(57)【要約】  本発明は、複数の植物ウイルスにより引き起こされた植物病害の遺伝子制御のための遺伝子標的、構築体および方法を提供する。本発明は、標的コード配列の同定、および植物に寄生するウイルスの標的コード配列の発現を転写後に抑制または阻害するための組換えＤＮＡ技術の使用を介して植物保護効果を達成することに関する。また、タンパク質発現ベースのアプローチを利用して、発現型抵抗性を増大し得る。かくして、１以上の植物発現カセットを含む単一の遺伝子組換え事象の転写は、ジェミニウイルス、トスポウイルスおよびポルテクスウイルス中の複数の植物ウイルス株および種に対する植物の広範囲の抵抗性を可能にできる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抵抗性が、ｄｓＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびビリオン集合の抑制よりなる群から選択される少なくとも２つの異なる作用機序により提供される、複数の植物ウイルス種に対する抵抗性を含むトマト植物。
【請求項２】
抵抗性が少なくとも３つの異なる作用機序により提供される請求項１記載の植物。
【請求項３】
抵抗性が、ベゴモウイルス、トスポウイルスまたはポルテクスウイルスに対する抵抗性を含む請求項１記載の植物。
【請求項４】
少なくとも１つの植物ウイルス種に提供される抵抗性が、ｄｓＲＮＡを生成する核酸構築体の発現により提供される請求項１記載の植物。
【請求項５】
少なくとも１つの植物ウイルス種に提供される抵抗性が、ｄｓＲＮＡ融合構築体の発現により提供される請求項４記載の植物。
【請求項６】
ｄｓＲＮＡが、ウイルス外皮タンパク質遺伝子、ウイルス移行タンパク質遺伝子またはウイルス複製遺伝子の発現に干渉する請求項４記載の植物。
【請求項７】
ｄｓＲＮＡを生成する核酸構築体が、配列番号：３７９〜４５５よりなる群から選択される配列を含む請求項４記載の植物。
【請求項８】
少なくとも１つの植物ウイルス種に提供される抵抗性が、ｍｉＲＮＡを生成する核酸構築体の発現により提供される請求項１記載の植物。
【請求項９】
ベゴモウイルスまたはトスポウイルスに対する抵抗性が、積み重なったｍｉＲＮＡ発現カセットによりコードされる配列により提供される請求項８記載の植物。
【請求項１０】
ｍｉＲＮＡが、ウイルス外皮タンパク質遺伝子、ウイルス移行タンパク質遺伝子またはウイルス複製遺伝子の発現に干渉する請求項８記載の植物。
【請求項１１】
ｍｉＲＮＡが、配列番号：１、７、１３、１９、２５、３１、３７、４３、４７、５１、５５、５９、６３、６７、７１、８５、９９、１１３、１２７および１４１よりなる群から選択される配列を含む請求項８記載の植物。
【請求項１２】
（ａ）ベゴモウイルスに対する抵抗性が、ベゴモウイルス複製遺伝子の発現に干渉するｄｓＲＮＡの発現により提供される；
（ｂ）トスポウイルスまたはポルテクスウイルスに対する抵抗性が、ウイルス外皮タンパク質遺伝子またはウイルス移行タンパク質遺伝子の発現に干渉するｄｓＲＮＡの発現により提供される；
（ｃ）ポルテクスウイルスに対する抵抗性が、ｍｉＲＮＡを生成する核酸構築体の発現により提供される；または
（ｄ）ベゴモウイルスまたはトスポウイルスに対する抵抗性が、積み重なったｍｉＲＮＡ発現カセットによりコードされた配列により提供される
請求項１記載の植物。
【請求項１３】
少なくとも１つの植物ウイルス種に提供される抵抗性が、ビリオン集合を抑制するトスポウイルスゲノムセグメント末端配列の発現により提供される請求項１記載の植物。
【請求項１４】
少なくとも１つの植物ウイルス種に提供される抵抗性が、ビリオン集合の抑制により提供され、ここに、ビリオン集合が、第１の核酸セグメントおよび第２の核酸セグメントを含む核酸構築体内に含まれた配列により抑制され、第１および第２のセグメントが実質的に相互の逆位反復配列であって、第３の核酸セグメントにより一緒に連結され、第３のセグメントが、ビリオン集合を抑制するトスポウイルスゲノムセグメントの少なくとも１つの末端配列を含む請求項１記載の植物。
【請求項１５】
第３の核酸が、ＣａＣＶまたはＧＢＮＶ Ｌゲノムセグメントの末端配列、ＣａＣＶまたはＧＢＮＶ Ｍゲノムセグメントの末端配列、ＣａＣＶまたはＧＢＮＶ Ｓゲノムセグメントの末端配列、トスポウイルスゲノムの末端反復配列、配列番号：１６７を含む核酸配列、配列番号：１６８を含む核酸配列、配列番号：３７６を含む核酸配列、配列番号：３７７を含む核酸配列、配列番号：３７８を含む核酸配列、および配列番号：４５５を含む核酸配列よりなる群から選択されるトスポウイルスゲノム末端配列を含む請求項１４記載の植物。
【請求項１６】
トスポウイルスゲノムセグメント・末端反復配列が、配列番号：１６７または配列番号：１６８を含む請求項１５記載の植物。
【請求項１７】
植物が、ジェミニウイルス科、ブニヤウイルス科およびフレキシウイルス科ファミリーの少なくとも２つのウイルスに対する抵抗性を含む請求項１記載の植物。
【請求項１８】
ウイルスが、ポルテクスウイルス、トスポウイルスおよびベゴモウイルス属から選択される請求項１７記載の植物。
【請求項１９】
ウイルスが、
（ａ）ＴＹＬＣＶ、ＴｏＳＬＣＶ、ＴｏＬＣＮＤＶ、ＰＨＹＶＶ、ＰｅｐＧＭＶの少なくとも１つ；
（ｂ）ＴＳＷＶ、ＧＢＮＶ、ＣａＣＶの１以上；および
（ｃ）ＰｅｐＭＶ
よりなる群から選択される請求項１８記載の植物。
【請求項２０】
ポルテクスウイルスが、ペピーノモザイクウイルスである請求項１８記載の植物。
【請求項２１】
ベゴモウイルスが、ＴＹＬＣＶ、ＴｏＬＣＮＤＶ、ＰＨＹＶＶ、ＴｏＳＬＣＶまたはＰｅｐＧＭＶである請求項１８記載の植物。
【請求項２２】
トスポウイルスが、ＣａＣＶ、ＧＢＮＶまたはＴＳＷＶである請求項１８記載の植物。
【請求項２３】
ベゴモウイルスがＴＹＬＣＶであって、ポルテクスウイルスがペピーノモザイクウイルスであるか；またはトスポウイルスがＴＳＷＶであって、ポルテクスウイルスがペピーノモザイクウイルスであるか；またはベゴモウイルスがＴＹＬＣＶであり、ポルテクスウイルスがペピーノモザイクウイルスであって、トスポウイルスがＴＳＷＶである請求項１８記載の植物。
【請求項２４】
配列番号：１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６および３６３〜３７５よりなる群から選択される配列をさらに含む請求項１記載の植物。
【請求項２５】
配列番号：１、７、１３、１９、２５、３１、３７、４３、４７、５１、５５、５９、６３、６７、７１、８５、９９、１１３、１２７、１４１および３７９〜４５４よりなる群から選択される配列をさらに含む請求項１記載の植物。
【請求項２６】
（ａ）配列番号：３７９〜４５４よりなる群から選択される少なくとも１つの配列および配列番号：１６７、１６８、３７６、３７７、３７８および４５５よりなる群から選択される少なくとも１つの配列；
（ｂ）配列番号：３７９〜４５４よりなる群から選択される少なくとも１つの配列および配列番号：１、７、１３、１９、２５、３１、３７、４３、４７、５１、５５、５９、６３、６７、７１、８５、９９、１１３、１２７および１４１よりなる群から選択される少なくとも１つの配列；または
（ｃ）配列番号：１、７、１３、１９、２５、３１、３７、４３、４７、５１、５５、５９、６３、６７、７１、８５、９９、１１３、１２７および１４１よりなる群から選択される少なくとも１つの配列、ならびに配列番号：１６７、１６８、３７６、３７７、３７８および４５５よりなる群から選択される少なくとも１つの配列を含む請求項１記載の植物。
【請求項２７】
植物が、
（ａ）第１の標的遺伝子のすべてまたは一部分に相補的であるＲＮＡ配列をコードする核酸配列；
（ｂ）少なくとも１つの第１の標的遺伝子の少なくとも１つのセグメントにアンチセンスである少なくとも１つのアンチセンスＤＮＡセグメントの複数コピーを含む核酸配列；
（ｃ）少なくとも１つの標的遺伝子からのセンスＤＮＡセグメントを含む核酸配列；
（ｄ）標的遺伝子の少なくとも１つのセンスＤＮＡセグメントの複数のコピーを含む核酸配列；
（ｅ）二本鎖ＲＮＡを形成することにより標的遺伝子を抑制するＲＮＡに転写し、かつ標的遺伝子のすべてまたは一部分にアンチセンスである少なくとも１つのセグメントおよび該遺伝子のセグメントを含み少なくとも１つのセンスＤＮＡを含む核酸配列；
（ｆ）標的遺伝子の少なくとも１つのセグメントにアンチセンスである複数の連続的アンチセンスＤＮＡ、ならびに該標的遺伝子の少なくとも１つのセグメントを含む複数の連続的センスＤＮＡを含む単一の二本鎖ＲＮＡの形成により標的遺伝子を抑制するＲＮＡに転写する核酸配列；
（ｇ）ＲＮＡの複数の二本鎖の形成により標的遺伝子を抑制するＲＮＡに転写し、かつ該標的遺伝子の少なくとも１つのセグメントにアンチセンスである複数のセグメント、ならびに標的遺伝子の複数のセンスＤＮＡセグメントを含み、該複数のアンチセンスＤＮＡセグメントおよび該複数のセンスＤＮＡセグメントは、一連の逆位反復配列にて配置される核酸配列；
（ｈ）植物ｍｉＲＮＡに由来したヌクレオチドを含む核酸配列；および
（ｉ）ビリオン集合に干渉する少なくとも１つのトスポウイルス末端配列をコードする核酸配列よりなる群から選択されるウイルス抵抗性を与える少なくとも１つの異種の核酸配列を含む請求項１記載の植物。
【請求項２８】
非遺伝子導入植物ウイルス抵抗性形質をさらに含む請求項２７記載の植物。
【請求項２９】
少なくとも１つの異種の核酸配列の発現が、トスポウイルス、ベゴモウイルスおよびポルテクスウイルスよりなる群から選択される２以上のウイルスに対する抵抗性を生じる請求項２７記載の植物。
【請求項３０】
請求項１記載の植物の遺伝子組換え種子。
【請求項３１】
トマト植物に複数の植物ウイルス種に対する抵抗性を与える方法であって、
植物中で該複数の植物ウイルス種に対する抵抗性を集団的に提供する少なくとも２つの核酸配列を発現し、ここに、少なくとも２つの異なる作用機序を利用してかかる抵抗性を提供し、ｄｓＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびビリオン集合に干渉する配列よりなる群から選択される少なくとも２つの配列の発現を含む該方法。
【請求項３２】
抵抗性が、ベゴモウイルス、トスポウイルスまたはポルテクスウイルスに対する抵抗性を含むことを特徴とする請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
少なくとも１つの植物ウイルス種に提供される抵抗性が、ｄｓＲＮＡを生成する核酸構築体の発現により提供されることを特徴とする請求項３１記載の方法。
【請求項３４】
少なくとも１つの植物ウイルス種に提供される抵抗性が、ｄｓＲＮＡ融合構築体の発現により提供されることを特徴とする請求項３１記載の方法。
【請求項３５】
ｄｓＲＮＡが、ウイルス外皮タンパク質遺伝子、ウイルス移行タンパク質遺伝子またはウイルス複製遺伝子の発現に干渉することを特徴とする請求項３３記載の方法。
【請求項３６】
核酸構築体が、配列番号：３７９〜４５５よりなる群から選択される配列を含むことを特徴とする請求項３３記載の方法。
【請求項３７】
少なくとも１つの植物ウイルス種に提供される抵抗性が、ｍｉＲＮＡを生成する核酸構築体の発現により提供されることを特徴とする請求項３１記載の方法。
【請求項３８】
ベゴモウイルスまたはトスポウイルスに対する抵抗性が、積み重なったｍｉＲＮＡ発現カセットによりコードされた配列により提供されることを特徴とする請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
ｍｉＲＮＡが、ウイルス外皮タンパク質遺伝子、ウイルス移行タンパク質遺伝子またはウイルス複製遺伝子の発現に干渉することを特徴とする請求項３７記載の方法。
【請求項４０】
ｍｉＲＮＡが、配列番号：１、７、１３、１９、２５、３１、３７、４３、４７、５１、５５、５９、６３、６７、７１、８５、９９、１１３、１２７および１４１よりなる群から選択される配列を含む請求項３７記載の方法。
【請求項４１】
（ａ）ベゴモウイルスに対する抵抗性が、ベゴモウイルス複製遺伝子の発現に干渉するｄｓＲＮＡの発現により提供される；
（ｂ）トスポウイルスまたはポルテクスウイルスに対する抵抗性が、ウイルス外皮タンパク質遺伝子またはウイルス移行タンパク質遺伝子の発現に干渉するｄｓＲＮＡの発現により提供される；
（ｃ）ポルテクスウイルスに対する抵抗性が、ｍｉＲＮＡを生成する核酸構築体の発現により提供される；または
（ｄ）ベゴモウイルスまたはトスポウイルスに対する抵抗性が、積み重なったｍｉＲＮＡ発現カセットによりコードされた配列により提供される
ことを特徴とする請求項３１記載の方法。
【請求項４２】
少なくとも１つの植物ウイルス種に提供される抵抗性が、ビリオン集合を抑制するトスポウイルスゲノムセグメント末端配列の発現により提供されることを特徴とする請求項３１記載の方法。
【請求項４３】
該少なくとも１つの植物ウイルス種に提供される抵抗性が、ビリオン集合の抑制により提供され、ビリオン集合は、第１の核酸セグメントおよび第２の核酸セグメントを含む核酸内に含まれた配列により抑制され、第１および第２のセグメントは、実質的に相互に逆位反復配列であり、第３の核酸セグメントにより一緒に連結され、第３のセグメントは、その発現がビリオン集合を抑制するトスポウイルスゲノムセグメントの少なくとも１つの末端配列を含むことを特徴とする請求項３１記載の方法。
【請求項４４】
第３の核酸が、ＣａＣＶまたはＧＢＮＶ Ｌゲノムセグメントの末端配列、ＣａＣＶまたはＧＢＮＶ Ｍゲノムセグメントの末端配列、ＣａＣＶまたはＧＢＮＶ Ｓゲノムセグメントの末端配列およびトスポウイルスゲノム末端反復配列よりなる群から選択されるトスポウイルスゲノム末端配列を含むことを特徴とする請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
末端配列または末端反復配列が、配列番号：１６７、配列番号：１６８、配列番号：３７６、配列番号：３７７または配列番号：３７８を含むことを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
複数の植物ウイルス種が、ジェミニウイルス科、ブニヤウイルス科およびフレキシウイルス科の少なくとも２つから選択されることを特徴とする請求項３１記載の方法。
【請求項４７】
ウイルスが、ポルテクスウイルス、トスポウイルスおよびベゴモウイルス属から選択されることを特徴とする請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
ウイルスが、
（ａ）ＴＹＬＣＶ、ＴｏＳＬＣＶ、ＴｏＬＣＮＤＶ、ＰＨＹＶＶ、ＰｅｐＧＭＶの１以上；
（ｂ）ＴＳＷＶ、ＧＢＮＶ、ＣａＣＶの１以上；および
（ｃ）ＰｅｐＭＶよりなる群から選択されることを特徴とする請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
核酸配列が、少なくとも１つの標的遺伝子を抑制するための少なくとも１つの遺伝子抑制要素を含むことを特徴とする請求項３１記載の方法。
【請求項５０】
（ａ）配列番号：３７９〜４５４よりなる群から選択される少なくとも１つの配列および配列番号：１６７、１６８、３７６、３７７、３７８および４５５よりなる群から選択される少なくとも１つの配列；
（ｂ）配列番号：３７９〜４５４よりなる群から選択される少なくとも１つの配列および配列番号：１、７、１３、１９、２５、３１、３７、４３、４７、５１、５５、５９、６３、６７、７１、８５、９９、１１３、１２７および１４１よりなる群から選択される少なくとも１つの配列；または
（ｃ）配列番号：１、７、１３、１９、２５、３１、３７、４３、４７、５１、５５、５９、６３、６７、７１、８５、９９、１１３、１２７および１４１よりなる群から選択される少なくとも１つの配列、ならびに配列番号：１６７、１６８、３７６、３７７、３７８および４５５よりなる群から選択される少なくとも１つの配列を植物中で発現することを特徴とする請求項３１記載の方法。
【請求項５１】
請求項１記載の植物の遺伝子導入植物細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概略、複数の植物ウイルスに対する抵抗性を増強するための方法および組成物に関する。
【０００２】
（関連出願の参照）
本願は、２００９年４月２０日付けで出願された米国仮出願シリアル番号６１／１７１，０２１号（ここに出典明示してその全開示を本明細書の一部とみなす）の優先権を主張する。
【０００３】
（配列表の組込み）
本開示の一部である配列表は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出された本発明のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列を含む「MONS213WO_ST25.txt」と題するコンピューター可読の９９９ｋＢのファイルを含む。この配列表の対象をここに出典明示してその全てを本明細書の一部とみなす。
【背景技術】
【０００４】
（関連技術分野の記載）
ナス科植物は、世界的に主要な作物損失の原因であるウイルス誘発病害を含めた複数の潜在的病害原因の病原体にさらされている。多数のＲＮＡウイルスについて、遺伝子組換え外皮タンパク質（ＣＰ）またはレプリカーゼの発現は、ウイルス感染プロセスの進行をブロックする。ＲＮＡベースの抵抗性は、ウイルスＲＮＡを低下させるために植物転写後遺伝子抑制（ＰＴＧＳ）メカニズムを利用する。しかしながら、かかるアプローチは、狭く基礎を置くおよび／または耐久性でない抵抗性を与え、特に、新しいウイルスの種または単離体が急速に広がり発生しかねない。いくつかの例において、古典的に定義された（非遺伝子組み換え）抵抗性形質は、ウイルス抵抗性の植物の開発を援助するのに利用可能である。加えて、植物ウイルスを感染させるように機能する昆虫のごとき植物病虫害の制御は、植物のウイルス感染による損失を制限するのを助け得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、概略、複数の植物ウイルスに対する抵抗性を増強するための方法および組成物に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、複数の植物ウイルスに抵抗性の植物を得るための方法および組成物を提供する。１つの態様において、本発明は、複数の植物ウイルス種に対する抵抗性を含むトマト植物を提供する。ある具体例において、抵抗性は、ｄｓＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびビリオン集合の抑制よりなる群から選択される、少なくとも２つの異なる作用機序により提供される。他の具体例において、抵抗性は、少なくとも３つの異なる作用機序により提供される。トマト植物の抵抗性は、ベゴモウイルス、トスポウイルスまたはポルテクスウイルス（potexvirus）に対する抵抗性を含み得る。
【０００７】
ある具体例において、少なくとも１つの植物ウイルス種に提供される抵抗性は、ｄｓＲＮＡを生成する核酸構築体の発現により提供される。いくつかの具体例において、少なくとも１つの植物ウイルス種に提供される抵抗性は、ｄｓＲＮＡ融合構築体の発現により提供される。本発明のいくつかの具体例において、ｄｓＲＮＡは、ウイルス外皮タンパク質遺伝子、ウイルス移行タンパク質遺伝子またはウイルス複製遺伝子の発現に干渉する。特定の具体例において、ｄｓＲＮＡを生成する核酸構築体は、配列番号：３７９〜４５５よりなる群から選択される配列を含む。
【０００８】
他の具体例において、少なくとも１つの植物ウイルス種に提供される抵抗性は、ｍｉＲＮＡを生成する核酸構築体の発現により提供される。かくして、ある具体例において、ベゴモウイルスまたはトスポウイルスに対する抵抗性は、積み重なった（stacked）ｍｉＲＮＡ発現カセットによりコードされた配列により提供される。さらに他の具体例において、ｍｉＲＮＡは、ウイルス外皮タンパク質遺伝子、ウイルス移行タンパク質遺伝子またはウイルス複製遺伝子の発現に干渉する。特定の具体例において、ｍｉＲＮＡは、配列番号：１、７、１３、１９、２５、３１、３７、４３、４７、５１、５５、５９、６３、６７、７１、８５、９９、１１３、１２７および１４１よりなる群から選択される配列を含む。
【０００９】
ある具体例において、トマト植物は、（ａ）ベゴモウイルス複製遺伝子の発現に干渉するｄｓＲＮＡの発現により提供されるベゴモウイルスに対する抵抗性；（ｂ）ウイルス外皮タンパク質遺伝子またはウイルス移行タンパク質遺伝子の発現に干渉するｄｓＲＮＡの発現により提供されるトスポウイルスおよびポルテクスウイルスに対する抵抗性；（ｃ）ｍｉＲＮＡを生成する核酸構築体の発現により提供されるポルテクスウイルスに対する抵抗性；または（ｄ）積み重なったｍｉＲＮＡ発現カセットによりコードされた配列により提供されるベゴモウイルスまたはトスポウイルスに対する抵抗性を含む。
【００１０】
