(57)【要約】  本発明は、シュードモナス・プチダＤＯＴ−Ｔ１Ｅ由来の細菌リプレッサーＴｔｇＲの制御下でトランスジーン発現を制御するための皮膚浸透化合物（例えばフロレチンなど）の使用、トランスアクチベーション又はトランスリプレッサードメインに融合されたレプレッサーＴｔｇＲについての遺伝子コードを含むベクター、ＴｔｇＲ特異的オペレーター配列（ＯＴｔｇＲ）、プロモーター及び内因性又は外因性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、ならびに言及するベクターを用いて一過性又は構成的にトランスフェクトされた哺乳動物細胞、ならびにナノ又はマイクロ容器中にそのような細胞を含む哺乳動物に関する。
2012523220.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランスジーン発現を制御するための皮膚浸透化合物の使用。
【請求項２】
トランスジーン発現がシュードモナス・プチダＤＯＴ−Ｔ１Ｅ由来の細菌リプレッサータンパク質ＴｔｇＲの制御下にある、請求項１記載の使用。
【請求項３】
皮膚浸透化合物がフラボノイド、カルコン、及びブチルパラベン、ならびにその誘導体より選択される、請求項１又は２記載の使用。
【請求項４】
皮膚浸透化合物がフロレチンである、請求項１又は２記載の使用。
【請求項５】
トランスアクチベーションドメイン又はトランスリプレッサードメインに融合されたシュードモナス・プチダＤＯＴ−Ｔ１Ｅ由来の細菌リプレッサータンパク質ＴｔｇＲを含むベクター。
【請求項６】
ＴｔｇＲについての遺伝子コード、ヘルペス単純ウイルスのｖｐ１６トランスアクチベーションドメイン、及び構成的サルウイルス４０プロモーター（ＰＳＶ４０）を含み、タンパク質ＴｔｇＲとＶＰ１６との融合に起因するトランスアクチベーターＴｔｇＡ１がＰＳＶ４０の制御下にあるようになる、請求項５記載のベクター。
【請求項７】
ＴｔｇＲについての遺伝子コード、ヒトＫｒｕｐｐｅｌ関連ボックスタンパク質のｋｒａｂトランスリプレッションドメイン、及び構成的サルウイルス４０プロモーター（ＰＳＶ４０）を含み、タンパク質ＴｔｇＲとＫＲＡＢとの融合に起因するトランスレプレッサーＴｔｇＫがＰＳＶ４０の制御下にあるようになる、請求項５記載のベクター。
【請求項８】
ＴｔｇＲ特異的オペレーター配列（ＯＴｔｇＲ）、プロモーター、及び内因性又は外因性のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項９】
最小ヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーター（ＰｈＣＭＶｍｉｎ）の５’に位置づけられるＯＴｔｇＲを含む、請求項８記載のベクターＰＴｔｇＲ１。
【請求項１０】
外因性タンパク質をコードするポリヌクレオチドがＳＥＡＰ発現をコードする配列である、請求項８又は９記載のベクター。
【請求項１１】
トランスアクチベーションドメイン又はトランスリプレッサードメインに融合されたＴｔｇＲ、内因性又は外因性タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ＴｔｇＲ特異的オペレーター配列（ＯＴｔｇＲ）、及びプロモーターを含む、請求項５記載のベクター。
【請求項１２】
請求項５〜７のいずれか一項記載のベクターを用いて及び請求項８〜１０のいずれか一項記載のベクターを用いてトランスフェクトされた哺乳動物細胞。
【請求項１３】
請求項１１記載のベクターを用いてトランスフェクトされた哺乳動物細胞。
【請求項１４】
請求項１２又は１３記載のナノ容器又はマイクロ容器中の哺乳動物細胞。
【請求項１５】
請求項１２、１３、又は１４記載の哺乳動物細胞を含む哺乳動物（ヒトを除く）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トランスジーン発現を制御するための皮膚浸透化合物の使用、ならびに対応するベクター及びそのようなトランスジーン発現を可能にするそのようなベクターを含む細胞に関する。
【０００２】
発明の背景
合成の哺乳動物発現回路は、可逆的で調整可能なトランスジーン発現を可能にし、機能ゲノム研究、創薬、産生困難なタンパク質治療薬の製造、電気回路の複雑さに達する合成遺伝子ネットワークレプリカの設計、及び遺伝子治療への適用における最近の進歩のために必須である。
【０００３】
今日まで、哺乳動物細胞及びトランスジェニック動物における使用のための多数の異種トランスジーン発現システムが記載されてきた（Weber W., Fussenegger M., 2007, Curr Opin Biotechnol 18(5): 399-410）。普及している設計は、原核生物リプレッサーを真核生物トランスアクチベーションドメインに融合させることにより操作された異種小分子応答性トランスアクチベーター及び最小真核生物プロモーターに連結されたマッチする原核生物オペレーターを含むトランスアクチベーター特異的プロモーターからなる。トランスアクチベーターのその同族プロモーターに対する親和性のインデューサー誘発性調整は、特定の標的遺伝子の調整可能で可逆的な転写をもたらす。近年において、そのような異種転写制御モダリティの一式が開発されており、それらは、種々のインデューサー分子、例えば抗生物質、ステロイドホルモン及びそれらのアナログ、クオラムセンシング分子、免疫抑制及び抗糖尿病薬物、ビオチン、Ｌアルギニンならびに揮発性アセトアルデヒドなどに応答性である（ＷＯ２００５／０２１７６６）。簡単に吸入できる気体アセトアルデヒドは別として、全ての他のインデューサーは、経口で取り込まれる、又は、任意の将来の遺伝子治療適用における注射により投与する必要がある。インデューサー分子の経皮及び局所送達は、従来の注射ベース又は経口投与を上回る利点（例えば利便性、改善された患者コンプライアンス、及び肝臓での初回通過効果の除去など）を提供しうるが、まだ開発されていない。
【０００４】
フロレチンは、抗細菌活性を伴う天然植物防御代謝物であり（Teran W., Krell T., Ramos J.L., Gallegos M.T., 2006, J Biol Chem 281(11): 7102-7109）、リンゴの木の根皮中ならびにリンゴ中に生じ、皮膚ベースの薬物送達のための可能な浸透エンハンサーとして試験されており、プロスタグランジンに拮抗することにより炎症を減弱させ、皮膚をＵＶ光誘導性の光損傷から防御し、癌処置のための化学予防薬剤として評価される。植物根圏は、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）（ＤＯＴ−Ｔ１Ｅ株）の天然生息場所の１つであるため、この原核生物は、多剤認識特性を伴うＲＮＤファミリートランスポーターＴｔｇＡＢＣを進化させており、それは、ＴｔｇＲプロモーター（ＰＴｔｇＲ）における特定のオペレーター（ＯＴｔｇＲ）へのその同族リプレッサーＴｔｇＲ結合により制御される。フロレチンは、ＴｔｇＲオペレーター複合体に、ＴｔｇＲの二量体当たり１つのエフェクター分子の化学量論比で結合し、ＯＴｔｇＲからＴｔｇＲを放出することが示されており、それは、ＴｔｇＡＢＣ産生の誘導及びＰプチダからのフラボノイドの効果的なポンプ媒介性排出をもたらす（Teran W. et al., loc. cit.）。
【０００５】
発明の概要
本発明は、トランスジーン発現、特に、シュードモナス・プチダＤＯＴ−Ｔ１Ｅ由来の細菌リプレッサーＴｔｇＲの制御下にあるトランスジーン発現を制御するための皮膚浸透化合物の使用に関する。本発明において使用される皮膚浸透化合物は、例えば、フラボノイド又はカルコン（例、フロリジン、フロレチンなど）、ブチルパラベン、又はその誘導体、特にフロレチンである。
【０００６】
本発明は、さらに、トランスアクチベーション又はトランスリプレッサードメインに融合されたシュードモナス・プチダＤＯＴ−Ｔ１Ｅ由来の細菌リプレッサーＴｔｇＲの遺伝子コードを含むベクター、特に、ＴｔｇＲについての遺伝子コードならびにヘルペス単純ウイルスのｖｐ１６トランスアクチベーションドメイン及び構成的サルウイルス４０プロモーター（ＰＳＶ４０）を含むベクターに関し、タンパク質ＴｔｇＲとＶＰ１６との融合に起因するトランスアクチベーターＴｔｇＡ１がＰＳＶ４０の制御下にあるようになる。
