【手続補正書】
【提出日】平成22年9月2日(2010.9.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
一実施態様によると、モノクローナル抗体は図３４の軽鎖配列を含む。他の実施態様によると、モノクローナル抗体は完全長ＩｇＧである。
本発明の一実施態様によると、第一アミノ酸配列のＸ１はＳである。本発明の他の実施態様によると、第一アミノ酸配列のＸ２はＧである。本発明のさらに他の実施態様によると、第一アミノ酸配列のＸ３はＳである。一実施態様によると、第一アミノ酸配列はＴＩＳＧＳＤ（配列番号：８）、ＴＩＴＮＳＤ（配列番号：１１）及びＴＩＳＧＳＷ（配列番号：１７）からなる群から選択される配列である。
本発明の更なる他の実施態様によると、配列番号：１１５のＸ３はＳ又はＡである。本発明の更なる他の実施態様によると、配列番号：１１５のＸ４はＹである。本発明の更なる他の実施態様によると、配列番号：１１５のＸ５はＧ又はＡである。本発明の更なる他の実施態様によると、配列番号：１１５のＸ６はＮ又はＡである。本発明の一実施態様によると、配列番号：１１５はＧＲＩＳＰＹＧＧＮＴＮ（配列番号：９）、ＡＴＩＹＰＹＧＧＹＴＹ（配列番号：１２）及びＡＷＩＡＰＹＳＧＡＴＤ（配列番号：１８）からなる群から選択される配列である。
本発明の一実施態様によると、配列番号：１１６のＸ１はＡである。本発明の他の実施態様によると、配列番号：１１６のＸ２はＲである。本発明の更なる他の実施態様によると、配列番号：１１６のＸ４はＬ又はＭである。本発明の好ましい一実施態様によると、Ｘ５−Ｘ８にある芳香族アミノ酸はトリプトファン残基である。他の実施態様によると、Ｘ５−Ｘ８のうちの一アミノ酸は欠損している。本発明のさらに他の実施態様によると、配列番号：１１６のＸ９はＦである。本発明の一実施態様によると、配列番号：１１６のＸ１０はＤである。本発明の一実施態様によると、配列番号：１１６のＸ１１はＹである。一実施態様によると、配列番号：１１６はＣＡＲＶＧＧＬＫＬＬＦＤＹ（配列番号：１０）、ＣＡＲＧＧＧＭＤＧＹＶＭＤＹ（配列番号：１３）及びＣＡＲＥＧＧＬＹＷＶＦＤＹ（配列番号：１９）からなる群から選択される配列である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
本発明の抗体は、（ａ）配列ＴＩＳＧＳＤ（配列番号：８）を含む第一アミノ酸配列；（ｂ）配列ＧＲＩＳＰＹＧＧＮＴＮ（配列番号：９）を含む第二アミノ酸配列；及び（ｃ）配列ＣＡＲＶＧＧＬＫＬＬＦＤＹ（配列番号：１０）を含む第三アミノ酸配列、又は該抗体の変異型を含みうる。あるいは、本発明の抗体は、（ａ）配列ＴＩＴＮＳＤ（配列番号：１１）を含む第一アミノ酸配列；（ｂ）配列ＡＴＩＹＰＹＧＧＹＴＹ（配列番号：１２）を含む第二アミノ酸配列；及び（ｃ）配列ＣＡＲＧＧＧＭＤＧＹＶＭＤＹ（配列番号：１３）を含む第三アミノ酸配列、又は該抗体の変異型を含みうる。あるいは、本発明の抗体は、（ａ）配列ＴＩＳＧＳＷ（配列番号：１７）を含む第一アミノ酸配列；（ｂ）配列ＡＷＩＡＰＹＳＧＡＴＤ（配列番号：１８）を含む第二アミノ酸配列；及び（ｃ）配列ＣＡＲＥＧＧＬＹＷＶＦＤＹ（配列番号：１９）を含む第三アミノ酸配列、又は該抗体の変異型を含みうる。あるいは、本発明の抗体は、（ａ）配列ＴＩＳＮＹＧ（配列番号：２０）を含む第一アミノ酸配列；（ｂ）配列ＧＲＩＳＰＳＮＧＳＴＹ（配列番号：２１）を含む第二アミノ酸配列；及び（ｃ）配列ＣＡＫＣＳＶＲＦＡＹ（配列番号：２２）を含む第三アミノ酸配列、又は該抗体の変異型を含みうる。あるいは、本発明の抗体は、（ａ）配列ＴＩＮＮＹＤ（配列番号：１４）を含む第一アミノ酸配列；（ｂ）配列ＧＹＩＳＰＰＳＧＡＴＹ（配列番号：１５）を含む第二アミノ酸配列；及び（ｃ）配列ＣＡＲＭＶＧＭＲＲＧＶＭＤＹ（配列番号：１６）を含む第三アミノ酸配列、又は該抗体の変異型を含みうる。
更なる実施態様では、上記の第一、第二及び第三アミノ酸配列はヒト重鎖に位置し、第一アミノ酸配列がカバットナンバリングシステムに従って、重鎖２８−３３残基内にあり、第二アミノ酸配列がカバットナンバリングシステムに従って重鎖４９−５８残基内にあり、第三アミノ酸配列がカバットナンバリングシステムに従って９２−１０２残基内にあるものである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
【図１】多種多様な種 ― ヒト（配列番号：３）、マウス（配列番号：４）、メダカ（配列番号：５）、ゼブラフィッシュ（配列番号：６）及びニワトリ（配列番号：７）―からのＳＴＯＰ−１をコードするアミノ酸配列の整列を示す。また、コンセンサス配列を提供する。矢印はシグナル配列切断部位を示す。赤は全ての種において保存される残基を示す。コンセンサス配列中の大文字は、全ての種にわたって保存された残基を示す。コンセンサス配列中の小文字は、大部分の種において保存される残基を示す。それらの種に保存されていない残基を「ピリオド．」で示す。「！」はＩ又はＶを示す。「＄」はＬ又はＭを表す。「％」がＦ又はＹを表す。「＃」はＢ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｑ又はＺを示す。
【図２】ヒトＳＴＯＰ−１のアミノ酸配列を示す（配列番号：３）。シグナル配列を囲みのアミノ酸で示す。三重らせん体領域を下線で示す。グリコシル化部位はアミノ酸１８６である。
【図３】（Ａ）特定の組織型に存在するヒトＳＴＯＰ−１のｍＲＮＡ、及び（Ｂ）マウス発生の異なる段階から得たマウスＳＴＯＰ−１のｍＲＮＡを示す。完全長ヒト又はマウスＳＴＯＰ−１のＤＮＡは、放射性同位元素で識別して、成人のヒト又は発生中のマウス胚の組織のノーザンブロットのプローブに用いた。