他の具体例において、少なくとも１つの植物ウイルス種に提供される抵抗性が、ビリオン集合を抑制するトスポウイルスゲノムセグメント末端配列の発現により提供されるトマト植物が提供される。ある具体例において、少なくとも１つの植物ウイルス種に提供される抵抗性は、ビリオン集合の抑制により提供され、ここに、第１の核酸セグメントおよび第２の核酸セグメントを含む核酸構築体内に含まれた配列により抑制され、第１および第２のセグメントは実質的に相互の逆位反復配列であり、第３の核酸セグメントにより一緒に連結され、第３のセグメントは、ビリオン集合を抑制するトスポウイルスゲノムセグメントの少なくとも１つの末端配列を含む。特定の具体例において、第３の核酸は、以下の配列よりなる群から選択されるトスポウイルスゲノム末端配列を含む：ＣａＣＶまたはＧＢＮＶ Ｌゲノムセグメントの末端配列、ＣａＣＶまたはＧＢＮＶ Ｍゲノムセグメントの末端配列、ＣａＣＶまたはＧＢＮＶ Ｓゲノムセグメントの末端配列、トスポウイルスゲノムの末端反復配列、配列番号：１６７を含む核酸配列、配列番号：１６８を含む核酸配列、配列番号：３７６を含む核酸配列、配列番号：３７７を含む核酸配列、配列番号：３７８を含む核酸配列、および配列番号：４５５を含む核酸配列。
【００１１】
ある具体例において、トマト植物は、ジェミニウイルス科、ブニヤウイルス科およびフレキシウイルス科ファミリーの少なくとも２つのウイルスに対する抵抗性を含む。かくして、いくつかの具体例において、ウイルスはポルテクスウイルス、トスポウイルスおよびベゴモウイルス属から選択される。特定の具体例において、ウイルスは以下のものよりなる群から選択される：ａ）ＴＹＬＣＶ、ＴｏＳＬＣＶ、ＴｏＬＣＮＤＶ、ＰＨＹＶＶ、ＰｅｐＧＭＶの少なくとも１つ；ｂ）ＴＳＷＶ、ＧＢＮＶ、ＣａＣＶの１以上；およびｃ）ＰｅｐＭＶ。より特定の具体例において、ポルテクスウイルスは、ペピーノモザイクウイルス（Pepino mosaic virus）である。ある具体例において、ベゴモウイルスはＴＹＬＣＶ、ＴｏＬＣＮＤＶ、ＰＨＹＶＶ、ＴｏＳＬＣＶまたはＰｅｐＧＭＶである。いくつかの具体例において、トスポウイルスはＣａＣＶ、ＧＢＮＶまたはＴＳＷＶである。特定の具体例において、ベゴモウイルスはＴＹＬＣＶであって、ポルテクスウイルスはペピーノモザイクウイルスであるか；またはトスポウイルスはＴＳＷＶであって、ポルテクスウイルスはペピーノモザイクウイルスであるか；またはベゴモウイルスはＴＹＬＣＶ、ポルテクスウイルスはペピーノモザイクウイルスであって、トスポウイルスはＴＳＷＶである。
【００１２】
いくつかの具体例において、トマト植物は、配列番号：１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、３６３〜３７５よりなる群から選択される配列を含み得る。それらまたは他の具体例において、トマト植物は、配列番号：１、７、１３、１９、２５、３１、３７、４３、４７、５１、５５、５９、６３、６７、７１、８５、９９、１１３、１２７、１４１および３７９〜４５４よりなる群から選択される配列を含むか、またはさらに含む。かくして、本発明のトマト植物は、以下のものを含み得る：（ａ）配列番号：３７９〜４５４よりなる群から選択される少なくとも１つの配列および配列番号：１６７、１６８、３７６、３７７、３７８および４５５よりなる群から選択される少なくとも１つの配列；（ｂ）配列番号：３７９〜４５４よりなる群から選択される少なくとも１つの配列および配列番号：１、７、１３、１９、２５、３１、３７、４３、４７、５１、５５、５９、６３、６７、７１、８５、９９、１１３、１２７および１４１よりなる群から選択される少なくとも１つの配列；または（ｃ）配列番号：１、７、１３、１９、２５、３１、３７、４３、４７、５１、５５、５９、６３、６７、７１、８５、９９、１１３、１２７および１４１よりなる群から選択される少なくとも１つの配列および配列番号：１６７、１６８、３７６、３７７、３７８および４５５よりなる群から選択される少なくとも１つの配列。
【００１３】
さらに他の具体例において、トマト植物は、以下の配列よりなる群から選択されるウイルス抵抗性を与える、少なくとも１つの異種の核酸配列を含む：ａ）第１の標的遺伝子のすべてまたは一部に相補的であるＲＮＡ配列をコードする核酸配列；ｂ）少なくとも１つの該第１の標的遺伝子の少なくとも１つのセグメントにアンチセンスである、少なくとも１つのアンチセンスＤＮＡセグメントの複数のコピーを含む核酸配列；ｃ）少なくとも１つの標的遺伝子からのセンスＤＮＡセグメントを含む核酸配列；ｄ）標的遺伝子の少なくとも１つのセンスＤＮＡセグメントの複数のコピーを含む核酸配列；ｅ）二本鎖ＲＮＡを形成することより標的遺伝子を抑制するためのＲＮＡに転写し、かつ標的遺伝子のすべてまたは一部にアンチセンスである少なくとも１つのセグメントおよび該標的遺伝子のセグメントを含む少なくとも１つのセンスＤＮＡセグメントを含む核酸配列；ｆ）標的遺伝子の少なくとも１つのセグメントにアンチセンスである複数の連続的アンチセンスＤＮＡセグメント、ならびに該標的遺伝子の少なくとも１つのセグメントを含む複数の連続的センスＤＮＡセグメントを含む単一の二本鎖ＲＮＡの形成により、標的遺伝子を抑制するＲＮＡに転写する核酸配列；ｇ）ＲＮＡの複数の二本鎖の形成により標的遺伝子を抑制するためのＲＮＡに転写し、かつ該標的遺伝子の少なくとも１つのセグメントにアンチセンスである複数のセグメント、ならびに該標的遺伝子の複数のセンスＤＮＡセグメントを含む核酸配列であって、ここに、該複数のアンチセンスＤＮＡセグメントおよび該複数のセンスＤＮＡセグメントは、一連の逆位反復配列で配置される該核酸配列；ｈ）植物ｍｉＲＮＡに由来したヌクレオチドを含む核酸配列；およびｉ）ビリオン集合に干渉する少なくとも１つのトスポウイルス末端配列をコードする核酸配列。また、本発明は、少なくとも１つの異種の核酸配列の発現の結果、トスポウイルス、ベゴモウイルスおよびポルテクスウイルスよりなる群から選択される２以上のウイルスに対する抵抗性を生じる植物を提供する。また、植物はさらに非遺伝子導入植物ウイルス抵抗性形質を含み得る。
【００１４】
本発明のもう一つの態様において、複数の植物ウイルス種に対する抵抗性を含むトマト植物のいずれかの世代の遺伝子組換え種子が提供され、ここに、抵抗性は、ｄｓＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびビリオン集合の抑制よりなる群から選択される少なくとも２つの異なる作用機序により提供される。
【００１５】
さらにもう一つの態様において、本発明は、トマト植物に複数の植物ウイルス種に対する抵抗性を与える方法を提供し、該方法は、植物中で該複数の植物ウイルス種に対する抵抗性を集団的に提供する少なくとも２つの核酸配列を発現することを含み、ここに、少なくとも２つの異なる作用機序を利用してかかる抵抗性を提供し、ｄｓＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびビリオン集合に干渉する配列よりなる群から選択される少なくとも２つの配列の発現を含む。ある具体例において、抵抗性は、ベゴモウイルス、トスポウイルスまたはポルテクスウイルスに対する抵抗性を含む。
【００１６】
抵抗性は、ｄｓＲＮＡを生成する核酸構築体の発現により少なくとも１つの植物ウイルス種に提供され得る。特定の具体例において、少なくとも１つの植物ウイルス種に提供される抵抗性は、ｄｓＲＮＡ融合構築体の発現により提供される。より特定の具体例において、ｄｓＲＮＡは、ウイルス外皮タンパク質遺伝子、ウイルス移行タンパク質遺伝子またはウイルス複製遺伝子の発現に干渉する。さらにより特定の具体例において、核酸構築体は、配列番号：３７９〜４５５よりなる群から選択される配列を含む。
【００１７】
他の具体例において、少なくとも１つの植物ウイルス種に提供された抵抗性は、ｍｉＲＮＡを生成する核酸構築体の発現により提供される。１つの具体例において、ベゴモウイルスまたはトスポウイルスに対する抵抗性は、積み重なったｍｉＲＮＡ発現カセットによりコードされた配列により提供されることが考えられる。さらに、生成されたｍｉＲＮＡは、ウイルス外皮タンパク質遺伝子、ウイルス移行タンパク質遺伝子またはウイルス複製遺伝子の発現に干渉し得る。特定の具体例において、ｍｉＲＮＡは、配列番号：１、７、１３、１９、２５、３１、３７、４３、４７、５１、５５、５９、６３、６７、７１、８５、９９、１１３、１２７および１４１よりなる群から選択される配列を含む。
【００１８】
かくして、ある具体例において、（ａ）ベゴモウイルスに対する抵抗性は、ベゴモウイルス複製遺伝子の発現に干渉するｄｓＲＮＡの発現により提供されるか；（ｂ）トスポウイルスまたはポルテクスウイルスに対する抵抗性は、ウイルス外皮タンパク質遺伝子またはウイルス移行タンパク質遺伝子の発現に干渉するｄｓＲＮＡの発現により提供されるか；（ｃ）ポルテクスウイルスに対する抵抗性は、ｍｉＲＮＡを生成する核酸構築体の発現により提供されるか；または、（ｄ）ベゴモウイルスまたはトスポウイルスに対する抵抗性は、積み重なったｍｉＲＮＡ発現カセットによりコードされる配列により提供される。
【００１９】
いくつかの具体例において、少なくとも１つの植物ウイルス種に提供された抵抗性は、ビリオン集合を抑制するトスポウイルスゲノムセグメント末端配列の発現により提供される。ある具体例において、抵抗性は、ビリオン集合の抑制により少なくとも１つの該植物ウイルス種に提供され、ここに、ビリオン集合は、第１の核酸セグメントおよび第２の核酸セグメントを含む核酸構築体内に含まれた配列により抑制され、第１および第２のセグメントは、実質的に相互の逆位反復配列であって、第３の核酸セグメントにより一緒に連結され、第３のセグメントは、その発現がビリオン集合を抑制するトスポウイルスゲノムセグメントの少なくとも１つの末端配列を含む。さらに、特定の具体例において、第３の核酸は、以下の配列よりなる群から選択されるトスポウイルスゲノム末端配列を含み得る：ＣａＣＶまたはＧＢＮＶ  Ｌゲノムセグメントの末端配列、ＣａＣＶまたはＧＢＮＶ Ｍゲノムセグメントの末端配列、ＣａＣＶまたはＧＢＮＶ Ｓゲノムセグメントの末端配列およびトスポウイルスゲノムの末端反復配列。より特定の具体例において、末端配列または末端反復配列は、配列番号：１６７、配列番号：１６８、配列番号：３７６、配列番号：３７７または配列番号：３７８を含む。
【００２０】
本発明の他の実施例において、複数の植物ウイルス種は、ジェミニウイルス科、ブニヤウイルス科およびフレキシウイルス科の少なくとも２つから選択される。かくして、ウイルスはポルテクスウイルス、トスポウイルスおよびベゴモウイルス属から選択され得る。ある具体例において、ウイルスは、ａ）ＴＹＬＣＶ、ＴｏＳＬＣＶ、ＴｏＬＣＮＤＶ、ＰＨＹＶＶ、ＰｅｐＧＭＶの１以上；ｂ）ＴＳＷＶ、ＧＢＮＶ、ＣａＣＶの１以上；およびｃ）ＰｅｐＭＶよりなる群から選択される。
【００２１】
他の具体例において、核酸配列は、少なくとも１つの標的遺伝子を抑制するための少なくとも１つの遺伝子抑制要素を含む。例えば、方法は、植物中で以下のものを発現することを含み得る：ａ）配列番号：３７９〜４５４よりなる群から選択される少なくとも１つの配列および配列番号：１６７、１６８、３７６、３７７、３７８および４５５よりなる群から選択される少なくとも１つの配列；（ｂ）配列番号：３７９〜４５４よりなる群から選択される少なくとも１つの配列および配列番号：１、７、１３、１９、２５、３１、３７、４３、４７、５１、５５、５９、６３、６７、７１、８５、９９、１１３、１２７および１４１よりなる群から選択される少なくとも１つの配列；または（ｃ）配列番号：１、７、１３、１９、２５、３１、３７、４３、４７、５１、５５、５９、６３、６７、７１、８５、９９、１１３、１２７および１４１よりなる群から選択される少なくとも１つの配列および配列番号：１６７、１６８、３７６、３７７、３７８および４５５よりなる群から選択される少なくとも１つの配列。
【００２２】
本発明のもう一つの態様は、複数の植物ウイルス種に対する抵抗性を含むトマト植物の遺伝子組換え細胞を提供し、ここに、抵抗性は、ｄｓＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびビリオン集合の抑制よりなる群から選択される、少なくとも２つの異なる作用機序により提供される。
【００２３】
「約」なる用語を用いて、値が、その値を決定するために使用されるデバイスまたは方法についての誤差の標準偏差を含むことを示す。特許請求の範囲における「または（もしくは）」なる用語の使用は、その開示が、選択肢だけおよび「および／または」をいう定義を支持するが、明示的に示されない限りは、選択肢だけまたは選択肢が相互に排他的であることをいう。特許請求の範囲において接続閉鎖（conjunction closed）の語法に用いない場合または特記されない限りは、「ａ」および［ａｎ］は、「１以上」を示す。かくして、「導入遺伝子により与えられた」なる用語は、１以上の導入遺伝子を含む。
【００２４】
「含む（comprise）」、「有する(have)」、「含む（include）」なる用語は、無制限の連結動詞である。また、「含む(comprises, comprising)」、「有する（has, having）」、「含む(includes, including)」のごとき１以上のこれらの動詞のいずれの形態または時制もオープンエンドである。例えば、１以上の工程を「含む（comprise）」、「有する」または「含む（include）」いずれの方法も、それらの１以上の工程だけを所有することに限定されなく、さらに、他のリストされていない工程もカバーする。同様に、１以上の形質を「含む」、「有する」または「含む」いずれの植物も、それらの１以上の形質だけの所有に制限されていなく、他のリストされていない形質に及ぶ。
【００２５】
本発明の他の目的、特徴および有利さは、以下の詳細な記載から明らかになるであろう。しかしながら、本発明の精神および範囲内の種々の変更および変形が、この詳細な記載から当業者に明らかとなるために、本発明の特定の実施例を示しつつ、提供された詳細な記載およびいずれの特定の実施例も、例示の方法によってのみ与えられると理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１：注目するウイルスのゲノム構成の模式図。
【図２Ａ】図２Ａ：植物ウイルス制御に効果的な配列を同定するアプローチを示す模式図。
【図２Ｂ】図２Ｂ：逆位反復配列として発現された場合、ウイルス制御についての有効性につきスクリーニングした領域の位置を示す典型的なベゴモウイルス  ＤＮＡ−Ａゲノムの模式図。番号を付した灰色の矢印は、試験されたゲノムの一部分を表す。
【図２Ｃ】図２Ｃ：逆位反復配列として発現された場合、ウイルス制御についての有効性につきスクリーニングした領域の位置を示す典型的なポルテクスウイルス（ペピーノモザイクウイルス；ＰｅｐＭＶ）ゲノムの模式図。番号を付した灰色の矢印は、試験されたゲノムの一部分を表す。
【図２Ｄ】図２Ｄ：逆位反復配列として発現された場合、ウイルス制御についての有効性につきスクリーニングした領域の位置を示すトスポウイルス（例えば、トマト−スポッテド−ウイルトウイルス（ＴＳＷＶ）ゲノム）の模式図。番号を付した灰色の矢印は、試験されたゲノムの一部分を表す。
【図３】図３：形質転換されたトマト植物中のｓｉＲＮＡ生成と関連するウイルス抵抗性。
【図４】図４：複数のウイルス抵抗性（「ＭＶＲ」）を与える典型的な人工ｄｓＲＮＡ融合構築体。
【図５】図５：５つの標的とされたジェミニウイルスに対して分析された（配列番号：１〜４２中の）適切な２１ｎｔ配列（完全マッチ：二重下線；Ｇ：Ｕ  ミスマッチ：単一アンダーライン；他のミスマッチまたは利用せず：下線なし）。
【図６】図６：トスポウイルスに対して分析された（配列番号：４３〜７０中の）適切な２１ｎｔ配列（完全マッチ：二重下線；Ｇ：Ｕ  ミスマッチ：単一アンダーライン；他のミスマッチまたは利用せず：下線なし）。
【図７Ａ−７Ｂ】図７Ａ、７Ｂ：標的とされたポルテクスウイルスに対して分析された（配列番号：７１〜１５４中の）適切な２１ｎｔ配列（完全マッチ：二重下線；Ｇ：Ｕ  ミスマッチ：単一アンダーライン；他のミスマッチまたは利用せず：下線なし）。
【図８】図８：段階的ｓｉＲＮＡでのごとき１つの遺伝子組換えカセット中で複数設計ｍｉＲＮＡを発生させるための典型的な構築体の模式図。
【図９】図９：ウイルス抵抗性についての複数の作用機序を発生させるための発現カセットを示す模式図。
【図１０】図１０：遺伝子組換えカセット中の複数設計ｍｉＲＮＡを発生させる、ならびにｄｓＲＮＡと共にｍｉＲＮＡを発現するさらなる典型的な構築体。
【図１１Ａ−１１Ｂ】図１１Ａ、１１Ｂ：抗ウイルスの効力を持ったｄｓＲＮＡとして発現され得るセグメントを規定するトスポウイルスゲノムの領域の走査。Ｘ軸は個々の事象および標的領域を表す（ＣＰ：外皮タンパク質；ＧＰ：膜糖タンパク質；およびＲｄＲＰ：ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ）。Ｙ軸は、ウイルス抵抗性を示す遺伝子組換えＲ１植物の％を表す。図１１Ａ：ＴＳＷＶ結果；図１１Ｂ：ＣａＣＶおよびＧＢＮＶの結果。「ＣＰ４＋」は、Ｒ１植物におけるｄｓＲＮＡコード配列に連結された選択マーカー遺伝子の存在をいう。
【図１２】図１２：このポルテクスウイルスに対するｄｓＲＮＡ媒介抵抗性の生成における有効性につき試験したＰｅｐＭＶゲノムの領域（ＣＰ：外皮タンパク質；Ｍｏｖ：移行タンパク質；ＲｄＲＰまたはＲｄＲ：ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ；ＴＧＢ：トリプルジーンブロックタンパク質）。
【図１３Ａ−１３Ｂ】図１３Ａ、１３Ｂ：このウイルス群に対するｄｓＲＮＡ媒介抵抗性の生成における有効性につきアッセイしたジェミニウイルスゲノムの領域。（ＣＰ：外皮タンパク質；Ｒｅｐ：複製タンパク質）。他の遺伝子導入植物はグリホサート耐性遺伝子を含む。「０％〜１００％」は、選択マーカー陽性であり、ウイルス抵抗性であるＲ１植物のパーセンテージを示す。図１３Ａ：ＴＹＬＣＶおよびＴｏＳＬＣＶについての代表的な結果；図１３Ｂ：ＰｅｐＧＭＶ、ＰＨＹＶＶおよびＴｏＬＣＮＤＶについての代表的な結果。ＰＨＹＶＶおよびＴｏＬＣＮＤＶの事象について、「Ｓｐｃ」は、スペクチノマイシン耐性を与える選択マーカー遺伝子の存在をいう。他の事象は、グリホサート耐性（「ＣＰ４陽性」）を与える選択マーカー遺伝子を含む構築体で形質転換した。
【図１４】図１４：複数のウイルスファミリー中の複数のウイルスを標的とする代表的な発現カセットを示す模式図。
【図１５】図１５：実施例３に言及された複数のウイルス抵抗性について、トスポウイルスおよびＰｅｐＭＶ（ポルテクスウイルス）のＣＰ発現を標的とする人工ｄｓＲＮＡ融合構築体の結果。用いた構築体を図４Ｂに模式的に示し、底部構築体：ＴＳＷＶ（１６０ｂｐ）、ＴＳＷＶ（２９６ｂｐ）、ＰｅｐＭＶ（２３１ｂｐ）、ＣａＣＶ／ＧＢＮＶ（２３２ｂｐ）。
【図１６】図１６：トスポウイルスの末端反復配列（配列番号：４５５に見出した配列番号：１６７、１６８、３７６、３７７、３７８、）を含む構築体で形質転換した接種ＣＰ４陽性Ｒ１植物中の接種ＣａＣＶに対して観察された抵抗性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下は、当業者が本発明を実施するのを援助するために提供された本発明の詳細な記載である。当業者ならば、本発明の精神または範囲から逸脱することなく、本明細書に記載された具体例において、変形および変更をなし得る。
【００２８】
本発明は、トマト（すなわち、LycopersiconまたはSolanum sp.）、コショウ（すなわち、Capsicum sp.）、ペチュニア（すなわち、Petunia sp.）、およびジャガイモおよびナス（すなわち、Solanum sp.ナス属）のごときナス科植物を含めた植物中のウイルス病の遺伝子制御のための方法および組成物を提供する。１つの具体例において、ＲＮＡ媒介遺伝子抑制は、導入遺伝子転写物のｄｓＲＮＡ領域に由来した低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の集団を生成する逆位反復配列導入遺伝子カセットの発現により与えることができる。遺伝子抑制のためのもう一つのＲＮＡ媒介アプローチは、特定の転写物を「標的」とし、それらの低下に導く１以上のｍｉＲＮＡセグメントの発現による。かくして、ｄｓＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔａ−ｓｉＲＮＡおよび／または段階的ｓｉＲＮＡを含むアプローチは、本発明により利用され得る。また、例えば、ベゴモウイルス由来または他のウイルス由来配列の標的複製、外皮タンパク質、およびＣ２および／またはＣ３タンパク質が利用され得る。同様に、ペピーノモザイクウイルスのごときポルテクスウイルスの制御のために、外皮（キャプシド）タンパク質（「ＣＰ」）の配列標的部分、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（「ＲｄＲＰ」）および／またはトリプルジーンブロック（「ＴＧＢ」）または「３０Ｋ」ＭＰを含み得る１以上の移行タンパク質（「ＭＰ」）のごとき複製タンパク質を用い得る。例えば、トスポウイルスの制御については、外皮タンパク質（「ＣＰ」、ヌクレオカプシドと命名された、「Ｎ」タンパク質）、ＲｄＲＰ、移行タンパク質（「ＮｓＭ」）および／または非構造な糖タンパク質（glyocoprotein）群（「Ｇ１」または「Ｇ２」遺伝子によりコードされる）を標的とする配列が、同様に利用され得る。かかる配列は、１以上のウイルス単離体からの配列に正確に対応し得るか、あるいは例えば、それらの抗ウイルス効力を増加させるかまたは非標的効果を回避するように設計された変異体であり得る。
