(57)【要約】  本発明は、細菌由来のタンパク質を用いて癌細胞を死滅させるための方法及び物質に関する。本発明は、特に、アズリン、Ｌａｚ、Ｐａ−ＣＡＲＤ、並びに融合タンパク質Ａｚｕ−Ｈ．８及びＨ．８−Ａｚｕ、並びに白血病細胞及び／又は卵巣癌細胞の死滅におけるそれらの使用に関する。【選択図】図１
2012518417.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カスパーゼ動員（ＣＡＲＤ）様ドメインを含む、癌細胞を死滅させることが可能な単離ペプチド。
【請求項２】
細菌に由来する、請求項１に記載の単離ペプチド。
【請求項３】
前記細菌が、シュードモナス・エルギノーサである、請求項２に記載の単離ペプチド。
【請求項４】
Ｐａ−ＣＡＲＤである、請求項１に記載の単離ペプチド。
【請求項５】
配列番号２７を含む、請求項１に記載の単離ペプチド。
【請求項６】
配列番号２７からなる、請求項５に記載の単離ペプチド。
【請求項７】
前記癌が、白血病、卵巣癌、線維肉腫、及び乳癌からなる群から選択される、請求項１に記載の単離ペプチド。
【請求項８】
化学的に修飾されて、その血中半減期が延長又は最適化されている、請求項１に記載の単離ペプチド。
【請求項９】
前記細胞を、請求項１に記載の単離ペプチド、Ｌａｚ、Ｈ８−Ａｚｕ、及びＡｚｕ−Ｈ８からなる群から選択される１つ又は複数のタンパク質と接触させることにより癌細胞を死滅させることを含む方法。
【請求項１０】
前記癌細胞が、白血病細胞、線維肉腫細胞、卵巣癌細胞、及び乳癌細胞からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
癌細胞を死滅させることが可能な１つ又は複数の細胞毒性剤と前記細胞を接触させることも含む、請求項９に記載の単離ペプチド。
【請求項１２】
前記１つ又は複数の細胞毒性剤が、シスプラチン、Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標）、レチノイン酸、５’−アザ−２’−デオキシシチジン、及び三酸化ヒ素からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記１つ又は複数の細胞毒性剤が、シスプラチンである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記癌細胞を、前記１つ又は複数のタンパク質とほぼ同時に、前記１つ又は複数の細胞毒性剤と接触させる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
癌を罹患している哺乳類患者に、請求項１に記載の単離ペプチド、Ｌａｚ、Ｈ８−Ａｚｕ、及びＡｚｕ−Ｈ８からなる群から選択される１つ又は複数のタンパク質を投与することを含む方法。
【請求項１６】
前記癌が、白血病、線維肉腫、卵巣癌、及び乳癌からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記患者に、癌細胞を死滅させることが可能な１つ又は複数の細胞毒性剤を投与することも含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記１つ又は複数の細胞毒性剤が、シスプラチン、Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標）、レチノイン酸、５’−アザ−２’−デオキシシチジン、及び三酸化ヒ素からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記１つ又は複数の細胞毒性剤が、シスプラチンである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記１つ又は複数の細胞毒性剤が、前記１つ又は複数のタンパク質とほぼ同時に投与される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞を、アズリン及びＬａｚのＨ．８領域を含むペプチドと接触させることにより白血病細胞を死滅させることを含む方法。
【請求項２２】
前記白血病細胞に、前記アズリン及び前記ＬａｚのＨ．８領域を含むペプチドを同時に又はほぼ同時に接触させる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
白血病を罹患している哺乳類患者に、アズリン及びＬａｚのＨ．８領域を含むペプチドを投与することを含む方法。
【請求項２４】
前記患者に、前記アズリン及び前記ＬａｚのＨ．８領域を含むペプチドを同時に又はほぼ同時に接触させる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
Ｌａｚ、アズリン、Ｈ．８−Ａｚｕ、Ａｚｕ−Ｈ．８、及び請求項１に記載の単離ペプチドからなる群から選択される１つ又は複数のタンパク質と白血病細胞を接触させることにより、前記白血病細胞の細胞分化を誘導することを含む方法。
【請求項２６】
Ｌａｚ、アズリン、Ｈ．８−Ａｚｕ、Ａｚｕ−Ｈ．８、及び請求項１に記載の単離ペプチドからなる群から選択される１つ又は複数のタンパク質と癌細胞を接触させることにより、前記癌細胞に選択的に進入することを含み、前記癌細胞が、白血病細胞及び卵巣癌細胞からなる群から選択される方法。
【請求項２７】
Ｌａｚ、アズリン、Ｈ．８−Ａｚｕ、Ａｚｕ−Ｈ．８、及び請求項１に記載の単離ペプチドからなる群から選択される１つ又は複数のタンパク質と癌細胞を接触させることにより、前記癌細胞の細胞周期停止を誘導することを含む方法。
【請求項２８】
前記癌細胞が、白血病細胞、線維肉腫細胞、乳癌細胞、及び卵巣癌細胞からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記タンパク質が、前記細胞のＷｅｅｌタンパク質レベルを増加させる、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記タンパク質が、リン酸化ＡＫＴ−Ｓｅｒ−４７３の枯渇を引き起こす、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記タンパク質が、前記細胞のＷｅｅｌタンパク質レベルを増加させ、且つリン酸化ＡＫＴ−Ｓｅｒ−４７３の枯渇を引き起こす、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
癌細胞を請求項１に記載のペプチドと接触させることによるカスパーゼ３活性化により、前記癌細胞のアポトーシスを誘導することを含む方法。
【請求項３３】
前記癌細胞が、卵巣癌細胞である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
癌細胞を請求項１に記載のペプチドと接触させることにより、前記癌細胞のＮＦ−ｋＢシグナル伝達経路遺伝子の発現を調節すること含む方法。
【請求項３５】
前記癌細胞が、卵巣癌細胞である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
請求項１に記載の単離ペプチドをコードする発現ベクター。
【請求項３７】
請求項４に記載の単離ペプチドをコードする、請求項３６に記載の発現ベクター。
【請求項３８】
請求項１に記載の単離ペプチドを含む医薬組成物。
【請求項３９】
薬学的に許容される担体を更に含む、請求項３８に記載の医薬組成物。
【請求項４０】
アズリン、Ｌａｚ、Ｈ．８−Ａｚｕ、及びＡｚｕ−Ｈ．８からなる群から選択されるタンパク質を更に含む、請求項３８に記載の医薬組成物。
【請求項４１】
癌細胞を死滅させることが可能な１つ又は複数の細胞毒性剤を更に含む、請求項３８に記載の医薬組成物。
【請求項４２】
前記薬学的に許容される担体が、静脈注射に適切である、請求項３８に記載の医薬組成物。
【請求項４３】
白血病を罹患している患者に、請求項３８に記載の医薬組成物を治療上有効量で投与することを含む方法。
【請求項４４】
前記医薬組成物が、静脈内、局所的、皮下、筋肉内、経口、及び腫瘍内からなる群から選択される様式で前記患者に投与される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
請求項３８に記載の医薬組成物を含むキット。
【請求項４６】
請求項１に記載の単離ペプチドをコードする核酸分子。
【請求項４７】
請求項４に記載の単離ペプチドをコードする核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、米国特許法１１９条及び１２０条に基づいて、２００９年２月２０日に出願された米国仮出願第６１／１５４，２３６号、及び２００９年５月１９日に出願された米国仮出願第６１／１７９，４３５号に対する優先権を主張するものであり、２００８年１２月１５日に出願された米国特許出願第１２／３１４，７０３号の一部継続出願であり、２００６年８月２３日に出願された米国特許出願第１１／５０８，１７３号の一部継続出願であり、２００５年１０月６日に出願された米国特許出願第１１／２４４，１０５号の一部継続出願であり、２００６年７月１９日に出願された米国特許出願第１１／４８８，６９５号の一部継続出願である。これら出願の全内容は、参照により全て本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
白血病は、骨髄及び血液の悪性癌である。白血病は、異常血液細胞が制御されずに蓄積されることを特徴とし、正常な血液細胞機能の阻害、及び多くの場合、死に結び付く。２００８年には、合衆国でおよそ４４，２７０人が、新たに白血病に罹患したと推定された。白血病は、男性の場合、癌による死亡の５番目に多い原因であり、女性の場合、癌による死亡の６番目に多い原因である。白血病は、２０歳未満の小児では、他のいかなる癌より多くの死亡を引き起こしている。（「Ｃａｎｃｅｒ  ｆａｃｔｓ  ａｎｄ  ｆｉｇｕｒｅｓ  ２００８」，Ａｔｌａｎｔａ：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ（２００８）；Ｘｉｅ  Ｙ  ｅｔａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  ９７：２２２９〜３５（２００３））。あるタイプの白血病は、治療が非常に難しく、例えば、急性前骨髄球白血病（ＡＰＬ）は、稀であるが致死的疾患であることが多く、３０％の患者が標準的化学療法に応答するに過ぎない。
【０００３】
多くの現行の治療方法は、ある程度有効であるが、癌細胞に対する特異性が欠如しているため著しく有害な副作用を示す。イマチニブという、Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標）として知られている非常に効果的な薬物が成功したことにより、標的特異的療法薬を開発しようとする努力が大きく加速している。Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標）は、Ｂｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼを特異的に阻害する。慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）では、染色体転座により、Ｂｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼの構成的活性化がもたらされ、次いでそれにより、癌増殖を促進する細胞シグナル伝達の活性化がもたらされる。レチノイン酸は、細胞分化に関与するホルモンであり、三酸化ヒ素の（Ａｓ２Ｏ３）と共に、ＡＰＬに対する好適な治療剤である。
【０００４】
しかしながら、耐性の発現は、キナーゼ等の単一攻撃点を標的とする薬物に伴う大きな問題であり、薬物の立体構造特異的結合性が変化する可能性がある。白血病患者において耐性が増加した場合、臨床医は、従来の複合薬療法に頼らざるを得ず、複合薬療法では、腫瘍特異的薬物を組み合わせて薬物活性の相乗作用を生み出し、非特異的薬物をより低用量で使用することを可能にし、他の効果的な治療を探求する。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、癌、特に白血病及び／又は卵巣癌を死滅させる細胞毒性ペプチドの組成物及び使用方法に関する。本発明の１つの態様は、カスパーゼ動員（ＣＡＲＤ）様ドメインを含む、癌細胞を死滅させることが可能な単離ペプチドである。単離ペプチドは、細菌、特にシュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に由来してもよい。幾つかの実施形態では、単離ペプチドは、Ｐａ−ＣＡＲＤである。他の実施形態では、単離ペプチドは、配列番号２７を含むか又はからなる。幾つかの実施形態では、単離ペプチドは、白血病細胞、線維肉腫細胞、卵巣癌細胞、及び／又は乳癌細胞を死滅させることが可能である。他の実施形態では、単離ペプチドは、その血中半減期を延長又は最適化するために、化学的に修飾されている。
【０００６】
本発明は、カスパーゼ動員（ＣＡＲＤ）様ドメイン、Ｌａｚ、Ｈ８−Ａｚｕ、及びＡｚｕ−Ｈ８を含む、癌細胞を死滅させることが可能な単離ペプチドからなる群から選択される１つ又は複数のタンパク質と細胞を接触させることにより、癌細胞を死滅させる方法にも関する。幾つかの実施形態では、癌細胞は、白血病細胞、線維肉腫細胞、卵巣癌細胞、及び乳癌細胞からなる群から選択される。この方法は、癌細胞を死滅させることが可能な１つ又は複数の細胞毒性剤と細胞を接触させることを更に含んでいてもよい。これら細胞毒性剤は、これらに限定されないが、シスプラチン、Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標）、レチノイン酸、５’−アザ−２’−デオキシシチジン、及び三酸化ヒ素であってもよい。特定の実施形態では、本方法は、癌細胞をシスプラチンと接触されることを含む。別の実施形態では、癌細胞を、１つ又は複数のタンパク質とほぼ同時に、１つ又は複数の細胞毒性剤と接触させる。
【０００７】
本発明は、癌を罹患している哺乳類患者に、カスパーゼ動員（ＣＡＲＤ）様ドメイン、Ｌａｚ、Ｈ８−Ａｚｕ、及びＡｚｕ−Ｈ８を含む、癌細胞を死滅させることが可能な単離ペプチドからなる群から選択される１つ又は複数のタンパク質を投与することを含む方法にも関する。幾つかの実施形態では、癌は、白血病、線維肉腫、卵巣癌、及び乳癌からなる群から選択される。更なる実施形態では、癌細胞を死滅させることが可能な１つ又は複数の細胞毒性剤は、患者に投与することもできる。細胞毒性剤には、これらに限定されないが、シスプラチン、Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標）、レチノイン酸、５’−アザ−２’−デオキシシチジン、及び三酸化ヒ素が含まれていてもよい。更なる実施形態では、患者に投与される追加的な細胞毒性剤は、シスプラチンである。別の実施形態では、１つ又は複数の細胞毒性剤は、１つ又は複数のタンパク質とほぼ同時に投与される。
【０００８】
本発明は、アズリン及びＬａｚのＨ．８領域を含むペプチドと細胞を接触させることにより白血病細胞を死滅させることを含む方法にも関する。更なる実施形態では、白血病細胞を、アズリン及びＬａｚのＨ．８領域を含むペプチドと同時に又はほぼ同時に接触させる。
【０００９】
本発明は、白血病を罹患している哺乳類患者に、アズリン及びＬａｚのＨ．８領域を含むペプチドを投与することを含む方法にも関する。更なる実施形態では、アズリン及びＬａｚのＨ．８領域を含むペプチドは、同時に又はほぼ同時に患者に投与される。
【００１０】
本発明は、Ｌａｚ、アズリン、Ｈ．８−Ａｚｕ、Ａｚｕ−Ｈ．８、及びカスパーゼ動員（ＣＡＲＤ）様ドメインを含む、癌細胞を死滅させることが可能な単離ペプチドからなる群から選択される１つ又は複数のタンパク質と白血病細胞を接触させることにより、白血病細胞の細胞分化を誘導することを含む方法にも関する。
【００１１】
本発明は、Ｌａｚ、アズリン、Ｈ．８−Ａｚｕ、Ａｚｕ−Ｈ．８、及びカスパーゼ動員（ＣＡＲＤ）様ドメインを含む、癌細胞を死滅させることが可能な単離ペプチドからなる群から選択される１つ又は複数のタンパク質と癌細胞を接触させることにより、癌細胞に選択的に進入することを含み、癌細胞が、白血病細胞及び卵巣癌細胞からなる群から選択される方法にも関する。
【００１２】
本発明は、Ｌａｚ、アズリン、Ｈ．８−Ａｚｕ、Ａｚｕ−Ｈ．８、及びカスパーゼ動員（ＣＡＲＤ）様ドメインを含む、癌細胞を死滅させることが可能な単離ペプチドからなる群から選択される１つ又は複数のタンパク質と癌細胞を接触させることにより、癌細胞の細胞周期停止を誘導することを含む方法にも関する。癌細胞は、白血病細胞、線維肉腫細胞、乳癌細胞、及び卵巣癌細胞からなる群から選択されてもよい。更なる実施形態では、タンパク質は、細胞のＷｅｅｌタンパク質レベルを増加させる。別の実施形態では、タンパク質は、リン酸化ＡＫＴ−Ｓｅｒ−４７３の枯渇を引き起こす。更に別の実施形態では、タンパク質は、細胞のＷｅｅｌタンパク質レベルを増加させ、且つリン酸化ＡＫＴ−Ｓｅｒ−４７３の枯渇を引き起こす。
【００１３】
本発明は、カスパーゼ動員（ＣＡＲＤ）様ドメインを含む、癌細胞を死滅させることが可能な単離ペプチドと癌細胞を接触させることにより、カスパーゼ３活性化による癌細胞のアポトーシスを誘導することを含む方法にも関する。更なる実施形態では、癌細胞は、卵巣癌細胞である。
【００１４】
本発明は、カスパーゼ動員（ＣＡＲＤ）様ドメインを含む、癌細胞を死滅させることが可能な単離ペプチドと癌細胞を接触させることにより、癌細胞のＮＦ−ｋＢシグナル伝達経路遺伝子の発現を調節することを含む方法にも関する。更なる実施形態では、癌細胞は、卵巣癌細胞である。
【００１５】
本発明は、カスパーゼ動員（ＣＡＲＤ）様ドメインを含む、癌細胞を死滅させることが可能な単離ペプチドをコードする発現ベクターにも関する。特定の実施形態では、発現ベクターは、Ｐａ−ＣＡＲＤをコードする。
【００１６】
本発明は、カスパーゼ動員（ＣＡＲＤ）様ドメインを含む、癌細胞を死滅させることが可能な単離ペプチドを含む医薬組成物にも関する。更なる実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体を更に含む。別の実施形態では、医薬組成物は、アズリン、Ｌａｚ、Ｈ．８−Ａｚｕ、及びＡｚｕ−Ｈ．８からなる群から選択されるタンパク質を更に含む。別の実施形態では、医薬組成物は、癌細胞を死滅させることが可能な１つ又は複数の細胞毒性剤を更に含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、静脈注射に適切な薬学的に許容される担体を含む。
【００１７】
本発明は、白血病を罹患している患者に、本発明で開示された医薬組成物の１つ又は複数を治療上有効量で投与することを含む方法にも関する。更なる実施形態では、医薬組成物は、静脈内、局所的、皮下、筋肉内、経口、及び腫瘍内からなる群から選択される様式で患者に投与される。
【００１８】
本発明の別の態様は、本明細書で開示された単離ペプチドの１つ又は複数コードする核酸分子である。
【００１９】
本発明の別の態様は、本明細書に記載の医薬組成物の１つ又は複数を含むキットである。
【００２０】
配列の簡単な説明
配列番号１は、ナイセリア・ゴノレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）ｌａｚ遺伝子のゲノムＤＮＡコード配列、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｙ００５３０である（ｃｔｇｇｃａｇｇｃｔ  ｔｇａｃｇｃｔｔｃｇ  ａｔａｃｇｃｔｃｔｇ  ｔｔｔｃｇｇｔｃａｇ  ｇｃｔｇｇｔｃｃｃｇ  ａａａｃｃｇｇａａａ  ａａｃｃｇｃｃｇａａ  ａａｃｃａａｔａｃｃ  ｃｔｇｃａｔｔｔｇａ  ｇｔａａｇｇｃｔｇｃ  ｇｃｔｇｇａｇａｇｔ  ｔｔｃｇｇｔｔｃｇｇ  ｃｇｇｃｇｇｃａａａ  ｇｔｔｇｇａａａａａ  ｃｇｇｃａｔｃｃｃｇ  ａａｔｔｇｇｃｇｇａ  ｇｇｃａｔｔｇｇｃａ  ａａｃｔｔｇｇｔｔａ  ｇａａｇｇｃａｔｇｇ  ｃｇｃａｔａａａａｔ  ｇｔａｔａｃｇｇｇａ  ａｔｔｔｇｔｇｔａａ  ａｃａｔｃｃｇｔｔａ  ａｔａｔｔａａｇａａ  ｇｔａａａｇｇａｔａ  ａｔｇｇｇｔｃｔａａ  ｔａｃｔａａａｇａａ  ａｔａｇｇｔｔｃｇｇ  ｇｇｔａａａａｔｔｇ  ｃｃｃｃｔｔｔｔａａ  ａｇｔａａａｃｇａｔ  ｔｇｔａａａｃｔｔｇ  ｃａｇａｃａｇｇｃｔ  ｔｔｇａｔｔｔｃａａ  ａｔｇａａａｔｔｔｇ  ｔａｇｃａａａａｔｇ  ｃｃｇｃｃｃｃｇａａ  ａｃａｔｃｔｇｔｔｔ  ｇｔｇｃａａｃｇｃｇ  ｇｃｇｇａａｔｃｔｔ  ｔｔｔｃａａｇｇｔｔ  ｔｔｇｔｔａａｔｇｇ  ｃｇｇｔｔｇｃａｃｔ  ｔｔｇａｔｔｔｃｔｇ  ｔａａａａｃｃｇａａ  ｔａｔｔａｔｔｔｔａ  ｔｃｇａｔｔｇｇａｇ  ａｔｔｔａｃｃａｔｇ  ａａａｇｃｔｔａｔｃ  ｔｇｇｃｔｃｔｇａｔ  ｔｔｃｔｇｃｃｇｃｃ  ｇｔｔａｔｃｇｇｔｔ  ｔｇｇｃｔｇｃｃｔｇ  ｃｔｃｔｃａａｇａａ  ｃｃｔｇｃｃｇｃｇｃ  ｃｔｇｃｔｇｃｃｇａ  ｇｇｃａａｃｔｃｃｔ  ｇｃｔｇｃｔｇａａｇ  ｃａｃｃｃｇｃｔｔｃ  ｃｇａａｇｃｇｃｃｔ  ｇｃｃｇｃｃｇａａｇ  ｃｔｇｃｔｃｃｔｇｃ  ａｇａｔｇｃｔｇｃｃ  ｇａａｇｃｃｃｃｔｇ  ｃｔｇｃｃｇｇｃａａ  ｔｔｇｔｇｃｇｇｃａ  ａｃｔｇｔｃｇａａｔ  ｃｃａａｃｇａｃａａ  ｔａｔｇｃａｇｔｔｃ  ａａｃａｃｃａａａｇ  ａｃａｔｃｃａａｇｔ  ｃａｇｃａａａｇｃａ  ｔｇｔａａａｇａｇｔ  ｔｔａｃｃａｔｃａｃ  ｔｃｔｇａａａｃａｔ  ａｃｃｇｇｔａｃｇｃ  ａａｃｃｃａａａｇｃ  ｃａｇｃａｔｇｇｇｔ  ｃａｃａａｃｃｔｔｇ  ｔｇａｔｔｇｃｃａａ  ａｇｃｔｇａａｇａｃ  ａｔｇｇａｃｇｇｃｇ  ｔａｔｔｔａａａｇａ  ｃｇｇｃｇｔａｇｇｔ  ｇｃｔｇｃｃｇａｔａ  ｃｃｇａｃｔａｔｇｔ  ｃａａａｃｃｔｇａｃ  ｇａｔｇｃｇｃｇｃｇ  ｔｔｇｔｔｇｃｃｃａ  ｃａｃｃａａａｃｔｇ  ａｔｃｇｇｃｇｇｃｇ  ｇｃｇａａｇａｇｔｃ  ｔｔｃｃｃｔｇａｃｔ  ｃｔｇｇａｔｃｃｔｇ  ｃｃａａａｔｔｇｇｃ  ｔｇａｃｇｇｃｇａｃ  ｔａｃａａａｔｔｔｇ  ｃｃｔｇｃａｃｔｔｔ  ｃｃｃｇｇｇｔｃａｃ  ｇｇｔｇｃｔｔｔｇａ  ｔｇａａｃｇｇｃａａ  ａｇｔｇａｃｔｔｔｇ  ｇｔｃｇａｔｔａａｔ  ｃｃｇｃｔｔａａａｇ  ｔｃｔｃａａａａｇａ  ｃｇｇａｃａｇｃｃｔ  ｇｃｔｔｔｇｔｇｃａ  ｇｇｃｔｇｔｔｔｔａ  ｔｔａｔａａａａｔｇ  ａｃｔｇｃｔｔｇａａ  ａａｇｔｇｃｃｃｃｇ  ｔｔｇａｇａａｃｇａ  ａａａｃａｔｇａａｔ  ｃｃｇｔｔｔｇａａａ）。
【００２１】
配列番号２は、シュードモナス・エルギノーサアズリン遺伝子のゲノムＤＮＡコード配列である（ｃｔｔｔｔｔｃａｔｇ  ｃａｇｃｇｇａｔｃｇ  ｃｔｃｇｃｇｃａｔｃ  ａｃｔｔｃａｇｇｇｔ  ｃａｇｇｇｔｇｃｃｃ  ｔｔｃａｔｃａｇｃｇ  ｃｇｇａｇｔｇｇｃｃ  ｃｇｇｇａａｇｇｔｇ  ｃａｇａａｇａａｃａ  ｔｇｔａｃｔｇｃｔｃ  ｇｃｃｔｔｃｃｔｔｃ  ａｇｃｔｔｇｇａｇａ  ｃｇｔｃｇａａｇｇｔ  ｃａｃｃｇａｇｔｃｃ  ｔｔｃｔｃｇｃｃｃｇ  ａｇｃｃｇａｔｃａｇ  ｃｔｔｇｇｔｇｔｇｇ  ｇｃｇａｔｇａｃａｃ  ｇｇｃｔｇｔｃｇｔｃ  ｇｇｇｃｔｔｃａｇｇ  ｔａａｔｃｃｔｔｇｔ  ｃｃａｇｇｃｃｇｇａ  ａｇｃｃａｔｇｃｃｇ  ｔｃｇｇｔｇａｃｃａ  ｃｇｃｃｃｔｇｃａｔ  ｇｔｃｇｇｃｇｇｃｇ  ｇｔｇｃｔｃａｇｔａ  ｃｃｃａｇｔｔｇｔｇ  ｇｃｃｃａｔｇａｃｇ  ｔｔｃｔｔｃｇｇｃａ  ｇｇｔｔｇｃｃｇｇｇ  ｇｔｇｇｇａｃａｇｇ  ｔｔｇａｃｇｇｔｇａ  ａｃｔｇｃｔｔｇｃａ  ｇｃｔｃｔｔｇｔｃｇ  ａｃｇｇｔｇａｔｇｇ  ｃａｔｔｇｇｔｇｔｔ  ｇａａｃｔｇｃａｔｃ  ｔｇｇｔｃｇｔｔａｃ  ｃｃｔｇｇａｔｇｔｃ  ｃａｃｃｇａｇｃａｃ  ｔｃｇｇｃａｇｃｃａ  ｇｃａｇｔｇｇｃｇｃ  ａｃｔｇａｇｃａｇｇ  ｇａｃａｇｃａｇｇｇ  ａｔａｃｃｇｃａｇｃ  ｇａｇｔｔｔａｃｇｔ  ａｇｃａｔｇｇａｇｃ  ａｇｃｃｔｃｃｔａｇ  ｇｃａｇｇｔｔｇｇｇ  ｃｇａｔｇａａｔｃｃ  ｔｇａａａｇａｇｃａ  ｇａｃｔｇｃｃｃｇａ  ｔｃｇｇｇｃａｃｃｇ）。
【００２２】
配列番号３は、ナイセリア・ゴノレアｌａｚ遺伝子のＨ．８領域のゲノムＤＮＡコード配列である（ｔｇｃｔｃｔｃａａｇ  ａａｃｃｔｇｃｃｇｃ  ｇｃｃｔｇｃｔｇｃｃ  ｇａｇｇｃａａｃｔｃ  ｃｔｇｃｃｇｇｔｇａ  ａｇｃａｃｃｃｇｃｔ  ｔｃｃｇａａｇｃｇｃ  ｃｔｇｃｃｇｃｃｇａ  ａｇｃｔｇｃｔｃｃｔ  ｇｃａｇａｔｇｃｔｇ  ｃｃｇａａｇｃｃｃｃ  ｔｇｃｔｇｃｃ）。
【００２３】
配列番号４は、ナイセリア・ゴノレアのＬａｚコード遺伝子（ｌａｚ）をＰＣＲ増幅するための順方向プライマーである（ｃｃｇｇａａｔｔｃｃ  ｇｇｃａｇｇｇａｔｇ  ｔｔｇｔａａａｔａｔ  ｃｃｇ）。
