【手続補正書】
【提出日】平成23年7月21日(2011.7.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a) 油中水型エマルジョンを形成して、複数の水性マイクロリアクターを作製する段階であって、マイクロリアクターの少なくとも1つが
1つの核酸鋳型、
第1のプライマー種の複数の分子を含む第1の集団をその表面上に配置した単一のビーズ、および、
第1のプライマー種の複数の分子および第2のプライマー種の複数の分子を含む第2の集団、ならびに核酸増幅を行なうために必要な試薬を含む増幅反応溶液
を含み、ここで該第1のプライマー種が該核酸鋳型の１つの鎖に結合でき、該第2のプライマー種が該核酸鋳型の相補鎖に結合でき、該第2のプライマー種の濃度が該増幅反応溶液中の該第1のプライマー種の該第2の集団の濃度より実質的に大きい、段階；
(b) 該増幅反応溶液中で該核酸鋳型を非対称増幅して、該核酸鋳型の増幅されたコピーの集団を形成する段階であって、該増幅反応溶液中の該第1のプライマー種の該第2の集団の分子の全てが実質的に枯渇する段階；
(c) 該核酸鋳型の非対称増幅された複数のコピーをマイクロリアクター中のビーズ上の該第1のプライマー種の該第1の集団に結合させる段階であって、該第1のプライマー種からビーズに結合した相補鎖が伸長される、段階；
(d) 該水性マイクロリアクターを破壊し、核酸が結合したビーズの少なくとも1つ、および、非結合の増幅産物を含む該増幅反応溶液を放出させる段階；および
(e) 該核酸が結合したビーズを回収する段階
を含む、1つまたは複数の核酸をビーズ上に増幅する方法。
【請求項２】
マイクロリアクターの大部分が単一の核酸鋳型を含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
増幅反応溶液が、ヌクレオチド3リン酸、熱安定性ポリメラーゼ、およびポリメラーゼ連鎖反応の条件に適合する緩衝液をさらに含むポリメラーゼ連鎖反応溶液である、請求項1記載の方法。
【請求項４】
エマルジョンがさらに乳化安定剤を含む、請求項1記載の方法。
【請求項５】
乳化安定剤が、Atlox 4912、Span 80、ならびにそれらの組み合わせおよび混合物からなる群より選択される、請求項4記載の方法。
【請求項６】
エマルジョンが熱安定性である、請求項1記載の方法。
【請求項７】
エマルジョンが95℃まで熱安定性である、請求項6記載の方法。
【請求項８】
増幅が、転写ベースの増幅、cDNA末端の迅速な増幅、連続フロー式増幅(continuous flow amplification)、およびローリングサークル増幅(rolling circle amplification)からなる群より選択される方法によって実行される、請求項1記載の方法。
【請求項９】
エマルジョンが、核酸鋳型、ビーズ、および増幅反応溶液を油へ滴加することによって形成される、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも10,000の核酸鋳型を用いて行われる、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも50,000の核酸鋳型を用いて行われる、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
マイクロリアクターの平均サイズが直径50μm〜250μmである、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
各ビーズが該核酸鋳型の10,000より多くの非対称増幅されたコピーに結合している、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
(a) 増幅される１つの１つの核酸鋳型を提供する段階；
(b) 直径が約10μm〜約80μmの概ね球状のビーズを含む固体支持体材料を提供する段階であって、該ビーズが、その表面上に配置されかつ核酸鋳型に結合できる第1のプライマー種の第1の集団の複数の分子を含む、段階；
(c) 第1のプライマー種の第2の集団の複数の分子、第2のプライマー種の複数の分子、および油中水型エマルジョンにおいて核酸増幅反応を実行するために必要な試薬を含む増幅反応溶液中で、該核酸鋳型と該ビーズを混合する段階であって、
