(57)【要約】  本発明は、核酸重合酵素及びセロビオースを含む乾固又は凍結乾燥した組成物に関するものであり、ここで、該酵素は、５５℃に至るまでの温度でさえも、ある期間の間、安定である。また、本発明の組成物は、更に、塩、サンプル中に存在する鋳型ＤＮＡに対して特異的なプライマー、プローブ等の更なる試薬を含むことができ、場合により他の安定化化合物を含むこともできる。本発明は、核酸重合酵素及びセロビオースを含む乾固又は凍結乾燥した組成物を、場合により容器中で、調製する方法に関するものであり、ここで、該酵素は、凍結乾燥され、サンプル添加時の分子生物学的用途に使える状態にある。【特許請求の範囲】
【請求項１】
乾固又は凍結乾燥した組成物であって、適切な溶媒を用いて希釈されるのに適したものであり、凍結乾燥及び５５℃以下の温度での貯蔵に耐えるために安定化された核酸重合酵素を含んでなり、前記組成物は、核酸重合酵素濃度が０．０１〜２５０ユニットの範囲にあり、濃度が５０ｍＭ（１７，１１５ｇ／Ｌ）〜５００ｍＭ（１７１，１５ｇ／Ｌ）のセロビオースと、緩衝剤とを含むことを特徴とする組成物。
【請求項２】
前記核酸重合酵素が、Ｔａｑポリメラーゼ、ホットスタートポリメラーゼ又はそれらの活性断片からなる群から選択されるＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
２５０ｍＭのセロビオース及び２ユニットの核酸重合酵素を含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
適切な溶媒を用いて希釈されるのに適した組成物であって、凍結乾燥及び５５℃以下の温度での貯蔵に耐えるために安定化された核酸重合酵素を含んでなり、前記組成物は、核酸重合酵素濃度が０．０１〜２５０ユニットの範囲にあり、、濃度が５０ｍＭ〜５００ｍＭのセロビオース、緩衝剤、ｄＮＴＰｓ、ＫＣｌ及びＭｇＣl２を含むことを特徴とする組成物。
【請求項５】
前記緩衝剤が、トリスＨＣｌであることを特徴とする請求項１又は４に記載の組成物。
【請求項６】
更に、下記成分（ｉ−ｉｉｉ）：
ｉ．界面活性剤及び／又は非還元糖からなる群から選択される安定剤；
ｉｉ．β−メルカプトエタノール、及びＤＴＴからなる群から選択される還元剤；並びに
ｉｉｉ．少なくとも１つのプローブであって、任意に標識化されたもの
の１種以上を含むことを特徴とする請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
核酸の増幅のための、請求項１又は４に記載の組成物の使用。
【請求項８】
前記増幅のプロセスが、自動で行われることを特徴とする請求項７に記載の使用。
【請求項９】
ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、融解曲線分析、高分解能融解分析、配列決定、定量的蛍光ＰＣＲ、多重ＰＣＲ、全ゲノム増幅又は等温増幅を行うための、請求項７又は８に記載の使用。
【請求項１０】
ａ．請求項１に記載の組成物を水中又は緩衝剤中に再構成する工程と；
ｂ．標的ＤＮＡに対して特異的なプライマーを加える工程と；
ｃ．核酸鋳型を加える工程と；
ｄ．ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰｓ、任意に標識化された少なくとも１つのプローブ、還元剤、及び更なる安定剤からなる群から選択される試薬の１種以上を加える工程と
を含むことを特徴とする核酸の増幅方法。
【請求項１１】
ａ．請求項４に記載の組成物を水中又は緩衝剤中に再構成する工程と；
ｂ．標的ＤＮＡに対して特異的なプライマーを加える工程と；
ｃ．核酸鋳型を加える工程と；
ｄ．任意に標識化された少なくとも１つのプローブ、還元剤、及び更なる安定剤を任意に加える工程と
を含むことを特徴とする核酸の増幅方法。
【請求項１２】
ａ．請求項１又は４に記載の乾固又は凍結乾燥した組成物と；
ｂ．前記組成物を再構成するための溶媒と
を含むことを特徴とする、すぐ使用できる製品。
【請求項１３】
請求項１又は４に記載の組成物を備え、任意には再構成のための指示及びポリメラーゼ連鎖反応における前記酵素の使用を備えることを特徴とするＤＮＡサンプルのＰＣＲ増幅用キット。
【請求項１４】
凍結乾燥中及び５５℃以下の温度での長期間の貯蔵中に核酸ポリメラーゼを保存するためのセロビオースの使用。
【請求項１５】
前記核酸ポリメラーゼがＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする請求項１４に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸重合酵素の安定化と、すぐ使用できる反応組成物及びかかるポリメラーゼ安定剤を含有するキットの製造とに関するものであり、それらは診断目的にも使用できる。
【背景技術】
【０００２】
核酸のインビボ及びインビトロでの合成は、そのストランドの正確な複製によって制御されており、ここで、一つ一つの核酸ストランドは、完全に相補的なストランド中のヌクレオチドの順番を決定する。ＤＮＡ複製に特異的な機構は、ポリメラーゼとして知られる酵素ファミリーの使用を必要とし、該酵素ファミリーによって行われる。
【０００３】
ポリメラーゼは、各種生物から精製されるものであり、研究及び診断において、特にはポリメラーゼ連鎖反応等の遺伝子増幅の各種システムの出現によって、よく使用されている（ＰＣＲ−Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第４，６８３，１９５号；第４，６８３，２０２号；及び第４，８００，１５９号）。
【０００４】
ＰＣＲの基本構成は、２つの合成プライマー、核酸鋳型及びそのポリメラーゼ酵素からなる。各プライマーは、標的核酸のある領域に相補的であり、又はそれ以上に、２つの相補鎖の１つに相補的である。
【０００５】
ポリメラーゼ酵素は、水素結合を介して鋳型鎖に結合できる標的特異性ポリヌクレオチドプライマーのヒドロキシル基にヌクレオチドを結合して、ヌクレオチドを連続して３’方向に加える能力が理由で、増幅システムの重要な部分であることは明らかである。
【０００６】
標準的な増幅混合物は、以下に示す組成を有することができる：ｄＮＴＰｓ、緩衝剤、ＭｇＣｌ２、順方向プライマー、逆方向プライマー、Ｔａｑポリメラーゼ、ＤＮＡ及びＨ２Ｏ。
【０００７】
その反応混合物は、鋳型ＤＮＡの二重らせんを変性するために、９０〜９５℃に加熱される必要がある。変性工程後、その温度を５０〜６０℃に下げて、プライマーの相補鎖とのアニーリングが可能になる；ポリメラーゼは、伸長として一般に知られている工程において前述のプライマーを伸長させることによって、その過程を完了する。
【０００８】
ＰＣＲ反応に使用される酵素は、好熱性生物から単離されており、それ故に、高温下にて安定である。それにもかかわらず、これら高温安定性酵素でさえ化学的因子、プロテアーゼ又は環境変化によって不活性化が起こり得る。
【０００９】
耐熱性酵素の使用は、他の酵素と同様に、高温、ＰＣＲの場合のように、補助因子及び基質の濃度が最適以下での水性混合物、並びに最大酵素活性に対して最適でないｐＨ等の変性条件の併用を要する場合が多い。
【００１０】
この状況は、酵素の安定化が強く望まれ、それは該酵素の長期間保存に必要であり、特には他の試薬と一緒に合わせた水性混合物及び核酸増幅用のすぐ使用できる反応混合物中に含まれる場合に必要であることを示唆する。
【００１１】
ポリメラーゼを安定化するために、多くの技術が知られており、特許及び出願において記載されている。前述の技術には、酵素の化学的修飾、固体支持体上での固定化、アプタマーの使用、酵素の遺伝子操作、及び安定剤の添加が含まれている。
【００１２】
安定化活性が実証されている物質の群は、酵素の活性形態とそれらが含まれる水性環境間の界面で作用する界面活性剤である。
【００１３】
分子生物学の技術において使用される酵素を安定化する通常の方法は、５０％グリセロール、及びジチオスレイトール（ＤＴＴ）、β−メルカプトエタノール等の還元剤を含有する溶液中における各酵素の液体調製物を−２０℃で貯蔵することによるものである。その手順は、酵素の活性を、何ヶ月もの間、活性の最小限の損失で保つのに十分である。対照的に、酵素活性は、室温又は＋４℃で貯蔵された場合、すぐに失われる。
【００１４】
Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０等の非イオン性洗剤が、ＤＮＡポリメラーゼ活性を安定化することが示された。特許出願ＥＰ７７６，９７０Ａ１は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの活性を安定化するため、Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）及びＮＰ−４０（登録商標）を含めた、非イオン性洗剤を使用することを記載する。低濃度のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）もまた、酵素活性を安定化することが示された。
【００１５】
酵素が室温への長期間暴露又は高温への短時間暴露に耐えることを可能にする酵素保存方法は、依然として、郵便委託及び新規分野の利用のより容易で且つ費用効率のより高いマネジメントへの実際の制限のみである。酵素、特には好熱性生物に由来するものを含んだポリメラーゼ、即ちポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に通常利用されるものは、これまで、＋２〜８℃より低い温度、通常では−２０℃で輸送されていた。
【００１６】
生物材料を保存するための方法のうち、凍結乾燥は、これまで、食品、細胞、生体膜、生体高分子、更には酵素を保存するために使用されてきた。
【００１７】
凍結乾燥法は、室内圧力より低い条件下での、凍結サンプルからの水の除去、即ち液体状態を通過せずに固体の水性成分の蒸発を含む。
【００１８】
タンパク質調製物は、乾固による構造歪みを低減するため、乾固させる前に通常凍結される。
【００１９】
不完全に乾燥した凍結乾燥、即ち依然として低いパーセントの水を含有するものは、完全に乾固したものと比べて、特には＋４〜１０℃より高くない温度での保存が行われる場合、より良好な保存を確保するように思う。しかしながら、これら条件下でさえ、酵素活性の小さな喪失がある。
【００２０】
しかしながら、ポリメラーゼ等の一部の酵素は、凍結乾燥型（乾燥又はそうでないもの）にもかかわらず、抗凍結剤の不在下における凍結乾燥後に完全に不活性化される。
【００２１】
