【手続補正書】
【提出日】平成21年1月14日(2009.1.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ) 固相上の複数の同一機能性反応性構造ＲＳｓｐ；および
ｂ) 親和性反応物１１上の反応性構造ＲＳａｒ１；
{ここで、ＲＳｓｐおよびＲＳａｒ１が、相互に反応して、親和性反応物１１を固相に固定化する結合構造を形成する}
を含む反応性構造の固定化ペアの使用によって、親和性反応物１１が固定化されている固相がその中に存在する反応キャビティーを含む流路であって、当該固相が、ＲＳｓｐから誘導されるが当該固相に親和性反応物１１を固定化しない複数の構造を含むことを特徴とする流路。
【請求項２】
反応性構造ＲＳｓｐおよびＲＳａｒ１の固定化ペアが、ビオチン結合化合物(例えばストレプトアビジン、アビジン、ニュートラアビジンおよび抗ビオチン抗体)、およびビオチン化親和性反応物(逆でも可)から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の流路。
【請求項３】
親和性反応物１１に結合しない複数の構造が、
ａ) １個以上のさらなる親和性反応物１２、１３・・・１ｎ(ここで、ｎは≧１の整数である)に結合している第１の部分；および／または
ｂ) ナンセンス基に結合している第２の部分；および／または
ｃ) ＲＳｓｐと同一である第３の部分；
を含むことを特徴とする、請求項１〜２の何れか１項に記載の流路。
【請求項４】
親和性反応物１１、１２、１３・・・１ｎを固定化する結合構造の量と、
親和性反応物１１、１２、１３・・・１ｎを固定化する結合構造の量、ナンセンス基に対する結合構造の量およびＲＳｓｐの量の総計
のモル比
が≧０.０１および／または≦０.９９の範囲であることを特徴とする、請求項１〜３の何れか１項に記載の流路。
【請求項５】
それが微小流体デバイスのマイクロチャネル構造であることを特徴とする、請求項１〜４の何れか１項に記載の流路。
【請求項６】
微小流体デバイスが、該複数のマイクロチャネル構造の少なくとも２個、３個もしくはそれ以上において、例えばｎ＝１を有する、複数の該マイクロチャネル構造を含むことを特徴とする、請求項５に記載の流路。
【請求項７】
親和性反応物１１、１２・・・１ｎ(ここで、ｎは≧１の整数である)の組み合わせが、該複数のマイクロチャネル構造の少なくとも２個(例えば該少なくとも２個のマイクロチャネル構造のそれぞれにおいて親和性反応物１１を有する)において、異なっているかもしくは同一であり、そして該少なくとも２個のマイクロチャネル構造の少なくとも１個、２個もしくはそれ以上において、典型的にｎ＝１、２、もしくは３を有することを特徴とする、請求項６に記載の流路。
【請求項８】
該複数のマイクロチャネル構造の１個、２個もしくはそれ以上の該比が同一であるが、該複数のマイクロチャネル構造の残りの１つの対応する比と比較して異なっていることを特徴とする、請求項４と組み合わせた請求項６〜７の何れか１項に記載の流路。
【請求項９】
反応キャビティーが、固相と同一であるかもしくは異なっているおよび／または固相毎に１、２、３もしくはそれ以上である整数ｎを有する、親和性反応物１１、１２・・・１ｎの数および／または組み合わせに関して異なっている、２個もしくはそれ以上の反応キャビティー／固相を含むより大きいチャンバーの一部であることを特徴とする、請求項１〜８の何れか１項に記載の流路。
【請求項１０】
親和性反応物１を含む隣り合った固相のペアの間にダミーの固相が存在することを特徴とする、請求項９に記載の流路。
【請求項１１】
親和性反応物１１、１２・・・１ｎ(ここで、ｎは≧１の整数である)が、
ａ) 抗原／ハプテン、
ｂ) 抗体およびその抗原／ハプテン結合フラグメントの抗原／ハプテン結合能を模倣する親和性反応物を含む、抗体またはその抗原／ハプテン結合フラグメント、
ｃ) 一重鎖および二重鎖の形態を含む核酸、およびポリヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチド、および核酸の模倣物、ならびに
ｄ) 触媒系、例えば酵素系のような生体触媒系の構成成分、
