；３’−ＭＮＭＮＭＮ−５’；Ｍは修飾ヌクレオチド、Ｎは非修飾ヌクレオチドである）。特定の実施形態では、修飾パターンは、本明細書に記載のいずれかの位置番号付けの規定に従って、５’または３’末端のいずれかの最初のヌクレオチド位置から始まる（特定の実施形態では、本発明のＤｓｉＲＮＡ剤の予測されるダイサー切断事象後の鎖の末端残基に関して１位を指定する；したがって、１位は、本発明のプロセシング前の薬剤の３’末端または５’末端残基を常に構成するとは限らない）。他の実施形態では、１位は、反対側の鎖の５’または３’末端に相補的な第一または第二鎖のヌクレオチド残基に関して１位を指定する。例えば、特定の実施形態では、１位は、第一のオリゴヌクレオチド鎖の５’末端ヌクレオチド残基に相補的な第二鎖のヌクレオチド残基である。本発明は、修飾パターンが、本明細書に記載のいずれかの位置番号付けの規定に従って、５’または３’末端から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１２、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４位のいずれかで始まるｄｓＲＮＡを包含する。本発明はまた、修飾パターンが、５’または３’末端残基から少なくとも１ヌクレオチドである任意の位置で始まるｄｓＲＮＡも包含する。
【０２０１】
交互位置での修飾ヌクレオチドのパターンは、鎖の全長にわたっていてもよいが、特定の実施形態では、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４個またはそれを超える修飾ヌクレオチドをそれぞれ含有する、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８個またはそれを超えるヌクレオチドを含む。
【０２０２】
本明細書で使用される「交互の対位置」は、ｄｓＲＮＡ鎖の定められた長さにわたり、２個の連続する修飾ヌクレオチドが２個の連続する非修飾ヌクレオチドにより隔てられているパターンを指す（例えば、５’−ＭＭＮＮＭＭＮＮＭＭＮＮ−３’；３’−ＭＭＮＮＭＭＮＮＭＭＮＮ−５’；Ｍは修飾ヌクレオチド、Ｎは非修飾ヌクレオチドである）。一実施形態では、修飾パターンは、本明細書に記載のいずれかの位置番号付けの規定に従って、５’または３’末端のいずれかの最初のヌクレオチド位置から始まる。交互位置での修飾ヌクレオチドのパターンは、鎖の全長にわたっていてもよいが、好ましくは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４個の修飾ヌクレオチドをそれぞれ含有する、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８個のヌクレオチドを含む。上記修飾パターンは典型的なものであって、本発明の範囲に対する制限を意図するものではないことを強調しておく。
【０２０３】
本明細書で使用される「塩基類似体」は、核酸二本鎖内に組み込まれ得る修飾ヌクレオチド内のヌクレオチド糖部分の１’位（または核酸二本鎖内に組み込まれ得るヌクレオチド糖部分置換における同等の位置）に位置する複素環部分を指す。本発明のｄｓＮＡにおいては、塩基類似体は一般に、通常の塩基であるグアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）を除く、プリンまたはピリミジン塩基のどちらかである。塩基類似体は、ｄｓＲＮＡ中の他の塩基または塩基類似体と二本鎖を形成し得る。塩基類似体としては、本発明の化合物および方法において有用なもの、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｅｎｎｅｒに対する米国特許第５，４３２，２７２号および第６，００１，９８３号、ならびにＭａｎｏｈａｒａｎに対する米国特許出願公開第２００８０２１３８９１号に開示されているものが上げられる。塩基の非限定的な例としては、ヒポキサンチン（Ｉ）、キサンチン（Ｘ）、３β−Ｄ−リボフラノシル−（２，６−ジアミノピリミジン）（Ｋ）、３−β−Ｄ−リボフラノシル−（１−メチル−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−５，７（４Ｈ，６Ｈ）−ジオン）（Ｐ）、イソ−シトシン（イソ−Ｃ）、イソ−グアニン（イソ−Ｇ）、１−β−Ｄ−リボフラノシル−（５−ニトロインドール）、１−β−Ｄ−リボフラノシル−（３−ニトロピロール）、５−ブロモウラシル、２−アミノプリン、４−チオ−ｄＴ、７−（２−チエニル）−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（Ｄｓ）およびピロール−２−カルボアルデヒド（Ｐａ）、２−アミノ−６−（２−チエニル）プリン（Ｓ）、２−オキソピリジン（Ｙ）、ジフルオロトリル、４−フルオロ−６−メチルベンゾイミダゾール、４−メチルベンゾイミダゾール、３−メチルイソカルボスチリリル、５−メチルイソカルボスチリリルおよび３−メチル−７−プロピニルイソカルボスチリリル、７−アザインドリル、６−メチル−７−アザインドリル、イミジゾピリジニル、９−メチル−イミジゾピリジニル、ピロロピリジニル、イソカルボスチリリル、７−プロピニルイソカルボスチリリル、プロピニル−７−アザインドリル、２，４，５−トリメチルフェニル、４−メチルインドリル、４，６−ジメチルインドリル、フェニル、ナフタレニル、アントラセニル、フェナントラセニル、ピレニル、スチルベンジル、テトラセニル、ペンタセニルならびにそれらの構造誘導体が挙げられる（Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５９：７２３８−７２４２（１９９４）；Ｂｅｒｇｅｒら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２８（１５）：２９１１−２９１４（２０００）；Ｍｏｒａｎら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１９：２０５６−２０５７（１９９７）；Ｍｏｒａｌｅｓら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１：２３２３−２３２４（１９９９）；Ｇｕｃｋｉａｎら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１８：８１８２−８１８３（１９９６）；Ｍｏｒａｌｅｓら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２（６）：１００１−１００７（２０００）；ＭｃＭｉｎｎら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１：１１５８５−１１５８６（１９９９）；Ｇｕｃｋｉａｎら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６３：９６５２−９６５６（１９９８）；Ｍｏｒａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９４：１０５０６−１０５１１（１９９７）；Ｄａｓら，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．，１：１９７−２０６（２００２）；Ｓｈｉｂａｔａら，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．，１：１６０５−１６１１（２００１）；Ｗｕら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２（３２）：７６２１−７６３２（２０００）；Ｏ’Ｎｅｉｌｌら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６７：５８６９−５８７５（２００２）；Ｃｈａｕｄｈｕｒｉら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１７：１０４３４−１０４４２（１９９５）；および米国特許第６，２１８，１０８号）。塩基類似体はまた、ユニバーサル塩基であってもよい。
【０２０４】
本明細書で使用される「ユニバーサル塩基」は、核酸二本鎖中に存在する場合、二重らせん構造（例えば、リン酸骨格の構造）を変化させずに２種類以上の塩基と反対側に位置し得る、修飾ヌクレオチド中のヌクレオチド糖部分の１’位またはヌクレオチド糖部分置換における同等の位置に位置する複素環部分を指す。さらに、ユニバーサル塩基は、それが存在する一本鎖核酸が標的核酸と二本鎖を形成する能力を損なわい。ユニバーサル塩基を含有する一本鎖核酸が標的核酸と二本鎖を形成する能力は、当業者に明らかな方法（例えば、ＵＶ吸収、円二色性、ゲルシフト、一本鎖ヌクレアーゼ感受性など）によりアッセイすることができる。さらに、二本鎖形成が観察される条件を、例えば、融解温度（Ｔｍ）は核酸二本鎖の安定性に関連するため、温度を変化させて、二本鎖の安定性または形成を判定し得る。標的核酸と正確に相補的な参照一本鎖核酸と比べて、ユニバーサル塩基を含有する一本鎖核酸は、相補的な核酸と共に形成される二本鎖よりもＴｍが低い二本鎖を、標的核酸と共に形成する。しかし、単一ミスマッチが生じるようにユニバーサル塩基を塩基で置き換えた参照一本鎖核酸と比べた場合、ユニバーサル塩基を含有する一本鎖核酸は、ミスマッチ塩基を有する核酸と共に形成される二本鎖よりもＴｍが高い二本鎖を、標的核酸と共に形成する。
【０２０５】
一部のユニバーサル塩基は、塩基対形成条件下で、ユニバーサル塩基と、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）のすべての塩基との間で水素結合を形成することにより塩基対を形成することが可能である。ユニバーサル塩基は、単一の相補的な塩基のみと塩基対を形成する塩基ではない。二本鎖内で、ユニバーサル塩基は、二本鎖の反対鎖上のそれと向かい合うＧ、Ｃ、Ａ、ＴおよびＵのそれぞれと、水素結合を形成しないか、１つの水素結合または２つ以上の水素結合を形成し得る。ユニバーサル塩基は、二本鎖の反対鎖上のそれと向かい合う塩基と相互作用しないことが好ましい。二本鎖内では、ユニバーサル塩基間の塩基対形成は、リン酸骨格の二重らせん構造を変化させることなく生じる。ユニバーサル塩基はまた、スタッキング相互作用により、同じ核酸鎖上の隣接するヌクレオチド内の塩基とも相互作用し得る。このようなスタッキング相互作用は、特にユニバーサル塩基が二本鎖の反対鎖上にそれと向かい合って位置する塩基との水素結合を全く形成しない状況において、二本鎖を安定化させる。ユニバーサル結合ヌクレオチドの非限定的な例としては、イノシン、１−β−Ｄ−リボフラノシル−５−ニトロインドールおよび／または１−β−Ｄ−リボフラノシル−３−ニトロピロールが挙げられる（Ｑｕａｙらに対する米国特許出願公開第２００７０２５４３６２号；Ｖａｎ  Ａｅｒｓｃｈｏｔら，Ａｎ  ａｃｙｃｌｉｃ  ５−ｎｉｔｒｏｉｎｄａｚｏｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ａｎａｌｏｇｕｅ  ａｓ  ａｍｂｉｇｕｏｕｓ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９５  Ｎｏｖ  １１；２３（２１）：４３６３−７０；Ｌｏａｋｅｓら，３−Ｎｉｔｒｏｐｙｒｒｏｌｅ  ａｎｄ  ５−ｎｉｔｒｏｉｎｄｏｌｅ  ａｓ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂａｓｅｓ  ｉｎ  ｐｒｉｍｅｒｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  ＰＣＲ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９５  Ｊｕｌ  １１；２３（１３）：２３６１−６；ＬｏａｋｅｓおよびＢｒｏｗｎ，５−Ｎｉｔｒｏｉｎｄｏｌｅ  ａｓ  ａｎ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂａｓｅ  ａｎａｌｏｇｕｅ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９４  Ｏｃｔ  １１；２２（２０）：４０３９−４３）。
【０２０６】
本明細書で使用される「ループ」は、核酸の一本鎖により形成される構造を指し、この構造では、特定の一本鎖ヌクレオチド領域に隣接する相補的領域が、相補的領域間にある一本鎖ヌクレオチド領域が二本鎖形成またはＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対形成から除外されるようにハイブリダイズする。ループは任意の長さの一本鎖ヌクレオチド領域である。ループの例としては、ヘアピン、ステムループまたは伸長ループのような構造中に存在する不対ヌクレオチドが挙げられる。
【０２０７】
本明細書で使用される、ｄｓＲＮＡとの関連における「伸長ループ」は、一本鎖ループおよび加えて、ループに隣接する１、２、３、４、５、６または２０以下の塩基対または二本鎖を指す。伸長ループにおいては、５’側のループと隣接するヌクレオチドが、３’側のループと隣接するヌクレオチドと二本鎖を形成する。伸長ループはヘアピンまたはステムループを形成し得る。
【０２０８】
本明細書で使用される、ｄｓＲＮＡとの関連における「テトラループ」は、隣接するＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋハイブリッド形成ヌクレオチドの安定性に寄与する安定な二次構造を形成する、４つのヌクレオチドからなるループ（一本鎖領域）を指す。理論に制限されるわけではないが、テトラループはスタッキング相互作用により、隣接するＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対を安定化させ得る。さらに、テトラループ内の４つのヌクレオチドの間の相互作用としては、非Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対形成、スタッキング相互作用、水素結合および接触相互作用が挙げられるが、これらに限定されない（Ｃｈｅｏｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ  １９９０  Ａｕｇ  １６；３４６（６２８５）：６８０−２；ＨｅｕｓおよびＰａｒｄｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９１  Ｊｕｌ  １２；２５３（５０１６）：１９１−４）。テトラループは、隣接する二本鎖の融解温度（Ｔｍ）を、任意の４つの塩基からなる単純なモデルループ配列から予想されるよりも高く上昇させる。例えば、テトラループは、少なくとも２塩基対の長さの二本鎖を含むヘアピンに、１０ｍＭ  ＮａＨＰＯ４中で少なくとも５５℃の融解温度をもたらし得る。テトラループは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドおよびそれらの組合せを含有し得る。ＲＮＡテトラループの例としては、テトラループのＵＮＣＧファミリー（例えば、ＵＵＣＧ）、テトラループのＧＮＲＡファミリー（例えば、ＧＡＡＡ）およびＣＵＵＧテトラループが挙げられる。（Ｗｏｅｓｅら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１９９０  Ｎｏｖ；８７（２１）：８４６７−７１；Ａｎｔａｏら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９１  Ｎｏｖ  １１；１９（２１）：５９０１−５）。ＤＮＡテトラループの例としては、テトラループのｄ（ＧＮＮＡ）ファミリー（例えば、ｄ（ＧＴＴＡ））、テトラループのｄ（ＧＮＲＡ）ファミリー、テトラループのｄ（ＧＮＡＢ）ファミリー、テトラループのｄ（ＣＮＮＧ）ファミリー、テトラループのｄ（ＴＮＣＧ）ファミリー（例えば、ｄ（ＴＴＣＧ））が挙げられる。（Ｎａｋａｎｏら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４１（４８），１４２８１−１４２９２，２００２．；ＳＨＩＮＪＩら，Ｎｉｐｐｏｎ  Ｋａｇａｋｋａｉ  Ｋｏｅｎ  Ｙｏｋｏｓｈｕ  ＶＯＬ．７８ｔｈ；ＮＯ．２；ＰＡＧＥ．７３１（２０００）．）。
【０２０９】
本発明のｄｓＲＮＡ組成物は、少なくとも部分的にはそのような組成物の鎖長により、ダイサー酵素の基質としてＲＮＡｉ経路に入るように形成されているため、本明細書ではダイサー基質ｓｉＲＮＡ（「ＤｓｉＲＮＡ」）剤とも呼ばれる。本発明の「ＤｓｉＲＮＡ剤」組成物は、ダイサー酵素プロセシングのための前駆体分子であるｄｓＲＮＡを含む、すなわち、本発明のＤｓｉＲＮＡは、インビボでプロセシングされて活性ｓｉＲＮＡを生じる。具体的には、ＤｓｉＲＮＡはダイサーによりプロセシングされて、ＲＩＳＣ内に組み込まれる活性ｓｉＲＮＡになる。本明細書において主に「ＤｓｉＲＮＡ剤」または「ＤｓｉＲＮＡ分子」と呼ばれるこの前駆体分子は、本明細書において前駆体ＲＮＡｉ分子とも呼ばれ得る。本明細書で使用される「活性ｓｉＲＮＡ」という用語は、各鎖がＲＮＡ、ＲＮＡ類似体（１つまたは複数）またはＲＮＡとＤＮＡを含む二本鎖核酸を指す。ｓｉＲＮＡは、１９〜２３個の間のヌクレオチドを含むか、または２１個のヌクレオチドを含む。活性ｓｉＲＮＡは通常、ｓｉＲＮＡ中の二本鎖領域が１７〜２１個のヌクレオチドまたは１９個のヌクレオチドを含むように、各鎖の３’末端に２ｂｐのオーバーハングを有する。
【０２１０】
特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡは、長さが１６〜５０個の間、１９〜３５個の間、１９〜２４個の間、２５〜３０個の間、２５〜３５個の間、２６〜３０個の間、２１〜２３個の間のヌクレオチドを含む第一および第二鎖を含むｄｓＲＮＡを含むが、これらに限定されない。
【０２１１】
本発明のＤｓｉＲＮＡ剤は、それがダイサーによりプロセシングされてｓｉＲＮＡを生じるのに十分な長さを有する。したがって、適切なＤｓｉＲＮＡ剤は、長さが少なくとも２５ヌクレオチドかつ約３５ヌクレオチド以下の１つのオリゴヌクレオチドである、第一の配列を含有する。このＲＮＡ配列は、約２６〜３５個の間、２６〜３４個の間、２６〜３３個の間、２６〜３２個の間、２６〜３１個の間、２６〜３０個の間および２６〜２９個の間のヌクレオチドの長さであり得る。この配列は、約２７もしくは２８ヌクレオチドの長さまたは２７ヌクレオチドの長さであり得る。ＤｓｉＲＮＡ剤の第二の配列は、真核細胞の細胞質内のような生物学的条件下で第一の配列とアニールする、任意の配列であり得る。一般的には、第二のオリゴヌクレオチド配列は、第一のオリゴヌクレオチ配列と相補的な少なくとも１９個の塩基対を有し、より通常には、第二のオリゴヌクレオチド配列は、第一のオリゴヌクレオチ配列と相補的な約２１個以上の塩基対または相補的な約２５個以上の塩基対を有する。一実施形態では、第二の配列は、第一の配列と同じ長さであり、かつＤｓｉＲＮＡ剤は平滑末端化されている。別の実施形態では、ＤｓｉＲＮＡ剤の末端は１つ以上のオーバーハングを有する。特定の実施形態では、第二の配列が第一の配列と同じ長さであり、前記第一鎖の前記３’末端の最終残基と第二鎖の前記５’末端の最終残基がミスマッチ塩基対を形成する。他の実施形態では、第二の配列が第一の配列と同じ長さであり、前記第一鎖の５’末端の最終残基と第二鎖の３’末端の最終残基がミスマッチ塩基対を形成する。他の実施形態では、第二の配列が第一の配列と同じ長さであり、第一鎖の３’末端の最終残基および最後から２番目の残基と第二鎖の５’末端の最終残基および最後から２番目の残基とが２つのミスマッチ塩基対を形成する。さらに他の実施形態では、第二の配列が第一の配列と同じ長さであり、第一鎖の５’末端の最終残基および最後から２番目の残基と第二鎖の３’末端の最終残基および最後から２番目の残基とが２つのミスマッチ塩基対を形成する。
【０２１２】
特定の実施形態では、ＤｓｉＲＮＡ剤の第一および第二のオリゴヌクレオチド配列は、化学的に合成することができ、また通常は化学合成された、別々のオリゴヌクレオチド上に存在する。いくつかの実施形態では、両鎖は長さが２６〜３５ヌクレオチドの間である。他の実施形態では、両鎖は、長さが２５〜３０ヌクレオチドまたは２６〜３０ヌクレオチドの間である。一実施形態では、両鎖は長さが２７ヌクレオチドであり、完全に相補的であり、かつ平滑末端を有する。一実施形態では、オリゴヌクレオチド鎖の一方または両方がダイサーに対する基質として働き得る。他の実施形態では、二本鎖ＲＮＡ構造が遺伝子発現を阻害する効率を最大化する配向でダイサーが二本鎖ＲＮＡ構造と結合することを促進する、少なくとも１つの修飾が存在する。本発明の特定の実施形態では、ＤｓｉＲＮＡ剤は異なる長さの２つのオリゴヌクレオチド鎖からなり、ＤｓｉＲＮＡは、第一鎖（センス鎖）の３’末端に平滑末端を、および第二鎖（アンチセンス鎖）の３’末端に３’オーバーハングを有する。ＤｓｉＲＮＡはまた、１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）塩基置換も含有する。
【０２１３】
２つ別々のオリゴヌクレオチドを含有する適切なＤｓｉＲＮＡ組成物は、化学的連結基により、それらのアニーリング領域以外で化学的に連結することができる。多くの適切な化学的連結基が当該技術分野で公知であり、使用することができる。適切な基は、ＤｓｉＲＮＡ上のダイサー活性をブロックせず、かつ標的遺伝子から転写されたＲＮＡの指令された破壊を妨げない。あるいは、ＤｓｉＲＮＡ組成物を形成している２つのオリゴヌクレオチドのアニーリングの際にヘアピン構造が生じるように、２つの別々のオリゴヌクレオチドを第三のオリゴヌクレオチドにより連結することができる。ヘアピン構造は、ＤｓｉＲＮＡ上のダイサー活性をブロックせず、かつ標的ＲＮＡの指令された破壊を妨げない。
【０２１４】
本明細書で使用される、標的ＲＮＡまたはｃＤＮＡ配列と「十分に相補的な」配列を有するｄｓＲＮＡ、例えば、ＤｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡは、ｄｓＲＮＡが、ＲＮＡｉ機構（例えば、ＲＩＳＣ複合体）またプロセスによる標的ＲＮＡ（ｃＤＮＡを取り上げる場合、その取り上げられたｃＤＮＡに対応するＲＮＡ配列）の破壊を誘発するのに十分な配列を有することを意味する。ｄｓＲＮＡ分子は、アンチセンス鎖のすべての残基が標的分子中の残基と相補的になるように設計することができる。あるいは、前記分子のプロセシング活性を安定化および／または増強するために、分子内で置換を行うことができる。置換は、鎖内で行うか、または鎖の末端の残基に対して行うことができる。特定の実施形態では、置換および／または修飾は、ＤｓｉＲＮＡ剤の特定の残基において行う。このような置換および／または修飾は、例えば、ＤｓｉＲＮＡ剤のセンス鎖の３’末端位置から数えて１、２および３位の１つ以上の残基におけるデオキシ修飾；ＤｓｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖の５’末端位置から数えて１、２、３または４位の１つ以上の残基におけるデオキシ修飾ならびにＤｓｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖の３’末端残基における２’−Ｏ−アルキル（例えば、２’−Ｏ−メチル）修飾の導入を含んでもよく、このような修飾はさらに、または代わりに、アンチセンス鎖の３’部分のオーバーハング位置におよび／またはＤｓｉＲＮＡ剤全体にわたって、例えば、プロセシングされて活性ｓｉＲＮＡ剤を形成するＤｓｉＲＮＡ剤の領域内に含まれるＤｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の交互の残基で、または残基の対で存在する。上記修飾は典型的なものとして提供されるものであり、決して制限することを意図するものではない。本発明のＤｓｉＲＮＡ剤に対して行い得るさらなる修飾および置換の記載を含めた、好適なＤｓｉＲＮＡ剤の構造のさらなる考察を以下に見出すことができる。
【０２１５】
「相補性」は、核酸が、従来のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋまたは他の非従来的なタイプのいずれかにより、別の核酸と水素結合（１つまたは複数）形成し得ることを意味する。本発明の核酸分子に関しては、核酸分子のその相補的な配列との結合自由エネルギーは、核酸の関連する機能、例えばＲＮＡｉ活性を進行させるのに十分なものである。核酸分子の結合自由エネルギーの決定は当該技術分野で公知である（例えば、Ｔｕｒｎｅｒら，１９８７，ＣＳＨ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．ＬＩＩ  ｐｐ．１２３−１３３；Ｆｒｉｅｒら，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：９３７３−９３７７；Ｔｕｒｎｅｒら，１９８７，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０９：３７８３−３７８５を参照されたい）。パーセント相補性は、第二の核酸配列と水素結合（例えば、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対形成）を形成し得る核酸分子中の連続する残基のパーセンテージを表す（例えば、１０ヌクレオチドを有する第二の核酸配列と塩基対を形成している第一のオリゴヌクレオチド中の全１０ヌクレオチドのうちの５、６、７、８、９または１０個のヌクレオチドは、それぞれ５０％、６０％、７０％、８０％、９０％および１００％相補的であることを表す）。「完全に相補的な」は、核酸配列のすべての連続する残基が、第二の核酸配列の同数の連続する残基と水素結合することを意味する。一実施形態では、本発明のＤｓｉＲＮＡ分子は、１つ以上の標的核酸分子またはその一部と相補的な約１９〜約３０個（例えば、約１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９個または３０個以上）のヌクレオチドを含む。
【０２１６】
「二本鎖領域」という語句は、相補的または実質的に相補的なオリゴヌクレオチド間での二本鎖形成を可能にするＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対形成またはその他の任意の方法により互いに塩基対を形成する２つの相補的または実質的に相補的なオリゴヌクレオチド内の領域を指す。例えば、２１ヌクレオチド単位を有するオリゴヌクレオチド鎖は、２１ヌクレオチド単位の別のオリゴヌクレオチドと塩基対を形成することができるが、各鎖上の１９塩基のみが相補的または実質的に相補的であるため、「二本鎖領域」は１９塩基対で構成される。残りの塩基対は、例えば、５’および３’オーバーハングとして存在する。さらに、二本鎖領域内では１００％の相補性は必要なく；実質的な相補性が二本鎖領域内で許容される。
【０２１７】
実質的な相同性は、生物学的条件下でアニーリング可能であるような鎖間の相補性を指す。２つの鎖が生物学的条件下でアニーリング可能であるか否かを実験的に判定する技術は、当該技術分野において公知である。あるいは、２つの鎖を合成して生物学的条件下で共に加え、それらが互いにアニールするか否かを判定することができる。
【０２１８】
多数の塩基にわたって塩基対を形成する一本鎖核酸を「ハイブリダイズ」するという。ハイブリダイゼーションは通常、生理学的なまたは生物学的に関連する条件下（例えば、細胞内：ｐＨ７．２、１４０ｍＭカリウムイオン；細胞外：ｐＨ７．４、１４５ｍＭナトリウムイオン）で判定される。ハイブリダイゼーション条件は一般に、一価陽イオンおよび生物学的に許容される緩衝剤を含有し、二価陽イオン、錯陰イオン（例えば、グルコン酸カリウム由来のグルコン酸）、ショ糖のような非荷電種、および試料中の水の活性を減少させる不活性ポリマー、例えばＰＥＧを含有してもしなくてもよい。このような条件は、塩基対が形成され得る条件を含む。
【０２１９】
ハイブリダイゼーションは、二本鎖を形成している一本鎖核酸を解離するのに必要な温度、すなわち（融解温度；Ｔｍ）により測定される。ハイブリダイゼーション条件はまた、塩基対が形成され得る条件でもある。様々なストリンジェンシー条件を用いてハイブリダイゼーションを判定することができる（例えば、Ｗａｈｌ，Ｇ．Ｍ．およびＳ．Ｌ．Ｂｅｒｇｅｒ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：３９９；Ｋｉｍｍｅｌ，Ａ．Ｒ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：５０７を参照されたい）。ストリンジェントな温度条件としては通常、少なくとも約３０℃、より好ましくは少なくとも約３７℃、そして最も好ましくは約４２℃が挙げられる。５０塩基対未満の長さであると予想されるハイブリッドのためのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）よりも５〜１０℃低くなければならず、ここでＴｍは、以下の方程式により決定される。１８塩基対未満の長さのハイブリッドでは、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基数）。１８〜４９塩基対の間の長さのハイブリッドでは、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）であり、式中、Ｎはハイブリッド中の塩基数であり、［Ｎａ＋］はハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオン濃度（１×ＳＳＣの［Ｎａ＋］＝０．１６５Ｍ）である。例えば、ハイブリダイゼーション判定用緩衝液を表１に示す。
【０２２０】
【表１】
2012528596.tif 000002
【０２２１】
ハイブリダイゼーション条件に関する有用な変形物は、当業者には用意に明らかになるであろう。ハイブリダイゼーション技術は当業者に公知であり、例えば、ＢｅｎｔｏｎおよびＤａｖｉｓ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９６：１８０，１９７７）；ＧｒｕｎｓｔｅｉｎおよびＨｏｇｎｅｓｓ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ７２：３９６１，１９７５）；Ａｕｓｕｂｅｌら（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１）；ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９８７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；ならびにＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されている。
【０２２２】
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド鎖」は一本鎖核酸分子である。オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド（例えば、２’修飾を有するヌクレオチド、合成塩基類似体など）またはそれらの組合せを含む。このような修飾オリゴヌクレオチドは、例えば、増強された細胞取り込みおよびヌクレアーゼ存在下での増加した安定性のような特性により、本来の形態よりも好適であり得る。
【０２２３】
本発明の特定のｄｓＲＮＡは、キメラ二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であり得る。本発明との関連における「キメラｄｓＲＮＡ」または「キメラ」は、それぞれ少なくとも１つのヌクレオチドからなる２つ以上の化学的に異なる領域を含有するｄｓＲＮＡである。こうしたｄｓＲＮＡは通常、ダイサー基質ｓｉＲＮＡ（「ＤｓｉＲＮＡ」）分子を形成するリボヌクレオチド（修飾リボヌクレオチドを任意に含む）を主として含む、少なくとも１つの領域を含有する。このＤｓｉＲＮＡ領域は、リボヌクレオチド二本鎖領域のいずれかの側で塩基対形成したデオキシリボヌクレオチドを含む、第二の領域（「ｄｓＲＮＡ領域」）と共有結合的に結合させることができ、このことが１つ以上の有益な特性（例えば、増大した有効性、例えば、増大したＤｓｉＲＮＡ活性の効力および／または持続時間、例えば培養中の細胞または被検体に投与された場合の認識ドメインまたはキメラｄｓＮＡを特定の位置に標的化する手段としての機能、官能基、ペイロード、検出用／検出可能な部分の結合向上のための延長領域としての機能、より望ましい修飾および／またはこのような修飾のスペーシングの向上を可能にする延長領域としての機能など）をもたらし得る。例えば塩基対形成したデオキシリボヌクレオチドを含む、この第二の領域はまた、修飾もしくは合成ヌクレオチドおよび／または修飾もしくは合成デオキシリボヌクレオチドも含み得る。
【０２２４】
本明細書で使用される「リボヌクレオチド」という用語は、天然および合成の非修飾および修飾リボヌクレオチドを包含する。修飾は、オリゴヌクレオチド中の糖部分、塩基部分および／またはリボヌクレオチド間の連結に対する改変を含む。本明細書で使用される「リボヌクレオチド」という用語は特に、２’リボース環部分に単一のプロトン基を有するヌクレオチドであるデオキシリボヌクレオチドは除外する。
【０２２５】
本明細書で使用される「デオキシリボヌクレオチド」という用語は、天然および合成の非修飾および修飾デオキシリボヌクレオチドを包含する。修飾は、オリゴヌクレオチド中の糖部分、塩基部分および／またはデオキシリボヌクレオチド間の連結に対する改変を含む。本明細書で使用される「デオキシリボヌクレオチド」という用語はまた、ｄｓＲＮＡ剤のダイサー切断をさせない修飾ヌクレオチド、例えば、残基の結合においてダイサー切断を生じさせない２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ホスホロチオアート−修飾リボヌクレオチド残基なども包含する。
【０２２６】
本明細書で使用される「ＰＳ−ＮＡ」という用語は、ホスホロチオアート修飾ヌクレオチド残基を指す。したがって、「ＰＳ−ＮＡ」という用語は、ホスホロチオアート修飾リボヌクレオチド（「ＰＳ−ＲＮＡ」）およびホスホロチオアート修飾デオキシリボヌクレオチド（「ＰＳ−ＤＮＡ」）を包含する。
【０２２７】
本明細書で使用される「ダイサー」は、ｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ含有分子、例えば二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）またはプレマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を、通常は３’末端に２塩基オーバーハングを有する約１９〜２５ヌクレオチド長の二本鎖核酸フラグメントに切断する、ＲＮアーゼＩＩＩファミリー内のエンドリボヌクレアーゼを指す。本発明のｄｓＲＮＡに関しては、本発明のｄｓＲＮＡのｄｓＲＮＡ領域により形成される二本鎖は、ダイサーにより認識され、かつ二本鎖の少なくとも一本の鎖上のダイサー基質である。ダイサーは、ＲＮＡ干渉経路の最初の段階を触媒し、これにより標的ＲＮＡの分解が生じる。ヒトダイサーのタンパク質配列は、ＮＣＢＩデータベースにおいてアクセッション番号ＮＰ＿０８５１２４で提供され、これは参照により本明細書に組み込まれる。
【０２２８】
ダイサー「切断」は以下のように判定される（例えば、Ｃｏｌｌｉｎｇｗｏｏｄら、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １８：１８７−２００（２００８）を参照されたい）。ダイサー切断アッセイでは、ＲＮＡ二本鎖（１００ｐｍｏｌ）を、１単位の組換えヒトダイサー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を含むかまたは含まない、２０μＬの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２中で１８〜２４時間、３７℃でインキュベートする。Ｐｅｒｆｏｒｍａ  ＳＲ  ９６ウェルプレート（Ｅｄｇｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を用いて試料を脱塩する。ダイサー処理の前および後の二本鎖ＲＮＡのエレクトロスプレーイオン化液体クロマトグラフィー質量分析（ＥＳＩ−ＬＣＭＳ）を、ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ  ＴＳＱ７０００、Ｘｃａｌｉｂｕｒデータシステム、ＰｒｏＭａｓｓデータ処理ソフトウェアおよびＰａｒａｄｉｇｍ  ＭＳ４  ＨＰＬＣ（Ｍｉｃｈｒｏｍ  ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅｓ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）からなるＯｌｉｇｏ  ＨＴＣＳシステム（Ｎｏｖａｔｉａ、ＰｒｉｎｃｅｔｏｎＮＪ；Ｈａｉｌら、２００４）を用いて行う。このアッセイでは、ダイサー基質ｄｓＲＮＡ（すなわち、２５〜３０ｂｐのｄｓＲＮＡ、好ましくは２６〜３０ｂｐのｄｓＲＮＡ）の少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％さえもが、より短いｄｓＲＮＡ（例えば、１９〜２３ｂｐのｄｓＲＮＡ、好ましくは２１〜２３ｂｐのｄｓＲＮＡ）に切断されるダイサー切断が生じる。
【０２２９】
