(57)【要約】コンドロイチン（ｃｏｎｄｒｏｉｔｉｎ）硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）（高分子量黒色腫関連抗原としても公知）が基底乳癌腫細胞（ＢＢＣ）（具体的には、トリプルネガティブ基底乳癌腫細胞（ＴＮＢＣ））上で過剰発現することを本明細書中に開示する。被験体における基底乳癌の検出方法を開示する。基底乳癌細胞の成長の阻害方法も開示する。これらの方法は、基底乳癌の癌細胞を有効量のＣＳＰＧ４に特異的に結合する抗体と接触させる工程を含む。さらなる処置方法および抗体パネルの使用も本明細書中に記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体における基底乳癌腫の検出方法であって、
該被験体から得たサンプルをＣＳＰＧ４に特異的に結合する抗体と、免疫複合体の形成に十分な期間接触させる工程、
該免疫複合体の存在を検出する工程であって、免疫複合体の存在が該被験体における基底乳癌腫の存在を証明する、工程
を含む、方法。
【請求項２】
前記サンプルが生検サンプル、血液サンプル、血清サンプル、または尿サンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記サンプルが非乳房由来の生検サンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記サンプルが乳房生検である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記サンプルをＣＳＰＧ４に特異的に結合する抗体のパネルと接触させる工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体がモノクローナル抗体２２５．２８、その機能的フラグメント、そのキメラ形態、またはそのヒト化形態である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記抗体が標識されている、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記基底乳癌がエストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、Ｈｅｒ２のいずれも発現しない、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記被験体が乳癌と診断されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
基底乳癌細胞の成長を阻害する方法であって、
該基底乳癌細胞を有効量の抗体と接触させ、それにより、該癌細胞の成長を阻害する工程であって、該抗体は、ＣＳＰＧ４に特異的に結合する、工程
を含む、方法。
【請求項１１】
前記抗体がエフェクター分子に共有結合する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記モノクローナル抗体が、２２５．２８、その機能的フラグメント、そのキメラ形態、またはそのヒト化形態である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記エフェクター分子が化学療法薬である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記エフェクター分子が有毒部分を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記有毒部分が、リシンＡ、アブリン、ジフテリア毒素またはそのサブユニット、シュードモナス外毒素またはその一部、およびボツリヌス毒素Ａ〜Ｆからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記シュードモナス外毒素がＰＥ３５、ＰＥ３７、ＰＥ３８、およびＰＥ４０からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記基底乳癌細胞がｉｎ  ｖｉｖｏにおけるものである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記基底乳癌細胞がトリプルネガティブ乳癌細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
前記基底乳癌細胞の成長を阻害する工程が、前記基底乳癌細胞の転移をｉｎ  ｖｉｖｏで減少させる工程を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
被験体において基底乳癌腫に対する免疫応答をもたらす方法であって、
基底乳癌腫を有する被験体を選択する工程、および
該被験体に治療有効量のＣＳＰＧ４ポリペプチドを投与し、それにより、該被験体において該基底乳癌腫に対する免疫応答をもたらす、工程
を含む、方法。
【請求項２２】
前記免疫応答がＢ細胞応答である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記免疫応答がＴ細胞応答である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記免疫応答によって前記被験体における前記基底乳癌の徴候または症状が軽減される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記免疫応答によって転移数が減少される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
アジュバントを投与する工程をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記基底乳癌腫がトリプルネガティブ乳癌癌腫である、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本願は、２００８年９月１９日に出願された米国仮特許出願第６１／０９８，５４８号の利益を主張し、この米国仮特許出願の全体の内容は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
政府支援の陳述
本発明は、国立癌研究所により授与された助成金ＣＡ１６０５６およＣＡ１０５５００の下、政府支援により成された。合衆国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
分野
本出願は、乳癌分野、具体的には、基底乳癌腫の検出および処置方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
乳癌は、米国人女性の間で最も一般的な上皮癌型である。毎年１８０，０００人を超える女性が乳癌と診断されている。米国人女性８人のうち約１人（およそ１２．８パーセント）が存命中に乳癌を発症するであろう。現時点では、その元の部位から転移した乳癌に利用可能な治癒的治療は存在しない。さらに、乳癌の検出および病期分類で用いる診断マーカーが必要である。
【０００５】
乳房腫瘍のＤＮＡマイクロアレイプロファイリングにより、臨床転帰が異なる特徴的なサブタイプが同定されている。これらには、正常乳房様サブタイプ、Ｈｅｒ−２過剰発現サブタイプ、管腔ＡサブタイプおよびＢサブタイプ（主にＥＲ＋）、および基底サブタイプが含まれる。基底様（基底という）乳癌（ＢＢＣ）（ＡサブタイプおよびＢサブタイプが含まれる）は、高悪性度、予後不良、および若年患者に関連する。エストロゲン、プロゲステロン、および上皮成長因子（Ｈｅｒ２）受容体の発現を欠くので、全乳癌の１５〜２０％に相当するトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）は、Ｈｅｒ２ターゲティング治療および／または抗エストロゲンベースの治療に適切ではない。さらに、ＢＢＣは、化学療法抵抗性および放射線抵抗性を示す。この腫瘍の抵抗性および攻撃的挙動は、ＣＤ４４＋およびＣＤ２４−／ｌｏ表現型を有する癌幹細胞（ＣＳＣ）の富化を反映し得る。ＣＳＣは化学療法抵抗性および放射線抵抗性を示し、転移拡散および疾患再発を担う。ＴＮＢＣ細胞株は、「幹細胞様」遺伝子発現を有し、基底Ｂに分類される。ＴＮＢＣの検出および処置方法が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
概要
コンドロイチン（ｃｏｎｄｒｏｉｔｉｎ）硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）（高分子量黒色腫関連抗原としても公知）がトリプルネガティブ乳癌細胞（ＴＮＢＣ）としても公知の型の基底乳癌腫細胞（ＢＢＣ）上で過剰発現することを本明細書中に開示する。
【０００７】
被験体における基底乳癌（ＢＢＣ）および／またはトリプルネガティブ乳癌の検出方法を開示する。これらの方法は、乳癌を有するか乳癌を有すると疑われる被験体を選択する工程、およびサンプル中のＣＤＰＧ４の存在を検出する工程を含む。一例を挙げれば、本方法は、被験体から得たサンプルをＣＳＰＧ４に特異的に結合する抗体と免疫複合体を形成するのに十分な期間接触させる工程、および免疫複合体の存在を検出する工程であって、免疫複合体の存在が被験体中の乳癌（ＢＢＣおよび／またはＴＮＢＣなど）の存在を証明する、検出する工程を含む。
【０００８】
基底乳癌細胞および／またはトリプルネガティブ乳癌細胞の成長を阻害する方法も開示する。これらの方法は、基底乳癌細胞および／またはトリプルネガティブ乳癌細胞を有効量のＣＳＰＧ４に特異的に結合する抗体と接触させ、それにより、癌細胞の成長を阻害する工程を含む。これらの方法は、ＢＢＣ（ＴＮＢＣなど）の処置に有用である。
【０００９】
さらなる処置方法および１つを超える抗体の使用も本明細書中に開示する。
【００１０】
上記および他の特徴および利点は、以下のいくつかの実施形態の詳細な説明からより明らかとなるだろう。この説明を添付の図面を参照して進める。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｄは、ＴＮＢＣによる優先的ＣＳＰＧ４発現を示すグラフおよびデジタル画像である。図１Ａは、公開された臨床マイクロアレイ発現データセット（ＧＳＥ５４６０）中のＣＳＰＧ４遺伝子発現レベルの分析がＥＲ−／Ｈｅｒ２＋、ＥＲ＋／Ｈｅｒ２−、およびＥＲ＋／Ｈｅｒ２＋乳癌よりエストロゲン受容体ＥＲ−、Ｈｅｒ２−乳癌で有意に高いレベルを示したことを示すグラフである。図１Ｂは、ＴＮＢＣ病変中のＣＳＰＧ４発現のデジタル画像組である。ＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂＤ２．８．５−Ｃ４Ｂ８（３μｇ／ｍｌ）によるヒトＴＮＢＣ病変の代表的なＩＨＣ染色を示す。染色を以下のように類別した。Ａ．（−）：ＣＳＰＧ４＋細胞は検出されなかった。Ｂ．（＋）：１０％未満のＣＳＰＧ４＋細胞が検出された。Ｃ（＋＋）：１０〜８０％のＣＳＰＧ４＋細胞が検出された。Ｄ（＋＋＋）：８０％を超えるＣＳＰＧ４＋細胞が検出された（２００倍）。図１Ｃは、管腔乳癌および基底乳癌／ＴＮＢＣ細胞株におけるＣＤ４４＋／ＣＤ２４−／ｌｏ細胞の差次的ＣＳＰＧ４発現および頻度を示すプロットセットである。細胞を、ＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂ２２５．２８、ＰＥ標識抗マウスＩｇＧ抗体、およびＦＩＴＣ標識抗ＣＤ２４、ＡＰＣ標識抗ＣＤ４４、および７−ＡＡＤと連続的にインキュベートした。染色された細胞をＦＡＣＳ分析に供した。ｍＡｂ２２５．２８によって染色された細胞の比率および平均蛍光強度を各ヒストグラム中に示す。ＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂ２２５．２８によって染色されたｍＡ低比率（１．５〜１３％）の乳癌細胞は、３つの管腔型乳癌細胞株（下のパネル）中の低比率（０〜３４．６％）のＣＤ４４＋／ＣＤ２４−／ｌｏ細胞に関連する。対照的に、ＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂ２２５．２８によって染色されたより高い比率（６６．７〜９６．１％）の乳癌細胞は、４つのＴＮＢＣ細胞株中の高比率（９２．５〜９９．０％）のＣＤ４４＋／ＣＤ２４−／ｌｏ細胞に関連する（上のパネル）。図１Ｄは、乳癌腫患者由来の胸水中のＣＳＰＧ４＋細胞における推定ＣＳＣ集団の富化を示すプロットセットである。７−ＡＡＤ−／ＣＤ４５−／ＣＳＰＧ４＋細胞を、ＣＤ４４／ＣＤ２４発現について分析した。４つの患者サンプル由来のＣＤ４４＋ＣＤ２４−／ｌｏ細胞の比率を、各プロットセットで示す。
【図１Ｂ】図１Ａ〜１Ｄは、ＴＮＢＣによる優先的ＣＳＰＧ４発現を示すグラフおよびデジタル画像である。図１Ａは、公開された臨床マイクロアレイ発現データセット（ＧＳＥ５４６０）中のＣＳＰＧ４遺伝子発現レベルの分析がＥＲ−／Ｈｅｒ２＋、ＥＲ＋／Ｈｅｒ２−、およびＥＲ＋／Ｈｅｒ２＋乳癌よりエストロゲン受容体ＥＲ−、Ｈｅｒ２−乳癌で有意に高いレベルを示したことを示すグラフである。図１Ｂは、ＴＮＢＣ病変中のＣＳＰＧ４発現のデジタル画像組である。ＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂＤ２．８．５−Ｃ４Ｂ８（３μｇ／ｍｌ）によるヒトＴＮＢＣ病変の代表的なＩＨＣ染色を示す。染色を以下のように類別した。Ａ．（−）：ＣＳＰＧ４＋細胞は検出されなかった。Ｂ．（＋）：１０％未満のＣＳＰＧ４＋細胞が検出された。Ｃ（＋＋）：１０〜８０％のＣＳＰＧ４＋細胞が検出された。Ｄ（＋＋＋）：８０％を超えるＣＳＰＧ４＋細胞が検出された（２００倍）。図１Ｃは、管腔乳癌および基底乳癌／ＴＮＢＣ細胞株におけるＣＤ４４＋／ＣＤ２４−／ｌｏ細胞の差次的ＣＳＰＧ４発現および頻度を示すプロットセットである。細胞を、ＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂ２２５．２８、ＰＥ標識抗マウスＩｇＧ抗体、およびＦＩＴＣ標識抗ＣＤ２４、ＡＰＣ標識抗ＣＤ４４、および７−ＡＡＤと連続的にインキュベートした。染色された細胞をＦＡＣＳ分析に供した。ｍＡｂ２２５．２８によって染色された細胞の比率および平均蛍光強度を各ヒストグラム中に示す。ＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂ２２５．２８によって染色されたｍＡ低比率（１．５〜１３％）の乳癌細胞は、３つの管腔型乳癌細胞株（下のパネル）中の低比率（０〜３４．６％）のＣＤ４４＋／ＣＤ２４−／ｌｏ細胞に関連する。対照的に、ＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂ２２５．２８によって染色されたより高い比率（６６．７〜９６．１％）の乳癌細胞は、４つのＴＮＢＣ細胞株中の高比率（９２．５〜９９．０％）のＣＤ４４＋／ＣＤ２４−／ｌｏ細胞に関連する（上のパネル）。図１Ｄは、乳癌腫患者由来の胸水中のＣＳＰＧ４＋細胞における推定ＣＳＣ集団の富化を示すプロットセットである。７−ＡＡＤ−／ＣＤ４５−／ＣＳＰＧ４＋細胞を、ＣＤ４４／ＣＤ２４発現について分析した。４つの患者サンプル由来のＣＤ４４＋ＣＤ２４−／ｌｏ細胞の比率を、各プロットセットで示す。
【図１Ｃ】図１Ａ〜１Ｄは、ＴＮＢＣによる優先的ＣＳＰＧ４発現を示すグラフおよびデジタル画像である。図１Ａは、公開された臨床マイクロアレイ発現データセット（ＧＳＥ５４６０）中のＣＳＰＧ４遺伝子発現レベルの分析がＥＲ−／Ｈｅｒ２＋、ＥＲ＋／Ｈｅｒ２−、およびＥＲ＋／Ｈｅｒ２＋乳癌よりエストロゲン受容体ＥＲ−、Ｈｅｒ２−乳癌で有意に高いレベルを示したことを示すグラフである。図１Ｂは、ＴＮＢＣ病変中のＣＳＰＧ４発現のデジタル画像組である。ＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂＤ２．８．５−Ｃ４Ｂ８（３μｇ／ｍｌ）によるヒトＴＮＢＣ病変の代表的なＩＨＣ染色を示す。染色を以下のように類別した。Ａ．（−）：ＣＳＰＧ４＋細胞は検出されなかった。Ｂ．（＋）：１０％未満のＣＳＰＧ４＋細胞が検出された。Ｃ（＋＋）：１０〜８０％のＣＳＰＧ４＋細胞が検出された。Ｄ（＋＋＋）：８０％を超えるＣＳＰＧ４＋細胞が検出された（２００倍）。図１Ｃは、管腔乳癌および基底乳癌／ＴＮＢＣ細胞株におけるＣＤ４４＋／ＣＤ２４−／ｌｏ細胞の差次的ＣＳＰＧ４発現および頻度を示すプロットセットである。細胞を、ＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂ２２５．２８、ＰＥ標識抗マウスＩｇＧ抗体、およびＦＩＴＣ標識抗ＣＤ２４、ＡＰＣ標識抗ＣＤ４４、および７−ＡＡＤと連続的にインキュベートした。染色された細胞をＦＡＣＳ分析に供した。ｍＡｂ２２５．２８によって染色された細胞の比率および平均蛍光強度を各ヒストグラム中に示す。ＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂ２２５．２８によって染色されたｍＡ低比率（１．５〜１３％）の乳癌細胞は、３つの管腔型乳癌細胞株（下のパネル）中の低比率（０〜３４．６％）のＣＤ４４＋／ＣＤ２４−／ｌｏ細胞に関連する。対照的に、ＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂ２２５．２８によって染色されたより高い比率（６６．７〜９６．１％）の乳癌細胞は、４つのＴＮＢＣ細胞株中の高比率（９２．５〜９９．０％）のＣＤ４４＋／ＣＤ２４−／ｌｏ細胞に関連する（上のパネル）。図１Ｄは、乳癌腫患者由来の胸水中のＣＳＰＧ４＋細胞における推定ＣＳＣ集団の富化を示すプロットセットである。７−ＡＡＤ−／ＣＤ４５−／ＣＳＰＧ４＋細胞を、ＣＤ４４／ＣＤ２４発現について分析した。４つの患者サンプル由来のＣＤ４４＋ＣＤ２４−／ｌｏ細胞の比率を、各プロットセットで示す。
【図１Ｄ】図１Ａ〜１Ｄは、ＴＮＢＣによる優先的ＣＳＰＧ４発現を示すグラフおよびデジタル画像である。図１Ａは、公開された臨床マイクロアレイ発現データセット（ＧＳＥ５４６０）中のＣＳＰＧ４遺伝子発現レベルの分析がＥＲ−／Ｈｅｒ２＋、ＥＲ＋／Ｈｅｒ２−、およびＥＲ＋／Ｈｅｒ２＋乳癌よりエストロゲン受容体ＥＲ−、Ｈｅｒ２−乳癌で有意に高いレベルを示したことを示すグラフである。図１Ｂは、ＴＮＢＣ病変中のＣＳＰＧ４発現のデジタル画像組である。ＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂＤ２．８．５−Ｃ４Ｂ８（３μｇ／ｍｌ）によるヒトＴＮＢＣ病変の代表的なＩＨＣ染色を示す。染色を以下のように類別した。Ａ．（−）：ＣＳＰＧ４＋細胞は検出されなかった。Ｂ．（＋）：１０％未満のＣＳＰＧ４＋細胞が検出された。Ｃ（＋＋）：１０〜８０％のＣＳＰＧ４＋細胞が検出された。Ｄ（＋＋＋）：８０％を超えるＣＳＰＧ４＋細胞が検出された（２００倍）。図１Ｃは、管腔乳癌および基底乳癌／ＴＮＢＣ細胞株におけるＣＤ４４＋／ＣＤ２４−／ｌｏ細胞の差次的ＣＳＰＧ４発現および頻度を示すプロットセットである。細胞を、ＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂ２２５．２８、ＰＥ標識抗マウスＩｇＧ抗体、およびＦＩＴＣ標識抗ＣＤ２４、ＡＰＣ標識抗ＣＤ４４、および７−ＡＡＤと連続的にインキュベートした。染色された細胞をＦＡＣＳ分析に供した。ｍＡｂ２２５．２８によって染色された細胞の比率および平均蛍光強度を各ヒストグラム中に示す。ＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂ２２５．２８によって染色された低比率（１．５〜１３％）の乳癌細胞は、３つの管腔型乳癌細胞株（下のパネル）中の低比率（０〜３４．６％）のＣＤ４４＋／ＣＤ２４−／ｌｏ細胞に関連する。対照的に、ＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂ２２５．２８によって染色されたより高い比率（６６．７〜９６．１％）の乳癌細胞は、４つのＴＮＢＣ細胞株中の高比率（９２．５〜９９．０％）のＣＤ４４＋／ＣＤ２４−／ｌｏ細胞に関連する（上のパネル）。図１Ｄは、乳癌腫患者由来の胸水中のＣＳＰＧ４＋細胞における推定ＣＳＣ集団の富化を示すプロットセットである。７−ＡＡＤ−／ＣＤ４５−／ＣＳＰＧ４＋細胞を、ＣＤ４４／ＣＤ２４発現について分析した。４つの患者サンプル由来のＣＤ４４＋ＣＤ２４−／ｌｏ細胞の比率を、各プロットセットで示す。
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｄは、ＴＮＢＣ細胞に及ぼすＣＳＧＧ４特異的モノクローナル抗体の影響を示すデジタル画像およびグラフである。図２Ａおよび２Ｂは、ＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂ２２５．２８によるｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＴＮＢＣ細胞成長の阻害を示すデジタル画像組およびグラフである。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、６日間の三次元（マトリゲル）設定においてｍＡｂ２２５．２８またはコントロールｍＡｂＦ３Ｃ２５のいずれかで処置した。両ｍＡｂのための溶媒として使用したＰＢＳを、１００％細胞成長の基準として使用した。Ｚｅｉｓｓ倒立蛍光顕微鏡（ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）下で各ウェルの写真を撮影し（１００倍）（図２Ａ）、次いで、各ウェル中の細胞を細胞回収液（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用してマトリゲルから回収し、トリパンブルーを使用して２人の個人によって計数した。結果を、基準としてＰＢＳのみで得た値を使用して細胞成長阻害率として示す。示した値は、３つの独立した実験の平均である。＊＊＊はｐ＜０．００１を示す（図２Ｂ）。図２Ｃは、ＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂ２２５．２８によるＴＮＢＣ細胞接着の阻害を示すグラフである。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞を播種し、接着アッセイおいてＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂ２２５．２８、アイソタイプコントロールｍＡｂＦ３Ｃ２５、またはＰＢＳのいずれかとインキュベートした。結果を、基準としてｍＡｂを使用しないＰＢＳ中で得た値を使用して、接着阻害率として示す。示した値は、３つの独立した実験の平均である。＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。図２Ｄは、ＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂ２２５．２８によるＴＮＢＣ細胞遊走の阻害を示すグラフである。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を播種し、遊走アッセイにおいてＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂ２２５．２８、コントロールｍＡｂＦ３Ｃ２５、またはＰＢＳのいずれかとインキュベートした。結果を、基準としてｍＡｂを使用しないＰＢＳ中で得た値を使用して、遊走阻害率として示す。示した値は、３つの独立した実験の平均である。＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。
【図２Ｂ】図２Ａ〜２Ｄは、ＴＮＢＣ細胞に及ぼすＣＳＧＧ４特異的モノクローナル抗体の影響を示すデジタル画像およびグラフである。図２Ａおよび２Ｂは、ＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂ２２５．２８によるｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＴＮＢＣ細胞成長の阻害を示すデジタル画像組およびグラフである。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、６日間の三次元（マトリゲル）設定においてｍＡｂ２２５．２８またはコントロールｍＡｂＦ３Ｃ２５のいずれかで処置した。両ｍＡｂのための溶媒として使用したＰＢＳを、１００％細胞成長の基準として使用した。Ｚｅｉｓｓ倒立蛍光顕微鏡（ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）下で各ウェルの写真を撮影し（１００倍）（図２Ａ）、次いで、各ウェル中の細胞を細胞回収液（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用してマトリゲルから回収し、トリパンブルーを使用して２人の個人によって計数した。結果を、基準としてＰＢＳのみで得た値を使用して細胞成長阻害率として示す。示した値は、３つの独立した実験の平均である。＊＊＊はｐ＜０．００１を示す（図２Ｂ）。図２Ｃは、ＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂ２２５．２８によるＴＮＢＣ細胞接着の阻害を示すグラフである。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞を播種し、接着アッセイおいてＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂ２２５．２８、アイソタイプコントロールｍＡｂＦ３Ｃ２５、またはＰＢＳのいずれかとインキュベートした。結果を、基準としてｍＡｂを使用しないＰＢＳ中で得た値を使用して、接着阻害率として示す。示した値は、３つの独立した実験の平均である。＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。図２Ｄは、ＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂ２２５．２８によるＴＮＢＣ細胞遊走の阻害を示すグラフである。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を播種し、遊走アッセイにおいてＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂ２２５．２８、コントロールｍＡｂＦ３Ｃ２５、またはＰＢＳのいずれかとインキュベートした。結果を、基準としてｍＡｂを使用しないＰＢＳ中で得た値を使用して、遊走阻害率として示す。示した値は、３つの独立した実験の平均である。＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。
【図２Ｃ】図２Ａ〜２Ｄは、ＴＮＢＣ細胞に及ぼすＣＳＧＧ４特異的モノクローナル抗体の影響を示すデジタル画像およびグラフである。図２Ａおよび２Ｂは、ＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂ２２５．２８によるｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＴＮＢＣ細胞成長の阻害を示すデジタル画像組およびグラフである。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、６日間の三次元（マトリゲル）設定においてｍＡｂ２２５．２８またはコントロールｍＡｂＦ３Ｃ２５のいずれかで処置した。両ｍＡｂのための溶媒として使用したＰＢＳを、１００％細胞成長の基準として使用した。Ｚｅｉｓｓ倒立蛍光顕微鏡（ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）下で各ウェルの写真を撮影し（１００倍）（図２Ａ）、次いで、各ウェル中の細胞を細胞回収液（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用してマトリゲルから回収し、トリパンブルーを使用して２人の個人によって計数した。結果を、基準としてＰＢＳのみで得た値を使用して細胞成長阻害率として示す。示した値は、３つの独立した実験の平均である。＊＊＊はｐ＜０．００１を示す（図２Ｂ）。図２Ｃは、ＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂ２２５．２８によるＴＮＢＣ細胞接着の阻害を示すグラフである。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞を播種し、接着アッセイおいてＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂ２２５．２８、アイソタイプコントロールｍＡｂＦ３Ｃ２５、またはＰＢＳのいずれかとインキュベートした。結果を、基準としてｍＡｂを使用しないＰＢＳ中で得た値を使用して、接着阻害率として示す。示した値は、３つの独立した実験の平均である。＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。図２Ｄは、ＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂ２２５．２８によるＴＮＢＣ細胞遊走の阻害を示すグラフである。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を播種し、遊走アッセイにおいてＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂ２２５．２８、コントロールｍＡｂＦ３Ｃ２５、またはＰＢＳのいずれかとインキュベートした。結果を、基準としてｍＡｂを使用しないＰＢＳ中で得た値を使用して、遊走阻害率として示す。示した値は、３つの独立した実験の平均である。＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。
【図２Ｄ】図２Ａ〜２Ｄは、ＴＮＢＣ細胞に及ぼすＣＳＧＧ４特異的モノクローナル抗体の影響を示すデジタル画像およびグラフである。図２Ａおよび２Ｂは、ＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂ２２５．２８によるｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＴＮＢＣ細胞成長の阻害を示すデジタル画像組およびグラフである。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、６日間の三次元（マトリゲル）設定においてｍＡｂ２２５．２８またはコントロールｍＡｂＦ３Ｃ２５のいずれかで処置した。両ｍＡｂのための溶媒として使用したＰＢＳを、１００％細胞成長の基準として使用した。Ｚｅｉｓｓ倒立蛍光顕微鏡（ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）下で各ウェルの写真を撮影し（１００倍）（図２Ａ）、次いで、各ウェル中の細胞を細胞回収液（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用してマトリゲルから回収し、トリパンブルーを使用して２人の個人によって計数した。結果を、基準としてＰＢＳのみで得た値を使用して細胞成長阻害率として示す。示した値は、３つの独立した実験の平均である。＊＊＊はｐ＜０．００１を示す（図２Ｂ）。図２Ｃは、ＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂ２２５．２８によるＴＮＢＣ細胞接着の阻害を示すグラフである。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞を播種し、接着アッセイおいてＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂ２２５．２８、アイソタイプコントロールｍＡｂＦ３Ｃ２５、またはＰＢＳのいずれかとインキュベートした。結果を、基準としてｍＡｂを使用しないＰＢＳ中で得た値を使用して、接着阻害率として示す。示した値は、３つの独立した実験の平均である。＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。図２Ｄは、ＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂ２２５．２８によるＴＮＢＣ細胞遊走の阻害を示すグラフである。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を播種し、遊走アッセイにおいてＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂ２２５．２８、コントロールｍＡｂＦ３Ｃ２５、またはＰＢＳのいずれかとインキュベートした。結果を、基準としてｍＡｂを使用しないＰＢＳ中で得た値を使用して、遊走阻害率として示す。示した値は、３つの独立した実験の平均である。＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。
