(57)【要約】  本発明は、マルチ−ＰＥＧ化顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）変異体を患者に投与することにより、放射線に暴露された患者における放射線誘発好中球減少症を処置または予防するための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
放射線暴露後にマルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体を患者に投与することを含む、放射線暴露に付された患者における好中球減少症を処置または予防するための方法であって、マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体が、
Ｇ−ＣＳＦ活性を示すポリペプチドであって、該ポリペプチドは配列番号：１に示されるアミノ酸配列と最大１５個のアミノ酸残基において異なるアミノ酸配列を含むポリペプチド、および
２つまたはそれ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分であって、それぞれのＰＥＧ部分は、直接的にまたは間接的にのいずれかでポリペプチドのアミノ酸残基に共有結合しているＰＥＧ部分
を含む方法。
【請求項２】
マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体が、配列番号：１のアミノ酸配列ならびにＴ１Ｋ、Ｐ２Ｋ、Ｌ３Ｋ、Ｇ４Ｋ、Ｐ５Ｋ、Ａ６Ｋ、Ｓ７Ｋ、Ｓ８Ｋ、Ｌ９Ｋ、Ｐ１０Ｋ、Ｑ１１Ｋ、Ｓ１２Ｋ、Ｆ１３Ｋ、Ｌ１４Ｋ、Ｌ１５Ｋ、Ｅ１９Ｋ、Ｑ２０Ｋ、Ｖ２１Ｋ、Ｑ２５Ｋ、Ｇ２６Ｋ、Ｄ２７Ｋ、Ａ２９Ｋ、Ａ３０Ｋ、Ｅ３３Ｋ、Ａ３７Ｋ、Ｔ３８Ｋ、Ｙ３９Ｋ、Ｌ４１Ｋ、Ｈ４３Ｋ、Ｐ４４Ｋ、Ｅ４５Ｋ、Ｅ４６Ｋ、Ｖ４８Ｋ、Ｌ４９Ｋ、Ｌ５０Ｋ、Ｈ５２Ｋ、Ｓ５３Ｋ、Ｌ５４Ｋ、Ｉ５６Ｋ、Ｐ５７Ｋ、Ｐ６０Ｋ、Ｌ６１Ｋ、Ｓ６２Ｋ、Ｓ６３Ｋ、Ｐ６５Ｋ、Ｓ６６Ｋ、Ｑ６７Ｋ、Ａ６８Ｋ、Ｌ６９Ｋ、Ｑ７０Ｋ、Ｌ７１Ｋ、Ａ７２Ｋ、Ｇ７３Ｋ、Ｓ７６Ｋ、Ｑ７７Ｋ、Ｌ７８Ｋ、Ｓ８０Ｋ、Ｆ８３Ｋ、Ｑ８６Ｋ、Ｇ８７Ｋ、Ｑ９０Ｋ、Ｅ９３Ｋ、Ｇ９４Ｋ、Ｓ９６Ｋ、Ｐ９７Ｋ、Ｅ９８Ｋ、Ｌ９９Ｋ、Ｇ１００Ｋ、Ｐ１０１Ｋ、Ｔ１０２Ｋ、Ｄ１０４Ｋ、Ｔ１０５Ｋ、Ｑ１０７Ｋ、Ｌ１０８Ｋ、Ｄ１０９Ｋ、Ａ１１１Ｋ、Ｄ１１２Ｋ、Ｆ１１３Ｋ、Ｔ１１５Ｋ、Ｔ１１６Ｋ、Ｗ１１８Ｋ、Ｑ１１９Ｋ、Ｑ１２０Ｋ、Ｍ１２１Ｋ、Ｅ１２２Ｋ、Ｅ１２３Ｋ、Ｌ１２４Ｋ、Ｍ１２６Ｋ、Ａ１２７Ｋ、Ｐ１２８Ｋ、Ａ１２９Ｋ、Ｌ１３０Ｋ、Ｑ１３１Ｋ、Ｐ１３２Ｋ、Ｔ１３３Ｋ、Ｑ１３４Ｋ、Ｇ１３５Ｋ、Ａ１３６Ｋ、Ｍ１３７Ｋ、Ｐ１３８Ｋ、Ａ１３９Ｋ、Ａ１４１Ｋ、Ｓ１４２Ｋ、Ａ１４３Ｋ、Ｆ１４４Ｋ、Ｑ１４５Ｋ、Ｓ１５５Ｋ、Ｈ１５６Ｋ、Ｑ１５８Ｋ、Ｓ１５９Ｋ、Ｌ１６１Ｋ、Ｅ１６２Ｋ、Ｖ１６３Ｋ、Ｓ１６４Ｋ、Ｙ１６５Ｋ、Ｖ１６７Ｋ、Ｌ１６８Ｋ、Ｈ１７０Ｋ、Ｌ１７１Ｋ、Ａ１７２Ｋ、Ｑ１７３ＫおよびＰ１７４Ｋからなる群から選択される配列番号：１に対して少なくとも１つの置換を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体のアミノ酸配列が、Ｑ７０Ｋ、Ｑ９０Ｋ、Ｔ１０５Ｋ、Ｑ１２０Ｋ、Ｔ１３３Ｋ、Ｓ１５９ＫおよびＨ１７０Ｋからなる群から選択される少なくとも１つの置換を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体のアミノ酸配列が、Ｋ１６Ｒ／Ｑ、Ｋ３４Ｒ／ＱおよびＫ４０Ｒ／Ｑからなる群から選択される少なくとも１つの置換をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体のアミノ酸配列が、置換Ｋ１６Ｒ、Ｋ３４Ｒ、Ｋ４０Ｒ、Ｔ１０５ＫおよびＳ１５９Ｋを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体のアミノ酸配列が、置換Ｋ１６Ｒ、Ｋ３４Ｒ、Ｋ４０Ｒ、Ｔ１０５ＫおよびＳ１５９Ｋならびに所望によりＮ−末端のメチオニン残基からなる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体が、それぞれ約１−１０ｋＤａの分子量を有する２−６つのＰＥＧ部分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体が、Ｎ−末端に結合しているＰＥＧ部分およびリジン残基に結合しているＰＥＧ部分を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦが、それぞれ約４−６ｋＤａの分子量を有する２−４つのＰＥＧ部分を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体のアミノ酸配列が、Ｋ１６Ｒ／Ｑ、Ｋ３４Ｒ／ＱおよびＫ４０Ｒ／Ｑから選択される１つまたはそれ以上の置換ならびにＱ７０Ｋ、Ｑ９０Ｋ、Ｔ１０５Ｋ、Ｑ１２０Ｋ、Ｔ１３３ＫおよびＳ１５９Ｋから選択される１つまたはそれ以上の置換を含み、それぞれ約１−１０ｋＤａの分子量を有する２−６つの結合しているＰＥＧ部分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体のアミノ酸配列が、Ｋ１６Ｒ／Ｑ、Ｋ３４Ｒ／ＱおよびＫ４０Ｒ／Ｑから選択される１つまたはそれ以上の置換ならびにＴ１０５ＫおよびＳ１５９Ｋから選択される少なくとも１つの置換を含み、それぞれ約１−１０ｋＤａの分子量を有する２−４つの結合しているＰＥＧ部分を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体のアミノ酸配列が、置換Ｋ１６Ｒ、Ｋ３４Ｒ、Ｋ４０Ｒ、Ｔ１０５ＫおよびＳ１５９Ｋを含み、それぞれ約４−６ｋＤａの分子量を有する２−４つの結合しているＰＥＧ部分を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体が、ＰＥＧ位置異性体種の混合物である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１４】
ＰＥＧ位置異性体種の混合物が、それぞれ３つの結合しているＰＥＧ部分を有する少なくとも２種のＰＥＧ位置異性体を含む、請求項１３に記載の方法であって、異性体の１つがＮ−末端、Ｌｙｓ２３およびＬｙｓ１５９に結合しているＰＥＧ部分を有し、他の異性体がＮ−末端、Ｌｙｓ１０５およびＬｙｓ１５９に結合しているＰＥＧ部分を有する方法。
【請求項１５】
ＰＥＧ部分がそれぞれ約１−１０ｋＤａの分子量を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ＰＥＧ部分がそれぞれ約５ｋＤａの分子量を有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
比較可能な条件下で動物モデルにおいて試験したとき、マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体が、ニューラスタ（登録商標）（ペグフィルグラスチム）と比較して改良された薬物動態特性を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体が、動物モデルにおいてニューラスタ（登録商標）と比較して血清半減期の上昇を示す、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体が、動物モデルにおいてニューラスタ（登録商標）と比較してＡＵＣの増加を示す、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体が、放射線誘発好中球減少症の動物モデル系において、マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体で処置されていない群と比較して、マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体で処置された群において重度の好中球減少症の期間を減少させるために有効な量において患者に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体が、放射線誘発好中球減少症の動物モデル系において、マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体で処置されていない群と比較して、マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体で処置された群において放射線暴露３０日後の生存者数を増加させるために有効な量において患者に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体が、約２０ｕｇ／ｋｇ患者体重から約３００ｕｇ／ｋｇ患者体重の用量において患者に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
患者が成人であり、マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体が患者あたり約１−３０ｍｇの用量において患者に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
１つまたはそれ以上のさらなる造血成長因子を投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
さらなる造血成長因子が、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＦＬＴ３−リガンド（ＦＬ）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、巨核球増殖発達因子（ＭＧＤＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ＴＰＯ−受容体アゴニストおよびエリスロポエチン（ＥＰＯ）から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体が、放射線暴露後、約３日以内に対象に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
放射線暴露が約１Ｇｙ以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
放射線暴露に付された患者における好中球減少症を処置または予防するための医薬の製造のためのマルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体の使用であって、放射線誘発好中球減少症の動物モデル系において、マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体で処置されていない群と比較して、マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体で処置された群において重度の好中球減少症の期間を減少させるために有効な量においてマルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体を該患者に投与することを含む使用。
【請求項２９】
放射線暴露に付された患者における好中球減少症を処置または予防するための医薬の製造のためのマルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体の使用であって、放射線誘発好中球減少症の動物モデル系において、マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体で処置されていない群と比較して、マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体で処置された群において放射線暴露３０日後の生存者数を増加させるために有効な量においてマルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体を該患者に投与することを含む使用。
【請求項３０】
動物モデル系が非ヒト霊長類モデル系である、請求項２８または２９に記載の使用。
【請求項３１】
マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体およびその使用が請求項１−２７のいずれかに定義のとおりである、請求項２８−３０のいずれかに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願との相互関係
３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．  §１１９（ｅ）にしたがって、本出願は、２００８年９月１９日に出願された米国仮出願第６１／０９８，５６９号（この内容は、すべての目的のためにその全体を出典明示により本明細書に包含させる）の利益を主張する。
【０００２】
技術分野
本発明は、マルチ(multi)−ＰＥＧ化顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）変異体を投与することにより、放射線誘発好中球減少症を処置または予防するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
骨髄において白血球が成長、分配および分化するプロセスは、造血と称される（Dexter and Spooncer, Ann. Rev. Cell. Biol., 3:423, 1987）。それぞれの血球型は多能性幹細胞から生じる。インビボにおいて生産される血球には、一般的に３つのクラス：赤血球(red blood cell)（赤血球(erythrocyte)）、血小板および白血球(white blood cell)（白血球(leukocyte)）が存在し、最後のものの大部分は宿主免疫防御に関与する。造血前駆細胞の増殖および分化は、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、Ｇ−ＣＳＦおよびインターロイキンを含むサイトカインのファミリーにより調節される（Arai et al., Ann. Rev. Biochem., 59:783-836, 1990）。インビボにおけるＧ−ＣＳＦの主な生物学的効果は、好中性顆粒球または好中球として知られている特定の白血球の成長および発達を刺激することである（Welte et al., PNAS 82:1526-1530, 1985; Souza et al., Science, 232:61-65, 1986）。血流に放出されたとき、好中性顆粒球は細菌感染症および他の感染症と闘う役割を果たす。
【０００４】
ヒトＧ−ＣＳＦ（ｈＧ−ＣＳＦ）のアミノ酸配列は、Nagata et al. (Nature 319:415-418, 1986)により報告された。ｈＧ−ＣＳＦは、２つのＧ−ＣＳＦ分子および２つの受容体の２：２複合体の形成によりＧ−ＣＳＦ受容体を二量体化するモノマータンパク質である（Horan et al., Biochemistry 35(15): 4886-96, 1996）。最近の文献（PNAS 103:3135-3140, 2006）において、Tamada et al.は、ヒトＧ−ＣＳＦとＧＣＳＦ受容体のリガンド結合領域間のシグナル伝達複合体の結晶構造を記載した。
【０００５】
白血球減少症（白血球のレベルの減少）および好中球減少症（好中球のレベルの減少）は、種々の型の感染症に罹患する可能性の増加を起こす障害である。約５００細胞／ｍｍ３以下の絶対好中球数（ＡＮＣ）により示される重度の好中球減少症（発熱性好中球減少症とも称される）を有する患者において、比較的軽い感染症でさえ重大かつ致命的にさえなり得る。組換えヒトＧ−ＣＳＦ（ｒｈＧ−ＣＳＦ）は、しばしば、白血球減少症および好中球減少症の種々の型を処置および予防するために使用される。ｒｈＧ−ＣＳＦの製品として、例えば、非−グリコシル化であり、組換え大腸菌細胞において生産されるニューポジェン(Neupogen)（登録商標）（フィルグラスチム）、および、単一のＮ−末端に連結された２０ｋＤａのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基を含む以外、ニューポジェン（登録商標）と同じアミノ酸配列を有するニューラスタ(Neulasta)（登録商標）（ペグフィルグラスチム）が市販されている。このモノ−ＰＥＧ化ｒｈＧ−ＣＳＦ分子は、非−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦと比較して半減期の上昇を有することが示されており、したがって非−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ生成物よりも少ない頻度で投与され、好中球減少症の期間を非−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦの投与とほぼ同じ日数に減少させ得る。