本明細書で使用される「ダイサー切断部位」は、ダイサーがｄｓＲＮＡ（例えば、本発明のｄｓＲＮＡのｄｓＲＮＡ領域）を切断する部位を指す。ダイサーは、通常はｄｓＲＮＡのセンスおよびアンチセンス両鎖を切断する２つのＲＮアーゼＩＩＩドメインを含有する。ＲＮアーゼＩＩＩドメインとＰＡＺドメイン間の平均距離が、それの生成する短い二本鎖核酸フラグメントの長さを決定し、この距離は様々であり得る（Ｍａｃｒａｅ  Ｉら，（２００６），「Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｂｙ  Ｄｉｃｅｒ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１１（５７５８）：１９５−８）。ダイサーは、アンチセンス鎖の３’末端から除去された２１番目と２２番目のヌクレオチドの間の部位およびセンス鎖の５’末端から除去された２１番目と２２番目のヌクレオチドの間の対応する部位に、２ヌクレオチドの３’オーバーハングを有するアンチセンス鎖を有する、本発明の特定の二本鎖核酸を切断すると予測される。ｄｓＲＮＡのこれらとは異なる予測されるおよび／または一般的なダイサー切断部位（１つまたは複数）は当該技術分野で公知であるか、またはＭａｃｒａｅらに記載のものを含めた当該技術分野において認められている方法により同様に特定し得る。ｄｓＲＮＡ（例えば、ＤｓｉＲＮＡ）のダイサー切断は、ダイサーにプロセシングされたｓｉＲＮＡの１９〜２３ヌクレオチド長の長さを生じさせ得る。実際、以下でより詳細に記載されている本発明の一態様では、二本鎖ＤＮＡ領域が、通常は好ましくない１９ｍｅｒ  ｓｉＲＮＡの一般的なダイサー切り出しを指令するために、ｄｓＲＮＡ内に含まれる。
【０２３０】
本明細書で使用される「オーバーハング」は、ｄｓＲＮＡの５’末端または３’末端のいずれかに１、２、３、４または５個の遊離末端を有する二本鎖との関連において、不対ヌクレオチドを指す。特定の実施形態では、オーバーハングはアンチセンス鎖またはセンス鎖上の３’または５’オーバーハングである。
【０２３１】
本明細書で使用される「ＤｍｉＲＮＡ」という用語は、ＤｍｉＲＮＡ剤のアンチセンス（ガイド）鎖内、具体的には、ＲＮＡ干渉剤として機能し、標的ＲＮＡの配列とハイブリダイズすると考えられるアンチセンス鎖の領域内に、少なくとも１つのミスマッチヌクレオチドを有するダイサー基質ｓｉＲＮＡ（「ＤｓｉＲＮＡ」）種を指す。このようなミスマッチヌクレオチドは、センス鎖（パッセンジャー）鎖に関して、ＤｍｉＲＮＡのアンチセンス鎖がハイブリダイズすると考えられる標的ＲＮＡ配列に関して、またはその両方に関して存在し得る。
【０２３２】
本明細書で使用される「ＲＮＡプロセシング」という用語は、以下でより詳細に記載されているｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはＲＮアーゼＨ経路の構成要素（例えば、Ｄｒｏｓｈａ、ダイサー、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ２またはその他のＲＩＳＣエンドリボヌクレアーゼ、およびＲＮアーゼＨ）により行われるプロセシング活性を指す（以下の「ＲＮＡプロセシング」の節を参照されたい）。この用語は、転写後プロセスのＲＮＡの５’キャップ形成および非ＲＩＳＣまたは非ＲＮアーゼＨ仲介プロセスを介したＲＮＡ分解とは明確に区別される。このようなＲＮＡの「分解」は、いくつかの形態、例えば、脱アデニル化（３’ポリ（Ａ）テールの除去）および／またはいくつかのエンドヌクレアーゼもしくはエキソヌクレアーゼ（例えば、ＲＮアーゼＩＩＩ、ＲＮアーゼＰ、ＲＮアーゼＴ１、ＲＮアーゼＡ（１、２、３、４／５）、オリゴヌクレオチダーゼなど）のいずれかによるＲＮＡの一部または全体のヌクレアーゼ消化であり得る。
【０２３３】
「相同配列」は、遺伝子、遺伝子産物および／または非コードポリヌクレオチドのような１つ以上のポリヌクレオチドの配列で共通するヌクレオチド配列を意味する。例えば、相同配列は、関連するが異なるタンパク質をコードする２つ以上の遺伝子、例えば遺伝子ファミリーの異なるメンバー、異なるタンパク質エピトープ、異なるタンパク質アイソフォーム、またはサイトカインとその対応する受容体のような完全に異なる遺伝子などで共通するヌクレオチド配列であり得る。相同配列は、非コードＤＮＡまたはＲＮＡ、調節配列、イントロンおよび転写制御または調節部位のような２つ以上の非コードポリヌクレオチドで共通するヌクレオチド配列であり得る。相同配列はまた、２つ以上のポリヌクレオチド配列に共通する保存配列領域も包含し得る。相同性は完全な相同性（例えば、１００％）である必要はなく、部分的な相同配列も本発明により考慮される（例えば、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％など）。実際、本発明のＤｓｉＲＮＡ剤の設計および使用は、本明細書に記載のＤｓｉＲＮＡ剤と完全な相補性を有する対象とする標的ＲＮＡに対するＤｓｉＲＮＡ剤だけでなく、例えば、前記ＤｓｉＲＮＡ剤に対して９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％などだけ相補的な配列を有する対象とする標的ＲＮＡに対するＤｓｉＲＮＡ剤の使用の可能性も考慮する。同様に、本明細書に記載の本発明のＤｓｉＲＮＡ剤は、前記ＤｓｉＲＮＡ剤と、例えば、特定の対立遺伝子変異体（例えば、治療目的を強化した対立遺伝子）の対象とする標的ＲＮＡとの間の相補性の程度を増大させるために、当業者により容易に変化させ得ることが考慮される。実際、対象とする標的配列に対して挿入、欠失および単一点突然変異を有するＤｓｉＲＮＡ剤配列も阻害に有用であり得る（おそらく、標的とする転写産物の破壊よりもマイクロＲＮＡ様の翻訳阻害を介して作用すると考えられる；したがって、このようなＤｓｉＲＮＡ剤は「ＤｍｉＲＮＡ」と呼ぶことができる）。あるいは、ヌクレオチド類似体置換または挿入を有するＤｓｉＲＮＡ剤配列が阻害に有用であり得る。
【０２３４】
配列同一性は、当該技術分野で公知の配列比較およびアライメントアルゴリズムにより決定し得る。２つの核酸配列（または２つのアミノ酸配列）のパーセント相同性を決定するために、配列を最適比較の目的で整列させる（例えば、最適アライメントのために第一配列または第二配列中にギャップを導入し得る）。次いで、対応するヌクレオチド（またはアミノ酸）位置におけるヌクレオチド（またはアミノ酸残基）を比較する。第一配列中のある位置が第二配列中の対応する位置と同じ残基で占められていれば、その分子はその位置において同一である。２つの配列のパーセント同一性は、任意に導入ギャップ数および／または導入ギャップ長に対してペナルティスコアを加算した、配列に共通の同一位置数の関数である（すなわち、％同一性＝同一位置数／位置の総数×１００。
【０２３５】
２つの配列間の配列比較およびパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて行うことができる。一実施形態では、十分な同一性を有する整列配列の特定部分に関してアライメントを作成するが、同一性の低い部分に関しては作成しない（すなわち、ローカルアライメント）。配列比較に使用されるローカルアライメントアルゴリズムの好ましい非限定的な例は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−７７におけるように修正された、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−６８のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムはＡｌｔｓｃｈｕｌら，（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０のＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）内に組み込まれている。
【０２３６】
別の実施形態では、適当なギャップを導入することによりアライメントを最適化し、整列配列の長さにわたってパーセント同一性を決定する（すなわち、ギャップアライメント）。比較目的でギャップアライメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２に記載のようにＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを用いることができる。別の実施形態では、適当なギャップを導入することによりアライメントを最適化し、整列配列の全長にわたってパーセント同一性を決定する（すなわち、グローバルアライメント）。配列の全域比較に使用される数学的アルゴリズムの好ましい非限定的な例は、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ，ＣＡＢＩＯＳ（１９８９）のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アライメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）内に組み込まれている。アミノ酸配列の比較のためにＡＬＩＧＮプログラムを用いる場合、ＰＡＭ１２０重み残基表、ギャップ長ペナルティ１２およびギャップペナルティ４を使用することができる。
【０２３７】
ＤｓｉＲＮＡアンチセンス鎖と対象ＲＮＡ配列の一部との間で８０％を超える配列同一性、例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性が好ましい。あるいは、ＤｓｉＲＮＡは、対象とするＲＮＡの一部とハイブリダイズすることができる（例えば、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、４０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ  ｐＨ６．４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０℃または７０℃でのハイブリダイゼーションを１２〜１６時間；次いで洗浄）ヌクレオチド配列（またはオリゴヌクレオチド配列）として機能的に定義され得る。さらなる好適なハイブリダイゼーション条件としては、１×ＳＳＣ中７０℃もしくは１×ＳＳＣ中５０℃、５０％ホルムアミドでのハイブリダイゼーション、次いで０．３ｘＳＳＣ中７０℃での洗浄、または４ｘＳＳＣ中７０℃もしくは４ｘＳＳＣ中５０℃、５０％ホルムアミドでのハイブリダイゼーション、次いで１×ＳＳＣ中６７℃での洗浄が挙げられる。５０塩基対未満の長さであると予想されるハイブリッドのためのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）よりも５〜１０℃低くなければならず、ここでＴｍは、以下の方程式により決定される。１８塩基対未満の長さのハイブリッドでは、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基数）。１８〜４９塩基対の間の長さのハイブリッドでは、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）であり、式中、Ｎはハイブリッド中の塩基数であり、［Ｎａ＋］はハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオン濃度（１×ＳＳＣの［Ｎａ＋］＝０．１６５Ｍ）である。ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションのためのストリンジェンシー条件のさらなる例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，第９および１１章、ならびにＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，第２．１０および６．３−６．４節に記載されている。同一ヌクレオチド配列の長さは、少なくとも約１０、１２、１５、１７、２０、２２、２５、２７または３０塩基であり得る。
【０２３８】
「保存配列領域」は、ポリヌクレオチド中の１つ以上の領域のヌクレオチド配列が、世代間で、または１つの生物学的システム、被検体もしくは生物体と別の生物学的システム、被検体もしくは生物体とで有意に変化しないことを意味する。ポリヌクレオチドは、コードおよび非コードＤＮＡおよびＲＮＡを共に含み得る。
【０２３９】
「センス領域」は、ＤｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス領域と相補性を有するＤｓｉＲＮＡ分子のヌクレオチド配列を意味する。さらに、ＤｓｉＲＮＡ分子のセンス領域は、標的核酸配列と同一性を有する核酸配列を含み得る。
【０２４０】
「アンチセンス領域」は、標的核酸配列と相補性を有するＤｓｉＲＮＡ分子のヌクレオチド配列を意味する。さらに、ＤｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス領域は、ＤｓｉＲＮＡ分子のセンス領域と相補性を有する核酸配列を含む。
【０２４１】
本明細書で使用される「アンチセンス鎖」は、標的ＲＮＡの配列と相補的な配列を有する一本鎖核酸分子を指す。アンチセンス鎖が塩基類似体を有する修飾ヌクレオチドを含有する場合、それは必ずしもその全長にわたって相補的であるとは限らないが、少なくとも標的ＲＮＡとハイブリダイズしなければならない。
【０２４２】
本明細書で使用される「センス鎖」は、アンチセンス鎖の配列と相補的な配列を有する一本鎖核酸分子を指す。アンチセンス鎖が塩基類似体を有する修飾ヌクレオチドを含有する場合、センス鎖はアンチセンス鎖の全長にわたって相補的である必要はないが、少なくともアンチセンス鎖と二本鎖を形成しなければならない。
【０２４３】
本明細書で使用される「ガイド鎖」は、ＲＮＡ干渉をもたらすために標的ＲＮＡの配列と十分に相補的な配列を有する、ｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ含有分子の一本鎖核酸分子を指す。ダイサーによるｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ含有分子の切断後、ガイド鎖のフラグメントはＲＩＳＣと会合したままであり、ＲＩＳＣ複合体の構成要素として標的ＲＮＡと結合し、ＲＩＳＣによる標的ＲＮＡの切断を促進する。本明細書で使用されるガイド鎖は、必ずしも連続する一本鎖核酸を指すわけではなく、好ましくはダイサーにより切断される部位において、不連続性を有し得る。ガイド鎖はアンチセンス鎖である。
【０２４４】
本明細書で使用される「パッセンジャー鎖」は、ガイド鎖の配列と相補的な配列を有するｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ含有分子のオリゴヌクレオチド鎖を指す。本明細書で使用されるパッセンジャー鎖は、必ずしも連続する一本鎖核酸を指すわけではなく、好ましくはダイサーにより切断される部位において、不連続性を有し得る。パッセンジャー鎖はセンス鎖である。
【０２４５】
「標的核酸」は、その発現、レベルまたは活性が調節されるべき任意の核酸配列を意味する。標的核酸はＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。発現レベルを、対象とする標的の上流エフェクターの標的化を介して標的化してもよく、または調節もしくは誤制御された標的の作用を、例えば、対象とする標的のシグナル伝達経路の下流の分子を標的化することにより調節してもよい。
【０２４６】
公知の通り、ＲＮＡｉ法は、多種多様な生物体における多種多様な遺伝子に適用可能であり、本開示の組成物および方法は、上記それぞれとの関連において使用することができる。本開示の組成物および方法により標的化し得る遺伝子の例としては、細胞または通常は細胞に天然ではない遺伝子に天然な遺伝子である内因性遺伝子が挙げられる。このような遺伝子としては、癌遺伝子、サイトカイン遺伝子、イディオタイプ（Ｉｄ）タンパク質遺伝子、プリオン遺伝子、血管新生を誘導する分子を発現する遺伝子、接着分子、細胞表面受容体、転移関連タンパク質、プロテアーゼのための遺伝子、アポトーシス遺伝子、細胞周期制御遺伝子、ＥＧＦおよびＥＧＦ受容体を発現する遺伝子、ＭＤＲ１遺伝子のような多剤耐性遺伝子が非限定的に挙げられる。
【０２４７】
より具体的には、本発明の標的ｍＲＮＡは、細胞タンパク質（たとえば、核、細胞質、膜貫通または膜関連タンパク質）のアミノ酸配列を指定する。別の実施形態では、本発明の標的ｍＲＮＡは、細胞外タンパク質（例えば、細胞外基質タンパク質または分泌タンパク質）のアミノ酸配列を指定する。本明細書で使用される、タンパク質の「アミノ酸配列を指定する」という語句は、ｍＲＮＡ配列が遺伝暗号の規則に従ってアミノ酸配列に翻訳されることを意味する。以下のタンパク質のクラスを例示の目的で列挙する：発生タンパク質（例えば、接着分子、サイクリンキナーゼインヒビター、Ｗｎｔファミリーメンバー、Ｐａｘファミリーメンバー、Ｗｉｎｇｅｄへリックスファミリーメンバー、Ｈｏｘファミリーメンバー、サイトカイン／リンホカインおよびそれらの受容体、成長／分化因子およびそれらの受容体、神経伝達物質およびそれらの受容体）；癌遺伝子にコードされるタンパク質（例えば、ＡＢＬＩ、ＢＣＬＩ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ６、ＣＢＦＡ２、ＣＢＬ、ＣＳＦＩＲ、ＥＲＢＡ、ＥＲＢＢ、ＥＢＲＢ２、ＥＴＳＩ、ＥＴＳＩ、ＥＴＶ６、ＦＧＲ、ＦＯＳ、ＦＹＮ、ＨＣＲ、ＨＲＡＳ、ＪＵＮ、ＫＲＡＳ、ＬＣＫ、ＬＹＮ、ＭＤＭ２、ＭＬＬ、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬＩ、ＭＹＣＮ、ＮＲＡＳ、ＰＩＭ  Ｉ、ＰＭＬ、ＲＥＴ、ＳＲＣ、ＴＡＬＩ、ＴＣＬ３およびＹＥＳ）；腫瘍サプレッサータンパク質（例えば、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＭＡＤＨ４、ＭＣＣ、ＮＦＩ、ＮＦ２、ＲＢＩ、ＴＰ５３およびＷＴＩ）；および酵素（例えば、ＡＣＣシンターゼおよびオキシダーゼ、ＡＣＰデサチュラーゼおよびヒドロキシラーゼ、ＡＤＰ−グルコースピロホリラーゼ、ＡＴＰアーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、カルコンシンターゼ、キチナーゼ、シクロオキシゲナーゼ、デカルボキシラーゼ、デキストリナーゼ、ＤＮＡおよびＲＮＡポリメラーゼ、ガラクトシダーゼ、グルカナーゼ、グルコースオキシダーゼ、顆粒結合デンプンシンターゼ、ＧＴＰアーゼ、ヘリカーゼ、ヘミセルラーゼ、インテグラーゼ、イヌリナーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、リゾチーム、ノパリンシンターゼ、オクトピンシンターゼ、ペクチンエステラーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、ホスホリラーゼ、フィターゼ、植物成長制御因子シンターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテイナーゼおよびペプチダーゼ、プラナーゼ、リコンビナーゼ、逆転写酵素、ＲＵＢＩＳＣＯ、トポイソメラーゼおよびキシラナーゼ）、ＡｐｏＢ１００およびＨＰＲＴ１。
【０２４８】
一態様では、本発明の標的ｍＲＮＡ分子は、病的状態に関連するタンパク質のアミノ酸配列を指定する。例えば、タンパク質は、病原体関連タンパク質（例えば、宿主の免疫抑制、病原体の複製、病原体の伝染または感染の維持に関与するウイルスタンパク質）、あるいは宿主内への病原体の侵入、病原体もしくは宿主による薬物代謝、病原体ゲノムの複製もしくは組込み、宿主内での感染の確立もしくは伝播または次世代の病原体組立てを促進する宿主タンパク質であり得る。病原体としては、ＲＮＡウイルス、例えばフラビウイルス、ピコルナウイルス、ラブドウイルス、フィロウイルス、レンチウイルスを含めたレトロウイルスなど、またはＤＮＡウイルス、例えばアデノウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、ヘパドナウイルスなどが挙げられる。さらなる病原体としては、細菌、真菌、蠕虫、住血吸虫およびトリパノソーマが挙げられる。その他の種類の病原体としては、哺乳動物転移因子を挙げ得る。あるいは、タンパク質は腫瘍関連タンパク質または自己免疫性疾患関連タンパク質であり得る。
【０２４９】
標的遺伝子は、任意の生物体に由来するか、またはそれに含有され得る。生物体は、植物、動物、原生動物、細菌、ウイルスまたは真菌であり得る。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，５０６，５５９号を参照されたい。
【０２５０】
本発明の一実施形態では、本発明のＤｓｉＲＮＡ分子の各配列は、独立して約２５〜約３５ヌクレオチドの長さであり、特定の実施形態では、約２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４または３５ヌクレオチドの長さである。別の実施形態では、本発明のＤｓｉＲＮＡ二本鎖は、独立して約２５〜約３０塩基対（例えば、約２５、２６、２７、２８、２９または３０塩基対）を含む。別の実施形態では、本発明のＤｓｉＲＮＡ分子の１つ以上の鎖は独立して、対象とする標的核酸分子に相補的な約１９〜約３５個のヌクレオチド（例えば、約１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４または３５個）を含む。本発明の典型的なＤｓｉＲＮＡ分子を図１および以下に示す。
【０２５１】
本明細書で使用される「細胞」は、その通常の生物学的意味で使用され、多細胞生物全体を指すものではなく、例えば、特にヒトを指すものではない。細胞は、生物体、例えば、鳥類、植物および哺乳動物、例えばヒト、ウシ、ヒツジ、類人猿、サル、ブタ、イヌおよびネコなどの中に存在し得る。細胞は原核（例えば、細菌細胞）または真核（例えば、哺乳動物または植物細胞）であり得る。細胞は、体細胞または生殖系列起源、全能性または多能性、分裂または非分裂であり得る。細胞はまた、配偶子もしくは胚、幹細胞または完全に分化した細胞に由来し得るか、またはそれらを含み得る。特定の態様においては、「細胞」という用語は、特に、本開示の１つ以上の単離ｄｓＮＡ分子を含有する、ヒト細胞のような哺乳動物細胞を指す。特定の態様では、細胞は、標的核酸のＲＮＡ干渉を生じるｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ含有分子を有し、かつＲＮＡｉに必要なタンパク質およびタンパク質複合体、例えば、ダイサーおよびＲＩＳＣを含有する。
【０２５２】
本発明のＤｓｉＲＮＡ分子は直接加えるか、または陽イオン性脂質と複合体を形成するか、リポソーム内にパッケージするか、他の方法で標的細胞もしくは組織まで送達し得る。核酸または核酸複合体は、それらをバイオポリマー中に組み込むか、または組み込まずに、エキソビボで、または直接的な真皮適用、経皮適用または注射によりインビボで関連する組織へ局所的に投与し得る。本発明の特定の態様では、図１に示される典型的なｄｓＲＮＡ−ペプチド構造のｄｓＲＮＡは、ＤｓｉＲＮＡ剤の修飾様式の以下の記載に従って修飾し得る。図１に記載の構築物の化学的修飾形態および以下の典型的構造は、本明細書に記載のＤｓｉＲＮＡ剤に関して記載されているあらゆる使用において使用し得る。
【０２５３】
別の態様では、本発明は、本発明の１つ以上のＤｓｉＲＮＡ分子を含有する哺乳動物細胞を提供する。１つ以上のＤｓｉＲＮＡ分子は、独立して同じまたは異なる部位に標的化し得る。
【０２５４】
「ＲＮＡ」は、少なくとも１つのリボヌクレオチド残基を含む分子を意味する。「リボヌクレオチド」は、β−Ｄ−リボフラノース部分の２’位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドを意味する。この用語は、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、単離ＲＮＡ、例えば部分精製ＲＮＡ、実質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換え生成ＲＮＡ、ならびに１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または改変による、天然ＲＮＡとは異なる改変ＲＮＡなどを包含する。このような改変は、ＤｓｉＲＮＡの末端（１つまたは複数）への、または例えば、ＲＮＡの１つ以上のヌクレオチドの内側での非ヌクレオチド物質の付加を含み得る。本発明のＲＮＡ分子のヌクレオチドはまた、非天然ヌクレオチドまたは化学合成ヌクレオチもしくはデオキシヌクレオチドのような非標準ヌクレオチドも含み得る。これらの改変ＲＮＡは、類似体または天然ＲＮＡの類似体と呼ばれ得る。
【０２５５】
「被検体」は、外植細胞のドナーもしくはレシピエントである生物体またはその細胞自体を意味する。「被検体」はまた、本発明のＤｓｉＲＮＡ剤を投与され得る生物体も指す。被検体は、ヒトまたはヒト細胞を含めた、哺乳動物または哺乳動物細胞であり得る。
【０２５６】
「薬学的に許容される担体」という語句は、治療剤投与のための担体を指す。典型的な担体としては、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノールおよびそれらの組合せが挙げられる。経口投与される薬物に関して、薬学的に許容される担体としては、薬学的に許容される添加剤、例えば不活性希釈剤、崩壊剤、結合剤、潤滑剤、甘味剤、着香剤、着色剤および保存剤などが挙げられるが、これらに限定されない。適切な不活性希釈剤としては、炭酸ナトリウムおよびカルシウム、リン酸ナトリウムおよびカルシウム、ならびにラクトースが挙げられ、コーンスターチおよびアルギン酸は適切な崩壊剤である。結合剤としては、デンプンおよびゼラチンを挙げ得る一方、潤滑剤は、もし存在すれば、一般的にステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクであろう。必要に応じて、錠剤をモノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルのような物質でコーティングして、消化管での吸収を遅延させ得る。本開示のｄｓＲＮＡ組成物の薬学的に許容される担体は、ミセル構造体、例えばリポソーム、キャプシド、キャプソイド、ポリマーナノカプセルまたはポリマーマイクロカプセルなどであり得る。
【０２５７】
ポリマーナノカプセルまたはマイクロカプセルは、カプセル化または結合ｄｓＲＮＡの細胞内への輸送または放出を促進する。これらには、特にポリブチルシアノアクリレート含めた、ポリマーおよびモノマー材料が含まれる。材料および製造法の要約が公開されている（Ｋｒｅｕｔｅｒ，１９９１を参照されたい）。重合／ナノ粒子生成段階においてモノマーおよび／またはオリゴマー前駆体から形成されるポリマー材料は、それ自体が従来技術から知られるものであり、ナノ粒子製造分野の当業者が通常の技術に従って適切に選択し得るポリマー材料の分子量および分子量分布も同様に知られる。
【０２５８】
本発明の様々な方法が、値、レベル、特徴、特質、特性などを、本明細書において互換的に「適当な対照」と呼ばれる「適切な対照」と比較することを含む段階を含む。「適切な対照」または「適当な対照」は、比較目的に有用な当業者に公知の任意の対照または基準である。一実施形態では、「適切な対照」または「適当な対照」は、本明細書に記載のようにＲＮＡｉ法を行う前に決定される値、レベル、特徴、特質、特性などである。例えば、転写速度、ｍＲＮＡレベル、翻訳速度、タンパク質レベル、生物学的活性、細胞の特質または特性、遺伝子型、表現型などを、本発明のＲＮＡサイレンシング剤（例えば、ＤｓｉＲＮＡ）を細胞または生物体内に導入する前に決定し得る。別の実施形態では、「適切な対照」または「適当な対照」は、細胞または生物体、例えば正常な形質を示す、例えば対照または正常の細胞または生物体において決定される値、レベル、特徴、特質、特性などである。さらに別の実施形態では、「適切な対照」または「適当な対照」は、所定の値、レベル、特徴、特質、特性などである。
【０２５９】
「インビトロ」という用語は、例えば、精製試薬または抽出物、例えば細胞抽出物を含めた、当該技術分野において認められているその意味を有する。「インビトロ」という用語はまた、例えば、生細胞、例えば不死化細胞、初代細胞、細胞系および／または生体内の細胞を含めた、当該技術分野において認められているその意味も有する。
【０２６０】
本明細書で使用される「治療（処置）」または「治療（処置）すること」は、疾患もしくは障害または疾患もしくは障害の症状を治す、治癒させる、軽減する、緩和する、変化させる、矯正する、改善する、向上させるまたはそれらに影響を与える目的で、障害を有する患者に治療剤（例えば、ＤｓｉＲＮＡ剤またはそれをコードするベクターもしくは導入遺伝子）を投与または適用すること、あるいは障害を有する患者由来の単離組織または細胞系に治療剤を適用または投与することと定義される。「治療（処置）」または「治療（処置）すること」という用語はまた、本明細書では予防的な薬剤投与との関連においても使用される。「有効量」または「有効投与量」という用語は、所望の効果を達成する、または少なくとも部分的に達成するのに十分な量と定義される。「治療有効量」という用語は、既に疾患に罹患している患者における疾患およびその合併症を治す、または少なくとも部分的に阻止するのに十分な量と定義される。「患者」という用語は、予防的または治療的処置のいずれかを受けるヒトおよびその他の哺乳動物被検体を包含する。
【０２６１】
ｄｓＲＮＡ−ペプチドの設計／合成
２５〜約３５ヌクレオチド（ＤｓｉＲＮＡ）、および特に２５〜約３０ヌクレオチドの比較的長いｄｓＲＮＡ種が、意外にも効力および作用持続時間の点で、１９〜２３ｍｅｒ  ｓｉＲＮＡ剤と比べて効果的な結果を生じることが実験的に見出された。ｄｓＲＮＡプロセシング機序の基礎理論に拘束されることを望むものではないが、比較的長いｄｓＲＮＡ種は、細胞の細胞質中においてダイサー酵素の基質として働くと考えられる。本発明のｄｓＲＮＡをより短いセグメントに切断することに加え、ダイサーは、切断されたｄｓＲＮＡに由来する一本鎖切断産物の、対象とする標的ＲＮＡの破壊に関与するＲＩＳＣ複合体内への取込みを促進すると考えられる。ダイサーによるｄｓＲＮＡ種（特にＤｓｉＲＮＡ剤）の切断性は、ｄｓＲＮＡ種の効力および作用持続時間の増加と対応していることが、先行研究（Ｒｏｓｓｉら，米国特許出願公開第２００７／０２６５２２０号）により示されている。
【０２６２】
本発明は、第一鎖と第二鎖とを含む二本鎖ＲＮＡを含むｄｓＲＮＡであって、第一鎖および第二鎖が、少なくとも１６ヌクレオチド長かつ最大で５０ヌクレオチド長（例えば、１６〜５０、１９〜３５、１９〜２４、２５〜３０、２５、３５、１９〜２３および２１〜２３ヌクレオチド長）の長さであるｄｓＲＮＡを包含する。
【０２６３】
Ａ．ｄｓＲＮＡ
ＤｓｉＲＮＡを含めたｄｓＲＮＡの設計は、数多くの可能なＤｓｉＲＮＡ剤の予測される活性／有効性のコンピュータによる評価をある配列領域にわたり行う、予測スコアリングアルゴリズムの使用を任意に含み得る。このようなスコアリングアルゴリズムの設計に関する情報は、例えば、Ｇｏｎｇら（ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２００６，７：５１６）に見出すことができるが、より最近の「ｖ３」アルゴリズムは、当該技術分野においてこれまで利用可能であったｓｉＲＮＡスコアリングアルゴリズムに比べて理論的に向上したアルゴリズムである。（「ｖ３」スコアリングアルゴリズムは、ヒト配列におけるいかなるバイアスにも依らない機械学習アルゴリズムである。さらに、「ｖ３」アルゴリズムは、Ｇｏｎｇらに記載のような旧型「ｖ２」が導出を行うデータセットよりも約３倍大きなデータセットから導出を行う。）
【０２６４】
本発明のＤｓｉＲＮＡ剤の第一および第二のオリゴヌクレオチドは、完全に相補的である必要はない。実際、一実施形態では、センス鎖の３’末端は１つ以上のミスマッチを含有する。一態様では、約２つのミスマッチがセンス鎖の３’末端において組み込まれている。別の実施形態では、本発明のＤｓｉＲＮＡは、それぞれが２７ヌクレオチドの長さであり、かつ互いにアニールすれば、センス鎖の３’末端（アンチセンス鎖の５’末端）上に平滑末端および２ヌクレオチドミスマッチを有する２つのＲＮＡオリゴヌクレオチドを含有する、二本鎖ＲＮＡ分子である。ミスマッチの使用または低下した熱力学的安定性（特に、３’センス／５’アンチセンス位置において）が、おそらくｓｉＲＮＡのＲＩＳＣ内への移行と共に生じるいくつかの律速的な巻戻し段階に影響を与えることにより、アンチセンス鎖のＲＩＳＣ内への移行を促進する、または移行を有利にするということが提唱されている（Ｓｃｈｗａｒｚら，２００３，Ｃｅｌｌ  １１５：１９９−２０８；Ｋｈｖｏｒｏｖａら，２００３，Ｃｅｌｌ  １１５：２０９−２１６）。したがって、活性な２１ｍｅｒ  ｓｉＲＮＡ二本鎖の選択のために、末端塩基組成物が設計アルゴリズムに含まれてきた（Ｕｉ−Ｔｅｉら，２００４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３２：９３６−９４８；Ｒｅｙｎｏｌｄｓら，２００４，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２２：３２６−３３０）。この実施形態のｄｓＲＮＡのダイサー切断により、ミスマッチを含有する小さな終末端配列は、アンチセンス鎖と不対のままにされる（３’−オーバーハングの一部となる）か、または最終的な２１−ｍｅｒ  ｓｉＲＮＡから完全に切断されるかのいずれかとなる。したがって、これらの「ミスマッチ」は、ＲＩＳＣの最終的なＲＮＡ成分においてミスマッチとして存続しない。ダイサー基質のセンス鎖の３’末端における塩基ミスマッチまたはセグメントの不安定化は、おそらくダイサーによるプロセシングを促進することにより、ＲＮＡｉにおける合成二本鎖の効力を向上させたという発見は、２５〜３０ｍｅｒ  ｄｓＲＮＡ（本明細書では「ＤｓｉＲＮＡ」とも呼ばれる）の設計および使用について記載している過去の研究の驚くべき発見であった（Ｒｏｓｓｉら，米国特許出願公開第２００５／０２７７６１０号、第２００５／０２４４８５８号および第２００７／０２６５２２０号）。
【０２６５】
Ｂ．ペプチド
本発明は、ペプチドとコンジュゲートされた本発明のｄｓＲＮＡを含む組成物を提供する。
【０２６６】
送達ペプチド
特定の実施形態では、対象とするペプチドは、上で定義されるような送達ペプチドである。
【０２６７】
本発明による有用な送達ペプチド配列
本発明による有用な送達ペプチドは、非コンジュゲートｄｓＲＮＡと比べて、ｄｓＲＮＡの作用発現、送達されたｄｓＲＮＡによる作用持続時間または本発明のｄｓＲＮＡの送達速度の少なくとも１つを増大させる。本発明のペプチドは、本明細書で定義されるように、非コンジュゲートｄｓＲＮＡと比べて、対象とするｄｓＲＮＡが標的ＲＮＡに到達するまでの遅延時間が減少するように作用発現を減少させる。本発明による有用な送達ペプチドは、本明細書で定義されるように、非コンジュゲートｄｓＲＮＡと比べて、ｄｓＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートが標的ＲＮＡを長時間阻害するように作用持続時間を増加させる。本発明による有用な送達ペプチドは、本明細書で定義されるように、ｄｓＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートが非コンジュゲートｄｓＲＮＡよりも速く標的ＲＮＡに到達するようにｄｓＲＮＡの送達速度を増大させる。
【０２６８】
本発明に従えば、送達ペプチドのアミノ酸配列が決定され、送達されるｄｓＲＮＡに対して最適化される。本発明による送達ペプチドに有用なペプチド配列を本明細書に記載する。
【０２６９】
一実施形態では、本発明による送達ペプチドは、プロリン残基、例えば、ｘ１−Ｐ−ｘ２−Ｐ−ｘ３の配列を含み、式中、ｘ１およびｘ３は任意のアミノ酸または２〜５０個のアミノ酸を含むペプチドセグメントであり、ｘ２は０もしくは１個のアミノ酸または２〜２０個のアミノ酸を含むペプチドセグメントである。別の実施形態では、ｘ１＝５個のアミノ酸残基を含むペプチド；ｘ２＝７個のアミノ酸残基を含むペプチドおよびｘ３＝４個のアミノ酸残基を含むペプチドである。別の実施形態では、ｘ１＝８個のアミノ酸残基を含むペプチド；ｘ２＝７個のアミノ酸残基を含むペプチドおよびｘ３＝４個のアミノ酸残基を含むペプチドである。さらに別の実施形態では、ｘ１＝８個のアミノ酸残基を含むペプチド；ｘ２＝８個のアミノ酸残基を含むペプチドおよびｘ３＝４個のアミノ酸残基を含むペプチドである（Ｄｅｂｅｒら，Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．１９８６；２５１（１）：６８−７６；およびＤｕら，Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｒｅｓ．１９９８；５１（３）：２３５−４３．）。
【０２７０】
本発明に有用な送達ペプチド配列としては以下のもの：
VRGIITSKTKSLDKGYNKALNDL (配列番号1)
VRGIIPFKTKSLDEGYNKALNDL (配列番号2)
KSVKAPGI (配列番号3)
HKAIDGRSLYNKTLD (配列番号4)
LRLTKNSRDDST (配列番号5)
KNIVSVKGIRKSI (配列番号6)
KSVIPRKGTKAPPRL (配列番号7)
