(57)【要約】  ターゲットポリペプチドの産生のための発現系を提供する。発現系は、ターゲットポリペプチドをコードするＤＮＡに機能可能であるように連結された誘導性プロモーターを含む発現カセット、およびＤＮＡ結合性転写制御因子タンパク質をコードするＤＮＡに機能可能であるように連結されたプロモーターを含む、ＤＮＡ結合性転写制御因子タンパク質を過剰発現させるための発現カセットを含む。発現カセットは直交性プロモーターの調節下にある。【選択図】図４
2012521752.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ターゲットポリペプチド産生のための発現系であって：
ａ）ターゲットポリペプチドをコードするＤＮＡに機能可能であるように連結された誘導性プロモーターを含む発現カセット；および
ｂ）ＤＮＡ結合性転写制御因子タンパク質をコードするＤＮＡに機能可能であるように連結されたプロモーターを含む、ＤＮＡ結合性転写制御因子タンパク質を過剰発現させるための発現カセット；
ここで該発現カセットは直交性プロモーターの調節下にある
を含む、前記発現系。
【請求項２】
ターゲットポリペプチドをコードする発現カセットおよびＤＮＡ結合性転写制御因子タンパク質を過剰発現させるための発現カセットが異なるベクター上に位置する、請求項１記載の発現系。
【請求項３】
ａ）ターゲットポリペプチドをコードするＤＮＡに機能可能であるように連結された誘導性プロモーターを含む発現カセット；および
ｂ）ＤＮＡ結合性転写制御因子タンパク質をコードするＤＮＡに機能可能であるように連結されたプロモーターを含む、ＤＮＡ結合性転写制御因子タンパク質を過剰発現させるための発現カセット；
ここで該発現カセットは直交性プロモーターの調節下にある
を含む、ベクター。
【請求項４】
請求項１または２記載の発現系、あるいは請求項３記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項５】
大腸菌（Ｅ  ｃｏｌｉ）である、請求項４記載の宿主細胞。
【請求項６】
請求項１または２記載の発現系の発現を含む、ターゲットポリペプチドの産生のためのプロセス。
【請求項７】
ＤＮＡ結合性転写制御因子タンパク質の発現に有利に働く条件下で、細胞を所望の増殖状態に増殖させ、そして細胞が所望の増殖状態に到達したら、条件をターゲットポリペプチドの発現に有利に働くものに調整する、請求項６記載のプロセス。
【請求項８】
ＤＮＡ結合性転写制御因子タンパク質が、ＤＮＡ結合タンパク質ＨＵ−α、ＤＮＡ結合タンパク質ＨＵ−β、およびＨＭＧＢファミリーからなる群より選択される、先行する請求項いずれか記載の発現系、ベクター、宿主細胞またはプロセス。
【請求項９】
ＤＮＡ結合性転写制御因子タンパク質が、構成的プロモーターに機能可能であるように連結されている、先行する請求項いずれか記載の発現系、ベクター、宿主細胞またはプロセス。
【請求項１０】
プロモーターが、Ｔ７Ａ１、Ｔ７Ａ２、Ｔ７Ａ３、ｓｐｃリボソームタンパク質オペロンプロモーター、β−ラクタマーゼ遺伝子プロモーター、ファージλのＰＬプロモーター、複製調節プロモーターＰＲＮＡＩおよびＰＲＮＡＩＩ、ｒｒｎＢリボソームＲＮＡオペロンのＰ１およびＰ２プロモーター、Ｌａｃリプレッサータンパク質プロモーターｐＬａｃＩ、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼおよび形質膜Ｈ（＋）−ＡＴＰアーゼプロモーター、接合因子−αプロモーター、ＫＥＸ２、ＴＥＦ−１、サルウイルス４０初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーターおよびヒトβアクチンプロモーターからなる群より選択される、請求項９記載の発現系、
ベクター、宿主細胞またはプロセス。
【請求項１１】
誘導性プロモーターが、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ依存性プロモーター、ｌａｃ、ｌａｃＵＶ５、ｔｒｐ、ｔａｃ、ｔｒｃ、ｐｈｏＡ、アラビノース誘導性プロモーター、温度誘導性プロモーター、銅誘導性プロモーター、ｕｓｐＡ、ｕｓｐＢ、ｍａｌＫ、浸透圧誘導性プロモーター、ガラクトース誘導性プロモーター、フェロモン誘導性プロモーター、グルコアミラーゼプロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター、ヒトｃ−ｆｏｓプロモーター、エクジソン誘導性プロモーターおよびグルココルチコイド誘導性プロモーターからなる群より選択される、先行する請求項いずれか記載の発現系、ベクター、宿主細胞またはプロセス。
【請求項１２】
ＤＮＡ結合性転写制御因子タンパク質の発現カセットが、構成的ｌａｃプロモーターに機能可能であるように連結された大腸菌ＤＮＡ結合タンパク質ＨＵ−α／ＤＮＡ結合タンパク質ＨＵ−βの発現カセットを含み、そしてターゲットポリペプチドの発現カセットがｔａｃプロモーターに機能可能であるように連結されたターゲットポリペプチドの発現カセットを含み、そしてまた単一のオペレーターも含む、請求項２記載の発現系。
【請求項１３】
ターゲットポリペプチドの発現カセットに含まれるオペレーターが、天然ｌａｃオペレーターまたは完全にパリンドロームであるｌａｃオペレーターである、請求項１２記載の発現系。
【請求項１４】
ＤＮＡ結合性転写制御因子タンパク質の発現カセットが、構成的ｌａｃプロモーターに機能可能であるように連結されたラットＨＭＧＢ−１の発現カセットを含み、そしてターゲットポリペプチドの発現カセットが、ａ）ｔａｃプロモーターに機能可能であるように連結されたターゲットポリペプチドの発現カセットを含み、そしてまた単一のオペレーターも含むか；またはｂ）Ｔ７プロモーターに機能可能であるように連結されたターゲットポリペプチドの発現カセットを含み、そしてまた２つの完全にパリンドロームであるオペレーターも含み、１つのオペレーターがプロモーターの上流に位置し、そして１つのオペレーターがプロモーターの下流に位置する、請求項２記載の発現系。
【請求項１５】
請求項１２、１３または１４記載の発現系の発現を含む、ターゲットポリペプチドの産生のためのプロセス。
【請求項１６】
ＤＮＡ結合性転写制御因子タンパク質の発現に有利に働く条件下で、細胞を所望の増殖状態に増殖させ、そして細胞が所望の増殖状態に到達したら、条件をターゲットポリペプチドの発現に有利に働くものに調整する、請求項１５記載のプロセス。
【請求項１７】
請求項１２、１３または１４記載の発現系を含む、宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はポリペプチドの発現のためのプロセス、および発現系に関する。
【背景技術】
【０００２】
学術的または商業的に関心対象である多くのポリペプチド、特に療法ポリペプチドは、組換え宿主細胞における発現によって好適に産生される。特に製造環境における、こうした異種ポリペプチドの効率的な産生のため、ポリペプチドが製造における適切な段階でのみ産生されるように、ポリペプチドを調節することが好ましい。したがって、望ましい場合に適切な条件の適用によって発現が誘発可能であるように、ポリペプチドの発現は誘導因子の調節下に置かれる。例えば、いくつかの異種ポリペプチドは、宿主細胞増殖およびプラスミド安定性に有害な影響を有し、全体の生産性を減少させるため、誘導前の異種ポリペプチドの発現（いわゆる「漏出性（ｌｅａｋｙ）」発現）、すなわち基底発現の劣った調節は、一般的に望ましくない。いくつかの場合、異種ポリペプチドの漏出性発現は、クローニング中のベクター安定性の問題を生じる可能性もあり、所望のポリペプチドを発現する安定な発現ベクター構築の失敗につながりうる。
【０００３】
異なる調節様式および誘導様式を持つ多くの異種ポリペプチド発現系があり、関心対象のポリペプチドを産生するための発現系／発酵プロセスの選択および最適化は大部分、経験的なプロセスとなっている。これには時間がかかり、そして望ましくない。したがって、発現の調節の改善、特に基底発現の調節の改善を提供する系が必要である。
【０００４】
誘導性遺伝子発現は、遺伝子機能の分析に重要なツールである。これらの系には、誘導されない細胞において、遺伝子発現の潜在的に有害な影響を減少させ、そしてかつ誘導された遺伝子の発現による生物学的に関連する影響の明らかな区別を可能にするために、基底遺伝子発現の厳重な調節が、決定的に必要である。
【０００５】
