(57)【要約】  分泌FXYDタンパク質は腸粘膜及び／又は関連組織によって発現され、組織の損傷に応答して腸陰窩における細胞増殖を調節する。そのような組織損傷は、疾患、有害化学物質への暴露（例えば中毒、化学療法、化学兵器による）、又は有害放射線への暴露（例えば原子力事故、核兵器、放射線療法による）から生じえる。これらのタンパク質は上皮組織の損傷に応答して分泌されるため、それらのいくつかは組織修復応答、又は組織損傷を長期化または悪化させる炎症性応答に関与する。これらタンパク質の例にはFXYD3、FXYD4およびFXYD5が含まれる。上皮組織の損傷におけるFXYDタンパク質の役割に基づく診断方法が開示される。また、FXYDファミリータンパク質に対して産生した抗体、ポリペプチドの少なくとも1種のエピトープを検出するキット、ポリペプチドのエピトープに対する抗体の製造方法、及び上皮組織の損傷を診断する方法が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象者において上皮組織に対する損傷を診断する方法であって、以下の工程：
前記対象者由来のサンプルにおいて、FXYD3、FXYD4およびFXYD5から成る群から選択される少なくとも１種のポリペプチドの存在または発現レベルのインジケーターを測定する工程；
前記測定したインジケーターを参照レベルと比較する工程；および
前記インジケーターが参照レベルと比較して増加／低下した場合に組織損傷と診断する工程、
を含む、方法。
【請求項２】
対象者の上皮組織における増殖性応答を検出する方法であって、以下の工程：
前記対象者由来のサンプルにおいて、FXYD3、FXYD4およびFXYD5から成る群から選択される少なくとも１種のポリペプチドの存在または発現レベルのインジケーターを測定する工程；
前記測定したインジケーターを参照レベルと比較する工程；および
前記インジケーターが参照レベルと比較して増加／低下した場合に前記組織における増殖性応答が認定される工程、
を含む、方法。
【請求項３】
前記インジケーターが、前記ポリペプチドをコードするmRNAのレベルのインジケーターである、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
前記インジケーターが、上皮組織から分泌された前記ポリペプチドのレベルのインジケーターである、請求項1または2に記載の方法。
【請求項５】
前記インジケーターを測定する工程が、前記サンプルを前記ポリペプチドと特異的に結合する抗体と接触させ、それによって前記抗体および前記ポリペプチドの複合体を形成する工程、および形成された複合体の量を測定する工程を含む、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
上皮組織に対する損傷が、化学療法または放射線療法によって誘発される、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
増殖性応答が、化学療法または放射線療法によって誘発される、請求項2に記載の方法。
【請求項８】
FXYD3、FXYD4およびFXYD5から成る群から選択されるポリペプチドのエピトープと特異的に結合する抗体を含む、実質的に純粋な抗体調製物。
【請求項９】
前記エピトープが高い予想抗原性を有する、請求項8に記載の実質的に純粋な抗体調製物。
【請求項１０】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項8に記載の実質的に純粋な抗体調製物。
【請求項１１】
前記抗体が、Fabフラグメント、F(ab')2フラグメント、Fvフラグメントおよび単鎖Fvフラグメント（scFv）から成る群から選択される抗体フラグメントである、請求項8に記載の実質的に純粋な抗体調製物。
【請求項１２】
以下を含む、上皮組織に対する損傷を検出するためのキット：
FXYD3、FXYD4およびFXYD5から成る群から選択されるポリペプチドのエピトープに対して産生された抗体；並びに
前記抗体を検出する手段。
【請求項１３】
前記抗体がそれに結合させた検出可能な標識を含む、請求項12に記載のキット。
【請求項１４】
前記抗体と特異的に結合する標識二次抗体を更に含む、請求項12に記載のキット。
【請求項１５】
FXYD3、FXYD4、FXYD5、またはそのフラグメントもしくは模倣物から成る群から選択される少なくとも１種のポリペプチドを含む、実質的に純粋なタンパク質調製物。
【請求項１６】
FXYD3、FXYD4およびFXYD5から成る群から選択されるタンパク質の高い予想抗原性を有する少なくとも1種のエピトープを含む少なくとも1種のポリペプチドを含む、実質的に純粋なタンパク質調製物。
【請求項１７】
凍結乾燥されている、請求項15または16に記載の実質的に純粋なタンパク質調製物。
【請求項１８】
医薬的に許容できる担体を更に含む、請求項15または16に記載の実質的に純粋なタンパク質調製物。
【請求項１９】
アジュバントを更に含む、請求項15または16に記載の実質的に純粋なタンパク質調製物。
【請求項２０】
非経口投与のために処方される、請求項15または16に記載の実質的に純粋なタンパク質調製物。
【請求項２１】
経腸投与のために処方される、請求項15または16に記載の実質的に純粋なタンパク質調製物。
【請求項２２】
局所投与のために処方される、請求項15または16に記載の実質的に純粋なタンパク質調製物。
【請求項２３】
FXYD3、FXYD4およびFXYD5から成る群から選択されるポリペプチドのエピトープと特異的に結合する抗体を製造する方法であって、以下の工程：
請求項15または16に記載の少なくとも1種のポリペプチドを動物に投与する工程；
前記動物において前記ポリペプチドに対する体液性応答を発達させる工程；および
前記動物から前記抗体を回収する工程、
を含む、方法。
【請求項２４】
FXYD3、FXYD4、FXYD5、またはそのフラグメントもしくは模倣物から成る群から選択される少なくとも１種のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸。
【請求項２５】
FXYD3、FXYD4およびFXYD5から成る群から選択されるタンパク質の高い予想抗原性を有する少なくとも１種のエピトープを含む少なくとも1種のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腸粘膜および／または関連組織によって発現される、組織の損傷に応答して腸陰窩で細胞増殖を調節するFXYDファミリーの分泌タンパク質の同定、そのようなタンパク質の抗体を生成するための使用、および粘膜または他の上皮組織の損傷診断のための方法、並びにそのようなFXYDタンパク質およびそのような抗体の調製物における使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
そのほぼ全長にわたって、哺乳動物の胃腸管は、一様な厚さの円柱状上皮細胞で構成される上皮で形成された粘液膜で内側が覆われている。小腸ではこの上皮は絨毛を被覆するように成形されている。絨毛とは結合組織の指様突起であり、多数存在して腸管腔に向けて突出するが、絨毛周辺および絨毛間の表面には陰窩（リーベルキューン陰窩）として知られる、小さなびんの形をした、上皮細胞の袋を構成する多数の腔が存在する。
絨毛を覆う上皮は非増殖性であり、完全に分化し機能を有する細胞から成り、老化を経て主として管腔中への排出によって消失する。小腸絨毛の細胞の消失は激しく、マウスでは5日毎およびヒトではおそらく20−30分毎におよそ109細胞（ほぼ1グラム）が排出される。この激しい細胞の消失は、絨毛基底周辺の陰窩の細胞分裂によって定常的状態に保たれる（陰窩で生産された新細胞は絨毛上に移動し絨毛から失われた細胞と置き換わる）。一般的には約6から10のこのような陰窩が各絨毛周辺に存在して機能を果たし、さらに各陰窩は2つ以上の絨毛のために機能しえる。
【０００３】
細胞置換プロセスの結果として、陰窩から絨毛への定常的な細胞移動が存在する。この細胞の移動を調べて細胞速度を決定することができる。陰窩の先端では、細胞は一般的に１時間当たり0.75から1.5細胞直径の速度で移動する。さらにまた、細胞の移動は垂直方向の円柱として生じ、横方向への移動は比較的少ない。マウスの小腸では、陰窩は約250個の細胞を含み、その150個は急速な細胞周期下にあり、各々は1日にほぼ2回分裂する。このことは小腸が身体でもっとも急激に分裂する組織の1つであることを意味する。しかしながら、この急激な分裂にもかかわらず小腸の癌は稀であり、このホメオスタシス機構が極めて良好に管理されていること、またはこのシステムが増殖および遺伝的誤謬持続から良好に護られていることを示唆している。
【０００４】
各陰窩は比較的少数の幹細胞を含む。前記幹細胞は陰窩内に移動細胞系列を生じ、前記細胞系列は順次垂直方向の細胞円柱を生じ、これら細胞は陰窩から絨毛先端（ここからそれらは放出される）へと移動する。各陰窩内の幹細胞の正確な数は明確ではないが、マウスの小腸ではおそらく4−16で、前記範囲の低い方がもっとも蓋然性が高い。この形態の組織編成および増殖に固有の特質は、この組織における細胞の局所解剖学的な位置が、細胞の成熟ステージおよび当該細胞が発生し移動していく陰窩内の位置と直接関係しえるという事実である。個々の位置の細胞の行動および特徴を調べることによって、ゆっくりとした細胞周期の幹細胞集団と密接に関係する特質またはより急速に分裂する移動細胞集団と密接に関係する特質を解明することができる。当該組織内の幹細胞の正確な位置は明確ではないが、それらは陰窩の基底に隣接して分布することが知られている（それらは、当該基底から最初の3細胞上方の位置に存在する分化パネート細胞中に分散されているか、または陰窩の基底から約4−5細胞（最も高い位置のパネート細胞のすぐ上）により優先的に存在する）。例えば以下の文献を参照されたい：Potten and Loeffler (1987), J Theoret Biol 127:381-391；Potten and Loeffler (1990), Development 110:1001-1020；およびPotten (1998), Phil Trans Roy Soc 353:821-830.