KPVMYKNTGKSEQ (配列番号8)
EFVMNPANAQGHTPGTRL (配列番号9)
EFVMNPANAQGHTAGTRL (配列番号10)
EFVMNAANAQGHTPGTRL (配列番号11)
EFVMNPANAQGRHTPGTRL (配列番号12)
NPKEFVMNPANAQGHTPGTRL (配列番号13)
NPKEFVMNPANAQGRHTPGTRL (配列番号14)
KKIIPPTNIRENLYNRTASLTDLGGEL (配列番号15)
CVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDL (配列番号16)
CVRGIIPFKTKSLDEGYNKALNDL (配列番号17)
CKSVKAPGI (配列番号18)
CHKAIDGRSLYNKTLD (配列番号19)
CLRLTKNSRDDST (配列番号20)
CKNIVSVKGIRKSI (配列番号21)
CKSVIPRKGTKAPPRL (配列番号22)
CKPVMYKNTGKSEQ (配列番号23)
CEFVMNPANAQGHTPGTRL (配列番号24)
CEFVMNPANAQGHTAGTRL (配列番号25)
CEFVMNAANAQGHTPGTRL (配列番号26)
CEFVMNPANAQGRHTPGTRL (配列番号27)
CNPKEFVMNPANAQGHTPGTRL (配列番号28)
CNPKEFVMNPANAQGRHTPGTRL (配列番号29)
CKKIIPPTNIRENLYNRTASLTDLGGEL (配列番号30)
GVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDL (配列番号31)
GVRGIIPFKTKSLDEGYNKALNDL (配列番号32)
GKSVKAPGI (配列番号33)
GHKAIDGRSLYNKTLD (配列番号34)
GLRLTKNSRDDST (配列番号35)
GKNIVSVKGIRKSI (配列番号36)
GKSVIPRKGTKAPPRL (配列番号37)
GKPVMYKNTGKSEQ (配列番号38)
GEFVMNPANAQGHTPGTRL (配列番号39)
GEFVMNPANAQGHTAGTRL (配列番号40)
GEFVMNAANAQGHTPGTRL (配列番号41)
GEFVMNPANAQGRHTPGTRL (配列番号42)
GNPKEFVMNPANAQGHTPGTRL (配列番号43)
GNPKEFVMNPANAQGRHTPGTRL (配列番号44)
GKKIIPPTNIRENLYNRTASLTDLGGEL (配列番号45)
VRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLC (配列番号46)
VRGIIPFKTKSLDEGYNKALNDLC (配列番号47)
KSVKAPGIC (配列番号48)
HKAIDGRSLYNKTLDC (配列番号49)
LRLTKNSRDDSTC (配列番号50)
KNIVSVKGIRKSIC (配列番号51)
KSVIPRKGTKAPPRLC (配列番号52)
KPVMYKNTGKSEQC (配列番号53)
EFVMNPANAQGHTPGTRLC (配列番号54)
EFVMNPANAQGHTAGTRLC (配列番号55)
EFVMNAANAQGHTPGTRLC (配列番号56)
EFVMNPANAQGRHTPGTRLC (配列番号57)
NPKEFVMNPANAQGHTPGTRLC (配列番号58)
NPKEFVMNPANAQGRHTPGTRLC (配列番号59)
KKIIPPTNIRENLYNRTASLTDLGGELC (配列番号60)
KSVKAPGIGGKSVKAPGI (配列番号61)
KSVKAPGIGGKSVKAPGIGGKSVKAPGI (配列番号62)
KSVKAPGIGG(KSVKAPGI)2 (配列番号63)
CKSVKAPGIGGKSVKAPGI (配列番号64)
CKSVKAPGIGGKSVKAPGIGGKSVKAPGI (配列番号65) 
GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYG (配列番号66)
CGLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYG (配列番号67)
GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYGC (配列番号68)
GRGDGG (配列番号69)
CRGDGG (配列番号70)
GRGDGC (配列番号71)
THALWHT (配列番号72)
GTHALWHT (配列番号73)
THALWHTG (配列番号74)
CTHALWHT (配列番号75)
THALWHTC (配列番号76)
QPFMQCLCLIYDASC (配列番号77)
GQPFMQCLCLIYDASC (配列番号78)
QPFMQCLCLIYDASCG (配列番号79)
RNVPPIFNDVYWIAF (配列番号80)
GRNVPPIFNDVYWIAF (配列番号81)
RNVPPIFNDVYWIAFG (配列番号82)
CRNVPPIFNDVYWIAF (配列番号83)
RNVPPIFNDVYWIAFC (配列番号84)
VFRVRPWYQSTSQS (配列番号85)
GVFRVRPWYQSTSQS (配列番号86)
VFRVRPWYQSTSQSG (配列番号87)
CVFRVRPWYQSTSQS (配列番号88)
VFRVRPWYQSTSQSC (配列番号89)
またはこれらの一部分が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２７１】
標的化ペプチド
他の実施形態では、対象とするペプチドは、上で定義されるような標的化ペプチドである。
【０２７２】
本発明に従って、標的化ペプチドのアミノ酸配列を決定し、送達のためのペプチドとコンジュゲートされたｄｓＲＮＡに対して最適化する。本発明による標的化ペプチドに有用なペプチド配列を本明細書に記載する。
【０２７３】
各リガンドファミリーには、異なるペプチド配列パターンが適切である。一実施形態では、本発明によるＬＤＬ−受容体の標的化に有用なペプチドは、ｘ１−Ｆ−ｘ２−ＹＧＧ−ｘ３の配列を含有してもよく、式中、ｘ１およびｘ３は任意のアミノ酸または２〜４０個のアミノ酸を含有するペプチドセグメントであり、ｘ２は任意のアミノ酸である。（Ｈｕｓｓａｉｎ，ＳｔｒｉｃｋｌａｎｄおよびＢａｋｉｌｌａｈ，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｎｕｔｒ．１９９９；１９：１４１−１７２．  Ｈｕｓｓａｉｎ，Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ．２００１；６：Ｄ４１７−Ｄ４２８）。
【０２７４】
本発明による有用な標的化ペプチド
本発明による有用な標的化ペプチドとしては、以下のリガンドのいずれかに由来のアミノ酸配列が挙げられるが、これらに限定されない：
１．副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）およびＰＴＨ−関連タンパク質
Ｐ０１２７０；ＰＴＨＹ＿ＨＵＭＡＮ
Ｐ２２８５８；ＰＴＨＲ＿ＭＯＵＳＥ
Ｑ８１１Ｓ６；Ｑ８１１Ｓ６＿ＭＯＵＳＥ
Ｐ０１２７０；ＰＴＨＹ＿ＨＵＭＡＮ
MIPAKDMAKV MIVMLAICFL TKSDGKSVKK RSVSEIQLMH NLGKHLNSME RVEWLRKKLQ DVHNFVALGA 
PLAPRDAGSQ RPRKKEDNVL VESHEKSLGE ADKADVNVLT KAKSQ (配列番号 90)
２．甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）
Ｐ０１２２２；ＴＳＨＢ＿ＨＵＭＡＮ
Ｐ１２６５６；ＴＳＨＢ＿ＭＯＵＳＥ
Ｐ０１２２２；ＴＳＨＢ＿ＨＵＭＡＮ
MTALFLMSML FGLACGQAMS FCIPTEYTMH IERRECAYCL TINTTICAGY CMTRDINGKL FLPKYALSQD 
VCTYRDFIYR TVEIPGCPLH VAPYFSYPVA LSCKCGKCNT DYSDCIHEAI KTNYCTKPQK SYLVGFSV (配列番号 91)
３．ＴＳＨ放出ホルモン
Ｂ２Ｒ８Ｒ１；Ｂ２Ｒ８Ｒ１＿ＨＵＭＡＮ
Ｂ２Ｒ８Ｒ１；Ｂ２Ｒ８Ｒ１＿ＨＵＭＡＮ
MPGPWLLLAL ALTLNLTGVP GGRAQPEAAQ QEAVTAAEHP GLDDFLRQVE RLLFLRENIQ RLQGDQGEHS 
ASQIFQSDWL SKRQHPGKRE EEEEEGVEEE EEEEGGAVGP HKRQHPGRRE DEASWSVDVT QHKRQHPGRR 
SPWLAYAVPK RQHPGRRLAD PKAQRSWEEE EEEEEREEDL MPEKRQHPGK RALGGPCGPQ GAYGQAGLLL 
GLLDDLSRSQ GAEEKRQHPG RRAAWVREPL EE (配列番号 92)
４．ＦＳＨ／ＬＨ放出ホルモン
Ｐ０１１４８；ＧＯＮ１＿ＨＵＭＡＮ
Ｏ４３５５５；ＧＯＮ２＿ＨＵＭＡＮ
Ｐ１３５６２；ＧＯＮ１＿ＭＯＵＳＥ
Ｐ０１１４８；ＧＯＮ１＿ＨＵＭＡＮ
MKPIQKLLAG LILLTWCVEG CSSQHWSYGL RPGGKRDAEN LIDSFQEIVK EVGQLAETQR FECTTHQPRS 
PLRDLKGALE SLIEEETGQK KI (配列番号93)
Ｏ４３５５５；ＧＯＮ２＿ＨＵＭＡＮ
MASSRRGLLL LLLLTAHLGP SEAQHWSHGW YPGGKRALSS AQDPQNALRP PGRALDTAAG SPVQTAHGLP 
SDALAPLDDS MPWEGRTTAQ WSLHRKRHLA RTLLTAAREP RPAPPSSNKV (配列番号94)
５．副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ＣＲＨ）
Ｐ０６８５０；ＣＲＦ＿ＨＵＭＡＮ
Ｑ８ＣＩＴ０；ＣＲＦ＿ＭＯＵＳＥ
Ｐ０６８５０；ＣＲＦ＿ＨＵＭＡＮ
MRLPLLVSAG VLLVALLPCP PCRALLSRGP VPGARQAPQH PQPLDFFQPP PQSEQPQQPQ ARPVLLRMGE 
EYFLRLGNLN KSPAAPLSPA SSLLAGGSGS RPSPEQATAN FFRVLLQQLL LPRRSLDSPA ALAERGARNA 
LGGHQEAPER ERRSEEPPIS LDLTFHLLRE VLEMARAEQL AQQAHSNRKL MEIIGK
(配列番号95)
６．副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）
Ｐ０１１８９；ＣＯＬＩ＿ＨＵＭＡＮ
Ｐ０１１９３；ＣＯＬＩ＿ＭＯＵＳＥ
Ｐ０１１８９；ＣＯＬＩ＿ＨＵＭＡＮ
MPRSCCSRSG ALLLALLLQA SMEVRGWCLE SSQCQDLTTE SNLLECIRAC KPDLSAETPM FPGNGDEQPL 
TENPRKYVMG HFRWDRFGRR NSSSSGSSGA GQKREDVSAG EDCGPLPEGG PEPRSDGAKP GPREGKRSYS 
MEHFRWGKPV GKKRRPVKVY PNGAEDESAE AFPLEFKREL TGQRLREGDG PDGPADDGAG AQADLEHSLL 
VAAEKKDEGP YRMEHFRWGS PPKDKRYGGF MTSEKSQTPL VTLFKNAIIK NAYKKGE (配列番号96)
７．プロテイナーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）リガンドおよびトロンビン受容体アゴニスト
Ｐ００７３４；ＴＨＲＢ＿ＨＵＭＡＮ
Ｐ１９２２１；ＴＨＲＢ＿ＭＯＵＳＥ
Ｐ００７３４；ＴＨＲＢ＿ＨＵＭＡＮ
MAHVRGLQLP GCLALAALCS LVHSQHVFLA PQQARSLLQR VRRANTFLEE VRKGNLEREC VEETCSYEEA 
FEALESSTAT DVFWAKYTAC ETARTPRDKL AACLEGNCAE GLGTNYRGHV NITRSGIECQ LWRSRYPHKP 
EINSTTHPGA DLQENFCRNP DSSTTGPWCY TTDPTVRRQE CSIPVCGQDQ VTVAMTPRSE GSSVNLSPPL 
EQCVPDRGQQ YQGRLAVTTH GLPCLAWASA QAKALSKHQD FNSAVQLVEN FCRNPDGDEE GVWCYVAGKP 
GDFGYCDLNY CEEAVEEETG DGLDEDSDRA IEGRTATSEY QTFFNPRTFG SGEADCGLRP LFEKKSLEDK 
TERELLESYI DGRIVEGSDA EIGMSPWQVM LFRKSPQELL CGASLISDRW VLTAAHCLLY PPWDKNFTEN 
DLLVRIGKHS RTRYERNIEK ISMLEKIYIH PRYNWRENLD RDIALMKLKK PVAFSDYIHP VCLPDRETAA 
SLLQAGYKGR VTGWGNLKET WTANVGKGQP SVLQVVNLPI VERPVCKDST RIRITDNMFC AGYKPDEGKR 
GDACEGDSGG PFVMKSPFNN RWYQMGIVSW GEGCDRDGKY GFYTHVFRLK KWIQKVIDQF GE (配列番号97)
８．補体受容体リガンド
Ｐ０１０２４；ＣＯ３＿ＨＵＭＡＮ
Ｐ０１０２７；ＣＯ３＿ＭＯＵＳＥ
Ｐ０１０２４；ＣＯ３＿ＨＵＭＡＮ
MGPTSGPSLL LLLLTHLPLA LGSPMYSIIT PNILRLESEE TMVLEAHDAQ GDVPVTVTVH DFPGKKLVLS 
SEKTVLTPAT NHMGNVTFTI PANREFKSEK GRNKFVTVQA TFGTQVVEKV VLVSLQSGYL FIQTDKTIYT 
PGSTVLYRIF TVNHKLLPVG RTVMVNIENP EGIPVKQDSL SSQNQLGVLP LSWDIPELVN MGQWKIRAYY 
ENSPQQVFST EFEVKEYVLP SFEVIVEPTE KFYYIYNEKG LEVTITARFL YGKKVEGTAF VIFGIQDGEQ 
RISLPESLKR IPIEDGSGEV VLSRKVLLDG VQNPRAEDLV GKSLYVSATV ILHSGSDMVQ AERSGIPIVT 
SPYQIHFTKT PKYFKPGMPF DLMVFVTNPD GSPAYRVPVA VQGEDTVQSL TQGDGVAKLS INTHPSQKPL 
SITVRTKKQE LSEAEQATRT MQALPYSTVG NSNNYLHLSV LRTELRPGET LNVNFLLRMD RAHEAKIRYY 
TYLIMNKGRL LKAGRQVREP GQDLVVLPLS ITTDFIPSFR LVAYYTLIGA SGQREVVADS VWVDVKDSCV 
GSLVVKSGQS EDRQPVPGQQ MTLKIEGDHG ARVVLVAVDK GVFVLNKKNK LTQSKIWDVV EKADIGCTPG 
SGKDYAGVFS DAGLTFTSSS GQQTAQRAEL QCPQPAARRR RSVQLTEKRM DKVGKYPKEL RKCCEDGMRE 
NPMRFSCQRR TRFISLGEAC KKVFLDCCNY ITELRRQHAR ASHLGLARSN LDEDIIAEEN IVSRSEFPES 
WLWNVEDLKE PPKNGISTKL MNIFLKDSIT TWEILAVSMS DKKGICVADP FEVTVMQDFF IDLRLPYSVV 
RNEQVEIRAV LYNYRQNQEL KVRVELLHNP AFCSLATTKR RHQQTVTIPP KSSLSVPYVI VPLKTGLQEV 
EVKAAVYHHF ISDGVRKSLK VVPEGIRMNK TVAVRTLDPE RLGREGVQKE DIPPADLSDQ VPDTESETRI 
LLQGTPVAQM TEDAVDAERL KHLIVTPSGC GEQNMIGMTP TVIAVHYLDE TEQWEKFGLE KRQGALELIK 
KGYTQQLAFR QPSSAFAAFV KRAPSTWLTA YVVKVFSLAV NLIAIDSQVL CGAVKWLILE KQKPDGVFQE 
DAPVIHQEMI GGLRNNNEKD MALTAFVLIS LQEAKDICEE QVNSLPGSIT KAGDFLEANY MNLQRSYTVA 
IAGYALAQMG RLKGPLLNKF LTTAKDKNRW EDPGKQLYNV EATSYALLAL LQLKDFDFVP PVVRWLNEQR 
YYGGGYGSTQ ATFMVFQALA QYQKDAPDHQ ELNLDVSLQL PSRSSKITHR IHWESASLLR SEETKENEGF 
TVTAEGKGQG TLSVVTMYHA KAKDQLTCNK FDLKVTIKPA PETEKRPQDA KNTMILEICT RYRGDQDATM 
SILDISMMTG FAPDTDDLKQ LANGVDRYIS KYELDKAFSD RNTLIIYLDK VSHSEDDCLA FKVHQYFNVE 
LIQPGAVKVY AYYNLEESCT RFYHPEKEDG KLNKLCRDEL CRCAEENCFI QKSDDKVTLE ERLDKACEPG 
VDYVYKTRLV KVQLSNDFDE YIMAIEQTIK SGSDEVQVGQ QRTFISPIKC REALKLEEKK HYLMWGLSSD 
FWGEKPNLSY IIGKDTWVEH WPEEDECQDE ENQKQCQDLG AFTESMVVFG CPN (配列番号 98)
Ｐ０Ｃ０Ｌ５；ＣＯ４Ｂ＿ＨＵＭＡＮ
MRLLWGLIWA SSFFTLSLQK PRLLLFSPSV VHLGVPLSVG VQLQDVPRGQ VVKGSVFLRN PSRNNVPCSP 
KVDFTLSSER DFALLSLQVP LKDAKSCGLH QLLRGPEVQL VAHSPWLKDS LSRTTNIQGI NLLFSSRRGH 
LFLQTDQPIY NPGQRVRYRV FALDQKMRPS TDTITVMVEN SHGLRVRKKE VYMPSSIFQD DFVIPDISEP 
GTWKISARFS DGLESNSSTQ FEVKKYVLPN FEVKITPGKP YILTVPGHLD EMQLDIQARY IYGKPVQGVA 
YVRFGLLDED GKKTFFRGLE SQTKLVNGQS HISLSKAEFQ DALEKLNMGI TDLQGLRLYV AAAIIESPGG 
EMEEAELTSW YFVSSPFSLD LSKTKRHLVP GAPFLLQALV REMSGSPASG IPVKVSATVS SPGSVPEVQD 
IQQNTDGSGQ VSIPIIIPQT ISELQLSVSA GSPHPAIARL TVAAPPSGGP GFLSIERPDS RPPRVGDTLN 
LNLRAVGSGA TFSHYYYMIL SRGQIVFMNR EPKRTLTSVS VFVDHHLAPS FYFVAFYYHG DHPVANSLRV 
DVQAGACEGK LELSVDGAKQ YRNGESVKLH LETDSLALVA LGALDTALYA AGSKSHKPLN MGKVFEAMNS 
YDLGCGPGGG DSALQVFQAA GLAFSDGDQW TLSRKRLSCP KEKTTRKKRN VNFQKAINEK LGQYASPTAK 
RCCQDGVTRL PMMRSCEQRA ARVQQPDCRE PFLSCCQFAE SLRKKSRDKG QAGLQRALEI LQEEDLIDED 
DIPVRSFFPE NWLWRVETVD RFQILTLWLP DSLTTWEIHG LSLSKTKGLC VATPVQLRVF REFHLHLRLP 
MSVRRFEQLE LRPVLYNYLD KNLTVSVHVS PVEGLCLAGG GGLAQQVLVP AGSARPVAFS VVPTAAAAVS 
LKVVARGSFE FPVGDAVSKV LQIEKEGAIH REELVYELNP LDHRGRTLEI PGNSDPNMIP DGDFNSYVRV 
TASDPLDTLG SEGALSPGGV ASLLRLPRGC GEQTMIYLAP TLAASRYLDK TEQWSTLPPE TKDHAVDLIQ 
KGYMRIQQFR KADGSYAAWL SRDSSTWLTA FVLKVLSLAQ EQVGGSPEKL QETSNWLLSQ QQADGSFQDL 
SPVIHRSMQG GLVGNDETVA LTAFVTIALH HGLAVFQDEG AEPLKQRVEA SISKANSFLG EKASAGLLGA 
HAAAITAYAL SLTKAPVDLL GVAHNNLMAM AQETGDNLYW GSVTGSQSNA VSPTPAPRNP SDPMPQAPAL 
WIETTAYALL HLLLHEGKAE MADQASAWLT RQGSFQGGFR STQDTVIALD ALSAYWIASH TTEERGLNVT 
LSSTGRNGFK SHALQLNNRQ IRGLEEELQF SLGSKINVKV GGNSKGTLKV LRTYNVLDMK NTTCQDLQIE 
VTVKGHVEYT MEANEDYEDY EYDELPAKDD PDAPLQPVTP LQLFEGRRNR RRREAPKVVE EQESRVHYTV 
CIWRNGKVGL SGMAIADVTL LSGFHALRAD LEKLTSLSDR YVSHFETEGP HVLLYFDSVP TSRECVGFEA 
VQEVPVGLVQ PASATLYDYY NPERRCSVFY GAPSKSRLLA TLCSAEVCQC AEGKCPRQRR ALERGLQDED 
GYRMKFACYY PRVEYGFQVK VLREDSRAAF RLFETKITQV LHFTKDVKAA ANQMRNFLVR ASCRLRLEPG 
KEYLIMGLDG ATYDLEGHPQ YLLDSNSWIE EMPSERLCRS TRQRAACAQL NDFLQEYGTQ GCQV (配列番号99)
９．ＬＤＬ受容体ファミリーに対するリガンド
Ｐ０５０６７；Ａ４＿ＨＵＭＡＮ
Ｐ１２０２３；Ａ４＿ＭＯＵＳＥ
Ｐ０５０６７；Ａ４＿ＨＵＭＡＮ
MLPGLALLLL AAWTARALEV PTDGNAGLLA EPQIAMFCGR LNMHMNVQNG KWDSDPSGTK TCIDTKEGIL 
QYCQEVYPEL QITNVVEANQ PVTIQNWCKR GRKQCKTHPH FVIPYRCLVG EFVSDALLVP DKCKFLHQER 
MDVCETHLHW HTVAKETCSE KSTNLHDYGM LLPCGIDKFR GVEFVCCPLA EESDNVDSAD AEEDDSDVWW 
GGADTDYADG SEDKVVEVAE EEEVAEVEEE EADDDEDDED GDEVEEEAEE PYEEATERTT SIATTTTTTT 
ESVEEVVREV CSEQAETGPC RAMISRWYFD VTEGKCAPFF YGGCGGNRNN FDTEEYCMAV CGSAMSQSLL 
KTTQEPLARD PVKLPTTAAS TPDAVDKYLE TPGDENEHAH FQKAKERLEA KHRERMSQVM REWEEAERQA 
KNLPKADKKA VIQHFQEKVE SLEQEAANER QQLVETHMAR VEAMLNDRRR LALENYITAL QAVPPRPRHV 
FNMLKKYVRA EQKDRQHTLK HFEHVRMVDP KKAAQIRSQV MTHLRVIYER MNQSLSLLYN VPAVAEEIQD 
EVDELLQKEQ NYSDDVLANM ISEPRISYGN DALMPSLTET KTTVELLPVN GEFSLDDLQP WHSFGADSVP 
ANTENEVEPV DARPAADRGL TTRPGSGLTN IKTEEISEVK MDAEFRHDSG YEVHHQKLVF FAEDVGSNKG 
AIIGLMVGGV VIATVIVITL VMLKKKQYTS IHHGVVEVDA AVTPEERHLS KMQQNGYENP TYKFFEQMQN (配列番号100)
１０．内分泌および外分泌受容体リガンド
Ｐ０１２４１；ＳＯＭＡ＿ＨＵＭＡＮ
Ｐ０６８８０；ＳＯＭＡ＿ＭＯＵＳＥ
Ｑ９ＵＢＵ３；ＧＨＲＬ＿ＨＵＭＡＮ
Ｑ９ＥＱＸ０；ＧＨＲＬ＿ＭＯＵＳＥ
Ｐ０１２４１；ＳＯＭＡ＿ＨＵＭＡＮ
MATGSRTSLL LAFGLLCLPW LQEGSAFPTI PLSRLFDNAM LRAHRLHQLA FDTYQEFEEA YIPKEQKYSF 
LQNPQTSLCF SESIPTPSNR EETQQKSNLE LLRISLLLIQ SWLEPVQFLR SVFANSLVYG ASDSNVYDLL 
KDLEEGIQTL MGRLEDGSPR TGQIFKQTYS KFDTNSHNDD ALLKNYGLLY CFRKDMDKVE TFLRIVQCRS 
VEGSCGF (配列番号101)
Ｑ９ＵＢＵ３；ＧＨＲＬ＿ＨＵＭＡＮ
MPSPGTVCSL LLLGMLWLDL AMAGSSFLSP EHQRVQQRKE SKKPPAKLQP RALAGWLRPE DGGQAEGAED 
ELEVRFNAPF DVGIKLSGVQ YQQHSQALGK FLQDILWEEA KEAPADK (配列番号 102)
１１．トランスフォーミング増殖因子リガンド
Ｐ０１１３７；ＴＧＦＢ１＿ＨＵＭＡＮ
Ｐ０４２０２；ＴＧＦＢ１＿ＭＯＵＳＥ
Ｐ０１１３７；ＴＧＦＢ１＿ＨＵＭＡＮ
MPPSGLRLLL LLLPLLWLLV LTPGRPAAGL STCKTIDMEL VKRKRIEAIR GQILSKLRLA SPPSQGEVPP 
GPLPEAVLAL YNSTRDRVAG ESAEPEPEPE ADYYAKEVTR VLMVETHNEI YDKFKQSTHS IYMFFNTSEL 
REAVPEPVLL SRAELRLLRL KLKVEQHVEL YQKYSNNSWR YLSNRLLAPS DSPEWLSFDV TGVVRQWLSR 
GGEIEGFRLS AHCSCDSRDN TLQVDINGFT TGRRGDLATI HGMNRPFLLL MATPLERAQH LQSSRHRRAL 
DTNYCFSSTE KNCCVRQLYI DFRKDLGWKW IHEPKGYHAN FCLGPCPYIW SLDTQYSKVL ALYNQHNPGA 
SAAPCCVPQA LEPLPIVYYV GRKPKVEQLS NMIVRSCKCS (配列番号103)
１２．ケモカイン受容体リガンド
Ｐ１３５００；ＣＣＬ２＿ＨＵＭＡＮ
Ｐ１０１４８；ＣＣＬ２＿ＭＯＵＳＥ
Ｐ１３５００；ＣＣＬ２＿ＨＵＭＡＮ
MKVSAALLCL LLIAATFIPQ GLAQPDAINA PVTCCYNFTN RKISVQRLAS YRRITSSKCP KEAVIFKTIV 
AKEICADPKQ KWVQDSMDHL DKQTQTPKT (配列番号104)
１３．インテグリン
Ｐ０５５５６；ＩＴＢ１＿ＨＵＭＡＮ
Ｐ０９０５５；ＩＴＢ１＿ＭＯＵＳＥ 
Ｐ０５５５６；ＩＴＢ１＿ＨＵＭＡＮ
MNLQPIFWIG LISSVCCVFA QTDENRCLKA NAKSCGECIQ AGPNCGWCTN STFLQEGMPT SARCDDLEAL 
KKKGCPPDDI ENPRGSKDIK KNKNVTNRSK GTAEKLKPED ITQIQPQQLV LRLRSGEPQT FTLKFKRAED 
YPIDLYYLMD LSYSMKDDLE NVKSLGTDLM NEMRRITSDF RIGFGSFVEK TVMPYISTTP AKLRNPCTSE 
QNCTSPFSYK NVLSLTNKGE VFNELVGKQR ISGNLDSPEG GFDAIMQVAV CGSLIGWRNV TRLLVFSTDA 
GFHFAGDGKL GGIVLPNDGQ CHLENNMYTM SHYYDYPSIA HLVQKLSENN IQTIFAVTEE FQPVYKELKN 
LIPKSAVGTL SANSSNVIQL IIDAYNSLSS EVILENGKLS EGVTISYKSY CKNGVNGTGE NGRKCSNISI 
GDEVQFEISI TSNKCPKKDS DSFKIRPLGF TEEVEVILQY ICECECQSEG IPESPKCHEG NGTFECGACR 
CNEGRVGRHC ECSTDEVNSE DMDAYCRKEN SSEICSNNGE CVCGQCVCRK RDNTNEIYSG KFCECDNFNC 
DRSNGLICGG NGVCKCRVCE CNPNYTGSAC DCSLDTSTCE ASNGQICNGR GICECGVCKC TDPKFQGQTC 
EMCQTCLGVC AEHKECVQCR AFNKGEKKDT CTQECSYFNI TKVESRDKLP QPVQPDPVSH CKEKDVDDCW 
FYFTYSVNGN NEVMVHVVEN PECPTGPDII PIVAGVVAGI VLIGLALLLI WKLLMIIHDR REFAKFEKEK 
MNAKWDTGEN PIYKSAVTTV VNPKYEGK (配列番号105)
１４．インターロイキン
Ｑ１３１６９；Ｑ１３１６９＿ＨＵＭＡＮ
Ｑ０ＰＧＳ４；Ｑ０ＰＧＳ４＿ＭＯＵＳＥ
Ｑ１３１６９；Ｑ１３１６９＿ＨＵＭＡＮ
MYRMQLLSCI ALILALVTNS APTSSSTKKT KKTQLQLEHL LLDLQMILNG INNYKNPKLT RMLTFKFYMP 
KKATELKQLQ CLEEELKPLE EVLNLAQSKN FHLRPRDLIS NINVIVLELK GSETTFMCEY ADETATIVEF 
LNRWITFCQS IISTLT (配列番号106)
１５．分化因子様骨分化因子
Ｐ１３４９７；ＢＭＰ１＿ＨＵＭＡＮ
Ｐ９８０６３；ＢＭＰ１＿ＭＯＵＳＥ
Ｐ１３４９７；ＢＭＰ１＿ＨＵＭＡＮ
MPGVARLPLL LGLLLLPRPG RPLDLADYTY DLAEEDDSEP LNYKDPCKAA AFLGDIALDE EDLRAFQVQQ 
AVDLRRHTAR KSSIKAAVPG NTSTPSCQST NGQPQRGACG RWRGRSRSRR AATSRPERVW PDGVIPFVIG 
GNFTGSQRAV FRQAMRHWEK HTCVTFLERT DEDSYIVFTY RPCGCCSYVG RRGGGPQAIS IGKNCDKFGI 
VVHELGHVVG FWHEHTRPDR DRHVSIVREN IQPGQEYNFL KMEPQEVESL GETYDFDSIM HYARNTFSRG 
IFLDTIVPKY EVNGVKPPIG QRTRLSKGDI AQARKLYKCP ACGETLQDST GNFSSPEYPN GYSAHMHCVW 
RISVTPGEKI ILNFTSLDLY RSRLCWYDYV EVRDGFWRKA PLRGRFCGSK LPEPIVSTDS RLWVEFRSSS 
NWVGKGFFAV YEAICGGDVK KDYGHIQSPN YPDDYRPSKV CIWRIQVSEG FHVGLTFQSF EIERHDSCAY 
DYLEVRDGHS ESSTLIGRYC GYEKPDDIKS TSSRLWLKFV SDGSINKAGF AVNFFKEVDE CSRPNRGGCE 
QRCLNTLGSY KCSCDPGYEL APDKRRCEAA CGGFLTKLNG SITSPGWPKE YPPNKNCIWQ LVAPTQYRIS 
LQFDFFETEG NDVCKYDFVE VRSGLTADSK LHGKFCGSEK PEVITSQYNN MRVEFKSDNT VSKKGFKAHF 
FSDKDECSKD NGGCQQDCVN TFGSYECQCR SGFVLHDNKH DCKEAGCDHK VTSTSGTITS PNWPDKYPSK 
KECTWAISST PGHRVKLTFM EMDIESQPEC AYDHLEVFDG RDAKAPVLGR FCGSKKPEPV LATGSRMFLR 
FYSDNSVQRK GFQASHATEC GGQVRADVKT KDLYSHAQFG DNNYPGGVDC EWVIVAEEGY GVELVFQTFE 
VEEETDCGYD YMELFDGYDS TAPRLGRYCG SGPPEEVYSA GDSVLVKFHS DDTITKKGFH LRYTSTKFQD 
TLHSRK (配列番号107)
１６．ガストリン放出ペプチド
Ｐ０７４９２；ＧＲＰ＿ＨＵＭＡＮ
Ｑ８Ｒ１Ｉ２；ＧＲＰ＿ＭＯＵＳＥ
Ｐ０７４９２；ＧＲＰ＿ＨＵＭＡＮ
MRGSELPLVL LALVLCLAPR GRAVPLPAGG GTVLTKMYPR GNHWAVGHLM GKKSTGESSS VSERGSLKQQ 
LREYIRWEEA ARNLLGLIEA KENRNHQPPQ PKALGNQQPS WDSEDSSNFK DVGSKGKVGR LSAPGSQREG 
RNPQLNQQ (配列番号108)
１７．血管作動性腸ペプチド（ＶＩＰ）
Ｐ０１２８２；ＶＩＰ＿ＨＵＭＡＮ
Ｐ３２６４８；ＶＩＰ＿ＭＯＵＳＥ
Ｐ０１２８２；ＶＩＰ＿ＨＵＭＡＮ
MDTRNKAQLL VLLTLLSVLF SQTSAWPLYR APSALRLGDR IPFEGANEPD QVSLKEDIDM LQNALAENDT 
PYYDVSRNAR HADGVFTSDF SKLLGQLSAK KYLESLMGKR VSSNISEDPV PVKRHSDAVF TDNYTRLRKQ 
MAVKKYLNSI LNGKRSSEGE SPDFPEELEK (配列番号109)
１８．インスリンおよびインスリン様増殖因子
Ｐ０１３０８；ＩＮＳ＿ＨＵＭＡＮ
Ｐ０１３４３；ＩＧＦ１Ａ＿ＨＵＭＡＮ
Ｐ０５０１９；ＩＧＦ１Ｂ＿ＨＵＭＡＮ
Ｐ０５０１７；ＩＧＦ１＿ＭＯＵＳＥ
Ｐ０１３０８；ＩＮＳ＿ＨＵＭＡＮ
MALWMRLLPL LALLALWGPD PAAAFVNQHL CGSHLVEALY LVCGERGFFY TPKTRREAED LQVGQVELGG 
GPGAGSLQPL ALEGSLQKRG IVEQCCTSIC SLYQLENYCN(配列番号110)
Ｐ０１３４３；ＩＧＦ１Ａ＿ＨＵＭＡＮ
MGKISSLPTQ LFKCCFCDFL KVKMHTMSSS HLFYLALCLL TFTSSATAGP ETLCGAELVD ALQFVCGDRG 
FYFNKPTGYG SSSRRAPQTG IVDECCFRSC DLRRLEMYCA PLKPAKSARS VRAQRHTDMP KTQKEVHLKN 
ASRGSAGNKN YRM(配列番号111)
Ｐ０５０１９；ＩＧＦ１Ｂ＿ＨＵＭＡＮ
MGKISSLPTQ LFKCCFCDFL KVKMHTMSSS HLFYLALCLL TFTSSATAGP ETLCGAELVD ALQFVCGDRG 
FYFNKPTGYG SSSRRAPQTG IVDECCFRSC DLRRLEMYCA PLKPAKSARS VRAQRHTDMP KTQKYQPPST 
NKNTKSQRRK GWPKTHPGGE QKEGTEASLQ IRGKKKEQRR EIGSRNAECR GKKGK (配列番号112)
１９．カルシトニンおよびカルシトニン遺伝子関連ペプチド
Ｐ０１２５８；ＣＡＬＣ＿ＨＵＭＡＮ
Ｐ７０１６０；ＣＡＬＣ＿ＭＯＵＳＥ
Ｐ０１２５８；ＣＡＬＣ＿ＨＵＭＡＮ
MGFQKFSPFL ALSILVLLQA GSLHAAPFRS ALESSPADPA TLSEDEARLL LAALVQDYVQ MKASELEQEQ 
EREGSSLDSP RSKRCGNLST CMLGTYTQDF NKFHTFPQTA IGVGAPGKKR DMSSDLERDH RPHVSMPQNA 
N (配列番号113)
２０．炎症性細胞様マスト細胞、好酸球、マクロファージ、単球および好中球に対するリガンド
Ｐ０９６０３；ＣＳＦ１＿ＨＵＭＡＮ
Ｐ０７１４１；ＣＳＦ１＿ＭＯＵＳＥ
Ｐ０Ｃ０Ｌ５；ＣＯ４Ｂ＿ＨＵＭＡＮ
Ｐ０１０２９；ＣＯ４Ｂ＿ＭＯＵＳＥ
Ｐ０９６０３；ＣＳＦ１＿ＨＵＭＡＮ
MTAPGAAGRC PPTTWLGSLL LLVCLLASRS ITEEVSEYCS HMIGSGHLQS LQRLIDSQME TSCQITFEFV 
DQEQLKDPVC YLKKAFLLVQ DIMEDTMRFR DNTPNAIAIV QLQELSLRLK SCFTKDYEEH DKACVRTFYE 
TPLQLLEKVK NVFNETKNLL DKDWNIFSKN CNNSFAECSS QDVVTKPDCN CLYPKAIPSS DPASVSPHQP 
LAPSMAPVAG LTWEDSEGTE GSSLLPGEQP LHTVDPGSAK QRPPRSTCQS FEPPETPVVK DSTIGGSPQP 
RPSVGAFNPG MEDILDSAMG TNWVPEEASG EASEIPVPQG TELSPSRPGG GSMQTEPARP SNFLSASSPL 
PASAKGQQPA DVTGTALPRV GPVRPTGQDW NHTPQKTDHP SALLRDPPEP GSPRISSLRP QGLSNPSTLS 
AQPQLSRSHS SGSVLPLGEL EGRRSTRDRR SPAEPEGGPA SEGAARPLPR FNSVPLTDTG HERQSEGSSS 
PQLQESVFHL LVPSVILVLL AVGGLLFYRW RRRSHQEPQR ADSPLEQPEG SPLTQDDRQV ELPV (配列番号114)
【０２７５】
本発明による有用なさらなる標的化ペプチドとしては以下のもの：
GTFVYGGCRAKRNNFKSAED (配列番号115)
GPFFYGGCGGNRNNFDTEEY (配列番号116)
GTFFYGGCRGKRNNFKTEEY (配列番号117)