漏出性基底発現の問題を減少させるかまたは排除することを試みる、多様な改善法には、成功と失敗が入り交じってきている。例えば、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）における基底発現を減少させるためのアプローチには、リプレッサータンパク質対オペレーター比の増加、突然変異体ファージの感染による誘導、プロモーター強度の減弱、アンチターミネーターと組み合わせた転写ターミネーターの使用が含まれる（Ｍａｋｒｉｄｅｓ，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，  １９９６，  ５１２−５３８によって概説される）。タンパク質を高レベルで発現するために、トランスで供給されるＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いるｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）に伴う基底発現の問題は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを阻害するＴ７リゾチームの同時過剰発現によって減少させうる。しかし、基底発現を減少させるかまたは排除するために使用する最適な発現構成要素の使用（Ｓｔｕｄｉｅｒ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  １９９１，  ２１９（１）：３７−４４）は経験的であり、基底発現および誘導性に対する多数のベクター（ｐＬｙｓＳ、ｐＬｙｓＬ、ｐＬｙｓＥおよびｐＬｙｓＨ）の影響を決定するスクリーニングを必要とする。哺乳動物細胞において用いられるテトラサイクリンが制御する発現系の基底発現は問題である（Ｍｅｙｅｒ−Ｆｉｃｃａら，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ，  ２００４，  ３３４：９−１９）。Ｌａｉら，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，  ２００３，  ２８５：７１１−７１９は、テトラサイクリンまたはエクジソン応答配列を用いて発現されるレポーター遺伝子（緑色蛍光タンパク質）を用いて、高い基底発現を持つ哺乳動物細胞がどのように生成されたかを記載する。これらの細胞は、レポーター遺伝子系と組み合わせて蛍光活性化細胞分取を用いることによって除去されうる。Ｂｅｃｋｅｒら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  
Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２００８，  １−１３は、大腸菌における天然ＨＵ抑制タンパク質に対する置換としての真核ＨＭＧＢタンパク質の使用を開示する。天然大腸菌ＬａｃＺ／ベータ−ガラクトシダーゼ遺伝子の産生抑制が研究されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｍａｋｒｉｄｅｓ，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，  １９９６，  ５１２−５３８
【非特許文献２】Ｓｔｕｄｉｅｒ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  １９９１，  ２１９（１）：３７−４４
【非特許文献３】Ｍｅｙｅｒ−Ｆｉｃｃａら，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ，  ２００４，  ３３４：９−１９
【非特許文献４】Ｌａｉら，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，  ２００３，  ２８５：７１１−７１９
【非特許文献５】Ｂｅｃｋｅｒら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２００８，  １−１３
【発明の概要】
【０００７】
本発明の１つの側面にしたがって、ターゲットポリペプチド産生のための発現系であって：
ａ）ターゲットポリペプチドをコードするＤＮＡに機能可能であるように連結された誘導性プロモーターを含む発現カセット；および
ｂ）ＤＮＡ結合性転写制御因子タンパク質をコードするＤＮＡに機能可能であるように連結されたプロモーターを含む、ＤＮＡ結合性転写制御因子タンパク質を過剰発現させるための発現カセット；
ここで該発現カセットは直交性（orthogonal）プロモーターの調節下にある
を含む、前記発現系を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、ＨｕｐＡ遺伝子配列である。
【図２】図２は、大腸菌コドン最適化ラットＨＭＧＢ−１遺伝子配列である。
【図３】図３は、ＩｇＧ  Ｆｃ遺伝子配列である。
【図４】図４は、実施例２の結果である。
【図５】図５は、実施例３の結果である。
【図６】図６は、実施例４の結果である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
プロモーターは、異なる条件によって活性化される際、直交性であると認識される。これらの条件は、互いに排他的であってもよいし、または適合可能であってもよい。互いに排他的なプロモーターは、１つのプロモーターの調節下にあるＤＮＡの発現に必要な条件が、別のプロモーターの調節下にあるＤＮＡの発現を防止するものであり、そしてこれには、例えば、テトラサイクリン反応系が含まれ、これは、テトラサイクリンの存在下で「オフ」である（すなわち発現が防止される）が、テトラサイクリンの非存在下で「オン」である（すなわち発現が促進される）（「テトラサイクリン・オフ」）ように設計可能であるし、またはテトラサイクリンの存在下で「オン」である（「テトラサイクリン・オン」）が、その非存在下で「オフ」であるようにも設計可能である。ＤＮＡ結合性転写制御因子タンパク質をコードするＤＮＡが、テトラサイクリン・オフであるプロモーターに機能可能であるように連結され、そしてターゲットポリペプチドをコードするＤＮＡが、テトラサイクリン・オンであるプロモーターに機能可能であるように連結される場合、テトラサイクリンの添加は、ターゲットポリペプチドの発現を誘導するが、ＤＮＡ結合性転写
制御因子タンパク質のさらなる発現を防止するであろう。
【００１０】
多くの態様において、機能可能であるように連結されるＤＮＡ配列は隣接する。
本発明の発現系で使用可能なＤＮＡ結合性転写制御因子タンパク質は、原核および真核生物由来のタンパク質を含む。原核タンパク質には、大腸菌ＤＮＡ結合タンパク質ＨＵ−α／ＤＮＡ結合タンパク質ＨＵ−β、組込み宿主因子（ＩＨＦ）−α、ＩＨＦ−βおよび相同体が含まれる。真核タンパク質は、好ましくは、酵母、例えばＮＨＰ６Ａ、ＮＨＰ６Ｂ、または哺乳動物タンパク質であり、そしてこれには、豊富配列非特異的高移動度群（ＨＭＧ）タンパク質が含まれる。ＨＭＧタンパク質は、３つのファミリー：  ＨＭＧＢファミリー、例えばＨＭＧＢ−１、ＨＭＧＢ−２、ＨＭＧＢ−３；  ＨＭＧＮファミリー、例えばＨＭＧＮ−１、ＨＭＧＮ−２、ＨＭＧＮ−３、ならびにＨＭＧＡファミリー、例えばＨＭＧＡ−１ａ、ＨＭＧＡ−１ｂ、ＨＭＧＡ−１ｃ、ＨＭＧＡ−２、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母におけるミトコンドリア・ヒストン（ＨＭ）タンパク質、ならびにヒトおよび両生類ミトコンドリアで見られる相同体、ならびに細菌ヒストン様タンパク質ＨＵに似たタンパク質をコードする植物（クリプト藻（Ｇｕｉｌｌａｒｄｉａ  ｔｈｅｔａ））葉緑体ｈｌｐＡを含む、原核ＤＮＡ結合性転写制御因子タンパク質の真核相同体に分けられる。好ましいＤＮＡ結合性転写制御因子タンパク質は、大腸菌ＤＮＡ結合タンパク質ＨＵ−α／ＤＮＡ結合タンパク質ＨＵ−βおよびＨＭＧＢ−１、特にラットＨＭＧＢ−１である。
【００１１】
本発明の発現カセットは、宿主細胞ゲノム内に組み込まれるか、またはプラスミドなどの染色体外要素内に含まれてもよい。染色体外要素内に含まれる場合、発現カセットは、同じ染色体外要素、例えばプラスミドベクター上に含まれてもよいし、または宿主細胞に同時形質転換される、適合する別個の染色体外要素上に含まれてもよい。あるいは、発現系は、ファージまたはウイルスベクター内に取り込まれてもよく、そしてこれらを用いて、宿主細胞系内に発現系が送達されてもよい。当該技術分野に知られる方法によって、プラスミドまたは他の発現ベクターを組み立ててもよい。本発明の発現カセットは、好ましくは、どちらも別個のプラスミドの形で使用される。プラスミドは自律複製プラスミドまたは組込み性プラスミドであってもよい。プラスミドは典型的には１以上の以下も含む：選択可能マーカー、例えば抗生物質耐性を与える配列、およびｃｅｒ安定性配列。
【００１２】
発現カセットが別個の染色体外要素上に含まれる態様において、両方の要素を含む形質転換宿主細胞を同定するため、異なる選択可能マーカーを使用することが好ましい。
ＤＮＡ結合性転写制御因子タンパク質を過剰発現するための発現カセットで使用するプロモーターは、構成的または誘導性プロモーターであってもよい。本発明の側面で使用可能な構成的プロモーターの例には、Ｔ７Ａ１、Ｔ７Ａ２、Ｔ７Ａ３、ｓｐｃリボソームタンパク質オペロンプロモーター、β−ラクタマーゼ遺伝子プロモーター、ファージλのＰＬプロモーター、複製調節プロモーターＰＲＮＡＩおよびＰＲＮＡＩＩ、ｒｒｎＢリボソームＲＮＡオペロンのＰ１およびＰ２プロモーター、Ｌａｃリプレッサータンパク質プロモーターｐＬａｃＩ、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）および形質膜Ｈ（＋）−ＡＴＰアーゼ（ＰＭＡ１）プロモーター、接合因子（ＭＦ）−αプロモーター、ＫＥＸ２、ＴＥＦ−１、サルウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターおよびヒトβアクチンプロモーターが含まれる。構成的プロモーターのさらなる例には、調節領域を除去するよう修飾されている誘導性プロモーター、例えばｌａｃまたはｔａｃオペレーターを除去するよう修飾されているｌａｃまたはｔａｃプロモーターが含まれ、そしてこうしたプロモーターは、本発明の特定の態様において、特にＤＮＡ結合性転写制御因子タンパク質をコードするＤＮＡに機能可能であるように連結されている場合に好適である。
【００１３】
