(57)【要約】  本発明は生体分子を単離する方法に関する。さらに詳しく言えば本発明は、抗体（ｍＡｂ）及び抗体フラグメント（Ｆａｂ）を含む関連タンパク質を単離する方法であって、これらが正かつ比較的疎水性であり、負荷電ポリマーと反応してポリマー−タンパク質複合体の沈殿を形成するような条件下で実施される方法に関する。単離は、様々な分子量のポリアクリル酸又はカルボキシメチルデキストランポリマーのような安価で生体適合性の負荷電ポリマーを沈殿剤として用いて達成できる。それは、広いｐＨ範囲にわたって比較的高いポリマー濃度（例えば、１０％）並びに高い塩濃度（＞５０ｍＭ）及び導電率（例えば、＞１０ｍＳ／ｃｍ）で行われる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体分子を単離する方法であって、
（ａ）前記生体分子を含む水性試料を用意する段階、
（ｂ）水性試料を塩の存在下で負荷電ポリマーと混合する段階であって、前記ポリマーが生体分子と選択的に複合体化して凝集することで生体分子を含む沈殿の混合物を形成するような条件下で実施される段階、
（ｃ）水性液体から生体分子沈殿を分離する段階、及び
（ｄ）生体分子を再懸濁緩衝液中に再懸濁する段階
を含んでなる方法。
【請求項２】
生体分子がホルモン又はポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体又は抗体から導かれるタンパク質を含むタンパク質である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
抗体がＩｇＧ抗体である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
生体分子が抗体フラグメント（Ｆａｂ）である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
負荷電ポリマーがポリアクリル酸（ＰＡＡ）である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
ＰＡＡが５ｋＤを超える分子量及び３％（ｗ／ｖ）を超える濃度を有する、請求項５記載の方法。
【請求項７】
ポリマーがカルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）又は他のカルボキシ修飾ポリマー或いは他のポリ酸ポリマー又は他の生物分解性ポリ酸ポリマーである、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記塩がリン酸Ｎａ、ＮａＣｌ、クエン酸Ｎａ及び硫酸Ｎａから選択される、請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記塩の濃度が５０ｍＭを超える、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
段階（ｂ）における混合物のｐＨが５〜９の範囲内にある、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
段階（ｂ）における混合物のｐＨが約７である、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
水性試料が、原核細胞又は真核細胞発現系からの清澄化発酵生成物、ウイルス培養系、全血、清澄化血液、組換えミルク、組換え植物溶液、及び興味の対象の生体分子を含むその他任意の水性試料からなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
清澄化又は他の初期試料精製分離段階が、遠心分離或いは各種の緩衝剤又は塩の存在下で１種又は２種の水溶性ポリマーによって形成されるものを含む１以上の水性多相分離システム中における分配によって実施される、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
分離が、
（ａ）混合物を遠心分離して沈殿及び水性液体を得る段階、並びに
（ｂ）水性液体を沈殿から除去する段階
を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
分離が、混合物を濾過して複合体を水性流体から単離することを含む。請求項１記載の方法。
【請求項１６】
前記沈殿した生体分子が、ｐＨ３〜９の水性緩衝液又は水中に再懸濁される、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
沈殿中の残留ＰＡＡ又は他のポリ酸が、段階（ｄ）後にスカベンジングによって除去される、請求項５乃至請求項７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
沈殿中の残留ＰＡＡ又は他のポリ酸が、段階（ｄ）後に水性多相システムによって除去される、請求項５乃至請求項７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
沈殿中の残留ＰＡＡ又は他のポリ酸が、段階（ｄ）後に、前記生体分子を顕著に吸着するがＰＡＡ又は他のポリ酸は吸着しないクロマトグラフィー媒体又は濾過媒体又は他の（モノリシック）捕捉媒体を通してそれを流すことによって除去される、請求項５乃至請求項７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
沈殿中の残留ＰＡＡ又は他のポリ酸が、段階（ｄ）後に、ＰＡＡ又は他のポリ酸が前記生体分子と異なる流速又は妨害度を有するクロマトグラフィー媒体又は濾過媒体又は他の（モノリシック）サイズ排除媒体を通してそれを流すことによって除去される、請求項５乃至請求項７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
さらに１以上の追加精製段階を含み、これが追加の水性相分配段階又は沈殿段階を含み得る、請求項１記載の方法。
【請求項２２】
追加の精製段階が、多モード陽イオン交換体を用いるクロマトグラフィー、プロテインＡ親和性カラム、疎水性相互作用カラム及び陽イオン交換を含む、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
請求項１記載の方法によって製造された生体分子含有溶液を低希釈度で精製するための、高導電率溶液と共に使用するように設計されたＣａｐｔｏ ＭＭＣ及び関連捕捉媒体の使用。
【請求項２４】
一定期間（例えば、数日、数週間、数ヶ月又は数年）にわたって貯蔵するための安定化形態でバイオ医薬品を単離するための、請求項１記載の方法の使用。
【請求項２５】
バイオ医薬品をポリマー付形剤又は他の付形剤と共に一定の濃度又は不溶状態にするための製剤化段階における、請求項１記載の方法の使用。
【請求項２６】
ポリマーがＣＭ−デキストランのような生物分解性ポリ酸を含む、請求項２５記載の使用。
【請求項２７】
ポリマー付形剤又は他の付形剤が製剤に補助性能を与える、請求項２５又は請求項２６記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生体分子を単離する方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、ポリマー−タンパク質複合体形成及び沈殿によって商業的に興味のある抗体及び他のタンパク質を単離する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ミルク及び血漿のような各種の清澄化供給液からのタンパク質の処理は、非常に大きなスケールで日常的に行われている。現在、モノクローナル抗体のようなバイオ医薬品を１００Ｋｇスケールで製造することが、バイオ医薬品製造業者によって日常的に論議されている。これは、高いｍＡｂ力価（１０ｇ／Ｌ）においてさえ、１００００リットルの発酵容量を処理する必要があり得ることを意味する。向上した処理能力を有するクロマトグラフィー媒体及び高い流量性能は、既存の大きい直径１．５〜２メートルのカラムを用いてかかる負荷量を扱うのに適する場合もある。しかし、かかるカラムは、特に夾雑物で汚損された場合に使用するのが難しいことがある。また、かかるカラムを通して大量の供給液を処理するための時間はやはりスケジューリング及びその他の問題を生じる。加えて、かかるプロセスは将来のバイオ医薬品製造或いは食品添加物、工業用触媒などとしてのタンパク質の処理に関係する恐らくは一層大量の供給液を扱うことができないであろう。したがって、迅速でコスト効率のよいプロセス容量（及び夾雑物）低減操作をクロマトグラフィー又は関連する下流操作の前に導入すべきであることはよく認識されている。これは特に、細菌性又は他の複合供給液流源（例えば、血液、組換えミルク又は組換え植物）からの供給液を処理する場合に言える。
【０００３】
各種の新規でコスト効率のよい一次回収方法が検討されている。かかる方法は単独で使用することもできるし、或いは発酵後に導入して既存の標的精製プロセスを向上させることもできる。理想的には、使用する方法は既存のプロセス（濾過、抗ウイルス又はクロマトグラフィー）と容易にインターフェースをなすべきであり、プロセス液流の不都合な希釈又は汚染を引き起こすべきでない。興味深い方法には、水性ポリマー相分配、及び沈殿又は濾過と共に使用される（標的又は夾雑物の）凝集（下記に示す参考文献を参照されたい）がある。親和性リガンド又は帯電リガンドで修飾されたポリマーによって誘起される標的タンパク質の凝集（本明細書中では沈殿と互換的に使用される）は、タンパク質を精製するために常用されているクロマトグラフィーアプローチと概念的に類似しているので魅力的である。加えて、帯電リガンドで修飾されたポリマーは親和性リガンドで修飾されたものより安価である。
【０００４】
清澄化供給液の沈殿に関する他者の最近の研究には、カルシウム及びリン酸塩で誘起される凝集（例えば、米国特許出願公開第２００７／００６６８０６号）或いはポリ（エチレングリコール）（例えば、国際公開第２００８／１００５７８号）を含む非帯電ポリマー又はポリビニルスルホン酸（下記参照）のような負荷電ポリマーによって支援されたかかる凝集の使用がある。ある者はまた、夾雑物の凝集を濾過と組み合わせた（例えば、米国特許出願公開第２００８／０１９３９８１号、国際公開第２００８／０７９３０２号）。場合によっては、凝集はある程度の選択性を達成することができる（米国特許出願公開第２００８／０１９３９８１号及びＪｕｄｙ Ｇｌｙｎｎ，ＢｉｏＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｍａｒｃｈ２，２００８を参照されたい）。
