(57)【要約】  本発明は、幹細胞特異的マーカー分子に結合する第１の薬剤および組織特異的マーカー分子に結合する第２の薬剤を含む抗原結合コンストラクトについて記載する。特に、本発明は、この組織特異的マーカーが筋肉特異的マーカー分子であるコンストラクトについて記載する。かかるコンストラクトは、筋肉の再生または心臓疾患に用いるための医薬組成物に用いられ得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞特異的マーカー分子に結合する第１の薬剤および組織特異的マーカー分子に結合する第２の薬剤を含む、抗原結合コンストラクト。
【請求項２】
前記組織特異的マーカーが筋肉特異的マーカー分子である、請求項１に記載のコンストラクト。
【請求項３】
前記組織特異的マーカーが心筋特異的マーカー分子である、請求項２に記載のコンストラクト。
【請求項４】
前記第１または第２の薬剤がモノクローナル抗体である、請求項１〜３のいずれかに記載のコンストラクト。
【請求項５】
前記第１または第２の薬剤がエピトープ結合ドメインである、請求項１〜３のいずれかに記載のコンストラクト。
【請求項６】
前記エピトープ結合ドメインが免疫グロブリン単一可変ドメインである、請求項５に記載のコンストラクト。
【請求項７】
前記幹細胞特異的マーカー分子および前記組織特異的マーカー分子がヒトのものである、請求項１〜６のいずれかに記載のコンストラクト。
【請求項８】
前記幹細胞特異的マーカー分子がｃ−Ｋｉｔである、請求項１〜７のいずれかに記載のコンストラクト。
【請求項９】
前記筋肉特異的マーカー分子が、ミオシン軽鎖（ＭＬＣ）、心臓ミオシン、ヒト心室ミオシン軽鎖１（ｖＭＬＣ１）、ＭＬＣ１、ＭＬＣ２およびＭＬＣ３を含むミオシン由来の分子、心臓トロポニンＩ、心臓トロポニン、テネイシンＣまたはクレアチンキナーゼからなる群から選択される、請求項１〜８のいずれかに記載のコンストラクト。
【請求項１０】
筋肉特異的マーカー分子に結合する前記薬剤が抗ＭＬＣ抗体である、請求項９に記載のコンストラクト。
【請求項１１】
前記抗ＭＬＣ抗体がＡＴＣＣ ＨＢ １１７０９から入手できるモノクローナル抗体である、請求項１０に記載のコンストラクト。
【請求項１２】
前記第１の薬剤が抗ｃ−Ｋｉｔモノクローナル抗体であり、前記第２の薬剤が抗ＭＬＣモノクローナル抗体である、請求項１〜１１のいずれかに記載のコンストラクト。
【請求項１３】
ＭＡｂｄＡｂである、請求項１〜１２のいずれかに記載のコンストラクト。
【請求項１４】
前記第１の薬剤が抗ｃ−Ｋｉｔ免疫グロブリン単一可変ドメインであり、前記第２の薬剤がモノクローナル抗ＭＬＣ抗体である、請求項１３に記載のコンストラクト。
【請求項１５】
ｃ−Ｋｉｔに結合する前記エピトープ結合ドメインが、請求項３０〜５２、５６〜６１のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメインもしくはポリペプチドであるか、または請求項５５に記載のリガンドである、請求項１〜１１、１３または１４のいずれかに記載のコンストラクト。
【請求項１６】
ｃ−Ｋｉｔに結合する前記エピトープ結合ドメインが、配列番号３０２〜３０５、４５７、４５８または４８２のいずれかに示すアミノ酸を有する免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチドである、請求項１〜１１、１３〜１５のいずれかに記載のコンストラクト。
【請求項１７】
前記抗ＭＬＣ抗体が、請求項２２〜２９のいずれかに記載のヒト心室ミオシン軽鎖１（ｖＭＬＣ１）に結合する抗原結合タンパク質または抗体である、請求項１〜１６のいずれかに記載のコンストラクト。
【請求項１８】
前記第１の薬剤および第２の薬剤が結合している、請求項１〜１７のいずれかに記載のコンストラクト。
【請求項１９】
前記リンカーが、Ｇ４Ｓリンカー（ＧＧＧＧＳ）、ＴＶＡＡＰＳ、ＡＳＴＫＧＰＴ、ＡＳＴＫＧＰＳ、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ、ＥＬＱＬＥＥＳＣＡＥＡＱＤＧＥＬＤＧ、ＡＳＴ、ＳＴＧＧＧＧＧＳ、ＳＴＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＳＴＧＰＰＰＰＰＳ、ＳＴＧＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＳ、ＳＴＧ、ＰＰＰＰＰＳ、ＳＴＧＳＲＤＰＹＬＷＳＡＰＳＤＰＬＥＬＶＶＴＧＴＳＶＴＰＳＲＬＰＴＥＰＰＳＳＶＡＥＦＳＥＡＴＡＥＬＴＶＳＦＴＮＫＶＦＴＴＥＴＳＲＳＩＴＴＳＰＫＥＳＤＳＰＡＧＰＡＲＱＹＹＴＫＧＮＧＳＴＧ、「ＳＴＧ」（セリン、スレオニン、グリシン）、「ＧＳＴＧ」または「ＲＳ」から選択される任意の１つである、請求項１５または１６に記載のコンストラクト。
【請求項２０】
前記コンストラクトが、表２４に記載のコンストラクトのいずれかから選択される、請求項１３に記載のコンストラクト。
【請求項２１】
請求項１〜１９のいずれかに記載のコンストラクトをコードする核酸分子。
【請求項２２】
ヒト心室ミオシン軽鎖１（ｖＭＬＣ１）に結合し、かつ配列番号１３もしくは配列番号１７のＣＤＲ３を含むか、またはＣＤＲ３に１、２もしくは３個のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗原結合タンパク質。
【請求項２３】
前記抗原結合タンパク質が以下のＣＤＲ、すなわちＣＤＲＨ１（配列番号１８）、ＣＤＲＨ２（配列番号１９）、ＣＤＲＨ３（配列番号２０）、ＣＤＲＬ１（配列番号１４）、ＣＤＲＬ２（配列番号１５）、ＣＤＲＬ３（配列番号１６）を含む、請求項２２に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項２４】
マウスｖＭＬＣ１およびヒトｖＭＬＣ１の両方に結合する、請求項２２または２３に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項２５】
前記抗原結合タンパク質が抗体である、請求項２２〜２４のいずれかに記載の抗原結合タンパク質。
【請求項２６】
前記抗体がヒト化抗体またはキメラ抗体である、請求項２５に記載の抗体。
【請求項２７】
配列番号２２、２５、２８もしくは３１から選択されるＶＨドメイン、および配列番号３４、３７もしくは４４０から選択されるＶκドメインを含む、請求項２２〜２６のいずれかに記載の抗原結合タンパク質または抗体。
【請求項２８】
配列番号３１に示す配列を有するＶＨドメインおよび配列番号３７に示す配列を有するＶκドメインを含む、請求項２７に記載の抗原結合タンパク質または抗体。
【請求項２９】
前記抗原結合タンパク質がＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニ抗体、単離ＶＨ、単離ＶΚまたはｄＡｂを含む、請求項２２〜２８のいずれかに記載の抗原結合タンパク質または抗体。
【請求項３０】
請求項２２〜２９のいずれかに記載の抗原結合タンパク質または抗体をコードする核酸分子。
【請求項３１】
第１のベクターおよび第２のベクターで形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞であって、前記第一のベクターが、請求項２２〜２９のいずれかに記載の抗原結合タンパク質または抗体の重鎖をコードする核酸分子を含み、前記第２のベクターが、請求項２２〜２９のいずれかに記載の抗原結合タンパク質または抗体の軽鎖をコードする核酸分子を含む、宿主細胞。
【請求項３２】
抗ｃ−Ｋｉｔ免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項３３】
解離定数（Ｋｄ）が１０ｐＭ〜１０μＭ、一実施形態において、１００ｐＭ〜１０μＭ、または０．１μＭ〜１μＭでｃ−Ｋｉｔに結合する、請求項３０に記載の抗ｃ−Ｋｉｔ免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項３４】
抗ｃ−Ｋｉｔ免疫グロブリン単一可変ドメインを含む単離ポリペプチド。
【請求項３５】
配列番号３９〜８７、２２４〜２４６、２７０〜２８２、２９７〜３００、３８３〜３８４または４７６のいずれかに示す配列を有する核酸によってコードされる少なくとも１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含み、かつｃ−Ｋｉｔに結合する、請求項３４に記載の単離ポリペプチド。
【請求項３６】
配列番号３９〜８７、２２４〜２４６、２７０〜２８２、２９７〜３００、３８３〜３８４または４７６のいずれかに示す配列を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチド。
【請求項３７】
図６、配列番号３９〜８７、２２４〜２４６、２７０〜２８２、２９７〜３００、３８３〜３８４または４７６に示す核酸配列のいずれかと少なくとも６０％同一であるヌクレオチド配列によってコードされ、かつｃ−Ｋｉｔに結合する、単離ポリペプチド。
【請求項３８】
ヒトｃ−Ｋｉｔに結合する、請求項３２〜３５のいずれかに記載の単離ポリペプチド。
【請求項３９】
ヒトｃ−Ｋｉｔおよびマウスｃ−Ｋｉｔの両方に結合する、請求項３４〜３８のいずれかに記載の単離ポリペプチド。
【請求項４０】
配列番号３９〜８７、２２４〜２４６、２７０〜２８２、２９７〜３００、３８３〜３８４または４７６のいずれかに示す配列を有する核酸によってコードされるいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３２に記載の抗ｃ−Ｋｉｔ免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項４１】
配列番号３９〜８７、２２４〜２４６、２７０〜２８２、２９７〜３００、３８３〜３８４または４７６に示す核酸配列のいずれかによってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項４０に記載の抗ｃ−Ｋｉｔ免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項４２】
ＤＯＭ２８ｈ−５（配列番号３９）、ＤＯＭ２８ｈ−４３（配列番号５１）、ＤＯＭ２８ｈ−３３（配列番号４９）、ＤＯＭ２８ｈ−９４（配列番号６５）、ＤＯＭ２８ｈ−６６（配列番号５８）、ＤＯＭ２８ｈ−１１０（配列番号７０）、ＤＯＭ２８ｈ−８４（配列番号６２）、ＤＯＭ２８ｍ−２３（配列番号８１）、ＤＯＭ２８ｍ−７（配列番号７８）、ＤＯＭ２８ｍ−５２（配列番号８４）、ＤＯＭ２８ｈ−７９（配列番号６１）、ＤＯＭ２８ｈ−７（配列番号４１）、ＤＯＭ２８ｈ−２０（配列番号４５）、ＤＯＭ２８ｈ−２６（配列番号４８）、ＤＯＭ２８ｈ−７８（配列番号６０）、ＤＯＭ２８ｈ−７３（配列番号５９）またはＤＯＭ２８ｈ−５４（配列番号５５）として特定される核酸配列のいずれかによってコードされるアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４１に記載の抗ｃ−Ｋｉｔ免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項４３】
前記抗ｃ−Ｋｉｔ免疫グロブリン単一可変ドメインがヒトｃ−Ｋｉｔに結合する、請求項４０〜４２のいずれかに記載の抗ｃ−Ｋｉｔ免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項４４】
２５以下のアミノ酸位置で修飾された配列番号３９〜８７、２２４〜２４６、２７０〜２８２、２９７〜３００、３８３〜３８４または４７６のいずれかに示す配列を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列を含み、かつ配列番号３９〜８７、２２４〜２４６、２７０〜２８２、２９７〜３００、３８３〜３８４または４７６のいずれかに示す配列を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列のいずれか１つの中のＣＤＲ１配列と少なくとも５０％同一であるＣＤＲ１配列を含む、請求項３２に記載の抗ｃ−Ｋｉｔ免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項４５】
２５以下のアミノ酸位置で修飾された配列番号３９〜８７、２２４〜２４６、２７０〜２８２、２９７〜３００、３８３〜３８４または４７６のいずれかに示す配列を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列を含み、かつ配列番号３９〜８７、２２４〜２４６、２７０〜２８２、２９７〜３００、３８３〜３８４または４７６のいずれかに示す配列を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列のいずれか１つの中のＣＤＲ２配列と少なくとも５０％同一であるＣＤＲ２配列を含む、請求項３２に記載の抗ｃ−Ｋｉｔ免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項４６】
２５以下のアミノ酸位置で修飾された配列番号３９〜８７、２２４〜２４６、２７０〜２８２、２９７〜３００、３８３〜３８４または４７６のいずれかに示す配列を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列を含み、かつ配列番号３９〜８７、２２４〜２４６、２７０〜２８２、２９７〜３００、３８３〜３８４または４７６のいずれかに示す配列を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列のいずれか１つの中のＣＤＲ３配列と少なくとも５０％同一であるＣＤＲ３配列を含む、請求項３２に記載の抗ｃ−Ｋｉｔ免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項４７】
２５以下のアミノ酸位置で修飾された配列番号３９〜８７、２２４〜２４６、２７０〜２８２、２９７〜３００、３８３〜３８４または４７６のいずれかに示す配列を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列を含み、かつ配列番号３９〜８７、２２４〜２４６、２７０〜２８２、２９７〜３００、３８３〜３８４または４７６のいずれかに示す配列を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列のいずれか１つの中のＣＤＲ１配列と少なくとも５０％同一であるＣＤＲ１配列を含み、かつ配列番号３９〜８７、２２４〜２４６、２７０〜２８２、２９７〜３００、３８３〜３８４または４７６のいずれかに示す配列を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列のいずれか１つの中のＣＤＲ２配列と少なくとも５０％同一であるＣＤＲ２配列を含む、請求項３２に記載の抗ｃ−Ｋｉｔ免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項４８】
２５以下のアミノ酸位置で修飾された配列番号３９〜８７、２２４〜２４６、２７０〜２８２、２９７〜３００、３８３〜３８４または４７６のいずれかに示す配列を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列を含み、かつ配列番号３９〜８７、２２４〜２４６、２７０〜２８２、２９７〜３００、３８３〜３８４または４７６のいずれかに示す配列を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列のいずれか１つの中のＣＤＲ１配列と少なくとも５０％同一であるＣＤＲ１配列を含む、請求項３２に記載の抗ｃ−Ｋｉｔ免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項４９】
２５以下のアミノ酸位置で修飾された配列番号３９〜８７、２２４〜２４６、２７０〜２８２、２９７〜３００、３８３〜３８４または４７６のいずれかに示す配列を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列を含み、かつ配列番号３９〜８７、２２４〜２４６、２７０〜２８２、２９７〜３００、３８３〜３８４または４７６のいずれかに示す配列を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列のいずれか１つの中のＣＤＲ３配列と少なくとも５０％同一であるＣＤＲ３配列を含む、請求項３２に記載の抗ｃ−Ｋｉｔ免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項５０】
２５以下のアミノ酸位置で修飾された配列番号３９〜８７、２２４〜２４６、２７０〜２８２、２９７〜３００、３８３〜３８４または４７６のアミノ酸配列を含み、かつ配列番号３９〜８７、２２４〜２４６、２７０〜２８２、２９７〜３００、３８３〜３８４または４７６のいずれかに示す配列を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列のいずれか１つの中のＣＤＲ１配列と少なくとも５０％同一であるＣＤＲ１配列を含み、かつ配列番号３９〜８７、２２４〜２４６、２７０〜２８２、２９７〜３００、３８３〜３８４または４７６のいずれかに示す配列を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列のいずれか１つの中のＣＤＲ２配列と少なくとも５０％同一であるＣＤＲ２配列を含む、請求項３２に記載の抗ｃ−Ｋｉｔ免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項５１】
配列番号３９〜８７、２２４〜２４６、２７０〜２８２、２９７〜３００、３８３〜３８４または４７６のいずれかに示す配列を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列のいずれか１つの中のＣＤＲ３配列のいずれかに示す配列と少なくとも５０％同一であるＣＤＲ３配列を含む、請求項３２に記載の抗ｃ−Ｋｉｔ免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項５２】
配列番号３９〜８７、２２４〜２４６、２７０〜２８２、２９７〜３００、３８３〜３８４または４７６のいずれかに示す配列を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列のいずれか１つの中のＣＤＲ３配列からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を含む、請求項３２に記載の抗ｃ−Ｋｉｔ免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項５３】
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含み、前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３が、配列番号３９〜８７、２２４〜２４６、２７０〜２８２、２９７〜３００、３８３〜３８４または４７６のいずれかに示す配列を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列のいずれか１つの中のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３と同一である、請求項３２に記載の抗ｃ−Ｋｉｔ免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項５４】
図７に示すＣＤＲ配列から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含む、請求項４０〜５３のいずれかに記載の抗ｃ−Ｋｉｔ免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項５５】
請求項３２〜５４のいずれかに記載のポリペプチドまたは抗ｃ−Ｋｉｔ免疫グロブリン単一可変ドメインをコードする核酸配列を含む、核酸分子。
【請求項５６】
配列番号３９〜８７、２２４〜２４６、２７０〜２８２、２９７〜３００、３８３〜３８４または４７６のいずれかに示す核酸配列を含む、核酸分子。
【請求項５７】
ｃ−Ｋｉｔに対する結合特異性を有し、かつ配列番号３９〜８７、２２４〜２４６、２７０〜２８２、２９７〜３００、３８３〜３８４または４７６のいずれかに示す配列を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む抗ｃ−Ｋｉｔ免疫グロブリン単一可変ドメインの結合を阻害する、リガンド。
【請求項５８】
ｃ−Ｋｉｔ受容体結合および／またはＳＣＦによる活性化が実質的に阻害されないような方法でｃ−Ｋｉｔに結合する、請求項３２〜５７のいずれかに記載の抗ｃ−Ｋｉｔの免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチドまたはリガンド。
【請求項５９】
ＤＯＭ２８ｈ−５（配列番号３９）、ＤＯＭ２８ｈ−３３（配列番号４９）、ＤＯＭ２８ｈ−４３（配列番号５１）、ＤＯＭ２８ｈ−６６（配列番号５８）、ＤＯＭ２８ｈ−８４（配列番号６２）、ＤＯＭ２８ｈ−９４（配列番号６５）、ＤＯＭ２８ｈ−１１０（配列番号７０）、ＤＯＭ２８ｍ−７（配列番号７８）、ＤＯＭ２８ｍ−２３（配列番号８１）、またはＤＯＭ２８ｍ−５２（配列番号８４）のいずれかに示す核酸配列によってコードされるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項５８に記載の抗ｃ−Ｋｉｔの免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチドまたはリガンド。
【請求項６０】
ｃ−Ｋｉｔ受容体結合および／またはＳＣＦによる活性化が実質的に阻害されるような方法でｃ−Ｋｉｔに結合する、請求項３２〜５７のいずれかに記載の抗ｃ−Ｋｉｔの免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチドまたはリガンド。
【請求項６１】
ＤＯＭ２８ｈ−７（配列番号４１）、ＤＯＭ２８ｈ−２０（配列番号４５）、ＤＯＭ２８ｈ−２６（配列番号４８）、ＤＯＭ２８ｈ−５４（配列番号５５）、ＤＯＭ２８ｈ−７３（配列番号５９）、ＤＯＭ２８ｈ−７８（配列番号６０）またはＤＯＭ２８ｈ−７９（配列番号６１）のいずれかに示す核酸配列によってコードされるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項６０に記載の抗ｃ−Ｋｉｔ免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項６２】
ヒトｃ−Ｋｉｔとマウスｃ−Ｋｉｔの間で交差反応を示す、請求項３２〜６１のいずれかに記載の抗ｃ−Ｋｉｔの免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチドまたはリガンド。
【請求項６３】
ＤＯＭ２８ｈ−５（配列番号３９）、ＤＯＭ２８ｈ−９４（配列番号６５）、ＤＯＭ２８ｍ−７（配列番号７８）、ＤＯＭ２８ｍ−２３（配列番号８１）およびＤＯＭ２８ｍ−５２（配列番号８４）のいずれかに示す核酸配列によってコードされるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項６２に記載の抗ｃ−Ｋｉｔの免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチドまたはリガンド。
【請求項６４】
請求項１〜６３のいずれかに記載の抗原結合コンストラクト、タンパク質、抗体、ポリペプチド、免疫グロブリン単一可変ドメインまたはリガンドを産生する方法であって、前記抗原結合コンストラクト、タンパク質、抗体、ポリペプチド、免疫グロブリン単一可変ドメインまたはリガンドをコードする組換え核酸を含む組換え宿主細胞を、前記組換え核酸が発現し、抗原結合コンストラクト、タンパク質、抗体、ポリペプチド、免疫グロブリン単一可変ドメインまたはリガンドが産生されるように、前記組換え核酸の発現に適する条件下で維持することを含む方法。
【請求項６５】
前記抗原結合コンストラクト、タンパク質、抗体、ポリペプチド、免疫グロブリン単一可変ドメインまたはリガンドを単離することをさらに含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
ｃ−Ｋｉｔ受容体活性化に伴う疾患または障害の治療のためにｃ−Ｋｉｔを標的にするのに使用するための、請求項３２〜５４または５７〜６３のいずれかに記載の抗ｃ−Ｋｉｔの免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチドまたはリガンド。
【請求項６７】
前記疾患または障害が、マスト細胞障害、または小細胞肺癌、結腸直腸癌、乳癌、婦人科系腫瘍および神経芽細胞腫を含む癌である、請求項６６に記載の抗ｃ−Ｋｉｔ免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項６８】
請求項３２〜５４または５７〜６３のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチドまたはリガンドを含む、医薬組成物。
【請求項６９】
請求項３２〜５４または５７〜６３のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチドまたはリガンドを含むデバイスであって、前記免疫グロブリン単一可変ドメインが前記デバイスの表面に結合している、デバイス。
【請求項７０】
前記デバイスがステントである、請求項６９に記載のデバイス。
【請求項７１】
心臓疾患の治療に使用するための、請求項１〜１９のいずれかに記載の抗原結合コンストラクト。
【請求項７２】
筋肉疾患の治療に使用するための、請求項１〜１９のいずれかに記載の抗原結合コンストラクト。
【請求項７３】
請求項１〜１９のいずれかに記載のコンストラクトを含む医薬組成物。
【請求項７４】
サイトカインをさらに含む、請求項７３に記載の医薬組成物。
【請求項７５】
前記サイトカインが、ＳＣＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＳＤＦ−１、ＡＭＤ３１００、ＶＥＧＦ、ＦＧＦおよびＤＰＰ−ＩＶ阻害剤から選択される、請求項７４に記載の医薬組成物。
【請求項７６】
請求項１〜１９のいずれかに記載の抗原結合コンストラクトを投与することを含む、心臓疾患を治療する方法。
【請求項７７】
サイトカインを投与することをさらに含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記サイトカインが、ＳＣＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＳＤＦ−１、ＡＭＤ３１００、ＶＥＧＦ、ＦＧＦおよびＤＰＰ−ＩＶ阻害剤から選択される、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
患者から骨髄細胞を抽出すること、前記細胞をインビトロで処理すること、かつコンストラクトを投与する前に前記細胞を前記患者に戻すことを含む、請求項７６〜７８のいずれかに記載の心臓疾患を治療する方法。
【請求項８０】
幹細胞の生存、分化または増殖を高める化合物を投与することをさらに含む、請求項７６〜７８のいずれかに記載の心臓疾患を治療する方法。
【請求項８１】
前記化合物が、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、スタチン、ＳＤＦ−１、ＣＸＣＲ４またはＳＤＦ−１βＰ２Ｇから選択される、請求項８０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
循環器疾患は心臓および／または血管の疾患であり、先進国世界において罹患率および死亡率の主要原因である。循環器疾患の主な原因となるものの１つは、虚血性の心臓疾患（ＩＨＤまたは心筋虚血）であり、これは、一般に、（冠状動脈のアテローム性動脈硬化症などの）冠動脈疾患の結果として、心筋が受け取る血液供給が減少することによって特徴づけられる。心筋への血液供給の減少は、心筋への損傷およびこれらの筋肉細胞の死をもたらし得、順に、心不全につながり得る。心不全は、慢性高血圧、ウイルス感染、心臓弁異常、ならびに遺伝的原因および他の原因によっても引き起こされ得る。
【０００２】
心不全は、重症度に応じて様々な範囲のアプローチで治療され得る。心不全の初期段階において、禁煙および身体的活動は、ＡＣＥ阻害剤およびβ遮断薬などの薬理学的介入と共に薦められ得る。より重症な症状の人々には、植え込み型除細動器またはペースメーカーが使用され得、極端な場合においては、心臓移植が薦められ得る（Ｊｅｓｓｕｐ ｅｔ ａｌ.,２００９,ＡＣＦＦ／ＡＨＡガイドライン）。現在の治療は、心筋梗塞（ＭＩ）後の罹患率および死亡率を減少させるが、現在のガイドラインに従って治療が行われる時でさえ、罹患率および死亡率のレベルは高いままである。
【０００３】
最近になって、心筋を再生させる心臓組織工学および細胞移植のアプローチが開発され始めている。これらのアプローチの多くは、冠内注射または心筋内注射のいずれか一方による、幹細胞の心臓への送達を含む（例えば、Ｆａｚｅｌ ｅｔ ａｌ.Ａｎｎ.Ｔｈｏｒａｃ.Ｓｕｒｇ.２００５；７９：Ｓ２２２３８−４７に概説されている）。主として、骨髄由来のこれらの細胞は、心筋細胞および血管細胞を含む多数の細胞型を生じさせることができ、それによって、それらの細胞型は、傷害後の心臓の再生を促進させるための魅力的な手段になる。これらのアプローチを用いた動物研究がいくらかの有効性を示したが、今までのところ、臨床的利点は観察されていない。これまで、これらのアプローチが限られた心臓機能の改善を示す理由は多くある。そのような１つの理由は、効果のない幹細胞のホーミングおよび維持である。実際、骨髄細胞を、心臓傷害後の心臓に注入すると、これらの細胞の大部分は、肺、脾臓および肝臓を含む他の臓器にたどり着くことを多数の研究が示している。従って、損傷した筋肉に幹細胞を標的化させる改良法が必要とされる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、筋肉を含む組織に幹細胞を標的化させる組成物および組成物を提供する。一実施形態において、本発明は、心臓に幹細胞を標的化させる組成物および方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一態様において、幹細胞特異的マーカー分子に結合する第１の薬剤および組織特異的マーカー分子に結合する第２の薬剤を含むコンストラクトを提供する。一実施形態において、このコンストラクトは、抗原結合コンストラクトである。一実施形態において、第１および／または第２の薬剤は、モノクローナル抗体などの抗体である。別の実施形態において、第１および／または第２の薬剤は、このマーカー分子上のエピトープに結合するエピトープ結合ドメインである。一実施形態において、このエピトープ結合ドメインは、免疫グロブリン単一可変ドメインである。このコンストラクトは、追加の幹細胞特異的マーカー分子もしくはかかる幹細胞特異的分子上のエピトープ、追加の組織特異的マーカー分子もしくはかかる組織特異的マーカー分子上の追加のエピトープに結合する薬剤もしくはエピトープ結合ドメイン、または他の分子に結合する薬剤もしくはエピトープ結合ドメインをさらに含んでもよい。したがって、一実施形態において、二重標的化コンストラクトを提供し、別の実施形態において、多重標的化コンストラクトを提供する。
【０００６】
一実施形態において、この幹細胞特異的マーカー分子および／または組織特異的分子はヒトの分子である。
【０００７】
幹細胞特異的マーカー分子は当業者によく知られており、例えば、ＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ１３３およびＣＤ１１７（ｃ−Ｋｉｔ）を含む。
【０００８】
したがって、一実施形態において、この幹細胞特異的マーカー分子はｃ−Ｋｉｔである。一実施形態において、ｃ−Ｋｉｔに結合す薬剤は、モノクローナル抗体などの抗体である。別の実施形態において、本明細書に記載の態様などの本発明の任意の態様に従って、ｃ−Ｋｉｔに結合する薬剤は、抗ｃ−Ｋｉｔ免疫グロブリン単一可変ドメインである。したがって、一実施形態において、本明細書に記載のｃ−Ｋｉｔ  ｄＡｂ、および組織特異的マーカー分子に結合する薬剤を含むコンストラクトを提供する。
【０００９】
一実施形態において、この組織特異的マーカー分子は、筋肉特異的マーカー分子である。
【００１０】
一実施形態において、この筋肉特異的分子は、ヒトの心室ミオシン軽鎖（ｖＭＬＣ１ｖ−ＭＬＣ１、ｖＭＬＣ−１）；ｃＭＬＣもしくはＭＬＣ３とも称される）、ＭＬＣ２またはミオシン重鎖６（ミオシン重鎖、心筋αアイソフォーム）を含むが、それらに限定されないミオシン軽鎖（ＭＬＣ）またはミオシン重鎖などのミオシン由来の分子から選択される。一実施形態において、この筋肉特異的マーカー分子は、心筋特異的マーカー分子である。一実施形態において、この「心筋特異的分子」は、健常で無傷の心筋ではなく、損傷を受けた心筋のみにおいて発現するか、または現れる分子である。心筋梗塞などの虚血性傷害後に、筋細胞損傷および壊死が起き、結果として、細胞が破裂し、細胞内のまたは心臓の構造タンパク質が環境に曝される。（ＭＬＣ３とも知られる）ｖＭＬＣ１は、かかる分子の一例である。他の心筋特異的分子には、心臓トロポニンＩまたは心臓トロポニンＴなどの心臓トロポニン、アネキシン、ならびにテネイシンＣおよびクレアチンキナーゼなどの心筋損傷部位で上方制御される分子が含まれる。
【００１１】
一実施形態において、筋肉特異的マーカー分子に結合する薬剤は抗ＭＬＣ抗体である。一実施形態において、この抗ＭＬＣ抗体は、ヒト心筋ミオシン軽鎖に高い親和性を有する。一実施形態において、この抗ＭＬＣ抗体はモノクローナル抗体である。抗ＭＬＣ抗体は、ヒト心筋ミオシン軽鎖１に結合する抗体を含み、例えば、（ＡＴＣＣ  ＨＢ１１７０９から利用できる、または市販されている、例えば、ＭＬＭ５０８（Ａｂｃａｍ）の）モノクローナル抗体３９−１５として、米国特許第５，７０２，９０５号に記載されている。
【００１２】
一実施形態において、本発明の一態様によるコンストラクト中の抗ＭＬＣ抗体は、本明細書に記載され、本発明の任意の態様によるヒト化抗ＭＬＣ抗体である。
【００１３】
別の実施形態において、抗ＭＬＣ抗体は、抗ＭＬＣ免疫グロブリン単一可変ドメイン抗体である。特定の単一可変ドメイン抗体を作製する方法を本明細書に記載する。
【００１４】
一実施形態において、本発明は抗ＭＬＣ免疫グロブリン単一可変ドメインおよび抗ｃ−Ｋｉｔ免疫グロブリン単一可変ドメインを含むコンストラクトを提供する。かかるコンストラクトは、「ｄＡｂ−ｄＡｂ」コンストラクトであり得る。
【００１５】
別の実施形態において、筋肉特異的マーカー分子に結合する薬剤は、ｃ−Ｋｉｔに結合する薬剤よりも高い親和性で結合する。
【００１６】
一実施形態において、本発明は、本明細書に記載の抗ＭＬＣモノクローナル抗体および抗ｃ−Ｋｉｔモノクローナル抗体を含むコンストラクトを提供する。
【００１７】
別の実施形態において、本発明は、免疫グロブリン単一可変ドメイン（ｄＡｂ）と組み合わせたモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を含むコンストラクトを提供する。かかるコンストラクトを、「ＭＡｂｄＡｂ」（または「ｍＡｂｄＡｂ」、「ｍＡｂ−ｄＡｂ」）と称する。一実施形態において、本発明によるコンストラクトは、モノクローナル抗ＭＬＣ抗体、および抗ｃ−Ｋｉｔ免疫グロブリン単一可変ドメインなどの筋肉特異的マーカー分子に結合する薬剤を含む。別の実施形態において、本発明は、モノクローナル抗ｃ−Ｋｉｔ抗体および抗ＭＬＣ免疫グロブリン単一可変ドメインを含むコンストラクトを提供する。ｍＡｂ−ｄＡｂコンストラクトは単一分子として発現することができるので、ｄＡｂを含むコンストラクトを使用することは好都合であり得る。さらに、ｄＡｂを使用することは、受容体と一価相互作用を可能にするため、受容体活性化の可能性を減少させ得る。
【００１８】
一実施形態において、本発明によるコンストラクトは、表２４に記載のコンストラクトのいずれかから選択される。別の実施形態において、このコンストラクトは、ＤＯＭ２８ｈ−９４系統由来のｄＡｂであるｄＡｂを含む。
【００１９】
一実施形態において、第１の薬剤ならびに／または第２の薬剤は、マウス、ラット、イヌ、ブタ、およびヒトではない霊長類の種などの別の種に由来する幹細胞特異的マーカー分子もしくは筋肉特異的マーカー分子と交差反応する。
【００２０】
一実施形態において、幹細胞特異的マーカー分子と結合する第１の薬剤および筋肉特異的マーカー分子に結合する第２の薬剤を連結する。適切なリンカーには、スルホＳＭＣＣなどの化学的結合剤およびピアス社などの製造業者から市販されている他の結合剤が含まれる。他の適切なリンカーは当業者によく知られているであろう。
【００２１】
適切なリンカーの他の例として、長さが１アミノ酸〜約１５０アミノ酸、または１アミノ酸〜約１４０アミノ酸、例えば、１アミノ酸〜約１３０アミノ酸、または１アミノ酸〜約１２０アミノ酸、または１アミノ酸〜約８０アミノ酸、または１アミノ酸〜約５０アミノ酸、または１アミノ酸〜約２０アミノ酸、または１アミノ酸〜約１０アミノ酸、または約５アミノ酸〜約１８アミノ酸であり得るアミノ酸配列が挙げられる。かかる配列は、それ自体の三次構造を有し得、例えば、本発明のリンカーは単一可変ドメインを含み得る。一実施形態において、リンカーのサイズは単一可変ドメインと等しい。適切なリンカーは、約１〜約２０オングストローム、例えば、約１５オングストローム未満、または約１０オングストローム未満、または約５オングストローム未満のサイズであり得る。
【００２２】
本発明の一実施形態において、このエピトープ結合ドメインの少なくとも１個は、約１〜約１５０アミノ酸、例えば、１〜約２０アミノ酸、例えば、１〜約１０アミノ酸を含むリンカーでＩｇ骨格に直接取り付けられている。かかるリンカーは、Ｇ４Ｓリンカー（ＧＧＧＧＳ；配列番号８８）、ＴＶＡＡＰＳ（配列番号８９）、ＡＳＴＫＧＰＴ（配列番号９０）、ＡＳＴＫＧＰＳ（配列番号９１）、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号９２）、ＥＬＱＬＥＥＳＣＡＥＡＱＤＧＥＬＤＧ（配列番号９３）、「ＡＳＴ」（配列番号９４）、ＳＴＧＧＧＧＧＳ（配列番号９５）、ＳＴＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９６）、ＳＴＧＰＰＰＰＰＳ（配列番号９７）、ＳＴＧＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＳ（配列番号９８）、「ＳＴＧ」（セリン、スレオニン、グリシン；配列番号９９）、「ＧＳＴＧ」（配列番号１００）または「ＲＳ」（配列番号１０１）のうちの任意の１つから選択され得る。一実施形態において、このリンカーは、ＳＴＧ、ＧＧＧＧＳおよびＰＰＰＰＰＳ（配列番号４８３）から選択される。一実施形態において、このリンカーは、立体障害により、ｄＡｂ領域およびＦｃドメインの間の相互作用の可能性を減少させ、それによって、Ｆｃドメインがその正常な相互作用に関与する機会を増加させるリンカーであり得る。この実施形態において、このリンカーは、ヒト糖タンパク質ＶＩ（ＧＰＶＩ）などのタンパク質の茎領域、例えば、ＳＴＧＳＲＤＰＹＬＷＳＡＰＳＤＰＬＥＬＶＶＴＧＴＳＶＴＰＳＲＬＰＴＥＰＰＳＳＶＡＥＦＳＥＡＴＡＥＬＴＶＳＦＴＮＫＶＦＴＴＥＴＳＲＳＩＴＴＳＰＫＥＳＤＳＰＡＧＰＡＲＱＹＹＴＫＧＮＧＳＴＧ（配列番号４８４）であり得る。本発明の抗原結合コンストラクトに使用するリンカーは、ＧＳ残基、例えば、「ＧＳＴＶＡＡＰＳ」（配列番号１０２）、「ＴＶＡＡＰＳＧＳ」（配列番号１０３）もしくは「ＧＳＴＶＡＡＰＳＧＳ」（配列番号１０４）のうちの１つ以上のセットを単独で、または他のリンカーに加えて含んでもよい。別の実施形態において、このエピトープ結合ドメイン、例えば、ｄＡｂとＩｇ骨格の間にリンカーはない。別の実施形態において、このエピトープ結合ドメイン、例えば、ｄＡｂは、リンカー「ＴＶＡＡＰＳ」（配列番号８９）によってＩｇ骨格に結合している。別の実施形態において、このエピトープ結合ドメイン、例えば、ｄＡｂはリンカー「ＴＶＡＡＰＳＧＳ」（配列番号１０３）によってＩｇ骨格に結合している。別の実施形態において、このエピトープ結合ドメイン、例えば、ｄＡｂは、リンカー「ＧＳ」（配列番号１０５）によってＩｇ骨格に結合している。