本発明の側面において使用可能な誘導性プロモーターの例には、ファージＲＮＡポリメラーゼ依存性プロモーター、特にＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ依存性プロモーター系、好ましくは単一のＴ７プロモーターが含まれ、本明細書に援用されるＳｔｕｄｉｅｒおよびＭｏｆｆａｔ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １８９：１１３−１３０（１９８６）によって開示されるもの、特にＴ７遺伝子１０プロモーターが含まれる。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ依存性プロモーター系を使用する場合、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの供給源が必要とされることが認識され、これは当該技術分野に知られる方法によって、そして一般的には大腸菌宿主株内に必要なファージポリメラーゼを発現するλＤＥ３プロファージを挿入して、溶原性宿主株を生成することによって提供される。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼはまた、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの遺伝子を所持する特殊化λ形質導入ファージでの感染によって細胞に送達されることも可能である。使用可能な誘導性プロモーターのさらなる例には、ｌａｃ、ｌａｃＵＶ５、ｔｒｐ、ｔａｃ、ｔｒｃ、ｐｈｏＡ、アラビノース誘導性プロモーター、温度誘導性プロモーター（高温および低温両方）、銅誘導性プロモーター、ｕｓｐＡ、ｕｓｐＢ、ｍａｌＫ、浸透圧誘導性プロモーター、ガラクトース誘導性プロモーター、フェロモン誘導性プロモーター、グルコアミラーゼプロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター、ヒトｃ−ｆｏｓプロモーター、エクジソン誘導性プロモーター、およびグルココルチコイド誘導性プロモーターが含まれる。プロモーターが一般的に、宿主細胞で有効であることが知られるプロモーターから選択されることが認識されるであろう。例えば、大腸菌プロモーターは、大腸菌宿主細胞において一般的に使用され、哺乳動物プロモーターは哺乳動物細胞において一般的に使用され、酵母プロモーターは、酵母細胞において一般的に使用される。原核宿主由来の多くのプロモーターは、真核宿主において使用可能であり、そして逆も可能であることが認識されるであろう。少なくとも１つの誘導性プロモーターが使用されることが好ましく、特に好ましくは、ターゲットポリペプチドをコードするＤＮＡに機能可能であるように連結された誘導性プロモーターが使用される。いくつかの態様において、ＤＮＡ結合性転写制御因子タンパク質をコードするＤＮＡに機能可能であるように連結された構成的プロモーターと組み合わされた、ターゲットポリペプチドをコードするＤＮＡに機能可能であるように連結された誘導性プロモーターが特に好ましい。
【００１４】
カセットの発現が適切な条件の改変によってスイッチ可能であるように、発現カセットにおいて、直交性プロモーターを使用する。ターゲットタンパク質の発現を誘導するように条件を調整するまで、ＤＮＡ結合性転写制御因子タンパク質の過剰発現は、ターゲットポリペプチドの基底発現を減少させるかまたは防止する効果を有する。
【００１５】
本発明のプロセスにおいて使用可能な誘導因子は、使用する誘導性プロモーターに対応するように選択され、そしてこれには、イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、ＩＰＴＧの類似体、例えばイソブチル−Ｃ−ガラクトシド（ＩＢＣＧ）、ラクトースまたはメリビオース、ガラクトース、アラビノース、ラムノース、温度、ｐＨ、溶解酸素レベル、銅などの金属イオン、インドールアクリル酸、テトラサイクリン、ホモセリンラクトン、エクジソン、サリチル酸塩、リン酸塩が含まれる。他の誘導因子を用いてもよく、そしてこれは、別の箇所により詳細に記載される（例えば、Ｔｈｅ  Ｏｐｅｒｏｎ，  ＭｉｌｌｅｒおよびＲｅｎｚｎｉｋｏｆｆ監修（１９７８)を参照されたい）。誘導因子を個々にまたは組み合わせて用いてもよい。
【００１６】
ターゲットポリペプチドの発現を誘導する場合、ＤＮＡ結合性転写制御因子タンパク質の発現を減少させるかまたは防止するように条件を選択することが好ましい。ターゲットタンパク質発現中に、ＤＮＡ結合性転写制御因子タンパク質の発現を減少させるかまたは防止するために使用する方法には、１以上の以下が含まれる：
ａ）効能を維持するために補充を必要とする、ＤＮＡ結合性転写制御因子タンパク質発現を調節するプロモーターおよび誘導因子を使用する。例えば誘導因子が代謝されるか、
無効であるように修飾されるか、または有効であるより低く濃度が低下するように細胞によって吸収される場合；
ｂ）ＤＮＡ結合性転写制御因子タンパク質の発現を調節する誘導因子を含有する培地から細胞を物理的に分離し、その後、ターゲットポリペプチドの発現を調節するのに必要な誘導因子を含有する培地内に細胞を再導入する；
ｃ）基底発現を調節するのに十分なＤＮＡ結合性転写制御因子タンパク質が産生される一方、発現が誘導された際にターゲットポリペプチドの発現を防止しないかまたは有意に損なわないように、ターゲットポリペプチドの発現を調節するプロモーターよりも、ＤＮＡ結合性転写制御因子タンパク質発現を調節するプロモーターの強度がより弱いように選択する；
ｄ）基底発現を調節するのに十分なＤＮＡ結合性転写制御因子タンパク質が産生される一方、発現が誘導された際にターゲットポリペプチドの発現を防止しないかまたは有意に損なわないように、ターゲットポリペプチドをコードするベクターよりもより少ないコピー数のＤＮＡ結合性転写制御因子タンパク質をコードするベクターを選択する；
ｅ）ＤＮＡ結合性転写制御因子タンパク質の発現を損なうための、アンチセンスまたはＲＮＡ干渉（例えばマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）または低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ））を使用する；
ｆ）例えば、ターゲットポリペプチドの発現が誘導される際に、阻害剤が発現されるように、選択されるＤＮＡ結合性転写制御因子タンパク質の阻害剤を発現する。多くのこうした態様において、阻害剤は、ターゲットポリペプチドと同じベクター上で発現されてもよい；
ｇ）例えば、ターゲットポリペプチドの発現が誘導される際に、プロテアーゼが発現されるように、選択されるＤＮＡ結合性転写制御因子タンパク質をターゲットとするプロテアーゼを発現する。多くのこうした態様において、プロテアーゼは、ターゲットポリペプチドと同じベクター上で発現されてもよい；
ｈ）例えば、ターゲットポリペプチドの発現が誘導される際に、阻害剤が発現されるように、選択されるＤＮＡ結合性転写制御因子タンパク質の発現の阻害剤を発現する。例には、ＤＮＡ結合性転写制御因子タンパク質の同族（ｃｏｇｎａｔｅ）リプレッサー（例えばｃＩリプレッサータンパク質）の構成的発現を伴わず、通常、誘導性であるプロモーター、例えばλｐＬを用いることが含まれる。誘導性プロモーターを用いてターゲットポリペプチドが発現され、そして同じ誘導性プロモーターを用いて阻害剤が発現される場合、誘導因子が存在しなければ、阻害はなく、そしてＤＮＡ結合性転写制御因子タンパク質発現は構成的である。ターゲットポリペプチドの発現を誘導する誘導因子の添加はまた、阻害剤の発現も誘導し、そして阻害剤は、ＤＮＡ結合性転写制御因子タンパク質の発現を防止する。多くのこうした態様において、阻害剤は、ターゲットポリペプチドと同じベクター上で発現されてもよい；
ｉ）ある程度のリードスルーを可能にするターゲットポリペプチドの転写ターミネーターを伴い、ＤＮＡ結合性転写制御因子タンパク質およびターゲットポリペプチドの発現要素を異なる方向で含むようにプラスミドベクターを設計する。ここで、ＤＮＡ結合性転写制御因子タンパク質発現要素は構成的プロモーターを含み、そしてターゲットポリペプチドの発現カセットに続く。誘導因子が添加されたら、ターゲットポリペプチドからＤＮＡ結合性転写制御因子タンパク質の発現カセットに進む転写リードスルーは、ＤＮＡ結合性転写制御因子タンパク質の転写を減少させるかまたは停止させるであろう；そして
ｊ）誘導因子が添加された際、ＤＮＡ結合性転写制御因子タンパク質発現要素がベクターまたは宿主ゲノムから切除され、そしてしたがってもはや発現不能となるが、ターゲットポリペプチド発現要素を損なわれず（ｉｎｔａｃｔ）に残すように、発現系を設計する。
【００１７】
ＤＮＡ結合性転写制御因子タンパク質の過剰発現が、宿主細胞で通常見られるより高いレベルでのこうしたタンパク質の発現を指すことが認識されるであろう。ＤＮＡ結合性転
写制御因子タンパク質が、宿主細胞に対して天然である場合、過剰発現は、こうしたタンパク質の発現を正常レベルより高く増加させることを含む。非天然ＤＮＡ結合性転写制御因子タンパク質を使用する場合、宿主細胞で通常見られるレベルはゼロである。ＤＮＡ結合性転写制御因子タンパク質は、ターゲットポリペプチドの基底発現が減少するかまたは防止されるレベルまで過剰発現される。
【００１８】
本発明記載の発現系で使用可能なオペレーター配列には、ｌａｃ、ｇａｌ、ｄｅｏおよびｇｌｎが含まれる。１以上、好ましくは２つのオペレーター配列を使用してもよい。特定の態様において、２以上の完全なパリンドローム・オペレーター配列を使用してもよい。多くの好ましい態様において、２つの完全なパリンドローム・オペレーター配列を使用し、最も好適には、１つのオペレーター配列はプロモーター下流に位置し、そして１つのオペレーター配列はプロモーター上流に位置する。２つのオペレーター系を使用する場合、オペレーター配列は、好ましくは、プロモーターの調節を最大にするように間隔を開けられる。２つのオペレーターは、最も一般的には、誘導性プロモーターと組み合わせて使用されることが認識されるであろう。多くの態様において、間隔は８５〜１５０塩基対離れており、好ましくは９０〜１２６塩基対離れており、そして最も好ましくは９１または９２塩基対離れている。特定の態様において、オペレーター配列は、転写開始点と重なる。
