(57)【要約】本発明は、ＩＧＦ−Ｉをコードする遺伝子を含むウイルスベクターを使用することによる、肝硬変及び肝線維症の治療方法を提供する。本発明は、パルボウイルスベクター及びＳＶ４０系ベクターのいずれも、さらにそれらの肝硬変の治療及び遺伝子療法のための使用、並びに前記ウイルスベクターの調製方法を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＧＦ−Ｉ又はその機能的に同等の変異体をコードし、肝臓特異的プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含んでなる、ウイルスゲノム。
【請求項２】
パルボウイルスベクター又はポリオーマウイルスベクターである、請求項１に記載のウイルスゲノム。
【請求項３】
前記ポリオーマウイルスベクターが、ＳＶ４０系ベクターである、請求項２に記載のウイルスゲノム。
【請求項４】
前記パルボウイルスベクターが、ＡＡＶである、請求項２に記載のウイルスゲノム。
【請求項５】
前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５又はＡＡＶ８である、請求項４に記載のウイルスゲノム。
【請求項６】
前記ＡＡＶベクターが、一本鎖ＡＡＶである、請求項４又は５に記載のウイルスゲノム。
【請求項７】
前記ＡＡＶベクターが、二本鎖ＡＡＶである、請求項４又は５に記載のウイルスゲノム。
【請求項８】
前記肝臓特異的プロモーターが、アルブミン遺伝子エンハンサー領域と、アルファ１−アンチトリプシンプロモーターとを含んでなるものである、請求項１〜７のいずれか一項に記載のウイルスゲノム。
【請求項９】
ＩＧＦ−Ｉは、ヒトＩＧＦ−Ｉに対応するものである、請求項１〜８のいずれか一項に記載のウイルスゲノム。
【請求項１０】
適切なパッケージング細胞において請求項１〜９のいずれかに記載のウイルスゲノムを発現させることにより得ることができる、ビリオン。
【請求項１１】
医薬として使用される、請求項１０に記載のビリオン。
【請求項１２】
請求項１１で定義されているビリオンと、薬学的に許容しうる担体とを含んでなる、医薬組成物。
【請求項１３】
肝硬変又は肝線維症の治療及び／又は予防方法であって、請求項１０又は１１で定義したビリオンを、それを必要としている被検者に投与することを含んでなる、方法。
【請求項１４】
肝硬変又は肝線維症の治療及び／又は予防方法であって、ＩＧＦ−Ｉ又はその機能的に同等の変異体をコードする配列を含んでなる組み換えパルボウイルスを、それを必要としている被検者に投与することを含んでなる、方法。
【請求項１５】
前記組み換えパルボウイルスが、ＡＡＶである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＡＡＶが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５又はＡＡＶ８である、請求項１５に記載野方法。
【請求項１７】
前記ＡＡＶが、一本鎖ＡＡＶである、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＡＡＶが、二本鎖ＡＡＶである、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＡＡＶが、ａＡＡＶ８偽型ＡＡＶ１、ＡＡＶ５又はＡＡＶ８である、請求項１５〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
ＩＧＦ−Ｉをコードする前記配列が、肝臓特異的プロモーターに作動可能に連結しているものである、請求項１４〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記肝臓特異的プロモーターが、アルブミン遺伝子エンハンサー領域とアルファ１−アンチトリプシンプロモーターとを含んでなる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＩＧＦ−ＩがヒトＩＧＦ−Ｉである、請求項１４〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記ビリオン又は組み換えパルボウイルスを、動脈内投与する、請求項１３〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記動脈内投与を、肝動脈を介して実施する、請求項２３で定義されている方法。
【請求項２５】
組み換えＡＡＶビリオンの調製方法であって、
（ｉ）細胞と、
（ａ）ｉ．ＩＧＦ−Ｉ又はその機能的に同等の変異体をコードし、肝臓特異的プロモーターに作動可能に連結した配列を含んでなる発現カセットと、
ｉｉ．（ｉ）で定義されている発現カセットの側に位置しているＡＡＶ  ５’−ＩＴＲ  及び３’−ＩＴＲと、
を含んでなる第１核酸配列と、
（ｂ）ＡＡＶｒｅｐタンパク質をコードする第２核酸配列と、
（ｃ）ＡＡＶｃａｐタンパク質をコードする第３核酸配列と、そして任意に
（ｄ）ＡＡＶが複製用に従属するウイルス性及び／又は細胞機能をコードする第４核酸配列とを、
前記細胞に前記三成分が侵入するのに適した条件下で接触させる工程と、
（ｉｉ）前記細胞から前記組み換えＡＡＶビリオンを回収する工程と
を含んでなる、方法。
【請求項２６】
前記工程（ｉ）において使用される細胞が昆虫細胞であり、前記第１核酸配列、第２核酸配列及び第３核酸配列がバキュロウイルスベクターに含まれるものである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記組み換えＡＡＶビリオンが、一本鎖ＡＡＶビリオンである、請求項２５又は２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記組み換えＡＡＶビリオンが、二本鎖ＡＡＶビリオンである、請求項２５又は２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記発現カセット（ａ）が、ＩＧＦ−Ｉ又はその機能的同等物をコードする配列の下流に位置してポリアデニル化信号を含んでなるものである、請求項２５〜２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
成分（ｂ）がＡＡＶ２ｒｅｐ遺伝子をコードする遺伝子を含んでなり、及び/又は成分（ｃ）がＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５若しくはＡＡＶ８ｃａｐ遺伝子を含んでなるものである、請求項２５〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
前記肝臓特異的プロモーターが、前記アルブミン遺伝子エンハンサー領域と前記アルファ１−アンチトリプシンプロモーターとを含んでなる、請求項２５〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
組み換えＳＶ４０ビリオンの調製方法であって、
（ｉ）細胞と、複製欠損ＳＶ４０ゲノムを含んでなるポリヌクレオチドとを接触させる工程であって、前記ゲノムがＩＧＦ−Ｉ又はその機能的に同等の変異体をコードし、肝臓特異的プロモーターに作動可能に連結した配列を含んでなる発現カセットを含んでなるものであり、前記細胞が前記ポリヌクレオチドにおける複製欠損を補完するＳＶ４０遺伝子を発現するものであり、前記接触に、前記ポリヌクレオチドが侵入するのに適した条件下で接触させる工程と、
（ｉｉ）前記組み換えＳＶ４０ビリオンを前記細胞から回収する工程と
を含んでなる方法。
【請求項３３】
前記複製欠損ＳＶ４０ゲノムがラージＴ抗原をコードする前記配列を欠いているものであり、前記パッケージング細胞が前記ラージＴ抗原を発現するものである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記肝臓特異的プロモーターが、前記アルブミン遺伝子エンハンサー領域と、前記アルファ１−アンチトリプシンプロモーターとを含んでなるものである、請求項３２又は３３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子療法の分野に関し、より詳細には、ウイルスベクターを使用することによる肝硬変及び肝線維症の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝移植は、進行性肝硬変を患った患者にとって唯一の治療の選択肢である。この方法は、外科的禁忌と臓器不足があることから、少数の患者にしか適用できない。実際に、米国における待ちリストは約１２５００人の患者であり、移植に要する平均日数が約３００日であり、４５％を超える患者の待ち時間が２年を超え、死亡率が１年における１０００人の患者あたり１３０人である（Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｒ．Ｂ．ら、Ａｍ  Ｊ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２００８；８：９５８−９７６）。
【０００３】
インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）は、有力な細胞保護的及びタンパク同化ホルモンである。血清ＩＧＦ−Ｉは、ほとんど肝臓由来であり、ＩＧＦ−Ｉ生物活性を調節する一連の結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）に結合して循環する（Ａｄａｍｏ  Ｍ、ら、１９８９、  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１２４：２７３７−２７４４及びＭｏｈａｎ  Ｓら、２００２、Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、１７５：１９−３１）。ＩＧＦＢＰの分解が遊離ＩＧＦ−Ｉを放出し、これは相互作用し、ＩＧＦ−Ｉ受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）を活性化することができる。また、ＩＧＦ−Ｉはインスリン受容体に結合し、インスリンはＩＧＦ−ＩＲを活性化することができるが、それらの同族受容体に対する親和性は１００〜１０００倍高い（Ｎｉｔｅｒｔ  ＭＤら、２００５、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２２９：３１−３７）。ＩＧＦ−ＩＲとの相互作用により、ＭＡＰキナーゼ及びＰＩ３キナーゼカスケード（細胞の生存、成長及び分化を調節する）が活性化される（Ｒｉｅｄｅｍａｎｎ  Ｊ．ら、２００６、Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｌａｔ．、Ｃａｎｃｅｒ．１３  Ｓｕｐｐｌ  １：Ｓ３３−４３）。
【０００４】
肝硬変にあっては、肝細胞の機能不全の結果、ＩＧＦ−Ｉレベルが著しく減少する。このホルモン欠乏が、肝硬変に生じる全身性代謝異常に関与することがある（Ｃｏｎｃｈｉｌｌｏ  Ｍ．ら、２００５；  ４３：６３０−６３６及びＬｏｒｅｎｚｏ−Ｚｕｎｉｇａ  Ｖ．ら、２００６、Ｇｕｔ  ５５：１３０６−１３１２）。実際、組み換えＩＧＦ−Ｉ（ｒＩＧＦ−Ｉ）で肝硬変ラットを治療すると、体重増加、窒素保持及び栄養素の腸内吸収が促進される（Ｃａｓｔｉｌｌａ−Ｃｏｒｔａｚａｒ  Ｉ．ら、２０００、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、３１：５９２−６００）。さらに、ｒＩＧＦ−Ｉは、肝硬変ラットにおいて肝臓保護活性を示すことが明らにされた（Ｃａｓｔｉｌｌａ−Ｃｏｒｔａｚａｒ  Ｉ．  ら、１９９７、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、１１３：１６８２−１６９１及びＭｕｇｕｅｒｚａ  Ｂら、２００１、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１５３６：１８５−１９５）。また、肝硬変の患者で体重１ｋｇ当たり１００μｇの投与量でｒＩＧＦ−Ｉを毎日投与する最近のパイロット臨床試験では、血清アルブミンが顕著に増加するとともに、Ｃｈｉｌｄ−Ｐｕｇｈスコアの改善がみられた（Ｃｏｎｃｈｉｌｌｏ  Ｍ．ら、２００５、Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．４３：６３０−６３６）。しかしながら、多量のｒＩＧＦ−Ｉを必要とするので、肝硬変におけるＩＧＦ−Ｉ療法の潜在的利益が、治療にかかる高コストにより相殺される。
【０００５】
ＩＧＦ−Ｉの直接投与の別法として、ＩＧＦ−Ｉをコードするポリヌクレオチドを含んでなるウイルスベクターを使用することが提案された。Ｖｅｒａ  Ｍ．ら（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、２００７、１４：２０３−２１０）は、健常なラットに、ＩＧＦ−Ｉをコードする組み換えＳｉｍｉａｎ  Ｖｉｒｕｓ４０ベクターを注射すると、ＣＣｌ４誘発肝臓障害から肝臓を守ることができることを述べている。Ｓｏｂｒｅｖａｌｓら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｖｏｌｕｍｅ  １６、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １、２００８年５月、Ｓ１４５）は、ＩＧＦ−Ｉをコードする組み換えＳｉｍｉａｎ  Ｖｉｒｕｓ４０ベクターを投与すると、ＣＣｌ４誘発肝硬変の影響を部分的に消すことがあることを述べている。しかしながら、ウイルスベクターに関する全ての結果が良い結果というわけではない。例えば、Ｚａｒａｉｔｅｇｕｉら、（Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２００２、５８：１６９−１７６）は、ＣＣｌ４誘発肝硬変を患っているラットにＩＧＦ−Ｉをコードするアデノ関連性ウイルスを筋肉内投与したところ、肝臓障害は顕著には改善されなかったことを述べている。
【０００６】
したがって、当該技術分野において、肝硬変の治療に有用なＩＧＦ−Ｉの送達を改善する必要性がある。
【発明の概要】
【０００７】
第一の態様によれば、本発明は、ＩＧＦ−Ｉ又はその機能的に同等の変異体をコードし、肝臓特異的プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含んでなる、ウイルスゲノムに関する。
【０００８】
第二の態様によれば、本発明は、好適なパッケージング細胞で、本発明によるウイルスゲノムを発現することにより得ることができるビリオンに関する。
【０００９】
別の態様によれば、本発明は、薬剤として使用される本発明によるビリオンに関する。更なる態様によれば、本発明は、請求項９で定義されているビリオンと薬学的に許容しうる担体とを含んでなる医薬組成物、及び肝硬変又は肝線維症の治療及び／又は予防方法であって、請求項８又は９で定義したビリオンを、それを必要としている被検者に投与することを含んでなる方法に関する。
【００１０】
別の態様によれば、本発明は、肝硬変又は肝線維症の治療及び／又は予防方法であって、ＩＧＦ−Ｉ又はその機能的に同等の変異体をコードする配列を含んでなる組み換えパルボウイルスを、それを必要としている被検者に投与することを含んでなる方法に関する。
【００１１】
別の態様によれば、本発明は、組み換えＡＡＶビリオンの調製方法であって、
（ｉ）細胞と、
（ａ）ｉ．ＩＧＦ−Ｉ又はその機能的に同等の変異体をコードし、肝臓特異的プロモーターに作動可能に連結した配列を含んでなる発現カセットと、
ｉｉ．（ｉ）で定義されている発現カセットの側に位置しているＡＡＶ  ５’−ＩＴＲ  及び３’−ＩＴＲと、
を含んでなる第１核酸配列と、
（ｂ）ＡＡＶｒｅｐタンパク質をコードする第２核酸配列と、
（ｃ）ＡＡＶｃａｐタンパク質をコードする第３核酸配列と、そして任意の
（ｄ）ＡＡＶが複製用に従属するウイルス性及び／又は細胞機能をコードする第４核酸配列とを、
前記細胞に前記三成分が侵入するのに適した条件下で接触させる工程と、
（ｉｉ）前記細胞から前記組み換えＡＡＶビリオンを回収する工程と
を含んでなる方法に関する。
【００１２】
別の態様によれば、本発明は、組み換えＳＶ４０ビリオンの調製方法であって、
（ｉ）細胞と、複製欠損ＳＶ４０ゲノムを含んでなるポリヌクレオチドとを接触させる工程であって、前記ゲノムが、ＩＧＦ−Ｉ又はその機能的に同等の変異体をコードし、肝臓特異的プロモーターに作動可能に連結された配列を含んでなる発現カセットを含んでなるものであり、前記細胞が、前記ポリヌクレオチドにおける複製欠損を補完するＳＶ４０遺伝子を発現するものであり、前記細胞と前記ポリヌクレオチドとの接触が、前記ポリヌクレオチドが前記細胞に侵入するのに適した条件下で行われる工程と、
（ｉｉ）前記組み換えＳＶ４０ビリオンを前記細胞から回収する工程と
を含んでなる方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１ＡＢ】確立された肝硬変モデルの分析。Ａ．このモデルの分析のために実施された実験の略図。Ｂ．トランスアミナーゼの分析。トランスアミナーゼ（ＡＳＴ、ＡＬＴ及びＡＬＰ）を、示された時間に、健常なラット又は肝硬変の対照動物から得た血清で評価した。
【図１ＣＤ】確立された肝硬変モデルの分析。肝線維症の評価。細胞外沈着を、Ｓｉｒｉｕｓ  Ｒｅｄ（Ｃ）で染色し、示された時間に、画像分析（Ｄ）により定量化した。
【図２】肝硬変におけるｄｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉの影響を評価するためにおこなった実験の略図。肝硬変を８週間誘発し、動物を犠牲死し、血液試料を、ベクターを投与してから４日後、２週間後、８週間後、１６週間後及び１年後に評価した。
【図３ＡＢ】ＩＧＦ−Ｉ処置した肝臓及び対照におけるＩＧＦ−Ｉ発現の分析。ＩＧＦ−Ｉ  ｍＲＮＡ（Ａ）及びタンパク質（Ｂ及びＣ）を、健常又は肝硬変対照動物（Ｃｉ）からか又はｄｓＡＡＶＬｕｃ（Ｃｉ＋Ｌｕｃ）若しくはｄｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉ（Ｃｉ＋ＩＧＦ−Ｉ）で、示されている時間、処置した動物から得た肝臓（Ａ及びＢ）又は血清（Ｃ）由来のｑＲＴ−ＰＣＲ（Ａ）又はＥＬＩＳＡ（Ｂ及びＣ）により定量化した。また、ＩＧＦＩ−ＢＰ３  ｍＲＮＡ（Ｄ）も、上記ＩＧＦ−Ｉに関する動物群から得た肝臓由来のＲＴ−ＰＣＲにより定量化した。
【図３ＣＤ】図３ＡＢにて説明。
【図４Ａ】ＩＧＦ−Ｉで処置したラット及び対照からの血清パラメータの分析。トランスアミナーゼ（ＡＳＴ、ＡＬＴ及びＡＬＰ）（Ａ）、ビリルビン（Ｂ）及びアルブミン  （Ｃ）を、健常ラット、肝硬変の対照動物（Ｃｉ）からか、又はｄｓＡＡＶＬｕｃ  （Ｃｉ＋Ｌｕｃ）若しくはｄｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉ（Ｃｉ＋ＩＧＦ−Ｉ）で、示された時間、処置した肝硬変の動物から得た血清で評価した。
【図４ＢＣ】図４Ａにて説明
【図５ＡＢ】ＩＧＦ−Ｉ処置ラット及び対照における肝線維症の評価。細胞外沈着を、Ｓｉｒｉｕｓ  Ｒｅｄ（Ａ）で染色し、画像解析（Ｂ）により定量化した。コラーゲンＩ（Ｃ）及びＩＶ（Ｄ）ｍＲＮＡを、ｑＲＴ−ＰＣＲにより定量化した。全ての試料を、健常なラット、対照肝硬変動物（Ｃｉ）から得るか、又はｄｓＡＡＶＬｕｃ  （Ｃｉ＋Ｌｕｃ）若しくはｄｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉ（Ｃｉ＋ＩＧＦ−Ｉ）で示された時間処置した肝硬変動物から得た。
【図５ＣＤ】図５ＡＢにて説明。
【図６ＡＢ】ＩＧＦ−Ｉ処置肝臓及び対照でのＭＭＰ及びＭＭＰ活性の発現の分析。ＭＭＰ活性を蛍光発生基質（Ａ）で測定し、ＭＭＰ２（Ｂ）及びＭＭＰ９（Ｃ）タンパク質をＥＬＩＳＡにより定量化し、ＭＭＰ１（Ｄ）、２（Ｅ）、９（Ｆ）、１４（Ｇ）  ｍＲＮＡ及びＴＩＭＰ２（Ｈ）を、健常肝臓由来ｑＲＴ−ＰＣＲ、対照動物（Ｃｉ）から得た肝硬変肝臓由来ｑＲＴ−ＰＣＲ、ｄｓＡＡＶＬｕｃ（Ｃｉ＋Ｌｕｃ）若しくはｄｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉ（Ｃｉ＋ＩＧＦ−Ｉ）で、示された時間処置した動物から得た肝臓由来ｑＲＴ−ＰＣＲにより定量化した。
【図６ＣＤ】図６ＡＢにて説明。
【図６ＥＦ】図６ＡＢにて説明。
【図６ＧＨ】図６ＡＢにて説明。
【図７ＡＢ】ＩＧＦ−Ｉ処置動物及び対照におけるプロフィブロジェニック因子ＴＮＦα及びＩＬ６の分析。αＳＭＡタンパク質（Ａ）及びｍＲＮＡ（Ｂ）を、健常肝臓、対照動物からの肝硬変肝臓（Ｃｉ）、又はｄｓＡＡＶＬｕｃ（Ｃｉ＋Ｌｕｃ）若しくはｄｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉ（Ｃｉ＋ＩＧＦ−Ｉ）で、示された時間、処理した動物から、免疫組織化学（Ａ）により検出するか、又はｑＲＴ−ＰＣＲ（Ｂ）により定量化した。これらの動物において、ＴＧＦβ  ｍＲＮＡ（Ｃ）及びタンパク質（Ｄ及びＥ）も、肝臓（Ｃ及びＤ）又は血液（Ｅ）で分析し、肝臓ＣＴＧＦ（Ｆ）、ＰＤＧＦ（Ｇ）、ＶＥＧＦ（Ｈ）、アンフィレグリン（ＡＲ、Ｉ）、ＴＮＦα（Ｊ）及びＩＬ６（Ｋ）ｍＲＮＡをｑＲＴ−ＰＣＲにより定量化した。
【図７ＣＤ】図７ＡＢにて説明。
【図７ＥＦ】図７ＡＢにて説明。
【図７ＧＨ】図７ＡＢにて説明。
【図７Ｉ】図７ＡＢにて説明。
【図７ＪＫ】図７ＡＢにて説明。
【図８ＡＢ】ＩＧＦ−Ｉ処置動物及び対照におけるＨＧＦ、ＨＮＦ４α及びＷＴの分析。ＨＧＦ（Ａ）、ＨＮＦ４α（Ｂ）及びＷＴ−１  ｍＲＮＡ（Ｃ）を、健常肝臓、対照動物からの肝硬変肝臓（Ｃｉ）又はｄｓＡＡＶＬｕｃ（Ｃｉ＋Ｌｕｃ）若しくはｄｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉ（Ｃｉ＋ＩＧＦ−Ｉ）で、示された時間、処置した動物からｑＲＴ−ＰＣＲにより定量化した。
【図８Ｃ】図８ＡＢにて説明。
【図９】ＩＧＦ−Ｉ処置動物及び対照における増殖の分析。Ｋｉ６７染色を、組織学的試料（Ａ）から定量化し、ＰＣＮＡ  ｍＲＮＡを、健常肝臓、対照動物（Ｃｉ）からの肝硬変肝臓、又はｄｓＡＡＶＬｕｃ（Ｃｉ＋Ｌｕｃ）若しくはｄｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉ（Ｃｉ＋ＩＧＦ−Ｉ）で、示された時間、処置した動物からの肝硬変肝臓から、ｑＲＴ−ＰＣＲにより定量化した。
【図１０ＡＢ】ＳＶＩＧＦ−Ｉ、ｄｓＡＡＶ−ＩＧＦ−Ｉで処置したラット及び対照における肝線維症の評価。細胞外沈着を、Ｓｉｒｉｕｓ  Ｒｅｄで染色し、画像解析（Ａ及びＢ）により定量化した。ＣｏｌｌａｇｅｎＩ（Ｃ）及びＩＶ（Ｄ）ｍＲＮＡを、ｑＲＴ−ＰＣＲにより定量化した。全ての試料は、健常なラット、対照肝硬変動物（Ｃｉ）、又はｄｓＡＡＶＬｕｃ（Ｃｉ＋ＡＡＶＬｕｃ）、ｄｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉ（Ｃｉ＋ＡＡＶＩＧＦ−Ｉ）、ＳＶＬｕｃ（Ｃｉ＋ＳＶＬｕｃ）若しくはＳＶＩＧＦ−Ｉ（Ｃｉ＋ＳＶＩＧＦ−Ｉ）で、示された時間、処置した肝硬変動物から得た。
【図１０ＣＤ】図１０ＡＢにて説明。
【図１１】ＳＶＩＧＦ−Ｉ、ｄｓＡＡＶ−ＩＧＦ−Ｉ及び対照で処置したラットにおけるＩＧＦ−Ｉ発現の分析。合計（Ａ）及び遊離（Ｂ）ＩＧＦ−Ｉタンパク質及びｍＲＮＡ（Ｃ）を、健常なラット、対照肝硬変動物（Ｃｉ）又はｄｓＡＡＶＬｕｃ（Ｃｉ＋ＡＡＶＬｕｃ）、ＳＶＩＧＦ−Ｉ（Ｃｉ＋ＳＶＩＧＦ−Ｉ）若しくはｄｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉ（Ｃｉ＋ＡＡＶＩＧＦ−Ｉ）で、示された時間、処置した肝硬変動物からの肝臓から、Ｅｌｉｓａ（Ａ及びＢ）又はｑＲＴ−ＰＣＲ（Ｃ）により定量化した。
【図１２】ＳＶＩＧＦ−Ｉ、ＡＡＶ−ＩＧＦ−Ｉ及び対照で処置したラットにおける活性化ＨＳＣの分析。αＳＭＡタンパク質（Ａ）及びｍＲＮＡ（Ｂ）を、健常なラット、対照肝硬変動物（Ｃｉ）、又はｄｓＡＡＶＬｕｃ（Ｃｉ＋ＡＡＶＬｕｃ）、ＳＶＩＧＦ−Ｉ（Ｃｉ＋ＳＶＩＧＦ−Ｉ）若しくはｄｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉ（Ｃｉ＋ＡＡＶＩＧＦ−Ｉ）で４日間（Ａ及びＢ）又は８週間（Ｂ）処置した肝硬変動物からの肝臓から、免疫組織化学（Ａ）で検出するか、ｑＲＴ−ＰＣＲ（Ｂ）により定量化した。
【図１３Ａ−Ｃ】ＳＶＩＧＦ−Ｉ、ｄｓＡＡＶ−ＩＧＦ−Ｉ及び対照で処置したラットにおけるＴＧＦβ、ＣＴＧＦ及びＶＥＧＦの分析。ＴＧＦβ  ｍＲＮＡ（Ａ）及びタンパク質（Ｂ及びＣ）を、健常なラット、対照肝硬変動物（Ｃｉ）、又はｄｓＡＡＶＬｕｃ  （Ｃｉ＋ＡＡＶＬｕｃ）、ＳＶＩＧＦ−Ｉ（Ｃｉ＋ＳＶＩＧＦ−Ｉ）若しくはｄｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉ（Ｃｉ＋ＡＡＶＩＧＦ−Ｉ）で４日間又は８週間処置した肝硬変動物から得た肝臓（Ａ及びＢ）又は血清（Ｃ）から、ｑＲＴ−ＰＣＲ（Ａ）又はＥＬＩＳＡ（Ｂ及びＣ）により定量化した。
【図１３ＤＥ】図１３Ａ−Ｃにて説明。
