(57)【要約】タンデム質量分析計において、複数の前駆体イオンを処理する方法は、イオン源によって、複数の前駆体イオンを発生させるステップを含む。複数の前駆体イオンのうちの少なくとも一部は、イオントラップ内に捕捉される。少なくとも２つの着目前駆体イオンが、濾波雑音場によって、複数の前駆体イオンから隔離される。着目前駆体イオンは、衝突セルに向かって連続的に放出される。連続的に放出された着目前駆体イオンは、衝突セル内で分裂される。次いで、分裂されたイオンの質量対電荷比スペクトルが、質量分析計によって決定される。
2012521002.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンデム質量分析計において、複数の前駆体イオンを処理する方法であって、該方法は、
ａ．イオン源によって、複数の前駆体イオンを発生させることと、
ｂ．該複数の前駆体イオンの少なくとも一部をイオントラップ内に捕捉することと、
ｃ．濾波雑音場によって、少なくとも２つの着目前駆体イオンを該複数の前駆体イオンから隔離することと、
ｄ．着目前駆体イオンを衝突セルに向かって連続的に放出させることと、
ｅ．該連続的に放出された着目前駆体イオンを衝突セル内で分裂させることと、
ｆ．質量分析計によって、該分裂されたイオンの質量対電荷比スペクトルを決定することと
を含む、方法。
【請求項２】
前記着目前駆体イオンを隔離することは、徐々に狭くなるノッチを有する濾波雑音場を印加することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
着目前駆体イオンを隔離することは、線形イオントラップ内において着目前駆体イオンを隔離することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記分裂されたイオンの質量対電荷比スペクトルを決定することは、飛行時間型質量分析計、四重極質量分析計、イオントラップ質量分析計、軌道トラップ質量分析計、およびＦＴＭＳ質量分析計のうちの少なくとも１つによって、該質量対電荷比スペクトルを決定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記着目前駆体イオンを連続的に放出させることは、共鳴励起によって、該着目前駆体イオンを連続的に放出させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記着目前駆体イオンを隔離する前に、前記複数の前駆体イオンの中の前駆体イオンを識別することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
タンデム質量分析計において、複数の前駆体イオンを処理する方法であって、該方法は、
ａ．イオン源によって、複数の前駆体イオンを発生させることと、
ｂ．該複数の前駆体イオンの少なくとも一部をイオントラップ内に捕捉することと、
ｃ．濾波雑音場によって、該複数の前駆体イオンから少なくとも２つの着目前駆体イオンを隔離することと、
ｄ．第１の標的前駆体イオンを放出させることと、
ｅ．該放出された第１の標的前駆体イオンを分裂させることと、
ｆ．質量分析計によって、該分裂された第１の標的前駆体イオンの質量対電荷比スペクトルを決定することと、
ｇ．第２の標的前駆体イオンを放出させることと、
ｈ．該放出された第２の標的前駆体イオンを分裂させることと、
ｉ．質量分析計によって、該分裂された第２の標的前駆体イオンの質量対電荷比スペクトルを決定することと
を含む、方法。
【請求項８】
前記少なくとも２つの着目前駆体イオンを隔離することは、徐々に狭くなるノッチを有する濾波雑音場を印加することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記着目前駆体イオンを隔離する前に、前記複数の前駆体イオンの中の前駆体イオンを識別することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
タンデム質量分析計において、複数の前駆体イオンを処理する方法であって、該方法は、
ａ．イオン源によって、複数の前駆体イオンを発生させることと、
ｂ．第１のイオントラップ内に該複数の前駆体イオンを捕捉することと、
ｃ．該第１のイオントラップから第２のイオントラップまで、該複数の前駆体イオンの一部を転移させることと、
ｄ．濾波雑音場によって、該第２のイオントラップ内の少なくとも２つの着目前駆体イオンを隔離することと、
ｅ．該第２のイオントラップから、該着目前駆体イオンを連続的に放出させることと、
ｆ．該連続的に放出された着目前駆体イオンを衝突セル内で分裂させることと、
ｇ．質量分析計によって、該分裂された着目前駆体イオンの質量対電荷比スペクトルを決定することと
を含む、方法。
【請求項１１】
前記濾波雑音場によって、前記イオントラップ内の少なくとも２つの着目前駆体イオンを隔離することは、徐々に狭くなる幅のノッチを適用することを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記イオントラップから、前記着目前駆体イオンを連続的に放出させることは、共鳴励起によって、該着目前駆体イオンを連続的に放出させることを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記質量分析計によって、前記分裂された着目前駆体イオンの質量対電荷比スペクトルを決定することは、飛行時間型質量分析計、四重極質量分析計、およびＱｔｒａｐ質量分析計のうちの少なくとも１つによって、該質量対電荷比スペクトルを決定することを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記衝突セルの複数の前駆体イオンを捕捉する前に、該複数の前駆体イオンの少なくとも一部を識別することをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記第２のイオントラップから前記第１のイオントラップまで、前記複数の前駆体イオンの一部を転移させ、前記濾波雑音場によって、該イオントラップ内で着目前駆体イオンを隔離することを１回以上繰り返すことをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記第２のイオントラップは、前記衝突セルを備える、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