【００１９】
オペレーター系は、一般的に、適切なリプレッサー配列とともに使用されることが認識されるであろう。リプレッサー配列は、リプレッサータンパク質を産生し、例えばｌａｃオペレーターを用いる場合、ｌａｃＩ遺伝子配列である。他のｌａｃリプレッサー配列もまた使用可能であり、例えばｌａｃＩＱ配列を用いて、ｌａｃリプレッサータンパク質レベルを増加させてもよい。また、宿主細胞ゲノムによって、またはさらなる適合プラスミドを用いることによって、リプレッサー配列を提供してもよい。
【００２０】
本発明の発現系は、ターゲットポリペプチドの基底発現の調節を提供し、そしてしたがって、より有効でそして調節可能なターゲットポリペプチド製造を提供する。さらに、本発明の発現系は、毒性の影響を有するか、あるいはベクターまたは宿主株の安定性に不都合に影響を及ぼす可能性がある、ターゲットポリペプチドの基底発現を抑制することによって、より有効なベクター組み立ておよび／またはクローニングを可能にする。
【００２１】
本発明の発現系をベクター組み立てまたはクローニングで使用する場合、特定の態様において、しばしば、所望のベクター組み立てまたはクローニング後、ターゲットポリペプチドに機能可能であるように連結されたプロモーターに有利に働く（favour）条件を選択すると、前記ポリペプチドの発現が可能になるように、発現系を選択する。こうした態様は、例えばベクター組み立てで使用するものと同じ宿主細胞、最も一般的には大腸菌において、ターゲットポリペプチドを発現させようとする状況に特に適している。他の態様において、ＤＮＡ結合性転写制御因子タンパク質によるターゲットポリペプチド発現の調節が非常に大きく、単にターゲットポリペプチド発現のための条件を選択するだけで、ターゲットポリペプチドがほとんどまたはまったく産生されないように発現系を選択する。こうした態様において、ターゲットポリペプチドの発現は、例えば以下によって達成可能である：
ａ）ＤＮＡ結合性転写制御因子タンパク質を発現する細胞がもはや選択不能であるが、ターゲットポリペプチドのみを発現する細胞が選択される発現条件を使用する。こうしたアプローチは、別個のベクター上にあるＤＮＡ結合性転写制御因子タンパク質およびターゲットポリペプチドの発現カセットの使用に適している；
ｂ）ターゲットポリペプチドを発現するが、ＤＮＡ結合性転写制御因子タンパク質を発現しない宿主細胞にベクターをトランスファーする。例えば、真核生物、例えば哺乳動物または酵母細胞におけるターゲットポリペプチドの発現のためのベクターを、原核生物、
特に大腸菌においてベクター組み立てまたはクローニングする。ＤＮＡ結合性転写制御因子タンパク質のプロモーターは、ターゲットポリペプチド発現宿主によって認識されない。このアプローチは、ＤＮＡ結合性転写制御因子タンパク質およびターゲットポリペプチドの発現カセットが、単一ベクター上に位置する発現系に特に適しており、そしてこれはまた、ＤＮＡ結合性転写制御因子タンパク質およびターゲットポリペプチドが別個のベクター上に位置する場合にもまた使用可能である；
ｃ）ＤＮＡ結合性転写制御因子タンパク質をコードする発現カセットを切除して、ベクターの構造を修飾する。こうしたアプローチは、ＤＮＡ結合性転写制御因子タンパク質およびターゲットポリペプチドの発現カセットが単一ベクター上に位置する発現系、ならびにＤＮＡ結合性転写制御因子タンパク質およびターゲットポリペプチドの発現カセットが別個のベクター上に位置する発現系に適している。
【００２２】
多くの好ましい態様において、対応する発現系と比較した際、ターゲットポリペプチドの発現を助け、そしてＤＮＡ結合性転写制御因子タンパク質の発現を嫌う発現条件を選択した際に、ターゲットポリペプチドの発現が防止されるかまたは損なわれないが、ＤＮＡ結合性転写制御因子タンパク質発現要素を欠くように、発現系を選択する。
【００２３】
特定の特に好ましい発現系は、大腸菌ＤＮＡ結合タンパク質ＨＵ−α／ＤＮＡ結合タンパク質ＨＵ−βの発現カセットを含み、最も好ましくは、これは、構成的ｌａｃプロモーターに機能可能であるように連結されている。こうした発現系は、好適には、大腸菌ＤＮＡ結合タンパク質ＨＵ−α／ＤＮＡ結合タンパク質ＨＵ−βの、そしてターゲットポリペプチドの、別個のベクターを含み、ターゲットポリペプチドのベクターは、ｔａｃプロモーターに機能可能であるように連結されたターゲットポリペプチドの発現カセットを含み、こうしたベクターはまた、好ましくは単一のオペレーター、特に天然ｌａｃオペレーターまたは完全にパリンドロームであるｌａｃオペレーターも含む。
【００２４】
さらに特に好ましい発現系は、ラットＨＭＧＢ−１の発現カセットを含み、最も好ましくは、これは、構成的ｌａｃプロモーターに機能可能であるように連結されている。こうした発現系は、好適には、ラットＨＭＧＢ−１の、そしてターゲットポリペプチドの、別個のベクターを含み、ターゲットポリペプチドのベクターは、ｔａｃプロモーターまたはＴ７、特にＴ７遺伝子１０プロモーターに機能可能であるように連結されたターゲットポリペプチドの発現カセットを含む。多くのこうした態様において、ターゲットポリペプチドのベクターがｔａｃプロモーターを含む場合、ベクターはまた、単一のオペレーター、特に天然ｌａｃオペレーターまたは完全にパリンドロームであるｌａｃオペレーターも含む。さらなるこうした態様において、ターゲットポリペプチドのベクターが、Ｔ７、特にＴ７遺伝子１０プロモーターを含む場合、ベクターはまた、２つの完全にパリンドロームであるオペレーター、特にｌａｃオペレーターも含み、最も好ましくは、１つのオペレーター配列はプロモーター上流に位置し、そして１つのオペレーター配列はプロモーター下流に位置する。
【００２５】
本発明の発現系を使用して、宿主細胞において、そして特に微生物において、ポリペプチドを発現させてもよい。宿主細胞は原核または真核であってもよい。原核細胞の例には、細菌細胞、例えば大腸菌、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｓｅｓｃｅｎｓ）および緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）を含むグラム陰性細菌細胞、ならびに枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を含むグラム陽性細菌細胞が含まれる。真核細胞の例には、酵母、例えばピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クロイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、シゾ
サッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）が含まれる。使用可能な哺乳動物宿主細胞には、ヒト細胞株、例えばヒト胎児腎臓およびＰＥＲＣ．６細胞；ネズミ細胞株、例えばＮＳ０細胞；ならびに特に、ハムスター細胞株、例えばベビーハムスター腎臓細胞および特にチャイニーズハムスター卵巣細胞が含まれる。他の真核宿主細胞、例えば糸状菌、植物、昆虫、両生類細胞または卵巣（ｏｖａｒｉａｎ）種もまた使用可能である。好ましい宿主細胞は細菌、特に腸内細菌科（ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃａｅ）、好ましくは大腸菌、そして特にそのＢまたはＫ１２株である。
【００２６】
本発明の発現系は、組換え細胞を培養することによる、ポリペプチド、特に組換えポリペプチドの製造のために使用される。
本発明のプロセスによって発現可能なポリペプチドには、療法タンパク質およびペプチドが含まれ、サイトカイン、増殖因子、抗体、抗体断片、免疫グロブリン様ポリペプチド、酵素、ワクチン、ペプチドホルモン、ケモカイン、受容体、受容体断片、キナーゼ、ホスファターゼ、イソメラーゼ、ヒドロリアーゼ、転写因子および融合ポリペプチドが含まれる。
【００２７】
発現可能な抗体には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体および生物学的活性を有する抗体断片が含まれ、前述のいずれかの多価および／または多重特異性型が含まれる。
【００２８】
天然存在抗体は、典型的には、４つのポリペプチド鎖、ジスルフィド結合によって相互連結された２つの同一の重（Ｈ）鎖および２つの同一の軽（Ｌ）鎖を含む。各重鎖は、可変領域（ＶＨ）および定常領域（ＣＨ）を含み、ＣＨ領域は、天然型で、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、可変領域（ＶＬ）および１つのドメインＣＬを含む定常領域を含む。
【００２９】
ＶＨおよびＶＬ領域をさらに、より保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と称される領域が介在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性領域にさらに分割してもよい。各ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成され、これらはアミノ末端からカルボキシ末端に、以下の順で配置される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。
