(57)【要約】  本発明は、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片に関する。より具体的には、本発明は、配列番号２７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１及び／又は配列番号２８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２及び／又は配列番号２９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３；及び／又は配列番号３０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１及び／又は配列番号３１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２及び／又は配列番号３２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、を有するヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片に関する。【選択図】なし
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１及び／又は配列番号２８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２及び／又は配列番号２９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３；及び／又は配列番号３０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１及び／又は配列番号３１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２及び／又は配列番号３２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、を有するヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片。
【請求項２】
前記ヒト化抗体又はその断片が、配列番号２７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号２８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２及び配列番号２９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を有する、請求項１に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項３】
前記ヒト化抗体又はその断片が、配列番号３０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号３２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を有する、請求項１に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項４】
前記ヒト化抗体又はその断片が、配列番号２７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号２８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２及び配列番号２９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を有し、かつ、配列番号３０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号３２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を有する、請求項１に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項５】
前記ヒト化抗体又はその断片が、配列番号１９、２０、２１、２２及び４２からなる群から選択される重鎖可変領域配列を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項６】
前記ヒト化抗体又はその断片が、配列番号１９、２０、２１、２２又は４２のフレームワーク領域配列と少なくとも８０％の相同性を有する重鎖可変フレームワーク領域配列を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項７】
前記ヒト化抗体又はその断片が、配列番号２１の重鎖可変領域配列を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項８】
前記ヒト化抗体又はその断片が、配列番号２１のフレームワーク領域配列と少なくとも８０％の相同性を有する重鎖可変フレームワーク領域配列を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項９】
前記ヒト化抗体又はその断片が、Ｖ３−３３＊０１（配列番号１１）、Ｖ３−１１＊０１（配列番号１２）、Ｖ３−３０＊−１８（配列番号１３）及びＶ３−４８＊０１（配列番号１４）からなる群から選択されるヒト遺伝子の産物であるか、又は、当該ヒト遺伝子に由来する重鎖可変フレームワーク領域を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項１０】
前記ヒト化抗体又はその断片の重鎖ＣＤＲの少なくとも１つが、少なくとも１つのアミノ酸改変を有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項１１】
前記アミノ酸改変が、カバットによる付番体系を用いて示されるアミノ酸位置において、重鎖ＣＤＲ１におけるアミノ酸置換Ｙ３２Ｆを有する、請求項１０に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項１２】
前記アミノ酸改変が、カバットによる付番体系を用いて示されるアミノ酸位置において、重鎖ＣＤＲ２におけるアミノ酸置換Ｙ５８Ｆ又はＹ５９Ｆを有する、請求項１０に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項１３】
前記アミノ酸改変が、カバットによる付番体系を用いて示されるアミノ酸位置において、Ｙ９６Ｆ、Ｙ９７Ｆ、Ｙ９８Ｆ及びＹ１００ＢＦからなる群から選ばれる１つ又はそれ以上の重鎖ＣＤＲ３におけるアミノ酸改変を有する、請求項１０に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項１４】
前記ヒト化抗体又はその断片の重鎖可変領域のフレームワーク領域の少なくとも１つが、対応マウス抗体の重鎖可変領域の対応するフレームワーク領域からの、少なくとも１つのアミノ酸改変を有する、請求項５〜１３のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項１５】
前記アミノ酸改変が、カバットによる付番体系を用いて示されるアミノ酸位置において、３７、４２、４８、４９、６７、７１、７８及び９４からなる群から選択されるアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を有する、請求項１４に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項１６】
前記アミノ酸改変が、カバットによる付番体系を用いて示されるアミノ酸位置において、４２、６７、７１、７８及び９４からなる群から選択されるアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を有する、請求項１４に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項１７】
前記アミノ酸改変が、カバットによる付番体系を用いて示されるアミノ酸位置において、Ｇ４２Ｒ、Ｆ６７Ｌ、Ｒ７１Ｋ、Ｌ７８Ｖ及びＲ９４Ｋからなる群から選択されるアミノ酸置換を有するが、ただし前記アミノ酸改変がＲ９４Ｋである場合は、前記重鎖可変領域配列が配列番号１９又は２０ではないことを条件とする、請求項１４に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項１８】
前記ヒト化抗体又はその断片が、配列番号２３、２４、２５、２６及び４１からなる群から選択される軽鎖可変領域配列を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項１９】
前記ヒト化抗体又はその断片が、配列番号２３、２４、２５、２６及び４１のフレームワーク領域配列と少なくとも８０％の相同性を有する軽鎖可変フレームワーク領域配列を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項２０】
前記ヒト化抗体又はその断片が、配列番号４１の軽鎖可変領域配列を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項２１】
前記ヒト化抗体又はその断片が、配列番号４１のフレームワーク領域配列と少なくとも８０％の相同性を有する軽鎖可変フレームワーク領域配列を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項２２】
前記ヒト化抗体又はその断片が、Ｖ１−５＊０３（配列番号３）、Ｖ１−２７＊０１（配列番号４）、Ｖ１−３９＊−０１（配列番号５）及びＶ１−１２＊０１（配列番号６）からなる群から選択されるヒト遺伝子の産物であるか、又は当該ヒト遺伝子に由来する軽鎖可変フレームワーク領域を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項２３】
前記ヒト化抗体又はその断片の軽鎖ＣＤＲの少なくとも１つが、少なくとも１つのアミノ酸改変を有する、請求項１〜４又は１８〜２２のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項２４】
前記アミノ酸改変が、カバットによる付番体系を用いて示されるアミノ酸位置において、軽鎖ＣＤＲ１におけるアミノ酸置換Ｙ３２Ｆを有する、請求項２３に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項２５】
前記アミノ酸改変は、カバットによる付番体系を用いて示されるアミノ酸位置において、軽鎖ＣＤＲ３におけるＮ９２Ａ、Ｔ９３Ａ及びＴ９３Ｖから選択される群から選択されるアミノ酸置換を有する、請求項２３に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項２６】
前記ヒト化抗体又はその断片の軽鎖可変領域の少なくとも１つのフレームワーク領域が、対応マウス抗体の軽鎖可変領域の対応するフレームワーク領域からの、少なくとも１つのアミノ酸改変を有する、請求項１８〜２５のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項２７】
前記アミノ酸改変が、カバットによる付番体系を用いて示されるアミノ酸位置において、４４、７１及び８７からなる群から選択されるアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を有する、請求項２６に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項２８】
前記アミノ酸改変が、カバットによる付番体系を用いて示されるアミノ酸位置において、Ｐ４４Ｖ、Ｐ４４Ｉ、Ｐ４４Ｌ、Ｆ７１Ｙ、Ｆ７１Ｈ、Ｆ７１Ｓ、Ｆ７１Ｔ及びＹ８７Ｆからなる群から選択されるアミノ酸置換を有する、請求項２６に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項２９】
前記アミノ酸改変が、カバットによる付番体系を用いて示されるアミノ酸位置において、Ｐ４４Ｖ、Ｐ４４Ｉ、Ｆ７１Ｙ及びＹ８７Ｆからなる群から選択されるアミノ酸置換を有する、請求項２６に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項３０】
前記ヒト化抗体又はその断片が、
（ａ）配列番号１９、２０、２１、２２及び４２からなる群から選択される重鎖可変領域配列と、
（ｂ）配列番号２３、２４、２５、２６及び４１からなる群から選択される軽鎖可変領域配列とを有する、請求項４に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項３１】
前記ヒト化抗体又はその断片が、
（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域配列と、
（ｂ）配列番号４１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域配列とを有する、請求項４に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項３２】
前記ヒト化抗体又はその断片が、配列番号３３、３４、３５、３６、３７、４３、４４、４５、４６、４７、５４及び５５からなる群から選ばれる重鎖可変領域を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項３３】
前記ヒト化抗体又はその断片が、配列番号２５、３８、３９、４０、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２及び６３からなる群から選択される軽鎖可変領域を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項３４】
前記ヒト化抗体又はその断片が、配列番号３７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号５９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する、請求項４に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項３５】
前記ヒト化抗体又はその断片が、配列番号４７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号６０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する、請求項４に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項３６】
前記ヒト化抗体又はその断片が、配列番号４７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号５９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する、請求項４に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項３７】
前記ヒト化抗体又はその断片が、配列番号３７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号２５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する、請求項４に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項３８】
前記ヒト化抗体又はその断片が、配列番号３７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号４９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する、請求項４に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項３９】
前記ヒト化抗体又はその断片が、配列番号４７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号４９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する、請求項４に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項４０】
前記ヒト化抗体又はその断片が、配列番号４３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号５９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する、請求項４に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項４１】
前記ヒト化抗体又はその断片が、
（ａ）配列番号６４のアミノ酸配列を有する重鎖配列と、
（ｂ）配列番号６５のアミノ酸配列を有する軽鎖配列とを有する、請求項４に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項４２】
前記ヒト化抗体又はその断片が、
（ａ）配列番号６６のアミノ酸配列を有する重鎖配列と、
（ｂ）配列番号６７のアミノ酸配列を有する軽鎖配列とを有する、請求項４に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項４３】
前記ヒト化抗体又はその断片が、
（ａ）配列番号６６のアミノ酸配列を有する重鎖配列と、
（ｂ）配列番号６５のアミノ酸配列を有する軽鎖配列とを有する、請求項４に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項４４】
ヒト重鎖及び／又は軽鎖定常領域をさらに有する、請求項１〜４０のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項４５】
前記ヒト重鎖定常領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＭ１、ＩｇＭ２、ＩｇＤ及びＩｇＥからなるヒト免疫グロブリンの群から選ばれる、請求項４４に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項４６】
前記ヒト重鎖定常領域がヒトＩｇＧである、請求項４４に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項４７】
前記ヒト重鎖定常領域がヒトＩｇＧ１である、請求項４４に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項４８】
前記重鎖定常領域が、ヒトＩｇＧ１由来のＣＨ１、ヒトＩｇＧ１由来のヒンジ及びヒトＩｇＧ３由来のＦｃ領域を有するアイソタイプ変異体を有する、請求項４４に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項４９】
（ａ）配列番号１２４のアミノ酸配列を有する重鎖配列と、
（ｂ）配列番号６５のアミノ酸配列を有する軽鎖配列とを有する、請求項４８に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項５０】
前記アイソタイプ変異体が、請求項４７に記載のヒト化抗体又はその断片と比較して向上した補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）を示す、請求項４８に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項５１】
前記ヒト軽鎖定常領域が、ヒトκ及びヒトλからなるヒト免疫グロブリンの群から選択される、請求項４４に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項５２】
前記ヒト軽鎖定常領域が、ヒトκである、請求項５１に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項５３】
前記抗体が全長抗体である、請求項１〜５２のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項５４】
前記抗体が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、２重特異性一本鎖Ｆｖ二量体、２重特異性抗体、３重特異性抗体、及び同一又は異なる抗体に遺伝子的に融合されたｓｃＦｖからなる群から選択される抗体断片である、請求項１〜５２のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項５５】
前記抗体が、親抗体のヒトＩｇＧのＦｃ領域と比べて少なくとも１つのアミノ酸改変を有するヒトＩｇＧの変異Ｆｃ領域を有するが、前記ヒトＩｇＧの変異Ｆｃ領域を有する抗体が、親細胞と比較して異なるエフェクター機能を示す、請求項１〜５３のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項５６】
前記エフェクター機能が、補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）及び／又は抗体依存性細胞媒介性細胞障害（ＡＤＣＣ）である、請求項５５に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項５７】
前記アミノ酸改変が、カバットによる付番体系を用いて示されるアミノ酸位置において、２６９、２７４、２７６、２９８、３２４及び３３４からなる群から選択されるアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を有する、請求項５５に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項５８】
前記アミノ酸改変が、カバットによる付番体系を用いて示されるアミノ酸位置において、Ｅ２６９Ｄ、Ｋ２７４Ｑ、Ｎ２７６Ｋ、Ｓ２９８Ａ、Ｓ３２４Ｎ及びＫ３３４Ｒからなる群から選択されるアミノ酸置換を有する、請求項５５に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項５９】
前記アミノ酸改変が、カバットによる付番体系を用いて示されるアミノ酸位置において、２６９／２７４、２６９／２７６、２６９／２９８、２６９／３２４、２６９／３３４、２７４／２７６、２７４／２９８、２７４／３２４、２７４／３３４、２７６／２９８、２７６／３２４、２７６／３３４、２９８／３２４、２９８／３３４、３２４／３３４、２６９／２７４／２７６、２６９／２７４／２９８、２６９／２７４／３２４、２６９／２７４／３３４、２６９／２７６／２９８、２６９／２７６／３２４、２６９／２７６／３３４、２６９／２９８／３２４、２６９／２９８／３３４、２７４／２７６／２９８、２７４／２７６／３２４、２７４／２７６／３３４、２７４／２９８／３２４、２７４／２９８／３３４、２７６／２９８／３２４及び２７６／２９８／３３４からなる群から選択されるアミノ酸位置におけるアミノ酸置換の組合せを有する、請求項５５に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項６０】
前記アミノ酸改変が、カバットによる付番体系を用いて示されるアミノ酸位置において、Ｅ２６９Ｄ／Ｋ２７４Ｑ、Ｅ２６９Ｄ／Ｎ２７６Ｋ、Ｅ２６９Ｄ／Ｓ２９８Ａ、Ｅ２６９Ｄ／Ｓ３２４Ｎ、Ｅ２６９Ｄ／Ｋ３３４Ｒ、Ｋ２７４Ｑ／Ｎ２７６Ｋ、Ｋ２７４Ｑ／Ｓ２９８Ａ、Ｋ２７４Ｑ／Ｓ３２４Ｎ、Ｋ２７４Ｑ／Ｋ３３４Ｒ、Ｎ２７６Ｋ／Ｓ２９８Ａ、Ｎ２７６Ｋ／Ｓ３２４Ｎ、Ｎ２７６Ｋ／Ｋ３３４Ｒ、Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎ、Ｓ２９８Ａ／Ｋ３３４Ｒ、Ｓ３２４Ｎ／Ｋ３３４Ｒ、Ｅ２６９Ｄ／Ｋ２７４Ｑ／Ｎ２７６Ｋ、Ｅ２６９Ｄ／Ｋ２７４Ｑ／Ｓ２９８Ａ、Ｅ２６９Ｄ／Ｋ２７４Ｑ／Ｓ３２４Ｎ、Ｅ２６９Ｄ／Ｋ２７４Ｑ／Ｋ３３４Ｒ、Ｅ２６９Ｄ／Ｎ２７６Ｋ／Ｓ２９８Ａ、Ｅ２６９Ｄ／Ｎ２７６Ｋ／Ｓ３２４Ｎ、Ｅ２６９Ｄ／Ｎ２７６Ｋ／Ｋ３３４Ｒ、Ｅ２６９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎ、Ｅ２６９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｋ３３４Ｒ、Ｋ２７４Ｑ／Ｎ２７６Ｋ／Ｓ２９８Ａ、Ｋ２７４Ｑ／Ｎ２７６Ｋ／Ｓ３２４Ｎ、Ｋ２７４Ｑ／Ｎ２７６Ｋ／Ｋ３３４Ｒ、Ｋ２７４Ｑ／Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎ、Ｋ２７４Ｑ／Ｓ２９８Ａ／Ｋ３３４Ｒ、Ｎ２７６Ｋ／Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎ及びＮ２７６Ｋ／Ｓ２９８Ａ／Ｋ３３４Ｒからなる群から選択されるアミノ酸置換の組合せを有する、請求項５５に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項６１】
前記ヒト化抗体又はその断片が、
（ａ）配列番号１１４のアミノ酸配列を有する重鎖配列と、
（ｂ）配列番号６５のアミノ酸配列を有する軽鎖配列とを有する、請求項５５に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項６２】
前記ヒト化抗体又はその断片が、
（ａ）配列番号１１５のアミノ酸配列を有する重鎖配列と、
（ｂ）配列番号６５のアミノ酸配列を有する軽鎖配列とを有する、請求項５５に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項６３】
前記ヒト化抗体又はその断片が、
（ａ）配列番号１１６のアミノ酸配列を有する重鎖配列と、
（ｂ）配列番号６５のアミノ酸配列を有する軽鎖配列とを有する、請求項５５に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項６４】
前記ヒト化抗体又はその断片が、
（ａ）配列番号１１７のアミノ酸配列を有する重鎖配列と、
（ｂ）配列番号６５のアミノ酸配列を有する軽鎖配列とを有する、請求項５５に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項６５】
前記ヒト化抗体又はその断片が、
（ａ）配列番号１１８のアミノ酸配列を有する重鎖配列と、
（ｂ）配列番号６５のアミノ酸配列を有する軽鎖配列とを有する、請求項５５に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項６６】
前記ヒト化抗体又はその断片が、
（ａ）配列番号１１９のアミノ酸配列を有する重鎖配列と、
（ｂ）配列番号６５のアミノ酸配列を有する軽鎖配列とを有する、請求項５５に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項６７】
前記ヒト化抗体又はその断片が、
（ａ）配列番号１２０のアミノ酸配列を有する重鎖配列と、
（ｂ）配列番号６５のアミノ酸配列を有する軽鎖配列とを有する、請求項５５に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項６８】
前記ヒト化抗体又はその断片が、
（ａ）配列番号１２１のアミノ酸配列を有する重鎖配列と、
（ｂ）配列番号６５のアミノ酸配列を有する軽鎖配列とを有する、請求項５５に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項６９】
前記ヒト化抗体又はその断片が、
（ａ）配列番号１２２のアミノ酸配列を有する重鎖配列と、
（ｂ）配列番号６５のアミノ酸配列を有する軽鎖配列とを有する、請求項５５に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項７０】
前記ヒト化抗体又はその断片が、
（ａ）配列番号１２３のアミノ酸配列を有する重鎖配列と、
（ｂ）配列番号６５のアミノ酸配列を有する軽鎖配列とを有する、請求項５５に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項７１】
前記ヒトＩｇＧのＦｃ領域に結合した成熟コア糖鎖構造がフコースを欠いている、請求項４６に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項７２】
ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片であって、前記抗体が、親抗体のアミノ酸位置３２４のセリンがアスパラギンに置き換えられたアミノ酸置換Ｓ３２４Ｎを有するヒトＩｇＧの変異Ｆｃ領域を有するが、前記ヒトＩｇＧの変異Ｆｃ領域を有する抗体が、親細胞と比較して向上した補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）を示す、前記ヒト化抗体又はその断片。
【請求項７３】
前記ヒト化抗体又はその断片が、対応キメラ抗体と比べて少なくとも１０％の中点蛍光（ＭＰＦ）でＲａｊｉ腫瘍細胞と結合する、請求項１〜７２のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項７４】
前記ヒト化抗体又はその断片が、５０ｎＭ以下の親和性（Ｋｄ）でヒトＣＤ１９に結合する、請求項１〜７２のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項７５】
前記ヒト化抗体又はその断片が、対応キメラ抗体のＣＤ１９結合親和性（Ｋｄ）の少なくとも２０％を保持する、請求項１〜７２のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項７６】
前記ヒト化抗体が、５０ｎＭ以下の親和性（Ｋｉ）でＲａｊｉ腫瘍細胞への結合に競合する、請求項１〜７２のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項７７】
前記ヒト化抗体又はその断片が、Ｒａｊｉ腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する、請求項１〜７２のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項７８】
アポトーシスが、Ｒａｊｉ腫瘍細胞の少なくとも１０％において誘導される、請求項７７に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項７９】
前記ヒト化抗体又はその断片が、Ｒａｊｉ腫瘍細胞におけるＡＤＣＣ活性を誘導する、請求項１〜７２のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項８０】
前記ヒト化抗体又はその断片が悪性Ｂ細胞の増殖を阻害する、請求項１〜７２のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項８１】
前記ヒト化抗体又はその断片が、対応キメラ抗体の悪性Ｂ細胞の増殖阻害能の少なくとも６０％を保持する、請求項８０に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項８２】
前記ヒト化抗体又はその断片が、Ｒａｊｉ腫瘍細胞のクローン形成能を阻害する、請求項１〜７２のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項８３】
前記ヒト化抗体又はその断片が、血中のＢ細胞枯渇を引き起こす、請求項１〜７２のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項８４】
引き起こされた前記Ｂ細胞枯渇が、対応するキメラ抗体により引き起こされるＢ細胞枯渇と少なくとも同一である、請求項８３に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項８５】
前記ヒト化抗体又はその断片がＲａｊｉ腫瘍細胞に取り込まれる、請求項１〜７２のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項８６】
前記ヒト化抗体が、６５℃を超えるＦＡＢ断片耐熱温度を有する、請求項１〜７２のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項８７】
前記ヒト化抗体のＦＡＢ断片耐熱温度が、親マウス抗体のＦＡＢ断片耐熱温度と同等である、請求項８６に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項８８】
請求項１〜７２のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその断片をコードする単離核酸。
【請求項８９】
微生物としてＤＳＭＺに寄託された受入番号ＤＳＭ２３３０２の、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化ＦＭＣ６３変異体の重鎖をコードする核酸配列を有する単離核酸。
【請求項９０】
微生物としてＤＳＭＺに寄託された受入番号ＤＳＭ２３３０３の、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化ＦＭＣ６３変異体の軽鎖をコードする核酸配列を有する単離核酸。
【請求項９１】
請求項８８に記載の単離核酸、又は請求項８９及び９０に記載の単離核酸を有するベクター。
【請求項９２】
請求項８８に記載の単離核酸、又は請求項８９及び９０に記載の単離核酸、又は請求項９１に記載のベクターを有する宿主細胞。
【請求項９３】
請求項９２に記載の宿主細胞を培養し、前記核酸を発現させて前記抗体を産生させることを含む、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片の製造方法。
【請求項９４】
請求項８９及び９０に記載の単離核酸にコードされた、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片。
【請求項９５】
請求項１〜７２のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその断片と、薬学的に許容しうる担体とを含む組成物。
【請求項９６】
治療薬に結合した請求項１〜７２のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその断片を有する、免疫複合体。
【請求項９７】
請求項９６に記載の免疫複合体と、薬学的に許容しうる担体とを含む組成物。
【請求項９８】
ＣＤ１９を発現する腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、前記腫瘍細胞の増殖を阻害するのに有効な量の請求項１〜７２のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその断片を前記細胞に接触させることを含む当該方法。
【請求項９９】
前記腫瘍細胞が、ヒトバーキットリンパ腫細胞、ヒト前駆Ｂ細胞白血病細胞、ヒトＢ細胞白血病細胞又はヒトＢ細胞リンパ腫細胞からなる群から選択される、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
対象においてＢ細胞を枯渇させる方法であって、前記対象からＢ細胞を枯渇させるのに有効な量の請求項１〜７２のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその断片を前記対象に投与することを含む当該方法。
【請求項１０１】
対象におけるＣＤ１９介在型障害を治療する方法であって、治療有効量の請求項１〜７２のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその断片を前記対象に投与することを含む当該方法。
【請求項１０２】
前記ＣＤ１９介在型障害が、関節リウマチを含む自己免疫疾患、がん、非ホジキンリンパ腫、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、有毛細胞白血病、バーキットリンパ腫、未文化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、小結節非正円形細胞リンパ腫、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、レンネルトリンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）、成人Ｔ細胞白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、中心芽細胞性／中心細胞性（ｃｂ／ｃｃ）濾胞性リンパ腫がん、Ｂ型びまん性大細胞型リンパ腫、血管免疫芽球性リンパ節症（ＡＩＬＤ）様Ｔ細胞リンパ腫、ＨＩＶ随伴型体腔型リンパ腫、胚性がん腫、鼻咽腔未分化がん（例えば、シュミンケ腫瘍）、キャッスルマン病、カポジ肉腫、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、抗ＣＤ２０抗体抵抗性Ｂ細胞がん、並びに他のＢ細胞リンパ腫及び白血病からなる群から選択される、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記ＣＤ１９介在型障害が、非ホジキンリンパ腫、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、有毛細胞白血病、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、及び抗ＣＤ２０抗体抵抗性Ｂ細胞がんからなる群から選択される、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０４】
前記ＣＤ１９介在型障害が腫瘍原性の障害である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０５】
請求項１〜７２のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその断片の医薬品としての使用。
【請求項１０６】
ＣＤ１９介在型障害の治療薬の製造における請求項１〜７２のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその断片の使用。
【請求項１０７】
医薬として使用するための、請求項１〜７２のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項１０８】
ＣＤ１９介在型障害の治療法における使用のための、請求項１〜７２のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項１０９】
ＣＤ１９介在型障害の治療のための、請求項１〜７２のいずれか１項に記載のヒト化抗体若しくはその断片、請求項９５若しくは９７に記載の組成物、又は請求項９６に記載の免疫複合体を含む製品。
【請求項１１０】
ＣＤ１９介在型障害の治療のための、請求項１〜７２のいずれか１項に記載のヒト化抗体若しくはその断片、請求項９５若しくは９７に記載の組成物、又は請求項９６に記載の免疫複合体を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体及びその断片に関する。より具体的には、本発明は、配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．）２７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１及び／又は配列番号２８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２及び／又は配列番号２９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３；及び／又は配列番号３０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１及び／又は配列番号３１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２及び／又は配列番号３２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を有する、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体及びその断片に関する。
【背景技術】
【０００２】
［発明の背景］
Ｂ細胞障害又は疾患、自己免疫疾患及び移植拒絶反応を治療するための標的として、Ｂ細胞表面マーカーが広く提案されている。Ｂ細胞表面マーカーの例としては、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ７２、ＣＤ７４、ＣＤ７５、ＣＤ７７、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤ８４、ＣＤ８５及びＣＤ８６などの白血球表面マーカーが挙げられる。これらのマーカーのうちの特定のものに特異的に結合する抗体が開発されており、中には疾患及び障害の治療用として試験されているものもある。
【０００３】
例えば、成熟Ｂ細胞及びその悪性物に特異的な細胞表面分子であるＣＤ２０を標的としたキメラ又は放射性標識のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）による治療が、非ホジキンリンパ腫のインビボ治療に効果的であることが示されている（Ｔｅｄｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １５：４５０−４５４（１９９４）；Ｐｒｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２２１−２４０（２００１）；Ｋａｍｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３２９：４５９−４６５（１９９３）；Ｗｅｉｎｅｒ，Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ，２６：４３−５１（１９９９）；Ｏｎｒｕｓｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｄｒｕｇｓ，５８：７９−８８（１９９９）；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１２：１７６３−１７６９（１９９８）；Ｒｅｆｆ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ，８３：４３５−４４５（１９９４）；Ｍａｌｏｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ，９０：２１８８−２１９５（１９９７）；Ｍａｌｏｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ，１５：３２６６−３２７４（１９９７）；Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃ，２５：７０５−７０８（１９９７））。また、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体療法は、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、特発性血小板減少性紫斑病及び溶血性貧血や、その他の免疫介在疾患の症状を寛解させることも知られている（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．，４８：１４８４−１４９２（２００２）；Ｅｄｗａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，４０：１−７（２００１）；Ｄｅ  Ｖｉｔａ  ｅｔ  ａｌ，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ，４６：２０２９−２０３３（２００２）；Ｌｅａｎｄｒｏ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．，６１  ：８８３−８８８（２００２）；Ｌｅａｎｄｒｏ  ｅｔ  ａｌ，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．，４６：２６７３−２６７７（２００１））。抗ＣＤ２２モノクローナル抗体ＬＬ−２は、化学療法により治療中の侵攻性及び再発性リンパ腫患者の治療に効果的であることが示されている（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇの米国特許第６，１３４，９８２号及び６，３０６，３９３号）。抗ＣＤ２０（ＩｇＧ１）抗体であるＲＩＴＵＸＡＮ（商標）は、成人免疫性血小板減少性紫斑病、関節リウマチ、自己免疫性溶血性貧血などの疾患の治療に用いられ、奏功している（Ｃｕｒｅｄ  ｅｔ  ａｌ，ＷＯ００／６７７９６）。この治療法は有効であるものの、ほとんどの急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）やその他の多くの悪性Ｂ細胞においては、ＣＤ２０が発現していない、低レベルでしか発現していない、あるいはＣＤ２０免疫療法によってＣＤ２０の発現が消失している（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２２：７３５９−７３６８（２００３））。更に、非ホジキンリンパ腫患者の半数しかＣＤ２０を標的とした免疫療法が奏功しないことから、ＣＤ２０の発現に基づいて抗ＣＤ２０治療への反応を予想することはできない。
【０００４】