【図４】（Ａ）ＣＨＯ−ＤＰ１２又は（Ｂ）ＣＨＯ−ｐｓｇｂ（ＡＴＣＣ）細胞によって生成され、ｎｉｃｋｅｌ−ＮＴＡ親和性クロマトグラフィによって精製されたヒトＳＴＯＰ−１タンパク質のクーマシー染色を示す。ベクター（ｐＲＫ５）は対照として用いた。
【図５】一過性の形質移入ＣＨＯ−ｐｓｇｂ細胞の（Ａ）上澄み及び（Ｂ）細胞溶解物中に存在するヒトヒスチジン標識ＳＴＯＰ−１タンパク質のウェスタンブロットを示す。ウェスタンブロットは抗ｈｉｓ抗体でプローブした。
【図６】ＳＦ９昆虫細胞のバキュロウイルス感染系を用いて発現させたヒトＳＴＯＰ−１タンパク質のオリゴマー化を示す。ＳＴＯＰ−１タンパク質及び多様な欠損突然変異型がＳＦ９細胞で発現され、サイズ排除カラムで分離し、光分散分析の対象とした、例えば（Ａ）Ｓ３１−Ｋ２４３、（Ｂ）Ｅ８９−Ｋ２４３及び（Ｃ）Ｌ９４−Ｋ２４３。モノマーの予測される分子量を、各グラフの左角に示す。いくつかのピークの隣に示す数は、ピークにある複合体の平均分子量を意味する。
【図７】哺乳動物細胞から発現されたヒトＳＴＯＰ−１タンパク質のオリゴマー化を示す。ヒトＳＴＯＰ−１タンパク質及び多様な欠損突然変異型がＣＨＯ細胞で発現され、サイズ排除カラムで分離し、光分散分析の対象とした、例えば（Ａ）Ｍ１−Ｋ２４３及び（Ｂ）デルタ−ＴＨＤ（残基１−５４、９４−２４３、及びヒスチジンタグ）。モノマーの予測される分子量を、各グラフの左角に示す。いくつかのピークの隣に示す数は、ピークにある複合体の平均分子量を意味する。非還元条件下で、ＣＨＯ−ｐｓｇｂ細胞で組み換えられて発現された分泌型のｈｉｓ標識した完全長ヒトＳＴＯＰ−１タンパク質のウェスタンブロットは、大部分がホモダイマー化した複合体であることを示した（Ｃ）。ウェスタンブロットは抗ｈｉｓ抗体でプローブした。
【図８】ヒトのｈｉｓ標識したＳＴＯＰ−１ＷＴ、デルタ−ＴＨＤ、及びデルタ−デルタ−ＴＨＤ  ＳＴＯＰ−１（残基１−５４、９４−２４３、及びヒスチジンタグ）を発現するＣＨＯ−ｐｓｇｂ細胞の（Ａ）細胞培養液及び（Ｂ）全細胞溶解物のウェスタンブロットを示し、還元及び非還元状態を対象とした。ウェスタンブロットは抗ｈｉｓ抗体でプローブした。
【図９】ｈｉｓ標識したＷＴ、Ｇ５３Ａ、及びＮ１８６Ａ  ＳＴＯＰ−１コンストラクトを発現するＣＨＯ−ｐｓｇｂ細胞の（Ａ）細胞培養液及び（Ｂ）全細胞溶解物のウェスタンブロットを示し、還元及び非還元状態を対象とした。ウェスタンブロットは抗ｈｉｓ抗体でプローブした。
【図１０】ｈｉｓ標識したＷＴ、Ｃ５５Ａ、Ｃ９３Ａ、及びＣ１０９Ａ  ＳＴＯＰ−１コンストラクトを発現するＣＨＯ−ｐｓｇｂ細胞の（Ａ）細胞培養液及び（Ｂ）全細胞溶解物のウェスタンブロットを示し、還元及び非還元状態を対象とした。ウェスタンブロットは抗ｈｉｓ抗体でプローブした。
【図１１】マウスＳＴＯＰ−１ｍＲＮＡ（ｍＳＴＯＰ−１ｍＲＮＡ）がＭＭＴＶ−ＷＮＴ１トランスジェニックマウス由来の胸部腫瘍に発現し、正常な哺乳動物内皮細胞では発現していないことを示す。ＲＮＡ試料は、胸部腫瘍細胞（「Ｔ１」−「Ｔ７」で示す）又はＣ５７Ｍｇマウス正常哺乳動物内皮細胞（「Ｎ」で示す）から採取し、ｍＳＴＯＰ−１プライマーとｍＲＬＰ１９プライマーでＲＴ−ＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物はアガロースゲル上にて分離した。
【図１２】（Ａ）ヒトＳＴＯＰ−１又は（Ｂ）マウスＳＴＯＰ−１を形質移入した後の３Ｔ３細胞の増殖を示す。図１２Ａは３Ｈ−チミジン添加後１２、２８及び９６時間時点での３Ｔ３細胞への３Ｈ−チミジン取り込みの量（１分当たりの数（ｃｐｍ））を示す。図１２Ｂは３Ｈ−チミジン添加後１２、２８及び９６時間時点での３Ｔ３細胞への３Ｈ−チミジン取り込みの量（１分当たりの数（ｃｐｍ））を示す。対照：ベクター（ｐｕｒｏ２及びｐｈ１）のみで形質移入したもの。
【図１３】ヒトＳＴＯＰ−１をコードするレトロウイルス感染後の３Ｔ３細胞又は２９３細胞の増殖を示す。図１３Ａ及びＢは、対照ベクター（Ｂａｂｅ）又はヒトＳＴＯＰ−１をコードするレトロウイルスをそれぞれ感染した３Ｔ３細胞又は２９３細胞から発現したヒトＳＴＯＰ−１タンパク質のウェスタンブロッドである。Ｓ７−ＩｇＧ抗体を用いて全細胞溶解物からＳＴＯＰ−１を免疫沈降した。ウェスタンブロッドはポリクローナル抗ヒトＳＴＯＰ−１抗体でプローブした。図１３Ｃは、比色分析のセルタイターアッセイにより検出されるように、感染した細胞集団にみられる細胞増殖のレベルを示す。
【図１４】マウスＳＴＯＰ−１が異種移植マウスモデルにおいて３Ｔ３線維芽細胞より腫瘍形成を誘導することを示す。図１４Ａは、ベクター単独（ｐ２ベクター）又はマウスＳＴＯＰ−１ないしＲＡＳタンパク質をコードするＤＮＡを形質移入した３Ｔ３線維芽細胞を移植したマウスにおける腫瘍の平均体積を示す。形質移入細胞はヌードマウス内に移植して、あるいはタンパク質発現を試験した。図１４Ｂ及びＣは、形質移入細胞の等量の上清及び溶解物それぞれのウェスタンブロッドを示す。ウェスタンブロッドはウサギ抗ＳＴＯＰ−１ポリクローナル抗体でプローブした。「ＴＩ」は腫瘍発生割合を意味する。
【図１５】ヒトＴＯＰ−１が異種移植マウスモデルにおいて３Ｔ３線維芽細胞より腫瘍形成を誘導することを示す。図１５は、ベクター単独又はマウスＳＴＯＰ−１、ＲＡＳタンパク質ないしＬＰ１をコードするＤＮＡを形質移入した３Ｔ３線維芽細胞を移植したマウスにおける腫瘍の平均体積を示す。Ｓ７は配列番号：８−１０を有する。Ｓ１６は配列番号：１１−１３を有する。Ｆ５は配列番号：１４−１６を有する。Ｓ４、Ｆ１３及びＦ４７は配列番号：１７−１９を有する。Ｓ９は配列番号：２０−２２を有する。
【図１６】組み換えＳＴＯＰ−１タンパク質がＳＫ−Ｍｅｌ−３１細胞の創傷治癒及び運動性を亢進することを示す。ＳＫ−Ｍｅｌ−３１細胞は、（Ａ）ＮＴ−外来性リガンドのない処理、（Ｂ）ｂ７６２−バキュロウイルス産生ヒトＳＴＯＰ−１タンパク質、（Ｃ）ｈｒＥＧＦ−（５０ｎｇ／ｍｌ）、（Ｄ）ｈｒＥＧＦ及びｂ７６２、又は（Ｅ）ＣＨＯ哺乳動物産生ヒトＳＴＯＰ−１タンパク質で処理した。