【図１４】ＳＶＩＧＦ−Ｉ、ｄｓＡＡＶ−ＩＧＦ−Ｉ及び対照で処置したラットにおけるＨＧＦ及びＨＮＦ４αの分析。ＨＧＦ（Ａ）及びＨＮＦ４α（Ｂ）ｍＲＮＡを、健常なラット、対照肝硬変動物（Ｃｉ）又はｄｓＡＡＶＬｕｃ（Ｃｉ＋ＡＡＶＬｕｃ）、ＳＶＩＧＦ−Ｉ（Ｃｉ＋ＳＶＩＧＦ−Ｉ）若しくはｄｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉ（Ｃｉ＋ＡＡＶＩＧＦ−Ｉ）で４日間又は８週間処置した肝硬変動物から単離した肝臓から、ｑＲＴ−ＰＣＲにより定量化した。
【図１５ＡＢ】ＩＧＦ−Ｉ発現及び活性の分析。Ａ：処置してから４日又は８週間後の肝臓抽出物におけるＩＧＦ−Ｉ  ｍＲＮＡ発現レベル。Ｂ：ベクター投与（４．８ｘ１０１０  ｖｐ／ラットの低用量）してから１６週間後の肝臓抽出物におるけるＩＧＦ−Ｉ  ｍＲＮＡ発現レベル。Ｃ：肝臓抽出物におけるＩＧＦ−Ｉタンパク質レベル。Ｄ及びＥ：処置してから４日後に定量化した総血清ＩＧＦ−Ｉ（Ｄ）及び遊離血清ＩＧＦ−Ｉ（Ｅ）レベル；ｓｓＡＡＶＬｕｃの場合、表されているＩＧＦ−Ｉレベルは、高用量１．２ｘ１０１２ｖｐ／ラット及び極低用量９．７ｘ１０９ｖｐ／ラットに相当する。Ｆ：処置してから４日又は８週間後の肝臓抽出物におけるＩＧＦ−ＩＢＰ３  ｍＲＮＡ発現レベル。Ｇ：ベクター投与（低用量４．８ｘ１０１０  ｖｐ／ラット）してから１６週間後の肝臓抽出物におけるＩＧＦ−ＩＢＰ３  ｍＲＮＡ発現レベル。Ｈ：肝臓抽出物におけるＩＧＦ−Ｉ受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）ｍＲＮＡ発現レベル。全てのｍＲＮＡ発現レベルを、ｑＲＴ−ＰＣＲにより定量化し、ＩＧＦ−Ｉタンパク質レベルをＥＬＩＳＡにより定量化した。三角形は、減少順の投与量を示す。
【図１５Ｃ】図１５ＡＢにて説明。
【図１５ＤＥ】図１５ＡＢにて説明。
【図１５ＦＧ】図１５ＡＢにて説明。
【図１５Ｈ】図１５ＡＢにて説明。
【図１６ＡＢ】血清トランスアミラーゼの分析。ベクターを投与してから４日（Ａ）、８週間（Ｂ）、１２週間（Ｃ）及び１年（Ｄ）後の血清の定量化されたトランスアミラーゼレベル（ＡＳＴ，  ＡＬＴ及びＡＬＰ）。１２週間後について、表されているレベルは、低用量ベクター（４．８ｘ１０１０vp/ラット）に相当する。１年後については、表されたレベルは、高用量ベクター（１．２ｘ１０１２vp/ラット）に相当する。三角形は、減少順の用量を示す。
【図１６ＣＤ】図１６ＡＢにて説明。
【図１７ＡＢ】血清ビリルビンの分析。ベクターを投与してから４日（Ａ）、８週間（Ｂ）、１２週間（Ｃ）及び１年（Ｄ）後の血清の定量化されたビリルビンレベル。１２週間後について、表されているレベルは、低用量ベクター（４．８ｘ１０１０vp/ラット）に相当する。１年後については、表されたレベルは、高用量ベクター（１．２ｘ１０１２vp/ラット）に相当する。三角形は、減少順の用量を示す。
【図１７ＣＤ】図１７ＡＢにて説明。
【図１８ＡＢ】血清アルブミンの分析。ベクターを投与してから４日（Ａ）、８週間（Ｂ）、１２週間（Ｃ）及び１年（Ｄ）後の血清の定量化されたアルブミンレベル。１２週間後について、表されているレベルは、低用量ベクター（４．８ｘ１０１０vp/ラット）に相当する。１年後については、表されたレベルは、高用量ベクター（１．２ｘ１０１２vp/ラット）に相当する。三角形は、減少順の用量を示す。
【図１８ＣＤ】図１８ＡＢにて説明。
【図１９ＡＢ】肝線維症の評価。肝線維症は、Ｓｉｕｓ  Ｒｅｄ（Ａ及びＣ）で染色した組織試料における細胞外沈着の画像解析定量化；及びｑＲＴ−ＰＣＲによる肝臓組織のコラーゲンＩ（Ｂ及びＤ）及びＩＶ（Ｃ及びＦ）ｍＲＮＡ発現レベルの定量化により評価した。表されたデータは、処置してから８週間後に採取した試料（Ａ〜Ｃ）及び処置してから１６週間後に採取した試料（Ｄ〜Ｆ）に相当する。後者については、表されたデータは、低用量ｓｓＡＡＶＬｕｃ及びｓｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉに相当する。三角形は、減少順の用量を示す。
【図１９ＣＤ】図１９ＡＢにて説明。
【図１９ＥＦ】図１９ＡＢにて説明。
【図２０ＡＢ】ＭＭＰ及びＭＭＰインヒビターの分析。肝臓抽出物試料を、処置後８週間後（Ａ〜Ｈ）又は１６週間後（Ｉ〜Ｍ）に得た。Ｅ及びＦ関して、ｓｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉについて表されたデータは、高用量及び極低用量に相当する。後者の場合、表されたデータは、低用量（４．８ｘ１０１０vp/ラット）のｓｓＡＡＶＬｕｃ及びｓｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉに相当する。ＭＭＰ１（Ａ、Ｉ）、ＭＭＰ２（Ｂ、Ｊ）、ＭＭＰ９（Ｃ、Ｋ）、ＭＭＰ１４（Ｄ、Ｌ）及びＴＩＭＰ−２（Ｅ、Ｍ）についてのｍＲＮＡ発現を、ｑＲＴ−ＰＣＲにより定量化した。ＭＭＰ２（Ｆ）及びＭＭＰ９（Ｇ）タンパク質レベルを、ＥＬＩＳＡにより定量化した。総ＭＭＰ活性も、評価した（Ｈ）。三角形は、減少順の用量を示す。
【図２０ＣＤ】図２０ＡＢにて説明。
【図２０ＥＦ】図２０ＡＢにて説明。
【図２０ＧＨ】図２０ＡＢにて説明。
【図２０ＩＪ】図２０ＡＢにて説明。
【図２０ＫＬ】図２０ＡＢにて説明。
【図２０Ｍ】図２０ＡＢにて説明。
【図２１Ａ】肝星細胞（ＨＳＣ）の分析。αＳＭＡ発現を、処置してから８週間（Ａ〜Ｂ）又は１６週間（Ｃ）後に得た肝臓試料で分析した。後者の場合、表されたデータは、低用量ｓｓＡＡＶＬｕｃ及びｓｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉに相当する。Ａ：αＳＭＡ特異的免疫組織化学による肝組織におけるαＳＭＡの局在化。Ｂ及びＣ：ｑＲＴ−ＰＣＲにより定量化されたαＳＭＡ  ｍＲＮＡ発現。三角形は、減少順の用量を示す。
【図２１ＢＣ】図２１Ａにて説明。
【図２２ＡＢ】炎症及びプロフィブロジェニック因子の分析。肝臓抽出物試料は、処置してから８週間（Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｋ及びＭ）又は１６週間（Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｉ、Ｊ、Ｌ及びＮ）後に得た。後者の場合、表されたデータは、低用量ｓｓＡＡＶＬｕｃ及びｓｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉに相当する。ＴＧＦβ、ＴＮＦα、ＩＬ−６、ＣＴＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ及びアンフィレギュリン（ＡＲ）ｍＲＮＡ発現を、ｑＲＴ−ＰＣＲにより定量化した。三角形は、減少順の用量を示す。
【図２２ＣＤ】図２２ＡＢにて説明。
【図２２ＥＦ】図２２ＡＢにて説明。
【図２２ＧＨ】図２２ＡＢにて説明。
【図２２ＩＪ】図２２ＡＢにて説明。
【図２２ＫＬ】図２２ＡＢにて説明。
【図２２ＭＮ】図２２ＡＢにて説明。
【図２３ＡＢ】肝細胞成長因子ＨＧＦの分析。肝臓抽出物試料を、処置してから４日（Ａ〜Ｂ）、８週間（Ｃ〜Ｄ）又は１６週間（Ｅ）後に得た。Ａ及びＢについて、ｓｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉについての表されたデータは、高用量及び極低用量に相当する。後者の場合、表されたデータは、低用量ｓｓＡＡＶＬｕｃ及びｓｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉに相当する。ＨＧＦ  ｍＲＮＡ発現を、ｑＲＴ−ＰＣＲ（Ａ、Ｃ及びＥ）により定量化した；ＨＧＦタンパク質レベルを、ＥＬＩＳＡ（Ｂ及びＤ）により定量化した。三角形は、減少順の用量を示す。
【図２３ＣＤ】図２３ＡＢにて説明。
【図２３Ｅ】図２３ＡＢにて説明。
【図２４ＡＢ】分化因子の分析。肝臓抽出物試料を、処置してから４日（Ａ）、８週間（Ｂ、Ｄ）又は１６週間（Ｃ、Ｅ）後に得た。４日後に関して、ｓｓＡＡＶＬｕｃについての表された用量は、極低用量に相当する。１６週間後に関して、表されたデータは、低用量のｓｓＡＡＶＬｕｃ及びｓｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉに相当する。成熟因子ＨＮＦ４a(Ａ、Ｂ及びＣ)及び分化因子ＷＴ−１(Ｄ及びＥ)ｍＲＮＡ発現レベルを、ｑＲＴ−ＰＣＲにより定量化した。三角形は、減少順の用量を示す。
【図２４Ｃ】図２４ＡＢにて説明。
【図２４ＤＥ】図２４ＡＢにて説明。
【図２５ＡＢ】増殖の分析。Ａ：処置してから４日後に得た肝組織試料におけるＫｉ６７染色核の定量化。Ｂ、Ｃ及びＤ：処置してから４日（Ｂ）、８週間（Ｃ）又は１６週間（Ｄ）後に得られる肝臓抽出物試料におけるｑＲＴ−ＰＣＲにより定量化された増殖因子ＰＣＮＡ  ｍＲＮＡ発現レベル。４日後に関して、ｓｓＡＡＶＬｕｃについての表された用量は、極低用量に相当する。１６週間後に関して、表されたデータは、低用量のｓｓＡＡＶＬｕｃ及びｓｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉに相当する。三角形は、減少順の用量を示す。
【図２５ＣＤ】図２５ＡＢにて説明。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明者らは、肝硬変を患ったラットに、ＩＧＦ−Ｉをコードするウイルスベクター（ここで、このＩＧＦ−Ｉをコードするポリヌクレオチドが肝臓特異的プロモーターの制御下にある）を投与すると、フィブロリシスの刺激、プロフィブロジェニック因子の下方制御及び細胞保護的分子の誘発により特徴付けられる健全な組織修復プログラムが活性化されることを見出した。これらの変化は、肝臓構造及び肝細胞機能の著しい改善と関連している。これらの知見は、硬変した肝臓にＡＡＶベクターによりＩＧＦ−Ｉ遺伝子導入することが、肝臓移植ができない進行性肝硬変を患った患者や、移植の待ちリストで順番がこない患者のための治療の選択肢となる可能性があることを示唆している。
【００１５】
ウイルスゲノム
本発明者らは、ＩＧＦ−Ｉを、これをコードする配列が肝臓特異的プロモーターの制御下にあるウイルスベクターを用いて、硬変した肝臓に導入すると、肝機能の改善及び肝線維症の減少を生じることを見出した（本発明の実施例３及び１０参照）。したがって、第一の態様によれば、本発明は、ＩＧＦ−Ｉ又はその機能的に同等の変異体をコードし、肝臓特異的プロモーターに作動可能に連結したヌクレオチド配列を含んでなるウイルスゲノムに関する。
【００１６】
本明細書において用いられている用語「ウイルスゲノム」は、一またはそれ以上の異種のヌクレオチド配列を含んでなる、組み換えウイルスゲノム（すなわち、ウイルスＤＮＡ）に関する。全ての他の構造及び非構造コード配列は、プラスミドなどのベクターによりあるいは配列をパッケージング細胞株に安定的に一体化することによってそれらをトランスに提供することができることから、ウイルスベクターに存在しないことが好ましい。ベクターは、試験管内、生体内又は生体外でＤＮＡを細胞に導入する目的で利用され得るものである。本発明で使用するのに適しているウイルスゲノムには、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、例えば、ポクスウイルス系ベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ポリオーマウイルスベクター、アルファウイルスベクター、ラブドウイルスベクター、ピコルナウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、例えば、ＥＢＶベクター、例えば、レンチウイルスベクター、ＭＭＬＶ系ベクターなどが挙げられるが、これらには限定されない。
【００１７】
用語「ヌクレオチド配列」は、本明細書において「ポリヌクレオチド」と同義的に使用され、いずれかの長さで、リボヌクレオチド及び／又はデオキシリボヌクレオチドからなる高分子型ヌクレオチドに関する。この用語には、一本鎖ポリヌクレオチド及び二本鎖ポリヌクレオチドの両方、並びに改変ポリヌクレオチド（メチル化、保護など）などが含まれる。
【００１８】
本明細書において用いられている用語「ＩＧＦ−Ｉ」は、用語「インスリン様成長因子Ｉ」及びソマトメジンＣと同義的に使用され、インスリンとアミノ酸相同性がほぼ５０％であるインスリン様効果及びインスリン様構造を示すポリペプチド群に関する。さらに、三次元モデリングによって、ＩＧＦの構造が、３つのジスルフィド架橋により架橋され、Ｂ鎖様アミノ末端部（Ｂドメイン）、接続ペプチド（Ｃドメイン）及びＡ鎖様部（Ａドメイン）からなる一本鎖ペプチドであるプロインスリンに類似していることが明らかにされた。さらに、プロインスリンには見られないカルボキシル末端延長が存在する（Ｄドメイン）。ＩＧＦ−Ｉポリペプチドは、さらにＥドメインと呼ばれるプロインスリンには見られない別のカルボキシル末端延長を含んでなる。
【００１９】
本発明に有用な好適なＩＧＦ−Ｉ分子には、以下に挙げるものなどが挙げられるが、これらには限定されない。
−プレプロＩＧＦ−Ｉ、プロＩＧＦ−Ｉ又は成熟ＩＧＦ−Ｉのヒトイソ型１にそれぞれ対応する、ＮＣＢＩに登録番号ＮＰ＿００１１０４７５３（配列番号１）のもと記述されているポリペプチドのアミノ酸１−１５８、４９−１５８又は４９−１１６。
−プレプロＩＧＦ−Ｉ、プロＩＧＦ−Ｉ又は成熟ＩＧＦ−Ｉのヒトイソ型２にそれぞれ対応する、ＮＣＢＩに登録番号ＮＰ＿００１１０４７５４（配列番号２）のもと記述されているポリペプチドのアミノ酸１−１３７、３３−１３７又は３３−１０２。
−ヒトプレプロＩＧＦ−Ｉ、プロＩＧＦ−Ｉ又は成熟ＩＧＦ−Ｉのヒトイソ型３にそれぞれ対応する、ＮＣＢＩに登録番号ＮＰ＿００１１０４７５５（配列番号３）のもと記述されているポリペプチドのアミノ酸１−１９５、４９−１９５又は４９−１１８。
【００２０】
また、本発明は、種々の動物種（限定されない）からのＩＧＦ−Ｉをコードするポリヌクレオチドの使用も意図している：アカシカインスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）ｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｕ６２１０６）；ウマインスリン様成長因子Ｉ前駆体（ＩＧＦ−Ｉ）ｍＲＮＡ、（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｕ２８０７０）；インスリン様成長因子Ｉ用ヤギｍＲＮＡ、（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｄ１１３７８）；アナウサギインスリン様成長因子１前駆体（ＩＧＦ−１）ｍＲＮＡ、（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｕ７５３９０）；ブタインスリン様成長因子Ｉ（ｐＩＧＦ−Ｉ）ｍＲＮＡ、（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｍ３１１７５）；ヒツジインスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）ｍＲＮＡ、（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｍ８９７８７）；ヒトインスリン様成長因子（ＩＧＦ−Ｉ）ＩＡ及びＩＢ遺伝子、エクソン１、（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｍ１２６５９及びＭ７７４９６）；ラットインスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）ｍＲＮＡ、（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｍ１５４８０）；ニワトリインスリン様成長因子（ＩＧＦ−Ｉ）ｍＲＮＡ、（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｍ３２７９１及びＭ２９７２０）；サケインスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）ｍＲＮＡ、（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｍ３２７９２）；アフリカツメガエルインスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）ｍＲＮＡ、（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｍ２９８５７）。
【００２１】
当業者は、ＩＧＦ−Ｉが前駆体として合成され、それから分泌経路へ到達してシグナルペプチダーゼによる第一開裂工程を経てプロＩＧＦ−Ｉが産生された後、そのＣ末端領域の細胞内タンパク質分解処理により処理されてＩＧＦ−Ｉに成熟することが理解されるであろう。したがって、本発明によるベクターに存在するヌクレオチド配列は、ＩＧＦ−Ｉ内在性シグナルペプチドの存在に基づいて標的細胞内機構により処理する必要がある全長前駆体型をコードしてもよい。あるいは、異種のシグナル配列に融合したプロＩＧＦ−Ｉをコードするポリヌクレオチド含むことも可能である。本明細書において用いられている「シグナル配列」との表現は、遺伝子とともに転写され、翻訳される構造遺伝子の５’端でのＤＮＡ配列を指す。リーダーは、プロ配列と呼ばれることがあるN末端ペプチド延長を有するタンパク質を生じる。細胞外培地又は膜に分泌するようになるタンパク質については、このシグナル配列は、タンパク質を小胞体に向け、小胞体から適当な目的地に排出される。リーダー配列は、通常異なる遺伝子配列から合成的に誘導するか、単離される所望の核酸によりコードされる。本発明によるポリヌクレオチドの分泌を促進するためのシグナル配列として好適な異種の配列には、ゲルゾリン、アルブミン、フィブリノーゲンのシグナル配列、とりわけ組織プラスミノーゲン活性化因子、インスリン及びニューロン成長因子（ＮＧＦ）からのシグナルペプチドなどがある。
【００２２】
また、当業者には、ウイルスゲノムの長さがウイルスカプシドのパッケージングサイズ限界を超えない限り、本発明によるウイルスゲノムはＩＧＦ−Ｉをコードするゲノム配列の一部分又は全て（この場合、ＩＧＦ−Ｉのコード領域はイントロン領域により遮断されている）を含んでなることもできることも理解されるであろう。
【００２３】
また、本発明は、当該技術分野において知られているＩＧＦ−Ｉ変異体をコードする配列及び断片、例えば、Ｓａｒａ、Ｖ．Ｒ．ら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国、１９８６、８３：４９０４−４９０７）、Ｂａｌｌａｒｄ、Ｆ．Ｊ．ら（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９８７、１４９：３９８−４０４）；Ｂａｙｎｅら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８８、２６３：６２３３−６２３９）；Ｓａｒａ  Ｖ．Ｒ．ら（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９８９、１６５：７６６−７７１）；Ｆｏｒｓｂｅｒｇら、１９９０、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２７１：３５７−３６３）；米国特許第４，８７６，２４２号及び第５，０７７，２７６号；並びに国際特許公開公報ＷＯ８７／０１０３８及びＷＯ８９／０５８２２により記載されているものを含んでなるウイルスゲノムも意図している。代表的な類似体には、成熟分子のＧｌｕ−３が欠失したもの、５以下のアミノ酸がＮ末端から切断された類似体、最初の３つのＮ末端アミノ酸が切断された類似体（ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ、ｄｅｓ−ＩＧＦ−Ｉ、ｔＩＧＦ−Ｉ又は脳ＩＧＦと称される）、及びヒトＩＧＦ−Ｉの最初の１６のアミノ酸の代りにヒトインスリンのＢ鎖の最初の１７のアミノ酸を含む類似体などがある。
【００２４】
したがって、本発明は、ＩＧＦ−Ｉの機能的に同等の変異体をコードするＤＮＡを含として解釈されるべきである。本明細書において用いられている用語「機能的に同等の変異体」は、配列が、配列における一つ以上のヌクレオチドを挿入するか、配列のいずれかの末端又は内部に一つ以上のヌクレオチドを付加するか、配列のいずれかの末端又は内部で、ＩＧＦ−Ｉの生物学的活性を実質的に保存する一つ以上のヌクレオチドを欠失させることにより、上記で定義される通りのＩＧＦ−Ｉの配列から得ることができるポリペプチドに関する。変異体が天然ＩＧＦ−Ｉの生物学的活性を保存するかどうかを測定する方法は当業者に広く知られており、Ｃａｎａｌｉｓら（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ、１９８０、６６：７０９−７１９）により記載されているＤＮＡの測定及び培養ラット頭蓋冠におけるタンパク質合成、Ｊｅｎｎｉｎｇｓら（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．、１９８０、５１：１１６６−７０）により記載されているひよこ軟骨におけるスルフェート及びチミジン取込みの刺激、又はＢａｙｎｅら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９８８、２６３：６２３３−６２３９）により記載されているラットクローン大動脈平滑筋細胞株Ａ１０におけるＤＮＡ合成の刺激などがある。
【００２５】
ＩＧＦ−Ｉの変異体は、ＩＧＦ−Ｉを産生するのに使用される宿主細胞におけるコドン選択する役割を果たすポリヌクレオチド内のヌクレオチドを置き換えることにより得ることができる。このような「コドンの最適化」は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ）により提供されている高度発現バクテリア遺伝子のコドン選択のための「Ｅｃｏｈｉｇｈ．Ｃｏｄ」などのコドン頻度テーブルを組み込むコンピュータアルゴリズムを介して決定することができる。他の有用なコドン頻度テーブルには、「Ｃｅｌｅｇａｎｓ＿  ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｃｅｌｅｇａｎｓ  ＿ｌｏｗ．ｃｏｄ」、「Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｈｕｍａｎ＿  ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｍａｉｚｅ＿  ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」及び「Ｙｅａｓｔ＿  ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」などがある。
【００２６】
ＩＧＦ−Ｉの変異体は、保存アミノ酸の変更を行い、上記した機能アッセイの一つ又は当該技術分野において知られている別の機能アッセイによって得られた変異体を試験することにより得ることができる。保存アミノ酸置換は、同様な側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンであり；脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸群は、セリン及びトレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸群はアスパラギン及びグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸群は、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸群は、リジン、アルギニン及びヒスチジンであり；イオウ含有側鎖を有するアミノ酸群は、システィン及びメチオニンである。好ましい保存アミノ酸置換基群は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン及びアスパラギン−グルタミンである。
【００２７】
