(57)【要約】本開示発明はセルラーゼ変異体に関する。特に、本願は改善された発現、活性、及び／又は安定性を有するセルラーゼ変異体に関する。このセルラーゼ変異体、このセルラーゼ変異体を含む組成物、及びこれらの使用方法も開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルラーゼ活性を有する成熟形態の変異体であり、配列番号３で定義される対照セロビオヒドロラーゼＩＩ（ＣＢＨ２）のアミノ酸配列に対応して数えられる位置番号の５，１８，１９，２８，３０，３２，３５，３８，７９，８０，８９，１００，１０２，１０３，１０４，１０５，１１１，１１７，１１９，１２１，１２５，１２６，１３３，１３７，１３８，１３９，１４０，１４１，１４３，１５０，１５８，１６２，１７７，１８０，１８１，１８２，１８５，１８６，１８８，１９０，１９１，１９２，１９３，１９６，２０１，２０７，２２５，２２６，２２８，２２９，２３０，２３３，２３４，２３６，２４０，２４３，２４５，２５１，２５２，２５８，２６７，２６８，２７４，２９２，２９３，３０３，３０４，３０６，３０７，３１３，３１９，３２２，３２８，３３１，３３８，３４０，３４６，３６１，３６２，３６３，３６４，３６５，３７１，３８４，３９４，３９６，４００，４０６，４０７，４１４，４１７，４２２，４２７，４３１，４３３，４３６，４４０，４４１，４４３，４４４，４４５、及び４４７からなる群より選択される１つ以上の位置において置換を含む、セルラーゼ変異体。
【請求項２】
前記変異体が、配列番号３で定義される対照セロビオヒドロラーゼＩＩ（ＣＢＨ２）のアミノ酸配列に対応して数えられる位置番号において、
（ｉ）６３，７７，１２９，１４６，１４７，１５１，１５３，１５７，１６１，１８９，１９４，１９７，２０３，２０４，２０８，２１１，２３７，２３９，２４４，２４７，２５４，２７７，２８１，２８５，２８８，２８９，２９４，３２７，３３９，３４４，３５６，３７８，３８２、及び４０５からなる第一グループ、又は
（ｉｉ）９４，９８，１０７，１２０，１３４，１４４，１５４，１７８，１７９，２０６，２１０，２１４，２３１，２３２，２６６，２７２，２７５，２９１，３１２，３１６，３２３，３４３，３６０，３８０，３８１，３８６，３９９，４１０，４１３，４１６，４２６，及び４２９からなる第二グループ、から選択される１つ以上の更なる位置における更なる置換を含む、請求項１に記載のセルラーゼ変異体。
【請求項３】
配列番号３で定義される対照セロビオヒドロラーゼＩＩ（ＣＢＨ２）のアミノ酸配列に対応して数えられる位置において、６３，７７，１２９，１４６，１４７，１５１，１５３，１５７，１６１，１８９，１９４，１９７，２０３，２０４，２０８，２１１，２３７，２３９，２４４，２４７，２５４，２７７，２８１，２８５，２８８，２８９，２９４，３２７，３３９，３４４，３５６，３７８，３８２、及び４０５からなる群より選択される１つ以上の位置において置換を含む、セルラーゼ変異体であって、前記位置が配列番号３で定義される対照セロビオヒドラーゼＩＩ（ＣＢＨ２）のアミノ酸配列に対応して番号付けされており、前記セルラーゼが一部位変異体である場合、この部位が、Ｋ／Ｅ，Ｒ／Ｑ，Ｎ／Ｄ，Ｑ／Ｅ，Ｄ／Ｎ、又はＥ／Ｑではない、セルラーゼ変異体。
【請求項４】
前記変異体が更に、
（ｉ）５，１８，１９，２８，３０，３２，３５，３８，７９，８０，８９，１００，１０２，１０３，１０４，１０５，１１１，１１７，１１９，１２１，１２５，１２６，１３３，１３７，１３８，１３９，１４０，１４１，１４３，１５０，１５８，１６２，１７７，１８０，１８１，１８２，１８５，１８６，１８８，１９０，１９１，１９２，１９３，１９６，２０１，２０７，２２５，２２６，２２８，２２９，２３０，２３３，２３４，２３６，２４０，２４３，２４５，２５１，２５２，２５８，２６７，２６８，２７４，２９２，２９３，３０３，３０４，３０６，３０７，３１３，３１９，３２２，３２８，３３１，３３８，３４０，３４６，３６１，３６２，３６３，３６４，３６５，３７１，３８４，３９４，３９６，４００，４０６，４０７，４１４，４１７，４２２，４２７，４３１，４３３，４３６，４４０，４４１，４４３，４４４，４４５，及び４４７からなる第一グループ、又は
（ｉｉ）９４，９８，１０７，１２０，１３４，１４４，１５４，１７８，１７９，２０６，２１０，２１４，２３１，２３２，２６６，２７２，２７５，２９１，３１２，３１６，３２３，３４３，３６０，３８０，３８１，３８６，３９９，４１０，４１３，４１６，４２６，及び４２９からなる第二グループから選択されるから選択される１つ以上の更なる位置において更なる置換を含み、前記更なる位置は配列番号３で定義される対照セロビオヒドロラーゼＩＩ（ＣＢＨ２）のアミノ酸配列に対応して数えられる、請求項３に記載のセルラーゼ変異体。
【請求項５】
セルラーゼ活性を有する成熟形態であり、配列番号３で定義される対照セロビオヒドロラーゼＩＩ（ＣＢＨ２）のアミノ酸配列に対応して数えられる位置、９４，９８，１０７，１２０，１３４，１４４，１５４，１７８，１７９，２０６，２１０，２１４，２３１，２３２，２６６，２７２，２７５，２９１，３１２，３１６，３２３，３４３，３６０，３８０，３８１，３８６，３９９，４１０，４１３，４１６，４２６，及び４２９からなる群より選択１つ以上の位置において１つ以上の置換を含む、セルラーゼ変異体であって、前記セルラーゼ変異体が一部位置換を有している場合、この一部位置換はＶ９４Ｅ，Ｐ９８Ｌ，Ｅ１０７Ｑ，Ｍ１２０Ｌ，Ｍ１３４Ｇ，Ｍ１３４Ｌ，Ｍ１３４Ｖ，Ｌ１４４Ｇ，Ｌ１４４Ｒ，Ｌ１４４Ｓ，Ｔ１５４Ａ，Ａ１７８Ｖ，Ｌ１７９Ｃ，Ｖ２０６Ｌ，Ｓ２１０Ｌ，Ｓ２１０Ｒ，Ｔ２１４Ｍ，Ｔ２１４Ｙ，Ｇ２３１Ｐ，Ｇ２３１Ｉ，Ｇ２３１Ａ，Ｇ２３１Ｎ，Ｇ２３１Ｓ，Ｇ２３１Ｔ，Ｔ２３２Ｖ，Ｈ２６６Ｓ，Ｈ２６６Ａ，Ｗ２７２Ａ，Ｗ２７２Ｄ，Ｗ２７２Ｙ，Ｎ２７５Ｌ，Ｓ３１６Ｐ，Ｖ３２３Ｌ，Ｖ３２３Ｎ，Ｖ３２３Ｙ，Ｇ３６０Ｒ，Ｓ３８０Ｔ，Ａ３８１Ｔ，Ｅ３９９Ｎ，Ｅ３９９Ｄ，Ｒ４１３Ｙ，Ｒ４１３Ｐ，及びＡ４１６からなる群より選択される１つではない、セルラーゼ変異体。
【請求項６】
請求項５に記載のセルラーゼ変異体であって、前記変異体が、
（ｉ）５，１８，１９，２８，３０，３２，３５，３８，７９，８０，８９，１００，１０２，１０３，１０４，１０５，１１１，１１７，１１９，１２１，１２５，１２６，１３３，１３７，１３８，１３９，１４０，１４１，１４３，１５０，１５８，１６２，１７７，１８０，１８１，１８２，１８５，１８６，１８８，１９０，１９１，１９２，１９３，１９６，２０１，２０７，２２５，２２６，２２８，２２９，２３０，２３３，２３４，２３６，２４０，２４３，２４５，２５１，２５２，２５８，２６７，２６８，２７４，２９２，２９３，３０３，３０４，３０６，３０７，３１３，３１９，３２２，３２８，３３１，３３８，３４０，３４６，３６１，３６２，３６３，３６４，３６５，３７１，３８４，３９４，３９６，４００，４０６，４０７，４１４，４１７，４２２，４２７，４３１，４３３，４３６，４４０，４４１，４４３，４４４，４４５，及び４４７からなる第一グループ；又は
（ｉｉ）６３，７７，１２９，１４６，１４７，１５１，１５３，１５７，１６１，１８９，１９４，１９７，２０３，２０４，２０８，２１１，２３７，２３９，２４４，２４７，２５４，２７７，２８１，２８５，２８８，２８９，２９４，３２７，３３９，３４４，３５６，３７８，３８２、及び４０５からなる第二グループ、
から選択される１つ以上の位置において更なる置換を含み、前記更なる位置が配列番号３で定義される対照セロビオヒドロラーゼＩＩ（ＣＢＨ２）のアミノ酸配列に対応して数えられる位置番号である、請求項５に記載のセルラーゼ変異体。
【請求項７】
前記１つ以上の位置における置換が２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，及び２５位からなる群より選択される、請求項１乃至６のいずれか１項に記載のセルラーゼ変異体。
【請求項８】
セルラーゼ変異体であって、前記変異体がセルラーゼ活性を有する成熟形態であり、１１１，１４４，１５４，１６２，４１０、及び４１３からなる群より選択される１つ乃至６つの位置における置換を含み、前記が
１１１位ではロイシン又はセリン
１４４位ではロイシン、グルタミン、又はトリプトファン
１５４位ではスレオニン、システイン、又はバリン、
１６２位ではタイロシン、又はアスパラギン
４１０位ではアルギニン又はセリン、及び
４１３位ではセリン、トリプトファン、又はタイロシン、であり、
これらの位置番号は配列番号３で定義される対照セロビオヒドロラーゼＩＩ（ＣＢＨ２）のアミノ酸に対応して数えられるものであり、このセルラーゼ変異体が一部位置換からなる場合、この一部位置換がＳ４１３Ｙではない、セルラーゼ変異体。
【請求項９】
セルラーゼ変異体であって、前記変異体がセルラーゼ活性を有する成熟形態であり、９８，１９４，３１３，３１６，３８４，及び４４３からなる群より選択される１つ乃至６つの位置での置換を含み、該置換が
９８位ではプロリン又はレクチン
１９４位ではリジン、システイン、又はグルタミン、
３１３位ではセリン又はスレオニン、
３１６位ではセリン又はプロリン、
３８４位ではグリシン、システイン、又はグルタミン、及び
４４３位ではアスパラギン又はイソロイシン、であり、
前記位置は配列番号３で定義される対照セロビオヒドロラーゼＩＩ（ＣＢＨ２）のアミノ酸配列に対応して番号付けされており、１つの位置換が、Ｐ９８Ｌ置換、Ｋ１９４Ｅ置換、及びＳ３１６Ｐ置換を含まない、セルラーゼ変異体。
【請求項１０】
セルラーゼ変異体であって、前記変異体がセルラーゼ活性を有する形態であり、１５３，１６１，２０３，２３３，４２２，及び４４４からなる群より選択される１つ乃至６つの位置において置換を含み、該置換が、
１５３位ではアルギニン又はグルタミン、
１６１位ではアスパラギン、アラニン、又はトリプトファン、
２０３位ではアルギニン又はヒスチジン、
２３３位ではプロリン又はバリン
４２２位ではグルタミン又はバリン、及び
４４４位ではプロリン又はグルタミン、であり、
これらの位置は配列番号３で定義される対照セロビオヒドロラーゼＩＩ（ＣＢＨ２）のアミノ酸配列に対応して番号付けされており、前記セルラーゼ変異体が１つの置換からなる場合、この１つの置換はＲ１５３Ｑ置換ではない、セルラーゼ変異体。
【請求項１１】
セルラーゼ変異体であって、前記変異体がセルラーゼ活性を有する形態であり、９８，１１１，１４４，３１３，３１６，４１３，及び４２２からなる群より選択される１つ乃至６つの位置において置換を含み、該置換が、
９８位ではプロリン又はロイシン
１１１位ではロイシン又はセリン、
１４４位ではロイシン又はトリプトファン、
３１３位ではセリン又はスレオニン、
３１６位ではセリン又はプロリン、
４１３位ではセリン又はトリプトファン、及び
４２２位ではグルタミン又はバリン、であり、
これらの位置は配列番号３で定義される対照セロビオヒドロラーゼＩＩ（ＣＢＨ２）のアミノ酸配列に対応して番号付けされており、前記セルラーゼ変異体が１つの置換からなる場合、この１つの置換はＳ３１６Ｐ置換ではない、セルラーゼ変異体。
【請求項１２】
配列番号３で定義される対照セロビオヒドロラーゼＩＩ（ＣＢＨ２）のアミノ酸配列に対応して番号付けされる位置の９８位においてグルタミンを含み、Ｔ１３８Ｃ，Ｓ３１６Ｐ，Ｓ３４３Ｑ，Ｑ３６２Ｉ，Ｓ３８６Ｃ，Ｃ４００Ｓ，及びＳ４０６Ｐからなる群より選択される１つの置換を含む、セルラーゼ変異体。
【請求項１３】
配列番号３で定義される対照セロビオヒドロラーゼＩＩ（ＣＢＨ２）のアミノ酸配列に対応して番号付けされる位置の１３８位においてシステインを含み、Ｓ３１６Ｐ，Ｓ３４３Ｑ，Ｑ３６２Ｉ，Ｓ３８６Ｃ，Ｃ４００Ｓ，及びＳ４０６Ｐからなる群より選択される１つの置換を含む、セルラーゼ変異体。
【請求項１４】
配列番号３で定義される対照セロビオヒドロラーゼＩＩ（ＣＢＨ２）のアミノ酸配列に対応して番号付けされる位置の３１６位においてプロリンを含み、Ｓ３４３Ｑ，Ｑ３６２Ｉ，Ｓ３８６Ｃ，Ｃ４００Ｓ，及びＳ４０６Ｐからなる群より選択される１つの置換を含む、セルラーゼ変異体。
【請求項１５】
配列番号３で定義される対照セロビオヒドロラーゼＩＩ（ＣＢＨ２）のアミノ酸配列に対応して番号付けされる位置の３４３位においてグルタミンを含み、Ｑ３６２Ｉ，Ｓ３８６Ｃ，Ｃ４００Ｓ，及びＳ４０６Ｐからなる群より選択される１つの置換を含む、セルラーゼ変異体。
【請求項１６】
配列番号３で定義される対照セロビオヒドロラーゼＩＩ（ＣＢＨ２）のアミノ酸配列に対応して番号付けされる位置の３６２位においてイソロイシンを含み、Ｓ３８６Ｃ，Ｃ４００Ｓ，及びＳ４０６Ｐからなる群より選択される１つの置換を含む、セルラーゼ変異体。
【請求項１７】
配列番号３で定義される対照セロビオヒドロラーゼＩＩ（ＣＢＨ２）のアミノ酸配列に対応して番号付けされる位置の３８６位においてシステインを含み、Ｃ４００Ｓ及びＳ４０６Ｐからなる群より選択される１つの置換を含む、セルラーゼ変異体。
【請求項１８】
４００位にセリンを含み、４０６位にプロリンを含む、請求項１に記載のセルラーゼ変異体。
【請求項１９】
セルラーゼ活性を有する成熟形態であり、配列番号３で定義する対照セロビオヒドロラーゼＩＩ（ＣＢＨ２）に対応して番号付けされた位置、９８，１１１，１８２，２９１，３１６，３６２，及び４００位において１つ乃至７つの置換を含み、該置換が、
９８位ではプロリン又はロイシン、又はグルタミン
１１１位ではロイシン又はセリン、
１８２位ではアスパラギン又はトリプトファン、
２９１位ではセリン又はグルタミン酸、
３１６位ではセリン又はプロリン、及び
４００位ではシステイン又はセリン、であり
前記セルラーゼ変異体が１つの置換からなる場合、この１つの置換はＰ９８Ｌ置換及びＳ３１６Ｐ置換からなる群より選択される１つではない、セルラーゼ変異体。
【請求項２０】
前記変異体がＬ４３９Ｐ又はＴ７４Ｓ置換を更に含む、請求項１９に記載のセルラーゼ変異体。
【請求項２１】
前記変異体がハイポクレアジェコリーナ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｊｅｃｏｒｉｎａ）ＣＢＨ２，ヒポクレアコニンギ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）ＣＢＨ２，フミコーラインソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）ＣＢＨ２，アクレモニウムセルロイティクス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）ＣＢＨ２，アガリクスビスポラス（Ａｇａｒｉｃｕｓ  ｂｉｓｐｏｒｕｓ）ＣＢＨ２，フサリウムオシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｓｙｓｐｏｒｕｍ）ＥＧ，フェノロカエテクリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）ＣＢＨ２，タラロマイセスエメルソニ（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）ＣＢＨ２，セルモビフィダフスカ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ．  Ｆｕｓｃａ）６Ｂ／Ｅ３  ＣＢＨ２，セルモビフィダフスカ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ）６Ａ／Ｅ２  ＥＧ，及びセルロモナスフィミ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｆｉｍｉ）ＣｅｎＡ  ＥＧからなる群より選択される親セルラーゼ由来である、請求項１乃至２０のいずれか１項に記載のセルラーゼ変異体。
【請求項２２】
前記変異体が、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、及び配列番号１２からなる群のメンバーに対して、少なくとも７５％，８０％，８５％，９０％，９５％，９６％，９７％，９８％，又は９９％同一であるアミノ酸配列を有する親セルラーゼ由来である、請求項１乃至２１に記載のセルラーゼ変異体。
【請求項２３】
前記変異体が単離されている、請求項１乃至２２のいずれか１項に記載のセルラーゼ変異体。
【請求項２４】
請求項１乃至２３のいずれか１項に記載のセルラーゼ変異体を含む組成物。
【請求項２５】
前記組成物が、前記セルラーゼ組成物を多く含む、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
請求項１乃至２２のいずれか１項に記載のセルラーゼ変異体をコードしている単離された核酸。
【請求項２７】
調節配列に作動可能に結合している請求項２６に記載の単離された核酸配列を含むベクター。
【請求項２８】
請求項２７の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２９】
好適な条件下の培地において請求項２８の宿主細胞を培養してセルラーゼ変異体を生成する工程を含む、セルラーゼ変異体を生成する方法。
【請求項３０】
請求項２９の宿主細胞及び培地を含む組成物。
【請求項３１】
請求項２９の培地の上清中にセルラーゼ変異体を含む組成物。
【請求項３２】
スブチリシン、中性メタロプロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、カルボヒドロラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼ、及びペルオキシダーゼから選択される少なくとも１つの追加的な酵素を含む、請求項２４の組成物。
【請求項３３】
請求項２４又は３２の組成物を、布の表面又は布を含む製品に接触させる工程を含む、布製品の洗浄又は処理方法。
【請求項３４】
請求項２４又は３２の組成物を、布の表面又は布を含む製品に接触させる工程を含む、毛羽立ちを取る又は表面を最終加工する方法。
【請求項３５】
請求項２４又は３２の組成物とバイオマスを接触させる工程を含む、バイオマスを糖に転換する方法。
【請求項３６】
請求項１乃至２２のいずれか１項に記載のセルラーゼ変異体を含む酵素組成物をバイオマス組成物に接触させて、糖溶液を生成する工程と、
この糖溶液を、燃料を生成するのに十分な条件下で発酵性微生物と接触させる工程とを含む、燃料を生成する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は２００９年６月３日に提出された米国仮出願Ｎｏ．６１／１８３，９５９に対して優先権を主張する。この仮出願の全体を参照により本明細書に援用する。
【０００２】
本開示発明は、米国政府の支援によって、米国エネルギー省から供与された制限条件付き供与番号ＤＥ−ＦＣ３６−０８ＧＯ１８０７８の下でなされた。米国政府は、本開示発明にある一定の権利を有する。
【０００３】
本願開示発明は、酵素、特にセルロース変異体に関する。また、該セルロース変異体をコードする核酸、該セルロース変異体を含む組成物、さらなる有用なセルロース変異体を特定する方法、および該組成物を使用する方法も開示される。
【背景技術】
【０００４】
セルロース及びヘミセルロースは光合成により生産される最も豊富な植物資源である。それらは、加水分解によりポリマー基質を単体糖類にすることができる細胞外酵素を作り出すバクテリア、イーストと糸状菌を含む、たくさんの微生物によって分解され、エネルギー源として使われることができる（Ａｒｏら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，第２７６巻，ｎｏ．２６，２４３０９−２４３１４頁，６月２９日，２００１年）。非再生資源の限界が近づいているので、主要な再生可能エネルギー源となるセルロースの潜在力は莫大である（Ｋｒｉｓｈｎａら．，Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈ．第７７巻：１９３−１９６，２００１年）。生物学的プロセスによるセルロースの有効利用は、食物、飼料および燃料の不足を克服することへの一つの手段である（Ｏｈｍｉｙａら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｇｅｎ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒ．Ｒｅｖ．第１４巻、３６５−４１４頁，１９９７年）。
【０００５】
セルラーゼはセルロース（ベータ−１、４−グルカン又はベータＤ−グルコシド結合）を加水分解して、グルコース、セロビオース、セロオリゴサッカライド及び同種のものを生成する酵素である。セルロースは従来から３つの型に分類されている。エンドグルカナーゼ（ＥＣ３．２．１．４）（「ＥＧ」）、エキソグルカナーゼまたはセロビオヒドロラーゼ（ＥＣ３．２．１．９１）（「ＣＢＨ」）およびベータ−グルコシダーゼ（［ベータ］−Ｄ−グルコシドグルコヒドロラーゼ：ＥＣ３．２．１．２１）（「ＢＧ」）である（Ｋｎｏｗｌｅｓら，ＴＩＢＴＥＣＨ  ５、２５５−２６１頁、１９８７年；Ｓｃｈｕｌｅｉｎ、  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１６０、２５、２３４−２４３頁、１９８８年）エンドグルカナーゼはセルロース繊維の非晶質部分に主に作用し、他方、セロビオヒドロラーゼは結晶セルロースも分解することができる。（Ｎｅｖａｌａｉｎｅｎ及びＰｅｎｔｔｉｌａ、  Ｍｙｃｏｔａ、３０３−３１９頁、１９９５年）。従って、したがって、結晶セルロースの効率的な可溶化のためには、セルラーゼ系中にセロビオヒドロラーゼが存在することが要求される（Ｓｕｕｒｎａｋｋｉら、  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ、第７巻、１８９−２０９頁、２０００年）。ベータグルコシダーゼはＤ−グルコース単位をセロビオース、セロオリゴ糖、および他のグルコシドから遊離することが知られている。（Ｆｒｅｅｒ、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６８巻、Ｎｏ．１３、９３３７−９３４２頁、１９９３年）。
【０００６】
セルラーゼは、多種類の細菌、酵母および糸状菌によって産生されることが知られている。ある種の糸状菌は、結晶形態のセルロースを分解する能力のある完全なセルラーゼ系を産生し、その結果これらのセルラーゼは発酵によって大量に容易に産生される。多くの酵母、たとえばサッカロマイセスサレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉsｉａｅ）は、セルロースを分解する能力を欠いているので、糸状菌は特別な役割を果たす（例えば、Ｗｏｏｄ  ら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１６０：８７−１１６，１９８８参照）。
【０００７】
ＣＢＨ、ＥＧおよびＢＧの糸状菌セルラーゼの分類はさらに拡張されて、各分類の中に複数の構成分を含むことができる。たとえば、複数のＣＢＨ、ＥＧおよびＢＧが、多様な糸状菌源、たとえばトリコデルマレーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）（ハイポクレアジェコリーナ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｊｅｃｏｒｉｎａ）とも呼ばれる。）から単離されており、これらは、２のＣＢＨ、すなわちＣＢＨＩ（「ＣＢＨ１」）およびＣＢＨＩＩ（「ＣＢＨ２」）、少なくとも８のＥＧ、すなわちＥＧＩ（「ＥＧ１」）、ＥＧＩＩ（「ＥＧ２」）、ＥＧＩＩＩ（「ＥＧ３」）、ＥＧＩＶ（「ＥＧ４」）、ＥＧＶ（「ＥＧ５」）、ＥＧＶＩ（「ＥＧ６」）、ＥＧＶＩＩ（「ＥＧ７」）およびＥＧＶＩＩＩ（「ＥＧ８」）ならびに少なくとも５のＢＧ、すなわちＢＧ１、ＢＧ２、ＢＧ３、ＢＧ４およびＢＧ５については公知の遺伝子を含んでいる。ＥＧＩＶ、ＥＧＶＩおよびＥＧＶＩＩＩもキシログカナーゼ活性を有している。
【０００８】
結晶セルロースをグルコースに効率的に転化するために、ＣＢＨ、ＥＧおよびＢＧの分類のそれぞれからの構成分を含む完全なセルラーゼ系が必要とされ、単離された成分では結晶セルロースを加水分解するのがより低度に有効である（Ｆｉｌｈｏら、Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．第４２巻、１−５頁、１９９６年）。異なった分類からのセルラーゼ成分の間に相乗関係が観察されている。とりわけ、ＥＧ型のセルラーゼとＣＢＨ型のセルラーゼとは相乗的に相互作用して、セルロースをより効率的に分解する。
【０００９】
セルラーゼは、洗剤組成物の洗浄能力を高める目的のために、柔軟剤として使用するために、綿織物の感触および外観を改善するために等、織物の処理に有用であることが従来技術で知られている。（Ｋｕｍａｒら、Ｔｅｘｔｉｌｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔ  ａｎｄ  Ｃｏｌｏｒｉｓｔ、第２９巻、３７−４２頁、１９９７年）。洗浄効果が向上されたセルラーゼ含有洗剤組成物（ＵＳ  Ｐａｔ．Ｎｏ．４、４３５、３０７；ＧＢ  Ａｐｐ．Ｎｏｓ．２、０９５、２７５及び２、０９４、８２６）及び布製品に対して風合い及び外観を改善するために使用すること（ＵＳ  Ｐａｔ．Ｎｏｓ．５、６４８、２６３、５、６９１、１７８、及び５、７７６、７５７；ＧＢ  Ａｐｐ．Ｎｏ．１、３５８、５９９）が開示されている。糸状菌および細菌中で産生されたセルラーゼは相当な関心を持たれている。とりわけ、トリコデルマ種（たとえば、トリコデルマロンギブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）またはトリコデルマレーシ）は、結晶形態のセルロースを分解する能力のある完全なセルラーゼ系を産生することが示されている。
【００１０】
セルラーゼ組成物はこれまで開示されてきているが、新しく改良されたセルラーゼ組成物の必要性がいまだ存在する。一般家庭用の洗剤、ストーンウォシュ用組成物又は洗濯用洗剤等に用いるための性能が改良されたセルラーゼについて特別な関心が集まるであろう。
【発明の開示】
【００１１】
発明の概要
【００１２】
本明細書は酵素、特にセルラーゼ変異体に関する。このセルラーゼ変異体をコードしている核酸、このセルラーゼ変異体を含む組成物、追加的に有用なセルラーゼ変異体を同定する方法、及びこれらの使用方法も開示する。
【００１３】
本明細書はセルラーゼ活性を有する成熟形態の変異体であり、配列番号３で定義される対照セロビオヒドロラーゼＩＩ（ＣＢＨ２）のアミノ酸配列に対応して数えられる位置番号の５，１８，１９，２８，３０，３２，３５，３８，７９，８０，８９，１００，１０２，１０３，１０４，１０５，１１１，１１７，１１９，１２１，１２５，１２６，１３３，１３７，１３８，１３９，１４０，１４１，１４３，１５０，１５８，１６２，１７７，１８０，１８１，１８２，１８５，１８６，１８８，１９０，１９１，１９２，１９３，１９６，２０１，２０７，２２５，２２６，２２８，２２９，２３０，２３３，２３４，２３６，２４０，２４３，２４５，２５１，２５２，２５８，２６７，２６８，２７４，２９２，２９３，３０３，３０４，３０６，３０７，３１３，３１９，３２２，３２８，３３１，３３８，３４０，３４６，３６１，３６２，３６３，３６４，３６５，３７１，３８４，３９４，３９６，４００，４０６，４０７，４１４，４１７，４２２，４２７，４３１，４３３，４３６，４４０，４４１，４４３，４４４，４４５、及び４４７からなる群より選択される１つ以上の位置において置換を含む、セルラーゼ変異を開示する。幾つかの態様において、１つ以上の位置における置換は対照ＣＢＨ２と比較して、改善された発現、活性、及び／又は安定性を有する。幾つかの態様において、この変異体は配列番号３で定義される対照セロビオヒドロラーゼＩＩ（ＣＢＨ２）のアミノ酸配列に対応して数えられる位置番号において、（ｉ）６３，７７，１２９，１４６，１４７，１５１，１５３，１５７，１６１，１８９，１９４，１９７，２０３，２０４，２０８，２１１，２３７，２３９，２４４，２４７，２５４，２７７，２８１，２８５，２８８，２８９，２９４，３２７，３３９，３４４，３５６，３７８，３８２、及び４０５からなる第一グループ、又は（ｉｉ）９４，９８，１０７，１２０，１３４，１４４，１５４，１７８，１７９，２０６，２１０，２１４，２３１，２３２，２６６，２７２，２７５，２９１，３１２，３１６，３２３，３４３，３６０，３８０，３８１，３８６，３９９，４１０，４１３，４１６，４２６，及び４２９からなる第二グループ、から選択される１つ以上の位置における更なる置換を含む。幾つかの態様において、１つ以上の位置における置換は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０位からなる群から選択される。
【００１４】
他の側面において、本開示発明は配列番号３で定義される対照セロビオヒドロラーゼＩＩ（ＣＢＨ２）のアミノ酸配列に対応して数えられる位置において、６３，７７，１２９，１４６，１４７，１５１，１５３，１５７，１６１，１８９，１９４，１９７，２０３，２０４，２０８，２１１，２３７，２３９，２４４，２４７，２５４，２７７，２８１，２８５，２８８，２８９，２９４，３２７，３３９，３４４，３５６，３７８，３８２、及び４０５からなる群より選択される１つ以上の位置において置換を含む、セルラーゼ変異体であって、前記位置が配列番号３で定義される対照セロビオヒドラーゼＩＩ（ＣＢＨ２）のアミノ酸配列に対応して番号付けされており、前記セルラーゼが一部位変異体である場合、この部位が、Ｋ／Ｅ，Ｒ／Ｑ，Ｎ／Ｄ，Ｑ／Ｅ，Ｄ／Ｎ、又はＥ／Ｑではない、セルラーゼ変異体を提供する。幾つかの態様において、１つ以上の位置における置換は対照ＣＢＨ２と比較して、改善された発現、活性、又は安定性を有するセルラーゼ変異体となる。幾つかの態様において、この単離されたセルラーゼ変異体は、更に、（ｉ）５，１８，１９，２８，３０，３２，３５，３８，７９，８０，８９，１００，１０２，１０３，１０４，１０５，１１１，１１７，１１９，１２１，１２５，１２６，１３３，１３７，１３８，１３９，１４０，１４１，１４３，１５０，１５８，１６２，１７７，１８０，１８１，１８２，１８５，１８６，１８８，１９０，１９１，１９２，１９３，１９６，２０１，２０７，２２５，２２６，２２８，２２９，２３０，２３３，２３４，２３６，２４０，２４３，２４５，２５１，２５２，２５８，２６７，２６８，２７４，２９２，２９３，３０３，３０４，３０６，３０７，３１３，３１９，３２２，３２８，３３１，３３８，３４０，３４６，３６１，３６２，３６３，３６４，３６５，３７１，３８４，３９４，３９６，４００，４０６，４０７，４１４，４１７，４２２，４２７，４３１，４３３，４３６，４４０，４４１，４４３，４４４，４４５，及び４４７からなる第一グループ、又は（ｉｉ）９４，９８，１０７，１２０，１３４，１４４，１５４，１７８，１７９，２０６，２１０，２１４，２３１，２３２，２６６，２７２，２７５，２９１，３１２，３１６，３２３，３４３，３６０，３８０，３８１，３８６，３９９，４１０，４１３，４１６，４２６，及び４２９からなる第二グループから選択されるから選択される１つ以上の更なる位置において更なる置換を含み、前記更なる位置は配列番号３で定義される対照セロビオヒドロラーゼＩＩ（ＣＢＨ２）のアミノ酸配列に対応して数えられる。幾つかの態様において、１つ以上の位置における置換は１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０位からなる群から選択される。