【図１７】抗ヒトＳＴＯＰ−１抗体である６Ｂ１２がシグナル配列と三重らせんドメインの間にあるヒトＳＴＯＰ−１のＮ末端配列に結合することを示す。図１７Ａは、図１８Ｂ及びＣのエピトープ位置研究に用いたｈｉｓタグ化ヒト及び完全長ゼブラフィッシュＳＴＯＰ−１タンパク質の構造図である。図１７Ｂ及びＣは、それぞれ抗ｈｉｓ抗体及び６Ｂ１２抗体をプローブとした、図１７Ａのタンパク質を組み換えして発現する細胞抽出物のウェスタンブロッドを示す。
【図１８】ヒトＳＴＯＰ−１に対する親和性を持つ多種のファージ由来抗体のＣＤＲのアミノ酸配列を示す。「Ｈ１」、「Ｈ２」及び「Ｈ３」はＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２及びＶＨ−ＣＤＲ３を意味する。一般的に頭の数値は、カバットナンバリングシステムに従って、アミノ酸位置２８−３３、４９−５８及び９２−１０２に一致する。列挙した配列の配列番号を以下に示す：Ａｂ名称Ｓ７、（Ｈ１）配列番号：８、（Ｈ２）配列番号：９、（Ｈ３）配列番号：１０。Ａｂ名称Ｓ１６、（Ｈ１）配列番号：１１、（Ｈ２）配列番号：１２、（Ｈ３）配列番号：１３。Ａｂ名称Ｆ５、Ｆ６、（Ｈ１）配列番号：１４、（Ｈ２）配列番号：１５、（Ｈ３）配列番号：１６。Ａｂ名称Ｓ４、Ｆ１３、Ｆ３７、（Ｈ１）配列番号：１７、（Ｈ２）配列番号：１８、（Ｈ３）配列番号：１９。Ａｂ名称Ｓ９、（Ｈ１）配列番号：２０、（Ｈ２）配列番号：２１、（Ｈ３）配列番号：２２。
【図１９】ＳＴＯＰ−１に対する抗体の親和性を測定するための競合的ＥＬＩＳＡに用いるための、Ｓ４及びＳ７Ｆａｂ又はＩｇＧの最適濃度を決定するためのＥＬＩＳＡアッセイのグラフを示す。「Ｓコート」は、マイクロタイタプレート上でコートされるＳＴＯＰ−１の短型（＃９４−２４３）を指す。「Ｆコート」は、マイクロタイタプレートにおおわれているヒトＳＴＯＰ−１の完全長型を指す。およそ９０％の最大結合は、競合的ＥＬＩＳＡアッセイの使用に最適であると考えられた。西洋わさびペルオキシダーゼ−複合タンパク質Ｇは、結合したＦａｂ及びＩｇＧ検出のために用いられた。
【図２０】Ｓ４及びＳ７Ｆａｂ又はＩｇＧの結合親和性を測定するための競合的ＥＬＩＳＡの結果をグラフに示す。プレートは、短い形又は完全長ヒトＳＴＯＰ−１でコートされ、それぞれ短い形又は完全長ＳＴＯＰ−１と競合させた（それぞれ図２０Ａ及びＢ）。算出した結合親和性は括弧内に示す。
【図２１】ＳＴＯＰ−１に対する多種のファージ由来抗体の結合親和性の概要を示す。「Ｓ／Ｓ」は、マイクロタイタプレートがＳＴＯＰ−１の短型でコートされ、ＳＴＯＰ−１の短型と競合したＥＬＩＳＡであることを指す。「Ｆ／Ｓ」は、マイクロタイタプレートがヒトＳＴＯＰ−１の完全長型でコートされ、ヒトＳＴＯＰ−１の短型と競合したＥＬＩＳＡであることを指す。「Ｆ／Ｆ」は、マイクロタイタプレートがＳＴＯＰ−１の完全長型でコートされ、ＳＴＯＰ−１の完全長形と競合したＥＬＩＳＡであることを指す。これらの研究で用いられるファージは、Ｓ４−Ｆａｂファージ及びＳ７−Ｆ（ａｂ）’２ファージであった。
【図２２】プレートを、ヒトＳＴＯＰ−１でコートし、Ｓ４  ＩｇＧを結合させ、そして、Ｓ４（Ｆａｂ）ファージ、Ｓ７（Ｆ（ａｂ）’２）ファージ（Ｓ９（Ｆａｂ）ファージ）Ｓ１６（Ｆ（ａｂ）’２）ファージ、及びＦ５（Ｆ（ａｂ）’２）ファージを競合させたＥＬＩＳＡアッセイをグラフに示す。Ｙ軸は、Ｓ４  ＩｇＧのないウェルのＯＤ４５０ｎｍ値でＳ４  ＩｇＧを遮断したウェルのＯＤ４５０ｎｍ値を割ることによって算出される非遮断の割合を示す。
【図２３】インビトロでの多種のプロテアーゼによって切断されるバキュロウイルス発現ヒトＳＴＯＰ−１タンパク質のクーマシーブルー染色ゲルを示す。「ＭＭＰ」は細胞外基質分解酵素を指す。
【図２４】Ｆ（ａｂ）’２ファージディスプレイタンパク質のＦａｂをコードするファジミド、又はＦａｂないしＩｇＧタンパク質をコードするベクターの構造図を示す。図２４Ａは、Ｆａｂ−ファジミドコンストラクトの構造図である。コンストラクトは、アルカリホスファターゼプロモータ、ＳＴＩＩシグナル配列、ＶＬ及びＣＬ軽鎖配列、ｇＤタグ、他のＳＴＩＩシグナル配列、重鎖ＶＨ及びＣＨ１領域と、Ｍ１３バクテリオファージｐＩＩＩコートタンパク質（ｃＰ３）のＣ末端の一部を含む。図２４Ｂは、Ｆ（ａｂ）’２−ファジミドコンストラクトの構造図である。コンストラクトは一般に、それは付加的にロイシンジッパー配列（ｚｉｐ）を含む場合を除き、Ｆａｂ−ファジミドと同じ配列を含む。図２４Ｃは、Ｆａｂタンパク質をコードする核酸分子の構造図である。図２４Ｄは、ＣＨ２及びＣＨ３配列を含むＩｇＧタンパク質をコードする核酸分子の構造図である。
【図２５Ａ】ファージディスプレイ抗Ｈｅｒ−２  Ｆａｂのアミノ酸配列及び核酸配列を記載する。より詳しくは、図２５は、抗Ｈｅｒ−２  Ｆａｂ軽鎖を含むアミノ酸配列（配列番号：８６）、抗Ｈｅｒ−２  Ｆａｂ重鎖領域を含むアミノ酸配列（配列番号：８７）、及びアミノ酸配列をコードしているファジミドの核酸配列（配列番号：８８）を示す。
【図２５Ｂ】ファージディスプレイ抗Ｈｅｒ−２  Ｆａｂのアミノ酸配列及び核酸配列を記載する。より詳しくは、図２５は、抗Ｈｅｒ−２  Ｆａｂ軽鎖を含むアミノ酸配列（配列番号：８６）、抗Ｈｅｒ−２  Ｆａｂ重鎖領域を含むアミノ酸配列（配列番号：８７）、及びアミノ酸配列をコードしているファジミドの核酸配列（配列番号：８８）を示す。
【図２５Ｃ】ファージディスプレイ抗Ｈｅｒ−２  Ｆａｂのアミノ酸配列及び核酸配列を記載する。より詳しくは、図２５は、抗Ｈｅｒ−２  Ｆａｂ軽鎖を含むアミノ酸配列（配列番号：８６）、抗Ｈｅｒ−２  Ｆａｂ重鎖領域を含むアミノ酸配列（配列番号：８７）、及びアミノ酸配列をコードしているファジミドの核酸配列（配列番号：８８）を示す。