【０００７】
本発明は、また、対応するコードされるトランスアクチベーター及びトランスリプレッサータンパク質（例、タンパク質ＴｔｇＡ１）に関する。
【０００８】
さらに、本発明は、ＴｔｇＲ特異的オペレーター配列（ＯＴｔｇＲ）、プロモーター、及び内因性又は外因性タンパク質をコードするポリヌクレオチド、例えば、最小ヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーター（ＰｈＣＭＶｍｉｎ）を含むベクター、ならびに両方の成分、即ち、トランスアクチベーションドメイン又はトランスリプレッサードメインに融合されたＴｔｇＲタンパク質についての遺伝子コード、内因性又は、好ましくは、外因性タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ＴｔｇＲ特異的オペレーター配列（ＯＴｔｇＲ）、及びプロモーターを含むベクターに関する。
【０００９】
本発明は、また、言及するベクターを用いて一過性又は構成的にトランスフェクトされた哺乳動物細胞、ナノ又はマイクロ容器中のそのような哺乳動物細胞、及びそのような哺乳動物細胞を含む哺乳動物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】細胞増殖及びタンパク質産生に対するフロレチンの影響。構成的なＳＥＡＰ発現のために操作されたＣＨＯ−Ｋ１を、異なるフロレチン濃度（０〜１００μM）を添加した培養液中で培養し、ＳＥＡＰ産生（バー）ならびに最高細胞密度（ライン）を４８時間後に評価する。略称：Ｃ．Ｄ．：細胞密度（１０６/mL）；Ｐｈｌ：フロレチン（μM）
【図２】フロレチン調整可能制御エレメント（ＰＥＡＣＥ）の設計及び機能性。（Ａ）発現ベクター。シュードモナス・プチダＤＯＴ−Ｔ１Ｅ由来の細菌リプレッサーＴｔｇＲタンパク質についての遺伝子コードを、ヘルペス単純ウイルスのＶＰ１６トランスアクチベーションドメインに融合させ、結果として得られるトランスアクチベーターＴｔｇＡ１（ＴｔｇＲ−ＶＰ１６）を、構成的サルウイルス４０プロモーター（ＰＳＶ４０）の制御下にクローン化する（ｐＭＧ１１）。フロレチン応答性プロモーター（ＰＴｔｇＲ１；  ＯＴｔｇＲ−ＰｈＣＭＶｍｉｎ）は、ＴｔｇＲ特異的オペレーター配列（ＯＴｔｇＲ、ＴｔｇＲ結合部位、下線）を含み、それは、最小ヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーター（ＰｈＣＭＶｍｉｎ）の５’に位置づけられ、ヒト胎盤分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の発現を駆動するように設定される（ｐＭＧ１０）。選択された制限部位：Ａ、ＡａｔＩＩ；Ｂ、ＢｓｓＨＩＩ；Ｂａ、ＢａｍＨＩ；Ｅ、ＥｃｏＲＩ；Ｈ、ＨｉｎｄＩＩＩ；Ｎ、ＮｏｔＩ；Ｓ、ＳｂｆＩ；Ｘ、ＸｂａＩ；Ｘｈ、ＸｈｏＩ。（Ｂ）ＰＥＡＣＥ機能性の略図。フロレチンの非存在において、ＴｔｇＡ１は、その同族オペレーター部位に結合し、ＰＴｔｇＲ１駆動ＳＥＡＰ発現を開始する。フロレチンの添加によって、ＴｔｇＡ１がＰＴｔｇＲ１から放出され、それがＳＥＡＰ発現をスイッチオフする。（Ｃ）ｐＭＧ１１（ＰＳＶ４０−ＴｔｇＡ１−ｐＡ）及びｐＭＧ１０（ＰＴｔｇＲ１−ＳＥＡＰ−ｐＡ）を用いて一過性にトランスフェクトし、４８時間にわたり異なるフロレチン濃度（０〜７０μM）の存在において培養されたＣＨＯ−Ｋ１のＳＥＡＰ発現プラファイル。略称：Ｐｈｌ：フロレチン（μM）
【図３】異なるＰＥＡＣＥトランスアクチベーター及びプロモーターの配置の設計及び組み合わせ特徴付け。異なるトランスアクチベーションドメインを持つＰＥＡＣＥトランスアクチベーター（Ａ、ＴｔｇＡ１、ＶＰ１６；ｐＭＧ１１）（Ｂ、ＴｔｇＡ２、ｐ６５；ｐＭＧ１８）（Ｃ、ＴｔｇＡ３、Ｅ２Ｆ４；ｐＭＧ１９）を、０（ＰＴｔｇＲ１；ｐＭＧ１０）、２（ＰＴｔｇＲ２；ｐＭＧ２０）、４（ＰＴｔｇＲ３；ｐＭＧ２１）、６（ＰＴｔｇＲ４；ｐＭＧ２２）、８（ＰＴｔｇＲ５；ｐＭＧ２３）及び１０（ＰＴｔｇＲ６；ｐＭＧ２４）塩基対リンカーをＴｔｇＲオペレーターと最小プロモーターの間に含むＳＥＡＰ駆動ＰＥＡＣＥプロモーター変異体を用いてＣＨＯ−Ｋ１中にコトランスフェクトし、ＳＥＡＰ発現を、異なるフロレチン濃度を添加した培地中での４８時間の培養後にプロファイル化する。
【図４】ＣＨＯ−Ｋ１中での自己調節されたＰＥＡＣＥ制御ＳＥＡＰ発現。ＳＥＡＰを第１シストロン中に、及び、ＴｔｇＡ１を第２シストロン中に持つＰＴｔｇＲ１駆動ジシストロン発現単位をコードするｐＭＧ１３を、ＣＨＯ−Ｋ１中にトランスフェクトし、ＳＥＡＰ発現を、フロレチンの存在（５０μM）及び非存在における培養後４８時間目に評価する。略称：Ｐｈｌ：フロレチン
【図５】異なるフラボノイドに対するＰＥＡＣＥ応答性。（Ａ）フラボノイドの毒性ＣＨＯ−Ｋ１を、ｐＳＥＡＰ２−Ｃｏｎｔｒｏｌを用いて一過性にトランスフェクトし、異なるフラボノイド（０、２５、５０μM）を添加した培地中で培養する。ＳＥＡＰレベルを４８時間後にスコア化する。（Ｂ）全てのＰＥＡＣＥ成分（ｐＭＧ１０及びｐＭＧ１１）を一過性に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を、異なるフラボノイドの存在において培養し、ＳＥＡＰ発現を４８時間後にプロファイル化する。略称：１：ベルベリン；２：ブチルパラベン；３：ゲニステイン；４：ルテオリン；５：βナフトール；６：ナリンゲニン；７：フロレチン；８：フロリジン；９：クエルセチン
【図６】フロレチン応答性ＳＥＡＰ発現についてトランスジェニックである安定的なＣＨＯ−ＰＥＡＣＥ細胞株の設計及び特徴付け。ＣＨＯ−Ｋ１を、ｐＭＧ１１（ＰＳＶ４０−ＴｔｇＡ１−ｐＡ）及びｐＭＧ１０（ＰＴｔｇＲ１−ＳＥＡＰ−ｐＡ）を用いて安定的にコトランスフェクトし、個々のクローンを、フロレチン調整ＳＥＡＰ発現について、４８時間の培養期間後に評価する。略称：Ｐｈｌ：フロレチン
【図７Ａ】フロレチン応答性ＳＥＡＰ発現についてトランスジェニックである安定的なＣＨＯ−ＰＥＡＣＥ８細胞株の設計及び特徴付け。（Ａ）ＣＨＯ−ＰＥＡＣＥ８の用量反応プロファイル。略称：Ｐｈｌ：フロレチン（μM）；ｔ：時間（ｈ）
【図７Ｂ】フロレチン応答性ＳＥＡＰ発現についてトランスジェニックである安定的なＣＨＯ−ＰＥＡＣＥ８細胞株の設計及び特徴付け。（Ｂ）７２時間にわたり５０μMフロレチンの存在及び非存在において培養されたＣＨＯ−ＰＥＡＣＥ８のＳＥＡＰ発現動態。略称：Ｐｈｌ：フロレチン（μM）；ｔ：時間（ｈ）
【図７Ｃ】フロレチン応答性ＳＥＡＰ発現についてトランスジェニックである安定的なＣＨＯ−ＰＥＡＣＥ８細胞株の設計及び特徴付け。（Ｃ）ＣＨＯ−ＰＥＡＣＥ８ベースのＳＥＡＰ産生の可逆性。２×１０５個のＣＨＯ−ＰＥＡＣＥ８を、１４４時間にわたり、５０μMフロレチンの存在及び非存在において培養した。４８時間ごとに細胞密度を２×１０５個に再調整し、培養のフロレチン状態を逆転させる。略称：Ｐｈｌ：フロレチン（μM）；ｔ：時間（ｈ）
【図８】十分に定義されたフロレチン分解プロファイルを使用したバイオリアクター中での自動的にプログラムされた産物遺伝子発現。２×１０３個細胞/mLのＣＨＯ−ＰＥＡＣＥ８を、６０、８０、又は１００μMのいずれかのフロレチンが添加された１Lの培養液を含むバイオリアクター中で培養し、ＳＥＡＰ産生を２１１時間にわたりプロファイル化する。培養中での定められたフロレチン分解プロファイル及び４０μMフロレチンの正確な誘導閾値のため、ＳＥＡＰ産生の開始が、非常に正確な時間点で、産生開始時での細胞密度及びフロレチン濃度を定めることにより生じるようにプログラムすることができる。略称：１：フロレチン（６０μM）；２：フロレチン（８０μM）；３：フロレチン（１００μM）；４：フロレチン分解（６０μM）；５：フロレチン分解（８０μM）；６：フロレチン分解（１００μM）；７：細胞数；Ｖ．Ｃ．：生細胞（１０６/mL）。
【図９】マウスにおけるＰＥＡＣＥ制御トランスジーン発現。（Ａ）マイクロカプセル化したＣＨＯ−ＰＥＡＣＥ８を、雌ＯＦ１マウス中に皮下移植する（２×１０６個細胞／マウス）。異なる量のフロレチン（０、５．２５、１０．５、２１、及び４２mg）を含む２００μLのクリームを、移植部位近くの剪毛した皮膚面に適用する。ＳＥＡＰ血清レベルを移植後７２時間目に定量化する。（Ｂ）インビトロで７２時間にわたり異なるフロレチン濃度で培養されたマイクロカプセル化したＣＨＯ−ＰＥＡＣＥ８インプラントバッチのＳＥＡＰ発現プロファイル。略称：Ｐｈｌ：フロレチン（μM）