【０００５】
Ｇｅｎｅｔｅｃｈ社による特許出願（米国特許出願公開第２００８／０１９３９８１号）では、凝集のためにポリビニルスルホン酸及びポリアクリル酸（ＰＡＡ）が使用されている。低い導電率（６ｍＳ／ｃｍ未満）及びかなり低い抗体濃度のレジームで研究されたシステムは、得られた複合体を再溶解する（即ち、供給液流を希釈する）という問題に直面したように思われ、良好な（＞９５％の）ＤＮＡ低減及び標的タンパク質単量体／凝集体比の維持を示しながらも約６０％のＨＣＰ低減及び＜９０％の標的ｍＡｂ回収率しか達成しなかった。この研究では、（ａ）（［０１２８］及び図１０に関して）「ｐＨ７及び１．５ｍＳ／ｃｍでは、ＰＡＡが３５０００より大きいＭＷを有するまで完全な沈殿は達成されなかったこと」、及び（ｂ）（［０１２９］及び図３３に関して）「ｐＨ７及び１２ｍＳ／ｃｍでは、２２００００（２２０ｋＤａ）より大きいＭＷを有するＰＳＳを使用するまで（ポリスチレンスルホン酸（ＰＳＳ）による）完全な沈殿は達成されなかったこと」が注目に値する。上記の著者らはまた、正味負荷電の標的タンパク質と相互作用する若干の正荷電ポリマーも検討した。
【０００６】
他のグループは、組換えタンパク質供給液中に存在する多くは正味負の（酸性）宿主細胞タンパク質及び他の夾雑物を複合体化し、濾過を用いてかかる複合体化夾雑物を標的タンパク質から単離することに努めた（例えば、Ｊｕｄｙ．Ｇｌｙｎｎ，Ｂｉｏｐｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｍａｒｃｈ ２，２００８；Ａ．Ｖｅｎｋｉｔｅｓｈｗａｒａｎ，Ｐ．Ｈｅｉｄｅｒ，Ｌ．Ｔｅｙｓｓｅｙｒｅ，Ｇ．Ｂｅｌｆｏｒｔ，Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ−ａｓｓｉｓｔｅｄ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ ｆｒｏｍ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ｕｓｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−ｆｏｕｌｉｎｇ ｃｒｏｓｓｆｌｏｗ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ６ Ｍａｙ ２００８ ｉｎ Ｗｉｌｅｙ ＩｎｔｅｒＳｃｉｅｎｃｅ（ｗｗｗ．ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ．ｗｉｌｅｙ．ｃｏｍ）．ＤＯＩ １０．１００２／ｂｉｔ．２１９６４）。しかし、かかるアプローチは、プロセスの初期において最も重要であり得る標的の濃縮（プロセス容量の低減）を提供しない。
【０００７】
上記の研究に関係する若干の制約は、２種以上のポリマーを２種以上のタンパク質と相互作用させて相互に結合した複合体を形成することに依存する不溶性のタンパク質−ポリマー複合体を形成する目的で標的タンパク質に富む溶液をポリマーで滴定するような状況を考察すれば最も良く理解される。ポリマー濃度が標的タンパク質濃度に対して増加するに従い、最初は標的が過剰（かつ可溶）な状況であるが、次いで標的及びポリマーが同じ濃度であるか、或いはこれらが複合体を形成し得る比率で存在する状況に移動し、最後にポリマーが過剰で複合体が解離する状況に至ると予想される。大抵の場合、上記のＧｅｎｅｔｅｃｈ社の出願に示されている通り、強いタンパク質−ポリマー相互作用を促進するために低いイオン強度が必要となり得る。もちろん、複合体の形成には（タンパク質のＭＷと同じく）ポリマーのＭＷが複雑な役割を演じる。これは、立体的に見ればポリマーサイズが大きいほど複合体形成に有利であるが、ポリマーのモル濃度及び拡散速度が低下することでそれを妨げるからである。
【０００８】
上記の議論に関しては、６つの点に注目すべきである。第一に、複合体形成及び関連する現象（コアセルベート相形成、沈殿形成）は、複合体（タンパク質−ポリマー及び関連水）に富む液体領域と非複合体化成分に富む液体領域との間におけるポリマー、タンパク質、塩及び水の分配を含む複雑な動的プロセスである。したがって、タンパク質の相対溶解度（疎水性）及び塩に関するホフマイスター系列効果（Ｌ．Ａ．Ｍｏｒｅｉｒａ，Ｍ．Ｂｏｓｔｒｏｍ，Ｂ．Ｗ Ｎｉｎｈａｍ，Ｅ．Ｃ．Ｂｉｓｃａｉａ，Ｆ．Ｗ．Ｔａｖａｒｅｓ，Ｈｏｆｆｍｅｉｓｔｅｒ ｅｆｆｅｃｔｓ：Ｗｈｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈａｒｇｅ，ｐＨ ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｄｅｐｅｎｄ ｏｎ ｔｈｅ ｃｈｏｉｃｅｓ ｏｆ ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ｃｏｌｌｏｉｄｓ ａｎｄ Ｓｕｒｆａｃｅｓ Ａ，２８２−２８３，（２００６）４５７−５６３を参照されたい）並びに分配効果（Ｈ．−Ｏ．Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，Ｇ．Ｋａｒｌｓｔｒｏｍ，Ｆ．Ｔｊｅｒｎｅｌｄ，Ｃ．Ａ．Ｈａｙｎｅｓ，Ｄｒｉｖｉｎｇ ｆｏｒｃｅｓ ｆｏｒ ｐｈａｓｅ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ ｉｎ ａｑｕｅｏｕｓ ｔｗｏ−ｐｈａｓｅ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ，７１１（１９９８）３−１７を参照されたい）を含むエントロピー的な考察が重要な役割を演じることがある。第二に、標的捕捉（即ち、複合体形成）を生じるために低い導電率を要求する操作は、プロセス供給液流の不要の希釈を意味するが、これはラージスケール作業では経済的に実行できないことがある。第三に、標的放出（すな、複合体溶解）を行うために特定のｐＨ条件及び低いタンパク質濃度を要求する操作は、やはりｐＨ調整及びプロセス液流の希釈の必要性を招くことがある。第四に、特定の標的放出条件及び再溶解時の標的濃度が、かかる操作をコスト効率よく結合できる他の下流分離方法を制限することがある。第五に、高ＭＷポリマーを用いて最適に働く操作は、溶液粘度の増加、可溶性夾雑ポリマーの除去、並びに高ＭＷポリマーがクロマトグラフィー、フィルター、ポンプ及び他のプロセス液流表面を非特異的に汚損する可能性の高さに関係する問題のため、プロセス中に統合するのが一層困難である。第六に、数時間を超える実質的な時間にわたり複合体として保存した場合の標的タンパク質の変質（又は変質からの保護）及びタンパク質を処理中にある時間にわたり複合体として保存した後における標的タンパク質の放出の容易さに関して特別な考慮を払いながら、形成された複合体の性質を理解するように注意しなければならない。
【０００９】
したがって、抗体及び他の生体分子を高い純度レベルに単離する方法であって、スケーラブルかつ効率的でありながら時間及びコストを節減する方法に対するニーズが今なお存在している。複合体形成、凝集、沈殿又は関連する方法に関しては、これらの基本的な満たされない要求に関係する若干の所望される特性を述べることができる。かかる方法は、多くの上流タンパク質供給液に関係する比較的高い塩濃度（例えば、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）、中性のｐＨ及び高いタンパク質濃度をもった溶液に対して働くべきである。それはまた、清澄化発酵供給液のような各種の溶液に対して働くべきである。それは、上流で使用できるように良好な標的選択性及びプロセス容量低減を与えるべきである。これは、（しばしば負に帯電している）ウイルス、細菌、細胞破片、毒素及び核酸夾雑物のような夾雑物の排除を含む。それは、良好な捕捉及び容易な放出を可能にするやり方で、実質的な回収率をもって抗体又は抗体フラグメントのような標的を結合すべきである。放出には過度の希釈又はｐＨの変化が要求されるべきでなく、標的は各種の他の分離方法（特に現在のプロセスに常用されているもの）との容易な統合を可能にする濃度及び溶液範囲内に維持されるべきである。それは高いタンパク質濃度でも機能すべきであり、もちろん、添加された夾雑物を除去するために新しい単位操作の追加又は既存の単位操作の実質的な修正を要求するような物質の添加を含むべきでない。
【００１０】
長年にわたり、バイオ医薬品の発酵、精製及びポリッシング／製剤化はしばしば別々のプロセス領域と見られてきた。これの主な理由は、これらが通例相異なる操作を含むと共に、各領域での標的の濃度に大きく関係するスケールを含むことにあった。即ち、発酵は恐らく１ｍｇ／ｍＬで行われ、親和性又はイオン交換による精製で濃度は恐らく３０ｍｇ／ｍＬに上昇し、そしてポリッシング及び製剤化段階は標的を液体又は固体形態で１００〜２００ｍｇ／ｍＬに持っていく。抗体及び他のバイオ医薬品は発酵供給液中で３０ｍｇ／ｍＬに達することがあり、またイオン交換クロマトグラフィーにおいて１００ｍｇ／Ｌ以上に達することがあるので、これらの区別はあいまいである。製剤化はしばしば、タンパク質又は他のバイオ医薬品を、Ｄｅｘｔｒａｎ（商標）、ポリ（エチレングリコール）又はＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ（商標）（ポリエトキシル化ソルビタン及びラウレート）を含むポリマー並びにＴｅｒｇｉｔｏｌ（商標）又はＰｌｕｒｏｎｉｃ（商標）のようなオキシエチレン又はオキシプロピレンの各種市販コポリマー又はブロックコポリマーのような付形剤と合わせることを含んでいる。アルブミンのような他のタンパク質（即ち、帯電した両親媒性バイオポリマー）の使用を含め、多くの付形剤は帯電していることがある。付形剤は、一部では、貯蔵中にバイオ医薬品を安定化し、凝集を誘起せずに高い濃度を維持し、体内での迅速な溶解及び取込みを可能にする。上記の事実を仮定すれば、生体適合性ポリマーを用いて溶液中の抗体又は他の標的タンパク質或いは不溶性複合体を局在させるいかなる分配又は沈殿方法も、バイオ医薬品の精製ばかりでなくその製剤化及び貯蔵の点からも興味の対象とすべきであることは当然である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