タンデム質量分析計において、複数の前駆体イオンを処理する方法であって、該方法は、
ａ．イオン源によって、複数の前駆体イオンを発生させることと、
ｂ．第１のイオントラップ内で該複数の前駆体イオンを捕捉することと、
ｃ．該第１のイオントラップから、着目前駆体イオンを放出させることと、
ｄ．第２のイオントラップによって、該放出された着目前駆体イオンを捕捉することと、
ｅ．該第２のイオントラップから、該着目前駆体イオンを連続的に放出させることと、
ｆ．該第２のイオントラップから放出された該着目前駆体イオンを分裂させることと、
ｇ．質量分析計によって、該放出された分裂着目前駆体イオンの質量対電荷比スペクトルを決定することと
を含む、方法。
【請求項１８】
前記第１および前記第２のイオントラップのうちの少なくとも１つから、前記着目前駆体イオンを放出させることは、共鳴励起によって、該着目前駆体イオンを放出させることを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記質量分析計によって、前記連続的に放出された分裂着目前駆体イオンの質量対電荷比スペクトルを決定することは、飛行時間型質量分析計、四重極質量分析計、およびＱｔｒａｐ質量分析計のうちの少なくとも１つによって、該質量対電荷比スペクトルを決定することを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記第２のイオントラップから、前記着目前駆体イオンを連続的に放出させる前に、濾波雑音場によって、該第２のイオントラップ内の該着目前駆体イオンを隔離することをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記イオントラップ内の複数の着目前駆体イオンを処理することは、徐々に狭くなる幅ノッチを有する濾波雑音場を印加することを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
タンデム質量分析計において、複数の前駆体イオンを処理する方法であって、該方法は、
ａ．イオン源によって、複数の前駆体イオンを発生させることと、
ｂ．濾波雑音場をイオントラップに印加することと、
ｃ．該濾波雑音場によって、該複数の前駆体イオンに該イオントラップを通過させることと、
ｄ．該イオントラップからの該複数の前駆体イオンを第２のイオントラップ内に捕捉することと、
ｅ．該第２のイオントラップ内の該複数の前駆体イオンの一部を該第１のイオントラップに逆転移させることと、
ｆ．該イオントラップから、着目前駆体イオンをそれらの質量対電荷比に従って、連続的に放出させることと、
ｇ．衝突セル内で該連続的に放出された着目前駆体イオンを分裂させることと、
ｈ．質量分析計によって、該連続的に放出された着目前駆体イオンの質量対電荷比スペクトルを決定することと
を含む、方法。
【請求項２３】
前記質量分析計によって、前記連続的に放出された着目前駆体イオンの質量対電荷比スペクトルを決定することは、飛行時間型質量分析計、四重極質量分析計、およびＱｔｒａｐ質量分析計のうちの少なくとも１つによって、該質量対電荷比スペクトルを決定することを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
濾波雑音場によって、前記イオントラップ内で前駆体イオンを隔離することをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記濾波雑音場によって、前記イオントラップ内で前駆体イオンを隔離することは、徐々に狭くなるノッチを有する濾波雑音場を印加することを備える、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
タンデム質量分析計において、複数の前駆体イオンを処理する方法であって、該方法は、
ａ．イオン源によって、複数の前駆体イオンを発生させることと、
ｂ．第１のイオントラップ内に該複数の前駆体イオンの少なくとも一部を捕捉することと、
ｃ．第２のイオントラップ内へと該複数の前駆体イオンの少なくとも一部を放出させることと、
ｄ．第２のイオントラップ内に該イオンを捕捉することと、
ｅ．該第２のイオントラップから衝突セル内へと標的前駆体イオンを連続的に放出させることと、
ｆ．該連続的に放出された標的前駆体イオンを分裂させることと、
ｇ．質量分析計によって、該分裂された標的前駆体イオンの質量対電荷比スペクトルを決定することと
を含む、方法
【請求項２７】
濾波雑音場によって、前記第２のイオントラップ内で標的前駆体イオンを隔離することをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
徐々に狭くなる幅ノッチを有する濾波雑音場を印加することをさらに備える、請求項２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本明細書に使用される見出しは、系統化目的のためだけのものであって、本願に説明される主題をいかようにも限定するものとして解釈されるべきではない。
【０００２】
タンデム質量分析計（ＭＳＭＳまたはＭＳ−ＭＳ装置と称される場合もある）は、２つ以上の質量分析器を有する質量分析計である。質量分析器は、必ずしも、同一種類の質量分析器である必要はない。種々のタンデム質量分析計の幾何学形状が存在する。例えば、四重極四重極、磁場型四重極、四重極線形イオントラップ、および四重極飛行時間型質量分析計幾何学形状を有するタンデム質量分析計が存在する。タンデム質量分析計は、通常、ある形態の分子分裂または反応によって分離される、複数回の質量分析が可能である。複数回の質量分析によって、研究者は、広範囲に及ぶ分子の構造および配列研究を行うことが可能となる。
【０００３】
本教示は、好適なおよび例示的な実施形態に従って、そのさらなる利点とともに、添付の図面と関連して検討される以下の発明を実施するための形態によって具体的に説明される。当業者は、以下に説明される図面が、例示目的にすぎないことを理解するであろう。図面は、必ずしも、正確な縮尺ではなく、代わりに、概して、本発明の原理を例示するために強調される。図面は、出願人の教示の範囲をいかようにも限定することを意図するものではない。