【００２３】
本発明によるＭＡｂｄＡｂコンストラクトを作製する適切な方法を本明細書に記載する。ｄＡｂがＭＡｂに付着する様々な位置が、本発明のこの態様の実施形態を形づくる。ｄＡｂ付着のかかる位置を図１５に例示し、ｄＡｂがＭＡｂの可変ドメインに付着することも含む。
【００２４】
別の実施形態において、ｄＡｂ−ｄＡｂを含むコンストラクトは、例えば、欧州特許ＥＰ１８６４９９８に記載されるように、Ｆｃ領域または重鎖定常領域によって結合してもよい。
【００２５】
一実施形態において、標的抗体の１個がモノクローナル抗体またはＦｃドメインに結合したｄＡｂであるコンストラクトは、このコンストラクトの血液からのクリアランス速度を減少させる、すなわち（このｄＡｂ単独と比較して）半減期の延長をもたらすのに十分なサイズであろう。半減期の延長のさらなる方法および半減期の延長を決定する方法は、例えば、国際特許ＷＯ２００８０９６１５８に記載されている。かかる方法は、プロテアーゼ抵抗性を生じさせること、血清アルブミン、ＡｌｂｕｄＡｂｓ（登録商標）などの血清タンパク質と結合することを含む。
【００２６】
一実施形態において、このコンストラクトには、ＡＤＣＣを引き起こさない不活性Ｆｃまたは別のＩｇＧアイソタイプが含まれる。
【００２７】
別の実施形態において、本発明の第一の態様よるコンストラクトをコードするヌクレオチド配列を提供する。
【００２８】
本発明のさらなる態様において、ミオシン軽鎖（ＭＬＣ）に結合する抗原結合タンパク質を提供する。一実施形態において、ＭＬＣに結合する抗原結合タンパク質は、心臓のＭＬＣアイソタイプ、例えば、心室ＭＬＣ（ｖＭＬＣ、ｖＭＬＣ−１、ＭＬＣ−３）またはヒトの心室ＭＬＣ（ＨＶＭＬＣ）に結合する抗原結合タンパク質である。したがって、一実施形態において、この抗原結合タンパク質は、ヒトの心室ミオシン軽鎖１（ｖＭＬＣ１）に結合する。
【００２９】
一実施形態において、本発明のこの態様による抗原結合タンパク質は、ｖＭＬＣ１に結合するマウスモノクローナル抗体３９−１５（ＡＴＣＣ ＨＢ１１７０９）に関連する抗体である。したがって、一実施形態において、本発明は、ｖＭＬＣ１に結合し、かつ配列番号１３もしくは配列番号１７に示す３９−１５の重鎖もしくは軽鎖のＣＤＲ３配列、またはＣＤＲ３における１、２もしくは３個のアミノ酸置換を含むそれらの変異体を含む抗原結合タンパク質を提供する。一実施形態において、いずれのかかる変異体もｖＭＬＣ１に結合する。
【００３０】
一実施形態において、本発明による抗原結合タンパク質は、以下のＣＤＲ：ＣＤＲＨ１（配列番号１８）、ＣＤＲＨ２（配列番号１９）、ＣＤＲＨ３（配列番号２０）、ＣＤＲＬ１（配列番号１４）、ＣＤＲＬ２（配列番号１５）、ＣＤＲＬ３（配列番号１６）を含む。
【００３１】
別の実施形態において、この抗原結合タンパク質は、ヒトｖＭＬＣ１およびマウス、イヌまたはカニクイザル（ｃｙｎｏ）などの異なる種に由来する別のＭＬＣ１の両方に結合する。一実施形態において、本発明による抗原結合タンパク質は、マウスおよびヒトのｖＭＬＣ１の両方に結合する。本発明の文脈において、ヒトと他の種のｖＭＬＣ１間のかかる交差反応により、同じ抗体コンストラクトを動物疾患モデルおよびヒトにおいて用いることが可能になる。
【００３２】
一実施形態において、この抗原結合タンパク質は、ヒト化抗体またはキメラ抗体などの抗体である。一実施形態において、本発明のＭＬＣ抗原結合タンパク質には、本明細書に記載のヒト化型などのマウスではない３９−１５の同等物が含まれる。一実施形態において、本発明による抗原結合タンパク質には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ダイアボディ（diabody）、トリアボディ（triabody）、テトラボディ（tetrabody）、ミニ抗体、単離ＶＨ、単離ＶΚまたはｄＡｂが含まれる。
【００３３】
一実施形態において、この重鎖可変領域を軽鎖可変領域と共に型にし、通常の免疫グロブリン法（例えば、ヒトＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭなど）で、またはヒトＭＬＣ（例えば、一本鎖Ｆｖ、ダイアボディ、Ｔａｎｄａｂなど）に結合する任意の他の「抗体様」形式でＭＬＣに結合することを可能にしてもよい（別の「抗体」形式の概要については、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ,Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ,２００５,Ｖｏｌ.２３,Ｎｏ.９,１１２６−１１３６を参照されたい）。
【００３４】
一実施形態において、本発明による抗原結合タンパク質には、ＭＬＣに結合する抗原結合ユニットを形成するために軽鎖可変領域とペアにした配列番号２２、２５、２８または３１から選択されるＶＨドメインが含まれる。別の実施形態において、本発明による抗原結合タンパク質には、ＭＬＣに結合する抗原結合ユニットを形成するために重鎖可変領域とペアにした配列番号３４または３７から選択されるＶＫドメインが含まれる。他の適切なペア形成を本明細書に例示する。さらなる実施形態において、配列番号２２、２５、２８または３１から選択されるＶＨドメインおよび配列番号３４または３７から選択されるＶＫドメインを含む抗原結合タンパク質を提供する。一実施形態において、この重鎖は配列番号３１に示す配列を有し、この軽鎖は配列番号３７に示す配列を有する。他の実施形態において、本明細書に記載のＶＨドメインまたはＶＫドメインのいずれかと、任意の軽鎖可変領域または重鎖可変領域との組み合わせを提供する。一実施形態において、このＶＨドメインまたはＶＫドメインは、図５に示す配列のいずれかである。
【００３５】
一実施形態において、本発明による抗原結合タンパク質は、ヒトＭＬＣ、例えば、ＨＶＭＬＣおよびＨＶＭＬＣ−１などのヒトの心臓のＭＬＣアイソフォームに、約０．１ｐＭ〜約１００ｎＭ、例えば、約０．１ｐＭ〜約１００ｐＭの範囲でＢｉａｃｏｒｅによって測定されるような高い親和性で結合する。
【００３６】
別の態様において、本発明による抗原結合タンパク質または抗体をコードする核酸分子を提供する。かかる核酸分子で形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞も提供する。別の態様において、第１および第２のベクターを提供し、前記第１のベクターは、本発明による抗原結合タンパク質または抗体の重鎖をコードする核酸分子を含み、前記第２のベクターは、本発明による抗原または抗体の軽鎖をコードする核酸分子を含む。
【００３７】
別の態様において、本発明は、抗ｃ−Ｋｉｔ免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。一実施形態において、第１の態様による抗ｃ−Ｋｉｔ免疫グロブリン単一可変ドメインは、約１０ｐＭ〜約１０μＭ、例えば、約１００ｐＭ〜約１０μＭ、約１０ｎＭ〜約１μＭ、または約１ｎＭ〜約１００ｎＭの範囲の解離定数（Ｋｄ、ＫＤ、ＫＤ）でｃ−Ｋｉｔに結合する抗ｃ−Ｋｉｔ免疫グロブリン単一可変ドメインである。
【００３８】
別の態様において、本発明は、抗ｃ−Ｋｉｔ免疫グロブリン単一可変ドメインを含む単離ポリペプチドを提供する。一実施形態において、この単離ポリペプチドは、配列番号３９〜８７、２２４〜２４６、２７０〜２８２、２９７〜３００、３８３〜３８４、３８３〜３８４または４７６のいずれかに示す配列を有する核酸によってコードされる少なくとも１つのアミノ酸配列と少なくとも約７０％同一であり、かつｃ−Ｋｉｔに結合するアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、この単離ポリペプチドは、配列番号１４８〜１６３、２４７〜２６９、２８３〜２９５、３０１〜３０５、４７７〜４８２のいずれかに示す少なくとも１つのアミノ酸配列と少なくとも約７０％同一であり、かつｃ−Ｋｉｔに結合するアミノ酸配列を含む。一実施形態において、この単離ポリペプチドは、ＤＯＭ２８ｈ−９４系列のアミノ酸配列と少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を含む。適切には、この単離ポリペプチドは、配列番号３０２〜３０５、４５７、４５８または４８２のいずれかに示す少なくとも１つのアミノ酸配列と少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００３９】
一態様において、本発明は、配列番号３９〜８７、２２４〜２４６、２７０〜２８２、２９７〜３００、３８３〜３８４、３８３〜３８４または４７６のいずれかに示す配列を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドを提供する。
【００４０】
別の態様において、本発明は、図６、図１６、図１７または図２０（配列番号３９〜８７、２２４〜２４６、２７０〜２８２、２９７〜３００、３８３〜３８４、３８３〜３８４もしくは４７６）に示す核酸配列のいずれかからなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも約６０％同一であるヌクレオチド配列によってコードされ、かつｃ−Ｋｉｔに結合する単離ポリペプチドを提供する。一実施形態において、本発明のいずれかの態様による単離ポリペプチドは、ヒトのｃ−Ｋｉｔに結合する。別の実施形態において、このポリペプチドは、ヒトのｃ−Ｋｉｔおよびマウス、イヌまたはカニクイザルなどの別の種のｃ−Ｋｉｔの両方に結合する。一実施形態において、このポリペプチドは、ヒトおよびマウスのｃ−Ｋｉｔの両方に結合する。
【００４１】
別の態様において、配列番号３９〜８７、２２４〜２４６、２７０〜２８２、２９７〜３００、３８３〜３８４または４７６のいずれかに示す配列を有する核酸によってコードされる任意の１つのアミノ酸配列のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む抗ｃ−Ｋｉｔ免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。一実施形態において、この抗ｃ−Ｋｉｔ免疫グロブリン単一可変ドメインは、配列番号３９〜８７、２２４〜２４６、２７０〜２８２、２９７〜３００、３８３〜３８４または４７６に示す核酸配列のいずれかによってコードされるアミノ酸配列を含む。一実施形態において、この抗ｃ−Ｋｉｔ免疫グロブリン単一可変ドメインは、ＤＯＭ２８ｈ−５（配列番号３９）、ＤＯＭ２８ｈ−４３（配列番号５１）、ＤＯＭ２８ｈ−３３（配列番号４９）、ＤＯＭ２８ｈ−９４（配列番号６５）、ＤＯＭ２８ｈ−６６（配列番号５８）、ＤＯＭ２８ｈ−１１０（配列番号７０）、ＤＯＭ２８ｈ−８４（配列番号６２）、ＤＯＭ２８ｍ−２３（配列番号８１）、ＤＯＭ２８ｍ−７（配列番号７８）、ＤＯＭ２８ｍ−５２（配列番号８４）、ＤＯＭ２８ｈ−７９（配列番号６１）、ＤＯＭ２８ｈ−７（配列番号４１）、ＤＯＭ２８ｈ−２０（配列番号４５）、ＤＯＭ２８ｈ−２６（配列番号４８）、ＤＯＭ２８ｈ−７８（配列番号６０）、ＤＯＭ２８ｈ−７３（配列番号５９）、ＤＯＭ２８ｈ−５４（配列番号５５）、ＤＯＭ２８ｈ−１１３（配列番号７２）、ＤＯＭ２８ｈ−１１５（配列番号７３）およびＤＯＭ２８ｍ−７３（配列番号８６）と同定される核酸配列の任意の１つによってコードされるアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む。一実施形態において、本発明の任意の態様による抗ｃ−Ｋｉｔ免疫グロブリン単一可変ドメインは、ヒトのｃ−Ｋｉｔに結合する。別の実施形態において、抗ｃ−Ｋｉｔ免疫グロブリン単一可変ドメインは、ヒトのｃ−Ｋｉｔおよびマウス、イヌまたはカニクイザル（ｃｙｎｏ）などサルなどの別の種のｃ−Ｋｉｔの両方に結合する。一実施形態において、抗ｃ−Ｋｉｔ免疫グロブリン単一可変ドメインは、ヒトおよびマウスのｃ−Ｋｉｔの両方に結合する。
【００４２】
別の態様において、せいぜい約２５個のアミノ酸の位置で修飾され、かつ配列番号３９〜８７、２２４〜２４６、２７０〜２８２、２９７〜３００、３８３〜３８４または４７６のいずれかに示す配列を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列の任意の１つの中のＣＤＲ１配列と少なくとも約５０％同一であるＣＤＲ１配列を含む、配列番号３９〜８７、２２４〜２４６、２７０〜２８２、２９７〜３００、３８３〜３８４または４７６のいずれかに示す配列を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む抗ｃ−Ｋｉｔ免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。
【００４３】
さらなる態様において、せいぜい約２５個のアミノ酸の位置で修飾され、かつ配列番号３９〜８７、２２４〜２４６、２７０〜２８２、２９７〜３００、３８３〜３８４または４７６のいずれかに示す配列を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列の任意の１つの中のＣＤＲ２配列と少なくとも約５０％同一であるＣＤＲ２配列を含む、配列番号３９〜８７、２２４〜２４６、２７０〜２８２、２９７〜３００、３８３〜３８４または４７６のいずれかに示す配列を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む抗ｃ−Ｋｉｔ免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。
【００４４】
別の態様において、せいぜい約２５個のアミノ酸の位置で修飾され、かつ配列番号３９〜８７、２２４〜２４６、２７０〜２８２、２９７〜３００、３８３〜３８４または４７６のいずれかに示す配列を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列の任意の１つの中のＣＤＲ３配列と少なくとも約５０％同一であるＣＤＲ３配列を含む、配列番号３９〜８７、２２４〜２４６、２７０〜２８２、２９７〜３００、３８３〜３８４または４７６のいずれかに示す配列を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む抗ｃ−Ｋｉｔ免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。
【００４５】
さらなる態様において、せいぜい約２５個のアミノ酸の位置で修飾され、配列番号３９〜８７、２２４〜２４６、２７０〜２８２、２９７〜３００、３８３〜３８４または４７６のいずれかに示す配列を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列の任意の１つの中のＣＤＲ１配列と少なくとも５０％同一であるＣＤＲ１配列を含み、かつ配列番号３９〜８７、２２４〜２４６、２７０〜２８２、２９７〜３００、３８３〜３８４または４７６のいずれかに示す配列を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列の任意の１つの中のＣＤＲ２配列と少なくとも約５０％同一であるＣＤＲ２配列を含む、配列番号３９〜８７、２２４〜２４６、２７０〜２８２、２９７〜３００、３８３〜３８４または４７６のいずれかに示す配列を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む抗ｃ−Ｋｉｔ免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。
【００４６】
別の態様において、せいぜい約２５個のアミノ酸の位置で修飾され、配列番号３９〜８７、２２４〜２４６、２７０〜２８２、２９７〜３００、３８３〜３８４または４７６のいずれかに示す配列を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列の任意の１つの中のＣＤＲ１配列と少なくとも約５０％同一であるＣＤＲ１配列を含み、かつ配列番号３９〜８７、２２４〜２４６、２７０〜２８２、２９７〜３００、３８３〜３８４または４７６のいずれかに示す配列を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列の任意の１つの中のＣＤＲ３配列と少なくとも約５０％同一であるＣＤＲ３配列を含む、配列番号３９〜８７、２２４〜２４６、２７０〜２８２、２９７〜３００、３８３〜３８４または４７６のいずれかに示す配列を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む抗ｃ−Ｋｉｔ免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。
【００４７】
さらに別の態様において、せいぜい約２５個のアミノ酸の位置で修飾され、配列番号３９〜８７、２２４〜２４６、２７０〜２８２、２９７〜３００、３８３〜３８４または４７６のいずれかに示す配列を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列の任意の１つの中のＣＤＲ２配列と少なくとも約５０％同一であるＣＤＲ２配列を含み、かつ配列番号３９〜８７、２２４〜２４６、２７０〜２８２、２９７〜３００、３８３〜３８４または４７６のいずれかに示す配列を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列の任意の１つの中のＣＤＲ３配列と少なくとも約５０％同一であるＣＤＲ３配列を含む、配列番号３９〜８７、２２４〜２４６、２７０〜２８２、２９７〜３００、３８３〜３８４または４７６のいずれかに示す配列を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む抗ｃ−Ｋｉｔ免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。
【００４８】
別の態様において、せいぜい約２５個のアミノ酸の位置で修飾され、配列番号３９〜８７のいずれかに示す配列を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列の任意の１つの中のＣＤＲ１配列と少なくとも約５０％同一であるＣＤＲ１配列を含み、配列番号３９〜８７、２２４〜２４６、２７０〜２８２、２９７〜３００、３８３〜３８４または４７６のいずれかに示す配列を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列の任意の１つの中のＣＤＲ２配列と少なくとも約５０％同一であるＣＤＲ２配列を含み、かつ配列番号３９〜８７、２２４〜２４６、２７０〜２８２、２９７〜３００、３８３〜３８４または４７６のいずれかに示す配列を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列の任意の１つの中のＣＤＲ３配列と少なくとも５０％同一であるＣＤＲ３配列を含む、配列番号３９〜８７、２２４〜２４６、２７０〜２８２、２９７〜３００、３８３〜３８４または４７６のいずれかに示す配列を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む抗ｃ−Ｋｉｔ免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。
【００４９】
さらなる態様において、配列番号３９〜８７、２２４〜２４６、２７０〜２８２、２９７〜３００、３８３〜３８４または４７６のいずれかに示す配列を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列の任意の１つの中のＣＤＲ３配列からなる群から選択されるＣＤＲ３配列と少なくとも約５０％同一であるＣＤＲ３配列を含む抗ｃ−Ｋｉｔ免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。
【００５０】
別の態様において、配列番号３９〜８７、２２４〜２４６、２７０〜２８２、２９７〜３００、３８３〜３８４または４７６のいずれかに示す配列を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列の任意の１つの中のＣＤＲ３配列からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を含む抗ｃ−Ｋｉｔ免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。
【００５１】
さらに別の態様において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含む抗ｃ−Ｋｉｔ免疫グロブリン単一可変ドメインを提供し、このＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３は、配列番号３９〜８７、２２４〜２４６、２７０〜２８２、２９７〜３００、３８３〜３８４または４７６のいずれかに示す配列を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列の任意の１つの中のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３と同一である。一実施形態において、本発明による抗ｃ−Ｋｉｔ免疫グロブリン単一可変ドメインは、図７に示すＣＤＲ配列から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含む。一態様において、本発明による抗ｃ−Ｋｉｔ免疫グロブリン単一可変ドメインをコードする核酸配列を含む核酸分子を提供する。一実施形態において、このヌクレオチド配列は、配列番号３９〜８７、２２４〜２４６、２７０〜２８２、２９７〜３００、３８３〜３８４または４７６のいずれかに示す核酸配列を含む。
【００５２】
別の態様において、ｃ−Ｋｉｔに対する結合特異性を有し、かつ配列番号３９〜８７、２２４〜２４６、２７０〜２８２、２９７〜３００、３８３〜３８４または４７６のいずれかに示す配列を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む抗ｃ−Ｋｉｔ免疫グロブリン単一可変ドメインの結合を阻害するリガンドを提供する。
【００５３】
幹細胞因子（ＳＣＦ）結合を介するシグナル伝達と共にｃ−Ｋｉｔの構造は、例えば、Ｒｏｎｎｓｔｒａｎｄ；Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ,６１（２００４）,２５３５−２５４８およびＹｕｚａｗａ ｅｔ ａｌ.Ｃｅｌｌ １３０（２００７）,３２３−３３４に記載されている。幹細胞因子がｃ−Ｋｉｔの細胞外領域に結合すると、チロシンキナーゼの活性化をもたらす。
【００５４】
一実施形態において、本発明による抗ｃ−Ｋｉｔ免疫グロブリン単一可変ドメインは、ＳＣＦによるｃ−Ｋｉｔ受容体の結合および／または活性化が実質的に阻害されない方法でｃ−Ｋｉｔに結合する。
【００５５】
別の実施形態において、本発明による抗ｃ−Ｋｉｔ免疫グロブリン単一可変ドメインは、ＳＣＦによるｃ−Ｋｉｔ受容体の結合および／または活性化が実質的に阻害されない方法でｃ−Ｋｉｔに結合する。
【００５６】
一実施形態において、ｃ−ＫｉｔへのＳＣＦ結合阻害を、本明細書に記載の競合結合アッセイで調べることができる。ｃ−Ｋｉｔ活性化を調べる他のアッセイは当業者によく知られており、例えば、上記で言及したＲｏｎｎｓｔｒａｎｄによって記載される下流のシグナル伝達成分を測定するアッセイを含む。他の適切なアッセイには、ＭＳＤ社（カタログ番号Ｋ１１１１９Ｄ−２）によって提供されるアッセイなどのリン酸化反応のアッセイが含まれる。
【００５７】
一実施形態において、ｃ−Ｋｉｔに結合し、ＳＣＦ結合に対して競合しない抗ｃ−Ｋｉｔ免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。この実施形態において、この抗ｃ−Ｋｉｔ免疫グロブリン単一可変ドメインは、ＤＯＭ２８ｈ−５（配列番号３９）、ＤＯＭ２８ｈ−３３（配列番号４９）、ＤＯＭ２８ｈ−４３（配列番号５１）、ＤＯＭ２８ｈ−６６（配列番号５８）、ＤＯＭ２８ｈ−８４（配列番号６２）、ＤＯＭ２８ｈ−９４（配列番号６５）、ＤＯＭ２８ｈ−１１０（配列番号７０）、ＤＯＭ２８ｍ−７（配列番号７８）、ＤＯＭ２８ｍ−２３（配列番号８１）およびＤＯＭ２８ｍ−５２（配列番号８４）のいずれかに示す核酸配列によってコードされるアミノ酸配列から選択されてもよい。競合しない他の適切な抗ｃ−Ｋｉｔ免疫グロブリン単一可変ドメインを本明細書に例示する。
【００５８】
別の実施形態において、ｃ−Ｋｉｔに結合し、ＳＣＦ結合に対して競合する抗ｃ−Ｋｉｔ免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。この実施形態において、この抗ｃ−Ｋｉｔ免疫グロブリン単一可変ドメインは、ＤＯＭ２８ｈ−７（配列番号４１）、ＤＯＭ２８ｈ−２０（配列番号４５）、ＤＯＭ２８ｈ−２６（配列番号４８）、ＤＯＭ２８ｈ−５４（配列番号５５）、ＤＯＭ２８ｈ−７３（配列番号５９）、ＤＯＭ２８ｈ−７８（配列番号６０）およびＤＯＭ２８ｈ−７９（配列番号６１）のいずれかに示す核酸配列によってコードされるアミノ酸配列から選択されてもよい。競合する他の適切な抗ｃ−Ｋｉｔ免疫グロブリン単一可変ドメインを本明細書に例示する。
【００５９】
一実施形態において、本発明の単一可変ドメインは、ヒトｃ−Ｋｉｔとマウス、イヌまたはカニクイザルなどの他の種のｃ−Ｋｉｔとの間で交差反応を示す。一実施形態において、本発明の単一可変ドメインは、ヒトｃ−Ｋｉｔとマウスｃ−Ｋｉｔとの間で交差反応を示す。この実施形態において、この可変ドメインは、ヒトｃ−Ｋｉｔとマウスｃ−Ｋｉｔに特異的に結合する。一実施形態において、ヒトｃ−Ｋｉｔとマウスｃ−Ｋｉｔに交差反応性のある可変ドメインは、ＤＯＭ２８ｈ−５（配列番号３９）、ＤＯＭ２８ｈ−９４（配列番号６５）、ＤＯＭ２８ｍ−７（配列番号７８）、ＤＯＭ２８ｍ−２３（配列番号８１）およびＤＯＭ２８ｍ−５２（配列番号８４）のいずれかに示す核酸配列によってコードされるアミノ酸配列から選択される。他の交差反応性可変ドメインを本明細書に例示する。上記に記載したとおり、薬剤開発が、薬剤をヒトにおいて試験する前に、マウスモデルなどの動物系においてリード薬剤候補の試験を一般的に必要とするので、交差反応は特に有用である。ヒトタンパク質および同等のマウスタンパク質などの種のホモログに結合することができる薬剤が供給されると、これらの系における結果を分析し、同じ薬剤を用いたデータの並行比較が可能になる。これは、例えば、マウスｃ−Ｋｉｔに対して作用する薬剤およびヒトｃ−Ｋｉｔに対して作用する別の薬剤を発見する必要がある面倒な事態を避け、同一ではない、すなわち代替の薬剤を用いたヒトおよびマウスの結果を比較する必要も避ける。
【００６０】
任意に、免疫グロブリン単一可変ドメインの少なくともマウスｃ−Ｋｉｔに対する結合親和性とヒトｃ−Ｋｉｔに対する結合親和性は、せいぜい約５倍、約１０倍、約５０倍または約１００倍異なる。
【００６１】
本発明の別の態様において、本発明による抗原結合コンストラクト（例えば、二重特異性リガンド、多特異性リガンド）、抗ＭＬＣ抗体または抗ｃ−Ｋｉｔの免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチドもしくはリガンドを産生する方法を提供し、組換え核酸の発現に適する条件下で、本発明の組換え核酸を含む組換え宿主細胞を維持することを含み、それによって、この組換え核酸が発現し、リガンドが産生される。いくつかの実施形態において、本方法は、このリガンドを単離することをさらに含む。
【００６２】
本発明の実施形態に適用できる開示の詳細については、国際特許ＷＯ２００７０８５１５、１６１ページの２４行〜１８９ページの１０行で言及されている。これにより、この開示は本開示の文脈に明確に現れ、本発明の実施形態に関連するかのように、かつ以下の特許請求の範囲に組込むために明確な支持を開示に提供するために、参照により本明細書に組込まれる。これは、国際特許ＷＯ２００７０８５１５、１６１ページの２４行〜１８９ページの１０行の中にある開示を含み、「免疫グロブリンに基づくリガンドの調製」、「ライブラリーベクター系」、「ライブラリー構築」、「単一可変ドメインの結合」、「リガンドの特徴づけ」、「リガンドの構造」、「骨格」、「タンパク質の骨組み」、「リガンド構築に使用するための骨組み」、「標準的な配列の多様化」および「治療組成物および診断組成物ならびに治療上の使用および診断上の使用」の詳細、ならびに「作動可能に連結する」、「未処理」、「予防」、「抑制」、「治療」、「アレルギー性疾患」、「Ｔｈ２介在性疾患」、「治療有効量」および「効果的」の定義を提供する。
【００６３】
一態様において、ｃ−Ｋｉｔ受容体活性化に伴う疾患もしくは障害の治療のためにｃ−Ｋｉｔを標的化することに使用する、本発明による抗ｃ−Ｋｉｔの免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチドまたはリガンドを提供する。一実施形態において、抗ｃ−Ｋｉｔ免疫グロブリン単一可変ドメインは、ｃ−ＫｉｔのＳＣＦ活性化を阻害するために競合結合アッセイでＳＣＦと競合する抗ｃ−Ｋｉｔ免疫グロブリン単一可変ドメインである。適切な競合するｄＡｂを本明細書に開示する。
【００６４】
ｃ−Ｋｉｔ活性化に伴う疾患または障害には、マスト細胞障害および癌が含まれる。特に、ｃ−Ｋｉｔ活性化は、腫瘍血管新生に関わると見なされている。したがって、ｃ−Ｋｉｔを標的化することは、抗癌治療における腫瘍血管新生の阻害を可能にし得る。さらに、小細胞肺癌、結腸直腸癌、乳癌、婦人科系腫瘍および神経芽細胞腫を含む多数の癌において、ｃ−ＫｉｔおよびＳＣＦの自己分泌ループが同定されている（そこで、腫瘍はｃ−ＫｉｔおよびＳＣＦの両方を発現する）（Ｒｏｎｎｓｔｒａｎｄ；Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ,６１（２００４）,２５３５−２５４８参照）。
【００６５】
別の態様において、本発明による免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドまたはリガンドを含む医薬組成物を提供する。
【００６６】
一実施形態において、本発明による抗ｃ−Ｋｉｔの免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチドまたはリガンドをステントなどのデバイスに取り付けてもよい。適切なかかるデバイスは、例えば、国際特許ＷＯ０３／０６５８８１に記載されている。一実施形態において、本発明による抗ｃ−Ｋｉｔの免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチドまたはリガンドをステントの表面に取り付けてもよく、その結果、これを幹細胞ホーミングに利用可能できる。この実施形態の一実施形態において、この抗ｃ−Ｋｉｔ免疫グロブリン単一可変ドメインは、競合せずにｃ−Ｋｉｔに結合する、すなわち、ｃ−ＫｉｔのＳＣＦ活性化に競合しない抗ｃ−Ｋｉｔ免疫グロブリン単一可変ドメインである。
【００６７】
別の態様において、標的組織に幹細胞を標的化するのに使用する、本発明による抗原結合コンストラクトを提供する。一実施形態において、この標的組織は、組織特異的マーカー分子を発現する。一実施形態において、この抗原結合コンストラクトは、その標的組織を再生するために標的組織に幹細胞を漸加するのに使用するためのものである。したがって、本発明のコンストラクトは疾患標的組織の治療に使用するためのものである。一実施形態において、本発明によるコンストラクトは、筋肉疾患の治療に使用するためのものである。一実施形態において、心臓疾患の治療に使用するための、本発明による抗原結合コンストラクトを提供する。
【００６８】
さらなる態様において、本発明による抗原結合コンストラクトを含む医薬組成物を提供する。一実施形態において、サイトカイン療法を用いて、骨髄の幹細胞および前駆細胞を動員することができる。サイトカイン療法は、例えば、Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ.Ｌａｎｃｅｔ （２００４）,３６３；７５１−６に記載されている。適切なサイトカインには、ＳＣＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＳＤＦ−１、ＡＭＤ３１００（会社名＝モゾビル（Ｍｏｚｏｂｉｌ））、ＶＥＧＦ、ＦＧＦおよびＤＰＰ−ＩＶの阻害剤が含まれる。
【００６９】
別の態様において、本発明による抗原結合コンストラクトを投与することを含む心臓疾患を治療する方法を提供する。一実施形態において、本方法は、一実施形態において、ＳＣＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＳＤＦ−１、ＡＭＤ３１００、ＶＥＧＦ、ＦＧＦおよびＤＰＰ−ＩＶの阻害剤から選択されるサイトカインを投与することをさらに含む。
【００７０】
別の実施形態において、治療している患者から骨髄細胞を抽出することができる。一実施形態において、この患者の胸骨または腸骨稜から骨髄細胞を抽出することができるか、またはその血液から細胞を単離してもよい。分画していない骨髄細胞を、次の全身／局所送達に使用するか、または細胞分離技術（例えば、ＦＡＣＳもしくは磁気ビーズ免疫選択）を用いて、特定の細胞集団を単離してもよい。細胞をインビトロで培養し、その後、この患者に注射して戻し、例えば、有糸分裂剤で処理することによって細胞数を増加させること、ＶＥＧＦおよびスタチンなどの因子で細胞機能を高めることなどの多数の機序を促進して、生存、分化または血管新生能を高めてもよい。細胞を遺伝子工学処理して、例えば、生存因子または再生促進因子の遺伝子発現を調節してもよい。磁気細胞分離技術を用いる細胞表面マーカーの選択に基づいて、細胞を精製してもよい（例えば、Ｌｏｓｏｒｄｏ ｅｔ ａｌ.Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ２００７ Ｊｕｎ ２６；１１５（２５）：３１６５−７２参照）。（例えば、Ｂａｒｉｌｅ ｅｔ ａｌ.,Ｎａｔｕｒｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ,Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２００７,Ｖｏｌ.４ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １に記載の）カーディオスフェア（ｃａｒｄｉｏｓｐｈｅｒｅ）などの細胞集団を、インビトロで産生してもよい。本発明にしたがって使用する他の細胞には、血管芽細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞または内皮前駆細胞が含まれる。したがって、一実施形態において、患者から骨髄細胞を抽出すること、前記細胞をインビトロで処理すること、かつこの患者に前記細胞を戻した後、コンストラクトを投与することを含む心臓疾患を治療する方法を提供する。
【００７１】
静脈内投与を用いるか、または、例えば、心筋内投与もしくはカテーテルによる冠内送達を介して、細胞をこの患者に投与してもよい。一実施形態において、細胞を、外科的介入中に局所的に投与してもよい。
【００７２】
一実施形態において、本発明によるコンストラクトは、筋肉などの標的組織に幹細胞を動員する。一実施形態において、このコンストラクトは心筋に幹細胞を動員する。一実施形態において、ｃ−Ｋｉｔ＋細胞を動員する。
【００７３】
一実施形態において、これらの幹細胞は筋芽細胞または筋細胞を産生することができる細胞であり、その結果、筋肉を修復することができる。一実施形態において、これらの幹細胞は、損傷を受けた脈管構造を修復する（内皮細胞および平滑筋細胞を含む）血管細胞を産生することができ、それ自体、筋肉および筋細胞の生存、幹細胞からの分化を促進する。一実施形態において、これらの幹細胞は心筋を修復することができる。特に、本発明の分子によって標的化される幹細胞は、心筋細胞、血管内皮細胞または平滑筋細胞に分化することができる細胞である。別の実施形態において、これらの幹細胞は、筋芽細胞または筋細胞を産生することができ、その結果、骨格筋への損傷を修復することができる。したがって、一実施形態において、幹細胞は、造血幹細胞、間葉系幹細胞、心臓幹細胞、内皮前駆細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）などの成人の幹細胞である。別の実施形態において、幹細胞は胚幹細胞である。心血管細胞種へ分化する幹細胞の作用に加えて、これらの幹細胞は、パラクライン様式で作用する能力も有し、傷害部位で作用して、細胞の生存、細胞修復、組織再生、血管新生および心筋再生を促進することができる増殖因子、サイトカインおよび他の分子を分泌する。一実施形態において、これらの幹細胞は造血幹細胞である。本発明で使用する幹細胞は、患者自身（すなわち、自己）に由来するか、または同種（すなわち、他人由来）であり得る。一実施形態において、これらの幹細胞はＣＤ３４＋細胞である。別の実施形態において、これらの幹細胞は、例えば、ヒトなどの霊長類の幹細胞、またはげっ歯類、ネコ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ウシもしくはウマの幹細胞を含む任意の哺乳類の幹細胞であり得る。
【００７４】
別の実施形態において、これらの幹細胞を遺伝子改変してもよく、その結果、これらの幹細胞は遺伝子治療のための導入遺伝子を包含する。
【００７５】
別の実施形態は筋肉疾患または心臓疾患を治療する方法であって、幹細胞の生存、分化または増殖を高める化合物を投与することをさらに含む方法を提供する。適切な化合物には、（例えば、Ｔａｎ ｅｔ ａｌ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｒｅｓ.（２００９年２月２４日に出版されたＡｄｖａｎｃｅ Ａｃｃｅｓｓ；ｄｏｉ：ｄｏｉ：１０．１０９３/ｃｖｒ／ｃｖｐ０４４）に記載される）ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、スタチン、ＳＤＦ−１、ＣＸＣＲ４またはＳＤＦ−１βＰ２Ｇが含まれる。例えば、Ｂａｌｌａｒｄ ａｎｄ Ｅｄｅｌｂｅｒｇ,Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００７,１００（８）：１１１６−２７に概説されるように、かかる化合物は、これらの細胞が心臓の再生に寄与する能力を改善し、心筋傷害後に観察される長期のダメージを防ぐ。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１−１】ヒトおよびマウスのｖＭＬＣ１−（６×ＨＩＳタグ）のアミノ酸配列ならびに核酸配列を示す。
【図１−２】図１−１の続き。
【図２−１】ヒト、マウス、イヌおよびカニクイザルのｃ−ＫＩＴ ＥＣＤ−ｈＩｇＧ１ Ｆｃ融合体（太字はｃ−ＫＩＴ ＥＣＤ（細胞外ドメイン））のアミノ酸配列を示す。
【図２−２】図２−１の続き。
【図３】ヒトおよびマウスのＳＣＦ−６×ＨＩＳタグのアミノ酸を示す。
【図４】抗ＭＬＣ抗体マウスκ鎖（太字はＶκ遺伝子；下線はＣＤＲ配列）および抗ＭＬＣ抗体マウスＩｇＧ１重鎖（太字はＶＨ遺伝子；下線はＣＤＲ配列）を示す。
【図５−１】ヒト化３９−１５ｍＡｂ Ｖ遺伝子（下線はＣＤＲ配列）を示す。
【図５−２】図５−１の続き。
【図５−３】図５−１の続き。
【図５−４】図５−１の続き。
【図５−５】図５−１の続き。
【図５−６】図５−１の続き。
【図５−７】図５−１の続き。
