(57)【要約】  本発明は、グルテン不耐症に起因する状態の予防又は治療に使用するための組成物であって、少なくとも一部が精製されたカリカイン（又はその生物活性のある断片、類似体若しくは変異体）を単独で、又はブロメライン及び/又は本明細書中に記載の腸管抽出物を含む他の適当な酵素と組合せて含む、前記組成物を提供する。また本発明は、そのような組成物をグルテン不耐症に起因する状態の予防又は治療に使用する方法も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルテン不耐症に関連した状態の予防又は治療のための組成物であって、少なくとも一部が精製されたカリカイン又はその生物活性のある断片、類似体若しくは変異体を含む、前記組成物。
【請求項２】
前記組成物の総重量の約5% w/w〜約95% w/wのカリカイン又はその生物活性のある断片、類似体若しくは変異体を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項３】
前記カリカインが、カリカ・パパイヤ由来のものである、請求項1又は2記載の組成物。
【請求項４】
前記カリカインが、図1若しくは2に示されるアミノ酸配列、又はその生物活性のある断片、類似体若しくは変異体を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の組成物。
【請求項５】
腸管抽出物を含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の組成物。
【請求項６】
ブロメライン又はその生物活性のある断片、類似体若しくは変異体を含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の組成物。
【請求項７】
腸溶コーティングされた錠剤又はカプセルとして製剤された、請求項1〜6のいずれか一項記載の組成物。
【請求項８】
グルテン不耐症に関連した状態の予防又は治療に使用するための組成物であって、組換えカリカイン又はその生物活性のある断片、類似体若しくは変異体をコードする核酸分子を含む、前記組成物。
【請求項９】
前記核酸分子が、図3若しくは4に示される核酸配列、又はその機能的等価物を含む、請求項8記載の組成物。
【請求項１０】
前記核酸分子が、図1若しくは2に示されるアミノ酸配列、又はその生物活性のある断片、類似体若しくは変異体をコードする、請求項8記載の組成物。
【請求項１１】
組換えブロメライン又はその生物活性のある断片、類似体若しくは変異体をコードする核酸分子を含む、請求項8〜10のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１２】
グルテン不耐症に関連した状態の予防又は治療に使用するための組成物であって、組換えカリカイン又はその生物活性のある断片、類似体若しくは変異体を発現することができる宿主細胞を含む、前記組成物。
【請求項１３】
組換えブロメライン又はその生物活性のある断片、類似体若しくは変異体を発現することができる宿主細胞を含む、請求項12記載の組成物。
【請求項１４】
グルテン不耐症に関連した状態の予防又は治療のための方法であって、それを必要とする対象に、少なくとも一部が精製されたカリカイン又はその生物活性のある断片、類似体若しくは変異体を含む組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項１５】
前記カリカインが、カリカ・パパイヤ由来のものである、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
前記カリカインが、図1若しくは2に示されるアミノ酸配列、又はその生物活性のある断片、類似体若しくは変異体を含む、請求項14又は15記載の方法。
【請求項１７】
それを必要とする対象に、腸管抽出物を含む組成物を投与することを含む、請求項14〜16のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
それを必要とする対象に、ブロメライン又はその生物活性のある断片、類似体若しくは変異体を含む組成物を投与することを含む、請求項14〜17のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
前記組成物が、腸溶コーティングされた錠剤又はカプセルを含む、請求項14〜18のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
前記組成物が、少なくとも15mgのカリカインを含む、請求項14〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
グルテン不耐症に関連した状態の予防又は治療のための方法であって、それを必要とする対象に、請求項5又は6記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項２２】
グルテン不耐症に関連した状態の予防又は治療のための方法であって、それを必要とする対象に、該対象において、組換えカリカイン又はその生物活性のある断片、類似体若しくは変異体を発現させることができる核酸分子を投与することを含む、前記方法。
【請求項２３】
前記核酸分子が、図1若しくは2に示されるアミノ酸配列、又はその生物活性のある断片、類似体若しくは変異体をコードする、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
前記核酸分子が、図3若しくは4に示される核酸配列、又はその機能的等価物を含む、請求項22記載の方法。
【請求項２５】
それを必要とする対象に、ブロメライン又はその生物活性のある断片、類似体若しくは変異体をコードする核酸分子を投与することを含む、請求項22〜24のいずれか一項記載の方法。
【請求項２６】
グルテン含有材料から得られる食品の製造方法であって、食品又はグルテン含有材料を、カリカイン又はその生物活性のある断片、類似体若しくは変異体で処理して、食品中に存在する毒性グルテン由来オリゴペプチドの量を減少させるようにすることを含む、前記製造方法。
【請求項２７】
食品又はグルテン含有材料を、ブロメライン又はその生物活性のある断片、類似体若しくは変異体で処理することを更に含む、請求項26記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は概して、グルテン不耐症に関連した状態の予防又は治療のための組成物、及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
グルテン不耐症は主に、小麦が主要な食料源である地域（例えば、欧州、北米及びオーストラリア）で見られる。これらの地域において、該疾患の発生率は、人口の100人あたり約1人である（DA Van Heelらの文献、Gut 2006; 55:1037-1046）。この状態の症状には、腹痛、腹部膨満及び下痢がある。重度でかつ長期に渡る場合、例えば、セリアック病などにおいては、腸管粘膜に炎症性の変化が起こり、その結果、栄養分の吸収障害、疲労、慢性的な下痢、体重減少、腹部膨満、貧血、出血傾向の増大、並びに消化器系のリンパ腫及び癌腫などの悪性腫瘍の危険性の増大を招く。
【０００３】
グルテン不耐症（又はセリアック病、セリアックスプルー）の病理発生は、遺伝的及び環境的なの両方の要因を有するようである。遺伝的素因が主な要因である（一等親血縁者の約10%が影響を受ける。）一方で、一卵性双生児が約75%だけの一致率を有するという事実は、環境も該疾患の発病に役割を果たしていることを示唆している。
【０００４】
グルテン不耐症の患者は特徴として、毒性グルテンペプチド中に存在する特定の配列を認識する、腸管粘膜に存在するT細胞を有している。これらのT細胞は、毒性に関与する特定のアミノ酸配列を含むペプチドを認識することによって、該疾患の免疫病原性において重要な役割を果たすことが、研究結果より示されている。例えば、セリアック病患者の腸由来のグリアジン特異的HLA-DQ2-拘束性T細胞のクローンの増殖は、インビトロにおいて、水溶性の、部分的に消化された形態のグリアジンが、抗原提示細胞上のHLA-DQ2に付加することによって開始することができる。
【０００５】
重篤なグルテン不耐症と関係がある関連疾患は、疱疹状皮膚炎であり、これは、激しいそう痒性の水疱の群発、丘疹及び蕁麻疹様病変によって特徴付けられる慢性的な発疹として現れる。研究により、正常に見え、かつ病変周囲の皮膚のほとんど全てにおいて、IgA沈着が生じることが示されている。無症候性のグルテン感受性腸疾患は、患者の75〜90%及びその血縁者の一部で見られる。疱疹状皮膚炎の発症は通常、発症表面の激しいそう痒及び灼熱感へと段階的に進行する。更に多くの場合、引っ掻くことで、原発病変が周辺の皮膚の湿疹化により不明確になり、湿疹の誤診を招く。
【０００６】
グルテンは、例えば、穀粉生地（cereal dough）中に見られるタンパク質画分であり、グルテニン及びプロラミンに細分することができる。プロラミンはまた、コムギ、ライムギ、オオムギ及びカラスムギの由来によって、それぞれグリアジン、セカリン（secalin）、ホルデイン及びアベニンに細分類することができる。グルテンの中で、グルテン不耐性患者に有害な影響を与える可能性のあるタンパク質は、コムギの貯蔵タンパク質であり、これらの種を挙げると、トリティカム・アエスティバム（Triticum aestivum）；トリティカム・アエチオピカム（Triticum aethiopicum）；トリティカム・バエオチカム（Triticum baeoticum）；トリティカム・ミリティナエ（Triticum militinae）；トリティカム・モノコッカム（Triticum monococcum）；トリティカム・シンスカジャエ（Triticum sinskajae）；トリティカム・ティモフィービィ（Triticum timopheevii）；トリティカム・タージダム（Triticum turgidum）；トリティカム・ウラーツ（Triticum urartu）；トリティカム・バビロビィ（Triticum vavilovii）；トリティカム・ジューコフスキー（Triticum zhukovskyi）；などがある（例えば、Colotの文献、Genet Eng (NY) 12:225-41, 1990を参照)。
【０００７】