抗凍結活性を持つ多くの物質又は添加剤は、ポリメラーゼを安定化するために使用され又は提案されている。例えば、ＵＳ５，６１４，３８７及びＵＳ５，８３４，２５４は、核酸増幅用の凍結乾燥した安定な酵素組成物を調製するための方法及び組成物を記載しており、ここで、トレハロース及び／又はポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）が凍結防止剤として使用された。
【００２２】
既知の技術及び現在市場に出回っている製品の分析は、重合酵素を保護する問題、及び重合連鎖反応混合物の調製を単純化する見込み（それ故に、実験室環境内でさえもＰＣＲ反応を標準化すること）が非常に話題であり、継続して開発されていることを示す。
【００２３】
市場で利用できるものは、標準ＰＣＲ増幅用の単一用量における予備混合凍結乾燥製剤からなるｐｕＲｅ  Ｔａｑ  レディー・トゥ・ゴー  ＰＣＲ  ビーズ（ＧＥヘルスケア）として知られるシステムである。しかしながら、そのシステムは、安定性及び純度のためにリード酵素として記載されている特定のＴａｑポリメラーゼ（ｐｕＲｅ  Ｔａｑポリメラーゼ）を用いて調製するという制限がある。対照的に、提案される本発明の方法は、全てのポリメラーゼを用いて使用できる。なぜなら、セロビオースが、単純なポリメラーゼや、ホットスタートポリメラーゼ、更にはクレノウ等のそれらの活性断片であろうとも、全てのＴａｑポリメラーゼを安定化及び保護することができるからである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２４】
【特許文献１】米国特許第４，６８３，１９５号
【特許文献２】米国特許第４，６８３，２０２号
【特許文献３】米国特許第４，８００，１５９号
【特許文献４】特許出願ＥＰ７７６，９７０Ａ１
【特許文献５】ＵＳ５，６１４，３８７
【特許文献６】ＵＳ５，８３４，２５４
【発明の概要】
【００２５】
本発明は、乾固又は凍結乾燥した組成物に関し、適当な溶媒を用いて希釈されるのに適したものであり、凍結乾燥及び５５℃以下の温度での貯蔵に耐えるために安定化された核酸重合酵素を含むものであり、ここで、前記組成物は、核酸重合酵素濃度が０．０１〜２５０ユニット（０，４〜１００００Ｕ／ｍｌ）の範囲にあり、濃度が５０ｍＭ（１７，１１５ｇ／Ｌ）〜５００ｍＭ（１７１，１５ｇ／Ｌ）のセロビオースと、緩衝剤とを含むことを特徴とする。前記核酸重合酵素は、好ましくはＴａｑポリメラーゼ、ホットスタートポリメラーゼ又はそれらの活性断片からなる群から選択されるＤＮＡポリメラーゼである。前記組成物は、「凍結乾燥したすぐ使用できる増幅混合物」又は「ユニバーサル・マスター・ミックス」ともいわれる。
【００２６】
本発明の更なる態様は、適切な溶媒を用いて希釈されるのに適した組成物に関し、凍結乾燥及び５５℃以下の温度での貯蔵に耐えるために安定化された核酸重合酵素を含むものであり、ここで、前記組成物は、核酸重合酵素濃度が０．０１〜２５０ユニットの範囲にあり、濃度が５０〜５００ｍＭのセロビオース、緩衝剤、ｄＮＴＰｓ、ＫＣｌ及びＭｇＣl２を含むことを特徴とする。
【００２７】
更に、本発明は、核酸の増幅のための、特には、ＰＣＲに限定されず、リアルタイムＰＣＲ、融解曲線分析、高分解能融解分析、配列決定、定量的蛍光ＰＣＲ、多重ＰＣＲ、全ゲノム増幅、等温増幅等の分子生物学的用途のための、上記組成物の使用に関する。
【００２８】
また更に、本発明は、核酸の増幅方法に関し、該方法は、
ｉ．本発明の組成物を水中又は緩衝剤中に再構成する工程と；
ｉｉ．標的ＤＮＡに対して特異的なプライマーを加える工程と；
ｉｉｉ．核酸鋳型を加える工程と；
ｉｖ．ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰｓ、任意に標識化された少なくとも１つのプローブ、還元剤、及び更なる安定剤からなる群から選択される試薬の１種以上を任意に加える工程と
を含む。
【００２９】
また、本発明は、本発明に従う乾固又は凍結乾燥した組成物と、前記組成物を再構成するための溶媒とを含むすぐ使用できる製品を提供する。
【００３０】
その上、本発明は、ＤＮＡサンプルのＰＣＲ増幅用キットであって、本発明に従う組成物を備え、任意には再構成のための指示及びポリメラーゼ連鎖反応における上記酵素の使用を備えるものを含む。
【００３１】
本発明の特に好適な実施態様は、凍結乾燥中及び５５℃以下の温度での長期貯蔵中に核酸ポリメラーゼを保存するためのセロビオースの使用から構成される。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】凍結乾燥プロセス完了直後での、凍結乾燥したすぐ使用できる増幅混合物のアガロースゲル電気泳動パターンである。レーン１〜６：会社Ｘからのホットスタートポリメラーゼを用いて調製された凍結乾燥したすぐ使用できる組成物を用いて増幅されたＰＣＲ産物；凍結乾燥前の体積：２５μｌ（レーン１〜３）又は９．１μｌ（レーン４〜６）。レーン７〜１２：会社ＹのホットスタートＤＮＡポリメラーゼを用いて調製された凍結乾燥したすぐ使用できる混合物を用いて得られた増幅産物；凍結乾燥前の体積：２５μｌ（レーン７〜９）又は７．５μｌ（レーン１０−１２）。レーン１３〜１５：会社Ｘから得たポリメラーゼを用いて調製された凍結乾燥したすぐ使用できる増幅混合物を用いて得られたＰＣＲ産物；凍結乾燥前の体積：２５μｌ。  Ｍ：分子量マーカー「ベンチトップＰＣＲマーカー」，Ｐｒｏｍｅｇａ。  ＰＣＲ産物：２６８ｂｐ：ヒトベータ−グロビン遺伝子の断片；２４０ｂｐ；マラリア原虫ｓｐｐ１８ｓＲＮＡ遺伝子の断片。
【図２】室温又は３７℃での３週間保存後の、凍結乾燥したすぐ使用できる増幅混合物のアガロースゲル電気泳動パターンである。レーン１〜８：会社ＸのホットスタートＤＮＡポリメラーゼを含有する増幅混合物を用いて得られた増幅産物；凍結乾燥前の体積：２５μｌ（レーン１〜４）又は９．１μｌ（レーン５〜８）。レーン９〜１２：会社ＸのＤＮＡポリメラーゼを含有する凍結乾燥したすぐ使用できる反応混合物を用いて得られた増幅産物；凍結乾燥前の体積：２５μｌ。室温（レーン１〜３、５〜７、９〜１１）又は３７℃（レーン４、８、１２）での３週間の保存。  Ｍ：分子量マーカー「ベンチトップＰＣＲマーカー」，Ｐｒｏｍｅｇａ。  ＰＣＲ産物：２６８ｂｐ：ヒトベータ−グロビン遺伝子の断片；２４０ｂｐ；マラリア原虫ｓｐｐ１８ｓＲＮＡ遺伝子の断片。
【図３】凍結乾燥プロセス完了直後での、凍結乾燥したすぐ使用できる増幅混合物のアガロースゲル電気泳動パターンである。上記凍結乾燥したすぐ使用できる混合物は、次のものを含有する：（ｉ）会社Ｗ（レーン１〜４）、会社Ｘ（レーン５〜８）、会社Ｒ（レーン９〜１２）又は会社Ｙ（レーン１３〜１９）の反応緩衝剤；（ｉｉ）会社Ｗ（レーン１、５、９及び１３）、会社Ｙ（レーン２、６、１０、１４、１７、１８及び１９）、会社Ｘ（レーン３、７、１１及び１５）又は会社Ｒ（レーン４、８、１２及び１６）から得たホットスタートＤＮＡポリメラーゼ。レーン１７、１８及び１９の増幅産物は、それぞれが０．２５％のＮＰ−４０及び０．２５％のＴｗｅｅｎ−２０、１００ｍＭのスクロース及び０．２５％のＮＰ−４０、０．２５％のＴｗｅｅｎ−２０及び１００ｍＭのスクロースをも含有する凍結乾燥したすぐ使用できる混合物を用いて得られた。  Ｍ：分子量マーカー「ベンチトップＰＣＲマーカー」，Ｐｒｏｍｅｇａ。  ＰＣＲ産物：２６８ｂｐ：ヒトベータ−グロビン遺伝子の断片；２４０ｂｐ；マラリア原虫ｓｐｐ１８ｓＲＮＡ遺伝子の断片。
【図４】室温での６週間保存後の、凍結乾燥したすぐ使用できる増幅混合物のアガロースゲル電気泳動パターンである。上記凍結乾燥したすぐ使用できる混合物は、次のものをそれぞれ含有する：（ｉ）会社Ｗ（レーン１〜４）、会社Ｘ（レーン５〜８）、会社Ｒ（レーン９〜１２）又は会社Ｙ（レーン１３〜１９）の反応緩衝剤；（ｉｉ）会社Ｗ（レーン１、５、９及び１３）、会社Ｙ（レーン２、６、１０、１４、１７、１８及び１９）、会社Ｘ（レーン３、７、１１及び１５）又は会社Ｒ（レーン４、８、１２及び１６）から得たホットスタートＤＮＡポリメラーゼ。レーン１７、１８及び１９の増幅産物は、それぞれが０．２５％のＮＰ−４０及び０．２５％のＴｗｅｅｎ−２０、１００ｍＭのスクロース及び０．２５％のＮＰ−４０、０．２５％のＴｗｅｅｎ−２０及び１００ｍＭのスクロースをも含有する凍結乾燥したすぐ使用できる混合物を用いて得られた。  Ｍ：分子量マーカー「ベンチトップＰＣＲマーカー」，Ｐｒｏｍｅｇａ。  ＰＣＲ産物：２６８ｂｐ：ヒトベータ−グロビン遺伝子の断片；２４０ｂｐ；マラリア原虫ｓｐｐ１８ｓＲＮＡ遺伝子の断片。
【図５】凍結乾燥プロセス完了直後での、２５０ｍＭのスクロースを含有する凍結乾燥したすぐ使用できる増幅混合物のアガロースゲル電気泳動パターンである。上記凍結乾燥したすぐ使用できる混合物は、次のものを含有する：（ｉ）会社Ｘ（レーン１、８及び９）、会社Ｗ（レーン２、３、１４〜１７）、会社Ｒ（レーン４、５、１０〜１３）又は会社Ｙ（レーン６、７、１８〜２１）の反応緩衝剤；（ｉｉ）会社Ｘ（レーン１〜７）又は会社Ｒ（レーン８〜２１）から得たホットスタートＤＮＡポリメラーゼ。レーン１、２、４、６、８、１０、１４及び１８において使用された上記凍結乾燥したすぐ使用できる混合物においては、物質が加えられず；レーン３、５、７、１１、１５及び１９のものでは、２５０ｍＭのスクロースを反応緩衝剤に加え；レーン９、１２、１６及び２０のものでは、２５０ｍＭのスクロースを貯蔵緩衝剤に加え；レーン１３、１７及び２１のものでは、２５０ｍＭのスクロースを反応緩衝剤及び貯蔵緩衝剤の両方に加えた。  Ｍ：分子量マーカー「ベンチトップＰＣＲマーカー」，Ｐｒｏｍｅｇａ。  ＰＣＲ産物：２６８ｂｐ：ヒトベータ−グロビン遺伝子の断片；２４０ｂｐ；マラリア原虫ｓｐｐ１８ｓＲＮＡ遺伝子の断片。
【図６】室温での８週間保存後の、２５０ｍＭのスクロースを含有する凍結乾燥したすぐ使用できる増幅混合物のアガロースゲル電気泳動パターンである。上記凍結乾燥したすぐ使用できる混合物は、次のものを含有する：（ｉ）会社Ｘ（レーン１、８及び９）、会社Ｗ（レーン２、３、１４〜１７）、会社Ｒ（レーン４、５、１０〜１３）又は会社Ｙ（レーン６、７、１８〜２１）の反応緩衝剤；（ｉｉ）会社Ｘ（レーン１〜７）又は会社Ｒ（レーン８〜２１）から得たホットスタートＤＮＡポリメラーゼ。レーン１、２、４、６、８、１０、１４及び１８において使用された上記凍結乾燥したすぐ使用できる混合物においては、物質が加えられず；レーン３、５、７、１１、１５及び１９のものでは、２５０ｍＭのスクロースを反応緩衝剤に加え；レーン９、１２、１６及び２０のものでは、２５０ｍＭのスクロースを貯蔵緩衝剤に加え；レーン１３、１７及び２１のものでは、２５０ｍＭのスクロースを反応緩衝剤及び貯蔵緩衝剤の両方に加えた。  Ｍ：分子量マーカー「ベンチトップＰＣＲマーカー」，Ｐｒｏｍｅｇａ。  ＰＣＲ産物：２６８ｂｐ：ヒトベータ−グロビン遺伝子の断片；２４０ｂｐ；マラリア原虫ｓｐｐ１８ｓＲＮＡ遺伝子の断片。