【図６Ａ−１】ｃ−ｋｉｔに結合するｄＡｂの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。
【図６Ａ−２】図６Ａ−１の続き。
【図６Ａ−３】図６Ａ−１の続き。
【図６Ａ−４】図６Ａ−１の続き。
【図６Ａ−５】図６Ａ−１の続き。
【図６Ａ−６】図６Ａ−１の続き。
【図６Ａ−７】図６Ａ−１の続き。
【図６Ａ−８】図６Ａ−１の続き。
【図６Ａ−９】図６Ａ−１の続き。
【図６Ｂ−１】ｃ−ｋｉｔに結合するｄＡｂの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。
【図６Ｂ−２】図６Ｂ−１の続き。
【図７】選択したｄＡｂの対応するアミノ酸配列の予想されるＣＤＲ配列を示す。Ｋａｂａｔナンバリングを用いて、これらのＣＤＲを以下のように決定する：（ＶＨ−ＣＤＲ１（３０−３５）、ＶＨ−ＣＤＲ２（５０−５６）、ＶＨ−ＣＤＲ３（９４−１０２）、ＶΚ−ＣＤＲ１（２６−３４）、ＶΚ−ＣＤＲ２（４９−５６）、ＶΚ−ＣＤＲ３（８９−９７）。
【図８】非競合的にヒトｃ−ｋｉｔに結合するｄＡｂのＢＩＡｃｏｒｅ結合トレースを示すグラフである。ストレプトアビジンチップ上に固定化したビオチン化ヒトｃ−ｋｉｔ（Ｈｉｓタグ付き）で、ｄＡｂ結合を評価した。これらのトレースは、これらのｄＡｂの相対的な解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）および結合速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）の目視比較を可能にし、動態モデルを用いる曲線のフィッティングは、これらのｄＡｂの親和定数の計算を可能にする。
【図９ａ】競合受容体結合アッセイ（ＲＢＡ）の結果を示すグラフである。このアッセイにおいて、ｄＡｂを評価し、ｄＡｂが、ヒトｃ−ｋｉｔとヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）との間の相互作用を阻害することができるか否かを決定する。ＳＣＦと競合するこれらのｄＡｂはこの相互作用を阻害し、このｄＡｂ濃度が上昇するにつれてこのシグナルを減少させるが、ＳＣＦと競合しないこれらのｄＡｂは効果がなく、それゆえに、このｄＡｂ濃度が上昇するにつれてこのシグナルは一定のままである。
【図９ｂ】競合受容体結合アッセイ（ＲＢＡ）の結果を示すグラフである。このアッセイにおいて、ｄＡｂを評価し、ｄＡｂが、ヒトｃ−ｋｉｔとヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）との間の相互作用を阻害することができるか否かを決定する。ＳＣＦと競合するこれらのｄＡｂはこの相互作用を阻害し、このｄＡｂ濃度が上昇するにつれてこのシグナルを減少させるが、ＳＣＦと競合しないこれらのｄＡｂは効果がなく、それゆえに、このｄＡｂ濃度が上昇するにつれてこのシグナルは一定のままである。
【図９ｃ】競合受容体結合アッセイ（ＲＢＡ）の結果を示すグラフである。このアッセイにおいて、ｄＡｂを評価し、ｄＡｂが、ヒトｃ−ｋｉｔとヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）との間の相互作用を阻害することができるか否かを決定する。ＳＣＦと競合するこれらのｄＡｂはこの相互作用を阻害し、このｄＡｂ濃度が上昇するにつれてこのシグナルを減少させるが、ＳＣＦと競合しないこれらのｄＡｂは効果がなく、それゆえに、このｄＡｂ濃度が上昇するにつれてこのシグナルは一定のままである。
【図１０】競合受容体結合アッセイ（ＲＢＡ）の結果を示すグラフである。このアッセイにおいて、ｄＡｂを評価し、ｄＡｂが、ヒトｃ−ｋｉｔとヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）との間の相互作用を阻害することができるか否かを決定する。ＳＣＦと競合するこれらのｄＡｂはこの相互作用を阻害し、このｄＡｂ濃度が上昇するにつれてこのシグナルを減少させるが、ＳＣＦと競合しないこれらのｄＡｂは効果がなく、それゆえに、このｄＡｂ濃度が上昇するにつれてこのシグナルは一定のままである。
【図１１ａ】フローサイトメトリーによって、競合しないｄＡｂがＫＵ８１２細胞に結合することを示すグラフである。このアッセイは、ｃ−ｋｉｔ＋ｖｅであると示されたＫＵ８１２細胞株への結合を調べることによって、これらのｄＡｂがこの細胞表面上に示されるｃ−ｋｉｔに特異的に結合することができるか否か決定する。２点曲線（１００−５００ｎＭ）を図１１ａに示し、２点曲線（８０−４００ｎＭ）を図１１ｂに示す。
【図１１ｂ】フローサイトメトリーによって、競合しないｄＡｂがＫＵ８１２細胞に結合することを示すグラフである。このアッセイは、ｃ−ｋｉｔ＋ｖｅであると示されたＫＵ８１２細胞株への結合を調べることによって、これらのｄＡｂがこの細胞表面上に示されるｃ−ｋｉｔに特異的に結合することができるか否か決定する。２点曲線（１００−５００ｎＭ）を図１１ａに示し、２点曲線（８０−４００ｎＭ）を図１１ｂに示す。
【図１２ａ】フローサイトメトリーによって、競合しないｄＡｂがＪｕｒｋａｔ細胞に結合することを示すグラフである。このアッセイは、ｃ−ｋｉｔ−ｖｅであると示されたＪｕｒｋａｔ細胞株への結合を調べることによって、これらのｄＡｂが細胞に特異的に結合しているのか、または非特異的に結合しているのかを決定する。２点曲線（１００−５００ｎＭ）を図１２ａに示し、２点曲線（８０−４００ｎＭ）を図１２ｂに示す。
【図１２ｂ】フローサイトメトリーによって、競合しないｄＡｂがＪｕｒｋａｔ細胞に結合することを示すグラフである。このアッセイは、ｃ−ｋｉｔ−ｖｅであると示されたＪｕｒｋａｔ細胞株への結合を調べることによって、これらのｄＡｂが細胞に特異的に結合しているのか、または非特異的に結合しているのかを決定する。２点曲線（１００−５００ｎＭ）を図１２ａに示し、２点曲線（８０−４００ｎＭ）を図１２ｂに示す。
【図１３】フローサイトメトリーによって、競合ｄＡｂがＫＵ８１２に結合することを示すグラフである。このアッセイは、ｃ−ｋｉｔ＋ｖｅであると示されたＫＵ８１２細胞株への結合を調べることによって、これらのｄＡｂがこの細胞表面上に示されるｃ−ｋｉｔに特異的に結合することができるか否かを決定する。３点曲線（４００ｎＭ−２μＭ−１０μＭ）を示す。
【図１４】フローサイトメトリーによって、競合ｄＡｂがＪｕｒｋａｔ細胞に結合することを示すグラフである。このアッセイは、ｃ−ｋｉｔ−ｖｅであると示されたＪｕｒｋａｔ細胞株への結合を調べることによって、これらのｄＡｂが細胞に特異的に結合しているのか、または非特異的に結合しているのかを決定する。３点曲線（４００ｎＭ−２μＭ−１０μＭ）を示す。
【図１５】フローサイトメトリーによって、ｄＡｂのパネルがｃ−ｋｉｔ＋ｖｅゲーティングされたマウス骨髄細胞に結合することを示すグラフである。このアッセイは、ｄＡｂがｃＫＩＴ＋ｖｅであることに基づいて選別されたマウス骨髄細胞に結合することができるか否かを決定する。２点曲線（５μＭ−１０μＭ）を示す。
【図１６Ａ−１】ｃ−ｋｉｔに結合するｄＡｂの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。
【図１６Ａ−２】図１６Ａ−１の続き。
【図１６Ａ−３】図１６Ａ−１の続き。
【図１６Ａ−４】図１６Ａ−１の続き。
【図１６Ｂ−１】ｃ−ｋｉｔに結合するｄＡｂの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。
【図１６Ｂ−２】図１６Ｂ−１の続き。
【図１６Ｂ−３】図１６Ｂ−１の続き。
【図１７Ａ−１】ｃ−ｋｉｔに結合するｄＡｂの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。
【図１７Ａ−２】図１７Ａ−１の続き。
【図１７Ｂ−１】ｃ−ｋｉｔに結合するｄＡｂの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。
【図１７Ｂ−２】図１７Ｂ−１の続き。
【図１８】細胞内で活性があり、ｍＡｂｄＡｂとして適合性のある１３個のｄＡｂのＢＩＡｃｏｒｅ結果を示すグラフである。
【図１９Ａ】配列−構造比較によるエピトープマッピングを示す。
【図１９Ｂ】配列−構造比較によるエピトープマッピングを示す。
【図２０−１】ｃ−ｋｉｔに結合するｄＡｂの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。
【図２０−２】図２０−１の続き。
【図２０−３】図２０−１の続き。
【図２０−４】図２０−１の続き。
【図２１】異なる抗体型を図解する模式図である。
【図２２】ｍＡｂｄＡｂ重鎖（上の図）またはｍＡｂｄＡｂ軽鎖（下の図）の構成を図解する模式図である。
【図２３】実施例５に記載のｍＡｂ−ｄＡｂの模式図である。
【図２４】ダミーｍＡｂ−ｃＫＩＴ ｄＡｂ ｍＡｂ−ｄＡｂのクローニングを図解する模式図である。
【図２５−１】実施例５に記載のコンストラクトの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。
【図２５−２】図２５−１の続き。
【図２５−３】図２５−１の続き。
【図２５−４】図２５−１の続き。
【図２５−５】図２５−１の続き。
【図２５−６】図２５−１の続き。
【図２５−７】図２５−１の続き。
【図２５−８】図２５−１の続き。
【図２５−９】図２５−１の続き。
【図２５−１０】図２５−１の続き。
【図２５−１１】図２５−１の続き。
【図２５−１２】図２５−１の続き。
【図２５−１３】図２５−１の続き。
【図２５−１４】図２５−１の続き。
【図２５−１５】図２５−１の続き。
【図２５−１６】図２５−１の続き。
【図２５−１７】図２５−１の続き。
【図２５−１８】図２５−１の続き。
【図２５−１９】図２５−１の続き。
【図２５−２０】図２５−１の続き。
【図２５−２１】図２５−１の続き。
【図２５−２２】図２５−１の続き。
【図２５−２３】図２５−１の続き。
【図２５−２４】図２５−１の続き。
【図２５−２５】図２５−１の続き。
【図２５−２６】図２５−１の続き。
【図２５−２７】図２５−１の続き。
【図２５−２８】図２５−１の続き。
【図２５−２９】図２５−１の続き。
【図２５−３０】図２５−１の続き。
【図２５−３１】図２５−１の続き。
【図２５−３２】図２５−１の続き。
【図２５−３３】図２５−１の続き。
【図２５−３４】図２５−１の続き。
【図２５−３５】図２５−１の続き。
【図２５−３６】図２５−１の続き。
【図２５−３７】図２５−１の続き。
【図２５−３８】図２５−１の続き。
【図２５−３９】図２５−１の続き。
【図２５−４０】図２５−１の続き。
【図２５−４１】図２５−１の続き。
【図２５−４２】図２５−１の続き。
【図２５−４３】図２５−１の続き。
【図２５−４４】図２５−１の続き。
【図２５−４５】図２５−１の続き。
【図２５−４６】図２５−１の続き。
【図２５−４７】図２５−１の続き。
【図２５−４８】図２５−１の続き。
【図２５−４９】図２５−１の続き。
【図２５−５０】図２５−１の続き。
【図２５−５１】図２５−１の続き。
【図２５−５２】図２５−１の続き。
【図２５−５３】図２５−１の続き。
【図２５−５４】図２５−１の続き。
【図２６】ｃ−ｋｉｔ ｄＡｂのエピトープ解析結果を示す。
【図２７】典型的なＢＩＡｃｏｒｅエピトープマッピング実験のＢＩＡｃｏｒｅ例を示すグラフであり、これらのエピトープは、市販の抗体２Ｂ８および４５５２（ダミーの骨組みＭａｂ中のＤＯＭ２８ｍ−１０７）に対して重複はない。
【図２８】典型的なＢＩＡｃｏｒｅエピトープマッピング実験のＢＩＡｃｏｒｅ例を示すグラフであり、これらのエピトープは、ダミーの骨組みＭａｂ４５０５（ＤＯＭ２８ｍ−７）および４５０３（ＤＯＭ２８ｈ−９４）に対して部分的に重複している。
【図２９】１０％マウス血清中の二重特異性ｍＡｂ−ｄＡｂ、対照分子およびＤＯＭ２８ｈ−９４親和性成熟クローンの比較を示すグラフである。
【図３０】細胞表面染色、細胞表面および細胞内の染色ならびに細胞内染色パターンを例証する写真である。
【図３１−１】本明細書で同定した配列の一覧表である。
【図３１−２】図３１−１の続き。
【図３１−３】図３１−１の続き。
【図３１−４】図３１−１の続き。
【図３１−５】図３１−１の続き。
【図３１−６】図３１−１の続き。
【図３１−７】図３１−１の続き。
【図３１−８】図３１−１の続き。
【発明を実施するための形態】
【００７７】
本明細書中、明瞭で簡潔な明細書を書くことができる方法で、本発明を実施形態に関して記載した。実施形態は、本発明から逸脱することなく様々に組み合わせられるか、または分けられ得ることを意図し、そのように理解されるべきである。
特に定義されない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、一般に、（例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技術および生化学の分野の）当業者が理解するのと同じ意味を有する。分子法、遺伝子法および生化学法（一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ.,Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ,２ｄ  ｅｄ.（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ,Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ,Ｎ.Ｙ.およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ.,Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９９９）４ｔｈＥｄ,Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ.参照。これは参照により本明細書に組込まれる）ならびに化学法については、標準的な技術を用いる。
【００７８】
命名法および略語
本明細書で使用する命名法および略語には、以下のものが含まれる。モノクローナル抗体（ＭＡｂ、ｍＡｂ）；複数のモノクローナル抗体（複数のｍＡｂ）；ドメイン抗体（ｄＡｂ）；複数のドメイン抗体（複数のｄＡｂ）；重鎖（Ｈ鎖）；軽鎖（Ｌ鎖）；Ｈ鎖可変領域（ＶＨ）；軽鎖可変領域（ＶＬ）；κ鎖可変領域（Ｖκ）；ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域１（ＣＨ１）；ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域２（ＣＨ２）；ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域３（ＣＨ３）；軽鎖／κ軽鎖定常領域（ＣＬ/ＣΚ）；および相補性決定領域（ＣＤＲ）−重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲＨ）；軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲＬ）；相補性決定領域１、２、３（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）。
【００７９】
標的組織および組織特異的マーカー分子
適切な標的組織には、心筋および骨格筋を含む筋肉組織、上皮組織、皮膚、結合組織、肝組織、神経組織、心臓（ｈｅａｒｔ）組織または心臓（ｃａｒｄｉａｃ）組織ならびに関節組織が含まれる。これらの組織の各々に対する組織特異的マーカーは当業者に知られている。一実施形態において、組織特異的マーカーには、炎症、瘢痕組織の成分のマーカー類、または心筋を含む筋肉組織、上皮組織、皮膚、結合組織、肝組織、神経組織、心臓組織および関節組織などの組織に特異的なマーカー類が含まれる。一実施形態において、本発明は、心筋組織を含む心臓組織、線維芽細胞、冠血管系および（間質腔または基底膜の中の）タンパク質類へ幹細胞を標的化するための組成物および方法を提供する。
【００８０】
筋肉特異的マーカー分子：ミオシン
ミオシンは、筋肉サルコメアに見られるモータータンパク質の巨大ファミリーであり、アクチンベースの運動性に関与する。ミオシン分子は、３次元構造において、重鎖および軽鎖が結合した形で構成される。（例えば、米国特許第５，７０２，９０５号に記載されているとおり）筋肉細胞中の軽鎖分子の細胞質前駆物質プールについて記載されており、例えば、心筋の損傷の際に、これらは血液循環の中に漏出すると考えられている。
【００８１】
筋肉中、ミオシン分子中のミオシン軽鎖（ＭＬＣ）はペアで見つけられる。心臓および骨格のＭＬＣは免疫学的に異なる。心臓のＭＬＣは、（例えば、Ｌｙｎ ｅｔ ａｌ.Ｐｈｙｓｉｏｌ.Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２０００；２：９３−１００；Ｍａｉｒ ｅｔ ａｌ.Ｃｌｉｎ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ １９９４；２２９：１５３−１５９およびＫｈａｗ ｅｔ ａｌ.Ｊ Ｃｌｉｎ.Ｉｎｖｅｓｔ.１９７６；５８：４３９−４４６に記載されているとおり）心筋および心筋梗塞に存在する。組織膜が心筋梗塞に損傷を与える時、ＭＬＣは抗ＭＬＣ抗体に接近しやすくなる。ミオシン軽鎖には、ＭＬＣ−１、ＭＬＣ−２、ＭＹＬ、ＭＹＬ−２／３、ヒト心室ミオシン軽鎖（ｖＭＬＣ）、ｖＭＬＣ−１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号Ｐ０８５９０）が含まれる。米国特許第５，７０２，９０５号は、ミオシン軽鎖の心臓のアイソフォームに高い親和性を有するヒト心室ミオシン軽鎖に対するマウスモノクローナル抗体について記載している。（ＭＬＣ−１、ＭＬＣ−３とも知られる）ｖＭＬＣは、心筋、骨格筋、血管平滑筋、臍動脈平滑筋細胞、ならびに筋組織、腎臓、結腸、輸卵管、直腸、精嚢、前立腺、皮膚、腸管内皮、膵臓、脂肪組織、網膜内皮細胞、膀胱上皮で発現する。例えば、Ｂｉｃｅｒ ａｎｄ Ｒｅｉｓｅｒ,Ｊ Ｍｕｓｃｌｅ Ｒｅｓ Ｃｅｌｌ Ｍｏｔｉｌ.２００４：２５（８）：６２３−３３参照。
【００８２】
本明細書で使用する「ＭＬＣ」には、ＭＬＣの一部または断片も含まれる。ＭＬＣには、天然に存在する、すなわち内在性の哺乳類ＭＬＣタンパク質、（天然に存在する、すなわち内在性の対応する哺乳類ＭＬＣタンパク質のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有する）タンパク質（（すなわち、有機合成化学の方法を用いて産生された）例えば、組換えタンパク質、合成タンパク質）が含まれる。したがって、本明細書で定義するとおり、この用語には、成熟ＭＬＣタンパク質、多型変異体または対立遺伝子変異体、およびＭＬＣの他のアイソフォーム、ならびにＭＬＣの修飾（例えば、脂質付加された、グリコシル化された）型もしくは非修飾型が含まれる。
【００８３】
幹細胞特異的マーカー分子
幹細胞特異的マーカー分子には、幹細胞上で発現するマーカー分子が含まれる。かかる分子には、ＣＤ３０、ネスチン、Ｓｔｒｏ−１、ＰＳＡ−ＮＣａｍ、ｐ７５、ニューロトロフィン、ＣＤ３４、Ｓｃａ−１、ＡＢＣＧ２、ＣＤ１３３およびｃ−Ｋｉｔが含まれる。（ＣＤ１１７およびＳＣＦＲ（幹細胞因子受容体）とも称される；ヒトｃ−Ｋｉｔについては、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ記録番号Ｐ１０７２１に記載されている）ｃ−Ｋｉｔは、細胞および膜に結合しているチロシンキナーゼ受容体である。幹細胞因子（ＳＣＦ）は、ｃ−Ｋｉｔへの結合を介してシグナル伝達をする糖タンパク質であり、このシグナル伝達経路は造血において重要な役割を担い、多くの場合、他のサイトカインとの相乗作用で、正負両方の制御因子として作用する。可溶性のｓｈｅｄ  ｃ−Ｋｉｔ受容体は、ＳＣＦを制御する重要な役割を果たし得る。一実施形態において、幹細胞特異的マーカー分子に結合する薬剤は、ＳＣＦなどの受容体結合タンパク質または増殖因子であり得る。
【００８４】
（ｃ−ＫＩＴ、ｃＫＩＴ、ｃ−ｋｉｔ、ｃｋｉｔ、ｃＫｉｔとも称される）ｃ−Ｋｉｔは、リンパおよび赤血球の系統に属する成熟細胞の前駆体である多能性造血幹細胞上で発現する。骨髄由来の幹細胞および前駆細胞、心臓の幹細胞におけるｃ−Ｋｉｔの発現、ならびにこれらの細胞の役割については、例えば、Ｆａｚｅｌ ｅｔ ａｌ.Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ,１１６（２００６）,７,１８６５−１８７６に記載されている。ｃ−Ｋｉｔは、幹細胞集団のかなりの部分で見られる初期の幹細胞マーカーであり、循環している白血球細胞の約１％で発現している。ｃ−Ｋｉｔを発現している細胞は、心筋細胞型および血管細胞型の両方を生じることが示されている。さらに、動物モデルにｃ−Ｋｉｔが存在しないと、ＭＩ後の心臓修復に機能障害を引き起こすことは、これらの細胞が心血管の再生に重要な役割を果たすことを示唆する。ｃ−Ｋｉｔ＋細胞は骨髄で見られ、その後、傷害後または動員薬の投与後に、血流に動員される（例えば、Ｂｅａｒｚｉ ｅｔ ａｌ.ＰＮＡＳ（２００７）１０４；３５；１４０６８−１４０７３に概説されている）。
【００８５】
本明細書で使用する「ｃ−Ｋｉｔ」には、ｃ−Ｋｉｔの一部または断片も含まれる。ｃ−Ｋｉｔには、天然に存在する、すなわち内在性の哺乳類ｃ−Ｋｉｔタンパク質、（天然に存在する、すなわち内在性の対応する哺乳類ｃ−Ｋｉｔタンパク質のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有する）タンパク質（（すなわち、有機合成化学の方法を用いて産生された）例えば、組換えタンパク質、合成タンパク質）が含まれる。したがって、本明細書で定義するとおり、この用語には、成熟ｃ−Ｋｉｔタンパク質、多型変異体または対立遺伝子変異体、およびｃ−Ｋｉｔの他のアイソフォーム、ならびにｃ−Ｋｉｔの修飾（例えば、脂質付加された、グリコシル化された）型もしくは非修飾型が含まれる。使用する哺乳類ｃ−Ｋｉｔには、（ｒｃ−Ｋｉｔ、ｒｃＫＩＴ、ｒｃ−ｋｉｔとも称される）ラットｃ−Ｋｉｔおよび（ｍｃＫＩＴ、ｍｃ−Ｋｉｔ、ｍｃ−ｋｉｔとも称される）マウス（ｍｏｕｓｅ）／マウス（ｍｕｒｉｎｅ）ｃ−Ｋｉｔが含まれる。
【００８６】
免疫グロブリン
本明細書で使用する「免疫グロブリン」とは、２つのβシート、および、通常、保存ジスルフィド結合を含む抗体分子の免疫グロブリン折り畳み特性を保持するポリペプチドのファミリーを表す。
【００８７】
ドメイン
本明細書で使用する「ドメイン」とは、タンパク質の残りの部分とは無関係に、その３次構造を保持する折り畳まれたタンパク質構造を表す。一般に、ドメインは、タンパク質の別々の機能特性に関与し、多くの場合、そのタンパク質の残部および／またはそのドメインの機能を喪失することなく、付加されるか、除去されるか、または他のタンパク質に移され得る。
【００８８】
免疫グロブリン単一可変ドメイン
「免疫グロブリン単一可変ドメイン」もしくは単一抗体可変ドメインという語句は、異なるＶ領域もしくはドメインまたは他のＶ領域もしくはドメインとは関係なく、抗原もしくはエピトープに特異的に結合する抗体可変ドメイン（ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ）または抗体結合ドメインを表す。かかる「免疫グロブリン単一可変ドメイン」は、抗体可変ドメインの配列特性を含む折り畳まれたポリペプチドドメインである。それゆえに、免疫グロブリン単一可変ドメインは、完全な抗体可変ドメインおよび修飾された可変ドメインを含み、例えば、そのドメイン内で、１個以上のループは、抗体可変ドメイン、切断された抗体可変ドメイン、またはＮ末端伸長もしくはＣ末端伸長を含む抗体可変ドメイン、ならびに少なくとも部分的に、その全長ドメインの結合活性および結合特異性を保持する可変ドメインの折り畳まれた断片の特性を示さない配列によって置き換えられている。免疫グロブリン単一可変ドメインは他の可変領域または可変ドメインを有する形式（例えば、ホモ多量体もしくはヘテロ多量体）で存在することができ、この他の領域もしくはドメインは、単一免疫グロブリン可変ドメインによる抗原結合に必要とされない（すなわち、この免疫グロブリン単一可変ドメイン、追加の可変ドメインとは関係なく抗原に結合する。「ドメイン抗体」または「ｄＡｂ」は、本明細書で使用する「免疫グロブリン単一可変ドメイン」である。「単一抗体可変ドメイン」または「抗体単一可変ドメイン」は、本明細書で使用する「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と同じである。一実施形態において、免疫グロブリン単一可変ドメインはヒト抗体可変ドメインであるが、げっ歯類などの他の種の単一抗体可変ドメイン（例えば、国際特許ＷＯ００／２９００４に開示され、この内容は、参照により、その全体が本明細書に組込まれる）、テンジクザメおよびラクダ科の動物のＶＨＨ ｄＡｂも含む。ラクダ科の動物のＶＨＨは、ラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダ、およびグアナコを含む種に由来する免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドであり、これは、生来、軽鎖を欠く重鎖抗体を生成する。ＶＨＨはヒト化され得る。
【００８９】
本発明の全ての態様において、このまたは各々の免疫グロブリン単一可変ドメインは、抗体の重鎖単一可変ドメインならびに軽鎖単一可変ドメイン、例えば、ＶＨ、ＶＬおよびＶＨＨから独立して選択される。
【００９０】
抗体
本明細書で使用する「抗体」とは、生来、抗体を産生する任意の種に由来するか、または組換えＤＮＡ技術によって作られる、例えば、血清、Ｂ細胞、ハイブリドーマ、トランスフェクトーマ、酵母もしくは細菌から単離されるＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥもしくは（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’)２、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、ｓｃＦｖ、閉構造の多特異性抗体、ジスルフィド結合ｓｃＦｖ、２重特異性抗体などの）断片を表す。
【００９１】
抗体型
一実施形態において、本発明による抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチドまたはリガンドは、任意の抗体型で提供され得る。本明細書で使用する「抗体型」とは、任意の適切なポリペプチド構造を表し、その中で、その構造上の抗原に対して結合特異性を与えるために、１個以上の抗体可変ドメインが組込まれ得る。キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、一本鎖抗体、２重特異性抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体の重鎖および／または軽鎖のホモダイマーならびに抗体の重鎖および／または軽鎖のヘテロダイマー、前述のいずれかの抗原結合断片（例えば、Ｆｖ断片（例えば、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ）、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片）、単一抗体可変ドメイン（例えば、ｄＡｂ、ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ）、ならびに前述のいずれかの修飾型（例えば、ポリエチレングリコールもしくは他の適切なポリマーの共有結合によって修飾された型またはヒト化ＶＨＨ）などの様々な適切な抗体型が当業で知られている。一実施形態において、別の抗体型には別の骨組みが含まれ、本発明による任意の分子のＣＤＲを、ａｆｆｉｂｏｄｙ、ＳｐＡ骨格、ＬＤＬ受容体クラスＡドメイン、ａｖｉｍｅｒ（例えば、米国特許出願公開第２００５／００５３９７３号、同第２００５／００８９９３２号、同第２００５／０１６４３０１号参照）またはＥＧＦドメインなどのタンパク質の適切な骨組みもしくは骨格上に結合することができる。さらに、本明細書に記載のリガンドは、二価（ヘテロ二価）または多価（ヘテロ多価）であり得る。他の実施形態において、本明細書で使用され得る「普遍的なフレームワーク」は、Ｋａｂａｔによって定義される、配列内に保存されている抗体の領域に対応する単一抗体フレームワーク配列（「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、米国保健福祉省）またはＣｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ,（１９８７）Ｊ.Ｍｏｌ.Ｂｉｏｌ.１９６：９１０−９１７で定義されるヒト生殖系列の免疫グロブリンのレパートリーもしくは構造に対応する単一抗体フレームワーク配列を表す。本発明は、超可変領域のみにおける変異を介して実質的に任意の結合特異性の誘導を可能にすることが判明している単一フレームワーク、または一連のかかるフレームワークの使用を提供する。
【００９２】
必要に応じて、「抗体」は、各々独立して、ペプチド部分、ポリペプチド部分、タンパク質部分または非ペプチド部分（例えば、ポリアルキレングリコール、脂質、炭水化物）であり得る１つ以上の追加の部分をさらに含むことができる。例えば、このリガンドは、半減期を延長した部分（例えば、ポリアルキレングリコール部分、アルブミンを含む部分、アルブミン断片またはアルブミン変異体、トランスフェリンを含む部分、トランスフェリン断片またはトランスフェリン変異体、アルブミンに結合する部分、新生児のＦｃ受容体に結合する部分）をさらに含むことができる。適切な半減期を延長した部分については、例えば、国際特許ＷＯ２００８０９６１５８に記載されている。別の方法は、例えば、欧州特許ＥＰ１５１７９２１、国際特許ＷＯ０３００２６０９、ＷＯ０４００３０１９、ＷＯ２００８０９６１５８、ＷＯ０４０５８８２１およびＷＯ２００７０８０３９２に記載されるとおり、血清アルブミンなどのペプチド部分、ポリペプチド部分もしくはタンパク質部分に結合する抗体または免疫グロブリン単一可変ドメインなどの追加の結合部分を含む。血清アルブミンに結合する適切なラクダ科の動物のＶＨＨには、国際特許２００４０４１８６２（Ａｂｌｙｎｘ Ｎ.Ｖ.）およびＷＯ２００７０８０３９２で開示されているＶＨＨが含まれる。
【００９３】
免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、リガンド、融合タンパク質などに関して「抗ＭＬＣ」または「抗ｃ−Ｋｉｔ」とは、ＭＬＣまたはｃ−Ｋｉｔを認識し、結合する部分を意味する。特に、「抗ＭＬＣ」の言及は、ｖＭＬＣ−１などを含む任意のＭＬＣ変異体に結合する部分を包含する。
【００９４】
エピトープ
「エピトープ」は、通常、免疫グロブリンＶＨ／ＶＬ対によって結合される構造のユニットである。エピトープは、抗体に対する最小結合部位を規定するため、抗体の特異性のある標的を表す。単一ドメイン抗体の場合、エピトープは、孤立した可変ドメインにより結合される構造のユニットを表す
エピトープ結合ドメイン
「エピトープ結合ドメイン」という用語は、異なるＶ領域もしくはドメインとは無関係に、抗原またはエピトープに特異的に結合するドメインを表し、これはドメイン抗体（ｄＡｂ）、例えば、ヒト、ラクダ科の動物またはサメの免疫グロブリン単一可変ドメインであってもよく、またはＣＴＬＡ−４（Ｅｖｉｂｏｄｙ）；リポカリン；タンパク質ＡのＺ−ドメイン（Ａｆｆｉｂｏｄｙ、ＳｐＡ）、Ａ−ドメイン（Ａｖｉｍｅｒ／Ｍａｘｉｂｏｄｙ）などのタンパク質Ａ由来の分子；ＧｒｏＥｌおよびＧｒｏＥＳなどの熱ショックタンパク質；トランスフェリン（ｔｒａｎｓ−ｂｏｄｙ）；アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）；ペプチドアプタマー；Ｃ−タイプレクチンドメイン（テトラネクチン）；ヒトγ−クリスタリンおよびヒトユビキチン（アフィリン（ａｆｆｉｌｉｎ））；ＰＤＺドメイン；ヒトプロテアーゼ阻害剤のスコーピオントキシンクニッツ（ｓｃｏｒｐｉｏｎ ｔｏｘｉｎｋｕｎｉｔｚ）型ドメイン；ならびにフィブロネクチン（アドネクチン（ａｄｎｅｃｔｉｎ））からなる群から選択される骨組みの誘導体であるドメインであってもよく、天然リガンド以外のリガンドへの結合を獲得するためにタンパク質工学処理されたドメインであってもよい。
【００９５】
結合
結合は解離定数（Ｋｄ）によって示される。抗原またはエピトープへの抗原結合タンパク質の特異的結合は、例えば、スキャッチャード（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ）分析および／または競合結合アッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、（ＥＬＩＳＡなどの）酵素免疫測定法およびサンドイッチ競合アッセイ）、ならびにそれらの異なる変形を含む適切なアッセイによって測定することができる。
【００９６】
結合親和性
結合親和性を、任意に、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、およびＢｉａｃｏｒｅシステム（Ｕｐｐｓａｌａ,Ｓｗｅｄｅｎ）を用いたＢｉａｃｏｒｅ（Ｋａｒｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ.,１９９１）を用いて測定する。このＢｉａｃｏｒｅシステムは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ、Ｗｅｌｆｏｒｄ Ｋ.１９９１,Ｏｐｔ.Ｑｕａｎｔ.Ｅｌｅｃｔ.２３：１；Ｍｏｒｔｏｎ Ａｎｄ Ｍｙｓｚｋａ,１９９８,Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２９５：２６８）を用いて、リアルタイムに生体分子の相互作用を観察し、表面プラズモン共鳴を用いて、ガラス支持体上の薄い金膜の表面で、最高で３００ｎｍまで離れたその表面の屈折率の変化の結果として光の共鳴角の変化を検出することができる。Ｂｉａｃｏｒｅ分析により、会合速度定数、解離速度定数、平衡解離定数、および親和性定数が都合よく得られる。結合親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴システム（Ｂｉａｃｏｒｅ,Ｉｎｃ.）を用いて、会合速度定数および解離速度定数を評価することによって得られる。製造業者（Ｂｉａｃｏｒｅ）の取扱説明書に従って、目的物の共有結合に対してバイオセンサーチップを活性化する。その後、この目的物を希釈し、このチップ上に注入し、固定した物質の反応単位のシグナルを得る。この共鳴単位（ＲＵ）のシグナルは、固定した物質の質量に比例し、これは、このマトリックス上に固定された目的物の様々な範囲の密度を表す。解離データを一部位モデル（ｏｎｅ−ｓｉｔｅ ｍｏｄｅｌ）に当てはめ、ｋｏｆｆ＋／−ｓ．ｄ．（測定値の標準偏差）を得る。偽一次速度定数（Ｋｄ’ｓ）を各結合曲線について計算し、タンパク質濃度の関数としてプロットし、ｋｏｎ＋／−ｓ．ｅ．（当てはめた値の標準誤差）を得る。結合の平衡解離定数Ｋｄを、ＳＰＲ測定値からｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算する。
【００９７】
ＣＤＲ
本明細書に記載の抗原結合タンパク質、抗体および免疫グロブリン単一可変ドメイン（ｄＡｂ）は、相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）を含む。ＣＤＲおよびフレームワーク（ＦＲ）領域の位置ならびにナンバリングシステムは、Ｋａｂａｔら（Ｋａｂａｔ,Ｅ.Ａ.ｅｔ ａｌ.,Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ,Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ,Ｕ.Ｓ.Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ,Ｕ.Ｓ.Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｏｆｆｉｃｅ（１９９１））によって定義されている。本明細書に開示するｄＡｂのＶＨ（ＣＤＲＨ１など）およびＶＬ（ＣＤＲＬ１など）（Ｖκ）のＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）のアミノ酸配列は、公知のＫａｂａｔアミノ酸ナンバリングシステムおよびＣＤＲの定義に基づいて、当業者に用意に明らかになる。配列変異性に基づいて、最も一般的に使用されている方法であるＫａｂａｔナンバリングシステムに従って、重鎖ＣＤＲ−Ｈ３の長さは変動し、挿入は、残基Ｈ１００とＨ１０1の間にＫまでの文字で番号が付けられる（すなわち、Ｈ１００、Ｈ１００Ａ．．．Ｈ１００Ｋ、Ｈ１０１）。もうひとつの方法として、（構造のループ領域の位置に基づく）Ｃｈｏｔｈｉａのシステム（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ.,（１９８９）Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎｓ；Ｎａｔｕｒｅ ３４２,ｐ８７７−８８３）を用いて、以下のようなＡｂＭ（ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａ間の妥協）または（結晶構造および抗原との接触残基の予測に基づく）接触法に従って、ＣＤＲを決定することができる。ＣＤＲを決定するための適切な方法については、ｈｔｔｐ：//ｗｗｗ.ｂｉｏｉｎｆ.ｏｒｇ.ｕｋ/ａｂｓ/を参照されたい。
【００９８】
一度、各残基に番号を付けると、以下のＣＤＲ定義を適用することができる：
Ｋａｂａｔ：
ＣＤＲ Ｈ１：３１〜３５／３５Ａ／３５Ｂ
ＣＤＲ Ｈ２：５０〜６５
ＣＤＲ Ｈ３：９５〜１０２
ＣＤＲ Ｌ１：２４〜３４
ＣＤＲ Ｌ２：５０〜５６
ＣＤＲ Ｌ３：８９〜９７
Ｃｈｏｔｈｉａ：
ＣＤＲ Ｈ１：２６〜３２
ＣＤＲ Ｈ２：５２〜５６
ＣＤＲ Ｈ３：９５〜１０２
ＣＤＲ Ｌ１：２４〜３４
ＣＤＲ Ｌ２：５０〜５６
ＣＤＲ Ｌ３：８９〜９７
ＡｂＭ：
（Ｋａｂａｔナンバリングを用いる）→（Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングを用いる）
ＣＤＲ Ｈ１：２６〜３５／３５Ａ／３５Ｂ→２６〜３５
ＣＤＲ Ｈ２：５０〜５８
ＣＤＲ Ｈ３：９５〜１０２
ＣＤＲ Ｌ１：２４〜３４
ＣＤＲ Ｌ２：５０〜５６
ＣＤＲ Ｌ３：８９〜９７
接触法：
（Ｋａｂａｔナンバリングを用いる）→（Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングを用いる）
ＣＤＲ Ｈ１：３０〜３５／３５Ａ／３５Ｂ→３０〜３５
ＣＤＲ Ｈ２：４７〜５８
ＣＤＲ Ｈ３：９３〜１０１
ＣＤＲ Ｌ１：３０〜３６
ＣＤＲ Ｌ２：４６〜５５
ＣＤＲ Ｌ３：８９〜９６
（「〜」は、Ｋａｂａｔと同じナンバリングを意味する）。
【００９９】
競合：
本明細書で言及する「競合する」という用語は、第一の標的物（例えば、ｃ−Ｋｉｔ）のその同族標的結合ドメイン（例えば、免疫グロブリン単一可変ドメイン）への結合を、前記同族標的物に特異的な第２の結合ドメイン（例えば、免疫グロブリン単一可変ドメイン）の存在下で阻害することを意味する。例えば、結合を、結合ドメインの物理的遮断によって、または結合ドメインの構造もしくは環境の変化によって立体的に阻害してもよく、その結果、標的物に対するその親和性または結合活性が減少する。第１および第２の結合ドメイン間の競合を測定する競合ＥＬＩＳＡ実験および競合ＢＩＡＣｏｒｅ実験を行う方法についての詳細は、国際特許ＷＯ２００６０３８０２７を参照されたい。これらの詳細は、参照により本明細書に組込まれ、本発明で使用するために明確な開示を提供する。
