(57)【要約】  本発明は、クプレドキシン又はクプレドキシンのバリアント、誘導体、及び構造的等価物であり得る化学予防剤と少なくとも１つの他の化学予防剤とを含む組成物及び方法に関する。特に、これらの組成物は、緑膿菌由来のアズリン及び／又はアズリンの５０〜７７残基領域（ｐ２８）を含み得る。本発明の組成物は、哺乳動物の細胞、組織、及び動物体における前悪性病変の発生を防止又は阻害するため、したがって、癌を防止するために使用され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞をクプレドキシン由来ペプチドに接触させることにより前記細胞中でのｐ５３のユビキチン化を防止することを含む、方法。
【請求項２】
前記ペプチドがクプレドキシンの切断型である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記クプレドキシンがアズリンである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記アズリンが緑膿菌に由来する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ペプチドが配列番号２を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ペプチドが配列番号２からなる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ペプチドが、配列番号２５、配列番号３８、配列番号３９、及び配列番号８６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ｐ５３の疎水性ＤＮＡ結合ドメイン内に結合する化合物にｐ５３を接触させることによりｐ５３のユビキチン化を防止することを含む、方法。
【請求項９】
前記疎水性ＤＮＡ結合ドメインがアミノ酸８０〜２７６を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記疎水性ＤＮＡ結合ドメインがアミノ酸８０〜２７６からなる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記化合物がクプレドキシン由来ペプチドである、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記ペプチドがクプレドキシンの切断型である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記クプレドキシンがアズリンである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ペプチドが配列番号２を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ペプチドが配列番号２からなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ペプチドが、配列番号２５、配列番号３８、及び配列番号３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
ｐ５３のユビキチン化をブロックすることにより癌の発生を阻害することを含む方法であって、前記ブロックが、ｐ５３の疎水性ＤＮＡ結合ドメイン内に結合する化合物にｐ５３を接触させることで達成される、方法。
【請求項１８】
前記疎水性ＤＮＡ結合ドメインがアミノ酸８０〜２７６を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記疎水性ＤＮＡ結合ドメインがアミノ酸８０〜２７６からなる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記化合物がクプレドキシン由来ペプチドである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記ペプチドがクプレドキシンの切断型である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記クプレドキシンがアズリンである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記ペプチドが配列番号２を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記ペプチドが配列番号２からなる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ペプチドが、配列番号２５、配列番号３８、及び配列番号３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
ｐ５３の疎水性ＤＮＡ結合ドメイン内に結合する化合物にｐ５３を接触させることにより前記ｐ５３のプロテアソーム分解を防止することを含む、方法。
【請求項２７】
前記疎水性ＤＮＡ結合ドメインがアミノ酸８０〜２７６を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記疎水性ＤＮＡ結合ドメインがアミノ酸８０〜２７６からなる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記化合物がクプレドキシン由来ペプチドである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記ペプチドがクプレドキシンの切断型である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記クプレドキシンがアズリンである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記ペプチドが配列番号２を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記ペプチドが配列番号２からなる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ペプチドが、配列番号２５、配列番号３８、及び配列番号３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
ｐ５３の疎水性ＤＮＡ結合ドメインに結合する化合物にｐ５３を接触させることにより、ＭＤＭ２依存性及びＰａｒｃ依存性の経路を介したｐ５３のプロテアソーム分解を防止することを含む、方法。
【請求項３６】
前記疎水性ＤＮＡ結合ドメインがアミノ酸８０〜２７６を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記疎水性ＤＮＡ結合ドメインがアミノ酸８０〜２７６からなる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記化合物がクプレドキシン由来ペプチドである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記ペプチドがクプレドキシンの切断型である、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
前記クプレドキシンがアズリンである、請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
前記ペプチドが配列番号２を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４２】
前記ペプチドが配列番号２からなる、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記ペプチドが、配列番号２５、配列番号３８、及び配列番号３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００９年５月１８日付で提出された米国特許出願第１２／４６７，７９９号の米国特許法第１１９条及び１２０条に基づく優先権を主張するものであり；２００８年１２月１５日付で提出された米国特許出願第１２／３１４，７０３号の一部継続出願であり且つ２００７年１２月１４日付で提出された米国仮特許出願第６１／０１３，７０９号の優先権を主張する２００９年２月１９日付で提出された米国特許出願第１２／３８９，１２０号の一部係属出願であり；２００６年９月１４日付で提出された米国仮特許出願第６０／８４４，３５８号の優先権を主張する２００７年９月１３日付で提出された米国特許出願第１１／８５４，６５４号の一部係属出願である２００８年１２月１７日付で提出された第１２／３３７，１６７号の一部係属出願であり；２００５年５月１３日付で提出された米国仮特許出願第６０／６８０，５００号及び２００４年１０月７日付で提出された米国仮特許出願第６０／６１６，７８２号の優先権を主張する２００５年１０月６日付で提出された米国特許出願第１１／２４４，１０５号の一部係属出願である。これらの先行する出願の内容全体を参照により本明細書に援用する。
【０００２】
技術分野
本発明は、癌関連の治療法に使用される、特に哺乳動物の細胞、組織、及び動物体における前悪性病変の発生を阻害するための、クプレドキシンのバリアント、誘導体、及び構造的等価物と化学予防療法のための少なくとも１つの他の化学予防剤とを含む組成物に関する。本発明は更に、クプレドキシン並びにクプレドキシンのバリアント、誘導体、及び構造的等価物並びに少なくとも１つの他の化学予防剤の、化学予防療法における及び／又は哺乳動物中で前悪性病変の発生、究極的には癌の発生を阻害する化学予防剤としての、使用及び／又は投与に関する。
【背景技術】
【０００３】
癌の化学予防とは、天然、合成、又は生物化学的な薬剤を用いて、侵襲性癌への発癌進行を逆転（ｒｅｖｅｒｓｅ）、抑制、又は防止（ｐｒｅｖｅｎｔ）することである。高リスク集団での癌防止における最近の臨床試験から、化学予防療法が高リスク患者にとって現実的な処置であることが示唆されている。化学予防療法は、ｍｕｌｔｉｆｏｃａｌ  ｆｉｅｌｄ  ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ及び多段階発癌という概念に基づく。ｆｉｅｌｄ  ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓでは、組織の場全体が一般的な発癌物質に曝されることで、組織中でのびまん性の上皮傷害及び変異細胞のクローン増殖が起こる。フィールド全体におけるこれらの遺伝的変異は、フィールドで１又は複数の前悪性病変又は悪性病変が発生する可能性を高める。これらの遺伝的変化及び表現型の変化の段階的な蓄積における多段階発癌。多段階発癌の１又は複数のステップを止めることで癌の発生が阻止又は防止され得る（概略については非特許文献１を参照されたい）。
【０００４】
アズリン及びその他のクプレドキシンは癌細胞特異的な細胞毒性を有する。アズリンはＪ７７４肺癌細胞においてアポトーシスを誘導する（非特許文献２）。アズリンは、Ｊ７７４肺癌細胞に移入すると、細胞質ゾル画分及び核画分に局在し、腫瘍抑制因子タンパク質ｐ５３と複合体を形成することでこれを安定化し、その細胞内レベルを上昇させる（上記文献）。アズリンにより仲介されるアポトーシスの誘導はＪ７７４細胞に限定されない。アズリンは、ヒトメラノーマＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞、ヒト乳癌ＭＣＦ−７細胞、骨肉腫等の癌細胞にも移入することができる（非特許文献３及び４）。アズリンは、細胞内ｐ５３レベルを上昇させ、Ｂａｘ形成及びかかる細胞でのアポトーシス誘導を促進する。非常に興味深いことに、Ｍｅｌ−２又はＭＣＦ−７ヒト癌を異種移植されたヌードマウスにアズリンを腹腔内注射すると、そのような癌が統計的に有意に逆転（ｒｅｖｅｒｓｅ）された（上記文献）。
【０００５】
マウス乳腺臓器培養（ＭＭＯＣ）モデルは、乳腺の発達及び上皮細胞の癌化に対するホルモン調節の効果を研究するためのかなりよく確立されたモデルである。ＭＭＯＣアッセイを用いて、ホルモンにより誘導される乳腺の構造分化及びＤＭＢＡにより誘発される腺中での前新生物性過形成性胞巣状小結節様病変の発生の両方に対する潜在的化学予防剤の阻害効果を評価することができる。乳腺は、臓器培養中にホルモンに応答して、胞巣状構造に分化するか、カゼイン及びａ−ラクトアルブミンの発現を誘導する。若い未交尾動物の乳腺は、インスリン（Ｉ）＋プロラクチン（Ｐ）＋アルドステロン（Ａ）存在下で６日間インキュベートした時、完全に成長した腺に分化することができる。これらの腺は妊娠マウスから得られた腺と形態的に類似している。アルドステロンはエストロゲン（Ｅ）＋プロゲステロン（Ｐｇ）で代用することができる。培地にヒドロコルチゾン（Ｈ）を含めると、乳腺の機能的分化が刺激される（非特許文献５及び６）。したがって、この培養系で観察されるホルモン誘導性の構造的及び機能的分化は、動物の種々の生理学的段階で観察されるホルモンへの応答を模倣している。
【０００６】
ＭＭＯＣでは、マウスは癌形成前に顕著な前新生物段階を示す。Ｃ３Ｈマウスではそのような前新生物病変はマウス乳房腫瘍ウイルスにより誘発され、ＢＡＬＢ／ｃマウスではＤＭＢＡにより誘発される。腺を成長期の３日目と４日目の間に２μｇ／ｍｌのＤＭＢＡに曝し、その後、インスリンのみを含む培地中で２〜３週間腺を退縮（ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）させると、乳房胞巣状病変（ｍａｍｍａｒｙ  ａｌｖｅｏｌａｒ  ｌｅｓｉｏｎ：ＭＡＬ）が形成される（非特許文献７及び８）。更に、ＤＭＢＡ誘発乳房病変を含む腺から調製した上皮細胞を同系の宿主に移植すると、乳腺癌が発生する（非特許文献９）。病理学的には、これらの腫瘍は、同じ株のマウスにＤＭＢＡを投与した際にインビボで観察されるものと同様のものである（上記文献）。
【０００７】
ＭＭＯＣにおけるＤＭＢＡ誘発乳房病変形成は、レチノイド等の種々のクラスの化学予防剤で阻害することができる。これらの化学予防剤には、天然産物に由来する化学予防剤、例えばブラシニン及びレスベレトロール、チオール類、抗酸化剤、オルニチンデカルボキシラーゼの阻害剤、例えばＯＦＭＯ及びデグエリン、プロスタグランジン合成の阻害剤、Ｃａ調整剤等が含まれる（非特許文献１０〜１２）。これらの研究は、この臓器培養系が乳癌発生に対する化合物の有効性を決定する固有のモデルになることを明確に示している。結果はそのような化合物をインビボで投与した場合に得られる阻害と密接に関連すると予想することができる。
【０００８】
アルドステロン及びヒドロコルチゾン存在下並びにエストロゲン及びプロゲステロン非存在下では、エストロゲン非依存性のＭＡＬが発生するようにＭＭＯＣを誘導することができる。乳管病変（ｍａｍｍａｒｙ  ｄｕｃｔａｌ  ｌｅｓｉｏｎ；ＭＤＬ）が形成されるようにＭＭＯＣを誘導することもできる。アルドステロン及びヒドロコルチゾンの代わりにエストロゲン及びプロゲステロンを培地に含めると、ＭＤＬを誘発することができる。卵巣ステロイド存在下での胞巣状構造は非常に小さいが、組織病理切片中に管内病変が観察される（非特許文献１３）。卵巣ホルモン依存的ＥＲ＋乳癌に選択的に作用するタモキシフェン等の抗エストロゲン薬はＭＤＬ形成を阻害したがＭＡＬ形成は阻害しなかった。したがって、ここにおいて、従来のＭＡＬ誘発プロトコールに加えてこの改変培養モデルをＭＡＬ及びＭＤＬの両方に対する化学予防剤の効果を評価するために使用することができる。
【０００９】
化学的に癌化させた実験的ＭＭＯＣモデルではｐ５３はほとんど変異又は変化しないが、ｐ５３を不活性化すると腫瘍の異数性が増加した。Ｃ３（１）タグ導入遺伝子を有するマウスにおける更なる研究から、ｐ５３機能の阻止が癌遺伝子存在下においても腫瘍形成に重要なイベントであり得ることが示唆された。研究により、ｐ５３がエストロゲンによって不活性化又は抑制されることが示された。したがって、このモデルは、乳房上皮細胞における前悪性病変の発生に対するアズリンの効果及びアズリンがｐ５３の発現を調節する能力を評価するために使用することができる。このモデルは更に、アズリンと組み合わせたエストロゲン受容体（ＥＲ）阻害化合物の効果を評価するためにも使用することができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｔｓａｏ  ｅｔ  ａｌ，ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  ５４：１５０−１８０（２００４）
【非特許文献２】Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ，ＰＮＡＳ  ９９（２２）：１４０９８−１４１０３（２００２）
【非特許文献３】Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．７０：７０５４−７０６２（２００２）
【非特許文献４】Ｐｕｎｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２３：２３６７−２３７８（２００４）
【非特許文献５】Ｍｅｈｔａ  ａｎｄ  Ｂａｎｅｒｊｅｅ，Ａｃｔａ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．８０：５０１（１９７５）
【非特許文献６】Ｍｅｈｔａ  ａｎｄ  Ｍｏｏｎ，Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ：Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  ３００，３００（Ｂａｓｉｌ  Ａ  Ｓｔｏｌｌ  ｅｄ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｐｒｅｓｓ  １９８６）
【非特許文献７】Ｈａｗｔｈｏｒｎｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４０：７０−７４（２００２）
【非特許文献８】Ｍｅｈｔａ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９：１９−２４（１９９７）
【非特許文献９】Ｔｅｌａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，ＰＮＡＳ  ７６：５８８６−５８９０（１９７９）
【非特許文献１０】Ｊａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５：２１８−２２０（１９９７）
【非特許文献１１】Ｍｅｈｔａ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ３６：１２７５−１２８２（２０００）
【非特許文献１２】Ｍｅｔｈａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８９：２１２−２１９（１９９７）
【非特許文献１３】Ｍｅｈｔａ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９３：１１０３−１１０６（２００１）
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、前悪性病変及び／又は癌に対して化学予防効果を有する、クプレドキシン又はクプレドキシンのバリアント、誘導体、切断型、若しくは構造的等価物であり得る化合物又はペプチドの投与又はその他の使用を含む方法に関する。
【００１２】
本発明のいくつかの実施形態では、クプレドキシンは、アズリン、シュードアズリン、プラストシアニン、ラスチシアニン、Ｌａｚ、オーラシアニン、ステラシアニン、及びキュウリ塩基性タンパク質からなる群から選択される。別の実施形態では、クプレドキシンはアズリンである。別の実施形態では、クプレドキシンは、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、アルカリゲネス・フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、アクロモバクター・キシロスオキシダン（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎ）、気管支敗血症菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、メチロモナスｓｐ．（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｅａ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・クロロラフィス、ピアス病菌（Ｘｙｌｅｌｌａ  ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ）、及び腸炎ビブリオからなる群から選択される生物に由来する。特定の実施形態では、クプレドキシンは緑膿菌に由来する。別の実施形態では、クプレドキシンは緑膿菌に由来するアズリンである。別の実施形態では、クプレドキシンは、本明細書に開示されている方法及び／又は技術の１又は複数を用いて修飾されている。別の実施形態では、ペプチドは、本明細書で意図されるクプレドキシンの切断型である。別の実施形態では、ペプチドは、緑膿菌由来のアズリン、及び／又はアズリンの５０〜７７残基領域（ｐ２８、配列番号２）、及び／又はアズリンの５０〜６７残基領域（ｐ１８、配列番号２５）、及び／又はアズリンの６０〜７７残基領域（ｐ１８ｂ、配列番号３８）、及び／又はアズリンの６０〜６７残基領域（配列番号８６）を含み得る。
【００１３】
本発明は更に、細胞をクプレドキシン由来ペプチドに接触させることにより細胞中でのｐ５３のユビキチン化を防止することを含む方法に関する。別の実施形態では、ペプチドはクプレドキシンの切断型である。別の実施形態では、クプレドキシンはアズリンである。別の実施形態では、アズリンは緑膿菌に由来する。別の実施形態では、ペプチドは配列番号２を含む。別の実施形態では、ペプチドは配列番号２からなる。別の実施形態では、ペプチドは、配列番号２５、配列番号３８、配列番号３９、及び配列番号８６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１４】
本発明は更に、ｐ５３の疎水性ＤＮＡ結合ドメイン内に結合する化合物にｐ５３を接触させることによりｐ５３のユビキチン化を防止することを含む方法に関する。別の実施形態では、疎水性ＤＮＡ結合ドメインはアミノ酸８０〜２７６を含む。更に別の実施形態では、疎水性ＤＮＡ結合ドメインはアミノ酸８０〜２７６からなる。本方法の別の実施形態では、化合物はクプレドキシン由来ペプチドである。別の実施形態では、ペプチドはクプレドキシンの切断型である。別の実施形態では、クプレドキシンはアズリンである。別の実施形態では、ペプチドは配列番号２を含む。別の実施形態では、ペプチドは配列番号２からなる。更に別の実施形態では、ペプチドは配列番号２５、配列番号３８、及び配列番号３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１５】
本発明は更に、ｐ５３のユビキチン化をブロックすることにより癌の発生を阻害することを含む方法であって、前記ブロックが、ｐ５３の疎水性ＤＮＡ結合ドメイン内に結合する化合物にｐ５３を接触させることにより達成される、方法に関する。別の実施形態では、疎水性ＤＮＡ結合ドメインはアミノ酸８０〜２７６を含む。更に別の実施形態では、疎水性ＤＮＡ結合ドメインはアミノ酸８０〜２７６からなる。別の実施形態では、化合物はクプレドキシン由来ペプチドである。別の実施形態では、ペプチドはクプレドキシンの切断型である。別の実施形態では、クプレドキシンはアズリンである。別の実施形態では、ペプチドは配列番号２を含み、更に別の実施形態では、ペプチドは配列番号２からなる。別の実施形態では、ペプチドは配列番号２５、配列番号３８、及び配列番号３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１６】
本発明は更に、ｐ５３の疎水性ＤＮＡ結合ドメイン内に結合する化合物にｐ５３を接触させることによりｐ５３のプロテアソーム分解を防止することを含む方法に関する。一実施形態では、疎水性ＤＮＡ結合ドメインはアミノ酸８０〜２７６を含む。別の実施形態では、疎水性ＤＮＡ結合ドメインはアミノ酸８０〜２７６からなる。別の実施形態では、化合物はクプレドキシン由来ペプチドである。別の実施形態では、ペプチドはクプレドキシンの切断型である。別の実施形態では、クプレドキシンはアズリンである。更に別の実施形態では、ペプチドは配列番号２を含む。別の実施形態では、ペプチドは配列番号２からなる。一実施形態では、ペプチドは配列番号２５、配列番号３８、及び配列番号３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１７】
本発明は更に、ｐ５３の疎水性ＤＮＡ結合ドメインに結合する化合物にｐ５３を接触させることによりＭＤＭ２非依存性及びＰａｒｃ非依存性の経路を介したｐ５３のプロテアソーム分解を防止することを含む方法に関する。別の実施形態では、疎水性ＤＮＡ結合ドメインはアミノ酸８０〜２７６を含む。更に別の実施形態では、疎水性ＤＮＡ結合ドメインはアミノ酸８０〜２７６からなる。いくつかの実施形態では、化合物はクプレドキシン由来ペプチドである。別の実施形態では、ペプチドはクプレドキシンの切断型である。別の実施形態では、クプレドキシンはアズリンである。更に別の実施形態では、ペプチドは配列番号２を含む。別の実施形態では、ペプチドは配列番号２からなる。更に別の実施形態では、ペプチドは配列番号２５、配列番号３８、及び配列番号３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１８】
本発明の上記及びその他の態様、利点、及び構成は以下の具体的な実施形態の図面及び詳細な説明から明らかになる。
【００１９】
配列の説明
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【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、ｐ２８（配列番号２）及びアズリンの有効性について評価した腺の写真である。図１Ａは、ＤＭＢＡで処置した腺における胞巣状病変の代表的な写真とＤＭＢＡ及び化学予防剤で処置した腺との比較を示す図である。図１Ｂ乃至１Ｇは、胞巣状病変の発生に対するｐ２８（配列番号２）の効果を表す代表的写真である。
【図２】図２は、ＤＭＢＡ誘発乳房胞巣状病変に対するｐ２８（配列番号２）の有効性を示すグラフである。
【図３】図３は、管病変の代表的切片及びｐ２８（配列番号２）の効果を写真である。
【図４】図４は、ＤＭＢＡ誘発管病変に対するｐ２８（配列番号２）の有効性を示すグラフである。
【図５】図５は、ｐ２８ペプチド領域（配列番号２）を太字で表したアズリンの３次元構造全体を示す図である。
【図６Ａ】図６Ａは、乳房胞巣状病変の代表的切片及び乳房胞巣状病変の発生に対するｐ２８（配列番号２）の効果を示す写真である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、乳房病変の代表的切片及び前記病変に対するｐ２８（配列番号２）の効果を示す写真である。
【図６Ｃ】図６Ｃは、乳房病変に対するｐ２８（配列番号２）及びタモキシフェンの効果を示すグラフである。
【図７Ａ】図７Ａは、エストロゲン及びプロゲステロンの存在下又は非存在下でインキュベートした乳腺中でのｐ５３の発現を比較したグラフである。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ｐ５３の発現に対するｐ２８（配列番号２）、タモキシフェン、及びこの２つの組合せの効果を示すグラフである。
【図７Ｃ】図７Ｃは、ＭＭＯＣの乳腺の代表的切片におけるｐ５３及びＫｉ６７の免疫組織化学染色の写真である。
【図７Ｄ】図７Ｄは、マウス乳腺の代表的切片並びに前記乳腺におけるｐ５３及びＫｉ−６７に対するアズリン、ｐ２８（配列番号２）、及びタモキシフェンの効果を示す写真である。
【図８】図８は、ＭＭＯＣモデルにおけるＭＡＬの発生に対するフェンレチニドとｐ２８（配列番号２）の組合せの効果を示すグラフである。
【図９】図９は、ＭＭＯＣモデルにおけるＭＤＬの発生に対するタモキシフェンとｐ２８（配列番号２）の組合せの効果を示すグラフである。
【図１０】図１０Ａ乃至１０Ｌは、マウス乳腺の代表的切片並びにこれらの乳腺におけるフェンレチニド及びｐ２８（配列番号２）の単独及び組合せの効果を示す写真である。
【図１１】図１１Ａ乃至１１Ｃは、様々な組織起源の癌細胞株及びその対応する正常細胞中へのアズリン由来ペプチドｐ１８（配列番号２５）及びｐ２８（配列番号２）の透過を示す写真である。（Ａ）３７℃で２時間後のＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ５６８標識されたｐ２８（配列番号２）又はｐ１８（配列番号２５）の透過を示す写真である。陽イオン性Ａｒｇ８（配列番号８２）を対照として用いた。（Ｂ）同じ細胞株中への３７℃で２時間後のＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ５６８標識されたｐ２８（配列番号２）又はｐ１８（配列番号２５）の透過のフローサイトメトリー分析を示すグラフである。（Ｃ）正常細胞からの蛍光に対する増加倍率を示すグラフである。４つのメラノーマ細胞株へのｐ２８（配列番号２）又はｐ１８（配列番号２５）の移入を同様に観察した結果、正常細胞からの蛍光に比べて数倍の増加が示された。
【図１２】図１２Ａ及び１２Ｂは、癌細胞及び正常細胞中へのａｚｕ６０〜７７（ｐ１８ｂ、配列番号３８）及びａｚｕ６６〜７７（ｐ１２、配列番号３９）の移入を示す写真である。細胞をａｌｅｘａｆｌｕｏｒ５６８標識されたｐ１８ｂ（配列番号３８）（Ａ）又はｐ１２（配列番号３９）（Ｂ）と３７℃で２時間インキュベートし、共焦点顕微鏡で画像を記録した。
【図１３】図１３Ａ及び１３Ｂは、アズリン及びそのペプチドの細胞膜毒性を示すグラフである。（Ａ）３７℃で種々の濃度のｐ２８（配列番号２）、ｐ１８（配列番号２５）、及びアズリンに１０分間暴露したＵＩＳＯＭｅｌ−２細胞のＬＤＨ漏出アッセイ。標準溶解バッファー（ｃｙｔｏｔｏｘ−ｏｎｅ試薬）を陽性対照として含めた。暴露後の蛍光の変化をｋ，ｘ５６０ｎｍ及びｋｅｍ５９０ｎｍで測定した。溶解バッファーを１００％ＬＤＨ放出と定義した。データは陽性対照の蛍光に対する％を表す。データは平均値±ＳＥＭで表す。（Ｂ）ｐ２８（配列番号２）、ｐ１８（配列番号２５）、及びアズリンとインキュベートしたヒト赤血球からのヘモグロビン漏出。ヒト赤血球をペプチドと３７℃で３０分間インキュベートし、５４０ｎｍの吸光度を測定した。０．１％トリトンＸ１００後のヘモグロビンの放出を１００％のヘモグロビン放出と定義した。データは３回の測定の平均値±ＳＥＭを表す。
【図１４】図１４は、ＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞中へのｐ２８（配列番号２）及びｐ１８（配列番号２５）の温度依存的且つ競合的な内部移行を示す写真である。２０１１ＭのＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ５６８標識されたｐ２８（配列番号２）（Ａ）又はｐ１８（配列番号２５）（Ｂ）の透過を種々の温度での共焦点顕微鏡法によって評価した。（Ｃ）及び（Ｄ）は、非標識ペプチド（２００倍過剰量）存在化／非存在下における３７℃で３０分後のＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞中への５μＭのＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ５６８標識されたｐ２８（配列番号２）（Ｃ）又はｐ１８（配列番号２５）（Ｄ）の移入の共焦点分析を示す図である。
【図１５】（Ａ）ヘパリン硫酸（１００μｇ／ｍｌ）の存在下／非存在下において３７℃で１時間後のＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞中へのｐ２８（配列番号２）、ｐ１８（配列番号２５）（２０μＭ）、及びＡｒｇ８（配列番号８２）（１０μＭ）の移入の共焦点分析を示す写真である。（Ｂ）阻害剤存在下におけるｐ２８（配列番号２）又はｐ１８（配列番号２５）の移入のフローサイトメトリー分析を示すグラフである。阻害剤非存在下における細胞蛍光強度（対照）を１００％と見なした。（Ｃ）阻害剤存在下における線維芽細胞中へのｐ２８（配列番号２）及びｐ１８（配列番号２５）の移入のＦＡＣＳ分析を示すグラフである。（Ｄ）ｐ１８（配列番号２５）及びｐ２８（配列番号２）とカベオリンＩの共局在を示す写真である（パネル１）。ＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞をＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ５６８標識されたｐ１８（配列番号２５）若しくはｐ２８（配列番号２）（２０μＭ）又は培地と３７℃で２時間インキュベートした。細胞を固定し、抗カベオリン１免疫染色用に処理した。３７℃で２時間後のＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞中へのＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ５６８標識されたｐ１８（配列番号２５）又はｐ２８（配列番号２）（２０μＭ）の移入の抗ゴルジン９７抗体による共焦点分析（パネル２）。ＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞中におけるＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ５６８標識されたアズリン、ｐ２８（配列番号２）、及びｐ１８（配列番号２５）（赤色）とｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ色素（緑色）（パネル３）及びＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ色素（緑色）（パネル４）の共局在。細胞を２０μＭのアズリン、ｐ２８（配列番号２）、ｐ１８（配列番号２５）、又は培地のみと３７℃でインキュベートした。９０分インキュベートした後、ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ／ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒプローブを添加して細胞を３０分間インキュベートした。細胞をＤＡＰＩ（青色）で対比染色した。アズリン、ｐ２８（配列番号２）、又はｐ１８（配列番号２５）の共局在は黄色蛍光として見られる。
【図１６】図１６は、種々の濃度のアズリン、ｐ２８（配列番号２）、又はｐ１８（配列番号２５）と３７℃で７２時間インキュベートしたＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞を示すグラフである；ＭＴＴ（Ａ）、直接細胞計数（Ｂ）。対照ウェル中の細胞生存率（ＭＴＴ）又は細胞数を１００％と見なした。データは平均値±ＳＥＭを表す。
【図１７】図１７は、ヒト乳癌細胞中へのｐ２８（配列番号２）の優先的移入を示すグラフである。（Ａ）ヒト乳癌細胞（ＭＣＦ−７、Ｔ４７Ｄ、及びＺＲ−７５−１）及び正常乳房細胞（ＭＣＦ−１０Ａ）へのｐ２８（配列番号２）の移入をフローサイトメトリーで調べた。値は正常乳房細胞からの蛍光に対する増加倍率を計算したものである。（Ｂ）ＭＣＦ−１０Ａ細胞（丸）と比べたＭＣＦ−７細胞（三角）中へのｐ２８（配列番号２）の移入のカイネティクスをフローサイトメトリー分析により求め、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を計算した。ｐ２８（配列番号２）濃度（μｍｏｌ／Ｌ）に対して速度（ＭＦＩ／秒）をプロットすることでＫｍ及びＶｍａｘを求めた。（Ｃ及びＤ）阻害剤の存在下及び非存在下におけるＭＣＦ−７細胞及びＭＣＦ−１０Ａ細胞中へのｐ２８（配列番号２）の移入のフローサイトメトリー分析。ＭＣＦ−７（Ｃ）及びＭＣＦ−１０Ａ（Ｄ）細胞を阻害剤で前処理し、２０μｍｏｌ／ＬのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５６８標識ｐ２８（配列番号２）と１時間インキュベートした。阻害剤非存在下（対照）のＭＦＩを１００％と見なした。バーは平均値±ＳＥＭを表す。
【図１８】図１８は、ｐ２８（配列番号２）によるヒト乳癌細胞の増殖阻害を示すグラフである。ＭＣＦ−７細胞を、ｐ２８（配列番号２）（０〜２００μＭ）と３７℃で２４、４８、及び７２時間インキュベートした。細胞計数（Ａ）及びＭＴＴアッセイ（Ｂ）。ドキソルビシン（１０μＭ）を陽性対照として用いた。対照の細胞数又は生存率を１００％と見なした。データは、対照の平均に対する％±ＳＥＭを表す。＊ｐ＜０．０５。（Ｃ）ｐ２８（配列番号２）によるＭＣＦ−７異種移植片の増殖阻害。一群当たり最低１０頭のマウスを、１０、１４、２１、及び２５日目に１５μｍｏｌ／ｋｇのＰａｃｌｉｔａｘｅｌ（ｉ．ｐ．）で処置するか、３０日間毎日５又は１０ｍｇ／ｋｇのｐ２８（配列番号２）（ｉ．ｐ．）で処置した。バーは平均値±ＳＥＭを表す。＊ｐ＜０．０５。
【図１９】図１９は、ｐ２８によるヒト乳癌細胞の増殖阻害を示すグラフである。（Ａ）ＭＣＦ−７細胞をｐ２８（配列番号２）（０〜２００μｍｏｌ／Ｌ）と３７℃にて２４、４８、及び７２時間インキュベートし、細胞数を計測した。（Ｂ）ＺＲ−７５−１細胞をｐ２８（配列番号２）で７２時間処置した（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）。ドキソルビシン（Ｄｏｘｏ）５〜１０μｍｏｌ／Ｌを内部標準として用いた。非処置（対照）ウェルにおける細胞数を１００％と見なした。データは対照の平均に対する％±ＳＥＭを表す。＊ｐ＜０．０５。
【図２０】（Ａ）２０μｍｏｌ／Ｌのｐ２８（配列番号２）又は１０μｍｏｌ／Ｌの陽イオン性（陽性対照）ペプチドであるオクタアルギニン（Ａｒｇ８、配列番号８２）で３７℃にて２時間処置し、カバースリップ上のフェノールレッドを含まないＭＥＭ中で一晩培養したＭＣＦ−７細胞及びＭＤＤ２細胞を示す写真を含む図である。赤色−Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ５６８標識ｐ２８（配列番号２）、青色−ＤＡＰＩ（核）。（Ｂ）及び（Ｃ）は、ｐ２８（配列番号２）で処置した同系乳癌細胞のＦＡＣＳ分析を示すグラフである。ＭＣＦ−７細胞（Ｂ）及びＭＤＤ２細胞（Ｃ）をｐ２８（配列番号２）（５０μｍｏｌ／Ｌ）で４８及び７２時間処置した。Ｙａｍａｄａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，１０１：４７７０−４７７５（２００４）に記載されているように、細胞をヨウ化プロピジウムで染色し、フローサイトメトリーにより分析した。Ｇ１、Ｓ、Ｇ２Ｍ、及びｓｕｂ−Ｇ１（アポトーシス）期の細胞の割合を示す。
【図２１】図２１Ａ及び２１Ｂは、細胞中のｐ５３レベルを示す写真である。（Ａ）ｐ２８（配列番号２）とインキュベートした後のＭＣＦ−７細胞中の経時的ｐ５３レベル。処置直前のｐ５３レベルに対する相対的変化（％）（０時間目を１００％とする）。（Ｂ）ＧＳＴ−ｐ２８とｐ５３の複合体形成を示すＧＳＴプルダウンアッセイである。左から順に、ＧＳＴ−ｐ２８（１０及び２０μｇ／反応液）、ＧＳＴ−ＭＤＭ２（２０μｇ／反応液）、及びＧＳＴのみ（２０μｇ／反応液）。抗ｐ５３抗体を用いたイムノブロット（ＩＢ）によりｐ５３を検出した。（Ｃ）過剰モル濃度のｐ２８断片ｐ１２（配列番号３９）、ｐ１８（配列番号２５）、及びｐ１８ｂ（配列番号３８）による、ＧＳＴ−ｐ５３へのｐ２８の結合に対する競合を示す写真である。結合の相対量（ｐ２８（配列番号２）のみを１００％とした）。Ｍ：ｐ２８マーカー。（Ｄ）は、ｐ２８（配列番号２）又はアズリンに曝した後のＭＣＦ−７核抽出物中におけるｐ５３ＤＮＡ結合活性アッセイを示すグラフである。Ｈ２Ｏ２処置したＭＣＦ−７細胞の核抽出物を内部標準とした。ｐ５３に対するモノクローナル抗体を用いてｐ５３−オリゴヌクレオチド複合体を定量した。データはｔｒｉｐｌｉｃａｔｅの平均値±ＳＥＭとして表されている。
【図２２】（Ａ）ｐ２８（配列番号２）に１６、２４、４８、及び７２時間曝したＭＣＦ−７細胞から抽出したＲＮＡを示す写真である。ｐ５３及び内部標準遺伝子としてのＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルをＲＴ−ＰＣＲ解析により決定した。右側のグラフに示すように、ｐ５３のバンドをＧＡＰＤＨに対して定量及び標準化した。（Ｂ）過剰モル濃度のｐ２８（配列番号２）存在下でＧＳＴ−ＭＤＤ２によりプルダウンされたｐ５３タンパク質レベルを示す写真である。タンパク質サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、抗ｐ５３抗体を用いたＩＢによってｐ５３を検出した。（Ｃ）プロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２の非存在下又は存在下で５０μｍｏｌ／Ｌのｐ２８（配列番号２）に２４、４８、及び７２時間曝したＭＣＦ−７細胞中におけるｐ５３のユビキチン化を示す写真である。ｐ５３−ユビキチンコンジュゲート（ｐ５３−Ｕｂｎ）の位置を示す。右のヒストグラムはｐ５３−Ｕｂｎの相対量を示す（各時点における非処置対照サンプルを１００％として表す）。（Ｄ）ｐ２８（配列番号２）の存在下でＧＳＴ−ｐ５３固定化ビーズと反応させた３つの異なる抗ｐ５３抗体、Ｐａｂ１８０１（３２〜７９ａａ）、ａｂ２４３３（２７７〜２９６ａａ）、及びＰａｂ１８０２（３０６〜３９３ａａ）を示す図である。抗ｐ２８抗体を用いたＩＢによりｐ２８（配列番号２）を検出した。