グリアジンは、コムギグルテンの70%アルコール可溶性タンパク質画分である。コムギ粉から誘導されたグリアジンは、それらの電気泳動移動度に従い、α-型、β-型、γ-型及びω-型を含む、いくつかの群に分類することができる。典型的にグリアジンは、特にN末端部に、グルタミン及びプロリンを豊富に含む。例えば、α及びγグリアジンの最初の100アミノ酸は、それぞれ約35%及び約20%のグルタミン及びプロリン残基を含む。種々のグリアジンが、コムギの各サブ品種（subcultivar）に、各型内のアミノ酸配列の変化を有して存在する。典型的にグリアジンは、約30〜50kダルトンの分子量であること、及び中性水溶液に不溶性であることによって特徴付けられる。グリアジン配列の例を挙げると、例えば、Genbankで規定されるもの、受入番号AJ133612；AJ133611；AJ133610；AJ133609；AJ133608；AJ133607；AJ133606；AJ133605；AJ133604；AJ133603；AJ133602；D84341.1；U51307；U51306；U51304；U51303；U50984；及びU08287のコムギα-グリアジン配列があるが、これらに限定されない。コムギω-グリアジンの配列は、Genbank受入番号AF280605で示される。
【０００８】
グルテン不耐性の個体において、通常小腸に存在し、グルテンの消化に必要となる酵素が、失われていることが発見されている。穀実タンパク質の不完全な消化によって生成されるペプチド断片は、そのような個体に対して毒性となり；最も毒性のペプチドはα-グリアジン、又はA-グリアジンと呼ばれる類似のタンパク質由来のものである。
【０００９】
セリン含有ペプチド（A-グリアジンの残基11〜19に見られるように、PSQQ及び場合によりQQQPモチーフも含む）は、細胞毒性効果を有するようである。チロシン含有ペプチド（A-グリアジンの残基75〜86に見られるように、QQPY及び/又はQPYPモチーフを含む）は、T細胞媒介による免疫活性、つまり毒性と関連する。
【００１０】
実験により、11〜19のような活性セリン含有タンパク質、及び75〜86のような活性チロシン含有ペプチドは、セリアック病に罹患している患者において、粘膜酵素によって不完全に消化されることが示されている。11〜18及び77〜84などの残留ペプチド配列は、いまだ毒性を有し、このことは、セリアック病の原因論が粘膜消化不全と関連付けられること、及び該疾患の病理発生が粘膜上の未消化ペプチドの活性に起因することを示している。これは結局のところ、セリアック病患者においてただ1つの酵素が欠損していることに起因し得るが、少なくとも2つの異なる型のペプチド残基が増大し、粘膜組織に損傷を起こさせる。
【００１１】
現在のところ、グルテンフリーの食事を患者に課す以外に、グルテン不耐症の影響を治療するための有効な治療法は存在しない。しかしながら、グルテンを含む穀類、又はグルテン自身のいずれかを含む食品数のために、この方法は、患者に利用できる食物の選択に対して厳しい制約となっている。更にグルテン離脱（withdrawal）は、グルテン不耐性患者の予後を改善させたが、いくらかの人々は、特に、最初に重篤なグルテン不耐症を呈する人々において、いまだ恐らくは、リンパ細網の疾患（特に、腸管リンパ腫）による疾患で死亡する。グルテン離脱は、リンパ細網の疾患の発病の危険を減少させるが、見かけ上の臨床的寛解は多くの場合、生検を検査すること、又はIgAクラスの抗筋内膜抗体（EMA）価を増大させることによってのみ検出される組織学的な再発に関連するようである。
【００１２】
深刻で、かつ広範に渡るグルテン不耐症の性質を考慮して、この状態の影響を治療する、予防する又は寛解させる改良方法が要求されている。したがって、グルテン不耐症に起因する状態を予防又は治療するための改善された組成物、及びその使用方法を提供することによって、当該分野の前記問題のいくつかを、克服する又は少なくとも一部軽減することが、本発明の一態様である
【００１３】
文書、行為、材料、装置、物品などに関する記載は、単に前後関係を本発明に提供する目的のためだけに本明細書中に含まれる。これらの事項の一部又は全部は、それが本出願の各請求項の優先日前に存在している場合に、先行技術基準の一部を形成したか、又は本発明に関する分野における通常の一般知識であったことは、示唆又は提示されない。
【発明の概要】
【００１４】
本発明の一態様において、グルテン不耐症に関連した状態の予防又は治療のための組成物であって、少なくとも一部が精製されたカリカイン（caricain）、又はその生物活性のある断片、類似体若しくは変異体を含む前記組成物を提供する。
一実施態様において、カリカインは、カリカ・パパイヤ（Carica papaya）由来である。
別の実施態様において、カリカインは、図1に示されるアミノ酸配列、又はその生物活性のある断片、類似体若しくは変異体を含む。
【００１５】
本発明の組成物は、本明細書に記載される、動物の腸内酵素抽出物を更に含むことができる。
別の実施態様において、本発明の組成物は、ブロメライン又はその生物活性のある断片、類似体若しくは変異体を含む。
本発明の組成物は、腸溶コーティングされた錠剤又はカプセルとして製剤することができる。
本発明のいくつかの実施態様において、当該組成物は、少なくとも15mgのカリカイン、又はその生物活性のある断片、変異体及び類似体を含む。
【００１６】
本発明の別の態様において、グルテン不耐症に関連した状態の予防又は治療に使用するための組成物であって、組換えカリカイン又はその生物活性のある断片、類似体若しくは変異体をコードする核酸分子を含む前記組成物を提供する。一実施態様において、該核酸分子は、図2に示されるヌクレオチド配列、又はその機能的等価物を含む。別の実施態様において、該核酸分子は、図1に示されるアミノ酸配列、又はその生物活性のある断片、類似体若しくは変異体をコードする。
【００１７】
本発明の組成物は、組換えブロメライン又はその生物活性のある断片、類似体若しくは変異体を発現させることができる核酸分子を更に含むことができる。
本発明の別の実施態様において、グルテン不耐症に関連した状態の予防又は治療に使用するための組成物であって、組換えカリカイン又はその生物活性のある断片、類似体若しくは変異体を発現させることができる宿主細胞を含む前記組成物を提供する。
本発明の更に別の実施態様において、当該組成物は、組換えブロメライン又はその生物活性のある断片、類似体若しくは変異体を発現させることができる宿主細胞を含む。
【００１８】
本発明の別の態様において、グルテン不耐症に関連した状態の予防又は治療のための方法であって、それを必要とする対象に、少なくとも一部が精製されたカリカイン又は本明細書中に記載のその生物活性のある断片、類似体若しくは変異体を投与することを含む前記方法を提供する。本発明のいくつかの実施態様において、当該組成物は、少なくとも15mgのカリカイン又はその生物活性のある断片、変異体若しくは類似体を含む。本発明のいくつかの実施態様において、該組成物は、食事前にそれを必要とする対象に投与される。
【００１９】
一実施態様において、本発明の方法は、それを必要とする対象に、腸管抽出物を含む組成物を投与することを含む。
更に別の実施態様において、本発明の方法は、それを必要とする対象に、ブロメライン又はその生物活性のある断片、類似体若しくは変異体を投与することを含む。
【００２０】
本発明の別の態様において、グルテン不耐症に起因する状態の予防又は治療のための方法であって、それを必要とする対象に、該対象において、組換えカリカイン又は本明細書中に記載のその生物活性のある断片、類似体若しくは変異体を発現させることができる核酸分子を投与することを含む前記方法を提供する。
一実施態様において、本発明の方法は、それを必要とする対象に、該対象において、組換えブロメライン又はその生物活性のある断片、類似体若しくは変異体を発現させることができる核酸分子を投与することを含む。
【００２１】
グルテン含有材料から得られる食品の製造方法であって、該食品又はグルテン含有材料を、カリカイン又はその生物活性のある断片、類似体若しくは変異体で処理して、食品中に存在する毒性グルテン由来オリゴペプチドの量を減少させるようにすることを含む、前記方法を提供することが、本発明の更に別の態様である。一実施態様において、本発明の方法は、食品又はグルテン含有材料を、ブロメライン又はその生物活性のある断片、類似体若しくは変異体で処理することを更に含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
（図）
【図１】カリカ・パパイヤのカリカインの一次アミノ酸配列を示す（GenBank受入番号X66060）。
【図２】カリカ・パパイヤのカリカインの一次アミノ酸配列を示す（GenBank受入番号X69877）。
【図３】カリカ・パパイヤのカリカインのmRNA配列を示す（GenBank受入番号X66060）。
【図４】カリカ・パパイヤのカリカインのmRNA配列を示す（GenBank受入番号X69877）。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
（発明の詳細な説明）
（組成物）
本発明の一態様において、グルテン不耐症に関連した状態の予防又は治療のための組成物であって、少なくとも一部が精製されたカリカイン又はその生物活性のある断片、類似体若しくは変異体を含む前記組成物を提供する。
カリカインは、グルテン摂取後に生成された毒性オリゴペプチドを改質して、無毒性ペプチドを生成することができ、これによって、グルテン不耐性の個体において、それらの毒性作用を予防する又は少なくとも一部を軽減する、改善された方法を提供できることが見出された。理論に拘束されるものではないが、該効果は、酵素量及び摂取グルテン量に用量依存的であることが予想される。
【００２４】
本明細書中で使用される用語「カリカイン」（EC 3.4.22.30）は、カリカ・パパイヤなどの植物のラテックスに一般に見られるシステインプロテアーゼを指す。当該分野で公知のカリカインの他の名称を挙げると、パパイヤプロテアーゼオメガ、パパイヤエンドペプチダーゼIII、パパイヤペプチダーゼA、パパイヤペプチダーゼII及びパパイヤプロテイナーゼIIIがある。カリカインは、パパインスーパーファミリーの一員であり、他の植物及び動物のシステインプロテアーゼと相同である。カリカインは、プロカリカインと呼ばれる不活性な酵素前駆体として天然に発現される。該プロテアーゼの不活性形態は、追加的106N末端アミノ酸からなる抑制性のプロ領域を含む。研究により、プロカリカインのインビトロでの活性化の律速段階は、プロドメインの解離であり、その後にプロ領域の延長ポリペプチド鎖のタンパク質切断が続くことが示された。該プロドメインは、プロカリカインのC末端ローブのフォールディングを促進し得る安定したスキャフォールドを提供する（Grovesらの文献、1996, Structure, 4(10):1193-1203を参照）。本発明者らは、初めて、コムギなどのグルテンタンパク質の毒性オリゴペプチドの無毒性断片への変換における鍵となる酵素としてカリカインを同定した。
【００２５】
一実施態様において、カリカインは、カリカ・パパイヤ由来であり、これは1967年にSchackによって発見された（Dubey K.らの文献、2007, パパイン様プロテアーゼ：その阻害剤の適用（Papain-like proteases: Applications of their inhibitors）; African Journal of Biotechnology 6(9) 1077-1086）。