【図３】図３は、ＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂ２２５．２８による細胞の成長、接着、および遊走に関連するシグナル伝達の下方制御を示すデジタル画像である。ｍＡｂ２２５．２８、アイソタイプｍＡｂＦ３Ｃ２５、またはＰＢＳのいずれかで処置した表示の培養細胞におけるＰＫＣ−α、ｐ−ＦＡＫ、ＦＡＫ、ｐ−Ｅｒｋ１／２、Ｅｒｋ１／２、ｐ−Ａｋｔ、およびＡｋｔのウェスタンブロッティング。ＨＬＡクラスＩ抗原を、ローディングコントロールとして使用した。
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｅは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂの影響を示すグラフおよびデジタル画像である。図４Ａおよび４Ｂは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの実験的転移のＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂによる阻害を示す。０日目に、８週齢の雌ＳＣＩＤマウスに、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（１×１０６）またはＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞（２×１０６）を静脈内（ｉ．ｖ．）移植した。３日目に、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１由来の転移を保有するマウスを２群に分けた。一方の群を、ＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂ２２５．２８（１００μｇ／ｉ．ｖ．注射）で処置し、もう一方の群をコントロールｍＡｂＦ３Ｃ２５（１００μｇ／ｉ．ｖ．注射）で処置した。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５由来の転移を保有するマウスを、３つの群に分けた。１つの群をＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂ２２５．２８（１００μｇ／ｉ．ｐ．注射）で処置し、１つの群をＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂ７６３．７４（１００μｇ／ｉ．ｐ．注射）で処置し、１つの群をコントロールｍＡｂ（１００μｇ／ｉ．ｐ．注射）で処置した。週に２回注射した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を移植したマウスを７９日目に安楽死させ（図４Ａ）、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞を移植したマウスを３４日目に安楽死させた（図４Ｂ）。肺を採取し、ブアン固定液（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で固定した。肺転移を解剖顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  ｓｔｅｍｉ  ＤＶ４）下で計数し、分析した。＊＊はｐ＜０．０１を示し、＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。図４Ｃ、４Ｄ、および４Ｅは、ＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂによるｉｎ  ｖｉｖｏでの確立された実験的転移の後退を示すグラフおよびデジタル画像である。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（１×１０６）を、０日目に１４匹のマウスにｉ．ｖ．注射した。その後、全腫瘍保有マウスを、無作為に２群に分けた（７匹／群）。２０日目から開始して、一方の群にＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂ２２５．２８（１００μｇ／マウス）を、他方の群にコントロールｍＡｂＦ３Ｃ２５（１００μｇ／マウス）を４８時間毎に全部で３回ｉ．ｖ．注射した。２５日目に、以下の分析のために、全てのマウスを屠殺し、肺を採取し、１０％ホルマリンで固定し、パラフィン包埋した：転移小結節（無作為に選択した５つの強拡大視野（２００倍）／各切片中）のサイズ／領域を測定し、ＳＰＯＴ  ＩＭＡＧＩＮＧ  ＳＯＦＴＷＡＲＥ  Ａｄｖａｎｃｅｄ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｉｎｃ．）によって計算した。示した値は、各群の平均腫瘍領域である。＊＊＊はｐ値＜０．００１（図４Ｃ）を示し、肺組織切片中のアポトーシス腫瘍細胞をＴＵＮＥＬアッセイによって検出し、１０視野／スライド（２００倍）の計数によって定量した。示した値は、各群の平均アポトーシス腫瘍細胞である。＊＊はｐ＜０．０１（図４Ｄ）を示し、肺組織切片中の増殖腫瘍細胞をｐ−ヒストンＨ３タンパク質の染色によって検出し、１０視野／スライド（２００倍）の計数によって定量した。示した値は、各群の平均有糸分裂腫瘍細胞である。＊＊はｐ値＜０．０１を示す（図４Ｅ）。
【図４Ｂ】図４Ａ〜４Ｅは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂの影響を示すグラフおよびデジタル画像である。図４Ａおよび４Ｂは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの実験的転移のＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂによる阻害を示す。０日目に、８週齢の雌ＳＣＩＤマウスに、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（１×１０６）またはＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞（２×１０６）を静脈内（ｉ．ｖ．）移植した。３日目に、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１由来の転移を保有するマウスを２群に分けた。一方の群を、ＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂ２２５．２８（１００μｇ／ｉ．ｖ．注射）で処置し、もう一方の群をコントロールｍＡｂＦ３Ｃ２５（１００μｇ／ｉ．ｖ．注射）で処置した。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５由来の転移を保有するマウスを、３つの群に分けた。１つの群をＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂ２２５．２８（１００μｇ／ｉ．ｐ．注射）で処置し、１つの群をＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂ７６３．７４（１００μｇ／ｉ．ｐ．注射）で処置し、１つの群をコントロールｍＡｂ（１００μｇ／ｉ．ｐ．注射）で処置した。週に２回注射した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を移植したマウスを７９日目に安楽死させ（図４Ａ）、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞を移植したマウスを３４日目に安楽死させた（図４Ｂ）。肺を採取し、ブアン固定液（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で固定した。肺転移を解剖顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  ｓｔｅｍｉ  ＤＶ４）下で計数し、分析した。＊＊はｐ＜０．０１を示し、＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。図４Ｃ、４Ｄ、および４Ｅは、ＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂによるｉｎ  ｖｉｖｏでの確立された実験的転移の後退を示すグラフおよびデジタル画像である。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（１×１０６）を、０日目に１４匹のマウスにｉ．ｖ．注射した。その後、全腫瘍保有マウスを、無作為に２群に分けた（７匹／群）。２０日目から開始して、一方の群にＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂ２２５．２８（１００μｇ／マウス）を、他方の群にコントロールｍＡｂＦ３Ｃ２５（１００μｇ／マウス）を４８時間毎に全部で３回ｉ．ｖ．注射した。２５日目に、以下の分析のために、全てのマウスを屠殺し、肺を採取し、１０％ホルマリンで固定し、パラフィン包埋した：転移小結節（無作為に選択した５つの強拡大視野（２００倍）／各切片中）のサイズ／領域を測定し、ＳＰＯＴ  ＩＭＡＧＩＮＧ  ＳＯＦＴＷＡＲＥ  Ａｄｖａｎｃｅｄ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｉｎｃ．）によって計算した。示した値は、各群の平均腫瘍領域である。＊＊＊はｐ値＜０．００１（図４Ｃ）を示し、肺組織切片中のアポトーシス腫瘍細胞をＴＵＮＥＬアッセイによって検出し、１０視野／スライド（２００倍）の計数によって定量した。示した値は、各群の平均アポトーシス腫瘍細胞である。＊＊はｐ＜０．０１（図４Ｄ）を示し、肺組織切片中の増殖腫瘍細胞をｐ−ヒストンＨ３タンパク質の染色によって検出し、１０視野／スライド（２００倍）の計数によって定量した。示した値は、各群の平均有糸分裂腫瘍細胞である。＊＊はｐ値＜０．０１を示す（図４Ｅ）。
【図４Ｃ】図４Ａ〜４Ｅは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂの影響を示すグラフおよびデジタル画像である。図４Ａおよび４Ｂは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの実験的転移のＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂによる阻害を示す。０日目に、８週齢の雌ＳＣＩＤマウスに、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（１×１０６）またはＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞（２×１０６）を静脈内（ｉ．ｖ．）移植した。３日目に、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１由来の転移を保有するマウスを２群に分けた。一方の群を、ＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂ２２５．２８（１００μｇ／ｉ．ｖ．注射）で処置し、もう一方の群をコントロールｍＡｂＦ３Ｃ２５（１００μｇ／ｉ．ｖ．注射）で処置した。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５由来の転移を保有するマウスを、３つの群に分けた。１つの群をＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂ２２５．２８（１００μｇ／ｉ．ｐ．注射）で処置し、１つの群をＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂ７６３．７４（１００μｇ／ｉ．ｐ．注射）で処置し、１つの群をコントロールｍＡｂ（１００μｇ／ｉ．ｐ．注射）で処置した。週に２回注射した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を移植したマウスを７９日目に安楽死させ（図４Ａ）、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞を移植したマウスを３４日目に安楽死させた（図４Ｂ）。肺を採取し、ブアン固定液（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で固定した。肺転移を解剖顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  ｓｔｅｍｉ  ＤＶ４）下で計数し、分析した。＊＊はｐ＜０．０１を示し、＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。図４Ｃ、４Ｄ、および４Ｅは、ＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂによるｉｎ  ｖｉｖｏでの確立された実験的転移の後退を示すグラフおよびデジタル画像である。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（１×１０６）を、０日目に１４匹のマウスにｉ．ｖ．注射した。その後、全腫瘍保有マウスを、無作為に２群に分けた（７匹／群）。２０日目から開始して、一方の群にＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂ２２５．２８（１００μｇ／マウス）を、他方の群にコントロールｍＡｂＦ３Ｃ２５（１００μｇ／マウス）を４８時間毎に全部で３回ｉ．ｖ．注射した。２５日目に、以下の分析のために、全てのマウスを屠殺し、肺を採取し、１０％ホルマリンで固定し、パラフィン包埋した：転移小結節（無作為に選択した５つの強拡大視野（２００倍）／各切片中）のサイズ／領域を測定し、ＳＰＯＴ  ＩＭＡＧＩＮＧ  ＳＯＦＴＷＡＲＥ  Ａｄｖａｎｃｅｄ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｉｎｃ．）によって計算した。示した値は、各群の平均腫瘍領域である。＊＊＊はｐ値＜０．００１（図４Ｃ）を示し、肺組織切片中のアポトーシス腫瘍細胞をＴＵＮＥＬアッセイによって検出し、１０視野／スライド（２００倍）の計数によって定量した。示した値は、各群の平均アポトーシス腫瘍細胞である。＊＊はｐ＜０．０１（図４Ｄ）を示し、肺組織切片中の増殖腫瘍細胞をｐ−ヒストンＨ３タンパク質の染色によって検出し、１０視野／スライド（２００倍）の計数によって定量した。示した値は、各群の平均有糸分裂腫瘍細胞である。＊＊はｐ値＜０．０１を示す（図４Ｅ）。
【図４Ｄ】図４Ａ〜４Ｅは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂの影響を示すグラフおよびデジタル画像である。図４Ａおよび４Ｂは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの実験的転移のＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂによる阻害を示す。０日目に、８週齢の雌ＳＣＩＤマウスに、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（１×１０６）またはＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞（２×１０６）を静脈内（ｉ．ｖ．）移植した。３日目に、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１由来の転移を保有するマウスを２群に分けた。一方の群を、ＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂ２２５．２８（１００μｇ／ｉ．ｖ．注射）で処置し、もう一方の群をコントロールｍＡｂＦ３Ｃ２５（１００μｇ／ｉ．ｖ．注射）で処置した。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５由来の転移を保有するマウスを、３つの群に分けた。１つの群をＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂ２２５．２８（１００μｇ／ｉ．ｐ．注射）で処置し、１つの群をＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂ７６３．７４（１００μｇ／ｉ．ｐ．注射）で処置し、１つの群をコントロールｍＡｂ（１００μｇ／ｉ．ｐ．注射）で処置した。週に２回注射した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を移植したマウスを７９日目に安楽死させ（図４Ａ）、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞を移植したマウスを３４日目に安楽死させた（図４Ｂ）。肺を採取し、ブアン固定液（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で固定した。肺転移を解剖顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  ｓｔｅｍｉ  ＤＶ４）下で計数し、分析した。＊＊はｐ＜０．０１を示し、＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。図４Ｃ、４Ｄ、および４Ｅは、ＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂによるｉｎ  ｖｉｖｏでの確立された実験的転移の後退を示すグラフおよびデジタル画像である。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（１×１０６）を、０日目に１４匹のマウスにｉ．ｖ．注射した。その後、全腫瘍保有マウスを、無作為に２群に分けた（７匹／群）。２０日目から開始して、一方の群にＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂ２２５．２８（１００μｇ／マウス）を、他方の群にコントロールｍＡｂＦ３Ｃ２５（１００μｇ／マウス）を４８時間毎に全部で３回ｉ．ｖ．注射した。２５日目に、以下の分析のために、全てのマウスを屠殺し、肺を採取し、１０％ホルマリンで固定し、パラフィン包埋した：転移小結節（無作為に選択した５つの強拡大視野（２００倍）／各切片中）のサイズ／領域を測定し、ＳＰＯＴ  ＩＭＡＧＩＮＧ  ＳＯＦＴＷＡＲＥ  Ａｄｖａｎｃｅｄ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｉｎｃ．）によって計算した。示した値は、各群の平均腫瘍領域である。＊＊＊はｐ値＜０．００１（図４Ｃ）を示し、肺組織切片中のアポトーシス腫瘍細胞をＴＵＮＥＬアッセイによって検出し、１０視野／スライド（２００倍）の計数によって定量した。示した値は、各群の平均アポトーシス腫瘍細胞である。＊＊はｐ＜０．０１（図４Ｄ）を示し、肺組織切片中の増殖腫瘍細胞をｐ−ヒストンＨ３タンパク質の染色によって検出し、１０視野／スライド（２００倍）の計数によって定量した。示した値は、各群の平均有糸分裂腫瘍細胞である。＊＊はｐ値＜０．０１を示す（図４Ｅ）。
【図４Ｅ】図４Ａ〜４Ｅは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂの影響を示すグラフおよびデジタル画像である。図４Ａおよび４Ｂは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの実験的転移のＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂによる阻害を示す。０日目に、８週齢の雌ＳＣＩＤマウスに、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（１×１０６）またはＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞（２×１０６）を静脈内（ｉ．ｖ．）移植した。３日目に、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１由来の転移を保有するマウスを２群に分けた。一方の群を、ＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂ２２５．２８（１００μｇ／ｉ．ｖ．注射）で処置し、もう一方の群をコントロールｍＡｂＦ３Ｃ２５（１００μｇ／ｉ．ｖ．注射）で処置した。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５由来の転移を保有するマウスを、３つの群に分けた。１つの群をＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂ２２５．２８（１００μｇ／ｉ．ｐ．注射）で処置し、１つの群をＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂ７６３．７４（１００μｇ／ｉ．ｐ．注射）で処置し、１つの群をコントロールｍＡｂ（１００μｇ／ｉ．ｐ．注射）で処置した。週に２回注射した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を移植したマウスを７９日目に安楽死させ（図４Ａ）、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞を移植したマウスを３４日目に安楽死させた（図４Ｂ）。肺を採取し、ブアン固定液（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で固定した。肺転移を解剖顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  ｓｔｅｍｉ  ＤＶ４）下で計数し、分析した。＊＊はｐ＜０．０１を示し、＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。図４Ｃ、４Ｄ、および４Ｅは、ＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂによるｉｎ  ｖｉｖｏでの確立された実験的転移の後退を示すグラフおよびデジタル画像である。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（１×１０６）を、０日目に１４匹のマウスにｉ．ｖ．注射した。その後、全腫瘍保有マウスを、無作為に２群に分けた（７匹／群）。２０日目から開始して、一方の群にＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂ２２５．２８（１００μｇ／マウス）を、他方の群にコントロールｍＡｂＦ３Ｃ２５（１００μｇ／マウス）を４８時間毎に全部で３回ｉ．ｖ．注射した。２５日目に、以下の分析のために、全てのマウスを屠殺し、肺を採取し、１０％ホルマリンで固定し、パラフィン包埋した：転移小結節（無作為に選択した５つの強拡大視野（２００倍）／各切片中）のサイズ／領域を測定し、ＳＰＯＴ  ＩＭＡＧＩＮＧ  ＳＯＦＴＷＡＲＥ  Ａｄｖａｎｃｅｄ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｉｎｃ．）によって計算した。示した値は、各群の平均腫瘍領域である。＊＊＊はｐ値＜０．００１（図４Ｃ）を示し、肺組織切片中のアポトーシス腫瘍細胞をＴＵＮＥＬアッセイによって検出し、１０視野／スライド（２００倍）の計数によって定量した。示した値は、各群の平均アポトーシス腫瘍細胞である。＊＊はｐ＜０．０１（図４Ｄ）を示し、肺組織切片中の増殖腫瘍細胞をｐ−ヒストンＨ３タンパク質の染色によって検出し、１０視野／スライド（２００倍）の計数によって定量した。示した値は、各群の平均有糸分裂腫瘍細胞である。＊＊はｐ値＜０．０１を示す（図４Ｅ）。
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｄは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂの影響を示す。図５Ａおよび５Ｂは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの術後の腫瘍の自然転移および再発のＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂによる阻害を示すグラフである。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞（２×１０６）を、０日目に各ＳＣＩＤマウスの乳房脂肪体に注射した。７日目に、腫瘍を測定可能であった場合、各群内の平均腫瘍体積が類似するように（１６ｍｍ３）マウスをそれぞれ５匹からなる３群に分けた。７日目から開始して、１つの群にＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂ７６３．７４（１００μｇ／マウス）を、１つの群にＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂ２２５．２８（１００μｇ／マウス）を、１週２回にて全部で１８回ｉ．ｐ．注射した。第３のマウス群に、コントロールｍＡｂ（１００μｇ／マウス）を注射した。７１日目に、全腫瘍を外科的に除去した。抗体を使用した処置を、９回のさらなる注射を使用した同一のレジメンを使用して継続した。１３１日目に、全てのマウスを屠殺し、肺転移（図５Ａ）および局所腫瘍再発（図５Ｂ）について試験した。この実験を２回繰り返した。＊はｐ値＜０．０５を示す。図５Ｃおよび５Ｄは、ＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂによる腫瘍血管形成の阻害ならびに細胞の成長、接着、および遊走に関連するｉｎ  ｖｉｖｏシグナル伝達の下方制御を示すデジタル画像およびグラフである。外科的に除去したＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞由来の原発性腫瘍中の血管数をＣＤ３１の染色によって検出し、各群由来の５つの腫瘍を使用した各切片の５つの無作為に選択した視野（４００倍）の記録によって定量した。＊はｐ値＜０．０５を示す（図５Ｃおよび５Ｄ）。ｍＡｂ２２５．２８で処置した５マウス／群およびアイソタイプコントロールｍＡｂＦ３Ｃ２５で処置した５マウス／群（１腫瘍サンプル／マウス／両群のレーン）から得た外科的に除去したＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞由来の原発性腫瘍中のＰＫＣ−α、ｐ−ＦＡＫ、ＦＡＫ、ｐ−Ｅｒｋ１／２、Ｅｒｋ１／２、ｐ−Ａｋｔ、およびＡｋｔのウェスタンブロッティング（図５Ｅ）。ＨＬＡクラスＩ抗原をローディングコントロールとして使用した。
【図５Ｂ】図５Ａ〜５Ｄは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂの影響を示す。図５Ａおよび５Ｂは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの術後の腫瘍の自然転移および再発のＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂによる阻害を示すグラフである。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞（２×１０６）を、０日目に各ＳＣＩＤマウスの乳房脂肪体に注射した。７日目に、腫瘍を測定可能であった場合、各群内の平均腫瘍体積が類似するように（１６ｍｍ３）マウスをそれぞれ５匹からなる３群に分けた。７日目から開始して、１つの群にＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂ７６３．７４（１００μｇ／マウス）を、１つの群にＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂ２２５．２８（１００μｇ／マウス）を、１週２回にて全部で１８回ｉ．ｐ．注射した。第３のマウス群に、コントロールｍＡｂ（１００μｇ／マウス）を注射した。７１日目に、全腫瘍を外科的に除去した。抗体を使用した処置を、９回のさらなる注射を使用した同一のレジメンを使用して継続した。１３１日目に、全てのマウスを屠殺し、肺転移（図５Ａ）および局所腫瘍再発（図５Ｂ）について試験した。この実験を２回繰り返した。＊はｐ値＜０．０５を示す。図５Ｃおよび５Ｄは、ＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂによる腫瘍血管形成の阻害ならびに細胞の成長、接着、および遊走に関連するｉｎ  ｖｉｖｏシグナル伝達の下方制御を示すデジタル画像およびグラフである。外科的に除去したＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞由来の原発性腫瘍中の血管数をＣＤ３１の染色によって検出し、各群由来の５つの腫瘍を使用した各切片の５つの無作為に選択した視野（４００倍）の記録によって定量した。＊はｐ値＜０．０５を示す（図５Ｃおよび５Ｄ）。ｍＡｂ２２５．２８で処置した５マウス／群およびアイソタイプコントロールｍＡｂＦ３Ｃ２５で処置した５マウス／群（１腫瘍サンプル／マウス／両群のレーン）から得た外科的に除去したＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞由来の原発性腫瘍中のＰＫＣ−α、ｐ−ＦＡＫ、ＦＡＫ、ｐ−Ｅｒｋ１／２、Ｅｒｋ１／２、ｐ−Ａｋｔ、およびＡｋｔのウェスタンブロッティング（図５Ｅ）。ＨＬＡクラスＩ抗原をローディングコントロールとして使用した。
【図５Ｃ】図５Ａ〜５Ｄは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂの影響を示す。図５Ａおよび５Ｂは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの術後の腫瘍の自然転移および再発のＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂによる阻害を示すグラフである。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞（２×１０６）を、０日目に各ＳＣＩＤマウスの乳房脂肪体に注射した。７日目に、腫瘍を測定可能であった場合、各群内の平均腫瘍体積が類似するように（１６ｍｍ３）マウスをそれぞれ５匹からなる３群に分けた。７日目から開始して、１つの群にＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂ７６３．７４（１００μｇ／マウス）を、１つの群にＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂ２２５．２８（１００μｇ／マウス）を、１週２回にて全部で１８回ｉ．ｐ．注射した。第３のマウス群に、コントロールｍＡｂ（１００μｇ／マウス）を注射した。７１日目に、全腫瘍を外科的に除去した。抗体を使用した処置を、９回のさらなる注射を使用した同一のレジメンを使用して継続した。１３１日目に、全てのマウスを屠殺し、肺転移（図５Ａ）および局所腫瘍再発（図５Ｂ）について試験した。この実験を２回繰り返した。＊はｐ値＜０．０５を示す。図５Ｃおよび５Ｄは、ＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂによる腫瘍血管形成の阻害ならびに細胞の成長、接着、および遊走に関連するｉｎ  ｖｉｖｏシグナル伝達の下方制御を示すデジタル画像およびグラフである。外科的に除去したＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞由来の原発性腫瘍中の血管数をＣＤ３１の染色によって検出し、各群由来の５つの腫瘍を使用した各切片の５つの無作為に選択した視野（４００倍）の記録によって定量した。＊はｐ値＜０．０５を示す（図５Ｃおよび５Ｄ）。ｍＡｂ２２５．２８で処置した５マウス／群およびアイソタイプコントロールｍＡｂＦ３Ｃ２５で処置した５マウス／群（１腫瘍サンプル／マウス／両群のレーン）から得た外科的に除去したＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞由来の原発性腫瘍中のＰＫＣ−α、ｐ−ＦＡＫ、ＦＡＫ、ｐ−Ｅｒｋ１／２、Ｅｒｋ１／２、ｐ−Ａｋｔ、およびＡｋｔのウェスタンブロッティング（図５Ｅ）。ＨＬＡクラスＩ抗原をローディングコントロールとして使用した。