【０００５】
小腸の組織が、細胞傷害性薬剤（例えば化学療法剤）または高い放射線量（例えばガンマ線またはX線）に暴露されることにより傷害または損傷されるとき、まず初めに陰窩のサイズが縮小して全体的な増殖活性が急速に低下し、急性細胞死（アポトーシス）および絨毛への細胞移動の継続の結果として細胞の枯渇が生じる。しかしながら一定期間後、損傷があまりに激烈でないことを条件として再生プロセスは本来の正常な定常的状態へと陰窩の活性を回復させる。実際、この再生期の間に陰窩のサイズは拡大するかまたは本来の正常サイズを超えることさえある。
陰窩の種々の領域にわたる増殖性変化の分布を細胞の位置の解析によって調べることを含む詳細な研究は、損傷後の再生性変化が幹細胞領域内で陰窩の基底に向かって開始すること、および爆発的な再生分裂だけでなくこの領域における細胞周期の短縮もまた存在しえることを示している。例えば以下の文献を参照されたい：Potten (1991), Univ Texas MD Anderson Conf Proceedings, John Wiley, NY, p155-171；Potten et al. (1988), Int J Radiat Biol 54(6):1041-1051；およびPotten (1990), Int J Radiat Biol 58(6):925-973。
【０００６】
医学的には、化学療法および／または放射線療法による上皮粘膜の傷害または損傷は、しばしば従来の癌療法の用量限定副作用である。したがって、化学療法剤および放射線の暴露は、急激に増殖する腫瘍細胞を効果的に死滅させることができるが、宿主の粘膜上皮の急速に分裂している幹細胞（腸陰窩の幹細胞を含む）もまた損傷または死滅させ、一般に“粘膜炎”と称される症状を生じる。口腔および胃腸管の粘膜炎は、患者が治療工程の継続を断念するに余りある痛みをもたらすか、および／または栄養吸収の障害により生命を脅かすほどのるい痩を引き起こしえる。
哺乳動物の腸粘膜上皮細胞の生存および増殖を測定する動物モデルおよびアッセイを用いて、化学療法および放射線療法誘発粘膜炎の緩和に有望な治療が試験され有効性が立証された。例えば、組換えヒトケラチノサイト増殖因子（KGF、Amgen社（Thousand Oaks, CA）からKepivance(商標)として販売）が前処置として用いられ、粘膜の厚さ（絨毛の高さおよび陰窩の深さ）を増加させ、小腸における陰窩の生存を3.5倍改善した（Farrell et al. (1998), Cancer Res 58:933-939）。さらにまた、放射線の致死線量に暴露したマウスへの毎日のKGF投与は口腔上皮の厚さを増加させ、陰窩の幹細胞に対する細胞傷害性作用から保護することができ（すなわち生存陰窩の数を増加させ）、それは生存の増加をもたらした（Potten et al. (2001), Cell Growth & Differentiation 12:265-275）。
【０００７】
FXYDファミリーのタンパク質は、モチーフPFXYDで始まる保存された35アミノ酸配列を有する、少なくとも7つの哺乳動物のタンパク質（FXYD1からFXYD8）から成る。2つのまた別のファミリーメンバーがゼブラフィッシュで同定された。これらの小さな膜タンパク質は身体に広く分布し、液体または溶質の輸送に必要とされるか、または電気的に興奮性の組織で高度に発現される。FXYDはイオン輸送調節物質として機能すると考えられる。具体的には、FXYDタンパク質はNa、K-ATPアーゼの組織特異的調節サブユニット、特にα1-βアイソザイムであるらしい（例えば以下を参照されたい：Crambert and Geering (2003), “FXYD Proteins: New Tissue-Specific Regulators of the Ubiquitous Na, K-ATAse,” Sci STKE 2003(166):RE1）。
しかしながら、本発明および本開示以前には、傷害または損傷に対する哺乳動物上皮組織の再生応答、特に細胞傷害性薬剤または放射線照射によって誘発される傷害または損傷に対する哺乳動物粘膜上皮の再生応答におけるFXYDタンパク質発現の役割は当分野では知られてなかった。
したがって当分野では、細胞傷害性薬剤または放射線照射によって誘発される上皮の傷害または損傷に対する再生応答の遺伝学的基礎および前記応答におけるFXYDタンパク質の役割の理解、具体的にはそのような傷害または損傷の程度を評価する診断ツールがなお希求されている。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、組織の損傷に応答して上皮組織および／または関連組織によって発現されるFXYDファミリーの分泌タンパク質の同定に部分的に依存する。そのような組織の損傷は、感染症（例えば胃潰瘍）、非感染症（例えば炎症性腸疾患）、機械的もしくは外科手術による外傷、有害化学物質への暴露（例えば中毒、化学療法、化学兵器による）、または有害放射線への暴露（例えば原子力事故、核兵器、放射線療法による）から生じえる。これらのFXYDファミリータンパク質は、損傷組織と非損傷組織における弁別的発現の解析とともにそのような分泌タンパク質を識別するバイオインフォーマティクスによる解析によって同定された。
これらの分泌FXYDファミリータンパク質は、それらの同定方法のために、上皮組織に対する損傷と必然的に密接に関係し、したがって当該損傷の診断薬である。したがって、これらの分泌FXYDファミリータンパク質を抗体（またはそのフラグメントもしくは誘導体）の作製に用いることが可能であり、さらに前記抗体を診断方法で用いて上皮細胞に対する損傷を検出または定量することができる。
【０００９】
したがってある特徴では、本発明は、本発明のFXYDファミリータンパク質の実質的に純粋な調製物を提供する。本発明のFXYDファミリータンパク質と特異的に結合する抗体を製造する方法で、これらのFXYDファミリータンパク質調製物を免疫原性組成物で用いることができる。
別の特徴では、本発明は、本発明のFXYDファミリータンパク質と特異的に結合する抗体を製造する方法を提供する。関連する特徴では、本発明は、本発明のFXYDファミリータンパク質と特異的に結合する抗体の実質的に純粋な調製物を提供する。前記抗体を診断方法で用いることができる。
別の特徴では、本発明は、上皮組織に対する損傷の検出および定量を含む診断方法を提供する。いくつかの実施態様では、上皮組織の損傷は化学療法または放射線療法によって引き起こされる。いくつかの実施態様では、損傷上皮組織は口腔粘膜または腸粘膜に存在する粘膜上皮である。これらの組織は、例えば口、鼻、のど、食道または胃腸管、毛嚢、腺（例えば唾液腺、肝臓、乳房、前立腺、内分泌腺）および肺の管腔内層に存在しえる。これらの診断方法は、分泌FXYDファミリータンパク質レベルにおける変化の検出を含む。
本発明のこれらの特徴および他の特徴は、下記の詳細な説明および実施例を見れば当業者には明白であろう。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本明細書で引用した特許文献、学術文献および技術文献は、出願の時点で当業者に利用可能であった知識を明確にする。本明細書で引用した発行米国特許、公開および係属中の出願、並びに学術及び技術文献の完全な開示は、あたかもそれらの各々が具体的におよび個々に指し示して参照により本明細書に含まれるかのように同程度に参照により本明細書に含まれる。矛盾がある場合はいずれも本開示が優先するであろう。
【００１１】
定義
本明細書で用いられる全ての学術用語および技術用語は、下記で特段に定義されないかぎり、当業者のある者が一般的に理解する意味と同じ意味を有することが意図される。本明細書で利用する技術についての言及は、当分野で一般的に理解されている技術を意味することが意図され、前記にはそれら技術の変型、または当業者には明白であるような等価のもしくは後に開発される技術の代用物が含まれる。さらにまた、本発明の内容をより明確にかつ簡潔に説明するために、本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられるある種の用語について以下の定義を提供する。
