(57)【要約】本発明は、安定化Ｆｃ領域を有する、抗体等のＦｃ含有ポリペプチドを産生する方法を提供する。本発明はまた、これらの方法に従って産生される安定化Ｆｃポリペプチド、ならびに、かかる抗体を治療薬として使用する方法を提供する。一実施形態において、キメラＦｃ領域を含む安定化ポリペプチドが提供され、上記安定化ポリペプチドは、ＩｇＧ４イソタイプのＩｇＧ抗体からの少なくとも１つのＣＨ２ドメインと、ＩｇＧ１イソタイプのＩｇＧ抗体からの少なくとも１つのＣＨ３ドメインとを含み、上記安定化ポリペプチドは、２９７、２９９、３０７、３０９、３９９、４０９、および４２７（ＥＵ付番慣例）からなる群から選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸位置に１つまたはそれ以上の安定化Ｆｃアミノ酸を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
キメラＦｃ領域を含む安定化ポリペプチドであって、前記安定化ポリペプチドは、ＩｇＧ４イソタイプのＩｇＧ抗体からの少なくとも１つのＣＨ２ドメインと、ＩｇＧ１イソタイプのＩｇＧ抗体からの少なくとも１つのＣＨ３ドメインとを含み、前記安定化ポリペプチドは、２９７、２９９、３０７、３０９、３９９、４０９、および４２７（ＥＵ付番慣例）からなる群から選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸位置に１つまたはそれ以上の安定化Ｆｃアミノ酸を含む、安定化ポリペプチド。
【請求項２】
前記キメラＦｃ領域は、ヒンジと、前記ＩｇＧ４イソタイプのＩｇＧ抗体からのＣＨ１およびＣＨ２ドメインと、前記ＩｇＧ１イソタイプのＩｇＧ抗体からのＣＨ３ドメインとを含み、前記抗体は、ＥＵ付番のアミノ酸位置２２８にプロリンを含む、請求項１に記載の安定化ポリペプチド。
【請求項３】
ＩｇＧ４抗体のＦｃ領域からのＣＨ２部分を含む安定化ポリペプチドであって、２４０Ｆ、２６２Ｌ、２６４Ｔ、２６６Ｆ、２９７Ｑ、２９９Ａ、２９９Ｋ、３０７Ｐ、３０９Ｋ、３０９Ｍ、３０９Ｐ、３２３Ｆ、３９９Ｓ、および４２７Ｆ（ＥＵ付番慣例）からなる群から選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸位置に、１つまたはそれ以上の安定化アミノ酸を含む、安定化ポリペプチド。
【請求項４】
アミノ酸位置２９７にＧｌｎを含む、請求項３に記載の安定化ポリペプチド。
【請求項５】
ＩｇＧ１抗体のＦｃ領域からのＣＨ２部分を含む安定化ポリペプチドであって、２９９Ｋおよび２９７Ｄ（ＥＵ付番慣例）からなる群から選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸位置に、１つまたはそれ以上の安定化アミノ酸を含む、安定化ポリペプチド。
【請求項６】
アミノ酸位置２９９にＬｙｓを含む、請求項４に記載の安定化ポリペプチド。
【請求項７】
アミノ酸位置２９９にＬｙｓ、およびアミノ酸位置２９７にＡｓｐを含む、請求項５に記載の安定化ポリペプチド。
【請求項８】
前記Ｆｃ領域は、非グリコシル化されたＦｃ領域である、請求項４に記載の安定化ポリペプチド。
【請求項９】
ＩｇＧ抗体は、ヒト抗体である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の安定化ポリペプチド。
【請求項１０】
前記安定化ポリペプチドの融解温度（Ｔｍ）は、前記安定化アミノ酸を欠く親ポリペプチドと比較して、少なくとも１℃向上される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の安定化ポリペプチド。
【請求項１１】
前記安定化Ｆｃポリペプチドの融解温度（Ｔｍ）は、約１℃以上、約２℃以上、約３℃以上、約４℃以上、約５℃以上、約６℃以上、約７℃以上、約８℃以上、約９℃以上、約１０℃以上、約１５℃以上、および約２０℃以上向上される、請求項１０に記載の安定化ポリペプチド。
【請求項１２】
前記融解温度（Ｔｍ）は、中性ｐＨ（約６．５〜約７．５）で向上される、請求項１０に記載の安定化ポリペプチド。
【請求項１３】
前記融解温度（Ｔｍ）は、約６．５以下、約６．０以下、約５．５以下、約５．０以下、約４．５以下、約４．０以下の酸性ｐＨで向上される、請求項１０に記載の安定化ポリペプチド。
【請求項１４】
前記安定化ポリペプチドは、安定化変異を欠く親ポリペプチドと比較して、高収率で発現する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の安定化ポリペプチド。
【請求項１５】
前記安定化Ｆｃポリペプチドは、約５ｍｇ／Ｌ以上、約１０ｍｇ／Ｌ以上、約１５ｍｇ／Ｌ以上、約２０ｍｇ／Ｌ以上の収率で、細胞培養において発現する、請求項１４に記載の安定化ポリペプチド。
【請求項１６】
前記安定化ポリペプチドの濁度は、前記安定化アミノ酸を欠く親ポリペプチドと比較して低下する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の安定化ポリペプチド。
【請求項１７】
前記濁度は、約１倍以上、約２倍以上、約３倍以上、約４倍以上、約５倍以上、約６倍以上、約７倍以上、約８倍以上、約９倍以上、約１０倍以上、約１５倍以上、約５０倍以上、および約１００倍以上からなる群から選択される倍数で低下する、請求項１６に記載の安定化ポリペプチド。
【請求項１８】
前記安定化ポリペプチドは、前記安定化変異を欠く親Ｆｃポリペプチドと比較して、低下したエフェクタ機能を有する、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の安定化ポリペプチド。
【請求項１９】
前記低下したエフェクタ機能は、低下したＡＤＣＣ活性である、請求項１８に記載の安定化ポリペプチド。
【請求項２０】
前記低下したエフェクタ機能は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩからなる群から選択されるＦｃ受容体（ＦｃＲ）への低下した結合である、請求項１８に記載の安定化ポリペプチド。
【請求項２１】
前記エフェクタ機能は、約１倍以上、約２倍以上、約３倍以上、約４倍以上、約５倍以上、約６倍以上、約７倍以上、約８倍以上、約９倍以上、約１０倍以上、約１５倍以上、約５０倍以上、および約１００倍以上からなる群から選択される倍数で低下する、請求項１８に記載の安定化ポリペプチド。
【請求項２２】
前記安定化ポリペプチドは、親Ｆｃポリペプチドと比較して、向上した半減期を有する、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の安定化ポリペプチド。
【請求項２３】
前記向上した半減期は、新生児受容体（ＦｃＲｎ）への結合の向上によるものである、請求項２２に記載の安定化ポリペプチド。
【請求項２４】
前記半減期は、約１倍以上、約２倍以上、約３倍以上、約４倍以上、約５倍以上、約６倍以上、約７倍以上、約８倍以上、約９倍以上、約１０倍以上、約１５倍以上、約５０倍以上、および約１００倍以上からなる群から選択される倍数で向上する、請求項２２に記載の安定化ポリペプチド。
【請求項２５】
前記Ｆｃ領域は、２つのポリペプチド鎖を含む二量体Ｆｃ領域である、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の安定化ポリペプチド。
【請求項２６】
前記Ｆｃ領域は、一本鎖Ｆｃ領域である、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の安定化ポリペプチド。
【請求項２７】
前記Ｆｃ領域の全てのＦｃ部分は、非グリコシル化される、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の安定化ポリペプチド。
【請求項２８】
前記非グリコシル化されたＦｃ領域は、前記Ｆｃ領域の位置２９９（ＥＵ付番慣例）に置換を含む、請求項７に記載の安定化ポリペプチド。
【請求項２９】
前記非グリコシル化されたＦｃ領域は、細菌性宿主細胞におけるその産生の結果として、非グリコシル化される、請求項７に記載の安定化ポリペプチド。
【請求項３０】
前記非グリコシル化されたＦｃ領域は、化学的または酵素的手段による脱グリコシル化の結果として、非グリコシル化される、請求項７に記載の安定化ポリペプチド。
【請求項３１】
前記非グリコシル化されたＦｃ領域は、キメラヒンジドメインを含む、請求項７に記載の安定化ポリペプチド。
【請求項３２】
前記キメラヒンジドメインは、アミノ酸位置２２８（ＥＵ付番慣例）の、プロリン残基による置換を含む、請求項３１に記載の安定化ポリペプチド。
【請求項３３】
前記安定化アミノ酸は、独立して、（ｉ）位置２９７の非荷電アミノ酸、ｉｉ）位置２９９の正電荷を持つアミノ酸、（ｉｉｉ）位置３０７の極性のアミノ酸、（ｉｖ）位置３０９の正電荷を持つもしくは極性のアミノ酸、（ｖ）位置３９９の極性のアミノ酸、（ｖｉ）位置４０９の正電荷を持つもしくは極性のアミノ酸、および（ｖｉｉ）位置４２７の極性アミノ酸からなる群から選択される、請求項１に記載の安定化ポリペプチド。
【請求項３４】
少なくとも１つの安定化アミノ酸は、アミノ酸位置２９７（ＥＵ付番）のＧｌｎである、請求項１に記載の安定化ポリペプチド。
【請求項３５】
前記安定化アミノ酸のうちの少なくとも１つは、位置２９９のリシン（Ｋ）またはチロシン（Ｙ）である、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の安定化ポリペプチド。
【請求項３６】
前記安定化アミノ酸のうちの少なくとも１つは、位置３０７のプロリン（Ｐ）またはメチオニン（Ｍ）である、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の安定化ポリペプチド。
【請求項３７】
前記安定化アミノ酸のうちの少なくとも１つは、位置３０９のプロリン（Ｐ）、メチオニン（Ｍ）、またはリシン（Ｋ）である、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の安定化ポリペプチド。
【請求項３８】
前記安定化変異のうちの少なくとも１つは、位置３９９のセリン（Ｓ）である、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の安定化ポリペプチド。
【請求項３９】
前記Ｆｃ領域は、結合部位と機能的に結合する、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の安定化ポリペプチド。
【請求項４０】
前記結合部位は、抗原結合部位、受容体のリガンド結合部分、またはリガンドの受容体結合部分から選択される、請求項３９に記載の安定化ポリペプチド。
【請求項４１】
前記結合部位は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ミニボディ、ジアボディ、トリアボディ、ナノボディ、カメリド抗体、およびＤａｂからなる群から選択される修飾抗体に由来する、請求項３９に記載の安定化ポリペプチド。
【請求項４２】
安定化完全長抗体である、請求項３９に記載の安定化ポリペプチド。
【請求項４３】
前記抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、およびヒト化抗体からなる群から選択される、請求項３９に記載の安定化ポリペプチド。
【請求項４４】
前記安定化完全長抗体は、従来の、または安定化ｓｃＦｖ分子に融合される、請求項３９に記載の安定化ポリペプチド。
【請求項４５】
安定化イムノアドヘシンである、請求項３９に記載の安定化ポリペプチド。
【請求項４６】
結合部位は、前記安定化ポリペプチドの前記Ｆｃ領域の表面上に重ねられる、請求項３９に記載の安定化ポリペプチド。
【請求項４７】
前記結合部位は、非免疫グロブリン結合分子に由来する、請求項３９に記載の安定化ポリペプチド。
【請求項４８】
前記非免疫グロブリン結合分子は、アドネクチン、アフィボディ、ＤＡＲＰｉｎ、およびアンチカリンからなる群から選択される、請求項４７に記載の安定化ポリペプチド。
【請求項４９】
受容体の前記リガンド結合部分は、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーの受容体、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーの受容体、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）スーパーファミリーの受容体、チロシンキナーゼ（ＴＫ）受容体スーパーファミリーの受容体、リガンド依存性（ＬＧ）スーパーファミリーの受容体、ケモカイン受容体スーパーファミリーの受容体、ＩＬ−１／トール様受容体（ＴＬＲ）スーパーファミリー、グリアのグリア由来の神経栄養因子（ＧＤＮＦ）受容体ファミリーの受容体、およびサイトカイン受容体スーパーファミリーからなる群から選択される受容体に由来する、請求項４０に記載の安定化ポリペプチド。
【請求項５０】
前記リガンドの受容体結合部分は、阻害性リガンドに由来する、請求項４０に記載の安定化ポリペプチド。
【請求項５１】
前記リガンドの受容体結合部分は、活性化リガンドに由来する、請求項４０に記載の安定化ポリペプチド。
【請求項５２】
前記リガンドは、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーの受容体、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーの受容体、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）スーパーファミリーの受容体、チロシンキナーゼ（ＴＫ）受容体スーパーファミリーの受容体、リガンド依存性（ＬＧ）スーパーファミリーの受容体、ケモカイン受容体スーパーファミリーの受容体、ＩＬ−１／トール様受容体（ＴＬＲ）スーパーファミリー、およびサイトカイン受容体スーパーファミリーからなる群から選択される受容体に結合する、請求項５０または５１に記載の結合ポリペプチド。
【請求項５３】
請求項１〜５２のいずれか１項に記載の安定化ポリペプチドと、薬学的に許容される担体と、を含む組成物。
【請求項５４】
請求項１〜５３のいずれか１項に記載の安定化結合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
【請求項５５】
請求項２５に記載の安定化結合ポリペプチドのポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
【請求項５６】
請求項５４または５５に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項５７】
請求項５６に記載のベクターを発現する、宿主細胞。
【請求項５８】
本発明の安定化Ｆｃポリペプチドを産生する方法であって、前記安定化Ｆｃポリペプチドが産生されるように、培養培地中で請求項５７に記載の宿主細胞を培養することを含む、方法。
【請求項５８】
非グリコシル化された、キメラＦｃ領域、もしくはその一部を含む親Ｆｃポリペプチドを安定化するための方法であって、前記Ｆｃ領域の少なくとも１つのＦｃ部分の選ばれたアミノ酸を安定化アミノ酸で置換し、前記出発ポリペプチドと比較して、安定性を向上させた安定化Ｆｃポリペプチドを産生することを含み、前記置換は、２９７、２９９、３０７、３０９、３９９、４０９、および４２７（ＥＵ付番慣例）からなる群から選択される前記Ｆｃ部分のアミノ酸位置でなされる、方法。
【請求項５９】
前記キメラＦｃ領域は、前記ＩｇＧ４イソタイプのＩｇＧ抗体からのＣＨ２ドメインと、前記ＩｇＧ１イソタイプのＩｇＧ抗体からのＣＨ３ドメインとを含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記安定化Ｆｃポリペプチド中に存在するアミノ酸位置およびアミノ酸は、２９７Ｑ、２９９Ａ、２９９Ｋ、３０７Ｐ、３０９Ｋ、３０９Ｍ、３０９Ｐ、３２３Ｆ、３９９Ｅ、３９９Ｓ、４０９Ｋ、４０９Ｍ、および４２７Ｆからなる群から選択される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
前記安定化Ｆｃポリペプチドは、位置２９７（ＥＵ付番）にＧｌｎを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
安定化Ｆｃ領域を含むポリペプチドの大規模な製造のための方法であって、
（ａ）少なくとも１つの安定化Ｆｃ部分をポリペプチドに遺伝的に融合し、安定化融合タンパク質を形成することと、
（ｂ）哺乳類宿主細胞に前記安定化融合タンパク質をコードする核酸分子をトランスフェクトすることと、
（ｃ）前記安定化融合タンパク質が発現されるような条件下で、１０Ｌ以上の培養培地中でステップ（ｆ）の前記宿主細胞を培養し、それによって、安定化融合タンパク質を産生することと、を含む、方法。
【請求項６３】
前記安定化Ｆｃ領域は、前記ＩｇＧ４イソタイプのＩｇＧ抗体からのＣＨ２ドメインと、前記ＩｇＧ１イソタイプのＩｇＧ抗体からのＣＨ３ドメインと、を含むキメラＦｃである、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記安定化Ｆｃ領域は、アミノ酸位置２９７（ＥＵ付番）にＧｌｎを含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
対象における疾患または障害を治療または予防するための方法であって、前記疾患または障害を患う対象に、請求項５３に記載の組成物を投与し、それによって、疾患または障害を治療または予防することを含む、方法。
【請求項６６】
前記疾患または障害は、炎症性障害、神経系障害、自己免疫障害、および腫瘍性障害からなる群から選択される、請求項６５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本特許出願は、２００９年１月２３日出願の米国暫定出願第６１／１４６，９５０号、名称「ＳＴＡＢＩＬＩＺＥＤ  Ｆｃ  ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳ  ＷＩＴＨ  ＲＥＤＵＣＥＤ  ＥＦＦＥＣＴＯＲ  ＦＵＮＣＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＵＳＥ（低下したエフェクタ機能を有する安定化Ｆｃポリペプチドおよび使用方法）」の利益を主張するものである。上記の参照暫定特許出願の全ての内容は、参照することにより、本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
獲得免疫反応は、体に侵入し、感染または疾病をもたらす外来の生物に対して、体が自らを防御する機構である。１つの機構は、宿主の可変領域を通して抗原に結合するために、産生される、または宿主に投与される、抗体の能力に基づく。抗原が抗体によって結合されると、この抗原は、抗体の定常領域またはＦｃ領域によって、しばしば、少なくとも部分的に媒介され、破壊の標的となる。
【０００３】
抗体のＦｃ領域によって媒介される幾つかのエフェクタ機能または活性がある。あるエフェクタ機能は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）と称されるプロセスにおいて、標的抗原、例えば、細胞病原体を溶解することを補助し得る、補体タンパク質に結合する能力である。Ｆｃ領域の別のエフェクタ活性は、免疫細胞、またはいわゆるエフェクタ細胞の表面上でＦｃ受容体（例えば、ＦｃγＲ）に結合することであり、これは、他の免疫効果を誘発する能力を有する。これらの免疫効果（例えば、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）および抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ））は、例えば、免疫活性物質の放出、抗体産生の調節、エンドサイトーシス、食菌作用、および細胞の死滅によって、病原体／抗原の除去に作用する。幾つかの臨床上の適用において、これらの応答は、抗体の効力にとって重要であるが、他の場合において、これらは、望まれない副作用を引き起こす。エフェクタによって媒介された副作用の１つの例は、急性発熱反応をもたらす炎症サイトカインの放出である。別の例は、抗原保有細胞の長期欠失である。
【０００４】
抗体のエフェクタ機能は、Ｆｃ領域（例えば、Ｆａｂ、Ｆ(ａｂ′)２、または一本鎖Ｆｖ（ｓcＦｖ））を欠く抗体断片を使用することにより避けられ得る。しかしながら、これらの断片は、腎臓を通る迅速なクリアランスにより減少した半減期を有し、ＦａｂおよびｓｃＦｖの場合、断片は、２つではなく１つのみの抗原結合部位を有し、結合親和力によるいかなる利点も損なう可能性があり、また、製造における課題を提示し得る。
【０００５】
代替のアプローチは、Ｆｃ領域の他の価値のある特質（例えば、長期にわたる半減期およびヘテロ二量化）を保持しながら、完全長抗体のエフェクタ機能を減少させることを目標としている。エフェクタ機能を減少させる１つのアプローチは、Ｆｃ領域の特定の残基に結合される糖を除去することによって、いわゆる非グリコシル化抗体を生成することである。非グリコシル化抗体は、例えば、その糖が付着している残基を除去するか、もしくは変更することによってか、酵素的にその糖を除去することによってか、グリコシル化阻害剤の存在下で培養された細胞中に抗体を産生することによってか、あるいはタンパク質をグリコシル化できない細胞（例えば、細菌性宿主細胞）中で抗体を発現することによって、生成することができる。別のアプローチは、ＩｇＧ１の代わりにＩｇＧ４抗体からのＦｃ領域を利用することである。ＩｇＧ４抗体が、ＩｇＧ１よりも低いレベルの補体活性化および抗体依存性細胞毒性を有することによって特徴付けられることは、公知である。
【０００６】
これらの代替アプローチの利点にもかかわらず、抗体のＦｃ領域からのオリゴ糖の除去は、その構造および安定性において顕著な悪影響を及ぼすことが、現在、十分に確立されている。さらに、ＩｇＧ４のＣＨ３ドメインが、ＩｇＧ１のＣＨ３ドメインに対して同程度の安定性を欠いているため、ＩｇＧ４抗体は、一般的に、より低い安定性を有する。いかなる場合でも、抗体安定性の損失または低下は、抗体薬物の開発に悪影響を及ぼすプロセス開発課題を提示し得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、変更された、もしくは低下したエフェクタ機能、および改善された安定性を有する、改善された抗体および他のＦｃ含有ポリペプチド、ならびにこれらの分子を作製する方法の必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の概要）
本発明は、Ｆｃ領域の安定性を強化するための改善された方法を提供することによって、先行技術の「エフェクタ無し」抗体の問題、実に、いかなる「エフェクタ無し」Ｆｃ
含有抗体の問題をも解決する。例えば、本発明は、安定性を操作したＦｃポリペプチド、例えば、安定化ＩｇＧ抗体または他のＦｃ含有結合分子を提供し、これは、ポリペプチドのＦｃ領域内における、安定化アミノ酸を含む。一実施形態においては、本発明は、Ｆｃ領域の向上した安定性をもたらす親ＦｃポリペプチドのＦｃ領域内における、特定のアミノ酸残基位置で、変異体を導入するための方法を提供する。好ましくは、該安定化Ｆｃポリペプチドは、（１つまたは複数の安定化アミノ酸を含まないポリペプチドと比較して）変化した、あるいは低下したエフェクタ機能を有し、親Ｆｃポリペプチドと比較して、強化された安定性を示す。
【０００９】
したがって、本発明は、限定されないが、以下を含む、いくつかの利点を有する：
−そのエフェクタ機能の低下により治療法として適している、安定化非グリコシル化Ｆｃ領域を含む安定化非グリコシル化Ｆｃポリペプチド、例えば、安定化融合タンパク質または非グリコシル化ＩｇＧ抗体を提供すること、
−そのエフェクタ機能の低下により治療法として適している、ＩｇＧ４抗体に由来するＦｃ領域を含む安定化Ｆｃポリペプチド、例えば、安定化グリコシル化もしくは非グリコシル化融合タンパク質、またはＩｇＧ４抗体を提供すること、
−（例えば、安定化親ポリペプチドへの変化を導入することによって、または安定化Ｆｃポリペプチドをコードする核酸分子を発現することによって）、ポリペプチドに対する変化を最小限にして、安定化Ｆｃポリペプチドを産生する効率的な方法、
−免疫原性および／またはエフェクタ機能のいかなる増加を避けながら、Ｆｃポリペプチドの安定性を強化する方法、
−Ｆｃポリペプチドの拡張性、製造、および／または長期安定性を強化する方法、
−本発明の安定化Ｆｃポリペプチドを用いた治療を必要とする対象を治療するための方法。
【００１０】
一態様においては、本発明は、キメラＦｃ領域を含む安定化ポリペプチドに関連し、該安定化ポリペプチドは、ヒトＩｇＧ４抗体に由来する少なくとも１つの定常ドメインおよびヒトＩｇＧ１抗体に由来する少なくとも１つの定常ドメインを含む。
【００１１】
一実施形態においては、該Ｆｃ領域は、グリコシル化されたＦｃ領域である。
【００１２】
一実施形態においては、該Ｆｃ領域は、非グリコシル化Ｆｃ領域である。
【００１３】
一実施形態においては、該Ｆｃ領域は、Ｆｃ領域の位置２９７（ＥＵ付番慣例）にグルタミン（Ｑ）、または位置２９９にアラニン（Ａ）を含む、非グリコシル化Ｆｃ領域である。
【００１４】
別の態様においては、本発明は、非グリコシル化Ｆｃ領域を含む安定化ポリペプチドに関連し、該安定化ポリペプチドは、該Ｆｃ領域の少なくとも１つのＦｃ部分において、１つまたはそれ以上のアミノ酸位置に、１つまたはそれ以上の安定化Ｆｃアミノ酸を含み、該アミノ酸位置は、２９７、２９９、３０７、３０９、３９９、４０９、および４２７（ＥＵ付番慣例）からなる群から選択される。
【００１５】
一実施形態においては、該キメラＦｃ領域は、該ＩｇＧ４イソタイプのＩｇＧ抗体からのＣＨ２ドメインおよび該ＩｇＧ１イソタイプのＩｇＧ抗体からのＣＨ３ドメインを含む。
【００１６】
一実施形態においては、該キメラＦｃ領域は、ヒンジと、該ＩｇＧ４イソタイプのＩｇＧ抗体からのＣＨ１およびＣＨ２ドメインと、該ＩｇＧ１イソタイプのＩｇＧ抗体からのＣＨ３ドメインとを含み、該抗体は、ＥＵ付番のアミノ酸位置２２８にプロリンを含む。
【００１７】
別の態様においては、本発明は、ＩｇＧ４抗体のＦｃ領域からのＣＨ２部分を含む安定化ポリペプチドに関連し、該安定化ポリペプチドは、２４０Ｆ、２６２Ｌ、２６４Ｔ、２６６Ｆ、２９７Ｑ、２９９Ａ、２９９Ｋ、３０７Ｐ、３０９Ｋ、３０９Ｍ、３０９Ｐ、３２３Ｆ、３９９Ｓ、および４２７Ｆ（ＥＵ付番慣例）からなる群から選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸位置に、１つまたはそれ以上の安定化アミノ酸を含む。
【００１８】
一実施形態においては、安定化ポリペプチドは、アミノ酸位置２９７にＧｌｎを含む。
【００１９】
一態様においては、本発明は、ＩｇＧ１抗体のＦｃ領域からのＣＨ２部分を含む、安定化ポリペプチドに関連し、該安定化ポリペプチドは、２９９Ｋおよび２９７Ｄ（ＥＵ付番慣例）からなる群から選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸位置に、１つまたはそれ以上の安定化アミノ酸を含む。
【００２０】
一実施形態においては、本発明の安定化ポリペプチドは、アミノ酸位置２９９にＬｙｓを含む。
【００２１】
別の実施形態においては、本発明の安定化ポリペプチドは、アミノ酸位置２９９にＬｙｓ、およびアミノ酸位置２９７にＡｓｐを含む。
【００２２】
一実施形態においては、該Ｆｃ領域は、非グリコシル化Ｆｃ領域である。
【００２３】
一実施形態においては、ＩｇＧ抗体は、ヒト抗体である。
【００２４】
一実施形態においては、安定化ポリペプチドの融解温度（Ｔｍ）は、安定化アミノ酸を欠失する親ポリペプチドと比較して、少なくとも１℃向上される。
【００２５】
一実施形態においては、該安定化Ｆｃポリペプチドの融解温度（Ｔｍ）は、約１℃以上、約２℃以上、約３℃以上、約４℃以上、約５℃以上、約６℃以上、約７℃以上、約８℃以上、約９℃以上、約１０℃以上、約１５℃以上、および約２０℃以上向上される。
【００２６】
一実施形態においては、該融解温度（Ｔｍ）は、中性ｐＨ（約６．５〜約７．５）で向上される。
【００２７】
別の実施形態においては、該融解温度（Ｔｍ）は、約６．５以下、約６．０以下、約５．５以下、約５．０以下、約４．５以下、約４．０以下の酸性ｐＨで向上される。
【００２８】
一実施形態においては、該安定化ポリペプチドは、安定化変異を欠く親ポリペプチドと比較して、高収率で発現する。
【００２９】
別の実施形態においては、該安定化Ｆｃポリペプチドは、約５ｍｇ／Ｌ以上、約１０ｍｇ／Ｌ以上、約１５ｍｇ／Ｌ以上、約２０ｍｇ／Ｌ以上の収率で、細胞培養において発現する。
【００３０】
一実施形態においては、該安定化ポリペプチドの濁度は、該安定化アミノ酸を欠く親ポリペプチドと比較して低下する。
【００３１】
別の実施形態においては、該濁度は、約１倍以上、約２倍以上、約３倍以上、約４倍以上、約５倍以上、約６倍以上、約７倍以上、約８倍以上、約９倍以上、約１０倍以上、約１５倍以上、約５０倍以上、および約１００倍以上からなる群から選択される倍数で低下する。
【００３２】
別の実施形態においては、該安定化ポリペプチドは、該安定化変異を欠く親Ｆｃポリペプチドと比較して、低下したエフェクタ機能を有する。
【００３３】
一実施形態においては、該低下したエフェクタ機能は、低下したＡＤＣＣ活性である。
【００３４】
別の実施形態においては、該低下したエフェクタ機能は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩからなる群から選択されるＦｃ受容体（ＦｃＲ）への低下した結合である。
【００３５】
一実施形態においては、該エフェクタ機能は、約１倍以上、約２倍以上、約３倍以上、約４倍以上、約５倍以上、約６倍以上、約７倍以上、約８倍以上、約９倍以上、約１０倍以上、約１５倍以上、約５０倍以上、および約１００倍以上からなる群から選択される倍数で低下する。
【００３６】
一実施形態においては、該安定化ポリペプチドは、親Ｆｃポリペプチドと比較して、向上した半減期を有する。
【００３７】
別の実施形態においては、該向上した半減期は、新生児受容体（ＦｃＲｎ）への結合の向上によるものである。
【００３８】
一実施形態においては、該半減期は、約１倍以上、約２倍以上、約３倍以上、約４倍以上、約５倍以上、約６倍以上、約７倍以上、約８倍以上、約９倍以上、約１０倍以上、約１５倍以上、約５０倍以上、および約１００倍以上からなる群から選択される倍数で向上する。
【００３９】
一実施形態においては、該Ｆｃ領域は、二量体Ｆｃ領域である。
【００４０】
別の実施形態においては、該Ｆｃ領域は、一本鎖Ｆｃ領域である。
【００４１】
一実施形態においては、該Ｆｃ領域の全てのＦｃ部分が、非グリコシル化である。
【００４２】
一実施形態においては、該非グリコシル化Ｆｃ領域は、該Ｆｃ領域の位置２９９（ＥＵ付番慣例）に置換を含む。
【００４３】
別の実施形態においては、該非グリコシル化Ｆｃ領域は、細菌性宿主細胞におけるその産生の結果として、非グリコシル化となる。一実施形態においては、該非グリコシル化Ｆｃ領域は、化学的または酵素的手段による脱グリコシル化の結果として、非グリコシル化となる。一実施形態においては、該非グリコシル化Ｆｃ領域は、キメラヒンジドメインを含む。
【００４４】
一実施形態においては、該キメラヒンジドメインは、アミノ酸位置２２８（ＥＵ付番慣例）の、プロリン残基による置換を含む。
【００４５】
一実施形態においては、該安定化アミノ酸は、独立して、（ｉ）位置２９７の非荷電アミノ酸、ｉｉ）位置２９９の正電荷を持つアミノ酸、（ｉｉｉ）位置３０７の極性のアミノ酸、（ｉｖ）位置３０９の正電荷を持つもしくは極性のアミノ酸、（ｖ）位置３９９の極性のアミノ酸、（ｖｉ）位置４０９の正電荷を持つもしくは極性のアミノ酸、および（ｖｉｉ）位置４２７の極性のアミノ酸からなる群から選択される。
【００４６】
一実施形態においては、少なくとも１つの安定化アミノ酸は、アミノ酸位置２９７（ＥＵ付番）のＧｌｎである。
【００４７】
一実施形態においては、該安定化アミノ酸のうちの少なくとも１つは、位置２９９のリシン（Ｋ）またはチロシン（Ｙ）である。
【００４８】
一実施形態においては、該安定化アミノ酸のうちの少なくとも１つは、位置３０７のプロリン（Ｐ）またはメチオニン（Ｍ）である。
【００４９】
一実施形態においては、該安定化アミノ酸のうちの少なくとも１つは、位置３０９のプロリン（Ｐ）、メチオニン（Ｍ）、またはリシン（Ｋ）である。
【００５０】
一実施形態においては、該安定化変異のうちの少なくとも１つは、位置３９９のセリン（Ｓ）である。
【００５１】
一実施形態においては、該安定化変異のうちの少なくとも１つは、位置２４０のフェニルアラニン（Ｆ）である。
【００５２】
一実施形態においては、該安定化変異のうちの少なくとも１つは、位置２６２のロイシン（Ｌ）である。
【００５３】
一実施形態においては、該安定化変異のうちの少なくとも１つは、位置２６４のトレオニン（Ｔ）である。
【００５４】
一実施形態においては、該安定化変異のうちの少なくとも１つは、位置２６６のフェニルアラニン（Ｆ）である。
【００５５】
一実施形態においては、該安定化変異のうちの少なくとも１つは、位置３２３のフェニルアラニン（Ｆ）である。
【００５６】
一実施形態においては、該安定化変異のうちの少なくとも１つは、位置４０９のリシン（Ｋ）またはメチオニン（Ｍ）である。
【００５７】
一実施形態においては、該安定化変異のうちの少なくとも１つは、位置４２７のフェニルアラニン（Ｆ）である。
【００５８】
一実施形態においては、本発明の安定化ポリペプチドは、（ｉ）位置２９９にアラニン（Ａ）またはリシン（Ｋ）、および（ｉｉ）位置２６６にフェニルアラニン（Ｆ）を含む、２つまたはそれ以上の安定化変異を含む。
【００５９】
一実施形態においては、本発明の安定化ポリペプチドは、（ｉ）位置２９９にアラニン（Ａ）またはリシン（Ｋ）、および（ｉｉ）位置３０７にプロリン（Ｐ）を含む、２つまたはそれ以上の安定化変異を含む。
【００６０】
一実施形態においては、本発明の安定化ポリペプチドは、（ｉ）位置２９９にリシン（Ｋ）、および（ｉｉ）位置３９９にセリン（Ｓ）を含む、２つまたはそれ以上の安定化変異を含む。
【００６１】
一実施形態においては、本発明の安定化ポリペプチドは、（ｉ）位置２９９にリシン（Ｋ）、および（ｉｉ）位置４２７にフェニルアラニン（Ｆ）を含む、２つまたはそれ以上の安定化変異を含む。
【００６２】
一実施形態においては、本発明の安定化ポリペプチドは、（ｉ）位置２９９にアラニン（Ａ）またはリシン（Ｋ）、（ｉｉ）位置２６２にロイシン（Ｌ）、および（ｉｉｉ）位置２６４にトレオニン（Ｔ）を含む、３つまたはそれ以上の安定化変異を含む。
【００６３】
一実施形態においては、本発明の安定化ポリペプチドは、（ｉ）位置２９９にリシン（Ｋ）、（ｉｉ）位置３０７にプロリン（Ｐ）、および（ｉｉｉ）位置３９９にセリン（Ｓ）を含む、３つまたはそれ以上の安定化変異を含む。
【００６４】
一実施形態においては、本発明の安定化ポリペプチドは、（ｉ）位置２９９にリシン（Ｋ）、（ｉｉ）位置３０９にリシン（Ｋ）、および（ｉｉｉ）位置３９９にセリン（Ｓ）を含む、３つまたはそれ以上の安定化変異を含む。
【００６５】
一実施形態においては、本発明の安定化ポリペプチドは、（ｉ）位置２９９にリシン（Ｋ）、（ｉｉ）位置３４８にフェニルアラニン（Ｆ）、および（ｉｉｉ）位置４２７にフェニルアラニン（Ｆ）を含む、３つまたはそれ以上の安定化変異を含む。
【００６６】
一実施形態においては、本発明の安定化ポリペプチドは、（ｉ）位置２９９にリシン（Ｋ）、（ｉｉ）位置３９９にセリン（Ｓ）、および（ｉｉｉ）位置４２７にフェニルアラニン（Ｆ）を含む、３つまたはそれ以上の安定化変異を含む。
【００６７】
一実施形態においては、本発明の安定化ポリペプチドは、（ｉ）位置２９９にアラニン（Ａ）またはリシン（Ｋ）、（ｉｉ）位置２６２にロイシン（Ｌ）、（ｉｉｉ）位置２６４にトレオニン（Ｔ）、および（ｉｖ）位置２６６にフェニルアラニン（Ｆ）を含む、４つまたはそれ以上の安定化変異を含む。
【００６８】
一実施形態においては、本発明の安定化ポリペプチドは、（ｉ）位置３０７にプロリン（Ｐ）、および（ｉｉ）位置２７６にセリン（Ｓ）を含む、２つまたはそれ以上の安定化変異を含む。
【００６９】
一実施形態においては、本発明の安定化ポリペプチドは、（ｉ）位置３０７にプロリン（Ｐ）、および（ｉｉ）位置２８６にトレオニン（Ｔ）を含む、２つまたはそれ以上の安定化変異を含む。
【００７０】
一実施形態においては、本発明の安定化ポリペプチドは、（ｉ）位置３０７にプロリン（Ｐ）、および（ｉｉ）位置３２３にフェニルアラニン（Ｆ）を含む、２つまたはそれ以上の安定化変異を含む。
【００７１】
一実施形態においては、本発明の安定化ポリペプチドは、（ｉ）位置３０７にプロリン（Ｐ）、および（ｉｉ）位置３０９にプロリン（Ｐ）、リシン（Ｋ）、またはメチオニン（Ｍ）を含む、２つまたはそれ以上の安定化変異を含む。
【００７２】
一実施形態においては、本発明の安定化ポリペプチドは、（ｉ）位置３０７にプロリン（Ｐ）、および（ｉｉ）位置３９９にセリン（Ｓ）を含む、２つまたはそれ以上の安定化変異を含む。
【００７３】
一実施形態においては、本発明の安定化ポリペプチドは、（ｉ）位置３０７にプロリン（Ｐ）、および（ｉｉ）位置４２７にフェニルアラニン（Ｆ）を含む、２つまたはそれ以上の安定化変異を含む。
【００７４】
一実施形態においては、本発明の安定化ポリペプチドは、（ｉ）位置３０７にプロリン（Ｐ）、（ｉｉ）位置２７６にセリン（Ｓ）、および（ｉｉｉ）位置２８６にトレオニン（Ｔ）を含む、３つまたはそれ以上の安定化変異を含む。
【００７５】
一実施形態においては、本発明の安定化ポリペプチドは、（ｉ）位置３０７にプロリン（Ｐ）、（ｉｉ）位置３０９にプロリン（Ｐ）、リシン（Ｋ）、またはメチオニン（Ｍ）、および（ｉｉｉ）位置３９９にセリン（Ｓ）を含む、３つまたはそれ以上の安定化変異を含む。
【００７６】
一実施形態においては、本発明の安定化ポリペプチドは、（ｉ）位置３０７にプロリン（Ｐ）、（ｉｉ）位置３９９にセリン（Ｓ）、および（ｉｉｉ）位置４２７にフェニルアラニン（Ｆ）を含む、３つまたはそれ以上の安定化変異を含む。
【００７７】
一実施形態においては、本発明の安定化ポリペプチドは、（ｉ）位置３０９にプロリン（Ｐ）、リシン（Ｋ）、またはメチオニン（Ｍ）、および（ｉｉ）位置３０８にイソロイシン（Ｉ）を含む、３つまたはそれ以上の安定化変異を含む。
【００７８】
一実施形態においては、本発明の安定化ポリペプチドは、（ｉ）位置３０９にプロリン（Ｐ）、リシン（Ｋ）、またはメチオニン（Ｍ）、および（ｉｉ）位置３９９にセリン（Ｓ）を含む、２つまたはそれ以上の安定化変異を含む。
【００７９】
一実施形態においては、該Ｆｃ領域は、結合部位と機能的に結合する。
【００８０】
一実施形態においては、該結合部位は、抗原結合部位、受容体のリガンド結合部分、またはリガンドの受容体結合部分から選択される。
【００８１】
一実施形態においては、該結合部位は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ミニボディ、ジアボディ、トリアボディ、ナノボディ、カメリド抗体、およびＤａｂからなる群から選択される修飾抗体に由来する。
【００８２】
一実施形態においては、該安定化ポリペプチドは、安定化完全長抗体である。
【００８３】
一実施形態においては、該抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、およびヒト化抗体からなる群から選択される。
【００８４】
一実施形態においては、少なくとも１つの結合部位は、リツキシマブ、ダクリズマブ、ガリキシマブ、ＣＢ６、Ｌｉ３３、５ｃ８、ＣＢＥ１１、ＢＤＡ８、１４Ａ２、Ｂ３Ｆ６、２Ｂ８、Ｌｙｍ１、Ｌｙｍ２、ＬＬ２、Ｈｅｒ２、５Ｅ８、Ｂ１、ＭＢ１、ＢＨ３、Ｂ４、Ｂ７２．３、ＣＣ４９、および５Ｅ１０からなる群から選択される抗体からの６つのＣＤＲ、可変重および可変軽領域、または抗原結合部位を含む。
【００８５】
一実施形態においては、該安定化完全長抗体は、従来の、または安定化ｓｃＦｖ分子に融合される。
【００８６】
一実施形態においては、該安定化ポリペプチドは、安定化イムノアドヘシンである。
【００８７】
一実施形態においては、結合部位は、該安定化ポリペプチドの該Ｆｃ領域の表面上に重ねられる。
【００８８】
一実施形態においては、該結合部位は、非免疫グロブリン結合分子に由来する。
【００８９】
一実施形態においては、非免疫グロブリン結合分子は、アドネクチン、アフィボディ、ＤＡＲＰｉｎ、およびアンチカリンからなる群から選択される。
【００９０】
一実施形態においては、受容体の該リガンド結合部分は、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーの受容体、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーの受容体、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）スーパーファミリーの受容体、チロシンキナーゼ（ＴＫ）受容体スーパーファミリーの受容体、リガンド依存性（ＬＧ）スーパーファミリーの受容体、ケモカイン受容体スーパーファミリーの受容体、ＩＬ−１／トール様受容体（ＴＬＲ）スーパーファミリー、グリアのグリア由来の神経栄養因子（ＧＤＮＦ）受容体ファミリーの受容体、およびサイトカイン受容体スーパーファミリーからなる群から選択される受容体に由来する。
【００９１】
一実施形態においては、リガンドの該受容体結合部分は、阻害性リガンドに由来する。
【００９２】
一実施形態においては、リガンドの該受容体結合部分は、活性化リガンドに由来する。
【００９３】
一実施形態においては、該リガンドは、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーの受容体、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーの受容体、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）スーパーファミリーの受容体、チロシンキナーゼ（ＴＫ）受容体スーパーファミリーの受容体、リガンド依存性（ＬＧ）スーパーファミリーの受容体、ケモカイン受容体スーパーファミリーの受容体、ＩＬ−１／トール様受容体（ＴＬＲ）スーパーファミリー、およびサイトカイン受容体スーパーファミリーからなる群から選択される受容体に結合する。
【００９４】
一実施形態においては、本発明は、本発明の安定化ポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む組成物に関する。
【００９５】
一態様においては、本発明は、非グリコシル化の、キメラＦｃ領域、もしくはその一部を含む親Ｆｃポリペプチドを安定化するための方法に関連し、該方法は、該Ｆｃ領域の少なくとも１つのＦｃ部分における選ばれたアミノ酸を、安定化アミノ酸で置換し、該出発ポリペプチドと比較して、向上した安定性を有する安定化Ｆｃポリペプチドを産生することを含み、該置換は、２９７、２９９、３０７、３０９、３９９、４０９、および４２７（ＥＵ付番慣例）からなる群から選択される該Ｆｃ部分のアミノ酸位置でなされる。
【００９６】
一実施形態においては、該キメラＦｃ領域は、該ＩｇＧ４イソタイプのＩｇＧ抗体からのＣＨ２ドメインと、該ＩｇＧ１イソタイプのＩｇＧ抗体からのＣＨ３ドメインとを含む。
【００９７】
一実施形態においては、安定化Ｆｃポリペプチドに存在するアミノ酸位置およびアミノ酸は、２９７Ｑ、２９９Ａ、２９９Ｋ、３０７Ｐ、３０９Ｋ、３０９Ｍ、３０９Ｐ、３２３Ｆ、３９９Ｅ、３９９Ｓ、４０９Ｋ、４０９Ｍ、および４２７Ｆからなる群から選択される。一実施形態においては、該安定化Ｆｃポリペプチドは、位置２９７（ＥＵ付番）にＧｌｎを含む。
【００９８】
別の態様においては、本発明は、Ｆｃ領域またはその一部を含む親Ｆｃポリペプチドの収率を向上させるための方法に関連し、該方法は、該Ｆｃ領域の少なくとも１つのＦｃ部分における、選ばれたアミノ酸を１つまたはそれ以上の安定化アミノ酸で置換し、該親ポリペプチドと比較して、収率を向上させる、安定化Ｆｃポリペプチドを産生することを含み、該安定化アミノ酸は、独立して、２４０Ｆ、２６２Ｌ、２６４Ｔ、２６６Ｆ、２９９Ｋ、３０７Ｐ、３０９Ｋ、３０９Ｍ、３０９Ｐ、３２３Ｆ、３９９Ｓ、および４２７Ｆ（ＥＵ付番慣例）からなる群から選択される。
【００９９】
一実施形態においては、該出発Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域である。
【０１００】
一実施形態においては、本発明の安定化ポリペプチドの出発Ｆｃ領域は、ＩｇＧ４  Ｆｃ領域である。
【０１０１】
一実施形態においては、該出発Ｆｃ領域は、非グリコシル化ＩｇＧ１  Ｆｃ領域である。
【０１０２】
別の実施形態においては、該出発Ｆｃ領域は、非グリコシル化ＩｇＧ４  Ｆｃ領域である。
【０１０３】
一実施形態においては、該安定化Ｆｃポリペプチドは、２つまたはそれ以上の安定化アミノ酸を含む。一実施形態においては、該安定化Ｆｃポリペプチドは、３つまたはそれ以上の安定化アミノ酸を含む。
【０１０４】
別の態様においては、本発明は、前述の請求項のいずれか１項に記載の安定化結合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子に関する。
【０１０５】
一実施形態においては、該核酸分子は、安定化結合ポリペプチドのポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１０６】
一実施形態においては、本発明は、安定化結合ポリペプチドまたはそのポリペプチド鎖をコードする核酸分子を含むベクターに関する。
【０１０７】
一実施形態においては、本発明は、ベクターを発現する宿主細胞に関連する。
【０１０８】
一実施形態においては、本発明は、該安定化Ｆｃポリペプチドが産生されるように、培養培地において宿主細胞を培養することを含む本発明の安定化Ｆｃポリペプチドを産生する方法に関連する。
【０１０９】
一態様においては、本発明は、安定化Ｆｃ領域を含むポリペプチドの大規模な製造のための方法に関連し、該方法は、
（ｄ）ポリペプチドへの少なくとも１つの安定化Ｆｃ部分を遺伝的に融合し、安定化融合タンパク質を形成することと、
（ｅ）該安定化融合タンパク質をコードする核酸分子により哺乳類宿主細胞をトランスフェクトすることと、
（ｆ）該安定化融合タンパク質が発現されるような条件下で、１０Ｌ以上の培養培地において、ステップ（ｆ）の該宿主細胞を培養し、
それによって、安定化融合タンパク質を産生することと、を含む。
【０１１０】
一実施形態においては、該安定化Ｆｃ領域は、該ＩｇＧ４イソタイプのＩｇＧ抗体からのＣＨ２ドメインおよび該ＩｇＧ１イソタイプのＩｇＧ抗体からのＣＨ３ドメインを含むキメラＦｃである。
【０１１１】
一実施形態においては、該安定化Ｆｃ領域は、アミノ酸位置２９７（ＥＵ付番）にＧｌｎを含む。
【０１１２】
一実施形態においては、本発明は、対象における疾患または障害を治療または予防するための方法に関連し、これは、該疾患または障害を患う対象に、本発明の結合分子またはかかる結合分子を含む組成物を含み、それによって、疾患または障害を治療または予防すること、を含む。
【０１１３】
一実施形態においては、該疾患または障害は、炎症性障害、神経系障害、自己免疫疾患障害、および腫瘍性障害からなる群から選択される。
【０１１４】
本発明の他の特性および利点は、以下の詳細な説明および請求項により明白であろう。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】典型的な抗原結合ポリペプチド（ＩｇＧ抗体）の構造、ならびに抗体の抗原結合およびエフェクタ機能（例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合）の機能的特性を示す。また、いかに抗体のＣＨ２ドメインにおける糖（グリコシル化）の存在がエフェクタ機能（ＦｃＲ結合）を変化させるが、抗原結合に影響を及ぼさないことも示す。
【図２Ａ】ＩｇＧ１のＸ線結晶構造からの２つの相互作用するＣＨ３ドメイン（パネルＡ）を示す（ｐｄｂコード１ｈｚｈ）。ＩｇＧ１残基Ｋ４０９およびＤ３９９をハイライト表示する。パネル２Ｂは、構造ベースのＨＭＭを用いて、ヒトＩｇＧ１／カッパ定常ドメイン配列のアラインメントを示す（Ｗａｎｇ，Ｎ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｗ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｂ．，Ａｉｖａｚｉａｎ，Ｄ．，Ｌｕｇｏｖｓｋｏｙ，Ａ．，Ｒｅｆｆ，Ｍ．，Ｇｌａｓｅｒ，Ｓ．，Ｃｒｏｎｅｒ，Ｌ．，Ｄｅｍａｒｅｓｔ，Ｓ．（２００８）Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ．Ｉｎ  Ｐｒｅｓｓ．）。ドメイン間の相互作用に関与するＣＬ、ＣＨ１、およびＣＨ３の残基位置、ならびに炭水化物と直接接触するアミノ酸と共に強く共変するアミノ酸位置を灰色でハイライト表示する。カバットおよびＥＵ番号をアラインメントの下に提供する。パネル２Ｃは、ＩｇＧ１−ＣＨ２ドメインの構造のリボンダイアグラムを示す（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ，２０００）。Ｎ結合型炭水化物によって埋もれたバリン残基およびＣＲ２ドメイン内の特有の６つのアミノ酸ループにラベルを付す。パネル２Ｄは、天然ＩｇＧ１−ＣＨ２配列および完全に修飾されたＩｇＧ１−ＣＨ２配列のアラインメントを示す。修飾された残基位置を黒色で示す。修飾された位置のＥＵ番号をアラインメントの上に示す。
【図２Ｂ】ＩｇＧ１のＸ線結晶構造からの２つの相互作用するＣＨ３ドメイン（パネルＡ）を示す（ｐｄｂコード１ｈｚｈ）。ＩｇＧ１残基Ｋ４０９およびＤ３９９をハイライト表示する。パネル２Ｂは、構造ベースのＨＭＭを用いて、ヒトＩｇＧ１／カッパ定常ドメイン配列のアラインメントを示す（Ｗａｎｇ，Ｎ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｗ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｂ．，Ａｉｖａｚｉａｎ，Ｄ．，Ｌｕｇｏｖｓｋｏｙ，Ａ．，Ｒｅｆｆ，Ｍ．，Ｇｌａｓｅｒ，Ｓ．，Ｃｒｏｎｅｒ，Ｌ．，Ｄｅｍａｒｅｓｔ，Ｓ．（２００８）Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ．Ｉｎ  Ｐｒｅｓｓ．）。ドメイン間の相互作用に関与するＣＬ、ＣＨ１、およびＣＨ３の残基位置、ならびに炭水化物と直接接触するアミノ酸と共に強く共変するアミノ酸位置を灰色でハイライト表示する。カバットおよびＥＵ番号をアラインメントの下に提供する。パネル２Ｃは、ＩｇＧ１−ＣＨ２ドメインの構造のリボンダイアグラムを示す（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ，２０００）。Ｎ結合型炭水化物によって埋もれたバリン残基およびＣＲ２ドメイン内の特有の６つのアミノ酸ループにラベルを付す。パネル２Ｄは、天然ＩｇＧ１−ＣＨ２配列および完全に修飾されたＩｇＧ１−ＣＨ２配列のアラインメントを示す。修飾された残基位置を黒色で示す。修飾された位置のＥＵ番号をアラインメントの上に示す。
【図２Ｃ】ＩｇＧ１のＸ線結晶構造からの２つの相互作用するＣＨ３ドメイン（パネルＡ）を示す（ｐｄｂコード１ｈｚｈ）。ＩｇＧ１残基Ｋ４０９およびＤ３９９をハイライト表示する。パネル２Ｂは、構造ベースのＨＭＭを用いて、ヒトＩｇＧ１／カッパ定常ドメイン配列のアラインメントを示す（Ｗａｎｇ，Ｎ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｗ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｂ．，Ａｉｖａｚｉａｎ，Ｄ．，Ｌｕｇｏｖｓｋｏｙ，Ａ．，Ｒｅｆｆ，Ｍ．，Ｇｌａｓｅｒ，Ｓ．，Ｃｒｏｎｅｒ，Ｌ．，Ｄｅｍａｒｅｓｔ，Ｓ．（２００８）Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ．Ｉｎ  Ｐｒｅｓｓ．）。ドメイン間の相互作用に関与するＣＬ、ＣＨ１、およびＣＨ３の残基位置、ならびに炭水化物と直接接触するアミノ酸と共に強く共変するアミノ酸位置を灰色でハイライト表示する。カバットおよびＥＵ番号をアラインメントの下に提供する。パネル２Ｃは、ＩｇＧ１−ＣＨ２ドメインの構造のリボンダイアグラムを示す（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ，２０００）。Ｎ結合型炭水化物によって埋もれたバリン残基およびＣＲ２ドメイン内の特有の６つのアミノ酸ループにラベルを付す。パネル２Ｄは、天然ＩｇＧ１−ＣＨ２配列および完全に修飾されたＩｇＧ１−ＣＨ２配列のアラインメントを示す。修飾された残基位置を黒色で示す。修飾された位置のＥＵ番号をアラインメントの上に示す。
【図２Ｄ】ＩｇＧ１のＸ線結晶構造からの２つの相互作用するＣＨ３ドメイン（パネルＡ）を示す（ｐｄｂコード１ｈｚｈ）。ＩｇＧ１残基Ｋ４０９およびＤ３９９をハイライト表示する。パネル２Ｂは、構造ベースのＨＭＭを用いて、ヒトＩｇＧ１／カッパ定常ドメイン配列のアラインメントを示す（Ｗａｎｇ，Ｎ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｗ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｂ．，Ａｉｖａｚｉａｎ，Ｄ．，Ｌｕｇｏｖｓｋｏｙ，Ａ．，Ｒｅｆｆ，Ｍ．，Ｇｌａｓｅｒ，Ｓ．，Ｃｒｏｎｅｒ，Ｌ．，Ｄｅｍａｒｅｓｔ，Ｓ．（２００８）Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ．Ｉｎ  Ｐｒｅｓｓ．）。ドメイン間の相互作用に関与するＣＬ、ＣＨ１、およびＣＨ３の残基位置、ならびに炭水化物と直接接触するアミノ酸と共に強く共変するアミノ酸位置を灰色でハイライト表示する。カバットおよびＥＵ番号をアラインメントの下に提供する。パネル２Ｃは、ＩｇＧ１−ＣＨ２ドメインの構造のリボンダイアグラムを示す（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ，２０００）。Ｎ結合型炭水化物によって埋もれたバリン残基およびＣＲ２ドメイン内の特有の６つのアミノ酸ループにラベルを付す。パネル２Ｄは、天然ＩｇＧ１−ＣＨ２配列および完全に修飾されたＩｇＧ１−ＣＨ２配列のアラインメントを示す。修飾された残基位置を黒色で示す。修飾された位置のＥＵ番号をアラインメントの上に示す。
【図３Ａ】撹拌後の本発明の例示的なＩｇＧ  Ｆｃ構造体の濁度（パネルＡ）およびモノマー含量％（パネルＢ）を示す。
【図３Ｂ】撹拌後の本発明の例示的なＩｇＧ  Ｆｃ構造体の濁度（パネルＡ）およびモノマー含量％（パネルＢ）を示す。
【図４】低ｐＨ維持（ｐＨ３．１）で、時間経過に伴うＩｇＧ  Ｆｃ構造体の相対ピーク高さを示す。
【図５】溶液親和性の表面プラズモン共鳴によって測定した、Ｆｃγ受容体への本発明の例示的なＩｇＧ１およびＩｇＧ４  Ｆｃ構造体の初期結合速度を示す。
【図６Ａ】ＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）（図６Ａ）およびＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩａ  Ｖ１５８）（図６Ｂ）への本発明の例示的なＩｇＧ１およびＩｇＧ４  Ｆｃ構造体の結合のＩＣ５０を計算するために使用された滴定曲線を示す。
【図６Ｂ】ＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）（図６Ａ）およびＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩａ  Ｖ１５８）（図６Ｂ）への本発明の例示的なＩｇＧ１およびＩｇＧ４  Ｆｃ構造体の結合のＩＣ５０を計算するために使用された滴定曲線を示す。
【図７Ａ】ＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）について、ＩｇＧ１  Ｔ２９９ＡおよびＩｇＧ１野生型と比較した、ＩｇＧ１  Ｔ２９９Ｋの結合（図７Ａ）、ならびにＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）について、Ｔ２９９Ａ変異を組み込む他の例示的なＩｇＧ４  Ｆｃ構造体およびＩｇＧ１野生型と比較した、Ｔ２９９Ｋ変異を組み込む例示的なＩｇＧ４  Ｆｃ構造体の結合（図７Ｂ）の低下をハイライト表示する滴定曲線を示す。
【図７Ｂ】ＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）について、ＩｇＧ１  Ｔ２９９ＡおよびＩｇＧ１野生型と比較した、ＩｇＧ１  Ｔ２９９Ｋの結合（図７Ａ）、ならびにＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）について、Ｔ２９９Ａ変異を組み込む他の例示的なＩｇＧ４  Ｆｃ構造体およびＩｇＧ１野生型と比較した、Ｔ２９９Ｋ変異を組み込む例示的なＩｇＧ４  Ｆｃ構造体の結合（図７Ｂ）の低下をハイライト表示する滴定曲線を示す。
【図８】ＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩａ  Ｖ１５８）について、Ｔ２９９Ａ変異を組みこむ他の例示的なＩｇＧ４  Ｆｃ構造体およびＩｇＧ１野生型と比較した、Ｔ２９９Ｋ変異を組み込む例示的なＩｇＧ４  Ｆｃ構造体の結合を示す。
【図９】補体Ｃ１ｑへの、本発明の例示的なＩｇＧ１およびＩｇＧ４  Ｆｃ構造体の結合を評価するために使用された滴定曲線を示す。
【図１０Ａ】パネルＡおよびＢは、それぞれ、ＣＤ６４およびＣＤ１６への、様々なＦｃ構造体の結合を評価するために使用された滴定曲線を示す。パネルＣは、Ｎ２９７Ｑ  ＩｇＧ４−ＣＨ２／ＩｇＧ１−ＣＨ３が、Ｔ２９９Ａ抗体（非グリコシル化ＩｇＧ１よりも若干短い）と同じ半減期を有することを示す。
【図１０Ｂ】パネルＡおよびＢは、それぞれ、ＣＤ６４およびＣＤ１６への、様々なＦｃ構造体の結合を評価するために使用された滴定曲線を示す。パネルＣは、Ｎ２９７Ｑ  ＩｇＧ４−ＣＨ２／ＩｇＧ１−ＣＨ３が、Ｔ２９９Ａ抗体（非グリコシル化ＩｇＧ１よりも若干短い）と同じ半減期を有することを示す。
【図１０Ｃ】パネルＡおよびＢは、それぞれ、ＣＤ６４およびＣＤ１６への、様々なＦｃ構造体の結合を評価するために使用された滴定曲線を示す。パネルＣは、Ｎ２９７Ｑ  ＩｇＧ４−ＣＨ２／ＩｇＧ１−ＣＨ３が、Ｔ２９９Ａ抗体（非グリコシル化ＩｇＧ１よりも若干短い）と同じ半減期を有することを示す。
【図１１Ａ】パネルＡは、ＣＤ６４への、Ｔ２９９Ｘ構造体の結合を評価するために使用された滴定曲線を示し、正電荷を持つ側鎖Ｔ２９９ＲおよびＴ２９９Ｋが、ＣＤ６４に対して低親和性を与えることを示す。パネルＢは、様々な代替的な構造体へのＣＤ６４の結合を評価するために使用された滴定曲線を示す。パネルＣおよびＤは、ＣＤ３２ａＲへの構造体の結合を評価するために使用された滴定曲線を示し、パネルＥおよびＦは、ＣＤ１６への構造体の結合を示す。パネルＧおよびＨは、Ｃ１ｑ  ＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図１１Ｂ】パネルＡは、ＣＤ６４への、Ｔ２９９Ｘ構造体の結合を評価するために使用された滴定曲線を示し、正電荷を持つ側鎖Ｔ２９９ＲおよびＴ２９９Ｋが、ＣＤ６４に対して低親和性を与えることを示す。パネルＢは、様々な代替的な構造体へのＣＤ６４の結合を評価するために使用された滴定曲線を示す。パネルＣおよびＤは、ＣＤ３２ａＲへの構造体の結合を評価するために使用された滴定曲線を示し、パネルＥおよびＦは、ＣＤ１６への構造体の結合を示す。パネルＧおよびＨは、Ｃ１ｑ  ＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図１１Ｃ】パネルＡは、ＣＤ６４への、Ｔ２９９Ｘ構造体の結合を評価するために使用された滴定曲線を示し、正電荷を持つ側鎖Ｔ２９９ＲおよびＴ２９９Ｋが、ＣＤ６４に対して低親和性を与えることを示す。パネルＢは、様々な代替的な構造体へのＣＤ６４の結合を評価するために使用された滴定曲線を示す。パネルＣおよびＤは、ＣＤ３２ａＲへの構造体の結合を評価するために使用された滴定曲線を示し、パネルＥおよびＦは、ＣＤ１６への構造体の結合を示す。パネルＧおよびＨは、Ｃ１ｑ  ＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図１１Ｄ】パネルＡは、ＣＤ６４への、Ｔ２９９Ｘ構造体の結合を評価するために使用された滴定曲線を示し、正電荷を持つ側鎖Ｔ２９９ＲおよびＴ２９９Ｋが、ＣＤ６４に対して低親和性を与えることを示す。パネルＢは、様々な代替的な構造体へのＣＤ６４の結合を評価するために使用された滴定曲線を示す。パネルＣおよびＤは、ＣＤ３２ａＲへの構造体の結合を評価するために使用された滴定曲線を示し、パネルＥおよびＦは、ＣＤ１６への構造体の結合を示す。パネルＧおよびＨは、Ｃ１ｑ  ＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図１１Ｅ】パネルＡは、ＣＤ６４への、Ｔ２９９Ｘ構造体の結合を評価するために使用された滴定曲線を示し、正電荷を持つ側鎖Ｔ２９９ＲおよびＴ２９９Ｋが、ＣＤ６４に対して低親和性を与えることを示す。パネルＢは、様々な代替的な構造体へのＣＤ６４の結合を評価するために使用された滴定曲線を示す。パネルＣおよびＤは、ＣＤ３２ａＲへの構造体の結合を評価するために使用された滴定曲線を示し、パネルＥおよびＦは、ＣＤ１６への構造体の結合を示す。パネルＧおよびＨは、Ｃ１ｑ  ＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図１１Ｆ】パネルＡは、ＣＤ６４への、Ｔ２９９Ｘ構造体の結合を評価するために使用された滴定曲線を示し、正電荷を持つ側鎖Ｔ２９９ＲおよびＴ２９９Ｋが、ＣＤ６４に対して低親和性を与えることを示す。パネルＢは、様々な代替的な構造体へのＣＤ６４の結合を評価するために使用された滴定曲線を示す。パネルＣおよびＤは、ＣＤ３２ａＲへの構造体の結合を評価するために使用された滴定曲線を示し、パネルＥおよびＦは、ＣＤ１６への構造体の結合を示す。パネルＧおよびＨは、Ｃ１ｑ  ＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図１１Ｇ】パネルＡは、ＣＤ６４への、Ｔ２９９Ｘ構造体の結合を評価するために使用された滴定曲線を示し、正電荷を持つ側鎖Ｔ２９９ＲおよびＴ２９９Ｋが、ＣＤ６４に対して低親和性を与えることを示す。パネルＢは、様々な代替的な構造体へのＣＤ６４の結合を評価するために使用された滴定曲線を示す。パネルＣおよびＤは、ＣＤ３２ａＲへの構造体の結合を評価するために使用された滴定曲線を示し、パネルＥおよびＦは、ＣＤ１６への構造体の結合を示す。パネルＧおよびＨは、Ｃ１ｑ  ＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図１１Ｈ】パネルＡは、ＣＤ６４への、Ｔ２９９Ｘ構造体の結合を評価するために使用された滴定曲線を示し、正電荷を持つ側鎖Ｔ２９９ＲおよびＴ２９９Ｋが、ＣＤ６４に対して低親和性を与えることを示す。パネルＢは、様々な代替的な構造体へのＣＤ６４の結合を評価するために使用された滴定曲線を示す。パネルＣおよびＤは、ＣＤ３２ａＲへの構造体の結合を評価するために使用された滴定曲線を示し、パネルＥおよびＦは、ＣＤ１６への構造体の結合を示す。パネルＧおよびＨは、Ｃ１ｑ  ＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図１２Ａ】パネルＡは、ＣＤ６４への構造体の結合を評価するために使用された滴定曲線を示し、パネルＢは、ＣＤ１６への構造体の結合を評価するために使用された滴定曲線を示す。
【図１２Ｂ】パネルＡは、ＣＤ６４への構造体の結合を評価するために使用された滴定曲線を示し、パネルＢは、ＣＤ１６への構造体の結合を評価するために使用された滴定曲線を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１１６】