【図５Ｄ】図５Ａ〜５Ｄは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂの影響を示す。図５Ａおよび５Ｂは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの術後の腫瘍の自然転移および再発のＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂによる阻害を示すグラフである。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞（２×１０６）を、０日目に各ＳＣＩＤマウスの乳房脂肪体に注射した。７日目に、腫瘍を測定可能であった場合、各群内の平均腫瘍体積が類似するように（１６ｍｍ３）マウスをそれぞれ５匹からなる３群に分けた。７日目から開始して、１つの群にＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂ７６３．７４（１００μｇ／マウス）を、１つの群にＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂ２２５．２８（１００μｇ／マウス）を、１週２回にて全部で１８回ｉ．ｐ．注射した。第３のマウス群に、コントロールｍＡｂ（１００μｇ／マウス）を注射した。７１日目に、全腫瘍を外科的に除去した。抗体を使用した処置を、９回のさらなる注射を使用した同一のレジメンを使用して継続した。１３１日目に、全てのマウスを屠殺し、肺転移（図５Ａ）および局所腫瘍再発（図５Ｂ）について試験した。この実験を２回繰り返した。＊はｐ値＜０．０５を示す。図５Ｃおよび５Ｄは、ＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂによる腫瘍血管形成の阻害ならびに細胞の成長、接着、および遊走に関連するｉｎ  ｖｉｖｏシグナル伝達の下方制御を示すデジタル画像およびグラフである。外科的に除去したＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞由来の原発性腫瘍中の血管数をＣＤ３１の染色によって検出し、各群由来の５つの腫瘍を使用した各切片の５つの無作為に選択した視野（４００倍）の記録によって定量した。＊はｐ値＜０．０５を示す（図５Ｃおよび５Ｄ）。ｍＡｂ２２５．２８で処置した５マウス／群およびアイソタイプコントロールｍＡｂＦ３Ｃ２５で処置した５マウス／群（１腫瘍サンプル／マウス／両群のレーン）から得た外科的に除去したＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞由来の原発性腫瘍中のＰＫＣ−α、ｐ−ＦＡＫ、ＦＡＫ、ｐ−Ｅｒｋ１／２、Ｅｒｋ１／２、ｐ−Ａｋｔ、およびＡｋｔのウェスタンブロッティング（図５Ｅ）。ＨＬＡクラスＩ抗原をローディングコントロールとして使用した。
【図５Ｅ】図５Ａ〜５Ｄは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂの影響を示す。図５Ａおよび５Ｂは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの術後の腫瘍の自然転移および再発のＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂによる阻害を示すグラフである。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞（２×１０６）を、０日目に各ＳＣＩＤマウスの乳房脂肪体に注射した。７日目に、腫瘍を測定可能であった場合、各群内の平均腫瘍体積が類似するように（１６ｍｍ３）マウスをそれぞれ５匹からなる３群に分けた。７日目から開始して、１つの群にＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂ７６３．７４（１００μｇ／マウス）を、１つの群にＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂ２２５．２８（１００μｇ／マウス）を、１週２回にて全部で１８回ｉ．ｐ．注射した。第３のマウス群に、コントロールｍＡｂ（１００μｇ／マウス）を注射した。７１日目に、全腫瘍を外科的に除去した。抗体を使用した処置を、９回のさらなる注射を使用した同一のレジメンを使用して継続した。１３１日目に、全てのマウスを屠殺し、肺転移（図５Ａ）および局所腫瘍再発（図５Ｂ）について試験した。この実験を２回繰り返した。＊はｐ値＜０．０５を示す。図５Ｃおよび５Ｄは、ＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂによる腫瘍血管形成の阻害ならびに細胞の成長、接着、および遊走に関連するｉｎ  ｖｉｖｏシグナル伝達の下方制御を示すデジタル画像およびグラフである。外科的に除去したＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞由来の原発性腫瘍中の血管数をＣＤ３１の染色によって検出し、各群由来の５つの腫瘍を使用した各切片の５つの無作為に選択した視野（４００倍）の記録によって定量した。＊はｐ値＜０．０５を示す（図５Ｃおよび５Ｄ）。ｍＡｂ２２５．２８で処置した５マウス／群およびアイソタイプコントロールｍＡｂＦ３Ｃ２５で処置した５マウス／群（１腫瘍サンプル／マウス／両群のレーン）から得た外科的に除去したＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞由来の原発性腫瘍中のＰＫＣ−α、ｐ−ＦＡＫ、ＦＡＫ、ｐ−Ｅｒｋ１／２、Ｅｒｋ１／２、ｐ−Ａｋｔ、およびＡｋｔのウェスタンブロッティング（図５Ｅ）。ＨＬＡクラスＩ抗原をローディングコントロールとして使用した。
【図６】図６Ａ〜６Ｂは、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞によって発現したＣＳＰＧ４の分子プロフィールを示すデジタル画像である。総ＲＮＡを、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞から抽出した。４３９ｂｐのＣＳＰＧ４のｃＤＮＡフラグメント（レーン７および８）をＲＴ−ＰＣＲによって合成した（Ｌｕｏ、Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２５、２８７３−２８８４、２００６）。１．５％アガロースゲルを使用してＰＣＲ産物を分析した。ＣＳＰＧ４コードプラスミドＤＮＡでのトランスフェクション後にＣＳＰＧ４を発現しない黒色腫細胞株Ｍ１４（レーン２および６）およびＣＳＰＧ４を発現するＭ１４／ＣＳＰＧ４（レーン３および７）をコントロールとして使用した。ハウスキーピング遺伝子β−アクチン（レーン２、３、および４）を、ＲＴ−ＰＣＲの内部コントロールとして使用した。レーン１および５はＤＮＡ分子マーカーである（図６Ａ）。細胞ＭＤＡ−ＭＢ−４３５由来の溶解物（レーン３および６）を、ＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂ７６３．７４を使用した免疫ブロット分析のために８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した（レーン１〜３）。アイソタイプはｍＡｂＭＫ２−２３（Ｋｕｓａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４３、３８４４−３８５２（１９８９）（レーン４〜６）およびＭ１４（レーン１および４）と適合し、Ｍ１４／ＣＳＰＧ４細胞（レーン２および５）をコントロールとして使用した。ｍＡｂＴＯ−５によって検出したカルネキシン（レーン１〜６）（Ｏｇｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２７８、３３−４４、２００３）を、ローディングコントロールとして使用した（図６Ｂ）。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
詳細な説明
本明細書中に記載の作業において、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）のＤＮＡマイクロアレイプロファイルおよびその後のヒト乳癌組織の異なるサブタイプの免疫組織化学（ＩＨＣ）を分析して、免疫療法の標的を同定した。この分析により、膜結合コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）（高分子量黒色腫関連抗原（Ｃａｍｐｏｌｉ，Ｍ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２４，２６７−２９６，２００４）としても公知）がＴＮＢＣ細胞上で優先的に発現することが示された。本明細書中に開示の研究で使用した細胞株を、ＤＮＡマイクロアレイによって基底様と定義した（Ｎｅｖｅ，ＲＭ，ｅｔ  ａｌ．（２００６），Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  １０：５１５−５２７（本明細書中で参考として援用される））。
【００１３】
系統発生的進化によって高度に保存されているＣＳＰＧ４は、Ｎ結合した２８０ｋＤａ糖タンパク質および４５０ｋＤａコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（共に黒色腫細胞上の決定基の発現において異種）からなる。少なくとも８０％の黒色腫病変中に制限された病変間および病変内（ｉｎｔｅｒ−  ａｎｄ  ｉｎｔｒａ−ｓｅｓｉｏｎａｌ）の異種性を伴うその発現の高さおよびその正常組織中の分布が制限されていることにより、ＣＳＰＧ４は黒色腫患者における免疫療法標的として使用されている。その臨床的意義は、疾患の臨床経過に及ぼすＣＳＰＧ４模倣物（Ｍｉｔｔｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ８９，４６６−４７０，１９９２）によって誘導されたＣＳＰＧ４特異的抗体の有益な影響によって示される。細胞の運動性および遊走におけるその役割（例えば、Ｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ２３５，２５４−２６４，１９９７を参照のこと）を有するＣＳＰＧ４およびそのラットホモログであるＮＧ２（例えば、Ｎｅｖｅ，Ｒ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  １０，５１５−５２７，２００６を参照のこと）は、腫瘍細胞の成長、生存、および治療抵抗性に重要である。これらの経路は、インテグリン機能（例えば、接着斑キナーゼ（ＦＡＫ））、成長および生存経路（ＥＲｋ１、２、およびＡｋｔなど）を調整する。さらに、ＮＧ２は、後成的機能による機能的ｃ−Ｍｅｔの発現を刺激することが示されている。
【００１４】
トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）は、エストロゲン受容体およびプロゲステロン受容体（ＥＲ／ＰＲ）およびＨＥＲ２タンパク質の発現について臨床的に陰性の最も一般的なＢＢＣの形態である（Ｃａｒｅｙ，Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２２（１１）（２００８年１０月１日にインターネットで利用可能）（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。ＴＮＢＣの１つの特徴は、遊走し、脳などに転移する能力である（Ｂｒａｂｌｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ５，７４４−７４９，２００５）。ＣＳＰＧ４タンパク質がＴＮＢＣ細胞上に発現することを本明細書中に証明する。さらに、ＣＳＰＧ４は、患者由来のＴＮＢＣ組織上に優先的に発現され、乳癌腫患者由来のＴＮＢＣ細胞株および悪性胸水の両方においてＣＳＣ表現型を有する細胞の亜集団によって高度に発現される。
【００１５】
ＣＳＰＧ４遮断の機能的役割を本明細書中で証明する。例えば、ＴＮＢＣ異種移植片転移において、ＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂが確立された転移の成長を有意に阻害し、後退させることを本明細書中に示す。制限されないが、ＴＮＢＣマウス実験モデルにおける結果を示し、同所性ＴＮＢＣマウスモデルにおける術後腫瘍再発および肺転移を有意に阻害した。実施例には、異種移植片腫瘍／転移を得るためにこれらの２つの腫瘍モデルで使用したＴＮＢＣ細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４３５およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１（これらは共に９９％の細胞で乳房ＣＳＣ表現型（ＣＤ４４＋、ＣＤ２４−／ｌｏ）を示す）の使用を記載する。ＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂによって媒介される腫瘍の再発および転移の阻害における分子作用機構は、ホスファチジルイノシトール（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔａｌ）−３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）／ＰＴＥＮ／ＡｋｔおよびＭＡＰＫ経路のシグナル伝達および腫瘍血管形成の両方を阻害する能力を含む。理論に拘束されないが、所見は、ＰＫＣ−α、ＦＡＫ  ＰＩ３Ｋ／ＡｋｔおよびＥｒｋ１、２経路（これらは全てＣＳＰＧ４機能に関連する）の活性化の阻害を反映する可能性が高い。これらの結果は、ＣＳＰＧ４がＴＮＢＣにおいて抗体ベースの免疫療法を適用するための重要な標的であることを示す。
【００１６】
用語
他で断りのない限り、技術用語を、従来の用法に従って使用する。分子生物学における一般用語の定義を、Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ  Ｖ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９４（ＩＳＢＮ  ０−１９−８５４２８７−９）；Ｋｅｎｄｒｅｗ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．，１９９４（ＩＳＢＮ  ０−６３２−０２１８２−９）；およびＲｏｂｅｒｔ  Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，１９９５（ＩＳＢＮ１−５６０８１−５６９−８）中に見出すことができる。
【００１７】
本開示の種々の実施形態の概説を容易にするために、特定の用語を以下に説明する。
【００１８】
抗原：哺乳動物における抗体の産生またはＴ細胞応答を刺激することができる化合物、組成物、または物質（動物に注射するか吸収される組成物が含まれる）。抗原は、特異的な体液性免疫または細胞性免疫の生成物（異種免疫原によって誘導される生成物が含まれる）と反応する。例示的な抗原はＣＳＰＧ４である。用語「抗原」には、全ての関連する抗原エピトープが含まれる。「エピトープ」または「抗原決定基」は、Ｂ細胞および／またはＴ細胞が応答する抗原上の部位をいう。エピトープを、隣接アミノ酸またはタンパク質の三次折り畳みによって並置された非隣接アミノ酸の両方から形成することができる。隣接アミノ酸から形成されたエピトープは、典型的には、変性溶媒への曝露の際に保持されるのに対して、三次折り畳みによって形成されたエピトープは、典型的には、変性溶媒での処置の際に喪失される。エピトープは、典型的には、固有の空間的高次構造の少なくとも３個、より通常には、少なくとも５個または８個から１０個のアミノ酸を含む。エピトープの空間的高次構造の決定方法には、例えば、Ｘ線結晶学および二次元核磁気共鳴が含まれる。
【００１９】
抗原は、組織特異的抗原または疾患特異的抗原であり得る。組織特異的抗原も疾患特異的抗原であり得るので、これらの用語は排他的ではない。組織特異的抗原は、限定された数の組織（１つの組織など）中に発現する。組織特異的抗原の制限されない具体例は、乳房特異的抗原または前立腺特異的抗原である。疾患特異的抗原は、疾患の経過と共に発現される。疾患特異的抗原の限定されない具体例は、その発現が乳癌（例えば、ＢＢＣまたはＴＮＢＣ）などの腫瘍形成と相関するか腫瘍形成が予測される抗原である。疾患特異的抗原は、Ｔ細胞またはＢ細胞によって認識される抗原であり得る。
【００２０】
増幅：核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子）の増幅は、検体中の核酸分子のコピー数を増加させる技術の使用をいう。増幅の例は、ポリメラーゼ連鎖反応である。これは、サンプル中でプライマーが核酸テンプレートとハイブリッド形成する条件下で被験体から回収した生物サンプルをオリゴヌクレオチドプライマー対と接触させる。適切な条件下でプライマーを伸長させ、テンプレートから解離させ、次いで、再アニーリングし、伸長させ、解離させて核酸のコピー数を増幅する。増幅産物を、標準的技術を使用した電気泳動、制限エンドヌクレアーゼ切断パーン、オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成またはライゲーション、および／または核酸配列決定によって特徴づけることができる。増幅の他の例には、米国特許第５，７４４，３１１号に開示の鎖置換増幅；米国特許第６，０３３，８８１号に開示の無転写等温増幅；ＷＯ９０／０１０６９号に開示の修復連鎖反応増幅；ＥＰ−Ａ−３２０  ３０８号に記載のリガーゼ連鎖反応増幅；米国特許第５，４２７，９３０号に開示のギャップ充填リガーゼ連鎖反応増幅；および米国特許第６，０２５，１３４号に開示のＮＡＳＢＡ（商標）ＲＮＡ無転写増幅が含まれる。
【００２１】
動物：生きている多細胞脊椎動物（例えば、哺乳動物および鳥類が含まれるカテゴリー）。用語哺乳動物には、ヒトおよび非ヒト哺乳動物（非ヒト霊長類が含まれる）が含まれる。同様に、用語「被験体」には、ヒト被験体および動物被験体の両方が含まれる。
【００２２】
乳癌：良性または悪性であり得る乳房組織の新生物容態。最も一般的な乳癌型は腺管癌腫である。腺管上皮内癌腫は、管の非浸潤性新生物容態である。小葉癌腫は侵襲性疾患ではないが、癌腫を発症し得ることの指標である。浸潤性（悪性）乳癌腫を、病期分類することができる（Ｉ、ＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡ、ＩＩＩＢ、およびＩＶ）。
【００２３】
乳癌腫は、正常な乳腺の典型的な組織学および構造を喪失している。一般に、癌腫細胞は、正常細胞が過成長し、腺様構造に分化する能力が喪失している。分化の喪失度は、一般に、腫瘍の攻撃性に関連する。例えば、「上皮内」癌腫は、その名の通り、基底膜がインタクトに保たれるのに対して、「浸潤性」に進行するにつれて、腫瘍は基底膜を突き抜ける。したがって、乳癌腫内に正常な乳房組織で認められる基底細胞の個別の層の染色が認められないと予想されるであろう。正常な乳房および乳癌腫の生理学および組織学の考察については、Ｒｏｎｎｏｖ−Ｊｅｓｓｅｎ，Ｌ．，Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｏ．Ｗ．＆  Ｂｉｓｓｅｌｌ，Ｍ．Ｊ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｒｍａｌ  ｔｏ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｂｒｅａｓｔ：ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ  ７６，６９−１２５（１９９６）を参照のこと。
【００２４】
乳癌を、その発現プロフィールに基づいた群に分類することができる。基底型癌腫は、通常、エストロゲン受容体（ＥＲ）発現に対して陰性であり、且つＨＥＲ２（ｅｒｂＢ２）およびプロゲステロン受容体（ＰＲ）の発現に対して陰性である。したがって、「トリプルネガティブ乳癌」または「ＴＮＢＣ」と呼ばれる。この乳癌型はＥＲ−／ＨＥＲ２−／ＰＲ−とも表示され、全乳癌の約１５〜２０％に相当し、一般に、Ｈｅｒ２標的治療またはエストロゲン標的治療を使用して処置することができない。この癌の攻撃性がＣＤ４４＋ＣＤ２４−／ｌｏ表現型を有する癌幹細胞（ＣＳＣ）の富化と相関すると考えられる。いくつかの実施形態では、基底癌腫は、プロゲステロン受容体（ＰＲ）発現に対して陰性であり、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）発現に対して陽性であり、サイトケラチン５（ＣＫ５）発現に対して陽性である。この表現型を以下のように表示する：ＥＲ−／ＰＲ−／ＨＥＲ２−／ＣＫ５＋／ＥＧＦＲ＋。
【００２５】
ヒト乳癌の基底管腔サブタイプは、細胞分画のみが基底サイトケラチン５に対して陽性である（＜７０％）という点で古典的な基底型腫瘍と区別される。さらに、３５％の基底管腔乳癌がＨＥＲ２の増幅または過剰発現を示す（Ｌａａｋｓｏ  ｅｔ  ａｌ，２００６，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１２：４１８５−４１９１）。一例を挙げれば、基底管腔サブタイプ腫瘍を、ＥＲ−／ＰＲ−／ＨＥＲ２＋／ＣＫ５＋／ＥＧＦＲ＋と特徴づけることができる。〔チェックのこと〕。
【００２６】
化学療法薬：異常な細胞成長によって特徴づけられる疾患の処置で有用な任意の化学物質。かかる疾患には、腫瘍、新生物、および癌、ならびに過形成性の成長によって特徴づけられる疾患（乾癬など）が含まれる。１つの実施形態では、化学療法薬は、乳癌および／または前立腺癌の処置で用いる薬剤である。１つの実施形態では、化学療法薬は放射性化合物である。当業者は、有用な化学療法薬を容易に同定することができる（例えば、Ｓｌａｐａｋ  ａｎｄ  Ｋｕｆｅ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ８６  ｉｎ  Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｐｅｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｃｈ．１７  ｉｎ  Ａｂｅｌｏｆｆ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２ｎｄ  ｅｄ．，（著作権）  ２０００  Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，Ｉｎｃ；  Ｂａｌｔｚｅｒ  Ｌ，Ｂｅｒｋｅｒｙ  Ｒ（ｅｄｓ）：Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｐｏｃｋｅｔ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，２ｎｄ  ｅｄ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏｓｂｙ−Ｙｅａｒ  Ｂｏｏｋ，１９９５；Ｆｉｓｃｈｅｒ  ＤＳ，Ｋｎｏｂｆ  ＭＦ，Ｄｕｒｉｖａｇｅ  ＨＪ（ｅｄｓ）：Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，４ｔｈ  ｅｄ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏｓｂｙ−Ｙｅａｒ  Ｂｏｏｋ，１９９３を参照のこと）。併用化学療法は、被験体への１つを超える癌処置薬の投与（放射性化合物または化学物質と組み合わせたＣＳＰＧ４に対する抗体の投与など）である。
【００２７】
保存的バリアント：「保存的」アミノ酸置換は、ＣＳＰＧ４の活性または抗原性に実質的に影響を及ぼさないか減少させない置換である。保存的置換の非限定的な具体例には、以下の例が含まれる。
【００２８】
【数１】
2012503203.tif 000002
用語「保存的変動」には、置換ポリペプチドに対して惹起した抗体も非置換ポリペプチドと免疫反応するという条件で、非置換親アミノ酸の代わりの置換アミノ酸の使用も含まれる。非保存的置換は、活性または抗原性を軽減させる置換である。
【００２９】
ｃＤＮＡ（相補ＤＮＡ）：転写を決定づける内部の非コードセグメント（イントロン）および調節配列を欠くＤＮＡ断片。ｃＤＮＡは、細胞から抽出された伝令ＲＮＡからの逆転写によって研究室内で合成される。
【００３０】
縮重バリアント：遺伝暗号の結果として縮重する配列を含むＣＳＰＧ４ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。２０種の天然アミノ酸が存在し、そのほとんどが１つを超えるコドンによって特定される。したがって、ヌクレオチド配列によってコードされるＣＳＰＧ４ポリペプチドのアミノ酸配列が不変である限り、全ての縮重ヌクレオチド配列は本開示に含まれる。
【００３１】
診断：病理学的容態（乳癌または前立腺癌などであるが、これらに限定されない）の存在または性質の同定。診断方法は、その感度および特異性が異なる。診断アッセイの「感度」は、試験される罹患個体が陽性である比率（真陽性率）である。診断アッセイの「特異性」は、１−偽陽性率であり、ここで、偽陽性率は、試験される罹患していない個体が陽性である比率と定義される。特定の診断方法では容態の確定診断を行えないが、その方法によって診断を補助する陽性を示すならば十分である。「予後」は、病理学的容態（乳癌（例えば、ＢＢＣ）または転移など）の発症の可能性（例えば、重症度）である。
【００３２】
エピトープ：抗原決定基。これらは、抗原性を示す（すなわち、特異的免疫応答を誘発する）分子上の特定の化学基またはペプチド配列である。抗体は、ポリペプチド上の特定の抗原エピトープに特異的に結合する。エピトープを、隣接アミノ酸またはタンパク質の三次折り畳みによって並置された非隣接アミノ酸の両方から形成することができる。隣接アミノ酸から形成されたエピトープは、典型的には、変性溶媒への曝露の際に保持されるのに対して、三次折り畳みによって形成されたエピトープは、典型的には、変性溶媒での処置の際に喪失される。エピトープは、典型的には、固有の空間的高次構造の少なくとも３個、より通常には、少なくとも５個または８個から１０個のアミノ酸を含む。エピトープの空間的高次構造の決定方法には、例えば、Ｘ線結晶学および二次元核磁気共鳴が含まれる。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６，Ｇｌｅｎｎ  Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｅｄ（１９９６）を参照のこと。
【００３３】
エストロゲン受容体（ＥＲ）：ホルモンである１７β−エストラジオール（エストロゲン）によって活性化される受容体。エストロゲン受容体の主な機能は、遺伝子発現を調節するＤＮＡ結合転写因子としての機能である。エストロゲン受容体は乳癌症例の約７０％で過剰発現し、「ＥＲ陽性」または「ＥＲ＋」と呼ばれる。ＥＲ＋乳癌の治療は、乳房組織中でＥＲアンタゴニストとして挙動する選択的エストロゲン受容体調節因子（ＳＥＲＭＳ）またはアロマターゼインヒビターを含む。ＥＲ状態を使用して、タモキシフェンおよびアロマターゼインヒビターに対する乳癌病変の感受性も決定する。
【００３４】
発現調節配列：作動可能に連結された異種核酸配列の発現を制御する核酸配列。発現調節配列は、発現調節配列が、核酸配列の転写、必要に応じて、翻訳を調節および制御する場合に核酸配列に作動可能に連結されている。したがって、発現調節配列には、適切なプロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、タンパク質コード遺伝子の前の開始コドン（すなわち、ＡＴＧ）、イントロンのスプライシングシグナル、ｍＲＮＡの適切な翻訳のための遺伝子の正確な読み取り枠の維持、および終止コドンが含まれ得る。用語「調節配列」には、最小限でもその存在が発現に影響を及ぼし得る成分が含まれることを意図し、その存在が有益なさらなる成分（例えば、リーダー配列および融合パートナー配列）も含まれ得る。発現調節配列には、プロモーターが含まれ得る。
【００３５】
プロモーターは、転写を指示するのに十分な最小の配列である。外部シグナルまたは外部因子によって細胞型特異的、組織特異的、または誘導性にプロモーター依存性遺伝子発現を調節可能にするのに十分なプロモーターエレメントも含まれる。かかるエレメントを遺伝子の５’領域または３’領域に配置することができる。構成的プロモーターおよび誘導性プロモーターの両方が含まれる（例えば、Ｂｉｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５３：５１６−５４４，１９８７を参照のこと）。例えば、細菌系でクローニングする場合、誘導性プロモーター（λバクテリオファージのｐＬ、ｐｌａｃ、ｐｔｒｐ、ｐｔａｃ（ｐｔｒｐ−ｌａｃハイブリッドプロモーター）など）を使用することができる。１つの実施形態では、哺乳動物細胞系でクローニングする場合、哺乳動物細胞ゲノム由来のプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例えば、レトロウイルス長末端反復；アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を使用することができる。組換えＤＮＡまたは合成技術によって産生されたプロモーターを使用して、核酸配列を転写することもできる。
【００３６】
ＨＥＲ２：ヒト上皮成長因子受容体２（Ｈｅｒ２）は、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（またはＥｒｂＢ−２、ＥＲＢＢ２）としても公知である。これは、ＥｒｂＢタンパク質ファミリー（上皮成長因子受容体ファミリーとしても公知）のメンバーである。ＨＥＲ２は、ＣＤ３４０（表面抗原分類３４０）およびｐ１８５とも示される。ＨＥＲ２は、乳癌の病変形成でのその役割および処置の標的として注目すべきである。これは、細胞膜表面結合受容体チロシンキナーゼであり、通常、細胞を成長および分化させるシグナル伝達経路に関与する。
【００３７】
およそ１５〜２０％の乳癌がＨＥＲ２遺伝子を増幅するか、そのタンパク質産物を過剰発現する。乳癌中のこの受容体の過剰発現は、疾患再発の増加および予後の悪化に関連している。その予後の役割のために、乳房腫瘍を、日常的にＨＥＲ２の過剰発現についてチェックする。過剰発現は、卵巣癌、胃癌、および生物学的に攻撃的な子宮癌形態（子宮漿液子宮内膜癌腫など）などの他の癌でも起こる。
【００３８】
宿主細胞：ベクターを増殖させ、そのＤＮＡを発現させることができる細胞。細胞は原核細胞または真核細胞であり得る。本用語には、本件の宿主細胞の任意の子孫も含まれる。複製中に起こる変異が存在し得るので、全ての子孫が親細胞と同一ではないかもしれないと理解される。しかし、用語「宿主細胞」を使用する場合、かかる子孫が含まれる。
【００３９】
免疫応答：免疫系細胞（Ｂ細胞、Ｔ細胞、または単球など）の刺激に対する応答。１つの実施形態では、応答は特定の抗原に特異的である（「抗原特異的応答」）。１つの実施形態では、免疫応答はＴ細胞応答（ＣＤ４＋応答またはＣＤ８＋応答など）である。別の実施形態では、応答はＢ細胞応答であり、それにより、特異的抗体（ＣＳＰＧ４に特異的に結合する抗体など）が産生される。
【００４０】
免疫抱合体：エフェクター分子の抗体への共有結合物。エフェクター分子は毒素であり得る。毒素の非限定的な具体例には、アブリン、リシン、シュードモナス外毒素（ＰＥ（ＰＥ３５、ＰＥ３７、ＰＥ３８、およびＰＥ４０など））、ジフテリア毒素（ＤＴ）、サポリン、レストリクトシン、もしくはその修飾毒素、または細胞成長の阻害または細胞の死滅を直接または間接的に行う他の毒物が含まれるが、これらに限定されない。例えば、ＰＥおよびＤＴは、典型的にはヒトにおいて肝臓および心臓に対する毒性によって死亡する毒性の高い化合物である。しかし、ＰＥおよびＤＴを、毒素の未変性のターゲティング成分（例えば、ＰＥのドメインＩａおよびＤＴのＢ鎖）の除去および異なるターゲティング部分（抗体など）との置換によって免疫毒素として使用するための形態に改変することができる。「キメラ分子」は、エフェクター分子に抱合した（カップリングした）ターゲティング部分（リガンドまたは抗体など）である。用語「抱合」または「連結」は、２つのポリペプチドから１つの隣接ポリペプチド分子を作製することをいう。１つの実施形態では、抗体（ＣＳＰＧ４に特異的に結合する抗体など）を、エフェクター分子（ＥＭ）に連結する。別の実施形態では、その体内での半減期を増加させるために、エフェクター分子に連結した抗体を、脂質もしくは他の分子またはタンパク質もしくはペプチドにさらに連結させる。化学的手段または組換え手段のいずれかによって連結することができる。１つの実施形態では、連結は化学的連結である。これは、抗体部分とエフェクター分子との間の反応によって２分子間で共有結合して１つの分子を形成する。ペプチドリンカー（短いペプチド配列）は、任意選択的に、抗体とエフェクター分子との間に含まれ得る。
