【手続補正書】
【提出日】平成23年3月8日(2011.3.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
スラウストキトリアレス（Thraustochytriales）目である微生物の多価不飽和脂肪酸含量を豊富にする方法であって、飽和の１％未満の溶存酸素レベルを有する発酵培地で、前記微生物を発酵させることを含む方法。
【請求項２】
微生物の脂質を生産するための方法であって、該方法が、
（ａ）スラウストキトリアレス目の微生物、炭素源、および制限栄養素源を含む培地の発酵を行い、バイオマス密度を増加させるために該発酵培地中で飽和の少なくとも約４％の溶存酸素レベルを維持するのに十分な条件を供するステップと、
（ｂ）次に、前記発酵培地中で飽和の約１％またはそれ未満の溶存酸素レベルを維持するのに十分な条件を供し、前記微生物が前記脂質を生産するのに十分な条件を供するステップと、
（ｃ）前記微生物の脂質を回収するステップと、
を含み、前記微生物の脂質の少なくとも約１５％が多価不飽和脂質である、方法。
【請求項３】
微生物の脂質を生産するための方法であって、該方法が、
（ａ）スラウストキトリアレス目の微生物、炭素源、および制限栄養素源を含む培地の発酵を行い、バイオマス密度を増加させるために該発酵培地中で飽和の少なくとも約４％の溶存酸素レベルを維持するのに十分な条件を供するステップと、
（ｂ）次に、前記発酵培地中で飽和の約１％またはそれ未満の溶存酸素レベルを維持するのに十分な条件を供し、前記微生物が前記脂質を生産するのに十分な条件を供するステップと、
（ｃ）前記微生物の脂質を回収するステップと、
を含み、前記脂質が、バイオマスの乾燥細胞重量の少なくとも２０％である、方法。
【請求項４】
微生物の脂質を生産するための方法であって、該方法が、
（ａ）スラウストキトリアレス目の微生物、および炭素源を含む培地の発酵を行い、バイオマス密度を増加させるために該発酵培地中で飽和の少なくとも約４％の溶存酸素レベルを維持するのに十分な条件を供するステップと、
（ｂ）次に、前記発酵培地中で飽和の約１％またはそれ未満の溶存酸素レベルを維持するのに十分な条件を供し、前記微生物が前記脂質を生産するのに十分な条件を供するステップと、
（ｃ）前記微生物の脂質を回収するステップと、
を含み、前記微生物の脂質の少なくとも約１５％が多価不飽和脂質である、方法。
【請求項５】
微生物の脂質を生産するための方法であって、該方法が、
（ａ）スラウストキトリアレス目の微生物、および炭素源を含む培地の発酵を行い、バイオマス密度を増加させるために該発酵培地中で飽和の少なくとも約４％の溶存酸素レベルを維持するのに十分な条件を供するステップと、
（ｂ）次に、前記発酵培地中で飽和の約１％またはそれ未満の溶存酸素レベルを維持するのに十分な条件を供し、前記微生物が前記脂質を生産するのに十分な条件を供するステップと、
（ｃ）前記微生物の脂質を回収するステップと、
を含み、前記脂質が、バイオマスの乾燥細胞重量の少なくとも２０％である、方法。
【請求項６】
前記発酵の間に、少なくとも１００ｇ／Ｌのバイオマス密度が達成される、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
前記発酵培地または成長培地が、少なくとも約２０℃の温度である、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
前記方法が、少なくとも約０．５ｇ／Ｌ／ｈｒの平均速度で脂質を生産する、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
前記方法が、少なくとも約０．５ｇ／Ｌ／ｈｒの平均速度で脂質を生産し、かつ、該脂質の少なくとも約１５％が多価不飽和脂質である、請求項１、３、または５のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
前記方法が、少なくとも約０．５ｇ／Ｌ／ｈｒの平均速度で脂質を生産し、かつ、ω−３およびω−６脂肪酸の合計量が前記脂質の少なくとも約２０％である、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
前記方法が、少なくとも約０．５ｇ／Ｌ／ｈｒの平均速度で脂質を生産し、かつ、該脂質の少なくとも約２５％がドコサヘキサエン酸である、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