【０００６】
急性放射線症候群（ＡＲＳ）（放射線疾患または放射線症としても知られている）は、血液、消化器および心血管系に影響する高線量の放射線への暴露により引き起こされる一連の複雑な病態生理学的プロセスを包含する。ＡＲＳは、一般的に、比較的短期間に送達された約０．７から１グレイ（Ｇｙ）またはそれ以上の全身または重要な部分照射後に生じる（Waselenko J.K. et al., Annals of Internal Medicine 140(12):1037-1051, 2004; Jarrett D.G. et al., Radiation Measurements 42:1063-1074, 2007)。ＡＲＳの種々の症状の潜伏期、重症度および期間は、放射線量、線量率および放射線の型ならびに引き起こす暴露の不均一または均一と相関関係である。
【０００７】
ＡＲＳは、いくつかの予測できる経過が起こり、放射線に対する種々の細胞、組織および臓器系の特定の反応の徴候である症状により特徴付けられる（例えば、上記Waselenko et al.,、特に図１、表１−３および表５、参照）。ＡＲＳと関連する症状は、吐き気、嘔吐、下痢、好中球減少症、皮膚のやけどおよび痛み、疲労、脱水症、炎症、脱毛、口腔粘膜およびＧＩ系の潰瘍、口内乾燥ならびに出血（例えば、鼻、口および直腸から）を含む。速い速度で複製する細胞、例えば、造血前駆細胞、精母細胞および腸陰窩細胞は、急性放射線暴露に即座に影響されやすい。測定可能な臨床影響の可能性は、全線量または線量率の増加と共に増加する。しかしながら、単一の迅速な暴露後に観察できる効果を生じる全放射線量が、非常に長期間にわたって与えられるとき、測定可能な効果が少なくて耐え得る。
【０００８】
循環造血細胞および造血前駆（骨髄）細胞は非常に高い放射線感受性細胞である。放射線疾患と関連する症状に関する一般的な基本的な原因は、このような細胞における放射線の効果である。造血症候群（Ｈ−ＡＲＳ）は、一般的に約０．７−１Ｇｙを越える有意な部分または全身放射線レベルに暴露されたヒトにおいて見られ（上記Jarrett et al.,;上記Waselenko et al.,）、まれにこのレベルより臨床的に有意に低い。有糸分裂の活性な造血前駆細胞は、２から３Ｇｙの全身放射線量後に分裂する能力が限定される。ＡＲＳの造血症候群は、潜在的に臨床的に有意な結果と共に、血球数−白血球（ＷＢＣ；好中球およびリンパ球）、血小板（血小板(thrombocyte)）および赤血球（ＲＢＣ）−の減少により特徴付けられる。電離放射線への暴露は、ＷＢＣ数の減少を引き起こし得、好中球減少症（好中球／顆粒球の減少）およびリンパ球減少症（リンパ球の減少）として現れる。ＲＢＣ減少は貧血症を引き起こし得、血小板減少は血小板減少症を引き起こし得る。放射線誘発好中球減少症、血小板減少症および貧血症の動態は、与えられた線量、線量率および体が照射される程度に依存する（上記Waselenko et al.,）。骨髄における細胞産生に対する放射線誘発ダメージは暴露時に始まる。多数の骨髄前駆細胞が十分に高い放射線量後に細胞死を引き起こしやすいが、幹細胞または補助細胞の亜集団は、おそらく非周期（Ｇ０）状態であるため、より放射線抵抗性であることが見出されており、これは潜在的致死線量の暴露後の造血の回復において重要な役割を果たし得る（上記Waselenko et al.,）。
【０００９】
放射線の効果は、また、暴露された体表面積量に依存する。人体は即座の死の危険なしに全身面積にわたって最大約２Ｇｙの単一線量を吸収することができると考えられている。約２Ｇｙを越える線量は、処置されないとき、骨髄機能不全のために死を引き起こす可能性が高い。短期間にわたって与えられた約８Ｇｙまたはそれ以上の全身線量では、ほとんど確実に死亡する。対照的に、１０Ｇｙが、長期間にわたって、および／または少量の組織に（例えば、癌治療のため）送達されるとき、耐えることができる。
【００１０】
放射線誘発好中球減少症は、腐生および病原生物による致命的な感染症への罹患率を増加させ、腸壁の完全性の破壊からの皮下組織における細菌拡散に対する免疫力を低下させる。感染症および敗血症に罹患しやすいことは、２−８Ｇｙ範囲における電離放射線への暴露を有する対象における死亡の主な原因である。好中球減少症と共に、種々の程度の血小板減少症も観察され得る。重度の血小板減少症は、処置されずに放置されると致命的な出血を引き起こす可能性が増加し得る。
【００１１】
ＡＲＳと関連する放射線誘発好中球減少症は、例えば、原子力事故または偶発的な放射線暴露を介して高レベルの放射線に暴露された患者において、有意な死亡率および罹患率につながる。ＡＲＳと関連する放射線誘発好中球減少症を減少させるために安全に投与され得る長時間作用型Ｇ−ＣＳＦ生成物、特にマルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ、ならびにこのようなＧ−ＣＳＦ生成物を使用する放射線誘発好中球減少症の処置および予防のための方法の必要性が存在する。
【発明の概要】
【００１２】
発明の簡単な説明
本発明の対象は、例えば、核爆発または偶発的な放射線暴露の結果として、放射線に暴露された患者における好中球減少症を処置または予防する方法を提供すること、放射線誘発好中球減少症の期間および／または重症度を減少させ、このような患者における致命的な感染症のリスクを減少させることにより生存性を増強することである。
【００１３】
したがって、本発明の１つの局面は、放射線暴露に付された患者における好中球減少症を処置または予防するための方法であって、放射線誘発好中球減少症、例えば、急性放射線症候群（ＡＲＳ）と関連する放射線誘発好中球減少症、例えば、ＡＲＳの造血症候群（Ｈ−ＡＲＳ）を減少させるために有効な量においてマルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体を該患者に投与することを含む方法に関する。
【００１４】
本発明のさらなる局面は、本明細書に記載されている方法の手段により好中球減少症を処置または予防するためのマルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体に関する。したがって、本発明のこの局面は、放射線誘発好中球減少症の処置のためのマルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体に関する。本発明のこの局面は、また、マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体を患者に投与することにより、放射線に暴露された患者における好中球減少症を処置または予防するためのマルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体に関する。
【００１５】
本発明のさらなる局面は、本明細書に記載されている方法の手段により放射線誘発好中球減少症を処置または予防するための医薬の製造のためのマルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体の使用に関する。したがって、本発明のこの局面は、放射線に暴露された患者における放射線誘発好中球減少症を処置または予防するための医薬の製造のためのマルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体の使用であって、マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体は放射線誘発好中球減少症を減少させるために有効な量において患者に投与される使用に関する。本発明のこの局面は、また、放射線誘発好中球減少症の処置のための医薬の製造のためのマルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体の使用に関する。本発明のこの局面は、また、マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体を患者に投与することにより、放射線暴露に付された患者における放射線誘発好中球減少症を処置または予防するための医薬の製造のためのマルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体の使用に関する。
【００１６】
いくつかの態様において、マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体は、放射線誘発好中球減少症の動物モデル系（例えば、非ヒト霊長類モデル系）において、マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体で処置されていない群と比較して、マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体で処置された群において重度の好中球減少症の期間を減少させるために有効な量において患者に投与される。他の態様において、マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体は、放射線誘発好中球減少症の動物モデル系（例えば、非ヒト霊長類モデル系）において、マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体で処置されていない群と比較して、マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体で処置された群において放射線暴露３０日後または６０日後の生存者数を増加させるために有効な量において患者に投与される。
【００１７】
本発明のこれらのおよび他の局面および特徴は、以下の詳細な説明を添付の図面と併せて読むとき、さらに完全に明白になる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、対数尺度における、プロビット致死率  対  グレイ（Ｇｙ）におけるＴＢＩ線量として示される、アカゲザルにおける６０日の造血症候群致死と線量応答関係を示す。２ＭＶ  ＬＩＮＡＣ光子に暴露され、対症療法を受けているアカゲザルに関する得られたＬＤ５０／６０値は、ＬＤ５０ＬＩＮＡＣ（角型括弧［  ］内に９５％信頼区間）として示されている。この図は、また、Ｃｏ−６０  ガンマおよび２ＭＶ  Ｘ−放射線に暴露されたアカゲザルのＴＢＩ線量応答および計算されたＬＤ５０／３０値（角型括弧［  ］内に９５％信頼区間）（それぞれＬＤ５０Ｃｏ６０およびＬＤ５０Ｘ線で示される）を示す２つの歴史的データセットを示す。歴史的試験における動物には対症療法を与えていなかった。
【００１９】
【図２】図２は、対症療法を与えられた、約ＬＤ３０／６０（７２０センチグレイ（ｃＧｙ））、ＬＤ５０／６０（７５５ｃＧｙ）およびＬＤ７０／６０（８０５ｃＧｙ）の線量にて全身照射暴露後のアカゲザルにおける平均絶対好中球数（ＡＮＣ）の経時変化を示す。
【００２０】
【図３】図３は、本発明の典型的なマルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体（本明細書において“Ｍａｘｙ−Ｇ２１”として同定される）が、モノ−ＰＥＧ化ｒｈＧ−ＣＳＦと比較して、放射線暴露後に非ヒト霊長類における好中球回復を改善することを証明する。アカゲザルにおける絶対好中球数（ＡＮＣ）は、６００ｃＧｙ（６．００Ｇｙ）照射および照射１日後にＭａｘｙ−Ｇ２１、ニューラスタ（登録商標）または対照（血清）の投与後に測定した。重度の好中球減少症（ＡＮＣ＜５００／μＬ）は水平線により示される。
【００２１】
【図４】図４は、照射１日後に３００μｇ／ｋｇのＭａｘｙ−Ｇ２１または３００μｇ／ｋｇのニューラスタ（登録商標）のいずれかを投与された６００ｃＧｙ−照射アカゲザルの薬物動態学（ＰＫ）プロフィールを示す。
【００２２】
【図５】図５は、７７６ｃＧｙ放射線に暴露され、次に本発明の典型的なマルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体（“Ｇ３４”、本明細書において“Ｍａｘｙ−Ｇ３４”としても同定される）または希釈剤（“ビヒクル”）で処置されたマウスのカプラン・マイヤー生存曲線を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを照射し、次に暴露２４時間および７日後（白ダイヤ）または暴露後２４時間、７日および１４日後（白四角）にＧ３４（１．０ｍｇ／ｋｇ＝２０μｇ／２０ｇｍマウス）を皮下注射した。対照マウスは、暴露２４時間、７日および１４日後（黒三角）に希釈剤を注射した。マウスは抗生物質で処理しなかった。
【００２３】
【図６】図６は、７９６ｃＧｙ放射線に暴露され、次に本発明の典型的なマルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体（“Ｇ３４”、本明細書において“Ｍａｘｙ−Ｇ３４”としても同定される）または希釈剤（“ビヒクル”）で処置されたマウスのカプラン・マイヤー生存曲線を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを照射し、次に暴露２４時間および７日後（白ダイヤ）または暴露後２４時間、７日および１４日後（白四角）にＧ３４（１．０ｍｇ／ｋｇ＝２０μｇ／２０ｇｍマウス）を皮下注射した。対照マウスは、暴露２４時間、７日および１４日後（黒三角）にビヒクルを注射した。マウスは抗生物質で処理しなかった。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
定義
本明細書および特許請求の範囲において、以下の定義が適用される。
【００２５】
“ポリペプチド”または“タンパク質”なる用語は、本明細書において互換的に使用され得、いずれかの特定の長さのアミノ酸配列に限定されないアミノ酸のポリマーを示す。これらの用語は、全長タンパク質だけなく、例えば、任意の与えられたタンパク質またはポリペプチドのフラグメント、短縮バージョン、変異体、ドメインなども含むことを意図する。
【００２６】
“Ｇ−ＣＳＦポリペプチド”は、配列番号：１で示されるヒト顆粒球コロニー刺激因子（ｈＧ−ＣＳＦ）の配列を有するポリペプチドまたはＧ−ＣＳＦ活性を示すｈＧ−ＣＳＦの変異体である。“Ｇ−ＣＳＦ活性”は、Ｇ−ＣＳＦ受容体に結合する能力であり得るが（Fukunaga et al., J. Bio. Chem, 265:14008, 1990、これは出典明示により本明細書に包含させる）、好ましくは、例えば、マウス細胞系ＮＦＳ−６０(ATCC Number: CRL-1838)を使用するインビトロ活性アッセイにおいて測定され得るＧ−ＣＳＦ細胞増殖活性である。ＮＦＳ−６０細胞系を使用するＧ−ＣＳＦ活性に関する適当なインビトロアッセイは、Hammerling et al. in J. Pharm. Biomed. Anal. 13(1):9-20, 1995（これは出典明示により本明細書に包含させる）に記載されている。“Ｇ−ＣＳＦ活性を示す”ポリペプチドは、測定可能な機能、例えば、インビトロアッセイにおける測定可能な細胞増殖活性を示すとき、このような活性を有すると考えられる。
【００２７】
“変異体”（例えば、“Ｇ−ＣＳＦ変異体”）は、１個またはそれ以上のアミノ酸残基において親ポリペプチドと異なるポリペプチドであって、ここで、親ポリペプチドは、一般的に天然野生型アミノ酸配列を有するもの、典型的に天然哺乳動物ポリペプチド、さらに典型的に天然ヒトポリペプチドである。したがって、変異体は、天然ポリペプチドと比較して、１つまたはそれ以上の置換、挿入または欠失を含む。これらは、例えば、１個もしくはそれ以上のアミノ酸残基によるＮ−および／もしくはＣ−末端の切断、またはＮ−および／もしくはＣ−末端に１個もしくはそれ以上のアミノ酸残基の付加、例えば、Ｎ−末端のメチオニン残基の付加を含んでもよい。変異体は、しばしば、最大１５個のアミノ酸残基、例えば、最大１２、１０、８または６個のアミノ酸残基において親ポリペプチドと異なっている。いくつかのＧ−ＣＳＦ変異体は、特に、Ｎ−末端のメチオニン残基の付加を有するか、または有さないいずれかのＧ−ＣＳＦ配列においてアミノ酸置換を有する。
【００２８】