【図７】凍結乾燥プロセス完了直後での、以下に記載の安定剤を含有する凍結乾燥したすぐ使用できる増幅混合物のアガロースゲル電気泳動パターンである。上記凍結乾燥したすぐ使用できる混合物は、会社Ｗ（レーン１〜５）又は会社Ｒ（レーン６〜１０）から得た、反応緩衝剤及びホットスタートＤＮＡポリメラーゼ酵素を含有する。上記凍結乾燥したすぐ使用できる混合物に安定剤として加えられたものは、２００ｍＭのトレハロース（レーン２及び７）、２５０ｍＭのスクロース（レーン３及び８）、２００ｍＭのマルトース（レーン４及び９）又は０．０２５％のアガロース（レーン５及び１０）であった。レーン１及び６で使用した上記凍結乾燥したすぐ使用できる混合物には、物質を加えなかった。  Ｍ：分子量マーカー「ベンチトップＰＣＲマーカー」，Ｐｒｏｍｅｇａ。  ＰＣＲ産物：２６８ｂｐ：ヒトベータ−グロビン遺伝子の断片；２４０ｂｐ；マラリア原虫ｓｐｐ１８ｓＲＮＡ遺伝子の断片。
【図８】室温又は３７℃での１週間保存後の、凍結乾燥したすぐ使用できる増幅混合物のアガロースゲル電気泳動パターンである。上記凍結乾燥したすぐ使用できる混合物は、会社Ｗ（レーン１〜５）又は会社Ｒ（レーン６〜１０）から得た、反応緩衝剤及びホットスタートＤＮＡポリメラーゼ酵素を含有する。上記凍結乾燥したすぐ使用できる混合物に安定剤として加えられたものは、２００ｍＭのトレハロース（レーン２及び７）、２５０ｍＭのスクロース（レーン３及び８）、２００ｍＭのマルトース（レーン４及び９）又は０．０２５％のアガロース（レーン５及び１０）であった。レーン１及び６で使用した上記凍結乾燥したすぐ使用できる混合物には、物質を加えなかった。  Ｍ：分子量マーカー「ベンチトップＰＣＲマーカー」，Ｐｒｏｍｅｇａ。  ＰＣＲ産物：２６８ｂｐ：ヒトベータ−グロビン遺伝子の断片；２４０ｂｐ；マラリア原虫ｓｐｐ１８ｓＲＮＡ遺伝子の断片。
【図９】凍結乾燥プロセス完了直後での、安定剤を含有する凍結乾燥したすぐ使用できる増幅混合物のアガロースゲル電気泳動パターンである。上記凍結乾燥したすぐ使用できる混合物は、会社Ｗ（レーン１〜５）又は会社Ｒ（レーン６〜１０）から得た、反応緩衝剤及びホットスタートＤＮＡポリメラーゼを含有する。上記凍結乾燥したすぐ使用できる混合物に加えたものは、２５０ｍＭのトレハロース（レーン２及び７）、６．６％のデキストロース（レーン３及び８）、２００ｍＭのセロビオース（レーン４及び９）又は６．６％のアミロペクチン（５及び１０）であった。レーン１及び６で使用した上記凍結乾燥したすぐ使用できる混合物には、物質を加えなかった。  Ｍ：分子量マーカー「ベンチトップＰＣＲマーカー」，Ｐｒｏｍｅｇａ。  ＰＣＲ産物：２６８ｂｐ：ヒトベータ−グロビン遺伝子の断片；２４０ｂｐ；マラリア原虫ｓｐｐ１８ｓＲＮＡ遺伝子の断片。
【図１０】３７℃での１週間保存後の、安定剤を含有する凍結乾燥したすぐ使用できる増幅混合物のアガロースゲル電気泳動パターンである。上記凍結乾燥したすぐ使用できる混合物は、会社Ｗ（レーン１〜５）又は会社Ｒ（レーン６〜１０）から得た、反応緩衝剤及びホットスタートＤＮＡポリメラーゼを含有する。上記凍結乾燥したすぐ使用できる混合物に加えたものは、２５０ｍＭのトレハロース（レーン２及び７）、６．６％のデキストロース（レーン３及び８）、２００ｍＭのセロビオース（レーン４及び９）又は６．６％のアミロペクチン（５及び１０）であった。レーン１及び６で使用した上記凍結乾燥したすぐ使用できる混合物には、物質を加えなかった。  Ｍ：分子量マーカー「ベンチトップＰＣＲマーカー」，Ｐｒｏｍｅｇａ。  ＰＣＲ産物：２６８ｂｐ：ヒトベータ−グロビン遺伝子の断片；２４０ｂｐ；マラリア原虫ｓｐｐ１８ｓＲＮＡ遺伝子の断片。
【図１１】凍結乾燥プロセス完了直後での、セロビオースを含有する凍結乾燥したすぐ使用できる増幅混合物のアガロースゲル電気泳動パターンである。上記凍結乾燥したすぐ使用できる混合物は、会社Ｗ（レーン１〜５）又は会社Ｒ（レーン６〜１０）から得た、反応緩衝剤及びホットスタートＤＮＡポリメラーゼを含有する。上記凍結乾燥したすぐ使用できる混合物に加えたものは、２５０ｍＭのトレハロース（レーン２及び７）、６．６％のデキストロース（レーン３及び８）、２００ｍＭのセロビオース（レーン４及び９）又は６．６％のアミロペクチン（５及び１０）であった。レーン１及び６で使用した上記凍結乾燥したすぐ使用できる混合物には、物質を加えなかった。  Ｍ：分子量マーカー「ベンチトップＰＣＲマーカー」，Ｐｒｏｍｅｇａ。  ＰＣＲ産物：２６８ｂｐ：ヒトベータ−グロビン遺伝子の断片；２４０ｂｐ；マラリア原虫ｓｐｐ１８ｓＲＮＡ遺伝子の断片。
【図１２】３７℃での２週間保存後の、セロビオースを含有する凍結乾燥したすぐ使用できる増幅混合物のアガロースゲル電気泳動パターンである。上記凍結乾燥したすぐ使用できる混合物は、会社Ｒ（レーン１〜１３）から得た、反応緩衝剤及びホットスタートＤＮＡポリメラーゼを含有する。セロビオースは、異なる濃度（ｍＭ）で、上記凍結乾燥したすぐ使用できる混合物に加えられた：０（レーン１）、５０（レーン２）、１００（レーン３）、１５０（レーン４）、２００（レーン５）、２５０（レーン６）、３００（レーン７）、３５０（レーン８）、４００（レーン９）、４５０（レーン１０）、５００（レーン１１）、６００（レーン１２）、７００（レーン１３）。  Ｍ：分子量マーカー「ベンチトップＰＣＲマーカー」，Ｐｒｏｍｅｇａ。  ＰＣＲ産物：２６８ｂｐ：ヒトベータ−グロビン遺伝子の断片；２４０ｂｐ；マラリア原虫ｓｐｐ１８ｓＲＮＡ遺伝子の断片。
【図１３】凍結乾燥プロセス完了直後での、セロビオース又はトレハロースを含有する凍結乾燥したすぐ使用できる増幅混合物のアガロースゲル電気泳動パターンである。上記凍結乾燥したすぐ使用できる混合物は、会社Ｒ（レーン１〜１６）から得た、反応緩衝剤及びホットスタートＤＮＡポリメラーゼを含有する。上記凍結乾燥したすぐ使用できる混合物に加えたものは、１００ｍＭのセロビオース（レーン１〜５）、２００ｍＭのセロビオース（レーン６〜１０）又は２００ｍＭのトレハロース（レーン１２〜１６）であった。レーン１１で使用した上記凍結乾燥したすぐ使用できる混合物には、物質を加えなかった。  Ｍ：分子量マーカー「ベンチトップＰＣＲマーカー」，Ｐｒｏｍｅｇａ。  ＰＣＲ産物：２６８ｂｐ：ヒトベータ−グロビン遺伝子の断片；２４０ｂｐ；マラリア原虫ｓｐｐ１８ｓＲＮＡ遺伝子の断片。
【図１４】３７℃での２週間保存後の、セロビオース又はトレハロースを含有する凍結乾燥したすぐ使用できる増幅混合物のアガロースゲル電気泳動パターンである。上記凍結乾燥したすぐ使用できる混合物は、会社Ｒ（レーン１〜１５）から得た、反応緩衝剤及びホットスタートＤＮＡポリメラーゼを含有する。上記凍結乾燥したすぐ使用できる混合物に加えたものは、１００ｍＭのセロビオース（レーン１〜５）、２００ｍＭのセロビオース（レーン６〜１０）又は２００ｍＭのトレハロース（レーン１１〜１５）であった。  Ｍ：分子量マーカー「ベンチトップＰＣＲマーカー」，Ｐｒｏｍｅｇａ。  ＰＣＲ産物：２６８ｂｐ：ヒトベータ−グロビン遺伝子の断片；２４０ｂｐ；マラリア原虫ｓｐｐ１８ｓＲＮＡ遺伝子の断片。
【図１５】５５℃での２４時間（レーン１及び６）、４８時間（レーン２及び７）、７２時間（レーン３及び８）、９６時間又は１週間（レーン５及び１０）保存後の、セロビオース又はトレハロースを含有する凍結乾燥したすぐ使用できる増幅混合物のアガロースゲル電気泳動パターンである。上記凍結乾燥したすぐ使用できる混合物は、会社Ｒ（レーン１〜１０）から得た、反応緩衝剤及びホットスタートＤＮＡポリメラーゼを含有する。  Ｍ：分子量マーカー「ベンチトップＰＣＲマーカー」，Ｐｒｏｍｅｇａ。  ＰＣＲ産物：２６８ｂｐ：ヒトベータ−グロビン遺伝子の断片；２４０ｂｐ；マラリア原虫ｓｐｐ１８ｓＲＮＡ遺伝子の断片。  全図面において、「Ｍ」は、Ｐｒｏｍｅｇａ社による分子量マーカー「ベンチトップＰＣＲマーカー」のレーンに対応しており；前記マーカーの断片は、５０ｂｐから１０００ｂｐまで幅がある。
【図１６】凍結乾燥したすぐ使用できる増幅混合物、及び参照方法によって得られた、野生型（ｗｔ）ＤＮＡ対照サンプル（Ｃ１）、未知のＤＮＡサンプル（Ｃ２）、変異ＤＮＡ対照サンプル（Ｃ３）、及び鋳型無しの対照（Ｎ）増幅産物のアガロースゲル電気泳動パターンである。図１６ａは、上記増幅産物の精製手順前の結果である。図１６ｂは、上記増幅産物の精製手順後の結果である。
【図１７】直接配列決定の結果である。図１７ａは、凍結乾燥したすぐ使用できる増幅混合物を用いて得た、野生型及び変異配列の増幅産物の直接配列決定の結果である。図１７ｂは、参照方法によって得た、野生型及び変異配列の増幅産物の直接配列決定の結果である。
【図１８ａ】図１８は、ＰＣＲ及びリアルタイムＰＣＲである。図１８ａ（ｉ）は、凍結乾燥したすぐ使用できる増幅混合物を用いて得た、野生型（ｗｔ）ＤＮＡ対照サンプル（Ｃ１）、未知のＤＮＡサンプル（Ｃ２）、変異ＤＮＡ対照サンプル（Ｃ３）、及び鋳型無しの対照（Ｎ）増幅産物のアガロースゲル電気泳動パターンである。図１８ａ（ｉｉ）は、凍結乾燥したすぐ使用できる増幅混合物を用いて得た、リアルタイムＰＣＲのテイクオフ曲線である。図１８ａ（ｉｉｉ）は、凍結乾燥したすぐ使用できる増幅混合物を用いて得た、リアルタイムＰＣＲの定量比較の結果である。
【図１８ｂ】図１８ｂ（ｉ）は、参照方法によって得られた、野生型（ｗｔ）ＤＮＡ対照サンプル（Ｃ１）、未知のＤＮＡサンプル（Ｃ２）、変異ＤＮＡ対照サンプル（Ｃ３）、及び鋳型無しの対照（Ｎ）増幅産物のアガロースゲル電気泳動パターンである。図１８ｂ（ｉｉ）は、参照方法によって得られた、リアルタイムＰＣＲのテイクオフ曲線である。図１８ｂ（ｉｉｉ）は、参照方法によって得られた、リアルタイムＰＣＲの定量比較の結果である。
【図１９】図１９ａは、凍結乾燥したすぐ使用できる増幅混合物を用いて得た、融解曲線分析の結果である。図１９ｂは、参照方法によって得られた、融解曲線分析の結果である。
【図２０】図２０ａは、凍結乾燥したすぐ使用できる増幅混合物を用いて得た、高分解能融解分析（ＨＲＭ）の結果である。図２０ｂは、参照方法によって得られた、高分解能融解分析（ＨＲＭ）の結果である。
【図２１】図２１ａは、定量的蛍光（ＱＦ）フェログラムであって、凍結乾燥したすぐ使用できる増幅混合物を用いて得られた結果である。図２１ｂは、定量的蛍光（ＱＦ）フェログラムであって、参照方法によって得られた結果である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