【００１５】
他の側面において、本開示発明は、セルラーゼ活性を有する成熟形態であり、配列番号３で定義される対照セロビオヒドロラーゼＩＩ（ＣＢＨ２）のアミノ酸配列の９４，９８，１０７，１２０，１３４，１４４，１５４，１７８，１７９，２０６，２１０，２１４，２３１，２３２，２６６，２７２，２７５，２９１，３１２，３１６，３２３，３４３，３６０，３８０，３８１，３８６，３９９，４１０，４１３，４１６，４２６，及び４２９からなる群より選択１つ以上の位置において１つ以上の置換を含む、セルラーゼ変異体であって、前記セルラーゼ変異体が一部位置換を有しており、この一部位置換はＶ９４Ｅ，Ｐ９８Ｌ，Ｅ１０７Ｑ，Ｍ１２０Ｌ，Ｍ１３４Ｇ，Ｍ１３４Ｌ，Ｍ１３４Ｖ，Ｌ１４４Ｇ，Ｌ１４４Ｒ，Ｌ１４４Ｓ，Ｔ１５４Ａ，Ａ１７８Ｖ，Ｌ１７９Ｃ，Ｖ２０６Ｌ，Ｓ２１０Ｌ，Ｓ２１０Ｒ，Ｔ２１４Ｍ，Ｔ２１４Ｙ，Ｇ２３１Ｐ，Ｇ２３１Ｉ，Ｇ２３１Ａ，Ｇ２３１Ｎ，Ｇ２３１Ｓ，Ｇ２３１Ｔ，Ｔ２３２Ｖ，Ｈ２６６Ｓ，Ｈ２６６Ａ，Ｗ２７２Ａ，Ｗ２７２Ｄ，Ｗ２７２Ｙ，Ｎ２７５Ｌ，Ｓ３１６Ｐ，Ｖ３２３Ｌ，Ｖ３２３Ｎ，Ｖ３２３Ｙ，Ｇ３６０Ｒ，Ｓ３８０Ｔ，Ａ３８１Ｔ，Ｅ３９９Ｎ，Ｅ３９９Ｄ，Ｒ４１３Ｙ，Ｒ４１３Ｐ，及びＡ４１６からなる群より選択される１つではない、セルラーゼ変異体を提供する。幾つかの態様において、１つ以上の位置における置換は対象ＣＢＨ２と比較して、改善された発現、活性、及び／又は安定性を有するセルラーゼ変異体となる。幾つかの態様において、この変異体は、（ｉ）５，１８，１９，２８，３０，３２，３５，３８，７９，８０，８９，１００，１０２，１０３，１０４，１０５，１１１，１１７，１１９，１２１，１２５，１２６，１３３，１３７，１３８，１３９，１４０，１４１，１４３，１５０，１５８，１６２，１７７，１８０，１８１，１８２，１８５，１８６，１８８，１９０，１９１，１９２，１９３，１９６，２０１，２０７，２２５，２２６，２２８，２２９，２３０，２３３，２３４，２３６，２４０，２４３，２４５，２５１，２５２，２５８，２６７，２６８，２７４，２９２，２９３，３０３，３０４，３０６，３０７，３１３，３１９，３２２，３２８，３３１，３３８，３４０，３４６，３６１，３６２，３６３，３６４，３６５，３７１，３８４，３９４，３９６，４００，４０６，４０７，４１４，４１７，４２２，４２７，４３１，４３３，４３６，４４０，４４１，４４３，４４４，４４５、及び４４７からなる第一グループ；又は（ｉｉ）６３，７７，１２９，１４６，１４７，１５１，１５３，１５７，１６１，１８９，１９４，１９７，２０３，２０４，２０８，２１１，２３７，２３９，２４４，２４７，２５４，２７７，２８１，２８５，２８８，２８９，２９４，３２７，３３９，３４４，３５６，３７８，３８２、及び４０５からなる第二グループ、から選択される１つ以上の位置において更なる置換を含む。前記更なる位置が配列番号３で定義される対照セロビオヒドロラーゼＩＩ（ＣＢＨ２）のアミノ酸配列に対応して数えられる位置番号である。幾つかの態様において、１つ以上の位置における置換は１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０位からなる群から選択される。
【００１６】
本開示発明はセルラーゼ変異体を更に提供する。この変異体は、セルラーゼ活性を有する成熟形態であり、１１１，１４４，１５４，１６２，４１０、及び４１３からなる群より選択される１つ乃至６つの置換を含み、該置換は、１１１位においてロイシン又はセリン、１４４位においてロイシン、グルタミン、又はトリプトファン、１５４位においてスレオニン、システイン、又はバリン、１６２位においてチロシン、又はアスパラギン、４１０位においてアルギニン又はセリン、及び４１３位においてセリン、トリプトファン、又はタイロシンであり、これらの位置番号は配列番号３で定義される対照セロビオヒドロラーゼＩＩ（ＣＢＨ２）のアミノ酸に対応して数えられるものであり、このセルラーゼ変異体が一部位置換からなる場合、この一部位置換がＳ４１３Ｙではない。
【００１７】
本開示発明により提供されたセルラーゼ変異体は、セルラーゼ活性を有する成熟形態であり、９８，１９４，３１３，３１６，３８４、及び４４３からなる群より選択される１つ乃至６つの位置での置換を含み、該置換は９８位においてプロリン又はレクチン、１９４位においてリジン、システイン、又はグルタミン、３１３位においてセリン又はスレオニン、３１６位においてセリン又はプロリン、３８４位においてグリシン、システイン、又はグルタミン、及び４４３位においてアスパラギン又はイソロイシンであり、前記位置は配列番号３で定義される対照セロビオヒドロラーゼＩＩ（ＣＢＨ２）のアミノ酸配列に対応して番号付けされており、このセルラーゼ変異体が一部位置換からなる場合、１つの位置換が、Ｐ９８Ｌ置換、Ｋ１９４Ｅ置換、及びＳ３１６Ｐ置換から選択される１つを含まない。
【００１８】
更に、本開示発明は、セルラーゼ活性を有する成熟形態であり、１５３，１６１，２０３，２３３，４２２、及び４４４からなる群より選択される１つ乃至６つの位置において置換を含み、該置換が、１５３位におけるアルギニン又はグルタミン、１６１位におけるアスパラギン、アラニン、又はトリプトファン、２０３位におけるアルギニン又はヒスチジン、２３３位におけるプロリン又はバリン４２２位におけるグルタミン又はバリン、及び
４４４位におけるプロリン又はグルタミンであり、これらの位置は配列番号３で定義される対照セロビオヒドロラーゼＩＩ（ＣＢＨ２）のアミノ酸配列に対応して番号付けされており、前記セルラーゼ変異体が１つの置換からなる場合、この１つの置換はＲ１５３Ｑ置換ではない、セルラーゼ変異体を提供する。
【００１９】
更に、本開示発明は、セルラーゼ活性を有する成熟形態であり、９８，１１１，１４４，３１３，３１６，４１３、及び４２２からなる群より選択される１つ乃至６つの位置において置換を含み、該置換が、９８位においてプロリン又はロイシン、１１１位においてロイシン又はセリン、１４４位においてロイシン又はトリプトファン、３１３位においてセリン又はスレオニン、３１６位においてセリン又はプロリン、４１３位においてセリン又はトリプトファン、及び４２２位においてグルタミン又はバリンであり、これらの位置は配列番号３で定義される対照セロビオヒドロラーゼＩＩ（ＣＢＨ２）のアミノ酸配列に対応して番号付けされており、前記セルラーゼ変異体が１つの置換からなる場合、この１つの置換はＳ３１６Ｐ置換ではない、セルラーゼ変異体を提供する。
【００２０】
本開示発明の更なる側面において、セルラーゼ変異体が提供され、この変異体は配列番号３で定義される対照セロビオヒドロラーゼＩＩ（ＣＢＨ２）のアミノ酸配列に対応して番号付けされる位置の９８位においてグルタミンを含み、Ｔ１３８Ｃ，Ｓ３１６Ｐ，Ｓ３４３Ｑ，Ｑ３６２Ｉ，Ｓ３８６Ｃ，Ｃ４００Ｓ、及びＳ４０６Ｐからなる群より選択される１つの置換を含む。
【００２１】
更に、提供されるセルラーゼ変異体は配列番号３で定義される対照セロビオヒドロラーゼＩＩ（ＣＢＨ２）のアミノ酸配列に対応して番号付けされる位置の１３８位においてシステインを含み、Ｓ３１６Ｐ，Ｓ３４３Ｑ，Ｑ３６２Ｉ，Ｓ３８６Ｃ，Ｃ４００Ｓ、及びＳ４０６Ｐからなる群より選択される１つの置換を含む。
【００２２】
他の側面において、このセルラーゼ変異体は配列番号３で定義される対照セロビオヒドロラーゼＩＩ（ＣＢＨ２）のアミノ酸配列に対応して番号付けされる位置の３１６位においてプロリンを含み、Ｓ３４３Ｑ，Ｑ３６２Ｉ，Ｓ３８６Ｃ，Ｃ４００Ｓ、及びＳ４０６Ｐからなる群より選択される１つの置換を含む。
【００２３】
更に、本開示発明は配列番号３で定義される対照セロビオヒドロラーゼＩＩ（ＣＢＨ２）のアミノ酸配列に対応して番号付けされる位置の３４３位においてグルタミンを含み、Ｑ３６２Ｉ，Ｓ３８６Ｃ，Ｃ４００Ｓ、及びＳ４０６Ｐからなる群より選択される１つの置換を含む、セルラーゼ変異体を提供する。
【００２４】
本開示発明は、配列番号３で定義される対照セロビオヒドロラーゼＩＩ（ＣＢＨ２）のアミノ酸配列に対応して番号付けされる位置の３６２位においてイソロイシンを含み、Ｓ３８６Ｃ，Ｃ４００Ｓ、及びＳ４０６Ｐからなる群より選択される１つの置換を含む、セルラーゼ変異体も提供する。
【００２５】
１つの側面において、提供されるセルラーゼ変異体は、配列番号３で定義される対照セロビオヒドロラーゼＩＩ（ＣＢＨ２）のアミノ酸配列に対応して番号付けされる位置の３８６位においてシステインを含み、Ｃ４００Ｓ及びＳ４０６Ｐからなる群より選択される１つの置換を含む。
【００２６】
更に、本開示発明は、セルラーゼ活性を有する成熟形態であり、配列番号３で定義する対照セロビオヒドロラーゼＩＩ（ＣＢＨ２）に対応して番号付けされた位置、９８，１１１，１８２，２９１，３１６，３６２、及び４００位において、９８位ではプロリン又はロイシン、１１１位ではロイシン又はセリン、１８２位ではアスパラギン又はトリプトファン、２９１位ではセリン又はグルタミン酸、３１６位ではセリン又はプロリン、及び４００位ではシステイン又はセリンの置換を含み、前記セルラーゼ変異体が１つの置換からなる場合、この１つの置換はＰ９８Ｌ置換及びＳ３１６Ｐ置換からなる群より選択される１つではない、セルラーゼ変異体を提供する。幾つかの態様において、この変異体は更にＬ４３９Ｐ置換又はＴ７４Ｓ置換を更に含む。
【００２７】
本開示発明の幾つかの好適な態様において、発明の概要で説明する、前述のパラグラフのいずれかのセルラーゼ変異体は、ハイポクレアジェコリーナ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｊｅｃｏｒｉｎａ）ＣＢＨ２，ヒポクレアコニンギ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）ＣＢＨ２，フミコーラインソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）ＣＢＨ２，アクレモニウムセルロイティクス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕ）ＣＢＨ２，アガリクスビスポラス（Ａｇａｒｉｃｕｓ  ｂｉｓｐｏｒｕｓ）ＣＢＨ２，フサリウムオシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｓｙｓｐｏｒｕｍ）ＥＧ，フェノロカエテクリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）ＣＢＨ２，タラロマイセスエメルソニ（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）ＣＢＨ２，セルモビフィダフスカ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ．  Ｆｕｓｃａ）６Ｂ／Ｅ３  ＣＢＨ２，セルモビフィダフスカ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ）６Ａ／Ｅ２  ＥＧ，及びセルロモナスフィミ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｆｉｍｉ）ＣｅｎＡ  ＥＧからなる群より選択される親セルラーゼ由来である。幾つかの態様において、このセルラーゼ変異体は配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、及び配列番号１２からなる群のメンバーに対して、少なくとも７５％、８０％，８５％，９０％，９５％，９６％，９７％，９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を有する親セルラーゼ由来である。幾つかの態様において、この変異体は単離されている。更に、本開示発明はこのセルラーゼ変異体を含む組成物も提供する。幾つかの好適な態様において、この組成物はセルラーゼ変異体を多く含む。
【００２８】
他の側面において、本開示発明は発明の概要の前述のパラグラフのいずれかで説明するセルラーゼ変異体をコードする単離された核酸を提供する。調節配列に作動可能に結合している単離された核酸を含む発現ベクターも提供され、この発現ベクターを含む宿主細胞も提供される。幾つかの態様において、好適な条件下で培養培地中で宿主細胞を培養してセルラーゼ変異体を生成する工程を含むセルラーゼ変異体を生成する方法も提供される。
【００２９】
発明の概要の前述の段落にいずれかのセルラーゼ変異体を含む組成物も提供される。幾つかの好適な態様において、この組成物はスブチリシン、中性メタロプロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、カルボヒドロラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼ、及びペルオキシダーゼから選択される少なくとも１つの追加的な酵素を含む。本開示発明はこの組成物を、布の表面又は布を含む製品に接触させる工程を含む、布製品の洗浄又は処理方法を提供する。更に、この組成物を、布の表面又は布を含む製品に接触させる工程を含む、毛羽立ちを取る又は表面を最終加工する方法も提供する。
【００３０】
幾つかの好適な態様において、発明の概要における前述の段落のいずれかのセルラーゼ変異体とバイオマスとを接触させる工程を含むバイオマスを糖に転化する方法も提供される。幾つかの好適な態様において、発明の概要における前述の段落のいずれかのセルラーゼ変異体を含む酵素組成物をバイオマス組成物に接触させて、糖溶液を生成する工程と、この糖溶液を、燃料を生成するのに十分な条件下で発酵性微生物と接触させる工程とを含む、燃料を生成する方法も提供される。
【００３１】
本開示発明の他の目的、特徴、及び利点は以下の詳細な説明から明らかとなる。しかしながら、この詳細な説明及び特定の実施例は、本開示発明の好適な態様を示しており、説明の目的にのみ提供されるものであることをご理解いただきたい。本開示発明の範囲及び精神の範囲内の各種変更及び修飾は、この詳細な説明を読むことにより当業者が理解するであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
図１はハイポクレアジェコリーナ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｊｅｃｏｒｉｎａ）ＣＢＨ２，ヒポクレアコニンギ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）ＣＢＨ２，フミコーラインソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）ＣＢＨ２，アクレモニウムセルロイティクス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）ＣＢＨ２，アガリクスビスポラス（Ａｇａｒｉｃｕｓ  ｂｉｓｐｏｒｕｓ）ＣＢＨ２，フサリウムオシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｓｙｓｐｏｒｕｍ）ＥＧ，フェノロカエテクリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）ＣＢＨ２，タラロマイセスエメルソニ（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）ＣＢＨ２，セルモビフィダフスカ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ．  Ｆｕｓｃａ）６Ｂ／Ｅ３  ＣＢＨ２，セルモビフィダフスカ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ）６Ａ／Ｅ２  ＥＧ，及びセルロモナスフィミ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｆｉｍｉ）ＣｅｎＡ  ＥＧの各種セルラーゼの成熟形態のアミノ酸配列のアラインメントである。
【００３３】
図２ＡはＣＢＨ２  ＳＥＬの荷電変化の生成物としての予備処理されたコーンストーバー（ＰＣＳ）のアッセイウィナーの予測値に対する実測値の相対度数のグラフを提供する。ＣＢＨ２の荷電が減少するとＰＣＳアッセイウィナー相対度数が有意に高くなる。
図２ＢはＣＢＨ２  ＳＥＬの荷電変化の生成物としての、リン酸膨張セルロース（ＰＡＳＣ）アッセイウィナーの予測値に対する実測値の相対度数のグラフを提供する。ＰＡＳＣウィナーの有意に高い度数は、荷電変化のない変異体に観察された。
【００３４】
図３はｐＴＴＴｐｙｒＧ−ｃｂｈ２のプラスミドマップを提供する。
【００３５】
図４はＴ．ｒｅｅｓｅｉ  ｋｕ８０欠失カセットの概略図である。
【００３６】
図５はｓｌａ選択マーカーとＴ．ｒｅｅｓｅｉ  ｋｕ８０との置換による野生型ｋｕ８０の不活性化を示す。
【００３７】
図６はＴ．ｒｅｅｓｅｉ  ｐｙｒ２欠失カセットの概略図である。
【００３８】
図７はｈｙｒ２遺伝子をｈｙｇＲ選択マーカー及びａｍｄＳフラグメントで置換することによるｐｙｒ２遺伝子の不活性化を示す。
【００３９】
図８はＴ．ｒｅｅｓｅｉ  ｈｙｇＲ欠失カセットの概略図である。
【００４０】
図９はｐｙｒ２選択マーカーと異種ｈｙｒｇＲ遺伝子の置換によるｈｙｒｇＲ遺伝子の不活性化を示している。
【００４１】
図１０はＴ．ｒｅｅｓｅｉ  ｂｇｌ１欠失カセットの概略図を提供する。
【００４２】
図１１はＴ．ｒｅｅｓｅｉ  ｅｇｌ３欠失カセットの概略図を提供する。
【００４３】
図１２はｃｒｅリコンンビナーゼの発現に用いるＴ．ｒｅｅｓｅｉテロメアベクターの概略図である。
【００４４】
図１３は所望の遺伝子（ＧＯＩ）のポリヌクレオチドの導入によるｐｙｒ２選択マーカーの不活性化と、ａｍｄＳ選択マーカーの活性化を説明する。例示的な態様において、このＧＩＯはＣＢＨ２変異体をコードする。
【００４５】
図１４は四欠失株由来のＭＡＤ６宿主細胞の誘導体の概略図を提供する。
【発明の詳細な説明】
【００４６】
各種態様の詳細な説明
【００４７】
本開示発明は酵素、特にセルラーゼ変異体に関する。このセルラーゼ変異体、このセルラーゼ変異体を含む酵素、このセルラーゼ変異体を含む組成物、更なる有用なセルラーゼ変異体を同定する方法、及びこの組成物を使用する方法も提供される。
【００４８】
前述の発明の概要と以下の詳細な説明の両方は例示的及び説明にのみ用いるものであり、本開示発明の組成物及び方法を限定するためのものではない。別に定義しない限り、ここに違った形で定義されない限り、ここに使ったすべての技術の、そして科学用語は、一般的に、当業者によって理解されているのと同じ意味を持っている。本出願において、単数の使用は別に定義されない限り、複数も含むものとする。「又は」の使用は別に定義しない限り、「及び／又は」を意味する。同様に「含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｅ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ、ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ、及びｉｎｃｌｕｄｅｓ）は限定を意図する意味に用いない。開示されている全ての特許、刊行物、並びにこれらに記載のアミノ酸配列は明示的に参照により本明細書に援用される。本明細書で提供する標題は本開示発明の各種側面又は態様を限定するたけのものではない。本開示発明は明細書全体を参照することにより、理解されるべきである。即ち、本明細書における用語は明細書全体を参照することにより完全に定義される。
【００４９】
別に定義しない限り、ここに使ったすべての技術の、そして科学用語は、一般的に、当業者によって理解されているのと同じ意味を持っている。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら，ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，２Ｄ  ＥＤ．，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９４年）及びＨａｌｅ及びＭａｒｈａｍ，ＴＨＥ  ＨＡＲＰＥＲ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＢＩＯＬｏＧＹ，Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１年）は、本開示発明で用いられる数多くの用語の一般的な辞書である。本明細書で述べたものと同類のまたは等しい技術および物質は、発明の実施に用いることができるが、ここでは、好ましい態様を開示する。数の範囲は範囲を定義している数を含めている。違った形で示されない限り、塩基配列は左から右に向かって５’末端から３’末端を表す；アミノ酸配列は、左から右に向かって、アミノ末端からカルボキシ末端を表す。専門家は特に本分野の定義と用語についてＳａｍｂｒｏｏｋら，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ  ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ（Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．，１９８９，ａｎｄ  Ａｕｓｕｂｅｌ  ＦＭら．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９３，を参考にすることができる。本開示発明は、説明された特定の方法、手段、試薬等が変更されるときに、これらに限定されないことは理解される。
Ｉ．定義
【００５０】
以下の用語は明細書全体を参照することにより完全に理解される。
【００５１】
ここで用いる「ポリペプチド」の語はペプチド結合で結合したアミノ酸残渣の単鎖よりなる化合物をいう。ここで用いる「タンパク質」の語は「ポリペプチド」の語と同義である。
【００５２】
「変異体」は、Ｃ−もしくはＮ−末端のいずれかもしくは双方への１以上のアミノ酸の付加、アミノ酸配列中の１もしくは多数の異なる部位における１以上のアミノ酸の置換、もしくはタンパク質の一方もしくは双方の末端における、もしくはアミノ酸配列中の１以上の部位における１以上のアミノ酸の欠失によって前駆体タンパク質（たとえば、野生型タンパク質）から誘導されたタンパク質、または１以上のアミノ酸が、電荷を変えることによって(すなわち、正電荷を除くこと、負電荷を加えること、または正電荷を除くことおよび負電荷を加えることの双方によって)修飾されることを意味する。このセルラーゼ変異体の調製は当業者に知られている方法により行うことができる。好適な態様において、セルラーゼ変異体は、好ましくは天然タンパク質をエンコードしたＤＮＡ配列の変更、適切な宿主細胞内でのＤＮＡ配列の形質転換及び生産酵素を形成するような修飾されたＤＮＡ配列の発現によって達成できる。本開示発明の酵素の変異体は、前駆体アミノ酸配列と比較して変更されたアミノ酸配列を含むペプタイドを含む。ここで、変異体酵素は、前駆体酵素が有していたセルロース分解能を有しており、いくつかの特定の様相においては変更された性質を示す。例えば、セルラーゼ変異体は改善されたｐＨの至適条件、高められた温度又は酸化安定性、セルロース以外の基質への低められた親和性又は結合性を示すがセルロース分解活性は維持したままである。発現されたセルラーゼ誘導体の機能的な活性が保持されている本開示発明に応じた変異体は、セルラーゼ変異体酵素をエンコードしているＤＮＡ断片から引き出されることが予想される。例えば、セルラーゼをエンコードしているＤＮＡ断片は、さらに、セルラーゼ領域の機能的な活性が保持されている５’または３’末端のどちらかで、このセルラーゼＤＮＡ配列に接続したヒンジ部またはリンカーをエンコードしているＤＮＡ配列または部分を含む。「変異体」及び「誘導体」の語は本明細書において等しく用いる。
【００５３】
「等しい残基」とは、三次構造がエックス線結晶解析によって決定されている前駆物質セルラーゼに対する三次構造のレベルで相同を決定することによって定義される。等しい残基は、セルラーゼ及びハイポクレアジェコリーナＣＢＨ２の特定アミノ酸残基の主鎖原子のうちの２つ以上の原子座標（ＮのＮ、ＣＡのＣＡ、ＣのＣ及びＯのＯ）が、位置あわせをしたときに、０．１３ｎｍ及び、好ましくは０．１ｎｍ内にあるものと定義される。最良モデルが、問題となるハイポクレアジェコリーナＣＢＨ２のセルラーゼの非水素タンパク質原子の原子座標の最大オーバーラップを与えるように、方向付けられて置かれた後に、位置あわせは達成される。この最良モデルは、利用しうる高解像度での実験的回析データに対して最も低い解離因子（Ｒ）を与える結晶モデルである。例えば、ＵＳ２００６／０２０５０４２を参照のこと。
【００５４】
ハイポクレアジェコリーナＣＢＨ２の特定の残基に機能的に類似している同等の残基は、ハイポクレアジェコリーナＣＢＨ２の特定の残基について定義され帰属される様式で、タンパク質の構造、基質との結合、又は触媒反応を、変え、修飾し、又は寄与するような立体配座をとることができるセルラーゼのアミノ酸であると定義される。さらに、この同等の残基は、所与の残基の主鎖原子は相同の位置を占めることに基づく同等の判断基準を満たさないかも知れないけれども、その残基の側鎖原子の少なくとも２の原子座標がハイポクレアジェコリーナＣＢＨ２の対応する側鎖原子から０．１３ｎｍに存在する程度に類似した位置を占める（その三次構造がＸ線結晶学によってすでに得られている）セルラーゼの残基である。ハイポクレアジェコリーナＣＢＨ２の結晶構造は、Ｚｏｕら、１９９９年（非特許文献５、前掲）に示されている。
【００５５】
「核酸分子」は、ＲＮＡ、ＤＮＡ及びｃＤＮＡ分子を含む。遺伝暗号の退縮の結果として、ＣＢＨ２及びこれらの変異体のような与えられたタンパクをエンコードしている塩基配列の多様性が生じる理解される。本開示発明は、遺伝暗号の退縮を与えることができるすべてのＣＢＨ２をコードしている変異塩基配列を予測するものである。
【００５６】
「非相同の」核酸構築物または配列は、それが発現する細胞固有のものではない配列の一部を有している。制御配列に関する非相同とは、発現を現在調節している同じ遺伝子を調節するために生来機能しない制御配列（すなわちプロモーター又はエンハンサー）をいう。一般的に、非相同な塩基配列はそれらのもともとの細胞又は遺伝子の一部には本来存在しないものであり、感染、トランスフェクション、形質転換、顕微注入、エレクトロポーション又は同様の方法により細胞へ添加されたものである。「非相同な」核酸構築物は、ネイティブの細胞の中で発見された制御シーケンス／ＤＮＡコーディングシーケンスの組み合わせと同じであるか、ネイティブの細胞で発見されるものとは異なる制御シーケンス／ＤＮＡコーディングシーケンスの組み合わせを含む。
【００５７】
ここで用いる「ベクター」という語は、異なる宿主細胞間を輸送することを目的とする核酸構築物である。発現ベクターとは、異質細胞内で、相同なＤＮＡ断片を取り込み、発現させる能力があるベクターをいう。多くの原核又は真核細胞のベクターは市販されている。適切な発現ベクターの選択は、当該技術分野においてよく知られている。
【００５８】
従って、「発現カセット」又は「発現ベクター」は、目的細胞内のある特定の核酸を転写させる一連の特定の核酸要素と共に用いる組み換え処理により、または合成的に生産された核酸構築物である。組み換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、色素体ＤＮＡ、ウイルス又は核酸断片に取り込むことができる。典型的には、発現ベクターが取り込まれた組み換えカセット部分は、他の配列の中に、転写されるべき核酸配列及びプロモーターになる。
【００５９】
本明細書で用いる「プラスミド」という語は、クローニングベクターとして用いられる環状２本鎖ＤＮＡ（ｄoｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ（ｄｓ））構築体であり、多くのバクテリア及び幾つかの真核生物において染色体外にある自己複製する遺伝子要素を形成するものである。
【００６０】
本明細書で用いる「選択マーカー−エンコードヌクレオチド配列」の語は細胞において発現できるヌクレオチド配列をいい、選択マーカーの発現により対応する選択因子の存在下、または成長環境で発現遺伝子を含む細胞は成長できるようになる。
【００６１】
本明細書で用いられる「プロモーター」という語は、下流遺伝子を直接転写する核酸配列をいう。このプロモーターは一般的に目的遺伝子を発現する宿主細胞に適している。このプロモーターは、他の転写又は翻訳調節核酸配列（「制御配列」ともいう）と共に、与えられる遺伝子の発現に必要である。一般的には、この転写又は翻訳調節配列には、プロモーター塩基配列、リボゾーム結合部位、転写開始又は終了塩基配列、翻訳開始又は終了配列、及びエンハンサー、又は活性配列を含むがそれらに限られない。
【００６２】
「キメラ遺伝子」又は「非相同核酸構造」は、調節領域を含む、異なる遺伝子の形質転換部分を構成する非野生型遺伝子（すなわち、宿主内に導入されたもの）をいう。宿主細胞の形質転換をするためのキメラ遺伝子構築物は、一般的に異種のタンパク質コーディング配列、または選択マーカーのキメラ遺伝子の中に、形質転換細胞に、例えば、抗生物質抵抗性を与えているタンパク質をエンコードしている選択マーカー遺伝子と操作可能に接続した転写の規制の部分（促進因子）から構成されている。本開示発明の典型的なキメラ遺伝子は、宿主細胞への輸送については、構成要素となる転写調節領域、又はこれらを誘発する転写調節領域、タンパク質コード配列及びターミネーター配列を含む。キメラ遺伝子構築体は、目的タンパク質の分泌が必要な場合には、シグナルペプチドをエンコードする第２のＤＮＡ配列も含む。
【００６３】