【００２４】
配列番号５は、ナイセリア・ゴノレアのＬａｚコード遺伝子（ｌａｚ）をＰＣＲ増幅するための逆方向プライマーである（ｇｇｇｇｔａｃｃｇｃ  ｃｇｔｇｇｃａｇｇｃ  ａｔａｃａｇｃａｔｔ  ｔｃａａｔｃｇｇ）。  
【００２５】
配列番号６は、ｐＵＣ１８−ｌａｚの３．１ｋｂ断片をＰＣＲ増幅するための順方向プライマーである（ｇｇｃａｇｃａｇｇｇ  ｇｃｔｔｃｇｇｃａｇ  ｃａｔｃｔｇｃ）。
【００２６】
配列番号７は、ｐＵＣ１８−ｌａｚの３．１ｋｂ断片をＰＣＲ増幅するための逆方向プライマーである（ｃｔｇｃａｇｇｔｃｇ  ａｃｔｃｔａｇａｇｇ  ａｔｃｃｃｇ）。
【００２７】
配列番号８は、ｐＵＣ１９−ｐａｚの０．４ｋｂ断片をＰＣＲ増幅するための順方向プライマーである（ｇｃｃｇａｇｔｇｃｔ  ｃｇｇｔｇｇａｃａｔ  ｃｃａｇｇ）。
【００２８】
配列番号９は、ｐＵＣ１９−ｐａｚの０．４ｋｂ断片をＰＣＲ増幅するための逆方向プライマーである（ｔａｃｔｃｇａｇｔｃ  ａｃｔｔｃａｇｇｇｔ  ｃａｇｇｇｔｇ）。
【００２９】
配列番号１０は、ｐＵＣ１９−ｐａｚの３．３ｋｂ断片をＰＣＲ増幅するための順方向プライマーである（ｃｔｔｃａｇｇｇｔｃ  ａｇｇｇｔｇｃｃｃｔ  ｔｃａｔｃ）。  
【００３０】
配列番号１１は、ｐＵＣ１９−ｐａｚの３．３ｋｂ断片をＰＣＲ増幅するための逆方向プライマーである（ｃｔｇｃａｇｇｔｃｇ  ａｃｔｃｔａｇａｇｇ  ａｔｃｃｃｇ）。
【００３１】
配列番号１２は、ｐＵＣ１８−ｌａｚの０．１３ｋｂ断片をＰＣＲ増幅するための順方向プライマーである（ｔｇｃｔｃｔｃａａｇ  ａａｃｃｔｇｃｃｇｃ  ｇｃｃｔｇｃ）。
【００３２】
配列番号１３は、ｐＵＣ１８−ｌａｚの０．１３ｋｂ断片をＰＣＲ増幅するための逆方向プライマーである（ｔａｇｇａｔｃｃｔｔ  ａｇｇｃａｇｃａｇｇ  ｇｇｃｔｔｃｇｇｃａ  ｇｃａｔｃｔｇｃ）。  
【００３３】
配列番号１４は、ｐＧＥＸ−５Ｘ−３からＧＳＴコード遺伝子をＰＣＲ増幅するための順方向プライマーである（ｃｇａｇｃｔｃａｔｇ  ｔｃｃｃｃｔａｔａｃ  ｔａｇｇｔｔａｔｔｇ  ｇ）。
【００３４】
配列番号１５は、ｐＧＥＸ−５Ｘ−３からＧＳＴコード遺伝子をＰＣＲ増幅するための逆方向プライマーである（ｃｃｃａａｇｃｔｔｔ  ｃａｇｇｇｇａｔｃｃ  ｃａｃｇａｃｃｔｔｃ  ｇａｔｃａｇａｔｃｃ）。
【００３５】
配列番号１６は、ｐＵＣ１８−ｌａｚからｌａｚのシグナルペプチド及びＨ．８コード領域をＰＣＲ増幅するための順方向プライマーである（ｇｇａａｔｔｃａｔａ  ｔｇａａａｇｃｔｔａ  ｔｃｔｇｇｃ）。
【００３６】
配列番号１７は、ｐＵＣ１８−ｌａｚからｌａｚのシグナルペプチド及びＨ．８コード領域をＰＣＲ増幅するための逆方向プライマーである（ｃｃｇｇａａｔｔｃｇ  ｇｃａｇｃａｇｇｇｇ  ｃｔｔｃｇｇｃ）。
【００３７】
配列番号１８は、ｐＵＣ１８−ｌａｚからＨ．８コード領域をＰＣＲ増幅するための順方向プライマーである（ｃｇｇｇａｔｃｃｃｃ  ｔｇｃｔｃｔｃａａｇ  ａａｃｃｔｇｃｃｇｃ  ｇｅｅ）。  
【００３８】
配列番号１９は、ｐＵＣ１８−ｌａｚからＨ．８コード領域をＰＣＲ増幅するための逆方向プライマーである（ｃｇｇａａｔｔｃｔｔ  ａｇｇｃａｇｃａｇｇ  ｇｇｃｔｔｃｇｇｃａ  ｇｃａｔｃｔｇｃａｇ  ｇ）。
【００３９】
配列番号２０は、ｐＧＥＸ−５Ｘ−３−Ｈ．８からＧＳＴ−Ｈ．８融合体領域をＰＣＲ増幅するための順方向プライマーである（ｃｇａｇｃｔｃａｔｇ  ｔｃｃｃｃｔａｔａｃ  ｔａｇｇｔｔａｔｔｇ  ｇ）。
【００４０】
配列番号２１は、ｐＧＥＸ−５Ｘ−３−Ｈ．８からＧＳＴ−Ｈ．８融合体領域をＰＣＲ増幅するための逆方向プライマーである（ｃｃｇｃｔｃｇａｇｔ  ｃａｇｇｃａｇｃａｇ  ｇｇｇｃｔｔｃｇｇｃ  ａｇ）。
【００４１】
配列番号２２は、ナイセリア・ゴノレア株Ｆ６２Ｌａｚタンパク質のアミノ酸配列、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｙ００５３０である（Ｃｙｓ  Ｓｅｒ  Ｇｌｎ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ａｓｐ  Ａｓｎ  Ｍｅｔ  Ｇｌｎ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  Ａｓｐ  Ｉｌｅ  Ｇｌｎ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ｇｌｕ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｈｉｓ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｇｌｎ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｍｅｔ  Ｇｌｙ  Ｈｉｓ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｉｌｅ  Ａｌａ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ａｓｐ  Ｍｅｔ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ  Ｖａｌ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ｖａｌ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ  Ａｌａ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ｐｈｅ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｍｅｔ  Ａｓｎ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ａｓｐ）。
【００４２】
配列番号２３は、シュードモナス・エルギノーサアズリンのアミノ酸配列である（Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ｃｙｓ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ａｓｐ  Ｉｌｅ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｍｅｔ  Ｇｌｎ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ  Ｔｈｒ  Ａｓｎ  Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ａｓｐ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ｇｌｎ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｈｉｓ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ａｓｎ  Ｖａｌ  Ｍｅｔ  Ｇｌｙ  Ｈｉｓ  Ａｓｎ  Ｔｒｐ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｍｅｔ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｍｅｔ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ｌｙｓ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｖａｌ  Ｉｌｅ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｐｈｅ  Ａｓｐ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ｇｌｕ  Ｇｌｎ  Ｔｙｒ  Ｍｅｔ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ｐｈｅ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｍｅｔ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ）。
【００４３】
配列番号２４は、ナイセリア・ゴノレア株Ｆ６２Ｌａｚタンパク質に由来するＨ．８領域のアミノ酸配列である（Ｃｙｓ  Ｓｅｒ  Ｇｌｎ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ａｌａ）。
【００４４】
配列番号２５は、ペプタペプチド（ｐｅｐｔａｐｅｐｔｉｄｅ）モチーフのアミノ酸配列である（Ａｌａ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｐｒｏ）。  
【００４５】
配列番号２６は、Ｐ．エルギノーサアルギニンデイミナーゼ（ＡＤＩ）のアミノ酸配列である（Ｍｅｔ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ  Ｍｅｔ  Ｖａｌ  Ｃｙｓ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｇｌｎ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｃｙｓ  Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｖａｌ  Ｉｌｅ  Ｔｒｐ  Ｖａｌ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ｈｉｓ  Ｐｈｅ  Ａｓｐ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  Ｍｅｔ  Ａｒｇ  Ｇｌｕ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｉｌｅ  Ａｓｐ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｍｅｔ  Ｈｉｓ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｇｌｕ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｔｒｐ  Ｉｌｅ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ｔｒｐ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｍｅｔ  Ｔｙｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｕ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ａｓｎ  Ｔｈｒ  Ｇｌｎ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ｔｈｒ  Ｃｙｓ  Ｔｒｐ  Ｉｌｅ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ｍｅｔ  Ｔｙｒ  Ｔｒｐ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｇｌｕ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ｔｙｒ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ  Ｈｉｓ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ｐｈｅ  Ａｌａ  Ａｓｎ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ｐｈｅ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ｔｒｐ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ａｓｐ  Ｌｙｓ  Ａｓｐ  Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｖａｌ  Ｍｅｔ  Ｐｒｏ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｍｅｔ  Ｇｌｙ  Ｇｌｕ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ  Ａｌａ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ａｒｇ  Ｖａｌ  Ｉｌｅ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｍｅｔ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ａｓｐ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｐｒｏ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｍｅｔ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ｔｈｒ  Ｐｈｅ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｖａｌ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ａｒｇ  Ｇｌｕ  Ｇｌｎ  Ｔｒｐ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ａｓｎ  Ｖａｌ  Ｖａｌ  Ｃｙｓ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｖａｌ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ａｒｇ  Ａｓｎ  Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ｔｈｒ  Ａｓｎ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｈｉｓ  Ｃｙｓ  Ｍｅｔ  Ｔｈｒ  Ｃｙｓ  Ｐｒｏ  Ｉｌｅ  Ｖａｌ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｉｌｅ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ）。  
【００４６】
配列番号２７は、Ｐ．エルギノーサＡＤＩのＣＡＲＤ領域、残基７５〜２２５のアミノ酸配列である（Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｇｌｕ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｔｒｐ  Ｉｌｅ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ｔｒｐ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｍｅｔ  Ｔｙｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｕ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ａｓｎ  Ｔｈｒ  Ｇｌｎ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ｔｈｒ  Ｃｙｓ  Ｔｒｐ  Ｉｌｅ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ｍｅｔ  Ｔｙｒ  Ｔｒｐ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｇｌｕ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ｔｙｒ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ  Ｈｉｓ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ｐｈｅ  Ａｌａ  Ａｓｎ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ｐｈｅ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ｔｒｐ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ａｓｐ  Ｌｙｓ  Ａｓｐ  Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ）。
【００４７】
配列番号２８は、Ｐ．エルギノーサＡＤＩの遺伝子のＣＡＲＤモチーフをＰＣＲ増幅するための順方向プライマーのヌクレオチド配列である（ＡＴＧＣＡＣＡＡＴＣ  ＴＧＣＴＧＡＣＣＧＡ  ＧＡＣＣＡＴＣＣＡＧ）。
【００４８】
配列番号２９は、Ｐ．エルギノーサＡＤＩの遺伝子のＣＡＲＤモチーフをＰＣＲ増幅するための逆方向プライマーのヌクレオチド配列である（ＣＡＧＧＴＣＧＡＧＧ  ＡＧＣＣＧＴＧＧＴＣ  ＣＴＴＧＴＣ）。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】図１は、ナイセリア・ゴノレア由来のｌａｚ（Ａ）及びシュードモナス・エルギノーサ由来のｐａｚ（Ｂ）の概略図である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）にクローニングし高発現させるためのＰ．エルギノーサアズリン遺伝子は、アズリン遺伝子自体（ｐａｚ）及びその周辺質位置を決定するシグナルペプチド（ｐｓｐ）配列で構成されていた（Ｂ）。ｌａｚのＨ．８領域を、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｌ）シグナル配列ｎｓｐを含むｐａｚ遺伝子の５’末端（ｐＵＣ１８−Ｈ．８−ｐａｚ）（Ｃ）、又はｐａｚ遺伝子の３’末端（ｐＵＣ１９−ｐａｚ−Ｈ．８）（Ｄ）のいずれかにインフレームでクローニングした。構築体を調製するための詳細な手順は、実施例１に示されている。ｎａｚ、ｌａｚ遺伝子に存在するナイセリア・ゴノレアのアズリン様配列；ｎｓｐ、ナイセリアシグナルペプチド配列。いずれの場合でも、シグナルペプチド配列は切断されて、成熟Ｐａｚ（周辺質）及びＬａｚ（表面露出）タンパク質が産生される。（Ｅ）Ｌａｚ、Ｐａｚ、及び融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。Ｌａｚ、Ｈ．８−Ｐａｚ、又はＰａｚ−Ｈ．８等のＨ．８融合タンパク質（全て約１７ｋＤａ）の変則的泳動は、ラピデイト化（ｌａｐｉｄａｔｅｄ）Ｈ．８含有タンパク質について以前に記述されている（Ｃａｎｎｏｎ、Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．２巻：Ｓ１〜Ｓ４頁（１９８９年）；Ｆｉｓｅｔｔｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８巻：４６２５２〜４６２６０頁（２００３年））。
【図２】図２は、Ｈ．８−Ｐａｚ融合タンパク質が種々の癌細胞に対して細胞毒性である程度を例示するグラフである。（Ａ）神経膠芽腫ＬＮ−２２９細胞に対する、合成Ｈ．８ペプチド、Ｐａｚ、Ｌａｚ、並びにＰａｚのカルボキシ末端（Ｐａｚ−Ｈ．８）及びＰａｚのアミノ末端（Ｈ．８−Ｐａｚ）でのＨ．８融合体の細胞毒性。細胞を、３つの異なる濃度（１０、２０、及び４０μＭ）のタンパク質で、６、１２、及び２４時間処理した。ＭＴＴアッセイを実施して、細胞毒性（細胞死パーセント）の根拠となる生細胞の程度を測定した。細胞毒性パーセントを算出するために、未処理生細胞の値を１００％として、Ｐａｚ、Ｌａｚ、及びＨ．８−融合タンパク質で処理した試料における生細胞の数を決定した。その後、細胞毒性の程度（％）を、死細胞の数から決定した。（Ｂ）ヒト乳癌ＭＣＦ−７細胞に対するＨ．８ペプチド、Ｐａｚ、Ｐａｚ−Ｈ．８、Ｈ．８−Ｐａｚ、及びＬａｚの細胞毒性。処理条件は全て、上記（Ａ）と同様である。
【図３】図３は、種々の蛍光標識アズリン関連タンパク質の、神経膠芽腫ＬＮ−２２９及び乳癌ＭＣＦ−７細胞への進入を示す図である。（Ａ）Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８が結合されたＨ．８ペプチド、Ｐａｚ、Ｐａｚ−Ｈ．８、Ｈ．８−Ｐａｚ、及びＬａｚ（各々２０μＭ）を、ＬＮ−２２９細胞と共に、３７℃で３０分間カバーガラス上にてインキュベートし、その後画像を撮影した。（Ｂ）共焦点顕微鏡で視覚化した、（Ａ）に記述されている種々のＡｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８結合タンパク質のＭＣＦ−７細胞内への内部移行。（Ｃ）Ｌａｚの内部移行を、共焦点顕微鏡で視覚化した。種々の濃度（２、４、８、及び１６μＭ）の蛍光標識Ｌａｚを、３７℃で３０分間ＬＮ−２２９細胞と共にインキュベートした。核は、ＤＡＰＩ（４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）で青色標識されている。（Ｄ）Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８結合Ｌａｚ（１０μＭ）を、ＬＮ−２２９細胞と共に種々の期間（５、１０、２０、及び３０分間）３７℃でインキュベートした。内部移行を、共焦点顕微鏡で視覚化した。（Ｅ）Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８結合Ｐａｚ（１０μＭ）を、ＬＮ−２２９細胞と共にカバーガラス上で３７℃にて種々の時間インキュベートし、その後画像を撮影した。測定可能な蛍光は、ほとんど検出されなかった（Ｅ）。
【図４】図４は、図３Ａ〜Ｄの共焦点顕微鏡画像に見出される蛍光の定量化を示す棒グラフである。（Ａ）図３Ａの画像における蛍光の定量化。アズリンタンパク質の蛍光の定量化は、Ａｄｏｂｅ（登録商標）Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（登録商標）を使用することにより実施した。エラーバーは、単一試料中の３つの異なる細胞の蛍光の標準偏差を表す。（Ｂ）図３Ｂの画像における蛍光の定量化。定量化を図４Ａのように実施した。（Ｃ）図３Ｃの画像における蛍光の定量化。定量化を図４Ａのように実施した。（Ｄ）図３Ｄの画像における蛍光の定量化。定量化を図４Ａのように実施した。
【図５】図５は、細胞内の標識融合タンパク質の画像、並びに取込み及び細胞毒性のグラフをそれぞれ示す図である。Ｈ．８−ＧＳＴ融合タンパク質と併用処理することにより、神経膠芽腫ＬＮ−２２９細胞へのＡｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８標識Ｐａｚの取込みが容易になる。未標識２０μＭの（Ａ）Ｈ．８、（Ｂ）ＧＳＴ、（Ｃ）ＧＳＴ−Ｈ．８、（Ｄ）Ｈ．８−ＧＳＴ、（Ｅ）ＰＢＳ緩衝液、及び２０μＭのＡｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８結合Ｐａｚを、３７℃で３０分間ＬＮ−２２９細胞と共にインキュベートした。内部移行を、共焦点顕微鏡で視覚化した。（Ｆ）Ｐａｚが存在する又はしない場合の、合成Ｈ．８ペプチド、ＧＳＴ、及びＧＳＴ−Ｈ．８／Ｈ．８−ＧＳＴ融合誘導体の細胞毒性。およそ５×１０３個のＬＮ−２２９細胞を９６ウエル培養プレートに播種し、２０μＭのＰａｚと共に（＋Ｐａｚ）又は伴わずに（−Ｐａｚ）、各々２０μＭのＨ．８ペプチド、ＧＳＴ、ＧＳＴ−Ｈ．８、Ｈ．８−ＧＳＴ、又は同体積のＰＢＳ緩衝液で２４時間処理した。
【図６】図６は、ＩＲｄｙｅ（登録商標）８００ＣＷ（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、リンカーン、ネブラスカ州）が結合されたＰａｚ、Ｈ．８−Ｐａｚ、及びＬａｚを注射したマウスの脳画像である。（Ａ）生存マウスの脳画像。ＩＲｄｙｅ（登録商標）８００ＣＷが結合された５００μｇのＰａｚ、Ｈ．８−Ｐａｚ、及びＬａｚを、生存ヌードマウスに腹腔内注射した。２４時間後、マウスを犠牲し、脳を摘出し、蛍光をＬＩ−ＣＯＲ  Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標）赤外線画像化システムで検出及び測定した。（Ｂ）（Ａ）のように処理したヌードマウス脳の頭側中脳領域の画像。マウス脳を水平に切断し、画像を撮影した。