【００２９】
ある具体例において、複数のウイルス抵抗性（「ＭＶＲ」）は、単一の形質転換構築体、または１を超える構築体から発現したｄｓＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡを利用することにより達成される。さらに、単一構築体は、植物ウイルスの感染、増殖および／または伝達に必要な１以上の機能を標的とするｄｓＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡを生成する１以上の発現カセット、ならびにある具体例において、標的とされるタンパク質またはタンパク質の一部分をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡを生成する１以上の発現カセットを含み得る。かくして、複数の植物ウイルスに対する抵抗性は、単一の遺伝子組換え「事象」において達成され得る。ＲＮＡ媒介抵抗性は、ジェミニウイルス抵抗性については、レプリカーゼまたは複製関連タンパク質、ｍ１３−Ｇ５のごときｓｓＤＮＡ結合タンパク質中の複製、発現または突然変異を抑制するアプタマー（例えば、米国特許第６，８５２，９０７号；Padidamら, 1999）を利用するタンパク質ベースのアプローチによりさらに増強でき、またはジェミニウイルス複製に干渉するペプチドアプタマーも使用し得る(例えば、Lopez-Ochoaら, 2006)。
【００３０】
また、例えば、核酸ベースのアプローチにより、ビリオン集合の抑制は、トマト植物に対するウイルス抵抗性を提供する際の作用機序として利用され得ることが考えられる。このビリオン集合の抑制は、例えば、末端反復配列のごときトスポウイルス末端配列の使用により提供され得る。「ビリオン集合の抑制」により、ウイルス粒子（「ビリオン」）を一緒に形成し得るウイルスのキャプシドタンパク質および核酸間の相互作用に対する干渉を意味する。かかる干渉は、例えば、逆転写酵素に競合する人工基質として機能できる、および／またはウイルスゲノム成分を複製する適切な環状化に対する干渉により生じる得る配列の発現により、生じ得る。
【００３１】
加えて、トマト、コショウおよび他のナス科植物中の耐性につき古典的遺伝的抵抗性の遺伝子座は、例えば、古典的な生育アプローチを介して利用され得る。また、ある具体例において、抵抗性のためのトスポウイルス「Ｎ」遺伝子（ヌクレオカプシド；外皮タンパク質）＋／−逆位反復配列およびポルテクスウイルス（例えば、ペピーノモザイクウイルス）外皮タンパク質（ＣＰ）およびレプリカーゼを用いるタンパク質ベースのアプローチが提供される。
【００３２】
遺伝子抑制方法は、アンチセンス、共抑制およびＲＮＡ干渉の使用を含み得る。植物中のアンチセンス遺伝子抑制は、米国特許第５，１０７，０６５号、第５，４５３，５６６号および第５，７５９，８２９号においてShewmakerらにより記載されている。抑制されるべき遺伝子をコードするｍＲＮＡに相補的なＤＮＡを使用する細菌中の遺伝子抑制は、米国特許第５，１９０，９３１号、第５，２０８，１４９号および第５，２７２，０６５号においてInouyeらにより開示されている。ＲＮＡ干渉またはＲＮＡ媒介遺伝子抑制は、例えば、Redenbaughら, 1992; Chuangら, 2000;およびWesleyら, 2001により記載されている。
【００３３】
ＲＮＡ媒介遺伝子抑制に関与するいくつかの細胞経路は記載され、各々は、特有の経路および特定の成分により識別されている。例えば、BrodersenおよびVoinnet (2006)ならびに TomariおよびZamore (2005)による概説参照。ｓｉＲＮＡ経路は、低分子干渉ＲＮＡ（「ｓｉＲＮＡ」）への二本鎖ＲＮＡの非段階的切断を含む。マイクロＲＮＡ経路は、一般的に、標的転写物のトランスにおける切断に導く（一般的に植物中の約２０〜２４ヌクレオチド）通常約１９〜約２５ヌクレオチドの非タンパク質コードＲＮＡのマイクロＲＮＡ（「ｍｉＲＮＡ」）を含み、種々の調節および発生経路に関与する遺伝子の発現をネガティブに調節する；Ambrosら (2003)参照。植物ｍｉＲＮＡは、ＤＣＬ１により、単一の特定の約２１ヌクレオチドのｍｉＲＮＡに処理される対のステム−ループ前駆物質、２−ヌクレオチド３’ オーバーハングを含む二本鎖ＲＮＡ前駆物質からのｍｉＲＮＡ＊種およびｍｉＲＮＡの単一の対の発現およびトランスにおける特定の標的のサイレンシングを含めた１組の特性により規定された（Bartel (2004); Kim (2005); Jones-Rhoadesら (2006); Ambrosら (2003)参照）。トランス作用性ｓｉＲＮＡ（「ｔａ−ｓｉＲＮＡ」）経路において、ｍｉＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡ前駆物質の生成につきＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを必要とするプロセスにおいてｓｉＲＮＡ１次転写物のインフェース処理に導くように機能し；トランス作用性ｓｉＲＮＡは、二次構造の欠如、二本鎖ＲＮＡの生成を開始するｍｉＲＮＡ標的領域、ＤＣＬ４およびＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＤＲ６）の必要性、および２−ヌクレオチド３’オーバーハングを含む完全に一致した二本鎖を持つ複数の完全に段階的約２１−ｎｔの小型ＲＮＡの生成により規定される（Allenら, 2005）。
【００３４】
多数のマイクロＲＮＡ遺伝子（ＭＩＲ遺伝子）が同定され、データベース（www.microrna.sanger.ac.uk/sequencesにてオンライン入手可能な「ｍｉＲＢａｓｅ」；Griffiths-Jonesら (2003)も参照）中で公に利用可能になっている。また、さらなるＭＩＲ遺伝子および成熟ｍｉＲＮＡは、米国特許出願公開第２００５／０１２０４１５号および第２００５／１４４６６９号に記載され、これらをここに出典明示して本明細書の一部とみなす。ＭＩＲ遺伝子ファミリーは、実質的であり、少なくともいくつかのゲノムの１％を占めると推測され、すべての遺伝子の約３分の１の発現に影響または調節することができるようである（例えば、Tomariら (2005); Tang (2005);およびKim (2005)参照）。ＭＩＲ遺伝子は遺伝子間領域に生じ、双方とも単離され、ゲノム中のクラスタ中で報告されるが、他の遺伝子（タンパク質コーディングおよび非タンパク質のコーディングの双方）のイントロン内に完全または部分的に位置できる。ｍｉＲＮＡ生物発生の最近の概説について、Kim (2005)を参照。ＭＩＲ遺伝子の転写は、少なくともいくらかの場合に、ＭＩＲ遺伝子自体のプロモーターに制御下にあることができる。「プリ−ｍｉＲＮＡ」と称する１次転写物は全く大きく（数キロベース）なることができ、多シストロン性になることができ、１以上のプレ−ｍｉＲＮＡ（成熟ｍｉＲＮＡに処理されるステム−ループ配置を含む折りたたみ構造）ならびに、ｍＲＮＡの５’「キャップ」およびポリアデニル化された尾部を含有する。例えば、Kim (2005)中の図１参照。
【００３５】
また、「段階的小型ＲＮＡ遺伝子座」を使用でき、それは標的遺伝子を抑制できる（「段階的小型ＲＮＡ」と称される）複数の小型二本鎖ＲＮＡにｉｎ ｖｉｖｏ相において切断される単一折りたたみ構造を形成するＲＮＡ転写物に転写する（例えば、米国特許出願公開第２００８００６６２０６号）。ｓｉＲＮＡとは対照的に、段階的小型ＲＮＡ転写物は、相中で切断される。ｍｉＲＮＡとは対照的に、段階的小型ＲＮＡ転写物は、ＤＣＬ４またはＤＣＬ４様オルソロガスリボヌクレアーゼ（ＤＣＬ１ではない）により切断されて、標的遺伝子を発現抑制させることができる複数の豊富な小型ＲＮＡを生成する。ｔａ−ｓｉＲＮＡ経路とは対照的に、段階的小型ＲＮＡ遺伝子座は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに独立して、および二本鎖ＲＮＡの生成を始めるｍｉＲＮＡ標的領域なくしてハイブリダイズしたＲＮＡを形成するＲＮＡ転写物に転写する。段階的小型ＲＮＡ遺伝子座に基づいて設計された新規な組換えＤＮＡは、ｍｉＲＮＡ、ｔａ−ｓｉＲＮＡまたは、ｓｉＲＮＡに処理するためのヘアピン構造を形成するように設計された発現ベクターを用いることなく、１または複数の標的遺伝子の抑制に有用である。さらに、適切な段階的小型ＲＮＡが内因性にまたは導入遺伝子として発現される場合に、段階的小型ＲＮＡに対応する認識部位は、細胞または組織中の標的配列の抑制に有用である。
【００３６】
Ａ．ウイルス標的
本発明により、トマトのごときナス科植物を含めた植物への複数のウイルスに対する抵抗性を与える方法および組成物が提供される。抵抗性が本発明において標的とされ得るウイルスは、限定なくして、ジェミニウイルス、トスポウイルスおよびポルテクスウイルス中からの２以上のウイルスを含む。図１は、これらのウイルス属の代表例のゲノム構成を示す。
【００３７】
１．ベゴモウイルス
ジェミニウイルス科は、広範囲の種々の植物を感染させて、世界中でかなりの作物損失を引き起こす、大きく種々のファミリーの植物ウイルスである。それらは、２つの正二十面体のキャプシド、ならびにｄｓＤＮＡ中間体を介して複製される環状ｓｓＤＮＡゲノムにより特徴付けられる。ジェミニウイルス（本明細書においては「ベゴモウイルス」および「ジェミニウイルス」は交換できるように用いる）は、複製および転写のための植物核ＤＮＡおよびＲＮＡポリメラーゼに依存する。これらのウイルスは複製および転写にほんの少数の要因に寄与する。ファミリージェミニウイルス科は、昆虫ベクター、宿主範囲およびゲノム構造により異なる、３つの主要な属（「サブグループ」とも先に称された）を含む。
【００３８】
ジェミニウイルス科サブグループＩ（マストレウイルス属）は、一般的に単子葉植物を感染させ、単一成分のゲノムを有するリーフホッパー伝達ウイルスを含む。
【００３９】
ジェミニウイルス科サブグループＩＩＩ（ベゴモウイルス属）は、双子葉植物植物を感染させて、最も一般的に二分ゲノムを有するコナジラミ伝達ウイルスを含む。
【００４０】
ジェミニウイルス科サブグループＩＩ（クルトウイルス属）ウイルスはリーフホッパーにより伝達され、サブグループＩのような単一成分のゲノムを有するが、サブグループＩＩＩのように双子葉植物を感染させる。
【００４１】
２．トスポウイルス
トスポウイルス属中のウイルスは、かなりの世界中の作物損失を引き起こす。この属名称は、トマト−スポッテド−ウイルトウイルス（「ＴＳＷＶ」）に由来する。トマトの斑点立ち枯れ病は、１９１５年にオーストラリアで最初に観察され、ウイルス起源であることをその後示された。１９９０年代の初めまで、ＴＳＷＶは、植物ウイルスのトマト斑点立ち枯れ病群のただ一つのメンバーであると考えられた。インパチェンスネクロティックスポットウイルス（ＩＮＳＶ）、トウガラシ退緑斑紋ウイルス（「ＣａＣＶ」）、ピーナッツ芽壊死ウイルス（さらに落花生類芽壊死ウイルス（Groundnut bud necrosis virus）「ＧＢＮＶ」としても知られる）およびトマトの白化スポットウイルスを含めたいくつかの同様のウイルスの同定および特徴付けは、ブニヤウイルス科ファミリー内の植物感染トスポウイルス属の生成に導いた。このファミリーは、優位に動物感染ウイルスの大きな群を含む。２０を超えるトスポウイルスは、それ以来同定され特徴づけられ、その属の以前に知られいない種は定期的に記載され続けている。
【００４２】
トスポウイルスは、両センス極性の三者間のＲＮＡゲノムを有する。ゲノムの３つの部分は、「Ｌ」セグメント、「Ｍ」セグメントおよび「Ｓ」セグメントと称される。ＲＮＡゲノムの各部分のコンセンサス末端配列が見出され、３’終端にてセグメントＵＣＵＣＧＵＵＡＧＣ（配列番号：１６７）および５’終端にてＡＧＡＧＣＡＡＵＣＧ（配列番号：１６８）により規定される。最大のＲＮＡの「Ｌセグメント」はレプリカーゼをコードする。中型ＲＮＡの「Ｍセグメント」は、相補的なセンスのＲＮＡ中のＧ１およびＧ２ｍならびに、ゲノムセンスＲＮＡ中の非構造タンパク質のＮＳｍをコードする。最も小さなセグメント「Ｓ部位」は、相補的なセンスＲＮＡ中のヌクレオカプシド・タンパク質（Ｎ）およびゲノムセンスＲＮＡの中の細胞間移行のＮＳをコードする。ウイルスは、フランクリニエラ属（５種）およびアザミウマ属（３種）中のアザミウマにより伝達される。また、ウイルスの機械的伝達が可能である。ＴＳＷＶは、７０の植物学ファミリーに属する９２５を超える植物類を感染できるが、他のトスポウイルス種は非常に狭い宿主範囲を有する。
【００４３】
３．ポルテクスウイルス
ペピーノモザイクウイルス（ＰｅｐＭＶ）は、フレキシウイルス中からの代表的なポルテクスウイルスであり、かなりの潜在性を持って高度に伝染性であり、保護されたトマト生成における損傷を引き起こす。作用が感染を除去するために講じられないならば、かなりの作物損失が可能である。ウイルスは、汚染されたツール、ヒトの手または衣類を介して、および直接的な植物間接触により容易に広がる。また、それは、感染した母植物の接ぎ木によりまたは感染した母植物からの挿し木を行う場合に伝達しかねない。外皮タンパク質媒介抵抗性の使用は、良好な抵抗性を提供し得る。しかしながら、逆位反復配列をＣＰに含ませることは、抵抗性の系の生成を増強し得る。
【００４４】
Ｂ．核酸組成物および構築体
本発明は、遺伝子導入植物中のベゴモウイルス、トスポウイルスおよびポルテクスウイルス中から複数の（すなわち、１を超える）ウイルス種および株に対する抵抗性の達成に用いる組換えＤＮＡ構築体および方法を提供する。ある具体例において、抵抗性は、少なくとも以下の群：ベゴモウイルス、トスポウイルスおよびポルテクスウイルスの少なくとも２つから選択された、２、３、４、５、６、７、８またはそれを超えるウイルス種に与えられる。抵抗性は、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの生成により指令でき、発現された外皮タンパク質またはレプリカーゼにより媒介された抵抗性、レプリカーゼの変異形態およびアプタマーの生成のごときタンパク質ベースのアプローチにより補足し得る。また、遺伝子ベースの耐性（すなわち、古典的な育種アプローチにおいて同定される）が利用され得る。
【００４５】
本明細書に用いた「核酸」なる用語は、５’から３’末端に読まれたデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの塩基の一本鎖または二本鎖の高分子をいう。また、「核酸」は、ポリメラーゼにより正確な読み取りを可能とし、その核酸によりコードされたポリペプチドの発現を低下させない非自然発生のヌクレオチド塩基または改変されたヌクレオチド塩基を所望により含有し得る。「ヌクレオチド配列」または「核酸配列」なる用語は、個々の一本鎖、または二本鎖における、核酸のセンスおよびアンチセンス鎖の双方をいう。「リボ核酸」（ＲＮＡ）なる用語は、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（小型ヘアピンＲＮＡ）、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（ミクロＲＮＡ）、ｔＲＮＡ（転移ＲＮＡ、対応するアシル化アミノ酸で帯電または帯電していない）およびｃＲＮＡ（相補的ＲＮＡ）を含み、「デオキシリボ核酸」（ＤＮＡ）なる用語は、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡおよびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを含む。「核酸セグメント」、「ヌクレオチド配列セグメント」、または、より一般的には、「セグメント」なる用語は、当業者により、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを発現するか、または発現するのに適合し得る双方のゲノムの配列、リボソームＲＮＡ配列、転移ＲＮＡ配列、メッセンジャーＲＮＡ配列、オペロン配列およびより小さな設計ヌクレオチド配列を含む機能的な用語として、理解されるであろう。
【００４６】
本明細書に用いた「実質的に相同性の」、「実質的な相同性」なる用語は、核酸配列に関して、配列番号：１６９〜４５５のいずれかにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含み、その一部分または相補体は、逆平行配列がその２つの配列間で発生するのを可能とするものであり、次いで、その２つの配列は、ストリンジェント条件下で反対鎖に対する対応する塩基との水素結合を形成して、高ストリンジェンシーの条件下で十分に安定である二本鎖分子を形成でき、当該技術分野においてよく知られた方法を用いて検出できる。実質的に相同性の配列は、その配列表に記載された参照ヌクレオチド配列またはその相補体に対して、約７０％〜約８０％の配列同一性、またはより好ましくは約８０％〜約８５％の配列同一性、または最も好ましくは、約９０％〜約９５％の配列同一性、約９９％の配列同一性までを有し得る。
【００４７】
本明細書に用いた「オルソログ」なる用語は、共通祖先のヌクレオチド配列から発生し、２以上の種において同一の機能を保持する２以上の種における遺伝子をいう。
【００４８】
本明細書に用いた「配列同一性」、「配列類似性」または「相同」なる用語を用いて、２以上のヌクレオチド配列の配列関連性を記載する。２つの配列間の「配列同一性」のパーセンテージは、参考された配列番号の全長のごとき比較ウィンドウ上の２つの最適に整列した配列の比較により決定され、ここに、比較ウィンドウ中の配列の部分は、その２つの配列の最適な配列のために、参照配列（これは付加または欠失を含まない）と比較した付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。パーセンテージは、双方の配列に同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が生じる位置の番号を決定して、適合した位置の数を得、比較のウインドウにおける位置の総数により適合した位置の数を割り、結果に１００を掛けて、配列同一性のパーセンテージを得ることにより計算される。参照配列に対する比較においてすべての位置にて同一である配列は、参照配列に同一であると言われ、逆もまた同様である。その５’から３’方向において観察される場合の第１のヌクレオチド配列は、第１のヌクレオチド配列が第２または参照配列と完全な相補性を示すならば、３’から５’方向において観察された第２または参照ヌクレオチド配列であることをいう。本明細書に用いた核酸配列分子は、５’〜３’の配列読みの一方のすべてのヌクレオチドが、３’から５’に読む場合に他方のすべてのヌクレオチドと相補性である場合に、「完全な相補性」を示すと言われる。参照ヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列は、参照ヌクレオチド配列の逆の相補性配列と同一の配列を示すであろう。これらの用語および記載は、当該技術分野において良好に定義されており、当業者により容易に理解される。
【００４９】
本明細書に用いた「比較ウィンドウ」は、少なくとも６つの隣接する位置の概念的なセグメント、通常約５０〜約１００、より通常には、約１００〜約１５０をいい、ここに、２つの配列が最適に整列した後、配列は、同数の隣接する位置の参照配列と比較される。比較ウィンドウは、２つの最適な配列のために、参照配列（これは付加または欠失を含まない）と比較して、約２０％以下の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。当業者ならば、Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0 (Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, Wis., USA)におけるごとき配列整列に用いる詳細な方法を参照するであろう。
【００５０】