本明細書で用いられるように、“FXYDファミリータンパク質”という用語は、1つまたは2つ以上のヒトFXYD3、FXYD4もしくはFXYD5タンパク質、または実質的に同じ生物学的活性を有するそのようなタンパク質の変種（例えば対立遺伝子変種、ホモローグまたはオルトローグ）、または実質的に同じ生物学的活性を有するそのようなタンパク質のフラグメント、または実質的に同じ生物学的活性を有する模倣タンパク質を指し、この場合、生物学的活性は実施例に記載するアッセイ状況で決定される。
【００１２】
タンパク質調製物に関して本明細書で用いられるように、“実質的に純粋”という用語は、意図的に含まれる他の化合物の重量を勘定に入れずに、対象のタンパク質を少なくとも60%（乾燥重量で）含む調製物を意味する。いくつかの実施態様では、調製物は、意図的に含まれる他の化合物の重量を勘定に入れずに、対象のタンパク質を乾燥重量で少なくとも75%、少なくとも90%、または少なくとも99%含む。純度は、任意の適切な方法、例えばカラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、またはHPLC分析によって測定することができる。調製物が本発明の2つまたは3つ以上の異なるタンパク質を意図的に含む場合は、“実質的に純粋な”調製物は、意図的に含まれる他の化合物の重量を勘定に入れずに、本発明のタンパク質の全乾燥重量が全乾燥重量の少なくとも60%である調製物を意味する。本発明の2つまたは3つ以上のタンパク質を含むような調製物については、本発明のタンパク質の全重量は、意図的に含まれる他の化合物の重量を勘定に入れずに、調製物の全乾燥重量の少なくとも75%、少なくとも90%、または少なくとも99%でありえる。したがって、本発明のタンパク質が、投与、安定性、貯蔵などの目的のために、1つまたは2つ以上の他のタンパク質（例えば血清アルブミン）または化合物（例えば希釈剤、界面活性剤、賦形剤、塩、多糖類、糖、脂質）と混合される場合、そのような他のタンパク質または化合物の重量は調製物の純度の計算では無視される。
【００１３】
本明細書で用いられるように、“抗体”という用語は、天然に産生される抗体、組換えによって生成される抗体、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を、抗体フラグメント（例えばFabフラグメント、F(ab')2フラグメント、Fvフラグメントおよび単鎖Fvフラグメント（scFv））とともに包含することが意図される。有用な抗体には全ての免疫グロブリンクラス、例えばIgM、IgG、IgD、IgE、IgAおよびそれらのサブクラスが含まれる。抗体は、当分野で周知の標準的な方法によって生成することができる。例えば以下の文献を参照されたい：Pluckthun (1990), Nature 347:497-498；Huse et al. (1989), Science 246:1275-1289；Chaudhary et al. (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1066-1070；Mullinax et al. (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8095-8099；Berg et al. (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4723-4727；Wood et al. (1990), J. Immunol. 145:3011-3016；および前記に引用されている参考文献。
【００１４】
本明細書で用いられるように、抗体は、それが本発明のタンパク質と特異的に相互作用して抗体とタンパク質を非共有結合により結合させることができるならば、本発明のタンパク質と“特異的に結合する”と称される。抗体がサンプル中に存在しえる任意の他のタンパク質または他の分子からあるタンパク質を識別するならば、抗体と当該タンパク質との結合は特異的である。“エピトープ”という用語は、抗体によって認識され前記と結合するタンパク質の一部分を意味する。抗原（本発明のタンパク質を含む）は1つまたは2つ以上のエピトープを有しえる。抗原の“免疫原性組成物”は、動物を誘発して当該抗原のエピトープと特異的に結合する少なくとも1種の抗体を産生することができる抗原を含む組成物である。
本明細書で用いられるように、“増加”および“低下”は、統計的有意を達成する（すなわちp<0.05）方法およびサンプルサイズによって決定したとき、それぞれ少なくとも5%の増加または低下を引き起こすことを意味する。
本明細書で用いられるように、“統計的に有意”という用語は、対応するゼロの仮定の下では5%未満の蓋然性を有すること（すなわちp<0.05）を意味する。
【００１５】
本明細書で用いられるように、変数について数字で範囲が記載されてあれば、当該範囲内の値のいずれかと同じ変数を用いて本発明を実施できることを示す。したがって、本質的に不連続な変数については、変数は、前記数字で示された範囲内の任意の整数（終末点を含む）に該当することができる。同様に、本質的に連続した変数については、変数は、前記数字で示された範囲内の任意の実数（終末点を含む）に該当することができる。例として（これらに限定されないが）、0と2の間の値を有すると記載されている変数は、前記変数が本質的に不連続である場合は0、1または2の値を取ることができ、前記変数が本質的に連続している場合は0.0、0.1、0.01、0.001….0.9、0.99、0.999の値または≧0および≦2の任意の他の実数を取ることができる。
本明細書で用いられるように、特段の規定がなければ、“または”という語は“および／または”という包括的な意味で用いられ、“〜であるかまたは〜である”という排除の意味で用いられない。
本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられるように、単語の単数形の使用並びに単数の冠詞“a”、“an”および“the”の使用は、文脈が明瞭にそうではないことを示していないかぎり、言及した用語の複数形を含むことが意図され、さらに言及した用語の複数形の使用を排除しない。
【００１６】
一般的考察
本発明は、腸粘膜および関連組織（例えば上皮、筋肉、内皮、固有層、筋線維芽細胞）によって発現され、さらに組織損傷に応答して上皮幹細胞を調節する分泌FXYDファミリータンパク質の同定に部分的に依存する。そのような組織の損傷は、感染症（例えば胃潰瘍）、非感染症（例えば炎症性腸疾患）、機械的もしくは外科手術による外傷、有害化学物質への暴露（例えば中毒、化学療法、化学兵器による）、または有害放射線への暴露（例えば原子力事故、核兵器、放射線療法による）から生じえる。これらのFXYDファミリータンパク質は、損傷組織と非損傷組織における弁別的発現の解析とともにそのような分泌タンパク質を同定するバイオインフォーマティクスによる解析によって確認された。
本発明は、組織傷害または損傷、例えば高線量放射線（例えばガンマ線、高エネルギーX-線または電子ビーム）または細胞傷害性薬剤（例えば化学療法剤）から生じる結果に続いて生じる、哺乳動物の胃腸管のある部分、特にマウス小腸の粘膜上皮の細胞増殖および分裂の研究からもたらされた。マウスの胃腸管は、絨毛および小さなびんの形状の上皮細胞の袋を構成する多数の腔（陰窩（リーベルキューンの陰窩）として知られている）を覆う上皮を含む。マウス回腸の陰窩は、そのうちのいくつかが幹細胞である約250の細胞を含み、約150は活発に細胞周期を繰り返す。これらの陰窩の細胞分裂は、絨毛に向かって移動し各絨毛について約2000細胞/日の速度で絨毛を覆う細胞と置き換えられる新規な細胞を生じる。回腸の増殖している上皮細胞集団は約11時間から19時間の細胞周期を有する。幹細胞を含むと期待される陰窩内の場所では細胞周期はより遅い。放射線への暴露は、幹細胞が存在すると期待されるこれらの場所でアポトーシス細胞が最初に出現する傾向があることを示した（Potten (1990), Int J Radiat Biol 58(6):925-973）。
【００１７】