【図７】図７は、大腸菌におけるＨ．８−Ｇｓｔ融合タンパク質の局在化に関するＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロット、及び共焦点顕微鏡画像である。（Ａ）クローニングされたｇｓｔ、Ｈ．８−ｇｓｔ、又はｇｓｔ−Ｈ．８遺伝子を有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、０．１ｍＭのＩＰＴＧと共に３７℃で培養した。細胞ペレットをＰＢＳで２回洗浄し、全細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動した。タンパク質検出にはクマシーブルー染色を使用した。（Ｂ）上記の手順を繰り返したが、今回は、全細胞溶解物及び細胞膜周辺腔の内容物を両方とも別々に単離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（２０μｇタンパク質）で泳動し、ＧＳＴ又はＧＳＴ−Ｈ．８融合タンパク質を、モノクローナル抗−ＧＳＴ抗体を用いたウエスタンブロットで検出して、タンパク質の総濃度及び周辺質濃度を決定した。（Ｃ）クローニングされたｇｓｔ、Ｈ．８−ｇｓｔ、又はｇｓｔ−Ｈ．８遺伝子を保持する大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ）細胞を、０．４ｍＭのＩＰＴＧと共に３７℃で培養した（表２）。これら細菌培養の各々１ｍｌを遠心分離し、その結果生じた細菌ペレットを収集した。ＰＢＳで２回洗浄した後、抗ＧＳＴ抗体（１：２０００）を含有する１ｍｌの１％ＦＢＳ−ＰＢＳを添加した。細胞懸濁液を１時間インキュベートし、その後ＰＢＳで２回洗浄した。細菌細胞を、ＦＩＴＣ結合抗ウサギＩｇＧと共に１％ＦＢＳ−ＰＢＳ中で３０分間インキュベートした。未結合抗体を除去するために細胞を再び洗浄し、氷上にでエタノールで固定した。ＤＡＰＩ（青色着色を付与する）で処理した大腸菌試料を、共焦点顕微鏡（×１００対物レンズ）で観察し、単一細胞の撮影も行った。（Ｄ）ｐＵＣ１９−ｐａｚ（Ｐ．エルギノーサアズリン）、ｐＵＣ１９−ｌａｚ（ナイセリア）、ｐＵＣ１８−Ｈ．８−ｐａｚ、又はｐＵＣ１８−ｐａｚ−Ｈ．８を保持する大腸菌細胞を、３７℃にて０．１ｍＭ  ＩＰＴＧの存在下で終夜培養した。このような培養の０．５ｍｌを遠心分離して、その結果生じた細菌ペレットを、冷却ＰＢＳで２回洗浄した。１ｍｌの１％ＦＢＳ−ＰＢＳ中の抗アズリン抗体（１：５００）を添加し、氷上で１時間インキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄した後、ＦＩＴＣ結合抗ウサギ抗体を添加し、氷上で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄し、冷却エタノールで固定した。細菌試料を、共焦点顕微鏡（×１００対物レンズ）で観察した。
【図８】図８は、ＭＴＴアッセイにより決定された細胞毒性を示すグラフである。（Ａ及びＢ）細胞毒性は、１０μＭのＬａｚ、アズリン（Ａｚｕ）、Ｈ８−Ａｚｕ、及びＡｚｕ−Ｈ８、又は陽性対照としての５μＭ  ＤＡＣで処理されたＨＬ６０細胞（Ａ）及びＫ５６２細胞（Ｂ）のＭＴＴアッセイで、２４時間、４８時間、及び７２時間後に決定した。（Ｃ）低濃度：３．７５ｎＭ、３７．５ｎＭ、７５ｎＭ、２．５μＭ、５μＭ、及び１０μＭのＬａｚ、Ａｚｕ、Ｈ８−Ａｚｕ、Ａｚｕ−Ｈ８、又は陽性対照としての５μＭ  ＤＡＣで処理されたＫ５６２細胞。（Ｄ）様々な濃度、１μＭ、２．５μＭ、５μＭ、及び１０μＭのＬａｚ、Ａｚｕ、Ｈ８−Ａｚｕ、Ａｚｕ−Ｈ８、又は５μＭのＤＡＣで処理されたＨＬ６０細胞のＭＴＴアッセイにより決定された細胞毒性。データは、三重反復で行われた３つの別々の実験の平均（±標準誤差）で表されている。数値は全て、対照と有意に異なっている（ｐ＜０．０５）。
【図９】図９は、ＨＬ６０細胞及びＫ５６２細胞においてＬａｚ及びアズリンにより誘導された細胞形態の変化に関する蛍光顕微鏡画像である。Ｌａｚは、蛍光顕微鏡により示されているように、ＨＬ６０細胞及びＫ５６２細胞の形態変化を誘導する。（Ａ）及び（Ｂ）は、未処理ＨＬ６０細胞及びＫ５６２細胞を表す。１０μＭのＬａｚで４８時間処理されたＨＬ６０細胞（Ｃ）又はＫ５６２細胞（Ｄ）は分化を起こし、分化は、その後細胞アポトーシスに繋がるプロセスである。矢印は、分化した肉芽腫性細胞を指している。細胞毒性は高かったが、１０μＭのアズリンで４８時間処理されたＨＬ６０細胞（Ｅ）又はＫ５６２細胞（Ｆ）で見られる形態変化は、より少ない。
【図１０】図１０は、ＨＬ６０細胞及びＫ５６２細胞内へのＬａｚ及びアズリンの選択的進入を示す共焦点顕微鏡の画像である。パネル１：アズリン及びＬａｚはいずれも、１０μＭ濃度で１時間インキュベーションした後、正常末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）に進入しない（Ａ及びＢ）。アズリンは、Ｌａｚと同様に（Ｃ）、１時間のインキュベーション後にＫ５６２細胞に進入する（Ｄ）。アズリンは、Ｌａｚと同様に（Ｅ）、１時間のインキュベーション後にＨＬ６０細胞に進入する（Ｆ）。パネル２：対照Ｋ５６２細胞と比較して、Ａｚｕ−Ｈ８、Ｈ８−Ａｚｕは、Ｌａｚと同様に、そのようなＫ５６２細胞に進入する。
【図１１】図１１は、アズリン、Ｌａｚ、及びＤＡＣの非存在下及び存在下での細胞周期進行を図表化にするグラフである。Ｋ５６２細胞を、以前に記述されているように１０μＭのＬａｚ、アズリン、及び５μＭのＤＡＣで４８時間処理し、固定し、染色し、ＤＮＡ含有量を分析した。
【図１２】図１２は、免疫ブロットの画像である。この図は、細胞質抽出物及び核抽出物における、Ｌａｚ及びＰａ−ＣＡＲＤで処理されたＫ５６２及びＨＬ−６０細胞中のタンパク質の免疫ブロットによるＡＫＴ（ＡＫＴ−Ｐ−Ｓｅｒ４７３）のリン酸化状態及びＷｅｅｌタンパク質レベルの分析を提供する。未処理細胞の対照と比較した、１０μＭのＬａｚ又は１０μＭのＰａ−ＣＡＲＤで４８時間処理した後のＨＬ６０細胞及びＫ５６２細胞に由来するＷｅｅｌ及びホスホ−ＡＫＴセリン４７３のレベルを比較する、細胞質タンパク質及び核タンパク質のウエスタンブロット分析が示されている。
【図１３】図１３は、白血病細胞に対して細胞毒性活性を示すＰ．エルギノーサ由来のＡＤＩのＣＡＲＤドメインの概略図である。（Ａ）構造に基づく配列アラインメントが示すように、ＣＡＲＤドメインは、Ｐａ−ＡＤＩ及びＭａ−ＡＤＩに存在するが、ＤＤＡＨ及びＡＧＡＴ等のグアニジノ基を修飾するスーパーファミリー酵素の他のメンバーには存在しない。ＣＡＲＤドメインは、哺乳類カスパーゼ−９．ＤＤＡＨ、ジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ；ＡＧＡＴ、アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼのＣＡＲＤドメインである。β−ストランド及びα−ヘリックスは、それぞれ矢印及び細長い帯として示されている。Ｉ〜Ｖのローマ数字は、５つのββαβサブユニットである。ｃｌｉｐ部分（α−ヘリックスモジュール）は、Ｐａ−ＡＤＩ、及びカスパーゼ−９タンパク質分子のＣＡＲＤドメインを形成する６α−ヘリックスモジュールに対して構造的相同性を保持するＭ．アルギニニ（Ｍ．ａｒｇｉｎｉｎｉ）ＡＤＩ（Ｍａ−ＡＤＩ）に見られる。Ｎ，Ｎ−末端；Ｃ，Ｃ−末端。（Ｂ）Ｐ．エルギノーサに由来する精製された４６ｋＤａのＡＤＩ及び１７ｋＤａのＣＡＲＤタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの泳動。（Ｃ）線維肉腫（ＨＴ−１０８０）、乳癌（ＭＣＦ−７）、及び白血病（ＨＬ６０）細胞に対するＰａ−ＡＤＩ及びＰａ−ＣＡＲＤの細胞毒性活性。細胞を、１０μＭのＰａ−ＡＤＩ又はＰａ−ＣＡＲＤで４８時間インキュベートし、その後細胞生存率をＭＴＴアッセイで決定した。
【図１４】図１４は、マイコプラズマ・アルギニニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｇｉｎｉｎｉ）及びシュードモナス・エルギノーサに由来するアルギニンデイミナーゼ（ＡＤＩ）酵素の構造的特徴を示す画像である。（Ａ）Ｐ．エルギノーサＡＤＩ（１ＲＸＸ＿Ａ）のリボン図であり、２つのドメインが強調されている（ＭｏｌＭｏｌプログラム）。（Ｂ）ここにあるのは、図１３Ａで示されている図の写しである。（Ｃ）記載されているＰ．エルギノーサＡＤＩ（Ｐａ−ＡＤＩ）の全体的な折り畳み構造及びトポロジーを示す模式図である。
【図１５】図１５は、Ｐａ−ＡＤＩ及びＰａ−ＣＡＲＤの精製及びアルギニンデイミナーゼ酵素活性を示すゲル画像及びグラフである。（Ａ）Ｐ．エルギノーサに由来する精製ＡＤＩ及びＣＡＲＤタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの泳動。（Ｂ）精製Ｐａ−ＡＤＩ及びＰａ−ＣＡＲＤの３７℃及びｐＨ７．２におけるＡＤＩ活性の動力学。酵素反応の産物であるシトルリンを、４９０ｎｍで測定した。Ｐａ−ＣＡＲＤのアルギニンデイミナーゼ酵素活性は、検出されなかった。
【図１６】図１６は、Ｐａ−ＣＡＲＤが、一連の癌細胞に対してＰａ−ＡＤＩより高い細胞毒性を有することを示すグラフである。（Ａ）線維肉腫（ＨＴ−１０８０）、乳癌（ＭＣＦ−７）、及び卵巣癌（ＳＫＯＶ−３）細胞を、２０μＭのＰａ−ＡＤＩ又はＰａ−ＣＡＲＤと共に４８時間インキュベートし、その後細胞生存率をＭＴＴアッセイで決定した。１ウエル当たりの生細胞数の平均（±標準誤差）を、３つの実験から三重重複培養で決定した。数値は全て、対照と有意に異なっている（ｐ＜０．０５）。（Ｂ）Ｐａ−ＣＡＲＤにより示された、卵巣癌ＳＫＯＶ−３細胞に対する用量依存的細胞毒性。時間（２４、４８、及び７２時間）の関数として表されている。（Ｃ）同じ実験を、Ｐａ−ＡＤＩを用いて実施した。１ウエル当たりの生細胞数の平均（±標準誤差）を、Ａに記述されているように３つの実験から三重重複培養で決定した（ｐ＜０．０５）。
【図１７】図１７は、卵巣癌ＳＫＯＶ−３細胞におけるＰａ−ＣＡＲＤ、アズリン、及びシスプラチンの比較細胞毒性効果を示すグラフである。（Ａ）全て２０μＭのＰａ−ＡＤＩ、Ｐａ−ＣＡＲＤ、アズリン、及びシスプラチンを、ＳＫＯＶ−３細胞又は正常卵巣ＨＯＳＥ６−３細胞のいずれかと共に４８時間インキュベートし、その後細胞生存率をＭＴＴアッセイで決定した。（Ｂ）Ｐａ−ＣＡＲＤは、ＳＫＯＶ−３細胞を用いた個々の処理と比較して、シスプラチンとの相加効果をある程度示す。
【図１８】図１８は、Ｐａ−ＣＡＲＤは、カスパーゼ活性化によりＳＫＯＶ−３細胞でアポトーシスを誘導するが、ＨＯＳＥ６−３細胞では誘導しないことを示す画像である。ｉｎ  ｓｉｔｕ細胞死検出フルオレセインキット（Ｒｏｃｈｅ社製）を使用してフルオレッセインタグ化ｄＵＴＰの組込みを測定することによりアポトーシス誘導性ＤＮＡ鎖切断を検出するために、ＴＵＮＥＬアッセイを使用した。ＳＫＯＶ−３細胞及びＨＯＳＥ６−３細胞を、８ウエルＬａｂ  Ｔｅｋチャンバースライドで増殖させ、１０μＭのＰａ−ＣＡＲＤ、Ｐａ−ＡＤＩ、及びアズリンと共に４８時間インキュベートした。未処理陰性対照又はＢＳＡ処理陰性対照も並行して維持した（最下段の行）。細胞核を、ＤＡＰＩで青色染色した。緑色（Ａ）及び青色（Ｂ）チャネル下で観察された細胞、並びに重ね合わせ画像（Ｃ）（シアン色）が示されている。
【図１９】図１９は、Ｐａ−ＣＡＲＤによるカスパーゼ活性化を示すグラフである。カスパーゼ活性は、Ｐｒｏｍｅｇａ社から購入したカスパーゼ−ＧｌｏＴＭ３／７アッセイキットで測定した。Ｐａ−ＡＤＩ及びＰａ−ＣＡＲＤを２つの異なる濃度で使用して、用量応答効果を評価した。カスパーゼ活性の増加は、薬物処理をしない対照と比較した倍数増として表されている。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
定義
本明細書で使用される場合、用語「細胞」は、「単一細胞」と特に記述されていない限り、この用語の単数又は複数を両方とも含む。
【００５１】
本明細書で使用される場合、用語「細胞毒性ペプチド」は、癌細胞、特に白血病細胞に対して選択的に細胞毒性であるが、正常細胞には細胞毒性でない本発明のペプチドを意味する。
【００５２】
本明細書で使用される場合、用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、同義的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、１つ又は複数のアミノ酸残基が、対応する天然アミノ酸の人工的な化学的類似体であるアミノ酸ポリマーに適用される。この用語は、天然アミノ酸ポリマーにも適用される。用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、これらに限定されないが、グリコシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ−カルボキシル化、ヒドロキシル化、及びＡＤＰ−リボシル化を含む修飾も包含する。ポリペプチドは、必ずしも完全に直鎖であるとは限らないことが認識されるだろう。例えば、ポリペプチドは、ユビキチン化の結果として分岐している場合があり、一般的に、天然のプロセシング事象及び自然には生じない人工的操作によりもたらされる事象を含む翻訳後事象の結果として環状（分岐有り又は分岐無し）である場合がある。環状ポリペプチド、分岐ポリペプチド、及び分岐環状ポリペプチドは、非翻訳性の天然プロセスにより合成されてもよく、同様に、完全に合成的な方法により合成されてもよい。合成ペプチドとは、細胞成分の支援を受けずに製作されたペプチドである。ペプチドを製作する合成的方法は、当技術分野で周知であり、商業的に利用可能である。更に、本発明では、本発明のタンパク質のメチオニン含有アミノ末端変異体及び無メチオニンアミノ末端変異体の両方の使用が企図される。
【００５３】
本明細書で使用される場合、用語「症状」は、生存動物又はその部分の１つの正常状態の障害を構成し、身体的機能のパフォーマンスを中断又は変更する正常性からの解剖学的及び生理学的逸脱を含む。
【００５４】
本明細書で使用される場合、用語「細胞増殖を阻害する」は、細胞分裂及び／又は細胞増殖を遅延又は停止させることを意味する。この用語は、細胞発生の阻害又は細胞死に増加も含む。
【００５５】
本明細書で使用される場合、用語「〜を罹患している」は、症状の兆候を現在示していることを含み、症状からの回復中及び症状から回復に際して、症状に顕著な兆候がない場合をさえ含む。  
【００５６】
本明細書で使用される場合、用語「治療」は、治療されている症状に関連した症状又は兆候の進行又は重症度を予防、低下、停止、又は逆行させることを含む。従って、用語「治療」は、必要に応じて、医学的、治療的、及び／又は予防的な投与を含む。治療は、前癌病変又は癌等の症状の発症を予防又は軽減させることを含むこともできる。
【００５７】
「治療上有効量」は、治療されている対象体の特定の症状の発症を予防、低下、停止、又は逆行させるか、又は治療されている対象体の特定の症状の既存の兆候を部分的に又は全体的に緩和するのに有効な量である。治療上有効量の決定は、十分に当業者の能力の範囲内である。
【００５８】
用語「実質的に純粋な」は、本明細書で使用される場合、本発明のタンパク質又は他の細胞性産物を修飾するために使用される場合に、例えば、他のタンパク質及び／又は活性阻害化合物が実質的に含まれていないか又は混入されていない形態の、増殖培地又は細胞内容物から単離されたタンパク質を指す。用語「実質的に純粋な」は、乾燥重量で単離画分の少なくとも約７５％の量又は少なくとも「７５％実質的に純粋な」量の数値を参照する、より限定的には、用語「実質的に純粋な」は、乾燥重量で少なくとも約８５％又は少なくとも「８５％実質的に純粋」な活性化合物の化合物を指す。最も限定的には、用語「実質的に純粋な」は、乾燥重量で少なくとも約９５％又は少なくとも「９５％実質的に純粋」な活性化合物の化合物を指す。用語「実質的に純粋な」は、例えば、合成タンパク質が、合成反応（複数化）の試薬及び副産物から単離される場合、合成的に製作された本発明のタンパク質又は化合物を修飾するために使用することもできる。
【００５９】
用語「医薬品等級」は、本明細書で使用される場合、本発明のペプチド又は化合物を指す場合に、合成試薬及び副産物を含む、その自然状態で見出される物質に通常伴っている成分から実質的に又は本質的に単離されており、医薬品としての使用を損なう可能性がある成分から実質的に又は本質的に単離されているペプチド又は化合物である。例えば、「医薬品等級」ペプチドは、あらゆる発癌物質から単離されていてもよい。幾つかの場合では、「医薬品等級」は、組成物を患者への静脈内投与に不適にする可能性があるあらゆる物質から実質的に又は本質的に単離されているペプチド又は化合物を指定するために、「静脈用医薬品等級」等、意図されている投与方法により修飾されている場合がある。例えば、「静脈用医薬品等級」ペプチドは、ＳＤＳ等の界面活性剤、及びアジ化物等の抗細菌剤から単離されていてもよい。
【００６０】
語句「単離された」、「精製された」、又は「生物学的に純粋な」は、その天然状態で見出される物質に通常伴っている成分が実質的に又は本質的に含まれていない物質を指す。従って、本発明による単離されたペプチドは、好ましくは、それらのｉｎ  ｓｉｔｕ環境にあるペプチドに通常関連している物質を含有しない。「単離された」領域は、その領域が由来するポリペプチドの配列全体を含まない領域を指す。「単離された」核酸、タンパク質、又はそれらの対応する断片は、そのｉｎ  ｖｉｖｏ環境から実質的に取り出されており、そのため、これらに限定されないが、ヌクレオチド配列決定、制限消化、指定部位突然変異誘発、及び核酸断片用発現ベクターへのサブクローニング、並びに実質的に純粋な量のタンパク質又はタンパク質断片の取得等、当業者により操作されていてもよい。
【００６１】
ペプチドに関して本明細書で使用される場合、用語「変異体」は、野生型ポリペプチドと比較して、アミノ酸が置換、欠失、又は挿入されている場合があるアミノ酸配列変異体を指す。変異体は、野生型ペプチドの切断型であってもよい。「欠失」は、野生型タンパク質内部から１つ又は複数のアミノ酸を除去することであり、「切断」は、野生型タンパク質の１つ又は複数の末端から１つ又は複数のアミノ酸を除去することである。従って、変異体ペプチドは、ポリペプチドをコードする遺伝子を操作することにより製作することができる。変異体は、ポリペプチドの基本的な組成又は特徴を変更するが、少なくともその根本的活性の幾つかは変更しないように製作することができる。例えば、ナイセリアペプチド又はＰａ−ＣＡＲＤペプチドの「変異体」は、白血病細胞を死滅させる能力を保持する変異ナイセリアペプチド又はＰａ−ＣＡＲＤペプチドであってもよい。幾つかの場合では、変異体ペプチドは、ε−（３，５−ジニトロベンゾイル）−Ｌｙｓ残基等の非天然アミノ酸を用いて合成される。（Ｇｈａｄｉｒｉ及びＦｅｒｎｈｏｌｚ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ、１１２巻：９６３３〜９６３５頁（１９９０年））。幾つかの実施形態では、変異体は、野生型のペプチドと比較して、２０、１９、１８、１７、又は１６個以下のアミノ酸が、置換、欠失、又は挿入されている。幾つかの実施形態では、変異体は、野生型のペプチドと比較して、１５、１４、１３、１２、又は１１個以下のアミノ酸が、置換、欠失、又は挿入されている。幾つかの実施形態では、変異体は、野生型のペプチドと比較して、１０、９、８、又は７個以下のアミノ酸が、置換、欠失、又は挿入されている。幾つかの実施形態では、変異体は、野生型のペプチドと比較して、６個以下のアミノ酸が、置換、欠失、又は挿入されている。幾つかの実施形態では、変異体は、野生型のペプチドと比較して、５又は４個以下のアミノ酸が、置換、欠失、又は挿入されている。幾つかの実施形態では、変異体は、野生型のペプチドと比較して、３、２、又は１個以下のアミノ酸が、置換、欠失、又は挿入されている。幾つかの実施形態では、変異体は、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第１２／３８９，１２０号に記載の技術及び方法を使用して生成される。
【００６２】
用語「アミノ酸」は、本明細書で使用される場合、任意の天然又は非天然又は合成アミノ酸残基を含むアミノ酸部分、つまり１個、２個、又は３個以上の炭素原子、典型的には１個の（α）炭素原子により直接連結されている少なくとも１個のカルボキシル残基及び少なくとも１個のアミノ残基を含むあらゆる部分を意味する。用語「残基」は、「アミノ酸」と同義である。
【００６３】
用語「誘導体」は、ペプチドに関して本明細書で使用される場合、対象ペプチドから誘導されるペプチドを指す。誘導には、ペプチドがその根本的活性の幾つかを依然として保持するように、ペプチドを化学的に修飾することが含まれる。例えば、ナイセリアペプチド又はＰａ−ＣＡＲＤペプチドの「誘導体」は、白血病細胞及び／又は卵巣癌細胞を死滅させるその能力を保持している化学的に修飾されたナイセリアペプチド又はＰａ−ＣＡＲＤペプチドであってもよい。対象となる化学的修飾には、これらに限定されないが、ペプチドのアミド化、アセチル化、硫酸化、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾、リン酸化、又はグリコシル化が含まれる。加えて、誘導体ペプチドは、ポリペプチド又はその断片と、これらに限定されないが、別のペプチド、薬物分子、又は他の治療剤、又は医薬品、又は検出可能なプローブ等の化学化合物との融合体であってもよい。幾つかの実施形態では、誘導体は、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第１２／３８９，１２０号に記載の技術及び方法を使用して生成される。
【００６４】
用語「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、２つの配列をアラインする場合に、候補配列のアミノ酸残基と同一であるポリペプチドのアミノ酸残基のパーセントと定義される。アミノ酸同一性％を決定するためには、配列をアラインし、必要に応じて、ギャップを導入して最大配列同一性％を達成し、保存的置換は、配列同一性の一部とはみなされない。同一性パーセントを決定するためのアミノ酸配列アラインメント手順は、当業者に周知である。多くの場合、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ２、ＡＬＩＧＮ２、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ社製）ソフトウェア等の公的に利用可能なコンピューターソフトウェアを使用して、ペプチド配列をアラインする。特定の実施形態では、Ｂｌａｓｔｐ（国立バイオテクノロジー情報センター、ベテスダ、メリーランド州）が、長複雑度フィルターの初期設定パラメーター、ｅｘｐｅｃｔ  １０、ｗｏｒｄ  ｓｉｚｅ  ３、ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ  １１、及びｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  １を使用して使用される。
【００６５】
アミノ酸配列をアラインする場合、所与のアミノ酸配列Ｂに対する、Ｂとの、又はＢと比べた、所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性％は（或いは、所与のアミノ酸配列Ｂに対して、Ｂとの、又はＢと比べて、あるアミノ酸配列同一性％を有する又は含む所与のアミノ酸配列Ａと言い直すことができる）、以下のように計算することができる：
アミノ酸配列同一性％＝Ｘ／Ｙ＊１００
式中、Ｘは、Ａ及びＢの配列アラインメントプログラム又はアルゴリズムのアラインメントにより同一性一致として得点されたアミノ酸残基の数であり、
Ｙは、Ｂのアミノ酸残基の総個数である。
【００６６】
アミノ酸配列Ａの長さが、アミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ｂに対するＡのアミノ酸配列同一性％は、Ａに対するＢのアミノ酸配列同一性％と等しくならいないだろう。より長い配列をより短い配列と比較する場合は、より短い配列が、「Ｂ」配列とされるだろう。例えば、切断型ペプチドを、対応する野生型ポリペプチドと比較する場合、切断型ペプチドが、「Ｂ」配列とされるだろう。
【００６７】
一般
本発明は、癌細胞に対して細胞毒性効果を示すが、正常細胞には示さない細菌性ペプチド、並びにそのようなペプチドの変異体、誘導体、及び構造的等価物を含む組成物、並びに哺乳類の癌の発症を予防し、哺乳類の癌を治療し、哺乳類の癌細胞を死滅させる方法を提供する。特に、本明細書で開示された組成物及び方法は、白血病及び／又は卵巣癌を予防、治療、及び／又は死滅させるために使用することができる。
