(57)【要約】  本発明は、微細藻類により産生されるＰＵＦＡ、特に、ロドモナス属のメンバー、特にロドモナス・サリナにより産生されるオメガ−３および／またはオメガ−６脂肪酸を含む組成物、方法およびキットを提供する。本発明は、また、ＰＵＦＡを含む、疾患または症状、特に、心血管および／または炎症性疾患または症状の予防的および／または治療的処置用の組成物、方法およびキットを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
重量で少なくとも８％の多価不飽和脂肪酸を含む多価不飽和脂肪酸組成物の製造方法であって、多価不飽和脂肪酸を微細藻類から抽出することを含み、ここで、
（ａ）ＳＤＡは、全脂肪酸の約５％ないし約５０％の量であり；
（ｂ）ＥＰＡは、全脂肪酸の約２％ないし約３０％の量であり；
（ｃ）ＤＨＡは、全脂肪酸の約２％ないし約３０％の量であり；そして、場合により、
（ｄ）ＧＬＡは、全脂肪酸の約０.１％ないし約１０％の量であり；
ここで、組成物は、重量で少なくとも８％の多価不飽和脂肪酸を含むものである、方法。
【請求項２】
微細藻類が野生型の微細藻類と比較して厚みの少ない細胞壁を有する微細藻類であり、該厚みの少ない細胞壁が微細藻類の脂質画分の抽出性および／またはバイオアベイラビリティーを改善する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
微細藻類が、渦鞭毛藻綱、クリプト藻綱、トレボウクシア藻綱、ピングイオ藻綱およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該微細藻類が、パリエトクロリス属、ロドモナス属、ポルフィリジウム属およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
該微細藻類がロドモナス・サリナである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも５％のステアリドン酸を含む組成物の製造方法であって、
（ａ）微細藻類を培養し、微細藻類バイオマスを産生すること；および、
（ｂ）該培養された微細藻類から該微細藻類油を抽出すること；または、
（ｃ）水を該微細藻類バイオマスから除去し、固体含有量５ないし１００重量％を達成すること；のいずれかを含み、
ここで、組成物は、少なくとも５％のステアリドン酸を含むものである、方法。
【請求項７】
微細藻類由来の脂肪酸を含む動物飼料添加物の製造方法であって、
（ａ）微細藻類を培養し、微細藻類バイオマスを産生すること；および、
（ｂ）該微細藻類バイオマスから微細藻類油を抽出し、微細藻類油を産生すること；または、
（ｃ）水を該微細藻類バイオマスから除去し、固体含有量５ないし１００重量％の微細藻類バイオマスを産生すること；のいずれかを含み、
ここで、動物飼料添加物は、微細藻類由来の脂肪酸を含むものである、方法。
【請求項８】
脂肪酸が短鎖オメガ−３脂肪酸である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
重量で少なくとも８％の多価不飽和脂肪酸を含む動物飼料添加物の製造方法であって、脂肪酸を微細藻類から抽出することを含み、ここで、
（ａ）ＳＤＡは、全脂肪酸の約５％ないし約５０％の量であり；
（ｂ）ＥＰＡは、全脂肪酸の約２％ないし約３０％の量であり；
（ｃ）ＤＨＡは、全脂肪酸の約２％ないし約３０％の量であり；そして、場合により、
（ｄ）ＧＬＡは、全脂肪酸の約０.１％ないし約１０％の量であり；
ここで、動物飼料添加物は、少なくとも８％の多価不飽和脂肪酸を含むものである、方法。
【請求項１０】
長鎖オメガ−３脂肪酸の組織含有量が増加した動物の産生方法であって、動物に微細藻類の多価不飽和脂肪酸を含む動物飼料添加物を与えることを含み、微細藻類の多価不飽和脂肪酸は、（ａ）培養された微細藻類バイオマスから抽出された微細藻類油、および／または、（ｂ）培養された微細藻類に由来する微細藻類バイオマス、ここで、水は微細藻類バイオマスから除去され、固体含有量５ないし１００％を達成している、を含み；ここで、長鎖オメガ−３脂肪酸の組織含有量が増加した動物が産生されるものである、方法。
【請求項１１】
長鎖オメガ−３脂肪酸の組織含有量が増加した動物の産生方法であって、動物に重量で少なくとも８％の多価不飽和脂肪酸を含む動物飼料添加物を与えることを含み；動物飼料添加物は、微細藻類から抽出された多価不飽和脂肪酸を含み、ここで、（ａ）ＳＤＡは、全脂肪酸の約５％ないし約５０％の量であり；（ｂ）ＥＰＡは、全脂肪酸の約２％ないし約３０％の量であり；（ｃ）ＤＨＡは、全脂肪酸の約２％ないし約３０％の量であり；そして、場合により、（ｄ）ＧＬＡは、全脂肪酸の約０.１％ないし約１０％の量であり；ここで、長鎖オメガ−３脂肪酸の組織含有量が増加した動物が産生されるものである、方法。
【請求項１２】
動物が、魚、家禽、ブタ、ヒツジ並びに肉牛および乳牛からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
動物が、魚、家禽、ブタ、ヒツジ並びに肉牛および乳牛からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
微細藻類から抽出した重量で少なくとも８％の多価不飽和脂肪酸を含む多価不飽和脂肪酸組成物の治療的有効量を対象に投与することによる、それを必要としている対象における哺乳動物の疾患の処置方法であって、ここで、微細藻類の脂肪酸抽出物は、
（ａ）全脂肪酸の約５％ないし約５０％の量のＳＤＡ；
（ｂ）全脂肪酸の約２％ないし約３０％の量のＥＰＡ；
（ｃ）全脂肪酸の約２％ないし約３０％の量のＤＨＡ；および、場合により、
（ｄ）全脂肪酸の約０.１％ないし約１０％の量のＧＬＡ
を含むものである、方法。
【請求項１５】
少なくとも５％のＳＤＡを非リン脂質形態で含む組成物の治療的有効量を対象に投与することによる、それを必要としている対象における哺乳動物の疾患の処置方法であって、その組成物は、（ａ）培養された微細藻類バイオマスから抽出された微細藻類油、または、（ｂ）培養された微細藻類に由来する微細藻類バイオマス、ここで、水は微細藻類バイオマスから除去され、固体含有量約５ないし１００重量％を達成している、のいずれかを含むものである、方法。
【請求項１６】
請求項１に記載の方法により製造された多価不飽和脂肪酸組成物。
【請求項１７】
ＧＬＡが、ルリジサ油由来のＧＬＡをさらに含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
請求項６に記載の方法により製造された多価不飽和脂肪酸組成物。
【請求項１９】
ＧＬＡが、ルリジサ油由来のＧＬＡをさらに含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
（ａ）０.０１−９９.９９重量％の請求項１６に記載の組成物を、（ｂ）９９.９９−０.０１重量％の、タンパク質、炭水化物および繊維並びにこれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１種のさらなる成分と組み合わせて含む、食品。
【請求項２１】
（ａ）０.０１−９９.９９重量％の請求項１８に記載の組成物を、（ｂ）９９.９９−０.０１重量％の、タンパク質、炭水化物および繊維並びにこれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１種のさらなる成分と組み合わせて含む、食品。
【請求項２２】
シリアル、押出されたバー、食品のトッピング、アイスクリーム、飲料、飴、スナックミックスまたは焼いた製品の形態である、請求項２０に記載の食品。
【請求項２３】
シリアル、押出されたバー、食品のトッピング、アイスクリーム、飲料、飴、スナックミックスまたは焼いた製品の形態である、請求項２１に記載の食品。
【請求項２４】
請求項７に記載の方法により製造された動物飼料添加物。
【請求項２５】
請求項９に記載の方法により製造された動物飼料添加物。
【請求項２６】
請求項２４に記載の動物飼料添加物を動物に与えることにより産生された、動物製品。
【請求項２７】
請求項２５に記載の動物飼料添加物を動物に与えることにより産生された、動物製品。
【請求項２８】
卵、乳または肉を含む、請求項２６に記載の動物製品。
【請求項２９】
卵、乳または肉を含む、請求項２７に記載の動物製品。
【請求項３０】
請求項１０に記載の方法により産生された動物。
【請求項３１】
請求項１１に記載の方法により産生された動物。
【請求項３２】
請求項３０に記載の動物から産生された動物製品。
【請求項３３】
請求項３１に記載の動物から産生された動物製品。
【請求項３４】
１種またはそれ以上のＰＵＦＡを含む微細藻類バイオマスの製造方法であって、１種またはそれ以上のＰＵＦＡを含む微細藻類バイオマスを提供するのに十分な培養条件下で微細藻類を培養することを含み、ここで、微細藻類バイオマスを少なくとも１の対数増殖期の後に回収する、方法。
【請求項３５】
微細藻類がロドモナスである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
微細藻類が、Provasoli-Guillard National Center for Culture of Marine Phytoplankton (CCMP) (West Boothbay Harbor, ME) に寄託された株であり、株番号が、ＣＣＭＰ２７２、ＣＣＭＰ２７３、ＣＣＭＰ２７５、ＣＣＭＰ３１８、ＣＣＭＰ３２２、ＣＣＭＰ３２３、ＣＣＭＰ３２４、ＣＣＭＰ７３９、ＣＣＭＰ７４０、ＣＣＭＰ７４１、ＣＣＭＰ７４２、ＣＣＭＰ７４３、ＣＣＭＰ７４４、ＣＣＭＰ７４６、ＣＣＭＰ７４７、ＣＣＭＰ７４８、ＣＣＭＰ７４９、ＣＣＭＰ７５０、ＣＣＭＰ７５１、ＣＣＭＰ７５２、ＣＣＭＰ７５３、ＣＣＭＰ７５４、ＣＣＭＰ７５５、ＣＣＭＰ７５６、ＣＣＭＰ７５７、ＣＣＭＰ７５８、ＣＣＭＰ７５９、ＣＣＭＰ７６０、ＣＣＭＰ７６１、ＣＣＭＰ７６２、ＣＣＭＰ７６３、ＣＣＭＰ７６６、ＣＣＭＰ７６７、ＣＣＭＰ７６８、ＣＣＭＰ１１７０、ＣＣＭＰ１１７１、ＣＣＭＰ１１７８、ＣＣＭＰ１３１９、ＣＣＭＰ１４１９、ＣＣＭＰ１４２０、ＣＣＭＰ１５３３、ＣＣＭＰ１７４９、ＣＣＭＰ２００５およびＣＣＭＰ２０４５からなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
微細藻類が、ＣＣＭＰ７５７で寄託された株である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
微細藻類が、配列番号１または配列番号２のものを含む小サブユニットリボソームＲＮＡ（ＳＳＵ ｒＲＮＡ）の遺伝子配列を有する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
１種またはそれ以上のＰＵＦＡが、オメガ−３脂肪酸、オメガ−６脂肪酸またはその両方である、請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
オメガ−３脂肪酸がステアリドン酸（ＳＤＡ）である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
回収時のＳＤＡが全脂肪酸の少なくとも約５％である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
オメガ−６脂肪酸がγ−リノレン酸（ＧＬＡ）である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
回収時のＧＬＡが全脂肪酸の約５％未満である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
１種またはそれ以上のＰＵＦＡを含む微細藻類バイオマスの製造方法であって、１種またはそれ以上のＰＵＦＡを含む微細藻類バイオマスを提供するのに十分な培養条件下で微細藻類を培養することを含み、ここで、微細藻類バイオマスを、微細藻類の少なくとも１の対数増殖期の後に回収し、ここで、オメガ−３脂肪酸はステアリドン酸（ＳＤＡ）であり、オメガ−６脂肪酸はγ−リノレン酸（ＧＬＡ）であり、回収時のＳＤＡは、全脂肪酸の少なくとも約３０％であり、回収時のＧＬＡは、全脂肪酸の約１％未満である、方法。
【請求項４５】
培養培地が、誘導期に第１のリン濃度を、そして、回収時の対数増殖期に第２のリン濃度を含み、ここで、第２のリン濃度は、第１のリン濃度の約２０％以下である、請求項３４または請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
請求項３４または請求項４４に記載の方法により製造された微細藻類バイオマス。
【請求項４７】
請求項４６に記載の微細藻類バイオマスから製造された脂質組成物。
【請求項４８】
請求項４６に記載の微細藻類バイオマスまたはそのバイオマスのＳＤＡ含有画分を含む食品。
【請求項４９】
請求項４７に記載の脂質組成物またはその脂質組成物のＳＤＡ含有画分を含む食品。
【請求項５０】
微細藻類バイオマスから製造された脂質組成物であって、微細藻類バイオマスからの抽出の際に、
（ａ）全脂肪酸の少なくとも１０％の総ＳＤＡ量の微細藻類に産生されたＳＤＡ；および、
（ｂ）全脂肪酸の約５％未満の総ＧＬＡ量の微細藻類に産生されたＧＬＡ
を含むものである、脂質組成物。
【請求項５１】
請求項５０に記載の脂質組成物またはその脂質組成物のＳＤＡ含有画分を含む食品。
【請求項５２】
全脂肪酸の少なくとも３０重量％をオメガ−３脂肪酸として有する脂質を含む微細藻類バイオマス。
【請求項５３】
全脂肪酸の少なくとも４０重量％をオメガ−３およびオメガ−６脂肪酸として有する脂質を含む微細藻類バイオマス。
【請求項５４】
バイオマスの乾燥重量の少なくとも１０％のオメガ−３脂肪酸含有量を含む微細藻類バイオマス。
【請求項５５】
食品が飼料または乳製品である、請求項４８、請求項４９または請求項５１のいずれかに記載の食品。
【請求項５６】
請求項４７または請求項５０に記載の脂質組成物またはその脂質組成物のＳＤＡ含有画分を含む医薬組成物。
【請求項５７】
請求項４７または請求項５０に記載の脂質組成物またはその脂質組成物のＳＤＡ含有画分を含む栄養補助食品。
【請求項５８】
１種またはそれ以上のＰＵＦＡを含む微細藻類バイオマスの製造方法であって、１種またはそれ以上のＰＵＦＡを含む微細藻類バイオマスを提供するのに十分な培養条件下で微細藻類を培養し、微細藻類の負の増殖加速期または定常期で微細藻類バイオマスを回収することを含む、方法。
【請求項５９】
微細藻類が、Provasoli-Guillard National Center for Culture of Marine Phytoplankton (CCMP) (West Boothbay Harbor, ME) に株番号ＣＣＭＰ７５７で寄託された株である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
微細藻類が、配列番号１または配列番号２のものを含む小サブユニットリボソームＲＮＡ（ＳＳＵ ｒＲＮＡ）の遺伝子配列を有する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
１種またはそれ以上のＰＵＦＡが、オメガ−３脂肪酸、オメガ−６脂肪酸またはその両方である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６２】
オメガ−３脂肪酸がステアリドン酸（ＳＤＡ）であり、オメガ−６脂肪酸がγ−リノレン酸（ＧＬＡ）である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
回収時のＳＤＡが全脂肪酸の少なくとも約５％であり、回収時のＧＬＡが全脂肪酸の少なくとも約５％である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
請求項５８に記載の方法により製造された微細藻類バイオマス。
【請求項６５】
請求項６４に記載の微細藻類バイオマスから製造された脂質組成物。
【請求項６６】
請求項６４に記載の微細藻類バイオマスまたはそのバイオマスのＳＤＡ含有画分を含む食品。
【請求項６７】
請求項６５に記載の脂質組成物またはその脂質組成物のＳＤＡ含有画分を含む食品。
【請求項６８】
微細藻類バイオマスから製造された脂質組成物であって、微細藻類バイオマスからの抽出の際に、
（ａ）全脂肪酸の少なくとも５％の総ＳＤＡ量の微細藻類に産生されたＳＤＡ；および、
（ｂ）全脂肪酸の少なくとも０.１％の総ＧＬＡ量の微細藻類に産生されたＧＬＡ
を含む、脂質組成物。
【請求項６９】
請求項６８に記載の脂質組成物またはその脂質組成物のＳＤＡ含有画分を含む食品。
【請求項７０】
食品が飼料または乳製品である、請求項６６、請求項６７または請求項６９のいずれかに記載の食品。
【請求項７１】
請求項６５または請求項６８に記載の脂質組成物またはその脂質組成物のＳＤＡ含有画分を含む医薬組成物。
【請求項７２】
請求項６５または請求項６８に記載の脂質組成物またはその脂質組成物のＳＤＡ含有画分を含む栄養補助食品。
【請求項７３】
対象に請求項４７または請求項６５に記載の脂質組成物を投与することを含む、対象の血漿トリグリセリドを低下させる方法。
【請求項７４】
対象が高トリグリセリド血症の対象である、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
対象に請求項４７または請求項６５に記載の脂質組成物を投与することを含む、対象におけるＩｇＥ−に誘導される好塩基球からのロイコトリエン放出を低下させる方法。
【請求項７６】
対象が喘息の対象である、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
請求項４７または請求項６５の脂質組成物を含むキット。
【請求項７８】
単離されたＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−９９８９のロドモナス株の微細藻類。
【請求項７９】
請求項７８に記載の単離されたロドモナスの生物学的に純粋な培養物。
【請求項８０】
ＣＣＭＰ７５７の生物学的に純粋な培養物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、一般的に、脂質代謝および食品栄養補充の分野に関する。本発明は、また、微細藻類、特に微細藻類バイオマスにより産生される多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を含む組成物、方法およびキット、並びに、ロドモナス（Rhodomonas）属のメンバー、特にロドモナス・サリナ（Rhodomonas salina）により産生されるオメガ−３および／またはオメガ−６脂肪酸を含む脂質組成物に関する。より具体的には、それは、異なる種の微細藻類に由来する多価不飽和脂肪酸の組合せを使用する、哺乳動物の疾患の予防および処置用の組成物および方法に関する。従って、本発明は、また、微細藻類により産生されるＰＵＦＡを含む、疾患または症状、特に、心血管および／または炎症性疾患または症状の予防的および／または治療的処置用の組成物、方法およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
オメガ−３脂肪酸は、正常なヒトの成長および発達に必須であり、それらの心血管疾患および関節リウマチに関する治療的および予防的利点は、十分に文書で証明されてきた（James et al., A. J. Clin. Nutr. 77: 1140-1145 (2003); Simopoulos, A. J. Clin, Nutr. 70: 560S-569S (1999)）。複数の研究が、魚油およびｎ−３多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の心血管疾患の進行に関する保護的役割を文書で証明した。魚油の心保護的利点は、大部分、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、２０：５ｎ−３）およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、２２：６、ｎ−３）などの２０および２２個の炭素の脂肪酸に起因し、それが細胞および血漿リポタンパク質において豊富であることは、炎症、血栓症、血圧、不整脈、内皮の活性化および血漿トリグリセリド（ＴＧ）濃度の減少をもたらす。
【０００３】
ヒトを含む哺乳動物は、飽和脂肪酸および一不飽和（ｎ−９）脂肪酸を合成できるが、（ｎ−６）または（ｎ−３）二重結合を合成できない。（ｎ−３）および（ｎ−６）脂肪酸は、細胞膜リン脂質において、そして、様々な酵素の基質として、必須成分である；従って、これらの結合を含む脂肪酸は、必須脂肪酸であり、食事で得られなければならない。（ｎ−６）脂肪酸は、主として、植物油由来のリノール酸［１８：２（ｎ−６）］として、そして、肉由来のアラキドン酸［ＡＡ、２０：４（ｎ−６）］として消費される。（ｎ−３）脂肪酸は、いくつかの植物油由来のｙ−リノレン酸［ＧＬＡ、１８：３（ｎ−３）］として消費され得る。より長い鎖（ｎ−３）の脂肪酸、主に、ＥＰＡおよびドコサヘキサエン酸［ＤＨＡ、２２：６（ｎ−３）］は、魚および魚油に見出される（Hardman, J. Nutr. 134: 3427S-3430S (2004))。
【０００４】
魚油の有利な効果についての圧倒的な証拠にも拘わらず、北米の集団におけるｎ−３ＰＵＦＡの消費は、非常に少ない。（ｎ−３）および（ｎ−６）脂肪酸は、ヒトでは相互に交換できないので、ヒトにおける（ｎ−３）と（ｎ−６）の脂肪酸のバランスは、適切な食事によってしか達成できない。しかしながら、現在の西洋の食事は、（ｎ−６）脂肪酸を支配的に含み、僅かな量の（ｎ−３）脂肪酸を含む。実際に、事実上の食事による魚油由来の脂肪酸の摂取は、アメリカ心臓協会（American Heart Association）(Ursin, J. Nutr. 133: 4271-4272 (2003)）により推奨されるレベルの１０分の１までに低いと見積もられる。そのような（ｎ−３）と（ｎ−６）の脂肪酸の不均衡は、喘息、心血管疾患、関節炎、癌を含む、様々な疾患と関連付けられてきた。
【０００５】
研究は、（ｎ−３）および（ｎ−６）脂肪酸が、２つのタイプの酵素：シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）およびリポオキシゲナーゼ（ＬＯＸ）の作用を通して、様々な疾患の症状に影響することを明らかにした。ＣＯＸおよびＬＯＸは、２０個の炭素の脂肪酸に作用し、細胞のシグナル伝達分子を産生する。ＡＡまたはＥＰＡに対するＣＯＸの活性は、プロスタグランジン類またはトロンボキサン類を産生する；ＡＡまたはＥＰＡに対するＬＯＸの活性は、ロイコトリエン類を産生する。ＡＡから産生される２系統のプロスタグランジン類は、殆どの組織で、炎症促進性かつ増殖性である傾向がある。ＥＰＡから産生される３系統のプロスタグランジン類では、炎症および増殖の促進性は低い傾向がある。従って、ＥＰＡに由来するプロスタグランジン類は、炎症および癌細胞の発達および増殖への有利さに乏しい (Hardman, J. Nutr. 134: 3427S-3430S (2004))。
【０００６】
炎症性疾患に影響を与えるための代替的アプローチは、（ｎ−６）系統の１８個の炭素の多価不飽和脂肪酸、ｙ−リノレン酸［ＧＬＡ、１８：３（ｎ−６）］を補充した食事であった。この脂肪酸は、主に、月見草およびルリジサの油に見出され、それより低い程度で肉および玉子に見出される。動物のデータおよびいくつかの臨床試験は、ＧＬＡによる食品栄養補充は、関節リウマチおよびアトピー性皮膚炎を含む２０種の慢性炎症性疾患の徴候および症状を減じ得ることを示唆する。ステアリドン酸［ＳＤＡ、１８：４（ｎ−３）］を含有する他の植物油であるシャゼンムラサキ属の油は、高トリグリセリド血症の患者において保護効果を有すると示された。
【０００７】
しかしながら、今日までの多くの食事研究における主な関心は、様々なＰＵＦＡの供給源が、それが魚油、ルリジサ、月見草またはシャゼンムラサキ属の油またはこれらの油の組合せであろうとなかろうと、抗炎症性の有効成分（ある種のＰＵＦＡ）を提供するが、それらは、潜在的に炎症促進性であるか、または、活性なＰＵＦＡの抗炎症作用を阻害するｎ−６脂肪酸も提供することである。２種のそのような脂肪酸は、ＡＡおよびリノール酸［１８：２（ｎ−６）］である。これらのｎ−６脂肪酸は、主に植物油由来のリノール酸および肉由来のＡＡとして消費される。リノール酸は、一連の不飽和化および伸長の段階により、ＡＡに変換される。多量の食物由来のリノール酸は、西洋諸国で観察されるオメガ６とオメガ３脂肪酸の大きな不均衡をもたらしてきた主な犯人である。リノール酸の多い食事は、いくつかの動物モデルで炎症促進性であると立証された。
【０００８】
アラキドン酸は、哺乳動物でロイコトリエン類、プロスタグランジン類およびトロンボキサン類と呼ばれる産物に変換される、２０個の炭素のｎ−６脂肪酸である。これらの産物は炎症を引き起こし、アスピリン、イブプロフェン、セレコキシブ（Celebrex（商標））およびモンテルカストナトリウム（Singulair（商標））などの薬物を利用するそれらの産生の阻害は、喘息および関節炎を含む炎症性疾患の徴候および症状を減ずる。炎症促進性産物の産生におけるＡＡの重要性に加えて、ＡＡは、また、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）−アルファなどの転写因子を介して哺乳動物における遺伝子発現を調節し、低レベルの全身の炎症を導く。上記で示した通り、最近の研究は、ＡＡが我々の食品供給の多くの品目に高濃度で存在することを明らかにしている。皮肉なことに、それはある種の魚に高濃度で見出される。ヒトの食事中のＡＡは、炎症促進性産物、血小板凝集およびアテローム性動脈硬化のレベルの上昇と相関させられてきた。
【発明の概要】
【０００９】
発明の概要
抗炎症性脂肪酸を含有する製剤の設計および開発における主な進歩は、最適な割合の抗炎症性または抗心血管疾患の脂肪酸を含有し、その中で無益または有害な脂肪酸は最小限である複合油を開発することであろう。これは、抗炎症性または抗心血管疾患の脂肪酸の食事による摂取を増加させ得、従って、ある種の予防できる疾患の管理および処置を可能にし得、人間の安寧を増進し得る。
【００１０】
従って、本発明は、微細藻類に由来する抗炎症性脂肪酸組成物の製造方法を対象とする。本発明は、さらに、これらの組成物およびこれらの組成物の使用方法を対象とする。
【００１１】
ある実施態様では、少なくとも８％の多価不飽和脂肪酸を含む多価不飽和脂肪酸組成物の製造方法が開示される；その方法は、多価不飽和脂肪酸を微細藻類から抽出することを含み、ここで、（ａ）ＧＬＡは、全脂肪酸の１％ないし１０％の量であり；（ｂ）ＳＤＡは、全脂肪酸の５％ないし５０％の量であり；（ｃ）ＥＰＡは、全脂肪酸の２％ないし３０％の量であり；そして、（ｄ）ＤＨＡは、全脂肪酸の２％ないし３０％の量であり；ここで、組成物は、少なくとも８％の多価不飽和脂肪酸を含む。
【００１２】
他の実施態様では、少なくとも５％のステアリドン酸を含む組成物の製造方法が開示され、その方法は、（ａ）微細藻類を培養し、微細藻類バイオマスを産生すること；および、（ｂ）該微細藻類バイオマスから該微細藻類油を抽出すること；または、（ｃ）水を該微細藻類バイオマスから除去し、固体含有量約５ないし１００％を達成することのいずれかを含み、ここで、組成物は、少なくとも５％のステアリドン酸を含む。
【００１３】
また他の実施態様では、微細藻類由来の脂肪酸を含む動物飼料添加物の製造方法が開示され、その方法は、（ａ）微細藻類を培養し、微細藻類バイオマスを産生すること；および、（ｂ）該微細藻類バイオマスから微細藻類油を抽出し、微細藻類油を産生すること；または、（ｃ）水を該微細藻類バイオマスから除去し、固体含有量約５％ないし１００％の微細藻類バイオマスを産生することのいずれかを含み、ここで、動物飼料添加物は、微細藻類由来の脂肪酸を含む。
【００１４】
さらなる実施態様では、少なくとも８％の多価不飽和脂肪酸を含む動物飼料添加物の製造方法が開示され、その方法は、脂肪酸を微細藻類から抽出することを含み、ここで、（ａ）ＧＬＡは、全脂肪酸の１％ないし１０％の量であり；（ｂ）ＳＤＡは、全脂肪酸の５％ないし５０％の量であり；（ｃ）ＥＰＡは、全脂肪酸の２％ないし３０％の量であり；（ｄ）ＤＨＡは、全脂肪酸の２％ないし３０％の量であり、ここで、動物飼料添加物は、少なくとも８％の多価不飽和脂肪酸を含む。