から選択されることを特徴とする、請求項１〜１０の何れか１項に記載の流路。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
本発明
我々は、阻害条件下で、ＲＳｓｐ構造を提示する固相と、ＲＳａｒ１を提示する親和性反応物の間で反応を行うことによって、上記の目的が達成されることを確認した。この結果は極めて好ましいものであって、固相を通過させた溶液から溶質を捕捉するのに用いられ得る多目的な固相が得られた。この文脈における「阻害」は、固定化されるべき親和性反応物のＲＳａｒ１との反応を阻害する反応物の存在下で、固定化反応が行われること、すなわち阻害反応物もまた、構造ＲＳａｒ１を提示するが、将来親和性反応物が関与すべき反応(すなわち固定化された親和性反応物とその溶解したカウンターパートとの反応)に関して無関係であることを意味する。阻害条件の使用により、十分に規制された量および密度の固定化された親和性反応物を有する流路のセットを得ることが簡単となる。固定化結合は簡単に形成される。固相上に親和性反応物を導入する革新的な方法を実施することによって、顧客は、例えば望ましい種類、キャパシティー、密度などの特定の要請に適合した親和性反応物を、容易に導入することができる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
本発明の第１の態様は、
ａ) 固相上の複数の同一の反応性構造ＲＳｓｐ、および
ｂ) 親和性反応物１上の構造ＲＳａｒ１、
{ここで、ＲＳｓｐおよびＲＳａｒ１は、親和性反応物１を固相に固定化している結合構造(リンカー)が、お互いに反応した結果として形成されるという意味で、相互に反応性である}
を含む、相互に反応性構造(ＲＳｓｐおよびＲＳａｒ１)の固定化ペアを用いることによって、親和性反応物１が固定化されている固相が存在する、反応キャビティーを含む流路である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
親和性反応物１１、１２、１３・・・１ｎを固定化する結合構造の量と、親和性構造１１、１２、１３・・・１ｎを固定化する結合構造の量、ナンセンス基に対する結合構造の量および影響されていないＲＳｓｐの量の総計の間のモル比は、≧０.０１、例えば≧０.１０、もしくは≧０.２０、もしくは≧０.４０、もしくは≧０.５０、もしくは≧０.６０、もしくは≧０.７０、および／または≦０.９９、例えば≦０.９０、もしくは≦０.８０、もしくは≦０.７０、もしくは≦０.６０、もしくは≦０.５０、もしくは≦０.４０、もしくは≦０.３０の範囲である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
親和性反応物の固定化
阻害条件は、ＲＳｓｐ固相が、ＲＳａｒ１を提示する形態の親和性反応物１、ならびに、それぞれＲＳｓｐと反応性の構造ＲＳｎｓを提示する１個以上のナンセンス反応物を含む液体サンプルと接触させることを意味し、典型的にＲＳｓｐ基の量と比較して過剰量の反応物の両方と先に記載した結合を形成する。ＲＳｎｓは、典型的に、ＲＳｓｐと等価である。最終的な固相における親和性反応物１の実際の密度は、親和性反応物１とナンセンス反応物(複数を含む)の固定化反応の反応比に関係して決定される。この方法で、顧客が、望ましい固定化された親和性反応物の量および密度に関して、広範囲に異なる反応キャビティーを設計することが容易になる。バッチ形式で、または反応キャビティー中のＲＳｓｐ固相とフロー条件(flow conditions)下での反応で、反応を行ってもよい。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
ある態様においては、１個以上のさらなる親和性反応物(それぞれが、上記のＲＳａｒ１について記載したＲＳｓｐと反応し得る反応性構造ＲＳａｒを有する)を、平行して固相と反応させる。言い換えれば、用いられる液体は、第１溶質に親和性を有する親和性反応物１１、第２のアナライトに親和性を有する親和性反応物１２、第３のアナライトに親和性を有する親和性反応物１３、・・・親和性反応物１ｎまで(ここで、ｎは整数である)を含む。最も単純な場合において、これらのさらなる反応物についてのＲＳは、ＲＳａｒ１と同一である。最終的な固相は、複数の親和性反応物を含み、また、１個以上の固定化された親和性反応物と、これらの反応物に対する１個以上の溶解したカウンターパートの間で、同時に相互作用を行なわせることが望ましい場合に有用である。この種の固相／流路は、同一液体サンプル中の２以上のアナライト(多重化)をアッセイするのに有益である。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