【０１００】
ｄＡｂとＩｇＧの結合
本発明で使用するドメイン抗体を、通常のＩｇＧの重鎖および／または軽鎖のＣ末端で結合することができる。さらに、いくつかのｄＡｂは、通常の抗体の重鎖および軽鎖の両方のＣ末端に結合することができる。
【０１０１】
ｄＡｂのＮ末端が、（ＣＨ３またはＣＬのいずれか一方の）抗体定常ドメインに融合しているコンストラクトにおいて、ペプチドリンカーはこのｄＡｂが抗原に結合するのに役立ち得る。実際、ｄＡｂのＮ末端は、抗原結合活性に関与する複数の相補性決定領域（ＣＤＲＳ）の近くに位置する。それゆえに、短いペプチドリンカーは、エピトープ結合ドメインとタンパク質の骨組みの定常ドメインとの間のスペーサーとして機能を果たし、これは、これらのｄＡｂ  ＣＤＲがより容易に抗原に達することを可能にし得、それゆえに、高い親和性で結合し得る。
【０１０２】
ｄＡｂがこのＩｇＧに結合する環境は、ｄＡｂが融合している抗体鎖によって異なる。
【０１０３】
ＩｇＧ骨格の抗体軽鎖のＣ末端に融合する時、各ｄＡｂは抗体ヒンジおよびＦｃ部分の近くに位置すると期待される。かかるｄＡｂは、互いに離れて位置すると思われる。従来の抗体において、Ｆａｂ断片間の角度および各Ｆａｂ断片とＦｃ部分との間の角度は、非常に著しく変えることができる。ｍＡｂｄＡｂでは、Ｆａｂ断片間の角度は大いに異ならないが、各Ｆａｂ断片と各Ｆｃ部分との間の角度では、いくぶんかの角度制限が観察され得るようである。
【０１０４】
ＩｇＧ骨格の抗体重鎖のＣ末端に融合する時、各ｄＡｂは、Ｆｃ部分のＣＨ３ドメインの近くに位置すると期待される。これらの受容体は、（受容体のＦｃγＲＩ、ＩＩおよびＩＩＩのクラスの）ＣＨ２ドメインに結合するか、または（例えば、ＦｃＲｎ受容体）ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとの間のヒンジに結合するので、各ｄＡｂが、Ｆｃ受容体（例えば、ＦｃγＲＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＦｃＲｎ）へのＦｃ結合特性に影響をあたえることは期待されない。かかる抗原結合コンストラクトの別の特徴は、両方のｄＡｂが互いに空間的に近いことが期待され、ただし、可動性は適切なリンカーの提供によってもたらされ、これらのｄＡｂはホモ２量体の種類をさらに形成し得、それゆえに、Ｆｃ部分の「ジッパーで止めたような（ｚｉｐｐｅｄ）」４次構造を増やし、このコンストラクトの安定性を高め得る。
【０１０５】
このような構造を考えることは、エピトープ結合ドメイン、例えば、ｄＡｂをタンパク質の骨組み、例えば、抗体上へ結合させるのに最も適した位置の選択に役立ち得る。
【０１０６】
リンカー
本発明のタンパク質の骨組みを、リンカーを使用することによってエピトープ結合ドメインに結合してもよい。適切なリンカーの例として、長さが１アミノ酸〜１５０アミノ酸、１アミノ酸〜１４０アミノ酸、１アミノ酸〜１３０アミノ酸、１アミノ酸〜１２０アミノ酸、１アミノ酸〜８０アミノ酸、１アミノ酸〜５０アミノ酸、１アミノ酸〜２０アミノ酸、１アミノ酸〜１０アミノ酸、または５アミノ酸〜１８アミノ酸であり得るアミノ酸配列が挙げられる。かかる配列は配列独自の３次構造を有し得、例えば、本発明のリンカーは単一可変ドメインを含み得る。一実施形態におけるリンカーのサイズは、単一可変ドメインと等しい。適切なリンカーは１〜２０オングストローム、例えば、１５オングストローム未満、１０オングストローム未満、または５オングストローム未満のサイズであり得る。
【０１０７】
本発明の一実施形態において、このエピトープ結合ドメインの少なくとも１つを、１〜１５０アミノ酸、例えば、１〜２０アミノ酸、例えば、１〜１０アミノ酸を含むリンカーで直接Ｉｇ骨格に取り付ける。
【０１０８】
かかるリンカーは、配列番号３〜８に示すリンカーの任意の１つから選択され得、例えば、このリンカーは「ＴＶＡＡＰＳ」であってもよく、もしくは「ＧＧＧＧＳ」またはかかるリンカー類の複数型であってもよい。本発明の抗原結合タンパク質に使用するリンカーは、ＧＳ残基、例えば、「ＧＳＴＶＡＡＰＳ」（配列番号１０２）、「ＴＶＡＡＰＳＧＳ」（配列番号１０３）、「ＧＳＴＶＡＡＰＳＧＳ」（配列番号１０４）、またはかかるリンカー類の複数型のうちの１個以上のセットを、単独でまたは他のリンカーに加えて含んでもよい。一実施形態において、このエピトープ結合ドメインを、リンカー「（ＰＡＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ」によってＩｇ骨格に結合する。別の実施形態において、このエピトープ結合ドメインを、リンカー「（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ」によってＩｇ骨格に結合する。別の実施形態において、このエピトープ結合ドメインを、リンカー「（ＴＶＡＡＰＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ」によってＩｇ骨格に結合する。別の実施形態において、このエピトープ結合ドメインを、リンカー「（ＧＳ）ｍ（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）ｎ」によってＩｇ骨格に結合する。別の実施形態において、このエピトープ結合ドメインを、リンカー「（ＧＳ）ｍ（ＴＶＡＡＰＳ）ｐ（ＧＳ）ｍ」によってＩｇ骨格に結合する。別の実施形態において、このエピトープ結合ドメインを、リンカー「（ＰＡＶＰＰＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ」によってＩｇ骨格に結合する。別の実施形態において、このエピトープ結合ドメインを、リンカー「（ＴＶＳＤＶＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ」によってＩｇ骨格に結合する。別の実施形態において、このエピトープ結合ドメインを、リンカー「（ＴＧＬＤＳＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ」によってＩｇ骨格に結合する。全てのかかる実施形態において、ｎ＝１〜１０、ｍ＝０〜４およびｐ＝２〜１０である。
【０１０９】
かかるリンカーの例として、（ＰＡＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ（式中、ｎ＝１およびｍ＝１）、（ＰＡＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ（式中、ｎ＝２およびｍ＝１）、（ＰＡＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ（式中、ｎ＝３およびｍ＝１）、（ＰＡＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ（式中、ｎ＝４およびｍ＝１）、（ＰＡＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ（式中、ｎ＝２およびｍ＝０）、（ＰＡＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ（式中、ｎ＝３およびｍ＝０）、（ＰＡＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ（式中、ｎ＝４およびｍ＝０）が挙げられる。
【０１１０】
かかるリンカーの例として、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ（式中、ｎ＝１およびｍ＝１）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ（式中、ｎ＝２およびｍ＝１）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ（式中、ｎ＝３およびｍ＝１）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ（式中、ｎ＝４およびｍ＝１）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ（式中、ｎ＝２およびｍ＝０）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ（式中、ｎ＝３およびｍ＝０）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ（式中、ｎ＝４およびｍ＝０）が挙げられる。
【０１１１】
かかるリンカーの例として、（ＧＳ）ｍ（ＴＶＡＡＰＳ）ｐ（式中、ｐ＝１およびｍ＝１）、（ＧＳ）ｍ（ＴＶＡＡＰＳ）ｐ（式中、ｐ＝２およびｍ＝１）、（ＧＳ）ｍ（ＴＶＡＡＰＳ）ｐ（式中、ｐ＝３およびｍ＝１）、（ＧＳ）ｍ（ＴＶＡＡＰＳ）ｐ（式中、ｐ＝４およびｍ＝１）、（ＧＳ）ｍ（ＴＶＡＡＰＳ）ｐ（式中、ｐ＝５およびｍ＝１）、または（ＧＳ）ｍ（ＴＶＡＡＰＳ）ｐ（式中、ｐ＝６およびｍ＝１）が挙げられる。
【０１１２】
かかるリンカーの例として、（ＴＶＡＡＰＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ（式中、ｎ＝１およびｍ＝１）、（ＴＶＡＡＰＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ（式中、ｎ＝２およびｍ＝１）、（ＴＶＡＡＰＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ（式中、ｎ＝３およびｍ＝１）、（ＴＶＡＡＰＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ（式中、４＝１およびｍ＝１）、（ＴＶＡＡＰＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ（式中、ｎ＝２およびｍ＝０）、（ＴＶＡＡＰＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ（式中、ｎ＝３およびｍ＝０）、（ＴＶＡＡＰＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ（式中、ｎ＝４およびｍ＝０）が挙げられる。
【０１１３】
かかるリンカーの例として、（ＧＳ）ｍ（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）ｎ（式中、ｎ＝１およびｍ＝１）、（ＧＳ）ｍ（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）ｎ（式中、ｎ＝２およびｍ＝１）、（ＧＳ）ｍ（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）ｎ（式中、ｎ＝３およびｍ＝１）、（ＧＳ）ｍ（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）ｎ（式中、ｎ＝４およびｍ＝１）、（ＧＳ）ｍ（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）ｎ（式中、ｎ＝５およびｍ＝１）、（ＧＳ）ｍ（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）ｎ（式中、ｎ＝６およびｍ＝１）、（ＧＳ）ｍ（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）ｎ（式中、ｎ＝１およびｍ＝０）、（ＧＳ）ｍ（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）ｎ（式中、ｎ＝２およびｍ＝１０）、（ＧＳ）ｍ（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）ｎ（式中、ｎ＝３およびｍ＝０）、または（ＧＳ）ｍ（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）ｎ（式中、ｎ＝０）が挙げられる。
【０１１４】
かかるリンカーの例として、（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）ｐ（ＧＳ）ｍ（式中、ｐ＝２およびｍ＝１）、（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）ｐ（ＧＳ）ｍ（式中、ｐ＝３およびｍ＝１）、（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）ｐ（ＧＳ）ｍ（式中、ｐ＝４およびｍ＝１）、（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）ｐ（ＧＳ）ｍ（式中、ｐ＝２およびｍ＝０）、（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）ｐ（ＧＳ）ｍ（式中、ｐ＝３およびｍ＝０）、（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）ｐ（ＧＳ）ｍ（式中、ｐ＝４およびｍ＝０）が挙げられる。
【０１１５】
かかるリンカーの例として、（ＰＡＶＰＰＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ（式中、ｎ＝１およびｍ＝１）、（ＰＡＶＰＰＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ（式中、ｎ＝２およびｍ＝１）（配列番号６５）、（ＰＡＶＰＰＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ（式中、ｎ＝３およびｍ＝１）、（ＰＡＶＰＰＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ（式中、ｎ＝４およびｍ＝１）、（ＰＡＶＰＰＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ（式中、ｎ＝２およびｍ＝０）、（ＰＡＶＰＰＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ（式中、ｎ＝３およびｍ＝０）、（ＰＡＶＰＰＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ（式中、ｎ＝４およびｍ＝０）が挙げられる。
【０１１６】
かかるリンカーの例として、（ＴＶＳＤＶＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ（式中、ｎ＝１およびｍ＝１）（配列番号６７）、（ＴＶＳＤＶＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ（式中、ｎ＝２およびｍ＝１）、（ＴＶＳＤＶＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ（式中、ｎ＝３およびｍ＝１）、（ＴＶＳＤＶＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ（式中、ｎ＝４およびｍ＝１）、（ＴＶＳＤＶＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ（式中、ｎ＝２およびｍ＝０）、（ＴＶＳＤＶＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ（式中、ｎ＝３およびｍ＝０）、（ＴＶＳＤＶＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ（式中、ｎ＝４およびｍ＝０）が挙げられる。
【０１１７】
かかるリンカーの例として、（ＴＧＬＤＳＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ（式中、ｎ＝１およびｍ＝１）、（ＴＧＬＤＳＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ（式中、ｎ＝２およびｍ＝１）、（ＴＧＬＤＳＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ（式中、ｎ＝３およびｍ＝１）、（ＴＧＬＤＳＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ（式中、ｎ＝４およびｍ＝１）、（ＴＧＬＤＳＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ（式中、ｎ＝２およびｍ＝０）、（ＴＧＬＤＳＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ（式中、ｎ＝３およびｍ＝０）、（ＴＧＬＤＳＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ（式中、ｎ＝４およびｍ＝０）が挙げられる。
【０１１８】
別の実施形態において、このエピトープ結合ドメインとＩｇ骨格との間にリンカーはない。別の実施形態において、このエピトープ結合ドメインを、リンカー「ＴＶＡＡＰＳ」（配列番号８９）によってＩｇ骨格に結合する。別の実施形態において、このエピトープ結合ドメインを、リンカー「ＴＶＡＡＰＳＧＳ」（配列番号１０３）によってＩｇ骨格に結合する。別の実施形態において、このエピトープ結合ドメインを、リンカー「ＧＳ」（配列番号１０５）によってＩｇ骨格に結合する。別の実施形態において、このエピトープ結合ドメインを、リンカー「ＡＳＴＫＧＰＴ」（配列番号９１）によってＩｇ骨格に結合する。
【０１１９】
相同性
本明細書に開示する配列に似た配列または相同な配列（例えば、少なくとも約７０％の配列同一性）は、本発明の一部でもある。いくつかの実施形態において、アミノ酸レベルの配列同一性は、約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上であり得る。核酸レベルの配列同一性は、約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上であり得る。あるいは、実質的な同一性は、この核酸断片が、選択的なハイブリダイゼーション条件（例えば、非常に高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件）下でその相補鎖にハイブリダイズする時に存在する。この核酸は、全細胞中に、細胞可溶化物中に、または部分精製形態もしくは十分に純粋な形態で存在する。
【０１２０】
本明細書で使用する「低ストリンジェンシー」、「中ストリンジェンシー」、「高ストリンジェンシー」、「非常に高いストリンジェンシー」条件という用語は、核酸のハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を説明する。ハイブリダイゼーション反応を実行するためのガイダンスは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ,Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ,Ｎ.Ｙ.（１９８９）,６．３.１−６.３．６の中で見つけることができ、これは参照によりその全体が本明細書に組込まれる。水性法および非水性法についてはこの参考文献に記載されており、いずれかを用いることができる。本明細書で言及する特定のハイブリダイゼーション条件は以下のとおりである：（１）約４５℃における６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）での低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、その後、少なくとも５０℃における０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの２回の洗浄（低ストリンジェンシー条件については、洗浄温度を５５℃まで上昇させることができる）；（２）約４５℃における６×ＳＳＣでの中ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、その後、６０℃における０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの１回以上の洗浄；（３）約４５℃における６×ＳＳＣでの高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、その後、６５℃における０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの１回以上の洗浄；（４）非常に高いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は約６５℃における０．５Ｍのリン酸ナトリウム、７％ＳＤＳであり、その後、６５℃における０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの１回以上の洗浄が続く。
【０１２１】
２つの配列間の「相同性」、「配列同一性」または「類似性」（これらの用語を、本明細書で互換的に使用する）の計算を以下のとおりに行う。これらの配列を、最適な比較目的のために整列させる（例えば、最適な整列のために、第１および第２のアミノ酸配列もしくは核酸配列の一方または両方に、ギャップを導入することができ、比較目的のために、非相同配列を無視することができる）。一実施形態において、比較目的のために整列させた参照配列の長さを、この参照配列の長さの少なくとも約３０％、任意に、少なくとも約４０％、任意に、少なくとも約５０％、任意に、少なくとも約６０％、任意に、少なくとも約７０％、８０％、９０％、または１００％である。その後、対応するアミノ酸の位置またはヌクレオチドの位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列における位置を、第２の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドが占める時、これらの分子はその位置において同一である（本明細書で使用するアミノ酸または核酸の「相同性」は、アミノ酸または核酸の「同一性」と等しい）。２つの配列間の％同一性は、２つの配列の最適な整列のために導入される必要があるギャップの数、および各ギャップの長さを考慮した、それらの配列に共通する同一の位置の数の関数である。
【０１２２】
本明細書で定義するアミノ酸配列およびヌクレオチド配列の整列ならびに相同性、類似性または同一性を、ＢＬＡＳＴ２配列アルゴリズムを用いて、初期設定のパラメータを用いて、任意に準備および決定する（Ｔａｔｕｓｏｖａ,Ｔ.Ａ.ｅｔ ａｌ．,ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ,１７４：１８７−１８８（１９９９））。もう一つの方法として、配列の整列のために、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（２．０版）を、初期値を設定したパラメータと共に用いる。ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）は、ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘのプログラムが用いる発見的探索アルゴリズムであり、これらのプログラムは、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ,１９９０,Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ ８７（６）：２２６４−８の統計的手法を用いて、これらのプログラムが発見した物に意味を帰する。
【０１２３】
核酸分子、ベクター、宿主細胞およびコンストラクトのタンパク質発現
本発明は、本明細書に記載のリガンド類（単一可変ドメイン、融合タンパク質、ポリペプチド、２重特異性リガンドおよび多特異性リガンド）をコードする単離核酸分子および／または組換え核酸分子も提供する。
【０１２４】
本発明は、本発明の組換え核酸分子を含むベクターも提供する。特定の実施形態において、このベクターは、本発明の組換え核酸に作動可能に連結された１つ以上の発現制御要素または発現制御配列を含む発現ベクターである。本発明は、本発明の組換え核酸分子または組換えベクターを含む組換え宿主細胞も提供する。適切なベクター（例えば、プラスミド、ファージミド）、発現制御要素、宿主細胞および本発明の組換え宿主細胞を作製する方法は当業で公知である。
【０１２５】
本発明の抗原結合コンストラクトを、本発明の抗原結合コンストラクトのコード配列を含む発現ベクターで宿主細胞をトランスフェクトすることによって作製してもよい。発現ベクターまたは組換えプラスミドを、宿主細胞中での複製および発現、ならびに／または宿主細胞からの分泌を制御することができる通常の調節制御配列と作動的に関連して、抗原結合コンストラクトのこれらのコード配列を配置することによって作製する。調節配列には、他の既知の抗体に由来し得るプロモーター配列、例えば、ＣＭＶプロモーター、ならびにシグナル配列が含まれる。同様に、軽鎖または重鎖の相補的な抗原結合コンストラクトをコードするＤＮＡ配列を有する第２の発現ベクターを作製することができる。特定の実施形態において、この第２の発現ベクターは、各ポリペプチド鎖が機能的に発現することをできるだけ確実にするようにコード配列および選択マーカーが関係する場合を除いて、第１の発現ベクターと同一である。もう１つの方法として、抗原結合コンストラクトの重鎖および軽鎖コード配列は、単一ベクター上に、例えば、同じベクターの２つの発現カセットの中にあってもよい。
【０１２６】
選択される宿主細胞を、従来技術によって、第１および第２のベクターの両方で同時トランスフェクトし（または、単一ベクターにより、単にトランスフェクトし）、組換え軽鎖および重鎖または合成の軽鎖および重鎖の両方を含む本発明のトランスフェクトされた宿主細胞を作り出す。その後、このトランスフェクトされた細胞を、従来技術によって培養し、本発明の遺伝子工学処理した抗原結合コンストラクトを作製する。組換え重鎖および／または軽鎖の両方の会合を含む抗原結合コンストラクトを、ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡなどの適切なアッセイによって培養物からスクリーニングする。同様の従来技術を用いて、他の抗原結合コンストラクトを構築してもよい。
【０１２７】
本発明の方法および組成物の構成に用いるクローニングステップおよびサブクローニングステップに適するベクターは、当業者によって選択され得る。例えば、従来のクローニングベクターのｐＵＣシリーズを用いてもよい。１つのベクターｐＵＣは、アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）（Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ,Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）またはファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）（Ｕｐｐｓａｌａ,Ｓｗｅｄｅｎ）などの供給企業から市販されている。さらに、容易に複製することができる任意のベクターは、豊富なクローニング部位および選択可能な遺伝子（例えば、抗生物質耐性）を有し、簡単に操作され、クローニングに用いられ得る。それゆえに、このクローニングベクターの選択は本発明の限定要因ではない。
【０１２８】
これらの発現ベクターは、異種性のＤＮＡ配列、例えば、哺乳類のジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ＤＨＦＲ）の発現を増幅するのに適する遺伝子によっても特徴づけられ得る。他のベクター配列には、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）およびβグロビンプロモーター配列（ｂｅｔａｇｌｏｐｒｏ）などに由来するポリＡシグナル配列が含まれる。本明細書に有用な発現ベクターを、当業者に公知の技術によって合成してもよい。
【０１２９】
選択した宿主における組換えＤＮＡ産物の発現および／または分泌を指示するのに使用するために、かかるベクターの構成要素、例えば、レプリコン、選択遺伝子、エンハンサー、プロモーター、シグナル配列などを、商業的供給源もしくは天然源から入手するか、または周知の手順によって合成してもよい。哺乳類、細菌、昆虫、酵母、および真菌での発現のための、当業で知られる様々な種類の他の適切な発現ベクターも、この目的のために選択してもよい。
【０１３０】
本発明は、本発明の抗原結合コンストラクトのコード配列を含む組換えプラスミドでトランスフェクトした細胞株も包含する。クローニングに有用な宿主細胞およびこれらのクローニングベクターの他の操作もありふれている。しかし、大腸菌の様々な株の細胞を、本発明の抗原結合コンストラクトの構築におけるクローニングベクターの複製および他のステップに使用してもよい。
【０１３１】
本発明の抗原結合コンストラクトの発現のための宿主細胞または細胞株の例として、ＮＳ０、Ｓｐ２／０、ＣＨＯ（例えば、ＡＴＣＣ受入番号ＣＲＬ−９０９６,ＣＨＯ ＤＧ４４（Ｕｒｌａｕｂ,Ｇ.ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ,ＬＡ.,Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ,７７（７）：４２１６−４２２０（１９８０）））、ＣＯＳ−１などのＣＯＳ（ＡＴＣＣ受入番号ＣＲＬ−１６５０）およびＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ受入番号ＣＲＬ−１６５１）、ＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ受入番号ＣＲＬ−１５７３）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ受入番号ＣＣＬ−２）、ＣＶ１（ＡＴＣＣ受入番号ＣＣＬ−７０）、ＷＯＰ（Ｄａｉｌｅｙ,Ｌ.,ｅｔ ａｌ.,Ｊ.Ｖｉｒｏｌ.,５４：７３９−７４９（１９８５）、３Ｔ３、２９３Ｔ（Ｐｅａｒ,Ｗ.Ｓ.,ｅｔ ａｌ.,Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.Ｕ.Ｓ.Ａ.,９０：８３９２−８３９６（１９９３））、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０、ＨｕＴ７８細胞などの哺乳類細胞、または植物（例えば、タバコ）（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ,Ｆ.Ｍ.ｅｔ ａｌ.,ｅｄｓ.Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ,Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ.（１９９３）参照）、線維芽細胞（例えば、３Ｔ３）、ならびに骨髄腫細胞が挙げられる。ヒトの細胞を用いると、分子をヒトのグリコシル化パターンで修飾することができる。もう一つの方法として、他の真核細胞株を用いてもよい。適切な哺乳類宿主細胞の選択、形質転換、培養、増幅、スクリーニングならびに生成物の生産および精製の方法は当業で公知である。例えば、上記で引用したＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ.を参照されたい。
【０１３２】
細菌細胞は、組換えＦａｂまたは本発明の他の実施形態の発現に適する宿主細胞として有用であると判明し得る（例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ,Ａ.,Ｉｍｍｕｎｏｌ.Ｒｅｖ.,１３０：１５１−１８８（１９９２）参照）。しかし、折り畳まれない形態か、もしくは不適切に折り畳まれた形態、またはグリコシル化されない形態にある、細菌細胞内で発現したタンパク質の傾向により、細菌の細胞内で産生した任意の組換えＦａｂを、抗原結合能の保持についてスクリーニングしなければならない。細菌細胞によって発現した分子が適切に折り畳まれた形態で生産された場合、その細菌の細胞は好ましい宿主であり、または別の実施形態において、この分子を細菌細胞で発現させ、その後、再び折り畳んでもよい。例えば、発現のために用いられる様々な大腸菌株は、バイオテクノロジーの分野において宿主細胞としてよく知られている。様々な枯草菌、ストレプトマイセス、他の桿菌なども、本方法に用いられ得る。
【０１３３】
当業者に知られる真菌または酵母の細胞株（例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ.、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、ならびに昆虫細胞、例えば、ショウジョウバエ、鱗翅類およびウイルスの発現系（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓｃｈｎｉｅｄｅｒ Ｓ２細胞、Ｓｆ９昆虫細胞（国際特許ＷＯ９４／２６０８７（Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ））も宿主細胞として利用できる。例えば、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ.,Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ,８：２７７−２９８,Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ（１９８６）およびその中に引用されている参考文献を参照されたい。
【０１３４】
これらのベクターを構築することができる一般的方法、本発明の宿主細胞を産生するのに必要とされるトランスフェクション法、およびかかる宿主細胞で本発明の抗原結合コンストラクトを産生するのに必要な培養法は、全て従来の技術であり得る。典型的な、本発明の培養法は、通常、血清を含まないで懸濁液で細胞を培養することによる血清を含まない培養法である。同様に、ひとたび産生すると、本発明の抗原結合コンストラクトは、硫安塩析、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含む当業の標準手順に従って、細胞培養内容物から精製することができる。かかる技術は当業の範囲にあり、本発明を限定しない。例えば、改変抗体の調製は、国際特許ＷＯ９９／５８６７９およびＷＯ９６／１６９９０に記載されている。
【０１３５】
この抗原結合コンストラクトの発現のさらに別の方法は、米国特許第４，８７３，３１６号に記載されるようなトランスジェニック動物内での発現を利用してもよい。これは、哺乳類に遺伝子導入で組込まれると、そのメスが母乳に所望の組換えタンパク質を産生することを可能にする動物のカゼインプロモーターを用いる発現系に関する。
【０１３６】
本発明のさらなる態様において、本発明の抗体を産生する方法を提供し、この方法は、本発明の抗体の軽鎖および／または重鎖をコードするベクターで形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞を培養し、それによって産生された抗体を回収するステップを含む。
【０１３７】
本発明に従って、本発明の抗原結合コンストラクトを生成する方法を提供し、この方法は以下のステップを含む：
（ａ）この抗原結合コンストラクトの重鎖をコードする第１のベクターを提供するステップ、
（ｂ）この抗原結合コンストラクトの軽鎖をコードする第２のベクターを提供するステップ、
（ｃ）哺乳類宿主細胞（例えば、ＣＨＯ）を前記第１および第２のベクターで形質転換するステップ、
（ｄ）前記宿主細胞由来の抗原結合コンストラクトの前記培地への分泌を促す条件下で、ステップ（ｃ）の宿主細胞を培養するステップ、
（ｅ）ステップ（ｄ）の分泌された抗原結合コンストラクトを回収するステップ。
【０１３８】
ひとたび所望の方法によって発現させると、その後、この抗原結合コンストラクトは、適切なアッセイを用いることによってインビトロ活性について調べる。現在、従来のＥＬＩＳＡアッセイ形式またはＢＩＡｃｏｒｅを用いて、この抗原結合コンストラクトのその標的への定性的かつ定量的な結合を評価する。さらに、他のインビトロアッセイも用いて、中和効果を確かめ、その後、次のヒトの臨床研究を行い、通常のクリアランス機構にも関わらず体内にあるこの抗原結合コンストラクトの残留性を評価する。
【０１３９】
有利に、本発明の抗原結合コンストラクトを、細胞発現系における単一分子として発現することができる。一実施形態において、この抗原結合コンストラクトは、ｍＡｂｄＡｂ分子を形成する二重標的化コンストラクトであり、このｍＡｂの重鎖はｄＡｂを含む単一分子を発現する。例えば、本発明によるｍＡｂｄＡｂコンストラクトが、抗ｃ−Ｋｉｔ免疫グロブリン単一可変ドメインに結合したＭＬＣに結合するモノクローナル抗体である場合、この抗ｃ−Ｋｉｔ免疫グロブリン単一可変ドメインは、抗ＭＬＣ抗体重鎖の一部として発現する。別の実施形態において、この抗ｃ−Ｋｉｔ免疫グロブリン単一可変ドメインは、抗ＭＬＣ抗体軽鎖の一部として発現する。
【０１４０】
有利に、かかる発現コンストラクトを、２つの抗原結合成分が化学的リンカーを用いて結合している分子よりも効果的に生成することができる。これは、化学的リンカーを用いた時、得られる最終生成物が、不完全な化学結合反応を示す分子の混合集団を含むからである。これは、結合成分Ａを結合成分Ｂと混合し、結合剤ｘを加えて化学的架橋を確かにする場合、結合反応後に得られる反応混合物は、Ａ、Ｂ、ｘ、Ａ−ｘおよびＢ−ｘならびに所望の化合物Ａ−ｘ−Ｂを含むことになる。したがって、製造工程でこれを用いると、全ての部分的に反応した成分を除去し、所望の化合物Ａ−ｘ−Ｂだけを得るための精製ステップが必要になる。
【０１４１】
２重標的コンストラクトの発現のためのインビトロ発現系は、そこから得られる全分子が所望の化合物であるような製造システムを提供する。かかるシステムは、生成物のより均質な集団を提供し、安全要求事項を満たすことができるより通例の生成工程を提供する簡易化した製造工程を提供する。
【０１４２】
治療
治療の投与量および期間は、ヒトの血液循環における本発明の分子の相対的期間に関し、治療される条件および患者の全体的な健康に応じて、当業者が調節することができる。延長期間（例えば、４〜６か月）にわたる繰り返し投与（例えば、３日に１度、１週間に１度または２週間に１度）は、最大治療効果を達成するために必要とされる可能性があると予想される。理想的な投薬は、心筋梗塞後（すなわち、ＭＩ後）１週間以内の単回投与である。
【０１４３】
本発明の治療薬の投与方法は、宿主にこの薬剤を送達する任意の適切な経路であり得る。本発明の抗原結合コンストラクト、免疫グロブリン単一可変ドメインおよび医薬組成物は、非経口投与、すなわち、皮下（ｓ.ｃ.）投与、髄腔内投与、腹腔内投与、筋肉内投与（ｉ.ｍ.）、静脈内（ｉ.ｖ.）投与もしくは鼻腔内投与または外科的処置中の投与に特に有用である。
【０１４４】
本発明の治療薬を、薬学的に許容される担体中の活性成分として、有効量の本発明の抗原結合コンストラクトまたは免疫グロブリン単一可変ドメインを含む医薬組成物として調製してもよい。一実施形態において、本発明の予防薬は、いつでも投与できる形態のこの抗原結合コンストラクトを含む水性懸濁液または溶液である。一実施形態において、この懸濁液または溶液は、生理的ｐＨで緩衝液の役割を果たす。非経口投与の組成物は、本発明の抗原結合コンストラクトの溶液または薬学的に許容される担体中に溶解したその混合物を含む。一実施形態において、この担体は水性担体である。様々な水性担体、例えば、０．９％生理食塩水、０．３％グリシンなどを用いてもよい。これらの溶液を無菌にすることができ、一般に粒状物質を含まない。これらの溶液を、従来の、よく知られる滅菌技術（例えば、濾過）により滅菌してもよい。これらの組成物は、ｐＨ調整剤および緩衝剤などのおおよそ生理的条件に必要とされる薬学的に許容される補助物質を含み得る。かかる医薬製剤中の本発明の抗原結合コンストラクトの濃度は、幅広く、すなわち、約０．５重量％未満、通常、約１重量％または少なくとも約１重量％〜約１５重量％もしくは約２０重量％程度まで変えることができ、選択される特定の投与方法に従って、主として、液量、粘度などに基づいて選択される。