【０００４】
明細書内での「一実施形態」または「ある実施形態」という語句の参照は、実施形態と併せて説明される、特定の特徴、構造、または特性が、本発明の少なくとも一実施形態に含まれることを意味する。明細書中の種々の場所における「一実施形態では」という語句の表出は、必ずしも、すべて同一実施形態を指すわけではない。
【０００５】
本教示の方法の個々のステップは、本発明が動作可能のままである限り、任意の順番で、および／または同時に行ってもよいことを理解されたい。さらに、本教示の装置および方法は、本発明が動作可能のままである限り、任意の数または全部の説明される実施形態を含むことが可能であることを理解されたい。
【０００６】
次に、添付の図面に示されるように、その例示的実施形態を参照して、本教示をより詳細に説明する。本教示は、種々の実施形態および実施例と併せて説明されるが、本教示をそのような実施形態に限定されることを意図するものではない。対照的に、本教示は、当業者によって理解されるように、種々の代替、修正、および均等物を包含する。本明細書の教示へのアクセスを有する当業者は、本明細書に説明されるように、本開示の範囲内にある、付加的実装、修正、および実施形態、ならびに他の使用分野を認識するであろう。
【０００７】
従来のタンデム質量分析計では、イオン源からの各前駆体イオンは、ＭＳＭＳのために、連続的に選択される。１つの前駆体イオンのＭＳＭＳスペクトルが得られている間、他の前駆体イオンは、並行して処理不可能であるので浪費される。前駆体イオンの混合物の連続的処理は、非効率的であって、試料材料は、浪費される。成分の濃度が非常に低い、多数の質量分析法用途では、いくつかの成分は、成分毎にＭＳＭＳスペクトルを得るための十分な時間がないので、完全に逸失され得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
イオントラップは、多くの飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析計において使用され、試料効率を改善する。イオントラップを有する飛行時間型質量分析計は、多重測定を行うことが可能である。線形イオントラップ（ＬＩＴ）等の質量選択イオントラップは、イオン源によって発生されるイオンを捕捉し、イオントラップから、衝突セル内へ、次いで、直交注入ＴＯＦ質量分析計等の質量分析計内へとイオンを選択的に放出可能である。イオントラップによって、研究者は、イオン源によって発生される実質的に全部または高割合のイオンの質量対電荷比を測定可能となる。
【０００９】
いくつかの質量分析計システムおよびいくつかの質量分析計システムを動作させるモードでは、イオントラップは、比較的に大きな密度のイオンを捕捉可能であって、したがって、比較的に高いレベルの空間電荷が、イオントラップ内に存在可能である。イオントラップ内にイオンが多過ぎると、イオントラップ内の電場は、歪曲される。イオントラップ内の比較的に高い空間電荷は、イオントラップからの質量選択放出を非効率的なことにする。加えて、イオントラップ内の比較的に高い空間電荷は、イオントラップのイオン選択性を低減させる。
【００１０】
比較的に高いレベルの空間電荷に付随する問題を解決する方法の１つは、有意に低減したレベルの空間電荷を被るように、着目イオンを隔離するイオントラップ内に濾波雑音場（ｆｉｌｔｅｒｅｄ  ｎｏｉｓｅ  ｆｉｅｌｄ）（ＦＮＦ）を確立することである。例えば、異なる質量対電荷比値を有するいくつかの着目イオンが存在する場合、ＦＮＦが、イオントラップ内に印加され、着目質量対電荷比値の各々の付近の質量窓領域を隔離し、それによって着目外の全イオンを排除し、それらの着目イオンのみをイオントラップ内に残すことが可能である。しかしながら、非常に高いレベルの空間電荷がイオントラップ内に存在すると、ＦＮＦを効果的に採用して着目イオンを隔離することが、困難となる可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、本教示に従って、濾波雑音場によって着目イオンを隔離し、多重測定を行うイオントラップを含む、タンデム質量分析計を例示する。
【図２】図２は、本教示に従って、濾波雑音場によって着目イオンを隔離し、多重の測定を行う２つのイオントラップを含む、タンデム質量分析計を例示する。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
図１は、本教示に従って、濾波雑音場によって着目イオンを隔離し、多重測定を行うイオントラップ１０２を含む、タンデム質量分析計１００を例示する。タンデム質量分析計１００は、カーテンプレート１０６に向かって方向付けされたイオンを発生させるイオン源１０４を含む。エレクトロスプレーイオン源等の多数の種類のイオン源を使用可能である。オリフィスプレート１０８は、カーテンプレート１０６に隣接して配置され、質量分析計１００の分析セクション内への望ましくない中性の流れを低減させる、オリフィスプレート１０８とカーテンプレート１０６との間に、カーテンガスを含有可能なカーテンチャンバ１１０を形成する。
【００１３】
スキマープレート１１２は、オリフィスプレート１０８に隣接して配置される。中間圧力チャンバ１１４は、オリフィスプレート１０８とスキマープレート１１２との間に形成される。スキマープレート１１２は、スキマープレート１１２を通って、タンデム質量分析計１００の第１のチャンバ１１６内へと通過するように設計される。第１のチャンバ１１６は、スキマープレート１１２を通過するイオンを収集および集束し、質量分析計の分析セクションへとイオンを方向付ける、イオンガイドＱ０  １１８を含む。第１の四重極間障壁またはレンズＩＱ１  １２０は、イオントラップ１０２から、第１のチャンバ１１６を分離するように配置される。レンズＩＱ１  １２０は、イオンを通過させるための開口を有する。
【００１４】
イオントラップ１０２は、第１のレンズＩＱ１  １２０に隣接する、入力を伴って配置される。波形発生器１２２の出力は、イオントラップ１０２に連結される。波形発生器１２２は、本明細書に説明されるように、イオントラップ１０２内の着目イオンを隔離するために使用される、濾波雑音場を発生させる。第２の四重極間障壁またはレンズＩＱ２  １２４は、イオントラップ１０２の出力端に配置される。