別の実施態様において、該カリカインは、図1に示されるアミノ酸配列、又はその生物活性のある断片、類似体若しくは変異体を含む。
【００２６】
本発明の組成物は、国際特許出願PCT/AU03/00633（公開番号WO2003/100051；その内容物は参照により本明細書中に組み込まれている。）に記載されているものなどの、腸内酵素抽出物を更に含むことができる。本発明者らは、初めて、カリカインとWO2003/100051に記載された腸内酵素抽出物との組合せによる相乗作用を特定した。
【００２７】
（少なくとも一部が精製されたカリカイン）
本発明の一実施態様において、カリカインは、当業者に公知の従来方法によって、天然源（例えば、パパイヤラテックス）から少なくとも一部が精製されている。本発明の特定の実施態様において、カリカインは、限定はされないが、Azarkan M.らの文献（「カリカ・パパイヤのラテックス中に貯蔵された酵素の分画及び精製（Fractionation and purification of the enzymes stored in the latex of Carica papaya）」J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2003 790(1-2):229-38）及びButtle D.J.の文献（カリカイン、タンパク質分解酵素のハンドブック（Caricain In Handbook of Proteolytic Enzymes）、第2版、p.1130-1132, Elsevier,London）に記載された方法を含む、当該分野で公知の任意方法を使用して、カリカ・パパイヤのラテックスから少なくとも一部が精製されている。
【００２８】
カリカ属のパパイヤ、木カリカ・パパイヤの果実は、ママオ（mamao）、ツリーメロン（tree melon）、フルータボンバ（fruta bomba）、レコサ（lechosa）又はパウパウ（pawpaw）としても公知である。パパイヤラテックスなどの天然源からのカリカインの単離に有用な方法を挙げると、固-液抽出、液-液抽出、固相抽出、膜濾過、限外濾過、透析、電気泳動、溶媒濃縮、遠心分離、超遠心分離、高圧を伴う又は伴わない液相又は気相クロマトグラフィー（サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどを含む）、凍結乾燥、蒸発、種々の「担体」（例えば、抗体）による沈降、結晶化及びそのいずれかの組合せがあるが、これらに限定されない。当業者は、精製手順を通してのその活性に従って、カリカインの各連続的画分を濃縮するために、逐次的様式で、そのような選択肢を使用する方法を理解するであろう。該少なくとも一部が精製されたカリカインの活性は、本明細書中に記載される、当業者に公知の様々な方法を使用して測定することができる。
【００２９】
固-液抽出は、限定はされないが、様々な溶媒、ボルテックス振盪機、超音波及び抽出を促進するための他の方法の使用、並びに濾過、遠心分離及び当該分野で説明される関連方法による回収を含む（例えば、Cannell RJPの文献、Natural Products Isolation, Humana Press, 1998を参照）。使用することができる溶媒の例を挙げると、炭化水素溶媒、塩素化溶剤、有機エステル、有機エーテル、アルコール、水及びそれらの組合せがあるが、これらに限定されない。
【００３０】
液-液抽出は、限定はされないが、当該分野で公知の溶媒、例えば、炭化水素溶媒、塩素化溶剤、有機エステル、有機エーテル、アルコール、水、種々の水溶液及びそれらの組合せの使用を含む。液-液抽出は、手操作により容易に行うことができるか、又は自動化（完全に又は部分的に）することもでき、溶媒は、当該分野の標準的な技術によって、除去及び/又は濃縮することができる。
【００３１】
膜、逆浸透及び限外濾過は、限定はされないが、当該分野で公知の各種膜の使用、並びに圧力、真空、遠心力、及び/又は膜及び限外濾過プロセスで利用することができる他の方法の使用を含む。
【００３２】
透析は典型的に、試料中のカリカインの相対純度を増大させるために、天然源からの様々な構成成分の除去に選択的な、分子量除去を有する膜の使用を含む。本発明は、限定はされないが、凍結乾燥及び結晶化を含む当該分野で公知の様々な方法によって、透析液又は残余分のいずれかから精製及び/又は分取した抽出物の回収も包含する。
【００３３】
クロマトグラフィーは、限定はされないが、通常のカラムクロマトグラフィー、フラッシュクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、中圧液体クロマトグラフィー（MPLC）、超臨界流体クロマトグラフィー（SFC）、向流クロマトグラフィー（CCC）、移動床クロマトグラフィー、擬似移動床クロマトグラフィー、拡張床クロマトグラフィー、及び平面クロマトグラフィーの使用を含む。クロマトグラフィーに使用することができる吸着剤の例を挙げると、シリカゲル、アルミナ、フルオリシル（fluorisil）、セルロース及び改質セルロース、種々の改質シリカゲル、イオン交換樹脂、サイズ排除ゲル、化学修飾ゲル、並びに当業者に公知の他の吸着剤があるが、これらに限定されない。また本発明は、クロマトグラフィー法によるカリカインの分画及び/又は部分的精製を達成するための、2以上の塩勾配の使用も含む。水又は水相を使用する場合、様々な量の無機又は有機塩を含むことができ、及び/又はpHを酸又は塩基によって異なる値に調整して、分取及び/又は精製が促進されるようにすることができる。
【００３４】
また、天然源からのカリカインを少なくとも一部を精製する方法は、元の抽出物、及び/又は分画した抽出物、及び/又は精製した抽出物からの溶媒除去による、精製された又は部分的に精製されたカリカインの濃縮を含むことができる。溶媒除去の技術は、当業者には公知であり、限定はされないが、回転蒸発、蒸留（常圧及び減圧）、遠心真空蒸発（スピードバック）、凍結乾燥及びそれらの組合せがある。
【００３５】
本発明のペプチド、タンパク質及びペプチド類似体（例えば、カリカイン又はブロメライン）に言及する場合、用語「少なくとも一部が精製された」とは典型的に、該ペプチド、タンパク質又は類似体が、非精製の状態（例えば、天然の状態又は環境物）で関連付けられている他の構成成分（例えば、他のタンパク質、核酸、脂質、炭水化物）を一部から完全に含まない組成物を意味する。該少なくとも一部が精製されたペプチド及びタンパク質は、乾燥状態又は水溶液中の状態であってよいが、一般に、均一又はほぼ均一な状態であり得る。純度及び均一性は典型的に、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又は高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学技術を使用して決定される。一実施態様において、カリカインなどのペプチドは、本明細書中に記載のものなどの、慣用及び周知の方法を使用して、更に精製することができる。
【００３６】
本発明の特定の実施態様において、少なくとも一部が精製されたタンパク質、例えば、カリカインは、組成物の総重量の少なくとも約1又は数重量パーセント、例えば、組成物の総重量の少なくとも約5重量パーセントを構成し得る。別の実施態様において、少なくとも一部が精製されたカリカインは、組成物の総重量の少なくとも約10重量パーセントを構成し得る。別の実施態様において、少なくとも一部が精製されたカリカインは、組成物の総重量の少なくとも約20重量パーセントを構成する。別の実施態様において、少なくとも一部が精製されたカリカインは、組成物の総重量の少なくとも約50重量パーセントを構成し得る。更なる実施態様において、少なくとも一部が精製されたカリカインは、組成物の総重量の少なくとも約80重量パーセントを構成し得る。他の実施態様において、少なくとも一部が精製されたカリカインは、組成物の総重量の少なくとも約90重量パーセント、又は少なくとも約95重量パーセント以上を構成する。
【００３７】
（カリカイン活性のアッセイ）
一部が精製されたカリカインは、本明細書中に記載される手順のいずれか1以上によって、その毒性グルテンペプチドの毒性を減少させる能力を試験することができる。パパイヤラテックスから、又はその他の適当な供給源から、カリカインを単離及び精製する方法は、グルテン不耐症に起因する状態の予防又は治療を提供するために、単離されたペプチダーゼの少なくともいくつかの酵素活性が保持されるようなものであることが、当業者には理解されるであろう。当業者は、本明細書中に記載のように、インビトロ又はインビボにおいて、少なくとも一部が精製されたカリカインの、毒性グルテンペプチドの毒性を減少させる能力を定性的に、及び/又は定量的に測定するための多数の方法及び技術が存在することを理解しているであろう。
【００３８】
本明細書に記載のように、カリカインは、基質を改質して毒性グルテンオリゴペプチドを不活性化させるその能力によって同定することができる。該基質に挙げることができるのは、グリアジン、ホルデイン、セカリン又はアベニンタンパク質があるが、これらに限定されない。毒性グリアジンオリゴペプチドは、健常なヒトの、グリアジン及び本明細書中に記載の食物性穀物（例えば、コムギ、ライムギ、オオムギなど）由来の関連貯蔵タンパク質の消化の間に誘導されたペプチドを含む。そのようなオリゴペプチドは、グルテン不耐症に起因する状態、例えば、セリアックスプルーに罹患している患者において、T細胞に対する抗原として作用すると考えられる。MHCクラスIIタンパク質への結合について、免疫原性ペプチドは一般には、長さ約8〜20アミノ酸であり、より一般には約10〜18アミノ酸である。そのようなペプチドには、QQPY又は関連のチロシン含有モチーフを含むことができる。オリゴペプチドが特定の患者に対して免疫原性であるかどうかの判定は、標準的なT細胞活性化及び当業者に公知の他のアッセイによって容易に決定される。カリカイン又は本明細書中に記載のその生物活性のある断片、類似体若しくは変異体の、毒性グルテンペプチドを不活性化する能力は、当該分野で公知の任意の方法によって、例えば、WO2003/100051並びにCornell及びTownleyの文献（1974; Gut, 15(11):862-869）（これらの両方とも参照により本明細書中に組み込まれている。）に記載される、例えば、ラット肝臓リソソーム（RLL）アッセイを使用することによって測定することができる。
【００３９】
特定の実施態様において、本発明のカリカインは、毒性ペプチド、例えば、PSQQ、QQQP及びQQPYモチーフを含むもの、並びにA-グリアジンコムギペプチドQNPSQQQPQ（残基11-19）、RPQQPYPQPQPQ（残基75-86）、LGQQQPFPPQQPY（残基31-43）、PQPQPFPSQQPY（残基44-55）及びLGQGSFRPSQQN（残基206-217）を改質することができる。