【図１０】ポジティブ調節のためのフロレチン調整可能制御エレメント（ＰＥＡＣＥ−ＯＮ）の設計及び機能性。（Ａ）発現ベクター。シュードモナス・プチダＤＯＴ−Ｔ１Ｅ由来の細菌リプレッサータンパク質ＴｔｇＲについての遺伝子コードを、ヒトＫｒｕｐｐｅｌ関連ボックスタンパク質のＫＲＡＢトランスリプレッションドメインに融合させ、結果として得られるトランスリプレッサータンパク質ＴｔｇＫ（ＴｔｇＲ−ＫＲＡＢ）を、構成的なサルウイルス４０プロモーター（ＰＳＶ４０）の制御下にクローン化する（ｐＭＧ２８）。フロレチン応答性プロモーター（ＰＴｔｇＲＯＮ；ＰＳＶ４０−８ｘＯＴｔｇＲ）は８つのＴｔｇＫ特異的オペレーター配列（８ｘＯＴｔｇＲ）を含み、それらは構成的ＰＳＶ４０の３’に位置づけられ、ヒト胎盤分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の発現を駆動するように設定される（ｐＭＧ２７）。選択された制限部位：Ｂ、ＢｓｓＨＩＩ；Ｂａ、ＢａｍＨＩ；Ｃ、ＣｌａＩ；Ｅ、ＥｃｏＲＩ；Ｈ、ＨｉｎｄＩＩＩ；Ｎ、ＮｏｔＩ；Ｘ、ＸｂａＩ；（Ｂ）ＰＥＡＣＥ−ＯＮ機能性の略図。フロレチンの非存在において、ＴｔｇＫはその同族オペレーター部位に結合し、ＰＴｔｇＲＯＮ駆動ＳＥＡＰ発現を阻害する。フロレチンの添加によって、ＴｔｇＫがＰＴｔｇＲＯＮから放出され、ＳＥＡＰ発現をスイッチオンする。（Ｃ）ｐＭＧ２８（ＰＳＶ４０−ＴｔｇＫ−ｐＡ）及びｐＭＧ２７（ＰＴｔｇＲＯＮ−ＳＥＡＰ−ｐＡ）を用いて一過性にトランスフェクトし、４８時間にわたり異なるフロレチン濃度（０〜５０μM）の存在において培養されたＣＨＯ−Ｋ１のＳＥＡＰ発現プロファイル。
【００１１】
発明の詳細な説明
ＰプチダＤＯＴ−Ｔ１Ｅのフロレチン応答性ＴｔｇＲ−ＯＴｔｇＲ相互作用を利用する際、合成の哺乳動物フロレチン調整可能制御エレメント（ＰＥＡＣＥ）を組み立て、それは、フロレチン含有スキンローションを使用してマウスにおける細胞インプラントのトランスジーン発現を可逆的に微調整することができ、標準的なバイオリアクター操作において自動産物遺伝子発現のために産生細胞株をプログラムすることができる。
【００１２】
フロレチンは化学式
【化１】
2012523220.tif 000003
３−［４−ヒドロキシフェニル］−１−［２，４，６−トリヒドロキシフェニル］−１−プロパノンである。
【００１３】
本発明は、トランスジーン発現、特に、シュードモナス・プチダＤＯＴ−Ｔ１Ｅ由来の細菌リプレッサータンパク質ＴｔｇＲの制御下でのトランスジーン発現を制御するための皮膚浸透化合物の使用に関する。本発明において使用される皮膚浸透化合物は、例えば、フラボノイド又はカルコン（例えばフロリジン、フロレチンなどである）、ブチルパラベン、又はその誘導体、特にフロレチンである。
【００１４】
フラボノイドは、イソフラボノイド及びネオフラボノイドを含み、２−フェニルクロメン−４−オン（フラボン）、３−フェニルクロメン−４−オン（イソフラボン）、及び４−フェニル−クマリン（ネオフラボン）に由来する天然産物である。カルコンは、フラバノイド（ｆｌａｖａｎｏｉｄ）に密接に関連し、ｏ−ヒドロキシフェニルフェニルビニルケトンに由来する開鎖アナログを表す。誘導は、フラボンの２（３）炭素−炭素二重結合の還元（フラバノン（カルコンの閉環異性体）を与える）又はさらなる還元（及び環開裂）（ｏ−（３−フェニル−プロパノイル）フェノール（ジヒドロカルコン）を与える）、ケト基の還元（フラバノールを与える）又はＣＨ２基に対するさらなる還元、及び種々の位置でのヒドロキシル化（複数のヒドロキシル化を含む）、及びまた塩、メチルエーテル及びグリコシドエーテル誘導体、ならびに酢酸及びそのようなヒドロキシル化化合物の没食子酸エステルを含む。
【００１５】
ブチルパラベンはブチル４−ヒドロキシベンゾエートである。フロリジンは、１−［２，４−ジヒドロキシ−６−［（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）−３，４，５−トリヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）オキサン−２−イル］オキシフェニル］−３−（４−ヒドロキシフェニル）プロパン−１−オン、即ち、フラボノイドグリコシドである。
【００１６】
フロレチンの誘導体は、例えば、陽イオンを伴う塩、エーテル、及びエステルである。特定の塩は、一、二、三、又は四価塩、例えば、アルカリ塩、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩又はカリウム塩、アルカリ土類塩、例えば、カルシウム塩又はマグネシウム塩、アルミニウム塩、遷移金属塩、例えば、第一鉄塩又は第二鉄塩、アンモニウム塩、例えば、アンモニウム塩、メチルアンモニウム塩、ジメチルアンモニウム塩、トリメチルアンモニウム塩、又はテトラメチル−アンモニウム塩、アルキルトリメチルアンモニウム塩であって、それにおいて、アルキルは、例えば、Ｃ２−Ｃ２０アルキル、特にＣ６−Ｃ２０アルキル、例えば  Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６、又はＣ１８アルキル、ヒドロキシエチルアンモニウム塩、ジ（ヒドロキシエチル）アンモニウム塩、又はトリ（ヒドロキシエチル）アンモニウム塩である。
【００１７】
特定のエーテルは、一、二、三、又は四価エーテル、例えば、メチル又はエチルエーテル、特にトリ及びテトラメチルエーテル、及びグリコシドである。特定のエステルは、一、二、三、又は四価エステル、例えば、アセチルエステル、特に、トリ及びテトラアセチルエステル、及び没食子酸エステルである。
【００１８】
ブチルパラベンの誘導体は、同様に、塩（例、ナトリウム塩）、エーテル（例、ブチル４−メトキシベンゾエート）、又はエステル（例、ブチル４−アセトキシベンゾエート）である。
【００１９】
フロリジンの誘導体は、同様に、塩（例、ナトリウム塩）、エーテル（例、メチル又はエチルエーテル）、又はエステル（例、酢酸）である。
【００２０】
フラボノイド又はカルコン（例えばフロレチンなど）は、植物界において広く分布するポリフェノールであり、ヒトにより通常消費される果物及び植物中に存在する。フロレチン及びその誘導体の一部が、強力な抗炎症活性、抗酸化活性、及びさらに一部の抗癌活性を有するとの最近の知見は、一般的なことわざ「一日一個のリンゴ、医者知らず」についての化学的基礎を形成する。フロレチンは、また、経皮薬物送達のための浸透エンハンサーとして（Auner B.G., Valenta C., Hadgraft J., 2003, J Control Release 89(2): 321-328; Valenta C., Cladera J., O’Shea P., Hadgraft J., 2001, J Pharm Sci 90(4): 485-492）及び外部損傷、例えばＵＶ照射（皮膚癌及び光による老化を誘発する）などに起因する皮膚防御減少酸化ストレスとして成功裏に評価されてきた。齧歯類における最近の試験では、フロレチンの皮膚投与が動物において全身的に広がること（Auner et al., loc. cit.）、及び、フロレチンがかなり短い半減期をインビボで有することが確認されている。上記の特徴の全てによって、フロレチンが高い代謝回転を伴う非毒性天然化合物であることが裏付けられ、それは、治療用トランスジーンの可逆的な経皮誘導のために理想的である。薬物の経皮及び局所送達ならびに分子の調節は、従来の経口又は注射ベースの投与を上回る利点（例えば利便性、改善された患者コンプライアンス、及び肝臓での初回通過効果の除去など）を提供する。しかし、大半の分子は、皮膚の優れたバリヤ特性のため、皮膚投与に適用可能ではなく、それは、浸透分子が、真皮乳頭層に達し、全身循環中へ毛細管壁を横断する前に、そのコンパクトな角質化細胞層を伴う角質層及び生きた表皮を通過することを必要とする。合成フロレチン応答性発現回路を持つ細胞インプラントを含むマウスの皮膚に置かれたフロレチン含有皮膚ローションは、動物において標的遺伝子発現を正確に微調整することができる。この先駆的な経皮転写制御システムによって、臨床的に許可を受けたデバイス中に含まれる細胞インプラントによりインサイチュで産生されるタンパク質医薬品の正確な患者制御投与が可能になる。この遺伝子治療に焦点を合わせたインビボの範囲でのフロレチン応答性トランスジーン発現の他、このシステムは、優れた調節性能（インビトロでの調整性及び可逆性を含む）を示す。培養中でのその短い半減期のため、バイオリアクター中で増殖させたフロレチン応答性産生培養物を、過剰なフロレチン濃度を用いた接種によるタイムリーな産生開始のために前もってプログラムすることができる。産生細胞培養物が増殖し、フロレチンレベルが正確な動態に従って減少し、産生を、定められた時間点で開始し、それは接種材料及び初期のフロレチン濃度の関数である。そのような時間遅延産生の概念は、特に、発現困難であるタンパク質治療法（増殖を損なう又は細胞傷害性であるものなど）のために貴重である。フロレチンが、ヒトにより通常消費され、皮膚ローション中での使用のために許可を受けている天然果物成分であるとの事実は、政府機関によるそのような生物医薬品製造プロトコールの承認を促す。