ＩＧＦ−Ｉの機能的に同等の変異体には、天然ＩＧＦ−Ｉに実質的に相同であるポリペプチドなどがある。本明細書において用いられている表現「実質的に相同」とは、ヌクレオチド配列が本発明によるヌクレオチドに対して、少なくとも６０％、有利には少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９５％の同一性度を有するときの上記のいずれかのヌクレオチド配列に関する。本発明によるヌクレオチド配列に実質的に相同であるヌクレオチド配列は、典型的には前記ヌクレオチド配列に含有されている情報に基づいて本発明によるポリヌクレオチドの産生生物から単離することができ、又は上記したＤＮＡ配列に基づいて構成される。２つのポリヌクレオチド間の同一性度は、当業者に周知のコンピュータアルゴリズム及び方法を用いて測定される。２つのアミノ酸配列間の同一性は、好ましくはＢＬＡＳＴＮアルゴリズム［ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．、ら、ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．２０８９４、Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．、ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）］を使用することにより測定される。ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０を用いて、本明細書に記載されているパラメータで、配列同一％を決定する。ＢＬＡＳＴ解析をおこなうためのソフトウエアは、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を介して公的に入手可能である。このアルゴリズムは、まずデータベース配列で同じワード長で整列したとき、ある正値のスコア閾値Ｔと一致するか又はそれを満足する照会配列における短ワード長Ｗを同定することにより高スコア配列対（ＨＳＰ）を同定することを含む。Ｔは、近接ワードスコア閾値（上記したＡｌｔｓｃｈｕｌら）と称される。これらの最初の近接ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見つけるための調査を開始するための種としての役割を果たす。ワードヒットは、累積整列スコアが増加する限りは、各配列に沿って両方向に延びる。累積スコアは、ヌクレオチド配列に関して、パラメータＭ（一対の一致残余についての報酬スコア；常に０）及びＮ（不一致残余についてのペナルティスコア；常に０）を用いて算出される。アミノ酸配列については、スコアマトリックスを使用して累積スコアを算出する。各方向におけるワードヒットの延長は、以下のときに停止する：累積整列スコアが、最大達成値から量Ｘだけ減少するとき；累積スコアが、一つ以上の負のスコア残余整列の累積のためゼロ以下になるとき；又はどちらかの配列の末端に至ったとき。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータ  Ｗ、Ｔ及びＸは、整列の感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４及び両方のストランドの比較を使用する。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰグログラムは、デフォルトとして、ワード長３、期待値（Ｅ）１０及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｄ．ＵＳＡ、��９８９、８９：１０９１５参照）整列（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４及び両方のストランドの比較を使用する。
【００２８】
当業者は、ＩＧＦ−Ｉの変異体又は断片が離散点突然変異を作成することを含む突然変異生成などの従来技術を用いるか、又は切断により生成することができることを理解するであろう。例えば、突然変異は、誘導源のポリペプチド成長因子の実質的に同じ又は一部分の生物学的活性を保持する変異体を生じることができる。
【００２９】
本明細書において用いられている用語「作動可能に連結された」とは、機能的な関係におけるポリヌクレオチド（又はポリペプチド）要素の連結を指す。核酸は、別の核酸配列と機能的な関係に配置されたときに「作動可能に連結」される。例えば、転写調節配列は、コード配列の転写に影響する場合には、コード配列に作動可能に連結される。作動可能に連結されたとは、連結されているＤＮＡ配列が、典型的に連続しており、必要に応じ、連続しており且つリーディングフレームにおける２つのタンパク質コード領域に接合していることを意味する。
【００３０】
本明細書において用いられている用語「プロモーター」又は「転写調節配列」は、一またはそれ以上のコード配列の転写を制御するように機能し、コード配列の転写開始部位の転写の方向に対して上流に位置しており、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼのための結合部位、転写開始部位及びいずれかの他のＤＮＡ配列、例えば、転写因子結合部位、リプレッサー及び活性化タンパク質結合部位（これらには限定されない）、さらにプロモーターからの転写の量を調節するために、直接又は間接的に作用する当業者に知られているいずれかの他のヌクレオチド配列、例えば、アテニュエーター又はエンハンサー、さらにサイレンサーの存在により構造的に同定される、核酸断片を指す。「構成」プロモーターは、ほとんどの生理学的及び発生学的条件下でほとんどの組織において活性であるプロモーターである。「誘発」プロモーターは、生理学的又は発生学的に、例えば、化学誘導物質の適用により調節されるプロモーターである。「組織特異的」プロモーターは、組織又は細胞の特異的型においてのみ活性であるプロモーターである。すなわち、本発明に関連して、組織特異的プロモーターは、他の組織よりも一つ又はいくつか（例えば、２、３又は４）の特定の組織においてより活性であるものである（すなわち、他に比較して特異的である組織において作動可能に連結されているコード配列の発現が可能であるプロモーターをより高く駆動できる）。典型的には、「組織特異的」プロモーターにおける下流遺伝子は、他におけるよりも特異的である組織においてはるかに高く活性であるものである。この場合、特異的であるもの以外の組織におけるプロモーターの活性がほとんど又は実質的になくてもよい。
【００３１】
本発明に関連して、肝臓特異的プロモーターは、肝臓における活性が、体内における他の組織における活性と比較して大きいプロモーターである。典型的には、肝臓特異的プロモーターの活性は、肝臓において他の組織よりもかなり大きい。例えば、このようなプロモーターは、他の細胞又は組織における発現を防止しながら、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍又は少なくとも１０倍活性が高い（例えば、一定組織における発現を駆動する能力により測定したとき）。したがって、肝臓特異的プロモーターは、肝臓における連結遺伝子の活性発現が可能であり、他の細胞又は組織における発現を防止する。
【００３２】
好適な肝臓特異的プロモーターには、α１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）プロモーター、チロイドホルモン結合グロブリンプロモーター、アルファフェトプロテインプロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、ＩＧＦ−ＩＩプロモーター、因子ＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ）プロモーター、ＨＢＶ塩基コアプロモーター（ＢＣＰ）及びＰｒｅＳ２プロモーター、アルブミンプロモーター、チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、肝臓制御領域（ＨＣＲ）−ＡｐｏＣＩＩハイブリッドプロモーター、ＨＣＲ−ｈＡＡＴハイブリッドプロモーター、ＡＡＴプロモーター（マウスアルブミン遺伝子エンハンサー（Ｅａｌｂ）要素と結合したもの）、アポリポタンパク質Ｅプロモーター、低密度リポタンパク質プロモーター、ピルビン酸キナーゼプロモーター、ホスフェノールピルビン酸カルボキシキナーゼプロモーター、レシチン−コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）プロモーター、アポリポタンパク質Ｈ（ＡｐｏＨ）プロモーター、トランスフェリンプロモーター、トランスサイレチンプロモーター、アルファ−フィブリノゲン及びベータ−フィブリノゲンプロモーター、アルファ１−抗キモトリプシンプロモーター、アルファ  ２−ＨＳ糖タンパク質プロモーター、ハプトグロビンプロモーター、セルロプラスミンプロモーター、プラスミノーゲンプロモーター、補体タンパク質のプロモーター  （ＣＩｑ、ＣＩｒ、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ８、Ｃ９、補体因子Ｉ及び因子Ｈ）、Ｃ３補体活性化因子及びαｌ−酸糖タンパク質プロモーターなどがあるが、これらには限定されない。追加の組織特異的プロモーターは、組織特異的プロモーターデータベースＴｉＰｒｏＤ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｊ４：Ｄ１０４−Ｄ１０７（２００６）に記載されている。
【００３３】
好ましい実施態様によれば、肝臓特異的プロモーターは、肝臓特異的エンハンサー及び肝臓特異的プロモーター、例えば、肝臓制御領域（ＨＣＲ）−ＡｐｏＣＩＩハイブリッドプロモーター、ＨＣＲ−ｈＡＡＴハイブリッドプロモーター、ＡＡＴプロモーター（マウスアルブミン遺伝子エンハンサー（Ｅａｌｂ）要素との組み合わせ）及びアポリポタンパク質Ｅプロモーターを含んでなるハイブリッドプロモーターである。好ましい実施態様によれば、ハイブリッドプロモーターは、マウスアルブミン遺伝子エンハンサー（Ｅａｌｂ）とマウスアルファ１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）プロモーター（Ｅａｌｂ−ＡＡＴｐ）とを含んでなる。さらにより好ましい実施態様によれば、プロモーター領域は、配列番号４の配列に相当する。
【００３４】
好ましい実施態様によれば、肝臓特異的プロモーターは、誘導性肝臓特異的プロモーター、例えば、テトラサイクリン誘発性肝臓特異的プロモーター、例えば、Ｗａｎｇら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１９９７；１５：２３９−４３）により記載されているプロモーター、Ｂｕｒｃｉｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９９、９６：３５５−６０）により記載されているアデノウイルス介在調節可能肝臓特異的プロモーター、Ｍａｎｉｃｋａｎら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００１、２７６：１３９８９−１３９９４）により記載されているテトラサイクリン調節性肝臓特異的プロモーター、Ｈａｎら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、２００５、１１、Ｓ１６１）により記載されているプロモーター、Ｔｉｅｔｇｅら（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２００３、５：５６７−５７５）により記載されている肝臓への生体内送達のためのテトラサイクリン調節アデノウイルス発現系、Ｃｒｅｔｔａｚら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ（２００６）１３、Ｓ２２４）に記載されているｍｉｆｅｐｒｉｓｔｏｎｅ（ＲＵ−４８６）誘発性肝臓特異的プロモーターである。
【００３５】
本発明によるウイルスゲノムに挿入されることができるさらなる要素としては、ＩＧＦ−Ｉ又はその変異体をコードするヌクレオチド配列の開始コドン付近のＫｏｚａｋコンセンサス配列がある。Ｋｏｚａｋコンセンサス配列は、本明細書ではＧＣＣＲＣＣ（ＡＵＧ）Ａ（配列番号５）として定義されている。ここで、Ｒは、プリン（すなわち、Ａ、アデノシン又はＧ、グアノシン）であり、（ＡＵＧ）はポルホビリノゲンデアミナーゼコード配列の開始コドンを意味する。Ｋｏｚａｋコンセンサス配列の前には、別のＧＣＣトリプレットがあってもよい。
【００３６】
また、本発明によるウイルスゲノムは、ＩＧＦ−Ｉまたその機能的に同等の変異体をコードする核酸に作動可能に連結したポリアデニル化信号を含んでもよい。本明細書において用いられている用語「ポリアデニル化信号」とは、ｍＲＮＡの３’端へのポリアデニンストレッチの連結を介在する核酸配列に関する。好適なポリアデニル化信号には、ＳＶ４０前半ポリアデニル化信号、ＳＶ４０後半ポリアデニル化信号、ＨＳＶチミジンキナーゼポリアデニル化信号、プロタミン遺伝子ポリアデニル化信号、アデノウイルス５ＥＩｂポリアデニル化信号、ウシ成長ホルモンポリアデニル化信号、ヒト変異体成長ホルモンポリアデニル化信号等がある。
【００３７】
好ましい実施態様によれば、本発明によるウイルスゲノムは、ポリオーマウイルスゲノムである。ＳＶ４０などのポリマーウイルスは、非分裂、さらには能動的分裂細胞を感染することが知られており、また、非免疫原性であり、同じ個体への反復投与が可能であることが知られている。さらに、導入遺伝子の長期発現を可能とする。ポリオーマウイルスには、ポリオーマウイルス属に基づくいずれのベクターも含まれ、ＪＣウイルス、ＢＫウイルス、ＫＩウイルス、Ｗｕウイルス、Ｍｅｒｋｅｌ細胞ポリマーウイルス及びＳｉｍｉａｎ空胞化ウイルス４０（以下、ＳＶ４０と称する）などが挙げられる。好ましい実施態様によれば、ポリオーマウイルスゲノムは、ＳＶ４０ゲノムである。
【００３８】
ＳＶ４０は、２つの調節領域と、プロモーター／オリジン領域と、ポリアデニル化領域とからなる、５．２５キロベースの長さの環状二本鎖ＤＮＡゲノムを含んでなる。プロモーター／オリジン領域は、長さ５００塩基対であり、２つの逆方向プロモーターと、複製及びパッケージ信号の中央オリジンの側面に位置する前半及び後半プロモーター（それぞれＳＶＥＰ及びＳＶＬＰ）を含んでなる。ポリアデニル化領域は、長さ１００塩基対であり、前半及び後半転写物の両方のポリアデニル化信号を含む。前半プロモーターは、ウイルス複製と後半プロモーターの活性化に必要な小、中及び大Ｔ抗原（それぞれｓｔａｇ、ｍｔａｇ及びＴａｇ）の発現を駆動する。後半プロモーターは、ウイルスカプシドタンパク質ＶＰ１、２及び３の発現を駆動する。
【００３９】
本発明は、ＳＶ４０の少なくとも一つの発現カセットを、肝臓特異的プロモーターと、ＩＧＦ−Ｉ又はその機能的に同等の変異体をコードする配列とを含んでなるポリヌクレオチドにより置き換えることを意図している。当業者は、肝臓特異的プロモーターとＩＧＦ−Ｉコード配列を含んでなるポリヌクレオチドは、前半プロモーター及び小、中及び大Ｔ抗原を置き換えることにより挿入できることは理解されるところであろう。別法として、肝臓特異的プロモーターとＩＧＦ−Ｉコード配列を含んでなるポリヌクレオチドは、後半プロモーター領域とウイルスカプシドタンパク質ＶＰ１、２及び３をコードする配列を置き換えることにより挿入してもよい。また、本発明は、全てのコード配列（ガットレス（gutless）ＳＶ４０ゲノム）を欠いているＳＶ４０ベクター、ベクターの複製及びパッケージングに必要な制御要素を含んでなる領域を除いた全てのウイルスゲノムを欠いているＳＶ４０ベクターを包含することも意図している。したがって、最小限のＳＶ４０ゲノムが、この領域から由来し、少なくとも完全複製オリジンを含んでいる。本発明に好適なＳＶ４０ベクターは、ｐＳＶＴ７及びｐＭＴ２を含む。
【００４０】
別の実施態様によれば、本発明によるウイルスゲノムは、パルボウイルスゲノムである。本発明で使用される用語「パルボウイルス」は、自己複製パルボウイルス及びディペンドウイルスなどのパルボウイルス科を包含する。自律型パルボウイルスには、パルボウイルス属、エリスロウイルス属、デンソウイルス属、イテラウイルス属及びコントラウイルス属などがある。典型的な自律型パルボウイルスには、微小マウスウイルス、ウシパルボウイルス、イヌパルボウイルス、ニワトリパルボウイルス、ネコ白血球減少ウイルス、ネコパルボウイルス、ガチョウパルボウイルス、Ｈ１パルボウイルス、タイワンアヒルパルボウイルス、Ｂ１９ウイルス及び現在知られているか又はこれから見出される他の自律型パルボウイルスなどがあるが、これらには限定されない。他の自己パルボウイルスは、当業者に知られている。例えば、ＢＥＲＮＡＲＤ  Ｎ．ＦＩＥＬＤＳら、ＶＩＲＯＬＯＧＹ、第２巻、第６９章（第４版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）参照。
【００４１】
一方及びそれらの属の名前から推定できるように、ディペンドウイルスに属するものは、細胞培養における増殖感染のためのアデノウイルス又はヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルスでの重感染を通常必要とする点で独特である。ディペンドウイルス属には、通常ヒトに感染するＡＡＶ（例えば、血清型１、２、３Ａ、３Ｂ、４、５及び６）又は霊長類（例えば、血清型１及び４）、及び他の温血動物（例えば、ウシ、イヌ、ウマ及びヒツジアデノ関連ウイルス）に感染する関連ウイルスなどがある。さらに、パルボウイルス及びパルボウイルス科に属する他のものについての情報が、Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ｉ．Ｂｅｒｎｓ、“Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ  Ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ（ウイルス及びそれらの複製），”Ｃｈａｐｔｅｒ  ６９  ｉｎ  Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（第３版、１９９６）に記載されている。
【００４２】
さらにより好ましい実施態様によれば、パルボウイルスゲノムは、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ゲノムである。本明細書において用いられている用語「アデノ関連ウイルス」（ＡＡＶ）は、ＡＡＶ血清型を含む。一般的に、ＡＡＶ血清型は、アミノ酸及び核酸レベルで顕著な相同性のゲノム配列を有し、同一の一連の遺伝機能を提供し、実質的に物理的及び機能的に同等であるビリオンを産生し、事実上同一の機構により複製し、集合する。特に、本発明は、ＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１）、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３（３Ａ型及び３Ｂ型など）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ａｖｉａｎ  ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、及び現在知られているか又は今後見出される他のＡＡＶを用いて実施されてもよい。例えば、Ｆｉｅｌｄｓら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２巻、第６９章（第４版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）参照。最近、多数の推定の新規ＡＡＶ血清型及び分岐群が確認された（例えば、Ｇａｏら、（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ７８：６３８１−６３８８；Ｍｏｒｉｓら、（２００４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ３３−：３７５−３８３；及び表１）。ＡＡＶ及び自律型パルボウイルスの種々の血清型のゲノム配列、さらには末端反復、Ｒｅｐタンパク質及びカプシドサブユニットの配列が当該技術分野において知られている。このような配列は、文献又は公開データベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋから入手できる。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ＿００２０７７、ＮＣ＿００１４０１、ＮＣ＿００１７２９、ＮＣ＿００１８６３、ＮＣ＿００１８２９、ＮＣ＿００１８６２、ＮＣ＿０００８８３、ＮＣ＿００１７０１、ＮＣ＿００１５１０、ＮＣ＿００６１５２、ＮＣ＿００６２６１、ＡＦ０６３４９７、Ｕ８９７９０、ＡＦ０４３３０３、ＡＦ０２８７０５、ＡＦ０２８７０４、Ｊ０２２７５、Ｊ０１９０１、Ｊ０２２７５、Ｘ０１４５７、ＡＦ２８８０６１、ＡＨ００９９６２、ＡＹ０２８２２６、ＡＹ０２８２２３、ＮＣ＿００１３５８、ＮＣ＿００１５４０、ＡＦ５１３８５１、ＡＦ５１３８５２、ＡＹ５３０５７９（これらに開示されているものは、パルボウイルス並びにＡＡＶ核酸及びアミノ酸配列を教示するために引用することにより本明細書の開示の一部とされる）参照。また、例えば、Ｓｒｉｖｉｓｔａｖａら、（１９８３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ４５：５５５；Ｃｈｉｏｒｉｎｉら、（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ７１：６８２３；Ｃｈｉｏｒｉｎｉら、（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ７３：１３０９；Ｂａｎｔｅｌ−Ｓｃｈａａｌら、（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ７３：９３９；Ｘｉａｏら、（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ７３：３９９４；Ｍｕｒａｍａｔｓｕら、（１９９６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２２１：２０８；Ｓｈａｄｅら、（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５８：９２１；Ｇａｏら、（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：１１８５４；Ｍｏｒｉｓら、（２００４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ３３−：３７５−３８３；国際特許公開ＷＯ００／２８０６１、ＷＯ９９／６１６０１、ＷＯ９８／１１２４４；及び米国特許第６，１５６，３０３号（これらに開示されているものは、パルボウイルス並びにＡＡＶ核酸及びアミノ酸配列を教示するために引用することにより本明細書の開示の一部とされる）も参照されたい。
【００４３】
説明の都合上、本発明を、ＡＡＶについて以下に述べ、さらに例示し且つ記載する。しかしながら、本発明は、ＡＡＶに限定されず、同等に他のパルボウイルスにも適用できる。
【００４４】
全ての知られているＡＡＶ血清型のゲノム機構は、極めて類似している。ＡＡＶのゲノムは、長さが約５，０００ヌクレオチド（ｎｔ）より短い直線状一本鎖ＤＮＡ分子である。逆方向末端反復（ＩＴＲ）は、非構造複製（Ｒｅｐ）タンパク質及び構造（ＶＰ）タンパク質のためのユニークコードヌクレオチド配列の側面に位置している。ＶＰタンパク質（ＶＰ１、−２及び−３）は、カプシドを形成する。末端１４５ｎｔは、自己相補的であり、Ｔ型ヘアピンを形成するエネルギー的に安定な分子内二本鎖を形成してもよいように構成される。これらのヘアピン構造は、細胞ＤＮＡポリメラーゼ複合体のプライマーとしての役割を果たす、ウイルスＤＮＡ複製のオリジンとして機能する。哺乳動物細胞におけるｗｔＡＡＶ感染に続いて、Ｒｅｐ遺伝子（すなわち、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２）が、それぞれＰ5プロモーター及びＰ１９プロモーターから発現され、両方のＲｅｐタンパク質はウイルスゲノムの複製において機能を有している。ＲｅｐＯＲＦにおけるスプライシング現象は、実際に４種のＲｅｐタンパク質（すなわち、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０）の発現を生じる。しかしながら、哺乳動物細胞においてＲｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質をコードする、つなぎ合わされていないｍＲＮＡが、ＡＡＶベクター産生に十分であることが判明した。また、昆虫細胞において、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質がＡＡＶベクター産生に十分である。
【００４５】
本明細書における「組み換えパルボウイルス又はＡＡＶゲノム」（又は「rＡＡＶゲノム」）は、目的とする一つまたはそれ以上のポリヌクレオチド配列、目的とする遺伝子又は「導入遺伝子」（少なくとも一つのパルボウイルス又はＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）が横に位置している）を含んでなるベクターを指す。このようなｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子産生物（すなわち、ＡＡＶＲｅｐ及びＣａｐタンパク質）を発現している昆虫宿主細胞に存在するとき、複製し、感染性ウイルス粒子にパッケージされることができる。ｒＡＡＶベクターがより大きな核酸構築物（例えば、染色体又は別のベクター、例えば、クローニング又はトランスフェクションに使用されるプラスミド又はバキュロウイルス）に組み込まれるとき、ｒＡＡＶベクターは、典型的には、ＡＡＶパッケージ機能及び必要なヘルパー機能の存在下での複製及びキャプシド形成により「レスキュー(rescue)」され得る「プロベクター(pro-vector)」と呼ばれる。