共有結合のためには、ＲＳａｒ１基は、典型的に、求電子性基および求核性基から選択される。用いられ得る基の例は、アミノ基および置換もしくは非置換−ＮＨ２を含む他の基、カルボキシ基(−ＣＯＯＨ／−ＣＯＯ−)、ヒドロキシ基、チオール基、ジスルフィド基、カルボニル基(ケト、アルデヒド)、炭素−炭素二重結合および三重結合を含む基、ハロアルキル基であり、特に、これらの基の反応性の形態(活性化形態)、例えば反応性エステル、反応性アミドもしくはイミド、１個以上のカルボニルが直接結合しているアルケンおよびアルキン(α−β不飽和カルボニル)、カルボニル基が直接結合しているハロアルキル(α−ハロカルボニル)などである。フリーラジカル反応もまた、固相上の結合構造への共有結合導入に用いられ得る。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
“コンジュゲート”という用語は、主に、共有結合コンジュゲートを言い、例えば化学結合コンジュゲート、およびリコンビナントで得られるコンジュゲートを言い、典型的にリンカーを介して共有結合する少なくとも２個の部位を含む。リコンビナント・コンジュゲートにおいて、リンカーならびに少なくとも１個の部位は、ペプチド構造を有する。該用語はまた、いわゆるネイティブ・コンジュゲート、すなわち、それぞれが互いに離れて位置する、２つの異なる分子に対して指向する親和性を有する２つの結合部位を示す親和性反応物を含む。従って、ネイティブ・コンジュゲートは、異なる物理的に別個の抗原決定子を有する抗原、ならびに分子の一部に種および／もしくはクラス特異的決定子を含み、かつ別の部分に抗原／ハプテン結合部位を含む抗体を含む。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
ＲＳａｒ１との反応における固相のキャパシティーは、単位体積当たりのmolで、固定化によって起こる結合部位のブロックおよび破壊に無関係なＲＳｓｐの量として測定され得る。この測定に伴い、適当な結合キャパシティーは、典型的には、液体で飽和されたベッド形態の固相ｎｌ当たり、０.００１〜３０００pmolの、例えば０.０１〜３００pmolの範囲内である。例えば、０.１pmol/nLのストレプトアビジンが固定化される場合、これは、０.４pmol/nLのビオチン結合部位に相当する。変換因子４は、ストレプトアビジン１分子当たり４個のビオチン結合部位を有するためである。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
結合キャパシティーはまた、ＲＳａｒ１の実際の結合キャパシティー、すなわち、ＲＳｓｐを含む固相(ベッド形態, 水などの液体で飽和)の単位容積当たりの活性なＲＳａｒ１結合構造のモル数として測定され得る。この種の結合キャパシティーは、固定化方法、固相の孔のサイズ、固定化されるものの大きさ、固相の物質および設計などに依存する。理想的には、結合部位の総量と同様の数値が、実際の結合キャパシティーに適用される(上記で定義した通り)。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
実際の結合キャパシティーの測定は、当分野に周知の原理に従って行われ得る。このことは、典型的には、固相のＲＳｓｐをＲＳａｒ１を含む過剰の試薬で飽和し、その後、ＲＳｓｐに結合した量を、例えば固相上で直接、または溶出後に測定することを意味する。測定を容易にするために、試薬のラベルされた形態を、例えばＲＳａｒ１を含むラベルされた試薬およびラベルされていない試薬の混合物の使用によって使用してもよい。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