ＦｃポリペプチドのＦｃ領域において、１つまたはそれ以上の安定化アミノ酸を含むことによって、低下したエフェクタ機能を有する安定化Ｆｃポリペプチド、例えば、非グリコシル化抗体またはＩｇＧ４抗体を産生するための方法が、開発されている。本方法は、特に、ポリペプチドに対してアミノ酸を最小限にのみ変化させる、真核細胞における治療のためのＦｃ含有ポリペプチドを産生するのに特に適している。本発明の方法は、それによって、免疫原性であり得るポリペプチドにアミノ酸配列を導入することを回避する。好ましくは、該安定化アミノ酸は、ポリペプチドのグリコシル化および／またはエフェクタ機能に影響を及ぼすことなく、ポリペプチドのＦｃ領域を安定化させ、ポリペプチドの他の所望の機能（例えば、抗原結合親和性または半減期）に大きな変化をもたらさない。
【０１１７】
本明細書および請求項の明確な理解を提供するために、以下の定義を、便宜上、提供する。
【０１１８】
定義
本明細書において使用される「エフェクタ機能」という用語は、タンパク質および／または免疫系の細胞に結合し、様々な生物学的効果を媒介する、Ｆｃ領域、またはその一部の機能的能力を指す。エフェクタ機能は、抗原依存性または抗原非依存性であり得る。エフェクタ機能の低下は、抗体（またはその断片）の可変領域の抗原結合活性を維持しながらの１つまたはそれ以上のエフェクタ機能の低下を示す。例えば、Ｆｃ受容体または補体タンパク質へのＦｃ結合のエフェクタ機能の増減は、倍率変化（例えば、１倍、２倍等による変化）を単位として表現することができ、例えば、当技術分野で周知のアッセイを使用して判定される結合活性の変化率（％）に基づいて計算することができる。
【０１１９】
本明細書において使用される「抗原依存性エフェクタ機能」という用語は、通常、対応する抗原への抗体の結合の後に誘導されるエフェクタ機能を指す。典型的な抗原依存性エフェクタ機能には、補体タンパク質（例えば、Ｃ１ｑ）に結合する能力が含まれる。例えば、Ｆｃ領域への補体のＣ１成分の結合は、古典的補体系を活性化することができ、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣＣ）と称されるプロセスである細胞病原体のオプソニン化および溶解につながる。補体の活性化は、炎症性反応も刺激し、自己免疫過敏性にも関与する可能性がある。
【０１２０】
他の抗原依存性エフェクタ機能は、抗体の、そのＦｃ領域を介する、細胞上のあるＦｃ受容体（「ＦｃＲ」）への抗体の結合によって媒介される。ＩｇＧ（ガンマ受容体、すなわちＩｇγＲ）、ＩｇＥ（エプシロン受容体、すなわちＩｇεＲ）、ＩｇＡ（アルファ受容体、すなわちＩｇαＲ）、およびＩｇＭ（ミュー受容体、すなわち、ＩｇμＲ）を含む、抗体の異なるクラスに対する特異的な多くのＦｃ受容体が存在する。細胞表面上のＦｃ受容体への抗体の結合は、免疫複合体のエンドサイトーシス、抗体で被覆された粒子または微生物の貪食および破壊（抗体依存性食作用、すなわちＡＤＣＰとも称される）、免疫複合体のクリアランス、キラー細胞による抗体で被覆された標的細胞の溶解（抗体依存性細胞媒介細胞毒性、すなわちＡＤＣＣと称される）、炎症性メディエータの放出、免疫系細胞活性化の調節、および免疫グロブリン産生の胎盤通過および制御を含む、多くの重要で多様な生物学的反応を誘引する。
【０１２１】
ある種のＦｃ受容体であるＦｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）は、免疫動員を無効にするか、または向上するかのいずれかにおいて重要な役割を果たす。ＦｃγＲは、白血球上で発現し、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩの３つの明確に異なるクラスからなる（Ｇｅｓｓｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，（１９９８），７６：２３１−４８）。構造的には、ＦｃγＲは、全て、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、２つまたは３つのいずれかのＩｇ様ドメインからなる細胞外部分を有するＩｇＧ−結合α−鎖を有する。ヒトＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）は、ヒト単球上で発現し、単量体ＩｇＧ１、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４に対して高親和性結合（Ｋａ＝１０８〜１０９Ｍ−１）を示す。ヒトＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）は、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３に対して低い親和性（Ｋａ＜１０７Ｍ−１）を有し、これらのＩｇＧイソタイプの複合体またはポリマー型のみに結合することができる。さらに、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩクラスは、「Ａ」および「Ｂ」型の両方を含む。ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）およびＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）は、膜透過ドメインによってマクロファージ、ＮＫ細胞、および一部のＴ細胞の表面に結合するが、ＦｃγＲＩＩｂ（ＣＤ３２ｂ）およびＦｃγＲＩＩＩｂ（ＣＤ１６ｂ）は、ホスファチジルイノシトールグリカン（ＧＰＩ）アンカーを介して顆粒球（例えば、好中球）の細胞表面に選択的に結合する。ヒトＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩのそれぞれのマウス同族体は、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ／１、およびＦｃγＲｌｏである。
【０１２２】
本明細書において使用される「抗原非依存性エフェクタ機能」という用語は、抗体がその対応する抗原に結合しているかどうかにかかわらず、抗体によって誘導することができるエフェクタ機能を指す。典型的な抗原非依存性エフェクタ機能は、免疫グロブリンの細胞輸送、循環半減期、およびクリアランス率、ならびに精製の促進を含む。回収受容体としても周知の、構造的に特有のＦｃ受容体である「新生児Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲｎ」は、半減期および細胞輸送の調節において重要な役割を果たす。微生物細胞（例えば、ブドウ球菌プロテインＡまたはＧ）から精製される他のＦｃ受容体は、高い親和性でＦｃ領域に結合することが可能であり、Ｆｃ含有ポリペプチドの精製を容易にするために使用することができる。
【０１２３】
免疫グロブリンスーパーファミリーに属するＦｃγＲとは異なり、ヒトＦｃＲｎは、構造的に主要組織適合抗原（ＭＨＣ）クラスＩのポリペプチドと類似する（Ｇｈｅｔｉｅ  ａｎｄ  Ｗａｒｄ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，（１９９７），１８（１２）：５９２−８）。ＦｃＲｎは、通常、可溶性βまたは軽鎖（β２ミクログロブリン）と複合した膜透過αまたは重鎖からなるヘテロ二量体として発現する。ＦｃＲｎは、クラスＩＭＨＣ分子と２２〜２９％の配列同一性を共有し、非機能版のＭＨＣペプチド結合溝を有する（Ｓｉｍｉｓｔｅｒ  ａｎｄ  Ｍｏｓｔｏｖ，Ｎａｔｕｒｅ，（１９８９），３３７：１８４−７。ＭＨＣと同様に、ＦｃＲｎのα鎖は、３つの細胞外ドメイン（α１、α２、α３）からなり、短い細胞質尾部が、タンパク質を細胞表面に固定する。α１およびα２ドメインは、抗体のＦｃ領域におけるＦｃＲ結合部位と相互作用する（Ｒａｇｈａｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，（１９９４），１：３０３−１５）。ＦｃＲｎは、哺乳類の胎盤子宮部または卵黄嚢において発現され、母親から胎児へのＩｇＧの移動に関与する。ＦｃＲｎは、げっ歯類の新生児の小腸においても発現され、摂取された初乳またはミルクからの母体ＩｇＧの刷子縁上皮全体への移動に関与する。ＦｃＲｎは、多数の種にわたり多数の他の組織において、および様々な内皮細胞株においても発現される。ヒト成人の血管内皮、筋血管系、および肝類洞においても発現される。ＦｃＲｎは、ＩｇＧを血清に結合および再循環することによって、ＩｇＧの循環半減期または血清レベルの維持において付加的役割を果たすと考えられる。ＩｇＧ分子のＦｃＲｎの結合は、厳密にｐＨ依存性であり、７．０未満のｐＨで最適結合となる。
【０１２４】
本明細書において使用される「半減期」という用語は、インビボにおける特定の結合ポリペプチドの生物学的半減期を指す。半減期は、対象に投与される量の半分が循環および／または動物における他の組織から除去されるのに必要な時間によって表すことができる。所定の結合ポリペプチドのクリアランス曲線が、時間の関数として構築される場合、曲線は、通常、急速なα相およびより長いβ相を有する二相性である。α相は、通常、血管内および血管外空間の投与されたＦｃポリペプチドの平衡を表し、部分的に、ポリペプチドの大きさによって決定される。β相は、通常、血管内空間における結合ポリペプチドの異化を表す。したがって、好ましい実施形態においては、本明細書において使用される半減期という用語は、β相における結合ポリペプチドの半減期を指す。ヒトにおけるヒト抗体の典型的なβ相半減期は、２１日である。
【０１２５】
本明細書において使用される「ポリペプチド」という用語は、天然アミノ酸または非天然アミノ酸の２つまたそれ以上のポリマーを指す。「Ｆｃポリペプチド」という用語は、Ｆｃ領域またはその一部（例えば、Ｆｃ部分）を含むポリペプチドを指す。好ましい実施形態においては、該Ｆｃポリペプチドは、本発明の方法に従って、安定化される。任意の実施形態においては、該Ｆｃポリペプチドは、さらに、ＦｃポリペプチドのＦｃ領域（またはその一部）と機能的に結合するか、または融合する、結合部位を含む。
【０１２６】
本明細書において使用される「タンパク質」という用語は、ポリペプチド（例えば、Ｆｃポリペプチド）、または１を超えるポリペプチドを含む組成物を指す。したがって、タンパク質は、モノマー（例えば、単一のＦｃポリペプチド）または多重体のいずれかであり得る。例えば、一実施形態においては、本発明のタンパク質は、二量体である。一実施形態においては、本発明の二量体は、ホモ二量体であり、２つの同一の単量体サブユニットまたはポリペプチド（例えば、２つの同一のＦｃポリペプチド）を含む。別の実施形態においては、本発明の二量体は、ヘテロ二量体であり、２つの非同一の単量体サブユニットまたはポリペプチド（例えば、２つの非同一のＦｃポリペプチド、または１つのＦｃポリペプチドおよびそのＦｃポリペプチド以外の第２のポリペプチド）を含む。二量体のサブユニットは、ポリペプチド鎖の少なくとも１つが、Ｆｃポリペプチドである、１つまたはそれ以上のポリペプチド鎖を含み得る。例えば、一実施形態においては、二量体は、少なくとも２つのポリペプチド鎖（例えば、少なくとも２つのＦｃポリペプチド鎖）を含む。一実施形態においては、二量体は、該鎖の１つまたは両方が、Ｆｃポリペプチド鎖である、２つのポリペプチド鎖を含む。別の実施形態においては、二量体は、ポリペプチド鎖の１つ、２つ、または全てが、Ｆｃポリペプチド鎖である、３つのポリペプチド鎖を含む。別の実施形態においては、二量体は、ポリペプチド鎖の１つ、２つ、３つ、または全てが、Ｆｃポリペプチド鎖である、４つのポリペプチド鎖を含む。
【０１２７】
本明細書において使用される「結合した」、「融合した」、または「融合」という用語は、同義的に使用される。これらの用語は、化学的共役または組み換え手段を含む、いかなる手段によっても行われる、２つまたはそれ以上の要素または成分を合わせて接合することを指す。化学的共役（例えば、ヘテロ二官能性架橋剤を使用する）の方法は、当技術分野で周知である。本明細書において使用されるように、「遺伝的に融合した」または「遺伝的融合」という用語は、これらのタンパク質、ポリペプチド、または断片をコードする単一のポリヌクレオチド分子の遺伝子発現による、それらの個々のペプチド骨格を介する２つまたそれ以上のタンパク質、ポリペプチド、またはそれらの断片の共線的共有結合または付着を指す。そのような遺伝的融合は、単一の連続した遺伝子配列の発現を引き起こす。好ましい遺伝的融合は、インフレームであり、すなわち、２つまたそれ以上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が、本来のＯＲＦの正確なリーディングフレームを維持する方法で、連続的なより長いＯＲＦを形成するように融合される。したがって、得られる組み換え融合タンパク質は、本来のＯＲＦ（天然では、断片は、通常それほど接合されていない）によってコードされるポリペプチドに対応する２つまたそれ以上のタンパク質断片を含有する一本鎖ポリペプチドである。リーディングフレームは、そのようにして融合遺伝断片全体に連続するようになるが、タンパク質断片は、例えば、インフレームポリペプチドリンカーによって物理的または空間的に分離される場合がある。
【０１２８】
本明細書において使用される「Ｆｃ領域」という用語は、抗体重鎖の２つまたはそれ以上のＦｃ部分によって形成される免疫グロブリンの一部として定義される。ある実施形態においては、該Ｆｃ領域は、二量体Ｆｃ領域である。「二量体Ｆｃ領域」または「ｄｃＦｃ」とは、２つの別々の免疫グロブリン重鎖のＦｃ部分によって形成される二量体を指す。二量体Ｆｃ領域は、２つの同一のＦｃ部分（例えば、天然に存在する免疫グロブリンのＦｃ領域）のホモ二量体、または２つの非同一のＦｃ部分のヘテロ二量体であり得る。他の実施形態においては、該Ｆｃ領域は、単量体または「一本鎖」Ｆｃ領域（すなわち、ｓｃＦｃ領域）である。一本鎖Ｆｃ領域は、単一のポリペプチド鎖（すなわち、単一の隣接遺伝子配列においてコードされる）内において、遺伝的に連鎖しているＦｃ部分から構成される。例示的なｓｃＦｃ領域は、２００８年５月１４日出願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００６２６０号に開示されており、この内容は、参照することにより、本明細書に組み込まれる。
【０１２９】
本明細書において使用される「Ｆｃ部分」という用語は、パパイン切断部位（すなわち、重鎖定常領域の第１の残基を１１４として、ＩｇＧにおける残基２１６）のちょうど上流にあるヒンジ領域で開始し、免疫グロブリン重鎖のＣ末端で終止する免疫グロブリン重鎖の一部に由来する配列を指す。したがって、Ｆｃ部分は、完全Ｆｃ部分またはその一部（例えば、ドメイン）であり得る。完全Ｆｃ部分は、少なくとも１つのヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン（例えば、ＥＵアミノ酸位置２１６〜４４６）を含む。さらなるリシン残基（Ｋ）が、Ｆｃ部分の最Ｃ末端に存在することがあるが、成熟抗体から切断されることが多い。Ｆｃ領域内におけるアミノ酸位置のそれぞれは、例えば、米国保健社会福祉省、１９８３および１９８７の「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」における、Ｋａｂａｔらによって参照される、当技術分野において承認されているカバットのＥＵ付番方式に従って付番されている。
【０１３０】
ある実施形態においては、Ｆｃ部分は、ヒンジ（例えば、上部、中部、および／もしくは下部ヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、または変異体、その一部、もしくは断片のうちの少なくとも１つを含む。好ましい実施形態においては、Ｆｃ部分は、少なくともＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインを含む。ある実施形態においては、該Ｆｃ部分は、完全Ｆｃ部分である。他の実施形態においては、該Ｆｃ部分は、天然に存在するＦｃ部分と比較して、１つまたはそれ以上のアミノ酸挿入、欠失、または置換を含む。例えば、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、またはＣＨ３ドメイン（またはその一部）の少なくとも１つを欠失し得る。例えば、Ｆｃ部分は、（ｉ）ＣＨ２ドメイン（またはその一部）と融合するヒンジドメイン（またはその一部）、（ｉｉ）ＣＨ３ドメイン（またはその一部）と融合するヒンジドメイン（またはその一部）、（ｉｉｉ）ＣＨ３ドメイン（またはその一部）と融合するＣＨ２ドメイン（またはその一部）、（ｉｖ）ＣＨ２ドメイン（またはその一部）、および（ｖ）ＣＨ３ドメインまたはその一部を含むか、またはそれらからなり得る。
【０１３１】
本明細書において説明されるように、当業者にとって当然のことながら、Ｆｃ部分も、天然に存在するＦｃ部分によって与えられる少なくとも１つの所望の機能を保持しながら、天然に存在する免疫グロブリン分子の完全Ｆｃ部分とアミノ酸配列において異なるように、修飾することができる。例えば、該Ｆｃ部分は、ＦｃＲｎ結合または延長した半減期に必要とされる当技術分野において周知の少なくともＦｃ部分の一部を含むか、またはそれらからなり得る。別の実施形態においては、Ｆｃ部分は、ＦｃγＲ結合に必要とされる当技術分野で周知の少なくとも一部を含む。一実施形態においては、本発明のＦｃ領域は、プロテインＡ結合に必要とされる当技術分野で周知の少なくとも一部を含む。一実施形態においては、本発明のＦｃ部分は、プロテインＧ結合に必要とされる当技術分野で周知の少なくとも一部を含む。
【０１３２】
ある実施形態においては、Ｆｃ領域のＦｃ部分は、同一のイソタイプのものである。例えば、Ｆｃ部分は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４イソタイプの免疫グロブリン（例えば、ヒト免疫グロブリン）に由来する場合がある。しかしながら、Ｆｃ領域（またはＦｃ領域の１つまたはそれ以上のＦｃ部分）は、キメラであってよい。キメラＦｃ領域は、異なる免疫グロブリンイソタイプに由来するＦｃ部分を含み得る。ある実施形態においては、二量体または一本鎖Ｆｃ領域のＦｃ部分のうちの少なくとも２つは、異なる免疫グロブリンイソタイプからのものであり得る。追加のまたは代替的な実施形態においては、該キメラＦｃ領域は、１つまたはそれ以上のキメラＦｃ部分を含み得る。例えば、キメラＦｃ領域または部分は、第１のイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ３イソタイプ）の免疫グロブリンに由来する１つまたはそれ以上の部分を含み得るが、Ｆｃ領域または部分の残りは、異なるイソタイプからのものである。例えば、ＦｃポリペプチドのＦｃ領域または部分は、第１のイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４イソタイプ）の免疫グロブリンに由来するＣＨ２および／もしくはＣＨ３ドメイン、ならびに第２のイソタイプ（例えば、ＩｇＧ３イソタイプ）の免疫グロブリンに由来するヒンジ領域を含み得る。別の実施形態においては、Ｆｃ領域または部分は、第１のイソタイプ（例えば、ＩｇＧ４イソタイプ）の免疫グロブリンに由来するヒンジおよび／もしくはＣＨ２ドメイン、ならびに第２のイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ３イソタイプ）の免疫グロブリンに由来するＣＨ３ドメインを含む。別の実施形態においては、キメラＦｃ領域は、第１のイソタイプ（例えば、ＩｇＧ４イソタイプ）に対して免疫グロブリンに由来するＦｃ部分（例えば、完全Ｆｃ部分）、ならびに第２のイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ３イソタイプ）の免疫グロブリンに由来するＦｃ部分を含む。１つの例示的な実施形態においては、Ｆｃ領域または部分は、ＩｇＧ４免疫グロブリンに由来するＣＨ２ドメインおよびＩｇＧ１免疫グロブリンに由来するＣＨ３ドメインを含む。別の実施形態においては、Ｆｃ領域または部分は、ＩｇＧ４分子に由来するＣＨ１ドメインおよびＣＨ２ドメイン、ならびにＩｇＧ１分子に由来するＣＨ３ドメインを含む。別の実施形態においては、Ｆｃ領域または部分は、抗体の特定のイソタイプに由来するＣＨ２ドメインの一部、例えば、ＣＨ２ドメインのＥＵ位置２９２〜３４０を含む。例えば、一実施形態においては、Ｆｃ領域または部分は、ＩｇＧ４部分に由来するＣＨ２のアミノ酸位置２９２〜３４、およびＩｇＧ１部分に由来するＣＨ２の残り（代替として、ＣＨ２の２９２〜３４は、ＩｇＧ１部分に由来し、ＣＨ２の残りは、ＩｇＧ４部分に由来し得る）を含む。
【０１３３】
他の実施形態においては、Ｆｃ領域または部分は、キメラヒンジ領域を含み得る。キメラヒンジは、部分的に、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４分子（例えば、上部、および下位中部ヒンジ配列）に由来し、そして部分的に、ＩｇＧ３分子（例えば、中部ヒンジ配列）に由来し得る。別の例においては、Ｆｃドメインまたは部分は、部分的に、ＩｇＧ１分子に由来し、そして部分的に、ＩｇＧ４分子に由来するキメラヒンジを含むことができる。特定の実施形態においては、キメラヒンジは、ＩｇＧ４分子に由来する上部および下部ヒンジドメイン、ならびにＩｇＧ１分子に由来する中部ヒンジドメインを含むことができる。そのようなキメラヒンジは、ＩｇＧ４ヒンジ領域の中部ヒンジドメインにおいて、ＥＵ位置２２８にプロリン置換（Ｓｅｒ２２８Ｐｒｏ）を導入することによって作製することができる。別の実施形態においては、キメラヒンジは、ＥＵ位置２３３〜２３６に、ＩｇＧ２抗体および／またはＳｅｒ２２８Ｐｒｏ変異からのものであるアミノ酸を含むことができ、ヒンジの残りのアミノ酸は、ＩｇＧ４抗体（例えば、配列ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰのキメラヒンジ）からのものである。さらなるキメラヒンジは、米国特許出願第１０／８８０，３２０号に記載されており、この内容は、参照することにより、その全体が本明細書に組み込まれる。
【０１３４】
「非グリコシル化Ｆｃ領域」は、「Ｆｃ領域」の定義内に具体的に含まれる。本明細書において使用される「非グリコシル化Ｆｃ領域」とは、例えば、１つまたはそれ以上のそのＦｃ部分において、ＥＵ位置２９７のＮグリコシル化部位で、共有結合するオリゴ糖またはグリカンを欠くＦｃ領域である。ある実施形態においては、非グリコシル化Ｆｃ領域は、完全に非グリコシル化であり、すなわち、そのＦｃ部分の全てが炭水化物を欠く。他の実施形態においては、この非グリコシル化は、部分的に非グリコシル化（すなわち、ヘミグリコシル化）である。非グリコシル化Ｆｃ領域は、脱グリコシル化されたＦｃ領域、つまり、Ｆｃ炭水化物が、例えば、化学的に、または酵素的に除去されているＦｃ領域であり得る。代替として、非グリコシル化Ｆｃ領域は、グリコシル化されていないかまたは未グリコシル化である、つまり、例えば、ＥＵ位置２９７もしくは２９９のＮグリコシル化部位で、グリコシル化パターンをコードするものまたは残基の変異によってか、タンパク質に対して炭水化物を天然に付着しない生物（例えば、細菌）における発現によってか、またはグリコシル化機構が、遺伝子操作によって、もしくはグリコシル化された阻害剤（例えば、グリコシルトランスフェラーゼ阻害剤）の添加によって欠損している宿主細胞もしくは生物における発現によって、Ｆｃ炭水化物を伴わないで発現する抗体であり得る。代替的な実施形態においては、Ｆｃ領域は、「グリコシル化されたＦｃ領域」であり、すなわち、それは、全ての利用可能なグリコシル化部位で完全にグリコシル化される。
【０１３５】
「親Ｆｃポリペプチド」という用語には、安定化が望ましい、Ｆｃ領域（例えば、ＩｇＧ抗体）を含有するポリペプチドが含まれる。好ましくは、親Ｆｃポリペプチドは、エフェクタ無しＦｃポリペプチドである。故に、親Ｆｃポリペプチドは、本発明の方法が行われるか、または安定性比較に対する基準点で使用することができる、元来のＦｃポリペプチドを示す。親ポリペプチドは、天然（すなわち、天然に存在する）Ｆｃ領域もしくは部分（例えば、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域もしくは部分）、または天然に存在する配列の既に存在するアミノ酸配列修飾（挿入、欠失、および／もしくは他の変化等）を有するが、１つまたはそれ以上の安定化アミノ酸を欠いているＦｃ領域を含み得る。
【０１３６】
「変異」または「変異させる」という用語は、（例えば、変化させることによって、例えば、部位特異的変異生成、異なるアミノ酸をコードするコドンを引き起こす１つのアミノ酸をコードする核酸分子のコドンによって）親Ｆｃポリペプチドにおいて物理的に変異を起こすこと、または（例えば、親Ｆｃ領域をコードする核酸分子のヌクレオチド配列を知ることによって、および本発明の安定化ポリペプチドをコードする核酸分子の１つまたはそれ以上のヌクレオチドを変異させる必要なく、親Ｆｃ領域の変異体をコードする核酸分子を含む核酸分子の合成を設計することによって）親Ｆｃ領域には見られないアミノ酸を有する変異Ｆｃ領域を合成することを含むことを理解するべきである。
【０１３７】
１つの例示的な実施形態においては、親Ｆｃポリペプチドは、エフェクタ無しＦｃポリペプチドからのＦｃ領域を含む。本明細書において使用される「エフェクタ無しＦｃポリペプチド」という用語は、ＩｇＧ１イソタイプの野生型の非グリコシル化抗体と比較して、変化した、または低下したエフェクタ機能を有する、Ｆｃポリペプチドを指す。好ましくは、低下した、または変化したエフェクタ機能は、抗体依存性エフェクタ機能、例えば、ＡＤＣＣおよび／またはＡＤＣＰである。一実施形態においては、エフェクタ無しＦｃポリペプチドは、ＦｃポリペプチドのＦｃ領域、例えば、非グリコシル化されたＦｃ領域において、修飾された、または低下したグリコシル化の結果として、低下したエフェクタ機能を有する。別の実施形態においては、エフェクタ無しＦｃポリペプチドは、ＩｇＧ４Ｆｃ領域またはその一部（例えば、ＩｇＧ４抗体のＣＨ２および／またはＣＨ３ドメイン）への組み込みのため、低下したエフェクタ機能を有する。
【０１３８】
「変異Ｆｃポリペプチド」または「Ｆｃ変異体」という用語には、親Ｆｃポリペプチドに由来するＦｃポリペプチドが含まれる。Ｆｃ変異体は、例えば、少なくとも１つのＦｃ安定化変異体への組み込みのため、１つまたはそれ以上の安定化アミノ酸残基を安定化させることを含む点において、親Ｆｃポリペプチドとは異なる。ある実施形態においては、本発明のＦｃ変異体は、１つまたはそれ以上の安定化Ｆｃアミノ酸の存在を別にすれば、親ポリペプチドのＦｃ変異体に対する配列において同一であるＦｃ領域（またはＦｃ部分）を含む。好ましい実施形態においては、Ｆｃ変異体は、親Ｆｃポリペプチドと比較して、向上した安定性を有し、任意に、親Ｆｃポリペプチドと比較して、同等の、または低下したエフェクタ機能を有する。
【０１３９】
指定されたポリペプチドまたはタンパク質に「由来する」ポリペプチドまたはアミノ酸配列は、ポリペプチドの起源を指す。好ましくは、特定の配列に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は、その配列またはその一部と本質的に同一のアミノ酸配列を有し、該一部は、少なくとも１０〜２０のアミノ酸、好ましくは少なくとも２０〜３０のアミノ酸、より好ましくは少なくとも３０〜５０のアミノ酸からなるか、そうでなければ、配列においてその起源を有するという理由で、当業者にとって識別可能である。ポリペプチドとの関連において、「直鎖状配列」または「配列」は、配列において互いに近接する残基が、ポリペプチドの一次構造において隣接するアミノからカルボキシル末端への方向のポリペプチドにおけるアミノ酸の順序である。
【０１４０】
別のポリペプチド（例えば、親Ｆｃポリペプチド）に由来するポリペプチド（例えば、変異体Ｆｃポリペプチド）は、出発または親ポリペプチドに対して１つまたはそれ以上の変異、例えば、別のアミノ酸残基で置換されているか、または１つもしくはそれ以上のアミノ酸残基挿入もしくは欠失を有する１つまたはそれ以上のアミノ酸残基を有する場合がある。好ましくは、ポリペプチドは、天然に存在しないアミノ酸配列を含む。そのような変異体は、出発ポリペプチドとの１００％未満の配列同一性または類似性を必ず有する。好ましい実施形態においては、変異体は、出発ポリペプチドのアミノ酸配列との約７５％〜１００％未満のアミノ酸配列同一性または類似性、より好ましくは約８０％〜１００％未満、より好ましくは約８５％〜１００％未満、より好ましくは約９０％〜１００％未満（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）、最も好ましくは約９５％〜１００％未満のアミノ酸配列の同一性または類似性を、例えば、変異体分子またはその一部（例えば、Ｆｃ領域またはＦｃ部分）の全長にわたって有するアミノ酸配列を有する。一実施形態においては、出発ポリペプチド配列（例えば、親ＦｃポリペプチドのＦｃ領域）とそれに由来する配列（例えば、変異体ＦｃポリペプチドのＦｃ領域）との間に１つのアミノ酸の相違がある。他の実施形態においては、出発ポリペプチド配列と変異体ポリペプチドとの間の２〜１０のアミノ酸の相違（例えば、約２〜２０、約２〜１５、約２〜１０、約５〜２０、約５〜１５、約５〜１０のアミノ酸の相違）がある。例えば、約１０未満のアミノ酸の相違（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のアミノ酸の相違）があり得る。この配列に対する同一性または類似性は、最大の割合（％）の配列同一性を得るために、必要に応じて、配列を整列し、ギャップを導入した後の、出発アミノ酸残基と同一（すなわち、同じ残基）である候補配列におけるアミノ酸残基の割合（％）として本明細書において定義される。
【０１４１】
本発明の好ましいＦｃポリペプチドは、ヒト免疫グロブリン配列に由来するアミノ酸配列（例えば、少なくとも１つのＦｃ領域またはＦｃ部分）（例えば、ヒトＩｇＧ分子に由来するＦｃ領域またはＦｃ部分）を含む。しかしながら、ポリペプチドは、別の哺乳類種からの１つまたはそれ以上のアミノ酸を含む場合がある。例えば、霊長類Ｆｃ部分または霊長類結合部位が、対象ポリペプチドに含まれる場合がある。代替として、１つまたはそれ以上のマウスアミノ酸が、Ｆｃポリペプチドに存在する場合がある。本発明の好ましいＦｃポリペプチドは、免疫原性ではない。
【０１４２】
また、当業者にとって当然のことながら、本発明のＦｃポリペプチドは、親ポリペプチドの１つまたはそれ以上の所望の活性（例えば、低下したエフェクタ機能）を保持しながら、それらが由来する親ポリペプチドとアミノ酸配列において異なるように、変化させることができる。特定の実施形態においては、Ｆｃポリペプチドを安定化させるヌクレオチドまたはアミノ酸置換が行われる。一実施形態においては、Ｆｃ変異体をコードする単離核酸分子は、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換、付加、または欠失が、コードされたタンパク質に導入されるように、１つまたはそれ以上のヌクレオチド置換、付加、または欠失を親Ｆｃポリペプチドのヌクレオチド配列に導入することによって作製することができる。変異（例えば、安定化変異）は、部位特異的変異生成およびＰＣＲ媒介変異生成等の標準の手法によって導入することができる。
【０１４３】
本明細書において使用される「タンパク質安定性」という用語は、環境条件（例えば、温度の上昇または低下）に応じたタンパク質の１つまたはそれ以上の物理的特性の維持の当技術分野において承認されている尺度を指す。一実施形態においては、物理的特性は、タンパク質の共有結合構造の維持である（例えば、タンパク質分解的切断、好ましくない酸化、または脱アミドの非存在）。別の実施形態においては、物理的特性は、正確に折り畳まれた状態のタンパク質の存在である（例えば、可溶性または不溶性凝集体または沈殿物の非存在）。一実施形態においては、タンパク質の安定性は、例えば、熱安定性、ｐＨアンフォールディングのプロファイル、グリコシル化の安定した除去、溶解性、生化学的機能（例えば、タンパク質（例えば、リガンド、受容体、抗原等）、もしくは化学部分等に結合する能力）、および／またはこれらの組み合わせ等のタンパク質の生物物理的特性をアッセイすることによって測定される。別の実施形態においては、生化学的機能は、相互作用の結合親和性によって示される。一実施形態においては、タンパク質の安定性の尺度は、熱安定性、すなわち、熱的チャレンジ（ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）に対する耐性である。安定性は、当該分野で周知の、および／または本明細書中に記載される方法を用いて測定することができる。例えば、「遷移温度」として称される「Ｔｍ」が、測定され得る。Ｔｍは、例えば、結合分子等の巨大分子の５０％が、変性し、タンパク質の熱安定性を説明するための基準パラペータであると考えられる、温度である。
【０１４４】
「アミノ酸」という用語には、アラニン（ＡｌａまたはＡ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、  ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、リジン（ＬｙｓまたはＫ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、トレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）、およびバリン（ＶａｌまたはＶ）が含まれる。非伝統的なアミノ酸も、本発明の範囲内であり、ノルロイシン、オミチン、ノルバリン、ホモセリン、およびＥｌｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．２０２：３０１−３３６（１９９１）に記載されるもの等の他のアミノ酸残基類似体を含む。そのような非天然のアミノ酸残基を生成するために、Ｎｏｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１８２（１９８９）および上述のＥｌｌｍａｎらの手順を使用することができる。簡潔に述べると、これらの手順は、天然に存在しないアミノ酸残基によるサプレッサｔＲＮＡを化学的に活性化し、その後、ＲＮＡのインビトロ転写および翻訳を行うことを伴う。非伝統的なアミノ酸の導入は、当技術分野で周知のペプチド化学を使用して達成することもできる。本明細書において使用される「極性のアミノ酸」という用語は、正味ゼロ電荷を有するが、それらの側鎖（例えば、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｓ、Ｙ、Ｎ、Ｑ、Ｃ）の異なる部分に非ゼロ部分電荷を有するアミノ酸を含む。これらのアミノ酸は、疎水性相互作用および静電相互作用に関与する場合がある。本明細書において使用される「荷電アミノ酸」という用語は、それらの側鎖（例えば、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｅ、Ｄ）に非ゼロ正味荷電を有することができるアミノ酸を含む。これらのアミノ酸は、疎水性相互作用および静電相互作用に関与する場合がある。本明細書において使用される「十分な立体容積を有するアミノ酸」という用語は、大きな三次元空間を占める側鎖を有するそれらのアミノ酸を含む。十分な立体容積の側鎖化学を有する例示的なアミノ酸としては、チロシン、トリプトファン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、グルタミン酸、グルタミン、およびメチオニン、またはその類似体もしくは模倣体を含む。
【０１４５】
「アミノ酸置換」とは、第２の異なる「置換」アミノ酸残基による、所定のアミノ酸配列（出発ポリペプチドのアミノ酸配列）における少なくとも１つの既存のアミノ酸残基の置換を指す。「アミノ酸挿入」は、所定のアミノ酸配列への少なくとも１つの付加的アミノ酸の組み込みを指す。挿入は、通常、１つまたは２つのアミノ酸残基の挿入からなるが、この大きな「ペプチド挿入」、例えば、約３〜約５または最大約１０、１５、もしくは２０のアミノ酸残基の挿入を行うことができる。挿入された残基は、上記において開示されるように、天然、または非天然であり得る。「アミノ酸欠失」は、所定のアミノ酸配列からの少なくとも１つのアミノ酸残基の除去を指す。上記に説明されるように、これらの用語は、既存の物理的核酸分子への実際の変化または既存の核酸配列への設計プロセス（例えば、紙面上またはコンピュータ上）中になされる変化を含む。
【０１４６】
ある実施形態においては、本発明のポリペプチドは、結合ポリペプチドである。本明細書において使用される「結合ポリペプチド」という用語は、標的分子（抗原または結合パートナー等）と特異的に結合する少なくとも１つの標的結合部位または結合ドメインを含むポリペプチド（例えば、Ｆｃポリペプチド）を指す。例えば、一実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドは、免疫グロブリン抗原結合部位、またはリガンド結合に関与する受容体分子の一部、または受容体結合に関与するリガンド分子の一部を含む。本発明の結合ポリペプチドは、少なくとも１つの結合部位を含む。一実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドは、少なくとも２つの結合部位を含む。一実施形態においては、結合ポリペプチドは、２つの結合部位を含む。別の実施形態においては、結合ポリペプチドは、３つの結合部位を含む。別の実施形態においては、結合ポリペプチドは、４つの結合部位を含む。一実施形態においては、結合部位は、直列に互いに結合される。他の実施形態においては、結合部位は、例えば、ＦｃポリペプチドのＦｃ領域の１つまたはそれ以上のＮまたはＣ末端で、結合ポリペプチドの異なる位置に位置する。例えば、Ｆｃ領域は、ｓｃＦｃ領域であり、結合部位は、ｓｃＦｃ領域のＮ末端、Ｃ末端、または両端に連結され得る。Ｆｃ領域は、二量体Ｆｃ領域であり、結合部位は、Ｎ末端の一端もしくは両端および／またはＣ末端の一端もしくは両端に連結され得る。
【０１４７】
本明細書において使用される「結合ドメイン」、「結合部位」、または「結合部分」という用語は、例えば、標的分子（例えば、抗原、リガンド、受容体、基質、または阻害剤）への特定の結合を媒介する、生物活性（Ｆｃ媒介生物活性）を有する、結合ポリペプチドの一部、領域、または部位を指す。例示的な結合ドメインとしては、生物活性のあるタンパク質もしくは部分、抗原結合部位、リガンドの受容体結合ドメイン、受容体のリガンド結合ドメイン、または酵素的ドメインが含まれる。別の例においては、「結合部分」という用語は、生物系の成分（例えば、血清中、細胞の表面上、または細胞マトリックス中のタンパク質）に結合し、結合が、生物学的効果を引き起こす（例えば、活性部分の変化および／もしくはそれに結合する成分の変化（例えば、細胞または対象における、活性部分および／もしくはそれに結合する成分の開裂、シグナルの伝達、または生物学的応答の増加もしくは阻害））、生物活性分子またはその一部を指す。
【０１４８】
本明細書において使用される「リガンド結合ドメイン」という用語は、少なくとも質的リガンド結合能、および好ましくは対応する天然受容体の生物活性を保持する、天然受容体（例えば、細胞表面受容体）もしくは領域、またはそれらの誘導体を指す。本明細書において使用される「受容体結合ドメイン」という用語は、少なくとも質的受容体結合能、および好ましくは対応する天然リガンドの生物活性を保持する、天然リガンドもしくは領域、またはそれらの誘導体を指す。一実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドは、例えば、細胞表面抗原または可溶性抗原等、減少または排除のために標的とされる分子に対して特異的な少なくとも１つの結合ドメインを有する。好ましい実施形態においては、結合ドメインは、抗原結合部位（例えば、可変重鎖配列および可変軽鎖配列を含む）または代替のフレームワーク領域（例えば、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を任意で含むヒトフレームワーク）に配置される抗体からの６つのＣＤＲを含むか、またはそれらからなる。
【０１４９】
本明細書において使用される「結合親和性」という用語は、結合相互作用の強度を、したがって実際の結合親和性および見掛けの結合親和性の両方を含む。実際の結合親和性は、会合速度の解離速度に対する比率である。したがって、結合親和性を与えるか、最適化することは、結合親和性の所望のレベルに到達するために、これらの要素の片方または両方を変化させることを含む。見掛けの親和性は、例えば、相互作用の結合力を含み得る。
【０１５０】
本明細書において使用される「結合自由エネルギー」または「結合の自由エネルギー」という用語は、その当技術分野において承認されている意味、および、特に、溶媒における結合部位−リガンドまたはＦｃ−ＦｃＲ相互作用に適用される際の意味を含む。結合自由エネルギーの低下は、親和性を強化するが、結合自由エネルギーの増加は、親和性を低下させる。
【０１５１】
「特異性」という用語は、既定の標的に特異的に結合する（例えば、免疫反応する）可能性のある結合部位の数を含む。結合ポリペプチドは、単一特異性であり、同じ標的（例えば、同じエピトープ）に特異的に結合する１つまたはそれ以上の結合部位を含有することができるか、または結合ポリペプチドは、多特異性であり、同じ標的の異なる領域（例えば、異なるエピトープ）または異なる標的に特異的に結合する２つまたそれ以上の結合部位を含有することができる。一実施形態においては、１を超える標的分子（例えば、１を超える抗原、または同じ抗原上の１を超えるエピトープ）に対して結合特異性を有する多特異性結合ポリペプチド（例えば、二重特異性ポリペプチド）を作製することができる。別の実施形態においては、多特異性結合ポリペプチドは、減少または排除に対して標的される分子に対して特異的な少なくとも１つの結合ドメイン、および細胞上の標的分子に対して特異的な少なくとも１つの結合ドメインを有する。別の実施形態においては、多特異性結合ポリペプチドは、減少または排除に対して標的される分子に対して特異的な少なくとも１つの結合ドメイン、および薬物に対して特異的な少なくとも１つの結合ドメインを有する。さらに別の実施形態においては、多特異性結合ポリペプチドは、減少または排除に対して標的される分子に対して特異的な少なくとも１つの結合ドメイン、および薬剤に対して特異的な少なくとも１つの結合ドメインを有する。さらに別の実施形態においては、多特異性結合ポリペプチドは、１つの標的分子に対して特異的な２つの結合ドメイン、および第２の標的分子に対して特異的な２つの結合部位を有する四価抗体である。
【０１５２】
本明細書において使用される「価数」という用語は、結合ポリペプチドまたはタンパク質における潜在的結合ドメインの数を指す。各結合ドメインは、１つの標的分子に特異的に結合する。結合ポリペプチドが１を超える結合ドメインを含む場合、各結合ドメインは、同じまたは異なる分子に特異的に結合することができる（例えば、異なるリガンドもしくは異なる抗原、または同じ抗原上の異なるエピトープに結合することができる）。一実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドは、一価である。別の実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドは、多価である。別の実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドは、二価である。別の実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドは、三価である。さらに別の実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドは、四価である。
【０１５３】
ある態様においては、本発明の結合ポリペプチドは、ポリペプチドリンカーを使用する。本明細書において使用される「ポリペプチドリンカー」という用語は、ポリペプチド鎖の直鎖状アミノ酸配列における２つのドメインを接続するペプチドまたはポリペプチド配列（例えば、合成ペプチドまたはポリペプチド配列）を指す。例えば、ポリペプチドリンカーを使用して、結合部位を本発明のＦｃポリペプチドのＦｃ領域（またはＦｃ部分）に接続することができる。好ましくは、そのようなポリペプチドリンカーは、ポリペプチド分子に柔軟性を提供する。例えば、一実施形態においては、ＶＨドメインまたはＶＬドメインは、ポリペプチドリンカーと融合または結合され、ポリペプチドリンカーのＮまたはＣ末端は、遺伝的に融合したＦｃ領域（またはＦｃ部分）のＣまたはＮ末端に付着し、ポリペプチドリンカーのＮ末端は、ＶＨまたはＶＬドメインのＮまたはＣ末端に付着する）。ある実施形態においては、ポリペプチドリンカーを使用して、２つのＦｃ部分またはｓｃＦｃポリペプチドのドメインを接続（例えば、遺伝的に融合）する。そのようなポリペプチドリンカーは、本明細書において、Ｆｃ結合ポリペプチドとも称される。本明細書において使用される「Ｆｃ結合ポリペプチド」という用語は、特に、２つのＦｃ部分またはドメインを接続（例えば、遺伝的に融合）する結合ポリペプチドを指す。本発明の結合分子は、１を超えるペプチドリンカーを含むことができる。
【０１５４】
本明細書において使用される「正確に折り畳まれたポリペプチド」という用語は、ポリペプチドを含む機能的ドメインの全てが明白に活性を有するポリペプチド（例えば、本発明の結合ポリペプチド）を含む。本明細書において使用される「不正確に折り畳まれたポリペプチド」という用語は、ポリペプチドの機能的ドメインの少なくとも１つが活性を有さないポリペプチドを含む。本明細書において使用される「正確に折り畳まれたＦｃポリペプチド」または「正確に折り畳まれたＦｃ領域」は、得られたＦｃ領域が少なくとも１つのエフェクタ機能を含むように、少なくとも２つの成分Ｆｃ部分が正確に折り畳まれたＦｃ領域（すなわち、ｓｃＦｃ領域）を含む。
【０１５５】
本明細書において使用される「免疫グロブリン」という用語は、ポリペプチドが任意の関連する特定の免疫反応性を有するかどうかに関わらず、２つの重鎖および２つの軽鎖の組み合わせを有するポリペプチドを含む。本明細書において使用される「抗体」という用語は、対象の抗原（腫瘍に関連する抗原）に対する有意な周知の特定の免疫反応活性を有するような集合体（例えば、その無傷抗体分子、抗体断片、または変異体）を指す。抗体および免疫グロブリンは、軽鎖および重鎖を含み、その間に鎖間共有結合が有る場合もあれば無い場合もある。脊椎骨系における塩基免疫グロブリン構造は、比較的よく理解されている。
【０１５６】
以下でより詳述されるように、一般名称「抗体」は、生化学的に区別することができる抗体の５つの明確に異なるクラスを含む。抗体の各クラスのＦｃ部分は、明らかに本発明の範囲内にあり、以下の考察は、概して、免疫グロブリン分子のＩｇＧクラスを対象とする。ＩｇＧに関して、免疫グロブリンは、分子量約２３，０００ダルトンの２つの同一の軽いポリペプチド鎖、および分子量５３，０００〜７０，０００の２つの同一の重鎖を含む。４つの鎖は、「Ｙ」構成において、ジスルフィド結合によって接合され、軽鎖は、「Ｙ」の開口部で開始し、可変ドメインを通して継続して、重鎖を囲う。
【０１５７】
免疫グロブリンの軽鎖は、カッパまたはラムダ（κ、λ）のいずれかとして分類される。各重鎖クラスは、カッパまたはラムダ軽鎖のいずれかと結合することができる。一般的に、軽および重鎖は、互いに共有結合され、２つの重鎖の「尾」部分は、免疫グロブリンが、ハイブリドーマ、Ｂ細胞、または遺伝子組み換えの宿主細胞のいずれかによって生成される場合、共有ジスルフィド結合または非共有結合によって互いに結合する。重鎖においては、アミノ酸配列は、Ｙ構成のフォーク状端部にあるＮ末端から、各鎖の下部にあるＣ末端にまで及ぶ。当業者は、重鎖が、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはエプシロン（γ、μ、α、δ、ε）のクラスとして分類され、その中でいくつかのサブクラス（例えば、γ１〜γ４）に分類されることを認識する。それが、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ  ＩｇＧ、またはＩｇＥのそれぞれの抗体の「クラス」を決定するこの鎖の性質である。免疫グロブリンサブクラス（イソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１等は、よく特徴付けられ、機能上の特性を与えることが周知である。これらのクラスおよびイソタイプのそれぞれの修飾版は、本開示を考慮して、当業者にとって容易に識別可能であり、したがって、本発明の範囲内にある。
【０１５８】
軽および重鎖の両方は、構造的および機能的相同性の領域に分けられる。「領域」という用語は、単一の免疫グロブリンの部分または一部（「Ｆｃ領域」という用語の場合のように）、または単一の抗体鎖を指し、定常領域または可変領域、および該ドメインのより個別的部分または一部を含む。例えば、軽鎖可変ドメインは、本明細書において定義される「フレームワーク領域」または「ＦＲ」の間に散在される「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」を含む。
【０１５９】
免疫グロブリンのある領域は、「定常」（Ｃ）領域または「可変」（Ｖ）領域として定義することができ、これは、「定常領域」の場合では、様々なクラスのメンバーの領域内の配列変異の相対的欠如、または「可変領域」の場合では、様々なクラスのメンバーの領域内の著しい変異に基づく。「定常領域」および「可変領域」という用語は、機能を表すように使用することもできる。この点において、免疫グロブリンまたは抗体の可変領域は、抗原認識および特異性を決定することが認識される。反対に、免疫グロブリンまたは抗体の定常領域は、分泌、経胎盤可動性、Ｆｃ受容体結合、補体結合等の重要なエフェクタ機能を与える。様々な免疫グロブリンクラスの定常領域のサブユニット構造および三次元構成は、周知である。
【０１６０】
免疫グロブリン重鎖または軽鎖の定常および可変領域は、ドメインに折り畳まれる。「ドメイン」という用語は、例えば、β−プリーツシートおよび／または鎖内ジスルフィド結合によって安定化されるペプチドループを含む（例えば、３〜４つのペプチドループを含む）重鎖または軽鎖ポリペプチドの独立折り畳み球状領域を指す。免疫グロブリンの軽鎖上の定常領域ドメインは、同義的に、「軽鎖定常領域ドメイン」、「ＣＬ領域」、または「ＣＬドメイン」と称される。重鎖（例えば、ヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２、またはＣＨ３ドメイン）上の定常ドメインは、同義的に、「重鎖定常領域ドメイン」、「ＣＨ」領域ドメイン、または「ＣＨドメイン」と称される。軽鎖上の可変ドメインは、ほとんど同じ意味で、「軽鎖可変領域ドメイン」、「ＶＬ領域ドメイン」または「ＶＬドメイン」と称される。重鎖上の可変ドメインは、同義的に、「重鎖可変領域ドメイン」、「ＶＨ領域ドメイン」、または「ＶＨドメイン」と称される。
【０１６１】
慣例により、可変および定常領域ドメインの番号は、それらが免疫グロブリンまたは抗体の抗原結合部位またはアミノ末端からより遠位になるにつれて増加する。各重および軽免疫グロブリン鎖のＮ末端は、可変領域であり、Ｃ末端は、定常領域であり、ＣＨ３およびＣＬドメインは、実際には、それぞれ、重鎖または軽鎖のカルボキシ末端を含む。したがって、軽鎖免疫グロブリンのドメインは、ＶＬ−ＣＬの方向に配置されるが、重鎖のドメインは、ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３の方向に配置される。
【０１６２】
ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸位置を含む、重鎖定常領域におけるアミノ酸位置は、本明細書において、ＥＵ指標付番方式（米国保健社会福祉省、第５版、１９９１の「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」におけるＫａｂａｔらを参照）に従って付番される。対照的に、軽鎖定常領域（例えば、ＣＬドメイン）におけるアミノ酸位置は、本明細書において、カバット指標付番方式（Ｋａｂａｔらの同書を参照）に従って付番される。
【０１６３】
カバット指標付番方式に従い、本明細書において使用される「ＶＨドメイン」という用語は、免疫グロブリン重鎖のアミノ末端可変ドメインを含み、「ＶＬドメイン」という用語は、免疫グロブリン軽鎖のアミノ末端可変ドメインを含む。
【０１６４】
本明細書において使用される「ＣＨ１ドメイン」という用語は、例えば、約ＥＵ位置１１８〜２１５から延長する免疫グロブリン重鎖の第１の（アミノ最末端）定常領域ドメインを含む。ＣＨ１ドメインは、免疫グロブリン重鎖分子のヒンジ領域までＶＨドメインおよびアミノ末端に隣接し、免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の一部を形成しない。一実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖分子（例えば、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４分子）に由来するＣＨ１ドメインを含む。
【０１６５】
本明細書において使用される「ヒンジ領域」という用語は、ＣＨ１ドメインをＣＨ２ドメインに接合する重鎖分子の部分を含む。このヒンジ領域は、約２５の残基を含み、柔軟であるため、２つのＮ末端抗原結合領域を独立して移動させることができる。ヒンジ領域は、上部、中部、および下部ヒンジドメインという、３つの明確なドメインにさらに分けることができる（Ｒｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８，１６１：４０８３）。
【０１６６】
本明細書において使用される「ＣＨ２ドメイン」という用語は、例えば、約ＥＵ位置２３１〜３４０から延長する重鎖免疫グロブリン分子の部分を含む。ＣＨ２ドメインは、別のドメインと密接に対をなさないという点において特有である。むしろ、２つのＮ結合型分枝炭水化物鎖は、無傷天然ＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメインの間に介入される。一実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドは、ＩｇＧ１分子（例えば、ヒトＩｇＧ１分子）に由来するＣＨ２ドメインを含む。別の実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドは、ＩｇＧ４分子（例えば、ヒトＩｇＧ４分子）に由来するＣＨ２ドメインを含む。例示的な実施形態においては、本発明のポリペプチドは、ＣＨ２ドメイン（ＥＵ位置２３１〜３４０）またはその一部を含む。
【０１６７】
本明細書において使用される「ＣＨ３ドメイン」という用語は、ＣＨ２ドメインのＮ末端から約１１０の残基、例えば、約位置３４１〜４４６ｂ（ＥＵ付番方式）から延長する重鎖免疫グロブリン分子の部分を含む。ＣＨ３ドメインは、通常、抗体のＣ末端部分を形成する。しかしながら、一部の免疫グロブリンにおいては、付加的ドメインが、分子のＣ末端部分を形成するためにＣＨ３ドメインから延長することができる（例えば、ＩｇＭのμ鎖およびＩｇＥのε鎖におけるＣＨ４ドメイン）。一実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドは、ＩｇＧ１分子（例えば、ヒトＩｇＧ１分子）に由来するＣＨ３ドメインを含む。別の実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドは、ＩｇＧ４分子（例えば、ヒトＩｇＧ４分子）に由来するＣＨ３ドメインを含む。
【０１６８】
本明細書において使用される「ＣＬドメイン」という用語は、例えば、約カバット位置１０７Ａ〜２１６から延長する免疫グロブリン軽鎖の第１の（アミノ最末端）定常領域ドメインを含む。ＣＬドメインは、ＶＬドメインに隣接する。一実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドは、カッパ軽鎖（例えば、ヒトカッパ軽鎖）に由来するＣＬドメインを含む。
【０１６９】
上記のように、抗体の可変領域により、抗体は、抗原のエピトープを選択的に認識し、特異的に結合することができる。つまり、抗体のＶＬドメインおよびＶＨドメインは、組み合わされて、三次元抗原結合部位を画定する可変領域（Ｆｖ）を形成する。この四次抗体構造は、Ｙの各アームに存在する抗原結合部位を形成する。より具体的には、抗原結合部位は、各重または軽鎖可変領域上の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によって画定される。
【０１７０】
本明細書において使用される「抗原結合部位」という用語は、細胞表面または可溶性抗原等の抗原）に特異的に結合（と免疫反応する）部位を含む。一実施形態においては、結合部位は、免疫グロブリン重鎖および軽鎖可変領域を含み、これらの可変領域によって形成される結合部位は、抗体の特異性を決定する。抗原結合部位は、ポリペプチドごとに異なる可変領域によって形成される。一実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドは、抗体分子（の少なくとも１つの重鎖または軽鎖ＣＤＲ（例えば、当技術分野で周知であるか、または本明細書において記載されるものの配列）を含む抗原結合部位を含む。別の実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドは、１つまたはそれ以上の抗体分子からの少なくとも２つのＣＤＲを含む抗原結合部位を含む。別の実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドは、１つまたはそれ以上の抗体分子からの少なくとも３つのＣＤＲを含む抗原結合部位を含む。別の実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドは、１つまたはそれ以上の抗体分子からの少なくとも４つのＣＤＲを含む抗原結合部位を含む。別の実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドは、１つまたはそれ以上の抗体分子からの少なくとも５つのＣＤＲを含む抗原結合部位を含む。別の実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドは、抗体分子からの６つのＣＤＲを含む抗原結合部位を含む。対象結合ポリペプチドに含むことができる少なくとも１つのＣＤＲを含む例示的な抗体分子は、当技術分野で周知であり、例示的な分子は、本明細書において記載される。
【０１７１】
本明細書において使用される「ＣＤＲ」または「相補性決定領域」という用語は、重鎖または軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内において見出される非隣接抗原結合部位を意味する。これらの特定の領域は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２，６６０９−６６１６（１９７７）およびＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ．（１９９１）、およびＣｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）、およびＭａｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２−７４５（１９９６）によって記載され、定義は、互いに比較される場合、アミノ酸残基の重複またはサブセットを含む。上記に記載される各参考文献によって定義されるＣＤＲを包含するアミノ酸残基は、比較のために説明される。好ましくは、「ＣＤＲ」という用語は、配列比較に基づくカバットによって定義されるＣＤＲである。
【０１７２】
【化１】
2012515556.tif 000002
本明細書において使用される「フレームワーク領域」または「ＦＲ領域」という用語は、可変領域の一部であるが、ＣＤＲの一部ではないアミノ酸残基を含む（例えば、ＣＤＲのカバット定義を使用して）。したがって、可変領域フレームワークは、約１００〜１２０のアミノ酸の長さであるが、ＣＤＲの外部にあるそれらのアミノ酸のみを含む。重鎖可変領域の具体例およびＫａｂａｔらによって定義されるＣＤＲに関して、フレームワーク領域１は、アミノ酸１〜３０を包含する可変領域のドメインに対応し、フレームワーク領域２は、アミノ酸３６〜４９を包含する可変領域のドメインに対応し、フレームワーク領域３は、アミノ酸６６〜９４を包含する可変領域のドメインに対応し、フレームワーク領域４は、アミノ酸１０３から可変領域の端部までの可変領域のドメインに対応する。軽鎖に対するフレームワーク領域は、各軽鎖可変領域ＣＤＲによって同様に分離される。同様に、ＣｈｏｔｈｉａらまたはＭｃＣａｌｌｕｍらによるＣＦＲの定義を使用して、フレームワーク領域境界は、上述のようなそれぞれのＣＤＲ末端によって分離される。好ましい実施形態においては、ＣＤＲは、カバットによって定義される。
【０１７３】
天然に存在する抗体においては、各単量体抗体上に存在する６つのＣＤＲは、抗体が、水性環境においてその三次元構成を担うため、抗原結合部位を形成するために特異的に位置するアミノ酸の短い非隣接配列である。重および軽可変ドメインの残りは、アミノ酸配列においてより少ない分子間変動性を示し、フレームワーク領域と称される。フレームワーク領域は、β−シート配座を主として採用し、ＣＤＲは、β−シート構造を接続し、場合によっては、その一部を形成するループを形成する。したがって、これらのフレームワーク領域は、鎖間非共有相互作用によって正確な方向に６つのＣＤＲの位置付けるための骨格を形成するように作用する。位置付けられたＣＤＲによって形成される抗原結合部位は、免疫反応性抗原のエピトープに補完的な表面を画定する。この補完的表面は、免疫反応性抗原エピトープへの抗体の非共有結合を促進する。ＣＤＲの位置は、当業者によって容易に認識することができる。
【０１７４】
ある実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドは、選択された抗原との結合ポリペプチドのつながりを提供する少なくとも２つの抗原結合ドメイン（例えば、同じ結合ポリペプチド内における（例えば、一本鎖ポリペプチドのＮおよびＣ末端の両方で）か、または本発明の多重結合タンパク質の各成分結合ポリペプチドに結合される）を含む。抗原結合ドメインは、同じ免疫グロブリン分子に由来する必要はない。この点において、可変領域は、所望の抗原に対して体液性反応を引き起こし、免疫グロブリンを生成するように誘導することができる、任意の種類の動物に由来することができるか、またはしなくてもよい。したがって、可変領域は、例えば、哺乳類由来であり得、例えば、ヒト、マウス、非ヒト霊長類（カニクイザル、マカク等）、オオカミ、ラクダ科の動物（例えば、ラクダ、ラマ、および関連種からの）である場合がある。
【０１７５】
「抗体変異体」または「修飾抗体」という用語は、天然に存在しない、本明細書において記載される少なくとも１つのアミノ酸またはアミノ酸修飾によって天然由来の抗体のものとは異なるアミノ酸配列またはアミノ酸側鎖化学を有する抗体を含む。本明細書において使用される「抗体変異体」という用語は、天然に存在するものとならないように変化される抗体の合成型を含み、例えば、少なくとも２つの重鎖部分を含むが、２つの完全重鎖を含まない抗体（ドメイン欠失抗体またはミニボディ等）、２つまたそれ以上の異なる抗原または単抗原上の異なるエピトープに結合するように変化される多特異性型の抗体（例えば、二重特異性、三重特異性等）、ｓｃＦｖ分子に接合する重鎖分子、一本鎖抗体、ジアボディ、トリアボディ、および変化したエフェクタ機能を有する抗体等がある。
【０１７６】