【００１５】
衝突ガス１２７を含有する、衝突セル１２６は、第２のレンズＩＱ２  １２４に隣接する入力を伴って配置される。第３の四重極間障壁またはレンズＩＱ３  １２８は、衝突ガス１２７が衝突セル１２６に進入すると、比較的に高い圧力に維持可能なように、衝突セル１２６の出力端に配置される。本圧力は、検体依存性であって、いくつかの検体に対して、約５ｍＴｏｒｒである可能性がある。衝突セル１２６によって発生される生成イオンは、レンズＱ３  １２８を通って、出口１３０へと通過する。
【００１６】
質量分析計１３２は、衝突セル１２６によって発生される生成イオンを受容する入力を伴って配置される。多数の種類の質量分析計１３２を使用可能である。例えば、質量分析計１３２は、ＱＴｒａｐ線形イオントラップ、四重極質量フィルタ、または直交ＴＯＦ質量分析計である可能性がある。直交ＴＯＦ質量分析計は、高質量分解能および高質量精度を有するが、本質的に、直交幾何学形状のデューティサイクル損失のため、限定された効率性を被る。デューティサイクルを改善する方法は、米国特許第６，２８５，０２７号および第６，５０７，０１９号（本譲受人に譲渡される）に開示されている。これらの方法は、直交ＴＯＦ質量分析計のデューティサイクルを改善し、最大試料効率およびイオン利用を達成するために使用されてもよい。
【００１７】
図２は、本教示に従って、濾波雑音場によって着目イオンを隔離し、多重測定を行う、２つのイオントラップを含む、タンデム質量分析計２００を例示する。タンデム質量分析計２００は、図１と併せて説明された、タンデム質量分析計１００に類似する。しかしながら、タンデム質量分析計２００は、直列に配置される、第１の１０２と、第２のイオントラップ１０３と、を含む。波形発生器１２２の出力は、イオントラップ１０２に連結され、波形発生器１２３の出力は、イオントラップ１０３に連結される。第１の１０２および第２のイオントラップ１０３は各々、別個のイオントラップとして動作可能である。本明細書に説明されるように、波形発生器１２２は、イオントラップ１０２内の着目イオンを隔離するために使用される濾波雑音場を発生させ、波形発生器１２３は、イオントラップ１０３内の着目イオンを隔離するために使用される濾波雑音場を発生させる。
【００１８】
当業者は、図１および２の表現は、概略であって、種々の付加的要素が、機能的装置を完成させるために必要となるであろうことを理解されたい。例えば、タンデム質量分析計１００、２００の異なる要素に、ＡＣおよびＤＣ電圧を送達するために、種々の電源が必要とされる。加えて、タンデム質量分析計の種々のチャンバの動作圧力を所望の動作レベルに維持するために、真空ポンプ配列が必要とされる。
【００１９】
多くの質量分析用途は、複合混合物中の複数の成分の識別を必要とする。タンデム質量分析法は、多くの場合、複合混合物中の各化合物の識別を提供する最も好適な方法である。多くの用途では、混合物の成分は、液体クロマトグラフィによっては、完全に分離されず、したがって、複数の成分は、イオン源１０４内に混合物として存在する。質量スペクトルは、これらの複数の成分に対応する多くのピークを含有し得る。
【００２０】
図１および２と併せて説明されるタンデム質量分析計は、複合試料中の複数の成分に対して、ＭＳＭＳスペクトルを提供することが可能である、高効率質量分析計である。これらのタンデム質量分析計を使用して、複数の前駆体イオンを処理および特性化する、多数の動作モードならびに方法が存在する。用途に応じて、イオントラップ１０２は、多重化せずに、正常ＭＳＭＳ動作のための質量フィルタとして動作可能であるか、または着目前駆体イオンの隔離を提供する濾波雑音場によって、イオントラップとして動作可能である。動作モードに応じて、図１および２と併せて説明されるタンデム質量分析計は、本明細書に説明されるように、高いレベルの空間電荷が存在する場合でも、高効率および高選択性を伴って動作可能である。
【００２１】
本教示に従う種々の方法では、イオン源１０４は、典型的には、多くの前駆体イオンから構成されるイオンの混合物を発生させる。イオンの混合物は、カーテンプレート１０６および隣接するオリフィスプレート１０８に向かって方向付けされる。カーテンガスは、カーテンチャンバ１１０内へと流入し、質量分析計の分析セクション内への望ましくない中性の流れを低減させることが可能である。いくつかの動作モードでは、オリフィスプレート１０８とスキマープレート１１２との間の中間圧力チャンバ１１４内の圧力は、約２Ｔｏｒｒである。イオンの混合物は、スキマープレート１１２を通って、質量分析計１００の第１のチャンバ１１６内へと通過する。
【００２２】
イオンガイドＱ０  １１８は、スキマープレート１１２を通過するイオンを収集および集束し、質量分析計１００の分析セクションへとイオンを方向付ける。種々の動作モードでは、イオン源１０４からの前駆体イオンは、Ｑ０イオンガイド１１８内に捕捉または留保され得る一方、前駆体イオンのバッチは、処置される。すなわち、イオンの混合物は、イオンガイドＱ０  １１８内に捕捉され得る一方、イオンは、イオントラップ１０２および／または１０３内で処理される。これは、本方法の全体的デューティサイクルを向上させ、着目前駆体イオンが浪費されないように、前駆体イオンを保存する。
【００２３】
第１の四重極間障壁またはレンズＩＱ１  １２０は、第１のチャンバ１１６からイオントラップ１０２に、イオンを通過させる。いくつかの方法では、質量スペクトル測定は、濾波雑音場によって、着目前駆体イオンを隔離する前に、すべての前駆体イオンを識別するように行われる。
【００２４】
波形発生器１２２は、イオントラップ１０２に印加される複数のノッチを有する濾波雑音場信号を発生させる。イオントラップ１０２は、複数の前駆体イオンから、少なくとも２つの着目前駆体イオンを捕捉または隔離する。いくつかの方法では、着目前駆体イオンは、数ミリ秒の間、イオントラップ１０２内の衝突によって冷却される。次いで、所望の前駆体イオンは、分裂のために、イオントラップ１０２から、衝突セル１２６に向かって、その中へと軸方向に放出される。
【００２５】
本発明は、着目前駆体イオンを捕捉または隔離する種々のモードを想定する。一動作モードでは、いかなるイオンも浪費することなく、着目前駆体イオンを捕捉し、次いで、前駆体イオンの各々の生成イオンスペクトル（または、いくつかの所望の生成イオンスペクトルのサブセット）を得ることが望ましい。本動作モードは、小試料のみが利用可能であるときに、非常に効率的かつ有用である。