“修飾された”Ｇ−ＣＳＦなる用語は、例えば、グリカン構造の変化により修飾されている、ヒトＧ−ＣＳＦの配列またはヒトＧ−ＣＳＦの変異体のいずれかを有するＧ−ＣＳＦ分子を示す。例えば、Ｇ−ＣＳＦのグリカン構造は、ポリエチレングリコール部分がグリコシル結合基、例えば、ＷＯ２００５／０５５９４６（これは出典明示により本明細書に包含させる）に記載されているシアル酸部分に結合している、グリコ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ分子を提供することを目的のために修飾され得る。修飾されたＧ−ＣＳＦ分子の他の例は、野生型ポリペプチドに存在しない少なくとも１つのＯ−結合グリコシル化部位を含むものである。このような非天然Ｏ−結合グリコシル化部位を有するＧ−ＣＳＦ分子ならびにＧ−ＣＳＦの修飾された糖のペグ化は、ＷＯ２００５／０７０１３８（これは出典明示により本明細書に包含させる）に記載されている。
【００２９】
他に記載のない限り、本明細書において使用される“Ｇ−ＣＳＦ”なる用語は、天然ヒト配列（配列番号：１）を有するＧ−ＣＳＦ分子ならびにヒトＧ−ＣＳＦ配列の変異体を包含することを意図する。どちらの場合においても、“Ｇ−ＣＳＦ”なる用語は、また、修飾されたＧ−ＣＳＦ、例えば、Ｇ−ＣＳＦグリコシル化変異体を含むことを意図する。
【００３０】
“複数のポリエチレングリコール部分”を含むＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ（本明細書において“マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ”としても称される）は、ポリペプチドに共有結合しているＰＥＧ部分を１つのみ有する“モノ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ”と対照的に、直接的にまたは間接的にのいずれかでポリペプチドのアミノ酸残基に共有結合している２つ以上のＰＥＧ部分を有するＧ−ＣＳＦポリペプチドを示す。適当な結合点は、例えば、リジン残基のεアミノ基またはＮ−末端アミノ基、遊離カルボン酸基（例えば、Ｃ−末端アミノ酸残基またはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸残基のもの）、システイン残基のチオール基、適当に活性化されたカルボニル基、酸化された炭水化物部分およびメルカプト基を含む。ＰＥＧ結合点およびＰＥＧ部分のタンパク質への結合のための方法に関するさらなる情報は、例えば、ＷＯ０１／５１５１０、ＷＯ０３／００６５０１およびNektar Advanced PEGylation Catalog 2005-2006(Nektar Therapeutics)（これらすべてを出典明示により本明細書に包含させる）において見出すことができる。ペグ化のための他の可能性は、例えば、グリカン修飾の方法（上記参照）により、Ｇ−ＣＳＦのグリカン構造にＰＥＧ部分を結合させることである。
【００３１】
“マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体”は、直接的にまたは間接的にのいずれかで変異体のアミノ酸残基に共有結合している２つ以上のＰＥＧ部分を有するＧ−ＣＳＦ変異体を示す。
【００３２】
本明細書において、アミノ酸名および原子名（例えば、ＣＡ、ＣＢ、ＮＺ、Ｎ、Ｏ、Ｃなど）は、IUPAC nomenclature (IUPAC Nomenclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides (residue names, atom names etc.), Eur. J. Biochem., 138, 9-37 (1984)（Eur. J. Biochem., 152, 1 (1985)における修正版と共に）に基づいているタンパク質データバンク（ＰＤＢ）により定義されるとおりに使用される。“アミノ酸残基”なる用語は、あらゆる天然または非天然アミノ酸残基、特に２０個の天然アミノ酸からなる基に含まれるアミノ酸残基、すなわちアラニン（ＡｌａまたはＡ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、グリジン（ＧｌｙまたはＧ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、リジン（ＬｙｓまたはＫ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、スレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、バリン（ＶａｌまたはＶ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）およびチロシン（ＴｙｒまたはＹ）残基を示すことを意図する。
【００３３】
本明細書におけるアミノ酸位置／置換で同定するために使用される専門用語は、以下の説明のとおりである：Ｆ１３は、参照アミノ酸配列においてフェニルアラニン残基により占有されている位置番号１３を示す。Ｆ１３Ｋは、位置１３のフェニルアラニン残基がリジン残基で置換されていることを示す。他に記載のない限り、本明細書で使用されるアミノ酸残基の番号は、配列番号：１に示されるｈＧ−ＣＳＦのアミノ酸配列に対応する。他の置換は“／”で示され、例えば、Ｋ１６Ｒ／Ｑは、位置１６におけるリジンがアルギニンまたはグルタミンのいずれかで置換されているアミノ酸配列を意味する。複数の置換は“＋”で示され、例えば、Ｋ４０Ｒ＋Ｔ１０５Ｋは、位置４０におけるリジン残基のアルギニン残基での置換および位置１０５におけるスレオニン残基のリジン残基での置換を含むアミノ酸配列を意味する。
【００３４】
“機能的(functional)インビボ半減期”なる用語は、通常の意味、すなわち試験分子（例えば、ＰＥＧ化複合体）の生物学的活性の５０％がなお体／標的臓器内に存在する時間、またはポリペプチドまたは複合体の活性が最初の値の５０％である時間において使用される。“血清半減期”は、複合体分子の５０％が、クリアされる前に、血漿または血流において循環する時間として定義される。血清半減期に対する代替用語は、“血漿半減期”、“循環半減期”、“血清クリアランス”、“血漿クリアランス”および“クリアランス半減期”を含む。試験分子（例えば、ＰＥＧ化複合体）は、１つ以上の細網内皮系（ＲＥＳ）、腎臓、脾臓または肝臓の作用により、受容体介在分解により、または、特異的もしくは非特異的タンパク質分解により、特に受容体介在クリアランスおよび腎臓クリアランスの作用により、クリアされる。通常、クリアランスは、サイズ（糸球体濾過に関するカットオフと比較して）、電荷、結合している炭水化物鎖およびタンパク質に対する細胞受容体の存在に依存している。維持されるべき機能性は、通常、増殖または受容体結合活性から選択される。機能的インビボ半減期および血清半減期は、当分野で既知の任意の適当な方法により決定され得る。
【００３５】
インビボ半減期または血清半減期に関して使用される“上昇”なる用語は、比較可能な条件下で測定される（一般的に実験動物、例えば、ラット、ウサギ、ブタまたはサルにおいて測定される）とき、試験分子、すなわちマルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体の半減期が、参照分子のもの、例えば、非結合（すなわち、非ＰＥＧ化）ｈＧ−ＣＳＦ（例えば、ニューポジェン（登録商標））のもの、または好ましくはモノ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦニューラスタ（登録商標）のものと比較して、統計的に有意に上昇していることを示すために使用される。例えば、試験分子の血清半減期（ｔ1/2）は、参照分子のものに対して少なくとも約１．２倍（すなわち、（試験分子のｔ1/2）／（参照分子のｔ1/2）＝１．２）、例えば、少なくとも約１．４倍、例えば、少なくとも約１．５倍、例えば、少なくとも約１．６倍、例えば、少なくとも約１．８倍、例えば、少なくとも約２．０倍、２．５倍、３倍、５倍または１０倍に上昇させ得る。
【００３６】
“ＡＵＣ”または“濃度曲線下面積”なる用語は、通常の意味、すなわち、試験分子が対象に投与されている血清濃度  対  時間曲線下の面積として使用される。実験濃度−時点が測定されたとき、ＡＵＣは、コンピュータープログラム、例えば、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）（GraphPad Software, Inc.）により好都合に計算され得る。
【００３７】
ＡＵＣに関して使用される“増加”なる用語は、比較可能な条件下で測定される（一般的に実験動物、例えば、ラット、ウサギ、ブタまたはサルにおいて測定される）とき、試験分子、すなわちマルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体のＡＵＣが、参照分子のもの、例えば、非結合ｈＧ−ＣＳＦ（例えば、ニューポジェン（登録商標））のもの、または好ましくはモノ−ＰＥＧ化ｈＧ−ＣＳＦニューラスタ（登録商標）のものと比較して、統計的に有意に増加していることを示すために使用される。例えば、試験分子のＡＵＣは、参照分子のものに対して少なくとも約１．２倍（すなわち、（試験分子のＡＵＣ）／（参照分子のＡＵＣ）＝１．２）、例えば、少なくとも約１．４倍、例えば、少なくとも約１．５倍、例えば、少なくとも約１．６倍、例えば、少なくとも約１．８倍、例えば、少なくとも約２．０倍、２．５倍、３倍、５倍または１０倍に増加させ得る。
【００３８】
“対象”なる用語は、動物、例えば、非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコまたはイヌ）または霊長類（例えば、サル、チンパンジーまたはヒト）を含む哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類（例えば、サルまたはチンパンジー）またはヒトを示す。場合によっては、対象は、放射線に暴露されている哺乳動物、例えば、ヒトである。“対象”なる用語は、本明細書において“患者”と互換的に使用される。
【００３９】
“急性放射線暴露”なる用語は、短期間、すなわち、２４時間（例えば、２０時間未満、１６時間未満、１２時間未満、１０時間未満、８時間未満、６時間未満、２時間未満、１時間未満、３０分未満、２０分未満、１０分未満、５分未満または１分未満）の放射線への暴露を示す。急性放射線暴露は、核事象（例えば、核爆発）；実験または製造事故；分または時間にわたって高い放射能源の取り扱い中の暴露；または偶発的もしくは故意の高い医薬品投与から生じ得る。
【００４０】
“放射線量”なる用語は、物質または組織により吸収された放射線の全量を示し、一般的にセンチグレイ（ｃＧｙ）またはグレイ（Ｇｙ）において表される。
【００４１】
“放射線量率”なる用語は、時間単位あたりの吸収された放射線量を示す。
【００４２】
“ＬＤｘ／ｙ”なる用語は、ｙ日に対象のｘ％の死を引き起こす放射線の平均線量を示す。例えば、ＬＤ５０／３０およびＬＤ５０／６０なる用語は、それぞれ３０または６０日に対象の５０％の死を引き起こす放射線の平均線量を示す。
【００４３】
さらなる種々の用語は、本明細書において定義されているか、または他で特徴付けられている。
【００４４】
発明の詳細な説明
本発明は、放射線に暴露された患者における好中球減少症を処置または予防するための方法であって、放射線誘発好中球減少症を減少させるために有効な量においてマルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体を該患者に投与することを含む方法を提供する。
【００４５】
我々は、マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体の投与が、照射された非ヒト霊長類モデルにおいて、モノ−ＰＥＧ化ｈＧ−ＣＳＦ（ニューラスタ（登録商標））の投与と比較して、放射線誘発好中球減少症の期間を減少させるのに非常に有効であることを見出した。絶対好中球回復（ＡＮＣ）にかかる時間の減少が、また、対照およびモノ−ＰＥＧ化ｈＧ−ＣＳＦ（ニューラスタ（登録商標））の両方と比較して、有意に改善された。本明細書において使用される“ＡＮＣ回復にかかる時間”なる用語は、化学療法の１日目から出発して、対象が上記０．５×１０９個のＡＮＣ細胞／Ｌの数、すなわち、上記重度の好中球減少症に対する定義限界を有する連続２日間の最初の日までの日数として定義する。ＡＮＣ回復にかかる時間、白血球減少症の期間／日数および重度の好中球減少症の期間／日数は、すべて、放射線に暴露された患者が免疫抑制状態である（“好中球減少症の日数”および“重度の好中球減少症の日数”なる用語は、本明細書において互換的に使用される）期間を示す。この期間中、患者は急性放射線症候群の他の症状を悪化させ得、死を引き起こし得る感染症に罹患しやすい。本明細書の実施例に記載されている結果を考慮すると、マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体の投与は、対象における放射線誘発好中球減少症の規模および期間の減少において、モノ−ＰＥＧ化ｈＧ−ＣＳＦ（ニューラスタ（登録商標））の投与よりも非常に有効であることが考えられる。
【００４６】
本発明の方法は、ＡＮＣ回復にかかる時間、白血球減少症の日数および好中球減少症の日数の減少において有効である。等用量にて、該方法は、モノ−ＰＥＧ化ｈＧ−ＣＳＦ（ニューラスタ（登録商標））と比較して、ＡＮＣ回復にかかる時間、白血球減少症の日数および好中球減少症の日数の減少において非常に有効である。
【００４７】
本発明の方法において、マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体は、好ましくは放射線暴露後７日以内に投与される。例えば、マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体は、放射線暴露後約４日以内、例えば、放射線暴露後３日以内、例えば、放射線暴露後２日以内、例えば、放射線暴露後１日（２４時間）以内に投与され得る。マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体は、患者の予後に依存して、処置レジメンの経過中に２倍またはそれ以上において投与され得る。例えば、マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体は、毎週、例えば、２週間、３週間または４週間投与され得る。非−ＰＥＧ化ｈＧ−ＣＳＦ（例えば、ニューポジェン（登録商標））およびモノ−ＰＥＧ化ｈＧ−ＣＳＦ（例えば、ニューラスタ（登録商標））と比較して、マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体のより優れたバイオアベイラビリティのため、マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体は、好ましくは、患者の予後に依存して、より長い時間にわたって、例えば、１０日ごと、２週間ごと、１８日ごとまたは３週間ごとに投与され得る。
【００４８】
マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体
マルチ−ＰＥＧ化タンパク質は、当分野で知られている多くの方法において製造され得る。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分のタンパク質またはポリペプチドへの共有結合（すなわち、結合）（“ペグ化”）は、例えば、循環半減期を改善する、および／または可能なエピトープを保護し、望ましくない免疫原性応答の可能性を減少させるために、このようなタンパク質またはポリペプチド、特に医薬タンパク質の特性を改善するための既知の技術である。活性化ＰＥＧに基づく多数の技術が、ＰＥＧ部分のタンパク質上の１つまたはそれ以上の基への結合を提供するために利用することができる。例えば、ｍＰＥＧ−スクシンイミジルプロピオネート（ｍＰＥＧ−ＳＰＡ、Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓから入手できる）は、一般的に、アミド結合を介してＮ−末端およびリジン残基のε−アミノ基への結合に対して選択的であると見なされている。上記のとおり、市販されているＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ生成物ニューラスタ（登録商標）は、Ｇ−ＣＳＦ分子のＮ−末端に結合している単一の２０ｋＤａのＰＥＧ部分を含む。
【００４９】