【図２５Ｄ】ファージディスプレイ抗Ｈｅｒ−２  Ｆａｂのアミノ酸配列及び核酸配列を記載する。より詳しくは、図２５は、抗Ｈｅｒ−２  Ｆａｂ軽鎖を含むアミノ酸配列（配列番号：８６）、抗Ｈｅｒ−２  Ｆａｂ重鎖領域を含むアミノ酸配列（配列番号：８７）、及びアミノ酸配列をコードしているファジミドの核酸配列（配列番号：８８）を示す。
【図２５Ｅ】ファージディスプレイ抗Ｈｅｒ−２  Ｆａｂのアミノ酸配列及び核酸配列を記載する。より詳しくは、図２５は、抗Ｈｅｒ−２  Ｆａｂ軽鎖を含むアミノ酸配列（配列番号：８６）、抗Ｈｅｒ−２  Ｆａｂ重鎖領域を含むアミノ酸配列（配列番号：８７）、及びアミノ酸配列をコードしているファジミドの核酸配列（配列番号：８８）を示す。
【図２５Ｆ】ファージディスプレイ抗Ｈｅｒ−２  Ｆａｂのアミノ酸配列及び核酸配列を記載する。より詳しくは、図２５は、抗Ｈｅｒ−２  Ｆａｂ軽鎖を含むアミノ酸配列（配列番号：８６）、抗Ｈｅｒ−２  Ｆａｂ重鎖領域を含むアミノ酸配列（配列番号：８７）、及びアミノ酸配列をコードしているファジミドの核酸配列（配列番号：８８）を示す。
【図２５Ｇ】ファージディスプレイ抗Ｈｅｒ−２  Ｆａｂのアミノ酸配列及び核酸配列を記載する。より詳しくは、図２５は、抗Ｈｅｒ−２  Ｆａｂ軽鎖を含むアミノ酸配列（配列番号：８６）、抗Ｈｅｒ−２  Ｆａｂ重鎖領域を含むアミノ酸配列（配列番号：８７）、及びアミノ酸配列をコードしているファジミドの核酸配列（配列番号：８８）を示す。
【図２５Ｈ】ファージディスプレイ抗Ｈｅｒ−２  Ｆａｂのアミノ酸配列及び核酸配列を記載する。より詳しくは、図２５は、抗Ｈｅｒ−２  Ｆａｂ軽鎖を含むアミノ酸配列（配列番号：８６）、抗Ｈｅｒ−２  Ｆａｂ重鎖領域を含むアミノ酸配列（配列番号：８７）、及びアミノ酸配列をコードしているファジミドの核酸配列（配列番号：８８）を示す。
【図２６Ａ】ファージディスプレイ抗Ｈｅｒ−２Ｆ（ａｂ）’２のアミノ酸配列及び核酸配列を記載する。より詳しくは、図２６は、抗Ｈｅｒ−２Ｆ（ａｂ）’２軽鎖を含むアミノ酸配列（配列番号：８９）、抗Ｈｅｒ−２Ｆ（ａｂ）’２重鎖領域を含むアミノ酸配列（配列番号：９０）、及びアミノ酸配列をコードしているファジミドの核酸配列（配列番号：９１）を示す。
【図２６Ｂ】ファージディスプレイ抗Ｈｅｒ−２Ｆ（ａｂ）’２のアミノ酸配列及び核酸配列を記載する。より詳しくは、図２６は、抗Ｈｅｒ−２Ｆ（ａｂ）’２軽鎖を含むアミノ酸配列（配列番号：８９）、抗Ｈｅｒ−２Ｆ（ａｂ）’２重鎖領域を含むアミノ酸配列（配列番号：９０）、及びアミノ酸配列をコードしているファジミドの核酸配列（配列番号：９１）を示す。
【図２６Ｃ】ファージディスプレイ抗Ｈｅｒ−２Ｆ（ａｂ）’２のアミノ酸配列及び核酸配列を記載する。より詳しくは、図２６は、抗Ｈｅｒ−２Ｆ（ａｂ）’２軽鎖を含むアミノ酸配列（配列番号：８９）、抗Ｈｅｒ−２Ｆ（ａｂ）’２重鎖領域を含むアミノ酸配列（配列番号：９０）、及びアミノ酸配列をコードしているファジミドの核酸配列（配列番号：９１）を示す。
【図２６Ｄ】ファージディスプレイ抗Ｈｅｒ−２Ｆ（ａｂ）’２のアミノ酸配列及び核酸配列を記載する。より詳しくは、図２６は、抗Ｈｅｒ−２Ｆ（ａｂ）’２軽鎖を含むアミノ酸配列（配列番号：８９）、抗Ｈｅｒ−２Ｆ（ａｂ）’２重鎖領域を含むアミノ酸配列（配列番号：９０）、及びアミノ酸配列をコードしているファジミドの核酸配列（配列番号：９１）を示す。
【図２６Ｅ】ファージディスプレイ抗Ｈｅｒ−２Ｆ（ａｂ）’２のアミノ酸配列及び核酸配列を記載する。より詳しくは、図２６は、抗Ｈｅｒ−２Ｆ（ａｂ）’２軽鎖を含むアミノ酸配列（配列番号：８９）、抗Ｈｅｒ−２Ｆ（ａｂ）’２重鎖領域を含むアミノ酸配列（配列番号：９０）、及びアミノ酸配列をコードしているファジミドの核酸配列（配列番号：９１）を示す。
【図２６Ｆ】ファージディスプレイ抗Ｈｅｒ−２Ｆ（ａｂ）’２のアミノ酸配列及び核酸配列を記載する。より詳しくは、図２６は、抗Ｈｅｒ−２Ｆ（ａｂ）’２軽鎖を含むアミノ酸配列（配列番号：８９）、抗Ｈｅｒ−２Ｆ（ａｂ）’２重鎖領域を含むアミノ酸配列（配列番号：９０）、及びアミノ酸配列をコードしているファジミドの核酸配列（配列番号：９１）を示す。
【図２６Ｇ】ファージディスプレイ抗Ｈｅｒ−２Ｆ（ａｂ）’２のアミノ酸配列及び核酸配列を記載する。より詳しくは、図２６は、抗Ｈｅｒ−２Ｆ（ａｂ）’２軽鎖を含むアミノ酸配列（配列番号：８９）、抗Ｈｅｒ−２Ｆ（ａｂ）’２重鎖領域を含むアミノ酸配列（配列番号：９０）、及びアミノ酸配列をコードしているファジミドの核酸配列（配列番号：９１）を示す。
【図２６Ｈ】ファージディスプレイ抗Ｈｅｒ−２Ｆ（ａｂ）’２のアミノ酸配列及び核酸配列を記載する。より詳しくは、図２６は、抗Ｈｅｒ−２Ｆ（ａｂ）’２軽鎖を含むアミノ酸配列（配列番号：８９）、抗Ｈｅｒ−２Ｆ（ａｂ）’２重鎖領域を含むアミノ酸配列（配列番号：９０）、及びアミノ酸配列をコードしているファジミドの核酸配列（配列番号：９１）を示す。
【図２７Ａ】ファージディスプレイ抗Ｓ４−Ｆａｂのアミノ酸配列及び核酸配列を記載する。より詳しくは、図２７は、Ｓ４−Ｆａｂ軽鎖を含むアミノ酸配列（配列番号：９２）、Ｓ４−Ｆａｂ重鎖領域を含むアミノ酸配列（配列番号：９３）、及びアミノ酸配列をコードしている核酸配列（配列番号：９４）を示す。
【図２７Ｂ】ファージディスプレイ抗Ｓ４−Ｆａｂのアミノ酸配列及び核酸配列を記載する。より詳しくは、図２７は、Ｓ４−Ｆａｂ軽鎖を含むアミノ酸配列（配列番号：９２）、Ｓ４−Ｆａｂ重鎖領域を含むアミノ酸配列（配列番号：９３）、及びアミノ酸配列をコードしている核酸配列（配列番号：９４）を示す。