【０１４５】
それゆえに、筋肉注射用の本発明の医薬組成物は、約１ｍＬの滅菌緩衝用水、ならびに約１ｎｇ〜約１００ｍｇの間の、例えば、５０ｎｇ〜約３０ｍｇまたは約５ｍｇ〜約２５ｍｇの間の本発明の抗原結合コンストラクトを含むように調製され得る。同様に、静脈内注入用の本発明の医薬組成物を、約２５０ｍｌの無菌のリンガー溶液、およびリンガー溶液１ｍＬあたり約１ｍｇ〜約３０ｍｇまたは約５ｍｇ〜約２５ｍｇの本発明の抗原結合コンストラクトを含むように作ることができる。非経口投与可能な組成物を調製する実際の方法はよく知られているか、または当業者には明らかであり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ,第１５版、Ｍａｃｋ出版会社、イーストン、ペンシルベニア州により詳細に記載されている。静脈内投与可能な本発明の抗原結合コンストラクト製剤の調製については、Ｌａｓｍａｒ Ｕ ａｎｄ Ｐａｒｋｉｎｓ Ｄ “Ｔｈｅ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｓ”,Ｐｈａｒｍａ.Ｓｃｉ.Ｔｅｃｈ.ｔｏｄａｙ,ｐａｇｅ １２９−１３７,Ｖｏｌ.３（３ｒｄ Ａｐｒｉｌ ２０００）；Ｗａｎｇ,Ｗ“Ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ,ｓｔａｂｉｌｉｓａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｑｕｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ”,Ｉｎｔ.Ｊ.Ｐｈａｒｍ １８５（１９９９）１２９−１８８；Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｐａｒｔ Ａ ａｎｄ Ｂ ｅｄ Ａｈｅｒｎ Ｔ.Ｊ.,Ｍａｎｎｉｎｇ Ｍ.Ｃ.,Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ,ＮＹ：Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ（１９９２）；Ａｋｅｒｓ,Ｍ.Ｊ.“Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ−Ｄｒｕｇ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ”,Ｊ.Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ９１（２００２）２２８３−２３００；Ｉｍａｍｕｒａ,Ｋ ｅｔ ａｌ“Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ｓｕｇａｒ ｏｎ ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｄｒｉｅｄ ｓｔａｔｅ”,Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ９２（２００３）２６６−２７４；Ｉｚｕｔｓｕ,Ｋｋｏｊｉｍａ,Ｓ.“Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ ｃｒｙｓｔａｌｉｎｉｔｙ ａｎｄ ｉｔｓ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ ｄｕｒｉｎｇ ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ”,Ｊ Ｐｈａｒｍ. Ｐｈａｒｍａｃｏｌ,５４（２００２）１０３３−１０３９；Ｊｏｈｎｓｏｎ,Ｒ,“Ｍａｎｎｉｔｏｌ−ｓｕｃｒｏｓｅ ｍｉｘｔｕｒｅｓ−ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ”,Ｊ.Ｐｈａｒｍ.Ｓｃｉ,９１（２００２）９１４−９２２；およびＨａ,Ｅ Ｗａｎｇ Ｗ,Ｗａｎｇ Ｙ.Ｊ.“Ｐｅｒｏｘｉｄｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ”,Ｊ.Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ,９１,２２５２−２２６４,（２００２）参照、これらの全内容は、参照により本明細書に組込まれ、読者が特に引用するものである。
【０１４６】
一実施形態において、本発明の治療薬は、医薬品の中にある時、単位用量形態で存在する。適切な治療有効量を当業者が容易に決定する。適切な用量を、患者の体重に従って、患者のために計算することができ、例えば、適切な用量は、約０．０１〜約２０ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．１〜約２０ｍｇ／ｋｇ、例えば、約１〜約２０ｍｇ／ｋｇ、例えば、約１０〜約２０ｍｇ／ｋｇまたは、例えば、約１〜約１５ｍｇ／ｋｇ、例えば、約１０〜約１５ｍｇ／ｋｇの範囲内であり得る。ヒトにおける本発明の使用条件を効果的にするための適切な用量は、約０．０１〜約１０００ｍｇ、例えば、約０．１〜約１０００ｍｇ、例えば、約０．１〜約５００ｍｇ、例えば、約５００ｍｇ、例えば、約０．１〜約１００ｍｇ、または約０．１〜約８０ｍｇ、約０．１〜約６０ｍｇ、約０．１〜約４０ｍｇ、または、例えば、約１〜約１００ｍｇ、もしくは約１〜５０ｍｇの範囲内の本発明の抗原結合コンストラクトであり得、非経口的に、例えば、皮下に、静脈内に、または筋肉内に投与され得る。かかる用量は、必要に応じて、医師によって選択される適切な時間間隔で、必要ならば繰り返され得る。
【０１４７】
本明細書に記載の抗原結合コンストラクトを、保管のために凍結乾燥し、使用前に適切な担体で再構成することができる。この技術は、従来の免疫グロブリンで効果があると示されており、当業で公知の凍結乾燥技術および再構成技術を利用することができる。
【０１４８】
疾患
本発明の医薬組成物によって治療することができる疾患には、心筋、骨格筋、血管平滑筋、臍動脈平滑筋細胞および筋肉組織、腎臓、結腸、卵管、直腸、精嚢、皮膚、網膜内皮細胞または膀胱上皮内に損傷のある疾患が含まれる。一実施形態において、治療することができる疾患には、循環器疾患、心筋梗塞、慢性心不全、虚血性心疾患、慢性虚血性心筋症もしくは非虚血性心筋症、高血圧、冠動脈疾患、糖尿病性心疾患、脳出血、血栓性脳卒中、塞栓性脳卒中、肢虚血、末梢血管疾患、または組織が虚血になった別の疾患が含まれる。一実施形態において、脊髄損傷は治療され得る。別の実施形態において、筋肉疾患または筋障害は治療され得る。筋肉疾患／筋障害には、例えば、サルコペニア、筋ジストロフィー、脊髄性筋萎縮症が含まれる。
【０１４９】
一実施形態において、この疾患は心筋梗塞であり、特に、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）である。心筋梗塞において、心筋内の筋細胞は、血液供給の機能不全を経た酸素欠乏によって損傷する。
【０１５０】
成功的治療を、駆出率、短縮率、左心室の収縮末期容量および拡張期容量、局所壁運動、梗塞サイズの減少などの心臓の形態学的測定を含む心臓の機能パラメータにおける改善によって評価することができる。これらを、心エコー検査またはＭＲＩ、核画像診断によって評価することができる。さらに、成功を、入院、後のＭＩおよび死を含む有害事象の減少、ならびに生活の質の改善および運動耐容能よって評価することができる。
【０１５１】
本発明を、例証のみの目的で、以下の実施例にさらに記載する。
【実施例】
【０１５２】
実施例１．タンパク質のクローニングおよび発現
１．組換えマウスｖＭＬＣ−１および組換えヒトｖＭＬＣ−１のクローニングおよび発現
心室ミオシン軽鎖１（ｖＭＬＣ−１）の遺伝子（ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｐ０８５９０（ヒト）、Ｐ０９５４２（マウス））をＰＣＲを用いて合成し、Ｃ末端にＧｌｙＳｅｒ（Ｈｉｓ）６タグも組み込んだ。
【０１５３】
以下のＰＣＲプライマーを用いた。
【表１】
2012528117.tif 000002
【０１５４】
ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、細胞培地中の発現／分泌を促進するために、Ｎ末端にＶ−Ｊ２−ＣマウスＩｇＧ分泌リーダー配列を有するｐＴＴ５誘導体の哺乳類発現ベクターであるベクターｐＤＯＭ５０に連結した。この分泌リーダー配列は以下のとおりである：
（アミノ酸）ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ（配列番号１１０）
（アミノ酸）ＡＴＧＧＡＧＡＣＣＧＡＣＡＣＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＧＴＧＣＣＣＧＧＡＴＣＣＡＣＣＧＧＧＣ（配列番号１１１）。
【０１５５】
タンパク質の発現を記載したとおりに行った。プラスミドＤＮＡを、ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ ｍｅｇａｐｒｅｐ（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を用いて調製した。１ｍｌあたり１μｇのＤＮＡをＨＥＫ２９３Ｅ細胞に２９３−Ｆｅｃｔｉｎでトランスフェクトし、血清を含まない培地中で培養した。このタンパク質を５日間の培養で発現させ、タンパク質Ａ親和性樹脂を用いて培養上清から精製し、１００ｍＭグリシンｐＨ２で溶出し、１／５体積の１ＭトリスｐＨ８．０で中和した。これらのタンパク質の緩衝液をＰＢＳに交換した。
【０１５６】
製造業者の取扱説明書に従って、ｖＭＬＣ１−６ｘＨＩＳタンパク質をＮｉ−ＮＴＡ樹脂（キアゲン）上で精製した。このカラムから溶出した後、このタンパク質の緩衝液をＰＢＳに交換した。
【０１５７】
ｖＭＬＣ１をビオチン化するために、製造業者の取扱説明書に従って、このタンパク質を、室温で一晩、ＰＢＳ中で３倍モル過剰のＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）と反応させた。その後、このタンパク質を、新しいＰＢＳの中で大規模に透析した。
【０１５８】
得られたＨＩＳタグ付きタンパク質のアミノ酸配列および核酸配列を図１に示す。
【０１５９】
２．組換えマウス、ヒト、カニクイザル、イヌのｃ−Ｋｉｔのクローニングおよび発現
ヒトｃＫｉｔ（ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｐ１０７２１）（ｈｃＫＩＴ）、マウスｃＫｉｔ（Ｐ０５５３２)（ｍｃＫＩＴ）、イヌｃＫｉｔ（Ｏ９７７９９）および（カニクイザル胸のｃＤＮＡライブラリー（ＢｉｏＣｈａｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）からクローニングされた）カニクイザルｃＫｉｔの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を、プライマーＳＣＴ００１とＳＣＴ００２（ヒトおよびカニクイザル）、ＳＣＴ０１４とＳＣＴ０２８（マウス）ならびにｓｃｔ０６７とＳＣＴ００２（イヌ）を用いて、ＰＣＲ増幅により合成した。
【表２】
2012528117.tif 000003
【０１６０】
ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩおよびＮｈｅＩで消化し、ｐＤＯＭ３８（３’ヒトＩｇＧ１−Ｆｃを提供する改変されたｐＤＯＭ５０哺乳類発現ベクター）に連結した。上記に記載したように、ＤＮＡをＨＥＫ２９３Ｅ細胞にトランスフェクトし、発現させ、タンパク質Ａ親和性樹脂を用いて精製した。
【０１６１】
ｃＫＩＴ−Ｆｃタンパク質をビオチン化するために、（製造業者の取扱説明書に従って）これらのタンパク質を、室温で一晩、ＰＢＳ中で３倍モル過剰のＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）と反応させた。その後、このタンパク質を、新しいＰＢＳの中で大規模に透析した。
【０１６２】
得られたｃＫＩＴ ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列を図２に示す。
【０１６３】
Ｈｉｓタグ付きタンパク質をｐＤＯＭ５０で発現することによって作製した。
【０１６４】
３．組換えヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）および組換えマウス幹細胞因子のクローニングおよび発現
ヒトおよびマウスの可溶性幹細胞因子（ＳＣＦ）（ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｐ２１５８３（ヒト）（ｈＳＣＦ）、Ｐ２０８２６（マウス）（ｍＳＣＦ））を合成し、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位を有する全長コンストラクトを作製した。この合成した遺伝子を保有しているベクターから切断し、ｐＤＯＭ５０哺乳類発現ベクターに連結した。ｖＭＬＣ−１について上記に記載したように、このＤＮＡをＨＥＫ２９３Ｅ細胞にトランスフェクトし、発現させて、精製した。
【０１６５】
ヒトおよびマウスのＨｉｓタグ付きタンパク質の各々についてのアミノ酸配列および核酸配列を図３に示す。
【０１６６】
４．ｒｃＫＩＴおよびｒＳＣＦ ＥＣＤのクローニング
ラットｃＫＩＴ ＥＣＤ（ｒｃＫＩＴ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号Ｑ６３１１６）およびラットＳＣＦ（ｒＳＣＦ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号Ｐ２１５８１）の合成遺伝子を合成した。このＳＣＦコンストラクトを、Ｃ末端にＧｌｙＳｅｒＨｉｓ（６）タグを組込むように設計した。これらの遺伝子を、それぞれｐＤＯＭ３８およびｐＤＯＭ５０に連結した。
【０１６７】
５．ヒトおよびマウスのｃＫＩＴタンパク質ならびにヒトおよびマウスのＳＣＦタンパク質の機能試験
ヒトおよびマウスのＳＣＦを、酢酸（ｐＨ４）の存在下、両方の抗原について、ＣＭ５ ＢＩＡｃｏｒｅチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に共有結合した。様々な種のｃＫＩＴを、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で１μＭまで希釈し、１ｎＭまで２倍連続希釈でＢＩＡｃｏｒｅを稼働させた。以下の表は、ヒト、マウスおよびカニクイザルのｃＫｉtの、ヒトおよびマウスのＳＣＦへの結合を示す。
【表３】
2012528117.tif 000004
【０１６８】
このＢＩＡｃｏｒｅは、６×ＨＩＳ（ＨＩＳ６）タグ付きタンパク質（ＥＣＤ−Ｈ６）は、ＢＩＡｃｏｒｅ上でＳＣＦに結合しない（「ＮＢ」として示した）が、Ｆｃ型は結合することを示した。ｍＳＣＦは、マウスｃＫｉtに結合しないように思われた。「乏しいデータ、適合不可」または「適合不良」は、これが必要であると見なされる１：１ラングミュアモデルまたは別の二価モデル（ｂｉｖａｌｅｎｔ ｍｏｄｅｌ）の標準フィッティングアルゴリズムに従って、ＢＩＡｃｏｒｅ曲線に適合することができないことを表す。抗ヒトＳＣＦおよび抗マウスＳＣＦのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を対照として用いた（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）。
【０１６９】
５．１  ｃＫｉｔ陽性細胞株ＭＣ／９のＲＴ−ＰＣＲ
Ｐ０５５３２から得られるｍｃＫＩＴの配列が細胞で発現するマウスｃＫＩＴと一致するか否かを確かめるために、ＲＴ−ＰＣＲを、標準的手順を用いて、ＭＣ／９細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−８３０６）から抽出したＲＮＡで行った。７個の無作為に集めたクローンの配列決定の結果、Ｐ０５５３２内の所定の配列と比較して、それらが全てＥ２０７Ａ変異を含むことが明らかになった。マウスｃＫＩＴ−ＳＣＦ複合体の構造上の位置２０７のマッピングは、これがＳＣＦ結合領域内に位置することを明らかにした。それゆえに、上記に記載のアッセイのＢＩＡｃｏｒｅによって、ｍｃＫＩＴがｍＳＣＦに結合できない原因はこれであり得る。
【０１７０】
５．２  ｍｃＫＩＴ ＧＮＮＫアイソフォーム
マウスｃＫＩＴはインビボで２つのアイソフォームで存在する。それらは、細胞外ドメインの膜近傍領域における「ＧＮＮＫ」モチーフの挿入によって異なる（Ｖｏｙｔｙｕｋ ｅｔ ａｌ.,２００３,Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ,２７８（１１）９１５９−９１６６）。これが、ｍｃＫＩＴのＳＣＦへの結合に影響を与えるか否かを調べるために、ｍｃＫＩＴ ＧＮＮＫを哺乳類発現ベクターｐＤＯＭ３８にクローニングした。簡単に説明すると、ＧＮＮＫ−マウスｃＫＩＴ−ｈＩｇＧ１Ｆｃ（ｐＤＯＭ３８−ｍｃＫＩＴ ＥＣＤ）を、プライマーＳＣＴ０２７およびＳＣＴ０９０（以下の表参照）を用いてＰＣＲ増幅し、ＧＮＮＫ＋マウスｃＫＩＴコンストラクトを作製した。キアゲン社のＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットを用いてＰＣＲ精製した後、このＰＣＲ産物をｐＣＲ−２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に連結した。コロニーをＭ１３順方向プライマーおよび逆方向プライマーを用いて配列決定をした。プライマーＳＣＴ０９３およびＳＣＴ０９４を用いた変異誘発によって修復されるＡｌａ−Ｖａｌ変異を除いた正しい配列に基づいて、クローン６Ｆを選択した。ｍｃＫＩＴ ＧＮＮＫコンストラクトを遊離するために、挿入断片をＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩの２つで消化し、これを哺乳類発現ベクターｐＤＯＭ３８に連結した。
【表４】
2012528117.tif 000005
【０１７１】
ｍｃＫＩＴ ＧＮＮＫを配列決定によって検証し、このＤＮＡをＥｎｄｏ−ｆｒｅｅ ｐｌａｓｍｉｄ ｍｅｇａ ｐｒｅｐキット（キアゲン）により調製した。２５０μｇのＤＮＡを２５０ｍｌのＨＥＫ２９３６ｅ細胞にトランスフェクトし、５日間３７℃で培養した。これらの細胞を遠心分離で沈殿させ、培地を回収し、濾過によりきれいにし、精製するために１ｍｌのタンパク質Ａ  ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ樹脂と混合した。４℃で一晩インキュベートした後、この樹脂をカラムに充填し、３０ｍｌの無菌のＰＢＳ、１０ｍｌの１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６で洗浄し、６．４ｍｌの１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ３および１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６でそれぞれ溶出および中和した。
【０１７２】
５．３  位置２０７における部位特異的変異誘発
位置２０７がｍｃＫＩＴ−ｍＳＣＦ結合に重要であるか否かを調べるために、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（商標）変異誘発（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を行い、位置２０７をグルタミン酸残基からアラニン残基に変異させた。用いたプライマーは、（以下の表に示した）Ｅ２０７Ａ ｒｅｖｅｒｓｅ ｍｃＫＩＴおよびＥ２０７Ａ ｆｏｒ ｍｃＫＩＴであった。
【表５】
2012528117.tif 000006
【０１７３】
ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（商標）を上記のプライマー（１００μＭで１μｌ）を用い、製造業者の取扱説明書に従って、５０μｌ反応に０．５μｌのホルムアミドを加えて行った。Ｐｆｕ ｔｕｒｂｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）は最適のポリメラーゼであり、ＰＣＲプログラムは、変性ステップ３０秒、アニーリング５５℃で３０秒、伸長反応ステップ６８℃で２０分であった。１８サイクル後、産物をアガロースゲルで調べた。試料をキアゲン社のＰＣＲ精製キットを用いて精製し、親の鋳型を、２時間３７℃で、４μｌのｄｐｎＩを用いて消化した。ＤＮＡをエタノール沈殿し、５μｌの水で溶出した。この５μｌ全部をＨＢ２１５１細胞に形質転換し、クローンを配列決定によって検証した。ｍｃＫＩＴ ＧＮＮＫ Ｅ２０７Ａもトランスフェクション用に調製し、ｍｃＫＩＴ ＧＮＮＫアイソフォームについて上記に記載したのと同じ方法で精製した。
【０１７４】
５．４  ＢＩＡｃｏｒｅによるｍｃＫＩＴ ＧＮＮＫおよびＥ２０７ＡのｍＳＣＦへの結合
ヒト、マウスおよびラットの幹細胞因子（ＳＣＦ）を、酢酸ｐＨ４．５の中で、１００ｎｇ／ｍｌでＣＭ５チップ上にコーティングした。ｃＫＩＴがそのリガンドＳＣＦに結合する時に生じる２量体化の事象を再現するために、このチップを意図的に高密度（おおよそＳＣＦあたり２０００ＲＵ）で作成した。
【０１７５】
ｍｃＫＩＴ ＧＮＮＫ＋およびｍｃＫＩＴ ＧＮＮＫ＋Ｅ２０７Ａは、１μＭから１７ｎＭまでの１２種類の濃度でＢＩＡｃｏｒｅ上を流れ、正確なＫＤ結果を得た。結果は、ｍｃＫＩＴ ＧＮＮＫ＋はｍＳＣＦおよびｒＳＣＦに部分的に結合することができるが、ｈＳＣＦには結合できないことを示した。さらに、この結合レベルは、ｍｃＫＩＴ ＧＮＮＫ−に非常に似ていた。しかし、ｍｃＫＩＴ ＧＮＮＫ＋Ｅ２０７Ａは、ｍｃＫＩＴおよびｒｃＫＩＴのみに、それぞれ２６および８１ｎＭで結合することができる。それゆえに、この単一アミノ酸の変更は、ｍｃＫＩＴのｍＳＣＦ／ｒＳＣＦへの正しい結合に役に立つ。
【０１７６】
それにもかかわらず、ｄＡｂをｍｃＫＩＴに結合する能力について選択するので、Ｐ０５５３２から得たｍｃＫＩＴを本明細書に記載のアッセイで用いる。
【０１７７】
実施例２：抗ＭＬＣ抗体
１．組換え抗ＭＬＣ抗体（３９−１５）の配列決定およびクローニング
３９−１５ｍＡｂ（ＡＴＣＣ番号ＨＢ１１７０９）のＮ末端を、以下のようにエドマン分解法により配列決定した。
【０１７８】
簡単に説明すると、κ鎖（Ｖκ）または重鎖（ＶＨ）を、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）のピログルタミン酸アミノペプチダーゼ（ＰＧＡＰ）（Ｓｉｇｍａ：カタログ番号Ｐ６２３６）で処理した。ＰＢＳ中０．２５ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ２０μｌを用いて、手元に届いたそのままの凍結乾燥ＰＧＡＰ０．０１ユニットを再懸濁した。このタンパク質懸濁液を７５℃で一晩インキュベートした。その後、処理したｍＡｂで、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロットおよびエドマン分解法の配列決定を行った。
【０１７９】
κ鎖（Ｖκ）のＮ末端配列を、ＤＩＶＭＳＱＳＰＳＳＬＡＶＳＡ（配列番号１２３）と同定した。
【０１８０】
重鎖（ＶＨ）のＮ末端配列を、ｘＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＡＳＰＧＡ（配列番号１２４）と同定した。
【０１８１】
全細胞ＲＮＡを、インビトロジェン社のＰｕｒｅＬｉｎｋ ｍｉｃｒｏ−ｔｏ−ｍｉｄｉキット（カタログ番号１２１８３−０１８）を用いて、製造業者の取扱説明書に従い、３９−１５ハイブリドーマ細胞（ＡＴＣＣ ＨＢ１１７０９）から抽出した。
【０１８２】
可変ドメインを、プロメガ社のＡｃｃｅｓｓＱｕｉｃｋ ＲＴ−ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ （カタログ番号９ＰＩＡ１７０）を用いて、プライマーセットから取った軽鎖および重鎖のプライマーのプールを用いて、ハイブリドーマＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲによって得た。Ｖ遺伝子κ軽鎖およびＶ遺伝子Ｈ鎖のリーダー配列の複数のＤＮＡ配列アライメントを用いて、プライマーセットを設計した。プライマーを、以下の基準に合うようにこれらのアライメントから手作業で設計した：１）できるだけ縮重を最小限にする（最も好ましくは１００配列未満、可能であれば１０００未満）、しかし、同時に必要とされる縮重プライマーの数を制限する；２）ａ）３つの３’塩基中にミスマッチがなく、優先的に、この配列の３’の半分にミスマッチがない；ｂ）この配列の全域にわたって３個だけのミスマッチを有する少なくとも１個のプライマーが存在しなければならない。
【０１８３】
ＰＣＲ産物を精製し、製造業者の取扱説明書に従って、ＴＯＰＯ−ＴＡクローニングベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（インビトロジェン  カタログ番号Ｋ４５００−０１）に連結した。
【０１８４】
コロニーの配列決定を行い、この重鎖の第１の残基（ｘ）がＧｌｎであることが示された。マウスκ鎖およびマウスＩｇＧ１重鎖の定常領域の配列決定を行った。これらの配列を図４に示す。
【０１８５】
組換え抗ＭＬＣｍＡｂ（３９−１５）を作製するために、配列決定したＶＨおよびＶκの遺伝子断片を、Ｈｏｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ.Ｇｅｎｅ,７７,ｐ６１（１９８９）の方法に従って、ＳＯＥ（単一重複伸長ＰＣＲ）によって、それぞれマウスＩｇＧ１の重鎖または軽鎖に連結した。
【０１８６】
簡単に説明すると、Ｖ遺伝子および定常ドメイン配列のＰＣＲ増幅を、重複プライマーを用いて別々に行った。用いたプライマーは以下のとおりである。
【表６】
2012528117.tif 000007
【０１８７】
これらの断片を別々に精製し、その後、隣接プライマーの３９−１５ＶκＳＯＥ断片５’、マウスＩｇＧ ＣκＳＯＥ断片３’、３９−１５ＶＨ ＳＯＥ断片５’およびマウスＩｇＧ ＣＨ ＳＯＥ断片３’のみを用いて、ＳＯＥ（単一重複伸長ＰＣＲ）反応にアセンブルした。
【０１８８】
このアセンブルしたＰＣＲ産物を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化し、この遺伝子をｐＤＯＭ５０の対応する部位に連結した。
【０１８９】
プラスミドＤＮＡをＱＩＡｆｉｌｔｅｒ ｍｅｇａｐｒｅｐ（キアゲン）を用いて調製した。１μｇＤＮＡ／ｍｌをＨＥＫ２９３Ｅ細胞に２９３−Ｆｅｃｔｉｎを用いてトランスフェクトし、血清を含まない培地中で培養した。このタンパク質を５日間の培養で発現させ、タンパク質Ａ親和性樹脂を用いて培養上清から精製し、１００ｍＭグリシンｐＨ２で溶出し、１／５体積の１ＭトリスｐＨ８．０で中和した。これらのタンパク質の緩衝液をＰＢＳに交換した。
【０１９０】
ハイブリドーマから精製した抗ＭＬＣ  ｍＡｂと比較して、組換え抗ＭＬＣｍＡｂ（３１−１５）のｖＭＬＣ−１への結合親和性（ＫＤ）を決定するために、精製したｍＡｂを、２倍連続希釈で８３３ｎＭから７ｎＭの濃度範囲にわたって、（上記に記載したとおりに作製した）ヒトｖＭＬＣ−１およびマウスｖＭＬＣ−１を固定化したＢＩＡｃｏｒｅによって分析した。
【表７】
2012528117.tif 000008
【０１９１】
２．マウス／ヒトキメラの作製および親和性決定
抗ＭＬＣ（抗ｖＭＬＣ−１）キメラのクローニング
マウス／ヒト抗ＭＬＣｍＡｂキメラを作製した。このマウス抗ＭＬＣのＶ遺伝子を、以下のプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。
【表８】
2012528117.tif 000009
【０１９２】
これらのＰＣＲ産物をＢａｍＨＩ／ＮｈｅＩ（ＶＨ）およびＳａｌＩ／ＢｓｉＷＩ（Ｖκ）で消化し、それぞれ、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ１−ＣＨ３ドメインを含むｐＤＯＭ５０由来の哺乳類発現ベクターｐＤＯＭ４０、またはヒトＩｇＧ  Ｃκドメインを含むｐＤＯＭ５０由来の哺乳類発現ベクターｐＤＯＭ３９に連結した。
【０１９３】
親和性を測定し、組換えまたはハイブリドーマにより作製したマウスｍＡｂと同様であった。
【０１９４】
実施例３．抗ＭＬＣのヒト化
ｍＡｂをヒト化するために、２個のヒトＶκ遺伝子（ＩＧＫＶ１−３９、ＩＧＫＶ１−４）および４個のヒトＶＨ遺伝子（ＩＧＨＶ１−３、ＩＧＨＶ１−４６、ＩＧＨＶ１−８、ＩＧＨＶ５−５１）は、ヒトフレームワーク骨格として機能を果たすのに適する特性を有することが判明した。マウスＶ遺伝子を、ヒトＶ遺伝子のフレームワーク配列に対して整列させた。抗ＭＬＣｍＡｂの相補性決定領域（ＣＤＲ）を、Ｋａｂａｔナンバリングシステムを用いて同定し、ヒト（抗体）骨格に接合した。元のヒト（抗体）骨格に存在しないＣＤＲＨ３の後ろのＪ領域ミニ遺伝子については、Ｋａｂａｔ  ｖｏｌ.ＩでマウスＪ領域を比較することによって、最も似た配列を選択した。これは、軽鎖についてはＪＫ２配列ＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲ（配列番号１３７）であり、重鎖についてはＪＫ４配列ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１３８）である。
【０１９５】
ヒト化可変ドメインを、Ｓｔｅｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ.Ｇｅｎｅ １６４（１）：４９−５３,１９９５に記載の方法に従って、重複オリゴを用いるＰＣＲアセンブリーを経て得た。制限酵素部位（ＶＨ  ＢａｍＨＩ／ＮｈｅＩ−Ｖκ  ＳａｌＩ／ＢｓｉＷＩ）を、Ｖ遺伝子の以下のプライマーを用いるＰＣＲにより取り付けた。
【表９】
2012528117.tif 000010
【０１９６】
その後、Ｖ遺伝子を消化し、（ヒトκ鎖（Ｃκ）およびヒトＩｇＧ１重鎖（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）それぞれの定常領域をすでに含むｐＤＯＭ５０ベクターに基づく）ｐＤＯＭ３９およびｐＤＯＭ４０哺乳類ベクターに連結し、その結果、各軽鎖（ＩＧＫＶ１−３９；ＩＧＫＶ４−１）を各重鎖（ＩＧＶＨ１−３、ＩＧＶＨ１−８、ＩＧＶＨ１−４６、ＩＧＶＨ５−５１）とペアを形成させ、８種類のヒト化ｍＡｂを作った。この重鎖および軽鎖のアミノ酸配列ならびに核酸配列を図５に示す。下線および太字の部分は、引き続き、ＣＤＲ配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を示す。
【０１９７】
上記に記載したように、このＤＮＡをＨＥＫ２９３Ｅ細胞にトランスフェクトし、発現させ、精製した。
【０１９８】
ヒト化３９−１５ ｍＡｂ Ｖ遺伝子
全８種類のヒト化ｍＡｂの親和性を、上記に記載したように、ＢＩＡｃｏｒｅによって測定した。これらの結果を以下の表に示す（ＮＤ＝測定されない結合）。
【表１０】
2012528117.tif 000011
【０１９９】
この１−３９軽鎖は結合を損なうように思われるが、この４−１軽鎖は結合を保つ。この１−３９とペアを形成したｍＡｂは、それらの結合速度が濃度と共に増加するように思われたので、ＫＤ値を得るのが難しかった。
【０２００】
ＩＧＶΚ４とのペア形成は、ＢＩＡｃｏｒｅにおける親和性および特性の観点から、ＩＧＶΚ１−３９よりも優れている。ＩＧＶΚ４とのペア形成の親和性における順位は、５−５１、１−３および１−４６が同順位で、最後に１−８となる。これは、両方の抗原を通して一貫性がある。重要なことは、４−１：５−５１が、マウスの親ｍＡｂと同じくらい有力である。
【０２０１】
３Ｄ−７（ＩＧＶΚ３Ｄ−７）の軽鎖も、４−１Ｖκについて記載した方法に従って合成した。ヒト３Ｄ−７フレームワークおよび３９−１５ヒト化κ鎖の配列を図５に示す。
【０２０２】
実施例４：ｄＡｂを選択する方法
Ａ）抗ヒトｃ−Ｋiｔ  ｄＡｂおよび抗マウスｃ−Ｋiｔ  ｄＡｂの未処理選択
４Ｇについては、ＧＡＳ１リーダー配列から発現する抗体の単一可変ドメインを示すファージライブラリー（国際特許ＷＯ２００５０９３０７４参照）であり、６Ｇについては、追加として加熱／冷却の事前選択のあるＧＡＳ１リーダー配列から発現する抗体の単一可変ドメインを示すファージライブラリー（国際特許ＷＯ０４１０１７９０）であるＤｏｍａｎｔｉｓ社の４Ｇおよび６Ｇの未処理ファージライブラリーを、（４ＶＨ１１−１３、４ＶＨ１４−１５、４ＶＨ１６−１７、４ＶＨ１８−１９、４Ｋ、６Ｈ、６Ｋと認定した）７つのプールに分けた。ライブラリーのアリコートは、各ライブラリーの代表の１０倍を超えることができるのに十分なサイズであった。ライブラリーのアリコートを、２％Ｍａｒｖｅｌ−ＰＢＳ中で抗原と１時間インキュベートし、ストレプトアビジン、タンパク質Ｇまたは抗Ｆｃ  Ｄｙｎａｂｅａｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で捕獲し、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳおよびＰＢＳで洗浄し、１ｍｇ／ｍｌのトリプシンで溶出した。ファージを対数期のＴＧ１細胞に感染させ（Ｇｉｂｓｏｎ,Ｔ.Ｊ.,（１９８４）エプスタイン・バーウイルスゲノムの研究、ＰｈＤ論文、ケンブリッジ大学）、これらの感染させた細胞を、テトラサイクリンプレート上に播いた（１５μｇ／ｍｌテトラサイクリン）。その後、ファージを感染させた細胞を、３７℃で一晩、テトラサイクリンを含む２ｘＴｙ中で培養し、ＰＥＧ−ＮａＣｌを用いて培養上清からファージを沈殿させ、次の選択のラウンドに用いた。
【０２０３】
上記に記載したビオチン化したヒトｃ−ｋｉｔおよびマウスｃ−ｋｉｔ（Ｈｉｓタグ付き）、ならびにヒトｃ−ｋｉｔ−Ｆｃおよびマウスｃ−ｋｉｔ−Ｆｃ融合の両方に対して選択を行った。抗原の濃度は、ラウンドが進行するに連れて１μＭから１０ｎＭに減少させ、力価は、ラウンドが進行するに連れて増加した。いくつかの選択を５μＭ糖化ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ）の存在下で行い、産出物中の炭水化物のバインダーの数を減少させた。
【０２０４】
スクリーニング方法
３ラウンドの選択後に、各ライブラリープールのｄＡｂ遺伝子を、ｐＤＯＭ４ファージベクターからｐＤＯＭ１０可溶性発現ベクターにサブクローニングした。
【０２０５】
選択後その都度、適切な選択ラウンドからファージＤＮＡのプールを、ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ ｍｉｄｉｐｒｅｐキット（キアゲン）を用いて調製し、このＤＮＡを制限酵素Ｓａｌ１およびＮｏｔ１を用いて消化し、濃縮したｄＡｂ遺伝子を、ｆｌａｇタグ付きｄＡｂを発現する可溶性発現ベクターであるｐＤＯＭ１０の対応する部位に連結する。
【０２０６】
ｐＤＯＭ１０ベクターは、ｐＵＣ１１９に基づくベクターである。タンパク質発現は、ＬａｃＺプロモーターによって促進される。ＧＡＳ１リーダー配列（国際特許ＷＯ２００５／０９３０７４参照）は、単離可溶性ｄＡｂの、大腸菌のペリプラズムおよび培養上清への分泌を確実にする。ｄＡｂをこのベクターのＳａｌＩ／ＮｏｔＩにクローニングし、このｄＡｂのＣ末端にｆｌａｇタグを付加する。
【０２０７】
連結したＤＮＡを用いて、大腸菌ＨＢ２１５１細胞に電気的形質転換を行い、その後、抗生物質カルベニシリンを含む寒天培地上で一晩培養する。得られたコロニーを、抗原結合について個々に評価する。
【０２０８】
個々のｄＡｂクローンの抗原結合を、ＥＬIＳＡまたはＢＩＡｃｏｒｅのいずれか一方を用いて評価した。このＥＬIＳＡアッセイは以下の形式をとった。ヒトｃ−ｋｉｔまたはマウスｃ−ｋｉｔ（Ｈｉｓタグ付きまたはＦｃ融合）を、１μｇ／ｍｌで、４℃で一晩、Ｍａｘｉｓｏｒｐ（ＮＵＮＣ）プレート上にコーティングした。その後、このプレートを２％ Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳでブロッキングし、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで１：１に希釈したｄＡｂ上清とインキュベートし、１：５０００の抗−ｆｌａｇ（Ｍ２）−ＨＲＰ（ＳＩＧＭＡ）で検出した（全てのステップを室温で行った）。ｄＡｂ上清の対照抗原（糖化ＢＳＡまたはＦｃ（ＳＩＧＭＡ））への結合も同時に分析した。ｃ−ｋｉｔに特異的結合を示したｄＡｂを取って、配列決定をした。
【０２０９】
ＢＩＡｃｏｒｅによるスクリーニングを、上記のように発現させ、ＨＢＳ−ＥＰ ＢＩＡｃｏｒｅランニング緩衝液で１：１に希釈したｄＡｂ上清を用いて行った。その後、各ｄＡｂを、ＳＡチップ上で、ブランクのフローセルおよびビオチン化したヒトｃ−ｋｉｔまたはマウスｃ−ｋｉｔでコーティングしたフローセルに注入した。ｃ−ｋｉｔに特異的結合を示したｄＡｂを再び取って、配列決定をした。
【０２１０】
全ての特有のｄＡｂクローンを、３７℃で一晩、５０ｍｌ培養（ＯｎＥＸ＋カルベニシリン）で発現させ、タンパク質Ａ（ＶＨ ｄＡｂ）またはタンパク質Ｌ（ＶΚ ｄＡｂ）で精製した。精製したｄＡｂを、１μＭで、ヒトまたはマウスのｃ−ｋｉｔのいずれか一方でコーティングしたＳＡ ＢＩＡｃｏｒｅチップに通過させ、ヒトまたはマウスのｃ−ｋｉｔのいずれか一方に特異的に結合したｄＡｂを同定した。これらのｄＡｂの核酸配列を、図６Ｂのアミノ酸配列と共に、図６Ａの配列番号３９〜８７に示す。Ｋａｂａｔによって決定したとおり、クローン群の対応するアミノ酸配列のＣＤＲ配列を図７に示す。
【０２１１】
図８は、図解のＢＩＡｃｏｒｅトレースを示す。異なる種のｃ−ｋｉｔへの選択したｄＡｂのおおよその親和性を以下の表に示す。以下に記載する競合的受容体結合アッセイによって決定されるとおり、表１１は、ヒトｃ−ｋｉｔに非競合的に結合するｄＡｂを表し、表１２は、ヒトｃ−ｋｉｔに競合的に結合するｄＡｂを表し、表１３はマウスｃ−ｋｉｔ結合ｄＡｂについて記載している。
【表１１】
2012528117.tif 000012
【０２１２】
【表１２】
2012528117.tif 000013
【０２１３】
【表１３】
2012528117.tif 000014
【０２１４】
その後、ヒトｃ−ｋｉｔまたはマウスｃ−ｋｉｔに特異的に結合したｄＡｂを、競合的受容体結合アッセイにおいて分析した。
【０２１５】
競合的受容体結合アッセイを以下のとおりに行った。球晶のストレプトアビジンポリスチレンビーズを、１μｇ／ｍｌのビオチン化ヒトｃ−ｋｉｔでコーティングした。２００μｌのビーズをＰＢＳで３回洗浄し、これらのビーズを回転させながら室温で１時間を超えて、１μｇ／ｍｌのビオチン化ヒトｃ−ｋｉｔとインキュベートし、その後、これらのビーズを再びＰＢＳで３回洗浄し、これらのビーズを５００μｌのＰＢＳに再懸濁した。その後、３８４ウェルの透明な底のＦＭＡＴプレートの中で、１０μｌの１：１０（全ての希釈を０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳで行った）ｃ−ｋｉｔコーティングビーズを、１０μｌの１：１００Ｒ＆Ｄヒト幹細胞因子（２０μｇ／ｍｌ原液）、１：１０００抗ヒト幹細胞因子ＩｇＧ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識）および１０μｌのｄＡｂ（１０μＭから始めた希釈系列）と混合し、６時間放置してインキュベートして、ＡＢ８２００ ＦＭＡＴで読み込んだ。