いくつかの態様において、本明細書に記載されているマルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体は、実験動物、例えば、ラットにおいて試験されるとき、モノ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦニューラスタ（登録商標）（ペグフィルグラスチム）と比較して、改善された薬物動態パラメーター、例えば、血清半減期の上昇および／または濃度曲線下面積（ＡＵＣ）の増加を示す。本発明において、マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体は、放射線誘発好中球減少症の動物モデルにおいて、等用量にて回復にかかる時間の短縮および好中球減少症／白血球減少症の期間の短縮を提供する、モノ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦニューラスタ（登録商標）を越える利点があることを見出した。
【００５０】
１つの態様において、本発明において投与されるマルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体は、アミド結合を介してＮ−末端アミノ基および／またはリジン残基のε−アミノ基に優先的に結合するアミン−特異的活性化ＰＥＧでＰＥＧ化され得る。アミン−特異的活性化ＰＥＧ誘導体の例として、ｍＰＥＧ−スクシンイミジル  プロピオネート（ｍＰＥＧ−ＳＰＡ）、ｍＰＥＧ−スクシンイミジルブタノエート（ｍＰＥＧ−ＳＢＡ）およびｍＰＥＧ−スクシンイミジル  α−メチルブタノエート（ｍＰＥＧ−ＳＭＢ）（Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓから利用できる；Nektar Advanced PEGylation Catalog 2005-2006, “Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation”参照）；ＰＥＧ−ＳＳ（スクシンイミジルスクシネート）、ＰＥＧ−ＳＧ（スクシンイミジルグルタレート）、ＰＥＧ−ＮＰＣ（ｐ−ニトロフェニルカーボネート）およびＰＥＧ−イソシアネート（ＳｕｎＢｉｏ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから利用できる）；ならびにＰＥＧ−ＳＣＭ（ＮＯＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから利用できる）を含む。ポリエチレングリコールは、直線または分岐のいずれかであり得る。
【００５１】
ＰＥＧ化タンパク質を得るための方法は当分野で知られている；例えば、Nektar Advanced PEGylation Catalog 2005-2006（これは出典明示により本明細書に包含させる）、参照。ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体およびそれらの製造方法は、例えば、ＷＯ０１／５１５１０、ＷＯ０３／００６５０１、ＵＳ６，６４６，１１０、ＵＳ６，５５５，６６０およびＵＳ６，８３１，１５８（これらそれぞれは出典明示により本明細書に包含させる）に記載されている。
【００５２】
好ましい態様において、マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体は、Ｎ−末端に結合しているＰＥＧ部分およびリジン残基に結合している少なくとも１個のＰＥＧ部分を含む。
【００５３】
１つの態様において、投与されるマルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体は、ペグ化が望ましい位置にリジン残基を導入するために、配列番号：１のｈＧ−ＣＳＦ配列において少なくとも１つの置換を含む。特に、リジン残基は、Ｔ１Ｋ、Ｐ２Ｋ、Ｌ３Ｋ、Ｇ４Ｋ、Ｐ５Ｋ、Ａ６Ｋ、Ｓ７Ｋ、Ｓ８Ｋ、Ｌ９Ｋ、Ｐ１０Ｋ、Ｑ１１Ｋ、Ｓ１２Ｋ、Ｆ１３Ｋ、Ｌ１４Ｋ、Ｌ１５Ｋ、Ｅ１９Ｋ、Ｑ２０Ｋ、Ｖ２１Ｋ、Ｑ２５Ｋ、Ｇ２６Ｋ、Ｄ２７Ｋ、Ａ２９Ｋ、Ａ３０Ｋ、Ｅ３３Ｋ、Ａ３７Ｋ、Ｔ３８Ｋ、Ｙ３９Ｋ、Ｌ４１Ｋ、Ｈ４３Ｋ、Ｐ４４Ｋ、Ｅ４５Ｋ、Ｅ４６Ｋ、Ｖ４８Ｋ、Ｌ４９Ｋ、Ｌ５０Ｋ、Ｈ５２Ｋ、Ｓ５３Ｋ、Ｌ５４Ｋ、Ｉ５６Ｋ、Ｐ５７Ｋ、Ｐ６０Ｋ、Ｌ６１Ｋ、Ｓ６２Ｋ、Ｓ６３Ｋ、Ｐ６５Ｋ、Ｓ６６Ｋ、Ｑ６７Ｋ、Ａ６８Ｋ、Ｌ６９Ｋ、Ｑ７０Ｋ、Ｌ７１Ｋ、Ａ７２Ｋ、Ｇ７３Ｋ、Ｓ７６Ｋ、Ｑ７７Ｋ、Ｌ７８Ｋ、Ｓ８０Ｋ、Ｆ８３Ｋ、Ｑ８６Ｋ、Ｇ８７Ｋ、Ｑ９０Ｋ、Ｅ９３Ｋ、Ｇ９４Ｋ、Ｓ９６Ｋ、Ｐ９７Ｋ、Ｅ９８Ｋ、Ｌ９９Ｋ、Ｇ１００Ｋ、Ｐ１０１Ｋ、Ｔ１０２Ｋ、Ｄ１０４Ｋ、Ｔ１０５Ｋ、Ｑ１０７Ｋ、Ｌ１０８Ｋ、Ｄ１０９Ｋ、Ａ１１１Ｋ、Ｄ１１２Ｋ、Ｆ１１３Ｋ、Ｔ１１５Ｋ、Ｔ１１６Ｋ、Ｗ１１８Ｋ、Ｑ１１９Ｋ、Ｑ１２０Ｋ、Ｍ１２１Ｋ、Ｅ１２２Ｋ、Ｅ１２３Ｋ、Ｌ１２４Ｋ、Ｍ１２６Ｋ、Ａ１２７Ｋ、Ｐ１２８Ｋ、Ａ１２９Ｋ、Ｌ１３０Ｋ、Ｑ１３１Ｋ、Ｐ１３２Ｋ、Ｔ１３３Ｋ、Ｑ１３４Ｋ、Ｇ１３５Ｋ、Ａ１３６Ｋ、Ｍ１３７Ｋ、Ｐ１３８Ｋ、Ａ１３９Ｋ、Ａ１４１Ｋ、Ｓ１４２Ｋ、Ａ１４３Ｋ、Ｆ１４４Ｋ、Ｑ１４５Ｋ、Ｓ１５５Ｋ、Ｈ１５６Ｋ、Ｑ１５８Ｋ、Ｓ１５９Ｋ、Ｌ１６１Ｋ、Ｅ１６２Ｋ、Ｖ１６３Ｋ、Ｓ１６４Ｋ、Ｙ１６５Ｋ、Ｖ１６７Ｋ、Ｌ１６８Ｋ、Ｈ１７０Ｋ、Ｌ１７１Ｋ、Ａ１７２Ｋ、Ｑ１７３ＫおよびＰ１７４Ｋ（残基の位置は配列番号：１に関する）からなる群から選択される１つまたはそれ以上の置換の手段により導入され得る。
【００５４】
したがって、好ましいアミノ酸置換の例は、１個またはそれ以上のＱ７０Ｋ、Ｑ９０Ｋ、Ｔ１０５Ｋ、Ｑ１２０Ｋ、Ｔ１３３Ｋ、Ｓ１５９ＫおよびＨ１７０Ｋ／Ｑ／Ｒ、例えば、これらの置換の２個、３個、４個または５個、例えば：Ｑ７０Ｋ＋Ｑ９０Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｔ１０５Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ、Ｔ１０５Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ、Ｔ１０５Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｔ１０５Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ１２０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ、Ｑ１２０Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ１２０Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｔ１３３Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｔ１３３Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｓ１５９Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｑ９０Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｑ９０Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｑ９０Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ９０＋Ｓ１５９Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｔ１０５Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ、Ｔ１０５Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｔ１０５Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｔ１０５Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｔ１０５Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｔ１０５Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ１２０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ１２０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ１２０Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｔ１３３Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｑ９０Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｑ９０Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｑ９０Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｑ９０Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１０５＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１０５＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１０５＋Ｓ１５９Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｔ１０５Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｔ１０５Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｔ１０５Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｔ１０５Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ＋Ｈ１７０ＫまたはＱ１２０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ＋Ｈ１７０Ｋを含む。上記のすべての変異体において、置換Ｈ１７０ＫはＨ１７０ＱまたはＨ１７０Ｒに代えられ得る。リジンを導入するために特に好ましい置換は、Ｔ１０５ＫとＳ１５９Ｋのうちの１つまたはその両方を含む。
【００５５】
さらなる態様において、Ｇ−ＣＳＦポリペプチドは、位置１６、２３、３４および４０における１個またはそれ以上の天然リジン残基がこれらの位置においてペグ化を避けるために除去されているＧ−ＣＳＦ変異体を生産するために、改変され得る。例えば、１個またはそれ以上のこれらのリジン残基は、好ましくはアルギニンまたはグルタミン残基、さらに好ましくはアルギニン残基での置換の手段により除去され得る。好ましくは、位置１６、３４および４０における１個またはそれ以上のリジン残基は置換の手段により除去され、さらに好ましくは、２個または３個のこれらのリジンは除去され、より好ましくは、この位置における全３個のリジンは置換により除去される。したがって、好ましい態様において、Ｇ−ＣＳＦ変異体は、Ｋ１６Ｒ、Ｋ１６Ｑ、Ｋ３４Ｒ、Ｋ３４Ｑ、Ｋ４０ＲおよびＫ４０Ｑからなる群から選択される少なくとも１つの置換；すなわち、Ｋ１６Ｒ／Ｑ、Ｋ３４Ｒ／ＱおよびＫ４０Ｒ／Ｑからなる群から選択される少なくとも１つの置換を有する配列番号：１の配列を含む。特に好ましい態様において、変異体は、置換Ｋ１６Ｒ／Ｑ＋Ｋ３４Ｒ／Ｑ＋Ｋ４０Ｒ／Ｑ、例えば、Ｋ１６Ｒ＋Ｋ３４Ｒ＋Ｋ４０ＲまたはＫ１６Ｑ＋Ｋ３４Ｒ＋Ｋ４０ＲまたはＫ１６Ｒ＋Ｋ３４Ｑ＋Ｋ４０ＲまたはＫ１６Ｒ＋Ｋ３４Ｒ＋Ｋ４０ＱまたはＫ１６Ｑ＋Ｋ３４Ｑ＋Ｋ４０ＲまたはＫ１６Ｒ＋Ｋ３４Ｑ＋Ｋ４０ＱまたはＫ１６Ｑ＋Ｋ３４Ｑ＋Ｋ４０Ｑを含む。
【００５６】
他の態様において、Ｇ−ＣＳＦ変異体は、上記説明のとおり、リジン残基を導入するための少なくとも１つの置換と、リジン残基を除去するための少なくとも１つの置換を含む。
【００５７】
他の態様において、マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体は、位置１６、３４および４０における１個またはそれ以上のリジン残基の、例えば、アルギニンまたはグルタミン残基、例えば、アルギニン残基での置換、ならびにＱ７０Ｋ、Ｑ９０Ｋ、Ｔ１０５Ｋ、Ｑ１２０Ｋ、Ｔ１３３ＫおよびＳ１５９Ｋから選択される１つまたはそれ以上の置換を含み、それぞれ約１０００−１０，０００Ｄａの分子量を有する２−６個、例えば、２−４個のポリエチレングリコール部分と結合する。
【００５８】
他の態様において、マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体は、Ｋ１６Ｒ、Ｋ３４ＲおよびＫ４０Ｒから選択される１つまたはそれ以上の置換、ならびにＱ７０Ｋ、Ｑ９０Ｋ、Ｔ１０５Ｋ、Ｑ１２０Ｋ、Ｔ１３３ＫおよびＳ１５９Ｋから選択される１つまたはそれ以上の置換を含み、それぞれ約１０００−１０，０００Ｄａの分子量を有する２−６個、例えば、２−４個のポリエチレングリコール部分と結合する。
【００５９】
他の態様において、マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体は、位置１６、３４および４０における１個またはそれ以上のリジン残基の、例えば、アルギニンまたはグルタミン残基、例えば、アルギニン残基での置換、ならびにＴ１０５ＫおよびＳ１５９Ｋから選択される少なくとも１つの置換を含み、それぞれ約１０００−１０，０００Ｄａの分子量を有する２−６個、例えば、２−４個のポリエチレングリコール部分と結合する。
【００６０】
他の態様において、マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体は、Ｋ１６Ｒ、Ｋ３４ＲおよびＫ４０Ｒから選択される１つまたはそれ以上の置換、ならびにＴ１０５ＫおよびＳ１５９Ｋから選択される少なくとも１つの置換を含み、それぞれ約１０００−１０，０００Ｄａの分子量を有する２−６個、例えば、２−４個のポリエチレングリコール部分と結合する。
【００６１】
特定の態様において、マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体は、置換Ｋ１６Ｒ、Ｋ３４Ｒ、Ｋ４０Ｒ、Ｔ１０５ＫおよびＳ１５９Ｋを含み、約１０００−１０，０００Ｄａの分子量を有する２−６個、例えば、２−４個のポリエチレングリコール部分と結合する。
【００６２】
特定の態様において、マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体は、約５０００−６０００Ｄａの分子量を有する２−６個、一般的に２−５個、例えば、２−４個の結合しているポリエチレングリコール部分、例えば、約５ｋＤａの分子量を有するｍＰＥＧを有し得る。好ましくは、マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体は、約５０００−６０００Ｄａの分子量を有する２−４個の結合しているポリエチレングリコール部分、例えば、５ｋＤａのｍＰＥＧを有する。本発明の方法において使用するために適当である特に好ましいマルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体は、置換Ｋ１６Ｒ、Ｋ３４Ｒ、Ｋ４０Ｒ、Ｔ１０５ＫおよびＳ１５９Ｋを含み、それぞれ約５ｋＤａの分子量を有する２−４個のＰＥＧ部分、例えば、３個のこのようなＰＥＧ部分を含む。
【００６３】
他の態様において、マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体は、複合体あたり単一の数のみ結合しているＰＥＧ部分、例えば、２、３、４もしくは５個いずれかのＰＥＧ部分を有するように、または異なる数の結合しているＰＥＧ部分を有する所望の複合体混合物、例えば、２−５個、２−４個、３−５個、３−４個、４−６個、４−５個もしくは５−６個の結合しているＰＥＧ部分を有する複合体混合物を有するように生産され得る。上記に示されているとおり、好ましい複合体混合物の例は、約５ｋＤａの２−４個のＰＥＧ部分を有するもの、例えば、複合体あたり主に３個の結合しているＰＥＧ部分を有する複合体であるが、少ない割合において２個または４個いずれかの結合しているＰＥＧ部分を有する複合体のものである。