定義
本発明の理解を容易にするため、一部の用語を以下に定義する。
【００３４】
「安定剤」の語は、生物活性材料に添加された場合に、安定剤の不在下において該材料を保存するのと比べて、長時間、活性が失われることを防ぐか又は遅らせることができる薬剤を意味する。
【００３５】
「ポリメラーゼ」の語は、ＤＮＡ鋳型及びリボヌクレオシド三リン酸又はデオキシヌクレオシド三リン酸の有効性から、核酸ストランド（ＲＮＡ又はＤＮＡ）を合成することができる酵素又はその活性断片を指す。
【００３６】
「ポリメラーゼ活性」の語は、リボヌクレオシド三リン酸又はデオキシヌクレオシド三リン酸から出発して核酸のストランド（ＲＮＡ又はＤＮＡ）を合成する酵素の能力を指す。
【００３７】
「緩衝剤」（「buffer」又は「buffering agents」）の語は、溶液に加えたときに、そのｐＨの変化に対する抵抗力を与える物質又は調製物を指す。
【００３８】
「還元剤」の語は、電子供与体、即ち第二物質の原子の１つ以上の酸化状態を還元するために第二物質に電子を提供する物質を指す。
【００３９】
「溶液」の語は、混合物を指し、水性でもよいし、非水性でもよい。
【００４０】
「緩衝液」の語は、緩衝剤を含有する溶液を指す。
【００４１】
「反応緩衝剤」の語は、酵素反応を展開する緩衝液を指す。
【００４２】
「貯蔵緩衝剤」の語は、酵素を保存する緩衝液を指す。
【００４３】
「鋳型」の語は、「標的」の存在について分析されている生物サンプルに由来する核酸を指す。
【００４４】
「標的」の語は、分子生物学的技術に関連して使用する場合に、増幅反応に用いる特異的プライマーによって認識される核酸の領域を指す。診断用途のＰＣＲの場合、標的ＤＮＡは、病原体の核酸からなる。
【００４５】
「プライマー」又はトリガーの語は、核酸合成を生じる条件下（ヌクレオチド及びポリメラーゼの存在下）で使用した場合に合成用トリガーとして作用できる合成したオリゴヌクレオチドを指す。
【００４６】
ｄＮＴＰｓ（デオキシヌクレオシド三リン酸）の語は、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン及びデオキシシチジンの混合物を指し、ここで、デオキシヌクレオシド三リン酸それぞれの濃度が示される。
【００４７】
「ＰＣＲ産物」又は「増幅断片」の語は、一般には二重らせんにあり、２つ以上のＰＣＲサイクルに由来するＤＮＡ断片を指し、即ち鋳型ＤＮＡ鎖の変性工程、それとの特異的プライマーのアニーリング工程、及び該プライマーのＯＨ末端から開始する鋳型ＤＮＡに相補的な鎖の伸長又は延長工程を受ける連鎖重合に由来するＤＮＡ断片を指す。
【００４８】
詳細な説明
本発明は、凍結乾燥（又は乾固）中、核酸重合酵素、特にはＤＮＡポリメラーゼ、ホットスタートＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ又はそれらの活性断片を安定化するための、及びそれらをこの形態で長時間保存するための、二糖セロビオースの使用に関する。
【００４９】
好適な態様において、本発明は、適当な溶媒を用いて希釈されるのに適している乾固又は凍結乾燥した組成物に関し、凍結乾燥及び５５℃以下の温度での貯蔵に耐えるために安定化された核酸重合酵素を含むものであり、ここで、前記組成物は、核酸重合酵素濃度が０．０１〜２５０ユニットの範囲にあり、濃度が５０ｍＭ（１７，１１５ｇ／Ｌ）〜５００ｍＭ（１７１，１５ｇ／Ｌ）のセロビオースと、緩衝剤とを含むことを特徴としており、ここで、該緩衝剤は、トリスＨＣｌであることが好ましい。前記核酸重合酵素は、好ましくはＴａｑポリメラーゼ、ホットスタートポリメラーゼ又はそれらの活性断片からなる群から選択されるＤＮＡポリメラーゼである。
【００５０】
前記組成物はまた、「凍結乾燥したすぐ使用できる増幅混合物」又は「ユニバーサル・マスター・ミックス」ともいわれる。
【００５１】
上記乾固又は凍結乾燥した組成物は、液体の又は凍結した混合物からの凍結乾燥（又は乾固）によって得られ、ここで、セロビオースは、５０ｍＭと５００ｍＭの間に含まれる濃度にあるか又は１５０ｍＭ（５１，３４５ｇ／Ｌ）と２５０ｍＭ（８５，５７５ｇ／Ｌ）の間に含まれる濃度にあるか、好ましくは２５０ｍＭであり、また、核酸重合酵素の濃度は、０．０１〜２５０ユニットの範囲にあり、好ましくは少なくとも２ユニットである。凍結乾燥に使用されるセロビオースは、分析グレードのものが好ましい。
【００５２】
本発明の好適な実施態様は、適切な溶媒を用いて希釈されるのに適した組成物に関し、凍結乾燥及び５５℃以下の温度での貯蔵に耐えるために安定化された核酸重合酵素を含むものであり、ここで、前記組成物は、核酸重合酵素濃度が０．０１〜２５０ユニットの範囲にあり、濃度が５０〜５００ｍＭのセロビオース、緩衝剤、ｄＮＴＰｓ、ＫＣｌ及びＭｇＣl２を含むことを特徴としており、ここで、該緩衝剤は、トリスＨＣｌであることが好ましい。
【００５３】
上記組成物は、好ましくはＲＣＲにおいてすぐ使用できる形態としての酵素の実施態様に従い、更に好ましくは、以下に示す試薬：
ｉ．界面活性剤、ＮＰ４０、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００等のイオン性若しくは非イオン性洗剤、及び／又はデキストロース、スクロース、トレハロース等の非還元糖からなる群から選択される安定剤；
ｉｉ．β−メルカプトエタノール、ＤＴＴ又は硫酸アンモニウムからなる群から選択される還元剤；
ｉｉｉ．少なくとも１つのプローブであって、任意に標識化されたもの
の少なくとも１種を含む。
【００５４】
任意には、上記凍結乾燥した組成物をリアルタイムＰＣＲに用いる場合、それは、プローブであって、場合によっては、例えばＴａｑＭａｎプローブ（登録商標）、モレキュラービーコンズ（登録商標）、スコーピオンズプローブ（登録商標）、ハイビーコンプローブ（登録商標）、又はリアルタイムＰＣＲに使用可能な他のプローブからなる群から選択される蛍光基を用いて標識化したものを含むことができる。
【００５５】
本発明の組成物がＤＮＡを含有する水又は緩衝システム中に再構成される場合、セロビオースは、５０ｍＭと５００ｍＭの間に含まれる濃度にあるか、１５０ｍＭと２５０ｍＭの間に含まれる濃度にあるか、好ましくは２５０ｍＭであり、この濃度であれば、それは、遺伝子増幅反応に干渉しない。
【００５６】
更に好ましくは、上記組成物は、好適な実施態様において記載した試薬の全てを含有し、チューブ、マイクロプレート等の単一容器における再構成又はバルクでの再構成の後、直接、遺伝子増幅するために予め調製された、すぐ使用できる凍結乾燥又は乾固した調製物からなる。
【００５７】
本発明は、更に、核酸増幅用の組成物の使用に関し、該増幅は、自動化された方法で行うことができ、具体的には、ＰＣＲに制限されず、リアルタイムＰＣＲ、融解曲線分析、高分解能融解分析、配列決定、定量的蛍光ＰＣＲ、多重ＰＣＲ、全ゲノム増幅、等温増幅等の分子生物学的用途のためである。
【００５８】
また、本発明は、本発明に従う乾固又は凍結乾燥した組成物と、前記組成物を再構成するための溶媒とを含むすぐ使用できる製品を提供する。
【００５９】
本発明に従って調製された上記凍結乾燥した組成物は、それらから行われるＰＣＲ法のかなりの単純化をもたらし、それ故に、汚染の問題を回避することができ、主に、その反応に必要な核酸の体積に関してかなりの柔軟性が許容され、結果として、テストロバスト性の増大が顕著である。この最後の態様は、より大きな体積の核酸が上記凍結乾燥した組成物と共に使用できるため、法医科学において特に興味深い。
【００６０】
更に、ポリメラーゼを含有する組成物の室温安定性のかなりの増加は、獣医学及びヒト診断分野、並びに食品分析分野への特定の興味の適用が、特に十分に設備が整っていない施設において行われる場合に、可能とされることを意味する。従って、これら使用は、特に好適である。また、５５℃以下の温度にて貯蔵するための組成物の安定性の増加は、出荷及び貯蔵について更なる柔軟性を許容する。
【００６１】
また更に、本発明は、核酸の増幅方法に関し、該方法は、
ｖ．本発明の組成物を水中又は緩衝剤中に再構成する工程と；
ｖｉ．標的ＤＮＡに対して特異的なプライマーを加える工程と；
ｖｉｉ．核酸鋳型を加える工程と；
ｖｉｉｉ．ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰｓ、任意に標識化された少なくとも１つのプローブ、還元剤、及び更なる安定剤からなる群から選択される試薬の１種以上を任意に加える工程と
を含む。
【００６２】
本発明の更なる態様は、室温にて安定なポリメラーゼ、好ましくはＤＮＡポリメラーゼ、更に好ましくはＴａｑポリメラーゼ、一層好ましくはホットスタートポリメラーゼを含有する乾固又は凍結乾燥した組成物の調製方法に関し、本質的には、前記酵素（複数の前記酵素）を、濃度が５０ｍＭ〜５００ｍＭ、好ましくは１５０ｍＭ〜２５０ｍＭのセロビオースと共に、例えばトリス−ＨＣｌからなることのできる凍結乾燥及び貯蔵緩衝剤中において、「最小」と定義された手順に従って混合することと、好ましくは迅速な凍結後に、その溶液に凍結乾燥又は乾固を受けさせることを特徴とする。
【００６３】
上記酵素は、少なくとも１〜５ＩＵの量で加えられる：その最小量方法はまた、塩、好ましくはＫＣｌ、ＭｇＣｌ２からなる群から選択されるものを凍結乾燥の前に加えることも備える。
【００６４】
本発明の利点の一つは、セロビオースを用いて安定化されたシステムが、様々な製造会社からの全ＤＮＡポリメラーゼに適応することである。
【００６５】
その上、セロビオースは、セルロース、植物起源のグルコース（糖）の長鎖からなる分子から出発する酵素加水分解システムによって作られる。上記植物起源は、トレハロースの場合のように生産がその合成のために細菌培養物を使用することを含む場合にありそうな細菌汚染から起こり得る核酸汚染物質の欠如を保証する。
【００６６】
酵素又は複数の酵素と安定剤（セロビオース）とを単に又は他の成分と共に混合するためのシステムは多く、全てが適用できる。例えば、溶解した酵素を含有する溶液に安定剤が加えられる方法、又は酵素を含有する溶液を安定剤を含有する第二溶液と混合する方法、又は酵素を安定剤を含有する溶液中に溶解させる方法があり、他には、酵素及び安定剤の両方を含有する溶液を液体又は凍結乾燥したものとして保存する方法がある。
【００６７】
凍結乾燥は、当該技術分野の専門家に知られている基準に従って行われる。凍結乾燥の実行できる手順の例は、以下のものである：
長時間凍結乾燥手順：
・５分で＋２０℃から−４０℃までの勾配
・−４０℃で３時間
・３０分で−４０℃から−１０℃までの勾配
・−１０℃で４時間