米国特許出願公開第２００８／０１９３９８１号明細書
【発明の概要】
【００１２】
本発明は生体分子を単離する方法に関する。さらに詳しく言えば本発明は、抗体（ｍＡｂ）及び抗体フラグメント（Ｆａｂ）を含む関連タンパク質を単離する方法であって、これらが正かつ比較的疎水性であり、負荷電ポリマーと反応してポリマー−タンパク質複合体の沈殿を形成するような条件下で実施される方法に関する。
【００１３】
かくして一実施形態では、本発明は、生体分子を単離する方法であって、（ａ）生体分子を含む水性試料を用意する段階、（ｂ）水性試料を塩の存在下で負荷電ポリマーと混合する段階であって、該ポリマーが生体分子と選択的に複合体化して凝集することで生体分子を含む沈殿の混合物を形成するような条件下で実施される段階、（ｃ）水性液体から生体分子沈殿を分離する段階、及び（ｄ）生体分子を再懸濁緩衝液中に再懸濁する段階を含んでなる方法を提供する。
【００１４】
単離は、様々な分子量のポリアクリル酸又はカルボキシメチルデキストランポリマーのような安価で生体適合性の負荷電ポリマーを沈殿剤として用いて達成できる。それは、（様々な因子に応じて５〜９という）広いｐＨ範囲にわたって比較的高いポリマー濃度（例えば、１０％）並びに高い塩濃度（＞５０ｍＭ）及び導電率（例えば、＞１０ｍＳ／ｃｍ）で行われる。本方法は過剰ポリマーのレジームで機能するので、それは溶液のタンパク質濃度にあまり敏感でない。大部分のポリマー及び塩は沈殿中に保持されず、上澄み液に「分配」されるので、これらを再循環させることができる。宿主細胞タンパク質、核酸（及び恐らくはウイルス、細菌、毒素などの他の負荷電夾雑物）のような夾雑物は、ポリマー−標的タンパク質複合体から排除される傾向がある。様々な研究では、９０＋％のｍＡｂが沈殿中に回収され、９５＋％のＨＣＰ及びＤＮＡが上澄み液中に回収された。
【００１５】
本方法は、標的及び他のタンパク質を高い濃度（例えば、１０ｇ／Ｌ）及び導電率で含む各種の複合溶液に関してうまく働くように思われる。これらの溶液には、清澄化発酵供給液のような溶液、及び水性ポリマー相分配からの標的含有相がある。沈殿は標的タンパク質リッチであり、各種の水溶液中に低希釈度で容易に溶解する。これらの溶液は低いｐＨを有することがあるが、それが必要なわけではない。これは、本方法を各種の他の分離及び下流処理方法や操作との直接統合を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、室温及びｐＨ７の様々な塩条件における、１０％（ｗ／ｗ）のＮａＰＡＡ ８０００を含む溶液中でのＧａｍｍａｎｏｒｍヒトポリクローナル抗体（ＧＮ）のポリマー−タンパク質複合体形成及び沈殿を示している。
【図２】図２は、抗体回収率を図１中の塩条件の関数として示している。
【図３】図３は、図１中の条件に関し、抗体回収率を緩衝液の導電率（ｍＳ／ｃｍ）の関数として示している。緩衝液の導電率はポリマーの寄与を含んでいないことに注意されたい。
【図４】図４は、室温及びｐＨ７の様々な塩条件における、１０％（ｗ／ｗ）のＮａＰＡＡ １５０００を含む溶液中でのＧａｍｍａｎｏｒｍヒトポリクローナル抗体（ＧＮ）のポリマー−タンパク質複合体形成及び沈殿を示している。
【図５】図５は、抗体回収率を図４中の塩条件の関数として示している。
【図６】図６は、図４中の条件に関し、抗体回収率を緩衝液の導電率（ｍＳ／ｃｍ）の関数として示している。緩衝液の導電率はポリマーの寄与を含んでいないことに注意されたい。
【図７】図７は、図１〜３中のＮａＰＡＡ ８０００関連実験について、Ｋ（沈殿したＡｂ／沈殿しないＡｂの比）及び対数（Ｌｎ）Ｋを導電率（ｍＳ／ｃｍ）に対してプロットしたグラフを示している。同様な直線関係は、図４〜６に関する結果についても見出された（データは示さず）。
【図８】図８は、水性ポリマー二相システム（ＡＰＴＰ）分配によって清澄化した実際のチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞発酵供給液からの再懸濁ｍＡｂ沈殿を、Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ多モード陽イオン交換クロマトグラフィー媒体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）上でのクロマトグラフィーに付した結果を示している。
【図９】図９は、図８に係る適用画分及び捕集画分のＳＤＳ ＰＡＧＥの結果を示している。レ−ン１：分子量マーカー、レ−ン２：ＷＡＶＥ ５１供給液、レ−ン３：ＷＡＶＥ ５１供給液のＡＴＰＳ、レ−ン４：上澄み液、レ−ン５：ｐＨ５．５の再懸濁沈殿、レ−ン６：画分Ａ１、レ−ン７：画分Ａ２、レ−ン８：画分Ａ３、レ−ン９：画分Ａ４、レ−ン１０：画分Ａ１〜４、レ−ン１１：画分Ａ６、溶出液、レ−ン１２：分子量マーカー。
【図１０】図１０は、分配、沈殿及びクロマトグラフィーに基づくタンパク質用の三段階一次精製スキームの概略を示している。第１の段階では、興味の対象のタンパク質（ｍＡｂ）の９５％以上が所望の相に分配される。発酵ブロスも大幅に清澄化される。第２の段階では、タンパク質の９０％以上が回収されると共に、ＨＣＰ及びＤＮＡの９５％以上の低減並びにウイルス及び毒素のレベルの顕著な低下が見られる。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
一態様では、本発明は、生体分子及び不純物を含む水性試料から生体分子を単離する方法に関する。詳しくは、負荷電カルボキシ基を含むポリマーは、各種の水溶液からの抗体のような正荷電生体分子と選択的に複合体化して凝集する（本明細書中では沈殿するという）ことが判明している。
【００１８】
本方法は多種多様の水性試料に適用できる。かかる試料には、特に限定されないが、原核細胞又は真核細胞発現系からの発酵生成物、血液、組換えミルク、組換え植物溶液、及び興味の対象の生体分子を含むその他任意の水性試料がある。かかる試料は好ましくは無細胞であり、さらに好ましくは固形夾雑物を除去するために清澄化されている。これは、任意の簡便に利用できる方法（例えば、濾過又は遠心分離）によって達成される。清澄化はまた、水性相分配方法によっても達成できる。
【００１９】
本方法は、抗体の濃縮及び単離のために適している。本明細書中で使用される「抗体」という用語は、任意の組換え抗体又は天然のインタクト抗体、例えば抗原結合可変領域並びにＬ鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びＨ鎖定常ドメインを含む抗体を意味する。この用語はまた、抗体フラグメント（特に限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')2、Ｆｖ及びＦｃフラグメントを含む）又は抗体フラグメントを含む分子も包含する。「抗体」という用語は、詳しくはＦｃ融合タンパク質、ペプチボディー及び他のキメラ抗体のような融合タンパク質を包含する。「抗体」という用語は、詳しくはモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の両方を包含する。様々な実施形態では、抗体はＩｇＧ抗体、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４抗体であり得る。抗体の単離は下記に例示されるが、本方法は正味正の電荷を示し得るその他多くのタンパク質又は生体分子の単離のためにも等しく有効であると想定されている。
【００２０】
興味の対象の生体分子を含む液体試料のｐＨは標的生体分子のｐＩ以下に調整され、或いはポリクローナル抗体の場合のように２種以上の標的生体分子が標的試料である場合には最低ｐＩの標的分子のｐＩ以下に調整される。生体分子のｐＩは、当業者に知られている各種のｐＩ測定方法の１つを用いて容易に測定できる。好ましい実施形態では、生体分子を含む試料上でキャピラリー等電集束法（ｃＩＥＦ）を実施し、ｐＩを測定することでｐＩが求められる。ｐＨの調整は、任意適宜の方法、例えば水性試料のｐＨが許容ｐＨ範囲内になるまでそれに酸性溶液のアリコートを添加することによって実施できる。５〜９の試料ｐＨ、例えばほぼ中性の試料ｐＨを達成して維持することが好ましい。
【００２１】
試料ｐＨの調整と同時又はその後に、生体分子の選択的複合体化及び凝集のため、負荷電カルボキシル基含有ポリマーを試料と混合することができる。適当なｐＨ及び塩条件下で、興味の対象の生体分子を含む凝集塊が形成される。好適には、ポリマーはポリカルボン酸（ＰＣＡ）である。当業者であれば、効果的な複合体形成のために適したＰＣＡポリマータイプ及び置換度（カルボキシル化度）を選択する原理は容易に理解される。他のポリマーもまた有用であろう。これらのポリマーには、ＣＭセルロース又はＣＭデンプン並びにアクリル酸に類似したモノマーを含むポリマーがある。もちろん、本方法での使用をさらに向上させるその他の性質（例えば、サイズ、特定条件下での溶解度、磁性）を示すようにポリマーを設計することもできる。
【００２２】
好ましくは、５０００を超える分子量を有する高度にカルボキシル化されたポリアクリル酸（ＰＡＡ）を用いて選択的な抗体の複合体化が達成される。同様な結果はまた、低い相対カルボキシル化度（置換度１．４）を有する高ＭＷのカルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）を用いても得られる。水性試料に対するポリマーの濃度は、好ましくは３〜３０％（ｗ／ｖ）、例えば５％（ｗ／ｖ）、１０％（ｗ／ｖ）又は１５％（ｗ／ｖ）である。
【００２３】
好ましい実施形態では、生体分子を含む凝集塊（沈殿）は、ポリマーの存在下においてほぼ中性のｐＨ及び比較的高い導電率（例えば、＞５０ｍＭリン酸Ｎａ）で形成される。最も好ましい実施形態では、ポリマーはＰＡＡ（ＭＷ＞５０００）又はＣＭＤ（ＭＷ１００００及び４００００、置換度２．２６及び３．２４ｍｍｏｌ／ｇ）である。
【００２４】