【００６８】
多くのクプレドキシンタンパク質、特にシュードモナス・エルギノーサアズリン、及びそれらの切断型は、ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏの両方において、多くのタイプの固形哺乳類癌細胞に優先的に進入及び死滅させる能力を有することが示されている。（Ｙａｍａｄａら、Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７巻：１４１８〜１４３１頁（２００５年）；Ｈｉｒａｏｋａら、ＰＮＡＳ  １０１巻：６４２７〜６４３２頁（２００４年）；Ｈｉｒａｏｋａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．３３８巻：１２８４〜１２９０頁（２００５年））。また、米国特許第７，４９１，３９４号、第７，３８１，７０１号、及び第７，０８４，１０５号、並びに米国特許出願第１１／４８８，６９３号、第１１／９５０，１６５号、第１１／８５４，６５４号、及び第１２／３３８，４８０号を参照されたい。これらの開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。アズリン様遺伝子は、ナイセリア・ゴノレア及びＮ．メニンギティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）等の多くの淋菌及び髄膜炎菌に存在する。（Ｇｏｔｓｃｈｌｉｃｈ及びＳｅｉｆｆ、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．４３巻：２５３〜２５５頁（１９８７年）；Ｋａｗｕｌａら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１巻：１７９〜１８５頁（１９８７年））。アズリンは、多数の病原性細菌により生成され、そのような遺伝子の中には著しい配列相同性が存在する（Ｙａｍａｄａら、Ｃｅｌｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７巻：１４１８〜１４３１頁（２００５年））。
【００６９】
「Ｈ．８」と名付けられているタンパク質エピトープは、病原性ナイセリア種中で保存されており、Ｈ．８と称されるモノクローナル抗体の結合により検出される。別の淋菌遺伝子ｌａｚは、Ｈ．８モノクローナル抗体と交差反応するタンパク質をコードする。（Ｈａｙａｓｈｉ及びＷｕ、Ｊ．Ｂｉｏｅｎｅｒｇ．Ｂｉｏｍｅｍｂｒ．２２巻：４５１〜４７１頁（１９９０年））。
【００７０】
Ｌａｚは、細菌性酵素シグナルペプチターゼＩＩにより認識されるシグナルペプチドリポタンパク質コンセンサス配列を含有する淋菌性細胞表層タンパク質であり、このペプチターゼは、この配列をプロセシングして、脂肪酸及びグリセロールによるシステイン残基のＮ末端アシル化をもたらす。（Ｈａｙａｓｈｉ及びＷｕ、同上；Ｙａｍａｄａら、Ｃｅｌｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７巻：１４１８〜１４３１頁（２００５年））。Ｌａｚリポタンパク質は、約１７ｋＤａであり、モチーフＡｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ（ＡＡＥＡＰ（配列番号２５））の不完全なペンタペプチド反復を含有するＮ末端の３９アミノ酸領域であるＨ．８領域を含む。（Ｇｏｔｓｃｈｌｉｃｈ及びＳｅｉｆｆ、同上；Ｋａｗｕｌａら、同上；Ｗｏｏｄｓら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｉｏｌ．３巻：４３〜４８頁（１９８９年））。Ｌａｚのこの３９アミノ酸Ｎ末端領域の先には、Ｐ．エルギノーサアズリンに対して高度に相同性の１２７アミノ酸領域がある。（Ｃａｎｎｏｎ、Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．２巻：Ｓ１〜Ｓ４頁（１９８９年））。Ｌａｚは、酸化ストレス及び銅毒性に対する防御に関与しており、ｅｘ  ｖｉｖｏ初代ヒト子宮膣部上皮アッセイにいて生存を増加させる。（Ｗｕら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７３巻：８４４４〜８４４８頁（２００５年））。
【００７１】
Ｌａｚタンパク質、ナイセリア・ゴノレア及び他のナイセリア種に由来するアズリン様タンパク質は、神経膠芽腫細胞等の脳癌細胞並びに他の腫瘍に特異的に進入及び死滅させることが可能であることが、今や判明している。実施例２及び７を参照されたい。更に、Ｌａｚタンパク質のＨ．８領域は、そのＮ末端又はＣ末端のいずれかに融合された場合、Ｐ．エルギノーサアズリンに対して、神経膠芽腫細胞に進入及び死滅させる能力を付与することができることが、今や判明している。実施例２及び３を参照されたい。  
【００７２】
Ｈ．８領域は、神経膠芽腫細胞に進入する能力をタンパク質に付与するのに、アズリン等の同時投与されるタンパク質と物理的に結合されている必要がないことも、今や判明している。実施例５を参照されたい。Ｈ．８及びＧＳＴのＮ−末端に融合されたＨ．８は両方とも、アズリン単独と比較して、物理的に結合されていないアズリンの神経膠芽腫細胞への進入を増加させたが、ＧＳＴのＣ末端に融合されたＨ．８は、効果がなかった。更に、Ｈ．８及びＧＳＴのＮ末端に融合されたＨ．８は両方とも、アズリンと同時投与された場合、神経膠芽腫細胞に対するアズリンの細胞毒性を増強した。実施例５を参照されたい。このＡＡＥＡＰ（配列番号２５）反復単位を使用して、白血病細胞を死滅させることになるペプチドを設計することができることも企図される。
【００７３】
アズリン及びｌａｚは、ｐ５３の複雑な形成及び安定化によるアポトーシスの誘導、血管新生の阻害、並びにＥｐｈＢ２／エフリンＢ２等の受容体チロシンキナーゼにより媒介される細胞シグナル伝達の阻害等の癌進行経路における複数のステップを標的にし、それにより耐性発現の可能性を最小限に抑えることが知られている。例えば、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，３８１，７０１号を参照されたい。アズリン及びＬａｚは、正常細胞と比較して、メラノーマ又は乳癌細胞に進入特異性を示すことが知られている。
【００７４】
驚くべきことに、アズリン及びＬａｚタンパク質は、固形タイプの癌細胞に対して胞毒性であることに加えて、本明細書に記載の実施例により実証されているように、白血病等の液体媒介性癌に対しても有効である。本実施例では、アズリン及びＬａｚは各々が、白血病細胞系に進入し、そこで細胞毒性効果を示すことができることが実証されている。更に、実施例９及び１１で考察され、図８〜１１でに実証されているように、Ｌａｚは、白血病細胞系に対して細胞毒性効果を発揮するが、正常な末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）に対してはほとんど効果を示さず、進入は非常に限定されている。これら細菌性タンパク質は、白血病細胞に進入特異性を示すが、正常ＰＢＭＣでは進入特異性を示さない（図１０、パネル１）。
【００７５】
アズリン及びＬａｚに加えて、アスパラギナーゼ及びアルギニンデイミナーゼ（ＡＤＩ）は、乳癌、メラノーマ、腎細胞癌、肝細胞癌等を含む固形腫瘍に対して活性であることが示されており、マイコプラズマ・アルギニニ由来のＡＤＩ（Ｍａ−ＡＤＩ）も、ヒト白血病細胞の増殖を阻害することが報告されている。（Ｙａｍａｄａ  Ｔら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００２年；９９巻：１４０９８〜１０３頁；Ｐｕｎｊ  Ｖら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２３巻：２３６７〜７８頁（２００４年）；Ｎｉ  Ｙら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．２６１巻：１〜１１頁（２００８年）；Ｆｉａｌｈｏ  ＡＭ、Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｙ  ＡＭ、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  ２巻：２２４〜３４頁（２００７年）；Ｅｎｓｏｒ  ＣＭら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６２巻：５４４３〜５０頁（２００２年）；Ｙｏｏｎ  ＣＹら、Ｉｎｔ．Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １２０巻：８９７〜９０５頁（２００７年）；Ｇｏｎｇ  Ｈら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １４巻：８２６〜９頁（２０００年））。Ｍａ−ＡＤＩの触媒トライアドは、Ｃｙｓ３９８−Ｈｉｓ２６９−Ｇｌｕ２１３である。しかしながら、白血病細胞に対するＭａ−ＡＤＩの効果に関する報告は１報しかなく、それを別にすると、白血病に対する考え得る治療応用における、ＡＤＩ等の細菌性タンパク質の役割については、これまでほとんど知られていなかった。
【００７６】
シュードモナス・エルギノーサも、Ｃｙｓ４０６−Ｈｉｓ２７８−Ａｓｐ１６６を触媒トライアドに有し、Ｍａ−ＡＤＩと一次配列相同性を有するＡＤＩ（Ｐａ−ＡＤＩ）を産生する。二次構造マッチング（ＳＳＭ）プログラムを使用することにより、Ｐａ−ＡＤＩ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ、ＰＤＢ  ＩＤコード１ＲＸＸ）のＮ末端領域にカスパーゼ動員ドメイン（「ＣＡＲＤ」）様ドメインが明らかされ、それは、ＣＡＲＤドメインを保持するカスパーゼ−９のプロドメイン（ＰＤＢ  ＩＤコード  ３ＹＧＳ）に対して識別可能な構造相同性を示す。図１４Ｄに示されているように、グアニジン基スーパーファミリーのメンバーの中で、ＡＤＩは、ＣＡＲＤドメインを保持するという点で独特である。細菌性タンパク質のＣＡＲＤ様ドメインは、上記で考察されたＭ．アルギニニＡＤＩ（ＰＤＢ  ＩＤコード  １ＬＸＹ）のＣＡＲＤ様ドメイン以外には、知られていない。驚くべきことに、本明細書で開示されたように、Ｐａ−ＡＤＩのＣＡＲＤドメイン（Ｐａ−ＣＡＲＤ）は、強力な抗癌活性を有する。手短に言えば、ＣＡＲＤドメインポリペプチドは、著しい抗癌活性示すが、正常細胞に対しては細胞毒性をほとんど示さない。
【００７７】
哺乳類ＣＡＲＤ含有タンパク質は、通常およそ９５アミノ酸残基で構成されており、デスドメイン（ＤＤ）及びデスエフェクタードメイン（ＤＥＤ）に対して配列類似性を有する。ＣＡＲＤの結晶構造は、ＣＡＲＤが、疎水性ポケットを取り囲む約６つの緊密にパックされたアルファ−ヘリックスで構成されることを示唆する。同様に、Ｐａ−ＣＡＲＤは、「ｃｌｉｐ−ｏｎ−ｆａｎ」部分の形態をとる５つのパックされたアルファ−ヘリックスを形成する８５アミノ酸残基で構成されている（図１４Ｂ及び１４Ｃ）。幾つかの哺乳類ＣＡＲＤドメインは癌増殖を促進するため、細菌性ＣＡＲＤが、哺乳類ＣＡＲＤ活性の妨害に寄与し、それにより推定ＣＡＲＤ様ドメインを含有するＰａ−ＡＤＩの抗癌活性に寄与するという可能性があることは興味深い。Ｐａ−ＣＡＲＤドメインは、哺乳類ＣＡＲＤタンパク質保有タンパク質から動員されてもよく、Ｐａ−ＣＡＲＤは、少なくとも部分的には、癌細胞で高発現されることが知られている哺乳類ＣＡＲＤタンパク質とのタンパク質間相互作用により、その細胞毒性を癌細胞で発揮することができることが企図される。この相互作用は、癌増殖の調節におけるＡＤＩの作用の原因であり得ることが更に企図される。
【００７８】
Ｐａ−ＣＡＲＤ（配列番号２７）は、白血病細胞及び卵巣癌細胞に対して予期しない細胞毒性活性を示す。特に、Ｐａ−ＣＡＲＤポリペプチドは、白血病細胞増殖を阻害する能力を有する。白血病細胞系ＨＬ６０及びＫ５６２では、Ｌａｚ及びＰａ−ＣＡＲＤの抗癌活性は、Ｗｅｅｌタンパク質安定化及び多くの癌タイプで調節不全であることが多いセリン／トレオニンキナーゼの活性型であるリン酸化ＡＫＴ−Ｓｅｒ−４７３の枯渇を伴うＧ２／Ｍ期での細胞周期停止により媒介される。実施例１１及び１２、並びに図１２を参照されたい。特に、Ｐａ−ＣＡＲＤ及びＬａｚは、Ｋ５６２細胞ではＷｅｅｌタンパク質の上方制御により、ＨＬ６０細胞では活性ＡＫＴ  Ｐ−Ｓｅｒ４７３の下方制御により、白血病細胞の細胞周期を阻害する（図１２）。
【００７９】
Ｗｅｅｌ及びリン酸化ＡＫＴ−Ｓｅｒ４７３（ＡＫＴ−Ｐ−Ｓｅｒ４７３）は両方とも、ひいては細胞死に結び付くことが知られているＧ２／Ｍ期での細胞周期停止に関与することが知られている。例えば、ＣＤＫ１としても知られている有糸分裂促進性キナーゼＣＤＣ２の活性化は、真核細胞のＧ２からＭ期への移行に必要であり、そこではＴｈｒ−１４及びＴｙｒ−１５残基でのＣＤＣ２のリン酸化が重要である。阻害性Ｔｙｒ−１５リン酸化は、Ｗｅｅｌプロテインキナーゼにより媒介され、従って、そのレベルが増強されることにより、そのようなＭ期移行の阻害が媒介される。ウイルスタンパク質は、Ｌａｚ／Ｐａ−ＣＡＲＤ媒介性Ｗｅｅプロテインキナーゼレベルの上昇を模倣することが知られている。ヒトパピローマウイルス１型（ＨＰＶ−１）Ｅ４タンパク質は、Ｗｅｅｌのレベルが上昇することにより触媒される阻害性Ｔｙｒ−１５リン酸化によって不活性サイクリンＢ１−ＣＤＫ１複合体が形成されることにより、細胞周期のＧ２期からＭ期への移行を阻害する。従って、Ｗｅｅｌの過剰発現は、Ｇ２期での細胞周期停止を増強する一方で、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によるＷｅｅｌの枯渇は、Ｅ４誘導性Ｇ２期移行阻止を緩和する。同様に、ＡＫＴ（プロテインキナーゼＢ）、ウイルス癌遺伝子ｖ−ａｋｔのヒト相同体は、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）経路において役割を果たす。ＰＤＫ２によるＡＫＴ−１のＳｅｒ−４７３残基におけるリン酸化は、細胞周期進行にとって重要であり、ＨＬ６０細胞でのＬａｚ及びＰａ−ＣＡＲＤの両方により明らかにされたように、リン酸化Ａｋｔ  Ｓｅｒ−４７３（Ａｋｔ−Ｐ−Ｓ４７３）レベルの低減は、Ｇ２／Ｍ期停止を増強する。
【００８０】
Ｐａ−ＣＡＲＤは、ＧＭ−ＣＳＦをコードする遺伝子の転写刺激により、ＳＫＯＶ−３（卵巣癌）細胞に対して効果を示す。その遺伝子が約３倍刺激されるＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−１２は両方とも、多くの腫瘍モデルにおいて抗腫瘍免疫の強力な誘導因子であり、腫瘍部位での顆粒球、マクロファージ、及び樹状細胞の浸潤を誘発させ、それにより腫瘍抗原提示を大幅に増強することが知られている。従って、Ｐａ−ＣＡＲＤ誘導性アポトーシス（図１８）は、Ｐａ−ＣＡＲＤの存在下で過剰産生されるあらゆるＧＭ−ＣＳＦの抗腫瘍応答を著しく増大させることができると考えられる。遺伝子発現様式は、多くのサイトカイン遺伝子の刺激を示したが、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）としても知られているケモカインＣＣＬ２（Ｃ−Ｃモチーフリガンド２）の遺伝子は、著しい（１７倍）の抑制を示した（表３）。ＣＣＬ２は、多くの場合、腫瘍の単球動員及び有害な腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）を増加させることにより、乳癌の悪性転換を促進することが示されている。ＣＣＬ２は、恐らくは、カドヘリン遺伝子ｃｄｈｌ２及びｃｄｈｌ９の転写を活性化する新規の転写因子ＭＣＰＩＰにより、血管新生及び転移を促進することも知られている。従って、Ｐａ−ＣＡＲＤによるＣＣＬ２レベルの低減は、血管新生及び腫瘍増殖進行を妨害することにより、腫瘍退縮を可能することができる。
【００８１】
要約すると、本明細書の実施例及び開示は、アズリン、Ｌａｚ、及びＰａ−ＣＡＲＤ等の細菌性タンパク質が、白血病細胞に進入することができ、ＣＤＣ２−サイクリンＢ抑制経路及び細胞性ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路により媒介される細胞シグナル伝達の調節により誘発されると考えられるＧ２／Ｍ期での細胞周期停止を誘導することができることを実証する。更に、ＡＤＩは、アルギニンの酵素的枯渇によること、及びＡＤＩ活性のないＮ末端推定ＣＡＲＤ様ドメインによることを含む幾つかの様式で、抗癌活性を示すことができる（図１４〜１６）。Ｐａ−ｃＡＲＤタンパク質は、主に癌細胞に対して阻害的役割を示すが、正常細胞に対しては示さない（図１８）。更に、抗癌活性は、カスパーゼ活性により媒介される場合があり（図１９）、卵巣癌細胞でアポトーシスを誘導することができる。
【００８２】
本発明の組成物
本発明は、細胞毒性ペプチド及び／又はそのようなペプチドの変異体、誘導体、切断型、又は構造的等価物を、単独で又は１つ又は複数の他の細胞毒性剤と組み合わせて提供する。
【００８３】
幾つかの実施形態では、細胞毒性ペプチドは、クプレドキシン又はその切断型である。幾つかの実施形態では、細胞毒性ペプチドは、アズリン又はその切断型である。他のそのような実施形態では、細胞毒性ペプチドは、Ｌａｚ又はその切断型である。他の実施形態では、細胞毒性ペプチドは、ＬａｚのＨ．８領域である。幾つかの実施形態では、細胞毒性ペプチドは、配列番号２２〜２４からなる群から選択されるアミノ酸配列の１つ又は複数を含む。
【００８４】
他の実施形態では、細胞毒性ペプチドは、ＣＡＲＤドメインを含む。幾つかの実施形態では、細胞毒性ペプチドは、ＣＡＲＤ保有タンパク質である。幾つかの実施形態では、ＣＡＲＤ保有タンパク質は、細菌に由来する。別の実施形態では、細菌は、Ｐ．エルギノーサである。１つの実施形態では、細胞毒性ペプチドは、Ｐａ−ＣＡＲＤである。別のそのような実施形態では、細胞毒性ペプチドは配列番号２７を含む。
【００８５】
幾つかの実施形態では、細胞毒性ペプチドは、当技術分野で周知の技術を使用して、より大きな細胞毒性効果をそれに付与する別のペプチドに融合されている。１つのそのような実施形態では、他のペプチドは、ＬａｚのＨ．８領域である。別のペプチドでは、他のペプチドは、配列番号２４を含む配列を有する。１つの実施形態では、細胞毒性ペプチドは、融合タンパク質Ａｚｕ−Ｈ．８である。別の実施形態では、細胞毒性ペプチドは、融合タンパク質Ｈ．８−Ａｚｕである。図１。  
【００８６】
本明細書に記載の細胞毒性ペプチドと組み合わせて投与することができる１つ又は複数の他の細胞毒性剤は、これらに限定されないが、シスプラチン、Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標）、レチノイン酸、５’−アザ−２’−デオキシシチジン（「ＤＡＣ」）、及び／又は三酸化ヒ素とレチノイン酸の併用を含む癌治療薬であってもよい。Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標）、レチノイン酸、ＤＡＣ、及び／又は三酸化ヒ素とレチノイン酸の併用以外の癌治療薬には、以下のものが含まれる：ｐ５３等の細胞周期制御タンパク質；ｐ１６、ｐ２１、又はｐ２７等のサイクリン依存性キナーゼ阻害剤；チミジンキナーゼ又はニトロレダクターゼ等の自殺タンパク質；インターロイキン１、インターロイキン２、又は顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）等のサイトカイン又は他の免疫調節タンパク質；シュードモナス・エルギノーサ菌体外毒素Ａ等の毒素；５−フルオロウラシル；インターフェロンα；メトトレキサート；タモキシフェン；ラロキシフェン；ビンクリスチン（Ｖｉｎｃｒｉｎｓｔｉｎｅ）；ナイトロジェンマスタード、スルホン酸アルキル、ニトロソ尿素、エチレンイミン、及びトリアゼン等のアルキル化剤；葉酸アンタゴニスト、プリン類似体、及びピリミジン類似体等の代謝拮抗剤；アントラサイクリン、ブレオマイシン、ミトマイシン、ダクチノマイシン、及びプリカマイシン等の抗生物質；Ｌ−アスパラギナーゼ等の酵素；ファルネシル−タンパク質転移酵素阻害剤；５アルファ−リダクターゼ阻害剤；１７ベータ―ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ３型の阻害剤；グルココルチコイド、エストロゲン／抗エストロゲン、アンドロゲン／抗アンドロゲン、プロゲスチン、及び黄体形成ホルモン放出ホルモンアンタゴニスト、酢酸オクトレオチド等のホルモン剤；エクチナサイジン又はそれらの類似体及び誘導体等の微小管破壊剤；タキサン、例えばパクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（商標））、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（商標））、及びそれらの類似体、並びにエポチロンＡ〜Ｆ及びそれらの類似体等のエポチロン等の微小管安定化剤；ビンカアルカロイド、エピポドフィロトキシン、タキサン等の植物由来産物；並びにトポイソメラーゼ（ｔｏｐｉｏｓｏｍｅｒａｓｅ）阻害剤；プレニルタンパク質転移酵素阻害剤；並びにヒドロキシ尿素、プロカルバジン、ミトタン、ヘキサメチルメラミン、シスプラチン及びカルボプラチン等の白金配位錯体等の様々な作用剤；並びに抗癌剤として使用される他の作用剤、及び生物応答修飾物質、増殖因子等の細胞毒性剤；免疫調節因子及びモノクローナル抗体；塩酸メクロレタミン、シクロホスファミド、クロラムブシル、メルファラン、イホスファミド、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン、チオテパ、ダカルバジン、メトトレキサート、チオグアニン、メルカプトプリン、フルダラビン、ペンタスタチン、クラドリビン、シタラビン、フルオロウラシル、塩酸ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、硫酸ブレオマイシン、マイトマイシンＣ、アクチノマイシンＤ、サフラシン、サフラマイシン、キノカルシン、ディスコデルモリド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、酒石酸ビノレルビン、エト���シド、リン酸エトポシド、テニポシド、パクリタキセル、エストラムスチン、リン酸エストラムスチンナトリウム、フルタミド、ブセレリン、ロイプロリド、プテリジン、ジイネセス（ｄｉｙｎｅｓｅｓ）、レバミソール、アフラコン（ａｆｌａｃｏｎ）、インターフェロン、インターロイキン、アルデスロイキン、フィルグラスチム、サルグラモスチム、リツキシマブ、ＢＣＧ、トレチノイン、塩酸イリノテカン、ベタメタゾン（ｂｅｔａｍｅｔｈｏｓｏｎｅ）、塩酸ゲムシタビン、アルトレタミン、及びトポテカ（ｔｏｐｏｔｅｃａ）、並びにそれらの任意の類似体又は誘導体。
【００８７】
他の細胞毒性剤の例には、以下のものも含まれる：ドイツ特許第４１３８０４２．８号；国際公開第９７／１９０８６号、国際公開第９８／２２４６１号、国際公開第９８／２５９２９号、国際公開第９８／３８１９２号、国際公開第９９／０１１２４号、国際公開第９９／０２２２４号、国際公開第９９／０２５１４号、国際公開第９９／０３８４８号、国際公開第９９／０７６９２号、国際公開第９９／２７８９０号、国際公開第９９／２８３２４号、国際公開第９９／４３６５３号、国際公開第９９／５４３３０号、国際公開第９９／５４３１８号、国際公開第９９／５４３１９号、国際公開第９９／６５９１３号、国際公開第９９／６７２５２号、国際公開第９９／６７２５３、及び国際公開第００／００４８５に見出されるようなエポチロン誘導体；国際公開第９９／２４４１６号に見出されるようなサイクリン依存性キナーゼ阻害剤（米国特許第６，０４０，３２１号も参照）；及び国際公開第９７／３０９９２号及び国際公開第９８／５４９６６号に見出されるようなプレニルタンパク質転移酵素阻害剤；及び米国特許第６，０１１，０２９号に遺伝学的及び特異的に記載されているもの等の作用剤；特に癌の治療において、ＡＲモジュレーター、ＥＲモジュレーター等の任意のＮＨＲモジュレーターと共に、ＬＨＲＨモジュレーターと共に使用することができる化合物。  
【００８８】
本発明は、クプレドキシン及び／又はＣＡＲＤ保有タンパク質の変異体、誘導体、切断型、又は構造的等価物である細胞毒性ペプチドを更に提供する。幾つかの実施形態では、細胞毒性ペプチドは単離されている。幾つかの実施形態では、細胞毒性ペプチドは、実質的に純粋であるか又は医薬品等級である。他の実施形態では、細胞毒性ペプチドは、細胞毒性ペプチドを含むか、又はから本質的になる組成物中にある。他の実施形態では、細胞毒性ペプチドは、細胞毒性ペプチド及び少なくとも１つの他の細胞毒性剤を両方とも含む組成物中にある。別の特定の実施形態では、細胞毒性ペプチドは、非抗原性であり、哺乳類及びより特定的にはヒトにおいて免疫応答を誘発しない。幾つかの実施形態では、細胞毒性ペプチドは、全長クプレドキシン又はＣＡＲＤ保有タンパク質より短く、全長タンパク質の薬理学的活性の幾つかを保持している。特に、幾つかの実施形態では、細胞毒性ペプチドは、癌細胞、特に白血病細胞を死滅させる能力を保持することができる。