【００４０】
基質を改質するというカリカインの能力は、例えば、37℃で1時間インキュベートした、1mg/mlの基質及び10mg/mlのカリカインを含む反応混合物において、遊離NH2末端濃度を増大させる酵素の能力を測定することによって決定することができる。本発明のカリカインは、そのような条件下で遊離アミノ末端の濃度を、一般には少なくとも約10%、より一般には少なくとも約25%、好ましくは少なくとも約50%増大させるであろう。本発明のカリカインはまた、50mg/mlの基質0.1ml中の約1000Daより大きいオリゴペプチドの毒性を、10mg/mlのペプチダーゼ0.2mlとともに2時間のインキュベーションした後に、少なくとも約2倍、一般には少なくとも約5倍、好ましくは少なくとも約10倍減少させることができる。そのようなオリゴペプチドの毒性は、当該分野で公知の方法によって、例えば、WO2003/100051並びにCornell及びTownleyの文献(1973); Clin.Chim. Acta 49: 181-188（これらの両方とも参照により本明細書中に組み込まれている。）に記載される、例えば、ラット肝臓リソソーム（RLL）アッセイを使用することによって測定することができる。
【００４１】
本発明の一実施態様において、カリカインは、リソソームに対して、少なくとも約20%、場合によっては少なくとも約50%、又は場合によっては少なくとも約90%保護の解毒化活性（例えば、RLLアッセイによる測定）を示す。
本発明のいくつかの実施態様において、当該組成物は、少なくとも15mgのカリカイン又はその生物活性のある断片、変異体及び類似体を含む。
【００４２】
（他の組成物）
本発明の別の実施態様において、関心対象の組成物は、カリカインを、毒性グルテンオリゴペプチドを不活性化させることができる他の酵素と組合せて含むことができ、該酵素には、限定はされないが、ブロメライン及び国際特許出願PCT/AU03/00633（公開番号WO2003/100051、その内容物は参照により本明細書中に組み込まれている。）に記載されたものを含む。
【００４３】
カリカインと腸内酵素抽出物（例えば、WO2003/100051に記載される）との組合せは、例えば、ラット肝臓リソソーム保護アッセイで示されるように、毒性グリアジンオリゴペプチドの切断に驚くべき相乗効果を生じさせることが、本発明者らによって見出された。
【００４４】
ブロメラインは典型的に、パイナップル（アナナス・コモスス（Ananas comosus））から単離される植物プロテアーゼである。それは、ペプチド結合に広い特異性をもつ基質に応じて、5〜8の最適pH範囲を有する。ブロメラインは、限定はされないが、Yamada F.らによって説明された精製方法（「パイナップル果実由来のプロテイナーゼ、果実ブロメラインFA2の精製と特徴づけ（Purification and characterization of a proteinase from pineapple fruit, fruit bromelain FA2）」; J Biochem (Tokyo). 1976; 79(6):1223-34）を含む当該分野で公知の任意の標準技術を使用して、パイナップルなどの供給源から精製することができる。単離及び精製されたブロメラインは、市販もされている。
【００４５】
カリカインは、パパイヤラテックスの高分子量画分（30〜35KDaの範囲の画分4；実施例の節を参照）で溶出し、その活性形態（Grovesらの文献、1996, Structure, vol4:1193-1203）の配列と一致することが、本発明者らによって見出された。Biosep SEC S 2000でのHPLCによる画分4の更なる精製により、早期の画分4の高分子量タンパク質は、カリカイン、グルタミンシクロトランスフェラーゼ及びキモパパインを含有するが、後者の2つの酵素は、グリアジンの解毒作用に対して重要な寄与因子ではないようであることが確認された。本出願人は、フッ化フェニルメチルスルホニル（PMSF）が、6mM濃度でラット肝臓リソソームにおける活動画分4を有意には阻害しないことを示し、この画分に存在する主要な酵素が、セリンプロテアーゼではないことを確認した。
ている。
【００４６】
本明細書中に記載される腸管抽出物は、限定はされないが、十二指腸を含む消化管の任意の部分から得ることができる。該腸管抽出物は、単独で又はカリカインとの相乗的能力で、毒性グリアジンペプチドを解毒する能力を示す限り、任意の種から得ることができる。本発明の特定の実施態様において、腸管抽出物は、ブタの腸から得られる。
これらのタンパク質の他の動物の形態を使用するか、又は改質形態を他の市販の供給源から単離してもよい。
【００４７】
本発明の組成物はまた、（限定はされないが）アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）（例えば、Byunらの文献、(2001) J. Agric. Food Chem. 49, 2061-2063）などのアスペルギルス種（Aspergillus spp.）、並びにラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）（例えば、Vesantoらの文献、(1995) Microbiol. 141, 3067-3075）及びラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）（Mayoらの文献、(1991) Appl. Environ. Microbiol. 57, 38-44）などのラクトバチルス種（Lactobacilli spp.）由来の真菌プロテアーゼなどの他の酵素も含むことができる。
【００４８】
（その生物活性のある断片、変異体及び類似体）
カリカインに関連して本明細書中で使用される用語「生物活性のある断片」とは、典型的に、インビトロ又はインビボにおいて、グルテンペプチドを解毒化するその能力を保持する断片を指す。
【００４９】
関心対象のペプチダーゼ断片は、限定はされないが、少なくとも約20の近接アミノ酸、より一般には少なくとも約50の近接アミノ酸の断片を含み、かつ100以上のアミノ酸から最大完全なタンパク質を含んでもよく、更に延長して追加的な配列を含でもよい。いずれの場合にも、鍵となる判断基準は、該断片が、グルテン不耐症に起因する状態の一因となる毒性オリゴペプチドを改質する能力を保持するかどうかということである。
【００５０】
本明細書中で使用される用語「天然の」とは、好ましくは、天然に存在する（例えば、天然のタンパク質）アミノ酸配列を有するカリカインを指す。そのような断片は一般に、例えば、先述のように、ペプチダーゼ活性の同定における当業者に周知の技術を使用して同定することができる。
【００５１】
ブロメラインに関連して本明細書中で使用される用語「生物活性のある断片」とは、典型的に、カリカイン又はその生物活性のある断片、類似体若しくは変異体と組合わせてグルテンペプチドの解毒化に寄与するその能力を保持する、ブロメラインの断片を指す。
【００５２】
カリカインに関連して本明細書中で使用される用語「類似体」とは、典型的に、天然のカリカインのアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するペプチダーゼを表す。ブロメラインに関連して本明細書中で使用される用語「類似体」とは、典型的に、各天然の酵素のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するペプチダーゼを表す。
【００５３】
類似体について使用される用語「実質的に同一」とは、典型的に、得られる類似体が、天然の酵素の生物活性の少なくともいくつかを有するような、1以上のアミノ酸の置換又は付加を表す。類似体は、対立遺伝子変異型若しくはmRNAスプライシング変異型などの天然のものであってよく、又はそれらは、当業者に利用可能な合成技術又は組換え技術を使用して構築されたものであってもよい。
【００５４】
カリカイン及びブロメラインに関連して本明細書中で使用される用語「変異体」とは、典型的に、天然の酵素に対して少なくとも80%同一のアミノ酸配列を示す酵素を表す。また、変異体が、天然の分子に対して少なくとも90%同一の、場合により少なくとも95%同一の、場合により少なくとも98%同一の、場合により少なくとも99%同一の、又は場合により少なくとも99.9%同一のアミノ酸配列を含む実施態様も検討される。パーセント相同性は、視覚的検査及び/又は当業者に公知の方法による数学的演算によって決定される。変異体は、天然に存在するもの、合成物又は組換え体であってよい。
【００５５】
本発明の一実施態様において、カリカイン又はブロメラインの変異体は、該酵素の天然形態と実質的に相同であるが、1以上の欠失、挿入又は置換のために天然形態とは異なったアミノ酸配列を有する酵素を含む。特定の実施態様は、天然の配列と比較した場合に、1〜10のアミノ酸残基の欠失、挿入又は置換を含むアミノ酸を含む。所与の配列を、例えば、類似の生理化学的特性を有する残基で置き換えることができる。例として、そのような1の脂肪族残基の別のものへの保存的置換、例えば、互いにIle、Val、Leu又はAla；1の極性残基の別のものへの置換、例えば、LysとArgとの間、又はGluとAspとの間、又はGlnとAsnとの間；又は1の芳香族残基の別のものへの置換、例えば、互いにPhe、Trp又はTyrがある。例えば、類似の疎水性特性を有する全体領域の置換を含む他の保存的置換が、当業者には周知である。変異体はまた、天然のペプチダーゼアミノ酸のトランケーションによっても産生することができる。更に、本発明によって包含される変異体を挙げると、脱グリコシル化アミノ酸若しくはその断片、又は天然の酵素と比較した場合にグリコシル化の増加を示すアミノ酸があるが、これらに限定されない。
【００５６】
「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基と置き換えられるものの1つである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で規定されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン）を有するアミノ酸を含む。したがって、カリカインのアミノ酸残基は、好ましくは、同じ側鎖ファミリー由来の別のアミノ酸残基と置き換えられる。好ましい実施態様において、突然変異は、飽和変異誘発法などによって、配列をコードする酵素の全部又は一部に従って不規則に導入され得る。得られた変異体は、天然酵素の生物学的活性の少なくともいくつかを示す変異体を同定するために、スクリーニングされ得る。変異誘発の後に、コード化タンパク質は組換えによって発現され、該酵素の活性は、本明細書中に記載の方法によって測定することができる。
【００５７】