本明細書において使用される「ｓｃＦｖ分子」という用語は、１つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、またはその一部、および１つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、またはその一部からなる結合分子を含み、各可変ドメイン（またはその一部）は、同じまたは異なる抗体に由来する。ｓｃＦｖ分子は、好ましくは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間に介入するｓｃＦｖリンカーを含む。ＳｃＦｖ分子は、当技術分野で周知であり、例えば、米国特許第５，８９２，０１９号、Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．１９８９．Ｇｅｎｅ  ７７：５１、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．１９８８  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３、Ｐａｎｔｏｌｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９１．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：１０１１７、Ｍｉｌｅｎｉｃ  ｅｔ  ａｌ．１９９１．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５１：６３６３、Ｔａｋｋｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９１．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ４：８３７において記載される。
【０１７７】
本明細書において使用される「ｓｃＦｖリンカー」は、ｓｃＦｖのＶＬおよびＶＨドメインとの間に介入する部分を指す。ｓｃＦｖリンカーは、好ましくは、抗原結合配座におけるｓｃＦｖ分子を維持する。一実施形態においては、ｓｃＦｖリンカーは、ｓｃＦｖリンカーペプチドを含むか、またはそれからなる。ある実施形態においては、ｓｃＦｖリンカーペプチドは、ｇｌｙ−ｓｅｒポリペプチドリンカーを含むか、またはそれからなる。他の実施形態においては、ｓｃＦｖリンカーは、ジスルフィド結合を含む。
【０１７８】
本明細書において使用される「ｇｌｙ−ｓｅｒポリペプチドリンカー」という用語は、グリシンおよびセリン残基からなるペプチドを指す。例示的なｇｌｙ／ｓｅｒポリペプチドリンカーは、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎを含む。一実施形態においては、ｎ＝１である。一実施形態においては、ｎ＝２である。別の実施形態においては、ｎ＝３、すなわち、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３である。別の実施形態においては、ｎ＝４、すなわち、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４である。別の実施形態においては、ｎ＝５である。さらに別の実施形態においては、ｎ＝６である。別の実施形態においては、ｎ＝７である。さらに別の実施形態においては、ｎ＝８である。別の実施形態においては、ｎ＝９である。さらに別の実施形態においては、ｎ＝１０である。別の例示的なｇｌｙ／ｓｅｒポリペプチドリンカーは、アミノ酸配列Ｓｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎを含む。一実施形態においては、ｎ＝１である。一実施形態においては、ｎ＝２である。好ましい実施形態においては、ｎ＝３である。別の実施形態においては、ｎ＝４である。別の実施形態においては、ｎ＝５である。さらに別の実施形態においては、ｎ＝６である。
【０１７９】
本明細書において使用される「天然システイン」という用語は、ポリペプチドの特定のアミノ酸部分で天然に存在する、人工的に修飾、導入、または変化されていないシステインアミノ酸を指す。「操作システイン残基、またはその類似体」または「操作システイン、またはその類似体」という用語は、システイン残基、またはその類似体をその位置に天然に含有しないポリペプチドのアミノ酸部分に、合成の手段（例えば、組み換え手法、インビトロペプチド合成、ペプチドの酵素的または化学的結合、またはこれらの手法のいくつかの組み合わせ）で導入される、非天然のシステイン残基またはシステイン類似体（例えば、チアゾリン−４−カルボン酸およびチアゾリジン−４−カルボン酸（チオプロリン、Ｔｈ）等のチオール含有類似体）を指す。
【０１８０】
本明細書において使用される「ジスルフィド結合」という用語は、２つの硫黄原子の間に形成される共有結合を含む。アミノ酸システインは、ジスルフィド結合を形成するか、第２のチオール基に架橋することができるチオール基を含む。大半の天然に存在するＩｇＧ分子では、ＣＨ１およびＣＬ領域は、天然ジスルフィド結合によって結合され、２つの重鎖は、カバット付番方式を使用すると２３９および２４２（ＥＵ付番方式では位置２２６または２２９）に対応する位置で２つの天然ジスルフィド結合によって結合される。
【０１８１】
本明細書において使用される「結合システイン」という用語は、第２の天然もしくは操作システイン、または同じもしくは異なるポリペプチド内に存在する他の残基とのジスルフィド結合または他の共有結合を形成するポリペプチド内における天然または操作システイン残基を指す。「鎖内結合システイン」は、同じポリペプチド内に存在する第２のシステインに共有結合（すなわち、鎖内ジスルフィド結合）される結合システインを指すものとする。「鎖間結合システイン」は、異なるポリペプチド内に存在する第２のシステインに共有結合（すなわち、鎖間ジスルフィド結合）される結合システインを指すものとする。
【０１８２】
本明細書において使用される「遊離システイン」という用語は、大幅に縮小した形で存在するポリペプチド配列（および類似体、またはその模倣剤、例えば、チアゾリン−４−カルボン酸およびチアゾリジン−４カルボン酸（チオプロリン、Ｔｈ））内における天然または操作システインアミノ酸残基を指す。遊離システインは、好ましくは、本発明のエフェクタ部分で修飾することが可能である。
【０１８３】
「チオール修飾試薬」という用語は、結合ポリペプチド（例えば、結合ポリペプチドのポリペプチドリンカー内）において操作システイン残基、またはその類似体のチオール基と選択的に反応することができ、それによって、結合ポリペプチドへのエフェクタ部分の部位特異的化学添加または架橋のための手段を提供し、それによって修飾結合ポリペプチドを形成する化学物質を指すものとする。好ましくは、チオール修飾試薬は、遊離システイン残基に存在するチオールまたはスルフヒドリル官能基を活用する。例示的なチオール修飾試薬としては、マレイミド、アルキルおよびハロゲン化アリール、α−ハロアシル、およびピリジルジスルフィドを含む。
【０１８４】
「機能的な部分」という用語は、好ましくは、所望の機能を結合ポリペプチドに追加する部分を含む。好ましくは、機能は、ポリペプチドの内因性の所望の活性、例えば、分子の抗原結合活性を有意に変化させずに付加される。本発明の結合ポリペプチドは、同じまたは異なり得る１つまたはそれ以上の機能的な部分を含むことができる。有用な機能的な部分の例としては、エフェクタ部分、親和性部分、および遮断部分が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８５】
例示的な遮断部分は、グリコシル化の低下が、例えば、ポリペプチドをグリコシル化するグリコシダーゼの能力を遮断することによって生じるように、十分な立体容積および／または電荷の部分を含む。遮断部分は、例えば、受容体または補体タンパク質に結合するＦｃ領域の能力を阻害することによって、エフェクタ機能をさらに、または代替として低下させることができる。好ましい遮断部分としては、システイン付加物、シスチン、混合ジスルフィド付加物、およびＰＥＧ部分を含む。例示的な検出可能な部分としては、蛍光部分、放射性同位体部分、Ｘ線不透過性部分等を含む。
【０１８６】
化学部分の共役に関して、「結合部分」という用語は、結合ポリペプチドの残余に機能的な部分を結合させることが可能な部分を含む。結合部分は、それが開裂可能または非開裂可能となるように選択することができる。開裂不可能な結合部分は、概して、高い系統的安定性を有するが、好ましくない薬物動態も有する場合がある。
【０１８７】
「スペーサ部分」という用語は、空間を分子に導入するよう設計される非タンパク質部分である。一実施形態においては、スペーサ部分は、炭素、酸素、窒素、硫黄等から選択される０〜１００個の原子の任意で置換された鎖であり得る。一実施形態においては、スペーサ部分は、それが水溶性となるように選択される。別の実施形態においては、スペーサ部分は、ポリアルキレングリコール、例えば、ポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコールである。
【０１８８】
「ペグ化部分」または「ＰＥＧ部分」という用語は、カップリング剤、またはカップリングまたは活性化部分（例えば、チオール、トリフラート、トレシレート、アジリジン、オキシラン、または好ましくは、マレイミド部分、例えば、ＰＥＧ−マレイミド）を有する誘導体化を伴う、または伴わない、ポリアルキレングリコール化合物、またはその誘導体を含む。他の適切なポリアルキレングリコール化合物としては、マレイミドモノメトキシＰＥＧ、活性ＰＥＧポリプロピレングリコールが含まれるが、以下の荷電または中性ポリマーも含む：デキストラン、コロミン酸、または他の炭水化物ベースのポリマー、アミノ酸のポリマー、およびビオチン誘導体。
【０１８９】
本明細書において使用される「エフェクタ部分」（Ｅ）という用語は、生物学的または他の機能活性を有する診断用および治療薬（例えば、タンパク質、核酸、脂質、薬物部分、およびそれらの断片）を含むことができる。例えば、結合ポリペプチドに共役されるエフェクタ部分を含む結合ポリペプチドは、非共役ポリペプチドと比較して、少なくとも１つの付加的機能または特性を有する。例えば、結合ポリペプチドへの細胞毒性薬物部分（例えば、エフェクタ部分）の（例えば、そのポリペプチドリンカーを介する）共役は、第２の機能として、（すなわち、抗原結合に加えて）薬剤細胞毒性を有する修飾ポリペプチドの形成をもたらす。別の例においては、第１の結合ポリペプチドへの第２の結合ポリペプチドの共役は、付加的結合特性を与えることができる。
【０１９０】
エフェクタ部分が、遺伝的にコードされた治療用もしくは診断用タンパク質または核酸である一態様においては、エフェクタ部分は、当技術分野で周知のペプチド合成または組み換えＤＮＡ方法のいずれかによって合成または発現することができる。エフェクタ部分が、非遺伝的にコードされたペプチド、または薬物部分である別の態様においては、エフェクタ部分は、人工的に合成するか、または天然源から精製することができる。
【０１９１】
本明細書において使用される「薬物部分」という用語は、抗炎症性、抗癌性、抗感染性（例えば、抗真菌性、抗菌性、駆虫性、抗ウイルス性等）、および麻酔性治療薬を含む。さらなる実施形態においては、薬物部分は、抗癌性または細胞毒性薬である。適合性薬物部分は、プロドラッグも含むことができる。
【０１９２】
本明細書において使用される「プロドラッグ」という用語は、親薬物と比較して活性、反応性、あるいは副作用を起こす傾向が低く、酵素的に活性化されるか、またはそうでなければインビボにおいてより活性を有する型に変換されることが可能な薬学的活性薬剤の前駆体または誘導体型を指す。本発明に適合するプロドラッグとしては、リン酸塩含有プロドラッグ、アミノ酸含有プロドラッグ、チオリン酸塩含有プロドラッグ、硫酸塩含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、β−ラクタム含有プロドラッグ、任意で置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグまたは任意で置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、５−フルオロシトシン、およびより活性を有する細胞毒性遊離薬物に変換することができる他の５−フルオロウリジンプロドラッグが挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、化合物の反応を、本発明の修飾結合タンパク質を調製する目的に対してより便利にするために、所望の薬物部分またはそのプロドラッグに対して化学修飾を行うことができる。薬物部分としては、本明細書において記載される薬物部分の誘導体、薬学的に許容される塩、エステル、アミド、およびエーテルも含まれる。誘導体は、特定の薬物の所望の治療活性を改善するか、または有意に低下させない、本明細書において認識される薬剤に対する修飾を含む。
【０１９３】
本明細書において使用される「抗癌剤」という用語は、腫瘍性または腫瘍細胞の成長および／または増殖に悪影響をもたらし、悪性腫瘍を減少、阻害、または破壊するように作用する場合がある薬剤を含む。そのような薬剤の例としては、細胞増殖抑制剤、アルキル化剤、抗生物質、細胞毒性ヌクレオシド、チューブリン結合剤、ホルモンおよびホルモン拮抗剤等が挙げられるが、これらに限定されない。免疫反応性細胞または悪性細胞の成長を遅延または減速させるように作用するいかなる薬剤も、本発明の範囲内にある。
【０１９４】
「親和性タグ」または「親和性部分」は、結合ポリペプチド、ポリペプチドリンカー、またはエフェクタ部分の１つまたはそれ以上に付着する化学部分であり、精製手順の間、他の成分からのその分離を容易にする。例示的な親和性ドメインとしては、Ｈｉｓタグ、キチン結合ドメイン、マルトース結合ドメイン、ビオチン等が含まれる。
【０１９５】
「親和性樹脂」は、反応混合物の他の成分から親和性ドメインに結合したタンパク質の分離を容易にするために、高い親和性を有する親和性ドメインに結合することが可能な化学的表面である。親和性樹脂は、固体支持体、またはその一部の表面に被覆することができる。代替として、親和性樹脂は、固体支持体を含むことができる。そのような固体支持体としては、適切に修飾されたクロマトグラフィカラム、マイクロタイタープレート、ビーズ、または生体素子（例えば、ガラスウェハ）を含めることができる。例示的な親和性樹脂は、ニッケル、キチン、アミラーゼ等から構成される。
【０１９６】
本明細書において使用される「ベクター」または「発現ベクター」は、所望のポリヌクレオチドを導入し、細胞において所望のポリヌクレオチドを発現するための媒体として、本発明に従って使用されるベクターを意味する。当業者に周知のように、そのようなベクターは、プラスミド、ファージ、ウイルス、およびレトロウイルスからなる群から容易に選択することができる。一般的に、本発明に適合するベクターは、選択マーカー、所望の遺伝子のクローン作成を用意にする適切な制限部位、および真核または原核細胞に侵入および／または複製する能力を含む。
【０１９７】
本発明の目的のために、多数の発現ベクター系を使用することができる。例えば、ベクターの１つのクラスは、ウシ乳頭腫ウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクチニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶまたはＭＯＭＬＶ）、またはＳＶ４０ウイルス等の動物ウイルスに由来するＤＮＡ要素を使用する。他は、内部リボソーム結合部位内におけるポリシストロン系の使用を含む。例示的なベクターには、米国特許第６，１５９，７３０号および同第６，４１３，７７７号、ならびに米国特許出願第２００３０１５７６４１Ａ１号に記載されるものが含まれる。さらに、ＤＮＡを染色体に統合した細胞は、トランスフェクト宿主細胞の選択を可能にする１つまたはそれ以上のマーカーを導入することによって選択することができる。マーカーは、栄養要求性宿主への原栄養性、または殺生物剤耐性（例えば、抗生物質）、または銅等の重金属に対する耐性を提供することができる。選択可能なマーカー遺伝子は、発現されるＤＮＡ配列に直接結合されるか、または同時形質転換によって同じ細胞に導入することができる。一実施形態においては、誘導性発現系を使用することができる。付加的要素も、ｍＲＮＡの最適な合成に必要となる場合がある。これらの要素は、シグナル配列、接合シグナル、および転写プロモータ、エンハンサ、および終結シグナルを含むことができる。一実施形態においては、分泌シグナル、例えば、幾つかのよく特徴付けられた細菌性リーダーペプチド（例えば、ｐｅｌＢ、ｐｈｏＡ、またはｏｍｐＡ）のいずれかも、ポリペプチドの最適な分泌を得るために、本発明のポリペプチドのＮ末端とインフレームで融合することができる（Ｌｅｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８），Ｎａｔｕｒｅ，３３１：５４３、Ｂｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０：１０４１、Ｍｕｌｌｉｎａｘ  ｅｔ  ａｌ，（１９９０）．ＰＮＡＳ，８７：８０９５）。
【０１９８】
「宿主細胞」という用語は、組み換えＤＮＡ手法を使用して構築され、少なくとも１つの異種遺伝子をコードするベクターによって形質転換された細胞を指す。組み換え宿主からのタンパク質の単離のためのプロセスの説明において、「細胞」または「細胞培養」という用語は、他に明確に特定されない限り、同義的に使用され、タンパク質源を意味する。言い換えれば、「細胞」からのタンパク質の回収は、遠心沈殿した全細胞、または培地および細胞浮遊液の両方を含有する細胞培養からのいずれかを意味し得る。タンパク質発現に対して使用される宿主細胞株は、最も好ましくは、哺乳類由来のものであり、当業者は、その中で発現される所望の遺伝子産物に対して最も適切な特定の宿主細胞株を選択的に判定する能力を有すると考えられる。例示的な宿主細胞株しては、ＤＧ４４およびＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣株、ＤＨＦＲマイナス）、ＨＥＬＡ（ヒト子宮頸癌）、ＣＶＩ（サル腎臓株）、ＣＯＳ（ＳＶ４０Ｔ抗原を有するＣＶＩの誘導体）、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞）ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎臓株）、ＳＰ２／Ｏ（マウス骨髄腫）、Ｐ３ｘ６３−Ａｇ３．６５３（マウス骨髄腫）、ＢＦＡ−１ｃ１ＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）、および２９３（ヒト腎臓）が挙げられるが、これらに限定されない。ＣＨＯ細胞が、特に好ましい。宿主細胞株は、通常、商業サービスであるＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、または既刊文献から入手可能である。本発明のポリペプチドは、細菌もしくは酵母等の非哺乳類細胞、または植物細胞においても発現することができる。この点において、当然のことながら、細菌等の様々な単細胞性非哺乳類微生物、すなわち、培養または発酵において成長することが可能なそれらも形質転換することができる。形質転換を起こしやすい細菌としては、大腸菌またはサルモネラ菌の株、枯草菌等のバシラス科、肺炎球菌、連鎖球菌、およびインフルエンザ菌等の腸内細菌科のメンバーが含まれる。細菌において発現される場合、ポリペプチドは、通常、封入体の一部となることがさらに認識される。ポリペプチドは、単離、精製、その後、機能分子に組み立てられなければならない。
【０１９９】
原核生物に加えて、真核微生物を使用することもできる。サッカロマイセスセレヴィシエ、すなわち一般的なパン酵母は、真核微生物の間で最も一般的に使用されるが、ピキアパストリスを含む、多数の他の株が、一般に入手可能である。サッカロミセスにおける発現に対して、例えば、プラスミドＹＲｐ７が、（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７９），Ｎａｔｕｒｅ，２８２：３９、Ｋｉｎｇｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７９），Ｇｅｎｅ，７：１４１、Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８０），Ｇｅｎｅ，１０：１５７）一般的に使用される。このプラスミドは、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６またはＰＥＰ４−１（Ｊｏｎｅｓ，（１９７７），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８５：１２）等の、トリプトファンにおいて成長する能力を欠く酵母の変異株に対する選択マーカーを提供するＴＲＰ１遺伝子を既に含有する。そして、酵母宿主細胞ゲノムの特性としてのｔｒｐｌ病変の存在は、トリプトファンの非存在下における成長による形質転換を検出するための効果的な環境を提供する。
【０２００】
インビトロ産生は、大量の本発明の所望の変化した結合ポリペプチドを得るための規模拡大を可能にする。組織培養条件下での哺乳類細胞培養のための方法は、当技術分野で周知であり、例えば、エアリフト反応器または継続的撹拌式反応器における同種浮遊培養、または例えば、中空糸、マイクロカプセル中、アガロースマイクロビーズまたはセラミックカートリッジ上での固定化または封入細胞培養を含む。必要および／または好ましい場合、ポリペプチドの溶液は、通常のクロマトグラフィ方法、例えば、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）、ＤＥＡＥ−セルロース上でのクロマトグラフィ、または親和性クロマトグラフィによって精製することができる。
【０２０１】
本明細書において使用される「腫瘍関連抗原」は、概して、腫瘍細胞と関連する、すなわち、正常細胞と比較して同じまたはそれ以上の程度で生じる任意の抗原を意味する。より一般的に、腫瘍関連抗原は、非悪性細胞上でのその発現に関係なく、腫瘍性細胞での免疫反応性抗体の局所化を提供する任意の抗原を含む。そのような抗原は、比較的腫瘍特異的であり、それらの発現において、悪性細胞の表面に限られる可能性がある。代替として、そのような抗原は、悪性および非悪性細胞の両方の上で見出すことがある。ある実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドは、好ましくは、腫瘍関連抗原に結合する。したがって、本発明の結合ポリペプチドは、腫瘍関連分子と反応する多くの抗体のいずれか１つから得、生成され、または加工することができる。
【０２０２】
本明細書において使用される「悪性腫瘍」という用語は、非良性腫瘍または癌を指す。本明細書において使用される「癌」という用語は、無秩序または無制御な細胞成長によって特徴付けられる悪性腫瘍を含む。例示的な癌としては、癌腫、肉腫、白血病、およびリンパ腫が含まれる。「癌」という用語は、原発性悪性腫瘍（例えば、細胞が、本来の腫瘍の部位以外に対象の体における部位に移動していないもの）および二次性悪性腫瘍（例えば、本来の腫瘍の部位と異なる二次部位への腫瘍細胞の移動である転移から生じるもの）を含む。
【０２０３】
本明細書において使用される「結合ポリペプチドの投与が有効である対象」という語句は、例えば、本発明の結合ポリペプチドによって認識される抗原の検出（例えば、診断法）に使用される結合ポリペプチドの投与、および／または結合ポリペプチドによって認識される標的を減少または排除するための結合ポリペプチドでの治療が有効である、哺乳類対象等の対象を含む。例えば、一実施形態においては、対象は、循環または血清からの可溶性または微粒子分子の減少または排除（例えば、毒素または病原体）、または標的を発現する細胞（例えば、腫瘍細胞）の集団の減少または排除が有効であり得る。上記のように、結合ポリペプチドは、非共役型で使用することができるか、または該対象に投与するための修飾結合ポリペプチドを形成するために、例えば、薬物、プロドラッグ、または同位体に共役することができる。
【０２０４】
「ペグ化」、「ポリエチレングリコール」、または「ＰＥＧ」という用語は、カップリング剤、またはカップリングもしくは活性化部分（例えば、チオール、トリフラート、トレシレート、アジリジン、オキシラン、または好ましくは、マレイミド部分、例えば、ＰＥＧ−マレイミド）を有する誘導体化を伴う、または伴わない、ポリアルキレングリコール化合物、またはその誘導体を含む。他の適切なポリアルキレングリコール化合物としては、これらに限定されないが、マレイミドモノメトキシＰＥＧ、活性ＰＥＧポリプロピレングリコールが含まれるが、以下の荷電または中性ポリマーも含む：  デキストラン、コロミン酸、または他の炭水化物ベースのポリマー、アミノ酸のポリマー、およびビオチン誘導体。
【０２０５】
（ＩＩ）親Ｆｃポリペプチド
多様Ｆｃポリペプチドは、当技術分野で周知である、親または出発Ｆｃポリペプチドに由来し得る。好ましい実施形態においては、親Ｆｃポリペプチドは、抗体として、そして好ましくは、例えば、サブタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４のＩｇＧ免疫グロブリン、そして好ましくはサブタイプＩｇＧ１もしくはＩｇＧ４のＩｇＧ免疫グロブリンである。親Ｆｃポリペプチドは、免疫グロブリンに由来するＦｃ領域を含むが、任意に、Ｆｃ領域に機能的に結合させるか、または融合される結合部位をさらに含み得る。好ましい実施形態においては、前述のポリペプチドは、リガンド、サイトカイン、受容体、細胞表面抗原、または癌細胞抗原等の抗原に結合する。本明細書の実施例は、ＩｇＧ抗体を使用するが、本方法は、いかなるＦｃポリペプチド内のＦｃ領域に同等に適用され得ることを理解されよう。Ｆｃポリペプチドが抗体である場合、抗体は、合成されるか、（例えば、血清に）天然に由来するか、細胞株（例えば、ハイブリドーマ）によって産生されるか、または遺伝子導入生物において産生され得る。
【０２０６】
ある実施形態においては、本発明のＦｃポリペプチドは、Ｆｃ領域の単一のＦｃ部分を含む。他の実施形態においては、Ｆｃポリペプチドは、ｄｃＦｃポリペプチドである。ｄｃＦｃポリペプチドとは、二量体Ｆｃ（またはｄｃＦｃ）領域を含むポリペプチドを指す。他の実施形態においては、本発明のＦｃポリペプチドは、ｓｃＦｃポリペプチドである。本明細書において使用されるｓｃＦｃポリペプチドという用語は、一本鎖Ｆｃ（ｓｃＦｃ）領域を含むポリペプチド、例えば、Ｆｃ部分の少なくとも２つの間に介入される柔軟ポリペプチドリンカー等を介して遺伝的に融合される、少なくとも２つのＦｃ部分を含むｓｃＦｃポリペプチドを指す。例示的なｓｃＦｃ領域は、２００８年５月１４日出願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００６２６０号に開示されており、この内容は、参照することにより、本明細書に組み込まれる。
【０２０７】
ある実施形態においては、本発明のポリペプチドは、同じ、または実質的に同じ配列組成のＦｃ部分を含むＦｃ領域（本明細書において「ホモマーＦｃ領域」と称される）を含むことができる。他の実施形態においては、本発明のポリペプチドは、異なる配列組成である少なくとも２つのＦｃ部分を含むＦｃ領域（すなわち、本明細書において「異種Ｆｃ領域」と称される）を含むことができる。ある実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドは、少なくとも１つの挿入またはアミノ酸置換を含むＦｃ領域を含む。１つの例示的な実施形態においては、異種Ｆｃ領域は、第１のＦｃ部分においてアミノ酸置換を含むが、第２のＦｃ部分には含まない。
【０２０８】
一実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドは、本明細書に記載されるＦｃ部分から独立して選択されるその構成Ｆｃ部分の２つまたそれ以上を有するＦｃ領域を含むことができる。一実施形態においては、Ｆｃ部分は同じである。別の実施形態においては、Ｆｃ部分の少なくとも２つは、異なる。例えば、本発明のＦｃポリペプチドのＦｃ部分は、同じ数のアミノ酸残基を含むか、またはそれらは、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基（例えば、約５つのアミノ酸残基（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つのアミノ酸残基）、約１０の残基、約１５の残基、約２０の残基、約３０の残基、約４０の残基、または約５０の残基）の長さにおいて異なり得る。さらに他の実施形態においては、Ｆｃ部分は、１つまたはそれ以上のアミノ酸位置において、配列が異なり得る。例えば、Ｆｃ部分の少なくとも２つは、約５のアミノ酸位置（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つのアミノ酸部分）、約１０の位置、約１５の位置、約２０の位置、約３０の位置、約４０の位置、または約５０の位置）で異なり得る。
【０２０９】
親Ｆｃポリペプチドは、共に集合させ、または他のポリペプチドと集合させて、多重結合Ｆｃポリペプチドまたはタンパク質（本明細書において「多重体」とも称される）を形成することができる。本発明の多重Ｆｃポリペプチドまたはタンパク質は、本発明の少なくとも１つの親Ｆｃポリペプチドを含む。したがって、親ポリペプチドには、単量体および多重体（例えば、二量体、三量体、四量体、および六量体）Ｆｃポリペプチドまたはタンパク質等を限定することなく含む。ある実施形態においては、該多重体の構成Ｆｃポリペプチドは、同じである（すなわち、ホモマー多重体、例えば、ホモ二量体、ホモ三量体、ホモ四量体）。他の実施形態においては、本発明の多重体タンパク質の少なくとも２つの構成Ｆｃポリペプチドは、異なる（すなわち、異種多重体、例えば、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、ヘテロ四量体）。ある実施形態においては、Ｆｃポリペプチドの少なくとも２つは、二量体を形成することが可能である。
【０２１０】
別の実施形態においては、本発明のＦｃポリペプチドは、二量体Ｆｃ領域（ｄｏｍｅｒを形成する１本鎖ポリペプチドあるいは二量体を形成する２本鎖ポリペプチドのいずれか）を含み、分子に存在する生物活性のある部分に対しては単量体である。例えば、そのようなＦｃ構造体は、１つの生物活性のある部分のみを含むことができる。１本または２本鎖安定化Ｆｃ単量体構造体は、例えば、標的分子の架橋結合が望ましくない場合（例えば、ある抗体、例えば、抗−ＣＤ４０抗体の場合）、望ましい。別の実施形態においては、そのようなＦｃ構造体は、２つの異なる生物活性のある部分を含むことができる。さらに別の実施形態においては、そのようなＦｃ構造体は、２つの同じ生物活性のある部分を含むことができる。さらに別の実施形態においては、そのようなＦｃ構造体は、３つ以上の同じ生物活性のある部分を含むことができる。
【０２１１】
Ａ．Ｆｃ部分
本発明の親Ｆｃポリペプチドを産生するために有用なＦｃ部分は、多数の異なる源から得ることができる。好ましい実施形態においては、結合ポリペプチドのＦｃ部分は、ヒト免疫グロブリンに由来する。しかしながら、当然のことながら、Ｆｃ部分は、例えば、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット）または非ヒト霊長類（例えば、チンパンジー、マカク）種を含む、別の哺乳類種の免疫グロブリンに由来することができる。さらに、Ｆｃは、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＥを含む、任意の免疫グロブリンクラス、ならびにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む、任意の免疫グロブリンイソタイプに由来することができる。好ましい実施形態においては、ヒトイソタイプＩｇＧ１またはＩｇＧ４が使用される。
【０２１２】
様々なＦｃ部分遺伝子配列（例えば、ヒト定常領域遺伝子配列）は、公的にアクセス可能な寄託の形で入手可能である。特定のエフェクタ機能を有するか（または特定のエフェクタ機能を欠く）、または免疫原性を低下させる特定の修飾を有するＦｃ部分配列を含む定常領域ドメインを選択することができる。抗体および抗体コード遺伝子の多くの配列は公表され、適切なＦｃ部分配列（例えば、ヒンジ、ＣＨ２、および／またはＣＨ３配列、またはそれらの一部）は、当技術分野において承認されている手法を使用してこれらの配列から導くことができる。前述の方法のいずれかを使用して得られた遺伝物質は、次いで、本発明のポリペプチドを得るために変化または合成することができる。本発明の範囲は、定常領域ＤＮＡ配列の対立遺伝子、変異体、および変異体を包含することがさらに認識される。
【０２１３】
Ｆｃ部分配列は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、および対象のドメインを増幅するよう選択されるプライマーを使用してクローン化することができる。抗体からＦｃ部分配列をクローン化するためには、ｍＲＮＡが、ハイブリドーマ、脾臓、またはリンパ細胞から単離され、ＤＮＡへ逆転写され、抗体遺伝子はＰＣＲによって増幅することができる。ＰＣＲ増幅方法は、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、同第４，８００，１５９号、同第４，９６５，１８８号、および例えば、「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）、Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．１９８９．Ｇｅｎｅ  ７７：５１、Ｈｏｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９３．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：２７０）において詳述される。ＰＣＲは、コンセンサス定常領域プライマー、または公表された重鎖または軽鎖ＤＮＡおよびアミノ酸配列に基づくより特異的なプライマーによって開始することができる。上記のように、ＰＣＲを使用して、抗体軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡクローンを単離することもできる。この場合、ライブラリは、コンセンサスプライマー、またはマウス定常領域プローブ等のより大きい同種プローブによってスクリーニングすることができる。抗体遺伝子の増幅に適切な多数のプライマーセットが、当技術分野で周知である（例えば、精製抗体のＮ末端配列に基づく５′プライマー（Ｂｅｎｈａｒ  ａｎｄ  Ｐａｓｔａｎ．１９９４．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７：１５０９）、ｃＤＮＡ端部の迅速増幅（Ｒｕｂｅｒｔｉ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．１９９４．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １７３：３３）、抗体リーダー配列（Ｌａｒｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．１９８９  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１６０：１２５０）。抗体配列のクローン作成は、Ｎｅｗｍａｎらの１９９５年１月２５日出願の米国特許第５，６５８，５７０号においてさらに記載され、この内容は、参照することにより、本明細書に組み込まれる。
【０２１４】
本発明の親Ｆｃポリペプチドは、単一のＦｃ部分または複数のＦｃ部分を含むことができる。２つまたはそれ以上のＦｃ部分（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、またはそれ以上のＦｃ部分、正確に折り畳まれたＦｃ領域（例えば、二量体Ｆｃ領域または１本鎖Ｆｃ領域（ｓｃＦｃ）を形成するように関連する少なくとも２つのＦｃ部分）がある。一実施形態においては、Ｆｃ部分は、異なる型のものであり得る。一実施形態においては、親Ｆｃポリペプチドに存在する少なくとも１つのＦｃ部分は、ヒンジドメイン、またはその一部を含む。別の実施形態においては、親Ｆｃポリペプチドは、少なくとも１つのＣＨ２ドメイン、またはその一部を含む少なくとも１つのＦｃ部分を含む。別の実施形態においては、親Ｆｃポリペプチドは、少なくとも１つのＣＨ３ドメイン、またはその一部を含む少なくとも１つのＦｃ部分を含む。別の実施形態においては、親Ｆｃポリペプチドは、少なくとも１つのＣＨ４ドメイン、またはその一部を含む少なくとも１つのＦｃ部分を含む。別の実施形態においては、親Ｆｃポリペプチドは、少なくとも１つのヒンジドメイン、またはその一部、および少なくとも１つのＣＨ２ドメイン、またはその一部（例えば、ヒンジ−ＣＨ２の方向における）を含む少なくとも１つのＦｃ部分を含む。別の実施形態においては、親Ｆｃポリペプチドは、少なくとも１つのＣＨ２ドメイン、またはその一部、および少なくとも１つのＣＨ３ドメイン、またはその一部（例えば、ＣＨ２−ＣＨ３の方向における）を含む少なくとも１つのＦｃ部分を含む。別の実施形態においては、親Ｆｃポリペプチドは、例えば、ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３、ヒンジ−ＣＨ３−ＣＨ２、またはＣＨ２−ＣＨ３−ヒンジの方向における、少なくとも１つのヒンジドメイン、またはその一部、少なくとも１つのＣＨ２ドメイン、またはその一部、および少なくとも１つのＣＨ３ドメイン、またはその一部を含む少なくとも１つのＦｃ部分を含む。
【０２１５】
ある実施形態においては、親Ｆｃポリペプチドは、１つまたはそれ以上の免疫グロブリン重鎖に由来する少なくとも１つの完全Ｆｃ領域を含む（例えば、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインを含む、Ｆｃ部分であるが、これらは同じ抗体に由来する必要はない）。他の実施形態においては、親Ｆｃポリペプチドは、１つまたはそれ以上の免疫グロブリン重鎖に由来する少なくとも２つの完全Ｆｃ領域を含む。好ましい実施形態においては、完全Ｆｃ部分は、ヒトＩｇＧ免疫グロブリン重鎖（例えば、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４）に由来する。
【０２１６】
別の実施形態においては、親Ｆｃポリペプチドは、完全ＣＨ３ドメイン（ＥＵ付番による抗体Ｆｃ領域のアミノ酸約３４１〜４３８）を含む少なくとも１つのＦｃ部分を含む。別の実施形態においては、親Ｆｃポリペプチドは、完全ＣＨ２ドメイン（ＥＵ付番による抗体Ｆｃ領域のアミノ酸約２３１〜３４０）を含む少なくとも１つのＦｃ部分を含む。別の実施形態においては、親Ｆｃポリペプチドは、少なくともＣＨ３ドメイン、およびヒンジ領域（ＥＵ付番による抗体Ｆｃ領域のアミノ酸約２１６〜２３０）の少なくとも１つ、およびＣＨ２ドメインを含む少なくとも１つのＦｃ部分を含む。一実施形態においては、親Ｆｃポリペプチドは、ヒンジおよびＣＨ３ドメインを含む少なくとも１つのＦｃ部分を含む。別の実施形態においては、親Ｆｃポリペプチドは、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインを含む少なくとも１つのＦｃ部分を含む。好ましい実施形態においては、Ｆｃ部分は、ヒトＩｇＧ免疫グロブリン重鎖に由来する。
【０２１７】
Ｆｃ部分を構成する定常領域ドメイン、またはその一部は、異なる免疫グロブリン分子に由来することができる。例えば、親Ｆｃポリペプチドは、ＩｇＧ４分子に由来するヒンジおよび／またはＣＨ２ドメイン、もしくはその一部、ならびにＩｇＧ１分子に由来するＣＨ３ドメイン、もしくはその一部を含むことができる。別の実施形態においては、親Ｆｃポリペプチドは、キメラヒンジドメインを含みことができる。例えば、キメラヒンジは、部分的にＩｇＧ１部分、部分的にＩｇＧ３部分に由来するヒンジドメインを含むことができる。別の実施形態においては、キメラヒンジは、ＩｇＧ１分子に由来する中部ヒンジドメインおよびＩｇＧ４分子に由来する下部ヒンジドメインを含む。
【０２１８】
本明細書において説明されるように、当業者にとって当然のことながら、親Ｆｃ部分も、天然に存在する免疫グロブリン分子の対応するＦｃ部分と同一であり得るか、またはアミノ酸配列において異なるように、変化させることができる。ある実施形態においては、親Ｆｃポリペプチドは、例えば、アミノ酸変異（例えば、付加、欠失、または置換）によって変化する。例えば、親Ｆｃポリペプチドは、Ｆｃ部分が由来する野生型Ｆｃと比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換を有するＦｃ部分であり得る。例えば、Ｆｃ部分がヒトＩｇＧ１抗体に由来する場合、変異体は、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域の対応する位置にある野生型アミノ酸と比較して、少なくとも１つのアミノ酸変異（例えば、置換）を含む。
【０２１９】
アミノ酸置換は、その残基が、抗体におけるＦｃ領域において与えられる位置番号（ＥＵ付番慣例を使用して記載される）に「対応する」と見なされるＦｃ部分内の位置に位置することができる。当業者は、Ｆｃ部分における位置に「対応する」ＥＵ番号を判定するためにアラインメントを容易に作成することができる。
【０２２０】
一実施形態においては、置換は、ヒンジドメイン、またはその一部に位置するアミノ酸位置におけるものである。別の実施形態においては、置換は、ＣＨ２ドメイン、またはその一部に位置するアミノ酸位置におけるものである。別の実施形態においては、置換は、ＣＨ３ドメイン、またはその一部に位置するアミノ酸位置におけるものである。別の実施形態においては、置換は、ＣＨ４ドメイン、またはその一部に位置するアミノ酸位置におけるものである。
【０２２１】
ある実施形態においては、親Ｆｃポリペプチドは、１を超えるアミノ酸置換を含む。親Ｆｃポリペプチドは、例えば、野生型Ｆｃ領域と比較して、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、またはそれ以上のアミノ酸置換を含むことができる。好ましくは、アミノ酸置換は、少なくとも１アミノ酸部分、またはそれ以上、例えば、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、またはそれ以上のアミノ酸位置、またはそれ以上の間隔で互いに空間的に位置する。より好ましくは、操作アミノ酸は、少なくとも５、１０、１５、２０、または２５のアミノ酸位置、またはそれ以上の間隔で互いに離れて空間的に位置する。
【０２２２】
ある実施形態においては、置換は、野生型Ｆｃ部分を含むＦｃ領域によって与えられた少なくとも１つのエフェクタ機能の変化（例えば、Ｆｃ受容体（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、もしくはＦｃγＲＩＩＩ）、または補体タンパク質（例えば、Ｃ１ｑ）に結合する、または抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、食作用、もしくは補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を誘引するＦｃ領域の能力の低下）を与える。
【０２２３】
親Ｆｃポリペプチドは、エフェクタ機能の変化を与えることが周知の当技術分野において承認されている置換を使用することができる。具体的に、本発明の親Ｆｃポリペプチドは、例えば、国際公開第ＷＯ８８／０７０８９Ａ１号、同第ＷＯ９６／１４３３９Ａ１号、同第ＷＯ９８／０５７８７Ａ１号、同第ＷＯ９８／２３２８９Ａ１号、同第ＷＯ９９／５１６４２Ａ１号、同第ＷＯ９９／５８５７２Ａ１号、同第ＷＯ００／０９５６０Ａ２号、同第ＷＯ００／３２７６７Ａ１号、同第ＷＯ００／４２０７２Ａ２号、同第ＷＯ０２／４４２１５Ａ２号、同第ＷＯ０２／０６０９１９Ａ２号、同第ＷＯ０３／０７４５６９Ａ２号、同第ＷＯ０４／０１６７５０Ａ２号、同第ＷＯ０４／０２９２０７Ａ２号、同第ＷＯ０４／０３５７５２Ａ２号、同第ＷＯ０４／０６３３５１Ａ２号、同第ＷＯ０４／０７４４５５Ａ２号、同第ＷＯ０４／０９９２４９Ａ２号、同第ＷＯ０５／０４０２１７Ａ２号、同第ＷＯ０４／０４４８５９号、同第ＷＯ０５／０７０９６３Ａ１号、同第ＷＯ０５／０７７９８１Ａ２号、同第ＷＯ０５／０９２９２５Ａ２号、同第ＷＯ０５／１２３７８０Ａ２号、同第ＷＯ０６／０１９４４７Ａ１号、同第ＷＯ０６／０４７３５０Ａ２号、および同第ＷＯ０６／０８５９６７Ａ２号、米国特許公開第ＵＳ２００７／０２３１３２９号、同第ＵＳ２００７／０２３１３２９号、同第ＵＳ２００７／０２３７７６５号、同第ＵＳ２００７／０２３７７６６号、同第ＵＳ２００７／０２３７７６７号、同第ＵＳ２００７／０２４３１８８号、同第ＵＳ２００７０２４８６０３号、同第ＵＳ２００７０２８６８５９号、同第ＵＳ２００８００５７０５６、または米国特許第５，６４８，２６０号、同第５，７３９，２７７号、同第５，８３４，２５０号、同第５，８６９，０４６号、同第６，０９６，８７１号、同第６，１２１，０２２号、同第６，１９４，５５１号、同第６，２４２，１９５号、同第６，２７７，３７５号、同第６，５２８，６２４号、同第６，５３８，１２４号、同第６，７３７，０５６号、同第６，８２１，５０５号、同第６，９９８，２５３号、同第７，０８３，７８４号、および同第７，３１７，０９１号において開示されるアミノ酸位置の１つまたはそれ以上の変化（例えば、置換）を含むことができ、Ｆｃ変異に関係があるそれぞれの部分は、参照することにより、本明細書に組み込まれる。一実施形態においては、特定の変化（例えば、当技術分野において開示される１つまたはそれ以上のアミノ酸の特定の置換）は、開示されるアミノ酸位置の１つまたはそれ以上で行われる場合がある。別の実施形態においては、開示されるアミノ酸位置の１つまたはそれ以上における異なる変化（例えば、当技術分野において開示される１つまたはそれ以上のアミノ酸部分の異なる置換）が行われる場合がある。
【０２２４】
好ましい実施形態においては、親Ｆｃポリペプチドは、Ｆｃ部分の「１５オングストローム接触帯」内にあるＥＵアミノ酸位置に対応するアミノ酸位置にアミノ酸置換を含むＦｃ部分変異体を含むことができる。１５オングストローム帯は、完全長野生型Ｆｃ部分のＥＵ位置２４３〜２６１、２７５〜２８０、２８２〜２９３、３０２〜３１９、３３６〜３４８、３６７、３６９、３７２〜３８９、３９１、３９３、４０８、および４２４〜４４０に位置する残基を含む。
【０２２５】
別の実施形態においては、親Ｆｃポリペプチドは、１つまたはそれ以上の切断されたＦｃ部分を含むとはいえ、１つまたはそれ以上の機能をＦｃ領域に与えるために十分なＦｃ領域を含む。例えば、ＦｃＲｎに結合するＦｃ部分の一部（なわち、ＦｃＲｎ結合部分）は、ＥＵ付番で、アミノ酸約２８２〜４３８を含む。したがって、親ＦｃポリペプチドのＦｃ部分は、ＦｃＲｎ結合部分を含むか、またはそれからなることができる。ＦｃＲｎ結合部分は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む、任意のイソタイプの重鎖に由来することができる。一実施形態においては、ヒトイソタイプＩｇＧ１の抗体からのＦｃＲｎ結合部分を使用する。別の実施形態においては、ヒトイソタイプＩｇＧ４の抗体からのＦｃＲｎ結合部分を使用する。ある実施形態においては、ＦｃＲｎ結合部分は、非グリコシル化である。他の実施形態においては、ＦｃＲｎ結合部分は、グリコシル化される。
【０２２６】
ある実施形態においては、親Ｆｃポリペプチドは、抗体の抗原非依存性エフェクタ機能、特に、抗体の循環半減期を変化させるＦｃ部分に対するアミノ酸置換を含む。そのようなポリペプチドは、これらの置換に欠くポリペプチドと比較した場合、ＦｃＲｎへの増加または低下した結合のいずれかを示し、したがって、それぞれ血清における増加または低下した半減期を有する。ＦｃＲｎに対する改善された親和性を有する親Ｆｃポリペプチドは、より長い血清半減期を有することが見込まれ、そのような分子は、例えば、慢性疾患または障害を治療するために、投与されたポリペプチドの長い半減期が望ましい場合の哺乳類を治療するための方法において有用な用途を有する。対照的に、低下したＦｃＲｎ結合親和性を有する親Ｆｃポリペプチドは、より短い半減期を有することが見込まれ、そのような分子も、例えば、インビボ画像診断、あるいは出発ポリペプチドが、長期に渡って循環に存在する場合に毒性副作用を有する状況等、短い循環時間が有利である可能性がある場合の哺乳類への投与において有用である。また、低下したＦｃＲｎ結合親和性を有する親Ｆｃポリペプチドは、胎盤を通過する可能性もより低くなるため、妊婦における疾患または障害の治療においても有用である。さらに、低下したＦｃＲｎ結合親和性が望ましい可能性がある他の用途は、脳、腎臓および／または肝臓における局所化が望ましい場合の用途を含む。例示的な一実施形態においては、親Ｆｃポリペプチドは、血管系から腎臓糸球体の上皮に渡って運搬の低下を示す。別の実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドは、脳から血液脳関門（ＢＢＢ）を渡る脈管性間隙への運搬の低下を示す。一実施形態においては、変化したＦｃＲｎ結合を有する親Ｆｃポリペプチドは、Ｆｃ部分の「ＦｃＲｎ結合ループ」内に１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有する少なくとも１つのＦｃ部分（例えば、１つまたは２つのＦｃ部分）を含む。ＦｃＲｎ結合ループは、野生型完全長Ｆｃ部分のアミノ酸残基２８０〜２９９（ＥＵ付番による）から構成される。他の実施形態においては、変化したＦｃＲｎ結合親和性を有する親Ｆｃポリペプチドは、１５
【化２】
2012515556.tif 000003
ＦｃＲｎ「接触帯」内に１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有する少なくとも１つのＦｃ部分（例えば、１つまたは２つのＦｃ部分）を含む。
【０２２７】
本明細書において使用される１５
【化３】
2012515556.tif 000004
ＦｃＲｎ「接触帯」という用語は、以下の野生型完全長Ｆｃ部分の位置にある残基を含む。２４３〜２６１、２７５〜２８０、２８２〜２９３、３０２〜３１９、３３６〜３４８、３６７、３６９、３７２〜３８９、３９１、３９３、４０８、４２４、４２５〜４４０（ＥＵ付番）。好ましい実施形態においては、変化したＦｃＲｎ結合親和性を有する親Ｆｃポリペプチドは、以下のＥＵ位置のいずれか１つに対応するアミノ酸位置に１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有する少なくとも１つのＦｃ部分（例えば、１つまたは２つのＦｃ部分）を含む。２５６、２７７〜２８１、２８３〜２８８、３０３〜３０９、３１３、３３８、３４２、３７６、３８１、３８４、３８５、３８７、４３４（例えば、Ｎ４３４ＡまたはＮ４３４Ｋ）、および４３８。ＦｃＲｎ結合活性を変化させる例示的なアミノ酸置換は、国際公開第ＷＯ０５／０４７３２７号に開示され、この内容は、参照することにより、本明細書に組み込まれる。
【０２２８】
他の実施形態においては、親Ｆｃポリペプチドは、溶媒に曝される表面に位置する操作システイン残基、またはその類似体を有する少なくとも１つのＦｃ部分を含む。好ましくは、操作システイン残基、またはその類似体は、Ｆｃ領域によって与えられるエフェクタ機能に干渉しない。好ましい実施形態においては、Ｆｃポリペプチドは、第２のシステイン残基へのジスルフィド結合を実質的に有さない少なくとも１つの操作された遊離システイン残基、またはその類似体を含むＦｃ部分を含む。好ましい実施形態においては、Ｆｃポリペプチドは、以下のＣＨ３ドメインにおける位置の１つまたはそれ以上に操作システイン残基、またはその類似体を有するＦｃ部分を含むことができる。３４９〜３７１、３９０、３９２、３９４〜４２３、４４１〜４４６、および４４６ｂ（ＥＵ付番）。さらに好ましい実施形態においては、Ｆｃポリペプチドは、以下位置のいずれか１つに操作システイン残基、またはその類似体を有するＦｃ変異体を含む。３５０、３５５、３５９、３６０、３６１、３８９、４１３、４１５、４１８、４２２、４４１、４４３、およびＥＵ位置４４６ｂ（ＥＵ付番）。上記の操作システイン残基、またはその類似体のいずれも、その後、当技術分野において承認されている手法を使用して機能的な部分に結合体化することができる（例えば、チオール反応性へテロ二官能性リンカーへの結合体化）。
【０２２９】
Ｂ．エフェクタ無しＦｃポリペプチド
ある実施形態においては、親Ｆｃポリペプチドは、変化したまたは低下したエフェクタ機能を有する「エフェクタ無し」Ｆｃポリペプチドである。好ましくは、低下した、または変化したエフェクタ機能は、抗原依存性エフェクタ機能である。例えば、親Ｆｃポリペプチドは、例えば、野生型Ｆｃポリペプチドと比較して、ポリペプチドの抗原依存性エフェクタ機能、特に、ＡＤＣＣまたは補体活性化を低下させる配列変異（例えば、アミノ酸置換）を含むことができる。残念なことに、そのような親Ｆｃポリペプチドは、しばしば、本発明の方法に従って安定化に対して理想的な候補にする低下した安定性を有する。
【０２３０】
低下したＦｃγＲ結合親和性を有するＦｃポリペプチドは、エフェクタ機能を低下させることが見込まれ、そのような分子も、標的細胞破壊が望ましくない状態、例えば、正常細胞が標的分子を発現する場合、またはポリペプチドの慢性投与によって好ましくない免疫系活性化が引き起こされる可能性がある場合の治療に有用である。一実施形態においては、Ｆｃポリペプチドは、野生型Ｆｃ領域を含むＦｃポリペプチドと比較して、オプソニン化、食作用、補体依存性細胞毒性、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、またはエフェクタ細胞改変からなる群から選択される少なくとも１つの抗原依存性エフェクタ機能の低下を示す。一実施形態においては、Ｆｃポリペプチドは、ＦｃγＲ（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、またはＦｃγＲＩＩＩａ）への変化した結合を示す。別の実施形態においては、Ｆｃポリペプチドは、阻害性ＦｃγＲ（例えば、ＦｃγＲＩＩｂ）への変化した結合親和性を示す。他の実施形態においては、低下したＦｃγＲ結合親和性を有するＦｃポリペプチド（例えば、低下したＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、またはＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性）は、以下の位置の１つまたはそれ以上に対応するアミノ酸位置にアミノ酸置換を有する少なくとも１つのＦｃ部分（例えば、１つまたは２つのＦｃ部分）を含む。２３４、２３６、２３９、２４１、２５１、２５２、２６１、２６５、２６８、２９３、２９４、２９６、２９８、２９９、３０１、３２６、３２８、３３２、３３４、３３８、３７６、３７８、および４３５（ＥＵ付番）。他の実施形態においては、低下した補体結合親和性（例えば、低下したＣ１ｑ結合親和性）を有するＦｃポリペプチドは、以下の位置の１つまたはそれ以上に対応するアミノ酸位置にアミノ酸置換を有するＦｃ部分（例えば、１つまたは２つのＦｃ部分）を含む。２３９、２９４、２９６、３０１、３２８、３３３、および３７６（ＥＵ付番）。ＦｃγＲまたは補体結合活性を変化させた例示的なアミノ酸置換は、国際公開第ＷＯ０５／０６３８１５号に開示され、この内容は、参照することにより、本明細書に組み込まれる。ある好ましい実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドは、以下の特定の置換の１つまたはそれ以上を含むことができる。Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２３９Ｅ、Ｍ２５２Ｔ、Ｈ２６８Ｄ、Ｈ２６８Ｅ、Ｉ３３２Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、Ｎ４３４Ａ、およびＮ４３４Ｋ（すなわち、抗体Ｆｃ領域におけるこれらのＥＵ付番位置の１つまたはそれ以上に対応するアミノ酸位置にあるこれらの置換の１つまたはそれ以上）。
【０２３１】
ある例示的な実施形態においては、親「エフェクタ無し」ポリペプチドのエフェクタ機能は、親Ｆｃポリペプチド内の非グリコシル化されたＦｃ領域により変化または低下させることができる。ある実施形態においては、非グリコシル化Ｆｃ領域は、Ｆｃ領域のグリコシル化を変化させるアミノ酸置換によって生成される。例えば、Ｆｃ領域内のＥＵ位置２９７のアスパラギンは、そのグリコシル化を阻害するために、（例えば、置換、挿入、欠失によって、または化学修飾によって）変化させることができる。別の例示的な実施形態においては、ＥＵ位置２９９のアミノ酸残基（例えば、トレオニン（Ｔ））を、（例えば、アラニン（Ａ））で置換し、隣接する残基２９７のグリコシル化を低下させる。グリコシル化を低下するまたは変化させる例示的なアミノ酸置換は、国際公開第ＷＯ０５／０１８５７２号および米国特許公開第２００７／０１１１２８１号に開示され、この内容は、参照することにより、本明細書に組み込まれる。他の実施形態においては、非グリコシル化Ｆｃ領域は、Ｆｃ領域をグリコシル化することができない宿主細胞（例えば、減少したグリコシル化機構を有する細菌性宿主細胞または哺乳類宿主細胞）における、オリゴ糖の酵素的もしくは化学的除去、またはＦｃポリペプチドの発現によって生成される。
【０２３２】
ある実施形態においては、非グリコシル化Ｆｃ領域は、部分的に、非グリコシル化またはヘミグリコシル化である。例えば、Ｆｃ領域は、第１のグリコシル化Ｆｃ部分（例えば、グリコシル化されたＣＨ２領域）および第２の非グリコシル化Ｆｃ部分（例えば、非グリコシル化されたＣＨ２領域）を含むことができる。他の実施形態においては、Ｆｃ領域は、完全に非グリコシル化である場合があり、すなわち、そのＦｃ部分で、グリコシル化されるものはない。
【０２３３】
「エフェクタ無し」ポリペプチドの非グリコシル化Ｆｃ領域は、任意のＩｇＧイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）のものであり得る。例示的な一実施形態においては、親Ｆｃポリペプチドは、「ａｇｌｙ  ＩｇＧ４．Ｐ」等のＩｇＧ４抗体の非グリコシル化Ｆｃ領域を含むことができる。Ａｇｌｙ  ＩｇＧ４．Ｐは、非グリコシル化Ｆｃ領域を産生するための、ヒンジ領域においてプロリン置換（Ｓｅｒ２２８Ｐｒｏ）、およびＣＨ２ドメインにおいてＴｈｒ２９９Ａｌａ変異（ＥＵ付番）を含むＩｇＧ４抗体の操作型である。Ａｇｌｙ  ＩｇＧ４．Ｐは、インビトロで測定可能な免疫エフェクタ機能がないことを示している。別の例示的な実施形態においては、親Ｆｃポリペプチドは、「ａｇｌｙ  ＩｇＧ１」等のＩｇＧ１抗体の非グリコシル化Ｆｃ領域を含む。Ａｇｌｙ  ＩｇＧ１は、低エフェクタ機能プロファイルを与えるＴｈｒ２９９Ａｌａ変異（ＥＵ付番）を有するＩｇＧ免疫グロブリンＩｇＧ１の非グリコシル化型である。ａｇｌｙ  ＩｇＧ４．Ｐおよびａｇｌｙ  ＩｇＧ１抗体は共に、免疫エフェクタ機能が望ましくない治療試薬の重要なクラスを示す。
【０２３４】
ある例示的な実施形態においては、「エフェクタ無し」親Ｆｃポリペプチドは、ＩｇＧ４抗体に由来するＦｃ領域を含む。ＩｇＧ４  Ｆｃ領域は、野生型Ｆｃ領域と同一であり得るか、または野生型ＩｇＧ４配列への１つまたはそれ以上の修飾を有し得る。そのようなＩｇＧ４様Ｆｃポリペプチドは、補体および／またはＦｃ受容体に結合するＩｇＧ４抗体の本質的に低下した能力の結果として、低下したエフェクタ機能を有する。ＩｇＧ４イソタイプの親Ｆｃポリペプチドは、グリコシル化されるか、または非グリコシル化であるかのいずかであり得る。さらに、ＩｇＧ４様ＦｃポリペプチドのＦｃ領域は、ＩｇＧ４抗体の完全Ｆｃ部分を含むことができるか、またはＦｃ部分の一部は、ＩｇＧ４抗体からのものであり、その残りは、別のイソタイプの抗体からのものである、キメラＦｃ部分を含むことができる。例示的な一実施形態においては、キメラＦｃ部分は、ＩｇＧ１抗体からのＣＨ３ドメインおよびＩｇＧ４抗体からのＣＨ２ドメインを含む。別の実施形態においては、ＩｇＧ４抗体は、キメラヒンジを含み、ヒンジ領域における、プロリン置換（Ｓｅｒ２２８Ｐｒｏ）の結果として、上部および下部ヒンジドメインは、ＩｇＧ４抗体からのものであるが、中部ヒンジドメインは、ＩｇＧ１抗体からのものである。さらに別の実施形態においては、親キメラキメラＩｇＧ４抗体は、キメラヒンジを含み、ヒンジ領域、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４抗体からのＣＨ１ドメイン、ＩｇＧ４抗体からのＣＨ２ドメイン（または位置２９２〜３４０、ＥＵ付番）、およびＩｇＧ１抗体からのＣＨ１ＣＨ３ドメインにおける、プロリン置換（Ｓｅｒ２２８Ｐｒｏ）の結果として、上部および下部ヒンジドメインは、ＩｇＧ４抗体からのものであるが、中部ヒンジドメインは、ＩｇＧ１抗体からのものである。
【０２３５】
ある実施形態においては、「エフェクタ無し」Ｆｃポリペプチドの低下したエフェクタ機能は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、および／またはＦｃγＲＩＩＩｂ受容体等のＦｃ受容体（ＦｃＲ）、または補体タンパク質、例えば、補体タンパク質Ｃ１ｑへの低下した結合である。結合のこの変化は、約１倍以上、例えば、約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、５０倍、または１００倍以上、またはその任意の間隔もしくは範囲の倍数であり得る。エフェクタ機能、例えば、Ｆｃ受容体または補体タンパク質へのＦｃ結合におけるこれらの低下は、例えば、本明細書において記載されるアッセイまたは当技術分野で周知のアッセイを用いて決定される結合活性の低下の割合に基づいて容易に計算される。
【０２３６】
本発明の一実施形態においては、安定化Ｆｃポリペプチドは、１本鎖Ｆｃ領域を含む。そのような１本鎖Ｆｃ領域は、当技術分野で周知であり（例えば、第ＷＯ２００８０１２４３，  ＷＯ２００８１３１２４２号、同第ＷＯ２００８１５３９５４号を参照のこと）、周知の方法を用いて作製することができる。本明細書に教示される安定化アミノ酸は、当業者に周知の方法を用いてそのような構造体の１つまたはそれ以上のＦｃ部分に組み込むことができる。そのような１本鎖Ｆｃ領域または遺伝的に融合したＦｃ領域は、単一のポリペプチド鎖（すなわち、単一の隣接遺伝子配列においてコードされる）内において、遺伝的に連鎖しているＦｃドメイン（またはＦｃ部分）から構成される合成Ｆｃ領域である。したがって、遺伝的に融合したＦｃ領域（すなわち、ｓｃＦｃ領域）は、１つのポリペプチド鎖を含むという点において、単量体であり、さらに、分子の適切な部分は、ｎ  Ｆｃ領域を形成するために二量化される。Ｆｃ部分に関する本明細書の教示は、２本鎖Ｆｃ二量体および１本鎖Ｆｃ二量の両方に適用可能であることを理解されよう。例えば、いずれの型のＦｃ領域構造体は、例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４抗体に由来し得るか、またはキメラ（例えば、キメラヒンジを含む、および／またはＩｇＧ４抗体からのＣＨ２ドメインおよびＩｇＧ１抗体からのＣＨ３ドメインを含む）であり得る。
【０２３７】
（ＩＩＩ）．安定化Ｆｃ領域を有する変異体Ｆｃポリペプチド
ある態様においては、本発明は、上述の親Ｆｃポリペプチドのうちのいずれか１つの変異体であるアミノ酸配列を含む変異体Ｆｃポリペプチドを提供する。特に、本発明の変異体Ｆｃポリペプチドは、親ＦｃポリペプチドのＦｃ領域（またはＦｃ部分）に由来するアミノ酸配列を有するＦｃ領域（またはＦｃ部分）を含む。好ましくは、変異体Ｆｃポリペプチドは、本明細書において記載される安定化Ｆｃ変異のうちの少なくとも１つの存在により、親Ｆｃポリペプチドとは異なる。ある実施形態においては、Ｆｃ変異体は、さらなるアミノ酸配列変化を含むことができる。好ましい実施形態においては、Ｆｃ変異体は、親Ｆｃポリペプチドと比較して、向上した安定性を有し、任意に、親Ｆｃポリペプチドと比較して、変化したエフェクタ機能を有する。例えば、変異体Ｆｃポリペプチドは、親Ｆｃポリペプチドの抗原依存性エフェクタ機能（例えば、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ）と同等の、またはそれより低い抗原依存性エフェクタ機能を有することができる。さらに、または代替として、親Ｆｃポリペプチドと比較して、変異体Ｆｃポリペプチドは、抗原非依存性エフェクタ機能（例えば、延長した半減期）を有することができる。
【０２３８】