【００８９】
クプレドキシン間の構造相同性は高いため、他のクプレドキシンは、特に白血病に関して、アズリン及びＬａｚと同じ細胞毒特性を有するだろうということが企図される。幾つかの実施形態では、クプレドキシンは、これらに限定されないが、アズリン、シュードアズリン、プラストシアニン、ルスチシアニン、オーラシアニン（ａｕｒａｃｙａｎｉｎ）、ステラシアニン、キュウリ塩基性タンパク質、又はＬａｚである。特に、特定の実施形態では、アズリン又はＬａｚは、シュードモナス・エルギノーサ、アルガリゲネス・フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、アクロモバクター・キシロスオキシダンス種デニトリフィカンスＩ（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ  ｓｓｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ  Ｉ）、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、メチロモナス種、ナイセリア・メニンギティディス（  Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ナイセリア・ゴノレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｅａ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・クロロラフィス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ）、キシレラ・ファスティディオーサ（Ｘｙｌｅｌｌａ  ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ）、ウルバ・ペルツッシス（Ｕｌｖａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、又はビブリオ・パラヘモリチカス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）に由来する。特定の実施形態では、アズリンは、シュードモナス・エルギノーサに由来する。
【００９０】
本発明は、野生型クプレドキシン又はＣＡＲＤ保有タンパク質と比較して、アミノ酸が置換、欠失、又は挿入されたクプレドキシン又はＣＡＲＤ保有タンパク質のアミノ酸配列変異体である細胞毒性ペプチドを提供する。本発明の変異体は、野生型タンパク質の切断型であってもよい。幾つかの実施形態では、本発明の細胞毒性ペプチドは、全長野生型ポリペプチドより短いクプレドキシン又はＣＡＲＤ保有タンパク質の領域を含む。  
【００９１】
本発明の細胞毒性ペプチドは、天然に存在しない合成アミノ酸で製作されたペプチドを含むこともできる。例えば、非天然アミノ酸を化学予防剤に組み込んで、血流中における組成物の半減期を延長又は最適化することができる。そのような化学予防剤には、これらに限定されないが、以下のものが含まれる：Ｄ，Ｌ−ペプチド（ジアステレオマー）（例えば、Ｆｕｔａｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６巻（８号）：５８３６〜４０頁（２００１年）；Ｐａｐｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４巻（１６号）：５７７９〜８６頁（２００４年）；Ｍｉｌｌｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３６巻（１号）：１６９〜７６頁（１９８７年）；非通常アミノ酸を含有するペプチド（例えば、Ｌｅｅら、Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ．６３巻（２号）：６９〜８４頁（２００４年））、その後炭化水素ステープリング（ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  ｓｔａｐｌｉｎｇ）されたオレフィン含有非天然アミノ酸（例えば、Ｓｃｈａｆｍｅｉｓｔｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２巻：５８９１〜５８９２頁（２０００年）；Ｗａｌｅｎｓｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０５巻：１４６６〜１４７０頁（２００４年））、及びε−（３，５−ジニトロベンゾイル）−Ｌｙｓ残基を含有するペプチド。
【００９２】
他の実施形態では、本発明の細胞毒性ペプチドは、クプレドキシン又はＣＡＲＤ保有タンパク質の誘導体である。クプレドキシン又はＣＡＲＤ保有タンパク質の誘導体は、ペプチドがその根本的活性の幾つかを依然として保持しているような、ペプチドの化学的修飾である。例えば、アズリン、Ｌａｚ、又はＰａ−ＣＡＲＤの「誘導体」は、癌細胞、特に白血病細胞及び／又は卵巣癌細胞を死滅させるその能力を保持している化学的に修飾されたタンパク質である。別の誘導体は、血中半減期を増加又は最適化したものであってもよい。化学的修飾には、これらに限定されないが、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第１２／３８９，１２０号で開示されたものが含まれる。
【００９３】
幾つかの実施形態では、細胞毒性ペプチドは、これらに限定されないが、ペプチドの加水分解を減少させる方法、ペプチドの脱アミド化を減少させる方法、酸化を減少させる方法、免疫原性を減少させる方法、及び／又はペプチドの構造安定性を増加させる方法を含む方法を使用して修飾されていてもよい。参照により本明細書に記載又は組み込まれている修飾の２つ以上を、１つの修飾クプレドキシン由来ペプチド中で組み合わせることができることが企図され、同様に、本明細書に記載の１つ又は複数の修飾を他の修飾と組み合わせて薬物動態特性を向上させることは、当業者に周知である。そのような変異体及び誘導体を設計するための方法は、多くが当技術分野で周知である。
【００９４】
使用方法
本発明は、哺乳類、特にヒトの癌細胞、特に白血病細胞及び／又は卵巣癌細胞を死滅させる方法を提供する。この方法は、癌細胞を、癌細胞に対して細胞毒性を有する単離ペプチド、又はその変異体、誘導体、切断型、若しくは構造的等価物と接触させることを含む。単離ペプチドは、本明細書に記載のクプレドキシン又はＣＡＲＤ保有タンパク質であってもよい。１つの実施形態では、単離ペプチドは、アズリンである。別の実施形態では、単離ペプチドは、Ｌａｚである。更に別の実施形態では、単離ペプチドは、Ｐａ−ＣＡＲＤである。更なる実施形態では、単離ペプチドは、ＬａｚのＨ．８領域を含む融合タンパク質である。１つのそのような実施形態では、融合タンパク質は、Ｈ．８−Ａｚｕである。別のそのような実施形態では、融合タンパク質は、Ａｚｕ−Ｈ．８である。細胞毒性ペプチドは、単独で、又は本明細書に記載の別の細胞毒性剤と組み合わせて、又はＬａｚのＨ．８領域と組み合わせて、癌細胞に投与することができる。幾つかの実施形態では、細胞毒性ペプチドは、ＬａｚのＨ．８領域と同時に又はほぼ同時に投与される。他の実施形態では、細胞毒性ペプチドは、配列番号２４を含む配列と同時に又はほぼ同時に投与される。
【００９５】
本発明は、癌細胞に対して細胞毒性効果を有する単離ペプチド又はその変異体、誘導体、切断型、若しくは構造的等価物を投与することにより、癌を有する哺乳類患者を治療する方法又はそうでなければ哺乳類患者の癌細胞を死滅させる方法も提供する。単離ペプチドは、本明細書に記載のクプレドキシン又はＣＡＲＤ保有タンパク質であってもよい。１つの実施形態では、単離ペプチドは、アズリンである。別の実施形態では、単離ペプチドは、Ｌａｚである。更に別の実施形態では、単離ペプチドは、Ｐａ−ＣＡＲＤである。更なる実施形態では、単離ペプチドは、ＬａｚのＨ．８領域を含む融合タンパク質である。１つのそのような実施形態では、融合タンパク質は、Ｈ．８−Ａｚｕである。別のそのような実施形態では、融合タンパク質は、Ａｚｕ−Ｈ．８である。細胞毒性ペプチドは、単独で、又は本明細書に記載の別の細胞毒性剤と組み合わせて、又はＬａｚのＨ．８領域と組み合わせて、投与することができる。幾つかの実施形態では、細胞毒性ペプチドは、ＬａｚのＨ．８領域と同時に又はほぼ同時に投与される。他の実施形態では、細胞毒性ペプチドは、配列番号２４を含む配列と同時に又はほぼ同時に投与される。
【００９６】
本発明は、白血病細胞及び／又は卵巣癌細胞に１つ又は複数の細胞毒性ペプチドを投与することにより、細胞分化による白血病細胞及び／又は卵巣癌細胞の死滅を誘導する方法も提供する。細胞毒性ペプチドは、本明細書に記載のクプレドキシン又はＣＡＲＤ保有タンパク質であってもよい。１つの実施形態では、細胞毒性ペプチドは、アズリンである。別の実施形態では、細胞毒性ペプチドは、Ｌａｚである。別の実施形態では、細胞毒性ペプチドは、融合タンパク質Ｈ．８−Ａｚｕである。更に別の実施形態では、細胞毒性ペプチドは、融合タンパク質Ａｚｕ−Ｈ．８である。
【００９７】
本発明は、白血病細胞及び／又は卵巣癌細胞に１つ又は複数の細胞毒性ペプチドを投与することにより、白血病細胞及び／又は卵巣癌細胞に選択的に進入させ、そこで細胞毒性効果を示させる方法も提供する。細胞毒性ペプチドは、本明細書に記載のクプレドキシン又はＣＡＲＤ保有タンパク質であってもよい。１つの実施形態では、細胞毒性ペプチドは、アズリンである。別の実施形態では、細胞毒性ペプチドは、Ｌａｚである。更に別の実施形態では、細胞毒性ペプチドは、Ｐａ−ＣＡＲＤである。更なる実施形態では、細胞毒性ペプチドは、ＬａｚのＨ．８領域を含む融合タンパク質である。１つのそのような実施形態では、融合タンパク質は、Ｈ．８−Ａｚｕである。別のそのような実施形態では、融合タンパク質は、Ａｚｕ−Ｈ．８である。
【００９８】
本発明は、Ｇ２／Ｍ期で細胞周期停止を引き起こすことにより白血病細胞及び／又は卵巣癌細胞を死滅させる方法であって、１つ又は複数の細胞毒性ペプチドを投与することを含む方法を更に含む。更なる実施形態では、細胞毒性ペプチドは、Ｗｅｅｌタンパク質を安定化させ、及び／又はこれらに限定されないが、細胞の細胞質及び／又は核を含む細胞中のＷｅｅｌタンパク質のレベルを増加させる。更に別の実施形態では、細胞毒性ペプチドは、リン酸化ＡＫＴ−Ｓｅｒ−４７３を枯渇させる。更に別の実施形態では、細胞毒性ペプチドは、Ｗｅｅｌタンパク質を安定化／Ｗｅｅｌタンパク質レベルを増加させ、且つリン酸化ＡＫＴ−Ｓｅｒ−４７３を枯渇させる。更なる実施形態では、細胞毒性ペプチドは、アズリンである。別の実施形態では、細胞毒性ペプチドは、Ｌａｚである。更に別の実施形態では、細胞毒性ペプチドは、Ｐａ−ＣＡＲＤである。更に別の実施形態では、細胞毒性ペプチドは、融合タンパク質Ｈ．８−Ａｚｕ及びＡｚｕ−Ｈ．８の１つ又は複数である。
【００９９】
細胞毒性ペプチドをコードする核酸及び発現ベクター
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の細胞毒性ペプチド、並びにそれらの変異体、誘導体、及び／又は構造的等価物をコードする核酸分子を提供する。本発明による核酸分子は、当技術分野で公知の技術の組み合わせにより調製することができる。これら核酸に使用されるコード配列は、特定のペプチドをコードする天然ゲノムＤＮＡに見出されるものであってもよく、又は公知のコドンから設計されてもよい。これらコード配列は、コドン使用頻度の交互化、及びペプチドが発現される生物の好ましいコドン使用頻度を考慮に入れて設計することもできる。細胞毒性ペプチドの核酸配列は、化学合成又はクローニングにより別々に調製してもよい。その後、目的の核酸分子を得るために、それら核酸配列をリガーゼでライゲーションして一緒にすることができる。
【０１００】
生物間で遺伝物質を行き来させるのに使用されるベクターは、２つの一般的なクラスに分類することができる：クローニングベクターは、適切な宿主細胞中での増殖に不可欠な領域を有し、外来性ＤＮＡを挿入することができる複製用プラスミド又はファージをであり、外来性ＤＮＡは、あたかもベクターの成分であるかのように複製及び増殖される。発現ベクター（プラスミド、酵母、又は動物ウイルスゲノム等）は、Ｌａｚ、アズリン、Ｐａ−ＣＡＲＤ、Ｈ．８−Ａｚｕ、又はＡｚｕ−Ｈ．８のような細胞毒性ペプチドのＤＮＡ等の外来性ＤＮＡを転写及び翻訳するために、外来性遺伝物質を宿主細胞又は組織へ導入するために使用される。発現ベクターでは、導入されたＤＮＡは、挿入ＤＮＡを高度に転写するように宿主細胞にシグナルを送るプロモーター等のエレメントに作用可能に連結されている。特定の因子に応答して遺伝子転写を制御する誘導可能なプロモーター等の幾つかのプロモーターは、非常に有用である。細胞毒性ペプチド並びにその変異体及び誘導体を、誘導可能なプロモーターに作用可能に連結することにより、特定の因子に応答して、細胞毒性ペプチド並びにその変異体及び誘導体の発現を制御することができる。古典的な誘導可能なプロモーターの例には、アルファ−インターフェロン、熱ショック、重金属イオン、及びグルココルチコイド（Ｋａｕｆｍａｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５巻：４８７〜５１１頁（１９９０年））等のステロイド、及びテトラサイクリンに応答するものが含まれる。他の望ましい誘導可能なプロモーターには、構築体が導入される細胞に内因性ではないが、誘導剤が外因的に供給される際に、それら細胞において応答性であるものが含まれる。一般的に、有用な発現ベクターは、プラスミドであることが多い。しかしながら、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）等の他の形態の発現ベクターが企図される。
【０１０１】
ベクターの選択は、使用されている生物又は細胞、及びベクターの所望の運命により決定される。一般的に、ベクターは、シグナル配列、複製開始点、マーカー遺伝子、ポリリンカー部位、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。
【０１０２】
細胞毒性ペプチドを含む医薬組成物
本発明は、クプレドキシン若しくはＣＡＲＤ保有タンパク質、又はクプレドキシン若しくはＣＡＲＤ保有タンパク質の変異体、誘導体、切断型、若しくは構造的等価物である少なくとも１つの細胞毒性ペプチドを、特に医薬組成物に、単独で又は少なくとも１つの他の細胞毒性剤と組み合わせて含む組成物も提供する。特定の実施形態では、医薬組成物は、特定の投与方法用に、例えば、これらに限定されないが、経口、腹腔内、又は静脈内用に設計される。そのような組成物は、水中で水和されていてもよく、又は後に水和するために乾燥されていてもよい（凍結乾燥等により）。そのような組成物は、これに限定されないが、アルコール等の水以外の溶媒中にあってもよい。
【０１０３】
細胞毒性ペプチドを含有する本発明の医薬組成物は、任意の従来方法で、例えば、従来の混合プロセス、溶解プロセス、造粒プロセス、糖剤製作プロセス、乳化プロセス、カプセル化プロセス、封入プロセス、又は凍結乾燥プロセスにより製造することができる。細胞毒性ペプチドは、当技術分野で周知の薬学的に許容される担体と容易に混合することができる。そのような担体により、錠剤、丸剤、糖剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、及び懸濁剤等として、調製物を製剤化することができる。好適な賦形剤には、例えば、充填剤及びセルロース調製物も含まれる。他の賦形剤には、例えば、香料、着色剤、粘着防止剤、増粘剤、及び他の許容される添加剤、アジュバント、又は結合剤が含まれていてもよい。  
【０１０４】
種々の実施形態では、組成物は、以下のものを含む：担体及び賦形剤（これらに限定されないが、緩衝剤、炭水化物、マンニトール、タンパク質、ポリペプチド、又はグリシン等のアミノ酸、酸化防止剤、静菌剤、キレート剤、懸濁化剤、増粘剤、及び／又は保存剤を含む）、水、油類、生理食塩水、デキストロース及びグリセリン水溶液、緩衝剤、等張化剤、及び湿潤剤等の生理学的状態を近似するのに必要な他の薬学的に許容される補助物質。本発明の組成物は、当業者に公知の任意の好適な担体を使用して投与することができ、担体のタイプは、投与方法に応じて変わることになることが認識されるだろう。化合物は、周知の技術を使用して、リポソーム内に封入することもできる。生分解性ミクロスフェアも、本発明の組成物用の担体として使用することができる。好適な生分解性ミクロスフェアは、例えば、米国特許第４，８９７，２６８号、第５，０７５，１０９号、第５，９２８，６４７号、第５，８１１，１２８号、第５，８２０，８８３号、第５，８５３，７６３号、第５，８１４，３４４号、及び第５，９４２，２５２号に示されている。本明細書で使用される場合、「化合物」には、本発明のペプチド、アミノ酸配列、積荷化合物及び複合体、並びに核酸が含まれる。
【０１０５】
本明細書で開示された細胞毒性ペプチド及び核酸を投与するための医薬組成物を調製するために使用される静脈内輸液は、晶質液又はコロイド液で構成されていてもよい。晶質液は、本明細書で使用される場合、ミネラル塩又は他の水溶性分子の水溶液である。コロイド液は、本明細書で使用される場合、ゼラチン等のより大型の不溶性分子を含有している。静脈内輸液は、無菌であってもよい。
【０１０６】
静脈内投与に使用することができる晶質液には、これらに限定されないが、表１に記載されているような、通常の生理食塩水（０．９％濃度の塩化ナトリウム溶液）、乳酸リンゲル液又はリンゲル液、及びＤ５Ｗと呼ばれることがある５％デキストロース水溶液が含まれる。
【０１０７】
2012518417.tif 000003
【０１０８】
本発明の組成物の血中半減期は、当業者に周知の幾つかの方法により延長又は最適化することができ、それら方法には、これらに限定されないが、以下のものが含まれる：環状化ペプチド（Ｍｏｎｋら、ＢｉｏＤｒｕｇｓ  １９巻（４号）：２６１〜７８頁（２００５年）；ＤｅＦｒｅｅｓｔら、Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ．６３巻（５号）：４０９〜１９頁（２００４年））、Ｄ，Ｌ−ペプチド（ジアステレオマー）（Ｆｕｔａｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２月２３日；２７６巻（８号）：５８３６〜４０頁（２００１年）；Ｐａｐｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４巻（１６号）：５７７９〜８６頁（２００４年）；Ｍｉｌｌｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３６巻（１号）：１６９〜７６頁（１９８７年））；非通常アミノ酸を含有するペプチド（Ｌｅｅら、Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ．６３巻（２号）：６９〜８４頁（２００４年））、並びにＮ−及びＣ−末端修飾（Ｌａｂｒｉｅら、Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｍｅｄ．１３巻（５号）：２７５〜８頁（１９９０年））。Ｄ置換又はＬ−アミノ酸置換によるｄ−異性化（置換）及びペプチド安定性の修飾が、特に興味深い。
【０１０９】
投与が注射による場合、組成物は、水溶液、好ましくは、ハンクス液、リンゲル液、又は生理食塩水緩衝液等の生理学的適合性を持つ緩衝液で製剤化することができる。溶液は、懸濁化剤、安定化剤、及び／又は分散剤等の製剤用作用剤を含有していてもよい。或いは、組成物は、使用前に好適な媒体、例えば発熱性物質除去滅菌水で構成するための粉末形態であってもよい。
【０１１０】
投与が吸入による場合、組成物は、好適な噴霧剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、二酸化炭素、又は他の好適なガスを使用して、加圧容器又は噴霧器からエアゾルスプレーの形態で送達することができる。加圧エアロゾルの場合、用量単位は、測定された量を送達するためのバルブを備えることにより決定することができる。タンパク質とラクトース又はデンプン等の好適な粉末基剤との粉末混合物を含有する、例えば吸入器又は注入器で使用されるゼラチンのカプセル及びカートリッジを製剤することができる。
【０１１１】
投与が局所投与による場合、組成物は、当技術分野で周知のように、液剤、ゲル剤、軟膏剤、クリーム剤、及び懸濁剤等として製剤化することができる。幾つかの実施形態では、投与は、経皮貼布による。投与が坐剤（例えば、直腸用又膣用）による場合、組成物は、従来の坐剤基剤を含有する組成物中に製剤化することもできる。投与が経口の場合、組成物は、当技術分野で周知の薬学的に許容される担体と組み合わせて容易に製剤化することができる。マンニトール、ラクトース、及びステアリン酸マグネシウム等の固体担体を使用することができ、そのような担体は、ケモタキシンを、治療しようとする対象体による経口摂取用に、錠剤、丸剤、糖剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、及び懸濁剤等として製剤化することを可能にする。例えば、散剤、カプセル剤、及び錠剤等の経口固形製剤の場合、好適な賦形剤には、糖等の充填剤、セルロース調製物、造粒剤、及び結合剤が含まれる。
【０１１２】
他の便利な担体には、当技術分野で周知のように、細菌性莢膜多糖、デキストラン、又は遺伝子操作されたベクター等の多価担体も含まれる。加えて、組成物を含む徐放性製剤は、長期間にわたる組成物の放出を可能にし、徐放性製剤でなければ、組成物は、治療効果を誘発又は増強する前に、対象体の系から除去されるか、並びに／又は例えばプロテアーゼ及び単純な加水分解により分解されるだろう。
【０１１３】
細胞毒性ペプチドを含むキット
別の態様では、本発明は、以下のうちの１つ又は複数を包装又は容器に含有するキットを提供する：（１）本明細書に記載の１つ又は複数の細胞毒性ペプチドを含む試薬；（２）薬学的に許容されるアジュバント又は賦形剤を含有する試薬；（３）注射器等の投与用媒体；（４）投与の説明書。構成要素（１）〜（４）の２つ以上が同じ容器に見出される実施形態も企図される。他の実施形態では、キット構成要素は、１つ又は複数の追加的な細胞毒性剤を含むこともできる。他の実施形態では、試薬は、静脈内投与用に製剤化されており、及び／又は投与の媒体は、静脈内投与に適切である。
【０１１４】
キットが供給される際、組成物の異なる成分は、別々の容器に包装されており、使用直前に混合してもよい。成分をそのように別々に包装することにより、活性成分の機能を失わずに長期間の保管が可能になる場合がある。
【０１１５】
キットに含まれる試薬は、様々な成分の寿命が保存され、容器の材料により吸着又は変更されないような任意の種類の容器で供給することができる。例えば、密封ガラスアンプルは、窒素等の中性の不活性ガス下で包装した凍結乾燥されたポリペプチド又はポリヌクレオチド又は緩衝液を含有することができる。アンプルは、ガラス、ポリカーボネート、ポリスチレン等の有機ポリマー、セラミック、金属、又は類似の試薬を入れるために典型的に使用される任意の他の材料等の任意の好適な材料で作られていてもよい。好適な容器の他の例には、アンプルとして類似の物質で製造されていてもよい単純なボトル、及びアルミニウム又は合金等のホイルで内張りされた内部を備えていてもよい薬袋が含まれる。他の容器には、試験管、バイアル、フラスコ、ボトル、又は注射器等が含まれる。容器は、皮下注射針で貫通することができる栓を有するボトル等、滅菌取出口を有していてもよい。他の容器は、取り外した際に成分の混合が可能になる容易に取り外し可能な膜により分離されている２つの区画を有していてもよい。取り外し可能な膜は、ガラス、プラスチック、ゴム等であってもよい。
【０１１６】
キットは、説明書と共に供給されてもよい。説明書は、紙又は他の基材に印刷されていてもよく、及び／又はフロッピーディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、Ｚｉｐディスク、ビデオテープ、音声テープ、フラッシュメモリ装置等の電子的に読取可能な媒体として供給されてもよい。詳細な説明書は、キットに物理的に付随していなくともよく、その代りに、キットの製造業者又は販売業者が指定するインターネットウェブサイトにユーザを誘導してもよく、又は電子メールとして供給されてもよい。