【００６４】
特定の数の結合しているＰＥＧ部分を有する複合体または定義の範囲の数の結合しているＰＥＧ部分を有する複合体混合物は、適当なペグ化条件を選択することにより、所望により所望の数のＰＥＧ部分を有する複合体を分離するために後に精製を使用することにより、得ることができることは理解される。異なる数の結合しているＰＥＧ部分を有するＧ−ＣＳＦ複合体の分離のための方法ならびに結合しているＰＥＧ部分の数を同定するための方法の例は、例えば、ＷＯ０１／５１５１０およびＷＯ０３／００６５０１（これら両方は出典明示により本明細書に包含させる）に記載されている。本発明の目的のために、複合体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおける分離が、ＰＥＧ部分の与えられた数に対応するバンド以外にバンドがないか、またはほんのわずかであるとき、与えられた数の結合しているＰＥＧ部分を有すると考えられ得る。例えば、複合体のサンプルは、サンプルを駆動したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルが、３個のＰＥＧ基それぞれに対応する主要なバンドおよびわずかなバンドのみを示すか、または、好ましくは２または４個のＰＥＧ基に対応するバンドを示さないとき、３個の結合しているＰＥＧ基を有すると考えられる。
【００６５】
いくつかの場合において、アミン−特異的活性化ＰＥＧ誘導体、例えば、ｍＰＥＧ−ＳＰＡは、もっぱらアミド結合を介してＮ−末端およびリジン残基のε−アミノ基に結合し得ないが、エステル結合を介してセリン、チロシンまたはスレオニン残基のヒドロキシ基に結合し得る。結果として、ＰＥＧ化タンパク質は、十分な程度の均一性を有し得ず、意図されたもの以外の多くの異なるＰＥＧ異性体を含み得る。エステル結合を介して結合しているこのようなＰＥＧ部分は、一般的に不安定であり、ヒドロキシ基に結合している不安定なＰＥＧ部分を除去するために十分な期間、ＰＥＧ化ポリペプチドを高いｐＨに付すことを含む米国仮出願第６０／６８６，７２６号（出典明示により本明細書に包含させる）に記載されている方法により除去することができる。この方法は、また、ＵＳＳＮ１１／４２０，５４６（米国特許第７，３８１，８０５号）およびＷＯ２００６／１２８４６０（これらそれぞれは出典明示により本明細書に包含させる）に記載されている。
【００６６】
好ましい態様において、マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体は、ＰＥＧ位置異性体種の混合物である。本明細書において使用されるタンパク質の“ＰＥＧ位置異性体”なる用語は、ＰＥＧ基がタンパク質の異なるアミノ酸位置に位置している、タンパク質の異なるＰＥＧ化型を示す。本発明において使用される好ましいマルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体は、リジン／Ｎ−末端ＰＥＧ異性体の混合物である。タンパク質の“リジン／Ｎ−末端ＰＥＧ異性体”なる用語は、ＰＥＧ基がタンパク質のアミノ−末端および／またはタンパク質におけるリジン残基のエプシロンアミノ基に結合していることを意味する。例えば、Ｇ−ＣＳＦに適用されている、フレーズ“３個の結合しているＰＥＧ部分を有するリジン／Ｎ−末端ＰＥＧ位置異性体”は、３個のＰＥＧ基がリジン残基のエプシロンアミノ基および／またはタンパク質のＮ−末端に結合されているＧ−ＣＳＦ  ＰＥＧ位置異性体の混合物を意味する。一般的に、“３個の結合しているＰＥＧ部分を有するリジン／Ｎ−末端ＰＥＧ位置異性体”は、２個のリジン残基に結合しているＰＥＧ部分および１個のＮ−末端に結合しているＰＥＧ部分を有する。ＰＥＧ位置異性体の分析は、ＷＯ２００６／１２８４６０（これは出典明示により本明細書に包含させる）に記載されている陽イオン交換ＨＰＬＣを使用して実施され得る。
【００６７】
一般的に、ＰＥＧ位置異性体種の混合物は、実質的に精製されたリジン／Ｎ−末端ＰＥＧ位置異性体の混合物である。ポリペプチドの“実質的に精製されたリジン／Ｎ−末端ＰＥＧ位置異性体の混合物”は、不純物、例えば、非−リジン／Ｎ−末端ＰＥＧ位置異性体を除去するために、クロマトグラフィーまたは他の精製方法に付した、リジン／Ｎ−末端ＰＥＧ位置異性体の混合物を示す。“実質的に精製されたリジン／Ｎ−末端ＰＥＧ位置異性体の混合物”は、例えば、本明細書に記載されている部分的な脱ペグ化工程および後の精製の非存在下で存在するであろう、ヒドロキシル基に結合している非常に不安定なＰＥＧ部分が存在しない、一般的にヒドロキシル基に結合している不安定なＰＥＧ部分を含むポリペプチドを約２０％未満、さらに一般的に約１５％未満含む。好ましくは、ヒドロキシル基に結合している不安定なＰＥＧ部分を含むポリペプチドは、約１０％未満、例えば、約５％未満である。
【００６８】
好ましくは、ＰＥＧ位置異性体種の混合物は、Ｇ−ＣＳＦ変異体のＰＥＧ位置異性体の均一混合物である。“ポリペプチド（Ｇ−ＣＳＦ）変異体のＰＥＧ位置異性体の均一混合物”なる用語は、異なるＰＥＧ位置異性体のポリペプチド部分が同じであることを意味する。これは、混合物の異なるＰＥＧ位置異性体がすべて単一のポリペプチド変異体配列に基づくことを意味する。例えば、ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦポリペプチド変異体のＰＥＧ位置異性体の均一混合物は、混合物の異なるＰＥＧ位置異性体が単一のＧ−ＣＳＦポリペプチド変異体に基づくことを意味する。
【００６９】
一般的に、Ｇ−ＣＳＦ変異体のＰＥＧ位置異性体の均一混合物は、実質的に均一性を示す。本明細書において使用される“均一性”は、異なる位置異性体、すなわち、異なる位置において結合している異なる数のＰＥＧ部分を含む異なるポリペプチド異性体の数、ならびにこれらの位置異性体の相対分布に関して、ＰＥＧ化ポリペプチドの均質性を示す。ヒトまたは動物における治療的使用を目的とする医薬ポリペプチドにおいて、異なるＰＥＧ位置異性体および異なるＰＥＧ化種の数が最小であることが一般的に望ましい。
【００７０】
１つの態様において、マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体（以下の実施例において“Ｍａｘｙ−Ｇ２１”として称される）は、Ｇ−ＣＳＦ変異体成分が、Ｓｅｒ６６またはＴｙｒ１６５の１つまたは両方において不安定なＰＥＧ部分、ならびにＮ−末端および１個または２個の位置Ｋ２３、Ｋ１０５およびＫ１５９において安定なＰＥＧ部分を含み、４個または５個いずれかの結合しているＰＥＧ部分をそれぞれ有する位置異性体を含む、置換Ｋ１６Ｒ、Ｋ３４Ｒ、Ｋ４０Ｒ、Ｔ１０５ＫおよびＳ１５９Ｋ（配列番号：１に関する）を有する配列番号：１のアミノ酸配列を有する、ＰＥＧ位置異性体の混合物である。本明細書においてＭａｘｙ−Ｇ２１として称されるマルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体は、それぞれ５０００Ｄａの平均分子量を有する、ｍＰＥＧ−ＳＰＡ（Ｎｅｋｔａｒ）であるＰＥＧ部分を含む。
【００７１】
“部分的な脱ペグ化”なる用語は、本明細書において、Ｎ−末端またはリジン残基のアミノ基に非常に安定に結合しているＰＥＧ部分は無傷で維持されるが、ヒドロキシル基に結合している不安定なＰＥＧ部分は除去されることを示す。このプロセスを実施するための方法は、ＵＳＳＮ６０／６８６，７２６、ＵＳＳＮ１１／４２０，５４６（米国特許第７，３８１，８０５号）およびＷＯ２００６／１２８４６０（これらそれぞれは出典明示により本明細書に包含させる）に記載されている。
【００７２】
他の態様において、マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体（以下の実施例において“Ｍａｘｙ−Ｇ３４”として称される）は、Ｇ−ＣＳＦ変異体成分が、置換Ｋ１６Ｒ、Ｋ３４Ｒ、Ｋ４０Ｒ、Ｔ１０５ＫおよびＳ１５９Ｋ（配列番号：１に関する）を有する配列番号：１のアミノ酸配列を有し、そして混合物の少なくとも８０％がそれぞれ３つの結合しているＰＥＧ部分を有する２種のＰＥＧ位置異性体を含む（ここで、異性体の１つがＮ−末端、Ｌｙｓ２３およびＬｙｓ１５９に結合しているＰＥＧ基を有し、他の異性体がＮ−末端、Ｌｙｓ１０５およびＬｙｓ１５９に結合しているＰＥＧ基を有する）、ＰＥＧ位置異性体の混合物である。本明細書においてＭａｘｙ−Ｇ３４として称されるマルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体は、それぞれ５０００Ｄａの平均分子量を有する、ｍＰＥＧ−ＳＰＡ（Ｎｅｋｔａｒ）であるＰＥＧ部分を含む。
【００７３】
上記すべての態様において、Ｇ−ＣＳＦ変異体およびマルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体は、所望によりＮ−末端に結合しているメチオニン残基を含み得る。
【００７４】
さらなる態様において、本発明において投与されるマルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体は、以下のいずれかに記載されているとおりに製造され得る（これらそれぞれは出典明示により本明細書に包含させる）：
・ＷＯ８９／０５８２４（Ｇ−ＣＳＦのリジン−欠失変異体）
・ＵＳ５，８２４，７７８（アミノ酸のカルボキシル基を介してポリペプチドの少なくとも１個のアミノ酸に共有結合している少なくとも１個のＰＥＧ部分を有するＧ−ＣＳＦ）
・ＷＯ９９／０３８８７（Ｇ−ＣＳＦのＰＥＧ化システイン変異体）
・ＷＯ２００５／０５５９４６（無傷のグリコシル連結基を介して結合しているＰＥＧ部分を有する“グリコ−ＰＥＧ化”Ｇ−ＣＳＦ複合体）
・ＷＯ２００５／０７０１３８（対応する野生型ポリペプチドに存在しないＯ−結合型グリコシル化部位をコードする変異ペプチド配列を含むＧ−ＣＳＦポリペプチド）
・ＵＳ２００５／０１１４０３７Ａ１（少なくとも１つの多くの異なる特定のアミノ酸位置に結合している少なくとも１つのポリマー部分を有するＧ−ＣＳＦ）
【００７５】
他の態様において、本発明において投与されるマルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体は、モノ−ＰＥＧ化ｈＧ−ＣＳＦ、ニューラスタ（登録商標）と比較して、改良された薬物動態特性、例えば、血清半減期の上昇および／またはＡＵＣの増加を示す。好ましくは、マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体は、ニューラスタ（登録商標）の血清半減期またはＡＵＣの少なくとも約１．２倍、例えば、モノ−ＰＥＧ化ｈＧ−ＣＳＦ、ニューラスタ（登録商標）の血清半減期またはＡＵＣの少なくとも約１．４倍、例えば、少なくとも約１．５倍、例えば、少なくとも約１．６倍、例えば、少なくとも約１．８倍、例えば、少なくとも約２．０倍、２．５倍、３倍、５倍または１０倍の上昇または増加を示す。
【００７６】
放射線暴露および処置
Ａ．造血系における放射線暴露の影響
放射線事故シナリオは、激しく照射された個体に対する緊急準備モデルおよび治療戦略の設計において有用ないくつかの定義的特性を提供している。源に対する体位、偶発遮蔽および距離が、個体のあらゆる群に対して片側、不均一および非均質暴露をもたらす。さらに、暴露から処置の開始までの期間は決して最適ではない。これらの暴露局面は、正確な吸収された線量を測定する困難性を強調する；確立しているトリアージ(triage)および処置の根拠ならびに、さらに、生物学的線量測定における処置の効果は知られていない。放射線暴露に関して、上記特性が、骨髄由来造血幹細胞および前駆細胞（“ＢＭ−由来ＨＳＣおよびＨＰＣ”）ならびに胸腺組織の温存の可能性とともに、高度に可変の線量分布を示し、それにより造血成長因子（“ＨＧＦ”）の適時投与に応答して造血およびリンパ球再生の可能性を増強すると仮定することは理にかなっている。
【００７７】
造血系は、急性全身照射（ＴＢＩ）後に、非常に放射線感受性かつ線量制限臓器系である。ＨＳＣおよびＨＰＣは、最小限の修復能で線量依存指数関数的に殺され、暴露線量のわずかな増加がＨＳＣおよびＨＰＣ死の過度の増加を引き起こすことを示す。成熟した、さらに分化した細胞は、高度に増殖性の幹および前駆細胞よりもさらに放射線抵抗性である。ＨＳＣの一部が比較的、放射線抵抗性であることが提案されている。ＨＳＣおよびＨＰＣにおける細胞死の指数関数的線量依存性質は、不均一放射線暴露および活性骨髄を横切る結果として可変線量分布の現実と組み合わせると、ほんのわずかのＨＳＣおよびＨＰＣ、ならびにそれぞれのＢＭ（骨芽細胞）、血管および胸腺（上皮細胞）ニッチの細胞が造血症候群を引き起こし得る致死線量の放射線で生存し、本明細書に記載されている治療アプローチに適していることを示唆する。
【００７８】
核爆発または事故により生じる急性暴露は、片側、不均一およびある程度の部分的な体の遮蔽が起こり得る。結果として、骨髄および血管ニッチ内に位置するＨＳＣおよびＨＰＣの画分は暴露されていないか、または有意に低い線量の放射線にのみ暴露されている可能性がある。部分または不均一照射の温存する効果(sparing effect)を証明する動物モデルにおける一貫したデータベースが存在する。片側暴露は、片側  対  両側暴露に関して、ＬＤ５０／３０値（３０日以内に対象の５０％の死を引き起こす放射線の平均線量）において約２０％の増加をもたらすことができる。放射線源に対する方向性も、生物学的期間において評価しなければならない。背側暴露は、若年成人の肋骨および骨盤の脊椎および背側面における大部分の活性骨髄によって骨髄ダメージを最大限にする。逆に、腹側暴露は、活性骨髄の大部分の腹側遮蔽によって骨髄ダメージを最小限にする。不均一暴露が、骨髄の部分的な体の遮蔽と同程度に有効であると見るべきでない。放射線量とＨＳＣ／ＨＰＣ生存の指数関数的関係のため、例えば、全身線量を半減させるとＨＳＣ生存は５０％の増加でなく、わずか１０％だけの増加であるため、これは有意である。
【００７９】
Ｂ．放射線量
非ヒト霊長類（“ＮＨＰ”）における急性放射線誘発造血症候群に基づくデータは、２５０キロボルトピーク（ｋＶｐ）のＸ−放射線またはＣｏ−６０ガンマおよび２メガボルト（ＭＶ）Ｘ−放射線における全身照射（ＴＢＩ）に関する実験由来であった。Ｃｏ−６０ガンマ放射線誘発致死性に基づくデータは、１９６７年に実施された単一の確立されていない実験（ｎ＝９０ＮＨＰ）である。Dalrymple et al. (Radiation Res. 25:377-400, 1965)は、ＴＢＩおよび造血症候群致死性に関する線量−応答関係を確立するために、２ＭＶ  Ｘ−放射線を使用した。これらの２つの試験は、対症療法を受けていない、ガンマ放射線または高エネルギーＸ線（２ＭＶ）に暴露されたＮＨＰにおける放射線誘発造血症候群致死性の線量−応答関係を確立するための基礎として役に立つ。このデータベースは、単一線量の放射線および関連致死性が確度で選択することができる対照コホートとして役に立っている。これらの以前の試験から得られたＮＨＰに関するＬＤ５０／３０値は、それぞれ６．４０Ｇｙ［６．０６、７．７５］および６．６５Ｇｙ［６．００、１０．１７］（角型括弧［  ］内に９５％信頼区間（ＣＩ））であった。比較のために、２５０ｋＶｐ  Ｘ線でＴＢＩにおいて暴露されたＮＨＰに関するそれぞれのＬＤ５０／３０値は、２ＭＶ  Ｘ線をＤａｌｒｙｍｐｌｅ実験において使用した低エネルギーＸ線と、Ｘ−照射の相対的生物学的効果を立証する約４．８０Ｇｙである。
【００８０】
ヒトにおける全身または重要な部分照射の効果に関するデータは、必ずしも、過去の原子力事故、例えば、広島の爆発およびチェルノブイリの事故から回収されていない。このようなデータは、テネシー州オークリッジ市における放射線緊急時支援センター／訓練施設（ＲＥＡＣ／ＴＳ）に登録されている。このデータに基づいて、リンパ球絶対数（ＡＬＣ）が透過性放射線への暴露後すぐに減少するため、４８時間にわたってリンパ球数の減少率を測定することにより、個体における放射線量を概算する方法が開発されている（Goans R.E., et al. Health Phys. 81:446-449, 2001）。このような概算は、４から６時間間隔を置かれる２つ以上のＡＬＣ測定を必要とする。このような測定は、例えば、大量の死傷者状況において非実用的である場合、他の放射線量の概算は放射線暴露後に対象が吐くまでの時間の長さに基づく。Berger, M.E. et al. (Occupational Medicine 56:162-172, 2006)は、少なくとも２Ｇｙの急性全身照射に暴露された多数の個体（７０−９０％）は暴露後１から２時間以内に吐き、少なくとも４Ｇｙの放射線に暴露された個体の実質的に１００％は１時間以内に吐き、少なくとも６Ｇｙの放射線に暴露された者は３０分以内に吐くことを示す表を提供している。急性全身放射線暴露（例えば、体温、頭痛、下痢）と関連する他の身体症状の重症度および発症までの時間も、Berger et al.（上記）に表にされている。