ある実施形態においては、変異体Ｆｃポリペプチドは、例えば、別のアミノ酸残基で置換されているか、または１つまたはそれ以上のアミノ酸残基の挿入もしくは欠失を有する、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基のような出発または親ポリペプチドと比較して、約１つまたはそれ以上の変異（例えば、約１〜約２０、約１〜約１５、約１〜約１０、約１〜約５、約１〜約４、約１〜約３、約２〜約２０、約２〜約１５、約２〜約１０、約５〜約２０、または約５〜約１０）の変異を別にすれば、親Ｆｃポリペプチド（Ｆｃ部分）のＦｃ領域と本質的に同一のＦｃ領域（またはＦｃ部分）を含む。ある実施形態においては、変異体Ｆｃポリペプチドは、出発ポリペプチドと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の変異を有する。好ましくは、変異体ポリペプチドは、天然に存在しないアミノ酸配列を含む。
【０２３９】
そのような変異体は、必然的に、出発ポリペプチドとの１００％未満の配列同一性または類似性を有する。好ましい実施形態においては、変異体は、出発ポリペプチドのアミノ酸配列との約７５％〜１００％未満のアミノ酸配列の同一性または類似性、より好ましくは約８０％〜１００％未満、より好ましくは約８５％〜１００％未満、より好ましくは約９０％〜１００％未満（例えば、９１〜９９％、９２〜９９％、９３〜９９％、９４〜９９％、９５〜９９％、９６〜９９％、９７〜９９％、９８〜９９％、または９９％）、最も好ましくは約９５％〜１００％未満のアミノ酸配列の同一性または類似性を、例えば、変異体分子またはその一部（例えば、Ｆｃ領域またはＦｃ部分）の全長にわたって有するアミノ酸配列を有する。一実施形態においては、出発ポリペプチド配列（例えば、親ＦｃポリペプチドのＦｃ領域）とそれに由来する配列（例えば、変異ＦｃポリペプチドのＦｃ領域）との間に１つのアミノ酸の相違がある。
【０２４０】
ある実施形態においては、本発明の変異体Ｆｃポリペプチドは、安定化Ｆｃポリペプチドである。つまり、安定化ポリペプチドは、安定化Ｆｃ変異である少なくとも１つの配列の変形または変異を含む。本明細書において使用される「安定化Ｆｃ変異」という用語は、それが由来する親Ｆｃポリペプチドと比較して、向上したタンパク質安定性（例えば、熱安定性）の変異体Ｆｃポリペプチドを与える変異体ＦｃポリペプチドのＦｃ領域内の変異を含む。好ましくは、安定化変異は、Ｆｃ領域への向上したタンパク質安定性（本明細書では、「安定化アミノ酸」）を与える置換アミノ酸との脱安定化アミノ酸の置換を含む。一実施形態においては、本発明の安定化Ｆｃポリペプチドは、１つまたはそれ以上のアミノ酸安定化Ｆｃ変異（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の安定化変異）を含む。安定化Ｆｃ変異は、好ましくは、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはＣＨ２およびＣＨ３ドメインの両方に導入される。
【０２４１】
ある例示的な実施形態においては、本発明の変異体Ｆｃポリペプチドは、上述の安定化変異体の「エフェクタ無し」親Ｆｃポリペプチドである。つまり、安定化変異体は、「エフェクタ無し親Ｆｃポリペプチド」と比較して、向上した安定性を有する。例示的な一実施形態においては、変異体Ｆｃポリペプチドは、ＩｇＧ１抗体の非グリコシル化Ｆｃ領域、例えば、Ｔ２９９Ａ変異（ＥＵ付番）を含む非グリコシル化ＩｇＧ１  Ｆｃ領域を含む、安定化変異体の親Ｆｃポリペプチドである。別の例示的な実施形態においては、変異体Ｆｃポリペプチドは、グリコシル化または非グリコシル化ＩｇＧ４抗体のＦｃ領域を含む安定化変異体の親Ｆｃポリペプチドである。例えば、変異体Ｆｃポリペプチドは、「ａｇｌｙ  ＩｇＧ４．Ｐ」抗体に由来するＦｃ領域において、安定化変異を含むことができる。
【０２４２】
好ましくは、本発明の安定化Ｆｃポリペプチドは、同一の測定条件下で、変異体Ｆｃポリペプチドと比較した場合、向上した安定性を示す。しかしながら、その親Ｆｃポリペプチドと比較して、Ｆｃ変異体ポリペプチドの安定性が向上する程度は、選択された測定条件下で、異なり得ることが認識される。例えば、安定性の向上は、特定のｐＨ、例えば、酸性、中性、または塩基性ｐＨで観察することができる。一実施形態においては、向上した安定性は、約６．０未満（例えば、約６．０、約５．５、約５．０、約４．５、または約４．０）の酸性ｐＨで観察される。別の実施形態においては、向上した安定性は、約６．０〜約８．０（例えば、約６．０、約６．５、約７．０、約７．５、約８．０）の中性ｐＨで観察される。別の実施形態においては、向上した安定性は、約８．０〜約１０．０（例えば、約８．０、約８．５、約９．０、約９．５、約１０．０）の塩基性ｐＨで観察される。
【０２４３】
変異体Ｆｃポリペプチドの向上した熱安定性は、例えば、以下に記載の方法のいずれかを用いて評価することができる。ある実施形態においては、安定化Ｆｃポリペプチドは、それが由来する親ポリペプチドの温度よりも約０．１、約０．２５、約０．５、約０．７５、約１、約１．２５、約１．５、約１．７５、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２５、約３０、約４０、または約５０℃を超える熱安定（例えば、融解温度またはＴｍ）を有するＦｃ領域（またはＦｃ部分）を有する。
【０２４４】
ある実施形態においては、本発明の安定化Ｆｃポリペプチド変異体は、二量体、四量体において２５％以下、またはそうでなければ凝集された形態（例えば、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、または約５％未満）の単量体の可溶性タンパク質として発現する。
【０２４５】
別の実施形態においては、安定化Ｆｃポリペプチドは、熱的チャレンジアッセイにおいて、４０℃を超える（例えば、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９℃、またはそれ以上の）Ｔ５０を有する（米国特許出願第１１／７２５，９７０号を参照されたく、この内容は、参照することにより、本明細書、ならびに以下の実施例２に組み込まれる）。さらに好ましい実施形態においては、本発明の安定化Ｆｃ分子は、５０℃を超える（例えば、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８℃、またはそれ以上の）Ｔ５０を有する。さらに好ましい実施形態においては、本発明の安定化Ｆｃ分子は、６０℃を超える（例えば、６０、６１、６２、６３、６４、６５℃、またはそれ以上の）Ｔ５０を有する。なおさらに好ましい実施形態においては、本発明の安定化Ｆｃ分子は、６５℃を超える（例えば、６５、６６、６７、６８、６９、７０℃、またはそれ以上の）Ｔ５０を有する。またさらに好ましい実施形態においては、本発明の安定化Ｆｃ分子は、７０℃を超える（例えば、７０、７１、７３、７４、７５℃、またはそれ以上の）Ｔ５０を有する。
【０２４６】
ある実施形態においては、本発明の安定化Ｆｃ分子は、約６０℃を超える（例えば、約６１、６２、６３、６４、６５℃、またはそれ以上の）、６５℃を超える（例えば、６５、６６、６７、６８、６９、またはそれ以上の）、または約７０℃を超える（例えば、７１、７２、７３、７４、７５、またはそれ以上の）Ｔｍ値を有するＣＨ２ドメインを有する。他の実施形態においては、本発明の安定化Ｆｃ分子は、約７０℃を超える（例えば、７１、７２、７３、７４、７５℃、またはそれ以上の）、約７５℃を超える（例えば、７６、７７、７８、７９、８０℃、またはそれ以上の）、８０℃を超える（例えば、８１、８２、８３、８４、８５℃、またはそれ以上の）Ｔｍ値を有するＣＨ３ドメインを有する。特定の実施形態においては、該安定化Ｆｃポリペプチドは、ＩｇＧ４抗体（例えば、ａｇｌｙ  ＩｇＧ４．Ｐ）の非グリコシル化またはグリコシル化されたＦｃ領域を含む親Ｆｃポリペプチドの変異体である。他の実施形態においては、該安定化Ｆｃポリペプチドは、ＩｇＧ１抗体（例えば、ａｇｌｙ  ＩｇＧ１）の非グリコシル化Ｆｃ領域を含む親Ｆｃポリペプチドの変異体である。さらに他の実施形態においては、本発明の安定化Ｆｃ分子は、グリコシル化されたＩｇＧ１抗体の熱安定性よりも実質的に同じ、またはそれを超える熱安定性を有するＦｃ領域またはＦｃ部分（例えば、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメイン）を有する。
【０２４７】
ある実施形態においては、本発明の変異体Ｆｃポリペプチドは、それが由来する親Ｆｃポリペプチドと比較して、低下した凝集をもたらす。一実施形態においては、本発明の方法によって産生される安定化Ｆｃ分子は、親Ｆｃ分子と比較して、少なくとも１％の凝集の低下を有する。他の実施形態においては、安定化Ｆｃポリペプチドは、親Ｆｃ分子と比較して、少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、または少なくとも１００％の凝集の低下を有する。
【０２４８】
他の実施形態においては、本発明の安定化Ｆｃポリペプチドは、それらが由来する親Ｆｃポリペプチドと比較して、増加した長期安定性または保存期間をもたらす。一実施形態においては、本発明の方法によって産生される安定化Ｆｃ分子は、非安定化結合分子と比較して、少なくとも１日の保存期間の増加を有する。これは、安定化Ｆｃポリペプチドの調製物が、前日に存在する場合、実質的に同量の生物活性のある変異体Ｆｃポリペプチドを有し、この調製物が、変異体ポリペプチドの任意の明らかな凝集または分解を有さないことを意味する。他の実施形態においては、安定化Ｆｃ分子は、非安定化Ｆｃ分子と比較して、少なくとも２日間、少なくとも５日間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも１ヶ月間、少なくとも２ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、または少なくとも１年間の保存期間の増加を有する。
【０２４９】
ある実施形態においては、本発明の安定化Ｆｃポリペプチドは、それらの親Ｆｃポリペプチドと比較して、増加した収率で発現する。一実施形態においては、本発明の安定化Ｆｃポリペプチドは、親Ｆｃ分子と比較して、少なくとも１％の収率の増加を有する。他の実施形態においては、安定化Ｆｃポリペプチドは、親Ｆｃ分子と比較して、少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも１００％の収率の増大を有する。
【０２５０】
例示的な実施形態においては、本発明の安定化Ｆｃポリペプチドは、宿主細胞、例えば、細菌性または真核性（例えば、酵母菌または哺乳類）宿主細胞において、（それらの親Ｆｃポリペプチドと比較して）増加した収率で発現する。本発明の安定化Ｆｃポリペプチドをコードする核酸分子を発現するために使用することができる例示的な哺乳類宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨＥＬＡ（ヒト子宮頸癌）細胞、ＣＶＩ（サル腎臓株）細胞、ＣＯＳ（ＳＶ４０Ｔ抗原を有するＣＶＩの誘導体）細胞、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽）細胞、ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽）細胞、ＨＡＫ（ハムスター腎臓株）細胞、ＳＰ２／Ｏ（マウス骨髄腫）細胞ＢＦＡ−１ｃ１ＢＰＴ細胞（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）（ヒト網膜に由来する細胞株、Ｃｒｕｃｅｌｌ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、および２９３細胞（ヒト腎臓）が含まれる。
【０２５１】
他の実施形態においては、本発明の安定化Ｆｃポリペプチドは、大規模（例えば、工業規模）条件下で、宿主細胞において、（それらの親Ｆｃポリペプチドと比較して）増加した収率で発現する。例示的な実施形態においては、安定化Ｆｃ分子は、少なくとも１０リットルの培養培地において発現する場合、増加した収率を有する。他の実施形態においては、安定化Ｆｃ結合分子は、少なくとも２０リットル、少なくとも５０リットル、少なくとも７５リットル、少なくとも１００リットル、少なくとも２００リットル、少なくとも５００リットル、少なくとも１０００リットル、少なくとも２０００リットル、少なくとも５，０００リットル、または少なくとも１０，０００リットルの培養培地中において、宿主細胞から発現する場合、収率の増加を有する。１つの例示的な実施形態においては、少なくとも１０ｍｇ（例えば、１０ｍｇ、２０ｍｇ、５０ｍｇ、または１００ｍｇ）の安定化Ｆｃ分子は、培養培地のリットルごとに産生される。
【０２５２】
（ａ）安定化Ｆｃアミノ酸
ある実施形態においては、本発明の安定化Ｆｃ分子は、以下からなる群から独立して選択される指示された位置（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、またはそれ以上の安定化Ｆｃ変異）に、１つまたはそれ以上の以下の安定化Ｆｃアミノ酸を含む。
ａ）ＥＵ位置２４０の、例えば、フェニルアラニン（２４０Ｆ）によるアミノ酸の置換、
ｂ）ＥＵ位置２６２の、例えば、ロイシン（２６２Ｌ）によるアミノ酸（例えば、バリン）の置換、
ｃ）ＥＵ位置２６６の、例えば、フェニルアラニン（２６６Ｆ）によるアミノ酸（例えば、バリン）の置換、
ｄ）ＥＵ位置２９９の、例えば、リシン（２９９Ｋ）によるアミノ酸（例えば、トレオニン）の置換、
ｅ）ＥＵ位置３０７の、例えば、プロリン（３０７Ｐ）によるアミノ酸（例えば、トレオニン）の置換、
ｆ）ＥＵ位置３０９の、例えば、リシン（３０９Ｋ）、メチオニン（３０９Ｍ）、またはプロリン（３０９Ｐ）によるアミノ酸（例えば、ロイシン）の置換、
ｇ）ＥＵ位置３２３の、例えば、フェニルアラニン（３２３Ｆ）によるアミノ酸（例えば、バリン）の置換、
ｈ）ＥＵ位置３９９の、例えば、セリン（３９９Ｓ）によるアミノ酸（例えば、アスパラギン酸）の置換、
ｉ）ＥＵ位置４０９の、例えば、リシン（４０９Ｋ）またはメチオニン（４０９Ｌ）によるアミノ酸（例えば、アルギニン）の置換、および
ｊ）ＥＵ位置４２７の、例えば、フェニルアラニン（４２７Ｆ）によるアミノ酸（例えば、バリン）の置換。
【０２５３】
例示的な一実施形態においては、安定化Ｆｃポリペプチドは、安定化Ｆｃ変異（ａ）を含む。別の例示的な実施形態においては、安定化Ｆｃポリペプチドは、安定化Ｆｃ変異（ｂ）を含む。別の例示的な実施形態においては、安定化Ｆｃポリペプチドは、安定化Ｆｃ変異（ｃ）を含む。別の例示的な実施形態においては、安定化Ｆｃポリペプチドは、安定化Ｆｃ変異（ｄ）を含む。別の例示的な実施形態においては、安定化Ｆｃポリペプチドは、安定化Ｆｃ変異（ｅ）を含む。別の例示的な実施形態においては、安定化Ｆｃポリペプチドは、安定化Ｆｃ変異（ｆ）を含む。別の例示的な実施形態においては、安定化Ｆｃポリペプチドは、安定化Ｆｃ変異（ｇ）を含む。別の例示的な実施形態においては、安定化Ｆｃポリペプチドは、安定化Ｆｃ変異（ｈ）を含む。別の例示的な実施形態においては、安定化Ｆｃポリペプチドは、安定化Ｆｃ変異（ｉ）を含む。別の例示的な実施形態においては、安定化Ｆｃポリペプチドは、安定化Ｆｃ変異（ｊ）を含む。
【０２５４】
例示的な一実施形態においては、本発明の安定化Ｆｃポリペプチドは、上記の安定化変異（ａ）〜（ｊ）のうちの２つまたはそれ以上（例えば、２、３、４、または５）を含む。ある実施形態においては、安定化変異（ｄ）〜（ｊ）または（ｄ）〜（ｈ）のうちの２つまたはそれ以上を含む。例えば、本発明の安定化Ｆｃポリペプチドは、以下の安定化変異の組み合わせのうちのいずれか１つを含むことができる。（ｄ）および（ｅ）、（ｄ）および（ｆ）、（ｄ）および（ｇ）、（ｄ）および（ｈ）、（ｄ）および（ｉ）、（ｄ）および（ｊ）、（ｅ）および（ｆ）、（ｅ）および（ｇ）、（ｅ）および（ｈ）、（ｅ）および（ｉ）、（ｅ）および（ｊ）、（ｆ）および（ｇ）、（ｆ）および（ｈ）、（ｆ）および（ｉ）、（ｆ）および（ｊ）、（ｈ）および（ｉ）、（ｈ）および（ｊ）、（ｉ）および（ｊ）。別の例示的な実施形態においては、本発明の安定化Ｆｃポリペプチドは、変異（ｄ）、（ｅ）、および（ｆ）を含む。別の例示的な実施形態においては、本発明の安定化Ｆｃポリペプチドは、変異（ｄ）、（ｅ）、および（ｇ）を含む。別の例示的な実施形態においては、本発明の安定化Ｆｃポリペプチドは、変異（ｄ）、（ｅ）、および（ｈ）を含む。別の例示的な実施形態においては、本発明の安定化Ｆｃポリペプチドは、変異（ｄ）、（ｆ）、および（ｇ）を含む。別の例示的な実施形態においては、本発明の安定化Ｆｃポリペプチドは、変異（ｄ）、（ｇ）、および（ｈ）を含む。別の例示的な実施形態においては、本発明の安定化Ｆｃポリペプチドは、変異（ｅ）、（ｆ）、および（ｇ）を含む。別の例示的な実施形態においては、本発明の安定化Ｆｃポリペプチドは、変異（ｅ）、（ｇ）、および（ｈ）を含む。別の例示的な実施形態においては、本発明の安定化Ｆｃポリペプチドは、変異（ｆ）、（ｇ）、および（ｈ）を含む。別の例示的な実施形態においては、本発明の安定化Ｆｃポリペプチドは、変異（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、および（ｈ）を含む。
【０２５５】
別の実施形態においては、本発明の安定化Ｆｃポリペプチドは、ＩｇＧ４分子のＣＨ２ドメイン（またはそのアミノ酸２９２〜３４０）およびＩｇＧ１分子からのＣＨ３ドメインを含み、位置２９７にＧｌｎ（Ｑ）残基を有する。別の実施形態においては、本発明の安定化Ｆｃポリペプチドは、ＩｇＧ１分子のＣＨ２およびＣＨ３ドメイン、ならびに位置２９７のＡｓｐ（Ｄ）残基のみ、あるいは組み合わせて、位置２９９にＬｙｓ（Ｋ）残基を含む。
【０２５６】
（ｂ）例示的な安定化Ｆｃ部分
本発明の例示的な安定化Ｆｃ部分は、本出願、実施例、配列表を通して見出すことができる。
【０２５７】
ある例示的な実施形態においては、本発明の安定化Ｆｃポリペプチドは、下表１に記載されるＦｃ部分アミノ酸配列のうちの１つ、２つまたはそれ以上を含む安定化ＩｇＧ４  Ｆｃ領域を含む。安定化Ｆｃ変異には、太字斜字体で下線が引かれている。
【０２５８】
【表１−１】
2012515556.tif 000005
【０２５９】
【表１−２】
2012515556.tif 000006
【０２６０】
【表１−３】
2012515556.tif 000007
【０２６１】
【表１−４】
2012515556.tif 000008
【０２６２】
【表１−５】
2012515556.tif 000009
【０２６３】
【表１−６】
2012515556.tif 000010
他の例示的な実施形態においては、本発明の安定化Ｆｃポリペプチドは、下表２に記載される１つ、２つ、またはそれ以上のキメラＦｃ部分アミノ酸配列を有する安定化キメラＦｃ領域を含む。
【０２６４】
【表２−１】
2012515556.tif 000011
【０２６５】
【表２−２】
2012515556.tif 000012
他の例示的な実施形態においては、本発明の安定化Ｆｃポリペプチドは、下表３に記載されるＩｇＧ１  Ｆｃ部分アミノ酸配列のうちの１つ、２つまたはそれ以上を含む安定化非グリコシル化されたＩｇＧ１  Ｆｃ領域を含む。
【０２６６】
【表３−１】
2012515556.tif 000013
【０２６７】
【表３−２】
2012515556.tif 000014
【０２６８】
【表３−３】
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【０２６９】
【表３−４】
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（ＩＶ）．変異体Ｆｃポリペプチドを安定化させるための方法
ある態様においては、本発明は、Ｆｃ領域（例えば、非グリコシル化Ｆｃ領域）を含むポリペプチドを安定化させる方法に関連し、該方法には、（ａ）変異のために出発Ｆｃ領域の少なくとも１つのＦｃ部分内において、１つまたはそれ以上のアミノ酸位置を選択することと、（ｂ）変異のために選択された１つまたはそれ以上のアミノ酸位置を変異させ、それによって、ポリペプチドを安定化することと、を含む。
【０２７０】
一実施形態においては、該出発Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１Ｆｃ領域である。別の実施形態においては、出発Ｆｃ領域は、ＩｇＧ４  Ｆｃ領域である。別の実施形態においては、出発Ｆｃ領域は、キメラＦｃ領域である。一実施形態においては、該出発Ｆｃ領域は、非グリコシル化ＩｇＧ１  Ｆｃ領域である。別の実施形態においては、該出発Ｆｃ領域は、非グリコシル化ＩｇＧ４  Ｆｃ領域である。
【０２７１】
一実施形態においては、変異のために選択されたアミノ酸位置は、出発ＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ４分子）のＦｃ領域において、延長したループ内にある。別の実施形態においては、変異のために選択されたアミノ酸位置は、ＣＨ３ドメイン間のインターフェイスに存在する。別の実施形態においては、変異のために選択されたアミノ酸位置は、１ｈｚｈ結晶構造中の炭水化物（例えば、Ｖ２６４、Ｒ２９２、またはＶ３０３）を有する接触部位付近である。他の実施形態においては、アミノ酸位置は、ＣＨ３／ＣＨ２のインターフェイス付近、またはＣＨ３／ＣＨ２のインターフェイス付近（例えば、Ｈ３１０）であり得る。別の実施形態においては、例えば、１組の表面が露出したグルタミン残基（Ｑ２６８、Ｑ２７４、またはＱ３５５）のうちの１つまたはそれ以上の、Ｆｃ領域の全表面電荷を変化させる１つまたはそれ以上の変異がなされ得る。別の実施形態においては、アミノ酸位置は、ＣＨ２およびＣＨ３の「バリン中心」に見出されるバリン残基である。ＣＨ２の「バリン中心」は、５つのバリン残基（Ｖ２４０、Ｖ２５５、Ｖ２６３、Ｖ３０２、およびＶ３２３）であり、全ては、ＣＨ２ドメインの同じ近接した内部の中心に方向付けられる。同様の「バリン中心」は、ＣＨ３（Ｖ３４８、Ｖ３６９、Ｖ３７９、Ｖ３９７、Ｖ４１２、およびＶ４２７）において観察される。別の実施形態においては、変異のために選択されるアミノ酸位置は、アミノ酸２９７のＮ結合型炭水化物と相互作用するか、接触することが予測される位置にある。そのようなアミノ酸位置は、同族Ｆｃ受容体（例えば、ＦｃγＲＩＩＩａ）に結合されるＦｃ領域の結晶構造の検査を行うことによって特定することができる。Ｎ２９７との相互作用を形成する例示的なアミノ酸は、残基２６２〜２７０によって形成されるループを含む。
【０２７２】
例示的なアミノ酸位置は、ＥＵ付番慣例によるアミノ酸位置２４０、２５５、２６２〜２６６、２６７〜２７１、２９２〜２９９、３０２〜３０９、３７９、３９７〜３９９、４０９、４１２、および４２７を含む。ある実施形態においては、変異のために選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸位置は、２４０、２５５、２６２、２６３、２６４、２６６、２６８、２７４、２９２、２９９、３０２、３０３、３０７、３０９、３２３、３４８、３５５、３６９、３７９、３９７、３９９、４０９、４１２、および４２７からなる群から選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸位置である。ある実施形態においては、変異のために選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸位置は、２４０、２６２、２６４、２６６、２９７、２９９、３０７、３０９、３９９、４０９、および４２７からなる群から選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸位置である。別の実施形態においては、１つまたはそれ以上のアミノ酸位置は、２９７、２９９、３０７、３０９、４０９、および４２７からなる群から選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸位置である。別の実施形態においては、１つまたはそれ以上のアミノ酸位置は、アミノ酸残基２４０、２６２、２６４、および２６６から選択される。別の実施形態においては、アミノ酸位置のうちの少なくとも１つは、ＥＵ位置２９７にある。別の実施形態においては、アミノ酸位置のうちの少なくとも１つは、ＥＵ位置２９９にある。別の実施形態においては、アミノ酸位置のうちの少なくとも１つは、ＥＵ位置３０７にある。別の実施形態においては、アミノ酸位置のうちの少なくとも１つは、ＥＵ位置３０９にある。別の実施形態においては、アミノ酸位置のうちの少なくとも１つは、ＥＵ位置３９９にある。別の実施形態においては、アミノ酸位置のうちの少なくとも１つは、ＥＵ位置４０９にある。別の実施形態においては、アミノ酸位置のうちの少なくとも１つは、ＥＵ位置４２７にある。
【０２７３】
ある実施形態においては、該Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域である。ある実施形態においては、該Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域であり、１つまたはそれ以上のアミノ酸位置は、アミノ酸残基２４０、２６２、２６４、２９９、２９７、および２６６から選択される。他の実施形態においては、該Ｆｃ領域は、ＩｇＧ４  Ｆｃ領域であり、１つまたはそれ以上のアミノ酸位置は、アミノ酸残基２９７、２９９、３０７、３０９、３９９、４０９、および４２７から選択される。
【０２７４】
一実施形態においては、変異は、アミノ酸位置（例えば、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、またはトレオニン（Ｔ）による置換）のアミノ酸側鎖の大きさを減少させる。別の実施形態においては、変異は、非極性側鎖を有するアミノ酸による置換（例えば、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、プロリン（Ｐ）、フェニルアラニン（Ｆ）、およびトリプトファン（Ｗ）による置換）である。別の実施形態においては、変異は、例えば、２つの相互作用するドメイン（例えば、Ｙ３４９Ｆ、Ｔ３５０Ｖ、およびＴ３９４Ｖ）間の関連性を増加する、またはインターフェイスの側鎖（例えば、Ｆ４０５Ｙ）の容積を増加するために、ＣＨ３インターフェイスへの疎水性を付加する。別の実施形態においては、「バリン中心」の１つまたはそれ以上のアミノ酸は、それらの安定性を増加させるために、イソロイシンまたはフェニルアラニンで置換される。別の実施形態においては、アミノ酸（例えば、Ｌ３５１および／またはＬ３６８）は、高分枝状の疎水性側鎖に変異させる。
【０２７５】
一実施形態においては、変異は、アラニン（Ａ）による置換である。一実施形態においては、変異は、フェニルアラニン（Ｆ）による置換である。別の実施形態においては、変異は、ロイシン（Ｌ）による置換である。一実施形態においては、変異は、トレオニン（Ｔ）による置換である。別の実施形態においては、変異は、リシン（Ｋ）による置換である。一実施形態においては、変異は、プロリン（Ｐ）による置換である。一実施形態においては、変異は、フェニルアラニン（Ｆ）による置換である。
【０２７６】
一実施形態においては、変異は、以下の表１．１、表１．２、表１．３、および／または表１．４に記載される１つまたはそれ以上の変異または置換を含む。
【０２７７】
ある実施形態においては、変異は、２４０Ｆ、２６２Ｌ、２６４Ｔ、２６６Ｆ、２９７Ｑ、２９７Ｓ、２９７Ｄ、２９９Ａ、２９９Ｋ、３０７Ｐ、３０９Ｋ、３０９Ｍ、３０９Ｐ、３２３Ｆ、３９９Ｓ、４０９Ｍ、および４２７Ｆ（ＥＵ付番慣例）からなる群から選択される１つまたはそれ以上の置換を含む。別の実施形態においては、変異は、２９９Ａ、２９９Ｋ、３０７Ｐ、３０９Ｋ、３０９Ｍ、３０９Ｐ、３２３Ｆ、３９９Ｅ、３９９Ｓ、４０９Ｋ、４０９Ｍ、および４２７Ｆからなる群から選択される１つまたはそれ以上の置換を含む。別の実施形態においては、１つまたはそれ以上のアミノ酸位置は、アミノ酸残基２４０Ｆ、２６２Ｌ、２６４Ｔ、および２６６Ｆから選択される。別の実施形態においては、置換のうちの少なくとも１つは、２９９Ａである。別の実施形態においては、置換のうちの少なくとも１つは、２９９Ｋである。別の実施形態においては、置換のうちの少なくとも１つは、３０７Ｐである。別の実施形態においては、置換のうちの少なくとも１つは、３０９Ｋである。別の実施形態においては、置換のうちの少なくとも１つは、３０９Ｍである。別の実施形態においては、置換のうちの少なくとも１つは、３０９Ｐである。別の実施形態においては、置換のうちの少なくとも１つは、３２３Ｆである。別の実施形態においては、置換のうちの少なくとも１つは、３９９Ｓである。別の実施形態においては、置換のうちの少なくとも１つは、３９９Ｅである。別の実施形態においては、置換のうちの少なくとも１つは、４０９Ｋである。別の実施形態においては、置換のうちの少なくとも１つは、４０９Ｍである。別の実施形態においては、置換のうちの少なくとも１つは、４２７Ｆである。
【０２７８】
別の実施形態においては、変異は、２つまたはそれ以上の置換（例えば、２、３、４、または５）を含む。別の実施形態においては、変異は、３つまたはそれ以上の置換（例えば、３、４、５、または６）を含む。なお別の実施形態においては、安定化Ｆｃ領域は、４つまたはそれ以上の置換（例えば、４、５、６、または７）を含む。
【０２７９】
別の態様においては、本発明は、安定化Ｆｃ領域を含む安定化結合分子を作製する方法に関連し、該方法は、結合部分のアミノ末端またはカルボキシ末端に、本発明の安定化Ｆｃ領域を含むポリペプチドを遺伝的に融合することを含む。ある実施形態においては、安定化Ｆｃ領域は、本発明の方法に従って、安定化される。
【０２８０】
Ｖ．  タンパク質安定性を評価する方法
本発明の組成物の安定性特性は、当技術分野で知られている方法を用いて分析することができる。当技術分野におけるものに許容される安定性パラメータを使用することができる。例示的なパラメータは、以下においてより詳述される。例示的な実施形態においては、熱安定性が評価される。提供された実施形態においては、本発明の組成物の（例えば、収率％によって測定した）発現レベルが評価される。他の好ましい実施形態においては、本発明の組成物の凝集レベルが評価される。
【０２８１】
ある実施形態においては、Ｆｃポリペプチドの安定性特性は、適切な対照の安定性特性と比較される。例示的な対照は、野生型Ｆｃポリペプチド、野生型（グリコシル化された）ＩｇＧ１またはＩｇＧ４抗体等の親Ｆｃポリペプチドを含む。別の例示的な対照は、非グリコシル化Ｆｃポリペプチド、非グリコシル化ＩｇＧ１またはＩｇＧ４抗体である。
【０２８２】
一実施形態においては、下述の１つまたはそれ以上のパラメータが測定される。一実施形態においては、これらのパラメータのうちの１つまたはそれ以上が、哺乳類細胞における発現後、測定される。一実施形態においては、下述の１つまたはそれ以上のパラメータは、大規模な製造条件（例えば、バイオリアクターにおいて、ＦｃポリペプチドまたはＦｃポリペプチドを含む分子の発現）下で測定される。
【０２８３】
ａ）熱安定性
本発明の組成物の熱安定性は、当技術分野で周知の多数の限定されない生物物理学的または生化学的手法を用いて解析することができる。ある実施形態においては、熱安定性は、分析分光測定法によって評価される。
【０２８４】
例示的な分析分光測定法は、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）である。ＤＳＣは、ほとんどのタンパク質またはタンパク質ドメインのアンフォールディングに伴って起こる熱吸収に敏感である熱量計を使用する（例えば、Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｒｕｉｚ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７：１６４８−５２，１９８８を参照）。タンパク質の熱安定性を決定するために、タンパク質の試料を熱量計に挿入し、Ｆｃポリペプチド（またはそのＣＨ２またはＣＨ３ドメイン）が開くまで、温度を上げる。タンパク質が開く温度が、全タンパク質安定性を示す。
【０２８５】
別の例示的な分析分光測定法は、円偏光二色性（ＣＤ）分光法である。ＣＤ分光分析は、温度増加の関数として、組成物の光学活性を測定する。円二色性（ＣＤ）分光測定は、構造的非対称により上昇する右回りの偏光に対して左回りの偏光の吸収の差を測定する。無秩序なまたは折り畳まれていない構造は、秩序立ったまたは折り畳まれた構造のそれとは非常に異なるＣＤスペクトルをもたらす。ＣＤスペクトルは、温度を増加させる変性効果に対するタンパク質の感度を反映し、したがって、タンパク質の熱安定性を示す（ｖａｎ  Ｍｉｅｒｌｏ  ａｎｄ  Ｓｔｅｅｍｓｍａ，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，７９（３）：２８１−９８，２０００を参照）。
【０２８６】
熱安定性を測定するための別の例示的な分析分光測定方法は、蛍光発光分光測定である（上述のｖａｎ  Ｍｉｅｒｌｏ  ａｎｄ  Ｓｔｅｅｍｓｍａを参照）。熱安定性を測定するためのさらに別の例示的な分析分光測定方法は、核磁器共鳴（ＮＭＲ）分光測定である（例えば、上述のｖａｎ  Ｍｉｅｒｌｏ  ａｎｄ  Ｓｔｅｅｍｓｍａを参照）。
【０２８７】
他の実施形態においては、本発明の組成物の熱安定性は、生化学的に測定される。熱安定性を評価するための例示的な生化学方法は、熱的チャレンジアッセイである。「熱的チャレンジアッセイ」において、本発明の組成物を、一定範囲の上昇した温度に設定された時間の間付す。例えば、一実施形態においては、Ｆｃ領域を含むテストＦｃポリペプチドを、一定範囲の増加させる温度に、例えば、１〜１．５時間付す。次いで、関連する生化学的アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡまたはＤＥＬＦＩＡ）によって、Ｆｃ受容体（例えば、ＦｃγＲ、プロテインＡ、またはプロテインＧ）に結合するＦｃ領域の能力をアッセイする。例示的な熱的チャレンジアッセイは、以下の実施例２に記載される。
【０２８８】
一実施形態においては、そのようなアッセイは、高スループット様式で行うことができる。別の実施形態においては、Ｆｃ変異体のライブラリは、当該分野で周知の方法を用いて作成することができる。Ｆｃ発現を誘導することができ、Ｆｃを熱的チャレンジに付すことができる。課題を課されたテスト試料は、結合についてアッセイすることができ、安定であるＦｃポリペプチドはスケールアップし、さらに特徴付けすることができる。
【０２８９】
ある実施形態においては、熱安定性は、上記の技術（例えば、分析分光測定技術）のいずれかを用いて本発明の組成物の融解温度（Ｔｍ）を測定することによって評価される。融解温度は、熱転移曲線の中点における温度であり、ここに、組成物の分子の５０％は折り畳まれた状態にある。
【０２９０】
他の実施形態においては、熱安定性は、分析熱量測定技術（例えば、ＤＳＣ）を用いて本発明の組成物の比熱または熱容量（Ｃｐ）を測定することによって評価される。組成物の比熱は、１モルの水の温度を１℃上げるのに必要なエネルギー（例えば、ｋｃａｌ／モル）である。大きなＣｐは、変性したまたは不活性なタンパク質組成物の特徴である。ある実施形態においては、組成物の熱容量の変化（ΔＣｐ）は、その熱転移の前および後に組成物の比熱を決定することによって測定される。他の実施形態においては、熱安定性は、アンフォールディングのギブス自由エネルギー（ΔＧ）、アンフォールディングのエンタルピー（ΔＨ）、またはアンフォールディングのエントロピー（ΔＳ）を含む熱力学的安定性の他のパラメータを測定または決定することによって評価することができる。
【０２９１】
他の実施形態においては、上記の生化学的アッセイ（例えば、熱的チャレンジアッセイ）の１つまたはそれ以上を用いて、組成物の５０％がその活性（例えば、結合活性）を保持する温度（すなわち、ＴＣ値）を決定する。
【０２９２】
ｂ）凝集％
ある実施形態においては、本発明の組成物の安定性は、凝集するその傾向を測定することによって決定される。凝集は、多数の非限定的生化学または生物物理学技術によって測定することができる。例えば、本発明の組成物の凝集は、クロマトグラフィ、例えば、サイズ−排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）を用いて評価することができる。ＳＥＣは、大きさに基づいて分子を分離する。カラムには、イオンおよび小さな分子をその内部に受け入れるが、大きなものは受け入れないポリマーゲルの半固体ビーズが充填される。タンパク質組成物がカラムの頂部に適応されると、緻密な折り畳まれたタンパク質（例えば、凝集していないタンパク質）は、大きなタンパク質凝集体が利用できるよりも大きな容量の溶媒を通って分布する。その結果、大きな凝集体は、カラムを通ってより迅速に移動し、このようにして、混合物はその成分に分離する、または分画することができる。各画分は、それがゲルから溶出されるにつれ、（例えば、光散乱によって）別々に定量化することができる。したがって、本発明の組成物の凝集％は、画分の濃度を、ゲルに適用されたタンパク質の全濃度と比較することによって決定することができる。安定な組成物は、実質的に単一の画分としてカラムから溶出され、溶出プロファイルまたはクロマトグラムにおいては実質的に単一のピークとして出現する。
【０２９３】
好ましい実施形態においては、ＳＥＣをインライン光散乱（例えば、古典的なまたは動的光散乱）と組み合せて使用して、組成物の凝集％を決定する。ある好ましい実施形態においては、静的光散乱を使用して、分子の形状または溶出位置から独立して、各画分またはピークの質量を測定する。他の好ましい実施形態においては、動的光散乱を使用して、組成物の流体力学的サイズを測定する。タンパク質安定性を評価するための他の例示的な方法は高速ＳＥＣを含む（例えば、Ｃｏｒｂｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２３（８）：１８８８−９４，１９８４を参照）。
【０２９４】
好ましい実施形態においては、凝集％は、タンパク質試料内のタンパク質凝集体の分率を測定することによって決定される。好ましい実施形態においては、組成物の凝集％は、タンパク質試料内の折り畳まれたタンパク質の分率を決定することによって測定される。
【０２９５】
ｃ）収率％
他の実施形態においては、本発明の組成物の安定性は、タンパク質の発現（例えば、組み換え発現）に続いて回収されるタンパク質の量（ここでは、「収率％」）を測定することによって評価される。例えば、収率％は、宿主培養培地の各ｍＬについて回収されたタンパク質のミリグラム（すなわち、タンパク質のｍｇ／ｍＬ）を決定することによって測定することができる。好ましい実施形態においては、収率％は、哺乳類宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）における発現に続いて評価される。
【０２９６】
ｄ）喪失％
さらに他の実施形態においては、本発明の組成物の安定性は、保存に続いての一定範囲の温度（例えば、−８０〜２５℃）における定義された時間の間でのタンパク質の喪失をモニタリングすることによって評価される。回収されたタンパク質の量または濃度は、当技術分野で周知のいずれかのタンパク質定量化法を用いて決定することができ、タンパク質の初期濃度と比較することができる。例示的なタンパク質定量化法は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析またはブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）アッセイ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２，２４８，（１９７６））を含む。％喪失を評価するための好ましい方法は、上述の分析ＳＥＣ方法のいずれかを使用する。％喪失測定は、例えば、凍結乾燥されたタンパク質調製物を含むいずれかの所望の保存条件または保存処方の下で決定することができると認識される。
【０２９７】
ｅ）タンパク質分解％
さらに他の実施形態においては、本発明の組成物の安定性は、標準的な条件下での保存に続いてタンパク質分解されたタンパク質の量を決定することによって評価される。１つの例示的な実施形態においては、タンパク質分解は、タンパク質の試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定され、そこでは、無傷タンパク質の量を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに出現する低分子量断片の量と比較する。別の例示的な実施形態においては、タンパク質分解は、質量分析（ＭＳ）によって決定され、そこでは、予測される分子量のタンパク質の量を、試料内の低分子量タンパク質断片の量と比較する。
【０２９８】
ｆ）結合親和性
さらに他の実施形態においては、本発明の組成物の安定性は、その標的結合親和性を決定することによって評価することができる。結合親和性を決定するための広く種々の方法が当技術分野で周知である。結合親和性を決定するための例示的な方法は、表面プラズモン共鳴を使用する。表面プラズモン共鳴は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ  ａｎｄ  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いる、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化の検出によって、リアルタイム生物特異的相互作用の分析を可能とする光学的現象である。さらなる詳細については、Ｊoｎｓｓｏｎ，Ｕ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ａｎｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．５１：１９−２６、Ｊoｎｓｓｏｎ，Ｕ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １１：６２０−６２７、Ｊｏｈｎｓｓｏｎ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．８：１２５−１３１、およびＪｏｈｎｎｓｏｎ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８：２６８−２７７を参照。
【０２９９】
ｇ）他の結合試験
さらに他の実施形態においては、本発明の組成物の安定性は、標識された化合物の、結合分子の変性した、またはアンフォールディング部分への結合を定量化することによってアッセイすることができる。そのような分子は、好ましくは、通常は天然タンパク質の内部に埋もれているが、変性した、またはアンフォールディング結合分子においては露出されるアミノ酸の大きな疎水性パッチと結合し、または相互作用するため、それらは、好ましくは、疎水性である。例示的な標識された化合物は、疎水性蛍光色素、１−アニリノ−８−ナフタリンスルホネート（ＡＮＳ）である。
【０３００】
（ＶＩ）安定化Ｆｃ領域を含む安定化結合ポリペプチド
ある態様においては、本発明は、本発明の安定化Ｆｃポリペプチドを含む安定化結合ポリペプチドを提供する。上記のように、本発明の変異体Ｆｃポリペプチド（および／またはそれが由来する親Ｆｃポリペプチド）は、さらに、安定化結合ポリペプチドを形成するために、結合部位を含むことができる。代替の設計の様々な結合ポリペプチドは、本発明の範囲内にある。例えば、１つまたはそれ以上の結合部位は、複数の方向で、ＦｃポリペプチドのＦｃ領域と融合、連結、または組み込む（例えば、重ねる）ことができる。例示的な一実施形態においては、結合ポリペプチドは、Ｆｃ領域のＮ末端と融合される結合部位を含む。別の例示的な実施形態においては、結合ポリペプチドは、Ｆｃ領域のＣ末端での結合部位を含む。本発明の結合ポリペプチドは、Ｆｃ領域のＣ末端およびＮ末端の両方での結合部位を含むことができる。さらに他の実施形態においては、結合ポリペプチドは、Ｆｃ領域のＮ末端および／またはＣ末端のドメイン間領域における結合部位（例えば、Ｆｃ部分のＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとの間）を含むことができる。代替として、結合部位は、Ｆｃ部分のヒンジとＣＨ２ドメインとの間のドメイン間領域に組み込むことができる。他の実施形態においては、ＦｃポリペプチドのＦｃ領域は、ｓｃＦｃ領域であり、結合ポリペプチドは、単一の隣接配列として、ｓｃＦｃ領域の２つまたはそれ以上のＦｃ部分に連結するリンカーポリペプチド内において、１つまたはそれ以上の結合部位を含むことができる。
【０３０１】
なおさらなる実施形態においては、本発明の安定化結合ポリペプチドは、安定化Ｆｃ領域のＦｃ部分に組み込まれる結合部位を含む。例えば、結合部位は、Ｎ末端ＣＨ２ドメイン、Ｎ末端ＣＨ３ドメイン、Ｃ末端ＣＨ２ドメイン、および／またはＣ末端ＣＨ３ドメインに重ねることができる。一実施形態においては、抗体のＣＤＲロープは、ｓｃＦｃ領域の片方または両方のＣＨ３ドメインに重ねられる。ＣＤＲループおよび他の結合部分をＦｃ領域のＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインに重ねるための方法は、例えば、国際公開第ＷＯ０８／００３１１６号において開示され、この内容は、参照することにより、本明細書に組み込まれる。
【０３０２】
安定化結合ポリペプチドは、方向の任意の組み合わせを使用して、本発明のＦｃポリペプチドの安定化Ｆｃ領域に連結、融合、または統一される（例えば、重ねられる）２つまたそれ以上の結合部位（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の結合部位）を含むことができることが、当業者によって認識される。
【０３０３】
ある実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドは、２つの結合部位、および少なくとも１つの安定化Ｆｃ領域を含む。例えば、結合部位は、安定化Ｆｃ領域のＮ末端およびＣ末端の両方に機能的に連結することができる。他の例示的な実施形態においては、結合部位は、複数の安定化Ｆｃ領域のＮ末端およびＣ末端の両方に機能的に連結することができる。安定化Ｆｃ領域が、ｓｃＦｃ領域である場合、２つまたはそれ以上のｓｃＦｃ領域は、連続して共に結合されて安定化Ｆｃ領域の縦列整列を形成することができる。
【０３０４】
他の実施形態においては、２つまたそれ以上の結合部位は、（例えば、ポリペプチドリンカーを介して）連続して互いに結合され、結合部位の縦列整列は、安定化Ｆｃ領域または安定化Ｆｃ領域の縦列整列（すなわち、縦列安定化ｓｃＦｃ領域）のＣ末端またはＮ末端のいずれかに機能的に連結される（例えば、化学的に結合体化されるか、または遺伝的に融合される（例えば、直接またはポリペプチドリンカーを介してのいずれか））。他の実施形態においては、結合部位の縦列整列は、単一の安定化Ｆｃ領域、または安定化Ｆｃ領域の縦列整列のＣ末端およびＮ末端の両方に機能的に連結される。
【０３０５】
他の実施形態においては、本発明の安定化結合ポリペプチドは、３つの結合部位を含む三価結合ポリペプチドである。本発明の例示的な三価結合ポリペプチドは、二重特異性または三重特異性である。例えば、三価結合ポリペプチドは、１つの特異性に対して二価（すなわち、２つの結合部位を有する）であり、第２の特異性に対して一価であり得る。
【０３０６】
さらに他の実施形態においては、本発明の安定化結合ポリペプチドは、４つの結合部位を含む四価結合ポリペプチドである。本発明の例示的な四価結合ポリペプチドは、二重特異性である。例えば、四価結合ポリペプチドは、各特異性に対して二価の（すなわち、２つの結合部位を有する）であり得る。
【０３０７】
上記のように、他の実施形態においては、１つまたはそれ以上の結合部位は、安定化ｓｃＦｃ領域の２つのＦｃ部分の間に挿入することができる。例えば、１つまたはそれ以上の結合部位は、本発明の結合ポリペプチドのポリペプチドリンカーの全部または一部を形成することができる。
【０３０８】
本発明の好ましい結合ポリペプチドは、抗原結合部位（例えば、抗体、抗体変異体、または抗体断片の抗原結合部位）、リガンドの受容体結合部分、または受容体のリガンド結合部分のうちの少なくとも１つを含む。
【０３０９】
他の実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドは、上述の生体関連ペプチドのいずれか１つの１つまたはそれ以上を含む少なくとも１つの結合部位を含む。
【０３１０】
ある実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドは、生物学的効果を媒介する標的分子に対して特異的な少なくとも１つの結合部位を有する。一実施形態においては、結合部位は、細胞活性化または阻害を媒介する（例えば、細胞表面受容体に結合し、活性化または阻害シグナルの伝達を引き起こすことによって）。一実施形態においては、結合部位は、細胞の死をもたらす（例えば、細胞シグナル誘導性経路によって、結合分子上に存在するペイロード（例えば、毒性ペイロード）への補体結合または暴露によって）か、または対象において疾患または障害を調節する（例えば、細胞死滅を媒介または促進することによって、フィブリン塊の溶解を促進するか、または血栓形成を促進することによって、または生物学的に利用可能な物質の量を調節することによって（例えば、対象におけるＴＮＦα等のリガンドの量を増加または減少させることによることによって））シグナルの変換を開始することが可能である。別の実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドは、少なくとも１つの遺伝的に融合したＦｃ領域（すなわち、ｓｃＦｃ領域）と合わせて、減少または排除を標的とする抗原、例えば、細胞表面抗原または可溶性抗原に対して特異的な少なくとも１つの結合部位を有する。
【０３１１】
別の実施形態においては、標的分子（例えば、抗原）への本発明の結合ポリペプチドの結合は、例えば、組織または循環からの標的分子の減少または排除を引き起こす。別の実施形態においては、結合ポリペプチドは、標的分子の存在を検出する（例えば、汚染物質を検出または病状または疾患を診断する）ために使用することができる標的分子に対して特異的な少なくとも１つの結合部位を有する。さらに別の実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドは、対象における特定の部位（例えば、腫瘍細胞、免疫細胞、または血栓）への分子を標的とする少なくとも１つの結合部位を含む。
【０３１２】
ある実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドは、２つまたそれ以上の結合部位を含むことができる。一実施形態においては、結合部位は、同一である。別の実施形態においては、結合部位は、異なる。
【０３１３】
他の実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドは、共に集合させ、または他のポリペプチドと集合させて、２つまたそれ以上のポリペプチドを有する結合タンパク質（「結合タンパク質」または「多重体」）を形成することができ、多重体の少なくとも１つのポリペプチドは、本発明の結合ポリペプチドである。例示的な多重体の型としては、二量体、三量体、四量体、および六量体の変化した結合タンパク質等を含む。一実施形態においては、結合タンパク質のポリペプチドは、同じである（すなわち、ホモマーの変化した結合タンパク質、例えば、ホモ二量体、ホモ四量体）。別の実施形態においては、結合タンパク質のポリペプチドは、異なる（例えば、ヘテロマー）。
【０３１４】
一実施形態においては、本発明のポリペプチドは、ＩｇＧ４抗体からのＣＨ１ドメイン、ＩｇＧ４抗体からのＣＨ２ドメイン、およびＩｇＧ１抗体からのＣＨ３ドメインである。一実施形態においては、ポリペプチドは、Ｓｅｒ２２８Ｐｒｏ置換を含む。ポリペプチドは、アミノ酸２９７および／もしくは２９９、例えば、２９７Ｑおよび／もしくは２９９Ｋ、または２９７Ｓおよび／もしくは２９９Ｋに変異をさらに含むことができる。また、ポリペプチドは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４抗体からのＣＨ１ドメイン、ＩｇＧ４抗体からのＣＨ２ドメイン、およびＩｇＧ１抗体からのＣＨ３ドメインを含むことができ、ポリペプチドは、１つまたはそれ以上のＳｅｒ２２８Ｐｒｏ、２９７Ｑ、または２９９Ｋ置換を含むことができる。（Ｓｅｒ２２８Ｐｒｏ置換を有する）ＩｇＧ４分子からのＣＨ１ドメイン、ＩｇＧ４抗体からのＣＨ２ドメイン、およびＩｇＧ１抗体からのＣＨ３ドメインからなるＦｃ領域のアミノ酸配列を、配列番号２８に提供する。一実施形態においては、本発明の安定化Ｆｃポリペプチドは、配列番号２５に記載されるアミノ酸配列を含む。一実施形態においては、本発明の安定化Ｆｃポリペプチドは、配列番号５９に記載されるアミノ酸配列を含む。一実施形態においては、本発明の安定化Ｆｃポリペプチドは、配列番号６０に記載されるアミノ酸配列を含む。一実施形態においては、本発明の安定化Ｆｃポリペプチドは、配列番号６１に記載されるアミノ酸配列を含む。一実施形態においては、本発明の安定化Ｆｃポリペプチドは、配列番号６２に記載されるアミノ酸配列を含む。
【０３１５】
一実施形態においては、本発明のポリペプチドのＦｃ領域は、１本鎖（ｓｃＦｃ）である。一実施形態においては、本段落において記載されるＦｃ領域を含む分子は、一価である。一実施形態においては、本段落に記載されるＦｃ領域を含む分子は、一価であり、Ｆｃ領域はｓｃＦｃである。また、本明細書において記載されるＦｃ領域を含む分子も、ｓｃＦｖを含むことができる。
【０３１６】
ｉ．抗原結合部位
（ａ）抗体
ある実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドは、抗体の少なくとも１つの抗原結合部位を含む。本発明の結合ポリペプチドは、当技術分野において承認されているプロトコルを使用して、抗体に由来する可変領域、またはその一部（例えば、ＶＬおよび／またはＶＨドメイン）を含むことができる。例えば、可変ドメインは、抗原、またはその断片で哺乳類に免疫を与えることによって、非ヒト哺乳類、例えば、マウス、モルモット、霊長類、ウサギ、またはラットにおいて産生される抗体に由来することができる。全ての目的に対して参照することにより組み込まれる、上述のＨａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅを参照。免疫グロブリンは、関連抗原（例えば、精製腫瘍関連抗原、またはそのような抗原を含む細胞または細胞抽出物）およびアジュバントの複数の皮下または腹腔内注入によって生成することができる。この免疫付与は、通常、活性化脾細胞またはリンパ球からの抗原反応性抗体の産生を含む免疫反応を引き出す。
【０３１７】
可変領域は、免疫性を与えられた哺乳類の血清から採取されるポリクローナル抗体あから得ることができるが、しばしば、所望の可変領域が由来するモノクローナル抗体（ＭＡｂ）の同種の製剤を提供するために、脾臓、リンパ節、または末梢血から個々のリンパ球を単離することが望ましい。ウサギまたはモルモットが、通常、ポリクローナル抗体を作製するために使用される。マウスが、通常、モノクローナル抗体を作製するために使用される。モノクローナル抗体は、抗原断片をマウスに注入し、「ハイブリドーマ」を調製し、抗原に特異的に結合する抗体に対してハイブリドーマをスクリーニングすることによって、断片に対して調製することができる。この周知のプロセス（Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７５），Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５）において、抗原を注入されたマウスの比較的短命か、または臨終のリンパ球は、不死の腫瘍細胞株（例えば、骨髄腫細胞株）と融合されるため、したがって、不死であり、Ｂ細胞によって遺伝的にコードされる抗体を産生することが可能なハイブリッド細胞または「ハイブリドーマ」を産生する。得られたハイブリッドは、単一抗体の形成のための特定の遺伝子を含む個々の株による選択、希釈、および再成長によって、単一の遺伝株に分離される。それらは、所望の抗原に対して同種であり、それらの純粋な遺伝的血統に関して「モノクローナル」と称される抗体を産生する。
【０３１８】
このようにして調製されるハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合親骨髄腫細胞の成長または生存を阻害する１つまたはそれ以上の物質を含有する適切な培地において播種され、成長する。当業者は、ハイブリドーマの形成、選択、および成長のための試薬、細胞株、および培地が、多数の供給源より市販され、標準的プロトコルが、十分に確立していることを認識する。概して、ハイブリドーマ細胞が成長している培養培地は、所望の抗原に対するモノクローナル抗体の産生に対して試験される。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降、またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩＳＡ）等のインビトロアッセイによって測定される。所望の特異性、親和性および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が特定されると、クローンは、希釈手順を制限することによってサブクローンされ、標準方法によって成長させることができる（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、例えば、親和性クロマトグラフィ（例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、またはタンパク質Ｌ親和性クロマトグラフィ）、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、または透析等の従来の精製手順によって、培地、腹水、または血清から分離することができることはさらに認識される。
【０３１９】
任意で、抗体は、抗原の他の非重複断片に結合せずに、抗原の特定の領域または所望の断片に結合するためにスクリーニングすることができる。後者のスクリーニングは、抗原の欠失変異体の集合への抗体の結合を判定し、どの欠失変異体が抗体に結合するかを判定することによって達成することができる。結合は、例えば、ウエスタンブロット法またはＥＬＩＳＡによって評価することができる。抗体への特定の結合を示す最小の断片が、抗体のエピトープを定義する。代替として、エピトープ特異性は、被検および参照抗体が抗原への結合に対して競合する競合アッセイによって判定することができる。被検および参照抗体が競合する場合、それらは、同じエピトープ、または１つの抗体の結合が他の抗体の結合に干渉するように、十分近接するエピトープに結合する。
【０３２０】
所望のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、定常領域ドメイン配列の単離のための上述の従来の手順のいずれかを使用して（例えば、マウス抗体の重鎖または軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することが可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用して）、容易に単離および配列決定することができる。単離され、サブクローンされたハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい源として作用する。より詳しくは、単離ＤＮＡ（本明細書において記載されるように合成することができる）は、本発明の結合ポリペプチドへの組み込みのための所望の可変領域配列をクローンするために使用することができる。
【０３２１】
他の実施形態においては、結合部位は、完全ヒト抗体に由来する。ヒトまたは実質的なヒト抗体は、内因性免疫グロブリン産生が不可能な遺伝子導入動物（例えば、マウス）において生成することができる（例えば、米国特許第６，０７５，１８１号、同第５，９３９，５９８号、同第５，５９１，６６９号、および同第５，５８９，３６９号を参照されたく、それぞれの内容は、参照することにより、本明細書に組み込まれる）。例えば、キメラおよび構造遺伝子変異マウスにおける抗体重鎖結合領域のホモ接合体欠失は、内因性抗体産生の完全阻害を引き起こすことが記載されている。そのような構造遺伝子変異マウスへのヒト免疫グロブリン遺伝子アレイの移動は、抗原チャレンジの際にヒト抗体の産生を引き起こす。ＳＣＩＤマウスを使用するヒト抗体を生成するための別の好ましい手段は、米国特許第５，８１１，５２４号において開示され、この内容は、参照することにより、本明細書に組み込まれる。これらのヒト抗体に関連する遺伝物質は、本明細書において記載されるように単離し、操作することもできることが認識される。
【０３２２】
組み換え抗体を生成するためのさらに別の効率の高い手段は、Ｎｅｗｍａｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：１４５５−１４６０（１９９２）によって開示される。具体的に、この手法は、サル可変ドメインおよびヒト定常配列を含有する霊長類化抗体の生成を引き起こす。この参照は、参照することにより、その全体として本明細書に組み込まれる。また、この手法は、同一出願人による米国特許第５，６５８，５７０号，同第５，６９３，７８０号、および同第５，７５６，０９６号においても記載され、それぞれの内容は、参照することにより、本明細書に組み込まれる。
【０３２３】
別の実施形態においては、リンパ球は、顕微操作で選択することができ、可変遺伝子を単離することができる。例えば、末梢血単核細胞は、免疫性を与えられた哺乳類から単離し、インビトロで役７日間培養することができる。培養物は、スクリーニング基準を満たす特定のＩｇＧをスクリーニングすることができる。陽性ウェルからの細胞は、単離することができる。個々のＩｇ産生Ｂ細胞は、ＦＡＣＳ、または補体媒介溶血プラークアッセイにおいてそれらを特定することによって単離することができる。Ｉｇ産生Ｂ細胞は、チューブへ顕微操作することができ、ＶＨおよびＶＬ遺伝子は、例えば、ＲＴ−ＰＣＲを使用して増幅することができる。ＶＨおよびＶＬ遺伝子は、発現のために、抗体発現ベクターにクローン化し、細胞（例えば、真核または原核細胞）にトランスフェクトすることができる。
【０３２４】
代替として、可変（Ｖ）ドメインは、最適な動物からの可変遺伝子配列のライブラリから得ることができる。ドメインの無作為な組み合わせ、例えば、ＶＨおよびＶＬドメインを発現するライブラリは、所望の結合特性を有する要素を特定するために所望の抗原によってスクリーニングすることができる。そのようなスクリーニングの方法は、当技術分野で周知である。例えば、抗体遺伝子レパートリは、λバクテリオファージ発現ベクターにクローン化することができる（Ｈｕｓｅ，ＷＤ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７６：１２７５）。さらに、表面に抗体を発現する細胞（Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４），ＰＮＡＳ，９０：１０４４４、Ｇｅｏｒｇｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１５：２９、Ｂｏｄｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｔｔｒｕｐ（１９９７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：５５３、Ｂｏｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０００），ＰＮＡＳ，９７：１０７０１、Ｄａｕｇｔｈｅｒｔｙ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．２４３：２１１）、またはウイルス（例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，ＨＲ．（１９９８），Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４：１、Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ＡＤ．（１９９８）．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：１０２）をスクリーニングすることができる。