・１５分で−１０℃から＋１０℃までの勾配
・＋１０℃で２時間
・１５分で＋１０℃から＋３０℃までの勾配
・＋３０℃で４〜８時間
【００６８】
凍結乾燥は、以下に示す短時間手順に従って行うこともでき、少量が含まれているという理由においても適用できる。凍結乾燥の実行できる手順の例は、以下のものである：
短時間凍結乾燥手順：
・５分で＋２０℃から−４０℃までの勾配
・−４０℃で３０分間
・１５分で−４０℃から−１０℃までの勾配
・−１０℃で３０分間
・１５分で−１０℃から＋１０℃までの勾配
・＋１０℃で６０分間
・１５分で＋１０℃から＋３０℃までの勾配
・＋３０℃で６０分間
【００６９】
短時間凍結乾燥手順は、上記酵素がグリセロール中に貯蔵されていない場合に特に示唆され、一方、長時間凍結乾燥手順は、上記酵素がグリセロール中に貯蔵されているかどうかにかかわらず使用できる。
【００７０】
更に好適な実施態様において、特には診断用途についてであるが、本発明は、ポリメラーゼを凍結乾燥するための組成物をすぐ使用できる形態で調製する方法に関するものであり、該方法は、以下に示す工程を含む：
・「最小」と定義された手順に従って、例えばトリス−ＨＣｌからなることができる凍結乾燥及び貯蔵緩衝剤中に、上記酵素を、５０と５００ｍＭの間に含まれる濃度、好ましくは１５０と２５０ｍＭの間に含まれる濃度のセロビオースと混合する工程（或いはその逆）、
・ＫＣｌ、トリス−ＨＣｌ、ＭｇＣｌ２からなる群から好ましくは選択される塩を加える工程、
・以下のものを任意に加える工程：
・ｄＮＴＰｓ、
・サンプル中に存在する標的ＤＮＡに対して特異的であるプライマー、好ましくは、少なくとも１つの５’プライマー（順方向）及び１つの３’プライマー（逆方向）、
・ＮＰ４０、Ｔｗｅｅｎ−２０等のイオン性若しくは非イオン性洗剤、及び／又は、デキストロース、スクロース、トレハロース等の非還元糖、又は、ＤＴＴ、β−メルカプトエタノール等の還元剤の任意の添加、
・先に示されたような、好ましくは迅速な凍結後の、凍結乾燥（又は乾固）を行い、上記酵素をこの形態で保存する工程。
【００７１】
また、上記方法は、重合連鎖反応のためのコントロールＤＮＡと、特異的プライマーとを凍結乾燥の前に加えることを含むこともできる。
【００７２】
安定剤の語は、ＮＰ−４０（アルキル−フェノールエトキシラート）、Ｔｗｅｅｎ−２０（ソルビタン−ポリオキシエチラートモノラウラート）、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００等の洗剤（又は界面活性剤）又はその類似物、及びデキストロース、スクロース、トレハロース等の非還元糖を意味する。
【００７３】
更なる試薬は、反応混合物中に一つずつ加えてもよいし、予め混合して加えてもよく、製造業者によって上記酵素と共に供給されたもの等であり、重合反応に用いる最終濃度よりｎ倍高く濃縮（一般には×１０）されている。
【００７４】
凍結乾燥した形態で、場合によってはすぐ使用できる上記酵素は、室温にて数カ月の間維持されることができる。
【００７５】
この形態の酵素であって、場合によってはその後のポリメラーゼ連鎖反応に対して特異的な試薬と組み合わせたものの凍結乾燥及び安定性は、その混合物を乾固した形態で且つ緩衝剤又は水を用いて再構成した後にすぐ使用できる形態で含む容器（チューブ、テストチューブ又はマイクロプレート）を用意することができ、場合によっては、サンプル中にＤＮＡ／ＲＮＡ鋳型を含有しており、存在する場合には、該サンプルを増幅する必要がある。
【００７６】
従って、この態様は、診断用途を含む本発明の全ての使用について、その後の増幅反応の標準化を可能にする。
【００７７】
その上、凍結乾燥及び保存手順は、典型的及びリアルタイムＰＣＲによる両方の鎖増幅反応に適しており、延いては定量的及び定性的なタイプの用途の両方にも適している。
【００７８】
本発明の利点の一つは、使用される安定剤（セロビオース）が、上記酵素の凍結乾燥及び保存の両方に対して効果的であることであり、一方で、既知の技術の安定剤は、一般に一方の目的又は他の目的のために使用されている。この目的に使用される他の分子と適合性があるにもかかわらず、セロビオースの使用は、他の「安定化させる」分子の使用を、様々な段階で不要にする。加えて、セロビオースはトレハロースより溶解し難いので、それが、吸湿性も低く、それ故に、凍結乾燥した製品により優れた保存寿命を与えることができることも期待されている。
【００７９】
その上、本発明は、本発明に従う組成物を備え、任意には再構成のための指示及びポリメラーゼ連鎖反応における上記酵素の使用を備えるＤＮＡサンプルのＰＣＲ増幅用キットを含む。
【００８０】
本発明の特に好適な実施態様は、凍結乾燥中、及び５５℃以下の温度での長期間の貯蔵中に核酸ポリメラーゼを保存するため、セロビオースを使用することで構成される。
【００８１】
前述の単一反応用の凍結乾燥した組成物は、数μｌ（２〜５０、好ましくは５〜３０）の最小体積での再構成後に、少なくとも１ｎｇのＤＮＡサンプルを増幅させるのに適している。
【００８２】
また、上記凍結乾燥物は、サンプルのＤＮＡを含有する緩衝剤中で直接再構成できる。すぐ使用できる凍結乾燥した組成物中、又は酵素の再構成の直後に加えられる反応混合物中における各種試薬の濃度は、該組成物を水又は緩衝剤を用いて適当な体積で再構成させた後、ＰＣＲによるＤＮＡ増幅に対して最適になるようにすべきであり、即ち、好ましくは、ＫＣｌが２０と１５０ｍＭの間の濃度にあり、ＭｇＣｌ２が０．５と５ｍＭの間の濃度にあり、標的ＤＮＡの重合反応及び増幅に対して特異的なプライマーが０．０５と０．２ｍＭの間の濃度にあり、ｄＮＴＰｓが５０と２００ｍＭの間の濃度にある。上記酵素を凍結乾燥した形態で含有するかかるキットは、室温にて維持できる。
【００８３】
本発明の他の態様は、凍結乾燥中及び５５℃以下の温度での貯蔵中に、ＤＮＡポリメラーゼ、好ましくはホットスタートＤＮＡポリメラーゼを保存するため、セロビオースを使用することに関する。
【００８４】
先に述べたように、上記酵素の凍結乾燥及びその安定性は、すぐ使用できる反応混合物の形態であっても、単一用量でもバルクであっても、鎖増幅反応の条件を更に標準化することが可能である。従って、本発明の組成物の好適な使用及び本発明によって可能となる凍結乾燥プロセスは、診断キット、具体的には体液又は組織中における寄生因子の存在を決定するためのものの準備に関する。従って、特に好適なものとしては、すぐ使用できる形態の凍結乾燥又は乾固した組成物であって、上記酵素及びセロビオース並びに上述の試薬（例えば、塩及びｄＮＴＰｓ）に加えて、マラリア原虫（ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、ｍａｌａｒｉａｅ、ｖｉｖａｘ及びｏｖａｌｅ種のそれぞれについて一対）の標的ＤＮＡに対して特異的なプライマーであって、好ましくは１８ｓＲＮＡ又はＬｅｉｓｈａｍａｎｉａの保存領域でデザインされたものを、好ましくは１８ｓＲＮＡ又はＴｏｘｏｐｌａｓｍａの保存領域でデザインされたプライマーと共に、好ましくは高反復領域ＨＲＥでデザインされたプライマーと共に含むものであり、ＤＮＡサンプルにおいて前述の病原体を診断確認するためのものである。
【００８５】
また、すぐ使用できる形態としての、それぞれの凍結乾燥した組成物は、好ましくは参照システム中で正常に発現した遺伝子のプライマー対に対応する内部増幅コントロールを含み、好ましくはヒトのベータ−グロビン遺伝子、任意には増幅用のコントロールＤＮＡ鋳型等である。
【００８６】
好ましくはすぐ使用できる形態で作られた組成物中に存在する追加の成分は、好ましくは５〜２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝剤（ｐＨ８．０）中における、再構成後の最終濃度が２０〜１５０ｍＭにあるＫＣｌと、０．０５〜０．５ｍＭのＭｇＣｌ２であり、任意には、濃度が０．０５〜０．２ｍＭのＤＮＡの増幅に対して特異的なプライマー（ここで、その存在はサンプル中で検出されるのに必要とされる）と、濃度が５０〜２００ｍＭのｄＮＴＰｓである。
【００８７】
本発明の実施は、具体的であるが非制限的な一部の例において説明される。
【実施例】
【００８８】
実験パート
材料
方法．  実験パートに記載の凍結乾燥した組成物は、他に独立して示されていない限り、適当な時間に加えられる下記の特定の試薬を一般に含有する：ＤＮＡポリメラーゼ（１〜５ユニットの範囲内）、製造業者によって供給される反応緩衝剤、ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰｓ及びプライマー。
【００８９】
特に、本発明について与えられる例では、反応混合物が、ＤＮＡ中の２つの領域：１）マラリア原虫ｓｐｐ．の１８ｓリボソームＲＮＡ遺伝子でデザインされた２４０ｂｐ（塩基対）の断片（標的ＤＮＡ）、２）内部増幅コントロール（ＤＮＡコントロール）として使用されるヒトβ−グロビン遺伝子でデザインされた２６８ｂｐ断片を増幅するためのプライマーと、塩と、ｄＮＴＰｓとを含有する。
【００９０】
凍結乾燥後、シリカゲル法によってマラリア原虫ｆａｌｃｉｐａｒｕｍが陽性の末梢血液から抽出された約１０ｎｇ（ナノグラム）のゲノムＤＮＡを、凍結乾燥した混合物に加え、滅菌蒸留水を用いて最終体積を２５μｌ（マイクロリットル）にした。
【００９１】
９４℃で２分間の初期変性後、変性（９４℃で２分間）、アニーリング（５５℃で３０秒間）及び伸長（７２℃で４５秒間）からなる増幅サイクルを行った。反応を完了させるため、上述のサイクルを４０回行った。
【００９２】
使用した凍結乾燥手順の一つは、以下のもので構成された：
・５分で＋２０℃から−４０℃までの勾配
・−４０℃で３時間
・３０分で−４０℃から−１０℃までの勾配
・−１０℃で４時間
・１５分で−１０℃から＋１０℃までの勾配
・＋１０℃で２時間
・１５分で＋１０℃から＋３０℃までの勾配
・＋３０℃で４〜８時間
【００９３】
例１．ＤＮＡポリメラーゼとホットスタートポリメラーゼ間の比較
凍結乾燥プロセス後に良好なポリメラーゼ活性を維持するＤＮＡポリメラーゼの種類を確認する目的で、我々は、市販のＤＮＡポリメラーゼを、異なる２つの製造業者から入手できる２つのホットスタートＤＮＡポリメラーゼと比較した。
【００９４】
図１において、レーン１〜６は、会社Ｘからのホットスタートポリメラーゼを用いて調製された凍結乾燥したすぐ使用できる混合物を用いて増幅されたＰＣＲ産物を示す；具体的には、凍結乾燥前の反応体積は、レーン１〜３が２５μｌ、レーン４〜６が９．１μｌに相当する。レーン７〜１２は、会社ＹからのホットスタートＤＮＡポリメラーゼを用いて調製された凍結乾燥したすぐ使用できる混合物を用いて得られた増幅産物に相当する；具体的には、凍結乾燥前の反応体積は、レーン７〜９が２５μｌ、レーン１０〜１２が７．５μｌに相当する。レーン１３〜１５は、会社Ｘから得たポリメラーゼを用いて調製された凍結乾燥したすぐ使用できる増幅混合物を用いて得られたＰＣＲ産物に相当する；その反応体積は２５μｌである。