任意には、１種以上の塩が存在して沈殿プロセスを助ける。かかる塩の１種がリン酸ナトリウムである。通例、導電率を沈殿が起こる閾値（例えば、大抵は５ｍＳ／ｃｍ）より高く上昇させなければならない。若干の塩特有の（例えば、ホフマイスター型の）効果が期待されるが、操作者は塩の選択にある程度の自由を有している。別法として、塩は塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム又は硫酸ナトリウム或いはカリウムその他の塩或いはかかる塩の混合物である。塩及びポリマーは固体の形態で添加することができるが、これは試薬の溶解及び混合のために追加の平衡化時間を要求することがある。塩及びポリマーはまた、１種以上の液体濃縮物の形態で添加してもよく、或いは場合によっては固体の形態で添加してもよい。
【００２５】
水性試料、ポリマー及び塩の混合物は、添加形態（上記参照）、混合（行われる場合）及び容量に応じ、１５分乃至２４時間の時間にわたってインキュベートされる。しかし通例は、適当に混合しながら液体濃縮物を添加すれば、大抵の用途にとって３０分の時間で十分なはずである。明らかに、複合体及び懸濁液体（上澄み液）を分離するための時間は、これらを分離するために使用する方法に依存する。（試験管サイズ以下の）小容量で自発的な複合体形成及び沈降を行わせるために数時間を要するのに対し、大容量を濾過又は遠心分離に付す場合の時間も同様である。インキュベーションの長さは単離すべき生体分子に応じて変化し得るが、所定セットの条件（例えば、ポリマー濃度、重量など）に関してインキュベート時間を変化させ、各インキュベーション時間について沈殿する生体分子の量を測定し、最適レベル又は所望レベルの単離をもたらすインキュベーション時間を選択することで最適化できる。
【００２６】
インキュベーション時間の経過中、混合物を連続的に混合しても、一定の間隔で混合しても、所望の回数だけ混合しても、或いは全く混合しなくてもよい。混合は要求されないが、当業者であれば、本発明の実施に際して沈殿の形成のために混合が望ましい時期が理解されよう。
【００２７】
インキュベーションは、沈殿の形成に役立つことが判明している任意の温度で実施できる。例えば、インキュベーションは２〜８℃の温度又は室温で実施できる。発酵試料は、さらなる処理中にプロテアーゼ活性を低下させるため、室温又はそれより低い温度に冷却されることが多い。実際、本発明の利点の１つはインキュベーション段階を室温で実施できることであって、混合物を冷蔵状態に保つ必要はなく、特定の温度に設定する必要さえない。
【００２８】
凝集塊が生じたならば、任意適宜のアプローチによって混合物を沈殿及び液相に分離できる。一実施形態では、混合物は遠心分離される。この実施形態では、沈殿は容器の底部に集まる一方、液相は不純物の大部分を含む。遠心分離後、例えばデカンティング又は吸引によって液相が除去される。
【００２９】
別の実施形態では、混合物は濾過によって分離できる。
【００３０】
液体試料から沈殿を分離した後、沈殿を任意に緩衝液で洗浄できる。任意の洗浄段階の目標は、残留液体成分を沈殿から除去することであり得る。任意の洗浄は、単に洗浄緩衝液を沈殿に接触させ、次いで吸引又はデカンテイングによって洗浄緩衝液を除去することからなり得る。
【００３１】
沈殿は、水又は緩衝溶液を含む水溶液中に容易に再懸濁（即ち、再溶解）できる。このように再懸濁溶液の選択が比較的自由であることは、標的をほとんど希釈することなく、しかも標的の天然活性を維持しかつさらなる分離段階を最適化すること以外をほとんど考慮せずに緩衝液の最適選択を可能にする点で有利である。好ましくは、再懸濁緩衝液は低イオン強度の溶液であり、４．０〜９．０のｐＨを有する。再懸濁緩衝液の一例は、ｐＨ５．０の酢酸ナトリウム緩衝液である。
【００３２】
下記の実施例では、５ｇ／Ｌ未満の抗体を含む試料溶液との複合体形成により、通例は出発液体の容量の２％未満（多くは１％未満）の凝集塊が得られる。したがって、沈殿は所望の生体分子の５０〜１００×濃縮を達成する。生体分子の回収率は高く（約９０％）、宿主細胞タンパク質及びＤＮＡの分離度も同様に高い（共に約９５％）。抗体分子の比較的高度に帯電したポリカチオン性の大きい表面積及び相対的な鎖の柔軟性には、大抵の夾雑物に比べて高い選択性が存在し得ると共に、ポリカルボン酸はポリ硫酸化ポリマーに比べて大きい鎖の柔軟性も与える。したがって、複合体はウイルス、毒素及び他の負荷電夾雑物のレベルの低下も示し得る。抗体の特定の性質（例えば、特定の抗原又はリガンドに対する結合部位親和性）がこの分離方法に関与することはない。したがって、それは抗体フラグメントを含む各種の他の分子に対しても働くと予想される。
【００３３】
顕著な容量低減及び各種溶液中への容易な複合体溶解（再懸濁）は、本凝集方法を標準的な下流精製プロセスと直接に統合することを支援する。このようにすれば、沈殿の再懸濁後には、溶液状態の再懸濁生体分子を１以上の追加精製段階（例えば、生体分子又は残留ポリマーに関して通過又は捕捉モードのクロマトグラフィー）で処理することで所望の生体分子をさらに精製することができる。
【００３４】
かくして一実施形態では、再懸濁生体分子は親和性媒体（例えば、プロテインＡ媒体）上に捕捉される。次いで、標的生体分子が溶出され、そして恐らくは陽イオン交換（標的捕捉）段階又は混合モード（標的通過、夾雑物捕捉）段階によるポリッシングに付される。
【００３５】
別の実施形態では、標的生体分子はポリマーが通過する陽イオン交換媒体上に装填される。異なる実施形態では、生体分子は高イオン強度溶液中に再懸濁され、そして疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム、混合モードカラム又は親和性カラム上に直接装填される。
【００３６】
上述した通り、沈殿中の残留ポリマーは捕捉クロマトグラフィー媒体を用いたスカベンジングによって除去できる。別法として、ポリマーは水性多相システムの相分配のような他の方法によっても除去できる。
【００３７】
さらに、沈殿中の残留ポリマーは、標的を顕著に吸着（捕捉）するがポリマーは吸着（捕捉）しないクロマトグラフィー媒体又は濾過媒体又は他の（モノリシック）捕捉媒体を通してそれを流すことで除去できる。別法として、沈殿中の残留ポリマーは、ポリマーに関して標的と異なる流速又は妨害度を有するクロマトグラフィー媒体又は濾過媒体又は他の（モノリシック）サイズ排除媒体を通してそれを流すことでも除去できる。
【００３８】
かくして、高導電率溶液と共に使用するように設計されたＣａｐｔｏ ＭＭＣ及び関連捕捉媒体を用いて、上記の方法で製造された標的含有溶液を精製する方法がさらに提供される。
【００３９】
本発明のすべての実施形態は、任意のスケールで使用できることに注意すべきである。例えば、本発明は、数十リットル、数百リットル又は数千リットルの細胞培養液から生体分子を単離するラージスケール生体分子製造作業に適用できる。別の例では、本発明はスモールスケールで使用できる。例えば、数リットル程度の容量又は１リットルより遙かに少ない容量の培養液から生体分子を単離するベンチトップスケール作業で使用できる。
【００４０】
新規な方法のために使用する容器は固定型又は使い捨て型のものであって、標的回収及び上澄み液の除去を向上させるための様々な自明のやり方で改造することができる。また、本方法は標的含有供給液にポリマー及び塩溶液を添加することのみを含むので、それは（例えば、複合体を単離するために沈降又は遠心分離ではなく濾過を用いて）オンラインモード又は連続処理モードで容易に実施できる。固体担体に依存しない液体方法であるので、最小限の高価な標的タンパク質及び供給液の使用を可能にする条件下で標的回収率及び夾雑物除去のような各種のパラメーターを最適化するため、（例えば、マイクロタイタープレートにおけるミリリットルスケールの容量での）高スループットスクリーニングを使用することが容易に可能である。
【００４１】
本方法の単純さ及び頑強性は、その他多数の刺激的な可能性を示唆している。例えば、ｐＨ依存性は、ＣＯ2分圧を用いてそれを実施して炭酸塩緩衝溶液中のｐＨを変化させることで、複合体が形成又は溶解するｐＨ条件間で交互に移動させ得ることを示唆している。沈殿後の再溶解段階では、ｐＨの低下と組み合わせて残留ウイルスを殺すこともできる。別の可能性は、沈殿を、ポリマー−塩、ポリマー−ポリマー又は熱応答性（逆熱溶解度）ポリマーの二相システム中での水性ポリマー二相分配と組み合わせることである。後者のシステムでは、ポリマーは曇り温度（Ｔｃ）で自己会合し、ポリマーリッチ相上に浮遊する水及び（標的）タンパク質リッチ相を形成する。かかるシステムにおける分配は、単位重力で（即ち、遠心分離を使用せずに）迅速な初期清澄化（細胞及び細胞破片の除去）並びにある程度の夾雑物除去をもたらすことができる（Ｊａｍｅｓ Ｖａｎ Ａｌｓｔｉｎｅ，Ｊａｍｉｌ Ｓｈａｎａｇａｒ及びＲｏｌｆ Ｈｊｏｒｔｈによって２００９年１月８日に提出された、「単一ポリマー相システムを用いる分離方法」と称するスウェーデン特許出願第０９０００１４−２号（その開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす））。しかもそれは、組換え体又は他のラージスケールタンパク質リッチ供給液に関連する導電率（血漿、血液又は組換え植物標的含有供給液流に関連するものを含む）において実施される。しかし、それはあまり多くの標的濃縮又はＨＣＰ除去を提供しない。したがって、それを本発明の方法と組み合わせることで、既存のプロセス又は新しいプロセス中に容易に挿入される二相清澄化及び精製レジームを生み出すのが理想的である（表１）。これには、もっぱら使い捨て部品のみを用いて働くように設計されたプロセスがある。それ以外にも、標的及び夾雑物は２つの区画室間を自由に移動できるが、複合体化ポリマーは末端共有結合による局在化によって保持されるか、或いは標的を通過させるが標的より遙かに大きいＭＷのポリマーは通過させないフィルターによりＭＷに基づいて保持されるような容器内で作業を実施するなどの様々な自明の可能性が存在する。
【００４２】
【表１】
2012515161.tif 000002
