(57)【要約】  イソプロパノール経路を有する非天然微生物には、イソプロパノール経路酵素をコードする少なくとも１つの外来性核酸を含む。該経路には、4-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼ、クロトナーゼ、3-ヒドロキシブチリル-CoA脱水素酵素、アセトアセチル-CoAシンテターゼ、アセチル-CoA：アセトアセタート-CoAトランスフェラーゼ、アセトアセチル-CoAヒドロラーゼ、アセトアセタートデカルボキシラーゼ、及びアセトン還元酵素から選択される1つの酵素を含む。W-ブタノール経路を有する非天然微生物には、w-ブタノール経路酵素をコードする少なくとも1つの外来性核酸を含む。他の非天然微生物は、w-ブタノール経路又はイソブタノール経路を有する。該生物を培養して、イソプロパノール、w-ブタノール、又はイソブタノールを産生する。【選択図】 図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
イソプロパノールを産生するのに十分な量で発現するイソプロパノール経路酵素をコードする少なくとも1つの外来性核酸を含むイソプロパノール経路を有する微生物を含み、該イソプロパノール経路が 4-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼ、クロトナーゼ、3-ヒドロキシブチリル-CoA脱水素酵素、アセトアセチル-CoAシンテターゼ、アセチル-CoA：アセトアセタート-CoAトランスフェラーゼ、アセトアセチル-CoAヒドロラーゼ、アセトアセタートデカルボキシラーゼ、及びアセトン還元酵素からなる群から選択される酵素を含む、非天然微生物。
【請求項２】
前記微生物が、イソプロパノール経路酵素を各々コードする2つの外来性核酸を含む、請求項１に記載の非天然微生物。
【請求項３】
前記微生物が、イソプロパノール経路酵素を各々コードする3つの外来性核酸を含む、請求項１に記載の非天然微生物。
【請求項４】
前記微生物が、イソプロパノール経路酵素を各々コードする4つの外来性核酸を含む、請求項１に記載の非天然微生物。
【請求項５】
前記微生物が、イソプロパノール経路酵素を各々コードする5つの外来性核酸を含む、請求項１に記載の非天然微生物。
【請求項６】
前記微生物が、イソプロパノール経路酵素を各々コードする6つの外来性核酸を含む、請求項１に記載の非天然微生物。
【請求項７】
前記微生物が、イソプロパノール経路酵素を各々コードする7つの外来性核酸を含む、請求項１に記載の非天然微生物。
【請求項８】
前記微生物が、イソプロパノール経路酵素を各々コードする8つの外来性核酸を含む、請求項１に記載の非天然微生物。
【請求項９】
前記少なくとも1つの外来性核酸が異種性核酸である、請求項１に記載の非天然微生物。
【請求項１０】
前記非天然微生物が、実質的に嫌気性培地中にある、請求項１に記載の非天然微生物。
【請求項１１】
前記4-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼが、fumA、fumB、fumC、fumH、fum1、MmcB、MmcC、hmd、BACCAP_02294、ANACOL_02527、NtherDRAFT_2368、dmdA、dmdB、crt、crt1、paaA、paaB、phaA、phaB、maoC、paaF、paaG、abfD、及びMsed_l220からなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項１に記載の非天然微生物。
【請求項１２】
前記4-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼがabfDによってコードされる、請求項１１に記載の非天然微生物。
【請求項１３】
前記クロトナーゼが、fumA、fumB、fumC、fumH、fum1、MmcB、MmcC、hmd、BACCAP_02294、ANACOL_02527、NtherDRAFT_2368、dmdA、dmdB、crt、crt1、paaA、paaB、phaA、phaB、maoC、paaF、paaG、abfD、及びMsed_1220からなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項１に記載の非天然微生物。
【請求項１４】
前記クロトナーゼが、crt、crt1、paaA、paaB、phaA、phaB、maoC、paaF、及びpaaGからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項１３に記載の非天然微生物。
【請求項１５】
前記3-ヒドロキシブチリル-CoA脱水素酵素が、thrA、akthr2、hom6、hom1、hom2、fadB、fadJ、Hbd2、Hbdl、hbd、HSD17B10、phbB、phaB、Msed_1423、Msed_0399、Msed_0389、Msed_1993、adh、adhA、adh‐A、mdh、ldhA、ldh、及びbdhからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項１に記載の非天然微生物。
【請求項１６】
前記3-ヒドロキシブチリル-CoA脱水素酵素が、hbd、Hbd2、Hbdl、Msed_1423、Msed_0399、Msed_0389、Msed_1993、fadB、及びfadJからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項１５に記載の非天然微生物。
【請求項１７】
前記アセトアセチル-CoAシンテターゼが、sucC、sucD、AACS、AF1211、scs、及びPAE3250からなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項１に記載の非天然微生物。
【請求項１８】
前記アセトアセチル-CoAシンテターゼが、sucC、sucD、AACS、及びAF1211からなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項１７に記載の非天然微生物。
【請求項１９】
前記アセチル-CoA：アセトアセタート-CoAトランスフェラーゼが、atoA、atoD、actA、cgO592、ctfA、ctfB、cat1、cat2、cat3、gctA、gctB、HPAGl_0676、HPAGl_0677、ScoA、及びScoBからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項１に記載の非天然微生物。
【請求項２０】
前記アセチル-CoA：アセトアセタート-CoAトランスフェラーゼが、 atoA、atoD、actA、cgO592、ctfA、ctfB、HPAGl_0676、HPAGl_0677、ScoA、及びScoBからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項１９に記載の非天然微生物。
【請求項２１】
前記アセトアセチル-CoAヒドロラーゼが、acotl2、hibch、BC_2292、tesB、acot8、tesA、ybgC、paaI、及びybdBからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項１に記載の非天然微生物。
【請求項２２】
前記アセトアセチルCoAヒドロラーゼが、acot12、hibch、及びtesAからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項２１に記載の非天然微生物。
【請求項２３】
前記アセトアセタートデカルボキシラーゼが、pdc、pdc1、mdlC、dpgB、ilvB-1、kgd、kdcA、lysA、panD、dmpH、dmpE、xylII、xylIII、Reut_B5691、Reut_B5692、CAD、pad1、pofK、（pad）、padC、及びpadからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項１に記載の非天然微生物。
【請求項２４】
前記アセトアセタートデカルボキシラーゼが、Adc、cbei_3835、CLL_A2135、RBAM_030030からなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項２３に記載の非天然微生物。
【請求項２５】
前記アセトン還元酵素が、thrA、akthr2、hom6、hom1、hom2、fadB、fadJ、Hbd2、Hbd1、hbd、HSD17B10、phbB、phaB、Msed_1423、Msed_0399、Msed_0389、Msed_1993、adh、adhA、adh‐A、mdh、ldhA、ldh、及びbdhからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項１に記載の非天然微生物。
【請求項２６】
前記アセトン還元酵素が、adh、adhA、及びadh‐Aからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項２５に記載の非天然微生物。
【請求項２７】
イソプロパノールを産生する条件下及び十分な時間で、請求項１に記載の非天然微生物を培養することを含む、イソプロパノールを産生する方法。
【請求項２８】
前記微生物が、イソプロパノール経路酵素を各々コードする2つの外来性核酸を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記微生物が、イソプロパノール経路酵素を各々コードする3つの外来性核酸を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記微生物が、イソプロパノール経路酵素を各々コードする4つの外来性核酸を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記微生物が、イソプロパノール経路酵素を各々コードする5つの外来性核酸を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記微生物が、イソプロパノール経路酵素を各々コードする6つの外来性核酸を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
前記微生物が、イソプロパノール経路酵素を各々コードする7つの外来性核酸を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
前記微生物が、イソプロパノール経路酵素を各々コードする8つの外来性核酸を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３５】
前記非天然微生物が、実質的に嫌気性培地中にある、請求項２７に記載の方法。
【請求項３６】
前記少なくとも1つの外来性核酸が異種性核酸である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３７】
前記4-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼが、fumA、fumB、fumC、fumH、fum1、MmcB、MmcC、hmd、BACCAP_02294、ANACOL_02527、NtherDRAFT_2368、dmdA、dmdB、crt、crt1、paaA、paaB、phaA、phaB、maoC、paaF、paaG、abfD、及びMsed_1220からなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項２７に記載の方法。
【請求項３８】
前記4-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼが、abfDによってコードされる、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記クロトナーゼが、fumA、fumB、fumC、fumH、fum1、MmcB、MmcC、hmd、BACCAP_02294、ANACOL_02527、NtherDRAFT_2368、dmdA、dmdB、crt、crt1、paaA、paaB、phaA、phaB、maoC、paaF、paaG、abfD、及びMsed_1220からなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項２７に記載の方法。
【請求項４０】
前記クロトナーゼが、crt、crt1、paaA、paaB、phaA、phaB、maoC、paaF、及びpaaGからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記3-ヒドロキシブチリル-CoA脱水素酵素が、thrA、akthr2、hom6、hom1、hom2、fadB、fadJ、Hbd2、Hbd1、hbd、HSD17B10、phbB、phaB、Msed_1423、Msed_0399、Msed_0389、Msed_1993、adh、adhA、adh‐A、mdh、ldhA、ldh、及びbdhからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項２７に記載の方法。
【請求項４２】
前記3-ヒドロキシブチリル-CoA脱水素酵素が、hbd、Hbd2、Hbdl、Msed_1423、Msed_0399、Msed_0389、Msed_1993、fadB、及びfadJからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記アセトアセチル-CoAシンテターゼが、sucC、sucD、AACS、AF1211、scs、及びPAE3250からなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項２７に記載の方法。
【請求項４４】
前記アセトアセチル-CoAシンテターゼが、sucC、sucD、AACS、及びAF1211からなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記アセチル-CoA：アセトアセタート-CoAトランスフェラーゼが、atoA、atoD、actA、cgO592、ctfA、ctfB、catl、cat2、cat3、gctA、gctB、HPAGl_0676、HPAGl_0677、ScoA、及びScoBからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項２７に記載の方法。
【請求項４６】
前記アセチル-CoA：アセトアセタート-CoAトランスフェラーゼが、atoA、atoD、actA、cgO592、ctfA、ctfB、HPAGl_0676、HPAGl_0677、ScoA、及びScoBからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記アセトアセチル-CoAヒドロラーゼが、acotl2、hibch、BC_2292、tesB、acot8、tesA、ybgC、paaI、及びybdBからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項２７に記載の方法。
【請求項４８】
前記アセトアセチル-CoAヒドロラーゼが、acot12、hibch、及びtesAからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記アセトアセタートデカルボキシラーゼが、pdc、pdc1、mdlC、dpgB、ilvB‐1、kgd、kdcA、lysA、panD、dmpH、dmpE、xylII、xylIII、Reut_B5691、Reut_B5692、CAD、padl、pofK、（pad）、padC、及びpadからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項２７に記載の方法。
【請求項５０】
前記アセトアセタートデカルボキシラーゼが、Adc、cbei_3835、CLL_A2135、RBAM_030030からなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項２７に記載の方法。
【請求項５１】
前記アセトン還元酵素が、thrA、akthr2、hom6、hom1、hom2、fadB、fadJ、Hbd2、Hbd1、hbd、HSD17B10、phbB、phaB、Msed_1423、Msed_0399、Msed_0389、Msed_1993、adh、adhA、adh‐A、mdh、ldhA、ldh、及びbdhからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項２７に記載の方法。
【請求項５２】
前記アセトン還元酵素が、adh、adhA、及びadh‐Aからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
n-ブタノールを産生するのに十分な量で発現するn-ブタノール経路酵素をコードする少なくとも1つの外来性核酸を含むn-ブタノール経路を有する微生物を含み、該n-ブタノール経路が、4-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼ、クロトノイル-CoA還元酵素、ブチリル-CoA還元酵素（アルデヒド形成）、ブチルアルデヒド還元酵素、及びブチリル-CoA還元酵素（アルコール形成）からなる群から選択される酵素を含む、非天然微生物。
【請求項５４】
前記微生物が、n-ブタノール経路酵素を各々コードする2つの外来性核酸を含む、請求項５３に記載の非天然微生物。
【請求項５５】
前記微生物が、n-ブタノール経路酵素を各々コードする3つの外来性核酸を含む、請求項５３に記載の非天然微生物。
【請求項５６】
前記微生物が、n-ブタノール経路酵素を各々コードする4つの外来性核酸を含む、請求項５３に記載の非天然微生物。
【請求項５７】
前記少なくとも1つの外来性核酸が異種性核酸である、請求項５３に記載の非天然微生物。
【請求項５８】
前記非天然微生物が、実質的に嫌気性培地中にある、請求項５３に記載の非天然微生物。
【請求項５９】
前記4-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼが、fumA、fumB、fumC、fumH、fuml、MmcB、MmcC、hmd、BACCAP_02294、ANACOL_02527、NtherDRAFT_2368、dmdA、dmdB、crt、crt1、paaA、paaB、phaA、phaB、maoC、paaF、paaG、abfD、及びMsed_l220からなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項５３に記載の非天然微生物。
【請求項６０】
前記4-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼが、abfDによってコードされる、請求項５９に記載の非天然微生物。
【請求項６１】
前記クロトノイル-CoA還元酵素が、bcd、etfA、etfB、Ter、TDE0597、IBD、RPA3448、FadH、及びenrからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項５３に記載の非天然微生物。
【請求項６２】
前記クロトノイル-CoA還元酵素が、bcd、etfA、etfB、Ter、及びTDE0597からなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項６１に記載の非天然微生物。
【請求項６３】
前記ブチリル-CoA還元酵素（アルデヒド形成）が、acrl、sucD、bphG、adhE、Msed_0709、mcr、asd‐2、Saci_2370、Ald、及びeutEからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項５３に記載の非天然微生物。
【請求項６４】
前記ブチリル-CoA還元酵素（アルデヒド形成）が、sucD、bphG、Msed_0709、mcr、及びAldからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項６３に記載の非天然微生物。
【請求項６５】
前記ブチルアルデヒド還元酵素が、alrA、ADH2、yqhD、bdhI、bdhII、adhA、4hbd、adhI、P84067、mmsb、dhat、及び3hidhからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項５３に記載の非天然微生物。
【請求項６６】
前記ブチルアルデヒド還元酵素が、alrA、ADH2、yqhD、bdhI、bdhII、4hbd、adhl、及びmmsbからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項６５に記載の非天然微生物。
【請求項６７】
前記ブチリル-CoA還元酵素（アルコール形成）が、adhE、adhE2、mcr、Rcas_2929、NAPl_02720、MGP2080_00535、及びFARからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項５３に記載の非天然微生物。
【請求項６８】
前記ブチリル-CoA還元酵素（アルコール形成）が、adhE2、mcr、及びFARからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項６７に記載の非天然微生物。
【請求項６９】
n-ブタノールを産生する条件下及び十分な時間で、請求項５３に記載の非天然微生物を培養することを含む、n-ブタノールを産生する方法。
【請求項７０】
前記微生物が、n-ブタノール経路酵素を各々コードする2つの外来性核酸を含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記微生物が、n-ブタノール経路酵素を各々コードする3つの外来性核酸を含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
前記微生物が、n-ブタノール経路酵素を各々コードする4つの外来性核酸を含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７３】
前記少なくとも1つの外来性核酸が異種性核酸である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７４】
前記非天然微生物が、実質的に嫌気性培地中にある、請求項６９に記載の方法。
【請求項７５】
前記4-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼが、fumA、fumB、fumC、fumH、fum1、MmcB、MmcC、hmd、BACCAP_02294、ANACOL_02527、NtherDRAFT_2368、dmdA、dmdB、crt、crt1、paaA、paaB、phaA、phaB、maoC、paaF、paaG、abfD、及びMsed_l220からなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項６９に記載の方法。
【請求項７６】
前記4-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼが、abfDによってコードされる、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記クロトノイル-CoA還元酵素が、bcd、etfA、etfB、Ter、TDE0597、IBD、RPA3448、FadH、及びenrからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項６９に記載の方法。
【請求項７８】
前記クロトノイル-CoA還元酵素が、bcd、etfA、etfB、Ter、及びTDE0597からなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記ブチリル-CoA還元酵素（アルデヒド形成）が、acr1、sucD、bphG、adhE、Msed_0709、mcr、asd‐2、Saci_2370、Ald、及びeutEからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項６９に記載の方法。
【請求項８０】
前記ブチリル-CoA還元酵素（アルデヒド形成）が、sucD、bphG、Msed_0709、mcr、及びAldからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記ブチルアルデヒド還元酵素が、alrA、ADH2、yqhD、bdhI、bdhII、adhA、4hbd、adhI、P84067、mmsb、dhat、及び3hidhからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項６９に記載の方法。
【請求項８２】
前記ブチルアルデヒド還元酵素が、alrA、ADH2、yqhD、bdhI、bdhII、4hbd、adhI、及びmmsbからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記ブチリル-CoA還元酵素（アルコール形成）が、adhE、adhE2、mcr、Rcas_2929、NAPl_02720、MGP2080_00535、及びFARからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項６９に記載の方法。
【請求項８４】
前記ブチリル-CoA還元酵素（アルコール形成）が、adhE2、mcr、及びFARからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
イソブタノールを産生するのに十分な量で発現するイソブタノール経路酵素をコードする少なくとも1つの外来性核酸を含むイソブタノール経路を有する微生物を含み、該イソブタノール経路が、4-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼ、クロトノイル-CoA還元酵素、イソブチリル-CoAムターゼ、4-ヒドロキシブチリル-CoAムターゼ、3-ヒドロキシイソブチリル-CoAデヒドラターゼ、メタクリリル-CoA-還元酵素、イソブチリル-CoA還元酵素（アルデヒド形成）、イソブチルアルデヒド還元酵素、及びイソブチリル-CoA還元酵素（アルコール形成）からなる群から選択される酵素を含む、非天然微生物。
【請求項８６】
前記微生物が、イソブタノール経路酵素を各々コードする2つの外来性核酸を含む、請求項８５に記載の非天然微生物。
【請求項８７】
前記微生物が、イソブタノール経路酵素を各々コードする3つの外来性核酸を含む、請求項８５に記載の非天然微生物。
【請求項８８】
前記微生物が、イソブタノール経路酵素を各々コードする4つの外来性核酸を含む、請求項８５に記載の非天然微生物。
【請求項８９】
前記微生物が、イソブタノール経路酵素を各々コードする5つの外来性核酸を含む、請求項８５に記載の非天然微生物。
【請求項９０】
前記少なくとも1つの外来性核酸が異種性核酸である、請求項８５に記載の非天然微生物。
【請求項９１】
前記非天然微生物が、実質的に嫌気性培地中にある、請求項８５に記載の非天然微生物。
【請求項９２】
1セットのイソブタノール経路酵素が、4-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼ、クロトノイル-CoA還元酵素、イソブチリル-CoAムターゼ、イソブチリル-CoA還元酵素（アルデヒド形成）、及びイソブチルアルデヒド還元酵素を含む、請求項８５に記載の非天然微生物。
【請求項９３】
1セットのイソブタノール経路酵素が、4-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼ、クロトノイル-CoA還元酵素、イソブチリル-CoAムターゼ、及びイソブチリル-CoA還元酵素（アルコール形成）を含む、請求項８５に記載の非天然微生物。
【請求項９４】
1セットのイソブタノール経路酵素が、4-ヒドロキシブチリル-CoAムターゼ、3-ヒドロキシイソブチリル-CoAデヒドラターゼ、メタクリリル-CoA還元酵素、イソブチリル-CoA還元酵素（アルデヒド形成）、及びイソブチルアルデヒド還元酵素を含む、請求項８５に記載の非天然微生物。
【請求項９５】
1セットのイソブタノール経路酵素が、4-ヒドロキシブチリル-CoAムターゼ、3-ヒドロキシイソブチリル-CoAデヒドラターゼ、メタクリリル-CoA-還元酵素、及びイソブチリル-CoA還元酵素（アルコール形成）を含む、請求項８５に記載の非天然微生物。
【請求項９６】
前記4-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼが、fumA、fumB、fumC、fumH、fum1、MmcB、MmcC、hmd、BACCAP_02294、ANACOL_02527、NtherDRAFT_2368、dmdA、dmdB、crt、crt1、paaA、paaB、phaA、phaB、maoC、paaF、paaG、abfD、及びMsed_l220からなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項８５に記載の非天然微生物。
【請求項９７】
前記4-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼが、abfDによってコードされる、請求項９６に記載の非天然微生物。
【請求項９８】
前記クロトノイル-CoA還元酵素が、bcd、etfA、etfB、Ter、TDE0597、IBD、RPA3448、FadH、及びenrからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項８５に記載の非天然微生物。
【請求項９９】
前記クロトノイル-CoA還元酵素が、bcd、etfA、etfB、Ter、及びTDE0597からなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項９８に記載の非天然微生物。
【請求項１００】
前記イソブチリル-CoAムターゼが、icm、icmB、icmA、Mpe_B0538、Mpe_B0541、scpA、mutA、mutB、mcmA、mcmB、sbm、SARI_04585、YfreA_01000861、argK、PPA0597、及びmeaBからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項８５に記載の非天然微生物。
【請求項１０１】
前記イソブチリル-CoAムターゼが、icmB、icmA、Mpe_B0538、及びMpe_B0541からなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項１００に記載の非天然微生物。
【請求項１０２】
前記4-ヒドロキシブチリル-CoAムターゼが、icm、icmB、icmA、Mpe_B0538、Mpe_B0541、scpA、mutA、mutB、mcmA、mcmB、sbm、SARI_04585、YfreA_01000861、argK、PPA0597、及びmeaBからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項８５に記載の非天然微生物。
【請求項１０３】
前記4-ヒドロキシブチリル-CoAムターゼが、icmB、icmA、Mpe_B0538、及びMpe_B0541からなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項１０２に記載の非天然微生物。
【請求項１０４】
前記3-ヒドロキシイソブチリル-CoAデヒドラターゼが、fumA、fumB、fumC、fumH、fum1、MmcB、MmcC、hmd、BACCAP_02294、ANACOL_02527、NtherDRAFT_2368、dmdA、dmdB、crt、crt1、paaA、paaB、phaA、phaB、maoC、paaF、paaG、abfD、及びMsed_1220からなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項８５に記載の非天然微生物。
【請求項１０５】
前記3-ヒドロキシイソブチリル-CoAデヒドラターゼが、crt、crt1、paaA、paaB、phaA、phaB、maoC、paaF、及びpaaGからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項１０４に記載の非天然微生物。
【請求項１０６】
前記メタクリリル-CoA還元酵素が、bcd、etfA、etfB、Ter、TDE0597、IBD、RPA3448、FadH、及びenrからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項８５に記載の非天然微生物。
【請求項１０７】
前記メタクリリル-CoA還元酵素が、bcd、etfA、etfB、Ter、及びTDE0597からなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項１０６に記載の非天然微生物。
【請求項１０８】
前記イソブチリル-CoA還元酵素（アルデヒド形成）が、acr1、sucD、bphG、adhE、Msed_0709、mcr、asd‐2、Saci_2370、Ald、及びeutEからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項８５に記載の非天然微生物。
【請求項１０９】
前記イソブチリル-CoA還元酵素（アルデヒド形成）が、sucD、bphG、Msed_0709、mcr、及びAldからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項１０８に記載の非天然微生物。
【請求項１１０】
前記イソブチルアルデヒド還元酵素が、alrA、ADH2、yqhD、bdhI、bdhII、adhA、4hbd、adhI、P84067、mmsb、dhat、及び3hidhからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項８５に記載の非天然微生物。
【請求項１１１】
前記イソブチルアルデヒド還元酵素が、alrA、ADH2、yqhD、bdhI、bdhII、4hbd、adhI、P84067、及びmmsbからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項１１０に記載の非天然微生物。
【請求項１１２】
前記イソブチリル-CoA還元酵素（アルコール形成）が、adhE、ahdE2、mcr、Rcas_2929、NAP1_02720、MGP2080_00535、及びFARからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項８５に記載の非天然微生物。
【請求項１１３】
前記イソブチリル-CoA還元酵素（アルコール形成）が、adhE2、mcr、及びFARからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項１１２に記載の非天然微生物。
【請求項１１４】
イソブタノールを産生する条件下及び十分な時間で、請求項８５に記載の非天然微生物を培養することを含む、イソブタノールを産生する方法。
【請求項１１５】
前記微生物が、イソブタノール経路酵素を各々コードする2つの外来性核酸を含む、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
前記微生物が、イソブタノール経路酵素を各々コードする3つの外来性核酸を含む、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１７】