【０２１６】
データ解析は、あるｄＡｂはｃ−ｋｉｔへの結合に対して幹細胞因子と競合するが、あるｄＡｂは競合しないことを明らかにした。これらのアッセイのデータを図９ａ〜ｃおよび図１０に示す。これらの図において、「競合する」ｄＡｂ（ＤＯＭ２８ｈ−７＆ＤＯＭ２８ｈ−７８）は、ヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）のヒトビオチン化ｃ−ｋｉｔへの結合を阻害し、それゆえに、ｄＡｂの濃度が増加するに連れてこの結合シグナルは減少するが、「競合しない」ｄＡｂは、ＳＣＦ−ｃ−ｋｉｔ相互作用の阻害はなく、それゆえに、全てのｄＡｂ濃度にわたって、この結合シグナルは一定のままである。
【０２１７】
ｃ−ｋｉｔへの結合に対して幹細胞因子と競合するｄＡｂおよび競合しないｄＡｂの両方を、フローサイトメトリーを用いて分析し、それらが細胞表面上でｃ−ｋｉｔを示す細胞株に選択的に結合するか否かを決定した。
【０２１８】
簡単に説明すると、細胞を収集し、ＰＢＳ／５％ＦＣＳで洗浄する。細胞を、１ウェルあたり１×１０５細胞の濃度で適切な数のウェルに分ける。これらの細胞を、４℃で３０分〜１時間、適切な濃度のｄＡｂとインキュベートする。これらの細胞をＰＢＳ／５％ＦＣＳで洗浄し、４℃で３０分〜１時間、１：５００の２次抗体（マウス抗ＦＬＡＧ、Ｓｉｇｍａ）とインキュベートする。これらの細胞を再びＰＢＳ／５％ＦＣＳ緩衝液で洗浄し、４℃で３０分〜１時間、１：５００の３次抗体（ヤギ抗マウスＦＩＴＣ、ｓｉｇｍａ）とインキュベートする。これらの細胞をＰＢＳ／５％ＦＣＳで洗浄し、２００μｌのＰＢＳ／２．５％ＦＣＳに再懸濁し、（ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ、ＦＡＣＳ Ｄｉｖａスフトウェアを用いる）フローサイトメトリーによって分析する。
【０２１９】
３種類の細胞株（ＫＵ８１２（Ｂｉｏｃａｔ  番号１１７２７８）、ＫＧ１（ＡＴＣＣ受入番号ＣＣＬ−２４６、Ｂｉｏｃａｔ  番号１２２８８２）およびＨＥＬ９２．１．７（Ｂｉｏｃａｔ  番号４９４８６））を、ヒトｃ−ｋｉｔ陽性株として用い、１つの細胞株（Ｊｕｒｋａｔ（Ｂｉｏｃａｔ  番号１１４４０６））を陰性対照のヒト細胞株として用いた。ｃ−ｋｉｔ陽性マウス細胞株が存在しないため、最初に、ｄＡｂを、陰性対照としてマウス細胞株Ｌ９２９（ＨＰＡ（ＥＣＡＣＣ）  番号８５０１１４２５）を用いて、ｃ−ｋｉｔでゲーティングした初代マウス骨髄細胞に対して試験した。ｄＡｂのＫＵ８１２細胞への競合しない結合を図１１ａおよび１１ｂに示し、ｄＡｂのＪｕｒｋａｔ細胞への競合しない結合を図１２ａおよび１２ｂに示す。ｄＡｂのＫＵ８１２細胞への競合する結合を図１３に示し、ｄＡｂのＪｕｒｋａｔ細胞への競合する結合を図１４に示す。結合をｃ−ｋｉｔ＋ｖｅでゲーティングした初代マウス骨髄細胞に対しても分析し、ｄＡｂのこれらの細胞への結合を図１５に示す。
【０２２０】
ｄＡｂをＳＥＣ−ＭＡＬＬＳによって分析し、ｄＡｂが溶液中で単量体なのか、またはより高次のオリゴマーを形成するか否かを決定した。ＳＥＣ ＭＡＬＬＳ（多角度レーザー光散乱によるサイズ排除クロマトグラフィー）は、溶液中の巨大分子の特徴づけのための非侵襲性技術である。簡単に説明すると、（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ  ＰＢＳ緩衝液中、１ｍｇ／ｍＬの濃度の）タンパク質を、サイズ排除クロマトグラフィー（カラム：ＴＳＫ３０００；Ｓ２００）によって、それらの流体力学的性質に従って分離する。分離後、このタンパク質の光を散乱する性質を、多角度レーザー光散乱（ＭＡＬＬＳ）検出器を用いて測定する。タンパク質がこの検出器を通過する間に散乱される光の強度を、角度に応じて測定する。屈折率（ＲＩ）検出器を用いたタンパク質濃度と決定共に行われるこの測定は、適切な式（分析ソフトウェアＡｓｔｒａ ｖ.５．３.４．１２の積分部分）を用いてモル質量の計算を可能にする。表１４は、ヒトｃ−ｋｉｔ ｄＡｂおよびマウスｃ−ｋｉｔ ｄＡｂのＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ分析について記載する。さらに、マウスｃ−ｋｉｔ ｄＡｂのＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ分析を表２２に示す。
【表１４】
2012528117.tif 000015
【０２２１】
ｄＡｂを示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によっても分析し、見かけのＴｍを測定した。簡単に説明すると、このタンパク質（ＰＢＳ中、１ｍｇ／ｍｌ）を１８℃／時の定速で加熱し、熱変性と関連する検出可能な熱変化を測定する。タンパク質の５０％が天然の高次構造にあり、他の５０％は変性する温度とされる遷移の中間点（ａｐｐＴｍ）を決定する。ここで、調べられるタンパク質の多くが完全に再び折り畳まれないので、ＤＳＣは見かけの遷移の中間点（ａｐｐＴｍ）を決定した。Ｔｍが高ければ高いほど、分子も安定である。用いたソフトウェアパッケージは、ＯｒｉｇｉｎＲ ｖ７．０３８３であった。
【表１５】
2012528117.tif 000016
【０２２２】
Ｂ）抗ヒトｃ−ｋｉｔ ｄＡｂの親和性の成熟
親和性成熟ライブラリー
ヒトｃＫＩＴおよびマウスｃＫＩＴに高い親和性のあるｄＡｂを同定するために、ＤＯＭ２８ｈ−５、ＤＯＭ２８ｈ−３３、ＤＯＭ２８ｈ−４３、ＤＯＭ２８ｈ−６６、ＤＯＭ２８ｈ−８４、ＤＯＭ２８ｈ−９４およびＤＯＭ２８ｈ−１１０の親ｄＡｂ（これらのｄＡｂ配列については図６参照）を用いて、エラープローン（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ライブラリーを作製した。このエラープローンライブラリーをｐＤＯＭ４ベクターで作製した。ベクターｐＤＯＭ４は、遺伝子ＩＩＩシグナルペプチド配列を、酵母糖脂質アンカー表面タンパク質（ＧＡＳ）シグナルペプチドと置換したＦｄファージベクターの誘導体である。これは、リーダー配列と遺伝子ＩＩＩとの間にｃ−ｍｙｃタグも含み、これにより、遺伝子ＩＩＩがインフレームに戻る。このリーダー配列は、ファージディスプレイベクターおよび他の原核生物の発現ベクターの両方において十分に機能し、広く使用され得る。
【０２２３】
エラープローン成熟ライブラリーについて、成熟させるｄＡｂをコードするプラスミドＤＮＡを、ＧＥＮＥＭＯＲＰＨ（登録商標）ＩＩランダム変異誘発キット（ランダムで、特有の変異誘発性キット、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてＰＣＲにより増幅した。この生成物をＳａｌ ＩおよびＮｏｔ Ｉで消化し、ファージベクターｐＤＯＭ４との連結反応に用いた。その後、この連結した生成物を用いて、大腸菌株ＴＢ１をエレクトロポレーションにより形質転換し、形質転換した細胞を、１５μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含む２ｘＴＹ寒天上に播き、＞２×１０８クローンのライブラリーサイズを得た。
【０２２４】
７つのエラープローンライブラリーは、ｄＡｂあたり約２〜５の間のアミノ酸の変異率を有し、平均サイズは３．９×１０８であった。
【０２２５】
選択
上記に記載したとおり、溶液中のビオチン化ヒトｃＫＩＴ（Ｈｉｓタグ付き）に対して、選択を行った。抗原の濃度を、ラウンドが進行するに連れて１００ｎＭから１ｎＭに減少させ、ファージの力価は、ラウンドが進行するに連れて増加した。
【０２２６】
スクリーニング方法および親和性決定
選択のラウンド２またはラウンド３の後、その都度、そのラウンドからファージＤＮＡのプールを、ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ ｍｉｄｉｐｒｅｐキット（キアゲン）を用いて調製し、このＤＮＡを制限酵素Ｓａｌ１およびＮｏｔ１を用いて消化し、濃縮したｖ遺伝子を、ｆｌａｇタグ付きｄＡｂを発現する可溶性発現ベクターであるｐＤＯＭ１０の対応する部位に連結する。連結したＤＮＡを用いて、大腸菌ＨＢ２１５１細胞に電気的形質転換を行い、その後、抗生物質カルベニシリンを含む寒天培地上で一晩培養する。得られたコロニーを、抗原結合について個々に評価する。その都度、少なくとも９６個のコロニーを、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）（表面プラズモン共鳴）により、ビオチン化ヒトｃＫＩＴおよびビオチン化マウスｃＫＩＴへの結合について試験した。可溶性ｄＡｂ断片を、３７℃で一晩、９６ウェルプレート中の細菌培養用ＯＮＥＸ培地中に産生させた。可溶性ｄＡｂを含む培養上清を遠心分離し、高密度のヒトｃＫＩＴおよびマウスｃＫＩＴのＳＡチップへの結合についてＢＩＡｃｏｒｅにより分析し、このライブラリーの適切な親ｄＡｂと比較して各々を作った。解離速度スクリーニングにより、ヒトｃＫＩＴ（およびマウスｃＫＩＴ）への親和性に改善を示したクローンを見つけた。解離速度に改善を示した全てのクローンの配列決定を行い、特有のｄＡｂ配列を明らかにした。
【０２２７】
特有のｄＡｂを、３７℃で２４時間、２５０ｒｐｍで、Ｏｎｅｘ培地を含む２．５Ｌ振盪フラスコ中で細菌上清として発現させた。ｄＡｂを、タンパク質Ａアガロースまたはタンパク質Ｌアガロースへの吸収により培地から精製し、その後、１０ｍＭグリシンｐＨ２．０で溶出した。ヒトｃＫＩＴおよびマウスｃＫＩＴへの結合親和性（ＫＤ）を、１０００ｎＭおよび５００ｎＭで精製ｄＡｂをＢＩＡｃｏｒｅに通過させることによって、ＢＩＡｃｏｒｅにより測定した。ヒトｃＫＩＴおよびマウスｃＫＩＴへの結合についてのＫＤ値を、それぞれ表１６および表１７に示す。全てのＤＯＭ２８ｈ−９４誘導体は、ヒトｃＫＩＴおよびマウスｃＫＩＴの両方への親和性を改善する一方で、全ての他の誘導体（ＤＯＭ２８ｈ−５、ＤＯＭ２８ｈ−３３、ＤＯＭ２８ｈ−６６、ＤＯＭ２８ｈ−８４およびＤＯＭ２８ｈ−１１０）は、ヒトｃＫＩＴへの親和性のみ改善した。
【０２２８】
これらのクローンのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を図１６Ａおよび１６Ｂに示す。
【０２２９】
全てのＤＯＭ２８ｈ−９４誘導体は、ヒトｃＫＩＴおよびマウスｃＫＩＴの両方への親和性を改善する一方で、全ての他の誘導体（ＤＯＭ２８ｈ−５、ＤＯＭ２８ｈ−３３、ＤＯＭ２８ｈ−６６、ＤＯＭ２８ｈ−８４およびＤＯＭ２８ｈ−１１０）は、ヒトｃＫＩＴへの親和性のみ改善した。
【０２３０】
これらのクローンのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を図１６Ａおよび１６Ｂに示す。
【表１６】
2012528117.tif 000017
【０２３１】
ＤＯＭ２８ｈ−９４変異体
マウスｃＫＩＴへの結合において最も改善を示したＤＯＭ２８ｈ−９４の配列解析により、このｄＡｂの親和性を改善するのに潜在的に関わる一連のコンセンサス変異が明らかになった。これらはＬ４Ｐ、Ａ２４Ｖ、Ｆ２９Ｖ/ＩおよびＷ１１０Ｒであった。これらの変異の異なる組み合わせを有するｄＡｂを、以下のとおりに部位特異的変異誘発によって作った：
ＤＯＭ２８ｈ−９４−１０：Ｆ２９Ｖ Ｗ１１０Ｒ
ＤＯＭ２８ｈ−９４−１１：Ｌ４Ｐ Ａ２４Ｖ Ｗ１１０Ｒ
ＤＯＭ２８ｈ−９４−１２：Ｌ４Ｐ Ａ２４Ｖ Ｆ２９Ｖ Ｗ１１０Ｒ
ＤＯＭ２８ｈ−９４−１２：Ｌ４Ｐ Ａ２４Ｖ Ｆ２９Ｉ Ｗ１１０Ｒ。
【０２３２】
これらのｄＡｂの２つ（ＤＯＭ２８ｈ−９４−１０およびＤＯＭ２８ｈ−９４−１２）のマウスｄＫＩＴへの結合をＢＩＡｃｏｒｅにより分析し、この分析のおおよその速度定数も表１７に示す。
【表１７】
2012528117.tif 000018
【０２３３】
選択されたクローンの（アミノ酸レベルにおける）親との最低限の同一性は９６％（ＤＯＭ２８ｈ−５−６：９６％、ＤＯＭ２８ｈ−５−７：９９％、ＤＯＭ２８ｈ−５−８：９８％）であった。
【０２３４】
選択されたクローンの（アミノ酸レベルにおける）親との最低限の同一性は９８％（ＤＯＭ２８ｈ−３３−９：９９％、ＤＯＭ２８ｈ−３３−１１：９８％、ＤＯＭ２８ｈ−３３−１２：９８％、ＤＯＭ２８ｈ−３３−１９：９９％）であった。
【０２３５】
選択されたクローンの（アミノ酸レベルにおける）親との最低限の同一性は９８％（ＤＯＭ２８ｈ−６６−３：９８％、ＤＯＭ２８ｈ−６６−６：９９％）であった。
【０２３６】
選択されたクローンの（アミノ酸レベルにおける）親との最低限の同一性は９６％（ＤＯＭ２８ｈ−８４−６：９６％、ＤＯＭ２８ｈ−８４−８：９８％、ＤＯＭ２８ｈ−８４−９：９８％、ＤＯＭ２８ｈ−８４−１０：９８％）であった。
【０２３７】
選択されたクローンの（アミノ酸レベルにおける）親との最低限の同一性は９６％（ＤＯＭ２８ｈ−９４−２：９８％、ＤＯＭ２８ｈ−９４−４：９６％、ＤＯＭ２８ｈ−９４−６：９９％、ＤＯＭ２８ｈ−９４−１０：９８％、ＤＯＭ２８ｈ−９４−１１：９８％、ＤＯＭ２８ｈ−９４−１２：９７％、ＤＯＭ２８ｈ−９４−１３：９７％）であった。
【０２３８】
選択されたクローンの（アミノ酸レベルにおける）親との最低限の同一性は９８％（ＤＯＭ２８ｈ−１１０−１：９８％、ＤＯＭ２８ｈ−１１０−３：９８％、ＤＯＭ２８ｈ−１１０−６：９８％）であった。
【０２３９】
Ｃ）マウスｃ−ｋｉｔに結合するｄＡｂのさらなるスクリーニング
さらに、ｍｃＫＩＴ結合ｄＡｂを作製し、特徴づけた。上記の表１３に示すラウンド３の選択結果（すなわち、ＤＯＭ ２８ｍ−７、ＤＯＭ ２８ｍ−２３およびＤＯＭ ２８ｍ−５２）を、ｐＤＯＭ４ファージベクターから、Ｃ末端にＦＬＡＧタグを有する可溶性ｄＡｂ発現用のｐＤＯＭ１０発現ベクターにもう一度サブローニングした。ラウンド３の結果のファージＤＮＡを上記に記載したとおりに調製した。
【０２４０】
クローニング後のライブラリーから配列多様性を失わないことを確実にするために、個々のクローンを取って、配列を決定し、９６ウェルプレート形式に再び取り入れた。全部で１３プレート、すなわち約１２００個のクローンを解析した。これらの細胞を、Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ（商標）自己誘導培地混合物（ａｕｔｏ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｍｅｄｉａ ｃｏｃｋｔａｉｌｓ）（Ｍｅｒｃｋ）を有する２ｘＴＹを含む２．２ｍｌの深底ウェルプレート中で培養した。細胞を、３０℃で７２時間、湿度のあるＩｎｆｏｒｓ社の高速振盪機の中で培養した。
【０２４１】
９６ウェルプレート発現の上清を、ＨＢＰ−ＥＰ ＢＩＡｃｏｒｅランニング緩衝液（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と１：１で混合し、ＢＩＡｃｏｒｅのＣＭ５ ｍｃＫＩＴコーティングチップ上に流した。
【０２４２】
さらに３８クローンを同定した。ｍｃＫＩＴへのそれらのＢＩＡｃｏｒｅ結合に基づいて、複製クローン、発現目的のために組換えｃ−ｋｉｔタンパク質に導入したＦｃドメインに結合したクローン、および配列決定に誤りのあったクローンを除き、１９個のｄＡｂのリストが得られ、それらの配列を図６Ａ、６Ｂ、図１７Ａおよび１７Ｂに示す。これらのクローンを、Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ（商標）自己誘導培地混合物（Ｍｅｒｃｋ）を有する５０ｍｌの２ｘＴＹ中で培養し、スクリーニング目的で、３０℃で７２時間、上記のＩｎｆｏｒｓ社の高速振盪機の中で培養した。５０ｍｌの上清を、１．５ｍｌのタンパク質Ａ樹脂またはタンパク質Ｌ樹脂と混合し、３時間室温で回転しながら結合させた。これらの樹脂を上清と共にカラムに充填し、試料を３０ｍｌのＰＢＳ、３０ｍｌの１０ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣＬ ｐＨ８で洗浄し、１０ｍｌの０．１ＭグリシンｐＨ２でこれらのｄＡｂを溶出することによってカラム精製した。発現解析、生物物理解析および結合解析のために、試料を２．５ｍｌの１Ｍ ＴＲＩＳ−ＨＣＬ ｐＨ８で中和し、約１ｍｌに濃縮し、ＰＢＳで透析した。
【０２４３】
これらのｄＡｂを、ｍｃＫＩＴへのこれらの結合およびｈｃＫＩＴへのこれらの交差反応性について試験した。そのデータを以下の表に示す。全ての結合解析を、１μＭのｄＡｂ濃度でＢＩＡｃｏｒｅ ２０００装置で行った。クローンＤＯＭ２８ｍ−７およびクローンＤＯＭ２８ｍ−２３を、ｍｃＫＩＴおよびｈｃｋｉｔへのそれらの結合について以前に分析した（表１２）。このＫＤ値は大体同意できるもの（ＢＩＡｃｏｒｅで期待される１０倍誤差内）である。クローンを、ｄＡｂ形式およびｍＡｂｄＡｂ形式の両方の細胞結合データに従って順位付けをした（表２０、２６および３０）。
【表１８】
2012528117.tif 000019
【０２４４】
Ｄ）ｃ−ｋｉｔ  ｄＡｂのｃ−ｋｉｔを発現する細胞への結合
実施例４に記載の方法を変更した方法を用いて、抗ヒトｃ−ｋｉｔ  ｄＡｂおよび抗マウスｃ−ｋｉｔ  ｄＡｂの陽性結合を試験し、ヒト細胞（ＨＥＬ−９２．１．７（Ｂｉｏｃａｔ  番号４９４８６）およびＫＵ８１２（Ｂｉｏｃａｔ  番号１１７２７８））上で発現したｃ−ｋｉｔへの結合を確かめた。マウスｃ−ｋｉｔを発現する２つのマウス細胞株（ＭＣ／９（ＡＴＣＣ受入番号ＣＲＬ−８３０６）およびＥＭＬ（ＡＴＣＣ受入番号ＣＲＬ−１１６９１）を同定し、その後、３種類の細胞株をフローサイトメトリー分析に用いた。ｃ−ｋｉｔを発現しない細胞株（ＪｕｒｃｕｔおよびＨｅＬａ（Ｂｉｏｃａｔ  番号１１３３４８））を、特異性を裏付けるために含めた。
【０２４５】
ｃ−ｋｉｔ  ｄＡｂを、２．５％ＦＢＳ（ＦＡＣＳ緩衝液）を含む２５μｌのＰＢＳで適切な濃度（４×最終濃度）まで希釈し、室温で１時間、２５μｌの４０μｇ／ｍｌ（４×）抗ＦＬＡＧ−ＢＩＯ（Ｓｉｇｍａ  番号Ｆ９２９１）を加え、これらの試薬を事前に複合体形成させた。細胞数を数え、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した。５０μｌの細胞を、１×１０６細胞／ウェルの密度でｄＡｂ／抗ＦＬＡＧ複合体に加え、４℃で１時間放置した。細胞を、４℃で３分間、１２００ｒｐｍで沈殿させ、氷冷したＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、４℃で４０分間、１．２５μｇ／ｍｌのストレプトアビジン−ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  番号４０５２０４）１００μｌとインキュベートした。細胞を沈殿させ、ＦＡＣＳ緩衝液で再び洗浄し、２００μｌのＰＢＳに再懸濁した。試料を、ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でｄＡｂ結合について分析した。全てのデータをＦｌｏｗ  Ｊｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）を用いて分析した。全ての親和性成熟クローンについてのプロファイルを作製し、それを用いて、これらのｄＡｂが、マウスＭＣ／９細胞およびＥＭＬ細胞上で発現するｃ−ｋｉｔに結合するか否かをスコア化した。ｃ−ｋｉｔを発現しない対照細胞株（ＨＥＬＡ（ＨｅＬａ））をこの分析に含めた。これらのｃ−ｋｉｔ  ｄＡｂの全ての結合（「有」または「無」）を、陰性対照分子（ＶκおよびＶＨ−２つのダミーｄＡｂ）の結合と比較して表した。
【０２４６】
表１９は、親のＤＯＭ２８ｈ−９４クローンよりもＤＯＭ２８ｈ９４、ＤＯＭ２８ｈ−９４−４およびＤＯＭ２８ｈ９４−６の全てはＭＣ／９細胞に良好に結合するが、ＤＯＭ２８ｈ−９４系統のいずれもＥＭＬ細胞には結合しなかったことを示す。ｃ−ｋｉｔ陰性ＨｅＬａ細胞株への結合はなかった。
【表１９】
2012528117.tif 000020
【０２４７】
表２０は、１３個の抗マウスｃ−ｋｉｔ  ｄＡｂの、細胞上で発現したｃ−ｋｉｔへの結合を示す。
【表２０】
2012528117.tif 000021
【０２４８】
Ｅ）抗マウスｃ−ＫＩＴクローンの種の交差反応性
１３個のｄＡｂをそれらの結合についてさらに分析した。ラットｃＫＩＴ抗原との交差反応性が、異なるｄＡｂをそれらの交差反応性に基づいて分類することができることを明らかにした。以下の表は、異種間のＢＩＡｃｏｒｅデータを強調する。
【表２１】
2012528117.tif 000022
【０２４９】
この分析は、マウスｃＫＩＴ、ヒトｃＫＩＴおよびラットｃＫＩＴの配列−構造アラインメントに基づいて、結合エピトープへの広い洞察を与えた（図１８および１９）。図１９は、マウスｃＫＩＴ、ヒトｃＫＩＴおよびラットｃＫＩＴの配列アラインメントを示す。このアラインメントに基づいて、全３種間の類似領域をｃＫＩＴの構造にマッピングし、様々なエピトープが存在し得る場所に近似指標を与えることができる。
【０２５０】
これらの１３個のｄＡｂクローンを、ＳＥＣ  ＭＡＬＬＳおよびＤＳＣによって、それらの生物物理学的特性について分析した。ＳＥＣ  ＭＡＬＬＳでは、タンパク質を、１ｍｇ／ｍｌのＰＢＳ緩衝液のＳＥＣカラムで分離し、溶出した分子の屈折率が分子量の正確な測定を与える。ＤＳＣは上記に記載のとおりに行った。クローンＤＯＭ２８ｍ−７およびクローンＤＯＭ２８ｍ−２３をＳＥＣ ＭＡＬＬＳで以前に試験した（表１４）。このデータは以下の表と一致する。ＤＯＭ２８ｍ−７も前もって一度ＤＳＣで試験した（表１５）。このデータは以下の表と一致する。
【表２２】
2012528117.tif 000023
【０２５１】
ＳＣＦ存在下および非存在下におけるマウスｄＡｂ／ｃ−ｋｉｔリン酸化アッセイ
非競合的受容体結合アッセイは、ｍｃ−ｋｉｔ結合ｄＡｂの検出に有用であるので、別のアッセイプラットフォームを利用して、１３個のｍｃ−ｋｉｔ結合ｄＡｂが、マウスｃ−ｋｉｔへの結合に対してマウスＳＣＦと競合しないことを確かめた。マウスＳＣＦがマウスｃ−ｋｉｔ発現細胞に結合した後のシグナル伝達カスケードの１つに対するｄＡｂの効果を、マウスｃ−ｋｉｔリン酸化ＭｅｓｏＳｃａｌｅＤｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）アッセイで調べた。
【０２５２】
マウスｃ−ｋｉｔ陽性細胞株であるＭＣ／９細胞およびＥＭＬ細胞、ならびにヒトＨｅＬa細胞（ｃ−ＫＩＴ陰性対照株）を用いた。これらのｄＡｂを、１５０ｎｇ／ｍｌのマウスＳＣＦの存在下または非存在下で、室温で５分間、適切な濃度で細胞に加えた。その後、これらの細胞を、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ溶解緩衝液（カタログ番号９８０３ Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて氷上で溶解させ、マウスｃ−ｋｉｔリン酸化アッセイを行った。簡単に説明すると、抗マウスｃ−ｋｉｔ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  番号１４−１１７１）を、４℃で一晩、ブランク標準結合ＭＳＤプレート（ｂｌａｎｋ ｓｔａｎｄａｒｄ ｂｉｎｄ ＭＳＤ ｐｌａｔｅ）（カタログ番号Ｌ１５ＸＡ−３／Ｌ１１ＸＡ−３）上に１μｇ／ｍｌの濃度でコーティングした。このプレートを洗浄し、室温で１時間、ＰＢＳ中３％ＢＳＡでブロッキングした。その後、このプレートを、０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで３回洗浄した。２５μｌの細胞溶解物を室温で１時間加え、前述同様に洗浄した。結合した抗原を、室温で１時間、０．５μｇ／ｍｌの抗リン酸化チロシンキナーゼ−ＳＵＬＰＨＯタグ付きＭＳＤ抗体（ＭＳＤ  番号Ｒ３２ＡＰ）で検出した。このプレートを再び洗浄し、１５０μｌの１×ＭＳＤ  ｒｅａｄ緩衝液（カタログ番号Ｒ９２ＴＣ）を加え、ＭＳＤ撮像装置で読み込んだ。
【０２５３】
ＥＭＬ細胞については、このプロトコールを変更した。リン酸化アッセイの４８時間前に培地からマウスＳＣＦ除去し、これらの細胞を欠乏させ、用いたＳＣＦの量を１μｇ／ｍｌまで増加させた。市販の抗ｃＫＩＴ抗体を対照として含めた。クローン２Ｂ８（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅカタログ番号１４−１１７１）は、ｃ−ｋｉｔリン酸化に影響を与えない非中和ｍＡｂであるが、クローンＡＣＫ４５（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎカタログ番号５５３８６８）は、マウスＳＣＦの存在下でｃ−ｋｉｔリン酸化を減少させ得る中和ｍＡｂである。
【０２５４】
得られたデータは、ＭＣ／９細胞において、ＤＯＭ２８ｍ−１０４を除いて、ＳＣＦ存在下で、ｃ−ｋｉｔ ｄＡｂがｃ−ｋｉｔリン酸化をベースラインレベルまで（すなわち、ＳＣＦ非存在下でのＭＳＤシグナル）完全に減少させないことを裏付けた。ＳＣＦ非存在下では、これらのｄＡｂはｃ−ｋｉｔリン酸化に影響を及ぼさなかった。対照は期待したとおりの反応を示した。
【０２５５】
ｍｃＫＩＴ  ｄＡｂの親和性成熟
７個のマウスｃＫＩＴ ｄＡｂ（ＤＯＭ２８ｍ−７、ＤＯＭ２８ｍ−１７、ＤＯＭ２８ｍ−２３、ＤＯＭ２８ｍ−１０４、ＤＯＭ２８ｍ‐１０７、ＤＯＭ２８ｍ−１０９、ＤＯＭ２８ｍ−１１２）を、ヒト／マウス交差反応性ｄＡｂであるＤＯＭ２８ｈ−９４と共に、親和性成熟について先を進めた。細胞結合ｍＡｂｄＡｂデータ（５.１．２（ｅ）欄）の結果に基づいて、これらを選択した。エラープローンＰＣＲを、鋳型の出発濃度を５０ｐｇにして行った。Ｍｕｔａｚｙｍｅポリメラーゼを含むＧｅｎｅＭｏｒｐｈランダム変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、この遺伝子の至る所にエラーを導入した。これらのエラープローンＰＣＲを、ＰＣＲ断片のより効率的な精製のために、ビオチン化３’および５’プライマーを用いて行った。その後、３μｇのエラープローン挿入断片を、消化効率を高めるために、濃縮形態のＳａｌＩおよびＮｏｔＩの制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて消化した。消化したエラープローン挿入断片を、ストレプトアビジンビーズで精製した。エラープローン挿入断片と同様に、ファージベクターｐＤＯＭ４も、濃縮形態のＳａｌＩおよびＮｏｔＩの制限酵素で消化したが、ＰｓｔＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）でのさらなる消化は、ベクター全体が消化されることを保証した。ｐＤＯＭ４は、市販のファージベクターｆｄ−ｔｅｔに基づくファージベクターであり、ファージディスプレー用の遺伝子ＩＩＩファージ表面タンパク質を用いて、ｄＡｂライブラリーをインフレームでクローン化することを保証する。調製した挿入断片およびベクターを、挿入断片：ベクターのモル比を３：１にして連結した。５μｇのベクターを用いて、１０８の範囲のライブラリーを全て作製した。かかるライブラリーのサイズは、新しく調製するＴＢ１コンピテント細胞を作製することによって可能になった。細胞を播き、ファージ回収のためにテトラサイクリンを補った１５０ｍｌの２ｘＴＹ中で培養した。０〜４個の間のアミノ酸変異、１遺伝子あたり平均１．３変異がタンパク質レベルでみられた。
【０２５６】
８個のｄＡｂライブラリーを、可溶液選択におけるビオチン化マウスｃＫＩＴに対して選択した。１００ｎＭ、１０ｎＭおよび２．５ｎＭのビオチン化ｍｃＫＩＴ、ならびに１００ｎＭ、５０ｎＭおよび５ｎＭのビオチン化ｍｃＫＩＴを用いて、２つのバッチの選択を行った。ラウンド２およびラウンド３後の、ファージベースのＥＬＩＳＡおよび配列決定は、選択の進行を決定するのに役立った。選択の第３ラウンド後に、得られたライブラリーを、前に記載したとおりに、ベクターｐＤＯＭ１０にサブクローニングした。
【０２５７】
親のｄＡｂと比較して改善したバインダーを、上清を用いたＢＩＡｃｏｒｅによってスクリーニングした。全１６プレート中、約１５００シグナルクローンが得られ、（上記に記載の）自己誘導混合物を補った１ｍｌの２ｘＴＹ中で、３０℃で７２時間培養した。これらの上清をＢＩＡｃｏｒｅ ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と１：１で混合し、グリシンｐＨ２の注入の終わりに再生時点を設けてＢＩＡｃｏｒｅを行った。ＢＩＡｃｏｒｅ解離速度が改善した全１１クローンを同定し、配列決定を行った。これらの大部分は、ＤＯＭ２８ｈ−９４系統由来であったが、多くの他の異なる系統の中に陽性が見つかった。これらのクローンのＫＤ値を、これらの親和性成熟クローンと共に、表２３に示す（結合が非常に弱くＫＤを決定できないｄＡｂを、「弱い」として表し、ＫＤ計測を、ＢＩＡｃｏｒｅソフトウェアを用いて正確に当てはめることができないｄＡｂを「適合不良」として表し、ＫＤ値を決定できなかったｄＡｂを「ＮＤ」として表す）。これらの１１クローンの配列を図２０に示す。
【表２３】
2012528117.tif 000024
【０２５８】
実施例５．  ２重標的ｍＡｂｄＡｂの作製
２重標的ｍＡｂｄＡｂを以下の方法で構築する。一実施形態において、ｍＡｂは本明細書に記載のＭＬＣ  ｍＡｂであり、ｄＡｂは本明細書に記載の抗ｃ−ｋｉｔ ｄＡｂである。発現コンストラクトを、モノクローナル抗体の重鎖もしくは軽鎖（または両方）をコードする配列へ、ドメイン抗体をコードする配列を結合することによって作製し、その結果、発現した時に、このｄＡｂが重鎖または軽鎖のＣ末端に取り付けられる。リンカー配列を用いて、このドメイン抗体を重鎖ＣＨ３または軽鎖ＣＫに結合させることができる。適切なリンカー配列には、ＳＴＧ（配列番号９９）、ＳＴＧＧＧＧＧＳ（配列番号９５）、ＳＴＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９６）、ＴＶＡＡＰＳ（配列番号８９）、ＧＳ（配列番号１０５）、ＧＳＴＶＡＡＰＳ（配列番号１０２）、ＳＴＧＰＰＰＰＰＳ（配列番号９７）、ＳＴＧＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＳ（配列番号９８）、ＡＳＴ（配列番号９４）、またはＡＳＴＫＧＰＳ（配列番号９１）が含まれる。他のコンストラクトにおいて、このドメイン抗体を、リンカー配列を含めないでこの重鎖または軽鎖に直接結合させることできる。
【０２５９】
ｍＡｂｄＡｂコンストラクトの一般的な模式図を図２１に示す（このｍＡｂ重鎖を灰色で、このｍＡｂ軽鎖を白色で、このｄＡｂを黒色で描く）。ｍＡｂｄＡｂのタイプ１およびタイプ２は４価のコンストラクトであり、ｍＡｂｄＡｂのタイプ３は６価のコンストラクトである。
【０２６０】
ｍＡｂｄＡｂ重鎖（上の図）またはｍＡｂｄＡｂ軽鎖（下の図）の構成を示す模式図を図２２に示す。
【０２６１】
ここで留意すべきは、重鎖について、「ＶＨ」という用語は、モノクローナル抗体可変重鎖配列であり、「ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３」はヒトＩｇＧ１重鎖定常領域の配列であり、「リンカー」は用いた特異的リンカー領域の配列であり、「ｄＡｂ」はこのドメイン抗体の配列である。軽鎖について、「ＶＬ」という用語は、モノクローナル抗体可変軽鎖配列であり、「ＣΚ」はヒト軽鎖定常領域の配列であり、「リンカー」は用いた特異的リンカー領域の配列であり、「ｄＡｂ」はこのドメイン抗体の配列である。
【０２６２】
ＤＮＡ発現コンストラクトを、制限酵素クローニングまたは部位特異的変異誘発によって、構築したオリゴによりまたは（上記に記載の）存在するコンストラクトから新たに作製する。
【０２６３】
これらのコンストラクト（ｍＡｂｄＡｂの重鎖または軽鎖）を、標準的な分子生物学技術を用いて哺乳類発現ベクター（Ｒｌｎ、ＲｌｄまたはｐＴＴベクターシリーズ）にクローニングする。哺乳類アミノ酸シグナル配列を、これらのコンストラクトの構成に用いてもよい。
【０２６４】
このｄＡｂがこのモノクローナル抗体の重鎖のＣ末端に連結しているｍＡｂｄＡｂの発現には、適切な重鎖ｍＡｂｄＡｂ発現ベクターを、そのモノクローナル抗体の適切な軽鎖発現ベクターとペアを組ませる。このｄＡｂがこのモノクローナル抗体の軽鎖のＣ末端に連結しているｍＡｂｄＡｂの発現には、適切な軽鎖ｍＡｂｄＡｂ発現ベクターを、そのモノクローナル抗体の適切な重鎖発現ベクターとペアを組ませる。
【０２６５】
このｄＡｂがこのモノクローナル抗体の重鎖のＣ末端に連結しており、かつこのｄＡｂがこのモノクローナル抗体の軽鎖のＣ末端に連結しているｍＡｂｄＡｂの発現には、適切な重鎖ｍＡｂｄＡｂ発現ベクターを、適切な軽鎖ｍＡｂｄＡｂ発現ベクターとペアを組ませる。
【０２６６】
ｍＡｂｄＡｂをＣＨＯＫ１細胞上清に一過的に発現させ、ＭＬＣ結合ＥＬＩＳＡおよびｃ−Ｋｉｔ結合ＥＬＩＳＡで活性について分析してもよい。
【０２６７】
５．１．実験
５．１．１序論
ｍＡｂ−ｄＡｂ分子を、ｄＡｂがそのＣ末端に融合している標準的なｍＡｂ軽鎖および改良したｍＡｂ重鎖を組み合わせることによって構築した。２重特異性ｍＡｂ−ｄＡｂ、単一特異性分子および型対照分子の全体的な構造を図２３に図解する。本明細書に記載のｍＡｂ−ｄＡｂの全ての定常領域は、ヒトＩｇＧ１アイソタイプの定常領域である。
【０２６８】
２重特異性抗ｖＭＬＣ／抗ｃ−ｋｉｔ ｍＡｂ−ｄＡｂを構築する全体的な方法は、第１の型の抗ｃ−ＫＩＴ  ｄＡｂをダミーｍＡｂフレームワークへ結合させることによってｍＡｂ−ｄＡｂとして選択し、ダミーｍＡｂ−ｃ−ＫＩＴ ｄＡｂ型式のｍＡｂ−ｄＡｂを作製することであった。ヒトおよびマウスの両方のｃ−ｋｉｔ結合ｄＡｂを調べた。
【０２６９】
その後、その型に所望の特性を有するｄＡｂを、このｍＡｂ部分が抗ｖＭＬＣマウスｍＡｂ３９−１５のＶドメインを含む２重特異性型の型にし、キメラｍＡｂ−ｃ−ＫＩＴ ｄＡｂ ｍＡｂ−ｄＡｂを作製した。最後に、ｃ−ｋｉｔ ｄＡｂを、様々なヒト化抗ｖＭＬＣ ｍＡｂと組み合わせた。本明細書に記載のｍＡｂ−ｄＡｂコンストラクトの一覧表を表２４に示す。
【表２４】
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【０２７０】
2012528117.tif 000026
【０２７１】
2012528117.tif 000027
【０２７２】
５．１．２ダミーｍＡｂ−ｃ−ＫＩＴ ｄＡｂ ｍＡｂ−ｄＡｂ
ａ）構築
ダミーｍＡｂ−ｄＡｂ重鎖および（ｍＡｂ）軽鎖発現カセットの鋳型を（国際特許ＷＯ２００９／０６８６４９に記載のように）以前に構築した。クローニングの制限酵素部位を以下の図２４に示す。ｃＫＩＴ ｄＡｂを、ＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位を用いて重鎖Ｃ末端に融合した。ここで留意すべきは、この部位の導入は、このｍＡｂとｄＡｂとの間にＳａｌＩをコードする３残基リンカー「ＳＴＧ」（セリン、スレオニン、グリシン）をもたらすことである。ｍＡｂ−ｄＡｂの重鎖をクローニングするための出発鋳型は、以下の通りに構築したｐＤＭＳ４０６８−ＨＣ（配列番号３０６）であった。ＶＨＤＵＭ−１（配列番号３０７）を、プライマーＤＴ１１６（配列番号３３８）ＤＴ１０６（配列番号３３９）を用いて、ＰＣＲによって増幅した。このＰＣＲ産物を、ＳａｌＩ末端およびＨｉｎｄＩＩＩ末端を用いて、この発現カセットにＶＨＤＵＭ−１＿ＣＨ１＿ＣＨ２＿ＣＨ３（図２４）を含むベクター骨格に挿入し、ｐＤＭＳ４０６８−ＨＣを作製した。このコンストラクトは、図２４に図解するように、ＢａｍＨＩ−ＮｈｅＩ部位の間の「ＶＨ」およびＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位の間の「ｄＡｂ」の代わりに、ＶＨＤＵＭ−１（ＶＨダミー）ｄＡｂ（配列番号３０７）を含んでいた。
【０２７３】
この軽鎖は、図２４に図解するように、「ＶＬ」の代わりに、ＳａｌＩ部位とＢｓｉＷＩ部位との間にＶΚＤＵＭ−１（Ｖκダミー、配列番号３０８）を含んでいた。
【０２７４】
２９個の異なるｃＫＩＴ  ｄＡｂをこの型式で構築した。簡単に説明すると、ｃＫＩＴ ｄＡｂ挿入断片をＰＣＲにより増幅し、ＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位を用いて切り取ったＣ末端ｄＡｂを有するｐＤＭＳ４０６８−ＨＣ骨格に連結した。ＰＣＲに用いたプライマーは、プライマーＤＴ１１６（配列番号３３８）、プライマーＤＴ１０６（配列番号３３９）、プライマーＤＴ０２７（配列番号３４０）、プライマーＤＴ１０４（配列番号３４１）、プライマーＴＢ１１８（配列番号３４２）、およびプライマーＴＢ１１２（配列番号３４３）である。プライマーのペアを、ｄＡｂ（ＶＨまたはＶκ）類、およびこれらのｄＡｂがプライマーアニーリング領域にフレームワーク変化を含むか否かに従って選択した。
【０２７５】
配列を検証したクローンを選択し、プラスミドＤＮＡの大量調製を、キアゲン社のＭａｘｉ  ＰｒｅｐキットまたはＭｅｇａ Ｐｒｅｐキットを用いて、製造業者の取扱説明書に従って行った。ｍＡｂ−ｄＡｂを、軽鎖（配列番号３４５）および重鎖（配列番号３０９〜３３７）の同時トランスフェクションにより、一過的トランスフェクション技術を用いて哺乳類ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞（Ｂｉｏｃａｔ  番号１２０３６３）内で発現させた。ＤＯＭ２８ｍ−２３ｄＡｂ（ｐＤＭＳ４５２０−ＨＣ）を含む全てのクローンは、上記に記載の「ＳＴＧ」よりもむしろ短いリンカー「ＳＴ」（セリン、スレオニン）を含むことが観察された。
【０２７６】
ｂ）精製、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析およびＳＥＣ解析
ダミーｍＡｂ−ｃＫＩＴ ｄＡｂ ｍＡｂ−ｄＡｂを、確立された手順に従って、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィーを用いて、透明な発現上清から精製した。精製試料の濃度を、２８０ｎｍにおける光の吸光度を測定する分光光度法により決定した。
【０２７７】
精製試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、非還元試料は約１７５ｋＤａの位置に泳動し、還元試料は、それぞれ軽鎖およびｄＡｂ融合重鎖に相当する約２５ｋＤａおよび約６０ｋＤａの位置に泳動する２個のバンドを示すことが明らかになった。
【０２７８】
分子ふるいクロマトグラフィー（ＳＥＣ）解析については、このｍＡｂ−ｄＡｂ濃度を１．０ｍｇ／ｍｌに調節し、事前に平衡化したＨＰＬＣシステムに取り付けられているＳ−２００ １０／３００ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に加え、ＰＢＳ中０．５ｍｌ／分で流した。
【０２７９】
ＳＥＣの性能基準として、（ａ）カラムに加えた試料に対する全溶出（％）、（ｂ）全ピークに対する主要ピークの面積（％）、（ｃ）主要ピークの溶出（％）および（ｄ）主要ピークの対称性を考慮して、ｍＡｂ−ｄＡｂを５〜１（５＝良好；１＝不良）のスケールでスコア化した。
【０２８０】
ｃ）ｃＫＩＴに対するＢＩＡｃｏｒｅ親和性および細胞結合特性
マウスｃＫＩＴを、チップ上に約１７５０ＲＵ（「高密度チップ」）を目標にして、酢酸ｐＨ４．５の存在下でＢＩＡｃｏｒｅ ＣＭ５チップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に結合させた。チップ上に約７５０ＲＵを目標にして、ストレプトアビジンコーティングＢＩＡｃｏｒｅチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上の結合させたｍｃＫＩＴの第２の低密度チップを作製した。
【０２８１】
陽性対照の抗マウスｃＫＩＴ抗体（２Ｂ８）を用いて、この高密度チップのみ、２Ｂ８に対して４０００ＲＵの理論的反応の代わりに１００の反応を示した。これは、ＢＩＡｃｏｒｅチップの表面上の活性ｃＫＩＴ分子の数が理論的に期待される数より少ないことを示す。