【００３０】
発現させてもよい抗体断片は、損なわれていない抗体の一部を含み、これは所望の生物学的活性を有する。抗体断片には、一般的に、少なくとも１つの抗原結合部位が含まれる。抗体断片の例には：（ｉ）ＶＬ、ＣＬ、ＶＨおよびＣＨ１ドメインを有するＦａｂ断片；（ｉｉ）Ｆａｂ誘導体、例えば２つのＦａｂ誘導体間のジスルフィド架橋によって二価断片を形成可能である、ＣＨ１ドメインのＣ末端に１以上のシステイン残基を有するＦａｂ’断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインを有するＦｄ断片；（ｉｖ）Ｆｄ誘導体、例えばＣＨ１ドメインのＣ末端に１以上のシステイン残基を有するＦｄ誘導体；（ｖ）抗体の単一のアームのＶＬおよびＶＨドメインを有するＦｖ断片；（ｖｉ）一本鎖抗体分子、例えばＶＬおよびＶＨドメインが共有結合している一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体；（ｖｉｉ）定常領域ドメインを含むかまたは含まない別の可変ドメイン（ＶＨまたはＶＬドメインポリペプチド）に連結された、定常領域ドメインを含まないＶＨまたはＶＬドメインポリペプチド（例えばＶＨ−ＶＨ、ＶＨ−ＶＬ、またはＶＬ−ＶＬ）（ｖｉｉｉ）ドメイン抗体断片、例えば、ＶＨドメイン、またはＶＬドメイン、およびＶＨまたはＶＬドメインいずれかの抗原結合断片、例えば単離ＣＤＲ領域からなる断片；（ｉｘ）２つの抗原結合部位を含む、いわゆる「ディアボディ」、例えば同じポリペプチド鎖中で、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；ならびに（ｘ）相補性軽鎖ポリペプチドとともに、抗原結合領域対を形成する、タンデムＦｄセグメント対を含む、いわゆる直鎖抗体が含まれる。
【００３１】
調製可能な好ましい抗体断片は、哺乳動物単一可変ドメイン抗体であり、免疫グロブリン可変ドメインに特徴的な配列を含み、そして抗原に特異的に結合し（すなわち５００ｎＭ以下、例えば４００ｎＭ以下、好ましくは２５０ｎＭ以下、そして最も好ましくは１００ｎＭ以下の解離定数）、そして単一可変ドメインとして；すなわちいかなる相補性可変ドメインも含まずに、抗原に結合する、折りたたまれたポリペプチドドメインを含む抗体断片である。単一可変ドメイン抗体には、完全抗体可変ドメインならびに修飾可変ドメイン、例えば１以上のループが、抗体可変ドメインに特徴的でない配列で置換されているもの、あるいは一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）されているかまたはＮもしくはＣ末端伸長を含む抗体可変ドメイン、ならびに可変ドメインの折りたたまれた断片が含まれる。調製可能な好ましい単一可変ドメインは、ＶＨおよびＶＬの群より選択され、ＶカッパおよびＶラムダが含まれる。最も好ましくは、単一可変ドメインは、ヒトまたはラクダ科（ｃａｍｅｌｉｄ）ドメインであり、ヒト化ラクダ科ドメインが含まれる。
【００３２】
したがって、本発明はまた、宿主細胞において、本発明の第一の側面にしたがった発現系を発現する工程を含む、ターゲットポリペプチドの産生のための方法も提供する。
発現系は、使用する細胞に関して、当該技術分野に周知の方法によって発現される。好ましい発現法には、増殖培地中で、特に発酵によって、組換え細胞を培養し、そして次いで発現されたタンパク質を回収する工程が含まれる。用語「増殖培地」は、組換え細胞を増殖させるために用いられる栄養培地を指す。多くの態様において、栄養溶液を使用する。所定の組換え細胞に適した増殖培地が当該技術分野に周知である。
【００３３】
基底発現は、ＤＮＡ結合性転写制御因子タンパク質をコードするＤＮＡに機能可能であるように連結されたプロモーターに適した条件を選択することによって調節される。適切な場合、例えば細胞が、例えば細胞密度を監視することによって決定される所望の増殖状態に到達するまで増殖している場合、ターゲットポリペプチドをコードするＤＮＡに機能可能であるように連結されたプロモーターに有利に働くように、条件を調整する。多くの態様において、この調整は、対数期増殖中に行われる。
【００３４】
本発明を以下の実施例によって限定なしに例示する。
【実施例】
【００３５】
プラスミドｐＡＢ０１３の構築
ｐＡＢ０１３を生成するための出発ベクターは、ＵＳ  ６，５３７，７７９に記載されるように調製されたｐＺＴ７＃２．０であった。ｐＺＴ７＃２．０は、ｐＡＴ１５３ベクター骨格、ｃｅｒ安定性配列、ｔｅｔ  Ａ／Ｒ、関心対象の遺伝子上流の単一天然ｌａｃオペレーター配列、および上流Ｔ４転写ターミネーターを有する。ＮｃｏＩ、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ制限酵素部位によって、合成オリゴヌクレオチドリンカーを用いて、Ｔ７Ａ３プロモーターおよび二重完全パリンドロームｌａｃオペレーターをこのプラスミド内にクローニングした。
【００３６】
オリゴヌクレオチド１および２をアニーリングさせることによって、リンカー１２を調製した：
【００３７】
【化１】
2012521752.tif 000003
【００３８】
次いで、リンカーをプラスミドｐＺＴ７＃２．０に連結させ、そしてＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩ断片として、クローニング宿主株ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ  ＭＲ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換した。形質転換体の最初のスクリーニングは、ＮｃｏＩを用いた制限消化によった。配列決定によって配列を確認した。次いで、オリゴヌクレオチド３および４をアニーリングさせることによって、Ｔ７Ａ３プロモーターカセットをこのベクター内にクローニングした：
【００３９】
【化２】
2012521752.tif 000004
【００４０】
アニーリングしたオリゴヌクレオチドをベクターに連結させ、そしてＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩ断片として、クローニング宿主株ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ  ＭＲ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換した。最初のスクリーニングは、プラスミドＤＮＡの制限消化によった。次いで、配列決定によって配列を確認した。
【００４１】
ヒト腫瘍壊死因子（ｈＴＮＦ）−α遺伝子をＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ断片として、このプラスミド内にクローニングして、ｐＡＢ０１３を生成した。このプラスミドは、Ｔ７Ａ３プロモーター／二重完全パリンドロームｌａｃオペレーター配列／ｌａｃリプレッサー系の調節下でｈＴＮＦ−αを発現する。
【００４２】
プラスミドｐＡＢ０４４の構築
出発ベクターは、ＵＳ  ６，５３７，７７９に記載されるように調製されたｐＺＴ７＃２．０であった。ｐＺＴ７＃２．０は、ｐＡＴ１５３ベクター骨格、ｃｅｒ安定性配列、ｔｅｔ  Ａ／Ｒ、関心対象の遺伝子上流の単一天然ｌａｃオペレーター配列、および上流Ｔ４転写ターミネーターを有する。ＮｃｏＩ、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ制限酵素部位によって、合成オリゴヌクレオチドリンカーを用いて、Ｔ７Ａ３プロモーターおよび二重完全パリンドロームｌａｃオペレーターをこのプラスミド内にクローニングした。
【００４３】
上述のように、オリゴヌクレオチド１および２をアニーリングさせることによって、リンカー１２を調製した。
次いで、リンカーをプラスミドｐＺＴ７＃２．０に連結させ、そしてＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩ断片として、クローニング宿主株ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ  ＭＲ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換した。形質転換体の最初のスクリーニングは、ＮｃｏＩを用いた制限消化によった。配列決定によって配列を確認した。オリゴヌクレオチド１７および１８をアニー
リングさせることによって、ｔａｃプロモーターカセットをこのベクター内にクローニングした：
【００４４】
【化３】
2012521752.tif 000005
【００４５】
アニーリングしたオリゴヌクレオチドを連結させ、そしてＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩ断片として、クローニング宿主株ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ  ＭＲ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換した。最初のスクリーニングは、プラスミドＤＮＡの制限消化によった。次いで、配列決定によって配列を確認した。ヒトＴＮＦα遺伝子をＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ断片として、このプラスミド内にクローニングして、ｐＡＢ０４４を生成した。このプラスミドは、ｔａｃプロモーター／二重完全パリンドロームｌａｃオペレーター配列／ｌａｃリプレッサー系の調節下でｈＴＮＦ−αを発現する。