核酸配列は、他の核酸配列と機能的な関係に置かれたときに、「作動可能に結合している」。例えば、分泌リーダーをコードしているＤＮＡは、もしそれが、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現するなら、ポリペプチドに関するＤＮＡと作動可能に結合する。プロモーター又はエンハンサーは、もしそれが、配列の転写に影響するなら、コード配列と作動可能に結合する。又はリボゾーム結合部位は、それが、転写を促進するような位置にあるならば、コード配列と作動可能に結合している。一般に「作動可能に結合」とは結合するＤＮＡ配列が隣接し、分泌開始端部の場合、隣接しかつリーディングフレーム中にあることを意味する。しかし、エンハンサーは隣接している必要はない。結合は、適宜の制限酵素認識部位で連結反応により達成される。そのような部位が存在しない場合、従来方法によりＰＣＲ用の合成オリゴヌクレオチド・アダプタ、リンカーまたはプライマーを用いる。
【００６４】
ここで用いる、「遺伝子」の語はポリペプチド鎖の生成に関するＤＮＡの染色体断片を意味し、コード領域に先行または後に続く領域（例えば、５’非翻訳（５’ＵＴＲ）またはリーダー配列及び３’非翻訳（３’ＵＴＲ）またはトレーラー配列）、及び個々のコード断片（エキソン）間の介在配列（イントロン）を含んでも含まなくてもよい。
【００６５】
一般に、配列番号１としてここに提供された野生型配列に対する中から高ストリンジェンシー条件下で、変異体ＣＢＨ２をエンコードする核酸分子はハイブリダイズする。しかし、場合によっては、ＣＢＨ２エンコーディング核酸配列によってエンコードされたタンパク質は天然タンパク質と同じ又は実質的に同じアミノ酸配列を有する一方で、実質的に異なるコドン使用頻度を有するＣＢＨ２エンコーディング核酸配列を、採用される場合がある。例えば、コーディング配列は、宿主によって利用される特定コドンの頻度に従い、特定の原核生物又は真核生物の発現システムにおいて、ＣＢＨ２の発現を早くするために修飾される。Ｔｅ’ｏら、（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、第１９０巻、１３−１９頁、２０００年）、は、例えば、糸状菌の発現についての遺伝子の最適化について記載している。
【００６６】
核酸配列は、２つの配列が中〜高ストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件及び洗浄条件下でお互いに特異的にハイブリダイズする場合、対照核酸配列に「選択的にハイブリダイズ可能」であると考えられる。ハイブリダイゼーション条件は、核酸結合体又はプローブの融点（Ｔｍ）に基づいている。例えば、「最大ストリンジェンシー」は典型的にＴｍ−５℃（プローブのＴｍより５℃低い）で起こる；「高ストリンジェンシー」はＴｍより約５−１０℃低い温度で起こる；「ゆるやかな」又は「中間ストリンジェンシー」はプローブのＴｍより約１０−２０℃低い温度で起こる；及び「低ストリンジェンシー」はＴｍより約２０−２５℃低い温度で起こる。機能的に、最大のストリンジェンシー条件は、ハイブリダーゼーションプローブと厳密な同一性またはほぼ厳密な同一性を有する配列を同定するために使われることができ；一方、高いストリンジェンシーは、プローブと約８０％以上同一性を有する配列を同定するために使われる。
【００６７】
中間ストリンジェンシー又は高ストリンジェンシー条件は、本技術分野でよく知られている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年、Ｃｈａｐｔｅｒｓ９及び１１、及びｉｎ  Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍ．、ら、１９９３年を参照のこと。これらは参照によりここに組み込まれる。）高ストリンジェンシー条件の例としては、５０％ホルムアミド、５ＸＳＳＣ、５Ｘデンハード溶液、０．５％ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌ変性キャリアＤＮＡ中、約４２℃でのハイブリダイゼーションを行い、続いて２ＸＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳ中で、室温で２回洗浄し、０．１ＸＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳ中で、更に４２℃で２回洗浄する。
【００６８】
例えば、細胞又は核酸、タンパク質、又はベクターについてここで用いる「組換え体」は、細胞、核酸、タンパク質、又はベクターが、非相同核酸配列又はタンパク質の導入によりあるいは天然の核酸又はタンパク質の修飾により、改変されているか、その細胞がそのように修飾された細胞由来であるこことを意味する。従って、例えば、組換え細胞は、天然細胞携帯（非組換え体）内には見られない遺伝子を発現するか、他の手段で天然遺伝子を以上に発現するか、又は未発現のままにするか、又は全く発現しない。
【００６９】
ここに用いる「形質転換」「安定な形質転換」「遺伝子組み換え」の語は、細胞に関して、ゲノムに組み込まれ、または複数の世代を通して維持されているエピゾームプラスミドとして非天然（非相同）核酸配列を有する細胞を意味している。
【００７０】
ここで用いられる、「発現」という語は、ポリペプチドが、遺伝子の核酸シーケンスに基づいて生み出される過程を言う。この過程は転写と翻訳の両方を含む。
【００７１】
核酸配列を細胞のなかに挿入するという文意の中で用いられている「導入」の語は、「トランスフェクション」、又は「形質転換」又は「形質導入」を意味し、核酸配列を真核又は原核細胞に組み込むことを含み、核酸配列が細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、色素体又はミトコンドリアＤＮＡ）に組み込まれ、自己複製子へ転換されるか、一時的に発現される（例えば、トランスフェクトｍＲＮＡ）。
【００７２】
「ＣＢＨ２発現」という語は、ｃｂｈ２遺伝子又はそれらの変異体の転写及び翻訳をいう、この生産物はＲＮＡ前駆体、ｍＲＮＡ、ポリペプチド、翻訳後調節過程のポリペプチド及びトリコデルマコニンギ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、ハイポクレアジェコリーナ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｊｅｃｏｒｉｎａ）（トリコデルマロンギブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  Ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）（トリコデルマレーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ））、又はトリコデルマビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）、としても知られている）及び、ハイポクレアシュワイニッチ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｓｃｈｗｅｉｎｉｔｚｉｉ）等の、関連種由来の新規タンパク質を有する生産物を言う。実施例で示す方法であるが、ＣＢＨ２発現を測定する方法は、ＣＢＨ２タンパクについてのウエスタンブロット、ｃｂｈ２のｍＲＮＡに対してのノザンブロット及び逆転写ポリメラーセ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）測定、並びに、以下で説明されているリン酸膨張セルラーゼ及びＰＡＨＢＡＨアッセイ、（ａ）ＰＡＳＣ：（Ｋａｒｌｓｓｏｎ、Ｊ．ら、（２００１年）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ、第２６８巻、６４９８−６５０７頁、Ｗｏｏｄ、Ｔ．（１９８８）ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１６０巻、Ｂｉｏｍａｓｓ  Ｐａｒｔ  ａ  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ａｎｄ  Ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  （Ｗｏｏｄ、Ｗ．＆Ｋｅｌｌｏｇ、Ｓ．Ｅｄｓ．）、１９−２５頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、  ＣＡ、ＵＳＡ）及び（ｂ）ＰＡＨＢＡＨ：（Ｌｅｖｅｒ、Ｍ．（１９７２年）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４７、２７３、Ｂｌａｋｅｎｅｙ、Ａ．Ｂ．＆Ｍｕｔｔｏｎ、Ｌ．Ｌ．（１９８０年）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ、第３１巻、８８９、Ｈｅｎｒｙ、Ｒ．Ｊ．（１９８４年）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｒｅｗｉｎｇ、第９０巻、３７頁）を含む。
【００７３】
「選択的スプライシング」は、複数のイソ型ポリペプチドを単一遺伝子から生成する方法を言い、該スプライシングは該遺伝子の全部ではないが、いくつかをプロセッシングする間、非連続エキソンをつなげる工程を含む。従って、特定のエキソンはいくつかの選択エキソンの１つに接続され、メッセンジャーＲＮＡを形成する。この選択的にスプライスされたｍＲＮＡは、いくつかの部分が共通で、いくつかの部分が異なる、ポリペプチド（スプライス変異体）を生産する。
【００７４】
「シグナル配列」という語は、細胞外への成熟型タンパクの分泌を促進するＮ末端部分アミノ酸配列である。細胞外タンパク質成熟型は、分泌過程の中で分裂するシグナル配列を欠いている。
【００７５】
「宿主細胞」という語は、ベクターを含み、発現構築物の複製、及び／又は転写又は、転写及び翻訳（発現）を支える細胞である。本開示発明で用いられる宿主細胞は、大腸菌のような原核生物の細胞又は、酵母菌、植物、昆虫、両生類又は哺乳類のような真核細胞である。一般的には、宿主細胞は糸状菌である。
【００７６】
「糸状菌」という語は、当該技術分野において糸状菌であると認められる任意の又は全ての糸状菌を意味する。好ましい、細菌は、アルペルギウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）又はエメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）、ハイポクレア（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）などそれらの別の有性型からなる群より選択される。無性の工業用菌類であるトリコデルマレーシは子嚢菌類のハイポクレアジェコリーナのクローンの誘導体であることは明らかである。Ｋｕｈｌｓら、ＰＮＡＳ（１９９６）９３：７７５５−７７６０参照。
【００７７】
「セロビオサッカライド」という語は、例えば、セロビオースのように、２−８のグルコース単位を含み、β−１，４結合を有する少糖類を言う。
【００７８】
「セルラーゼ」、「セルロース分解酵素」、又は「セルラーゼ酵素」の語は、セルロースポリマーをより短いセロオリゴ糖オリゴマー、セロビオース、及び／又はグルコースに分解する能力を有する酵素の分類をいう。エキソグルカナーゼ、エキソセロビオハイドラーゼ、エンドグルカナーゼ、及びグルコシダーゼのようなセルラーゼの多くの例は、細菌、植物及びバクテリアを含むセルロース分解能を有する有機体から得られる。これらの微生物から作られるこの酵素は、セルロースのグルコース転化有用な作用をする３タイプのタンパク質；エンドグルカナーセ（ＥＧ）、セロビオハイドラーゼ（ＣＢＨ）、及びベータ−グルコシダーゼ（ＢＧ）の混合物である。これらの３の異なる型のセルラーゼ酵素は相乗的に作用し、セルロース及びその誘導体をグルコースへ転化する。
【００７９】
木材腐敗菌であるトリコデルマ、堆肥バクテリアであるサーモモノスポラ（現サーモビヒダ）、バチルス及びセルロモナス；ストレプトマイセス；及び糸状菌フミコーラ、アスペルギウス及びフザリウムを含む多くの微生物はセルロースを加水分解する酵素を作る。
【００８０】
ハイポクレアジェコリーナ由来ＣＢＨ２は、グルコース化加水分解酵素ファミリー６（以下Ｃｅｌ６）のメンバーであり、特にハイポクレアジェコリーナにおいて確立されたグルコース化加水分解酵素ファミリー６の第一のメンバーである（以下Ｃｅｌ６Ａ）。グルコース化加水分解酵素ファミリー６はエンドグルカナーゼ及びセロビオハイドラーゼ／エキソグルカナーゼを含んでおり、ＣＢＨ２は後者である。したがって、ＣＢＨ２、ＣＢＨ２型タンパク質及びＣｅｌ６セロビオハイドラーゼという語は、ここにおいて互換的に使用される。
【００８１】
「セルロース結合領域」という語は、ここにおいて、セルラーゼのアミノ酸配列の一部分又セルラーゼ又はそれらの誘導体のセルロース結合活性に含まれる酵素の領域を言う。セルロース結合領域は、一般的にセルラーゼとセルロース、セルロース誘導体またはそれらのその他の多糖類同等物を非共有結合にすることにより機能する。従って、セルロース結合領域は触媒中心に起因する著しい触媒活性を示さない。他言すれば、セルロース活性部位は、触媒活性を有する構造成分とは区別されるセルロース酵素タンパク質の三次構造の構造成分である。セルロース結合部位とセルロース結合構成要素という語はここでは同義に使用される。
【００８２】
ここにおいて、「界面活性剤」という語は、表面活性特性を有すると当該技術分野で認められている任意の化合物をいう。従って、例えば、界面活性剤は、一般的に洗剤中入っている陰イオン性、陽イオン性及び非イオン性の界面活性剤から成る。陰イオン性界面活性剤は直鎖又は分岐のアルキル・ベンゼン・スルホン酸塩；直鎖又は分岐アルキル基又はアルケニル基を有するアルキル又はアルケニルエーテル硫酸塩；アルキル又はアルケニル硫酸塩；オレフィンスルフォン酸塩；及びアルカンスルフォン酸塩を含む。両性界面活性剤は、４級アンモニウム塩スルフォンサン塩、及びベタイン型両性界面活性剤を含む。そのような両性界面活性剤は同一分子内にプラス及びマイナスに帯電した部分を有している。非イオン性界面活性剤は高級脂肪酸アルカノールアミド又はそれらのアルキレン酸化物の付加物、脂肪酸グリセリンモノエステル及び同種のものだけでなく、ポリオキシアルキレンエーテルも同様に含まれる。
【００８３】
ここで用いる「セルロース含有繊維」とは、天然セルロース物質及び人工セルロース物質（例えば、ジュート、麻、ラミー、レーヨン及びライオセル）を含む綿または非綿含有セルロース含有物から作成されるいかなる縫合又は非縫合織物、毛糸又は繊維をいう。
【００８４】
ここで用いられる「綿を含む布地」とは、純粋な綿又は、綿織布、綿ニット、綿デニム、綿毛糸、原綿（綿花）及び同種のものを含んだ綿混合物から作成されるいかなる縫合又は非縫合織物、毛糸又は繊維をいう。
【００８５】
ここで用いる「ストーンウォシュ組成物」とは、セルロース含有織物のストーンウォシュに用いる製剤を言う。ストーンウォシュ組成物はセルロース含有布地を販売するに先立って加工するために用いられる、すなわち、製造過程において用いられる。対照的に、洗浄組成物は汚れた衣類の洗浄することを対象としており、工業的生産過程においては使用されない。
【００８６】
ここで用いられる「洗浄組成物」は、セルロースを含んだ汚れた布地の洗濯に対する洗浄手段に用いることを意図された混合物である。本開示発明の文脈中、そのような組成物生物は、セルラーゼ及び界面活性剤に加えて、さらに加水分解酵素、原材料、漂白剤、漂白活性剤、青味剤、蛍光染料、ケーキング抑制剤、マスキング剤、セルラーゼ活性剤、抗酸化剤、及び可溶化剤を含む。
【００８７】
ここで用いる「ｃｂｈ２遺伝子の発現の減少又は排除」とは、ｃｂｈ２遺伝子が遺伝子から削除されているために、組み換え宿主微生物によって発現できないこと；又は機能的なＣＢＨ２酵素が宿主の微生物によって生み出されないように、ｃｂｈ２遺伝子が修飾されていることのどちらかを意味する。
【００８８】
ここで用いる「変異体ｃｂｈ２遺伝子」は、ハイポクレアジェコリーナ由来のｃｂｈ２遺伝子の核酸配列が、コーディングシーケンスを取り除き、追加し、および／または処理することによって変更されたことを意味する。
【００８９】
ここで用いる、「精製する」という語は、一般に、遺伝子組換された核酸またはタンパク質を含む細胞を生化学的精製、および／またはカラムクロマトグラフィーにかけることを意味する。
【００９０】
ここで用いる「活性の」又は「生物学的に活性の」とは、ある特定のタンパク質と関係のある生物学的活性を言い、ここでは、互換的に使用される。例えば、プロテアーゼと関係する酵素活性はタンパク質分解であり、実際に、活性を有するプロテアーゼはタンパク質分解活性を有している。このことは、与えられたタンパク質の生物活性は一般に当業者によってそのタンパク質に帰属するどのような生物活性でも言うと理解される。
【００９１】
ここで用いる「濃縮する」という語は、ＣＢＨ２が入手できる、野生型又は自然発生する細菌性のセルラーゼ組成物に見られるＣＢＨ２濃度よりも相対的に高い濃度である。この濃縮する、高める、促進されたという語は、互換的に用いられる。
【００９２】
野生型糸状菌セルラーゼ組成物は、天然に存在する糸状菌源によって産生されたものであり、それは１以上のＢＧＬ、ＣＢＨおよびＥＧ成分を含み、これらの成分のそれぞれは該糸状菌源によって産生された割合で認められる。したがって、濃縮されたＣＢＨ組成物はＣＢＨを変えられた割合で有し、ＣＢＨの他のセルラーゼ成分（すなわち、ＥＧ、ベータ−グルコシダーゼおよび他のエンドグルカナーゼ）に対する比は高められている。従来技術で知られた任意の手段によって、ＣＢＨを増加するか、あるいは少なくとも１の他の成分を減少（または除去）することによって、この比は増加されることができる。
【００９３】
「単離された」又は「精製された」の語は、本来有している成分の少なくとも１つを除去した核酸又はアミノ酸を意味する。
【００９４】
従って、図示するように、自然発生的なセルラーゼシステムは、至適ｐＨにおけるイオンクロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、分子ふるい及び同種のものを含むものであり、出版された文献中に記載の分離技術により、大幅に精製された組成物に精製される。例えば、イオン交換クロマトグラフィー（たいていは陰イオン交換クロマトグラフィー）において、ｐＨ勾配又は塩勾配又はｐＨ及び塩の両者の勾配を用いた溶出により、セルラーゼ組成物を分離することは可能である。精製されたＣＢＨは、最終的にＣＢＨ濃度の高い溶液となる酵素溶液に添加される。可能であれば、他のセルラーゼをエンコードしている１以上の遺伝子の欠損部分と関連して、ＣＢＨをエンコードした遺伝子の過剰発現させる分子遺伝学的方法を用いて、微生物により生産されるＣＢＨの量を多くすることは可能である。
【００９５】
細菌のセルラーゼは１以上のＣＢＨ成分を含んでいる。この異なる成分は、イオン交換クロマトグラフィー及び同種のものを介して分離することが可能な、遺伝的に異なった等電点を有する。単一ＣＢＨ成分又はＣＢＨ成分の組み合わせのどちらか一方が、酵素溶液中に用いられる。
【００９６】
酵素溶液中に用いる場合、ＣＨＢ２の相同体又は変異体成分は一般的にバイオマスから可溶糖の放出速度を最も高くするのに十分な量が添加されている。追加された同族体または変異体のＣＢＨ２成分の量は、糖化される生物量のタイプに依存しており、熟練した者によって直ちに決定することができる。酵素溶液中に用いる、セルラーゼ組成物中の、相同又は変異ＣＢＨ２成分の重量パーセントは、１乃至１００の間であり、好ましくは約１、好ましくは約５、好ましくは約１０、好ましくは約１５、又は好ましくは約２０重量パーセントから、好ましくは約２５、好ましくは約３０、好ましくは約３５、好ましくは約４０、又は好ましくは約５０重量パーセントまでである。さらに、好ましい範囲は、約０．５から１５重量パーセント、約０．５から２０重量パーセント、約１から約１０重量パーセント、約１から約１５重量パーセント、約１から約２０重量パーセント、約１から約２５重量パーセント、約５から約２０重量パーセント、約５から約２５重量パーセント、約５から約３０重量パーセント、約５から約３５重量パーセント、約５から約４０重量パーセント、約５から約４５重量パーセント、約５から約５０重量パーセント、約１０から約２０重量パーセント、約１０から約２５重量パーセント、約１０から約３０重量パーセント、約１０から約３５重量パーセント、約１０から約４０重量パーセント、約１０から約４５重量パーセント、約１０から約５０重量パーセント、約１５から約６０重量パーセント、約１５から約６５重量パーセント、約１５から約７０重量パーセント、約１５から約７５重量パーセント、約１５から約８０重量パーセント、約１５から約８５重量パーセント、約１５から約９５重量パーセントである。しかしながら、（酵素溶液中に）用いられたときに、セルラーゼ組成物中の、あるＥＧタイプの成分に対する相同又は変異ＣＢＨ成分の重量パーセントは、好ましくは約１、好ましくは約５、好ましくは約１０、好ましくは約１５、又は、好ましくは約２０重量パーセントから、好ましくは約２５、好ましくは約３０、好ましくは約３５、好ましくは約４０、好ましくは４５、又は好ましくは約５０重量パーセントまでである。さらに、好ましい範囲は、約０．５から１５重量パーセント、約０−５から２０重量パーセント、約１から約１０重量パーセント、約１から約１５重量パーセント、約１から約２０重量パーセント、約１から約２５重量パーセント、約５から約２０重量パーセント、約５から約２５重量パーセント、約５から約３０重量パーセント、約５から約３５重量パーセント、約５から約４０重量パーセント、約５から約４５重量パーセント、約５から約５０重量パーセント、約１０から約２０重量パーセント、約１０から約２５重量パーセント、約１０から約３０重量パーセント、約１０から約３５重量パーセント、約１０から約４０重量パーセント、約１０から約４５重量パーセント、約１０から約５０重量パーセント、約１５から約２０重量パーセント、約１５から約２５重量パーセント、約１５から約３０重量パーセント、約１５から約３５重量パーセント、約１５から約４０重量パーセント、約１５から約４５重量パーセント、約１５から約５０重量パーセントである。
ＩＩ．セルラーゼ
【００９７】
セルラーゼは、当該技術分野において、セルロース（ベータ−１，４グルカン又はベータＤ−グルコシド結合）を加水分解し、グルコース、セロビオース、セロビオオリゴサッカライド及び同種のものを生産する酵素として知られている。上記のように、セルラーゼは伝統的に３つの主クラスに分類される：エンドグルカナーゼ（ＥＣ３−２−１−４）（「ＥＧ」）、エキソグルカナーゼ又はセロビオハイドラーゼ（ＥＣ３−２−１−９１）（「ＣＢＨ」）及びベータグルコシダーゼ（ＥＣ３−２−１−２１）（「ＢＧ」）である。
【００９８】
ある特定の細菌は、エキソセロビオハイドラーゼ又はＣＢＨ型セルラーゼ及びベータグルコシダーゼ又はＢＧ型セルラーゼを含む複合的なセルラーゼシステムを生産する。しかしながら、ときどきこれらのシステムは、或るときにはこれらのシステムはＣＢＨタイプセルラーゼを欠き、一般にほとんどまたは全くＣＢＨタイプセルラーゼを含まない細菌性セルラーゼを含む場合がある。加えて、ＥＧ成分及びＣＢＨ成分は、セルロースをより効果的に分解するために相乗的に相互作用をすることが示されている。この異なった成分、すなわち、複合成分又は完全なセルラーゼシステムの中のさまざまなエンドグルカナーゼ及びエキソセロビオハイドラーゼは、等電点、分子量、グリコシル化度、基質特異性及び酵素活性パターンなどにおいて、一般的に異なる性質を有する。
【００９９】
エンドグルカナーゼ型セルラーゼは、セルロースの結晶化度の低い部分の内部ベータ−１，４グルコシド結合を加水分解し、エキソセロビオハイドラーゼ型セルラーゼは、セルロースの還元又は非還元末端からセロビオースを加水分解する。それは、エンドグルカナーゼ成分の作用はエキソエロビオハイドラーゼ成分によると認められる新しい鎖端を作ることによるエキソセロビオハイドラーゼの作用を大いに促進することができるということになる。さらに、ベータグルコシダーゼタイプのセルラーゼは、セロビオースのような糖質残基を含むグルコシドだけでなく、メチル−β−Ｄグルコシド及びｐ−ニトロフェニルグルコシドのようなアルキル及び／又はアリールβ−Ｄ−グルコシダーゼの加水分解に触媒作用をすることが示されている。このことは、微生物の唯一の生産物として、グルコースを生産し、セロビオハイドラーゼ及びエンドグルカナーゼを抑制するセロビオースを減らすか又は排除する。
【０１００】
セルラーゼは、洗浄能力を高めるために、柔軟成分として、及び綿布製品の風合いを改善するために、洗剤組成物中に多くの使用例が見られる（Ｈｅｍｍｐｅｌ、ＩＴＢ  Ｄｙｅｉｎｇ／Ｐｒｉｎｔｉｎｇ／Ｆｉｎｉｓｈｉｎｇ、第３巻、５−１４頁、１９９１年；Ｔｙｎｄａｌｌ、Ｔｅｘｔｉｌｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔ  ａｎｄ  Ｃｏｌｏｒｉｓｔ、第２４巻、２３−２６頁、１９９２年；Ｋｕｍａｒら、Ｔｅｘｔｉｌｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔ  ａｎｄ  Ｃｏｌｏｒｉｓｔ、第２９巻、３７−４２頁、１９９７年）。一方その作用機能は、本開示発明の一部ではないが、セルラーゼの柔軟性及び色の回復特性はセルラーゼ組成物中のアルカリ性エンドグルカナーゼ成分に起因するものである。実証例として、ＵＳ  Ｎｏｓ．５，６４８，２６３、５，６９１，１７８、及び５，７７６，７５７がある。これらは、特定のアルカリ性エンドグルカナーゼ成分が豊富なセルラーゼ組成物を含んでいる洗剤成分は、アルカリ性エンドグルカナーゼ成分が豊富でないセルラーゼ組成物と比較すると、処理した衣類に対して色の回復及び柔軟性の改善を与えることができる。更に、そのようなアルカリ性エンドグルカナーゼ成分を洗剤成分へ用いることは、洗剤組成物のｐＨ要件を補完していることを示している。（すなわち、ＵＳ  Ｎｏ．５，６４８，２６３、５，６９１，１７８、及び５，７７６，７５７に開示されているように、７．５から１０のアルカリ性のｐＨにおいて最大活性を示すことによる）
【０１０１】
セルラーゼ組成物は、綿を含む布製品を分解し、最終的にこの布製品において強度が低くなることが示唆され（ＵＳ  Ｎｏ．４，８２２，５１６）、セルラーゼ組成物を市販の洗剤成分に使用することをためらう原因となっている。エンドヌクレアーゼ成分から成っているセルラーゼ組成物は、完全なセルラーゼシステムから成っている組成物に比べて綿を含んだ布に対して低い強度損失を示すことが示唆されている。
【０１０２】
セルラーゼは、セルラーゼバイオマスをエタノールに分解すること（ここにおいて、セルラーゼがセルラースをグルコースに分解し、酵母又は他の微生物がさらにグルコースをエタノールに発酵させる）において、機械パルプ（Ｐｅｒｅら、  Ｉｎ  Ｐｒｏｃ．  Ｔａｐｐｉ  Ｐｕｌｐｉｎｇ  Ｃｏｎｆ．、Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ、ＴＮ、２７−３１、ｐｐ．６９３−６９６、１９９６年）の処理、飼料添加物（ＷＯ９１／０４６７３）としての使用のために、そして粒子湿式粉砕において有益であることが明らかにされている。
【０１０３】
大部分のＣＢＨ及びＥＧは、リンカーペプタイド（Ｓｕｕｒｎａｋｋｉら、２０００年）による、セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）から分離されたコアドメインを含む多重ドメイン構造を有する。コアドメインは、酵素がセルロースに結合することによりセルロースとＣＢＤの相互作用が起きる活性部位を含んでいる。（ｖａｎ  Ｔｉｌｂｅｕｒｇｈ  ら．、１９８６；Ｔｏｍｍｅ  ら．、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第１７０巻、５７５−５８１頁、１９８８年）このＣＢＤは、結晶セルロースの加水分解に特に重量である。セロビオハイドラーゼが結晶セルラースを加水分解する能力は、ＣＢＤが存在しないときには明らかに減少することが示されている。（Ｌｉｎｄｅｒ  ａｎｄ  Ｔｅｅｒｉ、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．第５７巻、１５−２８頁、１９９７年）しかしながら、ＣＢＤの確かな役割及び作用機能はいまだ憶測の範疇にある。ＣＢＤは、セルロース表面での有効な酵素の濃度を増加することにより（Ｓｔａｈｌｂｅｒｇら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．第９巻、２８６−２９０頁、１９９１年）、及び／又はセルロース表面から、１本鎖セルロースを分離することにより（Ｔｏｒｍｏら、ＥＭＢＯ  Ｊ．  ｖｏｌ．１５、Ｎｏ．２１、５７３９−５７５１頁、１９９６年）、酵素活性を高めるということが示唆されてきた。異なる基質上におけるセルラーゼドメインの効果に関する研究の多くは、パパインを用いた有効なタンパク質分解によりコアプロテインを生産することができたので（Ｔｏｍｍｅら、  １９８８年）、セロビオハイドラーゼのコアプロテインを用いて実施した。数多くのセルラーゼは特定の文献に開示されており、（その例は以下のものに含まれる）：Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉの例：Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ、Ｓ．ら．、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１：６９１−６９６、１９８３年、この文献はＣＢＨ１を開示する。Ｔｅｅｒｉ、Ｔ．ら、  Ｇｅｎｅ、５１：４３−５２、１９８７年、この文献はＣＢＨ２を開示する。Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ以外の主由来のセルラーゼも説明されている、例えば、Ｏｏｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ｖｏｌ．１８、Ｎｏ．１９、１９９０年、この文献は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ由来のエンドグルカナーゼＦ１−ＣＭＣのシークエンスをコードしているｃＤＮＡを開示している。Ｋａｗａｇｕｃｈｉ  Ｔ．ら、Ｇｅｎｅ  １７３（２）：２８７−８、１９９６年、この文献はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ由来のベータグルコシダーゼ１をエンコードしているｃＤＮＡのクローニング及び配列決定を開示している。Ｓａｋａｍｏｔｏ  ら、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．第２７巻、４３５−４３９頁、１９９５年、この文献はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｋａｗａｃｈｉｉ  ＩＦＯ  ４３０８由来のエンドグルカナーゼＣＭＣａｓｅ−１をエンコードしているｃＤＮＡの塩基配列を開示している。Ｓａａｒｉｌａｈｔｉ  ら、Ｇｅｎｅ、第９０巻、９−１４頁、１９９０年、この文献はＥｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖａｒａ由来のエンドグルカナーゼを開示している。Ｓｐｉｌｌｉａｅｒｔ  Ｒら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２４（３）：９２３−３０、１９９４年この文献はＲｈｏｄｏ���ｈｅｒｍｕｓ  ｍａｒｉｎｕ由来の熱耐性ベータグルカナーゼをコードしているｂｇｌＡのクローニング及び配列決定を開示している。Ｈａｉｌｄｏｒｓｄｏｔｔｉｒ  ら、Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４９（３）：２７７−８４、１９９８年、これはグリコシルハイドラーゼ  ファミリー１２の熱耐性セルラーゼをエンコードしているＲｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ遺伝子のクローニング、配列決定及び過剰発現を開示している。熱ストレス条件下又は界面活性剤の存在中での性能の改善、高められた特異的活性、基質開裂パターンを変更すること、及び／又はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける高レベルでの発現のような改善された性質を有する新規セルラーゼを確立し、特徴づけることが求められている。