本発明は、細胞または微生物中のＲＮＡ転写物として発現して、少なくとも１つの植物ウイルスの標的遺伝子発現を抑制することができる１以上のＤＮＡ配列を提供する。この配列は、１以上の異なるヌクレオチド配列をコードするＤＮＡ分子を含み、ここに、異なるヌクレオチド配列の各々は、センスヌクレオチド配列およびアンチセンスヌクレオチド配列を含む。配列はスペーサー配列により接続され得る。スペーサー配列は、センスヌクレオチド配列またはアンチセンスヌクレオチド配列の一部分あるいは無関係なヌクレオチド配列を構成でき、センスおよびアンチセンス配列間のｄｓＲＮＡ分子内で形成する。スペーサー配列は、例えば、長さが少なくとも約１０〜１００ヌクレオチド、または代わりに長さが少なくとも１００〜２００ヌクレオチド、または長さが少なくとも約２００〜４００ヌクレオチド、または長さが少なくとも約４００〜５００ヌクレオチドのヌクレオチドの配列を含み得る。センスヌクレオチド配列またはアンチセンスヌクレオチド配列は、標的遺伝子またはその誘導体のヌクレオチド配列または相補的配列と実質的に同一であり得る。ｄｓＤＮＡ分子は、ｄｓＤＮＡを発現する宿主の細胞、組織または器官において機能する１以上のプロモーター配列の制御下で作動可能に配置して、ＲＮＡ分子を生成し得る。本明細書に用いた「発現する」または「発現」等は、転写されたポリヌクレオチドからのＲＮＡ分子の転写をいう。ＲＮＡ分子はポリペプチド配列に翻訳されてもされなくてもよい。
【００５１】
また、本発明は、ＲＮＡへのＤＮＡの発現およびに植物ウイルスとの接触に際して、標的ウイルス遺伝子またはウイルス複製または症候学（すなわち、症状の発現）の抑制を達成する植物の細胞における発現のためのＤＮＡ配列を提供する。植物中の遺伝子抑制分子の発現方法は知られており（例えば、米国公開第２００６／０２００８７８Ａ１；米国公開第２００６／０１７４３８０号；米国公開第２００８／００６６２０６号；Niuら、2006）、これを用いて、本発明のヌクレオチド配列を発現し得る。
【００５２】
本発明の組換えＤＮＡ構築体での使用に適する非構成的プロモーターは、空間特異的プロモーター、発生特異的なプロモーターおよび誘導プロモーターを含む。空間特異的プロモーターは、細胞小器官特異的、細胞特異的、組織特異的、または臓器特異的なプロモーター（例えば、色素体、根、花粉または種子中の第１の標的ＲＮＡの発現を抑制するための、各々、色素体特異的、根特異的、花粉特異的、種子特異的なプロモーター）を含むことができる。複数の場合において、種子特異的、胚特異的、アリューロン特異的、内乳特異的なプロモーターは、特に有用である。発生特異的プロモーターは、植物の発育環の、または一年の異なる季節でのある発生段階中に発現を促進する傾向があるプロモーターを含むことができる。誘導プロモーターは、限定されるものではないが、生物的または非生物的なストレス（例えば、水分欠乏または干ばつ、暑さ、寒さ、高低の栄養素または、塩レベル、高低の光レベルまたは害虫もしくは病原体感染）のごとき化学物質または環境条件により誘導されたプロモーターを含む。また、マイクロＲＮＡプロモーター、特に、発生特異的、空間特異的または誘導可能な発現パターンを有するものが注目される。また、発現特異的プロモーターは、「強プロモーター」または「弱プロモーター」として一般的にみなされるプロモーターを含めて、一般的に構成的に発現するが、異なる程度または「強度」の発現のプロモーターを含むことができる。
【００５３】
かくして、本発明による植物ウイルス制御用の遺伝子配列または断片は、遺伝子導入植物細胞において操作可能で、その中で発現して、ｄｓＲＮＡ分子を形成する遺伝子導入植物細胞中でｍＲＮＡを生成するプロモーターまたはプロモーター群の下流にてクローン化され得る。植物発現可能プロモーターの多数の例が、当該技術分野において知られている(例えば、特に、CaMV 35S; FMV 35S; PClSV (例えば、米国特許第５，８５０，０１９号); ScBV; AtAct7)。植物中のポリペプチドの発現に有用であるプロモーターは、Odellら (1985)に記載された誘導、ウイルス、合成または構成的であるもの、および／または時間的に調節、空間的に調節ならびに空間および時間的に調節されるプロモーターを含む。多数の臓器特異的なプロモーターが同定され、当該技術分野において知られている（例えば、米国特許第５，１１０，７３２号；第５，８３７，８４８号；第５，４５９，２５２号；第６，２２９，０６７号；Hirelら、1992）。植物組織中に含有されたｄｓＲＮＡ分子が植物中で発現され、標的とされたウイルス遺伝子発現の意図された抑制が達成される。遺伝子導入植物適用において一般的な原型の強プロモーターであるカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、またはＥ３５ＳまたはＦＭＶプロモーターのごとき関連プロモーターは、ウイルス抵抗性遺伝子を駆動するために使用し得る。また、組織特異的遺伝子発現を指令するプロモーターが同定されている。
【００５４】
導入遺伝子転写単位は、注目する遺伝子をコードするＤＮＡ配列を含む。注目する遺伝子は、ウイルス種からのコード配列または非コードの配列を含み得る。導入遺伝子転写単位により発現される非コードの配列の非限定例は、限定されるものではないが、５’非翻訳領域、プロモーター、エンハンサーまたは他の非コード転写領域、３’非翻訳領域、ターミネーター、イントロン、マイクロＲＮＡ、マイクロＲＮＡ前駆物質ＤＮＡ配列、低分子干渉ＲＮＡ、リボソームまたはリボザイムのＲＮＡ成分、小核小体ＲＮＡ、リガンド結合できるＲＮＡアプタマーおよび他の非コードＲＮＡを含む。
【００５５】
注目する遺伝子の非限定例は、さらに、限定されるものではないが、転写因子をコードする遺伝子、および注目する分子（例えば、アミノ酸、脂肪酸および他の脂質、糖および他の炭水化物、生物学的高分子、およびアルカロイド、テルペノイド、ポリケチド、非リボソームペプチドのごとき２次代謝産物、および混合した生合成起源の２次代謝産物）の生合成または異化作用に関与する酵素をコードする遺伝子のごとき翻訳可能な（コード）配列を含む。注目する遺伝子は、本発明の組換えＤＮＡ構築体が転写される細胞（例えば、植物細胞）に固有の遺伝子、または非天然の遺伝子であることができる。注目する遺伝子は、マーカー遺伝子、例えば、抗生物質、抗真菌剤、除草剤の抵抗性をコードする選択マーカー遺伝子、または容易に検出可能な形質（例えば、植物細胞において、フィトエン合成酵素または植物に特定の色素を与える他の遺伝子）をコードするマーカー遺伝子、または各々、蛍光性タンパク質、ルシフェラーゼまたはタンパク質または核酸の検出方法により検知可能なユニークなポリペプチドまたは、核酸「タグ」のごとき検知可能な分子をコードする遺伝子であることができる。選択マーカーは、本発明の構築体の成功した処理の同定に特定の有用性の注目する遺伝子である。
【００５６】
注目する遺伝子は、「標的遺伝子」と記載され得る遺伝子を含む。標的遺伝子は、抑制のために標的とされる単一遺伝子もしくは単一遺伝子の一部分を含むか、または例えば、標的遺伝子の複数の連続セグメント、標的遺伝子の複数の非連続セグメント、標的遺伝子の複対立遺伝子または１以上の種からの複数の標的遺伝子を含むことができる。標的遺伝子は、翻訳可能な（コード）配列であることができるか、または（非コード調節配列のごとき）非コードの配列、あるいはその双方であることができる。導入遺伝子転写単位は、導入遺伝子の転写に必要である５’もしくは３’配列またはその双方をさらに含むことができる。他の具体例（複数の株または種、例えば、ウイルスを横切って標的遺伝子を抑制することが望ましい場合）において、標的遺伝子を発現抑制させる複数の株または種に共通の標的遺伝子配列を抑制するための成熟ｍｉＲＮＡに処理される組換えＤＮＡ構築体を設計することが望ましいかもしれない。かくして、組換えＤＮＡ構築体から処理されたｍｉＲＮＡは、１つの分類群に特異的（例えば、他の分類群にはではなく属、ファミリーに特異的）であるように設計することができる。
【００５７】
配列表中の核酸分子もしくは核酸分子の断片または他の核酸分子は、ある環境下で他の核酸分子に特異的にハイブリダイズすることができる。本明細書に用いた、２つの核酸分子は、２つの分子が逆平行の二本鎖核酸構造を形成できるならば、相互に特異的にハイブリダイズできると言われる。核酸分子は、それらが完全な相補性を示すならば、もう一つの核酸分子の相補体であると言われる。２つの分子は、それらが少なくとも通常の「低ストリンジェンシー」条件下で相互にアニーニングしたままであることを可能にするように十分な安定性で相互にハイブリダイズできるならば、「最小に相補的である」と言われる。同様に、分子は、それらが従来の「高ストリンジェンシー」条件下でアニーニングしたままであることを可能にするように十分な安定性で相互にハイブリダイズできるならば、相補的であると言われる。通常のストリンジェンシー条件はSambrookら (1989)およびHaymesら (1985)により記載されている。
【００５８】
したがって、完全な相補性からの逸脱は、かかる逸脱が二本鎖構造を形成する分子の能力を完全に排除しない限りは、許容できる。かくして、核酸分子または核酸分子の断片が、プライマーまたはプローブとして機能するためには、使用される特定の溶媒および塩濃度下で安定な二本鎖行動を形成できるのに十分な配列における相補性だけが必要とされる。
【００５９】
ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件は、例えば、高選択性を必要とする適用では、約５０℃〜約７０℃の温度にて約０．０２Ｍ〜約０．１５Ｍ ＮａＣｌにより提供されるごとき、比較的低い塩および／または高温条件である。高ストリンジェンシー条件は、例えば、高ストリンジェンシーの洗浄緩衝剤（０．２×ＳＳＣまたは１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃）で少なくとも２回ハイブリダイゼーションフィルターを洗浄することである。また、４５℃の６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）に続いて、５０℃の２．０×ＳＳＣの洗浄のごとき他の条件は、当業者に知られているか、またはCurrent Protocols in Molecular Biology (1989)で見出すことができる。例えば、洗浄工程中の塩濃度は、５０℃の約２．０×ＳＳＣの低ストリンジェンシーから５０℃の約０．２×ＳＳＣの高ストリンジェンシーまでで選択できる。加えて、洗浄工程における温度は、室温の約２２℃での低ストリンジェンシー条件から約６５℃の高ストリンジェンシー条件まで増加できる。温度および塩の双方は変更できるか、または温度もしくは塩濃度は、他の変数を変化させつつ、一定に保持され得る。本発明に用いた核酸は、かかる条件下で、トスポウイルス、ベゴモウイルスおよびポルテクスウイルス、またはその相補体よりなる群から選択される植物ウイルスからの１以上の核酸分子に特異的にハイブリダイズし得る。特定の具体例において、本発明で用いた核酸は、配列表に記載した１以上の核酸分子またはその相補体と、少なくとも約８０％から、または少なくとも約９０％から、または少なくとも約９５％から、または少なくとも約９８％から、または約１００％さえの配列同一性を示すであろう。
【００６０】
また、本発明の核酸は、当該技術分野において知られた方法により、特に、植物優先配列を提供することが望ましい場合には、完全または部分的に合成できる。かくして、本発明の核酸の全てまたは一部分は、選択された宿主により好ましいコドンを用いて合成し得る。種優先コドンは、特定の宿主種において発現されたタンパク質に最も頻繁に用いたコドンから決定し得る。ヌクレオチド配列の他の改変の結果、わずかに変更された活性を有する変異体を生じることができる。
【００６１】
ＤｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列は、重合されたリボヌクレオチドの二本鎖を含むこともでき、リン酸−糖骨格またはヌクレオシドのいずれかへの改変を含み得る。ＲＮＡ構造中の改変を調整して、特定の遺伝子抑制を可能とし得る。１つの具体例において、ｄｓＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡ分子が生成されるように、酵素プロセスにより改変し得る。別法として、構築体は、ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ媒介抵抗性アプローチに用いるヌクレオチドセグメントを発現するように設計され得る。ｓｉＲＮＡは、いくつかの病原体中のいくつかの標的遺伝子につき下方調節効果を効率的に媒介できる。この酵素プロセスは、真核生物ＲＮＡｉ経路(Elbashirら, 2001; Hamilton およびBaulcombe, 1999)中の昆虫、脊椎動物、真菌または植物の細胞中に存在するリボヌクレアーゼ ＩＩＩ酵素またはＤＩＣＥＲ酵素の利用により達成し得る。また、このプロセスは、当業者に容易に知られている組換ＤＮＡ技術を介する標的昆虫の細胞に導入された組換えＤＩＣＥＲまたはリボヌクレアーゼ ＩＩＩを利用し得る。病原体において自然発生するかまたは組換ＤＮＡ技術を介して作成されるＤＩＣＥＲ酵素およびリボヌクレアーゼ ＩＩＩの双方は、より大きなｄｓＲＮＡ鎖をより小さなオリゴヌクレオチドに切断する。ＤＩＣＥＲ酵素は、ｄｓＲＮＡ分子をｓｉＲＮＡ部分に特異的に切断し、その各々は、長さが約１９〜２５ヌクレオチドであるが、リボヌクレアーゼ ＩＩＩ酵素は、ｄｓＲＮＡ分子を通常１２〜１５塩基対ｓｉＲＮＡに切断する。その酵素のいずれかにより生成されたｓｉＲＮＡ分子は、２〜３のヌクレオチド３’ 突出、５’リン酸および３’ヒドロキシル終端を有する。リボヌクレアーゼ ＩＩＩ酵素により生成されたｓｉＲＮＡ分子は、真核生物のＲＮＡｉ経路のダイサー酵素により生成されたものと同じであり、かくして、次いで、標的とされ、引き続いて捲かれたいない後に、固有の細胞ＲＮＡ分解メカニズムにより分解され、一本鎖ＲＮＡに分離し、標的遺伝子により転写されたＲＮＡ配列とハイブリダイズした。このプロセスの結果、病原体中の標的遺伝子のヌクレオチド配列によりコードされたＲＮＡ配列を有効に分解または除去する。この結果は、病原体内の特に標的とされたヌクレオチド配列を発現抑制させることである。酵素プロセスの詳細な記載は、Hannon (2002)に見出すことができる。
【００６２】
本発明のヌクレオチド配列は、コンピューター読取り可能な媒体に記録できる。本明細書に用いた「コンピューター読取り可能な媒体」は、コンピューターにより直接的に読まれアクセスできる表現のいずれかの明確な媒体をいう。かかる媒体は、限定されるものではないが、フロッピーディスク、ハードディスク、記憶媒体および磁気テープのごとき磁気記憶媒体：ＣＤ−ＲＯＭのごとき光記憶装置媒体；ＲＡＭおよびＲＯＭのごとき電気的記憶媒体；光学文字認識フォーマットコンピュータファイル、および磁気／光学的記憶媒体のごときこれらのカテゴリーのハイブリッドを含む。当業者は、現在知られたいずれのコンピューター読取り可能な媒体を用いても、本発明のヌクレオチド配列をその上に記録したコンピューター読取り可能な媒体を含む製造を生成できることを容易に認識することができる。
【００６３】
本明細書に用いた「記録された」とは、コンピューター読取り可能な媒体に情報を保存するプロセスをいう。当業者は、本発明のヌクレオチド配列情報を含む媒体を生成するためのコンピューター読取り可能な媒体に情報を記録する現在知られた方法のいずれを容易に採用できる。種々のデータ保存構造は、当業者が本発明のヌクレオチド配列をその上に記録したコンピューター読取り可能な媒体を作成するために利用可能である。データ保存構造の選択は、一般的に、格納された情報にアクセスするように選定された手段に基づくであろう。加えて、様々なデータ処理装置プログラムおよびフォーマットを用いて、コンピューター読取り可能な媒体上に本発明のヌクレオチド配列情報を保存できる。配列情報は、ワード処理テキストファイルにおいて表し、ワードパーフェクトおよびマイクロソフトワードのごとき市販のソフトウェアにフォーマットできるか、あるいはASCIIテキストファイルの形態で表し、ＤＢ２、サイベース、オラクル等のごときデータベース適用に保存できる。当業者は、容易に本発明のヌクレオチド配列情報をその上に記録したコンピューター読取り可能な媒体を得るために、いずれかに数のデータ処理装置構築フォーマット（例えば、テキストファイルまたはデータベース）も容易に適合できる。
【００６４】
当業者がコンピューター読取り可能な媒体中に供された配列情報にアクセスすることを可能にするコンピューター・ソフトウェアは、公に利用可能である。サイベース（Sybase）システム上でのＢＬＡＳＴ(Altschulら, 1990)およびＢＬＡＺＥ(Brutlag,ら, 1993)探索アルゴリズムを実施するソフトウェアを用いて、本明細書に提供され、他の生物からのＯＲＦまたはタンパク質に対する相同性を含むUnigeneおよびＥＳＴのごとき配列内のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を同定できる。かかるＯＲＦは、本発明の配列内のタンパク質をコードする断片であり、アミノ酸生合成、代謝、転写、翻訳、ＲＮＡプロセシング、核酸およびタンパク質分解、タンパク質改変およびＤＮＡ複製、制限、修飾、組換えおよび修復に用いる酵素のごとき一般的に重要なタンパク質を生成するのに有用である。
【００６５】
本明細書に用いた「標的」、「標的構造モチーフ」または「標的モチーフ」は、いずれかの合理的に選択された配列または配列の組合せをいい、ここに、その配列または配列群は、必要に応じて、標的モチーフまたはそのヌクレオチド配列の折り畳みに際して形成される３次元配置に基づいて選択される。当該技術分野において知られた種々の標的モチーフがある。
【００６６】
Ｃ．核酸発現および標的遺伝子抑制
本発明は、一例として、病原性標的生物の形質転換された宿主植物、形質転換された植物細胞ならびに形質転換された植物およびそれらの子孫を提供する。形質転換された植物細胞および形質転換された植物は、病原体保護効果を提供するために本明細書に記載された異種プロモーターの制御下で、ｄｓＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはｍＲＮＡ配列の１以上を発現するように設計され得る。これらの配列は病原体中で遺伝子抑制のために使用でき、それにより、保護された形質転換宿主生物上の病原体により引き起こされた病害のレベルまたは発生率を低下させる。本明細書に用いた、「遺伝子抑制」なる用語は、ｍＲＮＡへの遺伝子転写およびｍＲＮＡの引き続いての翻訳の結果として生成されたタンパク質のレベルを低下させるよく知られた方法のいずれをもいうと意図される。
【００６７】
また、遺伝子抑制は、転写後の遺伝子抑制および転写抑制を含めた遺伝子またはコード配列からのタンパク質発現の低下を意味することが意図される。転写後の遺伝子抑制は、抑制のために標的とされた遺伝子またはコード配列から転写されたｍＲＮＡの全てもしくは一部分および抑制のために用いた対応する二本鎖ＲＮＡ間の相同性により媒介され、リボソームによる結合またはリボソームによる翻訳の防止のための細胞に利用可能な利用可能なｍＲＮＡの量の実質的でかつ測定可能な低下をいう。転写されたＲＮＡは、共抑制と呼ばれるものを達成するセンス配向、アンチセンス抑制と呼ばれるものを達成するアンチセンス配向、またはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれるものを達成するｄｓＲＮＡを生成する双方の配向であることができる。
【００６８】
また、遺伝子抑制は、ウイルスの１以上の相同性または相補的配列の発現を阻害または抑制するように特に設計された、遺伝子抑制剤を含有する植物物質と接触し得る植物ウイルス中の標的遺伝子に対して有効であることができる。植物細胞中の形質発現を調節するアンチセンスまたはセンス配向のＲＮＡによる転写後遺伝子抑制は、米国特許第５，１０７，０６５号、第５，７５９，８２９号、第５，２８３，１８４号および第５，２３１，０２０号に開示されている。植物中の遺伝子を抑制するｄｓＲＮＡの使用は、ＷＯ９９／５３０５０、ＷＯ９９／４９０２９、米国公開第２００３／０１７５９６号、米国特許出願公開第２００４／００２９２８３号に開示されている。
【００６９】
植物ウイルスに対する転写後遺伝子抑制の有益な方法は、センス配向およびアンチセンス配向の安定化された転写されたＲＮＡを、例えば、ヘアピンまたはステム−アンド−ループ構造（例えば、米国公開第２００７／０２５９７８５号）として使用する。転写後の遺伝子抑制を達成するためのＤＮＡ構築物は、第１のセグメントが抑制のために標的とされた遺伝子のセグメントに実質的な同一性を示すアンチセンス配向を示すＲＮＡをコードするものであり得、それは、第１のセグメントに実質的な相補性を示すＲＮＡをコードする第２のセグメントに連結される。かかる構築体は、第１のセグメントと、第２のセグメントとのハイブリダイゼーションおよび、２つのセグメントを連結するヌクレオチド配列からのループ構造によるステム−アンド−ループ構造を形成する（ＷＯ９４／０１５５０、ＷＯ９８／０５７７０、米国第２００２／００４８８１４号および米国第２００３／００１８９９３号を参照）。また、前記（例えば、ＷＯ０５／０１９４０８）のごとく、さらなる標的遺伝子セグメントとの共発現を使用し得る。