【００２１】
哺乳動物細胞培養に対するフロレチンの安定性及び影響。培養液中でのフロレチンの安定性を評価し、哺乳動物細胞に対するその影響を評価するために、標準的ChoMaster（登録商標）HTS培地を、増加濃度のフロレチン（０、２５、５０、７５、１００μM）を用いて添加し、この培地を、構成的ＳＥＡＰ発現のために操作されたＣＨＯ−Ｋ１（ｐＳＥＡＰ２−Ｃｏｎｔｒｏｌ；ＰＳＶ４０−ＳＥＡＰ−ｐＡ，Clontech）の存在及び非存在においてインキュベートする。４８時間後に培養物から採取されたサンプル中でのＳＥＡＰレベルは、フロレチンが異種タンパク質産生（代謝の完全性及び生存率についての主指標である）に対してネガティブな影響を有さないことを示す。生細胞密度の並行スコアリングによって、リンゴフラボノイドが、ＣＨＯ−Ｋ１増殖を１００μMまで損なわないことが確認される（図１）。６４時間の期間にわたり無細胞培養液中で決定されたフロレチンレベルによって、このフラボノイドについて機能的な半減期７０時間が確立される。
【００２２】
本発明は、トランスアクチベーションドメイン又はトランスリプレッサードメインに融合されたシュードモナス・プチダＤＯＴ−Ｔ１Ｅ由来の細菌リプレッサーＴｔｇＲの遺伝子コードを含むベクターに関する。さらに、本発明は、ＴｔｇＲ特異的オペレーター配列（ＯＴｔｇＲ）、プロモーター、及び内因性又は、好ましくは、外因性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００２３】
合成の哺乳動物フロレチン調整可能制御エレメント（ＰＥＡＣＥ）の設計。植物根圏中で生き、シュードモナス・プチダＤＯＴ−Ｔ１Ｅは、種々の植物由来の抗菌剤に対する耐性を進化させており、それは、その標的プロモーターのオペレーター（ＯＴｔｇＲ）からのＴｔｇＲタンパク質のフロレチン誘導性放出及び広く特異的なＴｔｇＡＢＣ排出ポンプの続く誘導により誘発される（Teran W. et al., loc. cit.）。ＴｔｇＲ（Teran W., et al., 2003, Antimicrob Agents Chemother 47(10): 3067-3072）をヘルペス単純由来のトランスアクチベーションドメインＶＰ１６（Triezenberg S.J., Kingsbury R.C., McKnight S.L., 1988, Genes Dev 2(6): 718-729）に融合させることにより、合成の哺乳動物トランスアクチベーター（ＴｔｇＡ１）を作製し、それは、最小ヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーター（ＰｈＣＭＶｍｉｎ）に連結されたＯＴｔｇＲを持つプロモーター（ＰＴｔｇＲ１）に結合し、それからの転写をフロレチン応答性様式で活性化する（図２Ａ及びＢ）。ＴｔｇＡ１特異的ＰＴｔｇＲ１駆動ＳＥＡＰ発現単位をコードする構成的ＴｔｇＡ１発現ベクターｐＭＧ１１（ＰＳＶ４０−ＴｔｇＡ１−ｐＡ）及びｐＭＧ１０（ＰＴｔｇＲ１−ＳＥＡＰ−ｐＡ）のコトランスフェクションは、構成的ＰＳＶ４０駆動ＳＥＡＰ発現カセットを含むアイソジェニックベクター（ｐＳＥＡＰ２−Ｃｏｎｔｒｏｌ；２１．４±１．０U/L）と比較し、高レベルＳＥＡＰ発現（２３．６±３．１U/L）をもたらす。ｐＭＧ１０及びｐＭＧ１１コトランスフェクトＣＨＯ−Ｋ１細胞の培養への増加濃度のフロレチン（０〜７０μM）の添加は、完全抑制までＳＥＡＰ発現の用量依存的な低下をもたらす（図２Ｃ）。これらのデータは、ＰＥＡＣＥ制御トランスジーン発現が、調整可能であり、非毒性フロレチン濃度の範囲内で完全抑制を可能にすることを示す。
【００２４】
特に、本発明は、ＴｔｇＲについての遺伝子コード、ヘルペス単純ウイルスのｖｐ１６トランスアクチベーションドメイン、及び構成的サルウイルス４０プロモーター（ＰＳＶ４０）を含み、タンパク質ＴｔｇＲとＶＰ１６との融合に起因するトランスアクチベーターＴｔｇＡ１がＰＳＶ４０の制御下にあるようになるベクターに関する。同様に、本発明は、ｐ６５トランスアクチベーションドメインに融合されたＴｔｇＲについての遺伝子コード及び構成的サルウイルス４０プロモーター（ＰＳＶ４０）を含むベクター（ＴｔｇＲとｐ６５との融合に起因するトランスアクチベーターＴｔｇＡ２がＰＳＶ４０の制御下にあるようになる）、及びｅ２ｆ４トランスアクチベーションドメインに融合されたＴｔｇＲについての遺伝子コード及び構成的サルウイルス４０プロモーター（ＰＳＶ４０）を含むベクター（ＴｔｇＲとＥ２Ｆ４との融合に起因するトランスアクチベーターＴｔｇＡ３がＰＳＶ４０の制御下にあるようになる）に関する。考慮されるさらなるトランスアクチベーションドメインは、ＧＡＬ４、ＣＴＦ／ＮＦ１、ＡＰ２、ＩＴＦ１、Ｏｃｔ１、及びＳｐＩに由来する又はそれに関連するドメイン、及び、また、米国特許第６，２８７，８１３号に列挙されるものである。
【００２５】
異なるフロレチン依存的トランスアクチベーター変異体の操作及びバリデーション。３つの異なるトランスアクチベーターを設計し、ＶＰ１６（ＴｔｇＡ１；ｐＭＧ１１、ＴｔｇＲ−ＶＰ１６）（Triezenberg S. J. et al., loc. cit.）、ｐ６５（ＴｔｇＡ２；ｐＭＧ１８、ＴｔｇＲ−ｐ６５）（Urlinger S., et al., 2000, Gene 247(1-2):103-110）、又はヒトＥ２Ｆ４（ＴｔｇＡ３；ｐＭＧ１９、ＴｔｇＲ−Ｅ２Ｆ４）（Akagi K., Kanai M., Saya H., Kozu T., Berns A., 2001, Nucleic Acids Res 29(4): e23）トランスアクチベーションドメインのいずれかを持つ。ｐＭＧ１１、ｐＭＧ１８、又はｐＭＧ１９を、ｐＭＧ１０（ＰＴｔｇＲ１−ＳＥＡＰ−ｐＡ）と、ＣＨＯ−Ｋ１、ＨＥＫ−２９３ならびに初代ヒト線維芽細胞及びケラチノサイト中にコトランスフェクトし、ＳＥＡＰ発現を、４８時間の培養後に、５０μMフロレチンの存在又は非存在においてプロファイル化する。最高レベルのトランスジーン産生は、異なるトランスアクチベーターの間で有意に変動する：ＴｔｇＡ１は、全ての細胞株において最も高いトランスアクチベーションを可能にし、ＴｔｇＡ２は、ヒト初代細胞において最良の性能を示し、ＴｔｇＡ３活性は、全ての状況において劣る（表１）。全てのトランスアクチベーターが、フロレチンが培地中に存在する場合、類似の基礎発現レベルを媒介するが、しかし、それらの細胞型特異性及び段階的な最高転写開始能力のため、３つのトランスアクチベーターが、定義された発現ウィンドウの選択を提供する。
【００２６】
【表１】
2012523220.tif 000004
ケラチノサイトＳＥＡＰ産生を、ｐＭＧ１０（ＰＴｔｇＲ１−ＳＥＡＰ−ｐＡ）及びｐＭＧ１１（ＰＳＶ４０−ＴｔｇＡ１−ｐＡ；ＴｔｇＲ−ＶＰ１６）、ｐＭＧ１８（ＰＳＶ４０−ＴｔｇＡ２−ｐＡ；ＴｔｇＲ−ｐ６５）又はｐＭＧ１９（ＰＳＶ４０−ＴｔｇＡ３−ｐＡ；ＴｔｇＲ−Ｅ２Ｆ４）のいずれかの一過性コトランスフェクション後４８時間目に定量化した。
ａ）検出不能
ｂ）ヒト初代線維芽細胞
ｃ）ヒト初代ケラチノサイト
【００２７】