【０１０４】
さまざまな量のＣＢＨ型、ＥＧ型及びＢＧ型セルラーゼからなる新しく改良されたセルラーゼ組成物生物は：（１）高められた洗浄能力（柔軟成分として機能し、及び／又は綿布の風合いを改善する）を示す洗剤組成物中への使用（例えば、「ストーンウォッシュ」又は「生物研磨」）；（２）低品質なウッドパルプ又は他のバイオマスから糖を生産する組成物中への使用（例えば、バイオエタノール生産）及び／又は（３）食品組成物へ使用することにより重要な意味を持つ。
【０１０５】
本開示発明はセルラーゼ変異体を含む全セルラーゼ調製物を提供する。ここで用いる、「全セルラーゼ調製物」は、自然発生及び非自然発生組成物の両方を定義する。「自然発生」組成物は、自然発生源によって生産されるものであって、１以上のセロビオハイドラーゼタイプ、１以上のエンドグルカナーゼタイプ及び１以上のβ−グルコシダーゼタイプから構成され、これらの組成物は自然発生源により生産された比率で存在する。自然発生組成物は、セルロース分解酵素に関して、成分酵素の比率が自然界の有機体によって生産されるものと変わらないように、修飾されていない有機体によって生産されたものである。「非自然発生」組成物は、（１）自然発生の割合又は非自然発生の割合、すなわち、改変割合のどちらかの割合でセルロース分解酵組成物と結合している組成物；又は（２）１以上のセルロース分酵素を過剰発現するように又は発現しないように修飾された有機体；又は（３）少なくとも１のセルロース分解酵素が欠失するように修飾された有機体、によって生産された組成物を包含する。従って、幾つかの態様において、全セルラーゼ混合物は、１以上の各種ＥＧｓ及び／又はＣＢＨｓの欠失を有する。例えば、ＥＧ１は単独で、又は他のＥＧｓ及び／又はＣＢＨｓと共に欠失している。
【０１０６】
一般に、全セルラーゼ調製物は、酵素、たとえば、（ｉ）エンドグルカナーゼ（ＥＧ）または１，４−β−ｄ−グルカン−４−グルカノヒドロラーゼ（ＥＣ３．２．１．４）、（ｉｉ）エキソグルカナーゼ、たとえば１，４−β−ｄ−グルカングルカノヒドロラーゼ（セロデキストリナーゼとしても知られている。）（ＥＣ３．２．１．７４）および１，４−β−ｄ−グルカンセロビオヒドロラーゼ（エキソ−セロビオヒドロラーゼ、ＣＢＨ）（ＥＣ３．２．１．９１）、および（ｉｉｉ）β−グルコシダーゼ（ＢＧ）もしくはβ−グルコシドグルコヒドロラーゼ（ＥＣ３．２．１．２１）をこれらに限定されることなく含む。
【０１０７】
本開示発明では、全セルラーゼ調製物は、セルロース素材の加水分解に有用である任意の微生物由来のものであることができる。ある実施態様では、全セルラーゼ調製物は糸状菌の全セルラーゼである。「糸状菌」は、真菌類（Ｅｕｍｙｃｏｔａ）および卵菌類（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）の亜門のすべての糸状型を含む。ある実施態様では、全セルラーゼ調製物は、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス、エメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）、フサリウム、フミコーラ、ムコール、マイセリオフソーラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、スシタリジウム（Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ）、シーラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリプロクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）またはトリコデルマ種の全セルラーゼである。ある実施態様では、全セルラーゼ調製物は、アスペルギルスアクレアタス、アスペルギルスアワモリ、アスペルギルスフォチダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルスジャポニカ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃａ）、アスペルギルスニジュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）またはアスペルギルオリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）の全セルラーゼである。他の実施態様では、全セルラーゼ調製物は、フサリウムバクトリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フサリウムセレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フサリウムクルックウェレンス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フサリウムカルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フサリウムグラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フサリウムグラミナム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フサリウムヘテロスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フサリウムネガンディ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｎｅｇｕｎｄｉ）、フサリウムオキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フサリウムレティクラタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フサリウムロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ）、フサリウムサンブシナム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フサリウムサルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フサリウムスポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フサリウムサルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フサリウムトルロサム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フサリウムトリコセシオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）またはフサリウムベネナタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）の全セルラーゼである。他の実施態様では、全セルラーゼ調製物は、フミコーラインソレンス、フミコーララヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、ムコールミーヘイ（Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）、マイセリオフソーラサーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ニューロスポーラクラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐ��ｒａ  ｃｒａｓｓａ）、スシタリジウムサーモフィラム（Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）またはシーラビアテレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）の全セルラーゼである。他の実施態様では、全セルラーゼ調製物は、トリコデルマハージアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマコニンギ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマロンギブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマレーシ、たとえばＲＬ−Ｐ３７（Ｓｈｅｉｒ−Ｎｅｉｓｓら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９８４年、第２０巻、ｐ．４６−５３；Ｍｏｎｔｅｎｅｃｏｕｒｔ  Ｂ．Ｓ．、Ｃａｎ．、１９８７年）、ＱＭ９４１４（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．２６９２１）、ＮＲＲＬ  １５７０９、ＡＴＣＣ  １６３６１、５６７６４、５６４６６、５６７６７またはトリコデルマビリデ、たとえばＡＴＣＣ  ３２０９８および３２０８６の全セルラーゼである。ある実施態様では、全セルラーゼ調製物は、トリコデルマレーシＲｕｔＣ３０の全セルラーゼであり、これはアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）からトリコデルマレーシＡＴＣＣ  ５６７６５として入手可能である。
【０１０８】
本開示発明に用いるのに適した市販のセルラーゼ調製物の例は、たとえばＣＥＬＬＵＣＬＡＳＴ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ社から入手可能）およびＬＡＭＩＮＥＸ（商標）、ＩｎｄｉＡｇｅ（商標）およびＰｒｉｍａｆａｓｔ（商標）ＬＡＭＩＮＥＸ  ＢＧ酵素、（Ｄａｎｉｓｃｏ  ＵＳ社、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ部門から入手可能）を含む。
【０１０９】
本開示発明では、全セルラーゼ調製物は、セルロース素材を加水分解する能力のある酵素の発現をもたらす、従来技術で知られた任意の微生物培養方法由来のものであることができる。発酵は、セルラーゼが発現されまたは単離されるのを可能にする好適な培地中および条件下の、実験室または工業用発酵槽中の、振とうフラスコ培養、小規模または大規模発酵、たとえば連続、バッチ、流加もしくは固相発酵を含むことができる。
【０１１０】
一般に、セルロース素材を加水分解する能力のある酵素の産生に適した細胞培地中で、微生物は培養される。培養は、従来技術で知られた手順を用いて炭素および窒素源ならびに無機塩を含む好適な栄養培地中で行われる。好適な培地、成長およびセルラーゼの産生に適した温度範囲および他の条件は従来技術で知られている。非限定的な例として、トリコデルマレーシによるセルラーゼの産生のための普通の温度範囲は２４℃〜２８℃である。
【０１１１】
一般に、全セルラーゼ調製物は、発酵によって産生され最低限の回収および／もしくは精製をされた状態で、またはされない状態で用いられる。たとえば、セルラーゼが細胞によって細胞培地中に分泌されると、セルラーゼを含む細胞培地が用いられることができる。ある実施態様では、全セルラーゼ調製物は、培地および細胞を包含する発酵物質の非分画内容物を含む。あるいは、全セルラーゼ調製物は、任意の都合のよい方法、たとえば沈降、遠心分離、親和性、ろ過または従来技術で知られた任意の他の方法によって処理されることができる。ある実施態様では、全セルラーゼ調製物は、たとえば濃縮され、そしてさらなる精製なしに用いられることができる。ある実施態様では、全セルラーゼ調製物は、細胞生存率を減少しまたは細胞を殺す化学剤を含む。ある実施態様では、細胞は従来技術で知られた方法を用いて溶解されまたは透過性にされる。
ＩＩＩ．分子生物学
【０１１２】
１の実施態様では、本開示発明は、糸状菌中で機能するプロモーターの調節下における変異体ｃｂｈ２遺伝子の発現を提供する。したがって、本開示発明は、組換え遺伝学の分野のルーチンの手法に依存する（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ, Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、１９８９年、第２版；Ｋｒｉｇｅｒ、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、１９９０年；およびＡｕｓｕｂｅｌら編、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、１９９４年、米国、ニューヨーク州、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ社参照）。
ｃｂｈ２核酸配列を変異する方法
【０１１３】
変異を導入する従来技術で知られた任意の方法が、本開示発明によって検討されることができる。
【０１１４】
本開示発明は、変異体ｃｂｈ２の発現、精製および／または単離ならびに使用に関する。これらの酵素は、好ましくはハイポクレアジェコリーナ由来のｃｂｈ２遺伝子を用いる組換え方法によって調製される。発酵ブロスは精製されまたはされないで用いられることができる。
【０１１５】
ハイポクレアジェコリーナ由来のｃｂｈ２遺伝子の単離およびクローン化後に、従来技術で知られた他の方法、たとえば部位特異的変異誘発法が用いられて、発現されたｃｂｈ２変異体中の置換されたアミノ酸に対応する置換、付加または欠失が行われる。ここでも、部位特異的変異誘発法および発現されたタンパク質中にアミノ酸の変化を導入する他の方法は、従来技術で知られている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上掲；およびＡｕｓｕｂｅｌら、上掲）。
【０１１６】
ハイポクレアジェコリーナＣＢＨ２のアミノ酸配列変異体をコードするＤＮＡは、従来技術で知られた多様な方法によって調製される。これらの方法は、以下のものに限定されることなく、部位特異的（または、オリゴヌクレオチド媒介）変異誘発法、ＰＣＲ変異誘発法およびハイポクレアジェコリーナＣＢＨ２をコードする予め調製されたＤＮＡのカセット変異誘発法による調製を含む。
【０１１７】
部位特異的変異誘発法は、置換変異体を調製するための好まれる方法である。この技術は従来技術で周知である（たとえば、Ｃａｒｔｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９８５年、第１３巻、ｐ．４４３１−４４４３およびＫｕｎｋｅｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８７年、第８２巻、ｐ．４８８参照）。手短にいうと、ＤＮＡの部位特異的変異誘発法を実施する、出発ＤＮＡは、最初に所望の変異をコードするオリゴヌクレオチドをハイブリダイズして、かかる出発ＤＮＡの一本鎖にすることによって変えられる。ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、および出発ＤＮＡの一本鎖をテンプレートとして用いて、ＤＮＡポリメラーゼが用いられて第二の鎖が合成される。したがって、所望の変異をコードするオリゴヌクレオチドが、得られた二本鎖ＤＮＡ中に取り込まれる。
【０１１８】
ＰＣＲ変異誘発法も、出発ポリペプチド、すなわちハイポクレアジェコリーナＣＢＨ２のアミノ酸配列変異体をつくるのに適している。Ｈｉｇｕｃｈｉ、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、１９９０年、ｐ．１７７−１８３、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社：およびＶａｌｌｅｔｅら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９８９年、第１７巻、ｐ．７２３−７３３参照。たとえば、Ｃａｄｗｅｌｌら、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１９９２年、第２巻、ｐ．２８−３３も参照。手短にいうと、ＰＣＲ中に少量のテンプレートＤＮＡが出発物質として用いられると、テンプレートＤＮＡ中の対応する領域とは配列がわずかに異なるプライマーが用いられて、そのプライマーがそのテンプレートとは異なる位置においてのみテンプレート配列とは異なる比較的大量の特異的ＤＮＡ断片が生成されることができる。
【０１１９】
変異体を調製するための他の方法であるカセット変異誘発法は、Ｗｅｌｌｓら、Ｇｅｎｅ、１９８５年、第３４巻、ｐ．３１５−３２３に記載された手法に基くものである。出発物質は、変異されるべき出発ポリペプチドＤＮＡを含むプラスミド（または他のベクター）である。出発ＤＮＡ中の１または複数のコドンが同定される。同定された１または複数の変異部位の各側上に、特有の制限エンドヌクレアーゼ部位が存在しなければならない。かかる制限部位が存在しないならば、出発ポリペプチドＤＮＡ中の適当な場所に制限部位を導入する上記のオリゴヌクレオチド媒介変異誘発法を用いて、該制限部位が生成されることができる。プラスミドＤＮＡはこれらの部位で切断されて直線にされる。制限部位間のＤＮＡの配列をコードするが所望の１または複数の変異を含む二本鎖オリゴヌクレオチドが、標準的な手順を用いて合成され、その際該オリゴヌクレオチドの二本鎖は別々に合成され、そして次に標準的な手法を用いて一緒にハイブリダイズされる。この二本鎖オリゴヌクレオチドはカセットと呼ばれる。このカセットは、直線にされたプラスミドにそれが直接、結合されるように、該直線にされたプラスミドの両末端と相容性である５’および３’末端を有するように設計される。このプラスミドは今、変異されたＤＮＡ配列を有する。
【０１２０】
上記の代わりの方法で、または上記に加えて、変異体ＣＢＨ２をコードする所望のアミノ酸配列は決められることができ、またかかるアミノ酸配列変異体をコードする核酸配列は合成的に生成されることができる。
【０１２１】
このように調製された１または複数の変異体ＣＢＨ２は、しばしば、このセルラーゼの目的とする用途に依存してさらなる修飾に付されることができる。かかる修飾は、アミノ酸配列のさらなる変更、１または複数の非相同ポリペプチドへの融合および／または共有結合的修飾を含むことができる。
ＩＶ．ｃｂｈ２核酸およびＣＢＨ２ポリペプチド
Ａ．変異体ｃｂｈ２型核酸
【０１２２】
野生型ｃｂｈ２の核酸配列は配列番号１に示される。本開示発明は、本明細書に記載された変異体セルラーゼをコードする核酸分子を包含する。核酸分子はＤＮＡ分子であることができる。
【０１２３】
ＣＢＨ２変異体をコードするＤＮＡ配列がＤＮＡ構成体中にクローン化された後、このＤＮＡは微生物を形質転換するために用いられる。本開示発明に従って変異体ＣＢＨ２を発現する目的のために形質転換されるべき微生物は、好都合にはトリコデルマ種に由来する菌株を含むことができる。したがって、本開示発明に従って変異体ＣＢＨ２セルラーゼを調製するための好まれる様式は、変異体ＣＢＨ２の一部または全部をコードするＤＮＡの少なくとも断片を含むＤＮＡ構成体によって、トリコデルマ種宿主細胞を形質転換することを含む。ＤＮＡ構成体は一般にプロモーターに機能的に結合される。形質転換された宿主細胞は次に所望のタンパク質を発現するような条件下に育成される。その後、所望のタンパク質産生物は実質的な均一性まで生成されることができる。
【０１２４】
しかし、実際には、変異体ＣＢＨ２をコードする所与のＤＮＡのための最善の発現媒体はハイポクレアジェコリーナとは異なることがあるかもしれない。したがって、変異体ＣＢＨ２の源有機体と系統発生的相似性を持つ形質転換宿主中でタンパク質を発現することがもっとも好都合かもしれない。アスペルギルスニガーが発現媒体として用いられることができる。アスペルギルスニガーを用いる形質転換手法の説明については、国際公開第９８／３１８２１号参照。この開示内容は参照によってその全体が取り込まれる。
【０１２５】
したがって、アスペルギルス種発現系の本明細書の記載は、例示の目的のためのみにおよび本開示発明の変異体ＣＢＨ２を発現するための一つの選択肢として提供される。しかし、当業者は変異体ＣＢＨ２をコードするＤＮＡを適切であれば異なる宿主細胞中に発現したい気がするかもしれない。そこで、最適の発現宿主を決定するには変異体ＣＢＨ２の源が考慮されなければならないことが理解されなければならない。さらに、当業者は、従来技術で入手できる用具を用いるルーチンの手法によって、特定の遺伝子について最適の発現系を選択する能力があるだろう。
Ｂ．変異体ＣＢＨ２ポリペプチド
【０１２６】
本開示発明の変異体ＣＢＨ２は、前駆体ＣＢＨ２のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有する。ＣＢＨ２変異体のアミノ酸配列は、前駆体アミノ酸配列の１以上のアミノ酸の置換、欠失または挿入によって前駆体ＣＢＨ２のアミノ酸配列とは異なっている。好まれる実施態様では、前駆体ＣＢＨ２はハイポクレアジェコリーナＣＢＨ２である。ハイポクレアジェコリーナＣＢＨ２の成熟アミノ酸配列は配列番号３に示される。したがって、本開示発明は、ハイポクレアジェコリーナＣＢＨ２中の特定の同定された残基と同等である位置にアミノ酸残基を有するＣＢＨ２変異体に関する。ＣＢＨ２同属体の残基（アミノ酸）はハイポクレアジェコリーナＣＢＨ２の残基と、それが相同である（すなわち、一次あるいは三次構造における位置において対応している）か、あるいはハイポクレアジェコリーナＣＢＨ２中の特定の残基に、またはその残基の部分に機能的に類似している（すなわち、化学的もしくは構造的に結合し、反応しもしくは相互作用する、同一または類似した機能的能力を有する）ならば、同等である。本明細書で用いられる付番は、成熟ＣＢＨ２アミノ酸配列の付番（配列番号３）に対応するように意図されている。
【０１２７】
相同を決定するアミノ酸配列のアラインメントは、好ましくは「配列比較アルゴリズム」を用いることによって決定される。比較のための配列の最適のアラインメントは、たとえばＡｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．１９８１年、第２巻、ｐ．４８２のＳｍｉｔｈ & Ｗａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９７０年、第４８巻、ｐ．４４３の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８８年、第８５巻、ｐ．２４２２の相似性検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実行によって（米国、ウィスコンシン州、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ、５７５、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ社、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗｅａｒ  Ｐａｃｋａｇｅ中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）、または目視検査によって実施されることができる。目視検査は図形処理パッケージ、たとえばカナダ国、モントリオール、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ社によるＭＯＥを用いてもよい。
【０１２８】
配列相似性を決定するのに適しているアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、これはＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９０年、第２１５巻、ｐ．４０３−４１０に記載されている。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｗｗｗ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）を通して公的に入手可能である。このアルゴリズムは最初に、データベース配列中の同じ長さのワードで並べられたときに、ある正の閾値スコアＴに一致するか、あるいはそれを満たすクエリー配列中の長さＷのショートワードを同定することによって、高スコア配列対（ＨＳＰ）を同定することを含む。これらの最初の近傍ワードヒットは、これらを含むもっと長いＨＳＰを見出すための出発点の役割をする。このワードヒットは、比較されている２の配列に沿って、累積アラインメントスコアが増えることができる限り遠くまで両方向に拡張される。累積アラインメントスコアが最大到達値から量Ｘだけ減少したとき；累積スコアがゼロ以下になったとき；またはいずれかの配列が末端に達したときに、ワードヒットの伸長は停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは初期値としてワード長さ（Ｗ）１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアマトリクス（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ、１９８９年、第８９巻、ｐ．１０９１５参照）アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ’５、Ｎ’−４および両ストランドの比較を用いる。
【０１２９】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、次に２の配列の相似性の統計解析を実施する（ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ、１９９３年、第９０巻、ｐ．５８５７−５７８７参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって示される相似性の１の尺度は最小和確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは２のヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然によって起きる確率の目安を与える。たとえば、試験アミノ酸配列とプロテアーゼアミノ酸配列とを比較したときの最小和確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、もっとも好ましくは約０．００１未満であるならば、該アミノ酸配列はプロテアーゼに相似しているとみなされる。
【０１３０】
本開示発明の目的のために、同一性の程度は、従来技術で知られたコンピュータプログラム、たとえばＧＣＧプログラムパッケージ（ウィスコンシンパッケージのためのプログラムマニュアル、第８版、１９９４年８月、米国、５３７１１、ウィスコンシン州、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ、５７５、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ社）（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  Ｓ．Ｂ．およびＷｕｎｓｃｈ  Ｃ．Ｄ．、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９７０年、第４８巻、ｐ．４４３―４４５）において提供されるＧＡＰによって、以下のポリヌクレオチド配列比較用の設定値、すなわち５．０のＧＡＰクリエーションペナルティおよび０．３のＧＡＰエクステンションペナルティを有するＧＡＰを用いて適当に決定される。
【０１３１】
トリコデルマレーシＣＢＨ２と他のセルラーゼとの間の構造アラインメントが、トリコデルマレーシＣＢＨ２（配列番号３）と中程度から高度の相同性、たとえば約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％またはさらに９９％を有する他のセルラーゼにおける同等の／対応する位置を同定するために用いられることができる。当該構造アラインメントを得る１の方法は、ＧＣＧパッケージからのＰｉｌｅ  Ｕｐプログラムを、ギャップペナルティの初期値、すなわち３．０のギャップクリエーションペナルティおよび０．１のギャップエクステンションペナルティで用いることである。他の構造アラインメント方法は疎水性クラスター解析（Ｇａｂｏｒｉａｕｄら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９８７年、第２２４巻、ｐ．１４９−１５５）およびリバーススレッディング（ＨｕｂｅｒおよびＴｏｒｄａ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９８年、第７巻、１４２−１４９頁）を含む。
【０１３２】
