【手続補正書】
【提出日】平成21年1月7日(2009.1.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的ポリペプチドのアミノ酸配列を、そのポリペプチドをコードする標的ＤＮＡ配列を改変することにより改変する方法であって、標的ＤＮＡ配列にトランスポゾンを導入するステップを含み、該トランスポゾンは、その末端のそれぞれに向かう第１の制限酵素の認識配列を含み、該認識配列は、トランスポゾンの残りの部分にも、標的ＤＮＡ配列中にも、あるいは標的ＤＮＡ配列を含む構築物中にも存在せず、該第１の制限酵素の認識配列は、アウトサイドカッターである第１の切断酵素によって認識され、また、該トランスポゾンの末端の端を越えて位置するＤＮＡ切断部位を該第１の制限酵素が有するように位置することを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記アミノ酸配列が、少なくとも１つのアミノ酸の欠失、挿入又は置換によって改変される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ａ）前記トランスポゾン、前記標的ＤＮＡ及びトランスポザーゼ酵素を混合することを含む転移反応を行うステップ、
ｂ）前記トランスポゾンに含まれる第１の制限酵素の認識配列を認識する第１の制限酵素により、（ａ）由来のＤＮＡを消化するステップ、
ｃ）前記トランスポゾンを含まないＤＮＡを分離するステップ、
ｄ）（ｃ）由来のＤＮＡの分子内ライゲーション反応を行うステップ、及び
ｅ）（ｄ）由来のＤＮＡからタンパク質を発現させるステップ
を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記標的ポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸が別のアミノ酸で置換される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
ａ）前記トランスポゾン、前記標的ＤＮＡ及びトランスポザーゼ酵素を混合することを含む転移反応を行うステップ、
ｂ）前記トランスポゾンに含まれる第１の制限酵素の認識配列を認識する第１の制限酵素により、（ａ）由来のＤＮＡを消化するステップ、
ｃ）前記トランスポゾンを含まないＤＮＡを分離するステップ、
ｄ）（ｃ）由来のＤＮＡと第２のＤＮＡ配列との分子間ライゲーションを行うステップで
あって、第２のＤＮＡ配列は少なくとも２つの第２の制限酵素の認識部位を含み、第２の制限酵素の認識部位は切断部位の少なくとも１つが第２のＤＮＡ配列の末端にはないように位置することを特徴とする、ステップ、
ｅ）（ｄ）由来のＤＮＡで宿主生物を形質転換し、前記第２のＤＮＡ配列を含む細胞を選択するステップ、
ｆ）（ｅ）において選択される細胞からＤＮＡを単離し、そのＤＮＡを第２の制限酵素の認識部位を認識する第２の制限酵素で消化するステップであって、第２の制限酵素はアウトサイドカッターであることを特徴とする、ステップ、
ｇ）（ｆ）由来のＤＮＡの分子内ライゲーションを行うステップ、及び
ｈ）（ｇ）由来のＤＮＡからタンパク質を発現させるステップ
を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記第２の制限酵素が、前記第１の制限酵素と同じである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記第２のＤＮＡ配列が、第２のＤＮＡ配列を含まない細胞と比較して選択可能な特徴を第２のＤＮＡ配列を含む宿主細胞に与える遺伝子を含む、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
前記標的ポリペプチドのアミノ酸配列が、さらなるアミノ酸配列の挿入により改変される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項９】
ａ）前記トランスポゾン、前記標的ＤＮＡ及びトランスポザーゼ酵素を混合することを含む転移反応を行うステップ、
ｂ）前記トランスポゾンに含まれる第１の制限酵素の認識配列を認識する第１の制限酵素により、（ａ）由来のＤＮＡを消化するステップ、
ｃ）前記トランスポゾンを含まないＤＮＡを分離するステップ、
ｄ）さらなるアミノ酸配列をコードする第３のＤＮＡ配列と（ｃ）由来のＤＮＡとの分子間ライゲーションを行うステップ、及び
ｅ）（ｄ）由来のＤＮＡからタンパク質を発現させるステップ
を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記さらなるアミノ酸配列が、全タンパク質、タンパク質ドメイン又はタンパク質断片である、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