【００４１】
免疫原性ペプチド：ペプチドがＭＨＣ分子に結合して免疫原性ペプチドに由来する抗原（ＣＳＰＧ４など）に対して細胞傷害性Ｔリンパ球（「ＣＴＬ」）応答またはＢ細胞応答（例えば、抗体産生）を誘導するような対立遺伝子特異的モチーフまたは他の配列を含むペプチド。
【００４２】
１つの実施形態では、免疫原性ペプチドを、当該分野で公知の配列モチーフまたは他の方法（ニューラルネットまたは多項式の決定など）を使用して同定する。典型的には、アルゴリズムを使用してペプチドの「結合閾値」を決定し、一定の親和性で結合する確率を高くして免疫原性を示すスコアを有するペプチドを選択する。アルゴリズムは、特定の位置での特定のアミノ酸のＭＨＣ結合に及ぼす影響、特定の位置での特定のアミノ酸の抗体結合に及ぼす影響、またはモチーフ含有ペプチド中の特定の置換基の結合に及ぼす影響のいずれかに基づく。免疫原性ペプチドの文脈内で、「保存された残基」は、ペプチド中の特定の位置での無作為な分布によって予想されるよりも有意に高い頻度で出現する残基である。１つの実施形態では、保存された残基は、ＭＨＣ構造によって免疫原性ペプチドとの接触点を得ることができる残基である。ＭＨＣ結合予測プログラムがインターネット上で利用可能である（Ｉｍｔｅｃｈウェブサイトに存在するＰｒｏＰｅｄ−Ｉなど）（Ｓｉｎｇｈ  ａｎｄ  Ｒａｇｈａｖａ，ＰｒｏＰｒｅｄ１：Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ−Ｉ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２００３）。
【００４３】
免疫原性組成物：ポリペプチド（ＣＳＰＧ４ポリペプチドなど）を発現する細胞に対して測定可能な免疫応答を誘導する抗原ポリペプチド（ＣＳＰＧ４ポリペプチドなど）を含む組成物。免疫応答は、ＣＳＰＧ４ポリペプチドを発現する細胞に対する測定可能なＣＴＬ応答またはＣＳＰＧ４ポリペプチド（ＢＢＣ（ＴＮＢＣ）細胞など）に対する測定可能なＢ細胞応答（ＣＳＰＧ４に特異的に結合する抗体の産生など）であり得る。これは、さらに、ＣＳＰＧ４ポリペプチドを発現する（そしてＣＳＰＧ４に対する免疫応答を誘発する）ために使用することができるＣＳＰＧ４ポリペプチドをコードする単離核酸をいう。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの使用のために、免疫原性組成物は単離したタンパク質またはペプチドからなり得る。ｉｎ  ｖｉｖｏでの使用のために、免疫原性組成物は、典型的には、薬学的に許容可能なキャリアおよび／または他の薬剤中にタンパク質またはペプチドを含むであろう。任意の特定のペプチドであるＣＳＰＧ４ポリペプチドまたはこのポリペプチドをコードする核酸を、当該分野で認識されているアッセイによってＣＴＬ応答またはＢ細胞応答を誘導する能力について容易に試験することができる。
【００４４】
免疫グロブリン（抗体）：抗原に特異的に結合する免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされる１つまたは複数のポリペプチドを含むタンパク質。認識された免疫グロブリン遺伝子には、κ、λ、α（ＩｇＡ）、γ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、およびμ（ＩｇＭ）定常領域遺伝子、ならびに多種多様な免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。全長免疫グロブリン軽鎖は、一般に、約２５Ｋｄまたは２１４アミノ酸長である。全長免疫グロブリン重鎖は、一般に、約５０Ｋｄまたは４４６アミノ酸長である。軽鎖は、ＮＨ２末端側の可変領域遺伝子（約１１０アミノ酸長）およびＣＯＯＨ−−末端側のκまたはλ定常領域遺伝子によってコードされる。重鎖は、同様に、可変領域遺伝子（約１１６アミノ酸長）および他の定常領域遺伝子の１つによってコードされる。
【００４５】
抗体の基本構造単位は、一般に、２つの同一の免疫グロブリン鎖対からなる四量体であり、各対は１つの軽鎖および１つの重鎖を有する。各対では、軽鎖および重鎖の可変領域は抗原に結合し、定常領域はエフェクター機能を媒介する。免疫グロブリンはまた、種々の他の形態（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、および（Ｆａｂ’）２、ならびに二機能性ハイブリッド抗体および単鎖が含まれる）で存在する（例えば、Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：１０５，１９８７；Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５：５８７９−５８８３，１９８８；Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６，１９８８；Ｈｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｎ．Ｙ．，２ｎｄ  ｅｄ．，１９８４；Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｈｏｏｄ，Ｎａｔｕｒｅ  ３２３：１５−１６，１９８６）。
【００４６】
免疫グロブリンの軽鎖または重鎖の可変領域は、３つの超可変領域（相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれる）によって遮られたフレームワーク領域を含む（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｅ．Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９８３を参照のこと）。上述の通り、ＣＤＲは、主に、抗原のエピトープへの結合を担う。免疫複合体は、抗原に特異的に結合した抗体（モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体など）または機能的抗体フラグメントである。
【００４７】
キメラ抗体は、その軽鎖および重鎖の遺伝子が、典型的には遺伝子操作によって、異なる種に属する免疫グロブリンの可変領域遺伝子および定常領域遺伝子から構築された抗体である。例えば、マウスモノクローナル抗体由来の遺伝子の可変セグメントを、ヒト定常セグメント（κおよびγ１またはγ３など）に連結することができる。従って、一例を挙げれば、治療キメラ抗体は、マウス抗体由来の可変ドメインまたは抗原結合ドメインおよびヒト抗体由来の定常ドメインまたはエフェクタードメインから構成されるハイブリッドタンパク質であるが、他の哺乳動物種を使用することができるか、分子技術によって可変領域を産生することができる。キメラ抗体の作製方法は当該分野で周知である（例えば、米国特許第５，８０７，７１５号を参照のこと）。
【００４８】
「ヒト化」免疫グロブリンは、ヒトフレームワーク領域および非ヒト（マウス、ラット、または合成など）免疫グロブリン由来の１つまたは複数のＣＤＲを含む免疫グロブリンである。ＣＤＲを提供する非ヒト免疫グロブリンは「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを提供するヒト免疫グロブリンは「アクセプター」と呼ばれる。１つの実施形態では、全てのＣＤＲはヒト化免疫グロブリン中のドナー免疫グロブリンに由来する。定常領域が存在する必要はないが、存在する場合、定常領域はヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一でなければならない（すなわち、少なくとも約８５〜９０％同一（約９５％以上同一など））。それ故、全てのヒト化免疫グロブリン部分（おそらくＣＤＲを除く）は、天然のヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同一である。「ヒト化抗体」は、ヒト化軽鎖免疫グロブリンおよびヒト化重鎖免疫グロブリンを含む抗体である。ヒト化抗体は、ＣＤＲを提供するドナー抗体と同一の抗原に結合する。ヒト化免疫グロブリンまたは抗体のアクセプターフレームワークは、ドナーフレームワークから採取したアミノ酸との限定数の置換を有し得る。ヒト化または他のモノクローナル抗体は、抗原結合機能または他の免疫グロブリン機能に実質的に影響を及ぼさないさらなる保存的アミノ酸置換を有し得る。例示的な保存的置換は、ｇｌｙ、ａｌａ；ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ；ａｓｐ、ｇｌｕ；ａｓｎ、ｇｌｎ；ｓｅｒ、ｔｈｒ；ｌｙｓ、ａｒｇ；およびｐｈｅ、ｔｙｒなどの置換である。ヒト化免疫グロブリンを、遺伝子操作手段によって構築することができる（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号を参照のこと）。
【００４９】
ヒト抗体は、軽鎖遺伝子および重鎖遺伝子がヒト起源である抗体である。ヒト抗体を、当該分野で公知の方法を使用して生成することができる。ヒト抗体を、目的の抗体を分泌するヒトＢ細胞の不死化によって産生することができる。例えば、ＥＢＶ感染またはヒトＢ細胞を骨髄腫またはハイブリドーマ細胞と融合してトリオーマ細胞を産生することによって不死化することができる。ヒト抗体を、ファージディスプレイ法（例えば、Ｄｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／１７２７１号；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／００１０４７号；およびＷｉｎｔｅｒ，ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／２０７９１号（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）によって産生するか、ヒト組み合わせモノクローナル抗体ライブラリー（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓウェブサイトを参照のこと）から選択することもできる。ヒト抗体を、ヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニック動物の使用によって調製することもできる（例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＴ公開番号ＷＯ９３／１２２２７号およびＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ，ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／１０７４１号（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。
【００５０】
単離された：「単離された」生物学的成分（核酸、タンパク質、またはオルガネラなど）は、天然に存在する生物の細胞内の他の生物学的成分（すなわち、他の染色体および染色体外ＤＮＡおよびＲＮＡ、タンパク質、ならびにオルガネラ）から実質的に分離されているか、精製されている。「単離された」核酸およびタンパク質には、標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質が含まれる。この用語はまた、宿主細胞中での組換え発現によって調製された核酸およびタンパク質ならびに化学合成された核酸を含む。
【００５１】
標識：分子の検出を容易にするために別の分子に直接または間接的に抱合される検出可能な化合物または組成物。標識の非限定的な具体例には、蛍光タグ、酵素的連結、および放射性同位体が含まれる。
【００５２】
リンパ球：身体の免疫防御に関与する白血球型。主に以下の２つのリンパ球型が存在する：Ｂ細胞およびＴ細胞。
【００５３】
哺乳動物：この用語には、ヒトおよび非ヒト哺乳動物の両方が含まれる。同様に、用語「被験体」には、ヒト被験体および動物被験体が含まれる。
【００５４】
モノクローナル抗体：Ｂリンパ球の単一クローンまたは単一抗体の軽鎖遺伝子および重鎖遺伝子がトランスフェクトされた細胞によって産生された抗体。モノクローナル抗体を、当業者に公知の方法（例えば、骨髄腫細胞の免疫脾臓細胞との融合からハイブリッド抗体形成細胞を作製すること）によって産生する。モノクローナル抗体には、ヒト化モノクローナル抗体が含まれる。
【００５５】
オリゴヌクレオチド：約１００ヌクレオチドまでの塩基長の線状ポリヌクレオチド配列。
【００５６】
読み取り枠（ＯＲＦ）：いかなる内部末端コドンも使用せずにアミノ酸をコードする一連のヌクレオチドトリプレット（コドン）。これらの配列は、通常、ペプチドに翻訳可能である。
【００５７】
作動可能に連結された：第１の核酸配列は、第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的関係にある場合に第２の核酸配列と作動可能に連結されている。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、プロモーターはコード配列に作動可能に連結されている。一般に、作動可能に連結されたＤＮＡ配列は連続的であり、２つのタンパク質コード領域を連結する必要がある場合、同一の読み枠中に存在する。
【００５８】
ペプチド：３アミノ酸長と３０アミノ酸長との間（８〜１０アミノ酸長など）のアミノ酸鎖。１つの実施形態では、ペプチドは約１０〜約２５アミノ酸長である。さらに別の実施形態では、ペプチドは約１１〜約２０アミノ酸長である。さらに別の実施形態では、ペプチドは約１２アミノ酸長である。
【００５９】
ペプチド修飾：ＣＳＰＧ４ポリペプチドには、本明細書中に記載のペプチドの合成実施形態が含まれる。さらに、これらのタンパク質のアナログ（非ペプチド有機分子）、誘導体（開示のペプチド配列から開始して得た化学的に官能化したペプチド分子）、およびバリアント（ホモログ）を、本明細書中に記載の方法で使用することができる。本開示の各ポリペプチドは、天然に存在するか存在しないＬ型アミノ酸および／またはＤ型アミノ酸であり得るアミノ酸配列から構成される。
【００６０】
ペプチドを種々の化学的技術によって修飾して、非修飾ペプチドと本質的に同一の活性を有し、任意選択的に他の望ましい性質を有する誘導体を産生することができる。例えば、タンパク質のカルボン酸基（カルボキシル末端または側鎖のいずれであろうと）を、薬学的に許容可能なカチオンの塩の形態で得ることができるか、エステル化してＣ１〜Ｃ１６エステルを形成することができるか、式ＮＲ１Ｒ２（式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立してＨまたはＣ１〜Ｃ１６アルキルである）のアミドに変換することができるか、組み合わせて複素環（５員環または６員環など）を形成することができる。ペプチドのアミノ基（アミノ末端または側鎖のいずれであろうと）は、薬学的に許容可能な酸付加塩の形態（ＨＣｌ、ＨＢｒ、酢酸塩、安息香酸塩、トルエン硫酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、および他の有機塩など）にあり得るか、Ｃ１〜Ｃ１６アルキルまたはジアルキルアミノに修飾することができるか、アミドにさらに変換することができる。
【００６１】
ペプチド側鎖のヒドロキシル基を、十分に認識された技術を使用してＣ１〜Ｃ１６アルコキシまたはＣ１〜Ｃ１６エステルに変換することができる。ペプチド側鎖のフェニル環およびフェノール環を、１つまたは複数のハロゲン原子（フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素など）、Ｃ１〜Ｃ１６アルキル、Ｃ１〜Ｃ１６アルコキシ、カルボン酸およびそのエステル、またはかかるカルボン酸のアミドに置換することができる。ペプチド側鎖のメチレン基を、類似のＣ２〜Ｃ４アルキレンに伸長することができる。チオールを、多数の十分に認識された保護基のいずれか１つ（アセトアミド基など）で保護することができる。当業者はまた、高次構造を選択し、これに対して構造制約を提供して安定性を向上させるために本開示のペプチドに環状構造を導入する方法も認識するであろう。
【００６２】
ペプチド模倣物および有機模倣物の実施形態が予想される。それにより、かかるペプチド模倣物および有機模倣物の化学成分の三次元配置がペプチド骨格および成分のアミノ酸側鎖の三次元配置を模倣し、それにより、免疫応答を生じる能力が測定可能であるか増強されたＣＳＰＧ４ポリペプチドのかかるペプチド模倣物および有機模倣物が得られる。コンピュータモデリングアプリケーションのために、ファルマコフォアは生物学的活性のための構造要件に理想的な三次元定義である。ペプチド模倣物および有機模倣物を、現行のコンピュータモデリングソフトウェア（コンピュータ支援薬物デザインまたはＣＡＤＤを使用）を使用して各ファルマコフォアに適合するようにデザインすることができる。Ｗａｌｔｅｒｓ，”Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ，”  ｉｎ  Ｋｌｅｇｅｒｍａｎ  ＆  Ｇｒｏｖｅｓ，ｅｄｓ．，１９９３，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｔｅｒｐｈａｒｍ  Ｐｒｅｓｓ：Ｂｕｆｆａｌｏ  Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ，ｐｐ．１６５〜１７４  ａｎｄ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  Ｍｕｎｓｏｎ（ｅｄ．）１９９５，Ｃｈ．１０２（ＣＡＤＤで使用される技術の説明のため）を参照のこと。かかる技術を使用して調製した模倣物も含まれる。
【００６３】
薬学的に許容可能なキャリア：有用な薬学的に許容可能なキャリアは従来のキャリアである。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｂｙ  Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９７５）は、本明細書中に開示の融合タンパク質の薬学的送達に適切な組成物および処方物を記載している。
【００６４】
一般に、キャリアの性質は、使用される特定の投与様式に依存するであろう。例えば、非経口処方物は、通常、注射液（ビヒクルとしての薬学的および生理学的に許容可能な流動物（水、生理食塩水、平衡塩類溶液、デキストロース水溶液、またはグリセロールなど）が含まれる）を含む。固体組成物（例えば、粉末、丸薬、錠剤、またはカプセル形態）のために、従来の非毒性固体キャリアには、例えば、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムが含まれ得る。生物学的に中性のキャリアに加えて、投与すべき薬学的組成物は、少量の非毒性補助剤（湿潤剤、乳化剤、防腐剤、およびｐＨ緩衝剤など）（例えば、酢酸ナトリウムまたはモノラウリン酸ソルビタン）を含むことができる。
【００６５】
ポリヌクレオチド：用語ポリヌクレオチドまたは核酸配列は、少なくとも１０塩基長のポリマー形態のヌクレオチドをいう。組換えポリヌクレオチドには、由来する生物の天然に存在するゲノム中の直接隣接するコード配列の両方（５’末端上の１つおよび３’末端上の１つ）と直接隣接しないポリヌクレオチドが含まれる。したがって、この用語には、例えば、ベクター、自己複製プラスミドまたはウイルス、または原核生物または真核生物のゲノムＤＮＡに組込まれる組換えＤＮＡ、または他の配列と独立して個別の分子として存在する組換えＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）が含まれる。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはいずれかのヌクレオチドの修飾形態であり得る。この用語には、一本鎖および二本鎖形態のＤＮＡが含まれる。
【００６６】
ポリペプチド：長さや翻訳後修飾（例えば、グリコシル化またはリン酸化）と無関係の任意のアミノ酸鎖。１つの実施形態では、ポリペプチドはＣＳＰＧ４ポリペプチドである。
【００６７】
プローブおよびプライマー：プローブは、検出可能な標識またはレポーター分子に付着した単離核酸を含む。プライマーは、短い核酸、好ましくは、１５ヌクレオチド長以上のＤＮＡオリゴヌクレオチドである。プライマーを核酸ハイブリッド形成によって相補標的ＤＮＡ鎖にアニーリングしてプライマーと標的ＤＮＡ鎖との間にハイブリッドを形成し、次いで、ＤＮＡポリメラーゼ酵素によって標的ＤＮＡ鎖に沿って伸長することができる。プライマー対を、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または当該分野で公知の他の核酸増幅法による核酸配列の増幅のために使用することができる。当業者は、特定のプローブまたはプライマーの特異性がその長さと共に増加することを認識するであろう。したがって、例えば、２０個の連続するヌクレオチドを含むプライマーは、たった１５個のヌクレオチドの対応するプライマーよりも高い特異性で標的にアニーリングするであろう。したがって、より高い特異性を得るために、２０、２５、３０、３５、４０、５０、またはそれを超える連続ヌクレオチドを含むプローブおよびプライマーを選択することができる。
【００６８】
プロゲステロン受容体（ＰＲ）：プロゲステロンに特異的に結合するステロイド受容体であるＮＲ３Ｃ３（核内受容体サブファミリー３、群Ｃ、メンバー３）としても公知の受容体。プロゲステロン受容体は、トリプルネガティブ基底乳癌細胞上に発現されない。
【００６９】
プロモーター：プロモーターは、核酸の転写を指示する一連の核酸調節配列である。プロモーターは、転写開始部位付近の必要な核酸配列（ポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合、ＴＡＴＡエレメントなど）を含む。プロモーターはまた、任意選択的に、転写開始部位から数千塩基対程度の位置に存在し得る遠位エンハンサーまたはリプレッサーエレメントを含む。構成的プロモーターおよび誘導性プロモーターの両方が含まれる（例えば、Ｂｉｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５３：５１６−５４４，１９８７を参照のこと）。
【００７０】
プロモーターの非限定的な具体例には、哺乳動物細胞ゲノム由来のプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例えば、レトロウイルス長末端反復；アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）が含まれ、これらを使用することができる。組換えＤＮＡまたは合成技術によって産生されたプロモーターも使用することができる。ポリヌクレオチドを、宿主の挿入された遺伝子配列の効率的な転写を容易にするプロモーター配列を含む発現ベクターに挿入することができる。発現ベクターは、典型的には、複製起点、プロモーター、および形質転換された細胞の表現型選択が可能な特異的核酸配列を含む。
【００７１】
精製された：用語「精製された」は、絶対的な純度は必要なく、むしろ、相対的用語を意図する。したがって、例えば、精製された核酸は、核酸が天然の環境下での細胞内の核酸より富化された核酸である。同様に、精製されたペプチド調製物は、ペプチドまたはタンパク質が天然の環境下での細胞内のペプチドまたはタンパク質より富化されたものである。実質的精製は、他のタンパク質または細胞成分からの精製を示す。１つの実施形態では、タンパク質またはペプチドが調製物の総ペプチドまたはタンパク質含有量の少なくとも５０％（７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％などであるが、これらに限定されない）に相当するように調製物を精製する（または単離する）。本明細書中に開示のＣＳＰＧ４ポリペプチドを、当該分野で公知の任意の手段によって精製する（および／または合成する）ことができる（例えば、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｅｄ．Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９０；およびＳｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８２を参照のこと）。
【００７２】
組換え：組換え核酸は、天然に存在しない配列を有するか、２つの別の分離された配列セグメントの人為的組み合わせによって作製される配列を有する核酸である。この人為的組み合わせを、しばしば、化学合成、より一般的には、単離された核酸セグメントの人為的操作（例えば、遺伝子操作技術）によって行う。
【００７３】
選択的にハイブリッド形成する：無関係のヌクレオチド配列を排除する中ストリンジェント条件または高ストリンジェント条件下でのハイブリッド形成。
【００７４】
核酸ハイブリッド形成反応では、特定のストリンジェンシーレベルを達成するために使用される条件は、ハイブリッド形成される核酸の性質に応じて変化するであろう。例えば、核酸のハイブリッド形成領域の長さ、相補度、ヌクレオチド配列の組成（例えば、ＧＣ対ＡＴ含量）、および核酸型（例えば、ＲＮＡ対ＤＮＡ）を、ハイブリッド形成条件の選択で考慮することができる。例えば、フィルター上に核酸の１つを固定するかどうかをさらに考慮する。
【００７５】
連続的により高くなるストリンジェンシー条件の非限定的な具体例は以下である：ほぼ室温で２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（ハイブリッド形成条件）；ほぼ室温で０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（低ストリンジェンシー条件）；約４２℃で０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（中ストリンジェンシー条件）；および約６８℃で０．１×ＳＳＣ（高ストリンジェンシー条件）。当業者は、これらの条件のバリエーションを容易に決定することができる（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，ｖｏｌ．１−３，ｅｄ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）。これらの条件のうちの１つのみ（例えば、高ストリンジェンシー条件）を使用して洗浄することができるか、各条件を、例えば、上記順序で１０〜１５分間、列挙した工程のいずれかまたは全てを繰り返して使用することができる。しかし、上記のように、最適な条件は、関連する特定のハイブリッド形成反応に応じて変化し、この条件を経験的に決定することができる。
【００７６】
配列同一性：アミノ酸配列間の類似性を、配列間の類似性に関して示し、そうでなければ、配列同一性と呼ばれる。配列同一性は、頻繁に、同一率（または類似性または相同性）に関して測定される。この比率が高いほど２つの配列は類似する。ＣＳＰＧ４ポリペプチドのホモログまたはバリアントは、標準的な方法を使用してアラインメントした場合に比較的高い配列同一性を有するであろう。
【００７７】
比較のための配列のアラインメント方法は当該分野で周知である。種々のプログラムおよびアラインメントアルゴリズムが以下に記載されている：Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２，１９８１；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０；Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４，１９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ  ７３：２３７，１９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１，１９８９；Ｃｏｒｐｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １６：１０８８１，１９８８；およびＰｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４，１９８８。Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．６：１１９，１９９４は、配列アラインメント法および相同性の計算について詳細に検討している。
【００７８】
ＮＣＢＩ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３，１９９０）は、いくつかの供給源（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）が含まれる）およびインターネットから利用可能であり、これは、配列分析プログラムであるｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘと併せて用いる。このプログラムを使用した配列同一性の決定方法の説明は、インターネット上のＮＣＢＩウェブサイトで利用可能である。
【００７９】
ＣＳＰＧ４ポリペプチドのホモログおよびバリアントは、典型的には、  ＮＣＢＩ  Ｂｌａｓｔ  ２．０（デフォルトパラメーターに設定したギャップありのｂｌａｓｔｐ）を使用してＣＳＰＧ４のアミノ酸配列との全長アラインメントにわたって計数した少なくとも７５％（例えば、少なくとも８０％）の配列同一性を有することによって特徴づけられる。約３０個を超えるアミノ酸のアミノ酸配列の比較のために、デフォルトパラメーター（ギャップ存在コスト（ｇａｐ  ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ  ｃｏｓｔ）１１および１残基あたりのギャップコスト１）に設定したデフォルトＢＬＯＳＵＭ６２行列を使用したＢｌａｓｔ２配列関数を使用する。短いペプチド（およそ３０アミノ酸未満）をアラインメントする場合、デフォルトパラメーター（オープンギャップ９、伸長ギャップ１ペナルティ）に設定したＰＡＭ３０行列を使用したＢｌａｓｔ２配列関数を使用してアラインメントを行うべきである。基準配列とさらにより高い類似性を有するタンパク質は、この方法で評価した場合に同一率が増加するであろう（少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％配列同一性など）。全配列未満を配列同一性について比較する場合、ホモログおよびバリアントは、典型的には、１０〜２０アミノ酸の短いウィンドウにわたって少なくとも８０％配列同一性を有するであろう。そして、基準配列に対するその類似性に応じて少なくとも８５％または少なくとも９０％または９５％の配列同一性を有し得る。かかる短いウィンドウにわたる配列同一性の決定方法は、インターネット上のＮＣＢＩウェブサイトで利用可能である。当業者は、これらの配列同一性の範囲がガイダンスのみのために提供され、示した範囲外に非常に有意なホモログを得ることが完全に可能であると認識するであろう。
【００８０】
特異的結合剤：実質的に規定の標的のみに結合する薬剤。したがって、ＣＳＰＧ４特異的結合剤は、ＣＳＰＧ４ポリペプチドに実質的に結合する薬剤である。１つの実施形態では、特異的結合剤は、ＣＳＰＧ４に特異的に結合するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である。
【００８１】
被験体：生きている多細胞脊椎動物（ヒトおよび動物被験体（ヒトおよび非ヒト哺乳動物が含まれる）の両方が含まれるカテゴリー）。
【００８２】
Ｔ細胞：免疫応答に極めて重要な白血球。Ｔ細胞には、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞が含まれるが、これらに限定されない。ＣＤ４＋Ｔリンパ球は、その表面上に「表面抗原分類４」（ＣＤ４）として公知のマーカーを保有する免疫細胞である。しばしば「ヘルパー」Ｔ細胞と呼ばれるこれらの細胞は、免疫応答（抗体応答およびキラーＴ細胞応答が含まれる）の編成を補助する。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、「表面抗原分類８」（ＣＤ８）マーカーを保有する。１つの実施形態では、ＣＤ８Ｔ細胞は細胞傷害性Ｔリンパ球である。別の実施形態では、ＣＤ８細胞はサプレッサーＴ細胞である。
【００８３】