前記微生物が、イソブタノール経路酵素を各々コードする4つの外来性核酸を含む、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１８】
前記少なくとも1つの外来性核酸が異種性核酸である、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１９】
前記非天然微生物が、実質的に嫌気性培地中にある、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１２０】
1セットのイソブタノール経路酵素が、4-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼ、クロトノイル-CoA還元酵素、イソブチリル-CoAムターゼ、イソブチリル-CoA還元酵素（アルデヒド形成）、及びイソブチルアルデヒド還元酵素を含む、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１２１】
1セットのイソブタノール経路酵素が、4-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼ、クロトノイル-CoA還元酵素、イソブチリル-CoAムターゼ、及びイソブチリル-CoA還元酵素（アルコール形成）を含む、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１２２】
1セットのイソブタノール経路酵素が、4-ヒドロキシブチリル-CoAムターゼ、3-ヒドロキシイソブチリル-CoAデヒドラターゼ、メタクリリル-CoA-還元酵素、イソブチリル-CoA還元酵素（アルデヒド形成）、及びイソブチルアルデヒド還元酵素を含む、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１２３】
1セットのイソブタノール経路酵素が、4-ヒドロキシブチリル-CoAムターゼ、3-ヒドロキシイソブチリル-CoAデヒドラターゼ、メタクリリル-CoA-還元酵素、及びイソブチリル-CoA還元酵素（アルコール形成）を含む、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１２４】
前記4-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼが、fumA、fumB、fumC、fumH、fum1、MmcB、MmcC、hmd、BACCAP_02294、ANACOL_02527、NtherDRAFT_2368、dmdA、dmdB、crt、crt1、paaA、paaB、phaA、phaB、maoC、paaF、paaG、abfD、及びMsed_1220からなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１２５】
前記4-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼが、abfDによってコードされる、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２６】
前記クロトノイル-CoA還元酵素が、bcd、etfA、etfB、Ter、TDE0597、IBD、RPA3448、FadH、及びenrからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１２７】
前記クロトノイル-CoA還元酵素が、bcd、etfA、etfB、Ter、及びTDE0597からなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
前記イソブチリル-CoAムターゼが、icm、icmB、icmA、Mpe_B0538、Mpe_B0541、scpA、mutA、mutB、mcmA、mcmB、sbm、SARI_04585、YfreA_0l000861、argK、PPA0597、及びmeaBからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１２９】
前記イソブチリル-CoAムターゼが、icmB、icmA、Mpe_B0538、及びMpe_B0541からなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３０】
前記4-ヒドロキシブチリル-CoAムターゼが、icm、icmB、icmA、Mpe_B0538、Mpe_B0541、scpA、mutA、mutB、mcmA、mcmB、sbm、SARI_04585、YfreA_0l000861、argK、PPA0597、及びmeaBからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１３１】
前記4-ヒドロキシブチリル-CoAムターゼが、icmB、icmA、Mpe_B0538、及びMpe_B0541からなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３２】
前記3-ヒドロキシイソブチリル-CoAデヒドラターゼが、fumA、fumB、fumC、fumH、fum1、MmcB、MmcC、hmd、BACCAP_02294、ANACOL_02527、NtherDRAFT_2368、dmdA、dmdB、crt、crt1、paaA、paaB、phaA、phaB、maoC、paaF、paaG、abfD、及びMsed_l220からなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１３３】
前記3-ヒドロキシイソブチリル-CoAデヒドラターゼが、crt、crt1、paaA、paaB、phaA、phaB、maoC、paaF、及びpaaGからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３４】
前記メタクリリル-CoA還元酵素が、bcd、etfA、etfB、Ter、TDE0597、IBD、RPA3448、FadH、及びenrからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１３５】
前記メタクリリル-CoA還元酵素が、bcd、etfA、etfB、Ter、及びTDE0597からなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１３６】
前記イソブチリル-CoA還元酵素（アルデヒド形成）が、acr1、sucD、bphG、adhE、Msed_0709、mcr、asd‐2、Saci_2370、Ald、及びeutEからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１３７】
前記イソブチリル-CoA還元酵素（アルデヒド形成）が、sucD、bphG、Msed_0709、mcr、及びAldからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項１３６に記載の方法。
【請求項１３８】
前記イソブチルアルデヒド還元酵素が、alrA、ADH2、yqhD、bdhI、bdhII、adhA、4hbd、adhI、P84067、mmsb、dhat、及び3hidhからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１３９】
前記イソブチルアルデヒド還元酵素が、alrA、ADH2、yqhD、bdhI、bdhII、4hbd、adhI、P84067、及びmmsbからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４０】
前記イソブチリル-CoA還元酵素（アルコール形成）が、adhE、adhE2、mcr、Rcas_2929、NAPl_02720、MGP2080_00535、及びFARからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１４１】
前記イソブチリル-CoA還元酵素（アルコール形成）が、adhE2、mcr、及びFARからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、請求項１４０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の技術）
本出願は、2009年4月30日に出願された米国仮出願第61／174,482号の優先権の利益を主張し、当該内容は引用によりその全てが本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（本発明の背景）
本発明は一般に、有機化合物を産生することのできる生合成過程及び生物に関する。より具体的には、本発明は、有用化学物質イソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールを産生することのできる非天然生物に関する。
【背景技術】
【０００３】
イソプロパノールは、水を含むほとんどの溶媒と完全に混合する、無色で、可燃性の3炭素アルコールである。イソプロパノールについての最大の使用は、溶媒としてであり、イソプロパノールと水との混合物である「消毒用アルコール」としてのその周知のなおもわずかな使用を含む。溶媒として、イソプロパノールは、塗料、ラッカー、薄め液、インク、接着剤、汎用洗剤、消毒薬、化粧品、洗面用品、除氷液、及び医薬品などの多くの日用品において認められる。また、低い等級のイソプロパノールは、モーターオイルにおいて用いられる。第二の最大の使用は、（例えば、農業製品における）イソプロピルアミン、イソプロピルエーテル、及びイソプロピルエスエルの生産のための化学的中間体としてである。イソプロパノールは、2つの石油化学経路によって製造される。有力な過程は、硫酸触媒を用いるか又は用いないかのいずれかであるプロピレンの水和を必要とする。第二に、イソプロパノールは、フェノール及び酸化プロピレンの生産において形成される副産物であるアセトンの水素化を介して生産される。高価なプロピレンは、現に経費を上昇させており、拡大した範囲の低コスト供給原料についての需要を動機づける化学産業を通じて利鞘を低下させる。
【０００４】
ブタノール、又は等価のn-ブタノールは、石油化学原材料の使用を通じてほぼ広範に現に製造されている。主要な石油化学過程は、プロピレンのブチルアルデヒドへのカルボニル化に続くブタノールへの触媒性水素化を必要とする。ブタノールについての需要は、ブチルアクリラート及びブチルメタクリラートの生産のためのその使用によって駆られており、その両方は、水ベースのラテックスコーティング、エナメル、及びラッカーにおいて使用される乳化された及び溶液のポリマーにおいて採用される。他の適用には、酢酸ブチル及びグリコールブチルエーテルなどの大量の化学物質のための中間体としてのその使用、及び溶媒としてのその直接的な使用を含む。また、ブタノールは、再生可能な供給源に由来するバイオ燃料としての有望な適用のためにも考慮されているところである。ブタノールは、エタノールよりも燃料としてより良好に適している広範な範囲の特性を有する。例えば、ブタノールは、より高いエネルギー含有量、より低い揮発性及び吸湿性を有し、パイプライン基幹施設を通じて輸送することができ、配合せずに直接使用することができ、ディーゼル又はバイオディーゼルと配合することができる。
【０００５】
イソブタノールは、バイオ燃料としてかなり積極的に追求されている最中の別の無色で可燃性の4炭素アルコールである。現に、その主要な適用は、ラッカー及びコーティングの生産において使用される共通溶媒であるイソブチルアセタートのための出発材料としてであり、また、食品産業における調味料としてでもある。イソブチルエステルは、プラスチック、ゴム、及び他の分散物において使用される。イソブタノールについての追加的な適用には、塗料、ワニス除去剤、及びインクにおける溶媒としてのその使用を含む。石油由来の供給原料からのイソブタノール合成のための方法には、オキソ合成（Weberらの文献（Industrial & Engineering Chemistry Researchm, 62：33-37（1970）））、及びn-プロパノールを用いたメタノールのゲルベ縮合（Guerbet condensation）（Carliniらの文献（J. of Molecular Catalysis A: Chemical, 220：215-220（2004））；Carliniらの文献（J. of Moleuclar Catalysis A: Chemical, 184：273-280（2002））；Carliniらの文献（J. of Molecular Catalysis A: Chemical, 200：137-146（2003））；Carliniらの文献（J. of Molecular Catalysis A: Chemical, 206：409-418（2003）））を含む。
【０００６】
このように、低コストの供給原料を用いてイソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールを生産するための微生物及びその使用方法を開発する必要性が存在する。本発明は、この必要性を満たし、同様に、関連した利点を提供する。
【発明の概要】
【０００７】
いくつかの実施態様において、本発明は、イソプロパノールを産生するのに十分な量で発現するイソプロパノール経路酵素をコードする少なくとも1つの外来性核酸を有するイソプロパノール経路を有する微生物を含む非天然微生物を提供する。イソプロパノール経路には、4-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼ、クロトナーゼ、3-ヒドロキシブチリル-CoA脱水素酵素、アセトアセチル-CoAシンテターゼ、アセチル-CoA：アセトアセタート-CoAトランスフェラーゼ、アセトアセチル-CoAヒドロラーゼ、アセトアセタートデカルボキシラーゼ、及びアセトン還元酵素から選択される酵素を含む。
【０００８】
他の実施態様において、本発明は、イソプロパノールを産生する条件下及び十分な時間でイソプロパノール経路を有するこのような非天然微生物を培養することを含む、イソプロパノールを産生する方法を提供する。
【０００９】
いくつかの実施態様において、本発明は、n-ブタノールを産生するのに十分な量で発現するn-ブタノール経路酵素をコードする少なくとも1つの外来性核酸を有するn-ブタノール経路を有する微生物を含む非天然微生物を提供する。4-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼ、クロトノイル-CoA還元酵素、ブチリル-CoA還元酵素（アルデヒド形成）、ブチルアルデヒド還元酵素、及びブチリル-CoA還元酵素（アルコール形成）からなる群から選択される1つの酵素を含む。
【００１０】
いくつかの実施態様において、本発明は、n-ブタノールを産生する条件下及び十分な時間で、n-ブタノール経路を有する非天然微生物を培養することを含む、n-ブタノールを産生する方法を提供する。
【００１１】
いくつかの実施態様において、本発明は、イソブタノールを産生するのに十分な量で発現するイソブタノール経路酵素をコードする少なくとも1つの外来性核酸を有するイソブタノール経路を有する微生物を含む非天然微生物を提供する。イソブタノール経路には、4-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼ、クロトノイル-CoA還元酵素、イソブチリル-CoAムターゼ、4-ヒドロキシブチリル-CoAムターゼ、3-ヒドロキシイソブチリル-CoAデヒドラターゼ、メタクリリル-CoA-還元酵素、イソブチリル-CoA還元酵素（アルデヒド形成）、イソブチルアルデヒド還元酵素、及びイソブチリル-CoA還元酵素（アルコール形成）からなる群から選択される1つの酵素を含む。
【００１２】
いくつかの実施態様において、本発明は、イソブタノールを産生する条件下及び十分な時間で、イソブタノール経路を有する非天然微生物を培養することを含む、イソブタノールを産生する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、4-ヒドロキシブチリル-CoAからイソプロパノール、n-ブタノール、及びイソブタノールへの経路を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
（本発明の詳細な説明）
本発明は、イソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノール産生を触媒する酵素をコードする遺伝子を発現する非天然微生物に一部関する。本明細書に開示されたイソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールの産生のための経路は、図１に示されるように出発材料としての4-ヒドロキシブチリル-CoAに基づいている。これらの経路を成功裏に操作することは、十分な活性及び特異性を有する適切なセットの酵素を同定すること、該酵素の相応する遺伝子を産生宿主にクローニングすること、発酵条件を最適化すること、及び発酵後の産物形成についてアッセイすることを必要とする。
【００１５】
4-ヒドロキシブチリル-CoAは、高度に共通した中心代謝産物ではないが、4-ヒドロキシブチリル-CoAを合成する株を操作する方法は、そのすべてが本明細書に引用により組み込まれる米国特許出願第2009／0075351によって既に説明されている。例示的な方法は、コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素（CoA‐依存性）、4-ヒドロキシブチラート脱水素酵素、4-ヒドロキシブチラートキナーゼ、及びホスホトランスブチリラーゼの活性をコードする遺伝子を採用することによって、スクシニル-CoAから4-ヒドロキシブチリル-CoAを合成することを包含する。
【００１６】
グルコースを淡水化物供給原料と仮定すると、4-ヒドロキシブチリル-CoAからイソプロパノールを合成することは、1.33モル／モルの理論的収量を有する。これは、U.S. 2008／0293125においてSubbianらによって説明された経路を用いて達成することのできる最大収量よりも33％高い。イソプロパノール経路への4-ヒドロキシブチリル-CoAの別の利点は、外部電子受容体の不在下で酸化還元平衡を可能にすることができることであるのに対し、Subbianらの文献において説明される経路は、電子を外部電子受容体に移動させることによって消失しなければならない過剰のNADHを生じる。
【００１７】
4-ヒドロキシブチリル-CoAから合成することのできる別の化合物は、n-ブタノールである。グルコースを炭水化物供給原料と仮定すると、本経路は、約1.00モル／モル収量のn-ブタノールの理論的収量を有する。この収量は、アセチル-CoAからのアセトアセチル-CoAの形成、次いで4回の還元及び脱水を包含する、多くのクロストリジウム種に対して天然のn-ブタノールへの経路に匹敵する（Jonesらの文献（Microbiol. Rev., 50：484-524（1986）））。本発明の利点は、2つのアセチル-CoA分子から1分子のクロトノイル-CoAを形成するこの伝統的なブタノール産生経路（すなわち、アセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼ、3-ヒドロキシブチリル-CoA脱水素酵素、及びクロトナーゼ）の最初の3工程を迂回することである。これらの任意の酵素又はすべてが、産生に対する潜在的なネックを表す。例えば、大腸菌の組換え株は、伝統的なブタノール合成経路について必要なクロストリジウム遺伝子を発現するよう操作されているが、1g／L未満の力価を報告した（Atsumiらの文献（Metabolic Engineering, 2008, 10, 305-311））。本発明のさらなる利点は、2つのアセチル-CoA分子からn-ブタノールを生成するのとは反対に、4-ヒドロキシブチリル-CoAからn-ブタノールを生成するのに必要な根元的な中心となる代謝において見出される。具体的には、嫌気性条件下で最大収量及び酸化還元平衡を確立するために、伝統的なクロストリジウム経路は、n-ブタノールあたり2つの還元当量が、ピルビン酸からアセチル-CoAへの転換から抽出されることを必要とする（すなわち、2つのピルビン酸分子は、生成されるブタノールにつき2つのアセチル-CoA分子へと酸化されなければならない。）。このことは、ピルビン酸脱水素酵素が、嫌気性条件又は微好気性条件のもとで天然にはさほど活性が高くない、大腸菌などの生物における曝露を表す。本明細書に開示された生成経路は、生成されるn-ブタノールにつき、アセチル-CoAへと酸化されるべきたった1つのピルビン酸しか必要としない。追加的な還元当量は、イソクエン酸脱水素酵素によるイソクエン酸からアルファ-ケトグルタル酸への転換によって生じる。
【００１８】
同様に、4-ヒドロキシブチリル-CoA経路を介したイソブタノールの理論的収量は、グルコースを供給原料として仮定すると、約1.00モル／モルである。本発明の1つの利点は、Donaldsonらの文献（U.S 20070092957）において説明されるピルビン酸からイソブチリル-CoAへそれからイソブタノールへの転換経路のアセト乳酸シンターゼ、アセトヒドロキシ酸イソメロリダクターゼ、アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼ、及び分岐鎖アルファ-ケト酸脱水素酵素の工程を迂回することである。あるいは、またDonaldsonらの文献において説明される別の生合成経路を介したブチリル-CoA及びイソブタノールの生成に必要なアセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼ、3-ヒドロキシブチリル-CoA脱水素酵素、及びクロトナーゼの工程を迂回する。本発明によって迂回されたこれらの任意の酵素工程又は該工程のすべては、イソブタノール生成に対する潜在的なネックを表す。本発明の一実施態様において、ブチリル-CoA中間体は、4-ヒドロキシブチリル-CoAを3-ヒドロキシイソブチリル-CoAに転換することによって完全に迂回され、3-ヒドロキシイソブチリル-CoAはその後、脱水され、イソブチリル-CoAへと還元される。
【００１９】
最後に、また、本発明は、これらの非天然微生物の培養を通じてイソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールを産生する方法にも一部関する。このように、本明細書に開示された任意の株は、有用化学物質であるイソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールを提供するのに十分な時間、適切な条件下で培養することができる。
【００２０】
本明細書で使用する場合、用語「非天然」は、本発明の微生物（microbial organism）又は微生物（microorganism）に関して使用する場合、該微生物が、基準種の野生型種を含む天然型の基準種において通常認められない少なくとも1つの遺伝的変更を有することを意味することが意図される。遺伝的変更には、例えば、代謝ポリペプチドをコードする発現可能核酸、他の核酸付加、核酸欠失及び／又は当該微生物の遺伝物質の他の機能的な破壊を導入する修飾を含む。このような修飾には、例えば、基準（referenced）種に対し異種性、相同、又は異種性及び相同の両ポリペプチドのコード領域及びその機能的断片を含む。追加的な修飾には、例えば、該修飾が遺伝子又はオペロンの発現を変更する非コード調節領域を含む。典型的な代謝ポリペプチドには、イソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノール生合成経路の内の酵素又はタンパク質を含む。
【００２１】
代謝修飾とは、その天然状態から変更された生化学的反応をいう。それゆえ、非天然微生物は、代謝ポリペプチド又はその機能的断片をコードする核酸に対する遺伝的修飾を有することができる。典型的な代謝修飾は、本明細書に開示される。
【００２２】
本明細書で使用する用語「単離される」は、微生物に関して使用される場合、該基準微生物が天然に認められるときに少なくとも1つの構成要素を実質的に含まない生物を意味することを意図する。該用語は、その自然環境で認められるいくつか又は全ての構成要素から取り出された微生物を含む。また、該用語には、該微生物が非天然環境で認められるときにいくつか又は全ての成分から取り出された微生物を含む。それゆえ、単離された微生物は、天然に認められる場合のような他の物質、又は非天然環境で増殖し、保存し、若しくは維持される場合のような他の物質から、部分的に若しくは完全に分離される。単離された微生物の具体的な例には、部分的に純粋な微生物、実質的に純粋な微生物、及び非天然の培地で培養された微生物を含む。
【００２３】
本明細書で使用する場合、用語「微生物（microbial）」、「微生物（microbial organism）」又は「微生物（microorganism）」は、古細菌、細菌又は真核生物のドメイン内に含まれる微視的細胞として存在する任意の生物を意味することを意図する。それゆえ、該用語は、微視的サイズを有する原核若しくは真核の細胞若しくは生物を包含するよう意図され、全ての種の細菌、古細菌及び真正細菌、並びに酵母及び真菌などの真核微生物を含む。該用語には、生化学的産生のために培養することのできる任意の種の細胞培養物も含む。
【００２４】
本明細書で使用する場合、用語「CoA」又は「補酵素A」とは、活性のある酵素系を形成するためにその存在が多くの酵素（アポ酵素）の活性に必要とされる有機的補助因子又は補欠分子族（酵素の非タンパク質部分）を意味することを意図する。特定の縮合酵素における補酵素Aの機能は、アセチル又は他のアシル基転移において、並びに脂肪酸合成及び酸化、ピルビン酸酸化において、及び他のアセチル化において作用する。
【００２５】
本明細書で使用する場合、用語「実質的に嫌気性」は、培養又は増殖条件に関して使用される場合、酸素量が液体培地中の溶存酸素について約10%未満飽和していることを意味することを意図する。また、該用語は、約1%未満の酸素の雰囲気で維持される液体又は固体培地の密封チャンバーを含むことも意図する。
【００２６】
本明細書において使用する「外来性」は、該基準分子又は該基準活性が宿主微生物に導入されることを意味することを意図する。該分子は、例えば、宿主染色体への組込みなどによる宿主遺伝材料へのコード核酸の導入によって、又はプラスミドなどの非染色体性遺伝材料として、導入できる。それゆえ、該用語は、コード核酸の発現に関して使用される場合、発現可能な形態でのコード核酸の微生物への導入をいう。生合成活性に関して使用される場合、該用語は、宿主基準生物に導入される活性をいう。供給源は、例えば、宿主微生物への導入後に該基準活性を発現する相同若しくは異種性のコード核酸であり得る。それゆえ、用語「内在性」とは、宿主に存在する基準分子又は活性をいう。同様に、該用語は、コード核酸の発現に関して使用される場合、微生物内に含まれるコード核酸の発現をいう。用語「異種性」とは基準種以外の供給源に由来する分子又は活性をいうのに対し、「相同」とは宿主微生物に由来する分子又は活性をいう。したがって、本発明のコード核酸の外来性発現は、異種性若しくは相同のいずれか又は両方のコード核酸を利用することができる。
【００２７】
本発明の非天然微生物は、安定した遺伝的変更を含むことができ、これは該変更の損失なしに5世代を超えて培養することのできる微生物をいう。一般に、安定した遺伝的変更には、10世代を超えて持続する修飾を含み、特に安定した修飾は約25世代を超えて持続し、より特定には、安定した遺伝的修飾は50世代（無制限を含む）を超える。
【００２８】
当業者は、本明細書に例証される代謝修飾を含む遺伝的変更が、大腸菌などの好適な宿主生物及びそれらの相応する代謝反応、又は所望の代謝経路のための遺伝子などの所望の遺伝材料に好適な供給源生物に関して説明されることを理解するであろう。しかしながら、多種多様な生物の完全なゲノム配列決定及びゲノム科学領域における高水準の技術を考慮すると、当業者は、本質的に他の全ての生物に対して本明細書に提供される教示及びガイダンスを容易に適用することができるであろう。例えば、本明細書に例証した大腸菌の代謝的変更は、該基準種以外の種からの同じ若しくは類似したコード核酸を組み込むことにより、他の種に容易に適用することができる。このような遺伝的変更には、例えば、一般的には種ホモログの遺伝的変更、特に、オルソログ、パラログ又は非オルソロガス遺伝子置換を含む。
【００２９】
オルソログは、垂直系統に関連し、かつ異なる生物において実質的に同じ若しくは同一の機能の原因となる遺伝子（gene）又は遺伝子（genes）である。例えば、マウスエポキシド加水分解酵素及びヒトエポキシド加水分解酵素は、エポキシドの加水分解の生物学的機能のためのオルソログとみなすことができる。遺伝子は、例えば該遺伝子が相同であること、又は共通祖先からの進化により関連することを示すのに十分な量の配列類似性を共有する場合、垂直系統によって関連する。また、遺伝子は、該遺伝子が共通祖先から、該一次配列類似性が同定できない程度まで進化したことを示すのに十分な量の三次元構造を共有するが、必ずしも配列類似性を共有しない場合、オルソログとみなすこともできる。オルソロガスである遺伝子は、約25％〜100％アミノ酸配列同一性の配列類似性を有するタンパク質をコードすることができる。また、25％未満のアミノ酸類似性を共有するタンパク質をコードする遺伝子は、該タンパク質の三次元構造も類似性を示す場合、垂直系統により生じたとみなすこともできる。組織プラスミノーゲン活性化因子及びエラスターゼを含むセリンプロテアーゼファミリー酵素のメンバーは、共通祖先から垂直系統により生じたものとみなされる。
【００３０】
オルソログには、例えば進化を通じて、構造又は全体的な活性において分岐した遺伝子又は遺伝子のコードした遺伝子産物を含む。例えば、ある種が2つの機能を呈する遺伝子産物をコードし、かつこのような機能が第二の種において異なる遺伝子へと分離した場合、該3つの遺伝子及びそれらの相応する産物はオルソログであるとみなされる。生化学的産物の産生のために、当業者は、導入又は破壊されるべき代謝活性を有するオルソロガス遺伝子が非天然微生物の構築のために選択されるべきことを理解するであろう。単離可能な活性を呈するオルソログの例は、異なる活性が、2つ以上の種間の、又は単一種内の異なる遺伝子産物に分離される場合である。具体的な例は、エラスターゼタンパク質分解及びプラスミノーゲンタンパク質分解（2種類のセリンプロテアーゼ活性）の、異なった分子へのプラスミノーゲン活性化因子及びエラスターゼとしての分離である。第二の例は、マイコプラズマ5'-3'エキソヌクレアーゼ、及びショウジョウバエDNAポリメラーゼIII活性の分離である。第一の種由来のDNAポリメラーゼは、第二の種由来のエキソヌクレアーゼ又はポリメラーゼのいずれか又は両方に対するオルソログとみなすことができ、逆もまた真である。
【００３１】
対照的に、パラログは、例えば、複製とそれに続く進化的分岐に関連するホモログであり、類似の又は共通した、しかし同一ではない機能を有する。パラログは、例えば、同種から若しくは異種から生じ、又は由来し得る。例えば、ミクロソームのエポキシド加水分解酵素（エポキシド加水分解酵素I）及び可溶性エポキシド加水分解酵素（エポキシド加水分解酵素II）は、これらが、異なった反応を触媒し、該同種において異なる機能を有する共通祖先から共進化した2つの異なる酵素を表すので、パラログとみなすことができる。パラログは、相同であり、又は共通祖先からの共進化を通じて関連していることを示す、互いに有意な配列類似性を有する同種由来のタンパク質である。パラログタンパク質ファミリーの群には、HipAホモログ、ルシフェラーゼ遺伝子、ペプチダーゼ、及びその他を含む。
【００３２】
非オルソロガス遺伝子置換は、異なる種の基準遺伝子機能と置換することのできる1つの種からの非オルソロガス遺伝子である。置換には、例えば、異なる種の基準機能と比較して、起源の種において実質的に同じ又は類似の機能を果たすことのできるものを含む。一般に、非オルソロガス遺伝子置換は、該基準機能をコードする公知の遺伝子に構造的に関連するものとして同定することができるが、より構造的に関連が低いものの機能的に類似する遺伝子及び該遺伝子の相応する遺伝子産物は、それでもなお本明細書に使用される用語の意味の内に収まる。機能的類似性は、例えば、置換しようとする機能をコードする遺伝子と比較して、非オルソロガス遺伝子産物の活性部位又は結合領域において少なくとも若干の構造類似性を必要とする。それゆえ、非オルソロガス遺伝子には、例えば、パラログ又は関連のない遺伝子を含む。
【００３３】
それゆえ、イソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノール生合成能力を有する本発明の非天然微生物を同定すること及び構築することにおいて、当業者は、本明細書に提供される教示及びガイダンスを、代謝修飾の同定がオルソログの同定及び封入又は不活性化を含むことのできる特定の種に適用することで理解するであろう。パラログ及び／又は非オルソロガス遺伝子置換が、類似若しくは実質的に類似の代謝反応を触媒する酵素をコードする基準微生物に存在する程度まで、当業者はこれらの進化的に関連する遺伝子を利用することもできる。
【００３４】
オルソログ、パラログ及び非オルソロガス遺伝子置換は、当業者に周知の方法により決定することができる。例えば、2つのポリペプチドについての核酸配列又はアミノ酸配列の検査は、比較された配列間の配列同一性及び類似性を明らかにするであろう。このような類似性に基づいて、当業者は、該タンパク質が共通祖先から進化を介して関連することを示すために類似性が十分に高いかどうかを決定することができる。Align、BLAST、Clustal W、及びその他などの当業者に周知のアルゴリズムは、生の配列類似性又は同一性を比較及び決定し、更に、重み又はスコアを割り当てることができる配列の間隙の存在又は有意性を決定する。このようなアルゴリズムも当業者に公知であり、ヌクレオチド配列の類似性又は同一性を決定するのに同様に適用できる。相関性を決定するのに十分な類似性についてのパラメータは、統計的類似性を算出するための周知の方法、又はランダムポリペプチドにおける類似の対応（match）を見出す見込み、及び決定された対応の有意性に基づいて算出される。2以上の配列に関するコンピュータ比較は、所望の場合、当業者によって視覚的に最適化されることもできる。関連する遺伝子産物又はタンパク質は、高い類似性、例えば、25％〜100％の配列同一性を有すると予測することができる。関連性のないタンパク質は、十分なサイズのデータベースが走査される（約5％）場合、偶然生じることが予測されるのと本質的に同じである同一性を有することができる。5％〜24％の配列は、該比較された配列が関連していると結論づけるのに十分な相同性を表すことができ、又は表すことができない。データセットのサイズを考慮してこのような対応の有意性を決定するための追加的な統計的分析を実行して、これらの配列の関連性を決定することができる。
【００３５】
BLASTアルゴリズムを使用する2以上の配列の関連性を決定するための典型的なパラメータは、例えば、先に記載したものであることができる。簡潔にいうと、アミノ酸配列整列は、BLASTPバージョン2.0.8（1999年1月5日）及び以下のパラメータを使用して実施することができる：マトリックス: 0 BLOSUM62；間隙開口：11；間隙伸長：1；x_ドロップオフ：50；期待値：10.0；文字サイズ：3；フィルター：オン。核酸配列整列は、BLASTNバージョン2.0.6（1998年9月16日）及び以下のパラメータを使用して実施することができる：対応：1；ミスマッチ：−2；間隙開口：5；間隙伸長：2；x_ドロップオフ：50；期待値：10.0；文字サイズ：11；フィルター：オフ。当業者は、どの修飾を上記パラメータに導入して、該比較の厳密性を増加又は減少させることができるか、例えば、2以上の配列の相関性を決定することができるかを知っているであろう。
【００３６】