【００２６】
着目前駆体イオンを捕捉または隔離する別のモードでは、前駆体イオンの一部が、フィルタリングによって選択され、次いで、選択された前駆体イオンのみが、分裂のために、衝突セル１２６内へと伝送される。本捕捉モードでは、四重極イオントラップ１０２は、質量フィルタとして使用され、イオンは、イオントラップ１０３内に捕捉される。例えば、四重極質量フィルタ１０２は、低い分解能で動作し、イオンが捕捉される、イオントラップ１０３へと、比較的に広い質量範囲を伝送可能である。質量フィルタ１０２は、着目質量範囲内ではない全イオンを排除することによって、イオントラップ１０３内の空間電荷を実質的に減少させる。例えば、質量範囲３５０乃至４５０ａｍｕは、四重極質量フィルタ１０２によって、イオントラップ１０３内へと伝送され得る。次いで、伝送される質量範囲内の着目前駆体イオンは、その質量対電荷比に従って、イオントラップ１０３から、衝突セル１２６に向かって連続的に放出される。本明細書で使用されるように、用語「連続的に放出される」とは、一度に全部または瞬時にではなく、一定の時間にわたってイオンが放出されることを意味する。本教示は、多数の種類の順序を想定する。例えば、一方法では、１つの前駆体イオンが、イオントラップ１０２から、分裂のために、衝突セル１２６を通って放出された後、第２の前駆体イオンが、イオントラップ１０２から、衝突セル１２６内へと放出される。各標的前駆体イオンは、順序通り、選択された前駆体イオンのすべてが処理されるまで、分裂のために放出される。
【００２７】
前駆体イオンの質量対電荷比値は、非連続的であってもよい。例えば、ｍ／ｚ３８２が、最初に放出され得る。次いで、ｍ／ｚ４０３が、放出され得る。次いで、ｍ／ｚ４２２が、放出され得る。代替として、着目イオンは、そのｍ／ｚ値の順番を考慮せずに、放出され得る。本実施例を使用して、着目イオンは、ｍ／ｚ４０３、次いで、３８２、次いで、４２２の順番で放出され得る。これは、ＲＦ周波数またはＲＦ振幅を変更することによって、双極励起の周波数および／または着目イオンのｑ−値を変更することによって達成可能である。本明細書に説明される種々の方法では、着目イオンの連続的放出は、各々、波形発生器１２２または１２３から適切な電圧および波形を印加することによって、イオントラップ１０２またはイオントラップ１０３から行うことが可能である。
【００２８】
前駆体イオンは、いくつかの方法のうちの任意の１つによって放出可能である。例えば、前駆体イオンは、当技術分野において周知である、共鳴励起によって放出可能である。共鳴励起によって、ＲＦ四重極内の異なる質量対電荷比値のイオンが、最初に、電極上に固定ＲＦ電圧とともに捕捉される。特定の質量対電荷比値のイオンまたは質量対電荷値の範囲が、２つの対向ロッド間に双極励起を印加することによって、または４つのロッドに四重極ＡＣ励起電圧を印加することによって、励起される。
【００２９】
放射励起は、着目イオンの振動の永年周波数に対応する周波数で印加され、イオントラップ１０２からの出口に印加されるＤＣ障壁を越えて、選択された質量対電荷値のイオンを軸方向に放出させる。いくつかの方法では、前駆体イオンは、径方向閉込め場によって、軸方向の高調波ＤＣウェルの中に捕捉される。特定の質量対電荷値の選択的放出は、着目イオンの振動周波数と共鳴する周波数において、軸方向内に前駆体イオンの運動を励起することによって達成可能である。励起は、イオントラップ１０２から、出口近傍の障壁を越えてイオンを放出可能である。
【００３０】
衝突セル１２６は、連続的に放出された着目前駆体イオンを生成イオンへと分裂させる。種々の方法では、生成イオンは、さらなる処理のために、衝突セル１２６内に捕捉可能である、または第２の質量分析計に向かって伝送可能である。質量分析計１３２は、生成イオンまたは選択された標的生成イオンの質量スペクトルを記録する。
【００３１】
次いで、生成イオンの質量対電荷比スペクトルは、質量分析計１３２によって、決定可能である。本教示は、飛行時間型質量分析計、四重極質量分析計、イオントラップ質量分析計、軌道トラップ質量分析計、およびＦＴＭＳ質量分析計等の多数の種類の質量分析計を想定する。加えて、本教示は、質量定量分析を行うために使用する一般的方法である、選択的反応監視（ＳＲＭ）または複数の反応監視（ＭＲＭ）等の多数の種類の反応監視を想定する。
【００３２】
実際は、多数のイオンの存在は、運動のイオン周波数が、イオントラップ１０２内の空間電荷の量の関数であるように、イオントラップ１０２内の電場を修正する、高いレベルの空間電荷をもたらす。質量選択の効率および選択性は、イオンの共鳴周波数が、イオントラップ内のイオンの数に伴って変換するので、有意に低減される可能性がある。本教示の種々の方法は、イオントラップ１０２内の空間電荷に寄与する、望ましくないイオンを放出させることによって、イオントラップ１０２内の高いレベルの空間電荷の影響を克服する。これらの方法では、望ましくないイオンは、イオントラップ１０２から、イオントラップ１０２のロッド上で損失されるように、半径方向に放出される。空間電荷の量は、望ましくないイオンが放出されると減少し、その結果、着目イオンの励起周波数は、より正確に予測可能となる。
【００３３】
本教示は、イオントラップ１０２内の比較的に高い空間電荷の存在の下においてイオンを効率的に隔離し、高イオン電流によって、タンデム質量分析計の感度および動的範囲を改善するためのいくつかの方法を含む。イオントラップ１０２内の多数の望ましくないイオンを排除する方法の１つは、着目前駆体イオンの周波数に対応する、広周波数範囲内のノッチによって、広範囲の励起周波数を有する波形をイオントラップ１０２に印加することである。そのような波形は、当技術分野において、濾波雑音場（ＦＮＦ）波形と称される。ＦＮＦ波形は、望ましくないイオンが、イオントラップのロッドに損失されるまで、半径方向に励起される一方、着目イオンが励起されないように、選択される。
【００３４】