【００１５】
またさらなる実施態様では、長鎖オメガ−３脂肪酸の組織含有量が増加した動物の産生方法が開示され、その方法は、動物に微細藻類から回収した脂肪酸を含む動物飼料添加物を与えることを含み、動物飼料添加物は、さらに、（ａ）培養された微細藻類バイオマスから抽出された微細藻類油、および／または、（ｂ）培養された微細藻類に由来する微細藻類バイオマス、ここで、水は微細藻類バイオマスから除去され、固体含有量約５ないし１００％を達成している、を含み、ここで、長鎖オメガ−３脂肪酸の組織含有量が増加した動物が産生される。
【００１６】
追加の実施態様では、長鎖オメガ−３脂肪酸の組織含有量が増加した動物の産生方法が提供され、その方法は、動物に少なくとも８％の多価不飽和脂肪酸を含む動物飼料添加物を与えることを含み、その動物飼料添加物は、微細藻類から抽出された脂肪酸を含み、ここで、（ａ）ＧＬＡは、全脂肪酸の１％ないし１０％の量であり；（ｂ）ＳＤＡは、全脂肪酸の５％ないし５０％の量であり；（ｃ）ＥＰＡは、全脂肪酸の２％ないし３０％の量であり；そして、（ｄ）ＤＨＡは、全脂肪酸の２％ないし３０％の量であり；ここで、長鎖オメガ−３脂肪酸の組織含有量が増加した動物が産生される。
【００１７】
次の実施態様では、治療的有効量の少なくとも８％の多価不飽和脂肪酸を含む多価不飽和脂肪酸組成物を対象に投与することによる、それを必要としている対象における哺乳動物の疾患の処置方法が提供され；その組成物は、さらに、微細藻類から抽出された脂肪酸を含み、その微細藻類の脂肪酸抽出物は、（ａ）全脂肪酸の１％ないし１０％の量のＧＬＡ；（ｂ）全脂肪酸の５％ないし５０％の量のＳＤＡ；（ｃ）全脂肪酸の２％ないし３０％の量のＥＰＡ、および、（ｄ）全脂肪酸の２％ないし３０％の量のＤＨＡを含む。
【００１８】
他の次の実施態様では、治療的有効量の少なくとも５％のＳＤＡを含む組成物を対象に投与することによる、それを必要としている対象における哺乳動物の疾患の処置方法が提供され、その組成物は、（ａ）培養された微細藻類バイオマスから抽出された微細藻類油、または、（ｂ）培養された微細藻類に由来する微細藻類バイオマス、ここで、水は微細藻類バイオマスから除去され、固体含有量約５ないし１００％を達成している、のいずれかを含む。
【００１９】
さらなる次の実施態様では、少なくとも８％の多価不飽和脂肪酸を含む多価不飽和脂肪酸組成物が提供され；その組成物は、微細藻類から抽出された脂肪酸を含み、その微細藻類の脂肪酸抽出物は、（ａ）全脂肪酸の１％ないし１０％の量のＧＬＡ；（ｂ）全脂肪酸の５％ないし５０％の量のＳＤＡ；（ｃ）全脂肪酸の２％ないし３０％の量のＥＰＡ；および（ｄ）全脂肪酸の２％ないし３０％の量のＤＨＡを含む。
【００２０】
またさらなる次の実施態様では、少なくとも５％のＳＤＡを含む組成物が提供され、その組成物は、（ａ）培養された微細藻類バイオマスから抽出された微細藻類油、または、（ｂ）培養された微細藻類に由来する微細藻類バイオマス、ここで、水は微細藻類バイオマスから除去され、固体含有量約５ないし１００％を達成している、のいずれかを含む。
【００２１】
追加の次の実施態様では、（ａ）０.０１−９９.９９重量％の、少なくとも８％の多価不飽和脂肪酸を含む組成物、ここで、脂肪酸は、微細藻類から抽出されたものであり、さらに、微細藻類の脂肪酸抽出物は、（ｉ）全脂肪酸の１％ないし１０％の量のＧＬＡ；（ｉｉ）全脂肪酸の５％ないし５０％の量のＳＤＡ；（ｉｉｉ）全脂肪酸の２％ないし３０％の量のＥＰＡおよび（ｉｖ）全脂肪酸の２％ないし３０％の量のＤＨＡを含む；を、（ｂ）９９.９９−０.０１重量％の、タンパク質、炭水化物および繊維並びにこれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１種のさらなる成分、と組み合わせて含む食品が提供される。
【００２２】
本発明のさらなる実施態様は、（ａ）０.０１−９９.９９重量％の、少なくとも５％のステアリドン酸を含む組成物、この組成物は、（ｉ）培養された微細藻類バイオマスから抽出された微細藻類油、または、（ｉｉ）培養された微細藻類に由来する微細藻類バイオマス、ここで、水は微細藻類バイオマスから除去され、固体含有量約５ないし１００重量％を達成している、のいずれかを含む；を、（ｂ）９９.９９−０.０１重量％の、タンパク質、炭水化物および繊維並びにこれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１種のさらなる成分、と組み合わせて含む食品を提供する。
【００２３】
本発明の他の実施態様では、動物飼料添加物が提供され、その動物飼料添加物は、微細藻類から回収された脂肪酸を、ａ）培養された微細藻類バイオマスから抽出された微細藻類油、または、（ｂ）培養された微細藻類に由来する微細藻類バイオマス、ここで、水は微細藻類バイオマスから除去され、固体含有量約５ないし１００重量％を達成している、のいずれかの形態で含む。
【００２４】
ここでさらに提供されるのは、少なくとも８％の多価不飽和脂肪酸を含む動物飼料添加物であり、その添加物は、微細藻類から抽出された脂肪酸を含み、ここで、微細藻類の脂肪酸抽出物は、さらに、（ａ）全脂肪酸の１％ないし１０％の量のＧＬＡ；（ｂ）全脂肪酸の５％ないし５０％の量のＳＤＡ；（ｃ）全脂肪酸の２％ないし３０％の量のＥＰＡ；および（ｄ）全脂肪酸の２％ないし３０％の量のＤＨＡを含む。
【００２５】
本発明の他の実施態様は、微細藻類から回収された脂肪酸を、（ａ）培養された微細藻類バイオマスから抽出された微細藻類油、または（ｂ）培養された微細藻類に由来する微細藻類バイオマス、ここで、水は微細藻類バイオマスから除去され、固体含有量約５ないし１００重量％を達成している、のいずれかの形態で含む動物飼料添加物を動物に与えることにより産生される、動物製品を含む。
【００２６】
本発明のまた他の実施態様は、少なくとも８％の多価不飽和脂肪酸を含む動物飼料添加物を動物に与えることにより産生される動物製品を提供し、その添加物は、微細藻類から抽出された脂肪酸を含み、ここで、微細藻類の脂肪酸抽出物は、さらに、（ａ）全脂肪酸の１％ないし１０％の量のＧＬＡ；（ｂ）全脂肪酸の５％ないし５０％の量のＳＤＡ；（ｃ）全脂肪酸の２％ないし３０％の量のＥＰＡ、および、（ｄ）全脂肪酸の２％ないし３０％の量のＤＨＡを含む。
【００２７】
ある態様では、本発明は、１種またはそれ以上のＰＵＦＡを含む微細藻類バイオマスの製造方法を提供する。その方法は、１種またはそれ以上のＰＵＦＡを含む微細藻類バイオマスを提供するのに十分な培養条件下で微細藻類を培養することを含み、ここで、微細藻類バイオマスを、微細藻類の対数増殖期に回収する。
【００２８】
他の態様では、本発明は、１種またはそれ以上のＰＵＦＡを含む微細藻類バイオマスの製造方法を提供し、その方法は、１種またはそれ以上のＰＵＦＡを含む微細藻類バイオマスを提供するのに十分な培養条件下で微細藻類を培養することを含み、ここで、微細藻類バイオマスを、微細藻類の対数増殖期に回収し、オメガ−３脂肪酸はステアリドン酸（ＳＤＡ）であり、オメガ−６脂肪酸はγ−リノレン酸（ＧＬＡ）であり、回収時のＳＤＡは、全脂肪酸の少なくとも約３０％であり、回収時のＧＬＡは、全脂肪酸の約１％未満である。
【００２９】
いくつかの態様では、本発明は、微細藻類バイオマスから製造される脂質組成物を提供し、ここで、脂質組成物は、微細藻類バイオマスからの抽出時に、
（ａ）全脂肪酸の少なくとも１０％の総ＳＤＡ量の、微細藻類により産生されたＳＤＡ；および、
（ｂ）全脂肪酸の約５％より少ない総ＧＬＡ量の、微細藻類により産生されたＧＬＡ
を含む。
【００３０】
他の態様では、本発明は、全脂肪酸の少なくとも３０重量％を占める脂質をオメガ−３脂肪酸として含む微細藻類バイオマスを提供する。
ある態様では、本発明は、全脂肪酸の少なくとも４０重量％を占める脂質をオメガ−３およびオメガ−６脂肪酸として含む微細藻類バイオマスを提供する。
他の態様では、バイオマスの少なくとも１０％の乾燥重量の含有量のオメガ−３脂肪酸を含む微細藻類バイオマスが提供される。
【００３１】
ある態様では、本発明は、１種またはそれ以上のＰＵＦＡを含む微細藻類バイオマスの製造方法を提供し、その方法は、１種またはそれ以上のＰＵＦＡを含む微細藻類バイオマスを提供するのに十分な培養条件下で微細藻類を培養することを含み、ここで、微細藻類の負の増殖加速期（negative growth acceleration phase）または定常期で微細藻類バイオマスを回収する。
【００３２】
また他の態様では、本発明は、微細藻類バイオマスから製造される脂質組成物を提供し、ここで、脂質組成物は、微細藻類バイオマスからの抽出時に、
（ａ）全脂肪酸の少なくとも５％の総ＳＤＡ量の、微細藻類により産生されたＳＤＡ；および、
（ｂ）全脂肪酸の少なくとも５％の総ＧＬＡ量の、微細藻類により産生されたＧＬＡ
を含む。
【００３３】
ある態様では、本発明は、単離されたロドモナス株４Ｒｓａｌ（ＰＴＡ−９９８６）、５Ｒｓａｌ（ＰＴＡ−９９８７）、９Ｒｓａｌ（ＰＴＡ−９９８８）、１２Ｒｓｐ（ＰＴＡ−９９８９）および１６Ｒｓｐ（ＰＴＡ−９９９０）を提供し、これらは、ＡＴＣＣに２００９年４月３０日に寄託された。
【００３４】
他の態様では、本発明は、単離されたロドモナス株４Ｒｓａｌ（ＰＴＡ−９９８６）、５Ｒｓａｌ（ＰＴＡ−９９８７）、９Ｒｓａｌ（ＰＴＡ−９９８８）、１２Ｒｓｐ（ＰＴＡ−９９８９）および１６Ｒｓｐ（ＰＴＡ−９９９０）の生物学的に純粋な培養物を提供し、これらは、ＡＴＣＣに２００９年４月３０日に寄託された。
【００３５】
いくつかの態様では、本発明は、本発明に従って製造される微細藻類バイオマス、脂質組成物、および／または、それらの画分を含むキットを提供する。
【００３６】
上述および他の本発明の態様を、本明細書に記載する他の実施態様に関して、より詳細に説明する。本発明は異なる形態でも具体化できることを理解すべきであり、本明細書に記載の実施態様に限定されると解釈すべきではない。むしろ、これらの実施態様は、本開示が徹底的かつ完璧であるように、そして、本発明の範囲を完全に当業者に伝えるように提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
図面の簡単な説明
【図１】図１は、ロドモナス・サリナおよびアンフィジニウム・カルテラエ（Amphidinium carterae）の脂肪酸プロフィールを示す。
【図２】図２は、ロドモナス・サリナのクロロフィルａ濃度（Ａ）および細胞数（Ｂ）に対する光強度の影響を示す。
【図３】図３は、ロドモナス・サリナのクロロフィルａ濃度（Ａ）および細胞数（Ｂ）に対する温度の影響を示す。
【図４】図４は、ロドモナス・サリナの総色素プロフィールに対する光強度（Ａ）および温度（Ｂ）の影響を示す。
【図５】図５は、アンフィジニウム・カルテラエのクロロフィルａ濃度（Ａ）および細胞数（Ｂ）に対する光強度の影響を示す。
【図６】図６は、アンフィジニウム・カルテラエのクロロフィルａ濃度（Ａ）および細胞数（Ｂ）に対する温度の影響を示す。
【図７】図７は、アンフィジニウム・カルテラエの総色素プロフィールに対する光強度（Ａ）および温度（Ｂ）の影響を示す。
【図８】図８は、ロドモナス・サリナおよびアンフィジニウム・カルテラエの細胞毒性試験の結果を示す。
【図９】図９は、２８℃で増殖させたロドモナス・サリナにおける脂肪酸蓄積に対する、培養段階および栄養の影響を示す。
【図１０】図１０は、ロドモナス・サリナおよびアンフィジニウム・カルテラエのＳＤＡ含有量に対する温度の影響を示す。
【００３８】
【図１１】図１１は、ロドモナス・サリナのＳＤＡ含有量に対する光強度の影響を示す。
【図１２】図１２は、抗生物質処理の前（□）および後（■）に培養した株９Ｒｓａｌの脂肪酸（「ＦＡ」）プロフィールを示す。
【図１３】図１３は、定常期に測定した様々なロドモナス株のＦＡプロフィールを示す：（Ａ）特定の多価不飽和ＦＡ；および（Ｂ）不飽和および一不飽和ＦＡの合計。データは、細胞数に標準化していない。
【図１４】図１４は、ロドモナスの株の増殖の特徴を示す。
【図１５】図１５は、ロドモナスの株の不飽和ＦＡ（オメガ−３（Σｎ−３）、オメガ−６（Σｎ−６）、オメガ−９（Σｎ−９））の含有量を示す。
【図１６】図１６は、低（□）および高（■）密度のロドモナス株のＳＤＡ含有量を示す。
【図１７】図１７は、選択されたロドモナス株の不飽和ＦＡ含有量を示す。γ−リノレン酸（ＧＬＡ）およびアラキドン酸（ＡＡ）は、オメガ−６（ｎ−６；ａ／ｋ／ａΣｎ−６またはω−６）ＦＡである；α−リノレン酸（ＡＬＡ）、ステアリドン酸（ＳＤＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）は、オメガ−３（ｎ−３；ａ／ｋ／ａΣｎ−３またはω−３）ＦＡである。
【図１８】図１８は、５００ｍｌフラスコ中、ｈ／２培地中、通常（Ｎ；約３６μＭ）または低（Ｌ；約１８μＭ）リン酸塩の存在下で増殖させた抗生物質で処理した株１２Ｒｓｐの増殖の特徴を示す。矢印は、光強度を最初の７００ｌｕｘ（ｌｘ）から約１０００ｌｕｘ（ｌｘ）へ増加させる手技を示す。
【図１９】図１９は、通常（Ｎ；約３６μＭ）または低（Ｌ；約１８μＭ）リン酸塩の存在下で増殖させた抗生物質で処理した株１２Ｒｓｐの培養物中の、リン酸塩および硝酸塩の培養培地濃度を示す。
【図２０】図２０は、通常（Ｎ；約３６μＭ）または低（Ｌ；約１８μＭ）リン酸塩の存在下で増殖させた培養物中の、時間の関数としてのロドモナス株のＳＤＡ含有量を示す。
【００３９】
【図２１】図２１は、通常（Ｎ；約３６μＭ）または低（Ｌ；約１８μＭ）リン酸塩の存在下で増殖させた培養物における、時間の関数としてのロドモナス株のＥＰＡ含有量を示す。
【図２２】図２２は、通常（Ｎ；約３６μＭ）または低（Ｌ；約１８μＭ）リン酸塩の存在下で増殖させた培養物における、時間の関数としてのロドモナス株のＧＬＡ含有量を示す。
【図２３】図２３は、通常（Ｎ；約３６μＭ）または低（Ｌ；約１８μＭ）リン酸塩の存在下での、培地のリン酸塩濃度に対する、抗生物質で処理した株１２ＲｓｐにおけるＦＡ含有量（Ａ−Ｄ）および細胞数（Ｅ）を示す。また、通常（Ｎ；約３６μＭ）または低（Ｌ；約１８μＭ）リン酸塩の存在下での、培地の硝酸塩濃度に対する細胞数（Ｆ）も示す。細胞密度（破線の曲線）を各パネルに示す。
【図２４】図２４は、通常（Ｎ；約３６μＭ）または低（Ｌ；約１８μＭ）リン酸塩の存在下での、培地のリン酸塩濃度に対する、株４ＲｓａｌにおけるＦＡ含有量（Ａ−Ｄ）および細胞数（Ｅ）を示す。また、通常（Ｎ；約３６μＭ）または低（Ｌ；約１８μＭ）リン酸塩の存在下での、培地の硝酸塩濃度に対する細胞数（Ｆ）も示す。細胞密度（破線の曲線）を各パネルに示す。
【図２５】図２５は、通常（Ｎ；約３６μＭ）または低（Ｌ；約１８μＭ）リン酸塩の存在下での、培地のリン酸塩濃度に対する、株５ＲｓａｌにおけるＦＡ含有量（Ａ−Ｄ）および細胞数（Ｅ）を示す。また、通常（Ｎ；約３６μＭ）または低（Ｌ；約１８μＭ）リン酸塩の存在下での、培地の硝酸塩濃度に対する細胞数（Ｆ）も示す。細胞密度（破線の曲線）を各パネルに示す。
【図２６】図２６は、通常（Ｎ；約３６μＭ）または低（Ｌ；約１８μＭ）リン酸塩の存在下での、培地のリン酸塩濃度に対する、株１６ＲｓｐにおけるＦＡ含有量（Ａ−Ｄ）および細胞数（Ｅ）を示す。また、通常（Ｎ；約３６μＭ）または低（Ｌ；約１８μＭ）リン酸塩の存在下での、培地の硝酸塩濃度に対する細胞数（Ｆ）も示す。細胞密度（破線の曲線）を各パネルに示す。
【図２７】図２７は、通常（Ｎ；約３６μＭ）または低（Ｌ；約１８μＭ）リン酸塩の存在下での、株１２ＲｓｐのＦＡプロフィール（実線の曲線）を示す。細胞密度（破線の曲線）を各パネルに示す。
【図２８】図２８は、通常（Ｎ；約３６μＭ）または低（Ｌ；約１８μＭ）リン酸塩の存在下での、株４ＲｓａｌのＦＡプロフィール（実線の曲線）を示す。細胞密度（破線の曲線）を各パネルに示す。
【図２９】図２９は、通常（Ｎ；約３６μＭ）または低（Ｌ；約１８μＭ）リン酸塩の存在下での、株５ＲｓａｌのＦＡプロフィール（実線の曲線）を示す。細胞密度（破線の曲線）を各パネルに示す。
【００４０】
【図３０】図３０は、通常（Ｎ；約３６μＭ）または低（Ｌ；約１８μＭ）リン酸塩の存在下での、株１６ＲｓｐのＦＡプロフィール（実線の曲線）を示す。細胞密度（破線の曲線）を各パネルに示す。
【図３１】図３１は、株１２ＲｓｐのＦＡプロフィールを、その増殖曲線を介して示す。細胞密度（破線の曲線）を各パネルに示す。フラスコで細胞を培養する間に、ＦＡを評価した：（Ａ）全部；（Ｂ）ＳＤＡおよびＡＬＡ；（Ｃ）ＧＬＡおよびＬＡ；並びに（Ｄ）ＥＰＡおよびＤＨＡ。測定値は、デュプリケートのサンプルの平均である。
【図３２】図３２は、株（Ａ）１２Ｒｓｐおよび（Ｂ）５ＲＳＡＬの培養物において、ＳＤＡ含有量を培養培地および細胞の栄養（リン酸塩および硝酸塩）状態と共に示す。
【図３３】図３３は、５５ｍＭグルコースまたは２ｍＭ酢酸塩の非存在下（対照）または存在下で、９日間増殖させた株１２ＲｓｐのＦＡプロフィールを示す。ＦＡ分析用に、デュプリケートのサンプルを回収した。
【図３４】図３４は、アルミニウムの枠に置いた３０Ｌのガラスのフォトバイオリアクター（ＰＢＲ）（直径３４ｃｍｘ５０ｃｍ；Chem-Flowtronics, NJ）を示す。上に載せた空気圧モーター（見えない）が、テフロンのパドルの動力である。光源は枠の外に位置する。（Ａ）未播種のＰＢＲ；（Ｂ）新しく播種したＰＢＲ（約４.５ｘ１０４細胞／ｍｌ）；および（Ｃ）最高細胞密度（約０.８ｘ１０６細胞／ｍｌ）に近いＰＢＲ。
【図３５】図３５は、培養中の株１２Ｒｓｐの増殖の特徴を示す。リン酸塩（Ａ）および硝酸塩（Ｂ）のリアクターレベルを監視し、矢印で示す通りに加えた（Ｐ、実線；Ｎ、破線）。目標の栄養の範囲（最適の２０％未満）を、影をつけて囲んだ範囲で示す。
【図３６】図３６は、ＰＢＲ中で増殖させた株１２ＲｓｐのＦＡプロフィールを示す：（Ａ）は、未加工の細胞から Bligh および dyer の方法で脂質を抽出したときの株１２ＲｓｐのＦＡプロフィール（全ＦＡの％として）を示し、（Ｂ）は、２つの方法で脂質を抽出したときの株１２ＲｓｐのＦＡプロフィールの比較を示し（ペレット＝ Bligh および Dyer の方法で即座に抽出した１千万個の未加工の細胞；および、フィルター＝ガラス繊維濾紙に捕らえ、Bligh および Dyer の方法で抽出する前に終夜乾燥させた１千万個の細胞）；（Ｃ）は、全ＦＡの％として表現した、Ｂと同じデータを示し；そして、（Ｄ）は、使用した２つの抽出方法からの、全ＦＡの回収量を示す。
【図３７】図３７は、チューブ（●）、フラスコ（○）およびリアクター（▲）で、類似の栄養と入射光の条件下で増殖させた株１２Ｒｓｐの増殖の特徴を示す。細胞密度を、（Ａ）ｌｏｇ細胞／ｍｌまたは（Ｂ）細胞百万個／ｍｌのいずれかで表す。
【図３８】図３８は、クリプト藻類の系統樹におけるロドモナスのクラスターへの株１２Ｒｓｐの割当てを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
詳細な説明
本明細書で使用するとき、語句「治療的有効量」は、治療的または農業的効果であり得る所望の効果を奏するのに十分である化合物または組成物の量を表す。治療的有効量は、化合物または組成物を用いる目的である適用、微生物および／または対象の年齢および健康状態、症状の重篤度、処置期間、併用する処置の性質、使用する医薬的または農学的に許容し得る担体などの要因によって、当業者の知識と専門的見解の範囲内で変動する。個別のケースの適切な「治療的有効量」は、関連する教科書および文献を参照して、かつ／または、日常的な実験方法を使用して、当業者により決定できる（医薬的適用のためには、例えば、Remington, The Science And Practice of Pharmacy (9th Ed. 1995)参照）。
【００４２】
開示されるのは、多価不飽和脂肪酸の新規製造方法、および、微細藻類に由来する多価不飽和脂肪酸の新規組成物である。
【００４３】
一般的に、少なくとも８％の多価不飽和脂肪酸を含む多価不飽和脂肪酸組成物の製造方法は、少なくとも１種の脂肪酸を微細藻類から抽出することを含み、ここで、（ａ）ＧＬＡは、全脂肪酸の０.１％ないし１０％の量であり；（ｂ）ＳＤＡは、全脂肪酸の５％ないし５０％の量であり；（ｃ）ＥＰＡは、全脂肪酸の２％ないし３０％の量であり、そして、（ｄ）ＤＨＡは、全脂肪酸の２％ないし３０％の量であり、ここで、組成物は、少なくとも８％の多価不飽和脂肪酸を含む。
【００４４】
ある実施態様では、微細藻類は、異なる微細藻類の種の混合物であり得る。いくつかの実施態様では、脂肪酸の１種、ＧＬＡ、ＳＤＡ、ＥＰＡまたはＤＨＡは、組成物に含まれない。他の本発明の態様では、多価不飽和脂肪酸組成物は、植物供給源を含むがこれに限定されない他の供給源からの多価不飽和脂肪酸で補充される。多価不飽和脂肪酸の植物供給源には、ルリジサ、カシス、シャゼンムラサキ属および月見草が含まれるが、これらに限定されない。
【００４５】
いくつかの実施態様では、本発明の方法により製造される多価不飽和脂肪酸組成物は、多価不飽和脂肪酸を、５％ないし３５％の範囲の濃度で含み得る。従って、多価不飽和脂肪酸組成物は、多価不飽和脂肪酸を、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％などの濃度で含み得る。他の実施態様では、多価不飽和脂肪酸組成物は、多価不飽和脂肪酸を、５％ないし７％、５％ないし８％、５％ないし１０％、５％ないし１２％、５％ないし１５％、５％ないし２０％、５％ないし２５％、５％ないし３０％、６％ないし８％、６％ないし１０％、６％ないし１２％、６％ないし１５％、６％ないし２０％、６％ないし２５％、６％ないし３５％、７％ないし９％、７％ないし１１％、７％ないし１３％、７％ないし１４％、７％ないし１５％、７％ないし２０％、７％ないし２５％、７％ないし３０％、７％ないし３５％、８％ないし１０％、８％ないし１２％、８％ないし１４％、８％ないし１５％、８％ないし２０％、８％ないし２５％、８％ないし３５％、９％ないし１１％、９％ないし１３％、９％ないし１５％、９％ないし２０％、９％ないし２５％、９％ないし３０％、９％ないし３５％、１０％ないし１２％、１０％ないし１３％、１０％ないし１４％、１０％ないし１５％、１０％ないし２０％、１０％ないし２５％、１０％ないし３０％、１０％ないし３５％、１５％ないし２０％、１５％ないし２５％、１５％ないし３０％、２０％ないし２５％、２０％ないし３０％、２０％ないし３５％、２５％ないし３０％、２５％ないし３５％、３０％ないし３５％などの範囲で含み得る。ある実施態様では、多価不飽和脂肪酸組成物は、多価不飽和脂肪酸を、少なくとも８％の濃度で含む。
【００４６】
他の実施態様では、組成物中に含まれ得るＧＬＡの量は、全脂肪酸の０.１％ないし１０％の範囲にある。従って、ＧＬＡは、組成物中に、全脂肪酸の０.１％、０.２％、０.３％、０.４％、０.５％、０.６％、０.７％、０.８％、０.９％、１.０％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％などの量で含まれ得る。他の実施態様では、ＧＬＡは、組成物中に、全脂肪酸の０.１％ないし１％、１％ないし３％、１％ないし５％、１％ないし７％、１％ないし９％、２％ないし４％、２％ないし６％、２％ないし８％、２％ないし１０％、３％ないし５％、３％ないし７％、３％ないし９％、３％ないし１０％、４％ないし６％、４％ないし８％、４％ないし１０％、５％ないし７％、５％ないし８％、５％ないし９％、５％ないし１０％、６％ないし８％、６％ないし９％、６％ないし１０％、７％ないし９％、７％ないし１０％、８％ないし１０％、９％ないし１０％などの範囲の量で含まれ得る。
【００４７】
いくつかの実施態様では、本発明の組成物中に含まれ得るＳＤＡの量は、全脂肪酸の５％ないし５０％の範囲にある。従って、ＳＤＡは、組成物中に、全脂肪酸の５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％などの量で提供され得る。他の実施態様では、ＳＤＡは、組成物中に、全脂肪酸の５％ないし１０％、５％ないし１５％、５％ないし２０％、５％ないし２５％、５％ないし３０％、５％ないし３５％、５％ないし４０％、５％ないし４５％、５％ないし５０％、１０％ないし１５％、１０％ないし２０％、１０％ないし２５％、１０％ないし３０％、１０％ないし３５％、１０％ないし４０％、１０％ないし４５％、１０％ないし５０％、２０％ないし２５％、２０％ないし３０％、２０％ないし３５％、２０％ないし４０％、２０％ないし４５％、２０％ないし５０％、２５％ないし３０％、２５％ないし３５％、２５％ないし４０％、２５％ないし４５％、２５％ないし５０％、３０％ないし３５％、３０％ないし４０％、３０％ないし４５％、３０％ないし５０％、３５％ないし４０％、３５％ないし４５％、３５％ないし５０％、４０％ないし４５％、４０％ないし５０％、４５％ないし５０％などの範囲の量で含まれ得る。
【００４８】
他の実施態様では、ＥＰＡは、組成物中に、全脂肪酸の２％ないし３０％の範囲で含まれ得る。従って、ＥＰＡは、組成物中に、全脂肪酸の２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％などの量で提供され得る。他の実施態様では、ＥＰＡは、組成物中に、１％ないし５％、１％ないし１０％、１％ないし１５％、１％１５ないし２０％、１％ないし２５％、１％ないし３０％、５％ないし１０％、５％ないし１５％、５％ないし２０％、５％ないし２５％、５％ないし３０％、１０％ないし１５％、１０％ないし２０％、１０％ないし２５％、１０％ないし３０％、１５％ないし２０％、１５％ないし２５％、１５％ないし３０％、２０％ないし２５％、２０％ないし３０％、２５％ないし３０％などの範囲の全脂肪酸中のパーセントの量で含まれ得る。
【００４９】
本発明のいくつかの実施態様では、ＤＨＡは、組成物中に、全脂肪酸の２％ないし３０％の範囲で含まれ得る。従って、ＤＨＡは、組成物中に、全脂肪酸の２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％などの量で提供され得る。他の実施態様では、ＤＨＡは、組成物中に、全脂肪酸の量の１％ないし５％、１％ないし１０％、１％ないし１５％、１％ないし２０％、１％ないし２５％、１％ないし３０％、５％ないし１０％、５％ないし１５％、５％ないし２０％、５％ないし２５％、５％ないし３０％、１０％ないし１５％、１０％ないし２０％、１０％ないし２５％、１０％ないし３０％、１５％ないし２０％、１５％ないし２５％、１５％ないし３０％、２０％ないし２５％、２０％ないし３０％、２５％ないし３０％などの範囲で含まれ得る。
【００５０】
本発明の他の態様は、少なくとも５％のＳＤＡを含む組成物の製造方法を提供し、その方法は、（ａ）微細藻類を培養し、微細藻類バイオマスを産生すること；および、（ｂ）該微細藻類バイオマスから該微細藻類油を抽出すること；または（ｃ）水を該微細藻類バイオマスから除去し、固体含有量約５ないし１００重量％を達成すること、のいずれかを含み；ここで、少なくとも５％ステアリドン酸を含む組成物が製造される。
【００５１】
いくつかの実施態様では、ＳＤＡは、トリグリセリド形態である。他の実施態様では、ＳＤＡはリン脂質形態ではない。
【００５２】
いくつかの実施態様では、ＳＤＡは、２％ないし１０％の範囲の量で組成物中に存在する。従って、ＳＤＡは、組成物中に、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％などの量で存在する。他の実施態様では、ＳＤＡは、組成物中に、２％ないし４％、２％ないし６％、２％ないし８％、２％ないし１０％、３％ないし５％、３％ないし７％、３％ないし９％、３％ないし１０％、４％ないし６％、４％ないし８％、４％ないし１０％、５％ないし７％、５％ないし８％、５％ないし９％、５％ないし１０％、６％ないし８％、６％ないし９％、６％ないし１０％、７％ないし９％、７％ないし１０％、８％ないし１０％、９％ないし１０％などの範囲で含まれ得る。
【００５３】
本発明のさらなる実施態様には、動物飼料添加物の製造方法が含まれる。従って、本発明のある態様は、微細藻類由来の多価不飽和脂肪酸を含む動物飼料添加物の製造方法であって、その方法は、（ａ）微細藻類を培養し、微細藻類バイオマスを産生すること；および、（ｂ）該微細藻類バイオマスから微細藻類油を抽出し、微細藻類油を産生すること；または、（ｃ）水を該微細藻類バイオマスから除去し、固体含有量約５％ないし１００重量％の微細藻類バイオマスを産生すること、のいずれかを含み、ここで、動物飼料添加物は、微細藻類由来の多価不飽和脂肪酸を含む。