【００８１】
Ｃ．対症療法
抗生物質、液体、血液製剤、鎮痛剤および栄養の使用は、骨髄抑制および致死線量の放射線に暴露された患者のための“標準のケア”である。対症療法のみ、例えば、抗生物質、全血または血小板注入、液体および栄養は、照射された対象の生存率を有意に増加させることができる。致死線量の放射線に暴露された動物における対症療法と造血症候群生存率の関係は、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）ではないがイヌにおいて立証されている。Ｂｙｒｏｎ  ｅｔ  ａｌによる単回試験は、１００％致死線量に暴露されたアカゲザルにおいて７２％に生存率を有意に増加させる抗生物質レジメンのみの能力を立証した。さらに、軍放射性生物研究所（ＡＦＲＲＩ）およびメリーランド大学ボルティモア校（ＵＭＢ）におけるＭａｃＶｉｔｔｉｅ／Ｆａｒｅｓｅ実験は、単回の致死線量のＴＢＩ（ＬＤ７０／３０）における対症療法の効果が以下に記載されているデータベースから概算されることを立証した。これらのデータは、ＬＤ７０／３０に相当する線量（すなわち、３０日以内に対症療法の非存在下で対象の７０％の死を引き起こす線量）においてＣｏ−６０ガンマ放射線からＴＢＩで照射されたＮＨＰが、対症療法が投与される３０日間にわたって対象の死の数が約１４％に減少する（すなわち、ＬＤ１４／３０）ことを示す。同様の試験が（ＭａｃＶｉｔｔｉｅ／Ｆａｒｅｓｅ  ＵＭＢ  ラボ）、２５０ｋＶｐ  Ｘ線でＴＢＩに暴露されたアカゲザルで実施された。６．００Ｇｙ  ＴＢＩと関連する概算された７０％の致死率は、対症療法のみ加えて９％に減少した。
【００８２】
上記の対症療法を受けていない、ＮＨＰにおける放射線誘発造血症候群致死性の線量−応答試験において得られた結果は、対症療法を受けるＮＨＰにおける致死線量反応関係を測定するために最近の盲検、放射線量−ランダム試験を設計するために使用した（実施例１）。ＬＤ５０／６０に対する得られた値は、立証されていない歴史的対照コホートに対するＬＤ５０／６０の約６．５０Ｇｙと比較して、７．５２Ｇｙであった。これは、対症療法の生存率増加効果を確認する、ならびに造血症候群における対症療法（あるいは医学的管理として知られている）を投与される致死線量の放射線に暴露されたＮＨＰに対するそれぞれのＬＤ３０／６０、ＬＤ５０／６０およびＬＤ７０／６０の線量を決定するための線量関係を提供するために役立った。
【００８３】
この生存率増加効果は２つの条件に依存する。第１に、生存ＨＳＣおよびＨＰＣは自然再生をすることができるはずであり、第２に、造血回復は重要な臨床的に扱いやすい期間内に機能性好中球および／または血小板の生産をもたらはずである。
【００８４】
Ｄ．ＡＲＳの処置における造血成長因子の役割
造血成長因子（ＨＧＦ）が、最適のスケジュールで対症療法と組み合わせて投与されたとき、対症療法のみよりも好中球および血小板の生存率および回復が有意に増加することを立証する、骨髄抑制および／または致死放射線暴露の小型および大型動物モデルに基づく実質的な一貫したデータが存在する。ＭａｃＶｉｔｔｉｅ実験室は、以前に、完全型造血症候群を誘発するレベルにおけるＣｏ−６０  ＴＢＩに暴露されたイヌにおける、対症療法のみの、ならびにＧ−ＣＳＦの投与と組み合わせたものの有用性を立証した。対症療法なしのＬＤ５０／３０は２．６０Ｇｙであり、これは対症療法で３．３８Ｇｙに増加し、さらに最適投与スケジュール下でのＧ−ＣＳＦの添加で４．８８Ｇｙに増加した。この試験は、適度の線量率における均一ＴＢＩに関する照射の標準実験モデルを使用した。
【００８５】
ＨＧＦの投与のための慣用のスケジュールは、照射後２４時間以内の早期に処置を開始し、造血前駆細胞の再生および好中球および／または血小板の生産を保証するために連日投与を続けることである。しかしながら、核爆発または事故後の処置に関してさらに現実的なスケジュールは、照射４８−７２時間後の遅延投与である。多くの前臨床試験は、ＨＧＦの遅延投与の効果の評価のために実施されている。これらの試験の大多数は、造血応答の規模が、ＨＧＦ投与から照射までの期間の上昇により有意に減少したことを示す。Ｇ−ＣＳＦおよびＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦと共に、ＡＲＳの処置においてときどき使用される他のＨＧＦは、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＦＬＴ３−リガンド（ＦＬ）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、巨核球増殖発達因子（ＭＧＤＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ＴＰＯ−受容体アゴニストおよびエリスロポエチン（ＥＰＯ）を含む（Drouet, M. et al., Haematologica 93(3)465-466, 2008; Herodin F. et al., Experimental Hematology 35:1172-1181, 2007）。これらのうち、単剤として、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦのみが、承認適応症外使用として、致死の可能性がある照射された個人を処置するために現在利用されている。これらのＨＧＦは、ＦＤＡ“動物ルール”（ＡＲ）の下の承認に関して、ＦＤＡに恐らく最初に指名される。ＨＧＦ“カクテル”の考察は、それぞれの毒性および暴露後の投与時間の分析を含むべきである。
【００８６】
Ｅ．動物モデル系における放射線誘発好中球減少症の処置におけるマルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体
アカゲザルにおける放射線誘発血球減少症は、血小板減少症および好中球減少症の処置における医薬の有効性を試験するために有効なモデル系であることが証明されている。実施例２に記載されている試験において、本発明の典型的なマルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体（本明細書において“Ｍａｘｙ−Ｇ２１”として同定される）の単回注射は、末梢血全有核細胞、好中球、単核細胞の有意な増加およびコロニー形成細胞の末梢血への有意な動員を誘導した。好中球減少症を１４．８−１５．２日間示す６．０ＧｙのＴＢＩに暴露された対照動物と比較して、ＴＢＩ２４時間後に用量３００μｇ／ｋｇでＭａｘｙ−Ｇ２１を投与された動物は、好中球減少症を７．３±１．１日間に有意に短縮することを示した。好中球減少症の期間は、動物が５００／μＬ未満で観察されるか、または見なされるＡＮＣを有する日数として決定した。試験化合物の最初の投与後の少なくとも２日間に起こる、最初の最も低い観察されるか、または見なされるＡＮＣとして定義されるＡＮＣ最下点も、対照動物における４９±２２／μＬから１４０±４５／μＬに著しく改善された。試験１日目から、５００／μＬ以上で観察されるか、または見なされるＡＮＣの最初の２連続日までの日数として決定される回復時間も同様に、対照値の２１．２±０．４日間からＭａｘｙ−Ｇ２１処置コホートの１５．５±０．３日間に改善された。
【００８７】
試験内(intra-study)ニューラスタ（登録商標）群および歴史的コホート（ｎ＝９）を含む組合せニューラスタ（登録商標）コホートと比較して、Ｍａｘｙ−Ｇ２１は、好中球減少症の期間（ｐ＝０．０２）ならびに回復時間を有意に短縮させた。Ｍａｘｙ−Ｇ２１処置コホートは９．８日間のみ抗生物質を必要とし、組合せニューラスタ（登録商標）処置コホートは１４．７日間、抗生物質サポートを必要とするため、抗生物質の必要性もニューラスタ（登録商標）群と有意に異なる。
【００８８】
実施例２に記載されている試験は、アカゲザルに皮下投与された本発明の典型的なマルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体（本明細書においてＭａｘｙ−Ｇ２１として同定される）が、照射されたＮＨＰにおける好中球減少症の期間を有意に短縮させることを証明した。さらに、該効果は、試験内ニューラスタ（登録商標）コホートを含むコホートおよび歴史的ニューラスタ（登録商標）コホート（Ｎ＝９）と比較したとき、ニューラスタ（登録商標）のものを越えることを見出した。薬物動態学データは、マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体が、照射されたマカクザルにおいて、ニューラスタ（登録商標）と比較して、血漿半減期を著しく上昇させることを示す証拠を提供した（図４）。したがって、ＰＫデータは、マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体が、重度の放射線誘発骨髄抑制の状態を有しているＮＨＰならびに健常（非照射）ＮＨＰの両方において、モノ−ＰＥＧ化ｈＧ−ＣＳＦ、ニューラスタ（登録商標）よりも良いバイオアベイラビリティを有する作業仮説を支持する。
【００８９】
概して、マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体は、非ヒト霊長類における放射線誘発好中球減少症の期間を著しく短縮することを見出した。さらに、好中球減少症の期間の減少は、歴史的ニューラスタ（登録商標）コホートと比較したとき、ニューラスタ（登録商標）のものを越えることを見出した。放射線誘発好中球減少症の程度および期間は、本発明の方法にしたがって、マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体の投与により有意に減少させた。
【００９０】
実施例３に記載されている試験において、マウスを、２０％の未処置対照動物（７．７６Ｇｙ；ＬＤ２０／３０）または４５％の未処置対照動物（７．９６Ｇｙ；ＬＤ４５／３０）のいずれかの、殺すために十分な放射線の線量に暴露させた。ＴＢＩ後１日目に、動物に２０μｇ／２０ｇマウスの用量で本発明の典型的なマルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体（本明細書において“Ｍａｘｙ−Ｇ３４”として同定される）または希釈剤のいずれかを投与した。投与を７日目に、いくつかの動物において１４日目に繰り返した。ＬＤ２０／３０レベルおよびＬＤ４５／３０レベルで照射後にマルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体を投与されたマウスは、未処置動物と比較して、３０日後に有意に良い生存率を示した（それぞれ図５および６）。
【００９１】
実施例２および３の試験は、本発明のマルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体が、放射線誘発好中球減少症の程度および期間の減少ならびに２つの動物モデル系における生存率の増加において有効であることを証明する。したがって、マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体は、致命的な放射線暴露と関連する好中球減少症、例えば、原子力の緊急事態の事象におけるＡＲＳの処置において有効であり得る。
【００９２】
マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体の投与
Ａ．用量
本発明において投与されるマルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体の用量は、一般的に、成人患者あたり６ｍｇ（例えば、６０ｋｇの患者に対して１００μｇ／ｋｇ）である、化学療法適用においてモノ−ＰＥＧ化ｈＧ−ＣＳＦ（ニューラスタ（登録商標））に対して現在承認されている用量と同程度の規模である。したがって、マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体の適当な用量は、約１ｍｇから約３０ｍｇ、例えば、約２ｍｇから約２０ｍｇ、例えば、約３ｍｇから約１５ｍｇの範囲と考えられる。したがって、適当な用量は、例えば、約１ｍｇ、約２ｍｇ、約３ｍｇ、約６ｍｇ、約９ｍｇ、約１２ｍｇ、約１５ｍｇ、約２０ｍｇまたは約３０ｍｇであり得る。あるいは、用量は、マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体の適用な用量が約２０μｇ／ｋｇから約５００μｇ／ｋｇ、例えば、約３０μｇ／ｋｇから約４００μｇ／ｋｇ、例えば、約４０μｇ／ｋｇから約３００μｇ／ｋｇ、例えば、約５０μｇ／ｋｇから約２００μｇ／ｋｇの範囲であると考えられるような、患者の体重に基づき得る。したがって、適当な用量は、例えば、約２０μｇ／ｋｇ、約３０μｇ／ｋｇ、約４０μｇ／ｋｇ、約５０μｇ／ｋｇ、約６０μｇ／ｋｇ、約７５μｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ、約１２５μｇ／ｋｇ、約１５０μｇ／ｋｇ、約１７５μｇ／ｋｇ、約２００μｇ／ｋｇ、約２５０μｇ／ｋｇ、約３００μｇ／ｋｇ、約４００μｇ／ｋｇまたは約５００μｇ／ｋｇであり得る。マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体は、好ましくは放射線暴露後可能な限り早く、例えば、７日以内、４日以内、３日以内、２日以内（すなわち、４８時間以内）または、さらに好ましくは放射線暴露後１日以内（すなわち、２４時間以内）に投与される。患者の疾患および予後の性質ならびに応答に依存して、マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体の第２、あるいは第３の投与は、前回の投与後、１から４週間（例えば、約７日間、約１０日間、約１４日間、約１８日間、約２１日間、約２４日間、約２８日間）に投与され得る。
【００９３】
マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体の正確な用量および投与の頻度は、多くの因子、例えば、マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体の特定の活性および薬物動態学的特性、ならびに処置される状態の性質および重症度（例えば、放射線暴露のレベルおよび／または期間、暴露された体の面積および量、放射線の型、ＡＲＳ−関連症状の重症度）、当業者に既知の他の因子に依存する。通常、用量は、対象における好中球減少症の程度および／または期間を防止するか、または減少させることができるものである。このような用量は、“有効”または“治療有効”量と称され得る。本発明のマルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体の有効量は、とりわけ、処置される状態の重症度、用量、投与スケジュール、マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体を単独または他の治療剤と組み合わせて投与するかどうか、マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体の血清半減期および他の薬物動態学的特性、ならびに患者のサイズ、年齢および総体的な健康に依存することが、当業者に明らかである。投与の用量および頻度は、既知の技術を使用して当業者により確かめることができる。
【００９４】
Ｂ．医薬組成物
本発明において投与されるマルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体は、１つ以上の薬学的に許容される担体または賦形剤を含む組成物において投与され得る。マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体は、十分に保存に安定しており、ヒトまたは動物への投与のために適当である医薬をもたらすために、当分野でそれ自体既知の方法において医薬組成物に製剤化することができる。医薬組成物は、液体もしくはゲルまたは凍結乾燥された形態、または他のあらゆる適当な形態を含む種々の形態において製剤化され得る。好ましい形態は、処置される特定の適応に依存し、当業者に明らかである。