該第1のプライマー種が該核酸鋳型の１つの鎖に結合でき、該第2のプライマー種が該核酸鋳型の相補鎖に結合でき、該第2のプライマー種の濃度が該増幅反応溶液中の該第1のプライマー種の第2の集団よりも実質的に大きい、段階；
(d) 該第1のプライマー種の第2の集団および該第2のプライマー種を用いて該増幅反応溶液中で該核酸鋳型を非対称増幅して、該核酸鋳型の増幅コピーの集団を形成する段階であって、該増幅反応溶液中の該第1のプライマー種の該第2の集団の分子の全てが実質的に枯渇する段階；
(e) ビーズ上の該第1のプライマー種の該第1の集団に該核酸鋳型の非対称増幅した複数のコピーを結合させる段階であって、該第1のプライマー種からビーズに結合した相補鎖が伸長される、段階；および
(ｆ) 核酸が結合したビーズを回収する段階
を含む、核酸の増幅方法。
【請求項１５】
核酸が結合していないビーズから、該核酸鋳型の増幅コピーに結合したビーズを濃縮する段階をさらに含み、濃縮段階がアフィニティ精製、電気泳動、および細胞ソーティングからなる群より選択される、請求項1または請求項14記載の方法。
【請求項１６】
濃縮段階が、該核酸鋳型の増幅コピーに結合する磁性ビーズを用いたアフィニティ精製によって実行される、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
各ビーズに、少なくとも100,000の増幅コピーの該核酸鋳型が結合している、請求項1または14記載の方法。
【請求項１８】
各ビーズに、少なくとも1,000,000の増幅コピーの該核酸鋳型が結合している、請求項1または14記載の方法。
【請求項１９】
各ビーズに、少なくとも1〜20,000,000の増幅コピーの間の該核酸鋳型が結合している、請求項1または14記載の方法。
【請求項２０】
ビーズがセファロースビーズである、請求項1または14記載の方法。
【請求項２１】
該核酸結合ビーズと磁性ビーズを分離する段階；および磁場を用いて磁性ビーズを除去する段階、をさらに含む、請求項16記載の方法。
【請求項２２】
分離が、45℃を超える温度でのインキュベーションまたは該核酸結合ビーズと磁性ビーズを塩基性pHの溶液中でインキュベートすることにより達成される、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
(a) 長さが50〜800bpの複数の核酸鋳型、および、それぞれが第1のプライマー種の複数の分子の第1の集団を表面上に配置して含むビーズを提供する段階；
(b) 第1のプライマー種の複数の分子の第2の集団、第2のプライマー種の複数の分子、および核酸鋳型の増幅に必要な試薬を含む増幅反応溶液中で、該核酸鋳型とビーズを混合する段階であって、該第2のプライマー種の濃度が該増幅反応溶液中の該第1のプライマー種の第2の集団よりも実質的に大きく、また該第1のプライマー種が該核酸鋳型の１つの鎖に結合でき、該第2のプライマー種が該核酸鋳型の相補鎖に結合できる、段階；および
(c) エマルジョンを形成して、該核酸鋳型、ビーズ、および該増幅反応溶液を含む複数のマイクロリアクターを作製する段階であって、少なくとも1つのマイクロリアクターが該増幅反応溶液中に封入された単一の核酸鋳型および単一のビーズを含み、マイクロリアクターが同一の容器中に入れられている、段階
を含む、核酸のクローン集団の生成方法。
【請求項２４】
該核酸鋳型の転写および翻訳を行い、少なくとも10,000コピーの発現産物を産出するための段階をさらに含む、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
抗原/抗体、リガンド/受容体、6Xhis/ニッケル-ニトリロ3酢酸、およびFLAG タグ/FLAG抗体結合対からなる群より選択される結合対によって、発現産物がビーズに結合している、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
蛋白質のクローン集団を生成する、請求項24記載の方法。
【請求項２７】
蛋白質が抗体、抗体断片、および操作された抗体からなる群より選択される、請求項26記載の方法。