【０２８２】
ラットｃＫＩＴを、酢酸ｐＨ５．５の存在下でＣＭ５チップに結合させ、ｍｃＫＩＴと同様に、陽性ラットｃＫＩＴ結合ｄＡｂに結合することができた。最終的に、ミオシン軽鎖をストレプトアビジンチップに結合させた。
【０２８３】
ｍＡｂｄＡｂを、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で１μＭまで希釈し、異なるＢＩＡｃｏｒｅチップの全域に注入した。このチップを、ｐＨ２のグリシンの単回注入により再生した。
【０２８４】
ｄ）細胞結合
ｍＡｂｄＡｂを、ｃ−ｋｉｔ陽性のマウス細胞株（ＭＣ／９およびＥＭＬ）およびヒト細胞株（ＨＥＬ−９２．１．７およびＫＵ８１２）の細胞表面上で発現させたｃ−ｋｉｔへの結合について試験した。ｃ−ｋｉｔを発現しない陰性対照細胞株は、ＪｕｒｋａｔおよびＨｅＬａであった。簡単に説明すると、細胞数を数え、２．５％ＦＢＳを含むＰＢＳ（ＦＡＣＳ緩衝液）で細胞を洗浄した。細胞を、１ウェルあたり約５Ｘ１０５細胞の密度で９６ウェルプレートに加えた。これらの細胞を、４℃で１時間、適切な濃度でｍＡｂ−ｄＡｂと共にインキュベートした。これらの細胞を沈殿させ、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。その後、これらの細胞を、４℃で４０分間、２μｇ／ｍｌの抗ヒトＦＡｂ Ａｌｅｘａ−４８８抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 番号Ａ１１０１３）と共にインキュベートした。これらの細胞をＦＡＣＳ緩衝液で再び洗浄し、５０ｎＭのＴｏｐｒｏ−３ Ｉｏｄｉｄｅ ｄｅａｄ細胞染色用色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 番号Ｔ３６０５）を含む２００μｌのＰＢＳに再懸濁し、上記に記載のＦｌｏｗ Ｊｏソフトウェアを用いてＣａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーターで解析した。
【０２８５】
ｅ）結果
ダミーｍＡｂ−ｃＫＩＴ ｄＡｂ ｍＡｂ−ｄＡｂの大部分は、ヒトおよび／またはマウスｃ−ｋｉｔ発現細胞株のいずれかに結合した。ダミーｍＡｂ−ｃＫＩＴ ｄＡｂ ｍＡｂ−ｄＡｂを、所望の特性（ＳＥＣ、ＢＩＡｃｏｒｅ親和性および細胞結合）に基づいて順位付けをした。好ましい特性を示すマウス特異的ｃ−ＫＩＴ結合ｄＡｂを、前臨床試験の検査を進めた。８個のｃＫＩＴ ｄＡｂ、すなわちＤＯＭ２８ｈ−０９４、ＤＯＭ２８ｍ−００７、ＤＯＭ２８ｍ−０１７、ＤＯＭ２８ｍ−０２３、ＤＯＭ２８ｍ−１０４、ＤＯＭ２８ｍ−１０７、ＤＯＭ２８ｍ−１０９およびＤＯＭ２８ｍ−１１２（全てＶＨ ｄＡｂ）を次の段階へ進めるために選択し、これらのｄＡｂをキメラ抗ＭＬＣｍＡｂへ融合させることによって２重特異性ｍＡｂ−ｄＡｂを作製した。ＤＯＭ２８ｍ−１１４もＶκ ｄＡｂとして選んだ。
【０２８６】
５．１．３キメラ抗ｖＭＬＣ  ｍＡｂ−ｃＫＩＴ ｄＡｂ ｍＡｂ−ｄＡｂ
ａ）構築
キメラ抗ＭＬＣ  ｍＡｂ−ｃＫＩＴ ｄＡｂ ｍＡｂ−ｄＡｂを、上記に記載のダミーｍＡｂ−ｃＫＩＴ ｄＡｂ ｍＡｂ−ｄＡｂを取得して、（上記の実施例３に記載のとおりに）Ｆａｂ可変ドメインのＶＨおよびＶκダミーを抗ｖＭＬＣマウスｍＡｂ３９−１５のＶＨ領域およびＶκ領域（それぞれ配列番号３４８および３４９）と交換することによって作製した。
【０２８７】
ダミーｍＡｂ−ｃＫＩＴ ｄＡｂのＶＨダミーコード領域を、ＢａｍＨＩおよびＮｈｅＩで消化することによって切り取った。ＶＨ挿入断片を、プライマーＴＢ１３１およびＴＢ１３２（配列番号３４６および３４７）を用いてＰＣＲにより増幅し、ＢａｍＨＩ末端およびＮｈｅＩ末端を用いて、前述の骨格に連結した。得られた７個のキメラ重鎖を表２４にまとめる（配列番号３５１〜３５８）。
【０２８８】
３９−１５キメラ軽鎖発現カセット（３９−１５ＶΚ−ヒトＣｋ、配列番号３５０）を上記に記載のとおりに構築した（実施例３参照）。
【０２８９】
配列を検証したクローンを選択し、プラスミドＤＮＡの大量調製を、キアゲン社のＭａｘｉ  ＰｒｅｐキットまたはＭｅｇａ Ｐｒｅｐキットを用いて、製造業者の取扱説明書に従って行った。ｍＡｂ−ｄＡｂを、軽鎖（配列番号３５０）および重鎖（配列番号３５１〜３５８）の同時トランスフェクションにより、一過的トランスフェクション技術を用いて哺乳類ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞内で発現させた。
【０２９０】
ｂ）キメラ抗ｖＭＬＣ  ｍＡｂ−ｃＫＩＴ ｄＡｂ ｍＡｂ−ｄＡｂを、上記に記載の通りに精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。非還元試料は約１７５ｋＤａの位置に泳動し、還元試料は、それぞれ軽鎖およびｄＡｂ融合重鎖に相当する約２５ｋＤａおよび約６０ｋＤａの位置に泳動する２個のバンドを示した。
【０２９１】
上記に記載の通りにＳＥＣ解析を行い、５が良好で１が不良である５〜１のスケールでスコア化した。
【表２５】
2012528117.tif 000028
【０２９２】
ｃ）ＢＩＡｃｏｒｅ試験を上記に記載のとおりに行った。
【０２９３】
ｄ）細胞結合（「完全型」）
ｍＡｂ−ｄＡｂを、実質的には上記に記載のとおりであるが改良した検出システムを用いて、マウス細胞株の細胞表面上で発現させたｃ−ＫＩＴへの結合について試験した。ＭＬＣ ｍＡｂ部分によってｃ−ＫＩＴへ結合する分子を検出した。簡単に説明すると、キメラＭＬＣ ｍＡｂ−ｃＫＩＴ ｄＡｂ分子またはヒト化ＭＬＣ ｍＡｂ−ｃＫＩＴ ｄＡｂ分子とインキュベートした後、これらの細胞を、４℃で３０分間、０．５μｇ／ｍｌのビオチン化マウスｖＭＬＣ抗原と共にインキュベートした。これらの細胞を再びＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、４℃で３０分間、１μｇ／ｍｌのｓｔｒｅｐ−ＰＥと共にインキュベートした。その後、これらの細胞を再びＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、５０ｎＭのＴｏｐｒｏ−３ Ｉｏｄｉｄｅ ｄｅａｄ細胞染色用色素を含む２００μｌのＰＢＳに再懸濁し、Ｃａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーターで解析した。全データをＦｌｏｗ Ｊｏソフトウェアを用いて解析した。
【０２９４】
ｃ−ＫＩＴ陽性細胞株はＭＣ／９およびＥＭＬのマウス細胞を含んでいた。陰性対照細胞株はヒトＨｅＬａ細胞であった。この実験は、全てのキメラＭＬＣ ｍＡｂ−ｃＫＩＴ ｄＡｂ分子がマウス細胞上で発現したｃ−ｋｉｔに結合したことを裏付けた。
【表２６】
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【０２９５】
ｅ）ＳＣＦ存在下および非存在下でのダミーおよびキメラのｍＡｂ−ｄＡｂ／ｃ−ｋｉｔリン酸化アッセイ
これらのｍＡｂ−ｄＡｂが、ｃ−ＫＩＴを介したＳＣＦシグナル伝達と干渉しないことを確かめるために、これらのｍＡｂ−ｄＡｂ（ＤＭＳ ４０６９、４５０３、４５０５、４５３８、４５４９、４５５２、４５５４、４５５７、４５５８、４５７２、４５７３、５０６０、５０５２、５０５３、５０５５、５０５６、５０５７および５０５８）を、ＭＣ／９細胞およびＥＭＬ細胞におけるマウスｃ−ＫＩＴリン酸化ＭＳＤアッセイで試験した。５００ｎｇ／ｍｌのマウスＳＣＦをこれらの細胞に加え、このキメラＭＬＣ ｍＡｂをキメラＭＬＣ ｍＡｂ−ｃＫＩＴ ｄＡｂのｍＡｂ部分によってもたらされる任意の的外れの効果のための対照に含めたことを除いて、このアッセイを上記に記載のとおりに行った。
【０２９６】
これらの分子のいずれも、ＳＣＦによるｃ−ｋｉｔのリン酸化をベースラインレベルまで阻害しなかった。ＳＣＦ非存在下でのｃ−ｋｉｔリン酸化に対して重要な影響もなかった。
【０２９７】
５．１．４  ヒト化抗ｖＭＬＣ  ｍＡｂ−ｃＫＩＴ ｄＡｂ ｍＡｂ−ｄＡｂ
ａ）ヒト化抗ｖＭＬＣ  ｍＡｂ−ｃＫＩＴ ｄＡｂ ｍＡｂ−ｄＡｂの構築
ヒト化抗ＭＬＣ  ｍＡｂ−ｃＫＩＴ ｄＡｂ ｍＡｂ−ｄＡｂを、上記に記載のダミーｍＡｂ−ｃＫＩＴ ｄＡｂ ｍＡｂ−ｄＡｂを取得して、上記の実施例３に記載のとおり、Ｆａｂ可変ドメインのＶＨおよびＶκダミーをヒト化抗ｖＭＬＣｍＡｂのＶＨ領域およびＶκ領域と交換することによって作製した。２つのヒト化ＶＨ配列；１−３および５−５１（それぞれ配列番号３５９および３６０）、ならびに２つのヒト化Ｖκ配列；４−１および３Ｄ−７（それぞれ配列番号３６１および３６２）を組み合わせて、４つの異なるヒト化抗ＭＬＣ ＶＨ−Ｖκペアを形成させた。
【０２９８】
ヒト化抗ＭＬＣ ｍＡｂ−ｃＫＩＴ ｄＡｂ重鎖発現カセットを、ｐＤＭＳ４５０３−ＨＣ、ｐＤＭＳ４５０５−ＨＣ、ｐＤＭＳ４５３８−ＨＣ、ｐＤＭＳ４５４９−ＨＣ、ｐＤＭＳ４５５２−ＨＣ、ｐＤＭＳ４５５４−ＨＣ、ｐＤＭＳ４５５７−ＨＣおよびｐＤＭＳ４５２０−ＨＣ（表２４）を取得して、ＶＨダミーコード領域を、１−３ｍＡｂ重鎖および５−５１ｍＡｂ重鎖の発現カセットのヒト化抗ＭＬＣ ＶＨ領域の１−３および５−５１（それぞれ配列番号３６３および３６４）と交換することによって構築した。
【０２９９】
抗ＭＬＣ ＶＨ領域の１−３および５−５１をＢａｍＨＩおよびＮｈｅＩで切り取り、これらの切り取ったＶＨ挿入断片を、ＢａｍＨＩおよびＮｈｅＩで除去したＶＨダミーコード領域を有するｐＤＭＳ４５０３−ＨＣ、ｐＤＭＳ４５０５−ＨＣ、ｐＤＭＳ４５３８−ＨＣ、ｐＤＭＳ４５４９−ＨＣ、ｐＤＭＳ４５５２−ＨＣ、ｐＤＭＳ４５５４−ＨＣおよびｐＤＭＳ４５５７−ＨＣの骨格に連結することによって、（ｐＤＭＳ５０６３−ＨＣおよびｐＤＭＳ５０７３−ＨＣを除く）ヒト化抗ｖＭＬＣ ｍＡｂ−ｃＫＩＴ ｄＡｂ重鎖を構築した。（ａ）ＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて、ｐＤＭＳ４５２０−ＨＣからＤＯＭ２８ｍ−２３コード領域を切り取ること、（ｂ）ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩを用いて、ｐＤＭＳ４０６８−ＨＣ（配列番号３０６）からＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３コード領域を切り取ること、（ｃ）ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて、ｐＤＭＳ４０６８−ＨＣからｍＡｂ−ｄＡｂ ＨＣコード領域全体を除去し、その後、４断片の連結において、１−３または５−５１のいずれか一方を有する（ａ）および（ｂ）の挿入断片を（ｃ）のベクター骨格に連結することによって、ｐＤＭＳ５０６３−ＨＣおよびｐＤＭＳ５０７３−ＨＣを構築した。配列番号３６７〜３８２を有するヒト化抗ｖＭＬＣ ｍＡｂ−ｃＫＩＴ ｄＡｂ ｍＡｂ−ｄＡｂ重鎖を作製した。
【０３００】
ｂ）ヒト化２重特異性ｍＡｂ−ｄＡｂを構築するのに最適なヒト化抗ｖＭＬＣ  ＶＨ−Ｖκペア形成の決定
ｉ）１２個の異なる試験的ペア形成の一部の構築
生物物理学的特性に関して一番良好なヒト化抗ｖＭＬＣ ＶＨ−Ｖκペア形成を決定するために、表２４に一覧表にした６個の異なるｍＡｂ−ｄＡｂ重鎖の選択を、４−１および３Ｄ７の軽鎖（それぞれ４−１ＶΚ−ヒトＣκ、配列番号３６５および３Ｄ７ＶΚ−ヒトＣκ、配列番号３６６）と組み合わせた。これらの異なるペア形成は、ヒト化抗ｖＭＬＣ ｍＡｂ−ｃＫＩＴ ｄＡｂの重鎖と軽鎖のペア形成をもたらし、ＤＭＳ５０６８、５０６１、５０６２、５０７８、５０７１および５０７２ならびにＤＭＳ５０８８、５０８１、５０８２、５０９８、５０９１および５０９２と同定されるｍＡｂ−ｄＡｂを得た（表２４参照）。
【０３０１】
配列を検証したクローンを選択し、プラスミドＤＮＡの大量調製を、キアゲン社のＭａｘｉ  ＰｒｅｐキットまたはＭｅｇａ Ｐｒｅｐキットを用いて、製造業者の取扱説明書に従って行った。ｍＡｂ−ｄＡｂを、ペアにするものの同時トランスフェクションにより、一過的トランスフェクション技術を用いて哺乳類ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞内で発現させた。
【０３０２】
ｉｉ）１２個の異なるペア形成の一部の精製およびＳＥＣ解析
１２個のヒト化抗ｖＭＬＣ ｍＡｂ−ｃＫＩＴ ｄＡｂ ｍＡｂ−ｄＡｂを、確立した手順に従って、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィーを用いて、透明な発現上清から精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、非還元試料は約１７５ｋＤａの位置に泳動し、還元試料は、それぞれ軽鎖およびｄＡｂ融合重鎖に相当する約２５ｋＤａおよび約６０ｋＤａの位置に泳動する２個のバンドを示すことが明らかになった。非還元条件下において、ＤＭＳ５０６１、ＤＭＳ５０６２およびＤＭＳ５０６８は、約２６０ｋＤａの位置に泳動するさらに高い分子量のバンドを示す。
【０３０３】
分子ふるいクロマトグラフィー（ＳＥＣ）解析については、このｍＡｂ−ｄＡｂ濃度を（ＤＭＳ５０８１、ＤＭＳ５０８２、ＤＭＳ５０８８、ＤＭＳ５０９１およびＤＭＳ５０９２を、それぞれ０．２、０．２、０．２、０．１および０．４ｍｇ／ｍｌで流したことを除いて）０．５ｍｇ／ｍｌに調節し、事前に平衡化したＨＰＬＣシステムに取り付けられているＳ−２００ １０／３００ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に加え、ＰＢＳ中０．５ｍｌ／分で流した。
【０３０４】
ＳＥＣの性能基準として、（ａ）カラムに加えた試料に対する全溶出（％）、（ｂ）全ピークに対する主要ピークの面積（％）、（ｃ）主要ピークの溶出（％）および（ｄ）主要ピークの対称性を考慮して、ヒト化抗ｖＭＬＣ ｍＡｂ−ｃＫＩＴ ｄＡｂ ｍＡｂ−ｄＡｂを５〜１（５＝良好；１＝不良）のスケールでスコア化した。
【表２７】
2012528117.tif 000030
【０３０５】
ｉｉｉ）１２個の試験的組み合わせに基づく一番良好なヒト化抗ｖＭＬＣ  ＶＨ−Ｖκペア形成の選択
５−５１ＶＨと４−１Ｖκのペア形成を含むヒト化抗ｖＭＬＣ ｍＡｂ−ｃＫＩＴ ｄＡｂ分子を発現した１２個の組み合わせの中で、ＤＭＳ５０７１、ＤＭＳ５０７２およびＤＭＳ５０７８が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＳＥＣの一番良い結果を与えた。ＤＭＳ５０６１、ＤＭＳ５０６２およびＤＭＳ５０６８は匹敵するＳＥＣ評価を与えたが、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて追加の高分子量バンドが存在するために、１−３ＶＨと４−１Ｖκのペア形成を除外した。
【０３０６】
ｃ）ヒト化抗ｖＭＬＣ ｍＡｂ−ｃＫＩＴ ｄＡｂ ｍＡｂ−ｄＡｂの発現、精製およびＳＥＣ／ＭＡＬＬＳ解析
以下の表２８に一覧表にした軽鎖および重鎖のコンストラクトの配列を検証したクローンを選択し、プラスミドＤＮＡの大量調製を、キアゲン社のＭａｘｉ  ＰｒｅｐキットまたはＭｅｇａ Ｐｒｅｐキットを用いて、製造業者の取扱説明書に従って行った。ｍＡｂ−ｄＡｂを、表２８に一覧表にした軽鎖および重鎖の同時トランスフェクションにより、一過的トランスフェクション技術を用いて哺乳類ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞内で発現させた。
【表２８】
2012528117.tif 000031
【０３０７】
８個のヒト化抗ｖＭＬＣ ｍＡｂ−ｃＫＩＴ ｄＡｂ ｍＡｂ−ｄＡｂのＤＭＳ５０７１、ＤＭＳ５０７２、ＤＭＳ５０７３、ＤＭＳ５０７４、ＤＭＳ５０７５、ＤＭＳ５０７６、ＤＭＳ５０７７およびＤＭＳ５０７８を、確立された手順に従って、ｍＡｂ  Ｓｅｌｅｃｔ ＨｉＴｒａｐカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、親和性クロマトグラフィーにより透明な発現上清から精製した。精製試料の濃度を、２８０ｎｍにおける光の吸光度を測定する分光光度法により決定した。精製試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、非還元試料は約１７５ｋＤａの位置に泳動し、還元試料は、それぞれ軽鎖およびｄＡｂ融合重鎖に相当する約２５ｋＤａおよび約６０ｋＤａの位置に泳動する２個のバンドを示すことが明らかになる。
【０３０８】
ｍＡｂ−ｄＡｂを、ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ（多角度レーザー光散乱によるサイズ排除クロマトグラフィー）によってそれらの溶液の状態について特徴づけた。精製したＤＭＳ５０７１、ＤＭＳ５０７２、ＤＭＳ５０７３、ＤＭＳ５０７４、ＤＭＳ５０７５、ＤＭＳ５０７６、ＤＭＳ５０７７およびＤＭＳ５０７８をＰＢＳに緩衝液交換し、濾過して、濃度を１．０ｍｇ／ｍｌに調節した。ＲＳＡをシグマ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）社から購入し、さらに精製することなく（バッチ番号ＫＪ１３９８１２）使用した。
【０３０９】
サイズ排除クロマトグラフィーおよび検出器の設置
島津製作所のオートサンプラー（ＳＩＬ−２０Ａ）およびＳＰＤ−２０Ａ  Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ  ＵＶ／Ｖｉｓ検出器を備えるＬＣ−２０ＡＤ  Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ ＨＰＬＣシステムを、Ｗｙａｔｔ Ｍｉｎｉ Ｄａｗｎ Ｔｒｅｏｓ（ＭＡＬＬＳ、多角度レーザー光散乱検出器）およびＷｙａｔｔ Ｏｐｔｉｌａｂ ｒＥＸ ＤＲＩ（示差屈折率）検出器に接続した。これらの検出器を以下の順番ＬＳ−ＵＶ−ＲＩで接続した。ＲＩ装置およびＬＳ装置の両方は、４８８ｎｍの波長で作動させた。Ｓ−２００ １０／３００ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）（シリカベースのＨＰＬＣカラム）を、移動相をＰＢＳにして用いた。用いた流速を０．５ｍｌ／分である。タンパク質を緩衝液で１ｍｇ／ｍｌの濃度に調製し、注入量を１００μｌにした。
【０３１０】
検出器の較正
光散乱検出器を、製造業者の取扱説明書に従ってトルエンで較正した。
【０３１１】
ＢＳＡを用いた検出器の較正
ＵＶ検出器の出力およびＲＩ検出器の出力を光散乱装置に接続し、その結果、全３つ検出器からのシグナルを、Ｗｙａｔｔ ＡＳＴＲＡソフトウェアを用いて同時に収集することができた。ＰＢＳの移動相中にＢＳＡを数回注入（１ｍｌ／分）して、Ｓ−２００ １０／３００ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に流し、ＷｙａｔｔソフトウェアによってＵＶ、ＬＳおよびＲＩシグナルを収集した。その後、製造業者の取扱説明書に従って、トレースを、ＡＳＴＲＡソフトウェアを用いて解析し、これらのシグナルを基準化し、整列させ、バンドの広幅化について補正した。その後、較正定数を平均化し、さらに試料を流すために用いるテンプレートに入力した。
【０３１２】
絶対モル質量の較正
各試料１００μｌを事前に平衡化したカラム（Ｓ−２００ １０／３００ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））に注入した。ＳＥＣカラム後、この試料を３つのオンライン検出器ＵＶ、ＭＡＬＬＳ（多角度レーザー光散乱）およびＤＲＩ（示差屈折率）に通過させ、絶対モル質量の決定を可能にした。カラム上で行う希釈は約１０倍であり、必要に応じて溶液状態における濃度を決定した。
【０３１３】
ＡＳＴＲＡでの計算の基準、およびバッチ試料モードで実行される場合が多いＺｉｍｍプロット法の基準は、Ｚｉｍｍの式（Ｊ.Ｃｈｅｍ.Ｐｈｙｓ.１６,１０９３−１０９９（１９４８））である。
【０３１４】
これらの計算はＡＳＴＲＡソフトウェアが自動的に実行し、スライスの各々について測定したモル質量と共にプロットが得られる（ＡＳＴＲＡ取扱説明書）。
【０３１５】
ＳＥＣ／ＭＡＬＬＳの結果
ＳＥＣ／ＭＡＬＬＳ解析は、全８個の２重特異性ｍＡｂ−ｄＡｂであるＤＭＳ５０７１、ＤＭＳ５０７２、ＤＭＳ５０７３、ＤＭＳ５０７４、ＤＭＳ５０７５、ＤＭＳ５０７６、ＤＭＳ５０７７およびＤＭＳ５０７８が、ＭＡＬＬＳによって計算され、期待値に密接に匹敵する分子量を有する単量体の溶液状態であることを示した（表２９）。対照試料のラット血清アルブミンは予想どおり流れ、予想される多量体も生じた。
【表２９】
2012528117.tif 000032
【０３１６】
ｄ）ヒト化抗ｖＭＬＣ ｍＡｂ−ｃＫＩＴ ｄＡｂ ｍＡｂ−ｄＡｂのｃＫＩＴへのＢＩＡｃｏｒｅ親和性および細胞結合特性
ＤＭＳ５０７１、５０７２、５０７３、５０７４、５０７５、５０７６、５０７７および５０７８をＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で１μＭまで希釈し、１：３希釈で６段階の希釈系列を作った。試料を異なるＢＩＡｃｏｒｅチップの全域に注入し、グリシンｐＨ２で再生した。ＢＩＡｃｏｒｅ２価モデル（ｂｉｖａｌｅｎｔ ＢＩＡｃｏｒｅ ｍｏｄｅｌ）が生物学的に最も関連性があると期待されるので、ＢＩＡｃｏｒｅ２価モデルを用いてＢＩＡｃｏｒｅ曲線を適合させた。このモデルに従わない全ての曲線は、適合不良と見なした。この適合を利用して、１個のｄＡｂが単一のｃＫＩＴ／ＭＬＣ分子に結合する事象のＫＤ（ＫＤ）値を得た。
【０３１７】
ｅ）細胞結合
細胞結合実験（完全型）を、上記に記載の方法に従って、ＤＭＳ５０７１、５０７２、５０７３、５０７４、５０７５、５０７６、５０７７および５０７８に対して行った。
【０３１８】
ｍＡｂ−ｄＡｂを、マウスの初代骨細胞への結合についても試験した。簡単に説明すると、このマウスの骨髄試料を細胞濾過器に通過させ、その後、これらの細胞を遠心分離してペレットにした。その後、これらの細胞をＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ／２．５％ＦＣＳ）で２回洗浄し、系統枯渇（ｌｉｎｅａｇｅ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）Ｍｉｌｔｅｎｙｉキット（番号１３０−０９０−５８５８）を用いて、系統陰性細胞（Ｌｉｎｅａｇｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｅｌｌ）について濃縮した。濃縮した細胞を、４℃で１時間、５００ｎＭのヒト化ＭＬＣ ｍＡｂ−ｃＫＩＴ ｄＡｂで標識し、上記に記載の完全型の方法を用いて検出した。これらの細胞を、４℃で３０分間、０．２５μｇ／ｍｌの抗ｃＫＩＴ ＦＩＴＣ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ 番号５５３３５４）でも染色した。これらの細胞をＦＡＣＳ緩衝液で再び洗浄し、５０ｎＭのＴｏｐｒｏ−３ Ｉｏｄｉｄｅ ｄｅａｄ細胞染色用色素を含む２００μｌのＰＢＳに再懸濁し、Ｃａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーターで解析した。全データをＦｌｏｗ Ｊｏソフトウェアを用いて解析した。
【０３１９】
データを表３０にまとめる。ＤＭＳ５０７２、ＤＭＳ５０７４、ＤＭＳ５０７８、ＤＭＳ５１０２、ＤＭＳ５１０３、ＤＭＳ５１０４およびＤＭＳ５１０５は全て、ｃ−ｋｉｔ陽性のマウス初代骨髄細胞に結合することを示した。
【表３０】
2012528117.tif 000033
【０３２０】
５．１．５  親和性成熟ＤＯＭ２８ｈ−９４ｄＡｂを含むヒト化抗ｖＭＬＣ ｍＡｂ−ｃＫＩＴ ｄＡｂ ｍＡｂ−ｄＡｂ
ａ）親和性成熟ＤＯＭ２８ｈ−９４ｄＡｂを含むヒト化抗ｖＭＬＣ ｍＡｂ−ｃＫＩＴ ｄＡｂ重鎖の構築
上記に記載のとおりに、親和性成熟ＤＯＭ２８ｈ−９４は、いくつかの点変異を有する高親和性バインダーを産生した。ヒト化抗ｖＭＬＣ ｍＡｂ−ｃＫＩＴ ｄＡｂ重鎖の型にするために、位置４（プロリン）、１９（バリン）、２９（バリンまたはイソロイシン）および１１０（アルギニン）の位置における組み合わせた点変異を有する親和性成熟ｄＡｂを用いた。これらのうちの２つ（ＤＯＭ２８ｈ−９４−１１およびＤＯＭ２８ｈ−９４−１２）を親和性成熟から選択し、別の２つ（ＤＯＭ２８ｈ−９４−１４およびＤＯＭ２８ｈ−９４−１５）を、クロスオーバーＰＣＲによって作製した。簡単に説明すると、前述の点変異の１個以上を有する鋳型（ＤＯＭ２８ｈ−９４−２、ＤＯＭ２８ｈ−９４−６、ＤＯＭ２８ｈ−９４−１０、ＤＯＭ２８ｈ−９４−１１、ＤＯＭ２８ｈ−９４−１２およびＤＯＭ２８ｈ−９４−１３）の混合物をプールし、伸長時間を１０秒短くしてＰＣＲを行った。このｐＣＲ産物を、ＳａｌＩ末端およびＨｉｎｄＩＩＩ末端を用いてｍＡｂ−ｄＡｂ重鎖に連結した。プラスミドＤＮＡミニプレップのために、コロニーを無作為に取り、大腸菌培養液に植菌した。その後、プラスミドｍｉｎｉｐｒｅｐ ＤＮＡ（キアゲン）を用いて、哺乳類ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞にトランスフェクトした。同時トランスフェクションのために、各ミニプレップを軽鎖ＤＮＡ（４−１ＶΚ−ヒトＣκ、配列番号３６５）と混合した。発現７２時間後、上清を回収し、ＢＩＡｃｏｒｅによりヒトおよびマウスのｃ−ｋｉｔのバインダーについて試験した。所望の親和性を与える上清試料に留意し、それらのウェルにトランスフェクトするのに用いたミニプレップを配列決定して同定し、新しいクローン番号を与えた。親和性成熟ｄＡｂ配列ＤＯＭ２８ｈ−９４−１１、ＤＯＭ２８ｈ−９４−１３、ＤＯＭ２８ｈ−９４−１４およびＤＯＭ２８ｈ−９４−１５を含むｍＡｂ−ｄＡｂ重鎖のｐＤＭＳ５１０２−ＨＣ、ｐＤＭＳ５１０３−ＨＣ、ｐＤＭＳ５１０４−ＨＣおよびｐＤＭＳ５１０５−ＨＣ（それぞれ配列番号３８５、配列番号３８６、配列番号３８７および配列番号３８８）を作製した。
【０３２１】
重鎖コンストラクトの配列を検証したクローンを選択し、プラスミドＤＮＡの大量調製を、キアゲン社のＭｅｇａ Ｐｒｅｐキットを用いて、製造業者の取扱説明書に従って行った。ｍＡｂ−ｄＡｂを、軽鎖ＤＮＡ（４−１ＶΚ−ヒトＣκ）および重鎖の同時トランスフェクションにより、一過的トランスフェクション技術を用いて哺乳類ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞内で発現させた。
【０３２２】
ｂ）精製およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
４個のヒト化抗ｖＭＬＣ ｍＡｂ−ｃＫＩＴ ｄＡｂ ｍＡｂ−ｄＡｂ（タンパク質ＤＭＳ番号５１０２、５１０３、５１０４、５１０５（表２４参照））を、確立された手順に従って、ｍＡｂ Ｓｅｌｅｃｔ ＨｉＴｒａｐカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いる親和性クロマトグラフィーにより透明な発現上清から精製した。精製試料の濃度を、２８０ｎｍにおける光の吸光度を測定する分光光度法により決定し、試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により調べた。
【０３２３】
ｃ）ＳＥＣ／ＭＡＬＬＳ解析
ＤＭＳ５１０２、ＤＭＳ５１０３、ＤＭＳ５１０４およびＤＭＳ５０１５を、上記に要点を述べた方法を利用するＳＥＣ／ＭＡＬＬＳによって解析した。ＳＥＣ／ＭＡＬＬＳ解析は、全４個の２重特異性ｍＡｂ−ｄＡｂのＤＭＳ５１０２、ＤＭＳ５１０３、ＤＭＳ５１０４およびＤＭＳ５０１５が、ＳＥＣ／ＭＡＬＬＳによって計算され、期待値に密接に匹敵する分子量を有する単量体の溶液状態であることを示した（表３１）。対照試料のラット血清アルブミンは予想どおり流れ、予想される多量体も生じた。
【表３１】
2012528117.tif 000034
【０３２４】
ｄ）ＢＩＡｃｏｒｅおよび細胞結合のデータを、上記に記載の方法を用いて得た。
【表３２】
2012528117.tif 000035
【０３２５】
実施例６−ＢＩＡｃｏｒｅにおけるｍＡｂ−ｄＡｂエピトープマッピング
エピトープマッピングでは、ダミーフレームワークｍＡｂ−ｄＡｂを用いて、特有の重複エピトープを探した。用いたｍＡｂ−ｄＡｂはＤＭＳ４５０５、４５３８、４５２０、４５４９、４５５２、４５５３、４５５７、４５０３および市販の抗体２Ｂ８であった。ｍＡｂ−ｄＡｂを分析のために２μＭまで希釈した。各ｍＡｂ−ｄＡｂを、全ての配向で別のｍＡｂ−ｄＡｂとペアを形成させ、ＣＭ５チップに結合させたｍｃＫＩＴチップ上に流した。各注入後、このチップの表面をグリシンｐＨ２で再生した。ＤＭＳ４５２０はこのチップに弱く結合し、そのため重要なエピトープマッピングを決定することができなかった。図２６に、エピトープマッピングデータをまとめる。さらに、図２７および２８は、典型的なエピトープマッピングの例を示し、これらのエピトープは特有で、部分的に重複していると考えられた。
【０３２６】
実施例７−完全型のＭＳＤ  ＰＫアッセイによるｍＡｂ−ｄＡｂの順位
ヒト化ＭＬＣ ｍＡｂ−ｃＫＩＴ ｄＡｂのＤＭ５０７１、ＤＭＳ５０７２、ＤＭＳ５０７３、ＤＭＳ５０７４、ＤＭＳ５０７５、ＤＭＳ５０７６、ＤＭＳ５０７７、ＤＭＳ５０７８ならびに親和性成熟ＤＯＭ２８ｈ−０９４分子のＤＭＳ５１０２、ＤＭＳ５１０３、ＤＭＳ５１０４、およびＤＭＳ５１０５を、以下のとおりにＭＳＤ  ＰＫアッセイで流した。
【０３２７】
スポットコーティング緩衝液（スポットコーティング緩衝液＝２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ 番号Ｈ０８８７）＋０．０１５％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００（Ｆｉｓｈｅｒ 番号ＢＰ１５１−５００）＋ＭｉｌｌｉＱ水））中のｃＫＩＴ−Ｈ６（Ｈｉｓタグ付き）を５０μｇ／ｍＬの濃度で１ウェルあたり５μｌを用いて、９６ウェルＭＳＤ標準結合プレート（ＭＳＤ  番号Ｌ１１ＸＡ−６）をスポットコーティングした。プレートを、室温で２０時間（一晩）、層流フードの中で乾燥させた。プレートを、ＰＢＳ（Ｏｘｏｉｄ 番号ＢＲ００１４Ｇ）＋０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｆｉｓｈｅｒ 番号ＢＰＥ３３７）を含む洗浄緩衝液で３回洗浄し、ティッシュペーパー上にブロットした。その後、プレートを、室温で１時間、プレート振盪機で、ＰＢＳ（Ｏｘｏｉｄ 番号ＢＲ００１４Ｇ）＋５％ＢＳＡ （Ｓｉｇｍａ 番号Ａ７０３０）＋１％Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｆｉｓｈｅｒ 番号ＢＰ１５１−５００）からなるアッセイ緩衝液を１ウェルあたり１５０μｌ用いてインキュベートし、非特異的結合を阻止した。プレートを前記のように洗浄した。全ての試験ｍＡｂ−ｄＡｂおよび（陰性対照としてＤＭＳ４５７９およびＤＭＳ４５０３を含む）対照分子を、１０％対照マウス血清（Ｓｅｒａ Ｌａｂｓ 番号Ｓ−８０８−Ｄ）を含むアッセイ緩衝液で、２５００ｎｇ／ｍＬから１：２の連続希釈で１１段階にわたって希釈した。各分子は、１０％マウス血清を含むアッセイ緩衝液のブランク標準物質を含んだ。２５μＬの調製した標準物質をＭＳＤプレートに加えた。各分子分割の３つ組の複製物を、１プレートあたり１つの複製物で、３枚のＭＳＤプレートに流した。その後、プレートを、室温で１時間、プレート振盪機でインキュベートした。プレートを前記のように洗浄し、室温で１時間、プレート振盪機で、アッセイ緩衝液中０．２μｇ/ｍＬの濃度のｖＭＬＣ１−ｓｕｌｆｏｔａｇを１ウェルあたり５０μｌ用いてインキュベートした。（ｓｕｌｆｏｔａｇ ｖＭＬＣ１に対して、このタンパク質を、（製造業者の取扱手順書に従って調製した）５倍モル過剰のＭＳＤ Ｓｕｌｆｏ−ｔａｇ（ＭＳＤ 番号Ｒ９１ＡＮ−１）と反応させ、室温で２時間、暗い引き出しの中でインキュベートし、結合させた。その後、この結合したタンパク質−ｓｕｌｆｏｔａｇ混合物を、製造業者の取扱手順書に従って、Ｚｅｂａ Ｓｐｉｎ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇカラム（Ｐｉｅｒｃｅ 番号８９８９１）に通過させて精製し、この精製した結合混合物を収集し、アッセイに使用するまで４℃で保管した。）プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し、ティッシュペーパーにブロットし、蒸留水で１×まで希釈した界面活性剤（ＭＳＤ 番号Ｒ９２ＴＣ−１）を含むＭＳＤリード緩衝液Ｔを１ウェルあたり１５０μＬ加え、プレートをＭＳＤ Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ６０００を用いてすぐに読み取った。
【０３２８】
データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ４．０２およびマイクロソフトのエクセル２００７を用いて解析した。個々の分子の標準物質の生（データ）の数値を、（図２９に示すように）個々の分子の既知の濃度に対してプロットし、Ｘ＝ＬＯＧ（Ｘ）およびＹ＝ＬＯＧ（Ｙ）変換を適用した後、４ＰＬ非線形回帰モデルを用いて適合させた。その後、各個々の複製物の生の数値を曲線適合に対して内挿し、これらの得られた値を期待される（理論的）濃度のパーセンテージとして表すことによって、この適合の偏差をエクセルで評価した。定量化の下限値（ＬＬＯＱ）を一番低い濃度と決定し、全ての３つの複製物はこの理論的濃度の７０〜１３０％の範囲に入り、定量化の上限値（ＵＬＯＱ）を一番高い濃度と決定し、全ての３つの複製物はこの理論的濃度の７０〜１３０％の範囲に入った。
【０３２９】
ｍＡｂ−ｄＡｂの順位
ＵＬＯＱ（ｎｇ／ｍＬ）、ＬＬＯＱ（ｎｇ／ｍＬ）、ＵＬＯＱの信号対雑音比、ＬＬＯＱの信号対雑音比、一番高い標準物質濃度で得られた数および試験する各ｍＡｂ−ｄＡｂのバックグラウンド数の詳細をまとめの表（表３３）に順に並べた。
【表３３】
2012528117.tif 000036
【０３３０】
各ｍＡｂ−ｄＡｂを、上記で述べた個々のアッセイパラメータで評価し、各々に数値を割り当てた。各々のパラメータについて、最高のＵＬＯＱ、最低のＬＬＯＱ、一番良い信号対雑音比および最適数に１の値を割り当てた（これらのｍＡｂ−ｄＡｂは、許容レベルの範囲に入った）。次に一番良い結果に２などの値を割り当てた。一端全てのｍＡｂ−ｄＡｂがこれらのアッセイパラメータの値を割り当てられると、各々に割り当てられる全ての値の合計が計算される。その後、この合計が１〜１２に順位付けされ、このアッセイにおけるｍＡｂ−ｄＡｂの全体的性能の指標を提供する。最低合計数を有する２重特異性抗体は、許容できるアッセイパラメータに一番合い、全体的に１位に順位付けされるｍＡｂ−ｄＡｂを示した。その後、全ての他の２重特異性抗体を、連続して１２まで順位付けした。結果を表３４に示す。
【表３４】
2012528117.tif 000037
【０３３１】
結論
これらのデータは、試験した他のｍＡｂ−ｄＡｂおよび親のＤＯＭ２８ｈ−９４分子（ＤＭＳ５０７８）と比較した時、親和性成熟ＤＯＭ２８ｈ−９４分子（ＤＭＳ５１０２、ＤＭＳ５１０３、ＤＭＳ５１０４、ＤＭＳ５１０５）がこのアッセイにおいてより優れた性能のｍＡｂ−ｄＡｂであることを示す。この結果はグラフにも反映される（図２９）。親和性成熟ＤＯＭ２８ｈ−９４ ｍＡｂ−ｄＡｂは、このアッセイにおいて最高のシグナルを示した。ＬＬＯＱの信号対雑音比が他のｍＡｂ−ｄＡｂの信号対雑音比よりも非常に高いので、これらも、他のｍＡｂ−ｄＡｂよりも有力であると思われた。これらの分子のバックグラウンド数は、このアッセイの許容できるレベルにあり、他の２重特異性抗体（ＤＭＳ５０７１−ＤＭＳ５０７８）ならびに対照分子（ＤＭＳ４５７９およびＤＭＳ４５０３）に匹敵するレベルであった。対照ｍＡｂ−ｄＡｂのＤＭＳ４５７９およびＤＭＳ４５０３は、これらの分子に対して期待されたとおり、バックグラウンドレベルの数値を与えた（かつ平らなラインの曲線が生じた）。試験した全ての他のｍＡｂ−ｄＡｂは、親和性成熟ＤＯＭ２８ｈ−９４分子のシグナルよりの低いシグナルを与えたが、シグナルのレベルは、これらのｍＡｂ−ｄＡｂ間で非常に変動した。これらの分子のバックグラウンド数は期待されるレベルであった。
【０３３２】
実施例８−ｍＡｂ−ｄＡｂの内部移行特性を評価する免疫蛍光法
ダミーｍＡｂ−ｃ−ｋｉｔ−ｄＡｂを、以下の方法を用いて内部移行について調べた。８ウェルチャンバースライド（Ｌａｂ ＴＥＫ−ＩＩ 番号１５４５３４）を１Ｍ ＨＣＬで洗浄し、その後、ｄＨ２０で２回洗浄した。その後、これらのチャンバースライドを０．０５％ポリ−Ｌ−リシン（Ｓｉｇｍａ 番号Ｐ４７０７）でコーティングし、室温で２０分間インキュベートした。このポリ−Ｌ−リシンを吸引し、これらのチャンバーを５５〜６０℃で３０分間、オーブンの中で乾燥させ、その後、２日間だけ４℃で保管した。その後、ＭＣ／９細胞を、１ウェルあたり１．２Ｘ１０６細胞でこのコーティングチャンバーに播き、５％ＣＯ２、３７℃で２〜３時間インキュベートした。その後、この培地をこれらのチャンバーから吸引し、これらの細胞を、最終濃度が１００ｎＭになるまで培地で希釈したｍＡｂ ｄＡｂ＋／−マウス幹細胞因子（ｍＳＣＦ）１μｇ／ｍｌと、５％ＣＯ２、４℃または３７℃で３０分間インキュベートした。
【０３３３】
その後、これらの細胞を、室温で１０分間、ＰＢＳ中２％ホルムアルデヒドで固定し、その後、約７〜８分間、５％ＦＣＳ／ＰＢＳで２回洗浄／ブロッキングを行った。その後、これらのｍＡｂ−ｄＡｂを、透過処理のために、０．２％サポニンを含む５％ＦＣＳ／ＰＢＳで１：２００に希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ Ａｌｅｘａ ４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ 番号Ａ１１０１３）を（１ウェルあたり１００μｌ）用いて検出し、暗い所で最低３０分間インキュベートした。その後、この抗体混合物を吸引し、これらの細胞を、室温で最低５分間、１μｇ／ｍｌのＤＡＰＩ （４’６−ジアミジノ−２−フェニルインドールジヒドロ２塩酸塩 Ｓｉｇｍａ 番号Ｄ８４１７）を含むＰＢＳで洗浄した。
【０３３４】
その後、洗浄液を吸引し、製造業者から供給される装置を用いて、これらのチャンバーウェルを除去した。ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ Ｇ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号０１００−０１）の大滴、４ウェル間で１００μｌをこのスライドに加え、大きなカバースリップ（２２ｍｍ×５０ｍｍ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＵＫ カタログ番号５４７７６３０）このスライドの上部で反転させた。このカバースリップを透明なマニキュア液で密封し、ライカ社のＳＰ２共焦点顕微鏡でこれらのスライドの画像を取得した。
【０３３５】
結果−ダミーＩｇＧおよびｃＫＩＴ  ｄＡｂ分子の内部移行特性の研究
染色パターンの例を図３０に示す。この画像は、細胞表面染色（ＣＳ）を示した細胞、細胞表面染色および細胞内染色の両方（ＣＳ＆ＩＣ）を示した細胞、ならびに細胞内染色（ＩＣ）のみを有する細胞の代表例を示す。
【表３５】
2012528117.tif 000038
【０３３６】
実施例９−ｍＡｂ−ｄＡｂの内部移行特性を評価するためのフローサイトメトリーの方法