ヒトＣＤ１９分子は、特異な構造の細胞表面受容体であり、ヒトＢ細胞の表面で発現する。このヒトＢ細胞としては、プレＢ細胞、発生初期のＢ細胞（即ち、未成熟Ｂ細胞）、形質細胞への最終的な分化に渡る成熟Ｂ細胞及び悪性Ｂ細胞が含まれるが、これらに限定されない。ＣＤ１９は、ほとんどのプレＢ細胞急性リンパ性急性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、全リンパ性白血病、有毛細胞白血病、一般的な急性リンパ性白血病、及びいくらかのＮｕｌｌ細胞型急性リンパ性白血病において発現している（Ｎａｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３１：２４４−２５０（１９８３），Ｌｏｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ，７０：１３１６−１３２４（１９８７），Ｕｃｋｕｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ，７１：１３−２９（１９８８），Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，１９８４．Ｂｌｏｏｄ，６３：１４２４−１４３３（１９８４），Ｓｃｈｅｕｅｒｍａｎｎ，Ｌｅｕｋ．Ｌｙｍｐｈｏｍａ，１８：３８５−３９７（１９９５））。また、ＣＤ１９は、形質細胞において発現していることから、多発性骨髄腫やヴァルデンストレームマクログロブリン血症といった分化型のＢ細胞腫瘍においても発現していることが示唆される（（Ｇｒｏｓｓｂａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ，１０２：５０９−１５（１９９８）；Ｔｒｅｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ，３０：２４８−５２（２００３））。
【０００５】
ＣＤ１９抗原もまた、免疫療法の標的として提案される多くのもののひとつである。ＣＬＢ−ＣＤ１９抗体（抗ＣＤ１９マウスＩｇＧ２ａｍＡｂ）は、無胸腺マウスに移植されたヒト腫瘍の成長を抑制することが示されている（Ｈｏｏｉｊｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５５：８４０−８４６（１９９５））。他の研究では、マウスモノクローナル抗体ＦＭＣ６３（ＩｇＧ２ａ）を、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域を用いてキメラ化している（Ｚｏｌａ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ６９：４１１−２２（１９９１））。この抗体は、インビトロでは補体媒介性細胞障害性又はＡＤＣＣを惹起せず、ヒトＢ細胞リンパ腫を移入したＳＣＩＤマウス（異種移植モデル）へ投与すると、移植腫瘍細胞の死滅は中程度であるが非特異的であった（Ｐｉｅｔｅｒｓｚ  ｅｔ  ａｌ  ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，４１：５３−６０（１９９５））。
【０００６】
腫瘍を移植した異種移植モデルマウスを用いた結果を受けて、マウス抗ＣＤ１９抗体をヒト患者に用いる研究が進められた。進行性の非ホジキンリンパ腫と診断され、従来の治療法（化学療法及び放射線療法）が奏功しなかった６人の患者にマウスＣＬＢ−ＣＤ１９抗体が投与された。これらの患者には、計２２５から１０００ｍｇの範囲の抗体が投与された（Ｈｅｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，３２：３６４−３７２（１９９１））。２人の患者では、抗体注入後に一時的に循環がん細胞が減少したものの、２期の抗体治療の後に部分的な寛解が得られた患者は１人に過ぎなかった。このような難治性患者の小グループでは、治療効果について結論を得ることは出来なかった。
【０００７】
その後、この研究者らにより、非複合型ＣＤ２０ｍＡｂの抗腫瘍効果がＣＤ１９ｍＡｂよりもはるかに優れていることが、移植モデルにおいて示された（Ｈｏｏｉｊｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５５：８４０−８４６（１９９５）；及びＨｏｏｉｊｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５５：２６２７−２６３４（１９９５））。また、彼らによれば、ＣＤ１９ｍＡｂとＣＤ２０ｍＡｂを併用した場合でも、相加・相乗効果は観察されなかった（Ｈｏｏｉｊｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５５：８４０−８４６（１９９５））。異種移植動物モデルはヒト被験者の予後指標としては不十分であると認識されているものの、これらの動物実験で得られた否定的な結果により、裸の抗ＣＤ１９抗体による治療に対する興味が削がれることとなった。
【０００８】
抗ＣＤ１９抗体を用いた免疫毒素の使用についても、同じく落胆すべき結果が得られた。初期の臨床試験では、Ｂ４抗ＣＤ１９抗体（マウスＩｇＧ１ｍＡｂ）を植物毒素のリシンと結合したものが、従来の治療法が奏功しなかった多発性骨髄腫の患者（Ｇｒｏｓｓｂａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ，１０２：５０９−５１５（１９９８））、進行した非ホジキンリンパ腫の患者（Ｇｒｏｓｓｂａｒｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５：２３９２−２３９８（１９９９））、及び不応性Ｂ細胞悪性物の患者（Ｇｒｏｓｓｂａｒｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ，７９：５７６−５８５（１９９２））に投与された。これらの試験では、概してＢ４−リシン複合体のヒトへの投与について安全性が実証されたが、その結果はまちまちであり、奏効率はＲＩＴＵＸＡＮ（商標）の臨床試験と比較して落胆すべきものであった（Ｇｒｏｓｓｂａｒｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５：２３９２−２３９８（１９９９））。さらに、かなりの患者が、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答又はヒト抗リシン抗体（ＨＡＲＡ）応答を引き起こした。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
裸の抗ＣＤ１９抗体又は抗ＣＤ１９抗体の免疫毒素を用いた治療では、現在のところいずれも落胆すべき結果が得られていることから、ＣＤ１９介在型障害をより効果的に治療する抗ＣＤ１９抗体、例えばＢ細胞のアポトーシスを引き起こしたり増殖を抑制する、あるいはＡＤＣＣによる死滅を仲介することによって、効果的に腫瘍細胞死を誘導することのできる抗ＣＤ１９抗体の開発が要求されている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
［発明の概要］
本開示は、概して、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体及びその断片、並びにその調製法及びＣＤ１９介在型障害の治療法を含むその使用法に関する。本発明のヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片は、例えばＡＤＣＣ活性、アポトーシス誘導及びＢ細胞の増殖抑制を含む、数多くの望ましい特性を示す。
【００１１】
ある側面では、本開示は、配列番号２７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１及び／又は配列番号２８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２及び／又は配列番号２９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を有する、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片を提供する。別の側面では、本開示は、配列番号３０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１及び／又は配列番号３１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２及び／又は配列番号３２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を有する、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体及びその断片を提供する。
【００１２】
別の側面では、本開示は、配列番号２７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１及び／又は配列番号２８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２及び／又は配列番号２９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、及び／又は配列番号３０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、及び／又は配列番号３１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２及び／又は配列番号３２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３とを有する、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片を提供する。
【００１３】
さらなる側面では、本発明は、配列番号１９、２０、２１、２２及び４２からなる群から選択される重鎖可変領域配列を有する、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片を提供する。
【００１４】
さらなる側面では、本発明は、Ｖ３−３３＊０１（配列番号１１）、Ｖ３−１１＊０１（配列番号１２）、Ｖ３−３０＊−１８（配列番号１３）及びＶ３−４８＊０１（配列番号１４）からなる群から選択されるヒト遺伝子の産物又は当該ヒト遺伝子に由来する重鎖可変フレームワーク領域を有する、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片を提供する。
【００１５】
さらなる側面では、本発明は、配列番号２３、２４、２５、２６及び４１からなる群から選択される軽鎖可変領域配列を有する、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片を提供する。
【００１６】
さらなる側面では、本発明は、Ｖ１−５＊０３（配列番号３）、Ｖ１−２７＊０１（配列番号４）、Ｖ１−３９＊−０１（配列番号５）及びＶ１−１２＊０１（配列番号６）からなる群から選択されるヒト遺伝子の産物又は当該ヒト遺伝子に由来する軽鎖可変フレームワーク領域を有する、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片を提供する。
【００１７】
さらなる側面では、本発明は、配列番号３３、３４、３５、３６、３７、４３、４４、４５、４６、４７、５４及び５５からなる群から選択される重鎖可変領域を有する、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片を提供する。
【００１８】
さらなる側面では、本発明は、配列番号２５、３８、３９、４０、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２及び６３からなる群から選択される軽鎖可変領域を有する、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片を提供する。
【００１９】
さらなる側面では、本発明は、
（ａ）配列番号６４のアミノ酸配列を有する重鎖配列と、
（ｂ）配列番号６５のアミノ酸配列を有する軽鎖配列とを有する、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片を提供する。
【００２０】
さらなる側面では、本発明は、
（ａ）配列番号６６のアミノ酸配列を有する重鎖配列と、
（ｂ）配列番号６７のアミノ酸配列を有する軽鎖配列とを有する、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片を提供する。
【００２１】
さらなる側面では、本発明は、
（ａ）配列番号６６のアミノ酸配列を有する重鎖配列と、
（ｂ）配列番号６５のアミノ酸配列を有する軽鎖配列とを有する、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片を提供する。
【００２２】
さらなる側面では、本発明は、ヒト重鎖及び／又は軽鎖定常領域を有するヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片であって、当該ヒト重鎖定常領域が、ヒトＩｇＧ１由来のＣＨ１と、ヒトＩｇＧ１由来のヒンジと、ヒトＩｇＧ３由来のＦｃ領域とを有するアイソタイプ変異体を有するもの、を提供する。
【００２３】
さらなる側面では、本発明は、親抗体のヒトＩｇＧのＦｃ領域と比べて少なくとも１つのアミノ酸改変を有するヒトＩｇＧの変異Ｆｃ領域を有する、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片であって、当該ヒトＩｇＧの変異Ｆｃ領域を有する抗体は、親細胞と比較して異なるエフェクター機能を示すもの、を提供する。
【００２４】
さらなる側面では、本発明は、親抗体のアミノ酸位置３２４のセリンがアスパラギンに置き換えられたアミノ酸置換Ｓ３２４Ｎを有するヒトＩｇＧの変異Ｆｃ領域を有する、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片であって、当該ヒトＩｇＧの変異Ｆｃ領域を有する抗体は、親抗体と比較して向上した補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）を示すもの、を提供する。
【００２５】
さらなる側面では、本発明は、Ｒａｊｉ腫瘍細胞への結合、５０ｎＭ以下の親和性（Ｋｄ）でのヒトＣＤ１９への結合性、対応キメラ抗体のＣＤ１９結合親和性（Ｋｄ）の少なくとも２０％の保持、５０ｎＭ以下の親和性（Ｋｉ）でのＲａｊｉ腫瘍細胞への結合の競合、Ｒａｊｉ腫瘍細胞におけるアポトーシス誘導、Ｒａｊｉ腫瘍細胞におけるＡＤＣＣ活性、悪性Ｂ細胞の増殖阻害、Ｒａｊｉ腫瘍細胞のクローン形成能の阻害、血液中のＢ細胞枯渇の誘起、Ｒａｊｉ腫瘍細胞への取り込み、６５℃を超えるＦＡＢ断片耐熱性温度等の、種々の望ましい特性を有する、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片を提供する。
【００２６】
本開示は、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片をコードする単離核酸、ベクター、及び当該単離核酸又はベクターを有する宿主細胞も提供する。また、本ヒト化抗体又はその断片と、薬学的に許容される担体とを有する組成物、及び治療薬と結合した本ヒト化抗体又はその断片を有する免疫複合体も提供される。
【００２７】
本開示は、ＣＤ１９介在型障害を治療する方法、ＣＤ１９を発現する腫瘍細胞の成長を阻害する方法、及びそうした治療を必要とする被験体においてＢ細胞を枯渇させる方法も提供する。
【００２８】
本開示は、ＣＤ１９介在型障害を治療するための、本ヒト化抗体若しくはその断片、本組成物又は本免疫複合体を有する、製造用キット及び製品も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
［図面の簡単な説明］
【図１】図１Ａ及び図１Ｂは、ヒトアクセプター抗体のフレームワークに移植したＦＭＣ６３−ＣＤＲについて、Ｒａｊｉ腫瘍細胞への結合活性を測定したフローサイトメトリー分析を示す。
【図２】図２Ａ及び図２Ｂは、ＶＢＡＳＥ２から選択したジャームラインフレームワーク及びＣＤＲを移植したドナー増幅フレームワークについて、ＦＭＣ６３の軽鎖（Ａ）又は重鎖（Ｂ）可変領域とのアラインメントを示す。カバットの番号付けを用い、それを番号列の下に示す。
【図３】フローサイトメトリーにより測定した、ヒト化抗体のＳＵ−ＤＨＬ−６ヒトＢ細胞リンパ腫細胞への結合活性を示す。
【図４】図４Ａ及び図４Ｂは、ヒト化抗ＣＤ１９抗体のスキャッチャード分析曲線を示す。分析は、ユーロピウム標識抗体を用い、Ｒａｊｉ腫瘍細胞について行った。
【図５Ａ】Ｒａｊｉ腫瘍細胞におけるヒト化抗ＣＤ１９抗体のＡＤＣＣ活性を示す。
【図５Ｂ】Ｒａｊｉ腫瘍細胞におけるヒト化抗ＣＤ１９抗体のＡＤＣＣ活性を示す。
【図６】Ｒａｊｉ腫瘍細胞におけるヒト化抗ＣＤ１９抗体のアポトーシス誘導を示す。
【図７Ａ】ヒト化抗ＣＤ１９抗体によるＳＵ−ＤＨＬ−６ヒトＢ細胞リンパ腫細胞の増殖抑制を示す。
【図７Ｂ】ヒト化抗ＣＤ１９抗体による治療後のＲａｊｉ腫瘍細胞のクローン形成能を示す。
【図８】ヒト化抗ＣＤ１９抗体のＲａｊｉ腫瘍細胞への取り込みを示す。取り込みは、サポニン複合化二次抗体（Ｈｕｍ−ＺＡＰ）の細胞毒性により観察した。
【図９】抗ＣＤ１９抗体のＳ３２４の位置におけるミュータントの補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）について、野生型ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ−ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａとの比較を示し、（１）ＩｇＧ１コントロール抗体；（２）ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ−ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ；（３）ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ／Ｓ３２４Ｎ−ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ；（４）ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ／Ｓ３２４Ｇ−ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ；（５）ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ／Ｓ３２４Ａ−ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ；（６）ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ／Ｓ３２４Ｖ−ＶＬ４３  ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ；（７）ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ／Ｓ３２４Ｌ−ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ；（８）ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ／Ｓ３２４Ｉ−ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ；（９）ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ／Ｓ３２４Ｐ−ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ；（１０）ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ／Ｓ３２４Ｔ−ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ；（１１）ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ／Ｓ３２４Ｃ−ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ；（１２）ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ／Ｓ３２４Ｍ−ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ；（１３）ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ／Ｓ３２４Ｑ−ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ；（１４）ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ／Ｓ３２４Ｆ−ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ；（１５）ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ／Ｓ３２４Ｙ−ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ；（１６）ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ／Ｓ３２４Ｗ−ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ；（１７）ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ／Ｓ３２４Ｒ−ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ；（１８）ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ／Ｓ３２４Ｄ−ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ；（１９）血清のみ、である。
【図１０】抗ＣＤ１９抗体のＥ２６９、Ｓ２９８及びＳ３２４の位置が置換された変異体についてのＣＤＣアッセイを示し、（１）ネガティブコントロール−抗体無し；（２）ＩｇＧ１コントロール抗体；（３）ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ−ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ；（４）ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ／Ｓ３２４Ｎ−ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ；（５）ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ／Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎ−ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ；（６）ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ／Ｅ２６９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎ−ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ、である。
【図１１】選択した抗ＣＤ１９抗体の変異体についてのセルベースＡＤＣＣアッセイを示し、（１）ネガティブコントロール−抗体なし；（２）ＩｇＧ１コントロール抗体；（３）ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ−ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ；（４）ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ／Ｓ２９８Ａ−ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ；（５）ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ／Ｅ２６９Ｄ／Ｓ２９８Ａ−ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ、である。
【図１２】選択した抗ＣＤ１９抗体の変異体についてのセルベースＣＤＣアッセイを示し、（１）ＩｇＧ１コントロール抗体：（２）ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ−ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ；（３）ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ（１１３３）−ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ；（４）ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ／Ｋ２７４Ｑ−ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ；（５）ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ／Ｎ２７６Ｋ−ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ；（６）ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ／Ｋ３３４Ｒ−ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ；（７）ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ／Ｓ３２４Ｎ−ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ；（８）ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ／Ｋ２７４Ｑ／Ｎ２７６Ｋ−ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ；（９）ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ／Ｋ２７４Ｑ／Ｎ２７６Ｋ／Ｋ３３４Ｒ−ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ；（１０）ネガティブコントロール−抗体・血清無し；（１１）ネガティブコントロール−血清のみ、である。
【図１３】脱フコシル化抗ＣＤ１９抗体変異体についてのセルベースＡＤＣＣアッセイを示し、（１）ネガティブコントロール−抗体無し；（２）ＩｇＧ１コントロール抗体；（３）ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ−ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ；（４）ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ（ｓｈＲＮＡ）−ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ；（５）ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ（ＧＮＴＩＩＩ）−ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ；（６）ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ／Ｅ２６９Ｄ／Ｓ２９８Ａ（ｓｈＲＮＡ）−ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ；（７）ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ／Ｅ２６９Ｄ／Ｓ２９８Ａ（ＧＮＴＩＩＩ）−ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ、である。
【図１４】ＳＣＩＤマウスの脾臓において検出された、抗ＣＤ１９抗体変異体によるＢ細胞枯渇（全Ｂ細胞のＡＣＮ）を示し、（１）ネガティブコントロール−ＰＢＭＣ無し；（２）ヒトＰＢＭＣ−Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）；（３）ヒトＰＢＭＣ−Ｍａｂｔｈｅｒａ（登録商標）；（４）ヒトＰＢＭＣ−ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ−ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ；（５）ヒトＰＢＭＣ−ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ／Ｓ３２４Ｎ−ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ、である。
【図１５】ＳＣＩＤマウスの脾臓において検出された、抗ＣＤ１９抗体変異体によるＢ細胞枯渇（全Ｂ細胞に対する割合）を示し、（１）ネガティブコントロール−ＰＢＭＣ無し；（２）ヒトＰＢＭＣ−Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）；（３）ヒトＰＢＭＣ−Ｍａｂｔｈｅｒａ（登録商標）；（４）ヒトＰＢＭＣ−ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ−ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ；（５）ヒトＰＢＭＣ−ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ／Ｓ３２４Ｎ−ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ、である。
【発明の詳細な説明】
【００３０】
本開示は、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体及びその断片に関する。
【００３１】
本件で用いられる用語「ヒトＣＤ１９」には、ヒトＣＤ１９の変異体、アイソフォーム及び種相同体が含まれる。よって、本開示のヒト化抗体は、場合によってはヒト以外の種由来のＣＤ１９と交差反応しうる。実施例によっては、抗体は１つ又はそれ以上のヒトＣＤ１９タンパクに対して完全に特異的であってよく、種間又はその他の非ヒト間での交差反応を示さないものであってよい。ヒトＣＤ１９の一例の全アミノ酸配列のスイスプロット受入番号は、Ｐ１５３９１（配列番号１２５）である。ＣＤ１９は、Ｂ細胞表面抗原Ｂ４、Ｂ細胞抗原ＣＤ１９、ＣＤ１９抗原及びＬｅｕ−１２としても知られている。ヒトＣＤ１９は、Ｅｎｔｒｅｚ  ＧｅｎｅではＧｅｎｅＩＤ：９３０、ＨＧＮＣではＨＧＮＣ：１６３３と命名されている。ＣＤ１９は、ＣＤ１９と命名された遺伝子によりコードされうる。本件において「ヒトＣＤ１９」を用いる場合、すべてのヒトＣＤ１９の公知又は未発見の対立遺伝子及び多型が包含される。本件で用いられる用語「ＣＤ１９」は、特に示さない限り「ヒトＣＤ１９」をいう。
【００３２】
本件で用いられる用語「ＣＤ１９に結合する抗体」には、抗体、好ましくはＩｇＧ抗体であって、ヒトＣＤ１９、例えばＲａｊｉ腫瘍細胞ＤＳＭＺ  ＡＣＣ３１９などのＲａｊｉ腫瘍細胞の表面に発現したヒトＣＤ１９に結合する、親和性（Ｋｄ）が５００ｎＭ以下、好ましくは１００ｎＭ以下、より好ましくは５０ｎＭ以下の抗体が含まれる。
【００３３】
本件で用いられる「Ｂ細胞」又は「Ｂリンパ球」とは、骨髄で発生し、血液及びリンパ中を循環して体液性免疫をもたらすリンパ球の一種を意味する。Ｂ細胞は、遊離抗原を認識して、当該抗原を不活化する免疫グロブリン（抗体）を分泌する形質細胞へと分化・成熟する。また、後に同様の抗原に遭遇した場合に特異的な免疫グロブリン（抗体）を産生するメモリー細胞も作られる。Ｂ細胞は、ランゲルハンス島の「ベータ細胞」としても知られる。
【００３４】
本件で用語「抗体」と呼ばれるものには、抗体全体及びあらゆる抗原結合性の断片又はその一本鎖が含まれる。「抗体」とは、ジスルフィド結合により連結された少なくとも２本の重鎖（Ｈ鎖）及び２本の軽鎖（Ｌ鎖）を有する糖タンパク又はその抗原結合性の断片をいう。各重鎖は、重鎖可変領域（本件ではＶＨと略す）及び重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３の３つのドメインからなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本件ではＶＬと略す）及び軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬからなる。ＶＨ及びＶＬ領域は、さらに相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域に細分され、これはフレームワーク領域（ＦＲ又はＦＷ）と呼ばれるより保存された領域と入り交じっている。各ＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲと４つのＦＲからなり、アミノ末端からカルボキシ末端に向かってＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に並んでいる。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合部位を含む。抗体の定常領域は、免疫グロブリンが、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む、宿主組織又は宿主因子へ結合するのを媒介する。
【００３５】
本件で用いられる用語「キメラ抗体」には、その可変領域の配列が１つの種に由来し、その定常領域の配列が他の種に由来する抗体、例えば可変領域の配列がマウス抗体由来であり、定常領域の配列がヒト抗体由来である抗体などが含まれる。
【００３６】
本件で用いられる用語「ヒト化抗体」には、マウス等の別の哺乳動物種のジャームラインに由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植された抗体が含まれる。別の哺乳動物種のジャームラインに由来するＣＤＲ配列だけでなく、ヒトフレームワーク配列おいてフレームワーク領域がさらに改変されていてもよい。
【００３７】
本件で用いられる用語「ヒト抗体」には、フレームワーク及びＣＤＲ領域がヒトジャームライン免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体が含まれる。抗体が定常領域を含む場合には、定常領域もヒトジャームライン免疫グロブリン配列に由来する。本発明のヒト抗体は、ヒトジャームライン免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダム若しくは部位特異的突然変異又はインビボでの体細胞突然変異によって導入された変異）を含みうる。ただし、本件において用いられる用語「ヒト抗体」は、マウス等の別の哺乳動物種のジャームラインに由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植された抗体を含むものではない。
【００３８】
本件において、抗体の可変領域がヒトジャームライン免疫グロブリン遺伝子を使用した系から得られる場合には、ヒト化抗体は、特定のヒトジャームライン配列（ヒト遺伝子）の「産物」又は「由来」である重鎖又は軽鎖可変フレームワーク領域を有する。そのような系には、ヒト免疫グロブリン遺伝子を有する遺伝子導入マウスを対象とする抗原で免疫するか、ファージディスプレイによるヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーを対象とする抗原でスクリーニングすることが含まれる。ヒトジャームライン免疫グロブリン配列の「産物」又は「由来」である重鎖又は軽鎖可変フレームワーク領域を有するヒト化抗体は、当該ヒト化抗体の重鎖又は軽鎖可変フレームワークのアミノ酸配列を、ヒトジャームライン免疫グロブリンの重鎖又は軽鎖可変フレームワークのアミノ酸配列と比較することで同定することができる。特定のヒトジャームライン免疫グロブリン配列の「産物」である重鎖又は軽鎖可変フレームワーク領域を有するヒト化抗体は、その特定のヒトジャームライン免疫グロブリン配列の重鎖又は軽鎖可変フレームワーク領域とアミノ酸配列が１００％同一である重鎖又は軽鎖可変フレームワーク領域を有する。特定のヒトジャームライン免疫グロブリン配列に「由来」する重鎖又は軽鎖可変フレームワーク領域を有するヒト化抗体は、その特定のジャームライン配列の重鎖又は軽鎖可変フレームワーク領域と比較して、アミノ酸に違い（例えば自然発生による体細胞変異や部位特異的突然変異の意図的な導入によるもの）があってもよい。しかし通常は、ヒト化抗体は、重鎖又は軽鎖可変フレームワーク領域のアミノ酸配列が、ヒトジャームライン免疫グロブリン遺伝子の重鎖又は軽鎖可変フレームワーク領域によりコードされるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であり、他の種のジャームライン免疫グロブリンのアミノ酸配列（例えば、マウスジャームライン配列）と比較した際に、そのヒト化抗体がヒト由来であると同定できるアミノ酸残基を含んでいる。場合によっては、ヒト化抗体は、その重鎖又は軽鎖可変フレームワーク領域のアミノ酸配列が、ジャームライン免疫グロブリン遺伝子によりコードされる重鎖又は軽鎖可変フレームワーク領域のアミノ酸配列と好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、最も好ましくは少なくとも９７％、特別には少なくとも９８％、最も特別には少なくとも９９％同一であってよい。典型的には、特定のヒトジャームライン配列由来であるヒト化抗体の重鎖又は軽鎖可変フレームワーク領域は、ヒトジャームライン免疫グロブリン遺伝子によりコードされる重鎖又は軽鎖可変フレームワーク領域のアミノ酸配列に対して、１０アミノ酸以下、好ましくは５以下、より好ましくは４、３、２又は１以下の違いしか示さない。
【００３９】
本件で用いられる用語「Ｆａｂ」又は「Ｆａｂ領域」には、免疫グロブリンのＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ及びＣＬドメインを有するポリペプチドが含まれる。Ｆａｂとは、分離された当該領域をいうものであってもよく、あるいは全長抗体又は抗体断片中の当該領域をいうものであってもよい。
【００４０】
本件で用いられる用語「Ｆｃ」又は「Ｆｃ領域」には、免疫グロブリンドメインの１番目の定常領域を除いた抗体の定常領域を有するポリペプチドが含まれる。従って、Ｆｃとは、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＧの免疫グロブリンドメインの残る２つの定常領域、及びＩｇＥ及びＩｇＭの残る３つの定常領域、そしてこれらのＮ末端の可動性ヒンジをいう。ＩｇＡ及びＩｇＭについては、ＦｃはＪ鎖を含みうる。ＩｇＧについては、Ｆｃは、免疫グロブリンドメインＣガンマ２及びＣガンマ３（Ｃγ２及びＣγ３）と、Ｃガンマ１（Ｃγ１）とＣガンマ２（Ｃγ２）の間のヒンジとを有する。Ｆｃ領域の境界部は変化しうるものの、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、カバットのＥＵインデックスによる番号付けでＣ２２６又はＰ２３０からカルボキシ末端までの残基を有するものと定義される。ヒトＩｇＧ１については、本件ではＦｃ領域とは、カバットのＥＵインデックスによる番号付けでＰ２３２からカルボキシ末端までの残基を有するものと定義される。Ｆｃとは、分離された当該領域をいうものであってもよく、あるいは例えば抗体におけるＦｃポリペプチドの領域をいうものであってもよい。
【００４１】
本件における用語「ヒンジ」、「ヒンジ領域」又は「抗体ヒンジ領域」には、抗体の第１定常ドメインと第２定常ドメインとの間のアミノ酸を有する可動性のポリペプチドが含まれる。構造的には、ＩｇＧのＣＨ１ドメインが２２０のＥＵ位置で終了し、ＩｇＧのＣＨ２ドメインが２３７のＥＵ位置から開始する。よって、ＩｇＧについては、抗体ヒンジは、本件においてはカバットのＥＵインデックスによる番号付けで２２１（ＩｇＧ１ではＤ２２１）から２３１（ＩｇＧ１ではＡ２３１）までを含むと定義される。
【００４２】
本件において用いられる用語「親抗体」又は「親免疫グロブリン」には、後に変異体を作出するために改変される、未改変の抗体が含まれる。当該親抗体は、自然発生の抗体又は自然発生の抗体の変異体若しくは遺伝子操作したものであってもよい。親抗体とは、抗体そのもの、親抗体を含む組成物、又はそれをコードするアミノ酸配列をいうものであってもよい。本件において用いられる「親抗ＣＤ１９抗体」とは、ヒトＣＤ１９に結合する抗体又は免疫グロブリンであって、変異体を作出するために改変されるものを意味する。
【００４３】
本件において用いられる用語「親抗体」又は「親免疫グロブリン」には、ヒト化抗体を作出するために改変される前のマウス又はキメラ抗体が含まれる。
【００４４】
本件において用いられる用語「変異抗体」又は「抗体変異体」には、親抗体と比較して少なくとも１つのアミノ酸の改変がある点で、親抗体配列と異なる抗体配列が含まれる。本件における変異抗体配列は、親抗体配列と、好ましくは少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列の相同性を有することとなる。抗体変異体とは、抗体そのもの、抗体変異体を有する組成物、又はそれをコードするアミノ酸配列をいうものであってもよい。
【００４５】
本件における用語「アミノ酸改変」には、ポリペプチド配列におけるアミノ酸の置換、挿入及び／又は欠失が含まれる。本件における「アミノ酸置換」又は「置換」とは、親ペプチド配列の特定の位置においてアミノ酸が他のアミノ酸に置き換えられることを意味する。例えば、Ｒ９４Ｋ置換とは、変異ポリペプチドをいい、この場合、重鎖可変フレームワーク領域の変異体であって、９４の位置のアルギニンがリシンに置き換わっているものをいう。この例において、９４Ｋとは、９４の位置におけるリシンへの置換を示す。本件では、複数の置換は通常スラッシュにより分割される。例えば、Ｒ９４Ｋ／Ｌ７８Ｖとは、Ｒ９４ＫとＬ７８Ｖの置換を有する２重変異体を言う。本件で用いられる「アミノ酸挿入」又は「挿入」とは、親ペプチド配列の特定の位置におけるアミノ酸の挿入を意味する。例えば、挿入−９４は、９４の位置への挿入を示す。本件で用いられる「アミノ酸欠失」又は「欠失」とは、親ポリペプチド配列の特定の位置におけるアミノ酸の除去を意味する。例えば、Ｒ９４−は、９４の位置のアルギニンの欠失を示す。
【００４６】
本件で用いられる用語「保存的改変」又は「保存的配列改変」とは、そのアミノ酸配列を含む抗体の結合特性に大きく影響しない、又は結合特性を変えないアミノ酸の改変をいうものである。そのような保存的改変には、アミノ酸の置換、挿入及び欠失が含まれる。改変は、部位特異的変異誘発やＰＣＲを介した変異誘発といった、本分野において公知の標準的な技術により、本発明の抗体に導入される。
【００４７】
保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を持つアミノ酸残基と置き換わることである。類似の側鎖を持つアミノ酸ファミリーは、本分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を持つアミノ酸が含まれる。よって、本発明の抗体では、ＣＤＲ領域又はフレームワーク領域内のアミノ酸残基の１つ又はそれ以上を、同じ側鎖ファミリーに属する他のアミノ酸と置換することができ、そうして改変した抗体（変異抗体）が機能を維持しているかどうか試験することができる。
【００４８】
本発明で論じられている免疫グロブリン重鎖定常領域における位置について、その番号付けは、すべてカバットによるＥＵインデックスによるものである（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ  ｅｎｔｉｒｅｌｙ  ｂｙ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）。「カバットによるＥＵインデックス」とは、Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９６９，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６３：７８−８５に記載される、ヒトＩｇＧ１ＥＵ抗体の残基の番号付けをいう。
【００４９】
本件で用いられる用語「全長抗体」には、可変及び定常領域を含む、抗体の自然な生物学的形状を構成する構造が含まれる。例えば、ヒト及びマウスを含むほとんどの哺乳類では、ＩｇＧクラスの全長抗体は４量体であり、各ペアが２つの免疫グロブリン鎖からなる同一の２つのペアからなり、各ペアは１つの軽鎖と１つの重鎖を有し、各軽鎖は免疫グロブリンドメインＶＬ及びＣＬを有し、各重鎖は免疫グロブリンドメインＶＨ、ＣＨ１（Ｃγ１）、ＣＨ２（Ｃγ２）及びＣＨ３（Ｃγ３）を有する。哺乳類によっては、例えばラクダやラマでは、ＩｇＧ抗体は２つの重鎖のみからなり、各重鎖がＦｃ領域に付加された可変ドメインを有する場合もある。
【００５０】
