【手続補正書】
【提出日】平成21年4月6日(2009.4.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞上の刺激性事象の効果を試験する方法であって、
標識フリーバイオセンサを用意すること；
バイオセンサ上の細胞をインキュベートすること；
インキュベートされた細胞に刺激性事象を提供すること；および、
バイオセンサからバイオセンサ出力を集めることを含む方法。
【請求項２】
蛍光性標識、放射性の標識、発光顔料標識またはこれらの組合わせから選択された標識を検出する装置で、標識を検出することを更に含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
複数の標識フリーバイオセンサが用意され、
細胞がバイオセンサのうちの２つ以上の各々上で培養され、
刺激性事象が２つ以上のバイオセンサに提供され、
バイオセンサ出力は２つ以上のバイオセンサから集められる請求項１記載の方法。
【請求項４】
バイオセンサは、堆積された材料を含有しない混合物を有する第１領域と、堆積された材料を含有する混合物を有する第２の領域とを有し、細胞がセンサ上でインキュベートされたとき、第２の領域上の細胞が堆積材料によってトランスフェクションされる請求項１記載の方法。
【請求項５】
バイオセンサはパリアによってそれぞれ物理的に分離される２つ以上のバイオセンサからなり、ウェル内で区画を画定するパリアがマイクロプレートのウェルを画定しているパリアより低い請求項１記載の方法。
【請求項６】
インキュベートされた細胞が受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）を有し、インキュベートされた細胞がバイオセンサ界面上の細胞付着および細胞の成長を見越す濃度で血清を含んでいる培地において懸濁され、インキュベートされた細胞がバイオセンサ界面に付着する請求項１記載の方法。
【請求項７】
細胞の状態を同定する方法であって、
細胞−バイオセンサ組成を形成するために標識フリーバイオセンサの界面上で細胞を培養すること；および
細胞−バイオセンサ組成を分析して、細胞が培養される界面の不均質性を同定すること、を含む方法。
【請求項８】
細胞に対する化合物の影響を試験するための方法であって、
バイオセンサ上で細胞を培養すること；
細胞を洗浄すること；
細胞を飢餓させること；
細胞を有する化合物をインキュベートすること；および
バイオセンサでシグナルを記録することを含む方法。
【請求項９】
生体細胞の状態を決定する方法であって、共鳴導波路グレーティングバイオセンサで、細胞の内容物の動的質量再分布を観察することを含む方法。
【請求項１０】
方法は、細胞および化合物のためのシグニチャを同定する請求項１〜９のいずれか１に記載の方法。
【請求項１１】
細胞はバイオセンサ上で少なくとも７０％の密集度で培養またはインキュベートされる請求項１〜１０のいずれか１に記載の方法。
【請求項１２】
バイオセンサは共鳴性導波路グレーティングバイオセンサである請求項１〜１１のいずれか１に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４９】
薬剤発見は、化合物の巨大なライブラリが選ばれた標的に対して活性のためにスクリーニングされる工業化されたプロセスになった。
これらの一次性のスクリーニングから現れる活性化合物の財産は、薬物開発のボトルネックをつくった。
第１ラウンドのヒットはしばしば安全性を満たさない、そして、効能基準は人間処理のために要求したので、産物が人間に与えられる前に、最適化の逐次的な回診は必要である。
最適化は、Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ（吸収）、Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ（分布）、Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ（代謝）、Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ（排出）およびＴｏｘｉｃｉｔｙ（毒性）（ＡＤＭＥ／Ｔｏｘ）を試験するアッセイを必要とする。
ＡＤＭＥ／、今日３０億ドルの市場を薬剤発見および現像セッティングにおいて代表して、Ｔｏｘスクリーニングは、関連するリード化合物および薬剤障害の大きい画分を与えられる中心段階に毒性性状を持っていっている。
発生的配管路の全体の新薬摩滅の３０のパーセントは、毒性プロフィールおよび副作用に帰される。
ＡＤＭＥ／Ｔｏｘスクリーニングは、市場または医療に持ってこられるいくつかの薬剤によって生じる死亡を防いでもよかった（Ｚｅｃｈｎｉｃｈ、Ａ．Ｄ．その他（１９９４）Ｗｅｓｔ． Ｊ． Ｍｅｄ． １６０（３２１−５））。
この驚くべき毒性は、ＡＤＭＥ／Ｔｏｘスクリーニング年の初めに現在市場に出ている安全な抗ヒスタミン剤の数および薬剤科学者の中の発達する関心を考慮して優れたケーススタディを提供する。
リード化合物および薬剤障害の大きい画分が毒性性状と関連したと仮定すると、ＡＤＭＥ／Ｔｏｘスクリーニングは薬剤発見および現像セッティングの中心段階をしている。
化学物質ライブラリが正や負効果のスペクトルを有する化合物を含むという仮定は、ＡＤＭＥ／Ｔｏｘスクリーニングの基礎を形成する。
その中に、薬剤候補物質の有益な特徴は、高量特異性、低い毒性、良好な口の生体吸収および半減期を含む。
早い高量−スループットＡＤＭＥ／Ｔｏｘスクリーニングのゴールは、発見プロセスの初期に、毒性に関して、「良好」で「悪い」化合物とを区別することである。
課題の同定は、今日では、薬剤スクリーニングの初期に単一の最大のコストを節減する機会を薬剤工業において代表する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２９４】
次に、本発明の他の特徴については、多重細胞分析の重要性が増大しており、スループット（処理量）の増大のためだけではなく、単一分析から利用できる優れた確証的な情報のためにも多重細胞分析は重要であることがよく知られている。
よって、本発明がさらに多重生体細胞分析を同時に実行するように強化されることが望ましい。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２９５】
１つの実施例として、図２２に示す方法２２００を用いて多重生体細胞分析を同時に実行するように本発明を強化することができる。
方法２２００によれば、以下の手順により、複数種の生体細胞１００８における作動薬誘発性のＧＰＣＲ活性化に起因する質量再分布を測定することができる。
すなわち、（ａ）光学ＬＩＤバイオセンサ１０１４を用意し（ステップ２２０２）、
（ｂ）光学ＬＩＤバイオセンサ１０１４の上面１０１０の一部部位に生体細胞１００８が付着することを防止するスタンプを用いて、光学ＬＩＤバイオセンサ１０１４の上面１０１０の当該部位を遮蔽し（ステップ２２０４）、
（ｃ）光学ＬＩＤバイオセンサ１０１４の上面１０１０のうちの遮蔽されていない部位を覆う細胞媒体の中に第１のタイプの生体細胞１００８を配置して、光学ＬＩＤバイオセンサ１０１４の上面１０１０のうちの遮蔽されていない部位に生体細胞１００８が付着できるようにし（ステップ２２０６）、