本発明の分泌タンパク質
本発明のFXYDファミリータンパク質には、放射線および細胞傷害性化学物質（例えば放射線療法または化学療法に由来する）による傷害から生じる上皮組織の損傷に応答して上皮および関連組織によって分泌される、上記方法によって同定されたタンパク質が含まれる。前記タンパク質は、最初、ヒト組織の応答に有用なモデルとして有効性が実証された上皮組織損傷のマウスモデルで同定された（Booth et al. (2000), Int J Cancer 86:53-5；Farrell et al. (1998), Cancer Res 58:933-939；およびBooth and Potten (2000), J Natl Cancer Inst 29:16-20）。
これらに限定されないが、本発明のFXYDファミリータンパク質には以下が含まれる：
表A
2012518802.tif 000002
【００１８】
さらにまた、本発明のFXYDファミリータンパク質には、これらタンパク質の一定のフラグメントとともにこれらタンパク質を含む一定の融合タンパク質が含まれる。例えば、下記に記載する多様なアルゴリズムおよびコンピュータプログラムを用いて、本発明の抗体を製造するために用いることができる抗原性フラグメントを同定することができる（例えば以下を参照されたい：http://tools.immuneepitope.org/tools/bcel/iedb_input）。同様に、生物学的に活性なフラグメントも同定することができる（例えば構造ドメインを基にして）。融合タンパク質もまた、リガンド配列（例えばポリ-Hisタグ、ビオチン-アビジン配列、マルトース結合タンパク質、c-mycまたは他のエピトープ）の導入により精製を単純化または促進するために、または抗原性を高めるために（例えばアジュバント配列、例えばヘマグルチニン、ノイラミニダーゼ）標準的技術によって製造することができる。本発明のFXYDファミリータンパク質はまた標準的技術によって標識することができる。前記には同位元素（例えば125I、32P、15N、13C）標識、蛍光（例えばフルオレセイン、ローダミン）標識、および酵素（例えばアルカリホスファターゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ）標識が含まれる。
【００１９】
FXYDファミリータンパク質の調製
別の特徴では、本発明は、本発明の分泌FXYDファミリータンパク質の実質的に純粋な調製物を提供する。前記調製物は凍結乾燥調製物であっても、または医薬的に許容できる担体、緩衝剤もしくは希釈剤を含む溶液であってもよい。精製度は調製物の意図される使用にしたがって左右されよう。例えば、調製物は、動物で免疫原として使用される、天然にまたは組換えによりFXYDファミリータンパク質を発現する細胞の粗抽出物であってもよく、またはヒトへの経腸または非経口投与に適した高度に精製された医薬組成物であってもよい。
本発明のタンパク質は、標準的技術、例えば本発明の抗体によるイムノアフィニティー精製（下記参照）または液体クロマトグラフィー精製を用いて腸陰窩の細胞から単離するか、または本発明の形質転換細胞から単離することができる（前記形質転換細胞では前記タンパク質はより高レベルで、さらに場合によってより容易に単離および／または精製される融合タンパク質として発現される）。イムノアフィニティー精製または液体クロマトグラフィー精製は、結腸陰窩または腸陰窩の細胞粗抽出物を液体クロマトグラフィーカラムに通す工程を含むことができる。形質転換細胞からの単離は本発明のタンパク質をコードするcDNAを発現する工程を含むことができる。前記タンパク質はまた、約37℃の適切な塩類溶液に置いた腸断片から単純に拡散させることによって単離してもよい。これらの浸出物を続いて多様な標準的プロトコルによって精製してもよい。
【００２０】
本発明のFXYDファミリータンパク質には、表Aに開示した完全長のネズミおよびヒトタンパク質とともにこれらタンパク質の対立遺伝子変種、ホモローグまたはオルトローグが含まれる。
完全長FXYDファミリータンパク質のフラグメントはまたある種の応用で用いることができる。それらフラグメントは、特に抗体の生成のためのエピトープを含むフラグメント、または前記タンパク質の結合パートナー（例えば抗体またはレセプタータンパク質）と相互作用する構造ドメインを含むフラグメントである。本発明のタンパク質の潜在的に有用なエピトープは、標準的な配列解析技術（下記に記載する）によって同定することができる。これらタンパク質の機能的等価物はまた、当業者に公知の標準的技術（位置特異的変異導入を含む）とそれに続く生物学的活性のアッセイ（下記に記載する）によって製造することができる。
ある種の実施態様では、本発明のFXYDファミリータンパク質の少なくとも１つの構造ドメインと、または本発明のFXYDファミリータンパク質の完全長配列と少なくとも80％−100％（例えば85％、90％または95％）のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドが提供される。いくつかの実施態様では、本発明のFXYDファミリータンパク質と少なくとも80％−100％のアミノ酸配列同一性を有し、さらに本発明のタンパク質と実質的に同じ（またははるかに高い）生物学的活性を有するポリペプチドが提供される。したがって、日常的実験および当業者の技術を用いて、そのような模倣分子を標準的タンパク質合成方法または組換えタンパク質発現技術によって製造することができ、さらに下記に記載するアッセイを用いて所望の活性についてスクリーニングすることができる。
【００２１】
“医薬的に許容できる”という語句は、ヒトおよび動物の組織と接触する使用に適し（適切な医学的判断の範囲内である）、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症がなく、利益/リスク比が合理的に釣り合うような化合物、物質、組成物および／または調剤形を指すために本明細書では用いられる。
本明細書で用いられる“医薬的に許容できる担体”という語句は、ある器官または身体のある部分から別の器官または身体の別の部分へ対象アンタゴニストを運搬または輸送するために必要な、医薬的に許容できる物質、組成物またはベヒクル、例えば液体もしくは個体充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒または被包化物質を意味する。各担体は、処方物の他の成分に適合し、さらに患者に有害でないという意味で“許容できる”ことが必要である。
湿潤剤、乳化剤および滑沢剤は、着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、香料および芳香剤、保存料並びに酸化剤もまた本組成物に存在しえる。
【００２２】
抗体
別の特徴では、本発明は、本発明のFXYDファミリータンパク質と特異的に結合する抗体、そのような抗体の調製物、およびそのような抗体を作製する方法を提供する。本抗体はポリクローナルでもモノクローナルでもよく、当分野で周知の方法によって作製することができる。特に、本発明は、高い予想抗原性を有するエピトープに対して産生された抗体を提供し、したがって前記抗体は本発明のタンパク質と選択的に結合し、したがって本発明のタンパク質を単離および同定するであろう。
抗体は、完全長タンパク質に対して、タンパク質のフラグメントに対して、または、タンパク質に特徴的であり前記タンパク質を他のタンパク質から実質的に区別する任意のエピトープに対して産生することができる。ある種の実施態様では、抗体は、標準的アルゴリズムまたはコンピュータプログラム（例えば、GCGTM、Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, Madison, Wi; MacVectorTM, MacVector, Inc., Cary, NC）を用いて、疎水性、表面確率および抗原性インデックスを予想することによって同定したエピトープに対して産生される。さらにまた以下を参照されたい：http://tools.immuneepitope.org/tools/bcel/iedb_input；およびJameson and Wolf (1988), Comput Appl Biosci 4:181-186。