抗体断片には、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片（Ｆａｂ’及びＦａｂ’−ＳＨを含む）、（ｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｉｖ）単一の可変からなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）、（ｖ）２つの結合したＦａｂ断片を有する２価の断片であるＦ（ａｂ’）２断片、（ｖｉ）ＶＨドメインとＶＬドメインがペプチドリンカーで結合されて結びつき抗原結合部位を形成する一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６，Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：５８７９−５８８３）、（ｖｉｉ）２重特異性一本鎖Ｆｖ二量体（ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５）、（ｖｉｉｉ）遺伝子融合により作成される多価又は多重特異性断片である「２重特異性抗体」又は「３重特異性抗体」（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ．ａｌ．，２０００，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２６：４６１−４７９；ＷＯ９４／１３８０４；Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６４４４−６４４８）、及び（ｉｘ）同一又は異なる抗体に遺伝子的に融合したｓｃＦｖ（Ｃｏｌｏｍａ  &  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １５，１５９−１６３）、が含まれるがこれらに限定されない。
【００５１】
抗体は、その定常領域によって遺伝学的にクラス（アイソタイプとも呼ばれる）に分類される。ヒト定常軽鎖はκ（Ｃκ）及びλ（Ｃλ）軽鎖に分類される。重鎖は、μ、δ、γ、α又はεに分類され、抗体のアイソタイプをＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥに特定する。治療目的では、ＩｇＧクラスが最も一般的に用いられる。ヒトにおいて、このクラスはサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を有する。マウスでは、このクラスは、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ及びＩｇＧ３を有する。ＩｇＭは、サブクラスを有し、ＩｇＭ１及びＩｇＭ２が含まれるがこれらに限定されない。ＩｇＡは、いくつかのサブクラスを有し、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２が含まれるがこれらに限定されない。よって、本件において「アイソタイプ」とは、定常領域の化学的及び抗原特性により定められる、免疫グロブリンのクラス又はサブクラスを意味する。ヒト免疫グロブリンのアイソタイプとしては、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＭ１、ＩｇＭ２、ＩｇＤ、及びＩｇＥが知られている。
【００５２】
本件で用いられる用語「ＡＤＣＣ」又は「抗体依存性細胞媒介性障害」には、ＦｃγＲを発現する非特異的な細胞傷害性細胞が、標的細胞に結合した抗体を認識してその標的細胞を溶解させる細胞介在反応が含まれる。種々の側面において、ＡＤＣＣエフェクター機能の増強とは、効力又は有効性の増強を意味する。試験において用いられる「効力」とは、特定の治療効果が観察される抗体濃度のＥＣ５０（最大半量有効濃度）を意味する。試験において用いられる「有効性」とは、抗体の飽和レベルにおける最大可能なエフェクター機能を意味する。
【００５３】
本件で用いられる用語「ＡＤＣＰ」又は抗体依存性細胞貪食には、ＦｃγＲを発現する非特異的な細胞傷害性細胞が、標的細胞に結合した抗体を認識してその標的細胞を貪食する細胞介在反応が含まれる。
【００５４】
本件で用いられる用語「ＣＤＣ」又は「補体依存性細胞障害」には、１つ又はそれ以上の補体タンパク質成分が、標的細胞に結合した抗体を認識してその標的細胞を溶解させる反応が含まれる。
【００５５】
本件で用いられる用語「エフェクター機能」には、抗体のＦｃ領域とＦｃ受容体又はリガンドとの相互反応の結果として起こる生物学的事象が含まれる。エフェクター機能には、ＡＤＣＣやＡＤＣＰなどのＦｃγＲ介在エフェクター機能、及びＣＤＣなどの補体介在エフェクター機能が含まれる。
【００５６】
本件において用いられる用語「被験体」には、あらゆるヒト及び非ヒト動物が含まれる。用語「非ヒト動物」には、すべての脊椎動物、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、トリ、両性類、爬虫類等の哺乳類及び非哺乳類が含まれる。好ましくは、被験体はヒトである。
【００５７】
本件において用いられる用語「アイソタイプ変異体」には、あるアイソタイプの少なくとも１つのアミノ酸、好ましくはアイソタイプの重鎖定常領域の少なくとも１つのアミノ酸が、異なるアイソタイプのアラインメントにおいて対応するアミノ酸へと変換されるアミノ酸改変が含まれる。アミノ酸改変は、全定常領域免疫グロブリンドメイン、又は、好ましくはあるアイソタイプのＦｃ領域を異なるアイソタイプへと変換することを含んでよく、例えば、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域のＦｃ領域をヒトＩｇＧ３由来のＦｃ領域へと変換すると、ヒトＩｇＧ１由来のＣＨ１及びヒンジとヒトＩｇＧ３由来のＦｃ領域とを有するアイソタイプ変異体が得られる。
【００５８】
本件で用いられる用語「アイソタイプ改変」には、あるアイソタイプの１つのアミノ酸を異なるアイソタイプのアラインメントにおいて対応するアミノ酸へと変換する改変が含まれる。例えば、カバットの位置２９６は、ＩｇＧ１はチロシン、ＩｇＧ２はフェニルアラニンであるから、ＩｇＧ２におけるＦ２９６Ｙ置換はアイソタイプ改変であると言える。
【００５９】
本件で用いられる用語「成熟コア糖鎖構造（ｍａｔｕｒｅ  ｃｏｒｅ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）」には、Ｆｃ領域に結合した加工を受けたコア糖鎖構造であって、一般的には糖鎖構造ＧｌｃＮＡｃ（フコース）−ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ−（Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ）２からなり、典型的には以下の模式図に示される２分岐オリゴ糖が含まれる。
【化１】
2012518404.tif 000003
【００６０】
この用語には、特にβ１，２ＧｌｕＮＡｃ残基を欠くコア成熟糖鎖構造のＧ−１型が含まれる。しかし、好ましくは、コア糖鎖構造は双方のβ１，２ＧｌｕＮＡｃ残基を有する。本件における成熟コア糖鎖構造は、通常は高マンノシル化されていない。成熟コア糖鎖構造は、糖タンパクのＦｃ領域、通常はＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に、Ｎ結合を介して付加される。
【００６１】
［抗ＣＤ１９抗体］
第１の側面では、本発明は、配列番号２７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１及び／又は配列番号２８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２及び／又は配列番号２９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、を有するヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片を提供する。別の側面では、本開示は、配列番号３０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１及び／又は配列番号３１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２及び／又は配列番号３２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、を有するヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片を提供する。
【００６２】
別の側面では、本開示は、配列番号２７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１及び／又は配列番号２８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２及び／又は配列番号２９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３；及び／又は配列番号３０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１及び／又は配列番号３１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２及び／又は配列番号３２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、を有するヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片を提供する。
【００６３】
好ましくは、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片は、配列番号２７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号２８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２及び配列番号２９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、及び／又は配列番号３０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号３２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、を有する。より好ましくは、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片は、配列番号２７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号２８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２及び配列番号２９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、並びに配列番号３０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号３２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、を有する。
【００６４】
本分野ではよく知られているが、ＣＤＲ３ドメインは、同種抗原に対する抗体の結合特異性を、ＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２ドメインから独立して単独で決定することが可能であり、共通するＣＤＲ３配列に基づけば、同一の結合特性を有する複数の抗体を作出可能であることが予測される。例えば、Ｋｌｉｍｋａ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊ．ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ８３（２）：２５２−２６０（２０００）（マウス抗ＣＤ３０抗体Ｋｉ−４の重鎖可変ドメインＣＤＲ３のみを用いた、ヒト化抗ＣＤ３０抗体の製造について記載）、Ｂｅｉｂｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：８３３−８４９（２０００）（マウスＭＯＣ−３１抗ＥＧＰ−２親抗体の重鎖ＣＤＲ３配列のみを用いた、遺伝子組み換え上皮糖タンパク−２（ＥＧＰ−２）抗体について記載）、Ｒａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：８９１０−８９１５（１９９８）（マウス抗インテグリンαｖβ３抗体ＬＭ６０９の重鎖及び軽鎖可変ＣＤＲ３ドメインを用いた一連の抗インテグリンαｖβ３ヒト化抗体に関し、各抗体は、ＣＤＲ３外に異なる配列を有しており、親マウス抗体と同一のエピトープに親マウス抗体と同一又はそれを超える親和性で結合することができる抗体について記載）、Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：２１６１−２１６２（１９９４）（ＣＤＲ３ドメインが抗原への結合に最も大きく貢献することについて開示）を参照されたい。
【００６５】
従って、本発明は、ＣＤ１９に結合可能な非ヒト動物の抗体由来、例えばＦＭＣ６３などのマウス抗体由来の１つ又はそれ以上の重鎖及び／又は軽鎖ＣＤＲ３ドメイン、特に配列番号２９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３及び／又は配列番号３２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を有する、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片を提供する。いくつかの実施形態において、このような非ヒト抗体由来の１つ又はそれ以上の重鎖及び／又は軽鎖ＣＤＲ３ドメインを有する本発明の抗体は、対応する非ヒト親抗体（例えば、マウス抗体）に対して、（ａ）結合を競合することができ、（ｂ）機能的な特性を保持しており、（ｃ）同じエピトープに結合し、及び／又は（ｄ）同様の結合親和性を有する。
【００６６】
さらなる側面では、本発明は、配列番号１９、２０、２１、２２及び４２からなる群から選択される重鎖可変領域配列、好ましくは配列番号２１、２２及び４２からなる群から選択される重鎖可変領域配列、より好ましくは配列番号２１を有する重鎖可変領域配列を有する、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片を提供する。
【００６７】
別の側面では、本発明は、配列番号２３、２４、２５、２６及び４１からなる群から選択される軽鎖可変領域配列、好ましくは配列番号２５及び４１からなる群から選択される軽鎖可変領域配列、より好ましくは配列番号４１を有する軽鎖可変領域配列を有する、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片を提供する。
【００６８】
いくつかの実施形態では、ＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片は、配列番号１９、２０、２１、２２及び４２からなる群から選択される重鎖可変領域配列と配列番号２３、２４、２５、２６及び４１からなる群から選択される軽鎖可変領域配列、好ましくは配列番号２１、２２及び４２からなる群から選択される重鎖可変領域配列と配列番号２３、２４、２５、２６及び４１からなる群から選択される軽鎖可変領域配列、より好ましくは配列番号２１、２２及び４２からなる群から選択される重鎖可変領域配列と配列番号２５及び４１からなる群から選択される軽鎖可変領域配列、最も好ましくは配列番号２１を有する重鎖可変領域配列と配列番号４１を有する軽鎖可変領域配列を有する。
【００６９】
これらの重鎖及び軽鎖可変領域配列のそれぞれがヒトＤ１９に結合することができることから、重鎖及び軽鎖可変領域配列を「組合せ、マッチさせ」て、本発明の抗ＣＤ１９結合分子を作り出すことができる。このような「組合せ、マッチさせ」た抗体のＣＤ１９結合性は、例えば実施例に記載の結合アッセイを用いて試験することができる。
【００７０】
別の実施形態では、本発明は、ＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片の変異体を提供する。よって、本発明は、親ヒト化抗体の重鎖及び／又は軽鎖可変フレームワーク領域のアミノ酸配列（例えば、配列番号２１及び４１の重鎖及び軽鎖可変領域配列のいずれか又は双方）と少なくとも８０％同一の（少なくとも８０％のアミノ酸配列相同性を有する）重鎖及び／又は軽鎖可変フレームワーク領域のアミノ酸配列を有する、ヒト化抗体又はその断片を提供する。好ましくは、重鎖及び／又は軽鎖可変フレームワーク領域のアミノ酸配列同一性は、少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、特別には９６％、より特別には９７％、更により特別には９８％、最も特別には９９％であり、例えば８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％及び１００％が挙げられる。アミノ酸配列の同一性又は相同性とは、本件では、配列を整合させ（アラインメントし）、必要に応じてギャップを挿入して、配列同一性が最大％となるようにしたときの、ＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片と同一性を有する候補配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージと定義される。よって、配列同一性は、２つのポリペプチドのアミノ酸位置について類似度を比較するために通常用いられる標準的な方法により決定することができる。ＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡなどのコンピュータープログラムを用いると、２つのポリペプチドが、（一方又は双方の配列の全長又は所定の部分に沿って）それぞれのアミノ酸が最適にマッチングされるようにアラインメント（整合）される。プログラムは、オープニングペナルティーとギャップペナルティのデフォルトを設けている。また、ＰＡＭ２５０（標準スコアマトリックス；Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｖｏｌ  ５，ｓｕｐｐ．３（１９７８）参照）等のスコアマトリックスをコンピュータープログラムと共に使用することができる。例えば、同一性（％）は、完全一致の総数に１００を乗算し、それを一致範囲における長い方の配列の長さと２つの配列を整合させるためにその配列に導入されたギャップの数との和で除算することにより算出することができる。
【００７１】
よって、いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１９、２０、２１、２２又は４２のフレームワーク領域配列と少なくとも８０％同一の重鎖可変フレームワーク領域配列、及び／又は配列番号２３、２４、２５、２６及び４１のフレームワーク領域配列と少なくとも８０％同一の軽鎖可変フレームワーク領域配列を有する、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片を提供する。
【００７２】
いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号２１、２２又は４２のフレームワーク領域配列と少なくとも８０％同一の重鎖可変フレームワーク領域配列、及び／又は配列番号２５又は４１のフレームワーク領域配列と少なくとも８０％同一の軽鎖可変フレームワーク領域配列を有する、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号２１のフレームワーク領域配列と少なくとも８０％同一の重鎖可変フレームワーク領域配列、及び／又は配列番号４１のフレームワーク領域配列と少なくとも８０％同一の軽鎖可変フレームワーク領域配列を有する、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片を提供する。
【００７３】
別の側面では、本発明は、上記の重鎖及び／又は軽鎖ＣＤＲを有し、更にＶ３−３３*０１（配列番号１１）、Ｖ３−１１*０１（配列番号１２）、Ｖ３−３０*−１８（配列番号１３）及びＶ３−４８*０１（配列番号１４）からなる群から選択されるヒト遺伝子の産物であるか、又は当該ヒト遺伝子由来の重鎖可変フレームワーク領域、好ましくはＶ３−３０*−１８（配列番号１３）又はＶ３−４８*０１（配列番号１４）のヒト遺伝子の産物であるか、又は当該ヒト遺伝子由来の重鎖可変フレームワーク領域、より好ましくはＶ３−３０*−１８（配列番号１３）のヒト遺伝子の産物であるか、又は当該ヒト遺伝子由来である重鎖可変フレームワーク領域を有する、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片を提供する。重鎖可変フレームワーク領域は、これらのヒト遺伝子の産物中に存在するか、又は当該ヒト遺伝子に由来する、１つ又はそれ以上（例えば、１、２、３及び／又は４つ）の重鎖フレームワーク領域配列（例えば、フレームワーク１（ＦＷ１）、フレームワーク２（ＦＷ２）、フレームワーク３（ＦＷ３）及び／又はフレームワーク４（ＦＷ４））を有していてもよい。好ましくは、重鎖可変領域フレームワークは、Ｖ３−３３*０１（配列番号１１）、Ｖ３−１１*０１（配列番号１２）、Ｖ３−３０*−１８（配列番号１３）及びＶ３−４８*０１（配列番号１４）からなる群から選択されるヒト遺伝子の産物中に存在するか、又は当該ヒト遺伝子に由来するＦＷ１、ＦＷ２及び／又はＦＷ３、より好ましくはＦＷ１、ＦＷ２及びＦＷ３を有する。本件で用いられる重鎖フレームワーク領域配列には、カバットによる付番体系を用いて示されるアミノ酸位置において、ＦＷ１（１から２５の位置）、ＦＷ２（３６から４９の位置）、ＦＷ３（６６から９４の位置）及びＦＷ４（１０３から１１３の位置）が含まれる。
【００７４】
別の側面では、本発明は、Ｖ１−５*０３（配列番号３）、Ｖ１−２７*０１（配列番号４）、Ｖ１−３９*−０１（配列番号５）及びＶ１−１２*０１（配列番号６）からなる群から選択されるヒト遺伝子の産物であるか、又は当該ヒト遺伝子に由来する軽鎖可変フレームワーク領域、好ましくはＶ１−３９*−０１（配列番号５）のヒト遺伝子の産物であるか、又は当該ヒト遺伝子に由来する軽鎖可変フレームワーク領域を有する、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片を提供する。軽鎖可変フレームワーク領域は、これらのヒト遺伝子の産物中に存在するか、又は当該ヒト遺伝子に由来する１つ又はそれ以上（例えば、１、２、３及び／又は４つ）の軽鎖フレームワーク領域配列（例えば、フレームワーク１（ＦＷ１）、フレームワーク２（ＦＷ２）、フレームワーク３（ＦＷ３）及び／又はフレームワーク４（ＦＷ４））を有していてもよい。好ましくは、軽鎖可変領域フレームワークは、Ｖ１−５*０３（配列番号３）、Ｖ１−２７*０１（配列番号４）、Ｖ１−３９*−０１（配列番号５）及びＶ１−１２*０１（配列番号６）からなる群から選択されるヒト遺伝子の産物中に存在するか、又は当該ヒト遺伝子に由来する、ＦＷ１、ＦＷ２及び／又はＦＷ３、より好ましくはＦＷ１、ＦＷ２及びＦＷ３を有する。本件で用いられる軽鎖フレームワーク領域配列には、カバットによる付番体系を用いて示されるアミノ酸位置において、ＦＷ１（１から２３の位置）、ＦＷ２（３５から４９の位置）、ＦＷ３（５７から８８の位置）及びＦＷ４（９８から１０８の位置）が含まれる。
【００７５】
いくつかの実施形態では、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片は、Ｖ３−３３*０１（配列番号１１）、Ｖ３−１１*０１（配列番号１２）、Ｖ３−３０*−１８（配列番号１３）及びＶ３−４８*０１（配列番号１４）からなる群から選択されるヒト遺伝子の産物であるか、又は当該ヒト遺伝子に由来する重鎖可変フレームワーク領域と、Ｖ１−５*０３（配列番号３）、Ｖ１−２７*０１（配列番号４）、Ｖ１−３９*−０１（配列番号５）及びＶ１−１２*０１（配列番号６）からなる群から選択されるヒト遺伝子の産物であるか、又は当該ヒト遺伝子に由来する軽鎖可変フレームワーク領域とを有し、好ましくはＶ３−３０*−１８（配列番号１３）又はＶ３−４８*０１（配列番号１４）のヒト遺伝子の産物であるか、又は当該ヒト遺伝子に由来する重鎖可変フレームワーク領域と、Ｖ１−３９*−０１（配列番号５）のヒト遺伝子の産物であるか、又は当該ヒト遺伝子に由来する軽鎖可変フレームワーク領域とを有し、より好ましくはＶ３−３０*−１８（配列番号１３）のヒト遺伝子の産物であるか、又は当該ヒト遺伝子に由来する重鎖可変フレームワーク領域と、Ｖ１−３９*−０１（配列番号５）のヒト遺伝子の産物であるか、又は当該ヒト遺伝子に由来する軽鎖可変フレームワーク領域とを有する。
【００７６】
同様に、異なるヒト遺伝子の産物中に存在するか、又は当該ヒト遺伝子に由来する重鎖可変領域フレームワーク領域及び／又は異なるヒト遺伝子の産物中に存在するか、又は当該ヒト遺伝子に由来する軽鎖可変領域フレームワーク領域の組合せも、本発明に包含される。例えば、Ｖ３−３０*−１８（配列番号１３）の産物中に存在するか、又は当該ヒト遺伝子に由来するＦＷ１及びＦＷ２にＶ３−４８*０１（配列番号１４）の産物中に存在するか、又は当該ヒト遺伝子に由来するＦＷ３を組み合わせたもの、及び／又はＶ１−３９*−０１（配列番号５）の産物中に存在するか、又は当該ヒト遺伝子に由来するＦＷ１及びＦＷ２にＶ１−１２*０１（配列番号６）の産物中に存在するか、又は当該ヒト遺伝子に由来するＦＷ３を組み合わせたものである。
【００７７】
ヒト重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子のジャームラインＤＮＡ配列は、ヒトジャームライン配列データベース「ＶＢａｓｅ」（インターネット上（ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅ）にて利用可能）、あるいはＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｉ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）"Ｔｈｅ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ＶＨ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  Ｒｅｖｅａｌｓ  ａｂｏｕｔ  Ｆｉｆｔｙ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｏｆ  ＶＨ  Ｓｅｇｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  Ｌｏｏｐｓ"  Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６−７９８、及びＣｏｘ，Ｊ．Ｐ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）"Ａ  Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ＶＨ  Ｓｅｇｍｅｎｔｓ  Ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  Ｓｔｒｏｎｇ  Ｂｉａｓ  ｉｎ  ｔｈｅｉｒ  Ｕｓａｇｅ"  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：８２７−８３６で見つけることができる。また別の例として、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースにおいてヒト重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子のジャームラインＤＮＡ配列を見つけることができる。
【００７８】
別の側面では、本開示は、少なくとも１つの重鎖ＣＤＲ及び／又は少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲが、少なくとも１つのアミノ酸改変を有する、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片を提供する。改変は、部位特異的変異誘発又はＰＣＲ介在変異誘発によって導入することができ、その抗体結合性又は他の対象とする機能的特性への効果は、本明細書において実施例に記載するインビトロ又はインビボアッセイにより評価することができる。好ましくは、保存的改変が導入される。改変は、アミノ酸の置換、付加又は欠失であってもよいが、好ましくは置換である。通常、５つ以下、好ましくは４つ以下、より好ましくは３つ以下、更により好ましくは２つ以下、最も好ましくは１つ以下のアミノ酸改変が、ＣＤＲ領域において行われる。
【００７９】
よって、本開示は、重鎖ＣＤＲ１におけるアミノ酸置換Ｙ３２Ｆを有するアミノ酸改変、及び／又は重鎖ＣＤＲ２におけるアミノ酸置換Ｙ５８Ｆ又はＹ５９Ｆを有するアミノ酸改変、及び／又は重鎖ＣＤＲ３におけるＹ９６Ｆ、Ｙ９７Ｆ、Ｙ９８Ｆ及びＹ１００ＢＦからなる群から選択される１つ又はそれ以上のアミノ酸置換を有するアミノ酸改変を有する、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片も提供する。好ましくは、ヒト化抗体又はその断片におけるアミノ酸改変は、重鎖ＣＤＲ１におけるアミノ酸置換Ｙ３２Ｆ及び重鎖ＣＤＲ３におけるＹ９６Ｆ、Ｙ９７Ｆ、Ｙ９８Ｆ及びＹ１００ＢＦからなる群から選択されるアミノ酸置換である。より好ましくは、ヒト化抗体又はその断片におけるアミノ酸改変は、重鎖ＣＤＲ１におけるアミノ酸置換Ｙ３２Ｆ及び／又は重鎖ＣＤＲ３におけるアミノ酸置換Ｙ１００ＢＦである。
【００８０】
本開示は、軽鎖ＣＤＲ１におけるアミノ酸置換Ｙ３２Ｆを有するアミノ酸改変、及び／又はＣＤＲ３におけるＮ９２Ａ、Ｔ９３Ａ及びＴ９３Ｖからなる群から選択されるアミノ酸置換を有するアミノ酸改変を有する、ヒト化抗体又はその断片も提供する。好ましくは、ヒト化抗体又はその断片のアミノ酸改変は、軽鎖ＣＤＲ１におけるアミノ酸置換Ｙ３２Ｆ及び／又は軽鎖ＣＤＲ３におけるアミノ酸置換Ｎ９２Ａである。
【００８１】
いくつかの実施形態では、本開示は、重鎖ＣＤＲ１におけるアミノ酸置換Ｙ３２Ｆを有するアミノ酸改変、及び／又は重鎖ＣＤＲ２におけるアミノ酸置換Ｙ５８Ｆ又はＹ５９Ｆを有するアミノ酸改変、及び／又は重鎖ＣＤＲ３におけるＹ９６Ｆ、Ｙ９７Ｆ、Ｙ９８Ｆ及びＹ１００ＢＦからなる群から選択される１つ又はそれ以上のアミノ酸置換を有するアミノ酸改変、並びに軽鎖ＣＤＲ１におけるアミノ酸置換Ｙ３２Ｆを有するアミノ酸改変、及び／又はＣＤＲ３におけるＮ９２Ａ、Ｔ９３Ａ及びＴ９３Ｖからなる群から選択されるアミノ酸置換を有するアミノ酸改変を有する、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片を提供する。
【００８２】
ある実施形態では、フレームワーク配列を可変領域の操作に用いて、変異抗体を作成することができる。本発明の変異抗体には、例えば抗体の特性を向上させるために、ＶＨ及び／又はＶＫのフレームワーク残基について改変がなされたものが含まれる。通常、そのようなフレームワークの改変は、抗体の免疫原性を下げるために行われる。例えば、１つ又はそれ以上のフレームワーク残基を対応するマウス配列へと「復帰変異（ｂａｃｋｍｕｔａｔｅ）」させる、又は１つ又はそれ以上のフレームワーク残基を対応するジャームライン配列へと「復帰変異」させる手法がある。
【００８３】
よって、さらなる側面では、本開示は、ヒト化抗体又はその断片の重鎖可変領域のフレームワーク領域の少なくとも１つが、対応マウス抗体の重鎖可変領域の対応するフレームワーク領域からの１つのアミノ酸改変を有する、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片を提供する。好ましくは、アミノ酸改変は、アミノ酸置換である。通常、５つ以下、好ましくは４つ以下、より好ましくは３つ以下、更により好ましくは２つ以下、最も好ましくは１つ以下のアミノ酸改変が、フレームワーク領域において行われる。
【００８４】
いくつかの実施形態では、本開示は、重鎖可変領域のフレームワーク領域におけるアミノ酸改変が、３７、４２、４８、４９、６７、７１、７８及び９４からなる群から選択されるアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を有する、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片を提供する。好ましくは、重鎖可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸置換は、４２、６７、７１、７８及び９４からなる群から選択されるアミノ酸位置におけるものである。より好ましくは、重鎖可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸置換は、Ｇ４２Ｒ、Ｆ６７Ｌ、Ｒ７１Ｋ、Ｌ７８Ｖ及びＲ９４Ｋからなる群から選択されるが、ただしアミノ酸改変がＲ９４Ｋである場合は、重鎖可変領域配列が配列番号１９又は２０ではないことを条件とする。なお、Ｒ９４Ｋが、重鎖可変領域のフレームワーク領域における最も好ましいアミノ酸置換である。
【００８５】
本開示は、ヒト化抗体又はその断片の軽鎖可変領域のすくなくとも１つのフレームワーク領域が、対応マウス抗体の軽鎖可変領域の対応するフレームワーク領域からの、すくなくとも１つのアミノ酸改変を有する、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片を提供する。好ましくは、アミノ酸改変は、アミノ酸置換である。通常、５つ以下、好ましくは４つ以下、より好ましくは３つ以下、更により好ましくは２つ以下、最も好ましくは１つ以下のアミノ酸改変が、フレームワーク領域において行われる。いくつかの実施形態では、本開示は、軽鎖可変領域配列のフレームワーク領域におけるアミノ酸改変が、４４、７１及び８７からなる群から選択されるアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を有する、ヒト化抗体又はその断片を提供する。より好ましくは、軽鎖可変領域配列のフレームワーク領域におけるアミノ酸置換は、Ｐ４４Ｖ、Ｐ４４Ｉ、Ｐ４４Ｌ、Ｆ７１Ｙ、Ｆ７１Ｈ、Ｆ７１Ｓ、Ｆ７１Ｔ及びＹ８７Ｆからなる群から選択される。最も好ましくは、軽鎖可変領域配列のフレームワーク領域におけるアミノ酸置換は、Ｐ４４Ｖ、Ｐ４４Ｉ、Ｆ７１Ｙ及びＹ８７Ｆからなる群から選択されるが、Ｐ４４Ｉが特に好ましい。
【００８６】
いくつかの実施形態では、本発明のヒト化抗体又はその断片は、上記の重鎖可変領域配列のフレームワーク領域におけるアミノ酸改変と、上記の軽鎖可変領域配列のフレームワーク領域におけるアミノ酸改変とを有しうる。
【００８７】
本開示は、配列番号３３、３４、３５、３６、３７、４３、４４、４５、４６、４７、５４及び５５からなる群から選択される、好ましくは配列番号３７、４３及び４７からなる群から選択される、より好ましくは配列番号３７及び４７からなる群から選択される重鎖可変領域を有する、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片をも提供する。
【００８８】
本開示は、配列番号２５、３８、３９、４０、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２及び６３からなる群から選択される、好ましくは配列番号２５、５９及び６０からなる群から選択される、より好ましくは配列番号５９及び６０からなる群から選択される軽鎖可変領域を有する、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片を提供する。
【００８９】
いくつかの実施形態では、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片は、配列番号３３、３４、３５、３６、３７、４３、４４、４５、４６、４７、５４及び５５からなる群から選択される重鎖可変領域と、配列番号２５、３８、３９、４０、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２及び６３からなる群から選択される軽鎖可変領域とを有する。
【００９０】
いくつかの実施形態では、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片は、配列番号３７、４３及び４７からなる群から選択される重鎖可変領域と、配列番号２５、５９及び６０からなる群から選択される軽鎖可変領域とを有する。より好ましい実施形態では、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片は、配列番号３７及び４７からなる群から選択される重鎖可変領域と、配列番号５９及び６０からなる群から選択される軽鎖可変領域とを有する。もっとも好ましいのは、配列番号３７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と配列番号５９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを有するヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片、配列番号４７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と配列番号６０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを有するヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片、配列番号４７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と配列番号５９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを有するヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片、配列番号３７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と配列番号２５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを有するヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片、配列番号３７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と配列番号４９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを有するヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片、配列番号４７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と配列番号４９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを有するヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片、又は配列番号４３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と配列番号５９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを有するヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片、特に、配列番号３７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と配列番号５９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを有するヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片、配列番号４７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と配列番号６０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを有するヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片、配列番号４７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と配列番号５９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを有するヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片である。
【００９１】
これらの重鎖及び軽鎖可変領域配列は、それぞれがヒトＣＤ１９に結合できることから、重鎖及び軽鎖可変領域配列を「組合せ、マッチさせ」て、本発明の抗ＣＤ１９結合分子を作り出すことができる。このような「組合せ、マッチさせ」た抗体のＣＤ１９結合は、例えば実施例に記載の結合アッセイを用いて試験することができる。
【００９２】
いくつかの実施形態では、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片は、配列番号６４のアミノ酸配列を有する重鎖配列と、配列番号６５のアミノ酸配列を有する軽鎖配列とを有する。
【００９３】
いくつかの実施形態では、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片は、配列番号６６のアミノ酸配列を有する重鎖配列と、配列番号６７のアミノ酸配列を有する軽鎖配列とを有する。
【００９４】
いくつかの実施形態では、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片は、配列番号６６のアミノ酸配列を有する重鎖配列と、配列番号６５のアミノ酸配列を有する軽鎖配列とを有する。
【００９５】
本開示は、ヒト重鎖及び／又は軽鎖定常ドメインを更に有する、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片も提供する。ヒト重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡｌ、ＩｇＡ２、ＩｇＭ１、ＩｇＭ２、ＩｇＤ及びＩｇＥからなるヒト免疫グロブリンの群から選ばれるものであってよく、ヒト重鎖定常領域ＩｇＧ、特にＩｇＧ１が好ましい。ヒト軽鎖定常領域は、κ及びλ定常領域からなるヒト免疫グロブリンの群から選択されてよく、ヒトκ定常領域が好ましい。いくつかの好ましい実施形態では、ヒト化抗体又はその断片は、ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメインと、ヒト軽鎖κ定常ドメインとを有する。本開示は、ヒトＩｇＧ１由来のＣＨ１と、ヒトＩｇＧ１由来のヒンジと、ヒトＩｇＧ３由来のＦｃ領域とを有するアイソタイプ変異体を有するヒト重鎖定常領域を有する、ヒト重鎖及び／又は軽鎖定常領域を有するヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片も提供する。好ましくは、アイソタイプ変異体を有するヒト化抗体は、全長抗体である。ヒトＩｇＧ１由来のＣＨ１と、ヒトＩｇＧ１由来のヒンジと、ヒトＩｇＧ３由来のＦｃ領域とを有するアイソタイプ変異体を有するヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片は、配列番号１２４のアミノ酸配列を有する重鎖配列と、配列番号６５のアミノ酸配列を有する軽鎖配列とを有するものが特に好ましい。アイソタイプ変異体は、ヒトＩｇＧ１（通常は未変性ヒトＩｇＧ１）由来のヒト重鎖定常領域を有するヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片と比較して、即ちアイソタイプ変異体とは改変した重鎖定常領域のみが異なるヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片と比較して、向上した補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）を示すことが知られている。
【００９６】
本開示は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、２重特異性一本鎖Ｆｖ２量体、２重特異性抗体、３重特異性抗体、及び同一又は異なる抗体に遺伝子的に融合されたｓｃＦｖからなる群から選択される、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体の断片も提供する。好ましい断片は、ｓｃＦｖ、２重特異性一本鎖Ｆｖ２量体及び３重特異性抗体である。本開示は、ヒトＣＤ１９に結合する全長ヒト化抗体も提供する。
【００９７】