【図２７Ｃ】ファージディスプレイ抗Ｓ４−Ｆａｂのアミノ酸配列及び核酸配列を記載する。より詳しくは、図２７は、Ｓ４−Ｆａｂ軽鎖を含むアミノ酸配列（配列番号：９２）、Ｓ４−Ｆａｂ重鎖領域を含むアミノ酸配列（配列番号：９３）、及びアミノ酸配列をコードしている核酸配列（配列番号：９４）を示す。
【図２８Ａ】ファージディスプレイ抗Ｓ９  Ｆａｂのアミノ酸配列及び核酸配列を記載する。より詳しくは、図２８は、Ｓ９−Ｆａｂ軽鎖を含むアミノ酸配列（配列番号：９５）、Ｓ９−Ｆａｂ重鎖領域を含むアミノ酸配列（配列番号：９６）、及びアミノ酸配列をコードしている核酸配列（配列番号：９７）を示す。
【図２８Ｂ】ファージディスプレイ抗Ｓ９  Ｆａｂのアミノ酸配列及び核酸配列を記載する。より詳しくは、図２８は、Ｓ９−Ｆａｂ軽鎖を含むアミノ酸配列（配列番号：９５）、Ｓ９−Ｆａｂ重鎖領域を含むアミノ酸配列（配列番号：９６）、及びアミノ酸配列をコードしている核酸配列（配列番号：９７）を示す。
【図２８Ｃ】ファージディスプレイ抗Ｓ９  Ｆａｂのアミノ酸配列及び核酸配列を記載する。より詳しくは、図２８は、Ｓ９−Ｆａｂ軽鎖を含むアミノ酸配列（配列番号：９５）、Ｓ９−Ｆａｂ重鎖領域を含むアミノ酸配列（配列番号：９６）、及びアミノ酸配列をコードしている核酸配列（配列番号：９７）を示す。
【図２９Ａ】ファージディスプレイ抗Ｓ７−Ｆ（ａｂ）’２のアミノ酸配列及び核酸配列を記載する。より詳しくは、図２９は、Ｓ７−Ｆ（ａｂ）’２軽鎖を含むアミノ酸配列（配列番号：９８）、Ｓ７−Ｆ（ａｂ）’２重鎖領域を含むアミノ酸配列（配列番号：９９）、及びアミノ酸配列をコードしている核酸配列（配列番号：１００）を示す。
【図２９Ｂ】ファージディスプレイ抗Ｓ７−Ｆ（ａｂ）’２のアミノ酸配列及び核酸配列を記載する。より詳しくは、図２９は、Ｓ７−Ｆ（ａｂ）’２軽鎖を含むアミノ酸配列（配列番号：９８）、Ｓ７−Ｆ（ａｂ）’２重鎖領域を含むアミノ酸配列（配列番号：９９）、及びアミノ酸配列をコードしている核酸配列（配列番号：１００）を示す。
【図２９Ｃ】ファージディスプレイ抗Ｓ７−Ｆ（ａｂ）’２のアミノ酸配列及び核酸配列を記載する。より詳しくは、図２９は、Ｓ７−Ｆ（ａｂ）’２軽鎖を含むアミノ酸配列（配列番号：９８）、Ｓ７−Ｆ（ａｂ）’２重鎖領域を含むアミノ酸配列（配列番号：９９）、及びアミノ酸配列をコードしている核酸配列（配列番号：１００）を示す。
【図３０Ａ】ファージディスプレイ抗Ｓ１６−Ｆ（ａｂ）’２のアミノ酸配列及び核酸配列を記載する。より詳しくは、図３０は、Ｓ１６−Ｆ（ａｂ）’２軽鎖を含むアミノ酸配列（配列番号：１０１）、Ｓ１６−Ｆ（ａｂ）’２重鎖領域を含むアミノ酸配列（配列番号：１０２）、及びアミノ酸配列をコードしている核酸配列（配列番号：１０３）を示す。
【図３０Ｂ】ファージディスプレイ抗Ｓ１６−Ｆ（ａｂ）’２のアミノ酸配列及び核酸配列を記載する。より詳しくは、図３０は、Ｓ１６−Ｆ（ａｂ）’２軽鎖を含むアミノ酸配列（配列番号：１０１）、Ｓ１６−Ｆ（ａｂ）’２重鎖領域を含むアミノ酸配列（配列番号：１０２）、及びアミノ酸配列をコードしている核酸配列（配列番号：１０３）を示す。
【図３０Ｃ】ファージディスプレイ抗Ｓ１６−Ｆ（ａｂ）’２のアミノ酸配列及び核酸配列を記載する。より詳しくは、図３０は、Ｓ１６−Ｆ（ａｂ）’２軽鎖を含むアミノ酸配列（配列番号：１０１）、Ｓ１６−Ｆ（ａｂ）’２重鎖領域を含むアミノ酸配列（配列番号：１０２）、及びアミノ酸配列をコードしている核酸配列（配列番号：１０３）を示す。
【図３１Ａ】ファージディスプレイ抗Ｆ５Ｆ（ａｂ）’２のアミノ酸配列及び核酸配列を記載する。図３１は、Ｆ５−Ｆ（ａｂ）’２軽鎖を含むアミノ酸配列（配列番号：１０４）、Ｆ５−Ｆ（ａｂ）’２重鎖領域を含むアミノ酸配列（配列番号：１０５）、及び、アミノ酸配列をコードしている核酸配列（配列番号：１０６）を示す。
【図３１Ｂ】ファージディスプレイ抗Ｆ５Ｆ（ａｂ）’２のアミノ酸配列及び核酸配列を記載する。図３１は、Ｆ５−Ｆ（ａｂ）’２軽鎖を含むアミノ酸配列（配列番号：１０４）、Ｆ５−Ｆ（ａｂ）’２重鎖領域を含むアミノ酸配列（配列番号：１０５）、及び、アミノ酸配列をコードしている核酸配列（配列番号：１０６）を示す。
【図３１Ｃ】ファージディスプレイ抗Ｆ５Ｆ（ａｂ）’２のアミノ酸配列及び核酸配列を記載する。図３１は、Ｆ５−Ｆ（ａｂ）’２軽鎖を含むアミノ酸配列（配列番号：１０４）、Ｆ５−Ｆ（ａｂ）’２重鎖領域を含むアミノ酸配列（配列番号：１０５）、及び、アミノ酸配列をコードしている核酸配列（配列番号：１０６）を示す。
【図３２Ａ】Ｓ４−Ｆａｂのアミノ酸配列及び核酸配列を記載する。より詳しくは、図３２は、Ｓ４−Ｆａｂ軽鎖を含むアミノ酸配列（配列番号：１０７）、Ｓ４−Ｆａｂ重鎖領域を含むアミノ酸配列（配列番号：１０８）、及びアミノ酸配列をコードしているベクターの核酸配列（配列番号：１０９）を示す。
【図３２Ｂ】Ｓ４−Ｆａｂのアミノ酸配列及び核酸配列を記載する。より詳しくは、図３２は、Ｓ４−Ｆａｂ軽鎖を含むアミノ酸配列（配列番号：１０７）、Ｓ４−Ｆａｂ重鎖領域を含むアミノ酸配列（配列番号：１０８）、及びアミノ酸配列をコードしているベクターの核酸配列（配列番号：１０９）を示す。
【図３２Ｃ】Ｓ４−Ｆａｂのアミノ酸配列及び核酸配列を記載する。より詳しくは、図３２は、Ｓ４−Ｆａｂ軽鎖を含むアミノ酸配列（配列番号：１０７）、Ｓ４−Ｆａｂ重鎖領域を含むアミノ酸配列（配列番号：１０８）、及びアミノ酸配列をコードしているベクターの核酸配列（配列番号：１０９）を示す。
【図３２Ｄ】Ｓ４−Ｆａｂのアミノ酸配列及び核酸配列を記載する。より詳しくは、図３２は、Ｓ４−Ｆａｂ軽鎖を含むアミノ酸配列（配列番号：１０７）、Ｓ４−Ｆａｂ重鎖領域を含むアミノ酸配列（配列番号：１０８）、及びアミノ酸配列をコードしているベクターの核酸配列（配列番号：１０９）を示す。