また、カリカイン又はブロメラインの天然形態の一次配列を変化させない改変が想定され、これらを挙げると、タンパク質の化学的誘導体化（例えば、アセチル化又はカルボキシル化）、グリコシル化（例えば、その合成若しくはプロセシング中に、又は更なるプロセシング工程において、タンパク質のグリコシル化パターンを改変することによって作成されるもの）、並びにリン酸化アミノ酸残基（例えば、リン酸化チロシン、リン酸化セリン又はリン酸化スレオニン）を有する配列があるが、これらに限定されない。
【００５８】
また、本発明の実施において有用なものは、タンパク質分解及び/又は胃で見られるような酸性状態に対するそれらの抵抗性を改善するために、分子生物学的技術及び/又は化学を使用して改質し、溶解性を最適化した、又はそれらを治療薬としてより適当なものにさせたカリカイン又はブロメラインである。そのようなタンパク質の類似体を挙げると、天然のL-アミノ酸以外の残基を含むもの（例えば、D-アミノ酸又は非天然の合成アミノ酸）がある。
【００５９】
本発明のカリカインは、当該分野で公知の従来法を使用するインビトロ合成によって、製造することができる。様々な市販の合成装置、例えば、自動合成機（例えば、CS936Xペプチド合成機、CSBio社）が利用可能である。そのような合成機を使用して、当業者は、容易に天然のアミノ酸を1以上の非天然のアミノ酸と置換することができる。特定の配列及び製造の様式は、利便性、経済性、必要な純度などによって決定されるであろう。所望であれば、合成の間にタンパク質に様々な基を導入することができ、他の分子又は表面への結合を可能にする。例えば、システインを使用してチオエーテルを作ること、ヒスチジンを使用して金属イオン複合体に結合すること、カルボキシル基を使用してアミド又はエステルを形成すること、アミノ基を使用してアミドを形成することなどが可能である。
【００６０】
（核酸分子）
本発明の更に別の態様において、グルテン不耐症に起因する状態の予防又は治療のための組成物であって、カリカイン又はその生物活性のある断片、類似体若しくは変異体をコードする核酸配列を有する核酸分子を含む前記組成物を提供する。該核酸分子は、その生物活性のある断片、類似体若しくは変異体を含む、カリカインの組換え類似体の発現を駆動することができるものである。例えば、理論に拘束されるものではないが、該核酸分子は、それを投与された対象の消化管の内側を覆う細胞にトランスフェクションすることができ、ここでそれが対象のゲノムに組込まれる。次いで、該核酸分子の取込みは、組換えカリカイン又はその生物活性のある断片、類似体若しくは変異体の発現をもたらす。
【００６１】
本明細書中で使用される「核酸分子」は、DNA分子（例えば、cDNA又はゲノムDNA）及びRNA分子（例えば、mRNA）並びに例えば、ヌクレオチド類似体の使用によって生成されたDNA又はRNAの類似体を含む。該核酸分子は、一本鎖又は二本鎖であってもよいが、好ましくは二本鎖DNAである。天然及び合成の核酸分子、又はそれらの組合せが、本発明によって包含され、該核酸配列は、先述のように、カリカイン又はその生物活性のある断片、類似体若しくは変異体をコードする。
【００６２】
本明細書中で使用される「天然の」核酸分子とは、典型的に、天然に存在するヌクレオチド配列を有するRNA又はDNA分子を指す（例えば、パパイヤ植物に見られる）。
本明細書中で使用される用語「遺伝子」及び「組換え遺伝子」は、好ましくは、本明細書中に記載のペプチダーゼをコードする翻訳領域を含む核酸分子を指し、更に非翻訳領域制御配列及びイントロンを含み得る。
【００６３】
例えば、カリカインをコードする核酸分子は、天然のカリカインをコードするヌクレオチド配列に対して約65%〜約99%以上が相同する核酸配列を含む。該カリカインをコードする核酸分子は、限定はされないが、パパイヤを含む任意の供給源由来のものであり得るが、一方で、本発明の精神の範囲内で想定される類似体は、限定はされないが、ヒト、ブタ、ヒツジ及びウシを含む非植物種由来のものであってもよい。
本発明の特定の実施態様において、核酸分子は、図2に示される核酸配列、又はその機能的等価物を含む。
【００６４】
本明細書中で使用される用語「その機能的等価物」とは、機能的等価物である配列と類似の機能を有する配列を指す。「類似の機能」とは、該配列が、例えば、カリカイン又はその生物活性のある断片、類似体若しくは変異体のコードにおいて、共通の機能を共有することを意味する。いくつかの実施態様において、機能的に等価な配列は、機能的等価物である配列と配列相同性を示し得る。機能的等価物と機能的等価物である配列との間の配列相同性は、機能的等価物の長さの全域で少なくとも50%、機能的等価物の長さの全域で少なくとも60%、又は機能的等価物の長さの全域で70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%より長くてよい。
【００６５】
本発明の別の実施態様において、核酸分子は、図1に示されるアミノ酸配列、又は本明細書中に記載のその生物活性のある断片、類似体若しくは変異体をコードする。本明細書中に記載されるように、本発明の核酸分子は、ベクターに挿入され、かつ遺伝子治療用ベクターとして使用することができる。
本発明の更に別の実施態様において、組換えブロメライン又は本明細書中に記載のその生物活性のある断片、類似体若しくは変異体をコードする核酸分子を更に含む、本明細書中に記載の組成物を提供する。
【００６６】
（宿主細胞）
本発明の更に別の態様において、グルテン不耐症に関連した状態の予防又は治療のための組成物であって、組換えカリカイン又は本明細書中に記載のその生物活性のある断片、類似体若しくは変異体を発現させることができる宿主細胞を含む前記組成物を提供する。本発明の特定の実施態様において、前記宿主細胞は、胚性幹細胞、胚性癌細胞、造血幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、角化細胞、内皮細胞、気管支上皮細胞及び免疫細胞を含む群から選択される任意の種の真核細胞又は細胞株である。また宿主細胞は、細菌などの下等動物のものであってよい。一実施態様において、宿主細胞は、限定はされないが、ラクトバチルス種（Lactobacillus spp）などの、レシピエントの消化管に定着することができる微生物であってもよい。
【００６７】
本発明の別の実施態様において、宿主細胞は、組換えカリカイン及び/又はブロメライン、又は本明細書中に記載のその生物活性のある断片、類似体若しくは変異体を発現するように遺伝子操作された植物である。例えば、宿主細胞は食用植物であり、それを必要とする対象（例えば、グルテン不耐症の症状を呈しているか又はそれを呈する危険がある対象）が、該食用植物を経口摂取し、それによって、組換えカリカイン及び/又はブロメライン（又は本明細書中に記載のその生物活性のある断片、類似体若しくは変異体）の用量を投与することができる。本明細書中で使用される用語「植物」は、植物全体、植物の一部又は器官（例えば、葉、幹、根など）、植物細胞、種子及び同一の所産への言及を指す。本明細書中で使用される用語「植物細胞」は、限定することなく、種子、懸濁培養液、胚、分裂組織部位、カルス組織、葉、根、芽、配偶体、胞子体、花粉及び小胞子から得られる、又はこれらに見られる細胞を更に含む。植物細胞はまた、先述の組織から得られたプロトプラストなど、遺伝子操作された細胞を含むことも理解できる。本発明に従って使用することができる植物のクラスは、一般に、形質転換技術可能な高等植物のクラスのような広範なものであり、単子葉類及び双子葉類植物の両方を含む。特に好ましい植物を挙げると、トウモロコシ、ダイズ豆、ヒマワリ、ソルガム、キャノーラ、アルファルファ、ワタ、イネ、オオムギ及びアワがある。
【００６８】
限定はされないが、米国特許第6,977,325号（その内容物は参照により本明細書中に組み込まれている。）に記載の方法を含む、任意の適当な方法使用して、植物細胞を遺伝子操作し、組換えカリカイン及び/又はブロメライン（又は本明細書中に記載のその生物活性のある断片、類似体若しくは変異体）を発現させることができる。
【００６９】
当該組成物は、組換えブロメライン又は本明細書中に記載のその生物活性のある断片、類似体若しくは変異体を発現させることができる宿主細胞を更に含むことができる。例えば、本発明の特定の実施態様において、該組成物は、組換えカリカイン（又は本明細書中に記載のその生物活性のある断片、類似体若しくは変異体）及び組換えブロメライン（又は本明細書中に記載のその生物活性のある断片、類似体若しくは変異体）を発現させる宿主細胞を含む。別の実施態様において、本発明の組成物は、組換えカリカイン（又は本明細書中に記載のその生物活性のある断片、類似体若しくは変異体）を発現させる第1の宿主細胞、及び組換えブロメライン（又は本明細書中に記載のその生物活性のある断片、類似体若しくは変異体）を発現させる第2の宿主細胞を含む。
【００７０】
（医薬組成物）
先述のように、本発明の組成物は、医薬組成物の形態であってよく、医薬として許容し得る担体、賦形剤、希釈剤及び/又は補助剤を更に含む。本発明の医薬組成物は、単独で又は治療用化合物などの他の化合物と組合せて用いることができる。
本明細書中で使用される語句「医薬として許容され得る担体」には、限定はされないが、薬剤投与と適合性のある溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌及び抗真菌剤、等張及び吸収遅延剤などが含まれる。また、補助的な活性化合物を、該組成物に組込むこともできる。
【００７１】
医薬組成物は、意図する投与経路に適合させて製剤される。典型的に、投与経路は非経口的であり、経口（例えば、経口摂取、吸入）又は直腸を含む。非経口適用に使用される溶液剤又は懸濁剤は、1以上の下記構成成分を含むことができる：無菌希釈剤、例えば、注射用水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成用溶媒；抗菌剤、例えば、メチルパラベン；酸化防止剤、例えば、アスコルビン酸又は重亜硫酸ナトリウム；キレート剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸；緩衝液、例えば、酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩、及び浸透圧調整用試薬、例えば、塩化ナトリウム又は右旋糖。pHは、塩酸又は水酸化ナトリウムなどの酸又は塩基を用いて調整することができる。
【００７２】