ＭＣ／９細胞数を数え、この細胞を１００μｌの培地に１×１０６で再懸濁し、ｖ底の９６ウェルプレートに加え、再び遠心分離して沈殿させた。この培地を吸引し、その後、これらの細胞を５００ｎＭのｍＡｂ−ｄＡｂ＋／−１μｇ／ｍｌのｍＳＣＦを含む１００μｌの培地に再懸濁した。親和性成熟クローンを５０ｎＭで試験した。その後、これらの細胞を、４℃で３０分間、３７℃で３０分間、または３７℃で６０分間のいずれかでインキュベートした。その後、これらの細胞を遠心分離して沈殿させ、１ウェルあたり２００μｌの５％ＦＣＳ／ＰＢＳで２回洗浄した。全ての洗浄ステップを氷上で行い、さらなる内部移行を防いだ。その後、さらにブロッキングするために、これらの細胞を氷上で２０分間、１ウェルあたり２００μｌの５％ＦＣＳ／ＰＢＳでインキュベートした。その後、ブロッキングステップ後に、これらの細胞を遠心分離して沈殿させ、１：１０００希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ Ａｌｅｘａ ４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ 番号Ａ１１０１３）を含む１００μｌのＰＢＳと、せいぜい４０分間氷上でインキュベートした。その後、ＢＤ Ｃａｎｔｏ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）で（データを）取得するために、これらの細胞をＰＢＳで１回洗浄し、１００μｌのＰＢＳに再懸濁した。
【０３３７】
結果−２重特異性ヒト化抗ＭＬＣ ｍＡｂ ｃＫＩＴ−ｄＡｂ分子の内部移行特性の研究
表３６は、３７℃で３０分後および６０分後にｍＡｂ−ｄＡｂに結合するパーセンテージを示す（結合％を、４℃で観察される結合と比較する）。
【表３６】
2012528117.tif 000039
【０３３８】
上の表は、ＭＦＩが４℃でｍＡｂｄＡｂに結合することを示す（第２のカラム）。３７℃における３０分後または６０分後に結合する相対的レベルを、それぞれ第３および第４のカラムでの４℃の結合と比較したパーセンテージの値として示す。１００％結合は、３７℃における３０分後または６０分後のｍＡｂｄＡｂの細胞表面レベルが、４℃で観察されるレベルと同じであることを示す。１００％未満の値はいずれも、ｍＡｂｄＡｂの細胞表面レベルが減少したことを示し、内部移行が起きた可能性を示す。１００％を超える値はいずれも、３７℃において時間が増えた後、細胞表面レベルが増加し、それゆえに、ｍＡｂｄＡｂが内部移行しなかったことを示す。
【０３３９】
１００％を下回って観察される結合の全てを、影付きのセルで強調させる。細胞表面結合の減少は、この分子が内部移行することを示す。ＤＭＳ５０７３、５０７４、５０７６は、３７℃における３０分間後にシグナルのせいぜいな減少を示す。ＤＭＳ５０７５は、大きな減少示す。未処理の分子の全て（ＤＭＳ５０７１〜ＤＭＳ５０７８）は、３７℃における６０分後に結合の減少を示すが、ＤＭＳ５０７５のみ結合の大きな減少を示す。親和性成熟分子のいずれも、３７℃における３０分間または６０分間のいずれか一方でのインキュベーション後にいかなる結合の減少も示さない。
【０３４０】
実施例１０−インビボでのマウス研究
プロトコール：
１．骨髄（ＢＭ）の単離、標識および注射
３〜４月齢の野生型Ｂ６．１２９Ｓｖ−Ｇｔｒｏｓａ２６（Ｒｏｓａ−２６）（Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ Ｇ,Ｓｏｒｉａｎｏ Ｐ.Ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｔｒａｐｓ ｉｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：ａ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｃｒｅｅｎ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ａｎｄ ｍｕｔａｔｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｍｉｃｅ.Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ.１９９１ Ｓｅｐ：５（９）：１５１３−２３）マウスまたは他の遺伝子操作したマウスを、イソフルレンまたはネンブタールを投与することによって安楽死させる。大たい骨を除去し、筋肉および組織（ｅｘｔｒａｏｓｓｉａｌ ｔｉｓｓｕｅ）を取り除く。この骨を、幅を細く、幅を太く切断し、２６Ｇの針および１ｍｌの注射器を用いて、この骨髄細胞を、２％牛血清アルブミンを含む氷冷したリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）ですすぐ。細胞ペレットをすすぎ、４０μｍのナイロンフィルターでろ過する。これらの細胞ペレットを洗浄し、ＰＢＳに再懸濁し、トリパンブルーおよび血球計数器を用いて細胞濃度を計算する。
【０３４１】
骨髄細胞を、ＭＲＩ画像診断のためにＦｅｒｉｄｅｘ（極小超常磁性酸化鉄（ｕｌｔｒａｓｍａｌｌ ｓｕｐｅｒｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ ｉｒｏｎ ｏｘｉｄｅ））で標識し、２重特性抗体とインキュベートし、心外傷（すなわち、虚血−再灌流または永続的な心筋梗塞）を患っているレシピエントマウスに注射することができる。
【０３４２】
２．ＢＭのＦｅｒｉｄｅｘ標識
Ｆｅｒｉｄｅｘ（２５μｇ／ｍｌ）（Ｂｅｒｌｅｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、ポリ−Ｌ−リシン（３０ｎｇ／μｌ）（Ｓｉｇｍａ）と２時間インキュベートする。その一方で、骨髄細胞を収集し、ＰＢＳですすぎ、ダルベッコ変法イーグル培地＋１％ペニシリンおよびストレプトマイシンに再懸濁する。２時間後、Ｆｅｒｉｄｅｘ／ＰＬＬ溶液をこれらの細胞に加え、その後、３７℃で一晩（最高で２４時間）、５％ＣＯ２でインキュベートした。その後、これらの細胞をすくい取ってフラスコから取り除く。
【０３４３】
鉄取り込みを、プレートベースアッセイのＱｕａｎｔｉｃｈｒｏｍ Ｉｒｏｎ Ａｓｓａｙキット（ＢｉｏＡｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号 ＤＩＦＥ−２５０）を用いて定量化する。少なくとも２０ｐｇ／ｃｅｌｌの鉄含有量は、ＭＲＩによる後の検出に十分であると考えられる。
【０３４４】
３．２重特異性抗体での骨髄細胞標識
ドナーマウスの骨髄細胞（Ｒｏｓａ−２６もしくは他の遺伝子操作したマウスのいずれか一方）、または野生型マウスのＦｅｒｉｄｅｘ標識細胞を、エキソビボで２重特異性抗体（ｃ−ｋｉｔ Ｘ ＭＬＣ）とインキュベートし、レシピエントマウスに全身注射する。簡単に説明すると、骨髄細胞を４℃で１時間、ＰＢＳ中の抗体（５００ｎｇ−１５μｇ／１０７細胞）とインキュベートする。細胞を１０ｍｌ以上のＰＢＳですすぎ、遠心分離して、２ｍｌのＰＢＳに再懸濁し（すなわち、最終濃度＝１千万／２００μｌ）、使用するまで氷上で保持する。
【０３４５】
未処置の対照については、Ｒｏｓａ−２６マウスまたは野生型マウス、Ｆｅｒｉｄｅｘ標識マウスの骨髄細胞を収集し、すすぎ、数を数え、再懸濁して、最終濃度を１千万細胞にする。
【０３４６】
４．骨髄細胞の全身注射
骨髄細胞を、虚血−再灌流／冠動脈結紮の直後に、または１〜７日後のいずれかの日に、尾静脈または頸静脈注射により野生型レシピエントマウスに注射する（マウス１匹あたりＰＢＳ２００μｌ体積中１０７細胞）。
【０３４７】
５．虚血−再灌流モデル
マウスをネンブタール（６０ｍｇ／ｋｇ０．６ｍｌ ｉｐ）（Ｈａｎｎａ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｕｐｐｌｙ Ｃｏｍｐａｎｙ）で麻酔し、剪毛し、その後、防腐剤（ベタジン、Ｐｕｒｄｕｅ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ＬＰ,Ｓｔａｍｆｏｒｄ,ＣＴおよび７０％アルコール）を手術部位に塗りつける。動物を仰向けに置き、気管をＰＥ−９０管で挿管する。カニューレを、げっ歯類の人工呼吸器（Ｈａｒｖａｒｄ ａｐｐａｒａｔｕｓ）に取り付け、１０５／分の速度で、０．５ｍｌの体積で流れる部屋の空気に酸素を供給する（１Ｌ／分）。体温をＴ／ポンプ熱パッドにより維持する。胸腔を正中線の右または左の開胸に侵入させる。８−０縫合糸を左の冠動脈前下行枝の下を通過させ、バルーン閉鎖器（ｂａｌｌｏｏｎ ｏｃｃｌｕｄｅｒ）を動脈に適用する。心筋虚血および再灌流を膨張により引き起こし、その後、バルーン閉鎖器から空気を抜く。冠動脈閉塞および再灌流の実行が成功したことを、心筋の頂端部の蒼白および典型的なＥＣＧ変化によって検証する。残気および体液を排出するために、胸の管を胸腔に挿管する。切り口を、５−０縫合糸を用いて皮（筋肉および皮膚）を閉じ、胸を閉じた後、胸の管を取り除く。
【０３４８】
６．心筋梗塞モデル
ＭＩ誘導心不全モデルについては、再灌流が生じることなく、冠動脈（ＬＡＤ、左の下行前動脈、または他の冠動脈）を永続的に結紮することを除いて、上記の虚血性再灌流の手順と同様の外科的処置を用いる。
【０３４９】
７．Ａｂの全身注射
マウスを、効果があらわれるまでインフルレンによって麻酔する。Ａｂの全身注射を３０Ｇの針１ｃｃシリンジ（２００μｌ／マウス）を用いて頸動脈または尾静脈に直接注射することによって行う。
【０３５０】
８．機能解析および組織学的解析
研究の完了時に、マウスの心臓機能をＭＲＩによって評価する。Ｆｅｒｉｄｅｘ標識細胞を受け取るマウスにおいて、ＭＲＩも用いて、インビボで標識細胞を追跡する。機能解析の完了時に、マウスを屠殺し、心臓（ならびに、肝臓、肺および脾臓を含む他の臓器）を摘出し、エキソビボＭＲＩまたは組織学的検査および免疫組織化学検査のいずれか一方のために処置する。心臓の組織学的解析を用いて、この梗塞部位において取り込まれたＦｅｒｉｄｅｘ標識の梗塞面積または梗塞範囲を（パール染色（Ｐｅｒｌ’ｓ ｓｔａｉｎｉｎｇ）によって）測定してもよい。心臓部分の免疫組織化学を利用して、異なる遺伝的起源のドナー細胞を検出し（例えば、Ｒｏｓａ−２６細胞を、βガラクトシダーゼタンパク質の免疫染色によって検出することができる）、梗塞に（および他の臓器にも）ホーミングする抗体を同定し、心筋細胞、内皮細胞および平滑筋細胞を含む心筋細胞型へのドナー細胞の分化を評価してもよい。ＰＣＲも用いて、他の組織へホーミングする異なる遺伝的起源のドナー細胞を同定し、潜在的安全性の問題および的外れの効果を評価してもよい。
【０３５１】
９．超音波（心エコー検査）
心エコー検査を、Ｗｙａｔｔら（“Ｃｒｏｓｓ ｓｅｃｔｉｏｎａｌ Ｅｃｈｏｃａｒｄｉｏｇｒａｐｈｙ Ｉ：ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ ｍａｓｓ ｏｆ ｔｈｅ ｌｅｆｔ ｖｅｎｔｒｉｃｌｅ ｉｎ ｄｏｇｓ”；Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ,Ｖｏｌ ６０,Ｎｏ ５,ｐｐ１１０４−１１１３,Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９７９）およびＷｙａｔｔら（“Ｃｒｏｓｓ ｓｅｃｔｉｏｎａｌ Ｅｃｈｏｃａｒｄｉｏｇｒａｐｈｙ ＩＩ：ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｆｏｒ Ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ Ｖｏｌｕｍｅ ｏｆ ｔｈｅ ｆｏｒｍａｌｉｎ−ｆｉｘｅｄ ｌｅｆｔ ｖｅｎｔｒｉｃｌｅ”；Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｖｏｌ ６１,Ｎｏ ６,ｐｐ１１１９−１１２５,Ｊｕｎｅ １９８０）によって以前に報告されたとおりに行う。
【０３５２】
１０．インビボの心臓磁気共鳴画像診断
マウスを、１Ｌ／分の流速で１．５〜２．０％のイソフルレン／医療用空気混合を用いて麻酔する。内径２．９ｃｍの伝達／受け取りコイルを用いる９．４Ｔｖｅｒｔｉｃａｌ ｂｏｒｅ ｍａｇｎｅｔ（Ｂｒｕｋｅｒ Ｂｉｏｓｐｉｎ；Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ,ＭＡ）で、インビボ心臓磁気共鳴画像診断を行う。Ｌａｒｓｏｎら（Ｍａｇ Ｒｅｓ Ｍｅｄ ５１：９３−１０２（２００４））、Ｋｅｌｌｍａｎら（Ｍａｇ Ｒｅｓ Ｍｅｄ ５９：７７１−７７８（２００８）およびＵｒｉｂｅら（Ｍａｇ Ｒｅｓ Ｍｅｄ ５７：６０６−６１３（２００７）に記載のナビゲーターエコーを用いる同様のアプローチを用いて、インビボＭＲＩを、ワイヤレス自己ゲーティングｉｎｔｒａｇａｔｅシーケンスを用いて行う。
【０３５３】
マウスの心臓の長軸面および短軸面を得るために、グラディエントエコー法のスカウト画像を取得する。トリパイロット（ｔｒｉ−ｐｉｌｏｔ）スカウトシーケンス画像診断パラメータは以下のとおりである；ＴＥ／ＴＲ＝１．２／６７．５ｍｓ、ＦＯＶ＝４０ｍｍ×４０ｍｍ、行列＝１２８×１２８、フリップ角＝１５度、スライス厚＝１ｍｍ、１０スライス／直交面、１０反復、ＴＡ＝１：２６秒。
【０３５４】
このスカウトシーケンスの完了時に、長軸（冠状および矢状）および短軸（軸）のグラディエントエコー画像をマウスの心臓を貫いて取得する。このグラディエントエコーシネ画像を、以下のパラメータを用いて取得する；ＴＥ／ＴＲ＝１．８／６．８ｍｓ、ＦＯＶ＝２５ｍｍ×２５ｍｍ、行列＝１２８×１２８、フリップ角＝１０度、スライス厚＝１ｍｍ、２５０反復、ＴＡ＝３：３９秒。インビボ解像度は約１９５ミクロンであった。画像は心臓周期あたり１０段階を用いて再構築した。心臓機能（ＥＦ％、ＥＤＶ、ＥＳＶ、ＳＶ、ＣＯ）および形態（ＬＶ Ｍａｓｓ）の画像解析を、Ａｎａｌｙｚｅ ８．１ソフトウェアパッケージ（ＡｎａｌｙｚｅＤｉｒｅｃｔ,Ｌｅｎｅｘａ ＫＳ）を用いて行う。画像診断の完了時に、マウスを磁石から取り除き、部屋の空気を吸えるように回復させる。
１１．エキソビボ心臓磁気共鳴画像診断
マウスの心臓を切除し、（過剰の血液を除去するために）リン酸緩衝食塩水ですすぎ、１０％ホルマリン溶液ですぐに保管する。エキソビボ画像診断のために、心臓を内径８ｍｍのガラス管に入れ、０．２％のＧｄを添加した水溶液に懸濁する。内径１０ｍｍの伝達／受け取り体積コイルを用いる９．４Ｔｖｅｒｔｉｃａｌ ｂｏｒｅ ｍａｇｎｅｔ（Ｂｒｕｋｅｒ Ｂｉｏｓｐｉｎ；Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ,ＭＡ）で、エキソビボ心臓磁気共鳴画像診断を行う。グラディエントエコーのトリパイロットスカウト画像を、以下の画像診断パラメータを用いて取得する；ＴＥ／ＴＲ＝６／２６６ｍｓ、ＦＯＶ＝２０ｍｍ×２０ｍｍ、行列＝１２８×１２８、フリップ角＝３０度、スライス厚＝１ｍｍ、８スライス／直交面、ＮＥＸ＝１、１５６ミクロン解像度、ＴＡ＝０：３４秒。
【０３５５】
スカウト画像診断の完了時に、スピンエコーおよびグラディエントエコー画像を、冠状平面および軸平面の両方において取得する。スピンエコーシーケンスパラメータは以下の通りである；ＴＥ／ＴＲ＝１０．５／２０００ｍｓ、ＦＯＶ＝１０ｍｍ×１０ｍｍ、行列＝２５６×２５６、スライス厚＝０．３ｍｍ、ＮＥＸ＝４、３９ミクロン解像度、ＴＡ＝３４：０８秒。グラディエントエコーシーケンスパラメータは以下の通りである；ＴＥ／ＴＲ＝３．２／５００ｍｓ、ＦＯＶ＝１０ｍｍ×１０ｍｍ、行列＝２５６×２５６、スライス厚＝０．３ｍｍ、ＮＥＸ＝３２、３９ミクロン解像度、ＴＡ＝１時間８分１６秒。
【０３５６】
Ｔ２＊マルチ−グラディエントエコー画像（ＭＧＥ）を、心筋中の鉄沈着細胞を貫いた単一スライス上で取得する。このｍｇｅシーケンスパラメータは以下のとおりである；第１のエコー＝２．５５ｍｓ、エコー画像数＝１２、エコー距離＝２．５５ｍｓ、ＴＲ＝５００ｍｓ、ＦＯＶ＝１０ｍｍ×１０ｍｍ、行列＝２５６×２５６、スライス厚＝０．３ｍｍ、ＮＥＸ＝３２、３９ミクロン解像度、ＴＡ＝５１：１２秒。心臓の鉄シグナルの画像解析を、Ａｎａｌｙｚｅ ８．１ソフトウェアパッケージ（ＡｎａｌｙｚｅＤｉｒｅｃｔ,Ｌｅｎｅｘａ ＫＳ）を用いて行う。この画像診断の完了時に、パール染色による鉄の組織学的確認のために、心臓を磁石から取り除く。
【０３５７】
結果：
１．２価抗体を用いたエキソビボ処理後の梗塞心臓への骨髄細胞のホーミングの増加
全骨髄細胞を、遺伝的標識ＲＯＳＡ−２６マウス（その中の各細胞はβガラクトシダーゼタンパク質をコードするｌａｃＺ遺伝子を発現する）から抽出した。骨髄細胞を、４℃で１時間、２価抗体コンストラクトｃ−ｋｉｔ×ＭＬＣ−１で処理した。この実験において、この２価コンストラクトは、Ｓｅｎ ｅｔ ａｌ.Ｊ.Ｈａｅｍｏｔｈｅｒ.Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ.２００１,Ａｐｒ：１０（２）：２４７−６０（２００１）に記載の化学リンカーを用いて、抗ＭＬＣ抗体（３９−１５ｍＡｂ（ＡＴＣＣ ＨＢ１１７０９））に結合した抗ｃ−ｋｉｔ抗体（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄから入手した、クローン２Ｂ８）であった。野生型宿主（レシピエント）マウスを３０分間冠動脈結紮し、虚血を誘導した。再灌流の際、処理した骨髄細胞（または未処理の対照細胞）を、これらの宿主マウスの頸静脈に注射した（マウス１匹あたり２００μｌの生理食塩水中１千万細胞）。組織学的解析のために、５日後、これらの宿主マウスを屠殺し、それらの心臓を摘出した。心筋梗塞領域を貫く切片を免疫染色し、βガラクトシダーゼ陽性（β−ｇａｌ＋）ドナー骨髄細胞を検出し、それらの細胞を盲検方式で定量化した。病変部位におけるβ−ｇａｌ＋細胞／細胞総数のパーセンテージは、対照群では１０．８９±０．８３であり対する処理細胞群では２４．７３±３．５０であった。この解析は、処理細胞の梗塞領域へのホーミングが、未処理細胞のホーミングと比較して２倍を超えて増加した（ｐ＜０．０５）ことを明らかにした。したがって、これらのデータは、これらの細胞の２価抗体による処理が、心筋損傷の部位へホーミングする（かつその部位で保持される）能力を増加させることを示す。
【０３５８】
２．Ｇ−ＣＳＦによるｃ−ｋｉｔ陽性細胞の動員
マウスのＧ−ＣＳＦ処置（ニューポジェン、１００μｇ／ｋｇ／日）が、骨髄からの動員により血液中のｃ−ｋｉｔ陽性細胞のレベルの増加をもたらすことを示した。４日の処置は、血液中のｃ−ｋｉｔ陽性細胞において８．６倍の増加をもたらす。
【０３５９】
３．２価抗体（ｂｉＡｂ）の心筋梗塞部位へのホーミング
心筋梗塞後の２価抗体の送達の至適時期を調べるために、一組の野生型マウスにおいて永続的な冠動脈結紮を行い、心筋梗塞を誘導した。結紮後、様々な時点で（１、３および７日後）、この２価抗体を全身送達し、１時間循環させた。１時間後、これらのマウスを屠殺し、これらの心臓を摘出し、免疫組織化学染色をし、この２価抗体を検出した。ＭＩ後１日目に、この抗体を受け取ったマウスの梗塞領域において、最も高いレベルの抗体結合がみられた。３日目にこの抗体を受け取ったマウスにおけるレベルは低く、心筋梗塞後７日目にこの抗体を受け取ったマウスにおいて抗体はほとんど検出されなかった。したがって、この抗体の送達の至適時点（すなわち、ほとんどのＭＬＣが、心筋損傷部位に暴露される時）は、梗塞後１〜２日目でありそうである。
【０３６０】
４．ｂｉＡｂのインビボ送達は、ＭＩ後の心臓機能を改善する。
【０３６１】
この２価の抗体が心筋梗塞モデルの心臓機能を改善することができるか否かを調べることを望んだ。臨床規範を再現するために、永続的な冠動脈結紮の最初の３日間、マウスをＧ−ＣＳＦ（ニューポジェン、１００μｇ／ｋｇ／日、または対照は生理食塩水）で処置した。結紮２日後、この２価抗体を頸静脈より送達した（１５μｇ／マウス；対照Ａｂ（ＭＬＣ Ａｂのみ）＝７．５μｇ／マウス）。４つの処置グループ：１）模擬手術＋媒体処置；２）冠動脈結紮＋媒体処置；３）冠動脈結紮＋Ｇ−ＣＳＦ＋対照抗体（ＭＬＣ ｍＡｂのみ）；および４）冠動脈結紮＋Ｇ−ＣＳＦ＋２価抗体のうちの１つに、１２７匹のマウスをランダムに割り当てた。心臓機能を評価するために、ＭＩ後２週目、４週目および１２週目にＭＲＩ分析を行った。結果は以下のとおりであった。それを表３７Ａ〜Ｃにまとめる。
【表３７Ａ】
2012528117.tif 000040
【０３６２】
【表３７Ｂ】
2012528117.tif 000041
【０３６３】
【表３７Ｃ】
2012528117.tif 000042
【０３６４】
ａ．生存：
４つのグループの生存において、有意差は見られなかった。（この研究の開始から７週目における生存：グループ１＝９／９；グループ２＝２３／３６；グループ３＝２７／３４；グループ１＝２４／３８、ｐ＝ｎ．ｓ．）
ｂ．体重：
４つのグループの体重において、有意差は見られなかった。
【０３６５】
ｃ．駆出率（ＥＦ）：
（ＭＲＩによって測定した）ＥＦは、ＭＩ後２週目において、模擬対照（グループ１）と比較してグループ２のマウスで有意に低下した。グループ３のマウスは、比較的低下したＥＦを示した（ステューデントｔ検定によるグループ３のＥＦ対グループ２のＥＦ：ｐ＝ｎ．ｓ．）。しかし、この２価の抗体を与えたマウス（グループ４）は、対照抗体を与えたマウスと比較して、ＭＩ後２週目のＥＦにおいて有意な改善（それぞれグループ３；３８．１％対３１．５％、ｐ＜０．０５）を示したことは、この２価抗体の有益な効果を示唆した。特に、ＭＩ後４週目および１２週目のＭＲＩ分析は、この２価抗体の機能的利点がこれらのより遅い時点において維持されたことを示し、この処置の長期間の効果を示唆した。
【０３６６】
ｄ．比体重に対する左心室質量（ＬＶＭ：ＢＷ）：
ＬＶＭ：ＢＷは、心外傷に対する肥大性反応の指標である。ＥＦと対比して、ＬＶＭ：ＢＷは、予想通り、グループ１に対してグループ２において増加した。この比は、グループ３および４においても上昇したが、グループ４は平均のＬＶＭ：ＢＷ比を示し、グループ３と比較して有意に低下したことは、２価抗体処置マウスにおける肥大性反応の減弱を示し、これらのマウスにおいて心外傷が少ない可能性を示唆した。ＥＦに関しては、ＭＩ後２週目に得られた結果は、４週目および１２週目に得られた結果と同様であった。この研究の最後に行った血漿のバイオマーカー分析は、肥大性マーカーｐｒｏ−ＡＮＰが、グループ１に対してグループ２、３および４においてレベルの増加の傾向を示し、グループ４におけるレベルはグループ２および３に対して低下の傾向を示すことを示した。
【０３６７】
ｅ．梗塞面積：
ＭＩ後２週目のＭＲＩスキャンを用いて、（すなわち、乳頭中央切片における無動の心外膜の割合を決定することによって）梗塞面積の代替マーカーを得た。このデータは、梗塞面積はグループ２および３において同程度であるが、グループ３に対してグループ４では有意（ｐ＜０．０５）に低下したことを示し、この２価抗体処置が心保護的であることを示唆した（ＥＦデータと一致した）。
【０３６８】
ｆ．（ＭＲＩによる評価の）心臓機能およびリモデリングの他のマーカー：
収縮末期容量および拡張末期容量（心室拡張の指標）は、グループ２および３に対してグループ４において改善の傾向を示した。
【０３６９】
ｇ．組織診断：
この研究の最後に行った心臓切片の組織学的解析は、グループ４と比較してグループ３のマウスの心臓の梗塞領域を囲む境界部において小さな毛細血管の数の増加（おそらく、新生血管、血管内皮マーカーのフォン・ヴィルブランド因子およびマウス内皮細胞抗原の陽性）、ならびにグループに対してグループ４ではさらなる増加傾向を明らかにした。このことは、Ｇ−ＣＳＦ処置は血管形成の増加に関与し得るが、この２価抗体の添加は新しい血管形成をさらに高め得ることを示唆する。
【０３７０】
これらのデータをまとめると、対照抗体での処置と比較して、２価抗体の処置は心臓機能を改善し、心筋梗塞後の有害なリモデリングを衰えさせることができることが示唆される。さらに、これらの有益な効果は、梗塞後少なくとも３カ月間は維持される。
【０３７１】
本発明は、特に、本発明の実施形態を示し、本発明の実施形態に関して記載したが、添付の特許請求の範囲によって包含される本発明の範囲から逸脱することなく、本発明の中で、形態および詳細において様々な変更が行われ得ることを当業者は理解するであろう。
【図１−１】
2012528117.tif 000043
【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
2012528117.tif 000047
【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図５−６】
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【図５−７】
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【図６Ａ−１】
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【図６Ａ−２】
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【図６Ａ−３】
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【図６Ａ−４】
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【図６Ａ−５】
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【図６Ａ−６】
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【図６Ａ−７】
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【図６Ａ−８】
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【図６Ａ−９】
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【図６Ｂ−１】
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【図６Ｂ−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図９ｃ】
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【図１０】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2012528117.tif 000079
【図１６Ａ−１】
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【図１６Ａ−２】
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【図１６Ａ−３】
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【図１６Ａ−４】
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【図１６Ｂ−１】
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【図１６Ｂ−２】
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【図１６Ｂ−３】
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【図１７Ａ−１】
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【図１７Ａ−２】
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【図１７Ｂ−１】
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【図１７Ｂ−２】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２０−３】
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【図２０−４】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２５−３】
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【図２５−４】
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【図２５−５】
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【図２５−６】
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【図２５−７】
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【図２５−８】
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【図２５−９】
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【図２５−１０】
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【図２５−１１】
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【図２５−１２】
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【図２５−１３】
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【図２５−１４】
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【図２５−１５】
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【図２５−１６】
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【図２５−１７】
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【図２５−１８】
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【図２５−１９】
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【図２５−２０】
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【図２５−２１】
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【図２５−２２】
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【図２５−２３】
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【図２５−２４】
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【図２５−２５】
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【図２５−２６】
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【図２５−２７】
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【図２５−２８】
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【図２５−２９】
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【図２５−３０】
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【図２５−３１】
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【図２５−３２】
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【図２５−３３】
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【図２５−３４】
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【図２５−３５】
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【図２５−３６】
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【図２５−３７】
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【図２５−３８】
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【図２５−３９】
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【図２５−４０】
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【図２５−４１】
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【図２５−４２】
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【図２５−４３】
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【図２５−４４】
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【図２５−４５】
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【図２５−４６】
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【図２５−４７】
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【図２５−４８】
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【図２５−４９】
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【図２５−５０】
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【図２５−５１】
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【図２５−５２】
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【図２５−５３】
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【図２５−５４】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１−１】
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【図３１−２】
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【図３１−３】
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【図３１−４】
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【図３１−５】
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【図３１−６】
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【図３１−７】
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【図３１−８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年1月26日(2012.1.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞特異的マーカー分子に結合する第１の薬剤および組織特異的マーカー分子に結合する第２の薬剤を含む抗原結合コンストラクトであって、前記第１または第２の薬剤が、免疫グロブリン単一可変ドメインであるエピトープ結合ドメインである、抗原結合コンストラクト。
【請求項２】
前記組織特異的マーカーが筋肉特異的マーカー分子である、請求項１に記載のコンストラクト。
【請求項３】
前記組織特異的マーカーが心筋特異的マーカー分子である、請求項２に記載のコンストラクト。
【請求項４】
前記第１または第２の薬剤がモノクローナル抗体である、請求項１〜３のいずれかに記載のコンストラクト。
【請求項５】
前記幹細胞特異的マーカー分子がｃ−Ｋｉｔである、請求項１〜４のいずれかに記載のコンストラクト。
【請求項６】
前記筋肉特異的マーカー分子が、ミオシン軽鎖（ＭＬＣ）、心臓ミオシン、ヒト心室ミオシン軽鎖１（ｖＭＬＣ１）、ＭＬＣ１、ＭＬＣ２およびＭＬＣ３を含むミオシン由来の分子、心臓トロポニンＩ、心臓トロポニン、テネイシンＣまたはクレアチンキナーゼからなる群から選択される、請求項１〜５のいずれかに記載のコンストラクト。
【請求項７】
筋肉特異的マーカー分子に結合する前記薬剤が抗ＭＬＣ抗体である、請求項６に記載のコンストラクト。
【請求項８】
前記抗ＭＬＣ抗体がＡＴＣＣ ＨＢ １１７０９から入手できるモノクローナル抗体である、請求項７に記載のコンストラクト。
【請求項９】
前記第１の薬剤が抗ｃ−Ｋｉｔモノクローナル抗体であり、前記第２の薬剤が抗ＭＬＣモノクローナル抗体である、請求項１〜８のいずれかに記載のコンストラクト。
【請求項１０】
ＭＡｂｄＡｂである、請求項１〜９のいずれかに記載のコンストラクト。
【請求項１１】
前記第１の薬剤が抗ｃ−Ｋｉｔ免疫グロブリン単一可変ドメインであり、前記第２の薬剤がモノクローナル抗ＭＬＣ抗体である、請求項１０に記載のコンストラクト。
【請求項１２】
ｃ−Ｋｉｔに結合する前記エピトープ結合ドメインが、配列番号３０２〜３０５、４５７、４５８または４８２のいずれかに示すアミノ酸を有する免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチドである、請求項１〜１１のいずれかに記載のコンストラクト。
【請求項１３】
前記抗ＭＬＣ抗体が、ヒト心室ミオシン軽鎖１（ｖＭＬＣ１）に結合し、かつ配列番号２２、２５、２８もしくは３１から選択されるＶＨドメインおよび配列番号３４、３７もしくは４４０から選択されるＶκドメインを含む抗原結合タンパク質もしくは抗体、またはＣＤＲ３に１、２もしくは３個のアミノ酸置換を含むその変異体である、請求項１〜１２のいずれかに記載のコンストラクト。
【請求項１４】
配列番号３９〜８７、２２４〜２４６、２７０〜２８２、２９７〜３００、３８３〜３８４または４７６のいずれかに示す配列を有する核酸によってコードされる少なくとも１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含み、かつｃ−Ｋｉｔに結合する抗ｃ−Ｋｉｔ免疫グロブリン単一可変ドメインを含む、単離ポリペプチド。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれかに記載のコンストラクトまたは請求項１４に記載のポリペプチドを投与することを含む、心臓疾患を治療する方法。
【国際調査報告】
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