【図２３】図２３は、ｐ２８（配列番号２）によるサイクリン（ＣＤＫ及びＣＤＫＩ）カスケードの誘導を示す写真である。ＭＣＦ−７細胞（Ａ）及びＭＤＤ２細胞（Ｂ）をｐ２８（配列番号２）（５０μｍｏｌ／Ｌ）に２４、４８、及び７２時間曝し、タンパク質レベルをイムノブロットにより求めた。ＭＣＦ−７細胞中でのｐ２１（Ｃ）及びサイクリンＢ１（Ｄ）の細胞内局在及び相対レベル。細胞をｐ２８（配列番号２）（５０μｍｏｌ／Ｌ）とカバースリップ上で７２時間培養した。ｐ２１及びサイクリンＢを対応する特異的抗体で染色した。（Ｅ）抗ｐ−ｃｄｃ２抗体（カリフォルニア州のサンタクルーズ・バイオテクノロジー社製）を用いて、ＭＣＦ−７細胞中（左パネル）及びＭＤＤ２細胞中（右パネル）におけるリン酸化ｃｄｃ２のレベルを求めた。全ての結果はアクチンを内部標準として標準化されている（Ａ及びＥ）。
【図２４】図２４Ａ乃至２４Ｃは、ｐ２８（配列番号２）及びその修飾をグラフィックにより表した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
定義
本発明において、「細胞」という用語は、「単一細胞」として特別に記載されていない限り、単数形及び複数形の両方を包含する。
【００２２】
本発明において、「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指して同義で使用されている。これらの用語は、１又は複数のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工の化学的アナログであるアミノ酸ポリマーにも適用される。また、天然のアミノ酸ポリマーにも適用される。「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、限定されるものではないがグリコシル化、脂質付加、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ−カルボキシル化、ヒドロキシル化、ＡＤＰリボシル化等の修飾も含む。ポリペプチドは常に完全な直鎖とは限らないと理解される。例えば、ポリペプチドはユビキチン化によって分岐されていてもよく、典型的には天然のプロセシングイベント及び天然には起こらない人為的操作により生じるイベント等の翻訳後のイベントの結果、環状であってもよい（分岐はあってもなくてもよい）。環状、分岐、及び環状分岐鎖ポリペプチドは、翻訳でない天然のプロセス及び完全に合成的な方法によっても合成され得る。
【００２３】
本発明において、「薬理活性」という用語は、生体系への薬物又はその他の化学物質の効果を意味する。化学物質の効果は有益であることもあり（治療的）、有害であることもある（毒性）。純粋な化学物質又は混合物は、天然（植物、動物、又はミネラル）起源であってもよく、合成化合物であってもよい。
【００２４】
本発明において、「前悪性（ｐｒｅｍａｌｉｇｎａｎｔ）」という用語は、前癌性（ｐｒｅｃａｎｃｅｒｏｕｓ）、すなわち制御されていない異常な細胞分裂の前を意味する。
【００２５】
本発明において、「抗エストロゲン薬」という用語は、エストロゲンの活性をブロックするか細胞がエストロゲンを産生又は利用することを防止する物質を意味する。
【００２６】
本発明において、「ＥＲ」という用語はエストロゲン受容体を意味する。
【００２７】
本発明において、「病変」という用語は異常な組織領域を意味する。
【００２８】
本発明において、「病的状態（ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）」という用語は、身体機能のパフォーマンスを妨げるか変化させ、種々の因子（例えば栄養失調、工業災害、又は気候）、特定の感染体（例えば、虫、寄生原虫、細菌、又はウイルス）、その生物に固有の欠陥（例えば遺伝的異常）、又はこれらの因子の組合せに対する応答である、生きている動物又はその一部の正常状態の障害を構成する正常状態からの解剖学的及び生理学的逸脱を含む。
【００２９】
本発明において、「状態」という用語は、身体機能のパフォーマンスを妨げるか変化させる、生きている動物又はその一部の正常状態の障害を構成する正常状態からの解剖学的及び生理学的逸脱を含む。
【００３０】
本発明において、「罹患している（ｓｕｆｆｅｒｉｎｇ  ｆｒｏｍ）」という用語は、病的状態の症状を現在示していること、観察可能な症状を伴わずに病的状態を有していること、病的状態からの回復中であること、又は病的状態から回復したことを含む。
【００３１】
本発明において、「化学予防（ｃｈｅｍｏｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」という用語は、前悪性病変及び／又は癌の発生又は再発のリスク低減、防止、抑制、逆転、又は遅延のための、生物学的なものであっても化学的なものであってもよい薬物、ビタミン、又はその他の天然若しくは合成の薬剤の使用である。
【００３２】
本発明において、「第２の化学予防剤」という用語は、前悪性病変及び／又は癌の発生又は再発のリスク低減、防止、抑制、逆転、又は遅延のための、生物学的なものであっても化学的なものであってもよい、アズリンの切断型以外の薬物、ビタミン、又はその他の天然若しくは合成の薬剤を意味する。
【００３３】
本発明において、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、処置される状態に関連する状態又は症状の進行又は重症度を防止、低減、停止、又は逆転させることを含む。したがって、「処置」という用語は、必要に応じて医学的及び／又は予防的投与を含む。前悪性病変、癌等の状態の発生を防止又は軽減することも処置に含まれ得る。
【００３４】
本発明において、「細胞成長を阻害する」という用語は、細胞分裂及び／又は細胞増殖を鈍化又は停止させることを意味する。この用語には、細胞発達（ｃｅｌｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）の阻害又は細胞死の増加も含まれる。
【００３５】
「治療有効量」とは、処置される対象における特定の状態の発生の防止、低減、停止、若しくは逆転又はその既存の症状の部分的若しくは完全な軽減に有効な量である。当業者であれば治療有効量を決定することができる。
【００３６】
本発明において、「実質的に純粋な」という用語は、本発明のタンパク質又はその他の細胞産物を修飾して用いる場合、例えば、成長培地又は細胞内容物から他のタンパク質及び／又はその他の化合物が実質的に含まれない又は混ざっていない形態で単離されているタンパク質を意味する。「実質的に純粋な」という用語は、乾燥重量で単離画分の少なくとも約７５％の量の因子を指し、すなわち少なくとも「７５％実質的に純粋」であることを指す。より具体的には、「実質的に純粋な」という用語は、乾燥重量で単離された画分の少なくとも約８５％の化合物を指し、すなわち少なくとも「８５％実質的に純粋」であることを指す。最も具体的には、「実質的に純粋な」という用語は、乾燥重量で単離された画分の少なくとも約９５％の化合物を指し、すなわち少なくとも「９５％実質的に純粋」であることを指す。例えば合成反応の試薬及び副産物から合成タンパク質が単離される場合、「実質的に純粋な」という用語は、本発明の合成されたタンパク質又は化合物を修飾しても使用され得る。
【００３７】
本発明において、本発明のペプチド又は化合物に言及する場合の「医薬品グレード（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｇｒａｄｅ）」という用語は、自然の状態で見られる場合に材料に通常付随する成分（例えば合成試薬及び副産物）から実質的に又は本質的に単離されており、医薬品としての使用の障害となる成分から実質的又は本質的に単離されている、ペプチド又は化合物である。例えば、「医薬品グレード」のペプチドはあらゆる発癌物質から単離されているものであり得る。場合によっては、「医薬品グレード」という用語は、組成物を患者への静脈内投与に不適切にする如何なる物質からも実質的に又は本質的に単離されたペプチド又は化合物を指定するために、「静脈内医薬品グレード」のように、意図する投与方法によって修飾され得る。例えば、「静脈内医薬品グレード」のペプチドは、ＳＤＳ等の界面活性剤及びアジド等の抗菌剤から単離されているものであり得る。
【００３８】
「単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」、「精製された」、又は「生物学的に純粋な」という用語は、自然の状態で材料に通常不随する成分を実質的に又は本質的に含まない材料を指す。したがって、本発明に係る単離ペプチドは、好ましくは、それらのｉｎ  ｓｉｔｕ環境でペプチドに通常会合している材料を含まない。ポリペプチドの「単離された」領域とは、その領域が由来するポリペプチドの全配列を含まない領域を指す。「単離された」核酸、タンパク質、又はその各断片は、限定されるものではないが、ヌクレオチドシークエンシング、制限消化、部位特異的突然変異誘発、並びに核酸断片を得るため及びタンパク質又はタンパク質断片を実質的に純粋な量で得るための発現ベクターへのサブクローニング等の当業者による操作が可能なように、そのインビボ環境から実質的に取り出されているものである。
【００３９】
本発明において、ペプチドに関して、「バリアント」という用語は、野生型ポリペチドと比べて置換、欠失、又は挿入されたアミノ酸を有し得るアミノ酸配列バリアントを指す。バリアントは野生型ペプチドの切断型であってもよい。「欠失」とは、ポリペプチド内からの１又は複数のアミノ酸の除去であり、「切断」は、ポリペプチドの一方又は両方の末端からの１又は複数のアミノ酸の除去である。したがって、バリアントペプチドはポリペプチドをコードする遺伝子を操作することで作製され得る。バリアントは、ポリペプチドの基本的薬理活性の少なくとも一部を変化させずにポリペプチドの基本的な組成又は特徴を変化させることで作製され得る。例えば、アズリンの「バリアント」は、前悪性哺乳動物細胞の発生を阻害する能力を保持している変異されたアズリンであり得る。場合によっては、バリアントペプチドは、ε−（３，５−ジニトロベンゾイル）−Ｌｙｓ残基等の非天然アミノ酸で合成されている（Ｇｈａｄｉｒｉ  ＆  Ｆｅｒｎｈｏｌｚ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１１２：９６３３−９６３５（１９９０））。いくつかの実施形態では、バリアントは野生型ペプチド又はその一部と比べて２０個以下のアミノ酸が置換、欠失、又は挿入されている。いくつかの実施形態では、バリアントは野生型ペプチド又はその一部と比べて１５個以下のアミノ酸が置換、欠失、又は挿入されている。いくつかの実施形態では、バリアントは野生型ペプチド又はその一部と比べて１０個以下のアミノ酸が置換、欠失、又は挿入されている。いくつかの実施形態では、バリアントは野生型ペプチド又はその一部と比べて６個以下のアミノ酸が置換、欠失、又は挿入されている。いくつかの実施形態では、バリアントは野生型ペプチド又はその一部と比べて５個以下のアミノ酸が置換、欠失、又は挿入されている。いくつかの実施形態では、バリアントは野生型ペプチド又はその一部と比べて３個以下のアミノ酸が置換、欠失、又は挿入されている。
【００４０】
本発明において、「アミノ酸」という用語は、任意の天然、非天然、又は合成のアミノ酸残基を含むアミノ酸部分、すなわち、１、２、３、又はそれ以上の炭素原子（典型的には１個の（α）炭素原子）で直接連結された少なくとも１つのカルボキシル残基と少なくとも１つのアミノ残基とを含む任意の部分を意味する。
【００４１】
本発明において、ペプチドに関して、「誘導体（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）」という用語は、対象のペプチドに由来するペプチドを指す。誘導は、ペプチドの基本的活性の一部が保持されるようなペプチドの化学的修飾を含む。例えばアズリンの「誘導体」は、例えば、哺乳動物細胞中での脈管形成を阻害する能力を保持している化学的に修飾されたアズリンであり得る。関心のある化学的修飾としては、限定されるものではないが、ペプチドのアミド化、アセチル化、硫酸化、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾、リン酸化、又はグリコシル化が含まれる。更に、誘導体ペプチドは、ポリペプチド又はその断片と、限定されるものではないが、例えば別のペプチド、薬物分子、その他の治療薬剤、医薬品、検出可能なプローブ等の化合物との融合体であってもよい。
【００４２】
「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」という用語は、ポリペプチドと候補配列を整列させた時に候補配列中のアミノ酸残基と同一である、ポリペプチド中のアミノ酸残基の割合と定義される。％アミノ酸同一性を決定するには、配列を整列させ、必要に応じて％配列同一性を最大にするためにギャップを導入する。保存的置換は配列同一性の一部と見なさない。パーセント同一性を決定するためのアミノ酸配列アラインメント方法は当業者に周知である。多くの場合、ペプチド配列の整列にはＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ２、ＡＬＩＧＮ２、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ社製）ソフトウェア等の公的に利用可能なコンピュータソフトウェアが用いられる。具体的な実施形態では、Ｂｌａｓｔｐ（メリーランド州ベセスダの国立バイオテクノロジー情報センターから利用可能）を、ｌｏｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ  ｆｉｌｔｅｒ、ｅｘｐｅｃｔ  １０、ｗｏｒｄ  ｓｉｚｅ  ３、ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ  １１、及びｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  １のデフォルトのパラメータで用いる。
【００４３】
アミノ酸配列を整列させる場合、所与のアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する、所与のアミノ酸配列Ａの％アミノ酸配列同一性（所与のアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して、特定の％アミノ酸配列同一性を有する所与のアミノ酸配列Ａとも表現できる）は、
％アミノ酸配列同一性＝Ｘ／Ｙ＊１００
（式中、
Ｘは、配列整列用のプログラム又はアルゴリズムによるＡ及びＢの整列により同一マッチとしてスコアされるアミノ酸残基の数であり、
Ｙは、Ｂ中のアミノ酸残基の合計数である）として計算することができる。
【００４４】
アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ｂに対するＡの％アミノ酸配列同一性はＡに対するＢの％アミノ酸配列同一性と等しくならない。長い配列と短い配列を比較する場合、短い方の配列を「Ｂ」の配列とする。例えば、切断型ペプチドを対応する野生型ポリペプチドと比較する場合、切断型ペプチドを「Ｂ」の配列とする。
【００４５】
概略
本発明は、クプレドキシン並びにクプレドキシンのバリアント、誘導体、切断型、及び構造的等価物を含む組成物並びに哺乳動物の癌の発生を防止する方法を提供する。本発明は更に、化学予防のためのクプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、切断型、及び構造的等価物並びに他の化学予防剤を含む組成物を提供する。
【００４６】
本発明は更に、前悪性病変及び／又は癌に対する化学予防効果を有するクプレドキシン又はクプレドキシンのバリアント、誘導体、切断型、若しくは構造的等価物であり得る化合物及び／又はペプチドの投与又はその他の使用を含む方法を提供する。
【００４７】
本発明は更に、哺乳動物の癌の発生又は癌の再発を防止する能力を保持しているクプレドキシンのバリアント、誘導体、切断型、及び構造的等価物を提供する。本発明は更に、緑膿菌アズリン、アズリンのバリアント、誘導体、切断型、及び構造的等価物を含む組成物並びに患者、特に一般集団よりも癌発生リスクが高い患者を処置するためのその使用を提供する。
【００４８】
最後に、本発明は、前悪性病変を誘発する前又は後に細胞をクプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、切断型、若しくは構造的等価物と接触させ、前悪性及び／又は悪性の細胞の発生を観察することによる哺乳動物の細胞、組織、及び動物体における癌の発生を研究する方法を提供する。
【００４９】
これらの実施形態のそれぞれについて、本発明は、クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、切断型、及び構造的等価物と別の化学予防剤の組合せ又は共投与を提供する。
【００５０】
細胞への優先的移入
緑膿菌により産生される酸化還元タンパク質であるクプレドキシンのアズリンは、正常な細胞には移入しないがＪ７７４肺癌細胞に選択的に移入してアポトーシスを誘導する（Ｚａｂｏｒｉｎａ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４６：２５２１−２５３０（２０００））。アズリンは更に、ヒトメラノーマＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞又はヒト乳癌ＭＣＦ−７細胞に選択的に移入してこれを死滅させることができる（Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９９：１４０９８−１４１０３（２００２）；Ｐｕｎｊ  ｅｔ  ａｌ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２３：２３６７−２３７８（２００４））。したがって、アズリンは癌細胞を標的とするが、正常細胞に移入する能力がないため、正常細胞を標的としない（Ｆｉａｌｈｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｒｅｃｅｎｔ  Ｐａｔｅｎｔｓ  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．２：２２４−２３４（２００７））。
【００５１】
緑膿菌のアズリンは、Ｊ７７４マウス細網細胞肉腫細胞に優先的に移入し、腫瘍抑制因子タンパク質ｐ５３と複合体を形成してこれを安定化し、ｐ５３の細胞内濃度を上昇させ、アポトーシスを誘導する（Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ７０：７０５４−７０６２（２００２））。アズリン分子の種々のドメインの詳細な研究により、アミノ酸５０〜７７（ｐ２８、配列番号２）が内部移行及びその後のアポトーシス活性に必須のタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）を有することが示された（Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．７：１４１８−１４３１（２００５）。
【００５２】
アズリン及びｐ２８（配列番号２）の移入は、エンドサイトーシス成分の細胞透過を補助する陽イオン性細胞透過ペプチド（「ＣＰＰ」）の温度依存的移入を反映している（Ｙａｍａｄａ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７：１４１８−１４３１（２００５））。正常細胞中及び悪性細胞中へのアズリンの５０〜６７（ｐ１８、配列番号２５）の移入はｐ２８（配列番号２）よりも速いようである。ｐ１８（配列番号２５）の方がＫｍが低く、Ｖｍａｘが高いことから、ａａ５０〜６７はリン脂質膜と会合した時にアズリンの実際のＰＴＤにより近い両親媒性構造を形成することが示唆される。しかし、エネルギー依存的エンドサイトーシスプロセス又はポアに関連するプロセスがこれらのペプチドが利用可能な唯一の移入メカニズムではない。例えば、陽イオン性ペプチドの移入を阻害する代謝及び膜電位の阻害剤であるアジ化ナトリウム及びウアバイン（Ｎａ＋Ｋ＋ＡＴＰａｓｅ阻害剤）は、ＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞中又は線維芽細胞中へのｐ１８（配列番号２５）又はｐ２８（配列番号２）の移入を阻害しなかった（図１５Ｂ、Ｃ）。このことは、ペプチドがどちらも直接細胞膜を透過し得ることを示している。
【００５３】
ｐ１８（配列番号２５）、ｐ２８（配列番号２）、及びアズリンは、形質膜を透過して、カベオラに結合した後期エンドソーム、リソソーム、及びゴルジに達し、これはダイナミン非依存性のクラスリン依存性キャリアにより仲介される様式として説明されている（Ｋｉｒｋｈａｍ，Ｍ．ａｎｄ  Ｐａｒｔｏｎ，Ｒ．Ｇ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １７４６：３４９−３６３（２００５））。ノコダゾールによる顕著な透過阻害と、アクチンフィラメントを破壊するサイトカラシンＤによる阻害の相対的欠如は、カベオラにより仲介される移入を裏付けている。この移入経路は、不可欠な細胞表面成分及び一見したところ類似性のない分子、すなわちデキストラン、並びに古典的エンドサイトーシス経路を回避するためにカベオラを利用する様々な病原体又はその生産物によるものが報告されている。β−メチルシクロデキストラン、フィリピン、又はナイスタチンを用いて形質膜からコレステロールを除去することで、膜成分を隔てる液体プラットフォームを提供し且つ膜を区分する形質膜ドメインである脂質ラフトを破壊すると、ｐ１８（配列番号２５）及びｐ２８（配列番号２）のＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞中（それぞれ５０％及び約６０％）及び線維芽細胞中（それぞれ３５％及び４２％）への透過が有意に阻害され、このことはかなりの割合（約６０％）のｐ１８（配列番号２５）及びｐ２８（配列番号２）がカベオラを介して形質膜を透過することを示している。カベオラは、シグナル伝達の制御因子として機能するカベオリンに特有のタンパク質（カベオリン−１、−２、又は−３）の存在により規定される形質膜の５０〜１００ｎｍのオメガ型をした脂質ラフト陥入部のサブセットである。
【００５４】
ブレフェルジンＡはゴルジ装置を破壊し、ｐ１８（配列番号２５）の蓄積を阻害した。したがって、この経路もｐ１８（配列番号２５）及びｐ２８（配列番号２）の移入及び細胞内輸送に利用されている。カベオラを介したｐ１８（配列番号２５）及びｐ２８（配列番号２）の細胞透過は、Ｎ−グリコシル化阻害剤がＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞中への細胞移入を約６０％低下させ、線維芽細胞中への細胞移入をそれぞれ２５％及び３５％低下させるという証拠と一致している。ｐ１８（配列番号２５）及びｐ２８（配列番号２）の移入のパーセンタイルの差は、癌細胞と正常細胞におけるＮ−グリコシル化膜構造の数及びこのメカニズムを介したｐ２８（配列番号２）及びｐ１８（配列番号２５）の相対的移入経路に関連している（図１５Ｂ、Ｃ）。
【００５５】
アズリン、ｐ２８（配列番号２）、及びｐ１８（配列番号２５）は全て、多くの他の潜在的抗癌ペプチドよりも高い親和性及び高い容量で癌細胞に結合する。結合後、このタンパク質／受容体複合体はカベオラ中に局在し、内部移行し、最終的に（カベオソームを介して）ゴルジ、ＥＲ、及び核に移行すると考えられている。カベオラにより仲介される移入に加えて、カイネティクス解析により、ｐ２８（配列番号２）及びｐ１８（配列番号２５）が非クラスリン・カベオラ仲介プロセスにより形質膜を透過することも示されている。例えばインターロイキン２受容体のため及び特定のグリコシル−ホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカータンパク質のための構成的内部移行メカニズムとして、クラスリン及びカベオリン非依存性経路が存在し得る（Ｌａｍａｚｅ，Ｃ，ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ７：６６１−６７１（２００１）；Ｓａｂｈａｒａｎｊａｋ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ，Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ，２：４１１−４２３（２００２））。
【００５６】
癌細胞で正常細胞よりもカベオリン−１の発現が増加していることが癌細胞中にアズリン、ｐ２８（配列番号２）、及びｐ１８（配列番号２５）が優先的に移入するための唯一の理由ではないと思われる。線維芽細胞及び複数のその他の正常細胞もその表面にかなりの数のカベオラを有する。実施例６〜１２に反映されている発見は、アズリンのａａ５０〜６７（配列番号２５）及び５０〜７７（配列番号２）の細胞内透過が現在の全てのＣＣＰと比べて癌細胞選択性に関してユニークであり且つｐ２８（配列番号２）のＣ末端１０〜１２アミノ酸が細胞周期阻害及びアポトーシス活性に関与するドメインを含むことを示している。
【００５７】
化学予防
アズリン及びアズリンに由来するペプチド、例えばｐ２８（配列番号２）は、化学予防特性を有する。アズリン及びｐ２８（配列番号２）は、マウス乳腺臓器培養における前悪性・前新生物病変の形成を防止する。マウス乳腺臓器培養モデルでは、５０μｇ／ｍｌのアズリンが胞巣状病変の形成を６７％阻害することが見出された。同様に、２５μｇ／ｍｌのｐ２８（配列番号２）も胞巣状病変の形成を６７％阻害することが見出されたた（実施例１参照）。更に、５０μｇ／ｍｌのアズリンは管病変の形成を７９％阻害し、２５μｇ／ｍｌのｐ２８（配列番号２）は管病変の形成を７１％阻害することが見出された（実施例１参照）。アズリン及びｐ２８（配列番号２）が正常マウス乳房上皮細胞（ＭＭ３ＭＧ）及び乳癌細胞（４Ｔ１）に移入することが共焦点顕微鏡及びＦＡＣＳにより示された。ｐ２８（配列番号２）は、温度、時間、及び濃度依存的にヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）にも移入し、マトリゲル（登録商標）上にプレーティングされたＨＵＶＥＣの毛細管形成を用量依存的に阻害した。
【００５８】
クプレドキシンのバリアント、誘導体、及び構造的等価物、特にアズリン及びｐ２８（配列番号２）の、前悪性・前新生物病変の形成防止における有効性に関する更なる裏付けが実施例２〜４に見出される。アズリン及びｐ２８（配列番号２）はどちらも、ＭＭＯＣにおいて、乳房胞巣状病変及び卵巣ホルモン依存的な乳管病変の発生を阻害した。ｐ２８（配列番号２）はＭＡＬ及びＭＤＬの発生及び多数度（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ）を用量依存的に阻害した。この阻害は、これらの腺中でＫｉ６７の発現が減少していたことから明らかなように、抗増殖効果によるものであった。エストロゲン及びプロゲステロンで処置された腺はＥＲ及びＰＲを発現したが、アルドステロン及びヒドロコルチゾンとインキュベートした腺は、免疫組織化学により分析した時、ステロイド受容体に関して染色されなかった。ｐ２８（配列番号２）及びアズリンが、ホルモン非依存的なＭＡＬ及びエストロゲン・プロゲステロン依存的なＭＤＬの両方の発生を阻害したことから、アズリン及びｐ２８（配列番号２）の作用は、エストロゲン及びプロゲステロンの受容体に完全に依存するのでなく、ホルモン非依存性病変及びホルモン依存性病変の両方に有効であり得ると結論づけることができる。
【００５９】
クプレドキシン由来ペプチドとｐ５３の相互作用
前新生物病変の阻害におけるアズリン及びｐ２８（配列番号２）の最も可能性の高いメカニズムを後述する実施例に開示する。剛体タンパク質のドッキング及びクラスター解析の計算手法を用いて、ｐ５３とアズリンの結合が広範に調べられ、コンピュータによる突然変異誘発アプローチを用いて構造的結果が検証された（Ａｐｉｖｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．３３２：９６５−９６８（２００５）参照）。その後の報告で、腫瘍細胞の成長を抑制するアズリンの作用メカニズムが、本明細書中で議論されているようにｐ５３との物理的相互作用により仲介されることが強く示唆されている。乳癌におけるｐ５３の発現状態は、乳癌の約５０〜６０％が野生型ｐ５３を含むことを示唆している（Ｊｕｎｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｅｏｐｌａｓｉａ．１０：４５０−４６１（２００８）；Ｇａｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４（２）：７０−７６（２００２））。ｐ５３の不活性化がヒトの癌において頻繁に起こる重要なイベントの１つであることも複数の研究者によって報告されている（Ｋａｓｔａｎ，Ｃｅｌｌ．１２８：８３７−８４０（２００７））。
【００６０】
エストロゲン受容体（ＥＲ）陽性の乳癌細胞ではｐ５３の不活性化又はその作用の抑制が観察される。ＭＣＦ７細胞では、ＥＲαが直接ｐ５３に結合してその機能を不活性化する（Ｓｅｎｇｕｐｔａ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．１０２４：５４−７１（２００４）；Ｋｏｎｄｕｒｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００７；６７：７７４６−７７５５（２００７））。これらの研究は、ＥＲαにより仲介される細胞増殖及びｐ５３仲介アポトーシスの抑制のメカニズムの明確な可能性に取り組んでいる。このＥＲαとｐ５３の相互作用はＣｈＩＰアッセイにより証明されている。放射線は、安定なｐ５３の回復に有効であることが示されており、これらの細胞中に残存する発現を抑制する。放射線がその効果を仲介するメカニズムは十分に理解されていないが、放射線治療によってＥＲα−ｐ５３会合が破壊されることの直接的効果であり得るという仮説が立てられている（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１：９８３７−９３４０（２００６））。
【００６１】
現時点で、ｐ２８（配列番号２）は、乳房（ｍａｍｍａｒｙ）細胞中の核ｐ５３の蓄積を増加させるだけでなく、ｐ５３ｍＲＮＡの発現を誘導することも分かっている。本明細書中の実施例２〜４に開示されている結果は、エストロゲンによるｐ５３への干渉が哺乳動物細胞中でのｐ５３の発現を低下させ得ることを示している。しかし、ｐ２８（配列番号２）処置後の、エストラジオール存在下でのＤＭＢＡ誘発管病変の阻害及びｐ５３の核蓄積の増加は、ｐ２８（配列番号２）によるｐ５３の安定化がこれらの腺におけるＭＤＬ形成の抑制に関与し得ることを示している。
【００６２】
現時点で、ｐ２８（配列番号２）がｐ５３の発現を増加させること、したがって前悪性・前新生物病変の形成に対する阻害効果を有することも分かっている（例えば実施例１３〜１９参照）。実施例４に記載されている結果は、エストロゲンが存在するとｐ２８（配列番号２）により仲介されるｐ５３ｍＲＮＡの誘導が妨げられるが、おそらくＥＲとｐ２８ではｐ５３タンパク質上の結合部位が異なるために、ｐ５３／ｐ２８（配列番号２）相互作用は影響を受けないことを示している。もう１つの興味深い観察結果は、ｐ５３ｍＲＮＡ発現に対するアズリンとｐ２８（配列番号２）の作用の違いであった。
【００６３】
したがって、現時点で、クプレドキシン並びにクプレドキシンのバリアント、誘導体、切断型、及び構造的等価物、特にアズリン並びにアズリンのバリアント、誘導体、切断型、及び構造的等価物、例えばｐ２８（配列番号２）が、前悪性・前新生物病変の形成、したがって哺乳動物患者における癌、特に乳癌の発生の阻害、抑制、遅延、防止、及び／又は逆転に使用され得ることが分かっている。
【００６４】
実施例３及び４により示されるように、ｐ２８（配列番号２）又はアズリンは、タモキシフェンと組み合わされて、前悪性・前新生物病変の形成に対して、したがって、癌の発生に対して、予期されなかった向上された阻害効果を有する。タモキシフェンはＥＲ陽性の乳癌患者の処置における使用に成功している。タモキシフェンは乳癌予防試験における使用も承認されている。タモキシフェンは乳管病変（ＭＤＬ）の発生を阻害する。タモキシフェンの作用がエストロゲン受容体経路により仲介されることも証明されている。タモキシフェンがアズリン等のクプレドキシン及び／又はクプレドキシンのバリアント、誘導体、若しくは構造的等価物との組合せで前悪性・前新生物病変の形成に対して相乗的効果を有することは予想されていなかった。
【００６５】
ＥＲ−ｐ５３複合体はｐ５３の発現を妨げる。タモキシフェン処置はＥＲのｐ５３への結合を妨げる。そのため、タモキシフェン存在下で腺をｐ２８（配列番号２）とインキュベートするとこれらの腺におけるｐ５３の発現が促進されるか増加する。実施例４及び図７Ａに示されるように、腺をタモキシフェン及びｐ２８（配列番号２）とインキュベートすると、予期されなかったことに、ｐ２８（配列番号２）のみで処置した腺と比べてｐ５３ｍＲＮＡの発現が１２０倍増加した。
【００６６】
クプレドキシン類は構造類似性が高いため、アズリン及びｐ２８（配列番号２）だけでなく、他のクプレドキシン及び／又はクプレドキシンのバリアント、誘導体、切断型、若しくは構造的等価物も、哺乳動物の前悪性病変形成を阻害し、タモキシフェンと組み合わせて、前悪性病変及び癌の形成に対して相乗効果を発揮すると考えられる。そのようなクプレドキシンは、例えば細菌又は植物に見つけることができる。複数のクプレドキシンが緑膿菌のアズリンと同様な薬理活性を有することが知られている。例えば、鉄酸化細菌のラスチシアニンもマクロファージに移入してアポトーシスを誘導することができる（Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  ３：１１８２−１１８７（２００４）；Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ．Ｍｉｃｒｏ．７：１４１８−１４３１（２００５）。フォルミジウム・ラミノスムのプラストシアニン及びアクロモバクター・サイクロクラステスのシュードアズリンもマクロファージに対して細胞毒性である（２００６年２月２３日に公開された米国特許公開第２００６００４０２６９号）。したがって、他のクプレドキシンも本発明の組成物及び方法に使用され得ると考えられる。更に、哺乳動物の癌形成を阻害する能力を保持しているクプレドキシンのバリアント、誘導体、切断型、及び構造的等価物も本発明の組成物及び方法に使用され得る。これらのバリアント及び誘導体としては、限定されるものではないが、クプレドキシンの切断型、アミノ酸の保存的置換体、並びにタンパク質修飾、例えばＰＥＧ化及びαヘリックスの全炭化水素安定化（ａｌｌ−ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  ｓｔａｂｌｉｎｇ）等が含まれ得る。
【００６７】
ｐ５３を介する癌阻害
アズリンのアミノ酸５０〜７７（ｐ２８、配列番号２）とｐ５３の相互作用を研究し、後述する実施例１３〜１９に記載した。本明細書に開示しているように、ｐ２８（配列番号２）は、優先的透過を示し、ヒト乳癌細胞に対して抗増殖効果を発揮する。これは、ストレスに応答して機能的に活性になり細胞周期の停止又はアポトーシスによる細胞死を引き起こす腫瘍抑制因子タンパク質であるｐ５３に仲介される。一連のＧＳＴプルダウンアッセイ、グリセロール勾配遠心、微小熱量測定実験、単一分子力分光法、及びコンピュータモデリングを用いた実験は、アズリンがｐ５３のＮ末端又はＤＮＡ結合ドメインのいずれかの内部に結合してその細胞内レベルを上昇させることを示している。
【００６８】
ｐ５３へのアズリン結合ドメインがアズリンのＭｅｔ４４及びＭｅｔ６４により示される疎水性パッチを含むという示唆が、疎水性パッチを破壊した変異体（変異アズリンＭ４４ＫＭ６４Ｅ）がｗｔアズリンよりもヒトメラノーマ（Ｍｅｌ−２）細胞への細胞毒性が低いことから裏付けられた。このことは、アズリン分子のｐ５３結合ドメインが疎水性パッチ周辺であることを示している。最近のドッキングシミュレーション研究により、変異体複合体では野生型アズリンと比べて約７５ｋＪ／ｍｏｌの相互作用自由エネルギーの顕著な消失が示されており、このことも、Ｍｅｔ４４及びＭｅｔ６４残基周辺のアズリンの疎水性パッチがｐ５３との相互作用に重要であることを示している。Ｍｅｔ６４がｐ２８（配列番号２）のｐ５３結合部位内に存在すること（ｐ２８のａａ１５）、競合アッセイ、変異体実験、及びドッキング実験は、これがｐ５３に結合するアズリンのドメインであることを明確に示している。興味深いことに、これは細胞中へのアズリン移入のＰＴＤとして同定されている領域でもある。
【００６９】
ｐ２８（配列番号２）に応答したｐ５３の増加は翻訳後に起こり、本質的にｐ５３のプロテアソーム分解の減少によるものである。ｐ５３の安定性は主にユビキチン−プロテアソーム経路を介して調節されているため、ｐ５３のユビキチン化をブロックする分子の同定は癌処置の有望な治療戦略である。ｐ５３：ＭＤＭ２相互作用を妨げるシスイミダゾール類似体ＮｕｔｌｉｎやＭＤＭ２のＥ３ユビキチンリガーゼ活性を阻害するＨＬＩ９８等の小分子が癌治療薬としての潜在能に関してスクリーニングされてきた。ｐ５３に対する公知のユビキチンリガーゼのうち、ＭＤＭ２、ＣＯＰ１、Ｐｉｒｈ２、ＡＲＦ−ＢＰ１、並びにおそらくＰａｒｃ及びＴＯＰＯＲＳは、乳癌細胞中で発現され、そこでｐ５３と直接相互作用してユビキチン化及び分解を促進する。興味深いことに、ＣＯＰ１の有意な過剰発現が乳癌（３２のうち２５）及び卵巣癌（１７１のうち７６）で見られ、ＡＲＦ−ＢＰ１も、ＭＣＦ−７、Ｔ４７Ｄ等の乳癌細胞株の８０％（２０のうち１６）で高度に発現されており、一方、正常乳房ＭＣＦ−１０Ａでの発現レベルは非常に低い。ｐ５３上のＴＯＰＯＲＳ及びＡＲＦ−ＢＰ１の結合領域は決定されていないが、ＣＯＰ１はｐ５３の中央からＣ末端にかけてのドメイン内で会合することが示唆されている。Ｐｉｒｈ２は、ｐ５３ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）中のアミノ酸８２〜２９２の間の領域内で相互作用することが報告されている。Ｐａｒｃ、Ｐａｒｋｉｎ様ユビキチンリガーゼは、ｐ５３のＣ末端領域（ａａ２９０〜３９３）内で結合するようである。
【００７０】
ｐ２８（配列番号２）は、ｐ５３のＮ末端ＭＤＭ２結合領域（図２２Ｂ）又はＣ末端領域（図２２Ｄ）に結合しないので、ｐ２８（配列番号２）はｐ５３へのＭＤＭ２又はＰａｒｃの結合を阻害しないことになる。総合すると、本明細書に開示されているデータは、ｐ２８（配列番号２）がｐ５３ＤＢＤのａａ８０〜２７６内で結合し、ｐ５３とユビキチンリガーゼＰｉｒｈ２、ＣＯＰ１、並びにおそらくＴＯＰＯＲＳ及びＡＲＦ−ＢＰ１との相互作用を妨げることで、ｐ５３のユビキチン化及び分解を減少させることを示している。この示唆は、アズリンがｐ５３ＤＢＤの可動性Ｌ１（ａａ１１３〜１１５）及びｓ７−ｓ８（ａａ２２１及び２２４〜２２９）ループに結合してタンパク質−タンパク質の密なパッキングを介してそれらを安定化することを示唆するコンピュータモデリングデータとよく一致する（Ｄｅ  Ｇｒａｎｄｉｓ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ  ２００７；２０：２１５−２６）。Ｌ１及びｓ７−ｓ８ループは、互いに又はβシートコアに対してパッキングが非常に緩いのでｐ５３ＤＢＤ中の最も不安定な領域であるため、非常に可動性が高くなる。このコンホメーションの柔軟性は、巨大分子の認識特異性の決定に重要な役割を果たし、タンパク質−タンパク質相互作用の高効率且つ迅速な代謝回転を可能にする（Ｄｅ  Ｇｒａｎｄｉｓ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ  ２００７；２０：２１５−２６）。Ｌ１及びｓ７−ｓ８領域は、ｐ２８（配列番号２）を含まないアズリン中のβ１−β２及びβ７−β８シートとも会合するが、ａａＭｅｔ６４、Ｌｅｕ６８、及びＴｙｒ７２はｐ５３ＤＢＤ−アズリン結合領域内に含まれ、アズリンのａａ６０〜７７（ｐ１８ｂ、配列番号３８）内にある（Ｄｅ  Ｇｒａｎｄｉｓ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ  ２００７；２０：２１５−２６）。
【００７１】
腫瘍抑制因子タンパク質ｐ５３は、細胞周期進行の阻害物質である２１ｋＤａのタンパク質ｐ２１／Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１を含む多くの遺伝子の転写制御因子として作用する主に核に存在するタンパク質である。ＭＣＦ−７細胞をｐ２８（配列番号２）で処置すると、ｐ５３のレベルが上昇し、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）活性（特にそれぞれＧ１及びＧ２／Ｍの細胞周期進行を制御するｃｄｃ２及びＣＤＫ２）の強力な阻害剤であるｐ２１の細胞内レベルが上昇する。Ｇ２／Ｍ期の進行では、ｃｄｃ２キナーゼ及びＣＤＫ２キナーゼが主にサイクリンＢ及びサイクリンＡと会合して活性化される。ＣＤＫ阻害剤ｐ２１はＧ２／Ｍ停止細胞中でサイクリンＡと効率的に会合するが、同じ条件下でサイクリンＢ１はｐ２１と会合せず、サイクリンＢ１のレベルは連続的に上昇する。これは、ＭＣＦ−７細胞においてｐ２８（配列番号２）により誘導されるＧ２／Ｍでの停止がＣＤＫ２及びサイクリンＡの阻害に関連していることを示している（図２３Ａ）。
【００７２】
ＭＣＦ−７細胞においてｐ２８（配列番号２）により誘導されるｐ２１の増加は、Ｃｉｐ／Ｋｉｐ  ＣＤＫＩファミリーの別の一員であるｐ２７の時間依存的な増加も伴う。Ｈｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００８は最近、ルシフェラーゼアッセイによる測定で、ｐ５３の誘導がｐ２１及びｐ２７の両方のプロモーター活性を上昇させることを実証した（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＣＭＬＳ），２００８）。更に、ｐ２１及びｐ２７のプロモーターのｐ５３ＤＮＡ結合活性はｐ５３誘導因子プロゲステロンにより活性化され、このことは、ｐ２１だけでなくｐ２７もｐ５３により転写制御されることを意味する。総合すると、データは、ｐ２８（配列番号２）によるｐ５３レベルの増加が、その後、ｐ２１及びｐ２７をアップレギュレートし、それによって、ＭＣＦ−７細胞において細胞内のＣＤＫ２レベル及びサイクリンＡレベルの顕著な低下及びＧ２／Ｍでの細胞周期停止が誘導されることを示している（図２０Ａ）。サイクリンＢ１とｐ２１の間では会合がない又は非効率的であるという報告から、ｐ２８（配列番号２）暴露後のサイクリンＢ１活性の上昇が、ｐ２８（配列番号２）により誘導されるｐ２１の増加にならった同様なパターンを反映している可能性が示唆される。ｐ２８（配列番号２）暴露後にサイクリンＢ１の細胞内レベル上昇に伴いリン酸化ｃｄｃ２（不活性型）が増加することから、ｃｄｃ２−サイクリンＢ複合体の増加がｃｄｃ２リン酸化の増加を反映していることが示唆される。