【００５４】
いくつかの実施態様では、微細藻類から回収された脂肪酸は、短鎖オメガ−３脂肪酸である。中鎖オメガ−３脂肪酸には、ＳＤＡおよびアルファリノレン酸（ＡＬＡ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００５５】
さらなる実施態様では、微細藻類バイオマスから抽出した微細藻類油を、固体含有量約５％ないし１００重量％の微細藻類バイオマスと組み合わせることができる。
【００５６】
本発明の追加の態様は、少なくとも８％の多価不飽和脂肪酸を含む動物飼料添加物の製造方法を提供し、その方法は、脂肪酸を微細藻類から抽出することを含み、ここで、脂肪酸は、（ａ）ＧＬＡは、全脂肪酸の０.１％ないし１０％の量であり；（ｂ）ＳＤＡは、全脂肪酸の５％ないし５０％の量であり；（ｃ）ＥＰＡは、全脂肪酸の２％ないし３０％の量であり；そして、（ｄ）ＤＨＡは、全脂肪酸の２％ないし３０％の量であることを含み得、ここで、動物飼料添加物は、少なくとも８％の多価不飽和脂肪酸を含む。
【００５７】
いくつかの実施態様では、本発明の方法により製造される動物飼料添加物は、５％ないし３５％の範囲の濃度で多価不飽和脂肪酸を含み得る。従って、動物飼料添加物は、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％などの濃度で多価不飽和脂肪酸を含み得る。他の実施態様では、動物飼料添加物は、５％ないし７％、５％ないし８％、５％ないし１０％、５％ないし１２％、５％ないし１５％、５％ないし２０％、５％ないし２５％、５％ないし３０％、６％ないし８％、６％ないし１０％、６％ないし１２％、６％ないし１５％、６％ないし２０％、６％ないし２５％、６％ないし３５％、７％ないし９％、７％ないし１１％、７％ないし１３％、７％ないし１４％、７％ないし１５％、７％ないし２０％、７％ないし２５％、７％ないし３０％、７％ないし３５％、８％ないし１０％、８％ないし１２％、８％ないし１４％、８％ないし１５％、８％ないし２０％、８％ないし２５％、８％ないし３５％、９％ないし１１％、９％ないし１３％、９％ないし１５％、９％ないし２０％、９％ないし２５％、９％ないし３０％、９％ないし３５％、１０％ないし１２％、１０％ないし１３％、１０％ないし１４％、１０％ないし１５％、１０％ないし２０％、１０％ないし２５％、１０％ないし３０％、１０％ないし３５％、１５％ないし２０％、１５％ないし２５％、１５％ないし３０％、２０％ないし２５％、２０％ないし３０％、２０％ないし３５％、２５％ないし３０％、２５％ないし３５％、３０％ないし３５％などの範囲の濃度で多価不飽和脂肪酸を含み得る。ある実施態様では、動物飼料添加物は、少なくとも８％の濃度で多価不飽和脂肪酸を含む。
【００５８】
さらなる実施態様では、動物飼料添加物に含まれ得るＧＬＡの量は、全脂肪酸の０.１％ないし１０％の範囲にある。従って、ＧＬＡは、動物飼料添加物に、全脂肪酸の０.１％、０.２％、０.３％、０.４％、０.５％、０.６％、０.７％、０.８％、０.９％、１、０％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％などの量で含まれ得る。他の実施態様では、ＧＬＡは、動物飼料添加物に、０.１％ないし１％、１％ないし３％、１％ないし５％、１％ないし７％、１％ないし９％、２％ないし４％、２％ないし６％、２％ないし８％、２％ないし１０％、３％ないし５％、３％ないし７％、３％ないし９％、３％ないし１０％、４％ないし６％、４％ないし８％、４％ないし１０％、５％ないし７％、５％ないし８％、５％ないし９％、５％ないし１０％、６％ないし８％、６％ないし９％、６％ないし１０％、７％ないし９％、７％ないし１０％、８％ないし１０％、９％ないし１０％などの範囲の全脂肪酸中の量で含まれ得る。
【００５９】
またさらなる実施態様では、本発明の動物飼料添加物に含まれるＳＤＡの量は、全脂肪酸の５％ないし５０％の範囲にある。従って、動物飼料添加物は、全脂肪酸の５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％などの量でＳＤＡを含み得る。他の実施態様では、ＳＤＡは、動物飼料添加物中に、全脂肪酸の５％ないし１０％、５％ないし１５％、５％ないし２０％、５％ないし２５％、５％ないし３０％、５％ないし３５％、５％ないし４０％、５％ないし４５％、５％ないし５０％、１０％ないし１５％、１０％ないし２０％、１０％ないし２５％、１０％ないし３０％、１０％ないし３５％、１０％ないし４０％、１０％ないし４５％、１０％ないし５０％、２０％ないし２５％、２０％ないし３０％、２０％ないし３５％、２０％ないし４０％、２０％ないし４５％、２０％ないし５０％、２５％ないし３０％、２５％ないし３５％、２５％ないし４０％、２５％ないし４５％、２５％ないし５０％、３０％ないし３５％、３０％ないし４０％、３０％ないし４５％、３０％ないし５０％、３５％ないし４０％、３５％ないし４５％、３５％ないし５０％、４０％ないし４５％、４０％ないし５０％、４５％ないし５０％などの範囲の量で含まれ得る。
【００６０】
他の実施態様では、ＥＰＡは、全脂肪酸の２％ないし３０％の範囲で動物飼料添加物中に含まれ得る。従って、ＥＰＡは、動物飼料添加物中、全脂肪酸の２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％などの量で提供され得る。他の実施態様では、ＥＰＡは、動物飼料添加物中に、全脂肪酸の１％ないし５％、１％ないし１０％、１％ないし１５％、１％ないし２０％、１％ないし２５％、１％ないし３０％、５％ないし１０％、５％ないし１５％、５％ないし２０％、５％ないし２５％、５％ないし３０％、１０％ないし１５％、１０％ないし２０％、１０％ないし２５％、１０％ないし３０％、１５％ないし２０％、１５％ないし２５％、１５％ないし３０％、２０％ないし２５％、２０％ないし３０％、２５％ないし３０％などの範囲のパーセントの量で含まれ得る。
【００６１】
本発明のいくつかの実施態様では、ＤＨＡは、動物飼料添加物に、全脂肪酸の２％ないし３０％の範囲で含まれ得る。従って、ＤＨＡは、動物飼料添加物中に、全脂肪酸の２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％などの量で提供され得る。他の実施態様では、ＤＨＡは、動物飼料添加物中に、全脂肪酸の１％ないし５％、１％ないし１０％、１％ないし１５％、１％ないし２０％、１％ないし２５％、１％ないし３０％、５％ないし１０％、５％ないし１５％、５％ないし２０％、５％ないし２５％、５％ないし３０％、１０％ないし１５％、１０％ないし２０％、１０％ないし２５％、１０％ないし３０％、１５％ないし２０％、１５％ないし２５％、１５％ないし３０％、２０％ないし２５％、２０％ないし３０％、２５％ないし３０％などの範囲の量で含まれ得る。
【００６２】
本発明のさらなる実施態様は、少なくとも５％のＳＤＡを含む動物飼料添加物の製造方法を提供し、その方法は、（ａ）微細藻類を培養し、微細藻類バイオマスを産生すること；および、（ｂ）該微細藻類バイオマスから該微細藻類油を抽出すること；または、（ｃ）水を該微細藻類バイオマスから除去し、固体含有量約５ないし１００重量％を達成すること、のいずれかを含み、ここで、少なくとも５％のＳＤＡを含む動物飼料添加物が製造される。
【００６３】
いくつかの実施態様では、本発明の方法により製造されるＳＤＡは、組成物中に２％ないし１０％の範囲の量で存在する。従って、ＳＤＡは、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％などの量で組成物中に存在する。他の実施態様では、ＳＤＡは、組成物中に、２％ないし４％、２％ないし６％、２％ないし８％、２％ないし１０％、３％ないし５％、３％ないし７％、３％ないし９％、３％ないし１０％、４％ないし６％、４％ないし８％、４％ないし１０％、５％ないし７％、５％ないし８％、５％ないし９％、５％ないし１０％、６％ないし８％、６％ないし９％、６％ないし１０％、７％ないし９％、７％ないし１０％、８％ないし１０％、９％ないし１０％などの範囲で含まれ得る。
【００６４】
本発明による飼料添加物を他の食品成分と組み合わせ、加工動物飼料製品を製造することができる。そのような他の食品成分には、１種またはそれ以上の酵素サプリメント、ビタミンの食品添加物およびミネラルの食品添加物が含まれる。潜在的に数種類の異なるタイプの化合物を含む、得られる（組み合わせた）飼料添加物を、次いで、適量で穀物および植物タンパク質などの他の食品成分と混合し、加工食品を形成することができる。これらの成分を加工食品に加工することは、現在使用されている加工器具のいずれを使用しても実施できる。本発明の動物飼料添加物は、それ自体で、ビタミン、ミネラル、他の飼料酵素、農業副産物（例えば、コムギの中等品またはトウモロコシグルテン粉）を加えて、または、それらとの組合せで、動物飼料中のサプリメントとして使用され得る。
【００６５】
本発明のさらなる実施態様は、長鎖オメガ−３脂肪酸の組織含有量が増加した動物の産生方法を提供し、その方法は、本明細書に記載の動物飼料添加物を動物に与えることを含む。長鎖オメガ−３脂肪酸の組織含有量の増加は、本発明の動物飼料添加物を与えられていない動物のものに対するものである。
【００６６】
従って、本発明のある態様は、長鎖オメガ−３脂肪酸の組織含有量が増加した動物の産生方法を提供し、その方法は、動物に微細藻類から回収した脂肪酸を含む動物飼料添加物を与えることを含み、動物飼料添加物は、さらに、（ａ）培養された微細藻類バイオマスから抽出された微細藻類油、および／または、（ｂ）培養された微細藻類に由来する微細藻類バイオマス、ここで、水は微細藻類バイオマスから除去され、固体含有量約５ないし１００重量％を達成している、を含み、ここで、長鎖オメガ−３脂肪酸の組織含有量が増加した動物が産生される。
【００６７】
いくつかの実施態様では、長鎖オメガ−３脂肪酸の組織含有量が増加した動物の産生方法が提供され、その方法は、動物に少なくとも８％の多価不飽和脂肪酸を含む動物飼料添加物を与えることを含み、その動物飼料添加物は、微細藻類から抽出された脂肪酸を含み、ここで、脂肪酸は、（ａ）全脂肪酸の０.１％ないし１０％のＧＬＡ；（ｂ）全脂肪酸の５％ないし５０％の量のＳＤＡ；（ｃ）全脂肪酸の２％ないし３０％の量のＥＰＡ；および（ｄ）全脂肪酸の２％ないし３０％の量のＤＨＡであり得；ここで、長鎖オメガ−３脂肪酸の組織含有量が増加した動物が産生される。
【００６８】
他の実施態様では、長鎖オメガ−３脂肪酸の組織含有量が増加した動物の産生方法が提供され、その方法は、動物に少なくとも５％のＳＤＡを含む動物飼料添加物を与えることを含み、動物飼料添加物は、（ａ）培養された微細藻類バイオマスから抽出された微細藻類油、または、（ｂ）培養された微細藻類に由来する微細藻類バイオマス、ここで、水を（ｂ）の微細藻類バイオマスから除去し、固体含有量約５ないし１００重量％を達成する、のいずれかを含む。
【００６９】
本発明の動物には、卵、肉、乳または他の産物がヒトまたは他の動物に消費されるいかなる動物も含まれるが、これらに限定されるものではない。従って、本発明の動物には、魚、家禽（ニワトリ、シチメンチョウ、アヒルなど）、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、肉牛および乳牛が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用するとき、用語「組織含有量」は、筋肉、骨、皮膚、体毛および血液を含むがこれらに限定されない、動物の身体の様々な部位を表す。
【００７０】
本発明は、さらに、対象に治療的有効量の本発明の組成物を投与することによる、それを必要としている対象における哺乳動物の疾患の処置方法を提供する。いくつかの実施態様では、処置される哺乳動物の疾患には、心血管疾患、炎症性疾患および様々な癌性疾患が含まれるが、これらに限定されない。他の実施態様では、処置される心血管疾患には、高トリグリセリド血症、冠動脈心疾患、卒中、急性心筋梗塞およびアテローム性動脈硬化症が含まれるが、これらに限定されない。さらなる実施態様では、処置される炎症性疾患には、喘息、関節炎、アレルギー性鼻炎、乾癬、アトピー性皮膚炎、炎症性腸疾患、クローン病およびアレルギー性鼻結膜炎が含まれるが、これらに限定されない。またさらなる実施態様では、処置される癌性疾患には、前立腺癌、乳癌および大腸癌が含まれるが、これらに限定されない。さらなる実施態様では、処置される哺乳動物の疾患には、精神障害が含まれる。精神障害には、鬱病、双極性障害、統合失調症が含まれるが、これらに限定されない。加えて、本発明の組成物は、認知機能の維持および／または増強のために使用できる。
【００７１】
本発明の他の実施態様は、治療的有効量の、少なくとも８％の微細藻類から抽出した多価不飽和脂肪酸を含む多価不飽和脂肪酸組成物を対象に投与することによる、それを必要としている対象における哺乳動物の疾患の処置方法を提供し、ここで、脂肪酸は、（ａ）全脂肪酸の０.１％ないし１０％の量のＧＬＡ；（ｂ）全脂肪酸の５％ないし５０％の量のＳＤＡ；（ｃ）全脂肪酸の２％ないし３０％の量のＥＰＡ、および、（ｄ）全脂肪酸の２％ないし３０％の量のＤＨＡであり得る。組成物中の多価不飽和脂肪酸、ＧＬＡ、ＳＤＡ、ＥＰＡおよびＤＨＡの量および範囲のさらなる詳細は、組成物の説明において先に記載した通りである。
【００７２】
本発明のさらなる態様は、治療的有効量の、少なくとも５％のＳＤＡを含む組成物を対象に投与することによる、それを必要としている対象における哺乳動物の疾患の処置方法を提供し、その組成物は、（ａ）培養された微細藻類バイオマスから抽出された微細藻類油、または、（ｂ）培養された微細藻類に由来する微細藻類バイオマス、ここで、水を（ｂ）の微細藻類バイオマスから除去し、固体含有量約５ないし１００重量％を達成する、のいずれかを含む。いくつかの他の実施態様では、微細藻類油および微細藻類バイオマスを、５％ＳＤＡを含む組成物と組み合わせることができる。組成物中のＳＤＡの量および範囲のさらなる詳細は、組成物の説明において先に記載した通りである。
【００７３】
本発明に従って処置されるのに適する対象には、鳥類および哺乳動物の対象が含まれるが、これらに限定されない。本発明による例示的な鳥類には、ニワトリ、アヒル、シチメンチョウ、ガチョウ、ウズラ、キジ、走禽類（例えば、ダチョウ）、飼育されている鳥（例えば、オウムおよびカナリヤ）および卵内の鳥が含まれる。本発明の哺乳動物には、イヌ、ネコ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ブタ、齧歯類（例えば、ラットおよびマウス）、ウサギ、霊長類（ヒト以外の霊長類を含む）、ヒトなど、および、子宮内の哺乳動物が含まれるが、これらに限定されない。本発明に従って処置されることを必要としているいかなる哺乳動物対象も適当である。本発明のいくつかの実施態様によると、哺乳動物は、ヒト以外の哺乳動物である。いくつかの実施態様では、哺乳動物はヒト対象である。両性の、そしていかなる発達段階（即ち、新生児、乳児、若年者、青年、成人）の哺乳動物対象も、本発明に従って処置できる。
【００７４】
微細藻類
ＧＬＡ、ＳＤＡ、ＥＰＡおよびＤＨＡから少なくとも１種の多価不飽和脂肪酸を含有する微細藻類油または微細藻類バイオマスを産生できるいかなる微細藻類も、本発明の方法、組成物、栄養補助食品および飼料添加物で使用できる。従って、いくつかの実施態様では、本発明の微細藻類は、渦鞭毛藻綱、クリプト藻綱、トレボウクシア藻綱、ピングイオ藻綱およびこれらの組合せからなる群から選択される。他の実施態様では、本発明の微細藻類は、パリエトクロリス属（Parietochloris）の種、ロドモナス属の種、クリプトモナス属（Cryptomonas）の種、パリエトクロリス属の種、ヘミセブニス属（Hemisebnis）の種；ポルフィリジウム属（Porphyridium）の種、グロッソマスティックス属（Glossomastix）の種およびこれらの組合せからなる群から選択される。さらなる実施態様では、本発明の微細藻類は、パリエトクロリス・インシス（Parietochloris incise）、ロドモナス・サリナ、ヘミセブニス・ブルネセンス（Hemiselmis brunescens）、ポルフィリジウム・クルエンタム（Porphyridium cruentum）およびグロッソマスティックス・チリソプラスタ（Glossomastix chrysoplasta）およびこれらの組合せからなる群から選択される。またさらなる実施態様では、本発明の微細藻類はロドモナス・サリナである。
【００７５】
本発明のいくつかの実施態様では、微細藻類は、異なる微細藻類の種の混合物であり得る。他の実施態様では、微細藻類は、単一の微細藻類の種である。本発明のいくつかの実施態様では、微細藻類の脂肪酸は、微細藻類油として提供される。他の実施態様では、微細藻類の脂肪酸は、微細藻類バイオマスとして提供される。
【００７６】
さらに、本発明の微細藻類には、野生型、変異体（天然または誘導されたもの）または遺伝子改変された微細藻類が含まれるが、これらに限定されない。
【００７７】
加えて、本発明の微細藻類には、野生型の微細藻類の細胞と比較して厚みの少ない細胞壁の細胞を有する微細藻類が含まれ、それにより、厚みの少ない細胞壁が微細藻類の脂質画分の抽出性（extractability）および／またはバイオアベイラビリティーを改善する（例えば、微細藻類の消化の容易さおよび微細藻類バイオマスの細胞からの微細藻類油の抽出の容易さを改善する）。野生型の微細藻類の細胞と比較して厚みの少ない細胞壁の細胞を有する微細藻類は、天然産生であり、変異導入され、かつ／または、遺伝子改変されて、野生型の株と比較して厚みの少ない細胞壁を有するものであり得る。従って、本発明のある実施態様では、微細藻類は、野生型の微細藻類と比較して厚みの少ない細胞壁を有する微細藻類であり、該厚みの少ない細胞壁は、微細藻類脂質画分の抽出性および／またはバイオアベイラビリティーを改善する。
【００７８】
細胞壁の少ない微細藻類の産生方法には、出典明示により全体を本明細書の一部とするＷＯ２００６／１０７７３６Ａｌに見出されるものが含まれる。従って、化学物質または放射線を含むがこれらに限定されない当業者に公知の変異原で、微細藻類を変異誘発できる。特定の実施態様では、化学変異原には、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）、メタンスルホン酸メチル（ＭＭＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロソウレア（ＥＮＵ）、トリエチルメラミン（ＴＥＭ）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソウレア（ＭＮＵ）、プロカルバジン、クロラムブシル、シクロホスファミド、硫酸ジエチル、アクリルアミドモノマー、メルファラン、ナイトロジェンマスタード、ビンクリスチン、ジメチルニトロソアミン、Ｎ−メチル−Ｎ'−ニトロ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、ニトロソグアニジン、２−アミノプリン、７,１２ジメチル−ベンズ（ａ）アントラセン（ＤＭＢＡ）、エチレンオキシド、ヘキサメチルホスホラミド、ブスルファン、ジエポキシアルカン類（ジエポキシオクタン（ＤＥＯ）、ジエポキシブタン（ＢＥＢ）など）、２−メトキシ−６−クロロ−９［３−（エチル−２−クロロ−ｏ−エチルアミノプロピルアミノ］アクリジン二塩酸塩（ＩＣＲ−１７０）、ホルムアルデヒドなどが含まれるが、これらに限定されない。放射線変異誘発の方法には、ｘ線、ガンマ線照射、紫外線などが含まれるが、これらに限定されない。
【００７９】
細胞壁の変異体は、界面活性剤への感受性の増加に基づいて、または、細胞壁の厚みの変化の顕微鏡観察により（ＷＯ２００６／１０７７３６Ａｌ）、または、細胞壁の厚みの減少または細胞壁の完全性の低下を検出すると当分野で知られているいかなる他の方法によっても、選択できる。
【００８０】
本発明の微細藻類は、実施例１で後述する技法に従って培養できる。加えて、本発明の微細藻類は、米国特許第５,２４４,９２１号；米国特許第５,３２４,６５８号；米国特許第５,３３８,６７３号；米国特許第５,４０７,９５７号；Mansour et al., J. Appl. Phycol. 17: 287-300 (2005); および Bigogno et al., Phytochemistry, 60: 497-503 (2002)（これらの開示の全体を出典明示により本明細書の一部とする）に記載された技法を含む、当分野で知られている技法に従って培養できる。
【００８１】
従って、いくつかの実施態様では、１０℃ないし２５℃の範囲の温度で微細藻類を培養する。従って、微細藻類は、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃などの温度で培養できる。他の実施態様では、微細藻類を、１０℃ないし１５℃、１０℃ないし２０℃、１０℃ないし２５℃、１２℃ないし１５℃、１２℃ないし１７℃、１２℃ないし２０℃、１２℃ないし２２℃、１２℃ないし２４℃、１４℃ないし１７℃、１４℃ないし１９℃、１４℃ないし２２℃、１４℃ないし２５℃、１５℃ないし１８℃、１５℃ないし２０℃、１５℃ないし２３℃、１５℃ないし２５℃、１６℃ないし１８℃、１６℃ないし１９℃、１６℃ないし２１℃、１６℃ないし２３℃、１６℃ないし２５℃、１７℃ないし１９℃、１７℃ないし２０℃、１７℃ないし２３℃、１７℃ないし２５℃、１８℃ないし２０℃、１８℃ないし２２℃、１８℃ないし２３℃、１８℃ないし２５℃、１９℃ないし２１℃、１９℃ないし２３℃、１９℃ないし２５℃、２０℃ないし２３℃、２０℃ないし２５℃、２３℃ないし２５℃などの範囲で増殖させ得る。特定の実施態様では、微細藻類を１４℃で増殖させる。他の実施態様では、微細藻類を２２℃で増殖させる。
【００８２】
いくつかの実施態様では、微細藻類を、７５μｍｏｌｍ−２ｓ−１ないし１５０μｍｏｌｍ−２ｓ−１の範囲の光強度で培養する。従って、微細藻類を、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０｝μｍｏｌｍ−２ｓ−１の光強度で増殖させ得る。他の実施態様では、微細藻類を、７５ないし８５μｍｏｌｍ−２ｓ−１、７５ないし９５μｍｏｌｍ−２ｓ−１、７５ないし１０５μｍｏｌｍ−２ｓ−１、７５ないし１１５μｍｏｌｍ−２ｓ−１、７５ないし１２５μｍｏｌｍ−２ｓ−１、７５ないし１３５μｍｏｌｍ−２ｓ−１、７５ないし１５０μｍｏｌｍ−２ｓ−１、８５ないし１００μｍｏｌｍ−２ｓ−１、８５ないし１１５μｍｏｌｍ−２ｓ−１、８５ないし１３０μｍｏｌｍ−２ｓ−１、８５ないし１５０μｍｏｌｍ−２ｓ−１、９５ないし１１５μｍｏｌｍ−２ｓ−１、９５ないし１２５μｍｏｌｍ−２ｓ−１、９５ないし１３５μｍｏｌｍ−２ｓ−１、９５ないし１５０μｍｏｌｍ−２ｓ−１、１００ないし１１５μｍｏｌｍ−２ｓ−１、１００ないし１２５μｍｏｌｍ−２ｓ−１、１００ないし１４０μｍｏｌｍ−２ｓ−１、１００ないし１５０μｍｏｌｍ−２ｓ−１、１１０ないし１２５μｍｏｌｍ−２ｓ−１、１１０ないし１３５μｍｏｌｍ−２ｓ−１、１１０ないし１５０μｍｏｌｍ−２ｓ−１、１２０ないし１３０μｍｏｌｍ−２ｓ−１、１２０ないし１４０μｍｏｌｍ−２ｓ−１、１２０ないし１５０μｍｏｌｍ−２ｓ−１、１３０ないし１４０μｍｏｌｍ−２ｓ−１、１３０ないし１５０μｍｏｌｍ−２ｓ−１、１４０ないし１５０μｍｏｌｍ−２ｓ−１などの範囲の光強度で増殖させ得る。特定の実施態様では、微細藻類を１００μｍｏｌｍ−２ｓ−１の光強度で培養する。
【００８３】
微細藻類を所望の密度に培養した後、当業者に公知であり、遠心分離、綿状沈殿または濾過を含み得る常套の手順を使用して、微細藻類を回収する。次いで、回収した微細藻類細胞または微細藻類バイオマスを、脂肪酸供給源として直接使用するか、または、抽出し、脂肪酸を含む微細藻類油を得ることができる。微細藻類バイオマスを直接使用するいくつかの実施態様では、水を微細藻類バイオマスから除去し、固体含有量約５ないし１００重量％を達成する。追加的実施態様では、直接使用される微細藻類バイオマスは、細胞内の微細藻類油の抽出性および／またはバイオアベイラビリティーを高めるために少なくとも部分的に破壊された細胞壁をさらに含む微細藻類細胞からなる。微細藻類細胞の破壊は、沸騰している水で細胞を処理すること、または、粉砕、微粉砕、超音波処理もしくはフレンチプレスなどの機械的破壊、または、当業者に知られている任意の他の方法を含むがこれらに限定されない常套の技法に従って実施できる。
【００８４】
上記の通り、いくつかの実施態様では、微細藻類バイオマスを直接使用する場合、水を微細藻類バイオマスから除去し、固体含有量約５ないし１００％を達成する。従って、水を微細藻類バイオマスから除去し、固体含有量５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％などを達成する。追加的実施態様では、水を微細藻類バイオマスから除去し、約５％ないし５０％、５％ないし６０％、５％ないし７０％、５％ないし８０％、５％ないし９０％、５％ないし９５％、１０％ないし３０％、１０％ないし４０％、１０％ないし５０％、１０％ないし６０％１０％ないし６５％、１０％ないし７０％、１０％ないし７５％、１０％ないし８０％、１０％ないし８５％、１０％ないし９０％、１０％ないし９５％、１０％ないし１００％、１５％ないし４０％、１５％ないし５０％、１５％ないし６０％、１５％ないし６５％、１５％ないし７０％、１５％ないし７５％、１５％ないし８０％、１５％ないし８５％、１５％ないし９０％、１５％ないし９５％、１５％ないし１００％、２０％ないし５０％、２０％ないし６０％、２０％ないし６５％、２０％ないし７０％、２０％ないし７５％、２０％ないし８０％、２０％ないし８５％、２０％ないし９０％、２０％ないし９５％、２０％ないし１００％、２５％ないし５０％、２５％ないし６０％、２５％ないし７０％、２５％ないし７５％、２５％ないし８０％、２５％ないし８５％、２５％ないし９０％、２５％ないし９５％、２５％ないし１００％、３０％ないし５０％、３０％ないし６０％、３０％ないし７０％、３０％ないし７５％、３０％ないし８０％、３０％ないし８５％、３０％ないし９０％、３０％ないし９５％、４５％ないし１００％、５０％ないし７０％、５０％ないし７５％、５０％ないし８０％、５０％ないし８５％、５０％ないし９０％、５０％ないし９５％、５０％ないし１００％、５５％ないし７５％、５５％ないし８０％、５５％ないし８５％、５５％ないし９０％、５５％ないし９５％、５５％ないし１００％、６０％ないし７５％、６０％ないし８０％、６０％ないし８５％、６０％ないし９０％、６０％ないし９５％、６０％ないし１００％、７０％ないし８０％、７０％ないし８５％、７０％ないし９０％、７０％ないし９５％、７０％ないし１００％、７５％ないし８５％、７５％ないし９０％、７５％ないし９５％、７５％ないし１００％、８０％ないし８５％、８０％ないし９０％、８０％ないし９５％、８０％ないし１００％、８５％ないし９０％、８５％ないし９５％、８５％ないし１００％、９０％ないし９５％、９５％ないし１００％などの範囲の固体含有量を達成する。
【００８５】
いくつかの実施態様では、バイオマスの微細藻類細胞を破壊または溶解し、微細藻類油を抽出することができる。微細藻類細胞を当業者に公知の常套の技法に従って湿式または乾式で抽出し、脂肪酸を含有する複合体を産生できる。微細藻類細胞の破壊または溶解は、沸騰している水で細胞を処理すること、または、粉砕、微粉砕、超音波処理もしくはフレンチプレスなどの機械的破壊、または、当業者に知られている任意の他の方法を含むがこれらに限定されない、常套の技法に従って実施できる。溶解された細胞からの脂肪酸の抽出は、細胞溶解後に固体相から液体相を分離すること、溶媒の添加により液体相の脂肪酸を抽出すること、溶媒を蒸発させること、そして、溶解された細胞の液体相から得られる多価不飽和脂肪酸を回収することを含むがこれらに限定されない、微細藻類および他の生物で使用される、当業者に公知の標準的な手順に従う。また、Bligh and Dyer, Can. J. Biochem. Physiol. 37:911-917 (1959)；米国特許第５,３９７,５９１号；米国特許第５,３３８,６７３号および米国特許第５,５６７,７３２号（ここでの開示の全体を、出典明示により本明細書の一部とする）も参照。