本発明は、特に、最小ヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーター（ＰｈＣＭＶｍｉｎ）の５’に位置づけられたＴｔｇＲ特異的オペレーター配列（ＯＴｔｇＲ）、及び内因性又は、好ましくは、外因性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、ならびに、ＯＴｔｇＲがＰｈＣＭＶｍｉｎの５’末端に直接的に連結され、１〜２０塩基対、好ましくは２、４、又は１０塩基対がＯＴｔｇＲとＰｈＣＭＶｍｉｎの５’末端の間に挿入されているそのようなベクターに関する。
【００２８】
ＯＴｔｇＲと最小プロモーターの間の距離が異なるフロレチン応答性プロモーター変異体。オペレーター結合トランスアクチベーターと最小プロモーターの間のねじれ角及び距離は、転写開始機構の効率的な組み立てにおいて中心的な役割を果たす。ＰＴｔｇＲ配置のための最適な設計を達成することを目標に、２bp増加のリンカーを、０〜１０bpの範囲で、ＯＴｔｇＲとＰｈＣＭＶｍｉｎの間に操作し、ＳＥＡＰ発現ベクターを生成し、それは、ｐＭＧ１０（ＰＴｔｇＲ１、ｐＭＧ１０、ＯＴｔｇＲ−０ｂｐ−ＰｈＣＭＶｍｉｎ；ＰＴｔｇＲ２、ｐＭＧ２０、ＯＴｔｇＲ−２ｂｐ−ＰｈＣＭＶｍｉｎ；ＰＴｔｇＲ３、ｐＭＧ２１、ＯＴｔｇＲ−４ｂｐ−ＰｈＣＭＶｍｉｎ；ＰＴｔｇＲ４、ｐＭＧ２２、ＯＴｔｇＲ−６ｂｐ−ＰｈＣＭＶｍｉｎ；ＰＴｔｇＲ５、ｐＭＧ２３、ＯＴｔｇＲ−８ｂｐ−ＰｈＣＭＶｍｉｎ；ＰＴｔｇＲ６、ｐＭＧ２４、ＯＴｔｇＲ−１０ｂｐ−ＰｈＣＭＶｍｉｎ）とアイソジェニックである（以下の表４を参照のこと）。フロレチン応答性プロモーター変異体を持つＳＥＡＰ発現ベクターの各々を、ｐＭＧ１１（ＰＳＶ４０−ＴｔｇＡ１−ｐＡ）、ｐＭＧ１８（ＰＳＶ４０−ＴｔｇＡ２−ｐＡ）、又はｐＭＧ１９（ＰＳＶ４０−ＴｔｇＡ３−ｐＡ）と、ＣＨＯ−Ｋ１中にコトランスフェクトし、ＳＥＡＰ産生を、４８時間にわたる、０、２５、及び５０μMフロレチンを含む培地中での培養後にプロファイル化する（図３Ａ〜Ｃ）。ＯＴｔｇＲとＰｈＣＭＶｍｉｎの間に０bpを持つＰＴｔｇＲ１は、最高ＳＥＡＰ発現を駆動し、最も堅固な抑制を示す。ｐＭＧ２０、ｐＭＧ２１、及びｐＭＧ２４は、２、４、及び１０bpの増加を伴い、通常の性能を示す。しかし、６及び８bpの増加（ｐＭＧ２２及びｐＭＧ２３）は、最高トランスジーン発現及び抑制に対して強いネガティブな効果を有する。全てのプロモーター変異体が、類似のＴｔｇＡ特異的発現プロファイルを示し、トランスアクチベーター及びプロモーターの性能を非依存的に最適化することができることを示している（図３Ａ〜Ｃ）。
【００２９】
さらに、本発明は、トランスアクチベーションドメインに融合されたＴｔｇＲタンパク質をコードするポリヌクレオチド、内因性又は、好ましくは、外因性タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ＴｔｇＲ特異的オペレーター配列（ＯＴｔｇＲ）及びプロモーターを含むベクター、特に、プロモーターＰＴｔｇＲ１、トランスアクチベーターＴｔｇＡ１、及びさらにポリオウイルス内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳＰＶ）を含むベクターに関する。
【００３０】
自動調節フロレチン誘導性トランスジーン発現。古典的な２ベクター設計（別々のプラスミド上にコードされるトランスアクチベーター及び応答性プロモーター）に加えて、合成フロレチン制御回路の自己調節バージョンを構築し、それによって、単一ベクターフォーマットにおいてトランスアクチベーター（ＴｔｇＡ１）及びトランスジーン（ＳＥＡＰ）の同時ＰＴｔｇＲ１駆動発現が可能になる。ＣＨＯ−Ｋ１中でのｐＭＧ１３（ＰＴｔｇＲ１−ＳＥＡＰ−ＩＲＥＳＰＶ−ＴｔｇＡ１−ｐＡ）のトランスフェクションに続き、漏れやすいＰＴｔｇＲ１駆動転写物は、初期ＴｔｇＡ１のキャップ非依存的翻訳（ポリオウイルス内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳＰＶ）により媒介される）に導き、それは、自己調節ポジティブフィードバックループにおいて、コシストロン的にコードされるＳＥＡＰと共にＴｔｇＡ１の完全発現を誘発する。５０μMフロレチンの存在において、ポジティブフィードバックループが中断される。なぜなら、ＴｔｇＡ１はもはやＰＴｔｇＲ１に結合せず、ＳＥＡＰは完全に抑制されるからである（図４）。
【００３１】
ＰＥＡＣＥ制御と他のトランスジーン調節回路との適合性。ＰＥＡＣＥと、確立されたテトラサイクリン［ＴＥＴＯＦＦ；Gossen M., Bujard H., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89(12): 5547-5551］及びマクロライド［ＥＯＦＦ;Weber W., et al., 2002, Nat Biotechnol 20(9): 901-907］応答性発現回路との機能的な適合性を評価するために、ＣＨＯ−ＰＥＡＣＥ８を、ＴＥＴＯＦＦ（ｐＳＡＭ２００、ＰＳＶ４０−ｔＴＡ−ｐＡ；ｐＢＰ９９、ＰｈＣＭＶ＊−１−ＳＡＭＹ−ｐＡ）又はＥＯＦＦ（ｐＷＷ３５、ＰＳＶ４０−ＥＴ１−ｐＡ；ｐＢＰ１００、ＰＥＴＲ３−ＳＡＭＹ−ｐＡ）システム（テトラサイクリン及びエリスロマインにそれぞれ応答するバシラス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来の分泌αアミラーゼ（ＳＡＭＹ）を制御するために設定する）のいずれかを用いて、一過性にトランスフェクトする（フロレチン応答性ＳＥＡＰ発現についてトランスジェニックである）。ＳＥＡＰ及びＳＡＭＹ発現を、トランスフェクトされた集団の培養後４８時間目に、インデューサー分子（フロレチン、テトラサイクリン、エリスロマイシン）の存在（５０μM；２μg/mL）又は非存在においてスコア化する。交差調節の分析では、ＰＥＡＣＥ、ＴＥＴＯＦＦ、及びＥＯＦＦシステムの間に干渉が示されない（表２Ａ及びＢ）。
【００３２】
【表２】
2012523220.tif 000005
ＣＨＯ−ＰＥＡＣＥ８を、（Ａ）ｐＳＡＭ２００（ＰＳＶ４０−ｔＴＡ−ｐＡ）及びｐＢＰ９９（ＰｈＣＭＶ＊−１−ＳＡＭＹ−ｐＡ）又は（Ｂ）ｐＷＷ３５（ＰＳＶ４０−ＥＴ１−ｐＡ）及びｐＢＰ１００（ＰＥＴＲ３−ＳＡＭＹ−ｐＡ）を用いてコトランスフェクトし、４８時間にわたり、フロレチン（Ｐｈｌ、５０μM）、エリスロマイシン（ＥＭ、２μg/mL）、又はテトラサイクリン（Ｔｅｔ、２μg/mL）の存在及び非存在において、ＳＥＡＰ及びＳＡＭＹ産生を評価する前に増殖させた。
【００３３】
フロレチンならびに他のフラボノイド及びカルコンの調節性能。ＰプチダのＴｔｇＲタンパク質が、いくつかの植物由来フラボノイド及びカルコンと、高親和性で結合するとの事実に基づき（Teran W. et al., loc. cit.）、哺乳動物細胞におけるそれらのＰＥＡＣＥ制御能力が利用されてきた。ＣＨＯ−Ｋ１を、ｐＭＧ１０（ＰＴｔｇＲ１−ＳＥＡＰ−ｐＡ）及びｐＭＧ１１（ＰＳＶ４０−ＴｔｇＡ１−ｐＡ）（通常の性能をスコア化するため）を用いて、又は、ｐＳＥＡＰ２−Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＰＳＶ４０−ＳＥＡＰ−ｐＡ）（化合物関連の細胞毒性を評価するため）を用いて一過性に（コ）トランスフェクトし、次に、４８時間にわたり、異なる濃度（０、２５、５０μM）の特定のフラボノイド型化合物（ベルベリン、ブチルパラベン、ゲニステイン、ルテオリン、βナフトール、ナリンゲニン、フロレチン、フロリジン、又はクエルセチン）を含む培地中で、ＳＥＡＰ産生をプロファイル化する前に培養する（図５Ａ）。ゲニステイン、ルテオリン、βナフトール、ナリンゲニン、及びクエルセチンには、テストされた濃度範囲（ゲニステインは５０μMのみ）内で細胞毒性があるのに対し、ベルベリン、ブチルパラベン、フロリジン、及びフロレチンは細胞生存率を低下させない。しかし、ベルベリンはＰＥＡＣＥを制御せず、ブチルパラベンならびにフロリジンはＳＥＡＰ産生を調節できるが、しかし、完全には抑制しない（図５Ｂ）。従って、最高発現レベルならびに完全トランスジーン抑制を可能にするフロレチンが、好ましいＰＥＡＣＥインデューサーである。
【００３４】