【００７０】
本発明の１つの具体例により、外来性ヌクレオチド配列（すなわち、宿主植物細胞のゲノム中で天然には見出されていない）が提供され、その発現の結果、トスポウイルス、ベゴモウイルス、およびポルテクスウイルスよりなる群から選択される植物ウイルスの標的遺伝子のＲＮＡ分子に配列において実質的に類似し、ウイルスのゲノム内のヌクレオチド配列によりコードされたＲＮＡ配列を含むＲＮＡ配列の転写が生じる。実質的に類似したにより、外来性ＲＮＡ配列が、ウイルスゲノム中の標的配列のＲＮＡ媒介遺伝子抑制を達成できることを意味する。かくして、標的遺伝子に対応するヌクレオチド配列の発現の下方調節は達成される。
【００７１】
本発明のある具体例において、２１、３６、６０、１００、５５０または１０００までの隣接するヌクレオチドの断片、かかる配列と９０〜１００％の同一性を示す配列、またはそれらの相補体の発現を含めた、配列番号：１６９〜４５５またはその相補体のうちのいずれかの核酸配列の少なくとも２１の隣接するヌクレオチドの断片の発現を利用し得る。特定の具体例において、本発明により提供されるヌクレオチドは、配列番号：１、７、１３、１９、２５、３１、３７、４３、４７、５１、５５、５９、６３、６７、７１、８５、９９、１１３、１２７および１４１の中から選択された配列を含み得る。他の特定の具体例において、本発明により提供されるヌクレオチドは、配列番号：３７９〜４５５の中から選択された配列を含み得る。さらに他の具体例において、本発明により提供されるヌクレオチドは、配列番号：１６９〜４５５のいずれかの１以上のその配列の全長までのヌクレオチド１〜２１、２２〜５０、５１〜１００、１０１〜１５０、１５１〜２００、２０１〜２５０、２５１〜３００、３０１〜３５０、３５１〜４００、４０１〜４５０、４５１〜５００、５０１〜５５０、５５１〜６００、６０１〜６５０、６５１〜７００、７０１〜７５０、７５１〜８００、８０１〜８５０、８５１〜９００、９０１〜９５０、９５１〜１０００、１００１〜１０５０、１０５１〜１１００、１１０１〜１１５０、１１５１〜１２００、１２０１〜１２５０、１２５１〜１３００、１３０１〜１３５０、１３５１〜１４００、１４０１〜１４５０、１４５１〜１５００、１５０１〜１５５０、１５５１〜１６００、１６０１〜１６５０、１６５１〜１７００、１７０１〜１７５０、１７５１〜１８００、１８０１〜１８５０、１８５１〜１９００、１９０１〜１９５０、１９５１〜２０００、２００１〜２０５０、２０５１〜２１００、２３〜７５、７６〜１２５、１２６〜１７５、１７６〜２２５、２２６〜２７５、２７６〜３２５、３２６〜３７５、３７６〜４２５、４２６〜４７５、４７６〜５２５、５２６〜５７５、５７６〜６２５、６２６〜６７５、６７６〜７２５、７２６〜７７５、７７６〜８２５、８２６〜８７５、８７６〜９２５、９２６〜９７５、９７６〜１０２５、１０２６〜１０７５、１０７６〜１１２５、１１２６〜１１７５、１１７６〜１２２５、１２２６〜１２７５、１２７６〜１３２５、１３２６〜１３７５、１３７６〜１４２５、１４２６〜１４７５、１４７６〜１５２５、１５２６〜１５７５、１５７６〜１６２５、１６２６〜１６７５、１６７６〜１７２５、１７２６〜１７７５、１７７６〜１８２５、１８２６〜１８７５、１８７６〜１９２５、１９２６〜１９７５、１９７６〜２０２５、２０２６〜２０７５、２０７６〜２１２５、１〜５５０、２００〜７５０、３００〜８５０、４００〜９５０、５００〜１０５０、６００〜１１５０、７００〜１２５０、８００〜１３５０、９００〜１４５０、１０００〜１５５０、１１００〜１６５０、１２００〜１７５０、１３００〜１８５０、１４００〜１９５０、１５００〜２０５０の１以上を含むと記載し得る。配列番号：１６９〜４５５または配列番号：１、７、１３、１９、２５、３１、３７、４３、４７、５１、５５、５９、６３、６７、７１、８５、９９、１１３、１２７および１４１のいずれかの１以上の全てまたは一部分に相補的である配列、ここに、該配列の発現は、配列番号：１６９〜４５５のヌクレオチド配列によりコードされたいずれかの１以上の遺伝子の発現を抑制する、が考えられる。ｄｓＲＮＡを生成する発現のために配置された配列は、以下のものと組み合わせることができる：相乗的に標的ウイルスを抑制するための（１）積み重なったｍｉＲＮＡカセットに含むｍｉＲＮＡの生成のために設計された配列；および／または（２）ウイルスのアセンブリーの抑制のための配列。ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ媒介遺伝子抑制の標的として特定のサブ配列を選択する方法は、当該技術分野において知られている(例えば、Reynoldsら, 2004)。
【００７２】
本発明のｄｓＲＮＡ技術を用いる標的遺伝子の抑制は、ＲＮＡの二重領域に対応するヌクレオチド配列が抑制のために標的とされるという点で配列特異的である標的遺伝子転写物の一部分と同一のヌクレオチド配列を含むＲＮＡは、通常、抑制のために好ましい。また、標的配列に対する挿入、欠失および単一の点突然変異を含むＲＮＡ配列は、抑制に有効であることが判明した。本発明の効率において、抑制ｄｓＲＮＡおよび標的遺伝子の一部分は、少なくとも約８０％からの配列同一性、約９０％からの配列同一性、または約９５％からの配列同一性、または約９９％からの配列同一性、または約１００％さえの配列同一性を共有し得る。別法として、ＲＮＡの二重領域は、標的遺伝子転写物の一部分とハイブリダイズできるヌクレオチド配列として機能的に定義され得る。より大きな相同性を示す全長未満の配列は、より長い余り相同性でない配列を補う。同一のヌクレオチド配列の長さは、少なくとも約１８、２１、２５、５０、１００、２００、３００、４００、５００または少なくとも約１０００塩基であり得る。通常、標的遺伝子のサイズに依存して、２０〜１００を超えるヌクレオチドの配列が用いられるべきであり、しかしながら、約２００〜３００を超えるヌクレオチドの配列が好ましいかもしれなく、約５００〜１０００を超えるヌクレオチドの配列が特に好ましいかもしれない。本発明は、遺伝子突然変異、株多形性または進化的分岐により予期され得る配列変化を許容できるという有利さを有する。導入された核酸分子は、標的配列に絶対的には相同性であることを必要としないかもしれないく、標的遺伝子の１次転写生成物または完全に処理されたｍＲＮＡのいずれかに対して全長であることを必要としないかもしれない。したがって、当業者は、本明細書に開示されたごとく、ＲＮＡと標的遺伝子との間の１００％の配列同一性が本発明を実施するためには必要とさないことを理解する必要がある。
【００７３】
標的遺伝子発現の抑制は、内因性の標的ＲＮＡまたは標的ＲＮＡの翻訳により生成されたタンパク質のいずれかの測定により定量でき、抑制の結果は、細胞または生物の外部特性の検討により確認できる。ＲＮＡおよびタンパク質を定量するための技術は、当業者によく知られている。
【００７４】
ある具体例において、遺伝子発現は、少なくとも１０％、少なくとも３３％、少なくとも５０％、または少なくとも８０％抑制される。本発明の特定の具体例において、遺伝子発現は、ウイルスにより感染した宿主細胞内で少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％抑制され、かかるかなりの抑制が起こる。かなりの抑制は、検出可能な表現型（例えば、症状発現の低減）または抑制される標的遺伝子に対応するタンパク質のＲＮＡおよび／またはタンパク質における検出可能な減少を生じる十分な抑制をいうことを意図する。
【００７５】
ｄｓＲＮＡ分子は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにて合成され得る。ｄｓＲＮＡは、単一の自己相補的ＲＮＡ鎖により、または２つの相補的ＲＮＡ鎖から形成され得る。細胞の内因性ＲＮＡポリメラーゼは、ｉｎ ｖｉｖｏにて転写を媒介でき、または、クローン化されたＲＮＡポリメラーゼは、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏの転写に用いることができる。抑制は、器官、組織または細胞型における特定の転写；特定の環境要因（例えば、感染、ストレス、温度、化学的誘発物質）の刺激；および／または発生ステージまたは年齢での特定の設計転写により標的とされ得る。ＲＮＡ鎖はポリアデニル化されていてもされていないくてもよく；ＲＮＡ鎖は細胞の翻訳装置によりポリペプチドに翻訳できていてもできなくてもよい。
【００７６】
本明細書に用いた「病害防除剤」または「遺伝子抑制剤」なる用語は、ある具体例において、第３のＲＮＡセグメントにより連結した、第１のＲＮＡセグメントおよび第２のＲＮＡセグメントよりなる特定のＲＮＡ分子をいう。第１および第２のＲＮＡセグメントは、ＲＮＡ分子の長さ内に位置し、実質的に相互の逆位反復配列であり、第３のＲＮＡセグメントにより一緒に連結される。第１および第２のＲＮＡ間の相補性の結果、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏにてハイブリダイズして、ループを形成する第３のセグメントにより第１および第２のセグメントの各々の一端にて一緒に連結した二本鎖分子、すなわち、ステムを形成する２つのセグメントの能力を生じさせ、全構造はステムおよびループ構造に形成され、あるいは、より堅くハイブリダイズする構造は、ステム−ループノックド（knotted）構造に形成し得る。第１および第２のセグメントは常にであるが、しかし各々必ずではなく、ｄｓＲＮＡ分子により抑制されることを意図される標的ウイルス中の標的遺伝子から転写された標的ＲＮＡについて相同性のセンスおよびアンチセンス配列に対応する。
【００７７】
本明細書に用いた、植物ウイルスまたは宿主に適用する場合の「ゲノム」なる用語は、核内に見出されたウイルスＤＮＡもしくはＲＮＡまたは染色体ＤＮＡだけでなく、細胞の細胞内成分内に見出されたオルガネラＤＮＡを包含する。したがって、植物細胞に導入された本発明のＤＮＡは、染色体的に組み込むか、または細胞小器官局在化することができる。細菌に適用される場合の「ゲノム」なる用語は、細菌宿主細胞内の染色体およびプラスミドの双方を包含する。したがって、細菌宿主細胞に導入された本発明のＤＮＡは、染色体的に組み込むことも、プラスミド局在化することもいずれもできる。
【００７８】
本発明の組成物が、植物細胞のゲノムに組み込まれた組み換え遺伝子からの発現の生成物として植物種の種子内に組込むことができることが想定される。組み換え遺伝子を含有する植物細胞は、本明細書では、遺伝子組換え事象と考えられる。
【００７９】
Ｄ．組換えベクターおよび宿主細胞形質転換
組換えＤＮＡベクターは、例えば、線形または閉じた環状プラスミドであり得る。ベクター系は、細菌宿主のゲノムに導入される合計ＤＮＡを一緒に含有する単一のベクターまたはプラスミド、または２以上のベクターまたはプラスミドであり得る。加えて、細菌ベクターは発現ベクターであり得る。配列表に記載された核酸分子、またはその相補体もしくは断片は、例えば、連結したコード配列または他のＤＮＡ配列の発現を駆動するための１以上の微生物宿主において機能する適切なプロモーターの制御下でベクターに適切に挿入できる。多数のベクターがこの目的に利用可能であり、適切なベクターの選択は、主としてベクターに挿入される核酸のサイズ、およびベクターで形質転換される特定の宿主細胞に依存するであろう。各ベクターは、その機能（ＤＮＡの増幅またはＤＮＡの発現）、およびそれが適合性である特定の宿主細胞に依存する種々の成分を含む。細菌形質転換用のベクター成分は、一般的に、限定されるものではないが、１以上の以下のもの：シグナル配列、複製開始点、１以上の選択マーカー遺伝子、および外来性ＤＮＡの発現を可能にする誘導プロモーターを含む。
【００８０】
発現およびクローニングベクターは、一般的に、選択マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含む。この遺伝子は、選択培養培地中で増殖した、形質転換された宿主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードする。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート、テトラサイクリンへの抵抗性を与える、（ｂ）相補体栄養要求性欠失、または（ｃ）複合培地から利用可能でない非常に重要な栄養素、例えば、桿菌についてのＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子を提供するタンパク質をコードする。異種のタンパク質またはその断片で成功裡に形質転換されたそれらの細胞は、薬物抵抗性を与えるタンパク質を生成し、かくして、選択的方法から生存する。
【００８１】
また、ｍＲＮＡを生成する発現ベクターは、宿主生物により認識され、その核酸に作動可能に連結された誘導プロモーターを含有できる。調節配列および構造的ヌクレオチド配列について用いた「作動可能に連結した」なる用語は、調節配列が、連結した構造的ヌクレオチド配列の調節された発現を生じることを意味する。「調節配列」または「調節要素」は、構造的ヌクレオチド配列の上流（５’非コード配列）、内、下流（３’非翻訳配列）をいい、それは、関連した構造的ヌクレオチド配列の転写の時期およびレベルまたは量、ＲＮＡ処置または安定性、あるいは翻訳に影響する。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、エンハンサー、ステムループ構造、抑制因子結合配列およびポリアデニル化認識配列等を含み得る。
【００８２】
前記にリストされた成分の１以上を含む適切なベクターの構築は、標準的組換えＤＮＡ技術を使用する。単離されたプラスミドまたはＤＮＡ断片を、必要とされるプラスミドを生成することが望ましい形態において、切断、調整、再結合する。利用可能な細菌発現ベクターの例は、限定されるものではないが、Bluescript（商標） (Stratagene, La Jolla, CA)のごとき多機能の大腸菌クローニングおよび発現ベクター、ここに、例えば、核酸またはその断片は、β−ガラクトシダーゼのアミノ末端基Ｍｅｔおよび引き続いての７つの残基についての配列を含むフレームにおいてベクターに結合でき、その結果、ハイブリッドタンパク質が生成され；およびｐＩＮベクター(Van Heeke and Schuster, 1989)等を含む。
【００８３】
また、本発明は、１以上のＲＮＡ分子のウイルス抑制レベルの発現を達成するために植物への本発明のヌクレオチド配列の形質転換を考える。形質転換ベクターは当該技術分野において利用可能な方法を用いて容易に調製できる。形質転換ベクターは、ＲＮＡ分子に転写でき、かつ標的ウイルスまたはウイルス群のゲノムによりコードされた１以上のヌクレオチド配列に実質的に相同的および／または相補的である１以上のヌクレオチド配列を含み、その結果、それは標的植物寄生ウイルスにより１以上のヌクレオチド配列から転写されたＲＮＡの接触に際して、そのウイルスのゲノムのそれぞれのヌクレオチド配列の少なくとも１つの発現の下方調節が存在する。
【００８４】
形質転換ベクターは、ｄｓＤＮＡ構築体と称することもでき、また、組換え分子、病害防除剤、遺伝子分子またはキメラ的遺伝子構築体として定義され得る。本発明のキメラ遺伝子構築体は、例えば、１以上のアンチセンス転写物、１以上のセンス転写物、１以上の前記の各々をコードするヌクレオチド配列を含み、ここに、これらの形態の転写物の全てまたは一部分は、植物ウイルスのゲノム内のヌクレオチド配列によりコードされたＲＮＡ配列を含むＲＮＡ分子の全てまたは一部分に相同性である。
【００８５】
１つの具体例において、植物形質転換ベクターは、本発明の１以上のヌクレオチド配列に作動可能に連結された異種のプロモーターを含む単離され精製されたＤＮＡ分子を含む。ヌクレオチド配列は、標的ＲＮＡ転写物内に存在するＲＮＡの全てまたは一部分をコードするセグメントを含み、標的ＲＮＡの全てまたは一部分の逆位反復配列を含み得る。また、発現ベクターを含むＤＮＡ分子は、コード配列の上流またはコード配列内でさえ位置した機能的イントロン配列を含むこともでき、プロモーターと翻訳開始点との間に位置した５プライム（５’）非翻訳リーダー配列（すなわち、ＵＴＲまたは５’−ＵＴＲ）を含み得る。
【００８６】
植物形質転換ベクターは、１を超える遺伝子からの配列を含むことができ、かくして、１を超える標的ウイルスの遺伝子の発現を抑制するための１を超えるｄｓＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの生成を可能とし得る。例えば、ベクターまたは構築体は、図１０に示すごとく、抗ウイルス性配列の転写のための約８または１０まで、あるいはそれを超える核酸セグメントを含み得る。当業者は、その配列が異なる遺伝子に存在するものに対応するＤＮＡのセグメントが、遺伝子導入植物における発現用の単一の複合ＤＮＡセグメントに組み合わせることができることを容易に理解するであろう。あるいは、少なくとも１つのＤＮＡセグメントを既に含む本発明のプラスミドは、エンハンサーおよびプロモーターおよびターミネーター配列間のさらなるＤＮＡセグメントの連続する挿入により改変できる。複数遺伝子の抑制のために設計された本発明の病害防除剤において、抑制される遺伝子は、制御因子の有効性を増強するために同一植物ウイルス株または種から得ることができる。ある具体例において、遺伝子は、剤が有効であるウイルスの範囲を広げるために異なる植物ウイルスに由来できる。複数遺伝子が抑制または発現および抑制の組合せのために標的とされる場合、多シストロン性のＤＮＡ要素は、米国公開第２００４／００２９２８３号に例示および開示されるごとく調製できる。
【００８７】
本発明の組換えＤＮＡベクターまたは構築体は、植物細胞に選択可能な発現型を与える選択マーカーを含み得る。また、選択マーカーは、本発明のポリペプチドまたはタンパク質をコードする外来性の核酸を含む植物または植物細胞を選択するために用い得る。マーカーは、生物致死剤抵抗性、抗生物質耐性（例えば、カナマイシン、Ｇ４１８ブレオマイシン、ヒグロマイシン等）または除草剤耐性（例えば、グリホサート等）をコードし得る。選択マーカーの例は、限定されるものではないが、カナマイシン抵抗性をコードし、カナマイシン、Ｇ４１８等を用いて選択できるｎｅｏ遺伝子、ビアラホス抵抗性をコードするｂａｒ遺伝子；グリホサート抵抗性をコードする変異体ＥＰＳＰシンターゼ遺伝子；ブロモキシニルに対する抵抗性を与えるニトリラーゼ遺伝子；イミダゾリノンまたはスルホニル尿素抵抗性を与える変異体アセト乳酸シンターゼ遺伝子（ＡＬＳ）；およびメトトレキセート抵抗性ＤＨＦＲ遺伝子を含む。アンピシリン、ブレオマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、ヒグロマイシン、カナマイシン、リンコマイシン、メトトレキセート、ホスフィノトリシン、ピューロマイシン、スペクチノマイシン、リファンピシンおよびテトラサイクリン等に対する抵抗性を与える複数の選択マーカーが利用可能である。かかる選択マーカーの例は米国特許第５，５５０，３１８号；第５，６３３，４３５号；第５，７８０，７０８号および第６，１１８，０４７号に示されている。
【００８８】
また、本発明の組換えベクターまたは構築体は、スクリーニング（screenable）マーカーを含み得る。スクリーニングマーカーは、発現をモニターするために用い得る。典型的なスクリーニングマーカーは、種々の色素形成基質が知られている(Jeffersonら, 1987)酵素をコードする、β−グルクロニダーゼまたはｕｉｄＡ遺伝子（ＧＵＳ）；緑色蛍光性タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光性タンパク質（ＲＦＰ）または特有の波長で典型的に蛍光を発するタンパク質の大ファミリーのいずれかのもののごとき種々の蛍光性タンパク質（ＦＰ）遺伝子の１以上；植物組織におけるアントシアニン色素（赤色）の生成を調節する生成物をコードするＲ座遺伝子(Dellaportaら, 1988)；種々の色素形成基質が知られている（例えば、ＰＡＤＡＣ、色原体セファロスポリン）酵素をコードする遺伝子のβ−ラクタマーゼ遺伝子(Sutcliffeら, 1978)；ルシフェラーゼ遺伝子(Owら, 1986)  色原体カテコールを変換できるカテコールジオキシゲナーゼをコードするｘｙｌＥ遺伝子(Zukowskiら, 1983)；α−アミラーゼ遺伝子(Ikatuら, 1990)；ＤＯＰＡおよびドーパキノンにチロシンを酸化させ、今度は、メラニンに凝縮できる酵素をコードするチロシナーゼ遺伝子(Katzら, 1983)；色原体α−ガラクトース基質−を触媒するα−ガラクトシダーゼを含む。
【００８９】