【００４６】
したがって、別の態様によれば、本発明は、核酸構築物が組み換えパルボウイルス又はＡＡＶベクターであり、したがって、少なくとも一つのパルボウイルス又はＡＡＶＩＴＲを含んでなる、ＩＧＦ−Ｉ又はその機能的に同等の変異体（上記で定義される通りのもの）をコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸構築物に関する。好ましくは、核酸構築物において、ＩＧＦ−Ｉ又はその機能的に同等の変異体をコードするヌクレオチド配列は、どちらかの側にパルボウイルス又はＡＡＶＩＴＲが位置している。パルボウイルス又はＡＡＶＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４及び／又はＡＡＶ５からのＩＴＲを含む本発明の構築物に使用することができる。ＡＡＶ２のＩＴＲが、最も好ましい。
【００４７】
本発明において使用できるＡＡＶ配列は、いずれかＡＡＶ血清型のゲノム由来のものであることができる。一般的に、ＡＡＶ血清型は、アミノ酸及び核酸レベルで顕著な相同性のゲノム配列を有し、同一の一連の遺伝機能を提供し、実質的に物理的且つ機能的に同等であるビリオンを産生し、事実上同一の機構により複製し、集合する。種々のＡＡＶ血清型のゲノム配列及びゲノムの類似点の概略については、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ８９７９０；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｊ０１９０１；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０４３３０３；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０８５７１６；Ｃｈｌｏｒｉｎｉら（１９９７、Ｊ．Ｖｉｒ．７１：６８２３−３３）；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら（１９８３、Ｊ．Ｖｉｒ．４５：５５５−６４）；Ｃｈｌｏｒｉｎｉら（１９９９、Ｊ．Ｖｉｒ．７３：１３０９−１３１９）；Ｒｕｔｌｅｄｇｅら（１９９８、Ｊ．Ｖｉｒ．７２：３０９−３１９）；及びＷｕら（２０００、Ｊ．Ｖｉｒ．７４：８６３５−４７）を参照されたい。ＡＡＶ血清型１、２、３、４及び５は、本発明に関連して使用される好ましいＡＡＶヌクレオチド配列源である。好ましくは、本発明に関連して使用されるＡＡＶＩＴＲ配列は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２及び／又はＡＡＶ４から得られる。
【００４８】
カプシド遺伝子をコードする核酸配列はパッケージング細胞によるか又は第二ベクターによりトランスに提供されることが好ましいが、本発明は、上記したポリヌクレオチド配列をパッケージする一つ以上のカプシドタンパク質をコードする配列をさらに含んでなるＡＡＶゲノムも意図している。しかしながら、本発明に関連して使用されるＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３カプシドタンパク質をコードする配列は、既知の４２血清型のいずれかからか、より好ましくはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、又は、例えば、カプシドシャフリング法及びＡＡＶカプシドライブラリーにより得られる新規に開発されたＡＡＶ様粒子からから得ることができる。カプシドタンパク質をコードする配列がＩＴＲとして異なるＡＡＶ血清型由来であるとき、ＡＡＶゲノムは、国際特許公開ＷＯ００／２８００４及びＣｈａｏら、（２０００）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２：６１９に記載されているような、「ハイブリッド」パルボウイルスゲノム（すなわち、ＡＡＶカプシド及びＡＡＶ末端反復（単一または複数）が異なるＡＡＶ由来である）として知られている。本明細書に記載されているｒＡＡＶベクターは、現在知られているか又は今後見出されるいずれかの好適なｒＡＡＶベクターであることができる。別法として、カプシド遺伝子をコードする配列は、前記カプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドをパッケージング細胞に共トランスフェクションすることによりトランスで提供されてもよい。好ましい実施態様によれば、ウイルスベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２及び／又はＡＡＶ４からのＩＴＲと、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６又はＡＡＶ８からの一つ以上又は全てのカプシド遺伝子を含んでなる。
【００４９】
ウイルスベクターがカプシドタンパク質をコードする配列を含んでなる場合、これらは、外因性標的配列を含んでなるように改変してもよい。好適な外因性標的配列は、本発明によるビリオンに関して以下に詳細に説明する。
【００５０】
必要に応じて、本発明によるＡＡＶゲノムは、Ｒｅｐタンパク質をコードする追加の配列を含んでいてもよい。Ｒｅｐ（Ｒｅｐ７８／６８及びＲｅｐ５２／４０）コード配列は、好ましくはＡＡＶ１、ＡＡＶ２及び／又はＡＡＶ４由来である。ＡＡＶＲｅｐ及びＩＴＲ配列は、特にほとんどの血清型間に保存される。種々のＡＡＶ血清型のＲｅｐ７８タンパク質は、例えば、同一度が８９％超であり、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ及びＡＡＶ６間のゲノムレベルでの総ヌクレオチド配列同一度は、８２％ほどである（Ｂａｎｔｅｌ−Ｓｃｈａａｌら、１９９９、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７３：９３９−９４７）。さらに、数多くのＡＡＶ血清型のＲｅｐ配列及びＩＴＲは、哺乳動物細胞におけるＡＡＶ粒子の産生における他の血清型からの対応の配列を効率的に交差補足（すなわち、機能的に置き換え）することが知られている。ＵＳ２００３１４８５０６は、ＡＡＶＲｅｐ及びＩＴＲ配列が昆虫細胞において他のＡＡＶＲｅｐ及びＩＴＲ配列も効率的に交差補足することを報告している。
【００５１】
ＡＡＶＶＰタンパク質は、ＡＡＶビリオンの細胞栄養価値を決定することが知られている。ＶＰタンパク質コード配列は、Ｒｅｐタンパク質及び遺伝子よりも、異なるＡＡＶ血清型の間で保存されない。他の血清型の対応する配列を交差補足するＲｅｐ及びＩＴＲ配列の能力は、一つの血清型（例えば、ＡＡＶ５）のカプシドタンパク質及び別のＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ２）のＲｅｐ及び／又はＩＴＲ配列を含んでなる偽型rＡＡＶ粒子の産生を可能にすることである。このような偽型rＡＡＶ粒子は、本発明の一部分である。
【００５２】
典型的には、本発明によるＡＡＶゲノムは、肝臓特異的プロモーターと、ＩＧＦ−Ｉまたその機能的に同等の変異体をコードする配列とを含んでなる発現カセットの他に、以下の要素の一つ以上を含んでなる：
−逆方向末端反復
−非分解性末端反復
−カプシド遺伝子をコードする配列
−極小パッケージ性ゲノムサイズを完成するスタッファー配列
【００５３】
逆方向末端反復（ＩＴＲ）は、典型的に異種の配列を含む発現カセットを横に有する少なくとも２組のＡＡＶベクターに典型的に存在する。ＩＴＲは、典型的に異種のヌクレオチド配列（単一または複数）の５’端及び３’端にあるが、それらに隣接している必要はない。末端反復は、互いに異なっていても、同一でもよい。用語「末端反復」には、米国特許第５，４７８，７４５号（Ｓａｍｕｌｓｋｉら）に記載されている「二重Ｄ配列（ｄｏｕｂｌｅ−Ｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」などの逆方向末端反復として機能しヘアピン構造を形成するウイルス末端反復及び／又は部分的若しくは完全合成配列などがある。「ＡＡＶ末端反復」は、いずれかのＡＡＶ、例えば、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１若しくは１２又は現在知られているか又は今後見出されるいずれかの他のＡＡＶからのものであることができるが、これらには限定されない。ＡＡＶ末端反復は、末端反復が所望の機能、例えば、複製、ニッキング、ウイルスパッケージング、組み込み及び／又はプロウイルスレスキュー等を介在する限り、野生型配列を有する必要はない（例えば、野生型配列は、挿入、削除、切断又はミスセンス突然変異により変更してもよい）。ベクターゲノムは、同一でも異なっていてもよい一つ以上（例えば、２つ）のＡＡＶ末端反復を含んでなることができる。さらに、この一つ以上のＡＡＶ末端反復は、ＡＡＶカプシドと同じＡＡＶ血清型からのものでもよいし、又は異なっていてもよい。特定の実施態様によれば、ベクターゲノムは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１及び／又はＡＡＶ１２末端反復、特に特にＡＡＶ１、ＡＡＶ２及び／又はＡＡＶ４からのものを含んでなる。好ましい実施態様によれば、ＩＴＲはＡＡＶ２由来であることができ、配列番号６（５’ＩＴＲ）及び配列番号７（３’ＩＴＲ）により定義することができる。
【００５４】
本発明によるＡＡＶゲノムは、また、非分解性末端反復を含んでいてもよい。本明細書において用いらされる表現「非分解性末端反復」は、ＡＡＶＲｅｐタンパク質により認識されず、分解され（すなわち、「切断され」）、末端反復の分解が実質的に減少（例えば、分解性末端反復と比較して少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又はそれ以上）するか、又はなくなる末端反復に関する。このような非分解性末端反復は、天然末端反復配列（その変更形態を含む）であることができ、例えば、ＡＡＶなどのパルボウイルス由来であることができ、又は別のウイルスからのものであることができ、又はさらに別のものとして、部分的又は完全に合成であることができる。非分解性末端反復は、ＡＡＶＲｅｐタンパク質により認識されない非ＡＡＶウイルス配列であるか、又はもはやＡＡＶＲｅｐタンパク質により認識されないように改変された（例えば、挿入、置換及び／又は削除により）ＡＡＶ末端反復であることができる。さらに、非分解性末端反復は、ウイルスベクターを生成するために使用される条件下で非分解であるいずれかの末端反復であることができる。例えば、非分解性末端反復は、ベクターゲノムを複製するのに使用されるＲｅｐタンパク質により認識されなくてもよい。具体的には、非分解性末端反復は、自律型パルボウイルス末端反復、又はＡＡＶＲｅｐタンパク質により認識されないパルボウイルス末端反復以外のウイルス末端反復であることができる。好ましい実施態様によれば、分解性末端反復及びＲｅｐタンパク質は一つのＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ８）からのものでもよく、非分解性末端反復はＡＡＶ８Ｒｅｐタンパク質により認識されず、分解が実質的に減少又はなくなるような別のＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ２）からのものである。さらに、ＡＡＶ末端反復は、ＡＡＶＲｅｐタンパク質による分解が実質的に減少するか又はなくなるように改変することができる。非分解性末端反復は、ヘアピン構造を形成し、ＡＡＶＲｅｐタンパク質により切断されることができないいずれかの逆方向反復配列であることができる。
【００５５】
パルボウイルスＩＴＲヌクレオチド配列は、典型的には、「Ａ」領域、「Ｂ」領域及び「Ｃ」領域とも処されるほとんど相補的で対称的に配置された配列を含んでなるパリンドローム配列である。ＩＴＲは、複製源、複製における「シス」の役割を果たす部位として機能し、すなわち、パリンドローム及びパリンドロームに対して内部である特異的配列を認識する、例えば、Ｒｅｐ７８（又はＲｅｐ６８）などのトランス作用複製タンパク質のための認識部位である。ＩＴＲ配列の対称についての１つの例外は、ＩＴＲの「Ｄ」領域である。これは、ユニーク（１つのＩＴＲ内に相補を有しない）なものである。一本鎖ＤＮＡの切断が、Ａ領域とＤ領域との間の接合部で生じる。これは、新しいＤＮＡ合成が開始する領域である。Ｄ領域は、パリンドロームの一方の側に通常位置し、核酸複製工程へと導く。哺乳動物細胞中で複製しているパルボウイルスは、典型的に２つのＩＴＲ配列を有している。しかしながら、結合部位がＡ領域の両方の鎖上にあり、Ｄ領域がパリンドロームの各側に１つずつ対称に位置するようにＩＴＲを設計することができる。二本鎖環状ＤＮＡ鋳型（例えば、プラスミド）上に、次にＲｅｐ７８又はＲｅｐ６８アシスト核酸複製が両方向に進行する。単一のＩＴＲが、環状ベクターのパルボウイルス複製には十分である。したがって、１つのＩＴＲヌクレオチド配列を、本発明に関連して使用できる。しかしながら、好ましくは、２つ又は別の偶数のレギュラーＩＴＲが使用される。最も好ましくは、２つのＩＴＲ配列が使用される。したがって、本発明によれば、少なくとも１つのＩＴＲを使用することができ、すなわち、１つのＩＴＲを使用することができるが、より典型的には２つのＩＴＲが使用される。
【００５６】
好ましい実施態様によれば、本発明によるＡＡＶゲノムは、肝臓特異的プロモーターと、ＩＧＦ−Ｉ又はその機能的に同等の変異体と、ポリアデニル化信号とにより形成されている発現カセット（ＡＡＶＩＴＲが側に位置しているものであるも）を含んでなるポリヌクレオチドを含んでなる。さらにより好ましい実施態様によれば、肝臓特異的プロモーターは、アルブミンエンハンサーとアルファ１−アンチトリプシンプロモーター領域とを含んでなるハイブリッドプロモーターである。
【００５７】
本発明によるウイルスゲノムは、ＡＡＶベクターなどの一本鎖パルボウイルスベクターであることができる。好ましい実施態様によれば、ＡＡＶベクターは、一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）である。本明細書において用いられている表現「一本鎖パルボウイルスベクター」は、ＡＡＶカプシド内にパッケージされている一本鎖ポリヌクレオチド（典型的にはＤＮＡ）に関する。本明細書において用いられている用語「一本鎖」は、核酸分子として使用されるとき、別の核酸分子にハイブリダイズしておらず、生理学的条件又はストリンジェント条件下で分子内ハイブリダイズする領域がない核酸分子を指す。これは、鎖間塩基対相互作用により互いに保持される核酸の２つの鎖として存在する二本鎖標的と対照的である。一本鎖核酸分子は、両方の鎖が同等に伝染性であるので、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかである。
【００５８】
本明細書において用いられているのウイルスゲノムは、国際特許公開ＷＯ０１／９２５５１及びＭｃＣａｒｔｙら、（２００３）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １０：２１１２−２１１８に記載されているような二重パルボウイルスベクターであることができる。本発明に関連して、用語「二本鎖パルボウイルスベクター」と「二重パルボウイルスベクター」は同義であり、明細書を通じて区別せずに使用されている。特定の実施態様によれば、パルボウイルスベクターは、ＡＡＶベクター、好ましくは二本鎖ＡＡＶである。さらに、ＡＡＶカプシド又はベクターゲノムは、挿入、削除及び／又は置換を含む他の改変を含むことができる。ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１又はＡＡＶ１２カプシド（改変形態を含む）由来のＡＡＶカプシドを含んでなるが、これらには限定されない。必要に応じて、カプシドは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３若しくはＡＡＶ６カプシド又はそれらの改変型、例えば、シャフリング法及びＡＡＶカプシドライブラリーを用いて生成した改変カプシドであることができる。
【００５９】
本発明の代表的な実施態様によれば、ウイルスゲノムは、組み換えベクターゲノムが５’及び３’ＡＡＶ末端反復（分解性）と、ＩＧＦ−Ｉ又はその機能的変異体をコードする異種のヌクレオチド配列と、非分解性末端反復とを含んでなる、二重パルボウイルスベクターである。二重パルボウイルスベクターとそれらの産生については、国際特許公開ＷＯ０１／９２５５１及びＭｃＣａｒｔｙら、（２００３）  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １０：２１１２−２１１８に記載されている。
【００６０】
典型的には、ｒＡＡＶベクターゲノムは、極小の末端反復配列（単一または複数）（各々１４５塩基）を保持し、それにより、ベクターによって効率的にパッケージされ得るトランス遺伝子の大きさを最大化する。
【００６１】
一般的に、二重パルボウイルスベクターは、ＡＡＶカプシド内にパッケージされた二量体自己相補的ポリヌクレオチド（典型的にはＤＮＡ）である。ある態様によれば、カプシド内にパッケージされている組み換えウイルスゲノムは、実質的に分解して正及び負の極性の鎖を生成できない「補足」ＡＡＶ複製中間体である。二重パルボウイルスベクターは、従来のｒＡＡＶベクターに固有の相補ＤＮＡの宿主細胞介在合成の必要性を回避し、ｒＡＡＶベクターの制限の一つに対応できると思われる。
【００６２】
二重パルボウイルスベクターは、基本的に従来のｒＡＡＶベクター及び親ＡＡＶとは、ウイルスＤＮＡは、鎖内塩基対により、二本鎖ヘアピン構造を形成することができ、両方の極性のＤＮＡ鎖が封入されている点で異なる。したがって、二重パルボウイルスベクターは、由来源ＡＡＶではなく二本鎖ＤＮＡウイルスベクターに機能的に類似している。この特徴は、通常ＡＡＶにより封入された一本鎖ゲノムに相補的なＤＮＡを合成する所望の標的細胞の限定された傾向であるｒＡＡＶ介在遺伝子導入の以前から認識されていた欠点に対応している。
【００６３】
本発明を特定の理論により限定することを意図するものではないが、ビリオンゲノムが一本鎖形態でウイルスカプシド内にパッケージされた状態で保持されることが可能である。ウイルス感染中にカプシドから放出されると、二量体分子は「急速に元の状態にもどる」か、又はアニールして、鎖内塩基対により二本鎖分子を形成し、非分解性ＴＲ配列が一端に共有結合ヘアピン構造を形成すると思われる。この二本鎖ウイルスＤＮＡは、ＡＡＶ導入の律速段階であると想定された宿主細胞介在二本鎖合成の必要をなくす。
【００６４】
肝臓組織細胞の場合、二重パルボウイルスベクターは、遺伝子発現の開始をより速くし、及び／又は遺伝子発現レベルをより高くすることにより、用量を少なくして、ひいては標的組織における炎症の可能性及び／又は程度を減少することができるので有利であることがある。
【００６５】
二重パルボウイルスベクターゲノムは、一般的に、５’−３’方向に、（ｉ）分解性ＡＡＶ末端反復と、（ｉｉ）目的とする異種のヌクレオチド配列（コード又は非コード鎖）と、（ｉｉｉ）非分解性末端反復と、（ｉｖ）（ｉｉ）の目的とする異種のヌクレオチド配列に相補な配列又は実質的に相補な（例えば、少なくとも約９０％、９５％、９８％、９９％、又はそれ以上）配列と、（ｖ）分解性ＡＡＶ末端反復とを含んでなる。当業者は、ベクターゲノムが他の配列（上記で具体的に述べた配列間に介在している配列）を含むことができることを理解するであろう。
【００６６】
特定の実施態様によれば、ベクターゲノムの各半分における配列（例えば、全体の配列又はＡＡＶ末端反復と非分解性末端反復との間の配列）は、実質的に相補（すなわち、相補の度合いが少なくとも約９０％、９５％、９８％、９９％ヌクレオチド配列又はそれ以上）であり、ベクターゲノムは、相補配列間の塩基対により二本鎖分子を形成することができる。換言すれば、ベクターゲノムは、実質的に逆方向反復であり，両半分が非分解性末端反復により接合されている。特定の実施態様によれば、ベクターゲノムの両半分（すなわち、全体の配列又はＡＡＶ末端反復と非分解性末端反復との間の配列）は、実質的に完全に自己相補的（すなわち、わずかな数の一致しない塩基を含む）であるか又は完全に自己相補的である。
【００６７】
他の実施態様によれば、目的とする異種のヌクレオチド配列（調節要素があるか又はない）の二本鎖は、実質的に相補（すなわち、相補の度合いが少なくとも約９０％、９５％、９８％、９９％ヌクレオチド配列又はそれ以上）である。特定の実施態様によれは、異種のヌクレオチド配列の二本鎖は、実質的に完全に自己相補的（すなわち、わずかな数の一致しない塩基を含む）か又は完全に自己相補的である。
【００６８】
一般的に、二重パルボウイルスのベクターゲノムは、対応するｒＡＡＶベクターからよりも、二重パルボウイルスベクターからの異種のヌクレオチド配列の発現が高まる（例えば、開始がより早くなる、及び／又は発現レベルがより高くなる）程度までの非相補性の位置又は領域を含むことができる。本発明による二重パルボウイルスによれば、ｒＡＡＶベクターの欠点の一つ、すなわち一本鎖ｒＡＡＶビリオンＤＮＡを二本鎖ＤＮＡに転換するために宿主細胞が必要となることに向けられた、二本鎖分子を有する宿主細胞が提供される。ビリオンＤＮＡ内、特に異種のヌクレオチド配列内の、非相補性の実質的な領域の存在が宿主細胞により認識され、そして不一致塩基を修正するために採用されるＤＮＡ修復機構をもたらし、それにより二重パルボウイルスベクターの有利な特徴（例えば宿主細胞についてウイルス鋳型を処理する必要性が減る又は除かれる）を弱める。
【００６９】
非分解性ＡＡＶ末端反復は、当該技術分野において公知のいずれかの方法により生成できる。例えば、末端反復への挿入により、切断部位（すなわち、ｔｒｓ）を移し、非分解性末端反復を生じる。末端反復内の種々の領域又は要素の名称は、当該技術分野において知られている（例えば、ＢＥＲＮＡＲＤ  Ｎ．  ＦＩＥＬＤＳ  ら、ＶＩＲＯＬＯＧＹ、第２巻、第６９章、図５、第３版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ及びＷＯ０１／９２５５５１の図６参照）。また、末端分離部位（ｔｒｓ）の配列への挿入もおこなうことができる。別法として、Ａ要素内のＲｅｐ結合要素（ＲＢＥ）とｔｒｓとの間の部位に挿入することもできる（ＷＯ０１／９２５５５１の図６参照）。ＡＡＶｔｒｓ部位のコア配列は当該技術分野において知られており、記載されている（Ｓｎｙｄｅｒ  ら、（１９９０）  Ｃｅｌｌ、６０：１０５；  Ｓｎｙｄｅｒ  ら、（１９９３）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６７：６０９６；Ｂｒｉｓｔｅｒ及びＭｕｚｙｃｚｋａ、（２０００）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７４：７７６２；Ｂｒｉｓｔｅｒ及びＭｕｚｙｃｚｋａ、（１９９９）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７３：９３２５）。例えば、Ｂｒｉｓｔｅｒ及びＭｕｚｙｃｚｋａ、（１９９９）  Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７３：９３２５は、Ｄ要素に隣接する３’−ＣＣＧＧＴ／ＴＧ−５’のコアｔｒｓ配列を記載している。Ｓｎｙｄｅｒら、（１９９３）  Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６７：６０９６は、Ｂｒｉｓｔｅｒ及びＭｕｚｙｃｚｋａにより確認された配列と実質的に重なり合う３’−ＧＧＴ／ＴＧＡ−５’として、最小ｔｒｓ配列を同定した。
【００７０】
挿入は、末端反復の分解を実質的に減少する（少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又はそれ以上）又は分解をなくすいずれかの好適な長さであることができる。挿入は、少なくとも約３、４、５、６、１０、１５、２０若しくは３０ヌクレオチド又はそれ以上であることができる。好適なレベルのウイルス複製及びパッケージングが得られる限りは、挿入配列のサイズの上限は特にない（例えば、挿入は、５０、１００、２００若しくは５００ヌクレオチド又はそれ以上の長さであることができる）。
【００７１】
別の手法として、末端反復は、ｔｒｓ部位の欠失により非分解性とすることができる。欠失は、鋳型が所望の機能を保持する限りは、ｔｒｓ部位を越えて１、３、５、８、１０、１５、２０、３０ヌクレオチド又はそれ以上延びていてよい。ｔｒｓ部位の他に、Ｄ要素の一部又は全てを欠失させることができる（例えば、ＭｃＣａｒｔｙら（２００３）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １０：２１１２−２１１８；及びＷＯ０１／９２５５１参照）。欠失は、さらにＡ要素に延びることもできる；しかしながら、当業者は、ＲＢＥをＡ要素に保持して、例えば、パッケージジングを容易に効率的におこなうことが有利なことであることを理解されるところであろう。Ａ要素への欠失は、非分解性末端反復がいずれかの他の望ましい機能を保持する限りは、長さが２、３、４、５、８、１０又は１５ヌクレオチド又はそれ以上であることができる：さらに、末端反復配列の外のＤ要素を越えて位置しているウイルス配列の一部又は全て（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ０１／９２５５５１の図６におけるＤ要素の右まで）を欠失させて、変更した末端反復を修正する遺伝子変換プロセスを減少又は防止することができる。