【００７３】
公知の微小管破壊剤であり且つｐ２１の転写翻訳活性化因子であるノコダゾールでも、ＭＣＦ−７及びＭＤＡ−ＭＢ−４６８ヒト乳癌細胞において高レベルの細胞質サイクリンＢ１を伴う同様なＧ２での停止が誘導される。オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）、酪酸ナトリウム（ＳＢ）等の分化誘導物質は、口腔扁平上皮癌細胞において阻害及びＧ１停止を生じ、この現象はＧ１期の細胞周期調節タンパク質であるＣＤＫ６、ｐ２１及びｐ２７の誘導並びにＧ２期の細胞周期調節タンパク質であるＣＤＫ２の阻害に関連する。ｐ２８（配列番号２）はＭＤＤ２細胞でｐ２１を増加させず、これらの細胞にはｐ２７が存在しないようであるため、ＣＤＫ２及びサイクリンＡのレベルは有意に変化せず（図２３Ｂ）、細胞周期の阻害も起こらなかった。ヒト細胞におけるｃｄｃ２活性の主要な制御因子であるＣＤＫ２とサイクリンＡの複合体の減少がｐ２８（配列番号２）で誘導されることでＧ１及びＧ２／Ｍでの停止が引き起こされていることの更なる証拠は、ＣＤＫ２−サイクリンＡ複合体を不活性化してＧ２／Ｍで細胞周期を停止させるサイクリンＡのＲＮＡｉをＨｅＬａ細胞に導入した後に起こるＧ２の遅れに見られる。
【００７４】
ｐ２１、ｐ２７等のＣｉｐ／Ｋｉｐファミリータンパク質はサイクリンＡ依存性ＣＤＫ２の強力な阻害剤であるが、これらはサイクリンＤ依存性キナーゼの正の制御因子としても作用する。Ｃｉｐ／Ｋｉｐファミリータンパク質はＣＤＫ４及びＣＤＫ６を安定化することができる。ＣＤＫ４は、乳房、神経膠腫、肉腫、子宮頸癌等の幅広い腫瘍で増幅及び過剰発現され、一方、ＣＤＫ６遺伝子は、扁平上皮細胞癌、神経膠腫、リンパ腫瘍等の特定の種類の悪性腫瘍で増幅される。ＣＤＫ６の初期レベル又は制御レベルはＣＤＫ４よりも低いが、ｐ２８（配列番号２）に曝したＭＣＦ−７細胞ではＣＤＫ４レベルは連続的に上昇しないがＣＤＫ６レベルは連続的に上昇する。ここでも、ｐ２８（配列番号２）に応答したｐ５３及びｐ２１の増加がなかったＭＤＤ２細胞中ではＣＤＫ４及びＣＤＫ６は何ら変化しなかった（図２３Ｂ）。Ｉｎｋ４グループであるＣＤＫＩのｐ１６Ｉｎｋ４ａ、ｐ１５Ｉｎｋ４ｂ、ｐ１８Ｉｎｋ４ｃ、及びｐ１９Ｉｎｋ４ｄは、Ｇ１での細胞周期進行を制御するＣＤＫ４及びＣＤＫ６に特異的に会合してこれを阻害する。ＭＣＦ−７細胞ではｐ１６Ｉｎｋ４ａ遺伝子がホモで欠失しているので、Ｉｎｋ４  ＣＤＫＩタンパク質はＣＤＫ４よりもＣＤＫ６に対して阻害効果が少ないと考えられ、これは、実質的に安定なＣＤＫ４レベル存在下においてＣＤＫ６で観察されるＣＤＫ６の増加の理論的根拠となる。
【００７５】
総合すると、これらの結果はｐ２８（配列番号２）がｐ５３の疎水性ＤＮＡ結合ドメイン（ａａ８０〜２７６）内で結合し、このタンパク質を安定化し、プロテアソーム分解を減らすことでｐ５３レベルを増加させることを示している。ｐ２８（配列番号２）はその後、ｐ２１及びｐ２７をアップレギュレートしてＣＤＫ２−サイクリンＡ複合体を不活性化することで、インビトロでＭＣＦ−７乳癌細胞におけるＧ２／Ｍ細胞周期停止及び胸腺欠損マウスにおけるＭＣＦ−７異種移植片の成長阻害を引き起こす。ヒト固形腫瘍細胞の優先的透過並びにＭＤＭ２非依存性及びＰａｒｃ非依存性の経路を介したｐ５３分解の防止は、ｐ２８（配列番号２）及び同様なペプチドが、癌の処置における細胞分裂阻害薬剤及び細胞毒性（アポトーシス）薬剤の新規な源（ｓｏｕｒｃｅ）を提供することを示している。
【００７６】
本発明の組成物
本発明は、ｐ５３に結合してこれを安定化し且つ／又はｐ５３のユビキチン化を防止することができる化合物を提供する。本発明は更に、クプレドキシン及び／又はクプレドキシンのバリアント、誘導体、切断型、若しくは構造的等価物等の化学予防剤を、単独で又は少なくとも１つの他の化学予防剤と組み合せて供する。いくつかの実施形態では、第１の化学予防剤はクプレドキシン又はその切断型である。いくつかのそのような実施形態では、第１の化学予防剤は、配列番号２及び配列番号２５からなる群から選択されるアミノ酸配列の１又は複数を含むアズリンの切断型である。少なくとも１つの他の化学予防剤は、抗エストロゲン薬、例えばエストロゲン又はプロゲステロンの活性をブロックするもの、例えばタモキシフェン又はフェンレチニド、あるいはエストロゲン又はプロゲステロンの産生を妨げるもの、例えばエキセメスタン、アナストロゾール、及びレトロゾールのようなアロマターゼ阻害剤、又は同様な特性を有するその他の化合物であり得る。
【００７７】
本発明は更に、クプレドキシンのバリアント、誘導体、切断型、又は構造的等価物である化学予防剤を提供する。いくつかの実施形態では、化学予防剤は単離されている。いくつかの実施形態では、化学予防剤は実質的に純粋であるか医薬品グレードである。別の実施形態では、化学予防剤は、化学予防剤を含む又は本質的にからなる組成物中に含まれる。別の実施形態では、化学予防剤は、化学予防剤及び少なくとも１つの他の化学予防剤の両方を含む組成物中に含まれる。別の具体的な実施形態では、化学予防剤は、非抗原性であり、哺乳動物、より具体的にはヒトの免疫応答を惹起しない。いくつかの実施形態では、化学予防剤は全長クプレドキシンより短く、クプレドキシンの薬理活性の一部を保持している。具体的には、いくつかの実施形態では、化学予防剤は、マウス乳腺臓器培養中の前悪性病変の発生を阻害する能力を保持し得る。
【００７８】
本発明は更に、単独又は少なくとも１つの他の化学予防剤と組み合わされた、クプレドキシン又はクプレドキシンのバリアント、誘導体、切断型、若しくは構造的等価物である少なくとも１つの化学予防剤を含む、特に医薬組成物の形態の組成物を提供する。特定の実施形態では、医薬組成物は、特定の投与形態用に設計され、投与形態としては、例えば経口、腹腔内、又は静脈内が挙げられるが、これらに限定されるものではない。そのような組成物は、水和していてもよく、（例えば凍結乾燥により）乾燥されていて、後で水和されてもよい。そのような組成物は、水以外の溶媒中、例えば限定されるものではないがアルコール中にあってもよい。
【００７９】
クプレドキシン類は構造的相同性が高いので、クプレドキシン類はアズリン及びｐ２８（配列番号２）と同じ化学予防特性を有すると考えられる。いくつかの実施形態では、クプレドキシンは、アズリン、シュードアズリン、プラストシアニン、ラスチシアニン、オーラシアニン、ステラシアニン、キュウリ塩基性タンパク質、又はＬａｚであるが、これらに限定されるものではない。特に具体的な実施形態では、アズリンは、緑膿菌、アルカリゲネス・フェカリス、アクロモバクター・キシロスオキシダンスｓｓｐ．デニトリフィカンスＩ、気管支敗血症菌、メチロモナスｓｐ．、髄膜炎菌、淋菌、シュードモナス・フルオレッセンス、シュードモナス・クロロラフィス、ピアス病菌、ウルバ・ペルツシス（Ｕｌｖａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、又は腸炎ビブリオに由来する。具体的な実施形態では、アズリンは緑膿菌に由来する。別の具体的な実施形態では、クプレドキシンは配列番号１〜１９及び２５のアミノ酸配列を含む。
【００８０】
本発明は、野生型クプレドキシンと比べてアミノ酸が置換、欠失、又は挿入されているクプレドキシンのアミノ酸配列バリアントである化学予防剤を提供する。本発明のバリアントは野生型クプレドキシンの切断型であり得る。いくつかの実施形態では、本発明の化学予防剤は、全長野生型ポリペプチドよりも短いクプレドキシンの領域を含む。いくつかの実施形態では、本発明の化学予防剤は、約１０残基超、約１５残基超、又は約２０残基超の切断型クプレドキシンを含む。いくつかの実施形態では、化学予防剤は、約１００残基以下、約５０残基以下、約４０残基以下、約３０残基以下、又は約２０残基以下の切断型クプレドキシンを含む。いくつかの実施形態では、クプレドキシンは化学予防剤に対して、より具体的には配列番号１〜１９及び２５は本発明の化学予防剤に対して、少なくとも約７０％のアミノ酸配列同一性、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有する。
【００８１】
具体的な実施形態では、化学予防剤は、緑膿菌のアズリン残基５０〜７７（ｐ２８、配列番号２）、アズリン残基５０〜６７（ｐ１８、配列番号２５）、アズリン残基５０〜６８（配列番号２６）、アズリン残基５０〜６９（配列番号２７）、アズリン残基５０〜７０（配列番号２８）、アズリン残基５０〜７１（配列番号２９）、アズリン残基５０〜７２（配列番号３０）、アズリン残基５０〜７３（配列番号３１）、アズリン残基５０〜７４（配列番号３２）、アズリン残基５０〜７５（配列番号３３）、アズリン残基５０〜７６（配列番号３４）、又はアズリン残基３６〜８８（配列番号３５）を含む。別の実施形態では、化学予防剤は、緑膿菌のアズリン残基５０〜７７（配列番号２）、アズリン残基５０〜６７（配列番号２５）、アズリン残基５０〜６８（配列番号２６）、アズリン残基５０〜６９（配列番号２７）、アズリン残基５０〜７０（配列番号２８）、アズリン残基５０〜７１（配列番号２９）、アズリン残基５０〜７２（配列番号３０）、アズリン残基５０〜７３（配列番号３１）、アズリン残基５０〜７４（配列番号３２）、アズリン残基５０〜７５（配列番号３３）、アズリン残基５０〜７６（配列番号３４）、アズリン残基３６〜８８（配列番号３５）、又はアズリン残基６０〜６７（配列番号８６）からなる。別の具体的な実施形態では、化学予防剤は、アズリン以外のクプレドキシンの同等な残基からなる。アズリン残基５０〜７７（ｐ２８、配列番号２）又はアズリン残基３６〜８８（配列番号３５）と同様な薬理活性を有するように他のクプレドキシンバリアントを設計することもできると考えられる。そのためには、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ２、ＡＬＩＧＮ２、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ社製）を用いて対象のクプレドキシンアミノ酸配列を緑膿菌アズリン配列と整列させ、緑膿菌アズリンアミノ酸配列上の関連する残基を突き止め、対象のクプレドキシン配列上の対応する残基を見出すことで、同等なペプチドを設計する。
【００８２】
本発明の一実施形態では、化学予防剤はクロロフレクサス・アウランティアカスのオーラシアニンＢの少なくともアミノ酸５７〜８９（配列番号２０）を含む。本発明の別の実施形態では、化学予防剤はシュードモナス・シリンゲのアズリンの少なくともアミノ酸５１〜７７（配列番号２１）を含む。本発明の別の実施形態では、化学予防剤は髄膜炎菌のＬａｚの少なくともアミノ酸８９〜１１５（配列番号２２）を含む。本発明の別の実施形態では、化学予防剤は腸炎ビブリオのアズリンの少なくともアミノ酸５２〜７８（配列番号２３）を含む。本発明の別の実施形態では、化学予防剤は気管支敗血症菌のアズリンの少なくともアミノ酸５１〜７７（配列番号２４）を含む。
【００８３】
化学予防剤には、天然ではない合成アミノ酸できたペプチドも含まれ得る。例えば、非天然アミノ酸を化学予防剤に組み込んで血流中での組成物の半減期を延長又は最適化してもよい。そのような化学予防剤としては、限定されるものではないがＤ，Ｌ−ペプチド（ジアステレオマー）（例えばＦｕｔａｋｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（８）：５８３６−４０（２００１）；Ｐａｐｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４（１６）：５７７９−８６（２００４）；Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３６（１）：１６９−７６，（１９８７））；異常アミノ酸を含むペプチド（例えばＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ．６３（２）：６９−８４（２００４））、オレフィン含有非天然アミノ酸及びその後の炭化水素ステープリング（ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  ｓｔａｐｌｉｎｇ）（例えばＳｃｈａｆｍｅｉｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２：５８９１−５８９２（２０００）；Ｗａｌｅｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０５：１４６６−１４７０（２００４））、並びにε−（３，５−ジニトロベンゾイル）−Ｌｙｓ残基を含むペプチドが含まれる。
【００８４】
別の実施形態では、本発明の化学予防剤はクプレドキシンの誘導体である。クプレドキシンの誘導体とは、ペプチドが基本的な活性の一部を保持したままであるようなペプチドの化学的修飾物である。例えば、アズリンの「誘導体」は、哺乳動物の細胞、組織、又は動物体における前悪性病変の発生を阻害する能力を保持している化学的に修飾されたアズリンであり得る。関心のある化学的修飾としては、限定されるものではないが、ペプチドの、炭化水素安定化（ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  ｓｔａｂｌｉｎｇ）、アミド化、アセチル化、硫酸化、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾、リン酸化、及びグリコシル化、並びに本明細書に開示されている方法及び技術が含まれる。更に、誘導体ペプチドは、クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、若しくは構造的等価物と、限定されるものではないが例えば別のペプチド、薬物分子又はその他の治療薬若しくは医薬品、又は検出可能なプローブ等の化学物質との融合体であってもよい。関心のある誘導体としては、本発明のペプチド及び組成物の血流中の半減期を延長又は最適化することができる化学的修飾が含まれ、そのような化学修飾は、例えば、限定されるものではないが、環状ペプチド（例えばＭｏｎｋ  ｅｔ  ａｌ，ＢｉｏＤｒｕｇｓ  １９（４）：２６１−７８（２００５）；ＤｅＦｒｅｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ．６３（５）：４０９−１９（２００４））、Ｎ末端及びＣ末端の修飾（例えばＬａｂｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｍｅｄ．１３（５）：２７５−８（１９９０））、並びにオレフィン含有非天然アミノ酸及びその後の炭化水素ステープリング（例えばＳｃｈａｆｍｅｉｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２：５８９１−５８９２（２０００）；Ｗａｌｅｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０５：１４６６−１４７０（２００４））等の当業者に周知の複数の方法による。
【００８５】
いくつかの実施形態では、クプレドキシンは、例えば、限定されるものではないが、ペプチドの加水分解を低減する方法、ペプチドの脱アミド化を低減する方法、酸化を低減する方法、免疫原性を低減する方法、及び／又はペプチドの構造的安定性を増加させる方法等の方法を用いて変化させてもよい。１つの修飾クプレドキシン由来ペプチド中で本明細書に記載の修飾の２つ以上が組み合わされてもよく、本明細書に記載の１又は複数の修飾と当業者に周知の薬物動態特性を向上させるその他の修飾とが組み合わされてもよいと考えられる。そのようなバリアント及び誘導体を設計するための多くの方法が当該技術分野で周知である。
【００８６】
生体内変換
化学予防剤、特にアズリンの切断型等のクプレドキシン由来ペプチドの薬物動態特性を向上させるアプローチの１つは、より生体内変換を受けにくいクプレドキシン由来ペプチドのバリアント及び誘導体を作製することである。生体内変換は、ペプチドの薬理活性を低下させ且つ患者の体から排出される速度を速め得る。これを達成するための方法の１つは、最も生体内変換されやすいアミノ酸及び／又はアミノ酸配列を決定し、それらのアミノ酸をその特定の変換プロセスを受けにくいアミノ酸で置換することである。
【００８７】
いくつかの実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドは、非天然アミノ酸又は修飾アミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態では、特定の非天然アミノ酸を導入することでクプレドキシン由来ペプチドの薬物動態特性を向上させる。そのような導入は、部位特異的であってよく、インビボでの特定の生化学的修飾を回避するようになされ得る。例示的な非天然アミノ酸としては、ｂ−アミノ酸（例えば、ｂ３及びｂ２）、ホモアミノ酸、環状アミノ酸、芳香族アミノ酸、Ｐｒｏ及びＰｙｒの誘導体、３−置換アラニン誘導体、グリシン誘導体、環置換Ｐｈｅ及びＴｙｒ誘導体、直鎖コアアミノ酸（Ｌｉｎｅａｒ  Ｃｏｒｅ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ）、及びジアミノ酸が含まれる。そのような非天然アミノ酸は、ペプチドの部位特異的修飾、リボソーム翻訳、又は化学合成によってペプチドに導入され得る。これらの方法のそれぞれがクプレドキシン由来ペプチドの合成に適用され得る。
【００８８】
例えば、修飾クプレドキシン由来ペプチドは、非天然クプレドキシンバリアントを作製するための非天然アミノ酸構成要素と野生型アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ＡＡＲＳ）を使用することで合成され得る（Ｈａｒｔｍａｎ，ｅｔ  ａｌ，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２（１０）：ｅ９７２（２００７）；Ｍｉｒａｎｄａ，ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２９：１３１５３−１３１５９（２００７）参照）。リボソーム翻訳を用いてペプチドに導入することができる非天然アミノ酸の多様性はリボソーム翻訳装置の特異性によって限定される。側鎖及び骨格のアナログを含む、ＡＡＲＳの基質となる９０を超える非天然構成要素が明らかにされている（Ｈａｒｔｍａｎ，ｅｔ  ａｌ，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２（１０）：ｅ９７２（２００７））。５０を超える非天然アミノ酸が、全て酵素による翻訳系を用いてペプチド中に高効率で導入され得、最大１３個までの異なる非天然アミノ酸がペプチドに含まれ得る（Ｈａｒｔｍａｎ，ｅｔ  ａｌ，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２（１０）：ｅ９７２（２００７））。いくつかの実施形態では、そのようなアミノ酸がクプレドキシン由来ペプチドに導入されてもよい。
【００８９】
その他の修飾としては、光学活性α−アミノ酸の使用が含まれ得る。光学活性α−アミノ酸及びその誘導体は、医薬品中及び農薬中において、並びにキラル配位子として、その使用が広がっている。特に、キラルなグリシン及びアラニン同等物は重要な役割を果たす。α−アミノ酸を構築するための少なくとも１つの立体選択戦略が提唱されており、これは予め決定した立体化学のエナンチオピュアなα−アミノ酸を可能にする（参照によりその開示を本明細書に援用する、２００８年９月１１日にインターネット上で公開された（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．で公開予定の）Ｌｕ，ｅｔ  ａｌ．“Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  α−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ：Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｌｋｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｙｃｌｉｃ  ｉｍｉｎｏｌａｃｔｏｎｅｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  α−Ｍｅｔｈｙｌ  ｔｒａｎｓ−ｃｉｎｎａｍａｌｄｅｈｙｄｅ”、修飾クプレドキシン由来ペプチドは、エナンチオリッチな反復（ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｉｃａｌｌｙ  ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ｉｔｅｒａｔｉｏｎ）を生成するための光学活性α−アミノ酸を用いて合成され得る。
【００９０】
アスパラギン酸を含むペプチドでは通常、加水分解が問題になる。アスパラギン酸は脱水されて環状イミド中間体を形成し易く、これにより、アスパラギン酸が潜在的に不活性なイソアスパラギン酸アナログに変換され、最終的にペプチド鎖が切断される。例えば、ペプチド配列中にアスパラギン酸−プロリンが存在すると、酸触媒により環状イミド中間体が形成されることでペプチド鎖が切断され得る。同様に、ペプチド配列中にアスパラギン酸−グリシンが存在すると、環状中間体が元々のアスパラギン酸形態（無害）又はイソアスパラギン酸アナログのいずれかへと加水分解され得る。最終的に、全ての形態のアスパラギン酸がイソアスパラギン酸アナログに完全に変換され得る。同様に、セリンを含む配列も、脱水され、ペプチド鎖を切断し得る環状イミド中間体を形成し得る。ペプチドの切断は、ペプチドの血漿半減期の短縮及び特定の薬理活性の低下を招き得る。
【００９１】
クプレドキシン由来ペプチドの配列中のアスパラギン及び／又はセリンをその他のアミノ酸で置換することで、ペプチドの血漿半減期の延長及び薬理活性の比活性の上昇等の向上された薬物動態特性を有するペプチドが得られると考えられる。考えられるバリアントの１つでは、クプレドキシン由来ペプチドの１又は複数のアスパラギン残基が別のアミノ酸残基、具体的にはグルタミン酸残基で置換され得る。別の考えられるバリアントでは、クプレドキシン由来ペプチドの１又は複数のセリン残基が別のアミノ酸残基、具体的にはスレオニン残基で置換され得る。クプレドキシン由来ペプチドのいくつかのバリアントでは、１又は複数のアスパラギン残基及び１又は複数のセリン残基が置換される。いくつかの実施形態では、保存的置換がなされる。別の実施形態では、非保存的置換がなされる。
【００９２】
アミノ酸残基の脱アミド化は生体内変換の中でも特に問題である。この塩基触媒反応はしばしばアスパラギン−グリシン又はグルタミン−グリシンを含む配列中で起こり、上記のアスパラギン酸−グリシン配列と同様なメカニズムによる。アスパラギン−グリシン配列の脱アミド化は環状イミド中間体を形成し、これはその後加水分解されてアスパラギン酸又はアスパラギンのイソアスパラギン酸アナログを形成する。更に、環状イミド中間体は、Ｄ−アスパラギン酸又はアスパラギンのＤ−イソアスパラギン酸アナログへのラセミ化を招き得、これらは全てペプチドを不活性型にし得る。
【００９３】
クプレドキシンペプチド中の脱アミド化はクプレドキシンのアスパラギン−グリシン又はグルタミン−グリシン配列のグリシン、アスパラギン、及び／又はグルタミンを別のアミノ酸で置換することで防止され、ペプチドの血漿半減期の延長及び薬理活性の比活性の上昇等の薬物動態特性が改善されたペプチドが得られると考えられる。いくつかの実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドの１又は複数のグリシン残基が別のアミノ酸残基で置換される。具体的な実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドの１又は複数のグリシン残基がスレオニン残基又はアラニン残基で置換される。いくつかの実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドの１又は複数のアスパラギン残基又はグルタミン残基が別のアミノ酸で置換される。具体的な実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドの１又は複数のアスパラギン残基又はグルタミン残基がアラニン残基で置換される。別の具体的な実施形態では、緑膿菌アズリン（配列番号１）の残基５８及び／若しくは６３のグリシン又は他のクプレドキシンの対応するグリシンがアラニン又はスレオニンで置換される。別の具体的な実施形態では、緑膿菌アズリン（配列番号１）の残基５９のメチオニン又は別のクプレドキシン由来ペプチドの対応するメチオニン残基がアラニン残基で置換される。別の具体的な実施形態では、緑膿菌アズリン（配列番号１）の残基６３のグリシン又は別のクプレドキシン由来ペプチドの対応するグリシン残基がスレオニン残基で置換される。いくつかの実施形態では、保存的置換がなされる。別の実施形態では、非保存的置換がなされる。具体的な実施形態では、本発明の修飾クプレドキシン由来ペプチドは以下の配列を含む（下線を引いたアミノ酸が野生型緑膿菌ｐ２８配列中に置換により導入されている）：
ＬＳＴＡＡＤＭＱＡＶＶＴＤＴＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号４２）。
【００９４】
アミノ酸の可逆的酸化及び不可逆的酸化は、クプレドキシン由来ペプチドの薬理活性及び／又は血漿半減期を低減させ得るという問題を引き起こし得る別の生体内変換プロセスである。システイン及びメチオニン残基が可逆的酸化を受ける主な残基である。システインの酸化は、チオールがより容易に脱プロトン化されて鎖内又は鎖間ジスルフィド結合を容易に形成する、より高いｐＨで促進される。これらのジスルフィド結合は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）又はトリス（２−カルボキシエチルホスフィン）ヒドロクロリド（ＴＣＥＰ）で処理することでインビトロで容易に逆転させることができる。メチオニンは化学的経路及び光化学的経路の両方によって酸化されてメチオニンスホキシドを形成し、更にメチオニンスルホンになる。これらはどちらもほとんど逆転させることができない。
【００９５】
クプレドキシン由来ペプチド中の酸化はメチオニン及び／又はシステイン残基を別の残基で置換することで防ぐことができると考えられる。いくつかの実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドの１又は複数のメチオニン及び／又はシステイン残基が別のアミノ酸残基で置換される。具体的な実施形態では、メチオニン残基がロイシン又はバリン残基で置換される。別の具体的な実施形態では、緑膿菌アズリン（配列番号１）の残基５６及び６４のメチオニンの１若しくは複数又は別のクプレドキシン由来ペプチドの対応するメチオニン残基がロイシン又はバリンで置換される。いくつかの実施形態では、保存的置換がなされる。別の実施形態では、非保存的置換がなされる。具体的な実施形態では、本発明のクプレドキシンペプチドは以下の配列のいずれかを含む（下線を引いたアミノ酸が野生型緑膿菌ｐ２８配列中に置換により導入されている）：
ＬＳＴＡＡＤＬＱＧＶＶＴＤＧＬＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号４３）
又は
ＬＳＴＡＡＤＶＱＧＶＶＴＤＧＶＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号４４）。
【００９６】
クプレドキシン由来ペプチドの薬理活性、血漿半減期、及び／又は免疫原性に影響を与え得る別の生体内変換プロセスとしてジケトピペラジン及びピログルタミン酸の形成が挙げられる。ジケトピペラジン形成は通常、グリシンがＮ末端から３位以内にある場合、特にプロリン又はグリシンが１位又は２位以内にある場合に起こる。この反応は、２番目と３番目のアミノ酸の間のアミドカルボニル上のＮ末端窒素の求核攻撃を含み、これにより、最初の２つのアミノ酸がジケトピペラジンの形態で切断される。一方、ピログルタミン酸形成は、Ｎ末端にグルタミンがある場合にはほとんど避けられないであろう。これは、Ｎ末端窒素がグルタミンの側鎖カルボニル炭素を攻撃して脱アミノ化されたピログルタマイルペプチドアナログが形成される、同様な反応である。この変換はＮ末端にアスパラギンを含むペプチドでも起こるが、頻度はかなり低くなる。
【００９７】
ペプチドのＮ末端から１、２、又は３位のグリシン、Ｎ末端から３位のプロリン、又はＮ末端のアスパラギンを別のアミノ酸残基で置換することで、クプレドキシン由来ペプチド中でのジケトピペラジン及びピログルタミン酸の形成が減少すると考えられる。いくつかの実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドのＮ末端から１、２、又は３位のグリシンが別のアミノ酸残基で置換される。具体的な実施形態では、グリシン残基がスレオニン又はアラニン残基で置換される。別の実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドのＮ末端から３位のプロリンが別のアミノ酸残基で置換される。具体的な実施形態では、プロリンがアラニン残基で置換される。別の実施形態では、Ｎ末端のアスパラギンが別のアミノ酸残基で置換される。具体的な実施形態では、アスパラギン残基がグルタミン残基で置換される。いくつかの実施形態では、保存的置換がなされる。別の実施形態では、非保存的置換がなされる。
【００９８】
クプレドキシン由来ペプチドの薬理活性、血漿半減期、及び／又は免疫原性に影響を与え得る別の生体内変換プロセスとしてラセミ化が挙げられる。この用語はアミノ酸又はペプチドのキラル整合性の全体的消失を指して緩く使用される。ラセミ化では、アミノ酸の一方のエナンチオマー（通常Ｌ型）がＬ型及びＤ型のエナンチオマーの１：１混合物に塩基触媒変換される。一般的なペプチドの安定性を高める方法の１つは、ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ型（Ｄ異性体）ペプチドを作製することである。ペプチド構造の二重変換は、多くの場合、側鎖の表面トポロジーを損なわず、生理活性ペプチドを安定化するために広範に使用されてきた（Ｓｎｙｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ．２：０１８６−０１９３（２００４））。Ｌ−アミノ酸ペプチドだけでなくＤ−アミノ酸置換Ｔａｔも細胞中に内部移行する（Ｆｕｔａｋｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：５８３６−５８４０（２００１）；Ｈｕｑ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３８：５１７２−５１７７（１９９９））。いくつかの実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドの１又は複数のアミノ酸残基がそのアミノ酸残基のＤ異性体で置換される。別の実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸残基全てがそれらの残基のＤ異性体で置換される。一実施形態では、修飾クプレドキシン由来ペプチドはクプレドキシン由来ペプチドのｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ（Ｄ−異性体）型である。具体的な実施形態では、修飾クプレドキシン由来ペプチドは
ＤＤＰＫＬＹＤＫＤＬＧＳＡＭＧＤＴＶＶＧＱＭＤＡＡＴＳＬ（配列番号４５）
である。
【００９９】
生体内変換による分解からクプレドキシン由来ペプチドを保護するその他の方法にＮアセチル化及びＣアミド化がある。これらの誘導体は、ペプチドを分解から保護し得、クプレドキシン由来ペプチドに天然タンパク質中のアルファアミノ基及びカルボキシル基の電荷状態をより正確に模倣させ得る。Ｎアセチル化及び／又はＣアミド化を有するペプチドは市販の供給業者から供給され得る。本発明の一実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドのＮ末端がアセチル化されていてよい。本発明の別の実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドのＣ末端がアミド化されていてよい。具体的な一実施形態では、修飾クプレドキシン由来ペプチドは
アセチル化−ＬＳＴＡＡＤＭＱＧＶＶＴＤＧＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ−アミド化（配列番号４６）
である。
【０１００】
環化は、本明細書に記載のクプレドキシン等の治療用ペプチドに有益であり得る更なる様式の生体内変換である。環化により、治療用ペプチドが安定化することで、より長期の保存、より少ない投与量での投与、より少ない頻度での投与が可能になり得る。環化はペプチダーゼ及びプロテアーゼによる分解からペプチドを保護することが示されている。環化は化学的になされてもよく、酵素的になされてもよい。化学的環化は位置特異性及び立体特異性がないことがあり、環化ではなく多量体化が起こることがあり、複雑な多段階プロセスが必要になることがあるため、酵素的環化が一般的に化学的環化よりも問題が少ない。実際、タンパク質分解酵素に対してチオエーテル環化はジスルフィド結合よりも保護的且つ安定であることが示されている。
【０１０１】
ランチビオティック−（メチル）ランチオニン含有細菌ペプチド中における酵素的環化が報告されている（例えば、Ｒ．Ｒｉｎｋ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｓ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｔｈａｔ  Ｃａｎ  Ｂｅ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｂｙ  Ｌａｎｔｉｂｉｏｉｔｉｃ  Ｅｎｚｙｍｅｓ”４４  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，８８７３−８２（２００５）；Ｒ．Ｒｉｎｋ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｅｈｙｄｒｏａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ−Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｂｙ  Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ”７３：６  Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１７９２−９６（２００７）；Ｒ．Ｒｉｎｋ，ｅｔ  ａｌ．，“ＮｉｓＣ，ｔｈｅ  Ｃｙｌｃａｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  Ｎｉｓｉｎ，Ｃａｎ  Ｃａｔａｌｙｚｅ  Ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｅｓｉｇｎｅｄ  Ｎｏｎｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”４６  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３１７９−８９（２００７））（これらのそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する）。ランチビオティックはグラム陽性細菌により産生され、その成長を阻害する。ランチビオティック中では、酵素により仲介されるセリン及びスレオニン残基の脱水によりデヒドロアラニン及びデヒドロブチリンが生じ、次いで、脱水されたセリン及びスレオニン残基にシステインが酵素的に結合されてチオエーテル環が形成される。天然のランチビオティックは、最大１９残基離れた残基間でチオエーテル結合を介したそのような結合を有する。チオエーテル環形成はリーダーペプチドに依存する。環化の位置は、シクラーゼが仲介する位置特異的且つ立体特異的な閉環並びに脱水可能なセリン及びスレオニン残基の位置に依存する。
【０１０２】
特徴が最も解析されているランチビオティックは、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）により産生される５員環ペプチド抗生物質であるナイシンである。ナイシンは、４個のメチルランチオニン、１個のランチオニン、２個のデヒドロアラニン、１個のデヒドロブチリン、及び２６個の非修飾アミノ酸で構成される。ナイシンの５個のチオエーテル架橋は、セリン及びスレオニンに由来するデヒドロアラニン残基及びデヒドロブチリン残基にシステイン残基が付加されることで形成される。ナイシンは、膜結合タンパク質酵素複合体により翻訳後に導入されるチオエーテル含有アミノ酸を含む。この酵素複合体は、輸送体であるＮｉｓＴ、セリン及びスレオニンのデヒドラターゼであるＮｉｓＢ、並びにシクラーゼであるＮｉｓＣを含む。ＮｉｓＢはセリン残基及びスレオニン残基を脱水してそれらをそれぞれデヒドロアラニン及びデヒドロブチリンに変換する。その後、形成されたデヒドロ残基へのエナンチオ選択的なシステインの結合をＮｉｓＣが触媒する。ＮｉｓＴは修飾プレナイシンの搬出を促進する。ＮｉｓＰという別の酵素がプレナイシンからナイシンリーダーペプチドを切断する。
【０１０３】
シクラーゼＮｉｓＣは十分に特徴が解析されている（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  Ｃｙｌｃｌａｓｅ  Ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  Ｎｉｓｉｎ  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”３１１  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１４６４−６７（２００６））（その全体を参照により本明細書に援用する）。
【０１０４】
ランチビオティックにおける環化の分析から、ペプチド中の環化を引き起こし易いアミノ酸配列及び特徴が特定された。ＮｉｓＢ酵素はセリン及びスレオニン残基に特定のアミノ酸が隣接する場合により多く脱水することが示されている。セリン残基及びスレオニン残基に疎水性の非芳香族残基が近接する場合にランチビオティックプロペプチド中で環化がより多く起こることが示されている。修飾されたシステイン隣接残基は通常、修飾されたスレオニン及びセリン隣接残基よりも疎水性が低い。ヘキサペプチドＶＳＰＰＡＲ（配列番号４７）、ＹＴＰＰＡＬ（配列番号４８）、及びＦＳＦＦＡＦ（配列番号４９）等の例外も見つかっている。これらのヘキサペプチドは、３位又は４位にプロリンが存在するか両側に隣接するフェニルアラニンを有することで脱水が阻止され得ることを示唆している。環は通常、脱水残基がＣ末端側に位置するシステインに結合されることで形成される。しかし、脱水残基がＮ末端側に位置するシステインに結合されることでも環は形成され得る。
【０１０５】
ナイシンを脱水及び輸送する酵素はナイシンに特異的でなく、実際、非ナイシンペプチド（及び非ランチビオティックペプチド）の修飾に使用され得ることも示されている。ＮｉｓＢは、ランチビオティックリーダーペプチドにヒトペプチドホルモン等のペプチドがＮ末端融合された時に、そのようなペプチド中のセリン残基及びスレオニン残基を脱水することが示されている。非ランチビオティックペプチド上でも同様な環形成の特徴が適用される。すなわち、脱水の程度は、脱水可能なセリン残基及びスレオニン残基に隣接する領域のアミノ酸の内容により調節することができる。セリン及びスレオニンの周辺に疎水性隣接残基（例えばアラニン及びバリン）が存在すると、完全な脱水が可能になり、チオエーテル環形成が促進された。Ｎ末端アスパラギン及びＣ末端隣接アルギニンは脱水を防止した。プロリン残基及びフェニルアラニン残基の存在が脱水に好ましくないことも示されている。一般的に、親水性隣接残基が存在するとセリン残基及びスレオニン残基の脱水が防止された。疎水性隣接残基は脱水に好ましく、親水性隣接残基は脱水に好ましくない。実験により脱水が起こる場合、セリン及びスレオニンの隣接残基の平均疎水性は正であり、Ｎ末端側で０．４０、Ｃ末端側で０．１３であることが示された。また、脱水されないセリン及びスレオニンに隣接する残基の平均疎水性は負であり、Ｎ末端側で−０．３６、Ｃ末端側で−１．０３である。脱水は、一連の隣接するスレオニン残基の存在によって制限されず、ナイシンリーダーペプチドと脱水される残基の間の距離にも制限されない。
【０１０６】
ＮｉｓＣは天然のランチビオティックとは無関係のペプチド中でチオエーテル環の位置特異的形成を触媒することが示されている。通常は、そのようなペプチドはナイシンリーダーペプチドに融合させる必要がある。場合によっては、例えばデヒドロアラニンが２個のアミノ酸によってシステインから隔てられた場合、チオエーテル環が自然発生的に形成され得る。自然発生的な環化と異なり、ＮｉｓＣが触媒する環化は脱水されたプレナイシンに立体特異的である。その結果、ナイシン中のメチルランチオニン及びランチオニンはＤＬ形態になる。非ランチビオティック中の環化も立体特異的であると考えられている。
【０１０７】
これらの原理は、クプレドキシン並びにそのバリアント及び切断型を含む本明細書に記載の化合物にも適用することができる。
【０１０８】
チオエーテルブリッジ