【００８６】
抽出に使用できる溶媒には、ヘキサン、クロロホルム、エタノール、メタノール、イソプロパノール、ジエチルエーテル、ジオキサン、イソプロピルエーテル、ジクロロメタン、テトラヒドロフランおよびこれらの組合せが含まれるがこれらに限定されない。さらなる実施態様では、ＣＯ２またはＮＯなどの溶媒で超臨界流体抽出法を使用して、微細藻類細胞を抽出できる。超臨界抽出法を使用する抽出技法は、当業者に公知であり、McHugh et al. Supercritical Fluid Extraction, Butterworth, 1986（出典明示により全体を本明細書の一部とする）に記載されている。
【００８７】
本発明の方法、組成物、食品、栄養補助食品、飼料添加物などでは、多価不飽和脂肪酸は、遊離脂肪酸、コレステロールエステル、塩エステル、脂肪酸エステル、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、ジアシルグリセロール、モノグリセロール、スフィンゴリン脂質、スフィンゴ糖脂質、またはこれらの組合せの形態で提供され得る。本発明のいくつかの実施態様では、脂肪酸は、トリグリセリドの形態で提供される。他の実施態様では、脂肪酸は、リン脂質の形態で提供されない（例えば、非リン脂質形態で提供される）。
【００８８】
本発明のＧＬＡは、植物を含むがこれに限定されない他の供給源から得られた追加的ＧＬＡで補充され得る。従って、本発明のＧＬＡは、ルリジサ、カシス、シャゼンムラサキ属および月見草を含むがこれらに限定されない植物供給源から得られたＧＬＡで補充され得る。特定の実施態様では、補充のＧＬＡは、ルリジサまたはルリジサ油由来である。いくつかの実施態様では、微細藻類のＧＬＡは、微細藻類供給源に由来するさらなるＧＬＡで補充される。他の実施態様では、本発明のＧＬＡは補充されない。
【００８９】
微細藻類バイオマスの製造方法
他の態様では、本発明は、１種またはそれ以上のＰＵＦＡを含む微細藻類バイオマスの製造方法を提供する。その方法は、１種またはそれ以上のＰＵＦＡを含む微細藻類バイオマスを提供するのに十分な培養条件下で微細藻類を培養することを含み、ここで、微細藻類バイオマスを、微細藻類の対数増殖期に回収する。
【００９０】
一般的に、微細藻類バイオマスは微細藻類を含む。いくつかの実施態様では、バイオマスは、例えば、酵母、細菌、ウイルスなどの混入微生物を殆どまたは全く含まない。いくつかの実施態様では、微細藻類バイオマスは、少なくとも約５０％、例えば、少なくとも約５０、６０、７０、８０、９０、９５、９８、９９、９９.５および１００％の微細藻類の純度である。他の実施態様では、微細藻類バイオマスは、単一の微細藻類の株を含む。
【００９１】
いくつかの実施態様では、微細藻類は、ロドモナス属の一員である。ロドモナス属に属する種の例には、ロドモナス・サリナ、ロドモナス・アブレビアート（abbreviate）、ロドモナス・アストロセア（astrosea）、ロドモナス・バルチカ（baltica）、ロドモナス・クリソイデア（chrysoidea）、ロドモナス・デュプレックス（duplex）、ロドモナス・ファルカテ（falcate）、ロドモナス・レンス（lens）、ロドモナス・マクラテ（maculate）、ロドモナス・マリアナ（mariana）およびロドモナス・オバリス（ovalis）が含まれるが、これらに限定されない。
【００９２】
いくつかの実施態様では、微細藻類は、ロドモナスの種または株の遺伝子改変された変異体である。
本明細書で使用するとき、用語「遺伝子改変された変異体」は、所望の結果が達成されるように、その通常（例えば、野生型、天然産生）の形態から改変された（例えば、変異導入された、変更された）ゲノムを有する株を表すと意図する。例えば、微細藻類の種または株の遺伝子改変された変異体には、変更が微細藻類内に所望の効果を提供するように、核酸分子（例えば、脂肪酸シンターゼ、デサチュラーゼ、エロンガーゼ）が挿入、欠失、かつ／または改変された微細藻類の種または株が含まれ得る。また、例えば、所望の結果が達成されるように、微細藻類の種または株を、核酸分子が変更される条件および／または変異原に付すことにより（例えば、タンパク質コード領域または非コード領域内の１またはそれ以上の突然変異）、種または株の核酸分子を変更できる。
【００９３】
ある実施態様では、微細藻類はロドモナス・サリナである。
他の実施態様では、微細藻類は、Provasoli-Guillard National Center for Culture of Marine Phytoplankton (CCMP) (West Boothbay Harbor, ME) に寄託された株であり、株番号は、ＣＣＭＰ２７２、ＣＣＭＰ２７３、ＣＣＭＰ２７５、ＣＣＭＰ３１８、ＣＣＭＰ３２２、ＣＣＭＰ３２３、ＣＣＭＰ３２４、ＣＣＭＰ７３９、ＣＣＭＰ７４０、ＣＣＭＰ７４１、ＣＣＭＰ７４２、ＣＣＭＰ７４３、ＣＣＭＰ７４４、ＣＣＭＰ７４６、ＣＣＭＰ７４７、ＣＣＭＰ７４８、ＣＣＭＰ７４９、ＣＣＭＰ７５０、ＣＣＭＰ７５１、ＣＣＭＰ７５２、ＣＣＭＰ７５３、ＣＣＭＰ７５４、ＣＣＭＰ７５５、ＣＣＭＰ７５６、ＣＣＭＰ７５７、ＣＣＭＰ７５８、ＣＣＭＰ７５９、ＣＣＭＰ７６０、ＣＣＭＰ７６１、ＣＣＭＰ７６２、ＣＣＭＰ７６３、ＣＣＭＰ７６６、ＣＣＭＰ７６７、ＣＣＭＰ７６８、ＣＣＭＰ１１７０、ＣＣＭＰ１１７１、ＣＣＭＰ１１７８、ＣＣＭＰ１３１９、ＣＣＭＰ１４１９、ＣＣＭＰ１４２０、ＣＣＭＰ１５３３、ＣＣＭＰ１７４９、ＣＣＭＰ２００５およびＣＣＭＰ２０４５からなる群から選択される。いくつかの実施態様では、寄託された微細藻類に由来する株が本発明により提供される。
【００９４】
ある実施態様では、微細藻類は、Provasoli-Guillard National Center for Culture of Marine Phytoplankton (CCMP) (West Boothbay Harbor, ME)に寄託された株の遺伝子改変された変異体であり、株番号は、ＣＣＭＰ２７２、ＣＣＭＰ２７３、ＣＣＭＰ２７５、ＣＣＭＰ３１８、ＣＣＭＰ３２２、ＣＣＭＰ３２３、ＣＣＭＰ３２４、ＣＣＭＰ７３９、ＣＣＭＰ７４０、ＣＣＭＰ７４１、ＣＣＭＰ７４２、ＣＣＭＰ７４３、ＣＣＭＰ７４４、ＣＣＭＰ７４６、ＣＣＭＰ７４７、ＣＣＭＰ７４８、ＣＣＭＰ７４９、ＣＣＭＰ７５０、ＣＣＭＰ７５１、ＣＣＭＰ７５２、ＣＣＭＰ７５３、ＣＣＭＰ７５４、ＣＣＭＰ７５５、ＣＣＭＰ７５６、ＣＣＭＰ７５７、ＣＣＭＰ７５８、ＣＣＭＰ７５９、ＣＣＭＰ７６０、ＣＣＭＰ７６１、ＣＣＭＰ７６２、ＣＣＭＰ７６３、ＣＣＭＰ７６６、ＣＣＭＰ７６７、ＣＣＭＰ７６８、ＣＣＭＰ１１７０、ＣＣＭＰ１１７１、ＣＣＭＰ１１７８、ＣＣＭＰ１３１９、ＣＣＭＰ１４１９、ＣＣＭＰ１４２０、ＣＣＭＰ１５３３、ＣＣＭＰ１７４９、ＣＣＭＰ２００５およびＣＣＭＰ２０４５からなる群から選択される。
【００９５】
他の実施態様では、微細藻類は、株番号１２Ｒｓｐで寄託された株またはその遺伝子改変された変異体である。
以下の識別子：４Ｒｓａｌ、５Ｒｓａｌ、９Ｒｓａｌ、１２Ｒｓｐおよび１６Ｒｓｐを有する単離された微細藻類の株は、各々、the American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard Manassas, VA, 20110 に２００９年４月３０日に寄託され、以下の受託番号を割り当てられた：ＰＴＡ−９９８６；ＰＴＡ−９９８７；ＰＴＡ−９９８８；ＰＴＡ９９８９；およびＰＴＡ−９９９０。
ある実施態様では、微細藻類は、ＡＴＣＣ株番号ＰＴＡ−９９８９で寄託された１２Ｒｓｐ株またはその遺伝子改変された変異体である。
他の実施態様では、微細藻類は、配列番号１または配列番号２を含む小サブユニットリボソームＲＮＡ（ＳＳＵｒＲＮＡ）の遺伝子配列を有する。
【００９６】
ある実施態様では、１種またはそれ以上のＰＵＦＡは、オメガ−３、オメガ−６脂肪酸、または両方である。
他の実施態様では、オメガ−３脂肪酸は、Ｃ１６：３（ｎ−３）、Ｃ１８：３（ｎ−３）、Ｃ１８：４（ｎ−３）、Ｃ２０：３（ｎ−３）、Ｃ２０：４（ｎ−３）、Ｃ２０：５（ｎ−３）、Ｃ２２：５（ｎ−３）、Ｃ２２：６（ｎ−３）、Ｃ２４：５（ｎ−３）およびＣ２４：６（ｎ−３）からなる群から選択され、ここで、番号を伴う文字「Ｃ」は、炭化水素鎖の炭素数を示し、コロンおよび二重結合の数を表す数字が続き、ここで、（ｎ−３）は「オメガ−３」を示す。
【００９７】
いくつかの実施態様では、１種またはそれ以上のＰＵＦＡは、α−リノレン酸（ＡＬＡ）、ステアリドン酸（ＳＤＡ）、エイコサトリエン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）、クルパノドン酸、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、テトラコサペンタエン酸およびテトラコサヘキサエン酸からなる群から選択されるオメガ−３−脂肪酸である。他の実施態様では、オメガ−３−脂肪酸は、α−リノレン酸（ＡＬＡ）、ステアリドン酸（ＳＤＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）およびドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）からなる群から選択されるオメガ−３−脂肪酸である。
ある実施態様では、オメガ−３−脂肪酸はステアリドン酸（ＳＤＡ）である。
【００９８】
本明細書で使用するとき、用語「対数増殖期」は、微細藻類細胞の数が指数関数的に増加することを特徴とする培養段階を表す。一般的に、培養系では、播種の後に、誘導期、指数関数または「対数増殖期」、負の増殖加速期およびプラトーまたは「定常期」を含む特徴的な増殖パターンがある。例えば、対数増殖期には、微細藻類の増殖が続くにつれ、細胞は細胞分裂の最大速度に達し得、細胞数は時間に対して対数の関係で増加する。対数期の開始後の時間内に、細胞分裂の速度は低下し始め得、細胞のいくつかは死に始め得る。これは、曲線のゆるやかな平坦化により、増殖曲線に反映され得る。最終的に、細胞の死亡速度が本質的に細胞分裂と同等になり、すべての生きている個体数はしばらくの間同じままであり得る。これは、定常期またはプラトー期として知られており、増殖曲線では、傾きがゼロに近づく曲線の平坦化として表される。
【００９９】
いくつかの実施態様では、培養条件は、微細藻類が１種またはそれ以上のＰＵＦＡ（例えば、オメガ−３脂肪酸）および／または他の脂質産物を産生するのに十分なものである。培養条件は、微細藻類の増殖に適し、それによりＰＵＦＡを含む微細藻類バイオマスを提供する培養培地を含む。そのような培養培地は、炭素、窒素（例えば、硝酸塩）およびリン（例えば、リン酸塩）供給源を含む水性培地（例えば、海水）であり得る。培地は、塩、ビタミン、ミネラル、金属および他の栄養分も含み得る。好ましくは、培養条件は、適量の光と温度を微細藻類に提供するのに十分なものである。
【０１００】
いくつかの実施態様では、培養段階は、ＰＵＦＡ、好ましくは少なくとも１種のオメガ−３脂肪酸の量を増やすために、適当な時間にわたって栄養分（例えば、窒素、リン）を制限することをさらに含む。例えば、培養物を無リンまたは無窒素（またはこれらが少ない培地）に移すことができ、かつ／または、増殖培地の最初の窒素含有量を、後に、例えば指数増殖期の後の方で、窒素が枯渇するように提供することができる。ある実施態様では、培養培地の炭素の窒素に対する比は、高くてもよい。
【０１０１】
他の実施態様では、培養培地は、誘導期に第１のリン濃度を、そして、回収時の対数増殖期に第２のリン濃度を含み、ここで、第２のリン濃度は、第１のリン濃度の約２０％以下である。
他の実施態様では、第２のリン濃度は、第１のリン濃度の約２０％より高くてもよく、例えば、第１のリン濃度の約２０ないし約９０％、約２５ないし約８０％、約３０ないし約７０％および約４０ないし約５０％であり得る。
ある実施態様では、リンの供給源は、リン酸塩（例えば、リン酸ナトリウム）を含む。
【０１０２】
他の実施態様では、培養培地は、誘導期に第１の窒素濃度を、そして、回収時の対数増殖期に第２の窒素濃度を含み、ここで、第２の窒素濃度は、第１の窒素濃度の約２０％以下である。
他の実施態様では、第２の窒素濃度は、第１の窒素濃度の約２０％より高くてもよく、例えば、第１の窒素の濃度の約２０ないし約９０％、約２５ないし約８０％、約３０ないし約７０％および約４０ないし約５０％であり得る。
ある実施態様では、窒素の供給源は、硝酸塩（例えば、硝酸ナトリウム）を含む。いくつかの実施態様では、窒素の供給源は、アンモニウム（例えば、塩化アンモニウム）を含む。
【０１０３】
他の実施態様では、培養条件は、微細藻類が１種またはそれ以上のＰＵＦＡを産生するのに十分なものであり、１種またはそれ以上のＰＵＦＡはオメガ−３−脂肪酸を含み、オメガ−３−脂肪酸はＳＤＡであり、回収時の対数期のＳＤＡの量は、微細藻類の全脂肪酸含有量の少なくとも約５％、例えば、微細藻類の全脂肪酸含有量の約５ないし約５０％、約１５ないし約４０％および約２０ないし約３０％である。他の実施態様では、オメガ−３−脂肪酸はＳＤＡおよびＡＬＡであり、培養条件は、回収時の対数期のＳＤＡおよびＡＬＡの各々の量が、微細藻類の全脂肪酸含有量の少なくとも約５％、例えば、微細藻類の全脂肪酸含有量の約５ないし約５０％、約１５ないし約４０％および約２０ないし約３０％であるのに十分なものである。
【０１０４】
いくつかの実施態様では、培養条件は、対数期のオメガ−６−脂肪酸が、微細藻類の全脂肪酸含有量の約５０％未満、例えば、微細藻類の全脂肪酸含有量の約５０、４５、４０、３５、３０、３５、２５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、０.５および０.１％未満であるのに十分なものである。
【０１０５】
微細藻類の培養は、微細藻類を培養して微細藻類バイオマスを提供するのに適する常套のバイオリアクター中で実施できる。例えば、微細藻類は、回分、流加、細胞再利用および連続発酵を含むがこれらに限定されない発酵方法により培養できる。ある実施態様では、微細藻類をフォトバイオリアクターまたは池で培養する。他の実施態様では、培養は、フラットパネルまたは管状リアクター設計を使用して実施する。
【０１０６】
微細藻類細胞を培養培地から回収するために、様々な方法を使用できる。ある実施態様では、回収は、分離により、例えば、濾過（例えば、ベルト濾過、回転円筒型濾過）および／または遠心分離により、微細藻類バイオマスを培養培地から回収することを含む。所望により、回収した微細藻類細胞を、次いで洗浄、凍結、凍結乾燥、スプレー乾燥でき、かつ／または、Ｏ２の存在を低減または排除するために、非酸化雰囲気のガス（例えば、ＣＯ２、Ｎ２）下で保存できる。場合により、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノン（ＴＢＨＱ）、エトキシキン、ベータ−カロチン、ビタミンＥおよびビタミンＣを含むがこれらに限定されない合成および／または天然の抗酸化剤も、回収した細胞に添加できる。提供される抗酸化剤の量および／またはタイプは、所望の製品の設計、包装方法および／または所望の貯蔵期間によって決まり得る。
【０１０７】
また他の実施態様では、本発明は、１種またはそれ以上のＰＵＦＡを含む微細藻類バイオマスの製造方法を提供し、その方法は、１種またはそれ以上のＰＵＦＡを含む微細藻類バイオマスを提供するのに十分な培養条件下で微細藻類を培養することを含み、ここで、微細藻類の負の増殖加速期または定常期で微細藻類バイオマスを回収する。
【０１０８】
ある実施態様では、微細藻類は、株番号ＣＣＭＰ７５７で寄託された株またはその遺伝子改変された変異体である。
他の実施態様では、微細藻類は、ＡＴＣＣ株番号ＰＴＡ−９９８９で寄託された１２Ｒｓｐ株またはその遺伝子改変された変異体である。
また他の実施態様では、微細藻類は、配列番号１または配列番号２のものを含む小サブユニットリボソームＲＮＡ（ＳＳＵ ｒＲＮＡ）の遺伝子配列を有する。
【０１０９】
微細藻類バイオマス
他の態様では、本発明は、微細藻類バイオマスおよび／またはその画分および／または抽出物を提供する。
ある実施態様では、微細藻類バイオマスは、全脂肪酸の重量で少なくとも５％をオメガ−３脂肪酸として、例えば、全脂肪酸の重量で約５ないし約１００％、約７０ないし約９０％および約７０ないし約７５％をオメガ−３脂肪酸として有する脂質を含む。
【０１１０】
他の実施態様では、微細藻類バイオマスは、全脂肪酸の重量で少なくとも１０％、例えば、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９および１００％をオメガ−３およびオメガ−６脂肪酸として有する脂質を含む。
【０１１１】
いくつかの実施態様では、微細藻類バイオマスは、バイオマスの乾燥重量で少なくとも１％、例えば、バイオマスの乾燥重量で約１％ないし約５０％、約１２％ないし約４０％、約１４％ないし約３０％、約１６％ないし約２０％のオメガ−３脂肪酸含有量を含む。
【０１１２】
ある実施態様では、微細藻類バイオマスを本発明の方法に従って製造する。例えば、いくつかの実施態様では、微細藻類バイオマスを、微細藻類バイオマスを提供するのに十分な培養条件下で微細藻類を培養し、ここで、バイオマスは１種またはそれ以上のＰＵＦＡを含み、微細藻類バイオマスを、微細藻類の対数増殖期で回収することを含む方法により製造する。他の実施態様では、微細藻類の負の増殖加速期または定常期に微細藻類バイオマスを回収する。
【０１１３】
脂質組成物の製造方法
他の態様では、本発明は、１種またはそれ以上のＰＵＦＡを含む脂質組成物の製造方法を提供する。その方法は、微細藻類バイオマスを提供するのに十分な培養条件下で培養した微細藻類バイオマスから脂質組成物を得、ここで、バイオマスは１種またはそれ以上のＰＵＦＡを含み、微細藻類バイオマスを、微細藻類の対数増殖期で回収することを含む方法により製造する。他の実施態様では、微細藻類の負の増殖加速期または定常期に微細藻類バイオマスを回収する。
【０１１４】
バイオマスから脂質組成物を得る方法には、抽出、加熱、圧力、鹸化、超音波処理、凍結、粉砕、イオン交換、クロマトグラフィー、膜分離、電気透析、逆浸透、蒸留、化学的誘導体化、結晶化などが含まれるが、これらに限定されない。
【０１１５】
例えば、１種またはそれ以上のＰＵＦＡ（例えば、オメガ−３脂肪酸）を含む細胞の脂質を、微細藻類細胞から、エタノール、酢酸エチル、イソプロピルアルコール、メタノール、酢酸エチル、ヘキサン、塩化メチレン、メタノール、クロロホルムなどを含むがこれらに限定されない溶媒による抽出、または、加圧液体炭化水素、例えばブタン、ペンタン、プロパンまたはその他（共溶媒を含むか、または含まない）により、または、超臨界流体抽出（共溶媒を含むか、または含まない）を含むがこれらに限定されない任意の適する方法により抽出できる。場合により、抽出した油を減圧下で蒸発させ、溶媒を低減または除去し、かつ／または、濃縮された脂質物質のサンプルを産生することができる。
【０１１６】
他の実施態様では、例えば植物油または他の食用油中に、細胞を破壊または溶解し、脂質組成物を得ることができる。
抽出した油を、精製（例えば、化学的精製、物理的精製）に付すことができる。精製方法は、いくらかまたは全ての不純物を、抽出した油から除去できる。精製方法は、１つまたはそれ以上の、抽出した油の脱ガム、漂白、濾過、脱臭および／または研磨の方法を含み得る。
【０１１７】
他の実施態様では、抽出した脂質組成物に含まれる１種またはそれ以上のＰＵＦＡを、脂質を加水分解し、ＰＵＦＡ画分、好ましくはＳＤＡを含むＰＵＦＡ画分を濃縮することにより、例えば、尿素付加（urea adduction）、分留、カラムクロマトグラフィー、および／または、超臨界流体分画などの方法を用いて、濃縮できる。
【０１１８】
従って、ある実施態様では、脂質組成物をバイオマスから得る段階は、脂質組成物をバイオマスから抽出することを含む。他の実施態様では、抽出段階は、バイオマスを極性溶媒と接触させることを含む。
【０１１９】
例えば、多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）および／またはＰＵＦＡを含む分子を抽出するが、溶媒に不溶の化合物は抽出しないのに十分な抽出条件下で溶媒を使用して、油を微細藻類バイオマスから抽出し、脂質組成物を提供することができる。ある実施態様では、脂質組成物を微細藻類バイオマスから抽出し、細胞の残骸および／または沈殿した不溶性化合物を、ＰＵＦＡおよび溶媒を含むミセラ（miscella）から分離する。他の実施態様では、この方法は、さらに、細胞の残骸および沈殿した化合物を、濾過、遠心分離および／またはこれらの組合せなどの分離方法を使用して分離することを含む。
【０１２０】
いくつかの実施態様では、溶媒は極性溶媒である。極性溶媒の例には、エタノール、酢酸エチル、イソプロピルアルコール、メタノール、酢酸エチルおよびこれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。ある実施態様では、極性溶媒はエタノールである。
【０１２１】
脂質組成物の溶媒による抽出は、様々な方法で実施できる。例えば、抽出は、回分方法、連続方法、連続向流方法であり得る。連続向流方法では、溶媒の微細藻類との接触が油を溶媒に浸出させ、段々と濃縮されたミセラ（即ち、溶媒−油）を提供し、一方、溶媒−固体を、低下する濃度のミセラと接触させる。抽出に続き、当分野で公知の方法を使用して、溶媒をミセラから除去できる。例えば、蒸留、回転蒸発、または、上昇薄膜蒸発器および蒸気ストリッパーまたは任意の適する脱溶媒器を、溶媒の除去に使用できる。
【０１２２】
ある実施態様では、この方法は、抽出した脂質（即ち、脂質組成物）を、吸収方法（例えば、漂白）に付し、例えば、存在し得る色素体および／またはホスファチドなどの１種またはそれ以上の望まれない化合物を除去することをさらに含む。例えば、吸収方法は、脂質組成物を漂白物質（例えば、中性の土（自然粘土またはフラー土とも呼ばれる）、酸で活性化した土、活性炭、活性化した粘土、珪酸塩、および／または、これらの組合せ）および濾過助剤などと接触させることを含む、漂白方法であり得る。
【０１２３】
いくつかの実施態様では、使用する漂白物質の総量は、少なくとも約０.５重量％、例えば、約０.１ないし約３重量％；約０.３重量％ないし約２.５重量％；および約０.５ないし約１.５重量％である。ある実施態様では、約０.５％ずつ（重量で）の漂白粘土、活性炭および濾過助剤を漂白物質として使用する。
【０１２４】
ある実施態様では、この方法は、抽出した脂質を脱ガム段階に付すことをさらに含む。脱ガム方法は当分野で知られており、例えば、水による脱ガム、酸による脱ガム、酵素的脱ガムおよび膜による脱ガムを含む。
【０１２５】
いくつかの実施態様では、脂質組成物を、好ましくは吸収方法に続いて、脱ガムに付し、脱ガムの段階は、脂質組成物を、脂質組成物中に存在し得るガムおよび／またはクロロフィル型の化合物を沈殿させるのに有効な量の水性の酸の混合物と接触させることを含む。
【０１２６】
ある実施態様では、水性の酸の混合物は、硫酸およびリン酸を含む。他の実施態様では、等量の水性の酸を、脂質組成物と混合する。好ましくは、酸は、適する割合であり、そして、油と混合したときに、酸性のｐＨ、例えば、ｐＨ約１.５ないし約５を提供するのに十分な量である。ｐＨを監視および制御するのに、ｐＨプローブまたは他の適する方法を使用できる。
酸の混合後に形成される沈殿を、例えば、遠心分離および／または濾過（例えば、膜濾過）を使用して、脂質組成物から除去できる。
【０１２７】
いくつかの実施態様では、脱ガムした脂質組成物を、組成物の水分含有量を低下させるのに十分な時間、温度および／または真空条件で、乾燥に付すことができる。いくつかの実施態様では、乾燥させた脂質組成物の水分含有量は、約１０重量％より少なく、例えば、１０、５、１、０.９、０.８、０.７、０.６、０.５、０.４、０.３、０.２、０.１、０.０５および０.０１重量％より少ない。
【０１２８】
脂質組成物
他の態様では、本発明は、微細藻類バイオマスから製造された脂質組成物を提供し、ここで、脂質組成物は、バイオマスの微細藻類により産生された１種またはそれ以上のＰＵＦＡを含む。いくつかの実施態様では、脂質組成物を、本発明の方法に従って製造する。
【０１２９】
ある実施態様では、微細藻類はロドモナスである。他の実施態様では、微細藻類はロドモナス・サリナまたはその遺伝子改変された誘導体である。いくつかの実施態様では、微細藻類は、株番号１２Ｒｓｐで寄託された株またはその遺伝子改変された誘導体である。他の実施態様では、微細藻類は、ＡＴＣＣ株番号ＰＴＡ−９９８９で寄託された株またはその遺伝子改変された変異体である。
【０１３０】
いくつかの実施態様では、脂質組成物は、ＳＤＡを、脂質組成物の全脂肪酸含有量の少なくとも約５％の総ＳＤＡ量で、例えば、脂質組成物の全脂肪酸含有量の約５ないし約５０％、約１０ないし約４０％および約２０ないし約３０％で含み、ここで、ＳＤＡは微細藻類により産生されるものである。他の実施態様では、脂質組成物の総ＳＤＡ量は、脂質組成物の全脂肪酸含有量の約１５ないし約３０％である。
【０１３１】
他の実施態様では、脂質組成物に含まれるＧＬＡおよびＡＡの各々の総量は、脂質組成物の全脂肪酸含有量の約１０％未満、例えば、脂質組成物の全脂肪酸含有量の約１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、０.５および０.１％未満であり、ここで、ＧＬＡおよびＡＡは、存在するならば、それぞれ微細藻類により産生されるものである。
【０１３２】
ある実施態様では、脂質組成物は、脂質組成物の全脂肪酸含有量の少なくとも約５％の総ＡＬＡ量で、例えば、脂質組成物の全脂肪酸含有量の約５ないし約５０％、約１０ないし約４０％および約２０ないし約３０％で、ＡＬＡをさらに含み、ここで、ＡＬＡは微細藻類により産生されるものである。他の実施態様では、脂質組成物の総ＡＬＡ量は、脂質組成物の全脂肪酸含有量の約１５ないし約３０％である。
【０１３３】
いくつかの実施態様では、脂質組成物は、脂質組成物の全脂肪酸含有量の少なくとも約１％の総ＥＰＡ量で、例えば、脂質組成物の全脂肪酸含有量の約１ないし約５０％、約１０ないし約４０％および約２０ないし約３０％でＥＰＡをさらに含み、ここで、ＥＰＡは、微細藻類により産生されるものである。他の実施態様では、脂質組成物の総ＥＰＡ量は、脂質組成物の全脂肪酸含有量の約５ないし約１５％である。
【０１３４】
ある実施態様では、脂質組成物は、脂質組成物の全脂肪酸含有量の少なくとも約１％の総ＤＨＡ量で、例えば、脂質組成物の全脂肪酸含有量の約１ないし約５０％、約１０ないし約４０％および約２０ないし約３０％でＤＨＡをさらに含み、ここで、ＤＨＡは微細藻類により産生されるものである。他の実施態様では、脂質組成物の総ＤＨＡ量は、脂質組成物の全脂肪酸含有量の約５ないし約１５％である。
【０１３５】
他の実施態様では、脂質組成物の総ＳＤＡ量は、脂質組成物の全脂肪酸含有量の約１５ないし約３０％である。
【０１３６】
ある実施態様では、脂質組成物はＡＬＡ、ＥＰＡおよびＤＨＡをさらに含み、ここで、脂質組成物の総ＡＬＡ量は、脂質組成物の全脂肪酸含有量の約１５ないし約３０％であり、脂質組成物の総ＥＰＡ量は、脂質組成物の全脂肪酸含有量の約５ないし約１５％であり、脂質組成物の総ＤＨＡ量は、脂質組成物の全脂肪酸含有量の約５ないし約１５％であり、脂質組成物に含まれるＧＬＡおよびＡＡの各々の総量は、脂質組成物の全脂肪酸含有量の約１０％未満である。
【０１３７】
多価不飽和脂肪酸組成物、食品および動物飼料添加物
他の態様では、細胞全体の微細藻類バイオマス、その画分および／または抽出物を、消費のために、または食品添加物として使用し、ＰＵＦＡ含有量および食品の栄養価を高めることができる。
【０１３８】
例えば、いくつかの実施態様では、動物飼料（例えば、ウシ飼料、酪農飼料、水産飼料、家禽飼料）として使用するとき、微細藻類により産生される１種またはそれ以上のＰＵＦＡを、家畜、家禽、ウシおよび魚を含むがこれらに限定されない動物の肉または他の産物に組み込むことができる。ＰＵＦＡは、また、医薬または栄養の目的で、そして工業的応用に使用できる。
【０１３９】