【００７２】
さらなる別法として、切断部位で配列を、Ｒｅｐタンパク質による分解を減少又は実質的になくすように突然変異させることができる。例えば、Ａ及び／又はＣ塩基は、切断部位又はその近くで、Ｇ及び／又はＴ塩基の代りとすることができる。Ｒｅｐ切断での末端分解部位での置換の効果については、Ｂｒｉｓｔｅｒ及びＭｕｚｙｃｚｋａ、（１９９９）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７３：９３２５に記載されている。
【００７３】
さらなる別法として、ステムループ構造を形成することを想定していた切断部位を包囲している領域におけるヌクレオチド置換を使用して、末端分解部位でのＲｅｐ切断を減少させることができる。当業者には、非分解性末端反復における変更は、変更末端反復の所望の機能（もしあれば）（例えば、パッケージング、Ｒｅｐ認識及び／又は部位特異的組み込みなど）を維持するように選択できることが理解されるであろう。
【００７４】
さらに、非分解性末端反復は、Ｓａｍｕｌｓｋｉら、（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３３：１３５に記載されているように、遺伝子変換プロセスに対して耐性とすることができる。非分解性末端反復での遺伝子変換は、分解性末端反復を生成するｔｒｓ部位を回復する。遺伝子変換は、分解性末端反復と変更された末端反復との間の相同的組み換えから生じる。遺伝子変換を減少させる1つの方法は、当該技術分野において知られているように、ＤＮＡ修復が欠如している細胞株（例えば、哺乳動物）を用いてウイルスを産生することである。これは、ウイルス鋳型に導入される突然変異体を修正するこれらの細胞株の能力が低下するからである。
【００７５】
別法として、実質的に減少した遺伝子変換率を有する鋳型は、非相同性領域を非分解性末端反復に導入することにより生成することができる。非分解性末端反復と未変更末端反復（鋳型について）との間のｔｒｓ要素を包囲している領域における非相同性により、遺伝子変換が減少又はさらに実質的になくなる。遺伝子変換が減少するか又はなくなる限りは、いずれかの好適な挿入又は欠失を、非分解性末端反復に導入して非相同領域を生成することができる。非相同とするのに欠失を用いる方法が好ましい。さらに、欠失が鋳型の複製又はパッケージングを過度に害しないことが好ましい。欠失の場合、同じ欠失が、ｔｒｓ部位の分解を減じたり、さらには遺伝子変換を減少させたりするのに十分なこともある。
【００７６】
さらなる別法として、遺伝子変換は、非分解性末端反復への挿入によるか、又はＲＢＥとｔｒｓ部位との間のＡ要素に挿入することにより減少させることができる。挿入は、典型的には長さが、少なくとも約３、４、５、６、１０、１５、２０若しくは３０ヌクレオチド又はそれ以上のヌクレオチドである。挿入配列のサイズについては特に上限がなく、５０、１００、２００若しくは５００ヌクレオチド又はそれ以上のヌクレオチドでよいが、一般的に、挿入は、ベクターゲノムの複製及びパッケージングを過度に阻害しないように選択される。
【００７７】
非分解性末端反復と二重パルボウイルスベクターは、国際特許公開ＷＯ０１／９２５５１及びＭｃＣａｒｔｙら、（２００３）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １０：２１１２−２１１８）に記載されている。
【００７８】
また、本発明によるｒＡＡＶベクターは、転写終止シグナルも含んでよい。いずれの転写終止シグナルを本発明のベクターに含めてもよく、好ましくは転写終止シグナルはＳＶ４０転写終止シグナルである。
【００７９】
改変「ＡＡＶ」配列も、本発明に関連して、例えば、昆虫細胞におけるｒＡＡＶベクターの産生のために使用できる。このような改変配列は、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８又はＡＡＶ９  ＩＴＲ、Ｒｅｐ若しくはＶＰに対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又はそれ以上のヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列同一性を有する配列（例えば、約７５〜９９％ヌクレオチド配列同一性を有する配列）を含み、野生型ＡＡＶ  ＩＴＲ、Ｒｅｐ又はＶＰ配列の代りに使用できる。
【００８０】
多くの態様において他のＡＡＶ血清型と類似しているが、ＡＡＶ５は、他の知られているヒト及びサル血清型だけではなく他のヒト及びサルＡＡＶ血清型と異なる。この観点において、ｒＡＡＶ５の産生は、昆虫細胞における他の血清型の産生とは異なることができる。本発明による方法をｒＡＡＶ５を産生するのに用いる場合、集合的に複数の構築物の場合において、ＡＡＶ５  ＩＴＲを含んでなるヌクレオチド配列を含んでなる１つ以上の構築物は、ＡＡＶ５  Ｒｅｐコード配列を含んでなる（すなわち、ヌクレオチド配列は、ＡＡＶ５  Ｒｅｐ７８を含んでなる）ことが好ましい。このようなＩＴＲ及びＲｅｐ配列は、所望のように改変して、昆虫細胞におけるｒＡＡＶ５又は偽型ｒＡＡＶベクターを効率的に産生することできる。例えば、Ｒｅｐ配列の開始コドンは改変でき、ＶＰスプライス部位は改変できるか又はなくすことができ、及び／又はＶＰ１開始コドン及び隣接するヌクレオチドを改変して昆虫細胞におけるｒＡＡＶ５ベクターの産生を向上させることができる。
【００８１】
組み換えビリオン
別の態様によれば、本発明は、好適なパッケージング細胞における本発明によるウイルスゲノムを発現することにより得ることができるビリオンに関する。
【００８２】
用語「ビリオン」、「組み換えウイルス粒子」及び「ウイルスベクター」は、本明細書では、同義的に使用され、カプシド内にパッケージされたウイルスゲノムを含んでなる感染性複製欠損ウイルス粒子、及び場合によってはカプシドを包囲している脂質エンベロープに関する。
【００８３】
本発明によるビリオンは、ポリオーマビリオン、より好ましくはＳＶ４０ビリオンでよい。本発明によるＳＶ４０ビリオンは、５．２ｋｂの二本鎖環状ＤＮＡゲノムと、ウイルス小染色体を包囲し、３つのウイルスコードタンパク質、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３からなるウイルスカプシドを含んでなる。
【００８４】
別の実施態様によれば、ビリオンが本発明によるＡＡＶベクターのパッケージングにより得られる場合、本発明によるビリオンは、「組み換えＡＡＶビリオン」である。本明細書において用いられている用語「組み換えＡＡＶビリオン」又は「ｒＡＡＶビリオン」は、ＡＡＶ  ＩＴＲと１つ以上のＲｅｐタンパク質が両側に位置している、意図する異種のヌクレオチド配列をカプシドで包んだシェルにおけるＡＡＶタンパク質からなる感染性複製欠損ウイルスを指す。
【００８５】
本明細書において用いられている用語「Ｃａｐプタンパク質」は、天然ＡＡＶＣａｐタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）の少なくとも１つの機能活性を有するポリペプチドを指す。Ｃａｐタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）の機能活性には、例えば、カプシド形成を誘発する能力、一本鎖ＤＮＡの蓄積を容易にする能力、カプシドへのＡＡＶ  ＤＮＡパッケージング（すなわち、カプシド形成）を容易にする能力、細胞受容体に結合する能力、及び宿主細胞へのビリオンの侵入を容易にする能力などがある。好ましい実施態様によれば、Ｃａｐ遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列は、ＡＡＶ８
Ｃａｐ遺伝子に相当する。ＡＡＶビリオンのシェルは、２０面体対称を示し、通常主要Ｃａｐタンパク質、通常Ｃａｐタンパク質のうち最小のもの、及び１つ又は２つの少量のＣａｐタンパク質を含む。
【００８６】
本明細書において用いられている用語「Ｒｅｐタンパク質」は、天然のＡＡＶＲｅｐタンパク質（例えば、Ｒｅｐ４０、５２、６８、７８）の少なくとも１つの機能活性を有するポリペプチドを指す。Ｒｅｐタンパク質（例えば、Ｒｅｐ４０、５２、６８、７８）の「機能活性」は、ＤＮＡ複製のＡＡＶ源の認識、結合及び切断を介したＤＮＡの複製を容易にすることを含む、タンパク質の生理学的機能と関連した活性、さらにはＤＮＡヘリカーゼ活性である。さらなる機能には、ＡＡＶ（又は他の異種の）プロモーターからの転写の調節及び宿主染色体へのＡＡＶ  ＤＮＡの部位特異的組み込みなどが挙げられる。好ましい実施態様によれば、ｒｅｐ遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列は、ＡＡＶ１ｒｅｐ遺伝子に相当する。
【００８７】
当業者には、本発明によるＡＡＶビリオンは、ＡＡＶ血清型からのカプシドタンパク質を含んでなることができることを理解されるであろう。しかしながら、異なる細胞のための既知のＡＡＶ血清型の異なる指向性により、ＡＡＶビリオンは、肝細胞への送達により適しているカプシドタンパク質を含む。肝細胞の形質導入のためには、ＡＡＶ１、ＡＡＶ８及びＡＡＶ５カプシドタンパク質を有するｒＡＡＶビリオンが好ましい（Ｎａｔｈｗａｎｉら、２００７、Ｂｌｏｏｄ  １０９：１４１４−１４２１；Ｋｉｔａｊｉｍａら、２００６、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  １８６：６５−７３）。
【００８８】
さらに、本発明によるＡＡＶゲノムは、Ｓｔｅｍｍｅｒ、Ｗ．Ｐ．Ｃ．、（Ｎａｔｕｒｅ  ２７０：３８９−３９１、１９９４）；Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｄａｎｎｅｒｔら、（Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８：７５０−７５３、２０００）及びＯｒｅｎｅｉｓら、（Ｎａｔ．  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．９：２３８−２４２、２００１）に記載されているように、ＤＮＡシャッフリングにより調製されたＡＡＶゲノムも含む。ＤＮＡ又は遺伝子シャッフリングにより、遺伝子ファミリーのメンバーのランダム断片の作成及びそれらの組み換えで数多くの新しい組み合わせが生じる。ＡＡＶカプシド遺伝子をシャフルするために、以下のことを含むいくつかのパラメータを考慮する必要がある：３つのカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３並びに８つの血清型間の種々の相同性の関与。細胞又は組織特異的指向性の生存ｒｃＡＡＶベクターが得られる可能性を増加するために、例えば、高多様性及び多数の置換を生じるシャッフリングプロトコルが好ましい。キメラｒｃＡＡＶの生成のためのＤＮＡシャッフリングプロトコルとして、例えば、過渡的鋳型（ＲＡＣＨＩＴＴ）でのランダムキメラ形成がある（Ｃｏｃｏ  ら、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９：３５４−３５８、２００１）。
【００８９】
ＲＡＣＨＩＴＴ方法を使用して、２つの異なる血清型（例えば、ＡＡＶ１及びＡＡＶ２）のＡＡＶゲノム由来の２つのＰＣＲ断片を再結合することができる。例えば、ｃａｐ遺伝子の保存領域、同一度が85％、約1ｋｂｐにわたり、全て３つの遺伝子（ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３）についてのコドンを開始することを含む断片を、生体内シャッフリングプロトコルを含むＲＡＴＣＨＩＴＴ又は他のＤＮＡシャッフリングプロトコルを用いてシャッフリングすることができる（米国特許第５，０９３，２５７号；Ｖｏｌｋｏｖら、ＮＡＲ２７：ｅ１８、１９９９；及びＷａｎｇ  Ｐ．Ｌ．、Ｄｉｓ．  Ｍａｒｋｅｒｓ  １６：３−１３、２０００）。得られた組み合わせキメラライブラリーは、好適なＡＡＶ  ＴＲ含有ベクター（例えば、ｐＴＲ−ＡＡＶ２）にクローニングして、ＷＴ  ＡＡＶゲノムのそれぞれの断片を置き換えることができる。ランダムクローンを配列決定し、ベクターＮＴＩ７  Ｓｕｉｔｅ  ＳｏｆｔｗａｒｅのＡｌｉｇｎＸアプリケーションを用いて、親ゲノムと整列することができる。配列決定及び整列から、１Ｋｂｐ遺伝子当たりの交叉型組み換え数を求めることができる。別法として、ＡＡＶゲノムの可変領域を、本発明による方法を用いてシャッフリングすることができる。例えば、突然変異は、ＶＰ３において粒子表面ループを形成しうるＡＡＶの２つのアミノ酸クラスター（アミノ酸５０９−５２２および５６１−５９１）内で生成できる。この低相同性ドメインをシャッフリングするために、親の相同性とは無関係である組み換えプロトコル（Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：１２０５−１２０９、１９９９；Ｌｕｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ９８：１１２４８−１１２５３、２００１）及びＬｕｔｚら、（ＮＡＲ  ２９：Ｅ１６、２００１）又は低相同性のＤＮＡ断片をアニールし、組み換えるように改良されたＲＡＣＨＩＴＴプロトコルを利用することができる。
【００９０】
組み換えライブラリーは、ループを形成することが可能であり、粒子表面に露出して細胞表面受容体と相互作用するカプシド遺伝子の特定の位置への短ランダム化オリゴヌクレオチドの挿入を用いて構成することもできる（例えば、ＡＡＶ２におけるアミノ酸５０９−５２２及び５６１−５９１）（Ｘｉｅら、２００２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９９：１０４０５−１０４１０）。このようなライブラリーを使用して、新たな細胞／組織指向性のビリオンを選択することができる。ビリオンの選択は、図１Ｂ及び１Ｃに記載されているプロトコルを含む。
【００９１】
オリゴヌクレオチド合成、ランダムペプチド挿入及びＲＡＴＣＨＩＴＴ方法を退行することに加えて、ＡＡＶカプシド突然変異を作る方法も、使用することもできるであろう。別法として、例えば、部位特異的突然変異誘発（Ｗｕら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：５９１９−５９２６）；分子育種、核酸、エクソン及びＤＮＡファミリーシャッフリング（Ｓｏｏｎｇら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２５：４３６−４３９、２０００；Ｃｏｃｏら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２００１；１９：３５４；並びに米国特許第５，８３７，４５８号；第５，８１１，２３８号；及び６，１８０，４０６；Ｋｏｌｋｍａｎ及びＳｔｅｍｍｅｒ、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９：４２３−４２８、２００１；Ｆｉｓｃｈら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ９３：７７６１−７７６６、１９９６；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：２５９−２６４、１９９９）；リガンドの挿入(Ｇｉｒｏｄら、Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．９：１０５２−１０５６、１９９９）；並びにカセット突然変異誘発（Ｒｕｅｄａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２６３：８９−９９、１９９９；Ｂｏｙｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ６６：１０３１−１０３９、１９９２）などがある。ＡＡＶカプシド遺伝子の突然変異解析については、Ｗｕら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：８６３５−８６４７、２０００及びＲａｂｉｎｏｗｉｔｚら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２６５；２７４−２８５、１９９９を参照されたい。
【００９２】
改変「ＡＡＶ」配列も、例えば、昆虫細胞におけるｒＡＡＶベクターの産生のために、本発明に関連して使用できる。このような改変配列は、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８又はＡＡＶ９  ＩＴＲ、Ｒｅｐ若しくはＶＰに対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又はそれ以上のヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列同一性を有する配列（例えば、約７５〜９９％ヌクレオチド配列同一性を有する配列）を含み、野生型ＡＡＶ  ＩＴＲ、Ｒｅｐ又はＶＰ配列の代りに使用できる。
【００９３】
Ｒｅｐ（Ｒｅｐ７８／６８及びＲｅｐ５２／４０）コード配列は、いずれのＡＡＶ血清型由来でもよいが、好ましくはＡＡＶｌ、ＡＡＶ２及び／又はＡＡＶ４由来のものである。しかしながら、本発明に関連して使用されるＶＰｌ、ＶＰ２及びＶＰ３  カプシドタンパク質をコードする配列は、既知の４２の血清型、好ましくはＡＡＶｌ、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６又はＡＡＶ８から得てもよい。
【００９４】
また、本発明は、カプシドと組み換えウイルスゲノムとを含んでなり、外因性標的配列が天然カプシドに挿入又は代入されたビリオンも意図している。ビリオンは、外因性標的配列をカプシドへ置換又は挿入することにより標的とされる（すなわち、特定の細胞型を対象とする）ことが好ましい。あるいは、外因性標的配列は、ビリオンに対して変更された指向性を付与することが好ましい。さらにあるいは、標的配列は細胞への標的ベクターの送達効率を増加する。
【００９５】
外因性標的配列は、１つのカプシドサブユニット、あるいは複数のカプシドサブユニットの一部又は全てを置き換えるものでもよい。さらにあるいは、複数の外因性標的配列（例えば、２、３、４、５又はそれ以上の配列）をビリオンカプシドに導入してもよい。別の実施態様によれば、小カプシドサブユニット（例えば、ＡＡＶのＶｐ１及びＶｐ２）内での挿入又は置換が好ましい。ＡＡＶカプシドについて、Ｖｐ２又はＶｐ３における挿入又は置換も好ましい。
【００９６】
より好ましい実施態様によれば、外因性標的配列は、ビリオンカプシド内に挿入又は置換されてビリオンの指向性を変更する、ペプチド又はタンパク質をコードするアミノ酸配列でもよい。天然ビリオンの指向性は、アミノ酸配列の挿入又は置換により減少又はなくすこともできる。あるいは、外因性アミノ酸配列の挿入又は置換により、ビリオンを特定の細胞型に対する標的としてもよい。外因性標的配列は、ビリオンの指向性を変更するタンパク質又はペプチドをコードするいずれのアミノ酸配列でもよい。特定の実施態様によれば、標的ペプチド又はタンパク質は、天然あるいは完全又は部分的に合成したものでよい。典型的なペプチド及びタンパク質として、リガンド及び肝細胞に存在する細胞表面受容体に結合する他のペプチド、例えば、Ａｐｏｌｉｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ、ガラクトース及びラクトース特異的レクチンのＳｒ−Ｂ１受容体を結合することができるリガンド、低密度リポタンパク質受容体リガンド、アシアログリコプロテイン（ガラクトース−末端）リガンドなどがある。
【００９７】
あるいは、外因性標的配列は、抗体又はその抗原認識部分でもよい。本明細書において用いられている用語「抗体」は、全ての種類の免疫グロブリン、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥを指す。抗体は、モノクローナル抗体でも、ポリクローナル抗体でもよく、いずれの原種、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ウマ又はヒトでもよく、又はキメラ抗体でもよい。また、用語「抗体」には、当業者には知られている二重特異性又は「架橋」抗体が含まれる。本発明の範囲内の抗体断片には、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ‘）２及びＦｃ断片、並びにＩｇＧ以外の抗体からえられる対応の断片などがある。
【００９８】
ビリオンカプシドに挿入された外因性アミノ酸配列は、ビリオンの精製又は検出を容易にするものでよい。本発明のこの態様によれば、外因性アミノ酸配列も、改変パルボウイルスのビリオンを変更する必要がない。例えば、外因性アミノ酸配列は、当業者に知られているニッケルカラムでビリオンを精製するのに有用であるポリヒスチジン配列、又は標準免疫精製法によりビリオンを精製するのに用いることができる抗原性ペプチド又はタンパク質を含むことができる。あるいは、アミノ酸配列は、アフィニティー精製又は当該技術分野において知られているいずれかの他の方法（例えば、サイズ、密度、電荷若しくは等電点の差に基づく精製法、イオン交換クロマトグラフィー又はペプチドクロマトグラフィー）により、改変されたビリオンを精製するのに使用されることができる受容体リガンド又はいずれかの他のペプチド又はタンパク質をコードしていてもよい。
【００９９】
パルボウイルス小Ｃａｐサブユニット内、例えば、ＡＡＶ  Ｖｐ１及びＶｐ２サブユニット内に外因性アミノ酸配列を挿入することが好ましい。あるいは、Ｖｐ２又はＶｐ３における挿入が好ましい。
【０１００】
好ましいＡＡＶビリオンを改変して、Ｒｕｓｓｅｌｌ（２０００、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８１：２５７３−２６０４）により検討されているように、又はＵＳ２００８０００８６９０並びにＺａｌｄｕｍｂｉｄｅ及びＨｏｅｂｅｎ（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、２００８：２３９−２４６）に記載されているようにして、宿主反応を減少させる。
【０１０１】
好ましい実施態様によれは、本発明によるビリオンは、肝臓特異的プロモーターに作動可能に連結したＩＧＦ−Ｉ又はその機能的に同等の変異体をコードするヌクレオチド配列を含んでなるウイルスゲノムを含んでなる。さらに別の実施態様によれば、肝臓特異的プロモーターは、アルブミン遺伝子エンハンサー領域及びアルファ１−アンチトリプシンプロモーターを含んでなる。別の実施態様によれば、ＩＧＦ−Ｉは、ヒトＩＧＦ−Ｉである。
【０１０２】
治療法
本発明者らは、ＣＣｌ４誘発肝硬変を患っている動物にウイルスベクターを投与すると、生化学的肝臓検査（血清ＡＳＴ、ＡＬＴ、ＡＬＰ及びビリルビンの減少並びに血清アルブミンの増加）及び組織化学的観察（実施例３及び１０参照）により測定したときに肝機能が顕著に改善されることを見出した。さらに、本発明によるビリオンは、硬変した肝臓におけるフィブロリシスの誘発（実施例４及び１１参照）及びプロフィブロジェニック因子の減少（実施例５及び１２参照）を生じる。
【０１０３】
したがって、別の態様によれば、本発明は、薬剤として使用される本発明によるビリオンに関する。別の態様によれば、本発明は、本明細書において上記したビリオンを含んでなる医薬組成物に関する。医薬組成物は、さらに好ましくは薬学的に許容しうる担体を含んでなる。いずれかの好適な薬学的に許容しうる担体又は賦形剤を、本発明の組成物に使用できる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ（編者）Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９７年４月参照）。好ましい医薬の剤形は、無菌食塩水、デキストロース溶液、緩衝液又は他の薬学的に許容しうる無菌液を組み合わせたものである。あるいは、固体担体、例えば、微小担体ビーズは、そのまま使用してもよい。
【０１０４】
さらに別の態様によれは、本発明は、必要としている被検者に、本発明によるビリオンを投与することを含んでなる、肝硬変又は肝線維症の治療及び／又は予防に関する。
【０１０５】
別の態様によれば、本発明は、肝硬変又は肝線維症の予防及び／又は治療用薬剤の製造のための、本発明によるビリオンの使用に関する。
【０１０６】
さらに別の態様によれば、本発明は、肝硬変又は肝線維症の治療及び／又は予防に使用される、本発明によるビリオンに関する。
【０１０７】