（ｄ）光学ＬＩＤバイオセンサ１０１４の上面１０１０からスタンプを除去し（ステップ２２０８）、
（ｅ）光学ＬＩＤバイオセンサ１０１４を覆う細胞媒体の中に第２のタイプの生体細胞１００８を配置して、光学ＬＩＤバイオセンサ１０１４の新たな暴露表面（遮蔽物が除去された表面）１１０に当該第２のタイプの生体細胞１００８が付着できるようにし（ステップ２２１０）、
（ｆ）光学ＬＩＤバイオセンサ１０１４の上面１０１０に配置された細胞媒体の中に化合物含有溶液を添加し（ステップ２２１２）、
（ｇ）光学ＬＩＤバイオセンサ１０１４に対する計測を実行して、光学ＬＩＤバイオセンサ１０１４上にある２タイプの生体細胞１００８内の質量再分布を表す時間依存性の光学応答１６０１を測定する（ステップ２２１４）、
という手順である。前述した２タイプの細胞を互いに関連付けることができる点に留意すべきである。たとえば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に対して、過剰発現した標的受容体を含む遺伝子操作されたＣＨＯ細胞を関連付けることができる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３０１】
シグナル伝達経路細胞およびそれらの関連する細胞活性に関する動態および他細胞変化は細胞生物学および生理学を理解するだけではないことにとって極めて重要である、しかし、それらはまた、細胞アッセイ現像および薬剤発見にとって重要である。
たとえば、ＥＧＦＲシグナル伝達ネットは、ほとんど瞬間的な反応（リガンド結合の後の受容体リン酸化）から、多数分（ライソソームに対する小胞形成またはソーティング）を通じて起こる反応または特定の細胞株の形態学的変化まで変動している反応を含む。
ＥＧＦＲの中で輸送ことは多数ステップで管理される。そして、エンドサイトーシス、早いエンドソーム（ｅｎｄｏｓｏｍａｌ）のソーティングおよびライソソームターゲッティングを含む。
内部移行の後、ＥＧＦＲは形質膜へ往復されるか遅発タイプまたは多胞体（ｍｕｌｔｉｖｅｓｉｃｕｌａｒ）のエンドソームに輸送される。
後期エンドソームの受容体は、減生のためのライソソームに更にソートされるかまたは細胞表面に戻ってリサイクルした。
受容体の占有は、ソーティングプロセスの各々のステップに参加するそれらの能力を書き取らせる。
ＥＧＦＲシグナル伝達カスケードおよびその活性化配列の主要な階層が周知であるにもかかわらず、細胞発育、生残または分化のような異なる細胞応答を制御する合併した動態ネットワークおよび臨界なシグナル伝達現象は不十分だが理解される。
リガンドによって媒介されたＥＧＦＲ活性化による細胞応答のリアルタイム動態を測定する技術は、非常にシグナル伝達カスケードおよびネットの動態についてよく知っていることのためになる。
（（２） Ｇ−タンパク質共役型受容体経路）
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３０２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３０２】
ＧＰＣＲは、細胞表面受容体のファミリに帰属して、新薬化合物が設計される最も一般の標的の中である。
ＧＰＣＲが外部性シグナル（すなわち新薬のような刺激の存在）を細胞内応答（ｒｅｓｐｏｎｓｅ）に変換するので、ＧＰＣＲはそれらを薬剤標的として、そして、新薬を試験するために極めて価値がある。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３０３】
たとえば、ＧＰＣＲはシグナル伝達経路細胞の広いアレーに関与している。
リガンド結合は、受容体配座変化と、受容体オリゴマー形成と、Ｇタンパク質活性化（Ｇαサブユニット上のＧＤＰ−ＧＴＰ交換、ＧαおよびＧβγ脱会合、受容体からのＧタンパク質デカップリング、Ｇα−およびＧβγ−シグナル伝達複合体の生成）と、下流のシグナル伝達活性化（二次メッセンジャ生成（Ｃａ２＋可動化、イノシトール三リン酸（inositoltriphosphate）生成および／または細胞内のｃＡＭＰレベル転形）を導く）と、を含む一連の細胞内および細胞のシグナル伝達現象を始め、そして最終的に、特定の遺伝子形質発現の変化を起こす結果となる。
リガンドによって媒介されたＧＰＣＲ活性化も、細胞表面からＧＰＣＲの脱感作および多くの細胞内のタンパク質の輸送を導き、同じく、標的細胞のフェノタイプ、形態および物性の変化を導く。
これらの変化は、静的、長期持続または動的（例えばサイクリングまたは振動）である。
異なるシグナル伝達現象は、ミリ秒（例えばＧＰＣＲ配座変化）から、何十秒（例えばＣａ２＋フラックス）、何十分（例えば遺伝子形質発現または形態学的変化）、までの範囲で変動して、かなり異なる動態を呈する。
現在のＧＰＣＲアッセイは、リガンド受容体結合、二次メッセンジャ（Ｃａ２＋、ＩＰ３のｃＡＭＰ）アッセイ、タンパク質相互作用アッセイ、転位アッセイおよびリポータ遺伝子アッセイを含む。
ＧＰＣＲ活性化が最終的に輸送タンパク質および／または形態学的変化を導くので、細胞表面上のＧＰＣＲによるいかなる化合物の作用および続く遂行された細胞現象（例えば、輸送ことおよび／または形態学的変化）を研究する方法が要求される。
（（３） シグナル伝達経路受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ））
（（ａ） ＲＴＫｓの多様性）
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３０６】
全ての受容体チロシンキナーゼは、通常グリコシル化されて、受容体二量体化に関係しているドメインを結合している細胞外のリガンドを含む。
ドメインをリガンド結合は、単一の膜内外ヘリックスによる細胞質のチロシンキナーゼドメインに対する結合である。
細胞質のドメインは、異種タンパク質キナーゼによって自己リン酸化およびリン酸化に従属する節約されたタンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）コアおよび追加の調節配列を含む。
ＲＴＫｓは、受容体のいくつかのサブファミリへの更なる広告でありえる：
インシュリン受容体（ＩＲ）ファミリ、上皮増殖因子（ＥＧＦ）受容体ファミリ、たとえば、ＰＤＧＦ受容体ファミリ。
受容体チロシンキナーゼの上皮増殖因子（ＥＧＦ）ファミリは、４つの受容体、ＥＧＦ−Ｒ（ＥｒｂＢ１）、ＥｒｂＢ２（Ｎｅｕ）、ＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ４からなる。
（（ｂ） ＲＴＫｓの二量体化）
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３０７】
ＲＴＫｓのインシュリン受容体（ＩＲ）ファミリを除いては、全ての周知のＲＴＫｓ（例えば上皮増殖因子（ＥＧＦ）受容体、ＰＤＧＦ受容体）は、細胞膜のモノマーである。
リガンド結合は、それらの細胞質のドメインの自己リン酸化に結果としてなっているこれらの受容体の二量体化を誘発する。