ヒトFXYD3、FXYD4およびFXYD5タンパク質の有用なエピトープには以下が含まれる：
表B
2012518802.tif 000003
【００２３】
本発明のタンパク質の免疫原調製物は、粗抽出物から、天然にまたは組換えによりそれらを発現する細胞から実質的に精製したタンパク質またはペプチドから、または小さな免疫原については化学的なペプチド合成によって製造することができる。免疫原性調製物はまた融合タンパク質の形であってもよい。前記融合タンパク質では、一方の部分はそのアジュバント特性および／またはその精製促進能力（例えばポリヒスチジン）のために選択され、他方の部分は本発明のタンパク質に由来する。
免疫原性調製物は、アジュバントとともにまたはアジュバント無しに、本発明のFXYDファミリータンパク質またはそのフラグメントを医薬的に許容できる担体または希釈剤中に含むことができる。
一般的なこととして、本発明のFXYDファミリータンパク質と特異的に結合するモノクローナル抗体は、まず初めにマウス、ウサギ、ヤギまたは適切な動物に医薬的に許容できる担体または希釈剤中の免疫原を注射することによって製造することができる。担体タンパク質またはアジュバントを利用することができる。さらに必要に応じてブースター注射を用いてもよい（例えば8−10週間にわたって2週間毎または3週間毎）。体液性応答を進行させた後、動物を殺し、脾臓を取り出し、適切な緩衝液（例えばリン酸緩衝食塩水）に再懸濁する。脾臓細胞はリンパ球として機能し、そのうちのいくつかは適切な特異性を有する抗体を産生するであろう。続いて、これらの細胞を不朽化細胞株（例えばミエローマ）と融合させ、融合生成物を選別剤（例えばHAT）の存在下で組織培養ウェルにプレートする。前記ウェルを連続的にスクリーニングし、再プレートし、有用な抗体を産生する細胞を毎回選別する。ウェルが抗体産生について陽性である単一クローンを含むまで、典型的には数回のスクリーニングおよび再プレート工程を実施する。そのようなクローンによって産生されるモノクローナル抗体を、標準的な方法、例えばプロテインAセファロースを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって、イオン交換クロマトグラフィーによって、またはこれらの技術の変型および組み合わせによって精製することができる。
【００２４】
本発明の抗体は、ポリクローナルでもモノクローナルでもよく、または、抗体フラグメント（Fabフラグメント、F(ab')2フラグメント、Fvフラグメントおよび単鎖Fvフラグメント（scFv）を含む）でもよい。さらにまた、本発明の方法によって有用な抗体を同定した後、組換え抗体を作製することができる。前記には上記に列挙した任意の抗体フラグメントが含まれ、さらに本発明のFXYDファミリータンパク質に対する非ヒト抗体を土台にしたキメラおよび／またはヒト化抗体が含まれる。本発明のFXYDファミリータンパク質に関する本開示を考慮して、当業者は、多様な標準的手段のいずれかによって上記に記載した抗体を製造することができる。抗体技術の大要のために以下の文献を参照されたい：Antibody Engineering, 2nd Ed., Borrebaeck, ed., Oxford University Press, Oxford (1995)；Rubinstein et al. (2003), Anal Biochem 314:294-300；Traggia et al. (2004), Nat. Med. 10(8):871-875；およびLanzavecchia et al. (2006), Immunol. Rev., 2 11:303-309。抗体ファージディスプレー技術もまた利用して、キメラ抗体またはヒト化抗体を含む有用な抗体を当分野で公知のプロトコルにしたがって同定することができる（例えば、Krebs et al. (2001), J. Immunol. Methods 254: 67-84；Rauchenberger et al. (2003), J. Biol. Chem. 278:381 94-38205；Magnussen et al. (2005), Cancer Res. 65:2712-2721；米国特許第6,753,136号）。
【００２５】
本発明の抗体は種々の応用において用いることができる。例えば、抗体は、体液（例えば血液、リンパ、腸の粘膜層）におけるFXYDファミリータンパク質の存在またはレベルを検出するアッセイで、または特定の細胞（例えば上皮細胞（腸粘膜細胞を含み、さらに腸粘膜の幹細胞を含む））における本発明のタンパク質の存在または発現レベルを測定するアッセイで用いることができる。本発明の抗体を用いる技術には、本発明のFXYDファミリータンパク質を発現する細胞を同定するウェスタンブロッティング、本発明のタンパク質の細胞内または細胞外の位置を確定する免疫細胞化学または免疫蛍光技術、およびサンプルで本発明のFXYDファミリータンパク質の存在を検出または定量するELISA技術が含まれる。
本発明の抗体は、診断的使用のために他の化合物または物質と結合または連結させることができる。例えば、それらを標識、例えば放射性核種、蛍光化合物（例えばローダミン）、または画像化用酵素と結合させることができる。標識は抗体と共有結合または非共有結合により結合させることができる。
別の特徴では、本発明は、本発明のタンパク質の少なくとも１種のエピトープを検出するためのキットを提供する。キットは、本発明のタンパク質と特異的に結合する抗体および前記抗体を検出する手段を含む。抗体検出のための手段は、前記抗体または一次抗体を検出するための二次抗体に結合させた検出可能標識であってもよい（例えば本発明のタンパク質と特異的に結合するウサギ抗体を検出するための二次抗体としての標識ヤギ抗ウサギIg抗体）。
【００２６】
核酸調製物
ある特徴では、本発明は、本発明の分泌FXYDファミリータンパク質またはその有用なフラグメント（例えば抗原性フラグメント、機能性ドメイン）をコードする単離核酸分子の調製物を提供する。本発明のFXYDファミリータンパク質を合成するために、または本発明の診断方法のためのプローブまたはプライマーとしてこれらの核酸を用いることができる。
核酸分子は、DNAもしくはRNA分子、DNA-RNAハイブリッド分子または核酸アナローグでありえる。前記核酸アナローグは、改変塩基（例えば2'-ハロ-2'-デオキシヌクレオシド）および／または改変ヌクレオシド間結合（例えばペプチド核酸、ホスホロチオエート結合）を含むことができる。核酸は、本発明のタンパク質をコードする遺伝子配列の全部または一部分と一致するセンス分子でもよく、または本発明のタンパク質をコードする遺伝子配列の全部または一部分と相補的であるアンチセンス分子でもよい。核酸は、ゲノムDNAまたはcDNAから誘導されるかまたは前記と一致してもよく、またはタンパク質配列および遺伝暗号に基づく合成分子でもよい（発現系で用いられる宿主細胞のコドン使用頻度を反映する合成核酸）。
いくつかの実施態様では、核酸は、本発明のFXYDファミリータンパク質をコードする遺伝子の完全なコード配列を含む。そのような核酸を用いて、細胞の形質転換またはin vitro転写および翻訳系のための遺伝的構築物を製造することができる。そのような核酸はまたハイブリダイゼーションアッセイでプローブとして用いるか、または、サンプル中の配列（例えば本発明のタンパク質をコードするmRNAまたはcDNA分子）を検出するためにハイブリダイゼーションアレイに固定することができる。
【００２７】