フレームワーク領域又はＣＤＲ領域における改変に加えて、又はそれに代えて、本発明の抗体は、Ｆｃ領域における改変を含むように操作されていてもよく、典型的には血中半減期、補体固定、Ｆｃ受容体結合性及び／又は抗原依存性細胞性細胞障害といった抗体の機能的特性の１つ又はそれ以上を変化させるために行われる。更に、本発明の抗体は、化学的な改変（例えば、１つ又はそれ以上の化学成分を抗体に付加することができる）、又は糖鎖修飾を変更する改変を受けたものであってもよい。これらの実施形態については、各々以下に詳述する。以下に示すＦｃ領域における改変の概要は、カバットのＥＵインデックスにおけるＦｃ領域の残基の番号付けに従っている。ある実施形態では、ＣＨ１のヒンジ領域が、ヒンジ領域のシステイン残基数が変化するよう（例えば、増加又は減少するよう）改変されている。この手法については、Ｂｏｄｍｅｒらによる米国特許第５，６７７，４２５号に記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域におけるシステイン残基数は、例えば、軽鎖及び重鎖の組み立てを容易にするため、又は抗体の安定性を減少若しくは増加させるために変更される。別の実施形態では、抗体のＦｃヒンジ領域を変異させて、抗体の生物学的半減期を減少させている。より具体的には、抗体のブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）結合性を未変性ＦｃヒンジドメインのＳｐＡ結合性と比べて低下させるような、Ｆｃヒンジ断片のＣＨ２−ＣＨ３ドメイン境界領域における１つ又はそれ以上のアミノ酸変異を導入する。この手法は、Ｗａｒｄらによる米国特許第６，１６５，７４５号に詳述されている。別の実施形態では、抗体は、生物学的半減期が増加するよう改変されている。様々な手法が可能である。例えば、以下のような変異の１つ又はそれ以上を導入することができる：Ｗａｒｄらの米国特許第６，２７７，３７５号に記載されるＴ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆ。あるいは、Ｐｒｅｓｔａらによる米国特許第５，８６９，０４６号及び６，１２１，０２２号に記載されるように、生物学的半減期を増加させるために、ＩｇＧのＦｃ領域ＣＨ２ドメインの２つのループから得たサルベージ受容体に結合するエピトープを含むように、ＣＨ１又はＣＬ領域に変更を加えることができる。さらなる実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置き換えることでＦｃ領域を変更して、抗体のエフェクター機能を変更する。例えば、抗体のエフェクターリガンドへの親和性を変更しながらも親抗体の抗体結合能が保持されるように、２３４、２３５、２３６、２３７、２９７、３１８、３２０及び３２２のアミノ酸残基から選択される１つ以上のアミノ酸を他のアミノ酸に置き換えることができる。親和性を変更する対象のエフェクターリガンドは、例えばＦｃ受容体又は補体のＣ１成分であってよい。この手法は、Ｗｉｎｔｅｒらによる米国特許第５，６２４，８２１号及び５，６４８，２６０号に詳述されている。別の例では、抗体のＣ１ｑ結合性が変化するように、及び／又は抗体の補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）が減少若しくは無効化されるように、３２９、３３１及び３２２のアミノ酸残基から選択される１つ以上のアミノ酸を異なるアミノ酸残基に置き換えることができる。この手法は、Ｉｄｕｓｏｇｉｅらによる米国特許第６，１９４，５５１号に詳述されている。別の例では、ＣＨ２ドメインのＮ末端領域にある２３１から２３８のアミノ酸位置における１つ又はそれ以上のアミノ酸残基を変更し、それにより抗体が補体を固定する能力を変化させている。この手法は、ＢｏｄｍｅｒらによるＰＣＴ公報ＷＯ９４／２９３５１に詳述されている。更に別の例では、以下のアミノ酸位置：２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８又は４３９における１つ以上のアミノ酸を改変することによってＦｃ領域を改変して、抗体の抗体依存性細胞性細胞障害（ＡＤＣＣ）を増加させ、及び／又は抗体のＦｃγ受容体に対する親和性を増加させている。この手法は、ＰｒｅｓｔｒａによるＰＣＴ公報ＷＯ００／４２０７２に記載されている。
【００９８】
よって、好ましい実施形態では、本開示は、親抗体のヒトＩｇＧのＦｃ領域と比べて少なくとも１つのアミノ酸改変を有するヒトＩｇＧの変異Ｆｃ領域を有し、そのヒトＩｇＧの変異Ｆｃ領域を有する抗体は、親細胞と比較して異なるエフェクター機能を示す、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片を提供する。好ましくは、抗体はヒトＩｇＧ１の変異Ｆｃ領域を有する。より好ましくは、ヒトＩｇＧ１の変異Ｆｃ領域を有する全長抗体である。親抗体とは、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片であって、ヒトＩｇＧ変異Ｆｃ領域を有するヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体とはヒトＩｇＧのＦｃ領域におけるアミノ酸改変を除き同一であり、通常はヒトＩｇＧの未変性Ｆｃ領域を有する抗体である。アミノ酸改変は、好ましくはアイソタイプ型ではない。
【００９９】
変更されるエフェクター機能は、通常は抗体の補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）及び／又はＣ１ｑ結合性及び／又は抗体依存性細胞媒介性細胞障害（ＡＤＣＣ）及び／又はＦｃγ受容体に対する結合親和性であり、好ましくは補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）及び／又は抗体依存性細胞媒介性細胞障害（ＡＤＣＣ）である。抗体のＣＤＣ、Ｃ１ｑ結合、ＡＤＣＣ及びＦｃγ受容体に対する結合親和性は、当分野において公知且つ市販の標準的なインビトロアッセイにより測定される。通常、ＡＤＣＣは、例えば本願の実施例４に記載されるような乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）リリースアッセイにより測定され、ＣＤＣは、例えば本願の実施例１０に記載されるようなセルベースアッセイにより測定される。
【０１００】
ある実施形態では、親抗体と比較してエフェクター機能を変化させるアミノ酸改変は、カバットによる付番体系を用いて示されるアミノ酸位置において、２６９、２７４、２７６、２９８、３２４及び３３４からなる群から選択される、好ましくは２６９、２９８及び３２４からなる群から選択される、より好ましくは２９８及び／又は３２４のアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を有する。
【０１０１】
さらなる実施形態では、親抗体と比較してエフェクター機能を変化させるアミノ酸改変は、カバットによる付番体系を用いて示されるアミノ酸位置において、Ｅ２６９Ｄ、Ｋ２７４Ｑ、Ｎ２７６Ｋ、Ｓ２９８Ａ、Ｓ３２４Ｎ及びＫ３３４Ｒからなる群から選択される、好ましくはＥ２６９Ｄ、Ｓ２９８Ａ及びＳ３２４Ｎからなる群から選択される、より好ましくはＳ２９８Ａ及び／又はＳ３２４Ｎのアミノ酸置換を有する。
【０１０２】
さらなる実施形態では、親抗体と比較してエフェクター機能を変化させるアミノ酸改変は、カバットによる付番体系を用いて示されるアミノ酸位置において、２６９／２７４、２６９／２７６、２６９／２９８、２６９／３２４、２６９／３３４、２７４／２７６、２７４／２９８、２７４／３２４、２７４／３３４、２７６／２９８、２７６／３２４、２７６／３３４、２９８／３２４、２９８／３３４、３２４／３３４、２６９／２７４／２７６、２６９／２７４／２９８、２６９／２７４／３２４、２６９／２７４／３３４、２６９／２７６／２９８、２６９／２７６／３２４、２６９／２７６／３３４、２６９／２９８／３２４、２６９／２９８／３３４、２７４／２７６／２９８、２７４／２７６／３２４、２７４／２７６／３３４、２７４／２９８／３２４、２７４／２９８／３３４、２７６／２９８／３２４及び２７６／２９８／３３４からなる群から選択される、好ましくは２７４／２７６、２６９／２９８、２９８／３２４、２７４／２７６／３３４及び２６９／２９８／３２４からなる群から選択される、より好ましくは２９８／３２４及び２６９／２９８／３２４からなる群から選択されるアミノ酸位置におけるアミノ酸置換の組合せを有する。
【０１０３】
さらなる実施形態では、親抗体と比較してエフェクター機能を変化させるアミノ酸改変は、カバットによる付番体系を用いて示されるアミノ酸位置において、Ｅ２６９Ｄ／Ｋ２７４Ｑ、Ｅ２６９Ｄ／Ｎ２７６Ｋ、Ｅ２６９Ｄ／Ｓ２９８Ａ、Ｅ２６９Ｄ／Ｓ３２４Ｎ、Ｅ２６９Ｄ／Ｋ３３４Ｒ、Ｋ２７４Ｑ／Ｎ２７６Ｋ、Ｋ２７４Ｑ／Ｓ２９８Ａ、Ｋ２７４Ｑ／Ｓ３２４Ｎ、Ｋ２７４Ｑ／Ｋ３３４Ｒ、Ｎ２７６Ｋ／Ｓ２９８Ａ、Ｎ２７６Ｋ／Ｓ３２４Ｎ、Ｎ２７６Ｋ／Ｋ３３４Ｒ、Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎ、Ｓ２９８Ａ／Ｋ３３４Ｒ、Ｓ３２４Ｎ／Ｋ３３４Ｒ、Ｅ２６９Ｄ／Ｋ２７４Ｑ／Ｎ２７６Ｋ、Ｅ２６９Ｄ／Ｋ２７４Ｑ／Ｓ２９８Ａ、Ｅ２６９Ｄ／Ｋ２７４Ｑ／Ｓ３２４Ｎ、Ｅ２６９Ｄ／Ｋ２７４Ｑ／Ｋ３３４Ｒ、Ｅ２６９Ｄ／Ｎ２７６Ｋ／Ｓ２９８Ａ、Ｅ２６９Ｄ／Ｎ２７６Ｋ／Ｓ３２４Ｎ、Ｅ２６９Ｄ／Ｎ２７６Ｋ／Ｋ３３４Ｒ、Ｅ２６９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎ、Ｅ２６９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｋ３３４Ｒ、Ｋ２７４Ｑ／Ｎ２７６Ｋ／Ｓ２９８Ａ、Ｋ２７４Ｑ／Ｎ２７６Ｋ／Ｓ３２４Ｎ、Ｋ２７４Ｑ／Ｎ２７６Ｋ／Ｋ３３４Ｒ、Ｋ２７４Ｑ／Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎ、Ｋ２７４Ｑ／Ｓ２９８Ａ／Ｋ３３４Ｒ、Ｎ２７６Ｋ／Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎ及びＮ２７６Ｋ／Ｓ２９８Ａ／Ｋ３３４Ｒからなる群から選択される、好ましくはＫ２７４Ｑ／Ｎ２７６Ｋ、Ｅ２６９Ｄ／Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎ、Ｋ２７４Ｑ／Ｎ２７６Ｋ／Ｋ３３４Ｒ及びＥ２６９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎからなる群から選択される、より好ましくはＳ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎ及びＥ２６９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎからなる群から選択されるアミノ酸改変の組合せを有する。
【０１０４】
好ましくは、ヒトＩｇＧの変異Ｆｃ領域を有する本開示の抗ＣＤ１９ヒト化抗体は、上記のインビトロアッセイにおいて、親抗体と比較して向上したＣＤＣを示す。本件で用いられる向上したＣＤＣを示す、には、ａ）親抗体と比較して増強されたＣＤＣを示すこと、即ち親抗体も元々ＣＤＣを示すがヒトＩｇＧのＦｃ領域のアミノ酸改変によりそれが増強されていること、ｂ）親抗体と比較して新たにＣＤＣ活性を示すこと、即ち親抗体はＣＤＣを示さないが、ヒトＩｇＧのＦｃ領域におけるアミノ酸改変によりＣＤＣが新たに導入されていること、が含まれる。
【０１０５】
さらなる実施形態では、インビトロアッセイで親抗体と比較して向上したＣＤＣを示す本発明の抗ＣＤ１９ヒト化抗体におけるヒトＩｇＧのＦｃ領域の変異は、カバットによる付番体系を用いて示されるアミノ酸位置において、３２４、３３４、２７４／２７６、２９８／３２４、２７４／２７６／３３４及び２６９／２９８／３２４からなる群から選択される、好ましくは３２４、３３４、２９８／３２４、２７４／２７６／３３４及び２６９／２９８／３２４からなる群から選択される、より好ましくは３２４、２９８／３２４及び２６９／２９８／３２４からなる群から選択されるアミノ酸位置におけるアミノ酸置換又はアミノ酸置換の組合せを有する。
【０１０６】
さらなる実施形態では、インビトロアッセイで親抗体と比較して向上したＣＤＣを示す本発明の抗ＣＤ１９ヒト化抗体における、ヒトＩｇＧのＦｃ領域の変異は、カバットによる付番体系を用いて示されるアミノ酸位置において、Ｓ３２４Ｎ、Ｋ３３４Ｒ、Ｋ２７４Ｑ／Ｎ２７６Ｋ、Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎ、Ｋ２７４Ｑ／Ｎ２７６Ｋ／Ｋ３３４Ｒ及びＥ２６９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎからなる群から選択される、好ましくはＳ３２４Ｎ、Ｋ３３４Ｒ、Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎ、Ｋ２７４Ｑ／Ｎ２７６Ｋ／Ｋ３３４Ｒ及びＥ２６９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎからなる群から選択される、より好ましくはＳ３２４Ｎ、Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎ及びＥ２６９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎからなる群から選択されるアミノ酸位置におけるアミノ酸置換又はアミノ酸置換の組合せを有する。
【０１０７】
さらなる実施形態では、インビトロアッセイで親抗体と比較して向上したＡＤＣＣを示す抗ＣＤ１９ヒト化抗体における、ヒトＩｇＧのＦｃ領域の変異は、カバットによる付番体系を用いて示されるアミノ酸位置において、２６９、２９８、２６９／２９８、２６９／３２４、２９８／３２４及び２６９／２９８／３２４からなる群から選択される、好ましくは２９８、２６９／２９８及び２６９／２９８／３２４からなる群から選択されるアミノ酸位置におけるアミノ酸置換又はアミノ酸置換の組合せを有する。
【０１０８】
さらなる実施形態では、インビトロアッセイで親抗体と比較して向上したＡＤＣＣを示す本発明の抗ＣＤ１９ヒト化抗体における、ヒトＩｇＧのＦｃ領域の変異は、カバットによる付番体系を用いて示されるアミノ酸位置において、Ｅ２６９Ｄ、Ｓ２９８Ａ、Ｅ２６９Ｄ／Ｓ２９８Ａ、Ｅ２６９Ｄ／Ｓ３２４Ｎ、Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎ及びＥ２６９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎからなる群から選択される、好ましくはＳ２９８Ａ、Ｅ２６９Ｄ／Ｓ２９８Ａ及びＥ２６９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎからなる群から選択されるアミノ酸位置におけるアミノ酸置換又はアミノ酸置換の組合せを有する。
【０１０９】
よって、本開示が提供する、親ヒト化抗体と比較して異なるエフェクター機能を示すＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片であって特に好ましいものは、配列番号１１４のアミノ酸配列を有する重鎖配列（ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ／Ｓ２９８Ａ）及び配列番号６５のアミノ酸配列を有する軽鎖配列（ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ）；配列番号１１５のアミノ酸配列を有する重鎖配列（ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ／Ｅ２６９Ｄ／Ｓ２９８Ａ）及び配列番号６５のアミノ酸配列を有する軽鎖配列（ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ）；配列番号１１６のアミノ酸配列を有する重鎖配列（ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ／Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎ）及び配列番号６５のアミノ酸配列を有する軽鎖配列（ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ）；配列番号１１７のアミノ酸配列を有する重鎖配列（ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ／Ｅ２６９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎ）及び配列番号６５のアミノ酸配列を有する軽鎖配列（ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ）；配列番号１１８のアミノ酸配列を有する重鎖配列（ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ／Ｓ３２４Ｎ）及び配列番号６５のアミノ酸配列を有する軽鎖配列（ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ）；配列番号１１９のアミノ酸配列を有する重鎖配列（ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ／Ｋ２７４Ｑ）及び配列番号６５のアミノ酸配列を有する軽鎖配列（ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ）；配列番号１２０のアミノ酸配列を有する重鎖配列（ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ／Ｎ２７６Ｋ）及び配列番号６５のアミノ酸配列を有する軽鎖配列（ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ）；配列番号１２１のアミノ酸配列を有する重鎖配列（ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ／Ｋ３３４Ｒ）及び配列番号６５のアミノ酸配列を有する軽鎖配列（ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ）配列番号１２２のアミノ酸配列を有する重鎖配列（ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ／Ｋ２７４Ｑ／Ｎ２７６Ｋ）及び配列番号６５のアミノ酸配列を有する軽鎖配列（ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ）；又は配列番号１２３のアミノ酸配列を有する重鎖配列（ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ／Ｋ２７４Ｑ／Ｎ２７６Ｋ／Ｋ３３４Ｒ）及び配列番号６５のアミノ酸配列を有する軽鎖配列（ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ）を有する、ヒト化抗体又はその断片である。
【０１１０】
本開示は更に、親抗体のアミノ酸位置３２４のセリンがアスパラギンに置き換えられたアミノ酸置換Ｓ３２４Ｎを有するヒトＩｇＧの変異Ｆｃ領域を有し、そのヒトＩｇＧの変異Ｆｃ領域を有する抗体は、親抗体と比較して向上した補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）を示す、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片を提供する。好ましくは、抗体はヒトＩｇＧ１の変異Ｆｃ領域を有する。より好ましくは、ヒトＩｇＧ１の変異Ｆｃ領域を有する全長抗体である。驚くべきことに、アミノ酸位置３２４における１６の様々なアミノ酸置換のうち、実施例１０に示すように、Ｓ３２４Ｎ置換によりＣＤＣが親抗体と比較して大きく向上した。一方で、他の置換によっては、ＣＤＣは親抗体と比較して向上しなかった。理論にとらわれないのであれば、このＳ３２４Ｎ置換によるＣＤＣについての予期しない選択的な効果は、ヒト補体成分Ｃ１ｑへの結合性が増強されたためであろうと思われる。
【０１１１】
本開示は、ヒトＩｇＧのＦｃ領域を有し、当該ヒトＩｇＧのＦｃ領域に付加した成熟コア糖鎖構造のフコースが欠失している、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片も提供する。好ましくは、抗体は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域を有し、当該ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に付加した成熟コア糖鎖構造のフコースが欠失している。より好ましくは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域を有し、当該ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に付加された成熟コア糖鎖構造のフコースが欠失している、全長抗体である。ＷＯ２００３／０３５８３５によれば、ヒトＩｇＧのＦｃ領域に付加した成熟コア糖鎖構造におけるフコースの欠失によって、ＡＤＣＣが増強されうることが知られている。よって、さらなる実施形態では、本開示のヒト化抗体又はその断片は、ヒトＩｇＧのＦｃ領域を有し、当該ヒトＩｇＧのＦｃ領域に付加した成熟コア糖鎖構造のフコースが欠失しており、そのフコースを欠く抗体は、フコースが欠失していない親ヒト化抗体又はその断片と比較して増強されたＡＤＣＣを示す。ヒトＩｇＧのＦｃ領域を有し、当該ヒトＩｇＧのＦｃ領域に付加した成熟コア糖鎖構造のフコースが欠失しており、そのフコースを欠失した抗体がフコースを欠失していない親ヒト化抗体又はその断片と比較して増強されたＡＤＣＣを示す、ヒトＣＤ１９に結合する抗体又はその断片は、配列番号６４のアミノ酸配列を有する重鎖配列と、配列番号６５のアミノ酸配列を有する軽鎖配列とを有するものが好ましい。フコースを欠失した抗体を作成する方法として、例えば、（ａ）発現しているフコシル化タンパクの能力を減ずるよう（又は不活化するよう）操作された、又はそのような変異の宿主細胞の使用、（ｂ）フコシル化を妨げる又は減少させる条件下での細胞の培養、（ｃ）翻訳後のフコースの除去（例えば、フコシダーゼ酵素による）、（ｄ）翻訳後、例えば糖鎖修飾されていない糖タンパクを組み換え発現させた後の、所望の糖鎖の付加、又は（ｅ）糖タンパクを精製してフコシル化されていないものを選び出す、がある。好ましくは、実施例１４に記載の方法、例えばＬｏｎｇｍｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２），Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．３６５−９２又はＩｍａｉ−Ｎｉｓｈｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．（２００７），ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７，８４に記載の方法が用いられる。
【０１１２】
［抗ＣＤ１９抗体の特性］
ヒトＣＤ１９などに対する抗体の結合能を評価する標準的なアッセイは、当分野において公知であり、例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、ＲＩＡ、フローサイトメトリー分析が挙げられる。実施例には、好適なアッセイが詳述されている。抗体の結合キネティクス（例えば、Ｋｄなどの結合親和性）もまた、Ｓｃａｔｃｈａｒｄの方法又はＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムによる分析などの当分野で公知の標準的なアッセイにより評価することができ、例えば実施例３に記載されるように行い、算出することができる。相対親和性Ｋｉは、当分野で公知の標準的な競合アッセイにより評価することができ、例えば実施例３に記載されるように行い、算出することができる。結合性を評価するには、Ｒａｊｉ腫瘍細胞（ヒトバーキットリンパ腫、ＤＳＭＺＡＣＣ３１９）、ＮＡＬＭ−６（ヒト前駆Ｂ細胞白血病、ＤＳＭＺＡＣ１２８）又はＳＵ−ＤＨＬ−６（ヒトＢ細胞白血病、ＤＳＭＺＡＣＣ５７２）を用いることができ、好ましくは、ヒトバーキットリンパ腫ＤＳＭＺＡＣＣ３１９などのＲａｊｉ腫瘍細胞又はＳＵ−ＤＨＬ−６（ヒトＢ細胞白血病、ＤＳＭＺＡＣＣ５７２）、より好ましくはヒトバーキットリンパ腫ＤＳＭＺＡＣＣ３１９などのＲａｊｉ腫瘍細胞が用いられる。これらの細胞は、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ，ブラウンシュヴァイク，ドイツ等の公衆に利用可能なソースから入手可能であり、フローサイトメトリー等の標準的なアッセイに用いることができる。本発明のアッセイに使用可能な対応キメラ抗体とは、通常、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域に融合したＦＭＣ６３マウス重鎖可変ドメインと、κ定常ドメインに融合したマウス軽鎖可変ドメインとからなる、マウス抗体ＦＭＣ６３のキメラ体である。好ましくは、本発明のアッセイに使用される対応キメラ抗体は、配列番号６８のアミノ酸配列を有する重鎖配列と、配列番号６９のアミノ酸配列とを有する軽鎖配列とを有する、ＦＭＣ６３抗体のキメラ体である。本発明のアッセイに使用可能な非ヒト化親抗体又は対応する非ヒト化親抗体とは、通常は、マウス抗体、特にマウス抗体ＦＭＣ６３である。
【０１１３】
本開示は、対応キメラ抗体と比べて少なくとも１０％の中点蛍光（Ｍｉｄ−Ｐｏｉｎｔ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ、ＭＰＦ）でＲａｊｉ腫瘍細胞と結合する、ヒト化抗体又はその断片も提供する。Ｒａｊｉ腫瘍細胞は、その表面にＣＤ１９を発現しており、ヒト化抗体又はその断片はそこに結合することができる。中点蛍光の値は、抗体濃度に対する細胞染色の平均蛍光強度をフローサイトメトリーにより測定することにより得ることができる。好ましくは、ヒト化抗体又はその断片は、対応キメラ抗体の結合と比べて、少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも７０％、特別には少なくとも８０％、より特別には少なくとも９０％、最も特別には少なくとも９５％のＭＰＦでＲａｊｉ腫瘍細胞に結合する。上記のＲａｊｉ腫瘍細胞が、ＣＤ１９への結合性の評価に使用可能である。
【０１１４】
本開示は、５０ｎＭ以下、特別には４０ｎＭ以下、より特別には３０ｎＭ以下、更により特別には２０ｎＭ以下、最も特別には１５ｎＭ以下の親和性（Ｋｄ）でヒトＣＤ１９に結合する、ヒト化抗体又はその断片も提供する。上記のＲａｊｉ腫瘍細胞が、ヒトＣＤ１９への結合性の評価に使用可能である。
【０１１５】
本開示は、対応キメラ抗体のＣＤ１９結合親和性（Ｋｄ）の少なくとも２０％を保持している、ヒト化抗体又はその断片も提供する。好ましくは、ヒト化抗体又はその断片は、対応キメラ抗体のＣＤ１９結合親和性（Ｋｄ）の少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも６０％、最も好ましくは少なくとも８０％、特別には少なくとも９０％、より特別には少なくとも９５％を保持している。上記のＲａｊｉ腫瘍細胞又はＳＵ−ＤＨＬ−６細胞が、ヒトＣＤ１９への結合性を評価するのに使用可能である。
【０１１６】
本開示は、５０ｎＭ以下、好ましくは２０ｎＭ以下、より好ましくは１０ｎＭ以下、最も好ましくは５ｎＭ以下、特別には４ｎＭ以下、より特別には３ｎＭ以下、最も特別には少なくとも約１．５ｎＭから約５．０ｎＭ（例えば、１．９、１．６又は２．９から約２．６又は４．９ｎＭ）の親和性（Ｋｉ）でＲａｊｉ腫瘍細胞への結合に競合する、ヒト化抗体又は断片も提供する。結合の競合は、通常は対応キメラ抗体に対して測定され、上記のＲａｊｉ腫瘍細胞がＫｉの評価に使用可能である。
【０１１７】
本開示は、ヒトＣＤ１９に結合し、Ｒａｊｉ腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する、ヒト化抗体又はその断片も提供する。Ｒａｊｉ腫瘍細胞におけるアポトーシスの誘導は、アネキシンＶ及びヨウ化プロピジウム染色により測定可能である（Ｖｅｒｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．１８４：３９−５１）。対応キメラ抗体がアポトーシスの効果を持たないことからすれば、本発明のヒト化抗体がアポトーシス誘導の特性を示したことは大変な驚きである。上記のＲａｊｉ腫瘍細胞が、アポトーシスの評価に使用可能である。よって、本開示は、Ｒａｊｉ腫瘍細胞の少なくとも１０％、好ましくは少なくとも１５％、より好ましくは少なくとも２０％、最も好ましくは少なくとも２５％においてアポトーシスが誘導される、ヒト化抗体又はその断片も提供する。
【０１１８】
本開示は、ヒトＣＤ１９に結合し、Ｒａｊｉ腫瘍細胞に対するＡＤＣＣ活性を誘導する、ヒト化抗体又はその断片も提供する。ＡＤＣＣによる上記のＲａｊｉ腫瘍細胞などの標的細胞の選択的な溶解は、例えば乳酸デヒドロゲナーゼリリースアッセイ（ＣｙｔｏＴｏｘ  ９６  Ｎｏｎ  ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  ａｓｓａｙ，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＵＳＡ）を用いて評価することができる。驚くべきことに、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片は、対応キメラ抗体によるＡＣＤＤ活性の誘導と同等に又はそれを上回って、Ｒａｊｉ腫瘍細胞におけるＡＤＣＣ活性を誘導する。好ましくは、ＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその結合性断片は、対応キメラ抗体の少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも１００％、最も好ましくは少なくとも１２０％のＡＤＣＣ活性がある。
【０１１９】
本開示は、悪性Ｂ細胞の増殖を阻害する、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片も提供する。好ましくは、ヒト化抗体又はその断片は、対応キメラ抗体による悪性Ｂ細胞の増殖阻害能の少なくとも６０％、より好ましくは８０％、最も好ましくは少なくとも９０％、特別には９５％、より特別には１００％を保持している。抗体による細胞増殖の阻害を測定するには、上記のＲａｊｉ腫瘍細胞又はＳＵ−ＤＨＬ−６細胞が、悪性Ｂ細胞の増殖の評価に使用可能である。
【０１２０】
本開示は、Ｒａｊｉ腫瘍細胞のクローン形成能を阻害する、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片も提供する。クローン形成能の阻害は、抗体による治療後のクローン数を計数することで測定され、例えばＮａｈｉｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｂｌｏｏｄ．０：ｂｌｏｏｄ−２００８−０８−１７３３６９ｖ１"（Ｂｌｏｏｄ，２００９，Ｖｏｌ．１１３，Ｎｏ．１４，ｐｐ．３２７６−３２８６）に従って行うことができる。上記のＲａｊｉ腫瘍細胞が、クローン形成能の評価に使用可能である。本発明のヒト化抗体による治療後のクローン計測数は、対応キメラ抗体による治療後のクローン計測数よりも少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも６０％少ない。Ｒａｊｉ腫瘍細胞におけるクローン形成能の阻害から、本発明のヒト化抗体のＢ細胞増殖に対する強い阻害機能が確認された。
【０１２１】
本開示は、血中のＢ細胞枯渇を引き起こす、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片も提供する。好ましくは、引き起こされるＢ細胞枯渇が、対応するキメラ抗体により引き起こされるＢ細胞枯渇よりも少なくとも１．５倍、より好ましくは少なくとも２倍大きい。Ｂ細胞枯渇は、実施例に記載されるように、抗体と共にインキュベートした後の全血中の陽性Ｂ細胞％を測定することにより評価することができる。
【０１２２】
本開示は、Ｒａｊｉ腫瘍細胞に取り込まれる、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片も提供する。本発明のヒト化抗体又はその断片は、対応キメラ抗体に匹敵する程度にて取り込まれる。好ましくは、本発明のヒト化抗体を０．０１μｇ／ｍｌで用いた場合、取り込みの程度は、対応キメラ抗体が取り込まれる程度の５０％から１５０％、より好ましくは６０％から１４０％、最も好ましくは７０％から１３０％である。抗体の取り込みは、例えばサポリン毒素複合抗ヒト２次抗体を用い（Ｈｕｍ−Ｚａｐ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、上記のＲａｊｉ腫瘍細胞において評価することができる。
【０１２３】
本開示は、ＦＡＢ断片耐熱温度が６５℃を超える、好ましくは７０℃を超える、より好ましくは７５℃を超える、最も好ましくは８０℃を超える、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片も提供する。ＦＡＢ断片耐熱温度の分析には、示差走査熱量測定が用いられ、全長ＩｇＧ中におけるＦＡＢ断片の融点の中点温度（ｍｉｄ−ｐｏｉｎｔ  ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）が同定される。この種の熱量測定は、当業者に公知であり、例えばＧａｒｂｅｒ  ａｎｄ  Ｄｅｍａｒｅｓｔ（２００７），ＢＢＲＣ  ３５５：７５１−７に従って行うことができる。驚くべきことに、本発明のヒト化抗体は、対応キメラ抗体と同等のＦＡＢ断片耐熱温度を有することが明らかとなった。よって、本開示は、対応キメラ抗体のＦＡＢ断片耐熱温度と同等のＦＡＢ断片耐熱温度を有する、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片も提供する。
【０１２４】
［核酸、ベクター及び宿主細胞］
本開示は、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片をコードする単離核酸、ベクター及び当該核酸又はベクターを有する宿主細胞も提供する。核酸は、全細胞、細胞溶解液、又は部分精製若しくは実質的に純粋な状態で存在しうる。核酸が「単離された」又は「実質的に純粋である」とは、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動及び他の当分野で周知の方法（例えばＦ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ，ｅｄ．（１９８７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照）等の標準的な方法により、他の細胞成分又は他の混入物、例えば他の細胞核酸又はタンパク質から分離精製されたことをいう。本発明の核酸は、例えばＤＮＡ又はＲＮＡであってよく、イントロン配列を含んでいてもいなくてもよい。好ましい実施形態では、核酸はｃＤＮＡ分子である。
【０１２５】
本発明の核酸は、標準的な分子生物学の技術を用いて得ることができる。例えば、抗体の軽鎖及び重鎖をコードする、又はＶＨ及びＶＬセグメントをコードするｃＤＮＡは、標準的なＰＣＲ増幅又はｃＤＮＡクローニング技術により得ることができる。（例えば、ファージディスプレイ技術を用いた）免疫グロブリン遺伝子ライブラリーから得た抗体については、抗体をコードする１つ又はそれ以上の核酸を当該ライブラリーから回収することができる。外因性の核酸を宿主細胞に導入する方法は、当分野で周知であり、使用される宿主細胞により様々である。技法としては、デキストラン介在によるトランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、塩化カルシウム処理、ポリブレン介在によるトランスフェクション、原形質融合、エレクトロポレーション、ウイルス又はファージ感染、ポリヌクレオチドのリポソームカプセル化、及びＤＮＡの核への直接的なマイクロインジェクションが挙げられるが、これらに限定されない。哺乳類細胞の場合、トランスフェクションは一過性であっても安定的であってもよい。
【０１２６】
好ましくは、本発明の核酸分子は、配列番号２５、３８、３９、４０、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２及び６３からなる群から選択される軽鎖可変領域、及び／又は３３、３４、３５、３６、３７、４３、４４、４５、４６、４７、５４及び５５からなる群から選択される重鎖可変領域をコードするものである。より好ましくは、配列番号６４のアミノ酸配列を有する重鎖配列及び配列番号６５のアミノ酸配列を有する軽鎖配列をコードする核酸分子、配列番号６６のアミノ酸配列を有する重鎖配列及び配列番号６７のアミノ酸配列を有する軽鎖配列をコードする核酸分子、配列番号６６のアミノ酸配列を有する重鎖配列及び配列番号６５のアミノ酸配列を有する軽鎖配列をコードする核酸分子、配列番号１１４のアミノ酸配列を有する重鎖配列及び配列番号６５のアミノ酸配列を有する軽鎖配列をコードする核酸分子、配列番号１１５のアミノ酸配列を有する重鎖配列及び配列番号６５のアミノ酸配列を有する軽鎖配列をコードする核酸分子、配列番号１１６のアミノ酸配列を有する重鎖配列及び配列番号６５のアミノ酸配列を有する軽鎖配列をコードする核酸分子、配列番号１１７のアミノ酸配列を有する重鎖配列及び配列番号６５のアミノ酸配列を有する軽鎖配列をコードする核酸分子、配列番号１１８のアミノ酸配列を有する重鎖配列及び配列番号６５のアミノ酸配列を有する軽鎖配列をコードする核酸分子、配列番号１１９のアミノ酸配列を有する重鎖配列及び配列番号６５のアミノ酸配列を有する軽鎖配列をコードする核酸分子、配列番号１２０のアミノ酸配列を有する重鎖配列及び配列番号６５のアミノ酸配列を有する軽鎖配列をコードする核酸分子、配列番号１２１のアミノ酸配列を有する重鎖配列及び配列番号６５のアミノ酸配列を有する軽鎖配列をコードする核酸分子、配列番号１２２のアミノ酸配列を有する重鎖配列及び配列番号６５のアミノ酸配列を有する軽鎖配列をコードする核酸分子、配列番号１２３のアミノ酸配列を有する重鎖配列及び配列番号６５のアミノ酸配列を有する軽鎖配列をコードする核酸分子、又は配列番号１２４のアミノ酸配列を有する重鎖配列及び配列番号６５のアミノ酸配列を有する軽鎖配列をコードする核酸分子、である。
【０１２７】
本開示は、２０１０年２月５日に微生物としてＤＳＭＺに寄託した、受入番号ＤＳＭ２３３０２の、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化ＦＭＣ６３変異体の重鎖をコードする核酸配列を有する単離核酸も提供する。寄託した核酸配列によりコードされるヒトＣＤ１９に結合するヒト化ＦＭＣ６３変異体の重鎖は、配列番号２７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１と、配列番号２８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２と、配列番号２９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３とを有する。
【０１２８】
本開示は、２０１０年２月５日に微生物としてＤＳＭＺに寄託した、受入番号ＤＳＭ２３３０３の、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化ＦＭＣ６３変異体の軽鎖をコードする核酸配列を有する単離核酸も提供する。寄託した核酸配列によりコードされるヒトＣＤ１９に結合するヒト化ＦＭＣ６３変異体の軽鎖は、配列番号３０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１と、配列番号３１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２と、配列番号３２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３とを有する。
【０１２９】
よって、本開示は、２０１０年２月５日に微生物としてＤＳＭＺに寄託した、受入番号ＤＳＭ２３３０２の、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化ＦＭＣ６３変異体の重鎖をコードする核酸配列を有する単離核酸と、２０１０年２月５日に微生物としてＤＳＭＺに寄託した、受入番号ＤＳＭ２３３０３の、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化ＦＭＣ６３変異体の軽鎖をコードする核酸配列を有する単離核酸とによりコードされる、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片も提供する。
【０１３０】
実施形態の１つでは、２０１０年２月５日に微生物としてＤＳＭＺに寄託した、受入番号ＤＳＭ２３３０２の、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化ＦＭＣ６３変異体の重鎖をコードする核酸配列を有する単離核酸によりコードされる、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片は、カバットによる付番体系を用いて示されるアミノ酸位置において、２６９、２７４、２７６、２９８、３２４及び３３４からなる群から選択される、好ましくは２６９、２９８及び３２４からなる群から選択される、より好ましくは２９８及び／又は３２４のアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を有するヒトＩｇＧの変異Ｆｃ領域、好ましくはヒトＩｇＧ１の変異Ｆｃ領域を有する。
【０１３１】
一旦ＶＨ及びＶＬセグメントをコードするＤＮＡ断片が得られれば、そのＤＮＡ断片を標準的な遺伝子組換えＤＮＡ技術によりさらに操作して、例えば、可変領域遺伝子を全長抗体鎖の遺伝子、又はＦａｂ断片遺伝子若しくはｓｃＦｖ遺伝子等の上記断片に対応する断片遺伝子に変換することができる。こうした操作では、ＶＬ又はＶＨをコードするＤＮＡ断片は、抗体の定常領域又は可動性リンカー等の別のタンパクをコードする別のＤＮＡ断片へと作動可能に結合される。文中で用いられる「作動可能に結合される」とは、２つのＤＮＡ断片が、当該２つのＤＮＡ断片によりコードされるアミノ酸配列をインフレームに残したまま接続されることを意味するものである。ＶＨ領域をコードする単離ＤＮＡは、当該ＶＨ領域をコードするＤＮＡを、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子と作動可能に結合することにより、全長重鎖遺伝子へと変換することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、当分野で公知であり（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｌ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２参照）、この領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅により得ることができる。重鎖定常領域とは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ又はＩｇＤの定常領域であってよいが、最も好ましくはＩｇＧ１の定常領域である。重鎖Ｆａｂ断片遺伝子については、Ｖ［ｐｉ］をコードするＤＮＡを、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に結合することができる。ＶＬ領域をコードする単離ＤＮＡは、当該ＶＬ領域をコードするＤＮＡを軽鎖定常領域ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に結合することにより、全長軽鎖遺伝子（あるいは軽鎖Ｆａｂ遺伝子）へと変換することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当分野で公知であり（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２参照）、この領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅により得ることができる。好ましい実施形態では、軽鎖定常領域は、κ又はλ定常領域であってよく、好ましくはκ定常領域である。ｓｃＦｖ遺伝子を作成するには、ＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡ断片を、可動性リンカーをコードする（例えば、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３をコードする）別の断片に作動可能に結合して、ＶＨ及びＶＬ配列が可変リンカーで接続された連続する１本鎖タンパクとして発現するようにする（例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ  Ｕ���Ａ  ８５：５８７９−５８８３；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ，（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４参照）。ヒト化抗体の抗体断片の作成については、様々な技術が開発されている。従来は、これらの断片は、インタクトな抗体のタンパク分解性消化によるものであった（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２４：１０７−１１７（１９９２）；ａｎｄ  Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）参照）。しかし、これらの断片は、今や遺伝子組換え型宿主細胞により直接作成可能である。例えば、抗体断片は、上述の抗体ファージライブラリーから単離可能である。あるいは、Ｆａｂ’−ＳＨ断片は、大腸菌から直接回収可能であり、化学的にカップリングしてＦ（ａｂ’）２断片を形成させることができる（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：１６３−１６７（１９９２））。別の手法では、Ｆ（ａｂ’）２断片は、遺伝子組換え型宿主細胞の培養物より直接単離することができる。他の抗体断片の生産技術は、当業者に明らかであろう。他の実施形態では、１本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）が抗体として選択される（例えば、ＷＯ１９９３／１６１８５；米国特許第５，５７１，８９４号；米国特許第５，５８７，４５８号参照）。抗体断片は、例えば米国特許第５，６４１，８７０号に記載されるような、「線状抗体」であってよい。