いくつかの実施態様において、本発明は、イソプロパノールを産生するのに十分な量で発現するイソプロパノール経路酵素をコードする少なくとも1つの外来性核酸を有するイソプロパノール経路を有する微生物を含む非天然微生物を提供する。イソプロパノール経路には、4-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼ、クロトナーゼ、3-ヒドロキシブチリル-CoA脱水素酵素、アセトアセチル-CoAシンテターゼ、アセチル-CoA：アセトアセタート-CoAトランスフェラーゼ、アセトアセチル-CoAヒドロラーゼ、アセトアセタートデカルボキシラーゼ、及びアセトン還元酵素からなる群から選択される酵素を含む。
【００３７】
いくつかの実施態様において、微生物には、2つの外来性核酸を含み、各々、イソプロパノール経路酵素をコードするのに対し、他の実施態様においては、微生物には、3つの外来性核酸を含み。各々、イソプロパノール経路酵素をコードする。いくつかの実施態様において、微生物には、4つの外来性核酸を含み、各々イソプロパノール経路酵素をコードする。更なる実施態様において、微生物には5つの外来性核酸を含み、各々、イソプロパノール経路酵素をコードする。なおも更なる実施態様において、微生物には6つの外来性核酸を含み、各々イソプロパノール経路酵素をコードする。また、微生物には7つの外来性核酸を含むことができ、各々、イソプロパノール経路酵素をコードする。最後に、微生物には8つの外来性核酸を含むことができ、各々、イソプロパノール経路酵素をコードする。宿主生物へと挿入される上記の任意の遺伝子は、異種性核酸であり得る。いくつかの実施態様において、非天然微生物は、実質的に嫌気性培地中にある。
【００３８】
上記に従って、本発明は、4-ヒドロキシブチリル-CoAを、4-ヒドロキシブチリル-CoAの脱水を実施する酵素をコードする核酸を提供するイソプロパノール経路に提供し、図１の工程Aに示されるようにクロトノイル-CoAを形成する。その後、クロトナーゼは、クロトノイル-CoAを3-ヒドロキシブチリル-CoAへと水和し（工程B）、3-ヒドロキシブチリル-CoAが順に、3-ヒドロキシブチリル-CoA脱水素酵素によってアセトアセチル-CoAへと酸化される（工程C）。アセトアセチル-CoAは、シンテターゼ、トランスフェラーゼ、又はヒドロラーゼによってアセトアセタートへ転換される（工程D、工程E、又は工程F）。最終的な2工程は、アセトアセタートのデカルボキシル化を包含して、アセトン（工程G）及びそのその後のイソプロパノールへの還元（工程H）を形成する。
【００３９】
追加的な実施態様において、本発明は、イソプロパノール経路を有する非天然微生物を提供し、この中で、非天然微生物は、4-ヒドロキシブチリル-CoAをクロトノイル-CoAへ、クロトノイル-CoAを3-ヒドロキシブチリル-CoAへ、3-ヒドロキシブチリル-CoAをアセトアセチル-CoAへ、アセトアセトアセチル-CoA（acetoacetacetyl-CoA）をアセトアセタートへ、アセトアセタートをアセトンへ、及びアセトンをイソプロパノールへからなる群から選択される、基質を生成物へ転換する酵素又はタンパク質をコードする少なくとも1つの外来性核酸を含む。
【００４０】
いくつかの実施態様において、本発明は、n-ブタノールを生成するのに十分な量で発現するn-ブタノール経路酵素をコードする少なくとも1つの外来性核酸を有するn-ブタノール経路を有する微生物を含む非天然微生物を提供する。n-ブタノール経路には、4-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼ、クロトノイル-CoA還元酵素、ブチリル-CoA還元酵素（アルデヒド形成）、ブチルアルデヒド還元酵素、及びブチリル-CoA還元酵素（アルコール形成）からなる群から選択される酵素を含む。
【００４１】
いくつかの実施態様において、微生物には、2つの外来性核酸を含み、各々n-ブタノール経路酵素をコードするのに対し、他の実施態様において、微生物には3つの外来性核酸を含み、各々n-ブタノール経路酵素をコードする。更なる実施態様において、微生物には、4つの外来性核酸を含み、各々、n-ブタノール経路酵素をコードする。上記の任意の核酸は、異種性核酸として提供することができる。このような非天然微生物は、実質的に嫌気性の培地中で増殖することができる。
【００４２】
追加的な実施態様において、本発明は、n-ブタノール経路を有する非天然微生物を提供し、この中で、非天然微生物は、4-ヒドロキシブチリル-CoAをクロトノイル-CoAへ、クロトノイル-CoAをブチリル-CoAへ、ブチリル-CoAをn-ブタノールへ、ブチリル-CoAをブチルアルデヒドへ、及びブチルアルデヒドをn-ブタノールへからなる群から選択される基質を生成物へ転換する酵素又はタンパク質をコードする少なくとも1つの外来性核酸を含む。
【００４３】
4-ヒドロキシブチリル-CoAからn-ブタノールへの経路は、図１の工程Aに示されるような、4-ヒドロキシブチリル-CoAからクロトノイル-CoAへの脱水で始まり、次に、クロトノイル-CoAはブチリル-CoAへと還元される（工程I）。次に、ブチリル-CoAは、2つの別個の酵素である工程J及び工程Kによって、又は工程Lにおいて示される単一の二重機能酵素によってのいずれかで実施される2回の還元を受ける。
【００４４】
いくつかの実施態様において、本発明は、イソブタノールを生成するのに十分な量で発現するイソブタノール経路酵素をコードする少なくとも1つの外来性核酸を有するイソブタノール経路を有する微生物を含む非天然微生物を提供する。イソブタノール経路には、4−ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼ、クロトノイル-CoA還元酵素、イソブチリル-CoAムターゼ、4-ヒドロキシブチリル-CoAムターゼ、3-ヒドロキシイソブチリル-CoAデヒドラターゼ、メタクリリル-CoA-還元酵素、イソブチリル-CoA還元酵素（アルデヒド形成）、イソブチルアルデヒド還元酵素、及びイソブチリル-CoA還元酵素（アルコール形成）からなる群から選択される酵素を含む。
【００４５】
いくつかの実施態様において、微生物には、2つの外来性核酸を含み、各々、イソブタノール経路酵素をコードするのに対し、他の実施態様において、微生物には、3つの外来性核酸を含み、各々イソブタノール経路酵素をコードする。他の実施態様において、微生物には、4つの外来性核酸を含み、各々、イソブタノール経路酵素をコードする。さらに更なる実施態様において、微生物には、5つの外来性核酸を含み、各々、イソブタノール経路酵素をコードする。任意の外来性核酸は、異種性核酸であり得る。このような非天然微生物は、実質的に嫌気性の培地中で増殖することができる。
【００４６】
いくつかの実施態様において、非天然微生物は、4-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼ、クロトノイル-CoA還元酵素、イソブチリル-CoAムターゼ、イソブチリル-CoA還元酵素（アルデヒド形成）、イソブチルアルデヒド還元酵素を含む1セットのイソブタノール経路酵素を有する。このような微生物は、外来性核酸として提供されるイソブタノール経路酵素をコードする1、2、3、4、5、最大全部の核酸を有することができる。
【００４７】
いくつかの実施態様において、非天然微生物は、4-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼ、クロトノイル-CoA還元酵素、イソブチリル-CoAムターゼ、及びイソブチリル-CoA還元酵素（アルコール形成）を含む1セットのイソブタノール経路酵素を有する。このような微生物は、外来性核酸として提供されるイソブタノール経路酵素をコードする1、2、3、4、最大全部の核酸を有することができる。
【００４８】
いくつかの実施態様において、非天然微生物は、4-ヒドロキシブチリル-CoAムターゼ、3-ヒドロキシイソブチリル-CoAデヒドラターゼ、メタクリリル-CoA-還元酵素、イソブチリル-CoA還元酵素（アルデヒド形成）、及びイソブチルアルデヒド還元酵素を含む1セットのイソブタノール経路酵素を有する。このような微生物は、外来性核酸として提供されるイソブタノール経路酵素をコードする1、2、3、4、5、最大全部の核酸を有することができる。
【００４９】
いくつかの実施態様において、非天然微生物は、4-ヒドロキシブチリル-CoAムターゼ、3-ヒドロキシイソブチリル-CoAデヒドラターゼ、メタクリリル-CoA-還元酵素、及びイソブチリル-CoA還元酵素（アルコール形成）を含む1セットのイソブタノール経路酵素を有する。このような微生物は、外来性核酸として提供されるイソブタノール経路酵素をコードする1、2、3、4、最大全部の核酸を有することができる。
【００５０】
追加的な実施態様において、本発明は、イソブタノール経路を有する非天然微生物を提供し、この中で、非天然微生物は、4-ヒドロキシブチリル-CoAからクロトノイル-CoAへ、クロトノイル-CoAからブチリル-CoAへ、ブチリル-CoAからイソブチリル-CoAへ、4-ヒドロキシブチリル-CoAから3-ヒドロキシイソブチリル-CoAへ、3-ヒドロキシイソブチリル-CoAからメタクリリル-CoAへ、メタクリリル-CoAからイソブチリル-CoAへ、イソブチリル-CoAからイソブタノールへ、イソブチリル-CoAからイソブチルアルデヒドへ、及びイソブチルアルデヒド（isobutryaldehyde）からイソブタノールへからなる群から選択される基質から生成物へ転換する酵素又はタンパク質をコードする少なくとも1つの外来性核酸を含む。
【００５１】
4-ヒドロキシブチリル-CoAからイソブタノールへの転換は、イソブチリル-CoA中間体の形成を包含する。イソブチリル-CoAは、4-ヒドロキシブチリル-CoAから、図１の工程A、工程I、及び工程Mにおいて示されるような脱水、還元、及び炭素骨格再編成を介して形成することができる。あるいは、本中間体は、図１の工程Q、工程R、及び工程Sに示されるような最初の炭素骨格の再編成、次に脱水及び還元を介して得ることができる。次に、イソブチリル-CoAは、2つの還元を受けて、イソブタノールを形成する。還元は、2つの酵素である工程N及び工程Oか、又は工程Pに示されるような単一の二重機能酵のいずれかによって実施される。
【００５２】
これらの任意の経路を成功裏に操作することは、十分な活性及び特異性を有する適切なセットの酵素を同定すること、該酵素の相応する遺伝子を産生宿主へとクローニングすること、発酵条件を最適化すること、及び発酵後の生成物形成についてアッセイすることを必要とする。上記の任意の性生物の産生のための産生宿主を操作するために、1つ以上の外来性DNA配列を微生物において発現させることができる。加えて、微生物は、機能的に欠失した内在性遺伝子を有することができる。これらの修飾は、再生可能な供給原料を用いて、イソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールの産生を可能とするであろう。
【００５３】
下記に、本発明者らは、図１に示される工程の各々を触媒する酵素をコードすることのできる生化学的に特徴づけられたいくつかの遺伝子を説明する。組換え大腸菌との関連で記載されているが、当業者は、本質的に任意の他の生物にこれらの技術を適用することができる。具体的には、大腸菌に対して未変性の遺伝子、並びに適切にクローニングされ発現する場合に適切な形質転換を触媒するよう適用することのできる他の生物における他の遺伝子が列挙されている。
【００５４】
本発明は、一般的に代謝反応、反応物若しくはその産物に関して、又は基準代謝反応、反応物、若しくは産物と会合若しくは触媒する酵素を、又は会合するタンパク質をコードする1つ以上の核酸若しくは遺伝子に特に関して本明細書に説明される。本明細書で別段の明確な記載がない限り、当業者は、反応に対する引用はまた、反応の反応物及び産物に対する引用も構成することを理解するであろう。同様に、本明細書で別段の明確な記載がない限り、反応物又は産物に対する引用はまた、反応を引用し、これらの代謝構成体の任意に対する引用はまた、基準反応、反応物、又は産物を触媒する酵素又は包含されるタンパク質をコードする遺伝子（gene）又は遺伝子（genes）を引用する。同じく、代謝生化学、酵素学、及びゲノム科学の周知の分野を考慮すると、遺伝子に対する又は核酸をコードする本明細書での引用はまた、相応するコードした酵素、及び該酵素が触媒する反応、又は反応、並びに反応の反応物及び産物を触媒又は会合するタンパク質に対する引用も構成する。
【００５５】
図１に示されたすべての形質転換は、表1に示される形質転換の10個の一般的なカテゴリーへと収まる。下記に、各カテゴリーにおけるいくつかの生化学的に特徴づけられた遺伝子が説明されている。具体的に列挙されているのは、適切にクローニング及び発現した場合に、図１における適切な形質転換を触媒するのに適用することのできる遺伝子である。図１における工程の各々について典型的な遺伝子は、下記の表37にさらに提供される。
【００５６】
表1は、共通の中心代謝中間体をイソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールへ転換するのに有用な酵素の種類を示す。各標識の最初の3つの数字は、基質特異性とは無関係な形質転換の一般的な種類を示す最初の3つの酵素委員会（Enzyme Commission）番号数字に相応する。
【表１】
2012525156.tif 000003
【００５７】
図１における2つの形質転換は、アルデヒドをアルコールに還元する酸化還元酵素のカテゴリーに収まる。具体的には、これらは、それぞれ工程K及び工程Oにおいて示されるようなブチルアルデヒド還元酵素及びイソブチルアルデヒド還元酵素である。
【００５８】
アルデヒドからアルコールへの転換を触媒する酵素（すなわち、アルコール脱水素酵素又は等価のアルデヒド還元酵素）をコードする典型的な遺伝子には、C2-C14について中鎖アルコール脱水素酵素をコードするalrA（Taniらの文献（Appl. Environ. Microciol., 66：5231-5235（2000）））、出芽酵母由来のADH2（Atsumiらの文献（Nature, 451：86-89（2008）））、C3よりも長い分子について優先度を有する大腸菌由来のyqhD（Sulzenbacherらの文献（J. of Molecular Biology, 342：489-502（2004）））、並びにブチルアルデヒドをブタノールに転換するクロストリジウム・アセトブチリカム由来のbdhI及びbdhII（Walterらの文献（J. of Bacteriology, 174：7149-7158（1992）））を含む。yqhDの遺伝子産物は、NADPHを共因子として用いて、アセトアルデヒド、マロンジアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、及びアクロレインの還元を触媒する（Perezらの文献（J. Biol. Chem., 283：7346-7353（2008）））。ザイモモナス・モビリス由来のADH1は、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、及びアクロレインを含むいくつかのアルデヒドに関する活性を有することが示されている（Kinoshitaらの文献（Appl. Microbiol. Biotechnol, 22：249-254（1985）））。これらの典型的な遺伝子産物の各々についての配列に関連するデータは、表2に示される以下のGenBank受入番号を用いて見出すことができる。
【表２】
2012525156.tif 000004
【００５９】
また、3-ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素活性（EC1.1.1.61）を呈する酵素もこのカテゴリーに収まる。このような酵素は、ラルストニア・ユートロファ（Bravoらの文献（J. Forensic Sci., 49：379-387（2004）））、クロストリジウム・クルイベリ（Wolffらの文献（Protein Expr. Purif., 6：206-212（1995）））、及びシロイヌナズナ（Breitkreuzらの文献（J. Biol. Chem., 278：41552-41556（2003）））において特徴づけられている。なおも別の遺伝子は、ゲオバチルス・サーモグルコシダシウス由来のアルコール脱水素酵素adhIである（Jeonらの文献（J. Biotechnol, 135：127-133（2008）））。これらの典型的な遺伝子産物の各々についての配列と関連したデータは、表3に示される以下のGenBank受入番号を用いて見出すことができる。
【表３】
2012525156.tif 000005
【００６０】
別の典型的な酵素は、3-ヒドロキシイソブチラートのメチルマロナートセミアルデヒドへの可逆的酸化を触媒する3-ヒドロキシイソブチラート脱水素酵素である。この酵素は、バリン、ロイシン、及びイソロイシンの分解に関与し、細菌、真核生物、及び哺乳類において同定されている。サーマス・サーモフィラスHB8由来のP84067によってコードされる酵素が構造的に特徴づけられている（Lokanathらの文献（J. Mol. Biol., 352：905-917（2005）））。ヒト3-ヒドロキシイソブチラート脱水素酵素の可逆性は、同位体標識された基質を用いて示された（Manningらの文献（Bioichem J., 231：481-484（1985）））。この酵素をコードする追加的な遺伝子には、ヒト（Hawesらの文献（Methods Enzymol, 324：218-228（2000）））及びウサギ（Hawesらの文献（上記）；Chowdhuryらの文献（Biosci. Biotechnol Biochem., 60：2043-2047（1996）））における3hidh、緑膿菌におけるmmsb、及びプチダ菌におけるdhat（Hawesらの文献（上記）；Chowdhuryらの文献（Biosci. Biotechnol Biochem., 60：2043-2047（1996））；Chowdhuryらの文献（Biosci. Biotechnol Biochem., 67：438-441（2003））））を含む。これらの典型的な遺伝子産物の各々についての配列と関連したデータは、表4に示される以下のGenBank受入番号を用いて見出すことができる。
【表４】
2012525156.tif 000006
【００６１】
ケトン官能性を相応するヒドロキシル基へ転換する酸化還元酵素は、図１に示されるように、アセトンからイソプロパノールへの転換についての工程Hによって、及び3-ヒドロキシブチリル-CoAからアセトアセチル-CoAへの転換についての工程Cによって例証されている。アセトンをイソプロパノールへ転換する典型的なアルコール脱水素酵素は、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Ismaielらの文献（J. Bacteriol., 175：5097-5105（1993）））及びサーモアナエロバクター・ブロッキー（Lamedらの文献（Biochem. J. 195：183-190（1981））；Peretzらの文献（Biochemistry, 28：6549-6555（1989）））において示された。2-ペンタノール及びピルブアルデヒドに関して最大活性を呈するパイロコッカスフリオサス由来のadhAの遺伝子産物は、イソプロパノール及びアセトンを含む非常に広範な特異性を有することが示された（van derらの文献（Eur J Biochem, 268：3062-3068（2001）））。イソプロパノール及びアセトンに関する活性を有するなおも別の第二級アルコール脱水素酵素は、ロドコッカス・ルーバー（ruber）由来のadh‐Aの遺伝子産物によってコードされる（Kosjekらの文献（Biotechnol Bioeng, 86：55-62（2004）））。これらの遺伝子は、その他とともに下記の表5に列挙されている。
【表５】
2012525156.tif 000007
【００６２】
アセトアセチル-CoAから3-ヒドロキシブチリル-CoAへの還元を触媒する3-ヒドロキシブチリル-CoA脱水素酵素（工程C）は、クロストリジウムのいくつかの種におけるブチラートへのアセチル-CoA発酵経路に関与し、詳細に研究されている（Jones及びWoodsの文献（Microbiol. Rev., 50：484-524（1986）））。hbdによってコードされるクロストリジウム・アセトブチリカム由来の酵素がクローニングされており、大腸菌において機能的に発現する（Younglesonらの文献（J. Bacteriol., 171：6800-6807（1989）））。加えて、fadB及びfadJによってコードされる大腸菌における2つの脂肪酸酸化複合体のサブユニットは、3-ヒドロキシアシル-CoA脱水素酵素として機能する（Binstock及びSchulzの文献（Meth. Enzymol., 71 パートC：403-411（1981）））。この可逆的形質転換を触媒することが示されたなおも他の遺伝子は、ズーグレア・ラミゲラ（ramigera）由来のphbB（Plouxらの文献（Eur. J. Biochem., 174：177-182（1988）））及びロドバクター・スフェロイデス由来のphaB（Alberらの文献（Mol. Microbiol., 61：297-309（2006）））である。前者の遺伝子は、NADPH‐依存性であり、そのヌクレオチド配列が決定されており（Peoples及びSinskeyらの文献（Mol. Microbiol. 3：349-357（1989）））、遺伝子は大腸菌において発現している。該遺伝子に関する基質特異性研究は、アセトアセチル-CoAのほかに3-オキソプロピオニル-CoAを基質として受け入れることができるという結論をもたらした（Plouxらの文献（上述））。追加的な遺伝子には、クロストリジウム・クライベリにおけるHbd1（C‐末端ドメイン）及びHbd2（N‐末端ドメイン）（Hillmer及びGottschalkの文献（Biochim. Biophys. Acta 3334：12-23（1974）））並びにウシにおけるHSD17B10（Wakilらの文献（J. Biol. Chem., 207：631-638（1954）））を含む。これらの典型的な遺伝子産物の各々についての配列と関連したデータは、表6に示される以下のGenBank受入番号を用いて見出すことができる。
【表６】
2012525156.tif 000008
【００６３】
いくつかの類似の酵素は、表7に示されるように、クロストリジウムの他の種において、及びメタロスファエラ・セデュラ（Metallosphaera sedula）認められている（Bergらの文献（Archaea. Science, 318：1782-1786（2007）））。
【表７】
2012525156.tif 000009
【００６４】
あるいは、ケトンをヒドロキシル官能基に転換するいくつかの典型的なアルコール脱水素酵素が存在する。大腸菌由来のこのような2つの酵素は、リンゴ酸脱水素酵素（mdh）及び乳酸脱水素酵素（ldhA）によってコードされる。加えて、ラルストニア・ユートロファ由来の乳酸脱水素酵素は、乳酸、2-オキソブチラート、2-オキソペンタノアート、及び2-オキソグルタル酸などの種々の鎖の長さの基質に関して高い活性を呈することが示されている（Steinbuchelらの文献（Eur. J. Biochem., 130：329-334（1983）））。
【００６５】
また、図１における形質転換は、アシル-CoAの相応するアルコールへの2工程還元による。例えば、ブタノール経路における工程L及びイソブタノール経路における工程Pは、この形質転換による。アシル-CoAをアルコールに転換する典型的な2工程酸化還元酵素には、アセチル-CoAなどの基質をエタノールへ（例えば、大腸菌由来のadhE（Kesslerらの文献（FEBS. Lett., 281：59-63（1991）））、及びブチリル-CoAをブタノールへ（例えば、クロストリジウム・アセトブチリカム由来のadhE2（Fontaineらの文献（J. Bacteriol., 184：821-830（2002））））転換するものを含む。アセチル-CoAをエタノールへ還元することに加えて、ロイコノストック・メゼンテロイデスにおけるadhEによってコードされる酵素は、分岐鎖化合物イソブチルアルデヒドをイソブチリル-CoAへ酸化することが示されている（Kazahayaらの文献（J. Gen. Appl. Microbiol., 18：43-55（2005））。これらの典型的な遺伝子産物の各々についての配列と関連したデータは、表8に示される以下のGenBank受入番号を用いて見出すことができる。
【表８】
2012525156.tif 000010
【００６６】
別の典型的な酵素は、マロニル-CoAを3-HPへ転換することができる。この活性を有するNADPH‐依存性酵素は、3-ヒドロキシプロピオン酸サイクルに関与するクロロフレクサス・アウランティアクス（Chloroflexus aurantiacus）において特徴づけられている（Huglerらの文献（J. Bacteriol., 184：2404-2410（2002））；Straussらの文献（Eur. J. Biochem., 215：633-643（1993）））。この酵素は、300kDaの質量を有し、高度に基質特異的であり、他の公知の酸化還元酵素とあまり配列類異性を示さない（Huglerらの文献（上述））。ロゼイフレクサス・カステンホルツィイ（Roseiflexus castenholzii）、エリスロバクター（Erythrobacter）属NAP1、及び海生ガンマプロテオバクテリアHTCC2080を含む他の生物における酵素は、配列類似性によって推測することができる。これらの典型的な遺伝子産物の各々についての配列と関連したデータは、表9に示される以下のGenBank受入番号を用いて見出すことができる。
【表９】
2012525156.tif 000011
【００６７】
より長い鎖のアシル-CoA分子は、アルコールを形成する脂肪アシル-CoA還元酵素をコードするホホバ（シンモンドシア・キネンシス（Simmondsia chinensis））FARなどの酵素によって還元することができる。大腸菌におけるその過剰発現は、FAR活性及び脂肪アルコールの蓄積を結果として生じた（Metzらの文献（Plant Physiology, 122：635-644（2000）））（FAR、AAD38039.1、シンモンドシア・キネンシス）
【００６８】
また、本明細書に開示された経路は、アシル-CoAをアルデヒドへ転換する酸化還元酵素型の形質転換を包含する。具体的には、工程J及び工程Nは、ブチチル-CoA（butytyl-CoA）からブチルアルデヒドへの、及びイソブチリル-CoAからイソブチルアルデヒドへの還元をそれぞれ触媒する。いくつかのアシル-CoA脱水素酵素は、アシル-CoAをその相応するアルデヒドへ還元することができる。このような酵素をコードする典型的な遺伝子には、脂肪アシル-CoA還元酵素をコードするアシネトバクター・カルコアセティカスacr1（Reiserらの文献（J. of Bacteriology, 179：2969-2975（1997）））、アシネトバクター属M‐1脂肪アシル-CoA還元酵素（Ishigeらの文献（Environ. Microbiol., 68：1192-1195（2002）））、並びにクロストリジウム・クライベリにおけるsucD遺伝子によってコードされるCoA‐依存性及びNADP‐依存性スクシナートセミアルデヒド脱水素酵素（Sohlingらの文献（J. Bacteriol., 178：871-880（1996）））を含む。ポルフィロモナス・ジンジバリスのsucDは、別のスクシナートセミアルデヒド脱水素酵素である（Takahashiらの文献（J. Bacteriol., 182：4704-4710（2000）））。bphGによってコードされるシュードモナス属における酵素アシル化アセトアルデヒド脱水素酵素は、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、及びホルムアルデヒドを酸化及びアシル化することが示されたなおも別の酵素である（Powlowskiらの文献（J. Bacteriol., 175：377-385（1993）））。アセチル-CoAをエタノールへ還元することに加えて、ロイコノストック・メセンテロイデスにおけるadhEによってコードされる酵素は、分岐鎖化合物イソブチルアルデヒドをイソブチリル-CoAへ酸化することが示されている（Kazahayaらの文献（J. Gen. Appl. Microbiol. 18:43-55(1972)）；Kooらの文献（Bacteriol Lett. 27:505-510(2005)））。これらの典型的な遺伝子産物の各々についての配列と関連したデータは、表10に示される以下のGenBank受入番号を用いて見出すことができる。
【表１０】
2012525156.tif 000012
【００６９】
アシル-CoAをその相応するアルデヒドへ転換する追加的な酵素の種類は、マロニル-CoAをマロン酸セミアルデヒドへ形質転換するマロニル-CoA還元酵素である。マロニル-CoA還元酵素は、好熱酸性古細菌における3-ヒドロキシプロピオン酸サイクルを介した独立栄養性炭素固定における鍵酵素である（Bergらの文献（Science 318：1782-1786（2007））；Thauer, R.K.の文献（Science, 318：1732-1733（2007）））。酵素は、NADOHを共因子として利用し、メタロスファエラ菌種及びスルホロブス菌種において特徴づけられている（Alberらの文献（上述）；Huglerらの文献（J. Bacteriol. 184：2404-2410（2002）））。酵素は、メタロスファエラ・セデュラにおけるMsed_0709によってコードされる（Alberらの文献（上述）；Bergらの文献（上述））。スフホロブス・トコダイ（tokodaii）由来のマロニル-CoA還元酵素をコードする遺伝子がクローニングされ、大腸菌において異種性に発現した（Alberらの文献（上述））。また、この酵素は、メチルマロニル-CoAのその相応するアルデヒドへの転換を触媒することが示されている。これらの酵素のアルデヒド脱水素酵素官能性は、クロロフレクサス・アウランティアクス由来の二機能性脱水素酵素と類似しているが、配列類似性はほとんどない。マロニル-CoA還元酵素の両酵素は、アスパルチル-4-ホスファートのアスパルタートセミアルデヒドへの還元及び同時の脱リン酸化を触媒する酵素であるアスパルタート-セミアルデヒド脱水素酵素と高い配列類似性を有する。追加的な遺伝子は、スルホロブス・ソルファタリカス及びスルホロブス・アシドカルダリウスを含む他の生物におけるタンパク質との配列相同性によって見出すことができ、下記に列挙されている。CoAアシル化アルデヒド脱水素酵素についてのなおも別の酵素は、クロストリジウム・ベイジェリンキ由来のald遺伝子である（Tothらの文献（Appl. Environ. Microbiol., 65：4973-4980（1999）））。この酵素は、アセチル-CoA及びブチリル-CoAをそれらの相応するアルデヒドへ還元することが報告されている。この遺伝子は、サルモネラ・チフィリウム及び大腸菌のアセトアルデヒド脱水素酵素をコードするeutEと非常に類似している（Tothらの文献（上述））。これらの典型的な遺伝子産物の各々についての配列と関連したデータは、表11に示される以下のGenBank受入番号を用いて見出すことができる。
【表１１】
2012525156.tif 000013
【００７０】
図１に関して、工程Iとは、クロトニル-CoA還元酵素によるクロトニル-CoAからブチリル-CoAへの転換を指し、工程Sとは、メタクリリル-CoA還元酵素によるメタクリル-CoAからイソブチリル-CoAへの転換を指す。エノイル-CoA還元酵素の酵素は、いずれかの工程を実施することのできる酵素である。1つの典型的なエノイル-CoA還元酵素は、クロストリジウム・アセトブチリカム由来のbcdの遺伝子産物であり（Boyntonらの文献（J. Bacteriol. 178：3015-3024（1996））；Atsumiらの文献（Metab. Eng. (2007)））、クロトニル-CoAからブチリル-CoAへの還元を自然に触媒する。この酵素の活性は、電子転移フラボタンパク質をコードするクロストリジウム・アセトブチリカムetfAB遺伝子の発現とともにbcdを発現することによって亢進することができる。エノイル-CoA還元酵素工程についての追加的な酵素は、ユーグレナ・グラシリス（gracilis）由来のミトコンドリアエノイル-CoA還元酵素である（Hoffmeisterらの文献（J. Biol. Chem. 280：4329-4338（2005）））。そのミトコンドリア標的リーダー配列の除去後のこの配列由来のコンストラクトを大腸菌においてクローニングし、結果的に活性のある酵素を生じた（Hoffmeisterらの文献（上述））。このアプローチは、真核生物遺伝子を発現させる当業者、特に、原核生物において遺伝子産物の標的を特異的な細胞内区画とすることのできるリーダー配列を有する遺伝子を発現させる当業者に周知である。原核生物トレポネーマ・デンティコラ由来のこの遺伝子TDE0597の近いホモログは、大腸菌においてクローニング及び発現した第三のエノイル-CoA還元酵素を表す（Tucciらの文献（FEBS Lett, 581：1561-1566（2007）））。これらの典型的な遺伝子産物の各々についての配列と関連したデータは、表12に示される以下のGenBank受入番号を用いて見出すことができる。
【表１２】
2012525156.tif 000014
【００７１】
イソブチリル-CoA脱水素酵素は、図１の工程Sについての別の酵素であるが、イソブチリル-CoAのメタクリリル-CoAへの酸化を自然に触媒する。結合した基質を有する及び有さないヒトイソブチリル-CoA脱水素酵素の結晶構造が決定されている（Battaileらの文献（J. Biol. Chem. 279：16526-16534（2004）））。マウス及びロドシュードモナス・パルストリス由来の追加的なイソブチリル-CoA脱水素酵素は、配列類似性によって推測することができる。これらの典型的な遺伝子産物の各々についての配列と関連したデータは、表13に示される以下のGenBank受入番号を用いて見出すことができる。
【表１３】
2012525156.tif 000015
【００７２】
なおも更なる酵素には、広範な種々のα,β‐不飽和カルボン酸及びアルデヒドのNADH‐依存性還元を触媒することが公知である2-エノアート還元酵素（EC1.3.1.31）を含む（Rohdichらの文献（J. Biol. Chem. 276：5779-5787（2001）））。2-エノアート還元酵素は、クロストリジウム・チロブチリカム及びクロストリジウム・サーモアセチカム（thermoaceticum）（今ではムーレラ・サーモアセチカムと呼ばれている。）を含む（Rohdichらの文献（上述））クロストリジウムのいくつかの種におけるenrによってコードされる。（Gieselらの文献（Arch. Microbiol. 135：51-57（1983）））。クロストリジウム・クライベリに関して近年刊行されたゲノム配列において、エノアート還元酵素についての9のコード配列が報告されており、そのうちの1つが特徴づけられている（Seedorfらの文献（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105：2128-2133（2008）））。クロストリジウム・チロブチリカム及びクロストリジウム・サーモアセチカムの両方に由来するenr遺伝子は、クローニング及び配列決定されており、互いに59％の同一性を示す。また、前者はクロストリジウム・クライベリにおいて特徴づけられた遺伝子とおよそ75％の類似性を有することも見出されている（Gieselらの文献（上述））。enrが大腸菌におけるジエノイルCoA還元酵素（fadH）と非常に類似していることは、これらの配列結果に基づいて報告されている（Rohdichらの文献（上述））。また、クロストリジウム・サーモアセチカムenr遺伝子は、大腸菌における酵素的に活性のある形態で発現する（Rohdichらの文献（上述））。これらの典型的な遺伝子産物の各々についての配列と関連したデータは、表14に示される以下のGenBank受入番号を用いて見出すことができる。