各種の参照セルラーゼの成熟型の典型的アラインメントが図１に示される。参照セルラーゼは、ハイポクレアジェコリーナ（トリコデルマレーシとしても知られている。）ＣＢＨ２、（配列番号３）、ハイポクレアキニンギＣＢＨ２（配列番号４）、フミコーラインソレンスＣＢＨ２（配列番号５）、アクレモニウムセルロリティカスＣＢＨ２（配列番号６）、アガリカスビスポラスＣＢＨ２（配列番号７）、フサリウムオシスポラムＥＧ（配列番号８）、ファネロキーテクリソスポリウムＣＢＨ２（配列番号９）、タラロマイセスエメルソニＣＢＨ２（配列番号１０）、サーモビフィダ．フスカ６Ｂ／Ｅ３  ＣＢＨ２（配列番号１１）、サーモビフィダフスカ６Ａ／Ｅ２  ＥＧ（配列番号１２）およびセルロモナスフィミＣｅｎＡ  ＥＧ（配列番号１３）を含む。配列は、ＣｌｕｓｔａｌＷおよびＭＵＳＣＬＥ多重配列アラインメントアルゴリズムを用いてアラインメントされた。図１の配列アラインメントのセルラーゼの同一性パーセントを示すマトリクスは、表１に示される。
【表１】
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【０１３３】
配列検索は典型的には、所与の核酸配列をＧｅｎＢａｎｋ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓおよび他の公共データベース中の核酸配列と比較して評価するときに、ＢＬＡＳＴＩＮプログラムを用いて実施された。ＧｅｎＢａｎｋ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓおよび他の公共データベース中のアミノ酸配列に対してすべてのリーディングフレームにおいてすでに翻訳されている核酸配列を検索するためには、ＢＬＡＳＴＥＸプログラムが好まれる。ＢＬＡＳＴＩＮおよびＢＬＡＳＴＥＸの双方とも、１１．０のオープンギャップペナルティおよび１．０のエクステンションギャップペナルティの初期値パラメータを用いて作動され、ＢＬＯＳＵＭ−６２マトリクスを用いる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７年参照）。
Ｖ．組換えＣＢＨ２変異体の発現
【０１３４】
本開示発明の方法は、変異体ＣＢＨ２を発現する細胞を用いることに依存し、ＣＢＨ２発現の特別な方法は要求されない。変異体ＣＢＨ２は好ましくはこの細胞から分泌される。本開示発明は、変異体ＣＢＨ２をコードする核酸配列を含む発現ベクターをすでに形質導入され、形質転換されまたはトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。培養条件、たとえば温度、ｐＨ等は、形質導入、形質転換またはトランスフェクションの前に親宿主細胞についてすでに用いられたものであり、当業者には明らかであろう。
【０１３５】
１の研究方法では、糸状菌細胞または酵母細胞は、宿主細胞株中で変異体ＣＢＨ２をコードするＤＮＡセグメントに機能しうるように連結され、該変異体ＣＢＨ２が該宿主細胞株中で発現されるように機能するプロモーターまたは生物学的に活性なプロモーター断片または１以上（たとえば、一連）のエンハンサーを有する発現ベクターをトランスフェクトされる。
Ａ．核酸構成体／発現ベクター
【０１３６】
変異体ＣＢＨ２をコードする天然または合成ポリヌクレオチド断片（「ＣＢＨ２をコードする核酸配列」）は、糸状菌細胞または酵母細胞中に導入しそして複製する能力のある非相同核酸構成体またはベクター中に取り込まれることができる。本明細書に開示されたベクターおよび方法は、変異体ＣＢＨ２の発現のために宿主細胞中で用いるのに適している。任意のベクターが、それが複製可能であり、かつそれが導入される細胞中で生存可能である限り、用いられることができる。多数の好適なベクターおよびプロモーターが当業者には知られており、商業的に入手可能である。クローン化および発現ベクターはＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年、Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ  Ｍら、１９８９年およびＳｔｒａｔｈｅｒｎら、Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、１９８１年にも記載されており、これらのそれぞれは参照によって本明細書に明示的に取り込まれる。糸状菌に適切な発現ベクターは、ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｎｄｅｌ、Ｃ．Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｊ．ら、Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｊ．Ｗ．およびＬａｓｕｒｅ，Ｌ．Ｌ．編、Ｍｏｒｅ  Ｇｅｎｅ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｆｕｎｇｉ、１９９１年、ｐ．３９６−４２８、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ社に記載されている。適切なＤＮＡ配列は、多様な手順によってプラスミドまたはベクター（本明細書では「ベクター（類）」と総称される。）中に挿入されることができる。一般に、ＤＮＡ配列は、標準的な手順によって適切な１または複数の制限エンドヌクレアーゼ部位中に挿入される。かかる手順および関連したサブクローン化手順は、当業者の知識の範囲内であるとみなされる。
【０１３７】
変異体ＣＢＨ２のコーディング配列を含む組換え糸状菌は、変異体ＣＢＨ２をコードする配列を含む非相同核酸構成体を選択された株の糸状菌の細胞中に導入することによって、産生されることができる。
【０１３８】
所望の型の変異体ｃｂｈ２核酸配列が得られると、これは多様な様式で修飾されることができる。配列が非コーディングフランキング領域を含む場合には、該フランキング領域は切除、変異生成等に付される。したがって、転移、トランスバージョン、欠失および挿入が天然に存在する配列上に実施されることができる。
【０１３９】
選択された変異体ｃｂｈ２をコードする核酸は、周知の組換え技術に従って適当なベクター中に挿入され、ＣＢＨ２発現の能力のある糸状菌を形質転換するために用いられることができる。遺伝子暗号の本質的な縮重性のために、実質的に同じまたは機能的に同等のアミノ酸配列をコードする他の核酸配列が、変異体ＣＢＨ２をクローン化し発現するために用いられることができる。したがって、コーディング領域中のかかる置換は、本開示発明によって保護される配列変異体に属すると評価される。任意およびすべてのこれらの配列変異体は、親ＣＢＨ２をコードする核酸配列について本明細書に記載されたのと同じ様式で用いられることができる。
【０１４０】
本開示発明は、上記の変異体ＣＢＨ２をコードする核酸配列の１以上を含む組換え核酸構成体も含む。この構成体は、その中に本開示発明の配列が前方向または逆方向で挿入されているベクター、たとえばプラスミドまたはウイルスベクターを含む。
【０１４１】
非相同核酸構成体は、変異体ｃｂｈ２のためのコーディング配列を（ｉ）別個に；（ｉｉ）さらなるコーディング配列、たとえば融合タンパク質コーディング配列またはペプチドコーディング配列との組み合わせで（この場合、該ｃｂｈ２コーディング配列が主要なコーディング配列である）；（ｉｉｉ）適当な宿主中でのコーディング配列の発現に有効な非コーディング配列、たとえばイントロンおよび制御要素、たとえばプロモーターおよびターミネーター要素または５’および／もしくは３’非翻訳領域との組み合わせで；および／または（ｉｖ）ｃｂｈ２コーディング配列が非相同遺伝子であるベクターまたは宿主の環境において、含むことができる。
【０１４２】
本開示発明の１の側面では、非相同核酸構成体が、変異体ＣＢＨ２をコードする核酸配列をｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞中に移すために用いられ、該ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞は樹立糸状菌株および樹立酵母株を用いることが好まれる。変異体ＣＢＨ２の長期間の産生のためには、安定な発現が好まれる。安定な形質転換体を生成するのに有効な任意の方法が、本開示発明を実施するのに用いられることができるということになる。
【０１４３】
適切なベクターは、典型的には選択可能マーカーをコードする核酸配列、挿入部位および適当な制御要素、たとえばプロモーターおよび停止配列を備えている。ベクターは、宿主細胞中のコーディング配列の発現に有効な、該コーディング配列に機能しうるように連結された調節配列、たとえば非コーディング配列、たとえばイントロンおよび制御要素、すなわちプロモーターおよびターミネーター要素または５’および／もしくは３’非翻訳領域を含むことができる。多数の適当なベクターおよびプロモーターが当業者に知られており、その多くは商業的に入手可能であり、および／またはＳａｍｂｒｏｏｋら（上掲）に記載されている。
【０１４４】
典型的なプロモーターは、構造性プロモーターおよび誘導性プロモーターの双方を含み、その例はＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０早期プロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＥＦ−１アルファプロモーター、記載されているようなテットオン（ｔｅｔ−ｏｎ）またはテットオフ（ｔｅｔ  ｏｆｆ）系におけるテット反応エレメント（ＴＲＥ）を有するプロモーター（Ｃｌｏｎ  ＴｅｃｈおよびＢＡＳＦ）、ベータアクチンプロモーターおよびある種の金属塩の転化によって上方調節されることができるメタロチオニンプロモーターを含む。プロモーター配列は、発現の目的のために特定の糸状菌によって認識されるＤＮＡ配列である。これは、変異体ＣＢＨ２ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に機能しうるように連結されている。かかる連結は、本開示発明の発現ベクター中の変異体ＣＢＨ２ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の開始コドンに関してのプロモーターの位置決めを含む。プロモーター配列は、変異体ＣＢＨ２ポリペプチドの発現を媒介する転写および翻訳制御配列を有する。この例は、アスペルギルスニガー、アスペルギルスアワモリまたはアスペルギルスオリザエグルコアミラーゼ、アルファアミラーゼまたはアルファグルコシダーゼをコードする遺伝子；アスペルギルスニジュランスｇｐｄＡまたはｔｒｐＣ遺伝子；ニューロスポーラクラッサｃｂｈ１またはｔｒｐ１遺伝子；アスペルギルスニガーまたはリゾムコールミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテアーゼをコードする遺伝子；ハイポクレアジェコリーナ（トリコデルマレーシ）ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１、ｅｇｌ２または他のセルラーゼをコードする遺伝子由来のプロモーターを含む。
【０１４５】
適当な選択可能マーカーの選択は宿主細胞に依存し、異なる宿主のための適切なマーカーは従来技術で周知である。典型的な選択可能マーカー遺伝子は、アスペルギルスニジュランスまたはトリコデルマレーシ由来のａｒｇＢ、アスペルギルスニジュランス由来のａｍｄＳ、ニューロスポーラクラッサまたはトリコデルマレーシ由来のｐｙｒ４、アスペルギルスニガーまたはアスペルギルスニジュランス由来のｐｙｒＧを含む。さらなる典型的な選択可能マーカーは、以下のものに限定されることなく、ｔｒｐｃ、ｔｒｐ１、ｏｌｉＣ３１、ｎｉａＤまたはｌｅｕ２を含み、これらは変異体株、たとえばｔｒｐ−、ｐｙｒ−、ｌｅｕ−等を形質転換するために用いられる非相同核酸構成体に包含される。
【０１４６】
かかる選択可能マーカーは、糸状菌によっては普通、代謝されない代謝産物を利用する能力を形質転換体に与える。たとえば、酵素アセトミダーゼをコードする、ハイポクレアジェコリーナ由来のａｍｄＳ遺伝子は、形質転換体細胞にＡｃｅｔａｍｉｄｅを窒素源としてその上で成長することを可能にする。選択可能マーカー（たとえば、ｐｙｒＧ）は、選択的最少培地上で成長する能力を栄養要求性変異体株に回復することができ、または選択可能マーカー（たとえば、ｏｌｉｃ３１）は、阻害剤もしくは抗生物質の存在下に成長する能力を形質転換体に与えることができる。
【０１４７】
選択可能マーカーをコードする配列は、従来技術で用いられる一般的な方法を使用して任意の適当なプラスミド中にクローン化される。典型的なプラスミドは、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＲＡＸおよびｐＵＣ１００を含む。ｐＲＡＸプラスミドはアスペルギルスニジュランス由来のＡＭＡＬ配列を有し、これはアスペルギルスニガー中で複製することを可能にする。
【０１４８】
本開示発明の実施は、特に示されない限り、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の慣用の手法を用い、これらは当業者の技能の範囲内である。かかる手法は文献に完全に説明されている。たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ、１９８７年；Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９３年；およびＣｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９１年参照。
Ｂ．ＣＢＨ２産生のための宿主細胞および培養条件
（ｉ）糸状菌
【０１４９】
かくして、本開示発明は、対応する非形質転換糸状菌と比較して、変異体ＣＢＨ２の産生または発現をもたらすのに有効な様式で修飾され、選択されおよび培養された細胞を含む糸状菌を提供する。
【０１５０】
変異体ＣＢＨ２の発現のために処理されおよび／または修飾されることができる親糸状菌の種の例は、以下のものに限定されることなく、トリコデルマ、たとえばトリコデルマレーシ、トリコデルマロンギブラキアタム、トリコデルマビリデ、トリコデルマコニンギ；ペニシリウム種、フミコーラ種、たとえばフミコーラインソレンス；アスペルギルス種、クリソスポリウムフサリウム種およびエメリセラ種を含む。
【０１５１】
ＣＢＨ２発現細胞は、親糸状菌株を培養するために典型的に用いられる条件下に培養される。一般に、細胞は、生理的塩および栄養素、たとえばＰｏｕｒｑｕｉｅ，Ｊ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ、Ａｕｂｅｒｔ，Ｊ．Ｐ．ら編、１９８８年、ｐ．７１−８６、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社、およびＩｌｍｅｎ，Ｍ．ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９７７年、第６３巻、ｐ．１２９８−１３０６に記載されているようなものを含有する標準的な培地中で培養される。培養条件も標準的であり、たとえば培養物は振とう培養器または発酵槽中２８℃で、所望のレベルのＣＢＨ２の発現が達成されるまで温置される。
【０１５２】
所与の糸状菌のための好まれる培養条件は、科学文献中におよび／または糸状菌源、たとえばアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ；ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／）から見出されることができる。糸状菌の成長が達成された後、この細胞は、変異体ＣＢＨ２の発現を生じさせまたは可能にするために有効な条件に曝露される。
【０１５３】
ＣＢＨ２をコードする配列が誘導性プロモーターの制御下にある場合には、誘発剤、たとえば糖、金属塩または抗生物質が、ＣＢＨ２発現を誘発するのに有効な濃度で培地に添加される。
【０１５４】
１の実施態様では、株はアスペルギルスニガーを含み、これは過剰発現されたタンパク質を得るために有用な株である。たとえば、アスペルギルスニガーバールアワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ｖａｒ  ａｗａｍｏｒｉ）ｄｇｒ２４６は、高められた量の分泌型セルラーゼを分泌することが知られている（Ｇｏｅｄｅｇｅｂｕｕｒら、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ、２００２年、第４１巻、ｐ．８９−９８）。アスペルギルスニガーバールアワモリの他の株、たとえばＧＣＤＡＰ３、ＧＣＤＡＰ４およびＧＡＰ３−４が知られている（Ｗａｒｄら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１９９３年、第３９巻、ｐ．７３８−７４３）。
【０１５５】
他の実施態様では、株はトリコデルマレーシを含み、これは過剰発現されたタンパク質を得るために有用な株である。たとえば、Ｓｈｅｒ−Ｎｅｉｓｓら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１９８４年、第２０巻、ｐ．４６−５３によって記載されたＲＬ−Ｐ３７は、高められた量のセルラーゼ酵素を分泌することが知られている。ＲＬ−Ｐ３７の機能的同等物は、リコデルマリーゼイ株ＲＵＴ−Ｃ３０（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．５６７６５）および株ＱＭ９４１４（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．２６９２１）を含む。これらの株は変異体ＣＢＨ２を過剰発現するのに有用であろうと予想される。
【０１５６】
潜在的に有害な天然のセルロース分解活性のない変異体ＣＢＨ２を得ることが望まれるときは、変異体ＣＢＨ２をコードするＤＮＡ断片を有するＤＮＡ構成体またはプラスミドの導入前に１以上のセルラーゼ遺伝子を欠失させたトリコデルマ宿主細胞株を得ることが有用である。かかる株は、米国特許第５，２４６，８５３号および国際公開第９２／０６２０９号に開示された方法によって調製されることができ、これらの開示内容は参照によって本明細書に取り込まれる。宿主微生物中に１以上のセルラーゼ遺伝子を欠いている変異体ＣＢＨ２セルラーゼを発現することによって、同定およびその後の精製の手順が簡略化される。クローン化されたトリコデルマ種由来の任意の遺伝子、たとえばｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１およびｅｇｌ２遺伝子、ならびにＥＧ  ＩＩＩおよび／またはＥＧＶタンパク質をコードする遺伝子が欠失されることができる（たとえば、それぞれ、米国特許第５，４７５，１０１号および国際公開第９４／２８１１７号参照）。
【０１５７】
遺伝子の欠失は、従来技術で知られた方法によって、欠失または分離されるべき所望の遺伝子の型をプラスミド中に挿入することによって達成されることができる。欠失プラスミドは次に、所望の遺伝子コーディング領域の内側の適切な１または複数の制限酵素部位で切断され、そしてその遺伝子コーディング配列またはその一部が選択可能マーカーで置き換えられる。欠失または分離されるべき遺伝子の遺伝子座からのフランキングＤＮＡ配列、好ましくは約０．５〜２．０ｋｂのものが、選択可能マーカー遺伝子の両側に残る。適切な欠失プラスミドは、一般にその中に存在する特有の制限酵素部位を有し、フランキングＤＮＡ配列を含む欠失された遺伝子を有する断片および選択可能マーカー遺伝子が、単一の直鎖状片として除かれることを可能にする。
【０１５８】
選択可能マーカーは、形質転換された微生物の検知を可能にするように選択されなければならない。選択された微生物中に発現されている任意の選択可能マーカー遺伝子が適当である。たとえば、アスペルギルス種では、選択可能マーカーは、形質転換体中の該選択可能マーカーの存在がその特性に有意に影響を与えないように選択される。かかる選択可能マーカーは、アッセイ可能な産生物をコードする遺伝子であることができる。たとえば、アスペルギルス種遺伝子の機能性コピーが用いられることができ、これは、宿主株中に欠けているならば、栄養要求性表現型を示す宿主株をもたらす。同様に、選択可能マーカーはトリコデルマ種についても存在する。
【０１５９】
１の実施態様では、アスペルギルス種のｐｙｒＧ−誘導体株は、機能性ｐｙｒＧ遺伝子によって形質転換され、これはかくして形質転換のための選択可能マーカーを提供する。ｐｙｒＧ−誘導体株は、フルオロオロチン酸（ＦＯＡ）に耐性であるアスペルギルス種株の選択によって得られることができる。ｐｙｒＧ遺伝子は、ウリジンの生合成に要求される酵素であるオロチジン−５’−モノホスフェートデカルボキシラーゼをコードする。無傷ｐｙｒＧ遺伝子を有する株は、ウリジンを欠いているがフルオロオロチン酸に敏感である培地中で成長する。ＦＯＡ耐性を選び出すことによって、機能性のオロチジンモノホスフェートデカルボキシラーゼ酵素を欠いており成長のためにウリジンを要求するｐｙｒＧ−誘導体株を選択することが可能である。ＦＯＡ選択手法を用いて、機能性オロテートピロホスホリボシルトランスフェラーゼを欠いているウリジン要求株を得ることも可能である。この酵素をコードする遺伝子の機能性コピーを有するこれらの細胞を形質転換することが可能である（ＢｅｒｇｅｓおよびＢａｒｒｅａｕ、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．、１９９１年、第１９巻、ｐ．３５９−３６５、およびＨａｒｔｉｎｇｓｖｅｌｄｔら、ｐｙｒＧ遺伝子に基づくアスペルギルスニガーのための相同性形質転換系の開発（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｐｙｒＧ）、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、１９８６年、第２０６巻、ｐ．７１−７５）。誘導体株の選択は、上で言及したＦＯＡ耐性手法を用いて容易に実施され、したがってｐｙｒＧ遺伝子が選択可能マーカーとして好ましくは用いられる。
【０１６０】
第２の実施態様では、ハイポクレア種（ハイポクレア種（トリコデルマ種））のｐｙｒ４−誘導体株が機能性ｐｙｒ４遺伝子によって形質転換され、これはかくして形質転換のための選択可能マーカーを提供する。ｐｙｒ４−誘導体株は、フルオロオロチン酸（ＦＯＡ）に耐性であるハイポクレア種（トリコデルマ種）の選択によって得られることができる。ｐｙｒ４遺伝子は、ウリジンの生合成に要求される酵素であるオロチジン−５’−モノホスフェートデカルボキシラーゼをコードする。無傷ｐｙｒ４遺伝子を有する株は、ウリジンを欠いているがフルオロオロチン酸に敏感である培地中で成長する。ＦＯＡ耐性を選び出すことによって、機能性のオロチジンモノホスフェートデカルボキシラーゼ酵素を欠いており成長のためにウリジンを要求するｐｙｒ４−誘導体株を選択することが可能である。ＦＯＡ選択手法を用いて、機能性オロテートピロホスホリボシルトランスフェラーゼを欠いているウリジン要求株を得ることも可能である。この酵素をコードする遺伝子の機能性コピーを有するこれらの細胞を形質転換することが可能である（ＢｅｒｇｅｓおよびＢａｒｒｅａｕ、１９９１年）。誘導体株の選択は、上で言及したＦＯＡ耐性手法を用いて容易に実施されることができ、したがってｐｙｒ４遺伝子が選択可能マーカーとして好ましくは用いられる。
【０１６１】
１以上のセルラーゼ遺伝子を発現する能力を欠くようにｐｙｒＧ−アスペルギルス種またはｐｙｒ４−ハイポクレア種（トリコデルマ種）を形質転換するために、分離されたまたは欠失されたセルラーゼ遺伝子を含む単一のＤＮＡ断片が、次に欠失プラスミドから単離され、そして適切なｐｙｒ−アスペルギルスまたはｐｙｒ−トリコデルマ宿主を形質転換するために用いられる。形質転換体は次に、それぞれ、ｐｙｒＧまたはｐｙｒ４遺伝子産物を発現するそれらの能力に基づいて同定され選択され、かくして宿主株のウリジン栄養要求性を相補する。得られた形質転換体についてサザンブロット分析が次に実施されて、適切なｐｙｒ４選択可能マーカーによって欠失されるべき遺伝子のゲノムコピーのコーディング領域の一部またはすべてを置換る二重クロスオーバー組み込み事象を特定しおよび確認する。
【０１６２】
上記の特定のプラスミドベクターはｐｙｒ−形質転換体の調製に関するものであるけれども、本開示発明はこれらのベクターに限定されない。各種の遺伝子が、上記の手法を用いてアスペルギルス種またはハイポクレア種（トリコデルマ種）の株中で欠失され、置き換えられることができる。さらに、任意の入手可能な選択可能マーカーが上記のとおりに用いられることができる。事実、クローン化されかくして同定された任意の宿主、たとえばアスペルギルス種またはハイポクレア種の遺伝子が、上記の戦略を用いてゲノムから欠失されることができる。
【０１６３】
上記のように、用いられる宿主株は、非機能性遺伝子または選択された選択可能マーカーに相当する遺伝子を欠くかまたは有するハイポクレア種（トリコデルマ種）の誘導体であることができる。たとえば、アスペルギルス種のためにｐｙｒＧの選択可能マーカーが選択されると、特定のｐｙｒＧ−誘導体株が形質転換手順において受容体として用いられる。また、たとえばハイポクレア種のためにｐｙｒ４の選択可能マーカーが選択されると、特定のｐｙｒ４−誘導体株が形質転換手順において受容体として用いられる。同様に、アスペルギルスニジュランスの遺伝子、ａｍｄＳ、ｒｇＢ、ｔｒｐＣ、ｎｉａＤと同等なハイポクレア種（トリコデルマ種）の遺伝子を含む選択可能マーカーが用いられてよい。対応する受容体株は、よって、誘導体株、たとえばそれぞれ、ａｒｇＢ−、ｔｒｐＣ−、ｎｉａＤ−でなければならない。
【０１６４】
ＣＢＨ２変異体をコードするＤＮＡが、次に適当な微生物中への挿入のために調製される。本開示発明によれば、ＣＢＨ２変異体をコードするＤＮＡは、機能するセルロース分解活性を有するタンパク質をコードするのに必要なＤＮＡを含む。ＣＢＨ２変異体をコードするＤＮＡ断片は、糸状菌のプロモーター配列、たとえばアスペルギルス中のｇｌａＡ遺伝子のプロモーターまたはトリコデルマ中のｅｇｌ１遺伝子のプロモーターに機能しうるように結合されることができる。
【０１６５】
ＣＢＨ２変異体をコードするＤＮＡの１より多いコピーが株の中で組換えられて、過剰発現を促進することができることも意図される。ＣＢＨ２変異体をコードするＤＮＡは、該変異体をコードするＤＮＡを有する発現ベクターの構築によって調製されてよい。ＣＢＨ２変異体をコードする挿入されたＤＮＡ断片を有する発現ベクターは、所与の宿主生物中で自律的に複製する能力があるか、又は該宿主のＤＮＡ中に組み込まれる能力がある任意のベクターであることができ、典型的にはプラスミドである。好まれる態様では、遺伝子の発現を得るための２種類の発現ベクターが検討される。第１は、その中でプロモーター、遺伝子コーディング領域およびターミネーター配列の全てが発現されるべき遺伝子に由来する、ＤＮＡ配列を含む。遺伝子の末端削除は、不所望のＤＮＡ配列（たとえば、望まないドメインをコードする配列）を欠失することによって、それ自身の転写および翻訳調節配列の制御下で発現されるべきドメインを残すことが望まれる場合に、得られることができる。選択可能なマーカーも該ベクター上に含まれることができ、新規の遺伝子配列の複数コピーの宿主中への組み込みのための選択を可能にする。
【０１６６】
第２の種類の発現ベクターは予め組み立てられており、高レベルの転写に要求される配列および選択可能マーカーを含む。遺伝子またはその一部のコーディング領域が、この汎用の発現ベクター中に、発現カセットプロモーターおよびターミネーター配列の転写制御下にあるように挿入されることができることが検討される。
【０１６７】
たとえば、アスペルギルスでは、ｐＲＡＸはかかる汎用の発現ベクターである。遺伝子またはその一部は、強いｇｌａａプロモーターの下流に挿入されることができる。
【０１６８】
たとえば、ハイポクレアでは、ｐＴＥＸはかかる汎用の発現ベクターである。遺伝子またはその一部は、強いｇｌａａプロモーターの下流に挿入されることができる。
【０１６９】
上記のベクターでは、本開示発明のＣＢＨ２変異体をコードするＤＮＡ配列は、構造遺伝子へのリ−ディングフレームにおいて、転写および翻訳配列、すなわち適当なプロモーター配列およびシグナル配列と機能しうるように連結されなければならない。プロモーターは、宿主細胞中で転写活性を示す任意のＤＮＡ配列であることができ、また宿主細胞と相同か、あるいは非相同のタンパク質をコードする遺伝子に由来することができる。任意的なシグナルペプチドは、ＣＢＨ２変異体の細胞外産生をもたらす。シグナル配列をコードするＤＮＡ配列は、好ましくは発現されるべき遺伝子に天然に付随しているものである。しかしながら、任意の適当な源、たとえばトリコデルマ由来のエキソセロビオヒドラーゼまたはエンドグルカナーゼからのシグナル配列が、本開示発明において意図される。
【０１７０】
本開示発明の変異体ＣＢＨ２をコードするＤＮＡ配列とプロモーターとの結合および適当なベクター中への挿入に用いられる手法は、従来技術で周知である。
【０１７１】
上記のＤＮＡベクターまたは構成体は、公知の技術、たとえば形質転換、トランスフェクション、マイクロインジェクション、マイクロポレーション、バイオリスティック砲撃等に従って宿主細胞に導入されることができる。
【０１７２】
好まれる形質転換技術では、ハイポクレア種（トリコデルマ種）中のＤＮＡへの細胞壁の透過性が非常に低いことが考慮されなければならない。したがって、所望のＤＮＡ配列、遺伝子または遺伝子断片の取り込みは、よくても最小量である。形質転換プロセスの前に、誘導体株（すなわち、用いられた選択可能マーカーに相当する機能性遺伝子を欠いている）中のハイポクレア種（トリコデルマ種）の細胞壁の透過性を増加させるための多数の方法が存在する。
【０１７３】
形質転換のためにアスペルギルス種またはハイポクレア種（トリコデルマ種）を調製するための本開示発明において好まれる方法は、糸状菌の菌糸体由来のプロトプラストの調製を含む。Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  Ａ．ｎｉｇｅｒ  ｕｓｉｎｇ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｎｉａＤ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｎｉｔｒａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．、１９８９年、第１６巻、ｐ．５３−５６参照。菌糸体は、出芽した生長性胞子から得られることができる。菌糸体は、細胞壁を消化する酵素で処理されてプロトプラストをもたらす。プロトプラストは、次に懸濁媒質中で浸透圧スタビライザーの存在によって保護される。これらのスタビライザーは、ソルビトール、マンニトール、塩化カリウム、硫酸マグネシウム等を含む。通常、これらのスタビライザーの濃度は０．８Ｍ〜１．２Ｍ間で様々である。懸濁媒質中で約１．２Ｍのソルビトール溶液を用いることが好ましい。