GTFFYGGSRGKRNNFKTEEY (配列番号118)
GRFFYGGSRGKRNNFRTEEY (配列番号119)
GTFFYGGSRGRRNNFRTEEY (配列番号120) 
CTFVYGGCRAKRNNFKSAED (配列番号121)
CPFFYGGCGGNRNNFDTEEY (配列番号122)
CTFFYGGCRGKRNNFKTEEY (配列番号123)
CTFFYGGSRGKRNNFKTEEY (配列番号124)
CRFFYGGSRGKRNNFRTEEY (配列番号125)
CTFFYGGSRGRRNNFRTEEY (配列番号126)
TFVYGGCRAKRNNFKSAEDG (配列番号127)
PFFYGGCGGNRNNFDTEEYG (配列番号128)
TFFYGGCRGKRNNFKTEEYG (配列番号129)
TFFYGGSRGKRNNFKTEEYG (配列番号130)
RFFYGGSRGKRNNFRTEEYG (配列番号131)
TFFYGGSRGRRNNFRTEEYG (配列番号132)
TFVYGGCRAKRNNFKSAEDC (配列番号133)
PFFYGGCGGNRNNFDTEEYC (配列番号134)
TFFYGGCRGKRNNFKTEEYC (配列番号135)
TFFYGGSRGKRNNFKTEEYC (配列番号136)
RFFYGGSRGKRNNFRTEEYC (配列番号137)
TFFYGGSRGRRNNFRTEEYC (配列番号138)
STEELRVRLASHLRKLRKRLL (配列番号 149)
SSVIDALQYKLEGTTRLTRKRGLKLATALSLSNKFVEGS (配列番号 150)
EELRVRLASHLRKLRKRLLRDADDLQK (配列番号 154)
GQSTEELRARLASHLRKLRKR (配列番号 155)
RLASHLRKLRKRLLRD (配列番号 156)
H2N-c[D(Cys-Ser-Lys-Cys)]Gly-Peg12-Lys (配列番号 151)
H2N-c[Cys-Phe-Thr-Lys-D-Trp-Phe-Phe-Cys]-Peg12-Lys (配列番号 152)
H2N-Thr-Phe-Thr-Lys-D-Trp-Phe-Phe-D-Phe- Peg12-Lys (配列番号 153)
が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２７６】
一実施形態では、本発明のペプチドは、転移ドメイン、例えば神経毒の転移ドメインとコンジュゲートされている。本発明による有用な神経毒転移ドメインペプチド配列としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない。ペプチド配列は、配列内の任意のサブユニットから選択される。本発明の指定に適合する配列に基づいたペプチドセグメントが選択される。
１．Ａ型ボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ／Ａ）（ＥＣ３．４．２４．６９）（ボントキシリシン−Ａ）
Ｐ１０８４５；ＢＸＡ１＿ＣＬＯＢＯ
MPFVNKQFNY KDPVNGVDIA YIKIPNVGQM QPVKAFKIHN KIWVIPERDT FTNPEEGDLN PPPEAKQVPV 
SYYDSTYLST DNEKDNYLKG VTKLFERIYS TDLGRMLLTS IVRGIPFWGG STIDTELKVI DTNCINVIQP 
DGSYRSEELN LVIIGPSADI IQFECKSFGH EVLNLTRNGY GSTQYIRFSP DFTFGFEESL EVDTNPLLGA 
GKFATDPAVT LAHELIHAGH RLYGIAINPN RVFKVNTNAY YEMSGLEVSF EELRTFGGHD AKFIDSLQEN 
EFRLYYYNKF KDIASTLNKA KSIVGTTASL QYMKNVFKEK YLLSEDTSGK FSVDKLKFDK LYKMLTEIYT 
EDNFVKFFKV LNRKTYLNFD KAVFKINIVP KVNYTIYDGF NLRNTNLAAN FNGQNTEINN MNFTKLKNFT 
GLFEFYKLLC VRGIITSKTK SLDKGYNKAL NDLCIKVNNW DLFFSPSEDN FTNDLNKGEE ITSDTNIEAA 
EENISLDLIQ QYYLTFNFDN EPENISIENL SSDIIGQLEL MPNIERFPNG KKYELDKYTM FHYLRAQEFE 
HGKSRIALTN SVNEALLNPS RVYTFFSSDY VKKVNKATEA AMFLGWVEQL VYDFTDETSE VSTTDKIADI 
TIIIPYIGPA LNIGNMLYKD DFVGALIFSG AVILLEFIPE IAIPVLGTFA LVSYIANKVL TVQTIDNALS 
KRNEKWDEVY KYIVTNWLAK VNTQIDLIRK KMKEALENQA EATKAIINYQ YNQYTEEEKN NINFNIDDLS 
SKLNESINKA MININKFLNQ CSVSYLMNSM IPYGVKRLED FDASLKDALL KYIYDNRGTL IGQVDRLKDK 
VNNTLSTDIP FQLSKYVDNQ RLLSTFTEYI KNIINTSILN LRYESNHLID LSRYASKINI GSKVNFDPID 
KNQIQLFNLE SSKIEVILKN AIVYNSMYEN FSTSFWIRIP KYFNSISLNN EYTIINCMEN NSGWKVSLNY 
GEIIWTLQDT QEIKQRVVFK YSQMINISDY INRWIFVTIT NNRLNNSKIY INGRLIDQKP ISNLGNIHAS 
NNIMFKLDGC RDTHRYIWIK YFNLFDKELN EKEIKDLYDN QSNSGILKDF WGDYLQYDKP YYMLNLYDPN 
KYVDVNNVGI RGYMYLKGPR GSVMTTNIYL NSSLYRGTKF IIKKYASGNK DNIVRNNDRV YINVVVKNKE 
YRLATNASQA GVEKILSALE IPDVGNLSQV VVMKSKNDQG ITNKCKMNLQ DNNGNDIGFI GFHQFNNIAK 
LVASNWYNRQ IERSSRTLGC SWEFIPVDDG WGERPL (配列番号 139)
２．Ｂ型ボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ／Ｂ）（ＥＣ３．４．２４．６９）（ボントキシリシン−Ｂ）
Ｂ１ＩＮＰ５；ＢＸＢ＿ＣＬＯＢＫ
MPVTINNFNY NDPIDNNNII MMEPPFARGT GRYYKAFKIT DRIWIIPERY TFGYKPEDFN KSSGIFNRDV 
CEYYDPDYLN TNDKKNIFLQ TMIKLFNRIK SKPLGEKLLE MIINGIPYLG DRRVPLEEFN TNIASVTVNK 
LISNPGEVER KKGIFANLII FGPGPVLNEN ETIDIGIQNH FASREGFGGI MQMKFCPEYV SVFNNVQENK 
GASIFNRRGY FSDPALILMH ELIHVLHGLY GIKVDDLPIV PNEKKFFMQS TDAIQAEELY TFGGQDPSII 
TPSTDKSIYD KVLQNFRGIV DRLNKVLVCI SDPNININIY KNKFKDKYKF VEDSEGKYSI DVESFDKLYK 
SLMFGFTETN IAENYKIKTR ASYFSDSLPP VKIKNLLDNE IYTIEEGFNI SDKDMEKEYR GQNKAINKQA 
YEEISKEHLA VYKIQMCKSV KAPGICIDVD NEDLFFIADK NSFSDDLSKN ERIEYNTQSN YIENDFPINE 
LILDTDLISK IELPSENTES LTDFNVDVPV YEKQPAIKKI FTDENTIFQY LYSQTFPLDI RDISLTSSFD 
DALLFSNKVY SFFSMDYIKT ANKVVEAGLF AGWVKQIVND FVIEANKSNT MDKIADISLI VPYIGLALNV 
GNETAKGNFE NAFEIAGASI LLEFIPELLI PVVGAFLLES YIDNKNKIIK TIDNALTKRN EKWSDMYGLI 
VAQWLSTVNT QFYTIKEGMY KALNYQAQAL EEIIKYRYNI YSEKEKSNIN IDFNDINSKL NEGINQAIDN 
INNFINGCSV SYLMKKMIPL AVEKLLDFDN TLKKNLLNYI DENKLYLIGS AEYEKSKVNK YLKTIMPFDL 
SIYTNDTILI EMFNKYNSEI LNNIILNLRY KDNNLIDLSG YGAKVEVYDG VELNDKNQFK LTSSANSKIR 
VTQNQNIIFN SVFLDFSVSF WIRIPKYKND GIQNYIHNEY TIINCMKNNS GWKISIRGNR IIWTLIDING 
KTKSVFFEYN IREDISEYIN RWFFVTITNN LNNAKIYING KLESNTDIKD IREVIANGEI IFKLDGDIDR 
TQFIWMKYFS IFNTELSQSN IEERYKIQSY SEYLKDFWGN PLMYNKEYYM FNAGNKNSYI KLKKDSPVGE 
ILTRSKYNQN SKYINYRDLY IGEKFIIRRK SNSQSINDDI VRKEDYIYLD FFNLNQEWRV YTYKYFKKEE 
EKLFLAPISD SDEFYNTIQI KEYDEQPTYS CQLLFKKDEE STDEIGLIGI HRFYESGIVF EEYKDYFCIS 
KWYLKEVKRK PYNLKLGCNW QFIPKDEGWT E (配列番号 140)
３．Ｃ１型ボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ／Ｃ１）（ＥＣ３．４．２４．６９）（ボントキシリシン−Ｃ１）
Ｐ１８６４０；ＢＸＣ１＿ＣＬＯＢＯ
MPITINNFNY SDPVDNKNIL YLDTHLNTLA NEPEKAFRIT GNIWVIPDRF SRNSNPNLNK PPRVTSPKSG 
YYDPNYLSTD SDKDPFLKEI IKLFKRINSR EIGEELIYRL STDIPFPGNN NTPINTFDFD VDFNSVDVKT 
RQGNNWVKTG SINPSVIITG PRENIIDPET STFKLTNNTF AAQEGFGALS IISISPRFML TYSNATNDVG 
EGRFSKSEFC MDPILILMHE LNHAMHNLYG IAIPNDQTIS SVTSNIFYSQ YNVKLEYAEI YAFGGPTIDL 
IPKSARKYFE EKALDYYRSI AKRLNSITTA NPSSFNKYIG EYKQKLIRKY RFVVESSGEV TVNRNKFVEL 
YNELTQIFTE FNYAKIYNVQ NRKIYLSNVY TPVTANILDD NVYDIQNGFN IPKSNLNVLF MGQNLSRNPA 
LRKVNPENML YLFTKFCHKA IDGRSLYNKT LDCRELLVKN TDLPFIGDIS DVKTDIFLRK DINEETEVIY 
YPDNVSVDQV ILSKNTSEHG QLDLLYPSID SESEILPGEN QVFYDNRTQN VDYLNSYYYL ESQKLSDNVE 
DFTFTRSIEE ALDNSAKVYT YFPTLANKVN AGVQGGLFLM WANDVVEDFT TNILRKDTLD KISDVSAIIP 
YIGPALNISN SVRRGNFTEA FAVTGVTILL EAFPEFTIPA LGAFVIYSKV QERNEIIKTI DNCLEQRIKR 
WKDSYEWMMG TWLSRIITQF NNISYQMYDS LNYQAGAIKA KIDLEYKKYS GSDKENIKSQ VENLKNSLDV 
KISEAMNNIN KFIRECSVTY LFKNMLPKVI DELNEFDRNT KAKLINLIDS HNIILVGEVD KLKAKVNNSF 
QNTIPFNIFS YTNNSLLKDI INEYFNNIND SKILSLQNRK NTLVDTSGYN AEVSEEGDVQ LNPIFPFDFK 
LGSSGEDRGK VIVTQNENIV YNSMYESFSI SFWIRINKWV SNLPGYTIID SVKNNSGWSI GIISNFLVFT 
LKQNEDSEQS INFSYDISNN APGYNKWFFV TVTNNMMGNM KIYINGKLID TIKVKELTGI NFSKTITFEI 
NKIPDTGLIT SDSDNINMWI RDFYIFAKEL DGKDINILFN SLQYTNVVKD YWGNDLRYNK EYYMVNIDYL 
NRYMYANSRQ IVFNTRRNNN DFNEGYKIII KRIRGNTNDT RVRGGDILYF DMTINNKAYN LFMKNETMYA 
DNHSTEDIYA IGLREQTKDI NDNIIFQIQP MNNTYYYASQ IFKSNFNGEN ISGICSIGTY RFRLGGDWYR 
HNYLVPTVKQ GNYASLLEST STHWGFVPVS E (配列番号 141)
４．Ｄ型ボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ／Ｄ）（ＥＣ３．４．２４．６９）（ボントキシリシン−Ｄ）
Ｐ１９３２１；ＢＸＤ＿ＣＬＯＢＯ
MTWPVKDFNY SDPVNDNDIL YLRIPQNKLI TTPVKAFMIT QNIWVIPERF SSDTNPSLSK PPRPTSKYQS 
YYDPSYLSTD EQKDTFLKGI IKLFKRINER DIGKKLINYL VVGSPFMGDS STPEDTFDFT RHTTNIAVEK 
FENGSWKVTN IITPSVLIFG PLPNILDYTA SLTLQGQQSN PSFEGFGTLS ILKVAPEFLL TFSDVTSNQS 
SAVLGKSIFC MDPVIALMHE LTHSLHQLYG INIPSDKRIR PQVSEGFFSQ DGPNVQFEEL YTFGGLDVEI 
IPQIERSQLR EKALGHYKDI AKRLNNINKT IPSSWISNID KYKKIFSEKY NFDKDNTGNF VVNIDKFNSL 
YSDLTNVMSE VVYSSQYNVK NRTHYFSRHY LPVFANILDD NIYTIRDGFN LTNKGFNIEN SGQNIERNPA 
LQKLSSESVV DLFTKVCLRL TKNSRDDSTC IKVKNNRLPY VADKDSISQE IFENKIITDE TNVQNYSDKF 
SLDESILDGQ VPINPEIVDP LLPNVNMEPL NLPGEEIVFY DDITKYVDYL NSYYYLESQK LSNNVENITL 
TTSVEEALGY SNKIYTFLPS LAEKVNKGVQ AGLFLNWANE VVEDFTTNIM KKDTLDKISD VSVIIPYIGP 
ALNIGNSALR GNFNQAFATA GVAFLLEGFP EFTIPALGVF TFYSSIQERE KIIKTIENCL EQRVKRWKDS 
YQWMVSNWLS RITTQFNHIN YQMYDSLSYQ ADAIKAKIDL EYKKYSGSDK ENIKSQVENL KNSLDVKISE 
AMNNINKFIR ECSVTYLFKN MLPKVIDELN KFDLRTKTEL INLIDSHNII LVGEVDRLKA KVNESFENTM 
PFNIFSYTNN SLLKDIINEY FNSINDSKIL SLQNKKNALV DTSGYNAEVR VGDNVQLNTI YTNDFKLSSS 
GDKIIVNLNN NILYSAIYEN SSVSFWIKIS KDLTNSHNEY TIINSIEQNS GWKLCIRNGN IEWILQDVNR 
KYKSLIFDYS ESLSHTGYTN KWFFVTITNN IMGYMKLYIN GELKQSQKIE DLDEVKLDKT IVFGIDENID 
ENQMLWIRDF NIFSKELSNE DINIVYEGQI LRNVIKDYWG NPLKFDTEYY IINDNYIDRY IAPESNVLVL 
VQYPDRSKLY TGNPITIKSV SDKNPYSRIL NGDNIILHML YNSRKYMIIR DTDTIYATQG GECSQNCVYA 
LKLQSNLGNY GIGIFSIKNI VSKNKYCSQI FSSFRENTML LADIYKPWRF SFKNAYTPVA VTNYETKLLS 
TSSFWKFISR DPGWVE (配列番号 142)
５．Ｅ型ボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ／Ｅ）（ＥＣ３．４．２４．６９）（ボントキシリシン−Ｅ）
Ｑ００４９６；ＢＸＥ＿ＣＬＯＢＯ
MPKINSFNYN DPVNDRTILY IKPGGCQEFY KSFNIMKNIW IIPERNVIGT TPQDFHPPTS LKNGDSSYYD 
PNYLQSDEEK DRFLKIVTKI FNRINNNLSG GILLEELSKA NPYLGNDNTP DNQFHIGDAS AVEIKFSNGS 
QDILLPNVII MGAEPDLFET NSSNISLRNN YMPSNHRFGS IAIVTFSPEY SFRFNDNCMN EFIQDPALTL 
MHELIHSLHG LYGAKGITTK YTITQKQNPL ITNIRGTNIE EFLTFGGTDL NIITSAQSND IYTNLLADYK 
KIASKLSKVQ VSNPLLNPYK DVFEAKYGLD KDASGIYSVN INKFNDIFKK LYSFTEFDLR TKFQVKCRQT 
YIGQYKYFKL SNLLNDSIYN ISEGYNINNL KVNFRGQNAN LNPRIITPIT GRGLVKKIIR FCKNIVSVKG 
IRKSICIEIN NGELFFVASE NSYNDDNINT PKEIDDTVTS NNNYENDLDQ VILNFNSESA PGLSDEKLNL 
TIQNDAYIPK YDSNGTSDIE QHDVNELNVF FYLDAQKVPE GENNVNLTSS IDTALLEQPK IYTFFSSEFI 
NNVNKPVQAA LFVSWIQQVL VDFTTEANQK STVDKIADIS IVVPYIGLAL NIGNEAQKGN FKDALELLGA 
GILLEFEPEL LIPTILVFTI KSFLGSSDNK NKVIKAINNA LKERDEKWKE VYSFIVSNWM TKINTQFNKR 
KEQMYQALQN QVNAIKTIIE SKYNSYTLEE KNELTNKYDI KQIENELNQK VSIAMNNIDR FLTESSISYL 
MKIINEVKIN KLREYDENVK TYLLNYIIQH GSILGESQQE LNSMVTDTLN NSIPFKLSSY TDDKILISYF 
NKFFKRIKSS SVLNMRYKND KYVDTSGYDS NININGDVYK YPTNKNQFGI YNDKLSEVNI SQNDYIIYDN 
KYKNFSISFW VRIPNYDNKI VNVNNEYTII NCMRDNNSGW KVSLNHNEII WTFEDNRGIN QKLAFNYGNA 
NGISDYINKW IFVTITNDRL GDSKLYINGN LIDQKSILNL GNIHVSDNIL FKIVNCSYTR YIGIRYFNIF 
DKELDETEIQ TLYSNEPNTN ILKDFWGNYL LYDKEYYLLN VLKPNNFIDR RKDSTLSINN IRSTILLANR 
LYSGIKVKIQ RVNNSSTNDN LVRKNDQVYI NFVASKTHLF PLYADTATTN KEKTIKISSS GNRFNQVVVM 
NSVGNCTMNF KNNNGNNIGL LGFKADTVVA STWYYTHMRD HTNSNGCFWN FISEEHGWQE K (配列番号 143)
６．Ｆ型ボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ／Ｆ）（ＥＣ３．４．２４．６９）（ボントキシリシン−Ｆ）
Ｐ３０９９６；ＢＸＦ＿ＣＬＯＢＯ
MPVAINSFNY NDPVNDDTIL YMQIPYEEKS KKYYKAFEIM RNVWIIPERN TIGTNPSDFD PPASLKNGSS 
AYYDPNYLTT DAEKDRYLKT TIKLFKRINS NPAGKVLLQE ISYAKPYLGN DHTPIDEFSP VTRTTSVNIK 
LSTNVESSML LNLLVLGAGP DIFESCCYPV RKLIDPDVVY DPSNYGFGSI NIVTFSPEYE YTFNDISGGH 
NSSTESFIAD PAISLAHELI HALHGLYGAR GVTYEETIEV KQAPLMIAEK PIRLEEFLTF GGQDLNIITS 
AMKEKIYNNL LANYEKIATR LSEVNSAPPE YDINEYKDYF QWKYGLDKNA DGSYTVNENK FNEIYKKLYS 
FTESDLANKF KVKCRNTYFI KYEFLKVPNL LDDDIYTVSE GFNIGNLAVN NRGQSIKLNP KIIDSIPDKG 
LVEKIVKFCK SVIPRKGTKA PPRLCIRVNN SELFFVASES SYNENDINTP KEIDDTTNLN NNYRNNLDEV 
ILDYNSQTIP QISNRTLNTL VQDNSYVPRY DSNGTSEIEE YDVVDFNVFF YLHAQKVPEG ETNISLTSSI 
DTALLEESKD IFFSSEFIDT INKPVNAALF IDWISKVIRD FTTEATQKST VDKIADISLI VPYVGLALNI 
IIEAEKGNFE EAFELLGVGI LLEFVPELTI PVILVFTIKS YIDSYENKNK AIKAINNSLI EREAKWKEIY 
SWIVSNWLTR INTQFNKRKE QMYQALQNQV DAIKTAIEYK YNNYTSDEKN RLESEYNINN IEEELNKKVS 
LAMKNIERFM TESSISYLMK LINEAKVGKL KKYDNHVKSD LLNYILDHRS ILGEQTNELS DLVTSTLNSS 
IPFELSSYTN DKILIIYFNR LYKKIKDSSI LDMRYENNKF IDISGYGSNI SINGNVYIYS TNRNQFGIYN 
SRLSEVNIAQ NNDIIYNSRY QNFSISFWVR IPKHYKPMNH NREYTIINCM GNNNSGWKIS LRTVRDCEII 
WTLQDTSGNK ENLIFRYEEL NRISNYINKW IFVTITNNRL GNSRIYINGN LIVEKSISNL GDIHVSDNIL 
FKIVGCDDET YVGIRYFKVF NTELDKTEIE TLYSNEPDPS ILKNYWGNYL LYNKKYYLFN LLRKDKYITL 
NSGILNINQQ RGVTEGSVFL NYKLYEGVEV IIRKNGPIDI SNTDNFVRKN DLAYINVVDR GVEYRLYADT 
KSEKEKIIRT SNLNDSLGQI IVMDSIGNNC TMNFQNNNGS NIGLLGFHSN NLVASSWYYN NIRRNTSSNG 
CFWSSISKEN GWKE (配列番号 144)
７．Ｇ型ボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ／Ｇ）（ＥＣ３．４．２４．６９）（ボントキシリシン−Ｇ）
Ｑ６０３９３；ＢＸＧ＿ＣＬＯＢＯ
MPVNIKXFNY NDPINNDDII MMEPFNDPGP GTYYKAFRII DRIWIVPERF TYGFQPDQFN ASTGVFSKDV 
YEYYDPTYLK TDAEKDKFLK TMIKLFNRIN SKPSGQRLLD MIVDAIPYLG NASTPPDKFA ANVANVSINK 
KIIQPGAEDQ IKGLMTNLII FGPGPVLSDN FTDSMIMNGH SPISEGFGAR MMIRFCPSCL NVFNNVQENK 
DTSIFSRRAY FADPALTLMH ELIHVLHGLY GIKISNLPIT PNTKEFFMQH SDPVQAEELY TFGGHDPSVI 
SPSTDMNIYN KALQNFQDIA NRLNIVSSAQ GSGIDISLYK QIYKNKYDFV EDPNGKYSVD KDKFDKLYKA 
LMFGFTETNL AGEYGIKTRY SYFSEYLPPI KTEKLLDNTI YTQNEGFNIA SKNLKTEFNG QNKAVNKEAY 
EEISLEHLVI YRIAMCKPVM YKNTGKSEQC IIVNNEDLFF IANKDSFSKD LAKAETIAYN TQNNTIENNF 
SIDQLILDND LSSGIDLPNE NTEPFTNFDD IDIPVYIKQS ALKKIFVDGD SLFEYLHAQT FPSNIENLQL 
TNSLNDALRN NNKVYTFFST NLVEKANTVV GASLFVNWVK GVIDDFTSES TQKSTIDKVS DVSIIIPYIG 
PALNVGNETA KENFKNAFEI GGAAILMEFI PELIVPIVGF FTLESYVGNK GHIIMTISNA LKKRDQKWTD 
MYGLIVSQWL STVNTQFYTI KERMYNALNN QSQAIEKIIE DQYNRYSEED KMNINIDFND IDFKLNQSIN 
LAINNIDDFI NQCSISYLMN RMIPLAVKKL KDFDDNLKRD LLEYIDTNEL YLLDEVNILK SKVNRHLKDS 
IPFDLSLYTK DTILIQVFNN YISNISSNAI LSLSYRGGRL IDSSGYGATM NVGSDVIFND IGNGQFKLNN 
SENSNITAHQ SKFVVYDSMF DNFSINFWVR TPKYNNNDIQ TYLQNEYTII SCIKNDSGWK VSIKGNRIIW 
TLIDVNAKSK SIFFEYSIKD NISDYINKWF SITITNDRLG NANIYINGSL KKSEKILNLD RINSSNDIDF 
KLINCTDTTK FVWIKDFNIF GRELNATEVS SLYWIQSSTN TLKDFWGNPL RYDTQYYLFN QGMQNIYIKY 
FSKASMGETA PRTNFNNAAI NYQNLYLGLR FIIKKASNSR NINNDNIVRE GDYIYLNIDN ISDESYRVYV 
LVNSKEIQTQ LFLAPINDDP TFYDVLQIKK YYEKTTYNCQ ILCEKDTKTF GLFGIGKFVK DYGYVWDTYD 
NYFCISQWYL RRISENINKL RLGCNWQFIP VDEGWTE (配列番号 145)
８．破傷風毒素（ＥＣ３．４．２４．６８）（テントキシリシン）
Ｐ０４９５８；ＴＥＴＸ＿ＣＬＯＴＥ
MPITINNFRY SDPVNNDTII MMEPPYCKGL DIYYKAFKIT DRIWIVPERY EFGTKPEDFN PPSSLIEGAS 
EYYDPNYLRT DSDKDRFLQT MVKLFNRIKN NVAGEALLDK IINAIPYLGN SYSLLDKFDT NSNSVSFNLL 
EQDPSGATTK SAMLTNLIIF GPGPVLNKNE VRGIVLRVDN KNYFPCRDGF GSIMQMAFCP EYVPTFDNVI 
ENITSLTIGK SKYFQDPALL LMHELIHVLH GLYGMQVSSH EIIPSKQEIY MQHTYPISAE ELFTFGGQDA 
NLISIDIKND LYEKTLNDYK AIANKLSQVT SCNDPNIDID SYKQIYQQKY QFDKDSNGQY IVNEDKFQIL 
YNSIMYGFTE IELGKKFNIK TRLSYFSMNH DPVKIPNLLD DTIYNDTEGF NIESKDLKSE YKGQNMRVNT 
NAFRNVDGSG LVSKLIGLCK KIIPPTNIRE NLYNRTASLT DLGGELCIKI KNEDLTFIAE KNSFSEEPFQ 
DEIVSYNTKN KPLNFNYSLD KIIVDYNLQS KITLPNDRTT PVTKGIPYAP EYKSNAASTI EIHNIDDNTI 
YQYLYAQKSP TTLQRITMTN SVDDALINST KIYSYFPSVI SKVNQGAQGI LFLQWVRDII DDFTNESSQK 
TTIDKISDVS TIVPYIGPAL NIVKQGYEGN FIGALETTGV VLLLEYIPEI TLPVIAALSI AESSTQKEKI 
IKTIDNFLEK RYEKWIEVYK LVKAKWLGTV NTQFQKRSYQ MYRSLEYQVD AIKKIIDYEY KIYSGPDKEQ 
IADEINNLKN KLEEKANKAM ININIFMRES SRSFLVNQMI NEAKKQLLEF DTQSKNILMQ YIKANSKFIG 
ITELKKLESK INKVFSTPIP FSYSKNLDCW VDNEEDIDVI LKKSTILNLD INNDIISDIS GFNSSVITYP 
DAQLVPGING KAIHLVNNES SEVIVHKAMD IEYNDMFNNF TVSFWLRVPK VSASHLEQYG TNEYSIISSM 
KKHSLSIGSG WSVSLKGNNL IWTLKDSAGE VRQITFRDLP DKFNAYLANK WVFITITNDR LSSANLYING 
VLMGSAEITG LGAIREDNNI TLKLDRCNNN NQYVSIDKFR IFCKALNPKE IEKLYTSYLS ITFLRDFWGN 
PLRYDTEYYL IPVASSSKDV QLKNITDYMY LTNAPSYTNG KLNIYYRRLY NGLKFIIKRY TPNNEIDSFV 
KSGDFIKLYV SYNNNEHIVG YPKDGNAFNN LDRILRVGYN APGIPLYKKM EAVKLRDLKT YSVQLKLYDD 
KNASLGLVGT HNGQIGNDPN RDILIASNWY FNHLKDKILG CDWYFVPTDE GWTND (配列番号 146)
９．ジフテリア毒素（ＤＴ）（ＮＡＤ（＋）−−ジフタミドＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ）（ＥＣ２．４．２．３６）
Ｐ００５８８；ＤＴＸ＿ＣＯＲＢＥ
MLVRGYVVSR KLFASILIGA LLGIGAPPSA HAGADDVVDS SKSFVMENFS SYHGTKPGYV DSIQKGIQKP 
KSGTQGNYDD DWKGFYSTDN KYDAAGYSVD NENPLSGKAG GVVKVTYPGL TKVLALKVDN AETIKKELGL 
SLTEPLMEQV GTEEFIKRFG DGASRVVLSL PFAEGSSSVE YINNWEQAKA LSVELEINFE TRGKRGQDAM 
YEYMAQACAG NRVRRSVGSS LSCINLDWDV IRDKTKTKIE SLKEHGPIKN KMSESPNKTV SEEKAKQYLE 
EFHQTALEHP ELSELKTVTG TNPVFAGANY AAWAVNVAQV IDSETADNLE KTTAALSILP GIGSVMGIAD 
GAVHHNTEEI VAQSIALSSL MVAQAIPLVG ELVDIGFAAY NFVESIINLF QVVHNSYNRP AYSPGHKTQP 
FLHDGYAVSW NTVEDSIIRT GFQGESGHDI KITAENTPLP IAGVLLPTIP GKLDVNKSKT HISVNGRKIR 
MRCRAIDGDV TFCRPKSPVY VGNGVHANLH VAFHRSSSEK IHSNEISSDS IGVLGYQKTV DHTKVNSKLS 
LFFEIKS (配列番号 147)
１０．シュードモナスエキソトキシン
Ｐ１１４３９；ＴＯＸＡ＿ＰＳＥＡＥ
MHLTPHWIPL VASLGLLAGG SFASAAEEAF DLWNECAKAC VLDLKDGVRS SRMSVDPAIA DTNGQGVLHY 
SMVLEGGNDA LKLAIDNALS ITSDGLTIRL EGGVEPNKPV RYSYTRQARG SWSLNWLVPI GHEKPSNIKV 
FIHELNAGNQ LSHMSPIYTI EMGDELLAKL ARDATFFVRA HESNEMQPTL AISHAGVSVV MAQAQPRREK 
RWSEWASGKV LCLLDPLDGV YNYLAQQRCN LDDTWEGKIY RVLAGNPAKH DLDIKPTVIS HRLHFPEGGS 
LAALTAHQAC HLPLETFTRH RQPRGWEQLE QCGYPVQRLV ALYLAARLSW NQVDQVIRNA LASPGSGGDL 
GEAIREQPEQ ARLALTLAAA ESERFVRQGT GNDEAGAASA DVVSLTCPVA AGECAGPADS GDALLERNYP 
TGAEFLGDGG DISFSTRGTQ NWTVERLLQA HRQLEERGYV FVGYHGTFLE AAQSIVFGGV RARSQDLDAI 
WRGFYIAGDP ALAYGYAQDQ EPDARGRIRN GALLRVYVPR SSLPGFYRTG LTLAAPEAAG EVERLIGHPL 
PLRLDAITGP EEEGGRLETI LGWPLAERTV VIPSAIPTDP RNVGGDLDPS SIPDKEQAIS ALPDYASQPG 
KPPREDLK (配列番号 148)
【０２７７】
ペプチド合成
ペプチドを得るための方法は少なくとも４つある：（１）生物学的システム（例えば、組織、血清、尿など）からの精製；（Ｄｏｎｉｎｉ  Ｐら，Ａｃｔａ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（Ｃｏｐｅｎｈ）．１９６６；５２（２）：１６９−８５およびＤｏｎｉｎｉ  Ｐら，Ａｃｔａ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（Ｃｏｐｅｎｈ）．１９６６；５２（２）：１８６−９８．）（２）タンパク質消化後のペプチドフラグメントの精製；（Ｓｃｈｕｌｚ−Ｋｎａｐｐｅ  Ｐら，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｒｅｓ．１９９６；１（５）：２２３−３６ならびにＫｉｌａｒａ  ＡおよびＰａｎｙａｍ  Ｄ．Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ  Ｎｕｔｒ．２００３；４３（６）：６０７−３３）（３）当該技術分野で公知の遺伝子工学および組換え技術（Ｍａｒｔｉａｌ  ＪＡら，Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９７９；２０５（４４０６）：６０２−７）ならびに（４）直接化学合成（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９８４．Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｊｏｈｎ  Ｈｏｗｌ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２９８），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２００５．Ｎ．Ｌｅｏ  Ｂｅｎｏｉｔｏｎ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ）。
【０２７８】
最初の２つの方法はペプチド配列の制御を欠くため、実用的でない場合が多い。最初の方法はまた、生物試料中のペプチド濃度が低く、精製前に大幅な濃縮段階を必要とすることから問題がある。したがって通常は、短いペプチドには直接化学合成が魅力的な選択肢であり、大きなペプチドには組換え技術が好ましい。
【０２７９】
従来の有機化学合成法は一般に、４または５個を超えるアミノ酸残基を有するペプチドに対しては、アミノ酸およびペプチドの複雑さを理由に実用的ではない。問題としては、ペプチド中に複数の反応基の存在し、その反応基がペプチド上に複数のコンジュゲーション部位を生じることで、対象とするペプチドに関して純粋ではないペプチド混合物を生じるため、各段階後に精製が必要であるということが挙げられる。（参考文献：Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第３版，２０００．Ｄａｖｉｄ  Ｌ．ＮｅｌｓｏｎおよびＭｉｃｈａｅｌ  Ｍ．Ｃｏｘ編，Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ．）。
【０２８０】