特定の使用のための、結合キャパシティーの最適範囲(ＲＳａｒ１について)は、多くの因子に依存する。該因子は、例えば固定化ペア、例えば用いられる固定化親和性ペア、固相の種類(例えば多孔性およびその基礎物質)、固定化親和性ペアを用いるならばコンジュゲートの大きさなどである。該使用が分析アッセイ、分取方法、合成などであれば、この種の使用も含む。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
本発明による微小流体デバイスの典型的な形態は、複数の流路(マイクロチャネル構造)を含み、かつ、少なくとも下記Ａ〜Ｅの一つの特徴を含む：
Ａ) 整数ｎは、少なくとも１であり、２、３もしくはそれ以上の複数のマイクロチャネル構造数である；
Ｂ) 固相は、ＲＳｓｐとＲＳｎｓとの反応から誘導されるリンカー構造を介して固定化された、上記のダミー基を含む；
Ｃ) 親和性反応物１１、１２・・・１ｎ(ここで、ｎは≧１の整数である)の組み合わせは、微小流体デバイス中の少なくとも２個のマイクロチャネル構造で、異なっているか、または同一である；これらの少なくとも２個のマイクロチャネル構造でそれぞれ、親和性反応物１１は、典型的には同一であり、少なくとも１個、２個もしくはそれ以上のうち少なくとも２個のマイクロチャネル構造において、整数ｎ＝１、２、もしくは３である；
Ｄ) １個、２個もしくはそれ以上の複数のマイクロチャネル構造において、上記のモル比は同一であるが、残りのマイクロチャネル構造のそれぞれの対応する比とは、異なっている；
Ｅ) 反応キャビティーは、親和性反応物１１、１２・・・１ｎ(典型的には、整数ｎが、固相間で同一であるかまたは異なっており、かつ／またはそれぞれの固相で１、２、３もしくはそれ以上である)の数および／または組み合わせに関して異なっている、２個もしくはそれ以上の反応キャビティー／固相を含む、より大きなチャンバーの一部である。
望ましい態様において、親和性反応物１１、１２・・・１ｎを含む隣り合った固相のペアの間にダミーの固相がある。異なる固相は、互いに積層されている。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
固相の基礎物質は、無機物質および／または有機物質から製造されてもよい。典型的な無機物質は、ガラスを含む。典型的な有機物質は、有機ポリマーを含む。ポリマー物質は、無機ポリマー、例えばガラスおよびシリコンゴム、ならびに合成ポリマーもしくは生物由来のポリマー(生体高分子)といった有機ポリマーを含む。“生体高分子”という用語は、天然の生体高分子から誘導されるポリマー骨格を有する半合成ポリマーを含む。適切な合成有機ポリマーは、典型的には、架橋されており、しばしば重合可能な炭素−炭素二重結合を含むモノマーの重合によって得られる。適当なモノマーの例は、ヒドロキシアルキル アクリレート、例えば２−ヒドロキシアルキル アクリレート、および対応するメタクリレート類、アクリルアミド類、およびメタクリルアミド類、ビニルおよびスチリル エーテル、アルケン置換ポリヒドロキシポリマー、スチレンなどである。典型的には、生体高分子は、多くの場合で、炭水化物構造を示し、例えば寒天、デキストラン、澱粉などである。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
親和性反応物の固定化の際の流動条件
ＲＳａｒ１を示す親和性反応物は、親和性反応物が存在する液体が、連続フロー条件下もしくは交流フローおよび静止条件下、反応キャビティー／固相を通過する際に、固相上のＲＳｓｐに提示される。用いられる流速は、反応のために非拡散制限条件を提供し得るものであるが、拡散制限条件も使用し得る。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
多孔性ベッドを通る適切な流速は、下記の幾つかの因子に依存し得る：
ａ) 固定化されるべき親和性反応物；
ｂ) 反応キャビティーの大きさ(容積、長さなど)；
ｃ) 固相の種類(固相物質、多孔性、ベッドもしくはコートされた内壁など)；および
ｄ) その他。