【表１４】
2012525156.tif 000016
【００７３】
図１の工程Eは、アセチル-CoA：アセトアセタート-CoAトランスフェラーゼ又は類似のトランスフェラーゼによるアセトアセチル-CoAのアセトアセタートへの転換を指す。atoA（アルファサブユニット）及びatoD（ベータサブユニット）によってコードされる大腸菌酵素（Vanderwinkelらの文献（Biochem. Biophys. Res. Comm. 33：902-908（1968））；Korolevらの文献（Acta Crystallagr. D Biol Crystallagr. 58：2116-2121（2002）））は、アセタート-CoAトランスフェラーゼ（EC2.8.3.8）としても公知であり、この実際の形質転換を触媒し、イソブチラート（Matthiesらの文献（Appl. Environ. Microbiol. 58：1435-1439（1992）））、バレラート（Vanderwinkel（上述））、及びブタノアート（Vanderwinkel（上述））を含む種々の分岐鎖及び直鎖アシル-CoA基質からアセタートへCoA部分を転移させることが追加的に示されている。類似の酵素は、コリネバクテリウム・グルタミクムATCC 13032（Duncanらの文献（Appl. Environ. Miocrobiol. 68：5186-5190（2002）））、クロストリジウム・アセトブチリカム（90）、及びクロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム（saccharoperbutylacetoniucum）（112）に存在する。これらの典型的な遺伝子産物の各々についての配列と関連したデータは、表15に示される以下のGenBank受入番号を用いて見出すことができる。
【表１５】
2012525156.tif 000017
【００７４】
追加的な典型的トランスフェラーゼ形質転換は、スクシニル-CoA、4-ヒドロキシブチリル-CoA、及びブチリル-CoAのアセチルトランスフェラーゼ活性をそれぞれ呈することが示されているクロストリジウム・クライベリのcat1、cat2、及びcat3の遺伝子産物によって触媒される（Aberthartらの文献（J. Chem. Soc. 6：1404-1406（1979））；Agnihotriらの文献（Med. Chem. 11：9-20（2003）））。これらの典型的な遺伝子産物の各々についての配列と関連したデータは、表16に示される以下のGenBank受入番号を用いて見出すことができる。
【表１６】
2012525156.tif 000018
【００７５】
嫌気性細菌アシダミノコッカス・ファーメンタンス由来のグルタコナート-CoA-トランスフェラーゼ（EC2.8.3.12）は、二酸性グルタコニル-CoA及び3-ブテノイル-CoAと反応する（Mackらの文献（FEBS Lett. 405：209-212（1997）））。この酵素をコードする遺伝子は、gctA及びgctBである。この酵素は、グルタリル-CoA、2-ヒドロキシグルタリル-CoA、アジピル-CoA、及びアクリリル-CoAを含む他のCoA誘導体を用いて、低いが検出可能な活性を有する（Buckelらの文献(上述)）。該酵素は、大腸菌においてクローニングされ、発現された（Mackらの文献（Eur. J. Biochem. 226：41-51（1994）））。これらの典型的な遺伝子産物の各々についての配列と関連したデータは、表17に示される以下のGenBank受入番号を用いて見出すことができる。
【表１７】
2012525156.tif 000019
【００７６】
アセトアセチル-CoAをアセトアセタートに転換することのできる追加的な酵素には、コハク酸をCoA受容体として利用するスクシニル-CoA：3-ケト酸CoAトランスフェラーゼを含む。典型的なスクシニル-CoA：3：ケト酸-CoAトランスフェラーゼは、ヘリコバクター・ピロリ（Corthesy-Theulazらの文献（J. Biol. Chem. 272：25659-25667（1997）））及びバチルス・スブチリス（Stolsらの文献（Protein. Expr. Purif. 53：396-403（2007）））に存在する。これらの典型的な遺伝子産物の各々についての配列と関連したデータは、表18に示される以下のGenBank受入番号を用いて見出すことができる。
【表１８】
2012525156.tif 000020
【００７７】
図１の工程Fは、アセトアセチル-CoAのアセトアセタートへのアセトアセチル-CoAヒドロラーゼによる転換を指す。このような活性は、ラット（Patelらの文献（Biochem. J. Biochem. J. 176：951-958（1978）））、ウシ（Drummondらの文献（J. Biol. Chem. 235：318-325（1960）））、及びヒト（Rousの文献（Biochem. Biophys. Res. Commun. 69：74-78（1976）））において検出されているが、相応する酵素をコードする遺伝子配列は公知ではない。いくつかの真核生物アセチル-CoAヒドロラーゼ（EC3.1.2.1）は、広範な基質特異性を有し、したがって、アセトアセチル-CoAを加水分解するのに好適な酵素を表す。例えば、ラット脳由来の酵素acot12（NP_570103.1）（Robinson, Jr.らの文献（Biochem. Biophys. Res. Comm. 71：959-965（1976）））は、ブチリル-CoA、ヘキサノイル-CoA、及びマロニル-CoAと反応することができる。
【００７８】
追加的なヒドロラーゼ酵素には、バリン分解中の3-ヒドロキシイソブチリル-CoAの3-ヒドロキシイソブチラートへの転換を効率的に触媒することが説明されている3-ヒドロキシイソブチリル-CoAヒドロラーゼを含む（Shimomuraらの文献（J. Biol. Chem. 269：14248-14253（1994）））。この酵素をコードする遺伝子には、ラット（Shimomuraの文献（上述）；Shimomuraの文献（2000））及びヒト（Shimomuraらの文献（Methods Enzymol. 324：229-240（2000）））のhibchを含む。配列相同性によって同定された遺伝子には、出芽酵母のhibch及びバチルス・セレウスのBC_2292を含む。これらの典型的な遺伝子産物の各々についての配列と関連したデータは、表19に示される以下のGenBank受入番号を用いて見出すことができる。
【表１９】
2012525156.tif 000021
【００７９】
なおも別のヒドロラーゼは、グルタリル-CoA、アジピル-CoA、スベリル-CoA、セバシル-CoA、及びドデカンジオイル-CoAに関して活性を呈するヒトジカルボン酸チオエステラーゼacot8（Westinらの文献（J. Biol. Chem. 280：38125-38132（2005）））、並びに広範な範囲のCoAチオールエステルも加水分解することのできる最も近い大腸菌ホモログtesB（Naggertらの文献（J. Biol. Chem. 266：11044-11050（1991）））である。また、類似の酵素は、ラット肝臓においても特徴づけられている（Deana, Biochem. Int. 26：767-773（1992））。これらの典型的な遺伝子産物の各々についての配列と関連したデータは、表20に示される以下のGenBank受入番号を用いて見出すことができる。
【表２０】
2012525156.tif 000022
【００８０】
他の有望な大腸菌チオールエステルヒドロラーゼには、tesA（Bonnerらの文献（J. Biol. Chem. 247：3123-3133（1972）））、ybgC（Kuznetsovaらの文献（FEMS Microbiol. Rev. 29：263- 279（2005））；Zhuangらの文献（FEBS Lett. 516：161-163（2002）））、paaI（Songらの文献（J. Biol. Chem. 281：11028-11038（2006）））、及びybdB（Leducらの文献（J. Bacteriol. 189：7112-7126（2007）））を含む。これらの典型的な遺伝子産物の各々についての配列と関連したデータは、表21に示される以下のGenBank受入番号を用いて見出すことができる。
【表２１】
2012525156.tif 000023
【００８１】
図１の工程Gにおいて、アセトアセタートはデカルボキシル化されて、アセトンを形成する。この反応は、細菌のソルベント生成能における酵素の役割について研究された該酵酵素であるアセトアセタートデカルボキシラーゼ（EC4.1.1.4）によって触媒することができる。典型的な細菌酵素は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Bennerらの文献（J. Am. Chem. So. 103：993-994（1981））；HIghbargerらの文献（Biochemistry 35：41-46（1996））；Petersenらの文献（Appl. Environ. Microbiol. 56：3491-3498（1990））；Rozzelらの文献（J. Am. Chem. Soc. 106：4937-4941（1984）））及びクロストリジウム・ベイジェリンキ（Ravagnaniらの文献（Mol. Microbiol. 37：1172-1185（2000）））から特徴づけられている。また、アセトアセタートデカルボキシラーゼ活性は、プチダ菌及びバチルス・ポリミキサにおいても示されているが、遺伝子は、今日までこの活性と関連付けられていない（Matiasekらの文献（Curr. Microbiol. 42：276-281（2001）））。ボツリヌス菌及びバチルス・アミロリケファシエンスFZB42などの他の生物における細菌遺伝子は、配列相同性によって同定することができる。ヒト及び他の哺乳類において、アセトアセタートデカルボキシラーゼは、ケトン体経路の最終工程を触媒する（Kalapos（Biochim. Biophys. Acta 1621：122-139（2003）））が、この活性と関連付けられた遺伝子は、今日まで同定されていない。これらの典型的な遺伝子産物の各々についての配列と関連したデータは、表22に示される以下のGenBank受入番号を用いて見出すことができる。
【表２２】
2012525156.tif 000024
【００８２】
他の典型的なデカルボキシラーゼ酵素には、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（EC4.1.1.1）及びベンゾイルギ酸デカルボキシラーゼ（EC4.1.1.7）を含む。ピルビン酸デカルボキシラーゼ（PDC）は、ケト酸デカルボキシラーゼとも呼ばれ、ピルビン酸からアセトアルデヒドへのデカルボキシル化を触媒するアルコール発酵における鍵酵素である。出芽酵母由来の酵素は、2-ケトブチラート、2-ケトバレラート、3-ヒドロキシピルビン酸、及び2-フェニルビルビン酸を含む脂肪族2-ケト酸についての広範な基質範囲を有する（Liらの文献（Biochemistry 38：10004-10012（1999）））。この酵素は、広範に研究されており、変化した活性のために操作されており、大腸菌において機能的に発現している（Killenberg‐Jabsらの文献（Eur. J. Biochem. 268：1698-1704（2001））；Liらの文献（上述）；ter Schureの文献（Appl. Environ. Micriobol. 64：1303-1307（1998））。また、pdcによってコードされるザイモモナス・モビリス由来のPDCは、広範な基質範囲を有し、異なる基質について親和性を変化させる指向型（directed）操作研究の対象である（Siegertらの文献（Protein Eng. Des. Sel., 18：345-357（2005）））。この酵素の結晶構造は入手可能である（Killenberg‐Jabs（上述））。十分に特徴づけられた他のPDC酵素には、アセトバクター・パストリアンス（pasteurians）（Chandraらの文献, Arch. Microbiol. 176:443-451（2001））及びクルイベロミセス・ラクチス（Kriegerらの文献（Eur. J. Biochem. 269：3256-3263（2002））由来の酵素を含む。これらの典型的な遺伝子産物の各々についての配列と関連したデータは、表23に示される以下のGenBank受入番号を用いて見出すことができる。
【表２３】
2012525156.tif 000025
【００８３】
PDCと同様に、ベンゾイルギ酸デカルボキシラーゼ（EC4.1.1.7）は、幅広い基質範囲を有し、酵素操作研究の標的である。プチダ菌由来の酵素は、広範に研究されており、この酵素の結晶構造は入手可能である（Polovnikivaらの文献（Biochemistry 42：1820-1830（2003））；Hassonらの文献（Biochemistry 37：9918-9930（1998）））。プチダ菌酵素の活性部位における2つの残基の位置指定突然変異誘発は、天然基質及び非天然基質の親和性（Km）を変化させた（Siegertらの文献（Protein Eng. Des. Sel., 18：345-357（2005）））。この酵素の特性は、指向型操作によってさらに修飾されている（Lingenらの文献（Chembiochem 4：721-726（2003））；Lingenらの文献（Protein Eng. 15：585-593（2002）））。また、mdlCによってコードされる緑膿菌由来の酵素は、実験的に特徴づけられている（Barrowmanらの文献（FEMS Microbiol. Letters 34：57-60（1986）））。シュードモナス・スツッツェリ、蛍光菌、及び他の生物に由来する追加的な遺伝子は、配列相同性によって推測することができるか、又はプチダ菌において開発した増殖選択系を用いて同定することができる（Henningらの文献（Appl. Environ. Micribiol. 72：7510-7517（2006）））。これらの典型的な遺伝子産物の各々についての配列と関連したデータは、表24に示される以下のGenBank受入番号を用いて見出すことができる。
【表２４】
2012525156.tif 000026
【００８４】
2-オキソ酸をデカルボキシル化することのできる第三の酵素は、アルファ-ケトグルタル酸デカルボキシラーゼ（KGD）である。このクラスの基質の基質範囲は、今日まで研究されていない。結核菌由来のKDC（Tianらの文献（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102：10670-10675（2005）））はクローニングされており、Genomatica社の大腸菌において機能的に発現した。KDC酵素活性は、ブラディリゾビウム・ジャポニクム及びメソリゾビウム・ロティ（Mesorhizobium loti）を含む根粒菌のいくつかの種において検出されている（Greenらの文献（J. Bacteriol. 182：2838-2844（2000）））。KDCコード遺伝子はこれらの生物において単離されていないが、ゲノム配列は入手可能であり、各ゲノムにおけるいくつかの遺伝子は、推定KDCとして注解される。また、ユーグレナ・グラシリス由来のKDCも特徴づけられているが、この活性と関連した遺伝子は今日まで同定されていない（Shigeokaらの文献（Arch. Biochem. Biophys. 288：22-28（1991）））。n‐末端から開始する最初の20個のアミノ酸を
【化１】
2012525156.tif 000027
と配列決定した（Shigeokaらの文献（上述））。遺伝子は、このn‐末端配列を含む遺伝子をKDC活性について試験することによって同定することができる。これらの典型的な遺伝子産物の各々についての配列と関連したデータは、表25に示される以下のGenBank受入番号を用いて見出すことができる。
【表２５】
2012525156.tif 000028
【００８５】
3-ヒドロキシブチリル-CoAを形成するためのクロトニル-CoAの水和（工程B、図１）は、クロトナーゼ（EC4.2.1.55）によって触媒される。これらの酵素は、いくつかの生物、特にクロストリジウム種におけるn-ブタノール形成のための経路の一部であり、また、スルホロブス属、アシディアヌス属、及びメタロスファエラ属の好熱酸性古細菌における3-ヒドロキシプロピオナート／4-ヒドロキシブチラートサイクルの1工程も含む。クロトナーゼ酵素をコードする典型的な遺伝子は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Boyntonらの文献（Journal of Bacteriology 178：3015-3024（1996）））、クロストリジウム・クライベリ（Hillmerらの文献（FEBS Lett. 21：351-354（1972）））、及び、メタロスファエラ・セデュラ（Bergらの文献（Archaea. Science. 318：1782-1786（2007）））において認めることができるが、後者の遺伝子の配列は公知ではない。また、脂肪酸ベータ‐酸化及び／又は種々のアミノ酸の代謝に関与するエノイル-CoAヒドラターゼは、クロトニル-CoAの水和を触媒して、3-ヒドロキシブチリル-CoAを形成することができる（Agnihotriらの文献（Med. Chem., 11：9-20（2003））；Conradらの文献（J Bacteriol. 118：103-111（1974）））。プチダ菌のエノイル-CoAヒドラターゼphaA及びphaBは、フェニル酢酸異化作用の間に二重結合のヒドロキシル化を実施することが示されている（Oliveraらの文献（Proc. Natl. Acad. Sci USA 95：6419-6424（1998）））。蛍光菌由来のpaaA及びpaaBは、類似の形質転換を触媒する（Oliveraらの文献（上述））。最後に、いくつかの大腸菌遺伝子は、maoC（Parkらの文献（J Bacteriol. 185：5391-5397（2003）））、paaF（Ismailらの文献（Eur. J Biochem. 270：3047-3054（2003））；Parkらの文献（Appl. Biochem. Biotechnol 113-116：335-346（2004））；Parkらの文献（Biotechnol Bioeng 86：681-686（2004）））、及びpaaG（Ismailらの文献（上述）；Parkらの文献（上述）；Parkらの文献（上述））を含むエノイル-CoAヒドラターゼ官能性を示すことが示されている。これらの典型的な遺伝子産物の各々についての配列と関連したデータは、表26に示される以下のGenBank受入番号を用いて見出すことができる。
【表２６】
2012525156.tif 000029
【００８６】
あるいは、fadA及びfadBの大腸菌遺伝子産物は、エノイル-CoAヒドラターゼ活性を呈する脂肪酸酸化に関与する多酵素複合体をコードする（Hallerらの文献（Biochemistry, 39：4622-4629（2000））、Martinez-Carrionらの文献（J. Biol. Chem. 240：3538-3546（1965））、及びMattiesらの文献（Appl. Environ. Microbiol., 58：1435-1439（1992）））。fadRによってコードされる負の調節因子をノックアウトすることは、fadB遺伝子産物を活性化するために利用することができる（Jengらの文献（Biochem. 13：2898-2903（1974）））。fadI遺伝子及びfadJ遺伝子は、類似の機能をコードし、嫌気性条件下で自然に発現する（Atsumiらの文献（Nature 451：86-89（2008）））。これらの典型的な遺伝子産物の各々についての配列と関連したデータは、表27に示される以下のGenBank受入番号を用いて見出すことができる。
【表２７】
2012525156.tif 000030
【００８７】
4-ヒドロキシブチリル-CoAからクロトニル-CoAへの可逆的転換（工程A、図１）は、二機能性酵素4-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼ／ビニルアセチル-CoAΔ-イソメラーゼによって触媒される。この酵素はまず、4-ヒドロキシブチリル-CoAをビニルアセチル-CoAへと脱水し、その後、ビニルアセチル-CoAはクロトノイル-CoAを形成するよう再編成する。クロストリジウム・クライベリ及びクロストリジウム・アミノブチリカム（aminobutyrium）由来の酵素は精製され、特徴づけられ、n‐末端ドメインにおいて配列決定されている（Scherfらの文献（Eur. J. Biochem. 215：421-429（1993））；Scherfらの文献（Arch. Microbiol 161：239-245（1994）））。クロストリジウム・アミノブチリカム及びクロストリジウム・クライベリ由来のabfD遺伝子は、これらのn‐末端アミノ酸配列と実際に符合しており、4-ヒドロキシブチルル（4-hydroxybutyrul）-CoAデヒドラターゼ／ビニルアセチル-CoAΔ-イソメラーゼの活性をコードすることが示されている。加えて、ポルフィロモナス・ジンジバリスATCC33277由来のabfD遺伝子は、ゲノムプロジェクトから相同性を通じて同定されている。これらの典型的な遺伝子産物の各々についての配列と関連したデータは、表27に示される以下のGenBank受入番号を用いて見出すことができる。
【表２８】
2012525156.tif 000031
【００８８】
3-ヒドロキシイソブチリル-CoAからメタクリリル-CoAへの脱水（工程R）は、クロトナーゼ（3-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼ、EC4.2.1.55とも呼ばれる。）又はエノイル-CoAヒドラターゼ（3-ヒドロキシアシル-CoAデヒドラターゼ、EC4.2.1.17とも呼ばれる。）などの可逆的な3-ヒドロキシアシル-CoAデヒドラターゼによって達成することができる。これらの酵素は一般的に可逆的である（Moskowitzらの文献（Biochemistry 8：2748-2755（1969））；Durreらの文献（FEMS Microbiol Rev 17：251-262（1995）））。典型的な酵素を上記に列挙する。3-ヒドロキシイソブチリル-CoAは、これらの酵素の天然基質ではないが、天然基質3-ヒドロキシブチリル-CoAと構造上類似している。
【００８９】
図１に関して、工程Mは、ブチリル-CoAの炭素骨格をイソブチリル-CoAへと可逆的に再編成するコバラミン‐依存性メチルムターゼであるイソブチリル-CoAムターゼ（ICM）によって実施される（Ratnatillekeらの文献（J Biol Chem 274：31679-31685（1999）））。また、このような酵素は、図１の工程Qによって説明される、4-ヒドロキシブチリル-CoAから3-ヒドロキシイソブチリル-CoAへの転換を触媒するのにも好適である。ヘテロ二量体ICMをコードする遺伝子には、ストレプトマイセス・シナモネンシス（cinnamonensis）のicm及びicmBを含む（Ratnatillekeらの文献（上述）；Vrijbloedらの文献（J Bacteriol 181：5600-5605（1999））；Zerbe‐Burkhardtらの文献（J. Biol Chem 273：6508-6517（1998）））。ストレプトマイセス・アベルミチリス（avermitilis）MA‐4680における相同的な遺伝子は、同じ又は類似の形質転換を触媒するようである。メチリビウム・ペトロレイフィラム（Methylibium petroleiphilum）PM1由来の相応するペプチド配列とほぼ100％の同一性を有するβ-プロテオバクテリウムL108における新規のICM様酵素は、2-ヒドロキシイソブチリル-CoAを3-ヒドロキシブチラートに転換することが示された（Rohwerderらの文献（Appl Environ Microbiol 72：4128-4135（2006）））。また、この研究は、位置80においてIleを有する典型的なICM酵素におけるPhe残基の置換（例えば、Ratnatillekeらの文献（上述））が、2-ヒドロキシイソブチリル-CoAに関する活性の原因となる突然変異の1つであり得ることも示した。このことは、未変性ICM酵素又はICM様酵素が、4-ヒドロキシブチリル-CoAから3-ヒドロキシイソブチリル-CoAへの転換を自然に触媒することが不可能である場合、該酵素は、そのようにするよう操作され得ることを含意している。これらの典型的な遺伝子産物の各々についての配列と関連したデータは、表28に示される以下のGenBank受入番号を用いて見出すことができる。
【表２９】
2012525156.tif 000032
【００９０】
メチルマロニル-CoAムターゼ（MCM）酵素は、図３の工程P又は工程Tによって説明される形質転換を触媒するのに好適な追加的なクラスの酵素を表し、但し、該酵素が、ブチリル-CoA又は4-ヒドロキシブチリル-CoAに関して活性をそれぞれ自然に呈するか又は該活性を呈するよう操作することができることを条件とする。MCMは、スクシニル-CoAのメチルマロニル-CoAへの転換を自然に触媒する。大腸菌において、可逆的アデノシルコバラミン‐依存性ムターゼは、コハク酸からプロピオン酸への転換をもたらす3工程経路に関与する（Hallerらの文献（Biochenmistry. 39：4622-4629（2000）））。MCMは、大腸菌における遺伝子scpA（Hallerらの文献（上述）；Bobikらの文献（Anal Bioanal Chem 375：344-349（2003）））及びヒトにおける遺伝子mutA（Padovaniらの文献（Biochemistry 45：9300-9306（2006）））によってコードされる。いくつかの他の生物において、MCMは、アルファサブユニット及びベータサブユニットを含み、2つの遺伝子によってコードされる。2‐サブユニットタンパク質をコードする典型的な遺伝子は、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ種シャーマニ（shermani）mutA及びmutB、並びにメチロバクテリウム・エキストロクエンスmcmA及びmcmBである（Korotkovaらの文献（J Biol Chem. 279：13652-13658（2004）））。これらの典型的な遺伝子産物の各々についての配列と関連したデータは、表29に示される以下のGenBank受入番号を用いて見出すことができる。
【表３０】
2012525156.tif 000033
【００９１】
これらの配列を使用して、GenBank又は他のデータベースにおけるホモログタンパク質を、配列類似性検索（例えば、BLASTp）を通じて同定することができる。結果として生じるホモログタンパク質及びそれらの相応する遺伝子配列は、産生宿主を作出するために、大腸菌又は他の好適な宿主微生物への形質転換のための追加的な外来性DNA配列を提供する。追加的な遺伝子には以下を含み、以下は、大腸菌spcA遺伝子産物と高い相同性に基づいて同定された。これらの典型的な遺伝子産物の各々についての配列と関連したデータは、表30に示される以下のGenBank受入番号を用いて見出すことができる。
【表３１】
2012525156.tif 000034
【００９２】
メチルマロニル-CoAムターゼ触媒性遺伝子に近い遺伝子が、最大活性の一因となるという証拠が存在する。例えば、メチロバクテリウム・エキストロクエンス由来のmeaB遺伝子は、メチルマロニル-CoAムターゼと複合体を形成し、インビトロでのムターゼ活性を刺激し、かつ該活性を不可逆的不活性化からおそらく保護することが示されている（Korotkovaらの文献（上述））。メチロバクテリウム・エキストロクエンスmeaB遺伝子産物は、染色体上のscpAに近い大腸菌argK遺伝子の産物と非常に類似している（BLASTp：45％同一性、e‐値：4e-67）。プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒにおけるmeaBホモログについての配列は、GenBankに掲載されていない。しかしながら、アクネ菌KPA171202遺伝子産物YP_055310.1は、メチロバクテリウム・エキストロクエンスmeaBタンパク質と51％同一であり、また、その遺伝子は、染色体上のメチルマロニル-CoAムターゼ遺伝子に近い。これらの典型的な遺伝子産物の各々についての配列と関連したデータは、表31に示される以下のGenBank受入番号を用いて見出すことができる。
【表３２】
2012525156.tif 000035
【００９３】
大腸菌は、中間体であるコビナミド又はコバラミンとともに供給される場合、この反応についての必要な共因子であるアデノシルコバラミンを合成することができる（Lawrenceらの文献（J Bacteriol 177：6371-6380（1995））；Lawrenceらの文献（Genetics 142：11-24（1996）））。あるいは、新生コバラミンを合成する能力は、異種性遺伝子の発現後に大腸菌において与えられる（Rauxらの文献（J Bacteriol 178：753-767（1996）））。
【００９４】
図１における工程Dは、アセトアセチル-CoAのアセトアセタートへの転換を触媒する酸‐チオールリガーゼを指す。典型的な酸‐チオールリガーゼは、インビボで可逆的な反応である、1個のATPの同時消費を伴うコハク酸からのスクシニル-CoAの形成を触媒する大腸菌のsucCDによりコードされる酵素である（Buckらの文献, Biochemistry 24:6245-6252 (1985)）。追加的な酵素は、マウス（Hasegawaらの文献, Biochim Biophys Acta 1779:414-419 (2008)）及びヒト（Ohgamiらの文献, Biochem Pharmacol 65:989-994(2003)）由来のアセトアセチル-CoAシンテターゼであり、アセトアセタートのアセトアセチル-CoAへのATP‐依存性転換を自然に触媒する。このような酵素は、アセトアセチル-CoAをアセトアセタートへ転換することができ、該酵素は、アセトアセチル-CoAヒドロラーゼ活性を呈するべきである。これらの典型的な遺伝子産物の各々についての配列と関連したデータは、表32に示される以下のGenBank受入番号を用いて見出すことができる。
【表３３】
2012525156.tif 000036
【００９５】
ADPを形成するアセチル-CoAシンテターゼ（ACD、EC6.2.1.13）は、アシル-CoAエステルのその相応する酸への転換を、ATPの同時合成と共役させる別の酵素である。この酵素は、基質としてのアセトアセチル-CoAと反応することは示されていないが、幅広い基質特異性を有するいくつかの酵素は、文献において説明されている。AF1211によってコードされるアーケオグロブス・フルギダス由来のACDIは、アセチル-CoA、プロピオニル-CoA、ブチリル-CoA、アセタート、プロピオナート、ブチラート、イソブチリアート（isobutyryate）、イソバレラート、スクシナート、フマラート、フェニルアセタート、インドールアセタートを含む種々の直鎖及び分岐鎖の基質に関して作動することが示された（Musfeldtらの文献（J. Bacteriol 184：636-644（2002）））。ハロアーキュラ・マリスモルツイ由来の酵素（スクシニル-CoAシンテターゼとして注解される。）は、プロピオナート、ブチラート、及び分岐鎖酸（イソバレラート及びイソブチラート）を基質として受容し、順方向及び逆方向に作動することが示された（Brasenらの文献（Arch Microbiol. 182：277-287（2004）））。超好熱性クレン古細菌（crenarchaeon）であるピロバキュラム・アエロフィラム（aerophilum）に由来するPAE3250によってコードされるACDは、特徴づけられたすべてのACDのうちで最も幅広い基質範囲を示し、アセチル-CoA、イソブチリル-CoA（好ましい基質）、及びフェニルアセチル-CoAと反応した（Brasenらの文献（上述））。アーケオグロブス・フルギダス、ハロアーキュラ・マリスモルツイ、及びピロバキュラム・アエロフィラム由来の酵素はすべて、大腸菌においてクローニングされ、機能的に発現し、及び特徴づけられている（Musfeldtらの文献（上述）；Brasenらの文献（上述））。また、図１の工程Dによって示される正味の形質転換は、アセタートキナーゼ及びホスホトランスアセチラーゼ、又はブチラートキナーゼ及びホスホトランスブチリラーゼなど2つの酵素によって実施することができる。これらの典型的な遺伝子産物の各々についての配列と関連したデータは、表33に示される以下のGenBank受入番号を用いて見出すことができる。
【表３４】
2012525156.tif 000037
【００９６】
4-ヒドロキシブチリル-CoAからイソプロパノールを生成することのできる非天然微生物には、fumA、fumB、fumC、fumH、fum1、MmcB、MmcC、hmd、BACCAP_02294、ANACOL_02527、NtherDRAFT_2368、dmdA、dmdB、crt、crt1、paaA、paaB、phaA、phaB、maoC、paaF、paaG、abfD、及びMsed_1220からなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる4-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼを含むことができる。特定の実施態様において、4-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼは、abfDによってコードされる。
【００９７】
4-ヒドロキシブチリル-CoAからイソプロパノールを生成することのできる非天然微生物には、fumA、fumB、fumC、fumH、fum1、MmcB、MmcC、hmd、BACCAP_02294、ANACOL_02527、NtherDRAFT_2368、dmdA、dmdB、crt、crt1、paaA、paaB、phaA、phaB、maoC、paaF、paaG、abfD、及びMsed_1220からなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされるクロトナーゼを含むことができる。特定の実施態様において、クロトナーゼは、crt、crt1、paaA、paaB、phaA、phaB、maoC、paaF、及びpaaGからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる。
【００９８】
4-ヒドロキシブチリル-CoAからイソプロパノールを生成することのできる非天然微生物には、thrA、akthr2、hom6、hom1、hom2、fadB、fadJ、Hbd2、Hbd1、hbd、HSD17B10、phbB、phaB、Msed_1423、Msed_0399、Msed_0389、Msed_1993、adh、adhA、adh‐A、mdh、ldhA、ldh、及びbdhからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる3-ヒドロキシブチリル-CoA脱水素酵素を含むことができる。特定の実施態様において、3-ヒドロキシブチリル-CoA脱水素酵素は、hbd、Hbd2、Hbd1、Msed_1423、Msed_0399、Msed_0389、Msed_1993、fadB、及びfadJからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる。