前記タンパク質断片がエピトープ、結合ドメイン、アロステリック部位、明確な機能領域、またはオリゴマー化の接合部分である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記第３のＤＮＡ配列が、第３のＤＮＡ配列を含まない細胞と比較して選択可能な特徴を第３のＤＮＡ配列を含む宿主細胞に与える遺伝子を含む、請求項９〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記第３のＤＮＡ配列が、前記標的ＤＮＡのものと同じオープンリーディングフレームを有する、請求項９〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記第３のＤＮＡ配列が終止コドンまたは開始コドンを含む、請求項９〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記第１の制限酵素がＩＩＳ型酵素である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記トランスポゾンは標的部位の選択性が低い、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記トランスポゾンが、トランスポゾンを含まない細胞と比較して選択可能な特徴をトランスポゾンを含む宿主細胞に与える遺伝子を含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記トランスポゾンが、５'末端として５'−ＮＧＡＣＴＣ−３'及び３'末端として５'−ＧＡＧＴＣＮ−３'のＤＮＡ配列を含むか、又は、５'末端として５'−ＮＮＮＮＧＡＣＴＣ−３'及び３'末端として５'−ＧＡＧＴＣＮＮＮＮ−３'のＤＮＡ配列を含むか、又は、５'末端として５'−ＴＧＴＴＧＡＣＴＣ−３'及び３'末端として５'−ＧＡＧＴＣＡＡＣＡ−３'のＤＮＡ配列を含むか、又は、５'末端として５'−ＣＴＧＡＣＴＣ−３'及び３'末端として５'−ＧＡＧＴＣＡＧ−３'のＤＮＡ配列を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記標的ＤＮＡがプラスミド中に保持される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
末端のそれぞれに向かって制限酵素の認識配列を含む、前記請求項のいずれかに記載の方法に使用するに適したトランスポゾンであって、該認識配列はトランスポゾンの残りの部分には存在せず、アウトサイドカッターである制限酵素に対する認識配列であり、また、トランスポゾンの末端の端を越えて位置するＤＮＡ切断部位を該制限酵素が有するように位置していることを特徴とする、トランスポゾン。
【請求項２１】
それぞれの制限酵素の認識配列が、トランスポゾンの末端から１から２０ヌクレオチドの位置に存在している、請求項２０に記載のトランスポゾン。
【請求項２２】
前記制限酵素がＭｌｙＩである、請求項２０または２１に記載のトランスポゾン。
【請求項２３】
ａ）５'末端として５'−ＮＧＡＣＴＣ−３'及び３'末端として５'−ＧＡＧＴＣＮ−３'のＤＮＡ配列、
ｂ）５'末端として５'−ＮＮＮＮＧＡＣＴＣ−３'及び３'末端として５'−ＧＡＧＴＣＮＮＮＮ−３'のＤＮＡ配列、
ｃ）５'末端として５'−ＴＧＴＴＧＡＣＴＣ−３'及び３'末端として５'−ＧＡＧＴＣＡＡＣＡ−３'のＤＮＡ配列、
ｄ）５'末端として５'−ＣＴＧＡＣＴＣ−３'及び３'末端として５'−ＧＡＧＴＣＡＧ−３'のＤＮＡ配列、ならびに
ｅ）５'末端及び／又は３'末端のＤＮＡ配列において少なくとも１つの変異を含み、転移能力を有することを特徴とする、（ｃ）または（ｄ）の配列、
のいずれかを含む、請求項２２に記載のトランスポゾン。
【請求項２４】
配列番号１００で示されるＤＮＡ配列を有するプラスミドまたはその誘導体。
【請求項２５】
請求項２０〜２３のいずれかに記載のトランスポゾンを含むキット。
【請求項２６】
ａ）請求項２４に記載のプラスミド、
ｂ）トランスポザーゼ
ｃ）少なくとも１つの緩衝液、および
ｄ）少なくとも１つのオリゴヌクレオチド
のいずれかをさらに含む、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
標的ポリペプチドに突然変異を導入することがそのポリペプチドの検出可能な活性を変えるか否かを判定する方法であって、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法を含み、
ａ）改変されていない標的ポリペプチドと比較して、改変された標的ポリペプチドの活性の相違をスクリーニングするステップ、及び
ｂ）改変された標的ポリペプチドをシークエンシングして、アミノ酸の挿入、欠失又は置
換の位置を決定するステップ
をさらに含む、方法。