【００９５】
凍結乾燥前の反応混合物に安定剤を加えなかった。
【００９６】
増幅産物が凍結乾燥プロセスの直後に分析された図１中に示されるように、レーン７〜１２から、会社Ｙから得たホットスタートＤＮＡポリメラーゼを含有する混合物は、期待された２つの増幅産物の増幅が可能でなく、一方、両方のポリメラーゼ、会社Ｘから得られたホットスタート及び非ホットスタート（それぞれ１〜６及び１３〜１５）は、凍結乾燥後のそれらのポリメラーゼ活性を維持することが分かる。
【００９７】
会社Ｘは、その自身の反応緩衝剤内に、溶液密度を物理的に増大する物質を含んでおり、それらは、専ら総称的に安定剤として定義される。
【００９８】
会社Ｘから得たポリメラーゼを用いて調製された、ＰＣＲ用の凍結乾燥したすぐ使用できる混合物の熱安定性を評価する目的で、同一の混合物を室温及び３７℃にて３週間保存した。
【００９９】
写真２は、会社ＸのホットスタートＤＮＡポリメラーゼを含有する増幅混合物を用いて得られた増幅産物を示す；具体的に、ＰＣＲに用いる混合物の凍結乾燥前の最終体積は、レーン１〜４が２５μｌ、レーン５〜８が９．１μｌに相当する。レーン９〜１２は、会社ＸからのＤＮＡポリメラーゼを含有する凍結乾燥したすぐ使用できる反応混合物を用いて得られた増幅産物を示す；凍結乾燥前の反応体積は２５μｌに相当する。前述の凍結乾燥した反応混合物を、凍結乾燥後に３週間、室温（レーン１〜３、５〜７、９〜１１）又は３７℃（レーン４、８及び１２）にて保存した。
【０１００】
その写真に示されるように、室温で３週間した後、ホットスタートＤＮＡポリメラーゼを含有する混合物を用いて得た増幅産物（レーン１〜３及び５〜７）は、単純なＤＮＡポリメラーゼを用いて得たもの（レーン９〜１１）と比べてより強いものであることを証明する。更に、ホットスタートＤＮＡポリメラーゼは、他のポリメラーゼと対照的に、プライマー二量体の形成を生じない。
【０１０１】
結論として、３７℃での３週間の保存後では、ホットスタートＤＮＡポリメラーゼが、その酵素活性を維持し（レーン４及び８）、一方、単純なＤＮＡポリメラーゼは維持しなかった（レーン１２）。
【０１０２】
従って、以下のことを完全に確信している：１）安定剤の使用は、凍結乾燥プロセス中、ＤＮＡポリメラーゼの酵素活性を維持するのに重要であり、２）ホットスタートＤＮＡポリメラーゼは、通常のＤＮＡポリメラーゼと比べて、増幅効率に適しているものの、ＤＮＡポリメラーゼの両方のカテゴリーが類似の挙動を示すため、即ちそれらは凍結乾燥のために安定剤を要するため、凍結乾燥プロセスには適していない。
【０１０３】
最後に、この実験では、異なる２つ体積を凍結乾燥工程前に試験したが（２５及び９．１μｌ）、結果において変化は見られなかった。
【０１０４】
例２．異なるホットスタートＤＮＡポリメラーゼ間の比較
下記の例では、異なる４社（Ｗ、Ｘ、Ｒ、Ｙ）から得たホットスタートＤＮＡポリメラーゼを含有する凍結乾燥したすぐ使用できる混合物を調製した。それぞれは、合計１９の組み合わせで、４つの反応緩衝剤と組み合わされたり、ＮＰ−４０、Ｔｗｅｅｎ−２０、スクロース等の追加の安定剤と組み合わされたりしたものである。
【０１０５】
図３及び４において、レーン１〜４、５〜８、９〜１２及び１３〜１９は、会社Ｗ、Ｘ、Ｒ又はＹから得た反応緩衝剤をそれぞれ含有する凍結乾燥したすぐ使用できる混合物を用いたＰＣＲによって増幅された産物を示す。同一の図面において、レーン１、５、９及び１３は、会社Ｗから得たホットスタートＤＮＡポリメラーゼを含有する凍結乾燥したすぐ使用できる増幅混合物を用いて得られた増幅産物に相当する；レーン２、６、１０、１４、１７、１８及び１９は、会社Ｙから得たホットスタートＤＮＡポリメラーゼを含有する凍結乾燥したすぐ使用できる増幅混合物を用いて得られた増幅産物に相当する；レーン３、７、１１及び１５は、会社Ｘから得たホットスタートＤＮＡポリメラーゼを含有する凍結乾燥したすぐ使用できる増幅混合物を用いて得られた増幅産物に相当する；レーン４、８、１２及び１６は、会社Ｒから得たホットスタートＤＮＡポリメラーゼを含有する凍結乾燥したすぐ使用できる増幅混合物を用いて得られた増幅産物に相当する。図３及び４において、レーン１７、１８及び１９は、それぞれが０．２５％のＮＰ−４０及び０．２５％のＴｗｅｅｎ−２０、１００ｍＭのスクロース及び０．２５％のＮＰ−４０、０．２５％のＴｗｅｅｎ−２０及び１００ｍＭのスクロースをも含有する凍結乾燥したすぐ使用できる混合物を用いて得られた増幅産物に相当する。
【０１０６】
図３中に示されるＰＣＲ産物は、凍結乾燥手順の完了直後に、凍結乾燥したすぐ使用できる混合物を用いて増幅された。対照的に、図４は、同一の混合物を室温で６ヶ月間保存したものの結果を示す。
【０１０７】
図３中に明確に示されるように、会社Ｘの反応緩衝剤を含有する混合物は、凍結乾燥した直後に監視したところ、４つのポリメラーゼのうち３つにおいて酵素活性を維持し、一方で、４番目のものについては、活性が部分的に維持されただけであった。
【０１０８】
会社Ｗ又はＲの反応緩衝剤を用いて調製された混合物は、４つのポリメラーゼのうち１つの活性を維持した。最後に、会社Ｙから得た反応緩衝剤の存在下においては、期待された２つの断片に相当する増幅が見られなかった；残留酵素活性は、１００ｍＭのスクロースの存在下においてのみ見られた。加えて、凍結乾燥したすぐ使用できる増幅混合物を、ＰＣＲによる増幅を行う前に、室温にて６週間保存した。図４中に示されるように、会社Ｘの反応緩衝剤を用いて調製された凍結乾燥した混合物のみが、使用した４つのホットスタートＤＮＡポリメラーゼのうち３つの酵素活性を維持することができた。
【０１０９】
これら結果は、ポリメラーゼの酵素活性を維持するため、凍結乾燥プロセス中のＰＣＲ反応混合物中に安定剤を含むことの重要性を強調する。
【０１１０】
例３．２５０ｍＭのスクロースを含有する、ＰＣＲ用の凍結乾燥したすぐ使用できる組成物の安定性
凍結乾燥したＰＣＲ反応混合物についての安定性の改善を評価する目的で、貯蔵緩衝剤中、反応緩衝剤中、又は両方の緩衝剤中における２５０ｍＭのスクロースの存在の効果を最初に評価した。２つの異なる会社から得た２つの異なるホットスタートＤＮＡポリメラーゼを評価した。
【０１１１】
図５及び６において、レーン１〜７及びレーン８〜２１は、それぞれが会社Ｘ又はＲから得たホットスタートＤＮＡポリメラーゼを含有する凍結乾燥したすぐ使用できる反応混合物を用いて得られた増幅産物を示す。図５及び６において、レーン１、８及び９は、会社Ｘの反応緩衝剤を用いて調製された凍結乾燥したすぐ使用できる反応混合物を用いて得られた増幅産物に相当する；レーン２及び３並びにレーン１４〜１７は、会社Ｗの反応緩衝剤を用いて調製された凍結乾燥したすぐ使用できる反応混合物を用いて得られた増幅産物に相当する；レーン４及び５並びにレーン１０〜１３は、会社Ｒの反応緩衝剤を用いて調製された凍結乾燥したすぐ使用できる反応混合物を用いて得られた増幅産物に相当する；レーン６及び７並びにレーン１８〜２１は、会社Ｙの反応緩衝剤を用いて調製された凍結乾燥したすぐ使用できる反応混合物を用いて得られた増幅産物に相当する。図５及び６において、レーン３、５、７、１１、１５及び１９は、反応緩衝剤に２５０ｍＭのスクロースを加えることによって調製された凍結乾燥したすぐ使用できる反応混合物を用いて得られた増幅産物を示す；レーン９、１２、１６及び２０は、貯蔵緩衝剤に２５０ｍＭのスクロースを加えることによって調製された凍結乾燥したすぐ使用できる反応混合物を用いて得られた増幅産物を示す；レーン１３、１７及び２１は、反応緩衝剤及び貯蔵緩衝剤に２５０ｍＭのスクロースを加えることによって調製された凍結乾燥したすぐ使用できる反応混合物を用いて得られた増幅産物を示す。
【０１１２】
図５中に示される増幅産物は、凍結乾燥プロセスの完了直後に利用された凍結乾燥したすぐ使用できる反応混合物を用いて増幅され、一方、図６の結果は、図５のものと同一であるが、凍結乾燥したすぐ使用できる混合物を室温にて８週間保存した後のものである。
【０１１３】
図５中で強調されるように、貯蔵緩衝剤中ではなく反応緩衝剤中における２５０ｍＭのスクロースの存在は、凍結乾燥プロセス中及びその後に酵素活性を維持するのに重要である。室温での８週間の保存後、酵素活性の維持は、半分の場合（１０のうち５）において可能であっただけである（図６）。
【０１１４】
その結果として、スクロースは、酵素活性に対して保護作用を有するものの、長期間の保存に効果的ではないと結論を出すことができる。
【０１１５】
例４．異なる安定化物質を用いて調製された凍結乾燥した組成物の安定性
異なる安定剤を含有する凍結乾燥したすぐ使用できる増幅混合物の熱安定性を比較する目的で、二糖、多糖、炭水化物等の要素を利用した。それらは、導入部で記載したように調製された増幅混合物に加えられた。
【０１１６】
図７及び８において、レーン１〜５及びレーン６〜１０は、それぞれが会社Ｗ又はＲから得たホットスタートＤＮＡポリメラーゼを含有する凍結乾燥したすぐ使用できる増幅混合物を用いて得られた増幅産物を示す。図７及び８において、レーン１及び６、２及び７、３及び８、４及び９、並びに５及び１０は、それぞれが、安定剤を含有しない、２００ｍＭのトレハロースを含有する、２５０ｍＭのスクロースを含有する、２００ｍＭのマルトースを含有する、及び０．０２５％のアガロースを含有する凍結乾燥したすぐ使用できる増幅混合物に相当する。
【０１１７】
図７中に示される増幅産物は、凍結乾燥プロセスの完了直後に、凍結乾燥したすぐ使用できる増幅混合物を用いて得られたものであり、一方、図８中に示される結果は、図７のものと同一であるが、凍結乾燥したすぐ使用できる反応混合物を３７℃で１週間保存した後のものである。
【０１１８】
凍結乾燥したすぐ使用できる反応混合物中における２５０ｍＭのスクロース、２００ｍＭのトレハロース、２００ｍＭのマルトース及び０．０２５％のアガロースの存在は、異なる２つの会社から得た異なる２つのホットスタートＤＮＡポリメラーゼを用いることによって最初に評価された。図７中に強調されるように、凍結乾燥したすぐ使用できる反応混合物中におけるトレハロース、スクロース及びマルトース（それぞれレーン２及び７、３及び８並びに４及び９）の存在は、両方の酵素の酵素活性を維持できるようにするが、その作用は、会社Ｒから得た酵素に対しては効果が低いようである（レーン７、８及び９）；これは、スクロースについて特に明らかである（レーン８）。アガロースについては、増幅バンドが見られなかった（図７、レーン５及び１０）。加えて、凍結乾燥したすぐ使用できる混合物を、ＰＣＲによって処理する前に、３７℃で１週間保存した。２００ｍＭのトレハロースを含有する凍結乾燥した混合物は、両方のホットスタートＤＮＡポリメラーゼの酵素活性を完全なまま維持した（図８、レーン２及び７）一方で、２５０ｍＭのスクロース及び０．０２５％のアガロースを用いたものは維持しなかった（図８、それぞれレーン３及び８、５及び１０）。