【０１１７】
本発明のより完全な理解は、以下の特定の実施例を参照することにより得ることができる。実施例は、例示のために記載されているに過ぎず、本発明の範囲を制限することは意図されていない。形態における変化及び等価物の置換は、状況が便宜性を示唆するか又は付与することができるように企図される。特定の用語が本明細書で使用されているが、そのような用語は、説明的な意味で意図されており、限定のためではない。上記に示されているような本発明の改変及び変異は、その趣旨及び範囲から逸脱せずに製作することができ、従って添付の実施形態により示されているような限定のみが、課されるべきである。
【０１１８】
実施例
実施例１．Ｌａｚ及びＨ．８−アズリン融合遺伝子のクローニング及び発現
ナイセリア・ゴノレア由来のｌａｚ遺伝子を、その公知の配列（配列番号１）に基づいてクローニングした（図１Ａ）。ｐａｚと称するＰ．エルギノーサアズリン遺伝子（配列番号２）（図１Ｂ）、及びＮ．ゴノレア（Ｎ．ｇｏｎｎｅｒｒｈｏｅａｅ）に由来するｌａｚのＨ．８エピトープ配列（配列番号３）を使用して、下述のように、ｐａｚの５’−末端にＨ．８エピトープ遺伝子をインフレームでクローニングして、Ｈ．８−ｐａｚ（図１Ｃ）を生成し、ｐａｚの３’−末端にＨ．８エピトープ遺伝子をインフレームでクローニングして、ｐａｚ−Ｈ．８（図１Ｄ）を生成した。
【０１１９】
細胞系及び試薬。ヒト癌細胞、細菌株、及びプラスミドは、表２に列挙されている。ヒト乳癌ＭＣＦ−７細胞及び脳腫瘍ＬＮ−２２９細胞は、イリノイ大学シカゴ校（ＵＩＣ）外科腫瘍学科の保存培養コレクションに由来する。細胞を、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、０．１ｍＭ  ＭＥＭ必須アミノ酸を含有するイーグル塩を有し、１０％加熱不活性化ウシ胎仔血清、１００単位／ｍｌペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンで補完されたＭＥＭ中で培養した。細胞は全て、５％ＣＯ２中３７℃で増殖した。（Ｙａｍａｄａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９巻：１４０９８〜１４１０３頁（２００２年）；Ｐｕｎｊら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２３巻：２３６７〜２３７８頁（２００４年））。
【０１２０】
2012518417.tif 000004
2012518417.tif 000005
【０１２１】
ｐａｚ及びｌａｚ遺伝子のクローニング及び発現。アズリン遺伝子のクローニング及び高発現は、記述されている。（Ｙａｍａｄａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９巻：１４０９８〜１４１０３頁（２００２年）；Ｐｕｎｊら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２３巻：２３６７〜２３７８頁（２００４年））。ナイセリア・ゴノレアのＬａｚコード遺伝子（ｌａｚ）を、Ｎ．ゴノレア菌株Ｆ６２のゲノムＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして用いてＰＣＲで増幅した。順方向及び逆方向プライマーは、５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＣＧＧＣＡＧＧＧＡＴＧＴＴＧＴＡＡＡＴＡＴＣＣＧ−３’（配列番号４）及び５’−ＧＧＧＧＴＡＣＣＧＣＣＧＴＧＧＣＡＧＧＣＡＴＡＣＡＧＣＡＴＴＴＣＡＡＴＣＧＧ−３’（配列番号５）であり、追加導入されたＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩ制限部位には、それぞれ下線が引かれている。ＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩで消化された１．０ｋｂの増幅ＤＮＡ断片を、ｌａｚ遺伝子がｌａｃプロモーターの下流に配置されるようにｐＵＣ１８ベクター（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら、Ｇｅｎｅ  ３３巻：１０３〜１１９頁（１９８５年））の対応する部位に挿入して、発現プラスミドｐＵＣ１８−ｌａｚを得た（表２、図１）。
【０１２２】
Ｎ．ゴノレアＬａｚのＨ．８及びＰ．エルギノーサのアズリン（Ｐａｚ）の融合体を発現するプラスミドを、ｐＵＣ１９−ｐａｚ及びｐＵＣ１８−ｌａｚを鋳型として用いてＰＣＲで構築した。Ｈ．８−Ｐａｚ融合体の場合、ｐＵＣ１８−ｌａｚを鋳型とし、プライマー、５’−（リン酸化）ＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＣＴＴＣＧＧＣＡＧＣＡＴＣＴＧＣ−３’（配列番号６）及び５’−ＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＧ−３’（配列番号７）を用いて３．１ｋｂの断片を増幅した。ＳａｌＩ部位には下線が引かれている。ＰＣＲで増幅された０．４ｋｂの断片は、鋳型としてのｐＵＣ１９−ｐａｚ、及びプライマー、５’−（リン酸化）ＧＣＣＧＡＧＴＧＣＴＣＧＧＴＧＧＡＣＡＴＣＣＡＧＧ−３’（配列番号８）及び５’−ＴＡＣＴＣＧＡＧＴＣＡＣＴＴＣＡＧＧＧＴＣＡＧＧＧＴＧ−３’（配列番号９）から得た。ＸｈｏＩ部位には下線が引かれている。ｐＵＣ１８−ｌａｚに由来するＳａｌＩで消化されたＰＣＲ断片、及びｐＵＣ１９−ｐａｚに由来するＸｈｏＩで消化されたＰＣＲ断片をクローニングして、発現プラスミドｐＵＣ１８−Ｈ．８−ｐａｚ（表２、図１）を得た。
【０１２３】
Ｐａｚ−Ｈ．８融合体の場合、ｐＵＣ１９−ｐａｚを鋳型とし、プライマー、５’−ＣＴＴＣＡＧＧＧＴＣＡＧＧＧＴＧＣＣＣＴＴＣＡＴＣ−３’（配列番号１０）及び５’−ＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＧ−３’（配列番号１１）を用いて、３．３ｋｂの断片を増幅した。ＢａｍＨＩ部位には下線が引かれている。ｐＵＣ１８−ｌａｚを鋳型とし、プライマー、５’−（リン酸化）ＴＧＣＴＣＴＣＡＡＧＡＡＣＣＴＧＣＣＧＣＧＣＣＴＧＣ−３’（配列番号１２）及び５’−ＴＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＣＴＴＣＧＧＣＡＧＣＡＴＣＴＧＣ−３’（配列番号１３）を用いて、０．１３ｋｂの断片を増幅した。ＢａｍＨＩ部位には下線が引かれており、細菌遺伝子終止コドンに対応する追加導入されたＴＴＡは斜字体で示されている。２つのＢａｍＨＩ消化ＰＣＲ断片をクローニングして、発現プラスミドｐＵＣ１９ｐａｚ−Ｈ．８を得た（表２）。
【０１２４】
大腸菌ＪＭ１０９を、アズリン及びその誘導体遺伝子の発現用宿主菌株として使用した。組換え大腸菌株を、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、０．１ｍＭ  ＩＰＴＧ、及び０．５ｍＭ  ＣｕＳＯ４を含有する２×ＹＴ培地中で１６時間３７℃にて培養して、アズリンタンパク質を産生した。
【０１２５】
融合ＧＳＴタンパク質のプラスミド構築。ｐＧＥＸ−５Ｘ−３（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．製、ピスカタウエイ、ニュージャージー州）を鋳型ＤＮＡとして用いて、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）コード遺伝子をＰＣＲで増幅した。使用した順方向及び逆方向プライマーは、５’−ＣＧＡＧＣＴＣＡＴＧＴＣＣＣＣＴＡＴＡＣＴＡＧＧＴＴＡＴＴＧＧ−３’（配列番号１４）及び５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＣＡＧＧＧＧＡＴＣＣＣＡＣＧＡＣＣＴＴＣＧＡＴＣＡＧＡＴＣＣ−３’（配列番号１５）であり、追加導入されたＳａｃＩ及びＨｉｎｄＩＩＩの制限部位にはそれぞれ下線が引かれており、細菌遺伝子終止コドンに対応する追加導入されたＴＣＡは、斜字体で示されている。ＳａｃＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化された１．０ｋｂの増幅ＤＮＡ断片を、ｐＥＴ２９ａベクターの対応する部位に挿入して、発現プラスミドｐＥＴ２９ａ−ｇｓｔを得た（表２）。
【０１２６】
Ｈ．８−ＧＳＴ融合体の場合、ｐＵＣ１８−ｌａｚを鋳型ＤＮＡとして用いて、ｌａｚのシグナルペプチド及びＨ．８コード領域をＰＣＲで増幅した。使用した順方向及び逆方向プライマーは、５’−ＧＧＡＡＴＴＣＡＴＡＴＧＡＡＡＧＣＴＴＡＴＣＴＧＧＣ−３’（配列番号１６）及び５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＣＴＴＣＧＧＣ−３’（配列番号１７）であり、追加導入されたＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩ部位の制限部位には、それぞれ下線が引かれている。ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで消化された０．１４ｋｂの増幅ＤＮＡ断片を、ｐＥＴ２９ａ−ｇｓｔベクターの対応する部位に挿入して、発現プラスミドｐＥＴ２９ａ−Ｈ．８−ｇｓｔを得た（表２）。
【０１２７】
ＧＳＴ−Ｈ．８融合体の場合、ｐＵＣ１８−ｌａｚを鋳型ＤＮＡとして用いて、Ｈ．８コード領域をＰＣＲで増幅した。使用した順方向及び逆方向プライマーは、５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＣＴＧＣＴＣＴＣＡＡＧＡＡＣＣＴＧＣＣＧＣＧＣＣ−３’（配列番号１８）及び５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＣＴＴＣＧＧＣＡＧＣＡＴＣＴＧＣＡＧＧ−３’（配列番号１９）であり、追加導入されたＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩの制限部位には下線が引かれており、導入された細菌遺伝子終止コドンＴＴＡは、斜字体で示されている。ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで消化された０．１４ｋｂの増幅ＤＮＡ断片を、ｐＧＥＸ−５Ｘ−３ベクターの対応する部位に挿入して、ｐＧＥＸ−５Ｘ−３−Ｈ．８を得た。その後、ｐＧＥＸ−５Ｘ−３−Ｈ．８を鋳型ＤＮＡとして用いて、ＧＳＴ−Ｈ．８融合領域をＰＣＲで増幅した。使用した順方向及び逆方向プライマーは、５’−ＣＧＡＧＣＴＣＡＴＧＴＣＣＣＣＴＡＴＡＣＴＡＧＧＴＴＡＴＴＧＧ−３’（配列番号２０）及び５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＣＡＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＣＴＴＣＧＧＣＡＧ−３’（配列番号２１）であり、追加導入されたＳａｃＩ及びＸｈｏＩ部位の制限部位には、それぞれ下線が引かれており、細菌遺伝子終止コドンに対応する追加導入されたＴＣＡは、斜字体で示されている。ＳａｃＩ及びＸｈｏＩで消化された１．１ｋｂの増幅ＤＮＡ断片を、ｐＥＴ２９ａベクターの対応する部位に挿入して、発現プラスミドｐＥＴ２９ａ−ｇｓｔ−Ｈ．８を得た（表２）。
【０１２８】
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を、ｇｓｔ及びその機能誘導体の発現用宿主菌株として使用した。これらプラスミドを保持する大腸菌株をＩＰＴＧの存在下で増殖させ、細胞を溶解し、タンパク質を、アズリンの場合に記述されているように精製し（Ｙａｍａｄａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９巻：１４０９８〜１４１０３頁（２００２年）；Ｐｕｎｊら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２３巻：２３６７〜２３７８頁（２００４年）；Ｙａｍａｄａら、Ｃｅｌｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７巻：１４１８〜１４３１頁（２００５年））、種々のアズリン誘導体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一成分（図１Ｅ）として泳動したが、Ｈ．８含有タンパク質（約１７ｋＤａ）は、以前に記述されているように変則的な泳動を示した（Ｃａｎｎｏｎら、同上．；Ｆｉｓｅｔｔｅら、同上）。
【０１２９】
実施例２．Ｈ．８は、神経膠芽腫細胞に対するＰ．エルギノーサアズリンの細胞毒性を増強するが、乳癌細胞に対しては増強しない
癌細胞に対するＰａｚの優先的進入（Ｙａｍａｄａら、Ｃｅｌｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７巻：１４１８〜１４３１頁（２００５年））、並びにヒトメラノーマ（Ｙａｍａｄａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９巻：１４０９８〜１４１０３頁（２００２年））及び乳癌（Ｐｕｎｊら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２３巻：２３６７〜２３７８頁（２００４年））に対するその細胞毒性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの両方で報告されている。例えば、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第１２／３３８，４８０号も参照されたい。しかしながら、神経膠芽腫等の脳腫瘍に対するＰａｚ又はＬａｚの効果は知られていない。本明細書では、神経膠芽腫（ＬＮ−２２９細胞系）及び乳癌（ＭＣＦ−７細胞系）細胞の両方に対する、Ｐａｚ、Ｌａｚ、Ｈ．８−Ｐａｚ（Ｈ．８エピトープは、ＰａｚのＮ末端にある）及びＰａｚ−Ｈ．８（Ｈ．８エピトープは、ＰａｚのＣ末端にある）の効果を研究した。  
【０１３０】
タンパク質の調製。Ｐ．エルギノーサのアズリン（Ｐａｚ）、Ｎ．ゴノレアのＬａｚ、Ｐａｚ−Ｈ．８、及びＨ．８−Ｐａｚを、以前に記述されているように精製した。（Ｙａｍａｄａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９巻：１４０９８〜１４１０３頁（２００２年）；Ｐｕｎｊら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２３巻：２３６７〜２３７８頁（２００４年）；Ｙａｍａｄａら、Ｃｅｌｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７巻：１４１８〜１４３１頁（２００５年））。組換えＧＳＴ融合誘導体は全て、以前に記述されているように精製した。（Ｙａｍａｄａら、Ｃｅｌｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７：１４１８〜１４３１頁（２００５年））。化学合成された３９アミノ酸のＨ．８ペプチドは、購入した。
【０１３１】
細胞毒性アッセイ。３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル−２，５−ジフェニル）テトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイを実施して、癌細胞に対する細胞毒性を決定した。細胞（１ウエル当たり５×１０３個）を、３７℃、５％ＣＯ２で１００：１の培地の９６ウエル培養皿に播種した。終夜インキュベーションした後、上清を除去し、指定された種々の濃度のタンパク質を含有する新しい培地を、付着細胞に添加した。これら細胞を、指定された種々の期間インキュベートした後、１０μｌの５ｍｇ／ｍｌ  ＭＴＴ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製、セントルイス、ミズーリ州）溶液を培養物に添加し、３７℃で２時間インキュベートすることによるＭＴＴアッセイにより、生細胞の数を決定した。ＭＴＴ反応は、１００μｌのイソプロパノール中４０ｍＭ  ＨＣｌを添加することにより終了させた。形成されたＭＴＴホルマザンを、Ｍｏｓｍａｎｎ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６５巻：５５〜６３頁（１９８３年））により記述されている方法に従って分光測光法で測定した。
【０１３２】
合成Ｈ．８ペプチドは、神経膠芽腫ＬＮ−２２９（図２Ａ）又は乳癌ＭＣＦ−７（図２Ｂ）細胞のいずれに対しても細胞毒性をほとんど示さなかった。アズリン（Ｐａｚ）の効果は、低いとはいえ、神経膠芽腫（図２Ａ）では用量依存的であり、アズリン濃度が１０μＭから４０μＭに上昇すると共に、細胞毒性は増加したが、乳癌（図２Ｂ）細胞ではそうではなかった。６時間のインキュベーション期間後、細胞毒性は、ほんのわずかに増加したに過ぎなかった。最も注目すべきことは、神経膠芽腫及び乳癌細胞のＰａｚ、Ｐａｚ−Ｈ．８、Ｈ．８−Ｐａｚ、及びＬａｚの細胞毒性に差異があることだった。Ｐａｚ、Ｐａｚ−Ｈ．８、Ｈ．８−Ｐａｚ、及びＬａｚは、全ての用量で、様々なインキュベーション期間で、ＭＣＦ−７細胞に対して本質的に同一の細胞毒性を示したが（図２Ｂ）、Ｐａｚは、特により短いインキュベーション期間（６時間）で、神経膠芽腫細胞に対して、Ｐａｚ−Ｈ．８、Ｈ．８−Ｐａｚ、又はＬａｚよりはるかに低い細胞毒性を示した。従って、Ｈ．８部分は、それ自体は細胞毒性を欠如しているものの、神経膠芽腫に対してのみＰａｚの細胞毒性を増強し、乳癌細胞に対しては増強しないと考えられた。
【０１３３】
実施例３．Ｐａｚ又はＬａｚに存在するＨ．８エピトープは、神経膠芽腫細胞におけるアズリンの取込みを促進する
Ｐａｚと比較して、Ｐａｚ−Ｈ．８、Ｈ．８−Ｐａｚ、及びＬａｚの神経膠芽腫細胞に対する細胞毒性が増強されたことにより、Ｈ．８部分が、神経膠芽腫細胞におけるアズリンの取込みを何らかの形で促進したのかどうかという疑問が生じた。Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８標識赤色蛍光タンパク質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｃｏｒｐ．製、カールズバッド、カリフォルニア州）を使用して、神経膠芽腫及び乳癌細胞内部のこれらタンパク質の内部移行を決定した。この技術は、ＭＣＦ−７細胞におけるアズリンの内部移行を実証するため、以前に使用された（Ｐｕｎｊら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２３巻：２３６７〜２３７８頁（２００４年）；Ｙａｍａｄａら、Ｃｅｌｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７巻：１４１８〜１４３１頁（２００５年））。
【０１３４】
共焦点顕微鏡。顕微鏡試料を調製するために、細胞をカバーガラス上で５％ＣＯ２下、３７℃で終夜培養した。予め暖めておいた３７℃の新しい培地を、赤色蛍光標識（Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８）アズリン又はＧＳＴ融合誘導体と混合し、細胞と共に指定の時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、−２０℃で５分間メタノールを用いて固定した。ＰＢＳで３回洗浄し、核染色用の１．５ｍｇ／ｍｌ  ４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（登録商標）、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製、バーリンゲーム、カリフォルニア州）を含有する封入剤を添加した後、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ社製ＬＳＭ５１０レーザー走査型共焦点顕微鏡を使用することにより画像を撮影した。（Ｙａｍａｄａら、Ｃｅｌｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７巻：１４１８〜１４３１頁（２００５年））。
【０１３５】
アズリン（Ｐａｚ）は、Ｐａｚ−Ｈ．８、Ｈ．８−Ｐａｚ、及びＬａｚより低減された効率で内部移行し、神経膠芽腫ＬＮ−２２９細胞にはＰａｚ進入に対する障壁があることが実証された（図３Ａ及び４Ａ）。対照的に、Ｐａｚは、乳癌ＭＣＦ−７細胞では、以前に報告されているように、Ｐａｚ−Ｈ．８、Ｈ．８−Ｐａｚ、又はＬａｚと同じか又は多少より高い効率で効率的に内部移行した（図３Ｂ及び４Ｂ）。（Ｐｕｎｊら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２３巻：２３６７〜２３７８頁（２００４年）；Ｙａｍａｄａら、Ｃｅｌｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７巻：１４１８〜１４３１頁（２００５年））。ＬＮ−２２９細胞におけるＬａｚ進入の用量依存性は、３７℃で３０分間のインキュベーション期間中の最適濃度は約１６μＭであり（図３Ｃ及び４Ｃ）、その後は更なる増強はなかった（データ非表示）ことを実証した。１０μＭ濃度では、大部分のＬａｚは、約１０〜２０分でＬＮ−２２９細胞の中に内部移行したが（図３Ｄ及び４Ｄ）、Ｐａｚの内部移行は、そのような条件下では最小限であり（図３Ｅ）、Ｐａｚ内部移行はＬＮ−２２９細胞において本質的に非能率的だったことを示唆した。Ｐａｚ−Ｈ．８及びＨ．８−Ｐａｚの著しい内部移行は、Ｌａｚと同様だっだが、ＬＮ−２２９細胞でのＰａｚとは対照的であり（図３Ａ及び４Ａ）、ＰａｚのＮ末端又はＣ末端のいずれかにあるＨ．８部分の相対的位置は、神経膠芽腫細胞におけるＰａｚ部分の内部移行を促進するその能力に影響を及ぼさなかった。
【０１３６】
実施例４．Ｈ．８部分は、神経膠芽腫におけるＰａｚ進入を促進するが、乳癌細胞においては促進しない
神経膠芽腫細胞へのＰａｚ進入を促進するために、Ｈ．８エピトープが、Ｌａｚと同様にＰａｚの一部である必要があるかどうか又は単独で機能することができるかどうかを決定するために、Ｈ．８単独に加えて、種々のＨ．８融合タンパク質を使用した。３９アミノ酸の合成Ｈ．８部分等の小型ペプチドは、溶液中での安定性が低いため、本発明者らは、Ｐａｚ−Ｈ．８又はＨ．８−Ｐａｚと同様に、Ｈ．８がＧＳＴのＮ末端（Ｈ．８−ＧＳＴ）又はＧＳＴのＣ末端（ＧＳＴ−Ｈ．８）に組み込まれるように、Ｈ．８部分とグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合体を構築した。ＧＳＴ融合ペプチドの構築は、実施例１に記載されている。
【０１３７】
赤色蛍光を発するＡｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８結合Ｐａｚを、対照としてのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に加えて、未標識合成Ｈ．８ペプチド、ＧＳＴ、ＧＳＴ−Ｈ．８、及びＨ．８−ＧＳＴ融合タンパク質と共に別々にインキュベートし、３７℃で３０分間インキュベーションした後で、ＬＮ−２２９細胞における２０μＭ  Ｐａｚ混合物の内部移行を決定した。合成Ｈ．８ペプチドは、Ｐａｚと共に別々に導入された場合、ＰＢＳ（図５Ｅ）、ＧＳＴ（図５Ｂ）、又はＧＳＴ−Ｈ．８（図５Ｃ）と比較して、Ｐａｚ内部移行を増強した（図５Ａ）。蛍光を定量化することにより、Ｈ．８ペプチドが、Ｐａｚ進入を２．１倍刺激したことが示された。しかしながら、Ｈ．８−ＧＳＴの存在は、Ｐａｚの内部移行を著しく増強した（３倍超）（図５Ｄ）。その一方で、ＧＳＴ−Ｈ．８は、わずかな刺激を示したに過ぎなかった（図５Ｃ）。Ｐａｚそれ自体は、ゆっくりと神経膠芽腫細胞に進入したに過ぎず（図５Ｅ）、脳腫瘍細胞における進入は、Ｈ．８により媒介されることが実証された。Ｈ．８は単独では、神経膠芽腫細胞に進入しなかったが（図３Ａ）、Ｐａｚの内部移行を刺激するその能力（図５Ａ）は、脳腫瘍細胞へのタンパク質の進入を促進するその能力を反映している。
【０１３８】
実施例５．神経膠芽腫細胞におけるＨ．８−ＧＳＴの存在下でのＰａｚの内部移行の増強は、そのような細胞でのより高い細胞毒性に結び付く。