ＩＲファミリの構成メンバは、２２のヘテロダイマを形成している２つのポリペプチド鎖のジスルフィド結合されたダイマーである。
ＩＲの細胞外のドメインに対するインシュリン結合は、細胞質のドメインの増加する自己リン酸化に至る四原子ヘテロテトラマー（heterotetrameric）構造の再配列を誘発する。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３１１】
ＥＧＦＲｓのためのリガンドは、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、アンフィレギュリン（ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ）、ヘパリン−結合ＥＧＦのような成育因子、ベータセルリンおよびエピレギュリン（ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ）を含む。
ＥＧＦＲは多くの異なるリガンドのいかなる一つもの結合によって活性化され得る。そして、それぞれは生物応答のいくぶん異なるスペクトルを刺激するように見える。
さらに、異なるＥＧＦＲリガンドは、受容体微小環境（例えば小胞内の（ｉｎｔｒａｖｅｓｉｃｕｌａｒ）ペーハー）の関数として、受容体に結合するそれらの能力において変化する。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３１５】
特定の細胞株の細胞のコンテクストに従い、リガンド起因性ＥＧＦＲ活性化は、他と比較した主要成分になる異なるシグナル伝達経路または多数のシグナル伝達経路を導くであろう。
さらに、ＥＧＦＲｓの発現量は、１から他の細胞株まで変化してもよい。
それのため、リガンド起因性ＥＧＦＲ活性化によって媒介された細胞内の質量再分布は異なる細胞株の中で変化してもよい。
たとえば、人間の表皮がんＡ４３１細胞が、過剰発現するＥＧＦＲｓ（細胞につき約１，７００，０００コピー）を内生的にすることは公知で、このようにＥＧＦＲシグナル伝達のための理想モデルとして使われた(D.W. Barnes, "Epidermal growth factor inhibits growth of A431 human epidermoid carcinoma in serum-free cell culture," J. Cell. Biol. 1982, 93, 1-4)。
ＥＧＦを結合すると、即座に、Ａ４３１細胞のＥＧＦＲｓは、動作中になって、Ｒａｓ／ＭＡＰＫ経路を含んでいる異なる経路で、さまざまな細胞応答を導く。
たとえば、３７℃でのＥＧＦを有する静止Ａ４３１細胞の刺激作用は、細胞外のマトリックスから最終的に受容体エンドサイトーシス、屈折性の（ｒｅｆｒａｃｔｉｌｅ）形態学的変化および細胞離断を導く(Z. Lu, G. Jiang, P. Blume-Jensen, and T. Hunter, "Epidermal growth factor-induced tumor cell invasion and metastasis initiated by dephosphorylation and downregulation of focal adhesion kinase," Mol. Cell Biol. 2001, 21, 4016-4031. and Y. Danjo and I. K. Gipson, "Actin 'purse string' filaments are anchored by E-cadherin-mediated adherens junctions at the leading edge of the epithelial wound, providing coordinated cell movement," J. Cell Sci. 1998, 111, 3323-3332)。
また、受容体エンドサイトーシスはＥＧＦシグナルを減らす重要な細胞過程である。但し、若干の証明はＥＧＦ受容体複合体がエンドソーム（ｅｎｄｏｓｏｍａｌ）の区画のシグナルに続くことを示唆する。
エンドサイトーシスプロセスは、多数ステップを含む：
活性受容体に対する細胞内成分の加入、エンドソームへの結果としてなられた複合体の次の内部移行、細胞内のいくつかの区画の中の内面化された受容体複合体の運動および最終的に細胞膜に対する減生およびリサイクリング背。
細胞の密度が受容体および密度に表面をつけて、それらのリガンドの大きさのため、加えて、そして、受容体輸送と同様に使用する（例えばＡ４３１細胞株）細胞株の形態が活性化の後、引き起こすＲＴＫ経路の多くのシグナル伝達現象が、指向性質量再分布にある。
たとえば、細胞表面ＥＧＦＲｓに対するリガンドの結合は、細胞表面で質量の増加を導く；
短い期間の間の質量再分布のネット−ゼロ−変化の活性ＥＧＦＲｓ結果と相互に作用している逐次的な自己リン酸化および細胞内成分。
活性受容体の中で輸送は、各細胞の異なる区画内で有意な質量再分布を導く。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３２０】
ＰＤＧＦシグナル伝達ネットワークは、４つのリガンド、ＰＤＧＦＡ−Ｄおよび２つの受容体（ＰＤＧＦＲαおよびＰＤＧＦＲβ）からなる。
全てのＰＤＧＦは分泌された、ジスルフィドにリンクされたホモダイマとして機能する、しかし、ＰＤＧＦＡおよびＢだけは機能的ヘテロダイマを形成する。
ＰＤＧＦＲｓも、ホモおよびヘテロダイマとして、そして、アッセイがリガンドがそれらの親和性において異なることを証明し、そして、αβおよびββ受容体のために生体内において機能する。
全ての周知のＰＤＧＦは特性『ＰＤＧＦドメイン』を有する。そして、それは分子間および分子内結合に関係している８つの保存システインを含む。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３２１】
ＰＤＧＦＲｓは、ＥＧＦＲｓのように、受容体チロシンキナーゼである。
各々の受容体は、細胞質の領域の細胞外のリガンド−結合ドメインおよび裂けたチロシンキナーゼドメインの５つの免疫グロブリン反複を有する。
リガンド結合に、チロシンキナーゼドメインを活性化して、ＰＤＧＦＲｓは二量体化（ｄｉｍｅｒｉｚｅ）し、そして、それはそれから受容体細胞質のドメインのいくつかのＹ残基を自動的にリン酸化する。
これは、シグナル伝達タンパク質のためのドッキング部位およびＰＤＧＦＲ結合にシグナル伝達を始めるアダプタをつくる。
両方の受容体は同じ主要なシグナル伝達経路の多数を活性化する。そして、Ｒａｓ−ＭＡＰＫ（マイトジェンは、タンパク質キナーゼを活性化した）、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）およびホスホリパーゼＣ経路を含む。
しかし、相互に作用しているタンパク質のアレーはＰＤＧＦＲａおよびＰＤＧＦＲｓの間で僅かに異なる。そして、生体内にそれらの機能上の能力のなんらかの違いに結果としてなる。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３３２】