治療活性ポリペプチド：臨床反応（例えば、免疫細胞集団の増加、ＣＳＰＧ４に特異的に結合する抗体の産生、または全身腫瘍組織量の測定可能な軽減）によって測定した場合に免疫応答を誘導するＣＳＰＧ４ポリペプチドなどの薬剤。治療活性分子を、核酸から作製することもできる。核酸ベースの治療活性分子の例は、ＣＳＰＧ４ポリペプチドをコードする核酸配列であり、ここで、核酸配列は、プロモーターなどの調節エレメントに作動可能に連結している。治療活性剤には、有機化合物または他の化合物も含まれ得る。治療活性剤にはアジュバントも含まれ得る。
【００８４】
用語「ＣＳＰＧ４の治療有効フラグメント」または「ＣＳＰＧ４の治療有効バリアント」には、ＣＳＰＧ４の機能を保持しているか、ＣＳＰＧ４の抗原エピトープを保持しているＣＳＰＧ４の任意のフラグメントまたはＣＳＰＧ４のバリアントが含まれる。
【００８５】
１つの実施形態では、ＣＳＰＧ４フラグメントの治療有効量は、被験体において免疫応答をもたらすか、乳癌、具体的にはＢＢＣを処置するために使用される量である。非限定的な具体例は、ＣＳＰＧ４のＮ末端側またはＣＳＰＧ４のＣ末端側である。処置は、乳癌または前立腺癌の徴候または症状を改善するか全身腫瘍組織量を減少させる治療介入をいう。
【００８６】
形質導入された：形質導入された細胞は、分子生物学技術によって核酸分子を導入した細胞である。本明細書中で使用する場合、用語「形質導入」は、核酸分子をかかる細胞に導入することができる全ての技術（ウイルスベクターを使用したトランスフェクション、プラスミドベクターを使用した形質転換、ならびにエレクトロポレーション、リポフェクション、および遺伝子銃による裸のＤＮＡの導入が含まれる）を含む。
【００８７】
ベクター：宿主細胞に導入され、それにより形質転換された宿主細胞が産生される核酸分子。ベクターは、宿主細胞中で複製される核酸配列（複製起点など）を含むことができる。ベクターは、１つまたは複数の選択マーカー遺伝子および当該分野で公知の他の遺伝子エレメントも含むことができる。
【００８８】
他で説明されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示に属する当業者によって一般的に理解されている意味を有する。文脈が明らかに異なる場合を除いて、単数形の用語「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には複数形が含まれる。同様に、文脈が明らかに異なる場合を除いて、用語「ｏｒ」には「ａｎｄ」が含まれることを意図する。核酸またはポリペプチドについて与えられた全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、および全ての分子量または分子質量の値は近似値であり、且つ説明のために提供されているとさらに理解すべきである。本明細書中に記載の方法および材料に類似するか等価な方法および材料を本開示の実施または試験で使用することができるにもかかわらず、適切な方法および材料を以下に記載する。用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」は「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」を意味する。本明細書中に記載の全ての刊行物、特許出願、特許、および他のリファレンスは、その全体が参考として援用される。矛盾する場合、本明細書（用語の説明が含まれる）に従うであろう。さらに、材料、方法、および実施例は例示のみを目的とし、本発明を制限することを意図しない。
【００８９】
ＣＳＰＧ４に結合するモノクローナル抗体
ＣＳＰＧ４に特異的に結合する抗体（モノクローナル抗体が含まれる）を産生した。一例を挙げれば、ＣＳＰＧ４は以下のアミノ酸配列を有する。
【００９０】
【化１】
2012503203.tif 000003
ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＡＡＩ２８１１１（本明細書中で参考として援用される）も参照のこと。
【００９１】
ＣＳＰＧ４は、内皮基底膜上の初期の黒色腫細胞の拡大事象中の細胞−基層相互作用の安定化で役割を果たすヒト黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカンである。ＣＳＰＧ４は、ヒト悪性黒色腫細胞によって発現される内在性膜コンドロイチン硫酸プロテオグリカンを意味する。
【００９２】
ＣＳＰＧ４はＨＭＷ−ＭＡＡとしても示される。ｉｎ  ｖｉｖｏでは、これは、２つの非共有結合したグリコポリペプチドからなる分子中に存在する。一方の見かけ上の分子量は２８０Ｋであり、他方の見かけ上の分子量は４４０Ｋを超える。ＨＭＷ−ＭＡＡは、ヒト黒色腫細胞によって合成され、発現される（Ｓｐｉｒｏ，Ｒ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｆ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１７７９（１９８９）；Ｅｓｋｏ，Ｊ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０９２，１９８８）。プロテオグリカンは、そのコア中のセリン残基に共有結合したグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）ポリサッカリド鎖を有する糖タンパク質である。ＣＳＰＧ４コアタンパク質は、最初に、高マンノース型のアスパラギンＮ結合オリゴサッカリドを有する分子量２４０Ｋの前駆体として翻訳される。
【００９３】
別の例では、ＣＳＰＧ４は以下に示した核酸配列によってコードされる。
【００９４】
【化２】
2012503203.tif 000004
【００９５】
【化３】
2012503203.tif 000005
ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＢＣ１２８１１０（本明細書中に参考として援用される）も参照のこと。当業者は標準的分子生物学方法を使用してポリペプチド（ＣＳＰＧ４など）を産生するために核酸配列を容易に使用することができる（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，ｖｏｌ．１−３，ｅｄ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９を参照のこと）。
【００９６】
本明細書中に開示の方法を使用して、ＴＮＢＣ（乳房中のＴＮＢＣおよび他の器官に転移したＴＮＢＣが含まれる）を検出し、処置することができる。ＣＤＰＧ４の発現を検出するための核酸技術（ＲＴ−ＰＣＴなどのＰＣＲベースの分析など）を使用する方法をデザインすることができる。
【００９７】
いくつかの実施形態では、本明細書中に開示の方法は、ＣＳＰＧ４に特異的に結合して免疫複合体を形成する抗体（モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体など）を使用する。有用な抗体の例は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ８９／１１２９６号（本明細書中で参考として援用される）に開示されている。ＨＭＷ−ＭＡＡのアミノ酸配列がＣＳＰＧ４と同一であるので、これらの抗体には、高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）に結合する抗体が含まれる。
【００９８】
有用な抗体の例には、マウスモノクローナル抗体２２５．２８；７６３．７４；ＶＦ１−ＴＰ４１．２；ＶＴ８０．１１２；６５３．２５；７６３．７４；ＴＰ６１．５およびＴ８−２０３が含まれる（ＰＣＴ公開番号８９／１１２９６号；Ｄｒａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．ＤＯＩ  １０：１００７，ｓ００２６２−００８−０５６７−５，２００８；Ｇｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１４：３４０１−３４０７，２００８（全てが本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）〔目的の他の文献を列挙のこと〕。モノクローナル抗体２２５．２８および７６３．７４は、以前に他者によってＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託されていた。ＣＳＰＧ４に特異的に結合するいくつかのハイブリドーマ分泌抗体は、他者によってブダペスト条約に従って以前に寄託されていた）。１つの具体例では、抗体はモノクローナル抗体（ｍＡｂ）２２５．２８であるか、ｍＡｂ２２５．２８によって結合したエピトープに特異的に結合するキメラ抗体、ヒト化抗体、または完全なヒト抗体である。さらなる実施形態では、抗体は、ｍＡｂ２２５．２８によって結合したエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）２２５．２８の機能的フラグメント、キメラ抗体、ヒト化抗体、または完全なヒト抗体である。別の具体例では、抗体はｍＡｂ７６３．７４であるか、ｍＡｂ７６３．７４よって結合したエピトープに特異的に結合するキメラ抗体、ヒト化抗体、または完全なヒト抗体である。同様に、抗体は、ｍＡｂ７６３．７４によって結合したエピトープに特異的に結合するｍＡｂ７６３．７４の機能的フラグメント、またはキメラ抗体、ヒト化抗体、または完全なヒト抗体の機能的フラグメントであり得る。いくつかの実施形態では、抗体は、ＣＳＰＧ４に特異的に結合する任意の完全なヒト抗体である。
【００９９】
キメラ抗体、ヒト化抗体、および完全なヒト抗体、ならびに抗体フラグメント（これらの抗体またはフラグメントはＣＳＰＧ４に特異的に結合する）は、本明細書中に開示の方法で有用である。異なるエピトープに結合する一連の異なる抗体および／またはこれらの抗体の機能的フラグメントを、本明細書中に開示の任意の方法で使用することもできる。したがって、開示の方法は、ＣＳＰＧ４に特異的に結合する１、２、３、４、５、または６個の抗体またはその機能的フラグメントの使用を含むことができる。
【０１００】
マウス免疫グロブリンの重鎖および軽鎖可変ドメイン由来のドナー抗体（本明細書中に開示の抗体由来）相補性決定領域をヒト可変ドメインに移入し、次いで、ドナー対応物のフレームワーク領域中のヒト残基と置換することによってヒト化モノクローナル抗体を産生する。ヒト化モノクローナル抗体由来の抗体成分の使用により、ドナー抗体の定常領域の免疫原性に関連する潜在的な問題が排除される。ヒト化モノクローナル抗体の産生技術は、例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２，１９８６；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３，１９８８；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４，１９８８；Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：４２８５，１９９２；Ｓａｎｄｈｕ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：４３７，１９９２；およびＳｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：２８４４，１９９３によって記載されている。
【０１０１】
１つの実施形態では、ヒト化免疫グロブリン重鎖可変領域フレームワーク配列は、ドナー免疫グロブリン重鎖可変領域フレームワーク配列と少なくとも約６５％同一であり得る。したがって、ヒト化免疫グロブリン重鎖可変領域フレームワーク配列は、ドナー免疫グロブリン重鎖可変領域フレームワーク配列と少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９５％同一であり得る。ヒトフレームワーク領域およびヒト化抗体フレームワーク領域中に作製することができる変異は当該分野で公知である（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号を参照のこと）。
【０１０２】
抗体には、インタクトな分子ならびに重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、且つエピトープ決定基に特異的に結合することができるそのフラグメント（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖなど）が含まれる。これらの抗体フラグメントは、その抗原または受容体に特異的に結合するいくつかの能力を保持し、フラグメントを以下のように定義する。
（１）Ｆａｂ（抗体分子の１価の抗原結合フラグメントを含み、酵素パパインを使用した全抗体の消化によってインタクトな軽鎖および１つの重鎖の一部を産生することができるフラグメント）；
（２）Ｆａｂ’、（全抗体をペプシンで処置し、その後に還元してインタクトな軽鎖および重鎖の一部を生成することによって抗体分子のフラグメントを得ることができる。抗体１分子あたり２個のＦａｂ’フラグメントが得られる）；
（３）（Ｆａｂ’）２（全抗体を酵素ペプシンで処置し、その後に還元しないことによって得ることができる抗体のフラグメント。Ｆ（ａｂ’）２は２つのジスルフィド結合によって共に保持された２個のＦａｂ’フラグメントの二量体である）；
（４）Ｆｖ（２つの鎖として発現された軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含む遺伝子操作されたフラグメント）；および
（５）単鎖抗体（ｓｃＦｖなど）（遺伝子融合された単鎖分子として適切なポリペプチドリンカーによって連結された軽鎖の可変領域、重鎖の可変領域を含む遺伝子操作された分子として定義される）。ＣＳＰＧ４に特異的に結合する例示的なｓｃＦＶはｓｃＦｖ−ＦｃＣ２１であり、ｓｃＦｖフラグメントを、本明細書中に開示の任意の方法で使用することができる。
【０１０３】
これらのフラグメントの作製方法は当該分野で公知である（例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８を参照のこと）。エピトープは、抗体のパラトープに結合する抗原上の任意の抗原決定基である。エピトープ決定基は、通常、分子の化学的に活性な表面基（アミノ酸または糖の側鎖など）からなり、通常、特異的な三次元構造の特徴および特異的な電荷の特徴を有する。
【０１０４】
一例を挙げれば、免疫毒素中に含まれる可変領域は、個別のポリペプチドとして発現された軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含むＦｖである。Ｆｖ抗体は、典型的には約２５ｋＤａであり、各重鎖および各軽鎖あたり３個のＣＤＲを有する完全な抗原結合部位を含む。ＶＨおよびＶＬを、２つの個別の核酸構築物から発現することができる。ＶＨおよびＶＬが隣接せずに発現される場合、Ｆｖ抗体の鎖は、典型的には、非共有結合性相互作用によって相互に保持される。しかし、これらの鎖は希釈の際に解離する傾向があるので、グルタルアルデヒド、分子間ジスルフィド、またはペプチドリンカーによって鎖を架橋する方法が開発されている。したがって、一例を挙げれば、Ｆｖは、重鎖可変領域および軽鎖可変領域がジスルフィド結合によって化学的に連結されるジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）であり得る。
【０１０５】
当業者は、抗体の保存的バリアントを産生することができると理解しているであろう。ｄｓＦｖフラグメントまたはｓｃＦｖフラグメント中で使用されるかかる保存的バリアントは、正確な折り畳みおよびＶＨ領域とＶＬ領域との間の安定化に必要な重大なアミノ酸残基を保持し、分子の低ｐＩおよび低毒性を維持するための残基の荷電特性を保持するであろう。アミノ酸置換（せいぜい１個、せいぜい２個、せいぜい３個、せいぜい４個、またはせいぜい５個のアミノ酸置換など）をＶＨ領域とＶＬ領域との間に作製して収率を増加させることができる。
【０１０６】
抗体フラグメントを、抗体のタンパク質分解性加水分解またはフラグメントをコードするＤＮＡの大腸菌中での発現によって調製することができる。抗体フラグメントを、従来の方法による全抗体のペプシンまたはパパイン消化によって得ることができる。例えば、ペプシンでの抗体の酵素的切断によってＦ（ａｂ’）２と示される５Ｓフラグメントを得ることによって抗体フラグメントを産生することができる。このフラグメントを、さらに、チオール還元剤および任意選択的にジスルフィド結合の切断に起因するスルフヒドリル基の遮断基を使用して切断して３．５Ｓ  Ｆａｂ’１価フラグメントを産生することができる。あるいは、ペプシンを使用した酵素的切断により、２個の１価のＦａｂ’フラグメントおよびＦｃフラグメントが直接産生される（米国特許第４，０３６，９４５号および米国特許第４，３３１，６４７号、およびこれらに含まれる引例；Ｎｉｓｏｎｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．８９：２３０，１９６０；Ｐｏｒｔｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．７３：１１９，１９５９；Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，ｐａｇｅ  ４２２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９６７を参照のこと）。
【０１０７】
フラグメントがインタクトな抗体によって認識される抗原に結合する限り、他の抗体切断方法（１価の軽−重鎖フラグメントを形成するための重鎖の分離、フラグメントのさらなる切断、または他の酵素的技術、化学的技術、もしくは遺伝子技術など）を使用することもできる。
【０１０８】
例えば、Ｆｖフラグメントは、ＶＨ鎖およびＶＬ鎖の会合を含む。この会合は、非共有結合性であり得る（Ｉｎｂａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．６９：２６５９，１９７２）。あるいは、可変鎖を、分子間ジスルフィド結合によって連結することができるか、化学物質（グルタルアルデヒドなど）によって架橋することができる。例えば、Ｓａｎｄｈｕ，前出を参照のこと。したがって、ｄｓＦｖを産生することができる。さらなる例では、Ｆｖフラグメントはペプチドリンカーによって連結されたＶＨ鎖およびＶＬ鎖を含む。これらの単鎖抗原結合タンパク質（ｓＦｖ）を、オリゴヌクレオチドによって連結されたＶＨドメインおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子の構築によって調製する。構造遺伝子を発現ベクターに挿入し、次いで、宿主細胞（大腸菌など）に導入する。組換え宿主細胞は、２つのＶドメインを架橋するリンカーペプチドを使用して単一のポリペプチド鎖を合成する。ｓＦｖの産生方法は当該分野で公知である（Ｗｈｉｔｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ：ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２，ｐａｇｅ  ９７，１９９１；Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３，１９８８；米国特許第４，９４６，７７８号；Ｐａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：１２７１，１９９３；およびＳａｎｄｈｕ，前出を参照のこと）。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、開示の方法は、免疫抱合体を使用する。免疫抱合体には、診断薬または治療薬の抗体との共有結合が存在する分子が含まれるが、これらに限定されない。治療薬は、特定の標的分子または標的分子を保有する細胞に対して特定の生物学的活性を有する薬剤である。治療薬には、種々の薬物（ビンブラスチンおよびダウノマイシンなど）およびエフェクター分子（未変性または修飾シュードモナス外毒素またはジフテリア毒素などの細胞毒素など）、カプセル化剤（例えば、リポソーム）（これら自体が薬理学的組成物、標的部分、およびリガンドを含む）を含む。
【０１１０】
特定の治療薬の選択は、特定の標的分子または細胞および望ましい生物学的影響に依存する。したがって、例えば、治療薬は、特定の標的細胞を死滅させるために使用される細胞毒素であるエフェクター分子であり得る。逆に、単に非致死性の生物学的応答を引き起こすことを所望する場合、治療薬を、非致死性薬理学的作用因子または非致死性薬理学的作用因子含有リポソームに抱合することができる。
【０１１１】
毒素を、ＣＳＰＧ４ポリペプチドの任意の細胞外部分に結合する抗体およびフラグメント（ｓｖＦｖまたはｄｓＦｖなど）と共に使用して、免疫毒素として有用なキメラ分子を生成することができる。毒素の例には、シュードモナス外毒素（ＰＥ）、リシン、アブリン、ジフテリア毒素およびそのサブユニット、リボトキシン、リボヌクレアーゼ、サポリン、およびカリチアマイシン、ならびにボツリヌス毒素Ａ〜Ｆが含まれる。これらの毒素は当該分野で周知であり、多数を商業的供給元（例えば、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から容易に利用可能である。
【０１１２】
ジフテリア毒素は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅから単離される。典型的には、免疫毒素で用いるジフテリア毒素を、非特異的毒性を軽減または排除するように変異させる。完全な酵素活性を有するが、非特異的毒性が非常に軽減したＣＲＭ１０７として公知の変異体が１９７０年代から公知であり（Ｌａｉｒｄ  ａｎｄ  Ｇｒｏｍａｎ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９：２２０，１９７６）、ヒト臨床試験で使用されている。米国特許第５，７９２，４５８号および米国特許第５，２０８，０２１号を参照のこと。本明細書中で使用する場合、用語「ジフテリア毒素」は、必要に応じて、未変性ジフテリア毒素または酵素活性を保持するが、非特異的毒性を軽減するように修飾されているジフテリア毒素をいう。
【０１１３】
リシンは、Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ（トウゴマ）由来のレクチンＲＣＡ６０である。用語「リシン」はまた、その有毒バリアントをいう。例えば、米国特許第５，０７９，１６３号および米国特許第４，６８９，４０１号を参照のこと。Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ凝集素（ＲＣＡ）は、それぞれおよそ６５ｋＤおよび１２０ｋＤの分子量に従ってＲＣＡ６０およびＲＣＡ１２０と示される２つの形態で生じる（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ  ＆  Ｂｌａｕｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ２６６：５４３，１９７２）。Ａ鎖は、タンパク質合成の不活化および細胞の死滅を担う。Ｂ鎖は、リシンを細胞表面ガラクトース残基に結合させてＡ鎖のサイトゾルへの輸送を容易にする（Ｏｌｓｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２４９：６２７−６３１，１９７４および米国特許第３，０６０，１６５号）。
【０１１４】
リボヌクレアーゼはまた、免疫毒素として用いるためにターゲティング分子に抱合されている（Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １７：２６５−２７０，１９９９を参照のこと）。例示的リボトキシン（α−サルシンおよびレストリクトシンなど）は、例えば、Ｒａｔｈｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １９０：３１−３５，１９９７；およびＧｏｙａｌ  ａｎｄ  Ｂａｔｒａ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３４５  Ｐｔ  ２：２４７−２５４，２０００で考察されている。カリチアマイシンは、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａから最初に単離され、アポトーシスを引き起こすＤＮＡ中に二本鎖破壊を引き起こすエンジイン抗腫瘍抗生物質ファミリーのメンバーである（例えば、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ  ４２：１０７０−１０８７．１９８９を参照のこと）。薬物は、臨床試験における免疫毒素の有毒部分である（例えば、Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ  １１：７３５−７４１，２０００を参照のこと）。
【０１１５】
アブリンには、Ａｂｒｕｓ  ｐｒｅｃａｔｏｒｉｕｓ由来の有毒レクチンが含まれる。毒性成分アブリンａ、ｂ、ｃ、およびｄは、分子量が約６３〜６７ｋＤであり、２つのジスルフィド連結ポリペプチド鎖ＡおよびＢから構成される。Ａ鎖はタンパク質合成を阻害し、Ｂ鎖（アブリン−ｂ）はＤ−ガラクトース残基に結合する（Ｆｕｎａｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５２：１０９５，１９８８；およびＯｌｓｎｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．５０：３３０−３３５，１９７８を参照のこと）。
【０１１６】
１つの実施形態では、毒素はシュードモナス外毒素（ＰＥ）である。未変性シュードモナス外毒素  Ａ（「ＰＥ」）は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａから分泌され、且つ真核細胞におけるタンパク質合成を阻害する非常に活性な単量体タンパク質（分子量６６ｋＤ）である。未変性ＰＥ配列および修飾ＰＥの配列は、米国特許第５，６０２，０９５号（本明細書中で参考として援用される）に記載されている。１つの実施形態では、未変性ＰＥは、下記の配列を有する。
【０１１７】
【化４】
2012503203.tif 000006
【０１１８】
【化５】
2012503203.tif 000007
ＰＥの作用方法は、伸長因子２（ＥＦ−２）のＡＤＰリボシル化の不活化である。外毒素は、共同で作用して細胞傷害性を引き起こす３つの構造ドメインを含む。ドメインＩａ（アミノ酸１〜２５２）は細胞結合を媒介する。ドメインＩＩ（アミノ酸２５３〜３６４）はサイトゾルへの転位置を担い、ドメインＩＩＩ（アミノ酸４００〜６１３）は伸長因子２のＡＤＰリボシル化を媒介する。ドメインＩｂ（アミノ酸３６５〜３９９）の機能は依然として定義されていないが、細胞傷害性を喪失することなくその大部分であるアミノ酸３６５〜３８０を欠失することができる。Ｓｉｅｇａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１４２５６−１４２６１，１９８９を参照のこと。
【０１１９】
本明細書中で使用する場合、用語「シュードモナス外毒素」（「ＰＥ」）は、必要に応じて、全長の未変性（天然に存在する）ＰＥまたは修飾されたＰＥをいう。かかる修飾には、ドメインＩａの排除、ドメインＩｂ、ＩＩ、およびＩＩＩ中の種々のアミノ酸の欠失、単一のアミノ酸置換、ならびにカルボキシル末端の１つまたは複数の配列の付加（ＫＤＥＬ（配列番号４）およびＲＥＤＬ（配列番号５）など）が含まれ得るが、これらに限定されない（Ｓｉｅｇａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、前出を参照のこと）。いくつかの例では、ＰＥの細胞傷害性フラグメントは、未変性ＰＥの細胞傷害性の少なくとも５０％（約７５％、約９０％、または約９５％など）を保持する。１つの実施形態では、細胞傷害性フラグメントは、未変性ＰＥより毒性が高い。
【０１２０】
したがって、本明細書中に開示の免疫毒素中で使用されるＰＥには、未変性配列、未変性配列の細胞傷害性フラグメント、および未変性ＰＥの保存的に修飾されたバリアント、ならびにその細胞傷害性フラグメントが含まれる。ＰＥの細胞傷害性フラグメントには、標的細胞中のその後のタンパク質分解性プロセシングまたは他のプロセシング（例えば、タンパク質またはプレタンパク質として）を用いるか用いないで細胞傷害性を示すフラグメントが含まれる。当該分野で公知のＰＥの細胞傷害性フラグメントには、ＰＥ４０、ＰＥ３８、およびＰＥ３５が含まれる。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、ＰＥは、典型的には米国特許第４，８９２，８２７号に教示のドメインＩａの欠失によって非特異的細胞結合を軽減または排除するように修飾されているが、例えば、ドメインＩａの一定の残基の変異によってこれを行うこともできる。米国特許第５，５１２，６５８号は、例えば、ドメインＩａが存在するが、５７位、２４６位、２４７位、および２４９位のドメインＩａの塩基性残基を酸性残基（グルタミン酸、すなわち「Ｅ」）に置換した変異ＰＥが非特異的細胞傷害性を非常に減少させることを開示している。ＰＥのこの変異形態を、時折、ＰＥ４Ｅという。
【０１２２】
ＰＥ４０は、ＰＥの短縮誘導体である（Ｐａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：３３５８−３３６２，１９９１；およびＫｏｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：９４７０−９４７５，１９８８を参照のこと）。ＰＥ３５はアミノ酸残基１〜２７９が欠失されたＰＥの３５ｋＤカルボキシル末端フラグメントであり、この分子は、２８０位のｍｅｔから始まり、未変性ＰＥのアミノ酸２８１〜３６４および３８１〜６１３が続く。ＰＥ３５およびＰＥ４０は、例えば、米国特許第５，６０２，０９５号および米国特許第４，８９２，８２７号に開示されている。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、細胞傷害性フラグメントＰＥ３８を使用する。ＰＥ３８は、細胞内でプロセシングの際にその細胞傷害性形態に活性化される配列番号３のアミノ酸２５３〜３６４および３８１〜６１３から構成される短縮ＰＥプロタンパク質である（例えば、米国特許第５，６０８，０３９号およびＰａｓｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １３３３：Ｃ１−Ｃ６，１９９７を参照のこと）。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、ＰＥがＰＥ４Ｅ、ＰＥ４０、またはＰＥ３８である一方で、ターゲティング細胞中の転位置およびＥＦ−２リボシル化が依然として可能である限り、非特異的細胞傷害性が排除されているか、非ターゲティング細胞に対する有意な毒性が起こらないレベルまで軽減された任意のＰＥ形態を本明細書中に開示の免疫毒素で使用することができる。
【０１２５】
ＰＥの保存的に修飾されたバリアントまたはその細胞傷害性フラグメントは、アミノ酸レベルで目的のＰＥ（ＰＥ３８など）と少なくとも約８０％の配列同一性（少なくとも約８５％配列類似性、少なくとも約９０％配列同一性、または少なくとも約９５％配列類似性など）を有する。
【０１２６】
本明細書中に提供した抗体および免疫毒素を使用して、当業者は、機能的に等価な核酸（配列が異なるが同一のエフェクター分子（「ＥＭ」）または抗体配列をコードする核酸など）を含む種々のクローンを容易に構築することができる。したがって、抗体、抱合体、および融合タンパク質をコードする核酸を本明細書中に提供する。
【０１２７】
免疫毒素をコードする核酸配列を、任意の適切な方法（例えば、適切な配列のクローニングまたはＮａｒａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０−９９，１９７９のホスホトリエステル法；Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９−１５１，１９７９のホスホジエステル法；Ｂｅａｕｃａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．２２：１８５９−１８６２，１９８１のジエチルホスホルアミダイト法；例えば、Ｎｅｅｄｈａｍ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：６１５９−６１６８，１９８４に記載の自動化合成機を使用したＢｅａｕｃａｇｅ  ＆  Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔｓ．２２（２０）：１８５９−１８６２，１９８１に記載の固相ホスホルアミダイトトリエステル法；および米国特許第４，４５８，０６６号の固体支持体法などの方法による直接化学合成が含まれる）によって調製することができる。化学合成により、一本鎖オリゴヌクレオチドが産生される。相補配列とのハイブリッド形成またはテンプレートとして一本鎖を使用するＤＮＡポリメラーゼを使用した重合によってこれを二本鎖ＤＮＡに変換することができる。当業者は、ＤＮＡの化学合成が約１００塩基の配列に制限される一方で、より短い配列のライゲーションによってより長い配列を得ることができると認識するであろう。