図１０は、上記概念の一部を採用すると共に、後述する実験の詳細に従って、分配、沈殿及びクロマトグラフィーに基づくタンパク質用の三段階一次清澄化スキームを略示している。プロセス全体が使い捨て部品を用いて実施できる。段階１では、発酵試料又は組換え細胞（ｒＣｅｌｌ）又は組換え細菌（ｒＢａｃｔｅｒｉａ）（或いは植物又は動物関連の標的含有溶液）を水性ポリマー相分配に付すことで、細胞及び他の粒子状破片を除去して溶液を清澄化する。標的含有相（この例では、熱分離エチレンオキシドプロピレンオキシド（ＥＯＰＯ）型ポリマーに基づく１ポリマー二相システムからの水リッチ相）を単離し、次いで塩及びｐＨ及びタンパク質複合体化ポリマー（この例では、正味正荷電のｍＡｂタンパク質と容易に複合体化するＰＡＡ）の添加によって調整する。複合体形成及び（沈降、遠心分離又は濾過による）複合体の単離がそれに続く。この段階で、沈殿中の標的回収率を高めるため、上澄み液を別の沈殿ラウンドに付すことができる。次いで、複合体を新鮮な緩衝液に再溶解度することができる。これは、抗ウイルス処理の一部として低ｐＨ（例えば、ｐＨ４）の緩衝液であり得る。第３の分離段階では、再溶解された標的タンパク質を含む溶液がアフィニティークロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー又は他の分離方法（例えば、捕捉クロマトグラフィー）に付される。それはまた、サイズ排除或いは濾過、クロマトグラフィー、モノリスカラムなどに関係する他の方法で処理することもできよう。
【実施例】
【００４３】
以下の実施例は例示目的のためにのみ示されるものであり、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明を限定するものと決して解すべきでない。
【００４４】
材料及び検討されるユニット：
化学薬品
ＧａｍｍａＮｏｒｍ（ヒトポリクローナルＩｇＧ）：１６５ｍｇ／ｍｌ、ｐＩ約７、Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ社。
【００４５】
ポリアクリル酸Ｎａ塩（ＰＡＡ）：３５％（ｗ／ｗ），ＭＷ＝１５０００、４５％（ｗ／ｗ），ＭＷ＝８０００、ＭＷ＝５１００及びＭＷ＝２１００、すべてＡｌｄｒｉｃｈ社から入手。
【００４６】
カルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）０．３９（２．２６ｍｍｏｌ／ｇ）、ＭＷ ４００００、名糖産業社（日本）から入手。
【００４７】
カルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）１．３９（３．２４ｍｍｏｌ／ｇ）、ＭＷ ４００００、名糖産業社（日本）から入手。
【００４８】
デキストラン硫酸（１６〜１９％置換）、ＭＷ １００００、４００００、１０００００及び５０００００、ＰＫ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社（デンマーク）から入手。
【００４９】
Ｃａｐｔｏ（商標）Ｑ（１７−５３１９−１０）及びＨｉＴｒａｐ Ｃａｐｔｏ ＭＭＣカラム（１１−００３２−７３）はＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（ウプサラ、スウェーデン）から入手した。
【００５０】
本研究で使用した他の化学薬品はすべて分析用のものであって、ＭＥＲＣＫ社から購入した。
【００５１】
相システム配合用の熱応答性ポリマー
Ｂｒｅｏｘ ５０Ａ １０００（エチレンオキシド及びプロピレンオキシドの等量コポリマー（ＥＯＰＯ））、Ｍｗ ３９００、下記参照。
【００５２】
特記しない限り、ＥＯＰＯポリマーとは、５０％エチレンオキシド及び５０％プロピレンオキシドからなる（数平均）分子質量３９００ダルトンのランダムコポリマーであるＢｒｅｏｘ ５０Ａ １０００をいう。これはある種の用途についてＦＤＡの承認を得ており、（現在はＣｏｇｎｉｓ社（ｗｗｗ．ｃｏｇｎｉｓ．ｃｏｍ）の一部である）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社（サウサンプトン、英国）から入手した。
【００５３】
相システム
スモールスケール研究では、下記に示す原液の適当な量／容量を混合することで、二相システム（ＡＴＰＳ）溶液を（特記しない限り）直接に１０ｍｌ Ｓａｒｓｔｅｄｔ管中で調製した。各システムの最終容量は通例５ｍｌであった。混合物を約３０秒間渦動させ、次いで４０℃の水浴中に約１５分間放置して相形成させた。
【００５４】
原液
ＥＯＰＯ、２０％（ｗ／ｗ）：１０ｇのＥＯＰＯを４０ｇのＭＱ水に溶解することで調製した。
【００５５】
ＥＯＰＯ、４０％（ｗ／ｗ）：２０ｇのＥＯＰＯを３０ｇのＭＱ水に溶解することで調製した。
【００５６】
ＮａＰ（リン酸Ｎａ、０．８Ｍ）：０．８Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4及び０．８Ｍ Ｎａ2ＨＰＯ4を混合することで様々なｐＨ（ｐＨ５、６、７、８）を生み出した。
【００５７】
クエン酸Ｎａ（０．８Ｍ）：０．８Ｍクエン酸ナトリウム及び０．８Ｍクエン酸を混合することでｐＨ７の原液を調製した。
【００５８】
ＮａＣｌ（５Ｍ）：１４．６ｇのＮａＣｌを５０ｍｌのＭＱ水に溶解することで調製した。
【００５９】
実際の供給液試料
実際のｍＡｂ供給液Ｐ４及びＰ５並びにＷＡＶＥ ５１をＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（ウプサラ、スウェーデン）から内部的に入手した。これらはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞ベースの発酵液であった。
【００６０】
沈殿実験
原液
ＮａＰ（リン酸Ｎａ、０．８Ｍ、ｐＨ７）：０．８Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4及び０．８Ｍ Ｎａ2ＨＰＯ4を混合することで調製した。
【００６１】
ＮａＣｌ（５Ｍ）：１４６ｇのＮａＣｌを５００ｍｌのＭｉｌｌｉＱ水に溶解することで調製した。
【００６２】
方法
ポリマー溶液の調製：沈殿実験用のポリマー及び塩／緩衝剤溶液は、ポリマーの適当な量／容量を記載の原液の適当な量／容量と混合することで調製した。特記しない限り、密度は１と仮定した。
【００６３】
所要量のポリマー溶液及び塩／緩衝剤溶液（表２）を混合し、それに抗体を添加した。次に、（複合体化及び凝集のため）混合物を室温に約３時間保ち、次いで３０００×ｇで１５分間遠心分離した。次に、上澄み液を沈殿から単離した。分離した沈殿を水又は適当な緩衝液に再懸濁した。
【００６４】
電気泳動：Ｐｈａｓｔ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ウプサラ）上において、４〜１２％勾配のポリアクリルアミド及びドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）還元ゲル、１５０Ｖで１時間、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ（登録商標）を用いた１０分間の染色のような通常の動作条件下で実施した。
【００６５】
クロマトグラフィーは、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（ウプサラ、スウェーデン）から入手できるクロマトグラフィー媒体の供給者の推奨条件に従って実施した。
【００６６】
分析クロマトグラフィー
プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによるｍＡｂの測定：抗体捕捉に関するプロテインＡ相互作用の選択性により、それを分析目的のために使用して、９０＋％の夾雑物はカラムを通過させながら試料中のすべての抗体を結合することができる。ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅカラムを用いてｍＡｂの濃度を測定した。５０μｌの試料を１ｍｌ ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅカラムに適用した。溶出液ピークの面積を積分し、それぞれ供給液及び水相の容量を掛けた。ＡＴＰＳを用いた抽出に関する回収率を、面積単位の総数を比較することで算出した。ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅ段階に関するｍＡｂの回収率を同様にして算出した。試料：５０μｌの供給液又は水相、カラム：１ｍｌ ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅ、緩衝液Ａ：ＰＢＳ、緩衝液Ｂ：１００ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ＝３．０）、流量：１ｍｌ／分（１５０ｃｍ／ｈ）、勾配：０〜１００％Ｂの階段勾配。
【００６７】
凝集体レベルのサイズ排除測定：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ５／１５０ ＧＬゲル濾過カラム（サイズ排除クロマトグラフィー又はＳＥＣ）を用いて、二量体及び凝集体（さらにｍＡｂ濃度）を測定した。二量体ピーク及び単量体ピークの面積をＵＮＩＣＯＲＮソフトウェアによって自動的に積分した。供給液及び水相からの二量体の総面積を比較した。試料：５０μｌの供給液又は水相、カラム：３ｍｌ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ５／１５０ ＧＬ、緩衝液：ＰＢＳ、流量：０．３ｍｌ／分（４５ｃｍ／ｈ）。
【００６８】
使い捨てＷＡＶＥバイオリアクター中でのラージスケール発酵及び分配に基づく清澄化
実際の供給液であるｍＡｂ細胞培養物は、（内部的に供給された）５１ ＣＨＯ細胞株で発現される。培養期間は１８日であり、培養容器は２０Ｌのバッグ及びｐＨ／オキシウェルを有するＷＡＶＥバイオリアクターシステム２０／５０であった。培養液は、５ｇ／Ｌの加水分解物ＵＦ８８０４（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を含みかつ必要に応じてグルコース及びグルタミンを供給したＰｏｗｅｒＣＨＯ２（Ｌｏｎｚａ社）であった。供給液試料は、細胞の平均生存率が４０％を下回った場合に収穫可能と定義された。ＷＡＶＥバッグの内容物は、ポリマー−塩溶液を添加した場合、４２℃に温度安定化された。