本発明で用いた植物形質転換ベクターは、例えば、アグロバクテリウムチュメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)のＴｉプラスミド（例えば、米国特許第４，５３６，４７５号、第４，６９３，９７７号、第４，８８６，９３７号、第５，５０１，９６７号およびＥＰ ０ １２２ ７９１）に由来したものを含み得る。また、アグロバクテリウムリゾゲネス(Agrobacterium rhizogenes)プラスミド（または「Ｒｉ」）は当該技術分野において有用で、かつ知られている。他の好ましい植物形質転換ベクターは、例えば、Herrera-Estrella (1983); Bevan (1983), Klee (1985)およびＥＰ ０ １２０ ５１６により開示されたものを含む。
【００９０】
ある具体例において、機能的な組換えＤＮＡは、植物ゲノムに非特異性の位置で導入され得る。特別なケースにおいて、部位特異的な組込みにより組換えＤＮＡ構築体を挿入することは有用であり得る。植物中で機能することが知られているいくつかの部位特異的組換系が存在し、それは、米国特許第４，９５９，３１７号に開示されたｃｒｅ−ｌｏｘおよび米国特許第５，５２７，６９５に開示されたＦＬＰ−ＦＲＴを含む。
【００９１】
本発明で用いた宿主細胞の形質転換に適切な方法は、原形質体の形質転換(米国特許第５，５０８，１８４号; Omirullehら, 1993)による、乾燥／抑制媒介ＤＮＡ取込み(Potrykusら, 1985)による、エレクトロポレーション（米国特許第５，３８４，２５３号）による、、炭化ケイ素繊維(Kaepplerら, 1990; 米国特許第５，３０２，５２３号;および米国特許第５，４６４，７６５号)による、アグロバクテリウム媒介形質転換（米国特許第５，５６３，０５５号；第５，５９１，６１６号；第５，６９３，５１２号；第５，８２４，８７７号；第５，９８１，８４０号；第６，３８４，３０１号）およびＤＮＡ被覆粒子の加速（米国特許第５，０１５，５８０号；第５，５５０，３１８号；第５，５３８，８８０号；第６，１６０，２０８号；第６，３９９，８６１号；第６，４０３，８６５号；Padgetteら 1995）等によるごとき、細胞に導入できる事実上いずれの方法（例えば、Mikiら, 1993ご参照）も含むことが考えられる。これらのごとき技術の適用を介して、事実上いずれの種の細胞も安定的に形質転換し得る。複数細胞の種の場合には、遺伝子組換え細胞が遺伝子組み換え生物に再生され得る。
【００９２】
植物に発現ベクターを導入する最も広く利用された方法は、アグロバクテリウム（例えば、Horschら, 1985）の自然な形質転換系に基づく。A. tumefaciensとA. rhizogenesは、遺伝子的に植物細胞を形質転換する植物病原性の土壌細菌である。A.tumefaciensおよびA.rhizogenesのＴｉおよびＲｉプラスミドは、各々、植物の形質転換を担う遺伝子を運ぶ。アグロバクテリウム媒介遺伝子移入のためのアグロバクテリウム・ベクター系および方法の記載は、Gruberら 1993; Mikiら, 1993, Moloneyら, 1989,および米国特許第４，９４０，８３８号および第５，４６４，７６３号を含めた多数の参考文献により提供されている。自然に植物と相互作用するSinorhizobium、 RhizobiumおよびMesorhizobiumのごとき他の細菌は、多数の種々の植物に遺伝子移入を媒介するように改変できる。これらの植物関連共生細菌は、非武装Ｔｉプラスミドおよび適切なバイナリーベクターの双方の獲得により遺伝子移入に適格性となることができる(Broothaertsら, 2005)。また、植物にウイルス配列を導入する方法を用い得る(例えば、Grimsley, 1990, Boulton, 1996)。
【００９３】
植物における遺伝子導入植物の生成方法、および異種の核酸の発現方法は、特に知られており、植物病原ウイルスに低減された感受性を示す遺伝子導入植物を調製するために本明細書に提供された核酸と共に用い得る。植物形質転換ベクターは、例えば、本明細書に開示された核酸を生成するｄｓＲＮＡを植物形質転換ベクターに挿入し、次いで、これらを植物に導入することにより、調製できる。公知の１つのベクター系は、アグロバクテリウムチュメファシエンスの自然遺伝子移入系を改変することにより由来する。自然系は、Ｔ−ＤＮＡとして知られた大きなセグメントを含有する大きなＴｉ（腫瘍誘導）プラスミドを含み、これは、形質転換した植物に移される。Ｔｉプラスミドのもう一つのセグメントのｖｉｒ領域は、Ｔ−ＤＮＡ転移を担う。Ｔ−ＤＮＡ領域は、末端反復により隣接される。改変されたバイナリーベクターにおいて、腫瘍誘発遺伝子を欠失させて、ｖｉｒ領域の機能を利用して、Ｔ−ＤＮＡ境界配列により隣接する外来性ＤＮＡを移す。また、Ｔ領域は、遺伝子導入植物および細胞の効率的な回収のための選択マーカー、およびｄｓＲＮＡをコードする核酸のごとき転移のための配列を挿入するための複数クローニング部位を含み得る。
【００９４】
トマト細胞の形質転換用プロトコールは当該技術分野において知られている（例えば、McCormick, 1991）。別法の植物形質転換プロトコールは、Boulton (1996)および Grimsley (1990)に言及されている。コショウのごとき他の植物用の形質転換および再生プロトコールは、当該技術分野において知られている（例えば、ChristopherおよびRajam, 1996; 米国特許第５ ，２６２，３１６号; Liuら 1990）。例えば、トマトの形質転換用のかかるプロトコールは、種子消毒、種子発芽および生長、実生の外植、アグロバクテリウム培養増殖および調製、共培養、選択および再生のよく知られた工程を含むことができる。
【００９５】
Ｅ．遺伝子導入植物および細胞
アグロバクテリウム形質転換方法を典型的に用いて形成した遺伝子導入植物は、１つの染色体に挿入された単一の単純な組換えＤＮＡ配列を含むこともでき、これは遺伝子組換え事象と呼ばれている。かかる遺伝子導入植物は、挿入された外来性配列につきヘテロ接合と呼ぶことができる。例えば、導入遺伝子に対してホモ接合性の遺伝子導入植物は、それ自体、例えば、Ｆ０植物への単一の外来性遺伝子配列を含む独立した分離体遺伝子導入植物を性的に交配（自配）させ、Ｆ１種子を生成させることにより得ることができる。生成されたＦ１種子の４分の１は、導入遺伝子に対してホモ接合性であろう。Ｆ１種子の発芽の結果、典型的には、ヘテロ接合性とホモ接合性の区別を可能とするＳＮＰアッセイまたは熱増幅アッセイを用いる接合性につき試験（すなわち、接合状態アッセイ）できる植物を生じる。ヘテロ接合性植物と、それ自体またはもう一つのヘテロ接合性の植物との交配の結果、ヘテロ接合性の後代、ならびにホモ接合性遺伝子導入およびホモ接合性のヌル（null）後代も生じさせる。
【００９６】
組換えＤＮＡ構築体での植物の直接的な形質転換に加えて、遺伝子導入植物は、組換えＤＮＡに構築体を有する第１の植物とその構築体を欠く第２の植物とを交配することにより調製できる。例えば、遺伝子抑制用の組換えＤＮＡは、形質転換に受け入れられる第１の植物系に導入して、第２の植物系と交配できる遺伝子導入植物を生成して、遺伝子抑制用の組換えＤＮＡを第２の植物系に遺伝子移入できる。
【００９７】
Ｆ．ウイルス抵抗性スクリーニング
ＴＳＷＶ、ＴＹＬＣＶおよびＰｅｐＭＶのごときウイルスを用いる接種および病害試験は、機械的伝達またはアグロ感染のいずれかを用いて行った(例えば、Boulton, 1996; Grimsley, 1990)。いくつかの改変を含むKumarら, (1993)により本質的に記載されたＴＳＷＶ感染は機械的に達成された。植物のベゴモウイルス（例えば、ＴＹＬＣＶ）の接種および病害試験は、以下のごとくアグロ感染により達成された：トマト（Lycopersicon esculentum）品種の種子（抵抗性（Ｒ）：ＨＰ９１９；中間抵抗性（ＩＲ）：Ｈｉｌａｒｉｏ；感受性（Ｓ）：Ａｒｌｅｔｔａ）を蒔き、各接種につき約２０の植物ならびに、非接種またはモック接種対照を７〜１０日間、可視の初生葉のない子葉段階まで生育させた。次いで、より低い側の子葉を針がない注射器を用いて浸潤させ、引き続いて、さらなる接種を、約１〜２週間後に２〜３の本葉段階での茎への注入により行った。浸潤または注入は形質転換されたＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを利用し、新鮮な培養物の接種からシェーカー（１７０ＲＰＭ）上で２８℃で約１５時間ｐＢＩＮベクターの選択用抗生物質を含むＹＥＢブロス中で増殖させたウイルスの感染クローンを含有するアセトシリンゴンで誘導した。２８℃の増殖に続いて、培養物を沈降させ、１０ｍｌ ＭＭＡ（１リットルについて：２０ｇスクロース、５ｇ ＭＳ塩、１．９５ｇ ＭＥＳ、ＮａＯＨでｐＨ ５．６、および１ｍｌの２００ｍＭアセトシリンゴンストック；１リットルまでｄＨ２Ｏ）中で再懸濁した。植物は、２０〜２５℃（昼／夜）、温室またはグロースチャンバ中で１６時間の光で生育させた。６週後に、症状は以下のごとく得点した：
１  可視（抵抗性）の症状なし
３  非常に軽度（抵抗性）の症状
５  中度の症状
７  強度の症状
９  非常に強度の症状
【００９８】
ポルテクスウイルスペピーノモザイクウイルス（ＰｅｐＭＶ）での接種は以下のごとく達成した：ウイルス接種は、カーボランダムパウダーで葉のダスティング後のトマト実生（９〜１２日齢の感受性品種Apollo）を機械的に感染させることにより調製した。感染した組織を収穫し、１ｇの感染組織を５〜１０ｍｌのリン酸塩緩衝液（ｐＨ９）で均質化した。次いで、この調製した接種材料を用いて、子葉段階（播種後の７〜１０日）で実験植物に機械的に接種した。接種された植物は、７０％の相対湿度を持つ温室中で、２４時間当たり１６時間の光で１９〜２３℃（日／夜）で温室中で生育させた。植物は接種後１１〜２１日に評価し、以下のごとく得点した：
１  可視（抵抗性）の症状なし
３  いくらかの葉の白化
５  葉静脈の白化および／または退緑および葉のモザイク
７  葉静脈の白化および退緑および釘状（spiky）葉
９  葉静脈の白化および釘のごとき葉および黄色モザイク
【００９９】
Ｇ．ＲＮＡ抽出およびｓｉＲＮＡのノーザンブロット法
ＲＮＡは、本質的に製造者の指示（Invitrogen）に従いTrizol（登録商標）を用いて小型ＲＮＡノーザンブロットのために抽出した。略言すると、約１００〜２００ｍｇの新鮮な葉組織をドライアイス上に配置した１．５ｍｌの遠心分離管中の液体窒素中で粉砕した。試料をドライアイスから取り出し、１ｍｌのTrizolを換気フード下で添加した。これをよく混合し、室温（ＲＴ）にて１０分間インキュベートした。次に、０．２ｍｌのクロロホルムを添加し、試料を３０秒間手により振り、４℃で１５分間冷却されたテーブルトップ遠心分離機中で１３０００ｒｐｍにて遠心分離した。
【０１００】
水相を新しいチューブに移し、０．５ｍｌのイソプロパノールを添加し、チューブを数回反転させ、次に、ＲＴにて１０分間インキュベートし、続いて４℃にて１５分間冷却したテーブルトップ遠心分離機中で１３０００ｒｐｍの遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを０．７５ｍｌの７５％エタノールを添加することにより洗浄し、次に、４℃で１０分間１３０００ｒｐｍにて遠心分離した。上清を廃棄し、ＲＮＡは室温にて１０分間空気乾燥させた。
【０１０１】
ペレットをリボヌクレアーゼを含まない１００μｌのｄｄＨ２Ｏを添加することにより再懸濁し、数秒間撹拌した。試料は、ドライアイスで凍結し、ＲＮＡを約２０分間スピード真空の使用により濃縮した：この工程は、すべての微量のエタノールを除去する。ＲＮＡを分光光度計により定量した（通常、約８０〜１００μｇがトマト葉から回収される）。約７μｇの合計ＲＮＡをｓｉＲＮＡ分析のために負荷した。
【０１０２】
ＤＩＧ標識プローブを用いるｓｉＲＮＡノーザンブロット：約３０分間、１１０ボルトにて１５％ＴＢＥ尿素ゲル(Invitrogen EC68855BOX)を予め試行する。試料は、７μｌのNovex（登録商標）ＴＢＥ尿素試料緩衝剤２×（Invitrogen LC6876）を約７μｇの合計ＲＮＡに添加することにより、負荷のために調製し、それらを９４℃にて約１０分間変性させ、直ちに氷上で冷却した。紫外線下の試料の視覚化が必要であるならば、エチジウムブロマイドを、試料緩衝剤に添加した（緩衝剤１００μｌ毎につき１μｌのＥｔＢｒ＠０．６２４ｍｇ／ｍｌ）。試料は、ゲルウェルに負荷する前に簡単に沈降させて、青色色素がゲルの底に達するまで、電気泳動を０．５×ＴＢＥ中で１８０ボルトにて約１．５時間行った。その泳動が終了後、ゲルを紫外線下で観察した。
【０１０３】
ゲルのNytranスーパーチャージナイロン細胞膜(VWR 28151-318)への移行は、Transblotセミ乾燥移行セル(BioRad 170-3940)中で行った：この膜は、水中で予め濡らし、２片のかなり厚い紙(BioRad 170-3968)と一緒に０．５×ＴＢＥ中で平衡させた。その移行は、製造者の指示（陽極−ブロット紙−膜−ゲル−ブロット紙−陰極）により設定し、３８０ ｍＡｍｐにて５０分間続けた。移行後、膜を約１０分間空気乾燥させて、ＲＮＡをStratalinker 1800 (Stratagene)中でそれに架橋させた。
【０１０４】
ハイブリダイゼーション：膜は、ハイブリダイゼーションオーブン中で１０ｍｌのPerfectHyb 溶液(Sigma H7033)中で１時間４２℃にて予めハイブリダイズさせた。製造者の指示に従い、PCR DIG 標識ミックス(Roche 11585550910)で調製した２００ナノグラムのＤＩＧ標識プローブを９４℃にて１０分間変性させ、氷上で冷却し、１０ｍｌの新鮮なハイブリダイゼーション溶液に添加し、それを予めハイブリダイズした膜に添加して、ハイブリダイゼーションオーブン中で４２℃にて一晩インキュベートした。
【０１０５】
洗浄および検出：ハイブリダイゼーション溶液を廃棄後、膜を簡単に２×ＳＳＣ ０．１％ＳＤＳ中で濯ぎ；次いで、５０℃にて２０分間予め暖めた２×ＳＳＣ  ０．１％ＳＤＳ中で２回、５０℃にて２０分間予め暖めた１×ＳＳＣ  ０．１％ＳＤＳ中で２回、５０℃にて２０分間予め暖めた０．５×ＳＳＣ  ０．１％ＳＤＳ中で２回洗浄した。検出は、DIG Wash and Block Buffer Set (Roche 11585762001)で提供された指示に従い行った。略言すると、膜は、１×Washing Buffer中で２分間濯いだ後、１００ｍＬのDIG Blocking Solution (１０ｍＬ １０×ブロッキング緩衝液＋１０ｍＬ １０×マレイン酸＋８０ｍＬ水)中でＲＴにて１時間インキュベートした。次いで、それは、１０μｌの抗ジゴキシゲニン−ＡＰ抗体(Roche 11093274910)を添加した１００ ｍＬの新鮮なBlocking Solution中で室温にて１時間インキュベートした。膜は、１００ｍＬの1X DIG Washing BufferでＲＴにて２回洗浄し、１００ｍＬの1X DIG Detection Bufferで平衡させた。約１ｍＬのCDP-スター溶液 (Roche 12041677001)を膜の頂部にわたり分布させ、それを２つのプラスチックシート間に配置し、ＲＴにて５分間インキュベートし、展開前に可変量の時間フィルムに曝露した。
【０１０６】
Ｈ．遺伝子組換えトマト植物中の構築体の確認
ｄｓＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを生成するために設計された配列は、トマト形質転換用バイナリーベクターにクローン化した。Ｒ０遺伝子導入植物は、前記に概説し、実施例７に記載した小型ＲＮＡノーザンブロット解析および抵抗性アッセイにより特定の約２１ｍｅｒおよび／またはウイルス抵抗性効力の生成につき分析した。例えば、配列番号：１〜１５４のいずれかのうち、または配列番号：１６９〜４５５またはその一部分内からの、他の選択されたｄｓＲＮＡを生成する配列またはｍｉＲＮＡを生成する配列を利用して、さらなる有効な構築体を生成し得る。かくして、例えば、ＭＩＲ骨格配列、例えば、大豆からのＭＯＮ１、大豆からのＭＯＮ５、イネからのＭＯＮ１３、トウモロコシからのＭＯＮ１８、トウモロコシからのｍｉＲ１５９ａ、またはトウモロコシからのｍｉ１６７ｇ（配列番号：１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、または１６５）を利用して、ｄｓＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ生成配列を作成し得る。ある具体例において、ｄｓＲＮＡ生成配列またはｍｉＲＮＡ生成配列は、配列番号：１、７、１３、１９、２５、３１、３７、４３、４７、５５、５９、６３、６７、７１、８５、９９、１１３、１２７、１４１または３７９〜４５５のいずれかを含み得る。特定の具体例において、配列は、配列番号：１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４または３７５のいずれかを含み得る．
【０１０７】
本発明は、植物病害の制御の増強のための所望の形質を達成するために、非遺伝子組換えアプローチを含めた植物における他の病害制御形質との組合せを含む。区別される作用機序を使用する病害制御形質の組合せは、抵抗性が圃場において発生する可能性の低減のために、単一の制御形質を抱く植物上の優れた耐久性で保護された遺伝子導入植物を提供できる。かくして、ある具体例において、少なくとも２または少なくとも３つの作用機序を使用して、ウイルス抵抗性を与え、ここに、かかる作用機序は、ｄｓＲＮＡの発現、ｍｉＲＮＡの発現、ビリオン集合の抑制、非遺伝子組換えウイルス抵抗性形質の発現型発現および遺伝子組換えタンパク質発現よりなる群から選択される。特定の具体例において、遺伝子組換えタンパク質発現は、外皮タンパク質をコードする核酸配列の発現、移行タンパク質コード配列の発現またはレプリカーゼをコードする核酸配列の発現を含む。
【０１０８】
また、本発明は、本発明の１以上の配列を含む商品生成物に関し、本発明の１以上のヌクレオチド配列を含む組換え植物または種子から生成されることが、本発明の具体例として特に考えられる。本発明の１以上の配列を含む商品生成物は、限定されるものではないが、本発明の１以上の配列を含む植物のミール、油、粉砕または全体の粒子もしくは種子、または組換え植物もしくは種子のいずれかのミール、油、または粉砕または全体の粒子を含みことが意図される。本明細書に考えられた１以上の商品または商品生成物中の本発明の１以上の配列の検出は、その商品または商品生成物が、ｄｓＲＮＡ媒介遺伝子抑制方法を用いて植物病害を制御する目的で、本発明の１以上のヌクレオチド配列を発現するように設計された遺伝子導入植物よりなるという事実上の証拠である。
【０１０９】
Ｉ．核酸組成物
本発明は、ｄｓＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを生成するためのヌクレオチド配列を含む核酸を得る方法を提供する。１つの具体例において、かかる方法は以下のものを含む：（ａ）植物病原ウイルスの遺伝子のｄｓＲＮＡ媒介、またはｍｉＲＮＡ媒介またはｓｉＲＮＡ媒介抑制に際して、それらの発現、機能および発現型のための１以上の標的遺伝子を分析し；（ｂ）ｄｓＲＮＡ媒介抑制分析において改変された発現型を示す標的ウイルスからのすべてまたは一部分のヌクレオチド配列またはその相同体を含むハイブリダイゼーションプローブで核酸ライブラリーを探索し；（ｃ）ハイブリダイゼーションプローブとハイブリダイズするＤＮＡクローンを同定し；（ｄ）工程（ｂ）で同定されたＤＮＡクローンを単離し；次いで、（ｅ）工程（ｄ）で単離したクローンを含む核酸断片を配列決定し、ここに、配列決定された核酸分子は、ＲＮＡヌクレオチド酸配列またはその相同体のすべてまたは一部分を転写する。ｄｓＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを利用するＲＮＡ媒介抵抗性アプローチは、ｄｓＲＮＡコード配列のループに抗ウイルス性配列を配置することにより、またはポリペプチド発現カセットのイントロンに効果的なｄｓＲＮＡまたはｍｉＲＮＡコード配列を挿入する（イントロン性ｄｓＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ；Frizziら, 2008）（例えば、図９）ことにより補足し得る。例えば、外皮タンパク質および／またはレプリカーゼのごときウイルスタンパク質は、ｄｓＲＮＡのループにタンパク質コード配列を挿入することにより、さらなる導入遺伝子カセットを用いることなく、効果的なｄｓＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡをさらに発現する遺伝子導入植物中で発現し得る。
【０１１０】
もう一つの具体例において、ｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの実質的な部分を生成するヌクレオチド配列を含む核酸断片を得るための本発明の方法は、以下のものを含む：（ａ）標的病原体からの１つのヌクレオチド配列の一部分に対応する第１および第２のオリゴヌクレオチドプライマーを合成し；次いで、（ｂ）増幅された核酸分子が本発明のｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの実質的な部分の実質的な部分を転写する工程（ａ）の第１および第２のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、クローニングベクター中に存在する核酸挿入物を増幅する。