【０１７４】
宿主株（アスペルギルス種またはハイポクレア種（トリコデルマ種））中へのＤＮＡの取り込みは、カルシウムイオン濃度に依存する。通常、約１０ｍＭのＣａＣｌ２〜５０ｍＭのＣａＣｌ２が取り込み溶液において用いられる。取り込み溶液中にカルシウムイオンが必要なことの他に、一般的に含まれる他の成分は、緩衝系、たとえばＴＥ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ  ７．４；１ｍＭのＥＤＴＡ）または１０ｍＭのＭＯＰＳ、ｐＨ  ６．０緩衝液（モルフォリンプロパンスルホン酸）およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ポリエチレングリコールは細胞膜を融解する作用をし、かくして媒質の含有物が宿主細胞、例としてアスペルギルス種あるいはハイポクレア種の株の細胞質へ送入されることを可能にし、またプラスミドＤＮＡが核に移入されると考えられている。この融解はしばしば、宿主染色体中に組み込まれたプラスミドＤＮＡの複数コピーを残す。
【０１７５】
通常、１０５〜１０６／ｍＬ、好ましくは２×１０５／ｍＬの密度にて透過性処理に付されたアスペルギルス種のプロトプラストまたは細胞を含む懸濁液が、形質転換に用いられる。同様に、１０８〜１０９／ｍＬ、好ましくは２×１０８／ｍＬの密度にて透過性処理に付されたハイポクレア種（トリコデルマ種）のプロトプラストまたは細胞を含む懸濁液が、形質転換に用いられる。適当な溶液（たとえば、１．２Ｍソルビトール；５０ｍＭのＣａＣｌ２）中のこれらのプロトプラストまたは細胞の１００μＬの量が、所望のＤＮＡと混合される。一般に、高濃度のＰＥＧが取り込み溶液に添加される。２５％ＰＥＧ  ４０００の０．１〜１の量が、プロトプラスト懸濁液に添加されることができる。しかし、プロトプラスト懸濁液に約０．２５の量を添加することが好ましい。添加物、たとえばジメチルスルホキシド、ヘパリン、スペルミジン、塩化カリウム等も取り込み溶液に添加され、形質転換を補助してもよい。
【０１７６】
一般に、上記混合物は次に、１０〜３０分間、約０℃において培養される。追加のＰＥＧが次に混合物に添加され、所望の遺伝子またはＤＮＡ配列の取り込みをさらに増加する。２５％ＰＥＧ４０００は、一般に形質転換混合物の量の５〜１５倍の量で添加される。しかし、これより多いおよび少ない量が適当であることもある。２５％ＰＥＧ４０００は、好ましくは形質転換混合物の量の約１０倍である。ＰＥＧが添加された後、形質転換混合物は次に室温か、あるいは氷上において培養され、その後ソルビトールおよびＣａＣｌ２溶液が添加される。プロトプラスト懸濁物が次に、さらに成長培地の融解アリコートに添加される。この成長培地は、形質転換体の成長のみを許容する。所望の形質転換体を生育するのに適している任意の成長培地が、本開示発明に用いられることができる。しかし、Ｐｙｒ＋形質転換体が選択されるならば、ウリジンを含んでいない成長培地を用いることが好ましい。その後のコロニーが、ウリジンを含んでいない成長培地上に移され精製される。
【０１７７】
この段階では、安定な形質転換体は、不安定な形質転換体よりも速い成長速度、および、たとえばトリコデルマではウリジンを含んでいない固形成長培養培地上の不規則ではなくて滑らかな輪郭を有する円形のコロニーの形成によって、不安定な形質転換体とは識別されることができる。さらに、ある場合には、安定性のさらなる試験が、固形非選択（すなわち、ウリジンを含んでいる）培地上で形質転換体を成長させ、この培養培地から胞子を回収し、そしてのちにウリジンを含んでいない選択培地上で出芽し成長するであろうこれらの胞子のパーセントを測定することによって、行われることができる。
【０１７８】
上記の方法の特定の態様では、１または複数のＣＢＨ２変異体は、液状培地中における成長の後に、該ＣＢＨ２変異体の適切な翻訳後プロセシングの結果として、宿主細胞から活性型で回収される。
（ｉｉ）酵母
【０１７９】
本開示発明は、ＣＢＨ２産生のための宿主細胞として酵母の使用も意図する。加水分解性酵素をコードするいくつかの他の遺伝子が、酵母サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の様々な株に発現されている。これらは、２のエンドグルカナーゼ（Ｐｅｎｔｉｌｌａら、Ｙｅａｓｔ、１９８７年、第３巻、ｐ．１７５−１８５）、２のセロビオヒドロラーゼ（Ｐｅｎｔｉｌｌａら、Ｇｅｎｅ、１９８８年、第６３巻、ｐ．１０３−１１２）およびトリコデルマレーシ由来の１のベータ−グルコシダーゼ（ＣｕｍｍｉｎｇｓおよびＦｏｗｌｅｒ、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．、１９９６年、第２９巻、ｐ．２２７−２３３）、アウレオバシジウムプルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）由来のキシラナーゼ（ＬｉおよびＬｊｕｎｇｄａｈｌ、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１９９６年、第６２巻、第１号、ｐ．２０９−２１３）、小麦由来のアルファアミラーゼ（Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎら、Ｇｅｎｅ、１９８７年、第５５巻、ｐ．３５３−３５６）等をコードする配列を含む。さらに、ブチリビリオフィブリソルベンスエンド−［ベータ］−１，４−グルカナーゼ（ＥＮＤ１）、ファネロキーテクリソスポリウムセロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ１）、ルミノコッカスフラベファシエンスセロデキストリナーゼ（ＣＥＬ１）およびエンドマイセスフィブリゼルセロビアーゼ（Ｂｇｌ１）をコードするセルラーゼ遺伝子カセットが、サッカロマイセスセレビシエの実験室株中で成功裡に発現された（Ｖａｎ  Ｒｅｎｓｂｕｒｇら、Ｙｅａｓｔ、１９９８年、第１４巻、ｐ．６７−７６）。
Ｃ．宿主細胞中へのＣＢＨ２をコードする核酸配列の導入
【０１８０】
本開示発明はさらに、遺伝子操作されて、細胞外に供給された変異体ＣＢＨ２をコードする核酸配列を含む細胞および細胞組成物を提供する。親細胞または細胞株は、クローニングベクターまたは発現ベクターを用いて遺伝子操作される（すなわち、形質導入され、形質転換されまたはトランスフェクトされる）ことができる。ベクターは、さらに記載されるように、たとえばプラスミド、ウイルス粒子、ファージ等の形態をしていることができる。
【０１８１】
本開示発明の形質転換の方法は、糸状菌のゲノムへの形質転換ベクターのすべてまたは一部の安定な取り込みをもたらすことができる。しかし、自己複製染色体外形質転換ベクターの維持をもたらす形質転換も意図される。
【０１８２】
多くの標準的なトランスフェクション方法が、大量の非相同タンパク質を発現するトリコデルマレーシ細胞株を産生するために用いられることができる。ＤＮＡ構成体をトリコデルマのセルラーゼ産生株中に導入するための公表された方法のいくつかは、Ｌｏｒｉｔｏ、Ｈａｙｅｓ、ＤｉＰｉｅｔｒｏおよびＨａｒｍａｎ、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．、１９９３年、第２４巻、ｐ．３４９−３５６；Ｇｏｌｄｍａｎ、ＶａｎＭｏｎｔａｇｕおよびＨｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．、１９９０年、第１７巻、ｐ．１６９−１７４；Ｐｅｎｔｉｌｌａ、Ｎｅｖａｌａｉｎｅｍ、Ｒａｔｔｏ、ＳａｌｍｉｎｅｎおよびＫｎｏｗｌｅｓ、Ｇｅｎｅ、１９８７年、第６巻、ｐ．１５５−１６４を、アスペルギルスイェルトンについて、ＨａｍｅｒおよびＴｉｍｂｅｒｌａｋｅ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８４年、第８１巻、ｐ．１４７０−１４７４を、フサリウムバジャーについて、ＰｏｄｉｌａおよびＫｏｌａｔｔｕｋｕｄｙ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９１年、第８８巻、ｐ．８２０２−８２１２を、ストレプトマイセスについて、Ｈｏｐｗｏｏｄら、Ｔｈｅ  Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、１９８５年、英国、Ｎｏｒｗｉｃｈを、およびバチルスビリギジについて、ＤｅＲｏｓｓｉ、Ｂｅｒｔａｒｉｎｉ、ＲｉｃｃａｒｄｉおよびＭａｔｔｅｕｚｚｉ、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．、１９９０年、第５５巻、ｐ．１３５−１３８を含む。
【０１８３】
非相同核酸構成体（発現ベクター）を糸状菌（たとえば、ハイポクレアジェコリーナ）中に導入する他の方法は、以下のものに限定されることなく、粒子または遺伝子銃の使用、形質転換工程前の糸状菌細胞壁の透過性向上（たとえば、高濃度のアルカリ、たとえば０．０５Ｍ〜０．４ＭのＣａＣｌ２または酢酸リチウムの使用によって）、プロトプラスト融合またはアグロバクテリウムを介した形質転換を含む。ポリエチレングリコールおよびＣａＣｌ２を用いたプロトプラストまたはスフェロプラストの処理による糸状菌の形質転換の典型的な方法は、Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｅ．Ｉ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．、１９８９年、第１６巻、ｐ．５３−５６、およびＰｅｎｔｉｌｌａ、Ｇｅｎｅ、１９８８年、第６３巻、ｐ．１１−２２に記載されている。
【０１８４】
外来の核酸配列を宿主細胞中に導入するための周知の方法のいずれも用いられることができる。これらは、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、生物言語学、リポソーム、マイクロインジェクション、プラズマベクター、ウイルスベクターおよびクローン化されたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡまたは他の外来の遺伝子物質を宿主細胞中に導入するための他の周知の方法のいずれかの使用を含む（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上掲参照）。同様に用いられるのは、米国特許第６，２５５，１１５号に記載されたアグロバクテリウムを介したトランスフェクション法である。用いられる特定の遺伝子組換え方法が、非相同遺伝子を発現する能力のある宿主細胞中に少なくとも１の遺伝子を成功裡に導入することができることのみが必要である。
【０１８５】
さらに、変異体ＣＢＨ２をコードする核酸配列を含む非相同核酸構成体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されることができ、そして得られたＲＮＡが周知の方法、たとえばイインジェクションによって宿主細胞中に導入されることができる。
【０１８６】
本開示発明はさらに、糸状菌セルラーゼ組成物を産生するのに用いられる、糸状菌、たとえばハイポクレアジェコリーナおよびアスペルギルスニガーの新規かつ有用な形質転換体を含む。本開示発明は、糸状菌、とりわけ変異体ＣＢＨ２コーディング配列、または内因性ｃｂｈコーディング配列の欠失を含む糸状菌の形質転換体を含む。
【０１８７】
変異体ｃｂｈ２のコーディング配列を含む非相同核酸構成体の導入に引き続いて、プロモーターを活性化し、形質転換体を選択し、またはＣＢＨ２をコードする核酸配列の発現を増幅するのに適当なように修飾された慣用の栄養培地中で、この遺伝子組換えによって修飾された細胞が培養されることができる。培養条件、たとえば温度、ｐＨ等は、発現のために選択された宿主細胞についてすでに用いられたものであり、当業者には明らかであろう。
【０１８８】
かかる非相同核酸構成体がその中に導入された細胞の子孫は、一般にこの非相同核酸構成体中に認められる変異体ＣＢＨ２をコードする核酸配列を含むと考えられる。
【０１８９】
本開示発明はさらに、糸状菌セルラーゼ組成物を産生するのに用いられる糸状菌、たとえばハイポクレアジェコリーナの新規かつ有用な形質転換体を含む。アスペルギルスニガーも、変異体ＣＢＨ２を産生するのに用いられることができる。本開示発明は、糸状菌、とりわけ変異体ｃｂｈ２コーディング配列、または内因性ｃｂｈ２コーディング配列の欠失を含む糸状菌の形質転換体を含む。
【０１９０】
糸状菌の安定な形質転換体は、一般に不安定な形質転換体よりも速い成長速度、および、たとえばトリコデルマでは固形成長培養培地上の不規則ではなくて滑らかな輪郭を有する円形のコロニーの形成によって、不安定な形質転換体とは識別されることができる。さらに、ある場合には、安定性のさらなる試験が、固形非選択培地上で形質転換体を成長させ、この培養培地から胞子を回収し、そしてのちに選択培地上で出芽し成長するであろうこれらの胞子のパーセントを測定することによって、行われることができる。
ＶＩ．組換えＣＢＨ２タンパク質の単離および精製
【０１９１】
一般に、細胞培養で産生された変異体ＣＢＨ２タンパク質は培地中に分泌され、たとえば、細胞培地から望ましくない成分を除くことによって精製され単離されることができる。しかし、ある場合には、変異体ＣＢＨ２タンパク質は、細胞溶解物からの回収を必要とする細胞型で産生されることができる。かかる場合には、変異体ＣＢＨ２タンパク質は、当業者によってルーチンに用いられる技術を使用して、その中で産生された細胞から精製される。その例は、以下のものに限定されることなく、親和性クロマトグラフィー（Ｔｉｌｂｅｕｒｇｈら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、１９８４年、第１６巻、ｐ．２１５）、イオン交換クロマトグラフ法（Ｇｏｙａｌら、Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｎｏｌ．、１９９１年、第３６巻、ｐ．３７−５０；Ｆｌｉｅｓら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１９８３年、第１７巻、ｐ．３１４−３１８；Ｂｈｉｋｈａｂｈａｉら、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９８４年、第６巻、ｐ．３３６−３４５；Ｅｌｌｏｕｚら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、１９８７年、第３９６巻、ｐ．３０７−３１７）、たとえば高分解能を有する物質を用いるイオン交換（Ｍｅｄｖｅら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、１９９８年、第Ａ８０８巻、ｐ．１５３−１６５）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＴｏｍａｚおよびＱｕｅｉｒｏｚ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、１９９９年、第Ａ８６５巻、ｐ．１２３−１２８）、および二相分配法（Ｂｒｕｍｂａｕｅｒら、Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ、１９９９年、第７巻、ｐ．２８７−２９５）を含む。
【０１９２】
典型的には、変異体ＣＢＨ２タンパク質は、選択された特性、たとえば特定の結合剤、たとえば抗体もしくは受容体への結合親和性を有するタンパク質、または選択された分子量範囲もしくは等電点範囲を有するタンパク質を分離するために分画される。
【０１９３】
所与の変異体ＣＢＨ２タンパク質の発現が達成されると、それによって産生されたＣＢＨ２タンパク質は細胞または細胞培養物から精製される。かかる精製に適した典型的な手順は以下のもの、すなわち抗体−親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー；エタノール沈降；逆相ＨＰＬＣ；シリカ上またはカチオン交換樹脂、たとえばＤＥＡＥ上のクロマトグラフィー；クロマト分画；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈降；および、たとえばＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−７５を用いるゲルろ過を含む。タンパク質精製の各種の方法が用いられることができ、かかる方法は従来技術で知られており、たとえばＤｅｕｔｓｃｈｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９９０年、第１８２巻、第５７号、ｐ．７７９；Ｓｃｏｐｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１９８２年、第９０巻、ｐ．４７９−４９１に記載されている。選択される１または複数の精製段階は、たとえば用いられた産生工程および産生された特定のタンパク質の性質に依存する。
ＶＩＩ．ｃｂｈ２およびＣＢＨ２の用途
【０１９４】
変異体ｃｂｈ２核酸、変異体ＣＢＨ２タンパク質および変異体ＣＢＨ２タンパク質活性を含む組成物は、多種多様な用途への利用が見出され、これらの一部が以下に記載される。
【０１９５】
様々な量のＢＧ型、ＥＧ型および変異体ＣＢＨ型セルラーゼを含む新規かつ改善されたセルラーゼ組成物は、高められた清浄化能力、柔軟化剤としてのおよび／または綿布地の感触を改善する機能（たとえば、「ストーンウォッシング」または「バイオポリシング」）を示す洗剤組成物へ、木材パルプを糖に分解するための組成物へ（たとえば、バイオエタノールの製造のために）および／または飼料組成物への利用を見出す。各型のセルラーゼの単離および特性解析は、かかる組成物の側面を調節する能力を提供する。
【０１９６】
１の方法では、本開示発明のセルラーゼは洗剤組成物へまたは感触および概観を改善する布地の処理への利用を見出す。
【０１９７】
セルラーゼ分解産生物の加水分解の速度は、ゲノムに挿入されたｃｂｈ遺伝子の少なくとも１の追加のコピーを有する形質転換体を用いることによって増加されることができるので、セルロースまたはヘテログリカンを有する産生物は、より速い速度分解でおよびより高い程度まで分解されることができる。セルロースからの産生物、たとえば紙、綿、セルロースダイアパー等は、埋立地中でより効率的に分解されることができる。したがって、形質転換体から得られることができる発酵産生物または形質転換体そのものが、過密な埋立地に加重される多様なセルロース産生物の分解を液化によって促進するために組成物中に用いられることができる。
【０１９８】
分離された糖化および発酵は、それによってバイオマス、たとえばトウモロコシ茎葉、中に存在するセルロースがグルコースに転化されそしてその後酵母株がグルコースをエタノールに転化するプロセスである。同時の糖化および発酵は、それによってバイオマス、たとえばトウモロコシ茎葉、中に存在するセルロースがグルコースに転化されかつ同時におよび同じ反応器中で酵母株がグルコースをエタノールに転化するプロセスである。したがって、他の方法では、本開示発明の変異体ＣＢＨ型セルラーゼは、バイオマスからエタノールへの分解に利用を見出す。セルロースの容易に利用可能な源からのエタノールの産生は、安定な再生可能燃料源をもたらす。
【０１９９】
セルロースに基づいた供給原料は、農業廃棄物、草木および他の低価値バイオマス、たとえば都市ごみ（たとえば、古紙、木花ごみ等）から構成される。任意のこれらのセルロース供給原料の発酵からも、エタノールは産生されることができる。しかし、セルロースはまず糖に転化されなければならず、その後で初めてエタノールへの転化ができる。
【０２００】
非常に多彩な供給原料が、本開示発明の変異体ＣＢＨに用いられることができ、使用のために選択されるものは、転化が行われる地域に依存することができる。たとえば、米国中西部では、農業廃棄物、たとえば麦わら、トウモロコシ茎葉およびバガスが優位を占めるだろうし、他方、カリフォルニアではコメわらが優位を占めるだろう。しかし、任意の入手可能なセルロース性バイオマスが、任意の地域で用いられることができることが理解されなければならない。
【０２０１】
本開示発明の方法は、有機生産物、化学製品および燃料、プラスチックおよび他の生産物または中間品のための、化学供給原料としてのまたは微生物のための発酵供給原料としての、単糖、二糖および多糖の産生に用いられることができる。特に、処理残留物（乾燥ディスティラーズグレイン、醸造使用済み穀粒、サトウキビバガス等）の価値は、セルロースまたはヘミセルロースの部分的または完全な溶解によって上げられることができる。エタノールに加えて、セルロースおよびヘミセルロースから産生されることができる一部の化学製品は、アセトン、アセテート、グリシン、リシン、有機酸、（たとえば、乳酸）、１，３−プロパンジオール、ブタンジオール、グリセロール、エチレングリコール、フルフラール、ポリヒドロキシアルカノエート、シス，シス−ムコン酸、動物飼料およびキシロースを含む。
【０２０２】
高められた量のセロビオヒドロラーゼを有するセルラーゼ組成物は、エタノール産生への利用を見出す。このプロセスからのエタノールはさらに、オクタン価向上剤としてまたは直接、ガソリンの代わりに用いられることができ、燃料としてのエタノールは石油由来の生産物よりも環境に優しいのでこのことは有利である。エタノールの使用は空気の品質を改善し可能性として地域的なオゾンレベルおよびスモッグを低減することが知られている。その上、ガソリンの代わりとしてのエタノールの使用は、非再生可能エネルギーおよび石油化学供給原料への突然の移行の衝撃を和らげる上で戦略的に重要であるといえる。
【０２０３】
セルロース性バイオマス、たとえば木、草本植物、都市固形廃棄物および農林業廃棄物からの糖化および発酵プロセスによって、エタノールは産生されることができる。しかし、微生物によって産生された天然に存在するセルラーゼ混合物内の個々のセルラーゼ酵素の割合は、バイオマス中のセルロースからグルコースへの急速な転化のためにはもっとも効率的というわけではないかもしれない。エンドグルカナーゼは新しいセルロース鎖末端を生成する作用をし、該新しいセルロース鎖末端自体はセロビオヒドロラーゼの作用のための基質となり、それによって全セルロース系の加水分解の効率を改善することが知られている。したがって、増加されたまたは最適化されたセロビオヒドロラーゼ活性は、エタノールの産生を大幅に高めることができる。
【０２０４】
したがって、本開示発明のセロビオヒドロラーゼは、セルロースからその糖成分への加水分解に用途を見出す。１の実施態様では、変異体セロビオヒドロラーゼは、発酵性有機体の添加の前にバイオマスに添加される。第２の実施態様では、変異体セロビオヒドロラーゼは、発酵性有機体と同時にバイオマスに添加される。任意的に、他のセルロース成分がどちらの実施態様でも存在することができる。
【０２０５】
他の実施態様では、セルロース性供給原料は前処理されてもよい。前処理は、高められた温度および希酸、濃酸または希釈アリカリ溶液の添加によることができる。前処理溶液は、ヘミセルロース成分を少なくとも部分的に加水分解し、そして次に中和されるのに十分な時間添加される。
【０２０６】
セルロースへのＣＢＨ２の作用の主要産物はセロビオースであり、これは（たとえば、糸状菌セルラーゼ産生物中の）ＢＧ活性によるグルコースへの転化に利用可能である。セルロース性バイオマスの前処理によってか、あるいはバイオマスへの酵素作用によって、グルコースおよびセロビオースに加えて他の糖がバイオマスから入手可能にされることができる。バイオマスのセミセルロース含有量は、（セミセルロースによって）糖、たとえばキシロース、ガラクトース、マンノースおよびアラビノースに転換されることができる。かくして、バイオマス転化プロセスでは、酵素的糖化は、他の中間体または最終産生物への生物学的または化学的転化に利用可能にされる糖を産生することができる。したがって、バイオマスから生成された糖は、エタノールの生成に加えて多様なプロセスに用途を見出す。かかる転化の例はグルコースからエタノールへの発酵（Ｍ．Ｅ．Ｈｉｍｍｅｌら、「Ｆｕｅｌｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｂｉｏｍａｓｓ」中のｐ．２−４５、１９９７年、ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ６６６、Ｂ．Ｃ．ＳａｈａおよびＪ．Ｗｏｏｄｗａｒｄ編）およびグルコースから２，５−ジケト−Ｄ−グルコース（米国特許第６，５９９，７２２号）、乳酸（Ｒ．ＤａｔｔａおよびＳ−Ｐ．Ｔｓａｉ、ｐ．２２４−２３６、上掲）、サクシネート（Ｒ．Ｒ．Ｇｏｋａｒｎ、Ｍ．Ａ．ＥｉｔｅｍａｎおよびＪ．Ｓｒｉｇｈｅｒ、ｐ．２３７−２６３、上掲）、１，３−プロパンジオール（Ａ−Ｐ．Ｚｈｅｎｇ、Ｈ．ＢｉｅｂｌおよびＷ−Ｄ．Ｄｅｃｋｗａｒ、ｐ．２６４−２７９、上掲）、２，３−ブタンジオール（Ｃ．Ｓ．Ｇｏｎｇ、Ｎ．ＣａｏおよびＧ．Ｔ．Ｔｓａｏ、ｐ．２８０−２９３、上掲）への他の生物学的転化、およびキシロールからキシリトール（Ｂ．Ｃ．ＳａｈａおよびＲ．Ｊ．Ｂｏｔｈａｓｔ、ｐ．３０７−３１９、上掲）への化学的および生物学的転化である。また、たとえば国際公開第９８／２１３３９号参照。
【０２０７】
本開示発明の洗剤組成物は、（セロビオヒドロラーゼ含有量にかかわらず、すなわちセロビオヒドロラーゼのない、実質的にセロビオヒドロラーゼのないまたはセロビオヒドロラーゼが高められた）セルラーゼ組成物に加えて、界面活性剤、たとえばアニオン性、非イオン性および両性界面活性剤、ヒドロラーゼ、ビルダー、漂白剤、青味剤および蛍光染料、ケーキ防止剤、溶解剤、カチオン性界面活性剤等を用いることができる。すべてのこれらの成分は洗剤分野で知られている。上記のセルラーゼ成分は、液状希釈剤で、顆粒で、乳剤で、ゲルで、ペースト等で洗剤組成物に添加されることができる。かかる形態は当業者に周知である。固形洗剤組成物が用いられるときは、セルラーゼ組成物は、好ましくは顆粒として配合される。好ましくは、顆粒はセルラーゼ保護剤を含有するように配合されることができる。より完全な議論のためには、「ＣＢＨ２型成分の欠けたセルラーゼ組成物を含有する洗剤組成物」の表題の米国特許第６，１６２，７８２号参照。この内容は参照によって本明細書に取り込まれる。
【０２０８】
好ましくは、セルラーゼ組成物は全洗剤組成物に対して約０．００００５重量パーセント〜約５重量パーセント用いられる。より好ましくは、セルラーゼ組成物は全洗剤組成物に対して約０．０００２重量パーセント〜約２重量パーセント用いられる。
【０２０９】
さらに、変異体ＣＢＨ２核酸配列は、関連した核酸配列の同定および特性解析への利用を見出す。関連した遺伝子または遺伝子産物を測定（予測または確認）するのに有用な多数の手法は、以下のものに限定されることなく、（Ａ）ＤＮＡ／ＲＮＡ分析、たとえば（１）過剰発現、異所性発現および他の種における発現；（２）遺伝子ノックアウト（逆遺伝学、標的ノックアウト、ウイルス誘発遺伝子抑制（ＶＩＧＳ）（Ｂａｕｌｃｏｍｂ、１００  Ｙｅａｒｓ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、ＣａｌｉｓｈｅｒおよびＫｏｒｉｚｉｎｅｋ編、１９９９年、第１５巻、ｐ．１８９−２０１、米国、ニューヨ−ク州、ニューヨ−ク、Ｓｐｒｉｎｇ−Ｖｅｒｌａｇ社参照）；（３）遺伝子のメチル化状態の分析、とりわけフランキング調節領域；および（４）ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション；（Ｂ）遺伝子産物分析、たとえば（１）組換えタンパク質発現；（２）抗血清産生、（３）免疫学的局在決定；（４）触媒活性または他の活性の生化学アッセイ；（５）リン酸化状態；および（６）酵母２ハイブリッド分析による他のタンパク質との相互作用；（Ｃ）経路解析、たとえば遺伝子もしくは遺伝子産物をその過剰発現表現型に基づいてまたは関連した遺伝子との配列相同性によって特定の生化学的もしくシグナル経路内に置くこと；および（Ｄ）特定の代謝またはシグナル経路における単離遺伝子およびその産物の関与を測定または確認するために実施されることもでき、また遺伝子の機能を測定するのに役立つ他の分析を含む。
【実施例】
【０２１０】
本開示発明は、特許請求された本開示発明の範囲を限定する意図は決してない以下の実施例においてさらに詳細に記載される。添付された図面は、本開示発明の明細事項および記載と一体部分とみなされることが意図される。以下の実施例は特許請求された本開示発明を例示するが、限定しないために提供される。
【０２１１】
以下に続く実験の開示では、以下の略号が適用される：Ｍ（モル濃度）、ｍＭ（ミリモル濃度）；μＭ（マイクロモル濃度）；ｎＭ（ナノモル濃度）モル（ｍｏｌ）（モル数）；ｍｍｏｌ（ミリモル数）；μｍｏｌ（マイクロモル数）；ｎｍｏｌ（ナノモル数）；ｇｍ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；μｇ（マイクログラム）；ｐｇ（ピコグラム）；Ｌ（リットル）；ｍｌおよびｍＬ（ミリリットル）；μｌおよびμＬ（マイクロリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；μｍ（マイクロメートル）；ｎｍ（ナノメートル）；Ｕ（単位）；Ｖ（ボルト）；ＭＷ（分子量）；ｓｅｃ（秒）；ｍｉｎ（ｓ）（分）；ｈ（ｓ）およびｈｒ（ｓ）（時）；℃（摂氏度）；ＱＳ（十分量）；ＮＤ（行われていない）；ＮＡ（適用不可）；ｒｐｍ（毎分回転数）；Ｈ２Ｏ（水）；ｄＨ２Ｏ（脱イオン水）；ＨＣｌ（塩酸）；ａａ（アミノ酸）；ｂｐ（塩基対）；ｋｂ（キロ塩基対）；ｋＤ（キロダルトン）；ｃＤＮＡ（コピーまたは相補的ＤＮＡ）；ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）；ｓｓＤＮＡ（一本鎖ＤＮＡ）；ｄｓＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ）；ｄＮＴＰ（デオキシリボヌクレオチド３リン酸）；ＲＮＡ（リボ核酸）；ＭｇＣｌ２（塩化マグネシウム）；ＮａＣｌ（塩化ナトリウム）；ｗ／ｖ（重量対体積）；ｖ／ｖ（体積対体積）；ｇ（重力）；ＯＤ（光学密度）；ＣＮＰＧ（クロロニトロフェニル−ベータ−Ｄ−グルコシド）；ＣＮＰ（２−クロロ−４−ニトロフェノール）；ＡＰＢ（酸前処理バガス）；ＰＡＳＣ（リン酸膨潤セルロース）；ＰＣＳ（酸前処理トウモロコシ茎葉）；ｐｉまたはＰＩ（性能指数）；ＨＰＬＣ（高圧液体クロマトグラフィー）；ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）；ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）；およびＳＥＬ（部位評価ライブラリー）。