【００６９】
水性ポリマー二相システムは、９．５ｋｇのｍＡｂ供給液を含むＷＡＶＥバッグ中に原液混合物を直接ポンプ注入することで調製した。これは３．６Ｌの５０％Ｂｒｅｏｘ ＥＯＰＯポリマー原液、４．５Ｌの８００ｍＭリン酸Ｎａ（ＮａＰ）（ｐＨ８）、及び０．２７Ｌの５Ｍ ＮａＣｌ原液であって、９．５ｋｇの供給液に全部で８．３７Ｌが添加された。これにより、１０％（ｗ／ｗ）ＥＯＰＯ、２００ｍＭリン酸Ｎａ（ｐＨ８．０）及び１５０ｍＭ ＮａＣｌの概略最終濃度が得られた。添加した原液は４０℃であり、したがって供給液及び相システム混合物を４０℃で容易に平衡化させることができた。ポリマー混合物のポンプ注入時間は約５０分であった。ＷＡＶＥリアクター上に混合物を放置して１５分間振盪した後、バッグホルダーを含めたＷＡＶＥバッグをリアクターから取り外し、次いで長軸が垂直になるようにして実験台上に配置した。これは、相形成の可視化を助けると共に、バッグのチューブ挿入口をバッグの上部及び下部に位置させた。それはまた、一層ラージスケールのプロセスにおいて予想されるものと一致するように相の高さを調整した（上記の議論を参照されたい）。二相システムの形成は５分後に認められ、３０分後に完了した。細胞破片の層が界面に形成された。次いで、ＷＡＶＥバッグの上部からチューブを挿入し、それを蠕動ポンプに連結することで、上部相を複数の瓶に移した。次いで、ＷＡＶＥバッグを長軸が垂直になるように配置した場合にその下部コーナーになる部分に取り付けたチューブを用いて、下部（ポリマー）相を瓶に移した。
【００７０】
複数の瓶からの集めた上部相材料をプールし（約１３．５Ｌ）、次いで６インチＵＬＴＡ ＨＣ ０．２μｍフィルターに連結した６インチＵＬＴＡ ０．６μｍ ＧＦを用いて濾過した。７リットルの材料を濾過した後、圧力が２．５バールに増加したので、６インチＵＬＴＡ ０．６μｍ ＧＦを新しいフィルターと交換した。濾過した材料をＷＡＶＥバッグ中に集め、次いで４℃に保った。
【００７１】
ＡＴＰＳ後の上部ポリマープア相画分中におけるｍＡｂの回収率を、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ分析（上記参照）を用いて測定した。粗供給液及びＡＴＰＳ実験後の回収ｍＡｂに関するｍＡｂ回収率及び宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）データも分析した。これらの実験からの結果は、ｍＡｂが分配によって＞９９％の回収率で部分的に精製され、細胞破片の顕著な除去も見られることを示していた。抗体回収率を最適化するように選択されたこのシステムでは、ＨＣＰの顕著な低減は得られなかった。
【００７２】
他のアッセイ
宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）アッセイは、商業的な酵素結合免疫アッセイ法（Ｇｙｒｏｌａｂ社）によった。ＤＮＡは、標準の商業的なＰｉｃｏＧｒｅｅｎ色素ＤＮＡ分析法によって分析した。
【００７３】
実施例１−抗体沈殿用ポリマーのスクリーニング
予備的な研究（表２）では、適当に緩衝されたヒトポリクローナル抗体溶液に約１０％（ｗ／ｗ）の脱プロトン化ポリアクリル酸、即ちポリアクリル酸ナトリウム（以下互換的にＮａＰＡＡ又はＰＡＡと示す）を添加すれば、ＧａｍｍａｎｏｒｍポリクローナルＩｇ（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ社）試料で代表される広範囲のヒト抗体の沈殿が生じることが示唆された。かかる効果はまた、それより高い濃度（１０％（ｗ／ｗ））の高ＭＷカルボキシメチル修飾デキストラン（ＣＭデキストラン、名糖産業社（日本））を用いて再現することもできる。凝集を開始させるためには、≧５０ｍＭ ＮａＰ緩衝剤が必要とされることに注目すべきである。この緩衝剤濃度は、ＮａＰＡＡがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と共に二相システムを形成するために必要な塩濃度と同様であり、相形成のためのエントロピー的推進力を与えるＮａＣｌ又はＮａＰ塩の必要性に加えて、ポリマー由来の酸基の影響を相殺するためのｐＨの緩衝制御の必要性に関係するように思われる（この議論に関しては、Ｈ．Ｏ．Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ，１９９８及びＬ．Ａ．Ｍｏｒｅｉｒａ ｅｔ ａｌ，２００６を参照されたい）。
【００７４】
【表２】
2012515161.tif 000003
予備スクリーニングのための条件を表２に示す。これらの条件下で、約１グラムのＮａＰＡＡを含む溶液を、約７５マイクロリットル以上のＧａｍｍａｎｏｒｍポリクローナルヒト抗体（１６５ｍｇ／ｍｌ）と共に４ｍｌの緩衝剤含有溶液に添加することで、５ｍｌの全システム容量中に２．５〜１６ｍｇ／ｍｌ（ｇ／Ｌ）の抗体濃度を得た。デキストランのＭＷを１０００００に増加させかつ濃度を２０％に上昇させた場合でも、硫酸化デキストランでＡｂの凝集を誘起するのは不可能であった。しかし、上記の研究では、１ｍＳ／ｃｍ未満から３０ｍＳ／ｃｍ超までのＮａＰＡＡ（ＭＷ ８０００）溶液、６ｇ／Ｌ以上のｍＡｂ濃度、最終濃度として２００ｍＭ リン酸Ｎａ（ｐＨ７）及び１５０ｍＭ ＮａＣｌ、並びに遙かに高いポリマー濃度を用いて沈殿が起こった。（これらの研究では元の試料容量の通例２％未満になるように思われた）沈殿を≦１ｍｌの１００ｍＭ ＮａＰ（ｐＨ５）に再懸濁することは、試料容量を約１０〜２０分の１に低減させながら（即ち、１０〜２０倍に濃縮しながら）複合体を溶解したことになる。１６ｇ／Ｌの抗体濃度でもタンパク質及びポリマーの密度が約１であると仮定すれば、Ａｂは試料容量の２％未満をなすことに注意すべきである。（さらに考えを進めて）抗体が等質量のポリマー及び結合水と化合したとしても、得られた複合体はなおもシステム全体の６％未満をなし、したがって１６倍を超える抗体濃縮をもたらすことになる。
【００７５】
実施例２−抗体の沈殿に対するＰＡＡポリマーのＭＷ、緩衝剤濃度及び塩濃度の効果
さらなる沈殿研究のためにＧａｍｍａｎｏｒｍ（ＧＮ）ヒトポリクローナルＩｇＧ抗体（Ａｂ）を使用した。ポリクローナル抗体試料を使用したのは、存在する抗体の大部分に関係する結果が、ただ１種のモノクローナル抗体ではなく広範囲の抗体に関係することを確実にするためであった。ＰＡＡ（ＮａＰＡＡ）の様々な分子量を様々な緩衝剤及び塩濃度と組み合わせた（表３参照）。ＰＡＡの最終濃度は１０％（ｗ／ｗ）であり、各システムの容量は５ｍｌであった。結果は、これらの条件下では、５０００までの分子量を有するＰＡＡポリマーを用いてもほとんど沈殿は達成されないことを示した。かかる沈殿は、ポリマー又は塩濃度を増加させれば可能であるかもしれない。抗体の沈殿が得られたのは、分子量を８０００又は１５０００に増加させかつ高い緩衝剤又はＮａＣｌ塩濃度を使用した場合であった。しかし、緩衝剤及びＮａＣｌをシステムから排除した場合には僅かな沈殿が認められた。これは、ＰＡＡポリマーによる抗体の沈殿のためには高い緩衝剤濃度又は高い導電率が必要であることを表している。
【００７６】
【表３】
2012515161.tif 000004
実施例３−抗体の沈殿及び回収率に対するＰＡＡのＭＷ及び塩濃度の効果
沈殿及び抗体回収率に対する緩衝剤及び塩濃度の効果を検討するため、様々な緩衝剤及び塩濃度（表４及び表５）でＭＷ８０００又は１５０００のＮａＰＡＡを用いて、５ｇ／Ｌの抗体を含む総量５ｍｌのシステムを調製した。各管から上澄み液を除去した後、沈殿を１ｍｌの水中に再懸濁し、それぞれの吸光度を２８０ｎｍで分光測光的にモニターした。これにより、沈殿及び上澄み液中に回収された抗体の量を算出できた。表４及び表５並びに図１〜７中の結果は、抗体の複合体化及び回収率が緩衝剤／塩濃度（即ち、導電率）と共に増加することを示している。これらの比較的スモールスケール及び手動操作方法の条件下でも、≧２００ｍＭの総緩衝剤／塩濃度で８０〜９０％の回収率を達成するのが可能であった。総回収率は通例＞９５％であったが、これは１００ｍＭ ＮａＰ／１００ｍＭ ＮａＣｌでも二重沈殿を行って沈殿中に＞９０％のｍＡｂを確保するのが可能であることを示唆している。
【００７７】
【表４】
2012515161.tif 000005
【００７８】
【表５】
2012515161.tif 000006
実施例４−カルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）を用いた抗体の沈殿
本研究は、他のポリマーがポリアクリル酸と同様に機能し得ることを立証するために実施した。試験ポリマーはＰＡＡと全く異なっていた。即ち、それはナトリウム形で使用されず、天然の細菌起源のカルボキシメチル基（ＣＭ）で修飾された多糖デキストラン（Ｄ）であり、（ＰＡＡの場合のように）酸性基が単量体構造の一部であるような合成ポリマーではない。相異なる分子量（１００００及び４００００）を有する２種のＣＭＤポリマーを、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び２００ｍＭ ＮａＰ（ｐＨ７）の溶液中２０％（ｗ／ｗ）の濃度で、ポリクローナルＩｇＧ Ｇａｍｍａｎｏｒｍ
の沈殿に関して試験した。結果は、これらの条件下で抗体を沈殿させ得ることを示した。しかし、ＮａＰ緩衝剤及びＮａＣｌを排除した場合には沈殿は得られなかった（表６）。
【００７９】
【表６】
2012515161.tif 000007
実施例５−抗体の沈殿及び回収率に対するＣＭＤのＭＷ及びリガンド密度の効果
様々なシステム中における沈殿形成及びＧａｍｍａｎｏｒｍ抗体の回収率に対するＣＭＤポリマーの分子量の効果を検討するため、２種のＭＷ（１００００及び４００００）及び様々なグラフトＣＭリガンド密度を有するＣＭＤポリマーを、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び２００ｍＭ ＮａＰ（ｐＨ７）を含む１．２ｍｌのシステム中において２０％（ｗ／ｗ）で試験した（表７）。各管から上澄み液を除去した後、沈殿を１ｍｌの水中に再懸濁し、それぞれの吸光度を分光光度計により２８０ｎｍでモニターすることで、上澄み液及び沈殿した複合体中の抗体の量を推定した。結果は、沈殿中の抗体の回収率がカルボキシル基濃度（置換度×ポリマー濃度）と共に増加することを示唆している。抗体が非特異的な管壁吸着及び他の現象で失われると予想されるこのような小容量でも、２０％のＣＭＤ ４００００及び３．２４ｍｍｏｌ／ｇのカルボキシル密度で＞８０％の抗体回収率が得られた。８２％までの抗体が沈殿中に見出され、試料は蒸留水中にも容易に再溶解できた。