【０３２５】
当業者は、抗体可変ドメインをコードするＤＮＡを、当技術分野で周知の方法を使用して、ファージ、酵母、または細菌において発現される抗体ライブラリから得ることができることも認識する。例示的な方法が、例えば、欧州特許第ＥＰ３６８６８４Ｂ１号、米国特許第５，９６９，１０８号、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ２１：３７１、Ｎａｇｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：８０１、Ｈｕｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００１），ＰＮＡＳ，９８：２６８２、Ｌｕｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１５：１０６３において説明され、それぞれの内容は、参照することにより、本明細書に組み込まれる。幾つかの出版物（例えば、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２），Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３）は、鎖シャッフリングによる高親和性ヒト抗体の産生、および大きいファージライブラリを構築するための戦略として、組み合わせ感染およびインビボ組み換えを記載している。別の実施形態においては、リボゾーム提示法を、提示基盤としてバクテリオファージを置換するために使用することができる（例えば、Ｈａｎｅｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９９８），ＰＮＡＳ９５：１４１３０、Ｈａｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ．（１９９９），Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４３：１０７、Ｈｅ  ａｎｄ  Ｔａｕｓｓｉｇ．（１９９７），Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：５１３２、Ｈａｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０００），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：１２８７、Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１），ＰＮＡＳ，９８：３７５０、またはＩｒｖｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８：３１）。
【０３２６】
スクリーニングするための好ましいライブラリは、ヒト可変遺伝子ライブラリである。非ヒト源からのＶＬおよびＶＨドメインを使用することもできる。ライブラリは、未感作、免疫性を与えられた対象からのもの、または準合成であり得る（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ．（１９９２）．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）ＥＭＢＯ  Ｊ．１３：３２４５、ｄｅ  Ｋｒｕｉｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４８：９７、Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２），ＰＮＡＳ，８９：４４５７）。一実施形態においては、変異は、より高い異質性を有する核酸分子のライブラリを作成するために免疫グロブリンドメインに対して作製することができる（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５６：７７、Ｌａｍｍｉｎｍａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９１：５８９、Ｃａｌｄｗｅｌｌ  ａｎｄ  Ｊｏｙｃｅ．（１９９２），ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．２：２８、Ｃａｌｄｗｅｌｌ  ａｎｄ  Ｊｏｙｃｅ．（１９９４），ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．３：Ｓ１３６）。標準的スクリーニング手順を、高親和性変異体を選択するために使用することができる。別の実施形態においては、ＶＨおよびＶＬ配列の変更は、例えば、当技術分野で周知の手法を使用して結晶構造から得られた情報を使用して、抗体結合力を増加させるために行うことができる。
【０３２７】
また、本発明の結合ポリペプチドを産生するために有用な可変領域配列は、多くの異なる源から得ることができる。例えば、上述のように、様々なヒト遺伝子配列は、公的にアクセス可能な寄託の形で入手可能である。抗体および抗体コード遺伝子の多くの配列が、公表され、適切な可変領域配列（例えば、ＶＬおよびＶＨ配列）を、当技術分野において承認されている手法を使用して、これらの配列から化学的に合成することができる。
【０３２８】
別の実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドに存在する少なくとも１つの可変領域ドメインは、触媒として機能する（Ｓｈｏｋａｔ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ．（１９９０）．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：３３５）。触媒結合特異性を有する可変領域ドメインは、当技術分野において承認されている手法を使用して行うことができる（例えば、米国特許第６，５９０，０８０号、米国特許第５，６５８，７５３号を参照）。触媒結合特異性は、遷移状態を安定化させる酵素に対して特定されるものと同様の多数の基本的メカニズムによって作用することができ、それによって、活性化の自由エネルギーを低下させる。例えば、一般的な酸性および塩基性残基は、触媒活性部位内における触媒作用への参加のために最適に配置することができ、共有結合酵素基質中間体を形成することができ、触媒抗体は、反応のための適切な方向にもあり、少なくとも７桁、反応物の有効濃度を増加させることができ（Ｆｅｒｓｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９６８），Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９０：５８３３）、それによって、化学反応のエントロピーを大幅に低減させる。最後に、触媒抗体は、反応を促進するために、遷移状態の中間体の基質結合および／またはその後に行われる安定化の際に得られるエネルギーを変換することができる。
【０３２９】
酸性または塩基性残基は、免疫原として補完的に荷電した分子を使用することによって、抗原結合部位に組み込むことができる。この手法は、正電荷を持つアンモニウムイオンを含有するハプテンによる抗体の誘出に対して成功を収めた（Ｓｈｏｋａｔ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８８），Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．２７：２６９−２７１）。別の方法では、抗体は、所望の反応の遷移状態の中間体の大きさ、形状、および電荷が類似する安定化合物（すなわち、遷移状態の類似体）に誘出することができる。動物に免疫性を与える遷移状態の類似体の使用、および触媒抗体の産生を記載する米国特許第４，７９２，４４６号および米国特許第４，９６３，３５５号を参照されたい。これらの特許の両方は、参照することにより、本明細書に組み込まれる。そのような分子は、例えば、ＫＬＨ等の免疫原性の担体分子を有する免疫抱合体の一部として投与することができる。
【０３３０】
別の実施形態においては、本発明の変化した抗体の可変領域ドメインは、ＶＬ鎖の非存在下において安定する、例えば、カメリドに由来するＶＨドメインからなる（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）．Ｎａｔｕｒｅ，３６３：４４６、Ｄｅｓｍｙｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３：８０３、Ｄｅｃａｎｎｉｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，７：３６１、Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，９：５３１、Ｋｏｒｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．Ｊ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ．，１４：１６７）。
【０３３１】
さらに、本発明の結合ポリペプチドは、完全マウス、完全ヒト、キメラ、ヒト化、非ヒト霊長類、または霊長類化抗体に由来する可変ドメインまたはＣＤＲを含むことができる。非ヒト抗体、またはその断片またはドメインは、当技術分野において承認されている手法を使用して、それらの免疫原性を低下させるために変化させることができる。ヒト化抗体は、非ヒト抗体に由来する抗体であり、親抗体の結合特性を保持または実質的に保持するように修飾されているが、親非ヒト抗体ほどヒトにおいて免疫原性ではない。ヒト化標的抗体の場合、これは、（ａ）全非ヒト可変ドメインをヒト定常領域上に接合して、キメラ標的抗体を生成する、（ｂ）重要なフレームワーク残基を保持、また保持せずに、非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）の１つまたはそれ以上の少なくとも一部をヒトフレームワークおよび定常領域に接合する、（ｃ）全非ヒト可変ドメインを移植するが、表面残基の置換によってヒト様部分でそれらを「覆い隠す（ｃｌｏａｋ）」等を含む、様々な方法で得ることができる。そのような方法は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４），ＰＮＡＳ．８１：６８５１−５、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，（１９８８），Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４４：６５−９２、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ，（１９８８），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６、Ｐａｄｌａｎ，（１９９１），Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．２８：４８９−４９８、Ｐａｄｌａｎ，（１９９４），Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．３１：１６９−２１７、および米国特許第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、および同第５，６９３，７６２号において開示され、それらの全ての内容は、参照することにより、その全体として本明細書に組み込まれる。
【０３３２】
脱免疫化も、本発明の結合ポリペプチドの免疫原性を低下させるために使用することができる。本明細書において使用される「脱免疫化」という用語は、Ｔ細胞エピトープの修飾を含む（例えば、国際公開第ＷＯ９８５２９７６Ａ１号、同第ＷＯ００３４３１７Ａ２号を参照）。例えば、ＶＨおよびＶＬ配列は分析され、配列内における相補性決定領域（ＣＤＲ）および他の主要残基に関してエピトープの位置を示す各Ｖ領域からのヒトＴ細胞エピトープ「地図」が生成される。Ｔ細胞エピトープ地図からの個々のＴ細胞エピトープは、最終抗体の活性を変化させる低いリスクを有する代替のアミノ酸置換を特定するために分析される。アミノ酸置換の組み合わせを含む、種々の代替のＶＨおよびＶＬ配列が設計され、これらの配列は、その後、機能に対して試験される種々の本発明のポリペプチドに組み込まれる。通常、１２〜２４の変異抗体が生成され、試験される。その後、修飾ＶおよびヒトＣ領域を含む完全重鎖または軽鎖遺伝子は、発現ベクターにクローン化され、その後のプラスミドは、全抗体の産生のために細胞株に導入される。その後、抗体は、適切な生化学的および生物学的アッセイにおいて比較され、最適な変異体が特定される。
【０３３３】
一実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドにおいて使用される可変ドメインは、１つまたはそれ以上のＣＤＲの少なくとも部分的置換によって変化する。別の実施形態においては、可変ドメインは、例えば、部分的フレームワーク領域置換および配列変化によって、任意で変化することができる。ヒト化可変領域を作製する際、ＣＤＲは、フレームワーク領域が由来する抗体と同じクラスまたはさらにサブクラスの抗体から得ることができるが、ＣＤＲは、異なるクラスの抗体、好ましくは異なる種からの抗体に由来することが想定される。１つの可変ドメインの抗原結合能を別の可変ドメインへ移動させるために、ドナー可変領域からの完全ＣＤＲでＤＣＲの全てを置換することは不必要である場合がある。むしろ、結合ドメインの活性を維持する必要があるそれらの残基を移動させることのみが必要である場合がある。米国特許第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、および同第５，６９３，７６２号に記載される説明を踏まえると、低下した免疫原性を有する機能的な抗原結合部位を得ることは、日常の実験を行うか、または錯誤の試験のいずれかにより、十分当業者の能力内にある。
【０３３４】
一実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドは、所望の標的を認識する抗体からの少なくとも１つのＣＤＲを含む。別の実施形態においては、本発明の変化した抗体は、所望の標的を認識する抗体からの少なくとも２つのＣＤＲを含む。別の実施形態においては、本発明の変化した抗体は、所望の標的を認識する抗体からの少なくとも３つのＣＤＲを含む。別の実施形態においては、本発明の変化した抗体は、所望の標的を認識する抗体からの少なくとも４つのＣＤＲを含む。別の実施形態においては、本発明の変化した抗体は、所望の標的を認識する抗体からの少なくとも５つのＣＤＲを含む。別の実施形態においては、本発明の変化した抗体は、所望の標的を認識する抗体からの少なくとも６つのＣＤＲを含む。
【０３３５】
一実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドにおいて使用される抗原結合部位は、１つまたはそれ以上の腫瘍関連抗原に対して免疫反応性であり得る。例えば、癌または新生組織形成を治療するために、結合ポリペプチドの抗原結合ドメインは、好ましくは、選択された腫瘍関連抗原に結合する。新生組織形成に関連する報告された抗原の数、および関連抗体の数を踏まえると、当業者は、本発明の結合ポリペプチドが、多数の全抗体のいずれか１つに由来する可変領域配列、またはその一部を含むことができることを認識する。より一般的に、そのような可変領域配列は、選択された状態に関連する抗原またはマーカと反応する任意の抗体（文献において以前に報告されたものを含む）から得られるか、または引き出すことができる。本発明の結合ポリペプチドによって結合する例示的な腫瘍関連抗原には、例えば、ｐａｎＢ抗原（例えば、非ホジキンリンパ腫におけるもの等の悪性および非悪性の両方のＢ細胞の表面上に見られるＣＤ２０）およびｐａｎＴ細胞抗原（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７）が含まれる。他の例示的な腫瘍関連抗原としては、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＭＵＣ−１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ  Ｅ６  ＆  Ｅ７、ＴＡＧ−７２、ＣＥＡ、α−Ｌｅｗｉｓｙ、Ｌ６−抗原、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ８０、メソテリン、ＰＳＭＡ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＥＧＦ受容体、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体、クリプト抗原、およびＨＥＲ２受容体が含まれるが、これらに限定されない。
【０３３６】
他の実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドは、腫瘍関連抗原と反応すると過去に報告されている抗体からの完全抗原結合部位（またはその可変領域もしくはＣＤＲ配列）を含むことができる。腫瘍関連抗原と反応することが可能な例示的な抗体としては、２Ｂ８、Ｌｙｍ１、Ｌｙｍ２、ＬＬ２、Ｈｅｒ２、Ｂ１、ＢＲ９６、ＭＢ１、ＢＨ３、Ｂ４、Ｂ７２．３、５Ｅ８、Ｂ３Ｆ６、５Ｅ１０、α−ＣＤ３３、α−ＣａｎＡｇ、α−ＣＤ５６、α−ＣＤ４４ｖ６、α−Ｌｅｗｉｓ、およびα−ＣＤ３０が含まれる。より具体的に、これらの例示的な抗体としては、２Ｂ８およびＣ２Ｂ８（Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標）およびＲｉｔｕｘａｎ（登録商標）、Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）、Ｌｙｍ１およびＬｙｍ２（Ｔｅｃｈｎｉｃｌｏｎｅ）、ＬＬ２（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）、トシツモマブ（Ｂｅｘｘａｒ（登録商標）、Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｐｈａｒｍ．、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）、アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標）、Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）、ゲムツズマブオゾガマイシン（Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）、Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）、アバゴボマブ（Ｍｅｎａｒｉｎｉ、Ｉｔａｌｙ）、ＣＥＡ−Ｓｃａｎ（商標）（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ、Ｍｏｒｒｉｓ  Ｐｌａｉｎｓ、ＮＪ）、カプロマブ（Ｐｒｏｓｔａｓｃｉｎｔ（登録商標）、Ｃｙｔｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）、エドレコロマブ（Ｐａｎｏｒｅｘ（登録商標）、Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、ＮＪ）、イゴボマブ（ＣＩＳ  Ｂｉｏ  Ｉｎｔｌ．、Ｆｒａｎｃｅ）、ミツモマブ（ＢＥＣ２、Ｉｍｃｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ、ＮＪ）、ノフェツモマブ（Ｖｅｒｌｕｍａ（登録商標）、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｌｅｈｅｉｍ、Ｒｉｄｇｅｆｉｅｌｄ、ＣＴ）、ＯｖａＲｅｘ（Ａｌｔａｒｅｘ  Ｃｏｒｐ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、サツモマブ（Ｏｎｏｓｃｉｎｔ（登録商標）、Ｃｙｔｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）、アポリズマブ（ＲＥＭＩＴＯＧＥＮ（商標）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂｓ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）、ラベツズマブ（ＣＥＡＣＩＤＥ（登録商標）、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ  Ｉｎｃ．、Ｍｏｒｒｉｓ  Ｐｌａｉｎｓ、ＮＪ）、パーツズマブ（ＯＭＮＩＴＡＲＧ（商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．、Ｓ．Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）、パニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）、Ａｍｇｅｎ、Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ、ＣＡ）、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）、Ｉｍｃｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）、ＢＲ９６、ＢＬ２２、ＬＭＢ９、ＬＭＢ２、ＭＢ１、ＢＨ３、Ｂ４、Ｂ７２．３（Ｃｙｔｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）、ＳＳ１（ＮｅｏＰｈａｒｍ）、ＣＣ４９（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、カンツズマブメルタンシン（ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）、ＭＮＬ２７０４（Ｍｉｌｌｅｎｅｕｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）、ビバツズマブメルタンシン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、トラスツズマブ−ＤＭ１（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）、Ｍｙ９−６−ＤＭ１（ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ、Ｃａｂｒｉｄｇｅ）、ＳＧＮ−１０、−１５、−２５、および−３５（Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｓｅａｔｔｌｅ）、および５Ｅ１０（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｏｗａ）が挙げられるが、これらに限定されない。さらに他の実施形態においては、結合ポリペプチドは、抗ＣＤ２３抗体（例えば、ルミリキシマブ）、抗ＣＤ８０抗体（例えば、ガリキシマブ）、または抗ＶＬ５／α５β１−インテグリン抗体（例えば、ボロシキシマブ）の結合部位を含むことができる。他の実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドは、上記に列挙される抗体と同じ腫瘍関連抗原に結合する。特に好ましい実施形態においては、ポリペプチドは、Ｙ２Ｂ８、Ｃ２Ｂ８、ＣＣ４９、およびＣ５Ｅ１０と同じ抗原に由来するか、または結合する。
【０３３７】
対象の結合分子に組み込むことができる他の結合部位には、オルソクローンＯＫＴ３（抗ＣＤ３）（Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、ＮＪ）、ＲｅｏＰｒｏ（登録商標）（抗ＧｐＩＩｂ／ｇＩＩａ）（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ、Ｈｏｒｓｈａｍ、ＰＡ）、Ｚｅｎａｐａｘ（登録商標）（抗ＣＤ２５）（Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）（抗ＴＮＦα）（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ、Ｈｏｒｓｈａｍ、ＰＡ）、Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（登録商標）（抗ＣＤ２５）（Ｎｏｖａｒｔｉｓ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）（抗ＲＳＶ）（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）、Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）（抗ＴＮＦα）（Ａｂｂｏｔｔ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）、Ｘｏｌａｉｒ（登録商標）（抗ＩｇＥ）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）、Ｒａｐｔｉｖａ（登録商標）（抗ＣＤ１１ａ）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｔｙｓａｂｒｉ（登録商標）（ＢｉｏｇｅｎＩｄｅｃ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）（抗ＶＥＧＦ）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、およびＳｏｌｉｒｉｓ（登録商標）（Ａｌｅｘｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｃｈｅｓｈｉｒｅ、ＣＴ）において見られるものが含まれる。
【０３３８】
一実施形態においては、本発明の結合分子は、次の抗体の１つまたはそれ以上に由来する１つまたはそれ以上の結合部位を含むことができる。トシツモマブ（ＢＥＸＸＡＲ（登録商標））、ムロモナブ（ＯＲＴＨＯＣＬＯＮＥ（登録商標））およびイブリツモマブ（ＺＥＶＡＬＩＮ（登録商標））、セツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ（商標））、リツキシマブ（ＭＡＢＴＨＥＲＡ（登録商標）／ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））、インフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標））、アブシキシマブ（ＲＥＯＰＲＯ（登録商標））およびバシリキシマブ（ＳＩＭＵＬＥＣＴ（登録商標））、エファリズマブ（ＲＡＰＴＩＶＡ（登録商標）、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））、アレムツズマブ（ＣＡＭＰＡＴＨ（登録商標））、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））、ゲムツズマブ（ＭＹＬＯＴＡＲＧ（登録商標））、パリビズマブ（ＳＹＮＡＧＩＳ（登録商標））、オマリズマブ（ＸＯＬＡＩＲ（登録商標））、ダクリズマブ（ＺＥＮＡＰＡＸ（登録商標））、ナタリズマブ（ＴＹＳＡＢＲＩ（登録商標））およびラニビズマブ（ＬＵＶＥＮＴＩＳ（登録商標））、アダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ（登録商標））およびパニツムマブ（ＶＥＣＴＩＢＩＸ（登録商標））。
【０３３９】
一実施形態においては、結合ポリペプチドは、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）と同じ腫瘍関連抗原に結合する。Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）（リツキシマブ、ＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８およびＣ２Ｂ８としても称される）は、ヒトＢ細胞リンパ腫の治療に対する第１のＦＤＡに認可されたモノクローナル抗体である（米国特許第  ５，８４３，４３９号、同第５，７７６，４５６号、および同第５，７３６，１３７号を参照されたく、それぞれの内容は、参照することにより、本明細書に組み込まれる）。Ｙ２Ｂ８（９０Ｙ標識２Ｂ８、Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標）、イブリツモマブチウキセタン）は、Ｃ２Ｂ８のマウス親抗体である。Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）は、成長阻害性であり、インビトロの化学療法剤によるアポトーシスに対してある種のリンパ腫細胞株を感作すると報告されるキメラ抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である。該抗体は、ヒト補体に効率的に結合し、強いＦｃＲ結合を有し、補体依存性（ＣＤＣ）および抗体依存性（ＡＤＣＣ）メカニズムを介して、インビトロでヒトリンパ球を効率的に死滅させることができる（Ｒｅｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ８３：４３５−４４５（１９９４））。当業者は、本発明の結合ポリペプチドが、ＣＤ２０＋悪性腫瘍を提示する患者を治療する際にさらにより効果的な結合ポリペプチドを提供するために、Ｃ２Ｂ８または２Ｂ８の可変領域またはＣＤＲを含むことができることを認識する。
【０３４０】
本発明の他の実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドは、ＣＣ４９と同じ腫瘍関連抗原に結合する。ＣＣ４９は、ヒト由来のある腫瘍細胞の表面、特に、ＬＳ１７４Ｔ腫瘍細胞株に関連するヒト腫瘍関連抗原ＴＡＧ−７２に結合する。ＬＳ１７４Ｔは、ＬＳ１８０結腸腺癌株の変異体である。
【０３４１】
本発明の結合ポリペプチドは、成熟した多数のマウスモノクローナル抗体に由来し、ＴＡＧ−７２に対する結合特異性を有する抗原結合部位を含むことができる。Ｂ７２．３と命名された、これらのモノクローナル抗体の１つは、ハイブリドーマＢ７２．３によって産生されるマウスＩｇＧ１である。Ｂ７２．３は、免疫原としてヒト乳癌抽出物を使用して成熟した第一世代モノクローナル抗体である（ＣｏｌｃｈｅＲ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），７８：３１９９−３２０３（１９８１）、ならびに米国特許第４，５２２，９１８号および同第４，６１２，２８２号を参照されたく、それぞれの内容は、参照することにより、本明細書に組み込まれる）。ＴＡＧ−７２を対象にする他のモノクローナル抗体は、「ＣＣ」（結腸癌に対する）と命名される。Ｓｃｈｌｏｍら（米国特許第５，５１２，４４３号、この内容は、参照することにより、本明細書に組み込まれる）によって記載されるように、ＣＣモノクローナル抗体は、Ｂ７２．３で精製されたＴＡＧ−７２を使用して調製された第二世代マウスモノクローナル抗体のファミリーである。ＴＡＧ−７２へのそれらの比較的良い結合親和性のため、次のＣＣ抗体が好ましい。ＣＣ４９、ＣＣ８３、ＣＣ４６、ＣＣ９２、ＣＣ３０、ＣＣ１１、およびＣＣ１５。Ｓｃｈｌｏｍらは、ＰＣＴ／ＵＳ９９／２５５５２号において開示されるヒト化ＣＣ４９抗体の変異体、および米国特許第５，８９２，０１９号において開示される１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｃ）構造体も産生し、これらの内容は、参照することにより、本明細書に組み込まれる。当業者は、前述の抗体、構造体、または組み換え型、およびそれらの変異体のそれぞれが、合成であり、本発明による結合ポリペプチドの産生に対して結合部位を提供するために使用することができることを認識する。
【０３４２】
上述の抗ＴＡＧ−７２抗体に加えて、様々なグループが、ドメイン欠失ＣＣ４９およびＢ７２．３抗体の構造体および部分的特性解析も報告している（例えば、Ｃａｌｖｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ，８（１）：９５−１０９（１９９３），Ｓｌａｖｉｎ−Ｃｈｉｏｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５３：９７−１０３（１９９３）およびＳｌａｖｉｎ−Ｃｈｉｏｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．５５：５９５７−５９６７（１９９５）。したがって、結合ポリペプチドは、これらの抗体に由来する抗原結合部位、可変領域、またはＣＤＲをも含むことができる。
【０３４３】
一実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドは、ＣＤ２３抗原に結合する抗原結合部位を含む（米国特許第６，０１１，１３８号）。好ましい実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドは、５Ｅ８抗体と同じエピトープに結合する。別の実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドは、抗ＣＤ２３抗体、例えば、５Ｅ８抗体（例えば、ルミリキシマブ）からの少なくとも１つのＣＤＲ（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＣＤＲ）を含む。
【０３４４】
一実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドは、ＣＲＩＰＴＯ−Ｉ抗原に結合する（国際公開第ＷＯ０２／０８８１７０Ａ２号または国際公開第ＷＯ０３／０８３０４１Ａ２号）。より好ましい実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドは、Ｂ３Ｆ６抗体と同じエピトープに結合する。さらに別の実施形態においては、本発明の変化した抗体は、ＣＲＩＰＴＯ−Ｉ抗原、例えば、Ｂ３Ｆ６抗体からの少なくとも１つのＣＤＲ（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＣＤＲ）または可変領域を含む。
【０３４５】
別の実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドは、受容体のＴＮＦスーパーファミリー（「ＴＮＦＲ」）のメンバーである抗原に結合する。別の実施形態においては、本発明の結合分子は、例えば、ＴＮＦファミリー受容体等の細胞表面受容体に結合することにより、シグナルを細胞に変換する少なくとも１つの標的に結合する。「シグナルを変換する」ことは、細胞に結合することによって、結合分子が、例えば、シグナル変換経路を調節することによって、細胞表面受容体に対する細胞外影響を細胞性応答に変換することを意味する。「ＴＮＦ受容体」または「ＴＮＦ受容体ファミリーメンバー」という用語は、受容体の腫瘍壊死因子（「ＴＮＦ」）スーパーファミリーに属する任意の受容体を指す。ＴＮＦ受容体スーパーファミリー（「ＴＮＦＲＳＦ」）のメンバーは、システインノットとして配列される２つまたそれ以上の高システインドメイン（それぞれ約４０のアミノ酸）を有する細胞外領域によって特徴付けられる（Ｄｅｍｐｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ．（２００３）．１４（３−４）：１９３−２０９を参照のこと）。それらの同族ＴＮＦリガンドに結合する際、ＴＮＦ受容体は、ＴＲＡＦ（ＴＮＦ受容体関連因子）として周知の細胞質アダプタタンパク質と直接または間接的に相互作用することによってシグナルを変換する。ＴＲＡＦは、ＮＦ−カッパＢ、ＪＮＫ、ＥＲＫ、ｐ３８、およびＰＩ３Ｋ等のシグナル変換経路の活性化に最終的につながる幾つかのキナーゼカスケードの活性化を誘発することができ、それが、次いで、免疫機能および組織分化からアポトーシスにわたる細胞プロセスを調節する。幾つかのＴＮＦ受容体ファミリーメンバーのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、当技術分野で周知であり、少なくとも以下の２９のヒト遺伝子を含む。ＴＮＦＲＳＦ１Ａ（ＴＮＦＲ１、またＤＲ１、ＣＤ１２０ａ、ＴＮＦ−Ｒ−Ｉｐ５５、ＴＮＦ−Ｒ、ＴＮＦＲＩ、ＴＮＦＡＲ、ＴＮＦ−Ｒ５５、ｐ５５ＴＮＦＲ、ｐ５５Ｒ、またはＴＮＦＲ６０としても周知、ＧｅｎＢａｎｋ  ＧＩ番号４５０７５７５、米国特許第ＵＳ５，３９５，７６０号も参照））、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ（ＣＤ１２０ｂ、またｐ７５、ＴＮＦ−Ｒ、ＴＮＦ−Ｒ−ＩＩ、ＴＮＦＲ８０、ＴＮＦＲ２、ＴＮＦ−Ｒ７５、ＴＮＦＢＲ、またはｐ７５ＴＮＦＲとしても周知、ＧｅｎＢａｎｋ  ＧＩ番号４５０７５７７）、ＴＮＦＲＳＦ３（リンホトキシンベータ受容体（ＬＴβＲ）、またＴＮＦＲ２−ＲＰ、ＣＤ１８、ＴＮＦＲ−ＲＰ、ＴＮＦＣＲ、またはＴＮＦ−Ｒ−ＩＩＩとしても周知、ＧＩ番号４５０５０３８および２００７２２１２）、ＴＮＦＲＳＦ４（ＯＸ４０、またＡＣＴ３５、ＴＸＧＰ１Ｌ、またはＣＤ１３４抗原としても周知、ＧＩ番号４５０７５７９および８９２６７０２）、ＴＮＦＲＳＦ５（ＣＤ４０、またｐ５０、またはＢｐ５０としても周知、ＧＩ番号４５０７５８１および２３３１２３７１）、ＴＮＦＲＳＦ６（ＦＡＳ、またＦＡＳ−Ｒ、ＤｃＲ−２、ＤＲ２、ＣＤ９５、ＡＰＯ−１、またはＡＰＴ１としても周知、ＧｅｎＢａｎｋ  ＧＩ番号４５０７５８３、２３５１０４２１、２３５１０４２３、２３５１０４２５、２３５１０４２７、２３５１０４２９、２３５１０４３１、および２３５１０４３４））、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ（ＤｃＲ３、ＤＲＤＲ３、ＧｅｎＢａｎｋ  ＧＩ番号４５０７５６９、２３２０００２１、２３２０００２３、２３２０００２５、２３２０００２７、２３２０００２９、２３２０００３１、２３２０００３３、２３２０００３５、２３２０００３７、および２３２０００３９）、ＴＮＦＲＳＦ７（ＣＤ２７、またＴｐ５５またはＳ１５２としても周知、ＧｅｎＢａｎｋ  ＧＩ番号４５０７５８７）、ＴＮＦＲＳＦ８（ＣＤ３０、またＫｉ−１またはＤ１Ｓ１６６Ｅとしても周知、ＧｅｎＢａｎｋ  ＧＩ番号４５０７５８９および２３５１０４３７）、ＴＮＦＲＳＦ９（４−１−ＢＢ、またＣＤ１３７またはＩＬＡとしても周知、ＧＩ番号５７３００９５および７２８７３８）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、またＤＲ４またはＡｐｏ２としても周知、ＧｅｎＢａｎｋ  ＧＩ番号２１３６１０８６）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ（ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、またＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＩＣＫ２Ａ、またはＴＲＩＣＫＢとしても周知、ＧｅｎＢａｎｋ  ＧＩ番号２２５４７１１６および２２５４７１１９）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ（ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、またＤｃＲ１、ＬＩＴ、またはＴＲＩＤとしても周知、ＧｅｎＢａｎｋ  ＧＩ番号２２５４７１２１）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ（ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、またＤｃＲ２またはＴＲＵＮＤＤとしても周知）、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ（ＲＡＮＫ、ＧｅｎＢａｎｋ  ＧＩ番号４５０７５６５、米国特許第６，５６２，９４８号、同第６，５３７，７６３号、同第６，５２８，４８２号、同第６，４７９，６３５号、同第６，２７１，３４９号、同第６，０１７，７２９号を参照）、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ（オステオプロテジェリン（ＯＰＧ）、またＯＣＩＦまたはＴＲ１としても周知、ＧＩ番号３８５３０１１６、２２５４７１２２、および３３８７８０５６）、ＴＮＦＲＳＦ１２（輸送鎖関連膜タンパク質（ＴＲＡＭＰ）、またＤＲ３、ＷＳＬ−１、ＬＡＲＤ、ＷＳＬ−ＬＲ、ＤＤＲ３、ＴＲ３、ＡＰＯ−３、Ｆｎ１４、またはＴＷＥＡＫＲとしても周知、ＧｅｎＢａｎｋ  ＧＩ番号７７０６１８６、米国特許出願公開第２００４／００３３２２５Ａ１号）、ＴＮＦＲＳＦ１２Ｌ（ＤＲ３Ｌ）、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ（ＴＡＣＩ、ＧＩ番号６９１２６９４）、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ（ＢＡＦＦＲ、ＧＩ番号１６４４５０２７）、ＴＮＦＲＳＦ１４（ヘルペスウイルス侵入メディエータ（ＨＶＥＭ）、またＡＴＡＲ、ＴＲ２、ＬＩＧＨＴＲ、またはＨＶＥＡとしても周知、ＧｅｎＢａｎｋ  ＧＩ番号２３２０００４１、１２８０３８９５、および３８７８８２１）、ＴＮＦＲＳＦ１６（低親和性神経成長因子受容体（ＬＮＧＦＲ）、またニューロトロフィン受容体またはｐ７５（ＮＴＲ）としても周知、ＧｅｎＢａｎｋ  ＧＩ番号１２８１５６および４５０５３９３）、ＴＮＦＲＳＦ１７（ＢＣＭ、またＢＣＭＡとしても周知、ＧＩ番号２３２３８１９２）、ＴＮＦＲＳＦ１８（ＡＩＴＲ、またＧＩＴＲとしても周知、ＧｅｎＢａｎｋ  ＧＩ番号４７５９２４６、２３２３８１９４および２３２３８１９７）、ＴＮＦＲＳＦ１９（Ｔｒｏｙ／Ｔｒａｄｅ、またＴＡＪとしても周知、ＧｅｎＢａｎｋ  ＧＩ番号２３２３８２０２および２３２３８２０４）、ＴＮＦＲＳＦ２０（ＲＥＬＴ、またＦＬＪ１４９９３としても周知、ＧＩ番号２１３６１８７３および２３２３８２００）、ＴＮＦＲＳＦ２１（ＤＲ６）、ＴＮＦＲＳＦ２２（ＳＯＢａ、またＴｎｆｒｈ２または２８１００２８Ｋ０６Ｒｉｋとしても周知）、およびＴＮＦＲＳＦ２３（ｍＳＯＢ、またＴｎｆｒｈ１としても周知）。他のＴＮＦファミリーメンバーとしては、ＥＤＡＲ１（エクトジスプラシンＡ受容体、またＤｏｗｎｌｅｓｓ（ＤＬ）、ＥＤ３、ＥＤ５、ＥＤ１Ｒ、ＥＤＡ３、ＥＤＡ１Ｒ、ＥＤＡ−Ａ１Ｒとしても周知、ＧｅｎＢａｎｋ  ＧＩ番号１１６４１２３１、米国特許第６，３５５，７８２号）、ＸＥＤＡＲ（ＥＤＡ−Ａ２Ｒとしても周知、ＧｅｎＢａｎｋ  ＧＩ番号１１１４０８２３）、およびＣＤ３９（ＧＩ番号２１３５５８０および７６５２５６）が含まれる。別の実施形態においては、本発明の変化した抗体は、死ドメインに欠くＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに結合する。一実施形態においては、死ドメインに欠くＴＮＦ受容体は、組織分化に関与する。より具体的な実施形態においては、組織分化に関与するＴＮＦ受容体は、ＬＴβＲ、ＲＡＮＫ、ＥＤＡＲ１、ＸＥＤＡＲ、Ｆｎ１４、Ｔｒｏｙ／Ｔｒａｄｅ、およびＮＧＦＲからなる群から選択される。別の実施形態においては、死ドメインに欠くＴＮＦ受容体は、免疫調節に関与する。より具体的な実施形態においては、免疫調節に関与するＴＮＦ受容体ファミリーメンバーは、ＴＮＦＲ２、ＨＶＥＭ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、およびＧＩＴＲからなる群から選択される。これら、ならびに本明細書に記載される他の標的に対して特異的な結合部位を提供することができる例示的な抗体は、当技術分野で周知である。例えば、例示的な抗ＣＤ４０抗体配列は、例えば、米国特許第６，０５１，２２８号および同第６，３１２，６９３号に見出され得る。
【０３４６】
別の実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドは、ＴＮＦリガンドスーパーファミリーに属するＴＮＦリガンドに結合する。ＴＮＦリガンドは、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーの明確に異なる受容体に結合し、互いに１５〜２５％のアミノ酸配列相同性を示す（Ｇａｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（２００３），６６（８）：１４０３−８）。幾つかのＴＮＦ受容体（リガンド）スーパーファミリー（「ＴＮＦＳＦ」）メンバーのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、当技術分野で周知であり、少なくとも以下の１６のヒト遺伝子を含む。ＴＮＦＳＦ１（リンホトキシン−α（ＬＴＡ）、ＴＮＦβまたはＬＴとしても周知、ＧＩ番号：３４４４４および６８０６８９３）、ＴＮＦＳＦ２（ＴＮＦ、ＴＮＦα、またはＤＩＦとしても周知、ＧＩ番号２５９５２１１１）、ＴＮＦＳＦ３（リンホトキシン−β（ＬＴＢ）、ＴＮＦＣ、またはｐ３３としても周知）、ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ−４０Ｌ、ｇｐ３４、ＣＤ１３４Ｌ、またはタックス転写活性化糖タンパク質１，３４ｋＤ（ＴＸＧＰ１）としても周知、ＧＩ番号４５０７６０３）、ＴＮＦＳＦ５（ＣＤ４０ＬＧ、ＩＭＤ３、ＨＩＧＭ１、ＣＤ４０Ｌ、ｈＣＤ４０Ｌ、ＴＲＡＰ、ＣＤ１５４、またはｇｐ３９としても周知、ＧＩ番号４５５７４３３）、ＴＮＦＳＦ６（ＦａｓＬまたはＡＰＴ１ＬＧ１としても周知、ＧｅｎＢａｎｋ  ＧＩ番号４５５７３２９）、ＴＮＦＳＦ７（ＣＤ７０、ＣＤ２７Ｌ、またはＣＤ２７ＬＧとしても周知、ＧＩ番号４５０７６０５）、ＴＮＦＳＦ８（ＣＤ３０ＬＧ、ＣＤ３０Ｌ、またはＣＤ１５３としても周知、ＧＩ番号４５０７６０７）、ＴＮＦＳＦ９（４−１ＢＢ−ＬまたはＩＬＡリガンドとしても周知、ＧＩ番号４５０７６０９）、ＴＮＦＳＦ１０（ＴＲＡＩＬ、Ａｐｏ−２Ｌ、またはＴＬ２としても周知、ＧＩ番号４５０７５９３）、ＴＮＦＳＦ１１（ＴＲＡＮＣＥ、ＲＡＮＫＬ、ＯＰＧＬ、またはＯＤＦとしても周知、ＧＩ番号４５０７５９５および１４７９０１５２）、ＴＮＦＳＦ１２（Ｆｎ１４Ｌ、ＴＷＥＡＫ、ＤＲ３ＬＧ、またはＡＰＯ３Ｌとしても周知、ＧＩ番号  ４５０７５９７および２３５１０４４１）、ＴＮＦＳＦ１３（ＡＰＲＩＬとしても周知）、ＴＮＦＳＦ１４（ＬＩＧＨＴ、ＬＴｇ、またはＨＶＥＭ−Ｌとしても周知、ＧＩ番号２５９５２１４４および２５９５２１４７）、ＴＮＦＳＦ１５（ＴＬ１またはＶＥＧＩとしても周知）、またはＴＮＦＳＦ１６（ＡＩＴＲＬ、ＴＬ６、ｈＧＩＴＲＬ、またはＧＩＴＲＬとしても周知、ＧＩ番号４８２７０３４）。他のＴＮＦリガンドファミリーメンバーとしては、ＥＤＡＲ１＆ＸＥＤＡＲリガンド（ＥＤ１、ＧＩ番号４５０３４４９、Ｍｏｎｒｅａｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ．６３：３８０）、Ｔｒｏｙ／Ｔｒａｄｅリガンド、ＢＡＦＦ（ＴＡＬＬ１としても周知、ＧＩ番号５７３００９７）、およびＮＧＦリガンド（例えば、ＮＧＦ−β（ＧＩ番号４５０５３９１）、ＮＧＦ−２／ＮＴＦ３、ＧＩ番号４５０５４６９）、ＮＴＦ５（ＧＩ番号５４５３８０８））、ＢＤＮＦ（ＧＩ番号２５３０６２６７、２５３０６２３５、２５３０６２５３、２５３０６２５７、２５３０６２６１、２５３０６２６４、ＩＦＲ��１（ＧＩ番号４５０４６０７））が含まれる。さらに特定の実施形態においては、ＴＮＦリガンドは、免疫調節（例えば、ＣＤ４０ＬまたはＴＷＥＡＫ）に関与する。
【０３４７】
さらに他の実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドは、自己免疫または炎症性疾患または障害を治療する際に有用な分子に結合する。例えば、結合ポリペプチドは、自己免疫疾患または障害に関与する免疫細胞（例えば、ＢまたはＴ細胞）または自己抗原上に存在する抗原に結合することができる。自己免疫または炎症性障害に関連する抗原は、上述の腫瘍関連抗原であり得る。そのため、腫瘍関連抗原も、自己免疫または炎症性関連障害であり得る。本明細書において使用される「自己免疫疾患または障害」という用語は、免疫系が、体の自己の細胞を攻撃し、組織破壊を引き起こす、対象における障害または病状を指す。自己免疫疾患は、自己免疫反応が、多数の組織において同時に発生する一般的な自己免疫疾患、または自己免疫反応が単一の臓器を標的とする臓器特異的自己免疫疾患を含む。本発明の方法および組成物によって診断、予防、または治療することができる自己免疫疾患の例としては、クローン病、炎症性大腸炎（ＩＢＤ）、全身性エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、リウマチ性関節炎、グッドパスチャー症候群、グレーブス病疾病、橋本甲状腺炎、尋常性天疱瘡、重症筋無力症、硬皮症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少性紫斑病、多発性筋炎および皮膚筋炎、悪性貧血、シェーグレン症候群、強直性脊椎炎、血管炎、１型糖尿病、神経系疾患、多発性硬化症、および自己免疫疾病の結果として生じる二次疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３４８】
他の実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドは、炎症性疾患または障害に関連する標的分子に結合する。本明細書において使用される「炎症性疾患または障害」という用語は、炎症によって、少なくとも部分的に引き起こされるか、または悪化する疾患または障害、例えば、血流量増大、浮腫、および免疫細胞の活性化（例えば、増殖、サイトカイン産生、または食作用の強化）を含む。例えば、本発明の結合ポリペプチドは、異常な量、例えば、対象のためとなるように変化させることが有利となり得る量で、一部位に関与または存在する炎症性因子（例えば、マトリクスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、ＴＮＦα、インターロイキン、血漿タンパク質、サイトカイン、脂質代謝産物、プロテアーゼ、毒性ラジカル、ミトコンドリアタンパク質、アポトーシスタンパク質、接着分子等）に結合することができる。炎症プロセスは、損傷への生体組織の反応である。炎症の原因は、物理的損傷、化学物質、微生物、組織壊死、癌、または他の薬剤のためであり得る。急性炎症は、例えば、数日間のみ持続する短時間型である。しかしながら、それが持続する場合、それは慢性炎症と称され得る。
【０３４９】
炎症性障害は、急性炎症性障害、慢性炎症性障害、および再発性炎症性障害を含む。急性炎症性障害は、概して、比較的短期間であり、約数分間から約１〜２日間持続するが、それらは、数週間持続する場合がある。急性炎症性障害の主要な特性は、血流量増大、液状および血漿タンパク質の滲出（浮腫）、および好中球等の白血球の移動を含む。慢性炎症性障害は、概して、長期間、例えば、数週、数ヶ月、数年、またはそれ以上であり、リンパ球およびマクロファージの存在、および血管および結合組織の増殖に組織学的に関連する。再発性炎症性障害は、ある期間後に再発するか、または定期的な症状の出現を有する障害を含む。再発性炎症性障害の例には、喘息および多発性硬化症が含まれる。一部の障害は、１つまたはそれ以上のカテゴリに該当し得る。炎症性障害は、概して、熱、発赤、腫脹、疼痛および機能低下によって特徴付けられる。炎症性障害の原因の例としては、細菌感染（例えば、細菌、ウイルス、および真菌感染症）、物理的変化を生じさせるもの（例えば、火傷、放射線、および外傷）、化学物質（例えば、毒素および腐食性物質）、組織壊死、および様々な種類の免疫学的反応が挙げられるが、これらに限定されない。炎症性障害の例としては、変形性関節症、リウマチ性関節炎、急性および慢性感染（細菌、ウイルス、および真菌）、風邪を含む、急性および慢性気管支炎、副鼻腔炎、および他の呼吸器感染、急性および慢性胃腸炎および結腸炎、急性および慢性膀胱炎ならびに尿道炎、急性呼吸窮迫症候群、嚢胞性線維症、急性および慢性皮膚炎、急性および慢性結膜炎、急性および慢性漿膜炎（心膜炎、腹膜炎、滑膜炎、胸膜炎、および腱炎）、尿毒性心膜炎、急性および慢性胆嚢炎、急性および慢性膣炎、急性および慢性ブドウ膜炎、薬物反応、および火傷（熱的、化学的、および電気的）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３５０】
一好ましい実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドは、ＣＤ４０Ｌ抗体に結合する（例えば、５Ｃ８抗体と同じエピトープに結合する（すなわち、５Ｃ８抗体と競合する））。さらに別の実施形態においては、本発明のポリペプチドは、抗ＣＤ４０Ｌ抗体（例えば、５Ｃ８抗体）からの少なくとも１つの抗原結合部位、１つまたはそれ以上のＣＤＲ（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＣＤＲ）、または１つまたはそれ以上の可変領域（ＶＨまたはＶＬ）を含む。膜透過タンパク質であるＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４、ｇｐ３９）は、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞、マスト細胞、好塩基球、好酸球、天然キラー（ＮＫ）細胞、および活性化血小板上で発現される。ＣＤ４０Ｌは、Ｔ細胞依存性Ｂ細胞反応に対して重要である。ＣＤ４０Ｌの顕著な機能であるイソタイプ切り替えは、ＣＤ４０Ｌが先天的に欠損している高免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）症候群によって示される。ＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０の相互作用（樹枝状細胞等の抗原提示細胞に対する）は、Ｔ細胞プライミングおよびＴ細胞依存性体液性免疫反応に不可欠である。したがって、抗ＣＤ４０Ｌモノクローナル抗体（ｍＡｂ）によるＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用の遮断は、上記の情報および動物における試験に基づいて、ヒト自己免疫疾病にける可能な治療方針と考えられている。本発明の結合ポリペプチドが由来し得る例示的な抗ＣＤ４０Ｌ抗体は、米国特許第５，４７４，７７１号において記載され、この内容は、参照することにより、本明細書に組み込まれる、マウス抗体５Ｃ８、およびそのヒト化版、例えば、実施例において開示されるＨｕ５Ｃ８抗体を含む。他の抗ＣＤ４０Ｌ抗体は、当技術分野で周知である（例えば、米国特許第５，９６１，９７４号および国際公開第ＷＯ９６／２３０７１号を参照）。特定の実施形態においては、本発明の抗ＣＤ４０Ｌ結合ポリペプチドは、５Ｃ８抗体のＶＨおよび／またはＶＬ配列を含む。
【０３５１】
さらに他の実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドは、神経系疾患または障害を治療する際に有用な分子に結合する。
【０３５２】
例えば、結合ポリペプチドは、神経系細胞（例えば、ニューロン、グリア細胞、またはａ）上に存在する抗原に結合することができる。ある実施形態においては、神経系障害に関連する抗原は、上述の自己免疫または炎症性障害であり得る。本明細書において使用される「神経系疾患または障害」という用語は、神経系が変質している（例えば、神経変性疾患、および神経系が、適切に発達しない疾患）か、または後の外傷、例えば、脊髄損傷を再生することができない、対象における障害または病状を含む。本発明の方法および組成物によって診断、予防、または治療することができる神経系障害の例としては、多発性硬化症、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、神経因性疼痛、外傷性脳損傷、ギランバレー症候群、および慢性炎症性脱髄性多発神経障害（ＣＩＤＰ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３５３】
本発明の結合ポリペプチドを標的にすることができる神経系疾患または障害を治療する際に有用な例示的な分子には、ＬＩＮＧＯタンパク質、例えば、ＬＩＮＧＯ−１およびＬＩＮＧＯ−４、セマフォリンタンパク質、例えば、セマフォリン６Ａ、死受容体（ＤＲ）タンパク質、例えば、ＤＲ６、ＴＲＡＩＮ（またはＴＡＪ）タンパク質、ＴＲＫＡ、ＴＲＫＢ、ならびにＮＯＧＯタンパク質が含まれる。
【０３５４】
（ｂ）抗原結合断片
他の実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドの結合部位は、抗原結合断片を含むことができる。「抗原結合断片」という用語は、抗原に結合するか、または抗原結合（すなわち、特異的結合）のために無傷抗体（すなわち、それらが由来する無傷抗体）と競合する免疫グロブリン、抗体、または抗体変異体のポリペプチド断片を指す。例えば、該抗原結合断片は、上述の抗体または抗体変異体のいずれにも由来することができる。抗原結合断片は、当技術分野で周知の組み換えまたは生化学的方法によって産生することができる。例示的な抗原結合断片には、単一ドメイン抗体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、および（Ｆａｂ′）２が含まれる。
【０３５５】
例示的な実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドは、変異Ｆｃポリペプチドの安定化Ｆｃ領域のＣ末端および／またはＮ末端に機能的に連結される（例えば、化学的に結合体化されるか、または遺伝的に融合される（例えば、直接融合されるか、またはポリペプチドリンカーを介して融合される））少なくとも１つの抗原結合断片を含む。例示的な一実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドは、ヒンジドメイン、またはその一部（例えば、ＩｇＧ１ヒンジ、またはその一部、例えば、ヒトＩｇＧ１ヒンジ）を介して少なくとも１つの安定化Ｆｃ領域のＮ末端（またはＣ末端）に機能的に連結される抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ）を含む。例示的なヒンジドメイン部分は、配列ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧを含む。
【０３５６】
（ｃ）一本鎖結合分子
他の実施形態においては、本発明の結合分子は、一本鎖結合分子（例えば、一本鎖可変領域またはｓｃＦｃ）からの結合部位を含むことができる。一本鎖抗体の産生に関して記載される手法（米国特許第４，６９４，７７８号、Ｂｉｒｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４４２（１９８８）、Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３（１９８８）、およびＷａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５４４−５５４（１９８９））は、一本鎖結合分子を産生するために適合させることができる。一本鎖抗体は、アミノ酸架橋を介してＦｖ領域の重鎖または軽鎖断片を連結させることによって形成され、一本鎖抗体が得られる。大腸菌における機能Ｆｖ断片の集合のための手法も、使用することができる（Ｓｋｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：１０３８−１０４１（１９８８））。
【０３５７】
ある実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドは、一本鎖可変領域配列（ｓｃＦｃ）を含むか、またはそれからなる１つまたはそれ以上の結合部位または領域を含む。一本鎖可変領域配列は、１つまたはそれ以上の抗原結合部位、例えば、柔軟リンカーによってＶＨドメインに連結されるＶＬドメインを有する一本鎖ポリペプチドを含む。ＶＬおよび／またはＶＨドメインは、上述の抗体または抗体変異体のいずれにも由来することができる。ＳｃＦｖ分子は、ＶＨ−リンカー−ＶＬ方向またはＶＬ−リンカー−ＶＨ方向で構築することができる。抗原結合部位を作製するＶＬおよびＶＨドメインを連結する柔軟リンカーは、好ましくは、約１０〜約５０のアミノ酸残基を含む。一実施形態においては、ポリペプチドリンカーは、ｇｌｙ−ｓｅｒポリペプチドリンカーである。例示的なｇｌｙ／ｓｅｒポリペプチドリンカーは、式（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎのものであり、ｎは、正の整数（例えば、１、２、３、４、５、または６）である。他のポリペプチドリンカーは、当技術分野で周知である。一本鎖可変領域配列（例えば、一本鎖Ｆｖ抗体）を有する抗体および該一本鎖抗体を作製するための方法は、当技術分野で周知である（例えば、Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．１９８９．Ｇｅｎｅ  ７７：５１、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．１９８８  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３、Ｐａｎｔｏｌｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９１．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：１０１１７、Ｍｉｌｅｎｉｃ  ｅｔ  ａｌ．１９９１．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５１：６３６３、Ｔａｋｋｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９１．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ４：８３７を参照）。
【０３５８】
ある実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドにおいて使用されるｓｃＦｖ分子は、安定化ｓｃＦｖ分子である。一実施形態においては、安定化ｃＦｖ分子は、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間に介入するｓｃＦｃリンカーを含むことができ、ＶＨおよびＶＬドメインは、ＶＨにおけるアミノ酸とＶＬドメインにおけるアミノ酸との間のジスルフィド結合によって連結される。他の実施形態においては、安定化ｓｃＦｖ分子は、最適化された長さまたは組成物を有するｓｃＦｃリンカーを含むことができる。さらに他の実施形態においては、安定化ｓｃＦｖ分子は、少なくとも１つの安定化アミノ酸置換を有するＶＨまたはＶＬドメインを含むことができる。さらに別の実施形態においては、安定化ｓｃＦｖ分子は、上記に掲載された安定化特色の少なくとも２つを有することができる。安定化ｓｃＦｖ分子は、改善されたタンパク質安定性を有するか、またはそれが機能的に連結される結合ポリペプチドに改善されたタンパク質安定性を与える。本発明の好ましいｓｃＦｃリンカーは、従来の結合ポリペプチドと比較して、本発明の結合ポリペプチドの熱安定性を少なくとも約２℃または３℃改善する。例えば、本発明のｓｃＦｖ分子の間で比較を行うことができる。ある好ましい実施形態においては、安定化ｓｃＦｖ分子は、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４ｓｃＦｖリンカー、およびＶＨアミノ酸４４とＶＬアミノ酸１００を連結させるジスルフィド結合を含む。本発明の結合ポリペプチドにおいて使用することができる他の例示的な安定化ｓｃＦｖ分子は、２００６年１２月８日出願の米国暫定特許出願第６０／８７３，９９６号、または２００７年３月１９日出願の米国特許出願第１１／７２５，９７０号において記載され、それぞれの内容は、参照することにより、それらの全体として本明細書に組み込まれる。