他の実施態様では、核酸配列のサブセットが、核酸増幅反応のプライマーとして、サンプル中の配列を検出するハイブリダイゼーションアッセイもしくはアレイでのプローブとして、または正常もしくは野生型配列を異常もしくは変異配列から識別するプローブとして使用するために提供される。これらの実施態様では、本発明の核酸は、本発明のFXYDファミリータンパク質をコードする核酸配列から選択される、10−60ヌクレオチド、典型的には少なくとも10、14、16または18の連続するヌクレオチドを含む。応用の性質にしたがい、好ましくは、プローブが用いられまたは増幅されるサンプル中で固有の標的を有するか、または固有の標的を有すると期待される配列を選択することができる。したがって、例えば、より長い配列または頻繁に繰り返されるエレメント（例えばポリアデニル化シグナル）を含まない配列は、任意の与えられたサンプル中でまれにしか提示されない蓋然性がより高い。増幅反応のためのプライマーを選択する目的のためには、少なくとも15ヌクレオチドおよび典型的には18−25ヌクレオチドの配列が用いられる。プローブを使用する目的のためには、プローブは、プローブまたは第一のプローブの検出のための二次核酸プローブと結合させた検出可能な標識を有することができる（例えば、単離核酸と特異的にハイブリダイズする標識二次核酸）。これらの核酸は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で本発明のFXYDファミリータンパク質をコードする配列の少なくとも一部分とハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。そのような条件は、65℃で1.0ｘSSCによる洗浄工程およびその等価工程を用いるハイブリダイゼーションを含む。よりストリンジェントな条件は、0.5ｘSSC、0.2ｘSSCまたは0.1ｘSSCの洗浄工程さえも含むことができる。ストリンジェンシーにおいて等価である他の条件は当分野では周知である。例えば以下の文献を参照されたい：Ausubel et al., eds. (1989), Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, John Wiley & Sons, Inc., New York。
他の実施態様では、本発明の核酸は、少なくとも長さが10アミノ酸残基のアミノ酸配列を含むポリペプチドから完全なタンパク質の長さを含むポリペプチド（中間体または成熟形に最初から合成されるかまたは翻訳後に処理される）をコードする。
【００２８】
遺伝的構築物
別の特徴では、本発明は、本発明の核酸を含む遺伝的構築物を提供する。一連の実施態様では、コード配列（例えば全コード領域、構造ドメインをコードする配列、エピトープをコードする配列、または有用なプライマーもしくはプローブをコードする配列）は、内因性または外因性調節領域と作動できるように結合され、発現構築物を形成する。これらの目的のために有用な調節領域には、内因性調節領域、構成性プロモーター配列（例えばCMV、SV40、EF2）、および誘導性プロモーター配列（例えばlacZ、tet）が含まれる。多くの有用なベクター系が市場で入手できる。例えば、有用な細菌ベクターには以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：pQE70、pQE60、pQE-9 (Qiagen, Valencia, CA)、pBluescript IITM (Stratagene, La Jolla, CA)、並びにpTRC99a、pKK223-3、pDR540およびpRIT2T (Pharmacia, Piscataway, NJ)、pTrc (Amann et al. (1988), Gene 69:301-315) およびpET 11d (Studier et al. (1990), Methods Enzymol. 185:60-89)。酵母での発現のためのベクターの例には以下が含まれる：pYepSec1 (Baldari et al. (1987), EMBO J. 6:229-234)、pMFa (Kurjan et al. (1982), Cell 30:933-943)、pJRY88 (Schultz et al. (1987), Gene 54:113-123)、およびpYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA)。タンパク質はまた昆虫細胞（例えばSf9細胞）で発現させることができ、例えばバキュロウイルス発現ベクター（以下を含むが、ただしこれらに限定されない：pAcベクター（Smith et al. (1983), Mol. Cell Biol. 3:2156-2165）およびpVLベクター（Lucklow et al. (1989), Virology 170:31-39）が用いられる。哺乳動物発現ベクターの例には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：pCDM8（Seed (1987), Nature 329:840）およびpMT2PC （Kaufman et al. (1987), EMBO J. 6:187-195）。他の有用な真核細胞ベクターには以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：pXT1、pSG5（Stratagene, La Jolla, CA）並びにpSVK3、pBPV、pMSGおよびPSVLSV40（Pharmacia, Piscataway, NJ）。
【００２９】
別の一連の実施態様では、核酸コード配列は調節領域および外因性コード配列と結合され、融合タンパク質をコードする遺伝的構築物または融合ベクターを形成する。いくつかの実施態様では、コード配列を、新規で有用な特性を融合タンパク質に付与する外因性コード配列と結合させることができる。例えば、融合ベクターおよび融合タンパク質は、タンパク質の発現を増加させるため、タンパク質の溶解性を高めるため、またはタンパク質の精製を支援するために（アフィニティー精製のためのリガンド配列を提供することにより）有用でありえる。本発明のFXYDファミリータンパク質と融合成分との結合点にタンパク質分解切断部位を導入し、それにより本発明のFXYDファミリータンパク質が前記融合成分から容易に分離しえるようにできる。典型的な融合発現ベクターには、pGEX（Smith et al. (1988), Gene 67:31-40）、pMAL（New England Biolabs, Beverly, MA）およびpRIT5（Pharmacia, Piscataway, NJ）が含まれ、これらは、それぞれグルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）、マルトースE結合タンパク質、またはプロテインAを標的組換えタンパク質と融合させる。
【００３０】
形質転換細胞株
別の特徴では、本発明は、本発明の核酸分子で形質転換させた細胞株を提供する。そのような細胞株はこれらの核酸を簡単に増加させることができるか（例えばクローニングベクターで形質転換させるとき）、またはこれらの核酸によってコードされるポリペプチドを発現させることができる（例えば発現ベクターで形質転換させるとき）。そのような形質転換細胞株を用いて、本発明のFXYDファミリータンパク質および本発明のフラグメントを製造することができる。
前記形質転換細胞は細胞に外因性核酸または核酸アナローグを導入することによって製造することができるが、前記外因性核酸または核酸アナローグは、当該細胞内で複製し、当該細胞内で発現されるポリペプチド配列をコードし、さらに／または当該細胞のゲノムに組み込まれて遺伝子の発現に影響を及ぼす。形質転換は、当分野で形質転換、トランスフェクション、形質導入、エレクトロポレーション、弾道注入などと称される標準的な方法によって達成することができる。形質転換の方法は、形質転換される細胞のタイプおよび細胞に導入される遺伝的構築物の性質に適切であるように選択される。
【００３１】
形質転換に有用な細胞株には以下が含まれる：細菌細胞（例えば大腸菌（Escherichia coli））、酵母細胞（例えばサッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae））、昆虫細胞（例えばショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）シュナイダー（Schneider）細胞）、線形動物細胞（例えばカエノルハブジチス・エレガンス（Caenorhabditis elegans））、両性動物細胞（例えばアフリカツメガエル（Xenopus）卵母細胞）、げっ歯類細胞（例えばムス・ムスクルス（Mus musculus）（例えばネズミ3T3線維芽細胞）、ラッツス・ラッツス（Rattus rattus）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（例えばCHO-K1））、およびヒト細胞（例えばヒト皮膚線維芽細胞、ヒト胎児腎細胞（例えばHEK-293）、COS細胞）。