【００８０】
【表７】
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実施例６−ＰＡＡ及びＣＭＤを用いた様々な粗供給液からのｍＡｂの沈殿
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の発酵で産生させた様々なモノクローナルｍＡｂ発酵供給液（Ｐ４、Ｐ５及び５１という）について、遠心分離を用いた常法で細胞及び細胞破片を除去して清澄化した。試料タイプ５１は使い捨てのＷＡＶＥ（商標）バイオリアクター（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ウプサラ）中で製造し、その後は試料タイプ５１をＷＡＶＥ ５１ともいう。５１供給液の対照試料は、Ｂｒｅｏｘ ５０Ａ １０００熱応答性ポリマーを含む水性ポリマー二相システム中において４０℃（即ち、ポリマーのＴｃより高い温度）で清澄化した。これ以上の情報については、上記の「方法」及び「材料」を参照されたい。Ｂｒｅｏｘ及び他の「ＥＯＰＯ」ポリマー（例えば、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ及びＵｃｏｎ）を用いて形成される二相システムに関する追加の情報は、様々な情報源（例えば、Ｈ．Ｏ．Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ，１９９８（上記））から入手できる。遠心分離又は水性ポリマー二相分配によって清澄化された各種供給液の試料を、様々な緩衝剤及びＮａＣｌ濃度を使用しながら、様々な濃度のＰＡＡ及びＣＭＤポリマーで沈殿させた（表８参照）。凝集、遠心分離で支援された沈殿、及び各管からの上澄み液の除去後、沈殿を水中に再懸濁し、（上記の「方法」中に記載した）プロテインＡクロマトグラフィー分析によってｍＡｂ含有量を分析した。
【００８１】
これらの実験から得られた結果は、以下のことを示している。
●緩衝剤及びＮａＣｌをシステムから排除した場合には、ｍＡｂの沈殿は起こらなかった（実験２）。
●比較的高い緩衝剤ＮａＰ及びＮａＣｌ塩濃度を使用した場合でも、ＰＡＡの濃度を１０％から３％に低下させた場合には、ｍＡｂの沈殿は起こらなかった（実験３及び３ａ）。
●高い緩衝剤及びＮａＣｌ濃度を用いた１０％ＰＡＡ及び２０％ＣＭＤシステムでは、高濃度のｍＡｂ供給液（ＷＡＶＥ ５１及びＷＡＶＥ ５１ ＡＴＰＳ）を使用した場合でも、７８〜８８％のｍＡｂ沈殿回収率が得られた（実験４及び１ｄ〜１ｅ）。しかし、比較的低いｍＡｂ濃度を有する様々な供給液（Ｐ４及びＰ５）を使用した場合には、沈殿中のｍＡｂ回収率は５６〜６１％に減少した（実験１及び１ｂ）。ただし後者の場合は、単に、出発溶液の≪１％の容量を有する試料を生み出す共沈殿の高濃縮効果に原因する分析中の抗体試料の喪失によるものかもしれない。
【００８２】
【表８】
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Ｇｙｒｏｌａｂシステム（Ｇｙｒｏｓ社、ウプサラ）を用いて、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）含有量を酵素結合免疫アッセイ法により分析した（表９）。結果は、沈殿したｍＡｂ試料中でのＨＣＰ低減率が８８〜９４％であり、大部分のＨＣＰは上澄み液中に残留していることを示した。結果はまた、この沈殿方法が、清澄化供給液中の抗体試料ばかりでなく、水性ポリマー相システムの相（例えば、熱分離したＢｒｅｏｘ ＥＯＰＯポリマー含有二相システムのタンパク質リッチ上部相）からの抗体試料ともうまくインターフェースすることを示している。この点から見て、上部相中の残留ＥＯＰＯポリマーは抗体沈殿を妨害しないように思われた。Ｂｒｅｏｘポリマーの非帯電性を考えれば、これは予想外の結果ではない。
【００８３】
【表９】
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実施例７−１０ｍｌスケールでのＣＭＤ又はＰＡＡによるｍＡｂの沈殿
本方法の正確さ及び再現性を検討するため、表８に示した実験の一部を１０ｍｌスケールで繰り返した。表１０に示した結果は、比較的高いｍＡｂ濃度（即ち、ＷＡＶＥ ５１ ＡＰＴＰで清澄化された供給液）及び導電率の条件下で１０％ＰＡＡ又は２０％ＣＭＤ ４０００システムを使用した場合、沈殿中に高レベルのｍＡｂ回収率（７６％及び９９％）が得られたことを表している。表１１は、沈殿したｍＡｂ中でのＨＣＰ低減率が＞９４％であり、大部分のＨＣＰは上澄み液中に残留していることを示している。これらの結果は１．２〜５ｍｌのスケールにおいて上記で得られた結果と同様であり、本方法のスケーラビリティ及び頑強さ並びにマイクロタイタープレート又は小容量試験管のような小容量試験システムを用いたスクリーニングの可能性を示唆している。
【００８４】
【表１０】
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【００８５】
【表１１】
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実施例８−２００ｍｌスケールでのＰＡＡによるｍＡｂの沈殿
スケーラビリティ及び再現性をさらに試験するため、１０％ＮａＰＡＡ １５０００、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２００ｍＭ ＮａＰ（ｐＨ７）及び熱応答性ＡＰＴＰシステムでの分配（上記参照）によって清澄化したＷＡＶＥバイオリアクターからのｍＡｂ ５１供給液に基づく沈殿システムを、２００ｍｌスケールでの二重反復試験によって処理した（表１２）。複合体形成及び沈殿、並びに上澄み液の除去後、各沈殿を５０ｍｌの水中に再懸濁した。この場合には、再懸濁容量が大きかったので、追加の分析を実施することができ、また将来の分析のために若干の試料を凍結保存した。再懸濁溶液及び上澄み液の試料のｍＡｂ含有量を、抗体が（存在するｍＡｂの量の分析を可能にする）ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕｒｅプロテインＡ親和性カラムに結合するように塩濃度及びｐＨを調整することで分析した。上澄み液及び沈殿に関するタンパク質回収率を表１２に示す。予想された通り、複合体中には＞８６％の概略ｍＡｂ回収率が得られた。さらに、残りのｍＡｂは上澄み液中に存在するように思われた。これは、例えば、容易に第２の沈殿段階に付して精製ｍＡｂの量を増加させることができる。第２の沈殿段階は、単に少量のＮａＰＡＡを上澄み液に添加してＮａＰＡＡレベルを再び１０％に上昇させることで達成し得ることに気づいてほしい。この実施例では、約８６％のｍＡｂが沈殿中に見出され、１８％が上澄み液中に見出された（総量は標準誤差のために１０４％である）。最悪の場合として、沈殿中に８２％のｍＡｂが存在し（Ｋ＝８２／１８＝４．６）、そして第２の沈殿が同様な比率を与えたと仮定すれば、第１及び第２の段階からの沈殿をプールすることで約９７％のｍＡｂが複合体の形態で得られるであろう。
【００８６】
また、上記の実施例では、プロテインＡに基づくＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ親和性カラムは常法に従って使用され、正常に見えるクロマトグラム（図示せず）を与えたことに注意されたい。これは、プロテインＡタイプの親和性捕捉段階の上流に（即ち、それより以前に）沈殿段階又は分配とそれに続く沈殿段階を含めるのが可能であることを示唆している。かかる段階は、捕捉濾過、或いは充填若しくは膨張粒子ベッド又はモノリスカラムを用いる捕捉クロマトグラフィーを含み得る。
【００８７】
残留する中性のＡＰＴＰシステム関連ポリマーは、後続のアフィニティークロマトグラフィー又はイオン交換クロマトグラフィーに対してマイナスの影響を及ぼすことはない（即ち、ほとんど影響を及ぼさないか、或いはプラスの影響を及ぼすことさえある）（米国特許出願公開第２００７／０２１３５１３号）。クロマトグラフィー処理されるｍＡｂ試料中の残留ＰＡＡ（通例は初期沈殿溶液中のＰＡＡに対して僅かな比率にすぎない）に関しては、ＰＡＡは正味負の電荷を有するが、プロテインＡ類似体のｐＩは約５であるのでプロテインＡカラムも同様であることに注意すべきである。このことをそれの比較的小さいＭＷと考え合わせると、ＰＡＡはプロテインＡカラム（又は陽イオン交換カラムのような他の負荷電カラム）を通過して通過液中に入るはずである。ポリマーの小さいＭＷはまた、特異的濾過段階によるそれの除去を可能にし、或いは単に他の通常処理段階中に非特異的吸着によるそれの除去を可能にすることができる。
【００８８】
【表１２】
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実施例９−Ｃａｐｔｏ ＭＭＣカラム上での再溶解沈殿のクロマトグラフィー
この実験は、再懸濁したｍＡｂ沈殿試料が陽イオン交換媒体及び混合モード媒体を含む他の媒体上で処理できることを立証するために実施した。Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣは、バイオプロセシングのため商業的に入手できる多モード陽イオン交換媒体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ウプサラ）である。その構造及び用途に関する情報は、直接にメールで又はウェブサイトを介して供給者から入手できる（即ち、Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｅｌｕｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｎ Ｃａｐｔｏ ＭＭＣ ｕｓｉｎｇ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ １１−００３５−４８；Ｃａｐｔｏ ＭＭＣ Ｄａｔａ Ｆｉｌｅ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ １１−００２５−７６）。それは、通常乃至高い流量（大形カラムで６００ｃｍ／ｈ以上）及び通常乃至比較的高い移動相塩濃度（例えば、５〜５０ｍＳ／ｃｍ）で使用するために設計されており、高濃度の（正味正の状態の）標的タンパク質並びに残留塩及び負荷電ポリマーを含むを含む、微小容量溶液中に再懸濁した沈殿試料を処理するためには理想的と思われる。