【０１３２】
本発明の抗体をコードする核酸は、タンパク発現のために発現ベクターに組み込まれてもよい。様々な発現ベクターを、タンパク発現に利用しうる。発現ベクターには、染色体外自己複製型ベクター又は宿主遺伝子に組み込まれるベクターが含まれてよい。発現ベクターは、宿主細胞のタイプに適合するように構築される。よって、本発明で使用される発現ベクターは、哺乳類細胞、バクテリア、昆虫細胞、酵母及びインビトロ系においてタンパク発現が可能なものを含むが、これらに限定されない。当分野では公知であるが、本発明において抗体の発現に利用しうる様々な発現ベクターは、市販その他により利用可能である。
【０１３３】
発現ベクターは、典型的には、制御若しくは調節配列、選択マーカー、任意の融合パートナー及び／又は追加的な要素と作動可能に結合されたタンパクを有する。ここで「作動可能に結合」とは、核酸が他の核酸配列と機能的な関係を持つよう配置されることを意味する。用語「調節配列」とは、抗体鎖遺伝子の転写又は発現を制御する、プロモーター、エンハンサー及び他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むものである。このような調節配列は、例えばＧｏｅｄｄｅｌ（Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０））により記載されている。一般的に、これらの発現ベクターは、抗体をコードする核酸に作動可能に結合された転写及び翻訳調節核酸を含み、通常、タンパクの発現に用いる宿主細胞に適したものである。一般的に、転写及び翻訳調節配列は、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始及び終了配列、翻訳開始及び終了配列、並びにエンハンサー又はアクティベーター配列を含みうる。同じく当分野で公知であるが、発現ベクターは、通常、形質転換された発現ベクターを含む宿主細胞の選別を可能にする選択遺伝子又はマーカーを含む。選択遺伝子は、当分野で周知であり、用いる宿主細胞によって様々である。例えば、典型的な選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞に、Ｇ４１８、ハイグロマイシン又はメトトレキサートなどに対する薬剤耐性を付与する。好ましくは、選択マーカー遺伝子として、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート下で選択・増幅されるＤＨＦＲ宿主細胞に使用される）、及びネオ遺伝子（Ｇ４１８選択用）が挙げられる。
【０１３４】
本件のベクター中のＤＮＡをクローニング又は発現するのに好適な宿主細胞は、原核生物、酵母又は高等真核細胞である。この目的に好適な原核生物としては、グラム陰性又はグラム陽性菌等の真正細菌、例えば、エシェリキア属等の腸内細菌（大腸菌、エンテロバクター属、クレブシエラ属、プロテウス属、サルモネラ属（ネズミチブス菌等）、セラシア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ等）及び赤痢菌、あるいは杆菌（枯草菌及びＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ等）、シュードモナス属（緑膿菌等）及びストレプトミセス属が挙げられる。大腸菌のクローニング宿主としては、大腸菌２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）、大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）、大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）が好適である。
【０１３５】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母等の真核性微生物も好適なクローニング又は発現宿主である。出芽酵母、即ち通常のパン酵母が、下等真核微生物宿主のうちで最もよく用いられている。また、他の多くの属、種及び株、例えば、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ；Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ１２，４２４）、Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ１６，０４５）、Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ（ＡＴＣＣ２４，１７８）、Ｋ．ｗａｌｔｉｉ（ＡＴＣＣ５６，５００）、Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ（ＡＴＣＣ３６，９０６）、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ又はＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓｙａｒｒｏｗｉａ（欧州特許第４０２，２２６号）等のクルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）宿主；Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（欧州特許第１８３，０７０号）；カンジダ属；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ（欧州特許第２４４，２３４号）；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ；Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ等のシュワニオマイセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、ペニシリウム属、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）等の糸状菌、又はＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓ若しくははＡ．ｎｉｇｅｒ等アスペルギルス属宿主等も一般に利用可能であり、有用である。
【０１３６】
本発明のヒト化抗体の発現に好適な宿主細胞は、多細胞生物由来のものである。無脊椎動物細胞の例としては、ｐｌａｒｉｌ及び昆虫細胞が挙げられる。Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（イモムシ）、Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ（蚊）、Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ（蚊）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ショウジョウバエ）、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ等の宿主から、多くのバキュロウイルス株、変異株及び対応する許容昆虫宿主細胞が同定されている。トランスフェクション用の様々なウイルス株、例えば、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ＮＰＶのＬ−１変異体及びＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ＮＰＶのＢｍ−５株が一般に入手可能であり、このようなウイルスは、特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションに使用しうる。ワタ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマト及びタバコの植物細胞培養物も、宿主として利用可能である。
【０１３７】
好ましくは、本発明の遺伝子組換え抗体を発現させる宿主細胞は、哺乳類宿主細胞であり、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む。Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ  ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０に記載。例えばＲ．Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｐ．Ａ．Ｓｈａｒｐ（１９８２）Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ  １５９：６０１−６２１に記載されるように、ＤＨＦＲ選択マーカーと共に使用される。）、ＮＳＯミエローマ細胞、ＣＯＳ細胞及びＳＰ２細胞が挙げられる。特に、ＮＳＯミエローマ細胞を用いる場合、ＷＯ８７／０４４６２（Ｗｉｌｓｏｎ）、ＷＯ８９／０１０３６（Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ）及びＥＰ３３８８４１（Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ）に開示されるＧＳ遺伝子発現系も、好ましい発現系である。遺伝子組換え抗体を哺乳類宿主細胞に導入した場合、宿主細胞中で抗体が発現されるのに十分な期間、好ましくは宿主細胞が生育している培地中に抗体が分泌されるのに十分な期間、宿主細胞を培養することにより、抗体が生産される。ヒトＣＤ１９に結合する抗体を生産するのに有用な宿主細胞は、様々な培地で培養されうる。Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ），Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（（ＭＥＭ），（Ｓｉｇｍａ），ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ又はＣｈｅｍｉｅ  Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ  ＡＧ，ＰＡＡ，バーゼル、スイス），及びＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（（ＤＭＥＭ），Ｓｉｇｍａ）等の市販の培地が、宿主細胞の培養に好適である。抗体は、標準的なタンパク精製法を用いて培地から回収することができる。
【０１３８】
抗体は、発現タンパクのターゲティング、精製、スクリーニング、ディスプレイ等が可能となるよう、融合パートナーと作動可能に結合されていてもよい。融合パートナーは、リンカー配列を介して抗体に結合されていてもよい。リンカー配列は、長いものも使用しうるが、通常は少数のアミノ酸、典型的には１０個未満のものであろう。通常、リンカー配列は、可動性で難分解性のものが選ばれる。当業者には知られていることだが、広く様々な配列をリンカーとして使用しうる。例えば、よくあるリンカー配列は、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳを有する。融合パートナーは、融合パートナーを伴った抗体を所望の細胞部位又は細胞外培地へと導く、標的又はシグナル配列であってよい。当分野で公知であるが、ある種のシグナル配列は、タンパクを捕捉して、成長培地中、あるいは細胞の内膜及び外膜の間の細胞膜周辺腔に分泌させることができる。融合パートナーは、精製及び／又はスクリーニングを可能にするペプチド又はタンパクをコードする配列であってもよい。そのような融合パートナーとしては、ポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）（例えば、Ｈ６及びＨ１０又はその他のタグを、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）システム（例えば、Ｎｉ２＋アフィニティーカラム）と共に使用する。）、ＧＳＴ融合、ＭＢＰ融合、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ、細菌酵素ＢｉｒＡのＢＳＰビオチン化標的配列、及び酵素により捕捉されるエピトープタグ（例えば、ｃ−ｍｙｃタグ、ｆｌａｇタグ等）が挙げられるが、これらに限定されない。当業者には知られているが、このようなタグは、精製、スクリーニング又はその双方に有用である。
【０１３９】
［抗体の構築と生産］
抗体は、当業者に公知の組み換えＤＮＡ技術により生産することができる。また、自然抗体を酵素又は化学切断することにより生産することもできる。本発明のヒト化抗体は、非ヒト動物（例えば、マウス）のＶＨ及び／又はＶＬ領域由来の１つ以上のＣＤＲ又はその一部を、ヒトＶＨ及び／又はＶＬ領域由来の１つ又はそれ以上のフレームワーク領域に導入することにより構築することができる。抗体の免疫原性を下げる、及び／又は結合親和性を維持する必要又は希望がある場合は、任意に、ＶＨ及び／又はＶＬ領域に存在するヒトフレームワーク残基を、対応する非ヒト（例えば、マウス）残基に置き換えうる。ＣＤＲに存在する非ヒトアミノ酸残基は、任意に、ヒト残基に置き換えうる。キメラ抗体又は本発明のヒト化抗体は、上記のように調製された非ヒトモノクローナル抗体の配列に基づいて調製することができる。重鎖及び軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡは、対象とする非ヒトハイブリドーマから得ることができ、標準的な分子生物学技術を用いて、非マウス（例えば、ヒト）免疫グロブリン配列が含まれるように操作することができる。例えば、キメラ抗体を作出するには、当分野で公知の方法を用いて、マウス可変領域をヒト定常領域に結合させることができる（例えば、Ｃａｂｉｌｌｙらの米国特許第４，８１６，５６７号参照）。ヒト化抗体を作出するには、当分野で公知の方法を用いて、マウスＣＤＲ領域をヒトフレームワークに挿入することができる（例えば、Ｗｉｎｔｅｒの米国特許第５，２２５，５３９号、Ｑｕｅｅｎらの米国特許第５，５３０，１０１号；５，５８５，０８９号；５，６９３，７６２号及び６，１８０，３７０号）。
【０１４０】
本発明のヒト化抗体の構築にあたっては、重鎖可変領域のためのヒトアクセプター分子が、そのアクセプター分子本来の可変領域とマウス抗体の重鎖可変領域との相同性を考慮して選択されるものであってもよい。ジャームラインのヒトアクセプター分子は、起こりうる免疫原性を減少させるため、好ましい候補である。ジャームラインデータベースは、ＦＷ３領域の末端までとＣＤＲ３配列の一部の抗体配列からなる。ＦＷ４領域の選択には、選択したジャームライン分子由来である成熟抗体配列のデータベースをサーチすることができる。すなわち、ヒトドナーから選択したジャームライン配列由来の抗体配列を用いることができる。ヒトアクセプター分子は、マウスドナー分子と同じ重鎖クラスが選択されることが好ましく、マウスドナー分子の可変領域と同一の基準構造クラスであることが好ましい。重鎖可変領域のためのヒトアクセプター分子の選択に関して更に考慮する点として、マウスドナー分子とヒトアクセプター分子とのＣＤＲ長の相同性が挙げられる。好ましくは、ヒトアクセプター抗体分子は、Ｖ−ＢＡＳＥデータベースの相同性サーチにより選択されるが、Ｋａｂａｔや一般公開のＮＣＢＩ等の他のデータベースも用いてよい。
【０１４１】
本発明のヒト化抗体の構築にあたっては、軽鎖可変領域のためのヒトアクセプター分子が、そのアクセプター分子本来の可変領域とマウス抗体の軽鎖可変領域との相同性を考慮して選択されるものであってもよい。ジャームラインヒトアクセプター分子は、起こりうる免疫原性を減少させるため、好ましい候補である。ジャームラインデータベースは、ＦＷ３領域の末端までと、ＣＤＲ３配列の一部との抗体配列からなる。ＦＷ４領域の選択には、選択したジャームライン分子由来である成熟抗体配列のデータベースをサーチすることができる。すなわち、ヒトドナーから選択したジャームライン配列由来の抗体配列を用いることができる。ヒトアクセプター分子は、マウスドナー分子と同じ軽鎖クラスが選択されることが好ましく、マウスドナー分子の可変領域と同一の基準構造クラスであることが好ましい。軽鎖可変領域のためのヒトアクセプター分子の選択に関して更に考慮する点として、マウスドナー分子とヒトアクセプター分子とのＣＤＲ長の相同性が挙げられる。好ましくは、ヒトアクセプター抗体分子は、Ｖ−ＢＡＳＥデータベースの相同性サーチにより選択されるが、Ｋａｂａｔや一般開放のＮＣＢＩ等の他のデータベースを用いてもよい。非ヒト抗体をヒト化する方法については、以下の実施例を含む本明細書に記載されている。
【０１４２】
本発明は、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片の生産方法であって、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片をコードする単離核酸を有する宿主細胞、又はヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片をコードする単離核酸を有するベクターを有する宿主細胞を培養することで、当該核酸が発現されて当該抗体を産生することを有する、方法も提供する。好ましくは、抗体は単離される。
【０１４３】
宿主細胞、核酸及びベクターとしては、上記のものを用いることができる。核酸の発現は、例えば、遺伝子組換えＤＮＡ技術及び遺伝子トランスフェクション法の組合せであって、当分野で周知（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２）のものや上述したものにより、行うことができる。例えば、抗体又は抗体断片を発現させるには、軽鎖及び重鎖の一部又は全長をコードするＤＮＡを標準的な分子生物学技術（例えば、ＰＣＲ増幅又は対象とする抗体を発現するハイブリドーマを用いたｃＤＮＡクローニング）により得ることができ、当該ＤＮＡを発現ベクター等のベクターに挿入することができる。発現ベクター及び発現制御配列は、使用する発現用の宿主細胞に適合するものが選ばれる。抗体軽鎖遺伝子及び抗体重鎖遺伝子は、別々のベクターに挿入することができ、あるいはより一般的には、両方の遺伝子が同じ発現ベクターに挿入される。抗体遺伝子は、標準的な方法（例えば、抗体遺伝子断片とベクターの相補的な制限酵素部位における連結、あるいは制限酵素部位がなければ平滑末端連結）により、発現ベクターに挿入される。本件に記載される抗体の軽鎖及び重鎖可変領域を用いれば、これを既に所望のアイソタイプの重鎖定常領域と軽鎖定常領域がコードされている発現ベクターに挿入して、ＶＨセグメントがＣＨセグメントにベクター内で作動可能に結合され、ＶＫセグメントがＣＬセグメントにベクター内で作動可能に結合されるようにすることにより、あらゆるアイソタイプ抗体の全長抗体遺伝子を作成することができる。
【０１４４】
［抗ＣＤ１９抗体の評価及び精製］
本発明の抗体のヒトＣＤ１９への結合性は、例えば、標準的なＥＬＩＳＡ又はＲａｊｉ腫瘍細胞への結合性によって試験することができる。本発明の抗体は、当業者に公知の様々な方法により、単離又は精製されうる。標準的な精製方法としては、大気圧又は高圧下でのＦＰＬＣ及びＨＰＬＣシステムを用いて行われる、イオン交換、疎水性相互作用、アフィニティー、サイズ又はゲルろ過、及び逆相を含むクロマトグラフィー法が挙げられる。精製方法としては、電気泳動、免疫、沈殿、透析及びクロマトフォーカシング法が挙げられる。タンパク濃縮も同時に行う、限外濾過及びダイアフィルトレーション法も有用である。抗ＣＤ１９抗体を精製するには、選択した宿主細胞を、例えばモノクローナル抗体精製用のスピナーフラスコ中で生育させることができる。上清を、プロテインＡ−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によるアフィニティークロマトグラフィーに供する前に、ろ過及び濃縮することも可能である。溶出したＩｇＧを、ゲル電気泳動及び高性能液体クロマトグラフィーにより検査して、確実な精製とすることができる。
【０１４５】
［免疫複合体］
他の側面では、本発明は、細胞毒素、薬剤（例えば、免疫抑制剤）又は放射性毒素等の治療薬を結合した、ヒトＣＤ１９に結合する抗ＣＤ１９ヒト化抗体又はその断片を提供する。そのような複合体を、本件では「免疫複合体」と称する。１つ又はそれ以上の細胞毒素を含む免疫複合体は、「免疫毒素」と称される。細胞毒性又は細胞障害性の薬剤には、細胞に有害な（例えば、細胞を殺す）あらゆる薬剤が含まれる。例としては、タクソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ  ａｎｔｈｒａｃｉｎ  ｄｉｏｎｅ）、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール及びピューロマイシン並びにこれらの類似体又は相同体が挙げられる。また、治療薬としては、例えば、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルダカルバジン（ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ））、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパ（ｔｈｉｏｅｐａ）クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）及びロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロフォスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ及びシスジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（元ダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（元アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン及びアントラマイシン（ＡＭＣ））、及び有糸分裂阻害薬（例えば、ビンクリスチン及びビンブラスチン）が挙げられる。本発明の抗体に結合可能な他の細胞毒素治療薬の例としては、デュオカルマイシン、カリケアマイシン、マイタンシン及びアウリタスチン、及びこれらの誘導体が挙げられる。カリケアマイシン−抗体複合体については、市販されている例がある（Ｍｙｌｏｔａｒｇ（Ｒ）；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｏｍｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）。細胞毒素は、当分野で利用可能なリンカーを用いて抗体に結合することができる。細胞毒素を抗体に複合化するのに用いられているリンカーのタイプの例としては、ヒドラゾン、チオエーテル、エステル、ジスルフィド及びペプチド含有リンカーが挙げられるが、これらに限定されない。リンカーは、例えば、リソソームコンパートメント内で低ｐＨにより切断されやすいものや、プロテアーゼ（カテプシン（例えば、カテプシンＢ、Ｃ、Ｄ）等の腫瘍細胞において優先的に発現しているプロテアーゼ等）により切断されやすいものを選ぶことができる。細胞毒素のタイプ、リンカー及び治療薬を抗体に複合化する方法に関し、さらなる詳細については、Ｓａｉｔｏ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５５：１９９−２１５；Ｔｒａｉｌ，Ｐ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）���ａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５２：３２８−３３７；Ｐａｙｎｅ，Ｇ．（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ３：２０７−２１２；Ａｌｌｅｎ，Ｔ．Ｍ．（２００２）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ２：７５０−７６３；Ｐａｓｔａｎ，Ｉ．ａｎｄ  Ｋｒｅｉｔｍａｎ，Ｒ．Ｊ．（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ  ３：１０８９−１０９１；及びＳｅｎｔｅｒ，Ｐ．Ｄ．ａｎｄ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，ＣＪ．（２００１）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５３：２４７−２６４も参照されたい。本発明の抗体は、放射性同位体に結合させて細胞傷害性の放射性医薬品を作成できるものでもあり、これは放射性免疫複合体とも呼ばれる。診断用又は治療用として、抗体に複合化できる放射性同位体の例としては、ヨウ素１３１、インジウム１１１、イットリウム９０及びルテニウム１７７が挙げられるが、これらに限定されない。放射性免疫複合体の調製方法は、当分野において確立されている。放射性免疫複合体は市販されている例があり、Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標）（ＥＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）及びＢｅｘｘａｒ（登録商標）（Ｃｏｒｉｘａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）が挙げられる。本発明の抗体を用いた放射性免疫複合体も、同様の方法により調製することができる。本発明の抗体免疫複合体は、所定の生物学的応答を改変するのに用いることができ、薬剤部分は、古典的な化学治療薬に制限されるものではない。例えば、薬剤部分は、所望の生物活性を有するタンパク又はポリペプチドであってよい。そのようなタンパクとしては、例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス属の外毒素又はジフテリア毒素等の酵素的に活性な毒素又はその活性断片；腫瘍ネクローシス因子又はインターフェロン−γ等のタンパク；例えばリンホカイン、インターロイキン１（「ＩＬ１」）、インターロイキン２（「ＩＬ２」）、インターロイキン６（「ＩＬ６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）又はその他の成長因子等の生物学的応答変更因子が挙げられる。
【０１４６】
そのような治療薬を抗体に結合させる技術は公知である。例えば、Ａｒｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ，「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．２４３−  ５６（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ，「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」，ｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（２ｎｄ  Ｅｄ．），Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．６２３−５３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ，「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ」，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｉｎｃｈｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．４７５−５０６（１９８５）；「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．３０３−１６（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５），及び  Ｔｈｏｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，６２：１１９−５８（１９８２）を参照されたい。
【０１４７】
［医薬組成物］
別の側面では、本発明は組成物、例えば、本発明のヒト化抗体又はその断片と薬学的に許容される担体とを有する医薬組成物を提供する。そのような組成物には、本発明の抗体若しくは免疫複合体の単体又は組合せ（例えば、２つ又はそれ以上の異種）が含まれうる。例えば、本発明の医薬組成物は、標的抗原の異なるエピトープに結合する、又は相補的な活性を有する抗体（又は免疫複合体）の組合せを有しうる。本発明の医薬組成物は、併用療法において投与、即ち他の薬剤と併用することができる。例えば、併用療法には、本発明の抗ＣＤ１９抗体と他の少なくとも１つの抗炎症剤又は免疫抑制剤との組合せが含まれうる。
【０１４８】
本件で使用される「薬学的に許容される担体」には、生理学的に適合性のある、あらゆる溶媒、分散媒、抗菌・抗真菌剤、並びに等張剤及び吸収遅延剤等が含まれる。好ましくは、担体は、（例えば、注射又は点滴による）静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄又は表皮投与に好適である。投与経路により、活性化合物、即ち抗体又は免疫複合体は、それを不活化させるおそれのある酸又はその他の自然条件から保護するために、何らかの物質でコートされていてもよい。薬学的に許容される担体には、無菌水溶液又は分散液、及び無菌注射液又は分散液の即時調整用の無菌粉末が含まれる。そのような媒体及び薬剤を薬学的な活性物質のために使用することは、当分野で公知である。従来の媒体又は薬剤は、活性化合物に適合しない場合を除き、本発明の医薬組成物に使用されうる。補助的な活性化合物を、組成物に含めることもできる。
【０１４９】
他の側面では、本発明は、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片に治療薬が結合した免疫複合体と、薬学的に許容される担体とを有する組成物を提供する。使用可能な免疫複合体及び治療薬については、上述のとおりである。
【０１５０】
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される抗酸化剤を含んでもよい。薬学的に許容される抗酸化剤の例としては、（１）アスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等の水溶性抗酸化剤、（２）パルミチン酸アスコルビル、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レクチン、没食子酸プロピル、αトコフェノール等の油溶性抗酸化剤、及び（３）クエン酸、エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸等の金属キレート剤が含まれる。本発明の医薬組成物に用いうる好適な水性及び非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）及び好適なその混合物、オリーブオイル等の植物油、及びオレイン酸エチル等の注射用有機エステルが挙げられる。例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用、分散液における所望の粒子径の維持、及び界面活性剤の使用により、適切な流動性を保つことができる。こうした組成物は、保存料、湿潤剤、乳化剤及び分散剤等のアジュバントを含んでいてもよい。上記の無菌化工程と、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等の様々な抗菌・抗真菌剤の含入の双方により、微生物の混入防止を確実なものにすることができる。砂糖、塩化ナトリウム等の等張剤を組成物に含めることも望ましい。また、注射用の製剤では、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン等の吸収遅延剤を含めることによる持続的吸収を行ってもよい。
【０１５１】
［治療及びその他の用途］
本発明のヒト化抗体には、ＣＤ１９介在型障害の診断及び治療を含め、数多くのインビトロ及びインビボでの診断及び治療用途がある。例えば、本発明の分子を培養細胞、インビトロ若しくはエクスビボ、又はヒト被験体（例えば、インビボ）に投与して、様々なＣＤ１９介在型障害を治療、予防及び診断することができる。好ましくは、被験体はヒトであり、ＣＤ１９活性が介在する障害（ＣＤ１９介在型障害）を持つ患者が含まれる。本方法は、Ｂ細胞数の異常を伴うＣＤ１９介在型障害のヒト患者を治療するのに特に好適である。
【０１５２】
本発明において、「患者」には、ヒト及び他の動物の双方が含まれ、好ましくは哺乳類、最も好ましくはヒトである。よって、本発明の抗体には、ヒトの治療と獣医学的な用途の双方がある。本発明における用語「治療」又は「治療する」は、治療上の処置に加え、疾患又は障害の予防的又は抑制的方策も含むものを意味する。よって、例えば、疾患の発症前に抗体を投与し奏功すれば、疾患の治療となる。別の例として、疾患の臨床症状が現れた後に、その疾患の症状を抑えるために抗体を投与して奏効すれば、疾患の治療である。「治療」及び「治療する」には、疾患が出現した後の、その疾患を根絶するための抗体の投与も包含される。発症後及び臨床症状が現れた後に抗体を投与し、奏効して臨床症状の緩和、場合によっては疾患の寛解を伴えば、疾患の治療である。「治療を必要としている」者には、既に疾患又は障害を持っている哺乳動物だけでなく、疾患又は障害を予防すべきである動物を含め疾患又は障害にかかりやすい動物も含まれる。
【０１５３】
特定の実施形態では、ヒト化抗体は、様々なＣＤ１９介在型疾患のインビボでの治療、予防又は診断に用いられる。よって、本発明は、被験体におけるＣＤ１９介在型障害を治療する方法であって、治療有効量のヒト化抗体又はその断片を被験体に投与することを有する方法を提供する。ＣＤ１９介在型障害の例としては、関節リウマチを含む自己免疫疾患、がん、非ホジキンリンパ腫、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、有毛細胞白血病、バーキットリンパ腫、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、小結節非正円形細胞リンパ腫、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、レンネルトリンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）、成人Ｔ細胞白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、中心芽細胞性／中心細胞性（ｃｂ／ｃｃ）濾胞性リンパ腫がん、Ｂ型びまん性大細胞型リンパ腫、血管免疫芽球性リンパ節症（ＡＩＬＤ）様Ｔ細胞リンパ腫、ＨＩＶ随伴型体腔型リンパ腫、胚性がん腫、鼻咽腔未分化がん（例えば、シュミンケ腫瘍）、キャッスルマン病、カポジ肉腫、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、抗ＣＤ２０抗体抵抗性Ｂ細胞がん、並びに他のＢ細胞リンパ腫及び白血病が含まれる。抗ＣＤ２０抗体抵抗性のＢ細胞がんは、例えば、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標））抵抗性のＢ細胞がんであり、これは好ましい抗ＣＤ２０抗体抵抗性のＢ細胞がんである。好ましくは、がんは、血液性のがん、特にＣＤ１９を発現するリンパ腫及び白血病に関連するがん、とりわけ非ホジキンリンパ腫、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病及び有毛細胞白血病である。好ましくは、本発明の抗体で治療されるＣＤ１９介在型障害は、非ホジキンリンパ腫、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、有毛細胞白血病、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）及び抗ＣＤ２０抗体抵抗性Ｂ細胞がんからなる群から選択される。より好ましくは、本発明の抗体で治療されるＣＤ１９介在型障害は、関節リウマチ、非ホジキンリンパ腫又は抗ＣＤ２０抗体抵抗性Ｂ細胞がんである。
【０１５４】
「自己免疫疾患」には、同種膵島移植拒絶（ａｌｌｏｇｅｎｉｃ  ｉｓｌｅｔ  ｇｒａｆｔ  ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫性アジソン病、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）、副腎の自己免疫疾患、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性心筋炎、自己免疫性好中球減少症、自己免疫性卵巣炎及び精巣炎、自己免疫性血小板減少症、自己免疫性じんましん、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、キャッスルマン症候群、セリアック病−皮膚炎、慢性疲労免疫不全症候群、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、チャーグ・ストラウス症候、瘢痕性類天疱瘡、クレスト症候群、寒冷凝集素症、クローン病、皮膚筋炎、円板状ループス、本態性混合型クリオグロブリン血症、第ＶＩＩＩ因子欠乏症、、線維筋痛−線維筋炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、グッドパスチャー症候群、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、橋本甲状腺炎、血友病Ａ、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ神経障害、ＩｇＭポリ神経障害、免疫性の血小板減少、若年性関節炎、川崎病、扁平苔癬（ｌｉｃｈｅｎ  ｐｌａｎｒｕｓ）、エリテマトーデス（ｌｕｐｕｓ  ｅｒｔｈｅｍａｔｏｓｉｓ）、メニエール病、混合性結合組織病、多発性硬化症（ＭＳ）、Ｉ型糖尿病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発（性）筋痛、多発性筋炎及び皮膚筋炎、原発性ガンマグロブリン血症（ｐｒｉｍａｒｙ  ａｇａｍｍａｇｌｏｂｉｎｕｌｉｎｅｍｉａ）、無症候性原発性胆汁性肝硬変症、急性滴状乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象（Ｒｅｙｎａｕｌｄ’ｓ  ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ）、ライター症候群、関節リウマチ（ＲＡ）、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、固形臓器移植拒絶、スティフマン症候群、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、高安動脈炎、側頭動脈炎（ｔｅｍｐｏｒａｌ  ａｒｔｅｒｉｓｔｉｓ）／播種性巨細胞性動脈炎、血栓性血小板減少性紫斑病、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、皮膚炎ヘルペス状血管炎等の血管炎、白斑、血管炎を伴う抗好中球細胞質抗体、移植片対宿主病、クリオグロブリン血症、ＩｇＭ介在型神経障害、視神経脊髄炎、特発性膜性腎症、オプソクローヌス・ミオクローヌス症候群、及びヴェグナー肉芽腫（Ｗｅｇｎｅｒ’ｓ  ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｏｓｉｓ）が含まれる。
【０１５５】
更に、様々な腫瘍細胞においてＣＤ１９が発現していること、及び本発明のヒト化抗体又はその断片が上記のようにＣＤ１９を発現している悪性Ｂ細胞の増殖を阻害することからすると、ＣＤ１９介在型疾患には、好ましくは、がん等の腫瘍原生の障害、例えばＣＤ１９を発現する腫瘍細胞の存在を特徴とする障害であって、例として、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、有毛細胞白血病、バーキットリンパ腫、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、多発性骨髄腫、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、小結節非正円形細胞リンパ腫、リンパ球性リンパ腫、抹消Ｔ細胞リンパ腫、レンネルトリンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）、成人Ｔ細胞白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、中心芽細胞性／中心細胞性（ｃｂ／ｃｃ）濾胞性リンパ腫がん、Ｂ型びまん性大細胞型リンパ腫、血管免疫芽球性リンパ節症（ＡＩＬＤ）様Ｔ細胞リンパ腫、ＨＩＶ随伴型体腔型リンパ腫、胚性がん腫、鼻咽腔未分化がん（例えば、シュミンケ腫瘍）、キャッスルマン病、カポジ肉腫、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、抗ＣＤ２０抗体抵抗性Ｂ細胞がん、並びに他のＢ細胞リンパ腫及び白血病が含まれる。
【０１５６】
よって、さらなる側面では、本発明は、腫瘍細胞の成長を阻害するのに有効な量の本発明のヒト化抗体又はその断片を細胞に接触させることを有する、ＣＤ１９を発現する腫瘍細胞の成長を阻害する方法を提供する。腫瘍細胞は、通常、ヒトバーキットリンパ腫細胞、ヒト前駆Ｂ細胞白血病細胞、ヒトＢ細胞白血病細胞又はヒトＢ細胞リンパ腫細胞から選択され、好ましくはヒトバーキットリンパ腫細胞又はヒトＢ細胞リンパ腫細胞である。
【０１５７】
本発明のヒト化抗体又はその断片が、血液中のＢ細胞枯渇を引き起こすことから、本発明は、更に、被験体のＢ細胞を枯渇させるのに有効な量のヒト化抗体又はその断片を被験体に投与することを有する、被験体においてＢ細胞を枯渇させる方法を提供する。
【０１５８】
ある実施形態では、本発明の抗体は、ＣＤ１９のレベル、即ち膜表面上にＣＤ１９を有する細胞のレベルを検出するのに用いることができ、このレベルはある種の疾患の症状と関連しうる。あるいは、本抗体は、ＣＤ１９の機能を阻害又は遮断するのに用いることができ、これはある種の疾患の症状の予防又は寛解につながりうることから、ＣＤ１９は当該疾患の介在物質と位置づけられる。これは、抗体とＣＤ１９が複合体を形成できる条件下で、試料及びコントロール試料に抗ＣＤ１９抗体を接触させることで行うことができる。試料及びコントロール試料から、抗体とＣＤ１９が形成したあらゆる複合体を検出し、比較する。本発明の抗体のＣＤ１９に対する特異的な結合性を鑑みると、本発明の抗体は、細胞表面におけるＣＤ１９発現の特異的な検出に用いることでき、更には免疫アフィニティー精製によるＣＤ１９の精製に用いることができる。
【０１５９】
別の実施形態では、インビトロでの治療又は診断での使用に際して、まず本発明の抗体の結合活性について検査することができる。例えば、本発明の組成物は、以下の実施例に記載のフローサイトメトリーアッセイを用いて検査することができる。
【０１６０】
本開示は、更に、ヒト化抗体又はその断片の医薬品として使用、及びヒト化抗体又はその断片のＣＤ１９介在型障害の治療薬の調製のための使用を提供する。さらなる実施形態では、本開示は、医薬としての使用のためのヒト化抗体又はその断片を提供する。また、本開示は、ＣＤ１９介在型障害の治療法における使用のための、ヒト化抗体又はその断片を提供する。ＣＤ１９介在型障害とは、上記のものである。
【０１６１】
前述のとおり、本発明のヒト抗ＣＤ１９抗体は、１つ又はそれ以上の他の治療薬、例えば、細胞障害性の薬剤、放射毒性の薬剤又は免疫抑制剤と併用することができる。本抗体は、（免疫複合体として）当該薬剤と結合されていてもよく、あるいは当該薬剤と分離して投与可能である。後者（分離投与）の場合、本抗体を、薬剤より前、後、又は同時に投与することができ、あるいは放射線などの抗がん治療などの公知の治療と併用することができる。
【０１６２】
本抗体の投与について、用量は、ホストの体重に対して約０．０００１から１００ｍｇ／ｋｇ、より一般的には０．０１から１０ｍｇ／ｋｇである。治療計画の例としては、１週間に１回、２週間毎に１回、３週間ごとに１回、４週間ごとに１回、１月に１回、３月毎に１回、又は３から６月毎に１回の投与が必要となる。本抗体は、通常、複数回投与される。１回の投与の間隔は、例えば、週毎、月毎、３月毎又は年毎とすることができる。投与間隔は、患者における標的抗原に対する抗体の血中濃度を測定し、これを指標とした不定期とすることもできる。用量は、方法によっては、血漿抗体濃度が約１−１０００μｇ／ｍｌ、他の方法によっては約２５−３００μｇ／ｍｌとなるよう調節される。あるいは、抗体は、徐放性製剤として投与することができ、この場合より少ない頻度での投与でよい。用量及び頻度は、患者における抗体の半減期により様々である。投与の用量及び頻度は、処置が予防であるのか治療であるのかにより様々である。予防的な用途では、比較的少量の用量を比較的頻繁でない間隔で長期間にわたり投与する。患者によっては、残りの生涯にわたって治療を受け続ける。治療的な用途では、疾患の進行が減少又は停止するまで、比較的多量の用量が、比較的短い間隔で必要とされる場合もある。
【０１６３】
活性成分、即ち本発明の医薬組成物中の抗体の実際の用量レベルは、患者において所望の治療反応が得られる活性成分の有効量となるよう変化させることができるが、組成及び投与形態が患者に有害であってはならない。用量レベルは、用いる本発明の組成物の活性、投与経路、投与時間、用いる抗体の排泄率、治療期間、他の薬剤、用いる組成物と併用する化合物及び／又は物質、年齢、性別、体重、状態、総体的な健康、治療される患者の病歴、及び医療分野において公知のその他の因子等の様々な薬物動態に関する因子に依存して選択される。