１種またはそれ以上のＰＵＦＡを、特定の適用または使用に適する様々な形態／組成物のいずれでも提供できる。従って、例えば、いくつかの実施態様では、細胞全体の微細藻類バイオマスおよび／またはその画分および／または抽出物は、１種またはそれ以上のＰＵＦＡを提供する。他の実施態様では、ＰＵＦＡは、粉末形態であるか、または液体形態中の遊離油としてのものである（例えば、脂質組成物またはその画分または濃縮物）。
【０１４０】
様々な実施態様において、ヒトおよび／または動物の１種またはそれ以上のＰＵＦＡの消費／使用が企図されている。従って、ある実施態様では、微細藻類により産生されるＰＵＦＡを、飼料、栄養補助食品、食品、医薬製剤、乳製品および調整粉乳からなる群から選択される最終製品で使用するのに適する形態および／または等級で提供する。
【０１４１】
例えば、ある実施態様では、回収した微細藻類バイオマスを乾燥させ（例えば、噴霧乾燥、トンネル乾燥、真空乾燥）、肉および／または産物がヒトまたは動物（例えば、愛玩動物、家畜）により消費される動物または水産養殖の生物（例えば、魚、エビ、カニ、ロブスターなど）用の飼料または食品のサプリメントとして使用する。
【０１４２】
他の実施態様では、回収した微細藻類バイオマスを、乾燥脱水剤（例えば、粉にしたトウモロコシなどの粉にした穀物）と混合する。
他の実施態様では、医薬組成物が企図されている。
【０１４３】
本発明は、さらに、上記の本発明の方法により製造される組成物を提供する。従って、本発明のいくつかの実施態様では、多価不飽和脂肪酸組成物が提供され、多価不飽和脂肪酸組成物は、少なくとも８％の多価不飽和脂肪酸を含み；組成物は、少なくとも１種の微細藻類から抽出された脂肪酸を含み、ここで、（ａ）ＧＬＡは、全脂肪酸の０.１％ないし１０％の量であり；（ｂ）ＳＤＡは、全脂肪酸の５％ないし５０％の量であり；（ｃ）ＥＰＡは、全脂肪酸の２％ないし３０％の量であり、そして、（ｄ）ＤＨＡは、全脂肪酸の２％ないし３０％の量である。
【０１４４】
いくつかの実施態様では、多価不飽和脂肪酸組成物は、多価不飽和脂肪酸を、５％ないし３５％の範囲の濃度で含む。従って、多価不飽和脂肪酸組成物は、多価不飽和脂肪酸を、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％などの濃度で含み得る。他の実施態様では、多価不飽和脂肪酸組成物は、多価不飽和脂肪酸を、５％ないし７％、５％ないし８％、５％ないし１０％、５％ないし１２％、５％ないし１５％、５％ないし２０％、５％ないし２５％、５％ないし３０％、６％ないし８％、６％ないし１０％、６％ないし１２％、６％ないし１５％、６％ないし２０％、６％ないし２５％、６％ないし３５％、７％ないし９％、７％ないし１１％、７％ないし１３％、７％ないし１４％、７％ないし１５％、７％ないし２０％、７％ないし２５％、７％ないし３０％、７％ないし３５％、８％ないし１０％、８％ないし１２％、８％ないし１４％、８％ないし１５％、８％ないし２０％、８％ないし２５％、８％ないし３５％、９％ないし１１％、９％ないし１３％、９％ないし１５％、９％ないし２０％、９％ないし２５％、９％ないし３０％、９％ないし３５％、１０％ないし１２％、１０％ないし１３％、１０％ないし１４％、１０％ないし１５％、１０％ないし２０％、１０％ないし２５％、１０％ないし３０％、１０％ないし３５％、１５％ないし２０％、１５％ないし２５％、１５％ないし３０％、２０％ないし２５％、２０％ないし３０％、２０％ないし３５％、２５％ないし３０％、２５％ないし３５％、３０％ないし３５％などの範囲の濃度で含み得る。ある実施態様では、多価不飽和脂肪酸組成物は、多価不飽和脂肪酸を少なくとも８％の濃度で含む。
【０１４５】
本発明によると、組成物に含まれ得るＧＬＡの量は、全脂肪酸の１％ないし１０％の範囲である。従って、ＧＬＡは、全脂肪酸の０.１％、０.２％、０.３％、０.４％、０.５％、０.６％、０.７％、０.８％、０.９％、１.０％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％などの量で組成物に含まれ得る。他の実施態様では、ＧＬＡは、全脂肪酸の０.１％ないし１％、１％ないし３％、１％ないし５％、１％ないし７％、１％ないし９％、２％ないし４％、２％ないし６％、２％ないし８％、２％ないし１０％、３％ないし５％、３％ないし７％、３％ないし９％、３％ないし１０％、４％ないし６％、４％ないし８％、４％ないし１０％、５％ないし７％、５％ないし８％、５％ないし９％、５％ないし１０％、６％ないし８％、６％ないし９％、６％ないし１０％、７％ないし９％、７％ないし１０％、８％ないし１０％、９％ないし１０％などの範囲の量で組成物に含まれ得る。
【０１４６】
いくつかの実施態様では、本発明の組成物に含まれるＳＤＡの量は、全脂肪酸の５％ないし５０％の範囲にある。従って、ＳＤＡは、全脂肪酸の５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％などの量で組成物中に提供され得る。他の実施態様では、ＳＤＡは、全脂肪酸の５％ないし１０％、５％ないし１５％、５％ないし２０％、５％ないし２５％、５％ないし３０％、５％ないし３５％、５％ないし４０％、５％ないし４５％、５％ないし５０％、１０％ないし１５％、１０％ないし２０％、１０％ないし２５％、１０％ないし３０％、１０％ないし３５％、１０％ないし４０％、１０％ないし４５％、１０％ないし５０％、２０％ないし２５％、２０％ないし３０％、２０％ないし３５％、２０％ないし４０％、２０％ないし４５％、２０％ないし５０％、２５％ないし３０％、２５％ないし３５％、２５％ないし４０％、２５％ないし４５％、２５％ないし５０％、３０％ないし３５％、３０％ないし４０％、３０％ないし４５％、３０％ないし５０％、３５％ないし４０％、３５％ないし４５％、３５％ないし５０％、４０％ないし４５％、４０％ないし５０％、４５％ないし５０％などの範囲の量で組成物に含まれ得る。
【０１４７】
他の実施態様では、ＥＰＡは、全脂肪酸の２％ないし３０％の範囲で組成物に含まれ得る。従って、ＥＰＡは、全脂肪酸の２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％などの量で組成物中に提供され得る。他の実施態様では、ＥＰＡは、全脂肪酸の１％ないし５％、１％ないし１０％、１％ないし１５％、１％ないし２０％、１％ないし２５％、１％ないし３０％、５％ないし１０％、５％ないし１５％、５％ないし２０％、５％ないし２５％、５％ないし３０％、１０％ないし１５％、１０％ないし２０％、１０％ないし２５％、１０％ないし３０％、１５％ないし２０％、１５％ないし２５％、１５％ないし３０％、２０％ないし２５％、２０％ないし３０％、２５％ないし３０％などの範囲のパーセントの量で組成物に含まれ得る。
【０１４８】
本発明のいくつかの実施態様では、ＤＨＡは、全脂肪酸の２％ないし３０％の範囲で組成物に含まれ得る。従って、ＤＨＡは、全脂肪酸の２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％などの量で組成物中に提供され得る。他の実施態様では、ＤＨＡは、全脂肪酸の１％ないし５％、１％ないし１０％、１％ないし１５％、１％ないし２０％、１％ないし２５％、１％ないし３０％、５％ないし１０％、５％ないし１５％、５％ないし２０％、５％ないし２５％、５％ないし３０％、１０％ないし１５％、１０％ないし２０％、１０％ないし２５％、１０％ないし３０％、１５％ないし２０％、１５％ないし２５％、１５％ないし３０％、２０％ないし２５％、２０％ないし３０％、２５％ないし３０％などの範囲の量で組成物に含まれ得る。
【０１４９】
本発明は、さらに、少なくとも５％のＳＤＡを含む組成物を提供し、その組成物は、（ａ）培養された微細藻類バイオマスから抽出された微細藻類油、または、（ｂ）培養された微細藻類に由来する微細藻類バイオマス、ここで、水は微細藻類バイオマスから除去され、固体含有量約５ないし１００重量％を達成している、のいずれかを含む。いくつかの実施態様では、ＳＤＡはリン脂質の形態ではない。
【０１５０】
いくつかの実施態様では、ＳＤＡは、２％ないし１０％の範囲の量で組成物中に存在する。従って、ＳＤＡは、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％などの量で組成物中に存在する。他の実施態様では、ＳＤＡは、２％ないし４％、２％ないし６％、２％ないし８％、２％ないし１０％、３％ないし５％、３％２５ないし７％、３％ないし９％、３％ないし１０％、４％ないし６％、４％ないし８％、４％ないし１０％、５％ないし７％、５％ないし８％、５％ないし９％、５％ないし１０％、６％ないし８％、６％ないし９％、６％ないし１０％、７％ないし９％、７％ないし１０％、８％ないし１０％、９％ないし１０％などの範囲で組成物中に含まれ得る。いくつかの実施態様では、ＳＤＡはリン脂質の形態ではない。
【０１５１】
追加の実施態様では、本発明は、（ａ）０.０１−９９.９９重量％の、少なくとも８％の多価不飽和脂肪酸を含む組成物、ここで、脂肪酸は、微細藻類から抽出され、さらに、ここで、（ｉ）ＧＬＡは、全脂肪酸の０.１％ないし１０％の量であり；（ｉｉ）ＳＤＡは、全脂肪酸の５％ないし５０％の量であり；（ｉｉｉ）ＥＰＡは、全脂肪酸の２％ないし３０％の量であり、（ｉｖ）ＤＨＡは、全脂肪酸の２％ないし３０％の量である；を、（ｂ）９９.９９ないし０.０１重量％の、タンパク質、炭水化物および繊維並びにこれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１種のさらなる成分と組み合わせて含む食品を提供する。
【０１５２】
いくつかの実施態様では、本発明の食品は、多価不飽和脂肪酸を、５％ないし３５％の範囲の濃度で含み得る。従って、食品は、多価不飽和脂肪酸を、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％などの濃度で含み得る。他の実施態様では、食品は、多価不飽和脂肪酸を、５％ないし７％、５％ないし８％、５％ないし１０％、５％ないし１２％、５％ないし１５％、５％ないし２０％、５％ないし２５％、５％ないし３０％、６％ないし８％、６％ないし１０％、６％ないし１２％、６％ないし１５％、６％ないし２０％、６％ないし２５％、６％ないし３５％、７％ないし９％、７％ないし１１％、７％ないし１３％、７％ないし１４％、７％ないし１５％、７％ないし２０％、７％ないし２５％、７％ないし３０％、７％ないし３５％、８％ないし１０％、８％ないし１２％、８％ないし１４％、８％ないし１５％、８％ないし２０％、８％ないし２５％、８％ないし３５％、９％ないし１１％、９％ないし１３％、９％ないし１５％、９％ないし２０％、９％ないし２５％、９％ないし３０％、９％ないし３５％、１０％ないし１２％、１０％ないし１３％、１０％ないし１４％、１０％ないし１５％、１０％ないし２０％、１０％ないし２５％、１０％ないし３０％、１０％ないし３５％、１５％ないし２０％、１５％ないし２５％、１５％ないし３０％、２０％ないし２５％、２０％ないし３０％、２０％ないし３５％、２５％ないし３０％、２５％ないし３５％、３０％ないし３５％などの範囲の濃度で含み得る。ある実施態様では、食品は、多価不飽和脂肪酸を少なくとも８重量％の濃度で含む。
【０１５３】
本発明によると、食品に含まれ得るＧＬＡの量は、全脂肪酸の０.１％ないし１０％の範囲にある。従って、ＧＬＡは、全脂肪酸の０.１％、０.２％、０.３％、０.４％、０.５％、０.６％、０.７％、０.８％、０.９％、１.０％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％などの量で食品に含まれ得る。他の実施態様では、ＧＬＡは、全脂肪酸の０.１％ないし１％、１％ないし３％、１％ないし５％、１％ないし７％、１％ないし９％、２％ないし４％、２％ないし６％、２％ないし８％、２％ないし１０％、３％ないし５％、３％ないし７％、３％ないし９％、３％ないし１０％、４％ないし６％、４％ないし８％、４％ないし１０％、５％ないし７％、５％ないし８％、５％ないし９％、５％ないし１０％、６％ないし８％、６％ないし９％、６％ないし１０％、７％ないし９％、７％ないし１０％、８％ないし１０％、９％ないし１０％などの範囲の量で食品に含まれ得る。
【０１５４】
いくつかの実施態様では、本発明の食品に含まれるＳＤＡの量は、全脂肪酸の５％ないし５０％の範囲にある。従って、ＳＤＡは、全脂肪酸の５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％などの量で食品中に提供され得る。他の実施態様では、ＳＤＡは、全脂肪酸の５％ないし１０％、５％ないし１５％、５％ないし２０％、５％ないし２５％、５％ないし３０％、５％ないし３５％、５％ないし４０％、５％ないし４５％、５％ないし５０％、１０％ないし１５％、１０％ないし２０％、１０％ないし２５％、１０％ないし３０％、１０％ないし３５％、１０％ないし４０％、１０％ないし４５％、１０％ないし５０％、２０％ないし２５％、２０％ないし３０％、２０％ないし３５％、２０％ないし４０％、２０％ないし４５％、２０％ないし５０％、２５％ないし３０％、２５％ないし３５％、２５％ないし４０％、２５％ないし４５％、２５％ないし５０％、３０％ないし３５％、３０％ないし４０％、３０％ないし４５％、３０％ないし５０％、３５％ないし４０％、３５％ないし４５％、３５％ないし５０％、４０％ないし４５％、４０％ないし５０％、４５％ないし５０％などの範囲の量で食品に含まれ得る。
【０１５５】
他の実施態様では、ＥＰＡは、全脂肪酸の２％ないし３０％の範囲で食品に含まれ得る。従って、ＥＰＡは、全脂肪酸の２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％などの量で食品中に提供され得る。他の実施態様では、ＥＰＡは、全脂肪酸の１％ないし５％、１％ないし１０％、１％ないし１５％、１％ないし２０％、１％ないし２５％、１％ないし３０％、５％ないし１０％、５％ないし１５％、５％ないし２０％、５％ないし２５％、５％ないし３０％、１０％ないし１５％、１０％ないし２０％、１０％ないし２５％、１０％ないし３０％、１５％ないし２０％、１５％ないし２５％、１５％ないし３０％、２０％ないし２５％、２０％ないし３０％、２５％ないし３０％などの範囲のパーセントの量で食品中に含まれ得る。
【０１５６】
本発明のいくつかの実施態様では、ＤＨＡは、全脂肪酸の２％ないし３０％の範囲で食品中に含まれ得る。従って、ＤＨＡは、全脂肪酸の２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％などの量で食品中に提供され得る。他の実施態様では、ＤＨＡは、全脂肪酸の１％ないし５％、１％ないし１０％、１％ないし１５％、１％ないし２０％、１％ないし２５％、１％ないし３０％、５％ないし１０％、５％ないし１５％、５％ないし２０％、５％ないし２５％、５％ないし３０％、１０％ないし１５％、１０％ないし２０％、１０％ないし２５％、１０％ないし３０％、１５％ないし２０％、１５％ないし２５％、１５％ないし３０％、２０％ないし２５％、２０％ないし３０％、２５％ないし３０％などの範囲の量で食品に含まれ得る。
【０１５７】
本発明のさらなる実施態様は、（ａ）０.０１−９９.９９重量％の少なくとも５％のステアリドン酸（重量パーセント；ｗ／ｗ）を含む組成物、この組成物は、（ｉ）培養された微細藻類バイオマスから抽出された微細藻類油、または、（ｉｉ）培養された微細藻類に由来する微細藻類バイオマス、ここで、水は微細藻類バイオマスから除去され、固体含有量約５ないし１００重量％を達成している、のいずれかを含む；を、（ｂ）９９.９９ないし０.０１重量％の、タンパク質、炭水化物および繊維並びにこれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１種のさらなる成分と組み合わせて含む食品を提供する。本発明のいくつかの実施態様では、ＳＤＡはリン脂質の形態ではない。
【０１５８】
いくつかの実施態様では、ＳＤＡは、２％ないし１０％の範囲の量で組成物中に存在する。従って、ＳＤＡは、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％などの量で組成物中に存在する。他の実施態様では、ＳＤＡは、２％ないし４％、２％ないし６％、２％ないし８％、２％ないし１０％、３％ないし５％、３％ないし７％、３％ないし９％、３％ないし１０％、４％ないし６％、４％ないし８％、４％ないし１０％、５％ないし７％、５％ないし８％、５％ないし９％、５％ないし１０％、６％ないし８％、６％ないし９％、６％ないし１０％、７％ないし９％、７％ないし１０％、８％ないし１０％、９％ないし１０％などの範囲で組成物に含まれ得る。
【０１５９】
本発明では、本明細書に記載の食品のいずれかにおける脂肪酸組成物の量は、食品の０.０１％ないし９９.９９重量％であり得る。従って、食品中の脂肪酸組成物の量は、０.１％、０.２％、０.３％、０.４％、０.５％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９.５％、９９.７％、９９.８％、９９.９％などであり得る。他の実施態様では、食品中の脂肪酸組成物の量は、０.１％ないし５％、０.１％ないし１０％、０.１％ないし１５％、０.１％ないし２０％、０.１％ないし２５％、０.１％ないし３０％、０.１％ないし３５％、０.１％ないし４０％、０.１％ないし４５％、０.１％ないし５０％、０.１％ないし６０％、０.１％ないし７０％、０.１％ないし８０％、０.１％ないし９０％、０.１％ないし９９％、０.１％ないし９９.５％、０.５％ないし５％、０.５％ないし１０％、０.５％ないし１５％、０.５％ないし２０％、０.５％ないし２５％、０.５ないし３５％、０.５％ないし４５％、０.５％ないし５５％、０.５％ないし６５％、５％ないし２５％、５％ないし３５％、５％ないし４５％、５％ないし５５％、５％ないし６５％、５％ないし７５％、５％ないし８０％、５％ないし８５％、５％ないし９５％、５％ないし９９％、１０％ないし３０％、１０％ないし４０％１０％ないし５０％、１０％ないし６０％、１０％ないし７０％、１０％ないし７５％、１０％ないし８０％、１０％ないし８５％、１０％ないし９５％、１０％ないし９９％、１０％ないし９９.９％、１５％ないし３５％、１５％ないし４５％、１５％ないし５５％、１５％ないし６５％、１５％ないし７５％、１５％ないし８５％、１５％ないし９５％、１５％ないし９９％、１５％ないし９９.９％、２０％ないし４０％、２０％ないし５０％、２０％ないし６０％、２０％ないし７０％、２０％ないし７５％、２０％ないし８０％、２０％ないし８５％、２０％ないし９５％、２０％ないし９９％、２５％ないし４０％、２５％ないし５０％、２５％ないし６０％、２５％ないし７０％、２５％ないし７５％、２５％ないし８０％、２５％ないし８５％、２５％ないし９５％、２５％ないし９９％、３０％ないし５０％、３０％ないし５５％、３０％ないし６０％、３０％ないし６５％、３０％ないし７０％、３０％ないし７５％、３０％ないし８０％、３０％ないし８５％、３０％ないし９０％、３０％ないし９５％、３０％ないし９９％、３５％ないし５０％、３５％ないし５５％、３５％ないし６０％、３５％ないし６５％、３５％ないし７０％、３５％ないし７５％、３５％ないし８０％、３５％ないし８５％、３５％ないし９０％、３５％ないし９５％、３５％ないし９９％、４０％ないし５０％、４０％ないし５５％、４０％ないし６０％、４０％ないし６５％、４０％ないし７０％、４０％ないし７５％、４０％ないし８０％、４０％ないし８５％、４０％ないし９０％、４０％ないし９５％、４０％ないし９９％、４５％ないし６０％、４５％ないし６５％、４５％ないし７０％、４５％ないし７５％、４５％ないし８０％、４５％ないし８５％、４５％ないし９０％、４５％ないし９５％、４５％ないし９９％、５０％ないし６０％、５０％ないし６５％、５０％ないし７０％、５０％ないし７５％、５０％ないし８０％、５０％ないし８５％、５０％ないし９０％、５０％ないし９５％、５０％ないし９９％、５５％ないし６５％、５５％ないし７０％、５５％ないし７５％、５５％ないし８０％、５５％ないし８５％、５５％ないし９０％、５５％ないし９５％、５５％ないし９９％、６０％ないし７０％、６０％ないし７５％、６０％ないし８０％、６０％ないし８５％、６０％ないし９０％、６０％ないし９５％、６０％ないし９９％、６５％ないし８０％、６５％ないし８５％、６５％ないし９０％、６５％ないし９５％、６５％ないし９９％、７０％ないし８０％、７０％ないし８５％、７０％ないし９０％、７０％ないし９５％、７０％ないし９９％、７５％ないし８５％、７５％ないし９０％、７５％ないし９５％、７５％ないし９９％、８０％ないし９０％、８０％ないし９５％、８０％ないし９９％、８５％ないし９０％、８５％ないし９５％、８５％ないし９９％、９０％ないし９５％、９０％ないし９９％、９５％ないし９９％などの範囲にある。
【０１６０】
本発明は、さらに、炎症性障害の症状を減らすための液体の栄養補助食品を提供し、該補助食品は、本質的に、１９重量％の水；２５重量％のスクロース；３５重量％の油、ここで、油は、微細藻類由来のＧＬＡおよびＳＤＡである；１５重量％の香味料；および５重量％のグリセリンからなる。
【０１６１】
さらなる実施態様では、水は、１０−３０重量％の範囲であり得る。従って、水は、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％などの量で存在し得る。追加の実施態様では、スクロースは、１０％ないし４０％の範囲の量で存在する。従って、スクロースは、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％などの量で存在できる。
【０１６２】
またさらなる実施態様では、油は、２０％ないし５０％（重量％；ｗ／ｗ）の範囲の量で存在できる。従って、油は、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％などの量で存在できる。いくつかの実施態様では、香味料は、５％−２５％の範囲の量で存在できる。従って、香味料は、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％などの量で存在できる。他の実施態様では、グリセリンは、１％−２０％の範囲で存在できる。従って、グリセリンは、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％などの量で存在できる。
【０１６３】
液体の栄養補助食品は、さらに、抗酸化剤、保存料、着色料、安定化剤、乳化剤またはこれらの組合せから選択される１重量％未満の微量成分を含み得る。
【０１６４】
いくつかの実施態様では、液体の栄養補助食品におけるＧＬＡとＳＤＡの重量比は、６：１ないし１：６の範囲にあり得る。従って、ＧＬＡとＳＤＡの重量比は、６.０：１.０、５.０：１.０、４.０：１.０、３.０：１.０、３.０：０.５、２.５：１.５、２.５：０.５、２.０：１.０、２.０：０.５、１.０：１.０、１.０：２.０、１.０：３.０、１.０：４.０、１.０：５.０、１.０：６.０などであり得る。
【０１６５】
本発明は、さらに、本明細書に記載の本発明の方法により製造される動物飼料添加物を提供する。従って、本発明のいくつかの実施態様では、動物飼料添加物が提供され、動物飼料添加物は、微細藻類から回収された多価不飽和脂肪酸を、ａ）培養された微細藻類バイオマスから抽出された微細藻類油、または、（ｂ）培養された微細藻類に由来する微細藻類バイオマス、ここで、水は微細藻類バイオマスから除去され、固体含有量約５ないし１００重量％を達成している、のいずれかの形態で含む。
さらなる実施態様では、動物飼料添加物について、微細藻類から回収された脂肪酸は、短鎖オメガ−３脂肪酸である。
【０１６６】
ここでさらに提供されるのは、少なくとも８％の多価不飽和脂肪酸を含む動物飼料添加物である；この添加物は、微細藻類から抽出された脂肪酸を含み、ここで、（ａ）ＧＬＡは、全脂肪酸の０.１％ないし１０％の量であり；（ｂ）ＳＤＡは、全脂肪酸の５％ないし５０％の量であり；（ｃ）ＥＰＡは、全脂肪酸の２％ないし３０％の量であり、そして、（ｄ）ＤＨＡは、全脂肪酸の２％ないし３０％の量である。
【０１６７】
いくつかの実施態様では、動物飼料添加物は、５％ないし１５％の範囲の濃度で多価不飽和脂肪酸を含む。従って、動物飼料添加物は、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％などの濃度で多価不飽和脂肪酸を含み得る。他の実施態様では、動物飼料添加物は、５％ないし７％、５％ないし８％、５％ないし１０％、５％ないし１２％、５％ないし１５％、６％ないし８％、６％ないし１０％、６％ないし１２％、６％ないし１５％、７％ないし９％、７％ないし１１％、７％ないし１３％、７％ないし１４％、７％ないし１５％、８％ないし１０％、８％ないし１２％、８％ないし１４％、８％ないし１５％、９％ないし１１％、９％ないし１３％、９％ないし１５％、１０％ないし１２％、１０％ないし１３％、１０％ないし１４％、１０％ないし１５％などの範囲の濃度で多価不飽和脂肪酸を含み得る。ある実施態様では、動物飼料添加物は、多価不飽和脂肪酸を、少なくとも８％の濃度で含む。
【０１６８】
本発明によると、動物飼料添加物中のＧＬＡの量は、全脂肪酸の０.１％ないし１０％の範囲にある。従って、動物飼料添加物中のＧＬＡは、全脂肪酸の０.１％、０.２％、０.３％、０.４％、０.５％、０.６％、０.７％、０.８％、０.９％、１.０％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％などの量で存在し得る。他の実施態様では、動物飼料添加物中のＧＬＡは、全脂肪酸の０.１％ないし１％、１％ないし３％、１％ないし５％、１％ないし７％、１％ないし９％、２％ないし４％、２％ないし６％、２％ないし８％、２％ないし１０％、３％ないし５％、３％ないし７％、３％ないし９％、３％ないし１０％、４％ないし６％、４％ないし８％、４％ないし１０％、５％ないし７％、５％ないし８％、５％ないし９％、５％ないし１０％、６％ないし８％、６％ないし９％、６％ないし１０％、７％ないし９％、７％ないし１０％、８％ないし１０％、９％ないし１０％などの範囲の量であり得る。
【０１６９】
いくつかの実施態様では、本発明の動物飼料添加物中のＳＤＡの量は、全脂肪酸の５％ないし５０％の範囲にある。従って、動物飼料添加物は、全脂肪酸の５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％などの量でＳＤＡを含み得る。他の実施態様では、動物飼料添加物中のＳＤＡは、全脂肪酸の５％ないし１０％、５％ないし１５％、５％ないし２０％、５％ないし２５％、５％ないし３０％、５％ないし３５％、５％ないし４０％、５％ないし４５％、５％ないし５０％、１０％ないし１５％、１０％ないし２０％、１０％ないし２５％、１０％ないし３０％、１０％ないし３５％、１０％ないし４０％、１０％ないし４５％、１０％ないし５０％、２０％ないし２５％、２０％ないし３０％、２０％ないし３５％、２０％ないし４０％、２０％ないし４５％、２０％ないし５０％、２５％ないし３０％、２５％ないし３５％、２５％ないし４０％、２５％ないし４５％、２５％ないし５０％、３０％ないし３５％、３０％ないし４０％、３０％ないし４５％、３０％ないし５０％、３５％ないし４０％、３５％ないし４５％、３５％ないし５０％、４０％ないし４５％、４０％ないし５０％、４５％ないし５０％などの範囲の量である。
【０１７０】
他の実施態様では、動物飼料添加物中のＥＰＡは、全脂肪酸の２％ないし３０％の範囲であり得る。従って、動物飼料添加物中のＥＰＡは、全脂肪酸の２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％などの量である。
【０１７１】
他の実施態様では、動物飼料添加物中のＥＰＡは、全脂肪酸の１％ないし５％、１％ないし１０％、１％ないし１５％、１％ないし２０％、１％ないし２５％、１％ないし３０％、５％ないし１０％、５％ないし１５％、５％ないし２０％、５％ないし２５％、５％ないし３０％、１０％ないし１５％、１０％ないし２０％、１０％ないし２５％、１０％ないし３０％、１５％ないし２０％、１５％ないし２５％、１５％ないし３０％、２０％ないし２５％、２０％ないし３０％、２５％ないし３０％などの範囲のパーセントの量である。
【０１７２】