【０３５９】
ある例示的な実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドは、遺伝的に融合したＦｃ領域（すなわち、ｓｃＦｃ領域）のＣ末端および／またはＮ末端に機能的に連結される（例えば、化学的に結合体化されるか、または遺伝的に融合される（例えば、直接融合されるか、またはポリペプチドリンカーを介して融合される）少なくとも１つのｓｃＦｖ分子を含む。例示的な一実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドは、ヒンジドメイン、またはその一部（例えば、ＩｇＧ１ヒンジ、またはその一部、例えば、ヒトＩｇＧ１ヒンジ）を介して、少なくとも１つの遺伝的に融合したＦｃ領域のＮ末端（またはＣ末端）に機能的に連結される少なくとも１つのｓｃＦｖ分子（例えば、１つまたはそれ以上の安定化ｓｃＦｖ分子）を含む。例示的なヒンジドメイン部分は、配列ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧを含む。
【０３６０】
ある実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドは、連続して２つまたそれ以上のｓｃＦｖ分子を融合することによって形成される四価結合部位または領域を含む。例えば、一実施形態においては、ｓｃＦｖ分子は、第１のｓｃＦｖ分子が、同じまたは異なる結合特異性を有する少なくとも１つの付加的ｓｃＦｖ分子に、そのＮ末端で（例えば、ポリペプチドリンカー（例えば、ｇｌｙ／ｓｅｒポリペプチドリンカー）を介して）機能的に連結されるように、組み合わされる。ｓｃＦｖ分子の縦列整列は、少なくとも１つの遺伝的に融合したＦｃ領域（すなわち、ｓｃＦｃ領域）のＮ末端および／またはＣ末端に機能的に連結され、本発明の結合ポリペプチドを形成する。
【０３６１】
別の実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドは、ｓｃＦｖ分子を（例えば、ポリペプチドリンカーを介して）抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ断片）に機能的に結合することによって形成される四価結合部位または領域を含む。該四価結合部位または領域は、少なくとも１つの遺伝的に融合したＦｃ領域（すなわち、ｓｃＦｃ領域）のＮ末端および／またはＣ末端に機能的に連結され、本発明の結合ポリペプチドを形成する。
【０３６２】
（ｄ）修飾抗体
他の態様においては、本発明の結合ポリペプチドは、抗体の修飾型に由来する抗原結合部位、またはその一部を含むことができる。例示的なそのような型としては、例えば、ミニボディ、ジアボディ、トリアボディ、ナノボディ、カメリド、Ｄａｂ、四価抗体、イントラジアボディ（例えば、Ｊｅｎｄｒｅｙｋｏ  ｅｔ  ａｌ．２００３．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：４７８１３）、融合タンパク質（例えば、抗体サイトカイン融合タンパク質、Ｆｃ受容体の少なくとも一部と融合されるタンパク質）、および二重特異性抗体が含まれる。他の修飾抗体は、米国特許第４，７４５，０５５号、欧州特許第ＥＰ２５６，６５４号、Ｆａｕｌｋｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２９８：２８６（１９８２）、欧州特許第ＥＰ１２０，６９４号、欧州特許第ＥＰ１２５，０２３号、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１２３：７９３（１９７９）、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：２１９７（１９８０）、Ｒａｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ４１：２０７３（１９８１）、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：２３９（１９８４）、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２（１９８５）、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：６８５１（１９８４）、欧州特許第ＥＰ２５５，６９４号、欧州特許第ＥＰ２６６，６６３号、およびＷＯ８８／０３５５９号において記載される。再分類された免疫グロブリン鎖も、周知である。例えば、米国特許第４，４４４，８７８号、国際公開第ＷＯ８８／０３５６５号、および欧州特許第ＥＰ６８，７６３号、および本明細書において記載される参考文献を参照されたい。
【０３６３】
一実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドは、ミニボディである抗原結合部位もしくは領域、またはそれに由来する抗原結合部位を含む。ミニボディは、２つのポリペプチド鎖から作製される二量体分子であり、それぞれ、ポリペプチドリンカーを介してＣＨ３ドメイン、またはその一部と融合されるｓｃＦｖ分子を含む。ミニボディは、当技術分野において説明される方法を使用して、ｓｃＦｖ成分とポリペプチドリンカー−ＣＨ３成分を結合することによって作製することができる（例えば、米国特許第５，８３７，８２１号または国際公開第ＷＯ９４／０９８１７Ａ１号を参照）。これらの成分は、制限断片として別々のプラスミドから単離し、その後、結紮し、適切なベクター（例えば、発現ベクター）に再クローンすることができる。（例えば、単量体ミニボディポリペプチド鎖をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の）適切な集合は、制限消化およびＤＮＡ配列分析によって検証することができる。一実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドは、可変Ｆｃポリペプチドの少なくとも１つの安定化Ｆｃ領域に機能的に連結されるミニボディのｓｃＦｖ成分を含む。別の実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドは、結合部位または領域として四価ミニボディを含む。四価ミニボディは、２つのｓｃＦｖ分子がポリペプチドリンカーを使用して連結されることを除き、ミニボディと同じ方法で構築することができる。その後、連結されたｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ構造体は、安定化Ｆｃ領域に機能的に連結され、本発明の結合ポリペプチドを形成する。
【０３６４】
別の実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドは、ジアボディである抗原結合部位もしくは領域、またはそれに由来する抗原結合部位を含む。ジアボディは、二量体四価分子であり、それぞれ、ｓｃＦｖ分子と同様のポリペプチドを有するが、同じポリペプチド鎖上のＶＬおよびＶＨドメインが、相互作用することができないように、通常、可変ドメインの両方に接続する短い（例えば、１０未満、好ましくは１〜５）アミノ酸残基リンカーを有する。その代わりに、１つのポリペプチド鎖のＶＬおよびＶＨドメインは、第２のポリペプチド鎖上のＶＨおよびＶＬドメイン（それぞれ）を相互作用する（例えば、国際公開第ＷＯ０２／０２７８１号を参照）。一実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドは、本発明のＦｃポリペプチドの少なくとも１つの安定化Ｆｃ領域のＮ末端および／またはＣ末端に機能的に連結されるジアボディを含む。
【０３６５】
ある実施形態においては、結合分子は、安定化Ｆｃ領域に連結される単一ドメイン結合分子（例えば、単一ドメイン抗体）を含む。例示的な単一ドメイン分子は、軽鎖可変ドメインを有さない、抗体の単離重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、すなわち、重鎖可変ドメイン、および重鎖可変ドメインを有さない、抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、すなわち、重鎖可変ドメインを含む。本発明の結合分子における例示的な単一ドメイン抗体には、例えば、Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：４４６−４４８（１９９３）、およびＤｕｍｏｕｌｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１：５００−５１５（２００２）に記載されるカメリド重鎖可変ドメイン（約１１８〜１３６のアミノ酸残基）が含まれる。他の例示的な単一ドメイン抗体としては、Ｄａｂｓ（登録商標）（Ｄｏｍａｎｔｉｓ  Ｌｔｄ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）としても周知の単一ＶＨまたはＶＬドメインが含まれる。さらに他の単一ドメイン抗体は、サメ抗体（例えば、サメＩｇ−ＮＡＲ）を含む。サメＩｇ−ＮＡＲは、１つの可変ドメイン（Ｖ−ＮＡＲ）および５つのＣ様定常ドメインｓ（Ｃ−ＮＡＲ）のホモ二量体を含み、多様性は、長さが５〜２３残基と異なる伸長ＣＤＲ３領域において集中する。カメリド種（例えば、ラマ）においては、ＶＨＨと称される重鎖可変領域は、全抗原−結合ドメインを形成する。カメリドＶＨＨ可変領域と従来の抗体（ＶＨ）に由来する領域との間の主な違いは、（ａ）ＶＨＨにおける対応する領域と比較して、ＶＨの軽鎖接触表面におけるより多い疎水性のアミノ酸、（ｂ）ＶＨＨにおけるより長いＣＤＲ３、および（ｃ）ＶＨＨにおけるＣＤＲ１とＣＤＲ３との間のジスルフィド結合の頻発、を含む。単一ドメイン結合分子を作製するための方法は、米国特許第６，００５，０７９号および同第６，７６５，０８７号において記載され、両方の内容は、参照することにより、本明細書に組み込まれる。ＶＨＨドメインを含む例示的な単一ドメイン抗体としては、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）（Ａｂｌｙｎｘ  ＮＶ、Ｇｈｅｎｔ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）が含まれる。
【０３６６】
（ｅ）非免疫グロブリン結合分子
ある他の実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドは、非免疫グロブリン結合分子に由来する１つまたはそれ以上の結合部位を含む。本明細書において使用される「非免疫グロブリン結合分子」という用語は、免疫グロブリン以外のポリペプチドに由来するが、所望の結合特異性を与えるために操作する（例えば、変異を起こさせる）ことができる部分（例えば、骨格またはフレームワーク）を、結合部位が含む結合分子である。
【０３６７】
抗体分子に由来しない結合部位を含む結合分子の他の例としては、以下でより詳細に記載される受容体結合部位およびリガンド結合部位が含まれる。
【０３６８】
非免疫グロブリン結合分子は、免疫グロブリンではない免疫グロブリンスーパーファミリー（例えば、Ｔ細胞受容体または細胞接着タンパク質（例えば、ＣＴＬＡ−４、Ｎ−ＣＡＭ、テロキン））に由来する結合部位部分を含むことができる。そのような結合分子は、免疫グロブリン折り畳みの配座を保持し、標的分子に特異的に結合することが可能な結合部位部分を含む。他の実施形態においては、本発明の非免疫グロブリン結合分子は、免疫グロブリン折り畳みに基づかないタンパク質トポロジー（例えば、アンキリン反復タンパク質またはフィブロネクチン等）を有するが、それでも、標的に特異的に結合することが可能な結合部位も含む。
【０３６９】
非免疫グロブリン結合分子は、人工的に多様化された結合部位を有する結合分子のライブラリからの標的結合変異体の選択または単離によって特定することができる。多様化されたライブラリは、完全に無作為の方法（例えば、変異性ＰＣＲ、エクソンシャッフリング、または指向進化）を使用して生成するか、または当技術分野において承認されている設計方針によって促進することができる。例えば、結合部位が、その同族標的分子と相互作用する場合に、通常、関与するアミノ酸部分は、結合部位をコードする核酸内における対応する位置での縮重コドン、トリヌクレオチド、無作為ペプチド、またはループ全体の挿入によって無作為化することができる（例えば、米国公開第２００４０１３２０２８号を参照）。アミノ酸位置の場所は、標的分子を有する複合体における結合部位の結晶構造の調査によって特定することができる。無作為化の候補位置は、結合部位のループ、平面、螺旋、および結合孔を含む。ある実施形態においては、多様化に対して候補になる可能性が高い結合部位内におけるアミノ酸は、免疫グロブリン折り畳みとのそれらの相同性によって特定することができる。例えば、フィブロネクチンのＣＤＲ様ループ内における残基は、フィブロネクチン結合分子のライブラリを生成するために無作為化することができる（例えば、Ｋｏｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２８４：  １１４１−１１５１（１９９８）を参照）。無作為化することができる結合部位の他の部分は、平面を含む。無作為化後、多様化されたライブラリは、次いで、所望の結合特性を用いて、結合分子を得るために、選択またはスクリーニング手順に供することができる。例えば、選択は、ファージ提示法、酵母提示法、またはリボソーム提示法等の当技術分野において承認されている方法によって達成することができる。
【０３７０】
一実施形態においては、本発明の結合分子は、フィブロネクチン結合分子からの結合部位を含む。フィブロネクチン結合分子（例えば、フィブロネクチンＩ、ＩＩ、またはＩＩＩ型ドメインを含む分子）は、免疫グロブリンとは対照的に、鎖内ジスルフィド結合に依存しないＣＤＲ様ループを提示する。フィブロネクチン結合ポリペプチドを作製するための方法は、例えば、国際公開第ＷＯ０１／６４９４２号、および米国特許第６，６７３，９０１号、同第６，７０３，１９９号、同第７，０７８，４９０号、および同第７，１１９，１７１号において記載され、これらの内容は、参照することにより、本明細書に組み込まれる。例示的な一実施形態においては、フィブロネクチン結合ポリペプチドをＡｄＮｅｃｔｉｎ（登録商標）（Ａｄｎｅｘｕｓ  Ｔｈｅｒｐａｅｕｔｉｃｓ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）とする。
【０３７１】
別の実施形態においては、本発明の結合分子は、Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）からの結合部位を含む。アフィボディは、ブドウ球菌プロテインＡ（ＳＰＡ）の免疫グロブリン結合ドメインに由来する（例えば、Ｎｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５：７７２−７７７（１９９７）を参照）。本発明において使用されるアフィボディ結合部位は、ＳＰＡのドメイン（例えば、ドメインＢ）に由来するＳＰＡ関連タンパク質（例えば、タンパク質Ｚ）に変異をおこさせることによって、および所望の結合親和性を有する変異ＳＰＡ関連ポリペプチドを選択することによって合成することができる。アフィボディ結合部位を作製するための他の方法は、米国特許第６，７４０，７３４号および同第６，６０２，９７７号、ならびに国際公開第ＷＯ００／６３２４３号におい記載され、それぞれの内容は、参照することにより、本明細書に組み込まれる。
【０３７２】
別の実施形態においては、本発明の結合分子は、Ａｎｔｉｃａｌｉｎ（登録商標）（Ｐｉｅｒｉｓ  ＡＧ、Ｆｒｉｅｓｉｎｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）からの結合部位を含む。アンチカリン（リポカリンとしても周知）は、多様なβ−バレルタンパク質ファミリーのメンバーであり、その機能は、それらのバレル／ループ領域における標的分子に結合することである。リポカリン結合部位は、バレルの鎖を接続するループ配列を無作為化することによって、所望の標的に結合するように操作することができる（例えば、Ｓｃｈｌｅｈｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ，１０：２３−３３（２００５）、Ｂｅｓｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，９６：１８９８−１９０３（１９９９）を参照。本発明の結合分子において使用されるアンチカリン結合部位は、モンシロチョウのビリン結合タンパク質（ＢＢＰ）のアミノ酸位置２８〜４５、５８〜６９、８６〜９９、および１１４〜１２９を含む直鎖状ポリペプチド配列の配列位置に対応する４つの断片において変異されるリポカリンファミリーのポリペプチドから始めて取得可能であり得る。アンチカリン結合部位を作製するための他の方法は、国際公開第ＷＯ９９／１６８７３号および同第ＷＯ０５／０１９２５４号において記載され、それぞれの内容は、参照することにより、本明細書に組み込まれる。
【０３７３】
別の実施形態においては、本発明の結合分子は、高システインポリペプチドからの結合部位を含む。本発明の実践において使用される高システインドメインは、通常、α−螺旋、βシート、またはβ−バレル構造を形成しない。通常、ジスルフィド結合は、三次元構造へのドメインの折り畳みを促進する。通常、高システインドメインは、少なくとも２つのジスルフィド結合、より典型的には、少なくとも３つのジスルフィド結合を有する。例示的な高システインポリペプチドは、Ａドメインタンパク質である。Ａドメイン（時折、「相補型反復」と称される）は、約３０〜５０または３０〜６５のアミノ酸を含有する。一部の実施形態においては、ドメインは、約３５〜４５のアミノ酸、場合によっては、約４０のアミノ酸を含む。３０〜５０のアミノ酸内に、約６つのシステイン残基がある。６つのシステインのうち、ジスルフィド結合は、通常、以下のシステインの間で見られる。Ｃ１とＣ３、Ｃ２とＣ５、Ｃ４とＣ６。Ａドメインは、リガンド結合部分を構成する。ドメインのシステイン残基は、ジスルフィド結合され、小型の安定した機能的に独立した部分を形成する。これらの反復のクラスタは、リガンド結合ドメインを形成し、異なるクラスタリングは、リガンド結合に対して特異性を与えることができる。Ａドメインを含有する例示的なタンパク質としては、例えば、補体成分（例えば、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、および因子Ｉ）、セリンプロテアーゼ（例えば、エンテロペプチダーゼ、マトリプターゼ、およびコリン）、膜透過タンパク質（例えば、ＳＴ７、ＬＲＰ３、ＬＲＰ５、およびＬＲＰ６）、およびエンドサイトーシス受容体（例えば、ソルチリン関連受容体、ＬＤＬ−受容体、ＶＬＤＬＲ、ＬＲＰ１、ＬＲＰ２、およびＡｐｏＥＲ２）が含まれる。所望の結合特異性のＡドメインタンパク質を作製するための方法は、例えば、国際公開第ＷＯ０２／０８８１７１号および同第ＷＯ０４／０４４０１１号において開示され、それぞれの内容は、参照することにより、本明細書に組み込まれる。
【０３７４】
他の実施形態においては、本発明の結合分子は、反復タンパク質からの結合部位を含む。反復タンパク質は、互いに積み重なって隣接ドメインを形成する、小さい（例えば、約２０〜約４０のアミノ酸残基）構造単位または反復の連続複製を含有するタンパク質である。反復タンパク質は、タンパク質における反復数を調整することによって特定の標的結合部位に適するように修飾することができる。例示的な反復タンパク質としては、設計アンキリン反復タンパク質（すなわち、ＤＡＲＰｉｎｓ（登録商標）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ、Ｚｕｒｉｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）（例えば、Ｂｉｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２２：５７５−５８２（２００４）を参照）または高ロイシン反復タンパク質（すなわち、ＬＲＲＰ）（例えば、Ｐａｎｃｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４３０：１７４−１８０（２００４）を参照）が含まれる。これまで決定された、全てのアンキリン反復単位の三次構造は、βヘアピンおよび後続の２つの逆平行α−螺旋からなり、反復単位を次の単位と接続するループで終了する特性を共有する。アンキリン反復単位で構築されるドメインは、反復単位を、拡張および湾曲構造に積み重ねることによって形成される。ＬＲＲＰ結合部位は、ウミヤツメおよび他の無顎類の適応免疫系の一部を形成し、それらは、リンパ球熟成期の間に、一連の高ロイシン反復遺伝子の組み換えによって形成されるという意味で、抗体に類似する。ＤＡＲＰｉｎまたはＬＲＲＰ結合部位を作製する方法は、国際公開第ＷＯ０２／２０５６５号および同第ＷＯ０６／０８３２７５号において記載され、それぞれの内容は、参照することにより、本明細書に組み込まれる。
【０３７５】
本発明の結合分子において使用することができる他の非免疫グロブリン結合部位は、Ｓｒｃ相同性ドメイン（例えば、ＳＨ２またはＳＨ３ドメイン）、ＰＤＺドメイン、ベータ−ラクタマーゼ、高親和性プロテアーゼ阻害剤、またはサソリ毒等の小ジスルフィド結合タンパク質骨格に由来する結合部位を含む。これらの分子に由来する結合部位を作製するための方法は、当技術分野に開示され、例えば、Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２３（１２）：１４９３−４（２００５）、Ｐａｎｎｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７：２１６６６−２１６７４（２００２）、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１７：１７０−１７５（１９９９）、Ｌｅｇｅｎｄｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．，１１：１５０６−１５１８（２００２）、Ｓｔｏｏｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２１：１０６３−１０６８（２００３）、およびＶｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，９２：６４０４−６４０８（１９９５）を参照。さらに他の結合部位は、ＥＧＦ様ドメイン、クリングルドメイン、ＰＡＮドメイン、Ｇｌａドメイン、ＳＲＣＲドメイン、クニッツ／ウシトリプシン阻害物質ドメイン、カザール型セリンプロテアーゼ阻害剤ドメイン、トレフォイル（Ｐ型）ドメイン、フォンヴィレブランド因子Ｃ型ドメイン、アナフィラトキシン様ドメイン、ＣＵＢドメイン、チログロブリンＩ型反復、ＬＤＬ−受容体クラスＡドメイン、スシドメイン、リンクドメイン、トロンボスポンジンＩ型ドメイン、免疫グロブリン様ドメイン、Ｃ型レクチンドメイン、ＭＡＭドメイン、フォンヴィレブランド因子Ａ型ドメイン、ソマトメジンＢドメイン、ＷＡＰ型四ジスルフィドコアドメイン、Ｆ５／８Ｃ型ドメイン、ヘモペキシンドメイン、ラミニン型ＥＧＦ様ドメイン、Ｃ２ドメイン、ＣＴＬＡ−４ドメイン、および当業者に周知の他のそのようなドメイン、およびそれらの誘導体および／または変異体からなる群から選択される結合ドメインに由来することができる。さらなる非免疫グロブリン結合ポリペプチドには、Ａｖｉｍｅｒｓ（登録商標）（Ａｖｉｄｉａ，Ｉｎｃ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ、国際公開第ＷＯ０６／０５５６８９号および米国特許公開第２００６／０２３４２９９号を参照）、Ｔｅｌｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）（Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｓｔｕｄｉｏ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、Ｅｖｉｂｏｄｉｅｓ（登録商標）（Ｅｖｏｇｅｎｉｘ、Ｓｙｄｎｅｙ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ、米国特許第７，１６６，６９７号を参照）、およびＭｉｃｒｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）（Ｎａｓｃａｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）が含まれる。
【０３７６】
ｉｉ．受容体およびリガンドの結合部分
他の態様においては、本発明の結合ポリペプチドは、安定化Ｆｃ領域に機能的に連結される受容体のリガンド結合部位および／またはリガンドの受容体結合部分を含む。
【０３７７】
ある実施形態においては、結合ポリペプチドは、安定化Ｆｃ領域との、受容体のリガンド結合部分および／またはリガンドの受容体結合部分の融合である。リガンドまたはリガンド結合パートナーをコードするＤＮＡは、所望のＯＲＦ断片をコードするＤＮＡの５′および３′末端においてか、またはその近位で制限酵素によって開裂される。その後、得られたＤＮＡ断片は、遺伝的に融合したＦｃ領域をコードするＤＮＡに容易に挿入される（例えば、インフレームでの連結反応）。融合が行われる正確な部位は、可溶性融合タンパク質の分泌または結合特性を最適化するために実験的に選択することができる。その後、融合タンパク質をコードするＤＮＡは、適切な発現ベクターへサブクローンされ、その後、発現のために宿主細胞へトランスフェクトすることができる。
【０３７８】
一実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドは、リガンドまたは受容体（例えば、受容体の細胞外ドメイン（ＥＣＤ））の結合部位を、安定化Ｆｃ領域と組み合わせる。一実施形態においては、リガンドまたは受容体ドメインの結合ドメインは、安定化Ｆｃ領域のＣ末端に機能的に連結される（例えば、ポリペプチドリンカーを介して融合される）。Ｎ末端融合も、可能である。例示的な実施形態においては、安定化Ｆｃ領域のＣ末端、または即座に、安定化Ｆｃ領域のヒンジドメインへのＮ末端に、融合される。
【０３７９】
ある実施形態においては、受容体のリガンド結合部分の結合部位またはドメインは、上述の抗体または抗体変異体によって結合される受容体に由来することができる。他の実施形態においては、受容体のリガンド結合部分は、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーの受容体（例えば、可溶性Ｔ細胞受容体、例えば、ｍＴＣＲ（登録商標）（Ｍｅｄｉｇｅｎｅ  ＡＧ、Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、上述のＴＮＦ受容体スーパーファミリーの受容体（例えば、イムノアドヘシンの可溶性ＴＮＦα受容体、例えば、Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）（Ｗｙｅｔｈ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＮＪ））、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）受容体ファミリー（例えば、ＧＦＲα３）の受容体、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）スーパーファミリーの受容体、チロシンキナーゼ（ＴＫ）受容体スーパーファミリーの受容体、リガンド開口型（ＬＧ）スーパーファミリーの受容体、ケモカイン受容体スーパーファミリーの受容体、ＩＬ−１／トール様受容体（ＴＬＲ）スーパーファミリー、およびサイトカイン受容体スーパーファミリーからなる群から選択される受容体に由来する。
【０３８０】
他の実施形態においては、リガンドの受容体結合部分の結合部位またはドメインは、上述の抗体または抗体変異体によって結合されるリガンドに由来することができる。例えば、リガンドは、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーの受容体、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーの受容体、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）スーパーファミリーの受容体、チロシンキナーゼ（ＴＫ）受容体スーパーファミリーの受容体、リガンド開口型（ＬＧ）スーパーファミリーの受容体、ケモカイン受容体スーパーファミリーの受容体、ＩＬ−１／トール様受容体（ＴＬＲ）スーパーファミリー、およびサイトカイン受容体スーパーファミリーからなる群から選択される受容体に結合することができる。例示的な一実施形態においては、リガンドの受容体結合部分の結合部位は、上述のＴＮＦリガンドスーパーファミリーに属するリガンドに由来する（例えば、ＣＤ４０Ｌ）。別の実施形態においては、例示的な標的分子は、ＣＤ２００またはＣＤ２００Ｒである。
【０３８１】
他の例示的な実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドは、以下のタンパク質の１つまたはそれ以上に由来する１つまたはそれ以上のリガンド結合ドメインまたは受容体結合ドメインを含むことができる。
【０３８２】
１．サイトカインおよびサイトカイン受容体
サイトカインは、リンパ球の増殖、分化、および機能活性化に対する多面発現効果を有する。様々なサイトカイン、またはそれらの受容体結合部分を、本発明の融合タンパク質において使用することができる。例示的なサイトカインには、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、およびＩＬ−１８）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）（例えば、顆粒球ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）、および単球マクロファージＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ））、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）アルファおよびベータ、細胞毒性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）、およびインターフェロン−α、β、またはγ等のインターフェロンが含まれる（米国特許第  ４，９２５，７９３号および同第４，９２９，５５４号）。
【０３８３】
サイトカイン受容体は、通常、リガンド特異性アルファ鎖および共通ベータ鎖からなる。例示的なサイトカイン受容体には、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３（米国特許第５，６３９，６０５号）、ＩＬ−４（米国特許第５，５９９，９０５号）、ＩＬ−５（米国特許第５，４５３，４９１号）、ＩＬ１０受容体、ＩＦＮγ（欧州特許第ＥＰ０２４０９７５号）、および受容体のＴＮＦファミリー（例えば、ＴＮＦα（例えば、ＴＮＦＲ−１（欧州特許第ＥＰ４１７，５６３号）、ＴＮＦＲ−２（欧州特許第ＥＰ４１７，０１４号）リンホトキシンベータ受容体）に対するサイトカイン受容体が含まれる。
【０３８４】
２．接着タンパク質
接着分子は、細胞が互いに相互作用することを可能にする膜結合型タンパク質である。白血球ホーミング受容体および細胞接着分子、またはそれらの受容体結合部分を含む、様々な接着タンパク質は、本発明の融合タンパク質に組み込むことができる。白血球ホーミング受容体は、炎症中の白血球細胞表面上に発現され、細胞外基質成分への結合を媒介するβ−１インテグリン（例えば、ＶＬＡ−１、２、３、４、５、および６）、および血管内皮上の細胞接着分子（ＣＡＭ）に結合するβ２−インテグリン（例えば、ＬＦＡ−Ｉ、ＬＰＡＭ−１、ＣＲ３、およびＣＲ４）を含む。例示的なＣＡＭには、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＶＣＡＭ−１、およびＭＡｄＣＡＭ−Ｉが含まれる。他のＣＡＭには、Ｅ−セレクチン、Ｌ−セレクチン、およびＰ−セレクチンを含む、セレクチンファミリーのＣＡＭが含まれる。
【０３８５】
３．ケモカイン
感染症の部位への白血球の移動を刺激する走化性タンパク質であるケモカインも、本発明の融合タンパク質に組み込むことができる。例示的なケモカインには、マクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１−αおよびＭＩＰ−１−β）、好中球走化性因子、およびＲＡＮＴＥＳ（通常、Ｔ細胞発現および分泌される活性化に対して調節される）が含まれる。
【０３８６】
４．成長因子および成長因子受容体
成長因子、またはそれらの受容体（または受容体結合、もしくはそのリガンド結合部分）は、本発明の融合タンパク質に組み込むことができる。例示的な成長因子としては、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）およびそのイソフォーム（米国特許第５，１９４，５９６号）、ａＦＧＦおよびｂＦＧＦを含む、線維芽成長因子（ＦＧＦ）、心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ）、肝成長因子（ＨＧＦ、米国特許第  ５，２２７，１５８号および同第６，０９９，８４１号）、骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）等の神経栄養因子、グリア細胞由来神経栄養因子リガンド（例えば、ＧＤＮＦ、ニューツリン、アルテミン、およびパーセフィン）、ニューロトロフィン−３、−４、−５、または−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、またはＮＴ−６）、またはＮＧＦ−β血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）等の神経成長因子（米国特許第４，８８９，９１９号、同第４，８４５，０７５号、同第５，９１０，５７４号、および同第５，８７７，０１６号）、ＴＧＦ−アルファおよびＴＧＦ−ベータ等の形質転換成長因子（ＴＧＦ）（国際公開第ＷＯ９０／１４３５９号）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）を含む骨誘導因子、インスリン様成長因子−ＩおよびＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ、米国特許第６，４０３，７６４号および同第６，５０６，８７４号）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ、ｃ−ＭＰＬリガンド）、およびＷｎｔポリペプチド（米国特許第６，１５９，４６２号）が含まれる。
【０３８７】
本発明の標的受容体ドメインとして使用することができる例示的な成長因子受容体には、ＥＧＦ受容体、ＶＥＧＦ受容体（例えば、Ｆｌｔ１またはＦｌｋ１／ＫＤＲ）、ＰＤＧＦ受容体（国際公開第ＷＯ９０／１４４２５号）、ＨＧＦ受容体（米国特許第５，６４８，２７３号、および同第５，６８６，２９２号）、ならびにＮＧＦ、ＢＤＮＦ、およびＮＴ−３に結合するｐ７５ＮＴＲまたはｐ７５としても称される低親和性受容体（ＬＮＧＦＲ）、および受容体チロシンキナーゼのｔｒｋファミリーのメンバー（例えば、ｔｒｋＡ、ｔｒｋＢ（欧州特許第ＥＰ４５５，４６０号）、ｔｒｋＣ（欧州特許第ＥＰ５２２，５３０号））である高親和性受容体を含む、神経栄養因子受容体が含まれる。
【０３８８】
５．ホルモン
本発明の融合タンパク質における標的薬剤としての使用のための例示的な成長ホルモンには、レニン、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ、米国特許第５，８３４，５９８号）、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、成長ホルモン放出因子、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、チロキシン、プロインスリン、およびインスリン（米国特許第５，１５７，０２１号および同第６，５７６，６０８号）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、カルシトニン、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、レプチン、グルカゴン、ボンベシン、ソマトロピン、ミュラー管抑制物質、レラキシンおよびプロレラキシン、ゴナドトロピン関連ペプチド、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、ＯＢタンパク質、またはミュラー管抑制物質が含まれる。
【０３８９】
６．凝固因子
本発明の融合タンパク質における標的薬剤としての使用のための例示的な血液凝固因子としては、凝固因子（例えば、因子Ｖ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、およびＸＩＩＩ、フォンヴィレブランド因子）、組織因子（米国特許第５，３４６，９９１号、同第５，３４９，９９１号、同第５，７２６，１４７号、同第および６，５９６，８４号）、トロンビンおよびプロトロンビン、フィブリンおよびフィブロゲン、プラスミンおよびプラスミノゲン、ウロキナーゼまたはヒト尿もしくは組織型プラスミノゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）等のプラスミノゲン活性化因子が含まれる。
【０３９０】
ＩＩＩ．  多特異性結合ポリペプチドｓ
ある特定の態様においては、本発明の結合ポリペプチドは、多特異性であり、すなわち、分子の第１の分子またはエピトープに結合する少なくとも１つの結合部位、および第２の分子または第１の分子の第２のエピトープに結合する少なくとも１つの第２の結合部位を有する。本発明の多特異性結合分子は、少なくとも２つの結合部位を含むことができ、結合部位の少なくとも１つは、上述の結合分子の１つからの結合部位に由来するか、またはそれを含む。ある実施形態においては、本発明の多特異性結合分子の少なくとも１つの結合部位は、抗体の抗原結合領域、またはその抗原結合断片（例えば、上述の抗体または抗原結合断片）である。
【０３９１】
（ａ）二重特異性分子
一実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドは、二重特異性である。二重特異性結合ポリペプチドは、例えば、同じ標的分子または異なる標的分子上の２つの異なる標的部位に結合することができる。例えば、本発明の結合ポリペプチドの場合、その二重特異性変異体は、例えば、同じ抗原または２つの異なる抗原上の２つの異なるエピトープに結合することができる。二重特異性結合ポリペプチドは、例えば、診断的および治療的用途において使用することができる。例えば、それらは、免疫アッセイにおける使用で酵素を固定するために使用することができる。それらは、例えば、腫瘍関連分子および検出可能なマーカー（例えば、放射性核種に強固に結合するキレート剤）の両方に結合することによって、癌の診断および治療においても使用することができる。二重特異性結合ポリペプチドは、例えば、細胞毒性を特定の標的へ誘導することによって（例えば、病原体または腫瘍細胞、およびＴ細胞受容体またはＦｃγ受容体等の細胞毒性誘引分子に結合することによって）、ヒトの治療のために使用することもできる。二重特異性結合ポリペプチドは、例えば、線維素溶解剤またはワクチンアジュバントとして使用することもできる。
【０３９２】
二重特異性結合ポリペプチドの例には、異なる腫瘍細胞抗原に対する少なくとも２つのアームを有する二重特異性結合ポリペプチド、腫瘍細胞抗原に対する少なくとも１つのアーム、および細胞毒性誘引分子に対する少なくとも１つのアームを有する二重特異性の変化した結合タンパク質（抗Ｆｃ．ガンマ．ＲＩ／抗ＣＤ１５、抗ｐ１８５．ｓｕｐ．ＨＥＲ２／Ｆｃ．ガンマ．ＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、抗ＣＤ３／抗悪性Ｂ細胞（１Ｄ１０）、抗ＣＤ３／抗ｐ１８５．ｓｕｐ．ＨＥＲ２、抗ＣＤ３／抗ｐ９７、抗ＣＤ３／抗腎細胞癌、抗ＣＤ３／抗ＯＶＣＡＲ−３、抗ＣＤ３／Ｌ−Ｄ１（抗結腸癌）、抗ＣＤ３／抗メラニン細胞刺激ホルモン類似体、抗ＥＧＦ受容体／抗ＣＤ３、抗ＣＤ３／抗ＣＡＭＡ１、抗ＣＤ３／抗ＣＤ１９、抗ＣＤ３／ＭｏＶ１８、抗神経系細胞接着分子（ＮＣＡＭ）／抗ＣＤ３、抗葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）／抗ＣＤ３、抗膵臓癌関連抗原（ＡＭＯＣ−３１）／抗ＣＤ３等）、腫瘍抗原に特異的に結合する少なくとも１つのアーム、および毒素に結合する少なくとも１つのアームを有する二重特異性結合ポリペプチド（抗サポリン／抗Ｉｄ−１、抗ＣＤ２２／抗サポリン、抗ＣＤ７／抗サポリン、抗ＣＤ３８／抗サポリン、抗ＣＥＡ／抗リシンＡ鎖、抗インターフェロン−．アルファ．（ＩＦＮ−．アルファ．）／抗ハイブリドーマイディオタイプ、抗ＣＥＡ／抗ビンカアルカロイド等）、酵素活性プロドラッグを変換するための二重特異性結合ポリペプチド（抗ＣＤ３０／抗アルカリホスファターゼ（マイトマイシンアルコールへのマイトマイシンリン酸塩プロドラッグの変換を触媒する）等）、線維素溶解剤として使用することができる二重特異性結合ポリペプチド（抗フィブリン／抗組織プラスミノゲン活性化因子（ｔＰＡ）、抗フィブリン／抗ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子（ｕＰＡ）等）、細胞表面受容体への免疫複合体を標的とするための二重特異性結合ポリペプチド（抗低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）／抗Ｆｃ受容体（例えば、Ｆｃ．ガンマ．ＲＩ、Ｆｃ．ガンマ．ＲＩＩ、またはＦｃ．ガンマ．ＲＩＩＩ）等）、感染病の治療において使用するための二重特異性結合ポリペプチド（抗ＣＤ３／抗単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、抗Ｔ細胞受容体：ＣＤ３複合体／抗インフルエンザ、抗Ｆｃ．ガンマ．Ｒ／抗ＨＩＶ等）、インビトロまたはインビボにおける腫瘍検出のための二重特異性結合ポリペプチド（抗ＣＥＡ／抗ＥＯＴＵＢＥ、抗ＣＥＡ／抗ＤＰＴＡ、抗ｐ１８５ＨＥＲ２／抗ハプテン）、ワクチンアジュバントとしての二重特異性結合ポリペプチド（上述のＦａｎｇｅｒらを参照）、および診断ツールとしての二重特異性結合ポリペプチド（抗ウサギＩｇＧ／抗フェリチン、抗西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）／抗ホルモン、抗ソマトスタチン／拮抗物質Ｐ、抗ＨＲＰ／抗ＦＩＴＣ、抗ＣＥＡ／抗．ベータ．−ガラクトシダーゼ（上述のＮｏｌａｎらを参照）等）が含まれる。三重特異性ポリペプチドの例には、抗ＣＤ３／抗ＣＤ４／抗ＣＤ３７、抗ＣＤ３／抗ＣＤ５／抗ＣＤ３７、および抗ＣＤ３／抗ＣＤ８／抗ＣＤ３７が含まれる。
【０３９３】
好ましい実施形態においては、本発明の二重特異性結合ポリペプチドは、ＣＲＩＰＴＯ−Ｉに結合する１つのアームを有する。別の好ましい実施形態においては、本発明の二重特異性結合ポリペプチドは、ＬＴβＲに結合する１つのアームを有する。別の好ましい実施形態においては、本発明の二重特異性結合ポリペプチドは、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２に結合する１つのアームを有する。別の好ましい実施形態においては、本発明の二重特異性結合ポリペプチドは、ＬＴβＲに結合する１つのアーム、およびＴＲＡＩＬ−Ｒ２に結合する１つのアームを有する。
【０３９４】
本発明の多特異性結合ポリペプチドは、各特異性に対して一価であるか、各特異性に対して多価であり得る。例えば、本発明の結合ポリペプチドは、第１の標的分子と反応する１つの結合部位、および第２の標的分子と反応する１つの結合部位を含むことができるか、または第１の標的分子と反応する２つの結合部位および第２の標的分子と反応する２つの結合部位を含むことができる。
【０３９５】
本発明の結合ポリペプチドは、リガンドまたは受容体の２つまたそれ以上の結合ドメインからの少なくとも２つの結合特異性を有する場合がある。それらは、国際公開第ＷＯ８９／０２９２２号（１９８９年４月６日公開）、欧州特許第ＥＰ３１４，３１７号（１９８９年５月３日公開）、および１９９２年５月２日出願の米国特許第５，１１６，９６号において開示されるように、本質的にヘテロ二量体、ヘテロ三量体、またはヘテロ四量体として組み立てることができる。例には、ＣＤ４−ＩｇＧ／ＴＮＦ受容体−ＩｇＧ、およびＣＤ４−ＩｇＧ／Ｌ−セレクチン−ＩｇＧが含まれる。最後に記載された分子は、リンパ球ホーミング受容体（ＬＨＲ、Ｌ−セレクチン）のリンパ節結合機能とＣＤ４のＨＩＶ結合機能を組み合わせ、ＨＩＶ感染症、関連する病状の予防もしくは治療におけるか、または診断手段としての潜在的な用途を見出す。
【０３９６】
（ｂ）ｓｃＦｖ含有多特異性結合分子
一実施形態においては、本発明の多特異性結合分子は、少なくとも１つのｓｃＦｖ分子、例えば、上述のｓｃＦｖ分子を含む多特異性結合分子である。他の実施形態においては、本発明の多特異性結合分子は、２つのｓｃＦｖ分子、例えば、二重特異性ｓｃＦｖ（ビス−ｓｃＦｖ）を含む。ある実施形態においては、ｓｃＦｖ分子は、従来のｓｃＦｖ分子である。他の実施形態においては、ｓｃＦｖ分子は、上述の安定化ｓｃＦｖ分子である。ある実施形態においては、多特異性結合分子は、ｓｃＦｖ分子（例えば、安定化ｓｃＦｖ分子）を、ｓｃＦｃ分子を含む結合分子骨格に連結することによって作製することができる。一実施形態においては、出発分子は、上述の結合分子から選択され、ｓｃＦｖ分子および出発結合分子は、異なる結合部位を有する。例えば、本発明の結合分子は、第２の結合特異性を与える、第２のｓｃＦｖ分子または非ｓｃＦｖ結合分子に連結される第１の結合特異性を有するｓｃＦｖ分子を含むことができる。一実施形態においては、本発明の結合分子は、安定化ｓｃＦｖ分子が融合されている天然に存在する抗体である。
【０３９７】
安定化ｓｃＦｖが、親結合分子に連結される場合、安定化ｓｃＦｖ分子の連結は、好ましくは、結合分子の熱安定性を少なくとも約２℃または３℃改善する。一実施形態においては、本発明のｓｃＦｖ含有結合分子は、従来の結合分子と比較して、１℃改善された熱安定性を有する。別の実施形態においては、本発明の結合分子は、従来の結合分子と比較して、２℃改善された熱安定性を有する。別の実施形態においては、本発明の結合分子は、従来の結合分子と比較して、４、５、６℃改善された熱安定性を有する。
【０３９８】
一実施形態においては、本発明の多特異性結合分子は、少なくとも１つのｓｃＦｖ（例えば、２、３、または４つのｓｃＦｖ、例えば、安定化ｓｃＦｖ）を含む。ｓｃＦｖ分子に関する詳細は、米国特許第ＵＳＳＮ１１／７２５，９７０号において見られ、この内容は、参照することにより、本明細書に組み込まれる。
【０３９９】
一実施形態においては、本発明の結合分子は、第１の結合特異性を有する少なくとも１つのｓｃＦｖ断片、および第２の結合特異性を有する少なくとも１つのｓｃＦｖを有する多特異性多価結合分子である。好ましい実施形態においては、ｓｃＦｖ分子のうちの少なくとも１つは、安定化される。
【０４００】
別の実施形態においては、本発明の結合分子は、ｓｃＦｖ四価結合分子である。好ましい実施形態においては、ｓｃＦｖ分子のうちの少なくとも１つは、安定化される。
【０４０１】
（ｃ）多特異性結合分子断片
ある実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドは、多特異性結合分子断片からの結合部位を含むことができる。多特異性結合分子断片は、二重特異性Ｆａｂ２または多特異性（例えば、三重特異性）Ｆａｂ３分子を含む。例えば、多特異性結合分子断片は、異なる特異性を有するＦａｂまたはｓｃＦｖ分子の化学的に結合体化された多重体（例えば、二量体、三量体、または四量体）を含むことができる。
【０４０２】
（ｄ）タンデム可変ドメイン結合分子
他の実施形態においては、本発明の多特異性結合分子は、タンデム抗原結合部位を含む結合分子を含むことができる。例えば、可変ドメインは、連続して直接的に融合または連結される少なくとも２つの（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上）可変重ドメイン（ＶＨドメイン）を含むように操作される抗体重鎖、および連続して直接的に融合または連結される少なくとも２つの（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上）可変軽ドメイン（ＶＬドメイン）を含むように操作される抗体軽鎖を含むことができる。ＶＨドメインは、対応するＶＬドメインと相互作用して一連の抗原結合部位を形成し、結合部位のうちの少なくとも２つは、異なるエピトープに結合する。タンデム可変ドメイン結合分子は、重鎖または軽鎖の２つまたそれ以上を含むことができ、高次価数（例えば、二価または四価）のものである。タンデム可変ドメイン結合分子を作製するための方法は、当技術分野で周知であり、例えば、国際公開第ＷＯ２００７／０２４７１５号を参照されたい。
【０４０３】
（ｅ）二重特異性結合分子
他の実施形態においては、本発明の多特異性結合分子は、二重結合特異性を有する単一の結合部位を含むことができる。例えば、本発明の二重特異性結合分子は、２つのエピトープと交差反応する結合部位を含むことができる。二重特異性結合分子を産生するための当技術分野において承認されている方法は、当技術分野で周知である。例えば、二重特異性結合分子は、第１のエピトープに結合する結合分子をスクリーニングし、第２のエピトープに結合する能力に対して単離結合分子を逆スクリーニングすることによって単離することができる。
【０４０４】
（ｆ）多特異性融合タンパク質
別の実施形態においては、本発明の多特異性結合分子は、多特異性融合タンパク質である。本明細書において使用される「多特異性融合タンパク質」という語句は、少なくとも２つの結合特異性を有し、さらにｓｃＦｃを含む融合タンパク質（上記で定義される）を指定する。多特異性融合タンパク質は、本質的に国際公開第ＷＯ８９／０２９２２号（１９８９年４月６日公開）、欧州特許第ＥＰ３１４，３１７号（１９８９年５月３日公開）、および１９９２年５月２日出願の米国特許第５，１１６，９６４号において開示されるように、例えば、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、またはヘテロ四量体として組み立てることができる。好ましい多特異性融合タンパク質は、二重特異性である。ある実施形態においては、多特異性融合タンパク質の結合特異性のうちの少なくとも１つは、ｓｃＦｖ、例えば、安定化ｓｃＦｖを含む。
【０４０５】
様々な他の多価抗体構造体は、例えば、ＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９号、欧州特許出願第１８４，１８７号、欧州特許出願第１７１，４９６号、欧州特許出願第１７３，４９４号、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ８６／０１５３３号、米国特許第４，８１６，５６７号、欧州特許出願第１２５，０２３号、Ｂｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：３４３９−３４４３、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１−３５２６、Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：２１４−２１８、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７：９９９−１００５、Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４４６−４４９、Ｓｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８０：１５５３−１５５９）、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２−１２０７、Ｏｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４、米国特許第５，２２５，５３９、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５５２−５２５、Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４、Ｂｅｉｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３−４０６０、およびＷｉｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，３４９，ｐｐ．２９３−９９（１９９１））において記載される日常の組み換えＤＮＡ手法を使用して、当業者によって開発することができる。好ましくは、非ヒト抗体は、非ヒト抗原結合ドメインをヒト定常ドメインと連結させることによって「ヒト化」される（例えば、Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第４，８１６，５６７号、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１，ｐｐ．６８５１−５５（１９８４））。
【０４０６】
多価抗体構造体を調製するために使用することができる他の方法は、以下の出版物において記載される。Ｇｈｅｔｉｅ，Ｍａｒｉａ−Ａｎａ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｂｌｏｏｄ  ９７：１３９２−１３９８、Ｗｏｌｆｆ，Ｅｄｉｔｈ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：２５６０−２５６５、Ｇｈｅｔｉｅ，Ｍａｒｉａ−Ａｎａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：７５０９−７５１４、Ｋｉｍ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ９７（４）：５４２−５４７、Ｔｏｄｏｒｏｖｓｋａ，Ａｎｅｔａ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８：４７−６６、Ｃｏｌｏｍａ  Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １５：１５９−１６３、Ｚｕｏ，Ｚｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｓｕｐｐｌ．）１３（５）：３６１−３６７、Ｓａｎｔｏｓ  Ａ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５：３１１８ｓ−３１２３ｓ、Ｐｒｅｓｔａ，Ｌｅｏｎａｒｄ  Ｇ．（２００２）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３：２３７−２５６、ｖａｎ  Ｓｐｒｉｅｌ，Ａｎｎｅｍｉｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｒｅｖｉｅｗ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ２１（８）３９１−３９７。
【０４０７】
（ＶＩＩ）．安定化Ｆｃポリペプチドの産生
本発明の安定化Ｆｃポリペプチドは、ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子を発現する細胞において、合成する、または発現することができる。コード配列は、遺伝子コードを用いて選択することができ、任意に、選択された発現系に対して最適化することができる。
【０４０８】
例えば、向上した安定性を有する変異体Ｆｃポリペプチド、例えば、キメラ、ヒト、ヒト化、または合成ＩｇＧ抗体を選択すると、そのようなポリペプチドを産生するための様々な方法が利用可能である。コードの縮退のため、様々な核酸配列が、ポリペプチドの各アミノ酸配列をコードする。所望の核酸配列は、デボノ固相ＤＮＡ合成によってか、またはＦｃポリペプチドをコードする早期に調製されたポリヌクレオチドのＰＣＲ変異体生成によって産生することができる。オリゴヌクレオチド媒介変異体生成は、ポリペプチドのアミノ酸をコードするコドンを安定化変異で置換するための１つの方法である。例えば、標的ポリペプチドＤＮＡは、所望の変異体をコードするオリゴヌクレオチドを一本鎖ＤＮＡ鋳型にハイブリダイズすることによって変化させる。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡポリメラーゼを使用して、オリゴヌクレオチドプライマーを組み込む鋳型の第２の相補的鎖の全体を合成し、変異体ポリペプチドＤＮＡの選択された変化をコードする。一実施形態においては、遺伝子操作、例えば、プライマーベースのＰＣＲ変異体生成は、真核細胞において発現する場合、直ちに、安定化Ｆｃ領域、例えば、安定化非グリコシル化されたＦｃ領域を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを産生するための、本明細書において定義される第１のアミノ酸を変化させるために十分である。
【０４０９】
本発明の変異体Ｆｃポリペプチドは、通常、抗体定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、通常、ヒト免疫グロブリンのものを含む。通常、抗体は、軽鎖および重鎖定常領域の両方を含む。重鎖定常領域は、大抵、同じまたは異なるイソタイプの抗体に由来するかにかかわらず、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域を含む。しかしながら、当然のことながら、本明細書において記載される抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、およびＩｇＥを含む全ての型の定常領域、ならびにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含むいずれのイソタイプを有する抗体を含む。一実施形態においては、ヒトイソタイプＩｇＧ１が使用される。別の実施形態においては、ヒトイソタイプＩｇＧ４が使用される。一実施形態においては、キメラＦｃ領域が使用される。軽鎖定常領域は、ラムダまたはカッパであり得る。ヒト化抗体は、１を超えるクラスまたはイソタイプからの配列を含むことができる。抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、およびＦ（ａｂ′）２、およびＦｖのような別々の重鎖、軽鎖として、または重鎖および軽鎖可変ドメインが、スペーサーを通して連結される一本鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）として、２つの軽鎖および２つの重鎖を含む四量体として発現することができる。
【０４１０】
Ｆｃ領域を含むポリペプチド、例えば、抗体のエフェクタ機能を決定するための方法は、本明細書に記載され、これには、Ｆｃ受容体に結合する修飾Ｆｃ領域の能力の変化を決定するために細胞ベースの結合アッセイを含む。他の結合アッセイを使用して、補体タンパク質、例えば、Ｃ１ｑ補体タンパク質に結合するＦｃ領域の能力を決定することができる。修飾されたＦｃ領域のエフェクタ機能を決定するためのさらなる手法は、当技術分野で記載される。
【０４１１】
ＶＩＩＩ．機能的な部分を含む安定化Ｆｃ含有ポリペプチド
本発明の変異体Ｆｃ含有ポリペプチドは、所望の効果を提供するために、さらに修飾することができる。例えば、変異体ＦｃポリペプチドのＦｃ領域は、例えば、追加の部分、すなわち、例えば、遮断部分、検出可能な部分、診断部分、および／または治療部分等の機能的な部分に共有結合することができる。例示的な機能的な部分は、まず以下に記載され、続いて、異なるアミノ酸側鎖化学にそのような機能的な部分を連結するために有用な化学が記載される。
【０４１２】
有用な機能的な部分の例としては、遮断部分、検出可能な部分、診断部分、および治療部分が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４１３】
例示的な遮断部分は、エフェクタ機能が、例えば、受容体または補体タンパク質に結合するＦｃ領域の能力を阻害することによって低下するように、十分な立体容積および／または電荷の部分を含む。好ましい遮断部分は、ポリアルキレングリコール部分、例えば、ＰＥＧ部分、および好ましくは、ＰＥＧ−マレイミド部分を含む。好ましいペグ化された部分（または関連ポリマー）は、例えば、リエチレングリコール（「ＰＥＧ」）、ポリプロピレングリコール（「ＰＰＧ」）、ポリオキシエチル化グリセロール（「ＰＯＧ」）、および他のポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール（「ＰＶＡ」）、および他のポリアルキレンオキシド、ポリオキシエチル化ソルビトール、またはポリオキシエチル化グルコースであり得る。このポリマーは、それが少なくとも１つの活性スルホン部分を有する限り、ホモポリマー、ランダムポリマーまたはブロックコポリマー、上記に列記されたモノマーに基づくターポリマー、直鎖または分岐鎖、置換または非置換であり得る。ポリマー部分は、任意の長さまたは分子量であり得るが、これらの特徴は、生物学的特性に影響を及ぼし得る。薬学的適用におけるクリアランス速度を減少するために特に有用なポリマーの平均分子量は、２，０００〜３５，０００ダルトンの範囲にある。さらに、２つの基がポリマーに連結される場合（１つの基が各末端に結合される）、ポリマーの長さは、２つの基の間の有効距離および他の空間的関係に影響をもたらし得る。したがって、当業者は、望ましい生物活性を最適化するためか、または与えるためにポリマーの長さを変動することができる。ＰＥＧは、幾つかの理由で生物学的適応において有用である。ＰＥＧは、通常、透明、無色、無臭、水に溶け、熱に対して安定、多くの化学的試薬に対して不活性であり、加水分解せず、そして無毒である。ペグ化は、分子の外見上の分子量を増加させることによって分子の薬物動態学上の性能を改善し得る。この増加された外見上の分子量は、皮下投与または全身投与に続く体からのクリアランス速度を減少する。多くの場合、ペグ化は、抗原性および免疫原性を減少し得る。さらに、ペグ化は、生物活性分子の溶解度を増加し得る。
【０４１４】
ペグ化抗体および抗体断片は、概して、本明細書において記載される抗体および抗体断片の投与によって軽減または調節され得る病状を治療するために使用され得る。概して、ペグ化された非グリコシル化抗体および抗体断片は、ペグ化されない非グリコシル化抗体および抗体断片と比較して、増加した半減期を有する。ペグ化された非グリコシル化抗体および抗体断片は、単独で、一緒に、または他の薬学的組成物と組み合わせて使用され得る。
【０４１５】
本発明の方法およびポリペプチドにおいて有用な検出可能な部分の例には、蛍光部分、ラジオ同位体部分、ラジオパク部分等、例えば、検出可能標識（例えば、ビオチン、発蛍団、発色団、スピン共鳴プローブ、またはラジオ標識）が含まれる。例示的な発蛍団には、蛍光染色（例えば、フルオレセイン、ローダミン等）および他のルミネセント分子（例えば、ルミナール）が含まれる。発蛍団は、環境に敏感であり得、それゆえ、それが基質（例えば、ダンシルプローブ）に結合する際に構造的変化を受ける改変されるタンパク質中の１つまたはそれ以上の残基の近くに位置付けされる場合、その蛍光が変化する。例示的な放射性標識は、１つまたはそれ以上の感受性の低い核を有する低分子含有原子（１３Ｃ、１５Ｎ、２Ｈ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、９９Ｔｃ、４３Ｋ、５２Ｆｅ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、１１１Ｉｎ等）を含む。他の有用な部分は、当技術分野で周知である。