本発明は、さらに、言及するベクターを含む哺乳動物細胞（記載するベクターを用いて安定的に又は一過性にトランスフェクトされている）、及びナノ容器又はマイクロ容器中の（例、カプセル化形態中の）そのような哺乳動物細胞に関する。ナノ容器は、ウイルス、好ましくは弱毒化ウイルス、特にウイルスカプシド、合成又は半合成ナノ又はマイクロ粒子、例えば、哺乳動物細胞を取り込むための適した形状の球又はチューブなど、及び、例えば、アルギン酸−ポリ−Ｌ−リジンを用いた哺乳動物細胞のカプセル化によりインサイチュで形成されるナノ又はマイクロ容器でありうる。適したナノ又はマイクロ容器の特定の例は、商標名CELLMAX（登録商標）の下で製造されたホロー・ファイバーである。本発明は、さらに、記載する哺乳動物細胞、特に、ナノ又はマイクロ容器中の哺乳動物細胞を含む哺乳動物（ヒトを除く）に関する。
【００３５】
フロレチン制御トランスジーン発現は、異なる哺乳動物細胞株及びヒト初代細胞において機能的である。その多用途性を実証するために、ＰＥＡＣＥをいくつかの不死化させた哺乳動物細胞株ならびにヒト初代細胞においてテストする。ｐＭＧ１０（ＰＴｔｇＲ１−ＳＥＡＰ−ｐＡ）及びｐＭＧ１１（ＰＳＶ４０−ＴｔｇＡ１−ｐＡ）を、ＢＨＫ−２１、ＣＯＳ−７、ＨａＣａＴ、ＨＥＫ−２９３、ＨＴ−１０８０、及びＮＩＨ／３Ｔ３細胞株中に、ならびに、初代ヒト線維芽細胞及びケラチノサイト中にコトランスフェクトし、４８時間にわたり、フロレチンの存在（５０μM）及び非存在において培養し、ＳＥＡＰレベルのスコア化が続く（表３）。ＰＥＡＣＥ制御トランスジーン発現は、全てのテストされた細胞株において機能的であり、この技術が広く適用可能であることを示す。
【００３６】
【表３】
2012523220.tif 000006
初代ヒトケラチノサイトＳＥＡＰ産生を、示した細胞株及び初代細胞中へのｐＭＧ１０（ＰＴｔｇＲ１−ＳＥＡＰ−ｐＡ）及びｐＭＧ１１（ＰＳＶ４０−ＴｔｇＡ１−ｐＡ）のコトランスフェクション後４８時間目に定量化した。
* 検出不能
【００３７】
安定なトランスジェニックＣＨＯ−Ｋ１細胞株におけるＰＥＡＣＥ制御トランスジーン発現の発現動態、調節性、及び可逆性。ＣＨＯ−Ｋ１中へのｐＭＧ１１及びｐＭＧ１０の連続トランスフェクション及びクローン選択により、５つのダブルトランスジェニック細胞株（ＣＨＯ−ＰＥＡＣＥ）が生成され、それらの全てがフロレチン調節ＳＥＡＰ発現を示すが、しかし、それらの全体的な調節性能は異なる（最高及び漏れやすい発現レベル；図６）。ＣＨＯ−ＰＥＡＣＥ８は、好ましい細胞株であり、（ｉ）６０日を超える長期培養における不変の最高ＳＥＡＰ発現レベル（０日、７０．９±３．１U/L；６０日、６７．６±２．７U/L）、（ｉｉ）優れた調節性（図７Ａ）、（ｉｉｉ）指数関数的なＳＥＡＰ発現動態（図７Ｂ）、（ｉｖ）トランスジーン発現の完全可逆性（図７Ｃ）、及び（ｖ）他のトランスジーン調節回路との最適な適合性を示す（表２）。
【００３８】
プロトタイプ生物医薬品製造シナリオにおける産物遺伝子発現の時間遅延誘導。フロレチンは非毒性果物成分であるため、それは、生物医薬品製造シナリオのための理想的な産物インデューサーであり、それは、発現困難なタンパク質医薬品の正確なタイミング又は投与を必要とする。また、フロレチンは、決定された半減期７０時間を哺乳動物細胞培養システムにおいて有するため、任意の産生培養をプログラムし、産物遺伝子発現を、事前に定められた時間点で、フロレチン濃度が抑制閾値レベル未満に降下する際に開始することができる。１Ｌ  BioWave（登録商標）バイオリアクターを、２×１０３個のＣＨＯ−ＰＥＡＣＥ８及び異なるトランスジーン抑制フロレチン用量（６０、８０、又は１００μM）を用いて接種する。ＣＨＯ−ＰＥＡＣＥ８は、バイオプロセスの開始から指数関数的に増殖するが、ＳＥＡＰ産生は、一旦、フロレチンが非抑制レベルまで分解される場合、徐々に増加する（４０μM；図８）。ＰＥＡＣＥを使用し、哺乳動物産生培養を、実際に、任意のプロセス介入を伴わずに、産物遺伝子発現のタイムリーな誘導のためにプログラムすることができる。
【００３９】
マウスにおける皮下インプラント中でのフロレチン媒介性の経皮遺伝子発現。フロレチンは、経皮薬物送達のための浸透エンハンサーとして示唆されており、局所的な皮膚ベース投与に続いて、齧歯類において全身的に伝播されることが示されているため（Auner B.G. et al., loc. cit.）、フロレチンは、潜在的な経皮的治療用トランスジーン発現インデューサーとして評価されてきた。ＣＨＯ−ＰＥＡＣＥ８を、干渉性アルギン酸−ＰＬＬ−アルギン酸中にマイクロカプセル化し、マウス中に皮下移植する。処置マウスの背中を部分的に剪毛し、異なる量のフロレチン（０〜４２mg）を含むワセリンベースのスキンローション（２００μL）を毎日塗る。移植後７２時間目に処置マウスにおいて検出されたＳＥＡＰレベルは、培養され、インビトロでフロレチンに曝露された同じマイクロカプセル化インプラントバッチで観察されたものと類似のフロレチン依存的な用量反応特徴を示す（図９Ａ及びＢ）。構成的ＳＥＡＰ発現についてトランスジェニックであるＣＨＯ−Ｋ１細胞を受けたコントロールマウスは、フロレチン含有スキンローションを用いた任意の処置に対して非感受性である（０mgフロレチン：６．２±０．４３U/L；４２mgフロレチン：６．０２±０．５８U/L）。
【００４０】
本発明は、さらに、トランスリプレッサードメインに融合されたシュードモナス・プチダＤＯＴ−Ｔ１Ｅ由来の細菌リプレッサーＴｔｇＲについての遺伝子コードを含むベクター、特に、ＴｔｇＲについての遺伝子コードならびにヒトＫｒｕｐｐｅｌ関連ボックスタンパク質のｋｒａｂトランスリプレッションドメイン及び構成的サルウイルス４０プロモーター（ＰＳＶ４０）を含み、タンパク質ＴｔｇＲとＫＲＡＢとの融合に起因するトランスレプレッサーＴｔｇＫがＰＳＶ４０の制御下にあるようになるそのようなベクターに関する。考慮される他のトランスリプレッサードメインは、例えば、ｖ−ｅｒｂＡオンコジーン産物、甲状腺ホルモン受容体、Ｓｓｎ６／Ｔｕｐ１タンパク質複合体、ＳＩＲＩタンパク質、ＮｅＰ１、ＴＳＦ３、ＳＦ１、ＷＴ１、Ｏｃｔ−２．１、Ｅ４ＢＰ４、及びＺＦ５、ならびに、また、米国特許第６，２８７，８１３号に列挙されるものに由来する又はそれらに関連するドメインである。同様に、本発明は、トランスレプレッサードメインに融合されたＴｔｇＲタンパク質、外因性タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ＴｔｇＲ特異性オペレーター配列（ＯＴｔｇＲ）、及びプロモーターを含むベクターに関する。
【００４１】
ポジティブ調節のためのＰＥＡＣＥシステムの設計（ＰＥＡＣＥ−ＯＮ）。ＴｔｇＲをヒトＫｒｕｐｐｅｌ関連ボックスタンパク質（ＫＲＡＢ）（Moosmann P., Georgiev O., Thiesen H.J., Hagmann M., Schaffner W., 1977, Biol Chem 378(7): 669-677）に融合することにより、合成の哺乳動物トランスリプレッサー（ＴｔｇＫ）を作製し、それは、構成的サルウイルス４０プロモーター（ＰＳＶ４０）の３’に位置づけられる８つのＯＴｔｇＲエレメントを持つプロモーター（ＰＴｔｇＲＯＮ）に結合し、そこからの転写をフロレチン応答様式で阻害することができる（図１０Ａ及びＢ）。構成的ＴｔｇＫ発現ベクターｐＭＧ２８（ＰＳＶ４０−ＴｔｇＫ−ｐＡ）及びｐＭＧ２７（ＰＴｔｇＲＯＮ−ＳＥＡＰ−ｐＡ）（ＴｔｇＫ特異的ＰＴｔｇＲＯＮ駆動ＳＥＡＰ発現単位をコードする）のコトランスフェクションは、低レベルの基礎ＳＥＡＰ発現をもたらす（２．３±０．２６U/L）。ｐＭＧ２７及びｐＭＧ２８コトランスフェクトＣＨＯ−Ｋ１細胞の培養への増加濃度のフロレチン（０〜５０μM）の添加は、ＳＥＡＰ発現の用量依存的な誘導をもたらした（図１０Ｃ）。これらのデータは、ＰＥＡＣＥ制御トランスジーン発現が、フロレチンの添加により抑制される（ＰＥＡＣＥシステムを参照のこと。図２Ａ〜Ｃ）、又は、ＰＥＡＣＥ−ＯＮセットアップに示される通りに誘導されることを示す（図１０Ａ〜Ｃ）。システムの基礎発現（漏れ性）を低下させるために、漏れ性を低下させるための共役させた転写及び翻訳戦略を用いることができる。（ｉ）異なる構成的プロモーターの配置；（ｉｉ）プロモーターの３’方向でのオペレーター配列（ＯＴｔｇＲ）の数における変動（１〜１２のＯＴｔｇＲリピート）及び／又は構成的プロモーターの５’方向でのオペレーター配列の付加（１〜１２のＯＴｔｇＲリピート）；（ｉｉｉ）シストロンｓｉＲＮＡを介した特異的にタグ付けされた目的の遺伝子（ｇｏｉ）の媒介性ノックダウン。