天然には、ランチビオティックの酵素で誘導されるチオエーテルブリッジはブリッジ下に最大１９個のアミノ酸を有するように形成される。ブリッジ下に２〜４個のアミノ酸を有するチオエーテルブリッジは多数存在する。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、本発明の化学予防剤、具体的にはクプレドキシン及びクプレドキシンの誘導体、バリアント、切断型、又は構造的等価物、例えば切断型アズリンは、構造中にチオエーテルブリッジを導入することで修飾され得る。この方法を用いて例えばアズリン切断型ｐ２８（配列番号２）が修飾され得る。ソフトウェアパッケージＧＲＯＭＡＣＳ（ｗｗｗ．ｇｒｏｍａｃｓ．ｏｒｇ）を用いた拡張分子動力学シミュレーション（７０ｎｓ）は、３７℃において、６〜１６位までのｐ２８（配列番号２）のαヘリックス領域が不安定であり、ペプチドがβシータ形態をとりやすいことを示唆している（図２４Ａ及びＢ）。このことと、ｐ５３との相互作用に関与すると推定される分子部分が溶媒に曝されたままであることから、ｐ２８（配列番号２）ペプチドのこの領域にチオエーテルブリッジを導入しても機能性に影響しないことが示唆される。
【０１１０】
ｐ２８のアミノ酸配列は配列番号２（ＬＳＴＡＡＤＭＱＧＶＶＴＤＧＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ）である。ｐ１８として知られるアミノ酸配列は配列番号２５（ＬＳＴＡＡＤＭＱＧＶＶＴＤＧＭＡＳＧ）である。配列ＳＧＬＤＫＤ（配列番号８５）がｐ５３と相互作用し得る。チオエーテルブリッジはＮ側のＳｅｒ／ＴｈｒとＣ側のＣｙｓの間で形成され得る。このセリン／スレオニンは脱水され、その後、システインに結合する。セリンよりも容易に脱水されるため、スレオニンが好ましい。一般的に、スレオニンに隣接する疎水性残基（少なくとも１つ）は脱水の程度を高くするため好ましい。隣接残基である負に帯電したアミノ酸、グルタミン酸及びアスパラギン酸は、脱水に強い負の影響を与える。通常、親水性隣接残基、特にグリシンは、脱水に好ましくない。Ｃｙｓの前は帯電した親水性残基、特にグルタミン酸／アスパラギン酸になる傾向がわずかにある。チオエーテル環のサイズによっては、環を形成するアミノ酸の嵩高さが重要になる。
【０１１１】
一実施形態では、切断型アズリン配列はＬＳＴＡＡＤＭＱＧＶＶＴＤＧＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＴＰＧＣ（配列番号５０）である。チオエーテルブリッジはｐ２８（配列番号２）の２５位と２８位の間で形成され、カルボキシエチダーゼ（ｃａｒｂｏｘｙｅｔｉｄａｓｅ）から完全に保護されている。２、３、及び２５位が脱水されるが、移入配列及びｐ５３との相互作用に関与すると思われる配列はチオエーテル環の導入により変化しない。したがって、ペプチド活性は変化しないと考えられる。スレオニンは２個の疎水性アミノ酸の間にあるので、特定の基準に従ってデヒドラターゼＮｉｓＢによって完全に脱水されると予想される（Ｒｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００５参照）。同じ基準により、特にシステインの前にアスパラギン酸が位置するため、シクラーゼＮｉｓＣによる２５位及び２８位を含む環化も予測される。
【０１１２】
別の実施形態では、切断型アズリン配列はＬＳＴＡＡＤＣＱＧＶＶＴＤＧＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号５１）であり、チオエーテルブリッジは３位と７位の間に形成される。３位と７位の間の環はナイシンの環Ａを模倣しており、２位のスレオニンを利用する。６位のアスパラギン酸は環化に好ましい。
【０１１３】
別の実施形態では、切断型アズリン配列はＬＳＴＡＡＣＭＱＧＶＶＴＤＧＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号５２）であり、２位のスレオニンがチオエーテルブリッジの形成に利用される。
【０１１４】
別の実施形態では、上記段落に記載した切断型アズリン中のチオエーテル環の２つ以上が１つのペプチド中で組み合わされる。
【０１１５】
別の実施形態では、多くの切断型アズリン配列を作製し、硫黄ブリッジ下に１個のランチオニン環及び２〜３個の更なるアミノ酸を有するペプチドを分析することでスレオニン環についてスクリーニングしてもよい。これには以下の配列の１つ又は組合せが含まれ得る：
2012527466.tif 000014
【０１１６】
実用的アプローチは、このような配列を大量に遺伝的に作製し、修飾の程度及び生成レベルに基づいて選択して精製することである。
【０１１７】
別の実施形態では、チオエーテルブリッジはｐ２８（配列番号２）の１２位のスレオニンとペプチドのｃ末端の間に形成される。１３位のＣαと２８位のアスパラギン酸の距離は１７．５２オングストロームであり得、これは１．５ナノメートルよりも大きく、ペプチド構造の大きな変化が示唆される（図２４Ｃ）。
【０１１８】
別の実施形態では、ペプチド配列はＬＳＴＡＡＤＭＱＧＶＶＴＡＴＭＧＳＧＬＣＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号６７）であり、１４位から２位に４．３８オングストロームの距離のチオエーテルブリッジを有する。１３位のアスパラギン酸のアラニンへの変異は１４位のスレオニンの脱水に好ましい。１６位のアラニンのグリシンへの変異は１７位のセリンの脱水を完全に妨げ、環化を促進する。
【０１１９】
別の実施形態では、ペプチド配列はＬＳＴＡＡＤＭＱＧＶＶＴＤＬＴＡＳＧＬＣＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号６８）であり、１５位から２０位に５．８３オングストロームの距離のチオエーテルブリッジを有する。この場合、１４位のグリシンのロイシンへの変異は１５位のスレオニンの脱水に好ましい。
【０１２０】
三次構造の安定化
クプレドキシン由来ペプチドの三次構造の安定性は、とりわけ薬理活性、血漿半減期、及び／又は免疫原性を含む薬物動態のほとんどの面に影響を与える（Ｋａｎｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５２：２０２−２０８（２００３）；Ｋａｎｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ，ＰＮＡＳ  ２３：１２４３８−１２４４３（２００１）参照）。ペプチドのヘリックスはしばしばランダムコイルへとほどかれ、プロテアーゼの攻撃をより受けやすくなり、細胞膜を十分に透過しないことがある（Ｓｃｈａｆｍｅｉｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２：５８９１−５８９２（２０００））。したがって、ペプチドの全体的構造を安定化する方法の一つはペプチドのαヘリックス構造を安定化することである。ヘリックス形成に関与する分子内水素結合は極性アミド骨格の露出を減らすことで輸送ペプチドの膜透過の障壁を低減するため、関連する薬理活性を高め、プロテアーゼ切断に対するペプチドの抵抗性を高める（上記文献）。緑膿菌アズリン（配列番号１）は残基５３〜５６、５８〜６４、及び６８〜７０にαヘリックスを有する。
【０１２１】
αヘリックスを安定化する方法の１つは、αヘリックス中のグリシン、プロリン、セリン、アスパラギン酸等のヘリックス破壊性アミノ酸残基又はアラニン、スレオニン、バリン、グルタミン、アスパラギン、システイン、ヒスチジン、リジン、アルギニン等のヘリックスに対して中立のアミノ酸残基を、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、グルタミン酸、チロシン、トリプトファン、メチオニン等のヘリックス形成性残基又は例えばαアミノ−イソ酪酸（Ａｉｂ）等のヘリックスに好ましいアミノ酸残基置換体で置換することである（その開示を参照により本明細書に援用するＭｉｒａｎｄａ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，５１，２７５８−２７６５（２００８）参照）。１又は複数のグリシン、プロリン、セリン、及び／又はアスパラギン酸残基を他のアミノ酸に置換することでもクプレドキシン由来ペプチドのαヘリックスが安定化されると考えられる。具体的な実施形態では、グリシン、プロリン、セリン、アスパラギン酸、アラニン、スレオニン、バリン、グルタミン、アスパラギン、システイン、ヒスチジン、リジン、及び／又はアルギニン残基がロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、グルタミン酸、チロシン、トリプトファン、Ａｉｂ、及び／又はメチオニン残基で置換される（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｔｌ．１１：２１（２００５）参照）。別の具体的な実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドのαヘリックス中の１又は複数のセリン残基又はグルタミン残基が置換され得る。更により具体的な実施形態では、緑膿菌アズリン（配列番号１）の残基５３〜５６、５８〜６４、及び６８〜７０中のセリン及び／若しくはグルタミン残基又は他のクプレドキシン由来ペプチドの対応する残基が置換され得る。別の具体的な実施形態では、緑膿菌アズリン（配列番号１）のアミノ酸残基５７のグルタミン残基又は別のクプレドキシン由来ペプチドの対応する残基が置換され得、より具体的にはトリプトファンで置換され得る。別の具体的な実施形態では、緑膿菌アズリン（配列番号１）のアミノ酸残基５２のスレオニン残基又は別のクプレドキシン由来ペプチドの対応する残基が置換され得、より具体的にはトリプトファンで置換され得る。別の具体的な実施形態では、緑膿菌アズリン（配列番号１）のアミノ酸残基６１のスレオニン残基又は別のクプレドキシン由来ペプチドの対応する残基が置換され得、より具体的にはトリプトファンで置換され得る。別の具体的な実施形態では、緑膿菌アズリン（配列番号１）のアミノ酸残基６３のグリシン残基又は別のクプレドキシン由来ペプチドの対応する残基が置換され得、より具体的にはトリプトファンで置換され得る。別の具体的な実施形態では、緑膿菌アズリン（配列番号１）のアミノ酸残基５２、５７、６１又は６３の１又は複数のスレオニン、グルタミン、又はグリシン残基あるいは別のクプレドキシン由来ペプチドの対応する残基が置換され得、より具体的にはトリプトファンで置換され得る。具体的な実施形態では、クプレドキシンペプチドは以下の配列のいずれかを含む（下線を引いたアミノ酸が野生型緑膿菌ｐ２８配列中に置換により導入されている）：
2012527466.tif 000015
【０１２２】
別の実施形態では、他のクプレドキシン由来ペプチド中の対応するアミノ酸がトリプトファンで置換される。
【０１２３】
αヘリックスの三次構造を安定化する別の方法では、πスタッキング可能な非天然アミノ酸残基を使用する。例えば、Ａｎｄｒｅｗｓ  ａｎｄ  Ｔａｂｏｒ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ５５：１１７１１−１１７４３（１９９９））では、ペプチドのαヘリックス領域中に種々のスペーシングのε−（３，５−ジニトロベンゾイル）−Ｌｙｓ残基対が置換により導入されている。全体の結果は、ｉ，（ｉ＋４）のスペーシングが配置の安定化に最も効率的であることを示していた。水の割合を最大９０％まで増加させると、ペプチド中のヘリックス含有量が増加した。同じｉ，（ｉ＋４）のスペーシングのε−アシル−Ｌｙｓ残基対は安定化効果を示さなかった。このことは、安定化の大部分がπ−π相互作用によるものであることを示している。一実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドは、リジン残基がε−（３，５−ジニトロベンゾイル）−Ｌｙｓ残基で置換されるように修飾され得る。具体的な実施形態では、リジン残基がｉ，（ｉ＋４）のスペーシングでε−（３，５−ジニトロベンゾイル）−Ｌｙｓにより置換され得る。
【０１２４】
αヘリックスの三次構造を安定化する別の方法では、αヘリックスの側鎖間の静電相互作用を利用する。ペプチド中にＨｉｓ−Ｃｙｓ又はＨｉｓ−Ｈｉｓ残基対をｉ，（ｉ＋４）配置で置換により導入した場合、Ｃｕ、Ｚｎ、又はＣｄイオンの添加でペプチドは約５０％ヘリックスから約９０％ヘリックスに変化した。ルテニウム（Ｒｕ）塩をＨｉｓ−Ｈｉｓペプチドに添加した場合、大環状のシス−［Ｒｕ−（ＮＨ３）４Ｌ２］３＋錯体（式中、Ｌ２は２個のヒスチジンの側鎖である）である置換不活性複合体（ｅｘｃｈａｎｇｅ−ｉｎｅｒｔ  ｃｏｍｐｌｅｘ）が形成され、ヘリックスの安定性が改善された（Ｇｈａｄｉｒｉ  ａｎｄ  Ｆｅｒｎｈｏｌｚ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１２，９６３３−９６３５（１９９０））。いくつかの実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドは、大環状のシス−［Ｒｕ−（ＮＨ３）４Ｌ２］３＋錯体（式中、Ｌ２は２個のヒスチジンの側鎖である）を含み得る。いくつかの実施形態では、１又は複数のヒスチジン−システイン又はヒスチジン−ヒスチジン残基対が、クプレドキシン由来ペプチドのαヘリックス中にｉ，（ｉ＋４）配置で置換により導入され得る。別の実施形態では、緑膿菌アズリン（配列番号１）の残基５３〜５６、５８〜６４、及び６８〜７０又は他のクプレドキシン由来ペプチドの対応する残基中にｉ，（ｉ＋４）配置の１又は複数のヒスチジン−システイン又はヒスチジン−ヒスチジン残基対が置換により導入され得る。いくつかの実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドは更にＣｕ、Ｚｎ、Ｃｄ、及び／又はＲｕイオンを含み得る。
【０１２５】
αヘリックスの三次構造を安定化する別の方法では、αヘリックスの側鎖間でジスルフィド結合を形成する。ペプチド配列中の隔てられた残基間の正式な共有結合によってヘリックス構造を安定化することも可能である。一般的に用いられる天然の方法はジスルフィド結合の利用である（Ｐｉｅｒｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．，４６：４７１−４７９（１９９５）。いくつかの実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドのαヘリックス中に１又は複数のシステイン残基対が置換により導入される。別の実施形態では、緑膿菌アズリン（配列番号１）の残基５３〜５６、５８〜６４、及び６８〜７０又は他のクプレドキシン由来ペプチドの対応する残基に１又は複数のシステイン残基が置換により導入される。
【０１２６】
αヘリックスの三次構造を安定化する別の方法では、側鎖のラクタムブリッジを利用する。ラクタムとは、アミノ酸の環化により形成され得る環状アミドである。側鎖と側鎖のブリッジは、種々のペプチド及びペプチドアナログ、例えば両親媒性又はモデルαヘリックスペプチド、オキシトシンアンタゴニスト、メラノプトロピン（ｍｅｌａｎｏｐｔｒｏｐｉｎ）アナログ、グルカゴン、及びＳＤＦ−１ペプチドアナログにおける束縛にうまく利用されてきた。例えば、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−Ｉ）は、ヘリックスに好ましい特定の条件下で徐々にヘリックス構造をとり、ラクタムブリッジを用いて安定化することができる（Ｍｉｒａｎｄａ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，５１，２７５８−２７６５（２００８））。これらのラクタムブリッジは、サイズ、もたらされる安定性（ｅｆｆｅｃｔｉｎｇ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）、及び結合親和性が異なり得る（上記文献）。そのような修飾は、血漿中での化合物の安定性を向上させた（上記文献）。環化部位間のスペース及び残基の選択によっては、ターン又はヘリックスコンホメーションの誘導及び安定化にラクタムブリッジを用いることができる。いくつかの実施形態では、近傍のアミノ酸間にラクタムブリッジ（例えばｉからｉ＋４へのグルタミン酸−リジンの束縛）を有する１又は複数のクプレドキシン又はバリアントアナログが作製される。いくつかの実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドはαヘリックス含有量を高くするためにそのような修飾を含み得る。
【０１２７】
αヘリックスの三次構造を安定化する別の方法は、全炭素架橋（ａｌｌ−ｃａｒｂｏｎ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋ）である。全炭化水素架橋法はヘリックス構造の安定化、プロテアーゼ抵抗性、及び細胞透過性を強化することが証明されている（Ｗａｌｅｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０５，１４６６−１４７０（２００４））。α，α−二置換非天然アミノ酸を含むオレフィン含有テザーをペプチドに導入する。ルテニウムが触媒するオレフィンのメタセシスにより全炭化水素「ステープル」が生成してヘリックスが架橋される（Ｓｃｈａｆｍｅｉｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１２２，５８９１−５８９２（２０００）；Ｗａｌｅｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．の上記文献）。非天然アミノ酸を含むオレフィン含有テザーは、Ｓｃｈａｆｍｅｉｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（上記文献）及びＷｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｉｍ（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１１３：９２７６−９２８６（１９９１））に記載されている方法により合成することができる。いくつかの実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドは全炭化水素ステープルにより安定化される。具体的な実施形態では、天然のアミノ酸に対応するα，α−二置換非天然アミノ酸を含むオレフィン含有テザーの１又は複数対がクプレドキシン由来ペプチドのαヘリックス中に置換により導入される。別の実施形態では、天然アミノ酸に対応するα、α−二置換非天然アミノ酸を含むオレフィン含有テザーの１又は複数対が緑膿菌アズリン（配列番号１）の残基５３〜５６、５８〜６４、及び６８〜７０又は他のクプレドキシン由来ペプチドの対応する残基中に置換により導入される。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、修飾クプレドキシン由来ペプチドはＸ１ＳＸ２ＡＡＤＸ３Ｘ４Ｘ５ＶＶＸ６ＤＸ７Ｘ８ＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＸ９（配列番号８０）（式中、Ｘ１はＬ又はアセチル化−Ｌであり、Ｘ２はＴ又はＷであり、Ｘ３はＭ、Ｌ、又はＶであり、Ｘ４はＱ又はＷであり、Ｘ５はＧ又はＡであり、Ｘ６はＴ又はＷであり、Ｘ７はＧ、Ｔ又はＷであり、Ｘ８はＭ、Ｌ又はＶであり、Ｘ９はＤ又はアミド化−Ｄである）を含み得る。別の実施形態では、修飾クプレドキシン由来ペプチドはＸ１ＳＸ２ＡＡＤＸ３Ｘ４Ｘ５ＶＶＸ６ＤＸ７Ｘ８ＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＸ９（配列番号８０）（式中、Ｘ１はＬ又はアセチル化−Ｌであり、Ｘ２はＴ又はＷであり、Ｘ３はＭ、Ｌ又はＶであり、Ｘ４はＱ又はＷであり、Ｘ５はＧ又はＡであり、Ｘ６はＴ又はＷであり、Ｘ７はＧ、Ｔ又はＷであり、Ｘ８はＭ、Ｌ又はＶであり、Ｘ９はＤ又はアミド化−Ｄである）からなり得る。別の実施形態では、修飾クプレドキシン由来ペプチドはＸ１ＤＰＫＬＹＤＫＤＬＧＳＡＸ２Ｘ３ＤＸ４ＶＶＸ５Ｘ６Ｘ７ＤＡＡＸ８ＳＸ９（配列番号８１）（式中、Ｘ１はＤ又はアセチル化−Ｄであり、Ｘ２はＭ、Ｌ又はＶであり、Ｘ３はＧ、Ｔ又はＷであり、Ｘ４はＴ又はＷであり、Ｘ５はＧ又はＡであり、Ｘ６はＱ又はＷであり、Ｘ７はＭ、Ｌ又はＶであり、Ｘ８はＴ又はＷであり、Ｘ９はＬ又はアミド化−Ｌである）を含み得る。別の実施形態では、修飾クプレドキシン由来ペプチドはＸ１ＤＰＫＬＹＤＫＤＬＧＳＡＸ２Ｘ３ＤＸ４ＶＶＸ５Ｘ６Ｘ７ＤＡＡＸ８ＳＸ９（配列番号８１）（式中、Ｘ１はＤ又はアセチル化−Ｄであり、Ｘ２はＭ、Ｌ又はＶであり、Ｘ３はＧ、Ｔ又はＷであり、Ｘ４はＴ又はＷであり、Ｘ５はＧ又はＡであり、Ｘ６はＱ又はＷであり、Ｘ７はＭ、Ｌ又はＶであり、Ｘ８はＴ又はＷであり、Ｘ９はＬ又はアミド化−Ｌである）からなり得る。関心のある具体的なペプチドを表３に示す。
【０１２９】
ＰＥＧ化
治療及び診断に重要な薬物にＰＥＧを共有結合により付加すると、インビボでの薬物の血漿半減期が延長され且つ／又はそれらの免疫原性及び抗原性が低下した（Ｈａｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｓｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ２：２１４−２２１（２００３））。例えば、ＰＥＧの付加は、とりわけ、インターロイキン（Ｋａｕｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１５０６４（１９８８）；Ｔｓｕｔｓｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ３３：４４７（１９９５））、インターフェロン（Ｋｉｔａ  ｅｔ  ａｌ，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ６：１５７（１９９０））、カタラーゼ（Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：３５８２（１９７７））、スーパーオキシドジスムターゼ（Ｂｅａｕｃｈａｍｐ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３１：２５（１９８３））、アデノシンデアニマーゼ（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ６６０：２９３（１９８１））等の多くの治療タンパク質の薬物動態特性を向上させた。ＦＤＡは、食品、化粧品、及び注射可能な製剤、局所製剤、直腸用製剤、経鼻製剤等の医薬品における賦形剤又は基剤としてのＰＥＧの使用を承認している。ＰＥＧはほとんど毒性を示さず、体からそのまま、腎臓により排除されるか（ＰＥＧ＜３０ｋＤａの場合）、便中に排出される（ＰＥＧ＞２０ｋＤａの場合）。ＰＥＧは水溶性が高い。
【０１３０】
化学予防剤、特にアズリンの切断型等のクプレドキシン由来ペプチドのＰＥＧ化は、腎臓の限外ろ過を少なくして身体からの薬物の排出を減少させることで患者の血流中におけるペプチドの寿命を延長するために用いられ得る。電荷の遮蔽は腎臓透過に影響を与え得る。電荷遮蔽は、タンパク質のイオン化可能な官能基、すなわちアミン又はカルボキシルの、パラムケミカル（ｐａｒａｍｃｈｅｍｉｃａｌ）な修飾により生じ得る。特に、タンパク質−ＰＥＧ誘導体を作製するための最も一般的な手法では、タンパク質のアミノ基をアミドに変換して正電荷を失わせる。これにより、タンパク質の限外濾過を変化させることができる。腎臓の限外濾過は陰イオン性巨大分子を中性又は陽性の巨大分子よりもゆっくりと除去することがわかっているので、アミノ基にＰＥＧをコンジュゲートすると血流中でのＰＥＧ化ペプチドの寿命が延びると予想される。
【０１３１】
分子サイズ及び球状限外ろ過（ｇｌｏｂｕｌａｒ  ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）も治療ペプチドの腎臓限外ろ過に影響を与え得る。腎臓で天然球状タンパク質を排除するための分子量のカットオフは約７０ｋＤａであると考えられており、これは血清アルブミンの分子量に近い。したがって、分子量が７０ｋＤａを超えるタンパク質は、肝臓への取込み、タンパク質消化、免疫系によるクリアランス等の腎臓限外ろ過以外の経路によって主に体から排出される。したがって、ＰＥＧ化により治療ペプチドのサイズを大きくすることで患者の血流からのそのペプチドの腎臓限外ろ過を低減することができる。
【０１３２】
更に、ペプチドのＰＥＧ化は、ペプチドの免疫原性を低下させ得、また、タンパク質分解酵素、食細胞、及び治療ペプチドとの直接接触を必要とするその他の因子からペプチドを保護し得る。分岐ＰＥＧの傘様構造は特に、接近するタンパク質分解酵素、抗体、食細胞等に対して線状ＰＥＧよりも保護効果が高いことが判明している（Ｃａｌｉｃｅｔｉ  ａｎｄ  Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５５：１２６１−１２７７８（２００３））。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドは、システイン分子に共有結合した１又は複数のＰＥＧ分子を有するように修飾される。共有結合は、ＰＥＧ分子からクプレドキシン由来ペプチドへの直接の共有結合である必要はなく、互いに共有結合した及び／又はクプレドキシン由来ペプチドに共有結合した、１又は複数のリンカー分子に共有結合されていてもよい。いくつかの実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドは部位特異的ＰＥＧ化を有する。具体的な実施形態では、ＰＥＧ分子は緑膿菌アズリン（配列番号１）のシステイン残基３、２６、及び／又は１１２に共有結合してよい。別の実施形態では、クプレドキシン由来ペプチド中に１又は複数のシステイン残基が置換導入され、ＰＥＧ化され得る。いくつかの実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドをＰＥＧ化する方法は、とりわけ、ＮＨＳ、還元的アニメ化、マリミド、又はエポキシドであり得る。別の実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドは１又は複数のリジン、システイン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニン、若しくはチロシン、又はＮ末端アミノ基若しくはＣ末端カルボン酸上でＰＥＧ化され得る。より具体的な実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドは１若しくは複数のリジン又はＮ末端アミノ基でＰＥＧ化され得る。別の実施形態では、クプレドキシン由来ペプチド中に１又は複数のリジン、システイン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニン、又はチロシン残基が置換により導入され、ＰＥＧ化される。別の実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドは１又は複数のアミノ基でＰＥＧ化されてよい。別の実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドは、ランダムに部位非特異的にＰＥＧ化されてよい。いくつかの実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドは、ＰＥＧベースポリマーの平均分子量が約２００〜約１００，０００ダルトン、約２，０００〜約２０，０００ダルトン、又は約２，０００〜約５，０００ダルトンであり得る。別の実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドは、分岐ＰＥＧ、特に約５０ｋＤａの分岐した１又は複数のＰＥＧ分子を含み得る。別の実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドは１又は複数の線状ＰＥＧ分子、特に約５ｋＤａの線状ＰＥＧ分子を含み得る。
【０１３４】
別の実施形態では、化学予防剤は、グルコース調節タンパク質７８（ＧＲＰ７８）に特異的に結合して癌細胞中に内部移行される１３マーの環状オリゴペプチドＰｅｐ４２のコンジュゲートであるクプレドキシン又はそのバリアント、構造的等価物、若しくは誘導体であるペプチドである。クプレドキシン又はクプレドキシンのバリアント、構造的等価物、若しくは誘導体は、その開示全体を参照により本明細書に援用するＹｏｎｅｄａ  ｅｔ  ａｌ，“Ａ  ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｉｃ  ＧＲＰ７８  ｌｉｇａｎｄ  ｆｏｒ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｄｒｕｇ  ｔｈｅｒａｐｙ，”Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １８：１６３２−１６３６（２００８）に開示されている合成方法に従いＰｅｐ４２とコンジュゲートされ得る。
【０１３５】
別の実施形態では、化学予防剤は、クプレドキシンの構造的等価物であるペプチドである。クプレドキシンとその他のタンパク質の間の有意な構造的相同性を決定する研究の例としては、Ｔｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  １：８２−９２（２００１））が含まれる。具体的には、クプレドキシンと構造的等価物の間の有意な構造的相同性はＶＡＳＴアルゴリズムを用いて決定され得る（Ｇｉｂｒａｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ６：３７７−３８５（１９９６）；Ｍａｄｅｊ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ２３：３５６−３６９０（１９９５））。具体的な実施形態では、クプレドキシンと構造的等価物の構造比較から得られるＶＡＳＴのｐ値は約１０−３未満、約１０−５未満、又は約１０−７未満であり得る。別の実施形態では、クプレドキシンと構造的等価物の有意な構造的相同性はＤＡＬＩアルゴリズムを用いて決定され得る（Ｈｏｌｍ  ＆  Ｓａｎｄｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３３：１２３−１３８（１９９３））。具体的な実施形態では、ペアワイズ構造比較のＤＡＬＩＺのスコアは少なくとも約３．５、少なくとも約７．０、又は少なくとも約１０．０である。
【０１３６】
本発明の組成物の化学予防剤、特にペプチドは、クプレドキシンのバリアント、誘導体、及び／又は構造的等価物の２つ以上であってもよいと考えられる。例えば、ペプチドは、ＰＥＧ化したアズリンの切断型、すなわちバリアント及び誘導体の両方であってもよい。一実施形態では、本発明のペプチドはα，α−二置換非天然アミノ酸を含むオレフィン含有テザーを用いて合成され、その後、ルテニウムが触媒するオレフィンのメタセシスによる全炭化水素「ステープル」が形成される（Ｓｃｈａｒｍｅｉｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２：５８９１−５８９２（２０００）；Ｗａｌｅｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０５：１４６６−１４７０（２００４））。更に、アズリンの構造的等価物であるペプチドを他のペプチドに融合させて構造的等価物及び誘導体の両方であるペプチドを作製してもよい。これらの例は単に本発明を説明するためのものであり、本発明を限定するものではない。クプレドキシンのバリアント、誘導体、又は構造的等価物は銅に結合してもよく、しなくてもよい。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、若しくは構造的等価物である化学予防剤は緑膿菌アズリン（特にｐ２８）の薬理活性の一部を有する。具体的な実施形態では、クプレドキシン並びにクプレドキシンのバリアント、誘導体、及び構造的等価物は、哺乳動物の細胞、組織、又は動物体、特に、限定されるものではないが乳腺細胞における前悪性病変の発生を阻害又は防止し得る。本発明はまた、哺乳動物の前悪性病変、特に、限定されるものではないがメラノーマ、乳癌、膵臓癌、膠芽腫、アストロサイトーマ、肺癌、結腸直腸癌、頭頸部癌、膀胱癌、前立腺癌、皮膚癌、及び子宮頸部癌の細胞の発生を阻害する能力を有し得るクプレドキシン並びにクプレドキシンのバリアント、誘導体、及び構造的等価物も提供する。癌細胞の発生の阻害とは、対照処置と比べて統計的に有意な前悪性病変の発生のあらゆる低減、又は増加速度の低下である。
【０１３８】
クプレドキシンは哺乳動物の細胞、組織、又は動物体、特に乳房細胞、より具体的にはマウス乳腺細胞における前悪性病変の発生及び最終的には癌の発生を阻害することができることが現在分かっているので、現在、この化学予防活性を保持しているクプレドキシンのバリアント及び誘導体を設計することが可能である。そのようなバリアント、誘導体、及び構造的等価物は、例えば、クプレドキシン並びにクプレドキシン由来ペプチドの種々のバリアント、誘導体、及び構造的等価物の「ライブラリー」を作製し、次いで、それぞれについて実施例１の例示的方法のような当該技術分野で公知の多数の方法の１つを用いて化学予防活性、特にマウス乳腺臓器培養における化学予防活性を試験することで作製することができる。得られた化学予防活性を有するクプレドキシンのバリアント、誘導体、及び構造的等価物は本発明の方法においてアズリン又はｐ２８の代わりに又はそれに加えて使用することができると考えられる。
【０１３９】
いくつかの特定の実施形態では、クプレドキシンのバリアント、誘導体、又は構造的等価物は、マウス乳腺臓器培養（ＭＭＯＣ）において７，１２−ジメチルベンズ（ａ）アントラセン（ＤＭＢＡ）により誘発される前悪性病変の発生を非処置の対照と比べて統計的に有意な程度に防止し得る。この活性についてのペプチドの試験は、Ｍｅｈｔａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  ９３：１１０３−１１０６（２００１））及びＭｅｈｔａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｅｔｈ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １９：１９−２４（１９９７）に記載されているように又は実施例１に記載されているようにＭＭＯＣモデル系を用いて行うことができる。癌の発生が阻害されているかどうかを決定するその他の方法は当該技術分野で周知であり、それらを用いてもよい。
【０１４０】
いくつかの具体的な実施形態では、クプレドキシンのバリアント、誘導体、又は構造的等価物はＭＭＯＣモデルにおいて乳房胞巣状病変（ＭＡＬ）の発生を非処置の対照と比べて統計的に有意な程度に阻害する。いくつかの具体的な実施形態では、クプレドキシンのバリアント、誘導体、又は構造的等価物は、ＭＭＯＣモデルにおける乳管病変（ＭＤＬ）の発生を非処理対照と比べて統計的に有意な程度に阻害する。これらの活性についてのペプチドの試験は、実施例１に記載されているように、ＤＭＢＡにより前悪性病変を形成するように誘導したＭＭＯＣモデル系を用いて行うことができる。ＭＭＯＣモデル系における前悪性病変の発生の評価は、実施例１に記載されているように、形態計測学的分析又は組織病理学的分析によって決定され得る。
【０１４１】
クプレドキシン
これらの小さいブルー銅タンパク質（クプレドキシン）は、細菌の電子伝達鎖に関与するか機能が未知の電子伝達タンパク質（１０〜２０ｋＤａ）である。銅イオンは単独でタンパク質基質に結合される。銅周辺の２個のヒスチジンリガンド及び１個のシステインリガンドへの特別な歪んだ三角形平面配置により、金属部位の非常に特異な電子特性及び強い青色が生じる。複数のクプレドキシンは中〜高分解能の結晶学的解析がなされている。
【０１４２】
クプレドキシンは一般的に配列相同性は低いが構造相同性は高い（Ｇｏｕｇｈ  ＆  Ｃｌｏｔｈｉａ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  １２：９１７−９２５（２００４）；Ｄｅ  Ｒｉｅｎｚｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ９：１４３９−１４５４（２０００））。例えば、アズリンのアミノ酸配列同一性は、オーラシアニンＢのアミノ酸配列に３１％、ラスチシアニンのアミノ酸配列に１６．３％、プラストシアニンのアミノ酸配列に２０．３％、シュードアズリンのアミノ酸配列に１７．３％である（表１を参照）。しかし、これらのタンパク質の構造類似性はより顕著である。アズリンとオーラシアニンＢの構造を比較したＶＡＳＴのｐ値は１０−７．４、アズリンとラスチシアニンでは１０−５、アズリンとプラストシアニンでは１０−５．６、アズリンとシュードアズリンでは１０−４．１である。
【０１４３】
全てのクプレドキシンは８本鎖のギリシャキーβ−バレル（Ｇｒｅｅｋ  ｋｅｙ  ｂｅｔａ−ｂａｒｒｅｌ）又はベータ−サンドイッチフォールドを有し、高度に保存された部位構造を有する（Ｄｅ  Ｒｉｅｎｚｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ９：１４３９−１４５４（２０００））。メチオニン、ロイシン等の多くの長鎖脂肪族残基の存在により、顕著な疎水性パッチがアズリン、アミシアニン、ラン藻プラストシアニン、キュウリ塩基性タンパク質の銅部位周辺に存在し、それよりは低い程度でシュードアズリン及び真核プラストシアニンの銅部位周辺に存在する（上記文献）。疎水性パッチは、ステラシアニン及びラスチシアニンの銅部位にもこれより低い程度で見られるが、これらは異なる特徴を有する（上記文献）。
【０１４４】
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１整列させた長さ：２つの構造間で重なる同等なＣ−アルファ原子対の数、すなわち、３Ｄでの重ね合わせを計算するために使用された残基の数。
２ｐ値：ＶＡＳＴのｐ値は、比較の有意性の尺度であり、確率で表される。例えば、ｐ値が０．００１であれば、全く偶然にこの質のマッチを見る見込みは１０００分の１である。ＶＡＳＴのｐ値は、ＭＭＤＢデータベース中に５００個の独立した無関係の種類のドメインがあると仮定して多重比較の影響について調整されている。したがって、示されているｐ値は各ドメイン対をペアワイズ比較して５００で割ったｐ値に相当する。
３スコア：ＶＡＳＴ構造類似性スコア。この数は、重ねられた二次構造要素の数及びその重ね合わせの質に関連する。ＶＡＳＴスコアが高いほど類似性が高い。
４ＲＭＳＤ：オングストロームで表した２乗平均平方根重ね合わせ残差。この数字は、同等なＣ−アルファ炭素間の平均平方距離の平方根として、２つの構造の最適な重ね合わせ後に計算される。ＲＭＳＤ値は構造アラインメントの程度に応じて大きくなり、ＲＭＳＤを全体的な構造類似性の記述に用いる場合はこのサイズを考慮に入れなければならない。
５卵成熟におけるエフリンアンタゴニストであることが示されている線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）主要精子タンパク質（Ｋｕｗａｂａｒａ，  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １７：１５５−１６１（２００３））。
【０１４５】
アズリン
アズリンは、特定の細菌の電子伝達に関与するクプレドキシンファミリーに属する１２８アミノ酸残基の銅含有タンパク質である。アズリンには、緑膿菌（ＰＡ）由来のもの（配列番号１）、Ａ．ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ由来のもの、及びＡ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ由来のものが含まれる（Ｍｕｒｐｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１５：８５９−８７１（２００２））。アズリン間のアミノ酸配列同一性は６０〜９０％で変わり、これらのタンパク質は強い構造的相同性を示した。全てのアズリンは、ギリシャキーモチーフを有する特徴的なβサンドイッチを有し、単一の銅原子が常にタンパク質の同じ領域に配置される。更に、アズリンは、銅部位を囲む本質的に中性の疎水性パッチを有する（上記文献）。
【０１４６】
プラストシアニン
プラストシアニンは、１分子当たり１個の銅分子を含み、酸化型が青色である、ラン藻、藻類、及び植物の可溶性タンパク質である。これらは、葉緑体中で生じ、そこで電子キャリアとして機能する。１９７８年にポプラのプラストシアニンの構造が決定されてから、藻類（セネデスムス属、エンテロモルファ属、クラミドモナス属）及び植物（フレンチビーン）のプラストシアニンの構造が結晶学的方法又はＮＭＲ法により決定され、ポプラの構造は１．３３Åの解像度まで解明された。配列番号３は、好熱性ラン藻のフォルミジウム・ラミノスム由来のプラストシアニンのアミノ酸配列を示している。別の関心のあるプラストシアニンはウルバ・ペルツシスのものである。
【０１４７】
藻類と維管束植物のプラストシアニン間では、配列は相違している（例えば、クラミドモナスとポプラのタンパク質間で６２％の配列同一性）が、三次元構造は保存されている（例えば、クラミドモナスとポプラのタンパク質のＣアルファ位において０．７６Åのｒｍｓ偏差）。構造的特徴としては、８本鎖逆平行ベータバレルの一端における歪んだ四面体銅結合部位、顕著な負のパッチ、及び平坦な疎水性表面が含まれる。銅部位は、電子伝達機能に最適化されており、負及び疎水性のパッチが生理学的反応相手の認識に関与すると提唱されている。化学修飾、架橋、及び部位特異的突然変異誘発実験により、シトクロムｆとの結合相互作用における負及び疎水性のパッチの重要性が確認され、プラストシアニンに関わる２つの機能的に大きな電子伝達系路のモデルが確認された。推定電子伝達系路の１つは比較的短く（約４Å）、疎水性パッチ中の溶媒に露出した銅リガンドＨｉｓ−８７が関与し、もう一方の経路はそれより長く（約１２〜１５Å）、負のパッチ中にほぼ保存された残基Ｔｙｒ−８３が関与する（Ｒｅｄｉｎｂｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｅｎｅｒｇ．Ｂｉｏｍｅｍｂｒ．２６：４９−６６（１９９４））。