典型的には、反応キャビティーを通る輸送条件は、ＲＳａｒ１親和性反応物を含む液体アリコートについて、≧０.０１０秒、例えば≧０.０５０秒、もしくは≧０.１秒の滞留時間であるべきである。反応キャビティー／固相中のアリコートの滞留時間の上限は、典型的には、２時間以下、例えば１時間以下である。流速の例は、０.００１〜１０,０００ｎｌ／秒、例えば０.０１〜１,０００ｎｌ／秒、もしくは０.０１〜１００ｎＬ／秒、もしくは０.１〜１０ｎＬ／秒の範囲である。これらの流速の範囲は、主に、１〜１,０００ｎＬ、例えば１〜２００ｎＬ、もしくは１〜５０ｎＬ、もしくは１〜２５ｎＬの範囲の固相容積において、有用であり得る。滞留時間は、液体アリコートが反応キャビティー中の固相を通過するのにかかる時間を言う。典型的には、最適化は、それぞれの特定の系で実験による試験を必要とする。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
微小流体デバイス
微小流体デバイスは、μＬ範囲の、典型的にナノリットル(ｎＬ)範囲の容積を有し、かつ、種々の反応物、例えばアナライト、試薬、生成物、サンプル、および／または緩衝物質などを含む１つ以上の液体アリコート／サンプル、例えば液体サンプル１および／または２が処理される、１個、２個もしはそれ以上のマイクロチャネル構造(１０１ａ〜ｈ)を含むデバイスである。それぞれのマイクロチャネル構造(１０１ａ〜ｈ)は、微小流体デバイス内で行われる革新的なアッセイの工程を行うために必要な全ての機能性部分を含む。μＬ範囲は、≦１,０００μＬ、例えば≦１００μＬ、もしくは≦１０μＬの容積を意図し、５,０００ｎＬの上限を有するｎＬ範囲を含むが、ほとんどの場合で、≦１,０００ｎＬ、例えば≦５００ｎＬ、もしくは≦１００ｎＬの容積に関する。ｎＬ範囲は、ピコリットル(ｐＬ)範囲を含む。マイクロチャネル構造は、≦１０３μｍ、好ましくは、≦５×１０２μｍ、例えば≦１０２μｍである断面積を有する、１個以上のキャビティーおよび／または導管を含む。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
有利な形態において、親水性多孔性ベッドとしての微小反応キャビティー(１０４ａ〜ｈ)は、１個以上の入口装備(上流方向)(１０２，１０３ａ〜ｈ)に連通しており、該入口装備はそれぞれ、入口ポート(１０５ａ〜ｂ，１０７ａ〜ｈ)および少なくとも１個の容量測定ユニット(１０６ａ〜ｈ，１０８ａ〜ｈ)を含む。他の有利な入口装備(１０３ａ〜ｈ)の態様は、固相物質を含むことが意図された１個のマイクロチャネル構造(１０１ａ〜ｈ)および／または微小反応キャビティー(１０４ａ〜ｈ)にのみ連通している。別の有益な入口装置(１０２)は、固相物質を含むことが意図されたマイクロチャネル構造(１０１ａ〜ｈ)および／または微小反応キャビティー(１０４ａ〜ｈ)の全てもしくはサブセット(１００)で共通している。後者の態様は、共通の入口ポート(１０５ａ〜ｂ)、ならびに、それぞれのマイクロチャネル構造／微小反応キャビティー(１０１ａ〜ｈ／１０４ａ〜ｈ)のサブセット(１００)について１つの容量測定ユニット(１０６ａ〜ｈ)を有する分配多岐流路を含む。両者の態様において、それぞれの容量測定ユニット(１０６ａ〜ｈ，１０８ａ〜ｈ)は、順に、そのマイクロチャネル構造(１０１ａ〜ｈ)の下流部分、例えば微小反応キャビティー(１０４ａ〜ｈ)と通じている。共通の入口装備(１０２)および／または共通の分配多岐流路と連結しているマイクロチャネル構造は、マイクロチャネル構造のグループもしくはサブセット(１００)を定義する。それぞれの容量測定ユニット(１０６ａ〜ｈ,１０８ａ〜ｈ)は、典型的に、その出口末端にバルブ(１０９ａ〜ｈ，１１０ａ〜ｈ)を有する。このバルブは、典型的には、例えば出口末端での化学的表面特性における変化、例えば親水性表面と疎水性表面の間の境界(疎水性表面による継ぎ目)(WO 99 058245、WO 2004 103890、WO 2004 103891 および US SN 10/849,321 (Amersham Pharmacia Biotech AB and Gyros AB))、および／または幾何学的／物理学的表面特性(WO 98 007019 (Gamera))における変化を利用した、受動性のものである。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