細胞は、形質転換される細胞のタイプに適した、当分野で公知の任意の方法にしたがって形質転換することができる。適切な方法には以下の文献に一般的に記載された方法が含まれる：例えばSambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York；およびDavis et al. (1986), Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier。具体的な方法には以下が含まれる：リン酸カルシウム共沈（Graham et al. (1973), Virol. 52:456-467）、培養細胞への直接微量注入（Capecchi (1980), Cell 22:479-488）、エレクトロポレーション（Shigekawa et al. (1988), BioTechniques 6:742-751）、リポソーム媒介遺伝子導入（Mannino et al. (1988), BioTechniques 6:682-690）、脂質媒介形質導入（Felgner et al. (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417）、および高速度微小発射体を用いる核酸デリバリー（Klein et al. (1987), Nature 327:70-73）。
【００３２】
診断方法
別の特徴では、本発明は診断方法を提供する。前記診断方法では、本発明のFXYDファミリータンパク質の合成もしくは分泌の存在またはレベルをアッセイして、上皮組織の傷害または損傷、例えば、細胞傷害性薬剤（例えば化学療法剤）または放射線暴露（例えば放射線療法）によって誘発される粘膜上皮の傷害または損傷の存在またはレベルを検出するか、またはそのような損傷に対する上皮細胞の増殖応答の存在またはレベルを検出する。標準参照レベル（例えば上皮組織傷害または損傷を受けていない正常な健常個体のレベル）よりも有意に高いかまたは低いタンパク質合成もしくは分泌レベルは、対象者が持続的な上皮組織の傷害または損傷を有すること、またはそのような損傷に対して上皮細胞増殖応答が誘発されたことを示すものとして利用することができる。前記とは別に、または前記に加えて、一連の標準参照レベル（例えば一定の化学療法剤投与または一定の放射線レベルへの暴露により典型的に生じるレベル）を決定し、対象者が前記参照レベルと関係する上皮組織傷害または損傷度を受けていることを示すものとして、対象者で検出されたレベルを利用することができる。
いくつかの実施態様では、本発明の抗体（本発明のFXYDファミリータンパク質と特異的に結合する）を用いて、血液、リンパ、口腔（唾液）、涙管、腹腔、胸腔由来液、肺滲出物、尿もしくは便、または口腔粘膜もしくは胃腸粘膜の生検、引き抜いた毛の末端の細胞球、または対象者の乳首の吸引物に油来するサンプルを試験し、本発明のFXYDファミリータンパク質の合成もしくは分泌の存在またはレベルを決定することができる。本発明のFXYDファミリータンパク質の存在またはレベルを測定する技術には、ウェスタンブロッティング、免疫細胞化学または免疫蛍光技術、およびELISA技術が含まれる。
【００３３】
他の実施態様では、組織の生検が利用できるときは、下記のアッセイに記載されているようにmRNA発現を試験して本発明のFXYDファミリータンパク質の存在または発現レベルを確認することができる。タンパク質分泌の検出に関しては、発現のレベルを1つまたは2つ以上の標準参照レベルと比較し、組織損傷が生じたこと、または上皮細胞の増殖応答が誘発されたことを示すものとして利用することができる。mRNA発現量は、全ゲノムのマイクロアレイとハイブリダイズさせることによって、または対象の遺伝子用プローブおよび場合によって目盛定め用の追加のプローブを含む選別アレイによって測定することができる。そのような測定は、生検組織の細胞（例えば陰窩の細胞）で生成された全mRNAからcDNAを作製し、同時にcDNAを増幅し、このcDNAを用いてマイクロアレイとハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション量を測定することを含むことができる。また別には、mRNA発現量は、下記に記載するようにRT-qPCRによって測定してもよい。
FXYDファミリータンパク質の分泌量またはmRNA発現量を測定するこれらの方法または他の方法は、本明細書に開示した核酸配列およびタンパク質配列を基にすれば当業者には明白であろう。
【実施例】
【００３４】
実施例１
マイクロアレイを用いたマウス結腸陰窩の上部区域および下部区域におけるFXYDファミリーメンバー遺伝子のmRNA発現の測定
個々の腸陰窩のmRNA発現プロフィル決定：マウスを頸部脱臼によって殺し、10−12週齢の3匹の正常な雄BDF1マウス（C56/BL6雌ｘDBA2雄の第一世代ハイブリッド、Harlan UK Ltd, Oxon, UK）のグループから腸を切開した。以下の文献に記載された方法を用いて結腸断片から陰窩を単離した：Booth et al (1995) In Vitro 31: 234-43 Epith.Cell Biol 4:76-86、Evous et al (1992) J Cell Sci 101: 219-31。倒立顕微鏡を用いて個々の結腸陰窩をサファイアナイフで半分に切断した。上部および下部陰窩区域の各々から全RNAを調製した（RNAqueous(商標)-96, Applied Biosystems/Ambion, Austin, TX）。cDNAをmRNAから作製し、さらに以下の文献に記載された方法を用いて増幅させた：Brady et al. (1990), Methods Mol. Cell. Biol. 2:17-25；Al-Taher et al. (2000), Yeast 17(3):201-10；およびBrady (2000), Yeast 17(3):211-7。マウス全ゲノムマイクロアレイ（Agilent, Wokingham,UK）とcDNAをハイブリダイズさせることによって、核酸配列の相対的豊富さを決定した。
正常な結腸陰窩におけるFXYD遺伝子ファミリーの発現：3匹の個々のマウスから得た下部および上部陰窩のmRNAプロフィル決定の結果は表1に示されている。表1の上の部分は前記マウスの未加工データを示し、下の部分は上部と下部陰窩細胞との間の発現比を示す。FXYD4の発現レベルは結腸陰窩の上部区域で約2.6倍高く、FXYD3およびFXYD5の発現レベルは陰窩の両区域でより類似していた。他のFXYDファミリーメンバー遺伝子（FXYD1、FXYD2、FXYD6およびFXYD7）の発現は陰窩で検出されず、このことは文献と一致する（Geering (2006), Am. J. Physiol. Renal Physiol. 290(2):F241-50）。
【００３５】
表１：未処理マウス
未加工データ（任意蛍光単位）
2012518802.tif 000004
上部陰窩/下部陰窩での遺伝子発現比
2012518802.tif 000005
*Ave＝比によって決定した3つの最も近い値のうちの2つの平均
【００３６】
損傷応答の再生期におけるFXYDの発現：化学療法で誘発された損傷に対する応答で再生腸組織におけるFXYDファミリー遺伝子の潜在的役割を決定するために、マウスに化学療法を施し、個々の結腸陰窩のmRNAレベルのプロフィルを決定した。
化学療法損傷応答モデル（再生期）：10−12週齢の3匹の雄BDF1マウスのグループに、5-フルオロウラシル（5-FU, Sigma-Aldrich Corp., Poole, UK）の腹腔内注射（400mg/kg体重）を2回6時間の間隔で施した。2回目の5-FU処置から24時間後にマウスを殺した。