【００８９】
使い捨てＷＡＶＥバイオリアクター中で発酵され、次いで同じ使い捨てＷＡＶＥバイオリアクター中での水性ポリマー二相（ＡＰＴＰ）分配によって清澄化されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞発酵供給液（ｍＡｂ ５ｇ／Ｌ）からの実際の供給液の試料を用いて沈殿を生成した。沈殿は、１０％（ｗ／ｗ）ＮａＰＡＡ １５０００、２００ｍＭ ＮａＰ（ｐＨ７）及び１５０ｍＭ ＮａＣｌを達成するようにポリマー及び塩を添加することにより、（ＡＰＴＰに付された初期ｍＡｂの９０％以上を保有する）ｍＡｂ含有相を改質することで誘起した。分配によって約９０％のｍＡｂを含む沈殿は、沈殿システムの全溶液容量の＜２％（ｖ／ｖ）と推定された。それを、２５０ｍＭ ＮａＣｌ及び５０ｍＭ 酢酸Ｎａからなりかつ酢酸でｐＨ５．５に調整された１０容の緩衝液に溶解した。約１７ｍｌの試料を、Ｃａｐｔｏ ＭＭＣカラム（Ｃａｐｔｏ ＭＭＣを充填した１ｍｌのＨｉＴｒａｐカラム）に０．５ｍＬ／分（滞留時間２分）で適用した。溶出（緩衝液Ｂ）は、１Ｍ ＮａＣｌを含む１００ｍＭ ＮａＰ（ｐＨ７．６）で行った。
【００９０】
目標は、ｍＡｂをカラム上に結合し、残留ＨＣＰの大部分を通過させることであった。次いで、ｐＨ及び塩濃度を高めることにより、結合したｍＡｂがカラムから溶出された。次いで、恐らくは多少の夾雑物を含む残留タンパク質が最高のｐＨ及び塩濃度で溶出された。図８は、Ｃａｐｔｏ ＭＭＣカラム上における再懸濁沈殿のクロマトグラフィーデータを示している。クロマトグラフィー実験からの画分を集め、そのＨＣＰ及びＤＮＡ含有量を分析し、データを粗供給液、上澄み液及び沈殿のものと比較する（表１３）。純度チェックのため、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ ＰＡＧＥ）分析も実施した（図９）。
【００９１】
図８のクロマトグラムは溶出液中に幅の広い初期ピークを示しているが、これはかなりの量のｍＡｂがカラムを通過したことを示唆している（即ち、初期吸着緩衝液濃度又はｍＡｂの量が使用した小形カラムにとって高すぎた）。ＳＤＳ ＰＡＧＥによってこのことが確認された（図９）。しかし、記録されたクロマトグラムの中央部における鋭いピークによって証明されるように、多く（５０％以上）のｍＡｂはカラムによって捕捉されるように思われた（表１３並びに図８及び図９参照）。負荷電ＰＡＡポリマーは、負荷電ＨＣＰ並びに恐らくは毒素、ウイルス及び他の負荷電夾雑物（分析せず）と共に通過液中に溶出されると考えられた。吸着された夾雑物は、高ｐＨで高導電率の洗浄段階で（部分的に）除去されるであろう。
【００９２】
表１３は、溶出液（画分Ａ６）中のＨＣＰが約８００ｐｐｍに低減したことを示している。ＤＮＡ含有量のレベルが使用したアッセイの検出限界未満であったことで示されるように、ＤＮＡの顕著な低減が達成された。
【００９３】
【表１３】
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実施例１０−抗体フラグメント（Ｆａｂ）の沈殿
抗体フラグメント（Ｆａｂ）は、典型的には母体ｍＡｂのＭＷの１／３のＭＷを有するが、多くの場合に母体ｍＡｂと同様なイオン交換クロマトグラフィー挙動及び同様な滴定曲線を示す（ＭＷ及び残基数に関しては、例えば、（ｍＡｂについては）Ｃ．Ｈａｒｉｎａｒａｙａｎ，Ｊ．Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｌｊｕｎｇｌｏｆ，Ｒ．Ｆａｈｒｎｅｒ，Ｊ．Ｖａｎ Ａｌｓｔｉｎｅ，Ｒ．ｖａｎ Ｒｅｉｓ，Ａｎ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｉｎ Ｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ９５（２００６）７７５−７８７、また（Ｆａｂについては）Ａ．Ｌｊｕｎｇｌｏｆ，Ｋ．Ｍ．Ｌａｃｋｉ，Ｊ．Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｃ．Ｈａｒｉｎａｒａｙａｎ，Ｒ．ｖａｎ Ｒｅｉｓ，Ｒ．Ｆａｈｒｎｅｒ，Ｊ．Ｍ．Ｖａｎ Ａｌｓｔｉｎｅ，Ｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ９６（２００７）５１５−５２４）を参照されたい）。Ｆａｂの相対疎水性、電荷密度、ｐＩのような性質が同様であることは、これらが上述した方法によって複合体化し得ることを示唆している。しかし、Ｆａｂのサイズが小さく、それに伴ってポリマー相互作用のための表面積が減少しかつ拡散率が大きくなることは、これらがある種の条件下ではｍＡｂより低い程度にしか複合体化しないかもしれない子とを示唆している。これを試験するため、内部的に供給された３ｇ／ＬのＦａｂ溶液をポリマー及び塩と合わせて、１０％（ｗ／ｗ）ＮａＰＡＡ １５０００、２００ｍＭリン酸Ｎａ（ｐＨ７）及び１５０ｍＭ ＮａＣｌ中に０．６ｇ／ＬのＦａｂを含む５ｍｌのシステムを形成した。目に見える沈殿が生じた。ＵＶ分析（Ａ２８０ｎｍ）は、これらの条件下で２０％のＦａｂが複合体化したことを示唆した。それ以上の実験は行わなかったが、ポリマー又は塩濃度の増加、ポリマーのＭＷの増加、ｐＨの変化、温度の変化などを含む上述の方法によってこの将来有望な結果を実質的に拡張することは容易に可能なはずである。
【００９４】
Ａｂ及び関連するタンパク質に加えて、ある種の他のタンパク質にもこのアプローチによる処理を施し得ることに注目するのは興味深い。かかるタンパク質は、（使用するｐＨ条件下で）正味正の電荷を有すると共に、可能ならはある程度の表面疎水性を有するべきである。上述した通り、タンパク質のサイズも一定の役割を演じるであろう。その例には、血清アルブミン及びキモトリプシンのような商業的に興味深い若干のタンパク質、並びにインスリン及び若干の他のホルモンがある。かくしてＡｌｖｅｓ ｅｔ ａｌ．は、ＰＥＧ−塩及びＰＥＧ−デキストランシステムにおいて、インスリンは１０という高い分配係数をもって上部相を好む傾向があることを示した（Ｊｏｓｅ Ｇ．Ｌ．Ｆ．Ａｌｖｅｓ，Ｌｕｃｙ Ｄ．Ａ．Ｃｈｕｍｐｉｔａｚ，Ｌｕｉｚａ Ｈ．Ｍ．ｄａ Ｓｉｌｖａ，Ｔｅｌｍａ Ｔ．Ｆｒａｎｃｏ，ａｎｄ Ａｎｔｏｎｉｏ Ｊ．Ａ．Ｍｅｉｒｅｌｌｅｓ：Ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ ｏｆ ｗｈｅｙ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ ａｎｄ ｐｏｒｃｉｎｅ ｉｎｓｕｌｉｎ ｉｎ ａｑｕｅｏｕｓ ｔｗｏ−ｐｈａｓｅ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ，７４３（２０００）２３５−２３９）。Ｆｕｅｎｔｅｓ ｅｔ ａｌ．は最近、各種のタンパク質とクロマトグラフィー基質上に非共有結合的に吸着させたＣＭＤポリマーとの相互作用を研究した。彼らは、Ｅ．ｃｏｌｉのＨＣＰがＣＭＤで修飾したマトリックスにｐＨ５で結合したがｐＨ７では結合しなかったこと、ポリマー被覆表面とのＨＣＰ相互作用の低下がイオン強度の増加と共に減少したこと、そしてｐＨ７では比較的疎水性の塩基性タンパク質であるキモトリプシン（ｐＩ約９）が、移動相に＞２００ｍＭのＮａＣｌを添加するまでポリマーから放出されなかったことに注目した。彼らはまた、ポリマー相互作用が固有の活性を保持するタンパク質にある程度の構造安全性を付与するように思われることにも注目した（Ｍａｎｕｅｌ Ｆｕｅｎｔｅｓ，Ｂｅｎｅｖｉｄｅｓ Ｃ．Ｃ．Ｐｅｓｓｅｌａ，Ｊｏｒｇｅｔｔｅ Ｖ．Ｍａｑｕｉｅｓｅ，Ｃｌａｕｄｉａ Ｏｒｔｉｚ，Ｒｏｓａ Ｌ．Ｓｅｇｕｒａ，Ｊｏｓｅ Ｍ．Ｐａｌｏｍｏ，Ｏｌｇａ Ａｂｉａｎ，Ｒｏｄｒｉｇｏ Ｔｏｒｒｅｓ，Ｃｅｓａｒ Ｍａｔｅｏ，Ｒｏｂｅｒｔｏ Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｌａｆｕｅｎｔｅ，ａｎｄ Ｊ．Ｍ．Ｇｕｉｓａｎ，Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ａｎｄ Ｓｔｒｏｎｇ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ Ｉｏｎｉｃ Ｅｘｃｈａｎｇｅ ｏｎ Ｓｕｐｐｏｒｔｓ Ｃｏａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｓｕｌｆａｔｅ−Ｄｅｘｔｒａｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２０（２００４）１１３４−１１３９）。
【００９５】
本明細書中で言及された特許、特許出願公開及びその他の公表参考文献のすべては、各々が個別かつ詳細に本明細書中に組み込まれた場合と同じく、その全体が援用によって本明細書の内容の一部をなしている。以上、本発明の好ましい例示的な実施形態を記載してきたが、当業者には、限定のためでなく例示を目的として示した記載の実施形態以外のやり方でも本発明を実施できることが容易に理解されよう。本発明は、以下に示す特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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2012515161.tif 000026
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