本発明で用いられる親和性反応物は、典型的には、
ａ) タンパク質構造、例えば、ペプチド構造(例えばポリペプチドおよびオリゴペプチド構造)を含むアミノ酸構造、これらの構造の模倣物および化学修飾された形態などを含む；
ｂ) 炭水化物構造、これらの構造の模倣物および化学修飾された形態などを含む；
ｃ)ヌクレオチド構造、核酸構造、これらのヌクレオチド構造の模倣物および化学修飾された形態などを含む；
ｄ) 脂質構造、例えばステロイド構造、トリグリセリド構造など、これらの構造の模倣物および化学修飾された形態を含む；
ｅ) 他の有機もしくは生物有機構造；
から選択される１個以上の構造を示す。また、多くの他の構造および物質も、用いられる親和性反応物中に存在してもよい。このような他の構造および物質は、感染物(バクテリア、藻類、真菌、ウイルス、プリオン、カビ、寄生生物など)のハプテン／抗原構造、薬物、自己抗原、アレルゲン、診断目的または抗原特異的抗体試薬もしくは薬物の製造のために用いられる体液の免疫応答を刺激し得る合成もしくは天然免疫原が例示され得る。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
実験の部
アッセイ方法
本発明は２つのモデル系で調べた：
ａ) アナライトとして抗ＰＰＶ抗体、および親和性反応物１としてＰＰＶが結合した固相(抗原および親和性反応物２(抗原)として標識されたＰＰＶ)、および
ｂ) アナライトとして抗ＩｇＧモノクローナル抗体、親和性反応物１(抗原)としてＩｇＧが結合した固相、および検出可能な親和性反応物２(抗原)として標識されたＩｇＧ。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
固定化したビオチン化反応物のタイトレーション(固定化ＰＰＶ＝親和性反応物１)
ＰＰＶを検出可能な方法で抗体に結合させるために、ビオチン化ＰＰＶをビオチン化ウシ血清アルブミンと共に固相に固定化した。濃度の適当な組み合わせは、抗体が、ビオチン化した試薬と標識した試薬の両方に結合することができるように、すなわち２個の抗原調製物を“ブリッジング”するように定められなければならない。慣用の抗体アッセイにおいて、この測定は、カラムが抗原で飽和されている限りは必要ではない。しかし、本発明によるアッセイにおいて、抗体が固定化された抗原(親和性反応物１)に両方の腕で結合することは、そのことが検出抗原(親和性反応物Ｔ)に結合することを妨げるために、許容されていない。他方、応答を発生させるためには固相に固定化された抗原(親和性反応物１)が十分量でなければならず、そうでなければ該アッセイは使用できない。抗原と抗体の間の反応平衡が一方に偏向しすぎていれば、理論上シグナルを得ることは不可能である。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６９】
より詳細には、このタイトレーションを検定するために、試験者ダイアグラム(使用装置におけるソフトウェア・プログラム)を比較して評価した。カラム上のＰＰＶが多いほどシグナルが強く出ること、カラムの頂点のアナライトが多くなることが観察された。応答の絶対値は、１／６４ビオチン化ＢＳＡに対して１／８０の希釈でターニングポイントを示した。より多くのビオチン化ＢＳＡがピークにより広いベースを与え、プロファイルは崩れることが示された。カラムの頂点でピークを有するカラムのプロファイルは、可能な限り多くのシグナルをアルゴリズムで積算することが望ましかった。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７０】
ＢＳＡおよびＰＰＶの間の比は、約１.５７であるべきであると結論付けられた。試薬の節約のために、選択した希釈液は、ＰＰＶについては１／１００、そしてＢＳＡについては１／６４であり、それを１：１で混合した。これは、後にＰＰＶについて１／８０、そしてＢＳＡ調製物について１／５１に修飾した。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７１】
フルオロフォア標識ＰＰＶ(親和性反応物２)のタイトレーション