【０１６４】
「治療効果量」の本発明の抗ＣＤ１９抗体により、好ましくは、疾患の症状が緩和され、疾患の無症状期間の頻度及び期間が増加し、及び／又は疾患の苦痛による機能障害又は身体障害が防止される。例えば、腫瘍原生の障害（ＣＤ１９＋の腫瘍）の治療では、「治療効果量」により、細胞成長又は腫瘍成長が、未治療の被験体と比べて、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも４０％、更により好ましくは少なくとも６０％、更により一層好ましくは少なくとも８０％阻害される。化合物が腫瘍成長を阻害する能力は、ヒト腫瘍における効能を予測しうる動物モデル系において評価することができる。あるいは、この特性は、当該化合物が細胞成長を阻害する能力を試験することによって評価することができる。このような阻害能は、当業者に公知のアッセイによりインビトロで測定することができる。治療効果量の治療化合物により、腫瘍サイズを小さくしたり、あるいは被験体の症状を寛解させることができる。当業者であれば、被験体の大きさ、被験体の症状の程度、選択した組成及び投薬ルート等の要因に基づいて、その量を決定することができるであろう。
【０１６５】
本発明の組成物の抗体は、当分野で公知の様々な方法の１つ又はそれ以上を用いた、１つ又はそれ以上の投薬ルートにより投与することができる。当業者には知られているが、投与経路及び／又は投与形態は、所望する結果によって様々である。好ましくは、投与経路は、例えば注射又は点滴による、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄、又は他の非経口投与経路である。より好ましくは、投与経路は静脈内又は皮下である。本件で用いられる用語「非経口投与」は、通常は、経腸及び局所投与以外の注射による投与形態を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内、硬膜外及び胸骨内の注射及び点滴が挙げられるがこれらに限定されない。あるいは、本発明の抗体は、局所、表皮又は粘膜の投与経路等の非経口ではない経路で投与することができ、例えば、鼻腔内、経口、経膣、経直腸、舌下又は局所である。
【０１６６】
［製品及びキット］
本開示の別の側面では、本発明のヒト化抗体若しくはその断片、組成物又は免疫複合体を有する、ＣＤ１９介在型障害の治療のための製品が提供される。本製品は、容器及び容器に貼付又は添付したラベル又は添付文書を有していてもよい。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル又は注射器が挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチック等の各種材料で形成することができる。容器は、症状の治療に有効な組成物を収容し、無菌アクセス口（例えば、容器は静注液バッグ又は皮下注射針を貫通可能なストッパーを有するバイアル）を有していてもよい。組成物に含まれる活性物質の少なくとも１つは、本件に記載のヒト化抗体であってよい。ラベル又は添付文書には、組成物ががん等の適応症状の治療に使用されうることを表示してもよい。ある実施形態では、ラベル又は添付文書には、ヒト化抗体を含む組成物がＣＤ１９介在型障害の治療に使用されうる旨を表示することができる。
【０１６７】
更に、本製品は、（ａ）本件のヒト化抗体を有する組成物を収めた第１の容器と、（ｂ）当該ヒト化抗体以外の治療薬を有する組成物を収めた第２の容器とを有するものであってよい。本開示における実施形態である製品は、更に、第１及び第２の組成物がＣＤ１９介在型疾患又は障害の治療に併用可能である旨を表示する添付文書を有していてもよい。そのような治療薬は、上節に記載の補助療法のためのもの（例えば、血栓溶解剤、抗血小板薬、化学療法剤、血管新生阻害剤、抗ホルモン化合物、血管保護剤、及び／又はサイトカインなどの免疫機能制御因子）のいずれかであってよい。あるいは又は加えて、本製品は、無菌注射用水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液等の薬学的に許容できる緩衝液を含む第２（第３）の容器をさらに有することができる。本製品は、その他の緩衝液、希釈剤、フィルタ、針、注射器等の商業上又はユーザーの見地から望ましいその他の材料をさらに含むことができる。
【０１６８】
また、本発明の抗体、組成物又は免疫複合体と使用説明書とを有するキットも、本発明の範囲内に含まれる。本キットは、更に、免疫抑制剤、細胞障害性薬剤又は放射毒性薬剤等である１つ若しくはそれ以上の追加的な試薬、又は１つ若しくはそれ以上の追加的な本発明のヒト化抗体（例えば、第１のヒト化抗体とは異なるＣＤ１９抗原のエピトープに結合する、相補的な活性を有するヒト化抗体）を含んでいてもよい。
【０１６９】
［素材の寄託］
以下の素材は、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ），Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒ．７  Ｂ，３８１２４  ブラウンシュヴァイク，ドイツに寄託されている：
【０１７０】
実施例１に記載の、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化ＦＭＣ６３変異体の軽鎖をコードする核酸配列を有する単離核酸を有する微生物（大腸菌）（２０１０年２月５日にＤＳＭＺに寄託、受入番号：ＤＳＭ２３３０３）。実施例１に記載の、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化ＦＭＣ６３変異体の重鎖をコードする核酸配列を有する単離核酸を有する微生物（大腸菌）（２０１０年２月５日にＤＳＭＺに寄託、受入番号：ＤＳＭ２３３０２）。これらの寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約及びそれに基づく規則（ブダペスト条約）に基づいてなされた。
【０１７１】
さらなる説明がなくとも、当業者であれば、上記説明及び以下の実施例に基づいて、本開示の薬剤を作成・利用し、請求の範囲に記載の方法を実施することができるものと確信する。なお、以下の実施例は、本開示の実施を容易にするために提供するものであり、いかなる方法においても本開示の他の部分を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【０１７２】
［実施例］
［実施例１：ヒトＣＤ１９に対するマウスモノクローナルＦＭＣ６３抗体のヒト化］
ここでは、ヒトアクセプターフレームワークの選択、復帰変異、及び結合特性を実質的に保持および／又は向上させるＣＤＲ移植ヒトアクセプターフレームワークの変異を含む、抗ヒトＣＤ１９マウス抗体ＦＭＣ６３のヒト化について説明する。
【０１７３】
ＦＭＣ６３とは、ヒト前リンパ球性白血病細胞株ＪＶＭ３で免疫したマウスから単離した、マウスＩｇＧ２ａ・κ抗体（Ｚｏｌａ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ（１９９１），Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，６９：４１１−２２．）であり、その可変領域は公知であり、一般に利用可能である（重鎖のＮＣＢＩ受入番号、ＣＡＡ７４６５９（配列番号１）；軽鎖のＮＣＢＩ受入番号、ＣＡＡ７４６６０（配列番号２））。抗原結合親和性のアッセイ法は、当分野で周知であり、最大半量結合アッセイ、競合アッセイ及びスキャッチャードプロット分析が挙げられる。
【０１７４】
［再構築した可変領域の設計］
ヒトアクセプターフレームワークの選択：相同性マッチングを用いて、ＦＭＣ６３のＣＤＲを移植するヒトアクセプターフレームワークを選択した。データベース（例えば、ヒト及びマウスの免疫グロブリン座由来のジャームライン可変遺伝子のデータベース、ＶＢＡＳＥ２（Ｒｅｔｔｅｒ  Ｉ．ｅｔ  ａｌ，２００５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３３，Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ  Ｄ６７１−Ｄ６７４）、又はＫａｂａｔ  ｄａｔａｂａｓｅ（Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ，２０００，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２８，ｐ２１４−２１８））、又は出版物（例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，１９９２）を用いて、マウスの重鎖及び軽鎖Ｖ領域が属するヒトサブファミリーを同定し、アクセプター分子として用いるのに最適なヒトジャームラインフレームワークを決定することができる。アクセプターとして使用するＶＨ及びＶＬ配列をサブファミリー内から選択は、移植後にも６つのＣＤＲの相対的な提示が適切に保存されるように、ＣＤＲ１及びＤＣＲ２の配列相同性及び／又は構造の一致度に基づいて行ってよい。
【０１７５】
例えば、ＶＢＡＳＥ２データベースを使用すると、ＦＭＣ６３のＶＬフレームワークとヒトκサブファミリーＩのメンバーが高い相同性を有することが示されることから、ＦＭＣ６３のκ軽鎖がκサブファミリーの１つであることが示される。ＣＤＲとフレームワークの双方の配列について最も高い相同性及び同一性が見られたのは、４つのジャームライン配列：ＩＧＫＶ１−５＊０３（ＶＢＡＳＥ２  ＩＤ  ｈｕｍＩＧＫＶ０８７）（配列番号３）、ＩＧＫＶ１−２７＊０１（ＶＢＡＳＥ２  ＩＤ  ｈｕｍＩＧＫＶ１０６）（配列番号４）、ＩＧＫＶ１−３９＊０１（ＶＢＡＳＥ２  ＩＤ  ｈｕｍＩＧＫＶ１１５）（配列番号５）及びＩＧＫＶ１−１２＊０１（ＶＢＡＳＥ２  ＩＤ  ｈｕｍＩＧＫＶ０９４）（配列番号６）であり、ＣＤＲ３までの全配列についてはそれぞれ７０．４％、７５％、７６．１％及び７２．７％の配列同一性を、フレームワーク領域についてはそれぞれ７４．３％、７８．６％、７８．６％及び７７．１％の配列同一性を有していた。ＶＢＡＳＥ２には完全なＬＣＤＲ３及びフレームワーク４領域が含まれていないため、ヒトアクセプターに最もマッチするＪＫセグメント配列を、健康なドナーＢ細胞ｍＲＮＡから調製した相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の分析により同定した。続いて、これを表１に示す縮重プライマー及びκアイソタイプ由来の免疫グロブリン軽鎖第１定常ドメインを用いて増幅した。この手法を用いたところ、増幅産物のうち最もマッチする配列は、ＩＧＫＶ１−５＊０３（配列番号３）、ＩＧＫＶ１−２７＊０１（配列番号４）、ＩＧＫＶ１−３９＊０１（配列番号５）及びＩＧＫＶ１−１２＊０１（配列番号６）に対して、それぞれ配列番号７、配列番号８、配列番号９及び配列番号１０であった。
【０１７６】
【表１】
2012518404.tif 000004
【０１７７】
同様にして、ＦＭＣ６３のフレームワーク３までのＶＨ配列は、ヒトＶＨサブファミリーＩＩＩに属することが、ＶＢＡＳＥ２を用いて示される。ヒトＶＨサブファミリーＩＩＩのうち、ＦＭＣ６３と最も高い相同性を示したのは、ＩＧＨＶ３−３３＊０１（ＶＢＡＳＥ２−ＩＤ：ｈｕｍＩＧＨＶ１９９）（配列番号１１）、ＩＧＨＶ３−１１＊０１（ＶＢＡＳＥ２−ＩＤ：ｈｕｍＩＧＨＶ１７５）（配列番号１２）、ＩＧＨＶ３−３０＊１８（ＶＢＡＳＥ２−ＩＤ：ｈｕｍＩＧＨＶ１９５）（配列番号１３）及びＩＧＨＶ３−４８＊０１（ＶＢＡＳＥ２−ＩＤ：ｈｕｍＩＧＨＶ０３１）（配列番号１４）であり、フレームワーク及びＣＤＲ領域について７０．４％を超える配列相同性を示した。軽鎖については、健康なドナーＢ細胞ｍＲＮＡから調製し、縮重プライマーとＩｇＭ重鎖第１定常ドメインを用いて増幅したｃＤＮＡに基づいて、適合するＪＨセグメントを同定する（表２）。次の配列：配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８が、それぞれＩＧＨＶ３−３３＊０１（ＶＢＡＳＥ２−ＩＤ：ｈｕｍＩＧＨＶ１９９）（配列番号１１）、ＩＧＨＶ３−１１＊０１（ＶＢＡＳＥ２−ＩＤ：ｈｕｍＩＧＨＶ１７５）（配列番号１２）、ＩＧＨＶ３−３０＊０３（ＶＢＡＳＥ２−ＩＤ：ｈｕｍＩＧＨＶ１９５）（配列番号１３）及びＩＧＨＶ３−４８＊０１（ＶＢＡＳＥ２−ＩＤ：ｈｕｍＩＧＨＶ０３１）（配列番号１４）と最も近い。
【０１７８】
【表２】
2012518404.tif 000005
【０１７９】
［最初のＣＤＲ移植ヒト可変領域の作成］
上記で調製したヒトＶＨ及びＶＬ断片を、ヒト化プロセスの開始に使用した。ｃＤＮＡをオーバーラップＰＣＲアセンブリ（ｏｖｅｒｌａｐ  ＰＣＲ  ａｓｓｅｍｂｌｙ）を用いたＣＤＲ移植のテンプレートとして用い、本来のＣＤＲが表３に示すＦＭＣ６３のＣＤＲに置き換えられた次の重鎖及び軽鎖：ＶＨ２（配列番号１９）、ＶＨ５（配列番号２０）、ＶＨ１６（配列番号２１）、ＶＨ２０（配列番号２２）、ＶＬ３９（配列番号２３）、ＶＬ４０（配列番号２４）、ＶＬ４３（配列番号２５）及びＶＬ４４（配列番号２６）に基づいて、最初のヒト化候補を作成した。
【０１８０】
表３：ＦＭＣ６３のＣＤＲ領域
【表３】
2012518404.tif 000006
【０１８１】
重鎖ＶＨ２、ＶＨ５、ＶＨ１６及びＶＨ２０は、それぞれ配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８をコードするｃＤＮＡに基づいており、表４及び５に記載の４断片ＰＣＲ法（ｆｏｕｒ−ｆｒａｇｍｅｎｔ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ＰＣＲ  ｓｔｒａｔｅｇｙ）を用いて、ＣＤＲがＦＭＣ６３のＣＤＲに交換されている。表６及び７に示すように、同様の方法をＶＬ３９、ＶＬ４０、ＶＬ４３及びＶＬ４４についても用いた。
【０１８２】
重鎖については、表４に記載のＰＣＲ増幅産物を、アダプタープライマー（センスプライマーＨｉｎｄＩＩＩ  ＶＪ２Ｃ（配列番号９３）及びアンチセンスプライマーＳａｌＩ  ａｄａｐｔｏｒ（配列番号９２））を用いた２次ＰＣＲによりサブクローニングして、可変ドメインｃＤＮＡの３’末端にＳａｌＩサイトを付加した（以下参照）。表６に記載の増幅産物により、直接κ鎖をクローニングして哺乳動物細胞発現ベクターとすることが可能となる（以下に記載）。この場合、ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩサイト法により、可変ドメインだけでなく全長定常κドメインを含んだ産物を、哺乳動物細胞発現ベクターにおいてクローニングした。
【０１８３】
表４：最初のＣＤＲ移植重鎖可変領域を構築するために用いたテンプレート及びプライマーの概要
【表４】
2012518404.tif 000007
【０１８４】
表５：選択した最初のヒト重鎖ＣＤＲ移植可変領域を構築するのに用いたプライマーの配列
【表５】
2012518404.tif 000008
【０１８５】
表６：最初のＣＤＲ移植軽鎖可変領域を構築するために用いたテンプレート及びプライマーの概要
【表６】
2012518404.tif 000009
【０１８６】
表７：選択した最初のヒト軽鎖ＣＤＲ移植可変領域を構築するのに用いたプライマーの配列
【表７】
2012518404.tif 000010
【０１８７】
操作された重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡ配列は、ＣＭＶプロモーター及びウシ成長ホルモンポリアデニル化信号を持つ改良ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）ベクターをベースとする独立ベクターに結合した。ＢａｍＨＩ及びＢｓｉＷＩ制限酵素部位を用いて、可変κ軽鎖ｃＤＮＡ断片をκ軽鎖定常ドメインｃＤＮＡの前に結合することで、軽鎖用のベクターによるκアイソタイプ軽鎖の発現を可能とした。一方で、可変重鎖ｃＤＮＡ断片も、ＢａｍＨＩ及びＢｓｉＷＩ制限酵素部位を用いて、γ１、ヒンジ、γ２及びγ３定常領域をコードするｃＤＮＡの前に結合して、重鎖用のベクターを操作した。重鎖及び軽鎖の発現ベクターの双方において、ＢａｍＨＩサイトを有するマウスＶＪ２Ｃリーダーペプチドによる分泌を行わせた。尚、ＢｓｉＷＩサイトは、κ定常領域に位置し、ＳａｌＩサイトは、Ｃγ１ドメインに位置する。
【０１８８】
免疫グロブリン候補を一過性発現させるため、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いて、等量の重鎖及び軽鎖ベクターを懸濁順応型ＨＥＫ−ＥＢＮＡ細胞（ＡＴＣＣ−ＣＲＬ−１０８５２）に共トランスフェクションした。典型的には、濃度８０万−１２０万細胞／ｍｌとした細胞懸濁液１００ｍｌの細胞を、重鎖をコードする発現ベクター５０μｇ及び軽鎖をコードする発現ベクター５０μｇを含むＤＮＡ−ＰＥＩ混合物でトランスフェクションする。抗体遺伝子をコードする遺伝子組換え発現ベクターを宿主細胞に導入した場合、さらに４から５日間細胞を培養すると抗体が産生され、培地（（ＥＸ−ＣＥＬＬ  ２９３，ＨＥＫ２９３無血清培地，Ｓｉｇｍａ，ブーフス，スイス）、プルロニック酸０．１％、グルタミン４ｍＭ及びジェネティシン０．２５μｇ／ｍｌを追加）に分泌される。次いで、遺伝子組換えプロテインＡストリームラインメディア（ＧＥ，スイス）を用いて、無細胞上清から抗体を精製し、アッセイに先立ちリン酸緩衝食塩水にバッファー交換した。
【０１８９】
ヒト化の工程では、最初の４つの移植を受けた重鎖及び軽鎖（上記）を基本として、これらがペアとなるよう組み合わせて１６個の全長免疫グロブリン候補を作成した。これらの免疫グロブリンの抗原結合親和性を、Ｂ細胞リンパ腫細胞株（ＦＡＣＳ）に対する最大半量結合アッセイにより評価し、ＦＭＣ６３のキメラ体（実施例２に記載するように、これを抗ヒトＦｃＰＥ標識検出抗体による染色の基準レベルとした）と比較した。図１Ａ及び１Ｂからわかるように、この最初の研究では、ＶＨ１６（配列番号２１）又はＶＨ２０（配列番号２２）を含む免疫グロブリン候補が、ＦＡＣＳ実験において最高のＲａｊｉ細胞への結合性を示した。表８に示すように、重鎖ＶＨ１６と軽鎖ＶＬ４３のペアからなる抗体は、一過性トランスフェクションにおいて優れた発現レベルを示しただけでなく、そのＦＡＢ断片が優れた融点を示したため、これをさらなる復帰変異及び合理的操作に供する抗体として選択した。
【０１９０】
表８：最初のＣＤＲ移植抗体のＩｇＧ一過性発現レベル及びＦＡＢ安定性
【表８】
2012518404.tif 000011
【０１９１】
［ヒトフレームワークの復帰変異］
ＦＭＣ６３マウス抗体由来のＣＤＲをそのまま移植してもヒトアクセプターでは低い結合特性しか得られないことから、フレームワーク中の残基をいくつかの位置においてマウスの残基へと復帰変異させることが望ましい。この復帰変異と呼ばれるプロセスは、モノクローナル抗体のヒト化において最も予測できない工程であり、親抗体の結合特性を実質的に保持するのに不可欠な、保持すべき親抗体中のフレームワーク残基を特定する必要がある一方、同時に、変異により生じる抗体の免疫原性の可能性を最小にする必要がある。表９及び１０並びに図２Ａ及び２Ｂは、ＣＤＲのコンフォメーションに影響しうる残基（カバットの付番）であって、マウス残基への復帰変異の候補として選択されうるもの示す。
【０１９２】
表９：ＦＭＣ６３とヒトアクセプター軽鎖フレームワークの比較
【表９】
2012518404.tif 000012
【０１９３】
表１０：ＦＭＣ６３とヒトアクセプター重鎖フレームワークの比較
【表１０】
2012518404.tif 000013
【０１９４】
重鎖において可能な８つの復帰変異のうち、３７、４８及び４９の位置の変化は、保存的な性質であるため除外した。よって、ＶＨ１６について４つの再構築バージョンを作成し、ＶＬ４３の３つの復帰変異体すべてとペアになるよう組み合わせた。また、再構築した変異体は、親ＶＨ１６及び親ＶＬ４３ともペアにして、各々の復帰変異の効果を調査した。合計２４個の全長免疫グロブリン候補を調査した。この５つの重鎖変異体は、ＶＨ１６配列と比較して次の単一点変異を有する：Ｇ４２Ｒ、Ｆ６７Ｌ、Ｒ７１Ｋ、Ｌ７８Ｖ及びＲ９４Ｋ。一方、３つの軽鎖変異体は、ＶＬ４３と比較してＰ４４Ｖ、Ｆ７１Ｙ及びＹ８７Ｆを有する。
【０１９５】
ＦＡＣＳ実験（実施例２に記載）、一過性発現レベル及びＦＡＢ安定性の測定から、重鎖におけるＲ９４Ｋ及び／又は軽鎖におけるＰ４４Ｖの復帰変異が、表１１及び１２に示すように、Ｒａｊｉ細胞又はＮＡＬＭ−６細胞への結合性を劇的に増加させつつ、発現レベルを向上させ、ＦＡＢ安定性を維持することが明らかとなった。これらの２つの位置だけで、親ＦＭＣ６３抗体の結合性の約半分が回復した。
【０１９６】
表１１：Ｒａｊｉ及びＮＡＬＭ−６腫瘍細胞株における、復帰変異抗ＣＤ１９ヒト化抗体のＦＡＣＳ染色。数値（Ｒａｊｉ及びＮＡＬＭ−６細胞における測定値を、それぞれＲａｊｉ及びＮＡＬＭ−６と示す）は、フローサイトメトリーにより測定された抗体の中点蛍光（ＭＰＦ）をＦＭＣ６３キメラ抗体での値に対する％として表したものある。
【表１１】
2012518404.tif 000014
【０１９７】
表１２：復帰変異抗ＣＤ１９ヒト化抗体のＩｇＧ一過性発現レベル及びＦＡＢ安定性
【表１２】
2012518404.tif 000015
【０１９８】
［ジャームライン化］
通常、ジャームラインフレームワークは、ヒト化抗体のアクセプターフレームワークとしては、個々の成熟抗体フレームワークよりも優れている。これは、体細胞変異が無く、免疫原性が低いためである。ＶＨ１６は、ＶＢＡＳＥ２のジャームライン配列に従って設計した縮重プライマーを用いて、健康なドナーＢ細胞ｍＲＮＡからとり出されたものであり、この手法により、いかなる抗原とも未だ遭遇していない抗体が得られる。しかし、どの程度真に自然抗体であるかは、ソースとなるＢ細胞に強く依存しているため、この手法においても変異が見られうる（Ｋｌｅｉｎ  Ｕ．ｅｔ  ａｌ，１９９７，Ｂｌｏｏｄ  ８９，ｐ１２８８−１２９８）。ＶＨ１６及びＶＬ４３は共に、ジャームラインに復帰変異された非ジャームライン残基を少し含んでいた。表１３に示すように、これらの変化は、ＶＨ１６−Ｑ６Ｅ、ＶＬ４３−Ｖ３Ｑ及びＶＬ４３−Ｔ７Ｓであった。
【０１９９】
表１３：復帰変異／ジャームライン化ヒト化抗ＣＤ１９抗体の、Ｒａｊｉ腫瘍細胞株におけるＦＡＣＳ染色。数値（Ｒａｊｉと示す）は、フローサイトメトリーにより測定された抗体の中点蛍光（ＭＰＦ）をＦＭＣ６３キメラ抗体での値に対する％として表したものある。また、復帰変異／ジャームライン化ヒト化抗ＣＤ１９抗体のＩｇＧ一過性発現レベル及びＦＡＢ安定性を示す。
【０２００】
【表１３】
2012518404.tif 000016
【０２０１】
いずれのジャームラインでの変化も、ＶＨ１６−ＶＬ４３抗体の親和性及びＦＡＢ安定性のどちらにも何ら影響を与えないが、一過性発現レベルだけは大きく増加することがわかった。次いで、ジャームライン残基のＶＬ４３−Ｖ３Ｑ及びＶＬ４３−Ｔ７Ｓの位置におけるＶＨ１６−ＶＬ４３変異体を、合理的設計（ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎ）（以下）による親和性の改善に供した。
【０２０２】
［合理的デサイン及びＣＤＲ操作による復帰変異ヒトアクセプターの親和性の改善］
チロシン変異体ＦＭＣ６３のＣＤＲは、チロシン含有率が高い：重鎖ＣＤＲ１（位置３２）、重鎖ＣＤＲ２（位置５８及び５９）、重鎖ＣＤＲ３（位置９６、９７、９８及び１００ｂ）、軽鎖ＣＤＲ１（位置３２）及び軽鎖ＣＤＲ３（位置９６）。そのうち、重鎖ＣＤＲ３における４つのチロシン残基（Ｙ９６、Ｙ９７、Ｙ９８及びＹ１００ｂ）並びに重鎖ＣＤＲ１及び軽鎖ＣＤＲ１における共に３２の位置の２つのチロシン残基が特別である。これらの残基は、疎水性であり、そのほとんどが、特異性の決定を左右することが多く、最も重要なＣＤＲである重鎖ＣＤＲ３の一部であることに加え、ＶＨ１６−Ｒ９４Ｋ／ＶＬ４３の３Ｄモデルによれば抗体結合部位の外側に突き出ていることから、ヒトＣＤ１９分子と相互結合すると推定される部位を定めているであろう。これらの知見を合わせると、重鎖ＣＤＲ３の残基９６、９７、９８及び１００ｂ及び軽鎖ＣＤＲ１の残基３２が、合理的な親和性改善の候補として特定される。チロシン残基は、疎水性かつ極性（それぞれ芳香環及び水酸基に起因する）という独特な２重の性質を有する。よって、上記の残基をフェニルアラニンに変異させて疎水性を高め、これらの位置における疎水性に対する極性の重要性を調査した。重鎖Ｒ９４Ｋ変異体のフェニルアラニン変異体について測定したところ、表１４に示すように、軽鎖３２変異に加えて重鎖３２、９７及び９８変異体が、親分子ＶＨ１６−Ｒ９４Ｋ／ＶＬ４３よりも優れており、重鎖変異体Ｙ９７Ｆは、ＦＭＣ６３キメラ体の７２．８％の親和性を有していた。
【０２０３】
表１４：復帰変異／親和性成熟ヒト化抗ＣＤ１９抗体のＲａｊｉ腫瘍細胞株におけるＦＡＣＳ染色。数値（Ｒａｊｉと示す）は、フローサイトメトリーにより測定された抗体の中点蛍光（ＭＰＦ）をＦＭＣ６３キメラ抗体での値に対する％として表したものある。また、復帰変異／親和性成熟ヒト化抗ＣＤ１９抗体のＩｇＧ一過性発現レベル及びＦＡＢ安定性を示す。
【表１４】
2012518404.tif 000017
【０２０４】
軽鎖Ｐｒｏ４４変異体軽鎖のＰ４４は、重鎖と軽鎖の境界面の底部に位置しており、バリンに復帰変異させると親和性が大きく改善されるのは、この位置によるものと説明できよう。４４の位置について、軽鎖及び重鎖の境界面を最適化する（又は調節する）可能性のある他の２つの疎水性アミノ酸についても調査した：表１５に示すように、ＶＨ１６−Ｒ９４Ｋ変異体についてイソロイシン及びロイシン変異体を作成した。親和性及び安定性の測定により、４４の位置について、イソロイシンが復帰変異のバリンよりも優れている一方、ロイシンへの変換は、より論理的な選択であるにもかかわらず弱い改善が得られるに過ぎないことが明らかとなった。
【０２０５】
表１５：復帰変異／親和性成熟ヒト化抗ＣＤ１９抗体の、Ｒａｊｉ腫瘍細胞株におけるＦＡＣＳ染色。数値（Ｒａｊｉと示す）は、フローサイトメトリーにより測定された抗体の中点蛍光（ＭＰＦ）を、ＦＭＣ６３キメラ抗体での値に対する％として表したものある。また、復帰変異／親和性成熟ヒト化抗ＣＤ１９抗体のＩｇＧ一過性発現レベル及びＦＡＢ安定性を示す。
【表１５】
2012518404.tif 000018
【０２０６】
潜在的脱アミド部位の除去
脱アミドは、抗体分解の主要経路である。ＡｓｎからＡｓｐへの脱アミドは、配列に強く依存しており、ＣＤＲ領域のような可動性であることが知られている又は予想されているタンパク領域でおこる（Ｂｉｓｃｈｏｆｆ  ａｎｄ  Ｋｏｌｂｅ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ，６６２（１９９４），２６１−２７８）。通常、これにはＣＤＲに位置するＡｓｎ残基が含まれる。ＦＭＣ６３の軽鎖ＣＤＲ３の９１から９３の位置（ＧＮＴ）において、アスパラギンが高確率で脱アミドされることが特定された。よって、表１６に示すように、想定される脱アミドを防止するため、ＶＨ１６−Ｒ９４Ｋの重鎖について以下の変更を調査した：ＶＬ４３−Ｎ９２Ａ、ＶＬ４３−Ｔ９３Ｖ及びＶＬ−４３−Ｔ９３Ａ。Ｎ９２Ａ及びＴ９３Ａでは、どちらも結合親和性が維持されていることがわかった。また、Ｎ９２Ａ変異体ではＦＡＢ安定性が改善されていることもわかった。
【０２０７】
表１６：復帰変異／脱アミド部位除去ヒト化抗ＣＤ１９抗体のＲａｊｉ腫瘍細胞株におけるＦＡＣＳ染色。数値（Ｒａｊｉと示す）は、フローサイトメトリーにより測定された抗体の中点蛍光（ＭＰＦ）をＦＭＣ６３キメラ抗体での値に対する％として表したものある。また、復帰変異／脱アミド部位除去ヒト化抗ＣＤ１９抗体のＩｇＧ一過性発現レベル及びＦＡＢ安定性を示す。
【表１６】
2012518404.tif 000019
【０２０８】
ＶＬ４３ヒトアクセプターについて、Ｆ７１の位置において他の改良を行った。ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ  ＶＬ４３  Ｆ７１Ｈ（配列番号６１）、ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ  ＶＬ４３  Ｆ７１Ｓ（配列番号６２）及びＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ  ＶＬ４３  Ｆ７１Ｔ（配列番号６３）のＲａｊｉへの結合活性は、ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ  ＶＬ４３の結合活性と同様であった。
【０２０９】
［復帰変異と合理的設計による変異の組合せ］
Ｒａｊｉ細胞への結合性を更に高めるため、復帰変異と合理的設計による変異を系統立てた手法により組み合わせ、一定数の組合についてを試験した。重鎖及び軽鎖においてチロシンをフェニルアラニンに変換した変異体のうち最も改善がみられたもの（上記）に、ジャームラインの変更Ｖ３Ｑ及びＴ７Ｓに加えて軽鎖の変更Ｐ４４Ｉ及びＮ９２Ａを組み合わせた。
【０２１０】
ＣＤＲの変更は、親和性に関して相加的効果をしばしばもたらすが、こうしたＣＤＲの変更をフレームワークに影響を及ぼす変異と組み合わせた場合、その結果を予測することはできない。表１７は、ジャームライン、フレームワーク、復帰及びＣＤＲ変異を組み合わせたＶＨ１６／ＶＬ４３変異体のＦＡＣ染色の相対値を示す。重鎖ＣＤＲの変更Ｙ３２Ｆ及びＹ９７Ｆを復帰変異Ｒ９４Ｋを組み合わせると結合性が失われるが、Ｙ３２Ｆを重鎖復帰変異Ｒ９４Ｋ及び軽鎖の変更Ｐ４４Ｉ及びＮ９２Ａと組み合わせると、結合性が大きく改善され、我々の測定手段においては、染色の中点滴定値が相対的にＦＭＣ６３キメラ体よりも優れる結果となった。別の好適な組合せは、重鎖復帰変異Ｒ９４Ｋにおける重鎖ＣＤＲ変異Ｙ１００ＢＦ及びＹ３２Ｆの両方と軽鎖の変更Ｖ３Ｑ、Ｔ７Ｓ、Ｙ３２Ｆ、Ｐ４４Ｉ及びＮ９２Ａの組合せである。
【０２１１】
表１７：復帰変異／ジャームライン化／親和性成熟／脱アミド部位除去ヒト化抗ＣＤ１９抗体の、Ｒａｊｉ腫瘍細胞株におけるＦＡＣＳ染色。数値（Ｒａｊｉと示す）は、フローサイトメトリーにより測定された抗体の中点蛍光（ＭＰＦ）を、ＦＭＣ６３キメラ抗体での値に対する％として表したものある。
【表１７】
2012518404.tif 000020
【０２１２】
高い結合活性を示した組合せは、高い一過性発現レベル（表１８）と高いＦＡＢ断片耐熱性（表１９）も保持していた。
【０２１３】
表１８：復帰変異／ジャームライン化／親和性成熟／脱アミド化部位除去ヒト化抗ＣＤ１９抗体の、ＩｇＧ一過性発現レベル。
【表１８】
2012518404.tif 000021
【０２１４】
表１９：復帰変異／ジャームライン化／親和性成熟／脱アミド化部位除去ヒト化抗ＣＤ１９抗体のＦＡＢ安定性（℃）。
【表１９】
2012518404.tif 000022
【０２１５】
［実施例２：ＣＤ１９抗体のＢ細胞由来腫瘍細胞株への結合性：フローサイトメトリー分析］
ＣＤ１９ヒト化モノクローナル抗体の、Ｒａｊｉ腫瘍細胞（ヒトバーキットリンパ腫ＤＳＭＺ  ＡＣＣ３１９）、ＮＡＬＭ−６（ヒト前駆Ｂ細胞白血病ＤＳＭＺ  ＡＣＣ１２８）及びＳＵ−ＤＨＬ−６（ヒトＢ細胞リンパ腫ＤＳＭＺ  ＡＣＣ５７２）（細胞株はすべてＤＳＭＺブラウンシュヴァイク、ドイツより入手）に対する結合性をフローサイトメトリーにより評価した細胞を、各ヒト化モノクローナル抗体の段階希釈系と共に培養した。無関係のヒトＩｇＧ１を陰性コントロールとして用いた。細胞を洗浄し、フィコエリトリン標識（ＰＥ）抗ヒト二次抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＣＡ，米国）により検出し、フローサイトメトリーで分析した。ヒト化抗体候補と親マウス抗体の間での比較対象とできる染色レベルを確保するため、ＦＭＣ６３キメラ体、即ち配列番号６８に示すヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメインに融合したＦＭＣ６３マウス重鎖可変ドメインと、配列番号６９に示すκ定常ドメインに融合したマウス軽鎖可変ドメインとからなる抗体、を基準として用いた。Ｒａｊｉ及びＮＡＬＭ−６への結合性の結果は表１１、１３−１７に、ＳＵ−ＤＨＬ−６細胞株への結合性の結果は図３に示す。図３の結果は、すべて細胞染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）の測定値である。ＭＦＩ−抗体濃度の曲線から、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５（ＣＡ，米国）を用いて各抗ＣＤ１９ヒト化抗体の中点蛍光（ＭＰＦ）値を算出した。用量反応曲線におけるＭＰＦとは、最大染色の５０％が観察される抗体濃度（μｇ／ｍｌ）を表す。よって、細胞に対する結合活性が良好な抗体は、低いＭＰＦ（μｇ／ｍｌ）を有する。表１１及び１３−１７において、数値は、ＦＭＣ６３キメラ体と抗ＣＤ１９ヒト化変異体との間のＭＰＦの相対値を表しており、以下のように算出した：［１／（ＦＭＣ６３キメラ体のＭＰＦ／抗ＣＤ１９ヒト化抗体のＭＰＦ）］×１００。割合が高いほど、抗体の結合活性が良好である。
【０２１６】
図３は、ＶＨ１６／ＶＬ４３抗体からＶＨ１６−Ｒ９４Ｋ−Ｙ１００ＢＦ／ＶＬ４３−Ｖ３Ｑ−Ｔ７Ｓ−Ｐ４４Ｉ−Ｎ９２Ａ抗体に至る種々のヒト化工程に伴う、ＳＵ−ＤＨＬ−６細胞に対する親和性の劇的な改善を示す。後者では、Ｂ細胞に対する親和性がＦＭＣ６３キメラ体と同様の強い程度にまで達した。ＦＭＣ６３ヒト化抗体の細胞への親和性の改良は、上述のような、結合特性を実質保持及び／又は改善する、ＣＤＲ移植ヒトアクセプターフレームワークにおける変異により得られた直接的な結果である。
【０２１７】
［実施例３：抗ＣＤ１９ヒト化抗体のＲａｊｉ腫瘍細胞へのスキャッチャード結合分析］
［ヒト化抗体のＲａｊｉ−Ｂ腫瘍細胞へのスキャッチャード結合分析］
抗体の標的に対する結合親和性定数は、飽和結合曲線から決定することができる。平衡状態では、結合部位への結合抗体及び自由抗体の量から解離結合定数Ｋｄが示される。通常、単一の結合部位に対しては、結合／分離抗体に対する結合抗体の比は直線相関しており、その傾きは結合定数Ｋｄの逆数と一致する。
【０２１８】
試験した抗体は、ユーロピウム（Ｅｕ３＋）蛍光染料（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，ＭＡ，ＵＳＡ）で標識した。Ｅｕ３＋により、細胞に結合した抗体分子及び遊離抗体分子の定量が可能となる。選択したヒト化抗体候補のＲａｊｉ細胞に対する結合の飽和は、時間分解蛍光を用いてＥｕ３＋により追跡した。Ｅｕ３＋標識した候補抗体が結合特異性を有し、Ｅｕ３＋染料が細胞表面で非特異的な挙動を示さないことを実証するため、陰性のヒトＩｇＧ１アイソタイプもＥｕ３＋で標識した。
【０２１９】
実施例２に記載のＲａｊｉ細胞を、ＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｃｈｅｍｉｅ  Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ  ＡＧ，ＰＡＡ，バーゼル，スイス）にウシ胎児血清１０％（ＦＢＳ，Ｃｈｅｍｉｅ  Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ  ＡＧ，ＰＡＡ，バーゼル，スイス）、ｕｌｔｒａｇｌｕｔａｍｉｎｅ１、２ｍＭ（Ｌｏｎｚａ，ベルビエ，ベルギー）及びペニシリン／ストレプトマイシン１％（Ｃｈｅｍｉｅ  Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ  ＡＧ，ＰＡＡ，バーゼル，スイス）を加えたもので生育した。細胞を同一の培地で洗浄し、最終濃度１×１０６細胞／ｍｌとなるよう調整した。１００μｌ量のＲａｊｉ細胞を丸底９６穴プレートに播いた。Ｅｕ３＋標識抗体の段階希釈系列をＰＢＳ−２．５％／ＦＢＳ−０．０５％／アジ化ナトリウム（ＮａＮ３）により９６穴プレートにおいて調製し、４℃まで冷却した。その後、Ｅｕ３＋標識抗体の最終希釈が１３．３ｎＭから６．５ｐＭの範囲となるよう、１００μｌ量のＥｕ３＋標識抗体の各希釈液をＲａｊｉ細胞に加えた。細胞をＥｕ３＋抗体と共に氷上で１５分インキュベートして、平衡状態とした。無細胞上清の一部を取り出して（量は抗体濃度によって経験的に調節し、細胞は１３００ＲＰＭで２分間遠心した。）、１００μｌのＤｅｌｆｉａ液（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，ＭＡ，米国；Ｅｕ３＋蛍光エンハンサー）を含む新たなプレートに移し、遊離のＥｕ３＋標識抗体量を測定した上清を完全に除去するため、細胞をさらに１３００ＲＰＭで２分遠心沈殿させた。２度目の遠心分離の後、上清を除去し、細胞を２００μｌの冷結合緩衝液（ＰＢＳ−２．５％／ＦＢＳ−０．０５％／ＮａＮ３）で２回洗浄した。細胞ペレットを、１００μｌのＤｅｌｆｉａ液に再懸濁させた。両方のプレート（遊離又は結合Ｅｕ３＋抗体）について、時間分解蛍光を分光光度計（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ，ｓｙｎｅｒｇｙ２，ＶＴ，米国；励起波長３４０ｎｍ，放射波長６１５ｎｍ，遅延４００μｓ及び捕捉時間１０００μｓ）で測定した。解離定数Ｋｄは、スキャッチャード分析により決定した。結合抗体に対する結合／自由抗体の線形表現による傾きを１／Ｋｄと表す。Ｋｄは、各抗体につき２回求め、蛍光測定は、３回行った。上記の結合アッセイによれば、図４Ａ及び４Ｂでは、抗体ＶＨ１６−Ｒ９４Ｋ／ＶＬ４３（Ｋｄ＝４７ｎＭ）から抗体ＶＨ１６−Ｒ９４Ｋ−Ｙ１００ＢＦ／ＶＬ４３−Ｖ３Ｑ−Ｔ７Ｓ−Ｐ４４Ｉ−Ｎ９２Ａに至る種々の変異段階に沿って著しいＫｄの改善が示されている（Ｋｄ＝１０．９ｎＭ）。後者の抗体は、親ＦＭＣ６３キメラ体よりも良好なＫｄを有する（１１．８ｎＭ）。
【０２２０】
［ユーロピウム標識ＦＭＣ６３キメラ体と無標識抗ＣＤ１９ヒト化抗体との結合競合−Ｋｉ測定］
各ヒト化抗体の結合親和性を評価する別の方法として、Ｒａｊｉ細胞親についてＦＭＣ６３キメラに抗体に対する結合競合を測定する方法がある。ユーロピウム標識ＦＭＣ６３キメラ体（Ｅｕ３＋−ＦＭＣ６３）のＲａｊｉ細胞に発現しているＣＤ１９抗原への結合を阻害するために、漸増濃度の無標識抗体を一定量のＥｕ３＋−ＦＭＣ６３と共に加えた。この目的において、ＲＰＭＩ−１６４０培地（（Ｃｈｅｍｉｅ  Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ  ＡＧ，ＰＡＡ，バーゼル，スイス）にウシ胎児血清１０％（ＦＢＳ，Ｃｈｅｍｉｅ  Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ  ＡＧ，ＰＡＡ，バーゼル，スイス），ｕｌｔｒａｇｌｕｔａｍｉｎｅ１、２ｍＭ（Ｌｏｎｚａ，ベルビエ，ベルギー）及びペニシリン／ストレプトマイシン１％（Ｃｈｅｍｉｅ  Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ  ＡＧ，ＰＡＡ，バーゼル，スイス）を加えたもの）中で１×１０６細胞／ｍｌの濃度となるよう調製したＲａｊｉ細胞１００μｌ量を、丸底９６穴プレートに播いた。競合抗体の段階希釈系列をＰＢＳ−２．５％／ＦＢＳ−０．０５％／ＮａＮ３により９６穴プレートにおいて調製し、次いで一定量のＥｕ３＋−ＦＭＣ６３と混合した。事前に４℃に冷却した抗体希釈液を１００μｌ取り、Ｒａｊｉ細胞に加えた。無標識ヒト化抗体の最終濃度を１００ｎＭから４．２ｐＭの範囲とした一方、Ｅｕ３＋−ＦＭＣ６３の濃度は０．２ｎＭに維持した。細胞を抗体と共に氷上で１５分間インキュベートした。平衡状態に達した後、細胞を１３００ＲＰＭで２分間遠心して、上清を除去した。細胞ペレットを冷結合緩衝液（ＰＢＳ−２．５％／ＦＢＳ−０．０５％／ＮａＮ３）で２回洗浄し、１００μｌのＤｅｌｆｉａ液に再懸濁させた。細胞に結合したＥｕ３＋−ＦＭＣ６３を上述のように時間分解蛍光で測定した。ウェルあたりのＥｕ３＋−ＦＭＣ６３量（ｆモル）を求め、無標識抗体の全量に対してプロットした。Ｅｕ３＋−ＦＭＣ６３の結合阻害曲線を、単一部位競合モデルを用いてＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５ソフトウェア（ＣＡ，ＵＳＡ）で更に分析した結果、全リガンド固定濃度は０．２ｎＭ、結合阻害定数はナノモルの範囲であった。上記の実験によれば、表２０に示すように、変異を含まないフレームワークＶＨ１６ＶＬ４３は、Ｒａｊｉ細胞に対してほとんど親和性を示さない（７２．８ｎＭ）一方、ヒト化抗体ＶＨ１６−Ｒ９４Ｋ−Ｙ１００ＢＦ／ＶＬ４３−Ｖ３Ｑ−Ｔ７Ｓ−Ｐ４４Ｉ−Ｎ９２Ａは、ＦＭＣ６３キメラ体と同等の非常に高い親和性を示す（１．９ｎＭに対して１．４ｎＭ）。結果及び標準偏差は、少なくとも３回求めた。
【０２２１】
表２０：ヒト化抗ＣＤ１９抗体のＫｉ測定
【表２０】
2012518404.tif 000023
【０２２２】
［実施例４：抗体依存性細胞性細胞障害（ＡＤＣＣ）活性の評価］
ヒト化抗ＣＤ１９抗体のＡＤＣＣ活性は、ＣｙｔｏＴｏｘ  ９６  Ｎｏｎ−Ｒａｄｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ，マディソン，米国）を用いて乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）リリースアッセイにより測定した。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、標準Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ分離によりクエン酸全血より精製し、完全培地（ＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｃｈｅｍｉｅ  Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ  ＡＧ，ＰＡＡ，バーゼル，スイス）にウシ胎児血清１０％（ＦＢＳ，Ｃｈｅｍｉｅ  Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ  ＡＧ，ＰＡＡ，バーゼル，スイス），ｕｌｔｒａｇｌｕｔａｍｉｎｅ１  ２ｍＭ（Ｌｏｎｚａ，ベルビエ，ベルギー）及びペニシリン／ストレプトマイシン１％（Ｃｈｅｍｉｅ  Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ  ＡＧ，ＰＡＡ，バーゼル，スイス），及びヒトＩＬ−２  １００Ｕ／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ，ミズーリ，米国）を追加したもの）に再懸濁して３７℃で一晩インキュベートした。翌日、ＰＢＭＣを遠心分離により回収し、２回洗浄して、８×１０６細胞／ｍｌの濃度で培地に再懸濁させた。実施例２に記載するＣＤ１９＋細胞株のＲａｊｉを、標的細胞として用いた。Ｒａｊｉ細胞を、２回洗浄して、０．２×１０６細胞／ｍｌの濃度で完全培地に再懸濁させた。１．５μｇ／ｍｌに希釈した抗体５０μｌ（最終濃度０．５μｇ／ｍｌ）を標的細胞５０μｌと混合し、等量のＰＢＭＣを加えて丸底９６穴プレートに入れた。本実験では、常に標的とエフェクターの比を１：４０とした。３７℃で４時間インキュベートした後、細胞を遠心分離し、５０μｌの無細胞上清を回収して平底９６穴プレートに移し、アッセイした。溶解の割合は次のように算出した：（試料放出−標的の自己溶解−エフェクターの自己放出）／（最大放出−標的の自己放出）×１００。ここで標的の自己放出は標的細胞のみを含むウェルからの蛍光、エフェクターの自己放出はエフェクター細胞のみを含むウェルからの蛍光、最大放出は溶解バッファーで処理した標的細胞を含むウェルからの放出である。抗体を欠く場合（標的＋エフェクター細胞）に得られる溶解のバックグラウンド％を、試料の溶解％から差し引いた。
【０２２３】
図５Ａ及び５Ｂは、ＩｇＧ１のコントロールによるＲａｊｉ細胞の特異的な溶解がほとんど無いことを示す。しかし、ヒト化抗体により誘導された溶解は、ＶＨ１６−Ｒ９４Ｋ−Ｙ１００ＢＦ／ＶＬ４３−Ｖ３Ｑ−Ｔ７Ｓ−Ｙ３２Ｆ−Ｐ４４Ｉ−Ｎ９２Ａ抗体、ＶＨ１６−Ｒ９４Ｋ／ＶＬ４３−Ｖ３Ｑ−Ｔ７Ｓ−Ｐ４４Ｉ−Ｎ９２Ａ抗体、ＶＨ１６−Ｒ９４Ｋ−Ｙ１００ＢＦ／ＶＬ４３−Ｖ３Ｑ−Ｔ７Ｓ−Ｐ４４Ｉ−Ｎ９２Ａ又はＦＭＣ６３キメラ体において少なくとも３倍増加していた（図５Ａは、３つの異なるドナーの平均±標準偏差を示し、図５Ｂは１つのドナーについて３回繰り返し行った結果±標準偏差を示す。）。このデータにより、選択したヒト化抗ＣＤ１９抗体が、親ＦＭＣ６３キメラと同様に、ＣＤ１９＋発現細胞の細胞性細胞傷害を引き起こすことが実証された。
【０２２４】
［実施例５：抗ＣＤ１９抗体によるアポトーシス誘導］
抗体誘導性の細胞死を測定するため、実施例２に記載のＲａｊｉ細胞をＲＰＭＩ−１６４０培地（（Ｃｈｅｍｉｅ  Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ  ＡＧ，ＰＡＡ，バーゼル，スイス）にウシ胎児血清１０％（ＦＢＳ，Ｃｈｅｍｉｅ  Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ  ＡＧ，ＰＡＡ，バーゼル，スイス），ｕｌｔｒａｇｌｕｔａｍｉｎｅ１、２ｍＭ（Ｌｏｎｚａ，ベルビエ，ベルギー）及びペニシリン／ストレプトマイシン１％（Ｃｈｅｍｉｅ  Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ  ＡＧ，ＰＡＡ，バーゼル，スイス）を加えたもの）中で１×１０６細胞／ｍｌの濃度となるよう調製し、丸底９６穴プレートに１００μｌずつ、２４穴プレートに１ｍｌずつ播いた。細胞を、０．００１６から１μｇ／ｍｌ（０．０１μＭから６．６μＭ）の濃度範囲の抗体と共に、３７℃、５％ＣＯ２で１５分から２４時間インキュベートした。インキュベートの後、細胞を丸底プレートにて１３００ＲＰＭで３分間遠心分離して、２００μｌのＰＢＳで洗浄した。１００μｌの１×結合緩衝液（（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，アルシュビル，スイス）を各ウェルに加え、次いで２．５μｌのアネキシンＶ−ＦＩＴＣ及び２．５μｌのヨウ化プロピジウム（ＰＩ、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，アルシュビル，スイス）を加えた。フローサイトメトリー分析の前に、細胞をアネキシンＶ及びＰＩと共に室温でインキュベートした。アネキシンＶとＰＩの２重染色により死細胞の割合が明らかとなる一方、生存細胞はアネキシンＶ及びＰＩのいずれにも染色されない。