【００９９】
4-ヒドロキシブチリル-CoAからイソプロパノールを生成することのできる非天然微生物には、sucC、sucD、AACS、AF1211、scs、及びPAE3250からなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされるアセトアセチル-CoAシンテターゼを含むことができる。特定の実施態様において、アセトアセチル-CoAシンテターゼは、 sucC、sucD、AACS、及びAF1211からなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる。
【０１００】
4-ヒドロキシブチリル-CoAからイソプロパノールを生成することのできる非天然微生物には、atoA、atoD、actA、cg0592、ctfA、ctfB、cat1、cat2、cat3、gctA、gctB、HPAG1_0676、HPAG1_0677、ScoA、及びScoBからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされるアセチル-CoA：アセトアセタート-CoAトランスフェラーゼを含むことができる。特定の実施態様において、アセチル-CoA：アセトアセタート-CoAトランスフェラーゼは、atoA、atoD、actA、cg0592、ctfA、ctfB、HPAG1_0676、HPAG1_0677、ScoA、及びScoBからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる。
【０１０１】
4-ヒドロキシブチリル-CoAからイソプロパノールを生成することのできる非天然微生物には、acot12、hibch、BC_2292、tesB、acot8、tesA、ybgC、paaI、及びybdBからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされるアセトアセチル-CoAヒドロラーゼを含むことができる。特定の実施態様において、アセトアセチル-CoAヒドロラーゼは、acot12、hibch、及びtesAからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる。
【０１０２】
4-ヒドロキシブチリル-CoAからイソプロパノールを生成することのできる非天然微生物には、pdc、pdc1、mdlC、dpgB、ilvB-1、kgd、kdcA、lysA、panD、dmpH、dmpE、xylII、xylIII、Reut_B5691、Reut_B5692、CAD、pad1、pofK、（pad）、padC、及びpadからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされるアセトアセタートデカルボキシラーゼを含むことができる。また、4-ヒドロキシブチリル-CoAからイソプロパノールを生成することのできる非天然微生物には、Adc、cbei_3835、CLL_A2135、RBAM_030030からなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされるアセトアセタートデカルボキシラーゼも含むことができる。
【０１０３】
4-ヒドロキシブチリル-CoAからイソプロパノールを生成することのできる非天然微生物には、thrA、akthr2、hom6、hom1、hom2、fadB、fadJ、Hbd2、Hbd1、hbd、HSD17B10、phbB、phaB、Msed_1423、Msed_0399、Msed_0389、Msed_1993、adh、adhA、adh‐A、mdh、ldhA、ldh、及びbdhからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされるアセトン還元酵素を含むことができる。特定の実施態様において、アセトン還元酵素は、adh、adhA、及びadh‐Aからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる。
【０１０４】
4-ヒドロキシブチリル-CoAからn-ブタノールを生成することのできる非天然微生物には、fumA、fumB、fumC、fumH、fum1、MmcB、MmcC、hmd、BACCAP_02294、ANACOL_02527、NtherDRAFT_2368、dmdA、dmdB、crt、crt1、paaA、paaB、phaA、phaB、maoC、paaF、paaG、abfD、及びMsed_1220からなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる4-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼを含むことができる。特定の実施態様において、4-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼは、abfDによってコードされる。
【０１０５】
4-ヒドロキシブチリル-CoAからn-ブタノールを生成することのできる非天然微生物には、bcd、etfA、etfB、Ter、TDE0597、IBD、RPA3448、FadH、及びenrからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされるクロトノイル-CoA還元酵素を含むことができる。特定の実施態様において、クロトノイル-CoA還元酵素は、bcd、etfA、etfB、Ter、及びTDE0597からなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる。
【０１０６】
4-ヒドロキシブチリル-CoAからn-ブタノールを生成することのできる非天然微生物には、acr1、sucD、bphG、adhE、Msed_0709、mcr、asd‐2、Saci_2370、Ald、及びeutEからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされるブチリル-CoA還元酵素（アルデヒド形成）を含むことができる。特定の実施態様において、ブチリル-CoA還元酵素（アルデヒド形成）は、sucD、bphG、Msed_0709、mcr、及びAldからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる。
【０１０７】
4-ヒドロキシブチリル-CoAからn-ブタノールを生成することのできる非天然微生物には、alrA、ADH2、yqhD、bdhI、bdhII、adhA、4hbd、adhI、P84067、mmsb、dhat、及び3hidhからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされるブチルアルデヒド還元酵素を含むことができる。特定の実施態様において、ブチルアルデヒド還元酵素は、alrA、ADH2、yqhD、bdhI、bdhII、4hbd、adhI、及びmmsbからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる。
【０１０８】
4-ヒドロキシブチリル-CoAからn-ブタノールを生成することのできる非天然微生物には、adhE、adhE2、mcr、Rcas_2929、NAP1_02720、MGP2080_00535、及びFARからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされるブチリル-CoA還元酵素（アルコール形成）を含むことができる。特定の実施態様において、ブチリル-CoA還元酵素（アルコール形成）は、adhE2、mcr、及びFARからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる。
【０１０９】
4-ヒドロキシブチリル-CoAからイソブタノールを生成することのできる非天然微生物には、fumA、fumB、fumC、fumH、fum1、MmcB、MmcC、hmd、BACCAP_02294、ANACOL_02527、NtherDRAFT_2368、dmdA、dmdB、crt、crt1、paaA、paaB、phaA、phaB、maoC、paaF、paaG、abfD、及びMsed_1220からなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる4-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼを含むことができる。特定の実施態様において、4-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼは、crt、crt1、paaA、paaB、phaA、phaB、maoC、paaF、及びpaaGによってコードされる。
【０１１０】
4-ヒドロキシブチリル-CoAからイソブタノールを生成することのできる非天然微生物には、bcd、etfA、etfB、Ter、TDE0597、IBD、RPA3448、FadH、及びenrからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされるクロトノイル-CoA還元酵素を含むことができる。特定の実施態様において、クロトノイル-CoA還元酵素は、bcd、etfA、etfB、Ter、及びTDE0597からなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる。
【０１１１】
4-ヒドロキシブチリル-CoAからイソブタノールを生成することのできる非天然微生物には、icm、icmB、icmA、Mpe_B0538、Mpe_B0541、scpA、mutA、mutB、mcmA、mcmB、sbm、SARI_04585、YfreA_01000861、argK、PPA0597、及びmeaBからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされるイソブチリル-CoAムターゼを含むことができる。特定の実施態様において、イソブチリル-CoAムターゼは、icmB、icmA、Mpe_B0538、及びMpe_B0541からなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる。
【０１１２】
4-ヒドロキシブチリル-CoAからイソブタノールを生成することのできる非天然微生物には、icm、icmB、icmA、Mpe_B0538、Mpe_B0541、scpA、mutA、mutB、mcmA、mcmB、sbm、SARI_04585、YfreA_01000861、argK、PPA0597、及びmeaBからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる4-ヒドロキシブチリル-CoAムターゼを含むことができる。特定の実施態様において、4-ヒドロキシブチリル-CoAムターゼは、icmB、icmA、Mpe_B0538、及びMpe_B0541からなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる。
【０１１３】
4-ヒドロキシブチリル-CoAからイソブタノールを生成することのできる非天然微生物には、fumA、fumB、fumC、fumH、fum1、MmcB、MmcC、hmd、BACCAP_02294、ANACOL_02527、NtherDRAFT_2368、dmdA、dmdB、crt、crt1、paaA、paaB、phaA、phaB、maoC、paaF、paaG、abfD、及びMsed_1220からなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる3-ヒドロキシイソブチリル-CoAデヒドラターゼを含むことができる。特定の実施態様において、3-ヒドロキシイソブチリル-CoAデヒドラターゼは、crt、crt1、paaA、paaB、phaA、phaB、maoC、paaF、及びpaaGからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる。
【０１１４】
4-ヒドロキシブチリル-CoAからイソブタノールを生成することのできる非天然微生物には、bcd、etfA、etfB、Ter、TDE0597、IBD、RPA3448、FadH、及びenrからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされるメタクリリル-CoA還元酵素を含むことができる。特定の実施態様において、メタクリリル-CoA還元酵素は、bcd、etfA、etfB、Ter、及びTDE0597からなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる。
【０１１５】
4-ヒドロキシブチリル-CoAからイソブタノールを生成することのできる非天然微生物には、acr1、sucD、bphG、adhE、Msed_0709、mcr、asd‐2、Saci_2370、Ald、及びeutEからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされるイソブチリル-CoA還元酵素（アルデヒド形成）を含むことができる。特定の実施態様において、イソブチリル-CoA還元酵素（アルデヒド形成）は、sucD、bphG、Msed_0709、mcr、及びAldからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる。
【０１１６】
4-ヒドロキシブチリル-CoAからイソブタノールを生成することのできる非天然微生物には、alrA、ADH2、yqhD、bdhI、bdhII、adhA、4hbd、adhI、P84067、mmsb、dhat、及び3hidhからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされるイソブチルアルデヒド還元酵素を含むことができる。特定の実施態様において、イソブチルアルデヒド還元酵素は、alrA、ADH2、yqhD、bdhI、bdhII、4hbd、adhI、P84067、及びmmsbからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる。
【０１１７】
4-ヒドロキシブチリル-CoAからイソブタノールを生成することのできる非天然微生物には、adhE、adhE2、mcr、Rcas_2929、NAP1_02720、MGP2080_00535、及びFARからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされるイソブチリル-CoA還元酵素（アルコール形成）を含むことができる。特定の実施態様において、イソブチリル-CoA還元酵素（アルコール形成）は、adhE2、mcr、及びFARからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる。
【０１１８】
本発明の非天然微生物は、1以上のイソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノール生合成経路に関与する1以上の酵素又はタンパク質をコードする発現可能な核酸を導入することによって作出することができる。生合成のために選択された宿主微生物に応じて、特定のイソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールの生合成経路のいくつか若しくは全部のための核酸を発現させることができる。例えば、選択された宿主が所望の生合成経路の1以上の酵素又はタンパク質を欠損する場合、該欠損した酵素又はタンパク質のための発現可能な核酸が次の外来性発現のための宿主に導入される。あるいは、選択された宿主がいくつかの経路遺伝子の内在性発現を呈するものの他の遺伝子を欠損する場合、コード核酸は、欠損している酵素又はタンパク質について、イソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールの生合成を達成するために必要である。従って、本発明の非天然微生物は、所望の生合成経路を得るために外来性の酵素若しくはタンパク質の活性を導入することにより作出することができ、又は所望の生合成経路は、1以上の内在性の酵素若しくはタンパク質と共に、イソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールなどの所望の生成物を生成する1以上の外来性の酵素若しくはタンパク質の活性を導入することにより得ることができる。
【０１１９】
選択された宿主微生物のイソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールの生合成経路構成要素に応じて、本発明の非天然微生物は、少なくとも1つの外来的に発現したイソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールの経路コード核酸を含み、かつ、1以上のイソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールの生合成経路のための最大で全てのコード核酸を含む。例えば、イソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールの生合成は、経路酵素又はタンパク質を欠損した宿主において、該相応コード核酸の外来性発現を介して確立することができる。イソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールの経路の全ての酵素又はタンパク質を欠損する宿主において、該経路の全ての酵素又はタンパク質の外来性発現を含むことができるが、該宿主が該経路酵素又はタンパク質のうちの少なくとも1つを含む場合であってさえも、経路の全ての酵素又はタンパク質を発現することができることは理解される。例えば、イソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールの産生のための経路における全ての酵素又はタンパク質の外来性発現を含むことができる。
【０１２０】
本明細書に提供される教示及びガイダンスを考慮すると、当業者は、発現可能な形態で導入するコード核酸の数が、少なくとも、選択された宿主微生物のイソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールの経路欠損に対応することを理解するであろう。それゆえ、本発明の非天然微生物は、本明細書に開示されるイソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールの生合成経路を構成する酵素又はタンパク質をコードする、1、2、3、4、5、最大で全ての核酸までを有することができる。いくつかの実施態様において、非天然微生物は、イソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールの生合成を促進若しくは最適化する、又は該宿主微生物へ他の有用な機能を与える他の遺伝的修飾も含むことができる。このような他の官能性の1つには、例えば、アセチル-CoAなどの1以上のイソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールの経路前駆体の合成の増強を含むことができる。
【０１２１】
一般的に、宿主微生物は、天然産生分子として、又は所望の前駆体の新規産生、若しくは該宿主微生物により天然に産生される前駆体の高い産生のいずれかを提供する操作された生成物としてのいずれかで、イソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールの経路の前駆体を産生するように選択される。例えば、アセチル-CoAは、大腸菌などの宿主生物において天然に産生される。宿主微生物は、本明細書に開示されるように、前駆体の産生を高めるように操作することができる。加えて、所望の前駆体を産生するように操作された微生物は、宿主微生物として使用することができ、更にイソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールの経路の酵素又はタンパク質を発現するように操作することができる。
【０１２２】
いくつかの実施態様において、本発明の非天然微生物は、イソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールのを合成する酵素能力を含む宿主から作出される。この具体的な実施態様において、イソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールの経路生成物の合成又は蓄積を増加させて、例えばイソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールの産生の方にイソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールの経路反応を駆動することは有用であり得る。高い合成又は蓄積は、例えば、上記のイソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールの経路の酵素又はタンパク質の1以上をコードする核酸の過剰発現により達成することができる。イソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールの経路の酵素（enzyme）若しくは酵素（enzymes）及び／又はタンパク質（protein）若しくはタンパク質（proteins）の過剰発現は、例えば、内在性の遺伝子（gene）若しくは遺伝子（genes）の外来性発現により、又は異種性の遺伝子（gene）若しくは遺伝子（genes）の外来性発現により、起こすことができる。それゆえ、天然生物は、例えば、イソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールの生合成経路の酵素又はタンパク質をコードする1、2、3、4、5、すなわち最大で全ての核酸の過剰発現を通じて、イソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールを産生する本発明の非天然微生物であるように容易に作出することができる。加えて、非天然生物は、イソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールの生合成経路の酵素の活性の増加を結果的に生じる内在性遺伝子の突然変異誘発により作出することができる。
【０１２３】
特に有用な実施態様において、コード核酸の外来性発現が採用される。外来性発現は、宿主及び応用に対する発現エレメント及び／又は調節エレメントをカスタマイズして仕立てる能力を与えて、使用者により制御される所望の発現レベルを達成する。しかしながらまた、内在性発現は、誘導性プロモーター又は他の調節エレメントに連関された場合、遺伝子のプロモーターの負の調節性のエフェクター又は誘導を取り除くことなどによって、他の実施態様において利用することができる。従って、天然の誘導性プロモーターを有する内在性遺伝子は、適切な誘導剤を提供することにより上方制御することができ、又は、内在性遺伝子の調節領域は、誘導性の調節エレメントを組み込むように操作することができ、これにより所望の時に一度に、内在性遺伝子の高い発現の調節が可能となる。同様に、誘導性プロモーターは、非天然微生物に導入される外来性遺伝子のための調節エレメントとして含まれ得る。
【０１２４】
本発明の方法において、任意の1以上の外来性核酸は本発明の非天然微生物を作出するために微生物に導入することができることは理解される。核酸は、例えば、該微生物へのイソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールの生合成経路を与えるように導入することができる。あるいは、コード核酸は、イソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールの生合成能力を与えるいくつかの必要な反応を触媒する生合成能力を有する中間微生物を作出するために導入することができる。例えば、イソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールの生合成経路を有する非天然微生物は、所望の酵素又はタンパク質をコードする少なくとも2つの外来性核酸を含むことができる。従って、生合成経路の2以上の酵素又はタンパク質の任意の組み合わせは、本発明の非天然微生物に含まれ得ることは理解される。同様に、所望の生合成経路の酵素及び／又はタンパク質の組み合わせがその相応する所望の生成物の生成を生じる限り、生合成経路の3以上酵素又はタンパク質の任意の組み合わせが、所望のとおり本発明の非天然微生物などに含まれ得ることは理解される。同様に、所望の生合成経路の酵素及び／又はタンパク質の組み合わせがその相応する所望の生成物の生成を生じる限り、本明細書に開示される生合成経路の4以上酵素又はタンパク質の任意の組み合わせは、所望のとおり、本発明の非天然微生物に含まれ得ることは理解される。
【０１２５】
本明細書に記載されるイソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールの生合成に加えて、本発明の非天然微生物及び方法はまた、他の経路により生成物の生合成を達成するための当該技術分野において周知の互いとの並びに他の微生物及び方法との種々の組み合わせにおいても利用することができる。例えば、イソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールの産生体の使用以外でイソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールのを産生するための1つの選択肢は、イソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールの経路中間体をイソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールに転換することのできる別の微生物の添加を介することである。このような手順の１つには、例えば、イソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールの経路中間体を産生する微生物の発酵を含む。次に、イソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールの経路中間体は、イソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールの経路中間体をイソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールに転換する第2の微生物のための基質として使用することができる。イソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールの経路中間体は、第2の微生物の別の培養液に直接添加することができ、又はイソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールの経路中間体産生体の元の培養液は、例えば細胞分離によりこれらの微生物から枯渇させることができ、次に、その後の第2の微生物の該発酵ブロスへの添加は、中間体の精製工程なしで最終生成物を産生するために利用できることができる。
【０１２６】
他の実施態様において、本発明の非天然微生物及び方法は、例えば、イソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールの生合成を達成するための幅広い種々の下位経路において組み立てることができる。これらの実施態様において、本発明の所望の生成物のための生合成経路は、異なる微生物へと分離することができ、該異なる微生物は、最終生成物を産生させるために共培養することができる。このような生合成スキームにおいて、1つの微生物の生成物は、最終生成物が合成されるまでの第2の微生物のための基質である。例えば、イソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールの生合成は、1つの経路中間体の別の経路中間体又は生成物への転換のための生合成経路を含む微生物を構築することにより達成することができる。あるいは、イソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールは、同じ容器内の2つの微生物を使用する共培養又は共発酵を通じて、微生物から生合成で産生でき、ここで、該第1の微生物は、イソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールの中間体を産生し、該第2の微生物は該中間体をイソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールに転換する。
【０１２７】
本明細書に提供される教示及びガイダンスを考慮すると、当業者は、幅広い種々の組み合わせ及び順列が、本発明の非天然微生物及び方法にとって、他の微生物とともに、下位経路を有する他の非天然微生物の共培養物とともに、並びにイソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールを産生するための周知の他の化学的及び／又は生化学的手順の組み合わせとともに、存在することを理解するであろう。
【０１２８】
イソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールの経路の酵素又はタンパク質のためのコード核酸の供給源には、例えば、該コードされた遺伝子産物が当該反応を触媒することのできる任意の種を含むことができる。このような種には、古細菌及び真正細菌を含む細菌、並びに酵母、植物、昆虫、動物、及びヒトを含む哺乳動物を含む真核生物を含むがこれらに限定されない、原核生物及び真核生物の両方を含む。このような供給源のための例示的な種には、例えば、大腸菌、並びに本明細書に開示されるか、又は相応の遺伝子のための供給源生物として利用可能な、他の例示的な種を含む。しかしながら、395種の微生物ゲノム並びに種々の酵母、真菌、植物、及び哺乳動物のゲノムを含む、現在550超の種に利用可能な完全ゲノム配列（これらのうち半分超は、NCBIなどの公共データベースで利用可能である。）を用いて、例えば、公知の遺伝子のホモログ、オルソログ、パラログ及び非オルソロガス遺伝子置換、及び生物間での遺伝的変更の相互交換を含む、関連する種又は離れた種における1以上の遺伝子についての必要なイソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールの生合成活性をコードする遺伝子の同定は常用的であり、かつ当該技術分野において周知である。従って、大腸菌などの特定の生物に関して本明細書で説明されるイソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールの生合成を可能にする代謝的変更は、原核生物及び真核生物などを含む他の微生物に容易に適用することができる。本明細書に提供される教示及びガイダンスを考慮すると、当業者は、1つの生物において例証される代謝的変更が他の生物に同様に等しく適用することができるということを知っているであろう。
【０１２９】
代替的なイソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールの生合成経路が、関連性のない種において存在する場合など、いくつかの場合において、イソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールの生合成は、例えば、同様の、しかし同一ではない代謝反応を触媒して、当該反応を置き換える、関連性のない種から、パラログ（paralog）又はパラログ（paralogs）の外来性発現により宿主種に付与することができる。代謝ネットワーク中の特定の差異が、異なる生物間に存在するので、当業者は、異なる生物間の実際の遺伝子使用が異なり得ることを理解するであろう。しかしながら、本明細書に提供される教示及びガイダンスを考慮すると、当業者はまた、本発明の教示及び方法を全ての微生物に、本明細書に例証されたものと同様の代謝的変更を用いることで適用して、イソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールのを合成するであろう関心対象の種において微生物を構築することができることも理解するであろう。
【０１３０】
宿主微生物は、例えば、細菌、酵母、真菌又は発酵プロセスに適用できる任意の他の種々の微生物、及びこれらから作出された非天然微生物から選択することができる。例示的な細菌には、大腸菌、クレブシエラ・オキシトカ、アナエロビオスピリルム・スクシニシプロデュセンス（succiniciproducens）、アクチノバチルス・スクシノゲネス（succinogenes）、マンヘミア・スクシニシプロデュセンス（succiniciproducens）、リゾビウム・エトリ、枯草菌、コリネバクテリウム・グルタミクム、グルコノバクター・オキシダンス、ザイモモナス・モビリス、ラクトコッカス・ラクティス、ラクトバチルス・プランタルム、ストレプトマイセス・セリカラー、クロストリジウム・アセトブチリカム、蛍光菌、及びプチダ菌から選択される種を含む。例示的な酵母又は真菌には、出芽酵母、分裂酵母、クルイベロミセス・ラクチス、クルイベロミセス・マルキシアヌス（marxianus）、アスペルギルス・テレウス、クロコウジカビ、及びピキア・パストリスから選択される種を含む。大腸菌は、遺伝子工学に好適な十分に特徴づけられた微生物であるので、特に有用な宿主生物である。他の特に有用な宿主生物には、出芽酵母などの酵母を含む。
【０１３１】
イソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールを産生する非天然宿主の発現レベルを構築及び試験する方法は、例えば、当該技術分野において周知の組換え法及び検出法により実施することができる。このような方法は、例えば、Sambrookらの文献「分子クローニング：実験室マニュアル第3版（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Ed.）」（Cold Spring Harbor Laboratory, New York（2001））；及びAusubelらの文献「分子生物学の最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」（John Wiley and Sons, Baltimore, MD（1999））において説明されているのを認めることができる。
【０１３２】
イソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールの産生のための経路に関係する外来性核酸配列は、抱合、電気穿孔法、化学的形質転換、形質導入、トランスフェクション及び超音波形質転換を含むがこれらに限定されない当該技術分野において周知の技術を使用して、安定して又は一過的に宿主細胞へと導入することができる。大腸菌又は他の原核細胞における外来性発現のために、真核生物核酸の遺伝子又はcDNAにおけるいくつかの核酸配列は、n‐末端ミトコンドリアシグナル若しくは他のターゲッティングシグナルなどのターゲッティングシグナルをコードすることができ、該ターゲッティングシグナルは、所望の場合、原核宿主細胞への形質転換の前に除去することができる。例えば、ミトコンドリアリーダー配列の除去は、大腸菌における高い発現をもたらした（Hoffmeisterらの文献（J. Biol. Chem. 280：4329-4338（2005）））。酵母又は他の真核細胞の外来性発現のために、遺伝子は、リーダー配列を付加せずに細胞質において発現することができ、又は宿主細胞に適するミトコンドリアターゲッティング又は分泌シグナルなどの好適なターゲッティング配列の付加により、ミトコンドリア若しくは他の細胞小器官を標的にすることができ、若しくは分泌のために標的とすることができる。従って、ターゲッティング配列を取り除くか又は含むための核酸配列への適切な修飾は、望ましい特性を与えるために外来性核酸配列に組み込むことができることは理解される。さらに、遺伝子は、タンパク質の最適化された発現を達成するために、当該技術分野において周知の技術を用いるコドン最適化に供することができる。