ペプチドを固体支持体の一端に固定化したままペプチドを合成する固相ペプチド合成（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，１９６２）が登場したことにより、ペプチドの直接化学合成が大きく進歩した。今日、ほとんどの固相ペプチド合成がＦＭＯＣ化学を含む。簡潔には、カルボキシル末端（Ｃ末端）からアミノ末端（Ｎ末端）へと化学合成が進行する。固相支持体は不溶性のポリマーまたはレジンである。９−フルオレニル−メトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）基が、アミノ酸残基のα−アミノ基における不要な反応を阻止する。反応サイクルにおいて標準的な反応のセットを用いて、レジン上で１度に１アミノ酸ずつペプチドが形成される。最初に、ＦＭＯＣ基により保護されたα−アミノ基を有するＣ末端アミノ酸をレジン上の反応基と結合させる。レジンと結合したアミノ酸のα−アミノ基上の保護基を、一般には弱い有機塩基で除去する。この時点で、Ｃ末端アミノ酸を有するレジンはペプチドの２番目のアミノ酸を受け取る準備ができている。α−アミノ基（ＦＭＯＣ）およびカルボキシル基（一般的には、ジシクロヘキシルカルボジイミド、ＤＣＣ）において異なる化学物質で保護されたアミノ酸がそれぞれ受け取られる。ＤＣＣを除去することにより２番目のアミノ酸のカルボキシル基が活性化され、固体支持体上の１番目のアミノ酸の脱保護されたα−アミノ基と反応してペプチド結合を形成する（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９８４．Ｊｏｈｎ  Ｈｏｗｌ編（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２９８），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２００５．Ｎ．Ｌｅｏ  Ｂｅｎｏｉｔｏｎ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ）（参考文献：Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第３版，２０００．Ｄａｖｉｄ  Ｌ．ＮｅｌｓｏｎおよびＭｉｃｈａｅｌ  Ｍ．Ｃｏｘ編，Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ．）。
【０２８１】
サイクル内の連続する各段階において、保護化学基が不要な反応を阻止し、（ｉ）新生ペプチド上のα−アミノ基の脱保護；（ｉｉ）次のアミノ酸上のカルボキシル基の活性化および（ｉｉｉ）ペプチド結合を形成する反応のシーケンスが、全ペプチド配列が合成されるまで続く。ペプチド合成が完了すると、レジンとペプチド間の連結が切断されて、最終的なペプチドが得られる。最先端の固相ペプチド合成技術は自動化されており、何種類かの市販の機器が現在入手可能であり、当該技術分野で公知である（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９８４．Ｊｏｈｎ  Ｈｏｗｌ編（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２９８），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２００５．Ｎ．Ｌｅｏ  Ｂｅｎｏｉｔｏｎ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ；Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第３版，２０００．Ｄａｖｉｄ  Ｌ．ＮｅｌｓｏｎおよびＭｉｃｈａｅｌ  Ｍ．Ｃｏｘ編，Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ．）。
【０２８２】
固相合成は長いペプチドのための段階的プロセスであることから、全収率が低いためにコストが増すという重要な制限がある。例えば、９６％の段階的収率では、２１ｍｅｒ、５１ｍｅｒおよび１００ｍｅｒペプチドの全収率は、それぞれ４４％、１３％および１．７％である。同様に、９９．８％の段階的収率では、２１ｍｅｒ、５１ｍｅｒおよび１００ｍｅｒペプチドの全収率は、それぞれ９６％、９０％および８２％である。したがって、長いペプチドでは、遺伝子工学により発現カセット中に配列を合成し、適当な発現系（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）または酵母のような微生物発現系）または哺乳動物発現系（細胞培養）において発現させる方が、コスト的にも時間的にもより効率的である。しかし、小さなペプチドでは、遺伝子工学により配列を合成して発現させ、ペプチドを精製するコストは、一般的に固相ペプチド合成と比べて、コスト的にも時間的にも効率的である。
【０２８３】
本発明に有用なペプチドは、上記方法または当該技術分野で公知の他の合成、発現もしくは精製方法を用いて合成、発現または精製される。
【０２８４】
ｄｓＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートの形成
少なくとも１のペプチドを第一もしくは第二鎖のいずれかまたは両方に、３’末端もしくは５’末端のいずれかまたは両方で、または内側でｄｓＲＮＡとコンジュゲートする。本発明のペプチドは、ペプチド中の任意のアミノ酸残基を介して、例えば、Ｃ末端のＣ末端アミノ酸がＣ末端アミノ酸のカルボキシル基を介して、もしくはＮ末端のＮ末端アミノ酸がＮ末端アミノ酸のα−アミノ基を介して本発明のｄｓＲＮＡと、またはアミノ酸残基上の特定の官能基（例えば、Ｃｙｓ上の−ＳＨ基またはＬｙｓ上のアミノ基）とコンジュゲートし得る。
【０２８５】
ｄｓＲＮＡは、ペプチドまたはタンパク質のための当該技術分野で公知の任意のコンジュゲーション化学を用いて本発明のペプチドとコンジュゲートする（参考文献：Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９６．Ｇｒｅｇ  Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．；Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ，１９９１．  Ｓｈａｎ  Ｓ．Ｗｏｎｇ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ）。
【０２８６】
一実施形態では、（ＣＨ２）６ＮＨ３リンカーを有する第一または第二鎖の５’末端を合成し、マレイミド化学を用いてペプチドのＣｙｓの−ＳＨ基とコンジュゲートし、安定なコンジュゲートを形成する。
【０２８７】
別の実施形態では、（ＣＨ２）６−ＳＨリンカーを有する第一または第二鎖の３’末端を合成し、ジスルフィド交換を介してＣｙｓの−ＳＨ基またはペプチドとコンジュゲートし、切断可能なコンジュゲートを形成する。
【０２８８】
コンジュゲーション後に、ｄｓＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートを当該技術分野で公知の方法により精製し（Ｏｅｈｌｋｅ  Ｊら，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００２；２６９（１６）：４０２５−３２，Ｈａｍｍａ  ＴおよびＭｉｌｌｅｒ  ＰＳ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．２００３；１４（２）：３２０−３０，Ｚａｔｓｅｐｉｎ  ＴＳら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．２００５；１６（３）：４７１−８９，Ｆｅｒｅｎｃ  Ｇら，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．２００５；２４（５−７）：１０５９−６１）、標準的な分析法により同一性および純度に関して特徴付ける。
【０２８９】
ｄｓＲＮＡ−送達ペプチドコンジュゲートの機能の判定
本発明のｄｓＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートを、ｄｓＲＮＡが適切な標的に送達され、かつＲＮＡｉ切断を仲介する能力を判定するためにアッセイする（以下の「ＤｓｉＲＮＡ活性を評価するためのＲＮＡｉインビトロアッセイ」と題する節に記載されている）。また本発明のｄｓＲＮＡペプチドコンジュゲートを、ペプチドが適切な標的まで送達される能力を判定するためにアッセイする。
【０２９０】
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ−ペプチドまたは単独のペプチドが細胞表面と結合するか、または相互作用する。ｄｓＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートまたは単独のペプチドは、細胞膜を直接透過することにより、エンドサイトーシス経路により、その両方により、または当該技術分野で公知の他の方法により、細胞に取り込まれる。
【０２９１】
本発明のｄｓＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートの機能性は、以下の方法によるｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドの定量化により判定し得る。
【０２９２】
血漿または組織試料由来のＤｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを定量化するために使用される技術は、基質から分析物を単離するための固相抽出、それに続く逆相イオン対超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）による分離およびエレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ）による検出で構成される。分析機器は、Ｗａｔｅｒｓ  Ｑｕａｔｔｒｏ  Ｐｒｅｍｉｅｒｅ三連四重極型質量分析計と直列に接続されたフォトダイオードアレイ検出器を備えたＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣクロマトグラフで構成される。
【０２９３】
固相抽出は、ＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘのＣｌａｒｉｔｙ抽出媒体およびプロトコールを用いて行う。オリゴを含有する血漿試料に「負荷／溶解」緩衝液を加えて、任意の結合したタンパク質を除去する。オリゴが固相媒体上に優先的に吸着される。次いで、一連の緩衝液を用いてオリゴを洗浄して、分離およびイオン化を阻害する夾雑物および塩を除去する。最後に、オリゴを媒体から溶出し、濃縮して、下流の分析に従った緩衝液中に懸濁する。
【０２９４】
クロマトグラフィーによる分離は、ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）とトリエチルアミン（ＴＥＡ）の移動相およびＣ１８固定相を用いて行う。質量分析検出は、エレクトロスプレーイオン化、次いでタンデムＭＳ（ＭＳ／ＭＳ）分析を用いて行う。その特定のオリゴヌクレオチド分子に特徴的な遷移を判定するようにＬＣ／ＭＳシステムを組み立てる。試料中のＤｓｉＲＮＡ含有量の定量化は、試料のＭＳ応答を、様々な濃度の試験試料中の同じＤｓｉＲＮＡの標準曲線と比較することにより行う（Ｌｉｎら，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ａｎａｌ．２００７  Ｊｕｎ  ２８：４４（２）：３３０−３４１）。最終データを、試料の単位体積当たりのＤｓｉＲＮＡオリゴ質量の濃度（例えば、ｎｇ／ｍＬ）として表す。
【０２９５】
ＤｓｉＲＮＡの修飾
ｄｓＲＮＡおよびｄｓＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートを細胞培養モデル内にインビトロでトランスフェクトし、ｄｓＲＮＡｄｓＲＮＡ−ペプチドコンジュゲート取り込みまたは送達の比較を確立する。適当な細胞培養モデルを使用し、エンドポイント測定には、限定されるわけではないが以下のもの：（ｉ）ｑＰＣＲを用いたｍＲＮＡ定量化；（ｉｉ）ウエスタンブロットを用いたタンパク質の定量化；（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡおよびｄｓＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートの標識細胞への内部移行の１つ以上が含まれる。ｄｓＲＮＡおよびｄｓＲＮＡ−ペプチドコンジュゲート取り込みまたは送達の比較は、送達されたｄｓＲＮＡの量、ｄｓＲＮＡの送達速度および送達されたｄｓＲＮＡの安定性に関して、例えば、上記エンドポイント測定を用いて評価する。
【０２９６】
一つの例では、ｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートをＨｅＬａ細胞内にトランスフェクトするために、２４〜４８ウェルプレート中でトランスフェクションを行う。適用前に、ｄｓＲＮＡおよびｄｓＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートを細胞培地中に希釈し、室温で約３０分間インキュベートする。用量反応実験用に、適用されるｄｓＲＮＡおよびｄｓＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートの最終濃度を０〜５０ｎＭの範囲内で変化させる。経時的実験用には、本明細書で定義されるようなｄｓＲＮＡが送達される速度を判定するために、用量反応実験から決定されたｄｓＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートの最適濃度を、様々なインキュベーション時間、例えば、３０分〜７日に関して調べる。
【０２９７】
ペプチドおよびｄｓＲＮＡを蛍光タグで別々に標識して蛍光共局在実験を行うことにより、ペプチド、ｄｓＲＮＡおよびｄｓＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートの機能性も試験する。ペプチドを緑色蛍光色素でタグを付け、ｄｓＲＮＡを赤色蛍光色素でタグを付ける。この方法を用いて遊離（すなわち、非コンジュゲート）ｄｓＲＮＡの局在と比較することにより、ペプチドが単独のペプチドおよびｄｓＲＮＡ−ペプチドコンジュゲートの両方を内部移行させる能力を確認する。以下の参考文献は、蛍光局在および細胞輸送実験を行う方法を記載している−Ｍｏｓｃｈｏｓら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．２００７；１８（５）：１４５０−１４５９；Ｍｏｓｃｈｏｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ２００７；３５（４）：８０７−８１０；Ｌｏｒｄ−Ｆｏｎｔａｉｎｅら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ  ２００８；２５：１３０９−１３２２；Ｗｉｎｔｏｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００２；３６（６）：３２８２０−３２８２９；Ｌｕ，ＬａｎｇｅｒおよびＣｈｅｎ．Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ．２００９  Ｍａｒ  ３０．［印刷前電子出版］；ＭｃＮａｕｇｈｔｏｎら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２００９  Ａｐｒ  １４；１０６（１５）：６１１１−６１１６。
【０２９８】
ｄｓＲＮＡの修飾
二本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）の作用を阻害する１つの主な因子は、ヌクレアーゼによるｄｓＲＮＡ（例えば、二本鎖ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡおよびＤｓｉＲＮＡ）の分解である。３’−エキソヌクレアーゼは血清中に存在する主要なヌクレアーゼ活性であり、分解を防ぐためにアンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチドの３’末端を修飾することが重要である（Ｅｄｅｒら，１９９１，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓ  Ｄｅｖ，１：１４１−１５１）。ｓｉＲＮＡの調節および分解に関与する３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する、ＥＲＩ−１と呼ばれるＲＮアーゼ−Ｔファミリーヌクレアーゼが同定されている（Ｋｅｎｎｅｄｙら，２００４，Ｎａｔｕｒｅ  ４２７：６４５−６４９；Ｈｏｎｇら，２００５，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，３９０：６７５−６７９）。この遺伝子は、マウスにおいてはＴｈｅｘ１（ＮＭ＿０２０６７）として、またはヒトにおいてはＴＨＥＸ１（ＮＭ＿１５３３３２）としても知られており、ヒストンｍＲＮＡの分解に関与し；また、ｓｉＲＮＡにおける３’−オーバーハングの分解も仲介するが、二本鎖ＲＮＡは分解しない（Ｙａｎｇら，２００６，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２８１：３０４４７−３０４５４）。したがって、当然のことながら、本発明のＤｓｉＲＮＡを含めたｄｓＲＮＡの３’末端安定化が安定性を向上させることが予想される。
【０２９９】
ＸＲＮ１（ＮＭ＿０１９００１）は、Ｐボディ内に存在する５’→３’エキソヌクレアーゼであり、ｍｉＲＮＡにより標的化されるｍＲＮＡの分解に関与するとされ（Ｒｅｈｗｉｎｋｅｌら，２００５，ＲＮＡ  １１：１６４０−１６４７）、また、ｓｉＲＮＡに指令される内部切断により開始された分解の完了にも関与し得る。ＸＲＮ２（ＮＭ＿０１２２５５）は、核ＲＮＡプロセシングに関与する別の５’→３’エキソヌクレアーゼである。これらは共に、現在のところｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの分解またはプロセシングには関与すると考えられていないが、ＲＮＡを分解することができる既知のヌクレアーゼであり、考慮すべき重要なことでもあり得る。
【０３００】
ＲＮアーゼＡは、ＲＮＡを分解する、哺乳動物における主なエンヌクレアーゼ活性である。これはｓｓＲＮＡに対して特異的であり、ピリミジン塩基の３’末端で切断する。ＲＮアーゼＡ切断と一致するｓｉＲＮＡ分解産物を、血清中でのインキュベーション後の質量分析により検出し得る（Ｔｕｒｎｅｒら，２００７，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｓｙｓｔ  ３：４３−５０）。３’−オーバーハングは、ｓｉＲＮＡのＲＮアーゼ分解に対する感受性を増強する。血清からのＲＮアーゼＡの枯渇は、ｓｉＲＮＡの分解を低下させ；この分解は配列に対するいくらかの配列選択性を確かに示し、末端にポリＡ／Ｕ配列を有する配列に対してはさらに劣る（Ｈａｕｐｅｎｔｈａｌら，２００６  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ７１：７０２−７１０）。このことは、二本鎖の低安定性領域が、ＲＮアーゼＡによる分解に利用される一時的な一本鎖種を「吐き出し」て提供することを示唆している。ＲＮアーゼＡ阻害剤を血清に添加して、ｓｉＲＮＡの寿命および効力を向上させ得る（Ｈａｕｐｅｎｔｈａｌら，２００７，Ｉｎｔ  Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １２１：２０６−２１０）
【０３０１】
２１ｍｅｒにおいて、ホスホロチオアートまたはボラノホスファート修飾は、ヌクレオシド間のリン酸結合を直接安定化させる。ボラノホスファート修飾ＲＮＡは、サイレンシング剤としてヌクレアーゼ耐性が高く、強力であり、かつ比較的無毒である。ボラノホスファート修飾ＲＮＡは、標準的な化学合成法を用いて製造することは不可能であり、代わりにインビトロ転写（ＩＶＴ）により作製される（Ｈａｌｌら，２００４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３２：５９９１−６０００；Ｈａｌｌら，２００６，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３４：２７７３−２７８１）。ホスホロチオアート（ＰＳ）修飾は、任意の所望の位置でＲＮＡ二本鎖中に容易に配置することができ、かつ標準的な化学合成法を用いて作製することができる。ＰＳ修飾は用量依存的な毒性を示すため、ほとんどの研究者はｓｉＲＮＡ中への限定的な組込みを推奨し、ヌクレアーゼからの保護が最も重要である３’末端を好む（Ｈａｒｂｏｒｔｈら，２００３，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  １３：８３−１０５；ＣｈｉｕおよびＲａｎａ，２００３，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  １０：５４９−５６１；Ｂｒａａｓｃｈら，２００３，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２：７９６７−７９７５；Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉら，２００３，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１：５８９−５９５）。より広範なＰＳ修飾は、強力なＲＮＡｉ活性と適合し得る；しかし、糖修飾の使用（２’−Ｏ−メチルＲＮＡなど）の方が優れている場合がある（Ｃｈｏｕｎｇら，２００６，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３４２：９１９−９２７）。
【０３０２】
様々な置換は、二本鎖の安定性（Ｔｍ）を一般に増大させるリボースの２’位に配置することができ、ヌクレアーゼ耐性を大幅に向上させることができる。２’−Ｏ−メチルＲＮＡｉは、哺乳動物のリボソームＲＮＡおよび転移ＲＮＡにおいて見られる天然の修飾である。ｓｉＲＮＡにおける２’−Ｏ−メチル修飾が知られているが、効力を保持するために二本鎖内での修飾塩基の正確な位置が重要であり、ＲＮＡの２’−Ｏ−メチルＲＮＡへの完全な置換はｓｉＲＮＡを不活性化する。例えば、交互の２’−Ｏ−メチル塩基を用いるパターンは、未修飾ＲＮＡと同等の効力を有し、かつ血清中で非常に安定である（Ｃｈｏｕｎｇら，２００６，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３４２：９１９−９２７；Ｃｚａｕｄｅｒｎａら，２００３，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１：２７０５−２７１６）。
【０３０３】
２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾もｄｓＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡおよびＤｓｉＲＮＡ）機能に適合し；これはピリミジン部位で行われるのが最も一般的であり（試薬のコストおよび有用性による）、プリン位置での２’−Ｏ−メチル修飾と組み合わせることができ；２’−Ｆプリンが入手可能であり、使用することもできる。この種の大幅に修飾された二本鎖は、インビトロでのＲＮＡｉの強力なトリガーとなり得（Ａｌｌｅｒｓｏｎら，２００５，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ４８：９０１−９０４；Ｐｒａｋａｓｈら，２００５，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ４８：４２４７−４２５３；ＫｒａｙｎａｃｋおよびＢａｋｅｒ，２００６，ＲＮＡ  １２：１６３−１７６）、かつインビボで使用した際に効果を向上させ、作用持続時間を延長させ得る（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙら，２００５，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ４１：１３４９−１３５６；Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙら，２００５，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２３：１００２−１００７）。交互の２’−Ｆおよび２’−Ｏ−Ｍｅ塩基を含有する、非常に強力で、ヌクレアーゼ安定性である、平滑末端の１９ｍｅｒ二本鎖がＡｌｌｅｒｓｏｎにより教示されている。この設計では、交互の２’−Ｏ−Ｍｅ残基が、Ｃｚａｕｄｅｒｎａにより用いられたものと同じパターンで位置しているが、残りのＲＮＡ残基が２’−Ｆ修飾塩基に変換されている。Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙにより用いられた非常に強力なヌクレアーゼ耐性ｓｉＲＮＡは、インビボで非常に強力なヌクレアーゼ耐性ｓｉＲＮＡを用いた。２’−Ｏ−Ｍｅ  ＲＮＡおよび２’−Ｆ  ＲＮＡに加え、この二本鎖は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、反転した脱塩基残基および３’末端ＰＳヌクレオシド間結合を含む。広範な修飾は特定の利点を有するが、より限定的な二本鎖修飾もインビボでの効果を向上させることができ、かつ製造がより容易かつ低コストである。Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋら（２００４，Ｎａｔｕｒｅ  ４３２：１７３−１７８）は、インビボで二本鎖を使用し、ほとんどのＲＮＡが２つの２’−Ｏ−Ｍｅ  ＲＮＡ塩基および限定的な３’末端ＰＳヌクレオシド間結合を有していた。
【０３０４】
ロックト核酸（ＬＮＡ）は、ｄｓＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡおよびＤｓｉＲＮＡ）を安定化するために使用し得る別の種類の２’−修飾である。効力を保持するＬＮＡ組込みのパターンは、２’−Ｏ−メチルまたは２’−Ｆ塩基よりも限定されるため、限定的な修飾が好ましい（Ｂｒａａｓｃｈら，２００３，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２：７９６７−７９７５；Ｇｒｕｎｗｅｌｌｅｒら，２００３，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３１：３１８５−３１９３；Ｅｌｍｅｎら，２００５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３３：４３９−４４７）。限定的な組込みであっても、ＬＮＡ修飾の使用はインビボでのｄｓＲＮＡの効果を向上させることができ、かつオフターゲット効果プロファイルも向上させ得る（Ｍｏｏｋら，２００７，Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ６：８３３−８４３）。
【０３０５】
細胞または生きた動物内に導入された合成核酸は、「異質である」として認識されて免疫応答を誘発する。免疫刺激は、実験結果を劇的に変化させ、細胞死さえ引き起こし得る、主なオフターゲット効果の種類を構成する。自然免疫系は、これらの応答を仲介する、ＤＮＡおよびＲＮＡと特異的に相互作用する受容体分子の集合を含み、その一部は細胞質中に局在し、また一部はエンドソーム中に存在する（ＭａｒｑｕｅｓおよびＷｉｌｌｉａｍｓ，２００５，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２３：１３９９−１４０５；Ｓｃｈｌｅｅら，２００６，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １４：４６３−４７０）。陽イオン性脂質またはリポソームによるｓｉＲＮＡの送達は、ｓｉＲＮＡを細胞質およびエンドソーム区画の両方に露出させ、インビトロおよびインビボの両方における１型インターフェロン（ＩＦＮ）応答誘発の危険性を最大にする（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙら，２００５，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２３：１００２−１００７；ＳｉｏｕｄおよびＳｏｒｅｎｓｅｎ，２００３，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３１２：１２２０−１２２５；Ｓｉｏｕｄ，２００５，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３４８：１０７９−１０９０；Ｍａら，２００５，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３３０：７５５−７５９）。細胞内で転写されるＲＮＡは免疫原性が低く（（Ｒｏｂｂｉｎｓら，２００６，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２４：５６６−５７１）、脂質による方法を用いて送達した場合に免疫原性となる合成ＲＮＡは、力学的手段により細胞に導入すればインビボでさえ免疫刺激を回避し得る（Ｈｅｉｄｅｌら，２００４，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２２：１５７９−１５８２）。しかし、脂質による送達方法は、簡便、効率的であり、広く使用されている。特に、すべての細胞型が存在し、免疫応答を生じる危険性が最も高いインビボ適用に対しては、免疫応答を防ぐ何らかの一般的なストラテジーが必要とされる。化学修飾ＲＮＡの使用は、こうした問題の大部分、またはすべてでさえ解決し得る。
【０３０６】
特定の配列モチーフは他のものより明らかに免疫原性が強いが、自然免疫系の受容体は一般に、原核生物ＲＮＡよりも哺乳動物ＲＮＡにおいてよく見られる特定の塩基修飾の存在の有無を区別すると思われる。例えば、シュードウリジン、Ｎ６−メチル−Ａおよび２’−Ｏ−メチル修飾塩基は「自己」として認識され、合成ＲＮＡ内にこれらの残基を含むことは、免疫感知の回避に役立ち得る（Ｋａｒｉｋｏら，２００５，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２３：１６５−１７５）。未修飾ＲＮＡとして強い免疫刺激性のある配列の広範な２’−修飾は、マウスに静脈内投与された場合に免疫応答を阻止し得る（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙら，２００５，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２３：１００２−１００７）。しかし、免疫感知を回避するために広範な修飾は必要ではなく、ンビトロおよびインビボの両方での１型ＩＦＮ応答を阻止するためには、ｓｉＲＮＡ二本鎖の一本の鎖におけるわずか２つの２’−Ｏ−メチル塩基の置換で十分であり得；修飾ＵおよびＧ塩基が最も有効である（Ｊｕｄｇｅら，２００６，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １３：４９４−５０５）。さらなる利点として、２’−Ｏ−メチル塩基の選択的組込みは、オフターゲット効果の程度を低下させ得る（Ｊａｃｋｓｏｎら，２００６，ＲＮＡ  １２：１１９７−１２０５）。したがって、２’−Ｏ−メチル塩基の使用は、インビボ適用を対象としたすべてのｄｓＲＮＡに対して、免疫応答を阻止する手段として考慮されるべきであり、かつヌクレアーゼ安定性の向上およびオフターゲット効果の可能性の低減というさらなる利点を有する。
【０３０７】
細胞死は免疫刺激の結果生じ得るが、細胞生存率の評価はＩＦＮ応答の誘導をモニターするための適切な方法ではない。ＩＦＮ応答は細胞死を伴わずに存在することがあり、細胞死はＩＦＮ誘発の非存在下で標的ノックダウンにより生じることがある（例えば、標的遺伝子が細胞生存に不可欠である場合）。関連するサイトカインを培地中で直接測定することが可能であり、そのようなアッセイの実施をルーティン化する様々な市販のキットが存在する。多くの異なった免疫エフェクター分子を測定し得るが、スクリーニング目的では通常、トランスフェクションの４時間および２４時間後にＩＦＮ−α、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６のレベルを試験することで十分である。陽イオン性脂質は、特定の細胞において核酸カーゴの非存在下でも免疫応答を誘発し得るため、「トランスフェクション試薬のみの対照」を含むことが重要である。細胞培養研究では、ＩＦＮ経路誘導に関する対照を含むことが考慮されるべきである。インビボで核酸を投与する場合は、ＩＦＮ応答誘発の危険性が最も高いため、常に免疫刺激に関して試験することが不可欠である。
【０３０８】
修飾が、ＤｓｉＲＮＡ剤がダイサーの基質として働くことを妨げない限り、本発明のＤｓｉＲＮＡ剤に修飾を含み得る。一実施形態では、ＤｓｉＲＮＡ剤のダイサープロセシングを増強する１つ以上の修飾を行い得る。第二の実施形態では、より効率的なＲＮＡｉ生成をもたらす１つ以上の修飾を行い得る。第三の実施形態では、より大きなＲＮＡｉ効果を補助する１つ以上の修飾を行い得る。第四の実施形態では、細胞に送達される各ＤｓｉＲＮＡ剤分子当たりのより大きな効力を生じる１つ以上の修飾を行い得る。修飾は、３’末端領域、５’末端領域、３’末端および５’末端領域の両方、またはいくつかの場合には、配列内の様々な位置に組み込み得る。上記制限を考慮して、任意の数および組合せの修飾をＤｓｉＲＮＡ剤内に組み込み得る。複数の修飾が存在する場合、それらは同じであっても異なっていてもよい。塩基、糖部分、リン酸骨格およびそれらの組合せに対する修飾が考えられる。いずれの５’末端もリン酸化し得る。
【０３０９】
リン酸骨格に関して考えられる修飾の例としては、メチルホスホナート、ホスホロチオアート、およびアルキルホスホトリエステルのようなホスホトリエステル修飾を含めたホスホナートなどが挙げられる。糖部分に関して考えられる修飾の例としては、２’−アルキルピリミジン、例えば２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、アミノおよびデオキシ修飾などが挙げられる（例えば、Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉら，２００３，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１：５８９−５９５を参照されたい）。塩基グループに関して考えられる修飾の例としては、脱塩基糖、２−Ｏ−アルキル修飾ピリミジン、４−チオウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシルおよび５−（３−アミノアリル）−ウラシルなどが挙げられる。ロックト核酸またはＬＮＡも組み込み得る。他の多くの修飾が知られており、上記基準を満たす限り使用することができる。修飾の例は、米国特許第５，６８４，１４３号、第５，８５８，９８８号および第６，２９１，４３８号ならびに米国特許出願公開第２００４／０２０３１４５Ａ１号にも開示されている。その他の修飾は、Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ（２０００，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  １０：２９７−３１０）、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（２０００，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  １０：１１７−２１）、Ｒｕｓｃｋｏｗｓｋｉら（２０００，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  １０：３３３−３４５）、Ｓｔｅｉｎら（２００１，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  １１：３１７−２５）；Ｖｏｒｏｂｊｅｖら（２００１，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  １１：７７−８５）に開示されている。
【０３１０】
考えられる１つ以上の修飾をいずれかの鎖内に組み込み得る。ＤｓｉＲＮＡ剤における修飾の配置は、より大きな効力および安定性の付与、毒性の低下、ダイサープロセシングの増強および免疫応答の最小化を含めたＤｓｉＲＮＡ剤の特性に大きな影響を与え得る。一実施形態では、アンチセンス鎖もしくはセンス鎖または両鎖が１つ以上の２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを有する。別の実施形態では、アンチセンス鎖が２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含有する。別の実施形態では、アンチセンス鎖が、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドからなる３’オーバーハングを含有する。アンチセンス鎖は、追加の２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドも含み得る。
【０３１１】