【０４１６】
本発明の方法およびポリペプチドにおいて有用である診断部分の例には、疾患または障害の存在を解明するために適切な検出可能部分が含まれる。通常、診断部分は、分子、例えば、疾患または障害に関連する標的ペプチド、タンパク質、または複数のタンパク質の存在、非存在、またはレベルを決定することを可能にする。そのような診断はまた、疾患または障害およびその進行の予後診断および／または診断するために適している。
【０４１７】
本発明の方法およびポリペプチドにおいて有用である治療部分の例には、例えば、抗炎症剤、抗癌剤、抗神経変性剤、および抗感染剤が含まれる。この機能的な部分はまた、１つまたはそれ以上の上述の機能を有し得る。
【０４１８】
例示的な治療法には、核ＤＮＡに複数の鎖切断をもたらし得る高エネルギー電離放射線を有する放射性核種が含まれ、したがって、（例えば、癌の）細胞死を誘導するために適切である。例示的な高エネルギー放射性核種には、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎ、１０５Ｒｈ、１５３Ｓｍ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、１６６Ｈｏ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、および１８８Ｒｅが含まれる。これらの同位体は、通常、短い道長を有する高エネルギーα粒子またはβ粒子を産生する。そのような放射性核種は、それらの付近にある細胞、例えば、複合体が付着したか、または侵入した腫瘍性細胞を死滅させる。それらは、非局所細胞に対してほとんど作用を有さず、本質的に非免疫原性である。
【０４１９】
また、例示的な治療薬には、細胞増殖抑制剤（例えば、アルキル化剤、ＤＮＡ合成阻害剤、ＤＮＡ挿入剤または架橋剤、またはＤＮＡ−ＲＮＡ転写調節因子）、酵素阻害剤、遺伝子調節因子、細胞障害ヌクレオシド、チューブリン結合剤、ホルモンおよびホルモンアンタゴニスト、抗新脈管形成剤等の細胞毒性剤も含まれる。
【０４２０】
また、例示的な治療薬には、薬物のアントラサイクリンファミリー（例えば、アドリアマイシン、カルミノマイシン、シクロスポリンＡ、クロロキン、メトプテリン、ミトラマイシン、ポルフィロマイシン、ストレプトニグリン、ポルフィロマイシン、アントラセンジオン、およびアジリジン）等のアルキル化剤も含まれる。別の実施形態においては、化学療法部分は、ＤＮＡ合成阻害剤等の細胞増殖抑制剤である。ＤＮＡ合成阻害剤の例としては、メトトレキサート、およびジクロロメトトレキサート、３−アミノ−１，２，４−ベンゾトリアジン１，４−ジオキシド、アミノプテリン、シトシンβ−Ｄ−アラビノフラノシド、５−フルオロ−５′−デオキシウリジン、５−フルオロウラシル、ガンシクロビル、ヒドロキシ尿素、アクチノマイシン−Ｄ、およびマイトマイシン−Ｃが挙げられるが、これらに限定されない。例示的なＤＮＡ挿入剤または架橋剤としては、ブレオマイシン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シクロフォスファミド、シス−ジアミン白金（ＩＩ）二塩化物（シスプラチン）、メルファラン、ミトザントロン、およびオキサリプラチンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０４２１】
また、例示的な治療薬には、アクチノマイシンＤ、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ホモハリングトニン（ｈｏｍｏｈａｒｒｉｎｇｔｏｎｉｎｅ）、およびイダルビシン等の転写調節因子も含まれる。本発明に適する他の例示的な細胞増殖抑制剤には、アンサマイシンベンゾキノン、キノイド誘導体（例えば、キノロン、ゲニステイン、バクタサイクリン（ｂａｃｔａｃｙｃｌｉｎ））、ブスルファン、イホスファミド、メクロレタミン、トリアジクオン（ｔｒｉａｚｉｑｕｏｎｅ）、ジアジクオン（ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ）、カルバジルキノン、インドールキノンＥＯ９、ジアジリジニル（ｄｉａｚｉｒｉｄｉｎｙｌ）−ベンゾキノンメチルＤＺＱ、トリエチレンホスホラミド、およびニトロソ尿素類化合物（例えば、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン）も含まれる。
【０４２２】
また、例示的な治療薬には、例えば、アデノシンアラビノシド、シタラビン、シトシンアラビノシド、５−フルオロウラシル、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、フロクスウリジン、フトラファー（ｆｔｏｒａｆｕｒ）、および６−メルカプトプリン等の細胞毒性ヌクレオシド；タキソイド（ｔａｘｏｉｄｓ）（例えば、パクリタキセル、ドセタキセル、タキサン）、ノコダゾール（ｎｏｃｏｄａｚｏｌｅ）、リゾキシン（ｒｈｉｚｏｘｉｎ）、ドラスタチン（ｄｏｌａｓｔａｔｉｎ）（例えば、ドラスタチン−１０、−１１、または−１５）、コルヒチンおよびコルヒチノイド（ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｏｉｄ）（例えば、ＺＤ６１２６）、コンブレタスタチン（ｃｏｍｂｒｅｔａｓｔａｔｉｎ）（例えば、コンブレタスタチンＡ−４、ＡＶＥ−６０３２）、およびビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）（ナベルビン（ｎａｖｅｌｂｉｎｅ））等のチューブリン結合剤；アンジオスタチンＫ１−３、ＤＬ−α−ジフルオロメチル−オルニチン、エンドスタチン、フマギリン、ゲニステイン、ミノサイクリン、スタウロスポリン、および（±）−サリドマイド等の抗血管形成化合物が含まれる。
【０４２３】
また、例示的な治療薬としては、コルチコステロイド（例えば、プレドニゾン）、プロゲスチン（例えば、ヒドロキシプロゲステロンまたはメドロプロゲステロン）、エストロゲン、（例えば、ジエチルスチルベストロール）、抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン）、アンドロゲン（例えば、テストステロン）、アロマターゼ阻害剤（例えば、アミノグルテチミド）、１７−（アリルアミノ）−１７−デメトキシゲルダナマイシン、４−アミノ−１，８−ナフサリミド、アピゲニン、ブレフェルジン（ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ）Ａ、シメチジン、ジクロロメチレン−二リン酸、ロイプロリド（ロイプロレリン（ｌｅｕｐｒｏｒｅｌｉｎ））、黄体化ホルモン放出ホルモン、ピフィスリン（ｐｉｆｉｔｈｒｉｎ）−α、ラパマイシン、性ホルモン結合グロブリン、およびタプシガルジン等のホルモンおよびホルモンアンタゴニストも含まれる。
【０４２４】
また、例示的な治療薬としては、Ｓ（＋）−カンプトセシン、クルクミン、（−）−デグエリン（ｄｅｇｕｅｌｉｎ）、５，６−ジクロロベンズ−イミダゾール１−β−Ｄ−リボフラノシド、エトポシド、ホルメスタン（ｆｏｒｍｅｓｔａｎｅ）、ホストリエシン（ｆｏｓｔｒｉｅｃｉｎ）、ヒスピジン（ｈｉｓｐｉｄｉｎ）、２−イミノ−１−イミダゾリジン酢酸（シクロクレアチン）、メビノリン、トリコスタチンＡ、チルホスチン（ｔｙｒｐｈｏｓｔｉｎ）ＡＧ３４、およびチルホスチンＡＧ８７９等の酵素阻害剤も含まれる。
【０４２５】
また、例示的な治療薬としては、５−アザ−２′−デオキシシチジン、５−アザシチジン、コレカルシフェロール（ビタミンＤ３）、４−ヒドロキシタモキシフェン、メラトニン、ミフェプリストン、ラロキシフェン、トランス−レチナール（ビタミンＡアルデヒド）、レチン酸、ビタミンＡ酸、９−シス−レチン酸、１３−シス−レチン酸、レチノール（ビタミンＡ）、タモキシフェン、およびトログリタゾン等の遺伝子調節因子も含まれる。
【０４２６】
また、例示的な治療薬としては、薬物のプテリジンファミリー、ジイネン（ｄｉｙｎｅｎｅ）、およびポドフィロトキシン等の細胞毒性剤も含まれる。これらのクラスの特に有用なメンバーとしては、例えば、メトプテリン、ポドフィロトキシン、またはエトポシドまたはエトポシドリン酸、リューロシジン（ｌｅｕｒｏｓｉｄｉｎｅ）、ビンデシン、リューロイシン（ｌｅｕｒｏｓｉｎｅ）等のポドフィロトキシン誘導体が含まれる。
【０４２７】
本明細書の教示に適するさらに他の細胞毒性には、アウリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）（例えば、アウリスタチンＥおよびモノメチルアウリスタンＥ）、カリケアマイシン、グラミシジンＤ、メイタンサノイド（例えば、メイタンシン）、ネオカルチノスタチン、トポテカン、タキサン類、サイトカラシンＢ、エチジウム臭化物、エメチン、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、プロマイシン、およびこれらの類似体または相同体が含まれる。
【０４２８】
他のタイプの機能的な部分は、当技術分野で周知であり、本明細書に含まれる教示に基づく本発明の方法および組成物において容易に使用することができる。
【０４２９】
前述の機能的な部分（それは、低分子、核酸、ポリマー、ペプチド、タンパク質、化学治療法剤、または他のタイプの分子）を特定のアミノ酸側鎖に連結するための化学は、当技術分野で周知である（特定のリンカーの詳細な概説に関しては、例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）を参照のこと）。
【０４３０】
ＩＸ．  安定化Ｆｃポリペプチドの発現
本発明の変異体Ｆｃポリペプチドは、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子の組み換え発現によって産生されることが好ましい。一実施形態においては、本発明の安定化Ｆｃポリペプチドをコードする核酸分子は、ベクターに存在する。抗体の場合、軽鎖および重鎖可変領域をコードする、任意に、定常領域に連結する核酸を、発現ベクターに挿入する。軽鎖および重鎖は、同じまたは異なる発現ベクターにクローン化することができる。免疫グロブリン鎖をコードするＤＮＡ断片は、免疫グロブリンポリペプチドの発現を確実にする発現ベクターにおける制御配列に機能的に連結される。発現制御配列としては、プロモータ（例えば、天然に関連する、または異種プロモータ）、シグナル配列、エンハンサ要素、および転写終止配列が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、発現制御配列は、真核宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトすることが可能なベクターにおける真核プロモータ系である。ベクターが、適切な宿主に取り込まれると、この宿主は、ヌクレオチド配列の高レベルの発現に適切な条件下で、ならびに交差反応抗体の回収および精製に適切な条件下で維持される。
【０４３１】
これらの発現ベクターは、通常、エピソームとして、または宿主染色体ＤＮＡの不可欠な部分としてのいずれかで宿主生物において複製可能である。一般的に、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列によって形質転換されるそれらの細胞の検出を可能にする選択マーカー（例えば、アンピシリン耐性、ハイグロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性、またはネオマイシン耐性）を含む（例えば、Ｉｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第４，７０４，３６２号を参照）。
【０４３２】
大腸菌は、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ配列）をクローン作成するために特に有用である原核生物宿主の１つである。使用に適切な他の微生物宿主には、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｕｓ等のバチルス属、ならびにＳａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、および種々のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種等の他の腸内細菌科が含まれる。
【０４３３】
酵母等の他の微生物もまた、発現のために有用である。ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓおよびＰｉｃｈｉａは、望まれるような発現制御配列（例えば、プロモータ）、複製起点、終止配列等を有する適切なベクターを有する例示的な酵母宿主である。典型的なプロモータには、３−ホスホグリセラートキナーゼおよび他の糖分解酵素が含まれる。誘導酵母プロモータとしては、とりわけ、アルコール脱水素酵素、イソチトクロムＣ、およびメタノール、マルトース、およびガラクトースの使用に関与する酵素からのプロモータを含む。
【０４３４】
微生物に加えて、哺乳類組織培養もまた、本発明のポリペプチド（例えば、免疫グロブリンまたはその断片をコードするポリヌクレオチド）を発現および産生するために使用され得る。Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎ．Ｙ．，Ｎ．Ｙ．（１９８７）を参照のこと。異種のタンパク質（例えば、無傷免疫グロブリン）を分泌し得る多数の適切な宿主細胞株が当技術分野において開発され、これには、ＣＨＯ細胞株、種々のＣＯＳ細胞株、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、骨髄腫細胞株、形質転換されたＢ細胞、およびハイブリドーマを含むため、真核生物細胞が、実際には好ましい。これらの細胞のための発現ベクターは、複製起点、プロモータ、およびエンハンサ等の発現制御配列（Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８９：４９（１９８６））、ならびにリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写ターミネーター配列等の重要なプロセシング情報部位を含むことができる。好ましい発現制御配列は、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０，アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、サイトメガロウイルス等に由来するプロモータである。Ｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９（１９９２）を参照のこと。好ましい実施形態においては、当然のことながら、本発明のポリペプチドは、成熟ポリペプチドである、すなわち、それがシグナル配列を欠く。
【０４３５】
代替として、本発明の変異体Ｆｃポリペプチドをコードする配列は、遺伝子導入動物のゲノムへの導入およびその後の遺伝子導入動物の乳中での発現のためにトランス遺伝子の中に取り込むことができる（例えば、Ｄｅｂｏｅｒらの米国特許第５，７４１，９５７号、Ｒｏｓｅｎの米国特許第５，３０４，４８９号、およびＭｅａｄｅらの米国特許第５，８４９，９９２号を参照のこと）。適切なトランス遺伝子は、カゼインまたはベータラクトグロブリン等の、乳腺特異的遺伝子からのプロモータおよびエンハンサへの操作可能な連結における軽鎖および／または重鎖に対するコード配列を含む。
【０４３６】
対象のヌクレオチド配列（例えば、重鎖および軽鎖をコードする配列ならびに発現制御配列）を含有するベクターは、細胞宿主のタイプによって異なる、周知の方法によって、宿主細胞に移動することができる。例えば、塩化カルシウムのトランスフェクションを、原核細胞のために一般的に使用するが、リン酸カルシウム処理、電気穿孔、リポフェクション、微粒子銃、またはウイルスベースのトランスフェクションを、他の細胞宿主に対して使用することができる。（概して、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．，１９８９を参照）。哺乳類細胞を形質転換するために使用される他の方法には、ポリブレン、プロトプラスト融合、リポソーム、電気穿孔、および微量注入の使用が含まれる（概して、上述のＳａｍｂｒｏｏｋらを参照）。遺伝子導入動物の産生のために、トランス遺伝子が、受精した卵母細胞に微量注入され得るか、または胚幹細胞のゲノムに取り込まれ得、そしてそのような細胞の核は、除核卵母細胞に移動される。
【０４３７】
本発明のポリペプチドは、単一のベクターまたは２つのベクターを用いて発現することができる。例えば、抗体重鎖および軽鎖が、別々の発現ベクター上でクローン化される場合、ベクターは、無傷免疫グロブリンの発現および集合を得るために共トランスフェクションされる。発現されると、全抗体、それらの二量体、個々の軽鎖および重鎖、または本発明の他の免疫グロブリン型は、硫安分画、親和性カラム、カラムクロマトグラフィ、ＨＰＬＣ精製、ゲル電気泳動等を含む、当技術分野の標準的手順に従って精製することができる（概して、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．，（１９８２）を参照）。薬学的用途に対しては、少なくとも約９０〜９５％の均質性の実質上純粋な免疫グロブリンが好ましく、９８〜９９％またはそれ以上の均質性が、最も好ましい。
【０４３８】
本発明の安定化Ｆｃ分子は、特に、生産が拡大される場合に生じる撹拌に対して抵抗性があるため、大量生産に適している。さらに、これらの分子は、輸送および保存中、安定している。
【０４３９】
一実施形態においては、本発明は、安定化Ｆｃ融合タンパク質を含むポリペプチドの大規模な製造のための方法に関連し、該方法は、
（ａ）少なくとも１つの安定化Ｆｃ部分をポリペプチドに遺伝的に融合し、安定化融合タンパク質を形成することと、
（ｂ）哺乳類宿主細胞に該安定化融合タンパク質をコードする核酸分子をトランスフェクトすることと、
（ｃ）該安定化融合タンパク質が発現されるような条件下で、１０Ｌ以上の培養培地において、ステップ（ｂ）の該宿主細胞を培養し、
そのため、安定化融合タンパク質を産生することと、を含む。
【０４４０】
別の実施形態においては、該方法には、安定化融合タンパク質を発現し、培養培地から安定化融合タンパク質を回収するような条件下で、１０Ｌ以上の培養培地において、安定化融合タンパク質をコードする核酸分子を発現する宿主細胞を培養することを含む。任意に、１つまたはそれ以上の精製ステップを使用して、所望の純度の組成物を得ることができる（例えば、そこでは不適切なタンパク質、凝集体、不活性型の分子からの汚染物質を減少させる）。
【０４４１】
Ｘ．予防、診断、および治療方法
本発明はまた、とりわけ、例えば、治療抗体を用いて抗原に結合するが、エフェクタ機能を誘引するのを避けることが望ましい場合の疾患を含む、疾病の予後診断、診断、または処置のために適切な安定化Ｆｃポリペプチドの使用を対象とする。
【０４４２】
したがって、ある実施形態においては、本発明の変異体Ｆｃポリペプチドは、例えば、糸球体腎炎、強皮症、肝硬変、多発硬化症、ループス腎炎、アテローム硬化症、炎症性腸疾患、またはリウマチ性関節炎を含む免疫障害の予防または処置において有用である。別の実施形態においては、本発明の変異体Ｆｃポリペプチドは、アルツハイマー病、重度の喘息、アトピー皮膚炎、悪液質、ＣＨＦ虚血、冠動脈再狭窄、クローン病、糖尿病性腎症、リンパ腫、乾癬、放射線誘導線維症、若年性関節炎、脳卒中、外傷によってもたらされた脳または中枢神経系の炎症、および潰瘍性大腸炎を含む炎症障害が挙げられるが、これらに限定されない、炎症性疾患を処置または予防するために使用することができる。
【０４４３】
本発明の変異体Ｆｃポリペプチドを用いて予防または処置することができる他の炎症性障害には、角膜移植、慢性閉塞性肺疾患、肝炎Ｃ、多発骨髄腫、および変形性関節症に起因する炎症が含まれる。
【０４４４】
別の実施形態においては、本発明の変異体Ｆｃポリペプチドは、膀胱癌、乳癌、頭頸部癌、カポジ肉腫、黒色腫、卵巣癌、小細胞肺癌、胃癌、白血病／リンパ腫、および多発骨髄腫が挙げられるが、これらに限定されない、新生組織形成を予防または治療するために使用することができる。さらなる新生組織形成の病状は、子宮頸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、非扁平細胞肺癌、および前立腺癌を含む。
【０４４５】
別の実施形態においては、本発明の変異体Ｆｃポリペプチドは、アルツハイマー病、脳卒中、および外傷性脳または中枢神経系損傷が挙げられるが、これらに限定されない、神経変性障害を予防または治療するために使用することができる。さらなる神経変性障害は、ＡＬＳ／運動ニューロン疾患、糖尿病性末梢神経障害、糖尿病性網膜症、ハンティングトン病、筋肉変性、およびパーキンソン病を含む。
【０４４６】
さらに別の実施形態においては、本発明の変異体Ｆｃポリペプチドは、病原体、例えば、ウイルス、原核生物、また真核生物によってもたらされた感染を予防または処置するために使用することができる。
【０４４７】
臨床適用において、対象は、疾患または障害の少なくとも１つの徴候または症状を表すことによって上述の病状の１つを発症したか、または発展する危険があるとして特定される。本発明の少なくとも１つの変異体Ｆｃポリペプチドまたは少なくとも１つの変異体Ｆｃポリペプチドを含む組成物が、例えば、上述のような疾患または障害の少なくとも１つの症状を治療するのに十分な量で投与される。一実施形態においては、対象は、有害なＣＤ１５４活性（ＣＤ４０リガンドまたはＣＤ４０Ｌとしても公知である；例えば、Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，７３：Ｓ３６−９（２００２）、Ｓｃｈｏｎｂｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．４２：４−４３（２００１）、Ｋｉｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂ．Ｓｃｉ．３５６：６９１−７０２（２００１）、Ｆｉｕｍａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１１３：２６５−７４（２００１）、およびＢｉａｎｃｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．３（４）：３４３−５３（１９９９）を参照のこと）に関連する疾患または障害の少なくとも１つの徴候または症状を表として特定される。
【０４４８】
したがって、本発明の変異体Ｆｃポリペプチドは、例えば、本明細書において記載されるような、例えば、疾患または障害の予防または治療のために対象に有益な治療応答を生み出す条件下で、対象への治療用の免疫学的な試薬として投与するために適切である。
【０４４９】
本発明の治療剤は、通常、望ましくない汚染物質から実質的に純粋である。このことは、薬剤が、通常、少なくとも約５０％ｗ／ｗ（重量／重量）純度であること、ならびに干渉するタンパク質および汚染物質が実質的にないことを意味する。時々、この薬剤は、少なくとも約８０％ｗ／ｗ純度、より好ましくは、少なくとも９０％ｗ／ｗ純度または約９５％ｗ／ｗ純度である。しかしながら、従来のタンパク質精製技術を使用して、例えば、本明細書に記載されるように、少なくとも９９％ｗ／ｗの同質のペプチドが、得られ得る。
【０４５０】
本方法は、無症状の対象と現在疾病の症状を表している対象との両方に使用することができる。
【０４５１】
別の態様においては、本発明は、変異体Ｆｃポリペプチドを、薬学的担体と共に、薬学的組成物として投与することを特徴とする。代替として、変異体Ｆｃポリペプチドは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを投与することによって対象に投与することができる。Ｆｃポリペプチドが抗体である場合、このポリヌクレオチドは、抗体の重鎖および軽鎖のうちの１つ、またはその両方を産生するように発現させることができる。ある実施形態においては、このポリヌクレオチドは、対象において、抗体の重鎖および軽鎖を産生するために発現させる。例示的な実施形態においては、この対象は、対象の血液に投与された抗体のレベルに関してモニターされる。
【０４５２】
このようにして、本発明は、免疫条件、例えば、ＣＤ１５４関連免疫病状を予防または改善するための治療計画のための積年の必要性を満たす。
【０４５３】
本発明の抗体は、特に、例えば、低下したエフェクタ機能が望ましい場合の細胞ベースのアッセイを含む診断上の適用または調査上の適用等の診断上の適用または調査上の適用に関して適切であることも理解されたい。
【０４５４】
ＸＩ．Ｆｃポリペプチドの有効性を試験するための動物モデル
本発明の抗体は、例えば、獣医の目的か、またはヒト疾病（例えば、上に述べられた免疫疾病または条件）の動物モデルとしてのいずれかで、Ｆｃポリペプチド治療の必要がある非ヒト哺乳類に投与することができる。後者に関して、そのような動物モデルは、本発明の抗体の治療上の有効性を評価するために有用であり得る（例えば、投与のエフェクタ機能、投与量、および時間経過をテストすること）。
【０４５５】
リウマチ性関節炎（ＲＡ）を予防または治療するための本発明のＦｃポリペプチドの治療有効性を評価するために使用することができる動物モデルの例には、アジュバント誘導ＲＡ、コラーゲン誘導ＲＡ、およびコラーゲンｍＡｂ誘導ＲＡが含まれる（Ｈｏｌｍｄａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１８４：１８４、Ｈｏｌｍｄａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ａｇｅｉｎｇ  Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．１：１３５、Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．Ｒｅｐ．４：２３２）。
【０４５６】
炎症性大腸炎（ＩＢＤ）を予防または治療するための本発明の抗体または抗原結合断片の治療有効性を評価するために使用することができる動物モデルの例には、ＴＮＢＳ誘導ＩＢＤ、ＤＳＳ誘導ＩＢＤが含まれる（Ｐａｄｏｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｌｅｎｔｅｒｏｌ．Ｈｅｐａｔｏｌ．１２：２５７、Ｍｕｒｔｈｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．Ｓｃｉ．３８：１７２２）。
【０４５７】
糸球体腎炎を予防または治療するための本発明の抗体または抗原結合断片の治療有効性を評価するために使用することができる動物モデルの例には、抗ＧＢＭ誘導糸球体腎炎（Ｗａｄａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．４９：７６１−７６７）および抗ｔｈｙ１誘導糸球体腎炎（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．５６：１３５−１４４）が含まれる。
【０４５８】
多発硬化症を予防または治療するための本発明の変異体Ｆｃポリペプチドの治療有効性を評価するために使用することができる動物モデルの例には、実験的自己免疫脳脊髄炎（ｅａｅ）が含まれる（Ｌｉｎｋ  ａｎｄ  Ｘｉａｏ（２００１）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１８４：１１７−１２８）。
【０４５９】
動物モデルはまた、例えば、ＭＲＬ−Ｆａｓｌｐｒマウスを使用して、全身紅斑性狼蒼（ＳＬＥ）等のＣＤ１５４関連状態を予防または治療するための本発明の変異体Ｆｃポリペプチドの治療有効性を評価するために使用することができる（上述のＳｃｈｎｅｉｄｅｒ、Ｔｅｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０）。
【０４６０】
ＸＩＩ．治療計画および投与量
予防的用途において、薬学的組成物または医薬が、Ｆｃ領域を有するポリペプチドによって処置できる疾患、例えば、免疫系疾患に苦しむ対象に、疾患の危険を除去または減少させ、重症度を軽減するか、または疾患、その合併症および疾患の発症中に表れる中間の病態学上の表現型の生化学的、組織学的および／もしくは行動に現れる症状を含む、疾患の発生を遅らせるのに十分な量で、投与される。治療的用途において、組成物または医薬が、そのような疾患の疑いのある、またはそのような疾患に既に罹っている対象に、その合併症および疾患の発展段階における中間の病態学上の表現型を含む（生化学的、組織学的および／または行動に現れる）疾患の症状を治癒、または少なくとも部分的に押さえるのに十分な量で投与される。本発明のポリペプチドは、特に、血液中に存在する細胞表面抗原の生物活性を調節するために有用であり、治療または予防される疾病は、少なくとも部分的に、抗原の異常に高いかまたは低い生物活性によってもたらされる。
【０４６１】
幾つかの方法において、薬剤の投与は、例えば、ＣＤ１５４活性に関連する炎症等の免疫疾患を減少または除去する。治療処置または予防処置を達成する適切な量は、治療有効量または予防有効量として定義される。予防計画と治療計画との両方において、薬剤は、通常、十分な免疫応答が達成されるまで、何回かの投薬によって投与される。
【０４６２】
上述の状態の治療に対する、本発明の組成物の有効量は、投与手段、標的部位、対象の生理的状態、対象がヒトであるか、または動物であるか、投与される他の薬物、および治療が予防的であるか、または治療的であるか、を含む、多くの異なる要因によって異なる。通常、対象はヒトであるが、遺伝子組み換え哺乳類を含む非ヒト哺乳類も治療することができる。
【０４６３】
変異体Ｆｃポリペプチドによる受動免疫法のために、投与量は、宿主の体重１ｋｇあたり約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、そしてより一般には、０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲である。例えば、投与量は、１ｍｇ／ｋｇ体重または１０ｍｇ／ｋｇ体重、または１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内、好ましくは少なくとも１ｍｇ／ｋｇであり得る。対象は、そのような量を毎日、一日置きに、毎週または実証的分析によって決定された任意の他のスケジュールによって投与することができる。例示的な治療は、長期、例えば、少なくとも６ヶ月にわたる複数回の投与での投与を必要とする。付加的な例示的治療計画は、２週間に１回、または１ヶ月に１回、または３〜６ヶ月に１回の投与を必要とする。例示的な投与スケジュールは、連日の１〜１０ｍｇ／ｋｇまたは１５ｍｇ／ｋｇ、１日おきに３０ｍｇ／ｋｇまたは毎週６０ｍｇ／ｋｇを含む。幾つかの方法では、異なる結合特異性を有する２つまたそれ以上のモノクローナル抗体は、同時に投与され、その場合、投与される各抗体の投与量は、指示される範囲内にある。
【０４６４】
ポリペプチドは、通常、複数の回数において投与される。１回の投与量の間の間隔は、週ごと、月ごと、または年ごとであり得る。幾つかの方法では、投与量は、１〜１０００μｇ／ｍＬの血漿抗体濃度に到達するように調節され、幾つかの方法では、２５〜３００μｇ／ｍＬである。代替として、ポリペプチドは、徐放性製剤として投与することができ、その場合、低頻度投与しか必要とされない。投与量および頻度は、対象における抗体の半減期によって異なる。概して、ヒト抗体が、最も長い半減期を示し、ヒト化抗体、キメラ抗体、および非ヒト抗体が続く。
【０４６５】
投与量および投与頻度は、治療が予防的または治療的であるかどうかによって異なり得る。予防的用途においては、本発明の抗体または、そのカクテルを含有する組成物は、対象の耐性を向上させるために、まだ病状を有さない対象に投与される。そのような量は、「予防的有効量」と定義される。この使用において、ここでも、正確な量は、対象の健康状態および全身免疫に依存するが、概して、用量当たり０．１〜２５ｍｇ、特に、用量当たり０．５〜２．５ｍｇの範囲である。比較的低い投与量は、長期にわたって比較的頻繁ではない間隔で投与される。一部の対象は、一生治療を受け続ける。
【０４６６】
治療的用途においては、時として、比較的短い間隔での比較的高い投与量（例えば、用量当たり約１〜４００ｍｇ／ｋｇの抗体、より一般的に使用される５〜２５ｍｇの投与量）が、疾病の進行が低下または終了するまで、および好ましくは、対象が、疾病の症状の部分的または完全な改善を示すまで、必要とされる。その後、患者は、予防的計画として投与され得る。
【０４６７】
抗体をコードする核酸の用量は、１人の対象につき約１０ｎｇ〜１ｇ、１００ｎｇ〜１００ｍｇ、１μｇ〜１０ｍｇ、または３０〜３００μｇのＤＮＡの範囲である。感染ウイルスベクターの用量は、用量当たり１０〜１００ビリオン、またはそれ以上に変動する。
【０４６８】
治療剤は、予防および／または治療処置のために非経口的、局所的、静脈的、経口的、皮下的、動脈的、頭蓋内的、腹腔内、鼻腔内的、または筋肉内的手段によって投与することができる。タンパク質薬物の投与の最も一般的な経路は、血管内、皮膚下、または筋肉内であるが、他の経路も効果的であり得る。幾つかの方法においては、沈着物が蓄積した場合、特定の組織に直接的に注射され、その例には、例えば、頭蓋内注射が挙げられる。幾つかの方法においては、抗体は、徐放性組成物またはＭｅｄｉｐａｄ（商標）装置等の装置として投与される。タンパク質薬物はまた、例えば、乾燥粉末吸入装置を使用して、気道を介して投与することができる。
【０４６９】
本発明の薬剤は、任意に、免疫疾患の処置に少なくとも部分的には有効である他の薬剤と組み合わせて投与することができる
ＸＩＩＩ．薬学的組成物
本発明の治療組成物は、薬学的に許容される担体中に、本発明の少なくとも１つの安定化Ｆｃポリペプチドを含む。「薬学的に許容される担体」とは、通常、活性成分の投与のために使用される薬学的調製物の少なくとも１つの成分を指す。したがって、担体は、当技術分野において使用される任意の薬学的賦形剤および投与のための任意の形態のビヒクルを含有し得る。組成物は、例えば、注射用溶液、水性懸濁液もしくは水溶液、非水性懸濁液もしくは非水溶液、固形および液体経口製剤、軟膏剤（ｓａｌｖｅ）、ゲル、軟膏剤（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、皮内パッチ、クリーム、ローション、錠剤、カプセル、徐放性製剤等であり得る。さらなる賦形剤には、例えば、着色料、味遮蔽試薬、溶解補助剤、懸濁剤、圧縮剤、腸溶コーティング、徐放性補助剤等が含まれ得る。
【０４７０】
本発明の薬剤は、多くの場合、活性治療剤、すなわち、様々な他の薬学的に許容される成分を含む薬学的組成物として投与される。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１５ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（１９８０））を参照のこと。好ましい形態は、投与および治療的用途の意図される様式に依存する。この組成物はまた、望ましい製剤に依存して、動物またはヒト投与のための薬学的組成物を製剤化するために通常使用されるビヒクルとして定義される、薬学的に許容される、非毒性担体または希釈液を含むことができる。この希釈液は、組み合わせの生物活性を影響しないように選択される。そのような希釈液の例は、蒸留水、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、デクストロース溶液、およびハンク溶液である。さらに、薬学的組成物または薬学的製剤としてはまた、他の担体、アジュバント、または非毒性、非治療、非免疫原性安定剤等を含むことができる。
【０４７１】
変異体Ｆｃポリペプチドは、蓄積注射または移植調製剤の形態で投与することができ、これは、活性成分の徐放性を可能とするような様式で製剤化することができる。例示的な組成物は、ＨＣｌによりｐＨの６．０に調節された５０ｍＭのＬ−ヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌからなる緩衝水溶液中に製剤化される、５ｍｇ／ｍＬのモノクローナル抗体を含む。
【０４７２】
一般的に、組成物は、溶液または懸濁液のいずれかとしての注射物質として調製され、注射前の液体ビヒクルの溶液または懸濁液に適切な固体形態もまた、調製され得る。この調製物はまた、上で考察されたように、リポソーム中か、または向上されたアジュバント効果のためのポリ乳酸、ポリグリコリド、またはコポリマー等の微粒子中に乳化されるか、または被包され得る（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７（１９９０）およびＨａｎｅｓ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２８：９７（１９９７）を参照のこと）。
【０４７３】
以下の実施例は、説明の目的のために含まれるものであり、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【０４７４】
実施例を通して、特に明記しない限り、以下の材料および方法を使用した。
【０４７５】
材料および方法
一般的に、本発明の実施は、特に示さない限り、化学、分子生物学、組み換えＤＮＡ技術、免疫学（特に、例えば、抗体テクノロジー）の従来の手法、および電気泳動における標準の手法を使用する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），５１０，Ｐａｕｌ，Ｓ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒ（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ，１６９），ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｅｄ．，Ｉｒｌ  Ｐｒ（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃ．Ｓ．Ｈ．Ｌ．Ｐｒｅｓｓ，Ｐｕｂ．（１９９９）、およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９２）を参照のこと。
【０４７６】
親抗体
本発明の安定化抗体を産生するために、モデルヒト抗体（例えば、ｈｕ５ｃ８）、その変異体抗体、あるいは対応するＦｃ領域のいずれかをコードするポリヌクレオチドを、標準的な発現ベクターに導入した。ヒト抗体ｈｕ５ｃ８およびその変異型は、例えば、米国特許第５，４７４，７７１号および同第６，３３１，６１５号に記載されている。アミノ酸配列は、それぞれ、ｈｕ５ｃ８  ＩｇＧ４重鎖（配列番号３７）、ｈｕ５ｃ８軽鎖（配列番号３８）、ｈｕ５ｃ８  Ｆａｂ（配列番号３９）、親ＩｇＧ４抗体（配列番号４０）からの完全Ｆｃ部分、Ｓ２２８Ｐ変異を有する親ＩｇＧ４  Ｆｃ部分（配列番号４１）、およびＳ２２８Ｐ／Ｔ２９９Ａ変異を有する親非グリコシル化ＩｇＧ４  Ｆｃ部分（配列番号４２）に対して、以下に提供される。重鎖に対するリーダー配列は、ＭＤＷＴＷＲＶＦＣＬＬＡＶＡＰＧＡＨＳであった。また、親ＩｇＧ１非グリコシル化されたｈｕ５ｃ８抗体の重鎖（配列番号４３）およびＦｃ部分（配列番号４４）配列も提供される。
【０４７７】
Ｈｕ５ｃ８  ＩｇＧ４重鎖（ＥＡＧ１８０７）（配列番号３７）
Ｑ  Ｖ  Ｑ  Ｌ  Ｖ  Ｑ  Ｓ  Ｇ  Ａ  Ｅ  Ｖ  Ｖ  Ｋ  Ｐ  Ｇ  Ａ  Ｓ  Ｖ  Ｋ  Ｌ  Ｓ  Ｃ  Ｋ  Ａ  Ｓ  Ｇ  Ｙ  Ｉ  Ｆ  Ｔ  Ｓ  Ｙ  Ｙ  Ｍ  Ｙ  Ｗ  Ｖ  Ｋ  Ｑ  Ａ  Ｐ  Ｇ  Ｑ  Ｇ  Ｌ  Ｅ  Ｗ  Ｉ  Ｇ  Ｅ  Ｉ  Ｎ  Ｐ  Ｓ  Ｎ  Ｇ  Ｄ  Ｔ  Ｎ  Ｆ  Ｎ  Ｅ  Ｋ  Ｆ  Ｋ  Ｓ  Ｋ  Ａ  Ｔ  Ｌ  Ｔ  Ｖ  Ｄ  Ｋ  Ｓ  Ａ  Ｓ  Ｔ  Ａ  Ｙ  Ｍ  Ｅ  Ｌ  Ｓ  Ｓ  Ｌ  Ｒ  Ｓ  Ｅ  Ｄ  Ｔ  Ａ  Ｖ  Ｙ  Ｙ  Ｃ  Ｔ  Ｒ  Ｓ  Ｄ  Ｇ  Ｒ  Ｎ  Ｄ  Ｍ  Ｄ  Ｓ  Ｗ  Ｇ  Ｑ  Ｇ  Ｔ  Ｌ  Ｖ  Ｔ  Ｖ  Ｓ  Ｓ  Ａ  Ｓ  Ｔ  Ｋ  Ｇ  Ｐ  Ｓ  Ｖ  Ｆ  Ｐ  Ｌ  Ａ  Ｐ  Ｃ  Ｓ  Ｒ  Ｓ  Ｔ  Ｓ  Ｅ  Ｓ  Ｔ  Ａ  Ａ  Ｌ  Ｇ  Ｃ  Ｌ  Ｖ  Ｋ  Ｄ  Ｙ  Ｆ  Ｐ  Ｅ  Ｐ  Ｖ  Ｔ  Ｖ  Ｓ  Ｗ  Ｎ  Ｓ  Ｇ  Ａ  Ｌ  Ｔ  Ｓ  Ｇ  Ｖ  Ｈ  Ｔ  Ｆ  Ｐ  Ａ  Ｖ  Ｌ  Ｑ  Ｓ  Ｓ  Ｇ  Ｌ  Ｙ  Ｓ  Ｌ  Ｓ  Ｓ  Ｖ  Ｖ  Ｔ  Ｖ  Ｐ  Ｓ  Ｓ  Ｓ  Ｌ  Ｇ  Ｔ  Ｋ  Ｔ  Ｙ  Ｔ  Ｃ  Ｎ  Ｖ  Ｄ  Ｈ  Ｋ  Ｐ  Ｓ  Ｎ  Ｔ  Ｋ  Ｖ  Ｄ  Ｋ  Ｒ  Ｖ  Ｅ  Ｓ  Ｋ  Ｙ  Ｇ  Ｐ  Ｐ  Ｃ  Ｐ  Ｐ  Ｃ  Ｐ  Ａ  Ｐ  Ｅ  Ｆ  Ｌ  Ｇ  Ｇ  Ｐ  Ｓ  Ｖ  Ｆ  Ｌ  Ｆ  Ｐ  Ｐ  Ｋ  Ｐ  Ｋ  Ｄ  Ｔ  Ｌ  Ｍ  Ｉ  Ｓ  Ｒ  Ｔ  Ｐ  Ｅ  Ｖ  Ｔ  Ｃ  Ｖ  Ｖ  Ｖ  Ｄ  Ｖ  Ｓ  Ｑ  Ｅ  Ｄ  Ｐ  Ｅ  Ｖ  Ｑ  Ｆ  Ｎ  Ｗ  Ｙ  Ｖ  Ｄ  Ｇ  Ｖ  Ｅ  Ｖ  Ｈ  Ｎ  Ａ  Ｋ  Ｔ  Ｋ  Ｐ  Ｒ  Ｅ  Ｅ  Ｑ  Ｆ  Ｎ  Ｓ  Ｔ  Ｙ  Ｒ  Ｖ  Ｖ  Ｓ  Ｖ  Ｌ  Ｔ  Ｖ  Ｌ  Ｈ  Ｑ  Ｄ  Ｗ  Ｌ  Ｎ  Ｇ  Ｋ  Ｅ  Ｙ  Ｋ  Ｃ  Ｋ  Ｖ  Ｓ  Ｎ  Ｋ  Ｇ  Ｌ  Ｐ  Ｓ  Ｓ  Ｉ  Ｅ  Ｋ  Ｔ  Ｉ  Ｓ  Ｋ  Ａ  Ｋ  Ｇ  Ｑ  Ｐ  Ｒ  Ｅ  Ｐ  Ｑ  Ｖ  Ｙ  Ｔ  Ｌ  Ｐ  Ｐ  Ｓ  Ｑ  Ｅ  Ｅ  Ｍ  Ｔ  Ｋ  Ｎ  Ｑ  Ｖ  Ｓ  Ｌ  Ｔ  Ｃ  Ｌ  Ｖ  Ｋ  Ｇ  Ｆ  Ｙ  Ｐ  Ｓ  Ｄ  Ｉ  Ａ  Ｖ  Ｅ  Ｗ  Ｅ  Ｓ  Ｎ  Ｇ  Ｑ  Ｐ  Ｅ  Ｎ  Ｎ  Ｙ  Ｋ  Ｔ  Ｔ  Ｐ  Ｐ  Ｖ  Ｌ  Ｄ  Ｓ  Ｄ  Ｇ  Ｓ  Ｆ  Ｆ  Ｌ  Ｙ  Ｓ  Ｒ  Ｌ  Ｔ  Ｖ  Ｄ  Ｋ  Ｓ  Ｒ  Ｗ  Ｑ  Ｅ  Ｇ  Ｎ  Ｖ  Ｆ  Ｓ  Ｃ  Ｓ  Ｖ  Ｍ  Ｈ  Ｅ  Ａ  Ｌ  Ｈ  Ｎ  Ｈ  Ｙ  Ｔ  Ｑ  Ｋ  Ｓ  Ｌ  Ｓ  Ｌ  Ｓ  Ｌ  Ｇ
Ｈｕ５ｃ８軽鎖（配列番号３８）
ＤＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＶＳＰＧＥＲＡＴＩＳＣＲＡＳＱＲＶＳＳＳＴＹＳＹＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＫＹＡＳＮＬＥＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＥＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＨＳＷＥＩＰＰＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
Ｈｕ５ｃ８  ＶＨ／ＣＨ１ドメイン（配列番号３９）
Ｑ  Ｖ  Ｑ  Ｌ  Ｖ  Ｑ  Ｓ  Ｇ  Ａ  Ｅ  Ｖ  Ｖ  Ｋ  Ｐ  Ｇ  Ａ  Ｓ  Ｖ  Ｋ  Ｌ  Ｓ  Ｃ  Ｋ  Ａ  Ｓ  Ｇ  Ｙ  Ｉ  Ｆ  Ｔ  Ｓ  Ｙ  Ｙ  Ｍ  Ｙ  Ｗ  Ｖ  Ｋ  Ｑ  Ａ  Ｐ  Ｇ  Ｑ  Ｇ  Ｌ  Ｅ  Ｗ  Ｉ  Ｇ  Ｅ  Ｉ  Ｎ  Ｐ  Ｓ  Ｎ  Ｇ  Ｄ  Ｔ  Ｎ  Ｆ  Ｎ  Ｅ  Ｋ  Ｆ  Ｋ  Ｓ  Ｋ  Ａ  Ｔ  Ｌ  Ｔ  Ｖ  Ｄ  Ｋ  Ｓ  Ａ  Ｓ  Ｔ  Ａ  Ｙ  Ｍ  Ｅ  Ｌ  Ｓ  Ｓ  Ｌ  Ｒ  Ｓ  Ｅ  Ｄ  Ｔ  Ａ  Ｖ  Ｙ  Ｙ  Ｃ  Ｔ  Ｒ  Ｓ  Ｄ  Ｇ  Ｒ  Ｎ  Ｄ  Ｍ  Ｄ  Ｓ  Ｗ  Ｇ  Ｑ  Ｇ  Ｔ  Ｌ  Ｖ  Ｔ  Ｖ  Ｓ  Ｓ  Ａ  Ｓ  Ｔ  Ｋ  Ｇ  Ｐ  Ｓ  Ｖ  Ｆ  Ｐ  Ｌ  Ａ  Ｐ  Ｃ  Ｓ  Ｒ  Ｓ  Ｔ  Ｓ  Ｅ  Ｓ  Ｔ  Ａ  Ａ  Ｌ  Ｇ  Ｃ  Ｌ  Ｖ  Ｋ  Ｄ  Ｙ  Ｆ  Ｐ  Ｅ  Ｐ  Ｖ  Ｔ  Ｖ  Ｓ  Ｗ  Ｎ  Ｓ  Ｇ  Ａ  Ｌ  Ｔ  Ｓ  Ｇ  Ｖ  Ｈ  Ｔ  Ｆ  Ｐ  Ａ  Ｖ  Ｌ  Ｑ  Ｓ  Ｓ  Ｇ  Ｌ  Ｙ  Ｓ  Ｌ  Ｓ  Ｓ  Ｖ  Ｖ  Ｔ  Ｖ  Ｐ  Ｓ  Ｓ  Ｓ  Ｌ  Ｇ  Ｔ  Ｋ  Ｔ  Ｙ  Ｔ  Ｃ  Ｎ  Ｖ  Ｄ  Ｈ  Ｋ  Ｐ  Ｓ  Ｎ  Ｔ  Ｋ  Ｖ  Ｄ  Ｋ  Ｒ  Ｖ
親ＩｇＧ４  Ｆｃ部分（配列番号４０）
Ｅ  Ｓ  Ｋ  Ｙ  Ｇ  Ｐ  Ｐ  Ｃ  Ｐ  Ｓ  Ｃ  Ｐ  Ａ  Ｐ  Ｅ  Ｆ  Ｌ  Ｇ  Ｇ  Ｐ  Ｓ  Ｖ  Ｆ  Ｌ  Ｆ  Ｐ  Ｐ  Ｋ  Ｐ  Ｋ  Ｄ  Ｔ  Ｌ  Ｍ  Ｉ  Ｓ  Ｒ  Ｔ  Ｐ  Ｅ  Ｖ  Ｔ  Ｃ  Ｖ  Ｖ  Ｖ  Ｄ  Ｖ  Ｓ  Ｑ  Ｅ  Ｄ  Ｐ  Ｅ  Ｖ  Ｑ  Ｆ  Ｎ  Ｗ  Ｙ  Ｖ  Ｄ  Ｇ  Ｖ  Ｅ  Ｖ  Ｈ  Ｎ  Ａ  Ｋ  Ｔ  Ｋ  Ｐ  Ｒ  Ｅ  Ｅ  Ｑ  Ｆ  Ｎ  Ｓ  Ｔ  Ｙ  Ｒ  Ｖ  Ｖ  Ｓ  Ｖ  Ｌ  Ｔ  Ｖ  Ｌ  Ｈ  Ｑ  Ｄ  Ｗ  Ｌ  Ｎ  Ｇ  Ｋ  Ｅ  Ｙ  Ｋ  Ｃ  Ｋ  Ｖ  Ｓ  Ｎ  Ｋ  Ｇ  Ｌ  Ｐ  Ｓ  Ｓ  Ｉ  Ｅ  Ｋ  Ｔ  Ｉ  Ｓ  Ｋ  Ａ  Ｋ  Ｇ  Ｑ  Ｐ  Ｒ  Ｅ  Ｐ  Ｑ  Ｖ  Ｙ  Ｔ  Ｌ  Ｐ  Ｐ  Ｓ  Ｑ  Ｅ  Ｅ  Ｍ  Ｔ  Ｋ  Ｎ  Ｑ  Ｖ  Ｓ  Ｌ  Ｔ  Ｃ  Ｌ  Ｖ  Ｋ  Ｇ  Ｆ  Ｙ  Ｐ  Ｓ  Ｄ  Ｉ  Ａ  Ｖ  Ｅ  Ｗ  Ｅ  Ｓ  Ｎ  Ｇ  Ｑ  Ｐ  Ｅ  Ｎ  Ｎ  Ｙ  Ｋ  Ｔ  Ｔ  Ｐ  Ｐ  Ｖ  Ｌ  Ｄ  Ｓ  Ｄ  Ｇ  Ｓ  Ｆ  Ｆ  Ｌ  Ｙ  Ｓ  Ｒ  Ｌ  Ｔ  Ｖ  Ｄ  Ｋ  Ｓ  Ｒ  Ｗ  Ｑ  Ｅ  Ｇ  Ｎ  Ｖ  Ｆ  Ｓ  Ｃ  Ｓ  Ｖ  Ｍ  Ｈ  Ｅ  Ａ  Ｌ  Ｈ  Ｎ  Ｈ  Ｙ  Ｔ  Ｑ  Ｋ  Ｓ  Ｌ  Ｓ  Ｌ  Ｓ  Ｌ  Ｇ
Ｓ２２８Ｐ変異を有する親ＩｇＧ４  Ｆｃ部分（配列番号４１）
Ｅ  Ｓ  Ｋ  Ｙ  Ｇ  Ｐ  Ｐ  Ｃ  Ｐ  Ｐ  Ｃ  Ｐ  Ａ  Ｐ  Ｅ  Ｆ  Ｌ  Ｇ  Ｇ  Ｐ  Ｓ  Ｖ  Ｆ  Ｌ  Ｆ  Ｐ  Ｐ  Ｋ  Ｐ  Ｋ  Ｄ  Ｔ  Ｌ  Ｍ  Ｉ  Ｓ  Ｒ  Ｔ  Ｐ  Ｅ  Ｖ  Ｔ  Ｃ  Ｖ  Ｖ  Ｖ  Ｄ  Ｖ  Ｓ  Ｑ  Ｅ  Ｄ  Ｐ  Ｅ  Ｖ  Ｑ  Ｆ  Ｎ  Ｗ  Ｙ  Ｖ  Ｄ  Ｇ  Ｖ  Ｅ  Ｖ  Ｈ  Ｎ  Ａ  Ｋ  Ｔ  Ｋ  Ｐ  Ｒ  Ｅ  Ｅ  Ｑ  Ｆ  Ｎ  Ｓ  Ｔ  Ｙ  Ｒ  Ｖ  Ｖ  Ｓ  Ｖ  Ｌ  Ｔ  Ｖ  Ｌ  Ｈ  Ｑ  Ｄ  Ｗ  Ｌ  Ｎ  Ｇ  Ｋ  Ｅ  Ｙ  Ｋ  Ｃ  Ｋ  Ｖ  Ｓ  Ｎ  Ｋ  Ｇ  Ｌ  Ｐ  Ｓ  Ｓ  Ｉ  Ｅ  Ｋ  Ｔ  Ｉ  Ｓ  Ｋ  Ａ  Ｋ  Ｇ  Ｑ  Ｐ  Ｒ  Ｅ  Ｐ  Ｑ  Ｖ  Ｙ  Ｔ  Ｌ  Ｐ  Ｐ  Ｓ  Ｑ  Ｅ  Ｅ  Ｍ  Ｔ  Ｋ  Ｎ  Ｑ  Ｖ  Ｓ  Ｌ  Ｔ  Ｃ  Ｌ  Ｖ  Ｋ  Ｇ  Ｆ  Ｙ  Ｐ  Ｓ  Ｄ  Ｉ  Ａ  Ｖ  Ｅ  Ｗ  Ｅ  Ｓ  Ｎ  Ｇ  Ｑ  Ｐ  Ｅ  Ｎ  Ｎ  Ｙ  Ｋ  Ｔ  Ｔ  Ｐ  Ｐ  Ｖ  Ｌ  Ｄ  Ｓ  Ｄ  Ｇ  Ｓ  Ｆ  Ｆ  Ｌ  Ｙ  Ｓ  Ｒ  Ｌ  Ｔ  Ｖ  Ｄ  Ｋ  Ｓ  Ｒ  Ｗ  Ｑ  Ｅ  Ｇ  Ｎ  Ｖ  Ｆ  Ｓ  Ｃ  Ｓ  Ｖ  Ｍ  Ｈ  Ｅ  Ａ  Ｌ  Ｈ  Ｎ  Ｈ  Ｙ  Ｔ  Ｑ  Ｋ  Ｓ  Ｌ  Ｓ  Ｌ  Ｓ  Ｌ  Ｇ
Ｓ２２８Ｐ／Ｔ２９９Ａ変異（ＹＣ４０７）を有する親ＩｇＧ４非グリコシル化されたＦｃ部分（配列番号４２）
ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＡＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ
親ＩｇＧ１非グリコシル化されたＦｃ部分（配列番号４３）
ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＡＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ
Ｓ２２８Ｐ／Ｎ２９７Ｑ変異（ＥＡＧ２４１２）を有する親ＩｇＧ４非グリコシル化されたＦｃ（配列番号４４）
ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＱＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰ
親ＩｇＧ１（配列番号４５）
ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ
実施例１．安定性を獲得したＩｇＧ  Ｆｃ変異の論理的設計
非グリコシル化された抗体は、免疫エフェクタ機能が望ましくない治療試薬の重要なクラスを示す。しかしながら、ＩｇＧ１およびＩｇＧ４におけるＣＨ２関連オリゴ糖の除去は、抗体構造および安定性に影響を及ぼすことが、十分に確立している。抗体安定性の損失は、プログラムのタイムラインおよび資源に悪影響を及ぼすプロセス開発における課題を提示し得る。ここでは、ＩｇＧ  Ｆｃの安定性を増加させるために、ＣＨ２およびＣＨ３でのアミノ酸位置のライブラリを設計するために使用されるいくつかの方法を詳述する。
【０４７８】
Ａ．エフェクタ無しＩｇＧ：ＩｇＧ４  ＣＨ２ドメインのための共変動および残基頻度
多様なＣ１−クラスのＩｇ−折り畳み配列データベースを用いた共変動分析を、以前に記載されたように行った（Ｇｌａｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。また、Ｃ１−クラスのＩｇ−折り畳み配列の編集および構造／ＨＭＭベースのアラインメントも、以前に記載されたように行った（Ｇｌａｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。共変動分析は、一対のアミノ酸が特定のタンパク質配列内に共に保存されることがどのように見出されるか、または見出されないかに関連する、相関係数、φ値のデータセットからなる。φ値は、−１．０〜１．０の範囲である。１．０のφ値は、アミノ酸が、配列のサブセット内のある位置で見出される場合、異なる残基位置で別のアミノ酸も、常に、そのサブセットに存在することが見出されることを示す。−１．０のφ値は、アミノ酸が、配列のサブセット内のある位置で見出される場合、異なる残基位置で別のアミノ酸が、そのサブセットに決して存在しないことを示す。０．２を超えるφの絶対値が、分析されたデータセットに対して統計的に有意であることが見出された（Ｇｌａｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。データセットを用いた経験に基づいて、φ値＞０．２５が、有意であると見なされた（すなわち、アミノ酸対の共存の物理的理由である可能性がある）が、φ値＞０．５は、非常に強力であり、かつ重要な機能的または構造的理由のために共に保存される可能性があると見なされた。
【０４７９】
本試験については、ＩｇＧ４からのＣＨ２配列をクエリー配列として使用し、φ値＞０．３をカットオフとして使用し、共変動による変異を特定した。共変動から特定された残基は、表１．１に列挙される（実施例１の残余を通して詳述された全てのその後の残基は、表１．１に列挙される）。表１．１においては、各残基は、ＥＵ付番方式に従って、その位置での所望のアミノ酸置換への言及を得る。「論理的根拠」とは、使用される設計方法を指す。共変動および残基頻度は、米国特許出願第１１／７２５，９７０号に詳述されている。さらなる共変動連関の数とは、所与の位置での、列挙されるアミノ酸型への変異によって形成されるさらなる共変動関係から、この置換を行うことによって失われた共変動関係の数を引いた数を指す。さらなる共変動連関の数とは、示唆された共変動変異の質のさらなる測定であることを意味する。複数のアミノ酸置換が、共変動連関の追加の数に主要な関連がないことを示唆する場合、ライブラリアプローチを、この位置で使用して、２０全てのアミノ酸を、デルフィア（Ｄｅｌｐｈｉａ）の熱的チャレンジアッセイを用いてスクリーニングした（実施例２に詳述される）。本方法を用いて、６つのアミノ酸位置を、示唆された特異的な共変動変異を用いて特定した：Ｌ２４２Ｐ（位置２４２のＬをＰに変更することを意味する）、Ｑ２６８Ｄ、Ｎ２８６Ｔ、Ｔ３０７Ｐ、Ｙ３１９Ｆ、およびＳ３３０Ａ。さらに、複数の好ましい（正のさらなる共変動連結）置換を有する５つの残基位置を特定し、ライブラリアプローチを使用した。これらの位置は、Ｄ２７０、Ｐ２７１、Ｅ２９４、Ａ２９９、およびＮ３１５である。
【０４８０】
タンパク質折り畳み内の個々の位置の、残基頻度分析に基づいて安定性を改善させる方法は、成功裏に使用され（Ｓｔｅｉｐｅ，２００４、Ｄｅｍａｒｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）、抗ＬＴβＲ  抗体ＢＨＡ１０  ＶＨおよびＶＬ−ドメイン内でライブラリ位置の特定について、特許出願ＢＧＮＡ２４２−１「ＳＴＡＢＩＬＩＺＥＤ  ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＥＶＡＬＵＡＴＩＮＧ  ＡＮＤ  ＩＮＣＲＥＡＳＩＮＧ  ＴＨＥ  ＳＴＡＢＩＬＩＴＹ  ＯＦ  ＳＡＭＥ」に前述されている。残基頻度分析を使用して、安定性獲得変異に対する５つの残基位置：Ｎ２７６Ｓ、Ｋ２８８Ｒ、Ｖ３０８Ｉ、Ｓ３２４Ｎ、およびＧ３２７Ａを特定した。さらに、共変動および残基頻度変異の産生におけるＰＣＲエラーによって、２つの残基：Ｌ３０９およびＮ３２５を生成した。
【０４８１】
【表４−１】
2012515556.tif 000017
【０４８２】
【表４−２】
2012515556.tif 000018
【０４８３】
【表４−３】
2012515556.tif 000019
【０４８４】
【表４−４】
2012515556.tif 000020
Ｂ．エフェクタ無しＩｇＧのための構造分析設計
共変動および残基頻度分析による変異の設計に加えて、無傷ヒトＩｇＧ  ｂ．１２抗体の公開された結晶構造の構造分析（ｐｄｂコード：１ｈｚｈ；参照：Ｓａｐｈｉｒｅ，Ｅ．Ｏ．，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ＩＧＧ  ａｇａｉｎｓｔ  ＨＩＶ−１：ａ  ｔｅｍｐｌａｔｅ  ｆｏｒ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｓｉｇｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９３：１１５５−１１５９）。構造分析は、ＩｇＧ分子の安定性を改善するために修飾され得る特異的な構造特質を特定した。ＩｇＧ１の安定性により近くにＩｇＧ４分子の安定性を転換するために、ＩｇＧ１分子とＩｇＧ４分子との間の構造的な差異を補正するために多くの変異がなされた。あるそのような変異は、ＩｇＧ４中の延長したループ内、Ｅ２６９に位置する。ライブラリアプローチを使用して、本ループの追加の長さを補正し得る残基についてスクリーニングした。また、本ループは、本実施例のパートＣに詳述されるさらなる変更を条件とした。
【０４８５】
ＣＨ３ドメイン間のインターフェイスは、ＩｇＧ分子のＦｃドメインにおいて、最大のタンパク質−タンパク質の接触領域を構成する。ＩｇＧ１とＩｇＧ４との間のインターフェイスの単一の置換差異は、残基４０９の位置にある。ＩｇＧ１においては、リシンが位置４０９の位置にあり、ＩｇＧ４分子においては、アルギニンが位置４０９の位置にある。ＩｇＧ１  Ｋ４０９へのＩｇＧ４におけるＲ４０９の置換は、ＩｇＧ１  ＣＨ３に対して観察された優れた安定性特質を導入するように設計された。また、Ｒ４０９ＭおよびＲ４０９Ｉは、本理論を試験するために設計された。ＩｇＧ４  ＣＨ３インターフェイスにおいて、アルギニンの追加容積をより良好に適合させるために、反対のＣＨ３ドメインからの接触残基Ｄ３９９：Ｄ３９９ＥおよびＤ３９９Ｓで、いくつかの変異を行った（図２Ａ）。この位置でのより小さい側鎖を置換することによって、反対のＣＨ３ドメインは、アルギニンの追加容積をより良好に適合させ、ＣＨ３ドメインの全安定性を増加させ得る。２つの相互作用するドメイン（Ｙ３４９Ｆ、Ｔ３５０Ｖ、およびＴ３９４Ｖ）間の関連性を増加する、ならびにインターフェイスの側鎖（Ｆ４０５Ｙ）の容積を増加するために、ＣＨ３インターフェイスへの疎水性を付加する変異を設計するために、別のアプローチが使用された。また、１ｈｚｈ結晶構造における、炭水化物を有する接触部位付近に位置する残基（Ｖ２６４、Ｒ２９２、Ｖ３０３）、ならびにＣＨ３／ＣＨ２インターフェイス付近のＨ３１０における、安定化を試験するために、変異が設計された。１組の表面が露出したグルタミン残基（Ｑ２６８、Ｑ２７４、およびＱ３５５）はまた、全表面電荷を変化させるための多くの変異の焦点であった。同じアプローチをＥ４１９に対して使用した。
【０４８６】
最終的に、好熱性タンパク質の増加した熱安定性を説明するために使用される最も一般的な機構の１つは、タンパク質の内部中心のより強化した充填が関与する（参照：Ｊａｅｎｉｃｋｅ，Ｒ．ａｎｄ  Ｚａｖｏｄｓｚｋｙ，Ｐ．１９９０．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｕｎｄｅｒ  ｅｘｔｒｅｍｅ  ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２６８：３４４−３４９）。この現象を再現するために、ＣＨ２およびＣＨ３の「バリン」に見出されるバリン残基を、イソロイシンまたはフェニルアラニンで置換した。安定性の増加は、さらなる分枝状の側鎖およびより多くの関連した容積から予測された。ＣＨ２の「バリン中心」は、５つのバリン残基（Ｖ２４０、Ｖ２５５、Ｖ２６３、Ｖ３０２、およびＶ３２３）であり、全ては、ＣＨ２ドメインの同じ近接した内部の中心に方向づけられる。同様の「バリン中心」が、ＣＨ３（Ｖ３４８、Ｖ３６９、Ｖ３７９、Ｖ３９７、Ｖ４１２、およびＶ４２７）において観察される。さらに、Ｌ３５１およびＬ３６８を、さらに高分枝状の疎水性側鎖に変異させた。
【０４８７】
Ｃ．エフェクタ無しＩｇＧのための共変動設計：  他のＣ−クラスＩｇ−ドメインにおいて観察される共変動パターンに基づいたＣＨ２グリコシル化部位付近の協調変異
ＩｇＧ  ＣＨ２ドメインは、多くの残基を共保存し、ＥＵ位置Ｎ２９７のＮ結合型炭水化物との相互作用とＣＤ１６、ＣＤ３２、およびＣＤ６４の様々なＦｃγＲ型との相互作用の両方を維持する。炭水化物の除去は、ＩｇＧ−ＦｃによるＦｃγＲ結合の劇的な低下をもたらす（Ｔａｙｌｏｒ  ａｎｄ  Ｇａｒｂｅｒ，２００５）。本明細書に記載される設計については、ＩｇＧ−Ｆｃ内のＮ結合型炭水化物付近の残基の共変異は、他のＣ−クラスＩｇ−折り畳みドメインにおいて共保存されることが見出されたアミノ酸で置換することによって、研究が行われた。これらの修飾が共に、非グリコシルＦｃ内で、特に良好な耐容性を示し得、非グリコシルのＦｃ部分およびグリコシル化されたＦｃ部分の両方において、ＦｃγＲとの相互作用を低下させ得ることが可能であったため、これらの共変異が、Ｎ結合型炭水化物の存在および不在下において、ＦｃγＲ結合に対して、およびＣＨ２ドメインの安定性に対して及ぼすであろう効果が調査された。
【０４８８】
Ｎ結合型炭水化物と潜在的に相互作用するために重要な残基が、本試験の焦点であった。Ｎ２９７で炭水化物と直接接触させるＩｇＧ１−ＣＨ２残基が、ＦｃγＲＩＩＩａに結合したＩｇＧ１−Ｆｃの公開された結晶構造およびプログラムＭＯＬＭＯＬを用いて特定された（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ，Ｐ．，Ｈｕｂｅｒ，Ｒ．，Ｏｏｓｔｈｕｉｚｅｎ，Ｖ．，Ｊａｃｏｂ，Ｕ．（２０００）Ｔｈｅ  ３．２  A  ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ１  Ｆｃ  ｆｒａｇｍｅｎｔ−ＦｃｇＲＩＩＩ  ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｎａｔｕｒｅ，４０６：  ２６７−２７３、Ｋｏｒａｄｉ，Ｒ．，Ｂｉｌｌｅｔｅｒ，Ｍ．＆  Ｗｕｔｈｒｉｃｈ，Ｋ．（１９９６）ＭＯＬＭＯＬ：ａ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  ｄｉｓｐｌａｙ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｇｒａｐｈ．１４：５１-５５）。それは、共変動分解および設計の焦点であるこれらのアミノ酸であった。
【０４８９】
Ｃ１−クラスのＩｇ−折り畳み配列の編集および構造／ＨＭＭベースのアラインメントを、以前に記載されたように行った（Ｇｌａｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。また、多様なＣ１−クラスのＩｇ−折り畳み配列データベースを用いた共変動分析を、以前に記載されたように行った（Ｇｌａｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。共変動分析は、一対のアミノ酸が特定のタンパク質配列内に共に保存されることがどのように見出されるか、または見出されないかに関連する、相関係数、φ値のデータセットからなる。φ値は、−１．０〜１．０の範囲である。１．０のφ値は、アミノ酸が、配列のサブセット内の１つの位置で見出される場合、異なる残基位置で別のアミノ酸も、常に、そのサブセットに存在することが見出されることを示す。−１．０のφ値は、アミノ酸が、配列のサブセット内のある位置で見出される場合、異なる残基位置で別のアミノ酸が、そのサブセットに決して存在しないことを示す。０．２を超えるφの絶対値が、分析されたデータセットに対して統計的に有意であることが見出された（Ｇｌａｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。データセットを用いた経験に基づいて、φ値＞０．２５が、有意であると見なされた（すなわち、アミノ酸対の共存の物理的理由である可能性がある）が、φ値＞０．５は、非常に強力であり、かつ重要な機能的または構造的理由のために共に保存される可能性があると見なされた。
【０４９０】
構造分析に基づいて、疎水性残基Ｖ２６２およびＶ２６４は、Ｎ結合型炭水化物によって溶媒から隔離されるＣＨ２ドメインの表面上に疎水性パッチを形成することが見出された。さらに、Ｖ２６６は、Ｖ２６２およびＶ２６４の近接にある残基であり、ＣＨ２ドメインに特有であるが、ループに存在し、それ自体ドメインの内部に埋もれている。Ｖ２６２、Ｖ２６４、およびＶ２６６は、互いのきわめて大きな相関係数（φ値：Ｖ２６２−Ｖ２６４＝０．４４、Ｖ２６２−Ｖ２６＝０．４０、Ｖ２６４−Ｖ２６６＝０．５４）を有するＩｇＧ−ＣＨ２ドメイン内で高度に共保存されることが見出された。ＩｇＧ定常ドメインの構造ベースの配列アラインメントにおいて、残基をハイライト表示する（図２Ｂ）。
【０４９１】
３つのバリン残基（２６２、２６４、および２６６）はまた、ＣＨ２ドメインにおいて、特有のループ構造を形成する残基（残基２６７〜２７１）と強い相関係数を有する。このループは、他のＩｇＧ定常ドメインＣＬ、ＣＨ１、およびＣＨ３によって形成されるコンセンサスループよりも２アミノ酸だけ長い。特定の相関関係は、Ｖ２６２とＥ２６９とＤ２７０（それぞれ、φ値＝０．３８および０．３１）、Ｖ２６４とＳ２６７、Ｄ２６８、およびＥ２６９（それぞれ、φ値＝０．２７、０．４４、および０．５２）、ならびにＶ２６６とＳ２６７（φ値＝０．３０）との間にある。これらの相関関係に基づいて、このループは、Ｎ２９７およびその炭水化物を含むループを位置付ける、ならびにＦｃγＲとの相互作用に重要であることが周知の残基３２５〜３３０を含むループを位置付けるのに重要である可能性があると推定した（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００、Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。