【００９５】
“薬学的に許容される”は、使用される用量および濃度において投与される患者において悪影響を引き起こさない担体または賦形剤を意味する。このような薬学的に許容される担体および賦形剤は、当分野でよく知られている（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company (1990); Pharmaceutical Formulatiion Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer and L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis (2000) ;およびHandbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press (2000)、参照）。
【００９６】
Ｃ．非経口組成物
医薬組成物の例は、非経口投与、例えば、皮下経路のために設計された溶液である。多くの場合において、医薬溶液製剤は即時使用のために適当な液体形態において提供されるが、このような非経口製剤は、また、凍結または凍結乾燥形態において提供され得る。前者の場合、組成物は、使用前に解凍しなければならない。後者の形態は、凍結乾燥製剤がそれらの液体対応物よりも一般的により安定であることが当業者に認識されているため、しばしば、多様な貯蔵条件下で組成物に含まれる活性化合物の安定性を増強するために使用される。このような凍結乾燥製剤は、使用前に、１種以上の適当な薬学的に許容される希釈剤、例えば、注射用滅菌水または滅菌生理食塩水の添加により再構成される。
【００９７】
非経口の場合において、それらは、凍結乾燥製剤または水溶液としての貯蔵のために、適当なとき、所望の純度を有するポリペプチドを、一般的に当分野で使用される１つ以上の薬学的に許容される担体、賦形剤または安定剤（これらすべては“賦形剤”と称される）、例えば、緩衝剤、安定剤、防腐剤、等張剤、非イオン性洗剤、抗酸化剤および／または他の種々の添加物と混合することにより製造される。
【００９８】
緩衝剤は、おおよそ生理学的条件の範囲におけるｐＨを維持するように助ける。それらは、一般的に、約２ｍＭから約５０ｍＭの濃度において存在する。本発明で使用するために適当な緩衝剤は、有機酸および無機酸の両方ならびにそれらの塩、例えば、クエン酸緩衝液（例えば、クエン酸モノナトリウム−クエン酸ジナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸トリナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸モノナトリウム混合物など）、コハク酸緩衝液（例えば、コハク酸−コハク酸モノナトリウム混合物、コハク酸−水酸化ナトリウム混合物、コハク酸−コハク酸ジナトリウム混合物など）、酒石酸緩衝液（例えば、酒石酸−酒石酸ナトリウム混合物、酒石酸−酒石酸カリウム混合物、酒石酸−水酸化ナトリウム混合物など）、フマル酸緩衝液（例えば、フマル酸−フマル酸モノナトリウム混合物、フマル酸−フマル酸ジナトリウム混合物、フマル酸モノナトリウム−フマル酸ジナトリウム混合物など）、グルコン酸緩衝液（例えば、グルコン酸−グルコン酸ナトリウム混合物、グルコン酸−水酸化ナトリウム混合物、グルコン酸−グルコン酸カリウム混合物など）、シュウ酸緩衝液（例えば、シュウ酸−シュウ酸ナトリウム混合物、シュウ酸−水酸化ナトリウム混合物、シュウ酸−シュウ酸カリウム混合物など）、乳酸緩衝液（例えば、乳酸−乳酸ナトリウム混合物、乳酸−水酸化ナトリウム混合物、乳酸−乳酸カリウム混合物など）および酢酸緩衝液（例えば、酢酸−酢酸ナトリウム混合物、酢酸−水酸化ナトリウム混合物など）を含む。さらなる可能性のあるものは、リン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液およびトリメチルアミン塩、例えば、トリスである。
【００９９】
防腐剤は、微生物の増殖を遅らせるために加えられ、一般的に約０．２％−１％（ｗ／ｖ）の量において加えられる。本発明で使用するために適当な防腐剤は、フェノール、ベンジルアルコール、メタクレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウムクロライド、ベンザルコニウムハライド（例えば、ベンザルコニウムクロライド、ブロマイドまたはアイオダイド）、ヘキサメトニウムクロライド、アルキルパラベン、例えば、メチルまたはプロピルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノールおよび３−ペンタノールを含む。
【０１００】
等張剤は、液体組成物の等張性を保証するために加えられ、多価糖アルコール、好ましくは三価またはそれ以上の糖アルコール、例えば、グリセリン、エリトリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトールおよびマンニトールを含む。多価アルコールは、他の成分の相対量を考慮して、０．１重量％から２５重量％、一般的に１重量％から５重量％の量において存在し得る。
【０１０１】
安定剤は、増量剤から、治療剤を溶解させるか、または変性もしくは容器壁への付着を防止することを助ける添加剤まで、機能が種々であり得る広範なカテゴリーの賦形剤を示す。典型的な安定剤は、多価糖アルコール（上記）；アミノ酸、例えば、アルギニン、リジン、グリジン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン（omithine）、Ｌ−ロイシン、２−フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニンなど、有機糖または糖アルコール、例えば、ラクトース、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイノシトール、ガラクチトール、グリセロールなど、シクリトール、例えば、イノシトール；ポリエチレングリコール；アミノ酸ポリマー；硫黄含有還元剤、例えば、ウレア、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α−モノチオグリセロールおよびチオ硫酸ナトリウム；低分子量ポリペプチド（すなわち、＜１０残基）；タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；単糖類、例えば、キシロース、マンノース、フルクトースおよびグルコース；二糖類、例えば、ラクトース、マルトースおよびスクロース；三糖類、例えば、ラフィノース、および多糖類、例えば、デキストランであり得る。安定剤は、活性なタンパク質重量に基づいて、一般的に０．１から１０，０００重量部の範囲で存在する。
【０１０２】
非イオン性界面活性剤または洗剤（“湿潤剤”としても知られている）は、治療剤の溶解を助け、ならびに撹拌−誘導凝集に対して治療ポリペプチドを保護するために存在してもよく、これは、また、ポリペプチドの変性を引き起こすことなく表面応力をせん断するために、製剤に暴露することが可能である。適当な非イオン性界面活性剤は、ポリソルベート（２０、８０など）、ポリオキサマー（１８４、１８８など）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ポリオール、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート(polyoxyethylene sorbitan monoethers)（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−８０など）を含む。
【０１０３】
さらなる種々の賦形剤は、増量剤または充填剤（例えば、デンプン）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ）および共溶媒を含む。
【０１０４】
活性成分は、また、例えば、コアセルベーション(coascervation)技術もしくは界面重合により製造される、マイクロカプセル、例えば、ヒドロキシメチルセルロース、ゼラチンもしくはポリ−（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル、コロイド薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）またはマクロエマルジョンに取り込まれていてもよい。このような技術は、上記Remington's Pharmaceutical Sciencesに記載されている。
【０１０５】
インビボ投与のために使用される非経口製剤は、滅菌でなければならない。これは、例えば、滅菌濾過膜を介する濾過により容易に達成される。
【０１０６】
本発明は、さらに以下の非限定的な例により記載されている。
【実施例】
【０１０７】
実施例１
放射線誘発好中球減少症の非ヒト霊長類モデルにおける対症療法の致死放射線量応答および効果
以下に、高線量の全身電離放射線（ＴＢＩ）に暴露され、対症療法（“医学的管理”とも称される）を受けるアカゲザルにおける線量反応を定義するために設計された予備試験を記載する。この試験は、以下のものを評価するために設計された：
１．ＬＩＮＡＣ−由来６ＭＶ（平均エネルギー、２ＭＶ）光子で致死線量のＴＢＩ  プラス  医学的管理に暴露されたアカゲザルに関するＬＤ５０／３０および支持放射線−線量生存曲線、ならびに
２．歴史的データセットと比較して、ＴＢＩのみにおけるそれぞれのＬＤ５０／３０および線量反応関係における医学的管理の効果。
【０１０８】
材料および方法
四十八（４８）匹のオスアカゲザルを、８０±２．５ｃＧｙ／分の線量率で６メガボルト（ＭＶ）のＬＩＮＡＣ光子源（Ｖａｒｉａｎ  ｍｏｄｅｌ  ＃ＥＸ−２１）（平均２ＭＶの光子）を使用する両側、均一、全身照射（ＴＢＩ）に暴露した。放射線量あたり２−８匹の群における動物を、ＴＢＩ：７．２０Ｇｙ、７．５５Ｇｙ、７．８５Ｇｙ、８．０５Ｇｙ、８．４０Ｇｙおよび８．９０Ｇｙの６つのランダム線量で照射した。医学的管理は、抗生物質、液体、血液注入、栄養補給、下痢止め薬、抗潰瘍薬、解熱薬および疼痛管理からなるものから提供された。照射された動物をＴＢＩ後６０日間観察した。
【０１０９】
主な臨床的な関連パラメーターは、６０日死亡率であった。二次エンドポイントは、それぞれの好中球および血小板最下点、好中球減少症（ＡＮＣ＜５００／μｌ）および血小板減少症（ＰＬＴ＜２０，０００／μｌ）の期間ならびにＡＮＣ＞１，０００／μｌおよびＰＬＴ＞２０，０００／μｌへの回復時間を含む、重要な好中球−および血小板（ＰＬＴ）−関連パラメーターであった。ＡＮＣ＜１００／μｌの日および期間も記録した。他のパラメーターは、熱（Ｔｅｍｐ≧１０３゜Ｆ）を有する日数、確認された感染症の発生率、発熱性好中球減少症および死者の平均生存時間（ＭＳＴ）を含んだ。
【０１１０】
データは、それぞれ８匹の動物の６つの線量群、７．２０、７．５５、７．８５、８．０５、８．４０および８．９０Ｇｙにおいて、ＴＢＩで暴露された４８匹のオスアカゲザルの６０日間を回収した。死亡率を、それぞれの線量の群に対して計算した。
【０１１１】
記述的分析およびロジスティック回帰は、ＳＡＳバージョン９を使用して実施し、ＬＤ推定値は、ＳＰＬＵＳバージョン６．２を使用して実施した。ロジスティック回帰分析は、主効果に対して０．０５および限界効果に対して０．１０のアルファレベルで両側として実施した。頻度およびパーセントはカウントデータで提示される；平均、標準偏差、中央、最小および最大は連続的なデータで提示される。結果の６０日の死亡率におけるロジスティック回帰分析によって、線量の自然対数を使用して実施された計算で線量の効果を分析した。
【０１１２】
結果
Ａ．放射線量および致死性
四十八（４８）匹のオスアカゲザルを、７つのコホート（コホート１、ｎ＝２；コホート２、ｎ＝６；コホート３から７、ｎ＝８）において７．２０Ｇｙから８．９０Ｇｙの線量範囲にわたって照射し、医学的管理を投与した。全４８匹の動物の三十二（３２）匹（６６．６％）が造血症候群によって死亡した。線量反応関係を図１および表１に示した。放射線量は、高い線量で高い死亡率である、死亡率の有意な予測因子（Ｐ＝０．０１）であった。
表１．アカゲザルにおける放射線暴露後の生存率および平均生存時間
【表１】
2012503014.tif 000002
【０１１３】
この試験においてＴＢＩに暴露されたアカゲザルに対する推定ＬＤ３０／６０、ＬＤ５０／６０およびＬＤ７０／６０値（角型括弧内に９５％ＣＩ）は、それぞれ７．０９Ｇｙ［６．５０，７．７３］、７．５２Ｇｙ［７．１２、７．９３］および７．９７Ｇｙ［７．６０，８．３６］であった。さらに、ＬＤ９５／６０（９．０５Ｇｙ）［８．４５、１２．９３］およびＬＤ９０／６０（８．６８Ｇｙ）［８．２２、１１．２７］と比較してＬＤ５／６０（６．２４Ｇｙ）［３．５６、６．９１］およびＬＤ１０／６０（６．５１Ｇｙ）［４．０９、７．０９］の推定値は、“少ない”と“多い”動物間の致死線量のそれぞれの比率を決定した。ＬＤ５：ＬＤ９５は１．４５［１．２４、３．５７］であり、ＬＤ１０：ＬＤ９０は１．３３［１．１８、２．７０］である。“少ない”と“多い”致死事象間のＧｙのそれぞれの差は、約２．８１から２．１７である。
【０１１４】
Ｂ．ＬＤ５０に対する医学的管理の効果
図１に示されるとおり、同様の質のＴＢＩに暴露されたアカゲザルに対して利用できる２つの歴史的試験由来のＬＤ５０／３０は、対症療法（医学的管理）の非存在下で、６．４０Ｇｙ（Ｃｏ−６０  γ−放射線、ＬＤ５０Ｃｏ６０）および６．６５Ｇｙ（２ＭＶ  Ｘ−放射線、ＬＤ５０Ｘ線）と概算された。２ＭＶの平均ＬＩＮＡＣ光子のＴＢＩ  プラス  医学的管理を使用する現在の試験から概算されるＬＤ５０／６０の値は、７．５２Ｇｙである。このレトロスペクティブ比較は、医学的管理が致死性の造血症候群放射線量の範囲にわたってＬＤ５０値および生存率を増加させることを示す（図１および表２）。
【０１１５】
それぞれの放射線量での死者の平均生存時間（ＭＳＴ）は、１６．２日間から２２．２日間の範囲である（表１）。試験の全ての線量における全平均ＭＳＴは１９．４日間であった。医学的管理を受けていない動物に対する致死性線量−応答試験を行わなかったため、ＭＳＴはアカゲザルを使用する全ての公開線量反応試験に関して計算した。この分析は、全ての既知の試験にわたって１４．０日間の平均ＭＳＴを生じた（表２）。
表２．全身照射および６０日死亡率：
医学的管理を投与された全ての動物に対する、概算されたＬＤ３０／６０、ＬＤ５０／６０およびＬＤ７０／６０ならびに死者のＭＳＴ
【表２】
2012503014.tif 000003
＊  一方の完全な線量反応試験（２ＭＶ  ｘ線）は、文献（Dalrymple, et al. 1965）を利用できる；もう一方（Ｃｏ−６０）は、Dr. MacVittieとのパーソナル・コミュニケーションとして提供された。医学的管理は、これらの試験において提供されなかった。
＊＊  １４．０日の平均ＭＳＴは、医学的管理なしの造血症候群に対するアカゲザルにおける致死線量反応を決定する、全ての利用できる文献から計算した。
【０１１６】
医学的管理を受けた死者は、医学的管理を受けなかったものと比較して、約５．４日のＭＳＴにおける平均上昇を示した。この観察は、可能性のある緩和剤(mitigator)、例えば、本発明のマルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体（例えば、Ｍａｘｙ−Ｇ３４）を有効な医学的管理を受けている致死的に照射された動物に投与することを考慮すると、有意である。この場合において、候補緩和剤は、骨髄再生および成熟細胞、例えば、好中球の生産をさらに５日間上昇させる利益を有する。
【０１１７】
Ｃ．放射線誘発好中球減少症の期間
好中球は、日和見感染症に対する第一の防御を提供する。この試験において投与されたＴＢＩの致死線量は、放射線量にかかわりなく、ＴＢＩ後、約５日以内に循環絶対好中球数（ＡＮＣ）を５００／μＬに減少させた（表３）。
表３．血球減少症の期間：好中球関連パラメーター
【表３】
2012503014.tif 000004
＊  期間（日）は、死の前に、例えば、ＡＮＣ≧１００／μＬまたは≧５００／μＬのレベルまで回復が起こらない限り、死者動物由来のデータは含まない。
【０１１８】