フルオロフォア標識反応物の最適濃度はまた、３個の異なる希釈液、すなわち１％ ＢＳＡを含むＰＢＳ中、１／１０、１／２０、および１／４０において、フルオロフォア標識ＰＰＶのストック溶液を用いることによって試験した。ウサギ抗ＰＰＶ血清を順に希釈し、全てのタイトレーションのためのデータポイントを作成するための対照サンプルとして用いた。希釈液１／４０が最もバックグラウンドが低いことが分かった。従ってこの希釈液を用いた。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７２】
性能
精度：マウスの血清を１％ ＢＳＡを含むＰＢＳで１２５倍に希釈し、そして１２回繰り返し吸引してアッセイした。偏差係数(ＣＶ)は１.８９％であった。
測定範囲：図２に示されている。
再現性：図３に示されている。
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７３】
サンプル希釈
血清サンプルの可能な希釈因子を評価するために、低力価(low titers)の抗ＰＰＶを有する２匹のマウス、中間力価の抗ＰＰＶ有する２匹のマウス、および高力価の抗ＰＰＶ有する２匹のマウスが選択された。全てのサンプルを免疫処置の２週後に採取した。サンプルを１／２、１／４、１／８、１／１６および１／３２として希釈し、３回行った。何れの技術上の問題点もなく、サンプルを異なる希釈液で分析した。最小希釈のサンプルを、全てのマウスで測定することができ、かつバックグラウンド・シグナルから区別できた。
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７４】
ゲル濾過
ブリッジングアッセイが免疫グロブリンのクラスに依存しないことを明らかにするために、ゲル濾過試験を行った。ＰＰＶ免疫処置中に５匹のマウスから２回血清を取り、１００μｌを集めた：ａ) ＩｇＭが期待され得る免疫処置後２週(2vI)；およびｂ) 多くの場合でＩｇＧが存在するブースター後５週(5vII)。最初にカラムを milliQ 水で３回洗浄し、次に脱気したＰＢＳで２回平衡化し、その後血清サンプルを注入することによって、集積液を個別に Superdex(商標)(AEKTA FPLC(登録商標))のクロマトグラフィーにかけた。フラクションをマイクロタイター・ウェルに集めた。検出範囲内の各２番目のフラクションを、Bioaffy(登録商標) CD microlaboratory で本発明のアッセイ方法で試験した。
【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７５】
免疫処置後２週で得られた集積液について、２個の異なるピークで活性が示された。より低い活性ピークは、ボイド容量付近であるが、より高い活性ピークはアルブミン保持容量に近かった。従って、アナライトの分子サイズは広く変化し、そしてＰＰＶ特異的ＩｇＭが低い活性ピークに寄与し、ＰＰＶ特異的ＩｇＧが高い活性ピークに寄与すると思われる。ブースター後５週で採取したサンプルにおいて、活性ピークは１つしか見られなかった。このピークは、ＩｇＧと予測されるクロマトグラムの領域に位置付けられた。
【手続補正２９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７６】
未知のサンプルの定量
ＰＰＶで免疫処置中のマウス由来の総量２３４の血清を、１／２５の通常の希釈で３回試験した。この希釈では、飽和させたカラムで分かった高抗ＰＰＶ抗体力価を有するサンプルには、不十分であることが明らかとなった。飽和カラムを示すサンプルは、さらに希釈したもので再試験を行った。
【手続補正３０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８２】
ストレプトアビジンのカラムのタンパク質による飽和を確実にするために、そして非特異的相互作用を避けるために、１／１６ ＢＳＡ希釈液を最も希釈したビオチン化ＩｇＧと共に用いた。モノクローナル抗ｈＩｇＧ抗体を(アナライト)、５０００ng/mLから８ng/mLまでの範囲の濃度で別個に行い、５個のデータポイントで曲線を引いた。検出は、６９nM フルオロフォア標識ｈＩｇＧで行った。