【０１２８】
１つの実施形態では、免疫毒素をコードする核酸配列をクローニング技術によって調製する。適切なクローニング技術および配列決定技術の例ならびに多数のクローニング演習によって当業者に指示するのに十分な説明は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，前出，Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ（ｅｄｓ．），前出およびＡｕｓｕｂｅｌ，前出中に見出される。製造者からの生物学的試薬および実験装置の製品情報からも有用な情報が得られる。かかる製造者には、ＳＩＧＭＡ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ａｍｅｒｓｈａｍ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、ＣＬＯＮＴＥＣＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）、Ｃｈｅｍ  Ｇｅｎｅｓ  Ｃｏｒｐ．、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｃａ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｋａ  Ａｎａｌｙｔｉｋａ（Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＡＧ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、およびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、および当業者に公知の多数の他の商業的供給元が含まれる。
【０１２９】
核酸を、増幅方法によって調製することもできる。増幅方法には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写ベースの増幅系（ＴＡＳ）、自立した配列複製系（３ＳＲ）が含まれる。広範な種々のクローニング方法、宿主細胞、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ増幅方法は、当業者に周知である。
【０１３０】
一例を挙げれば、ＥＭをコードするｃＤＮＡを含むベクターへの可変領域をコードするｃＤＮＡの挿入によって有用な免疫毒素を調製する。１つの連続するポリペプチドが産生されるように可変領域およびＥＭがインフレームで読み取られるように挿入する。ポリペプチドは、機能的Ｆｖ領域および機能的ＥＭ領域を含む。１つの実施形態では、細胞毒素がｓｃＦｖのカルボキシル末端に存在するように細胞毒素をコードするｃＤＮＡをｓｃＦｖにライゲーションする。一例を挙げれば、毒素がｓｃＦｖのアミノ末端に存在するように非特異的結合を排除または軽減されるように変異されたシュードモナス外毒素（「ＰＥ」）をコードするｃＤＮＡをｓｃＦｖにライゲーションする。別の例では、ＰＥ３８をｓｃＦｖのアミノ末端（ｓｃＦｖ−ＦｃＣ２１など  ［チェックのこと］）に配置する。さらなる例では、毒素が重鎖可変領域のカルボキシル末端に存在するように、細胞毒素をコードするｃＤＮＡを目的の抗原に結合する抗体の重鎖可変領域にライゲーションする。次いで、重鎖可変領域を、ジスルフィド結合を使用して抗体の軽鎖可変領域にライゲーションすることができる。さらに別の例では、細胞毒素が軽鎖可変領域のカルボキシル末端に存在するように、細胞毒素をコードするｃＤＮＡを抗原（例えば、ＣＳＰＧ４）に結合する抗体の軽鎖可変領域にライゲーションする。次いで、軽鎖可変領域を、ジスルフィド結合を使用して抗体の重鎖可変領域にライゲーションすることができる。
【０１３１】
一旦免疫毒素をコードする核酸が単離およびクローニングされると、組換え操作された細胞（細菌細胞、植物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞など）中にタンパク質を発現することができる。１つまたは複数の免疫毒素をコードするＤＮＡ配列を、好適な宿主細胞へのＤＮＡ導入によってｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現することができる。細胞は原核細胞または真核細胞であり得る。本用語には、本件の宿主細胞の任意の子孫も含まれる。複製中に起こる変異が存在し得るので、全ての子孫が親細胞と同一ではないかもしれないと理解される。安定な導入方法（外来ＤＮＡが宿主中に継続的に維持されることを意味する）は当該分野で公知である。
【０１３２】
免疫毒素をコードするポリヌクレオチド配列を、発現調節配列に作動可能に連結することができる。発現調節配列に適合する条件下でコード配列が発現されるようにコード配列に作動可能に連結された発現調節配列をライゲーションする。発現調節配列には、適切なプロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、タンパク質コード遺伝子の前の開始コドン（すなわち、ＡＴＧ）、イントロンのスプライシングシグナル、ｍＲＮＡの適切な翻訳のための遺伝子の正確な読み取り枠の維持、および終止コドンが含まれるが、これらに限定されない。
【０１３３】
免疫毒素をコードするポリヌクレオチド配列を、発現ベクター（配列の挿入または組込みが可能なように操作することができるプラスミド、ウイルス、または他のビヒクルが含まれるが、これらに限定されない）に挿入し、原核生物または真核生物のいずれかで発現させることができる。宿主には、微生物、酵母、昆虫、および哺乳動物が含まれ得る。原核生物中に真核生物配列またはウイルス配列を有するＤＮＡ配列を発現させる方法は当該分野で周知である。宿主中で発現および複製することができる生物学的に機能的なウイルスおよびプラスミドＤＮＡベクターは、当該分野で公知である。
【０１３４】
組換えＤＮＡでの宿主細胞の形質転換を、当業者に周知の従来の技術によって行うことができる。宿主が原核生物（大腸菌など）である場合、ＤＮＡを取り込むことができるコンピテント細胞を、指数増殖期後に回収した細胞から調製し、次いで当該分野で周知の手順を使用したＣａＣｌ２法によって処置することができる。あるいは、ＭｇＣｌ２またはＲｂＣｌを使用することができる。必要に応じて宿主細胞のプロトプラストの形成後またはエレクトロポレーションによって形質転換を行うこともできる。
【０１３５】
宿主が真核生物である場合、リン酸カルシウム共沈、従来の機械的手順（微量注入、エレクトロポレーション、リポソーム中にカプセル化されたプラスミドまたはウイルスベクターの挿入など）などのＤＮＡのトランスフェクション方法を使用することができる。真核細胞を、免疫毒素をコードするポリヌクレオチド配列および選択可能な表現型をコードする第２の外来ＤＮＡ分子（単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子など）で同時形質転換することもできる。別の方法は、真核細胞に一過性に感染させるか真核生物を形質転換し、タンパク質を発現するための真核生物ウイルスベクター（サルウイルス４０（ＳＶ４０）またはウシ乳頭腫ウイルスなど）の使用である（例えば、Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｇｌｕｚｍａｎ  ｅｄ．，１９８２を参照のこと）。当業者は、細胞（高等真核細胞（ＣＯＳ，ＣＨＯ，ＨｅＬａ、および骨髄腫細胞株など）が含まれる）中でのタンパク質産生で用いる発現系（プラスミドおよびベクターなど）を容易に使用することができる。
【０１３６】
組換え的に発現したポリペプチドの単離および精製を、従来の手段（分取クロマトグラフィおよび免疫学的分離が含まれる）によって行うことができる。一旦発現すると、組換え免疫毒素を、当該分野の標準的手順（硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティカラム、およびカラムクロマトグラフィなどが含まれる）に従って精製することができる（一般に、Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．，１９８２を参照のこと）。少なくとも約９０〜９５％相同な実質的に純粋な組成物を本明細書中に開示し、９８〜９９％またはそれを超える相同性を薬学的目的のために使用することができる。一旦必要に応じて部分的または均一まで精製されると、治療で使用される場合、ポリペプチドは内毒素を実質的に含むべきではない。
【０１３７】
大腸菌などの細菌由来の単鎖抗体の発現および／または適切な活性形態（単鎖抗体が含まれる）への再折り畳み方法が記載されており、当該分野で周知であり、本明細書中に開示の抗体に適用可能である。Ｂｕｃｈｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０５：２６３−２７０，１９９２；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：５４５，１９９１；Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５，１９８９、およびＷａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４，１９８９（全てが本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【０１３８】
しばしば、大腸菌または他の細菌由来の機能的な異種タンパク質を封入体から単離し、この単離には、強い変性剤を使用した可溶化およびその後の再折り畳みが必要である。可溶化工程中に、当該分野で周知のように、ジスルフィド結合を分離するために還元剤が存在しなければならない。還元剤を含む緩衝液の例は以下である：０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）、６Ｍグアニジン、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．３Ｍ  ＤＴＥ（ジチオエリスリトール）。Ｓａｘｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ９：５０１５−５０２１，１９７０（本明細書中で参考として援用される）に記載され、Ｂｕｃｈｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，前出に具体的に記載のように、還元形態および酸化形態の低分子量チオール試薬の存在下でジスルフィド結合の再酸化が起こり得る。
【０１３９】
典型的には、変性および還元タンパク質の再折り畳み緩衝液での希釈（例えば、１００倍）によって復元される。例示的な緩衝液は、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、０．５Ｍ  Ｌ−アルギニン、８ｍＭ酸化グルタチオン（ＧＳＳＧ）、および２ｍＭ  ＥＤＴＡである。
【０１４０】
２つの鎖抗体精製プロトコールの修正形態として、重鎖領域および軽鎖領域を個別に可溶化および還元し、次いで、再折り畳み溶液中で合わせた。一方のタンパク質が他方の５倍モル過剰を超えないようなモル比でこれら２つのタンパク質を混合した場合に例示的な収量が得られる。レドックスシャフリングが完了した後に過剰な酸化グルタチオンまたは他の酸化低分子量化合物を再折り畳み溶液に添加することが望ましい。
【０１４１】
組換え法に加えて、本明細書中に開示の免疫抱合体、ＥＭ、および抗体を、標準的ペプチド合成を使用して、全体または部分的に構築することもできる。約５０アミノ酸長未満のポリペプチドの固相合成を、配列のＣ末端アミノ酸を不溶性支持体に付着させ、その後に配列中の残存アミノ酸を連続的に添加することによって行うことができる。固相合成技術は、Ｂａｒａｎｙ  ＆  Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ．  Ｖｏｌ．２：Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐａｒｔ  Ａ．  ｐｐ．３−２８４；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５６，１９６３，およびＳｔｅｗａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，１９８４に記載されている。より長いタンパク質を、より短いフラグメントのアミノ末端とカルボキシル末端との縮合によって合成することができる。カルボキシル末端の活性化（例えば、カップリング試薬Ｎ、Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ｄｉｃｙｃｙｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）の使用による）によるペプチド結合の形成方法は当該分野で周知である。
【０１４２】
抗体を使用した薬学的組成物および治療方法
上記で開示するように、ＣＳＰＧ４に特異的に結合する抗体を含む組成物を、基底乳癌腫（ＢＢＣ）の処置のために使用することができる。一例を挙げれば、エストロゲン、プロゲステロン、またはＨｅｒ２を発現しないトリプルネガティブ基底乳癌（ＴＮＢＣ）の処置方法を本明細書中に開示する。したがって、ＢＢＣ（ＴＮＢＣなど）の処置で用いる治療有効量のＣＳＰＧ４に特異的に結合する抗体を含む組成物を本明細書中に提供する。一例を挙げれば、ＢＢＣ（ＴＮＢＣなど）は転移性を示す。さらなる実施形態では、結腸癌、卵巣癌、乳癌、前立腺、肺癌、または膵臓癌の処置方法を提供する。
【０１４３】
１つの実施形態では、本方法は、ＢＢＣ（ＴＮＢＣなど）と診断された被験体を選択する工程、被験体に治療有効量のＣＳＰＧ４に特異的に結合する抗体を投与する工程を含む。一例を挙げれば、本方法は、転移性ＢＢＣ（転移性ＴＮＢＣなど）を有する被験体を選択する工程を含む。
【０１４４】
さらなる実施形態では、癌細胞の成長および／または転移を阻害する方法を提供する。癌細胞は、結腸癌細胞、卵巣癌細胞、乳癌細胞、前立腺癌細胞、肺癌細胞、または膵臓癌細胞であり得る。癌細胞はＢＢＣ細胞であり得る。癌細胞はＴＮＢＣ細胞であり得る。細胞はｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにあり得る。
【０１４５】
抗体は、任意のＣＳＰＧ４に特異的に結合する抗体（本明細書中に記載の抗体など）であり得る。したがって、抗体がＣＳＰＧ４に特異的に結合するという条件で、抗体は、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、完全なヒト抗体、または抗体の機能的フラグメントであり得るが、これらに限定されない。これらの薬剤の組み合わせを、開示の方法で使用することもできる。
【０１４６】
いくつかの非限定的な例では、抗体は、ｍＡｂである２２５．２８、７６３．７４、ＴＰ４１．２、またはＴＰ６１．５、そのヒト化形態、またはＣＳＰＧ４に特異的に結合するその機能的フラグメントである。別の非限定的な例では、抗体はｓｃＦｖ−Ｆｃ  Ｃ２１である。これらの抗体を、単独または任意の組み合わせで使用することができる。いくつかの実施形態では、抗体を毒素に結合する。
【０１４７】
本明細書中に開示の抗体を含む組成物を、被験体に投与するための単位投薬形態で調製することができる。所望の目的を達成するための投与量および投与のタイミングは、担当医の裁量による。一例を挙げれば、非経口投与（静脈内投与など）のための抗体または免疫毒素を処方する。他の例では、全身または局所（腫瘍内など）投与のための抗体または免疫毒素を処方する。これらの組成物は、乳癌（ＢＢＣ（例えば、ＴＮＢＣ）など）を有する被験体の処置で有用である。したがって、本明細書中に開示の方法は、ＢＢＣ（ＴＮＢＣなど）を有する被験体を選択する工程を含む。本方法は、ＢＢＣを有する被験体を同定し、そして／または以下に開示のようにＣＳＰＧ４に特異的に結合する抗体を使用してＴＮＢＣを有する被験体を同定する工程、次いで、被験体を処置する工程を含むこともできる。いくつかの例では、ＢＢＣは転移性ＢＢＣ（転移性ＴＮＢＣなど）である。いくつかの例では、本方法は、被験体におけるＢＢＣ（ＴＮＢＣなど）の処置方法である。
【０１４８】
治療的投与のための組成物は、一般に、乳癌（ＢＢＣ（例えば、ＴＮＢＣ）など）を有する被験体への投与のための薬学的に許容可能なキャリア（水性キャリアなど）中に溶解した抗体（免疫毒素など）の溶液を含むであろう。種々の水性キャリア（例えば緩衝化生理食塩水など）を使用することができる。これらの溶液は、無菌且つ一般に望ましくない物質を含まない。これらの組成物を、従来の周知の滅菌技術によって滅菌することができる。組成物は、生理学的条件に近づけるために必要な薬学的に許容可能な補助剤（ｐＨ調整剤および緩衝剤、毒性調整剤など（例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、および乳酸ナトリウムなど）を含むことができる。これらの処方物中の融合タンパク質の濃度は広範に変動し得、選択された特定の投与様式および患者の要求に従って、主に、流動物の体積、粘度、および体重などに基づいて選択されるであろう。
【０１４９】
抗原（ＣＳＰＧ４）を発現する細胞（ＢＢＣ細胞（例えば、ＴＮＢＣ細胞）など）の成長を遅延させるか阻害するなどのために抗体を投与することができる。これらの適用では、治療有効量のＣＳＰＧ４に結合する抗体（例えば、免疫毒素）を、抗原発現細胞（ＢＢＣ（ＴＮＢＣ）細胞など）の成長を阻害するのに十分な量で被験体に投与する。適切な被験体には、ＣＳＰＧ４を発現する乳癌を有する被験体（ＢＢＣ（例えば、ＴＮＢＣ）を有する被験体など）が含まれる。適切な被験体には、ＢＢＣと考えられる転移性癌および／またはＴＮＢＣと考えられる転移性癌を有する被験体も含まれる。
【０１５０】
静脈内投与用の典型的な抗体医薬品（免疫毒素組成物など）は、約０．１〜１０ｍｇ／患者／日を含む。特に循環系やリンパ系ではなく隔離された部位（体腔または器官の内腔など）に薬剤を投与する場合、０．１ｍｇ〜約１００ｍｇ／患者／日の投薬量を使用することができる。投与可能な組成物の実際の調製方法は、当業者に公知であるか明らかであり、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９９５）などの刊行物により詳細に記載されている。
【０１５１】
抗体を公知の濃度の無菌溶液でも提供するが、抗体を凍結乾燥形態で提供し、投与前に滅菌水で再水和することができる。次いで、抗体溶液を、０．９％塩化ナトリウム（ＵＳＰ）を含む輸液バッグに添加し、典型的には、０．５〜１５ｍｇ／ｋｇ体重の投薬量で投与する。豊富な経験を抗体医薬の投与分野で利用可能であり、抗体医薬は１９９７年のリツキサン（登録商標）の承認以来、米国で販売されている。抗体医薬を、ＩＶプッシュまたはボーラスよりもむしろ遅延注入によって投与することができる。一例を挙げれば、より高い負荷用量で投与し、次いで、より低いレベルの維持用量を投与する。例えば、初期負荷用量４ｍｇ／ｋｇを約９０分間にわたって注入し、前の用量が十分に許容された場合、その後に２ｍｇ／ｋｇの維持用量を３０分間にわたって毎週４〜８週間注入することができる。
【０１５２】
必要な投薬量および頻度および被験体に許容されるかどうかに応じて、組成物を単回または複数回投与する。任意の事象では、組成物により、乳癌（例えば、ＢＢＣ）患者を有効に処置するために十分な量の本明細書中に開示の抗体の少なくとも１つが提供されるはずである。投薬量を１回で投与することができるが、治療結果が得られるか、副作用によって治療が中断されるまで定期的に適用することができる。一例を挙げれば、ある用量の抗体を隔日に３０分間注入する。この例では、約１回〜約１０回投与することができる（例えば、隔日に３回または６回投与することができる）。さらなる例では、約５日〜約１０日間連続注入する。被験体を、所望の治療結果が達成されるまで、規則的な間隔で（月１回など）処置することができる。一般に、用量は、患者に対して許容不可能な毒性を生じることなく疾患の症状または徴候を処置または改善するのに十分である。
【０１５３】
この用途のための有効量は、疾患の重症度および患者の全体的な健康状態に依存するであろう。抗体の治療有効量は、症状の主観的緩和または臨床医または他の適任の観察者によって注目される客観的に同定可能な改善のいずれかが得られる量である。これらの組成物を、別の化学療法薬と併せて同時または連続的に投与することができる。
【０１５４】
抗体を含む組成物の制御放出非経口処方物を、埋没物、油性注射液、または特定の系として作製することができる。タンパク質送達系の概説については、Ｂａｎｇａ，Ａ．Ｊ．，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，ａｎｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．，Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，ＰＡ，（１９９５）（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。特定の系には、ミクロスフィア、微粒子、マイクロカプセル、ナノカプセル、ナノスフェア、およびナノ粒子が含まれる。マイクロカプセルは、中心コアとして治療タンパク質（細胞毒素または薬物など）を含む。ミクロスフィアでは、治療薬は、粒子全体にわたって分散されている。約１μｍ未満の粒子、ミクロスフィア、およびマイクロカプセルを、一般に、それぞれナノ粒子、ナノスフェア、およびナノカプセルという。毛細管は、ナノ粒子のみが静脈内投与されるように直径がおよそ５μｍである。微粒子は、典型的には、直径がおよそ１００μｍであり、皮下または筋肉内に投与される。例えば、Ｋｒｅｕｔｅｒ，Ｊ．，Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｋｒｅｕｔｅｒ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ｐｐ．２１９−３４２，１９９４；およびＴｉｃｅ  ＆  Ｔａｂｉｂｉ，Ｔｒｅａｔｉｓｅ  ｏｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ａ．Ｋｙｄｏｎｉｅｕｓ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ｐｐ．３１５−３３９，１９９２（共に本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【０１５５】
本明細書中に開示の抗体または免疫抱合体組成物のイオン制御放出のためのポリマーを使用することができる。制御薬物送達で用いる種々の分解性および非分解性のポリマーマトリックスは当該分野で公知である（Ｌａｎｇｅｒ，Ａｃｃｏｕｎｔｓ  Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２６：５３７−５４２，１９９３）。例えば、ブロックコポリマーであるポロキサマー４０７は、低温で粘着性を示すが流動性のある液体として存在するが、体温で半固体ゲルを形成する。これは、組換えインターロイキン−２およびウレアーゼの処方および徐放性送達に有効なビヒクルであることが示されている（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．９：４２５−４３４，１９９２；およびＰｅｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐａｒｅｎｔ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．４４（２）：５８−６５，１９９０）。あるいは、ヒドロキシアパタイトは、タンパク質の制御放出のためのマイクロキャリアとして使用されている（Ｉｊｎｔｅｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．１１２：２１５−２２４，１９９４）。さらに別の態様では、リポソームを、脂質カプセル化薬物の制御放出および薬物ターゲティングのために使用する（Ｂｅｔａｇｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，ＰＡ，１９９３）。治療タンパク質の制御放出のための多数のさらなる系が公知である。例えば、米国特許第５，０５５，３０３号；米国特許第５，１８８，８３７号；米国特許第４，２３５，８７１号；米国特許第４，５０１，７２８号；米国特許第４，８３７，０２８号；米国特許第４，９５７，７３５号；米国特許第５，０１９，３６９号；米国特許第５，０５５，３０３号；米国特許第５，５１４，６７０号；米国特許第５，４１３，７９７号；米国特許第５，２６８，１６４号；米国特許第５，００４，６９７号；米国特許第４，９０２，５０５号；米国特許第５，５０６，２０６号；米国特許第５，２７１，９６１号；米国特許第５，２５４，３４２号、および米国特許第５，５３４，４９６号（それぞれ、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【０１５６】
抗体の有効量は、疾患の重症度および患者の全体的な健康状態に依存するであろう。抗体の治療有効量は、症状の主観的緩和または臨床医または他の適任の観察者によって注目される客観的に同定可能な改善のいずれかが得られる量である。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、ＣＳＰＧ４に特異的に結合する抗体を、他の薬剤（化学療法薬など）と共に同時または連続的に投与する。多数の化学療法薬は、現在、当該分野で公知である。したがって、本方法は、治療有効量のＣＳＰＧ４に特異的に結合する抗体および治療有効量の化学療法薬を投与する工程を含むことができる。いくつかの実施形態では、化学療法薬は、分裂阻止因子、アルキル化剤、代謝拮抗物質、介入抗生物質、成長因子インヒビター、細胞周期インヒビター、酵素、トポイソメラーゼインヒビター、抗生存因子、生物学的応答調節物質、抗ホルモン（例えば、抗アンドロゲン）、および抗血管形成薬からなる群から選択される。
【０１５８】
アルキル化剤の例には、ナイトロジェンマスタード（メクロレタミン、シクロホスファミド、メルファラン、ウラシルマスタード、またはクロラムブシルなど）、スルホン酸アルキル（ブスルファンなど）、ニトロソ尿素（カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン、またはダカルバジンなど）が含まれる。代謝拮抗物質の例には、葉酸アナログ（メトトレキサートなど）、ピリミジンアナログ（５−ＦＵまたはシタラビンなど）、およびプリンアナログ（メルカプトプリンまたはチオグアニンなど）が含まれる。天然物の例には、ビンカアルカロイド（ビンブラスチン、ビンクリスチン、またはビンデシンなど）、エピポドフィロトキシン（エトポシドまたはテニポシドなど）、抗生物質（ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、またはマトマイシンＣ（ｍｉｔｏｃｙｃｉｎ  Ｃ）など）、および酵素（Ｌ−アスパラギナーゼなど）が含まれる。種々の薬剤の例には、白金配位錯体（シスプラチンとしても公知のシス−ジアミン−ジクロロ白金ＩＩなど）、置換尿素（ヒドロキシ尿素など）、メチルヒドラジン誘導体（プロカルバジンなど）、および副腎皮質抑制剤（ミトタンおよびアミノグルテチミドなど）が含まれる。ホルモンおよびアンタゴニストの例には、副腎皮質ステロイド（プレドニゾンなど）、プロゲスチン（カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、および酢酸メゲストロール（ｍａｇｅｓｔｒｏｌ  ａｃｅｔａｔｅ）など）、エストロゲン（ジエチルスチルベストロールおよびエチニルエストラジオールなど）、抗エストロゲン（タモキシフェンなど）、およびアンドロゲン（プロピオン酸テストステロンおよびフルオキシメステロンなど）が含まれる。開示の免疫療法と同時投与することができる最も一般的に使用される化学療法薬の例には、アドリアマイシン、アルケラン、Ａｒａ−Ｃ、ＢｉＣＮＵ、ブスルファン、ＣＣＮＵ、カルボプラチン（Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎｕｍ）、シスプラチン（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎｕｍ）、サイトキサン、ダウノルビシン、ＤＴＩＣ、５−ＦＵ、フルダラビン、ハイドレア、イダルビシン、イフォスファミド、メトトレキサート、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、ナイトロジェンマスタード、タキソール（または他のタキサン（ドセタキセルなど））、ベルバン、ビンクリスチン、ＶＰ−１６が含まれるが、いくつかのより新しい薬物には、ゲムシタビン（ジェムザール）、ハーセプチン、イリノテカン（コンプトサル、ＣＰＴ−１１）、ロイスタチン、ナベルビン、リツキサンＳＴＩ−５７１、タキソテール、トポテカン（ハイカムチン）、ゼローダ（カペシタビン）、ゼヴァリン、およびカルシトリオールが含まれる。使用することができる免疫調節薬の非限定的な例には、ＡＳ−１０１（Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔ  Ｌａｂｓ．）、ブロピリミン（Ｕｐｊｏｈｎ）、γインターフェロン（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ＩＬ−２（ＣｅｔｕｓまたはＨｏｆｆｍａｎ−ＬａＲｏｃｈｅ）、ヒト免疫グロブリン（Ｃｕｔｔｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、ＩＭＲＥＧ（Ｎｅｗ  Ｏｒｌｅａｎｓ，Ｌａ．のイムレグ）、ＳＫ＆Ｆ  １０６５２８、およびＴＮＦ（腫瘍壊死因子；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）が含まれる。
【０１５９】
いくつかの非限定的な具体例では、治療有効量のアブラキサン（登録商標）（注射用懸濁液のためのパクリタキセルタンパク質結合粒子）、アドリアマイシン（登録商標）（ドキソルビシン）、アレディア（登録商標）（一般名パミドロン酸二ナトリウム）、アリミデックス（登録商標）（アナストロゾール）、アロマシン（登録商標）（エキセメスタン）、サイトキサン（登録商標）（シクロホスファミド）、エレンス（登録商標）（エピルビシン）、エビスタ（登録商標）（ラロキシフェン）、フェアストン（登録商標）（トレミフェン）、フェマラ（登録商標）（レトロゾール）、ハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）、メガス（登録商標）（メゲストロール）、タモキシフェン、タキソール（登録商標）（パクリタキセル）、タキソテール（登録商標）（ドセタキセル）、ゼローダ（登録商標）（カペシタビン）、ゾラデックス（登録商標）（酢酸ゴセレリン）、および／またはゾメタ（登録商標）（一般名ゾレドロン酸）を投与する。
【０１６０】
基底乳癌腫の診断
ＣＳＰＧ４はヒト乳癌で差次的に発現されることを本明細書中に開示する。具体的には、ＣＳＰＧ４は、しばしば化学療法抵抗性および放射線抵抗性を示すＢＢＣ（具体的にはＴＮＢＣ）中に発現する。ＣＳＰＧ４は、癌幹細胞（ＣＳＣ）中に発現する。したがって、ＣＳＰＧ４ポリペプチドの発現を使用してＢＢＣ（ＴＮＢＣ）を診断することができるか、これを使用して乳癌を病期分類することができるか、これを使用して乳癌（ＢＢＣ（例えば、ＴＮＢＣ）など）を有する被験体の予後を決定することができる。したがって、ＢＢＣ（ＴＮＢＣなど）の診断のためのＣＳＰＧ４に特異的に結合する抗体の使用を本明細書中に開示する。いくつかの実施形態では、本方法は、被験体が別の乳癌形態と比較してＢＢＣ（ＴＮＢＣなど）を有するかどうかを決定する。診断方法を使用して、転移（脳転移など）がＢＢＣ（ＴＮＢＣなど）であるかどうかを決定することができる。
【０１６１】