伝統的に、細胞骨格構造を妨げるモジュレータに対するスクリーニング方法は主に生体内のアッセイを使用している結合能計測に基づく。そして、アクチン結合タンパク質アッセイ、マイクロチューブル安定化／不安定化アッセイおよびアクチン／チュブリン重合アッセイを含む。
他方法は高分解能蛍光映像技術に基づき、直接、細胞内の細胞骨格構造を視覚化するかまたは化合物処理の後細胞の運動性を測定するか、または細胞骨格−相互に作用しているメーカータンパク質（例えばＣｄｃ４２またはＲｈｏ）の活性化を測定する。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３４１】
もう一つの実施例では、光学バイオセンサを使用してＲＴＫｓに対しリガンドの効力を決定するための方法が開示され、次のステップを含む：
（ａ）マイクロプレートに多数ウェル（底に埋め込まれる光学型標識フリーバイオセンサを有する各ウェル）を供給し；
（ｂ）細胞が所望の密集度で各々のバイオセンサに付けられるようにＲＴＫの比較的高い形質発現レベルを有する細胞の特定の数を培地に提供し；
（ｃ）特定時間で付着細胞を飢餓させるために培地を交換し；
（ｄ）各々が細胞の層によってカバーされているバイオセンサを有するマイクロプレートを検出系に配置して、応答をモニタリングし；
（ｆ）各々のバイオセンサをカバーしている培地に、異なる濃度でリガンドを含んでいる溶液を適用し；
（ｇ）細胞の用量依存および時間依存応答をモニタして、比較する。
それらの対応する動態と同様に結合している用量依存的およびＤＭＲシグナルは、関心のあるＲＴＫに使ってリガンドの効力を決定する。
かかる方法がまた、ＲＴＫまたは他のシグナル伝達分子の活性化および次の細胞変化のために全体的なＤＭＲシグナルで有意な役割を演ずる下流標的に対して、阻害物質の効力を決定するために使われると理解されなければならない。
たとえば、静止Ａ４３１細胞のＥＧＦ−起因性ＤＭＲシグナルは、調整され得るかまたはＭＥＫ１／２またはアクチンフィラメントのような下流に重合（ｐｏｌｙｅｒｍｉｚａｔｉｏｎ）またはダイナミンまたは受容体キナーゼ活性によって影響を受けるかまたは上流に分子（例えばカルバコールを含んでいる特定のＧＰＣＲ作動薬）を送られている。
標的に対するまた、それらのユニークなＤＭＲシグニチャを使用して検査され得るモジュレータまたは得られた全体的なＤＭＲシグナルに対する影響の効力。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３５２】
分子状酸素（酸素；Ｏ２）、全部の生残のための必須は、好気性生物である。
好気エネルギー代謝は、酸化的リン酸化（ミトコンドリア電子伝達（多成分ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ酵素の複合体を経た）の酸化還元エネルギーがＡＴＰの高エネルギーリン酸結合に変換されるプロセス）に依存している。
Ｏ２はシトクロムｃオキシダーゼ（このミトコンドリア酵素の複合体の末端の酵素の成分）のための最終的な電子受容体として役立つ。そして、それはＨ２ＯにＯ２の四電子還元に触媒作用を及ぼす。
Ｏ２の部分的に還元され非常に活性メタボライトはこれらの（そして、その他）電子伝達反応の間、形成され得る。これらＯ２メタボライトはスーパーオキシドアニオン（Ｏ２・）および過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）（それぞれ、Ｏ２の一および二電子還元によって形成される）を含む。
遷移金属イオンがある場合には、より多くの活性水酸基ラジカル（ＯＨ・）は、形成され得る。
Ｏ２のこれらの部分的に還元したメタボライトは、分子Ｏ２と関連してしばしばそれらのより高い反応性による「活性酸素種」（ＲＯＳ）と称する。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３５３】
ＲＯＳは、細胞の機能に対する二相の衝撃を有する。
ＲＯＳは、まず最初に脂質、タンパク質およびＤＮＡに原因損傷にポテンシャルを有する代謝の毒性副生成物とみなされる。
ＲＯＳの潜在的に損害を与えている効果から守るために、細胞はいくつかの抗酸化剤酵素（例えばＳＯＤ（それは、Ｏ２・をＨ２Ｏ２に還元する）、カタラーゼおよびグルタチオンペルオキシダーゼ（それは、Ｈ２Ｏ２をＨ２Ｏに還元する））を所有する。
このように、酸性の応力は、オキシダント産生間のインバランスおよび細胞の抗酸化剤容量として広義には酸性の外傷を防ぐことであってもよい。
酸性の応力は、アテローム性動脈硬化、肺線維症、癌、神経変性疾患および加齢を含む多数の人間の疾患に関係した。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３６０】
コンドリオソームの（ｉ） 細胞代謝。
コンドリオソームのＲＯＳの生成は、還元条件の下で全体のＯ２消費量の約１−２％を説明する。
ミトコンドリアＳＯＤの高濃度のために、細胞原形質に逃げそうにないＯ２の内部ミトコンドリア濃度は、非常に低い定常タイプレベルで維持されてあって、ある。
特にアポトーシスの調節に関して、細胞シグナル伝達を媒介するミトコンドリアＲＯＳのためのポテンシャルは、近年の有意な耳目を得た。
酸素圧低下−起因性遺伝子転写を媒介することは、また、コンドリオソームが「Ｏ２センサ」として機能することを示唆された。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３８２】
ここで議論され開示された分子を同定する方法が、高いスループット手段を使用して実行され得ると理解される。
たとえば、推定の阻害物質は、急速に相互作用を同定するために蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を使用して同定され得る。
技術の下にある理論は２つの分子がバックグラウンドを越えてレベルで空間の近くに相互に作用するときに、シグナルが生じるということである、または、シグナルは消滅され得る。
それから、様々な実験は実行され得る。そして、たとえば、推定の阻害物質において加わることを含む。
阻害物質が２つのシグナル伝達分子間の相互作用と争う場合、シグナルは空間の各々から除去される、そして、使用するシグナルのタイプに従い、これによってシグナルの減少または増加が生じる。
この減少または増加しているシグナルは、推定の阻害物質の有無と相関している。
いかなるシグナル伝達手段も、使われる。
たとえば、たとえば、開示され分子二つの間の相互作用の阻害物質を同定する方法が開示され、次のステップ：推定の阻害物質がある場合、一緒に第１の分子および第２の分子に連絡させるステップ（そこにおいて、第１の分子または第２の分子は蛍光ドナーからなり、または、第１であるか第２の分子は概して蛍光ドナー分子でなく蛍光受容体からなり、）と；そして、推定の阻害物質が存在および不存在の場合、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ）を測定するステップ（そこにおいて、その非共存のＦＲＥＴ計測と比較した推定の阻害物質がある場合には、ＦＲＥＴの減少は、推定の阻害物質が２つの分子間のバインディングを抑制することを示す）とを含む。