【図３２Ｅ】Ｓ４−Ｆａｂのアミノ酸配列及び核酸配列を記載する。より詳しくは、図３２は、Ｓ４−Ｆａｂ軽鎖を含むアミノ酸配列（配列番号：１０７）、Ｓ４−Ｆａｂ重鎖領域を含むアミノ酸配列（配列番号：１０８）、及びアミノ酸配列をコードしているベクターの核酸配列（配列番号：１０９）を示す。
【図３２Ｆ】Ｓ４−Ｆａｂのアミノ酸配列及び核酸配列を記載する。より詳しくは、図３２は、Ｓ４−Ｆａｂ軽鎖を含むアミノ酸配列（配列番号：１０７）、Ｓ４−Ｆａｂ重鎖領域を含むアミノ酸配列（配列番号：１０８）、及びアミノ酸配列をコードしているベクターの核酸配列（配列番号：１０９）を示す。
【図３２Ｇ】Ｓ４−Ｆａｂのアミノ酸配列及び核酸配列を記載する。より詳しくは、図３２は、Ｓ４−Ｆａｂ軽鎖を含むアミノ酸配列（配列番号：１０７）、Ｓ４−Ｆａｂ重鎖領域を含むアミノ酸配列（配列番号：１０８）、及びアミノ酸配列をコードしているベクターの核酸配列（配列番号：１０９）を示す。
【図３３Ａ】ＩｇＧタンパク質のＳ４軽鎖配列を記載する。より詳しくは、図３３は、Ｓ４  軽鎖を含むアミノ酸配列（配列番号：１１０）、及びアミノ酸配列をコードしているベクターの核酸配列（配列番号：１１１）を示す。
【図３３Ｂ】ＩｇＧタンパク質のＳ４軽鎖配列を記載する。より詳しくは、図３３は、Ｓ４  軽鎖を含むアミノ酸配列（配列番号：１１０）、及びアミノ酸配列をコードしているベクターの核酸配列（配列番号：１１１）を示す。
【図３３Ｃ】ＩｇＧタンパク質のＳ４軽鎖配列を記載する。より詳しくは、図３３は、Ｓ４  軽鎖を含むアミノ酸配列（配列番号：１１０）、及びアミノ酸配列をコードしているベクターの核酸配列（配列番号：１１１）を示す。
【図３３Ｄ】ＩｇＧタンパク質のＳ４軽鎖配列を記載する。より詳しくは、図３３は、Ｓ４  軽鎖を含むアミノ酸配列（配列番号：１１０）、及びアミノ酸配列をコードしているベクターの核酸配列（配列番号：１１１）を示す。
【図３３Ｅ】ＩｇＧタンパク質のＳ４軽鎖配列を記載する。より詳しくは、図３３は、Ｓ４  軽鎖を含むアミノ酸配列（配列番号：１１０）、及びアミノ酸配列をコードしているベクターの核酸配列（配列番号：１１１）を示す。
【図３３Ｆ】ＩｇＧタンパク質のＳ４軽鎖配列を記載する。より詳しくは、図３３は、Ｓ４  軽鎖を含むアミノ酸配列（配列番号：１１０）、及びアミノ酸配列をコードしているベクターの核酸配列（配列番号：１１１）を示す。
【図３４Ａ】ＩｇＧタンパク質のＳ４重鎖配列を記載する。より詳しくは、図３４は、Ｓ４  重鎖を含むアミノ酸配列（配列番号：１１２）、及びアミノ酸配列をコードしているベクターの核酸配列（配列番号：１１３）を示す。
【図３４Ｂ】ＩｇＧタンパク質のＳ４重鎖配列を記載する。より詳しくは、図３４は、Ｓ４  重鎖を含むアミノ酸配列（配列番号：１１２）、及びアミノ酸配列をコードしているベクターの核酸配列（配列番号：１１３）を示す。
【図３４Ｃ】ＩｇＧタンパク質のＳ４重鎖配列を記載する。より詳しくは、図３４は、Ｓ４  重鎖を含むアミノ酸配列（配列番号：１１２）、及びアミノ酸配列をコードしているベクターの核酸配列（配列番号：１１３）を示す。
【図３４Ｄ】ＩｇＧタンパク質のＳ４重鎖配列を記載する。より詳しくは、図３４は、Ｓ４  重鎖を含むアミノ酸配列（配列番号：１１２）、及びアミノ酸配列をコードしているベクターの核酸配列（配列番号：１１３）を示す。
【図３４Ｅ】ＩｇＧタンパク質のＳ４重鎖配列を記載する。より詳しくは、図３４は、Ｓ４  重鎖を含むアミノ酸配列（配列番号：１１２）、及びアミノ酸配列をコードしているベクターの核酸配列（配列番号：１１３）を示す。
【図３４Ｆ】ＩｇＧタンパク質のＳ４重鎖配列を記載する。より詳しくは、図３４は、Ｓ４  重鎖を含むアミノ酸配列（配列番号：１１２）、及びアミノ酸配列をコードしているベクターの核酸配列（配列番号：１１３）を示す。
【図３４Ｇ】ＩｇＧタンパク質のＳ４重鎖配列を記載する。より詳しくは、図３４は、Ｓ４  重鎖を含むアミノ酸配列（配列番号：１１２）、及びアミノ酸配列をコードしているベクターの核酸配列（配列番号：１１３）を示す。
【図３５】カバットデータベースからヒト抗体軽鎖配列のアミノ酸の頻度を示す。
【図３６】適切なコドンセット設定の例示的一実施態様を示す。
【図３７】ＣＤＲのＬ１、Ｌ２及びＬ３の多様化のための、制限酵素多様性変性（本明細書において、「ノンランダム（無作為でない）」とも称す）コドンセットの例示的実施態様である。
【図３８】ＣＤＲのＬ１、Ｌ２及びＬ３の多様化のための、制限酵素多様性変性（本明細書において、「ノンランダム（無作為でない）」とも称す）コドンセットの例示的実施態様である。
【図３９】ＣＤＲのＬ３の多様化のための、制限酵素多様性変性（本明細書において、「ノンランダム（無作為でない）」とも称す）コドンセットの例示的実施態様である。
【図４０】ＣＤＲのＬ１、Ｌ２及びＬ３の多様化のための、制限酵素多様性変性（本明細書において、「ノンランダム（無作為でない）」とも称す）コドンセットの例示的実施態様である。
【図４１】（１）抗ＨＩＳ抗体、（２）抗ＨＩＳ抗体とＳＴＯＰ−１タンパク質、又は（３）抗ｆｌａｇ抗体とＳＴＯＰ−１タンパク質で処置した後に、フルオレッセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）抱合−ヤギ抗マウス抗体で処理した２９３、ＨｅＬａ、ＨＴ１０８０又はＨＵＶＥＣ細胞の個体群のフローサイトメトリー解析を示す。抗ｆｌａｇ抗体に結合した細胞は少なく、有意差がなかった（すなわち２９３、ＨｅＬａ及びＨＴ１０８０グラフのｘ軸のはなれた左角のピーク）。ｘ軸は、細胞の数（ログフルオレセインシグナル強度）を示す。ｙ軸は、標識した細胞によって発される蛍光のレベル（現象）を示す。
【図４２】（１）抗ＨＩＳ抗体、（２）抗ＨＩＳ抗体とＳＴＯＰ−１タンパク質、（３）抗ｆｌａｇ抗体とＳＴＯＰ−１タンパク質、（３）ＳＴＯＰ−１タンパク質、（４）ＳＴＯＰ−１タンパク質とＳ７抗体、又は（５）ＳＴＯＰ−１と６ｂ１２抗体で処理した後に、ＦＩＴＣ抱合−ヤギ抗マウス抗体で処理したＨＴ１０８０細胞集団のＦＡＣＳ分析を示す。