生物サンプル中のポリペプチド発現の分析による細胞または組織中のＣＳＰＧ４ポリペプチド発現の検出方法を本明細書中に提供する。サンプルは、任意のサンプル（生検、剖検、および病理学的検体由来の組織が含まれるが、これらに限定されない）であり得る。生物サンプルには、組織切片（組織学的目的のために採取された凍結切片など）も含まれる。生物サンプルには、体液（血液、血清、または尿など）がさらに含まれる。一例を挙げれば、生物サンプルは乳房組織サンプルである。別の実施形態では、生物サンプルは、脳生検などにおいて転移性乳癌の存在が決定されるような別の器官（乳房でない）由来の組織サンプルである。生物サンプルを、典型的には、哺乳動物（ラット、マウス、ウシ、イヌ、モルモット、ウサギ、または霊長類（ヒトなど）など）から得る。
【０１６２】
さらなる実施形態では、被験体は癌（乳癌など）を有するか、癌を有する疑いがある。一例を挙げれば、乳癌はＢＢＣ（ＴＮＢＣなど）である。
【０１６３】
生物サンプル中のＣＳＰＧ４を検出する方法も本明細書中に提供する。本方法は、サンプルを１つまたは複数のＣＳＰＧ４に特異的に結合する抗体に接触させて抗体−ＣＳＰＧ４複合体を形成する工程を含む。複合体の有無を検出する。本方法は、ＢＢＣ（例えば、ＴＮＢＣ）などの組織診断（診断の確認または腫瘍起源の決定など）の信頼度の改善に有用である。したがって、本明細書中に開示の方法を使用して、ＢＢＣ（ＴＮＢＣなど）の診断を確認することができる。
【０１６４】
本方法は、診断を必要とする被験体（乳癌を有するか乳癌を有する疑いのある被験体（マンモグラフィを使用して同定された被験体など）など）を選択する工程およびこの被験体からサンプルを得る工程を含むことができる。いくつかの例では、本方法は、乳癌を有する被験体を選択する工程および本明細書中に開示の方法を使用して乳癌がＢＢＣ（ＴＮＢＣなど）であるかどうかを決定する工程を含む。
【０１６５】
ＣＳＰＧ４に特異的に結合する抗体を、本明細書中に開示の方法で使用する。抗体には、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、ヒト化抗体およびキメラ抗体、ならびに完全なヒト抗体が含まれる。いくつかの実施形態では、抗体フラグメント（ここで、抗体フラグメントはＣＳＰＧ４に特異的に結合する）をこれらの方法で使用する。一例を挙げれば、抗体フラグメントはＦｖフラグメントである。さらなる実施形態では、抗体を標識する（蛍光標識、放射性標識、または酵素標識などで）。さらなる例では、抗体を、化合物（酵素、磁性ビーズ、コロイド状磁性ビーズ、ハプテン、蛍光色素、金属化合物、または放射性化合物が含まれるが、これらに限定されない）に抱合することができる。抗体の標識方法は当該分野で周知である。
【０１６６】
タンパク質の有無の決定方法は当該分野で周知である。有用なアッセイには、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、または免疫組織化学アッセイが含まれるが、これらに限定されない。生物サンプル中のＣＳＰＧ４の検出方法は、一般に、免疫学的反応条件下でＣＳＰＧ４と特異的に反応する抗体と生物サンプルを接触させる工程を含む。抗体を免疫学的反応条件下で特異的に結合させて免疫複合体を形成させ、免疫複合体（結合抗体）の存在を直接または間接的に検出する。コントロール細胞（非形質転換細胞または同一組織型の切片など）をコントロールとして含めることができる。
【０１６７】
１つの実施形態では、サンプル中のポリペプチドの検出方法を提供する。ポリペプチドの検出キットは、典型的には、ＣＳＰＧ４に特異的に結合する抗体を含むであろう。抗体は、ＣＳＰＧ４に特異的に結合するモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体であり得る。いくつかの実施形態では、抗体フラグメント（Ｆｖフラグメントなど）がキットに含まれる。ｉｎ  ｖｉｖｏでの使用のために、抗体はｓｃＦｖフラグメントまたはヒト抗体であり得る。さらなる実施形態では、抗体を直接標識する（例えば、蛍光標識、放射性標識、または酵素標識）。
【０１６８】
１つの実施形態では、キットは、ＣＳＰＧ４に特異的に結合する抗体（例えば、ＢＢＣ（ＴＮＢＣなど）（ＣＳＰＧ４を発現する細胞）の検出用）の使用手段を開示した説明書を含む。説明書は、書面、電子的形態（例えば、フロッピー（登録商標）ディスクまたはコンパクトディスク）であり得るか、視覚性媒体（例えば、ビデオファイル）であり得る。キットはまた、キットがデザインされる特定の適用を容易にするためのさらなる成分を含むことができる。したがって、例えば、キットは、標識（例えば、酵素標識のための酵素基質、蛍光標識を検出するためのフィルターセット、または適切な二次標識（二次抗体など）など）の検出手段をさらに含むことができる。キットは、特定の方法の実施のために日常的に使用される緩衝液および他の試薬をさらに含むことができる。かかるキットおよび適切な成分は、当業者に周知である。
【０１６９】
１つの実施形態では、診断キットは、免疫アッセイ（ＢＢＣ（ＴＮＢＣなど）を検出または病期分類するための免疫アッセイなど）を含む。免疫アッセイの詳細は使用した特定の形式に応じて変化し得るにもかかわらず、生物サンプル中のＣＳＰＧ４の検出方法は、一般に、免疫学的反応条件下でＣＳＰＧ４ポリペプチドと特異的に反応する抗体と生物サンプルを接触させる工程を含む。抗体を免疫学的反応条件下で特異的に結合させて免疫複合体を形成させ、免疫複合体（結合抗体）の存在を直接または間接的に検出する。
【０１７０】
本方法はまた、サンプル中の核酸（ここで、核酸はＣＳＰＧ４をコードする）を検出する工程を含む。適切な方法は当該分野で周知である。例えば、被験体由来のサンプルを試験して、ＣＳＰＧ４をコードする核酸が存在するかどうかを決定することができる。１つの実施形態では、増幅手順を使用して、ＣＳＰＧ４をコードする核酸を検出する（逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）など）。別の実施形態では、ブロッティング手順（例えば、ノーザンブロットまたはドットブロット）を使用して、ＣＳＰＧ４をコードする核酸の存在を検出する。したがって、ＣＳＰＧ４をコードする核酸と特異的にハイブリッド形成するプローブまたはプライマーを使用して、ＢＢＣ（ＴＮＢＣなど）の存在を検出する。
【０１７１】
別の一連の実施形態では、生物サンプル中のＣＳＰＧ４をコードする核酸を検出するためのキットを提供することができる。例えば、被験体由来のサンプルを試験して、ＣＳＰＧ４ポリペプチドをコードする核酸（ＣＳＰＧ４ポリペプチドをコードするｍＲＮＡなど）が存在するかどうかを決定することができる。１つの実施形態では、増幅手順を使用して、ＣＳＰＧ４をコードする核酸を検出する。別の実施形態では、ブロッティング手順（例えば、ノーザンブロットまたはドットブロット）を使用して、核酸の存在を検出する。さらなる実施形態では、目的の核酸を増幅し、これらの核酸を配列決定してＣＳＰＧ４ポリペプチドが発現されるかどうかを決定する。したがって、キットは、ストリンジェントな条件下または高ストリンジェント条件下でＣＳＰＧ４をコードする核酸と特異的にハイブリッド形成するプローブまたはプライマーを含むことができる。
【０１７２】
１つの実施形態では、キットは、ＣＳＰＧ４をコードする核酸を増幅するプライマーを提供する。便宜上、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅する。しかし、多数の他の技術が当該分野で公知であり、使用が意図される。例えば、Ｍａｒｓｈａｌｌの米国特許第５，６８６，２７２号は、リガーゼ連鎖反応（すなわち「ＬＣＲ」）を使用したＲＮＡ配列の増幅を開示している（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７，１９８８）；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４：５６９，１９８９；Ｂａｒａｎｙ，ｉｎ  ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  １：５，１９９１）；およびＢａｒａｎｙ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：１８９，１９９１）。あるいは、ＲＮＡをＤＮＡに逆転写し、次いで、ＬＣＲ、ＰＣＲ、または他の方法によって増幅することができる。例示的なＲＮＡの逆転写プロトコールは、米国特許第５，７０５，３６５号に教示されている。適切なプライマーおよびＰＣＲプロトコールの選択は、例えば、Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，１９９０（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に教示されている。得られた核酸を配列決定することができるか、特異的ＣＳＰＧ４プローブを使用し、且つ当該分野で周知のハイブリッド形成技術およびブロッティング技術を使用して同定することができる。
【０１７３】
１つの実施形態では、キットは、プライマーまたはプローブの使用手段を開示した説明書を含む。キットはまた、キットがデザインされる特定の適用を容易にするためのさらなる成分を含むことができる。キットは、特定の方法の実施のために日常的に使用される緩衝液および他の試薬をさらに含むことができる。かかるキットおよび適切な成分は、当業者に周知である。
【０１７４】
基底乳癌腫に対する免疫応答を誘導するためのＣＳＰＧ４の使用
１つの実施形態では、ＣＳＰＧ４ポリペプチドに対して免疫応答を生成する方法を提供する。本方法は、例えば、被験体における癌の成長の軽減または癌の徴候または症状の軽減などによる癌の処置に有用である。癌は、乳癌（ＢＢＣ（例えば、ＴＮＢＣ）など）であり得る。本方法は、治療有効量のポリペプチド（ＣＳＰＧ４ポリペプチドが含まれる）またはそのフラグメントを被験体に投与する工程を含む。本方法は、このポリペプチドをコードする核酸を被験体に投与する工程も含むことができる。
【０１７５】
１つの実施形態では、本方法は、治療有効量のＣＳＰＧ４ポリペプチドを含む薬理学的に許容可能なキャリアを投与する工程を含む。さらなる実施形態では、本方法は、単離されたＣＳＰＧ４の免疫原性エピトープを被験体に投与する工程を含む。免疫原性エピトープにより、Ｂ細胞応答および／またはＴ細胞応答を誘導することができる。基底乳癌処置のためのこれらのポリペプチドおよびエピトープをコードする核酸の使用も想定する。かかるエピトープの使用により、抗体を産生することができ、そして／またはＴ細胞応答（Ｔ細胞の活性化またはサイトカインの産生など）を得ることができる。
【０１７６】
ＭＨＣクラスＩ分子によるペプチドの提示は、ペプチドのアンカー残基によるＭＨＣクラスＩ分子中の間隙への結合に関連し、最終的に細胞表面上に提示される。特定のアンカー残基に応じて、特に、一定のペプチドは、他の分子よりも特定のＨＬＡ分子に強固に結合することができる。十分に結合するペプチドが、通常、「ドミナント」エピトープである一方で、あまり結合しないペプチドは、しばしば、「サブドミナント」または「潜在性」エピトープである。自己タンパク質または外来タンパク質のいずれかのドミナントエピトープは、強い寛容または免疫応答を誘導する。サブドミナントまたは潜在性のエピトープは、弱い応答を生じるか応答を全く生じない。理論に拘束されないが、ドミナントエピトープによるＨＬＡ分子へのより強い結合により、細胞表面上の提示がより密になり、免疫細胞との反応機会が多くなり、免疫応答または免疫寛容を誘発する可能性がより高くなる。ＭＨＣクラスＩ分子は、ＣＴＬ細胞への提示のために内因性タンパク質由来のエピトープを提示する。ＨＬＡ  Ａ分子、ＨＬＡ  Ｂ分子、およびＨＬＡ  Ｃ分子は、特定の係留残基（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ  ｒｅｓｉｄｕｅ）を有する約８〜１０アミノ酸長のペプチドに結合する。ＨＬＡクラスＩ分子によって認識される係留残基は、ＨＬＡ分子の特定の対立遺伝子形態に依存する。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、細胞上の特定のＨＬＡ分子によって提示された場合に特異的エピトープを認識するＴ細胞受容体を保有する。ＣＴＬ前駆体が抗原提示細胞によって刺激されて細胞傷害性Ｔリンパ球となり、これがかかるＨＬＡ−ペプチド複合体を保有する細胞と接触する場合、ＣＴＬは細胞と抱合体を形成し、細胞を破壊する。一例を挙げれば、本明細書中に開示のポリペプチドが結合し、ＨＬＡ−Ａ２．１によって提示される。ＣＳＰＧ４のアミノ酸配列を使用して、当業者はコンピュータプログラムを使用してＴ細胞を刺激するエピトープを同定することができる。かかるプログラムはインターネット上で公的に利用可能である（例えば、Ｉｍｔｅｃｈウェブサイトで利用可能なＰｒｏＰｅｄ−Ｉ）。ＣＳＰＧ４ポリペプチドまたはその免疫原性エピトープを含む融合タンパク質も使用することができる。例えば、ＣＳＰＧ４ポリペプチドを、免疫グロブリンポリペプチド、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ポリ−ヒスチジン、またはβ−ガラクトシダーゼに融合することができる。
【０１７７】
被験体は、目的の任意の被験体であり得る。１つの実施形態では、被験体は、乳癌、具体的にはＢＢＣ（ＴＮＢＣなど）を有する。さらなる薬剤（化学療法薬またはアジュバントなどであるが、これらに限定されない）を含めることができる。本方法は、ＢＢＣ（ＴＮＢＣなど）を有する被験体を同定および／または選択する工程を含むことができる。１つの実施形態では、ＣＳＰＧ４ポリペプチドまたはそのフラグメントもしくはエピトープを、安定化界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）、ミセル形成剤、およびオイルの２つ以上を含むアジュバントと混合する。適切な安定化界面活性剤、ミセル形成剤、およびオイルは、米国特許第５，５８５，１０３号；米国特許第５，７０９，８６０号；米国特許第５，２７０，２０２号；および米国特許第５，６９５，７７０号（その全てが本明細書中で参考として援用される）に詳述されている。安定化界面活性剤は、乳化成分を安定な乳濁液として保持させる任意の界面活性剤である。かかる界面活性剤には、ポリソルベート、８０（ツウィーン（商標））（ソルビタン−モノ−９−オクタデカノアート−ポリ（オキシ−１，２−エタンジイル；ＩＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ製）、ツウィーン４０（商標）、ツウィーン２０（商標）、ツウィーン６０（商標）、ツビッターゲント（商標）３−１２、ティーポールＨＢ７（商標）、およびＳＰＡＮ８５（商標）が含まれる。これらの界面活性剤を、通常、およそ０．０５〜０．５％（約０．２％など）の量で提供する。ミセル形成剤は、ミセル様構造が形成されるように他の成分を使用して形成された乳濁液を安定化させることができる薬剤である。かかる薬剤は、一般に、マクロファージを動員して細胞応答を増強するために注射部位をいくらか刺激する。かかる薬剤の例には、ＢＡＳＦ  Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ（例えば、Ｓｃｈｍｏｌｋａ，Ｊ．Ａｍ．Ｏｉｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．５４：１１０，１９７７；およびＨｕｎｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １２９：１２４４，１９８１など）に記載の高分子表面活性剤（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）（プルロニック（商標）Ｌ６２ＬＦ、Ｌ１０１、およびＬ６４、ＰＥＧ１０００、ならびにテトロニック（商標）１５０１、１５０Ｒ１、７０１、９０１、１３０１、および１３０Ｒ１）が含まれる。かかる薬剤の化学構造は当該分野で周知である。１つの実施形態では、Ｈｕｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１３３：３１６７，１９８４によって定義された０と２との間の親水性−親油性バランス（ＨＬＢ）を有する薬剤を選択する。薬剤を、有効量（例えば、０．５％と１０％との間（１．２５％と５％との間の量など））で提供することができる。
【０１７８】
組成物中に含まれるオイルを、水中油型乳濁液中の抗原の保持を促進するために（すなわち、所望の抗原のためのビヒクルを得るために）選択し、このオイルは、室温（約２０℃〜２５℃）または一旦乳濁液の温度が室温に低下すると乳濁液を形成するように、６５℃未満の融解温度を有し得る。かかるオイルの例には、スクアレン、スクアラン、エイコサン（商標）、テトラテトラコンタン、グリセロール、およびピーナッツ油または他の植物油が含まれる。１つの非限定的な具体例では、１％と１０％との間（２．５％と５％との間など）の量のオイルを提供する。オイルは、このオイルを体内で長期間にわたって分解することができ、且つ、オイル使用の際に副作用（肉芽腫など）が明白でないような生分解性および生体適合性の両方を示すべきである。
【０１７９】
アジュバントを組成物中に含めることができる。１つの実施形態では、アジュバントは、安定化界面活性剤、ミセル形成剤、および商標名プロバックス（登録商標）で販売されているオイル（ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の混合物である。応答を刺激するためにペプチドまたはタンパク質を利用可能である時間を延長するために、ペプチドまたはタンパク質を、埋没物、油性注射液、または特定の系として提供することができる。特定の系は、微粒子、マイクロカプセル、ミクロスフィア、ナノカプセル、または類似の粒子であり得る（例えば、Ｂａｎｇａ、前出を参照のこと）。合成高分子に基づいた特定のキャリアは、制御放出が得られるのに加えて、免疫応答を増強するためのアジュバントとして作用することが示されている。アルミニウム塩をアジュバントとして使用して、体液性免疫応答をもたらすこともできる。したがって、１つの実施形態では、ポリペプチドを、体液性応答を誘導する様式で投与する。
【０１８０】
ＣＳＰＧ４ポリペプチド、そのフラグメント、もしくは免疫原性エピトープ、またはこれらのポリペプチドをコードする核酸を、当業者に公知の任意の手段（Ｂａｎｇａ，Ａ．，“Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，ＰＡ，１９９５を参照のこと）（筋肉内注射、皮下注射、腫瘍内注射、または静脈内注射など）によって投与することができるが、経口投与、鼻腔投与、または肛門投与も意図される。１つの実施形態では、投与は皮下注射または筋肉内注射による投与である。
【０１８１】
別の実施形態では、薬学的組成物は、ポリペプチドをコードする核酸またはその免疫原性フラグメントを含む。治療有効量のポリヌクレオチドを被験体に投与して免疫応答をもたらすことができる。１つの非限定的な具体例では、治療有効量のポリヌクレオチドを被験体に投与して癌（卵巣癌、結腸癌、前立腺癌、乳癌、肺癌、または膵臓癌など）を処置する。
【０１８２】
核酸投与に対する１つのアプローチは、プラスミドＤＮＡ（哺乳動物発現プラスミドなど）を使用した直接免疫化である。上記のように、ヌクレオチド配列はＣＳＰＧ４をコードすることができる。１つの実施形態では、本方法は、治療有効量のＣＳＰＧ４をコードする核酸を含む薬理学的に許容可能なキャリアを被験体に投与する工程を含む。ポリペプチドの組み合わせを投与することができるように、１つを超えるポリペプチドをコードする核酸配列を発現ベクター中に含めることができる。
【０１８３】
核酸構築物による免疫化は当該分野で周知であり、例えば、米国特許第５，６４３，５７８号（細胞性応答または体液性応答を誘発するために所望の抗原をコードするＤＮＡを導入することによる脊椎動物の免疫化方法を記載している）ならびに米国特許第５，５９３，９７２号および米国特許第５，８１７，６３７号（発現することができる調節配列への抗原をコードする核酸配列の作動可能な連結を記載している）で教示されている。米国特許第５，８８０，１０３号は、免疫原性ペプチドまたは他の抗原をコードする核酸の生物へのいくつかの送達方法を記載している。本方法は、核酸（または合成ペプチド自体）、および免疫刺激構築物（すなわち、イスコムス（商標）（コレステロールとクイルＡ（商標）（サポニン）との混合の際に自発的に形成される３０〜４０ｎｍのサイズの負電荷のケージ様構造））のリポソーム送達を含む。抗原用送達ビヒクルとしてイスコムス（商標）を使用して、感染症（トキソプラズマ症およびエプスタイン・バーウイルス誘導性腫瘍が含まれる）の種々の実験モデルで防御免疫が得られている（Ｍｏｗａｔ  ａｎｄ  Ｄｏｎａｃｈｉｅ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １２：３８３，１９９１）。イスコムス（商標）にカプセル化された１μｇほどの低抗原用量でクラスＩ媒介性ＣＴＬ応答が得られることが見出されている（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４４：８７３，１９９０）。
【０１８４】
免疫化のための核酸使用に対する別のアプローチでは、弱毒化したウイルス宿主もしくはウイルスベクターまたは細菌ベクターによってポリペプチドを発現することもできる。組換えワクシニアウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、または他のウイルスベクターを使用して、ペプチドまたはタンパク質を発現し、それにより、ＣＴＬ応答を誘発することができる。例えば、免疫プロトコールで有用なワクシニアベクターおよび方法は、米国特許第４，７２２，８４８号に記載されている。ＢＣＧ（カルメット・ゲラン菌）からペプチド発現のための別のベクターが得られる（Ｓｔｏｖｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３５１：４５６−４６０，１９９１を参照のこと）。
【０１８５】
１つの実施形態では、ポリペプチドをコードする核酸を、細胞に直接導入する。例えば、標準的な方法によって核酸を金ミクロスフィア上にローディングし、Ｂｉｏ−Ｒａｄ’ｓ  Ｈｅｌｉｏｓ（商標）遺伝子銃などのデバイスによって皮膚に移入することができる。強力プロモーターの調節下でプラスミドからなる核酸は「裸」であり得る。ＤＮＡを他の部位（転移に近接した組織が含まれる）に直接注射することができるにもかかわらず、典型的には、ＤＮＡを筋肉内に注射する。注射のための投薬量は、通常、約０．５μｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇであり、典型的には約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇである（例えば、米国特許第５，５８９，４６６号を参照のこと）。
【０１８６】
本開示を、以下の制限されない実施例によって説明する。
【実施例】
【０１８７】
トリプルネガティブ基底乳癌（ＴＮＢＣ）に利用可能な有効な標的治療は存在しない。乳癌患者由来の胸水およびＴＮＢＣ細胞株においてＣＤ４４＋、ＣＤ２４−／ｌｏ細胞として同定したところ、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）がＴＮＢＣ癌組織上に優先的に発現され、ＴＮＢＣ細胞および乳癌幹細胞（ＣＳＣという）上で過剰発現されることをここに証明する。ＣＳＰＧ４特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、単独で、実験ＴＮＢＣマウスモデルにおいて成長を有意に阻害し、樹立された転移を後退させ、同所性ＴＮＢＣマウスモデルにおいて術後の自発的肺転移および腫瘍再発を有意に阻害した。異種移植片腫瘍／転移を得るためにこれら２つの腫瘍モデル型で使用したヒトＴＮＢＣ細胞株は、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１（共に９９％の細胞で乳房ＣＳＣ表現型（ＣＤ４４＋、ＣＤ２４−／ｌｏ）を示す）であった。標的療法の機構研究により、ＣＳＰＧ４特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）が（ホスファチジルイノシチド（Ｐｈｏｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｄｅ）−３−キナーゼ）ＰＩ３Ｋ／ＰＴＥＮ／Ａｋｔおよびマイトジェン活性化タンパク質キナーゼタンパク質（ＭＡＰ）キナーゼ（ＭＡＰＫ）経路シグナル伝達の両方を阻害することができることが明らかとなった。さらに、ＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂは、腫瘍血管形成を軽減することができた。これらの所見により、術後の腫瘍の再発および転移リスクの軽減ための抗体ベースの免疫療法の重要な治療標識としてのＣＳＰＧ４が確立される。
【０１８８】
実施例１  材料と方法
患者、胸水、および細胞調製物。乳癌患者由来の胸水を、承認された細胞および組織獲得プロトコール下で得た。簡潔に述べれば、ＰｌｅｕｒＸカテーテルを用いて滲出液を排出させてこの液体をボトルに回収した。腫瘍細胞を、流動物のフィコールでの分離（典型的には、５００ＭＬ−２Ｌ）によって単離してデブリおよび赤血球交雑物を除去し、低温保存した。典型的な細胞収量は２×１０８〜３×１０１１細胞／リットル流動物であった。
【０１８９】
マウス。雌ＳＣＩＤ／ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃ．Ｂ−Ｉｇｈ−１ｂＩｃｒＴａｃ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ、６〜８週齢）をＮＣＩから購入した。
【０１９０】
細胞株。黒色腫細胞株および乳癌細胞株ＨＳ５７８Ｔ、ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓ、ＳＫ−ＢＲ−３、ＳＵＭ１４９、およびＴ４７Ｄを、Ｄｕｋｅ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅから入手した。全ての細胞株およびヒト黒色腫細胞株Ｍ１４およびＭ１４／ＣＳＰＧ４トランスフェクタント（４００μｇ／ｍｌのさらなるＧ４１８）を、１０％ＦＣＳ、ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補足したＲＰＭＩ１６４０培地中で維持した。
【０１９１】
抗体。ＣＳＰＧ４の異なる決定基を認識するｍＡｂである２２５．２８、７６３．７４、ＴＰ４１．２、およびＴＰ６１．５（Ｃａｍｐｏｌｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２４，２６７−２９６，２００４）、ホルマリン固定し、パラフィン包埋した組織切片中のＣＳＰＧ４の決定基を認識するｍＡｂＤ２．８．５−Ｃ４Ｂ８、抗イディオタイプｍＡｂＦ３Ｃ２５（Ｐｅｒｏｓａ，＆  Ｆｅｒｒｏｎｅ，Ｈｕｍ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２３，２５５−２６９，１９８８）、ならびにＭＫ２−２３およびカルネキシン特異的ｍＡｂＴＯ−５を記載のように作製した（Ｋｕｓａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４３，３８４４−３８５２，１９８９）；Ｏｇｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２７８，３３−４４，２００３）。ＩｇＧ２ａであるｍＡｂ２２５．２８およびＦ３Ｃ２５を除いた全てのｍＡｂはＩｇＧ１であり、これらのｍＡｂを、連続的硫酸アンモニウムおよびカプリル酸沈殿によって腹水から精製した（Ｔｅｍｐｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ８，８５−９５，１９８９）。ＰＥ抗マウスＩｇＧ、ＦＩＴＣ−ＣＤ２４、ＡＰＣ−ＣＤ４４、ＰｅｒＣＰ−ＣＤ４５、７−ＡＡＤ、および系統カクテル（ＣＤ２，３，１０，１６，１８，３１，４５、６４，１４０ｂ）抱合抗体、非抱合抗マウスＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ１）抗体をＢＤ／Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから購入した。以下に特異的な抗体を購入した：ＰＫＣα（Ｓｉｇｍａ）；リン酸化および非ホスホＦＡＫ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）；リン酸化およびｐａｎ  Ａｋｔ、ホスホ−ＰＴＥＮ（Ｓｅｒ３８０／Ｔｈｒ３８２／３８３）、ホスホ−Ｍｅｔ（Ｔｙｒ１２３４／１２３５）（Ｄ２６）、ホスホ−Ｇａｂ（Ｔｙｒ  ３０７）、ホスホ−Ｍｅｔ（Ｔｙｒ１００３）、ホスホ−ｐ４４／４２  ＭＡＰＫ（Ｅｒｋ１／２）、（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）、およびホスホ（ｐｈｏｐｈｏ）−ヒストンＨ３（Ｓｅｒ１０）（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。
【０１９２】
遺伝子発現分析。１２５サンプルからなり、且つホルモン状態にしたがって分類された公的に利用可能な臨床的な注釈つきの乳癌データセットについてのＲＭＡ遺伝子発現データを入手した（ＧＥＯ受入番号：ＧＳＥ５４６０）（ＥＲ−／Ｈｅｒ２−、ＥＲ−／Ｈｅｒ２＋、ＥＲ＋／Ｈｅｒ２−、およびＥＲ＋／Ｈｅｒ２＋）（Ｌｕ，Ｘ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｔｒｅａｔ  １０８，１９１−２０１，２００８）。各亜群についてのコンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）（２０４７３６＿ｓ＿ａｔ、  ２１４２９７＿ａｔ）に対応する遺伝子発現レベルを得、Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア、バージョン４．０３を使用したノンパラメトリックなマン・ホイットニーのＵ検定によって群間の相違を分析した。０．０５未満の両側ｐ値を統計的に有意と見なした。
【０１９３】
フローサイトメトリー分析。複数の滲出液由来の腫瘍細胞調製物を、十分に特徴づけられた表面細胞マーカー（ＣＤ４４、ＣＤ２４）に対する抗体で標識し、Ａｌ−Ｈａｊｊ  ｅｔ  ａｌに記載の通りに特にＣＤ４４＋ＣＤ２４−／ｌｏｗ細胞を捜索するフローサイトメトリーによって種々の細胞集団の存在および比率を評価してＣＳＣを同定した。簡潔に述べれば、細胞をＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂで３０分間染色し、ＰＢＳで２回洗浄し、ＰＥ標識抗マウスＩｇＧ抗体と３０分間インキュベートした。３回の洗浄後、細胞を、ＦＩＴＣ−ＣＤ２４、ＡＰＣ−ＣＤ４４、およびＰｅｒＣＰ−ＣＤ４５（系統マーカーとしてのＣＤ４５）または標識されたＣＤ２、３、１０、１６、１８、３１、４５、６４、１４０ｂ抗体のカクテルおよび７ＡＡＤ（死滅細胞の排除のため）で３０分間染色した。２回の洗浄後、細胞をフローサイトメトリーによって分析した。ＰｅｒＣＰ−ＣＤ４５（系統マーカーとしてのＣＤ４５）または標識したＣＤ２、３、１０、１６、１８、３１、４５、６４、１４０ｂ抗体のカクテルを使用することを除いた同一の染色手順を乳房腫瘍細胞株に適用する。
【０１９４】
免疫組織化学
ＣＳＰＧ４：患者から得た腫瘍のホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）切片を脱パラフィンし、水和した。１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）中で１５分間ボイルすることによって抗原回復を行った。スライドを、３％水素ペルオキシダーゼおよび１％ウシ血清アルブミン／５％正常ウマ血清を含むトリス緩衝化生理食塩水によってツウィーン２０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）と共にブロッキングして、ＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂであるＤ２．８．５−Ｃ４Ｂ８（３μｇ／ｍｌ）と加湿した密室中にて４℃で一晩インキュベートした。ＥｎＶｉｓｉｏｎ＋Ｓｙｓｔｅｍ−ＨＲＰ（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ  Ｉｎｃ）を使用してシグナルを増幅し、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ，ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ  Ｉｎｃ．）によって発色させた。サンプルをヘマトキシリンを用いて対比染色し、脱水し、カナダバルサム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｉｎｃ．）中にマウントした。