【０１３３】
発現ベクター（vector）又は発現ベクター（vectors）は、宿主生物において機能的な発現制御配列に作用可能に連結された本明細書に例証されるような核酸をコードする1以上のイソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールの生合成経路を含むように構築することができる。本発明の微生物宿主生物での使用に適用できる発現ベクターには、例えば、宿主染色体への安定した組込みのために作用可能なベクター及び選択配列又は標識を含む、プラスミド、ファージベクター、ウイルスベクター、エピソーム及び人工染色体を含む。加えて、発現ベクターには、1以上の選択可能な標識遺伝子及び適切な発現制御配列を含むことができる。また、例えば、抗生物質若しくは毒素に対する耐性を提供し、栄養要求性欠損を補完し、又は培地にはない必須栄養素を供給する、選択可能な標識遺伝子も含まれ得る。発現制御配列には、当該技術分野において周知である、構成的プロモーター及び誘導性プロモーター、転写エンハンサー、転写ターミネーター、及びこれらに類するものを含むことができる。2以上の外来性コード核酸が同時発現すべきである場合、両方の核酸は、例えば、単一の発現ベクターへと、又は別々の発現ベクターの中に、挿入できる。単一ベクター発現のために、コード核酸は、1つの共通発現制御配列に操作的に連結することができ、又は1つの誘導性プロモーター及び1つの構成的プロモーターなどの異なる発現制御配列に操作的に連結することができる。代謝経路若しくは合成経路に関係する外来性核酸配列の形質転換は、当該技術分野において周知の方法を使用して確認することができる。このような方法には、例えば、mRNAのノーザンブロット法若しくはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅などの核酸分析、又は遺伝子産物の発現についての免疫ブロット法、又は導入される核酸配列若しくはその相応の遺伝子産物の発現を試験するのに好適な他の分析法を含む。外来性核酸が所望の生成物を産生するように十分な量で発現することは当業者に理解され、発現レベルが当該技術分野において周知のかつ本明細書に開示される方法を使用して十分な発現を得るように最適化することができることは更に理解される。
【０１３４】
本発明は、イソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールの経路を完了させる酵素をコードする1、2、3、4、5、6、7、8、最大すべての外来性核酸を組み込む生物を含む、イソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールを産生する条件下及び十分な時間で、本明細書に開示された非天然微生物を培養することを含む、イソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールを産生する方法を提供する。いくつかの実施態様において、少なくとも1つの外来性核酸は、異種性核酸である。最後に、本発明の非天然微生物の培養は、実質的に嫌気性の培地中で実施することができる。
【０１３５】
イソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールの産生について試験するのに好適な精製及び／又はアッセイは、周知の方法を使用して実施することができる。三つ組の培養物などの好適な複製物は、試験されるべき操作された株ごとについて増殖させることができる。例えば、操作された産生宿主の生成物及び副産物の形成をモニターすることができる。最終生成物及び中間体、及び他の有機化合物は、HPLC（高性能液体クロマトグラフィー）、GC‐MS（ガスクロマトグラフィー‐質量分析）、LC‐MS（液体クロマトグラフィー‐質量分析）又は当該技術分野において周知の常用手順を使用する他の好適な分析法などの方法により分析することができる。また、発酵ブロスにおける生成物の放出は、培養上清を用いても試験することができる。副産物及び残余のグルコースは、例えば、グルコース及びアルコールのための屈折率検出器、並びに有機酸のための紫外線検出器を使用するHPLC（Linらの文献（Biotechnol. Bioeng. 90：775-779（2005）））、又は当該技術分野において周知の他の好適なアッセイ及び検出法により定量化することができる。また、外来性DNA配列由来の個々の酵素活性又はタンパク質活性は、当該技術分野において周知の方法を使用してアッセイすることもできる（例えば、WO／2008／115840、及びHanaiらの文献（Appl Environ Microbiol 73：7814-7818（2007））を参照されたい）。
【０１３６】
イソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールは、当該技術分野において周知の種々の方法を使用して、培養物中の他の成分から分離することができる。このような分離法には、例えば、抽出手順、並びに連続液体‐液体抽出、浸透気化法、膜濾過、膜分離、逆浸透、電気透析、蒸留、結晶化、遠心分離、抽出濾過、イオン交換クロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、及び限外濾過を含む方法を含む。上記の方法の全ては、当該技術分野において周知である。
【０１３７】
本明細書に説明される任意の非天然微生物を培養して、本発明の生合成生成物を産生及び／又は分泌させることができる。例えば、イソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールの産生体は、イソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールの生合成産生のために培養することができる。
【０１３８】
イソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールの産生のために、組換え株は、炭素源及び他の必須栄養素を有する培地において培養される。全体のプロセスの経費を削減するために、発酵槽における嫌気的条件を維持することは大変望ましい。このような条件は、例えば、最初に窒素を培地に散布（sparging）して、それから中隔及び圧着キャップでフラスコを封止することで得ることができる。増殖が嫌気的に観察されない株について、微好気性状態は、限られた通気のための小開口を用いて中隔を穿孔することにより適用することができる。例示的な嫌気的条件は先に説明されており、かつ当該技術分野において周知である。例示的な好気性状態及び嫌気性状態は、例えば、2007年8月10日に出願の米国特許出願シリアル番号第11／891,602号に説明されている。本明細書に開示されるように、発酵は、バッチ、供給バッチ又は連続様式で実施することができる。
【０１３９】
所望の場合、培地のpHは、所望のpH、特に、所望のpHに培地を維持するために必要なNaOH若しくは他の塩基などの塩基又は酸の添加によるほぼ7のpHなどの中性のpHに維持することができる。増殖速度は、分光光度計（600nm）を使用する光学密度を、及び経時的に炭素源枯渇をモニターすることによるグルコース取り込み速度を測定することにより決定することができる。
【０１４０】
先に例証されたものなどの再生可能原料に加え、本発明のイソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールの微生物は、その炭素源として合成ガスにおける増殖のために修飾することもできる。この具体的な実施態様において、1以上のタンパク質又は酵素は、イソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールを産生する生物において発現し、合成ガス又は他の気体の炭素源の利用のための代謝経路を提供する。
【０１４１】
本発明の生物は、例えば、非天然微生物に炭素源を供給することのできる任意の炭水化物源を利用することができる。このような供給源には、例えば、グルコース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、マンノース、フルクトース及びデンプンなどの糖類を含む。炭水化物の他の供給源には、例えば、再生可能原料及びバイオマスを含む。本発明の方法の原料として使用することのできる例示的な種類のバイオマスは、セルロースバイオマス、ヘミセルロースバイオマス及びリグニン原料又は原料部分を含む。このようなバイオマス原料は、例えば、グルコース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、マンノース、フルクトース及びデンプンなどの炭素源として有用な炭水化物基質を含む。本明細書に提供される教示及びガイダンスを考慮すると、当業者は、先に例証されたもの以外の再生可能原料及びバイオマスも、イソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールの産生のための本発明の微生物を培養するために使用することができることを理解するであろう。
【０１４２】
従って、本明細書に提供される教示及びガイダンスを考慮すると、当業者は、合成ガス、CO及び／又はCO2などの炭素源において増殖する場合に本発明の生合成された化合物を分泌する非天然微生物を作出することができることを理解するであろう。このような化合物には、例えば、イソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールを、及びイソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールの経路の任意の中間代謝物を含む。必要とされることの全ては、1以上の必要とされる酵素活性又はタンパク質活性を操作して、例えば、イソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールの生合成経路の一部若しくは全部の包含を含む、所望の化合物又は中間体の生合成を達成することである。従って、本発明は、炭水化物又は他の炭素源において増殖する場合にイソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールを産生及び／又は分泌する非天然微生物を、並びに炭水化物又は他の炭素源において増殖する場合にイソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールの経路に示される任意の中間代謝物を産生及び／又は分泌する非天然微生物を提供する。本発明のイソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールを産生する微生物は、中間体、例えば、アセチル-CoAから合成を開始することができる。
【０１４３】
本発明の非天然微生物は、本明細書に例証される当該技術分野において周知の方法を使用して、イソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールを産生するのに十分な量のイソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールの経路酵素又はタンパク質をコードする少なくとも1つの核酸を外来的に発現するよう構築される。本発明の微生物は、イソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールを産生するのに十分な条件下で培養されることが理解される。本明細書に提供される教示及びガイダンスに従い、本発明の非天然微生物は、約0.1〜2000mM以上の細胞内濃度を結果として生じるイソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールの生合成を達成することができる。一般的に、イソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールの細胞内濃度は、約3〜1800mM、特定には約5〜1700mM、及びより特定には約100mM、200mM、500mM、800mM、又はそれより多くを含む約8〜1600mMである。これらの例示的な範囲の各々の間の及び該各々を上回る細胞内濃度も、本発明の非天然微生物から達成することができる。
【０１４４】
いくつかの実施態様において、培養条件には、嫌気性の又は実質的に嫌気性の増殖条件又は維持条件を含む。例示的な嫌気的条件は既に説明されており、当該技術分野において周知である。発酵プロセスのための例示的な嫌気的条件は本明細書に説明されており、例えば、2007年8月10日に出願の米国特許出願第US2009／0047719号に説明されている。任意のこれらの条件は、非天然微生物と共に、並びに当該技術分野において周知の他の嫌気的条件と共に、採用することができる。このような嫌気的条件の下で、イソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールの産生体は、5〜10mM以上の細胞内濃度で、並びに本明細書に例証される他の全ての濃度で、イソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールを合成することができる。先の説明が細胞内濃度に関する場合であっても、イソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールを産生する微生物は、細胞内にイソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールを産生することができ、及び／又は培地中に生成物を分泌することができることは理解される。
【０１４５】
培養条件には、例えば、液体培養手順並びに発酵手順及び他の大量培養手順を含むことができる。本明細書に説明されるように、本発明の生合成生成物の特に有用な収量は、嫌気性の若しくは実質的に嫌気性の培養条件の下で得ることができる。
【０１４６】
本明細書に説明されるように、イソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールの生合成を達成するための1つの例示的な増殖条件には、嫌気培養条件又は発酵条件を含む。ある種の実施態様において、本発明の非天然微生物は、嫌気性の若しくは実質的に嫌気性の条件下で持続することができ、培養することができ、又は発酵することができる。簡潔にいうと、嫌気性条件とは、酸素のない環境をいう。実質的に嫌気性の条件には、例えば、培地中の溶存酸素濃度が飽和の0〜10％にとどまるような培養、バッチ発酵又は連続発酵を含む。また、実質的に嫌気性の条件には、1％未満の酸素の雰囲気で維持される密封チャンバー内での液体培地中での又は固体寒天上での増殖細胞若しくは静止細胞も含む。酸素のパーセントは、例えば、N2／CO2混合物又は他の好適な非酸素ガス（gas）又は非酸素ガス（gases）を該培養物に散布することにより維持することができる。
【０１４７】
本明細書に説明される培養条件は、イソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールの製造のために規模拡大することができ、連続増殖することができる。例示的な増殖手順には、例えば、流加バッチ発酵及びバッチ分離；流加バッチ発酵及び連続分離、又は連続発酵及び連続分離を含む。これらのプロセスの全ては、当該技術分野において周知である。発酵手順は、イソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールの商業的な量の生合成産生に特に有用である。一般的に、及び非連続培養手順を用いるものとして、イソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールの連続産生及び／又はほぼ連続した産生は、対数期の増殖を維持及び／又はほぼ維持するのに十分な栄養素及び培地における本発明のイソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールを産生する非天然生物を培養することを含む。このような条件下での連続培養には、例えば、1、2、3、4、5、6若しくは7日又はそれより長い日数を含むことができる。加えて、連続培養には、1、2、3、4若しくは5週又は長い週数でかつ最長数ヵ月を含むことができる。あるいは、本発明の生物は、特定の適用に好適な場合、何時間も培養することができる。連続培養条件及び／又はほぼ連続した培養の条件には、これらの例示的な期間の間の時間的間隔をすべて含むこともできることは理解されるべきである。本発明の微生物を培養する時間は、所望の目的のために十分な量の生成物を産生するのに十分な期間に関することが更に理解される。
【０１４８】
発酵手順は、当該技術分野において周知である。簡潔にいうと、イソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールの生合成産生のための発酵は、例えば、流加バッチ発酵及びバッチ分離；流加バッチ発酵及び連続分離、又は連続発酵及び連続分離において利用することができる。バッチ発酵手順及び連続発酵手順の例は、当該技術分野において周知である。
【０１４９】
相当量のイソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールの連続産生のための本発明のイソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールの産生体を使用する先の発酵手順に加え、該イソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールの産生体は、例えば、所望の場合、化学合成手順に同時に供して、該生成物を他の化合物へと転換することもできるか、又は該生成物を該発酵培養物から分離し、順次化学的転換に供して該生成物を他の化合物へと転換することもできる。
【０１５０】
いくつかの実施態様において、合成ガスは、炭素原料として使用することができる。合成ガス発酵のための重要なプロセスの考慮は、高いバイオマス濃度及び良好な気液物質移動である（Bredwellらの文献（Biotechnol Prog. 15：834-844（1999）））。水中のCOの溶解度は、酸素の溶解度よりもやや低い。連続的に気体を散布された発酵は、質量分析及び周期的液体サンプリングによる定常オフガス分析、並びにGC及びHPLCによる分析を用いて制御された発酵槽において実施することができる。液相は、バッチモードで機能することができる。アルコール、有機酸、及び残留メタノールを伴う残留グルコースなどの発酵産物は、HPLC（Shimadzu, Columbia MD）により、例えば、Aminex（登録商標）シリーズのHPLCカラム（例えば、HPX‐87シリーズ）（BioRad, Hercules CA）を使用して、グルコース及びアルコールのための屈折率検出器を使用して、及び有機酸のための紫外線検出器を使用して、定量化される。増殖速度は、分光光度計（600nm）を使用する光学密度を測定することにより決定される。これらのシステムの全ての配管は、嫌気的条件を維持するガラス又は金属である。ガス散布は、泡サイズを減少させ、物質移動を向上させるガラスフリットを用いて実施される。種々の散布速度が試験され、それは約0.1〜1vvm（1分当たりの蒸気量）の範囲である。ガス取り込み速度の正確な測定結果を得るために、気流が一時的に停止する周期的なチャレンジが実施され、該気相組成物は時間の関数としてモニターされる。
【０１５１】
全体の目標産生性を達成するために、細胞保持又はリサイクルの方法が採用される。微生物濃度を上昇させる1つの方法は、側流から接線流膜を介して細胞をリサイクルすることである。ムーレラによる酢酸の産生について先に説明されたように（Sakaiらの文献（J Biosci.Bioeng 99：252-258（2005）））、反復バッチ培養を使用することもできる。種々の他の方法も使用することができる（Bredwellらの文献（Biotechnol Prog. 15：834-844（1999））；Datarらの文献（Biotechnol Bioeng 86：587-594（2004）））。物質移動を改良するための1.5気圧における超過圧力などの追加的な最適化を試験することができる（Najafpour及びYounesiの文献（Enzyme and Microbial Technology 38[1-2], 223-228（2006）））。
【０１５２】
供給物として純粋なH2/COを使用して満足な性能が一旦達成されると、商業的な合成ガスに存在しそうな阻害剤を含む合成ガス混合物を生産する。例えば、典型的な不純物特性は、4.5％のCH4、0.1％のC2H2、0.35％のC2H6、1.4％のC2H4及び150ppmの一酸化窒素である（Datarらの文献（Biotechnol Bioeng 86：587-594（2004）））。ベンゼン、トルエン、エチルベンゼン、p-キシレン、o-キシレン、及びナフタレンなどの化合物により表されるタールをppmレベルで添加し、産生における任意の効果について試験する。例えば、40ppmのNOがクロストリジウム・カルボキシジボランス（carboxidivorans）に対して阻害的であることが示された（Ahmed及びLewisの文献（Biotechnol Bioeng 97：1080-1086（2007）））。培養物は、発酵槽へ移動する前に、振蘯フラスコ培地において試験される。また、これらの異なるレベルの潜在的阻害性化合物は、該化合物が細胞増殖に関して有する効果を定量化するために試験される。この知識を使用して合成ガス純度についての明細書を展開し、これは規模拡大研究及び産生のために利用される。任意の特定の成分が規模拡大のために使用する合成ガスから減少又は除去するのが困難であるとわかった場合、適応進化手順を利用して、1以上の不純物を許容させるように細胞を適応させる。
【０１５３】
タンパク質工学の分野における進展によって、本明細書に開示された任意の酵素を変化させて該酵素にとって天然であることが公知ではない基質に効率的に作用することがありがちとなる。下記は、関心対象の異なるクラス由来の広範な特異性の酵素のいくつかの例、及び非天然基質に作用するようこのような酵素を進化させるために用いられた方法である。
【０１５４】
本明細書に開示された経路における1つのクラスの酵素は、ケトン又はアルデヒドをアルコールに相互転換する酸化還元酵素である（1.1.1）。このクラスにおおける酵素は、広範な範囲の基質に関して作動することができる。ダイズ細菌ブレビバクテリウム種KU1309から精製されたアルコール脱水素酵素（1.1.1.1）（Hiranoらの文献（J. Biosci. Bioeng. 100：318-322（2005）））は、高い活性で脂肪族アルコール及び芳香族アルコールの多血症に関して作動することが示された。表34は、異なるアルコールに関する酵素活性及びそのKmを示す。該酵素は、可逆的であり、また表34において示されるようにいくつかのアルデヒドに関して非常に高い活性を有する。
【表３５】
2012525156.tif 000038
【０１５５】
この表において、19.2U／mgに相応する2-フェニルエタノールの活性を100％とした。
【表３６】
2012525156.tif 000039
【０１５６】
ラルストニア・ユートロファ由来の乳酸脱水素酵素（1.1.1.27）は、2-オキソブチラート、2-オキソペンタノアート、及び2-オキソグルタラート（2-オキソアジパートに類似したC5化合物）などのいくつかの2-オキソ酸に関して高い活性を有することが示された別の酵素である（Steinbuchelらの文献（Eur. J. Biochem. 130：329-334（1983）））。表36における第2列は、ラルストニア・ユートロファ（旧アルカリゲネス・ユートロフス）由来のldhAの異なる基質に対する活性を示す（Stein buchelらの文献（上述））。
【表３７】
2012525156.tif 000040
【０１５７】
2-オキソ酸をそのアシル-CoA対応物（1.2.1）に転換することのできる酸化還元酵素は、複数の基質を同様に受け入れることが示されている。例えば、2-オキソイソ吉草酸脱水素酵素（1.2.1.25）としても公知の分岐鎖2-ケト-酸脱水素酵素複合体（BCKAD）は、分岐鎖アミノ酸分解経路に関与し、バリン、ロイシン、及びイソロイシンの2-ケト酸誘導体をそれらのアシル-CoA誘導体及びCO2に転換する。ラット（Paxtonらの文献（Biochem. J. 234：295-303（1986）））及び出芽酵母（Sinclairらの文献（Biochem. Mol. Int. 31：911-922（1993）））を含むいくつかの生物において、この複合体は、分岐鎖アミノ酸前駆体に加えて、2-オキソブタン酸及びアルファ-ケトグルタル酸などの直鎖オキソ酸を含む広範な基質範囲を有することが示されている。
【０１５８】
CoAトランスフェラーゼ（2.8.3）は、2つ以上の基質に作用する能力を持つことが示されている。具体的には、CoAトランスフェラーゼは、クロストリジウム・アセトブチリカムから精製され、アセタート、プロピオナート、及びブチラートに関して最も高い活性を有することが報告された。また、CoAトランスフェラーゼは、バレラート、イソブチラート、及びクロトナートを用いて有意な活性を有した（Wiesenbornらの文献（Appl. Environ. Microbiol. 55：323-329（1989）））。別の研究において、アセタート-CoAトランスフェラーゼ（EC2.8.3.8）としても公知の大腸菌酵素アシル-CoA：アセタート-CoAトランスフェラーゼは、CoA部分を、イソブチラート（Matthiesらの文献（Appl Environ Microbiol 58：1435-1439（1992）））、バレラート（Vanderwinkelらの文献（Biochem. Bioiphys. Res Commun. 33：902-908（1968）））、及びブタノアート（Vanderwinkelらの文献（上述））を含む種々の分岐鎖及び直鎖アシル-CoA基質からアセタートに転移させることが示されている。
【０１５９】
前記酵素の幅広い基質特異性についての論拠は、本発明者らが、他の酵素クラスを探究したので、さらに強化される。また、いくつかのイソメラーゼ（5.3.3）は、複数の基質に作動することも立証されている。例えば、シュードモナス・スツッツェリは、種々のアルドラーゼとケトースの間の異性化を触媒する（Yoshidaらの文献（J. Mol. Biol. 365：1505-1516（2007）））。これらには、L-ラムノースとL-ラムヌロースの、L-マンノースとL-フルクトースの、L-キシロースとL-キシルロースの、D-リボースとD-リブロースの、及びD-アロースとD-プシコースの間の異性化を含む。
【０１６０】
なおも別のクラスの酵素において、L-ホモセリンをL-ホモセリンホスファートに転換する大腸菌由来のホモセリンキナーゼ（2.7.1.39）は、数多くのホモセリンアナログをリン酸化することが認められた。これらの基質において、R‐位のカルボキシル官能基は、エステルによって、又はヒドロキシメチル基によって置換されていた（Huoらの文献（Biochemistry 35：16180-16185（1996）））。表37は、このキナーゼの幅広い基質特異性を示す。
【表３８】
2012525156.tif 000041
【０１６１】
本発明者らが、提唱した経路において遭遇した別のクラスの酵素は、酸‐チオールリガーゼ（6.2.1）である。他のクラスにおける酵素と同様に、このクラスにおけるある酵素は幅広い基質特異性を有することが決定されている。例えば、プチダ菌由来のアシルCoAリガーゼは、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、及びオクタン酸を含むいくつかの脂肪族基質に、並びにフェニル酢酸及びフェノキシ酢酸などの芳香族化合物に作用することが示されている（Fernandez-Valverdeらの文献（Appl. Environ. Microbiol. 59：1149-1154（1993）））。関連酵素であるリゾビウム・トリフォリ（trifolii）由来のマロニルCoAシンテターゼ（6.3.4.9）は、いくつかの二酸、すなわち、エチルマロナート、プロピルマロナート、アリルマロナート、イソプロピルマロナート、ジメチルマロナート、シクロプロピルマロナート、シクロプロピルメチレンマロナート、シクロブチルマロナート、及びベンジルマロナートをそれらの相応するモノチオエステルに転換することができた（Pohlらの文献（J. Am. Chem. Soc. 123：5822-5823（2001）））。類似の特質において、本発明者らはまた、幅広い基質範囲を有するデカルボキシラーゼ（4.1.1）も発見した。ケト‐酸デカルボキシラーゼとも呼ばれるピルビン酸デカルボキシラーゼ（PDC）は、ピルビン酸のアセトアルデヒドへのデカルボキシル化を触媒するアルコール発酵における鍵酵素である。出芽酵母から単離された酵素は、2-ケト酪酸、2-ケト吉草酸、及び2-フェニルピルビン酸を含む脂肪族2-ケト酸について幅広い基質範囲を有する（Liらの文献（Biochemistry 38：10004-10012（1999）））。同様に、ベンゾイルギ酸デカルボキシラーゼは、幅広い基質範囲を有し、酵素工学研究の標的であった。プチダ菌由来の該酵素は、広範に研究されており、この酵素の結晶構造は入手可能である（Polovnikovaらの文献（Biochemistry 42：1820-1830（2003））；Hassonらの文献（Biochemistry 37：9918-9930（1998）））。分岐鎖アルファ-ケト酸デカルボキシラーゼ（BCKA）は、3〜6の炭素鎖長で変動する種々の化合物に作用することが示されている（Okuらの文献（J. Biol Chm. 263：18386-18396（1998）））。ラクトコッカス・ラクティスにおける該酵素は、2-オキソブタン酸、2-オキソヘキサン酸、2-オキソペンタン酸、3-メチル-2-オキソブタン酸、4-メチル-2-オキソブタン酸、及びイソカプロン酸を含む種々の直鎖及び分岐鎖の基質に関して特徴づけられている（Smitらの文献（Appl Environ Microbiol 71：303-311（2005）））。
【０１６２】
興味深いことに、1つの優性の活性を有することが公知の酵素はまた、非常に異なる機能を触媒することが示されている。例えば、バチルス・ステアロサーモフィルス及びバチルス・スブチリス由来の共因子‐依存性ホスホグリセラートムターゼ（5.4.2.1）は、ホスファターゼとして同様に機能することが公知である（Ridgenらの文献（Protein Sci. 10：1835-1846（2001）））。バチルス・ステアロサーモフィルス由来の該酵素は、3-ホスホグリセラート、アルファ-ナフチルホスファート、p-二トロフェニルホスファート、AMP、フルクトース-6-ホスファート、リボース-5-ホスファート、及びCMPを含むいくつかの基質に関して活性を有することが公知である。
【０１６３】
酵素が広範な基質特異性を天然に有するこれらの例とは対照的に、数多くの酵素は、それらの非天然基質に対する特異性を広げるよう、定向進化を用いて修飾されている。あるいはまた、酵素の基質優先性は、定向進化を用いて変化している。これらの方法の成功は、文献において十分に記載されており、天然／非天然基質に及ぼす効率的な機能について所与の酵素を操作することが非常に可能であるという本発明者らの主張を強化する。例えば、緑膿菌由来のリパーゼのエナンチオ選択性が有意に改良されたことが報告されている。この酵素は、(S)-酸に有利に、たったの2％の鏡像体過剰率（ee）でp-ニトロフェニル2-メチルデカノアートを加水分解した。しかしながら、エラープローン突然変異誘発及びスクリーニングの4回の成功したラウンドの後、必要な反応を81％eeで触媒するバリアントを作製した（Reetzらの文献（Angew. Chem. Int. Ed Engl. 36：2830-2832（1997）））。
【０１６４】
より早期に記載したように、定向進化法によって、酵素の修飾は、該酵素に対して天然ではない基質のアレイに機能することができた。緑膿菌におけるリパーゼの基質特異性は、活性部位近くのアミノ酸残基の無作為化によって広がった。このことは、この酵素によってアルファ置換カルボン酸エステルの受容を可能にした（Reetzらの文献（Angew. Chem. Int. Ed Engl. 44：4192-4196（2005）））。別の成功した試行において、DNAシャッフリングを採用して、野生型酵素によってほとんど受容されないβ-分岐鎖基質を受容する大腸菌アミノトランスフェラーゼを作製した（Yanoらの文献（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 95：5511-5515（1998）））。具体的には、4回のシャッフリングの終了時に、バリン及び2-オキソバリンについてのアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの活性は、最大5オーダーの程度ほど増大したのに対し、天然基質であるアスパラギン酸に対する活性を最大30倍ほど低下させた。Scienceにおける非常に最近の報告において、アルゴリズムを使用して、非天然かつ非生物の基質である4-ヒドロキシ-4-(6-メトキシ-2-ナフチル)-2-ブタノンにおける炭素間結合の切断を触媒するために使用することのできるレトロ-アルドラーゼを設計した。これらのアルゴリズムは、4つの異なる触媒モチーフの異なる組み合わせを使用して、新たな酵素を設計し、実験的特徴づけのために選択された設計のうちの20は、触媒していない反応よりも4倍改良された速度を有していた（Jiangらの文献（Science 319：1387-1391（2008）））。このように、これらの工学アプローチは、酵素が作用することのできる基質のアレイを拡張することができるだけでなく、非常に効率的な酵素の設計及び構築も可能である。例えば、DNAシャッフリングの方法（一過性テンプレートにおける無作為なキメラ形成又はRACHITT）は、複合体基質に関する脱硫の改良された速度及び非天然基質の20倍迅速な転換を有する操作されたモノオキシゲナーゼをもたらすことが報告された（Cocoらの文献（Nat. Biotechnol. 19：354-359（2001）））。同様に、遅鈍な突然変異体トリオースホスファタートイソメラーゼ酵素の比活性は、1.3倍から最大19倍改良された（Hermesらの文献（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 87：696-700（1990）））。比活性におけるこの亢進は、タンパク質の全長にわたる無作為な突然変異誘発を用いることによって達成され、該改良は、6個のアミノ酸残基における突然変異であることを突き止めることができた。
【０１６５】