【図４３】ｂＦＧＦ又はＳＴＯＰ−１（「７６２」）又はネガティブな対照で処理した後、変更されたボイデン走化性チャンバでのＨＴ１０８０細胞の移動（細胞の数）を示す。
【図４４】抗ＳＴＯＰ−１抗体（６Ｂ１２）又は抗体対照（４Ｂ７）がある条件及びない条件下でのＭＤＡ４３５細胞へのＳＴＯＰ−１結合のＦＡＣＳ分析を示す。検出抗体である抗ｆｌａｇＭ２ＦＩＴＣ抗体は、ＳＴＯＰ−１結合に影響を与えなかった。
【図４５Ａ】組み換えヒトＴＮＦαのある条件下及びない条件下にて、（Ａ）８及び３４時間の低酸素条件下で処理した後のＳＴＯＰ−１ｍＲＮＡ発現の倍変化を示すグラフである。
【図４５Ｂ】組み換えヒトＴＮＦαのある条件下及びない条件下にて、（Ｂ）３、８及び３４時間の正常酸素条件下で処理した後のＳＴＯＰ−１ｍＲＮＡ発現の倍変化を示すグラフである。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
本発明のポリペプチド、抗体、アンタゴニスト又は組成物の「細胞障害性量」は、細胞、特に腫瘍、例えば癌細胞をインビトロ又はインビボで破壊できる量である。腫瘍性細胞成長の阻害の目的のための本発明のポリペプチド、抗体、アンタゴニスト又は組成物の「細胞障害性量」は、当分野で公知の方法で経験的に決定することができる。
「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、例えば、単一の抗ＳＴＯＰ−１モノクローナル抗体(アゴニスト、アンタゴニスト、及び中和抗体を含む)、多エピトープ(polyepitopic)特異性を持つ抗ＳＴＯＰ−１抗体組成物、ポリクローナル抗体、一本鎖抗ＳＴＯＰ−１抗体、及び天然のＳＴＯＰ−１ポリペプチドに特異的に結合し、及び／又はこの発明の生物学的又は免疫学的活性を示す限りは抗ＳＴＯＰ−１抗体の断片（下記を参照）を包含する。一実施態様によると、抗体はＳＴＯＰ−１のオリゴマー型、例えば三量体に結合する。更なる実施態様によると、抗体はヒトＳＴＯＰ−１の残基９４−２４３の間に特異的に結合する。他の実施態様によると、抗体はＳＴＯＰ−１に特異的に結合し、その結合は本発明のモノクローナル抗体（例えば、本発明の委託された抗体など）により阻害されうるものである。抗体の「機能的断片又は類似体」なる句は、質的に抗体の意味するのと同じような生物学的活性を有する化合物である。例えば、抗ＳＴＯＰ−１抗体の機能的断片又は類似体はＳＴＯＰ−１分子に特異的に結合可能なものであり得る。一実施態様では、抗体は細胞増殖を引き起こすＳＴＯＰ−１分子の能力を阻害又は実質的に減低させることができる。「免疫グロブリン」（Ｉｇ）という用語は、ここでの「抗体」と相互に置き換え可能に用いられる。一実施態様によると、本発明の抗体はアミノ酸配列ＧＷＮＳＶＳＲＩＩＩＥＥＬＰＫ（配列番号：１１７）を有するペプチドには結合しない。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７２】
実施例
実施例１  ＳＴＯＰ−１は進化の過程で保存される。
ヒト、マウス及びゼブラフィッシュのＳＴＯＰ−１を含む核酸分子をＰＣＲにより得た。ヒト、マウス及びゼブラフィッシュのＳＴＯＰ−１に相同な配列はＧｅｎｅｂａｎｋ  データベース  マウスＥＳＴ：ＡＫ００３６７４；ニワトリＥＳＴｓ：Ａｌ５８５１２９、ＡＬ５８５１３０；メダカＥＳＴｓ：ＢＪ４９０４３１、ＢＪ４９８０８０、ＢＪ５１０２０３、ＢＪ５０４７３０；及びゼブラフィッシュＥＳＴｓ：ＡＬ７２７８７４、ＡＷ５９５３８８；及びＨＧＴ  ＡＬ８４４５２１で見つけることができる。ヒト、マウス、メダカ、ゼブラフィッシュ及びニワトリのＳＴＯＰ−１のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号：３、４、５、６及び７と図１に記載する。ヒトＳＴＯＰ−１のｃＤＮＡは以下に示すように、ブダペスト条約の規約のもとにアメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, USAに委託した。
種        材料                      委託番号              委託日
ヒト      ７６３９３−１６６４      ２０３３２３          １９９８年１０月６日
ヒト      ｈ７６２ＨＩＰ            ＰＴＡ−５０１９      ２００３年２月２１日
多種の高等脊椎動物種（ヒト、マウス、ニワトリ、ゼブラフィッシュ及びメダカ）の間でのアミノ酸配列は、特に三重らせんドメインを含むＣ末端ドメインに高く保存される部位を示す（図１）。コンセンサス配列中のアステリスクがすべての種で保存されている残基を示す。黒丸はほとんどの種で保存されている残基を示す。
図２はヒトＳＴＯＰ−１タンパク質を示す。囲みの配列はシグナル切断部位を示す。三重らせん体領域を下線で示す。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０１】
ｈ４Ｄ５抗体は、Ｈｅｒ−２（ｅｒｂＢ２）として知られている癌関連抗原を特異的に認識するヒト化抗体である。この研究において、ｈ４ｄ５は、ｈｕｍＡｂ４Ｄ５の８型（「ｈｕｍＡｂ４Ｄ５−８」）配列及び、ＰＣＲ産物に５’ＮｓｉＩ部位と３’ＸｂａＩ部位を生じるように遺伝子操作したプライマー(Carter 等., (1992) PNAS 89:4285-4289)を用いてポリメラーゼ連鎖反応により得た。ＰＣＲ産物はＮｓｉＩとＸｂａＩによって切断して、ｐＳ０６４３ファジミドベクターに結合させた。ｈ４Ｄ５核酸配列は、大部分はヒトのコンセンサス配列Ｆａｂフレームワーク内にあるＨｅｒ−２特異的マウスモノクローナル抗体由来の修飾したＣＤＲ領域をコードしている。具体的には、配列は、ＶＨおよびＣＨ１ドメイン（ＨＣ領域）の、カッパ軽鎖（ＬＣ領域）上流域を含む。抗Ｈｅｒ−２抗体作製方法及び可変ドメイン配列の同定は、米国特許第５，８２１，３３７号及び第６，０５４，２９７号に示されている。