実施例１
アッセイ
【０２１２】
下記の実施例では以下のアッセイが用いられた。以下に与えられた手順からの何らかの逸脱は、実施例に示されている。これらの実験では、反応の完了後に生成された産生物の吸光度を測定するために、分光光度計が用いられた。
Ａ．残存グルコースの測定のためのヘキソキナーゼアッセイ
【０２１３】
ＣＢＨ２変異体を発現するハイポクレアジェコリーナ培養物上清からの残存グルコースが、ヘキソキナーゼアッセイを用いて測定された。５μｌの量の上清が、９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ平底ＰＳ）中の１９５μｌのグルコースヘキソキナーゼアッセイ（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社、蘭国、Ｂｒｅｄａ）に加えられた。このプレートは室温で１５分間培養された。培養後、吸光度が３４０ｎｍＯＤで測定された。残存グルコースを発現する培養物の上清が、さらなる検討のために合体物から除かれた。
Ｂ．タンパク質含有量測定のためのＨＰＬＣ
【０２１４】
集められた培養物上清からのＣＢＨ２変異体タンパク質の濃度が、Ｐｒｏｓｗｉｆｔ  ＲＰ  ２Ｈカラム（Ｄｉｏｎｅｘ社）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １１００（Ｈｅｗｌｅｔ  Ｐａｃｋａｒｄ社）ＨＰＬＣを用いて測定された。１０マイクロリットルのサンプルが、ろ過された脱イオン水中の５０μｌの１０％アセトニトリルと混合されて、０．０１％トリフルオロ酢酸を含有する１０％アセトニトリルで平衡化された後のＨＰＬＣカラムに注入された。化合物は１０％〜３０％アセトニトリルで０．３分〜１分の傾斜を用いて、引き続いて３０％〜６５％で１分〜４分の傾斜によって溶出された。ＣＢＨ２変異体のタンパク質濃度は、精製野生型ＣＢＨ２を用いて生成された較正曲線から決定された（６．２５、１２．５、２５、５０μｇ／ｍｌ）。性能指数（ＰｉまたはＰＩ）を計算するために、変異体によって産生された（平均）総タンパク質と、同じ施量において野生型によって産生された（平均）総タンパク質との比が、平均化された。
Ｃ．リン酸膨潤セルロース（ＰＡＳＣ）による比活性の決定
【０２１５】
セルロースの加水分解：リン酸膨潤セルロース（ＰＡＳＣ）が、公表された方法に従ってＡｖｉｃｅｌから調製された（Ｗａｌｓｅｔｈ、Ｔａｐｐｉ、１９７１年、第３５巻、ｐ．２２８；およびＷｏｏｄ、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ、１９７１年、第１２１巻、ｐ．３５３−３６２）。この物質は、酢酸ナトリウムの最終濃度が５０ｍＭ、ｐＨ５．０となるように緩衝液および水で１ｗ／ｖ％混合物になるまで希釈された。５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）中のＰＡＳＣの１％懸濁物の１００マイクロリットルが、９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ平底ＰＳ）中に分注された。ＣＢＨ２欠失株からの１０マイクロリットルの５ｍｇ／ｍｌ培養物上清がこのＰＡＳＣに添加され、そして野生型ＣＢＨ２か、あるいは変異体ＣＢＨ２を発現するハイポクレアジェコリーナ細胞からの５、１０、１５または２０μｌの集められた培養物上清がそれに添加された。ハイポクレアジェコリーナ（トリコデルマレーシとも呼ばれる。）由来のＣＢＨ２遺伝子の欠失は、米国特許第５，８６１，２７１号および第５，６５０，３２２号に記載されている。酢酸塩緩衝液の分注量は、総量における差を埋めるように添加された。マイクロタイタープレートは密封され、熱電対付き培養器中５０℃で９００ｒｐｍの連続振とう下に培養された。２時間後に加水分解反応は、各ウェルに１００μｌのグリシン緩衝液、ｐＨ１０の添加によって停止された。加水分解反応生成物はＰＡＨＢＡＨアッセイによって分析された。
ＰＡＨＢＡＨアッセイ：ＰＡＨＢＡＨ還元糖（５ｗ／ｖ％ｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド）（ＰＡＨＢＡＨ、Ｓｉｇｍａ社＃Ｈ９８８２，０．５Ｎ  ＨＣｌ中溶解物）、（Ｌｅｖｅｒ、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、１９７２年、第４７巻、２７３−２７９頁）の１５０μｌのアリコートが、空のマイクロタイタープレートのすべてのウェルに添加された。１０マイクロリットルの加水分解反応上清がＰＡＨＢＡＨ反応プレートに添加された。すべてのプレートは密封され、６９℃で９００ｒｐｍの連続振とう下に培養された。１時間後にプレートは氷上に５分間置かれ、そして室温で５分間７２０ｘｇで遠心分離された。生成されたＰＡＨＢＡＨ反応混合物の８０μＬのサンプルは、汚れていない（読み取り）プレートに移され、分光光度計において４１０ｎｍで吸光度が測定された。セロビオース標準物が対照として含められた。施量応答曲線が野生型ＣＢＨ２タンパク質について作られた。
Ｄ．希酸前処理トウモロコシ茎葉（ＰＣＳ）の加水分解による比活性の測定
【０２１６】
前処理トウモロコシ茎葉（ＰＣＳ）：トウモロコシ茎葉が記載されたように２ｗ／ｗ％Ｈ２ＳＯ４で前処理され（Ｓｃｈｅｌｌら、Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２００３年、第１０５巻、ｐ．６９−８６）、脱イオン水で複数回洗われて４．５のｐＨを有するペーストが得られた。酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）が次に５０ｍＭの酢酸ナトリウムの最終濃度まで添加され、そして必要によりこの混合物は次に１Ｎ  ＮａＯＨを用いてｐＨ５．０まで滴定された。反応混合物中のセルロース濃度は、約７％であった。６５マイクロリットルのこのセルロース懸濁物は、９６ウェルマイクロタイタープレートにウェルごとに添加された（Ｎｕｎｃ社平底ＰＳ）。ＣＢＨ２欠失株からの１０マイクロリットルの５ｍｇ／ｍｌ培養物上清がＰＣＳに添加され、そして野生型ＣＢＨ２か、あるいは変異体ＣＢＨ２を発現するハイポクレアジェコリーナ細胞からの５、１０、１５または２０μｌの集められた培養物上清がそれに添加された。酢酸塩緩衝液の埋め合わせ量が、総量における差を埋めるように添加された。プレートの密封後、このプレートは熱電対付き培養器中に５０℃で１３００ｒｐｍの連続振とう下に５分間置かれた。このプレートは次に乾燥を防止するために８０％湿度下に２２０ｒｐｍで振とうされながら５０℃で培養された。７日後にプレートは氷上に５分間置かれ、加水分解反応が、各ウェルに１００μｌのグリシン緩衝液、ｐＨ１０の添加によって停止された。加水分解反応生成物はＰＡＨＢＡＨアッセイによって分析された。
ＰＡＨＢＡＨアッセイ：ＰＡＨＢＡＨ還元糖試薬（５ｗ／ｖ％ｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド）（ＰＡＨＢＡＨ、Ｓｉｇｍａ社＃Ｈ９８８２，０．５Ｎ  ＨＣｌ中溶解物）、（Ｌｅｖｅｒ、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、１９７２年、第４７巻、２７３−２７９頁）の１５０μｌのアリコートが、空のマイクロタイタープレートのすべてのウェルに添加された。１０マイクロリットルの加水分解反応上清がＰＡＨＢＡＨ反応プレートに添加された。すべてのプレートは密封され、６９℃で９００ｒｐｍの連続振とう下に培養された。１時間後にプレートは氷上に５分間置かれ、そして室温で５分間７２０ｘｇで遠心分離された。生成されたＰＡＨＢＡＨ反応混合物の８０μＬのサンプルは、汚れていない（読み取り）プレートに移され、分光光度計において４１０ｎｍで吸光度が測定された。セロビオース標準物が対照として含められた。施量応答曲線が野生型ＣＢＨ２タンパク質について作られた。
Ｅ．アンモニア前処理コーンストーバー（ＣＣ）の加水分解による比活性の測定
【０２１７】
コーンコブを粉砕し、０．９ｍｍのスクリーンを通して、ＷＯ２００１１１０９０１の実施例４に記載のように前処理した（この方法を参照により本明細書に援用する。）前処理したコーンコブを５０ｍＭ酢酸ナトリウム中７％のセルロース懸濁液として用いた。この懸濁液を１ウェル当り６５マイクロリットルで、９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｎｕｍｃ  Ｆｌａｔ  Ｂｏｔｔｏｍ  ＰＳ）に添加した。精製されたＴ．ｒｅｅｓｅｉベータグルコシダーゼ１（Ｃｅｌ３Ａ）０．２３ｍｇ／ｍｌで懸濁した株（△ｅｇｌ１、△ｅｇｌ２、△ｃｂｈ１、△ｃｂｈ２）からの上清３．４ｍｇ／ｍｌの２０μｌを各ウェルに添加した。野生型ＣＢＨ２又はＣＢＨ２変異体のいずれかを発現しているＨ．ｊｅｃｏｒｉｎａ細胞由来のプールされた培養上清を２０又は４０マイクロリットル添加した。酢酸緩衝液を添加して、総量を同じにした。このプレートを５０℃、２２０ｒｐｍ、乾燥を防ぐために８０％の湿度で、インキュベートした。３日後このプレートを氷上に５分間静置し、１００μｌの１００ｍＭグリシン、ｐＨ１０．０を添加した。混合後、このプレートを５分間３０００ｒｐｍで遠心分離した。１０μｌの上清を１９０μｌの水で希釈した。この希釈した溶液２０μｌを、１００μｌ  ＡＢＴＳグルコースアッセイ混合液（２．７４ｍｇ／ｍｌの２，２‘アジノ−ビス（３−エチルベンゾ−チアゾ−６−スルホン酸、０．３３３Ｕ／ｍｌのホースラディッシュペルオキシダーゼ  タイプＩＶ、１Ｕ／ｍｌのグルコースオキシダーゼ）を含む新たな９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ  Ｆｌａｔ  Ｂｏｔｔｍ  ＰＳ）に移し、マイクロタイター分光光度計（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｐｌｕｓ３８４、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｓｅ）でＡ４２０の上昇を記録した。グルコース濃度の範囲は、各プレートにおける標準曲線（６．２５、１２．５、２５、５０、１００、２００、４００ｍＭ）の範囲内にあった。アッセイは２回行った。ラングミュラー方程式（Ｙ＝（ｘ＊ａ）／（ｘ＋ｂ）にデータを当てはめて野生型ＣＢＨ２について、投与反応曲線を作成した。ＣＢＨ２変異体の活性をサンプルプレートの野生型ＣＢＨ２の計算された値で割って性能指数を計算した。
Ｆ．エタノールの存在下における変異体ＣＢＨ２の安定性
【０２１８】
野生型ＣＢＨ２およびＣＢＨ２変異体の安定性が、４９℃において４．５％エタノールの存在下に試験された。ＣＢＨ２変異体を発現するハイポクレアジェコリーナ細胞の培養物上清の集合物（８０μｌ）が、ウェルごとに１０μｌの４０．５％ＥｔＯＨを含む９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社Ｖ底ＰＳ）に添加された。このプレートは密封され、熱電対付き培養器中４９℃で１６時間９００ｒｐｍで振とうされながら培養された。培養後にプレートは氷上に５分間置かれた。残存ＣＢＨ２活性が、上記のリン酸膨潤セルロース（ＰＡＳＣ）加水分解アッセイを用いて測定された。
【０２１９】
残存活性を計算するために、５、１０、１５および２０μｌのＥｔＯＨ培養されたＣＢＨ２の残存活性ＰＡＳＣアッセイへの添加によって生成された産生物の値が、５、１０、１５および２０μｌのＥｔＯＨを含まないＣＢＨ２のＰＡＳＣアッセイへの添加によって生成された産生物の値によって割られた。これらの４の比の個々の値は、次に平均化されて平均残存活性を与えた。変異体についてのＰＩを決定するために、変異体についての平均残存活性の値が次に野生型ＣＢＨ２対照の残存活性の平均によって割られた。
Ｇ．ＣＢＨ２変異体の熱安定性
【０２２０】
野生型ＣＢＨ２およびＣＢＨ２変異体の熱安定性が、５３℃で試験された。ＣＢＨ２変異体を発現するハイポクレアジェコリーナ細胞の培養物上清の集合物（８０μＬ）が、９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社Ｖ底ＰＳ）に添加された。このプレートは密封され、熱電対付き培養器中５３℃で１６時間９００ｒｐｍで振とうされながら培養された。培養後にプレートは氷上に５分間置かれた。残存ＣＢＨ２活性が、上記のリン酸膨潤セルロース（ＰＡＳＣ）加水分解アッセイを用いて測定された。
【０２２１】
残存活性を計算するために、５、１０、１５および２０μｌの熱処理されたＣＢＨ２の残存活性ＰＡＳＣアッセイへの添加によって生成された産生物の値が、５、１０、１５および２０μｌの加熱されていないＣＢＨ２のＰＡＳＣアッセイへの添加によって生成された産生物の値によって割られた。これらの４の比の個々の値は、次に平均化されて平均残存活性を与えた。変異体についてのＰＩを決定するために、変異体についての平均残存活性の値が次に野生型ＣＢＨ２対照の残存活性の平均によって割られた。
実施例２
【０２２２】
ハイポクレアジェコリーナＣＢＨ２タンパク質をコードする配列（配列番号１）を有するＴＴＴｐｙｒ−ｃｂｈ２プラスミドが、部位評価ライブラリー（Ｓｉｔｅ  Ｅｖａｕａｔｉｏｎ  Ｌｉｂｒａｒｙ）（ＳＥＬ）を作成するためにＢＡＳＦＣｌｅａｒ社（蘭国、Ｌｅｉｄｅｎ）、ＧｅｎｅＡｒｔ社（独国、Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ）およびＳｌｏｎｉｎｇ  Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（独国、Ｐｕｃｈｈｅｉｍ）に送られた。ＴＴＴｐｙｒ−ｃｂｈ２のプラスミドマップは図３に示される。ハイポクレアジェコリーナＣＢＨ２成熟タンパク質（配列番号３）のそれぞれの部位における位置ライブラリーの作成が、表２−１に示すように、上記業者に要求された。ＣＢＨ２完全長タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２に示される。
【０２２３】
以下の配列番号１は、参照ハイポクレアジェコリーナＣＢＨ２をコードするＤＮＡ配列を記載する。
［式１］
2012528598.tif 000003
【０２２４】
配列番号２はハイポクレアジェコリーナＣＢＨ２完全長タンパク質配列を示す。
［式２］
2012528598.tif 000004
【０２２５】
配列番号３はハイポクレアジェコリーナＣＢＨ２成熟タンパク質配列を示す。
［式３］
2012528598.tif 000005
【０２２６】
表２−１で列挙されている１６２部位のそれぞれについて、平均で１８個の置換変異体が作成された。このライブラリーをＣＢＨ２変異体タンパク質をコードしている精製プラスミドとして受け取った。
【表２】
2012528598.tif 000006
【表３】
2012528598.tif 000007
【０２２７】
Ｓｌｏｎｉｎｇ  Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（独国、Ｐｕｃｈｈｅｉｍ）およびＢＡＳＦＣｌｅａｒ社（蘭国、Ｌｅｉｄｅｎ）により４つのＣＢＨ２組み合わせライブラリーも生成した。表２−２乃至表２−５は合成ＣＢＨ２組み合わせライブラリーのメンバー中に存在する置換を列挙している（番号付けはＣＢＨ２成熟タンパク質アミノ酸配列に基づいている）。
【表４】
2012528598.tif 000008
【表５】
2012528598.tif 000009
ＣＢＨ２変異体タンパク質の生成
【０２２８】
ＣＢＨ２変異体配列をコードする読み取り枠を有する精製ｐＴＴＴｐｙｒ−ｃｂｈ２プラスミド（ｐｃｂｈ１、Ａｍｐ（商標）、Ａｃｅｔａｍｉｄｅ（商標））が、上で特定した業者から得られた。ハイポクレアジェコリーナ株（Δｅｇ１、Δｅｇ２、Δｃｂｈ１、Δｃｂｈ２）のプロトプラストがｐＴＴＴｐｙｒ構成体によって形質転換され、Ａｃｅｔａｍｉｄｅを含む選択寒天培地上で２８℃で７日間育成された。手短に言うと、ハイポクレアジェコリーナのバイオリスティック形質転換は以下の手順およびその中のセロビオヒドロラーゼＩ（ＣＢＨＩ、Ｃｅｌ７ａ）、セロビオヒドロラーゼＩＩ（ＣＢＨＩＩ、Ｃｅｌ６ａ）、エンドグルカナーゼＩ（ＥＧＩ、Ｃｅｌ７ｂ）およびエンドグルカナーゼＩＩ（ＥＧＩＩ、Ｃｅｌ５ａ）をコードする遺伝子が不活性化されている株を用いて実施された。バイオリスティック形質転換法によるこのハイポクレアジェコリーナの形質転換は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社（米国、カリフォルニア州、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）からのＢｉｏｌｉｓｔｉｃ（商標）ＰＤＳ−１０００／ｈｅ粒子送達系を用いて、製造業者の指示（国際公開第０５／００１０３６号および米国特許出願公開第２００６／０００３４０８号参照）に従って達成された。胞子が収穫され、Ａｃｅｔａｍｉｄｅ寒天上に移され、２８℃で７日間培養された。胞子は１５５グリセロール中に収穫され、さらなる使用のために−２０℃で貯蔵された。ＣＢＨ２変異体タンパク質の産生のために、１０μｌの胞子懸濁物が、ＰＶＤＦフィルタープレート中の２％のグルコース／ソホロース混合物；６．０ｇ／Ｌグリシン、４．７ｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４；５．０ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４；１．０ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；３３．０ｇ／Ｌ  ＰＩＰＰＳ；ｐＨ５．５を補充された２００μｌのグリシン最少培地に添加され、炭素源としての約２％のグルコース／ソホロース混合物、１０ｍｌ／Ｌの１００ｇ／ＬのＣａＣｌ２、２．５ｍｌ／Ｌのトリコデルマレーシ微量元素（４００Ｘ）：１７５ｇ／Ｌ無水クエン酸；２００ｇ／Ｌ  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；１６ｇ／Ｌ  ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；３．２ｇ／Ｌ  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ；１．４ｇ／Ｌ  ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ；０．８ｇ／Ｌ  Ｈ３ＢＯ３の滅菌後添加をされた。各ＣＢＨ２変異体は正副４通りに育成された。プレートを酸素透過性膜でシールした後、プレートは２２０ｒｐｍで振とうされながら２８℃で６時間培養された。培地を低圧力下にマイクロタイタープレートに移すことによって、上清が収穫され、実施例１に記載されたヘキソキナーゼアッセイを用いて残存グルコースの有無について試験された。
実施例３
ＣＢＨ２変異体の発現、活性および性能
【０２２９】
ハイポクレアジェコリーナ電荷変異体が、関心の対象である様々な特性について試験された。特に、セルラーゼ変異体が、実施例１に記載されたようにＨＰＬＣアッセイ（ＨＰＬＣ）を用いてタンパク質の発現について、ＰＡＳＣ加水分解アッセイ（活性ＰＡＳＣ）およびＰＣＳ加水分解アッセイ（活性ＰＣＳ）を用いて比活性について、エタノールの存在下における安定性（ＥｔＯＨ比率）および熱安定性（熱比率）について試験された。ＣＢＨ２電荷変異体の性能データが表３−１に示される。
【０２３０】
性能指数（ＰＩ）は、変異体セルラーゼの性能と親セルラーゼまたは参照セルラーゼの性能との比である。下に記載される様々な項が突然変異を記述するのに用いられる。すなわち、アップ突然変異はＰＩ＞１を有し、中立突然変異はＰＩ≧０．５を有し、非有害突然変異はＰＩ＞０．０５を有し、有害突然変異はＰＩ＝０．０５を有し、合体可能突然変異は変異体が少なくとも１の特性について性能指数値≧０．５を有するような突然変異である。合体可能突然変異は、合体されて１以上の所望の特性について適切な性能指数を有するタンパク質を産み出すことができる突然変異である。突然変異が起きる位置は以下のように分類される。すなわち、非制限位置は少なくとも１の特性について２０％以上の中立突然変異を有し、制限位置は活性および安定性について２０％未満の中立突然変異を有する。完全制限位置は活性または安定性について中立突然変異を有しない。
【０２３１】
これらのデータは、任意のＣＢＨ２を遺伝子操作するために用いられることができる。たとえ遺伝子操作されるべきＣＢＨ２が特定の位置においてハイポクレアジェコリーナＣＢＨ２のアミノ酸とは異なるアミノ酸を有していても、最良の選択である置換、たとえばハイポクレアジェコリーナＣＢＨ２野生型アミノ酸への置換を特定することによって、これらのデータが所望の特性を変える置換を見出すために用いられることができる。
【０２３２】
表３−１は、ハイポクレアジェコリーナＣＢＨ２の２８２８の変異体についての性能指数値（ＰｉまたはＰＩ）を示す。０．０５以下の性能指数は０．０５に固定され、同表中にボールドイタリック体で示される。
【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
2012528598.tif 000013
【表１０】
2012528598.tif 000014
【表１１】
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【表１２】
2012528598.tif 000016
【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
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【表１８】
2012528598.tif 000022
【表１９】
2012528598.tif 000023
【表２０】
2012528598.tif 000024
【表２１】
2012528598.tif 000025
【表２２】
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【表２３】
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【表２４】
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【表２５】
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【表２６】
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【表２７】
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【表２８】
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【表２９】
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【表３０】
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【表３１】
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【表３２】
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【表３３】
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【表３４】
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【表３５】
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【表３６】
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【表３７】
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【表３８】
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【表３９】
2012528598.tif 000043
【表４０】
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【表４１】
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【表４２】
2012528598.tif 000046
【表４３】
2012528598.tif 000047
【表４４】
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【表４５】
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【表４６】
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【表４７】
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【表４８】
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【表４９】
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【表５０】
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【表５１】
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【表５２】
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【表５３】
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【表５４】
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【表５５】
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【表５６】
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【表５７】
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【表５８】
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【表５９】
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【表６０】
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【表６１】
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【０２３３】
非組み合わせ変異体はＰｉ値の０．０５以下であるものである。ハイポクレアジェコリーナＣＢＨ２において、２８２８変異体のうち６つが組み合わせ変異体とはならなかった。それらはＡ１２１Ｑ、Ｌ２４３Ｈ、Ａ３２２Ｑ、Ｌ３２８Ｃ、Ｌ３２８Ｙ、Ｖ４３６Ｙであった。ハイポクレアジェコリーナＣＢＨ２に対してこれらの置換を１つを有する任意のＣＢＨ２が、この位置における組み合わせ可能な置換の１つ、又はハイポクレアジェコリーナＣＢＨ２の１２１、２４３、３２２、３２８、又は４６３に存在するアミノ酸を変異することにより、改善された。
【表６２】
2012528598.tif 000066
【表６３】
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【表６４】
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【表６５】
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【表６６】
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【表６７】
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【表６８】
2012528598.tif 000072
実施例４
ＣＢＨ２タンパク質の分類
【０２３４】
前述のように、セルラーゼ変異体の機能は、性能指数（ＰＩ）として定量化される。これは親又は参照セルラーゼの性能に対する変異体の性能の比である。変異体を説明するために用いる各種用語を以下で定義する。高度な変異体は１より大きいＰＩを有する。中程度の変異体は０．５より大きいＰＩを有する。有害ではない変異体は０．０５より大きいＰＩを有する。有害な変異体は０．０５のＰＩを有する。組み合わせ可能な変異体は少なくとも１つの性質について０．５の性能指数を有し、全ての性質について、０．０５より大きい性能指数を有するものである。組み合わせ可能な変異体は、１つ以上の好ましい性質について適切な性能指数を有するタンパク質を提供するために組み合わせることができる。変異が生じる位置は、少なくとも１つの性質について２０％より大きい中程度の変異を有する。制限部位は、活性及び安定性について２０％未満の中程度の変異を有する。
【０２３５】
表４−１に示すように、ＣＢＨ２の試験された１６２個の位置について、１６２個の全てが非制限的であった。非制限部位はそれらが数多くの組み合わせ可能変異体を有しているから、組み合わせ可能ライブラリーの構築に用いるのに最も適した位置である。
【表６９】
2012528598.tif 000073
【表７０】
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【表７１】
2012528598.tif 000075
【表７２】
2012528598.tif 000076
実施例５
ＣＢＨ２変異体活性への電荷変化の効果
【０２３６】
この実施例では、セルラーゼ活性の前処理トウモロコシ茎葉（ＰＣＳ）アッセイにおける、ＣＢＨ２活性への電荷の変化の効果が評価された。手短に言うと、ＣＢＨ２  ＣＥＬ中のＰＣＳウィナーの数が、正味電荷特性の変化として測定された。表９−１では、ＰＣＳアッセイでの実測されたウィナーと予測されたウィナーとの比（ｏ／ｅ）が測定された。ボールドイタリック体の値は、それぞれの列に列挙された１０個のランダム分布の平均値プラスマイナス標準偏差値（ｓｄ）とは有意に異なっている。
【表７３】
2012528598.tif 000077
【０２３７】