【００４２】
実施例
発現ベクターの設計ｐＭＧ１０（ＰＴｔｇＲ１−ＳＥＡＰ−ｐＡ）は、フロレチン応答性ＳＥＡＰ発現単位を持ち、ｐＭＧ１１（ＰＳＶ４０−ＴｔｇＡ１−ｐＡ）は、フロレチン依存的トランスアクチベーターの構成的発現をコードする。発現ベクターの設計及び使用されるプラスミドに関する詳細情報を、以下の表４に提供する。
【００４３】
【表４】
2012523220.tif 000007
2012523220.tif 000008
参考文献：（ａ）Weber W., Kramer B.P., Fux C., Keller B., Fussenegger M., 2002, J Gene Med 4(6): 676-686.（ｂ）Weber W., et al., 2002, Nat Biotechnol 20(9): 901-907.（ｃ）Fussenegger M., Moser S., Mazur X., Bailey J.E., 1997, Biotechnol Prog 13(6): 733-740. （ｄ）Moser S., et al., 2001, J Gene Med 3(6): 529-549.（ｅ）Clontech, Palo Alto, CA, USA.（ｆ）Schlatter S., Rimann M., Kelm J., Fussenegger M., 2002, Gene 282(1-2): 19-31.（ｇ）Picoscript, Houston, TX, USA.
【００４４】
略称：Ｅ２Ｆ４、ヒトＥ２Ｆ転写因子４のトランスアクチベーションドメイン；ＥＴ１、マクロライド依存的トランスアクチベーター（Ｅ−ＶＰ１６）；ＥＴ２、マクロライド依存的トランスアクチベーター（Ｅ−ｐ６５）；ＥＴ３、マクロライド依存的トランスアクチベーター（Ｅ−Ｅ２Ｆ４）；ＥＴＲ、マクロライド依存的トランスアクチベーターに特異的なオペレーター；ＩＲＥＳＰＶ、ポリオウイルス内部リボソーム進入部位；ＮＦ−κＢ、ヒト転写因子；ＯＴｔｇＲ、ＴｔｇＲ特異的オペレーター；ｐ６５、ＮＦ−κＢのトランスアクチベーションドメイン；ｐＡ、ポリアデニル化部位；ＰＥＴＲ３−９、ＥＴＲとＰｈＣＭＶｍｉｎの間に異なるスペーサーを含むマクロライド応答性プロモーター；ＰｈＣＭＶ、ヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーター；ＰｈＣＭＶｍｉｎ、最小ＰｈＣＭＶ；ＰｈＣＭＶ＊−１、テトラサイクリン応答性プロモーター；ＰＰＩＲ３、ストレプトグラミン応答性プロモーター；ＰＳＶ４０、サルウイルス４０プロモーター；ＰＴｔｇＲ１−６、ＯＴｔｇＲとＰｈＣＭＶｍｉｎの間に異なるスペーサーを含むフロレチン応答性プロモーター；ＳＥＡＰ、ヒト胎盤分泌アルカリホスファターゼ；ＳＡＭＹ、バシラス・ステアロサーモフィラス由来の分泌αアミラーゼ；ＴｔｇＲ、シュードモナス・プチダＤＯＴ−Ｔ１Ｅ  ＡＢＣ多剤排出ポンプのリプレッサー；ＴｔｇＡ１、フロレチン依存的トランスアクチベーター（ＴｔｇＲ−ＶＰ１６）；ＴｔｇＡ２、フロレチン依存的トランスアクチベーター（ＴｔｇＲ−ｐ６５）；ＴｔｇＡ３、フロレチン依存的トランスアクチベーター（ＴｔｇＲ−Ｅ２Ｆ４）；ＶＰ１６、ヘルペス単純ウイルス由来トランスアクチベーションドメイン。
【００４５】
細胞培養及びトランスフェクション。野生型チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１、ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−６１）及びその派生体を標準的培地中で培養する：５%（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（FCS,PAN Biotech GmbH, Aidenbach, Germany, Cat. No. 3302, Lot No.P251110）及び１%（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（Sigma, St Louis, MO, USA, Cat. No.P4458）を添加したChoMaster（登録商標）HTS（Cell Culture Technologies, Gravesano, Switzerland）。ヒト胚性腎臓細胞（HEK-293, Mitta B., et al., 2002, Nucleic Acids Res 30(21): e113）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＣＯＳ−７，  ＡＴＣＣ：  ＣＲＬ−１６５１）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ−２１，  ＡＴＣＣ：  ＣＣＬ１０）、ヒト線維肉腫細胞（ＨＴ−１０８０，  ＡＴＣＣ：  ＣＣＬ−１２１）、ヒトケラチノサイト細胞株ＨａＣａＴ（Boukamp P., et al., 1988, J Cell Biol 106(3): 761-771）、及びマウス線維芽細胞（ＮＩＨ／３Ｔ３，  ＡＴＣＣ：  ＣＲＬ−１６５８）を、１０%  ＦＣＳ（ｖ／ｖ）及び１%（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシン溶液を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Invitrogen,Cat. No. 52100-39）中で培養する。初代ヒト包皮線維芽細胞を、２０%  ＦＣＳ（ｖ／ｖ）及び１%（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシン溶液を添加したＤＭＥＭ中で培養し、初代ヒト包皮ケラチノサイトを、化学的に定義された無血清ケラチノサイト培地（Invitrogen, Cat. No. 10744019）中で培養する。全ての細胞型を、３７℃で、５%  ＣＯ２含有加湿空気中で培養する。ＣＨＯ−Ｋ１の一過性トランスフェクションのために、１μgの全プラスミドＤＮＡ（等量の各プラスミドのコトランスフェクションのため）を、２４ウェルプレートの１ウェル当たり５０，０００個の細胞中に、最適化されたリン酸カルシウムプロトコール（Greber D., Fussenegger M., 2007, Biotechnol Bioeng 96(5): 821-834）に従いトランスフェクトする。プラスミドＤＮＡを、全容積２５μLの０．５M  ＣａＣｌ２溶液に希釈させ、それを、２５μLの２×ＨＢＳ溶液（５０mM  ＨＥＰＥＳ、２８０mM  ＮａＣｌ、１．５mM  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ  ７．１）と混合する。１５分間にわたる室温でのインキュベーション後、沈殿物を直ぐにウェルに加え、細胞上で遠心し（１，２００ｘｇで５分間）、トランスフェクション効率を増加させる。３時間後、細胞を０．５mLのグリセロール溶液（１５%グリセロールを含むChoMaster（登録商標）HTS培地）を用いて６０秒間にわたり処理する。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ダルベッコのリン酸緩衝食塩水；Invitrogen, Cat. No. 21600-0069）を用いた１回の洗浄後、細胞を、０．５mLの標準的なChoMaster（登録商標）HTS培地中で、異なる濃度のフロレチンの存在又は非存在において培養する。ＢＨＫ−２１、ＣＯＳ−７、及びＨＥＫ−２９３のトランスフェクションのために、プラスミドＤＮＡ−Ｃａ２ＰＯ４沈殿物を調製し、細胞に適用する（上に記載する通り）。ＨＥＫ−２９３及びＣＯＳ−７細胞を、ＤＮＡ−Ｃａ２ＰＯ４沈殿物を用いた３時間のインキュベーション後にＰＢＳを用いて１回洗浄し、続いて、標準的ＤＭＥＭ中で培養し、ＢＨＫ−２１細胞を、沈殿物を用いて一晩インキュベートし、次に、ＰＢＳを用いて１回洗浄した後、ＤＭＥＭ培地中で培養する。ＨａＣａＴ、ＨＴ−１０８０、ＮＩＨ／３Ｔ３ならびに初代ヒト線維��細胞及びケラチノサイトを、Fugene（商標）6（Roche Diagnostics AG, Basel, Switzerland, Cat. No. 11814443001）を用いて、製造者のプロトコールに従ってトランスフェクトし、上で特定する細胞培養液中で培養する。トランスフェクション後、全ての細胞を、異なる濃度のフロレチンを添加したＤＭＥＭ中で培養し、レポータータンパク質レベルをトランスフェクションから４８時間後にプロファイル化する（別に示さない場合）。