【００４６】
プラスミドｐＡＢ２３５の構築
ｐＡＢ２３５の出発ベクターはｐＡＣＹＣ−Ｄｕｅｔ（Ｎｏｖａｇｅｎカタログ番号７１１４７−３）であった。ＤＮＡ結合タンパク質ＨＵ（熱不安定性）−βをコードするＨｕｐＢ配列を大腸菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ番号ＡＴＣＣ２７３２５より得られる）のゲノムＤＮＡからＰＣＲによって増幅した。用いたプライマーは、プライマー１：  ＧＣＣＡＴＡＴＧＣＡＧＧＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＡＴＧＡＡＴＡＡＡＴＣＴＣＡＡＴＴＧ（配列番号７）およびプライマー２：  ＧＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＧＴＴＴＡＣＣＧＣＧＴＣＴＴＴＣＡＧ（配列番号８）であった。ＰＣＲ産物を、ベクターｐＣＲ２．１  ＴＯＰＯ  Ｂｌｕｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ｋ２８００２０より得られる）内にクローニングした。挿入物を、ＮｃｏＩ−ＸｈｏＩ消化（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）によって取り除き、そしてｐＡＣＹＣ−Ｄｕｅｔ内にクローニングして、ベクターＮＢＪ０５８５−６−１を作製した。
【００４７】
ＨｕｐＡ遺伝子（ＤＮＡ結合タンパク質ＨＵ−α）を、構成的ｌａｃプロモーター（ｌａｃオペレーター配列を除く）およびＨｕｐＡ遺伝子除去のためのＮｄｅＩ部位を含有するＭｌｕＩ−ＮｃｏＩ断片として設計した。これをベクターＮＢＪ０５８５−６−１にクローニングして、プラスミドｐＡＢ２３５を作製した。ＨｕｐＡ遺伝子配列を図１に提供する（配列番号９）。
【００４８】
プラスミドｐＡＢ２４９の構築
ｐＡＢ２４９の出発ベクターはｐＡＣＹＣ−Ｄｕｅｔであった。構成的ｌａｃプロモーター（ｌａｃオペレーター配列を除く）およびＨｕｐＡ遺伝子除去のためのＮｄｅＩ部位を含有するＭｌｕＩ−ＮｃｏＩ断片として設計されたＨｕｐＡ遺伝子（ＤＮＡ結合タンパク質ＨＵ−α）を、ＭｌｕＩ−ＮｃｏＩ断片として、ｐＡＣＹＣ−Ｄｕｅｔにクローニングして、ベクターＮＢＪ０５８５−１８−１を作製した。これを次いで、ＮｄｅＩ−ＸｈｏＩで消化して、ＨｕｐＡ遺伝子を取り除いた。次いで、大腸菌コドン最適化ラットＨＭＧＢ−１（高移動度群Ｂ）遺伝子をクローニングして、ｐＡＢ２４９を作製した。大腸菌
コドン最適化ラットＨＭＧＢ−１遺伝子配列を図２に提供する（配列番号１０）。
【００４９】
ｐＡＢ２４６の構築
ｐＡＢ２４６の出発ベクターはｐＣＩ−Ｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｅ１８４１）であった。ラットＨＭＧＢ−１タンパク質（チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞における発現のために最適化された遺伝子配列コドン）を、クローニングのため、ＮｈｅＩ−ＮｏｔＩ断片として合成した。これをｐＣＩ−ＮｅｏにクローニングしてｐＡＢ２４６を作製した。
【００５０】
ｐＡＢ１９３の構築
ｐＡＢ１９３の出発ベクターはｐＯＰＲＳＶ１／ＭＣＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）であった。ＩｇＧ  Ｆｃ遺伝子配列（図３−配列番号１１）をＮｈｅＩ／ＮｏｔＩ断片として、ＳｐｅＩ／ＮｏｔＩ消化したｐＯＰＲＳＶＩ／ＭＣＳにクローニングして、ｐＡＢ１９３を生成した。
【００５１】
実施例１
エレクトロポレーションを用いて、プラスミドｐＡＢ０４４を大腸菌宿主株Ｗ３１１０に形質転換した。テトラサイクリンを補充したルリアブロス（ＬＢ）寒天上にプレーティングすることによって、コロニーを選択した。ＣＬＤ０４７と称される、生じた組換え株を精製し、そしてグリセロールストック中、−８０℃で維持した。
【００５２】
エレクトロポレーションを用いて、プラスミドｐＡＢ２３５およびｐＡＢ０４４を大腸菌宿主株Ｗ３１１０に同時形質転換した。テトラサイクリンおよびクロラムフェニコールを補充したルリアブロス（ＬＢ）寒天上にプレーティングすることによって、コロニーを選択した。ＣＬＤ２８３と称される、生じた組換え株を精製し、そしてグリセロールストック中、−８０℃で維持した。
【００５３】
エレクトロポレーションを用いて、プラスミドｐＡＢ２３５およびｐＡＢ０１３を大腸菌宿主株Ｗ３１１０に同時形質転換した。テトラサイクリンおよびクロラムフェニコールを補充したルリアブロス（ＬＢ）寒天上にプレーティングすることによって、コロニーを選択した。ＣＬＤ２７１と称される、生じた組換え株を精製し、そしてグリセロールストック中、−８０℃で維持した。
【００５４】
エレクトロポレーションを用いて、プラスミドｐＡＢ２４９およびｐＡＢ０１３を大腸菌宿主株Ｗ３１１０に同時形質転換した。テトラサイクリンおよびクロラムフェニコールを補充したルリアブロス（ＬＢ）寒天上にプレーティングすることによって、コロニーを選択した。ＣＬＤ２７２と称される、生じた組換え株を精製し、そしてグリセロールストック中、−８０℃で維持した。
【００５５】
エレクトロポレーションを用いて、プラスミドｐＡＢ０１３を大腸菌宿主株Ｗ３１１０に形質転換した。テトラサイクリンを補充したルリアブロス（ＬＢ）寒天上にプレーティングすることによって、コロニーを選択した。ＣＬＤ０１８と称される、生じた組換え株を精製し、そしてグリセロールストック中、−８０℃で維持した。
【００５６】
組換え大腸菌株の要約を表１に提示する。
表１：組換え大腸菌株
【００５７】
【表１】
2012521752.tif 000006
＊ＤＮＡ結合タンパク質ＨＵ（熱不安定性）−α／ＤＮＡ結合タンパク質ＨＵ（熱不安定性）−β
【００５８】
実施例２
ＣＬＤ０４７およびＣＬＤ２８３のバイアルを−８０℃フリーザーから取り出し、そして融解させた。融解したグリセロールストック各々の１０μｌを、別個に、テトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ、ＣＬＤ０４７）またはＣＬＤ２８３用にクロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）およびテトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ）を補充した５ｍｌルリアブロス（ＬＢ、５ｇ／Ｌ酵母エキス（Ｏｘｏｉｄ）、１０ｇ／Ｌトリプトン（Ｏｘｏｉｄ）、および５ｇ／Ｌ塩化ナトリウム）に接種した。ＣＬＤ０４７およびＣＬＤ２８３の培養を３７℃で、軌道振盪装置中、２００ｒｐｍで１６時間、インキュベーションした。次いで、５００μｌのこれらの培養各々を用いて、５０ｍｌのルリアブロス（上記のような組成）を含有する２５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコに別個に接種した。フラスコを３７℃で、軌道振盪装置中、２００ｒｐｍでインキュベーションした。上記条件下でインキュベーションを続け、その間に、増殖、細菌細胞内のｈＴＮＦαの集積を測定するために、試料を採取した（４時間および２２時間）。ＣＬＤ０４７およびＣＬＤ２８３の非誘導培養におけるｈＴＮＦαの基底集積レベルを、試料細菌のＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のウェスタンブロット分析（抗ｈＴＮＦα抗体を用いる）によって比較した。誘導の非存在下での長期のインキュベーションを用いて、観察されうるいかなる基底発現も増幅するであろう最悪条件を提供した。
【００５９】
データを図４に示す。驚くべきことに、ＤＮＡ結合タンパク質ＨＵ（熱不安定性）−α／ＤＮＡ結合タンパク質ＨＵ（熱不安定性）−β（ＣＬＤ２８３）の存在下でのｈＴＮＦαの基底発現は、２２時間に渡る長期インキュベーション後であってさえ、有意に減少した。
【００６０】
実施例３
ＣＬＤ０１８、ＣＬＤ２７１およびＣＬＤ２７２のバイアルを−８０℃フリーザーから取り出し、そして融解させた。融解したグリセロールストック各々の１０μｌを、別個に、テトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ、ＣＬＤ０１８）またはＣＬＤ２７１およびＣＬＤ２７２用にクロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）およびテトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ）を補充した５ｍｌルリアブロス（ＬＢ、５ｇ／Ｌ酵母エキス（Ｏｘｏｉｄ）、１０ｇ／Ｌトリプトン（Ｏｘｏｉｄ）、および５ｇ／Ｌ塩化ナトリウム）に接種した。培養を３７℃で、軌道振盪装置中、２００ｒｐｍで１６時間、インキュベーションした。次いで、５００μｌのこれらの培養各々を用いて、５０ｍｌのルリアブロス（上記のような組成）を含有する２５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコに別個に接種した。フラスコを３７℃で、軌道振盪装置中、２００ｒｐｍでインキュベーションした。ＯＤ６００＝０．５〜０．７（〜中期指数増殖期）まで増殖を監視し、そして試料を採取した。さらに２２時間、上記条件下でインキュベーションを続け、その間に、増殖、細菌細胞内のｈＴＮＦαの