かかる方法は、細胞システムにもよって実行され得る。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３８６】
ペプチドを単離するように設計された組合せの方法のための好適な他の方法は、コーエンその他に記載されている(Cohen B.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(24):14272-7 (1998))。この方法は、２−ハイブリッド技術を利用して、修正する。
イースト２−雑種系は、タンパク質：タンパク質相互作用の検出および解析に役立つ。
二−雑種系（まず最初にイーストサッカロマイセス酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に記載されている）は、新規な調節分子（場および宋（ネイチャー３４０：２４５−６（１９８９）（Fields and Song, Nature 340:245-6 (1989)））のタンパク質に対する特性）を同定するための強力な分子的遺伝学的技術である。
選出の分子を結合する合成薬品または設計されたペプチド配列間の新しい相互作用が同定されてもよいために、コーエンその他はこの技術を修正した。
かかる技術の利点は、選抜が細胞内の生育環境においてされるということである。
方法は、酸性活性化ドメインに付属したペプチド分子のライブラリを利用する。
従来技術において方法論を当業者にとって周知に扱って、さまざまな組合せのライブラリと協力して、それらの小分子または巨大分子を単離することができて、特徴づける。そして、それは所望の標的を結合するかまたは相互に作用する。
これらの化合物の相対的な結合能は比較され得る、そして、最適化合物は競争的結合研究を使用することを同定した。そして、それは従来技術において当業者にとって周知である。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３８８】
組合せのライブラリは、多くの異なる合成の手技を使用している分子の広いアレーから作られる。例えば、縮合２，４−ピリミジンジオン (U.S. Patent 6,025,371) ジハイドロベンゾピラン (U.S. Patents 6,017,768 and 5,821,130), アミドアルコール (U.S. Patent 5,976,894), ヒドロキシ−アミノ酸アミド（(U.S. Patent 5,972,719) 炭水化物 (U.S. Patent 5,965,719),１，４−ベンゾジアゼピン−２，５−ジオン(U.S. Patent 5,962,337),サイクリックス (U.S. Patent 5,958,792), ビアリールアミノ酸アミド (U.S Patent 5,948,696), チオフェン(U.S. Patent 5,942,387), トリサイクリックテトラハイドロキノリン(U.S. Patent 5,925,527),ベンゾフラン (U.S. Patent 5,919,955),イソキノリン (U.S. Patent 5,916,899), ヒダントインおよびチオヒダントイン (U.S. Patent 5,859,190), インドール (U.S. Patent 5,856,496), イミダゾルピリドインドールおよびイミダゾル−ピリドベンゾチオフェン (U.S. Patent 5,856,107) 置換２−ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ−２、３−ジハイドロチアゾル(U.S. Patent 5,847,150),キノリン (U.S. Patent 5,840,500), ＰＮＡ(U.S. Patent 5,831,014), 含有タグ (U.S. Patent 5,721,099), polyketides(U.S. Patent 5,712,146), モルホリノスブユニット(U.S. Patents 5,698,685 and 5,506,337), サルファミド (U.S. Patent 5,618,825), およびベンゾジアゼピン (U.S. Patent 5,288,514).
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３９２】
このように、選出の分子を結合する分子を単離する１本の道は、合理的設計である。
これは、構造知見およびコンピュータモデリングで達成される。
コンピュータモデリング技術は、選択された分子の三次元原子構造および分子と相互に作用する新化合物の合理的な設計の可視化を許す。
三次元作成物は、選択された分子のＸ線結晶学的解析またはＮＭＲ画像化から、概してデータに依存する。
分子の力学は、力場データを必要とする。
コンピュータグラフィックス系は、新化合物が標的分子とつながって、化合物および標的分子の構造の実験的操作を許す方法の予報に結合特異性を仕上げるのを可能にする。
分子−化合物相互作用が小さい変化が一方または両方において作られる時であるというの予報は分子力学ソフトウェアおよびコンピュータによる加強法を必要とする。そして、通常分子デザインプログラムおよびユーザー間のユーザーフレンドリーな、メニュー選択方式の界面に結合する。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５３０】
また、バイオセンサが光学型バイオセンサである方法を含む方法が、開示される。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５３１】
また、バイオセンサが標識フリーバイオセンサである方法を含む方法が、開示される。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６０６】
また、飢餓ステップの後、緩衝液を有する濯ぎのステップを更に含んでいる方法６０５が、開示される；
または、方法において、細胞は９０％を超える密集度に育てられる；
または、方法において、細胞は洗浄液で二回洗浄される；
または、方法において、細胞を飢餓させることは、それらをＤＭＥＭだけで培養することから成る；
または、方法において、細胞を飢餓させることは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０時間、起こる；
または、方法において、細胞を飢餓させることは、一晩起こる；
または、方法において、すすぎ緩衝液は、２．５ｍＭのプロベニシド（ｐｒｏｂｅｎｉｃｉｄ）がある場合には、１×標準ハンクス均衡塩類溶液、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、ペーハー７．０から成る；
または、方法において、シグナルはカルシウムシグナルである；
または、方法において、カルシウムシグナルは６秒の間隔で、６分以上記録された；
または、方法において、バイオセンサはＨＴＳ７０００バイオアッセイリーダ（BioAssay Reader）から成る；
または、方法において、方法は室温で、起こる；
または、方法において、バイオセンサはコーニングＥｐｉｃ（商標登録）角度測定システムである；
または、方法において、バイオセンサは、ＴＭモードの使用する；