本明細書において用いられている用語「肝硬変」は、肝臓組織が線維性瘢痕組織及び再生結節により置き換えられるため、肝臓がゆっくりと劣化し機能不全となる状態に関する。これにより、肝臓を介して血液の流れの部分的な障害、さらに感染を制御し、血液からバクテリア及び毒素を除去し、栄養素、ホルモン及び薬物を処理し、血液凝固を調節するタンパク質を生成し、脂肪含有コレステロール及び脂肪可溶ビタミンを吸収しやすくする胆汁を製造する肝臓の能力に障害を生じる。本発明の治療方法は、種々の原因の肝硬変、例えば、アルコール関連肝硬変、慢性肝炎Ｃ、Ｂ又はＤ、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、自己免疫性肝炎、原発性又は続発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、遺伝疾患、例えば、嚢胞性線維症、アルファ１アンチトリプシン欠乏症、ヘモクロマトーシス、ウィルソン病、ガラクトース血症及びグリコーゲン蓄積症の治療に好適である。
【０１０８】
本明細書において用いられている用語「肝線維症」は、コラーゲンなどの細胞外のマトリックスタンパク質の肝臓における蓄積の増加により特徴付けられる状態に関し、メタビア（ｍｅｔａｖｉｒ）スコアシステムによる線維化スコア１（最小瘢痕）、２（瘢痕が生じ、血管を含む肝臓における領域の外に延びている）、３（架橋線維症が広がり、線維症を含む他の領域に接続している）又は４（肝硬変又は肝臓の進行した瘢痕）；又はＫｎｏｄｅｌｌスコアによるスコア１−４、５−８、９−１２又は１３−１８を含む。
【０１０９】
ビリオンの量及びこの組成物の投与の時間は、本開示の利点を認識した当業者には明らかであろう。実際のところ、本発明者らは、本発明によるビリオンの治療に有効な量を投与することは、単一投与、例えばこのような治療を受ける患者に治療効果を得るのに十分な数の感染性粒子を一回注射することによりなされると考えている。あるいは、ある状況では、ビリオン組成物を、この組成物の投与を監督している医療従事者により決定されるであろう、比較的短期間又は比較的長期間にわたる、複数回又は連続投与が望ましい。例えば、哺乳動物に投与した感染性粒子数は、治療されている特定疾患又は障害の治療を達成するのに必要とされる単回投与としてか、あるいは２回以上の投与に分割して、約１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３又はそれ以上の感染性粒子／ｍｌであることができる。実際に、一定の実施態様によれば、２種以上の異なるビリオンベクター組成物を、単独か又は１種以上の治療薬剤と組み合わせて投与して、所望の特定の治療レジメン効果を得ることが好ましいことがある。ほとんどのビリオン系遺伝子療法レジメンにおいて、本発明者らは、ＩＧＦ−Ｉ又はその機能的に同等の変異体の発現を制御するために肝臓特異的プロモーターを使用することにより、従来の遺伝子療法プロトコルと比較して、本発明によるビリオンを用いたときには、より低い力価の感染性粒子が必要されることになると考えている。
【０１１０】
本発明の特に好ましい実施態様によれば、目的とするヌクレオチド配列は、対象の肝臓に送達される。肝臓への投与は、当該技術分野において知られている方法、例えば、静脈投与、門脈内投与、胆管内投与、動脈内投与及び肝実質への直接注射（これらには限定されない）によりおこなうことができる。好ましい実施態様によれば、ビリオンオンは、動脈内投与される。さらに好ましい実施態様によれば、動脈内投与は肝動脈を介して実施される。
【０１１１】
ＩＧＦ−Ｉをコードするパルボウイルスベクターを用いた肝硬変及び線維症の予防方法及び／又は治療方法
本発明者らが得た結果から、ＩＧＦ−Ｉコード配列を含んでなる組み換えパルボウイルスビリオンを投与すると、動物肝硬変モデルにおいて肝機能が改善されることが明らかとなった（実施例３〜６及び１０〜１４参照）。さらに、他のウイルスベクターで観察された結果は、ＩＧＦ−Ｉは、疾患の発生前に適用すると、疾患の進行を遅らせることを示している。したがって、本発明によるビリオンは、肝硬変又は肝線維症の発生を予防することにも適する。
【０１１２】
したがって、別の態様によれば、本発明は、医薬として使用するため、より好ましくは肝硬変又は肝線維症の治療及び／又は予防に使用するための、ＩＧＦ−Ｉ又はその機能的に同等の変異体をコードする配列を含んでなる組み換えパルボウイルスに関する。
【０１１３】
別の態様によれば、本発明は、肝硬変又は肝線維症の治療及び／又は予防用薬剤の調製のための、ＩＧＦ−Ｉ又はその機能的に同等の変異体をコードする配列を含んでなる組み換えパルボウイルスの使用に関する。
【０１１４】
別の実施態様によれば、本発明は、必要としている被検者に、ＩＧＦ−Ｉ又はその機能的に同等の変異体をコードする配列を含んでなる組み換えパルボウイルスを投与することを含んでなる肝硬変又は肝線維症の治療方法に関する。
【０１１５】
本明細書において用いられている用語「治療」は、このような用語が適用される障害若しくは状態、又はこのような障害若しくは状態の１つ以上の症状の進行を回復、軽減、又は抑制する作用を指す。
【０１１６】
本明細書において用いられている用語「予防」は、このような用語が使われる疾患、障害や状態の発症若しくは再発、又は疾患、障害や状態と関連した１つ以上の症状が発生、存在しないようにしたり、遅延させたりする作用を指す。
【０１１７】
用語「肝硬変」及び「肝線維症」については、既に詳細に説明した。
【０１１８】
用語「パルボウイルス」も、本発明によるウイルスベクターとの関連で、既に詳細に説明した。好ましくは、パルボウイルスは、アデノ関連性ウイルスである。さらに好ましくは、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２及び／又はＡＡＶ４由来であるＩＴＲが側に位置するＩＧＦ−Ｉ又はその機能的に同等の変異体をコードする配列を含んでなるゲノムを含んでなる。さらにより好ましい実施態様によれば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２及び／又はＡＡＶ４で偽型化したＡＡＶ１、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６又はＡＡＶ８である。すなわち、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６又はＡＡＶ８由来のｃａｐタンパク質を含有する。好ましい実施態様によれば、組み換えパルボウイルスは、一本鎖パルボウイルス、好ましくは一本鎖ＡＡＶである。別の好ましい実施態様によれば、組み換えパルボウイルスは、二本鎖パルボウイルス、好ましくは二本鎖ＡＡＶである。
【０１１９】
用語「ＩＧＦ−Ｉ」は、本発明によるウイルスベクターに言及しながら、既に詳細に説明した。好ましい実施態様によれば、ＩＧＦ−Ｉは、ヒトＩＧＦ−Ｉである。
【０１２０】
ＩＧＦ−Ｉ又はその機能的に同等の変異体をコードする配列は、プロモーター領域に作動可能に連結したものでよい。本発明の治療法に使用されるビリオンに使用するのに好適なプロモーターには、構成プロモーター及び肝臓特異的プロモーターを含む肝臓細胞における下流配列の転写を活性化することができるプロモーターが含まれる。肝臓における異種の配列の発現に好適な構成プロモーターには、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＴＲ）のプロモーター、アデノシンデアミナーゼのプロモーター、ピルビン酸キナーゼのプロモーター、β−アクチンのプロモーター、鎖延長因子１アルファ（ＥＦ１）プロモーター、ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ユビキチン（Ｕｂｃ）プロモーター、アルブミンプロモーター、中間フィラメント（デスミン、ニューロフィラメント、ケラチン、ＧＦＡＰ等）のプロモーター及び他の構成プロモーターなどがあるが、これらには限定されない。真核細胞において構成的に機能する典型的なウイルスプロモーターには、例えば、ＳＶ４０初期プロモーター領域（Ｂｅｒｎｏｉｓｔ及びＣｈａｍｂｏｎ、１９８１、Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４−３１０）、ラウス肉腫ウイルスの３’の長い末端反復に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９８０、Ｃｅｌｌ  ２２：７８７−７９７）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４１−１４４５）などがある。
【０１２１】
好ましい実施態様によれば、ＩＧＦ−Ｉ又はその機能的に同等の変異体をコードする配列に作動可能に連結しているプロモーターは、肝臓特異的プロモーターである。より好ましい実施態様によれば、肝臓特異的プロモーターは、アルブミン遺伝子エンハンサー領域とアルファ１−アンチトリプシンプロモーターとを含んでなるハイブリッドプロモーターである。別の好ましい実施態様によれば、肝臓特異的プロモーターは、誘発性肝臓特異的プロモーターである。
【０１２２】
本発明の治療方法には、ビリオン／ウイルス粒子とともにインキュベーションすることにより細胞に形質導入することによって、ＩＧＦ−Ｉ又はその機能的に同等の変異体をコードするパルボウイルスビリオンを投与することが含まれる。細胞は生物に存在するものでよく、この場合、細胞は、針注射、ジェット式注射又は粒子ガンにより到達可能であるものである。一方、形質導入される細胞は、生物から単離され、生物外で感染し、その後再び生物に戻してもよい。このような細胞は、自己細胞と称される。さらに、生物に関して、形質導入のために、同種異系細胞を使用することもできる。これに関連して、これらの細胞が生物に対応するＨＬＡ型に属するのが好ましい。当業者には、一定のＨＬＡ型を有する細胞を提供する方法が知られている。ビリオン調製の好ましい力価は、通常１０７〜１０９感染性ウイルス／ｍｌである。
【０１２３】
本発明は、獣医及び医療いずれにも使用できる。好適な対象には、鳥類及び哺乳動物の両方が含まれ、哺乳動物が好ましい。本明細書において用いられている用語「鳥類」として、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、シチメンチョウ及びキジなどがあげられるが、これらには限定されない。本明細書において用いられている用語「哺乳動物」として、ヒト、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギなどが挙げられるが、これらには限定されない。対象として、ヒトが最も好ましい。ヒト対象として、胎児、新生児、幼児、若年者、大人が挙げられる。
【０１２４】
したがって、本発明の主題は、本発明によるパルボウイルス粒子、好ましくはＡＡＶ粒子を含んでなる薬剤にも関する。ここで、薬剤は、薬学的に許容しうる担体をさらに含んでいてもよい。このような薬剤の好適な担体及び剤形は、当業者に知られている。好適な担体は、例えば、リン酸緩衝食塩水、水、エマルジョン、例えば、油／水エマルジョン、湿潤剤、滅菌溶液等を含んでなる。担体の種類は、プラスミド及び／又はパルボウイルス粒子をパッケージングしている本発明によるパルボウイルスベクターをどのように投与するかに依存する。好適な用量は、主治医により決定され、種々の因子、患者の年齢、性別及び体重、疾患の重症度、投与の種類などに依存する。プラスミド及び／又は粒子をパッケージングしている本発明によるパルボウイルスベクターにより、ほとんどの異なる細胞、例えば、角膜上皮又は筋肉細胞の一次細胞で、高形質導入率を得ることができる。
【０１２５】
本発明によるパルボウイルス粒子を、それを必要としているヒト被検者又は動物に投与することは、ウイルスベクターを投与するための当該技術分野において公知の手段により行うことができる。典型的な投与形態として、経口、直腸、経粘膜、局所、経皮、吸入、非経口（例えば、静脈内、皮下、皮内、筋肉内及び関節内）投与等、さらには直接組織又は器官注射、あるいは鞘内、直接筋肉内、心室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内又は眼内注射などがある。注射物質は、注射前の液体における液剤又は懸濁剤に好適な溶液又は懸濁液、固形物してか、又は乳剤として、従来の形態で調製できる。あるいは、例えば、貯蔵又は持続放出製剤において、全身ではなく局所的にウイルスを投与してもよい。
【０１２６】
本発明の特に好ましい実施態様によれば、目的とするヌクレオチド配列は、対象の肝臓に送達される。肝臓への投与は、当該技術分野において知られているいずれかの方法、例えば、静脈内投与、門脈内投与、胆管内投与、動脈内投与、肝実質への直接注射（これらには限定されない）などによりおこなうことができる。好ましい実施態様によれば、ビリオンを、動脈内に投与する。さらに好ましい実施態様によれば、動脈内投与を、肝動脈を介して実施する。
【０１２７】
本発明によるパルボウイルス粒子の用量は、投与形態、個々の対象の状態、特定のウイルスベクター及び送達される遺伝子に依存し、通常の方法で決定できる。治療効果を得るための典型的な用量は、少なくとも約１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４の形質導入単位又はそれ以上、好ましくは約１０８〜１０１３形質導入単位、さらに好ましくは１０１２形質導入単位のウイルス力価である。
【０１２８】
本発明の特定の実施態様によれば、複数回の投与（例えば、２回、３回、４回又はそれ以上の回数の投与）により、治療レベルの遺伝子発現を達成してもよい。この実施態様によれば、そして上記したように、各投与により抗体を中和する効果を防止する種々の抗原特性を有するパルボウイルスベクターを使用することが好ましい。
【０１２９】
組み換えＡＡＶビリオンを調製する方法
さらに本発明の別の態様によれば、組み換えＡＡＶビリオンの製造方法であって、
細胞と、
（ａ）ｉ．ＩＧＦ−Ｉ又はその機能的に同等の変異体をコードし、肝臓特異的プロモーターに作動可能に連結した配列を含んでなる発現カセットと、
ｉｉ．（ｉ）で定義されている発現カセットの側に位置しているＡＡＶ  ５’−ＩＴＲ  及び３’−ＩＴＲと、
を含んでなる第１核酸配列と、
（ｂ）ＡＡＶｒｅｐタンパク質をコードする第２核酸配列と、
（ｃ）ＡＡＶｃａｐタンパク質をコードする第３核酸配列と、そして任意の
（ｄ）ＡＡＶが複製用に従属するウイルス性及び／又は細胞機能をコードする第４核酸配列とを、
前記細胞に前記の三つ又は四つの成分が侵入するのに適切な条件下で接触させる工程と、
前記細胞から前記組み換えＡＡＶビリオンを回収する工程と
を含んでなる方法が提供される。
【０１３０】
組み換えＡＡＶビリオンを製造する方法の工程（ｉ）は、
細胞と、
（ａ）ｉ．ＩＧＦ−Ｉ又はその機能的に同等の変異体をコードし、肝臓特異的プロモーターに作動可能に連結した配列を含んでなる発現カセットと、
ｉｉ．（ｉ）で定義されている発現カセットの側に位置しているＡＡＶ  ５’−ＩＴＲ及び３’−ＩＴＲと、
を含んでなる第１核酸配列と、
（ｂ）ＡＡＶｒｅｐタンパク質をコードする第２核酸配列と、
（ｃ）ＡＡＶｃａｐタンパク質をコードする第３核酸配列と、そして任意の
（ｄ）ＡＡＶが複製用に従属するウイルス性及び／又は細胞機能をコードする第４核酸配列とを、
前記細胞に前記三つ又は四つの成分が侵入するのに適切な条件下で接触させることを含んでなる。
【０１３１】
第一の核酸配列を構成する要素は、実質的に本発明によるウイルスベクターと関して既に説明した通りのものである。好ましい実施態様によれば、第一の核酸配列は、ＩＧＦ−Ｉ又はその機能的に同等の変異体をコードする配列の下流に位置するポリアデニル化信号をさらに含んでなる。好適なポリアデニル化信号は、先に述べた通りである。一例として、ポリアデニル化信号は、ＳＶ４０ポリアデニル化信号である。
【０１３２】
肝臓特異的プロモーターは、上記したいずれかのプロモーターであることができる。好ましい実施態様によれば、肝臓特異的プロモーターは、アルブミンエンハンサー領域と、α１−アンチトリプシンのプロモーターとを含んでなるハイブリッドプロモーターである。別の好ましい実施態様によれば、肝臓特異的プロモーターは、誘発性肝臓特異的プロモーターである。
【０１３３】
パッケージングを容易にするために組み換えベクターゲノムは、一般的に野生型ゲノムのサイズの約８０％〜約１０５％であり、適切なパッケージングシグナルを含んでなる。ＡＡＶカプシドへのパッケージングを容易にするために、ゲノムは、好ましくはサイズが約５．２ｋｂ以下である。他の実施態様によれば、ゲノムは、好ましくは長さが約３．６、３．８、４．０、４．２又は４．４ｋｂを超え及び／又は長さが約５．４、５．２、５．０又は４．８ｋｂ未満である。あるいは、異種のヌクレオチド配列は、典型的にはＡＡＶカプシドによる組み換えゲノムのパッケージングを容易にするために、長さが約５ｋｂ未満（より好ましくは約４．８ｋｂ未満、さらに好ましくは長さが約４．４ｋｂ未満、さらにより好ましくは長さが約４．２ｋｂ未満）である。
【０１３４】
本発明によるビリオンの製造に必要とされる第２核酸配列及び第３核酸配列は、いわゆる「ＡＡＶヘルパー機能」であり、主要ＡＡＶ  ＯＲＦＳ、すなわち、ｒｅｐ及びｃａｐコード領域又はそれらの機能的相同体の１つ又は両方を含んでなる。本発明の方法に使用されるｒｅｐ及びｃａｐタンパク質をコードする好適な核酸配列は、本発明によるビリオンに関して先に詳細に説明した通りである。
【０１３５】
しかしながら、当業者は、第１、第２、及び第３核酸配列を、種々の組み合わせで２以上の配列上に提供できることを理解されるであろう。本明細書において用語「ベクター」には、適切な制御要素と関連したときに複製でき、細胞間で遺伝子配列を移送することができる、遺伝子要素、例えば、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミッド、染色体、人工染色体、ウイルス、ビリオン等などが含まれる。したがって、この用語には、クローニング及び発現ビヒクル、さらにはウイルスベクターが含まれる。
【０１３６】
あるいは、ＡＡＶｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子は、遺伝子を安定的に発現するパッケージング細胞により提供できる（例えば、Ｇａｏら、（１９９８）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ９：２３５３；Ｉｎｏｕｅら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：７０２４；米国特許第５，８３７，４８４号；ＷＯ９８／２７２０７；米国特許第５，６５８，７８５；ＷＯ９６／１７９４７参照）。
【０１３７】
好ましい実施態様によれば、第２及び第３ポリヌクレオチドは、通常ＡＡＶヘルパー機能ベクターと称される単一ベクターにおいて提供してもよい。本明細書で使用されるのに好適なベクターとしては、例えば、米国特許第６，００１，６５０号に記載されているｐＨＬＰ１９及び米国特許第６，１５６，３０３号に記載されているｐＲｅｐ６ｃａｐ６ベクターなどがある（これらの特許に開示されている事項の全体は、引用することによりその全体が本明細書の開示の一部とされる）。
【０１３８】
他の特定の実施態様によれば、第２及び第３核酸配列は、ＡＡＶＲｅｐ及び／又はカプシドタンパク質をコードするハイブリッドヘルパーウイルスであってもよいアデノウイルスヘルパーウイルスの形態である。ＡＡＶｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子を発現するハイブリッドヘルパーＡｄ／ＡＡＶベクター及びこれらの試薬を用いたＡＡＶストックを製造する方法は、当該技術分野において知られている（例えば、米国特許第５，５８９，３７７号；米国特許第５，８７１，９８２号、米国特許第６，２５１，６７７号；及び米国特許第６，３８７，３６８号参照）。好ましくは、本発明によるハイブリッドＡｄは、ＡＡＶカプシドタンパク質（すなわち、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３）を発現する。あるいは又はさらに、ハイブリッドアデノウイルスは、ＡＡＶＲｅｐタンパク質の１つ以上を発現できる（すなわち、Ｒｅｐ４０、Ｒｅｐ５２、Ｒｅｐ６８及び／又はＲｅｐ７８）。ＡＡＶ配列は、組織特異的又は誘発可能プロモーターと作動可能に関連させることができる。
【０１３９】
別の特定の実施態様によれば、組み換えＡＡＶビリオンの調製に使用される細胞は昆虫細胞であり、第１、第２及び第３核酸配列はバキュロウイルスベクターに含まれる。
【０１４０】
好ましい実施態様によれば、この方法により製造される組み換えＡＡＶビリオンは、一本鎖ＡＡＶビリオンである。別の好ましい実施態様によれば、製造される組み換えＡＡＶビリオンは、二本鎖ＡＡＶビリオンである。
【０１４１】
異なる核酸配列は、細胞に前記核酸配列が侵入するのに適切な条件下で、細胞と接触させられる。この目的に好適な多数のトランスフェクション法は、一般的に当該技術分野において知られており、リン酸カルシウム共沈、培養細胞への直接マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソーム介在遺伝子導入、脂質介在形質導入、及び高速ミクロプロジェクタイルを用いた核酸伝達等がある。
【０１４２】
成分（ｄ）は、ＡＡＶが複製のために依存する非ＡＡＶ由来ウイルス及び／又は細胞機能（すなわち、「アクセサリー機能」）をコードする核酸配列を含んでなる。アクセサリー機能には、ＡＡＶ複製のために必要とされる機能、例えば、ＡＡＶ遺伝子導入の活性化、時期特異的ＡＡＶ  ｍＲＮＡスプライシング、ＡＡＶ  ＤＮＡ複製、ｃａｐ発現産物の合成及びＡＡＶカプシドアセンブリーに関与している部分（これらには限定されない）などがある。ウイルス系アクセサリー機能は、既知のヘルパーウイルス、例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス型１以外）及びワクチンウイルスから得ることができる。
【０１４３】
あるいは、成分（ｄ）の核酸配列は、パッケージング細胞によりエピソーム的に実施したり、及び／又はパッケージング細胞のゲノムに組み込まれたりしてもよい。アクセサリー機能は、上記した第４核酸（成分（ｄ））とパッケージング細胞との間に分配できる。
【０１４４】
アデノウイルスは多数の異なるサブグループを含むが、サブグループＣ（Ａｄ５）のアデノウイルス型５が最も一般的に使用される。ヒト、非ヒト哺乳動物及び鳥類オリジンの非常に多くのアデノウイルスが知られており、ＡＴＣＣなどの寄託機関から入手可能である。
【０１４５】
通常「ヘルパーウイルス」と称されるウイルスＤＮＡ配列として第４ヌクレオチド配列を提供することもできる。本発明による好適なヘルパーウイルスは、例えば、ドイツ国特許出願１９６  ４４  ５００．０−４１に記載されており、これらは、例えば、ヘルパーウイルスＤＮＡ配列として、Ｅ１領域を除く完全アデノウイルス５配列を含んでなるプラスミドｐＴＧ９５８５のこの特許出願に開示されているＤＮＡ配列も含んでなる。
【０１４６】
ヘルペスウイルスＤＮＡを構成する配列は、通常「ＡＡＶベクターパッケージングプラスミド」と称されるベクターに組み込まれてもよい。また、パッケージングプラスミドは、ｐＴＧ９５８５におけるものとは、特にヌクレオチド１６６１４−１８６６９の領域において、Ａｄ５配列の構造遺伝子Ｌ１が欠失している点で異なるヘルパーウイルスＤＮＡ配列を含むこともできる。
【０１４７】
アクセサリーウイルスＤＮＡ配列は、好ましくはヘルペスウイルス又はアデノウイルスから得られたものであり、アデノウイルス５（Ａｄ５）が好ましい。
【０１４８】
特に好ましい実施態様によれば、本発明によるＡＡＶベクターパッケージングプラスミドは、ヘルパーウイルスＤＮＡ配列として、例えば、ドイツ国特許出願１９６  ４４  ５００．０−４１に記載されているｐＤＧプラスミドから得ることができ、各起源プロモーターによるか又は異種のプロモーターにより制御される、Ａｄ５遺伝子Ｅ２Ａ、Ｅ４及びＶＡを含有する。
【０１４９】
さらに、ＡＡＶベクターパッケージングプラスミドは、標的細胞にＡＡＶベクターパッケージングプラスミドをうまく導入するように、検出可能な発現型マーカーをコードする遺伝子を含有してもよい。さらに好ましい実施態様によれば、したがって、本発明によるＡＡＶベクターパッケージングプラスミドは、マーカータンパク質、好ましくは蛍光タンパク質の発現用発現カセットをさらに含有する。これに関連して、用語「発現カセット」は、例えば、蛍光遺伝子をコードする遺伝子と、この遺伝子を制御する好適なプロモーターと、ポリアデニル化信号との組み合わせを指す。これにより、容易に所望の標的細胞のトランスフェクションが提供される。蛍光タンパク質をコードする好適な遺伝子は、例えば、ＲＦＰ−（赤）、ＧＦＰ−（緑）、ＣＦＰ−（シアン）及びＹＦＰ−（黄色）遺伝子であり、ＲＦＰ−（赤）（Ｄｓｒｅｄ−ｃＤＮＡ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が好ましい。好適なプロモーターは、例えば、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター及びＨＳＶ（単純ヘルペスウイルス）ｔｋプロモーターであり、ＲＳＶプロモーターが好ましい。この発現カセットを、ＡＡＶベクターパッケージングプラスミドの、当業者により容易に決定できる好適な部位、好ましくはｃａｐ遺伝子の３’端と、例えば、ＣｌａＩ開裂部位におけるアデノウイルスＶＡ遺伝子の開始との間に挿入される。このＣｌａＩ開裂部位は、ｐＤＧに存在する。