ＡＮＣが値＜１００／μＬに減少し続けることが予期されたため、ＡＮＣ＜５００／μＬであるとき、抗生物質を投与した。重度のグレード４の好中球減少症（ＡＮＣ＜１００／μＬ）において、動物は感染症および敗血症に対して非常に危険である。さらに、これらの値は、一次予防の抗生物質の投与の有効性を決定する。全ての致死的に照射された動物におけるＡＮＣは、次の１．５から３．０日以内に＜１００／μＬに減少し、１つ（７．８５Ｇｙ）を除いて全ての線量コホートにおいて、絶対好中球減少症（ＡＮＣ〜０／μＬ）に減少し続けた。７．８５Ｇｙコホートの平均最下点は５／μＬであった（表３）。生存者におけるグレード４の好中球減少症（ＡＮＣ＜１００／μＬ）の期間は、全線量コホートにわたって、９．８から１５．０日間の範囲であり、ＡＮＣ＜５００／μＬの期間は、全線量コホートにわたって、１１．５から２４．０日間の範囲である。さらなる好中球−関連パラメーターは表３に示されている。図２は、約ＬＤ３０／６０、ＬＤ５０／６０およびＬＤ７０／６０レベルのＴＢＩの線量に暴露された全ての動物に対する好中球回復曲線を示す。
【０１１９】
結論において、この試験は、平均２ＭＶ  ＬＩＮＡＣ光子での均一ＴＢＩの線量が致死率の有意な予測因子であったことを証明する。本明細書で使用されるＴＢＩの線量は、ＡＲＳの造血症候群と関連する致死率を緩和する薬物に対する有効性試験の設計に関して、ＬＤ３０／６０、ＬＤ５０／６０およびＬＤ７０／６０レベルの推定値を可能にした。この試験において、ＬＤ３０／６０、ＬＤ５０／６０およびＬＤ７０／６０レベルは、それぞれ７．０９、７．５２および７．９７Ｇｙであった。医学的管理の利益なしにアカゲザルの致死放射線量応答を評価するために設計された試験において決定された文献値と比較して、医学的管理（本明細書の試験において投与される）は、ＡＲＳの造血症候群と関連するＬＤ５０／６０を増加させ、死者のＭＳＴを上昇させた。
【０１２０】
実施例２
放射線誘発好中球減少症の非ヒト霊長類モデルにおけるマルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体の薬物動力学および薬物動態学
試験プロトコール：
該試験は、Guide for the Care and Use of Laboratory Animals(The Institute of Laboratory Animals Resources, National Research Council, 1996)において公表された原則にしたがって、実施した。４．６＋／−０．７ｋｇの平均重量を有するオスアカゲザル(Macaca mulatta)を、後部−前部位置の片側に０．１３Ｇｙ／分で２５０ｋＶｐ  Ｘ−照射を暴露し、全６．００Ｇｙ暴露の完了のために前部−後部位置に中間−線量（３．００Ｇｙ）で１０８Ｅ回転させた。必要なとき、動物に抗生物質、新鮮な照射された全血および液体からなる臨床支援を与えた。Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ(Elkin Sinn, Cherry Hill NJ)を、処置の最初の７日間、１０ｍｇ／日で筋肉内に（ｉ．ｍ．）毎日（ｑ．ｄ．）投与した。Ｂａｙｔｒｉｌ（登録商標）(Bayer Corp., Shawnee Mission, KS)を、抗微生物処理の全期間中、１０ｍｇ／日でｉ．ｍ．ｑ．ｄ．投与した。動物が３日連続でＷＢＣ＞１，０００／μｌを維持し、ＡＮＣ＞５００／μｌに達するまで、抗生物質を投与した。血小板（ＰＬＴ）数が＜２０，０００／μｌであり、ヘマトクリット（ＨＣＴ）が＜１８％であるとき、動物に、サルのランダムドナープール由来の、新鮮な、照射された（１５．００Ｇｙ  Ｃｏ６０−照射された）全血を約３０ｍｌ／輸血で与えた。
【０１２１】
９匹の照射された、および２匹の照射されていないオスアカゲザルを、本発明の典型的なマルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体（本明細書において“Ｍａｘｙ−Ｇ２１”として同定される）で処置し、４匹の照射されたアカゲザルをニューラスタ（登録商標）で処置した。希釈剤のみ（“ビヒクル”）で処置された４匹の動物は、対照として使用した。ニューラスタ（登録商標）群において、２匹の動物をＰＫ分析のためのサンプルとしたが、全てのＭａｘｙ−Ｇ２１−処置動物を薬物動態学評価に含んだ。それぞれの動物に、全身照射２４時間後に、試験化合物またはビヒクルを単回皮下投与で投与した。Ｍａｘｙ−Ｇ２１は２つの異なる用量を使用した。それぞれ４匹または５匹のサルを使用して、ｋｇあたり１００または３００μｇであった。ニューラスタ（登録商標）群に３００μｇ／ｋｇを投与した。３００μｇ／ｋｇのＭａｘｙ−Ｇ２１を投与した２匹の照射されていない動物を、ＣＤ３４＋細胞およびインビトロでのコロニー形成細胞（ＣＦＣ）の動員を試験するために使用した。血液サンプルを伏在静脈から回収した。試験デザインの全体像を表４に提供する。
表４．試験プロトコールの要約
【表４】
2012503014.tif 000005
＊これらの動物を、ＣＤ３４＋細胞およびインビトロでのコロニー形成細胞（ＣＦＣ）の動員を試験するために使用した。
【０１２２】
結果：
１４．８−１５．７日間の好中球減少症の期間を示す、自己血清（ＡＳ）を投与された６．００ＧｙのＴＢＩで暴露された対照動物と比較して、３００μｇ／ｋｇのＭａｘｙ−Ｇ２１を投与された照射された動物は、７．３±１．１日間に好中球減少症の期間を短縮することを示した。ＡＮＣ最下点も、対照動物における４９±２２／μＬの低さから１４０±４５／μＬに著しく改善された。同様に、回復時間は、２１．２±０．４および２３．０±０．０日間の対照値（３つの別々の対照コホートにおいて）から、Ｍａｘｙ−Ｇ２１処置コホートにおける１５．５±０．３日間に改善された。等用量のニューラスタ（登録商標）（３００μｇ／ｋｇ）を使用する試験内ニューラスタ（登録商標）コホート（Ｎ＝４）と比較して、Ｍａｘｙ−Ｇ２１は、好中球減少症の期間を２日間（９．３から７．３日に）、回復時間を３日間（１８．５から１５．５日に）および抗生物質必要性を３日間（１１．５から９．８日に；表５）減少させることを見出した。
表５．６．００Ｇｙのｘ−照射アカゲザルにおける好中球関連パラメーターにおける、Ｍａｘｙ−Ｇ２１投与  対  ニューラスタ（登録商標）処置または対照自己血清（ＡＳ）の効果：好中球減少期間、最下点、回復時間および臨床支援
【表５】
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＊  別々の対照コホート
＊＊  本試験を含む組合せニューラスタ（登録商標）コホートおよびＭａｃＶｉｔｔｉｅ実験室から確立されたコホート
【０１２３】
歴史的ニューラスタ（登録商標）コホート（ｎ＝５）からのデータを現在の試験内ニューラスタ（登録商標）コホート（ｎ＝４）と組み合わせたとき、好中球減少症の期間は１２．１±１．３日間であった。好中球減少症の期間は、組合せニューラスタ（登録商標）群と比較してＭａｘｙ−Ｇ２１群において有意に短縮した（Ｐ＝０．０２）（図３、表５）。対照およびＭａｘｙ  Ｇ２１−処置コホートのみが９．８日間、抗生物質を必要としたが、組合せニューラスタ（登録商標）−処置コホートは１４．７日間の抗生物質支持を必要とした。１００μｇ／ｋｇで投与されたＭａｘｙ−Ｇ２１（データは示していない）は、全ての好中球−関連パラメーターにより評価されるとおり、本試験の条件下で好中球回復の刺激において有効ではなかった。
【０１２４】
Ｍａｘｙ−Ｇ２１の皮下投与後、薬物は照射および非照射アカゲザルの両方において２４から９６時間以内にピーク血漿濃度に達した。２つの３００μｇ／ｋｇの投与群において、ピーク血漿濃度は１００μｇ／ｋｇの群よりも約３倍高かった。二相Ｍａｘｙ−Ｇ２１除去パターンが、３００μｇ／ｋｇの薬物で処置された正常および照射動物の両方において見られる（図４）。
【０１２５】
３００μｇ／ｋｇのＭａｘｙ−Ｇ２１で処置された照射された動物は、５９時間の平均血清半減期の早期−除(early-slow)排出相を示した。早期−除相の期間は、１２−１３日間であった（図４）。早期プロフィールは、５匹のマカクザルにおいて均一性により特徴付けられる。薬物の注射１５日後、除相は、１６時間の平均血漿半減期を示す高速相(faster phase)により置き換えられる。３つの動物由来のデータの分析に基づく後期排出相は、血漿半減期におけるさらなる動物間変化により特徴付けられた。１００μｇ／ｋｇのＭａｘｙ−Ｇ２１で処置された照射された動物において、薬物は、４９時間の平均血清半減期で単相において除去された。
【０１２６】
非照射（“正常”）動物は、動力学プロフィールにおいて急速−早期および除−後期にて、Ｍａｘｙ−Ｇ２１（３００μｇ／ｋｇ）を除去した。後期の平均血漿半減期は、公開されている試験の非照射動物においてニューラスタ（登録商標）に対して３５時間未満（データは示していない）と比較して、６２時間であった。非照射および照射動物の比較は、同じ用量の３００μｇ／ｋｇのＭａｘｙ  Ｇ２１でＡＵＣにおいて３倍の違いを示す（表６）。
【０１２７】
ニューラスタ（登録商標）は、単相において２３時間の平均血漿半減期で除去されることが見出され、これはＭａｘｙ−Ｇ２１において観察されるものよりも著しく速い（図４）。ニューラスタ（登録商標）のピーク血漿濃度は、Ｍａｘｙ−Ｇ２１と比較して５−６倍低いことが見出された（表６）。１１から１５日後、ニューラスタ（登録商標）は血漿において検出されなかった。ニューラスタ（登録商標）に対するＡＵＣは、Ｍａｘｙ−Ｇ２１と比較して約９−１０倍低かった。
表６．Ｍａｘｙ−Ｇ２１およびニューラスタ（登録商標）−処置照射アカゲザルならびにＭａｘｙ−Ｇ２１処置非照射アカゲザルの薬物動態学
値は平均±標準偏差を示す
【表６】
2012503014.tif 000007
【０１２８】
結論：
本試験は、アカゲザルへ皮下投与される本発明の典型的なマルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体（本明細書においてＭａｘｙ−Ｇ２１として同定される）が、放射線誘発好中球減少ＮＨＰにおける好中球減少症の期間を有意に短縮することができるという証拠を提供する。さらに、該効果は、試験内ニューラスタ（登録商標）コホートおよび歴史的ニューラスタ（登録商標）コホート（Ｎ＝９）を含むコホートと比較したとき、ニューラスタ（登録商標）のものを越えることを見出した。
【０１２９】
概して、典型的なマルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体Ｍａｘｙ−Ｇ２１は、重度の放射線誘発骨髄抑制の状態を有しているＮＨＰならびに健常（非照射）非ヒト霊長類において、モノ−ＰＥＧ化ｈＧ−ＣＳＦニューラスタ（登録商標）と比較して、血漿半減期を著しく上昇させることを示した。ＰＫデータは、マルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体、例えば、Ｍａｘｙ−Ｇ２１が、重度の放射線誘発骨髄抑制の状態中ならびに正常（非照射）ＮＨＰにおけるモノ−ＰＥＧ化ニューラスタ（登録商標）と比較して、より良いバイオアベイラビリティおよび作用の持続期間を有するという作業仮説を支持する。
【０１３０】
実施例３
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける致死放射線暴露後に皮下投与されるマルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体の放射性軽減活性
典型的なマルチ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体（本明細書においてＭａｘｙ−Ｇ３４として同定される）の有効性は、１ｍｇ／ｋｇ用量および２つの異なる致死線量の放射線で試験した。それぞれの放射線量レベルでのマウスを、７．７６Ｇｙまたは７．９６Ｇｙでの照射後、１、７および１４日目または１および７日目にＭａｘｙ−Ｇ３４を与える、それぞれ２０匹のマウス（メス１０匹およびオス１０匹）の処置群に配分した。ビヒクル−処置マウスには、希釈剤（１０ｍＭの酢酸ナトリウム、４５ｍｇ／ｍｌのマンニトール、０．０５ｍｇ／ｍｌのポリソルベート２０、ｐＨ４．０の滅菌液）を１、７および１４日目に与えた。したがって、３つの群のマウスに以下の処置の１つを与えた：
１．Ｍａｘｙ−Ｇ３４；７．７６Ｇｙの照射後２４±４時間および７日±４時間
（Ｍａｘｙ−Ｇ３４  １日、７日）
２．Ｍａｘｙ−Ｇ３４；７．７６Ｇｙの照射後２４±４時間、７日±４時間および１４日±４時間
（Ｍａｘｙ−Ｇ３４  １日、７日、１４日）
３．ビヒクル；７．７６Ｇｙの照射後２４±４時間、７日±４時間および１４日±４時間
（ビヒクル  １日、７日、１４日）
４．Ｍａｘｙ−Ｇ３４；７．９６Ｇｙの照射後２４±４時間および７日±４時間
（Ｍａｘｙ−Ｇ３４  １日、７日）
５．Ｍａｘｙ−Ｇ３４；７．９６Ｇｙの照射後２４±４時間、７日±４時間および１４日±４時間
（Ｍａｘｙ−Ｇ３４  １日、７日、１４日）
６．ビヒクル；７．９６Ｇｙの照射後２４±４時間、７日±４時間および１４日±４時間
（ビヒクル  １日、７日、１４日）
【０１３１】
マウスを、以下の線量で１４−１６匹の動物群において照射した：
７．７６Ｇｙ：６６．１０４ｃＧｙ／分（暴露時間１１分４４秒）
７．９６Ｇｙ：６６．１０４ｃＧｙ／分（暴露時間１２分０２秒）
該マウスに抗生物質は投与しなかった。一次エンドポイントは３０日全生存とし、二次エンドポイントは平均生存時間（ＭＳＴ）とした。
【０１３２】
結果：
３０日生存率および平均生存時間（ＭＳＴ）を表７、表８、図５および図６に示す。
表７．３０日生存率およびＭＳＴ
【表７】
2012503014.tif 000008
【０１３３】
表８．生存率および平均生存時間の統計分析
（７．７６Ｇｙおよび７．９６Ｇｙの統合データ）
【表８】
2012503014.tif 000009
【０１３４】
７．７６Ｇｙの放射線量でマウスの照射、次に、暴露１日、７日および１４日後にビヒクルで処置は、３０日後８０％の生存率（すなわち、ＬＤ２０／３０）となった。７．７６Ｇｙ（ＬＤ２０／３０）で照射されたマウスの暴露１日、７日および１４日後に、または暴露１日および７日後に１ｍｇ／ｋｇのＭａｘｙ−Ｇ３４での処置により、両方とも３０日後の生存率が９５％に増加した（表７）。
【０１３５】
７．９６Ｇｙの放射線量で、ビヒクル  １日、７日、１４日群における生存率は、暴露後３０日間で５５％（すなわち、ＬＤ４５／３０）であった。１日および７日に１ｍｇ／ｋｇのＭａｘｙ−Ｇ３４で処置された、７．９６Ｇｙ（ＬＤ４５／３０）で照射されたマウスは、暴露後３０日間で７５％生存率を示し、Ｍａｘｙ−Ｇ３４  １日、７日、１４日群は、暴露後３０日間で８５％生存率を示した。この放射線量レベルで、３週投与レジメン（１日、７日、１４日）は、２週投与レジメン（１日、７日）よりもより有効であるように見えた。
【０１３６】
２つのレベルの放射線から得られたデータを組み合わせた（表８）。この試験の条件下、３週Ｍａｘｙ−Ｇ３４投与群および２週Ｍａｘｙ−Ｇ３４投与群の両方が、照射後３０日の生存において、ビヒクル対照群のものを越える統計的に有意な増加を示した。この試験において使用される放射線量で、処置群とビヒクル対照群間のＭＳＴにおける違いは、統計的に有意ではなかった。
【０１３７】
前述の発明は明瞭および理解の目的のためにより詳細に記載されているが、本明細書の解釈から、形式および細部において種々の変化が本発明の範囲から逸脱することなく作成することができることが当業者に明らかである。本明細書に記載されている実施例および態様は実例の目的のみであり、種々の修飾または変化が当業者に示唆され、それらは本出願の精神および範囲ならびに特許請求の範囲に包含されると理解される。それぞれの個々の出願、特許、特許出願および／または他の文書が全て目的のためにその全体を出典明示により本明細書に包含され個々に示されているのと同じ範囲で、全ての刊行物、特許、特許出願および／または本出願において引用されている他の文書は、全て目的のためにそれら全体を出典明示により本明細書に包含させる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
2012503014000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成23年5月12日(2011.5.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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2012503014.tif 000018
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