本発明の特定の実施形態では、ＤｓｉＲＮＡ剤は、ダイサーによるそのプロセシングを増強する１つ以上の特性を有する。これらの実施形態によれば、ＤｓｉＲＮＡ剤は、それがダイサーによりプロセシングされて活性ｓｉＲＮＡを生じるのに十分な長さ、ならびに少なくとも１つの以下の特性を有する：（ｉ）ＤｓｉＲＮＡ剤は非対称である、例えば、アンチセンス鎖上に３’オーバーハングを有する、および（ｉｉ）ＤｓｉＲＮＡ剤は、ダイサーが結合してｄｓＲＮＡを活性ｓｉＲＮＡにプロセシングする方向を指定するために、センス鎖に修飾された３’末端を有する。この実施形態によれば、ｄｓＲＮＡ中の最長鎖は２５〜３５個のヌクレオチドを含む。一実施形態では、ＤｓｉＲＮＡ剤は、センス鎖が２５〜２８個のヌクレオチドを含み、かつアンチセンス鎖が２５〜３０個のヌクレオチドを含むような非対称となっている。したがって、得られたｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端上にオーバーハングを有する。オーバーハングは１〜４ヌクレオチド、例えば２ヌクレオチドである。センス鎖は５’リン酸も有し得る。
【０３１２】
他の実施形態では、ダイサープロセシングのために、ＤｓｉＲＮＡ剤のセンス鎖をセンス鎖の３’末端に位置する適切な修飾剤により修飾する、すなわち、ダイサーの結合およびプロセシングの方向を指定するようにＤｓｉＲＮＡ剤を設計する。適切な修飾剤としては、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、非環状ヌクレオチドなどのようなヌクレオチド、蛍光分子などのような立体障害分子が挙げられる。非環状ヌクレオチドは、ｄＮＭＰ中に通常存在する２’−デオキシリボフラノシル糖の代わりに２−ヒドロキシエトキシメチル基を有する。他のヌクレオチド修飾剤としては、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）、２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）、ならびに３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）および２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）の一リン酸ヌクレオチドを挙げ得る。一実施形態では、デオキシヌクレオチドを修飾剤として使用する。ヌクレオチド修飾剤を用いる場合、センス鎖の３’末端上のリボヌクレオチドを１〜３個のヌクレオチド修飾剤または２個のヌクレオチド修飾剤に置換する。立体障害分子を用いる場合、それらをアンチセンス鎖の３’末端のリボヌクレオチドに結合させる。したがって、修飾剤の組込みによって鎖の長さは変わらない。別の実施形態では、本発明は、アンチセンス鎖のダイサープロセシングの方向を指定するために、ＤｓｉＲＮＡ剤中で２つのＤＮＡ塩基を代わりに用いることを考慮する。本発明のさらなる実施形態では、センス鎖３’末端およびアンチセンス鎖５’末端上で二本鎖の平滑末端を形成しているセンス鎖３’末端上の２つのリボヌクレオチドが、２つの末端ＤＮＡ塩基に置換され、２ヌクレオチドのＲＮＡオーバーハングがアンチセンス鎖の３’末端上に位置する。これは、平滑末端上にＤＮＡを、およびオーバーハング末端上にＲＮＡ塩基を有する非対称組成物である。
【０３１３】
本発明のＤｓｉＲＮＡ剤のセンスとアンチセンス鎖は、細胞の細胞質中で見られる条件のような生物学的条件下でアニールする。さらに、ＤｓｉＲＮＡ剤の、特にアンチセンス鎖の一配列の領域は、少なくとも１９ヌクレオチドの配列長を有し、これらのヌクレオチドは、アンチセンス鎖の３’末端に隣接する２１ヌクレオチド領域中にあり、かつ標的遺伝子から産生されるＲＮＡのヌクレオチド配列と十分に相補的である。
【０３１４】
ＤｓｉＲＮＡ剤はまた、１つ以上の以下のさらなる特性も有し得る：（ａ）アンチセンス鎖は典型的な２１ｍｅｒから右方へのシフトを有する、（ｂ）鎖は完全に相補的でなくてもよい、すなわち、鎖は単純なミスマッチ対を含有し得る、および（ｃ）ロックト核酸（１つまたは複数）のような塩基修飾がセンス鎖の５’末端に含まれ得る。「典型的な」２１ｍｅｒ  ｓｉＲＮＡは従来技術を用いて設計される。一技術では、試薬の１つが効果的であることを期待して、一般に様々な部分を、並行して、または同じ標的に対して特異的ないくつかの異なるｓｉＲＮＡ二本鎖を含有するプールにおいて試験する（Ｊｉら，２００３，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ５５２：２４７−２５２）。他の技術では、活性なＲＮＡｉエフェクター分子を得る可能性を高める設計規則およびアルゴリズムを用いる（Ｓｃｈｗａｒｚら，２００３，Ｃｅｌｌ  １１５：１９９−２０８；Ｋｈｖｏｒｏｖａら，２００３，Ｃｅｌｌ  １１５：２０９−２１６；Ｕｉ−Ｔｅｉら，２００４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３２：９３６−９４８；Ｒｅｙｎｏｌｄｓら，２００４，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２２：３２６−３３０；Ｋｒｏｌら，２００４，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９：４２２３０−４２２３９；Ｙｕａｎら，２００４，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３２（Ｗｅｂｓｅｒｖｅｒ  ｉｓｓｕｅ）：Ｗ１３０−１３４；Ｂｏｅｓｅら，２００５，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ３９２：７３−９６）。ｓｉＲＮＡのハイスループットな選択も開発されている（米国特許出願公開第２００５／００４２６４１Ａ１号）。潜在的な標的部位を二次構造予測により解析することもできる（Ｈｅａｌｅら，２００５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３３（３）：ｅ３０）。次いで、この２１ｍｅｒを用いて、２１ｍｅｒの５’末端上に３〜９個の追加のヌクレオチドを含むように右方シフトを設計する。これらの追加のヌクレオチドの配列は、任意の配列を有し得る。一実施形態では、追加されるリボヌクレオチドは、標的遺伝子の配列に基づくものである。この実施形態においてさえ、標的配列とアンチセンスｓｉＲＮＡの間の完全な相補性を必要としない。
【０３１５】
本発明のＤｓｉＲＮＡ剤の第一および第二のオリゴヌクレオチドは完全に相補的である必要はない。これらは、生物学的条件下でアニールし、かつ標的配列と十分に相補的なｓｉＲＮＡを産生するダイサー基質を供給するために、実質的に相補的であることが必要なだけである。ロックト核酸またはＬＮＡは当業者に公知である（Ｅｌｍｅｎら，２００５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３３：４３９−４４７；Ｋｕｒｒｅｃｋら，２００２，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３０：１９１１−１９１８；Ｃｒｉｎｅｌｌｉら，２００２，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３０：２４３５−２４４３；ＢｒａａｓｃｈおよびＣｏｒｅｙ，２００１，Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ８：１−７；Ｂｏｎｄｅｎｓｇａａｒｄら，２０００，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６：２６８７−２６９５；Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔら，２０００，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７：５６３３−５６３８）。一実施形態では、ＬＮＡをセンス鎖の５’末端で組み込む。別の実施形態では、アンチセンス鎖上に３’オーバーハングを含むように設計された二本鎖のセンス鎖５’末端でＬＮＡを組み込む。
【０３１６】
特定の実施形態では、本発明のＤｓｉＲＮＡ剤は非対称構造を有し、センス鎖は２５塩基対の長さを有し、アンチセンス鎖は、２塩基の３’−オーバーハングを含む２７塩基対の長さを有する。他の実施形態では、非対称構造を有するこのＤｓｉＲＮＡ剤はさらに、２つのリボヌクレオチドの代わりにセンス鎖の３’末端に２つのデオキシヌクレオチドを含有する。
【０３１７】
２つの別々のオリゴヌクレオチドを含有する特定のＤｓｉＲＮＡ剤組成物を、第三の構造体により連結し得る。第三の構造体はＤｓｉＲＮＡ剤上でのダイサー活性を阻止せず、標的遺伝子から転写されたＲＮＡの指令された破壊を阻害しない。一実施形態では、第三の構造体は化学連結基であり得る。多くの適切な化学連結基が当該技術分野で公知であり、使用することができる。あるいは、第三の構造体は、ｄｓＲＮＡ組成物を構成する２つのオリゴヌクレオチドのアニーリングの際にヘアピン構造を生じるようにＤｓｉＲＮＡ剤の２つのオリゴヌクレオチドを連結する、オリゴヌクレオチドであり得る。ヘアピン構造はＤｓｉＲＮＡ剤上でのダイサー活性を阻止せず、標的ＲＮＡの指令された破壊を阻害しない。
【０３１８】
特定の実施形態では、本発明のＤｓｉＲＮＡ剤は、ダイサーによるそのプロセシングを増強するいくつかの特性を有する。このような実施形態によれば、ＤｓｉＲＮＡ剤は、それがダイサーによりプロセシングされてｓｉＲＮＡを生じるのに十分な長さ、ならびに少なくとも１つの以下の特性を有する：（ｉ）ＤｓｉＲＮＡ剤は非対称である、例えば、アンチセンス鎖上に３’オーバーハングを有する、および（ｉｉ）ＤｓｉＲＮＡ剤は、ダイサーが結合してｄｓＲＮＡを活性ｓｉＲＮＡにプロセシングする方向を指定するために、センス鎖に修飾された３’末端を有する。これらの実施形態によれば、ＤｓｉＲＮＡ剤中の最長鎖は２５〜３０個のヌクレオチドを含む。一実施形態では、センス鎖が２５〜３０個のヌクレオチドを含み、かつアンチセンス鎖が２５〜２８個のヌクレオチドを含む。したがって、得られたｄｓＲＮＡは、センス鎖の３’末端上にオーバーハングを有する。オーバーハングは１〜４ヌクレオチド、例えば２ヌクレオチドなどである。アンチセンス鎖は５’リン酸も有し得る。
【０３１９】
特定の実施形態では、ダイサープロセシングのために、ＤｓｉＲＮＡ剤のセンス鎖をセンス鎖の３’末端に位置する適切な修飾剤により修飾する、すなわち、ダイサーの結合およびプロセシングの方向を指定するようにＤｓｉＲＮＡ剤を設計する。適切な修飾剤としては、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、非環状ヌクレオチドなどのようなヌクレオチド、および蛍光分子などのような立体障害分子が挙げられる。非環状ヌクレオチドは、ｄＮＭＰ中に通常存在する２’−デオキシリボフラノシル糖の代わりに２−ヒドロキシエトキシメチルを有する。他のヌクレオチド修飾剤としては、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）、２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）、ならびに３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）および２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）の一リン酸ヌクレオチドを挙げ得る。一実施形態では、デオキシヌクレオチドを修飾剤として使用する。ヌクレオチド修飾剤を用いる場合、センス鎖の３’末端上のリボヌクレオチドを１〜３個のヌクレオチドまたは２個のヌクレオチドに置換する。立体障害分子を用いる場合、それらをアンチセンス鎖の３’末端のリボヌクレオチドに結合させる。したがって、修飾剤の組込みによって鎖の長さは変わらない。別の実施形態では、本発明は、アンチセンス鎖のダイサープロセシングの方向を指定するために、ｄｓＲＮＡ中で２つのＤＮＡ塩基を代わりに用いることを考慮する。さらなる発明では、アンチセンス鎖５’末端およびセンス鎖３’末端で二本鎖の平滑末端を形成している２つのリボヌクレオチドの代わりに、２つの末端ＤＮＡ塩基がセンス鎖の３’末端上に位置し、２ヌクレオチドのＲＮＡオーバーハングがアンチセンス鎖の３’末端上に位置する。これは、平滑末端上にＤＮＡを、およびオーバーハング末端上にＲＮＡ塩基を有する非対称組成物である。
【０３２０】
他の特定の実施形態では、ダイサープロセシングのために、ＤｓｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖をアンチセンス鎖の３’末端に位置する適切な修飾剤により修飾する、すなわち、ダイサーの結合およびプロセシングの方向を指定するようにＤｓｉＲＮＡ剤を設計する。適切な修飾剤としては、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、非環状ヌクレオチドなどのようなヌクレオチド、および蛍光分子などのような立体障害分子が挙げられる。非環状ヌクレオチドは、ｄＮＭＰ中に通常存在する２’−デオキシリボフラノシル糖の代わりに２−ヒドロキシエトキシメチルを有する。他のヌクレオチド修飾剤としては、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）、２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）、ならびに３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）および２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）の一リン酸ヌクレオチドを挙げ得る。一実施形態では、デオキシヌクレオチドを修飾剤として使用する。ヌクレオチド修飾剤を用いる場合、アンチセンス鎖の３’末端上のリボヌクレオチドを１〜３個のヌクレオチドまたは２個のヌクレオチドに置換する。立体障害分子を用いる場合、それらをアンチセンス鎖の３’末端のリボヌクレオチドに結合させる。したがって、修飾剤の組込みによって鎖の長さは変わらない。別の実施形態では、本発明は、ダイサープロセシングの方向を指定するために、ｄｓＲＮＡ中で２つのＤＮＡ塩基を代わりに用いることを考慮する。さらなる発明では、センス鎖５’末端およびアンチセンス鎖３’末端で二本鎖の平滑末端を形成している２つのリボヌクレオチドの代わりに、２つの末端ＤＮＡ塩基がアンチセンス鎖の３’末端上に位置し、２ヌクレオチドのＲＮＡオーバーハングがセンス鎖の３’末端上に位置する。これも、平滑末端上にＤＮＡを、およびオーバーハング末端上にＲＮＡ塩基を有する非対称組成物である。
【０３２１】
センスとアンチセンス鎖は、細胞の細胞質中で見られる条件のような生物学的条件下でアニールする。さらに、ｄｓＲＮＡの、特にアンチセンス鎖の一配列の領域は、少なくとも１９ヌクレオチドの配列長を有し、これらのヌクレオチドは、アンチセンス鎖の３’末端に隣接し、かつ標的ＲＮＡのヌクレオチド配列と十分に相補的である。
【０３２２】
さらに、ダイサーによる切断から生じるオリゴヌクレオチドセグメントが遺伝子発現の阻害に最も効果的であるオリゴヌクレオチドの一部となることが確実になるように、ＤｓｉＲＮＡ剤構造を最適化し得る。例えば、本発明の一実施形態では、ＤｓｉＲＮＡ剤構造の２７ｂｐオリゴヌクレオチドを合成し、このオリゴヌクレオチドでは、遺伝子発現を阻害する予想される２１〜２２ｂｐセグメントが、アンチセンス鎖の３’末端上に位置する。アンチセンス鎖の５’末端上に位置する残りの塩基は、ダイサーにより切断され、破棄される。この切断された部分は、相同（すなわち、標的配列の配列に基づく）または非相同であり得、核酸鎖を延長するために付加され得る。
【０３２３】
米国特許出願公開第２００７／０２６５２２０号は、２７ｍｅｒ  ＤｓｉＲＮＡが、化学修飾がなくても、同等の２１ｍｅｒ  ｓｉＲＮＡ組成物を上回る向上した血清安定性を示すことを開示している。ＤｓｉＲＮＡ剤の修飾、例えば、上で詳述されているようなパターンでアンチセンス鎖中に２’−Ｏ−メチルＲＮＡを含むことなどは、５’リン酸の付加と組み合わせた場合、ＤｓｉＲＮＡ剤の安定性を向上させ得る。合成ＲＮＡ二本鎖のすべての鎖に５’−リン酸を付加することは、ある程度のヌクレアーゼ安定性を付与するための安価かつ生理学的な方法となり得る。本発明のＤｓｉＲＮＡ剤の化学修飾パターンは、このような薬剤の有効性を増強するように設計される。したがって、このような修飾は、ＤｓｉＲＮＡ剤の効力低下を回避する；ＤｓｉＲＮＡ剤のダイサープロセシングの阻害を回避する；ＤｓｉＲＮＡ剤の生体液中での安定性を向上させる（ヌクレアーゼ感受性を低下させる）；または自然免疫系による感知を阻止または回避するように設計される。このような修飾はまた、毒性であることを回避し、かつ本発明のＤｓｉＲＮＡ剤の製造コストの増加を回避するまたは製造簡便性に影響を及ぼすようにも設計される。
【０３２４】
ＤｓｉＲＮＡ活性を評価するためのＲＮＡｉインビトロアッセイ
無細胞系においてＲＮＡｉを再現するインビトロアッセイを用いて、対象ＲＮＡ配列（１つまたは複数）を標的とするＤｓｉＲＮＡ構築物を評価し得る。このアッセイは、標的ＲＮＡに対するＤｓｉＲＮＡでの使用に適合させた、Ｔｕｓｃｈｌら（１９９９，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１３，３１９１−３１９７）およびＺａｍｏｒｅら（２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２５−３３）により記載されているシステムを含む。シンシチウム胚盤葉由来のショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）抽出物を用いて、インビトロでＲＮＡｉ活性を再構築する。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いた、標的ＲＮＡを発現する適当なプラスミドからのインビトロ転写により、または化学合成により標的ＲＮＡを作製する。センスおよびアンチセンスＤｓｉＲＮＡ鎖（例えば、それぞれ２０ｕＭ）を、９０℃で１分間、次いで３７℃で１時間の緩衝液（１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．４、２ｍＭ酢酸マグネシウムなど）中でのインキュベーションによりアニールさせ、次いで、溶解緩衝液（例えば、１００ｍＭ酢酸カリウム、ｐＨ７．４の３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、２ｍＭ酢酸マグネシウム）中で希釈する。アニーリングは、ＴＢＥ緩衝液中、アガロースゲル上でのゲル電気泳動および臭化エチジウム染色によりモニターし得る。酵母を加えた糖蜜寒天上で回収し、卵膜除去して溶解させた、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｒバエの０〜２時間齢胚を用いて、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）溶解物を調製する。溶解物を遠心分離し、上清を単離する。アッセイは、５０％溶解物［ｖｏｌ／ｖｏｌ］、ＲＮＡ（最終濃度１０〜５０ｐＭ）およびＤｓｉＲＮＡ（最終濃度１０ｎＭ）含有１０％［ｖｏｌ／ｖｏｌ］溶解緩衝液を含有する反応混合物を含む。反応混合物はまた、１０ｍＭのクレアチンリン酸、１０ｕｇ／ｍｌのクレアチンホスホキナーゼ、１００ｕｍのＧＴＰ、１００ｕＭのＵＴＰ、１００ｕＭのＣＴＰ、５００ｕＭのＡＴＰ、５ｍＭのＤＴＴ、０．１Ｕ／ｕＬのＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）および１００ｕＭの各アミノ酸も含有する。酢酸カリウムの最終濃度を１００ｍＭに調整する。反応物を氷上で予備会合を行い、２５℃で１０分間インキュベートしてからＲＮＡを加え、次いで、２５℃でさらに６０分間インキュベートする。４体積の１．２５×Ｐａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で反応を停止させる。標的ＲＮＡの切断を、ＲＴ−ＰＣＲ解析または当該技術分野で公知の他の方法によりアッセイし、反応にＤｓｉＲＮＡを含めない対照反応と比較する。
【０３２５】
あるいは、内側で標識したアッセイ用のＲＮＡを［アルファ−３２Ｐ］ＣＴＰの存在下、インビトロ転写により調製して、スピンクロマトグラフィーによりＧ５０  Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムに通し、さらなる精製を行わずに標的ＲＮＡとして使用する。任意に、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ酵素を用いて、標的ＲＮＡを５’−３２Ｐ末端標識する。上記のようにアッセイを行い、標的ＲＮＡおよびＲＮＡｉにより生じた特定のＲＮＡ断片をゲルのオートラジオグラフ上で可視化する。インタクトの対照ＲＮＡまたはＤｓｉＲＮＡを含まない対照反応のＲＮＡおよびアッセイにより生じた切断産物を表すバンドのＰＨＯＳＰＨＯＲ  ＩＭＡＧＥＲ（登録商標）（オートラジオグラフィー）定量化により、切断のパーセンテージを決定する。
【０３２６】
一実施形態では、このアッセイを用いて、ＤｓｉＲＮＡ仲介によるＲＮＡｉ切断のための対象ＲＮＡ標的中の標的部位を決定し、ここでは、例えば、標識された標的ＲＮＡの電気泳動またはノーザンブロッティングのみならず、当該技術分野で公知の他の方法によりアッセイ反応を解析することで、ＲＮＡｉ仲介による対象ＲＮＡ標的の切断に関して複数のＤｓｉＲＮＡ構築物をスクリーニングする。
【０３２７】
ｄｓｉＲＮＡ−ペプチド剤の構造
特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、以下の構造のいずれかを有し得る。
【０３２８】
１つの上記実施形態では、ｄｓＲＮＡは：
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDDP-3'
3’-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5’
を含み、配列中、「Ｘ」＝ＲＮＡであり、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４個のＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡであり、かつ「Ｐ」＝ペプチドである。上の鎖がセンス鎖であり、下の鎖がアンチセンス鎖である。上の鎖がセンス鎖であり、下の鎖がアンチセンス鎖である。
【０３２９】
別の上記実施形態では、ｄｓＲＮＡは：
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3’-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5’
を含み、配列中、「Ｘ」＝ＲＮＡであり、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４個のＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡであり、かつ「Ｐ」＝ペプチドである。上の鎖がセンス鎖であり、下の鎖がアンチセンス鎖である。
【０３３０】
別の上記実施形態では、ｄｓＲＮＡは：
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3’-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5’
を含み、配列中、「Ｘ」＝ＲＮＡであり、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４個のＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡであり、かつ「Ｐ」＝ペプチドである。上の鎖がセンス鎖であり、下の鎖がアンチセンス鎖である。
【０３３１】
別の上記実施形態では、ｄｓＲＮＡは：
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3’-PYXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5’
を含み、「Ｘ」＝ＲＮＡであり、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４個のＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡであり、かつ「Ｐ」＝ペプチドである。上の鎖がセンス鎖であり、下の鎖がアンチセンス鎖である。
【０３３２】
別の上記実施形態では、ｄｓＲＮＡは：
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3’-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5’
を含み、配列中、「Ｘ」＝ＲＮＡであり、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４個のＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡであり、かつ「Ｐ」＝ペプチドである。上の鎖がセンス鎖であり、下の鎖がアンチセンス鎖である。
【０３３３】
別の上記実施形態では、ｄｓＲＮＡは：
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDDP-3'
3’-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5’
を含み、配列中、「Ｘ」＝ＲＮＡであり、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４個のＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡであり、かつ「Ｐ」＝ペプチドである。上の鎖がセンス鎖であり、下の鎖がアンチセンス鎖である。
【０３３４】
別の上記実施形態では、ｄｓＲＮＡは：
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3’-PYXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5’
を含み、配列中、「Ｘ」＝ＲＮＡであり、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４個のＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡであり、かつ「Ｐ」＝ペプチドである。上の鎖がセンス鎖であり、下の鎖がアンチセンス鎖である。
【０３３５】
別の上記実施形態では、ｄｓＲＮＡは：
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3’-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5’
を含み、配列中、「Ｘ」＝ＲＮＡであり、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４個のＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡであり、かつ「Ｐ」＝ペプチドである。上の鎖がセンス鎖であり、下の鎖がアンチセンス鎖である。
【０３３６】
別の上記実施形態では、ｄｓＲＮＡは：
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDDP-3'
3’-PYXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5’
を含み、配列中、「Ｘ」＝ＲＮＡであり、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４個のＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡであり、かつ「Ｐ」＝ペプチドである。上の鎖がセンス鎖であり、下の鎖がアンチセンス鎖である。
【０３３７】
別の上記実施形態では、ｄｓＲＮＡは：
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDDP-3'
3’-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5’
を含み、配列中、「Ｘ」＝ＲＮＡであり、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４個のＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡであり、かつ「Ｐ」＝ペプチドである。上の鎖がセンス鎖であり、下の鎖がアンチセンス鎖である。
【０３３８】
他の実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは：
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-PYXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-PYXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-PYXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDDP-3'
3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-PYXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDDP-3'
3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-PYXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDDP-3'
3'-PYXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDDP-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDDP-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDDP-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDDP-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDDP-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDDP-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDDP-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-PYXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-PYXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-PYXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDDP-3'
3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-PYXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDDP-3'
3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-PYXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDDP-3'
3'-PYXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDDP-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDDP-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDDP-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDDP-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDDP-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDDP-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDDP-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-PYXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-PYXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
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3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDDP-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDDP-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-PYXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-PYXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-PYXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
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または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
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または
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3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDDP-3'
3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
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3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
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または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDDP-3'
3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
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または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDDP-3'
3'-PYXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDDP-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDDP-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
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または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
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または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDDP-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDDP-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDDP-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDDP-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDDP-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