【０１４８】
ラスチシアニン
ラスチシアニンは、チオバチルス属（今はアシドチオバチルス属と呼ばれる）から得られたブルー銅含有単鎖ポリペプチドである。鉄酸化細菌由来の非常に安定で非常に酸化性のクプレドキシンラスチシアニン（配列番号４）の酸化型のＸ線結晶構造が多波長異常回折により決定され、１．９Åの解像度まで解明されている。ラスチシアニンは、６本鎖及び７本鎖のβシートで構成されるコアベータサンドイッチフォールドから構成される。他のクプレドキシン同様、歪んだ四面体形に配置された４個の保存残基（Ｈｉｓ８５、Ｃｙｓ１３８、Ｈｉｓ１４３、Ｍｅｔ１４８）のクラスターが銅イオンに配位している（Ｗａｌｔｅｒ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：７３０−５１（１９９６））。
【０１４９】
シュードアズリン
シュードアズリンはブルー銅含有単鎖ポリペプチドファミリーである。アクロモバクター・サイクロクラステスから得られたシュードアズリンのアミノ酸配列を配列番号５に示す。シュードアズリンのＸ線構造解析は、シュードアズリンがアズリンと配列相同性は低いが同様な構造を有することを示している。シュードアズリンとアズリンの全体的構造の主な違いは２つである。シュードアズリンはアズリンよりも長いカルボキシ末端を有し、これは２個のアルファヘリックスからなる。ペプチド中央の領域で、アズリンは短いαヘリックスを含むフラップを形成する伸張されたループを含むが、これがシュードアズリンでは短くなっている。銅原子部位における唯一の主な違いはＭＥＴ側鎖のコンホメーション及びＭｅｔ−Ｓ銅結合長であり、シュードアズリンのＭｅｔ−Ｓ銅結合長はアズリンよりも有意に短い。
【０１５０】
フィトシアニン
フィトシアニンとして特定可能なタンパク質には、限定されるものではないが、キュウリ塩基性タンパク質、ステラシアニン、マビシアニン、ウメシアニン、キュウリピーリングクプレドキシン（ｃｕｃｕｍｂｅｒ  ｐｅｅｌｉｎｇ  ｃｕｐｒｅｄｏｘｉｎ）、エンドウ豆の鞘（ｐｅａ  ｐｏｄｓ）の推定ブルー銅タンパク質、及びシロイヌナズナのブルー銅タンパク質が含まれる。キュウリ塩基性タンパク質及びエンドウ豆の鞘タンパク質を除く全てにおいて、ブルー銅部位に通常見られる軸方向のメチオニンリガンドがグルタミンで置換されている。
【０１５１】
オーラシアニン
好熱性緑色滑走光合成細菌クロロフレクサス・アウランティアカスからオーラシアニンＡ、オーラシアニンＢ−１、及びオーラシアニンＢ−２と命名された３つの小さなブルー銅タンパク質が単離されている。２個のＢ型は糖タンパク質であり、互いにほぼ同じ特性を有するが、Ａ型とは明らかに異なる。ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、見かけのモノマー分子質量が１４（Ａ）、１８（Ｂ−２）、及び２２（Ｂ−１）ｋＤａであることが示された。
【０１５２】
オーラシアニンＡのアミノ酸配列が決定され、オーラシアニンＡは１３９残基のポリペプチドであることが示された（Ｖａｎ  Ｄｒｅｉｓｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ８：９４７−９５７（１９９９））。公知の小さな銅タンパク質プラストシアニン及びアズリン同様、Ｈｉｓ５８、Ｃｙｓ１２３、Ｈｉｓ１２８、及びＭｅｔ１３２が、それらが進化上保存されている金属リガンドであるとした場合に予想される通りの間隔で配置されている。二次構造予測も、オーラシアニンが緑膿菌のアズリン及びポプラの葉のプラストシアニンと同様な一般的なベータバレル構造を有することを示している。しかし、オーラシアニンは、両方の小さな銅タンパク質配列クラスの配列特徴を有しているようである。アズリンのコンセンサス配列との全体的類似性はプラストシアニンのコンセンサス配列との全体的類似性とほぼ同じであり、３０．５％である。オーラシアニンのＮ末端配列領域１〜１８にはグリシン及びヒドロキシアミノ酸が顕著に多い（上記文献）（例示的アミノ酸配列としてクロロフレクサス・アウランティアカスのオーラシアニンの鎖Ａである配列番号１５を参照されたい（ＮＣＢＩタンパク質データバンクアクセッション番号ＡＡＭ１２８７４））。
【０１５３】
オーラシアニンＢ分子は標準的なクプレドキシンフォールドを有する。クロロフレクサス・アウランティアカスのオーラシアニンＢの結晶構造が研究されている（Ｂｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．３０６：４７−６７（２００１））。追加的Ｎ末端鎖を除き、この分子は細菌のクプレドキシンであるアズリンと非常に類似している。他のクプレドキシンにおけるのと同様、ポリペプチドの鎖４上にＣｕリガンドの１つが存在し、残りの３つは鎖７と鎖８の間の大きなループに沿って存在する。Ｃｕ部位の形状は後者の３つのリガンド間のアミノ酸間隔を用いて記述される。結晶解析されたオーラシアニンＢのＣｕ結合ドメインはおそらく、複数の他の膜結合電子伝達タンパク質において知られているテザーと有意な配列同一性を示すＮ末端テイルによって細胞質膜のペリプラスム側に繋ぎ止められている。Ｂ型のアミノ酸配列はＭｃＭａｎｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：６５３１−６５４０（１９９２）に記載されている（例示的アミノ酸配列としてクロロフレクサス・アウランティアカスのオーラシアニンの鎖Ｂについて配列番号１６を参照されたい（ＮＣＢＩタンパク質データバンクアクセッション番号１ＱＨＱＡ））。
【０１５４】
ステラシアニン
ステラシアニンは、植物クプレドキシンの広範なファミリーであるフィトシアニンのサブクラスである。ステラシアニンの例示的配列を配列番号１４として本明細書に含める。セイヨウワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）の根から得られたステラシアニンであるウメシアニン（Ｋｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２７：１５８−１６６（２００５））及びキュウリステラシアニン（Ｈａｒｔ  ｅｌ  ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ５：２１７５−２１８３（１９９６））の結晶構造も公知である。このタンパク質の全体的フォールドは他のフィトシアニンと同様である。エフリンＢ２タンパク質外部ドメインの三次構造はステラシアニンと有意な類似性を有する（Ｔｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  １：８３−９２（２００１））。ステラシアニンの例示的アミノ酸配列は全米バイオテクノロジー情報センタータンパク質データバンクのアクセッション番号１ＪＥＲに見られる（配列番号１４）。
【０１５５】
キュウリ塩基性タンパク質
キュウリ塩基性タンパク質の例示的アミノ酸配列を配列番号１７として本明細書に含める。タイプ１ブルー銅タンパク質であるキュウリ塩基性タンパク質（ＣＢＰ）の結晶構造は１．８Åの解像度で解明されている。この分子は、ギリシャキーベータバレル構造を有する点で他のブルー銅タンパク質と似ているが、バレルが一方の側で開いており、「ベータサンドイッチ」又は「ベータタコス（ｂｅｔａ−ｔａｃｏ）」と記述する方が近い（Ｇｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：６８６−７０５（１９９６））。エフリンＢ２タンパク質外部ドメインの三次構造はキュウリ塩基性タンパク質に対して高い類似性を有する（５０α炭素に関してｒｍｓ偏差１．５Å）（Ｔｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  １：８３−９２（２００１））。
【０１５６】
Ｃｕ原子は、結合長がＣｕ−Ｎ（Ｈｉｓ３９）＝１．９３Ａ、Ｃｕ−Ｓ（Ｃｙｓ７９）＝２．１６Ａ、Ｃｕ−Ｎ（Ｈｉｓ８４）＝１．９５Ａ、Ｃｕ−Ｓ（Ｍｅｔ８９）＝２．６１Ａである通常のブルー銅ＮＮＳＳ’配位を有する。ジスルフィド結合（Ｃｙｓ５２）−Ｓ−Ｓ−（Ｃｙｓ８５）が分子構造の安定化に重要な役割を果たしているようである。ポリペプチドのフォールドは、ブルー銅タンパク質（フィトシアニン）サブファミリー及びＣＢＰと配列同一性が高い非金属タンパク質であるブタクサアレルゲンＲａ３に典型的なものである。現在フィトシアニンとして特定可能なタンパク質はＣＢＰ、ステラシアニン、マビシアニン、ウメシアニン、キュウリピーリングクプレドキシン、エンドウ豆の鞘の推定ブルー銅タンパク質、及びシロイヌナズナのブルー銅タンパク質である。ＣＢＰ及びエンドウ豆の鞘のタンパク質を除く全てにおいて、ブルー銅部位に通常見られる軸方向のメチオニンリガンドがグルタミンに置換されている。キュウリ塩基性タンパク質の例示的配列はＮＣＢＩタンパク質データバンクのアクセッション番号２ＣＢＰに見られる（配列番号１７）。
【０１５７】
抗エストロゲン薬
本発明の組成物及び方法に使用され得る抗エストロゲン薬としては、限定されるものではないが、エストロゲン又はプロゲステロンが受容体に結合するのを防止する化合物、例えばタモキシフェン、トレミフェン、エストラジオール、ラロキシフェン、ＥＭ−６５２、アルゾキシフェン、ラソフォキシフェン、ＩＣＩ−１６４，３８４、ＧＷ７６０４、及びＴｏｃｒｉｓ（ＩＣＩ−１８２，７８０）が含まれる。エストロゲン及びエストロゲン受容体の活性を標的にするかブロックする化合物にはフルベストラント及びその開示全体を参照により本明細書に援用するＫａｔｚｅｎｅｌｌｅｎｂｏｇｅｎ，Ｂ．Ｓ．ａｎｄ  Ｆｒａｓｏｒ，Ｊ．，Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ  ３１，Ｎｏ．１，Ｓｕｐｐｌ．３  ２８−３８（２００４）に記載されているその他の化合物も含み得る。
【０１５８】
本発明の組成物及び方法に使用され得る抗エストロゲン薬としては更に、限定されるものではないが、エストロゲン又はプロゲステロンの産生を防止する化合物、例えば、限定されるものではないが、アナストラゾール、エキセメスタン、レトロゾール等のステロイド性であっても非ステロイド性であってもよいアロマターゼ阻害剤及びその開示全体を参照により本明細書に援用するＥｉｓｅｎ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，３４：１５７−１７４（２００８）に開示又は記載されているその他の化合物が含まれ得る。Ｅｉｓｅｎの論文に開示されている用量、例えば毎日２０ｍｇのタモキシフェン、毎日１ｍｇのアナストロゾール、毎日２．５ｍｇのレトロゾール、及び毎日２５ｍｇのエキセメスタンも、本明細書に開示する本発明の組成物及び方法において使用され得る。
【０１５９】
使用方法
化学予防療法は、発癌に関与するプロセスを妨げることで癌の発生が防止される又は少なくとも遅くなるという証拠に基づく。クプレドキシン緑膿菌アズリン（配列番号１）、切断型アズリンペプチドｐ２８（アズリンのアミノ酸５０〜７７；配列番号２）及び切断型アズリンペプチドｐ１８（アズリンのアミノ酸５０〜５７）（配列番号２５）は、現在、前悪性病変の初期の形成を阻害することによって又は存在している前悪性病変を死滅させるかその成長を阻害することによって前悪性病変の発生を阻害することが知られている。
【０１６０】
したがって、前悪性病変の発生を阻害する、抑制する、防止する、逆転させる、遅らせる、又はそのリスクを低減する能力を有する本明細書に記載のクプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、切断型、若しくは構造的等価物を、前悪性病変に罹患している患者、癌に罹患している患者、又はその他の点では健康な患者の化学予防療法に単独で又は１若しくは複数の他の化学予防剤と組み合わせて使用することができると考えられる。そのようなその他の点では健康な患者は、いくつかの実施形態では、一般集団よりも癌が発生するリスクが大きい患者である。本発明の組成物を用いた処置により処置又は防止され得る癌としては、限定されるものではないが、メラノーマ、乳癌、膵臓癌、膠芽腫、アストロサイトーマ、肺癌、結腸直腸癌、頭頸部癌、膀胱癌、前立腺癌、皮膚癌、及び子宮頸癌が含まれる。いくつかの実施形態では、患者はヒトであり得る。別の実施形態では、患者はヒトでなく、例えば非ヒト哺乳動物である。
【０１６１】
本発明は、哺乳動物の細胞及び／又は患者の前悪性病変及び癌に対して化学予防効果を有する方法であって、ｐ１８（配列番号２５）、ｐ２８（配列番号２）等のアズリンの切断型であり得る第１の化学予防剤と、抗エストロゲン薬等の第２の化学予防剤と、薬学的に許容されるキャリアとを含む医薬組成物を患者に投与することを含む方法、を提供する。
【０１６２】
本発明は更に、前述のクプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、切断型、若しくは構造的等価物である少なくとも１つの化学予防剤を単独で又は抗エストロゲン薬等の１又は複数の他の化学予防剤と組み合わせて投与することにより、哺乳動物患者を処置する方法、すなわち哺乳動物の細胞及び／又は患者において化学予防効果を有する方法を提供する。本発明の方法で使用される抗エストロゲン薬には、タモキシフェン、フェンレチニド、及びアロマターゼ阻害剤が含まれ得る。実施例３及び４に示されるように、アズリンの切断型ｐ２８等のクプレドキシン及びタモキシフェンは、癌病変に対して相乗的阻害効果を有する。
【０１６３】
本発明は更に、例えばｐ１８（配列番号２５）、ｐ２８（配列番号２）等のアズリンの切断型であり得る少なくとも１つの化学予防剤及び抗エストロゲン薬を任意の順序で細胞又は患者に投与することによる哺乳動物細胞及び哺乳動物患者においてｐ５３の発現を増加させる方法を含む。実施例４に示されるように、ｐ２８は、タモキシフェン又はエストロゲン活性をブロックするための別の抗エストロゲン薬が存在する場合、哺乳動物細胞中でのｐ５３の発現を増加させることができる。
【０１６４】
本発明は更に、例えばｐ１８（配列番号２５）、ｐ２８（配列番号２）等のアズリンの切断型であり得る少なくとも１つの化学予防剤及び抗エストロゲン薬を任意の順序で哺乳動物の細胞又は患者に投与することによる、哺乳動物細胞又は哺乳動物患者においてエストロゲン受容体のｐ５３への結合を減少させる方法を含む。本明細書に記載されているように、エストロゲン受容体（「ＥＲ」）−ｐ５３複合体はｐ５３の発現を防止する。タモキシフェンで処置すると、ＥＲのｐ５３への結合が防止される。実施例３及び４に示されるように、タモキシフェンの存在下で腺をｐ２８とインキュベートすると、哺乳動物細胞中でのｐ５３の発現が促進されるか増加する。
【０１６５】
本発明は更に、例えばｐ１８（配列番号２５）、ｐ２８（配列番号２）等の切断型アズリンであり得る化学予防剤を１回投与量のタモキシフェンと哺乳動物患者又は哺乳動物細胞に投与することによる、タモキシフェンの用量関連毒性を低減する方法を含む。実施例３により示されるように、低用量のタモキシフェンと低濃度のｐ２８を組み合わせることで前悪性病変及び癌を阻害することができる。いくつかの実施形態では、化学予防剤（例えばｐ２８）及び抗エストロゲン薬（例えばタモキシフェン）は、同時又はほぼ同時に任意の順序で投与され得る。
【０１６６】
本発明は更に、哺乳動物細胞を、発癌物質とインキュベートする前又は後に、１若しくは複数の他の化学予防剤と組み合わされた又は単独のクプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、切断型、若しくは構造的等価物を含む組成物に接触させ、細胞の発生を観察することを含む、癌の発生を研究する方法を含む。いくつかの実施形態では、細胞はマウス乳腺細胞であり、別の実施形態では、細胞は哺乳動物の体内で悪性になり得る他の細胞である。
【０１６７】
本発明は更に、細胞をクプレドキシン由来ペプチドに接触させることにより細胞中のｐ５３のユビキチン化を防止することを含む方法に関する。別の実施形態では、ペプチドはクプレドキシンの切断型である。別の実施形態では、クプレドキシンはアズリンである。別の実施形態では、アズリンは緑膿菌に由来する。別の実施形態では、ペプチドは配列番号２を含む。別の実施形態では、ペプチドは配列番号２からなる。別の実施形態では、ペプチドは、配列番号２５、配列番号３８、配列番号３９、及び配列番号８６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１６８】
本発明は更に、ｐ５３の疎水性ＤＮＡ結合ドメイン内に結合する化合物にｐ５３を接触させることによりｐ５３のユビキチン化を防止することを含む方法に関する。別の実施形態では、疎水性ＤＮＡ結合ドメインはアミノ酸８０〜２７６を含む。更に別の実施形態では、疎水性ＤＮＡ結合ドメインはアミノ酸８０〜２７６からなる。本方法の別の実施形態では、化合物はクプレドキシン由来ペプチドである。別の実施形態では、ペプチドはクプレドキシンの切断型である。別の実施形態では、クプレドキシンはアズリンである。別の実施形態では、ペプチドは配列番号２を含む。別の実施形態では、ペプチドは配列番号２からなる。更に別の実施形態では、ペプチドは、配列番号２５、配列番号３８、及び配列番号３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１６９】
本発明は更に、ｐ５３のユビキチン化をブロックすることによって癌の発生を阻害することを含む方法であって、前記ブロックが、ｐ５３の疎水性ＤＮＡ結合ドメイン内に結合する化合物にｐ５３を接触させることにより達成される、方法に関する。別の実施形態では、疎水性ＤＮＡ結合ドメインはアミノ酸８０〜２７６を含む。更に別の実施形態では、疎水性ＤＮＡ結合ドメインはアミノ酸８０〜２７６からなる。別の実施形態では、化合物はクプレドキシン由来ペプチドである。別の実施形態では、ペプチドはクプレドキシンの切断型である。別の実施形態では、クプレドキシンはアズリンである。別の実施形態では、ペプチドは配列番号２を含み、更に別の実施形態では、ペプチドは配列番号２からなる。別の実施形態では、ペプチドは、配列番号２５、配列番号３８、及び配列番号３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１７０】
本発明は更に、ｐ５３の疎水性ＤＮＡ結合ドメイン内に結合する化合物にｐ５３を接触させることによりｐ５３のプロテアソーム分解を防止することを含む方法に関する。一実施形態では、疎水性ＤＮＡ結合ドメインはアミノ酸８０〜２７６を含む。別の実施形態では、疎水性ＤＮＡ結合ドメインはアミノ酸８０〜２７６からなる。別の実施形態では、化合物はクプレドキシン由来ペプチドである。別の実施形態では、ペプチドはクプレドキシンの切断型である。別の実施形態では、クプレドキシンはアズリンである。更に別の実施形態では、ペプチドは配列番号２を含む。別の実施形態では、ペプチドは配列番号２からなる。一実施形態では、ペプチドは、配列番号２５、配列番号３８、及び配列番号３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１７１】
本発明は更に、ｐ５３の疎水性ＤＮＡ結合ドメインに結合する化合物とｐ５３を接触させることによりＭＤＭ２非依存性及びＰａｒｃ非依存性の経路を介したｐ５３のプロテアソーム分解を防止することを含む方法に関する。別の実施形態では、疎水性ＤＮＡ結合ドメインはアミノ酸８０〜２７６を含む。更に別の実施形態では、疎水性ＤＮＡ結合ドメインはアミノ酸８０〜２７６からなる。いくつかの実施形態では、化合物はクプレドキシン由来ペプチドである。別の実施形態では、ペプチドはクプレドキシンの切断型である。別の実施形態では、クプレドキシンはアズリンである。更に別の実施形態では、ペプチドは配列番号２を含む。別の実施形態では、ペプチドは配列番号２からなる。更に別の実施形態では、ペプチドは、配列番号２５、配列番号３８、及び配列番号３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１７２】
本明細書に開示されている方法は、前悪性病変患者、癌患者、及び／又は一般集団よりも癌が発生するリスクが高い患者を処置するために使用され得る。一般集団よりも癌が発生するリスクが高い患者は、高リスク特性を有する患者、前悪性病変を有する患者、及び初発癌の治療歴を有する又は前悪性病変の根治的処置を施された患者であり得る（概略はＴｓａｏ  ｅｔ  ａｌ，ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  ５４：１５０−１８０（２００４）参照）。高リスク特性は、患者の行動的要因、遺伝的要因、環境的要因、又は生理的要因であり得る。患者を様々な形態の癌に罹りやすくする行動的要因には、限定されるものではないが、喫煙、食事（ｄｉｅｔ）、飲酒、ホルモン置換療法、高い肥満度指数、未産、ビンロウジ（ｂｅｔａｌ  ｎｕｔ）の使用、口腔洗浄薬の頻繁な使用、ヒトパピローマウイルスへの暴露、小児期の及び慢性的な日光への暴露、若年齢での初性交、複数の性的パートナー、及び経口避妊薬の使用が含まれる。患者を様々な形態の癌に罹りやすくする遺伝的要因には、限定されるものではないが、癌の家族歴、ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２の遺伝子保有状態、乳房新生物の前病歴、家族性腺腫性ポリポーシス（ＦＡＰ）、遺伝性非ポリポーシス結腸直腸癌（ＨＮＰＣＣ）、赤毛又はブロンド毛及び皮膚が色白の表現型、色素性乾皮症、並びに民族性が含まれる。患者を様々な形態の癌に罹りやすくする環境特性としては、限定されるものではないが、ラドン、多環式芳香族炭化水素、ニッケル、クロマート、ヒ素、アスベスト、クロロメチルエーテル、ベンゾ［ａ］ピレン、放射線、及びゴム由来の芳香族アミンへの暴露、又は塗料への職業的暴露が含まれる。患者を様々な形態の癌に罹りやすくするその他の種々の要因としては、限定されるものではないが、気道閉塞による慢性閉塞性肺疾患、慢性膀胱感染症、住血吸虫症、高齢、及び免疫不全状態が含まれる。
【０１７３】
更に、癌が発生するリスクの高い患者は、特定の種類の癌について開発された種々のリスクモデルを用いて決定され得る。例えば、乳癌に罹りやすい患者は、とりわけ、ゲイル（Ｇａｉｌ）リスクモデル又はクラウス（Ｃｌａｕｓ）モデルを用いて決定され得る（Ｇａｉｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  ８１：１８７９−１８８６（１９８９）；Ｃｕｚｉｃｋ，Ｂｒｅａｓｔ  １２：４０５−４１１（２００３）；Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ａｍ  Ｊ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ  １５１：７０３−７１４（２０００）参照）。
【０１７４】
前悪性病変を有する患者は一般集団よりも癌が発生するリスクが高い。患者が前悪性病変を有するかどうかは当業者に周知の多くの方法で決定され得る。前悪性病変起源の中間体マーカー又はバイオマーカーを患者の体内で測定して患者が前悪性病変を有するかどうかを決定してもよい。大部分の癌患者において、腫瘍細胞及び隣接する組織学的に正常な組織で染色体異常が生じている。染色体異常の進行は前悪性病変から浸潤癌への表現型の進行と並行する（Ｔｈｉｂｅｒｖｉｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５：５１３３−５１３９（１９９５））。したがって、癌に関連する染色体異常を患者の前悪性病変を検出するための中間体マーカーとして用いることもできる。癌に伴う一般的な染色体異常としては、限定されるものではないが、３ｐ（ＦＨＩＴ等）、９ｐ（ｐ１６ＩＮＫ４、ｐ１５ＩＮＫ４Ｂ、及びｐ１９ＡＲＦでは９ｐ２１）、１７ｐ（ｐ５３遺伝子等では１７ｐ１３）及び１３ｑ（網膜芽細胞腫遺伝子Ｒｂ等には１３ｑ１４）等の腫瘍抑制因子遺伝子における対立遺伝子の欠失又はヘテロ接合性の消失（ＬＯＨ）が含まれる。３ｐ及び９ｐにおける欠失は喫煙及び肺癌の初期段階に関係している（Ｍａｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８９：８５７−８６２（１９９７））。３ｐ、５ｑ、８ｐ、１７ｐ、及び１８ｑに影響を与える欠失は上皮癌において一般的な変化である（概略についてはＴｓａｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＡ  Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．Ｃｌｉｎ．５４：１５３（２００４）参照）。癌に関連するその他の染色体変異として、癌遺伝子を活性化するものが含まれる。その存在を中間体マーカーとして使用することができる癌遺伝子には、限定されるものではないが、Ｒａｓ、ｃ−ｍｙｃ、上皮増殖因子、ｅｒｂ−Ｂ２、並びにサイクリンＥ、Ｄ１、及びＢ１が含まれる（概略については上記文献の１５４参照）。
【０１７５】
その他の中間体マーカーとしては、前悪性細胞及び癌細胞においてアップレギュレートされる遺伝子産物を挙げることができる。前悪性細胞においてアップレギュレートされ得る遺伝子には、限定されるものではないが、シクロオキシゲナーゼＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２、テロメラーゼが含まれる。癌細胞及び一部の前悪性細胞のその他のバイオマーカーには、限定されるものではないが、ｐ５３、上皮増殖因子受容体（ＧＦＲ）、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）、ＲＡＳ、ＣＯＸ−２、Ｋｉ−６７、ＤＮＡ異数性、ＤＮＡポリメラーゼ−α、ＥＲ、Ｈｅｒ２ｎｅｕ、Ｅ−カドヘリン、ＲＡＲβ、ｈＴＥＲＴ、ｐ１６ＩＮＫ４ａ、ＦＨＩＴ（３ｐ１４）、Ｂｃｌ−２、ＶＥＧＦ−Ｒ、ＨＰＶ感染、ＬＯＨ  ９ｐ２１、ＬＯＨ  １７ｐ、ｐ−ＡＫＴ、ｈｎＲＮＰ  Ａ２／Ｂ１、ＲＡＦ、Ｍｙｃ、ｃ−ＫＩＴ、サイクリンＤ１、Ｅ及びＢ１、ＩＧＦ１、ｂｃｌ−２、ｐ１６、ＬＯＨ  ３ｐ２１．３、ＬＯＨ  ３ｐ２５、ＬＯＨ  ９ｐ２１、ＬＯＨ  １７ｐ１３、ＬＯＨ  １３ｑ、ＬＯＨ  ８ｐ、ｈＭＳＨ２、ＡＰＣ、ＤＣＣ、ＤＰＣ４、ＪＶ１８、ＢＡＸ、ＰＳＡ、ＧＳＴＰ１、ＮＦ−ｋＢ、ＡＰ１、Ｄ３Ｓ２、ＨＰＶ感染、ＬＯＨ  ３ｐ１４、ＬＯＨ  ４ｑ、ＬＯＨ  ５ｐ、膀胱腫瘍抗原（ＢＴＡ）、ＢＴＫ  ＴＲＡＫ（ワシントン州レドモンドのアリデックス社（Ａｌｉｄｅｘ，Ｉｎｃ）製）、尿路マトリックスタンパク質２２、フィブリン分解産物、自己分泌型細胞運動刺激因子（ａｕｔｏｄｒｉｎｅ  ｍｏｔｉｌｉｔｙ  ｆａｃｔｏｒ）受容体、ＢＣＬＡ−４、サイトケラチン２０、ヒアルロン酸、ＣＹＦＲＡ２１−１、ＢＣＡ、ベータ−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、並びに組織ポリペプチド抗原（ＴＰＡ）が含まれる（概略については上記文献の１５５〜１５７参照）。
【０１７６】
初発癌を治療された患者又は前悪性病変の根治的処置を施された患者も一般集団よりも癌を発症するリスクが高い。第２の原発腫瘍（Ｓｅｃｏｎｄ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｔｕｍｏｒ）とは、癌の病歴を有する人における新たな原発性癌を意味する。第２の原発腫瘍は、頭頸部癌における主な死亡原因である（上記文献の１５０）。第２の原発腫瘍と転移は前者が新規なものであるのに対し後者は既に存在する腫瘍を起源とするという点で異なる。乳房、頭頸部、肺、及び皮膚の癌又は前悪性病変の治療歴を有する患者は第２の原発腫瘍を発症するリスクが特に高い。
【０１７７】
クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、切断型、若しくは構造的等価物及び１又は複数の他の化学予防剤を含む組成物は、当業者に周知の多くの経路及び多くの投与計画により患者に投与することができる。具体的な実施形態では、クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、切断型、若しくは構造的等価物及び１又は複数の他の化学予防剤は、静脈内、筋肉内、皮下、局所、経口、又は吸入により投与される。組成物は、癌が発生するリスクのある患者の体内の部位に組成物を送達する任意の手段によって患者に投与され得る。具体的な実施形態では、クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、切断型、若しくは構造的等価物及び１又は複数の他の化学予防剤は静脈内投与される。
【０１７８】
一実施形態では、方法は、例えば前悪性病変を有する又は前悪性病変を発生させるリスクのある患者にクプレドキシン又はクプレドキシンのバリアント、誘導体、切断型、若しくは構造的等価物を含む組成物の１単位投与量及び別の化学予防薬を含む組成物の１単位投与量を、任意の順番で、ほぼ同時に、又は他方の投与からほぼ所定の時間以内に、例えば他方の薬物を投与してから約１〜約６０分以内若しくは他方の薬物を投与してから約１〜約１２時間以内に、共投与することを含み得る。関心のある化学予防薬としては、限定されるものではないが、抗エストロゲン薬、例えばタモキシフェン及びアロマターゼ阻害薬、例えばレトロゾール、エキセメスタン、及びアナストロゾール（Ａｒｉｍｉｄｅｘ（登録商標））；レチノイド、例えばＮ−［４−ヒドロキシフェニル］レチンアミド（４−ＨＰＲ、フェンレチニド）；非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、例えばアスピリン及びスリンダク；セレコキシブ（ＣＯＸ−２阻害薬）、デフルオロメチルオルニチング（ＤＦＭＯ）、ウルソデオキシコール酸、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａレダクターゼ阻害薬、ＥＫＩ−７８５（ＥＧＦＲ阻害薬）、ベバシズマブ（ＶＥＧＦ受容体に対する抗体）、セツキシマブ（ＥＧＦＲに対する抗体）、レチノール、例えばビタミンＡ、ベータ−カロテン、１３−シスレチノイン酸、イソトレチノイン、及びパルミチン酸レチニル；α−トコフェロール、インターフェロン、腫瘍退縮アデノウイルスｄｌ１５２０（ＯＮＹＸ−０１５）、ゲフィチニブ、エトレチナート、フィナステリド、インドール−３−カルビノール、レスベラトロール、クロロゲン酸、ラロキシフェン、及びオルチプラズが含まれる。
【０１７９】
クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、切断型、若しくは構造的等価物と１又は複数の他の化学予防剤とを含む医薬組成物
クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、切断型、若しくは構造的等価物と１又は複数の他の化学予防剤とを含む医薬組成物は任意の従来の様式、例えば従来の混合、溶解、顆粒化、糖衣錠化、乳化、カプセル化、封入、又は凍結乾燥プロセスによって製造され得る。実質的に純粋な又は医薬品グレードのクプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、切断型、及び構造的等価物並びに１又は複数の他の化学予防剤は当該技術分野で周知の薬学的に許容されるキャリアと容易に組み合わせることができる。そのようなキャリアは、錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等に調合物を製剤することを可能にする。好適なキャリア又は補形剤には、例えば充填剤及びセルロース標品も含まれ得る。その他の補形剤としては、例えば香味剤、着色剤、脱粘着剤、増粘剤、及びその他の許容可能な添加剤、アジュバント、又は結合剤が含まれ得る。いくつかの実施形態では、医薬製剤は保存剤を実質的に含まない。別の実施形態では、医薬製剤は少なくとも１つの保存剤を含んでもよい。医薬品の剤形に関する一般的方法論はＡｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ  ＭＤ（１９９９））に記載されている。
【０１８０】
本発明に使用されるクプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、切断型、若しくは構造的等価物と１又は複数の他の化学予防剤とを含む組成物は、注射（例えば皮内、皮下、筋肉内、腹腔内等）、吸入、局所投与、坐剤、経皮パッチ、又は経口等の種々の方法で投与され得る。薬物送達系に関する一般的情報は上記のＡｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌに記載されている。いくつかの実施形態では、クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、切断型、若しくは構造的等価物と１又は複数の他の化学予防剤とを含む組成物は、とりわけ、皮下及び静脈内投与用に注射剤として製剤化して直接使用することができる。注射可能な製剤は、特に、化学予防療法に適した患者の処置への使用に都合がよいことがある。クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、切断型、若しくは構造的等価物と１又は複数の他の化学予防剤とを含む組成物は、ポリプロピレングリコール等の保護剤又は同様なコーティング剤と混合した後に経口摂取することもできる。
【０１８１】
投与が注射によるものである場合、クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、切断型、若しくは構造的等価物及び１又は複数の他の化学予防剤は、水溶液、特に生理学的に適合性のあるバッファー、例えばハンクス液、リンゲル液、又は生理食塩水バッファー等の中に処方され得る。溶液は、懸濁剤、安定化剤、及び／又は分散剤等の製剤化剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ  ａｇｅｎｔ）を含み得る。あるいは、クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、切断型、若しくは構造的等価物及び１又は複数の他の化学予防剤は、使用前に好適なビヒクル（例えば発熱性物質を含まない滅菌水）と構築されるための粉末形態であってもよい。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ペプチドにより刺激される免疫応答を亢進するアジュバント又は任意のその他の物質を含まない。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ペプチドへの免疫応答を阻害する物質を含む。
【０１８２】
投与が静脈内輸液によるものである場合、クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、切断型、若しくは構造的等価物及び１又は複数の他の化学予防剤の投与に用いられる静脈内輸液は、クリスタロイド又はコロイドで構成され得る。本発明において、クリスタロイドは無機塩又はその他の水溶性分子の水溶液である。本明細書において、コロイドはゼラチン等のより大きな不溶性分子を含む。静脈内輸液は無菌であり得る。
【０１８３】
静脈内投与に使用され得るクリスタロイド液としては、限定されるものではないが、表２に示されるように、通常食塩水（濃度０．９％の塩化ナトリウム溶液）、乳酸リンゲル又はリンゲル液、及びＤ５Ｗとも呼ばれる５％デキストロース水溶液が含まれる。
【０１８４】
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＊乳酸リンゲル液は更に２８ｍｍｏｌ／Ｌの乳酸、４ｍｍｏｌ／ＬのＫ＋、及び３ｍｍｏｌ／ＬのＣａ２＋を含む。
【０１８５】
投与が吸入によるものである場合、クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、切断型、若しくは構造的等価物及び１又は複数の他の化学予防剤は、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、二酸化炭素、又はその他の好適な気体等の好適な噴射剤を用いて加圧パック又はネブライザーからのエアロゾルスプレーの形態で送達され得る。加圧エアロゾルの場合、計量された量を送達するための弁を設けることで用量単位が決定され得る。吸入器（ｉｎｈａｌｅｒ）又は吹き付け器（ｉｎｓｕｆｆｌａｔｏｒ）で使用するためのカプセル及び薬包（例えばゼラチン）は、タンパク質とラクトース又はでんぷん等の好適な粉末基剤との粉末混合物を含むように製剤化され得る。
【０１８６】
投与が局所投与によるものである場合、クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、切断型、若しくは構造的等価物及び１又は複数の他の化学予防剤は、当該技術分野で周知のように、溶液、ゲル、軟膏、クリーム、ゼリー、懸濁液等として製剤化され得る。いくつかの実施形態では、投与は経皮パッチによる。投与が坐剤によるものである場合（例えば直腸又は腟内）、クプレドキシン又はそのバリアント、切断型、及び誘導体並びに１又は複数の他の化学予防剤の組成物は、従来の坐剤基剤を含む組成物に製剤化されてもよい。
【０１８７】
投与が経口によるものである場合、クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、切断型、若しくは構造的等価物及び１又は複数の他の化学予防剤は、クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、切断型、若しくは構造的等価物及び１又は複数の他の化学予防剤を当該技術分野で周知の薬学的に許容されるキャリアと組み合わせて容易に製剤化され得る。マンニトール、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム等の固体キャリアを用いてもよく、そのようなキャリアは、クプレドキシン及びそのバリアント、誘導体、又は構造的等価物を、処置される対象による経口摂取のための錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル剤、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等として製剤化することを可能にする。例えば散剤、カプセル剤、錠剤等の経口用固体製剤のための好適な補形剤としては、糖、セルロース標品、造粒剤、結合剤等の充填剤が含まれる。
【０１８８】
当該技術分野で周知のその他の便利なキャリアとして、細菌莢膜性多糖類、デキストラン、遺伝子操作されたベクター等の多価キャリアも含まれる。更に、クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、切断型、若しくは構造的等価物と１又は複数の他の化学予防剤とを含む徐放性製剤は、長期間にわたるクプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、切断型、若しくは構造的等価物及び１又は複数の他の化学予防剤の放出を可能し、徐放性製剤がない場合にはクプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、切断型、若しくは構造的等価物及び１又は複数の他の化学予防剤が治療効果を引き出す又は高める前に対象の系から除去され且つ／又は例えばプロテアーゼ及び単純な加水分解により分解される。
【０１８９】
本発明のペプチド及び１又は複数の他の化学予防剤の血流中における半減期は当業者に周知の複数の方法により延長又は最適化することができる。本発明のペプチドバリアント及び１又は複数の他の化学予防剤としては、限定されるものではないが、哺乳動物の細胞、組織、及び動物体において前悪性病変の発生を阻害するペプチド及び１又は複数の他の化学予防剤の活性を保持しつつ、血流中でその安定性、比活性、寿命を高め得且つ／又はクプレドキシンの免疫原性を低下させ得る種々のバリアントが含まれ得る。そのようなバリアントとしては、限定されるものではないが、ペプチド及び１又は複数の他の化学予防剤の加水分解を低減するもの、ペプチド及び１又は複数の他の化学予防剤の脱アミド化を低減するもの、酸化を低減するもの、免疫原性を低減するもの、ペプチドの構造的安定性を強化するもの、又はペプチド及び１又は複数の他の化学予防剤のサイズを大きくするものが含まれる。そのようなペプチドには、環状ペプチド（Ｍｏｎｋ  ｅｔ  ａｌ，ＢｉｏＤｒｕｇｓ  １９（４）：２６１−７８（２００５）；ＤｅＦｒｅｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ．６３（５）：４０９−１９（２００４））参照）、Ｄ，Ｌ−ペプチド（ジアステレオマー）（Ｆｕｔａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｆｅｂ  ２３；２７６（８）：５８３６−４０（２００１）；Ｐａｐｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４（１６）：５７７９−８６（２００４）；Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３６（１）：１６９−７６（１９８７）参照）；異常アミノ酸を含むペプチド（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ．６３（２）：６９−８４（２００４）参照）、Ｎ末端及びＣ末端の修飾（Ｌａｂｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｍｅｄ．１３（５）：２７５−８（１９９０）参照）、炭化水素ステープリング（Ｓｃｈａｆｍｅｉｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２：５８９１−５８９２（２０００）；Ｗａｌｅｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０５：１４６６−１４７０（２００４）参照）、及びＰＥＧ化も含まれる。
【０１９０】