【０２２５】
図６は、１μｌの抗体と共に２．５時間インキュベートしたＲａｊｉ細胞のアネキシンＶ及びＰＩ染色を示す。驚くべきことに、ＶＨ１６−Ｒ９４Ｋ−Ｙ１００ＢＦ／ＶＬ４３−Ｖ３Ｑ−Ｔ７Ｓ−Ｐ４４Ｉ−Ｎ９２Ａ及びＶＨ１６−Ｒ９４Ｋ／ＶＬ４３−Ｖ３Ｑ−Ｔ７Ｓ−Ｐ４４Ｉ−Ｎ９２Ａヒト化抗ＣＤ１９抗体が、強いアネキシンＶ染色及び細胞死を誘導したのに対し、親キメラＦＭＣ６３はアポトーシスの効果を示さなかった。尚、図６で見られたＦＭＣ６３キメラによる処理後のアネキシンＶ染色の僅かな増加は、再現出来ず、有意でもなかった。驚くべきことに、ヒト化抗ＣＤ１９抗体を加えた１５分後には細胞がアネキシンＶで染色され、ヒト化抗ＣＤ１９抗体と共に４時間インキュベートすると、両方の染色（アネキシンＶ＋ＰＩ）は平衡に達した（図示せず）。抗ＣＤ１９抗体によるアポトーシスのメカニズムは、Ｒａｊｉ細胞における抗ＦａｓＬ誘導アポトーシスとは異なる。実際、ＦａｓＬは、Ｒａｊｉ細胞におけるアネキシンＶ染色を誘導しない（図示せず）。この結果より、ヒト化によって抗ＣＤ１９抗体に新たな特性が付与されたことが明らかとなった。同型細胞接着を引き起こす能力（図示せず）に加えて、ヒト化抗ＣＤ１９抗体に親キメラＦＭＣ６３には無い新たなアポトーシス特性が付与されたことは予想外であり、抗ＣＤ２０抗体の研究において非常に重要である。実際、Ｂｅｅｒｓらは、強いアポトーシス特性及び細胞接着特性を有する抗ＣＤ２０抗体が、動物における良好なＢ細胞枯渇能を有することを示している（Ｂｅｅｒｓ  Ｓ．Ａ．ｅｔ  ａｌ，２００８，Ｂｌｏｏｄ  １１２，ｐ４１７０−４１７７）。また、抗ＣＤ１９抗体を追加して１５分後にはＲａｊｉ細胞がアネキシンＶで染色された。この染色は４時間のインキュベートで平衡に達した。この速いアポトーシスは、通常２４時間後にアポトーシス効果が見られる抗ＣＤ２０抗体より優れている（Ｃｈａｎ  Ｈ．Ｔ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６３：５４８０−５４８９）。
【０２２６】
［実施例６：インビトロでの悪性Ｂ細胞の増殖阻害］
［増殖−アマラーブルー］
抗体による細胞増殖の阻害を測定するため、２×１０５／ｍｌとした細胞（実施例２に記載のＲａｊｉ又はＳＵ−ＤＨＬ−６）をウェルあたり１００μｌずつ播いた。細胞は、ＲＰＭＩ−１６４０培地（（Ｃｈｅｍｉｅ  Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ  ＡＧ，ＰＡＡ，バーゼル，スイス）にウシ胎児血清１０％（ＦＢＳ，Ｃｈｅｍｉｅ  Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ  ＡＧ，ＰＡＡ，バーゼル，スイス），ｕｌｔｒａｇｌｕｔａｍｉｎｅ１、２ｍＭ（Ｌｏｎｚａ，ベルビエ，ベルギー）及びペニシリン／ストレプトマイシン１％（Ｃｈｅｍｉｅ  Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ  ＡＧ，ＰＡＡ，バーゼル，スイス）を加えたもの）で最終濃度が０．００１６から１μｇ／ｍｌ（０．０１μＭから６．６μＭ）となるよう希釈した、事前に無菌化した抗体１００μｌと共にインキュベートした。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした。その後、２０μｌのアマラーブルー（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ，デュッセルドルフ，ドイツ）を、４から８時間加えた。増殖細胞により、５４０ｎｍで励起され６２０ｎｍを発光するアマラーブルーの蛍光が化学的に減少する。処理細胞と非処理細胞（媒体のみ）の％差は、実験を３回行って算出した。図７Ａは、抗体と共に７２時間培養後の、ＳＵ−ＤＨＬ−６細胞の増殖レベルを示す。無関係のＩｇＧ１及びＳＵ−ＤＨＬ−６に強く結合する抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体を、それぞれ陰性及び陽性コントロールとして用いた。ヒト化抗体ＶＨ１６−Ｒ９４Ｋ−Ｙ１００ＢＦ／ＶＬ４３−Ｖ３Ｑ−Ｔ７Ｓ−Ｙ３２Ｆ−Ｐ４４Ｉ−Ｎ９２Ａ，ＶＨ１６−Ｒ９４Ｋ／ＶＬ４３−Ｖ３Ｑ−Ｔ７Ｓ−Ｐ４４Ｉ−Ｎ９２Ａ及びＶＨ１６−Ｒ９４Ｋ−Ｙ１００ＢＦ／ＶＬ４３−Ｖ３Ｑ−Ｔ７Ｓ−Ｐ４４Ｉ−Ｎ９２Ａ（図示せず）は、０．０１μｇ／ｍｌの低い濃度でも細胞増殖に対する強い阻害能を有する。従って、抗ＣＤ１９抗体は、初期のアポトーシス誘導に加えて、７２時間以内にＢ細胞の増殖を阻止する。
【０２２７】
［クローン形成能］
ヒト化抗ＣＤ１９抗体による腫瘍細胞死を評価する別の方法として、クローン形成能アッセイがある。この方法は、抗体の抗増殖能の評価に度々用いられている（Ｃｈａｎ  ＨＴＣ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００３）。我々は、コロニー形成細胞アッセイ及び完全ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，グルノーブル，フランス）を用いて、クローン形成能アッセイを行った。Ｒａｊｉ細胞（実施例２に記載のもの）を、１×１０６細胞／ｍｌで調製し、９６穴プレートに１００μｌ／ウェルで播いた。その後、細胞を、ＲＰＭＩ−１６４０培地（（Ｃｈｅｍｉｅ  Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ  ＡＧ，ＰＡＡ，バーゼル，スイス）にウシ胎児血清１０％（ＦＢＳ，Ｃｈｅｍｉｅ  Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ  ＡＧ，ＰＡＡ，バーゼル，スイス），ｕｌｔｒａｇｌｕｔａｍｉｎｅ１、２ｍＭ（Ｌｏｎｚａ，ベルビエ，ベルギー）及びペニシリン／ストレプトマイシン１％（Ｃｈｅｍｉｅ  Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ  ＡＧ，ＰＡＡ，バーゼル，スイス）を加えたもの、抗体濃度０．２μｇ／ｍｌ）で希釈した、事前に無菌化した抗体１００μｌと共に９０分間インキュベートした。その後、Ｒａｊｉ細胞＋抗体を、１００μｌ中に５００細胞となるようＩｓｃｏｖｅ培地で希釈してから、１．１ｍｌのＭｅｔｈｏＣｕｌｔ培地と混合した。この調製液０．８ｍｌを、ツベルクリン注射器で３５ｍｍ×１０ｍｍディッシュに分注した。細胞を３７℃（５％ＣＯ２）で９日間インキュベートし、顕微鏡（×５０倍）でコロニーを計数した。図７Ｂに示す結果は、上記実施例５で観察されたヒト化抗体の驚くべきアポトーシス特性（アネキシンＶ＋ＰＩ染色）と一致するものであり、同様に、ヒト化抗体が驚くほど良好な抗増殖能を示す一方で、親キメラＦＭＣ６３は、ほとんど又は全くクローン形成能について効果を有さなかった。ヒト化抗ＣＤ１９抗体は、インキュベーション開始から９０分間におけるアポトーシスの誘導及び殺細胞、並びに細胞分裂の阻害のいずれか又は双方により、Ｒａｊｉクローン数を大きく減少させる。この実験は、いくつかの実験の代表例であり、２回行った。この結果により、ヒト化抗ＣＤ１９細胞のＢ細胞に対する殺細胞及び増殖阻害効果が確認された。
【０２２８】
［実施例７：抗ＣＤ１９モノクローナル抗体の取り込み］
［Ｈｕｍ−Ｚａｐアッセイを用いた取り込み］
抗体の取り込みを評価するため、サポリン毒素を複合化した抗ヒト２次抗体（Ｈｕｍ−Ｚａｐ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，サンディエゴ，ＣＡ，米国）を用いた。リボソーム不活化タンパクであるサポリンが取り込まれると細胞死が誘導され、それをアマラーブルーアッセイを用いて観察することができる。実施例２に記載のＲａｊｉ細胞を、ＲＰＭＩ−１６４０培地（（Ｃｈｅｍｉｅ  Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ  ＡＧ，ＰＡＡ，バーゼル，スイス）にウシ胎児血清１０％（ＦＢＳ，Ｃｈｅｍｉｅ  Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ  ＡＧ，ＰＡＡ，バーゼル，スイス），ｕｌｔｒａｇｌｕｔａｍｉｎｅ１、２ｍＭ（Ｌｏｎｚａ，ベルビエ，ベルギー）及びペニシリン／ストレプトマイシン１％（Ｃｈｅｍｉｅ  Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ  ＡＧ，ＰＡＡ，バーゼル，スイス）を加えたもの）で１×１０５細胞／ｍｌとして、ウェル当たり１００μｌずつ播いた。あらかじめ、ＲＰＭＩ−１６４０完全培地（上記）で１００ｎｇ／１０μｌに調製したＨｕｍ−Ｚａｐで、抗体を希釈した。１０μｌの抗体＋Ｈｕｍ−Ｚａｐ混合物をＲａｊｉ細胞に加えた。抗体の最終濃度は、０．５から０．００５μｇ／ｍｌの範囲とした。その後、アマラーブルーを用いた細胞毒性の測定前に、細胞を抗体と共に４８時間インキュベートした。細胞増殖の割合は、以下のように算出した：抗体処理細胞の蛍光（発光５９０ｎｍ）／コントロール細胞（Ｈｕｍ−Ｚａｐのみ）の蛍光（発光５９０ｎｍ）×１００。抗体を加えＨｕｍ−Ｚａｐを加えないコントロールも試験したが、４８時間後でも細胞増殖に対して何ら有意な効果を示さなかった。ヒト化抗ＣＤ１９抗体の取り込みが、我々により観察された（図８）。抗体との相互作用に続くＣＤ１９の取り込みは、既に従前の研究に記載されているが、Ｒａｊｉ細胞及び末梢血由来のフレッシュなＢ細胞のどちらでも、６時間後は有意でなく、２４時間後でも少量であった（Ｉｎｇｌｅ  Ｇ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ，ＢＪＨ，２００７，１４０，ｐ  ４６−５８）。Ｈｕｍ−Ｚａｐを用いたところ、ヒト化抗ＣＤ１９抗体ＶＨ１６−Ｒ９４Ｋ／ＶＬ４３−Ｖ３Ｑ−Ｔ７Ｓ−Ｐ４４Ｉ−Ｎ９２Ａの取り込みは、親キメラＦＭＣ６３と非常によく似ていた。しかし、抗体ＶＨ１６−Ｒ９４Ｋ−Ｙ１００ＢＦ／ＶＬ４３−Ｖ３Ｑ−Ｔ７Ｓ−Ｙ３２Ｆ−Ｐ４４Ｉ−Ｎ９２Ａは、ずっと少ない取り込みを示し、１０ｎｇ／ｍｌでは取り込みが無かった。高レベルの取り込みが望ましいのは、治療用抗体を細胞傷害ペイロード又は毒素との複合体として使用する設計とする場合のみである。
【０２２９】
［実施例８：示差走査熱量測定法による抗ＣＤ１９モノクローナル抗体の熱安定性］
ヒト化抗ＣＤ１９モノクローナル抗体及びＦＭＣ６３キメラの熱安定性を、表８、１２−１６及び１９に示す熱量測定を用いて比較した。モノクローナル抗体の溶融プロファイルは、アイソタイプによって特徴的である（Ｇａｒｂｅｒ  ａｎｄ  Ｄｅｍａｒｅｓｔ（２００７），ＢＢＲＣ  ３５５：７５１−７）が、ＦＡＢ断片の溶融中点は、全長ＩｇＧの一部であっても容易に同定することができる。このようなＦＡＢ部分の溶融中点により、ヒト化モノクローナル抗体候補の安定性を観察した。
【０２３０】
熱量測定は、ＶＰ−ＤＳＣ示差走査熱量計（ＭｉｃｒｏＣａｌ，ノーサンプトン，英国）により行った。細胞容積は０．１２８ｍｌ、加熱速度は１℃／ｍｉｎ、過剰圧力は６４ｐ．ｓ．ｉ．に保った。全てのタンパク断片は、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で１〜０．５ｍｇ／ｍＬの濃度にて使用した。各タンパクのモル熱容量は、タンパクを除いた同一の緩衝液を含む複製試料との比較によって推定した。部分モル熱容量及び融解曲線は、標準的な手順により分析した。Ｏｒｉｇｉｎｖ７．０ソフトウェアの非二状態（ｎｏｎ−ｔｗｏ  ｓｔａｔｅ）モデルを使用して分析するにあたり、示差熱図のベースライン補正及び濃度正規化を行った。
【０２３１】
［実施例９：Ｂ細胞枯渇についての研究］
［ヒト全血におけるＢ細胞枯渇］
ヒト化抗ＣＤ１９抗体のヒト全血におけるＢ細胞枯渇能を評価するため、Ｂ細胞枯渇アッセイを行った。静脈穿刺により末梢血を採取し、ＲＰＭＩ−１６４０培地（（Ｃｈｅｍｉｅ  Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ  ＡＧ，ＰＡＡ，バーゼル，スイス）にウシ胎児血清１０％（ＦＢＳ，Ｃｈｅｍｉｅ  Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ  ＡＧ，ＰＡＡ，バーゼル，スイス），ｕｌｔｒａｇｌｕｔａｍｉｎｅ１、２ｍＭ（Ｌｏｎｚａ，ベルビエ，ベルギー）及びペニシリン／ストレプトマイシン１％（Ｃｈｅｍｉｅ  Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ  ＡＧ，ＰＡＡ，バーゼル，スイス）を加えたもの）で２倍希釈した。希釈全血を２４穴プレートに播き（ウェルあたり１−２ｍｌ）、１０μｇの抗体又はＰＢＳ（非処理）を加え、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で２４時間培養した。血液をＲＢＣ溶解緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＴＨＰ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ウィーン，オーストリア）で室温、５℃にて２回溶解し、１１００ＲＰＭで３分遠心分離した。細胞ペレットを２ｍｌの結合緩衝液（（ＰＢＳ、２．５％ＦＣＳ，１００ｍｇ／ｌ，ＭｇＣｌ２，０．５ｍＭＣａＣｌ２，０．０５％ＮａＮ３及び１０％Ｖｅｒｓｅｎｅ（ｖ／ｖ））で２回洗浄した。その後、細胞を０．５ｍｌの結合緩衝液に再懸濁させ、抗−ＣＤ１９−ＰＥ−Ｃｙ５、抗−ＣＤ２０−ＰＥ又は抗−ＣＤ２２−ＦＩＴＣのいずれかで染色した。氷上で２０分間インキュベートした後、細胞を結合緩衝液で１回洗浄し、フローサイトメトリーで分析した。Ｂ細胞の割合を求め、変化（％）を以下のように求めた：（非処理（ＰＢＳ）細胞中のＢ細胞％−抗体処理細胞中のＢ細胞％）／（非処理（ＰＢＳ）細胞中のＢ細胞％）×１００
【０２３２】
表２１に示すように、４つの血液検体について１０μｇ／ｍｌの抗体を用い、ヒト化抗ＣＤ１９抗体処理後における全血中のＢ細胞枯渇を観察した。一方、コントロールのＩｇＧ１処理後では、Ｂ細胞数の変化は見られなかった。コントロールＩｇＧ１と共にインキュベートした場合、ＣＤ１９＋、ＣＤ２０＋又はＣＤ２２＋のＢ細胞は、典型的には白血球群中９％から１０％を占めた。抗体ＶＨ１６−Ｒ９４Ｋ−Ｙ１００ＢＦ／ＶＬ４３−Ｖ３Ｑ−Ｔ７Ｓ−Ｐ４４Ｉ−Ｎ９２Ａが、Ｂ細胞枯渇について最も高い効果を示した（平均＝１５．２５％）。一方、親ＦＭＣ６３キメラは、最も効果が低かった（平均＝７．２５％）。
【０２３３】
表２１：全血のＢ細胞枯渇
【表２１】
2012518404.tif 000024
【０２３４】
［実施例１０：補体依存性エフェクター機能を強化したＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ−ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ変異体］
補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を強化することを目的として、多数の変異体を設計した。Ｆｃγ受容体との結合によるＦｃの相互作用がＡＤＣＣを仲介するのと同様に、補体成分Ｃ１ｑとのＦｃの相互作用がＣＤＣを仲介する。現在、Ｆｃ／Ｃ１ｑ複合体の構造について利用可能なものは無いが、幾つかの研究では、ヒトＩｇＧ上のＣ１ｑ結合部位はＤ２７０，Ｋ３２２，Ｐ３２９及びＰ３３１の残基を中心とする領域に位置するとされている（Ｉｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０００，１６４：４１７８−４１８４）。ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ−ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａについて、ＣＤＣ仲介能が強化された変異体を探索するため、ＣＨ２ドメインのＣ２６９−Ｋ３３４領域におけるアミノ酸改変を設計した。
【０２３５】
この研究により、Ｅ２６９、Ｓ２９８及びＳ３２４の位置における残基の置換によって、ＣＤＣが少なくとも１．６倍（図９）から最大５．５倍（図１０）増加した変異体が得られることが示された。
【０２３６】
これらの変異体のｃＤＮＡをコードする配列を作出するため、ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ重鎖をコードするｃＤＮＡ（配列番号６４）を、標準的な変異誘発によりＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ／３２４（ＮＮＫ）、ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ／Ｓ２９８Ａ（配列番号１１４）、ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ／Ｅ２６９Ｄ／Ｓ２９８Ａ（配列番号１１５）、ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ／Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎ（配列番号１１６）、ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ／Ｅ２６９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎ（配列番号１１７）に変換した。３２４の位置におけるＮＮＫとは、野生型であるセリンをコードするコドンを、２０種すべてのアミノ酸への置換（ハードランダム化）をもたらすＮＮＫコドンに置換することを示す。
【０２３７】
これらの変異体をコードするＤＮＡ配列を、ＣＭＶプロモーター及びウシ成長ホルモンポリアデニル化信号を持つ改良ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，米国）ベクターを基にしたベクターに結合した。この発現ベクターでは、マウスＶＪ２Ｃリーダーペプチドにより分泌を行わせる。
【０２３８】
一過性発現のため、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いて、懸濁順応型ＨＥＫ−ＥＢＮＡ細胞（ＡＴＣＣ−ＣＲＬ−１０８５２）を、等量の重鎖及び軽鎖ベクターで共トランスフェクションした。典型的には、濃度８０万−１２０万細胞／ｍｌの細胞懸濁液とした細胞１００ｍｌを、変異体重鎖をコードする発現ベクター５０μｇ及びＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ（配列番号６５）軽鎖をコードする発現ベクター５０μｇを含むＤＮＡ−ＰＥＩ混合物でトランスフェクションする。各々の操作した鎖遺伝子をコードする遺伝子組換え発現ベクターを宿主細胞に導入する場合、さらに４から５日間細胞を培養すると構築物が産生され、培地（（ＥＸ−ＣＥＬＬ２９３，ＨＥＫ２９３無血清培地，Ｓｉｇｍａ，ブーフス，スイス）にプルロニック酸０．１％、グルタミン４ｍＭ及びジェネティシン０．２５μｇ／ｍｌを追加）に分泌される。次いで、遺伝子組換えプロテインＡストリームラインメディア（ＧＥ，スイス）を用いて、無細胞上清から構築物を精製し、以後の分析に供した。
【０２３９】
これらの変異体の発現レベルを表２２に表記する。
表２２：ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ／ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ−Ｔ７Ｓ−Ｐ４４Ｉ−Ｎ９２Ａ重鎖変異体のＩｇＧ一過性発現レベル
【表２２】
2012518404.tif 000025
【０２４０】
［Ｒａｊｉ細胞における補体媒介性細胞障害］
セルベースアッセイを用いて、変異体のＣＤＣを仲介する能力を測定した。
【０２４１】
乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の放出を利用して溶解を測定し、変異体によりオプソニン化したＲａｊｉ細胞の幼齢ウサギ補体（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃ−００９９Ｆ，ＡＮ  ＶＥＮＲＡＹ，オランダ）による溶解を観察した。標的細胞を完全培地（（ＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｃｈｅｍｉｅ  Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ  ＡＧ，ＰＡＡ，バーゼル，スイス）ウシ胎児血清（ＦＢＳ，Ｃｈｅｍｉｅ  Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ  ＡＧ，ＰＡＡ，バーゼル，スイス）１０％及びＵｌｔｒａｇｌｕｔａｍｉｎｅ１％（Ｌｏｎｚａ，ベルビエ，ベルギー）を追加）で遠心分離及び再懸濁して２回洗浄した。変異体−抗体を、上記の最終濃度１μｇ／ｍｌとなるよう加えた。幼齢ウサギ血清を完全培地で７．５％に希釈し、抗体オプソニン化標的細胞に加えた。プレートを３７℃で３時間インキュベートした。細胞障害性は、Ｃｙｔｏ  Ｔｏｘ  ９６非放射性細胞傷害性アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，マジソン，米国）を用いて測定した。
【０２４２】
このアッセイによる代表的なデータを図９及び図１０に示す。
【０２４３】
図９及び図１０は、ＩｇＧ１コントロール抗体（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ  Ｐｈａｒｍａ  Ａ．Ｇ．，ライナハ，スイス）による特異的な溶解がほとんど無いことを示す。一方、補体により引き起こされる溶解は、ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ／Ｓ３２４Ｎ（配列番号１１８）−ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ（配列番号６５）抗体においては、Ｒａｊｉ細胞の生存能のばらつきによるアッセイの変動に依存して、少なくとも１．６倍（図９）から最大５．５倍（図１０）増加していた。また、ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ／Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎ（配列番号１１６）−ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ（配列番号６５）抗体、及びＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ／Ｅ２６９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎ（配列番号１１７）−ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ（配列番号６５）抗体も、親抗体を超えるＣＤＣの改善（少なくとも４．４倍）を示した。図９及び図１０は、３回繰り返し行った結果±標準偏差を示す。
【０２４４】
［実施例１１：抗体依存性細胞性細胞障害（ＡＤＣＣ）を強化したＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ−ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ変異体］
本研究で調査した、Ｅ２６９及びＳ２９８の位置の残基が置換された実施例１０に記載の抗ＣＤ１９抗体の変異体について、ＡＤＣＣを誘導する能力を評価した。
【０２４５】
抗体のＡＤＣＣ活性は、Ｃｙｔｏ  Ｔｏｘ  ９６  非放射性細胞傷害性アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，マジソン，米国）を用いて、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）リリースアッセイにより測定した。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、標準Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ分離によりクエン酸全血から精製し、完全培地（ＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｃｈｅｍｉｅ  Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ  ＡＧ，ＰＡＡ，バーゼル，スイス）にウシ胎児血清１０％（ＦＢＳ，Ｃｈｅｍｉｅ  Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ  ＡＧ，ＰＡＡ，バーゼル，スイス），ｕｌｔｒａｇｌｕｔａｍｉｎｅ１  ２ｍＭ（Ｌｏｎｚａ，ベルビエ，ベルギー）及びペニシリン／ストレプトマイシン１％（Ｃｈｅｍｉｅ  Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ  ＡＧ，ＰＡＡ，バーゼル，スイス），及びヒトＩＬ−２  １００Ｕ／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ，ミズーリ，米国）を追加したもの）に再懸濁して３７℃で一晩インキュベートした。翌日、ＰＢＭＣを遠心分離により回収し、２回洗浄して、８×１０６細胞／ｍｌの濃度で培地に再懸濁させた。実施例２に記載するＣＤ１９＋細胞株のＲａｊｉを、標的細胞として用いた。Ｒａｊｉ細胞を２回洗浄して、０．２×１０６細胞／ｍｌの濃度で完全培地に再懸濁させた。１．５μｇ／ｍｌに希釈した抗体５０μｌ（最終濃度０．５μｇ／ｍｌ）を標的細胞５０μｌと混合し、等量のＰＢＭＣを加えて丸底９６穴プレートに入れた。本実験では、常に標的とエフェクターの比を１：４０とした。３７℃で４時間インキュベートした後、細胞を遠心分離し、無細胞上清５０μｌを回収して平底９６穴プレートに移し、アッセイに供した。溶解の割合は次のように算出した：（試料放出−標的の自己放出−エフェクターの自己放出）／（最大放出−標的の自己放出）×１００。ここで標的の自己放出は標的細胞のみを含むウェルからの蛍光、エフェクターの自己放出はエフェクター細胞のみを含むウェルからの蛍光、及び最大放出は溶解バッファーで処理した標的細胞を含むウェルからの放出である。抗体を欠く場合（標的＋エフェクター細胞）に得られる溶解のバックグラウンド％を、試料の溶解％から差し引いた。
【０２４６】
図１１は、ＩｇＧのコントロール抗体（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ  Ｐｈａｒｍａ  Ａ．Ｇ．，ライナハ，スイス）ではＲａｊｉ細胞の特異的な溶解が起こらず、親抗体ではいくらかの細胞障害が有ることを示す。図中のデータは、１人の検体から単離したＰＢＭＣを用いた３つのウェルでの平均値±ＳＤである。一方、抗体により誘導された溶解は、ＶＨ１６−Ｒ９４Ｋ／Ｓ２９８Ａ（配列番号１１４）−ＶＬ４３−Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ（配列番号６５）抗体では少なくとも５倍、ＶＨ１６−Ｒ９４Ｋ／Ｅ２６９Ｄ／Ｓ２９８Ａ（配列番号１１５）−ＶＬ４３−  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ（配列番号６５）抗体では少なくとも６．８倍増加した。このデータにより、選択した抗ＣＤ１９抗体変異体ではＣＤ１９＋発現細胞に対する細胞性細胞傷害が強化されていることが実証された。
【０２４７】
［実施例１２：ヒトＩｇγ３由来の置換及びヒトＩｇγ１／Ｉｇγ３ヒンジＦｃドメインのシャフリングにより、補体媒介性エフェクター機能が強化されたＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ−ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ変異体］
ヒトＩｇＧ３抗体は、通常、ヒトＩｇＧ１抗体よりも強いＣＤＣを有するが、ＩｇＧ３のＦｃがＩｇＧ１のＦｃよりも強いＣ１ｑに対する結合親和性を有することが、この一因である（Ｓｃｈｕｍａｋｅｒ  ＶＮ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９７６，１５：５１７５−８１．）
【０２４８】
ヒトＩｇＧ３とヒトＩｇＧ１のＦｃ部分の配列の違いに基づいて、ＶＨ１６  Ｒ９４ＫのＦｃ領域におけるアミノ酸改変を試みた。相補的手法により、ヒトＩｇＧ１のヒンジ及び定常ドメインとヒトＩｇＧ３のヒンジ及び定常ドメインのシャフリングを行い、ＣＤＣが強化された抗ＣＤ１９抗体のアイソタイプキメラを作成した。
【０２４９】
この研究により、Ｋ２４７及びＮ２７６の位置の残基の置換、及びＩｇＧ１由来のＣＨ１及びヒンジとＩｇＧ３由来のＦｃとからなるキメラ変異体（末尾を１１３３と表記する）により、それぞれ１．７倍及び２．２倍のＣＤＣの増加が得られることが示された。
【０２５０】
Ｋ２７４及びＮ２７６の位置の残基に置換を有する変異体のｃＤＮＡをコードする配列を作出するため、ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ重鎖（配列番号６４）をコードするｃＤＮＡを、標準的な変異誘発技術によりＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ／Ｋ２７４Ｑ（配列番号１１９）、ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ／Ｎ２７６Ｋ（配列番号１２０）、ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ／Ｋ３３４Ｒ（配列番号１２１）、ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ／Ｋ２７４Ｑ／Ｎ２７６Ｋ（配列番号１２２）及びＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ／Ｋ２７４Ｑ／Ｎ２７６Ｋ／Ｋ３３４Ｒ（配列番号１２３）に変換した。
【０２５１】
さらに、ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ−ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ  ＩｇＧ１について、重鎖遺伝子の一部（カバット残基２３１からカルボキシル末端までをコードする部分）を、対応するヒトＩｇＧ３重鎖遺伝子（ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ０３６０４．１，残基１６１から３７７）に発現ベクター中で置換することにより、ヒト抗ＣＤ１９ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ（１１３３）（配列番号１２４）−ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ（配列番号６５）アイソタイプキメラを作出した。
【０２５２】
これらの変異体をコードするＤＮＡ配列を、改良ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，米国）ベクターを基とする、ＣＭＶプロモーター及びウシ成長ホルモンポリアデニル化信号を持つベクターに結合した。この発現ベクターでは、マウスＶＪ２Ｃリーダーペプチドにより分泌が行われる。
【０２５３】
これらの変異体を一過性発現させるため、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いて、懸濁順応型ＨＥＫ−ＥＢＮＡ細胞（ＡＴＣＣ−ＣＲＬ−１０８５２）を、等量の重鎖及び軽鎖ベクターで共トランスフェクションした。典型的には、濃度８０万−１２０万細胞／ｍｌの懸濁液とした細胞１００ｍｌを、変異体重鎖をコードする発現ベクター５０μｇ及びＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ（配列番号６５）軽鎖をコードする発現ベクター５０μｇを含むＤＮＡ−ＰＥＩ混合物でトランスフェクションする。操作した各々の鎖遺伝子をコードする遺伝子組換え発現ベクターを宿主細胞に導入した場合、さらに４から５日間細胞を培養すると構築物が産生され、培地（（ＥＸ−ＣＥＬＬ２９３，ＨＥＫ２９３無血清培地，Ｓｉｇｍａ，ブーフス，スイス）にプルロニック酸０．１％，グルタミン４ｍＭ及びジェネティシン０．２５μｇ／ｍｌを追加）に分泌される。その後、遺伝子組換えプロテインＡストリームラインメディア（ＧＥ，スイス）を用いて、無細胞上清から構築物を精製し、以後の分析に供した。
【０２５４】
これらの変異体の発現レベルを表２３に表記する。
【０２５５】
表２３：ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ／ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ−Ｔ７Ｓ−Ｐ４４Ｉ−Ｎ９２Ａ重鎖変異体のＩｇＧ一過性発現レベル
【表２３】
2012518404.tif 000026
【０２５６】
［Ｒａｊｉ細胞における補体依存性細胞毒性］
実施例１０のセルベースアッセイに従い、変異体のＣＤＣを仲介する能力を測定した。乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の放出を利用して溶解を測定し、変異体によりオプソニン化したＲａｊｉ細胞の幼齢ウサギ補体（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃ−００９９Ｆ，ＡＮ  ＶＥＮＲＡＹ，オランダ）による溶解を観察した。標的細胞を完全培地（（ＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｃｈｅｍｉｅ  Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ  ＡＧ，ＰＡＡ，バーゼル，スイス）ウシ胎児血清（ＦＢＳ，Ｃｈｅｍｉｅ  Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ  ＡＧ，ＰＡＡ，バーゼル，スイス）１０％及びＵｌｔｒａｇｌｕｔａｍｉｎｅ１％（Ｌｏｎｚａ，ベルビエ，ベルギー）を追加）による遠心分離及び再懸濁で２回洗浄した。変異体−抗体を、上記の最終濃度１μｇ／ｍｌとなるよう加えた。幼齢ウサギ血清を完全培地で５％に希釈し、抗体オプソニン化標的細胞に加えた。プレートを３７℃で３時間インキュベートした。
【０２５７】
細胞障害性を、Ｃｙｔｏ  Ｔｏｘ  ９６  非放射性細胞傷害性アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，マジソン，米国）を用いて測定した。このアッセイによる代表的なデータを図１２に示す。
【０２５８】
図１２は、ＩｇＧ１コントロールによる特異的な溶解がほとんど起きていないことを示す。親抗体と比較すると、補体誘導による溶解は、ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ／Ｋ２７４Ｑ／Ｎ２７６Ｋ（配列番号１２２）−ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ（配列番号６５）については１．７倍、ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ／Ｋ２７４Ｑ／Ｎ２７６Ｋ／Ｋ３３４Ｒ（配列番号１２３）−ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ（配列番号６５）については２倍、ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ（１１３３）（配列番号１２４）−ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ（配列番号６５）については２．２倍増加していた。図１２は、３回繰り返し行った結果±標準偏差を示す。
【０２５９】
［実施例１３：抗ＣＤ１９抗体発現のための細胞株の確立］
高収率の哺乳動物タンパク発現系を開発した。系は、定評のあるＣＨＯ細胞系（ＣＨＯ−Ｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，バーゼル，スイス）を基として、既知組成の無血清培地中での懸濁増殖、高効率のトランスフェクション法、及び高産生細胞株のクローンを同定するスクリーニング法を施すよう構成した。この哺乳動物タンパク発現系を、抗ＣＤ１９抗体のヒト化変異体の安定的な発現に用いた。
【０２６０】
実施例１で用いたＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ軽鎖のｃＤＮＡ配列（配列番号６５）を有するプラスミドと、ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ重鎖のｃＤＮＡ配列（配列番号６４）を有するプラスミドｐＡＥ１８＿ＶＨ１６＿Ｒ９４Ｋとを共にＸｂａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化して、軽鎖及び重鎖挿入断片を遊離させた。これらの挿入断片を、ゲル電気泳動により単離し、ゲル抽出し、精製して、更にＰｒｏｍｅｇａ（マディソン，ＷＩ，米国）社のｐＧＬ３を基にした発現ベクターの多重クローニング部位にクローニングした。発現ベクターは、あらかじめ同じ制限酵素で消化し、同じゲル電気泳動及び精製法を用いて調製した。これにより、２つの発現プラスミドが得られる：ｐＧＬ４１［１８＿ＨＣ］プラスミド及びｐＧＬ４１［１８＿ＬＣ］プラスミドであり、それぞれＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ−ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ抗ＣＤ１９抗体の重鎖及び軽鎖を有する。
【０２６１】
ジェネティシン耐性遺伝子ｎｅｏを発現するベクターｐＳＶ２ｎｅｏをＣｌｏｎｔｅｃｈ（マウンテンビュー，ＣＡ，米国）より購入し、また、ＳＶ４０プロモーター及びｐＢＡＢＥ−Ｐｕｒｏ社（Ａｄｄｇｅｎｅ，Ｃａｍｅｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，米国）のピューロマイシン耐性遺伝子（ｐａｃ）をＰｒｏｍｅｇ社のｐＧＬ３ベクターにクローニングして、ピューロマイシン耐性ベクターｐＳＶ−Ｐｕｒｏを得た。これらの４つのプラスミドを、アンピシリン耐性遺伝子（ａｍｐＲ）中の単一制限酵素部位により直線化して、エタノール沈殿により他の塩基から精製した。同様に、他のヒト化変異体（ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ／Ｙ１００ＢＦ（配列番号６６）−ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ（配列番号６５）及びＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ／Ｙ１００ＢＦ（配列番号６６）−ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｙ３２Ｆ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ（配列番号６７））についても、上述のように同じ制限酵素を用いて切り出して、ｐＧＬ４１のバックボーンにクローニングした。
【０２６２】
宿主細胞株ＣＨＯ−Ｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）への安定的な組み込みのため、１×１０６細胞／ｍｌの濃度とした細胞１０ｍｌを５０ｍｌバイオリアクターろ過管（ＴＰＰ，トラザディンゲン，スイス）に播き、一晩培養したトランスフェクションに先立ち、既知組成の細胞培養培地（ＰｏｗｅｒＣＨＯ２，Ｌｏｎｚａ，バーゼル，スイス）をトランスフェクション培地（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に置き換えた。ポリカチオン性トランスフェクション剤ＪｅｔＰＥＩ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｓ，Ｉｌｌｋｉｒｃｈ，フランス）を用い、製造者の取扱説明書に従って、重鎖及び軽鎖発現プラスミド、ｐＳＶ−Ｐｕｒｏ並びにｐＳＶ２ｎｅｏの混合物を含む直線化したベクターカクテル１２．５μｇで細胞をトランスフェクションした。トランスフェクションから４−５時間後に、細胞を１倍量の成長培地で希釈した。翌日、細胞を１：１０、１：２０又は１：３０の比で５．０μｇ／ｍｌのピューロマイシン及び５００μｇ／ｍｌのジェネティシンを含む成長培地で希釈し、９６穴プレートに分配した。１４日間の選別後、薬物耐性コロニーを抗体特異的ＥＬＩＳＡを用いてアッセイし、各陽性クローンを抗体産生分析に供するために増幅した。クローン集団を得るため、最も優良なクローンを、細胞培養培地（ＰｏｗｅｒＣＨＯ２，Ｌｏｎｚａ）で１、１０、及び１００細胞／ｍｌの濃度に希釈した。こうして、グルタミンを追加したＰｏｗｅｒＣＨＯ２細胞培養培地を用いた１２日間の振盪バッチアッセイにより、最も生産性の高いクローンについて、ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ−ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ抗体は４００から６００ｍｇ／Ｌ、ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ／Ｙ１００ＢＦ−ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ及びＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ／Ｙ１００ＢＦ−ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｙ３２Ｆ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ抗体は２００−３００ｍｇ／Ｌの範囲となる力価が得られた。
【０２６３】
［実施例１４：抗ＣＤ１９抗体の脱フコシル化変異体の作成］
哺乳動物では、ほとんどすべての複合型Ａｓｎ結合オリゴ糖の最内ＧｌｃＮＡｃにフコース残基がα１，６結合している。β−１，４−マンノシル−糖タンパク４−β−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（ＧＮＴＩＩＩ）を発現する安定細胞株を調製した。この酵素は、例えば抗体など糖タンパクのＮ−結合型オリゴ糖に、バイセクティングＮ−アセチルグルコサミンを導入する。このような改変により、抗体のＦｃオリゴ糖が、フコース残基を糖鎖の還元性Ｎアセチルグルコサミンへ転移させるＦｕｔ８酵素がアクセスできない基質へと変化し（Ｌｏｎｇｍｏｒｅ  ａｎｄ  Ｓｃｈａｃｈｔｅｒ，１９８２，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ  Ｒｅｓ  ３６５−９２）、その結果フコシル化が阻害される。ラットのｇｎｔＩＩＩ遺伝子は、Ｉｍａｇｅｎｅｓ（ベルリン、ドイツ）に注文したものであり、特異的プライマーを用いて増幅した。その後、単位増幅配列をＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ酵素により消化し、ゲル精製して、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより開裂した発現ベクターｐＧＬＥＸ３３のマルチクローニング部位にクローニングした。ｐＧＬＥＸ３３は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（バーゼル、スイス）社のｐｃＤＮＡ３．１プラスミドを基としてマウスＣＭＶプロモーターにより制御される哺乳動物発現ベクターである。得られたベクターは、ｐＧＮＴＩＩＩと称する。
【０２６４】
ＳＶ４０プロモーター及びｐＢＡＢＥ−Ｐｕｒｏ（Ａｄｄｇｅｎｅ，Ｃａｍｅｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，米国）のピューロマイシン耐性遺伝子（ｐａｃ）をＰｒｏｍｅｇａ（マジソン、ＷＩ、米国）のｐＧＬ３ベクターにクローニングして、ピューロマイシン耐性ベクターｐＳＶ−Ｐｕｒｏを得た。この２つのベクターを、アンピシリン耐性遺伝子（ａｍｐＲ）中の単一制限酵素部位により直線化して、エタノール沈殿により他の塩基から精製した。
【０２６５】
宿主細胞株ＣＨＯ−Ｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）への安定的な組み込みのため、１×１０６細胞／ｍｌの濃度とした細胞１０ｍｌを５０ｍｌバイオリアクターろ過管（ＴＰＰ，トラザディンゲン，スイス）に播き、一晩培養したトランスフェクションに先立ち、既知組成の細胞培養培地（ＰｏｗｅｒＣＨＯ２，Ｌｏｎｚａ，バーゼル，スイス）をトランスフェクション培地（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に置き換えた。ポリカチオン性トランスフェクション剤ＪｅｔＰＥＩ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｓ，Ｉｌｌｋｉｒｃｈ，フランス）を用い、製造者の取扱説明書に従って、ｐＧＮＴＩＩＩ及びｐＳＶ−Ｐｕｒｏの混合物を含む１２．５μｇの直線化したベクターカクテルで細胞をトランスフェクションした。トランスフェクションから４−５時間後に、細胞を１倍量の増殖培地で希釈した。翌日、細胞を１：１０、１：２０又は１：３０の比で５．０μｇ／ｍｌのピューロマイシンを含む増殖培地で希釈し、９６穴プレートに分配した。１４日間の選別後、ラットＧＮＴＩＩＩ遺伝子を発現している薬物耐性コロニーを単離した。