一般に医薬組成物は、製造及び貯蔵の条件下で安定であり、細菌及び真菌などの微生物の汚染の影響に備えて保存される。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール又は液体ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの適当な混合物を含有する、溶媒又は分散媒であり得る。適切な流動度は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、分散の場合に必要な粒径を維持することによって、又は表面活性剤を使用することによって保持され得る。微生物の活動の予防は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどの様々な抗菌及び抗真菌剤を組込むことによって達成できる。多くの場合、該組成物中に、等張化剤、例えば、糖、塩化ナトリウム、又はマンニトール若しくはソルビトールなどのポリアルコールを含むことが好ましいであろう。
【００７３】
経口用組成物は一般に、不活性希釈剤又は可食担体を含む。経口用治療投与のために、活性化合物を賦形剤とともに組込むことができ、かつ錠剤、トローチ剤又はカプセル剤、例えば、ゼラチンカプセルの形態で使用することができる。経口用組成物はまた、口腔洗浄薬として使用するための流体担体を使用して製造することができる。医薬として適合し得る結合剤及び/又は補助材料を、該組成物の一部として含むことができる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、下記の成分のいずれか、又は類似の性質の化合物を含むことができる：結合剤、例えば、結晶セルロース、トラガントガム又はゼラチン；賦形剤、例えば、デンプン又はラクトース；崩壊剤、例えば、アルギン酸、プリモゲル又は改質コーンスターチ；潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム又は他のステアリン酸塩；流動促進剤（glidant）、例えば、コロイド状二酸化ケイ素；甘味剤、例えば、スクロース又はサッカリン；又は香味剤、例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル又はオレンジフレーバー剤。
【００７４】
一実施態様において、本発明の組成物は、身体からの迅速な排除に対して本発明の組成物を保護する担体を用いて製造され、例えば、徐放性製剤には、植込錠及びマイクロカプセル化した送達システムを含む。生分解性、生体適合性ポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸などを使用することができる。そのような製剤の製造方法は、当業者には明らかであろう。またリポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を有する感染細胞を標的とするリポソームを含む）を、医薬として許容し得る担体として使用することもできる。
【００７５】
投与の容易性及び用量の均一性のために、用量単位形態で、経口又は非経口組成物を製剤することが有利である。本明細書中で使用される「用量単位形態」とは、治療すべき対象用の単位用量として適した物理的に別個の単位を指し；各単位は、必要な医薬担体と関連して所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を含む。そのような化合物の毒性及び治療効果は、インビトロアッセイ、細胞培養又は実験動物を含む標準的な薬学的手法、例えば、研究化合物に応じてLD50（個体群の50%に対する致死量）及びED50（個体群の50%における用量治療効果）を測定することによって、決定することができる。毒性と治療効果との間の用量比は、治療係数であり、LD50/ED50の比率として表すことができる。高い治療係数を示す化合物が好ましい。毒性の副作用を示す化合物が使用され得る一方で、見込まれる非感染性の細胞への損害を最小化し、それによって副作用を低減させるために、患部組織の部位に対してそのような化合物を標的とする送達システムを設計することに注意すべきである。
【００７６】
インビトロ研究、細胞培養及び動物実験から得られたデータは、ヒトへの使用のための用量の範囲を検討するのに使用することができる。好ましくは該用量は、ほとんど又は全く毒性のない状態でのED50を含む循環濃度の範囲内にある。該用量は、用いられる用量及び利用される投与経路に応じて、この範囲内で変化し得る。酵素の治療的に有効な用量は、最初にインビトロアッセイから見積もることができる。そのような情報を使用して、より正確に、ヒトにおいて有用な用量を決定することができる。本発明の一実施態様において、カリカインの有効用量は、成人について、各食事の摂取とともに少なくとも約0.1mg/kg体重であり、かつ小児については典型的に、その用量の半分である。
【００７７】
治療されている患者及び状態、並びに投与経路に応じて、カリカイン又はその生物活性のある断片、変異体及び類似体は、約0.1mg〜約500mg/kg体重/日、例えば、平均的な人について約15mg/日の用量で投与することができる。例えば、患者におけるカリカイン又はその生物活性のある断片、類似体若しくは変異体の典型的な用量は、少なくとも約1mg/成人、より一般には少なくとも約15mg；好ましくは少なくとも約50mg；及び好ましくは約500mg以下であろう。用量は小児用製剤用に、適切に調節されるであろう。小児における有効用量は、より低くてもよく、例えば、少なくとも約0.1mg又は0.5mgの、カリカイン又はその生物活性のある断片、変異体及び類似体であってもよい。例えば、カリカイン及び腸のプロリダーゼを含む併用療法において、同程度の用量の組成物が与えられ得る；しかし、その比率は、胃腸の不活性化に関する該組成物の相対的な安定性に影響されるであろう。該カリカインは、少なくとも一部が精製された抽出物として、又は合成された医薬として許容し得るタンパク質として、本発明の組成物中に存在してもよい。
【００７８】
用量のレベルが、特定の酵素の機能、症状の重篤度及び副作用に対する対象の感受性に従って変化し得ることは、当業者には容易に理解されよう。いくつかの実施態様において、所与の酵素に対する用量は、様々な方法によって、当業者により容易に決定される。例示的な方法は、該症状を克服するのに必要な所定の化合物の生物活性を測定することである。
本発明のいくつかの実施態様において、本発明の組成物は、少なくとも15mgのカリカイン又はその生物活性のある断片、変異体及び類似体を含む。
【００７９】
当業者には、特定の因子が、対象を効果的に治療するのに必要な用量、及びタイミングに影響を与え得ることが理解されるであろう。該因子には、用いられる特定の化合物の活性、対象の年齢、体重、全体的な健康、性別及び食生活、投与時間、投与経路、排せつ速度、任意の薬剤併用、調節すべき発現又は活性の程度、グルテンへの感受性、前治療並びに存在する他の疾患が含まれる。
【００８０】
医薬組成物は、投与のための説明書とともに、容器、包装又はディスペンサーに含まれ得る。
経口投与について、本発明の組成物は、単独で、又は錠剤、散剤、顆粒剤又はカプセル剤を製造するのに適した添加剤、例えば、従来の添加剤、例えば、ラクトース、マンニトール、コーンスターチ又はジャガイモデンプンと；結合剤、例えば、結晶セルロース、セルロース異形、アラビアゴム、コーンスターチ又はゼラチンと；崩壊薬、例えば、コーンスターチ、ジャガイモデンプン又はナトリウムカルボキシメチルセルロースと；潤滑剤、例えば、タルク又はステアリン酸マグネシウムと；及び所望であれば、希釈剤、緩衝液、湿潤剤、保存剤及び香味剤と組合せて使用することができる。
【００８１】
本発明の一実施態様において、経口用製剤は、活性剤が腸管に送達されるように腸溶コーティングを含む。腸溶製剤は多くの場合、活性成分を胃の強酸内容物から保護するのに使用される。そのような製剤は、固形製剤を、酸環境には不溶性であり、かつ塩基性環境では可溶性であるポリマーの薄膜でコーティングすることによって作り出すことができる。例示的な薄膜は、酢酸フタル酸セルロース、酢酸フタル酸ポリビニル、フタル酸メチルセルロースヒドロキシプロピル、酢酸コハク酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メタクリル酸コポリマー、酢酸フタル酸セルロース及びAcryl-Ease（Colorcon社）などのアクリルコーティングシステムである。
【００８２】
他の腸溶製剤は、生物学的に浸食可能なポリマーで製造された人工のポリマー性微粒子を含み、これは、胃腸の粘液及び細胞内膜との強力な接着性の相互作用を示し、パイエル板のリンパ組織を覆っている粘膜の吸収性の上皮、及び濾胞関連上皮の両方を越えることができる。該ポリマーは、長期間、腸上皮との接触を維持し、実際に、細胞中及び細胞間でそれに浸透する（例えば、Mathiowitzらの文献、(1997) Nature 386 (6623): 410-414を参照）。薬剤送達システムはまた、Dorkooshらの文献（(2001) J Control Release 71 (3):307-18）に記載されるように、超多孔性ハイドロゲル（SPH）のコア及びSPH複合体（SPHC）を利用することができる。
【００８３】
（予防法又は治療法）
本発明の別の態様において、グルテン不耐症に関連した状態の予防又は治療のための方法であって、それを必要とする対象に、本明細書中に記載の本発明の組成物を投与することを含む前記方法を提供する。
【００８４】
本発明のいくつかの実施態様において、該方法は、それを必要とする対象に、少なくとも15mgのカリカイン又はその生物活性のある断片、変異体及び類似体を投与することを含む。本発明のいくつかの実施態様において、該方法は、それを必要とする対象に、少なくとも15mgのカリカイン又はその生物活性のある断片、変異体及び類似体を、食事前に、食事後に又は食事とともに、投与することを含む。
【００８５】
本発明の方法は、予防又は保護、並びに治療目的に使用することができる。したがって、本明細書中で使用される用語「治療」などは、グルテン不耐症の基礎疾患、状態又は症状の重症度、特に、限定はされないが、疲労、慢性的な下痢及び栄養分の吸収障害、体重減少、腹部膨満並びに貧血などの症状の重症度によって判断されるようなもののいずれかの減少を指す。本明細書中で使用される用語「予防」などは、グルテン不耐症の疾患、状態又は症状の予防を指す。グルテン不耐症の他の指標を挙げると、グルテンに特異的な抗体の存在、組織トランスグルタミナーゼに特異的な抗体の存在、炎症促進性T細胞及びサイトカインの存在、組織学又は他の試験から明らかとなる小腸の絨毛状構造への損害、腸透過性の増強があるが、これらに限定されない。
【００８６】
本発明の方法から利益を得ることができる対象は、任意の年齢層であり、成人及び小児を含み得る。毒性グルテンペプチドに容易に曝露されるのを防止することで、疾患の初期発生を防止することができるため、特に、小児は、予防的治療から利益を得る。予防に適した小児は、例えば、HLAタイピング、家族歴、T細胞アッセイ、又は当業者に公知の他の方法による、素因の遺伝子検査によって特定することができる。
【００８７】
本発明の一実施態様において、該予防又は治療方法は、それを必要とする対象に、有効量の少なくとも一部が精製されたカリカイン又は本明細書中に記載のその生物活性のある断片、類似体若しくは変異体を投与することを更に含む。