本発明のいくつかの実施態様では、動物飼料添加物中のＤＨＡは、全脂肪酸の２％ないし３０％の範囲にある。従って、動物飼料添加物中のＤＨＡは、全脂肪酸の２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％などの量である。他の実施態様では、動物飼料添加物中のＤＨＡは、全脂肪酸の１％ないし５％、１％ないし１０％、１％ないし１５％、１％ないし２０％、１％ないし２５％、１％ないし３０％、５％ないし１０％、５％ないし１５％、５％ないし２０％、５％ないし２５％、５％ないし３０％、１０％ないし１５％、１０％ないし２０％、１０％ないし２５％、１０％ないし３０％、１５％ないし２０％、１５％ないし２５％、１５％ないし３０％、２０％ないし２５％、２０％ないし３０％、２５％ないし３０％などの範囲の量である。
【０１７３】
本発明の他の実施態様は、本明細書に記載の動物飼料添加物を動物に与えることにより産生される動物製品をさらに含む。従って、本発明のある態様は、微細藻類から回収される多価不飽和脂肪酸を、（ａ）培養された微細藻類バイオマスから抽出された微細藻類油、または（ｂ）培養された微細藻類に由来する微細藻類バイオマス、ここで、水は微細藻類バイオマスから除去され、固体含有量約５ないし１００重量％を達成している、のいずれかの形態で含む動物飼料添加物を動物に与えることにより産生される、動物製品を含む。
【０１７４】
本発明のまた他の態様は、少なくとも８％の多価不飽和脂肪酸を含む動物飼料添加物を動物に与えることにより産生される動物製品を提供し；その添加物は、微細藻類から抽出された脂肪酸を含み、微細藻類の脂肪酸抽出物は、（ａ）全脂肪酸の０.１％ないし１０％の量のＧＬＡ；（ｂ）全脂肪酸の５％ないし５０％の量のＳＤＡ；（ｃ）全脂肪酸の２％ないし３０％の量のＥＰＡ；および（ｄ）全脂肪酸の２％ないし３０％の量のＤＨＡを含む。
本発明の動物製品には、卵、乳または肉が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７５】
本明細書に記載の本発明の組成物は、完全な食品として、食品の成分として、栄養補助食品として、または、栄養補助食品の一部として、飼料添加物として使用し得、液体、半固体または固体のいずれかの形態であり得る。本明細書に記載の本発明の組成物は、さらに、医薬組成物の形態であり得る。本発明の組成物、栄養補助食品、食品、乳児用食品、飼料添加物、および／または、医薬組成物は、個体の健康の増進方法において有利に利用され得る。
【０１７６】
上記の通り、組成物は、液体、半固体または固体の形態であり得る。組成物は、例えば、錠剤、ゲルパック、カプセル剤、ゼラチンカプセル剤、味付きの飲料、そのような飲料に再構成できる粉末、調理用油、サラダ油またはドレッシング、ソース、シロップ、マヨネーズ、マーガリンなどとして投与され得る。さらに、本発明の食品、栄養補助食品などには、乳製品、乳児用食品、調整粉乳、飲み物、バー、粉末、食品のトッピング、飲料、シリアル、アイスクリーム、飴、スナックミックス、焼いた食品および揚げた食品が含まれ得るが、これらに限定されない。本発明の飲み物には、エネルギー飲料、栄養補助飲料、スムージー、スポーツ飲料、オレンジジュースおよび他の果物の飲料が含まれるが、これらに限定されない。本発明のバーには、代替食（meal replacement）、栄養バー、スナックバーおよびエネルギーバー、押出されたバー（extruded bar）などが含まれるが、これらに限定されない。本発明の乳製品には、ヨーグルト、ヨーグルト飲料、チーズおよび乳が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７７】
本発明の食品または栄養補助食品は、さらに、草本、草本抽出物、真菌抽出物、酵素、繊維源、ミネラルおよびビタミンを含み得る。本発明の微細藻類油および微細藻類バイオマスを、本発明の組成物において、治療的用途および非治療的用途の両方で使用し得る。従って、本発明の組成物、食品および動物飼料添加物は、治療または非治療目的で使用し得る。
【０１７８】
経口投与を意図する組成物は、栄養補助食品または医薬製剤の製造用のいかなる既知方法によっても製造し得、そのような組成物は、食事的または医薬的に心地よい調製物を提供するために、味を改善する物質、例えば、甘味料または香味料、安定化剤、乳化剤、着色料および保存料からなる群から選択される少なくとも１種の添加物を含み得る。任意の生理的に許容し得る供給源に由来するビタミン、ミネラルおよび微量元素も、本発明の組成物に含まれ得る。
【０１７９】
本発明の医薬組成物は、本発明の該組成物を、治療的有効量で含む。これらの組成物は、さらに、医療用医薬品または一般用医薬品を含み得る。これらの組合せは、次の１つまたはそれ以上の効果を有利に奏し得る：（１）相加および／または相乗的利益；（２）該製剤の非存在下の医療用医薬品の使用に伴う副作用および／または有害作用の減少；および／または（３）該製剤の非存在下で必要とされる医療用医薬品の量と比較して、医療用医薬品の投与量を下げる能力。
【０１８０】
本発明の活性物質は、それらの医薬的に許容し得る塩の形態で製造できる。当業者に理解される通り、医薬的に許容し得る塩は、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、望まれない毒物学的作用を与えない塩である。そのような塩の例は、（ａ）無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸などで形成される酸付加塩；および、有機酸、例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸などで形成される塩；（ｂ）塩素、臭素、およびヨウ素などの元素の陰イオンから形成される塩；および（ｃ）アンモニウム塩、アルカリ金属塩、例えば、ナトリウムおよびカリウムのもの、アルカリ土類金属塩、例えば、カルシウムおよびマグネシウムのもの、有機塩基、例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、ジシクロヘキシルアミンおよびＮメチル−Ｄ−グルカミンとの塩などの塩基由来の塩である。
【０１８１】
いくつかの実施態様では、１種またはそれ以上のＰＵＦＡは、トリグリセリド形態である。他の実施態様では、１種またはそれ以上のＰＵＦＡは、エステル化形態（例えば、エチルエステル形態）である。またさらなる実施態様では、脂肪酸は、酸性塩の形態である。
【０１８２】
活性物質を、既知の薬学の技法に従って、投与用に製剤化できる。例えば、Remington, The Science And Practice of Pharmacy (9th Ed. 1995) を参照。本発明による医薬組成物の製造において、典型的には、活性物質（その生理的に許容し得る塩を含む）を、とりわけ、許容し得る担体と混合する。当然、担体は、製剤中の他の成分と適合するという観点で許容し得るものでなくてはならず、対象に有害であってはならない。担体は、固体または液体、または両方であり得、単位用量製剤、例えば錠剤として活性物質と共に製剤化でき、それは、重量で０.０１％または０.５％ないし９５％または９９％、または、０.０１％ないし９９％の任意の値の活性物質を含有できる。１種またはそれ以上の活性物質を本発明の組成物に組み込むことができ、それは、薬学の周知技法のいずれによっても製造でき、各成分を、場合により１種またはそれ以上の補助成分を含めて、混合することを含む。さらに、担体は、上記の通り、保存料を含まないものであり得る。
ある実施態様では、医薬的に許容し得る担体は、生理食塩水、リンガー液またはリン酸緩衝食塩水である。
【０１８３】
いくつかの実施態様では、活性物質は、組成物の重量で約０.０１、０.０２、０.０３、０.０４、０.０５、０.０６、０.０７、０.０８、０.０９、１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０％の範囲の下限から、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９および１００％の範囲の上限で含まれる。いくつかの実施態様では、活性物質は、組成物の重量で約０.０５％から、約９９％を超えて含まれる。
【０１８４】
本発明の実施態様による医薬組成物は、一般的に、経口および局所（即ち、皮膚、目および粘膜表面）投与用に製剤化され、各場合で最も適する経路は、処置される症状の性質および重篤度、および、使用される特定の活性物質の性質によって決まる。
【０１８５】
しかしながら、本発明の医薬組成物は、また、例えば、静脈内、皮下、直腸、膣などを含むがこれらに限定されない、有効成分が効果的に投与され得る任意の他の経路での使用のために製剤化できる。
【０１８６】
経口投与に適する製剤は、分離した単位で、例えば、予め定められた量の活性化合物を各々含有するカプセル剤、カシェ剤、トローチ剤または錠剤として；散剤または顆粒剤として；水性または非水性の液体中の液剤または懸濁剤として；または、水中油または油中水乳剤として、与えられ得る。そのような製剤は、薬学のいかなる適する方法によっても製造でき、それには、活性化合物と適する担体（それは、１種またはそれ以上の上記の補助成分を含み得る）を一体とすることを含む。一般に、本発明の製剤は、活性化合物を、液体または細かく分割された固体担体、または両方と、均一かつ完全に混合し、次いで、必要であれば、得られる混合物を形づくることにより製造する。
【０１８７】
例えば、錠剤は、活性化合物を含有する粉末または顆粒を、場合により１種またはそれ以上の補助成分と共に、圧縮または成形することにより製造できる。圧縮錠剤は、適する機械で、自由に流動する形態の化合物、例えば、粉末または顆粒を、場合により結合剤、滑沢剤、不活性希釈剤および／または界面活性剤／分散剤と混合して、圧縮することにより製造できる。成形錠剤は、適する機械で、不活性の液体の結合剤で湿らせた粉末の化合物を成形することにより製造できる。
【０１８８】
他の実施態様では、１種またはそれ以上のＰＵＦＡを含むカプセル剤が提供される。例えば、カプセル剤は、ＰＵＦＡを含有する製剤をカプセル殻の内側に置くことにより製造できる。カプセルは、活性物質を含む容器または囲いの中で投与される投与形であり得る。いくつかの実施態様では、１種またはそれ以上のＰＵＦＡは、液体形態（例えば、脂質組成物）であり、ハードまたはソフトカプセルに満たされる。カプセル殻は、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアルコール、または、変性ゼラチンもしくはスターチ、または他の材料を原料とするものであり得る。ハードシェルカプセルは、典型的には、比較的高いゲル強度の骨およびブタの皮膚のゼラチンの混合物を原料とする。いくつかの実施態様では、単位投与形は、ゲルカプセル剤である。他の実施態様では、カプセル殻は、グリセリンカプセル殻である。またさらなる実施態様では、カプセルは、ウシゼラチン殻である。他の適するカプセル殻材料には、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリビニルクロライド、ポリスチレン、ポリウレタン、ポリテトラフルオロエチレン、ナイロン、ポリホルムアルデヒド、ポリエステル、セルロースアセテートおよびニトロセルロースが含まれるが、これらに限定されない。ゼラチンカプセル殻も提供され、例えば、タピオカ、草、植物由来または魚由来のゼラチンを原料とし得る。植物をベースとするゼラチンカプセルは、例えば、植物由来のヒドロキシプロピルメチルセルロースを原料とし得る。カプセル殻は、また、例えば、加工トウモロコシデンプン、グリセロール、および／または、カラゲナンをゲル化剤として含むことを意図する。
【０１８９】
他の実施態様では、カプセル殻は、熱形成方法により製造された多孔性またはｐＨ感受性ポリマーを原料とし得る。ある実施態様では、カプセル殻は、比較的薄い皮を表面に有することを特徴とする膜の形態である；その厚みの殆どは、透過性の高い多孔性材料で構成される。
【０１９０】
従って、いかなる数の医薬的に許容し得る経口投与形も意図されており、丸剤、錠剤、ゲルカプセル剤などが含まれるがこれらに限定されない。また意図されているのは、医薬製剤を単位投与形で含む医薬組成物である。そのような投与形では、製剤は、所望の目的を達成するのに有効な、適当な量のＰＵＦＡを含有する適当なサイズの投薬単位にさらに分けられる。
【０１９１】
従って、本発明は、カプセル剤、錠剤、液剤、シロップ剤、懸濁剤、舌下錠、飴剤、咀嚼錠のＰＵＦＡ製剤の投与形も提供する。
【０１９２】
いくつかの実施態様では、液体形態の製剤には、液剤、懸濁剤および乳剤が含まれる。液体医薬製剤の例には、経口用液剤、懸濁液および乳剤用の、プロピレングリコール溶液および甘味料を含有する溶液が含まれる。注射可能な溶液も意図されている。さらに、局所投与に適する製剤は、例えば、シロップ剤、懸濁剤または乳剤、吸入剤、噴霧剤、ムース、油、ローション、軟膏、ゲル、固体などを含むクリームおよび液体の形態であり得る。
【０１９３】
適する医薬的に許容し得る局所用担体には、水、グリセロール、アルコール、プロピレングリコール、脂肪アルコール、トリグリセリド、脂肪酸エステルおよびミネラルオイルが含まれるが、これらに限定されない。適する局所美容用の許容し得る担体には、水、ワセリン、ペトロラタム、ミネラルオイル、植物油、動物油、有機および無機ワックス、例えば、微結晶性、パラフィンおよびオゾケライトワックス、天然ポリマー、例えばキサンタン、ゼラチン、セルロース、コラーゲン、澱粉またはアラビアゴム、合成ポリマー、アルコール、ポリオールなどが含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、その非毒性局所特性のために、医薬的および／または美容的に許容し得る担体は、実質的に水に混和性である。そのような水混和性担体の組成物は、持続または遅延放出担体、例えば、リポソーム、マイクロスポンジ、マイクロスフェアまたはマイクロカプセル、水をベースとする軟膏、油中水または水中油乳液、ゲルなども含み得る。
【０１９４】
他の実施態様では、本発明の医薬組成物は、さらに、補助剤を含み得る。補助剤の例には、賦形剤、安定化剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、界面活性剤、滑沢剤などが含まれるが、これらに限定されない。補助剤は、不活性であり得るか、または、医薬的利点を有し得る。賦形剤は、意図する投与形に関連して選択できる。
【０１９５】
医薬製剤は、さらに、抗炎症性製剤、化学療法剤、活性のある補助剤、骨粗鬆症薬、抗鬱剤、抗痙攣薬、抗ヘリコバクターピロリ薬、神経変性疾患の処置薬、変性性肝疾患の処置薬、抗生物質、および、コレステロール低下製剤も含み得る。
【０１９６】
ある実施態様では、本発明は、細胞全体の微細藻類バイオマス、その画分および／または抽出物を含む医薬組成物を提供する。他の実施態様では、医薬組成物は、微細藻類バイオマスから抽出された脂質組成物を含む。いくつかの実施態様では、細胞全体の微細藻類バイオマスおよび／またはその画分および／または抽出物は、医薬組成物中に、予防的または治療的有効量で存在する。他の実施態様では、医薬組成物は、さらに、医薬的に許容し得る担体を含む。
【０１９７】
ある実施態様では、本発明の製剤は、さらに、可塑剤を含み得る。可塑剤の例には、ポリエチレングリコール、例えば、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１４５０、ＰＥＧ３３５０およびＰＥＧ８００、ステアリン酸、プロピレングリコール、オレイン酸、トリエチルセルロースおよびトリアセチンが含まれるが、これらに限定されない。
【０１９８】
また、被覆組成物／製剤、例えば、腸溶性被覆も意図されている。被覆材料の例には、ポリビニルアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートスクシネート、セルロースアセテートフタレート、メタクリル酸コポリマー、ヒドロキシプロピルメチルセルローススクシネート、セルロースアセテートスクシネート、セルロースアセテートヘキサヒドロフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースヘキサヒドロフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ）、セルロースプロピオネートフタレート、セルロースアセテートマレエート、セルロースアセテートトリメリテート、セルロースアセテートブチレート、セルロースアセテートプロピオネート、メタクリル酸／メタクリレートポリマー、メタクリル酸−メチルメタクリレートコポリマー、エチルメタクリレート−メチルメタクリレート−クロロトリメチルアンモニウムエチルメタクリレートコポリマーおよびこれらの組合せが含まれるが、これらに限定されない。被覆の他の例には、天然樹脂（例えば、セラック、コパールコロホリウム（copal collophorium））および合成樹脂（例えば、カルボキシル基を有する樹脂）が含まれる。
【０１９９】
他の実施態様では、本発明の組成物／製剤は、さらに、安定化剤および／または保存料も含み得る。いくつかの実施態様では、安定化剤は抗酸化剤である。保存料の例には、ソルビン酸カリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸およびその塩、他のパラヒドロキシ安息香酸のエステル、例えばブチルパラベン、アルコール、例えばエチルまたはベンジルアルコール、フェノール化合物、例えばフェノール、または、四級化合物、例えば塩化ベンザルコニウムが含まれるが、これらに限定されない。
【０２００】
本発明の医薬的に許容し得る化合物は、通常、毎日の投薬計画で対象に投与される。成体の対象には、これは、例えば、０.１ｇないし１５ｇのＧＬＡの経口用量であり得る。さらなる実施態様では、ＧＬＡの経口用量は、０.５ｇないし１０ｇであり得る。またさらなる実施態様では、ＧＬＡの経口用量は、０.５ｇないし３ｇであり得る。他の実施態様では、ＳＤＡの経口用量は、０.１ｇないし１０ｇであり得る。追加の実施態様では、ＳＤＡの経口用量は、０.２５ｇないし５ｇであり得る。なお追加の実施態様では、ＳＤＡの経口用量は、０.２５ｇないし３ｇであり得る。加えて、本発明のいくつかの実施態様は、場合により、ＥＰＡまたはＤＨＡの経口用量約０.１ｇないし約１５ｇを含み得る。
【０２０１】
医薬組成物は、１日に１ないし４回投与し得る。従って、特定の実施態様では、組成物は、１：１（ｗ／ｗ）の比のＧＬＡ：ＥＰＡを含むと企図され、ここで、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ｇのＧＬＡが存在し得る。他の実施態様では、２：１（ｗ／ｗ）の比のＧＬＡ：ＥＰＡが存在し得、ここで、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５ｇのＧＬＡが存在し得る。当然、投与するＧＬＡ：ＥＰＡの比は、本明細書で上記したものから変動し得る。例えば、０.１、０.２５、０.５、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ｇのＥＰＡを含む任意の量のＥＰＡを、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５ｇのＧＬＡを含む任意の量のＧＬＡと共に投与し得る。そのような量のサプリメントは、１つの組成物中に混合されていてもよく、別個の組成物中にあってもよい。
【０２０２】
処置方法
従って、本発明のさらなる態様は、疾患または症状の治療的および／または予防的処置のためにヒトにＰＵＦＡを投与することを提供する。
例えば、本発明は、本明細書に記載の脂肪酸組成物および／または製剤を提供することによる、心血管疾患、自己免疫障害、炎症性障害、中枢神経系の障害および慢性疼痛の予防および処置方法を含む。対象は、ヒトまたはヒト以外であり得る。ヒト以外の対象には、家畜の動物、例えば、ウシ、ヒツジおよびウマ、並びに、家庭内の伴侶動物、例えば、ネコおよびイヌが含まれる。
【０２０３】
ある実施態様では、疾患または症状は、心血管疾患、慢性炎症、急性炎症、胃腸障害、癌、悪液質、心臓の再狭窄、神経変性障害、肝臓の変性性障害、血液脂質障害、骨粗鬆症、骨関節炎、自己免疫疾患、子癇前症、早産、加齢関連黄斑症、肺障害、統合失調症、鬱病、体重の維持およびペルオキシソーム病からなる群から選択される。
【０２０４】
心血管疾患および本明細書に記載の脂肪酸製剤で処置できる障害には、狭心症、アテローム性動脈硬化症、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、低ＨＤＬ、高血圧症、レイノー病および不整脈が含まれるが、これらに限定されない。本明細書に記載の脂肪酸製剤による処置方法には、開心術（冠動脈バイパス術および弁の手術を含むが、これらに限定されない）後の合併症（鬱病、神経−認知の低下、うっ血性心不全および梗塞、血栓性の事象および不整脈を含むが、これらに限定されない）を防止するための予防、および、そのような合併症の処置が含まれる。本発明には、脂肪酸を含有する組成物および本明細書に記載の製剤を少なくとも１日１回、少なくとも６０日間、１８０日間、３６０日間またはそれ以上にわたり、１回目の心筋梗塞後の患者に提供することによる、２回目の心筋梗塞の予防またはリスクの低下の方法が含まれる。
【０２０５】
本明細書に記載の方法および組成物で処置できる疾患および症状の非限定的な例には、また、脱毛症、アルツハイマー型認知症、不安障害、喘息、注意欠陥障害、注意欠陥多動障害、アトピー性皮膚炎、自閉症、双極性障害、境界型人格障害、心血管疾患、慢性疲労症候群、慢性疼痛、慢性多発性関節炎、認知障害、コミュニケーション障害、クローン病、嚢胞性線維症、認知症、鬱病、糖尿病（インスリン非依存性またはインスリン依存性の形態）、糖尿病関連続発症、糖尿病性神経障害、ドライアイおよび他の炎症性眼障害、乾燥肌、月経困難症、摂食障害（例えば、神経性食欲不振症または神経性大食症および肥満症）、湿疹、線維筋痛症、痛風、ループス、男性不妊症、メタボリックシンドローム、メラノーマ、軽度認知障害、片頭痛、気分障害、多発性硬化症、強迫性障害、反抗挑戦性障害、骨関節炎、骨粗鬆症、広汎性発達障害、結節性多発動脈炎、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、統合失調症、強皮症、自傷行動、鎌状赤血球貧血、チック障害、潰瘍性大腸炎または血管炎性障害（例えば、結節性多発動脈炎および側頭動脈炎）が含まれる。
【０２０６】
ある実施態様では、本明細書に記載の脂肪酸組成物および製剤は、細胞腫の予防に使用できる。いくつかの実施態様では、本明細書に記載の組成物および製剤は、再発のリスクを下げるために、寛解中の患者に与えられる。
【０２０７】
本明細書に記載の脂肪酸組成物および製剤は、ヒトおよび動物において、美容目的でも使用できる。例えば、製剤を、皮膚の質および透明性および毛髪または外被の輝きを改善するために使用し得る。
【０２０８】
当業者は、特定の対象のための特有の投与レベルは、年齢、体重、全般的健康状態、性別、食事、投与時間および投与経路を含む様々な要因に応じて決まることを知っている。
【０２０９】
ある実施態様では、本発明は、対象の疾患または障害の処置方法を提供し、その方法は、治療的または予防的有効量の本発明の脂質組成物を対象に投与することを含む。
【０２１０】
いくつかの実施態様では、治療的または予防的有効量は、少なくとも対象の１日のカロリーの約０.１％、例えば、１日のカロリーの少なくとも約０.１ないし約３０、約０.５ないし約２０および約１ないし約５％として提供される脂質組成物である。
【０２１１】
他の実施態様では、治療的または予防的有効量は、少なくとも約０.１ｇ／日、例えば、約０.１ないし約５０ｇ／日、約１ないし約３０ｇ／日、約５ないし約２０ｇ／日および約１０ないし約１５ｇ／日である。
【０２１２】
ある実施態様では、対象は高トリグリセリド血症の対象である。他の実施態様では、対象は喘息である。
【０２１３】
いくつかの実施態様では、本発明は、対象における血漿トリグリセリドの低下方法を提供し、その方法は、対象に本発明の脂質組成物を投与することを含む。ある実施態様では、対象は高トリグリセリド血症の対象である。
【０２１４】
他の実施態様では、本発明は、対象における、ＩｇＥ−に誘導される好塩基球からのロイコトリエン放出の低下方法を提供し、その方法は、対象に本発明の脂質組成物を投与することを含む。ある実施態様では、対象は高トリグリセリド血症の対象である。ある実施態様では、対象は喘息の対象である。
【０２１５】
キット
他の態様では、本発明の組成物および製剤を含むキットまたはパッケージが提供される。例えば、包装された医薬製剤は、容器内に１またはそれ以上のＰＵＦＡ投与形；および、その投与形を対象の予防的または治療的処置に使用するための指示書を含み得る。いくつかの実施態様では、本発明は、本発明の医薬組成物を含むキットを提供する。そのキットは、１個またはそれ以上の分離した容器を含み得る。
【０２１６】
指示用の資料は、存在するとき、典型的には記載または印刷された資料を含むが、それらはそのようなものに限定されない。そのような情報を保存でき、それらを最終使用者に伝達できるいかなる媒体も、本発明により意図されている。そのような媒体には、電子的保存媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えば、ＣＤ ＲＯＭ）などが含まれるが、これらに限定されない。そのような媒体は、そのような指示用の資料を提供するインターネットサイトへのアドレスを含み得る。
【０２１７】
キットの構成要素が１種またはそれ以上の液体の溶液で提供される場合、その液体の溶液は、好ましくは水性溶液であり、滅菌水性溶液が特に好ましい。しかしながら、キットの構成要素は、乾燥粉末として提供されてもよい。物質または構成要素が乾燥粉末として提供される場合、その粉末は、適する溶媒の添加により再構成できる。溶媒も他の容器で提供され得ることが想定されている。例えば、キットの構成要素が凍結乾燥形態である場合、キットは、場合により、水、塩水、緩衝塩水などの無菌かつ生理的に許容し得る再構成媒体を含み得る。
【０２１８】
いくつかの実施態様では、キットの容器は、少なくとも１個のバイアル、試験管、フラスコ、瓶、シリンジまたは他の容器を含み得、その中に本発明の組成物／製剤、および任意の他の所望の物質が入れられてよく、好ましくは、適切に分注されている。分離した構成要素が含まれる場合、キットは、また、一般的に、少なくとも第２の容器を含み、その中に、これらが入れられ、別々に設定された用量の投与を可能にする。また、キットは、無菌の医薬的に許容し得るバッファーまたは他の希釈剤を含めるために、さらなる容器を含み得る。
【０２１９】
キットは、本発明の化合物を投与するための装置、例えば、１個またはそれ以上の針またはシリンジ、または、点眼容器、ピペット、または他のそのような器具も含み得る。本発明のキットは、典型的には、バイアルなどと他の構成要素を販売用にまとまった配置で含むための構造、例えば、所望のバイアルおよび他の器具を置き、保持するための射出またはブロー成形されたプラスチック容器を含む。
【０２２０】
ここで、以下の実施例を参照して本発明を説明する。この実施例は、本発明の態様を例示説明するためのものであり、特許請求の範囲により定められる本発明の範囲を限定しない。
【実施例】
【０２２１】
実施例
実施例１
培養条件
ロドモナス・サリナの細胞を、増殖培地（下記参照）５０ｍｌを含む１２５ｍ１のフラスコ中、室温で、５０μｍｏｌｍ−２ｓ−１の連続的照射で維持した。培養フラスコは、振盪テーブルを使用して、１００ｒｐｍでの一定の振盪下にあった。
【０２２２】
全ての実験について、白色蛍光灯（４０ワット）で照明を提供し、様々な光強度は、電球の数を変えることにより、または、培養フラスコと電球の距離を調節することにより達成した。温度の実験には、培養フラスコを１４℃ないし３４℃の温度の水浴でインキュベートした。水浴中の温度は、電気加熱ロッド（Aquatic Ecosystem, Apopka, Florida）により、２２℃、２８℃または３４℃に各々制御した。１−２％ＣＯ２で富化した圧縮空気を使用して培養物を混合し、ガス（０２およびＣＯ２）交換および液体の物質移動を促進した。
【０２２３】
使用した増殖培地は、以下のｆ／２培地組成物であった（表１）：
表１：増殖培地ｆ／２
【表１】