【０２６６】
第２の安定細胞株を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＣＨＯ−Ｓ細胞株を用いて調製した。既知の小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）配列（Ｉｍａｉ−Ｎｉｓｈｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．２００７，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７：８４）を用い、ヒトＵ６プロモーター及びｔＲＮＡＶａｌプロモーターの制御下でＦｕｔ８（α１，６−フコシルトランスフェラーゼ）及びＧＭＤ（ＧＤＰ−マンノーズ４，６−デヒドラターゼ）をノックダウンする２つのｓｈＲＮＡを発現するベクターで、細胞をトランスフェクションした。構築物は、（レーゲンスブルグ，ドイツ）に注文して得た。詳細には、ｔＲＮＡＶａｌプロモーターがＦｕｔ８特異的なｓｈＲＮＡの発現を制御し、Ｕ６プロモーターがＧＭＤ特異的なｓｈＲＮＡの発現を制御する。構築物はＮｈｅＩ及びＮｒｕＩ部位に隣接し、これらの制限酵素部位を用いて消化及びゲル精製された断片を、あらかじめ同じ酵素で消化したｐＧＬＥＸ１ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の改良版）のバックボーンにクローニングする。
【０２６７】
新生経路によるこれらの２つの酵素の複合ノックダウンには、細胞をフコースの不存在下で培養すれば、ＩｇＧ１のＮ結合型オリゴ糖構造におけるフコース欠失を促進する相乗的な効果があることが示されている（Ｉｍａｉ−Ｎｉｓｈｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．２００７，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７：８４）。フコースの存在下の場合では、ＧＭＤ酵素はサルベージ経路の一部ではないため、フコシル化の減少はＦｕｔ８酵素のノックダウンに依存するのであろう。２重ノックダウン発現カセットでトランスフェクションした細胞では、Ｎ結合型オリゴ糖におけるフコシル化の９０−９８％が喪失することが既に示されている（Ｉｍａｉ−Ｎｉｓｈｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．２００７，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７：８４）。宿主細胞株ＣＨＯ−Ｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）への安定的な組み込みのため、ｓｉＲＮＡベクターをアンピシリン耐性中の単一制限酵素部位により直線化した。選択したプラスミドで細胞をトランスフェクションして、上述のように選別した。
【０２６８】
それぞれ実施例１及び１１に記載するＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ（配列番号６４）−ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ（配列番号６５）抗体及びＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ／Ｅ２６９Ｄ／Ｓ２９８Ａ（配列番号１１５）−ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ（配列番号６５）抗体の双方をコードするプラスミドで、２つの細胞株を一過性にトランスフェクションした。
【０２６９】
一過性トランスフェクションのため、１×１０６細胞／ｍｌの濃度とした細胞２００ｍｌを１０００ｍｌ丸型ショットボトルに播き、一晩培養した。トランスフェクションに先立ち、既知組成の細胞培養培地（ＰｏｗｅｒＣＨＯ２，Ｌｏｎｚａ）を１００ｍｌのトランスフェクション培地（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に置き換えた。ポリカチオン性トランスフェクション剤ＪｅｔＰＥＩ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｓ）を用い、製造者の取扱説明書に従って、重鎖５０％・軽鎖５０％のＤＮＡの混合物を含むベクターカクテル２５０μｇで細胞をトランスフェクションした。トランスフェクションから４−５時間後に、細胞を１倍量の増殖培地で希釈した。５日目に培地を収集した。遠心分離後、上清をろ過（０．２μｍ）し、Ａｋｔａ  ｐｕｒｉｆｉｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（Ｈｉｔｒａｐ，ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）により精製した。実施例１１に記載のＡＤＣＣアッセイを行った。
【０２７０】
上述のｓｈＲＮＡ及びＧＮＴＩＩＩ細胞株で生産した抗体変異体は、それぞれ末尾にｓｈＲＮＡ及びＧＮＴＩＩＩと表記する。図１３は、脱フコシル化変異体のＡＤＣＣが、フコシル化された親抗体から少なくとも２倍増加していることを示す。
【０２７１】
［実施例１５：ヒト化ＳＣＩＤマウスの移植Ｂ細胞に対する抗ＣＤ１９抗体の効果］
この研究は、ｈｕＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスを抗ＣＤ１９抗体治療したときのインビボでの効果を評価するために計画したものである。治療を始める前に、３０匹の健康な重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ，ＨＡＲＬＡＮ）雌マウス（５−６週齢、１６−２０ｇ）を、２匹の１群と７匹の４群に体重に基づいて無作為となるよう選んだ。各群の平均体重は同程度であり、他の群と統計的に相違しない（分散分析）。その後、０日目に、全マウスにγ線源（１．８Ｇｙ，６０Ｃｏ，ＩＮＲＡ  ＢＲＥＴＥＮＩＥＲＥ，ディジョン，フランス）を用いた全身照射を施した。１日目及び８日目に、抗体（Ａｂ）（ｍＣＤ１２２抗原，ラットＩｇＧ２ｂアイソタイプ，ＴＭ−Ｂｅｔａ１，ＢｉｏＸＣｅｌｌ，米国）を枯渇させるＮＫ細胞を２０ｍｇ／ｋｇでマウスに皮下注射した。
【０２７２】
健康なボランティアドナーから４つの新鮮な軟膜試料を回収し、全血採取から４８時間以内に、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（登録商標）ｐｌｕｓ法（Ｒｅｆ０７９０７，ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従い、勾配遠心分離により末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を精製した。インビボ注射の前に、ＰＢＭＣの生存率を０．２５％トリパンブルー色素排除法により評価した。３日目に、ドナー＃１、＃２及び＃３から得た３ｘ１０７のｈＰＢＭＣ（ＰＢＳにて５００μＬ希釈、腹腔内経路）（群２−５、ドナーあたり２−３匹）又はＰＢＳ（群１）をマウスに腹腔内注射した。１４日目に、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（陰性コントロール，２１．０ｍｇ／ｍｌ，バッチ番号Ｂ１４９２），Ｍａｂｔｈｅｒａ（登録商標）（陽性コントロール，１０．０ｍｇ／ｍｌ，バッチ番号Ｂ２１３６），抗ＣＤ１９抗体変異体ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ（配列番号６４）−ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ（配列番号６５）又は抗ＣＤ１９抗体変異体ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ／Ｓ３２４Ｎ（配列番号１１８）−ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ（配列番号６５）を、１０ｍｇ／ｋｇ／ｉｎｊ．でそれぞれ群２、３、４及び５のマウスに単回静脈内投与した。治療スケジュールを以下の表２４に要約する。
【０２７３】
表２４：治療スケジュール
【表２４】
2012518404.tif 000027
【０２７４】
脾臓中のヒトＢリンパ球を４色のフローサイトメトリー分析により検出した。各試料について、ｈＣＤ４５（＋）、ｍＣＤ４５（−）、ｈＣＤ２０（＋）及びｈＣＤ１９（＋）の細胞表面発現並びＰＫＨ２６基準マイクロビーズ（ＲｅｆＰ７４５８，Ｓｉｇｍａ）によりヒトＢリンパ球細胞を定量した。以下の表２５に記載する抗体を用いた。
【０２７５】
表２５：ヒトＢリンパ球細胞検出用抗体
【表２５】
2012518404.tif 000028
【０２７６】
ＣＤマーカー発現の分析のため、２００μＬの染色緩衝液［ＰＢＳ（Ｒｅｆ１７−５１６Ｆ，Ｌｏｎｚａ）、０．２％ＢＳＡ（ＲｅｆＡ７０３０，Ｓｉｇｍａ）０．０２％ＮａＮ３（ＲｅｆＳ２００２，Ｓｉｇｍａ）］中の脾臓から得た細胞１０００００個を、ｈＣＤ１９  ＰｅｒＣＰ、ｈＣＤ２０  ＦＩＴＣ、ｈＣＤ４５  ＡＰＣ及びｍＣＤ４５  ＡＰＣ−Ｃｙ７抗体の混合液、又はｍＩｇＧ１−ＦＩＴＣ、ｒＩｇＧ２ｂ−ＡＰＣ−Ｃｙ７、ｍＩｇＧ１−ＡＰＣ及びｍＩｇＧ１−ＰｅｒＣＰ抗体の混合液のいずれかと共に、室温、暗室で２０分間インキュベートした。
【０２７７】
それぞれの場合においてアイソタイプのコントロール抗体を陰性コントロールとして用いた。
【０２７８】
赤血球細胞は、「Ｆｉｘ  ａｎｄ  Ｌｙｓｅ」手法を用いて溶解した。簡潔には、２５μＬのＩＯＴｅｓｔ３  １０×固定液（ＲｅｆＡ０７８００，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を１ｍＬのＶｅｒｓａＬｙｓｅ（ＲｅｆＡ０９７７７，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）に加えて「Ｆｉｘ  ａｎｄ  Ｌｙｓｅ」緩衝液を調製し、この混合物１ｍｌを染色細胞に加えた。ボルテックスして、室温、暗室で１０分間インキュベートした後、細胞を遠心分離して３ｍＬの染色緩衝液で１回洗浄し、０．５ｍＬの基準マイクロビーズ溶液（ＰＫＨ２６，ＲｅｆＰ７４５８，Ｓｉｇｍａ，染色緩衝液で１／２に希釈）に再懸濁させた試料は、ＦＡＣＳ分析に供するまで遮光して氷上にて保存した。染色した細胞を、ＣｙＦｌｏｗ（登録商標）ｓｐａｃｅフローサイトメーター（Ｐａｒｔｅｃ  Ｓ．Ａ．Ｒ．Ｌ．）を用いて波長４８８ｎｍのレーザー励起により分析した。各試料について、１００００カウント（到達すれば）のｈＣＤ４５（＋）が回収された時点で回収を終了した。回収中は、すべてのイベントを保存した。
【０２７９】
ＦＡＣＳの結果は、細胞の大きさと複雑度を可視化するため、ＦＳＣ−ＳＳＣパラメータ（前方及び側方散乱検出器）をドットプロットにより示し、ｈＣＤ４５（ＦＩＴＣ）蛍光強度をドットプロットにより示した。
【０２８０】
絶対細胞計数の算出は、以下の式により行った。
【数１】
2012518404.tif 000029
ここで、
−ＡＣＮはμＬあたりの絶対細胞数、
−ＣＮは細胞数、
−ＢＮはビーズ数、
−ビーズ濃度は、製造者の示すバッチにより遅い日付で特定し、
−Ｖｆ（ｍＬで示す）は細胞ペレットを再懸濁するのに用いたマイクロビース溶液の量、
−Ｖｉ（μＬで示す）はＦＡＣＳ分析に用いた血液の初期量、である。
１８日目における、移植ＳＣＩＤマウスの脾臓中の全Ｂ細胞のＡＣＮを表１４に示す。１８日目における、移植ＳＣＩＤマウスの脾臓中の全Ｂ細胞の割合を表１５に示す。
【０２８１】
ｈＰＢＭＣ&抗ＣＤ１９変異体Ｖ１８の群のマウス１匹（マウス番号３８１７）を除き、すべてのマウスにおいてｈＰＢＭＣの移植が成功し、マウス血液中から循環ヒトＣＤ４５＋白血球が検出された。ヒトＣＤ４５＋白血球のレベルは、ｈＰＢＭＣを移植したマウスのほとんどにおいて、血液細胞の１５％を超えていた。更に、移植マウスの５２％において、高レベルのヒト細胞再構成（血液細胞中のｈＣＤ４５＋白血球の３１−７３％に達する）が観察された。ｈＣＤ４５＋白血球のレベルは、実験中無変化又は増加したが、これは、ヒトＰＢＭＣを移植したＳＣＩＤマウスの移植効率を反映するものである。ヒトＣＤ４５＋白血球は、移植後１８日の脾臓でも検出され、平均移植レベルは、脾臓細胞のおよそ４５％がｈＣＤ４５＋細胞であった。
【０２８２】
脾臓中のヒトＢ細胞の割合は、投薬から４日後、即ち移植から１８日後のマウスを殺処置する際に分析した。陰性コントロール群のすべての移植マウスにおいて、脾臓では、ｈＣＤ４５＋白血球のうち、Ｂ細胞が５−１１％含まれていた。脾臓中のヒトＢ細胞は、ｈＣＤ１９＋／ｈＣＤ２０＋の２重陽性のＢ細胞だけでなく、ｈＣＤ１９＋又はｈＣＤ２０＋の単陽性細胞からも構成されていた。Ｍａｂｔｈｅｒａ（登録商標）、抗ＣＤ１９抗体変異体ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ−ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ、又は抗ＣＤ１９抗体変異体ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ／Ｓ３２４Ｎ−ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａで治療したマウスの脾臓からは、低いレベル（<３％）のヒトＢ細胞しか検出されず、ヒトＢ細胞の減少は、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）の群と比較して統計的に有意であった。一方で、抗ＣＤ１９変異体抗体ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ−ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ又は抗ＣＤ１９抗体変異体ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ／Ｓ３２４Ｎ−ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２ＡとＭａｂｔｈｅｒａ（登録商標）による治療の間では、脾臓でのＢ細胞枯渇について統計的に有意な差は観察されなかった。
【０２８３】
以上の結果から、抗ＣＤ１９抗体変異体ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ−ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａ又は抗ＣＤ１９抗体変異体ＶＨ１６  Ｒ９４Ｋ／Ｓ３２４Ｎ−ＶＬ４３  Ｖ３Ｑ／Ｔ７Ｓ／Ｐ４４Ｉ／Ｎ９２Ａを１０ｍｇ／ｋｇで単回静脈内投与すると、治療を受けたマウスの脾臓においてＢ細胞が枯渇し、ＧＢＲ抗体への応答の強度は、Ｍａｂｔｈｅｒａ（登録商標）と同等であることが実証された。
【図１】
2012518404.tif 000030
【図２】
2012518404.tif 000031
【図３】
2012518404.tif 000032
【図４】
2012518404.tif 000033
【図５Ａ】
2012518404.tif 000034
【図５Ｂ】
2012518404.tif 000035
【図６】
2012518404.tif 000036
【図７Ａ】
2012518404.tif 000037
【図７Ｂ】
2012518404.tif 000038
【図８】
2012518404.tif 000039
【図９】
2012518404.tif 000040
【図１０】
2012518404.tif 000041
【図１１】
2012518404.tif 000042
【図１２】
2012518404.tif 000043
【図１３】
2012518404.tif 000044
【図１４】
2012518404.tif 000045
【図１５】
2012518404.tif 000046
【配列表】
2012518404000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成23年12月8日(2011.12.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１及び／又は配列番号２８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２及び／又は配列番号２９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３；及び／又は配列番号３０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１及び／又は配列番号３１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２及び／又は配列番号３２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、を有するヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片。
【請求項２】
前記ヒト化抗体又はその断片が、配列番号２７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号２８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２及び配列番号２９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を有する、請求項１に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項３】
前記ヒト化抗体又はその断片が、配列番号３０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号３２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を有する、請求項１に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項４】
前記ヒト化抗体又はその断片が、配列番号２７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号２８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２及び配列番号２９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を有し、かつ、配列番号３０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号３２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を有する、請求項１に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項５】
前記ヒト化抗体又はその断片が、配列番号１９、２０、２１、２２及び４２からなる群から選択される重鎖可変領域配列を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項６】
前記ヒト化抗体又はその断片が、配列番号１９、２０、２１、２２又は４２のフレームワーク領域配列と少なくとも８０％の相同性を有する重鎖可変フレームワーク領域配列を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項７】
前記ヒト化抗体又はその断片が、配列番号２１の重鎖可変領域配列を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項８】
前記ヒト化抗体又はその断片が、配列番号２１のフレームワーク領域配列と少なくとも８０％の相同性を有する重鎖可変フレームワーク領域配列を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項９】
前記ヒト化抗体又はその断片が、Ｖ３−３３＊０１（配列番号１１）、Ｖ３−１１＊０１（配列番号１２）、Ｖ３−３０＊−１８（配列番号１３）及びＶ３−４８＊０１（配列番号１４）からなる群から選択されるヒト遺伝子の産物であるか、又は、当該ヒト遺伝子に由来する重鎖可変フレームワーク領域を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項１０】
前記ヒト化抗体又はその断片の重鎖ＣＤＲの少なくとも１つが、少なくとも１つのアミノ酸改変を有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項１１】
前記アミノ酸改変が、カバットによる付番体系を用いて示されるアミノ酸位置において、重鎖ＣＤＲ１におけるアミノ酸置換Ｙ３２Ｆを有する、請求項１０に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項１２】
前記アミノ酸改変が、カバットによる付番体系を用いて示されるアミノ酸位置において、重鎖ＣＤＲ２におけるアミノ酸置換Ｙ５８Ｆ又はＹ５９Ｆを有する、請求項１０に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項１３】
前記アミノ酸改変が、カバットによる付番体系を用いて示されるアミノ酸位置において、Ｙ９６Ｆ、Ｙ９７Ｆ、Ｙ９８Ｆ及びＹ１００ＢＦからなる群から選ばれる１つ又はそれ以上の重鎖ＣＤＲ３におけるアミノ酸改変を有する、請求項１０に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項１４】
前記ヒト化抗体又はその断片の重鎖可変領域のフレームワーク領域の少なくとも１つが、対応マウス抗体の重鎖可変領域の対応するフレームワーク領域からの、少なくとも１つのアミノ酸改変を有する、請求項５〜１３のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項１５】
前記アミノ酸改変が、カバットによる付番体系を用いて示されるアミノ酸位置において、３７、４２、４８、４９、６７、７１、７８及び９４からなる群から選択されるアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を有する、請求項１４に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項１６】
前記アミノ酸改変が、カバットによる付番体系を用いて示されるアミノ酸位置において、４２、６７、７１、７８及び９４からなる群から選択されるアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を有する、請求項１４に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項１７】
前記アミノ酸改変が、カバットによる付番体系を用いて示されるアミノ酸位置において、Ｇ４２Ｒ、Ｆ６７Ｌ、Ｒ７１Ｋ、Ｌ７８Ｖ及びＲ９４Ｋからなる群から選択されるアミノ酸置換を有するが、ただし前記アミノ酸改変がＲ９４Ｋである場合は、前記重鎖可変領域配列が配列番号１９又は２０ではないことを条件とする、請求項１４に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項１８】
前記ヒト化抗体又はその断片が、配列番号２３、２４、２５、２６及び４１からなる群から選択される軽鎖可変領域配列を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項１９】
前記ヒト化抗体又はその断片が、配列番号２３、２４、２５、２６及び４１のフレームワーク領域配列と少なくとも８０％の相同性を有する軽鎖可変フレームワーク領域配列を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項２０】
前記ヒト化抗体又はその断片が、配列番号４１の軽鎖可変領域配列を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項２１】
前記ヒト化抗体又はその断片が、配列番号４１のフレームワーク領域配列と少なくとも８０％の相同性を有する軽鎖可変フレームワーク領域配列を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項２２】
前記ヒト化抗体又はその断片が、Ｖ１−５＊０３（配列番号３）、Ｖ１−２７＊０１（配列番号４）、Ｖ１−３９＊−０１（配列番号５）及びＶ１−１２＊０１（配列番号６）からなる群から選択されるヒト遺伝子の産物であるか、又は当該ヒト遺伝子に由来する軽鎖可変フレームワーク領域を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項２３】
前記ヒト化抗体又はその断片の軽鎖ＣＤＲの少なくとも１つが、少なくとも１つのアミノ酸改変を有する、請求項１〜４又は１８〜２２のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項２４】
前記アミノ酸改変が、カバットによる付番体系を用いて示されるアミノ酸位置において、軽鎖ＣＤＲ１におけるアミノ酸置換Ｙ３２Ｆを有する、請求項２３に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項２５】
前記アミノ酸改変は、カバットによる付番体系を用いて示されるアミノ酸位置において、軽鎖ＣＤＲ３におけるＮ９２Ａ、Ｔ９３Ａ及びＴ９３Ｖから選択される群から選択されるアミノ酸置換を有する、請求項２３に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項２６】
前記ヒト化抗体又はその断片の軽鎖可変領域の少なくとも１つのフレームワーク領域が、対応マウス抗体の軽鎖可変領域の対応するフレームワーク領域からの、少なくとも１つのアミノ酸改変を有する、請求項１８〜２５のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項２７】
前記アミノ酸改変が、カバットによる付番体系を用いて示されるアミノ酸位置において、４４、７１及び８７からなる群から選択されるアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を有する、請求項２６に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項２８】
前記アミノ酸改変が、カバットによる付番体系を用いて示されるアミノ酸位置において、Ｐ４４Ｖ、Ｐ４４Ｉ、Ｐ４４Ｌ、Ｆ７１Ｙ、Ｆ７１Ｈ、Ｆ７１Ｓ、Ｆ７１Ｔ及びＹ８７Ｆからなる群から選択されるアミノ酸置換を有する、請求項２６に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項２９】
前記アミノ酸改変が、カバットによる付番体系を用いて示されるアミノ酸位置において、Ｐ４４Ｖ、Ｐ４４Ｉ、Ｆ７１Ｙ及びＹ８７Ｆからなる群から選択されるアミノ酸置換を有する、請求項２６に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項３０】
前記ヒト化抗体又はその断片が、
（ａ）配列番号１９、２０、２１、２２及び４２からなる群から選択される重鎖可変領域配列と、
（ｂ）配列番号２３、２４、２５、２６及び４１からなる群から選択される軽鎖可変領域配列とを有する、請求項４に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項３１】
前記ヒト化抗体又はその断片が、
（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域配列と、
（ｂ）配列番号４１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域配列とを有する、請求項４に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項３２】
前記ヒト化抗体又はその断片が、配列番号３３、３４、３５、３６、３７、４３、４４、４５、４６、４７、５４及び５５からなる群から選ばれる重鎖可変領域を有する、請求項１〜４のいずれか１項又は請求項１０に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項３３】
前記ヒト化抗体又はその断片が、配列番号２５、３８、３９、４０、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２及び６３からなる群から選択される軽鎖可変領域を有する、請求項１〜４のいずれか１項又は請求項２３に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項３４】
前記ヒト化抗体又はその断片が、配列番号３７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号５９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する、請求項２３に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項３５】
前記ヒト化抗体又はその断片が、配列番号４７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号６０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する、請求項２３に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項３６】
前記ヒト化抗体又はその断片が、配列番号４７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号５９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する、請求項２３に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項３７】
前記ヒト化抗体又はその断片が、配列番号３７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号２５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する、請求項４に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項３８】
前記ヒト化抗体又はその断片が、配列番号３７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号４９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する、請求項４に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項３９】
前記ヒト化抗体又はその断片が、配列番号４７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号４９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する、請求項１０に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項４０】
前記ヒト化抗体又はその断片が、配列番号４３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号５９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する、請求項１０及び請求項２３に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項４１】
前記ヒト化抗体又はその断片が、
（ａ）配列番号６４のアミノ酸配列を有する重鎖配列と、
（ｂ）配列番号６５のアミノ酸配列を有する軽鎖配列とを有する、請求項２３に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項４２】
前記ヒト化抗体又はその断片が、
（ａ）配列番号６６のアミノ酸配列を有する重鎖配列と、
（ｂ）配列番号６７のアミノ酸配列を有する軽鎖配列とを有する、請求項１０及び請求項２３に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項４３】
前記ヒト化抗体又はその断片が、
（ａ）配列番号６６のアミノ酸配列を有する重鎖配列と、
（ｂ）配列番号６５のアミノ酸配列を有する軽鎖配列とを有する、請求項１０及び請求項２３に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項４４】
ヒト重鎖及び／又は軽鎖定常領域をさらに有する、請求項１〜４０のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項４５】
前記ヒト重鎖定常領域がヒトＩｇＧである、請求項４４に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項４６】
前記重鎖定常領域が、ヒトＩｇＧ１由来のＣＨ１、ヒトＩｇＧ１由来のヒンジ及びヒトＩｇＧ３由来のＦｃ領域を有するアイソタイプ変異体を有する、請求項４４に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項４７】
（ａ）配列番号１２４のアミノ酸配列を有する重鎖配列と、
（ｂ）配列番号６５のアミノ酸配列を有する軽鎖配列とを有する、請求項４６に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項４８】
前記抗体が全長抗体である、請求項１〜４７のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項４９】
前記抗体が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、２重特異性一本鎖Ｆｖ二量体、２重特異性抗体、３重特異性抗体、及び同一又は異なる抗体に遺伝子的に融合されたｓｃＦｖからなる群から選択される抗体断片である、請求項１〜４７のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項５０】
前記抗体が、親抗体のヒトＩｇＧのＦｃ領域と比べて少なくとも１つのアミノ酸改変を有するヒトＩｇＧの変異Ｆｃ領域を有するが、前記ヒトＩｇＧの変異Ｆｃ領域を有する抗体が、親細胞と比較して異なるエフェクター機能を示す、請求項１〜４７のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項５１】
前記ヒト化抗体又はその断片が、
（ａ）配列番号１１４のアミノ酸配列を有する重鎖配列と、
（ｂ）配列番号６５のアミノ酸配列を有する軽鎖配列とを有する、請求項５０に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項５２】
前記ヒト化抗体又はその断片が、
（ａ）配列番号１１５のアミノ酸配列を有する重鎖配列と、
（ｂ）配列番号６５のアミノ酸配列を有する軽鎖配列とを有する、請求項５０に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項５３】
前記ヒト化抗体又はその断片が、
（ａ）配列番号１１６のアミノ酸配列を有する重鎖配列と、
（ｂ）配列番号６５のアミノ酸配列を有する軽鎖配列とを有する、請求項５０に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項５４】
前記ヒト化抗体又はその断片が、
（ａ）配列番号１１７のアミノ酸配列を有する重鎖配列と、
（ｂ）配列番号６５のアミノ酸配列を有する軽鎖配列とを有する、請求項５０に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項５５】
前記ヒト化抗体又はその断片が、
（ａ）配列番号１１８のアミノ酸配列を有する重鎖配列と、
（ｂ）配列番号６５のアミノ酸配列を有する軽鎖配列とを有する、請求項５０に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項５６】
前記ヒト化抗体又はその断片が、
（ａ）配列番号１１９のアミノ酸配列を有する重鎖配列と、
（ｂ）配列番号６５のアミノ酸配列を有する軽鎖配列とを有する、請求項５０に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項５７】
前記ヒト化抗体又はその断片が、
（ａ）配列番号１２０のアミノ酸配列を有する重鎖配列と、
（ｂ）配列番号６５のアミノ酸配列を有する軽鎖配列とを有する、請求項５０に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項５８】
前記ヒト化抗体又はその断片が、
（ａ）配列番号１２１のアミノ酸配列を有する重鎖配列と、
（ｂ）配列番号６５のアミノ酸配列を有する軽鎖配列とを有する、請求項５０に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項５９】
前記ヒト化抗体又はその断片が、
（ａ）配列番号１２２のアミノ酸配列を有する重鎖配列と、
（ｂ）配列番号６５のアミノ酸配列を有する軽鎖配列とを有する、請求項５０に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項６０】
前記ヒト化抗体又はその断片が、
（ａ）配列番号１２３のアミノ酸配列を有する重鎖配列と、
（ｂ）配列番号６５のアミノ酸配列を有する軽鎖配列とを有する、請求項５０に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項６１】
前記ヒトＩｇＧのＦｃ領域に結合した成熟コア糖鎖構造がフコースを欠いている、請求項４５に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項６２】
ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片であって、前記抗体が、親抗体のアミノ酸位置３２４のセリンがアスパラギンに置き換えられたアミノ酸置換Ｓ３２４Ｎを有するヒトＩｇＧの変異Ｆｃ領域を有するが、前記ヒトＩｇＧの変異Ｆｃ領域を有する抗体が、親細胞と比較して向上した補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）を示す、前記ヒト化抗体又はその断片。
【請求項６３】
請求項１〜６２のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその断片をコードする単離核酸。
【請求項６４】
微生物としてＤＳＭＺに寄託された受入番号ＤＳＭ２３３０２の、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化ＦＭＣ６３変異体の重鎖をコードする核酸配列を有する単離核酸。
【請求項６５】
微生物としてＤＳＭＺに寄託された受入番号ＤＳＭ２３３０３の、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化ＦＭＣ６３変異体の軽鎖をコードする核酸配列を有する単離核酸。
【請求項６６】
請求項６３に記載の単離核酸、又は請求項６４及び６５に記載の単離核酸を有するベクター。
【請求項６７】
請求項６３に記載の単離核酸、又は請求項６４及び６５に記載の単離核酸、又は請求項６６に記載のベクターを有する宿主細胞。
【請求項６８】
請求項６７に記載の宿主細胞を培養し、前記核酸を発現させて前記抗体を産生させることを含む、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片の製造方法。
【請求項６９】
請求項６４及び６５に記載の単離核酸にコードされた、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体又はその断片。
【請求項７０】
請求項１〜６２のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその断片と、薬学的に許容しうる担体とを含む組成物。
【請求項７１】
治療薬に結合した請求項１〜６２のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその断片を有する、免疫複合体。
【請求項７２】
請求項７１に記載の免疫複合体と、薬学的に許容しうる担体とを含む組成物。
【請求項７３】
ＣＤ１９を発現する腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、前記腫瘍細胞の増殖を阻害するのに有効な量の請求項１〜６２のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその断片を前記細胞に接触させることを含む当該方法。
【請求項７４】
前記腫瘍細胞が、ヒトバーキットリンパ腫細胞、ヒト前駆Ｂ細胞白血病細胞、ヒトＢ細胞白血病細胞又はヒトＢ細胞リンパ腫細胞からなる群から選択される、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
対象においてＢ細胞を枯渇させる方法であって、前記対象からＢ細胞を枯渇させるのに有効な量の請求項１〜６２のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその断片を前記対象に投与することを含む当該方法。
【請求項７６】
対象におけるＣＤ１９介在型障害を治療する方法であって、治療有効量の請求項１〜６２のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその断片を前記対象に投与することを含む当該方法。
【請求項７７】
前記ＣＤ１９介在型障害が、関節リウマチを含む自己免疫疾患、がん、非ホジキンリンパ腫、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、有毛細胞白血病、バーキットリンパ腫、未文化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、小結節非正円形細胞リンパ腫、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、レンネルトリンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）、成人Ｔ細胞白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、中心芽細胞性／中心細胞性（ｃｂ／ｃｃ）濾胞性リンパ腫がん、Ｂ型びまん性大細胞型リンパ腫、血管免疫芽球性リンパ節症（ＡＩＬＤ）様Ｔ細胞リンパ腫、ＨＩＶ随伴型体腔型リンパ腫、胚性がん腫、鼻咽腔未分化がん（例えば、シュミンケ腫瘍）、キャッスルマン病、カポジ肉腫、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、抗ＣＤ２０抗体抵抗性Ｂ細胞がん、並びに他のＢ細胞リンパ腫及び白血病からなる群から選択される、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記ＣＤ１９介在型障害が、非ホジキンリンパ腫、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、有毛細胞白血病、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、及び抗ＣＤ２０抗体抵抗性Ｂ細胞がんからなる群から選択される、請求項７６に記載の方法。
【請求項７９】
前記ＣＤ１９介在型障害が腫瘍原性の障害である、請求項７６に記載の方法。
【請求項８０】
請求項１〜６２のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその断片の医薬品としての使用。
【請求項８１】
ＣＤ１９介在型障害の治療薬の製造における請求項１〜６２のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその断片の使用。
【請求項８２】
医薬として使用するための、請求項１〜６２のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項８３】
ＣＤ１９介在型障害の治療法における使用のための、請求項１〜６２のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項８４】
ＣＤ１９介在型障害の治療のための、請求項１〜６２のいずれか１項に記載のヒト化抗体若しくはその断片、請求項７０若しくは７２に記載の組成物、又は請求項７１に記載の免疫複合体を含む製品。
【請求項８５】
ＣＤ１９介在型障害の治療のための、請求項１〜６２のいずれか１項に記載のヒト化抗体若しくはその断片、請求項７０若しくは７２に記載の組成物、又は請求項７１に記載の免疫複合体を含むキット。
【国際調査報告】
2012518404.tif 000047
2012518404.tif 000048
2012518404.tif 000049
2012518404.tif 000050
2012518404.tif 000051
2012518404.tif 000052
2012518404.tif 000053
2012518404.tif 000054