種々の実施形態において、医薬組成物は、キャリア及び補形剤（限定されるものではないが、バッファー、炭水化物、マンニトール、タンパク質、ポリペプチド、又はグリシン等のアミノ酸、抗酸化剤、静菌剤、キレート剤、懸濁剤、増粘剤、及び／又は保存剤が含まれる）、水、油、食塩水、デキストロース及びグリセロールの水溶液；生理学的条件に近づけるために必要なその他の薬学的に許容される補助剤物質、例えば緩衝剤、張性調節剤、湿潤剤等を含む。当業者に公知の任意の好適なキャリアを本発明の組成物の投与に使用できるが、キャリアの種類は投与形態によって異なることが理解されよう。化合物は、周知の技術を用いてリポソーム内にカプセル化してもよい。生分解性マイクロスフェアも本発明の医薬組成物のキャリアとして使用され得る。好適な生分解性マイクロスフェアは、例えば米国特許第４，８９７，２６８号、同第５，０７５，１０９号、同第５，９２８，６４７号、同第５，８１１，１２８号、同第５，８２０，８８３号、同第５，８５３，７６３号、同第５，８１４，３４４号、及び同第５，９４２，２５２号に開示されている。
【０１９１】
医薬組成物は従来の周知の滅菌技術で滅菌されてよく、あるいは滅菌ろ過されてもよい。得られた水溶液は、そのまま又は凍結乾燥されてパーケージ化され得、凍結乾燥標品は投与前に無菌溶液と混合される。
【０１９２】
クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、切断型、若しくは構造的等価物及び１又は複数の化学予防剤の投与
クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、切断型、若しくは構造的等価物及び１又は複数の他の化学予防剤は、医薬組成物として製剤化されて投与され得、任意の好適な経路、例えば経口、頬側、吸入、舌下、直腸、腟内、経尿道、経鼻、局所、経皮（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓすなわちｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、又は非経口（例えば静脈内、筋肉内、皮下、及び冠動脈内）、又は硝子体内投与（ｖｉｔｒｅｏｕｓ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）により投与され得る。その医薬製剤は、その意図する目的の達成に有効な任意の量で投与され得る。より具体的には、組成物は治療有効量で投与される。具体的な実施形態では、治療有効量は通常、約０．０１〜２０ｍｇ／ｄａｙ／ｋｇ体重である。
【０１９３】
クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、切断型、若しくは構造的等価物を含む化合物は、単独又は他の化学予防剤との組合せで、癌の防止に有用である。適切な用量は、当然ながら、例えば使用されるクプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、若しくは構造的等価物の化合物、共投与に選択される他の化学予防剤の種類（あれば）、宿主、投与形態、並びに潜在的な癌の性質及び重症度によって変わる。しかし、一般的に、１日用量が約０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重の時にヒトにおいて満足な結果を得られることが示されている。ヒトにおいて指定される１日用量は、クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、若しくは構造的等価物の化合物約０．７〜約１４００ｍｇであり、これは、例えば１日１回、週１回、月１回、及び／又は連続投与によって、都合に良いように投与される。１日投与量は、１日当たり１〜１２回の個別の用量にしてもよい。あるいは、投与量は、２日に１回、３日に１回、４日に１回、５日に１回、６日に１回、週に１回、以下同様に１日単位で最大３１日以上に１回投与してもよい。あるいは、投与は、パッチ、ｉ．ｖ．投与等を用いた連続投与であってもよい。
【０１９４】
正確な処方、投与経路、及び用量は、患者の状態を考慮して主治医が決定する。投薬の量及び間隔は、活性なクプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、若しくは構造的等価物及び１又は複数の他の化学予防剤の治療効果を維持するのに十分な血漿濃度が得られるように個別に調節され得る。通常、所望のクプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、切断型、若しくは構造的等価物及び１又は複数の他の化学予防剤は、意図する投与経路及び標準的な薬学的実務に即して選択された薬学的キャリアとの混合物の形態で投与される。
【０１９５】
一態様では、クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、切断型、若しくは構造的等価物及び可能であれば１又は複数の他の化学予防剤はＤＮＡとして送達され、その結果、ｉｎ  ｓｉｔｕでポリペプチドを生じる。一実施形態では、ＤＮＡは、例えばＵｌｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１７４５−１７４９（１９９３））に記載されておりＣｏｈｅｎ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１６９１−１６９２（１９９３））に概括されているように「ネイキッド」である。生分解性ビーズ等のキャリア上にＤＮＡをコーティングすることでネイキッドＤＮＡの取込みを促進することができ、これはその後細胞中に効率的に輸送される。そのような方法では、ＤＮＡは、核酸発現系、細菌発現系、ウイルス発現系等の当業者に公知の種々の送達系のいずれに含まれてもよい。そのような発現系にＤＮＡを組み込むための技術は当業者に周知である（例えば、国際公開第９０／１１０９２号、同第９３／２４６４０号、同第９３／１７７０６号、及び米国特許第５，７３６，５２４号参照）。
【０１９６】
生物間で遺伝材料をシャトルするために使用されるベクターは２つの一般的なクラスに分けられる。クローニングベクターは、外来ＤＮＡを挿入することができる適切な宿主細胞中での増殖に必須な領域を有する複製プラスミド又はファージであり、外来ＤＮＡはベクターの構成要素のように複製及び増殖される。発現ベクター（例えばプラスミド、酵母、又は動物ウイルスゲノム）は、クプレドキシンＤＮＡ等の外来ＤＮＡを転写及び翻訳するために宿主の細胞又は組織中に外来遺伝材料を導入するために用いられる。発現ベクター中では、導入されたＤＮＡは、挿入されたＤＮＡを高度に転写するように宿主細胞にシグナルを送るプロモーター等のエレメントに作動可能に連結されている。特定の因子に応答して遺伝子転写を制御する誘導性プロモーター等の一部のプロモーターは非常に有用である。クプレドキシン並びにそのバリアント及び誘導体と１又は複数の他の化学予防剤とを誘導性プロモーターに作動可能に連結することで、特定の因子に応答させてクプレドキシン並びにそのバリアント、切断型、及び誘導体と１又は複数の他の化学予防剤の発現を制御することができる。古典的な誘導性プロモーターの例としては、α−インターフェロン、ヒートショック、重金属イオン、及びステロイド、例えばグルココルチコイド（Ｋａｕｆｍａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：４８７−５１１（１９９０））及びテトラサイクリンに応答するものが含まれる。その他の望ましい誘導性プロモーターとしては、コンストラクトを導入する細胞に内在性でないが、外部から誘導物質を供給した時にこれらの細胞中で応答性であるものが含まれる。一般的に、有用な発現ベクターは多くの場合プラスミドである。しかし、その他の形態の発現ベクター、例えばウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）も予期される。
【０１９７】
ベクターの選択は、用いる生物及び細胞並びに所望するベクターの運命により決定される。ベクターは通常、シグナル配列、複製起点、マーカー遺伝子、ポリリンカー部位、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。
【０１９８】
クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、切断型、若しくは構造的等価物及び１又は複数の他の化学予防剤を含むキット
一態様では、本発明は、パッケージ又は容器中に以下の１又は複数を含む治療法（ｒｅｇｉｍｅｎ）又はキットを提供する：（１）少なくとも１つのクプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、切断型、若しくは構造的等価物を含む薬理活性組成物；（２）１又は複数の他の化学予防剤；及び（３）シリンジ、ネブライザー等の、生理活性組成物を患者に投与する装置。
【０１９９】
キットを提供する場合、適切であれば、組成物の種々の成分は別個の容器にパッケージ化され、使用直前に混合されてもよい。そのように成分を別個にパッケージ化することで、活性成分の機能を失うことなく長期間の保存が可能になり得る。
【０２００】
キットに含められる試薬は、種々の成分の寿命が維持され且つ容器の材料による吸着又は変化が起こらない任意の種類の容器に入れて提供され得る。例えば、密封されたガラス製アンプルに、凍結乾燥したクプレドキシン並びにそのバリアント、誘導体、及び構造的等価物又はバッファーを窒素等の中性の非反応性気体下でパッケージ化して含めてもよい。アンプルは、任意の好適な材料、例えばガラス、有機ポリマー、例えばポリカーボナート、ポリスチレン等、セラミック、金属、又は同様な試薬を保持するために通常使用される任意のその他の材料からなり得る。好適な容器のその他の例としては、アンプルと同様な物質から作製され得る単純なボトル、並びに裏地がアルミニウム又は合金等のホイルである内部を含み得る包み（ｅｎｖｅｌｏｐｅ）が含まれる。その他の容器としては、試験管、バイアル、フラスコ、ボトル、シリンジ等が含まれる。容器は無菌アクセスポートを有し得、例えば皮下注射針で孔を開けることができるストッパーを有するボトルである。別の容器は、容易に除去可能な膜で隔てられた２つのコンパートメントを有し得、この膜を除去することで成分を混合することができる。除去可能な膜はガラス、プラスチック、ゴム等であり得る。
【０２０１】
キットに指示書を添付してもよい。指示は、紙等の基体に印刷されてもよく且つ／又は電子読取り可能な媒体、例えばフロッピーディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、Ｚｉｐディスク、ビデオテープ、オーディオテープ、フラッシュメモリー素子等として提供されてもよい。詳細な指示は物理的にキットに付属されなくてもよく、その代わりに、キットのメーカー又は供給業者が指定するインターネットウェブサイトに使用者を導いてもよく、又は電子メールで提供されてもよい。
【０２０２】
クプレドキシン並びにそのバリアント、誘導体、切断型、及び構造的等価物の修飾
クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、切断型、若しくは構造的等価物を化学的に修飾するか遺伝子操作して前述したバリアント及び誘導体を作製してもよい。そのようなバリアント、切断型、及び誘導体は標準的な技術により合成され得る。
【０２０３】
クプレドキシンの天然のアレルバリアントに加えて、前悪性病変の発生を阻害するクプレドキシンの能力を大きく変化させることなくコードされるクプレドキシンのアミノ酸配列に変化を生じさせるような変異をクプレドキシンのコード配列中に入れることでも変化を導入することができる。「非必須」アミノ酸残基とは、薬理活性を変えることなくクプレドキシンの野生型配列から変化させることができる残基であり、一方、「必須」アミノ酸残基はそのような薬理活性に必要なものである。例えばクプレドキシン間で保存されているアミノ酸残基は特に変化を受けにくく、したがって、「必須」であると予想される。
【０２０４】
ポリペプチドの薬理活性を変化させない保存的置換を行うことができるアミノ酸は当該技術分野で周知である。有用な保存的置換を表３の「好ましい置換」に示す。１つのクラスのアミノ酸を同じ種類の別のアミノ酸で置換する保存的置換は、置換が化合物の薬理活性を顕著に変化させない限り、本発明の範囲内である。
【０２０５】
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【０２０６】
（１）βシート又はαヘリックスコンホメーション等のポリペプチド骨格の構造、（２）電荷、（３）疎水性、又は（４）標的部位の側鎖の嵩、に影響を与える非保存的置換は薬理活性を変化させ得る。残基は、表４に示すように一般的な側鎖特性に基づいてグループに分類される。非保存的置換ではこれらのクラスの１つのメンバーが別のクラスに交換される。置換は保存的置換部位、より具体的には非保存部位に導入され得る。
【０２０７】
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【０２０８】
バリアントポリペプチドは、オリゴヌクレオチド仲介（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキャニング、及びＰＣＲ突然変異誘発等の当該技術分野で公知の方法を用いて作製することができる。部位特異的突然変異誘発（Ｃａｒｔｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２３７：１−７（１９８６）；Ｚｏｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３２９−３５０（１９８７））、カセット変異導入、制限部位選択突然変異誘発（Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  ３４：３１５−３２３（１９８５））、又はその他の公知の技術をクローニングしたＤＮＡに対して用いてクプレドキシンバリアントＤＮＡを作製することができる。
【０２０９】
クプレドキシンの公知の変異を用いて本発明の方法で使用するバリアントクプレドキシンを作製することもできる。例えば、アズリンのＣ１１２Ｄ変異体及びＭ４４ＫＭ６４Ｅ変異体は天然アズリンとは異なる細胞毒性及び成長停止活性を有することが知られており、そのような変化した活性は本発明の処置方法において有用であり得る。
【０２１０】
以下の具体的な実施例を参照することで本発明を更に深く理解することができる。実施例は説明のみを目的として記載するものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。状況から示唆され得る又は適切であり得る形態の変更及び均等物の置換も予期される。本明細書中では具体的な用語を使用するが、そのような用語は記述のために用いるものであり、限定することを目的としたものではない。前述したような本発明の修正例及び変更例をその精神及び範囲から逸脱することなく作製することができる。
【実施例１】
【０２１１】
ＭＭＯＣモデルにおいてＤＭＢＡ誘発乳房病変に対するペプチドｐ２８（配列番号２）の効果
マウス乳腺臓器（ＭＭＯＣ）培養モデルを用いて、乳癌発生に対する潜在的な化学予防剤の同定に成功した。ＭＭＯＣにおけるインビトロでの有効性と実験的発癌モデルにおけるインビボの有効性の間には７５％の正の相関が観察される（Ｍｅｈｔａ  ａｎｄ  Ｐｅｚｚｕｔｏ，Ｃｕｒｒ．Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｐ  ４：４７８−４８６（２００２））。
【０２１２】
ＭＭＯＣモデルを用いることで、ＤＭＢＡに応答した乳房胞巣状病変（ＭＡＬ）又は乳管病変（ＭＤＬ）の発生に対する潜在的な化学予防剤の有効性を評価することができる。ＤＭＢＡは適切なインキュベーション条件下で培地中のホルモン環境に応じてＭＡＬ又はＭＤＬを形成する（Ｈａｗｔｈｏｒｎｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４０：７０−７４（２００２）；Ｍｅｈｔａ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９３：１１０３−１１０６（２００１））。培養中にエストロゲン及びプロゲステロンで処置された腺では管病変が発生するが、アルドステロン及びヒドロコルチゾンで処置された線ではエストロゲン及びプロゲステロンに非依存性の胞巣状病変が形成される。発癌物質又は化学予防剤に曝されなかった乳腺は、成長促進ホルモンの非存在下で構造的に退縮し、３日目と４日目の間に２４時間ＤＭＢＡで処置すると、ホルモンの欠乏によって引き起こされる構造の退縮が防止される。これは、腺が正常なホルモン応答性を失って発達の過程が変化したためであると推測される。癌化（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）細胞を同系マウスに移植して乳腺癌を発生させることで、これらの抑制されない領域の前悪性・前新生物性の性質が証明された。
【０２１３】
胸部の乳腺対を各Ｂａｌｂ／ｃマウスから無菌的に切り出し、腺を複数の群に分けた。培地中で４種類に希釈したｐ２８の効果を評価した。被験薬剤を用いずに発癌物質で処置した腺を、化学予防剤非存在下での発生率を決定するための尺度とした。更に化学予防の陽性対照となる対照を含めた。アズリンを濃度５０μｇ／ｍｌで培地に含めた。胞巣状病変（ＭＡＬ）では、染色された腺（病変を含む腺）を病変の発生について評価した（所定の処置群における腺の合計数と比較）。管病変（ＭＤＬ）でも同様のプロトコールを採用したが、以下の方法のセクションに記載するように、ホルモンの組合せが胞巣状病変と管病変では異なる。腺をホルマリンで固定した後、病理組織診断用に処理した。切片をエオシン及びヘマトキセレンで染色し、顕微鏡下で評価した。ここでは対照と処置群の間で管病変の多数度を比較する。
【０２１４】
臓器培養手順
研究に用いる実験動物は、マサチューセッツ州ウィルミントンのチャールス・リバー社（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）から入手した３〜４週齢の若い未交尾のＢＡＬＢ／ｃ雌マウスである。１μｇのエストラジオール−１７β＋１ｍｇのプロゲステロンを９日間にわたって毎日皮下注射することによりマウスを処置した。ステロイドで前処置されなかった動物はインビトロでホルモンに応答しないため、この処置は必須である。この培養全体の手順は詳細に記載されている（Ｊａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５：２１８−２２０（１９９７）；Ｍｅｈｔａ，Ｅｕ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ３６：１２７５−１２８２（２０００）；Ｍｅｈｔａ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８９：２１２−２１９（１９９７）；Ｍｅｈｔａ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９３：１１０３−１１０６（２００１））。
【０２１５】
簡潔には、頸椎脱臼によりマウスを屠殺し、絹のラフト上に胸部の乳腺対を切り出し、無血清Ｗａｙｍｏｕｔｈ  ＭＢ７５２／１培地中で１０日間インキュベートした（５腺／５ｍｌ／ディッシュ）。乳腺胞巣状病変（ＭＡＬ）を誘発するためのプロトコールでは、グルタミン、抗生物質（ペニシリン及びストレプトマイシン１００ユニット／ｍｌ培地）、及び成長促進ホルモン（培地１ｍｌ当たり、５μｇのインスリン（Ｉ）、５μｇのプロラクチン（Ｐ）、１μｇのアルドステロン（Ａ）、及び１μｇのヒドロコルチゾン（Ｈ））を培地に添加した。管病変（ＭＤＬ）の誘発では、培地に５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌのＰ、０．００１μｇ／ｍｌのエストラジオール１７β、及び１μｇ／ｍｌのプロゲステロン（Ｐｇ）を含めた（Ｍｅｈｔａ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９３：１１０３−１１０６（２００１））。３日目と４日目の間に発癌物質ＤＭＢＡ（２μｇ／ｍｌ）を培地に添加した。本実験では、ＤＭＢＡを終濃度４ｍｇ／ｍｌでＤＭＳＯに溶かし、５０μｇのＩを１００ｍｌの培地に添加して終濃度を２μｇ／ｍｌにした。対照のディッシュには溶媒（ｖｅｈｉｃｌｅ）としてＤＭＳＯを含めた。
【０２１６】
４日目に、腺を新鮮な培地ですすぎ、ＤＭＢＡを含まない新鮮な培地の入った新しいディッシュに移すことで、培地からＤＭＢＡを除去した。１０日間インキュベートした後、Ｉ（５μｇ／ｍｌ）だけを含む培地中に腺を更に１４日間維持した。培養期間全体を通して、腺は９５％Ｏ２及び５％ＣＯ２環境下で３７℃に維持した。成長促進期の最初の１０日間、培地に化学予防剤を含めた。被験ペプチドｐ２８を１２．５〜１００μｇ／ｍｌの４種類の濃度で評価した。培地中の５０μｇ／ｍｌのアズリンを評価した。ペプチドは使用前に滅菌水に溶かしてろ過した。培地は週に３回（月曜日、水曜日、金曜日）交換した。暴露の最後に、腺をホルマリンで固定した。
【０２１７】
結果はカイ二乗分析及びフィッシャー直接検定で解析した。
【０２１８】
ＭＡＬの形態計測解析
ＭＡＬを調べるために、腺をアルムカーミン（ａｌｕｍ  ｃａｒｍｉｎｅ）で染色し、病変が存在するかどうかを評価した。乳房病変の有無、各腺における病変の重症度、及び薬剤の毒性について腺にスコアを付けた。キシレン中に保存された腺を、解剖顕微鏡下で、乳房病変の有無、発生率、重症度について各腺を評価した。乳房病変について正又は負のスコアを乳腺に与え、その群中の腺の総数に対する病変を示す腺の割合として発生率を求めた。化学予防剤を用いた処置による管の拡張又は乳房構造の崩壊を毒作用と見なした。発生率についてデータを統計解析し、潜在的化学予防剤の有効性を決定した。
【０２１９】
図１Ａは、ＤＭＢＡで処置した腺における胞巣状病変の代表的写真及びＤＭＢＡと化学予防剤で処置した腺との比較を示す図である。胞巣状病変の発生に対するｐ２８（配列番号２）の効果を図１Ｂ〜１Ｇに示し、図２にまとめた。ペプチドｐ２８（配列番号２）は濃度２５μｇ／ｍｌでＭＡＬ形成を６７％阻害した。濃度を更に１００μｇ／ｍｌに上げてもペプチドの効果は高まらなかった。このペプチドとアズリンの比較から、ｐ２８（配列番号２）はＭＡＬの発生に対してアズリンと同じくらい効果的であることが示された。濃度５０μｇ／ｍｌのアズリンは６７％の阻害であった。統計解析から、ｐ２８（配列番号２）の効果は１２．５μｇ／ｍｌを超える濃度でＤＭＢＡ対照と比べて統計的に有意であることが示された（ｐ＜０．０１、フィッシャー直接検定；カイ二乗分析）。
【０２２０】
ＭＤＬの組織病理学的評価
ＭＤＬでは、腺を組織病理学的に評価するために処理した。腺を５ミクロンの切片に縦方向に切片化し、エオシン・ヘマトキセリンで染色した。各腺の縦断切片を複数のフィールドに分け、それぞれのフィールドを管病変について評価した（Ｍｅｈｔａ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９３：１１０３−１１０６（２００１））。簡潔には、顕微鏡下で腺全体を評価した。小さい腺は大きい腺に比べて総フィールドが少ない。したがって、各腺でフィールドの数は異なる。多くの場合、管を横切る切片の数も腺によって大きく異なり、そのため、群によって数が異なる。管の過形成又は異型を含むフィールドを決定し、評価されたフィールドの総数を各腺で比較した。過形成又は異型と極度に閉塞した腺は区別しなかった。これらの組織学的パターンを含む全てのフィールドを病変に対して陽性と見なした。重症度について処置群を対照と比較し、阻害率を算出した。
【０２２１】
図３に代表的管病変を示す。ＤＭＢＡは、過形成、異型から管の完全閉塞まで、さまざまな管病変を誘発する。管病変／管切片の総数の割合を決定した。ここでも、濃度１２．５μｇ／ｍｌのｐ２８はＭＤＬ形成を１５％だけ抑制した。しかし、２５μｇ／ｍｌでは、５０μｇ／ｍｌのアズリンに匹敵する有意な病変阻害を示した。１２．５μｇ／ｍｌを超える濃度のｐ２８（配列番号２）の効果は統計的に有意であった（ｐ＜０．０１、フィッシャー直接検定）。これらの結果は図４にまとめられている。化学予防剤の効果はしばしばＭＡＬとＭＤＬで異なり得る。例えば、タモキシフェンはＭＤＬの発生は阻害したがＭＡＬの発生は阻害しなかった。アズリン及びｐ２８（配列番号２）がエストロゲン及びプロゲステロンに依存性の管病変並びに非依存性の胞巣状病変の両方を阻害したことは興味深い。
【０２２２】
本実施例は、ｐ２８（配列番号２）及びアズリンの両方が乳房組織における前癌性病変の発生を防止できることを示している。したがって、ｐ２８（配列番号２）及びアズリンは哺乳動物患者における化学予防剤として使用され得る。
【実施例２】
【０２２３】
ＭＭＯＣモデルにおける乳房胞巣状病変の誘発に対するアズリン及びペプチドｐ２８（配列番号２）の効果
化学物質：アズリン及びその他の合成ペプチド：緑膿菌ＰＡ０１株のアズリンコード遺伝子（ａｚｕＡ）を発現させるための宿主株として大腸菌ＪＭ１０９を用いた。この組換え大腸菌株を、５０μｇのアンピシリン／ｍｌ、０．１ｍＭのＩＰＴＧ、及び０．５ｍＭのＣＵＳＯ４を含む２ＹＴ培地中で、３７℃にて１６時間培養した（３１）。Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．３４９：１１１７−１１２４（２００６）に以前に記載されているようにして、アズリン（配列番号１）を組換え大腸菌ＪＭ１０９株のペリプラスム画分から単一バンドに精製し、エンドトキシンが含まれていないことを確認した。ｐ２８の配列は、ＬＳＴＡＡＤＭＱＧＶＶＴＤＧＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号２）であり、Ｃ  Ｓ  Ｂｉｏ社（カリフォルニア州メンローパーク）により９５％超の純度で化学合成されたものである。清浄な滅菌バイアルにアズリン及びｐ２８（配列番号２）を分注し、乾燥させ、デシケーター中で−２０℃にて保存した。全ての化合物は、使用直前に培養培地中に溶解させてろ過（０．２２μｐｍ）滅菌した。
【０２２４】
乳腺臓器培養（ＭＭＯＣ）：ＭＭＯＣの手順は以前に詳細に記載されている（Ｍｅｈｔａ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９２：４１８−４２３（２０００））。簡潔に記載すると、エストロゲン及びプロゲステロンで前処理された雌の４週齢Ｂａｌｂ／ｃマウスから胸部乳腺を無菌的に切り出し、成長促進ホルモンを含むＷｅｙｍｏｕｔｈ  ７５２／ＭＢ合成培養培地中に外植した。卵巣ホルモン非依存性の成長では、腺を、インスリン（５μｇ／ｍｌ）、プロラクチン（５μｇ／ｍｌ）、アルデオステロン（１μｇ／ｍｌ）、及びヒドロコルチゾン（１μｇ／ｍｌ）とインキュベートした。ホルモン依存性病変では、腺を、インスリン、プロラクチン、及びエストラジオール１７β（０．００１μｇ／ｍｌ）、及びプロゲステロン（１μｇ／ｍｌ）と１０日間インキュベートした。発癌物質である７，１２ジメチルベンズ（ａ）アントラセン（ＤＢＭＡ）（２μｇ／ｍｌ）を３日目に２４時間導入した。腺は１０日間インキュベートし、その後、インスリンのみの存在下で更に１４日間退縮（ｒｅｇｒｅｓｓ）させた。したがって、典型的には、乳房病変の発生では、培養期間は２４日間である。腺を、胞巣状病変（エストロゲン非依存性）及び組織病理学的に同定された管病変（エストロゲン依存性病変）についてアルムカーミンで染色する。腺を培養の最初の１０日間だけアズリン、ｐ２８（配列番号２）、又はタモキシフェンで処置した。ｐ２８（配列番号２）とｐ５３の相互作用を調べるために、腺をホルモン及びｐ２８（配列番号２）と４日間インキュベートした。４８時間後にＰＣＲ及び免疫組織化学の両方による発現を測定した。
【０２２５】
免疫組織化学：アズリン又はｐ２８（配列番号２）の存在下又は非存在下で乳腺を成長促進ホルモンと４日間インキュベートした。３日目に２４時間、ＤＭＢＡを培地に含めた。ホルマリン固定してパラフィン包埋した組織切片を脱パラフィンし、水和させた。ｐ５３抗原では、予め温めた（９５℃）１０ｍＭのクエン酸バッファー中にスライドを置いてマイクロウェーブに３分間かけることで回復を行った。次いで、スライドをクエン酸バッファー中で９５〜１０００のオーブンに１時間入れた。ＥＲ／ＰｇＲ及びＫｉ−６７免疫染色では、抗原回復は、圧力チャンバーを用いて１０ｍＭのクエン酸バッファー中で６分間行った。ＰＢＳですすいだ後、スライドを５％ゼラチン中でインキュベートすることで非特異的染色をブロッキングし、その後、アビジン及びビオチン（カリフォルニア州南カリフォルニアのザイメッド・ラボラトリーズ社（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）製）中でインキュベートした。切片を、一次抗体（マウス血清を予め吸収させた、ｐ５３、Ｖｅｃｔｏｒ／ｎｏｖａｃａｓｔｒａ−ＶＰ−Ｐ９５６、ＰＧＲ、ＥＲ、及びＫｉ−６７（カリフォルニア州フリーモントのラボビジョン社（Ｌａｂｖｉｓｉｏｎ）製）、Ｋｉ−６７（カリフォルニア州サンタクルーズのサンタクルーズ・バイオテクノロジー社製））とＲＴで９０分間インキュベートした。ＰＢＳ洗浄（３回）後、切片を適切なビオチン化ヤギ抗ウサギ／抗マウス抗体とインキュベートし、その後、ＡＢＣ試薬（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣキット）ＤＡＢ（ジアミノベンジジン、ミズーリ州セントルイスのシグマ社製）を色素原として用いて免疫反応性を可視化した。切片をギルヘマトキシリンＮｏ１を用いて対比染色した。
【０２２６】
ＲＮＡ抽出及びリアルタイムＰＣＲ：Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｅａｒｏｒ（ウィスコンシン州ラシーンのバイオスペック・プロダクツ社（Ｂｉｏｓｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．）製）を用いて個々の乳腺をホモジナイズした。核酸が水相に分離されてタンパク質が有機下相に溶出するフェノール：クロロホルム抽出法を用いて、ＲＮＡを抽出した。イソプロパノールを用いて水相を更に精製し、ＤＥＰＣ水で調製した氷冷７０％エタノールでＲＮＡを沈殿させる。ＲＮＡをＤＥＰＣに溶解させ、分光測定により解析した。バイオ・ラッド社製サーマルサイクラーＰＣＲ機を用いてＲＮＡをｃＤＮＡに変換した。
【０２２７】
以前に記載されているように、ＭｙｉＱリアルタイムＰＣＲ検出システム（カリフォルニア州ハーキュリーズのバイオ・ラッド社製）において１μＬの逆転写産物を用いて、メーカーのガイドラインに従いｉＱ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（バイオ・ラッド社製）を用いてリアルタイムＰＣＲを行った。ｐ５３の発現を測定した。２つのハウスキーピング遺伝子１８ＳミトコンドリアＤＮＡ及びＣＡＰＭの発現をデータ解析に用いた。リアルタイムＰＣＲに用いたプライマーは、ｐ５３では（フォワード：５−ＧＡＴＧＡＣＴＧＣＣＡＴＧＧＡＧＧＡＧ−３’；リバース：’−ＧＴＣＣＡＴＧＣＡＡＧＧＴＧＡＴＧ−３’）（配列番号３６及び８３）であり、リボソーム１８Ｓでは（フォワード：５’−ＣＡＴＧＣＣＣＧＴＴＣＴＴＡＧＴＴＧＧＴ−３’；リバース：５’−ＧＡＡＣＧＣＣＡＣＴＴＧＴＣＣＣＴＣＴＡ−３’）（配列番号３７及び８４）である。
【０２２８】
統計解析：カイ二乗分析を行い、対照及び化学予防剤処置群におけるＭＡＬ及びＭＤＬの発生の間の統計的有意性を評価した。
【０２２９】
アズリン及びｐ２８（配列番号２）：図５に示されるように、アズリンは、好気性細菌により産生される１２８アミノ酸、１４ｋＤの銅含有タンパク質である。ｐ２８（配列番号２）を作製し、細胞中への移入を評価した。その結果、ＧＳＴに融合させた２８アミノ酸ペプチドａｚｕ５５〜７７（配列番号２）（図５）はＧＳＴをＪ７７４細胞中に輸送できるが、ＧＳＴはそれ自体では内部移行されないことが示された。これらの結果は、あり得るアズリン作用のための活性ペプチドとしてアズリンの２８アミノ酸（ａａ５０〜７７、配列番号２）コンストラクトを選択する確かな理論的根拠を提供するものであり、これをｐ２８（配列番号２）と命名した。したがって、最初の実験はアズリンを用いて行われ、後の実験ではｐ２８（配列番号２）を使用し、アズリンを陽性対照とした。
【０２３０】
乳房胞巣状病変（ＭＡＬ）の誘発に対するアズリン及びｐ２８の効果：３つの異なる濃度（１０、２０及び５０μｇ／ｍｌ）のアズリンの効果を評価し、各群には１５個の腺を含めた。その結果、ＤＭＢＡ対照群の腺におけるＭＡＬ発生率は７１．４％であり、３つの濃度のアズリンでそれぞれ１６、２０及び６３％の発生阻害が観察された。濃度５０μｇ／ｍｌでは、アズリンに仲介されるＭＡＬ発生阻害は統計的に有意であった（ｐ＜０．０５）。濃度１０〜１００μｇ／ｍｌのｐ２８（配列番号２）を評価することで、ＭＡＬ発生に対するｐ２８（配列番号２）の有効性も確認された。ペプチドは乳腺発達の成長期の最初の１０日間、培地に添加した。
【０２３１】
図６Ａ及び６Ｂは、対照群及びｐ２８（配列番号２）（５０μｇ／ｍｌ）処置群におけるＭＡＬを有する腺の代表的ホールマウントを示す図である。図６Ａでは、乳腺を、ＭＡＬ発生の成長促進期中の１０日間、ＤＭＢＡと又はＤＭＢＡ及びｐ２８（配列番号２）とインキュベートした。２４日間の培養期間後にアルムカーミンで腺を染色した。ｐ２８（配列番号２）で処置された腺ではＭＡＬの数の減少が観察される。具体的には、図６Ａは、５０μｇのｐ２８（配列番号２）の非存在下又は存在下における乳房胞巣状病変の組織病理を示す図である。２５μｇのｐ２８（配列番号２）はＭＡＬ発生を６０％超阻害した（ｐ＜０．０５）。これはアズリンで得られた阻害に匹敵する。いずれの濃度のｐ２８（配列番号２）も毒性を伴わず、いずれの処置群でも管の拡張は観察されなかった。
【０２３２】
図６Ｂでは、ヘマトキセレン・エオシン染色した組織病理学的切片中の管病変を同定した。代表的切片は、ＤＭＢＡ処置された腺では乳管が閉塞されているが、ｐ２８（配列番号２）処置では乳房が正常な組織構造を示すことを示している。
【０２３３】
本実施例は更に、ｐ２８（配列番号２）及びアズリンの両方が乳房組織における前悪性病変の発生を防止できることを示している。したがって、ｐ２８（配列番号２）及びアズリンは哺乳動物患者における化学予防剤として使用され得る。
【実施例３】
【０２３４】
ＭＭＯＣモデルにおけるＤＭＢＡ誘発乳房病変に対するペプチドｐ２８（配列番号２）とタモキシフェンの組合せの効果
ＭＭＯＣシステムは、ＤＭＢＡにより誘発された病変の、エストロゲン及びプロゲステロン依存性のものとホルモン非依存性のものとを区別することができる。エストロゲン及びプロゲステロンの存在下で発生する病変はＭＤＬであり、これらはヒトＤＣＩＳ／管癌に相当する。エストロゲン非存在下で発生する明確な胞巣状病変と異なり、エストロゲン存在下及びアルドステロン非存在下で形成される胞巣状構造は非常に小さく、そのため、エストロゲン依存性病変の胞巣状構造に対する化学予防剤の効果を測定することは困難である。抗エストロゲン薬であるタモキシフェンは、このモデルにおいて、ＭＤＬを選択的に阻害することができ、ＭＡＬは阻害しない。
【０２３５】
上記実施例２に記載の実験手順に従い、ＭＤＬの発生に対するｐ２８（配列番号２）及びタモキシフェンの効果を評価した。図６Ｃは、ＭＡＬ及びＭＤＬに対するｐ２８（配列番号２）の効果又はＭＤＬに対するｐ２８（配列番号２）と１μｇ／ｍｌのタモキシフェンの効果を示す図である。１群当たり１０個の腺を、ＭＡＬにはＩＰＡＦを用いて、ＭＤＬにはＩＰＥＰｇを用いて、種々の処置でインキュベートした。ＭＡＬの場合はアルムカーミンで腺を染色し、ＭＤＬの場合は腺を組織学的に処理した。ＭＡＬの発生率（実験群と比較した、処置群におけるＭＡＬを有する腺の数）又はＭＤＬの場合は多数度（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ：実験群と比較した対照における１フィールド当たりのＭＤＬを有する管の数）に対する実験薬剤の効果を評価した。
【０２３６】
その結果、ｐ２８（配列番号２）は５０μｇ／ｍｌでＭＤＬの発生を阻害した（図６Ｃ）。２５μｇ／ｍｌではＭＤＬが７０％阻害されたのに対し、１２．５μｇ／ｍｌでは阻害は３０％だけであった。濃度を１００μｇ／ｍｌに上げてもＭＤＬの防止が更に促進されることはなかった。タモキシフェン（１μＭ）処置のみでは、ＭＤＬ形成は約５０％阻害された。しかし、非有効濃度のｐ２８（１２．５μｇ／ｍｌ）と１μＭのタモキシフェンの組合せでは有効性が７０％にまで高まった（図６Ｃ）。タモキシフェン処置を低濃度のｐ２８（配列番号２）と組み合わせることでタモキシフェンの用量関連毒性を有意に抑えることができるため、これらの組合せの劇的な効果は臨床的な価値を有し得る。ｐ２８処置した乳腺切片で対照と比べてＫｉ６７の発現低下が観察されたことから、ｐ２８（配列番号２）によるＭＡＬ及びＭＤＬの両方の形成の抑制は細胞増殖の阻害によるものであった（図３）。
【０２３７】
これらの結果は、エストロゲン依存性の前癌性乳管病変の発生に対する保護向上にタモキシフェンと低濃度のｐ２８（配列番号２）を組み合わせることが有益であることを意味する。
【実施例４】
【０２３８】
ＭＭＯＣモデルにおけるｐ５３の誘導に対するペプチドｐ２８（配列番号２）及びタモキシフェンの効果
以前の研究でアズリンとｐ５３が相互作用し得ることを示す証拠の一部が得られていたが、これらの相互作用又はアズリンによるｐ５３の安定化の機能的意義は報告されていなかった。ＭＭＯＣ実験のデザインは、２つの別個のホルモン条件下でｐ５３の発現を比較することでエストロゲン及びプロゲステロンとｐ５３の相互作用の役割を同定することが可能であるので、一連の実験を行い、ステロイドホルモンがｐ５３の発現に対して選択的な役割を有するかどうかを決定した。アルドステロン／ヒドロコルチゾン及びエストロゲン／プロゲステロンは独立して乳腺中での胞巣状構造の発生を誘発するが、これらの２つのホルモン環境下で形成されるＤＭＳＡ誘発病変は異なる。更に、前新生物病変の発生は後期のイベントである。腺を培養期間中の非常に早い時期に発癌物質に曝しても、病変が形成されるのは２４日後である。したがって、培養の最初の数日内に、前悪性病変の発生に重要な役割を果たし得る初期の細胞シグナル伝達イベントをモニタリングすることができる。
【０２３９】
図７Ａは、エストロゲン及びプロゲステロンの存在下又は非存在下でインキュベートした乳腺中でのｐ５３ｍＲＮＡ発現を比較した図である。腺を、アルドステロン及びプロゲステロンと、又はエストラジオール及びプロゲステロンと合成培地中で４日間培養した後、各群中の４つの腺から個々に全ＲＮＡを単離した。ＲＮＡをｃＤＮＡに変換し、ｉＱ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘを用いて、ＭｙｉＱリアルタイムＰＣＲ検出システム中で１μＬの逆転写産物を用いてリアルタイムＰＣＲを行った。ｐ５３の発現を測定した。２つのハウスキーピング遺伝子１８ＳミトコンドリアＤＮＡ及びＧＡＰＤＨの発現をデータ解析に用いた。ｐ５３発現を対照に対して標準化した。
【０２４０】
図７Ａに示されるように、ＩＰＡＦ（非存在下）又はＩＰＥＰｇ（存在下）とインキュベートした乳腺ではｐ５３のｍＲＮＡは有意に発現していなかった。これらの対照の腺を１に標準化し、ｐ２８（配列番号２）により生じる相対的な増加又は減少を決定した。その結果、エストロゲン及びプロゲステロンの非存在下でｐ２８（配列番号２）とインキュベートした腺はｐ５３ｍＲＮＡ発現が１２倍増加し、一方、腺をエストロゲン及びプロゲステロンの存在下でｐ２８（配列番号２）とインキュベートした場合にはｐ５３の発現増加は観察されなかった。
【０２４１】
しかし、ｐ２８（配列番号２）処置した腺では、培養条件（エストロゲンの存在／非存在）に関係なく、免疫組織化学測定でｐ５３発現の増加が観察された。図７Ｃは、ＭＭＯＣの乳腺中でのｐ５３（写真ａ〜ｆ）及びＫｉ６７（写真ｇ〜ｌ）の免疫組織化学染色を示す図である。マウス乳腺を、ＤＭＢＡのみと（ａ、ｄ、ｇ、ｊ）、又はｐ２８（配列番号２）存在下（ｂ、ｅ、ｈ、ｋ）で、又はアズリン存在下（ｃ、ｆ、ｉ、ｌ）で、４日間インキュベートした。パラフィン包埋切片を、ｐ５３（ａ〜ｆ）及びＫｉ６７（ｇ〜ｉ）の免疫組織化学染色用に処理した。これらの腺のいくつかはエストロゲン／ＩＰＡＦ非存在下（ａ、ｂ、ｃ、ｇ、ｈ、ｉ）でインキュベートし、一部はエストロゲン／ＩＰＥＰｇ存在下（ｄ、ｅ、ｆ、ｊ、ｋ、ｌ）でインキュベートした。
【０２４２】
更に、免疫組織化学によりＫｉ６７染色を決定することで測定された細胞増殖活性は、ｐ２８及びアズリンの両方が細胞増殖を阻害することを示唆していた。ホルモン処置の成長促進効果により上皮細胞中のＫｉ６７は強く染色された（図７Ｃ）が、腺をアズリンで処置した場合にはＫｉ６７の発現が有意に減少していた。したがって、ｐ２８（配列番号２）は、アズリン及びｐ２８（配列番号２）の抗増殖効果において、ｐ５３タンパク質の再構築を安定化していると考えられる。
【０２４３】
最近の文献で乳癌細胞においてエストロゲンがｐ５３の作用に干渉することが示されているので、エストロゲン及びプロゲステロンで処置した乳腺中でのｐ５３の発現を調べた。図７Ｄは、ｐ５３及びＫｉ６７タンパク質発現に対するアズリン及びｐ２８（配列番号２）の効果を免疫組織化学により示す図である。上記実施例２に記載した方法に示されるように、マウス乳腺のパラフィン包埋切片をＩＰＥＰｇ含有培地と４日間インキュベートした。対照（ａ、ｅ、ｉ）；ＩＰＥＰｇ＋５０μｇのｐ２８（配列番号２）（ｂ、ｆ、ｊ）；ＩＰＥＰｇ＋１０μＭのタモキシフェン（ｃ、ｇ、ｋ）；ＩＰＥＰｇ＋タモキシフェン＋５０μｇ／ｍｌのｐ２８（配列番号２）（ｄ、ｈ、ｌ）。４日後、腺を緩衝ホルマリンで固定し、パラフィン切片法に供した。抗原回復手順後にｐ５３（ａ〜ｄ）及びＫｉ−６７（ｅ〜ｈ）の免疫組織化学染色を行った。タモキシフェン及びタモキシフェン＋ｐ２８（配列番号２）存在下でインキュベートした腺において乳腺上皮細胞の核ｐ５３発現（ｉ〜ｌ）が観察された。同様に、タモキシフェン及びタモキシフェン＋ｐ２８（配列番号２）で処置した腺でＫｉ−６７の減少が観察された。Ｈ・Ｅ切片を示す。
【０２４４】