イオントラップ内の空間電荷が比較的に高いレベルにある、いくつかの動作モードでは、ＦＮＦ波形を印加することは、望ましくないイオンを排除し、着目イオンを留保することに有効ではないであろう。この非有効性は、空間電荷のレベルが、着目イオンの共鳴周波数がその予測された共鳴周波数から有意に変化するほど十分に高くないときに生じる。この状況では、ＦＮＦ波形内のノッチは、着目前駆体イオンの共鳴周波数と整合しない。したがって、着目前駆体イオンの周波数は、ノッチのないＦＮＦ波形内の領域へとシフトし、その結果、これらの着目イオンは、イオントラップ１０２から放出される。本教示は、高い空間電荷に関するこれらの問題を克服して、着目イオンを隔離することにおいて良好な選択性を提供するためのいくつかの方法を含む。方法は、ＭＳＭＳに先立って、前駆体イオンを隔離するか、またはｎ番目のＭＳまたはイオン反応等の他の処理を行うことに先立って、ＭＳＭＳまたは他の手段によって既に処理された着目イオンを隔離するために使用することが可能である。
【００３５】
そのような方法の１つでは、波形発生器１２２は、広いかまたは粗い隔離窓領域を有するＦＮＦ波形を発生させ、次いで、短時間の間、信号をイオントラップ１０２に印加する。そのようなＦＮＦ波形を印加することは、空間電荷を有意に減少させ、また、イオントラップ１０２内に、着目前駆体イオンとともに、着目イオンの各々の質量対電荷比値の付近の窓領域内にある質量対電荷比値を有する他のイオンを残すであろう。いくつかの方法では、波形発生器１２２は、次いで、望ましくないイオンの数をさらに減少させる、段階的に細かくなるステップにおいて、徐々に細かくなるノッチを含む、ＦＮＦ波形を発生させる。故に、ＦＮＦ波形は、着目イオンの各々の付近の隔離窓領域を、したがって、着目イオンが被る空間電荷効果を効果的に縮小させる。
【００３６】
別の方法では、ＦＮＦ波形は、所望の着目イオンの各々の付近を中心とする広範囲の質量対電荷比値を除く、比較的に広いノッチとともに発生される。広ノッチを含むことによって、所望の前駆体イオンの共鳴周波数が、空間電荷の存在によってシフトされる場合でも、共鳴周波数が、依然として、広ノッチの幅内に残留することが保証される。広ノッチを有するそのようなＦＮＦ波形は、着目前駆体イオンが存在しない波形スペクトルの領域内の有意な数の望ましくないイオンの放出をもたらす、したがって、空間電荷を有意に低減させることが可能である。
【００３７】
広ノッチを有するＦＮＦ波形が、実質的な数の望ましくないイオンを放出させるために十分な長い時間の間、印加された後、より狭いノッチを有する第２のＦＮＦ波形が印加される。第２のＦＮＦ波形は、着目イオンの質量対電荷比に近い質量対電荷比を有する、望ましくないイオンを排除することによって、空間電荷をさらに減少させる。
【００３８】
徐々に狭くなるノッチを印加し、着目前駆体イオンのみをより選択的に留保するプロセスは、イオントラップ１０２内の空間電荷が、ある閾値または標的レベルを下回って減少させられるまで継続される。次いで、特定の前駆体イオンが、イオントラップ１０２から、衝突セル１２６内へと連続的に放出される。次いで、衝突セル１２６内に発生された生成イオンは、ＭＳＭＳ分析のために、質量分析計１３２へと通過される。
【００３９】
上述のように、段階的ステップにおいて、ＦＮＦ波形をイオントラップ１０２に印加した後、実質的に着目前駆体イオンのみが、さらなる処理のために、イオントラップ１０２内に残留する。大部分の他のイオンは、イオントラップ１０２から、実質的に放出される。着目前駆体イオンは、いくつかの大きく異なる質量対電荷比値にある可能性がある。望ましくないイオンの放出は、イオントラップ内に遥かにより小さい集団のイオンを、したがって、イオントラップ内に遥かに少ない空間電荷をもたらす。その結果、望ましくないイオンの放出は、着目前駆体イオンの励起周波数を遥かにより予測可能にし、したがって、着目イオンは、イオントラップから衝突セル１０２に向かって、より選択的に放出可能となる。
【００４０】
比較的に高い空間電荷またはイオン電流の存在の下において、イオンを効率的に隔離する、別の方法は、第１のイオントラップ１０２内にイオンを捕捉し、次いで、経時的に、イオントラップ１０３内へと前駆体イオンをゆっくりと転移させる一方、波形発生器１２３が、濾波雑音場をイオントラップ１０３に印加するというものである。前駆体イオンをゆっくりと転移させることは、イオンすべてが、ＦＮＦを印加する前に、イオントラップ１０３内にともに捕捉される他の方法と比較して、充填されることに伴ってイオントラップ１０３内の空間電荷を減少させる。本方法では、イオントラップ１０３内のイオンは、イオントラップ１０３内のイオンの数が、隔離の際、大幅に縮小され得るため、空間電荷の減少を被る。
【００４１】
イオントラップ１０２内の比較的に高い空間電荷の存在下、イオンを効率的に隔離する、さらに別の方法は、イオントラップ１０２内にイオンすべてを捕捉し、次いで、段階的に、それらをイオントラップ１０３へと転移させ、そこで、着目前駆体イオンは、ＦＮＦ波形によって隔離されるというものである。イオントラップ１０３内の小さい割合のイオンの隔離は、空間電荷効果の低減によって達成可能である。イオントラップ１０３内の第１の割合のイオンを隔離した後、イオントラップ１０２内の第２の割合のイオンが、イオントラップ１０３に転移可能となり、次いで、ＦＮＦが、再印加され、着目前駆体イオンを隔離可能となる。本プロセスは、実質的に全イオンがイオントラップ１０３内に隔離されるまで、繰り返すことが可能である。本プロセスでは、イオントラップ１０３内のイオンは、イオントラップ１０３内のイオンの数が、隔離の間、大幅に減少され得るので、隔離ステップの間、空間電荷効果の低減を被る。
【００４２】
本教示に従って、高い空間電荷の存在の下において有効である、ＦＮＦ波形を発生させるさらに別の方法では、イオン源１０４からの全前駆体イオンが、最初に、イオントラップ１０２から下流の衝突セル１２６内に捕捉される。次いで、衝突セル１２６内に捕捉された前駆体イオンの一部が、衝突セル１２６から、イオントラップ１０２内へと逆転移される。次いで、ＦＮＦ波形が、イオントラップ１０２に印加され、着目前駆体イオンを隔離させる。本方法では、イオントラップ１０２内の空間電荷の量を着目前駆体イオンの効率的な隔離を得るために十分な低レベルまで減少させるために十分な少量の捕捉されたイオンが、イオントラップ１０２内へと逆転移されることが可能である。
【００４３】