また、所望の基質についての酵素の基質特異性を変化させるためのタンパク質工学の有効性も示されている。サーマス・サーモフィラス由来のイソプロピルリンゴ酸脱水素酵素は、活性部位に近い残基を変化させることによって修飾され、それにより基質としてのリンゴ酸及びD-乳酸にいまや作用することができた（Fujitaらの文献（Biosci. Biotechnol Biochem. 65：2695-2700（2001）））。本研究において及び他の研究において、1つ又は少数の残基を修飾して基質特異性を変更させることができることが指摘された。適例は、単一のアミノ酸が、ジヒドロケンフェロールを優先的に還元することのできる推定基質結合領域において変化した、ジヒドロフラボノール4-還元酵素である（Johnsonらの文献（Plant J. 25：325-333（2001）））。大腸菌由来の非常に特異的なイソクエン酸脱水素酵素の基質特異性は、活性部位における1つの残基を変化させることによって、イソクエン酸からイソプロピルリンゴ酸へと変化した（Doyleらの文献（Biochemistry 40：4234-4241（2001）））。類似の特質において、NAD＋‐依存性1,5-ヒドロキシプロスタグランジン脱水素酵素の共因子特異性は、N‐末端近くの少数の残基を変化させることによって、NADP＋に変更した（Choらの文献（Arch. Biochem. Biophys. 419：139-146（2003）））。配列分析及び分子モデリング分析を使用して、修飾のための鍵残基を同定し、該残基はさらに、位置指定突然変異誘発によって研究した。
【０１６６】
酵素の機能が、酵素の天然基質よりも1つの非天然基質を選ぶよう変化した、多様なクラスの酵素にわたる多くの他の例がある。フコシダーゼは、DNAシャッフリング及びスクリーニングによって、大腸菌におけるガラクトシダーゼから進化した。（Zhangらの文献（Proc Natl Acad Sci U S. A 94：4504-4509（1997）））。同様に、大腸菌由来のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼは、相同性モデリング及び位置指定突然変異誘発を用いてチロシンアミノトランスフェラーゼへと転換した（Onufferらの文献（Protein Sci. 4：1750-1757（1995）））。プチダ菌由来のベンゾイルギ酸デカルボキシラーゼの活性部位における2つの残基の位置指定突然変異誘発は報告によると、天然基質及び非天然基質に対する親和性（Km）を変更させた（Siegertらの文献（Protein Eng Des Sel 18：345-357（2005）））。出芽酵母由来のチトクロムcペルオキシダーゼ（CCP）を定向分子進化に供し、古典的なペルオキシダーゼ基質であるグアヤコールに対する高い活性を有する突然変異体を作製し、従って、タンパク質チトクロムcから有機小分子へとCCPの基質特異性を変化させた。3回のDNAシャッフリング及びスクリーニングの後、突然変異体を単離し、該突然変異体は、グアヤコールに対して300倍高い活性を、及び天然基質に対する特異性と比較してこの基質に対する最大で1000倍高い特異性を有していた（Ifflandらの文献（Biochemistry 39：10790-10798（2000）））。
【０１６７】
いくつかの場合、両方の親酵素とは異なる基質優先性を有する酵素が得られている。例えば、ポリ塩化ビフェニルのビフェニル-ジオキシゲナーゼ仲介性分解は、2つの細菌シュードモナス・シュードアルカリゲネス及びセパシア菌に由来する遺伝子をシャッフリングすることによって改良された（Kumamaruらの文献（Nat. Biotechnol 16, 663-666（1998）））。結果として生じるキメラビフェニルオキシゲナーゼは、両方の親酵素とは異なる基質優先性を示し、関連したビフェニル化合物と、該酵素についての元来弱い基質であるトルエン及びベンゼンなどの単一の芳香環炭化水素とに対する分解活性を亢進させた。
【０１６８】
酵素特異性を変化させることが可能であるだけでなく、酵素が低い活性を天然に有する基質に関する活性を亢進することも可能である。1つの研究は、広範な基質特異性を有する（とりわけ、リシン、アルギニン、アラニン、セリン、メチオニン、システイン、ロイシン、及びヒスチジンに対して）ものの、トリプトファンに対する低い活性を有するプチダ菌由来のアミノ酸ラセマーゼが、無作為突然変異誘発によって有意に改良することができることを示した（Kinoらの文献（Appl. Microbiol. Biotechnol. 73：1299-1305（2007）））。同様に、ウシBCKADの活性部位を操作して、代替的な基質アセチル-CoAに有利にした（Mengらの文献（Biochemistry 33：12879-12885（1994）））。これらのアプローチに関する関心対象の態様は、無作為法が、効果的な活性を有するこれらの突然変異した酵素を作製するために適用された場合でさえ、活性に改良を与える実際の突然変異または構造変化が同定することができることである。例えば、上記の研究において、トリプトファンに関する改良された活性を容易にした突然変異は、2つの異なる位置を突き止めることができた。
【０１６９】
また、定向進化は、発現することが困難なタンパク質を発現させるために使用されている。例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼを無作為突然変異誘発及び遺伝子組換えに供することによって、野生型よりも14倍活性の大きな突然変異体を抽出することができた（Linらの文献（Biotechnol. Prog. 15：467-471（1999）））。
【０１７０】
定向進化の最終的な例は、酵素がある範囲の所望の機能を達成するよう供することのできる広範な修飾を示す。バチルス・ステアロサーモフィルス由来の酵素である乳酸脱水素酵素を位置指定突然変異誘発に供し、3つのアミノ酸置換を、異なるヒドロキシ酸に対する特異性を決定すると考えられる部位で実施した（Clarkeらの文献（Biochem. Biophys. Res. Commun. 148：15-23（1987）））。これらの突然変異の後、ピルビン酸を上回るオキサロ酢酸に対する特異性は、1000のオキサロ酢酸を上回るピルビン酸に対する触媒特異性を有する野生型酵素とは対照的に500まで増大した。この酵素をさらに、分岐鎖置換ピルビン酸に対する活性を有するよう、位置指定突然変異誘発を使用して操作した（Wilksらの文献（Biochemistry 29：8587-8591（1990）））。具体的には、該酵素は、アルファ-ケトイソカプロン酸についてK触媒における55倍の改良を有した。3つの構造的修飾を同じ酵素において実施して、その基質特異性を乳酸からリンゴ酸に変化させた。該酵素は、リンゴ酸に対して非常に活性がありかつ特異的であった（Wilksらの文献（Science 242：1541-1544（1988）））。バチルス・ステアロサーモフィルス由来の同じ酵素を、アンモニウム基を含むアルファ-ケト酸など、正に帯電した側鎖を有するアルファ-ケト酸に対する高い触媒活性を有するよう操作した（Hoganらの文献（Biochemistry 34：4225-4230（1995）））。酵素の位置102に導入された酸性アミノ酸を有する突然変異体は、このような側鎖アンモニウム基の結合に有利であった。得られた結果は、突然変異体が、オメガ-アミノ-アルファ-ケト酸基質についてk触媒／Km値における最大25倍の改良を示すことを立証した。また、この酵素は、乳酸脱水素酵素の替わりにフェニル乳酸脱水素酵素として機能するよう構造的に修飾された（Wilksらの文献（Biochemistry 31：7802-7806（1992）））。制限部位を、遺伝子の一領域を切除することのできる酵素についての遺伝子へと導入した。この領域は、バルクの溶媒から活性部位の空胞を正常に封止しかつ基質特異性の主要な決定因子であるポリペプチドの可動性表面ループをコードした（残基98〜110）。可変長及び配列ループを、切断した遺伝子へと挿入し、基質特異性の変化したヒドロキシ酸脱水素酵素を合成するのに使用した。1つのより長いループ構築を用いて、ピルビン酸による活性は、100倍低下したが、フェニルピルビン酸による活性は大きく変化しなかった。390,000倍の特異性（k触媒／Km）の切り替えを達成した。この酵素のピルビン酸を上回るフェニルピルビン酸に対する1700：1の選択性は、フェニル乳酸脱水素酵素において必要とされるものである。
【０１７１】
先に示したように、定向進化は、酵素の特性を改良及び／又は変化させるために具体的な遺伝子を標的とした突然変異の導入を包含する強力なアプローチである。改良及び／又は変化した酵素は、多くの酵素バリアント（たとえば、＞104）の自動スクリーニングを可能にする高感度高処理量スクリーニングアッセイの開発及び実施を通じて同定することができる。典型的に、反復ラウンドの突然変異誘発及びスクリーニングを実施して、最適化した特性を有する酵素を生じる。また、突然変異誘発のための遺伝子の領域を同定するのに役立つことのできる計算アルゴリズムも開発されており、作製及びスクリーニングするのに必要な酵素バリアントの数を有意に減少させることができる。
【０１７２】
多様なバリアントライブラリーを作製するのに有効であるよう数多くの定向進化技術が開発されており（総説については、Hibbertらの文献（Biomol.Eng 22:11-19, 2005）；Huismanらの文献「化学プロセス適用のための酵素進化（Enzyme evolution for chemical process applications）」（p. 717-742, 2007. R. N. Patel（編）医薬産業及びバイオテクノロジー産業における生物触媒現象（Biocatalysis in the pharmaceutical and biotechnology industries） CRC Press）; Ottenらの文献（Biomol.Eng 22:1-9, 2005）；並びに Senらの文献（Appl Biochem.Biotechnol 143:212-223, 2007）を参照されたい。）、これらの方法は、多くの酵素クラスを通じて幅広い範囲の特性の改良に成功裏に適用している。
【０１７３】
定向進化技術によって改良及び／又は変化した酵素特徴には、例えば、選択性／特異性（非天然基質の転換のため）；温度安定性（頑強な高温処理のため）；pH安定性（より低いpH条件又はより高いpH条件下でのバイオプロセシングのため）；基質又は生成物の耐性（それにより高い生成物力価を達成することができる。）；結合（Km）（非天然基質を含むよう基質結合を拡張する。）；阻害（Ki）（生成物、基質、又は鍵となる中間体による阻害を除去する。）；活性（kcat）（所望の流れを達成する用酵素反応速度を増大させる。）；発現レベル（タンパク質収量及び全体的な経路の流れを増大させる。）；酸素安定性（好気性条件下での空気感受性酵素の操作のため）；並びに好気性活性（酸素の不在下での好気性酵素の操作のため）を含む。
【０１７４】
以下の例示的な方法は、具体的な酵素の所望の特性を標的とするための遺伝子の突然変異誘発及び多様化のために開発されている。任意のこれらを使用して、デカルボキシラーゼ酵素の活性を変化／最適化することができる。
【０１７５】
EpPCR（Pritchardらの文献（J Theor. Biol 234：497-509（2005））は、Mn2+イオンの添加による、dNTP濃度を偏向させることによる、又は他の条件的変動による、PCR反応におけるDNAポリメラーゼの忠実度を低下させることによって、無作為点突然変異を導入する。関心対象の標的遺伝子に突然変異誘発を限局するための5工程クローニングプロセスは、下記を包含する：1）関心対象の遺伝子のエラープローンPCR増幅；2）制限酵素消化；3）所望のDNA断片のゲル精製；4）ベクターへの連結反応；5）好適な宿主への遺伝子バリアントの形質転換及び改良された性能のためのライブラリーのスクリーニング。本方法は、単一の遺伝子における複数の突然変異を同時に作製することができ、該方法は有用であり得る。多数の突然変異体をEpPCRによって作製することができ、それにより高処理量スクリーニングアッセイ又は選択法（特にロボット工学を使用する。）は、望ましい特徴を有する突然変異体を同定するのに有用である。
【０１７６】
エラープローンローリングサークル増幅（Rolling Circle Amplification）（epRCA）（Fujiiらの文献（Nucleic Acids Res 32：e145（2006））；及びFujiiらの文献（Nat. Protoc. 1：2493-2497（2006）））は、epPCRと同じ要素の多くを有するが、例外として、環状プラスミド全体をテンプレートとして使用し、最後の2ヌクレオチドにおけるエキソヌクレアーゼ耐性チオリン酸連鎖を有するランダムな6マーを使用してプラスミドを増幅した後に細胞への形質転換を実施して、細胞の中でプラスミドを縦列反復配列で再環状化させる。Mn2+濃度を調整することは、突然変異率を幾分変動させることができる。この技術は、単純なエラープローン単一工程法を使用して、3〜4突然変異／kbpでプラスミドの完全なコピーを作製する。制限酵素消化又は特異的プライマーは必要とされない。加えて、本方法は典型的には、キットとして入手可能である。
【０１７７】
DNA又はファミリーシャッフリング（Stemmer, W. P.の文献（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91：10747-10751（1994））；及びStemmer, W. P.の文献（Nature 370：389-391（1994）））は典型的には、DNAポリメラーゼの存在下でアニーリング及び伸長の周期によって再構築されるランダム断片のプールを生じて、キメラ遺伝子のライブラリーを作製するために、Dnase I又はEndo Vなどのヌクレアーゼを用いた2以上のバリアント遺伝子の消化を包含する。断片は互いに刺激し、かつ、組換えは、1つのコピーが別のコピーを刺激する場合に生じる（テンプレートスイッチ）。本方法は、1kbp超のDNA配列を用いて使用することができる。断片の再構築によって作製される突然変異性の組換え体に加え、本方法は、エラープローンPCRと類似の速度で伸長工程において点突然変異を導入する。該方法を使用して、抗原性を与え得る有害な無作為中立突然変異を除去することができる。
【０１７８】
付着伸長（StEP）（Zhaoらの文献（Nat. Biotechnol 16：258-261（1998）））は、テンプレート刺激後に、変性及び非常に短い時間のアニーリング／伸長（5秒程度短い。）を用いる反復した周期の2工程PCRを必要とする。増殖する断片は、異なるテンプレートとアニーリングし、かつさらに伸長し、全長の配列を作製するまで反復される。断片を最も多く生じるテンプレート切り替えは、複数の親を有する。低忠実度のポリメラーゼの組み合わせ（Taq及びMutazyme）は、反対の変異性のスペクトルのため、エラープローン偏向を低下させる。
【０１７９】
無作為刺激組換え（RPR）において、ランダム配列プライマーを使用して、テンプレートの異なるセグメントと相補的な多くの短いDNA断片を作製する（Shaoらの文献（Nucleic Acids Res 26：681-683（1998）））。epPCRを介する塩基誤組換え及び誤刺激は、点突然変異を与える。短いDNA断片は、相同性に基づいて互いに刺激し、反復した温度周期によって組換えされ、全長へと再構築される。この工程の前のテンプレートの除去は、低い親組換え体を保証する。本方法は、ほとんどの他の方法と同様に、複数の反復にわたって実施され、異なる特性を進化させることができる。本技術は、配列の偏りを回避し、遺伝子の長さとは無関係であり、適用にとって親DNAを極めてほとんど必要としない。
【０１８０】
ヘテロ二本鎖組換えにおいて、直鎖状プラスミドDNAを使用して、ミスマッチ修復によって修復されるヘテロ二本鎖を形成する（Volkovらの文献（Nucleic Acids Res 27：e18（1999））；及びVolkovらの文献（Methods Enzymol. 328：456-463（2000）））。ミスマッチ修復工程は、少なくとも幾分突然変異誘発性である。ヘテロ二本鎖は、直鎖状ホモ二本鎖よりも効率的に形質転換する。本方法は、大きな遺伝子及び、オペロン全体にとって好適である。
【０１８１】
一過性テンプレートにおける無作為キメラ形成（RACHITT）（Cocoらの文献（Nat. Biotechnol 19：354-359（2001）））は、Dnase I断片化と一本鎖DNAのサイズ分画とを採用する。相同的断片は、ポリメラーゼの不在下で、相補的一本鎖DNA足場とハイブリッド形成する。任意の重複するハイブリッド形成していない断片の末端はエキソヌクレアーゼによって刈り込まれる。断片間の間隙は充填された後、連結して、（Uを含んで増幅を妨げる）足場とハイブリッド形成した全長の多様な鎖のプールを与える。次に、足場を破壊し、PCR増幅によって、多様な鎖と相補的な新たな鎖によって置き換える。該方法は、唯一の親に由来する1つの鎖（足場）を包含するのに対し、刺激する断片は、他の遺伝子に由来し；親足場はこれに対して選択される。従って、親断面との再アニーリングは生じない。重複する断片は、エキソヌクレアーゼを用いて刈り込まれる。さもなくば、これは、DNAシャッフリング及びStEPと概念的に類似している。それゆえ、同胞がなく、不活性物が数個で、かつシャッフリングされていない親がないべきである。本技術は、数個又は0の親遺伝子が作製され、かつはるかに多い乗換えが、標準的なDNAシャッフリングに対して結果として生じることができるという利点を有する。
【０１８２】
切断型テンプレート（RETT）に関する組換え伸長は、テンプレートのプールとして使用される一方向性一本鎖DNA断片の存在下でプライマーから一方向性に増殖する鎖のテンプレート切り替えを必要とする（Leeらの文献（J. Molec. Catalysis 26：119-129（2003）））。DNAエンドヌクレアーゼは使用しない。一方向性一本鎖DNAは、ランダムプライマーを有するDNAポリメラーゼによって、又はエンドヌクレアーゼを用いる連続欠失によって製造される。一方向性一本鎖DNAは、唯一のテンプレートであり、プライマーではない。ランダムプライミング及びエキソヌクレアーゼは、DNAシャッフリング／RACHITTの酵素切断に当てはまるものとして配列の偏りを導入しない。RETTは、非常に短い伸長の替わりに通常のPCR条件を使用するので、StEPよりも最適化するのが容易であることができる。組換えは、PCR工程の構成要素として生じ、直接的なシャッフリングはない。本方法はまた、休止の欠如により、StEPよりもランダムであることができる。
【０１８３】
縮重オリゴヌクレオチド遺伝子シャッフリング（DOGS）において、縮重プライマーを使用して、分子間の組換え（Bergquist及びGibbsの文献（Methods Mol. Biol 352：191-204（2007）））；Bergquisらの文献「（Biomol. Eng 22：63-72（2005））；Gibbsらの文献（Gene 271：13-20（2001））を制御し；これを使用して、DNAシャッフリングなどの他の方法の傾向を制御して、親遺伝子を再生することができる。本方法は、選択された遺伝子セグメントのランダム突然変異誘発（epPCR）と組み合わせることができる。該方法は、親配列の再編成を遮断する良好な方法であり得る。エンドヌクレアーゼは必要ではない。作製されたセグメントの入力された濃度を調整することによって、所望の骨格に対して偏向させることができる。本方法によって、制限酵素消化なしで関連性のない親からのDNAシャッフリングが可能となり、無作為突然変異誘発法の選択が可能となる。
【０１８４】
ハイブリッド酵素の作製のための増加性切断（ITCHY）は、関心対象の遺伝子又は遺伝子断片の1塩基対の欠失をともなうコンビナトリアルライブラリーを作製する（Ostermeierらの文献（Proc Natl Acad Sci U S.A. 96：3562-3567（1999））；Ostermeierらの文献（Nat. Biotechnol. 17：1205-1209（1999）））。切断は、2つの異なる遺伝子のピースに関して反対方向で導入される。これらを互いに連結し、融合をクローニングする。本技術は、2つの親遺伝子間の相同性を必要としない。ITCHYがDNAシャッフリングと組み合わされる場合、システムはSCRATCHYと呼ばれる（下記参照）。両方の主要な利点は、親遺伝子間の相同性についての必要性がなく；例えば、大腸菌とヒト遺伝子の間の機能的融合を、ITCHYを介して作製する。ITCHYライブラリーを作製する場合、すべての起こり得る乗換えを捕捉する。
【０１８５】
ハイブリッド酵素の作製のためのチオ‐増加性切断（THIO‐ITCHY）は、ITCHYとほぼ同じであるが、例外は、ホスホチオアートdNTPを使用して切断を生じることである（Lutz, S.、M. Ostermeier、及びS.J. Benkovicの文献「（Rapid generation of incremental truncation libraries for protein engineering using alpha-phosphothioate nucleotides）」（Nucleic Acids Res 29：E16（2001）））。ITCHYに対して、THIO‐ITCHYは、最適化するのがより簡単であり得、より高い再現性及び調整性を提供する。
【０１８６】
DNAシャッフリングと組み合わせたSCRATCHY‐ITCHYは、DNAシャッフリング及びITCHYの組み合わせであり；それゆえ、複数の乗換えを可能にする（Lutzらの文献（Proc Natl Acad Sci U S.A. 98：11248-11253（2001）））。SCRATCHYは、ITCHY及びDNAシャッフリングの最良の特色を組み合わせる。計算推定は、最適化において使用することができる。SCRATCHYは、配列同一性が80％を下回る場合、DNAシャッフリングよりも有効である。
【０１８７】
無作為浮動突然変異誘発（RNDM）において、突然変異は、epPCR後の、使用可能な活性を保持するものについてのスクリーニング／選択を介して実施される（Bergquistらの文献（Biomol. Eng 22：63-72（2005）））。次に、これらをDOGSにおいて使用して、複数の活性のある突然変異体間の、又は活性のある突然変異といくつかの他の望ましい親の間の融合を有する組換え体を作製する。中立変異の単離を促進するよう設計され；その目的は、この活性が元の遺伝子におけるよりも高いか又は低いかどうかを、保持された触媒活性についてスクリーニングすることである。RNDMは、スクリーニングが、背景を上回る活性を検出することができる場合、高処理量アッセイにおいて使用可能である。RNDMは、多様性を生じる上で、DOGSに対するフロントエンドとして使用されてきた。該技術は、シャッフリング又は他のその後の工程の前に活性についての必要条件を課し；中立浮動ライブラリーは、より小さなライブラリーから活性におけるより高い／より迅速な改良を結果として生じることが示されている。epPCRを用いて刊行されているが、このことは他の大規模突然変異誘発法に適用され得る。
【０１８８】
配列飽和突然変異誘発（SeSaM）は、1）ホスホチオアートヌクレオチドの無作為組み込み及び切断を用いてランダム長断片のプールを生じ；このプールをテンプレートとして使用して、2）イノシンなどの「普編的な」塩基の存在下で伸長し；3）イノシン含有相補物（complement）の複製は、無作為な塩基組み込み及び結果として突然変異誘発を与える、ランダム突然変異誘発法である（Wongらの文献（PCR. Biotechnol J 3：74-82（2008））；Wongの文献（Nucleic Acids Res 32：e26（2004））；Wongらの文献（Anal. Biochem. 341：187-189（2005）））。本技術を用いて、単純な方法を使用して2〜3日以内で突然変異体の大きなライブラリーを作製することが可能であり得る。このことは、DNAポリメラーゼの突然変異性の偏りと比較して非常に非定向性である。このアプローチの差は、本技術をepPCRと相補的（又は代替的）にする。
【０１８９】
合成シャッフリングにおいて、重複するオリゴヌクレオチドを設計して、「標的におけるすべての遺伝的多様性」をコードし、シャッフリングされた後代について非常に高い多様性を可能にする（Nessらの文献（Nat. Biotechnol 20：1251-1255（2002）））。本技術において、シャッフリングされるべき断片を設計することができる。このことは、結果として生じる後代の多様性を増大させることを助ける。配列／コドンの偏りを設計して、より密接に関連する配列にアプローチする速度でより離れて関連する配列を作製することができ、テンプレート遺伝子を物理的に有する必要がない。
【０１９０】
ヌクレオチド交換及び切除技術NexTは、dUTPの組み込みに次ぐウラシルDNAグリコシラーゼ及びその後のピペリジンによる処理の組み合わせを活用して、エンドポイントDNA断片化を実施する（Mullerらの文献（Nucleic Acids Res 33：e117（2005）））。遺伝子は、プルーフリーディングポリメラーゼによる内部PCRプライマー伸長を用いて再構築する。シャッフリングのための大きさは、変動するdUPT：：dTTP比を用いて直接的に制御可能である。このことは、ウラシルの組み込み及び切断のための単純な方法を用いたエンドポイント反応である。本方法を用いて、8-オキソ-グアニンなどの他のヌクレオチドアナログを使用することができる。加えて、該技術は、非常に短い断片（86bp）を用いて十分作用し、低いエラー率を有する。DNAの化学的切断は、非常に少数のシャッフリングされていないクローンを生じさせる。
【０１９１】
配列相同性非依存性タンパク質組換え（SHIPREC）において、リンカーを使用して、2つの遠隔に／関連していない遺伝子間の融合を促進させ；ヌクレアーゼ処理を使用して、2つの間のある範囲のキメラを生じる。結果は、これらの融合の単一の乗換えライブラリーである（Sieberらの文献（Nat. Biotechnol 19：456-460（2001）））。このことは、限定された種類のシャッフリングを生じ；突然変異誘発は別個のプロセスである。本技術は、2つの関連していない親遺伝子の各々の画分を変動させながら、キメラのライブラリーを作製することができる。相同性は必要ではない。SHIPRECを、哺乳類CP450のn-末端領域と融合した細菌CP450のヘム結合ドメインを用いて試験し；このことは、より可溶性の酵素における哺乳類活性を生じた。
【０１９２】
遺伝子部位飽和突然変異誘発（GSSM）において、出発材料は、インサートを有するスーパーコイル二本鎖DNAプラスミドであり、2つのプライマーは、突然変異に所望の部位で縮重する（Kretzらの文献（Methods Enzymol. 388：3-11（2004）））。プライマーは、関心対象の突然変異を招来し、DNAの反対鎖において同じ配列とアニーリングし；プライマーの中間部における突然変異及び各側に隣接する〜20ヌクレオチドの正確な配列を生じる。プライマーの配列は、NNN又はNNK（コード化）及びMNN（非コード化）である（N＝すべて4、K＝G、T、M＝A、C）。伸長後、DpnIを使用して、ダム‐メチル化した（dam-methylated）DNAを消化し、野生型テンプレートを除去する。本技術は、所与の座（すなわち1つのコドン）におけるすべての起こり得るアミノ酸置換を探索する。該技術は、ノンセンスコドンを有さない1つの部位におけるすべての起こり得る置換の発生を容易にし、たいていの起こり得る対立遺伝子の等しい又はほぼ等しい提示を容易にする。標的酵素の構造、機序、又はドメインに関する先行知識を必要としない。シャッフリング又は遺伝子再構築が続く場合、本技術は、単一部位の上方突然変異のすべての起こり得る組み合わせを含む組換え体の多様なライブラリーを作製する。本技術の組み合わせの有用性は、50超の異なる酵素の成功裏の進化について示されており、また、所与の酵素における2つ以上の特性についても示されている。
【０１９３】
コンビナトリアルカセット突然変異誘発（Combinatorial Cassette Mutagenesis）（CCM）は、限定された領域を多数の起こり得るアミノ酸配列変更と置き換えるための短いオリゴヌクレオチドカセットの使用を包含する（Reidhaar‐Olsonらの文献（Methods Enzymol. 208：564-586（1991））；及びReidhaar‐Olsonらの文献（Science 241：53-57（1998）））。2つの部位又は3つの部位での同時置換は、本技術を用いて可能である。加えて、該方法は、限定された範囲の部位で起こり得る配列変化の大きな多重度を試験する。該方法は、ラムダリプレッサーDNA結合ドメインの情報内容を探索するために使用されてきた。
【０１９４】
コンビナトリアル多重カセット突然変異誘発（Combinatorial Multiple Cassette Mutagenesis）（CMCM）は、CCMと本質的に同様であるが、例外は、より大きなプログラムの一部として採用されることである：1）高い突然変異率でのepPCRの使用により、2）ホットスポット及びホット領域を同定した後、3）CMCMによる伸長で、タンパク質配列空間の規定された領域をカバーする（Reetzらの文献（Angew. Chem. Int. Ed Engl. 40：3589-3591（2001）））。CCMを使用するので、本方法は、標的領域にわたるすべての起こり得る変更を実質的に試験することができる。ランダム突然変異及びシャッフリングされた遺伝子を作製するための方法とともに使用する場合、多様なシャッフリングされたタンパク質を作製する優れた手段を提供する。本アプローチは、該酵素のエナンチオ選択性を51倍増大させる点で成功していた。
【０１９５】
ミューテーター株技術において、条件的tsミューテータープラスミドは、ランダムな20〜4000倍の増加と選択の間の天然の突然変異頻度とを可能にし、選択が必要とされない場合、有害な突然変異の蓄積を遮断させる（Selifonovaらの文献（Appl Environ Microbiol 67：3645-3649（2001）））。本技術は、DNAポリメラーゼIIIの突然変異体サブユニットをコードする、プラスミド由来のmutD5遺伝子に基づいている。本サブユニットは、内在性DNAポリメラーゼIIIに結合し、該プラスミドを有する任意の株におけるポリメラーゼIIIのプルーフリーディング能を損なう。広範な範囲の塩基置換及びフレームシフト突然変異が生じる。有効な使用のために、ミューテータープラスミドは、所望の表現型に一旦達成すると、除去されるべきであり；このことは、41℃でのプラスミド治療を可能にする複製の温度感受性起源を通じて達成される。ミューテーター株が、かなりの時間探索されたことは留意すべきである（例えば、Winter及び共同研究者（J. Mol. Biol, 260, 359-3680（1996））を参照されたい。）。本技術において、非常に高い自発性の突然変異率が観察される。条件的特性は、所望されていない背景突然変異を最小化する。本技術は、突然変異誘発率を亢進し、かつ所望の表現型をより迅速に達成するために、適応進化と組み合わされ得る。
【０１９６】
「探索型突然変異誘発（Look-Through Mutagenesis）（LTM）は、選択されたアミノ酸の組み合わせ突然変異を評価及び最適化する多次元突然変異誘発法である」（Rajpaらの文献（Proc Natl Acad Sci U S. A 102：8466-8471（2005）））。起こり得るすべてのアミノ酸変化を有する各部位を飽和させるよりもむしろ、9の1セットを選択して、アミノ酸R基化学の範囲をカバーする。1部位あたりより少数の変化は、複数の部位をこの種類の突然変異誘発に供する。低いナノモル濃度からピコモル濃度までの抗体に対する結合親和性における800倍超の増加が、本方法を通じて達成された。これは、無作為な組み合わせの数を最小化する合理的アプローチであり、スクリーニングされるべきクローンの数を著しく減少させることによって、改良された形質を見出す能力を高めるべきである。このことは、抗体工学に適用され、具体的には、結合親和性を増大させ及び／又は解離を低下させる。該技術は、スクリーニング又は選択のいずれかと組み合わせることができる。
【０１９７】
遺伝子再構築は、複数の遺伝子に一度に、又は単一の遺伝子のキメラ（複数の突然変異）の大きなライブラリーを作製することに適用することのできるDNAシャッフリング法である（www.verenium.com/Pages/Technology/EnzymeTech/TechEnzyTGR.htmlにおけるワールドワイドウェブ）。典型的には本技術を、所望の改良のために表される配列空間を質問するために、超高処理量スクリーニングとの併用で使用する。本技術は、相同性とは無関係の複数の遺伝子組換えを可能にする。乗換え事象の実際の数及び位置は、生物情報学的分析を介して設計された断片を使用してあらかじめ決定することができる。本技術は、非常に高レベルの多様性をもたらし、親遺伝子の再形成を本質的に有さず、低レベルの不活性遺伝子を有する。GSSMと組み合わせると、大きな範囲の突然変異を、改良された活性について試験することができる。該方法は、DNAシャッフリングの「配合」及び「微調整」を可能にし、例えば、コドンの使用は最適化することができる。
【０１９８】
インシリコタンパク質設計自動化PDAは、特定の倍数を有する構造的に規定されたタンパク質骨格を固定し、かつ倍数及び全体的なタンパク質エネルギー性を安定化させることのできるアミノ酸置換のための配列空間を検索する、最適化アルゴリズムである（Hayesらの文献（Proc Natl Acad Sci U S. A 99：15926-15931（2002）））。本技術は、タンパク質アミノ酸変動に対する構造的耐性を検索するために、インシリコでの構造ベースのエントロピー予測を可能にする。統計的メカニクスを適用して、各位置におけるカップリング相互作用を算出し‐アミノ酸置換に対する構造的耐性は、カップリングの尺度である。究極的には、本技術は、構造特徴の統合性を維持しながら、タンパク質特性の所望の修飾を生じるよう設計される。該方法は、非常に多数の起こり得る配列バリアント（1050）のフィルタリングを計算上評価し可能にする。試験するための配列バリアントの選択は、最も好ましい熱力学に基づいた予測と関連しており、安定性と連関した表面上は唯一の安定性又は特性を、本技術を用いて効果的に扱うことができる。該方法は、いくつかの治療用タンパク質において、特に免疫グロブリンを操作する上で、成功裏に使用されてきた。インシリコの予測は、極端に多数の潜在的なバリアントを試験するのを回避する。既存の3次元構造に基づいた予測は、仮説上の構造に基づいた予測よりも成功しそうである。本技術は、複数の同時突然変異の標的指向化（targeted）スクリーニングを容易に予測及び可能にすることができ、数の指数関数的増加により、純粋に実験的な技術を用いて可能ではないこともある。
【０１９９】
反復性飽和突然変異誘発（ISM）は、1）構造／機能の知識を使用して、酵素の改良にありがちな部位を選択すること、2）Stratagene QuikChange（又は他の好適な手段）を使用して選択された部位における飽和突然変異誘発、3）所望の特性についてのスクリーニング／選択、4）改良されたクローンを用いて、別の部位及び持続した反復でやり直すことを包含する（Reetzらの文献（Nat. Protoc. 2：891-903（2007））；及びReetzらの文献（Angew. Chem. Int. Ed Engl. 45：7745-7751（2006）））。これは、所与の位置における起こり得るすべての置き換えが、スクリーニング／選択についてなされることを保証する立証された方法論である。
【０２００】
突然変異誘発のための上記の任意の方法は、単独で又は任意の組み合わせで使用することができる。加えて、定向進化方法の任意の1つ又は組み合わせは、適応進化の技術とともに使用することができる。
【０２０１】