その結果、エストロゲン及びプロゲステロンで処置した腺においてｐ５３発現の抑制が示された。エストロゲンにより仲介されるｐ５３発現の抑制がタモキシフェンにより打ち破られるかどうかを決定するために、抗エストロゲン薬であるタモキシフェンで処置した腺におけるｐ５３発現を測定した。図７Ｂに示されるように、個々のｐ２８（配列番号２）又はタモキシフェンは乳腺でのｐ５３の発現に影響を与えなかったが、低濃度のｐ２８（配列番号２）とタモキシフェンの組合せの存在下では、予期されなかったことに、ｐ５３のｍＲＮＡ発現が１２５倍増加した。これらの実験は、乳腺においてｐ２８（配列番号２）によって仲介されるｐ５３の誘導はグルココルチコイドとインキュベートした腺に選択的ではないが、エストロゲンの機能をブロックした場合、エストロゲン及びプロゲステロンで処置された腺においてｐ２８（配列番号２）がｐ５３を等しく誘導できることを明確に示している。免疫組織化学実験により更にこれらの知見を確認した。その結果、エストロゲン及びプロゲステロンで処置した腺又はホルモン及び個々のｐ２８若しくはタモキシフェンで処置した腺は核ｐ５３タンパク質を発現しなかった。しかし、腺をｐ２８（配列番号２）とタモキシフェンの組合せとインキュベートした場合、ｐ５３タンパク質の核発現の驚くべき増加が観察された（図７、ｌ）。免疫組織化学分析は更に、エストラジオールとインキュベートした乳腺で腺中のＥＲ及びＰＲのアップレギュレーションが誘導されることを示した。
【０２４５】
したがって、低濃度のｐ２８（配列番号２）とタモキシフェンを組み合わせることには、ｐ５３誘導を促進して前悪性病変及び腫瘍の発生を阻害するという従来予想されなかった顕著な利点がある。
【実施例５】
【０２４６】
ＤＭＢＡ誘発乳房病変に対するフェンレチニド及びタモキシフェンと組み合わせたペプチドｐ２８（配列番号２）の効果
マウス乳腺臓器培養（ＭＭＯＣ）アッセイを用いて、ホルモンにより誘導される乳腺の構造的分化及び乳腺においてＤＭＢＡにより誘発される前新生物性過形成性胞巣状小結節様病変の発生の両方に対する潜在的化学予防剤の阻害効果を評価した。若い未交尾動物に由来する乳腺は、インスリン（Ｉ）＋プロラクチン（Ｐ）＋アルドステロン（Ａ）の存在下で６日間インキュベートすると、完全に成長した腺に分化することができる。これらの腺は妊娠マウスから得られた腺に形態的に類似している。アルドステロンはエストロゲン（Ｅ）＋プロゲステロン（Ｐｇ）で代用することができる。培地にヒドロコルチゾン（Ｈ）を含めると腺の機能的分化が刺激される（Ｍｅｈｔａ，Ｒ．Ｇ．，ａｎｄ  Ｂａｎｅｒｊｅｅ，Ｍ．Ｒ．，Ａｃｔａ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，８０：５０１（１９７５）；Ｍｅｈｔａ，Ｒ．Ｇ．，ａｎｄ  Ｍｏｏｎ，Ｒ  Ｃ，Ｃａｎ  Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  Ｂｅ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｉｎ：Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ：Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ，Ｂａｓｉｌ  Ａ．Ｓｔｏｌｌ（ｅｄ．），Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｐｒｅｓｓ，３００，１９８６．）。したがって、この培養系で観察されるホルモンにより誘導される構造的及び機能的分化は、動物の種々の生理学的段階で観察されるホルモンへの応答を模倣している。
【０２４７】
２つの公知の化学予防化合物を選択した。ＭＡＬの発生には、フェンレチニド（４−ＨＰＲ、Ｎ−４−ヒドロキシフェニルレチンアミド）を選択した。フェンレチニドはＭＡＬの発生を６０％超阻害し、高リスク閉経前女性の乳癌発生に対する臨床的有効性を示した（Ｖｅｒｏｎｅｓｉ，Ｕ．，ｅｔ  ａｌ，Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．１７：１０６５−１０７１（２００６））。本プロジェクトに選択した第２の化学予防剤は、ＭＤＬではタモキシフェンである。タモキシフェンは、乳癌患者の予防及び処置に臨床的に使用されてきた。ＭＭＯＣにおいてタモキシフェンは抗エストロゲン薬としてその作用を仲介し、ＭＤＬ発生に対して有効であるので、ｐ２８（配列番号２）との組合せでＭＭＯＣにおけるＭＤＬ発生の防止についてタモキシフェンを評価した。ＭＡＬに２つ、ＭＤＬに２つの４つの実験を行った。ＭＡＬでは、有効濃度で４−ＨＰＲを単独又は種々の濃度のｐ２８（配列番号２）と組み合わせて用いた。同様に、ＭＤＬの実験では、単一濃度のタモキシフェンを単独又は種々の濃度のｐ２８（配列番号２）の存在下で用いた。サンプルプロトコールを表５に示す。
【０２４８】
2012527466.tif 000020
ペプチド溶液の調製：３ｍｇのｐ２８を５バイアル分計量し、−７０℃で保存する。１ｍｇ／２ｍｌ溶解し、ろ過した後、１〜４ｍｌの培地を添加する（最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるように５００μｇ／５ｍｌ）。同様にｐ２８を添加してプロトコールに示される最終濃度を得る。
４−ＨＰＲ：
培養プロトコール：ＭＡＬ用の標準的プロトコール。
【０２４９】
４つの異なる濃度（１２．５、２５、５０及び１００μｇ／ｍｌ）のｐ２８（配列番号２）の効果を単独又は４−ＨＰＲ若しくはタモキシフェンのいずれかと組み合わせて評価した。被験薬剤なしで発癌物質で処置した腺を、化学予防剤非存在下での発生率を決定するための基準とした。化学予防の陽性対照とするために更にアズリン対照（５０μｇ／ｍｌ）を含めた。胞巣状病変では、染色した腺を病変の発生率（所与の処置群における腺の総数と比較した、なんらかの病変を含む腺）について評価した。管病変にも同様なプロトコールを採用したが、胞巣状病変と管病変ではホルモンの組合せが異なる。ＭＤＬに対するｐ２８（配列番号２）及びタモキシフェンの効果を決定するためのプロトコールを表６に示す。
【０２５０】
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ペプチド溶液の調製：３ｍｇのｐ２８（配列番号２）を５バイアル分計量し、−７０℃で保存する。１ｍｇ／２ｍｌ溶解し、ろ過した後、１〜４ｍｌの培地を添加する（最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるように５００μｇ／５ｍｌ）。同様にｐ２８（配列番号２）を添加してプロトコールに示す最終濃度を得る。
タモキシフェン
培養プロトコール：ＭＤＬ用の標準的プロトコール
【０２５１】
腺をホルマリンで固定した後、病理組織診断用に処理した。切片をエオシン及びヘマトキセレンで染色し、顕微鏡下で評価した。
【０２５２】
臓器培養手順：本研究に用いた実験動物は、マサチューセッツ州ウィルミントンのチャールス・リバー社から入手した３〜４週齢の若い未交尾ＢＡＬＢ／ｃ雌マウスである。これらのマウスは容易に入手可能であり、過去の研究のほとんどでＢＡＬＢ／ｃマウスが使用されている。マウスを９日間毎日、１μｇのエストラジオール−１７β＋１ｍｇのプロゲステロンの皮下注射により処置した。この処置は、ステロイドで前処置されなかった動物はインビトロでホルモンに応答しないため、必須である。培養全体の手順はＭｅｈｔａ，Ｒ．Ｇ．ａｎｄ  Ｂａｎｅｒｊｈｅｅ，Ｍ．，Ａｃｔａ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．８０：５０１（１９７５）及びＭｅｈｔａ，Ｒ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ，ＪＮＣＩ  ９３：１１０３−１１０６（２００１）に詳細に記載されている。
【０２５３】
簡潔には、動物を頸椎脱臼により屠殺し、胸部の乳腺対を絹のラフト上に切り出し、無血清Ｗａｙｍｏｕｔｈ  ＭＢ７５２／１培地中で１０日間インキュベートした（５腺／５ｍｌ／ディッシュ）。乳房胞巣状病変（ＭＡＬ）を誘発するためのプロトコールでは、培地にグルタミン、抗生物質（ペニシリン及びストレプトマイシン１００ユニット／ｍｌ培地）、及び成長促進ホルモン（培地１ｍｌ当たり５μｇのＩ、５μｇのＰ、１μｇのＡ、及び１μｇのＨ）を添加した。管病変（ＭＤＬ）の誘発では、培地に５μｇ／ｍｌのＩ、５μｇ／ｍｌのＰ、０．００１μｇ／ｍｌのエストラジオール−１７β、及び１μｇ／ｍｌのプロゲステロン（Ｐｇ）を含める（１４）。３日目と４日目の間に培地に発癌物質ＤＭＢＡ（２μｇ／ｍｌ）を添加した。本実験では、ＤＭＢＡを終濃度４ｍｇ／ｍｌでＤＭＳＯに溶解させ、１００ｍｌの培地に５０μｇのＩを添加し、終濃度を２μｇ／ｍｌとした。対照のディッシュは溶媒としてＯＭＳＯを含めた。４日目に、腺を新鮮な培地ですすぎ、ＯＭＢＡを含まない新鮮な培地を含む新しいディッシュに移すことで、培地からＯＭＢＡを除去する。１０日間インキュベートした後、腺をＩ（５μｇ／ｍｌ）のみを含む培地中に更に１４日間維持した。全培養期間中、腺は９５％Ｏ２及び５％ＣＯ２環境下で３℃に維持した。成長促進期の最初の１０日間、培地に化学予防剤を含めた。被験ペプチドｐ２８（配列番号２）を１２．５〜１００μｇ／ｍｌの４つの濃度で評価した。フェンレチニド（ＭＡＬの実験）及びタモキシフェン（ＭＤＬの実験）を１μＭ濃度で含めた（エタノールに溶解）。アズリンを培地中５０μｇ／ｍｌで評価した。ｐ２８（配列番号２）ペプチドは使用前に滅菌水に溶かしてろ過した。週に３回培地を交換した（月曜日、水曜日及び金曜日）。暴露の最後に、腺をホルマリンで固定した。ＭＡＬを調べるためには、腺をアルムカーミンで染色し、病変の有無について評価した。乳房病変の有無、各腺における病変の重症度、及び薬剤の毒性について腺にスコアを付けた。ＭＤＬでは、腺を組織病理学的評価用に処理し、腺を縦方向に５ミクロンの切片にし、エオシン・ヘマトキセリンで染色した。
【０２５４】
化学予防剤：薬剤アズリン及びｐ２８（配列番号２）はＣＤＧセラピューティックス社（ＣＤＧ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．）により供給されたものである。薬剤は安定且つ純粋であると想定した。
【０２５５】
形態計測分析：キシレン中に保存した腺を、解剖顕微鏡下で各腺について乳房病変の有無、発生率、及び重症度に関して評価した。乳房病変について陽性又は陰性として乳腺にスコアを付け、その群中の腺の総数に対する病変を呈する腺の割合として、発生率を求めた。化学予防剤処置による管の拡張又は乳房構造の崩壊を毒作用と見なした。データを発生率に関して統計解析にかけ、潜在的化学予防剤の有効性を決定した。
【０２５６】
ＭＤＬの組織病理学的評価：各腺の縦方向の切片を複数のフィールドに分け、各フィールドを管病変について評価した。簡潔に説明すると、腺全体を顕微鏡下で評価する；小さい腺は大きい腺よりも総フィールド数が少なくなる。したがって、各腺でフィールド数は異なる。多くの場合、管全体の切片の数も腺によって大きく異なり、そのため、群と群の間で数が異なる。各腺について、管の過形成又は異型を含むフィールドを決定し、評価したフィールドの総数と比較した。過形成又は異型と極度に閉塞された腺は区別しない。これらの組織学的パターンのいずれかを含む全てのフィールドを病変について陽性と見なした。処置群を重症度について対照と比較し、阻害率を計算した。
【０２５７】
統計解析：１群当たり１５個の腺を用いた時に化学予防剤が６０％以上の阻害を示す場合、結果は統計的に有意と見なされる（ｐ＜０．０５）。結果はフィッシャー直接検定で解析した。
【０２５８】
結果及び議論：ＭＭＯＣモデルは、ＤＭＢＡに応答した乳房胞巣状病変又は管病変の発生に対する潜在的有効化学物質の有効性を評価することを可能にする。ＤＭＢＡは、適切なインキュベーション条件下で、培地中のホルモン環境に応じてＭＡＬ又はＭＤＬを形成する（Ｍｅｈｔａ，Ｒ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ，ＪＮＣＩ  ９３：１１０３−１１０６（２００１））。エストロゲン及びプロゲステロンで処置した培養中の腺は管病変を発生し、アルドステロン及びヒドロコルチゾンで処置した腺はエストロゲン・プロゲステロン非依存性の胞巣状病変を形成する。発癌物質又は化学予防剤に曝されなかった乳腺は成長促進ホルモンの非存在下では構造的に退縮するが、３日目と４日目の間にＤＭＢＡで２４時間処置すると、ホルモンの欠乏により生じる構造的退縮が防止される。これは、腺が正常なホルモン応答性を失い、発達の過程が変化したためであると考えられる。以前に指摘されているように、癌化細胞を同系マウスに移植することで乳腺癌を発生させることで、これらの退縮領域が前新生物性の性質であることが証明されている。
【０２５９】
ｐ２８（配列番号２）及び４−ＨＰＲの効果：胞巣状病変の発生に対するｐ２８（配列番号２）及び４−ＨＰＲ単独並びに組合せの効果を表７及び図８に要約する。
【０２６０】
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フィッシャー直接検定
＊グループ１ｖｓ３  ＋ＮＳ  ｐ＋０．１３９４
他全てＶＳグループ１：ｐ＜０．０５
【０２６１】
全ての腺の写真を撮った。写真を図１０に示す。ペプチドｐ２８（配列番号２）は濃度２５μｇ／ｍｌでＭＡＬ形成を６７％阻害した。ｐ２８（配列番号２）の濃度を更に１００μｇ／ｍｌまで上昇させると、阻害は８０％になった。併用化学予防実験の結果、予想通り、４−ＨＰＲがＭＡＬの発生を６７％阻害することが示された。アズリンはＭＡＬの発生を約７０％抑制した。統計解析により、ｐ２８（配列番号２）（＞２５μｇ／ｍｌ）、４−ＨＰＲ、及び全ての組合せの効果が、ＤＭＢＡ対照と比較して統計的に有意であることが示された（ｐ＜０．０１、フィッシャー直接検定）。
【０２６２】
ｐ２８（配列番号２）及びタモキシフェンの効果−表８及び図９に、ｐ２８（配列番号２）及びタモキシフェンとの組合せによるＭＤＬの化学予防についての結果を要約する。
【０２６３】
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【０２６４】
ｐ２８（配列番号２）（１２．５μｇ／ｍｌ）はＭＤＬ形成を３２％抑制した。一方、タモキシフェンのみは病変のほぼ５０％を阻害した。低濃度のｐ２８（配列番号２）とタモキシフェンの組合せでは阻害は７１％まで上昇した。全ての化学予防剤が全ての濃度においてＤＭＢＡのみと比較して統計的に有意であった。同時に、ｐ２８（配列番号２）（１２．５μｇ／ｍｌ）又はタモキシフェンのみも、組合せ処置と比べて有意に異なった。結果は、ｐ２８（配列番号２）がＭＡＬ及びＭＤＬの両方の発生を抑制できることを示している。ｐ２８（配列番号２）（１２．５μｇ／ｍｌ）をタモキシフェンと組み合わせると、いずれかの薬剤単独と比べて化学予防活性が有意に上昇した。アズリン及びｐ２８（配列番号２）はエストロゲン・プロゲステロンに依存性の管病変及び非依存性の胞巣状病変の両方を阻害した。
【実施例６】
【０２６５】
細胞中への優先的移入のメカニズム
ヒト細胞株中へのｐ１８（配列番号２５）及びｐ２８（配列番号２）の移入
細胞培養及び細胞株：ヒトの癌及び非癌（不死化及び非不死化）細胞株をＡＴＣＣから入手した［肺癌（Ａ５４９及びＮＣＩ−Ｈ２３腺癌）、正常肺（ＣＣＤ−１３Ｌｕ）、前立腺癌（ＤＵ１４５及びＬＮ−ＣＡＰ）、正常前立腺（ＣＲＬ１１６１１）、乳癌（ＭＣＦ−７）、正常乳房（ＭＣＦ−１０Ａ）、結腸癌（ＨＣＴ１１６）、正常結腸（ＣＣＤ３３Ｃｏ）、線維肉腫（ＨＴ１０８０）、及び卵巣癌（ＳＫ−ＯＶ３腺癌）］。皮膚から単離した正常線維芽細胞を樹立した。正常卵巣細胞（ＨＯＳＥ６−３）はＤｒ．Ｓ．Ｗ．Ｔｓａｏ（香港大学）から寄贈された。メラノーマ系統（ＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２、２３、２９）を樹立及び特徴解析した。ＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２を除く全ての細胞を、１０％熱失活ウシ胎児血清（ジョージア州ローレンスビルのアトランタ・バイオロジカル社（Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．）製）、１００ユニット／ｍｌのペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを添加したＭＥＭ−Ｅ（カリフォルニア州カールズバッドのインビトロジェン社製）中で、３７℃、５％ＣＯ２又は空気中で培養した。
【０２６６】
増殖アッセイ／細胞成長：メラノーマ細胞を１２×１０３細胞／ウェルの密度で平底２４ウェルプレート（ニュージャージー州フランクリンレイクスのベクトン・ディッキンソン社製）に播種した（ｆｏｕｒ  ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ）。２４時間後、培地を交換し、新鮮なｐ１８（配列番号２５）、ｐ２８（配列番号２）、アズリン、又はペプチドを含まない同様な体積の培地（ｅｉｇｈｔ  ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ）を７２時間毎日添加した。次いで、細胞をベックマン・コールター（Ｚ１コールター粒子カウンター）で計数した。値は４つのｒｅｐｌｉｃａｔｅの平均値±ＳＤを表す。
【０２６７】
ＭＴＴアッセイ：メラノーマ細胞を２０００細胞／ウェルの密度で平底９６ウェルプレート（ニュージャージー州フランクリンレイクスのベクトン・ディッキンソン社製）に播種し、２４時間付着させた。次いで、新たに調製したペプチド（１０μｌ）又は培養培地を各ウェルに添加した。２４時間後、培地を交換し、ｐ１８（配列番号２５）、ｐ２８（配列番号２）、又はアズリンを毎日添加した。７２時間インキュベートした後、１０μｌのＭＴＴ試薬（メリーランド州ゲイサーズバーグのトレビジェン社（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）製）を各ウェルに添加し、サンプルをＲＴ／ｓｉｇで３時間インキュベートし、界面活性剤１００μｌを各ウェルに添加し、更に３７℃で３時間サンプルをインキュベートした。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ３４０プレートリーダー（カリフォルニア州サニーベールのモレキュラー・デバイス社製）で吸光度を測定し、非処置対照と比較した処置細胞の５７０ｎｍの吸光度変化率を決定した。値は平均値±−ＳＤを表す。対照と処置群の間の有意性はスチューデントｔ検定により決定した。
【０２６８】
ペプチド合成：ｐ１８（Ｌｅｕ５０〜Ｇｌｙ６７：ＬＳＴＡＡＤＭＱＧＶＶＴＤＧＭＡＳＧ（配列番号２５））、ｐ２８（Ｌｅｕ５０〜Ａｓｐ７７：ＬＳＴＡＡＤＭＱＧＶＶＴＤＧＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号２））、ｐ１８ｂ（Ｖａｌ６０〜Ａｓｐ７７：ＶＴＤＧＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号３８））、ＭＡＰ、マストパラン−７、及びポリアルギニン（Ａｒｇ８、配列番号８２）を含む全てのアズリン由来ペプチドはＣ  Ｓ  Ｂｉｏ社（Ｃ  Ｓ  Ｂｉｏ，  Ｉｎｃ．；カリフォルニア州メローパーク）による合成である。ペプチドは分注された凍結乾燥粉末として受け取り、気密デシケーター中に−２０℃で保存した。その後、全てのペプチドを質量分析法及び逆相ＨＰＬＣで分析し、９５％超の純度及びマスバランス（ｍａｓｓ  ｂａｌａｎｃｅ）を確認した。
【０２６９】
アズリンペプチドの予測的モデリング：ＧＥＮＥＴＹＸソフトウェア（ｖｅｒ．６．１）を用いてアズリン由来ペプチドのＲｏｂｓｏｎの構造モデルを作製した（Ｇａｍｉｅｒ，Ｊ．，Ｏｓｇｕｔｈｏｒｐｅ，Ｄ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｒｏｂｓｏｎ，Ｂ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，１２０：９７−１２０（１９７８））。ＭＡＰＡＳソフトウェアを用いて、強く膜に接触するための所与のタンパク質構造を予測し、そのような接触部を最も形成し易いタンパク質表面領域を決定した（Ｓｈａｒｉｋｏｖ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，５：１１９（２００８））。タンパク質すなわちアズリンが、膜親和性残基スコア（ＭＲＳ）＞３、膜親和性領域スコア（ＭＡＳ）＞６０％、及び膜親和性非対称係数（Ｋｍｐｈａ）＞２．５である場合、タンパク質が実際に膜接触領域を有する確率は高い。
【０２７０】
ペプチド／タンパク質の標識：ペプチドを１ｍｌのＰＢＳに溶解させ、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ５６８色素（オレゴン州ユージーンのモレキュラー・プローブ社製）とタンパク質：色素の比率１：２で混合し、１００μｌの重炭酸ナトリウムを添加し、混合物を連続撹拌しながら４℃で一晩インキュベートした。ｐ１２にはＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒｇ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｃａｓｓｅｔｔｅｓ  １０００  ＭＷＣＯ、その他のものには２０００  ＭＷＣＯ（イリノイ州ロックフォードのピアース・バイオテクノロジー社（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）製）を用いて、冷ＰＢＳに対して透析することで、標識ペプチドを遊離の色素から分離した。
【０２７１】
細胞透過／共焦点分析：細胞をガラス製のカバースリップ上に播種し、５％ＣＯ２下にて３７℃で一晩付着させた。細胞を新鮮な培地ですすぎ、予め温めた、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ５６８標識アズリンペプチド（２０μＭ）若しくはＡｒｇ８（配列番号８２）（５μＭ）を含む培地中又は培地のみの中で、３７℃にて２時間インキュベートした。インキュベーション後、カバースリップをＰＢＳで３回すすぎ、細胞を２．５％ホルマリンで５分間固定し、ＰＢＳで２回、ｄ．ｉ．Ｈ２Ｏで１回洗浄し、カバースリップを、核対比染色用の１．５μｇ／ｍｌのＤＡＰＩ（カリフォルニア州バーリンゲームのベクター・ラボラトリーズ社製ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（登録商標））を含む液中でマウントした。細胞の取込み及び分布を倒立共焦点レーザー走査顕微鏡（ドイツ、ゲッティンゲンのカールツァイス社（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｉｎｃ．）のモデルＬＣ５１０）下で撮影した。
【０２７２】
ガラス製カバースリップ上で成長中の細胞を、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ５６８標識されたアズリン又はペプチドと３７℃にて２時間インキュベートすることで、リソソーム又はミトコンドリアとペプチドの共局在を調べた。Ｍｉｔｒｏｔｒａｃｋｅｒ（ＭｉｔｒｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  ＦＭ、カリフォルニア州カールズバッドのインビトロジェン社製）又はｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ（ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  ＤＮＤ−２６、カリフォルニア州カールズバッドのインビトロジェン社製）をインキュベーションの最後の３０分間に添加した（終濃度１μＭ）。細胞をＰＢＳで３回すすぎ、２．５％ホルマリンで５分間固定し、ＰＢＳで２回洗浄し、０．１％トリトン−Ｘ１００を含むＰＢＳ中で１５分間インキュベートした。次いで、細胞を１μｇ／ｍｌウサギ抗ヒトゴルジン（ｇｏｌｇｉｎ）９７又は抗ヒトカベオリンＩ（マサチューセッツ州ケンブリッジのＡｂｃａｍ社製）を含むＰＢＳ中で１％ＢＳＡと共にインキュベートした。４℃で１時間インキュベートした後、カバースリップをＰＢＳで１回洗浄し、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４６８コンジュゲートヤギ抗ウサギ抗体を含むＰＢＳ中で１０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回、ｄ．ｉ．Ｈ２Ｏで１回洗浄した。次いで、カバースリップを核対比染色用の１．５μｇ／ｍｌのＤＡＰＩを含む液中でマウントした。Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ５６８（赤色）とＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ４６８（緑色）の共局在（黄色）を分析し、撮影した。
【０２７３】
カバースリップ上のＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞を、１００μｇ／ｍｌのヘパリン硫酸（ミズーリ州セントルイスのシグマ−アルドリッチ社製）を含むＭＥＭ−Ｅ中で３０分間プレインキュベートし、ｐ１８（配列番号２５）、ｐ２８（配列番号２）、又はＡｒｇ８（配列番号８２）を終濃度が２０μＭになるように添加した。１時間後、カバースリップを前述のように洗浄、固定、及び分析した。
【０２７４】
ＦＡＣＳによる細胞透過：細胞（１．０×１０６／５００μｌ  ＰＢＳ）を、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ５６８で標識したｐ１８（配列番号２５）若しくはｐ２８（配列番号２）（２０μＭ）、Ａｒｇ８（配列番号８２）（５μＭ）と又は培地のみと３７℃で２時間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、２．５％ホルマリンで５分間固定し、ＰＢＳで２回洗浄し、２００μｌのＰＢＳに再懸濁し、篩に通して単一細胞懸濁液を得た。ＭｏＦｌｏ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒ（デンマーク、グロストルップ（Ｇｌｏｓｔｒｕｐ）のＤａｋｏ社製）λｅｘ５６８ｎｍ及びλｅｍ６０３ｎｍを用いてサンプルを分析し、バックグラウンドレベルに対する平均蛍光強度の倍率を計算した。結果は３つの別個の実験の平均蛍光を表す。
【０２７５】
移入阻害剤：３７℃でフェノールレッド及び血清を含まないＭＥＭ−Ｅ中に維持したＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞（３×１０５／３００μｌ）を以下を含む阻害剤で前処置した：クロロプロマジン（Ｃｈｌｏｒｏｐｒｏｍａｚｉｎｅ）（クラスリン仲介エンドサイトーシスの阻害剤、１０μｇ／ｍｌ、６０分間）；アミロリド（マクロピノサイトーシス阻害剤、５０μＭ、３０分間）；ナイスタチン（５０μｇ／ｍｌ、３０分間）；メチル−β−シクロデキストリン（ＭβＣＤ、５ｍＭ、６０分間）；フィリピン（カベオラ仲介エンドサイトーシスの阻害剤、３μｇ／ｍｌ、６０分間）；タキソール（微小管安定化剤、２０μＭ、３０分間）；スタウロスポリン（細胞周期阻害剤、２５０ｎＭ、１０分間）；アジ化ナトリウム（代謝阻害剤、１ｍＭ、６０分間）；ウアバイン（ＡＴＰａｓｅ依存性Ｎａ＋／Ｋ＋ポンプ阻害剤、５０ｍＭ、６０分間）；ブレフェルジンＡ（ＢＦＡ；ゴルジ装置破壊剤、１００μＭ、６０分間）；ワートマニン（初期エンドソーム阻害剤、１００ｎＭ、３０分間）；モネンシン（後期エンドソーム／リソソームにおける阻害、１０μＭ、６０分間）；ノコダゾール（カベオソーム形成を阻害、１０μＭ、６０分間）；サイトカラシンＤ（アクチンフィラメント及び微小管の破壊剤、５μＭ、３０分間）；ベンジル２−アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＢｎＧａｌＮａｃ；Ｏ結合型グリコシル化阻害剤、３ｍＭ、４８時間）；ツニカマイシン（Ｎ結合型グリコシル化阻害剤、２０μｇ／ｍｌ、４８時間）；及びノイラミニダーゼ（タンパク質からシアル酸残基を切断、ＩＵ／ｍｌ、３０分間）。終濃度は個々の阻害剤の用量反応曲線から決定した。次いで、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ５６８標識されたｐ１８（配列番号２５）又はｐ２８（配列番号２（２０μＭ）を添加し、１時間インキュベートし、細胞を洗浄及び固定し、前述したようにサイトメトリー分析用に調製した。
【０２７６】
細胞膜毒性アッセイ／ＬＤＨ漏出アッセイ：ＬＤＨ漏出アッセイをメーカーの取扱説明書（ＣｙｔｏＴｏｘ−Ｏｎｅ、ウィスコンシン州のプロメガ社）に従い１００μｌのＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞（５×１０３）を用いて行った。ペプチド／タンパク質なしの細胞を陰性対照として用いた。実験はｔｒｉｐｌｉｃａｔｅで行った（データは平均値±ＳＥＭを表す）。
【０２７７】
溶血アッセイ：ヒト全血サンプル（２〜３ｍｌ）を１０００×ｇで１０分間遠心し、ペレットをＰＢＳで１回、ｐＨ７．４のＨＫＲバッファーで１回洗浄した（１８）。次いで、赤血球が４％となるように細胞ペレットをＨＫＲバッファーに再懸濁し、５０μｌを、ペプチド、アズリン（５、５０及び１００μＭ）、又は０．１％トリトンＸ−１００を含むＨＲＫバッファー９５０μｌと共に１．５ｍｌチューブに移してＲＢＣ膜を完全に破壊した。ＭＡＰ及びマストパラン７（カリフォルニア州トランスのバケム・カリフォルニア社（Ｂａｃｈｅｍ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，  Ｉｎｃ．）製）を陽性対照として用いた。３７℃で３０分間回転させながらインキュベートした後、チューブを１０００×ｇで２分間遠心し、上清３００μｌを９６ウェルプレートに移し、５４０ｎｍの吸光度を記録した。
【０２７８】
移入のカイネティクス：１．５ｍｌチューブ中のＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞（５×１０５細胞）をフェノールレッドを含まないＭＥＭＥ培地に懸濁した。Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ５６８コンジュゲートｐ１８（配列番号２５）を０、１０、２０、５０、１００、１５０及び２００μＭで５、１０、１５及び２０秒間又はＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ５６８コンジュゲートｐ２８（配列番号２）を１、１０、２５、５０、１００、１５０及び２００μＭで３０、６０、９０及び１２０秒間氷上で添加することで、反応を開始させた。インキュベーション後、２５０μｌの反応混合液に１ｍｌの冷ＰＢＳを添加した。細胞を４℃、６００×ｇで２分間、２回遠心した。各反応液について少なくとも１０，０００個の固定細胞をフローサイトメトリーで分析し、バックグラウンド及び相対蛍光を計算した。
【０２７９】
アズリンのＩ１２５標識及び競合アッセイ：ペプチドの結合及び移入の測定には、ＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞を含むＨＥＰＥＳ溶液（５０，０００細胞／ｍｌ）を用いた全細胞（ｗｈｏｌｅ  ｃｅｌｌ）アッセイを用い、１０００倍過剰量の非標識ｐ１８（配列番号２５）、ｐ２８（配列番号２）、又はアズリン存在下／非存在下で種々の濃度（０〜１７５ｎＭ）の放射性標識されたアズリンと３７℃で３０分間インキュベートし、次いで氷冷ＰＢＳで３回洗浄し、細胞ペレットに残っている放射活性をγ線計数器で測定した。Ｉ１２５アズリンのみとインキュベートした細胞中の放射活性を全結合と見なし、非標識アズリン、ｐ１８（配列番号２５）、又はｐ２８（配列番号２）存在下での放射活性を非特異的結合と見なした。全結合から非特異的結合を引くことで特異的結合を決定し、スキャッチャード・プロットを作製した。
【実施例７】
【０２８０】
癌細胞中への優先的移入に関与するｐ２８（配列番号２）のドメイン
ペプチド−ＧＳＴコンストラクトから得られた初期のデータから、アズリンのａａ５０〜７７が細胞透過の推定ＰＴＤとして定義され、これはアズリン分子を安定化するアズリンの残基５４〜６７を含むαヘリックス領域を示す構造的証拠とよく一致している。ｐ２８／アズリンのｐ２８（配列番号２）及びｐ１８（配列番号２５）（図１１Ａ）はヒトメラノーマ、前立腺癌細胞、肺癌細胞、乳癌細胞、及び卵巣癌細胞を比較的同様な効率で透過するが、組織学的に対応する正常細胞株は同じ程度に透過しないことが最初に共焦点分析により示唆された（図１１Ａ）。唯一の例外は肺線維芽細胞に由来する細胞株であるＣＣＤ１３−Ｌｕであった。陽イオン性のＡｒｇ８（配列番号８２）は素早く効率的に線維芽細胞（図１１Ａ）及び試験した全てのその他の正常細胞株に取り込まれた（データ示さず）。
【０２８１】
これらの観察結果は、より感度の高いＦＡＣｓ解析で本質的に確認され（図１１Ｂ）、肺癌を除き、ｐ２８（配列番号２）及びｐ１８（配列番号２５）の蛍光は対応する正常細胞株よりもそれぞれ約０．５〜６倍及び約０．５〜３倍高かった。組織学的亜種のメラノーマ内でも細胞内蛍光強度に同様なパターンが観察され、ｐ１８（配列番号２５）の相対強度はｐ２８で観察された強度の約５０％であった（図１１Ｃ）。バックグランドに対する蛍光強度も、ｐ２８（配列番号２）に曝された正常細胞及び癌細胞の組よりもｐ１８（配列番号２５）に曝された正常細胞及び癌細胞の組で一貫して低く（データ示さず）、ここでも、個々の細胞への移入はｐ１８（配列番号２５）の方が少ないことが示唆された。全ての場合で、癌細胞又は正常細胞中へのｐ１８（配列番号２５）及びｐ２８（配列番号２）の移入の程度は、移入に優先性が観察されなかったＡｒｇ８（配列番号８２）で観察されたよりも有意に低かった（図１１Ａ）。予測されたｐ１８（配列番号２５）のＲｏｂｓｏｎ構造（データ示さず）はＣ末端アミノ酸が部分的なβシートを形成することを示唆している。このこと及びｐ１８（配列番号２５）がｐ２８（配列番号２）の親水性Ｃ末端１０アミノ酸（ａａ６８〜７７）（配列番号４０）を欠いており短いことは、アズリンの推定ＰＴＤとしてのｐ１８（配列番号２５）の癌細胞及び正常細胞への移入が、エンドサイトーシスプロセス又は膜受容体仲介プロセスによる移入よりも非エンドサイトーシスプロセスによる移入の方が速いであろうことを示唆している。ＭＡＰＡＳのデータ（ＭＲＳ  ３．７４、ＭＡＳ  ８７．１、Ｋｍｐｈａ  ２．３７）から、アズリンのａａ６９、７０、７５、７６、８５が最も膜に接触し易いことが予想され、ｐ１８（配列番号２５）（ａａ５０〜６７）には存在しないｐ２８（配列番号２）のＣ末端領域が細胞の状態に関係なく細胞膜上の特定の残基に最も接触し易いことが示唆される。
【０２８２】
同じ細胞株をアズリン６０〜７７（ｐ１８ｂ、配列番号３８）又はｐ２８のＣ末端１２ａａであるａａ６６〜７７（ｐ１２、配列番号３９）に曝すことでｐ１８（配列番号２５）及びｐ２８（配列番号２）の優先的透過を確認した（図１２Ａ、Ｂ）。ここでは、ｐ１８及びｐ２８で観察された優先的透過は完全に消失していた。ｐ１８ｂ（配列番号３８）（理論的ｐＩ＝４．１３）は短いαヘリックス及び部分的βシートを有し、極端に親水性であり、これらが合わさって優先的移入が消失している可能性がある。ｐ１２（理論的ｐＩ＝４．３３）はαヘリックス二次構造を欠くがやはり親水性であり、全体的に親水性であることが細胞透過の選択性低下への主要な要因であることが示唆される。
【実施例８】
【０２８３】
細胞透過は膜破壊によるものではない
アズリン、ｐ２８（配列番号２）、及びｐ１８（配列番号２５）による細胞透過は膜破壊によるものではない。５〜１００μＭのｐ２８（配列番号２）、ｐ１８（配列番号２５）、又はアズリン存在下でＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞を用いたＬＤＨ漏出アッセイ（図１３Ａ）により、ペプチドもアズリンも形質膜の完全性を変化させて細胞に移入するのではないことが示唆された。両親媒性αヘリックスとして細胞膜を通過してヘテロ三量体Ｇタンパク質を活性化する肥満細胞脱顆粒ペプチドのマストパラン７及び受容体模倣ＭＡＰに対してヒト赤血球へのアズリン、ｐ２８（配列番号２）、及びｐ１８（配列番号２５）の溶血活性を測定することで、膜破壊がないことを確認した。マストパラン７は２５μＭで完全な細胞溶解を引き起こしたが、アズリン、ｐ２８（配列番号２）、及びｐ１８（配列番号２５）は対照（ペプチドなし）と比べて溶血効果を有さなかった（図１３Ｂ）。
【実施例９】
【０２８４】
ｐ１８（配列番号２５）／ｐ２８（配列番号２）の透過はエネルギー依存的且つ飽和性である
ＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞中へのｐ２８（配列番号２）（図１４Ａ）及びｐ１８（配列番号２５）（図１４Ｂ）の透過は温度依存性である。細胞透過及び細胞内輸送は４℃では３時間にわたり比較的ゆっくりと起こるが、種々のコンパートメントを介した移入及び細胞内輸送は２２℃及び３７℃では素早く起こり、ｐ１８（配列番号２５）及びｐ２８（配列番号２）は暴露から２時間以内にＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞の核中に存在した。２００倍過剰量の非標識ペプチド存在下で３０分後のＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞中への５μＭのｐ２８（配列番号２）（図１４Ｃ）又はｐ１８（配列番号２５）（図１４Ｄ）の透過は強く抑制され、このことは、移入が飽和プロセスであり、特異的受容体又は細胞表面のタンパク質若しくは特定の残基が少なくとも部分的に、初期の移入に関与していることを示唆している。
【実施例１０】
【０２８５】
ｐ２８（配列番号２）及びｐ１８（配列番号２５）のカイネティクス
ヒト線維芽細胞と比較したＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞中へのｐ２８（配列番号２）及びｐ１８（配列番号２５）の移入のカイネティクスを、インキュベーション後、細胞を固定して平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定した時に計算した。ペプチド濃度（μＭ）と速度（ＭＦＩ／秒）をプロットするかスキャッチャード分析により、各ペプチドのＫｍ及びＶｍａｘを算出した。アズリン断片５０〜６７（ｐ１８（配列番号２５）及び５０〜７７（ｐ２８（配列番号２）の癌細胞への透過（それぞれＶｍａｘ  ２．４６、Ｋｍ  １０１．６及びＶｍａｘ  １．８７、Ｋｍ  １５９．１）及び正常細胞中への透過（それぞれＶｍａｘ  ２．８８、Ｋｍ  １０２．１及びＶｍａｘ  １．８９、Ｋｍ  １６６．０）は互いに有意に異なり、ｐ１８（配列番号２５）が約４２％速く移入するが、正常細胞及び癌細胞中に各ペプチドが移入する割合は実質的に同じである。ｐ１８（配列番号２５）よりもｐ２８（配列番号２）に癌細胞を暴露した後の方が蛍光量が増加しているのは、悪性細胞に移入するｐ２８（配列番号２）の量の増加によるものであろう。１２５Ｉアズリン及びｐ１８（配列番号２５）は同様な親和性でＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞に結合した。対称的に、より高い温度（３７℃ｖｓ４℃）でより長時間（２０分間ｖｓ２分間）暴露した場合、ｐ１８（配列番号２５）（Ｋｄ  １８ｍｉｎ、Ｂｍａｘ  ０．５１ｐｍ）又はアズリン（Ｋｄ  １０ｎｍ及び０．４８ｐｍ）よりもｐ２８（配列番号２）がより高い親和性で有意により多くＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞に結合した（Ｋｄ  ２．５μｍ、Ｂｍａｘ  ３．０ｐｍ）。これらの結果は、アズリン、ｐ２８（配列番号２）、及びｐ１８（配列番号２５）は全て移入前に癌細胞及び正常細胞の表面の部位に比較的高い親和性及び容量で結合するが、移入は２つ以上のメカニズムを介している可能性があることを示している。
【実施例１１】
【０２８６】
ｐ１８（配列番号２５）／ｐ２８（配列番号２）の透過にはカベオラ及びゴルジ複合体が関与する
膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）又は細胞送達ベクター（ＣＤＶ）と呼ばれるペプチド、例えばペネトラチン、トランスポータン、Ｔａｔ（アミノ酸４７〜５７又は４８〜６０）、及びモデル両親媒性ペプチドＭＡＰは、短く、両親媒性であり、陽イオン性である、ペプチド及びペプチド誘導体であり、通常、複数のリジン残基及びアルギニン残基を含む（Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｐ．Ｍ．，Ｍｅｄ  Ｒｅｓ  Ｒｅｖ，２７：７５５−７９５（２００７））。これらは、遺伝子治療における細胞毒性薬剤、アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質、ペプチド等の種々のカーゴの潜在的な輸送剤又は送達媒体（ｖｅｈｉｃｌｅ）として及び囮ペプチドとして大きな注目を集めている小分子のクラスを形成する（Ｈａｌｌｂｒｉｎｋ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １５１５：１０１−１０９（２００１）；Ｌｉｎｄｇｒｅｎ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．２１：９９−１０３（２０００）；Ｇｕｓａｒｏｖａ，ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，１１７：９９−１１１（２００７）；Ｍｅｌｎｉｃｋ，Ａ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｔｒａｎｓ，３５：８０２−８０６（２００７）；Ａｓｔｒｉａｂ−Ｆｉｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ，１９：７４４−７５４（２００２）；Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ，８：１２６２−１２７３（２００６）；及びＣａｓｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，６：８１３−８２３（２００２））。