2012525846.tif 000002
【０２２４】
全ての栄養成分を、最終的に、濾過した天然海水または３.４％海塩からなる人工海水のいずれか１ｌに溶解した。海水は、Institute of Marine Sciences at UNC - Chapel Hill, Morehead City, North Carolina から集めた。海塩は、Aquatic Ecosystem Inc. (Apopka, Florida) から購入した。多量栄養素、微量栄養素またはビタミン混合物の原液は、別々に調製し、使用前に一緒にして混合した。純粋培養培地の調製には、混合した培地をオートクレーブした。
【０２２５】
実施例２
増殖の測定
特有の増殖速度を、細胞計数、５５０ｎｍの吸光度（Ｏ.Ｄ.５５０）、クロロフィル濃度または乾燥重量により測定した。
細胞計数：培養懸濁液１ｍｌを、毎日採取した。微細藻類の細胞をルゴール液（Lugol's solution）で固定し、血球計算器で計数した。細胞濃度を培養体積１ｍｌ当たりの総細胞数として表す。
【０２２６】
乾燥重量分析：１ないし１０ｍｌの培養サンプルを、予め乾燥させ、重量を測定した Whatman GF/C 濾紙で濾過した。濾紙上の細胞を３.４％重炭酸アンモニアで３回洗浄し、塩を除去した。藻類の細胞を含む濾紙を終夜１００℃のオーブンで乾燥させた。重炭酸アンモニアをこの過程で蒸発させた。最終重量と濾過前の重量の差は、サンプルの乾燥重量であった (Lu et al., J. Phycol. 30: 829-833 (1994))。
【０２２７】
Ｏ.Ｄ.５５０：培養懸濁液１ｍｌを毎日採取し、Genesys 10Vis 分光光度計 (Thermo Electron Corp.) を使用して、５５０ｎｍの吸光度を監視した。
クロロフィル＆カロテノイド：０.５ｍｌないし５ｍｌの培養サンプルを、Whatman GF/C濾紙での濾過により回収した。１００％メタノール１ｍｌを使用して色素を終夜４℃で抽出した。遠心分離後に上清を集め、吸収分光法により色素を測定した。下式を使用して、クロロフィルおよびカロテノイドの含有量を算出した：Chl-α (μgmL-1) = 13.9 A665; 総カロテノイド (μgmL-1) = 4A480 (Montero et al., Botanica Marina 45: 305-315 (2002))。
【０２２８】
下式を使用して、特有の増殖速度を算出した：
μ（ｄ−１）＝（ＬｎＮ２−ＬｎＮ１）／（ｔ２−ｔ１）、ここで、ｔ１およびｔ２は異なる時点を表し、Ｎ１およびＮ２は、各々時点ｔ１および時点ｔ２でのクロロフィル濃度、Ｏ.Ｄ.５５０、乾燥重量または細胞濃度を表す。
【０２２９】
実施例３
脂肪酸の抽出および測定
Whatman GF/C 濾紙での濾過により細胞を回収した。Bligh and Dyer (Bligh, E. and W. Dyer, Can. J. Biochem. Physiol. 37: 911-917 (1959) の方法に従って、全脂質を抽出した。
２３０℃のスプリット／スプリットレスインジェクター（split/splittless injector）を備えた Agilent 6890 GC、２６０℃の水素炎イオン化検出器、オートサンプラー (Agilent Technologies, Waldbronn, Germany) および CP SIL 88 カラム (100 m、0.25 mm、0.2.25m フィルム厚、Varian, Datuistadt, Germany) を使用して、脂肪酸メチルエステル分析を実施した。キャリアガスとして、一定流速１ｍｌ／分で水素を使用した。ＧＣオーブンの温度は、３分間７０℃、８℃／分で１８０℃まで上昇、２分間維持、４℃／分で２１０℃まで上昇、４分間維持、２℃／分で最終温度２４０℃まで上昇、２５分間維持に設定した。HP Chemstation ソフトウェア (Rev. A.08.03) をデータ分析に使用した。１：１０のスプリット比を使用してサンプルを注入した。
【０２３０】
実施例４
細胞毒性試験
細胞毒性の測定方法を、Meyer et al. (Planta Med. 45, 31-34 (1982)) に従って改変した。簡潔に述べると、藻類の細胞を、５ｘ１０６細胞／ｍｌの濃度で、トリプリケートで、９６ウェルのマイクロプレートを使用して試験した。ブラインシュリンプの卵 (Artemia salina Leach) を地元のペット店で購入し、人工海水（３.４％海塩の溶液）中、室温で孵化させた。２４時間後、幼生（ノープリウス幼生）を集めた。８−１２匹のノープリウス幼生の懸濁液（１００μｌ）を、藻類の細胞を含む各ウェルに添加し、マイクロプレートを覆い、２４−７２時間室温でインキュベートした。この期間中に、両眼顕微鏡（１０Ｘ）を使用して、各ウェル中の死んだノープリウス幼生の数を計数した。ノープリウス幼生の生存率を、試験した藻類の種の毒性の指標として使用した。
【０２３１】
実施例５
ロドモナス・サリナおよびアンフィジニウム・カルテラエの脂肪酸プロフィール
微細藻類を、１２５ｍｌフラスコ中、ｆ／２培地を用いて、５０μｍｏｌｍ−２ｓ−１の光強度で、室温で培養した。１週間後、細胞を濾過により回収し、脂肪酸組成物をガスクロマトグラフィーにより分析した。
ロドモナス・サリナおよびアンフィジニウム・カルテラエは、十分な量のＳＤＡ（各々、３４％および１７％）を含有すると測定された（図１）。加えて、両方の種は、魚油の主成分であるＥＰＡおよびＤＨＡを産生すると見出された。ＳＤＡの直接の前駆体であるアルファ−リノレン酸（ＡＬＡ）は、Ｒ.サリナでは非常に高かったが、Ａ.カルテラエでは高くなく、ＡＬＡをＳＤＡに変換するＡ−６デサチュラーゼの活性が低レベルであることを示す。
【０２３２】
実施例６
増殖の特徴解析
光強度および温度は、微細藻類の増殖に影響を与える２つの最も重要な環境要因である。Ｒ.サリナおよびＡ.カルテラエの最適増殖条件を決定するために、それらの光強度および温度への必要条件を定義した。
【０２３３】
Ａ. ロドモナス・サリナの増殖の特徴解析
１. Ｒ.サリナの増殖に対する光強度の影響
Ｒ.サリナの細胞を、室温で２０ないし２００μｍｏｌｍ−２ｓ−１の範囲の様々な光強度に付した。サンプルを毎日採取し、Ｒ.サリナの増殖をＣｈｌ−ａおよび細胞数として測定した。
最適光強度は、増殖をＣｈｌ−ａの増加として測定したとき、１００μｍｏｌｍ−２ｓ−１より低かった（図２Ａ）。２００μｍｏｌｍ−２ｓ−１の光強度は、最初の３日間の穏やかな増加の後、鮮明な低下を引き起こした。この結果は、Ｒ.サリナには低い光強度がより好適であり、高い光強度は、Ｒ.サリナの遅い増殖を導く光阻害を引き起こし得ることを示した。同じことが、細胞数を使用してＲ.サリナの増殖を評価した場合にも該当する。従って、１週間後に、光強度１００ないし１５０μｍｏｌｍ−２ｓ−１の培養物から最高の細胞濃度が得られた（図２Ｂ）。これらの増殖条件下で、最終細胞濃度は２ｘ１０６細胞／ｍｌに達し、それは、我々の事前の研究で得られた結果よりも１０倍高いことに留意すべきである。この改善は、培養培地をＥＳで富化した海水培地からｆ／２培地に変更したことによるかもしれない。
【０２３４】
２. Ｒ.サリナの増殖に対する温度の影響
Ｒ.サリナの細胞を、光強度５０μｍｏｌｍ−２ｓ−１で、水浴で１４℃、２２℃、２８℃および３４℃に制御した様々な温度に付した。サンプルを毎日採取し、Ｒ.サリナの増殖をＣｈｌ−ａおよび細胞数として測定した。
【０２３５】
Ｒ.サリナの最適温度は、Ｃｈｌ−ａ（図３Ａ）または細胞数（図３Ｂ）のいずれかの増加として増殖を測定したとき、１４℃であると見出された。増殖は、２２℃および２８℃で、１４℃でのものと比較して低かった。３４℃では増殖は検出できず、この温度で３日後に、Ｃｈｌ−ａおよび細胞数の両方の減少が観察された。海の種として、Ｒ.サリナは３４℃の高温に耐えられず、２８℃でさえ、増殖の有意な減速を引き起こした。
【０２３６】
総色素プロフィールに対する光強度および温度の影響
Ｒ.サリナに対する光強度と温度の影響をさらに分析するために、様々な光強度および温度で増殖させた細胞を濾過により回収し、総色素をメタノールで抽出した。色素プロフィールを図４に示す。クロロフィルの２つの標準的なピークが６６６ｎｍおよび４４０ｎｍ付近で観察され、カロテノイドの肩が４８０ｎｍ付近にあった。異なる光強度と温度は総色素の絶対量に明確な影響を示したが、色素プロフィールのパターンは相互に有意に異ならず、試験した光強度と温度が色素プロフィールに有意に影響を与えないことを示す。
【０２３７】
Ｂ. アンフィジニウム・カルテラエの増殖の特徴
１. Ａ.カルテラエに対する光強度の影響
Ａ.カルテラエの細胞を、室温で、２０ないし２００μｍｏｌｍ−２ｓ−Ｉの範囲の様々な光強度に付した。培養フラスコからサンプルを毎日採取し、Ａ.カルテラエの増殖をＣｈｌ−ａおよび細胞数として測定した。増殖をＣｈｌ−ａの増加として測定したとき、２０ないし１５０μｍｏｌｍ−２ｓ−１の光強度は、増殖に有意な影響を与えなかった（図５Ａ）。対照的に、２００μｍｏｌｍ−２ｓ−１の光強度は、Ｃｈｌ−ａの急速な減少および最終的な培養物の漂白を引き起こした。増殖を細胞数の増加として測定したとき、最適な光強度は、１００ないし１５０μｍｏｌｍ−２ｓ−１の範囲にあった。２００μｍｏｌｍ−２ｓ−１の光強度で、増殖は観察されなかった（図５Ｂ）。これらの結果は、微細藻類のＡ.カルテラエは、高い光強度に非常に敏感であり、合理的な増殖速度のために低い光強度に適応できることを示す。
【０２３８】
２. Ａ.カルテラエに対する温度の影響
Ａ.カルテラエの細胞を、光強度５０μｍｏｌｍ−２ｓ−１で、水浴で１４℃、２２℃、２８℃、３４℃に制御した様々な温度に付した。培養物からサンプルを毎日採取し、Ａ.カルテラエの増殖をＣｈｌ−ａおよび細胞数として測定した。増殖をＣｈｌ−ａ（図６Ａ）および細胞数（図６Ｂ）の増加として測定したとき、Ａ.カルテラエの最適温度は、２２℃の温度であると見出された。１４℃で、増殖速度は２２℃でのものと似ていたが、最終細胞濃度は低かった。３４℃では増殖は検出されなかった；それよりも、Ｃｈｌ−ａおよび細胞数の両方の減少が観察された。
【０２３９】
Ｃ. 総色素プロフィールに対する光強度および温度の影響
Ａ.カルテラエの色素プロフィールを図７に示す。Ｒ.サリナと同様に、色素プロフィールのパターンは、異なる処理（光強度および温度）の間で有意に異ならなかった；しかしながら、総色素の絶対量は、異なる試験条件下で異なった。
【０２４０】
Ｄ. Ｒ.サリナおよびＡ.カルテラエの細胞毒性試験
海藻の細胞毒性は、特に、藻類を水産養殖飼料またはヒトの栄養法に使用するとき、関心事である。Ｒ.サリナおよびＡ.カルテラエを、それらが毒性であるか否かを決定するために試験した。ブラインシュリンプの細胞毒性アッセイをその試験に用い、他の海の微細藻類である舟形珪藻（ＮＬＤ）を負の対照として使用した。様々な濃度の微細藻類細胞を９６ウェルプレートのウェルに分配し、新しく孵化したブラインシュランプの幼生（ノープリウス幼生）を、ノープリウス幼生約１０匹／ウェルの密度で各ウェルに導入した。微細藻類を含まず培地のみを含むウェルを、バックグラウンドの対照として供した。生きているノープリウス幼生の数を毎日計数し、生存率をモニターした。
【０２４１】
図８に示す通り、Ｒ.サリナは、ノープリウス幼生に有害作用を示さず、それは、Ｒ.サリナの細胞が枯渇するまで、数日間増殖し続けた。ＮＤＬは、７０％〜９０％の生存率を示し、それは、バックグラウンド（培地のみ、微細藻類なし）から得られた率と同様であった。Ａ.カルテラエについて、結果は全く驚くべきものであった：２４時間後、５０％を超えるノープリウス幼生が死亡した；４８時間後、１０％未満が生き残った。Ａ.カルテラエがブラインシュリンプのノープリウス幼生に対して毒性であることが明らかである。毒性のメカニズムは決定されなかった。これらの結果は、Ｒ.サリナはブラインシュリンプに対して細胞毒性ではないが、Ａ.カルテラエは明確な毒性を示すことを立証する。
【０２４２】
実施例７
脂肪酸蓄積の条件決定
細胞毒性試験で得られた結果に基づき、Ｒ.サリナをさらなる脂肪酸蓄積の特徴解析およびスケールアップした製造のために選択した。以下の実験は、Ｒ.サリナにおける脂肪酸の蓄積を増加できる方法を試験するために設計した。
【０２４３】
１. Ｒ.サリナの培養段階の影響
典型的な微細藻類の回分培養には、３つの段階が含まれる：（１）誘導期−培養の開始、低い増殖速度の適応期；（２）指数増殖期、急速な細胞分裂を伴う、最も速い増殖期；および（３）定常期−栄養分の枯渇のために、二次的代謝物の蓄積を伴って増殖は減速する。
【０２４４】
Ｒ.サリナが大量の脂肪酸を蓄積する増殖段階を決定するために、以下の実験を実施した。Ｒ.サリナ細胞を、予め決定した最適な光強度および温度（２２℃および１００μｍｏｌｍ−２ｓ−１）で、ｆ／２増殖培地に播種した。細胞を、脂肪酸分析のために、指数増殖期および定常期に各々回収した。
【０２４５】
定常期のＲ.サリナ細胞は、指数増殖期の細胞よりも３倍高い脂肪酸レベルを含むと測定された（図９；青色のバー）。この結果は、Ｒ.サリナからの脂肪酸の製造戦略を設計するうえで興味深い。例えば、細胞を最初に最大のバイオマスを得るのに最適な条件下で培養し、それを定常期で維持し、回収前に所望の脂肪酸を蓄積させることができる。
【０２４６】
２. 栄養の枯渇の効果
微細藻類における脂肪酸の蓄積を誘導するのに有効な方法は、細胞を栄養の枯渇に、最も一般的には窒素またはリンの飢餓に付すことである (Cohen, Z. and C. Ratledge, Single Cell Oils, American Oil Chemists' Society, Champaign, IL, USA (2005))。この方法の実現可能性を試験するために、Ｒ.サリナの細胞を、窒素またはリンを含まないｆ／２培地で３回洗浄し、次いで、同じ培地で６日間増殖させた。６日間の終わりに細胞を回収し、脂肪酸レベルを測定した（図９、右側、黄色のバー）。
【０２４７】
対照と比較して、窒素の飢餓は、有意な脂肪酸の蓄積を誘導しなかった。対照的に、リンを含まない培地は、脂肪酸含有量の有意な増加を誘導した。この結果は、ＳＤＡの大量生産のために、リンの飢餓を用いて脂肪酸の蓄積を誘導できることを示唆する。
【０２４８】
３. 温度の影響
温度は、微細藻類における脂肪酸の蓄積に影響を与え得る要因の１つである。従って、以下の実施例では、Ｒ.サリナおよびＡ.カルテラエにおけるＳＤＡの蓄積に対する温度の影響を研究した。
Ｒ.サリナおよびＡ.カルテラエの細胞を、５０μｍｏｌｍ−２ｓ−１の低い光強度で完全なｆ／２増殖培地に播種し、１４℃、２２℃、２８℃または３３℃の温度に付した。１週間の増殖後、細胞を濾過により回収し、脂質を抽出し、脂肪酸含有量について分析した。図１０に示す通り、Ｒ.サリナのＳＤＡ含有量は、１４℃および２２℃の低温で、３３℃の高温でよりも有意に高いと測定された（図１０）。同様の傾向が、全体的なＳＤＡ含有量がＲ.サリナと比較して少ないＡ.カルテラエにも観察された。ロドモナス・サリナにおけるＳＤＡ含有量に対する光強度の影響を、図１１に示す。
【０２４９】
実施例８
培養されたロドモナス属の微細藻類の脂質プロフィール
ＰＵＦＡのプロフィールをさらに特徴付け、測定するために、ロドモナス属に属する様々な微細藻類の培養物を異なる培養条件下で増殖させ、それらの脂肪酸含有量を定性的および定量的に測定した。
株：ロドモナス株は、ＣＣＭＰから得た（表２）
表２：ロドモナス株および対応する培養培地
【表２】
2012525846.tif 000003
【０２５０】
抗生物質処理（単離段階）：藻類の株４Ｒｓａｌ、５Ｒｓａｌ、９Ｒｓａｌ、１２Ｒｓｐおよび１６−Ｒｓｐを、抗生物質処理に付した。株１２Ｒｓｐの希釈培養物を、１／１０００希釈の無菌トリプシン処理大豆ブロス（細菌の増殖を促進し、それにより抗生物質への感受性を高める）で終夜インキュベートした（外界室温、１３／１１明／暗）。翌日、ゲンタマイシン（８０μｇ／ｍｌ）、バンコマイシン（５０μｇ／ｍｌ）およびクリンダマイシン（２０μｇ／ｍｌ）の組合せを添加し、培養物を４８時間処理した。処理した培養物を、抗生物質を含まない培地に希釈した（１／１０および１／１００）。これらの希釈物のサンプルを、トリプトン、酵母抽出物およびグルコースを添加して栄養価を高めたトリプチケースソイアガー（trypticase soy agar）（海水をベースとする培地で調製）に画線し、細菌の増殖を評価した（外界室温、１３／１１明／暗）。また、希釈した培養物をヒツジ血液寒天培地に画線し、３７℃で増殖させた。これらの富化した固体培地のいずれでも、細菌は増殖しなかった。
【０２５１】
株４Ｒｓａｌ、５Ｒｓａｌ、９Ｒｓａｌおよび１６−Ｒｓｐに関して、これらの株を（１）トリプシン処理大豆ブロス（細菌の増殖を促進し、それにより抗生物質への感受性を高める）の１／１０００希釈物の存在下、４８時間抗生物質で処理し；（２）抗生物質を含まない培地に希釈し；次いで、（３）トリプチケースソイアガー上に増殖した細菌について少なくとも２回評価した。株９Ｒｓａｌおよび１６Ｒｓｐを、ゲンタマイシン（８０μｇ／ｍｌ）、バンコマイシン（５０μｇ／ｍｌ）およびクリンダマイシン（２０μｇ／ｍｌ）の組合せで処理した。株４Ｒｓａｌを上述の抗生物質カクテルで処理し、次いで、セフタジジム（１００μｇ／ｍｌ）で処理した。株５Ｒｓａｌをゲンタマイシン／バンコマイシン／クリンダマイシンのプロトコールに付し、次いで、シプロフロキサシン（１００μｇ／ｍｌ）、メロペネム（１００μｇ／ｍｌ）およびリファンピン（５０μｇ／ｍｌ）でさらに処理した。
【０２５２】
藻類の培養：海水をベースとする培地で、室温（２３−２５℃）で、１３時間／１１時間の明／暗サイクルで、懸濁培養で細胞を増殖させた。光源は、約６００ないし１０００ｌｕｘ（ｌｘ）をインキュベーターの全箇所に提供するSoftWhite 蛍光灯を備えていた。表３および４に示す通り、培地は濾過した海水で調製し、０.０７５ｇのＮａＮＯ３、０.００５ｇのＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２０、培地特異的な微量ミネラル混合物、ビタミン混合物、および、約０.０２７ないし０.００２７ｇのＮＨ４Ｃｌを含有した（１ｌ当たり）（株に応じて異なる）。
【０２５３】
表３：藻類の培地
【表３】
2012525846.tif 000004
ａ組成について、表３を参照。
ｂＣＣＭＰから入手。
ｃオートクレーブ後に添加し、冷却した；オートクレーブした培地を終夜室温で静置し、ＣＯ２で再平衡化を可能にした。
【０２５４】
表４：原液の微量ミネラルおよびビタミン混合物
【表４】
2012525846.tif 000005
ａｇ／Ｌ脱イオン水
ｂ最終１Ｌの脱イオン水に成分を添加または溶解した
ｃ最終体積１Ｌの脱イオン水に成分を添加し、濾過滅菌した
【０２５５】
ビタミンおよびＮＨ４Ｃｌを、オートクレーブ後に無菌の原液から添加した。細胞をオートクレーブしたガラス管（２０ｘ１２５ｍｍ）またはホイルで蓋をしたガラスフラスコ（１２５−５００ｍｌ）中、静置懸濁液で、断続的に２−４日毎に穏やかに混合しながら（回旋による）、増殖させた。標準的な無菌的技法を使用して細胞を継代培養した。全ての培養物および使用済みの培地は、廃棄前にオートクレーブした。
【０２５６】
増殖速度の列挙および評価：細胞増殖を、これらの着色した生物の懸濁液の色（株によって、赤色または茶色）の増加の目視検査によりモニターした。適当な希釈物（２５−３０細胞／１０スクエア（suquares））を、血球計算器で、２−３日間隔で計数することにより、細胞を数えた。これらは鞭毛のある生物であるので、細胞の生存率の評価を海水に希釈した懸濁液において顕微鏡的にモニターした。より正確な計数は、殆どの株の細胞を動かなくするリン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）に希釈したサンプルで実施した。増殖率を、培養日数の関数としての細胞数の片対数プロットの傾きから見積もられる倍加時間（ＤＴ）として表し、一次方程式（ｙ＝ａｘ＋ｂ）を使用して、ｙ＝ｌｏｇ２（細胞密度の倍加）、ｂ＝０として、ｌｏｇ２＝傾きｘＤＴである。ＤＴについて解くと、ｌｏｇ２＝０.３０１のとき、ＤＴ＝０.３０１／傾きである。
【０２５７】
脂肪酸含有量の評価：サンプル当たり約５百万−１千万個の細胞から、Bligh and Dyer, Can. J. Biochem. Physiol., 37:911-7 (1959) の方法により全脂質を抽出した。ガラススクリューキャップ（Teflon ライナー）のある１６ｘ１２５ｍｍのチューブ中の遠心分離（１０００ｘｇ；２０分間；２５℃）により懸濁液中の細胞を回収し；そして、細胞を含まない培地を吸引し、廃棄した。細胞のペレットを０.８ｍｌ脱イオンＨ２０に懸濁し、メタノール２ｍｌの添加により溶解し、クロロホルム１ｍｌの添加により抽出した。単相を達成するのに必要であれば、メタノールを滴下して添加した。希Ｈ２ＳＯ４１ｍｌ（濃Ｈ２ＳＯ４０.２５ｍｌ／脱イオンＨ２０５００ｍｌ）およびクロロホルム１ｍｌを添加し、続いて激しく混合し、遠心分離（４００ｘｇ、１０分間、４℃）することにより相を分けた。全脂質は、底のクロロホルム相に回収され、それを、内部標準（トリヘプタデカノイン）１０μｇを含むガラススクリューキャップのある新しい１６ｘ１２５ｍｍのチューブに移した。クロロホルム抽出物を窒素ガス気流下で乾燥させた。エタノール１ｍｌおよび５０％ＫＯＨ（ｗ／ｖ）０.１ｍｌの添加により全脂肪酸を鹸化した。蓋のあるチューブを、加熱ブロック中、１０分間６０℃で加熱し、ボルテックスする前に、続いてさらに２０分間６０℃で加熱した。チューブが冷えた後、中性の脂質およびコレステロールを、ヘキサン２ｍｌおよび脱イオンＨ２０１ｍｌの添加により抽出した。激しく混合した後、相を遠心分離（４００ｘｇ、１０分間、４℃）により分離し、上（ヘキサン）の相を吸引し、廃棄した。遊離脂肪酸を下の水相から、ヘキサン２ｍｌおよび氷酢酸０.１ｍｌの添加、続いて激しい混合および遠心分離（４００ｘｇ１０分間、４℃）により抽出した。脂肪酸を含有する上の相（ヘキサン）を、ガラススクリューキャップ（Teflon ライナー）のある新しい１３ｘ１００ｍｍのチューブに移した。ヘキサン抽出物を窒素ガス気流下で乾燥させた。乾燥させた抽出物に０.５Ｍ ＮａＯＨ（メタノール中）１ｍｌを添加し、５分間１００℃で加熱することにより、脂肪酸を誘導体化のために調製した。三フッ化ホウ素（メタノール中の１４％ＢＦ３１ｍｌ／チューブ）の存在下、５分間１００℃で加熱して、脂肪酸を誘導体化した。ヘキサン２ｍｌおよび飽和ＮａＣｌ２ｍｌ（３６ｇ／脱イオンＨ２０１００ｍｌ）を添加し、続いて激しく混合し、遠心分離（４００ｘｇ、１０分間、４℃）することにより、脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）誘導体を抽出した。上の相（ヘキサン）を新しい１３ｘ１００ｍｍチューブに移した。ヘキサン抽出物を窒素ガス気流下で乾燥させ、イソオクタン（０.２５−０.５ｍｌ）に再溶解し、新しい１ｍｌのクリンプ栓のバイアルに移し、密封した。
【０２５８】
脂肪酸メチルエステルを分離し、ガス液体クロマトグラフィー（ＧＬＣ）により、オン−カラムキャピラリーインレット、水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）および Agilent 7683B オートサンプラー／インジェクターを備えた、温度をプログラムされた Agilent 6890N ガスクロマトグラフに設置された CP-Select CB for FAME キャピラリーカラム、100m x 0.25mm id, (Varian) で定量した。クロマトグラフィーの条件は、Ｈ２キャリアガス、２０ｐｓｉ上部圧力；窒素メークアップガス、２５ｍｌ／分；オーブンの温度より３℃高い入口温度；および２３０℃でのＦＩＤであった。オーブンの温度は、９０℃で始まり、０.５分間維持、１０℃／分で１５０℃まで上昇、２.５℃／分で２００℃まで上昇、１.５℃／分で最終温度の２２０℃まで上昇、２２０℃で２０分間維持するようプログラムした。総ランタイムは、６０分間プラス、各ランの間の平衡化期間の５分間である。
【０２５９】
クロマトグラフィーのデータ収集および分析は、Chrom Perfect（商標） Spirit Chromatography Data System, Version 5.5 (Justice Laboratory Software) を Microsoft Windows XP で走らせる、2.8 GHz Intel Pentium 4 パーソナルコンピューターへのＵＳＢシリアルアダプターによった。各クロマトグラムを、構成脂肪酸の正しい同定および品質管理のために調べた。データは、Microsoft Excel で、サンプル当たりの各々の同定された脂肪酸の量として報告された。主要な脂肪酸の較正は、クロマトグラフィーソフトウェアにより実施し、既知組成物の標準的ＦＡＭＥ液の定期的な注入により更新した。
【０２６０】
栄養のアッセイ：培地のリン酸塩を、日常的な比色分析アッセイを使用して測定した。リン酸塩を含む洗浄剤で洗浄されていない専用のチューブ（ガラススクリューキャップ（Teflon ライナー）のある１６ｘ１２５ｍｍのチューブ）およびキャップをこのアッセイに使用した。デュプリケートで、海水９００μｌ中、リン酸ナトリウム（二塩基性）の１ｍＭ原液を使用して、標準曲線を構築した（０、２、５、１０、２０、４０、６０ｎｍｏｌｅ／チューブ、体積６０μｌ）。脱イオンＨ２０（６０μｌ）をデュプリケートのサンプルチューブに添加し、続いて９００μｌの細胞を含まない培地を添加した。各標準およびサンプルのチューブに３回の添加を行い、続いてボルテックスで混合した。これらの添加は、過塩素酸１５０μｌ（６０％）、２.５％モリブデン酸アンモニウム１６７μｌおよび１０％アスコルビン酸１６７μｌであった（ｗ／ｖ；新たに調製した）。チューブに蓋をし、５０℃で１５分間インキュベートした。チューブが冷えた後、脱イオンＨ２０に対して８２０ｎｍの吸光度を測定した。サンプルのリン酸塩濃度を標準曲線から見積もった。
【０２６１】
紫外分光光度法を使用して硝酸塩を見積もった。１ｍＭ硝酸ナトリウム原液を使用して標準曲線を構築した（０、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０μＭ、脱イオンＨ２０５ｍｌ中、デュプリケート）。細胞を含まない培地および海水（ブランク）を脱イオンＨ２０２ｍｌ中で１対４０に希釈した（トリプリケートまたはクアドロプリケート）。標準および希釈したサンプルの２２０ｎｍでの吸光度を、脱イオンＨ２０に対して測定した。海水のブランクを差し引いた後、サンプルの硝酸塩の濃度を標準曲線から見積もった。
【０２６２】
図１２に示す通り、抗生物質での処理は、例えば９Ｒｓａｌについて測定される脂肪酸のプロフィールを変えなかった。
図１３は、定常期に測定したロドモナスの株の脂肪酸（ＦＡ）分析を示す（データは、細胞数に標準化していない）。結果は、株１２Ｒｓｐについて、比較的高いＳＤＡの含有量（３３.８％；図１３Ａ）および比較的低い不飽和および一飽和ＦＡの含有量（３６.７％；図１３Ｂ）を示す。
【０２６３】
実施例９
培養された微細藻類のロドモナス属の増殖の特徴および脂質のプロフィール
株１Ｒｓａｌ、６Ｒｓａｌ、８Ｒｓａｌ、１３Ｒｓｐおよび１７Ｒｓａｐを除く全ての株を、ガラスの培養チューブにトリプリケートで、適当なＣＣＭＰに推奨される培地５ｍｌ中、約１０４細胞／ｍｌの密度で播種した。株１Ｒｓａｌ、６Ｒｓａｌ、８Ｒｓａｌ、１３Ｒｓｐおよび１７Ｒｓａｐには、最初のＣＣＭＰ懸濁液４ｍｌをガラスの培養チューブにトリプリケートで分注した。全チューブをインキュベーターに入れ、室温（２３−２４℃）で増殖させ、２３Ｗの小型蛍光灯で１３時間の明所（７ａｍ−８ｐｍ）／１１時間の暗所のサイクルで照射した。各株のトリプリケートのチューブの１本を、３−４日間隔で計数した。株の受領の１、２日後に、第２の対のチューブに、各々、より濃い株で、細胞のバックソース（back source）として播種した。これらの培養物を、後にＦＡ分析に使用した。結果を表５に示す。
【０２６４】
表５：微細藻類細胞の倍加時間
【表５】
2012525846.tif 000006
【０２６５】
表５に示す通り、倍加時間（ＤＴ）は１.９ないし６.８日間の範囲にあり、殆どの株は、約２.３日毎に倍加した。この実験設定で利用した培養体積（５−１０ｍｌ）では、殆どの生存株は、最初に培地に播種されたときに、明白な増殖の誘導時間を示さなかった（図１４）。