【０１１９】
２００ｍＭでのマルトースは、１つのポリメラーゼの活性を維持したが（図８、レーン９）、他のものの活性については部分的に維持したのみであった。
【０１２０】
次に、凍結乾燥する前に反応混合物に加えられた、２５０ｍＭのトレハロース、６．６％のデキストロース、２００ｍＭのセロビオース（ＦｌｕｋａＡｎａｌｙｔｉｃａｌ２２１５０  Ｄ−(＋)−セロビオース）及び６．６％のアミロペクチンの作用を上記の２つのポリメラーゼに対して評価した。
【０１２１】
図９及び１０において、レーン１〜５及びレーン６〜１０は、それぞれが会社Ｗ又はＲから得たホットスタートＤＮＡポリメラーゼを用いて調製された凍結乾燥したすぐ使用できる反応混合物を用いて得られた増幅産物を示す。図９及び１０において、レーン１及び６、２及び７、３及び８、４及び９、５及び１０は、それぞれが、安定剤を含有しない、２５０ｍＭのトレハロースを含有する、６．６％のデキストロースを含有する、２００ｍＭのセロビオースを含有する又は６．６％のアミロペクチンを含有する凍結乾燥したすぐ使用できる反応混合物に相当する。図９中の結果は、凍結乾燥プロセスを完了した直後に処理された凍結乾燥した混合物に相当し、一方、図１０中に示される結果は、先のものと同時に調製された同一の特徴を有する反応混合物に相当するものであるが、３７℃で１週間保存されたものである。
【０１２２】
図９中に示されるように、凍結乾燥した反応混合物中にトレハロース及びセロビオースを組み入れることは、両方のホットスタートＤＮＡポリメラーゼの酵素活性を維持した（それぞれレーン２及び７、４及び９）一方で、デキストロース及びアミロペクチンは、２つの酵素のうち１つのみを保護した（それぞれレーン３及び８、５及び１０）。加えて、先のものと同時に調製された同一の特徴を有する反応混合物を、ＰＣＲによって処理する前に、３７℃にて１週間保存した。２５０ｍＭのトレハロース及び２００ｍＭのセロビオースを安定剤として含有する凍結乾燥した反応混合物は、両方のポリメラーゼの酵素活性を保護した（図１０、それぞれレーン２及び７、４及び９）一方で、６．６％のデキストロース及び６．６％のアミロペクチンは、それを維持しなかった（図１０、それぞれレーン３及び８、５及び１０）。
【０１２３】
加えて、０．５％のアルブミン、２％のアルブミン及び３％のラクトースについても評価したが、トレハロース及びセロビオースを用いて得られた結果に匹敵する結果は得られなかった。
【０１２４】
従って、セロビオース及びトレハロースのみがＤＮＡポリメラーゼに対して保護を提供すると明確に実証された。
【０１２５】
例５．凍結乾燥した組成物を安定化させるためのセロビオースの最適濃度の評価
ＤＮＡポリメラーゼの酵素活性を維持する際に最も効果的なセロビオース濃度を確認する目的で、導入部において記載したように、漸増濃度のセロビオースを含有する凍結乾燥したすぐ使用できる反応混合物を調製した。
【０１２６】
分析濃度は、０〜７００ｍＭのセロビオースに及ぶ。
【０１２７】
図１１及び１２において、レーン１〜１３は、それぞれが０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００及び７００ｍＭの濃度で加えられたセロビオースを含有する凍結乾燥した反応混合物を用いて得られた増幅産物を示す。
【０１２８】
図１１の増幅産物は、凍結乾燥プロセスの完了直後に、凍結乾燥した反応混合物を用いることによって得られたものであり、一方、図１２の結果は、先のものと同時に調製された同一の特徴を有する反応混合物に相当するものであるが、３７℃で２週間保存されたものである。
【０１２９】
図１１及び１２中に示されるように、ポリメラーゼの酵素活性を最高に維持するセロビオース濃度は、３７℃で１週間の保存の後であっても（図１２）、１５０〜２５０ｍＭの範囲内にある。
【０１３０】
従って、セロビオースは、１５０〜２５０ｍＭの濃度範囲で、凍結乾燥したすぐ使用できる反応混合物に対して最高の安定性を提供することが実証された。
【０１３１】
例６．トレハロース又はセロビオースを安定剤として含有する凍結乾燥したすぐ使用できる組成物の時間安定性の評価
トレハロース又はセロビオースを含有する凍結乾燥したすぐ使用できる混合物の時間安定性を確認する目的で、導入部で記載されるようにして、凍結乾燥したすぐ使用できる反応混合物を調製した。しかしながら、２００ｍＭのセロビオース又は２００ｍＭのトレハロースが加えられている。該混合物は、ＰＣＲによる増幅を受ける前に凍結乾燥された。
【０１３２】
図１３において、レーン１〜５、６〜１０、１１及び１２〜１６は、それぞれが１００ｍＭのセロビオースを含有する、２００ｍＭのセロビオースを含有する、安定剤を含有しない、２００ｍＭのトレハロースを含有する混合物に相当する。
【０１３３】
図１３中に示される増幅産物は、凍結乾燥プロセスの完了直後に、凍結乾燥した反応混合物を用いて得られたものであり、一方、図１４の結果は、先のものと同時に調製された同一の特徴を有する反応混合物に相当するものであるが、３７℃で２週間保存されたものである。
【０１３４】
図１４において、レーン１〜５、６〜１０、１１〜１５は、それぞれが１００ｍＭのセロビオース、２００ｍＭのセロビオース、又は２００ｍＭのトレハロースを含有する凍結乾燥した混合物に相当する。図１５中に示される増幅産物は、それぞれが５５℃にて２４時間、４８時間、７２時間、９６時間及び１週間保存された凍結乾燥した反応混合物を用いて得られた（それぞれレーン１、６及び１１；２、７及び１２；３、８及び１３；４、９及び１４；５、１０及び１５）。
【０１３５】
図１５において、レーン１〜５は、５５℃で２４時間（レーン１及び６）、４８時間（レーン２及び７）、７２時間（レーン３及び８）、９６時間又は１週間（レーン５及び１０）の保存後の、セロビオース又はトレハロースを含有する凍結乾燥したすぐ使用できる増幅混合物のアガロースゲル電気泳動パターンを示す。凍結乾燥したすぐ使用できる混合物は、会社Ｒから得た、反応緩衝剤及びホットスタートＤＮＡポリメラーゼを含有する（レーン１〜１０）。Ｍ：分子量マーカー「ベンチトップＰＣＲマーカー」，Ｐｒｏｍｅｇａ。
【０１３６】
ＰＣＲ産物：２６８ｂｐ：ヒトのベータ−グロビン遺伝子の断片；２４０ｂｐ：マラリア原虫ｓｐｐ１８ｓＲＮＡ遺伝子の断片。
【０１３７】
全ての図面において、「Ｍ」は、Ｐｒｏｍｅｇａ社による分子量マーカー「ベンチトップＰＣＲマーカー」のレーンに対応しており；前述のマーカーの断片は、５０ｂｐ〜１０００ｂｐの幅がある。
【０１３８】
図１３中に示されるように、この例の凍結乾燥したすぐ使用できる反応混合物中に存在する安定剤は、確実にポリメラーゼ活性を維持する。また、凍結乾燥した反応混合物を、ＰＣＲで処理する前に、３７℃で１週間保存した。
【０１３９】
このストレスにさらされた後でさえも、２００ｍＭのセロビオースを含有する凍結乾燥したすぐ使用できる反応混合物（図１４、レーン６〜１０）中に存在するポリメラーゼは、その酵素活性を完全なまま維持し、２００ｍＭのトレハロースが加えられたものも維持した（図１４、レーン１１〜１５）。３７℃での２週間の保存後の、２００ｍＭのセロビオース（図１４、レーン６〜１０）又は２００ｍＭのトレハロース（図１４、レーン１１〜１５）の場合では、酵素がそれらの活性を維持した。
【０１４０】
最後に、先のものと同時に調製された同一の特徴を有する反応混合物を５５℃で２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、及び１週間保存し（図１５）、次いで、ＰＣＲによる増幅を受けた。
【０１４１】
安定剤としてトレハロースの使用（図１５、レーン６〜１０）は、５５℃のストレス後であっても、ホットスタートＤＮＡポリメラーゼの酵素活性の保護を可能にする。５５℃での長期間の処理（４８時間、７２時間及び９６時間）は、酵素活性が部分的に損なわれた（図１５、それぞれレーン２、３及び４）。
【０１４２】
しかしながら、２００ｍＭのセロビオースを含有する凍結乾燥したすぐ使用できる混合物は、２００ｍＭのトレハロースを含有する混合物と安定性が同じである。従って、我々は、安定剤として、セロビオースが、トレハロースと同一の特性を有するものの、それと比べると、セルロース、植物起源の長いグルコース（糖）鎖からなる分子からの酵素加水分解システムによる産生を含む上述した利点があると主張する。該植物起源は、トレハロース産生の場合のように細菌培養物がその合成に使用される場合に常にあり得そうな細菌汚染から生じ得る核酸汚染物質の欠如を保証する。
【０１４３】
例７．寄生虫学の分野における診断キット用のすぐ使用できる組成物を形成するための、セロビオース安定剤の使用
寄生虫学の分野における診断キットの形成に適したすぐ使用できる凍結乾燥した混合物の調製において、ホットスタートＤＮＡポリメラーゼ酵素の安定剤として、セロビオースを用いた。
【０１４４】
具体的には、調査した寄生虫それぞれについて、以下のものを含有する最終反応混合物を前もって調製した：
１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭのＫＣｌ、０．２５μＭの順方向プライマー、０．２５μＭの逆方向プライマー、０．２ｍＭのｄＮＴＰｓ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、及び２ユニットのＴａｑポリメラーゼ。
【０１４５】
マラリア原虫（ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、ｍａｌａｒｉａｅ、ｖｉｖａｘ及びｏｖａｌｅ種のそれぞれについて１対）のトリガー又はプライマーは、１８ｓＲＮＡの保存領域でデザインされた。Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａのプライマーは、１８ｓＲＮＡの保存領域でデザインされた。Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａのプライマーは、高反復領域ＨＲＥでデザインされた。
【０１４６】