【０２８７】
１つのクラスとして、ｐＴａｔ、Ａｒｇ８（配列番号８２）等の陽イオン性ＣＰＰは、エンドサイトーシスの前に陰イオン性の硫酸化プロテオグリカンに最初に結合することで細胞に移入する。無血清条件下で１００μｇ／ｍｌのヘパリン硫酸（ＨＳ）の存在下／非存在下でｐ２８（配列番号２）及びｐ１８（配列番号２５）及びＡｒｇ８（配列番号８２）をＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞とインキュベートすると、細胞内のＡｒｇ８（配列番号８２）の量は有意に低下したが、ｐ２８（配列番号２）又はｐ１８（配列番号２５）の移入は変化しなかった（図１５Ａ）。Ｏ結合型グリコシル化の特異的阻害剤ＢｎＧａｌＮａｃ及びシアル酸残基を切断するネルアミニダーゼ（ｎｅｒｕａｍｉｎｉｄａｓｅ）の存在下／非存在下におけるＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞中へのｐ１８（配列番号２５）及びｐ２８（配列番号２）の透過を更に特徴解析した結果（図１５Ｂ）、透過阻害は観察されなかった。しかし、Ｎ結合型グリコシル化の阻害剤であるツニカマイシンは細胞膜を横切るｐ１８（配列番号２５）及びｐ２８（配列番号２）の透過を有意に低下させた。
【０２８８】
ＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞中へのｐ１８（配列番号２５）及びｐ２８（配列番号２）の移入を、エネルギー依存的輸送機構（すなわちＡＴＰ）の阻害剤を用いて更に分析した。アジ化ナトリウム（図１５Ｂ）及びウアバイン（Ｎａ＋Ｋ＋  ＡＴＰａｓｅポンプ）はどちらのペプチドの透過も有意に阻害しなかった。このことは、これらのペプチドの透過に非エンドサイトーシス経路も関与し得ることを示唆している。クラスリン仲介エンドサイトーシスの特異的阻害剤であるクロルプロマジン（ＣＰＺ）も透過に影響を与えず、マクロピノサイトーシス阻害剤であるアミロリドも影響を与えなかった（図１５Ｂ）。タキソールによる微小管の安定化も透過に影響を与えなかったが、サイトカラシンＤを用いたアクチンフィラメントの破壊及びマクロピノサイトーシスの阻害はｐ１８及びｐ２８の透過を再現可能に少し（約２０％）阻害した。アミロリドが影響を与えなかったことは、サイトカラシンＤの阻害活性がおそらくアクチンフィラメントへの影響によるものであることを示している。
【０２８９】
スタウロスポリンを用いて細胞周期を阻害しても透過はブロックされなかった。このことは、透過が細胞周期特異的でないことを示している。ｐ１８（配列番号２５）及びｐ２８（配列番号２）の癌細胞形質膜の透過にスタウロスポリンが影響しないことは更に、Ｓｒｃキナーゼ／チロシンキナーゼ依存性経路が透過に関与しないこと、ダイナミン非依存性であること、したがってカベオラの出芽（ｂｕｄｄｉｎｇ）非依存性であることも示している。ｐ１８及びｐ２８のどちらも、形質膜内に存在しエンドサイトーシス中間体の特定の集団内に存在するタンパク質であるフロチリン−１と共局在せず（データ示さず）、このことからも、内部移行におけるフロチリン及びダイナミンの役割は否定される。一方、カベオラ輸送を阻害し且つコレステロール動員の阻害剤である、したがって、カベオラ仲介エンドサイトーシスの阻害剤である、ノコダゾールは、透過を５０〜６５％阻害した。
【０２９０】
次いで、初期エンドソーム形成阻害剤であるワートマニン、後期エンドソーム／リソソームを阻害するモネンシン、及びゴルジ装置破壊剤であるブレフェルジンＡ（ＢＦＡ）を用いてｐ１８（配列番号２５）及びｐ２８（配列番号２）の細胞内配置を解析した。ワートマニンは、ｐ１８（配列番号２５）又はｐ２８（配列番号２）のいずれの細胞内蓄積もブロックしなかったことから、コレラ毒素とは異なり、ｐ１８（配列番号２５）及びｐ２８（配列番号２）の細胞内輸送にはカベオラから初期エンドソームへの経路が関与しないことが示された。ｐ１８（配列番号２５）及びｐ２８（配列番号２）の細胞内輸送に初期エンドソームが関与しないことは更に、クラスリン仲介エンドサイトーシスもこれらのペプチドの内部移行に関与しないことを示している。
【０２９１】
しかし、モネンシン（図１５Ｂ）及びＢＦＡは両方のペプチドの細胞内蓄積を低下させ、ｐ２８（配列番号２）への阻害効果（約３０％）はｐ１８（配列番号２５）への阻害効果（約１０％）よりも大きかった（図１５Ｂ）。線維芽細胞中へのｐ２８（配列番号２）及びｐ１８（配列番号２５）の透過もＭβＣＤ、ノコダゾール、モネンシン、及びツニカマイシンで阻害されたが、アミロリド、アジ化ナトリウム、及びＣＰＺでは阻害されなかった（図１５Ｃ）。このことは、癌細胞及び正常細胞中への移入の少なくとも１つのメカニズムが類似し得るが、癌細胞中への更なる優先的蓄積は、共通する膜の受容体又は構造体（すなわちカベオラ）の数によって変わり得ることを示している（図１５Ｄ、パネル１、２）。Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ５６８標識されたｐ１８（配列番号２５）及びｐ２８（配列番号２）はカベオリン−１及びゴルジン９７抗体と共局在した（図１５Ｄ、パネル１、２）。このことから、これらのオルガネラがｐ１８（配列番号２５）及びｐ２８（配列番号２）の細胞内輸送に関与することが確認された。興味深いことに、アズリンはミトコンドリア特異的蛍光と共局在したが、ｐ１８（配列番号２５）及びｐ２８（配列番号２）はミトコンドリア特異的蛍光と共局在しなかった（図１５Ｄ、パネル３）。一方、ｐ２８（配列番号２）及びアズリンはリソソームと共局在したが、ｐ１８（配列番号２５）はリソソームと共局在しなかった（図１５Ｄ、パネル４）。
【実施例１２】
【０２９２】
ｐ２８（配列番号２）及びｐ１８（配列番号２５）の機能的分析
アズリンは複数のヒト癌細胞株の成長をインビトロ及びインビボで阻害する。図１６Ａ及びＢに、ＭＴＴ及び細胞計数により測定したＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞に対するｐ１８（配列番号２５）及びｐ２８（配列番号２）の効果をアズリン及びダカルバジン（ＤＴＩＣ）と比較して示す。暴露７２時間後、アズリンは１００μＭ及び２００μＭで細胞生存率を約１５％低下させた（ｐ＜０．０５）（図１５Ａ）。ｐ２８（配列番号２）は１００μＭ及び２００μＭで細胞の生存をそれぞれ１４％及び２２％阻害した（ｐ＜０．０５）。一方、ｐ１８（配列番号２５）は何ら影響を与えず、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）はＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２の生存を用量依存的に有意に低下させた。アズリン及びｐ２８（配列番号２）（２００μＭ）はＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２３細胞及びＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２９細胞の生存も有意に低下させた。ｐ１８（配列番号２５）はＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞の増殖に何ら影響しなかった。
【０２９３】
細胞の直接計数により測定されたｐ２８（配列番号２）及びアズリンによるメラノーマ細胞増殖阻害の明らかな上昇（約３０〜３５％：ＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２）は、阻害効果が何らかの遅延後のアポトーシスを伴う細胞周期のレベルに主に存在することを示している。ｐ１８（配列番号２５）は、癌細胞を優先的に透過したが、ｐ２８（配列番号２）とは異なり、細胞増殖に対する阻害活性を実質的に有していなかった。この結果は、ｐ２８（配列番号２）の細胞分裂阻害活性及び細胞毒性活性が配列のＣ末端１０〜１２ａａにあることを示している。
【実施例１３】
【０２９４】
ｐ５３実験
アズリン由来ペプチドを用いたｐ５３を介した癌成長阻害：
材料及び方法
細胞培養：ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ−７（ｐ５３  ｗｔ）、Ｔ４７Ｄ（ｐ５３  ｍｕｔ）ＺＲ−７５−１（ＡＴＣＣ；バージニア州マナッサス）、及びＭＤＤ２（ｐ５３ドミナントネガティブ；ニューヨーク州バッファローのロズウェルパーク癌研究所（Ｒｏｓｅｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）のＤｒ．Ａｎｄｒｅｉ  Ｖ．Ｇｕｄｋｏｖの好意による）細胞を、２ｍｍｏｌ／ＬのＬ−グルタミン、１０％熱失活ウシ胎児血清を添加した０．１ｍｍｏｌ／Ｌの必須アミノ酸を含むＭＥＭ−Ｅ（カリフォルニア州カールズバッドのインビトロジェン社製）中で培養した。
【０２９５】
細菌培養及びアズリンの単離：大腸菌ＪＭ１０９の培養及びアズリンの精製工程はＹａｍａｄａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ，７０：７０５４−７０６２（２００２）及びＧｏｔｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，４７：５４９−４４９（２００３）に記載されている通りである。
【０２９６】
ペプチド合成：ｐ１８（Ｌｅｕ５０〜Ｇｌｙ６７  ＬＳＴＡＡＤＭＱＧＶＶＴＤＧＭＡＳＧ（配列番号２５））、ｐ２８（Ｌｅｕ５０〜Ａｓｐ７７  ＬＳＴＡＡＤＭＱＧＶＶＴＤＧＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号２））、ｐ１８ｂ（Ｖａｌ６０〜Ａｓｐ７７  ＶＴＤＧＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号３８））、ｐ１２（Ｓｅｒ６６〜Ａｓｐ７７  ＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号３９））、及びポリアルギニン（Ａｒｇ８：配列番号８２）を含む全てのアズリン由来ペプチドはＣ  Ｓ  Ｂｉｏ社（カリフォルニア州メンローパーク）により９５％超の純度及びマスバランスで合成された。
【０２９７】
増殖アッセイ：細胞を１２×１０３細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレート（ニュージャージー州フランクリンレイクスのベクトン・ディッキンソン社製）中のＭＥＭ−Ｅ中に播種し（ｑｕａｄｒｕｐｌｉｃａｔｅ）、５、５０、１００、及び２００μＭのｐ２８（配列番号２）存在下で２４、４８及び７２時間インキュベートした。培地は毎日交換した。対照のウェルにはｐ２８（配列番号２）を含まないＭＥＭ−Ｅを入れた（８ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ）。ドキソルビシン（１０μＭ）を陽性対照として用いた（Ｚ１カウンター；カリフォルニア州フラートンのベックマン・コールター社製）。値は対照の（％）を表す。対照と処置群の間の有意性はスチューデントｔ検定により決定した。
【０２９８】
ＭＴＴアッセイ：ＭＣＦ−７細胞を２０００細胞／ウェルの密度で播種し（ｑｕａｄｒｕｐｌｉｃａｔｅ）、２４時間付着させ、新たに調製したペプチド（１０μｌ）又はＭＥＭ−Ｅを各ウェルに添加した。２４時間後、培地及びｐ１８（配列番号２５）、ｐ２８（配列番号２）、アズリン、又はドキソルビシンを毎日添加した。インキュベーション後、１０μｌのＭＴＴ試薬（メリーランド州ゲイサーズバーグのトレビジェン社製）を各ウェルに添加し、サンプルをＲＴで３時間インキュベートし、１００μｌの界面活性剤を各ウェルに添加し、３７℃で更に３時間インキュベートした。吸光度（５７０ｎｍ）を測定し（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ３４０プレートリーダー；カリフォルニア州サニーベールのモレキュラー・デバイス社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）製）、処置した細胞における変化率を決定した。対照と処置群の間の有意性（ｐ＜０．０５）はスチューデントｔ検定により決定した。
【０２９９】
異種移植モデル；エストラジオールで前処置（０．７２ｍｇ／ペレット、６０日間放出；フロリダ州サラソータのイノベイティブ・リサーチ社（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）製）された雌の胸腺欠損マウス（ハーラン社（Ｈａｒｌａｎ）製；４〜５週齢）の右側腹部に３×１０６個のＭＣＦ−７細胞を皮下（ｓ．ｃ．）接種し、処置前に対照及び実験群にランダムに分けた。対照動物にはＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）／ひまし油を腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ（１５μｍｏｌ／ｋｇ）を含むＰＢＳ／ひまし油を腫瘍細胞接種後１０、１４、２１及び２５日目にｉ．ｐ．注射するか、ｐ２８（配列番号２）（５又は１０ｍｇ／ｋｇ）を含む滅菌ＰＢＳを３０日間毎日ｉ．ｐ．注射した。腫瘍体積は週３回測定し、体重は週２回測定した。マウスの死体解剖を３１日目に行い、全ての腫瘍を回収して病理組織診断及び免疫細胞化学に用いた。対照と処置群の間の有意性（ｐ＜０．０５）はスチューデントｔ検定により決定した。
【０３００】
免疫細胞化学：死体解剖の２時間前にＢｒｄＵ（５０ｍｇ／ｋｇ体重）をｉ．ｐ．注射した。ＢｒｄＵで標識された腫瘍細胞核を抗ＢｒｄＵモノクローナル抗体（ニュージャージー州フランクリンレイクスのベクトン・ディッキンソン社製）を用いて特定した。圧力釜中で６分間１０ｍＭのクエン酸バッファーで処置したホルマリンで固定した５μのパラフィン切片中のｐ５３の発現を定量した。冷却したスライドを３％Ｈ２Ｏ２で１０分間処置して内因性ペルオキシダーゼをブロックし、ブロッキング用血清で１０分間覆い、ｐ５３抗体（ＤＯ−１；カリフォルニア州サンタクルーズのサンタクルーズ・バイオテクノロジー社製）に室温で２時間曝した。ラット抗マウスＩｇＧ２ａを二次抗体として用いた。Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣキット（カリフォルニア州バーリンゲームのベクター・ラボラトリーズ社製）及び３，３’−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド（ミズーリ州セントルイスのシグマ・アルドリッチ社製）を用いてｐ５３発現細胞を特定した。スライドをヘマトキシリンで対比染色した。各腫瘍周辺の重複しない１０個のフィールド（２５０細胞／フィールド）をｐ５３標識細胞についてスクリーニングした（４０×）。
【０３０１】
共焦点顕微鏡法及びＦＡＣＳによる細胞透過実験：細胞を５％ＣＯ２下、３７℃でガラス製カバースリップ上に一晩播種し、新鮮な培地ですすぎ、予め温めたＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５６８標識ペプチド（２０μＭ）若しくはＡｒｇ８（配列番号８２）（５μＭ）を含む培地中又は単独培地中にて３７℃で２時間インキュベートした。インキュベーション後、カバースリップをＰＢＳで３回すすぎ、２．５％ホルマリンで５分間固定し、ＰＢＳで２回、ｄ．ｉ．Ｈ２Ｏで１回洗浄し、核を対比染色するための１．５μｇ／ｍｌのＤＡＰＩ（ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（登録商標）、ベクター・ラボラトリーズ社製）を含む液中でマウントした。固定した細胞を、メタノール及びアセトンで透過処理し、ＰＢＳで洗浄し、１：２００希釈した抗ｐ２１又は抗サイクリンＢ（サンタクルーズ・バイオテクノロジー社製）とインキュベートし、サイクリンＢ１及びｐ２１の染色を行った。二次抗体とコンジュゲートしたＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５６８を１：１００希釈して用いた。倒立共焦点レーザー走査顕微鏡（モデルＬＣ５１０；ドイツ、ゲッティンゲンのカールツァイス社製）を用いて、画像を撮り、細胞取込み及び細胞内分布を決定した。
【０３０２】
ｐ２８の移入のカイネティクス：ＭＣＦ−７、ＭＣＦ−１０Ａ、及びＭＤＤ２細胞（３×１０５細胞）をフェノールレッドを含まないＭＥＭ−Ｅに懸濁した。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５６８コンジュゲートｐ２８を１〜３００  ２００μｍｏｌ／Ｌで３０、６０、９０及び１２０秒間氷上で添加することで反応を開始させた。インキュベーション後、反応混合液に１ｍｌの冷ＰＢＳを添加し、細胞を２回、４℃、６００×ｇで２分間遠心した。各時点及び濃度について少なくとも１０，０００個の固定細胞をフローサイトメトリーで分析し、そのバックグラウンド及び相対蛍光を算出した。
【０３０３】
細胞周期の分析：ＭＣＦ−７及びＭＤＤ２細胞を５０μｍｏｌ／Ｌのｐ２８と一緒に３７℃で４８時間及び７２時間インキュベートし、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、７０％エタノールを用いて−２０℃で固定した。固定細胞をＰＢＳで２回洗浄し、２０μｇ／ｍＬのＲＮａｓｅ  Ａを含む５０μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）のＰＢＳ溶液で染色した。フローサイトメトリー（ＥＰＩＣＳ  Ｅｌｉｔｅ  ＥＳＰ；カリフォルニア州フラートンのベックマン・コールター社製）を用いてＤＮＡ含量を測定した。各実験について最低一万個の細胞を回収した。
【０３０４】
イムノブロット及び免疫沈降分析：ＭＣＦ−７細胞及びＭＤＤ２細胞を５０μｍｏｌ／Ｌのｐ２８（配列番号２）と０、２４、４８及び７２時間培養し、Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ，７０：７０５４−７０６２（２００２）に記載されているように全細胞溶解液を調製した。１０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＦ、１３７ｍｍｏｌ／ｌのＮａＣｌ、１ｍｍｏｌ／ＬのＮａＶＯ４、１０ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ、１％のＮＰ−４０、１ｍｍｏｌ／ＬのＤＴＴ、及びプロテイナーゼ阻害剤（シグマ・アルドリッチ社製）中で調製した細胞溶解液中のリン酸化ｃｄｃ２（ｐ−ｃｄｃ２）を分析した。Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｕｌｌ，２７：６９９−７０１（２００４）及びＫｉｔａｇａｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ，７：２４４５−５４（２００８）に記載されているようにして、ユビキチン化されたｐ５３を検出した。ＭＣＦ−７細胞を、回収する前７時間のプロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２（シグマ・アルドリッチ社製）の非存在下又は存在下、５０μｍｏｌ／Ｌのｐ２８と２４、４８及び７２時間培養した。等量のタンパク質を抗ｐ５３抗体を用いて免疫沈降した。全細胞溶解液（Ｉｎｐｕｔ）も、ローディング対照として抗アクチン抗体を用いたウェスタン解析に供した。免疫複合体を２回洗浄し、４〜１２％のゲルで分離し、ＰＶＤＦ膜に移した。ｐ５３に対する抗体（ＤＯ−１及びＦＬ３９３）、ｐ２７に対する抗体、ＣＤＫに対する抗体、サイクリンに対する抗体（サンタクルーズ・バイオテクノロジー社製）、ｐ２１に対する抗体（インビトロジェン社製）をメーカーの取扱説明書に従いイムノブロットに用いた。モノクローナルアクチン抗体（サンタクルーズ・バイオテクノロジー社製）及びＥＣＬ試薬（サンタクルーズ・バイオテクノロジー社製）を用いて可視化したタンパク質バンドによりアクチンの発現を測定した。
【０３０５】
抗ｐ２８抗体：ｐ２８（配列番号２）（カリフォルニア州メンローパークのＣＳ  Ｂｉｏ社製）のＮ末端にシステインを導入し、次いで、このペプチドを、システイン残基のチオール基を介してキーホールリンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）にコンジュゲートさせ、この複合体を皮内接種及び皮下接種し、ｐ２８（配列番号２、アズリンの６０〜７７ａａ）の１１〜２８ａａに特異的なポリクローナル抗体をウサギ（ニュージーランドホワイト；ミシガン州のコーヴァンス社（Ｃｏｖａｎｃｅ）製）中で産生させた。ｐ２８（０〜３μｇ／ウェル）を用いた直接ＥＬＩＳＡ法により抗体価を求めた。９６ウェルプレート（ニューヨーク州ロチェスターのＮｕｎｃ社製）を１μｇ／ウェルのｐ２８（配列番号２）でコーティングした場合、２５℃で基質（１−Ｓｔｅｐ  ＰＮＰＰ、イリノイ州ロックフォードのピアース社製）と１５分間インキュベートした後の４５０ｎｍにおける再現可能な吸光度変化０．５を得るには、１：１４０，０００の抗体希釈物で十分であった。
【０３０６】
ＧＳＴプルダウン及び競合アッセイ：基本的にＰｕｎｊ，ｅｔ  ａｌ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２３：２３６７−２３７８（２００４）に記載されているようにＧＳＴプルダウンアッセイを用いて、ｐ５３へのｐ２８（配列番号２）の結合をアッセイした。精製したＧＳＴ−ｐ２８（１０及び２０μｇ／反応液）、ＧＳＴ−ＭＤＭ２（Ｍｕｒｉｎｅ  ｄｏｕｂｌｅ  ｍｉｎｕｔｅ  ２、２０μｇ／反応液）、及びＧＳＴ単独（２０μｇ／反応液）をグルタチオンセファロース４Ｂビーズ（ニュージャージー州のＧＥヘルスケア社製）に結合させ、結合しなかったペプチドをＰＢＳで２回洗浄して除去した。プロテイナーゼ阻害剤カクテル（シグマ・アルドリッチ社製）を含むＰＢＳ／０．１％トリトンＸ−１００を氷上で１５分間用いてＭＣＦ−７細胞の全細胞溶解物を調製し、４℃、１４０００ｒｐｍで３０分間遠心した。得られた上清をビーズと混合し、４℃で２時間インキュベートし、膜をＰＢＳで２回洗浄して結合しなかった細胞溶解物を除去した後、ＳＤＳサンプルバッファー中で煮沸し、その後、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。次いで、膜を、スキムミルク（５％）を含むＴＢＳＴ（Ｔｒｉｓ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）及びポリクローナルｐ５３抗体（ＦＬ−３９３、サンタクルーズ・バイオテクノロジー社製）を含む５％スキムミルクと４℃でインキュベートし、ＴＢＳＴで３回洗浄し、二次ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ抗体（シグマ・アルドリッチ社製）を添加し、室温（ｒ／ｔ）で１時間インキュベートし、ＴＢＳＴで３回洗浄した。
【０３０７】
ｐ５３上の潜在的結合部位を以下のようにして特定した。ｐ２８（配列番号２）の存在下（１０〜５０モル濃度過剰）でＧＳＴプルダウンアッセイを用いてｐ５３のＭＤＭ２結合部位（１９〜２６ａａ）の相互作用を解析し、イムノブロッティング（ＩＢ）によりｐ５３のバンドを検出した。市販の最も広範囲に天然ｐ５３をカバーする３つの異なる抗ｐ５３抗体、Ｐａｂ１８０１（３２〜７９ａａ；サンタクルーズ・バイオテクノロジー社製）、ａｂ２４３３（２７７〜２９６ａａ；マサチューセッツ州ケンブリッジのＡｂｃａｍ社製）、及びＰａｂ１８０２（３０６〜３９３ａａ；サンタクルーズ・バイオテクノロジー社製）をそれぞれｐ２８（配列番号２）の存在下でＧＳＴ−ｐ５３固定化ビーズと反応させた。インキュベーション後、サンプルをＰＢＳで２回洗浄して結合しなかったｐ２８（配列番号２）を除去し、ネイティブＰＡＧＥサンプルバッファー（Ｔｒｉ／グリセロール／ＢＰＢ）中で煮沸し、５％ネイティブＰＡＧＥにかけた。エレクトロブロッティング（０．２Ａｍｐで１時間）によりサンプルをＰＶＤＦ膜に移し、膜をスキムミルク（５％）を含むＴＢＳＴでブロッキングし、ｐ２８（配列番号２）に対するポリクローナル抗体（１：５０００希釈）を含む５％スキムミルクと４℃でインキュベートした。ＴＢＳＴで洗浄した後、ＨＲＰコンジュゲートウサギ抗ＩｇＧ抗体（１：７０００希釈、サンタクルーズ・バイオテクノロジー社製）を添加した。ＥＣＬ試薬を用いてｐ２８（配列番号２）のバンドを可視化した。
【０３０８】
グルタチオンセファロース４Ｂビーズ上に固定したＧＳＴ−ｐ５３（２０μｇ／反応液）に対してｐ２８（配列番号２）とｐ２８の断片ｐ１２（配列番号３９）、ｐ１８（配列番号２５）、及びｐ１８ｂ（配列番号３８）との間の競合アッセイを用いて、ｐ５３に結合するｐ２８（配列番号２）の領域を特定した。反応液を４℃で２時間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄して結合しなかったｐ２８を除去し、次いで、ネイティブＰＡＧＥサンプルバッファー（Ｔｒｉ／グリセロール／ＢＰＢ）中で煮沸し、５％ネイティブＰＡＧＥにかけた。エレクトロブロッティング（０．２Ａｍｐで１時間）によりタンパク質をＰＶＤＦ膜に移し、ブロッキングし、ｐ２８に対するポリクローナル抗体と４℃で１６時間インキュベートした。ｐ２８（配列番号２）のバンドをＥＣＬ試薬で可視化した。Ｇｅｌ＆Ｇｒａｐｈ  Ｄｉｇｉｔｉｚｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＵＮ−ＳＣＡＮ−ＩＴ（商標）（ユタ州オレム（Ｏｒｅｍ）のシルク・サイエンティフィック社（Ｓｉｌｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）製）を用いてバンドの強度を決定し、特異的タンパク質／アクチンの比率を算出した。各タンパク質バンドの下に示した数字は、処置直前のタンパク質バンドの強度に対する相対的割合である（０時間を１００％として表す）。図２１Ｃ。
【０３０９】
ｐ５３のＤＮＡ結合活性：５０μｍｏｌ／Ｌのｐ２８（配列番号２）又はアズリンと２４時間インキュベートした後、メーカーの取扱説明書に従いＭＣＦ−７細胞から核画分を単離した（Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、カリフォルニア州カールズバッドのアクティブモチーフ社（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ）製）。１４，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心して核抽出物上清を回収した。ブラッドフォード法を用いてタンパク質濃度を測定した。ＴｒａｎｓＡＭ  ｐ５３キット（アクティブモチーフ社製）を用いてｐ５３のＤＮＡ結合活性を解析した。簡潔には、ＤＴＴ及びポリ［ｄ（Ｉ−Ｃ）］を含む４０μｌの結合バッファーを各ウェルに添加してｐ５３のコンセンサスオリゴヌクレオチドへの非特異的結合を防いだ。核抽出物を各ウェルに添加し、Ｈ２Ｏ２処置したもの又はバッファーのみをそれぞれ陽性対照及び陰性対照とし、ｒ／ｔで１時間インキュベートした。ウェルを３回洗浄し、１００μｌのｐ５３抗体（１：１０００希釈）を添加し、ｒ／ｔで１時間インキュベートした。洗浄後、ＨＲＰをコンジュゲートした二次抗体を添加し、サンプルを１時間インキュベートして暗黒化で３分間現像した。ＤＮＡへのｐ５３の結合を４５０及び６５５ｎｍの吸光度から求めた。
【０３１０】
ＲＴ−ＰＣＲ：ＭＣＦ−７細胞を５０μｍｏｌ／Ｌのｐ２８（配列番号２）に１６、２４、４８及び７２時間曝した。ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ及びＲＮｅａｓｙキット（カリフォルニア州バレンシアのキアゲン社製）を用いてＲＮＡを抽出し、１μｇのＲＮＡを、５００ｎｇのオリゴ（ｄＴ）１２−１８及びＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（カリフォルニア州のインビトロジェン社製）と一緒に５０℃で５０分間の逆転写に用いた。アニーリング温度は５７℃（２５サイクル）であり、使用したプライマーは以下の通りである：ｐ５３、５’−ＣＡＧ  ＣＣＡ  ＡＧＴ  ＣＴＧ  ＴＧＡ  ＣＴＴ  ＧＣＡ  ＣＧＴ  ＡＣ−３’及び５’−ＣＴＡ  ＴＧＴ  ＣＧＡ  ＡＡＡ  ＧＴＧ  ＴＴＴ  ＣＴＧ  ＴＣＡ  ＴＣ（配列番号８７及び８８）；ＧＡＰＤＨ、５’−ＡＣＣ  ＴＧＡ  ＣＣＴ  ＧＣＣ  ＧＴＣ  ＴＡＧ  ＡＡ−３’及び５’−ＴＣＣ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＣＴＧ  ＴＴＧ  ＣＴＧ  ＴＡ−３’（配列番号８９及び９０）。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲル電気泳動にかけ、臭化エチジウムで可視化した。
【実施例１４】
【０３１１】
ヒト乳癌細胞中へのペプチドの移入
ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ−７、Ｔ４７Ｄ、及びＺＲ−７５−１中へのｐ２８（配列番号２）の移入は、正常乳房細胞株ＭＣＦ−１０Ａよりも２〜３倍多かった（図１７Ａ）。ＦＡＣｓにより測定されたＭＣＦ−１０Ａと比べたＭＣＦ−７細胞中へのｐ２８（配列番号２）の移入から、ｐ２８によるＭＣＦ−７乳癌細胞の透過（Ｖｍａｘ  １．８９ＭＦＩ／秒、Ｋｍ  １４４．３μｍｏｌ／Ｌ）及び正常ＭＣＦ−１０Ａ細胞の透過（Ｖｍａｘ  ０．７９ＭＦＩ／秒、Ｋｍ  ９９．４μｍｏｌ／Ｌ）が飽和性であり、ＭＣＦ−７細胞で約２．４倍速いことが示された（図１７Ｂ）。カベオラ仲介エンドサイトーシスの特異的阻害剤であるメチル−β−シクロデキストリン（ＭβＣＤ）にＭＣＦ−７細胞を曝すと、ｐ２８の透過が有意に阻害された（図１７Ｃ）。カベオソームの形成及び輸送を阻害する微小管破壊剤であるノコダゾールにより、ｐ２８（配列番号２）の透過にカベオラ仲介エンドサイトーシスが関与することが確認された（図１７Ｃ）。一方、それぞれクラスリン仲介エンドサイトーシス、マクロピノサイトーシス、及びエネルギー依存的輸送の阻害剤であるクロルプロマジン（ＣＰＺ）、アミロリド、及びアジ化ナトリウム（ＮａＮ３）はｐ２８（配列番号２）の透過に影響を与えなかった（図１７Ｃ）。後期エンドソーム／リソソームプロセシングの阻害剤であるモネンシンもｐ２８の細胞内蓄積を減少させた（図１７Ｃ）。ＭＣＦ−１０Ａ細胞中へのｐ２８（配列番号２）の透過も、ＭβＣＤ、ノコダゾール、及びモネンシンで阻害されたが、アミロリド、ＣＰＺ、及びアジ化ナトリウムでは阻害されなかった（図１７Ｄ）。ＭＣＦ−７細胞は更に、ＭβＣＤ（約２．１倍）、ノコダゾール（約１．６倍）、及びおそらくモネンシンの効果に対してＭＣＦ−１０Ａよりも感受性が高かった（図１７Ｃ及びＤ）。このことは、ＭＣＦ−７及びＭＣＦ−１０Ａは同様な移入経路を共有し得るが、移入部位の数は（乳）癌細胞上でより多いであろうことを示している。
【実施例１５】
【０３１２】
インビトロ及びインビボにおけるヒト癌細胞の成長に対するｐ２８（配列番号２）処置の効果
アズリンは、ｐ５３が仲介するアポトーシスの誘導を介して抗癌活性を発揮する。図１８Ａ〜Ｂ及び図１９は、直接細胞計数及びＭＴＴアッセイにより測定した、ｗｔ  ｐ５３（陽性）  ＭＣＦ−７細胞及びｐ５３ｍｕｔ  ＺＲ−７５−１細胞に対するｐ２８（配列番号２）及びドキソルビシンの効果を示す図である。ｐ２８（配列番号２）は、インビトロで用量及び時間依存的にＭＣＦ−７細胞（図１８Ａ及び１９Ａ）及びＺＲ−７５−１細胞（図１９Ｂ）の増殖を阻害した。最初の実験（図１８Ａ）では、この阻害は、２４時間暴露後、５μＭで約２３％、５０〜２００μＭで約３６％、細胞数を最初に有意に減少させた（ｐ＜０．０５）。ドキソルビシン（ＤＮＡ挿入剤）も細胞成長を時間依存的に有意に阻害した。ＭＴＴアッセイにより求められた細胞生存率はｐ２８（配列番号２）では有意に変化しなかったが、ドキソルビシンはＭＣＦ−７細胞の生存率を時間依存的に有意に減少させた（図１８Ｂ）。第２の実験（図１９Ａ）におけるＭＣＦ−７細胞に対するｐ２８（配列番号２）の抗増殖効果は用量及び時間依存的であり（ｐ＜０．０５）、５０μｍｏｌ／Ｌで２４、４８、及び７２時間でそれぞれ約９．３％、約２９％、及び約５０％細胞数を減少させた（図１９Ａ）。ｐ２８はＺＲ−７５−１細胞の成長も７２時間暴露後に５０μｍｏｌ／Ｌで１６％、１００μｍｏｌ／Ｌで４４％阻害し（ｐ＜０．０５）、ドキソルビシンの効果と類似していた（図１９Ｂ）。
【０３１３】
更に、ｐ２８（配列番号２）は、３０日間毎日の腹腔内（ｉ．ｐ．）暴露で、胸腺欠損マウスの異種移植ＭＣＦ−７細胞の体積を用量依存的に有意に減少させ（図１８Ｃ）、体重減少又は行動変化のいずれも誘導せずに、Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ（登録商標）で観察された程度に腫瘍体積を減少させた（ｐ＜０．０５）。３０日目まで、１０ｍｇ／ｋｇのｐ２８（毎日、ｉ．ｐ．）は、腫瘍細胞接種後１０、１４、２１及び２５日目に、１５μｍｏｌ／ｋｇのＰａｃｌｉｔａｘｅｌ（登録商標）よりも強く（約２０％）ＭＣＦ−７の成長を阻害し、実験のほぼ全期間にわたり腫瘍体積をＰａｃｌｉｔａｘｅｌ（登録商標）の場合よりも減少させた。ｐ２８により誘導される腫瘍体積減少に関連するＢｒｄＵ標識の減少により細胞増殖の減少が確認された（表９）。ＢｒｄＵ標識及び腫瘍体積の減少に伴い、核ｐ５３染色が、対照と比べて、ｐ２８（配列番号２）処置群においてわずかに増加し、Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ（登録商標）処置群において有意に増加した（表９）。
【０３１４】
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全ての腫瘍は処置後３１日目に回収した。値は平均値±ＳＥＭを表す。それぞれの対照に対して、＊ｐ＜０．０２５；＊＊ｐ＜０．０１。スチューデントのｔ検定。
【実施例１６】
【０３１５】
ｐ２８（配列番号２）による細胞周期進行の阻害
ｐ２８（配列番号２）は２つの同系ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ−７及びＭＤＤ２に同様なカイネティクスで移入した（図２０Ａ）：Ｖｍａｘ（ＭＣＦ−７：１．８９ＭＦＩ／秒；ＭＤＤ２：２．２１ＭＦＩ／秒）、Ｋｍ（ＭＣＦ−７：１４４．２μｍｏｌ／Ｌ；ＭＤＤ２：１４７．９μｍｏｌ／Ｌ）。２つの同系乳癌細胞株ＭＣＦ−７（ｐ５３  ｗｔ）及びＭＤＤ２（ｐ５３ドミナントネガティブ）の細胞周期分析から、ＭＣＦ−７細胞において、ｐ２８（配列番号２）に４８〜７２時間暴露した後にＧ２／Ｍ期の細胞集団が増加し、その後、７２時間目にアポトーシスが誘導される（約２２％）ことが明らかになった（図２０Ｂ）。一方、ｐ２８処置されたＭＤＤ２細胞では細胞周期進行の阻害又はアポトーシスは本質的になかった（図２０Ｃ）。ｐ２８処置されたＭＤＤ２細胞において細胞周期阻害及びアポトーシスがなかったことは、ＭＤＤ２細胞中へのｐ２８（配列番号２）の移入の差（図２０Ａ）又は移入のカイネティクスの差によるものではなかった。
【実施例１７】
【０３１６】
ｐ２８（配列番号２）によるｐ５３レベルの上昇
アズリンは、ｐ５３と複合体を形成し、ＭＣＦ−７細胞の細胞内ｐ５３レベルを上昇させる。ＭＣＦ−７細胞をｐ２８（配列番号２）に暴露した後の細胞溶解液のイムノブロットにより、ｐ２８暴露後にもＭＣＦ−７細胞のｐ５３の細胞内レベルが時間と共に顕著に増加することが明らかになった（図２１Ａ）。ＧＳＴプルダウンアッセイにより、ｐ２８（配列番号２）がｐ５３に結合することが示された（図２１Ｂ）。ここで、ＧＳＴ−ｐ２８及びＧＳＴ−ＭＤＭ２（Ｍｕｒｉｎｅ  ｄｏｕｂｌｅ  ｍｉｎｕｔｅ  ２）はＭＣＦ−７細胞溶解液からｐ５３をプルダウンしたが、単独のＧＳＴはｐ５３をプルダウンしなかった。
【０３１７】
同様なアッセイ及びｐ２８（配列番号２）の断片を用いて、ｐ２８（配列番号２）のｐ５３相互作用領域をマッピングした。セファロース４Ｂ−グルタチオンビーズ上に固定したＧＳＴ−ｐ５３タンパク質を、アズリンのｐ２８（配列番号２）及びｐ１８（ａａ５０〜６７、配列番号２５）、ｐ１８ｂ（ａａ６０〜７７、配列番号３８）、又はｐ１２（ａａ６６〜７７、配列番号３９）とインキュベートした時、ｐ１８（配列番号２５）及びｐ１８ｂ（配列番号３８）ではかなりの量のｐ２８（配列番号２）が置換されたが、競合物質としてｐ１２（配列番号３９）を用いた場合にはｐ２８は弱くしか置換されなかった（図２１Ｃ）。これらの結果は、ｐ５３への結合がｐ２８（配列番号２）のａａ１１〜１８（アズリンのａａ６０〜６７）内で最大となり、Ｃ末端１２ａａはｐ５３との結合効率がそれより低いことを示している。
【０３１８】
ｐ２８（配列番号２）又はアズリンで処置したＭＣＦ−７細胞核抽出物から得られたｐ５３のＤＮＡ結合活性も対照より約１．８倍及び約２．３倍高かった（ｐ＞０．１、ｐ２８（配列番号２）ｖｓアズリン）。ｐ５３  ｗｔコンセンサスは、ｐ２８（配列番号２）により誘導されるｐ５３の増加を完全にブロックしたが、変異したオリゴヌクレオチド配列はブロックしなかった。このことから、ＭＣＦ−７細胞の核抽出物中のｐ５３が活性を維持しており、ｗｔ  ｐ５３コンセンサスオリゴヌクレオチド配列に特異的に結合することが確認された（図２１Ｄ）。
【実施例１８】
【０３１９】
プロテアソーム分解の防止によるｐ５３の安定化
ｐ２８（配列番号２）暴露に応答したｐ５３の増加は、ｐ５３の転写活性化又はタンパク質安定化のいずれかによるものであり得るので、ｐ２８（配列番号２）に暴露している間のＭＣＦ−７細胞中でのｐ５３発現のレベル及びタイムコースを求めた。ｐ２８（配列番号２）暴露後約１６時間においてｐ５３ｍＲＮＡのアップレギュレートが一時的であり且つわずかであることがＲＴ−ＰＣＲにより示された。このことは、ｐ２８（配列番号２）が翻訳後にｐ５３を安定化したことを示している（図２２Ａ）。ｐ２８（配列番号２）のモル濃度を上げても、ＧＳＴ−ＭＤＭ２との結合と競合しなかった（図２２Ｂ）。このことは、ｐ２８（配列番号２）により誘導されるｐ５３ユビキチン化の減少はいずれもＭＤＭ２が仲介する経路を介したものではないこと（図２２Ｃ）及びＭＤＭ２結合部位であるｐ５３のａａ１９〜２６がｐ２８（配列番号２）の好ましい結合部位ではないことを示している。ＭＣＦ−７細胞を５０μｍｏｌ／Ｌのｐ２８に２４時間暴露した場合、主要なｐ５３分解経路であるｐ５３のユビキチン化により生じるｐ５３特異的な高分子量のスメアなバンドラダー（ｐ５３−Ｕｂｎ）が、プロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２存在下で非処置対照と比べて顕著に減少した（図２２Ｃ）。反応にプロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２を導入すると、この阻害効果は強まり、ｐ２８暴露後４８時間後にまで延びた。７２時間目では、ｐ５３−Ｕｂｎレベルは対照よりわずかに高かった。ｐ２８は７２時間暴露後もｐ５３を蓄積させ続けたので（約３３２％、図２１Ａ）、わずかに高いレベルのｐ５３は、プロテアソーム経路による分解を促進する複数の更なる公知のＥ３ユビキチンリガーゼの基質となり得る。まとめると、これらの結果は、ｐ２８により誘導されるｐ５３レベルの上昇が転写活性化ではなくユビキチン化及びプロテアソーム分解の減少を介したｐ５３の安定化によるものであることを示している。
【０３２０】
このことは、ｐ２８（配列番号２）が結合するｐ５３領域が、これらの認識部位（図２２Ｄ）の外側であるが、ａａ１〜１８、２７〜３１、８０〜２７６、又は２９７〜３０５のいずれかを境界とする領域内であることを示している。
【実施例１９】
【０３２１】
ｐ２８（配列番号２）による細胞周期関連タンパク質の調節
ＣＤＫ阻害剤（ＣＤＫＩ）であるｐ２１及びｐ２７をアップレギュレートすると細胞周期進行がブロックされる。ｐ２８（配列番号２）は、暴露後の時間経過と共に、ＭＣＦ−７細胞で対照に比べてｐ２１、ｐ２７、ＣＤＫ６及びサイクリンＢ１の細胞内レベルを上昇させた（図２３Ａ）。その後、ＭＣＦ−７細胞のｐ２８暴露後、時間と共に、有糸分裂プロセスに必須のタンパク質であるＣＤＫ２及びサイクリンＡのレベルが低下した（図２３Ａ）。一方、ＭＤＤ２細胞中では、ｐ５３、ｃｄｃ２、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４及びＣＤＫ６が実質的に一定に維持され（図２３Ｂ）、サイクリンＡ及びサイクリンＢ１（４８時間）がわずかに増加した。ｐ２１はＭＤＤ２細胞中でｐ５３非依存性の経路により発現され得るので、ｐ２１は検出可能なままであった。しかし、ｐ２８（配列番号２）はｐ２１のレベルを変化させなかった（図２３Ｂ）。一方、ｐ２７は、非処置又はｐ２８（配列番号２）に暴露したＭＤＤ２細胞中で検出されなかった。イムノブロッティングで検出されたＭＣＦ−７細胞中におけるｐ２８（配列番号２）に応答したｐ２１及びサイクリンＢ１レベルの上昇はそれぞれ核コンパートメント及び細胞質ゾルコンパートメントにおける上昇に反映されている（図２３Ｃ及びＤ）。ＭＣＦ−７細胞をｐ２８（配列番号２）に暴露すると、不活性型のｃｄｃ２であるリン酸化ｃｄｃ２（ｐ−ｃｄｃ２）の蓄積も誘導され、これはＭＤＤ２細胞をｐ２８（配列番号２）に暴露した後には上昇しなかった（図２３Ｅ）。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図１Ｆ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１０−５】
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【図１０−６】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【国際調査報告】
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