集積を測定するために、試料を採取した（３時間（後期指数増殖期）および２２時間（安定期））。長期インキュベーション後のＣＬＤ０１８、ＣＬＤ２７１およびＣＬＤ２７２の非誘導培養におけるｈＴＮＦαの基底集積レベルを、試料細菌のＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のウェスタンブロット分析（抗ｈＴＮＦα抗体を用いる）によって比較した。
【００６１】
データを図５に示す。データによって、ＤＮＡ結合タンパク質ＨＵ（熱不安定性）−α／ＤＮＡ結合タンパク質ＨＵ（熱不安定性）−β（ＣＬＤ２７１）のまたは真核ラットＨＭＧＢ−１（ＣＬＤ２７２）の存在下での、実施例２で用いたものとは異なるプロモーター／発現系を用いたｈＴＮＦαの基底発現は、長期インキュベーション後であってさえ、有意に減少することが確認される。
【００６２】
実施例４
チャイニーズハムスター卵巣細胞、細胞タイプＣＨＯ−ＰＦ（ＥＣＡＣＣ、カタログ番号００１０２３０７）のアンプルを凍結ストックから生き返らせ、そして１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）および４ｍＭ  Ｌ−グルタミンを補充したイスコフの修飾ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）細胞培養増殖培地５０ｍｌ中、Ｔ１７５静置培養内に回収した。トランスフェクション日まで、フラスコを１：５の分割比でルーチンに継代した。培地を除去し、そしてフラスコ内容物を２０ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ）で洗浄した後、４ｍｌのトリプシンを添加し、そして３７℃で３分間インキュベーションすることによって、細胞をフラスコから解離させた。細胞を解離させた際、新鮮な培地をフラスコに添加して、トリプシン活性を中和した。トランスフェクション日、細胞をフラスコから解離させ、そして試料を採取して、ＶｉｃｅｌｌＴＭ自動化細胞計数装置を用いて、生存細胞濃度および生存度を決定した。細胞濃度を７．５ｘ１０５細胞．ｍｌ−１に調整し、そして１ｍｌの細胞懸濁物を６ウェル細胞培養マイクロタイタープレートの各ウェルにトランスファーした。加湿５％ＣＯ２インキュベーター（Ｓａｎｙｏ）中、３７℃で２時間プレートをインキュベーションし、そしてトランスフェクション複合体を以下のように調製した：
１３．３μｇ  ｐＡＢ１９３および３．３μｇのｐＡＢ２４６（等量のｐＣＭＶｌａｃＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａｃリプレッサーを発現する））に加えて、８０μＬ  Ｆｕｇｅｎｅ（登録商標）６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１８１４４４３００１）および６６７μＬ  ＩＭＤＭ。ＤＮＡ／Ｆｕｇｅｎｅ（登録商標）６複合体を室温で２時間インキュベーションした後、複合体由来の２００μＬを細胞培養プレート上の４ウェル各々に添加した。ｐＡＢ２４６プラスミドＤＮＡを除いて、上述の半量を用いて第二の複合体を調製した。これをまた２時間インキュベーションした後、６ウェル細胞培養プレートの２ウェルに添加した。細胞培養プレートを、加湿５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で２４時間インキュベーションした。最終濃度５ｍＭまでＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）を添加することによって、ｐＡＢ２４６を含有する細胞培養プレート上のいくつかのウェルを誘導して、所望のタンパク質ＩｇＧ−Ｆｃの誘導を確認した。細胞培養プレートを、加湿５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃でさらに５日間インキュベーションした。酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって、細胞培養増殖培地内へのＩｇＧ−Ｆｃの発現／分泌を測定した。
【００６３】
データを図６に示す。該データは、ＨＭＧＢ−１同時発現を用いて、哺乳動物発現系において、タンパク質基底発現を減少させうることを立証する。さらに、誘導因子ＩＰＴＧを培養に添加すると、ＩｇＧ−Ｆｃタンパク質の誘導がなお可能であり、そして誘導後、タンパク質レベル増加が生じる。
【００６４】
実施例５
プラスミドｐＡＢ００７およびｐＡＢ０３１の構築
ｐＡＢ０３１の生成のための出発ベクターは、ＵＳ  ６，５３７，７７９に記載されるように調製されたｐＺＴ７＃２．０であった。ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ制限酵素部位に
よって、合成オリゴヌクレオチドリンカーを用いて、Ｔ７Ａ３プロモーターおよび単一完全パリンドロームｌａｃオペレーターをこのプラスミド内にクローニングした。
【００６５】
上述のように、オリゴヌクレオチド３および４によって、Ｔ７Ａ３プロモーターを含有するリンカーを作製した。
オリゴヌクレオチド３および４をアニーリングさせ、次いで、形成されたリンカーをプラスミドｐＺＴ７＃２．０に連結させ、そしてＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩ断片として、クローニング宿主株ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ  ＭＲ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換した。最初のスクリーニングは、プラスミドＤＮＡの制限消化によった。次いで、配列決定によって配列を確認した。ヒトＴＮＦα遺伝子をＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ断片として、このプラスミド内にクローニングして、ｐＡＢ０３１を生成した。このプラスミドは、Ｔ７Ａ３プロモーター／単一完全パリンドロームｌａｃオペレーター配列／ｌａｃリプレッサー系の調節下でｈＴＮＦ−αを発現する。
【００６６】
プラスミドｐＡＢ０４０の構築
ｐＡＢ０４０の生成のための出発ベクターは、ＵＳ  ６，５３７，７７９に記載されるように調製されたｐＺＴ７＃２．０であった。ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ制限酵素部位によって、合成オリゴヌクレオチドリンカーを用いて、ｔａｃプロモーターおよび単一完全パリンドロームｌａｃオペレーターをこのプラスミド内にクローニングした。
【００６７】
オリゴヌクレオチド１３および１４をアニーリングさせることによって、リンカー１３１４を調製した。
【００６８】
【化４】
2012521752.tif 000007
【００６９】
次いで、リンカーをプラスミドｐＺＴ７＃２．０に連結させ、そしてＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩ断片として、クローニング宿主株ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ  ＭＲ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換した。形質転換体の最初のスクリーニングは、ＮｃｏＩを用いた制限消化によった。配列決定によって配列を確認した。ヒトＴＮＦα遺伝子をＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ断片として、このプラスミド内にクローニングして、ｐＡＢ０４０を生成した。このプラスミドは、Ｔａｃプロモーター／単一完全パリンドロームｌａｃオペレーター配列／ｌａｃリプレッサー系の調節下でｈＴＮＦαを発現する。
【００７０】
プラスミドｐＡＢ０４１の構築
ｐＡＢ０４１の生成のための出発ベクターは、ＵＳ  ６，５３７，７７９に記載されるように調製されたｐＺＴ７＃２．０であった。ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ制限酵素部位によって、合成オリゴヌクレオチドリンカーを用いて、ｔａｃプロモーターおよび単一天然ｌａｃオペレーターをこのプラスミド内にクローニングした。
【００７１】
オリゴヌクレオチド１１および１２をアニーリングさせることによって、リンカー１１
１２を調製した。
【００７２】
【化５】
2012521752.tif 000008
【００７３】
次いで、リンカーをプラスミドｐＺＴ７＃２．０に連結させ、そしてＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩ断片として、クローニング宿主株ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ  ＭＲ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換した。形質転換体の最初のスクリーニングは、ＮｃｏＩを用いた制限消化によった。配列決定によって配列を確認した。ヒトＴＮＦα遺伝子をＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ断片として、このプラスミド内にクローニングして、ｐＡＢ０４１を生成した。このプラスミドは、Ｔａｃプロモーター／単一天然ｌａｃオペレーター配列／ｌａｃリプレッサー系の調節下でｈＴＮＦαを発現する。
【００７４】
プラスミドｐＡＢ３５０の構築