より良好な産生体を作出するために、代謝モデリングを利用して、増殖条件を最適化することができる。また、モデリングを使用して、経路の利用を追加的に最適化する遺伝子ノックアウトを設計することができる（例えば、米国特許公報US 2002／0012939、US 2003／0224363、US 2004／0029149、US 2004／0072723、US 2003／0059792、US 2002／0168654、及びUS 2004／0009466、並びに米国特許第7,127,379号を参照されたい。）。モデリング分析は、イソプロパノール、n-ブタノール、又はイソブタノールのより効率的な産生の方へ代謝を移行させることが細胞増殖に及ぼす効果に関して、信頼性のある予測を可能にする。
【０２０２】
所望の生成物の生合成を助力する代謝的変更を同定及び設計するための1つの計算方法は、OptKnock計算フレームワークである（Burgardらの文献（Biotechnol. Bioeng. 84：647-657（2003）））。OptKnockは、標的生成物を過剰産生する遺伝的に安定した微生物を結果として生じる遺伝子欠失戦略を示唆する代謝モデリング及びシミュレーションプログラムである。具体的には、該フレームワークは、所望の生化学物質を細胞増殖の絶対的な副産物となることを余儀なくさせる遺伝的操作を示唆するために、微生物の完全な代謝的及び／又は生化学的ネットワークを検討する。戦略的に配置された遺伝子欠失又は他の機能的遺伝子破壊を通じて、生化学的産生を細胞増殖と連関させることによって、バイオリアクターでの長期間後の該操作された株に課される増殖淘汰圧は、増殖と連関した強制的な生化学的産生の結果として、性能の向上をもたらす。最後に、遺伝子欠失が構築される場合、OptKnockにより選択される遺伝子がゲノムから完全に除去されるはずなので、該設計された株はその野生型状態に復帰するごくわずかな可能性がある。それゆえ、この計算方法論を使用して所望の生成物の生合成をもたらす代替経路を同定することができるか、又は所望の生成物の生合成の更なる最適化のために非天然微生物との関連で使用することができるかのいずれかである。
【０２０３】
簡潔にいうと、OptKnockは、細胞代謝をモデル化するための計算方法及びシステムを指すために本明細書において使用される用語である。OptKnockプログラムは、特定の制約を流動バランス分析（FBA）モデルに組み込むモデル及び方法のフレームワークに関する。これらの制約には、例えば、質的な動力学的情報、質的な調節情報、及び／又はDNAマイクロアレイ実験データを含む。また、OptKnockは、例えば、遺伝子の付加又は欠失の存在下で、流動バランスモデルに由来する流動境界を厳しくすること、及びその後代謝ネットワークの性能限界を探査することにより、種々の代謝的課題に対する解も計算する。OptKnock計算フレームワークは、代謝ネットワークの性能限界の有効な問い合わせを可能にするモデル考案の構築を可能にし、その結果としての混合整数線形プログラム課題を解決するための方法を提供する。本明細書においてOptKnockと称される代謝的なモデリング方法及びシミュレーション方法は、例えば、U.S. 2002／0168654、WO 2002／055995、及びU.S. 2009／0047719に説明されている。
【０２０４】
生成物の生合成産生を助力する代謝的変更を同定及び設計する別の計算方法は、SimPheny（登録商標）と称される代謝モデリング及びシミュレーションシステムである。この計算方法及びシステムは、2002年6月14日に出願のU.S. 2003／0233218、及びWO／2003／106998に説明されている。SimPheny（登録商標）は、インシリコでネットワークモデルを作成し、かつ生物系の化学反応を介する質量、エネルギー又は電荷の流れを模倣して、計算システムにおける化学反応の任意の及び全ての起こり得る機能性を含む解空間を規定し、それにより該生物系に許容されるある範囲の活性を測定するために使用することのできるシステムである。本アプローチは、該解空間が、該包含される反応の公知の化学量論などの制約、並びに反応による最大流と関連する反応熱力学制約及び容量制約により規定されるので、制約系モデリングと呼ばれる。これらの制約により規定される空間は、該生物系の、又はその生化学成分の表現型の能力及び挙動を決定するために調べることができる。
【０２０５】
生物系は柔軟で、かつ多くの異なる経路で同じ結果に到達することができるので、これらの計算的アプローチは生物学的実体と整合する。生物系は、全ての生体系が対面しなければならない根本的制約により制限された進化的機構により設計される。それゆえ、制約系モデリング戦略は、これら全般的実体を包含する。更に、制約の厳しさを介して更なる制限をネットワークモデルに連続的に課す能力は結果的に、該解空間のサイズの減少を生じ、これにより生理学的性能又は表現型を予測することのできる精度を高める。
【０２０６】
本明細書に提供される教示及びガイダンスを考慮すると、当業者は、種々の計算フレームワークを代謝モデリング及びシミュレーションに適用して、宿主微生物の所望の化合物の生合成を設計及び実施することができる。このような代謝モデリング方法及びシミュレーション方法には、例えば、SimPheny（登録商標）及びOptKnockとして先に例証される計算システムを含む。本発明の引例のために、いくつかの方法は、モデリング及びシミュレーションのためのOptKnock計算フレームワークに関して本明細書に説明される。当業者は、OptKnockを当該技術分野において周知の任意のそのような他の代謝モデリング及びシミュレーション計算フレームワークに対して使用する、代謝的変更の同定、設計及び実施の適用法を知っているであろう。
【０２０７】
先に説明した方法は、破壊するための1セットの代謝反応を提供する。該セットの範囲内の各反応の除去又は代謝的修飾は結果的に、該生物の増殖相の間の必須生成物として、所望の生成物を生じることができる。該反応は公知であるので、二層性のOptKnock課題への解はまた、該セットの反応内の各反応を触媒する1以上の酵素をコードする関連した遺伝子（gene）又は遺伝子（genes）も提供する。1セットの反応及び各反応に関与する酵素をコードする相応する該反応の遺伝子の同定は、一般的に、自動化されたプロセスであり、該反応と、酵素とコード遺伝子の関係を有する反応データベースとの相関を介して達成される。
【０２０８】
一旦同定されると、所望の生成物の産生を達成するために破壊されるはずの該セットの反応は、該セット内の各代謝反応をコードする少なくとも1つの遺伝子の機能的な破壊により標的の細胞又は生物において行う。該反応セットの機能的な破壊を達成する1つの特に有用な手段は、各コード遺伝子の削除によるものである。しかしながら、いくつかの場合において、例えば、プロモーター若しくは調節因子のためのシス結合部位などの調節領域の突然変異、欠失を含む他の遺伝的異常により、又は任意のいくつかの位置でのコード配列の切り詰めにより該反応を破壊することは、有益であり得る。これらの後者の異常は、該遺伝子セットの決して全部ではない欠失を生じ、例えば、生成物の連関の迅速な評価が望まれる場合、又は遺伝的復帰があまり起こりそうにない場合に有用であり得る。
【０２０９】
破壊するためのさらなるセットの反応をもたらす、又は所望の生成物の増殖と連関した生合成を含む生合成を結果的に生じることのできる代謝修飾をもたらす先に説明した二層性のOptKnock課題に対する追加的な生産的解を同定するために、整数カットと称される最適化方法を行うことができる。本方法は、先に例証したOptKnock課題を、各反復での整数カットと称される追加的な制約の組み込みを用いて反復して解くことにより進められる。整数カット制約は、解決手順が、生成物の生合成を増殖に強制的に連関させる任意の先行反復において同定される正確な同一セットの反応を選択することを効果的に防止する。例えば、既に同定された増殖連関代謝修飾が破壊のための反応1、2及び3を条件として指定する場合、以下の制約は、同じ反応が、その後の解において同時に考慮されるのを防止する。整数カット方法は、当該技術分野において周知であり、例えばBurgardらの文献（Biotechnol. Prog. 17：791-797（2001））において説明されているのが認められ得る。代謝モデリング及びシミュレーションのためのOptKnock計算フレームワークと組み合わせた、本明細書に説明されるすべての方法の使用に関して、該方法と同様に、反復的な計算分析の冗長性を低減する整数カット法はまた、例えばSimPheny（登録商標）を含む当該技術分野において周知の他の計算フレームワークと共に適用することもできる。
【０２１０】
本明細書に例証される方法は、標的生化学的生成物の産生と、同定された遺伝的変更を有するように操作された細胞又は生物の増殖との必須の連関を含む、所望の生成物を生合成的に産生する細胞及び生物の構築を可能にする。それゆえ、本明細書に説明される計算方法は、OptKnock又はSimPheny（登録商標）から選択されるインシリコ法により同定される代謝修飾の同定及び実施を可能にする。代謝修飾のセットには、例えば、1以上の生合成経路酵素の添加及び／又は例えば遺伝子欠失による破壊を含む1以上の代謝反応の機能的な破壊を含むことができる。
【０２１１】
先に論議したように、OptKnock方法論は、長期の増殖選択に供する場合、変異体微生物ネットワークがそれらの計算的に予測された最高増殖の表現型の方へ進化することができるという前提で開発された。換言すれば、該アプローチは、選択圧の下で自己最適化する生物の能力を強化する。OptKnockフレームワークは、ネットワーク化学量論に基づく生化学的産生と細胞増殖の間の連関を余儀なくする遺伝子欠失の組み合わせの網羅的な列挙を可能にする。最適な遺伝子／反応ノックアウトの同定は、結果として生じるネットワークのための最適な増殖の解が、関心対象の生化学物質を過剰産生するように、活性のある反応のセットを選択する二層性の最適化課題の解を必要とする（Burgardらの文献（Biotechnol. Bioeng. 84：647-657（2003）））。
【０２１２】
大腸菌代謝のインシリコ化学量論的モデルを採用して、既に例証されたように、並びに例えば、米国特許公報US 2002/0012939、US 2003／0224363、US 2004／0029149、US 2004／0072723、US 2003／0059792、US 2002／0168654及びUS 2004／0009466並びに米国特許第7,127,379号において説明されているように、代謝経路のための必須遺伝子を同定することができる。本明細書に開示するように、OptKnock数学的フレームワークは、所望の生成物の増殖連関産生をもたらすピンポイントでの遺伝子欠失に適用することができる。更に、二層性のOptKnock課題の解は、1セットの欠失のみを提供する。意味のあるすべての解、すなわち、増殖連関産生形成をもたらすノックアウトの全セットを列挙するために、整数カットと称される最適化技術を行うことができる。これは、先に論議したように、各反復における整数カットと称される追加的な制約の組み込みを用いてOptKnock課題を反復的に解くことを必要とする。
【０２１３】
本発明の種々の実施態様の活性に実質的には影響を及ぼさない修飾も本明細書に提供される本発明の定義内に含まれることが理解される。したがって、以下の実施例は、本発明を説明するよう意図されており、限定するよう意図するものではない。
【実施例】
【０２１４】
（実施例I）
（4-ヒドロキシブチリル-CoAをイソプロパノールに転換するための経路を有する微生物を作出するイソプロパノールの調製）
本実施例は、4-ヒドロキシブチリル-CoAからイソプロパノールを産生することのできる微生物の作出を説明する。
【０２１５】
大腸菌を標的生物として用い、4-ヒドロキシブチリル-CoAから出発する図１に示されるイソプロパノール経路を操作する。大腸菌は、イソプロパノールを産生することのできる非天然微生物を作出するための良好な宿主を提供する。大腸菌は、遺伝子操作に敏感に反応し、嫌気性条件又は微好気性条件の下で効果的に、エタノール、酢酸、ギ酸、乳酸、及びコハク酸のような種々の生成物を産生することができることが公知である。
【０２１６】
3-ヒドロキシイソ酪酸を産生するよう操作された大腸菌株を作出するために、該経路において利用される該酵素をコードする核酸を、周知の分子生物学技術を用いて大腸菌において発現させる（例えば、Sambrookの文献（上述、2001）；Ausubelの文献（上述、1999））。特に、コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素（CoA‐依存性）、4-ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、4-ヒドロキシ酪酸キナーゼ、及びホスホトランスブチリラーゼ の活性をそれぞれコードするsucD（YP_001396394）遺伝子、4hbd（YP_001396393）遺伝子、buk1（Q45829）遺伝子、及びptb（NP_349676）遺伝子を、Burkらの文献（米国公報2009／0075351）において説明されるように、発現ベクターへとクローニングし、又は染色体へと組み込む。加えて、4-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼ、ビニルアセチル-CoA Δ-イソメラーゼ、及びエノイル-CoAヒドラターゼの活性をそれぞれコードするabfD（P55792）遺伝子及びcrt1（NP_349318.1）遺伝子を、PA1／lacOプロモーターの下でpZE13ベクター（Expressys, Ruelzheim, Germany）へとクローニングする。次に、3-ヒドロキシブチリル-CoA脱水素酵素及びアセチル-CoA：アセトアセタート-CoAトランスフェラーゼの活性をそれぞれコードするhbd（NP_349314.1）及びatoAD（P76459.1、P76458.1）をPA1／lacOプロモーターの下でpZS23ベクター（Expressys, Ruelzheim, Germany）へとクローニングする。次に、アセトアセタートデカルボキシラーゼ及びアセトン還元酵素 の活性をコードするadc（NP_149328.1）遺伝子及びadh（AAA23199.2）遺伝子をPA1／lacOプロモーターの下でpZS13ベクター（Expressys, Ruelzheim, Germany）へとクローニングする。pZS23は、周知の分子生物学技術によって、pZS13ベクター（Expressys, Ruelzheim, Germany）のアンピシリン耐性モジュールをカナマイシン耐性モジュールと置き換えることによって得られる。3セットのプラスミドを、大腸菌の4-ヒドロキシブチリル-CoA産生株へと形質転換させ、4-ヒドロキシブチリル-CoAからのイソプロパノール合成に必要なタンパク質及び酵素を発現させる。
【０２１７】
結果として生じる遺伝子操作した生物を、当該技術分野で周知の手順に従って、グルコース含有培地において培養する（例えば、Sambrookらの文献（上述、2001）を参照されたい。）。また、大腸菌の宿主株を操作して、コバラミンを新規に合成させない限り、コバラミンを培地に供給して、ムターゼ酵素の活性を保証する（例えば、Rauxらの文献（J. Bacteriol. 178：753-767（1996））を参照されたい。）。イソプロパノール合成遺伝子の発現は、例えば、ノーザンブロット法、mRNAのPCR増幅、免疫ブロット法、及びこれらに類するものを含む、ポリペプチド発現又は酵素活性を決定するための、当該技術分野で周知の方法を用いて確証される。発現した酵素の酵素活性は、個々の活性に特異的なアッセイを用いて確認される。イソプロパノールを産生するよう操作された大腸菌株の能力は、HPLC、ガスクロマトグラフィー‐質量分析（GCMS）、及び／又は液体クロマトグラフィー‐質量分析（LCMS）を用いて確認される。
【０２１８】
機能的なイソプロパノール合成経路を有するよう操作された微生物株は、該経路の効率的な利用のための最適化によってさらに増加する。簡潔には、操作された株を評価して、任意の外来性遺伝子が律速レベルで発現するかどうかを決定する。発現は、例えば追加的な遺伝子コピー数の導入によって経路を通じて流れを制限することのできる低レベルで発現した任意の酵素について増大している。
【０２１９】
より良好な産生体を作出するために、代謝モデリングを利用して、増殖条件を最適化する。また、モデリングを使用して、経路の利用を追加的に最適化する遺伝子ノックアウトを設計する（例えば、米国特許公報US 2002／0012939、US 2003／0224363、US 2004／0029149、US 2004／0072723、US 2003／0059792、US 2002／0168654、及びUS 2004／0009466、並びに米国特許第7,127,379号を参照されたい。）。モデリング分析は、イソプロパノールのより効率的な産生の方へ代謝を移行させることが細胞増殖に及ぼす効果に関して、信頼性のある予測を可能にする。1つのモデリング法は、二層性最適化アプローチであるOptKnockであり（Burgardらの文献（Biotechnol. Bioengineer. 84：647-657（2003）））、イソプロパノールのより良好な産生を集約的に結果として生じる遺伝子ノックアウトを選択するために適用される。また、適応進化を使用して、例えば、イソプロパノール生成物の4-ヒドロキシブチリル-CoA中間体のより良好な産生体を作出することができる。適応進化を実施して、増殖特徴及び産生特徴の両方を改良する（Fong及びPalssonの文献（Nat. Genet. 36：1056-1058（2004））；Alperらの文献（Science 314：1565-1568（2006）））。結果に基づいて、モデリング、遺伝子操作、及び適応進化のその後のラウンドをイソプロパノール産生体に適用して、産生をさらに増大させることができる。
【０２２０】
イソプロパノールの大規模産生のために、先の生物を、当該技術分野で公知の培地を用いて発酵槽において培養し、嫌気性条件下で該生物の増殖を支持する。発酵は、バッチ、供給バッチ、又は連続様式のいずれかで実施する。嫌気性条件は、まず培地に窒素を散布し、次に培養容器を封止することによって維持され、例えば、フラスコは、中隔及び圧着キャップを用いて封止することができる。また、微好気性条件は、限られた通気のための小開口を提供することによって利用することができる。培地のpHは、H2SO4などの酸の添加によって、ほぼ7のpHに維持される。増殖速度は、分光光度計（600nm）を用いて光学密度を測定することによって決定され、グルコース取り込み速度は、炭素源枯渇を経時的にモニターすることによって決定される。望ましくないアルコール、有機酸、及び残余のグルコースなどの副産物は、例えば、Aminex（登録商標）シリーズのHPLCカラム（例えば、HPX‐87シリーズ）（BioRad, Hercules CA）を備え、グルコース及びアルコールのために屈折率検出器を、並びに有機酸のために紫外線検出器を用いるHPLC（Shimadzu, Columbia MD）によって定量化することができる（Linらの文献（Biotechnol. Bioeng., 775-779（2005）））。
【０２２１】
（実施例II）
（4-ヒドロキシブチリル-CoAをn-ブタノールに転換するための経路を有する微生物を作出するn-ブタノールの調製）
本実施例は、4-ヒドロキシブチリル-CoAからn-ブタノールを産生することのできる微生物の作出を説明する。
【０２２２】
大腸菌を標的生物として使用して、4-ヒドロキシブチリル-CoAから出発する図１において示されるブタノール経路を操作する。大腸菌は、ブタノールを産生することのできる非天然微生物を作出するための良好な宿主を提供する。大腸菌は、遺伝子操作に敏感に反応し、嫌気性条件又は微好気性条件の下で効果的に、エタノール、酢酸、ギ酸、乳酸、及びコハク酸のような種々の生成物を産生することができることが公知である。
【０２２３】
3-ヒドロキシイソ酪酸を産生するよう操作された大腸菌株を作出するために、該経路において利用される酵素をコードする核酸を大腸菌において、周知の分子生物学技術を用いて発現させる（例えば、Sambrookの文献（上述、2001）；Ausubelの文献（上述、1999）を参照されたい）。特に、コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素（CoA‐依存性）、4-ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、4-ヒドロキシ酪酸キナーゼ、及びホスホトランスブチリラーゼの活性をそれぞれコードするsucD（YP_001396394）遺伝子、4hbd（YP_001396393）遺伝子、buk1（Q45829）遺伝子、及びptb（NP_349676）遺伝子を、Burkらの文献（米国公報2009／0075351）において説明されるように、発現ベクターへとクローニングし、又は染色体へと組み込む。加えて、4-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼ及びビニルアセチル-CoAΔイソメラーゼの活性をコードするabfD（P55792）遺伝子をPA1／lacOプロモーターの下で、pZE13ベクター（Expressys, Ruelzheim, Germany）へとクローニングする。次に、クロトニル-CoA還元酵素活性をコードするbcd（NP_349317.1）遺伝子及びetfAB（NP_349315.1、NP_349316.1）遺伝子をPA1／lacOプロモーターの下でpZS23ベクター（Expressys, Ruelzheim, Germany）へとクローニングする。次に、ブチリル-CoA還元酵素（アルデヒド形成）及びブチルアルデヒド還元酵素の活性をコードするald（AAT66436）遺伝子及びadhI（AAR91477.1）遺伝子を、PA1／lacOプロモーターの下でpZS13ベクター（Expressys, Ruelzheim, Germany）へとクローニングする。pZS23は、周知の分子生物学技術によって、pZS13ベクター（Expressys, Ruelzheim, Germany）のアンピシリン耐性モジュールをカナマイシン耐性モジュールと置き換えることによって得られる。3セットのプラスミドを大腸菌の4-ヒドロキシブチリル-CoA産生株へと形質転換させ、4-ヒドロキシブチリル-CoAからのブタノール合成に必要なタンパク質及び酵素を発現させる。
【０２２４】
結果として生じる遺伝子操作した生物を、当該技術分野で周知の手順に従って、グルコース含有培地において培養する（例えば、Sambrookらの文献（上述、2001）を参照されたい。）。また、大腸菌の宿主株を操作して、コバラミンを新規に合成させない限り、コバラミンを培地に供給して、ムターゼ酵素の活性を保証する（例えば、Rauxらの文献（J. Bacteriol. 178：753-767（1996））を参照されたい。）。ブタノール合成遺伝子の発現は、例えば、ノーザンブロット法、mRNAのPCR増幅、免疫ブロット法、及びこれらに類するものを含む、ポリペプチド発現又は酵素活性を決定するための、当該技術分野で周知の方法を用いて確証される。発現した酵素の酵素活性は、個々の活性に特異的なアッセイを用いて確認される。ブタノールを産生するよう操作された大腸菌株の能力は、HPLC、ガスクロマトグラフィー‐質量分析（GCMS）、及び／又は液体クロマトグラフィー‐質量分析（LCMS）を用いて確認される。
【０２２５】
機能的ブタノール合成経路を有するよう操作した微生物株は、該経路の効率的な利用のための最適化によってさらに増加する。簡潔には、操作した株を評価して、任意の外来性遺伝子が律速レベルで発現するかどうかを決定する。発現は、例えば追加的な遺伝子コピー数の導入によって該経路を通じた流れを制限することのできる低レベルで発現した任意の酵素について増大している。
【０２２６】
より良好な産生体を作出するために、代謝モデリングを利用して、増殖条件を最適化する。また、モデリングを使用して、前記経路の利用を追加的に最適化する遺伝子ノックアウトを設計する（例えば、米国特許公報US 2002/0012939、US 2003/0224363、US 2004/0029149、US 2004/0072723、US 2003/0059792、US 2002/0168654、及びUS 2004/0009466、並びに米国特許第7,127,379号を参照されたい。）。モデリング分析は、ブタノールのより効率的な産生の方へ代謝を移行させることが細胞増殖に及ぼす効果に関して、信頼性の高い予測を可能にする。1つのモデリング法は、二層性最適化アプローチであるOptKnockであり（Burgardらの文献（Biotechnol. Bioengineer. 84：647-657（2003）））、ブタノールのより良好な産生を集約的に結果として生じる遺伝子ノックアウトを選択するよう適用される。また、適応進化を使用して、例えばブタノール生成物の4-ヒドロキシブチリル-CoA中間体のより良好な産生体を作出することができる。適応進化を実施して、増殖特徴及び産生特徴の両方を改良する（Fong及びPalssonの文献（Nat. Genet. 36：1056-1058（2004））；Alperらの文献（Science 314：1565-1568（2006）））。本結果に基づいて、モデリング、遺伝子操作、及び適応進化のその後のラウンドをブタノール産生体に適用して、産生をさらに増大させることができる。
【０２２７】
ブタノールの大規模な産生のために、先の生物を、当該技術分野で公知の培地を用いて発酵槽において培養し、嫌気性条件下で該生物の増殖を支持する。発酵は、バッチ、供給バッチ、又は連続様式のいずれかで実施される。嫌気性条件は、まず培地に窒素を散布した後、培養容器を封止することによって維持され、例えば、フラスコは、中隔又は圧着キャップを用いて封止することができる。また、微好気性条件は、限られた通気のための小開口を提供することによって利用することができる。培地のpHは、H2SO4などの酸の添加によって、ほぼ7のpHに維持される。増殖速度は、分光光度計（600nm）を用いて光学密度を測定することによって決定され、グルコース取り込み速度は、炭素源枯渇を経時的にモニターすることによって決定される。望ましくないアルコール、有機酸、及び残余のグルコースなどの副産物は、例えば、Aminex（登録商標）シリーズのHPLCカラム（例えば、HPX‐87シリーズ）（BioRad, Hercules CA）を用い、グルコース及びアルコールのために屈折率検出器を、並びに有機酸のために紫外線検出器を用いるHPLC（Shimadzu, Columbia MD）によって定量化することができる（Linらの文献（Biotechnol. Bioeng., 90：775-779（2005）））。
【０２２８】
（実施例III）
（4-ヒドロキシブチリル-CoAをイソブタノールに転換するための経路を有する微生物を作出するイソブタノールの調製）
本実施例は、4-ヒドロキシブチリル-CoAからイソブタノールを産生することのできる微生物の作出を説明する。
【０２２９】
大腸菌を標的生物として使用し、4-ヒドロキシブチリル-CoAから出発する図１に示されるイソブタノール経路を操作する。大腸菌は、イソブタノールを産生することのできる非天然微生物を作出するための良好な宿主を提供する。大腸菌は、遺伝子操作に敏感に反応し、嫌気性条件又は微好気性条件の下で効果的に、エタノール、酢酸、ギ酸、乳酸、及びコハク酸のような種々の生成物を産生することができることが公知である。
【０２３０】
3-ヒドロキシイソ酪酸を産生するよう操作した大腸菌株を作出するために、該経路において利用される酵素をコードする核酸を、周知の分子生物学技術を用いて大腸菌において発現させる（例えば、Sambrookの文献（上述、2001）；Ausubelの文献（上述、1999））。特に、コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素（CoA‐依存性）、4-ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、4-ヒドロキシ酪酸キナーゼ、及びホスホトランスブチリラーゼの活性をそれぞれコードするsucD（YP_001396394）遺伝子、4hbd（YP_001396393）遺伝子、buk1（Q45829）遺伝子、及びptb（NP_349676）遺伝子を、Burkらの文献（米国公報2009／0075351）において説明されるように、発現ベクターへとクローニングし、又は染色体へと組み込む。加えて、4-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼ、ビニルアセチル-CoAΔイソメラーゼ、及びイソブチリル-CoAムターゼの活性をコードするabfD（P55792）遺伝子、icm（AAC08713.1）遺伝子、及びicmB（CAB59633.1）遺伝子をPA1／lacOプロモーターの下で、pZE13ベクター（Expressys, Ruelzheim, Germany）へとクローニングする。次に、クロトニル-CoA還元酵素活性をコードするbcd（NP_349317.1）遺伝子及びetfAB（NP_349315.1、NP_349316.1）遺伝子をPA1／lacOプロモーターの下でpZS23ベクター（Expressys, Ruelzheim, Germany）へとクローニングする。次に、イソブチリル-CoA還元酵素（アルコール形成）活性をコードするadhE（AAV66076.1）遺伝子を、PA1／lacOプロモーターの下でpZS13ベクター（Expressys, Ruelzheim, Germany）へとクローニングする。pZS23は、周知の分子生物学技術によって、pZS13ベクター（Expressys, Ruelzheim, Germany）のアンピシリン耐性モジュールをカナマイシン耐性モジュールと置き換えることによって得られる。3セットのプラスミドを大腸菌の4-ヒドロキシブチリル-CoA産生株へと形質転換させ、4-ヒドロキシブチリル-CoAからのイソブタノール合成に必要なタンパク質及び酵素を発現させる。
【０２３１】
結果として生じる遺伝子操作した生物を、当該技術分野で周知の手順に従って、グルコース含有培地において培養する（例えば、Sambrookらの文献（上述、2001）を参照されたい。）。また、大腸菌の宿主株を操作して、コバラミンを新規に合成させない限り、コバラミンを培地に供給して、ムターゼ酵素の活性を保証する（例えば、Rauxらの文献（J. Bacteriol. 178：753-767（1996））を参照されたい。）。イソブタノール合成遺伝子の発現は、例えば、ノーザンブロット法、mRNAのPCR増幅、免疫ブロット法、及びこれらに類するものを含む、ポリペプチド発現又は酵素活性を決定するための、当該技術分野で周知の方法を用いて確証される。発現した酵素の酵素活性は、個々の活性に特異的なアッセイを用いて確認される。イソブタノールを産生するよう操作された大腸菌株の能力は、HPLC、ガスクロマトグラフィー‐質量分析（GCMS）、及び／又は液体クロマトグラフィー‐質量分析（LCMS）を用いて確認される。
【０２３２】
機能的イソブタノール合成経路を有するよう操作した微生物株は、該経路の効率的な利用のための最適化によってさらに増加する。簡潔には、操作した株を評価して、任意の外来性遺伝子が律速レベルで発現するかどうかを決定する。発現は、例えば追加的な遺伝子コピー数の導入によって該経路を通じた流れを制限することのできる低レベルで発現した任意の酵素について増大している。
【０２３３】
より良好な産生体を作出するために、代謝モデリングを利用して、増殖条件を最適化する。また、モデリングを使用して、前記経路の利用を追加的に最適化する遺伝子ノックアウトを設計する（例えば、米国特許公報US 2002/0012939、US 2003/0224363、US 2004/0029149、US 2004/0072723、US 2003/0059792、US 2002/0168654、及びUS 2004/0009466、並びに米国特許第7,127,379号を参照されたい。）。モデリング分析は、イソブタノールのより効率的な産生の方へ代謝を移行させることが細胞増殖に及ぼす効果に関して、信頼性の高い予測を可能にする。1つのモデリング法は、二層性最適化アプローチであるOptKnockであり（Burgardらの文献（Biotechnol. Bioengineer. 84：647-657（2003）））、イソブタノールのより良好な産生を集約的に結果として生じる遺伝子ノックアウトを選択するよう適用される。また、適応進化を使用して、例えばイソブタノール生成物の4-ヒドロキシブチリル-CoA中間体のより良好な産生体を作出することができる。適応進化を実施して、増殖特徴及び産生特徴の両方を改良する（Fong及びPalssonの文献（Nat. Genet. 36：1056-1058（2004））；Alperらの文献（Science 314：1565-1568（2006）））。本結果に基づいて、モデリング、遺伝子操作、及び適応進化のその後のラウンドをイソブタノール産生体に適用して、産生をさらに増大させることができる。
【０２３４】
イソブタノールの大規模な産生のために、先の生物を、当該技術分野で公知の培地を用いて発酵槽において培養し、嫌気性条件下で該生物の増殖を支持する。発酵は、バッチ、供給バッチ、又は連続様式のいずれかで実施される。嫌気性条件は、まず培地に窒素を散布した後、培養容器を封止することによって維持され、例えば、フラスコは、中隔又は圧着キャップを用いて封止することができる。また、微好気性条件は、限られた通気のための小開口を提供することによって利用することができる。培地のpHは、H2SO4などの酸の添加によって、ほぼ7のpHに維持される。増殖速度は、分光光度計（600nm）を用いて光学密度を測定することによって決定され、グルコース取り込み速度は、炭素源枯渇を経時的にモニターすることによって決定される。望ましくないアルコール、有機酸、及び残余のグルコースなどの副産物は、例えば、Aminex（登録商標）シリーズのHPLCカラム（例えば、HPX‐87シリーズ）（BioRad, Hercules CA）を用い、グルコース及びアルコールのために屈折率検出器を、並びに有機酸のために紫外線検出器を用いるHPLC（Shimadzu, Columbia MD）によって定量化することができる（Linらの文献（Biotechnol. Bioeng., 90：775-779（2005）））。
【表３９−１】
2012525156.tif 000042
【表３９−２】
2012525156.tif 000043
【表３９−３】
2012525156.tif 000044
【表３９−４】
2012525156.tif 000045
【表３９−５】
2012525156.tif 000046
【表３９−６】
2012525156.tif 000047
【表３９−７】
2012525156.tif 000048
【表３９−８】
2012525156.tif 000049
【０２３５】
本出願を通じて、種々の特許、刊行された出願中の出願、及び非特許の論文参考文献に対する引用がなされている。このような参考文献はすべて、それらの全体が引用により本明細書に組み込まれている。
【０２３６】
本発明は開示された実施態様に関して説明されているが、当業者は、先に詳述した具体
的な実施例及び研究が本発明の単なる実例となるにすぎないことを容易に認めるであろう。
種々の修飾が本発明の精神を逸脱せずに実施することができることを理解すべきである。したがって、本発明は、以下の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図１】
2012525156.tif 000050
【手続補正書】
【提出日】平成24年2月1日(2012.2.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2012525156000001.app
【国際調査報告】
2012525156.tif 000051
2012525156.tif 000052
2012525156.tif 000053