または、方法において、バイオセンサがｐ−偏光を所定のＴＭ０モードにおいて使われる；
または、方法において、化合物はすすぎ緩衝液において薄められた；
または、方法において、すすぎ緩衝液は、１×標準ハンクス均衡塩類溶液、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、ペーハー７．０から成る；
または、方法において、細胞を飢餓させることは、ＦＢＳを欠いている緩衝液で起こる；
または、方法において、溶液が０．０５％未満のＤＭＳＯを有する溶液において、化合物はある；
または、方法において、飢餓させるステップは、３７℃で起こる；
または、方法において、更に飢餓させるステップは、空気／５％のＣＯ２の下で起こる；
または、方法において、細胞は細胞を有する化合物溶液をインキュベートする前に化合物を欠いている化合物溶液によって前処理される、それまで、安定した位相に達する；
または、方法において、バイオセンサは共鳴バンドの中央の位置の画素密度の変化を同定する；
または、方法において、バイオセンサは共鳴バンドのまたは更に時間の関数として、バイオセンサデータをプロットするステップから成る角のシフトを測定する；
または、方法において、増加するシグナル（Ｐ−ＤＭＲ）は検知体積内で生体分子の総計の増加を意味する、そして、減少されたシグナル（Ｎ−ＤＭＲ）は検知体積内で生体分子の総計の減少を意味する；
または、方法において、方法は細胞および化合物のためのシグニチャを同定する；
または、方法において、シグニチャは次のＮ−ＤＭＲ位相が続くＰ−ＤＭＲ位相から成る；方法において、Ｐ−ＤＭＲ位相はＮ−ＤＭＲ位相の崩壊速度より高い速度で起こる；
または、方法において、シグニチャはＰ−ＤＭＲがそれまで位相が評価プラトーに渡すＰ−ＤＭＲを段階的に実行することを成る；
または、方法において、シグニチャは２つの連続的Ｐ−ＤＭＲ現象から成る。方法において、高いレベルに対する第１のＰ−ＤＭＲ位相は第２のＰ−ＤＭＲ位相が１秒起こる速度がレベルを上げたより、大きい速度で起こる；
または、方法において、シグニチャは化合物濃度の関数として、シグナルをバイオセンサからプロットするステップから成る、更にノイズレベルより上のいかなるＤＭＲシグナルも含まない。
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６３８】
図３３は、全部のセンサの共振バンド像が異なる密集度でＣＨＯ細胞の層によってカバーしたことをＴＭ０モードに明らかにする。
像は、緩衝液（カラム２）を有する、そして、１８％のＤＭＳＯ（カラム１）を有する２５分処理の後、される。
像は、その（ｉ）に緩衝液によって処理される細胞が物質を全部のセンサの共振バンドのいかなる変化もの否定結果にしないことを示唆する細胞の密集度があること；
そして、１８％のＤＭＳＯで処理される細胞が密集度依存している共振バンド広がりに、上昇に与える（ｉｉ）。
細胞の密集度が７０％を超えるであるときに、ＤＭＳＯ−起因性共振バンド広がりがある。
これらの結果は、共振バンド広がりの広幅化が化合物毒性のためのシグニチャとして使われることを示唆する；
そして、細胞密度または密集度は、有効な見積を作るために重要である。
共鳴ピークスペクトル、広幅化またはＤＭＳＯ処理に応答する共鳴バンド像の形変化に対する同様は動的機構である。そして、ＤＭＳＯ−起因性細胞応答が特定の細胞のシグナル伝達経路（例えばアポトーシス）に関するかもしれないことを示唆する。
より重要なことに、マイクロプレート内の全ての９６のセンサのための共鳴バンド像は３秒内で集められる。そして、共鳴バンド像またはスペクトルに基づく本発明の方法が極めて高いスループット技術を細胞毒性価値判断および複毒性スクリーニングに対して提供することを示唆する。
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６５６】
図４２は、ＡＧ１４７８によって静止Ａ４３１細胞起因性のＥＧＦ−誘導応答の供与量依存している抑制を示す。
これらのＤＭＲ現象が受容体リン酸化、強力および特定のＥＧＦＲキナーゼに依存していると同定するために、阻害物質チロホスチン（ｔｙｒｐｈｏｓｔｉｎ）ＡＧ１４７８が、使われた。
Ａ４３１は予め２０時間のいかなるＦＢＳのないも培地において飢餓させた。そして、それらが同じ期間（図４２Ａ）の０．１％のＦＢＳ媒体で飢餓させたより、かなり耐性のＰ−ＤＭＲ現象およびより短い遷移時間のための動態に結果としてなった。
１時間の異なる濃度でのＡＧ１４７８を有するＡ４３１細胞の前処理は、ＥＧＦ−誘導応答の用量依存的抑制において、Ｎ−ＤＭＲシグナルの振幅がＡＧ１４７８の機能としてプロットされるときに、典型的阻害を生むことは約１９４ｎＭのＩＣ５０によってカーブする結果になった（図４２、そして、ｂ）。
しかし、０．５％のジメチルスルホキシドを有するＡ４３１の前処理は、ＥＧＦ−誘導応答（示されないデータ）に対する少しの影響を有した。
これらのデータは、ＥＧＦＲキナーゼリン酸化がＥＧＦ−起因性ＤＭＲ変化のために必要なことを示す；
そして、使って光学バイオセンサを使用して得られたＤＭＲシグナルは、測定されるＤＭＲ現象で重要な役割を演ずるモジュレータの効力を決定する。
（（６） 静止Ａ４３１細胞の３２ナノメートルのＥＧＦ−誘導応答上のラス癌遺伝子／ＭＡＰＫ経路モジュレータの効果）
【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６５７】
ＥＧＦは、細胞増殖および分化を管理して、部分の最少で、下流シグナルとしてマイトジェン−活性タンパク質キナーゼを使用する。
さらに、ＥＲＫ活性化はＥＧＦＲ活性化の大域的、陰のシグナル下流を表すようである。そして、それは脱接着（deadhesion）において重要でもよい。
このように、ＭＥＫ阻害物質Ｕ０１２６、ｐ３８ ＭＡＰＫ阻害物質ＳＢ２０３５８０およびＳＢ２０２１９を含む、Ｒａｓ−ＭＡＰＫ経路を標的としている阻害物質の効果、そして、ＪＮＫ阻害物質ＳＰ６００１２５は、検査された（図４４参照）。
Ｕ０１２６は、かなり後発の時間ｔを有するＰ−ＤＭＲてＮ−ＤＭＲシグナルの振幅を圧縮した。
これは、ＭＥＫ１／２の阻害がＮ−ＤＭＲシグナル（前の研究と整合した）を導く細胞離断および運動を防ぐことを示唆する。
しかし、ＭＥＫ１／２が抑制されるときに、活性ＥＧＦＲのエンドサイトーシスはまだ起こってもよい。
エンドサイトーシスが細胞離断および運動と比較してセンサ界面から離れて起こるので、エンドサイトーシスはかなり総合応答率により貢献してはならない。
したがって、それらの静止Ａ４３１の応答がＭＥＫ１／２つの阻害物質によって前処理したＥＧＦ−起因性は、受容体エンドサイトーシスと整合している。
これは、更に計算のモデリング結果と整合している応答の動態で支えられた。
対照的に、ＳＢ２０３５８０およびＳＢ２０２１９は不完全な減衰を導くだけだったのに、ＳＰ６００１２５はＥＧＦ−誘導応答に対するほとんど影響を有しなかった。
これらの結果は、ＤＭＲの静止Ａ４３１細胞ＥＧＦ模倣において応答がＭＥＫでＲａｆ−ＭＥＫ経路および収益を含むことを示す。
（（７） 静止Ａ４３１細胞の３２ナノメートルのＥＧＦ−誘導応答上のタンパク質キナーゼ阻害物質の効果）