ＦＮＦ波形を印加後のある時点において、衝突セル１２６内に捕捉された前駆体イオンの別の一部が、衝突セル１２６から、イオントラップ１０２内へと逆転移される。次いで、ＦＮＦ波形が、イオントラップ１０２に再印加される。本プロセスは、実質的に全イオンが、イオントラップ１０２に逆転移され、隔離されるまで、繰り返すことが可能である。段階的方法によって、ＦＮＦ波形は、大量のイオンおよびそれに付随するより高いレベルの空間電荷の存在下、着目前駆体イオンの漸増的隔離によって、効果的に使用される。例えば、特定の方法の１つでは、イオンの約１０％が、各ステップにおいて、転移される。転移されるイオンの量は、増加前に、短い時間の間、レンズＩＱ２  １２４上の電圧を降下させることによって制御可能である。電圧が降下する時間の長さによって、転移されるイオンの数を制御可能である。実際は、転移させるステップの時間周期は、イオントラップ１０２内のイオンが枯渇することに伴って、漸増的に増加可能である。衝突セル１２６内に軸方向電場を印加し、イオントラップ１０２に向かって、イオン流を制御するのを補助することは、有用であり得る。例えば、軸方向場は、電圧が降下すると、イオンが障壁に接近するように、障壁として作用するレンズＩＱ２  １２４に向かって方向付けされてもよい。
【００４４】
本教示に従って、高い空間電荷の存在の下で有効である、ＦＮＦ波形を発生させる別の方法は、最初に、イオン源からのイオンをイオントラップ１０２から下流の衝突セル１２６内に捕捉するというものである。ＦＮＦ波形は、イオントラップ１０２に継続的に印加される一方、前駆体イオンは、衝突セル１２６から、イオントラップ１０２内へと、ゆっくりとではあるが、継続的に逆転移される。衝突セル１２６からイオントラップ１０２内へとイオンを段階的に転移させることは、衝突セル１２６とイオントラップ１０２との間のポテンシャル障壁として作用する、レンズＩＱ２  １２４上の電圧を徐々に降下させることによって達成可能である。障壁は、下方に徐々に傾斜させられ、徐々により多くのイオンをイオントラップ１０２内へと分散可能である。ポテンシャル障壁が降下される速度は、イオンがイオントラップ１０２内へと転移される速度を制御可能である。プロセスを段階的にすることによって、ＦＮＦをイオントラップ１０２に印加しながら、イオントラップ１０２内のイオンの数は、空間電荷が、着目前駆体イオンの効果的隔離を可能にするために十分な低い値に維持されるように制御可能である。例えば、レンズＩＱ２  １２４上の電圧は、１００ｍｓにわたって、イオンが転移不可能な値から、全イオンが転移される値まで、線形的に減少させることが可能である。いくつかのイオンは、他のイオンよりもエネルギー性であるので、よりエネルギー性のまたは熱的により熱いイオンは、最初に、電圧が降下されることに伴って障壁を越え、転移され、低いエネルギー性のイオンは、傾斜において、後に転移されるであろう。ある場合には、レンズＩＱ２  １２４に印加される電圧勾配は、時間的に非線形であってもよい。
【００４５】
前駆体イオンが、完全に転移され、イオントラップ１０２内に隔離されると、それらは、分裂のために、衝突セル１２６内へと連続的に放出される。衝突セル１２６内の軸方向電場は、出口１３０に向かって、イオンを押動させるために使用可能である。選択された前駆体イオンの各ＭＳＭＳスペクトル測定は、ほんの１０−２０ｍｓだけを必要としてもよい。合計取得時間は、比較的に短い可能性がある。例えば、イオントラップ１０２を充填するステップが、約１０ｍｓかかり、段階的隔離ステップが、約１００ｍｓかかる場合、１０個のＭＳＭＳスペクトルは、合計時間約２１０乃至３１０ｍｓ内で取得することが可能であると推定される。
【００４６】
本教示に従って、高い空間電荷の存在の下において有効である、ＦＮＦ波形を発生させる別の方法は、ＦＮＦ波形をイオントラップ１０２に印加する一方、前駆体イオンが、イオントラップ１０２を通って流動し、（分裂せずに）衝突セル１２６内に捕捉されるというものである。本方法では、イオンは、イオントラップ１０２内に捕捉されない。イオントラップ１０２を通る前駆体イオンの典型的な遷移時間は、約１ｍｓ未満である。本流入動作モードは、着目前駆体イオンの粗い隔離のみを提供する。しかしながら、流入動作モードは、衝突セル１２６に到達する前に、有意な数の望ましくない前駆体イオンを除去する。したがって、衝突セル１２６内に捕捉される、望ましくない前駆体イオンの数は、有意に減少される。
【００４７】
衝突セル１２６が、所望の程度にまで充填されると、次いで、イオンは、イオントラップ１０２内に逆転移される一方、イオン源１０４からの前駆体イオンは、イオンガイドＱ０  １１８内の上流に捕捉される。イオントラップ１０２内に捕捉される前駆体イオンは、さらに処理され、より長い時間にわたってＦＮＦ波形をイオントラップ１０２に再印加することによって、ＭＳＭＳのために、全標的前駆体イオンを隔離可能である。加えて、前駆体イオンの混合物もまた、分裂のために、着目前駆体イオンを衝突セル１２６内へと連続的に放出させることによって処理可能である。
【００４８】
本教示に従う、図２とともに説明されたタンデム質量分析計２００等の２つのイオントラップを含む、タンデム質量分析計は、空間電荷の効果を低減させる付加的動作モードを達成可能である。例えば、２つのイオントラップを有するタンデム質量分析計は、２ステップの軸方向放出プロセスによって、着目前駆体イオンの隔離を提供可能である。イオンは、最初に、イオントラップ１０２内に捕捉される。次いで、中程度に高い振幅の励起波形が、着目前駆体イオンの周波数に対応する周波数において、イオントラップ１０２に印加される。例えば、１０個の着目前駆体イオンが存在する場合、当技術分野において周知のように、双極または四重極励起を使用して、１０個の異なる励起周波数をイオントラップ１０２に印加可能である。励起振幅が比較的に高い場合、各標的値の付近の比較的に広範囲のイオン質量対電荷比値が、障壁レンズＩＱ２を越えて、イオントラップ１０３内へと励起および転移されるであろう。空間電荷が、着目イオンの周波数をシフトさせる場合でも、各標的質量対電荷比値の付近の比較的に広い質量範囲が転移される場合、イオントラップ１０３内へと転移可能となる。
【００４９】