本発明者らは、合成Ｈ．８ペプチド、ＧＳＴ、ＧＳＴ−Ｈ．８、及びＨ．８−ＧＳＴタンパク質（各々２０μＭ）を、２０μＭ  Ｐａｚの非存在下又は存在下で、ＬＮ−２２９細胞と共に２４時間インキュベートし、その後２４時間後にＭＴＴアッセイより成育可能な神経膠芽腫細胞を測定することにより、細胞毒性の程度を測定した。Ｐａｚの非存在下では、Ｈ．８ペプチド、ＧＳＴ、又はＧＳＴ融合タンパク質はいずれも、いかなる著しい細胞毒性も示さなかった（図５Ｆ、−Ｐａｚ）。それ自体がＨ．８ペプチド又はＰＢＳの存在下で低い細胞毒性を示す２０μＭ  Ｐａｚの存在下では（図５Ｆ、＋Ｐａｚ）、ＧＳＴそれ自体又はＧＳＴ−Ｈ．８は、細胞毒性のある程度の増強を示したが（図５Ｆ、＋Ｐａｚ）、細胞毒性の大幅な増強は、Ｈ．８−ＧＳＴの存在下でのみ観察された（図５Ｆ、＋Ｐａｚ）。まとめると、これらのデータにより、Ｈ．８部分は、Ｐａｚ等のタンパク質の一部として存在するか又はその存在下にある場合、そのような細胞内部へのＰａｚ輸送を促進し、細胞毒性の増強をもたらすことが示唆される。
【０１３９】
実施例６．Ｈ．８は、ＢＢＢの通過を媒介し、脳への進入を可能にする
Ｈ．８エピトープに、神経膠芽腫ＬＮ−２２９細胞における融合体又は個々のタンパク質の内部移行の増強を可能にする能力があることは（図３Ａ、４Ａ、及び５Ｄ）、Ｈ．８−Ｐａｚ又はＬａｚのＮ末端の一部としてのＨ．８が、ＢＢＢの通過を促進し、これらタンパク質の末梢循環から脳細静脈への輸送を可能にしたかどうかという疑問を提起した。
【０１４０】
Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標）アッセイ。タンパク質は全て、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷ（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、リンカーン、ネブラスカ州）を製造業者により推奨された条件下で使用して標識した。ＩＲｄｙｅ（登録商標）８００ＣＷが結合された５００μｇのＰａｚ、Ｈ．８−Ｐａｚ、及びＬａｚを、ヌードマウスに腹腔内注射した。２４時間後、マウスを犠牲し、脳を摘出し、脳画像をＬＩ−ＣＯＲ  Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標）赤外線画像化システム（解像度８４μｍ、オフセット１ｍｍ）で検出した。その後、マウス脳を水平に切断し、標識タンパク質の存在を検出するために、頭側中脳領域画像を撮影した。  
【０１４１】
アズリンタンパク質の蛍光の定量化。蛍光の定量化は、Ａｄｏｂｅ（登録商標）Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（登録商標）を使用することにより、以下のように測定した：１つの細胞をＰｈｏｔｏｓｈｏｐ（登録商標）の投げ縄ツール（Ｌａｓｓｏ  Ｔｏｏｌ）により選択し、平均値を、画像メニューの赤色ヒストグラムから得た。１つの試料について少なくとも３つの異なる細胞を測定し、標準偏差を計算した。  
【０１４２】
赤外色素ＩＲｄｙｅ（登録商標）８００ＣＷ（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）で標識された５００μｇのＰａｚ、Ｈ．８−Ｐａｚ、及びＬａｚタンパク質を、生存ヌードマウスに腹腔内注射した。２４時間後、マウスを犠牲し、脳を単離し、画像を、ＬＩ−ＣＯＲ  Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標）赤外線画像化システムを使用して撮影した。Ｐａｚは少量が脳細静脈に進入することが見出されたが、更により多くのＬａｚ及び特にＨ．８−Ｐａｚ（４倍超）が、そのような条件下において脳の内部で検出され（図６）、Ｈ．８エピトープが、融合タンパク質の脳への進入を可能にするのに明らかな役割を果たすことを実証した。
【０１４３】
実施例７．Ｈ．８エピトープは、Ｎ末端にある場合、周辺質タンパク質の細菌表面提示を可能にする。
ＬａｚのＨ．８エピトープがＮ末端に配置されていることが、その表面提示に寄与しているかどうかを研究するために、Ｈ．８融合誘導体を、実施例１に記載のように、ＧＳＴ（図５）及びＰａｚ（図２及び図３Ａ／Ｂ及び４Ａ／Ｂ）のＮ末端及びＣ末端に構築した。
【０１４４】
大腸菌における表面露出タンパク質の局在化。ｐＥＴ２９ａ−ｇｓｔ、ｐＥＴ２９ａ−Ｈ．８．ｇｓｔ、又はｐＥＴ２９ａ−ｇｓｔ−Ｈ．８を保持する大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）、及びｐＵＣ１９−ｐａｚ、ｐＵＣ１９−ｐａｚ−Ｈ．８、ｐＵＣ１８−Ｈ．８−ｐａｚ、又はｐＵＣ１８−ｌａｚを保持する大腸菌株ＪＭ１０９を、０．４ｍＭイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）と共に３７℃で培養した。これら細菌培養の各々１ｍｌを遠心分離し、その結果生じたペレットを収集した。ＰＢＳで２回洗浄した後、ＧＳＴ誘導体に対する抗ＧＳＴ抗体（１：２０００）又はアズリン誘導体に対する抗アズリン抗体（１：５００）を含有する１ｍｌの１％ＦＢＳ−ＰＢＳを添加した。細胞懸濁液を氷上で１時間インキュベートし、その後ＰＢＳで２回洗浄した。ＧＳＴ誘導体に対するＦＩＴＣ結合抗ウサギＩｇＧ、又はアズリン誘導体に対するＦＩＴＣ結合抗ウサギ抗体を添加し、氷上で３０分間インキュベートした。未結合抗体を除去するために細胞をＰＢＳで２回洗浄し、氷上でエタノールを用いて固定した。その後、ＤＡＰＩで処理された大腸菌試料を、共焦点顕微鏡で観察した。
【０１４５】
Ｈ．８融合タンパク質を精製した（図１Ｅ及び図７Ａ）。ＧＳＴの細胞局在化、並びにＮ末端及びＣ末端の２つのＨ．８融合体（Ｈ．８−ＧＳＴ及びＧＳＴ−Ｈ．８）が、図７Ｂに示されている。抗ＧＳＴ抗体を使用したウエスタンブロッティングで検出すると、３つのタンパク質は全て大腸菌中で高発現され、大腸菌の全細胞溶解物中に存在した（図７Ｂ）。周辺質画分を大腸菌から単離し、３つのタンパク質の存在を調査すると、ＧＳＴ及びＧＳＴ−Ｈ．８タンパク質は、大量に検出されたが（図７Ｂ、周辺質画分下のレーン１及び３）、Ｈ．８−ＧＳＴは、そのような周辺質画分では、わずか少量しか検出することができなかった（図７Ｂ、周辺質画分下のレーン２）。  
【０１４６】
残りのＨ．８−ＧＳＴ融合タンパク質が、大腸菌細胞の表面に輸送された可能性があるかどうかを調査するために、３つのタンパク質を高発現する細胞を増殖し、回収し、洗浄し、抗ＧＳＴ抗体で処理して、あらゆる表面露出ＧＳＴを結合させ、再び洗浄し、ＦＩＴＣ結合二次抗体で処理した。ＧＳＴが表面に露出していれば、抗ＧＳＴ抗体はそれらに結合し、それはその後ＦＩＴＣ結合二次抗体により検出することができるだろう。実際、Ｈ．８−ＧＳＴを保持する大腸菌細胞のみが、ＦＩＴＣの発生する緑色蛍光を示し（図７Ｃ、Ｈ．８−ＧＳＴ）、Ｈ．８エピトープがＧＳＴのＮ末端に存在することにより、細胞表面へのＨ．８−ＧＳＴの輸送が促進されたことを示唆した。ＧＳＴのＣ末端にＨ．８部分が存在するもの（ＧＳＴ−Ｈ．８）、並びにＧＳＴそれ自体は、大部分は周辺質及び細胞内に留まり、表面提示はされなかった（図７Ｃ、ＧＳＴ、及びＧＳＴ−Ｈ．８）。
【０１４７】
上述と同じ技術を使用して、Ｐａｚ及びＰａｚ−Ｈ．８は細胞内に留まるが（図７Ｄ、Ｐａｚ及びＰａｚ−Ｈ．８）、Ｈ．８−Ｐａｚ及びＬａｚは両方とも表面提示を示したことが決定され、Ｎ−端末にＨ．８が存在することは、恐らくは脂質化に遊離システインが必要であるため、融合タンパク質を輸送して外膜を貫通させ表面に届けるのに重要であることが確認された。
【０１４８】
実施例８．白血病研究用のアズリン、Ｌａｚ、及びＰａ−ＣＡＲＤペプチドの調製
野生型（ｗｔ）アズリン及び突然変異体アズリンを、Ｙａｍａｄａ  Ｔら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９巻：１４０９８〜１０３頁（２００２年）及びＰｕｎｊ  Ｖら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２３巻：２３６７〜７８頁（２００４年）に記述されているように精製した。Ｌａｚは、Ｈｏｎｇ  ＣＳら、Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  ５巻：１６３３〜４１頁（２００６年）に記述されているのと同じプロトコールを使用して精製した。手短に述べると、ｐＵＣ１８ベクターを使用してＬａｚを大腸菌で発現させた。細胞を２４時間インキュベートし、遠心し、ＰＢＳで２回洗浄し、その後周辺質画分を単離するために溶解した。周辺質画分を、タンパク質精製用Ｑセファロース交換のために収集する。画分を濃縮し、ＦＰＬＣを実施して精製タンパク質を単離する。  
【０１４９】
Ｐａ−ＣＡＲＤのクローニング、発現、及び精製。そのＮ８２末端領域にＳＵＭＯ融合タンパク質を有するｐＥＴ−ＳＵＭＯ発現ベクターを、Ｐ．エルギノーサＡＤＩ由来の可溶性アルギニンデイミナーゼ、及びカスパーゼ動員ドメイン（ＣＡＲＤ）含有ドメインの高レベル発現用に使用した。ＡＤＩ遺伝子のＣＡＲＤモチーフをｐＥＴ−ＳＵＭＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にクローニングするために、以下のプライマー対を用いてＰ．エルギノーサの臨床分離株のゲノムＤＮＡから、遺伝子を増幅した：Ｆ、順方向：５’−ＡＴＧＣＡＣＡＡＴＣＴＧＣＴＧＡＣＣＧＡＧＡＣＣＡＴＣＣＡＧ−３’（配列番号２８）及びＲ、逆方向：５’−ＴＣＡＧＧＴＣＧＡＧＧＡＧＣＣＧＴＧＧＴＣＣＴＴＧＴＣ−３’（配列番号２９）。ＰＣＲ産物を、ｐＥＴ−ＳＵＭＯ  ＴＡクローニングベクターに直接ライゲーションした。その結果生じた発現ベクターの配列を確認し、大腸菌９０菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。
【０１５０】
終夜培養を、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有する３７℃のＬＢ培地で増殖させた。ＯＤ５９５ｎｍがおよそ０．５の時に、ＩＰＴＧを０．５ｍＭの終濃度で培養に添加し、３７℃で５時間インキュベートした。５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離することにより、細胞を収集した。細胞ペレットを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、及び２５％（重量／容積）スクロースを含有する溶解緩衝液、ｐＨ、８．０で溶解した。溶解緩衝液を添加した後、２０ｍｇ／ｍｌリゾチームを細胞懸濁液に添加し、４℃で２０分間インキュベートした。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００［終濃度０．０１％（容積／容積）］を添加し、５分間インキュベートした。培養液５００ｍｌにつき１００μｌのＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅを添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。細胞懸濁液を、４℃で３５分間１５，０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を、予め平衡化しておいた１ｍｌのＮｉ−ＮＴＡカラムに負荷した。負荷した後、カラムを、緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、１０ｍＭイミダゾール）で洗浄した。ＳＵＭＯ−ＣＡＲＤは、溶出緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．９）中の５０〜５００ｍＭイミダゾールの２５ｍｌステップ勾配で溶出した。精製ＳＵＭＯ−ＣＡＲＤ画分を貯留し、ＳＵＭＯプロテアーゼ消化用の緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）と緩衝液を交換した。その後、ＳＵＭＯ−ＣＡＲＤタンパク質を１．５〜２ｍｌまで濃縮した。その後、ＤＴＴを１ｍＭの終濃度で添加した。ＳＵＭＯプロテアーゼを添加した後、消化混合物を２〜３時間３０℃でインキュベートし、Ｐａ−ＣＡＲＤと呼ばれるＣＡＲＤポリペプチドを、ニッケル樹脂を使用することにより精製した。最終タンパク濃度は、ＢＳＡを標準物質として使用して、タンパク質試薬（Ｐｉｅｒｃｅ社製）で測定した。ＣＡＲＤドメインがそれに由来していたＰ．エルギノーサのＡＤＩ酵素を、同一の手順を使用してＳＵＭＯ−ＡＤＩ融合タンパク質から精製した（Ｐａ−ＡＤＩ）。
【０１５１】
細胞培養。細胞系は全て、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、２％ペニシリン／ストレプトマイシン、及び２％グルタミンで補完されたＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．製）で培養した。細胞は全て、５％ＣＯ２の加湿された３７℃インキュベーター中で増殖させた。
【０１５２】
細胞毒性アッセイ。ＭＴＴ［３−（４，５ジメチルチアゾール−２−イル−２，５テトラゾリウムブロミド）］アッセイを、Ｙａｍａｄａ  Ｔら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９巻：１４０９８〜１０３頁（２００２年）及びＰｕｎｊ  Ｖら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２３巻：２３６７〜７８頁（２００４年）に記述されているように、ｗｔ及び突然変異体アズリンの細胞毒性を測定するために使用した。手短に述べると、水溶性テトラゾリウム塩、［３−（４，５ジメチルチアゾール−２−イル−２，５テトラゾリウムブロミド）］は、無傷ミトコンドリアデヒドロゲナーゼにより水不溶性ホルマザンに代謝される。その後、ホルマザンを、２−プロパノール＋４０ｍＭ  ＨＣｌを添加して１時間インキュベーションすることにより可溶化する。３×１０４個の細胞を、様々な濃度のアズリン、Ｌａｚ、又はＰａ−ＣＡＲＤ、並びに陽性対照としての５−アザ−２−デオキシシチジン（ＤＡＣ）で処理した。細胞の生存率を、５７０ｎｍの光学密度により分光測光法で検出されたホルマザンの形成に基づいて評価した。
【０１５３】
細胞周期分析。ＨＬ６０及びＫ５６２細胞を（１ウエルにつき３×１０５個の細胞を２４ウエルプレートに播種）、野生型アズリン、Ｐａ−ＣＡＲＤ、又はＬａｚ（５及び１０μＭ）で４８時間処理した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、−２０℃で２４時間７０％メタノールを用いて固定した。固定した細胞を、ＰＢＳで２回洗浄し、２０μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡを含有するＰＢＳ中５０μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムを用いて暗所で３０分間染色し、フローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）で分析した。細胞周期の様々な期にある細胞のパーセントを、ＭＯＤＦＩＴ  ＬＴソフトウェアで決定した。
【０１５４】
ウエスタンブロッティング。イムノブロッティングの場合、細胞質画分及び核画分を、完全プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ社製）を用いて、製造業者のプロトコールに従って、ＮＥ−ＰＥＲ抽出試薬（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を使用して単離した。細胞溶解物のタンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ  Ｂｉｏ−Ｒａｄアッセイを使用して測定した。細胞溶解物タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、イムノブロッティング用のＰＶＤＦ膜に移した。５％脱脂粉乳（Ｄｉｆｃｏ社製）を含有するＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）中で、膜をブロッキングし、一次抗体（ＴＢＳＴ、５％脱脂粉乳での推奨希釈）と共に、４℃で終夜穏やかに撹拌しながらインキュベートした。ＴＢＳＴで３回、各回５分間洗浄した後、Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（サンフランシスコ、カリフォルニア州）から購入した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギ又はウサギ抗マウス抗体（ＴＢＳＴ、５％脱脂粉乳中１：３０００）で、膜を１時間室温で探索した。追加的洗浄ステップの後、膜を化学発光基質と共に室温で１分間インキュベートした。各抗体インキュベーション間で未結合抗体を除去するために、製造業者のプロトコールに従ってＲｅｓｔｏｒｅウエスタンブロットストリップ緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ社製）中で膜をインキュベートし、再び探索した。抗Ｂアクチンは、Ｓｉｇｍａ社製だった。ＡＫＴ、Ｗｅｅｌ、及び抗ホスホ−ＡＫＴ−Ｓ４７３抗体は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製（ベヴァリー、マサチューセッツ州）だった。二次抗体、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギ及びウサギ抗マウスは、Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製（サンフランシスコ、カリフォルニア州）だった。  
【０１５５】
共焦点顕微鏡。アズリンタンパク質及びＬａｚタンパク質を、蛍光性化学物質ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５６８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）と結合させ、ＨＬ６０、Ｋ５６２、又は正常末梢血単核細胞と共に１時間インキュベートした。細胞への蛍光化学標識ペプチド又はタンパク質の進入は、Ｙａｍａｄａ  Ｔら、Ｃｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７巻：１４１８〜３１頁（２００５年）に記述されているように、共焦点顕微鏡（ＬＣ５１０型、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ社製）で観察した。
【０１５６】
実施例９．白血病細胞に対するアズリン及びＬａｚの効果
細菌タンパク質Ｌａｚ及びアズリンを、それらが細胞毒性を誘導し、それにより２つの白血病細胞系、ＡＭＬ細胞系であるＨＬ６０、及びＣＭＬ細胞系であるＫ５６２の生存率を低減する能力について調査した。細胞系ＨＬ６０及びＫ５６２の生存率は、１０μＭのＬａｚ又はアズリンで処理した２４時間、４８時間、７２時間後に、ＭＴＴを代謝的に還元して紫色のホルマザン産物にするそれらの能力により測定した（図１Ａ及びＢ）。１０μＭのタンパク質には、非常に細胞毒性であることが判明し、９０％を超えて細胞生存率を低減させた。Ｌａｚは、アズリン部分を有するナイセリアタンパク質であり、Ｐ．エルギノーサアズリンと実質的な配列同一性を有するが、Ｈ８エピトープと呼ばれる追加的な３９アミノ酸のペプチドを有する。
【０１５７】
このＨ８エピトープが、アズリンの抗癌活性を調節するかどうかを決定するために、Ｈ．８エピトープをＰ．エルギノーサアズリンのＮ末端及びＣ末端にクローニングして、Ｈ８アズリン（Ｈ８−Ａｚｕ）及びＡｚｕ−Ｈ８を得た。Ｈｏｎｇ  ＣＳら、Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  ５巻：１６３３〜４１頁（２００６年）。これら２つのＬａｚ様タンパク質も、白血病細胞系に対して試験した。より低い有効量を決定するために、Ｋ５６２細胞を、３．７５ｎＭ以上の終濃度の様々な濃度のタンパク質で処理し、ＨＬ６０細胞を、１〜１０μＭの終濃度で処理した。細菌タンパク質は全て、２つの白血病細胞系に対して用量依存的な細胞毒性効果を示した。著しい細胞生存率の低減は、ナノモル（ｎＭ）のタンパク質濃度でさえ観察され、生存率のピークは、５μＭのタンパク質で低減された（図８Ｃ及びＤ）。この細胞毒性効果は、処理の２４時間後で明らかであり、全てのタンパク質は、ＨＬ６０細胞及びＫ５６２細胞の両方で細胞毒性効果を発揮した（図８Ａ及びＢ）。
【０１５８】
Ｌａｚ及びアズリンの細胞毒性効果を、公知の白血病薬、５−アザ−２’−デオキシシチジン（ＤＡＣ）とも比較した。５−アザ−２’−デオキシシチジンは、ＤＮＡ過剰メチル化によりサイレンシングされる腫瘍抑制遺伝子を再活性化させることにより作用するＤＮＡメチル化阻害剤である。腫瘍抑制遺伝子の再活性化は、細胞周期停止及びアポトーシスに結び付く。各細菌タンパク質の生存率低減効果は、ＤＡＣの効果より著しく良好だった（図８Ｃ及びＤ）。アズリン又はＬａｚは、癌細胞に対して細胞毒性であり、正常細胞には細胞毒性でない。この細胞毒性は、エンドトキシン等の細胞性夾雑物によるものではなく、ペプチド自体によることも示された。
【０１５９】
Ｌａｚ及びアズリンにより誘導された細胞死の考え得る機序を識別するために、明白な全体的形態変化を蛍光顕微鏡で探した。最終的に細胞死に結び付くことになるプロセスである細胞壊死、アポトーシス、及び細胞分化の識別を支援する可能性がある変化を探した。肉芽形成又は細胞肥大等の変化は、急性骨髄性及び慢性骨髄性白血病細胞の両方の場合における、考え得る分化又はネクローシス及び最終的細胞死の指標である。蛍光顕微鏡の結果は、Ｌａｚ及びアズリンが、１０μＭの濃度で４８時間インキュベーション２１０した後で、ＨＬ６０細胞及びＫ５６２細胞の細胞分化を誘導することができることを示す（図９）。
【０１６０】
実施例１０．ＨＬ６０細胞及びＫ５６２細胞へのＬａｚ及びアズリンの進入
ＨＬ６０細胞及びＫ５６２細胞に進入するアズリン及びＬａｚの能力を、共焦点顕微鏡及びＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５６８結合赤色蛍光アズリン又はＬａｚを使用して調査した。これら２つのタンパク質は、正常ＰＢＭＣには進入しないと考えられたが（図１０Ａ及びＢ、パネル１）、Ｌａｚ及びアズリンは、Ｋ５６２細胞（図１０Ｃ及びＤ、パネル１）及びＨＬ６０細胞（図１０Ｅ及びＦ、パネル１）の両方に著しく進入した。アズリンの進入は、より少ないことが示された（図１０Ｄ及びＦ、パネル１）。１．０〜２．５μＭのアズリンの細胞毒性レベル（図８Ｃ及びＤ）は、ＨＬ６０細胞又はＫ５６２細胞へのその進入レベルに関連している可能性がある。
【０１６１】
Ｈ８結合アズリン、Ａｚｕ−Ｈ８、及びＨ８−Ａｚｕの進入を調査し、特に１．０〜２．５μＭ等のより低い濃度では、アズリンと同様か又は多少より高いが、Ｌａｚに匹敵する細胞毒性があることが実証された（図８Ｃ及びＤ）。Ａｚｕ−Ｈ８及びＨ８−Ａｚｕは両方とも、アズリンより高レベル、Ｋ５６２細胞へのＬａｚの進入に匹敵するレベルの進入を示し（図１０、パネル２）、白血病細胞へのアズリン又はＬａｚの進入を可能にすることにＨ８エピトープが役割を果たしていることを実証した。  
【０１６２】
実施例１１．Ｌａｚは、Ｗｅｅｌタンパク質レベルを増加させ、リン酸化ＡＫＴを減少させることにより、Ｋ５６２細胞において細胞周期停止を引き起こす
細胞周期進行に対するＬａｚ、アズリン、及び／又は５−アザ−２−デオキシシチジン（ＤＡＣ）の効果を、Ｋ５６２細胞のフローサイトメトリー分析を使用して評価し、Ｋ５６２細胞は非常に感受性であると考えられた。Ｋ５６２の細胞周期停止に対するＬａｚ、アズリン、及びＤＡＣの効果を観察した（図１１）。Ｌａｚ、アズリン、及びＤＡＣは、Ｇ２／Ｍ期でＫ５６２細胞を停止することができる。Ｇ２／Ｍ期での細胞周期停止は、アズリン及びＬａｚで観察されたように、アポトーシス及び細胞死の誘導に結び付くことが多い。Ｌａｚ及びアズリン等のタンパク質が、白血病細胞のＧ２細胞周期調節因子のレベル及び／又は活性に影響を及ぼすことができるというのは考え得ることである。
【０１６３】
Ｗｅｅｌ及びリン酸化ＡＫＴを含む、Ｇ２期進行停止を媒介する細胞周期調節因子に対するＬａｚの効果を分析した。Ｗｅｅｌタンパク質は、Ｇ２／Ｍ期での細胞周期停止のメディエーターであることが知られている。多くのウイルスタンパク質が、ｉｎ  ｖｉｖｏで、Ｗｅｅｌと相互作用しＷｅｅｌ活性に影響を及ぼすことにより、細胞周期をＧ２期で停止させることができることが示されている。１０μＭ  ＬａｚによるＫ５６２細胞の処理は、Ｗｅｅｌがそこでその効果を発揮することが知られている細胞質及び核の両方で、Ｗｅｅｌタンパク質レベルの増加に結び付いた（図１２）。Ｋ５６２細胞とは対照的に、ＨＬ６０細胞は、Ｗｅｅｌタンパク質のレベルが著しく低減されたことを示した。セリン４７３でのＡＫＴリン酸化の阻害、及び従ってＡＫＴ活性は、Ｇ２／Ｍ細胞周期停止にも関連している。Ｌａｚ処理は、リン酸化ＡＫＴセリン４７３レベルの減少により明らかなように、ＨＬ６０細胞におけるＡＫＴ活性の著しい減少にも結び付いた（図１２）。興味深いことには、ＡＫＴ−Ｐ−Ｓｅｒ４７３レベルの減少は、Ｋ５６２細胞よりＨＬ６０細胞でより顕著であり、Ｌａｚによる核Ｗｅｅｌタンパク質レベルの変化は、Ｋ５６２細胞でより顕著だった。