【００８８】
本発明の別の実施態様において、該予防又は治療方法は、それを必要とする対象に、有効量のブロメライン（又は本明細書中に記載のその生物活性のある断片、類似体若しくは変異体）、腸管抽出物（先述のもの）、又はそれらの任意の組合せを、投与することを更に含む。カリカインは、ブロメライン及び/又は腸管抽出物とともに、又は必要であれば別個の調剤として投与することができる。
【００８９】
本発明の更なる態様において、該予防又は治療方法は、それを必要とする対象に、組換えカリカイン又は本明細書中に記載のその生物活性のある断片、類似体若しくは変異体をコードする核酸配列を含む核酸分子を、投与することを含む。本発明の方法は、対象に、組換えブロメライン（又は本明細書中に記載のその生物活性のある断片、類似体若しくは変異体）をコードする核酸配列を含む核酸分子を、投与することを更に含むことができる。
【００９０】
本発明の更に別の態様において、該予防又は治療方法は、それを必要とする対象に、該対象において、組換えカリカイン又は本明細書中に記載のその類似体若しくは変異体を発現させることができる宿主細胞を、投与することを含む。本発明の方法は、対象に、組換えブロメライン（又は本明細書中に記載のその生物活性のある断片、類似体若しくは変異体）を発現させることができる宿主細胞を、投与することを更に含むことができる。
【００９１】
また本発明の方法は、他の様式と組合せて実施することができ、該他の様式には、限定はされないが、それを必要とする対象に、組織トランスグルタミナーゼの阻害剤、抗炎症薬、抗潰瘍薬、肥満細胞安定化剤及び/又はアン-アレルギー薬（an-allergy agent）を投与することを含む。そのような薬剤の例を挙げると、抗炎症特性を有するHMG-CoAレダクターゼ阻害剤、例えば、コンパクチン、ロバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン及びアトルバスタチン；抗アレルギー性ヒスタミンH1受容体遮断薬、例えば、アクリバスチン、セチリジン、デスロラタジン、エバスチン、フェキソフェナジン、レボセチリジン、ロラタジン及びミゾラスチン；ロイコトリエン受容体遮断薬、例えば、モンテルカスト及びザフィルルカスト；COX2阻害剤、例えば、セレコキシブ及びロフェコキシブ；p38 MAPキナーゼ阻害剤、例えば、BIRB-796；並びに肥満細胞安定化剤、例えば、クロモグリク酸ナトリウム（クロモリン）、ペミロラスト、プロキシクロミル、レピリナスト、ドキサントラゾール、アンレキサノクス、ネドクロミル及びプロビクロミルがある。
【００９２】
様々な投与方法が、好ましくは例えば、食事との経口投与を使用して、採用され得る。治療用製剤の用量は、疾患の性質、投与頻度、投与様式、ホストからの薬剤のクリアランスなどに応じて広く変化するであろう。初期用量は大きく、続いて、維持量を小さくしてもよい。該用量は、週1回又は隔週の頻度で投与できるか、又はより多くの場合、より小さい用量に分割し、食事とともに毎日、週2回、又は有効な投与レベルを維持する必要に応じる別法で、投与することができる。
【００９３】
治療効果は、臨床転帰から判断することができるか、又は免疫学的若しくは生化学的検査によって決定することができる。有害なT細胞活性の抑制は、活性Th1細胞を計数すること、病変部位のサイトカインの放出を測定すること、又は当該分野で公知の自己免疫性T細胞の存在用の他のアッセイを使用することによって測定することができる。あるいは、疾患の症状の重症度の減少を探索することができる。
【００９４】
（食料品の製造）
本発明の別の態様において、グルテン含有材料から得られる食品の製造方法であって、該食品又はグルテン含有材料を、カリカイン又はその生物活性のある断片、類似体若しくは変異体で処理して、食品中に存在する毒性グルテン由来オリゴペプチドの量を減少させるようにすることを含む前記方法を提供する。
本発明の更に別の態様において、該方法は、食品又はグルテン含有材料を、ブロメライン（又は本明細書中に記載のその生物活性のある断片、類似体若しくは変異体）で処理することを更に含む。
【００９５】
文書、行為、材料、装置、物品などに関する記載は、単に前後関係を本発明に提供する目的のためだけに本明細書中に含まれる。これらの事項の一部又は全部が、本出願の各請求項の優先日前に、先行技術基準の一部を形成したか、又は本発明に関する分野おける通常の一般知識であったことは、示唆又は提示されない。
最後に、本明細書中に概説される本発明の精神を逸脱することなく、様々な他の修正及び/又は変更がなされることが理解されるべきである。
【００９６】
ここで、本発明の特定の実施態様のグルテン不耐症に起因する状態の予防又は治療における、組成物及びその使用を下記実施例にて説明する。しかしながら、下記の記載は、例示的なものにすぎず、決して上記発明の一般性を制限するものと捉えるべきではないことが理解されるべきである。
【実施例】
【００９７】
（材料）
粗製カリカインは、乾燥パパイヤラテックス（Enzyme Solutions社）から抽出した（実施例2参照）。パパイヤラテックスは、パパイヤの果実から単離されたタンパク質分解酵素の食品等級混合物である。2回のラット肝臓リソソーム（RLL）アッセイにおいて、5mgの通常のグリアジン消化物量を該アッセイに使用して、粗製カリカインは、約10mg/mlの濃度でおよそ92%〜94%の良好な保護を提示した。
【００９８】
例えば、Cornell及びTownleyの文献（1973; Clinica Chimica Acta 49:181-188）並びにCornell及びTownleyの文献（1974; Gut, 15(11):862-869）に記載されるように、該ラット肝臓リソソーム（RLL）アッセイは、コムギグリアジンのペプシン-トリプシン-膵臓消化物が、ラット肝臓リソソームを破壊するという事実に基づいており、これらの小器官の懸濁液の光学濃度（400nmでの）の減少をもたらす。これは、消化物中に存在するペプチドによる細胞毒性反応の根拠となる。しかし、該酵素抽出物を毒性グリアジン消化物と、2時間プレインキュベートすると、該光学濃度の変化は、該リソソームとのインキュベート後に非常に小さくなる。対照（毒性消化物なし）、毒性試料（毒性のグリアジン消化物とインキュベートしたリソソーム）、及び抽出物処理した試料（リソソーム添加より前に酵素抽出物とプレインキュベートした毒性のグリアジン消化物）を比較することによって、保護の程度を測定することができる。保護指数（P.I.）は、下記式から算出することができる。
【数１】
2012515173.tif 000002
【００９９】
（実施例1：分画実験）
更にカリカインを特徴付けるために、パパイヤラテックスを、イオン交換カルボキシメチル（CM）セファデックスC-50カラム、及びサイズ排除セファクリルS-300カラムで分画した。
イオン交換カラム（3.2×20cm）を、0.02Mのリン酸緩衝液 pH4.6で平衡化し、2gの粗製パパインを開始緩衝液（30ml）に加えた。非吸収画分を得た後、pH6.8の0.05Mリン酸緩衝液の適用、次いで、同pHであるが0.1M、0.3M及び0.7Mの塩化ナトリウムを含有する塩含有緩衝液の適用により、pHを増大させることによって、他の画分を溶出した。該画分を蒸留水で透析し、凍結乾燥した。次いで、それらを10mg/mlの濃度でRLLアッセイを使用して試験した。結果を下記表1に示す。
【表１】
2012515173.tif 000003
【０１００】
その後、イオン交換クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーの両方から回収した画分を、RLLアッセイ（例えば、WO2003/100051、並びにCornell及びTownleyの文献（1973; Clinica Chimica Acta 49:181-188）を参照することにより本明細書中に記載；これらの内容物は参照により本明細書中に組込まれる。）及びPEPアッセイ（例えば、Martiらの文献、「全グルテンにおけるプロリルエンドペプチダーゼ媒介性のT細胞エピトープの破壊：化学的及び免疫学的特徴付け（Prolyl endopeptidase-mediated destruction of T cell epitopes in whole gluten: chemical and immunological characterization）」J Pharmacol Exp Ther. 2005, 312(1):19-26に記載；この内容物は参照により本明細書中に組込まれる。）の両方により試験して、パパイヤラテックスの活性画分を特徴付けした。該PEPアッセイは、Z-グリシルプロリン-4-ニトロ-アニリドを基質として使用して、プロリン残基のC末端側への攻撃速度を測定する。
【０１０１】
サイズ排除セファクリルS-300カラム（88×2.2cm）を、pH5.2のリン酸緩衝食塩水で平衡化し、該緩衝液（10ml）中1.2gのパパイヤラテックスの試料を慎重に加え、その後30ml/時の速度で溶出を続けた。15mlの画分を回収し、1Mの水酸化ナトリウムでpH7.5に調節し、各画分の0.2ml分量を使用して直接アッセイした。得られた結果を表2に示す。
【表２】
2012515173.tif 000004
【０１０２】
上記表2に示されるように、画分6及び7は、最も高い保護値を提示し、およそ30,000ダルトンMWのタンパク質に相当した。ベンゾイル-アルギニンエチルエステル（BAEE）アッセイ（例えば、Arnon R.の文献、(1970) Methods in Enzymology, XIX, 226-228；その内容物は参照により本明細書中に組込まれる。）による測定により、画分5は最大量のプロリルエンドペプチダーゼ（PEP）を含むが、画分8は最大量のプロテアーゼを有した。これら後者の酵素は、通常、約23,000ダルトンの分子量を有することが報告されている。
【０１０３】
（実施例2：植物/動物由来酵素の相乗効果）
ブタの腸内酵素抽出物（例えば、WO2003/100051に記載のもの）を、粗製カリカイン調製物と組合せて、毒性グルテンペプチドを解毒するそれらの能力に相乗効果があるかどうかを、先述のRRLアッセイを用いて測定し評価した。パパイヤラテックス抽出物を水に溶解すること、硫酸アンモニウムの濃度を60%の調整すること、得られた沈殿物を濾過により回収すること、それを透析すること、及び凍結乾燥することによって、粗製カリカインを調製した。この材料を、0.7Mの塩化ナトリウムを有する粗製QCの溶出を用い、リン酸緩衝液を使用するCMセファデックスクロマトグラフィーで更に濃縮し、続いて、透析し、凍結乾燥した。酵素調製物を、6mg/mlの濃度でRLLアッセイを使用して試験した。
【表３】
2012515173.tif 000005
【０１０４】
（実施例3：熱及び酸抵抗性）