例えば、標的イオン質量対電荷比値が、ｍ／ｚ４３２であって、高い空間電荷が、イオントラップ１０２内に存在する場合、ｍ／ｚ４３２の永年周波数は、実際には、ｍ／ｚ４２５のイオンに対応する周波数であってもよい。しかしながら、中程度に高い振幅励起が印加される場合、ｍ／ｚ４２５にある着目イオンを含む、値４２０と４５０との間のｍ／ｚのイオンは、転移されてもよい。これは、イオントラップ１０２からイオントラップ１０３へのある範囲のイオンの高速かつ粗い転移を提供する。全着目前駆体イオンとともに、異なる質量対電荷比値の多くの他のイオンが、イオントラップ１０３内に捕捉されるように、複数の高振幅波形が、粗い分解能によってイオントラップ１０２から１０３内へと着目イオンを転移させるように印加可能である。しかしながら、多くのイオンは、依然として、イオントラップ１０２内に残留するであろうが、いかなるノッチも伴わない高振幅ＦＮＦによって、または他の方法によって、排除可能である。イオントラップ１０３内に残留するイオンは、イオントラップ１０２内にあったときより少ない空間電荷を有するであろう。
【００５０】
さらに、本明細書に説明されるＦＮＦ方法は、イオントラップ１０３内に個々の着目前駆体イオンを隔離するために使用可能である。着目イオンは、衝突セル１２６内へと連続的に放出可能である。代替として、イオントラップ１０２からイオントラップ１０３内へとイオンを転移させた後、空間電荷は、周波数が空間電荷によって影響を受けないように十分に低い値まで低減されてもよい。次いで、着目イオンは、ＦＮＦを印加せずに、イオントラップ１０３から連続的に放出され、イオンをさらに隔離可能となる。
【００５１】
いくつかの動作モードでは、イオントラップ１０２内の空間電荷の量を減少させる必要性はない。例えば、イオン源１０４によって発生されるイオンの強度は、空間電荷が転移プロセスに影響を及ぼさないように十分に低くてもよい。これらの動作モードでは、ＦＮＦ波形を使用して、前駆体イオンを隔離する必要はない。実質的に全イオンが、イオントラップ１０２内に捕捉可能となり、数ミリ秒の間、冷却される。次いで、着目前駆体イオンは、分裂のために、衝突セル１２６に連続的に転移され、次いで、測定のために、質量分析計１３２に転移可能である。これは、特に、イオンがイオンガイドＱ０  １１８内に留保される一方、前駆体イオンがイオントラップ１０２内および衝突セル１２６内で処理される場合、全着目前駆体イオンの高い効率処理を可能にする。
【００５２】
本教示に従って、タンデム質量分析計を動作させる種々のモードでは、ＭＳＭＳスペクトルは、イオン源によって発生される前駆体イオンの一部または全部に対して取得可能である。例えば、動作モードの１つでは、全イオンが、イオントラップ１０２内に捕捉され、次いで、前駆体イオンが、その質量対電荷比に従って、順序通り、連続的に放出される。特定の動作モードの１つでは、前駆体イオンは、最低の質量対電荷比値から開始し、最高の質量対電荷比値まで進むように放出される。本動作モードでは、ＭＳＭＳ測定は、高い効率性によって、１回の実験において全前駆体イオンに対して取得可能である。
【００５３】
本教示に従う、タンデム質量分析計の別の動作モードでは、ある特定の前駆体イオンおよび／または生成イオンのみの強度が、継続的に測定される。そのような測定は、高速で取得可能である。本動作モードでは、着目前駆体イオンを捕捉し、次いで、放出させることによってイオンを処理することは、不必要または望ましくない場合がある。タンデム質量分析計１００は、イオントラップ１０２を通して、分裂される前駆体イオンを伝送させることによって、捕捉することなく動作可能である。代わりに、イオントラップ１０２は、ＲＦ／ＤＣ分解モードで動作し、所望の順序において、１つの選択された前駆体から別の選択された前駆体へと進み、次いで、ＭＳＭＳスペクトルを取得する。
【００５４】
例えば、イオントラップ１０２は、本伝送モードでは、質量フィルタとして動作し、１ａｍｕの小ステップサイズを有する選択された質量範囲を通して進み、各前駆体イオンに関するＭＳＭＳスペクトルを取得可能である。例えば、ＭＳＭＳスペクトルの取得速度は、１０ｍｓ毎に約１つのＭＳＭＳスペクトル、または５ｍｓ毎に約１つのＭＳＭＳスペクトルであることさえ可能である。本動作モードは、より高速であるが、潜在的に低感度を有する分析もたらす。また、動作モードは、試料を効率的に使用せず、いくつかの用途に対して好適ではなくなる。
【００５５】
本教示に従う、タンデム質量分析計の別の動作モードでは、非常に狭い範囲の前駆体イオン質量対電荷比のみが測定される。本動作モードでは、イオントラップ１０２は、高分解能質量選別器であって、処理のために、衝突セル１２６内への幅１ａｍｕを遥かに下回り得る、非常に狭い範囲の質量対電荷比値を可能にするように構成される。例えば、特定の方法の１つでは、前駆体イオン質量対電荷比値の範囲は、幅０．１ａｍｕ未満である。この高分解能モードは、狭い質量範囲にわたってイオントラップ１０２を非常にゆっくりと走査することによって達成可能である。非常にゆっくりとした走査は、小質量窓領域内の等重の成分を分離するために、非常に狭い質量範囲にわたって行うことが可能である（「ズーム走査」）か、またはフル走査を完了するためにより長い時間を必要とする、より広い質量範囲にわたって行われてもよい。本方法では、同一公称質量であるが、異なる正確な質量の前駆体イオンを分離することが可能である。本方法は、複合試料内の信号対雑音（Ｓ／Ｎ）を改善する。
【００５６】
当業者は、本教示に従う、タンデム質量分析計の動作が、イオントラップ１０２が前駆体イオン選択のためのＲＦ／ＤＣ四重極質量フィルタである動作モードから、本明細書に説明されるように、軸方向電場によってイオンが捕捉され、次いで、イオントラップ１０２から放出される動作モードに容易に変更可能であることを理解するであろう。例えば、いくつかの質量分析計では、動作モードは、ソフトウェアによって完全に制御可能である。
【００５７】
（均等物）
出願人の教示は、種々の実施形態と併せて説明されるが、出願人の教示がそのような実施形態に限定されることを意図するものではない。対照的に、出願人の教示は、当業者によって理解されるように、教示の精神および範囲から逸脱することなく、本明細書に成され得る、種々の代替、修正、および均等物を包含する。
【図１】
2012521002.tif 000003
【図２】
2012521002.tif 000004
【国際調査報告】
2012521002.tif 000005
2012521002.tif 000006
2012521002.tif 000007