【０１６４】
実施例１２．Ｐａ−ＣＡＲＤ、抗癌性細菌タンパク質は、白血病細胞に対する活性を示す。
Ｍ．アルギニニＡＤＩは、Ｇ１／Ｓ期での増殖停止を引き起こし、アポトーシスに導くことにより、培養ヒトリンパ白血病細胞の増殖を阻害することが報告されている。Ｇｏｎｇ  Ｈら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １４巻：８２６〜９頁（２０００年）。ＡＤＩは、アルギニンを枯渇させ、アルギニンをシトルリン及びアンモニアに変換することにより、その作用を発揮すると考えられている。哺乳類細胞は、シトルリンからアルギニンを再合成することができるため、アルギニンは、非必須アミノ酸である。しかしながら、肝細胞癌、メラノーマ、又は腎細胞癌等のある種の癌は、シトルリンからのアルギニン合成に重要な酵素であるアルギニノスクシネートシンテターゼをｉｎ  ｖｉｖｏで発現せず、そのため、そのような癌細胞は、ＡＤＩ作用によるアルギニン欠乏に対して感受性となることが特徴である。
【０１６５】
Ｍ．アルギニニＡＤＩの興味深い特徴は、哺乳類ＣＡＲＤタンパク質に対する、そのＮ末端部分の識別可能な構造的類似性である。真核生物、主に哺乳類のＣＡＲＤタンパク質は、タンパク質間相互作用モチーフであるカスパーゼ動員ドメインと呼ばれるドメインを保有する。ＣＡＲＤ保有タンパク質にＣＡＲＤドメインが存在することは、ＣＡＲＤ間相互作用により複合体の形成を可能にし、ＮＦ−ｋβにより媒介される細胞シグナル伝達又は細胞死に結び付くプロセスの活性化／阻害に結び付く。カスパーゼ等のＣＡＲＤ保有タンパク質は、アポトーシスの誘導に関与するだけでなく、炎症性サイトカイン産生にも関与する。従って、カスパーゼ１等のカスパーゼは、ＩＬ−１Ｂ等のサイトカインのタンパク質分解プロセシングに関与し、それが活性化形態で細胞から放出されることを可能にする。ＩＬ−１Ｂは、血管新生を促進し、多くの腫瘍で過剰産生されるため、カスパーゼ１等のＣＡＲＤ保有タンパク質は、抗癌剤としての阻害剤開発の主要な標的であるとみなされる。
【０１６６】
それぞれＭａ−ＡＤＩ及びＰａ−ＡＤＩと呼ばれるＭ．アルギニニ及びＰ．エルギノーサに由来するＡＤＩの遺伝子配列及び結晶構造は公知であり、約２７％の配列同一性を示し、Ｎ−末端に共通ＣＡＲＤモチーフが存在する（図１３Ａ）。ＡＤＩは、ジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ（ＤＤＡＨ）及びアルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼ（ＡＧＡＴ）等の他のファミリーメンバーに類似した、グアニジウム炭素原子での求核置換反応を触媒する能力を有するグアニジン修飾酵素（ＧＭＥ）スーパーファミリーのメンバーである。しかしながら、ＧＭＥスーパーファミリーメンバーの構造特徴をアラインメントすることにより、ＣＡＲＤモチーフはＡＤＩにのみ存在し、他のメンバーには存在しないことが示され（図１３Ａ）、ＡＤＩによるＣＡＲＤドメインの動員を示し、それに結合する抗癌剤としてのその潜在的役割を示唆する。
【０１６７】
ＣＡＲＤ（アミノ酸７５〜２２５）の構造的特徴を有するＰ．エルギノーサＡＤＩ由来の領域を、プラスミドｐＥＴ−ＳＵＭＯに由来するＳＵＭＯ部分と共にインフレームでクローニングして、ＳＵＭＯ−ＣＡＲＤ融合タンパク質を得た。この融合タンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡカラムを使用して精製し、ＣＡＲＤポリペプチドを、均質な１７ｋＤａタンパク質として単離した（図１３Ｂ）。その後、Ｐ．エルギノーサＡＤＩのＮ末端ＣＡＲＤドメイン、並びにＰ．エルギノーサに由来するＡＤＩ（Ｐａ−ＡＤＩ、４６ｋＤａ、図１３Ｂ）に由来するため、Ｐａ−ＣＡＲＤと呼ばれるこのタンパク質の活性を、固形腫瘍細胞系、線維肉腫ＨＴ−１０８０、乳癌ＭＣＦ−７、及び白血病細胞系ＨＬ−６０を使用して決定した。
【０１６８】
Ｐａ−ＣＡＲＤは、ＨＴ−１０８０、ＭＣＦ−７、及び白血病ＨＬ６０、並びに他の癌に対する著しい細胞毒性活性を示したが（図１３Ｃ）、正常線維芽細胞及びＭＣＦ−１０Ａ等の正常乳腺細胞に対する細胞毒性活性はより低かった（データ非表示）。Ｍ．アルギニニＡＤＩは、細胞周期停止を誘導することによりヒト白血病細胞増殖を阻害することが報告されているため、Ｐａ−ＣＡＲＤが癌細胞の細胞周期停止を誘導する能力も測定した。Ｌａｚ及びアズリンについて以前に報告したように（図１１）、Ｐａ−ＣＡＲＤは、細胞周期の著しい停止を示した（データ非表示）。Ｌａｚと同様に、Ｐａ−ＣＡＲＤは、Ｋ５６２細胞の核画分のＷｅｅｌタンパク質レベルを増強したが、ＨＬ６０細胞ではそのような活性を示さなかった（図１２）。しかしながら、ＨＬ６０細胞の核画分、並びにＫ５６２及びＨＬ６０細胞の細胞質画分では、ＡＫＴ−Ｐ−Ｓ４７３レベルは、Ｐａ−ＣＡＲＤにより著しく低減され（図１２）、Ｐａ−ＣＡＲＤによるＨＬ６０細胞の細胞周期停止の主要機序は、ＡＫＴの４７３位セリンのリン酸化の低減により媒介される可能性があり、その一方でＫ５６２細胞では、そのような効果は、細胞質ＡＫＴの４７３位セリンのリン酸化もある程度は影響されるが、核Ｗｅｅｌタンパク質レベルの増強により主に媒介されることを示唆した。Ｌａｚは、そのような効果（Ｋ５６２での核Ｗｅｅｌの増強、及びＨＬ６０細胞での細胞質ＡＫＴ−Ｓ４７３枯渇）を媒介する際にＰａ−ＣＡＲＤを模倣し、共通の作用機序を示唆する。
【０１６９】
実施例１３．卵巣癌研究用の物質及び方法
化学薬品、試薬、及び細胞培養：ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）及びヨウ化プロピジウムは、Ｓｉｇｍａ社から購入した。予め染色されたゲルは、Ｂｉｏｒａｄ社から得た。ｐＥＴ  ＳＵＭＯキット及びＳＵＭＯプロテアーゼは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入した。ヒト癌及び正常細胞系ＳＫ−ＯＶ３、ＨＯＳＥ６−３、ＭＣＦ−７、及びＨＴ１０８０細胞は全て、イリノイ大学シカゴ校（ＵＩＣ）外科腫瘍学科、シカゴの保存培養コレクションに由来する。細胞を、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、０．１ｍＭ  ＭＥＭ必須アミノ酸を含有するイーグル塩を有し、１０％加熱不活性化ウシ胎仔血清、１００単位／ｍｌペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンで補完されたＭＥＭ中で培養した。細胞は全て、５％ＣＯ２、３７℃で増殖した。
【０１７０】
タンパク質のクローニング、発現、及び精製：本明細書の実施例８に記載のように実施した。
【０１７１】
ＭＴＴ−細胞毒性アッセイ：３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル−２，５−ジフェニル）テトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイを、実施例８に記載のように実施して、癌細胞に対する細胞毒性を決定した。
【０１７２】
カスパーゼ−３／７活性アッセイ：試験は、Ｙａｍａｄａ，Ｔ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、２００２年、９９巻、１４０９８〜１４１０３頁に記載のように、カスパーゼ−Ｇｌｏ３／７（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）試薬を使用して、９６ウエルプレートで実施した。
【０１７３】
フローサイトメトリーによる細胞周期停止：ＳＫＯＶ３細胞を、１ウエル当たり１０６個の細胞の１ウエル当たり２ｍｌの容積で６ウエルプレートに播種した。細胞ペレット（＞１×１０６個の細胞）を回収し、１ｍＬの７０％エタノールで６０分間４℃にて固定し、１ｍＬのＰＢＳで洗浄し、０．５ｍｇのＲＮＡｓｅＡ（Ｓｉｇｍａ社製）を含有する４００□ＬのＰＢＳに再懸濁した。穏やかに混合した後、１００μＬ等量のヨウ化プロピジウム（１ｇ／Ｌ  ＰＢＳ）（Ｓｉｇｍａ社製）を添加した。細胞を、暗所で１５分間室温にてインキュベートし、その後フローサイトメトリー分析するために、４℃にて暗所で保管した。各試料について、少なくとも１×１０４個の細胞を、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターを使用して、ＤＮＡ含有量を分析した。サブＧ１、Ｇ１、Ｓ、及びＧ２−Ｍ期にある細胞の分布を、Ｍｕｌｔｉ  Ｃｙｃｌｅ  ＡＶソフトウェアを使用して決定した。
【０１７４】
ＴＬＲ経路及びＮＦ−ｋＢシグナル伝達遺伝子のマイクロアレイ：ＳＫＯＶ３細胞（１ウエル当たり２ｍｌの容積で１ウエル当たり１００，０００個の細胞）を、６ウエルプレートに播種した。タンパク質により処理した後、細胞を溶解緩衝液で回収した。トール様受容体遺伝子及びＮＦ−ｋＢシグナル伝達遺伝子用のマイクロアレイにするために、試料をＳｕｐｅｒａｒｒａｙ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社に送付した。
【０１７５】
ＴＵＮＥＬアッセイ：この技術は、Ｙａｍａｄａ，Ｔ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、２００２年、９９巻、１４０９８〜１４１０３頁に記載されているように、末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼを使用して、ＤＮＡ断片の３’末端にフルオレセイン−ｄＵＴＰを酵素的に組み込むことにより、断片化ＤＮＡを含有する核を特定する。
【０１７６】
実施例１４．ＡＤＩは推定ＣＡＲＤ様ドメインを有する
二次構造比較は、Ｐａ−ＡＤＩとＭａ−ＡＤＩとの間に２７％の配列同一性があることを示した。ＭｏｌＭｏｌプログラム及びＶＡＳＴアルゴリズムを使用して、構造アラインメントすることにより、Ｐａ−ＡＤＩ及びＭａ−ＡＤＩの推定ＣＡＲＤ様ドメイン及び触媒ドメインの両方の存在が明らかに示されている（図１４Ａ及びＢ）。Ｐａ−ＡＤＩ及びＭａ−ＡＤＩは両方とも、ジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ（ＤＤＡＨ）及びアルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼ（ＡＧＡＴ）タンパク質がそのメンバーであるグアニジン修飾酵素スーパーファミリーの全てのタンパク質に存在する特徴的な５つのββαβサブユニットを有する（図１４Ｂ）。しかしながら、ＤＤＡＨ及びＡＧＡＴとは異なり、Ｐａ−ＡＤＩ及びＭａ−ＡＤＩは両方とも、第１と第２のββαβサブドメインとの間に正確に挿入され、典型的な「Ｃｌｉｐ−ｏｎ−ｆａｎ」部分を生じさせる特有な８５残基の５アルファヘリックス束ドメインを有する（図１４Ｂ及び１４Ｃ）。哺乳類ＣＡＲＤ含有タンパク質に対して構造類似性を示すのは、この領域である。ＣＡＲＤ様ドメインは、Ｐａ−ＡＤＩ及びＭａ−ＡＤＩにのみ存在するが、他のメンバーには存在しないため（図１４Ｂ）、ファミリーの他のメンバーによっては動員されないが、ＡＤＩによるＣＡＲＤドメインの動員が、ＡＤＩにその特有な抗癌性特性を与えている可能性が高い。
【０１７７】
実施例１５．Ｐａ−ＣＡＲＤは抗癌性活性を示す
ＣＡＲＤ含有哺乳類タンパク質は、ヘリカーゼ、キナーゼ、及びカスパーゼ活性等の多様な機能を有する。ＣＡＲＤドメイン自体は、ＣＡＲＤ間相互作用により、より大きなタンパク質複合体の形成を媒介することに以外には、いかなる他の活性も知られていない。細菌が、その生存及び増殖の供給源として身体内部で同じ栄養素を癌細胞と競争すると仮定すると、細菌が哺乳類供給源からＣＡＲＤドメインを獲得して、癌増殖を妨害すると推定することは可能である。この仮説を試験するために、Ｐａ−ＡＤＩ由来の疎水性ポケットを有する推定ＣＡＲＤドメイン（アミノ酸７５〜２２５）をクローニング及び精製し、抗癌剤としてのその機能並びにあらゆる考え得るＡＤＩ様活性を調査した。アミノ酸７５〜２２５を包含するＰａ−ＡＤＩ並びに全長ＡＤＩタンパク質の遺伝子配列を、実施例８に記載されているように、プラスミドｐＥＴ−ＳＵＭＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）由来のＳＵＭＯ部分と共にインフレームでクローニングして、ＳＵＭＯＣＡＲＤ融合体及びＳＵＭＯ−ＡＤＩタンパク質を得た。これら組換えタンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡカラムを使用して単一ステップで精製し、その後ＳＵＭＯプロテアーゼで切断した。これら２つの細菌タンパク質の均質性及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動パターンは、図１５Ａに示されている。予想した通り、精製Ｐａ−ＡＤＩは、Ｍｗ４６ｋＤａの単一バンドとして泳動したが、Ｐａ−ＣＡＲＤは、１７ｋＤａタンパク質として泳動した。
【０１７８】
次に、これら２つのタンパク質のアルギニンデイミナーゼ活性を決定した。予想した通り、Ｐａ−ＡＤＩは、強力な酵素活性を示したが、Ｐａ−ＡＤＩの触媒トライアドの重要なアミノ酸Ｃｙｓ−４０６及びＨｉｓ−２７８は、Ｐａ−ＣＡＲＤでは欠失しているため、Ｐａ−ＣＡＲＤは、そのような活性を示さなかった（図１５Ｂ）。そのような活性の存在は、Ｐａ−ＡＤＩ又はＰａ−ＣＡＲＤでは評価されていないが、Ｍ．アルギニニＡＤＩ（Ｍａ−ＡＤＩ）は、抗癌活性を有することが知られている。Ｐａ−ＡＤＩ及びＰａ−ＣＡＲＤの増殖阻害活性を、線維肉腫ＨＴ−１０８０、乳癌ＭＣＦ−７、及び卵巣癌ＳＫＯＶ−３等の一連のヒト癌細胞に対して調査した（図１６Ａ）。Ｐａ−ＡＤＩ及びＰａ−ＣＡＲＤは両方とも、全ての癌細胞タイプに対して著しい阻害活性を示した。最も興味深いことには、Ｐａ−ＣＡＲＤは、これら癌細胞に対してＰａ−ＡＤＩより高い増殖阻害活性を示した（図１６Ａ）。Ｐａ−ＡＤＩ及びＰａ−ＣＡＲＤは、卵巣癌ＳＫＯＶ−３細胞に対して多少より高い活性を示したため、種々の濃度のＰａ−ＣＡＲＤ（図１６Ｂ）及びＰａ−ＡＤＩ（図１６Ｃ）の細胞毒性を、これら細胞と共にインキュベーションした時間の関数として決定した。細胞毒性活性は２４時間のインキュベーション中に明らかだったが、活性は、４８時間のインキュベーション中に、より高い濃度（１０〜２０μＭ）で著しく上昇した。同様に、Ｐａ−ＣＡＲＤは、Ｐａ−ＡＤＩと比較して、濃度及び時間依存的様式でより高い細胞毒性を示した。
【０１７９】
実施例１６．Ｐａ−ＣＡＲＤは、正常細胞に対して阻害効果をほとんど示さない
卵巣癌ＳＫＯＶ−３及び正常卵巣ＨＯＳＥ６−３細胞の両方に対する、２０μＭ濃度でのＰａ−ＡＤＩ及びＰａ−ＣＡＲＤの細胞毒性を調査した。アズリンは、一連の癌に対して抗癌活性を示すが、正常細胞には進入することができず、そのような細胞に対する細胞毒性をほとんど示さないため、これら研究では、２０μＭのアズリンを対照として添加した。公知の抗癌剤「シスプラチン」（ｃｉｓ−ジアンミンジクロロ白金（ＩＩ）；ＣＤＤＰ）を、陽性対照として使用した。ＨＯＳＥ６−３正常卵巣及びＳＫＯＶ−３卵巣癌細胞に対するこれら作用剤の細胞毒性活性は、図１７Ａに示されている。Ｐａ−ＡＤＩ及びＰａ−ＣＡＲＤは両方とも、ＳＫＯＶ−３対して著しい細胞毒性活性を示すが、正常卵巣細胞に対しては細胞毒性をほとんど示さなかった。アズリンは、同様の細胞死特性も示した。Ｐａ−ＣＡＲＤ及びアズリンは両方とも、正常ＨＯＳＥ６−３細胞に対して、一般的に使用されている薬物であるシスプラチンより低い細胞毒性を示した。更に、Ｐａ−ＣＡＲＤ及びシスプラチンで処理されたＳＫＯＶ−３細胞は、個々に処理された場合と比較して、多少より高い細胞毒性効果を示し（図１７Ｂ）、ある程度の相加効果を示す。
【０１８０】
実施例１７．Ｐａ−ＣＡＲＤは、カスパーゼ活性化により癌細胞のアポトーシスを誘導する
Ｐａ−ＣＡＲＤにより誘導される細胞死の性質を決定するため、並びにアズリン及びＬａｚ等の他の細菌タンパク質が、カスパーゼ活性化により癌細胞のアポトーシスを誘導することが知られているため、卵巣癌ＳＫＯＶ−３及び正常卵巣ＨＯＳＥ６−３細胞の両方におけるＰａ−ＣＡＲＤ、Ｐａ−ＡＤＩ、及びアズリンによるアポトーシスの誘導の程度を、ｉｎ  ｓｉｔｕ細胞死検出フルオレセインキット（Ｒｏｃｈｅ社製）を使用したＴＵＮＥＬアッセイにより決定した。ＳＫＯＶ−３又はＨＯＳＥ６−３細胞をＤＮａｓｅＩで処理すると、本質的に全ての細胞が、緑色蛍光を発した（陽性対照、図１８）。ＳＫＯＶ−３細胞及びＨＯＳＥ６−３細胞の両方を、１０μＭのＰａ−ＣＡＲＤ、Ｐａ−ＡＤＩ、及びアズリンで処理すると、アポトーシスは、明らかにＳＫＯＶ−３細胞で選択的に増強された。また、ＳＫＯＶ−３細胞をＰａ−ＣＡＲＤで処理すると、Ｐａ−ＡＤＩ及びアズリンと比較して、最も高いパーセントのアポトーシスが観察された。アポトーシス細胞は、接着特性を損なう傾向があるため、アポトーシス細胞のパーセントがより高いスライドに見られる細胞はより少数である（図１８）。ＨＯＳＥ６−３細胞は、少数の細胞が全ての条件下で緑色蛍光を示したに過ぎず（図１８）、Ｐａ−ＣＡＲＤは、主に癌細胞でアポトーシス性細胞死を誘導するが、正常細胞では誘導しないことを確認した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）による処理又は無タンパク質処理（対照）は、視野の中に緑色蛍光を発する細胞がほとんどなく、多くが青色（非アポトーシス細胞）だったことを示し（図１８、最下部行）、Ｐａ−ＣＡＲＤ、Ｐａ−ＡＤＩ、又はアズリンにより処理されない限り、癌又は正常細胞は、自発的にそれほどアポトーシスを起こさないことを示した。
【０１８１】
Ｐａ−ＣＡＲＤが、カスパーゼ３活性化により、正常卵巣細胞ではなく卵巣癌細胞で細胞死を誘導するかどうかを決定するために、ＳＫＯＶ−３及びＨＯＳＥ６−３細胞でのカスパーゼ３／カスパーゼ７のレベルを、Ｐａ−ＡＤＩ、Ｐａ−ＣＡＲＤ、シスプラチン、及びアズリンの非存在下又は存在下で測定した。カスパーゼ酵素活性を、カスパーゼ−ＧｌｏＴＭ３／７アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）で決定した。Ｐａ−ＡＤＩ及びＰａ−ＣＡＲＤを、２つの異なる濃度、１０及び２０μＭで使用した。Ｐａ−ＡＤＩ及びＰａ−ＣＡＲＤは両方とも、用量依存的な様式でカスパーゼ３／７活性化を誘導したが、卵巣癌ＳＫＯＶ−３細胞においてのみだった。正常卵巣細胞ＨＯＳＥ６−３では、活性化はほとんど見られなかった（図１９）。
【０１８２】
実施例１８．Ｐａ−ＣＡＲＤは、Ｇ２／Ｍ期で細胞周期を阻害する
マイコプラズマ・アルギニニＡＤＩ（Ｍａ−ＡＤＩ）は、肝細胞癌の増殖を阻害し、白血病細胞の細胞周期停止及びアポトーシスを誘導することが以前に示されている。肝癌、白血病、及び他の癌での誘導を含む、カスパーゼ活性化によるアポトーシスの誘導は、Ｇ２／Ｍ期での細胞周期停止により媒介されることが多いことが知られている。
【０１８３】
Ｐａ−ＡＤＩ及びＰａ−ＣＡＲＤで処理された癌細胞、又は処理されなかった癌細胞での、Ｇ１、Ｓ、及びＧ２期のレベルを調査した。ＳＫＯＶ−３細胞を、１０μＭ濃度で２４時間Ｐａ−ＡＤＩで処理した場合、Ｇ１期の細胞は、８６．０％から６９．１％に低下したが、Ｓ及びＧ２期の細胞は、それぞれ７．９から１９．７に、及び６．１から１１．２％に上昇した。しかしながら、同様の条件下でのＰａ−ＣＡＲＤによる処理は、Ｇ１期レベルの細胞を８６．０から１９．１％に低減させたが、細胞のＳ及びＧ２期は、それぞれ７．９から４３．５％に、及び６．１から３７．４％に上昇し（データ非表示）、Ｐａ−ＣＡＲＤが、Ｇ２／Ｍ期で細胞周期を著しく阻害したことを明らかに示した。
【０１８４】
実施例１９．Ｐａ−ＣＡＲＤは、ＮＦ−ｋＢシグナル経路遺伝子の発現を調節する
ＳＫＯＶ−３細胞におけるＰａ−ＣＡＲＤの効果を、ＮＦ−ｋＢシグナル経路に関与する幾つかの遺伝子の発現を測定することにより調査した。目的は、Ｐａ−ＣＡＲＤタンパク質による処理後に、ＳＫＯＶ−３細胞の運命の決定に重大な役割を果たす可能性がある遺伝子候補を特定することだった。この研究の場合、ＳＫＯＶ−３細胞を、各々１０μＭのＰａ−ＣＡＲＤ及びアズリンと共に４８時間インキュベートし、対照はいかなる処理もせずにインキュベートした。全ＲＮＡを単離して、定量的リアルタイムＰＣＲマイクロアレイを実施した。ハウスキーピング遺伝子の発現で正規化することにより、制御の倍数を計算した。対照レベルの２倍を超えた変化だけが報告されている。
【０１８５】
遺伝子の発現プロファイルにおける顕著な観察は、ＳＫＯＶ−３細胞を、Ｐａ−ＣＡＲＤで処理した場合、アズリンと比べて、トール様受容体（ＴＬＲ）を含むＮＦ−ｋＢ経路のほとんどの遺伝子が全体的に上方制御されたことだった（表３）。これは、ＳＫＯＶ−３細胞でのＰａ−ＣＡＲＤ−哺乳類ＣＡＲＤ相互作用によるものである。哺乳類ＣＡＲＤ保有タンパク質は、ＮＦ−ｋＢシグナル伝達経路を調節することが知られており、Ｐａ−ＣＡＲＤとのあらゆる相互作用は、そのような遺伝子発現特性を観察されたように変更する可能性が高い。その一方で、アズリンは、ＮＦ−ｋＢ経路の調節によるのではなく、ｐ５３と受容体チロシンキナーゼとのタンパク質間相互作用により癌細胞増殖を阻害することが知られている。従って、これら２つの細菌抗癌性タンパク質は、２つの異なる作用機序を有する。
【０１８６】
ＳＫＯＶ−３細胞におけるＰａ−ＣＡＲＤによる遺伝子の最も著しい上方制御には、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）としても知られているコロニー刺激因子ＣＳＦ２をコードする遺伝子の発現が５５倍増加することが伴う。ＩＬ−１２遺伝子の発現も、そのような条件下で約３倍刺激される（表３）。ウエスタンブロッティングデータ（非表示）により、そのような条件下でＧＭ−ＣＳＦが過剰産生（約５倍）されることが確認された。そのレベルは、５５倍増加よりは低かったが、それは、ＧＭ−ＣＳＦが、細胞から出て行く分泌可能なタンパク質であるためと推定される。その発現がＰａ−ＣＡＲＤ処理中に上方制御される他のサイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１アルファ、及びＩＬ−１ベータである（表３）。
【０１８７】
表３．リアルタイムＰＣＲマイクロアレイを使用した、トール様受容体（ＴＬＲ）及びＮＦ−ｋＢ経路遺伝子のｍＲＮＡレベルの測定：ＳＫＯＶ−３細胞を、各々１０μＭのＣＡＲＤ及びアズリンと共に４８時間インキュベートした。対照として、ＳＫＯＶ−３細胞の１つの試料を、未処理のままにしておいた。インキュベーションした後、細胞を回収し、全ＲＮＡを抽出した。試料は、リアルタイムＰＣＲマイクロアレイ分析（Ｓｕｐｅｒａｒｒａｙ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を使用して分析した。結果は、ハウスキーピング遺伝子に対して正規化した。太字の数値は、未治療対照試料と比べた上方制御を示し、星印（＊）が付いている数字は下方制御を示す。発現の減少は、マイナス記号で示されている。
【０１８８】
2012518417.tif 000006
【図１】
2012518417.tif 000007
2012518417.tif 000008
【図２】
2012518417.tif 000009
【図３】
2012518417.tif 000010
【図４】
2012518417.tif 000011
【図５】
2012518417.tif 000012
【図６】
2012518417.tif 000013
【図７】
2012518417.tif 000014
【図８】
2012518417.tif 000015
【図９】
2012518417.tif 000016
【図１０】
2012518417.tif 000017
【図１１】
2012518417.tif 000018
【図１２】
2012518417.tif 000019
【図１３】
2012518417.tif 000020
【図１４】
2012518417.tif 000021
【図１５】
2012518417.tif 000022
【図１６】
2012518417.tif 000023
【図１７】
2012518417.tif 000024
【図１８】
2012518417.tif 000025
【図１９】
2012518417.tif 000026
【国際調査報告】
2012518417.tif 000027
2012518417.tif 000028