【０１１１】
本発明を実施において、標的遺伝子はベゴモウイルス、トスポウイルスまたはポルテクスウイルスに由来し得る。いくつかの基準が好ましい標的遺伝子の選択に使用し得ることが考えられる。かかる配列は、例えば、複数の株および／または種からのベゴモウイルスまたはトスポウイルス配列を整列することにより同定し得る。バイオインフォマティクス・アプローチは、１００を超えるベゴモウイルス株および種に大部分保存される多数の２１ｍｅｒを同定した。いくつかの例において、特定の２１ｍｅｒ以内のミスマッチはより広いターゲッティング標的を可能とした。
【０１１２】
本明細書に用いた「由来した」なる用語は、特定の指定された出所または種から得ることもできる特定のヌクレオチド配列をいい、その指定された出所または種から必ずしも直接的でなくてもよい。
【０１１３】
１つの具体例において、ウイルス複製および／または症候学の抑制を生じる遺伝子が選択される。本発明で用いられる他の標的遺伝子は、例えば、ウイルス伝達、植物内の移行またはビリオン集合（例えば、末端反復配列を含むトスポウイルス末端配列）に重要な役割を果たすものを含み得る。ウイルス制御のための本発明の１つの態様により、標的配列は、実質的に標的植物ウイルスに由来し得る。ベゴモウイルス、トスポウイルスまたはポルテクスウイルスからクローン化された典型的な標的配列のうちのいくつかは、配列表、例えば、配列番号：１、７、１３、１９、２５、３１、３７、４３、４７、５１、５５、５９、６３、６７、７１、８５、９９、１１３、１２７および１４１、ならびに配列番号：１６９〜４５５中で見出し得る。
【０１１４】
本発明の目的で、ｄｓＲＮＡ分子は、ｇＤＮＡもしくはｃＤＮＡライブラリー、またはその部分から由来した標的遺伝子配列のポリメラーゼ鎖（ＰＣＲ）増幅により得ることもできる。ＤＮＡライブラリーは、当業者により知られる方法を用いて調製し、ＤＮＡ／ＲＮＡを抽出し得る。標的生物から生成されたゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーは、ｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの生成用のＰＣＲ増幅に用い得る。
【０１１５】
次いで、標的遺伝子配列は、当該技術分野において容易に利用可能な方法を用いて、ＰＣＲ増幅および配列決定し得る。当業者は、ＰＣＲ条件を改変して、最適なＰＣＲ生成物形成を保証し得る。確認されたＰＣＲ生成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のためのテンプレートとして用いて、含まれた最小のプロモーターを含むセンスおよびアンチセンスＲＮＡを生成し得る。１つの具体例において、本発明は、植物ウイルス制御因子として用い得る単離および精製されたヌクレオチド配列を含む。単離および精製されたヌクレオチド配列は、配列表に記載されたものを含み得る。
【０１１６】
本明細書に用いた「コード配列」、「構造的ヌクレオチド配列」または「構造的核酸分子」なる語句は、適切な調節配列の制御下に配置された場合に、通常ｍＲＮＡを介して、ポリペプチドに翻訳されるヌクレオチド配列をいう。コード配列の境界は、５’終点での翻訳開始コドンおよび３’終点での翻訳停止コドンにより決定される。コード配列は、限定されるものではないが、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＥＳＴおよび組換えヌクレオチド配列を含むことができる。
【０１１７】
「組換えＤＮＡ」または「組換えヌクレオチド配列」なる用語は、突然変異誘発、制限酵素等を介する操作により遺伝子的に設計された改変を含むＤＮＡをいう。
【０１１８】
実施例
本発明者らは、本明細書において、植物に設計されたｍｉＲＮＡ、ｔａ−ｓｉＲＮＡおよび／または段階的ｓｉＲＮＡを組み込むことにより、植物中のウイルス感染を制御するための手段を同定した。これらの属性のいずれもまたはいずれの組合せも、植物感染の有効な抑制、植物病害の抑制および／または病害症状の重症度の低下を生じることができる。
【０１１９】
実施例１
複数ウイルス抵抗性の標的
標的ウイルスの配列はＧｅｎｂａｎｋから組み立てた。図１は、模式的に代表的な標的ウイルスのゲノム構成を示す。標的ベゴモウイルスについて、５８単離体のトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）、３０単離体のトマト巻葉ニューデリーウイルス（ＴｏＬＣＮＤＶ）、５単離体のトマト重度（severe）巻葉ウイルス（ＴｏＳＬＣＶ）、５単離体のコショウ黄金モザイクウイルス（ＰｅｐＧＭＶ）および２単離体のコショウワステコ（huasteco）黄色葉脈ウイルス（ＰＨＹＶＶ）を分析した。標的トスポウイルスについて、トマト−スポッテド−ウイルトウイルス（ＴＳＷＶ）、落花生類芽壊死ウイルス（ＧＢＮＶ）およびトウガラシ退緑斑紋ウイルス（ＣａＣＶ）、６Ｌセグメント（ＴＳＷＶ：４；ＧＢＮＶ：１；ＣａＣＶ：１）、２３Ｍセグメント（ＴＳＷＶ：２０；ＧＢＮＶ：２；ＣａＣＶ：１）および４５Ｓセグメント（ＴＳＷＶ：４１ ＧＢＮＶ：２；ＣａＣＶ：２）を分析した。標的ポルテクスウイルス単離体について、ペピーノモザイクウイルス（ＰｅｐＭＶ）の１３単離体を分析した(例えば、Lopezら, 2005; Cotillonら, 2002)。バイオインフォマティクス・アプローチを利用して、できる限り多数の標的ウイルスを抑制するために、人工ｍｉＲＮＡとして用いる約２０〜２４のヌクレオチド配列を同定した。
【０１２０】
以下の表（表１）は、ｄｓＲＮＡ媒介ウイルス抵抗性アプローチで用いられる設計されたｍｉＲＮＡの生成ならびに、配列の同定のための導入遺伝子構築体の設計における可能な使用のために分析した配列をリストする。
【０１２１】
【表１−１】
2012523850.tif 000002
【０１２２】
【表１−２】
2012523850.tif 000003
【０１２３】
実施例２
ＲＮＡｉ用ウイルスセグメント
選択されたウイルスゲノムは、部分的に約５０ｂｐがオーバーラップした約３５０〜５００ｂｐ断片に分割した（例えば、図２Ａ〜２Ｄ参照）。効力データは、形質転換植物中で個々に発現された場合に、特定のウイルス種を制御するための単一の配列の能力につき収集した。最初の試験において、２．７ｋＢジェミニウイルスＤＮＡ−Ａゲノムの約２．３ ｋＢに対応するセグメントをスクリーニングした（図２Ｂ；セグメント１〜８）。同様に、図２Ｃに示すごとく、６．５ｋＢ ＰｅｐＭＶ（ポルテクスウイルス）ゲノムの約４ｋＢを表すセグメント１〜８を試験した。図２Ｄは、効力につき試験した三者間のトスポウイルスゲノム部分：８．９ｋＢ Ｌ ｖＲＮＡ（すなわち、ウイルスＲＮＡ）（セグメント１〜３）の約１．５ ｋＢ；５．４ｋＢ Ｍ ｖＲＮＡ（セグメント４〜６）の約１．５ ｋＢ；および２．９ｋＢ Ｓ ｖＲＮＡ（セグメント７〜８）の約１ｋＢを示す。
【０１２４】
１つの代表的な試験において、ＴＳＷＶ外皮タンパク質（ヌクレオカプシド）の一部分に対応する核酸セグメントを、逆位反復配列（図３）として発現した場合の効力につき試験した。ウイルス抵抗性は、トマト植物中のｓｉＲＮＡ生成と相関することが判明した。また、ＴＹＬＣＶ抵抗性スクリーニングにおいて、Ｒ１植物を導入遺伝子の存在につき最初に検討し、次いで、ＴＹＬＣＶ伝染性クローンに感染させた。対照として、非形質転換（野生型）トマト系を含み；これらの野生型の植物は、典型的にはこのアッセイにおける接種により、５％未満の「抵抗性」、すなわち、５％未満の植物回避感染を有する。対照的に、ＣＰ４陽性植物（ウイルス配列を含む発現カセットに連結されたグリホサートに対する抵抗性を特定する選択マーカー遺伝子を含む）中で、複製タンパク質（３構築体）を標的とする導入された核酸セグメントを含むＲ１植物の５６％、外皮タンパク質（３構築体）を標的とする導入された核酸セグメントを含む２７％、およびコード領域（２構築体）の残りを標的とする導入された核酸を含む３８％が、ＴＹＬＣＶに対する抵抗性を示した。
【０１２５】
次いで、トスポウイルスゲノムのこれらおよびさらなる部分にわたるさらなる試験を、代表的なウイルスに対するｄｓＲＮＡ関連ウイルス抵抗性を媒介できるウイルスゲノムの一部分を同定および規定するために試みた。これらの配列は、二本鎖の（ｄｓＲＮＡ）生成構築体における逆位反復配列として試験され、ここに、試験された構築体は、アンチセンス配向における所与の配列（例えば、後記のごとき配列番号：３７９〜４４２）に続いて、ループ配列、次いで、センス配向にて所与の配列、および転写ターミネーターに作動可能に連結したプロモーターを含んだ。逆方向反復配列の転写および塩基対合後、二本鎖ＲＮＡ領域は、ウイルス遺伝子発現を標的とし干渉する特定の抗ウイルス性ｓｉＲＮＡを生成するために、ダイサーまたはダイサー用リボヌクレアーゼにより切断する。
【０１２６】
他のトスポウイルスのうち、トウガラシ退緑斑紋ウイルス（ＣａＣＶ）、落花生類芽壊死ウイルス（ＧＢＮＶ）およびトマト−スポッテド−ウイルトウイルス（ＴＳＷＶ）。遺伝子組換えＲ１植物のウイルス抵抗性試験は、トスポウイルスゲノムの全領域がｄｓＲＮＡの標的と同じくらい等しく有効であることを示した。かくして、かなりのウイルス抵抗性は、トスポウイルス外皮タンパク質（ＣＰ）、ならびに糖タンパク質をコードするウイルスゲノムセグメントのＧＰ１、ＧＰ２、ＧＰ３、およびＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）タンパク質セグメントの発現を破壊する転写体の発現後に見られた。図１１Ａ〜Ｂは、遺伝子導入植物から見られた抵抗性の結果を記載する。個々の遺伝子組換え事象および標的領域を表す各バーを用いて、例えば、ＣＰ領域を標的とするｄｓＲＮＡを発現するＲ１植物の５０〜８０％はＣａＣＶに抵抗性であったが、ウイルス糖タンパク質を標的とするｄｓＲＮＡを発現するＲ１の約２５〜９０％がウイルス抵抗性を示し、ウイルスＲｄＲＰを標的とするｄｓＲＮＡを発現するＲ１の約２５〜８０％は、抵抗性を示した（例えば、図１１Ｂ）。ＴＳＷＶに対するｄｓＲＮＡ媒介抵抗性は特に有効であり、Ｒ１の１００％は、外皮タンパク質を標的とする構築体を含むすべての試験した事象からのウイルス抵抗性を示す（図１１Ａ）。トスポウイルス遺伝子発現を標的とするｄｓＲＮＡの生成において用いる選択された代表的なＴＳＷＶ、ＣａＣＶおよびＧＢＮＶ配列を（リストしたアンチセンス配向にて）配列番号：４１９〜４３６にリストする。
【０１２７】
さらなる試験は、ＰｅｐＭＶゲノムの全領域がこのポルテクスウイルスに対するｄｓＲＮＡ媒介抵抗性を生成するのに等しく有効であることを示した。図１２は、ほとんどの場合、ＣＰ（外皮タンパク質）、ＣＰ／ＭＯＶ（外皮タンパク質および移行タンパク質配列）、ＲｄＲＰ、ＴＧＢ（宿主植物中のウイルス細胞−対−細胞および長距離移行に関与するトリプルジーンブロック・モチーフ・タンパク質）またはＴＧＢ／ＲｄＲＰを標的とするウイルスにコードされたセグメントを含むすべての遺伝子組換えＲ１植物の９５〜１００％は、ＰｅｐＭＶに抵抗性であったことを示す。ポルテクスウイルス遺伝子発現を標的とするｄｓＲＮＡの生成における使用につき選択された代表的なＰｅｐＭＶ配列をリストされたアンチセンス配向にて、配列番号：４３７〜４４２にリストする。
【０１２８】
同様に、ベゴモウイルス（ジェミニウイルス）ゲノムの領域を、このウイルス群に対するｄｓＲＮＡ媒介抵抗性を生成するためのそれらの能力につき試験した。ＴＹＬＣＶ、ＴｏＳＬＣＶ、ＰｅｐＧＭＶ、ＰＨＹＶＶおよびＴｏＬＣＮＤＶを代表的なベゴモウイルスとしてバイオアッセイにおいて試験した。図１３Ａ〜Ｂは、遺伝子組換えＲ１植物の約７０％までが、ＣＰがｄｓＲＮＡ標的であった場合に、所与のウイルスに抵抗性を示すが、遺伝子組換えＲ１植物の約１００％までが、ウイルス複製タンパク質をコードする核酸セグメントがｄｓＲＮＡ標的であった場合には、抵抗性を示すことを示す。ベゴモウイルス遺伝子発現を標的とするｄｓＲＮＡの生成における使用につき選択された代表的なトスポウイルス配列をリストされたアンチセンス配向にて、配列番号：３７９〜４１８にリストする。
【０１２９】
一緒に、これらの３つの属（すなわち、トスポウイルス、ポルテクスウイルス、ベゴモウイルス）中のウイルスの多数の有効なｄｓＲＮＡ標的を同定した。
【０１３０】
これらのＲＮＡｉ結果に基づいて、効果的な標的領域を標的とする配列を各ウイルスにつき選択し、核酸構築体上の２つの遺伝子組換えカセットに融合して、複数のウイルスファミリー中の複数のウイルスを標的とした。このアプローチの一例を図１４に示す。ベゴモウイルスについて、Ｒｅｐ領域を用い、トスポウイルスおよびポルテクスウイルスについては、ＣＰ領域が同一ウイルスの異なる株中に比較的多く保存されるので、ＣＰ領域を選択した。カセット中で利用した配列のいくつかは、関連するウイルス株への保護が広がることを可能とするために予期されたＧ：：Ｕ塩基対合に徴して、さらに改変した。カセット中のウイルス遺伝子発現を標的とするｄｓＲＮＡの生成における使用につき選択された代表的な配列は、図１４の「カセット１」について配列番号：４４３〜４４６に、図１４の「カセット２」について配列番号４４７〜４５１にリストし、各々は、配列表にリストされたアンチセンス配向である。かくして、例えば、カセット１（配列番号：４４３）に見出されるＧＢＮＶ−ＣＰ１を標的とする核酸セグメントは、配列番号：４２９に見出されるＧＢＮＶ−ＣＰ１を標的とするセグメントに類似するが、同様に、カセットに用いた他の核酸セグメントについては、相対的効力につき最初に試験された標的セグメントに対し前記のごとき改変を有し得る。
【０１３１】
実施例３
複数ウイルス抵抗性のための人工ｄｓＲＮＡ融合構築体
また、異なるウイルス群（ジェミニウイルス、トスポウイルス、ポルテクスウイルス）の２または３からのｄｓＲＮＡ発現のためのヌクレオチドセグメントを単一の発現カセット中で組み合わせ、植物を形質転換細胞から生成し、１を超えるウイルスに対する抵抗性につき分析した。これを、例えば、実施例２に示したウイルス抵抗性を与えるｓｉＲＮＡを生成するのに有効な試験したウイルスゲノムの断片を融合させることにより達成した。実施例２と同様に、これらの配列を二本鎖（ｄｓＲＮＡ）生成構築体における逆位反復配列セグメントとして試験し、ここに、試験した構築体は、アンチセンス配向にて所与の配列（例えば、後記の配列番号：４５２−４５４）に作動可能に連結したプロモーターに続いて、ループ配列、次いで、センス配向にて所与の配列、および転写ターミネーターを含んだ。逆位反復配列の転写および塩基対合後、二本鎖ＲＮＡ領域をダイサーまたはダイサー様リボヌクレアーゼにより切断して、ウイルス遺伝子発現を標的とし干渉する特定の抗ウイルス性ｓｉＲＮＡを生成する。このアプローチにおいて、各標的ウイルスに特異的なｄｓＲＮＡセグメントは、複数ウイルス抵抗性に用いた（図４Ａ）。
【０１３２】
別法として、種々のウイルスゲノムの保存領域は、種または密接に関連した種内の異なる変異体に対するより広範囲スペクトルの抵抗性を提供し得る。加えて、ウイルスゲノムの標的セグメントに高度に類似するが、１００未満の同一性である配列を含む逆位反復配列を設計でき、効力につき試験し得る。このアプローチ、すなわち、部分的に類似するか、または「不完全な」逆位反復配列は、関連するウイルス株および種に対するＲＮＡ媒介保護を広げる得る。例えば、ＲＮＡレベルでのＧ−Ｕ塩基対合が、いくらかの典型的なワトソンクリック塩基対合（例えば、Ａ−Ｕ）として比較可能な程度の熱力学的安定性を有するので、いくつかの不完全な反復はそれにもかかわらず完全および不完全なウイルス標的のＲＩＳＣおよびガイド切断を活性化し得る。
【０１３３】
また、この例において、かかる部分的に類似する逆位反復配列は、ＲＮＡｉ媒介ウイルス抵抗性を刺激するために、１以上のウイルス標的配列に約１００％の同一性を示す長さが少なくとも２１ヌクレオチドの１以上のサブ配列を含み得る。かくして、例えば、１以上のウイルス標的に対する不完全な反復セグメントの全体の同一性は、７５％の低さであり得るが、２１〜２４ヌクレオチドの２〜４またはそれを超えるサブ配列は、ウイルスの標的配列に対する１００％の同一性を示す。加えて、かかる「不完全な」ｄｓＲＮＡの存在は、植物中のｄｓＲＮＡの蓄積を増加させ、かつ転写遺伝子発現抑制のトリガリングを防止するのを助け得る。かくして、ウイルスの１を超える株または１を超えるウイルスからのヌクレオチドセグメントは、ｄｓＲＮＡ発現のための融合構築体の設計および調製に利用し得る。
【０１３４】
かかる配列は、例えば、複数の株および／または種からのジェミニウイルスまたはトスポウイルス配列を整列させることにより同定し得る。表２は、全体のゲノムレベルにてジェミニウイルス標的間のパーセント類似性を示す。表３は、全体のゲノムレベルにてトスポウイルス標的間のパーセント類似性を示す。
【０１３５】
【表２】
2012523850.tif 000004
【０１３６】
【表３】
2012523850.tif 000005
【０１３７】
図４Ｂは、模式的にｄｓＲＮＡ発現のための典型的な融合構築体を示す。ヒトおよび宿主植物のゲノムとのかなりの同一性を欠く配列を含むコード配列を逆位反復配列の生成につき選択した。ウイルス由来セグメントは、例えば、ｄｓＲＮＡ発現につき「アンチセンス−ループ−センス」にて配向し得る。このアプローチは、複数のウイルス抵抗性に必要な遺伝子組換えｄｓＲＮＡカセットのサイズを低減できる。図４Ｂの模式的に記載された人工融合構築体を、配列番号：４５２〜４５３としてリストする。配列番号：４５２の人工外皮タンパク質構築体は、以下のごとき配列を含む：ｂｐ１〜１５７：ループ用のＴＹＬＣＶプレコートタンパク質；ＴＹＬＣＶおよびＴｏＬＣＮＤＶ ＣＰを標的とするｂｐ１５８〜５０７（すなわち、３５０ｂｐセグメント）；ＴｏＳＬＣＶ、ＰｅｐＧＭＶおよびＰＨＹＶＶ ＣＰ発現を標的とするｂｐ５０８〜８５１（すなわち、３４４ｂｐセグメント）。配列番号：４５３は以下のごときセグメントを含む：ループ用のＴＳＷＶ外皮タンパク質（ＣＰ）を標的とするｂｐ１〜１６０；ＴＳＷＶ ＣＰを標的とするｂｐ１６１〜４５６（すなわち、２９６ｂｐセグメント）；ＰｅｐＭＶ ＣＰを標的とするｂｐ４５７〜６８７（すなわち、２３１ｂｐセグメント）；ＣａＣＶおよびＧＢＮＶ ＣＰを標的とするｂｐ６８８〜９１９（すなわち、２３２ｂｐセグメント）。配列番号：４５３、複数のトスポウイルスに対する人工ＣＰ配列およびＰｅｐＭＶについての効力結果を図１５に示す。５つのジェミニウイルス（ＴＹＬＣＶ、ＴｏＬＣＮＤＶ、ＴｏＳＬＣＶ、ＰｅｐＧＭＶおよびＰＨＹＶＶ）のＲｅｐタンパク質を標的とするさらなる人工ｄｓＲＮＡ融合構築体を配列番号：４５４として与える。この配列において、ｂｐ１〜１５０は、ループ用のＴＹＬＣＶＲｅｐタンパク質を標的とし；ｂｐ１５１〜５００（すなわち、３５０ｂｐセグメント）は、ＴＹＬＣＶおよびＴｏＬＣＮＤＶＲｅｐタンパク質を標的とし；ｂｐ５０１〜８６０（すなわち、３６０ｂｐセグメント）は、ＴｏＳＬＣＶ、ＰｅｐＧＭＶおよびＰＨＹＶＶＲｅｐタンパク質を標的とする。
【０１３８】
実施例４
設計されたｍｉＲＮＡアプローチ：適切な配列の選択
実施例１に記載したバイオインフォマティクス・アプローチを用いて、ジェミニウイルス複製および／または症状発現のｍｉＲＮＡ媒介抑制に有用であると考えられるジェミニウイルス配列を標的とする、長さが約２１ｎｔのいくつかの適切な配列を同定した（表４；図５）。
【０１３９】
【表４】
2012523850.tif 000006
【０１４０】
実施例１に記載したバイオインフォマティクス・アプローチを用いて、トスポウイルス複製および／または症状発現のｍｉＲＮＡ媒介抑制に有用であると考えられるトスポウイルス配列を標的とする、長さが約２１ｎｔのいくつかの適当な配列を同定した（表５；図６）。
【０１４１】
【表５】
2012523850.tif 000007
【０１４２】
実施例１に記載されたバイオインフォマティクス・アプローチを用いて、トスポウイルス複製および／または症状発現のｍｉＲＮＡ媒介抑制に有用であると考えられるポルテクスウイルス配列を標的とする、長さが約２１ｎｔのいくつかの適当な配列を同定した（表６；図７Ａ 〜７Ｂ）。
【０１４３】
【表６】
2012523850.tif 000008
【０１４４】
実施例５
ＭＩＲ遺伝子骨格におけるｍｉＲＮＡを生成する配列の組込み
表４〜６のｍｉＲＮＡを生成する配列を遺伝子合成により導入遺伝子構築体に組み込んだ。例えば、野性型２１ｎｔのｍｉＲＮＡを生成する配列（本願の配列番号：１５５）を含む大豆からの野性型ＭＩＲ遺伝子骨格「ＭＯＮ１」（米国公開第２００７／０３００３２９号を参照）を改変して、野生型ｍｉＲＮＡを生成する配列をＧｅｍｉｎｉ１標的（配列番号：１）で置換し、Ｇｅｍｉｎｉ１／ＭＯＮ１構築体（配列番号：１５６）を生じさせた。かくして、ＭＩＲ骨格（例えば、配列番号：１５５のＭＯＮ１骨格）は、野性型２１ｎｔのｍｉＲＮＡを生成する配列を表４〜６のｍｉＲＮＡ配列のいずれかで置換することにより改変できる。