化学療法を施した化学療法損傷応答モデルのマウスの下部および上部陰窩のmRNAプロフィル決定の結果は表2に示される。表2の上の部分は前記マウスの未加工データを示し、一方、下の部分は、下部と上部の陰窩細胞間における発現比（左部分）、および上部と下部の陰窩細胞間における発現比（右部分）を示す。FXYD4発現レベルは、未処理マウスの約2.6倍と比較して、結腸陰窩の上部区域で54.7倍高かった。FXYD3発現は、未処理マウスの2.5倍の平均と比較して、処理マウスの陰窩の下部区域で約3.5倍高かった。FXYD5発現については、未処理と処理マウスで差異は観察されなかった。
【００３７】
表2：化学療法処理マウス
未加工データ（任意蛍光単位）
2012518802.tif 000006
上部陰窩と下部陰窩の遺伝子発現比
2012518802.tif 000007
*Ave＝3つの最も近い値のうちの2つの平均
損傷応答の再生期の上部および下部結腸陰窩におけるFXYD遺伝子の弁別的mRNA発現は、この遺伝子ファミリーが細胞増殖を統合している可能性を示している。
【００３８】
実施例２
マウスの結腸陰窩の下部および上部区域におけるFXYDファミリー遺伝子のmRNA発現変化のRT-qPCRによる確認
実施例1のマイクロアレイの結果を確認し、さらに発現レベルをより正確に定量するために、典型的で包括的なcDNAサンプルについてリアルタイムの定量的PCR（RT-qPCR）を実施した。オリゴヌクレオチドプローブ（表3）を蛍光標識し(SYBR（登録商標） Green qPCR Core kit, Eurogentec, Liege, Belgium)、RT-qPCRを実施した（ABI PRISM（登録商標） 7000 Sequence Detection System, Applied Biosystems, Inc., Carlsbad, CA）。
【００３９】
表3：マウスFXYD遺伝子のためのオリゴヌクレオチドプローブ
FXYD3
関連配列のアクセッション番号NM_008557
5'-TTCTCCTCCCCTCCTGACACT-3'（センス）
5'-CTGAACAAAGAGCCTGCTACCA-3'（アンチセンス）
FXYD4
関連配列のアクセッション番号NM_033648
5'-GGCAGGTTTTTGACAACTTTCTG-3'（センス）
5'-CAGTATGTTCTAGGGAAGCCATCCT-3'（アンチセンス）
FXYD5
関連配列のアクセッション番号BC013340
5'-TGATCAACATGAAAGAATCCTGAAA-3'（センス）
5'-GGTGGGAAGACCATTAGCCTTA-3'（アンチセンス）
【００４０】
3匹の個々の正常マウスの下部および上部陰窩のmRNA発現プロフィル決定の結果は表4に示されている。FXYD3発現レベルは結腸陰窩の下部区域で約2.2倍高く、FXYD4発現レベルは結腸陰窩の上部区域で約2.6倍高かった、弁別的発現パターンはFXYD5では観察されなかった。
表4：未処理マウス
未加工データ（PCR単位、一次元）
2012518802.tif 000008
上部陰窩と下部陰窩の遺伝子発現比
2012518802.tif 000009
*Ave＝3つの最も近い値のうちの2つの平均
【００４１】
損傷応答の再生期におけるFXYD発現レベル
実施例1のマイクロアレイの結果を確認し、さらに発現レベルをより正確に定量するために、化学療法によって誘発した損傷に対する再生応答期の腸陰窩から調製した典型的で包括的なcDNAサンプルについてリアルタイムの定量的PCR（RT-qPCR）を実施した。
3匹の個々のマウスの下部および上部陰窩のmRNAプロフィル決定の結果は表5に示されている。FXYD4発現レベルは、未処理マウスの約2.6倍と比較して、結腸陰窩の上部区域で約73.1倍高かった。FXYD3発現レベルは、未処理マウスの約2.2倍と比較して、結腸陰窩の下部区域で約3.1倍高かった。さらにFXYD5発現レベルは、未処理マウスの類似するレベルと比較して、下部陰窩で約11.2倍高かった。
RT-qPCRの結果は実施例1のマイクロアレイの結果を確認し、さらに化学療法により誘発した損傷に対する応答の再生期にFXYD3、FXYD4およびFXYD5遺伝子の発現レベルが増加することを示した。これらの結果は、FXYD遺伝子は、結腸陰窩の細胞増殖の調節に必要であることを示している。
【００４２】
表5：化学療法処理マウス
未加工データ（PCR単位、一次元）
2012518802.tif 000010
上部陰窩と下部陰窩の遺伝子発現比
2012518802.tif 000011
*Ave＝3つの最も近い値のうちの2つの平均
【００４３】
等価物
本発明をその好ましい実施態様を引用しながら具体的に示し説明してきたが、添付の特許請求の範囲に規定した本発明の精神および範囲を逸脱することなく形態および細部で多様な変更を加ええることは当業者には容易に理解されよう。当業者は、日常的な実験以上のものを用いることなく、本明細書に具体的に記載した本発明の個々の実施態様と等価である多くのものを理解しまたは確認することができよう。そのような等価物は添付の特許請求の範囲内に包含される。
【００４４】
配列表
配列番号：1（マウスFXYD3、アクセッション番号NP_032583.1）
1 mqevvlsllv llaglptlda ndpenkndpf yydwyslrvg glicagilca lgiivlmsgk
61 ckckfrqkps hrpgegppli tpgsahnc
配列番号：2（ヒトFXYD3、アクセッション番号NP_001129479.1）
1 mgrgysgalq arggleeple rglrgpsftq splhgaaaay lsaqrdaslp vpgqrsdmqk
61 vtlgllvfla gfpvldandl edknspfyyd whslqvggli cagvlcamgi iivmsakckc
121 kfgqksghhp getpplitpg saqs
配列番号：3（マウスFXYD4、アクセッション番号NP_387468.1）
1 meeitcafll llaglpalea sdpvdkdspf yydweslqlg glifggllci agiamalsgk
61 ckcrrthkps slpgkatpli ipgsantc
配列番号：4（ヒトFXYD4、アクセッション番号NP_775183.1）
1 mervtlalll lagltalean dpfankddpf yydwknlqls glicggllai agiaavlsgk
61 ckckssqkqh spvpekaipl itpgsattc
配列番号：5（マウスFXYD5、アクセッション番号NP_001104543.1）
1 mslssrlcll tivalilpsr gqtpkkptsi ftadqtsatt rdnvpdpdqt spgvqttpli
61 wtreeatgsq taaqtetqql tkmatsnpvs dpgphtsskk gtpavsriep lspsknfmpp
121 syiehpldsn ennpfyyddt tlrkrgllva avlfitgiii ltsgkcrqls qfclnrhr
配列番号：6（ヒトFXYD5、アクセッション番号NP_054883.3）
1 mspsgrlcll tivglilptr gqtlkdttss ssadstimdi qvptrapdav ytelqptspt
61 ptwpadetpq pqtqtqqleg tdgplvtdpe thkstkaahp tddtttlser pspstdvqtd
121 pqtlkpsgfh eddpffydeh tlrkrgllva avlfitgiii ltsgkcrqls rlcrnrcr
【配列表】
2012518802000001.app
【国際調査報告】
2012518802.tif 000012
2012518802.tif 000013
2012518802.tif 000014
2012518802.tif 000015
2012518802.tif 000016
2012518802.tif 000017