【手続補正２９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６５８】
ＥＧＦＲシグナル伝達が様々な他のタンパク質キナーゼを含んだ時から、ＥＧＦ−誘導応答上のタンパク質キナーゼ阻害物質の効果は検査された。
Ａ４３１の前処理の１μＭワートマニン（ｗｏｒｔｍａｉｎｎｉｎ）（強力および選択的ＰＩ３Ｋ阻害物質）、１μＭＫＴ ５７２０（タンパク質キナーゼＡの有力で選択的阻害物質）１０μＭ ＫＴ５８２３（タンパク質キナーゼＧの選択的阻害物質）、そして、１０μＭ ＫＮ ６２（ＣａＭキナーゼＩＩの選択的阻害物質）は、応答上のほとんど効果を有しなかった。
対照的に、ＧＦ １０９２０３ｘ（タンパク質キナーゼＣの選択的阻害物質）は応答（図４５参照）上の部分音減衰を呈した。
これらの結果はそのタンパク質キナーゼＣを示す、しかし、ＰＩ３Ｋ（タンパク質キナーゼＡおよびＣａＭＩＩ）はＤＭＲ変化を刺激するためにＥＧＦの機能を変えない。
（（８） 静止Ａ４３１細胞の３２ナノメートルのＥＧＦ−誘導応答上の細胞骨格モジュレータの効果）
【手続補正３０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６６０】
ｃＡＭＰ（ｃＡＭＰ）は、細胞内の二次メッセンジャの概念図式として役立って、実質的に細胞の機能（例えば代謝、収縮性、運動性および全ての細胞タイプの転写）の無数を管理する。
前の研究は、細胞のコンテクスト上のそのｃＡＭＰ経路クロストークおよび従属する漸先形の成育因子−刺激されたＭＡＰキナーゼ活性を示した。
ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）が細胞のｃＡＭＰレベルを管理するので、ＥＧＦ−誘導応答上のＰＤＥｓの役割がＰＤＥ阻害物質シロスタミド（ｃｉｌｏｓｔａｍｒｉｄｅ）、ミルリノン、Ｒｏ２０−１７２４、Ｒ（−）−ロリプラムおよびザルダベリンを使用して研究されて、（１０時に各々μＭ）。
これらの阻害物質のどれも応答（図４７参照）に対する明らかな影響を有しなかった。そして、ｃＡＭＰが全体的なＤＭＲ応答に関係していないことを示唆した。
前の研究は、タンパク質キナーゼＡがＲａｆ−１の活性に敵対することができて、このようにＰＤＥ活性を調整することによるＲａｓ−ＭＡＰＫ経路を管理することを示した。
しかし、静止状態において、細胞Ｒａｆ−１はＰＫＡ阻害物質を知覚しえない構成リン酸化を呈し、これは、ＰＫＡ阻害物質ＫＴ５７２０（図４５）およびＰＤＥ４阻害物質Ｒｏ ２０−１７２４およびＲ−（−）−ロリプラム（ｒｏｌｉｐｒａｍ）がＥＧＦ−起因性ＤＭＲシグナルにほとんど遂行しないという我々の目視観測と整合した。
（（１０） ＥＧＦ起因性ＥＧＦＲ内部移行、細胞形態変化および室温で、Ａ４３１細胞（２２℃）の指向性質量再分布）
【手続補正３１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６６１】
ＥＧＦを有するＡ４３１細胞の刺激作用は、室温で、最終的に受容体エンドサイトーシスを導く受容体二量体化および成行き自己リン酸化によるＥＧＦＲ活性化の引き起こす（図４８Ａ−Ｃ、屈折率（ｒｅｆｒａｃｔｉｌｅ）形態学的変化（図４８Ｄ参照）および指向性質量再分布（図２Ａ、図１８および他参照）を参照のこと。
酸ストリップ法を使用している界面−境界テトラメチルローダミン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄｉｍｉｎｅ）の標識されたＥＧＦ（ＴＭＲ−ＥＧＦ）を選択的に除去することによって、ＥＧＦＲ内部移行の外延が、検査されて、細胞培養条件に依存しているとわかった。
増殖している細胞のそれらより非常に高い細胞表層で内面化された受容体は、静止状態細胞で見つけられた。
静止状態細胞のＥＧＦ−起因性形態学的変化は、定着の後、テキサス赤標識ファロイジン染色によって視覚化された。
前の研究は、３７℃でのＡ４３１がＥＧＦ処理に細胞間マトリックスから時間に依存する屈折率形態学的変化および離断を呈することを示した。
これらの研究と整合して、細胞の端にフィラメントアクチンの端によって示されるように、ＥＧＦ処理およびこの変化の約１５分の後、変化に始まるアクチンリモデリングは、より長い刺激作用でより劇的になった。
（（１１） 略図は、ＥＧＦ−起因性ＤＭＲシグナル−受容体エンドサイトーシスのための１つの可能な機構を示す）
【手続補正３２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６６３】
孔形成試薬はサポニンおよびフィリピンのような界面活性剤またはジギトニンまたはストレプトリシンＯのようなトキシンを含む。そして、公知のウェルはこれらの試薬を有する細胞のその処理である細胞表層膜の小孔形成の結果としてなる。
結果としてなられた透過化処理された細胞は、細胞内材料（主に可溶タンパク質）の特定の総計を放出する。
しかし、直接結合することによる隔離または細胞骨格構造を有する会合のためにこれらの透過化処理された細胞によってまだとどまる多くの生体材料が、ある。
実は、これらの透過化処理された細胞は、タンパク質合成のような生体細胞の生物学的な機能の多数を保持する。
細胞骨格構造を分裂させる化合物を有する細胞の処理は、相当に生体材料をこれらの透過化処理された細胞から自由にすることに結果としてなることが可能である。
【手続補正３３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６６５】
図５０は、時間の関数として、サポニンに応答してＬＩＤセンサの界面上のＣＨＯ細胞被着の用量依存的応答を示す。
異なる濃度でのサポニンの添加の後、異なる応答は、顕性である。
低濃度で、応答がほとんどない。
サポニンの濃度が約２０μｇ／ｍｌより上にあるときに、続かれる減少されたシグナルが増加応答によってある。
初期の増加するシグナルはセンサの界面上の細胞から平らにすることのために最適でありえる。そして、センサの検知体積内で、質量増加に結果としてなる。
ところが、減少されたシグナルは、細胞からたぶん生体材料の減失を反映する。
他の可能性は、センサの検知体積内で、ネット−減少された質量を導く細胞の成分および／または形態変化の再配列による。
試験される最も高い濃度で、初期の増加するシグナルがない。
逆に、下部の濃度でのそれらより大きい有意な応答を有する減少されたシグナルだけが、ある。
【手続補正３４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６８７】
外部性刺激の光、イオン、ニューロトランスミッタ（neurotransmittors）およびホルモンを含んでいる多種多様アレーは、ＧＰＣＲによる細胞の生理学および病態生理学特性をを変調（ここでは調整とも称する）する。
作動薬によって媒介されたＧＰＣＲの活性化はそれらの関連するＧタンパク質および他調節タンパク質を有する動的な相互作用の引き起こす。そして、それは細胞内反応のカスケードを支配する。
ＧＰＣＲは三基に分割され得る。そして、それらの被結合Ｇタンパク質亜タイプ：Ｇｑ、ＧｓおよびＧｉによって特徴づけられる。