【０１９５】
ＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂで染色した乳癌切片を、以前に記載のプロトコール（Ｋａｇｅｓｈｉｔａ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５３，３３４９−３３５４，１９９３）の修正形態を使用して２人の研究者によって個別に悪性度分類した。
【０１９６】
ＣＤ３１：亜鉛（Ｚｉｎｃ  Ｆｉｘａｔｉｖｅ，ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）固定し、パラフィン包埋した外科的に除去した異種移植片の組織切片を、以前に記載のように（Ｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６７，７８７５−７８８４，２００７）、抗マウスＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ１）抗体で染色した。
【０１９７】
ホスホ−ヒストン  ３：製造者のプロトコールにしたがって、肺切片のＦＦＰＥを抗ｐ−ヒストン３抗体で染色した。
【０１９８】
アポトーシス：製造者のプロトコールにしたがって、肺切片のＦＦＰＥを、ＡＰＯＰ＊ＰＬＵＳペルオキシダーゼｉｎ  ｓｉｔｕアポトーシスキット（商標）（Ｓ７１０１）（末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介ｄＵＴＰニック末端標識（ＴＮＵＥＬ）アッセイ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してアポトーシス細胞について染色した。
【０１９９】
ＲＴ−ＰＣＲ。ＲＴ−ＰＣＲを記載のように行った（Ｌｕｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２５，２８７３−２８８４，２００６）。
【０２００】
ウェスタンブロッティング。ＣＳＰＧ４についてのウェスタンブロットアッセイを記載のように行い（Ｗａｎｇ，Ｘ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２９９，１３９−１５１，２００５）、他のシグナル伝達関連タンパク質については、以下の２つの細胞溶解物型に対して標準的な技術を使用して行った：１）培養細胞の溶解物（９６ウェルプレート中の２×１０４細胞／ウェルを４８時間血清飢餓状態にし、次いで、ｍＡｂ２２５．２８（０．１ｍｇ／ｍｌ）、アイソタイプ（０．１ｍｇ／ｍｌ）、またはＰＢＳのいずれかでさらに４８時間処置し、細胞を溶解緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣ、１％ＮＰ４０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％ＢＳＡ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１／５０のプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ））中で溶解した）および２）瞬間冷凍した外科的に除去した異種移植片の溶解物（１／５０のプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を含む氷冷ＲＩＰＡ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の添加前後に組織を均質化した）。６０秒間のボルテックス後、サンプルを４５分間氷冷した。不溶性物質を、１３，０００ｒｐｍにて４℃で３０分間の遠心分離によって組織溶解物から除去した。タンパク質濃度をブラッドフォード試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって測定した。
【０２０１】
細胞の成長、接着、および遊走。細胞成長アッセイのために、細胞（５×１０４細胞／ウェル）を４８時間血清飢餓状態にし、次いで、４倍希釈したマトリゲル（成長因子軽減マトリゲル−ＣＢ−４０２３０，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および０．２５ｍｇ／ｍｌのｍＡｂ２２５．２８、コントロールｍＡｂＦ３Ｃ２５、またはＰＢＳのいずれかを含む無血清ＲＰＭＩ１６４０培地（総体積２００μｌ／ウェル）を含む９６ウェルプレート中に播種し、３７℃で５％ＣＯ２のインキュベーター中で６日間培養した。次いで、細胞を撮影し、細胞をトリプシン処理し、計数した。細胞接着アッセイのために、細胞（２×１０５細胞／ウェル）を播種し、０．０５ｍｇ／ｍｌのｍＡｂ２２５．２８、コントロールｍＡｂＦ３Ｃ２５、またはＰＢＳのいずれかと１００μｌ／ウェルの１２μｇ／ｍｌフィブロネクチンを含むＰＢＳでコーティングした９６ウェルプレート中で４０分間インキュベートした。非接着細胞をＰＢＳで洗い流した。接着細胞を７０％エタノールによって固定し、クリスタルバイオレットによって染色し、ＰＢＳ中に再懸濁した。５４０ｎｍでの吸光度を測定した。結果を、基準としてｍＡｂを含まないＰＢＳで得た接着値を使用した接着阻害率として示した。示した値は、３つの独立した実験の平均であった。遊走アッセイのために、細胞（５×１０４細胞／ウェル）を４８時間血清飢餓状態にし、次いで、０．２５ｍｇ／ｍｌのｍＡｂ２２５．２８、コントロールｍＡｂＦ３Ｃ２５、またはＰＢＳを含む２４トランスウェルプレート（２４ウェルインサート、孔径８μｍ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中に播種した。細胞は、１０μｇ／ｍｌフィブロネクチンを含む無血清ＲＰＭＩ１６４０培地に向かって遊走した。４８時間後、遊走した細胞をＨＥＭＡ３染色セットで染色し、撮影し、Ｚｅｉｓｓ倒立蛍光顕微鏡（ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）下で計数した。６つの独立した強拡大視野（１００倍）の平均をカラムとして示す。上記の全実験を三連で行った。
【０２０２】
実験肺転移および処置実験。図４に示すように、ＳＣＩＤマウスにＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞またはＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を静脈内注射し、ｍＡｂで処置した。
【０２０３】
自発的肺転移および処置実験。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞をＳＣＩＤマウスの乳房脂肪体に移植した。図５に示すように、原発性腫瘍を外科的に除去し、ｍＡｂを投与した。
【０２０４】
実施例２  ＥＲ陰性およびＨｅｒ２陰性乳癌における優先的ＣＳＰＧ４発現
公的に利用可能な臨床的な注釈つきの乳癌データセット（ＧＳＥ５４６０）を使用したＥＲ−／Ｈｅｒ２−、ＥＲ−／Ｈｅｒ２＋、ＥＲ＋／Ｈｅｒ２−、およびＥＲ＋／Ｈｅｒ２＋乳癌細胞におけるＣＳＰＧ４  ｍＲＮＡレベルの比較により、ＣＳＰＧ４遺伝子発現レベルがＥＲ−／Ｈｅｒ２−亜群で他の亜群よりも有意に（マン・ホイットニー、ｐ＝０．０１〜０．０６）高いことが示された。これは、基底乳癌表現型（ＥＲ−／Ｈｅｒ２−）と最良に相関するようである（図１ａ）。
【０２０５】
ＥＲ−、ＰＲ−、およびＨｅｒ２−リプルネガティブ乳癌組織による優先的ＣＳＰＧ４発現を、ＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂを使用したヒト乳癌の異なるサブタイプにおける免疫組織化学的染色の結果によって実証した。４４人の患者由来の７２．７％のトリプルネガティブ乳癌組織中でＣＳＰＧ４が検出された。対照的に、それぞれ、１８人の患者由来のＥＲ＋乳癌組織の２８．６％ならびに１８人の患者由来の２８個のＥＲ＋原発性乳癌病変および１８個のＨｅｒ２＋乳癌組織の１６．７％でＣＳＰＧ４が検出された（表１および図１ｂ）。
【０２０６】
【表１】
2012503203.tif 000008
使用した悪性度分類システムは、図１ｂの説明に記載の通りである。
【０２０７】
実施例３  ＴＮＢＣ細胞株の乳房ＣＳＣ亜集団によるＣＳＰＧ４発現
フローサイトメトリーによってＣＤ４４＋ＣＤ２４−／ｌｏ細胞と同定されたＣＳＣの頻度は、管腔乳癌細胞株よりもＴＭＢＣで遥かに高かった。これらは、細胞株ＳＫ−ＢＲ−３では検出不可能であり、細胞株Ｔ−４７ＤおよびＭＣＦ−７でそれぞれ１．５％および３４．６％の頻度であった。対照的に、これらはＴＮＢＣ細胞株ＨＳ５７８Ｔ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、およびＳＵＭ−１４９において９２．５〜９９．０％の頻度であった１２（図１ｃ）。興味深いことに、ＣＳＰＧ４は、基底乳癌細胞株および管腔乳癌細胞株に存在するＣＤ４４＋ＣＤ２４−／ｌｏ細胞上に差次的に発現する。これは、４つのＴＮＢＣ細胞株において高い比率（６６．７〜９６．１％）でＣＳＣ上で高発現するが、３つの管腔乳癌細胞株において低比率（１．５〜１３．０％）のＣＳＣ上で低発現するか、発現がほとんど検出されない（図１ｃ）。
【０２０８】
フローサイトメトリー分析により、染色細胞の比率および染色強度に関してＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂである２２５．２８、７６３．７４、ＴＰ４１．２、およびＴＰ６１．５によって認識される異なる決定基が各細胞株上に差次的に発現することが示された。ＳＵＭ−１４９細胞株では、約９５％のＣＳＣがｍＡｂ２２５．２８によって認識される決定基を発現し、５％未満のＣＳＣがｍＡｂ７６３．７４およびＴＰ４１．２によって認識される決定基を発現する。対照的に、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞株では、少なくとも９０％のＣＳＣが４つのＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂによって認識される決定基を発現する。全細胞集団上でのＣＳＰＧ４決定基の発現パターンは、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５およびＳＵＭ−１４９細胞株における自家ＣＳＣに類似する。対照的に、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞株では、約９０％のＣＳＣが４つのＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂによって認識される決定基を発現する。ｍＡｂ７６３．７４およびＴＰ４１．２によって認識されるＣｐＳＧ４決定基の発現パターンはＨＳ５７８ＴおよびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株における自家全細胞集団上よりもＣＳＣ上で低く、ＣＳＣ上に発現されるＣＳＰＧ４エピトープの固有の修飾が示唆される（表２ａ、２ｂ＊）。
【０２０９】
【表２】
2012503203.tif 000009
＊表中に示したデータについて、ＴＮＢＣ細胞株ＨＳ５７８Ｔ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、およびＳＵＭ−１４９ならびに管腔癌細胞株ＭＣＦ−７、ＳＫ−ＢＲ−３、およびＴ−４７Ｄを、異なるＣＳＰＧ４決定基を認識するｍＡｂである２２５．２８、７６３．７４、ＴＰ４１．２、およびＴＰ６１．５で染色し、ＦＡＣＳ分析に供した。表は、（ａ）全細胞集団および（ｂ）ＣＤ４４＋／ＣＤ２４−／ｌｏとして同定された推定ＣＳＣの亜集団における染色細胞の比率および平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。７ＡＡＤ＋細胞（死細胞）を、両実験中のゲーティングによって排除した。ＮＡ：該当なし。
【０２１０】
ＣＤＰＧ４決定基発現の異種性は、この分子のグリコシル化の相違を反映する可能性が高い。ＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂにより、複数の細胞培養継代による変動がほんのわずかであることが示された。これらの結果は、腫瘍形成性の高い乳癌細胞の亜集団によるＣＳＰＧ４発現が安定特性であることを示す。
【０２１１】
実施例４  乳癌患者由来の胸水中の乳房ＣＳＣ亜集団によるＣＳＰＧ４発現
Ａｌ−Ｈａｊｊ  ｅｔ  ａｌ．の方法（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １００：３９８３−３９８８）を使用して、１４人の乳癌患者の胸水から単離した細胞中の０．７１〜９２．７％の乳房ＣＳＣが系統陰性（ＣＤ２、３、１０、１６、１８、３１、４５、６４、１４０ｂ）、ＣＤ４５−、ＣＤ４４＋、ＣＤ２４−／ｌｏと同定された（表２）。この表面表現型を有する細胞は、腫瘍形成性の高い亜集団について富化されることが示されている。系統陰性胸水細胞中のＣＳＣの比率は、９人の患者で低く（１０％未満）、４人の患者で中程度であり（１８．６〜３５．０％）、１人の患者で高かった（９２．７％）。ＣＳＣ表現型と一致して、全滲出細胞中のＣＳＣの比率は０．０１％〜０．８９％の範囲であった（表２）。富化の範囲は、染色のために使用したＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂに応じて異なり、結果は、細胞株上に認められた対応する決定基の発現の異種性と一致した（表３）。
【０２１２】
【表３】
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＊１２人の転移性乳癌患者由来の胸水由来の腫瘍細胞を、ＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂである２２５．２８、７６３．７４、ＴＰ４１．２、またはＴＰ６１．５、ＰＥ標識抗マウスＩｇＧ抗体、およびＦＩＴＣ標識抗ＣＤ２４、ＡＰＣ標識抗ＣＤ４４、ＰｅｒＣＰ標識抗ＣＤ４５、ならびに７−ＡＡＤと連続的にインキュベートした。染色した細胞をＦＡＣＳ分析に供した。ＣＤ４５−７−ＡＡＤ−集団およびＣＤ４５−７−ＡＡＤ−ＣＳＰＧ４＋集団中のＣＤ４４＋ＣＤ２４−／ｌｏ細胞の比率を決定した。ＣＳＰＧ４陽性細胞のゲーティングによるＣＤ４４＋ＣＤ２４−／ｌｏ集団の富化を、ＣＤ４５−７−ＡＡＤ−ＣＳＰＧ４＋集団中のＣＤ４４＋ＣＤ２４−／ｌｏ細胞の比率をＣＤ４５−７−ＡＡＤ−集団中の比率で割ることによって計算し、各ウェル中の括弧内に示す。最も高い比率および富化倍率を、各患者サンプルについて右のカラムに示す。
【０２１３】
【表４】
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実施例５  乳房ＣＳＣによって発現されるＣＳＰＧ４の分子プロフィール
ＲＴ−ＰＣＲによってＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞中でＣＳＰＧ４  ｍＲＮＡが検出され、そのほとんど（９９％）がＣＳＣ表現型（ＣＤ４４＋ＣＤ２４−／ｌｏ）を発現した（図６ａ）。ｍＡｂ７６３．７４を用いたＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞溶解物のウェスタンブロット分析により、ＣＳＰＧ４の２つの成分が検出された（図６ｂ）。
【０２１４】
実施例６  ＰＩ３Ｋ／ＰＴＥＮ／ＡｋｔおよびＭＡＲＰＫ経路シグナル伝達の阻害を介したｉｎ  ｖｉｔｒｏでの腫瘍細胞の成長、接着、および遊走のＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂによる阻害
以前の研究により、ＣＳＰＧ４が前駆体および腫瘍細胞の運動性、接着、および成長を促進し、それによって黒色腫細胞および神経膠腫細胞が成長および転移することが示されている。ＣＳＰＧ特異的モノクローナル抗体を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで腫瘍細胞の運動性および成長を遮断する能力について試験した。図２に示すように、ＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂである２２５．２８はｉｎ  ｖｉｔｒｏでＣＳＰＧ４＋ＴＮＢＣ細胞の成長、接着、および遊走を阻害した。図２に示すように、表示の投薬量のｍＡｂ２２５．２８の存在下でＴＮＢＣ細胞は、三次元マトリックス設定（これはｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍成長条件に密接に類似する）において細胞成長を７０％阻害し（図２ａ，ｂ）これらの細胞のフィブロネクチン（ｆｉｇｒｏｎｅｃｔｉｎ）への接着も４５％阻害し（図２ｃ）、Ｂｏｙｄｅｎチャンバーアッセイにおいてフィブロネクチンへのこれらの細胞の運動性を５６％阻害した（図２ｄ）。
【０２１５】
以前の研究では、ＣＳＰＧ４が腫瘍細胞の細胞骨格、成長、運動性、および生存に影響を及ぼす複数のシグナル伝達経路を改変するように機能することが示されている。具体的には、いくつかの重要な経路がＣＳＰＧ４機能に関連すると同定されている。これらの経路には、プロテインキナーゼ  Ｃ（ＰＫＣ）α、ＦＡＫ、Ｅｒｋ１，２、およびＰＩ３キナーゼ（全てトリプルネガティブ乳癌によって活性化され、且つ関連する）が含まれる。図３に示すように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＣＳＰＧ４特異的モノクローナル抗体２２５．２８とのインキュベーションにおけるｍＡｂ２２５．２８は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の両方においてＰＫＣαの発現を阻害し、ＦＡＫ、Ｅｒｋ１，２、およびＡＫＴの活性化も阻害した。
【０２１６】
実施例７    ＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂによるｉｎ  ｖｉｖｏでのヒトＴＮＢＣ樹立実験転移の阻害／後退
ＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂ２２５．２８は、高い比率でＣＤ４４＋／ＣＤ２４−／ｌｏ細胞を有し、中レベルから高レベルでＣＳＰＧ４を発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の実験的転移を阻害した（図４Ａ）。腫瘍細胞の静脈内（ｉ．ｖ．）注射の３日後、マウスを２群に無作為に分けた。一方の群にｍＡｂ２２５．２８（１００μｇ／注射）を週２回注射し、他方の群にコントロールｍＡｂ（１００μｇ／注射）を週２回注射した。腫瘍細胞接種したマウスの７９日後の評価により、ＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂがコントロールｍＡｂと比較して９９％を超えるＭＤＡ−ＭＢ−２３１転移を阻害することが証明された。同様に、ＣＳＰＧ４を高発現し、且つＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に類似のＣＤ４４＋／ＣＤ２４−／ｌｏ表現型を有するＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の転移は、コントロールｍＡｂと比較してｍＡｂ２２５．２８またはｍＡｂ７６３．７４のいずれかで９５％を超えて阻害された（図４ｂ）。
【０２１７】
実施例８  ＰＩ３Ｋ／ＰＴＥＮ／ＡｋｔおよびＭＡＲＰＫ経路シグナル伝達の阻害を介したｉｎ  ｖｉｖｏでのＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂによるヒト同所性ＴＮＢＣ腫瘍の術後再発および自発的転移の阻害
臨床的に関連する研究を行うために、ＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂがＳＣＩＤマウスにおけるヒト乳房ＭＤＡ−ＭＢ−４３５乳腺腫瘍の再発および自発的転移を阻害する能力を、原発性腫瘍の外科的除去（ヒト疾患と臨床的に類似する背景）後に試験した。ｍＡｂ２２５．２８および７６３．７４で処置したマウスは、コントロールｍＡｂを投与したマウスよりも自発的肺転移が有意に低かった（図５ａ）。さらに、ｍＡｂ７６３．７４および２２５．２８でそれぞれ処置したそれぞれ５匹のマウスからなる２群では、たった１つの小さいサイズの局所腫瘍再発のみの検出および検出なしであった。対照的に、コントロールｍＡｂで処置した５匹のマウスにおいて３つの巨大な腫瘍再発が見出された（図５Ｂ）。結果は、２つの独立した実験の代表である。結果は、ＣＳＰＧ４のターゲティングが原発性腫瘍の外科的除去後の腫瘍の転移および再発の両方を阻害するのに臨床的に有用であり得ることを示す。
【０２１８】
ｍＡｂ２２５．２８で処置したマウスから外科的に除去した原発性腫瘍は、コントロールｍＡｂで処置したマウス由来の原発性腫瘍と比較して有意により低い血管密度レベルを示した（図５Ｃおよび５Ｄ）。血管密度に及ぼす影響は、ＣＳＰＧ４を発現し、腫瘍内の新規に形成された血管の成熟に重要である周皮細胞のターゲティングに一部起因し得る。
【０２１９】
ＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂ２２５．２８で処置したマウスおよびコントロールｍＡｂで処置したマウスから除去した原発性腫瘍から生成した細胞溶解物を、ＴＮＢＣの成長および進行に関連する特異的シグナル伝達経路の活性化についても評価した。これらには、それぞれ、ＦＡＫ活性化によって示されるインテグリン媒介性シグナル伝達ならびにＥｒｋ１，２およびＡｋｔの活性化によって示される重要な腫瘍細胞の成長促進および生存のシグナル伝達経路が含まれる。これら３つのシグナル伝達経路の活性化は、コントロールｍＡｂで処置されたマウスから除去した原発性腫瘍と比較してＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂ２２５．２８で処置されたマウスから除去した原発性腫瘍で顕著に減少した。さらに、ＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂで処置されたマウスから除去した原発性腫瘍はまた、コントロールｍＡｂで処置されたマウスから除去した原発性腫瘍と比較してＰＫＣαレベルが低かった（図５Ｅ）。これらの結果は、ｍＡｂでのＣＳＰＧ４ターゲティングが乳癌の進行および転移に重要な細胞の成長、接着、および生存に関連する経路に有意な阻害効果を及ぼすことを示す。
【０２２０】
遺伝子発現プロファイリング、免疫化学的研究、および免疫組織化学的染色は、乳癌ＣＳＰＧ４が基底／ＴＮＢＣ中に優先的に発現されることを説得力を持って示した。ＥＧＦＲ発現と基底様表現型との間の関連も証明されたので、ＣＳＣ表現型を有する分化細胞および細胞の両方における基底乳癌および管腔乳癌中のＣＳＰＧ４の差次的発現はＣＳＰＧ４に固有ではない（Ｋｏｒｓｈｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ  ８２：１５２５−１５３３，２００２）。さらに、ＩＨＣ染色によって基底／ＴＮＢＣ病変中にサイトケラチンＣＫ５／６、Ｓ期キナーゼ関連タンパク質２（ＳＫＰ２）、および間葉フォークヘッド１（ＦＯＸＣ２）が主に検出された（Ｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０４：１００６９−１００７４，２００７）。ＴＮＢＣおよび他の乳癌サブタイプにおける差次的ＣＳＰＧ４発現が起源とする異なる細胞型または乳癌の異なるサブタイプ中の遺伝子発現の調節機構の相違のいずれを反映するかは依然として決定されていない。他方では、ＣＳＧＰ４がマッピングされた１５番染色体（２８）中の遺伝子材料の喪失がこれらの乳癌のサブタイプで記載されていなかったので、乳癌の他のサブタイプ中でのＣＳＰＧ４発現の喪失またはレベルの低さはコードする遺伝子の喪失を反映している可能性が低い。ＴＮＢＣにおけるＣＳＰＧ４遺伝子活性化の根底にある分子機構が何であれ、この乳癌サブタイプにおけるその優先的発現により、診断バイオマーカーおよび治療標的としてのその潜在的な用途が示唆される。
【０２２１】
ＴＮＢＣでは、ＣＤ４４＋ＣＤ２４−／ｌｏ表現型を有する亜集団に排他的ではないが、ＣＳＰＧ４が主に発現されるようである。ＣＤ４４＋ＣＤ２４−／ｌｏ表現型を有する細胞が肺への転移を容易にする高浸潤性である可能性があり（Ｓｈｅｒｉｄａｎ，Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ８：Ｒ５９，２００６）、且つ乳癌患者の骨髄中で検出される癌細胞の大部分を示すので（Ｂａｌｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １２：５６１５−５６２１，２００６）、乳癌のこのサブタイプ中で富化されるこの細胞亜集団は進行で重要な役割を果たすようである。悪性細胞の遊走、転移（Ｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １７７：２９９−３１２，１９９８）、および化学療法抵抗性（Ｃｈｅｃｋｅｎｙａ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２７：５１８２−５１９４，２００８）、ならびに間葉細胞の起源であり得る（Ｃｒｉｓｅｎ，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ３：３０１−３１３，２００８）周皮細胞上のその発現（Ｏｚｅｒｄｅｍ，Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ７：２６９−２７６，２００４）におけるＣＳＰＧ４の役割を考慮すると、この細胞表面プロテオグリカンのコアタンパク質がこの亜集団の幹様性質およびその上皮間葉移行（ＥＭＴ）に寄与する可能性がある。後者の形態学的分化転換過程により、癌腫細胞が悪性疾患の進行中に運動性および浸潤性の増加に寄与する間葉の外観／遺伝子発現プロフィールを獲得することができる（Ｈａｙ，Ａｃｔａ  Ａｎａｔ（Ｂａｓｅｌ）１５４：８−２０，１９９５）。
【０２２２】
ＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂは、複数のＴＮＢＣ細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞が含まれる）の転移の阻害で有効である。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞株を、ＣＳＰＧ４＋ＣＤ４４＋ＣＤ２４−／ｌｏ細胞の腫瘍転移および再発の評価ならびに前臨床モデルにおける攻撃的転移表現型を有する細胞におけるｍＡｂでのＣＳＰＧ４ターゲティング効率の原理の証明のためのモデルとしてこれらの研究で試験する。
【０２２３】
基底／ＴＮＢＣは、特に、攻撃的挙動および予後不良に関連し、典型的には、ホルモン受容体やＨＥＲ−２を発現しない（「トリプルネガティブ」表現型）。したがって、ＴＮＢＣ患者は、現在利用可能な標的全身治療から恩恵を受ける可能性が低い。さらに、転移性基底／ＴＮＢＣにおけるセツキシマブによるＥＧＦＲ標的療法では、臨床試験でむしろ期待はずれの結果が得られた。この制限を克服するために、基底／ＴＮＢＣ上に優先的に発現されるタンパク質（ＣＳＰＧ４など）は、治療標的の魅力的な候補である。機能遮断性のＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂ２２５．２８は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの腫瘍細胞の成長、接着、および遊走ならびにｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍細胞の増殖および腫瘍血管形成を阻害し、ＴＮＢＣ細胞からなる原発性腫瘍内の腫瘍細胞アポトーシスを誘導する。結果として、ＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂにより、樹立されたＴＮＢＣ細胞由来の肺転移の７０％超が後退し、原発性腫瘍の外科的除去後の再発および転移性の拡大が阻害された。
【０２２４】
基底／ＴＮＢＣは、特に、攻撃的挙動および予後不良に関連し、典型的には、典型的には、ホルモン受容体やＨＥＲ−２を発現しない（「トリプルネガティブ」表現型）。したがって、ＴＮＢＣ患者は、現在利用可能な標的全身治療から恩恵を受ける可能性が低い。さらに、転移性基底／ＴＮＢＣにおけるセツキシマブによるＥＧＦＲ標的療法では、ＴＮＢＣ細胞からなる原発性腫瘍内での臨床試験でむしろ期待はずれの結果が得られた。結果として、ＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂにより、樹立されたＴＮＢＣ細胞由来の肺転移の７０％超が後退し、外科的に除去された原発性腫瘍の再発および転移が阻害される。ＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂは、ＴＮＢＣ細胞の悪性進行に重要なシグナル伝達経路の活性化も阻害する。
【０２２５】
以前の研究により、ＣＳＰＧ４およびＮＧ２ラットホモログが他の腫瘍モデルにおけるこれらの重要な経路のいくつかに関連することが証明されている。これらには、細胞骨格再構築（例えば、ｃｄｃ４２およびＲａｃ）、インテグリン媒介性接着（例えば、ＦＡＫ活性化）、成長促進経路（例えば、Ｅｒｋ１，２活性化の持続）、および細胞生存経路（例えば、Ａｋｔ活性化）に重要な経路が含まれる。ｍＡｂでのＣＳＰＧ４のターゲティングはＴＮＢＣ細胞に多面的に影響を及ぼす。これは、Ｅｒｋ１，２の持続的活性化などの成長関連シグナル伝達経路を阻害することなくＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ関連経路をターゲティングするようである他の現在の治療ｍＡｂ（ハーセプチンなど）と対照的である。ＳＣＩＤマウスにおけるＮＫ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ枯渇がその治療効率に影響を及ぼさないので、ＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂ２２５．２８は抗体依存性の細胞媒介性細胞傷害を示さないようであった。さらに、抗体は腫瘍細胞の補体依存性細胞傷害性を媒介しなかった。まとめると、これらのデータは、腫瘍の成長および転移に及ぼすｍＡｂ２２５．２８の阻害効果が腫瘍細胞の悪性進行に重要なシグナル伝達経路を阻害するその能力の直接的結果であることを示す。
【０２２６】
一定のタンパク質（「幹細胞様」腫瘍表現型に関連するＳＨｈおよびｗｎｔ関連シグナル伝達経路など）をターゲティングするために相当な努力が払われている。ＣＳＰＧ４は、正常組織中の分布が制限されており、且つ異なる器官内の前駆体集団に関連する。しかし、ＣＳＰＧは基本的に正常な幹細胞の維持および自己再生に必要とされないので、ＣＳＰＧ４は、ＳＨｈおよびＷｎｔシグナル伝達経路として他の標的を超える治療標的としての利点を付与する。したがって、ｍＡｂでのＣＳＰＧ４のターゲティングは、正常な組織幹細胞に及ぼす負の影響に関連する可能性が低い。ＣＳＰＧ４特異的免疫はヒトにおいて副作用を生じないようであり、ｍＡｂ２２５．２８の全身投与（１週間に２回）の半年後にマウスにおいて一般毒性（体重減少など）および創傷治癒の遅延を生じなかった。ＣＳＰＧ４特異的ｍＡｂの精巧な特異性により、これらの抗体が悪性腫瘍内の高度に腫瘍形成性／転移性の細胞亜集団のターゲティングに理想的に適合する。モノクローナル抗体の精巧な特異性を高レベルでＣＳＰＧ４を発現する癌幹細胞の処置に理想的に適合させることができることを本明細書中に開示する。
【０２２７】
記載の本発明の精神を逸脱することなく記載の方法または組成物の正確な詳細を変更または修正することができることが明らかであろう。本発明者らは、下記の特許請求の範囲の範囲および精神の範囲内に含まれる全てのかかる修正形態および変更形態を主張する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｄ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図３】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｅ】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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