前記微生物が、スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
前記微生物が、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属である、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
前記炭素源が、非アルコール炭素源である、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
前記炭素源が、炭水化物である、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
前記方法が、平均で少なくとも約０．２ｇ／Ｌ／ｈｒのドコサヘキサエン酸を生産する、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
最初の成長期の間、溶存酸素のレベルが飽和の約１０％より大きく、かつ、次の生産期の間、溶存酸素のレベルが飽和の１％未満である、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
炭素源を含む発酵培地中で微生物の発酵を行うことにより、スラウストキトリアレス目の微生物から多価不飽和脂肪酸を含む脂質を生産するための方法であって、該方法が、
（ａ）少なくとも２０℃の温度および５〜１１のｐＨで炭素源を含む発酵培地を供するステップと、
（ｂ）前記微生物を前記発酵培地に加えるステップと、
（ｃ）フェッド・バッチ法において前記発酵培地に追加の量の炭素源を加えて発酵培地のバイオマス密度を乾燥細胞重量で少なくとも１００ｇ／Ｌに増加させるステップであって、前記追加の量の炭素源が、発酵培地のバイオマス密度が少なくとも１００ｇ／Ｌに増加するのに十分な速度で添加されるステップと、
（ｄ）前記発酵培地から脂質を回収するステップと、
を含み、
前記発酵培地のバイオマス密度が乾燥細胞重量で少なくとも１００ｇ／Ｌであるときに、前記微生物による炭素源の主な使用が脂質を生産することであり、
前記脂質が多価不飽和脂肪酸を含み、
前記バイオマス密度が少なくとも１００ｇ／Ｌであるときに、前記脂質がバイオマスの少なくとも２０％である、方法。
【請求項１９】
非アルコール炭素源および制限栄養素源を含む発酵培地中で微生物の発酵を行うことにより、スラウストキトリアレス目の微生物から多価不飽和脂肪酸を含む脂質を生産するための方法であって、該方法が、
（ａ）非アルコール炭素源および制限栄養素源を含む発酵培地を供するステップと、
（ｂ）前記微生物を前記発酵培地に加えるステップと、
（ｃ）前記発酵培地に追加の量の非アルコール炭素源および制限栄養素源を加えて発酵培地のバイオマス密度を乾燥細胞重量で少なくとも１００ｇ／Ｌに増加させるステップであって、前記追加の量の非アルコール炭素源が、発酵培地のバイオマス密度が少なくとも１００ｇ／Ｌに増加するのに十分な速度で添加されるステップと、
（ｄ）追加する制限栄養素源の量を減少させながら追加の量の炭素源を加え、前記微生物による脂質生産を誘導するステップと、
（ｅ）前記発酵培地から脂質を回収するステップと、
を含み、
前記微生物による炭素源の主な使用が脂質生産の誘導後に脂質を生産することであり、
前記バイオマス密度が乾燥細胞重量で少なくとも１００ｇ／Ｌであるときの前記微生物の発酵が、多価不飽和脂肪酸を含む脂質を生産し、
前記バイオマス密度が少なくとも１００ｇ／Ｌであるときに、前記脂質がバイオマスの少なくとも２０％である、方法。
【請求項２０】
炭素源を含む発酵培地中で微生物の発酵を行うことにより、スラウストキトリアレス目の微生物から多価不飽和脂肪酸を含む脂質を生産するための方法であって、該方法が、
（ａ）少なくとも２０℃の温度および５〜１１のｐＨで炭素源を含む発酵培地を供するステップと、
（ｂ）前記微生物を前記発酵培地に加えるステップと、
（ｃ）フェッド・バッチ法において前記発酵培地に追加の量の炭素源を加えて発酵培地のバイオマス密度を乾燥細胞重量で少なくとも１００ｇ／Ｌに増加させるステップであって、前記追加の量の炭素源が、発酵培地のバイオマス密度が少なくとも１００ｇ／Ｌに増加するのに十分な速度で添加されるステップと、