概してＧＰＣＲで媒介されたリガンド起因性細胞現象は、受容体コンフォメーションおよびオリゴマー形成状態と共に始まる。そして、シグナル伝達活性化Ｇタンパク質活性（Ｇαサブユニット上のＧＤＰ−ＧＴＰ交換、ＧαおよびＧβγ脱会合、受容体からのＧタンパク質デカップリング、Ｇα−の生成およびＧβγ−シグナル伝達複合体）、並びに、二次メッセンジャ生成（Ｃａ２＋可動化、イノシトール三リン酸（inositoltriphosphate）生成および／または細胞内のｃＡＭＰレベル転形）を導く下流シグナル伝達、が続く。
その後、ＧＰＣＲシグナル伝達は、エンドサイトーシスによる細胞表面から特性遺伝子の形質発現およびＧＰＣＲの脱感作まで至る；そのいずれかの多数が多数の細胞内のタンパク質の中で動的輸送を巻き込む。
最終的に、フェノタイプ、形態および標的細胞の物性は、変えられる。
シグナル伝達および調節性機構は、一般に細胞応答を支配するタイムリで正確に管理された作用をする。
その結果、シグナル伝達ほとんどすべてのＧＰＣＲは、細胞の内容物の動的再分布がシグナル伝達サイクルの間、命じられて、管理されるという感覚において共通である。
細胞の内容物の動的な再分布をモニタすることは、ＧＰＣＲシグナル伝達の洞察およびＧＰＣＲスクリーンのための強力な手段を決意しなければならない。
（ａ） 材料および方法）
（（１） 材料）
【手続補正３５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０７０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０７０６】
ここの我々は、多種多様なＧＰＣＲを標的とする作動薬のパネルによって刺激される静止Ａ４３１細胞の光学シグニチャを組織的に検査した。
作動薬の選出は、部分的にＡ４３１の周知の内因性のＧＰＣＲに基づいた。
結果は、光学シグニチャ（すなわち媒介体（すなわちＨＢＳＳ）だけで処理されるそれに対する同様）（図６３ｄ）の四分の一タイプの他に、光学シグニチャが三大前提カテゴリ（図６３ａ，ｂおよびｃ）に、それらの作動薬落下によって媒介することを示した。
三異なるストラテジは、これらの光学シグニチャのための細胞のシグナル伝達機構会計を明らかにするために使用された。
最初に、従来の二次メッセンジャアッセイ（すなわちＦｌｕｏ−３つのアッセイ）は、Ｃａ２＋可動化が生じるそれらの能力のための作動薬を分類するために用いた。
第２に、活性化物質（フォルスコリンおよびＮＫＨ４４７）が使われた２つのアデニリルシクラーゼ（ｃｙｌａｓｅ）（ＡＣ）は、静止Ａ４３１細胞を刺激する。
ＧＰＣＲ作動薬によって媒介されたアデニル酸シクラーゼ活性化物質−媒介された光学シグニチャ間の類似は、検査されて、Ｇｓによって媒介されたシグナル伝達を指摘したものである。
三分の一、特定の作動薬による光学シグニチャ起因性上の周知のモジュレータのパネルの効果の系統学のマッピングは、その細胞の機構およびシグナル伝達ネット相互作用を調査するために実行された。
これらの研究に基づく、光学シグニチャの３つの主要なクラスは、ＧＰＣＲシグナル伝達の３つの古典的なタイプに割り当てられた：
Ｇｑ−、Ｇｓ−およびＧｉ−シグナル伝達。
限界のため、内存性の情報はＡ４３１細胞（更に確かめられるＧｉ−タイプ光学シグニチャ必要）の受容体をＧｉ−ｃｏｕｐｌｅｄした。但し、ＨＴＭＴによる用量依存的応答起因性は強くかかる指示を支持した。
【手続補正３６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０７２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０７２３】
細胞骨格再構成を管理するＲｈｏ活性化を導くＰＡＲ細胞内シグナル伝達は、２つの主要なシグナル伝達経路を含むように見える：
ホスホイノシトール加水分解およびカルシウムに依存するＲｈｏ活性化に結果としてなっているＧｑ−被結合経路およびＧ１２／１３−被結合ｐ１１５Ｒｈｏ−ＧＥＦによるＲｈｏのカルシウムから独立した直接の活性化。
このように、Ｃａ２＋シグナル伝達を標的とするモジュレータの効果は、検査された。
使用するモジュレータは、有力なＰＫＣ阻害物質ＧＦ１０９２０３ｘおよび有力なＣａ２＋／カルモジュリン(ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ)に依存するタンパク質キナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）阻害物質ＫＮ−６２（図７３）であった。
ＧＦ１０９２０３ｘは、トロンビンおよびトリプシンによって媒介されたＤＭＲシグナルに対する明らかな影響を有しなかった。
しかし、ＫＮ−６２の前処理は、異なってトロンビンおよびトリプシンによって媒介されたＤＭＲシグナルに影響を及ぼした。
ＫＮ−６２が僅かにトロンビンによって媒介されたＤＭＲシグナルを抑制するときに、それはほとんど完全にトリプシンによって媒介されたＤＭＲシグナルを破壊した。
トリプシン活性を直接抑制しているＫＮ−６２の可能性を検査するために、ＢＡＥＥ加水分解（ｈｙｄｒｏｌｙｉｓｉｓ）アッセイが、使われた。
結果は、ＫＮ−６２の存在がトリプシン活性（示されないデータ）に遂行することが明らかでないことを示した。
【手続補正３７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０７３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０７３５】
ＲＯＳは、受容体から細胞核まで多数レベルで多数のシグナル伝達経路を管理する。
より透明でないにもかかわらず、細胞の標的は同定されて、過去の１０位を通じて広がった。
受容体キナーゼおよびホスファターゼは、酸性の応力の標的であってもよい。
生長因子受容体は、リガンド起因性二量体化またはオリゴマー形成（その細胞質のキナーゼドメインを自動的にリン酸化する）によって非常に最も活性化される。
紫外線に応答する受容体のリガンドから独立した菌株群形成および活性化はまた、かなり示された、そして、この効果はＲＯＳによって媒介されたように見える。
外部性Ｈ２Ｏ２（通常ミリモル範囲の）は、ＰＤＧＦ−およびＥＧＦ受容体のＹリン酸化および活性化を誘発することを示した。
ＥＧＦ受容体のリゾフォスファチジン（Ｌｙｓｏｐｈａｔｉｄｉｃ）酸の起因性トランスアクチベーションは、ＲＯＳの中間の発生によって媒介されたように見える。
大部分の成育因子およびサイトカインが形質膜で、又はその近くで、ＲＯＳを生成するように見えるので、リン脂質メタボライトはレドックスシグナル伝達のための潜在的に重要な標的である。
たとえば、ジアシルグリセロールの酸化タイプは、ＰＫＣを活性化する際に、その未酸化されたフォームより効果的だった。
加えて、ＰＫＣ活性化およびタンパク質Ｙリン酸化は、血管内皮細胞および繊維芽細胞のＨ２Ｏ２−起因性ＰＬＤ活性化のために必要に見える。
Ｓｒｃファミリ（Ｓｒｃキナーゼ）およびヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）ファミリに帰属している非ＲＴＫｓは、また、少なくとも、外因的な加算オキシダントのための標的である。