【０２６６】
ＦＡ含有量分析には、回収時の密度約３０ないし３５０万個の細胞／ｍｌの各株のサンプル（５百万−１千万個の細胞／サンプル）を、各々低密度から高密度まで、抽出し、加工し、ＦＡ含有量について分析した。各株の回収時の密度を表６に示す。
表６：回収時の細胞密度
【表６】
2012525846.tif 000007
a 回収時
【０２６７】
表５に示す株（低密度回収）のＰＵＦＡの分布のまとめを、図１５に示す。結果は、これらの株のＰＵＦＡ含有量は総ＦＡの約７５−８０％を占め、不飽和または一飽和の種が優勢であることを示す。さらに、図１６に示す通り、細胞のＳＤＡ含有量は、細胞回収の密度によって変動した。μｇ量（細胞百万個当たり）の単位では、定常期の細胞は、より多くのＳＤＡを含有する傾向があった。しかしながら、ＳＤＡは、増殖曲線の後ろの段階では、総ＦＡ含有量中の少ない割合であった。株４Ｒｓａｌ、５Ｒｓａｌ、９Ｓａｌ、１２Ｒｓｐおよび１６ＲｓａｌのＰＵＦＡ含有量を、図１７に示す。
【０２６８】
実施例１０
細胞密度および栄養レベルはＦＡプロフィールに影響する
ＦＡ含有量に対する細胞密度および／または栄養レベルの影響を測定するために、様々な微細藻類株の増殖曲線、ＦＡプロフィールおよび栄養利用を並行して調べた。
株４Ｒｓａｌ、５Ｒｓａｌ、１６Ｒｓｐおよび１２Ｒｓｐの各々を、そのＣＣＭＰ−に推奨される培地中、２つの異なる培地のリン酸塩の濃度で増殖させた：通常（即ち、約３６μＭ；ＣＣＭＰ推奨）；および低い（即ち、約１８μＭ）。
【０２６９】
細胞を遠心分離（１０００ｘｇ、ＲＴ、１０分間）により集め、それらの適当な基礎培地（リン酸塩なし）で１回洗浄した。洗浄した細胞を、それらの適当な培地（通常または低リン酸塩の適当な基礎培地）２０ｍｌに懸濁した。これらの懸濁液を、表７に示す通り、無菌の５００ｍｌガラスフラスコ中の同じ培地３８０ｍｌに添加した。
表７：微細藻類の培養物
【表７】
2012525846.tif 000008
【０２７０】
静的条件下、約２４℃で、約７００ルクスで照射される１３／１１時間の光周期で、培養物を増殖させた。３−４日の間隔で細胞の計数を実施した。培地の栄養レベル、細胞のＦＡ含有量および細胞の脂質リン含有量のために、定期的にサンプルを回収した。これらのサンプルについて、ある量の細胞懸濁液（可能なときはデュプリケートで）をフラスコから取り、細胞を遠心分離（１０００ｘｇ、ＲＴ、１０分間）により集めた。細胞を含まない上清を、標識した新しいチューブに移し、培地の硝酸塩およびリン酸塩の測定のために−２０℃で保存した。細胞のペレットを Bligh and Dyer, Can. J. Biochem Physiol., 37:911-7 (1959) に従って抽出し、総脂質抽出物をＦＡ分析および脂質リン含有量のために−２０℃で保存した。後者は、培地のリン酸塩について記載したアッセイを使用して測定したが、但し、５百万個の細胞からの総脂質抽出物を窒素ガス気流下で乾燥させ、その後、水６０μｌおよび６０％過塩素酸１５０μｌを添加した。この混合物を、１７０−１８０℃で、乾いたヒートブロック中、溶液が無色になるまで（２−８時間）消化させ、その後、上記の通りにアッセイを継続した。
【０２７１】
図１８は、通常（Ｎ）または低（Ｌ）培地リン酸塩条件下で増殖させたときの株１２Ｒｓｐの増殖曲線を示す。指数増殖または定常増殖期は、この株について、培地のリン酸レベルにより大きく影響はされなかった。同様の観察が、株４Ｒｓａｌ、５Ｒｓａｌおよび１６Ｒｓｐについて行われた。
【０２７２】
主要な藻類の栄養（硝酸塩およびリン酸塩）の培地濃度を、藻類の増殖の過程でモニターした。図１９は、１２Ｒｓｐを増殖させた培地中の栄養レベルを示す。低い条件の最初のリン酸塩濃度（図１９、Ａ）は約１８μＭであり、約３０日で消費されるまで、ほぼ一定の割合で減少した。通常のリン酸塩条件（約３５μＭ）でのリン酸塩の利用は、最初の１５日間で遅く、次いで、約４０日で消費されるまで、ほぼ一定の割合で減少した。硝酸塩の利用は、両方のリン酸塩条件で類似し（図１９、Ｂ）、完全には消費されなかった。１２Ｒｓｐ細胞を培養したｈ／２培地は、アンモニウムの形態で第２の窒素供給源を有し、それはこの実験では測定せず、恐らく、比較的遅い硝酸塩の消費を説明するものである。
【０２７３】
ＦＡ含有量を、増殖曲線中のいくつかの時点で、各株について、各培地リン酸塩条件で評価した。図２０に示す通り、細胞のＳＤＡ含有量は、全ての株について、培養中の時間に伴っていくらか変動する。株中の最大のＳＤＡ含有量は、株１２Ｒｓｐ、４Ｒｓａｌ、５Ｒｓａｌおよび６Ｒｓｐについて、各々、総ＦＡの約３０％、２５％、３５％および４０％であった。ＳＤＡ含有量は各株において最大になり、次いで２０−２５日間を過ぎて減少する傾向があり、そのときに殆どの培養物は指数増殖期後期または定常期に入る。長鎖ＦＡ、ＤＨＡの含有量は、増殖曲線においていくらかの変化を示すが、一般的に、ＳＤＡより低いままである（総ＦＡの７−２０％）（図２１参照）。
【０２７４】
さらに、図２２に示す通り、株１２Ｒｓｐは、総ＦＡの約５％のＧＬＡ含有量を有した。最初の培地リン酸塩レベルは、細胞のＧＬＡ含有量に本質的に何の影響もないと思われた。
【０２７５】
さらに、図２３は、１２ＲｓｐにおけるＳＤＡのレベルは、培地のリン酸塩が減少し始め、細胞が急速な増殖の期間である対数期中期に入ると最大に達することを示す。次いで、ＳＤＡ含有量は、さらにリン酸塩が消費されるにつれ、減少する。対照的に、ＧＬＡ含有量は、対数期で低く、細胞がより多くの培地のリン酸塩を消費し、対数期後期−定常期に入ると増加し始める。ＤＨＡレベルは、培地中の栄養レベルの変化を、相対的に免れると思われる。（消費により枯渇した）栄養をさらに補充されていない培地における、増殖曲線の後ろの段階での１２Ｒｓｐの通常の増殖は、ＳＤＡの合成からＧＬＡの合成への移行を引き起こすと思われる。株４Ｒｓａｌ、５Ｒｓａｌおよび１６Ｒｓｐの結果を、各々図２４、２５および２６に示す。さらに、増殖曲線の関数としてのＦＡ分析のまとめを、株１２Ｒｓｐ、４Ｒｓａｌ、５Ｒｓａｌおよび１６Ｒｓｐについて、各々図２７、２８、２９および３０に示す。
【０２７６】
株１２Ｒｓｐでは、細胞密度の増加に伴い、細胞の全脂肪酸含有量はわずかに増加した（図３１）。α−リノレン酸［ＡＬＡ、Ｃ１８：３（ｎ−３）］、ＳＤＡ、ＥＰＡおよびＤＨＡは、全て、培養が定常増殖期に移行すると、総ＦＡの割合として小さい減少を示した（図３１）。驚くべきことに、１２Ｒｓｐにおいて、細胞密度が上昇するにつれて、オメガ−６ １８炭素ＦＡ、ＬＡおよびＧＬＡの予想外の付随した増加があった（図３１Ｃ）。対照的に、この移行は、調査した他の株（４Ｒｓａｌ、５Ｒｓａｌ、９Ｒｓａｌ、１６Ｒｓｐ）のいずれでも見られなかった（データは示さない）。これらの結果は、株１２Ｒｓｐにおいて、細胞が定常期でストレスを受けると、Δ１５デサチュラーゼの段階（これは、ｎ−６脂肪酸をｎ−３脂肪酸に変換する）がある程度阻害され得ることを示唆する。実際に、１２ＲｓｐのＳＤＡ含有量は、培地のリン酸塩が３０％のみに減少し、培地の硝酸塩濃度が変化しないときに、最大に達する（総ＦＡの２９％；図３２Ａ、破線）。対照的に、株５ＲｓａｌのピークのＳＤＡ含有量（総ＦＡの３１％；図３２Ｂ、破線）は、培地の硝酸塩が７０％まで減少し、培地のリン酸塩濃度が変化しないときに起こった。従って、同じ属の構成員におけるＰＵＦＡ合成は、異なって制御されていると思われる。さらに、これらの知見は、ロドモナスのＦＡ含有量を、所望のＦＡ組成物を得るために操作できることを示唆する。さらに、最初の実験は、藻類バイオマスの約２５−３５％（乾燥重量）は、ＦＡをベースとする脂質からなることを示唆する。
【０２７７】
細胞密度の増加に伴う１２Ｒｓｐにおけるオメガ−６ １８炭素ＦＡ、ＬＡおよびＧＬＡの驚くべき増加は、ＳＤＡおよびＡＬＡだけではなくＧＬＡも含有する藻類の産生に、決定的な手段を提供する。ＳＤＡ／ＧＬＡの組合せを含有する種実油は、患者集団において慢性疾患のヒトのバイオマーカーを阻止するのに最も有効であると示されてきた。
【０２７８】
実施例１１
ＦＡプロフィールに対する炭素供給源の影響
藻類のＦＡ含有量を操作する代替的な方法を決定するために、株Ｒｓｐ１２の増殖およびＦＡ含有量を、単一の量のグルコース（５５ｍＭ）または酢酸塩（２ｍＭ）の存在下で測定した。図３３に示す通り、オメガ−６系統の前駆物質のリノール酸（ＬＡ）の少しの減少およびいくつかのオメガ−３ＦＡ（ＡＬＡ、ＳＤＡ、ＥＰＡ、ＤＨＡ）の少しの増加が観察された。これらの知見は、選択されたロドモナスの株は、有機炭素供給源を利用でき、それらの補充はＦＡプロフィールを変更できることを示唆する。最も光に敏感な株（１６Ｒｓｐ）の増殖を、グリセロール（０.１Ｍおよび０.４Ｍ）の存在下で調べた。これらの量は、以前に珪藻類および緑藻類の研究において使用された。結果は、株１６Ｒｓｐは繁栄しなかったが、死亡しなかったことを示す（データは示さない）。しかしながら、グリセロールへの曝露は、細胞からのクロロフィルの喪失を誘導した。
【０２７９】
実施例１２
リアクターで培養されたロドモナスの増殖およびＦＡのプロフィール
ロドモナス株がリアクター条件下で繁栄できるか否かを決定するために、株１２Ｒｓｐを３０Ｌガラスリアクターで増殖させた（図３４）。
ガラス壁の３０Ｌリアクター（ChemFlowtronics）を、１０％ブリーチで清浄化し（終夜）、少なくとも６回水道水ですすぎ、次いで、少なくとも３回脱イオン水ですすいだ（図３４Ａ）。リアクターを空気乾燥させた。Teflon の蓋を同様に洗浄し、７０％イソプロパノールですすぎ、組み立てるまでオートクレーブ紙で包んでおいた。リアクターを７０％イソプロパノールで徹底的にすすぎ、リアクターが湿っているうちに蓋を載せ、組み立てたリアクターを空気乾燥させた。培地を添加する前に、乾燥させたリアクターを、濾過した海水ですすいだ。オートクレーブした漏斗を使用して、蓋の出入り口を通して、濾過した海水約２８Ｌをリアクターに添加した。３０Ｌの最終体積に適する体積のＣＣＭＰ培地キット（ｆ／２）用の１０００ｘ栄養分をリアクターに添加した。塩化アンモニウムを培地に添加し、１２Ｒｓｐに必要なｈ／２培地を作成した。パドル（３層のTeflon）の撹拌機構を約６０−１００ｒｐｍで開始し、それは、家庭用送気管上のフィルター付き空気圧モーターを動力とした。
【０２８０】
リアクターに１２Ｒｓｐ約２Ｌを播種し、最初の細胞密度約４.５ｘ１０４細胞／ｍｌを得た（図３４Ｂ）。培養物を継続的に撹拌し、３個の１４Ｗ蛍光灯で照射した（１３／１１時間の明／暗サイクル）。細胞密度、ｐＨ（試験紙、次いでｐＨメーターにより）、栄養分（リン酸塩、硝酸塩）レベルおよびＣＯ２含有量（ＮａＯＨによるフェノールフタレイン滴定；まだ定量的ではなく、そのときの相対値のみ）を規則的な間隔でモニターした。最大の細胞密度を得るために、栄養分が消費されるにつれ、培地にそれを補充した。
【０２８１】
培養物が最大密度に達すると（約８０万個の細胞／ｍｌ；図３４Ｃ）、リアクター表面、特に入射光を受ける表面近くへの細胞の接着の増加が観察された。それでも、栄養分の変動、継続的撹拌および高密度での自己遮蔽により誘導される潜在的なストレスにも拘わらず、株１２Ｒｓｐはリアクター中で繁栄した。従って、培養の大規模化を達成することは実現可能である。
【０２８２】
さらに、このフォトバイオリアクター（ＰＢＲ）で達成される最大細胞密度は、リアクター表面への細胞の接着のために、総バイオマスを過小評価する。リアクターの培養物を４１日目に細胞密度５.４ｘ１０５細胞／ｍｌで回収した。これは、１９日目のピーク細胞密度７.６ｘ１０５細胞／ｍｌより低い。恐らく、たとえ細胞密度が減少しても、培養物は定常期にあった。容器壁およびパドルへの接着の増加が、培養時間の最後の部分で観察された。栄養分の添加にも拘わらず、細胞が栄養のストレス要因を経験した見込みが高い。
【０２８３】
回収時の細胞のＦＡ含有量を、細胞の乾燥重量の見積りとして評価した。総脂質抽出物をデュプリケートの約１千万個の細胞のサンプルから調製し、上記の通りに分析した。１千万個の細胞を、予め乾燥させ、予め重量測定したガラス繊維濾紙（４.２５ｃｍ）で濾過し、重炭酸アンモニウム３.４％で３回洗浄することにより、乾燥重量を見積もった。洗浄した濾紙を終夜乾燥させ（１００℃）、再び重量を測定し、乾燥重量を差により算出した。回収した細胞は、９８.９μｇ／細胞百万個であった。リアクターから回収された細胞の総数は、１.６ｘ１０１０細胞であった（懸濁液中の細胞の密度に基づく；やはり回収された接着した細胞のために、恐らく過小評価である）。従って、リアクター回収物の総乾燥重量は、藻類バイオマス乾燥重量１.５８ｇであると予想される。
【０２８４】
懸濁液約３０Ｌを、１ミクロンの孔の予め重量測定したポリエステルフェルトフィルター袋（sock）２枚を通して濾過し（McMaster-Carr, Atlanta）、体積の約半分を各袋に通した。孔サイズ（この生物より小さい）にも拘わらず、濾液は錆色に見え、濾液中の１２Ｒｓｐ藻類の存在を示した。これを濾液の顕微鏡観察により確認した。従って、濾液を遠心分離（１０００ｘｇ、ＲＴ、２０分）し、細胞を回収した。上清をデカンタし、溜まった残りの細胞をフィルター袋に戻して加えた。全ての細胞を含まない培地を、廃棄前にオートクレーブした。紙タオルを数枚取り替えながら、その上にフィルター袋を置き、できるだけ多くの液体を締め出した。袋の開口部を２重にした透明のプラスチックラップで覆い、輪ゴムで留めた。各袋を小型の個別のプラスチック袋に入れ、ラベルした。両方の袋をもっと大きい袋に入れ、さらに処理するまで−２０℃で保存した。
【０２８５】
図３５に示す通り、１２Ｒｓｐの増殖速度は、栄養物の添加に応答性であった。リン酸塩（図３５Ａ）は、硝酸塩（図３５Ｂ）の約２倍の速度で消費された。しかしながら、硝酸塩の添加（＋Ｎ、破線矢印；３２日目）は、リン酸塩（＋Ｐ、実線矢印；２５＆３９日目）の添加よりも強く、増殖速度を回復させるように見えた。我々は、培地のリン酸塩および硝酸塩の濃度をそれらの最適レベルの２０％以内（赤く囲んだ範囲）に維持することが、増殖速度に対する栄養分の限定の影響を最小限にするという仮説を立てる。結果は、培地のリン酸塩および硝酸塩の濃度をそれらの最適レベルの２０％以内（図３５、影をつけた範囲）に維持することが、増殖速度に対する栄養分の限定の影響を最小限にできることを示唆する。これらの細胞のＧＬＡ（Ｃ１８：３ｎ−６；約２.４％）含有量の増加は、それらが栄養のストレスを経験し始めていたことを示唆する（図３６Ａ；図３６Ｃ）。
【０２８６】
実施例１３
様々な培養容器における微細藻類の増殖
図２６は、今日までに試験された様々な培養容器における株Ｒｓｐ１２の増殖曲線の比較を示す。容器のサイズが大きくなるにつれて増殖速度は低下し（図３７Ａ）、倍加時間（ＤＴ；表８も参照）の増加をもたらした。
表８：倍加時間
【表８】
2012525846.tif 000009
【０２８７】
また、容器のサイズに伴って最初の誘導時間が長くなった（図２６Ｂ）（チューブ、２日間；フラスコ、１８日間；リアクター、２０日間）。容器の直径を考慮にいれると（ＤＴ／√直径）、３つの容器における微細藻類の補正した倍加時間（表８；直径で補正した倍加時間）は同等である。
【０２８８】
より大きい容器における長い光の経路が、明確な遅い増殖の原因であると思われる。他の選択された株（表８）の倍加時間が、１２Ｒｓｐについて観察されたものと同じ傾向に従うと思われることは、注目に値する。従って、全ての株の増殖速度は、容器のサイズと構造によって定義でき、より低い程度で藻類の株の固有の特性によって定義できる。
【０２８９】
実施例１４
微細藻類株１２Ｒｓｐの系統学的判定
株１２Ｒｓｐをさらに測定するために、その核およびヌクレオモルフにコードされる１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を配列決定し、分析した。
細胞培養および核酸抽出：１２Ｒｓｐを、２２℃で、ｆ／２−Ｓｉ培地中、１４ｈ−１０ｈの日周サイクルで増殖させた。濃い１００−２００ｍＬの培養物を遠心分離により回収し、核酸抽出に付した。細胞のペレットをＴｒｉｓ−ＨＣｌ抽出バッファー（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.５、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、０.５％ＳＤＳ）に再懸濁し、１０分間５０℃でインキュベートした。サンプルを５分間遠心分離し（１５,０００Ｘｇ）、フェノールおよびクロロホルムを使用して水相を２回抽出した。ＤＮＡを水相からエタノール沈殿させ、最高速度の遠心分離によりペレットにした。ペレットをエタノールで洗浄し、乾燥させ、２００ｍｌのＴＥバッファーに再懸濁し、−２０℃で保存した。
【０２９０】
ＰＣＲ増幅、クローニングおよび配列決定：小サブユニットリボソームＲＮＡ（ＳＳＵ ｒＲＮＡ）遺伝子を、Eppendorf Mastercycler で、Platinum High Fidelity Taq ポリメラーゼ (Invitrogen) および以下のプライマー: Cr.NM.SSU.F1: 5'-CAG TAG TCA TAT GCT TGT CTT AAG-3'(配列番号３); G07: 5'-AGC TTG ATC CTT CTG CAG GTT CAC CTA-3'(配列番号４) を使用して、ＰＣＲで増幅させた。ＰＣＲの条件には、最初の５分間の９４℃の変性段階、９４℃で３０秒間、５０℃で１分間および６８℃で４分間を４５サイクル、および最後の５分間の６８℃での伸長が含まれた。ＰＣＲ産物を０.８％アガロースクリスタルバイオレットゲルで電気泳動に付した。予想されるサイズの増幅産物（約１.８キロ塩基対）を切り出し、MinElute Gel Extraction Kit (Catalog number 28604, Qiagen, Valencia, CA) で精製した。精製した産物を、TOPO XL Cloning Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA) を使用してクローニングした。１６個のクローンを、挿入断片の存在について、Ｍ１３フォワードおよびリバースプライマーを使用して、ＰＣＲでスクリーニングした（９４℃３分間、４５サイクルの９４℃３０秒間、４５℃３０秒間、７２℃３分間）。挿入断片を含むクローン８個を、CEQ Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, Calif.) を使用して配列決定し、Beckman CEQ8000 キャピラリーＤＮＡシークエンサーで実行した。ユニバーサル（Ｍ１３）プライマーおよび内部の遺伝子特異的プライマーの組合せを使用して、挿入配列を両鎖で完全に配列解読した。
【０２９１】
１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列分析および株の決定：上記で決定したＳＳＵ ｒＲＮＡ遺伝子配列を、BLASTn アルゴリズムおよび BLAST ツリーウィジェットを Neighbor Joining 設定で使用して (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)、GenBank の公開データベースに存在するものと比較した。これらの分析は、２つの別個の遺伝子断片が１２Ｒｓｐから増幅されたことを明らかにし、これらは、核およびヌクレオモルフにコードされる遺伝子座の両方に相当し、これらの遺伝子断片は、各々１７０５（配列番号１）および１８２２（配列番号２）ヌクレオチドのサイズであった。ヌクレオモルフの遺伝子断片は、ロドモナス・マリアナのヌクレオモルフＳＳＵ ｒＤＮＡ遺伝子 (GenBank Accession # X81374) と９９％の同一性（１８２２残基中、１８０８）を有すると見出された。核遺伝子断片は、ＣＣＭＰ７５７コンセンサス配列中の２つの不明瞭な位置を除き、ロドモナス・マクラテ (Accession # AF508274) およびロドモナス・サリナ (Accession # EU926158) のＳＳＵｒ ＲＮＡ遺伝子と同一であった。
【０２９２】
ＢＬＡＳＴおよび系統学的分析に基づき、株１２Ｒｓｐは、ロドモナス・バルチカＲＣＣ３５０、Ｒ.サリナＣＣＭＰ１３１９およびロドモナス・マリアナを含むロドモナス株のクラスターに非常に近いが、同一ではないことが明らかである。図３９に、拡張されたクリプト藻類のファミリーを含む系統樹のセクションにおける株１２Ｒｓｐの暫定的な位置を示す。
【０２９３】
実施例１５
微細藻類から抽出した脂質組成物
微細藻類バイオマス約１.５８ｇ（乾燥重量）を含むフィルター袋２枚を、洗浄１回につき３Ａバージンエタノール１００ｍｌを使用して、各々５回別々に洗浄し、藻類および残留油をそこから取り出した。
【０２９４】
これにより、全部で約１,０００ｍｌの溶液を得、次いで、熱プローブと組み合わせたホットプレートスターラーを使用して、それを窒素被覆下で５０℃に加熱した。この条件でスターラーバーにより溶液を３０分間穏やかに撹拌した。次いで、溶液を２５０ｍｌまで（Brinkman 169 Vacuum Aspirator に合わせた Rotovapor R110 により）蒸発させ、アルコールの大部分を除去した。浴温度は、完全な許容し得る真空で、４６−４８℃で変動した。各容器間の移動中に、少量（２０ｍｌ未満）のエタノールを使用して、物質を含まない前の容器を洗浄した。得られた溶液は暗緑色であり、アルコールの大部分、並びに、溶解したクロロフィルおよび油を含んだ。少量の白色沈殿があり、これは、残留した塩および藻類由来のいくつかのステロール類である可能性が高いと判定された。
【０２９５】
次いで、２５０ｍｌ（概算）の溶液を、各０.５％（重量で）の以下のものを添加した５００ｍｌのビーカーに移した：漂白粘土、活性炭および濾過助剤。この混合物をホットプレートに戻し、窒素下、６０℃で３０分間撹拌し、次いで、真空の補助を使用して、無灰紙で濾過した。得られた産物（今や顕著に色が明るい）を、２５０ｍｌのビーカーに戻し、６０℃のホットプレート／スターラーにより、そして窒素吸引により補助して、さらに減らす。体積が３０ｍｌに達したら、物質を再度、等量の酸性水（等割合の硫酸およびリン酸により、ｐＨ１.５）を含む１００ｍｌのビーカーに移した。これを６０℃で、窒素被覆下、５０分間加熱／撹拌し、総体積約４０ｍｌへの減少をもたらす。この溶液は、主に、暗色の沈殿および暗緑色の油膜を伴う、着色した水であると思われた。クロロフィル沈殿を含む水を除去した。油膜を２５ｍｌのビーカーに入れ、２５０ｍｌの容器をエタノール１０ｍｌですすぎ、全部の移動を確実にした。アルコールを６０℃で、ホットプレート／スターラー（デジタルの設定値のあるプレート、熱プローブなし）で、窒素吸引して蒸発させた。アルコールがほぼなくなったら、物質を段階的に４ｍｌのバイアルに移し、油が完全に乾燥するまで、６０℃に設定したヒートブロックに入れ、窒素で吸引した。結果は、約３ｍｌの油であった。
【０２９６】
実施例１６
微細藻類から調製した脂質組成物を含む食品
実施例１５に従い調製した脂質組成物を、約１.８ｇ／杯または調製ヨーグルトベースの１.０％のレベルで、ヨーグルトに添加した。油を含むヨーグルト（バッチ１）および油を含まない対照のヨーグルト（バッチ２）の処方および算出した概算の組成を、表９および１０に挙げる。
表９：ヨーグルトの成分
【表９】
2012525846.tif 000010
【０２９７】
表１０：ヨーグルト組成物
【表１０】
2012525846.tif 000011
【０２９８】
ヨーグルトベース３００ｇのバッチを、規定のヨーグルトを製造するための典型的な実験室規模の工程に従って作成する。
１. 脱脂乳および全乳の一部（８１.６２ｇ）を混ぜ合わせる。
２. 乾燥成分を混ぜ合わせ、粉末を分散させるが過度な泡を作らないように十分に撹拌しながら、脱脂乳／全乳混合物に添加する。
３. ロドモナス油を残りの全乳４０ｇに添加し、混合物を２個のハブを有する２０ゲージのホモジナイズ用針に２０回通すことによりホモジナイズし、油を確実に完全に乳化させる。（対照バッチには、油を含まない全乳４０ｇを同様にホモジナイズする。）
４. ホモジナイズした油／全乳混合物を、次いで、段階２の残りの乳溶液に添加する。
５. 全ての乳混合物（ヨーグルトベース）を、８０℃で１分間低温殺菌する。
６. ヨーグルトベースを４２℃に冷却し、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）およびラクトバシルス・デルブリュッキ（Lactobacillus delbrueckii）亜種、ブルガリクス（bulgaricus）の混合物を、製造業者により記載された割合で播種する。
７. ヨーグルトベースを４２℃で約７時間、ｐＨが４.６に達し、生成物が柔らかいゲルになるまでインキュベートする。
８. ヨーグルトを４℃に冷却し、分析用に保持する。
【０２９９】
２日後、乳清の離水、油の分離および質感について、ヨーグルトを評価した。質感の分析は、羽根型スピンドル (スピンドル#74, 0.08 rpm) を取り付けた Brookfield, DV-III Ultra Viscometer を使用する降伏力の決定により測定する。
【０３００】
油を含むヨーグルトは、僅かに低い収量であり、これは、低融点の脂肪を含むヨーグルトには予想外ではない。３００−５００ｐａの範囲の収量は許容でき、１０−１１％無脂乳固形分で作られた加糖の市販のヨーグルト、特に、かなり穏やかな熱処理のものには一般的である。油を含むヨーグルトは、僅かな量のクリーム化を示し、（標準的なヨーグルト製造において典型的に行われるように）低温殺菌後にヨーグルトを完全にホモジナイズできないことが、恐らくそのような結果に寄与する。加えて、対照のヨーグルト（バッチ２）は、１.５％の脂肪しか含まず、これは、規定のヨーグルトのクリーム化をもたらすと予想されないレベルである。また、バッチ１のクリーム化の量は、３.２％の脂肪を含有する多くの市販の高脂肪のヨーグルトで典型的に見られるものより少ない。４℃で２日間保存した後の、離水、油の分離および質感の測定結果を、表１１に示す。
【０３０１】
表１１：ヨーグルトの離水、油の分離および質感
【表１１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【図２８−１】
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【図２８−２】
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【図２９−１】
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【図２９−２】
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【図３０−１】
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【図３０−２】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３４Ｃ】
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【図３５】
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【図３６−１】
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【図３６−２】
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【図３６−３】
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【図３６−４】
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【図３７】
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【図３８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年12月15日(2011.12.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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