【０１５０】
別の特に好ましい実施態様によれば、本発明は、ＡＡＶベクターパッケージングプラスミドに関し、ＡＡＶ発現ベクターＤＮＡ配列はＣＭＶプロモーターの制御下のＨＰＶ１６−Ｌ１コードＤＮＡ配列を含有する。ｐＤＳ２−Ｌｈ１と称されるこのようなＡＡＶベクターパッケージングプラスミドは、２００１年７月１７日のブタペスト条約の規定に基づき、ドイツ国ＢｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇにあるＤＳＭＺ［Ｇｅｒｍａｎ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ］に、ＤＳＭ  １４４０６で寄託された。このようなプラスミドは、全ての必要とするアクセサリー機能又は必要な機能の一部分のみを有していてもよい。一部分のみを有する場合、残りのアクセサリー機能は、パッケージング細胞により提供されてもよい。
【０１５１】
別の方法によれば、本発明によるＡＡＶビリオンは、
（ｉ）ｉ．ＩＧＦ−Ｉ又はその機能的に同等の変異体をコードし、肝臓特異的プロモーターに作動可能に連結した配列を含んでなる発現カセットと、
ｉｉ．（ｉ）で定義されている発現カセットの側に位置しているＡＡＶ  ５’−ＩＴＲ及び３’−ＩＴＲと
を含んでなる第一核酸配列を、
ＡＡＶカプシドタンパク質を含んでなる組成物と接触させる工程と、
（ｉｉ）前記混合物から組み換えＡＡＶビリオンを回収する工程と
を含んでなる方法により製造してもよい。
【０１５２】
ＡＡＶビリオンを製造する別の方法は、昆虫細胞系システムを使用する。バキュロウイルス発現システムは、真核生物クローニング及び発現ベクターとして使用されることは周知である（Ｋｉｎｇ、Ｌ．Ａ．、及びＲ．Ｄ．Ｐｏｓｓｅｅ、１９９２、「Ｔｈｅ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（バキュロウイルス発現システム）」、Ｃｈａｐｍａｎ及びＨａｌｌ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ；Ｏ‘Ｒｅｉｌｌｙ、Ｄ．Ｒ．ら、１９９２。バキュロウイルス発現ベクター：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ．）。バキュロウイルス発現システムの利点は、とりわけ、発現タンパク質がほとんどいつも可溶性であり、正しく折り畳まれ、生物学的に活性であることである。さらなる利点には、高タンパク質発現レベル、より早い産生、巨大タンパク質の発現に好適、及び大規生産に好適などである。
【０１５３】
バキュロウイルス発現システムは、組み換えアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの製造にうまく使用されてきた（Ｕｒａｂｅら、２００２、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  １３：１９３５−１９４３；ＵＳ６，７２３，５５１及びＵＳ２００４０１９７８９５）。このシステムは、昆虫細胞においてＡＡＶ製造システムを開発したＵｒａｂｅら（２００２、前掲）により記載された。
【０１５４】
このシステムでは、以下の核酸配列を生成する：
（ｉ）ＩＧＦ−Ｉ又はその機能的に同等の変異体をコードし、肝臓特異的プロモーターに作動可能に連結した配列を含んでなる発現カセットと、前記発現カセットの側に位置しているＡＡＶ５’−ＩＴＲ及び３’−ＩＴＲとを含んでなる第１核酸配列、
（ｉｉ）ＡＡＶｒｅｐタンパク質をコードする第２核酸配列及び
（ｉｉｉ）ＡＡＶｃａｐタンパク質をコードする第３核酸配列。
【０１５５】
３つの核酸配列は、昆虫細胞適合性ベクターであるベクターに典型的に担持されている。配列は、１つ、２つ又は３つのベクターに担持されることができる。上記したように、第１ヌクレオチド配列は、少なくとも１つのＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）ヌクレオチド配列を含んでなる。第２ヌクレオチド配列は、典型的には昆虫細胞において発現のための少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結したＡＡＶ  ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含んでなる。第３ヌクレオチド配列は、典型的には昆虫細胞における発現のための少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結したＲｅｐ５２又はＲｅｐ４０コード配列及びＲｅｐ７８又はＲｅｐ６８コード配列をコードするオープンリーディングフレームを含んでなる。Ｒｅｐタンパク質は、単一のオープンリーディングフレームによりコードされることができる。
【０１５６】
ＡＡＶビリオンを生成する方法は、例えば、１つ、２つ又は３つの昆虫細胞適合性ベクター（典型的にはバキュロウイルス）に含まれる核酸配列を昆虫細胞に導入すること、及びＡＡＶが産生される条件下で昆虫細胞を維持することを含んでなる。次に、ＡＡＶを回収する。
【０１５７】
昆虫細胞においてＡＡＶを産生するため、３つのＡＡＶカプシドタンパク質（ＶＰｌ、ＶＰ２及びＶＰ３）を正しい化学量論とするために、改変が必要なことがある。これは、２つのスプライスアクセプター部位の交互利用と、正確には昆虫細胞により再現しないＶＰ２用ＡＣＧ開始コドンの準最適利用との組み合わせによるものである。昆虫細胞においてカプシドタンパク質の正しい化学量論を示すために、Ｕｒａｂｅら（２００２、前掲）は、スプライシングを必要とすることなく全ての３つのＶＰタンパク質を発現できる単一のポリシストロニックメッセンジャーに翻訳される構築物で、最も上流の開始コドンが準最適開始コドンＡＣＧにより置き換えられたものを使用することを提案した。ＷＯ２００７／０４６７０３は、昆虫細胞において産生されるＡＡＶカプシドタンパク質の化学量論の最適化により、バキュロウイルス産生ｒＡＡＶベクター系産生の感染性がさらに向上することを開示している。
【０１５８】
Ｕｒａｂｅら（２００２、前掲）により最初に開発されたＡＡＶ昆虫細胞発現システムにおけるＡＡＶＲｅｐタンパク質の発現のために、２つの独立したＲｅｐ発現単位（Ｒｅｐ７８について１つ及びＲｅｐ５２について１つ）（各々別個の昆虫細胞プロモーター、δＩＥ１及びＰｏｌＨプロモーターの制御下）を有する組み換えバキュロウイルス構築物が使用される。
【０１５９】
Ｋｏｈｌｂｒｅｎｎｅｒら（２００５、ＭｏＩ．Ｔｈｅｒ．  １２：１２１７−２５；ＷＯ２００５／０７２３６４）は、Ｕｒａｂｅらにより使用されたような２つのＲｅｐタンパク質の発現用バキュロウイルス構築物は、固有的に不安定であることを報告した。Ｕｒａｂｅのオリジナルベクターにおける２つのＲｅｐ遺伝子の回帰性配向を分割し、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ７８を発現するための２つの別個のバキュロウイルスベクターを設計することにより、Ｋｏｈｌｂｒｅｎｎｅｒら（２００５、前掲）は、ベクターの通過安定性を増加した。しかしながら、少なくとも５回通過にわたっての昆虫細胞における２つの独立したバキュロウイルスＲｅｐ構築物からのＲｅｐ７８及びＲｅｐ５２の一貫した発現にも関わらず、ｒＡＡＶベクターの収率は、Ｕｒａｂｅら（２００２、前掲）により設計されたオリジナルバキュロウイルスｒＲｅｐ構築物と比較して、５〜１０倍低い。
【０１６０】
ＷＯ２００７／１４８９７１では、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質の単一のコード配列を用いることにより、昆虫細胞においてｒＡＡＶベクター産生の安定性を顕著に向上した。ここでは、準最適開始コドンを、スキャンリボソームにより部分的にスキップされているＲｅｐ７８タンパク質に使用して、翻訳の開始がさらに下流でＲｅｐ５２タンパク質の開始コドンでも生じることを可能にしている。
【０１６１】
上記した改変の全ては、本明細書において用いられている方法で使用してもよい。
【０１６２】
本発明の昆虫細胞において、第１、第２及び第３核酸配列は、好ましくは核酸ベクター内に含まれ、ベクターは同一又は異なるベクターでよい。昆虫細胞は、３つの別個の核酸構築物（第１、第２及び第３核酸配列の各々について１つずつ）を含んでなるものでもよいし、又は昆虫細胞は、単一型核酸構築物を含んでなるものでもよいし、又は適切に分配された第１、第２及び第３核酸配列を含んでなる２つのベクター（例えば、第１核酸配列が第１ベクターに位置し、第２及び第３核酸配列が第２ベクターに位置していてもよい）を含んでなるものでもよい。
【０１６３】
好ましくは、第２及び第３核酸配列は、昆虫細胞における発現のための発現制御配列に作動可能に連結している。これらの発現制御配列は、少なくとも昆虫細胞において活性であるプロモーターを含む。昆虫宿主細胞において外来遺伝子を発現することについて当該技術分野において知られている技術を使用して、本発明を実施することができる。分子工学及び昆虫細胞におけるポリペプチドの発現方法は、例えば、Ｓｕｍｍｅｒｓ及びＳｍｉｔｈ．１９８６、Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（バキュロウイルスベクター及び昆虫培養手順についての方法）、Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌ．  Ｎｏ．７５５５、Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ、Ｔｅｘ．；Ｌｕｃｋｏｗ．１９９１．Ｉｎ  Ｐｒｏｋｏｐら、Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｖｅｃｔｏｒｓ‘  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（バキュロウイルスベクターの組み換えＤＮＡ技術を用いた昆虫細胞における異種の遺伝子のクローニング及び発現、並びに用途）、９７−１５２；Ｋｉｎｇ、Ｌ．Ａ．及びＲ．Ｄ．Ｐｏｓｓｅｅ、１９９２、Ｔｈｅ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（バキュロウイルス発現システム）、Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ、Ｄ．Ｒ．、Ｌ．Ｋ．Ｍｉｌｌｅｒ、Ｖ．Ａ．Ｌｕｃｋｏｗ、１９９２、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ（バキュロウイルス発現ベクター）：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ及びＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ、Ｃ．Ｄ．、１９９５、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（バキュロウイルス発現プロトコル）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｌｕｍｅ３９；ＵＳ４，７４５，０５１；ＵＳ２００３１４８５０６；及びＷＯ０３／０７４７１４に記述されている。本発明による第１及び第２ヌクレオチド配列の転写に好適なプロモーターには、例えば、多面体（ＰｏＩＨ）、ｐｌＯ、ｐ３５、ＩＥ−Ｉ又はδＩＥ−１プロモーター及び上記文献に記載されているさらなるプロモーターなどがある。哺乳動物細胞において、Ｒｅｐ５２と比較してＲｅｐ７８の発現が十分ではないことが、高ベクター収率には好ましい（Ｌｉら、１９９７、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７１：５２３６−４３；Ｇｒｉｍｍら、１９９８、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ９、２７４５−２７６０）知られているので、好ましくは、Ｒｅｐ７８又は６８タンパク質の発現を駆動するために、Ｒｅｐ５２又は４０タンパク質の発現に使用されるプロモーターよりも弱いプロモーターを使用する。例えば、より強い多面体プロモーターを、Ｒｅｐ５２又は４０タンパク質の発現に使用し、δＩＥ１プロモーター、ＰｏＩＨプロモーターよりもはるかに弱���プロモーターを、Ｒｅｐ７８又は６８タンパク質の発現を駆動するのに選択することができる。好ましくは、それぞれＲｅｐ５２又は４０タンパク質及びＲｅｐ７８又は６８タンパク質のためのプロモーターは、昆虫細胞において、バキュロウイルス発現を用いて、好ましくは約２０〜４０時間後感染、より好ましくは約３０〜４０時間後感染で、Ｒｅｐ７８／６８：Ｒｅｐ５２／４０モル比が１：１０〜１０：１、１：５〜５：１又は１：３〜３：１の範囲で産生するように選択する。Ｒｅｐ７８とＲｅｐ５２のモル比は、好ましくはＲｅｐ７８／６８及びＲｅｐ５２／４０の共通抗原決定基を認識するモノクローナル抗体を用いるか、又はマウス抗Ｒｅｐ抗体（３０３．９、Ｐｒｏｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ；希釈比１：５０）を用いて、ウエスタンブロット法により決定できる。
【０１６４】
好ましくは、昆虫細胞において本発明による第２及び第３ヌクレオチド配列発現のための核酸構築物は、昆虫細胞適合性ベクターである。「昆虫細胞適合性ベクター」又は「ベクター」は、昆虫又は昆虫細胞の産生形質転換又はトランスフェクションができる核酸分子である。典型的には生物学的ベクターには、プラスミド、線状核酸分子及び組み換えウイルスなどがある。昆虫細胞適合性でる限りは、いずれのベクターも用いることができる。ベクターは、昆虫細胞ゲノムに組み込んでもよいが、ベクターはエピソームでもよい。昆虫細胞におけるベクターの存在は永久的である必要はなく、過渡的エピソームベクターも含まれる。ベクターは、いずれかの公知の手段、例えば、細胞の化学処理、エレクトロポレーション又は感染により導入できる。好ましい実施態様によれは、ベクターは、バキュロウイルス、ウイルスベクター又はプラスミドである。より好ましい実施態様によれば、ベクターはバキュロウイルスである。すなわち、構築物はバキュロウイルスベクターである。バキュロウイルスベクター及びそれらの使用方法は、昆虫細胞の分子工学について上記で引用された文献に記載されている。
【０１６５】
昆虫細胞は、異種のタンパク質の産生に好適であるいずれかの細胞であることができる。好ましくは、昆虫細胞は、バキュロウイルスベクターの複製が可能であり、培養において維持できる。より好ましくは、昆虫細胞は、ｒＡＡＶベクターを含む組み換えパルボウイルスベクターの複製が可能である。例えば、使用される細胞株は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞株又は蚊細胞株由来のもの、例えば、Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ由来細胞株であることができる。好ましい昆虫細胞又は細胞株は、バキュロウイルス感染しやすい昆虫種由来の細胞、例えば、Ｓｅ３０１、ＳｅＩＺＤ２１０９、ＳｅＵＣＲｌ、Ｓｆ９、Ｓｆ９００＋、Ｓｆ２１、ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４、ＭＧ−Ｉ、Ｔｎ３６８、ＨｚＡｍＩ、Ｈａ２３０２、Ｈｚ２Ｅ５、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）及びｅｘｐｒｅｓＳＦ＋（登録商標）（ＵＳ６，１０３，５２６；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．、ＣＴ、ＵＳＡ）である。
【０１６６】
本発明による方法において使用される好ましい昆虫細胞は、組み換えパルボウイルスベクターの産生用昆虫細胞である。この昆虫細胞は、さらに、上記した「第２」及び「第３」核酸配列の他に、少なくとも１つのパルボウイルス逆方向末端反復（ＩＴＲ）ヌクレオチド配列及びＩＧＦ−Ｉ又はその機能的に同等の変異体をコードし、肝臓特異的プロモーターに作動可能に連結した配列を含んでなる第１核酸構築物を含んでなる。
【０１６７】
組み換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターの産生用昆虫細胞に（上記した３つの核酸配列を送達するために）用いられる核酸構築物数は、本発明では限定されない。例えば、１、２、３、４、５又はそれ以上の別個の構築物を、本発明による方法による昆虫細胞においてｒＡＡＶを産生するのに用いることができる。５つの構築物を用いる場合、１つの構築物はＡＡＶ  ＶＰ１をコードし、別の構築物はＡＡＶ  ＶＰ２をコードし、さらに別の構築物はＡＡＶ  ＶＰ３をコードし、さらに別の構築物は上記で定義したＲｅｐタンパク質をコードし、最後の構築物は少なくとも１つのＡＡＶ  ＩＴＲを含んでなる。５つより少ない構築物を使用する場合、構築物は、少なくとも１つのＡＡＶ  ＩＴＲと、ＶＰｌ、ＶＰ２、ＶＰ３及びＲｅｐタンパク質コード配列の種々の組み合わせを含んでなることができる。
【０１６８】
本明細書において用いられている「パッケージング」は、ウイルスベクター、特にｒＡＡＶベクターのアセンブリー及びカプシド形成を生じる一連の細胞内現象を指す。したがって、好適なベクターを適当な条件下でパッケージング細胞株に導入するとき、ウイルス粒子に集合できる。ウイルスベクター、特にｒＡＡＶベクターのパッケージングに関連した機能は、本明細書及び当該技術分野において説明されている。
【０１６９】
ＡＡＶビリオンを製造する方法の工程（ｉｉ）は、パッケージング細胞からビリオンを回収することを含んでなる。このために、ウイルス含有試料を、１回以上の精製工程、例えば密度勾配分離及びクロマトグラフィーに附する
【０１７０】
ｒＡＡＶビリオンを精製する方法の一例は、数工程を含む。第一に、ｒＡＡＶビリオンで感染された複数の細胞を準備する。これらの感染細胞から、ｒＡＡＶビリオンを集める。次に、これらのビリオンをイオディキサノール勾配を用いるものなどの密度勾配分離工程に附する。典型的なイオディキサノール工程勾配は、１５％イオディキサノール工程、２５％イオディキサノール工程、４０％イオディキサノール工程及び６０％イオディキサノール工程を含む。イオディキサノール工程は、さらに１Ｍ  ＮａＣｌを含む。ビリオン含有イオディキサノール工程では遠心分離し、得られたビリオン含有試料をイオディキサノール勾配工程から集める。次に、この試料を、クロマトグラフィー工程、例えば、イオン交換又はヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー工程に附する。
【０１７１】
本発明による精製方法は、ＡＡＶ血清型１及び５由来のカプシド含有タンパク質を有するビリオンを精製するのに特に有用である。この理由は、これらの血清型がヘパリンカラムに結合しないからである。ｒＡＡＶ１及びｒＡＡＶ５ビリオンを精製するために、イオディキサノール密度勾配遠心分離後にアニオン交換又はヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーをおこなう精製プロトコルを用いる。イオディキサノールは、ヒトへの注射用のＸ線コントラスト化合物として最初に生成されるヨード密度勾配媒体である。巨大分子を分画するのに一般的に使用される高浸透圧無機塩（ＣｓＣｌ）及びスクロース勾配とは異なり、イオディキサノール溶液は、全ての密度で等浸透圧とすることができる。この性質のため、イオディキサノールが分析及び下流の精製工程のための理想的な媒体である。さらに、イオディキサノールは、ベクターゲノム含有（全）カプシドから、遊離カプシドタンパク質及び空カプシドを分離する能力を有している。イオディキサノールを使用することは本発明において好ましいが、他の好適な密度勾配媒体を代りに用いてもよい。
【０１７２】
密度勾配遠心分離後、ｒＡＡＶベクターをカラムクロマトグラフィーにより精製する。ｒＡＡＶビリオンを精製できるいずれのクロマトグラフィー法も使用することができる。例えば、イオン交換クロマトグラフィーを使用できる。イオン交換クロマトグラフィーは、意図するタンパク質と、一般的にアガロース、デキストラン並びに架橋セルロース及びアガロース（帯電した基に共有結合している）などの樹脂からなるイオン交換マトリックスとの間の電荷の相互作用による方法である。荷電基は、型（カチオン及びアニオン）及び強度（強弱）により分類される。イオン交換クロマトグラフィー法では、いくつかの工程をおこなう：標的タンパク質結合に理想的なｐＨ及びイオン条件へのカラムの平衡化、対イオン置換による試料のカラムへの可逆吸着、結合タンパク質を置換するための緩衝液のｐＨ又はイオン強度を変化させる溶離条件の導入、及び結合強度の順序でのカラムからの物質の溶離（弱く結合したタンパク質が最初に溶離する）。イオン交換クロマトグラフィーは、小規模から大規模レベルに直接アップグレードできる。アニオン交換クロマトグラフィーは、負に帯電した樹脂が正味が正の電荷のタンパク質に結合する、イオン交換クロマトグラフィーの一種である。市販のアニオン交換樹脂としては、例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ製ＨｉＴｒａｐＱ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）製ＭｏｎｏＱ、ＭｏｎｏＳ、ＭｉｎｉＱ、Ｓｏｕｒｃｅ  １５Ｑ、３０Ｑ、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＤＥＡＥ、及びＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ；Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）製ＷＰ  ＰＥＩ、ＷＰ  ＤＥＡＭ及びＷＰ  ＱＵＡＴ；Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  Ｌａｂｓ（Ｔｅｒｒｅ  Ｈａｕｔｅ、Ｉｎｄ．）製Ｈｙｄｒｏｃｅｌｌ  ＤＥＡＥ及びＨｙｄｒｏｃｅｌｌ  ＱＡ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆ．）製ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  Ｑ、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  ＤＥＡＥ及びＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  ＨｉｇｈＱ；Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ（Ｆｒｅｍｏｎｔ、Ｃａｌｉｆ．）製Ｃｅｒａｍｉｃ  ＨｙｐｅｒＤ  Ｑ、Ｃｅｒａｍｉｃ  ＨｙｐｅｒＤ  Ｓ、Ｃｅｒａｍｉｃ  ＨｙｐｅｒＤ  ＤＥＡＥ、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ  Ｍ  ＤＥＡＥ、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ  ＬＳ．  ＤＥＡＥ、Ｓｐｈｅｒｏｄｅｘ  ＬＳ  ＤＥＡＥ、ＱＭＡ  Ｓｐｈｅｒｏｓｉｌ、及びＱＭＡ  Ｍ  Ｓｐｈｅｒｏｓｉｌ；Ｄｏｗ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ（Ｍｉｄｌａｎｄ、Ｍｉｃｈ．）製ＤＯＷＥＸ  ＭＯＮＯＳＰＨＥＲＥ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｅｄｆｏｒｄ、Ｍａｓｓ．）製Ｍａｔｒｅｘ  Ｑ５００、Ｍａｔｒｅｘ  Ａ５００、Ｍａｔｒｅｘ  Ｑ８００、Ｍａｔｒｅｘ  Ａ８００及びＭａｔｒｅｘ  Ａ２００；Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）製Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＴＭＡＥ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＤＥＡＥ及びＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＤＭＡＥ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）製Ｉ型アンバーライト強アニオン交換体、ＩＩ型アンバーライト強アニオン交換体、Ｉ型ＤＯＷＥＸ強アニオン交換体、ＩＩ型ＤＯＷＥＳ強アニオン交換体、Ｉ型Ｄｉａｉｏｎ強アニオン交換体、Ｉ型Ｄｉａｉｏｎ強アニオン交換体、ＩＩ型Ｄｉａｉｏｎ強アニオン交換体、アンバーライト弱アニオン交換体及びＤＯＷＥＸ弱アニオン交換体；Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｅｐ（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＰＡ）製ＴＳＫ  Ｇｅｌ  ＤＥＡＥ−５ＰＷ−ＨＲ、ＴＳＫ  Ｇｅｌ  ＤＥＡＥ−５ＰＷ、ＴＳＫ  Ｇｅｌ  Ｑ−５ＰＷ−ＨＲ及びＴＳＫ  Ｇｅｌ  Ｑ−５ＰＷ；並びにＷｈａｔｍａｎ（Ｋｅｎｔ、ＵＫ）製ＱＡ５２、ＤＥ２３、ＤＥ３２、ＤＥ５１、ＤＥ５２、ＤＥ５３、Ｅｘｐｒｅｓｓ−Ｉｏｎ  Ｄ及びＥｘｐｒｅｓｓ−Ｉｏｎ  Ｑなどが挙げられる。ｒＡＡＶ１及びｒＡＡＶ５ビリオンの精製には、アニオン交換クロマトグラフィーが好ましい。