【０４９２】
これらの観察に基づいて、これらの位置で、特に、非グリコシルＩｇＧにおいて、他のアミノ酸型の耐容性（すなわち、ＣＨ２ドメインの折り畳みおよび安定性に対する影響）を調査するように設計を行った。観察することを望んだ別の特徴は、これらの部位で修飾作用がＩｇＧのＦｃγＲ結合特性に及ぼす効果であった。これらの観察に基づいてＣＨ２ドメイン内で行われたアミノ酸変化を表１．２に列記し、図２Ｃ中のＩｇＧ−Ｆｃの構造を示す（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ，Ｐ．，Ｈｕｂｅｒ，Ｒ．，Ｏｏｓｔｈｕｉｚｅｎ，Ｖ．，Ｊａｃｏｂ，Ｕ．（２０００）Ｔｈｅ  ３．２  A  ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ１  Ｆｃ  ｆｒａｇｍｅｎｔ−ＦｃｇＲＩＩＩ  ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｎａｔｕｒｅ，４０６：２６７−２７３）。全ての変異を含む配列（ＳＤＥ９）に対する天然配列のアラインメントを図２Ｄに示す。
【０４９３】
【表５】
2012515556.tif 000021
Ｄ．  補助変異
所定の残基位置で特定の変異型の特異性を試験するために、一連のさらなる変異を設計した。これらには、安定性が増加することが示された残基位置で、異なるアミノ酸型（極性、疎水性、および電荷）を試験することが含まれる。また、様々なＩｇＧイソタイプおよびグリコシル化状態に対する全ての安定性獲得変異の適用も試験する。これらの変異を表１．３に列記する。
【０４９４】
【表６−１】
2012515556.tif 000022
【０４９５】
【表６−２】
2012515556.tif 000023
【０４９６】
【表６−３】
2012515556.tif 000024
Ｅ．さらなる複数の変異構造体
安定性変異Ｔ２９９Ｋを用いてペプチドから生成される潜在的なＴ細胞エピトープを低下させ、非グリコシル化されたＩｇＧ１およびＩｇＧ４をもたらす他の変異と組み合わせて、Ｔ３０７ＰおよびＤ３９９Ｓの安定性変異を使用するために、以下の構造体も生成する（表１．４）。
【０４９７】
【表７】
2012515556.tif 000025
実施例２．大腸菌において産生されたＩｇＧ  Ｆｃ抗体ドメインの熱安定性スクリーニング
米国特許出願第１１／７２５，９７０号に記載される修飾された熱的チャレンジアッセイを、ｐＨ４．５で熱的チャレンジ事象に続いて、４０℃で保持された可溶性ＩｇＧ  Ｆｃタンパク質の量を決定するための安定性スクリーニングとして使用された。
【０４９８】
大腸菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．Ｃａｔ．＃２７３２５）を、Ｃプロモータの誘導性領域の制御下で、ｐＢＲＭ０１２（ＩｇＧ１）およびｐＢＲＭ０１３（Ｓ２２８Ｐ、Ｔ２９９Ａ変異を有するＩｇＧ４）Ｆｃに加えてＣ末端ヒスチジンタグをコードするプラスミドを用いて形質転換した。形質転換細胞を、０．６％  グリシン、０．６％トリトンＸ１００、０．０２％  アラビノース、および５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンが補充されたＳＢ（Ｔｅｋｎｏｖａ，Ｈａｌｆ  Ｍｏｏｎ  Ｂａｙ，Ｃａ．Ｃａｔ．＃Ｓ０１４０）からなる発現培地中で、３０℃で成長させた。細菌を、遠心分離によってペレット化し、上清を、さらなる処理のために採取した。
【０４９９】
熱的チャレンジ後、凝集した材料を遠心分離によって除去し、処置済みの除去された上清に残留している可溶性Ｆｃ試料を、プロテインＡ（Ｓｉｇｍａ  Ｐ７８３７）に結合することに対して、ＤＥＬＦＩＡアッセイによってアッセイした。２つの９６ウェルプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ，Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ，Ｃａｔ．＃４３７１１１）は、ＰＢＳ中の０．５μｇ／ｍＬで、プロテインＡを用いて、３７℃で１時間被覆し、次いで、室温で振動させながら、１時間、ＤＥＬＦＩＡアッセイ緩衝液（ＤＡＢ、１０ｍＭ  トリスＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０μＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  ＢＳＡ、０．０２％  Ｔｗｅｅｎ２０、０．０１％ＮａＮ３、ｐＨ７．４）で遮断した。プレートを、ＢＳＡのないＤＡＢ（洗浄緩衝液）で３回洗浄し、１０μＬの上清を９０μＬのＤＡＢに添加し、最終容量の１００μＬ（参照プレート）を達成した。次に、１０μＬの１０％ＨＯＡｃを、ポリプロピレンプレート中の各上清に添加し、４．５の試料ｐＨを達成した。プレートを４０℃で９０分間インキュベートし、１４００ｘｇで、遠心分離することによって変性タンパク質を除去した。１０μＬの酸および熱処理した上清を、１００ｍＭ  トリス、ｐＨ８．０（課題プレート）が補充された９０μＬのＤＡＢを含有する別のＤＥＬＦＩＡプレート中に添加した。ＤＥＬＦＩＡプレートを、１時間振動させながら、室温でインキュベートし、前のように、３回洗浄した。結合したＦｃは、２５０ｎｇ／ｍＬのＥｕ標識Ｈｉｓ６抗体（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ，Ｃａｔ．＃ＡＤ０１０９）を含有するＤＡＢの１ウェル当たり１００μＬを添加することによって検出され、１時間振動させながら、室温でインキュベートした。プレートを、洗浄緩衝液を用いて３回洗浄し、１００μＬのＤＥＬＦＩＡ向上溶液（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ，Ｃａｔ．＃４００１−００１０）を、各ウェルに添加した。１５分間、インキュベートした後、ビクター２（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）上でユーロピウム法を用いて、プレートを読み取った。４０℃で、様々な構造体に対して参照プレートと課題プレートの間のＥｕ蛍光の比を順位付けすることによって、データを分析した。ｐＢＲＭ０１３に対する値よりも大きい蛍光値を、標的構造体（ＩｇＧ４．Ｐ  ａｇｌｙ）を上回る安定性の増加として解釈した。データを表２．１に示す。
【０５００】
【表８−１】
2012515556.tif 000026
【０５０１】
【表８−２】
2012515556.tif 000027
【０５０２】
【表８−３】
2012515556.tif 000028
実施例３．安定化ＩｇＧ  Ｆｃ抗体の産生
Ａ．大腸菌における、安定化ＩｇＧ  Ｆｃ部分の変異生成、一時的発現、および精製
安定性変異を、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｑｕｉｋ−Ｃｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ変異生成キットを用いた部位特異的突然変異誘発法によって、実施例２に既に詳述されるＢＲＭ１３構造体に組み込んだ。１つまたはそれ以上のＣ／Ｇ塩基中で開始し、終結する、少なくとも４０％ＧＣ含量の両側に１０〜１５塩基の正しい配列を有する中央に変異を有する３６〜４０塩基長のプライマーを設計した。全ての変異構造体を下の表３．１に列記する。
【０５０３】
【表９−１】
2012515556.tif 000029
【０５０４】
【表９−２】
2012515556.tif 000030
変異を導入するプライマーを用いたＰＣＲ後、親プラスミドを完全に消化するために、３７℃で５分間、Ｄｐｎ  Ｉ制限酵素を加えて、各変異生成物を消化させた。次いで、変異生成反応物を、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ大腸菌超形質転換受容性細胞（ｕｌｔｒａｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ）に形質転換した。アンピシリン耐性コロニーをスクリーニングし、ＤＮＡ塩基配列決定法を用いて、変異生成反応物からの正しい配列を確認した。
【０５０５】
ＤＮＡを確認した配列を、ＥＣ３プログラムを用いた電気穿孔によって、３１１０個の細胞に形質変換した。特有のコロニーを厳選し、１０ｍＬ  ＬＢ−ａｍｐのスターター培養液中で一晩成長させた。この前培養物を、１Ｌの発現培地［ＳＢ＋０．０２％アラビノース＋ａｍｐ／ｃａｒｂ  ５０ｍｇ／Ｌ］に移し、３２℃で一晩成長させた。細胞を、遠心分離機中で遠心沈殿させ、１００ｍＬのスフェロプラスト緩衝液（２０％スクロース、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、およびリゾチーム（０．０１％ｗ／ｖ））中で再懸濁した。細胞を遠心沈殿させ、得られたタンパク質は、上清中であった。
【０５０６】
ＩｇＧ−Ｆｃ構造体を、プロテインＡセファロースＦＦ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてバッチ精製によって精製した。Ｆｃ分子を、ｐＨ３．０で、０．１Ｍ  グリシンを用いて、プロテインＡセファロースから溶出し、トリス塩基を用いて中和し、最終的に、Ｐｉｅｒｃｅ  １０ｍＬの透析カセット（１０，０００ＭＷＣＯ  カットオフ）を用いて、ＰＢＳに対して透析した。
【０５０７】
Ｂ．ＣＨＯ細胞における、安定化抗体の変異生成、一時的発現、抗体精製、および特性解析
安定性変異は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｑｕｉｋ−Ｃｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ変異生成キットを用いた部位特異的突然変異誘発法によって、ＩｇＧ４．Ｐ抗体（アミノ酸２２８にプロリンヒンジ変異を既に含むＶＨ構造体）に組み込まれた。Ｆａｂを認識する抗原は、抗ＣＤ４０抗体５ｃ８からのものであった。１つまたはそれ以上のＣ／Ｇ塩基中で開始し、終結する、少なくとも４０％ＧＣ含量の両側に１０〜１５塩基の正しい配列を有する中央に変異を有する３６〜４０塩基長のプライマーを設計した。全てのグリコシル化および非グリコシル化された変異構造体を、表３．２に列記する。
【０５０８】
【表１０−１】
2012515556.tif 000031
【０５０９】
【表１０−２】
2012515556.tif 000032
変異を導入するプライマーを用いたＰＣＲ後、親プラスミドを完全に消化するために、３７℃で５分間、Ｄｐｎ  Ｉ制限酵素を加えて、各変異生成物を消化させた。次いで、変異生成反応物を、ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ大腸菌超形質転換受容性細胞に形質転換した。アンピシリン耐性コロニーをスクリーニングし、ＤＮＡ塩基配列決定法を用いて、変異生成反応物からの正しい配列を確認した。
【０５１０】
確認した配列からのＤＮＡは、拡大し、ＴＯＰ１０大腸菌超形質転換受容性細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に形質転換した。アンピシリン薬物耐性になるように形質転換した大腸菌コロニーを、挿入物の存在についてスクリーニングした。次いで、コロニーを２５０ｍＬの大量の培養液に培養した。Ｑｉａｇｅｎ  ＨｉＳｐｅｅｄ  Ｍａｘｉｐｒｅｐキットを使用して、一時的トランスフェクションのための細菌培養からＤＮＡを抽出し、精製した。このＤＮＡは、ＤＮＡ濃度を測定するためにε２８０を用いて定量化し、トランスフェクションのために使用された。
【０５１１】
次いで、等量の５ｃ８  ＶＬプラスミドと共に変異プラスミドを使用して、抗体タンパク質の一時発現のためにＣＨＯ−Ｓ細胞を共トランスフェクションした。このトランスフェクションに使用されるＤＮＡ量は、０．５ｍｇ／ＬのＶＨおよび０．５ｍｇ／ＬのＶＬであった。トランスフェクション培地（ＳＡＦＣからのＬＯＮＧ  Ｒ４ＩＧＦ−１を有するＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ）を、３ｍｇのＰＥＩに対して１ｍｇのＤＮＡの比率で、１ｍｇ／ｍＬのＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃａｔ．＃２３９６６）を有する５％のトランスフェクション量で調製した。ＤＮＡをトランスフェクション培地／ＰＥＩ溶液に添加し、かき混ぜ、次いで、室温で５分間静置した。次いで、混合物を、１ｅ６細胞／ｍＬで、５００ｍＬのＣＨＯ−Ｓ細胞に添加した。４時間後、３７℃で、５％ＣＯ２で、１×容量の拡張培地（ＣＨＯＭ３７＋２０ｇ／Ｌ  ＰＤＳＦ＋Ｐｅｎｓｔｒｅｐ／アンホステリシン）を、１Ｌの最終培養容量に対して添加した。１日目に、２００ｇ／Ｌで１０ｍＬの綿加水分解物を添加し、温度を２８℃まで下げた。培養生存率は、生存率が７０％を下回るまでモニタリングされた（８〜１２日）。また、抗ＩｇＧチップへの結合を測定する際に、Ｏｃｔｅｔ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を用いて、タンパク質発現に対する力価をこの時点で調べた。細胞を、２４００ｒｐｍで１０分間、培養液を遠心沈殿させることによって回収し、次いで、上清を０．２μｍの限外濾過を通して濾過した。
【０５１２】
ＡＫＴＡ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上のプロテインＡセファロースＦＦ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、上清から５Ｃ８抗体を捕捉した。抗体分子は、ｐＨ３．０で、０．１Ｍグリシンを用いて、プロテインＡから溶出し、トリス塩基を用いて中和し、Ｐｉｅｒｃｅ  １０ｍＬの透析カセット（１０，０００ＭＷＣＯ  カットオフ）を用いて、ＰＢＳに対して透析し、１ｍＬの最終容量まで濃縮し、分取サイズ排除クロマトグラフィ（ＴＯＳＯＨＡＳＳ，ＴＯＳＯＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてさらに精製した。５Ｃ８分子は、ｐＨ６．０で、２０ミリモルのクエン酸塩、１５０ミリモルのＮａＣｌ溶液に透析された。モノマー抗体生成物の純度および割合は、それぞれ、４〜２０％トリス−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび分析サイズ排除ＨＰＬＣによって評価された。
【０５１３】
Ｂ．質量スペクトル解析を用いた安定性を操作した抗体のタンパク質配列および翻訳後の修飾の確認
還元条件下で、試料を分析した。４Ｍ  グアニジンＨＣｌの存在下で、３７℃で１時間、１００ｍＭ  ＤＴＴ中で還元を行った。注射前に、この試料を、ＰＢＳを用いて１：１に希釈した。氷酢酸を混合物に添加し、２％（ｖ／ｖ）の最終濃度にした。５μｇの各試料を、フェニルカラムに注射し、ＥＳＩ−ＴＯＦによって分析した。結合および溶出方法を使用した。緩衝液Ａは、水中の０．０３％ＴＦＡを含有し、緩衝液Ｂは、アセトニトリル中の０．０２５％  ＴＦＡを含有する。流量は、１分間当たり１００μＬで一定に保った。スペクトルは、Ａｎａｌｙｓｔソフトウェアから得、ＭａｘＥｎｔ１を用いて解析した。還元分析後、試料のうち３つは、糖型として検出され、したがって、３つの試料：ＥＣ３２３、ＥＣ３２６、およびＥＡＧ２３００において、脱グリコシル化を行った。還元条件下：２０ｍＭ  ＤＴＴの存在下で、１ｍＵのＮ−グリカナーゼ／２μｇのタンパク質、１０ｍＭ  トリス  ｐＨ７．０で、脱グリコシル化を行った。３７℃で、試料を脱グリコシル化した。２時間後、さらに３０ｍＭのＤＴＴを、２．７Ｍ  グアニジンＨＣｌの存在下で、試料に添加し、さらに３０分間、３７℃でインキュベートした。５μｇのそれぞれの還元した、脱グリコシル化試料をフェニルカラムに注射し、上述のように分析した。
【０５１４】
結果は、ピログルタミン酸（ＰＥ）への重鎖のＮ末端グルタミン（Ｑ）の変換を有する、１３個の試料全てが何であるかを確認した。表３．３は、グリコシル化および脱グリコシル化された全ての試料に対して得られた質量を列記する。全ての軽鎖および重鎖は、１％以下の低レベルの糖化を含んだ。修飾されないＮ末端グルタミンに対応する質量は、約２０〜４０％の相対強度で試料のそれぞれに観察された。スペクトルをデコンボリューション処理した全ての軽鎖は、予想通りに同一であった。
【０５１５】
【表１１−１】
2012515556.tif 000033
【０５１６】
【表１１−２】
2012515556.tif 000034
試料ＥＣ３２３、ＥＣ３２６、およびＥＡＧ２３００は、通常のＧ０Ｆ、Ｇ１Ｆ、Ｇ２Ｆ二分岐グリカンを含み、Ｇ０Ｆが最も豊富な種類であり、続いて、Ｇ１Ｆ、Ｇ２Ｆであった。試料ＥＣ３２３およびＥＣ３２６は、コアフコース（Ｇ０）が欠損しているＧ０Ｆグリカンに対応するＧ０Ｆピークからの−１４６Ｄａでピークを得た。ＥＣ３２３については、Ｇ０（−フコース）の相対的割合強度は、２％であったが、ＥＣ３２６試料の強度は、２３％であった。３つのグリコシル化された試料は全て、Ｇ２Ｆグリカンにおいて、低レベル（＜１％）のシアル酸を含んだ。
【０５１７】
全ての試料鎖は、ＥＳＩ−ＴＯＦの上昇したガス温度と関連して器具アーチファクト（ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  ａｒｔｉｆａｃｔ）であることを示している−１８Ｄａピークを含んだ。３５０℃の温度を使用して、ＴＦＡ付加物を排除した。
【０５１８】
実施例４．非グリコシル化されたＩｇＧ  Ｆｃ抗体の熱安定性
タンパク質安定性は、タンパク質治療薬の発展および拡大の中心的課題である。不十分な安定性は、バイオリアクターのスケールアップ生産についての不適当性、タンパク質精製の困難、および薬学的調製物および使用についての不適当性に及ぶ数々の発展問題をもたらす場合がある。エフェクタ機能が欠けたＦｃ骨格を生成するために、変異をａｇｌｙ  ＩｇＧ４．Ｐ（Ｓ２２８Ｐ）に導入して、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの全安定性を増加させた。本試験の目標は、設計した変異が、熱安定性を増加させるかどうかを調査することであった。したがって、各構造体の熱安定性を、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を用いて評価した。大腸菌産生Ｆｃドメイン構造体および完全長抗体構造体は共に、ＤＳＣによって評価された。大腸菌産生Ｆｃドメイン構造体および完全長抗体構造体のための発現および精製方法を実施例３に詳述した。
【０５１９】
抗体を、ｐＨ６．０で、２５ｍＭ  クエン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ緩衝液に対して透析した。抗体を１ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、紫外吸光度によって測定した。自動キャピラリーＤＳＣ（ＭｉｃｒｏＣａｌ，ＬＬＣ，Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ，ＭＡ）を用いて、走査を行った。ベースライン減算のために、２回の緩衝走査を行った。走査は、中程度のフィードバックモードを用いて、１℃／分で、２０〜１０５℃で行った。次いで、走査は、Ｏｒｉｇｉｎ（ＭｉｃｒｏＣａｌ  ＬＬＣ，Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ，ＭＡ）ソフトウェアを用いて分析した。三次多項式を用いて非ゼロベースラインを修正し、各抗体のアンフォールディング転移を、非２状態アンフォールディングモデルを用いて当てはめを行ったさせた。これらの構造体の安定性をさらに評価するために、完全長抗体を、ｐＨ４．５で、２５ｍＭ  リン酸ナトリウム、２５ｍＭ  クエン酸ナトリウム、１５０ｎＭ  ＮａＣｌ緩衝液に対して透析した。同じＤＳＣプロトコルを、上で詳述されるように使用した。
【０５２０】
Ｆａｂドメインを欠いている大腸菌発現Ｆｃドメイン構造体を使用して、実施例２において詳述されるように、デルフィア（Ｄｅｌｐｈｉａ）の熱的チャレンジアッセイにおいて特定された変異の安定性向上を試験した。構造体ＢＲＭ０２３、ＢＲＭ０３０、およびＣＲ１０３−１１９を、表４．１中にそれらの融解温度と共に列記する。
【０５２１】
【表１２−１】
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【０５２２】
【表１２−２】
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【０５２３】
【表１２−３】
2012515556.tif 000037
表４．１中に示されるように、対照ａｇｌｙ  ＩｇＧ１およびＩｇＧ４．Ｐ（Ｓ２２８Ｐ、Ｔ２９９Ａ）Ｆｃ部分は、ＣＨ２に対して、それぞれ６５．９℃および６２．３℃、ＣＨ３に対して、それぞれ８２．６℃および７１．２℃の融解温度を有した。単一の部位変異のうち、ＢＲＭ０２３（Ｔ３０７Ｐ）およびＢＲＭ０３０（Ｔ２９９Ｋ）は、ａｇｌｙ  ＩｇＧ４．Ｐ（Ｓ２２８Ｐ、Ｔ２９９Ａ）に対して、ＣＨ２の融解温度の、３．４〜３．９℃の増加を示した。リシンまたはメチオニンを有する位置Ｒ４０９での置換は、ＣＨ３の融解温度の、１２および６．６℃の増加を示した。より小さい疎水性側鎖（ＬｅｕおよびＩｌｅ）への置換は、ＣＨ３に対して増加した安定性をもたらさなかった。この位置は、ＩｇＧ１とＩｇＧ４との間のＣＨ３インターフェイスの単一の差異を示す。位置Ｄ３９９での変異を、（実施例１において詳述される）ＩｇＧ４  ＣＨ３インターフェイスにおいて、位置４０９でのアルギニン側鎖の付加容積に対して補うためになされた。より小さい側鎖（Ｓｅｒ）の置換は、約４℃の融解温度の増加を促した。同じ大きさを有するが、電荷を欠く側鎖（Ａｓｐ）、あるいは同じ電荷を有するより大きい側鎖（Ｇｌｕ）のいずれへの置換も共に、安定性の増加を示さなかった。実施例１において詳述される疎水性バリン中心の置換は、約４℃のＣＨ３の融解温度の増加を示したＶ４２７Ｆを除いて、融解温度の効果も、低下も示さなかった。
【０５２４】
単一の変異および複数の変異の組み合わせを評価するために、完全長ＩｇＧ分子を使用した。実施例３に詳述されるように、変異を完全長５ｃ８抗体に組み込んだ。ｐＨ６．０およびｐＨ４．５で、ＤＳＣによって測定された、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの融解温度に対する変異の効果を下の表４．２に要約する。
【０５２５】
【表１３−１】
2012515556.tif 000038
【０５２６】
【表１３−２】
2012515556.tif 000039
【０５２７】
【表１３−３】
2012515556.tif 000040
【０５２８】
【表１３−４】
2012515556.tif 000041
表４．２中に示されるように、Ｄ３９９Ｓ変異は、ｐＨ６．０で、平均して２℃、およびｐＨ４．５で１０℃という大きさで、ａｇｌｙ  ＩｇＧ４．ＰのＣＨ３ドメインの熱安定性を増加させた。変異体Ｔ２９９Ｋを使用して、非グリコシル化されたＣＨ２を生成する。位置２９９でのリシン置換は、この位置におけるアラニンの置換と比較して、ＩｇＧ４．Ｐ分子において、ｐＨ６．０で、５℃、およびｐＨ４．５で１１℃だけ融解温度を増加させる。また、Ｔ２９９Ｋ変異は、ｐＨ６．０で、ＩｇＧ１  ＣＨ２に対する融解温度を６℃増加させる。Ｔ３０７Ｐ変異は、Ｄ３９９Ｓと組み合わせて使用した場合、グリコシル化されたＩｇＧ４．Ｐ  ＣＨ２ドメインに対して４℃の増加を示した。それ自体では、Ｔ３０７Ｐは、グリコシル化されたＩｇＧ４．Ｐ型において融解温度を増加しなかった。非グリコシル化型においては、Ｔ３０７Ｐ変異は、ＣＨ２の融解温度を６℃増加させた。Ｔ２９９Ｋ変異と組み合わせた場合、ＣＨ２に対する融解温度は、８℃増加した。Ｌ３０９Ｋ変異は、Ｔ３０７ＰおよびＴ２９９Ａを組み合わせた場合、非グリコシル化されたＩｇＧ４．Ｐに対する安定性において、１℃の増加をもたらした。しかしながら、Ｔ３０７ＰとＴ２９９Ｋの組み合わせにおいては、Ｌ３０９Ｋ変異により、３℃の増加をもたらした。グリコシル化型のＩｇＧ４．Ｐにおいては、Ｌ３０９Ｋ変異は、ＣＨ２に対して融解温度を２℃増加させる。Ｌ３０９Ｋ変異は、Ｔ３０７ＰおよびＴ２９９Ａを組み合わせた場合、非グリコシル化されたＩｇＧ４．Ｐに対する安定性において、１℃の増加をもたらした。しかしながら、Ｔ３０７ＰおよびＴ２９９Ｋの組み合わせにおいては、Ｌ３０９Ｋ変異により、ｐＨ４．５で、３℃の増加をもたらした。ＣＨ２におけるＶ３２３Ｆ変異は、ＣＨ２ドメインの融解温度に効果を示さなかったが、Ｖ２４０Ｆ変異は、融解温度を１３℃低下させた。さらに、Ｖ４２７Ｆ変異はまた、ＣＨ２に対して１３℃の融解温度の低下を示した。
【０５２９】
融解温度の最も劇的な増加が、ＩｇＧ４．Ｐにおいて、Ｔ２９９Ｋ、Ｔ３０７Ｐ、Ｌ３０９Ｋ、およびＤ３９９Ｓの組み合わせにおいて観察される。本構造体は、Ｔ２９９Ａ  ＩｇＧ４．Ｐと比較した場合、ＣＨ２に対する融解温度は１１℃（ｐＨ６．０）および１２℃（ｐＨ４．５）の増加を示す。実際には、Ｔ３０７Ｐ、Ｌ３０９Ｋ、およびＤ３９９Ｓを組み合わせた場合、Ｔ２９９Ｋ変異は、Ｔ２９９Ａ変異を上回って、融解温度を２〜３℃増加する。さらに、ＩｇＧ１からのＣＨ３へのＩｇＧ４．ＰイソタイプのＣＨ３の変換と組み合わせてＩｇＧ４．Ｐ  ＣＨ２へのＴ２９９Ｋの導入は、ａｇｌｙ  ＩｇＧ４．Ｐを上回って、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインに対して、それぞれ、６℃および１５℃の増加をもたらした。
【０５３０】
ＣＨ２グリコシル化の共変動試験において特定された変異は、ＩｇＧ１  ＣＨ２（Ｖ２６２Ｌ、およびＶ２６２Ｌと組み合わせたＶ２６４Ｔ、ループ置換）に対して融解温度においてほとんどか全く効果を示さないか、または７℃の低下した効果を示した（Ｖ２６６Ｆ、Ｖ２６４Ｔ  ＆  Ｖ２６６Ｆ、ループ＆Ｖ２６４Ｔ＆Ｖ２６６Ｆ）。１０〜１２℃の融解温度の大幅な低下が、Ｖ２６２Ｌ、Ｖ２６４Ｔ、およびＶ２６６Ｆの組み合わせに対して観察された。
【０５３１】
簡潔に言えば、Ｔ２９９Ｋ、Ｔ３０７Ｐ、Ｌ３０９Ｋは、単一の変異として、あるいは互いの組み合わせのいずれかで、ＣＨ２ドメインの熱安定性を増加させる能力を示した。Ｄ３９９Ｓは、ＩｇＧ４．ＰのＣＨ３ドメインへの安定性をもたらした。
【０５３２】
実施例５：ＩｇＧ  Ｆｃ抗体の撹拌およびｐＨ保持ステップ試験
タンパク質治療薬にとって、製造生産および保存時のタンパク質の物理的または化学的特性への最小限の変化を伴う、長期の保存期間を有することが、非常に望ましい。関連ストレスを評価することは、製剤開発の重要な部分であり、２つの関連したストレスのタイプを、ＩｇＧ  Ｆｃ変異体に対して評価した。
【０５３３】
Ａ．  撹拌ストレス
撹拌は、製造およびプロセス時のストレス対抗を模倣し、ならびに実際の出荷（すなわち、試験場所への薬物製品バイアルの出荷）時のストレスを想定する。したがって、４８時間にわたって、撹拌安定性を分析し、タンパク質凝集または沈殿を、分析サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）を用いてモニタリングし、濁度は、３２０ｎＭで吸光度をモニタリングすることによって測定された。濁度は、タンパク質／緩衝液を濁らせるか、または極端な場合、不透明にする、凝集および沈殿形成による光散乱の測定である。各実験セットにおいて、以下の方法を、一貫して使用した。０．５ｍｇ／ｍＬで、１ｍＬの各試料を６５０ｒｐｍで３ｍＬの製剤中で振り、ゴム製の栓で密閉し、パラフィルムで再度密閉した。１００μＬの試料を、必要な時点（０、６、２４、および４８時間）で抽出し、１４，０００ｒｐｍで５分間沈降させ、形成した凝集物または沈殿物を沈降させた。次いで、試料を流し、分析ＳＥＣカラム上で分析した。ＳＥＣ溶出プロファイルにおいて、凝集タンパク質は、より短い保持時間で溶出し、タンパク質分解性生物は、より長い保持時間で溶出する。したがって、所定の時点で、タンパク質の全安定性をモニタリングするために、モノマー種の割合を使用した。
【０５３４】
最高の熱安定性を有する構造体（実施例４を参照）を撹拌試験のために選択した。非グリコシル化されたＩｇＧ４分子については、ＹＣ４０１からＹＣ４０３（全ての非グリコシル化されたＩｇＧ４．Ｐ  Ｔ２９９ＡおよびＤ３９９Ｓ［加えて、それぞれ、Ｔ３０７Ｐ、Ｌ３０９Ｋ、およびＴ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｋ］、ＹＣ４０４からＹＣ４０６（全ての非グリコシル化されたＩｇＧ４．Ｐ  Ｔ２９９ＫおよびＤ３９９Ｓ［加えて、それぞれ、Ｔ３０７Ｐ、Ｌ３０９Ｋ、およびＴ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｋ］、野生型ＩｇＧ４．Ｐ非グリコシル化（Ｔ２９９Ａ）対照としてＹＣ４０７、ＣＮ５７８（非グリコシル化されたＩｇＧ１  Ａ２９９Ｋ）、ＥＣ３３１（ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインを有する非グリコシル化されたＩｇＧ４．Ｐ  Ｔ２９９ＫおよびＴ３０７Ｐ）、非グリコシル化されたＩｇＧ１（Ｔ２９９Ａ）、非グリコシル化されたＩｇＧ４．Ｐ（Ｔ２９９Ａ）、ならびに非グリコシル化されたＩｇＧ１（Ｔ２９９Ａ）を、試験のために選択した。グリコシル化分子については、ＥＣ３０４（グリコシル化されたＩｇＧ４．Ｐ  Ｔ３０７Ｐ、Ｄ３９９Ｓ）、ＥＣ３２３（グリコシル化されたＩｇＧ４．Ｐ  Ｄ３９９Ｓ、Ｌ３０９Ｋ）、ＥＣ３２６（グリコシル化されたＩｇＧ４．Ｐ  Ｔ３０７Ｐ、Ｄ３９９Ｓ、Ｌ３０９Ｋ）、グリコシル化されたＩｇＧ４．Ｐ  Ｔ２９９Ａ、およびグリコシル化されたＩｇＧ１を、試験のために選択した。
【０５３５】
濁度に関して非グリコシル化された変異と比較して（下の表５．１および図３Ａを参照）、ＹＣ４０３（非グリコシル化されたＩｇＧ４．Ｐ  Ｔ２９９Ａ、Ｔ３０７Ｐ、Ｌ３０９Ｋ、およびＤ３９９Ｓ）およびＹＣ４０６（非グリコシル化されたＩｇＧ４．Ｐ  Ｔ２９９Ｋ、Ｔ３０７Ｐ、Ｌ３０９Ｋ、およびＤ３９９Ｓ）は、野生型ＹＣ４０７（非グリコシル化されたＩｇＧ４．Ｐ  Ｔ２９９Ａ）と比較して、最低濁度を示した。構造体は共に、各時点で、野生型と比較して１／３の濁度を一貫して示す。２つの構造体間の唯一の違いは、Ｔ２９９Ａ（ＹＣ４０３）およびＴ２９９Ｋ（ＹＣ４０６）である。
【０５３６】
【表１４】
2012515556.tif 000042
モノマー％（下の表５．２および図３Ｂを参照）を比較する際、全ての変異構造体は、時間経過に伴う低下した凝集を示した。２４時間の時点で、全ての変異構造体は、野生型よりも良好で、４８時間の時点で、ほとんどの構造体は、少なくとも２倍良好であった。しかしながら、最高のモノマー％を保持した構造体は、ＹＣ４０３であり、続いて、ＹＣ４０２（非グリコシル化されたＩｇＧ４．Ｐ  Ｔ２９９Ａ、Ｌ３０９Ｋ、およびＤ３９９Ｓ）、ＹＣ４０６（非グリコシル化されたＩｇＧ４．Ｐ  Ｔ２９９Ｋ、Ｔ３０７Ｐ、Ｌ３０９Ｋ、およびＤ３９９Ｓ）であった。これらの構造体は、時間経過に伴う％モノマーの最も漸次的な喪失を示した。最も上位の構造体に共通して見られる一般的な変異は、Ｌ３０９Ｋ変異である。このデータは、選ばれた変異が、機械的ストレス関係において、全安定性を改善することを実証する。非グリコシル化されたＩｇＧ４．Ｐ構造体における両方の凝集測定を比較すると、ＹＣ４０３（非グリコシル化されたＩｇＧ４．Ｐ  Ｔ２９９Ａ、Ｔ３０７Ｐ、Ｌ３０９Ｋ、およびＤ３９９Ｓ）とＹＣ４０６（非グリコシル化されたＩｇＧ４．Ｐ  Ｔ２９９Ｋ、Ｔ３０７Ｐ、Ｌ３０９Ｋ、およびＤ３９９Ｓ）構造体は、時間経過に伴う機械的ストレスに最も耐性を示す。両方の分子は、熱的および構造的安定性を改善することが可能なさらなる変異（Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｋ）を示す。
【０５３７】
【表１５】
2012515556.tif 000043
ＩｇＧ１非グリコシル化された分子については、ＣＮ５７８（非グリコシル化されたＩｇＧ１  Ａ２９９Ｋ）は、最小濁度を示し、これはまた、全実験を通して、本質的に凝集がないことも示した。ＣＮ５７８は、ＩｇＧ１  Ｔ２９９Ａ、および野生型ＩｇＧ１  ２９９Ｔ分子よりも良好に機能し、ゆえに、Ａ２９９Ｋ変異が、非グリコシル化されたＩｇＧ１分子に対する凝集において最小限の効果を有することを示す。ＣＮ５７８は、濁度試験において、ＩｇＧ１  Ｔ２９９Ａよりも５倍良好である。ＣＮ５７８分子はまた、４８時間にわたって凝集がないことを示し、これは、非グリコシル化されたＩｇＧ１  Ｔ２９９Ａとグリコシル化されたＩｇＧ１  ２９９Ｔの両方と同じ結果である。ＥＣ３３１（ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインを有する非グリコシル化されたＩｇＧ４．Ｐ  Ｔ２９９ＫおよびＴ３０７Ｐ）  は、他の構造体と比較して、非常によく機能したので、凝集試験を通して、１００％モノマーも維持した。それは、ＩｇＧ４．Ｐ  ａｇｌｙ構造体（ＹＣシリーズ）と比較して、濁度において、２倍の改善を示した。このデータは、ＩｇＧ１  ＣＨ３部分が、分子の熱的安定性および構造的安定性の両方に大いに役立つことを示唆する。
【０５３８】
グリコシル化された分子であるＥＣ３０４（グリコシル化されたＩｇＧ４．Ｐ  Ｔ３０７Ｐ、Ｄ３９９Ｓ）、ＥＣ３２３（グリコシル化されたＩｇＧ４．Ｐ  Ｄ３９９Ｓ、Ｌ３０９Ｋ）、ＥＣ３２６（グリコシル化されたＩｇＧ４．Ｐ  Ｔ３０７Ｐ、Ｄ３９９Ｓ、Ｌ３０９Ｋ）、野生型グリコシル化されたＩｇＧ４．Ｐ分子と比較して凝集試験の経過に伴うモノマー％の改善がある（表５．２および図３Ｂを参照）。しかしながら、濁度は、各時点で、７５倍まで著しく増加する。一貫して、各分子は、Ｄ３９９Ｓを含むため、データが示すように、この変異が、構造的安定性を損なう可能性がある。
【０５３９】
Ｂ．  低ｐＨ保持ステップ試験
タンパク質治療薬にとって、製造可能性および拡張可能性を有することが、非常に望ましい。ｐＨ保持ステップ試験を行うことは、プロセス開発にとって不可欠である。ｐＨ保持試験は、タンパク質の製造および精製段階時のプロセス開発を模倣する。製造段階においては、タンパク質における再現性および一貫性は、品質保証にとって不可欠である。本方法を使用して、高ｐＨ、あるいは低ｐＨのいずれかで、タンパク質の安定性を測定することができる。試験のために、１ｍｇのタンパク質を、ＡＫＴＡ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、現在のＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、プロテインＡカラム上にロードし、ｐＨ３．１で、緩衝酢酸溶液で溶出した。タンパク質を、２時間間隔で最長６時間、低ｐＨで保持した。１００μＬのアリコートを得、次いで、分析ＳＥＣ上に流し、分解および凝集によるタンパク質の喪失を測定した。表５．３（以下を参照）および図４において、結果を要約する。
【０５４０】
【表１６】
2012515556.tif 000044
本試験については、ＥＣ３０４（グリコシル化されたＩｇＧ４．Ｐ  Ｔ３０７Ｐ、Ｄ３９９Ｓ）、ＥＣ３２３（グリコシル化されたＩｇＧ４．Ｐ  Ｄ３９９Ｓ、Ｌ３０９Ｋ）、ＥＣ３２６（グリコシル化されたＩｇＧ４．Ｐ  Ｔ３０７Ｐ、Ｄ３９９Ｓ、Ｌ３０９Ｋ）、グリコシル化されたＩｇＧ４．Ｐ  Ｔ２９９Ａ、ＥＣ３３１（ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインを有する非グリコシル化されたＩｇＧ４．Ｐ  Ｔ２９９ＫおよびＴ３０７Ｐ）、非グリコシル化されたＩｇＧ１（Ｔ２９９Ａ）、非グリコシル化されたＩｇＧ４．Ｐ（Ｔ２９９Ａ）、ならびにグリコシル化されたＩｇＧ１を、試験のために選択した。データから、ＥＣ３３１は、多くの収量を喪失することなく、少なくとも６時間、低ｐＨ保持に抵抗することが可能であることを示す。これは、実行された非グリコシル化されたＩｇＧ４野生型対照と比較した改善である。他の非グリコシル化された構造体は、この構造体が、低ｐＨ保持に抵抗することが可能であったので、分解によりいかなるタンパク質を喪失しないことを予測する。両方が、グリコシル化されると共に、ＥＣ３０４およびＥＣ３２６は、それらの収量も維持し、これは、グリコシル化されたＩｇＧ１野生型と同程度である。また、グリコシル化されたＥＣ３２３は、時間経過に伴い、あまり正しく配列しなかった。Ｌ３０９Ｋ変異のみは、Ｔ３０７Ｐ変異と一緒に安定化することを必要とすると仮定し、これは、さらに安定化したＥＣ３２６構造体に見られる。
【０５４１】
実施例６．安定性を操作したＩｇＧ  Ｆｃ抗体のＦｃ受容体結合
本発明の非グリコシル化された変異体抗体のエフェクタ機能を、Ｆｃ受容体またはＣ１ｑ等の補体分子に結合するそれらの能力によって特徴付けた。
【０５４２】
Ａ．液相競合Ｂｉａｃｏｒｅ実験
Ｆｃγ受容体への結合は、溶液親和性の表面プラズモン共鳴を用いて分析された（Ｄａｙ  ＥＳ，Ｃａｃｈｅｒｏ  ＴＧ，Ｑｉａｎ  Ｆ，Ｓｕｎ  Ｙ，Ｗｅｎ  Ｄ，Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ  Ｍ，Ｈｓｕ  ＹＭ，Ｗｈｉｔｔｙ  Ａ．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ  ａｎｄ  ＡＰＲＩＬ  ｆｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅ  ＴＮＦ  ｆａｍｉｌｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ＢＡＦＦＲ／ＢＲ３  ａｎｄ  ＢＣＭＡ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２００５  Ｆｅｂ  １５；４４（６）：１９１９−３１を参照）。本方法は、リガンド結合（センサーチップに結合するタンパク質結合）の初期速度は、溶液中のリガンドの濃度に比例する、いわゆる「物質移動限界」結合の条件を使用する（ＢＩＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（１９９４）Ｃｈａｐｔｅｒ６：Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ，ｐｐ６−１−６−１０，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢを参照）。これらの条件下で、チップ上の固定化したタンパク質への可溶性検体（チップ表面上を流れるタンパク質）の結合は、チップ表面上のデキストランマトリックスへの検体の拡散と比較して速い。したがって、検体の拡散特性およびチップ表面上を流れる溶液中の検体の濃度は、検体がチップに結合する速度を決定する。この実験においては、溶液中の遊離Ｆｃ受容体の濃度は、固定化ＩｇＧ１  ＭＡｂを含むＣＭ５  Ｂｉａｃｏｒｅチップに結合する初期速度によって決定される。これらのＦｃ受容体溶液に、安定性を操作した構造体を滴定した（下の表６．１を参照）。これらの構造体の半最大（５０％）抑制濃度（ＩＣ５０）は、センサーチップの表面上に固定化した固定化ＩｇＧ１抗体に結合することからＦｃ受容体を抑制する能力によって示された。初期結合速度は、センサーグラム生データから得られた（図５）。ＩＣ５０を計算するために使用された滴定曲線をＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）については図６ＡおよびＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩａ  Ｖ１５８）については図６Ｂに示す。結果を表６．１に示し、２つの滴定の平均として報告する。
【０５４３】
【表１７】
2012515556.tif 000045
ＣＤ６４結合アッセイにおいては、ＩｇＧ１対照抗体は、９．６μＭのＩＣ５０を有したが、ＩｇＧ１  Ｔ２９９Ａ（ａｇｌｙ）およびＩｇＧ４．Ｐ  Ｔ２９９Ａ（ａｇｌｙ）は、それぞれ、２０５μＭおよび７３９μＭのＩＣ５０を有した。予想通りに、ＩｇＧ１分子は、ＩｇＧ４分子よりもＣＤ６４に対してより大きな親和性を有し、非グリコシル化されたＩｇＧ１は、グリコシル化されたＩｇＧ１と比較して低下した親和性を示した。安定性を操作したグリコシル化されたＩｇＧ４．Ｐ分子（ＥＣ３００およびＥＣ３２６）は、４４０μＭから５０００μＭを超える範囲に及ぶ安定性を操作した非グリコシル化されたＩｇＧ４．Ｐ分子（ＥＣ３３１およびＹＣ４００シリーズ）と比較して、約８μＭのＩＣ５０値を有した。安定性を操作したＩｇＧ４．Ｐグリコシル化された分子（ＥＣ３００、ＥＣ３２６）に対するＩＣ５０は、グリコシル化されたＩｇＧ１対照と同等であり、Ｔ２９９Ａ（ＹＣ４０１、ＹＣ４０３）を有する安定性を操作した非グリコシル化されたＩｇＧ４．Ｐは、非グリコシル化されたＩｇＧ４．Ｐ  Ｔ２９９Ａ対照と同等のＩＣ５０の対数を有した。しかしながら、Ｔ２９９Ｋを有する安定性を操作した非グリコシル化されたＩｇＧ４．Ｐは、Ｔ２９９Ａ置換を有する等価分子と比較して、親和性の１から２対数大きい低下を示した。図７Ａ。また、この結果は、非グリコシル化されたＩｇＧ１  Ｔ２９９Ａ対照と比較して、親和性の対数低下を示した安定性を操作した非グリコシル化されたＩｇＧ１  Ｔ２９９Ｋ（ＣＮ５７８）についても観測された（図７Ｂ）。実際、Ｔ２９９Ｋ置換は、非グリコシル化されたＩｇＧ４．Ｐ  Ｔ２９９Ａ対照よりもＣＤ６４に対してより大きな親和性を有することから、非グリコシル化されたＩｇＧ４．Ｐ対照と比較して、非グリコシル化されたＩｇＧ１（Ｔ２９９Ｋ）に対して低下した親和性を有することへと、非グリコシル化されたＩｇＧ１（Ｔ２９９Ａ）分子を転換する（図７Ｂ）。簡潔に言えば、Ｔ２９９Ｋ変異は、ＩｇＧ１分子およびＩｇＧ４分子の両方において、ＣＤ６４に対する親和性を低下させる。
【０５４４】
ＣＤ１６アッセイについては、ＩｇＧ１対照は、１０５μＭのＩＣ５０を有したが、非グリコシル化されたＩｇＧ４．Ｐ  Ｔ２９９ＡおよびＩｇＧ１  Ｔ２９９Ａは共に、１０００μＭを超えるＩＣ５０値を有した。グリコシル化された安定性を操作したＩｇＧ４．Ｐ分子は、ＩｇＧ１対照に対して同等の対数ＩＣ５０値を有し、全ての安定性を操作した非グリコシル化された分子（ＩｇＧ４．ＰおよびＩｇＧ１の両方）は、１０００μＭを超えるＩＣ５０値を有した。Ｔ２９９Ｋが、ＣＤ１６対する親和性をさらに低下したかどうかを調査するために、唯一の差異（ＹＣ４０１、ＹＣ４０４、ＹＣ４０３、およびＹＣ４０６）としてＴ２９９Ｋ置換を有する２セットの構造体を高濃度の抗体（５μＭ）で試験した。結合曲線は、高濃度で、Ｔ２９９Ｋ変異によって生じるＣＤ１６に対する親和性の低下を示す（図８）。簡潔に言えば、Ｔ２９９Ｋ変異は、ＩｇＧ分子において、ＣＤ１６に対する親和性を低下させる。
【０５４５】
Ｂ．  Ｃ１ｑ結合ＥＬＩＳＡ
Ｃｑ結合アッセイは、ＰＢＳ中の１０ｕｇ／ｍＬで５０μＬの組み換え可溶性ヒトＣＤ４０リガンドで、９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｂ  ＥＬＩＳＡプレート（Ｎａｌｇｅ−Ｎｕｎｃ  Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ，ＵＳＡ）を４℃で一晩被覆することによって、行った。ウェルを吸引し、洗浄緩衝液（ＰＢＳ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄し、２００μＬ／ウェルの遮断／希釈緩衝液（０．１Ｍ  Ｎａ２ＨＰ０４、ｐＨ７．０、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０、１％  ゼラチン）で１時間遮断した。抗体を、３倍の希釈で遮断／希釈緩衝液で希釈し、室温で２時間インキュベートした。上記のように、吸引し、洗浄した後、遮断／希釈緩衝液で希釈した５０ｐｌ／ウェルの２Ｊ．ゲルのＳｉｇｍａヒトＣ１ｑ（Ｃ０６６０）を添加し、室温で１．５時間インキュベートした。
【０５４６】
上記のように、吸引し、洗浄した後、遮断／希釈緩衝液中で３，５６０倍に希釈した５０Ｊ．ウェルのヒツジ抗Ｃ１ｑ（Ｓｅｒｏｔｅｃ  ＡＨＰ０３３）を添加した。室温で１時間インキュベートした後、上記のように、ウェルを吸引し、洗浄した。次いで、遮断／希釈緩衝液中で１：１０，０００に希釈した５０ｐｌｌ／ウェルのロバ抗ヒツジＩｇＧ  ＨＲＰ複合体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  ７１３−０３５−１４７）を添加し、ウェルを室温で１時間インキュベートした。
【０５４７】
上記のように、吸引し、洗浄した後、１００個のＴＭＢ基質（４２０ｐｌＭ  ＴＭＢ、０．１Ｍ  酢酸ナトリウム／クエン酸緩衝液中の０．００４％  Ｈ２Ｏ２、ｐＨ４．９）を全て添加し、１００ｕＬ  ２Ｎ  硫酸で反応を停止する前に、２分間インキュベートした。Ｓｏｆｔｍａｘ  ＰＲＯ機器を用いて、吸光度を４５０ｎｍで読み出し、Ｓｏｆｔｍａｘソフトウェアを使用して、４パラメータフィットを用いて相対的結合親和性（Ｃ値）を決定した。
【０５４８】
実験の結果は、ＣＮ５７８（ＩｇＧ１  Ｔ２９９Ｋ）およびＹＣ４０６（非グリコシル化されたＩｇＧ４．Ｐ  Ｔ２９９Ｋ、Ｔ３０７Ｐ、Ｌ３０９Ｋ、およびＤ３９９Ｓ）は共に、Ｃ１ｑへの測定可能な結合を有さない（図９）が、ＩｇＧ１  Ｔ２９９Ａは、幾つかの残留結合を有する。
【０５４９】
実施例８．ＩｇＧ１  ＣＨ３は、エフェクタ機能がなく、非グリコシル化されたＩｇＧ４  ＣＨ２を安定する。
【０５５０】
５ｃ８抗体に由来する項に記載されるタンパク質は、特に示さない限り、ＩｇＧ４からのＣＨ１領域、ＩｇＧ４からのＣＨ２ドメイン、およびＩｇＧ１またはＩｇＧ４抗体からのＣＨ３ドメイン（示されるように）を含む。実施例３に記載されるように、タンパク質を産生し、精製した。修飾抗体のＣＨ２およびＣＨ３ドメインの熱安定性は、ｐＨ  ６．０およびｐＨ４．５で、ＤＳＣによって測定された（実施例４に詳述）。撹拌ストレスの効果は、分析ＳＥＣによって、およびＡ３２０ｎｍでの濁度測定（実施例５）によって測定された。本発明の非グリコシル化された変異体抗体のエフェクタ機能は、Ｆｃ受容体またはＣ１ｑ等の補体分子に結合するそれらの能力によって特徴付けられた。Ｆｃγ受容体への結合は、溶液親和性の表面プラズモン共鳴を用いて分析され、補体因子Ｃ１ｑへの結合は、ＥＬＩＳＡによって分析された（実施例６）。最終的に、血清半減期は、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおいて行われる薬物動態学的試験によって決定された（実施例７）。
【０５５１】
ＩｇＧ４−ＣＨ２／  ＩｇＧ１−ＣＨ３の非グリコシル化された構造体は、実施例３に詳述されるように、１リットルの培養液当たり７から３０  ｍｇの収量を有するＣＨＯにおいて発現した。ＩｇＧ１−ＣＨ３の導入は、ＩｇＧ４からのＣＨ３を有する同じ構造体と比較して、より大きい収量（約１．５倍）を与えると思われる（表８．１）。さらに、ＩｇＧ１非グリコシルＩｇＧ４−ＣＨ２／ＩｇＧ１−ＣＨ３は、野生型非グリコシルＩｇＧ４のＣＨ３ドメインの安定性（Ｔｍ＝７４℃、表８．２および４．２）と比較して、ＣＨ３ドメインにおいて増加した熱安定性（Ｔｍ＝８５℃）を有した。興味深い観察は、ＩｇＧ１  ＣＨ３が、撹拌安定性の決定特性である（表８．３）ということである。なぜなら、ＣＨ２ドメインにおけるグリカンの欠如が、安定性において重要因子であるとこれまで考えられていたからである。
【０５５２】
ＥＡＧ２４１２構造体（Ｎ２９７Ｑ  ＩｇＧ４−ＣＨ２／ＩｇＧ１−、すなわち、Ｎ２９７ＱおよびＳｅｒ２２８Ｐｒｏ置換を有する５ｃ８可変領域（ＩｇＧ１フレームワーク）、ＩｇＧ４  ＣＨ１、ＩｇＧ４  ＣＨ２、ＩｇＧ１  ＣＨ３）は、Ｔ２９９ＡおよびＴ２９９Ｋ  ＩｇＧ４−ＣＨ２／ＩｇＧ１−ＣＨ３と比較して、ＣＤ６４およびＣＤ３２に対して最低結合を有する、良好なエフェクタ機能プロファイルを示すことが観察される。ＩｇＧ１−ＣＨ３は、Ｆｃγ受容体に結合する効果がないことが見出された。非グリコシルＩｇＧ４−ＣＨ２ドメインを含有する構造体は全て、Ｃ１ｑに結合しない。
【０５５３】
安定性を操作したＩｇＧ４／ＩｇＧ１分子の安定性および血清半減期に対処するために、薬物動態学的試験が、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおいて行われた。ラットは、Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ動物実験委員会、ならびに実験動物の人道的管理および取り扱いに対する市、州、および連邦政府のガイドラインに従って維持された。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に希釈された１ｍｇ／ｋｇ（１ｍｇ／ｍＬ）の抗体の単一のボーラス注射を雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに静脈投与した。ラットは、注射してから０、０．２５、０．５、１、２、６、２４、４８、９６、１６８、２１６、２６４、および３３６時間後に、殺処分した。血清試料は、抗体のレベルを定量化するために分析用に調製した。試料は、５％  正常マウス血清（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  ０１５−０００−１２０）が補充されたＤＡＢ中で希釈され、検出試薬は、２５０ｎｇ／ｍＬの最終濃度で使用されたＥｕ標識マウス抗ヒトＦｃ抗体（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  １２４４−３３０）であった。精製した抗体の標準曲線と比較して、ＥｘｃｅｌのＴＲＥＮＤ機能を用いることによって、定量化を行った。
【０５５４】
Ｎ２９７Ｑ  ＩｇＧ４−ＣＨ２／ＩｇＧ１−ＣＨ３は、Ｔ２９９Ａ  ＩｇＧ４抗体と同様の半減期を有し、これは、予想通りに、非グリコシル化されたＩｇＧ１よりも若干短かった（表８．５）。データを図１０Ｃにプロットした。
【０５５５】
【表１８−１】
2012515556.tif 000046
【０５５６】
【表１８−２】
2012515556.tif 000047
実施例９．Ｔ２９９は、安定性およびエフェクタ機能の決定因子である。
【０５５７】
本項に記載されるタンパク質は全て、５ｃ８抗体に由来し、特に示さない限り、ＩｇＧ１抗体のＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインを含む。実施例３に記載されるように、タンパク質を産生し、精製した。ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの融解温度における変異の効果は、ｐＨ６．０およびｐＨ４．５で、ＤＳＣによって測定された（実施例４に詳述）。本発明の非グリコシル化された変異体抗体のエフェクタ機能は、Ｆｃ受容体またはＣ１ｑ等の補体分子に結合するそれらの能力によって特徴付けられた。Ｆｃγ受容体への結合は、溶液親和性の表面プラズモン共鳴を用いて分析され、補体因子Ｃ１ｑへの結合は、ＥＬＩＳＡによって分析された（実施例６）。
【０５５８】
ＩｇＧ１  Ｔ２９９ＸおよびＮ２９７Ｘ／Ｔ２９９Ｋの非グリコシル化された構造体は、実施例３に詳述されるように、１リットルの培養液当たり７から３０ｍｇの収量を有するＣＨＯにおいて発現した（表９．１）。Ｔ２９９Ｋと組み合わせて位置Ｎ２９７における第２の変異への添加により、１．５〜４．４℃で、ＣＨ２ドメインの熱安定性は減少しなかった（表９．２）。さらに、Ｔ２９９Ｘ変異は、Ａｒｇ（Ｔ２９９Ｒ）およびＬｙｓ（Ｔ２９９Ｋ）の正電荷を持つ側鎖から最大の安定性の増加を示した（表９．２）。２つの極性側鎖のＡｓｎ（Ｔ２９９Ｎ）およびＧｌｎ（Ｔ２９９Ｑ）は共に、正電荷を持つ側鎖ほど大きくはないが、Ｔ２９９Ａと比較して、より大きな安定性を示した。プロリン（Ｔ２９９Ｐ）は、Ｔ２９９Ａと比較して安定性のわずかな低下を示し、より大きな疎水性側鎖Ｐｈｅ（Ｔ２９９Ｆ）は、２．４℃で、ＣＨ２ドメインの熱安定性を低下させた。最後に、負電荷を持つ側鎖Ｇｌｕ（Ｔ２９９Ｅ）は、ＣＨ２の熱安定性に対してほとんど効果を及ぼさなかった。これらの結果は、ＣＨ２ドメインにおける熱安定性を増加させるために、位置Ｔ２９９に正電荷を持つ側鎖を置換する新規の特性を示す。
【０５５９】
Ｎ２９７Ｘ、Ｔ２９９Ｋ変異（ＣＮ６４５、ＣＮ６４６、およびＣＮ６４７）は全て、ＣＤ６４に対する親和性を若干増加させたが、ＣＤ３２ａおよびＣＤ１６に対する非常に低い親和性を維持することが観察される（図１１Ｂ、１１Ｄ、および１１Ｆ）。Ｔ２９９Ｘ変異は、ＣＤ１６に対して一貫して低親和性を示したが、ＣＤ３２ａに対する低親和性は、Ｔ２９９Ｅの場合には、増加した（表９．３および図１１Ｃ、９Ｅ）。また、正電荷を持つ側鎖Ｔ２９９ＲおよびＴ２９９Ｋのみが、ＣＤ６４に対して低親和性を与えることを示すことも興味深い（表９．３および図１１Ａ）。最後に、Ｔ２９９Ｋ、Ｔ２９９Ｐ、およびＴ２９９Ｑは、Ｃ１ｑ結合の痕跡がなく、Ｔ２９９Ｎ、Ｔ２９９Ｅ、Ｔ２９９Ｆは、若干上昇したが、それでも非常に低いＣ１ｑへの結合を示す（図１１Ｇおよび１１Ｈ）。Ｎ２９７Ｐ／Ｔ２９９Ｋ、Ｎ２９７Ｄ／Ｔ２９９Ｋ、およびＮ２９７Ｓ／Ｔ２９９Ｋは、Ｃ１ｑへの結合を示さない（図１１Ｈ）。
【０５６０】
【表１９−１】
2012515556.tif 000048
【０５６１】
【表１９−２】
2012515556.tif 000049
実施例１０．安定化Ｆｃ構造体は、安定性変異の適用は、Ｆａｂから独立していることを示す
本項に記載されるタンパク質は、５ｃ８抗体に由来する結合部位を含む。ＥＡＧ２４７６構造体は、ＩｇＧ４免疫グロブリン分子からのＦｃ部分を含み、ＥＡＧ２４７８は、ＩｇＧ１分子からのＦｃ部分を含む（ＥＡＧ２４７６およびＥＡＧ２４７８は、それぞれ、ＹＣ４０６およびＣＮ５７８構造体のＦｃ版（Ｆａｂなし）である）。
【０５６２】
実施例３に記載されるように、タンパク質を産生し、精製した。ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの融解温度における変異の効果は、ｐＨ６．０で、ＤＳＣによって測定された（実施例４に詳述）。本発明の非グリコシル化された変異抗体のエフェクタ機能を図１２に示す。抗体は、Ｆｃ受容体に結合するそれらの能力によって特徴付けられた。Ｆｃγ受容体への結合は、溶液親和性の表面プラズモン共鳴を用いて分析された（実施例６）。
【０５６３】
安定化Ｆｃ非グリコシル化された構造体は、実施例３に詳述されるようにＣＨＯにおいて発現され、収量は（表１０．１）に詳述する。。ＣＨ２ドメイン（Ｔ２９９Ｋ、Ｔ３０７Ｐ、およびＬ３０９Ｋ）における変異は、Ｆａｂの存在または不在下で、同じ熱安定性を示し（表１０．２）、ならびに、同じＦｃγ受容体結合親和性を有した（表１０．３）。総合すれば、本発明に詳述される安定化変異は、予想通りに、Ｆａｂから独立しており、Ｆａｂが貢献しているどうかにかかわらず、Ｆｃドメインを安定化するのに適用可能である。
【０５６４】
【表２０】
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実施例１１．水素／重水素交換質量測定およびＸ線結晶解析によって決定された安定化したエフェクタ無し抗体のタンパク質構造、力学、および構造
構造および力学は、タンパク質の機能に大きく貢献する。根本的な構造機構を理解することは、観察された機能的な効果を説明するのに重要である。この理由のために、水素／重水素交換質量測定（（Ｈ／ＤＸ  ＭＳ）およびＸ線結晶解析の両方によって、上で詳述したタンパク質構造および力学における安定性増加変異の効果の検査を行なった。
【０５６５】
Ａ．水素／重水素交換質量測定
質量測定によって水素／重水素交換を検出することは、タンパク質力学および構造を特徴付けるための１つのアプローチである。タンパク質力学／構造は、タンパク質中の水素に対する重水素の交換の速度に影響を及ぼし、したがって、時間経過に伴うタンパク質の重水素化を測定することは、タンパク質構造が修飾される（例えば、変異を伴って）際の、構造への変化を明らかにすることができる。したがって、非グリコシル化された抗体Ｆｃ骨格の水素／重水素交換における安定化変異の効果を試験した。
【０５６６】
抗体（５０ｍＭ  リン酸ナトリウム、１００ｍＭ  塩化ナトリウム、Ｈ２Ｏ、ｐＨ６．０）は、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム、１００ｍＭ  塩化ナトリウム、Ｄ２Ｏ、ｐＤ６．０を用いて２０倍に希釈し、様々な時間（１０秒、１、１０、６０、および２４０分）、室温でインキュベートした。交換反応物は、２００ｍＭ  リン酸ナトリウム、０．５Ｍ  ＴＣＥＰ、および４Ｍ  グアニジン  ＨＣｌ、Ｈ２Ｏ、ｐＨ２．４を有する、１：１希釈を用いてｐＨを２．６まで低減させることによって反応停止した。反応停止した試料を、ｎａｎｏＡＣＱＵＩＴＹプラットフォームに基づいたＷａｔｅｒｓ  ＵＰＬＣシステムを用いたオンラインで、消化、脱塩、分離した。約２０ｐモルの交換および反応停止した抗体を、固定化したペプシンカラムに注射した。１５℃で、０．１ｍＬ／分の流量で、０．０５％ギ酸を含有する水中で、２分間にわたりオンライン消化を行った。得られた消化性ペプチドを、０℃で維持したＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８  １．７μｍ  ペプチドトラップ（Ｗａｔｅｒｓ，  Ｍｉｌｆｏｒｄ，  ＭＡ）上にトラップし、水、０．０５％ギ酸を用いて脱塩した。流量は、切り替え弁によって切り替え、Ｗａｔｅｒｓ  ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８  １．７μｍ、１ｍｍ×１００ｍｍカラムに、４０μＬ／分でｈトラップから溶出し、０℃で保持した（平均背圧は、約９０００ｐｓｉであった）。０．０５％ギ酸を有する６分間の直線状アセトニトリル勾配（８〜４０％）を使用して、ペプチドを分離した。溶出液を、エレクトロスプレーイオン化およびロック質量補正を有するＷａｔｅｒｓ  Ｓｙｎａｐｔ質量分析計に導いた（Ｇｌｕフィブロゲンペプチドを用いて）。質量スペクトルを、ｍ／ｚ範囲２６０〜１８００にわたって得た。ペプシン断片は、完全質量とＭＳ／ＭＳの組み合わせを使用して特定され、Ｗａｔｅｒｓ  ＩｄｅｎｔｉｔｙＥソフトウェアによって促進された。ペプチド重水素レベルは、Ｗｅｉｓらによって記載されるように、ＥｘｃｅｌベースのプログラムＨＸ−Ｅｘｐｒｅｓｓを用いて、決定された。
【０５６７】
無傷ＩｇＧ４．Ｐ対Ｎ２９７Ｑ  ＩｇＧ４．Ｐ、Ｎ２９７Ｑ  ＩｇＧ４．Ｐ対Ｎ２９７Ｑ  ＩｇＧ４．Ｐ−ＣＨ２／ＩｇＧ１−ＣＨ３、およびＴ２９９Ａ  ＩｇＧ４．Ｐ対ＹＣ４０６（Ｔ２９９Ｋ、Ｔ２０７Ｐ、Ｌ３０９Ｋ、Ｄ３９９Ｓ）についてのＨ／ＤＸ−ＭＳデータを上記のように回収した。無傷（グリコシル化された）ＩｇＧ４および非グリコシル化されたＮ２９７Ｑ  ＩｇＧ４の比較は、非グリコシル形態がより大きな交換を示す配列の領域を示す。さらに、Ｈ／Ｄ交換が、ペプチドＬ２３５−Ｆ２４１、Ｆ２４１−Ｄ２４９、Ｉ２５３−Ｖ２６２、Ｖ２６３−Ｆ２７５、およびＨ３１０−Ｅ３１８において観察される。Ｎ２９７Ｑ  ＩｇＧ４．Ｐ−ＣＨ２／ＩｇＧ１−ＣＨ３構造体における同じペプチドと比較して、より高いＩｇＧ４ペプチドＭ３５８−Ｌ３６５、Ｔ４１１−Ｖ４２２、およびＡ４３１−Ｓ４４２の交換は、Ｎ２９７Ｑ  ＩｇＧ４−ＣＨ２と組み合わせたＩｇＧ１−ＣＨ３から生じた安定性の増加を示す。この場合では、ＩｇＧ４からのＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ１−ＣＨ３と比較して、ＣＨ３の３つの明確に異なる領域においてより大きな交換を示す。最終的に、ペプチドＬ２３５−Ｆ２４１、Ｆ２４１−Ｍ２５２、Ｖ２６３−Ｆ２７５、Ｖ２６６−Ｆ２７５、およびＶ２８２−Ｆ２９６は、具体的には、脱グリコシル化のため、さらに交換しやすい配列領域において、非グリコシル化されたＩｇＧ４（Ｔ２９９Ａ）と比較して、変異構造体ＹＣ４０６によって安定性の増加を示す。興味深いことに、熱安定性の若干の増加を生じながら、ＣＨ３ドメインにおけるＤ３９９Ｓ変異は、野生型配列よりもより大きな交換を与える。概して、Ｈ／Ｄ交換ＭＳは、脱グリコシル化の結果として配座の変化は、安定性変異によって部分的に、あるいは完全に回復されたことを示した。
【０５６８】
Ｂ．安定性を向上したＦｃ構造体のＸ線結晶学
ＥＡＧ２４７６構造体（ａｇｌｙ  ＩｇＧ４−Ｆｃ  Ｔ２９９Ｋ、Ｔ３０７Ｐ、Ｌ３０９Ｋ、Ｄ３９９Ｓ）を、結晶化し、データを２．８A分解能（データ完全性  全体の９２％、高分解能シェル  ６６％）まで収集した。この構造は、電子密度に組み込まれ、それぞれ、Ｒ／Ｒｆｒｅｅの２７．７／３３．９％まで精密化された。この構造は、２本の鎖間でほとんど偏差がない重ねることができる非対称ユニット（ＡＳＵ）における２本のＦｃ鎖を示す。ループＶ２６６−Ｅ２７２、特に、Ｐ２９１−Ｖ３０２は、野生型ＩｇＧ４結晶構造（ｐｄｂ  １ＡＤＱ）において観察されたものとはまったく異なる。これは、変異Ｔ２９９Ｋの直接的結果であり得る。
【０５６９】
ＥＡＧ２４７８構造体の結晶構造（ａｇｌｙ  ＩｇＧ１  Ｆｃ  Ｔ２９９Ｋ）は、２．５A分解能（データ完全性  全体の９２％、高分解能シェル  ６６％）に分解された。この構造は、組み込まれ、それぞれ、Ｒ／Ｒｆｒｅｅの２７．４／３５．８％まで精密化された。ＥＡＧ２４７６の構造とは異なり、ＡＳＵにおける２本のＦｃ鎖は、ＥＡＧ２４７８構造において同一ではない。鎖Ａは、酵素的に脱グリコシル化されたＩｇＧ１  Ｆｃ（ｐｄｂ  ３ＤＮＫ）の構造とさらに同様であることが観察される。ＥＡＧ２４７８構造におけるＣＨ２ドメインは、酵素的に脱グリコシル化されたＩｇＧ１  Ｆｃ（ｐｄｂ  ３ＤＮＫ）およびマウス非グリコシル化されたＩｇＧ１  Ｆｃ（ｐｄｂ  ３ＨＫＦ）において観察されるよりも近い。ＣＨ２ドメインは、ＥＡＧ２４７８構造に観察されるものよりもＥＡＧ２４７６構造においてさらに開かれている。この構造は、いずれの場合においても、Ｔ２９９Ｋ変異は、ドッキングしたＦｃガンマＩＩＩ受容体のＹ１２９側鎖に対して行われ、これは、この変異において観察される受容体に対する低下した親和性を説明することを示す。
【０５７０】
同等物
当業者であれば、日常的な実験のみを用い、本明細書中に記載された本発明の具体的な実施形態に対して多くの同等物がある。そのような同等物は、以下の特許請求の範囲に含まれることを意図する。
【図２Ａ】
2012515556.tif 000051
【図７Ａ】
2012515556.tif 000052
【図７Ｂ】
2012515556.tif 000053
【図８】
2012515556.tif 000054
【図１】
2012515556.tif 000055
【図２Ｂ】
2012515556.tif 000056
【図２Ｃ】
2012515556.tif 000057
【図２Ｄ】
2012515556.tif 000058
【図３Ａ】
2012515556.tif 000059
【図３Ｂ】
2012515556.tif 000060
【図４】
2012515556.tif 000061
【図５】
2012515556.tif 000062
【図６Ａ】
2012515556.tif 000063
【図６Ｂ】
2012515556.tif 000064
【図９】
2012515556.tif 000065
【図１０Ａ】
2012515556.tif 000066
【図１０Ｂ】
2012515556.tif 000067
【図１０Ｃ】
2012515556.tif 000068
【図１１Ａ】
2012515556.tif 000069
【図１１Ｂ】
2012515556.tif 000070
【図１１Ｃ】
2012515556.tif 000071
【図１１Ｄ】
2012515556.tif 000072
【図１１Ｅ】
2012515556.tif 000073
【図１１Ｆ】
2012515556.tif 000074
【図１１Ｇ】
2012515556.tif 000075
【図１１Ｈ】
2012515556.tif 000076
【図１２Ａ】
2012515556.tif 000077
【図１２Ｂ】
2012515556.tif 000078
【配列表】
2012515556000001.app
【国際調査報告】
2012515556.tif 000079
2012515556.tif 000080
2012515556.tif 000081