【０１４５】
同様に、大豆からのＭＯＮ５（配列番号：１５７）、イネからのＭＯＮ１３（配列番号：１５９）、トウモロコシからのＭＯＮ１８（配列番号：１６１）、トウモロコシからのｍｉＲ１５９ａ（配列番号：１６３）、またはｍｉＲ１６７ｇ（配列番号：１６５）は、表４〜６のｍｉＲＮＡを生成する配列を含む骨格配列として用いた。かくして、以下の配列を生成した（表７）：
【０１４６】
【表７】
2012523850.tif 000009
【０１４７】
例えば、配列番号：１〜１５４のいずれかのうちから、または配列番号：１６９〜３６２またはその部分内からの他の選択されたｍｉＲＮＡを生成する配列は、ＭＩＲ骨格配列、例えば、大豆からのＭＯＮ１、大豆からのＭＯＮ５、イネからのＭＯＮ１３、トウモロコシからのＭＯＮ１８、トウモロコシからのｍｉＲ１５９ａ、またはトウモロコシからのｍｉ１６７ｇ（配列番号：１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、または１６５）と利用して、さらなる効果的なｍｉＲＮＡを生成する構築体を生成し得る。加えて、ＭＩＲ骨格配列は、例えば、選択されたウイルスに由来または人工（例えば、コンセンサス）配列でｍｉＲＮＡを特定する植物由来骨格配列の配列の一部分を置換することにより、および／または、短い、例えば、３’および／または５’終端にてなされた欠失により、改変でき、これらは例えば、後記の配列番号：１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、３６３、３６４、３６５、３６７、３６９、３７０、３７３、３７４および３７５のｍｉＲＮＡを生成する配列およびＭＩＲ骨格部分に反映されている。
【０１４８】
配列番号：１６９〜３６２内から同定されたされた２１−ｍｅｒ、例えば、配列番号：１〜１５４のうちまたは内を個々に、または１つの発現カセットが存在する時間にて２以上をＴＹＬＣＶおよびＴＳＷＶのごとき適当なウイルスに対する遺伝子組換えトマト植物中の効力につき試験した。複数の有効な２１−ｍｅｒは、多シストロン性または段階的ｓｉＲＮＡ骨格を用いて、１つの遺伝子組換えカセットにおいて発現する（例えば、図８）。２１−ｍｅｒのかかる試験からのウイルス抵抗性アッセイの結果を実施例７に示す。
【０１４９】
一旦、効果的な抗ウイルス性ｍｉＲＮＡを同定すれば、単一遺伝子組換え形質として発現することにより複数ｍｉＲＮＡが発生して、遺伝子導入植物中の複数ウイルス抵抗性を達成する。これは、前記と一緒に（例えば、配列番号：１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、３６３〜３７５を作成するため）記載されたか、複数抗ウイルス性の約２１ｎｔ配列を送達できるｔａ−ｓｉＲＮＡまたは段階的ｓｉＲＮＡ遺伝子構造を用いて、設計されたＭＩＲ遺伝子を融合させることにより達成される（例えば、図８）。後のアプローチは、野生型ｓｉＲＮＡをｔａ−ｓｉＲＮＡまたは段階的ｓｉＲＮＡ骨格中の有効な抗ウイルス性２１ｎｔ配列で置換するために、遺伝子合成の新しいラウンドを介して達成される。
【０１５０】
実施例６
ＲＮＡベースの抵抗性の補足
ｄｓＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを利用するＲＮＡ媒介抵抗性アプローチは、ｄｓＲＮＡコード配列のループに、抗ウイルス性配列、例えば、タンパク質をコードするものを配置することにより、またはポリペプチド発現カセットのイントロンへ効果的なｄｓＲＮＡまたはｍｉＲＮＡコード配列の挿入（イントロン性ｄｓＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ；Frizziら, 2008）により補足できる（例えば、図９）。例えば、外皮タンパク質および／またはレプリカーゼのごときウイルスタンパク質は、ｄｓＲＮＡのループにタンパク質コード配列を挿入することにより、さらなる導入遺伝子カセットの使用なくして、効果的なｄｓＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡも発現する遺伝子導入植物において発現し得る。また、ジェミニウイルス複製に干渉するペプチド・アプタマーコード配列を使用し得る(例えば、Lopez-Ochoaら, 2006)。
【０１５１】
かくして、人工配列は、ウイルス抵抗性の発現型を増大するためにｄｓＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡと共に発現し得る。例えば、トスポウイルスゲノムから設計された人工ヌクレオチドループを用い得る。トスポウイルス（ｓｓＲＮＡ）ゲノムは、各ゲノム成分の両端にて８〜１１ｎｔの保存された末端反復の存在により「パンハンドル（panhandle）」構造を含む。例えば、ＧＢＮＶ（落花生類芽壊死ウイルス）またはＣａＣＶ（トウガラシ退緑斑紋ウイルス）からのゲノムの各成分からのこれらの末端反復（配列番号：１６７〜１６８）を融合し、植物形質転換構築体中のループ形成配列の一部分として用い得る。かかる人工配列は、例えば、配列番号：３７６〜３７８または配列番号：４５５を含むことができ、逆転写酵素に競合する人工基質として機能でき、ウイルス−ゲノム成分の複製の適切な環状化に干渉でき、それら自体はＲＮＡｉを介して効果的なヌクレオチドセグメントを生成でき、または前記の１以上を含み、かくして、ビリオン集合に干渉する。
【０１５２】
図１６は、ｄｓＲＮＡを生成するための構築体中のトスポウイルス末端配列の包含（inclusion）の結果、ＣａＣＶのごときウイルスに対する測定可能な抵抗性を生じることを示す。試験した構築体のおいて、それら自体が配列番号：１６８を含む配列番号：３７６〜３７８を融合して、配列番号：４５５（すなわち、配列番号：４５５のｂｐ１〜２４７は配列番号：３７６を含み；ｂｐ２４８〜３０３は配列番号：３７７を含み、ｂｐ３０４〜３６９は配列番号：３７８を含む）を生成した。この構築体をセンスおよびアンチセンス配向の双方で試験し、ウイルス抵抗性のレベルを非遺伝子組み換えであるが、同質遺伝子的である対照トマト植物により示されたものと比較した。
【０１５３】
例えば、外皮タンパク質またはレプリカーゼをコードする配列、ならびに前記のごとき人工配列を同様にイントロン配列内に組み込み得る。かくして、複数の作用機序は、単一の発現カセット（例えば、図９）、または１以上の発現カセットに設計することにより、発生し得る。
【０１５４】
実施例７
設計されたｍｉＲＮＡを用いる典型的なウイルス抵抗性アッセイの結果
表７にリストした設計されたｍｉＲＮＡ生成構築体を効力につき試験した。ジェミニウイルスおよびポルテクスウイルスのアッセイについてのバイオアッセイ結果を表８〜９に示す。ウイルス抵抗性はｍｉＲＮＡ発現により観察され、所与の導入遺伝子転写物の発現および適切な処理に関連した。例えば、配列番号：１６６について、ＰｅｐＭＶ６／ｍｉｒ１６７ｇの適切な処理は観察されなく、この構築体にウイルス抵抗性は見られなく、かくして、遺伝子組換えＲ１植物においてｍｉＲＮＡ生成とウイルス抵抗性と関連した。トスポウイルス実験に関しては、各々、ＲｄＲＰ、ＲｄＲＰ、ＮｓＭおよびＮ遺伝子を標的とする配列番号：３７０、３７１、３７３および３７５からの転写体の発現および適当な処理を観察した。ＴＳＷＶに感染した場合に、ＣＰ４陽性Ｒ１植物は症状の低減を示した。各々、ＮｓＭおよびＮ遺伝子を標的とする配列番号：３７２および３７４について、ｍｉＲＮＡの適切な処理を観察せず、症状の低減は示されなかった。
【０１５５】
合成ｍｉＲＮＡは、ＰｅｐＭＶに対して最も有効であり、ジェミニウイルスおよびトスポウイルスに対する、遅延または低減したウイルス感染症状を与えた。構築体は標的ウイルスを相乗的に抑制するために積み重なったｍｉＲＮＡカセット中で組み合わせることができる。単一の発現カセットから複数のｍｉＲＮＡを発現できるので、例えば、８または１０の抗ウイルス性ｍｉＲＮＡを発現する構築体（図１０Ａ〜１０Ｂに示した）を生成できる。さらなるアプローチとして、抗ウイルス性ｍｉＲＮＡ発現カセットは、ｄｓＲＮＡ発現カセットの「ループ」配列（例えば、図９）として挿入して、ウイルスの制御用のｄｓＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの機序を組み合わせることができる（図１０Ｃ参照）。
【０１５６】
【表８】
2012523850.tif 000010
ａ  遺伝子導入植物に検出されたｍｉＲＮＡの適切な処理
ｂ  トマト黄化巻葉ウイルス（ＴＹＬＣＶ）、トマト巻葉ニューデリー・ウイルス（ＴｏＬＣＮＤＶ）、コショウ黄金モザイクウイルス（ＰｅＰＧＭＶ）、またはコショウワステコ黄色葉脈ウイルス（ＰＨＹＶＶ）に対する抵抗性についてのＲ１ ＣＰ４陽性分離体平均パーセンテージ±ｓ．ｄ。
【０１５７】
【表９】
2012523850.tif 000011
ａ  遺伝子導入植物に検出されたｍｉＲＮＡの適切な処理
ｂ  ＰｅｐＭＶに対する抵抗についてのＲ１ ＣＰ４陽性分離体の平均パーセンテージ±ｓ．ｄ。
＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊ 
【０１５８】
本明細書に開示および特許請求したすべての組成物および方法は、本開示に徴して過度の実験なくして調製および実施できる。本発明の組成物および方法は、前記の例示的具体例の点から記載されているが、変形、変化、改変および変更が、本明細書に記載された組成物、方法、および方法の工程または工程の順序において、本発明の真の概念、精神および範囲に逸脱することなく、適用し得ることは当業者には明らかであろう。より詳しくは、化学的また生理学的に関連するある剤が、同一または同様の結果が達成しつつ、本明細書に記載された剤の代わりに用い得ることは明らかであろう。当業者に明白なかかる同様の置換および改変のすべては、添付した特許請求の範囲により規定される発明の精神、範囲および概念内にあるとみなされる。
【０１５９】
参考文献
以下にリストした参考文献を、背景を補足、説明、提供し、または本明細書に用いた方法、技術および／または組成物を教示する範囲まで、ここに出典明示して本明細書の一部とみなす。
米国特許第４，５３６，４７５号；米国特許第４，６９３，９７７号；米国特許第４，８８６，９３７号；米国特許第４，９４０，８３８号；米国特許第４，９５９，３１７号；米国特許第５，０１５，５８０号；米国特許第５，１０７，０６５号；米国特許第５，１１０，７３２号；米国特許第５，２３１，０２０号；米国特許第５，２６２，３１６号；米国特許第５，２８３，１８４号；米国特許第５，３０２，５２３号；米国特許第５，３８４，２５３号；米国特許第５，４６４，７６３号；米国特許第５，４６４，７６５号；米国特許第５，５０１，９６７号；米国特許第５，５０８，１８４号；米国特許第５，５２７，６９５号；米国特許第５，４５９，２５２号；米国特許第５，５３８，８８０号；米国特許第５，５５０，３１８号；米国特許第５，５６３，０５５号；米国特許第５，５９１，６１６号；米国特許第５，６９３，５１２号；米国特許第５，６３３，４３５号；米国特許第５，７５９，８２９号；米国特許第５，７８０，７０８号；米国特許第５，８２４，８７７号；米国特許第５，８３７，８４８号；米国特許第５，８５０，０１９号；米国特許第５，９８１，８４０号；米国特許第６，１１８，０４７号；米国特許第６，１６０，２０８号；米国特許第６，２２９，０６７号；米国特許第６，３８４，３０１号；米国特許第６，３９９，８６１号；米国特許第６，４０３，８６５号；米国特許第６，８５２，９０７号。
【０１６０】
米国公開第２００２／００４８８１４号；米国公開第２００３／０１７５９６号；米国公開第２００３／０１８９９３号；米国公開第２００４／００２９２８３号；米国公開第２００５／０１２０４１５号；米国公開第２００５／１４４６６９号；米国公開第２００６／０２００８７８号；米国公開第２００６／０１７４３８０号；米国公開第２００７／０２５９７８５号；米国公開第２００７／０３００３２９号；米国公開第２００８／００６６２０６号。
【０１６１】
Allenら, Cell 121:207-221, 2005.  
Altschulら, J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990.  
Ambrosら, RNA 9:277-279, 2003.  
Bartel, Cell 116:281-297, 2004. 
Bevan, Nature 304:184-187, 1983.
Boulton, “Agrobacterium-Mediated Transfer of Geminiviruses to Plant Tissues,” in “Methods in Molec. Biol., vol. 49：Plant Gene Transfer and Expression Protocols, ed. H. Jones, Humana Press, Totowa, NJ, 1996.
BrodersenおよびVoinnet, Trends Genetics, 22:268-280, 2006. 
Broothaertsら, Nature, 433:629-633, 2005.
Brutlagら, Comp. Chem. 17：203-207, 1993.
ChristopherおよびRajam, Pl. Cell Tiss. Org. Cult. 46:245-250, 1996.
Chuangら, PNAS, 97:4985-4990, 2000. 
Cotillonら, Arch. Virol. 147:2225-2230, 2002.  
Dellaportaら, Stadler Symposium 11:263-282, 1988.
Elbashirら, Genes & Devel., 15:188-200, 2002.
Frizziら, Plant Biotechnol. J., 6:13-21, 2008.
【０１６２】
Griffiths-Jones, Nucleic Acids Res., 31:439-441, 2003.  
Grimsley, Physiol. Plantarum, 79:147-153, 1990.  
Gruberら, In：Vectors for Plant Transformation, GlickおよびThompson (Eds.), CRC Press, Inc., Boca Raton, 89-119, 1993.
HamiltonおよびBaulcombe, Science, 286:950-952, 1999.  
Hannon, Nature 418:244-251, 2002.
Haymesら, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985). 
Herrera-Estrella Nature 303:209-213, 1983.
Hirelら, Plant Molecular Biology, 20:207-218, 1992.
Horschら, Science, 227:1229, 1985.
Ikatuら, Bio/Technol. 8:241-242, 1990.
Jeffersonら, EMBO J. 6:3901-3907, 1987.
Jones-Rhoadesら Annu. Rev. Plant Biol., 57:19-53, 2006.   
【０１６３】
Kaepplerら, Plant Cell Reports, 9:415-418, 1990.
Katzら, J. Gen. Microbiol. 129:2703-2714, 1983.
Kim, Nature Rev. Mol. Cell Biol., 6:376-385, 2005.  
Klee, Bio/Technol. 3:637-642, 1985.
Kumarら, Plant Dis. 77:938-941, 1993.
Liuら, Plant Cell Rep. 9:360-364, 1990. 
Lopezら, Arch. Virol. 150:619-627, 2005.
Lopez-Ochoaら, J. Virol., 80:5841, 2006.
McCormick, Plant Tissue Culture Manual B6:1-9, 1991.  
Mikiら, In：Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, GlickおよびThompson (Eds.), CRC Press, 67-88, 1993.  
Moloneyら, Plant Cell Reports, 8:238, 1989.
Niuら, Nature Biotechnology 24:1420-1428, 2006.
【０１６４】
Odellら, Nature 313:810-812, 1985.
Omirullehら, Plant Mol. Biol., 21:415-28, 1993.
Owら, Science 234:856-859, 1986.
Padidamら, J. Gen. Virol. 73:1609-1616, 1999.  
Potrykusら, Mol. Gen. Genet., 199:183-188, 1985.
Redenbaughら in “Safety Assessment of Genetically Engineered Fruits and Vegetables”, CRC Press, 1992.
Reynoldsら, Nat Biotechnol. 22:326-30, 2004.
Sambrookら, (ed.), Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
Sutcliffeら, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 75:3737-3741, 1978.
Tang,  Trends Biochem. Sci., 30:106-14, 2005.
TomariおよびZamore, Genes & Dev., 19:517-529, 2005.  
Tomariら Curr. Biol., 15:R61-64, 2005.
Van HeekeおよびSchuster, J. Biol. Chem. 264:5503-5509, 1989.
Wesleyら, Plant J., 27:581-590, 2001.
【０１６５】
国際公開第９８／０５７７０号；国際公開第９９／０５３０５０号；国際公開第９９／０４９０２９号；国際公開第９４／０１５５０号；国際公開第０５／０１９４０８号
【図１】
2012523850.tif 000012
【図２Ａ】
2012523850.tif 000013
【図２Ｂ】
2012523850.tif 000014
【図２Ｃ】
2012523850.tif 000015
【図２Ｄ】
2012523850.tif 000016
【図３】
2012523850.tif 000017
【図４】
2012523850.tif 000018
【図５】
2012523850.tif 000019
【図５−１】
2012523850.tif 000020
【図６】
2012523850.tif 000021
【図６−１】
2012523850.tif 000022
【図７Ａ】
2012523850.tif 000023
【図７Ａ−１】
2012523850.tif 000024
【図７Ｂ】
2012523850.tif 000025
【図７Ｂ−２】
2012523850.tif 000026
【図８】
2012523850.tif 000027
【図９】
2012523850.tif 000028
【図１０】
2012523850.tif 000029
【図１１Ａ】
2012523850.tif 000030
【図１１Ｂ】
2012523850.tif 000031
【図１２】
2012523850.tif 000032
【図１３Ａ】
2012523850.tif 000033
【図１３Ｂ】
2012523850.tif 000034
【図１４】
2012523850.tif 000035
【図１５】
2012523850.tif 000036
【図１６】
2012523850.tif 000037
【配列表】
2012523850000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成23年12月16日(2011.12.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2012523850000001.app
【国際調査報告】
2012523850.tif 000038
2012523850.tif 000039
2012523850.tif 000040