（ｄ）前記発酵培地から脂質を回収するステップと、
を含み、
前記発酵培地のバイオマス密度が乾燥細胞重量で少なくとも１００ｇ／Ｌであるときに、前記微生物による炭素源の主な使用が脂質を生産することであり、
前記方法が、多価不飽和脂肪酸を含む脂質を生産し、
前記バイオマス密度が少なくとも１００ｇ／Ｌであるときに、多価不飽和脂肪酸が全脂質の少なくとも１５％である、方法。
【請求項２１】
炭素源および制限栄養素源を含む発酵培地中で微生物の発酵を行うことにより、スラウストキトリアレス目の微生物を増殖するための方法であって、該方法が、
（ａ）炭素源および制限栄養素源を含む発酵培地を供するステップと、
（ｂ）前記微生物を前記発酵培地に加えるステップと、
（ｃ）前記発酵培地に追加の量の炭素源および制限栄養素源を加えて発酵培地のバイオマス密度を乾燥細胞重量で少なくとも１００ｇ／Ｌに増加させるステップであって、前記追加の量の炭素源および制限栄養素源が、発酵培地のバイオマス密度が少なくとも１００ｇ／Ｌに増加するのに十分な速度で添加されるステップと、
（ｄ）追加する制限栄養素源の量を減少させながら追加の量の炭素源を加え、前記微生物による脂質生産を誘導するステップと、
（ｅ）前記発酵培地から脂質を回収するステップと、
を含み、
前記微生物による炭素源の主な使用が脂質生産の誘導後に脂質を生産することであり、
前記バイオマス密度が乾燥細胞重量で少なくとも１００ｇ／Ｌであるときの前記微生物の発酵が、多価不飽和脂肪酸を含む脂質を生産し、
前記バイオマス密度が少なくとも１００ｇ／Ｌであるときに、前記脂質がバイオマスの少なくとも２０％であり、
前記微生物により生産される全脂質の少なくとも１５％が多価不飽和脂肪酸である、方法。
【請求項２２】
前記方法が、少なくとも約０．５ｇ／Ｌ／ｈｒの平均速度で脂質を生産する、請求項１８〜２１のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】
前記微生物が、スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１８〜２１のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
前記微生物が、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属である、請求項１８〜２１のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５】
前記炭素源が、炭水化物である、請求項１８〜２１のいずれか一項記載の方法。
【請求項２６】
ドコサヘキサエン酸が全脂質の少なくとも１５％である、請求項１８〜２１のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
前記脂質が、発酵の時間あたり発酵培地のリッターあたり少なくとも０．５グラムの平均速度で生産され、かつ、ω−３およびω−６脂肪酸の合計量が前記脂質の少なくとも約２０％である、請求項１８〜２１のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８】
前記脂質が、発酵の時間あたり発酵培地のリッターあたり少なくとも０．５グラムの平均速度で生産され、かつ、ドコサヘキサエン酸が前記脂質の少なくとも２５％である、請求項１８〜２１のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９】
前記微生物が、好気性条件下で脂質を生産する、請求項１８〜２１のいずれか一項記載の方法。
【請求項３０】
前記発酵培地中の溶存酸素が制御されている、請求項１８〜２１のいずれか一項記載の方法。
【請求項３１】
前記方法が、発酵の時間あたり発酵培地のリッターあたり平均少なくとも０．２グラムのドコサヘキサエン酸を生産する、請求項１８〜２１のいずれか一項記載の方法。
【請求項３２】
前記微生物から脂質を回収する前に、前記発行培地から水を除去して乾燥微生物を供することをさらに含み、ここで、該脂質の少なくとも１５％は多価不飽和脂肪酸である、請求項１８〜２１のいずれか一項記載の方法。
【請求項３３】
前記微生物から脂質を回収する前に、前もって遠心せずに蒸発により前記発酵培地から水を除去して乾燥微生物を供する、請求項１〜５または１８〜２１のいずれか一項記載の方法。