カリカインは、加熱又は酸性環境に曝露後、その活性のおよそ70%の活性を保持することが示された。例えば、本出願人は、CMセファデックスクロマトグラフィーから得られた画分4が、85℃に加熱後にその活性の約80%を保持したという彼らの知見によって、カリカインが熱に対して高い抵抗性を有することを示した。更に、画分4を0.05Mの塩酸で15時間処理したときに、それはその活性の約70%を保持し、これはカリカインが酸抵抗性を有することも示している。
【０１０５】
（実施例4：プロテオミクス解析）
本出願人は、質量分析によって、上記実施例1（表1）に示された画分4における主要タンパク質としてカリカインを示した。
【表４】
2012515173.tif 000006
プロテオミクス解析は、ルードビッヒ癌研究所の関連プロテオミクスサービス施設（Joint Proteomics Services Facility）及びウォルター・エライザ・ホール医学研究所（メルボルン、オーストラリア）で、下記のパラメータを使用して実施された。
【表５】
2012515173.tif 000007
【０１０６】
（実施例5：精製カリカインのタンパク質分解活性）
精製カリカインの試料は、ブリュッセル自由大学、ベルギー（Yvan Looze教授のご厚意により；Azarkan Mらの文献、「カリカ・パパイヤのラテックスに貯蔵された酵素の分画及び精製（Fractionation and purification of the enzymes stored in the latex of Carica papaya）」J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci (2003) 790:229-238参照）から供給された。本出願人は、この精製カリカインの試料が、本明細書中に記載のラット肝臓リソソーム（RLL）アッセイにおいて、粗製カリカインと比較して高い活性を有することを示した。
【０１０７】
（算出）
RLLアッセイにおいてグリアジンに対して提示された保護＝32.3%。
比活性＝32.3/0.0043＝7512（式中、0.0043はアッセイにおいて、ミリグラム数である；すなわち、4.3マイクログラム）。
粗製カリカインの比活性は、40であった。したがって、7512/40＝188（比活性の比率である）倍の精製が達成された。
このように、精製カリカインの活性は、粗製カリカインの活性のおよそ190倍であり、RLLアッセイにおいて、4マイクログラムの低いレベルでさえも機能した。該結果は、カリカインがこのような研究において、グリアジンの解毒化に最も貢献していることを示している。
【０１０８】
（実施例6：グルテン不耐症及びセリアック病に関連した症状の治療におけるカリカイン抽出物の使用）
組織診によりセリアック病と診断された年齢45歳の男性について、彼の症状を、6週間の期間、カリカイン抽出物の錠剤を摂取することによって治療した。この期間彼は、各食事の開始時に1錠の錠剤（1錠あたり15mgのカリカイン）を摂取した。該患者は毎日、全ての症状の記録を続け、重症度に従ってそれを格付けした（0＝症状なし；3＝軽度の症状；6＝中等度の症状）。これら結果を、試験期間前の6週間（この期間該患者は、彼の症状を同じ方法で記録した）に得られた結果と比較した。
結果から、治療開始前の症状ポイント307から、治療終了時の症状ポイント86に、重症度が低下（72%低下）したことが示された。症状の重症度の大きな低下とは別に、該患者は、症状のない日を経験し、該錠剤が外食の不安を取り除いたとも回答した。グルテンへの曝露は、該錠剤を使用した場合に、以前の下痢の発生を軽い悪心の発生へと変化させた。
【０１０９】
（実施例7：グルテン不耐症及び疱疹状皮膚炎（DH）に関連した症状の治療におけるカリカイン抽出物の使用）
組織診によりDHと診断された年齢48歳の男性を、彼が中程度に有痛性のそう痒を発症するまで、朝食用シリアル及びトーストを含む食事、並びにサンドイッチを含む昼食を7日間経験させた。該そう痒を鎮静させるのに3週間与えた後、該患者に、7日間同じ食事を経験させ、この期間彼は、錠剤形態のカリカイン抽出物（1錠あたり15mgのカリカイン）による治療も、朝食及び昼食の各食事とともに摂取することで行われた。該患者は、彼がカリカイン抽出物の錠剤を摂取している間に、ほんの数回の軽度のそう痒が発症したことを指摘し、該錠剤が彼の疾患の症状を軽減するのに非常に有用であったとコメントした。体験から彼は、錠剤を用いない任意の更なるグルテン投与は、すぐに有痛性の発疹を生じるのに対し、カリカイン抽出物錠剤においては、軽度かつ低頻度のそう痒が、有痛性の発疹となるステージに進行しそうにないように考えられると指摘している。該結果は、DH罹患者が、カリカインによる処理が、グルテンの誤飲に対する予防手段を提供するできることを見出すか、又は彼らが重度の症状を発症することなしに、少量のグルテンに耐えるのを助ける可能性があることを示している。
【０１１０】
本願に基づいて、又は本願の優先権主張に基づいて、更なる特許出願を提出することが可能である。下記の特許請求項は、いかなるそのような更なる出願においても、主張され得るものの範囲を限定することを意図しないことが理解されるべきである。発明（単数又は複数）を定義する又は再定義するために、後日、特徴が該請求項に加えられ得るか、又は該請求項から除外され得る。
【図１】
2012515173.tif 000008
【図２】
2012515173.tif 000009
【図３】
2012515173.tif 000010
【図４】
2012515173.tif 000011
【手続補正書】
【提出日】平成22年6月21日(2010.6.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルテン不耐症に関連した状態の予防又は治療のための経口用組成物であって、少なくとも一部が精製されたカリカイン又はその生物活性のある断片、類似体若しくは変異体を含む、前記経口用組成物。
【請求項２】
前記経口用組成物の総重量の約5% w/w〜約95% w/wのカリカイン又はその生物活性のある断片、類似体若しくは変異体を含む、請求項1記載の経口用組成物。
【請求項３】
前記カリカインが、カリカ・パパイヤ由来のものである、請求項1又は2記載の経口用組成物。
【請求項４】
前記カリカインが、図1若しくは2に示されるアミノ酸配列、又はその生物活性のある断片、類似体若しくは変異体を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の経口用組成物。
【請求項５】
腸管抽出物を含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の経口用組成物。
【請求項６】
腸溶コーティングされた錠剤又はカプセルとして製剤された、請求項1〜5のいずれか一項記載の経口用組成物。
【請求項７】
グルテン不耐症に関連した状態の予防又は治療に使用するための経口用組成物であって、組換えカリカイン又はその生物活性のある断片、類似体若しくは変異体をコードする核酸分子を含む、前記経口用組成物。
【請求項８】
前記核酸分子が、図3若しくは4に示される核酸配列、又はその機能的等価物を含む、請求項7記載の経口用組成物。
【請求項９】
前記核酸分子が、図1若しくは2に示されるアミノ酸配列、又はその生物活性のある断片、類似体若しくは変異体をコードする、請求項7記載の経口用組成物。
【請求項１０】
グルテン不耐症に関連した状態の予防又は治療に使用するための経口用組成物であって、組換えカリカイン又はその生物活性のある断片、類似体若しくは変異体を発現することができる宿主細胞を含む、前記経口用組成物。
【請求項１１】
グルテン不耐症に関連した状態の予防又は治療のための方法であって、それを必要とする対象に、少なくとも一部が精製されたカリカイン又はその生物活性のある断片、類似体若しくは変異体を含む経口用組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項１２】
前記カリカインが、カリカ・パパイヤ由来のものである、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
前記カリカインが、図1若しくは2に示されるアミノ酸配列、又はその生物活性のある断片、類似体若しくは変異体を含む、請求項11又は12記載の方法。
【請求項１４】
それを必要とする対象に、腸管抽出物を含む組成物を投与することを含む、請求項11〜13のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
前記経口用組成物が、腸溶コーティングされた錠剤又はカプセルを含む、請求項11〜14のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
前記経口用組成物が、少なくとも15mgのカリカインを含む、請求項11〜15のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
グルテン不耐症に関連した状態の予防又は治療のための方法であって、それを必要とする対象に、請求項5記載の経口用組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項１８】
グルテン不耐症に関連した状態の予防又は治療のための方法であって、それを必要とする対象に、該対象において、組換えカリカイン又はその生物活性のある断片、類似体若しくは変異体を発現させることができる核酸分子を投与することを含む、前記方法。
【請求項１９】
前記核酸分子が、図1若しくは2に示されるアミノ酸配列、又はその生物活性のある断片、類似体若しくは変異体をコードする、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
前記核酸分子が、図3若しくは4に示される核酸配列、又はその機能的等価物を含む、請求項18記載の方法。
【手続補正書】
【提出日】平成24年4月11日(2012.4.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
（図）
【図１】カリカ・パパイヤのカリカインの一次アミノ酸配列を示す（GenBank受入番号X66060）（配列番号1）。
【図２】カリカ・パパイヤのカリカインの一次アミノ酸配列を示す（GenBank受入番号X69877）（配列番号2）。
【図３】カリカ・パパイヤのカリカインのmRNA配列を示す（GenBank受入番号X66060）（配列番号3）。
【図４】カリカ・パパイヤのカリカインのmRNA配列を示す（GenBank受入番号X69877）（配列番号4）。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2012515173000001.app
【国際調査報告】
2012515173.tif 000012
2012515173.tif 000013
2012515173.tif 000014