ヒト化４Ｄ５（８型）を含むｐＳ０６４３プラスミドは、また更に修飾した。例えば、単純ヘルペスウイルス１型グリコプロテインＤエピトープタグ（ｇＤタグ）を、部位特異的突然変異を用いてＬＣのＣ末端のフレーム内に付加した。ＬＣの停止コドン下流に続き、リボソーム結合部位及びｓｔＩＩシグナル配列をコードする核酸分子をＨＣ配列のＮ末端に結合した。したがって、ＨＣ配列は、Ｍ１３ファージのマイナーコートタンパク質、ｐ３（ｃＰ３）のＣ末端ドメインを有するフレーム内にある。ゆえに、ファージ上に表出（ディスプレイ）するＦａｂは一コンストラクトから産生される。当該Ｆａｂファジミドベクターは、ｐＶ０３５０−２ｂ（図２５Ａ−Ｈ）と称して、図２４Ａに構成図を示す。
ファージ上に表出するＦ（ａｂ）’２を生成するために、ｐＶ０３５０−２ｂベクターを、カセット突然変異生成法により、ＨＣ及びｃＰ３配列間に二量体化可能なロイシンジッパーGCN4配列(GRMKQLEDKVEELLSKNYHLENEVARLKKLVGERG) (配列番号：84)を挿入することによって、更に修飾した。ＧＣＮ４ロイシンジッパーは、大腸菌周辺質で２セットのＬＣ／ＨＣ−ｃＰ３融合ポリペプチドをまとめて、ファージ表面上で二量体を示す。当該Ｆ（ａｂ）’２ファジミドベクターは、ｐＶ０３５０−４（図２６Ａ−Ｈ）と称して、図２４Ｂに構成図を示す。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０５】
最初に、３８４−ウェルマイクロタイタプレートのウェルを、１ウェルあたり２０μｌ（２μｇ／ｍｌ  ＰＢＳ）の完全長又は「短型」（＃９３ａａ−２４３ａａ）ｈｉｓタグ付加ヒトＳＴＯＰ−１、ＩＧＦ−１、Ｈｅｒ−２又は抗ｇＤにて４℃にて一晩又は室温にて２時間でコートした。
2011026321.tif 000001
他の９６ウェルプレートに、選別２~４で得たクローンを５０ｕｇ／ｍｌカルベニシリン及びヘルパーファージＫ０７を含む５０：５０  ２ＹＴ／ＣＲＡＰ培養液１５０μｌにて３７℃で一晩成育した。プレートを２５００ｒｐｍで２０分間遠心沈殿した。５０μｌの上清を１２０μｌのＥＬＩＳＡバッファー（PBS−０．５%BSA及び０．０５%Tween20）と混ぜた。３０μｌの混合液を４分の１の３８４ウェルコーティングプレートに加え、室温で１時間インキュベートした。結合は、０．５％ＢＳＡ及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ中の西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗Ｍ１３抗体  ７５μｌ／ウェルを加えて室温で３０分間置いて定量した(Sidhu等、上掲)。PBS―０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０にて少なくとも５回ウェルを洗浄した。次に、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン（TMB）ペルオキシダーゼ基質及びペルオキシダーゼ溶液Ｂ（H２O２）((Kirkegaard Perry Laboratories (Gaithersburg, MD))を１：１の比率で含む溶液１００μｌ／ウェルをウェルに加えて、室温にて５分間インキュベートした。反応は、各ウェルに１００μlの１Ｍリン酸（Ｈ３ＰＯ４）((Kirkegaard Perry Laboratories (Gaithersburg, MD))を加えることによって止めた。各ウェルの黄色の４５０ｎｍのＯＤを、標準のＥＬＩＳＡプレート読み込み器を用いて定量した。コートプレートに対して約９０％の最大結合を生じるＦ（ａｂ）又はＦ（ａｂ）’２ファージ濃度を、溶液結合競合的ＥＬＩＳＡ法に用いた。ＢＳＡ、ＩＧＦ−１、Ｈｅｒ２及び抗ｇＤより３−４倍大きな結合を有するＦ（ａｂ）およびＦ（ａｂ）’２ファージを、より良好な特性を有すると判断した。それらの結合体をシークエンスした。
図１８は、より高い親和性及び特性を示す様々な結合体（例えばＳ７、Ｓ１６、Ｆ５、Ｓ４、Ｆ１３、Ｆ４７及びＳ９）の部分的なアミノ酸配列を示す。３つのクローン−Ｆ１３、Ｆ４７及びＳ４は同一のＣＤＲ配列を有する。Ｓ７及びＳ１６もいくらか配列相同性を示した。Ｆ１３、Ｆ４７、Ｓ４、Ｓ７、Ｓ９及びＳ１６のＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２及びＶＨ−ＣＤＲ３領域間の配列相同性に基づいて、共通に認識されるエピトープのコンセンサス配列を引き出した。ファージディスプレイＳ４−Ｆａｂ、ファージディスプレイＳ９−Ｆａｂ、ファージディスプレイＳ７−Ｆ（ａｂ）’２、ファージディスプレイＳ１６−Ｆ（ａｂ）’２、ファージディスプレイＦ５−Ｆ（ａｂ）’２のアミノ酸及び核酸配列を、それぞれ図２７Ａ−Ｃ、図２８Ａ−Ｃ、図２９Ａ−Ｃ、図３０Ａ−Ｃ及び図３１Ａ−Ｃに示す。Ｓ７は配列番号：８−１０を有する。Ｓ１６は配列番号：１１−１３を有する。Ｆ５は配列番号：１４−１６を有する。Ｓ４、Ｆ１３及びＦ４７は配列番号：１７−１９を有する。Ｓ９は配列番号：２０−２２を有する。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２８】
主要な配列リスト
2011026321.tif 000002
2011026321.tif 000003
2011026321.tif 000004
2011026321.tif 000005
ここに挙げたすべての特許、出願及び文献は出典明記によりここに組み込まれる。