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3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
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または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
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または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
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または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-PYXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDDP-3'
3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-PYXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDDP-3'
3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-PYXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDDP-3'
3'-PYXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDDP-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDDP-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDDP-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDDP-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDDP-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDDP-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDDP-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-PYXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-PYXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-PYXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDDP-3'
3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-PYXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDDP-3'
3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-PYXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDDP-3'
3'-PYXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDDP-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDDP-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDDP-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDDP-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDDP-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDDP-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDDP-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-PYXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-PYXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-PYXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDDP-3'
3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-PYXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDDP-3'
3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-PYXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDDP-3'
3'-PYXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDDP-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDDP-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDDP-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDDP-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDDP-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDDP-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDDP-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-PYXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-PYXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-PYXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5'
または
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
または
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-3'
3'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-5'
を含み、配列中、「Ｘ」＝ＲＮＡであり、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡであり、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４個のＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線部の残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡであり、かつ「Ｐ」＝ペプチドである。上の鎖がセンス鎖であり、下の鎖がアンチセンス鎖である。
【０３３９】
別の実施形態では、ｄｓＲＮＡは長さの等しい鎖を含む。
【０３４０】
１つの上記実施形態では、ｄｓＲＮＡは：
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXMMP-3'
3’-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXMM-5’
を含み、配列中、「Ｘ」＝ＲＮＡであり、「Ｍ」は核酸残基（ＲＮＡ、ＤＮＡまたは非天然もしくは修飾核酸）であり、かつ「Ｐ」＝ペプチドである。上記薬剤の上記残基はいずれも、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであってもよく、また上記非対称の薬剤で示されるような下の（第二）鎖の３’末端残基から始まる２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーの交互位置を、上記平滑−平滑ｄｓＲＮＡ剤において使用してもよい。
【０３４１】
１つの上記実施形態では、ｄｓＲＮＡは：
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXMM-3'
3’-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXMM-5’
を含み、配列中、「Ｘ」＝ＲＮＡであり、「Ｍ」は核酸残基（ＲＮＡ、ＤＮＡまたは非天然もしくは修飾核酸）であり、かつ「Ｐ」＝ペプチドである。上記薬剤の上記残基はいずれも、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであってもよく、また上記非対称の薬剤で示されるような下の（第二）鎖の３’末端残基から始まる２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーの交互位置を、上記平滑−平滑ｄｓＲＮＡ剤において使用してもよい。
【０３４２】
１つの上記実施形態では、ｄｓＲＮＡは：
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXMM-3'
3’-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXMMP-5’
を含み、配列中、「Ｘ」＝ＲＮＡであり、「Ｍ」は核酸残基（ＲＮＡ、ＤＮＡまたは非天然もしくは修飾核酸）であり、かつ「Ｐ」＝ペプチドである。上記薬剤の上記残基はいずれも、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであってもよく、また上記非対称の薬剤で示されるような下の（第二）鎖の３’末端残基から始まる２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーの交互位置を、上記平滑−平滑ｄｓＲＮＡ剤において使用してもよい。
【０３４３】
１つの上記実施形態では、ｄｓＲＮＡは：
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXMM-3'
3’-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXMM-5’
を含み、配列中、「Ｘ」＝ＲＮＡであり、「Ｍ」は核酸残基（ＲＮＡ、ＤＮＡまたは非天然もしくは修飾核酸）であり、かつ「Ｐ」＝ペプチドである。上記薬剤の上記残基はいずれも、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであってもよく、また上記非対称の薬剤で示されるような下の（第二）鎖の３’末端残基から始まる２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーの交互位置を、上記平滑−平滑ｄｓＲＮＡ剤において使用してもよい。
【０３４４】
１つの上記実施形態では、ｄｓＲＮＡは：
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXMMP-3'
3’-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXMM-5’
を含み、配列中、「Ｘ」＝ＲＮＡであり、「Ｍ」は核酸残基（ＲＮＡ、ＤＮＡまたは非天然もしくは修飾核酸）であり、かつ「Ｐ」＝ペプチドである。上記薬剤の上記残基はいずれも、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであってもよく、また上記非対称の薬剤で示されるような下の（第二）鎖の３’末端残基から始まる２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーの交互位置を、上記平滑−平滑ｄｓＲＮＡ剤において使用してもよい。
【０３４５】
１つの上記実施形態では、ｄｓＲＮＡは：
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXMM-3'
3’-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXMMP-5’
を含み、配列中、「Ｘ」＝ＲＮＡであり、「Ｍ」は核酸残基（ＲＮＡ、ＤＮＡまたは非天然もしくは修飾核酸）であり、かつ「Ｐ」＝ペプチドである。上記薬剤の上記残基はいずれも、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであってもよく、また上記非対称の薬剤で示されるような下の（第二）鎖の３’末端残基から始まる２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーの交互位置を、上記平滑−平滑ｄｓＲＮＡ剤において使用してもよい。
【０３４６】
１つの上記実施形態では、ｄｓＲＮＡは：
5'-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXMMP-3'
3’-PXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXMMP-5’
を含み、配列中、「Ｘ」＝ＲＮＡであり、「Ｍ」は核酸残基（ＲＮＡ、ＤＮＡまたは非天然もしくは修飾核酸）であり、かつ「Ｐ」＝ペプチドである。上記薬剤の上記残基はいずれも、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであってもよく、また上記非対称の薬剤で示されるような下の（第二）鎖の３’末端残基から始まる２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーの交互位置を、上記平滑−平滑ｄｓＲＮＡ剤において使用してもよい。
【０３４７】
本発明はまた、以下に記載する典型的な構造のいずれかを考慮し、これらの構造では、少なくとも１つの本発明のペプチドが、本発明のｄｓＲＮＡの第一もしくは第二鎖の少なくとも一方の少なくとも一端と、または第一もしくは第二鎖の少なくとも一方と内側でコンジュゲートされている。
【０３４８】
別の実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、ダイサー切断を方向付ける働きをする１〜３個のミスマッチ残基を有する長さの等しい鎖を含む（特に、第一鎖と第二鎖が互いにアニールする場合、ＤｓｉＲＮＡの第一鎖上の３’末端残基から数えて１、２または３位の１つ以上が、第二鎖上の５’末端領域の対応する残基とミスマッチである）。２個の末端ミスマッチ残基を有する典型的な２７ｍｅｒ  ＤｓｉＲＮＡ剤を示す：
【０３４９】
【化１】
2012528596.tif 000003
【０３５０】
配列中、「Ｘ」＝ＲＮＡであり、「Ｍ」は、鎖がアニールする場合、別の相補的な鎖の対応する「Ｍ」残基と塩基対（水素結合）を形成しない核酸残基（ＲＮＡ、ＤＮＡまたは非天然もしくは修飾核酸）である。上記薬剤の残基はいずれも、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであってもよく、また上記非対称の薬剤で示されるような下の（第二）鎖の３’末端残基から始まる２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーの交互位置を、上記「平滑／ほつれ（ｆｒａｙ）」ＤｓｉＲＮＡ剤において使用してもよい。上の鎖（第一鎖）がセンス鎖であり、下の鎖（第二鎖）がアンチセンス鎖である。
【０３５１】
特定のさらなる実施形態では、本発明は、予測されるセンス鎖ダイサー切断部位の３’およびそれに対応して、予測されるアンチセンス鎖ダイサー切断部位の５’に位置する二本鎖核酸（ｄｓＮＡ）の領域内に１つ以上の塩基対形成したデオキシリボヌクレオチドを有する、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）のための組成物を提供する。本発明の組成物は、前駆体分子であるｄｓＮＡを含む、すなわち、本発明のｄｓＮＡは、インビボでプロセシングされて活性な小型の干渉核酸（ｓｉＲＮＡ）を生じる。ｄｓＮＡはダイサーによりプロセシングされて、ＲＩＳＣ内に組み込まれる活性ｓｉＲＮＡとなる。
【０３５２】
特定の実施形態では、本発明のＤｓｉＲＮＡ剤は、以下の典型的な構造のいずれかを有し得る。
【０３５３】
１つの上記実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは：
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DNDD-3'
3’-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DNXX-5’
を含み、配列中、「Ｘ」＝ＲＮＡであり、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである０〜１０個のＲＮＡモノマーからなる任意選択のオーバーハングドメインであり、特定の実施形態では、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４個のＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡであり、かつ「Ｎ」＝１〜５０以上であるが、任意に１〜８である。「Ｎ＊」＝０〜１５以上であるが、任意に０、１、２、３、４、５または６である。一実施形態では、上の鎖がセンス鎖であり、下の鎖がアンチセンス鎖である。あるいは、下の鎖がセンス鎖であり、上の鎖がアンチセンス鎖である。
【０３５４】
関連する一実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは：
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DNDD-3'
3’-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DNDD-5’
を含み、配列中、「Ｘ」＝ＲＮＡであり、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである０〜１０個のＲＮＡモノマーからなる任意選択のオーバーハングドメインであり、特定の実施形態では、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４個のＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡであり、かつ「Ｎ」＝１〜５０以上であるが、任意に１〜８である。「Ｎ＊」＝０〜１５以上であるが、任意に０、１、２、３、４、５または６である。一実施形態では、上の鎖がセンス鎖であり、下の鎖がアンチセンス鎖である。あるいは、下の鎖がセンス鎖であり、上の鎖がアンチセンス鎖である。
【０３５５】
別の上記実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは：
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DNDD-3'
3’-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DNZZ-5’
を含み、配列中、「Ｘ」＝ＲＮＡであり、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡであり、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである０〜１０個のＲＮＡモノマーからなる任意選択のオーバーハングドメインであり、特定の実施形態では、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４個のＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡであり、「Ｚ」＝ＤＮＡまたはＲＮＡであり、かつ「Ｎ」＝１〜５０以上であるが、任意に１〜８である。「Ｎ＊」＝０〜１５以上であるが、任意に０、１、２、３、４、５または６である。一実施形態では、上の鎖がセンス鎖であり、下の鎖がアンチセンス鎖である。あるいは、下の鎖がセンス鎖であり、上の鎖がアンチセンス鎖であり、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーが上の図に今示した下の鎖ではなく、上の鎖に沿った交互の残基に位置する。
【０３５６】
別の上記実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは：
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DNDD-3'
3’-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DNZZ-5’
を含み、配列中、「Ｘ」＝ＲＮＡであり、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡであり、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである０〜１０個のＲＮＡモノマーからなる任意選択のオーバーハングドメインであり、特定の実施形態では、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４個のＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡであり、「Ｚ」＝ＤＮＡまたはＲＮＡであり、かつ「Ｎ」＝１〜５０以上であるが、任意に１〜８である。「Ｎ＊」＝０〜１５以上であるが、任意に０、１、２、３、４、５または６である。一実施形態では、上の鎖がセンス鎖であり、下の鎖がアンチセンス鎖である。あるいは、下の鎖がセンス鎖であり、上の鎖がアンチセンス鎖であり、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーが上の図に今示した下の鎖ではなく、上の鎖に沿った交互の残基に位置する。
【０３５７】
別の実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは：
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*[X1/D1]NDD-3'
3’-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*[X2/D2]NZZ-5’
を含み、配列中、「Ｘ」＝ＲＮＡであり、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである０〜１０個のＲＮＡモノマーからなる任意選択のオーバーハングドメインであり、特定の実施形態では、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４個のＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡであり、「Ｚ」＝ＤＮＡまたはＲＮＡであり、かつ「Ｎ」＝１〜５０以上であるが、任意に１〜８であり、ここでは、少なくとも１つのＤ１Ｎが上の鎖中に存在し、かつ下の鎖中の対応するＤ２Ｎと塩基対を形成している。任意に、Ｄ１ＮおよびＤ１Ｎ＋１は、対応するＤ２ＮおよびＤ２Ｎ＋１と塩基対を形成する塩基である；Ｄ１Ｎ、Ｄ１Ｎ＋１およびＤ１Ｎ＋２は、対応するＤ２Ｎ、Ｄ１Ｎ＋１およびＤ１Ｎ＋２と塩基対を形成する塩基である、などである。「Ｎ＊」＝０〜１５以上であるが、任意に０、１、２、３、４、５または６である。一実施形態では、上の鎖がセンス鎖であり、下の鎖がアンチセンス鎖である。あるいは、下の鎖がセンス鎖であり、上の鎖がアンチセンス鎖であり、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーが上の図に今示した下の鎖ではなく、上の鎖に沿った交互の残基に位置する。
【０３５８】
上で示した構造のいずれにおいても、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかの５’末端は、リン酸基を任意に含む。
【０３５９】
別の実施形態では、ＤＮＡ：ＤＮＡ延長ＤｓｉＲＮＡは、ダイサー切断を方向付ける働きをする１〜３個のミスマッチ残基を有する長さの等しい鎖を含む（特に、第一鎖と第二鎖が互いにアニールする場合、ＤｓｉＲＮＡの第一鎖上の３’末端残基から数えて１、２または３位の１つ以上が、第二鎖上の５’末端領域の対応する残基とミスマッチである）。２個の末端ミスマッチ残基を有する典型的なＤＮＡ：ＤＮＡ延長ＤｓｉＲＮＡ剤を示す：
【０３６０】
【化２】
2012528596.tif 000004
【０３６１】
配列中、「Ｘ」＝ＲＮＡであり、「Ｍ」は、鎖がアニールする場合、別の相補的な鎖の対応する「Ｍ」残基と塩基対（水素結合）を形成しない核酸残基（ＲＮＡ、ＤＮＡまたは非天然もしくは修飾核酸）であり、「Ｄ」＝ＤＮＡであり、かつ「Ｎ」＝１〜５０以上であるが、任意に１〜８である。「Ｎ＊」＝０〜１５以上であるが、任意に０、１、２、３、４、５または６である。上記薬剤の残基はいずれも、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであってもよく、また上記非対称の薬剤で示されるような下の（第二）鎖の３’末端残基から始まる２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーの交互位置を、上記「平滑／ほつれ（ｆｒａｙ）」ＤｓｉＲＮＡ剤において使用してもよい。一実施形態では、上の鎖（第一鎖）がセンス鎖であり、下の鎖（第二鎖）がアンチセンス鎖である。あるいは、下の鎖がセンス鎖であり、上の鎖がアンチセンス鎖である。また非対称／オーバーハング薬剤に関して上に示されるものと同等な修飾およびＤＮＡ：ＤＮＡ延長パターンを、上記「平滑／ほつれ（ｆｒａｙｅｄ）」薬剤内に組み込んでもよい。
【０３６２】
一実施形態では、ダイサー切断の特定の方向付けを介して機能するように形成された部位に位置するデオキシリボヌクレオチドを含む、長さが延長されたＤｓｉＲＮＡ剤が提供されるが、これは、塩基対形成したデオキシリボヌクレオチドの存在をｄｓＮＡ構造中に必要としない。このような分子の典型的な構造を示す：
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXDDXX-3'
3’-YXXXXXXXXXXXXXXXXXDDXXXX-5’
配列中、「Ｘ」＝ＲＮＡであり、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである０〜１０個のＲＮＡモノマーからなる任意選択のオーバーハングドメインであり、特定の実施形態では、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４個のＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、かつ「Ｄ」＝ＤＮＡである。一実施形態では、上の鎖がセンス鎖であり、下の鎖がアンチセンス鎖である。あるいは、下の鎖がセンス鎖であり、上の鎖がアンチセンス鎖である。上記構造は、その一次プロセシング後形態として最低で２１ｍｅｒの二本鎖をダイサーに切断させるように形成されている。上記構造の下の鎖がアンチセンス鎖である実施形態では、２つのデオキシリボヌクレオチド残基がアンチセンス鎖の５’末端の最終残基および最後から２番目の残基に位置することにより、オフターゲット効果が減少すると思われる（先行研究では、少なくともアンチセンス鎖の５’末端から最後から２番目の２’−Ｏ−メチル修飾がオフターゲット効果を減少させることが示されている；例えば、米国特許出願公開第２００７／０２２３４２７号を参照されたい）。
【０３６３】
一実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは：
5'-DNXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*Y-3'
3’-DNXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*-5’
を含み、配列中、「Ｘ」＝ＲＮＡであり、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである０〜１０個のＲＮＡモノマーからなる任意選択のオーバーハングドメインであり、特定の実施形態では、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４個のＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡであり、かつ「Ｎ」＝１〜５０以上であるが、任意に１〜８である。「Ｎ＊」＝０〜１５以上であるが、任意に０、１、２、３、４、５または６である。一実施形態では、上の鎖がセンス鎖であり、下の鎖がアンチセンス鎖である。あるいは、下の鎖がセンス鎖であり、上の鎖がアンチセンス鎖である。
【０３６４】
関連する一実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは：
5'-DNXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DD-3'
3’-DNXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*XX-5’
を含み、配列中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡであり、かつ「Ｎ」＝１〜５０以上であるが、任意に１〜８である。「Ｎ＊」＝０〜１５以上であるが、任意に０、１、２、３、４、５または６である。一実施形態では、上の鎖がセンス鎖であり、下の鎖がアンチセンス鎖である。あるいは、下の鎖がセンス鎖であり、上の鎖がアンチセンス鎖である。
【０３６５】
別の上記実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは：
5'-DNXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DD-3'
3’-DNXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*ZZ-5’
を含み、配列中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡであり、かつ「Ｎ」＝１〜５０以上であるが、任意に１〜８である。「Ｎ＊」＝０〜１５以上であるが、任意に０、１、２、３、４、５または６である。「Ｚ」＝ＤＮＡまたはＲＮＡである。一実施形態では、上の鎖がセンス鎖であり、下の鎖がアンチセンス鎖である。あるいは、下の鎖がセンス鎖であり、上の鎖がアンチセンス鎖であり、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーが上の図に今示した下の鎖ではなく、上の鎖に沿った交互の残基に位置する。
【０３６６】
別の上記実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは：
5'-DNZZXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DD-3'
3’-DNXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*ZZ-5’
を含み、配列中、「Ｘ」＝ＲＮＡであり、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡであり、「Ｄ」＝ＤＮＡであり、「Ｚ」＝ＤＮＡまたはＲＮＡであり、かつ「Ｎ」＝１〜５０以上であるが、任意に１〜８である。「Ｎ＊」＝０〜１５以上であるが、任意に０、１、２、３、４、５または６である。一実施形態では、上の鎖がセンス鎖であり、下の鎖がアンチセンス鎖である。あるいは、下の鎖がセンス鎖であり、上の鎖がアンチセンス鎖であり、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーが上の図に今示した下の鎖ではなく、上の鎖に沿った交互の残基に位置する。
【０３６７】
別の上記実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは：
5'-DNZZXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*Y-3'
3’-DNXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*-5’
を含み、配列中、「Ｘ」＝ＲＮＡであり、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡであり、「Ｄ」＝ＤＮＡであり、「Ｚ」＝ＤＮＡまたはＲＮＡであり、かつ「Ｎ」＝１〜５０以上であるが、任意に１〜８である。「Ｎ＊」＝０〜１５以上であるが、任意に０、１、２、３、４、５または６である。「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである０〜１０個のＲＮＡモノマーからなる任意選択のオーバーハングドメインであり、特定の実施形態では、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４個のＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインである。一実施形態では、上の鎖がセンス鎖であり、下の鎖がアンチセンス鎖である。あるいは、下の鎖がセンス鎖であり、上の鎖がアンチセンス鎖であり、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーが上の図に今示した下の鎖ではなく、上の鎖に沿った交互の残基に位置する。
【０３６８】
別の実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは：
5'-[X1/D1]NXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DD-3'
3’-[X2/D2]NXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*ZZ-5’
を含み、配列中、「Ｘ」＝ＲＮＡであり、「Ｄ」＝ＤＮＡであり、「Ｚ」＝ＤＮＡまたはＲＮＡであり、かつ「Ｎ」＝１〜５０以上であるが、任意に１〜８であり、ここでは、少なくとも１つのＤ１Ｎが上の鎖中に存在し、かつ下の鎖中の対応するＤ２Ｎと塩基対を形成している。任意に、Ｄ１ＮおよびＤ１Ｎ＋１は、対応するＤ２ＮおよびＤ２Ｎ＋１と塩基対を形成する塩基である；Ｄ１Ｎ、Ｄ１Ｎ＋１およびＤ１Ｎ＋２は、対応するＤ２Ｎ、Ｄ１Ｎ＋１およびＤ１Ｎ＋２と塩基対を形成する塩基である、などである。「Ｎ＊」＝０〜１５以上であるが、任意に０、１、２、３、４、５または６である。一実施形態では、上の鎖がセンス鎖であり、下の鎖がアンチセンス鎖である。あるいは、下の鎖がセンス鎖であり、上の鎖がアンチセンス鎖であり、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーが上の図に今示した下の鎖ではなく、上の鎖に沿った交互の残基に位置する。
【０３６９】
関連する一実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは：
5'-[X1/D1]NXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*Y-3'
3’-[X2/D2]NXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*-5’
を含み、配列中、「Ｘ」＝ＲＮＡであり、「Ｄ」＝ＤＮＡであり、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである０〜１０個のＲＮＡモノマーからなる任意選択のオーバーハングドメインであり、特定の実施形態では、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４個のＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、かつ「Ｎ」＝１〜５０以上であるが、任意に１〜８であり、ここでは、少なくとも１つのＤ１Ｎが上の鎖中に存在し、かつ下の鎖中の対応するＤ２Ｎと塩基対を形成している。任意に、Ｄ１ＮおよびＤ１Ｎ＋１は、対応するＤ２ＮおよびＤ２Ｎ＋１と塩基対を形成する塩基である；Ｄ１Ｎ、Ｄ１Ｎ＋１およびＤ１Ｎ＋２は、対応するＤ２Ｎ、Ｄ１Ｎ＋１およびＤ１Ｎ＋２と塩基対を形成する塩基である、などである。「Ｎ＊」＝０〜１５以上であるが、任意に０、１、２、３、４、５または６である。一実施形態では、上の鎖がセンス鎖であり、下の鎖がアンチセンス鎖である。あるいは、下の鎖がセンス鎖であり、上の鎖がアンチセンス鎖であり、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーが上の図に今示した下の鎖ではなく、上の鎖に沿った交互の残基に位置する。