表５−１及び図２Ａに示されるように、低くなっている荷電（例えば、―１、−２）はＰＣＳアッセイにおいてＣＢＨ２ウィナーの有意に高い相度数となり、高くなっている荷電（＋１）はＰＣＳアッセイにおいて有意に低い度数となっている。対照的に、表５−２及び図２Ｂにおいて示すように、ＣＢＨ２ウィナーの有意に高い度数は荷電変化のない変異体において観察され（例えば、０）、ＣＢＨ２ウィナーの有意に低い頻度は荷電変化のある変異体について観察された（例えば、―２、−１、＋２）。
【０２３８】
対照的に、ＰＣＳ上のＣＢＨ２活性は荷電の減少に相関関係がある。ＰＡＳＣ上のＣＢＨ２活性はセルロース分解活性とは相関を示さなかったが、ＰＣＳ物質については特異性を示した。
実施例６
トリコデルマレーシスクリーニング株の生成
【０２３９】
酵素変異体のアミノ酸配列に関係のない因子の存在下でＢＣＨ２変異体発現の濃度を高めるために改善されたスクリーニング株を生成した。特に、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉスクリーニング変異体をターゲティングベクターと組み合わせて作成し、ｃｂｈ２変異体遺伝子の組み込みを強めた（例えば、調節配列と作動可能に組み合わせたコード領域）。本開示発明を開発する間に調製された新しい株は変異ライブラリーをスクリーニングするために有利である幾つかの変異を組み合わせる。遺伝子改変工程の概要は図４に示す。
【０２４０】
Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ四欠失誘導体からのｋｕ８０の欠失：ＭＵＳ５２の単一オーソログである、ヒトＫＵ８０のＮ．ｃｒａｓｓａオーソログ、をＨ．ｊｅｃｏｒｉｎａＱＭ６ａ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）のゲノム配列でＢＬＡＳＴＩＮサーチにより同定し、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ  ｋｕ８０と名づけた。タンパク質ＩＤは５８２１３。ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｊｇｉ−ｐｓｆ．ｏｒｇ／Ｔｒｉｒｅ２／Ｔｒｉｒｅ２．ｈｏｍｅ．ｈｔｍｌ。Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ  ｋｕ８０のヌクレオチド配列は配列番号２３で定義される。
［式４］
2012528598.tif 000078
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【０２４１】
Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ  ｋｕ８０遺伝子を本分野の標準的な方法を用いて四欠失誘導株から欠失させた。簡単に言うと、ｋｕ８０配列の５’末端の１．３ｋｂとｋｕ８０配列の３‘末端の２．３ｋｂの間にある選択マーカーを用いて、ｋｕ８０カセットを構築した。図５に概要を示す。このハーバサイドクロリムロンエチルに対する変異Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ  ａｌｓをＷＯ２００８／０３９３７０に記載の様に、選択マーカーとして用いた。ｋｕ８０ノックアウトカセットのヌクレオチド配列は７６８５ベースペアの長さである。１塩基乃至１２７１塩基は５’末端ｋｕ８０ホモロガス領域に相当する。１２８０塩基乃至７６８５塩基はａｌｓ−クロリムロンエチル耐性変異体（Ａ１９０Ｄ）に相当する。５３８１塩基乃至７６８５塩基は３’末端ｋｕ８０ホモロガス領域に相当する。このｋｕ８０ノックアウトカセットのヌクレオチド配列は配列番号１４で定義される。
［式５］
2012528598.tif 000080
［式６］
2012528598.tif 000081
［式７］
2012528598.tif 000082
［式８］
2012528598.tif 000083
【０２４２】
Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ△ｋｕ８０四欠失誘導株からのＡｒｃｈｙ２株の生成：このｋｕ８０ノックアウト株からｐｙｒ２遺伝子を欠失させる。ｐｙｒ２欠失カセットはＴ．ｒｅｅｓｅｉ  ｃｂｈ１プロモーター、ハイグロマイシン耐性遺伝子、及び５’及び３’ｐｙｒ２配列に隣接している部分的なａｍｄＳ選択マーカーを含む。概要を図６に示す。このベクターを使用すると、ｐｙｒ２ノックアウト形質転換体のハイグロマイシン及びフルオロオロ酸の耐性をスクリーニングすることができる。部分的なａｍｄＳ遺伝子は、この遺伝子の３‘部分を含んでいるが、プロモーター及びコード領域のアミノ末端部分を欠いている。ｐｙｒ２ノックアウトカセットのヌクレオチド配列は９２５２ベースペアの長さを有する。１塩基−１９９４塩基はｐｙｒ２の３’ホモロガス領域に相当する。２００２塩基乃至３４９７塩基はＴ．ｒｅｅｓｅｉ  ｃｂｈ１プロモーターに相当する。３５６３塩基乃至５４４９塩基はハイグロマイシン選択マーカーに相当する。５４５０塩基乃至７４４０塩基はＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓ  ａｍｄＳの３’部分的マーカーに相当する。７４４１塩基乃至９２５９塩基はｐｙｒ２の５’ホモロガス領域に相当する。ｐｙｒ２ノックアウトカセットのヌクレオチド配列は配列番号１５で定義される。
［式９］
2012528598.tif 000084
［式１０］
2012528598.tif 000085
［式１１］
2012528598.tif 000086
［式１２］
2012528598.tif 000087
【０２４３】
Ａｒｃｈｙ２  Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ株からのＡｒｃｈｙ３株の生成：Ａｒｃｈｙ２株は同じｐｙｒ２遺伝子座に組み込み、ハイグロマイシン遺伝子をｐｙｒ２遺伝子のコード領域で置き換えるために、ベクターで形質転換した。このハイグロマイシン欠失カセットを図７で示す。このｐｙｒ２遺伝子座に再び導入されたｐｙｒ２遺伝子は、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ  ｃｂｈ１プロモーターと部分的選択マーカーの間に導入された。この株はウリジンプロトトロフィーで選択することができ、ハイグロマイシンに対して感受性がある。ｈｙｇＲノックアウトカセットは９０８８ベースペアの長さである。１塩基乃至１９９４塩基はｐｙｒ２の３’ホモロガス領域に相当する。１９９５塩基乃至３４９７塩基はＴ．ｒｅｅｓｅｉ  ｃｂｈ１プロモーターに相当する。３５６４塩基乃至５１３７塩基はｐｙｒ２選択マーカーに相当する。５２８０塩基乃至７２７０塩基はＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓ  ａｍｄＳの３’部分的マーカーに相当する。７２７１塩基乃至９０８８塩基はｐｙｒ２の５’ホモロガス領域に相当する。ｈｙｇＲノックアウトカセットのヌクレオチド配列は配列番号１６で定義される。
［式１３］
2012528598.tif 000088
［式１４］
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［式１５］
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［式１６］
2012528598.tif 000091
【０２４４】
Ａｒｃｈｙ３  Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ株からのＡ５Ｄ株の生成：野生型Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ  ｂｇｌ１を当分野で知られているダブルリコンビナントベクターを用いてＡｒｃｈｙ３から欠失させた。ハイグロマイシン耐性は、  ｂｇｌ１欠失のための選択マーカーとして用いた。更に、ハイグロマイシン耐性マーカーをｌｏｘＰ部位に隣接させた。この欠失カセットを図８に示す。次いで、ハイグロマイシン耐性形質転換体をｂｇｌ１について解析した。ｂｇｌ１の欠失が確認された株を形質転換の選択のためにｃｒｅリコンビナーゼ及び機能ａｍｄＳをコードしているテロメアベクターで形質転換したｃｒｅリコンビナーゼ発現及びｌｏｘＰのループアウトによりハイグロマイシン除去を促進した。ｃｒｅリコンビナーゼをコードしているテロメアベクターを図１０で説明する。形質転換体はまずアセトアミド培地で得られ、その後、ポテトデキストトースアガーに移して、同様にハイグロマイシン培地上で平板培養して、ハイグロマイシン感受性を調査した。ハイグロマイシンに感受性のある株は再度ポテトデキストロース培地に移され、同様にして、アセトアミド培地に平板培養された。アセトアミド上で育成する力が少ない株が選択され、この事をテロメアベクターの損失の指標とする。ｂｇｌ１ノックアウトカセットは配列番号１７で定義される。
［式１７］
2012528598.tif 000092
［式１８］
2012528598.tif 000093
［式１９］
2012528598.tif 000094
【０２４５】
テロメアベクター、ｐＴＴＴ−ｃｒｅ、のヌクレオチド配列は配列番号１８で定義される。
［式２０］
2012528598.tif 000095
［式２１］
2012528598.tif 000096
［式２２］
2012528598.tif 000097
［式２３］
2012528598.tif 000098
［式２４］
2012528598.tif 000099
【０２４６】
Ａ５Ｄ  Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ株からのＭＡＤ６株の生成：野生型ｅｇｌ３をｂｇｌ１欠失で、前に説明した方法を用いて、Ａ５Ｄ株から欠失させた。欠失カセットの概要は図９に示す。ハイグロマイシン耐性はｅｇｌ３欠失についての選択マーカーを用いた。このハイグロマイシン耐性マーカーをｌｏｘＰ部位に隣接させた。形質転換体をｅｇｌ３の欠失［に用いた方法］でこの株から排除した。ｅｇｌ３欠失カセットの核酸配列は配列番号１９で定義される。
［式２５］
2012528598.tif 000100
［式２６］
2012528598.tif 000101
［式２７］
2012528598.tif 000102
実施例７
活性及び熱安定性アッセイにおける選択された一部位置換ＣＢＨ２変異体の解析
【０２４７】
Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ株の６欠失体（△ｅｇｌ１、△ｅｇｌ２、△ｅｇｌ３、△ｃｈｂ１、△ｃｂｈ２、△ｂｇｌ１）のプロトプラストをＷＯ２００９／０４８４８８に記載のように、ｐＴＴＴｐｙｒＧベクターにコードされている選択されたＣＢＨ２  ＳＥＬ変異体で形質転換した。胞子を収穫し、アセトアミドアガー上で再度平板培養し、２８℃で７日間インキュベートした。次いで、アガー上で胞子を形成しているトリコデルマ株を２５ｍｌＹＥＧ培地（５ｇ／Ｌ酵母抽出物、２０ｇ／Ｌグルコース）に接種し、２８℃、２００ｒｐｍで２日間インキュベートして、ＣＢＨ２変異体を生成した。このＹＥＧ培養物の５ｍｌを２％グルコース／ソホロース混合物を含むグリシン培地、４５ｍｌに接種した。この培地を６ウェルマイクロタイタープレートに注ぎ、酵素高含有環境下、２８℃で５日間静置してインキュベートした。０２μｍフィルターでろ過して細胞を除去した。１０ｋＤ分子量を取り除くビバスピンスピンセルを用いて、上清を濃縮した。この変異体を５０℃でリン酸膨張セルロース（ＰＡＳＣ）、５０℃で希酸処理コーンストーバー（ＰＣＳ）、５０℃及び７５℃で希アンモニア処理コーンコブの加水分解能力について試験を行った。更に、各種変異体は熱安定性についても試験を行った。
【０２４８】
リン酸膨張セルロース上での酵素活性は、以下の違いを除いては、実施例１で説明したように行った。各ウェルにＣＢＨ２欠失株（△ｅｇｌ１、△ｅｇｌ２、△ｃｂｈ１、△ｃｂｈ２）からの上清中４．９μｇのタンパク質を含むものを１０μｌ添加した。このプレートを２００ｒｐｍで振とうしながら、５０℃でインキュベートした。２時間後、このプレートを５分間氷上に置き、１００μｌの１００ｍＭグリシン、ｐＨ１０、を添加した。混合の後、このプレートを５分間遠心分離した。４０μｌの上清を１６０μｌの水で希釈した。１０μｌの希釈された溶液を１００μｌのＡＢＴＳグルコースアッセイ混合物（２．７４ｍｇ／ｍｌの２，２’アジノ−ビス（３−エチルベンゾ−チアゾ−６−スルホン酸、１Ｕ／ｍｌのホースラディッシュペルオキシダーゼ、タイプＩＶ、１Ｕ／ｍｌのグルコースオキシダーゼ）を含む新しい９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ  Ｆｌａｔ  Ｂｏｔｔｏｍ  ＰＳ）に移し、Ａ４２０の上昇をマイクロタイター分光光度計（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｐｌｕｓ  ３４８  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で記録した。グルコース濃度は各プレートの標準曲線の範囲内であった（０；０．００８；０．０１６；０．０３１；０．０６３；０．１２５；０．２５；０．５；１ｍｇ／ｍｌ）。アッセイは２回行った。Ｔｅｍｋｉｎ  ｉｓｏｔｈｅｒｍ方程式（Ｙ＝ａ＋ｂ（１ｎ（１＋ｃ＊ｘ））にデータをあてはめて、野生型ＣＢＨ２の投与量反応曲線を作成し、サンプルプレートの野生型ＣＢＨ２の計算された活性でＣＢＨ２変異体の活性を割って、性能指数を算出した。
【０２４９】
ＰＣＳ  ５０℃
洗浄された希酸処理コーンストーバー上の酵素活性を以下の違いを除いては、実施例１、セクションＤで説明したのとほぼ同様に試験した。各ウェルにＣＢＨ２欠失株（△ｅｇｌ１、△ｅｇｌ２、△ｃｂｈ１、△ｃｂｈ２）からの上清中４９μｇのタンパク質を含むものを１０μｌ添加した。このプレートを２００ｒｐｍで振とうしながら、５０℃でインキュベートした。２時間後、このプレートを５分間氷上に置き、１００μｌの１００ｍＭグリシン、ｐＨ１０、を添加した。混合の後、このプレートを５分間遠心分離した。４０μｌの上清を１９０μｌの水で希釈した。１０μｌの希釈された溶液をＡＢＴＳを含む新しい９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ  Ｆｌａｔ  Ｂｏｔｔｏｍ  ＰＳ）に移し、ＰＡＳＣアッセイについて説明したように、評価及び解析した。
【０２５０】
コーンコブ  ５０℃
コーンコブ５０℃における酵素活性を以下の違いを除いて、実施例１、セクションＥで説明したのと同様に行った。各ウェルにＣＢＨ２欠失株（△ｅｇｌ１、△ｅｇｌ２、△ｃｂｈ１、△ｃｂｈ２）由来上清に４６．５５μｇのタンパク質を含む１０μｌを添加し、４．９０μｇのＴ．ｒｅｅｓｅｉ  ＣＢＨ１、６．４８μｇのＴ．ｒｅｅｓｅｉ  Ｘｙｎ２Ｙ５（Ｘｉｏｎｇ  ら．Ｅｘｔｈｅｍｏｐｈｉｌｅｓ  ８：３９３−４００、２００４）、２．２８μｇのＦｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｏｄｉａ（Ｆｖ）５１Ａ、５．３２μｇのＦｖ３Ａ、０．７６μｇのＦｖ４３Ｄ、及び２．４５μｇのＴ．ｒｅｅｓｅｉ  ＢＧＬ１で懸濁した。このＦｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｏｉｄｅｓ酵素はＵＳ６１／２４５２６９に説明されている（参照により本明細書に援用する）。ＣＢＨ２変異体を発現している形質転換されたＴ．ｒｅｅｓｅｉ株の異なる容量の上清を実施例１で説明する様に添加した。このプレートを２００ｒｐｍで振とうしながら、５０℃で２日間インキュベートした。
【０２５１】
コーンコブ  ７５℃
コーンコブを粉砕して、０．９ｍｍスクリーンを通過させて、ＷＯ２００６／１１０９０１（参照により本明細書に援用する）の実施例４に記載されているように前処理した。前処理したコーンストーバーを５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０中７％セルロース懸濁液７０マイクロリットルを９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ  Ｆｌａｔ  Ｂｏｔｔｏｍ  ＰＳ）１ウェル当りに添加した。４６．５５μｇのタンパク質を含むＣＢＨ２欠失株（△ｅｇｌ１、△ｅｇｌ２、△ｃｂｈ１、△ｃｂｈ２）の上清、４．９０μｇのＣＢＨ１変異体（Ｓ８Ｐ／Ｔ４１Ｉ／Ｎ８９Ｄ／Ｓ９２Ｔ／Ｓ１１３Ｎ／Ｓ１９６Ｔ／Ｐ２２７Ｌ／Ｄ２４９Ｋ／Ｔ２５５Ｐ／Ｓ２７８Ｐ／Ｅ２９５Ｋ／Ｔ２９６Ｐ／Ｔ３３２Ｙ／  Ｖ４０３Ｄ／Ｓ４１１Ｆ／Ｔ４６２Ｉ）、６．８４μｇのＴ．ｒｅｅｓｅｉ  Ｘｙｎ２  Ｙ５（Ｘｉｏｎｇら，Ｅｘｔｈｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ、第８巻、３９３−４００頁、２００４年）、２．２８μｇのＦｖ５１Ａ、５．３２μｇのＦｖ３Ａ、０．７６μｇのＦｖ４３Ｄ，２．４５μｇのＴａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉベータグルコシダーゼを添加した。野生型ＣＢＨ２又はＣＢＨ２変異体のいずれかを発現しているＨ．ｊｅｃｏｒｉｎａ細胞からの上清を最大で２０マイクロリットル添加した。酢酸緩衝液を添加して、総量を同じにした。このプレートを２００ｒｐｍで振とうしながら、５７℃でインキュベートした。２日後このプレートを５分間氷上に置き、１００ｍＭグリシン、ｐＨ１０．０、１００μｌを添加した。混合後、このプレートを３０００ｒｐｍで５分間インキュベートした。１０μｌの上清を１９０μｌの水で希釈した。この希釈溶液１０μｌの１００μｌのＡＢＴＳグルコースアッセイ混合物を含む新しい９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ  Ｆｌａｔ  Ｂｏｔｔｏｍ  ＰＳ）に移し、前述のように、評価及び解析を行った。
【０２５２】
ＣＢＨ２熱安定性アッセイ
ＣＢＨ２変異体の熱安定性を試験するために、５０μｌの上清をＰＣＲ機器中で、５０乃至７０℃の温度範囲で試験した。０．００２５％のＴｗｅｅｎ８０を含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．０中に０．６２５ｍｇ／ｍｌのセロトリオースを含む８０μｌの溶液を２０μｌの上清とインキュベートして、残余活性を測定した。１時間後、１００ｍＭグリシンｐＨ１０を４０μｌ添加した。２０μｌを８０μｌのＡＢＴＳ試薬（上掲）に添加して、ＯＤ４２０における呈色を５分間記録した。擬似融点（Ｔｍ）を各温度における残余活性を以下の式に当てはめて計算した。
Y=1/(1+exp(-(a*(1-b/c-ln(c/b)+d*((1/c)-(1/d)))/e))
式中、熱キャパシティー（ｋｃａｌ＊ｍｏｌ−１＊Ｋ−１）ｂは融点（Ｋ）である。ｃはアッセイ温度（Ｋ）、ｄはエントロピー変化（ｋｃａｌ＊ｍｏｌ−１＊Ｋ−１）、ｅは気体係数（ｋｃａｌ＊ｍｏｌ−１＊Ｋ−１）である。
【表７４】
2012528598.tif 000103
【表７５】
2012528598.tif 000104
【表７６】
2012528598.tif 000105
【０２５３】
変異のカテゴリーを分類した。少なくとも１つの性質について０．７５より大きいＰＩを有し、全ての性質で０．０５より大きいＰＩを有する変異体を包含するものは高度に組み合わせ可能変異体とした。前述の例で説明したように、幾つかの変異体は２つの高い組み合わせ可能変異を有しており、対象ＣＢＨ２酵素よりも高い活性及び／又は安定性を有している。高い組み合わせ可能への蓄積が各別個の変異がすぐれた活性、熱安定性及び／又は発現レベルを変異体酵素に付与するために、十分ではない、有利な変異体を作成するために用いることができる。
実施例８
ＣＢＨ２組み合わせライブラリー変異体及びそれらの活性
【０２５４】
合成ＣＢＨ２組み合わせライブラリーをＧｅｎｅＯｒｃｌｅ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）により生成した。表８−１はＣＢＨ２成熟アミノ酸配列にしたがっている）このライブラリーは表７−１に列挙されているＴｍ及び／又は特性に基づいて、高度な変異体及び／又は高度に組換え可能な変異として分類した。
【表７７】
2012528598.tif 000106
このライブラリーは、プライマー、ＧＡＣＣＧＧＡＣＧＴＧＴＴＴＴＧＣＣＣＴＴＣＡＴ（配列番号２０）及びＧＴＧＴＧＡＣＣＧＧＣＴＴＴＧＧＣＧＡＧＴＧ（配列番号２１）を用いて、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ宿主細胞中でｐｙｒ２遺伝子座の組み込みを強化するために、ｃｂｈ１プロモーターの上流約１．１ｋｂまでと、ａｍｄＳマーカーの下流約１．８５ｋｂまでに隣接するｃｂｈ２遺伝子を増幅して、得られたＰＣＲ産物として提供された。スクリーニングする株への発現カセットの相同組換えの概要を図１１に示す。配列番号２０及び配列番号２１のプライマーを用いて、ｐＴＴＴｐｙｒＧ−ＣＢＨ２から増幅されたＰＣＲ断片（親のｃｂｈ１プロモーター、ｃｂｈ２遺伝子、及び／又は部分的ａｍｄＳ遺伝子）の核酸配列を配列番号２２で定義する。
［式２８］
2012528598.tif 000107
［式２９］
2012528598.tif 000108
［式３０］
2012528598.tif 000109
【０２５５】
実施例６で説明したＡＤ５  Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ株（△ｅｇｌ１、△ｅｇｌ２、△ｃｂｈ１、△ｃｂｈ２、△ｂｇｌ１）をＵＳ２００６／００９０４０８４に記載の直鎖ＤＮＡライブラリーで形質転換して、アセトアミドを含む選択培地で２８℃、７日間育成した。（０．６ｇ／Ｌのアセトアミド、１．６８ｇ／ＬのＣｓＣｌ、２０ｇ／Ｌのグルコース、６ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、０．６ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．６ｇ／ＬＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．５ｇ／Ｌのウリジン、微量元素、１０ｇ／Ｌの低融点アガロース）。２４時間後、１．２ｇ／Ｌのフルオロオロ酸（ＦＯＡ）を懸濁した選択アガーを積層させた。全部で３８０コロニーを１．２ｇ／ＬのＦＯＡを含むポテトデキストロースアガープレートに移して、２８℃で４乃至５日間インキュベートした。胞子を新しいポテトデキストロースアガーに移し、２８℃で３日間インキュベートした。あるいは、実施例６で説明したＭＤＡ６株のプロトプラストをＡＤ５の変わりに、変異ライブラリーメンバーの発現に用いることができる。同様に、追加的なセルラーゼが失活させられているＭＡＤ６株の誘導体のプロトプラストもこの目的に用いることができる。そのような誘導体は十分に低いセルラーゼ活性を有している。
【０２５６】
ＣＢＨ２セルラーゼタンパク質生成について、胞子を９６ピンプリケーターを用いてＰＶＤフィルタープレート（６．０ｇ／Ｌのグリシン，４．７ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４；５．０ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４；１．０ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；３３．０ｇ／ＬのＰＩＰＰＳ；ｐＨ５．５；滅菌した２％グルコース／ソホロース混合物を炭素源として含む、１０ｍｌ／Ｌの１００ｇ／ＬのＣａＣｌ２，２．５ｍｌ／ＬのＴ．ｒｅｅｓｅｉ微量元素（４００Ｘ）：１７５ｇ／Ｌの無水クエン酸；２００ｇ／ＬのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；１６ｇ／ＬのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；３．２ｇ／ＬのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ；１．４ｇ／ＬのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ；０．８ｇ／ＬのＨ３ＢＯ３）中に２％のグルコース／ソホロースを含む２００μＬのグリシン最小培地へ移した。各ＣＢＨ２変異体について４回育成を行った。このプレートを酸素透過性膜で密閉した後、２８℃で６日間インキュベートした。培養培地をマイクロタイタープレートへ低圧下で移すことにより上清を回収した。
【０２５７】
５７℃でコーンコブ上で改善された活性を示した全部で１０の変異体を単離した。これらの株のゲノムＤＮＡを単離し、それらのｃｂｈ２遺伝子を決定した。このＣＢＨ２変異体を所望の性質について試験した。コーンコブ及びコーンストーバーにおける組み合わせライブラリーメンバーの置換と活性を表８−２に示す。洗浄された希酸前処理コーンストーバー（ＰＣＳ  ５０℃）５０℃でのコーンコブ（ＣＣ  ５０℃）、７５℃でのコーンコブ（ＣＣ  ７５℃）は実施例７に記載のように決定した。
【表７８】
2012528598.tif 000110
実施例９
ＣＢＨ２一部位及び二部位置換変異体及びそれらの活性
【０２５８】
ＣＢＨ２変異体をコードしている合成遺伝子をＧｅｂｅＯｒａｃｌｅ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｗｅ，ＣＡ）によりｐＴＴＴｐｙｒＧ中で構築した。表９−１は構築された一部位及び二部位置換変異体を列挙する（番号付けはＣＢＨ２成熟アミノ酸配列に基づく）。
【表７９】
2012528598.tif 000111
【０２５９】
ＣＢＨ２熱安定性アッセイ２
ＣＢＨ２変異体の熱安定性を試験するために、５０μｌの上清を５０乃至７０℃にわたる温度範囲でＰＣＲ機器でインキュベートした。残存活性を０．００２５％Ｔｗｅｅｎ８０を含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．０中０．６２５ｍｇ／ｍｌセロトリオースを含む培地８０μＬで上清２０又はｌをインキュベートした。１時間後、４０μｌの１００ｍＭグリシン、ｐＨ１０を添加した。２０μｌを８０μｌのＡＢＴＳに添加して、ＯＤ４２０での発色を５分間記録した。各温度での残存活性を以下の式にあてはめて、仮の融点（Ｔｍ）を計算した。
【０２６０】
このライブラリーは、プライマー、ＧＡＣＣＧＧＡＣＧＴＧＴＴＴＴＧＣＣＣＴＴＣＡＴ（配列番号２０）及びＧＴＧＴＧＡＣＣＧＧＣＴＴＴＧＧＣＧＡＧＴＧ（配列番号２１）を用いて、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ宿主細胞中でｐｙｒ２遺伝子座の組み込みを強化するために、ｃｂｈ１プロモーターの上流約１．１ｋｂまでと、ａｍｄＳマーカーの下流約１．８５ｋｂまでに隣接するｃｂｈ２遺伝子を増幅して、得られたＰＣＲ産物として提供された。配列番号２０及び配列番号２１のプライマーを用いて、ｐＴＴＴｐｙｒＧ−ＣＢＨ２から増幅されたＰＣＲ断片（親のｃｂｈ１プロモーター、ｃｂｈ２遺伝子、及び／又は部分的ａｍｄＳ遺伝子）の核酸配列は実施例８において配列番号２２として定義されている。
【０２６１】
変異体を実施例８で説明したようにマイクロタイタープレート上で育成した、振とうフラスコの育成について、２５ｍｌのＹＥＧ培地（５ｇ／Ｌ酵母抽出物、２０ｇ／Ｌグルコース）をアガー上で胞子形成しているＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ株を接種して、２８℃、２００ｒｐｍで２日間インキュベートした。次いで、５ｍｌのＹＥＧ培地を２％のグルコース／ソホロース混合物を含む、振とうフラスコ中４５ｍｌのグリシン培地の接種に用いた。接種に次いで、培地を共鳴アコースティックインキュベーター（Ａｐｐｌｉｋｏｎ）中で２８℃で３日間インキュベートした。細胞を０．２μｍフィルターでろ過して除去した。上清を１０ｋＤａ分子量を除去するビバスピンスピンセルを用いて濃縮した。
【０２６２】
マイクロライタープレート上で育成したサンプルを実施例１で説明する様にＨＰＬＣによりＣＢＨ２生成レベルについて解析した。マイクロタイタープレートと振とうフラスコ育成サンプルの両方を所望の性質について試験した。表９−２は所望の複数の性質についてのＣＢＨ２変異体の性質を列挙する。
【表８０】
2012528598.tif 000112
【表８１】
2012528598.tif 000113
１Ｔｍ＝仮の融点（Ｔｍ）は熱安定性アッセイ２で決定された
２ＩＲ＝安定性についての性能指数は熱安定アッセイ２により決定された
【０２６３】
ＣＢＨ２熱安定性アッセイ３
ＣＢＨ２変異体の熱安定性を解析するために、４０μＬの上清を５０℃のＰＣＲ機器中でインキュベートした。試験は３回繰り返した。サンプルはインキュベーション後、３０、６０、及び１２０分後に取り出した。１０μｌの上清を残存活性を０．００２５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．０中１ｍｇ／ｍｌのセロトリオースを含む溶液５０μｌとインキュベートして残存活性を決定した。１時間後、４０μｌの１００ｍＭグリシン、ｐＨ１０、を添加した。３倍濃度のＡＢＴＳ試薬（上掲）の１５μＬを添加してＯＤ４２０での定職を３分間記録した。時間内の残存活性を指数関数元帥の式にあてはめた。
Ｙ＝Ａｏ＊ｅｘｐ（−ｋ＊ｔ）
式中、Ａｏはｔ＝０における活性、ｔは時間、ｋは減衰係数。性能指数（ＰＩ）は以下の式で計算した。
ＰＩ＝−ｌｏｇ（ｋｖａｒｉａｎｔ）／−ｌｏｇ（ｋｗｔ）
【図１−１】
2012528598.tif 000114
【図１−２】
2012528598.tif 000115
【図１−３】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
2012528598.tif 000119
【図５】
2012528598.tif 000120
【図６】
2012528598.tif 000121
【図７】
2012528598.tif 000122
【図８】
2012528598.tif 000123
【図９】
2012528598.tif 000124
【図１０】
2012528598.tif 000125
【図１１】
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【配列表】
2012528598000001.app
【国際調査報告】
2012528598.tif 000127
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