【００４６】
安定細胞株の構築。安定ＣＨＯ−ＰＥＡＣＥ８細胞株（フロレチン制御ＳＥＡＰ発現についてトランスジェニックである）を２ステップで構築する：（ｉ）ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、ｐＭＧ１１（ＰＳＶ４０−ＴｔｇＡ１−ｐＡ）及びｐＳＶ２ｎｅｏ（Clontech, Cat. No. 6172-1）を比率２０：１でコトランスフェクトし、クローン選択は細胞株ＣＨＯ−ＴｔｇＡをもたらす。（ｉｉ）ＣＨＯ−ＴｔｇＡを、ｐＭＧ１０（ＰＴｔｇＲ１−ＳＥＡＰ−ｐＡ）及びｐＰｕｒ（Clontech, Cat. No. 6156-1）（比率２０：１）を用いてコトランスフェクトし、フロレチン応答性ＳＥＡＰ産生ダブルトランスジェニック細胞株ＣＨＯ−ＰＥＡＣＥ８をクローン選択後に選ぶ。ＣＨＯ−ＰＥＡＣＥ８のフロレチン依存的な用量反応特徴を、１００，０００個細胞/mLを、４８時間にわたり、標準的ChoMaster（登録商標）HTS培地中で、異なるフロレチン濃度（０〜７０μMの範囲）で培養することにより分析する。フロレチン媒介性ＳＥＡＰ産生の可逆性を、ＣＨＯ−ＰＥＡＣＥ８（１００，０００個細胞/mL）を１４４時間にわたり培養することにより評価し、フロレチン濃度を０〜５０μMで４８時間ごとに変える。
【００４７】
レポータータンパク質産生の定量化。ヒト胎盤分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の産生を、ｐ−ニトロフェニルリン酸ベースの光吸収を使用して経時的に定量化する。バシラス・ステアロサーモフィラス由来の分泌αアミラーゼ（ＳＡＭＹ）レベルを、ブルースターチPhadebas（登録商標）アッセイ（Pharmacia Upjohn, Peapack, NJ, USA; Cat. No. 10-5380-32）を使用して評価する（Schlatter S., Rimann M., Kelm J., Fussenegger M., 2002, Gene 282(1-2): 19-31）。
【００４８】
インビボ方法。ＣＨＯ−ＰＥＡＣＥ８及びＣＨＯ−ＳＥＡＰ１８（Fluri D.A., Kemmer C., Daoud-El Baba M., Fussenegger M., 2008, J Control Release 131(3): 211-219）を、アルギン酸−ポリ−（Ｌ−リジン）−アルギン酸ビーズ（４００μM；２００個細胞／カプセル）中に、Inotech Encapsulator Research IE-50R（Recipharm, Basel, Switzerland）を使用して、製造者の指示及び以下のパラメーターに従ってカプセル化する：０．２mmノズル、２０mLシリンジ（流速４０５単位）、ノズル振動数１０２４Hz、及び９００V（ビーズ分散用）。雌ＯＦ１マウス（oncins France souche 1, Charles River Laboratories, France）の背中を剪毛し、３００μLのChoMaster（登録商標）HTS（２×１０６個のカプセル化ＣＨＯ−ＰＥＡＣＥ８を含む）を皮下注射する。コントロールマウスを、マイクロカプセル化ＣＨＯ−Ｋ１を用いて注射する。剪毛によって、フロレチン含有クリームと動物の皮膚との直接接触が確実となる。移植後１時間目、２００μＬのフロレチン含有クリームを、注射部位の周辺の皮膚に適用する。クリーム中のフロレチン量は０〜４２mgの範囲である。クリームを、１日１回、最長３日間にわたり適用する。その後、マウスを屠殺し、血液サンプルを回収し、ＳＥＡＰレベルを血清（製造者（Beckton Dickinson, Plymouth, UK）の指示に従い、ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ  ＳＳＴチューブを使用して単離される）中で定量化する。マウスを含む全ての実験を、European Community Councilの指令（８６／６０９／ＥＥＣ）に従って実施する。
【００４９】
バイオリアクター操作。ＣＨＯ−ＰＥＡＣＥ８（２×１０３個細胞/mLの接種材料）を、１L培養の最適ｐＨ及びＤＯ制御について最適化された２Ｌ  Wave Bag（登録商標）を備えたBioWave 20SPS-Fバイオリアクター（Wave Biotech AG, Tagelswangen, Switzerland）中で培養する。バイオリアクターを、ロッキング速度１５分−１、ロッキング角度６°、及びエアレーション速度１００mL/分で操作し、入り口ガス加湿（HumiCare（登録商標）200, Gruendler Medical, Freudenstadt, Germany）を伴い、培地の蒸発を予防する。培地（ChoMaster（登録商標）HTS、５%  ＦＣＳ、１%ペニシリン／ストレプトマイシン）に、６０、８０、又は１００μMフロレチンを添加する。
【００５０】
インデューサー化合物及びスキンローションの製剤化。ベルベリン（Acros, Geel, Belgium, Cat. No. 20425-0100）及びルテオリン（Alfa Aesar, Karlsruhe, Germany, Cat. No. L14186）を、１：５（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ／Ｈ２Ｏ中の１０mMストック溶液として調製する。ブチルパラベン（ABCR, Karlsruhe, Germany, Cat. No. AV14043）、ゲニステイン（Axonlab, Baden, Switzerland, Cat. No. A2202.0050）、βナフトール（Sigma, Cat. No. 185507）、ナリンゲニン（Sigma, Cat. No. N5893）、フロレチン（Sigma, Cat. No. P7912）、フロリジン（Sigma, Cat. No. P3449）、及びケルセチン（Sigma, Cat. No. Q0125）を、ＤＭＳＯ中の５０ｍＭストック溶液として調製し、最終濃度５０μMで使用する（別に示さない場合）。ワセリンベースのフロレチン含有クリームが専門的に製剤化され（Pharmacy Hoengg Ltd., Zurich, Switzerland）、２５、１２．５、６．２５、及び３．１２５%（ｗｔ／ｗｔ）のフロレチンを含む。２００μlのスキンローションを、マウス１匹当たり及び処置１回当たりに局所的に適用し、それは、用量当たりのそれぞれの全フロレチン量４２、２１、１０．５、及び５．２５mgに相当する。テトラサイクリン（Sigma, Cat. No. T7660）をＨ２Ｏ中の１mg/mLストック溶液として、エリスロマイシン（Fluka, Buchs, Switzerland, Cat. No. 45673）をエタノール中の１mg/mLストック溶液として調製する。両方の抗生物質を最終濃度２μg/mLで使用する。
【００５１】
細胞培養液中のフロレチンを定量化するために、サンプルを５×１０４個のＣＨＯ−ＰＥＡＣＥ８に加え、ＳＥＡＰ定量化前に、４８時間にわたりインキュベートする。フロレチンレベルを、ＳＥＡＰ産生を較正曲線（図７Ａ）（同じパラメーター及び定義されたフロレチン濃度を使用して確立する）と比較することにより算出する。同様に、フロレチンの半減期を、細胞培養において観察される分解動力学に基づいて推定する。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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