【０３７０】
上で示した構造のいずれにおいても、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかの５’末端は、リン酸基を任意に含む。
【０３７１】
別の実施形態では、ＤＮＡ：ＤＮＡ延長ＤｓｉＲＮＡは、ダイサー切断を方向付ける働きをする１〜３個のミスマッチ残基を有する長さの等しい鎖を含む（特に、第一鎖と第二鎖が互いにアニールする場合、ＤｓｉＲＮＡの第一鎖上の３’末端残基から数えて１、２または３位の１つ以上が、第二鎖上の５’末端領域の対応する残基とミスマッチである）。２個の末端ミスマッチ残基を有する典型的なＤＮＡ：ＤＮＡ延長ＤｓｉＲＮＡ剤を示す：
【０３７２】
【化３】
2012528596.tif 000005
【０３７３】
配列中、「Ｘ」＝ＲＮＡであり、「Ｍ」は、鎖がアニールする場合、別の相補的な鎖の対応する「Ｍ」残基と塩基対（水素結合）を形成しない核酸残基（ＲＮＡ、ＤＮＡまたは非天然もしくは修飾核酸）であり、「Ｄ」＝ＤＮＡであり、かつ「Ｎ」＝１〜５０以上であるが、任意に１〜８である。「Ｎ＊」＝０〜１５以上であるが、任意に０、１、２、３、４、５または６である。上記薬剤の残基はいずれも、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであってもよく、また上記非対称の薬剤で示されるような下の（第二）鎖の３’末端残基から始まる２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーの交互位置を、上記「平滑末端／ほつれ（ｆｒａｙ）」ＤｓｉＲＮＡ剤において使用してもよい。一実施形態では、上の鎖（第一鎖）がセンス鎖であり、下の鎖（第二鎖）がアンチセンス鎖である。あるいは、下の鎖がセンス鎖であり、上の鎖がアンチセンス鎖である。また非対称／オーバーハングに関して上に示されるものと同等な修飾およびＤＮＡ：ＤＮＡ延長パターンを、上記「平滑末端／ほつれ（ｆｒａｙｅｄ）」薬剤内に組み込んでもよい。
【０３７４】
別の実施形態では、ダイサー切断の特定の方向付けを介して機能するように形成された部位に位置するデオキシリボヌクレオチドを含む、長さが延長されたＤｓｉＲＮＡ剤が提供されるが、これは、塩基対形成したデオキシリボヌクレオチドの存在をｄｓＮＡ構造中に必要としない。このような分子の典型的な構造を示す：
5'-XXDDXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*Y-3'
3’-DDXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*-5’
配列中、「Ｘ」＝ＲＮＡであり、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである０〜１０個のＲＮＡモノマーからなる任意選択のオーバーハングドメインであり、特定の実施形態では、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４個のＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、かつ「Ｄ」＝ＤＮＡである。「Ｎ＊」＝０〜１５以上であるが、任意に０、１、２、３、４、５または６である。一実施形態では、上の鎖がセンス鎖であり、下の鎖がアンチセンス鎖である。あるいは、下の鎖がセンス鎖であり、上の鎖がアンチセンス鎖である。上記構造は、その一次プロセシング後形態として最低で２１ｍｅｒの二本鎖をダイサーに切断させるように形成されている。上記構造の下の鎖がアンチセンス鎖である実施形態では、２つのデオキシリボヌクレオチド残基がアンチセンス鎖の５’末端の最終残基および最後から２番目の残基に位置することにより、オフターゲット効果が減少すると思われる（先行研究では、少なくともアンチセンス鎖の５’末端から最後から２番目の２’−Ｏ−メチル修飾がオフターゲット効果を減少させることが示されている；例えば、米国特許出願公開第２００７／０２２３４２７号を参照されたい）。
【０３７５】
特定の実施形態では、上記構造のいずれかの「Ｄ」残基は、少なくとも１つのＰＳ−ＤＮＡまたはＰＳ−ＲＮＡを含む。任意に、上記構造のいずれかの「Ｄ」残基は、ダイサー切断を阻害する少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。
【０３７６】
上記「ＤＮＡ延長」ＤｓｉＲＮＡ剤は、「左延長」または「右延長」のいずれかに分類し得るが、単一薬剤内に左および右の両延長ＤＮＡを含有する配列を含む（例えば、コアｄｓＲＮＡ構造を囲む両側がｄｓＲＮＡ延長である）ＤｓｉＲＮＡ剤も、「右延長」および「左延長」薬剤に関して本明細書に記載のものと同様の方法で生成して使用し得る。
【０３７７】
いくつかの実施形態では、本発明のＤｓｉＲＮＡは、ＤＮＡ：ＤＮＡ延長ＤｓｉＲＮＡ剤のセンス鎖とアンチセンス鎖を連結する連結部分またはドメインをさらに含む。任意に、このような連結部分ドメインは、センス鎖の３’末端とアンチセンス鎖の５’末端を連結する。連結部分は、オリゴメチレンジオールリンカー、オリゴエチレングリコールリンカーまたはその他の当該技術分野で認められているリンカー部分のような化学（非ヌクレオチド）リンカーであり得る。あるいは、リンカーは、任意に延長ループおよび／またはテトラループを含むヌクレオチドリンカーであり得る。
【０３７８】
一実施形態では、ＤｓｉＲＮＡ剤は、センス鎖が２５塩基対の長さであり、アンチセンス鎖が１〜４塩基３’−オーバーハング（例えば、１塩基３’−オーバーハング、２塩基３’−オーバーハング、３塩基３’−オーバーハングまたは４塩基３’−オーバーハング）を有する２７塩基対の長さである、非対称構造を有する。別の実施形態では、このＤｓｉＲＮＡ剤は、センス鎖の３’末端に２個のデオキシヌクレオチドをさらに含有する非対称構造を有する。
【０３７９】
別の実施形態では、ＤｓｉＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖が２５塩基対の長さであり、センス鎖が１〜４塩基３’−オーバーハング（例えば、１塩基３’−オーバーハング、２塩基３’−オーバーハング、３塩基３’−オーバーハングまたは４塩基３’−オーバーハング）を有する２７塩基対の長さである、非対称構造を有する。別の実施形態では、このＤｓｉＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’末端に２個のデオキシヌクレオチドをさらに含有する非対称構造を有する。
【０３８０】
上記本発明の平滑／ほつれ（ｆｒａｙ）薬剤に関して、ほつれ（ｆｒａｙｅｄ）末端構造の正確な配列は有効性に重要ではないことが認められており、例えば、第一鎖の１個または２個の３’末端残基が、第二鎖の対応する５’末端残基と非相補的であるだけでよい。特定の実施形態では、本発明のＤｓｉＲＮＡ剤は、例えば、第一鎖の少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個または少なくとも２６個の残基が、第二鎖の対応する残基と相補的であることが必要である。特定の関連する実施形態では、第二鎖の対応する残基に相補的なこれらの第一鎖残基は任意に、連続した残基である。加えておよび／またはあるいは、特定のミスマッチ残基が、例えばセンス鎖の５’側半分の中に位置していてもよく、これは、特定の実施形態では、第一鎖と第二鎖の間の完全な相補性が、第一鎖の３’末端／第二鎖の５’末端におけるほつれ（ｆｒａｙ）構造を除いても、第一および第二鎖の全体にわたって適用されるのではないという意味であり、このような実施形態では、第一鎖と第二鎖の間の残基全体の相補性の程度は、ほつれ（ｆｒａｙｅｄ）薬剤のための第一鎖の２つの３’末端残基／第二鎖の２つの５’末端残基を任意に除き、残基の少なくとも８０％、残基の少なくとも８５％、残基の少なくとも９０％、残基の少なくとも９０％、残基の少なくとも９６％であるが、第一鎖は有効な第一鎖であり得る。特定の実施形態では、第一鎖に対する、または標的ＲＮＡ配列に対する本発明のＤｓｉＲＮＡの第二鎖の相補性の程度は、このようなＤｓｉＲＮＡの第一鎖に関して上で記載したものと同等の、第一鎖または標的ＲＮＡ配列との相補性のレベルであり得る。
【０３８１】
ＲＮＡプロセシング
ｓｉＲＮＡ
ｓｉＲＮＡ仲介によるＲＮＡｉのプロセスは、細胞内の長いｄｓＲＮＡ分子の存在により誘発される。ＲＮＡｉの開始段階において、これらのｄｓＲＮＡは、２つのＲＮアーゼＩＩＩ様ドメインを含む酵素の保存されたファミリーであるダイサーにより２１〜２３ヌクレオチド（ｎｔ）の低分子干渉ＲＮＡ二本鎖（ｓｉＲＮＡ）に分解される（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら，２００１；Ｅｌｂａｓｈｉｒら，２００１）。ｓｉＲＮＡは、各鎖上の１９〜２１塩基対の二本鎖領域および２ヌクレオチドの３’オーバーハングを特徴とする。ＲＮＡｉのエフェクター段階では、ｓｉＲＮＡはＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と呼ばれる多量体タンパク質複合体の中に組み込まれ、そこでは、分解のための完全に相補的なｍＲＮＡ基質を選択するためのガイドとして働く。分解はｓｉＲＮＡに相補的な領域内でのｍＲＮＡのヌクレオチド鎖切断により開始される。より正確には、ガイドｓｉＲＮＡの５’末端から１０ヌクレオチドの位置でｍＲＮＡが切断される（Ｅｌｂａｓｈｉｒら，２００１  Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．１５：１８８−２００；Ｎｙｋａｎｅｎら，２００１  Ｃｅｌｌ  １０７：３０９−３２１；Ｍａｒｔｉｎｅｚら，２００２  Ｃｅｌｌ  １１０：５６３−５７４）。この切断に関与するエンドヌクレアーゼはＡｒｇｏｎａｕｔｅ２として同定された（Ａｇｏ２；Ｌｉｕら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０５：１４３７−４１）。
【０３８２】
ｍｉＲＮＡ
ヒトｍｉＲＮＡの大部分（７０％）、そしておそらく他の哺乳動物のｍｉＲＮＡの大部分は、イントロンおよび／またはエクソンから転写され、約３０％が遺伝子間領域に存在する（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．２００４，１４（１０Ａ），１９０２−１９１０）。ヒトおよび動物では、ｍｉＲＮＡは通常、ＲＮＡポリメラーゼＩＩにより（Ｆａｒｈら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００５，３１０（５７５５）、そしていくつかの場合にはｐｏｌＩＩＩにより（Ｂｏｒｃｈｅｒｔら，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００６，１３（１２），１０９７−１１０１）転写される。ウイルスによりコードされる特定のｍｉＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩにより転写され（Ｐｆｅｆｆｅｒら，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００５，２（４），２６９−２７６；Ａｎｄｅｒｓｓｏｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００５，７９（１５），９５５６−９５６５）、一部のものはウイルス遺伝子のオープンリーディングフレーム内に存在する（Ｐｆｅｆｆｅｒら，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００５，２（４），２６９−２７６；Ｓａｍｏｌｓら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００５，７９（１４），９３０１−９３０５）。ｍｉＲＮＡ転写により、大型のモノシストロニック、バイシストロニックまたはポリシストロニックな一次転写産物（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）が産生される。単一のｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは、長さが約２００ヌクレオチド（ｎｔ）〜数キロベース（ｋｂ）の範囲であり、かつ５’７−メチルグアノシン（ｍ７）キャップと３’ポリ（Ａ）テールを共に有し得る。成熟ｍｉＲＮＡ配列は、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ内の不完全なステムループ配列の領域に局在するのが特徴的である（Ｃｕｌｌｅｎ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ２００４，１６（６），８６１−８６５）。
【０３８３】
核内でのｍｉＲＮＡ成熟の第一段階は、ＲＮアーゼＩＩＩＤｒｏｓｈａ−ＤＧＣＲ８核マイクロプロセッサー複合体によるｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの認識および切断であり、これにより、５’末端に一リン酸および３’末端にヒドロキシル基を有する２ｎｔのオーバーハングを有する、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡと呼ばれる約７０ｎｔのヘアピンを含む前駆体分子が放出される（Ｃａｉら，ＲＮＡ  ２００４，１０（１２），１９５７−１９６６；Ｌｅｅら，Ｎａｔｕｒｅ  ２００３，４２５（６９５６），４１５−４１９；Ｋｉｍ  Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２００５，６（５），３７６−３８５）。次の段階は、担体タンパク質であるエクスポーチン−５による、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの核から細胞質内への核輸送である（Ｙｉら，Ｇｅｎｅｓ．Ｄｅｖ．２００３，１７（２４），３０１１−３０１６，Ｂｏｈｎｓａｃｋら，ＲＮＡ  ２００４，１０（２），１８５−１９１）。エクスポーチン−５およびＧＴＰ結合型のその補助因子Ｒａｎが共に、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡに特徴的な２ヌクレオチドの３’オーバーハングおよび隣接するステムを認識して結合する（Ｂａｓｙｕｋら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００３，３１（２２），６５９３−６５９７，Ｚａｍｏｒｅ  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．２００１，８（６），１１５８−１１６０）。細胞質中では、ＧＴＰ加水分解によりｐｒｅ−ｍｉＲＮＡが放出され、次いで、これが細胞エンドヌクレアーゼＩＩＩ酵素ダイサーによりプロセシングされる（Ｂｏｈｎｓａｃｋら）。ダイサーは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を仲介するｓｉＲＮＡの生成におけるその役割により最初に認識された。ダイサーは、その補助因子ＴＲＢＰ（トランス活性化部位結合タンパク質；Ｃｈｅｎｄｒｉｍａｔａら，Ｎａｔｕｒｅ  ２００５，４３６（７０５１），７４０−７４４）およびＰＡＣＴ（インターフェロン誘導性二本鎖ＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼ活性化因子；Ｌｅｅら，ＥＭＢＯ  Ｊ．２００６，２５（３），５２２−５３２）と共同して働く。これらの酵素は、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡヘアピン底部の３’２ヌクレオチドオーバーハングで結合して末端ループを除去し、両末端が５’一リン酸、３’２ヌクレオチドオーバーハングおよび３’ヒドロキシル基を有する約２１ｎｔのｍｉＲＮＡ二本鎖中間体を生じる。次いで、その５’末端がエネルギー的に安定性の低いｍｉＲＮＡガイド鎖がＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体）内への組込みに選択されるが、「パッセンジャー」は放出されて分解される（Ｍａｎｉａｔａｋｉら，Ｇｅｎｅｓ．Ｄｅｖ．２００５，１９（２４），２９７９−２９９０；Ｈａｍｍｏｎｄら，Ｎａｔｕｒｅ  ２０００，４０４（６７７５），２９３−２９６）。ＲＩＳＣの組成はまだ完全には明らかになっていないが、鍵となる構成要素はＡｒｇｏｎａｕｔｅ（Ａｇｏ）タンパク質ファミリーのメンバーである（Ｍａｎｉａｔａｋｉら；Ｍｅｉｓｔｅｒら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．２００４，１５（２），１８５−１９７）。
【０３８４】
次いで成熟ｍｉＲＮＡが、ＲＩＳＣを相補的なｍＲＮＡ種へ導く。標的ｍＲＮＡが、ｍｉＲＮＡを備えたＲＩＳＣと完全に相補的であれば、そのｍＲＮＡは切断され、分解される（Ｚｅｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２００３，１００（１７），９７７９−９７８４；Ｈｕｔｖａｇｎｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００２，２９７（５５  ８９），２０５６−２０６０）。しかし、哺乳動物細胞における最も一般的な状態としては、ｍｉＲＮＡは不完全な相補性のｍＲＮＡを標的とし、それらの翻訳を抑制することにより、対応するタンパク質の発現を減少させる（Ｙｅｋｔａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００４，３０４（５６７０），５９４−５９６；Ｏｌｓｅｎら，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１９９９，２１６（２），６７１−６８０）。ｍｉＲＮＡの５’領域、特にｍｉＲＮＡのヌクレオチド２〜７または８（５’末端の１位から始めて）におけるｍｉＲＮＡと標的配列の間のマッチはシード領域と呼ばれ、ｍｉＲＮＡ標的化に基本的に重要であり、このシード領域は、ｍｉＲＮＡ標的化のコンピュータ予測で広く用いられる基本原理にもなっている（Ｌｅｗｉｓら，Ｃｅｌｌ  ２００５，１２０（１），１５−２０；Ｂｒｅｎｎｅｃｋｅら，ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ．２００５，３（３），ｅ８５）。ｍｉＲＮＡ−ｍＲＮＡ二本鎖のｍｉＲＮＡ調節は、主として３’ＵＴＲ内の複数の相補的部位により仲介されるが、数多くの例外がある。ｍｉＲＮＡはまた、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲおよび／またはコード領域とも結合して、同様の結果をもたらし得る（Ｌｙｔｌｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２００７，１０４（２３），９６６７−９６７２）。
【０３８５】
ＲＮアーゼＨ
ＲＮアーゼＨは、ＤＮＡ／ＲＮ二本鎖中のＲＮＡの３’−Ｏ−Ｐ結合を切断して、３’−ヒドロキシルおよび５’−リン酸で終わる産物を生じるリボヌクレアーゼである。ＲＮアーゼＨは非特異的エンドヌクレアーゼであり、酵素結合二価金属イオンによる補助を受けて、加水分解機構を介したＲＮＡ切断を触媒する。ＲＮアーゼＨファミリーのメンバーは、古細菌および原核生物から真核生物のほぼすべての生物体において見られる。ＤＮＡ複製中に、ＲＮアーゼＨは、岡崎フラグメントの生成開始に関与するＲＮＡプライマーを切断すると考えられている；しかし、ＲＮアーゼＨ酵素は、より一般的には、十分な長さの任意のＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド配列（例えば、典型的には、哺乳動物における４塩基対以上の長さのＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド配列）を切断するために使用され得る。
【０３８６】
マイクロＲＮＡおよびマイクロＲＮＡ様治療剤
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、鋳型転写産物の３’ＵＴＲと結合して、古典的なＲＮＡ干渉と関連するがそれとは異なる機序により、鋳型転写産物によりコードされるタンパク質の発現を阻害することで作用すると記載されている。具体的には、ｍｉＲＮＡは、標的転写産物の安定性を低下させるのではなく、その翻訳を低下させることにより作用すると考えられている。天然のｍｉＲＮＡは通常、約２２ｎｔの長さである。これらは、約７０ｎｔ長の小分子ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）として知られるより大きな前駆体に由来すると考えられている。
【０３８７】
ｓｉＲＮＡのような干渉薬剤、より具体的には、例えば３’ＵＴＲ内（または、標的転写産物内の他の場所、例えばＮｏｔｃｈおよび／またはＮｏｔｃｈファミリーの転写産物の、例えば反復エレメント内）で結合して翻訳を阻害するｍｉＲＮＡなどは、ｓｉＲＮＡ／鋳型（ｍｉＲＮＡ／鋳型）二本鎖中の多数のミスマッチを許容し得、特に、二本鎖の中心領域内のミスマッチを許容し得る。実際、いくつかのミスマッチが望ましいまたは必要なものであり得るという証拠があり、天然のｓｔＲＮＡがそのようなミスマッチを示すことが多いのと同様、インビトロで転写を阻害することが示されているｍｉＲＮＡもそのようなミスマッチを示す（Ｚｅｎｇら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ，９：１−２０）。例えば、標的転写産物とハイブリダイズした場合、このようなｍｉＲＮＡは、ミスマッチ領域により隔てられた２つの完全に相補的なストレッチを含むことが多い。このようなハイブリダイズ複合体は通常、ヌクレオチド対を含む完全に相補的な２つの領域と、少なくとも１つのミスマッチ塩基対、例えば、Ｇ：Ａ、Ｇ：Ｕ、Ｇ：Ｇ、Ａ：Ａ、Ａ：Ｃ、Ｕ：Ｕ、Ｕ：Ｃ、Ｃ：Ｃ、Ｇ：−、Ａ：−、Ｕ：−、Ｃ：−などであり得る塩基対とを含む。このようなミスマッチヌクレオチドは、特に直列に存在する場合（例えば、ミスマッチの２、３または４ヌクレオチド領域）、二本鎖部分が両側に位置するようにそれを隔てるバルジを形成し得る。様々な構造が可能である。例えば、ｍｉＲＮＡは、複数の非同一（ミスマッチ）の領域を含み得る。非同一（ミスマッチ）の領域は、標的とｍｉＲＮＡが共に不対ヌクレオチドを含むという意味で、対称性である必要なない。例えば、一方の鎖だけが不対ヌクレオチドを含む構造が記載されている（Ｚｅｎｇら，図１４）。通常、ｍｉＲＮＡ剤内の完全に相補的なストレッチが少なくとも５ヌクレオチド長、例えば、６、７またはそれを超えるヌクレオチド長であるのに対し、ミスマッチ領域は、例えば、１、２、３または４ヌクレオチド長であり得る。
【０３８８】
一般に、任意の特定のｓｉＲＮＡは、（ｉ）標的転写産物の安定性が低下し、多くの場合ｓｉＲＮＡと標的の間の完全な相補性が好ましい、「古典的」ｓｉＲＮＡ経路を介して、および（ｉｉ）標的転写産物の翻訳が阻害される「代替」経路（一般的に、動物におけるｍｉＲＮＡ経路として特徴付けられる）によっても、遺伝子発現を阻害するように機能し得る。一般的には、機序（ｉ）を介する特定のｓｉＲＮＡにより標的とされる転写産物は、機序（ｉｉ）を介して標的とされる転写産物と異なり得るが、古典的および代替経路の両方の標的として働き得る領域を単一の転写産物が含有し得ることがあり得る。（「古典的」および「代替」という用語は、単に便宜上使用されるのであって、一般的には、動物細胞におけるそのような機序発見の歴史上のタイミングを反映すると考えられているが、両機序の重要性、有効性またはその他の特性を反映するものではないことに留意されたい。）ｓｉＲＮＡ設計の１つの共通の目的は、機序（ｉｉ）を介して誘発される可能性のある効果を含めたオフターゲット効果を最小化しながら、機序（ｉ）を介して単一の転写産物を高度な特異性で標的とすることであった。しかし、天然のｍｉＲＮＡの活性を模倣する目的で、あるいはミスマッチを許容する、および実際はおそらくそれにより増強される「ＤｍｉＲＮＡ」剤の阻害および／または治療の効果／効力を有する、対応するｍｉＲＮＡが現在知られていない標的ＲＮＡに対する薬剤を作出するために、設計によるミスマッチ残基を有するＲＮＡ干渉剤を提供することが本発明の目的に含まれる。
【０３８９】
ミスマッチヌクレオチドに対するｍｉＲＮＡ剤の許容性（ならびに実際は、細胞中の上記機序（ｉｉ）の存在および自然な使用）は、機序（ｉ）を介して作用する完全に相補的なｓｉＲＮＡの「古典的な」使用に有利な、および／またはそれを発展させる方法でのｍｉＲＮＡの使用を示唆する。ｍｉＲＮＡは天然に存在する分子であるため、ｍｉＲＮＡを治療剤として適用する明らかな利点があると思われる。ｍｉＲＮＡは、その機能の何億年もの進化的「微調整」の恩恵を受けている。したがって、配列特異的「オフターゲット」効果は、天然のｍｉＲＮＡに関して、ひいては、天然のｍｉＲＮＡを直接模倣するように設計された本発明の合成ＤｍｉＲＮＡに関して問題となるはずがない。さらに、ｍｉＲＮＡが、上方および下方制御を駆動して（特定の場合には、細胞内で単一のｍｉＲＮＡが複数の標的ＲＮＡに無差別に作用して両機能を同時に行い）遺伝子群の発現を調節するように進化してきた結果、複雑な細胞機能が調節され得る。このような天然のｍｉＲＮＡの代替は、１つ以上のｍｉＲＮＡの下方制御により影響を受けてきた正常な増殖、アポトーシス、細胞周期およびその他の細胞機能を回復させる目的で、合成ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ模倣物（例えば、ＤｍｉＲＮＡ）を患部組織内に導入することを含み得る。特定の場合において、このようなｍｉＲＮＡ制御にされた経路の再活性化が有意な治療応答をもたらしている（例えば、心肥大に関する一研究において、ｍｉＲＮＡ発現カセットのアデノウイルス仲介性の送達によるｍｉＲ−１３３の過剰発現が、動物のアゴニスト誘導性心肥大を防いだのに対し、野生型マウスにおけるａｎｔａｇｏｍｉｒによるｍｉＲ−１３３の減少は、逆に肥大マーカーの増加を引き起こした（Ｃａｒｅら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１３：６１３−６１８））。
【０３９０】
これまで、６００を超えるｍｉＲＮＡがヒトゲノム内でコードされているものとして同定されており、こうしたｍｉＲＮＡは、核および細胞質内のタンパク質の組合せにより発現およびプロセシングされる。ｍｉＲＮＡは脊椎動物の間では高度に保存されており、哺乳動物の全遺伝子の約２％を占める。各ｍｉＲＮＡは複数の、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０〜数百の異なる遺伝子の発現を制御すると思われるため、ｍｉＲＮＡは「マスタースイッチ」として機能し、複数の細胞経路およびプロセスを効率的に制御および統合している可能性がある。複数の遺伝子の発現を統合することにより、ｍｉＲＮＡは胚発生、免疫、炎症ならびに細胞の成長および増殖において重要な役割を果たす。
【０３９１】
発現および機能の研究により、特定のｍｉＲＮＡの発現の変化が様々なヒト疾患に重要であることが示唆されている。疾患細胞および組織内への特定のｍｉＲＮＡの導入が、好ましい治療応答を引き起こし得るという証拠が増えている（Ｐａｐｐａｓら，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｔｈｅｒ  Ｔａｒｇｅｔｓ．１２：１１５−２７）。ｍｉＲＮＡ治療の有望性は、特定のｍｉＲＮＡの腫瘍抑制因子としての明白な役割から、おそらく癌において最も高いであろう。例えば、癌に対するｍｉＲＮＡベースの治療法の理論的根拠は、少なくとも部分的には以下の知見により支持される：
（１）ｍｉＲＮＡは、正常組織に比べて、患部組織において誤制御さ苣膀ꓥ隌臣龁菣馃菣ꞁ駧뺏臣貂苣뒠郥貁ꓥ蒁胣貙뗧钹臣誁臣ꚁ胣鶁臣뺯뿥馁苣ꎭ룥蒵맧뺯臣讂뷯覽볯꺼볯것菣ꮃ臣覤賥貁闦骤臣꺁ꃧ뚩臣袂苣몤臣貂臣蒁苣芀ꓥ辁臣뒠郥膀駧뺏臣覤賥꾁胣릉껥꺁뷯覽볯꺼볯꺁駧뺏臣鞢諥뺁臣꾁룦醰苣閼臣략臣馁臩鶼귥膪蓧覤闧꺁뗧鲞臣芁苣芀鯥覜臣趽뷯늼볯ꆼ駧뺏뷧趐苣覜臣讂雧ꎂ臣膀꣨궖臣袂臣袺뻥麃菣ꮂ菣ꢁ臣ꚁ裥ꢔ臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣膀臣ꒁ鳦몙飦꺁볯鎽뷯늼볯ꆼ볯꒼뷯覽볯꺼볯覼觥ꞁ꣦蒚賥馁苣鎁臣貁臣趁苣芀戼㹲袼볯覼ꫨ뚈뻥閁苣龁뷯覽볯꺼볯꾁胣貙臩鶼귥뺁臣꾁藨趘諦뚈鯥邭臣鞁臣龩菨馁苣鎁臣ꮁ苣誂胣貙駧钁臣蒯룤馁苣芀駧몁볤邭臣膀臣꺁臩낉駧뺏臣龁臣趸臩螈臣뮴胦隌臣몙駧銂볥趁뗨鎁臣몁볤邭臣鞁臣骮뻧閁苣讂胣ꮅ飧醊裥ꂛ귥꾁胣내菨貁駧Ꞁ臣ꪁ苣꺁苣늘臣龁苣ꮁ뿥膦臣몁볤邭臣芁苣鮼藨趘諦뚈鯥邭臣许雦뚈뻥뺁臣꾁룤뮴胦隌臣貙臣肸裨蒚臣颪駧ꂛ귥ꞁ臣讂胣ꆸ苣ꒂ菣꺁臩鶼귥貁ꗥꦁ臣겖觧馨髧ꞁ臣讂臣膂胣馨髧隌臣膀觧骮臣貙臣蚈귥몟鯧ꮁ觧낕髧ꮁ뷤ꢔ臣鞾苣芀駧貙胦趽뷯늼볯ꆼ臣设臣趽뷯늼裢醼볯閼臣袂臣趽뷯늼裢醼볯銈볯銼臣芁苣鮼뷯薽뷯銈볯꾁藨趘諦뚈胦趽뷯늼볯ꆼ臣设臣芁苣芀戼㹲袼볯覼뷯覽볯꺼볯꺁諦躸臣膀觥ꢇ뫥開觧龮꣩ꮁ臣蒁臣膀藨趘ꋥ隮苣뮘귦뺁臣꾁뷤鮸臣讂臣ꢁ臣袂苣뮲駧鲿귧銂볥趁뗨鎁臣芀뷯覽볯꺼볯龩菨銂鯥ꦾ臣鮁苣鎁臣ꮁ苣誂胣ꒂ菣鎃菣궃臣袂臣開觧ꊃ菣ꮃ臣誁臣ꚁ苣貙듧麃臣鞢껦銂飩ꊭ臣龁臣躽룦鞁뻥讂臣ꢁ苣몤臣芦뿥龮꣨钠ꧧ貁胣醧귥螖賧ꮁ苣誂迦鮾臣貂苣芀苣辁觧뒾믤醁苣貂臣设臣膀매貙臣袂臣몂駧꺁菣螃菣ꮁ臣醁苣貽뷯钽裢鞼臣鞊藨趘듦Ꞁ臣芁苣芀뷯薽뷯銈볯銂꣦ꎀ臣讂苣蚁臣궨꣨閁苣龁鳦몙飦꺁볯鎽뷯늼볯ꆼ볯꒼뷯覽볯꺼볯覼苣ꢔ臣ꚁ胣鎁臣袂臣ꪁ駧銂꣦蒚賥馁苣鎁臣貁迥붃臣芁苣膀臣龁鳦躘듧뢛臣風볨꺁볯鎽뷯늼볯ꆼ꣨袨菣ꦃ菣벃苣벃苣ꢔ臣ꚁ胣뺯뿥馁苣ꦤ蓧꺁뷯覽볯꺼볯貁鿧覂苣ꚁ臣ꪁ臣馨髧늼볯ꆼ볯设臣낁胣꺼뷯钽뷯袽臣龁臣鶁臣隻臣ꊻ蛥ꎔ觧薆臣趏뻥覼臣뺯臣讂雦辦臣꒼뷯覽볯꺼볯袼볯趽뷯늼볯ꆼ볯ꒉ苣龔裦鞁胣뮲駧ꪃ菣覃賥袐觧膀뻤袁臣膀觥ꢇ뫥開觧ꊃ菣ꮃ臣誁臣ꚁ藨趘蟩銂뷤鮸臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂雨ꒉ苣릂苣ꪃ菣讃菣낂臣讂臣ꢁ苣꾏菨ꞁ臣讂胣㲂牢ਾ볯钼볯릉껥꺁뷯覽볯꺼볯꾁ꓨ낕臣내菨貵럨銂裥ꆾ臣讂臣膂胣ꪄ苣龁닦芙듦Ꞁ苣覜臣鞾苣芀臣꺁铧ꦉ귥ꮁ苣貂臣膀뷯覽볯꺼볯꾁苣躃菣꺁胣麃苣뾂菣릂苣莃菣趀臣鞁臣龩菨鞁胣螤闦꺁臩鶼귥ꎔ觧銂裥ꆾ臣膀ꓨ낕臣貵럨銂뗧袐臣ꚁ臣讂迥붃胦貁臣讂胣趽뷯늼볯ꆼ臣袂苣뚈뻥閁苣讂臩鶼귥ꮁ臣膀뻥ꖝ臣貙臩鶼귥誁苣뎁藨趘諦뚈鯥邭苣뎂菣覃臣讂臩鶼귥貁郥뺁苣膀臣貂苣꺁ꓥ辁臣膀臣貂臣貂雨ꦉ꣦蒚臣鞁臣뮌雨궥闧ꮁ苣誂軦花臣貂臣蒁苣芀臣龁臣ꎁ臣膀뷯覽볯꺼볯뮲駧ꒉ臣膀ꓨ낕臣뺖苦誁苣뎁볯뺁臣꾁駧ꊖ胩몁볤邭苣馨髧隌臣讂臣ꢁ臣袂苣膀뷯覽볯꺼볯誁苣뎁臣꺁믤꺁뷥讅臣ꪃ菣覃賥袐觧袂苣节蓥貂臣뮴胦銂鳦鞁뻥讂胣趽뷯늼볯ꆼ臣꒪裥ꆾ臣骤臣꺁ꃥ袐胣ꮅ飧ꊽ裦꺁菣궃苣릂臣誁臣讂裥龜뫤ꆱ臣芁苣ꢁ臣蚁鿧讦苣莀藦馁苣낁胣ꂬ臣龁뷯覽볯꺼볯꺁믤辂苣ꢁ臣讂뷯覽볯꺼볯芙돦꾁胣肜苣ꦁ裥ꪁ닦芙돦ꢁ臣誂뻥讂胣㲂牢ਾ볯閼볯趽뷯늼볯ꆼ臣ꦤ蓧꺁裥邭臣芁苣龁苣膀鷩릉闧蒚臣꾉뷤ꢔ苣閼臣략臣馁若醐臣醰臣蒁胣閽駧螸맥节臣늀賥貁胣趽뷯늼볯ꆼ臣馨髧ꆃ菣뮂菣뢂菣벃볯꺼볯ꢁ臣뢛뫤鲽铧銂뻥뾪闦馁苣趽뷯늼볯ꆼ臣뚈뻥趃菣袃菣벃苣꺁駧钁苣莿臣龁胣鞁臣貁臣ꚁ胣趽뷯늼볯ꆼ臣袂臣趽뷯늼볯ꆼꫨ躰뷤袼뻤袁臣膀ꓥ뚄臣趽뷯늼볯ꆼ苣ꆨ胥馁苣袂臣ꮁ꣨袨臣貂臣꒼뷯覽볯꺼볯覼臣膀臩螈臣뚊돦ꞁ臩ꢔ臣貂臣膀臣꺁藩鞈觧낕髧貀苣閃苣벃苣莃菣趀諥鲞臣膀苣鞁臣讂臣鞁臣节臣辁菥讁臣芁苣蚁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鎼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†뷯覽볯꺼볯ꢁ뷯覽볯꺼볯꺁觧蚐髧릉胦꾁ꇩ벼臣ꚁ臣讂胣鞁臣貁臣ꚁ胣鎽뷯늼볯ꆼ볯设臣낁胣겜駧躘臣꒼뷯覽볯꺼볯覼臣膀臩ꮁ鳦ꢔ臣肊ꇨ꾁胣袐裦趽뷯늼볯ꆼ볯设臣낁胣겜駧躘臣꒼뷯覽볯꺼볯覼臣膀臩ꮁ臣蒁臣节郥颧臣覜铧ꞁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鎼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ볯鎽뷯늼볯ꆼ觥꺁苣뎃苣ꖃ苣벃苣ꞃ菣誁苣뎁胩钁戼㹲 릉껥꺁껥붖뷥讅臣꾁胣겜駧躘臣膀雧ꎂ苣鞁臣꾁髩뎮苣覜臣讂胣뺁臣꾁雧ꎂ苣鞁臣꾁髩뎮臣몙韧馁苣농駩Ꞁ臣芁苣ꎂ胨銂닦芙臣讂臣膂臣릖돦ꮁ雩馁苣芀臣꺁苣蚁臣龮雦ꊽ藦ꞁ臣膀볯鎽뷯늼볯ꆼ臣膀雧ꎂ臣龁臣鲚껥銂裥ꆾ臣讂臣膂臣낖ꛨꪁ닦芙觥ꢁ臣ꚁ뷤ꢔ臣鞾苣芀臣꺁雦閳臣膀꣦蒚볯꺼볯꺁駧뺏胣것菣ꮃ臣袂臣込臣龁臣뮴胦貁룦醰臣讂苣蚁臣膀鳦몙飦꺁賥겖뗧邈觧銂苦薀볯设臣낁胣銃菣覼臣閊룤馁苣鎁臣銂郥肂胣뺁臣뺯뇨ꢁ臣讂볯꺼볯ꮁ苣誂苣벃菣閁苣讂菣ꪃ菣鞃菣覃臣몙迧膀菣馃菣誁苣뎁볯뺁臣꾁듦Ꞁ苣膀볯鎽뷯늼볯ꆼ臣ꊻ蛥ꎔ觧꺁鷩뎂菣覃ꃩ龟볯设臣낁胣馨髧隌臣貂臣閼胢떼볯늼臣龁臣鎼胢떼볯늼藩鞈볯ꮁ꿥馁苣节臣ꞁ臣讂臣膀鳦몙飦꺁볯鎽뷯늼볯ꆼ臣袂苣鮸냥鞁뻥讂胣겜駧躘臣꒼뷯覽볯꺼볯꾁臣꺁ꯩꚺ臣릉闧Ꞁ臣袂苣膀믤辄臣膀胥薀臣袂臣込臣龁臣蚛鯥꺁룤ꮁꓥ讞꿥讫臩鶼귥貁귥ꢜ臣讂꿥讫臩鶼귥ꮁ觧낕髧ꪁ雦閳臣膀듧麃臣袂臣蒵맧꺁꿥ꆱ臣馁苣超裥銂觧낕髧ꮁ꣦蒚賥鞁뻥讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鎼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†雧ꎂ臣龁臣鲚껥꺁닦芙臣誁臣ꚁ胣꒼뷯覽볯꺼볯꾁ꋨ鲤뷤꺁듧麃臣龁臣蒵맧膀뻤袁臣膀苣뎃菣꾂돨꺁ꫨ肯闧뢸苣몤臣膀臣袂臣込臣龁臣ꖈ臣뾂菣醃苣ꪳ菣馃菣銂룦醰臣鮁苣龁苣ꮁ꣦蒚賥閁苣龁胣ꮢꓦ鎽臣내菨뺁臣꾁뗧钹臣ꖎ꟨閁臣鞾苣芀뻤袁臣膀꿥ꆱ臣馁苣늼볯ꆼ藩鞈臣馁臣ꚁ臣龁臣肸菩ꢁ껥ꪳ髧ꮁ郥肸臣꒼뷯覽볯꺼볯銂胣鎁臣袂臣ꪁ듧麃臣ꒂ菣鎃菣뺁臣꾁苣뎃菣袃菣ꞁ軦ꚧ臣鮁苣讁胣뺁臣꾁臣꺁룤ꮁ냥ꖅ臣鞾苣芀郥颧臣膀꿥ꆱ臣馁苣늼볯ꆼ藩鞈臣馁臣ꚁ臣龁臣肸菩ꢁ껥ꪳ髧ꮁ郥肸臣꒼뷯覽볯꺼볯銂胣뺖苦뺁臣꾁髩뎮苣覜臣讂臣뺁臣꾁臣꺁跥몙胦꺁臣讂ꋨ鲤뷤ꮁ胣뒛軦閊룤鞁뻥讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鎼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†鳦몙飦꺁볯鎽뷯늼볯ꆼ觥꺁닦芙髧뾽铧꾁胣螤闦꺁闧ꪁ苣꒼뷯覽볯꺼볯ꒉ臣超裥銂郥肂볯鎽뷯늼볯ꆼ觥꺁ꏨꒉ臣뾽铧銂郥뾁뻥讂胣设臣낁胣겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣貂臣蒁苣겖觥꺁볯ꒁ믤誸胣鎼臣ꖻ룤膀볯ꒁ믤誸胣閼臣ꖻ룤ꪁ臣銂뗧뾁郥辂臣ꚁ胣设臣낁胣馨髧늼볯ꆼ臣螤闦꺁闧ꪁ苣颠鿥銂꣦蒚臣馁苣膀臣龁臣뺯뇨ꢁ臣讂볯꺼볯銂꣦蒚臣馁苣ꂁ臣ꞁ臣辁胣设臣낁胣뺯뇨ꢁ臣讂꣦蒚볯꺼볯ꢁ雩ꎀ臣讂雧ꎂ苣鞁臣꾁髩뎮臣ꊖ胩馁苣내菨馨髧몁볤邭苣馨髧ꢁ臣讂胣붣觥銂뷤붣臣鞾苣芀鳦몙飦꺁볯鎽뷯늼볯ꆼ觥꾁臣龁胣꒼뷯覽볯꺼볯ꒉ臣ꆸ軩貁诧讫臣ꚁ볯꺼볯馨髧꺁볯ꒁ믤誸臣颠鿥銂꣦蒚臣馁苣袂臣ꮁ胣뺁臣꾁볯鎽뷯늼볯ꆼ觥꺁룤릖臣階臣鎽ꧨ肊ꇨ蚈蟩ꞁ藥ꖟ臣馨髧趽볯꺼볯꺁듧麃꣦蒚臩鶼귥銂꣦蒚臣馁苣袂臣ꮁ꟦覯臣鞾苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣邼볯馼볯醀⼼䥄㹖 馨髧뢠藩蚈귥꺁볯ꒁ믤誸臣颠鿥銂꣦蒚臣馁苣骤ꧦ붃胦꒼뷯覽볯꺼볯蚈귥꺁뷤ꢔ苣膀볯꺼볯것菣ꮃ臣袂臣몙迧꺁볥鮊臣뮘껥銂苣龁苣鞁뻥讂胣设臣낁胣겜駧躘臣颍룤꺁ꓥ龩菨Ꞁ볯鎽뷯늼볯ꆼ꟦覯觧꾁룤릖苣馨髧ꢁ臣鞾苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣邼볯馼볯醀⼼䥄㹖 鞁臣貁臣ꚁ胣겜駧躘臣꒼뷯覽볯꺼볯ꒉ臣膀꣦蒚볯꺼볯ꢁ雩ꎀ臣龁雧ꎂ臣龁臣鲚껥銂닦芙胣뮘껥膀뷤鮸臣龁臣袺飩馁苣龁苣ꮁ胣颍诧ꞁ胣뺁臣꾁믤꺁雨ꦉ臣蒵臣袐苣鮁臣节臣辁臣떽铧鞁臣뾽铧鞁뻥讂胣设臣낁胣꒼뷯覽볯꺼볯蚈귥銂跥겋臣膀臣龁臣뮲駧ꮁ臩螈臣ꆝ믤许臣醼臣ꖻ룤꺁雨ꦉ臣蒵臣袐苣鮁臣膀ꋨ鲤뷤ꮁ諦躸臣讂臣膀臣龁臣鎽ꗦ薀臣躘苣讁臣隻臣ꦁ뷥ꪁ듧麃臣閊룤鞁뻥讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鎼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†볯鎽뷯늼볯ꆼ裥邭臣뺁臣膀ꋨ鲤뷤뺁臣꾁铧ꦉ뷤궸臣馨髧늼볯ꆼ臣ꊖ胩鞁臣뺖苦뺁臣꾁髩뎮苣뮲駧膀飩뎮胣躽룦뺁臣꾁뫤늘臣讂臣膂臣膀믤꺁韦ꖟ臣뮲駧ꢁ뗧뾁郥辂臣ꚁ뷤ꢔ臣讂臣ꢁ苣ꞁ臣讂胣设臣낁胣風볨꺁裥邭臣膀뷥늩諦鎡裥躇臣겅鿧꺁ꋨ鲤뷤뺁臣꾁铧ꦉ뷤궸臣馨髧늼볯ꆼ臣ꊖ胩鞁臣뺖苦뺁臣꾁髩뎮苣뮲駧膀飩뎮胣躽룦뺁臣꾁뫤늘臣讂臣膂臣膀볯ꒁ믤誸臣ꊗ鿧꺁賥袐觧膀닦芙臣龁臣讉ꃩꢁ뗧뾁郥辂臣ꚁ뷤ꢔ臣鞾苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣邼볯馼볯醀⼼䥄㹖 겜駧躘臣꒼뷯覽볯꺼볯ꒉ臣膀裥꺁菩蚈볯设臣낁胣骃菣膃菣꺁苣蚁臣麝ꃦ뢅菩蚈볯膀鳦龩賥袐觧袼뻤袁臣膀觨ꂴ胣뎂菣릂菣궃菣ꮃ臣ꦁ볯ꢁ苣뎃苣ꖃ苣벃菣袼뻤袁臣膀臣꺁苣뎃苣뺁臣꾁苣뎃菣뮂菣릂軩꺁臣꺁볯馀臣龁臣鎼胢ꮜꯧꞁ볯閁苣ꚁ臣ꚁ苣뎂菣뢂菣늂菣袃臣貂臣蒁臣辁臣节苣蒁胣鎁臣袂臣ꮁ볯鎽뷯늼볯ꆼ觥銂뿤뺣臣讂臣ꢁ臣膀꿥鲿臣讂鷩뎂菣뢂菣늂菣袃볯鎽뷯늼볯ꆼ觥ꮁ꿦릁臣膀뻥覂苣龁볯鎽뷯늼볯ꆼ觥颪냥鎽臣내菨随苣벾臣銂郥誸臣鮁苣讁胣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