ｐＺＴ７＃３．３発現プラスミドをＵＳ  ６，５３７，７７９に記載されるように調製した。ヒトＴＮＦα遺伝子をＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ断片として、このプラスミド内にクローニングして、ｐＡＢ３５０を生成した。このプラスミドは、Ｔ７遺伝子１０プロモーター／二重完全パリンドロームｌａｃオペレーター配列／ｌａｃリプレッサー系の調節下でｈＴＮＦαを発現する。
【００７５】
株構築
ＣＬＤ０３２
エレクトロポレーションを用いて、プラスミドｐＡＢ０３１を大腸菌宿主株Ｗ３１１０に形質転換した。テトラサイクリンを補充したルリアブロス（ＬＢ）寒天上にプレーティングすることによって、コロニーを選択した。ＣＬＤ０３２と称される、生じた組換え株を精製し、そしてグリセロールストック中、−８０℃で維持した。
【００７６】
ＣＬＤ４０８
エレクトロポレーションを用いて、プラスミドｐＡＢ２３５およびｐＡＢ０３１を大腸菌宿主株Ｗ３１１０に同時形質転換した。テトラサイクリンおよびクロラムフェニコールを補充したルリアブロス（ＬＢ）寒天上にプレーティングすることによって、コロニーを選択した。ＣＬＤ４０８と称される、生じた組換え株を精製し、そしてグリセロールストック中、−８０℃で維持した。
【００７７】
ＣＬＤ４０９
エレクトロポレーションを用いて、プラスミドｐＡＢ２４９およびｐＡＢ０３１を大腸菌宿主株Ｗ３１１０に同時形質転換した。テトラサイクリンおよびクロラムフェニコールを補充したルリアブロス（ＬＢ）寒天上にプレーティングすることによって、コロニーを選択した。ＣＬＤ４０９と称される、生じた組換え株を精製し、そしてグリセロールストック中、−８０℃で維持した。
【００７８】
ＣＬＤ０４２
エレクトロポレーションを用いて、プラスミドｐＡＢ０４１を大腸菌宿主株Ｗ３１１０に形質転換した。テトラサイクリンを補充したルリアブロス（ＬＢ）寒天上にプレーティングすることによって、コロニーを選択した。ＣＬＤ０４２と称される、生じた組換え株を精製し、そしてグリセロールストック中、−８０℃で維持した。
【００７９】
ＣＬＤ４１０
エレクトロポレーションを用いて、プラスミドｐＡＢ２３５およびｐＡＢ０４１を大腸菌宿主株Ｗ３１１０に同時形質転換した。テトラサイクリンおよびクロラムフェニコールを補充したルリアブロス（ＬＢ）寒天上にプレーティングすることによって、コロニーを選択した。ＣＬＤ４１０と称される、生じた組換え株を精製し、そしてグリセロールストック中、−８０℃で維持した。
【００８０】
ＣＬＤ４１１
エレクトロポレーションを用いて、プラスミドｐＡＢ２４９およびｐＡＢ０４１を大腸菌宿主株Ｗ３１１０に同時形質転換した。テトラサイクリンおよびクロラムフェニコールを補充したルリアブロス（ＬＢ）寒天上にプレーティングすることによって、コロニーを選択した。ＣＬＤ４１１と称される、生じた組換え株を精製し、そしてグリセロールストック中、−８０℃で維持した。
【００８１】
ＣＬＤ４１２
エレクトロポレーションを用いて、プラスミドｐＡＢ２３５およびｐＡＢ０４０を大腸菌宿主株Ｗ３１１０に同時形質転換した。テトラサイクリンおよびクロラムフェニコールを補充したルリアブロス（ＬＢ）寒天上にプレーティングすることによって、コロニーを選択した。ＣＬＤ４１２と称される、生じた組換え株を精製し、そしてグリセロールストック中、−８０℃で維持した。
【００８２】
ＣＬＤ４１３
エレクトロポレーションを用いて、プラスミドｐＡＢ２４９およびｐＡＢ０４０を大腸菌宿主株Ｗ３１１０に同時形質転換した。テトラサイクリンおよびクロラムフェニコールを補充したルリアブロス（ＬＢ）寒天上にプレーティングすることによって、コロニーを選択した。ＣＬＤ４１３と称される、生じた組換え株を精製し、そしてグリセロールストック中、−８０℃で維持した。
【００８３】
ＣＬＤ０２３
エレクトロポレーションを用いて、プラスミドｐＡＢ３５０を大腸菌宿主株ＢＬ２１（λＤＥ３）に形質転換した。テトラサイクリンを補充したルリアブロス（ＬＢ）寒天上にプレーティングすることによって、コロニーを選択した。ＣＬＤ０２３と称される、生じた組換え株を精製し、そしてグリセロールストック中、−８０℃で維持した。
【００８４】
ＣＬＤ４１４
エレクトロポレーションを用いて、プラスミドｐＡＢ２３５およびｐＡＢ３５０を大腸菌宿主株ＢＬ２１（λＤＥ３）に同時形質転換した。テトラサイクリンおよびクロラムフェニコールを補充したルリアブロス（ＬＢ）寒天上にプレーティングすることによって、コロニーを選択した。ＣＬＤ４１４と称される、生じた組換え株を精製し、そしてグリセロールストック中、−８０℃で維持した。
【００８５】
ＣＬＤ４１５
エレクトロポレーションを用いて、プラスミドｐＡＢ２４９およびｐＡＢ３５０を大腸菌宿主株ＢＬ２１（λＤＥ３）に同時形質転換した。テトラサイクリンおよびクロラムフェニコールを補充したルリアブロス（ＬＢ）寒天上にプレーティングすることによって、
コロニーを選択した。ＣＬＤ４１５と称される、生じた組換え株を精製し、そしてグリセロールストック中、−８０℃で維持した。
【００８６】
実施例５で使用する組換え大腸菌株の要約を表２に示す。
表２
【００８７】
【表２】
2012521752.tif 000009
＊ＤＮＡ結合タンパク質ＨＵ（熱不安定性）−α／ＤＮＡ結合タンパク質ＨＵ（熱不安定性）−β
【００８８】
ＣＬＤ０３２、ＣＬＤ４０８、ＣＬＤ４０９、ＣＬＤ０４２、ＣＬＤ４１０、ＣＬＤ４１１、ＣＬＤ０４１２、ＣＬＤ０４１３、ＣＬＤ０２３、ＣＬＤ４１４およびＣＬＤ４１５のバイアルを−８０℃フリーザーから取り出し、そして融解させた。融解したグリセロールストック各々の１０μｌを、別個に、テトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ、ＣＬＤ００３２、ＣＬＤ０４２、ＣＬＤ０４３およびＣＬＤ０２３）またはＣＬＤ４０８、ＣＬＤ４０９、ＣＬＤ４１０、ＣＬＤ４１１、ＣＬＤ４１２、ＣＬＤ４１３およびＣＬＤ４１４用にクロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）およびテトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ）を補充した５ｍｌルリアブロス（ＬＢ、５ｇ／Ｌ酵母エキス（Ｏｘｏｉｄ）、１０ｇ／Ｌトリプトン（Ｏｘｏｉｄ）、および５ｇ／Ｌ塩化ナトリウム）に接種した。培養を３７℃で、軌道振盪装置中、２００ｒｐｍで１６時間、インキュベーションした。次いで、５００μｌのこれらの培養各々を用いて、５０ｍｌのルリアブロス（上記のような組成）を含有する２５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコに別個に接種した。フラスコを３７℃で、軌道振盪装置中、２００ｒｐｍでインキュベーションした。ＯＤ６００＝０．５〜０．７（〜中期指数増殖期）まで増殖を監視した。試料を採取し、そしてフラスコ各対の一方を０．５ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導した。さらに２２時間、上記条件下でインキュベーションを続け、その間に、増殖、細菌細胞内のｈＴＮＦαの集積を測定するために、試料を採取した（３時間（後期指数増殖期）および２２時間（安定期））。長期インキュベーション後の培養中のｈＴＮＦα集積レベルを、試料細菌のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって比較した。ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのレーザー濃度計によって、ｈＴＮＦ
α集積レベル（％総細胞微生物タンパク質（％ＴＣＰ）として表わす）を決定し、そして株ＣＬＤ０３２、ＣＬＤ４０８、ＣＬＤ４０９、ＣＬＤ０４２、ＣＬＤ４１０、ＣＬＤ４１１、ＣＬＤ０２３、ＣＬＤ４１４およびＣＬＤ４１５に関して検出されたレベルを、以下の表３に示す。株ＣＬＤ０４１２およびＣＬＤ０４１３に関して検出されたレベルを以下の表４に示す。
【００８９】
表３のデータは、本発明記載の発現系を含む例示的な株が、ＤＮＡ結合性転写制御因子タンパク質の発現カセットを欠く対応する系と比較して、ｈＴＮＦαの基底発現の有意な減少を示すことを示す。しかし、ｈＴＮＦα発現がＩＰＴＧ添加によって誘導された際、本発明記載の株によって産生されるｈＴＮＦαのレベルは、ＤＮＡ結合性転写制御因子タンパク質の発現カセットを欠く対応する系によって産生されるレベルに匹敵する。
【００９０】
表４のデータは、本発明記載の発現系を含むこれらの株に関するｈＴＮＦαの基底発現の優れた調節および優れた誘導産生を示す。
表３．  ｈＴＮＦα発現レベル
【００９１】
【表３】
2012521752.tif 000010
＊＝本発明記載
【００９２】
表４．  ｈＴＮＦα発現レベル
【００９３】
【表４】
2012521752.tif 000011
【図１】
2012521752.tif 000012
【図２】
2012521752.tif 000013
【図３】
2012521752.tif 000014
【図６】
2012521752.tif 000015
【図４】
2012521752.tif 000016
【図５】
2012521752.tif 000017
【配列表】
2012521752000001.xml
【国際調査報告】
2012521752.tif 000022
2012521752.tif 000023
2012521752.tif 000024
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