調製された全ての混合物は、ヒトのベータ−グロビン遺伝子配列でデザインされたプライマー対に対応する内部コントロールを含有する。
【０１４７】
様々な構造の各プライマーは、０．２５μＭの濃度で供給された。
【０１４８】
例８．ＤＮＡ増幅及び直接配列決定の性能の比較
増幅した、野生型（ｗｔ）ＤＮＡ対照サンプル（Ｃ１）、未知のＤＮＡサンプル（Ｃ２）、変異ＤＮＡ対照サンプル（Ｄ３）及び非鋳型コントロール（Ｎ）のアガロースゲル電気泳動パターン。
【０１４９】
ＤＮＡ増幅は、凍結乾燥したすぐ使用できる増幅混合物を用いて得られたＰＣＲ産物と、参照方法によって得られたものとを比較するために行われた。
【０１５０】
凍結乾燥したすぐ使用できる増幅組成物には、以下に示す成分が加えられた：
プライマー順方向  ０．４μＭ
プライマー逆方向  ０．４μＭ
ＤＮＡ  ３０ｎｇ
Ｈ２Ｏ  ２５μｌまで
【０１５１】
参照方法は、以下の組成を有する：
ｄＮＴＰｓ  それぞれ０．２ｍＭ
反応緩衝剤  １×
ＭｇＣｌ２  １．５ｍＭ
プライマー順方向  ０．４μＭ
プライマー逆方向  ０．４μＭ
Ｔａｑポリメラーゼ  ０．００３Ｕ／μｌ
ＤＮＡ  ３０ｎｇ
Ｈ２Ｏ  ２５μｌまで
【０１５２】
ＰＣＲ収率は、両方の系で同程度であった。増幅した産物は、２％のアガロースゲル上での電気泳動によって分析された（図１６ａ）。
【０１５３】
配列決定分析の前に、各ＰＣＲ産物を、マルチスクリーンＨＴＳ真空マニホールドシステム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて精製した。その精製手順は、ユニバーサル・マスター・ミックスを用いて得たＰＣＲ産物を参照方法によって得たものと比較するため、短時間で行われた。凍結乾燥形態は、高品質のＰＣＲ産物を保障し、精製工程を妨害し遅らせる場合がある通常の添加剤の存在を除去し、その後の配列決定分析に十分な量の増幅産物を生じる（図１６ｂ）。
【０１５４】
その結果は、凍結乾燥したすぐ使用できる増幅混合物（ユニバーサル・マスター・ミックス）が、増幅反応及びその後の配列決定分析に最適であることを示す（図１７）。
【０１５５】
例９．蛍光染料の存在下におけるリアルタイムＰＣＲ、融解曲線分析、及び高分解能融解分析（ＨＲＭ）性能の比較
凍結乾燥したすぐ使用できる増幅混合物（ユニバーサル・マスター・ミックス）の性能は、ロータージーン６０００（コルベットライフサイエンス）の使用によって評価された。この機器は、同一の分析セッションで３つの異なる適用を可能にした：蛍光二重鎖特異的染料（ＥｖａＧｒｅｅｎ、Ｂｉｏｔｉｕｍ）の存在下におけるリアルタイムＰＣＲ、融解曲線分析、及び高分解能融解分析。それぞれの適用について、凍結乾燥したすぐ使用できる増幅混合物（ユニバーサル・マスター・ミックス）を参照方法と比較した。
【０１５６】
３つの適用それぞれについての結果は、同様な増幅効率が示された、野生型ＤＮＡ対照サンプル（Ｃ１）、未知のＤＮＡサンプル（Ｃ２）、Ａ＞Ｇ置換を保有する変異ＤＮＡサンプル（Ｄ３）及び非鋳型コントロール（Ｎ）について示される。
【０１５７】
増幅分析及びリアルタイムＰＣＲテイクオフ値の結果は、凍結乾燥したすぐ使用できる増幅混合物（ユニバーサル・マスター・ミックス）がＰＣＲ及びリアルタイムＰＣＲに最適であることを示す。
【０１５８】
融解分析は、凍結乾燥したすぐ使用できる増幅混合物（ユニバーサル・マスター・ミックス）及び参照方法を用いた場合の両方で、明確な融解温度（Ｔ融解）の確認を可能にした。具体的に、凍結乾燥したすぐ使用できる増幅混合物（ユニバーサル・マスター・ミックス）を用いて得たサンプルのＴ融解は、８９℃で確認され、一方、参照方法を用いて得たものは、８７℃で確認された。更に、凍結乾燥したすぐ使用できる増幅混合物（ユニバーサル・マスター・ミックス）を用いて得られた融解プロファイルは、異なるサンプル間で完全な重なりが認められた；参照方法を用いて得た融解プロファイルでは、この状態が見られなかった。
【０１５９】
融解曲線分析及び高分解能融解分析の結果は、凍結乾燥したすぐ使用できる増幅混合物（ユニバーサル・マスター・ミックス）が両方の用途に最適であることを示す。
【０１６０】
例１０．定量的蛍光（ＱＦ）ＰＣＲの性能の比較
凍結乾燥したすぐ使用できる増幅混合物（ユニバーサル・マスター・ミックス）を用いて得られた、具体的には最も一般的な常染色体及び性染色体の異常性の出生前診断についての、ＱＦＰＣＲにおける、性能及び結果を、参照方法を用いて得られたものと比較して評価した。ＱＦＰＣＲ分析は、染色体に特異的なＤＮＡマイクロサテライトの増幅、検出及び分析を含む。蛍光標識されたマーカーに特異的なプライマーは、個々のマーカーのＰＣＲ増幅に使用され、各マーカーのコピー数は、染色体のコピー数を示す。得られたＰＣＲ産物は、自動化された遺伝子分析器を用いて分析及び定量化できる。
【０１６１】
ＱＦＰＣＲプロトコル：
参照方法の増幅ミックス  ７．５μｌ
プライマーセット  ７．５μｌ
ＤＮＡ  ５０ｎｇ
Ｈ２Ｏ  ２５μｌまで
【０１６２】
組成物
プライマーセット  ７．５μｌ
ＤＮＡ  ５０ｎｇ
Ｈ２Ｏ  ２５μｌまで
【０１６３】
ＱＦＰＣＲ産物は、ソフトウェアジーンマーカーを用いて分析された。増幅産物それぞれのピーク高さ及びピーク面積比の分析は、凍結乾燥したすぐ使用できる増幅混合物（ユニバーサル・マスター・ミックス）が定量的蛍光用途に最適であることを示す。
【図１】
2012527226.tif 000002
【図２】
2012527226.tif 000003
【図３】
2012527226.tif 000004
【図４】
2012527226.tif 000005
【図５】
2012527226.tif 000006
【図６】
2012527226.tif 000007
【図７】
2012527226.tif 000008
【図８】
2012527226.tif 000009
【図９】
2012527226.tif 000010
【図１０】
2012527226.tif 000011
【図１１】
2012527226.tif 000012
【図１２】
2012527226.tif 000013
【図１３】
2012527226.tif 000014
【図１４】
2012527226.tif 000015
【図１５】
2012527226.tif 000016
【図１６】
2012527226.tif 000017
【図１７】
2012527226.tif 000018
【図１８ａ】
2012527226.tif 000019
【図１８ｂ】
2012527226.tif 000020
【図１９】
2012527226.tif 000021
【図２０】
2012527226.tif 000022
【図２１】
2012527226.tif 000023
【手続補正書】
【提出日】平成23年11月22日(2011.11.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乾固又は凍結乾燥した組成物であって、
濃度が０．０１〜２５０ユニットにある、凍結乾燥及び５５℃以下の温度での貯蔵に耐えるために安定化された核酸重合酵素と、
濃度が５０ｍＭ（１７，１１５ｇ／Ｌ）〜５００ｍＭ（１７１，１５ｇ／Ｌ）のセロビオースと、
緩衝剤と
を含むことを特徴とする組成物。
【請求項２】
前記核酸重合酵素が、Ｔａｑポリメラーゼ、ホットスタートポリメラーゼ又はそれらの活性断片からなる群から選択されるＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
２５０ｍＭのセロビオース及び２ユニットの核酸重合酵素を含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
濃度が０．０１〜２５０ユニットにある、凍結乾燥及び５５℃以下の温度での貯蔵に耐えるために安定化された核酸重合酵素と、
濃度が５０ｍＭ〜５００ｍＭのセロビオースと、
緩衝剤、ｄＮＴＰｓ、ＫＣｌ及びＭｇＣl２と
を含むことを特徴とする組成物。
【請求項５】
前記緩衝剤が、トリスＨＣｌであることを特徴とする請求項１又は４に記載の組成物。
【請求項６】
更に、下記成分（ｉ−ｉｉｉ）：
ｉ．界面活性剤及び／又は非還元糖からなる群から選択される安定剤；
ｉｉ．β−メルカプトエタノール、及びＤＴＴからなる群から選択される還元剤；並びに
ｉｉｉ．少なくとも１つのプローブであって、任意に標識化されたもの
の１種以上を含むことを特徴とする請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
核酸の増幅のための、請求項１又は４に記載の組成物の使用。
【請求項８】
前記増幅のプロセスが、自動で行われることを特徴とする請求項７に記載の使用。
【請求項９】
ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、融解曲線分析、高分解能融解分析、配列決定、定量的蛍光ＰＣＲ、多重ＰＣＲ、全ゲノム増幅又は等温増幅を行うための、請求項７又は８に記載の使用。
【請求項１０】
ａ．請求項１に記載の組成物を水中又は緩衝剤中に再構成する工程と；
ｂ．標的ＤＮＡに対して特異的なプライマーを加える工程と；
ｃ．核酸鋳型を加える工程と；
ｄ．ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰｓ、任意に標識化された少なくとも１つのプローブ、還元剤、及び更なる安定剤からなる群から選択される試薬の１種以上を加える工程と
を含むことを特徴とする核酸の増幅方法。
【請求項１１】
ａ．請求項４に記載の組成物を水中又は緩衝剤中に再構成する工程と；
ｂ．標的ＤＮＡに対して特異的なプライマーを加える工程と；
ｃ．核酸鋳型を加える工程と；
ｄ．任意に標識化された少なくとも１つのプローブ、還元剤、及び更なる安定剤を任意に加える工程と
を含むことを特徴とする核酸の増幅方法。
【請求項１２】
ａ．請求項１又は４に記載の乾固又は凍結乾燥した組成物と；
ｂ．前記組成物を再構成するための溶媒と
を含むことを特徴とする、すぐ使用できる製品。
【請求項１３】
請求項１又は４に記載の組成物を備え、任意には再構成のための指示及びポリメラーゼ連鎖反応における前記酵素の使用を備えることを特徴とするＤＮＡサンプルのＰＣＲ増幅用キット。
【請求項１４】
凍結乾燥中及び５５℃以下の温度での長期間の貯蔵中に核酸ポリメラーゼを保存するためのセロビオースの使用。
【請求項１５】
前記核酸ポリメラーゼがＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする請求項１４に記載の使用。
【国際調査報告】
2012527226.tif 000024
2012527226.tif 000025