【０１７３】
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、好適なクロマトグラフィー法の別の例である。ヒドロキシアパタイトは、結晶形態のリン酸カルシウムである。ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの機構は、負に帯電したタンパク質カルボキシル基と樹脂の正に帯電したカルシウムイオンとの間、及び正に帯電したタンパク質アミノ基と樹脂の負に帯電したリン酸イオンとの間の非特異的相互作用を含む。市販のヒドロキシアパタイト樹脂としては、例えば、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆ．）製Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  ＨＴ及びＣＨＴセラミック樹脂；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）製高分解能ヒドロキシアパタイト及び高速流ヒドロキシアパタイト；Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ（Ｆｒｅｍｏｎｔ、Ｃａｌｉｆ．）製ＨＡ  Ｕｌｔｒｏｇｅｌ；及びＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）製ヒドロキシアパタイトなどがある。アニオン交換クロマトグラフィーの他に、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いて、ｒＡＡＶ５ビリオンを精製した（図３Ｂ）。好ましいヒドロキシアパタイト樹脂の一例として、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆ．製セラミックヒドロキシアパタイトがある。これは、過剰のリン酸塩により低結合能を克服する向上したカルシウム：リン酸塩比を有する、安定な多孔形態のヒドロキシアパタイトである。
【０１７４】
ｒＡＡＶ２ビリオンを精製するためには、ヘパリン−アガロースクロマトグラフィーが好ましい。例えば、米国特許第６，１４６，８７４号を参照されたい。
【０１７５】
イオディキサノール工程勾配後アフィニティーヘパリン（ｒＡＡＶ２を精製するため）、ヒドロキシアパタイト又はアニオン交換クロマトグラフィー（ＡＡＶ１、２及び５を精製するため）を組み合わせて使用し、いくつかのウイルスの高処理量を容易にして、動物モデル及び細胞培養における形質導入効率及び特異性を直接比較できるようにする。組織培養におけるウイルスの大規模生産は、大培養表面積を有する細胞工場、例えば、プラスチックトレイを使用することにより容易になる（Ｎｕｎｃ、ＲＯＣＨＥＳＴＥＲ、Ｎ．Ｙ．）。さらに重要なことに、Ｑ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅによるｒＡＡＶ１、２及び５ビリオンの精製により、同じ方法を用いて精製したビリオンの比較ができる。さらに、細胞工場系プロトコルにより、１×１０９個の細胞から精製した１×１０１２〜１×１０１３ｖｇ／ｍｌの力価を有するビリオンストックが得られる。これらのクロマトグラフィー法は、１×１０10個の細胞からのウイルスを精製するのを容易にスケールアップすることができる。
【０１７６】
トランスフェクションプロトコル及び精製方法を最適化することにより、細胞１個当たり１００〜２００感染単位（ＩＵ）が通常得られる。１×１０９個の細胞から調製するために、例えば、ｒＡＡＶの最終収率は、約１〜５×１０１１ＩＵ又は約１×１０１２〜１×１０−１３ベクターゲノムである。
【０１７７】
また、ビリオンは、密度勾配遠心分離の不存在下でクロマトグラフィーを用いても精製される。一例として、感染細胞からの溶解物を、クロマトグラフィーに直接附してｒＡＡＶビリオンを精製する。クロマトグラフィーを含むｒＡＡＶベクターの大規模生産法については、Ｐｏｔｔｅｒら（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２００２、３４６：４１３−４３０）を参照されたい。
【０１７８】
組み換えビリオンは、抗ＡＡＶ抗体、好ましくは固定化抗体を用いたビリオンベクターのアフィニティー精製の追加の工程を実施又は含んでもよい。抗ＡＡＶ抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である。特に好適な抗体は、例えば、ラクダ又はラマから得ることができる単一鎖ラクダ科抗体又はその断片である（例えば、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ、２００１、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４：２７７−３０２参照）。ｒＡＡＶのアフィニティー精製用抗体は、好ましくはＡＡＶカプシドタンパク質にエピトープを特異的に結合する抗体である。好ましくは、エピトープは、複数のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質に存在するエピトープである。例えば、抗体は、ＡＡＶ２カプシドへの特異的結合に基づいて産生、又は選択するが、同時に、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３及びＡＡＶ５カプシドに特異的に結合してもよい。
【０１７９】
組み換えＳＶ４０ビリオンの調製方法
別の態様によれば、本発明は、組み換えＳＶ４０ビリオンの調製方法であって、
（ｉ）細胞と、複製欠損ＳＶ４０ゲノムを含んでなるポリヌクレオチドとを接触させる工程であって、前記該ゲノムがＧＦ−Ｉ又はその機能的に同等の変異体をコードし、かつ肝臓特異的プロモーターに作動可能に連結された配列を含んでなる発現カセットを含んでなるものであり、前記細胞が前記ポリヌクレオチドにおける複製欠損を補完するＳＶ４０遺伝子を発現するものであり、前記細胞と前記ポリヌクレオチドと接触が、前記ポリヌクレオチドが前記細胞に侵入するのに適している条件下で行われる工程と、
（ｉｉ）前記組み換えＳＶ４０ビリオンを前記細胞から回収する工程と
を含んでなる方法に関する。
【０１８０】
工程（ｉ）において、細胞を、複製欠損ＳＶ４０ゲノムを含んでなるポリヌクレオチドと接触させる、ここで前記ゲノムはＩＧＦ−Ｉ又はその機能的に同等の変異体をコードし、肝臓特異的プロモーターに作動可能に連結した配列を含んでなる発現カセットを含んでなる。好ましくは、ＳＶ４０ゲノムはラージＴ抗原をコードする領域を欠いている。
【０１８１】
ラージＴ抗原をコードする配列を欠いているが、後期プロモーターの制御下でカプシドタンパク質をコードする配列を未だ含むＳＶ４０ゲノムは、次に通常のクローニングベクターにおいて増殖できる。肝臓特異的プロモーターの制御下で導入遺伝子を、次にラージＴ抗原により前に占められていたクローニングベクターの領域にクローニングすることができる。ウイルスＤＮＡ配列は、クローニングベクターから切り取り、精製し、再結紮して環状ＤＮＡを形成することができる。ビリオンは、ラージＴ抗原を発現するパッケージング細胞に再結紮した環状ウイルスベクターＤＮＡをトランスフェクションすることにより産生し、増幅することができる。特に好ましいパッケージング細胞は、ＳＶ４０ベクターを補完することができるＴ抗原を構成的に発現する細胞株である。好適な細胞は、Ｃｏｓ−１細胞株である。しかしながら、他の細胞株を、ＳＶ４０ラージＴ抗原用遺伝子を導入後使用することができる。
【０１８２】
肝臓特異的プロモーターは、上記で定義したいずれのプロモーターでもよい。好ましい実施態様によれば、肝臓特異的プロモーターは、アルブミンエンハンサー領域と、α１−アンチトリプシンのプロモーターとを含んでなるハイブリッドプロモーターである。別の好ましい実施態様によれば、肝臓特異的プロモーターは、誘発性肝臓特異的プロモーターである。
【０１８３】
本発明を、以下の実施例により説明するが、以下の実施例は説明の目的のみであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０１８４】
肝硬変におけるＩＧＦ−Ｉ（ｄｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉ）をコードする二本鎖ＡＡＶベクターの効果の評価
材料及び方法
二本鎖ＡＡＶベクター構築及び産生  この検討において使用されるＡＡＶプラスミドは、ＡＡＶ２と適切なスタッファー配列からの２つのＩＴＲが横に位置する発現カセットを含んでおり、ＡＡＶゲノムのサイズを、ＡＡＶについて述べた最適なパッケージング能に調整する。導入遺伝子発現カセットは、以下の要素を有している：ＡＡＶ２由来５’ＩＴＲ、アルブミンエンハンサー由来調節配列を有する肝臓特異的プロモーターＥａｌｂＡＡＴｐ（Ｋｒａｍｅｒら、２００３、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．７：３７５−８５）、ラットＩＧＦ−Ｉ  ｃＤＮＡ、ＳＶ４０ポリアデニル化、及びＡＡＶ２由来３’ＩＴＲ。二本鎖ＡＡＶベクターを精製するために、３’ＩＴＲは、ＭｃＣａｒｔｙら（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ２００３；１０：２１１２−２１１８）により記載されているような末端分解部位を欠いていた。このＡＡＶプラスミドを、ｐＡＡＶＩＧＦ−Ｉと命名した。同様な構築物を、どこにでも存在し、ルシフェラーゼリポーター遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｍ１５０７７）であるＰＢＧＤプロモーターを用いて作成した。このＡＡＶプラスミドを、ｐＡＡＶＬｕｃと命名した。二本鎖ｄｓＡＡＶ２／１ベクターを、３つの異なるプラスミドｐＡｄＤｅｌｔａＦ６、ｐ５Ｅ１８−ＶＤ２／８及び治療（ｐＡＡＶＩＧＦ−Ｉ）又はリポーター遺伝子（ｐＡＡＶＬｕｃ）（Ｈｅｒｍｅｎｓら、１９９９  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１０：１８８５−９１及びＧａｏら２００２、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９９：１１８５４−９）の２９３細胞へのリン酸カルシウム介在共トランスフェクションにより生成した。簡単に述べると、２９３細胞に、リン酸カルシウムによりｐＡｄＤｅｌｔａＦ６、ｐ５Ｅ１８−ＶＤ２／８及び標的ベクターを共トランスフェクションし、トランスフェクションしてから４８時間後に、ウイルスを細胞の凍結解凍により採取した。ウイルスは、イオン交換カラムクロマトグラフィー及びイオディキサノール勾配遠心分離した後、濾過及びさらにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）−５％スクロースに対して濃縮することにより精製した。ゲノムコピー数／ｍｌでのｄｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉウイルス力価を、ｈＡＡＴプロモーター領域の９５ｂｐ断片を増幅する、プライマーｐｒ３００ｆｗ５’ＣＣＣＴＧＴＴＴＧＣＴＣＣＴＣＣＧＡＴＡＡ３’（配列番号８）ｐｒ３０１ｒｖ５’ＧＴＣＣＧＴＡＴＴＴＡＡＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＣＡ３’（配列番号９）を用いた、三重でおこなうＱ−ＰＣＲ、ＴａｑＭａｎ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）分析により決定した。タンパク質組成と純度をドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により決定した。
【０１８５】
肝硬変のモデル  体重１８０〜２００ｇの雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに、説明されているように８週間にわたって四塩化炭素（ＣＣｌ４、Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅ  Ｈａａｅ）を週に１回胃内投与するとともに、飲料水にフェノバルビタールを４００ｍｇ／ｌ入れることにより、肝硬を誘発した（Ｒｕｎｙｏｎ  ＢＡら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ１９９１；１００：４８９−４９３）。簡単に説明すると、最初のＣＣｌ４用量は、ラット１匹あたり２０μlであった。続いての用量は、最終用量の４８時間後に体重変化に基づいて調整した（Ｒｕｎｙｏｎら、前掲）。全てのラットを、死亡するまで毎日少なくとも２回観察した。このプロトコル後では、動物の一部では明らかに腹水症となっていた。血液試料を、ＣＣｌ４を最初に投与してから３、５及び８週間後に、眼窩後叢から採取した。血清トランスアミナーゼ（アラニンアミノトランスフェラーゼ並びにアスパラギン酸及びアルカリホスファターゼ）、アルブミン及びビリルビンを、Ｈｉｔａｃｈｉ自動測定装置（Ｒｏｃｈｅ）で測定した（ＡＢＸ診断法）。結果から、トランスアミナーゼが、ＣＣｌ４を投与して８週間後に最高レベルに達したことが分かった。
【０１８６】
ウイルスベクターの投与  ４つの実験動物群を分析した：健常なラット  （ｎ＝１９）、食塩水を注射した肝硬変ラット（Ｃｉ）（ｎ＝１６）、ｄｓＡＡＶＬｕｃの３．４  ｘ  １０９ウイルス粒子で処置した肝硬変ラット（Ｃｉ＋Ｌｕｃ）（ｎ＝１９）又はｄｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉの３．４  ｘ  １０９ウイルス粒子で処置した肝硬変ラット（Ｃｉ＋ＩＧＦ−Ｉ）（ｎ＝２３）。肝動脈に注射することにより、ベクターを投与した。ベクター投与後、４日後（健常ｎ＝５、Ｃｉ  ｎ＝４、Ｃｉ＋Ｌｕｃ  ｎ＝４、Ｃｉ＋ＩＧＦ−Ｉ  ｎ＝６）、２週間後（健常ｎ＝４、Ｃｉ  ｎ＝３、Ｃｉ＋Ｌｕｃ  ｎ＝５、Ｃｉ＋ＩＧＦ−Ｉ  ｎ＝６）、８週間後（健常ｎ＝５、Ｃｉ  ｎ＝４、Ｃｉ＋Ｌｕｃ  ｎ＝５、Ｃｉ＋ＩＧＦ−Ｉ  ｎ＝５）、１６週間後（健常ｎ＝５、Ｃｉ  ｎ＝５、Ｃｉ＋Ｌｕｃ  ｎ＝５、Ｃｉ＋ＩＧＦ−Ｉ  ｎ＝６）又は１年後（健常ｎ＝３、食塩水ｎ＝４、Ｃｉ＋ＡＡＶＬｕｃ  ｎ＝２、Ｃｉ＋ＩＧＦ−Ｉ  ｎ＝４）に犠牲死した。また、健常なラットも、対照として犠牲死した。ＳＶＩＧＦ−Ｉの１０１１ウイルス粒子で処置し、ＣＣｌ４の最終投与してから４日後及び８週間後に犠牲死した動物も、陽性対照として含め、補足情報に含める。血液試料を、犠牲死前に採取し、上記したようにして分析した。肝臓試料を、組織学的分析並びにさらなる分析のためのＲＮＡ及びタンパク質の精製のために処理した。
【０１８７】
血清マーカー及び血清中ＩＧＦ−Ｉの分析  血清トランスアミナーゼ（アラニンアミノトランスフェラーゼ並びにアスパラギン酸及びアルカリフォスファターゼ）、アルブミン及びビリルビンを、Ｈｉｔａｃｈｉ自動分析装置（Ｒｏｃｈｅ）で測定した（ＡＢＸ診断法）。血清中のＩＧＦ−Ｉを、ＥＬＩＳＡによりＯＣＴＥＩＡラット／マウスＩＧＦ−Ｉ（ＩＤＳ）で定量化した。
【０１８８】
肝組織学び免疫組織化学  肝臓コラーゲン含量を評価し、説明されているようにして定量化した（Ｖｅｒａ  Ｍ．ら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００７；１４：２０３−２１０）。α−平滑筋アクチン（αＳＭＡ）のための免疫組織化学染色を１：１００又は１：４００で希釈した抗体１Ａ４（Ｍ０８５１、Ｄａｋｏ）を用い、Ｋｉ−６７については１：５０で希釈した抗体ＳＰ６（ＲＭ−９１０６、ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ）を用いておこなった。
【０１８９】
肝臓タンパク質及びＲＮＡ分析。総肝臓ＩＧＦ−Ｉ（ＯＣＴＥＩＡラット／マウスＩＧＦ−Ｉ、生体外）を、ＥＬＩＳＡにより肝臓抽出物で測定した。ＨＧＦ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ、Ｌｄｔ）、ＭＭＰ２（Ｍａｔｒｉｘ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−２  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  Ｂｉｏｔｒａｋ  Ｓｙｓｔｅｍ）及びＭＭＰ９（Ｍａｔｒｉｘ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−９  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  Ｂｉｏｔｒａｋ  Ｓｙｓｔｅｍ）を、ＥＬＩＳＡにより肝臓抽出物で測定した。
【０１９０】
総ＭＭＰ活性も、肝臓抽出物で、蛍光発生ペプチド基質（Ｍｃａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄｐａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＮＨ２；Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）（Ｋｎｉｇｈｔ  ＣＧら  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９９２；２９６：２６３−２６６）を用いて測定した。組み換えヒトＭＭＰ−２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を、陽性対照として使用した。
【０１９１】
総ＲＮＡを、先に述べたようにして抽出した（Ｖｅｒａら、前掲）。ｑＲＴ−ＰＣＲを、表１に示すプライマーを用いて、説明されているようにしておこなった（Ｖｅｒａら、前掲）。
【０１９２】
【表１】
2012521750.tif 000002
【０１９３】
肝細胞の単離  肝細胞を、プロナーゼ及びリベラーゼ（星細胞、クッパー細胞及び内皮細胞を単離するため）でのかんりゅう、及びコラゲナーゼ（肝細胞を単離するため）でのかんりゅう後に単離した（Ｗａｎｇ  ＳＲらＩｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．１９８５；２１：５２６−５３０）。肝細胞を単離するために、肝細胞を５００ｒｐｍで４分間４℃で遠心分離した。肝細胞ペレットを無血清Ｗｉｌｌｉａｍ培地で２回洗浄し、５００ｒｐｍで２分間、４℃で遠心分離した。細胞生存率が７０％未満であるとき、生存肝細胞を８０％パーコール勾配で精製した。星細胞、クッパー細胞及び内皮細胞を単離するため、肝細胞をまず５０ｇで５分間、４℃で遠心分離後に捨てた。上清を、３回無血清ＤＭＥＭ−Ｆ１２中、４５０ｇで７分間、４℃で遠心分離することにより洗浄した。次に、細胞を、Ｎｙｃｏｄｅｎｚ勾配で、１４５０ｇで２０分間、４℃で分離した。肝星細胞を、勾配の上層から除去し、ＤＭＥＭで洗浄し、４５０ｇで５分間、４℃で遠心分離した。クッパー細胞及び内皮細胞を、Ｎｉｃｏｄｅｎｚ勾配の相間から回収し、無血清ＤＭＥＭで洗浄した。
【０１９４】
統計分析  データを、平均±標準偏差として表した。統計的有意性を、スチューデントt検定で推定した。<０．０５のＰ値は、有意であるとみなした（＊）。全ての統計分析を、ＳＰＳＳ  ｖ１１．０（ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ）を用いて実施した。
【０１９５】
実施例１  肝硬変のモデルの分析
血液試料を、ＣＣｌ４を最初に投与してから８、１６、２５及び３３週後に眼窩後叢から採取した（図１Ａ）。血清トランスアミナーゼ（アラニンアミノトランスフェラーゼ並びにアスパラギン酸及びアルカリフォスェート）、アルブミン及びビリルビンを、Ｈｉｔａｃｈｉ自動分析装置（Ｒｏｃｈｅ）で測定した（ＡＢＸ診断法）。結果から、ＣＣｌ４を投与してから８週間後にトランスアミナーゼは最高レベルに達したことが明らかである（図１Ｂ）。次に、トランスアミナーゼが減少したが、レベルはＣＣｌ４を投与してから３３週間後であっても、健常動物よりも高かった（図１Ｂ）。ビリルビンでも同じ結果が得られた（データを図示せず）。また、アルブミンレベルが、ＣＣｌ４を投与してから８週間後に減少し、プロトコルを開始してから３３週間後、健常対照より低いままであった（データは図示せず）。
【０１９６】
動物を、ＣＣｌ４を最初に投与してから１６、２１又は３３週間後に犠牲死した（図１Ａ）。肝臓試料を、４％パラホルムアルデヒドに固定し、パラフィン包埋し、ヘマトキシリンエオシンで染色して、肝臓の形態を評価した（データは図示せず）。肝臓のコラーゲン含量を、Ｓｉｒｉｕｓレッド染色により評価し、画像解析（ＡｎａｌｙＳＩＳ  ３．１、Ｓｏｆｔ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）（Ｖｅｒａら、前掲）により記録した。肝線維症は、プロトコルを開始してから１６週間後で明らかとなり、プロトコルを開始してから２１週間及び３３週間後維持されていた（図１Ｃ及び図１Ｄ）。同様のレベルが、全ての場合において、Ｓｉｒｉｕｓレッド染色の定量化により示すように観察された（図１Ｄ）。種々の試料において、実質結節のサイズにおいては有意な変化は観察されなかった。
【０１９７】
実施例２  硬変した肝臓へのＩＧＦ−Ｉ遺伝子導入
ラットの硬変した肝臓におけるＩＧＦ−Ｉ効果を評価するために、肝硬変をＣＣｌ４で８週間誘発した（図２）。肝硬変ラットを、動脈内投与により、食塩水で処置するか、又はルシフェラーゼ（ｄｓＡＡＶＬｕｃ）又はＩＧＦ−Ｉ（ｄｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉ）をコードする組み換え二本鎖アデノ関連（ｄｓＡＡＶ）ベクターで処置した。本発明者らは、ｄｓＡＡＶＬｕｃでの先におこなわれた実験でベクターの動脈内注射後に良好な発現レベルを示したので、このルートを選択した。また、肝動脈へのカテーテル法でのこのルートが、患者において使用される最も適当な手順と思われる。処置した動物を、ウイルスを注射してから４日、２週間、８週間、１６週間及び１年後に犠牲死した。また、健常なラットを対照として犠牲死した。
【０１９８】
ラットの肝臓におけるｄｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉからの遺伝子導入発現を評価するために、本発明者らは、肝臓におけるＩＧＦ−Ｉ及び全ての群からの血清試料のｑＲＴ−ＰＣＲ及びＥＬＩＳＡをおこなった。予測したように、ＩＧＦ−ＩのｍＲＮＡ及びタンパク質レベルの両方が、Ｃｉ＋ＩＧＦ−Ｉ群において顕著に増加し、健常なラットと比較して、対照の硬変した肝臓で減少した（Ｃｉ及びＣｉ＋Ｌｕｃ）（図３Ａ及び３Ｂ）。説明したように、ＩＧＦ−Ｉが、ＣＣｌ４の最終用量を投与してから４日後に、健常対照と比較して肝硬変動物における血清において減少した。しかしながら、肝硬変動物及び健常動物におけるＩＧＦ−Ｉレベルは、肝臓毒物質を最終投与してから２週間後も同様であった。ｄｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉ投与は、いずれの分析時間でも血清においてＩＧＦ−Ｉの増加を生じなかった（図３Ｃ）。まとめると、これらのデータは、ｄｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉベクターは、硬変した肝臓に形質導入でき、そして肝臓に保持するＩＧＦ−Ｉタンパク質を発現することができたことを示している。ＩＧＦ−ＩＢＰ３  ｍＲＮＡレベルを、肝臓抽出物で、ｑＲＴ−ＰＣＲにより評価した（図３Ｄ）。結果から、ＩＧＦ−Ｉは対照と比較してｄｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉで処置した動物で増加することが明らかである。発現したＩＧＦ−Ｉは、ＩＧＦ−ＩＢＰ３の発現を活性化できるので活性である。ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＢＰ３のレベルの増加は、ｄｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉを注射してから１年後でも検出できる。しかしながら、これらの因子のレベルは、ベクター投与後のもっと早い時期で観察されるよりも低い。
【０１９９】
実施例３  硬変した肝臓へのＩＧＦ−Ｉ遺伝子導入により肝機能が改善され、肝線維症が著しく減少する
ｄｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉで処置した肝硬変ラットは、生化学的肝臓検査で顕著な改善を示した：血清ＡＳＴ、ＡＬＴ、ＡＬＰ及びビリルビンは、対照肝硬変ラットにおけるよりも顕著に低く、健常対照とは同様であった（図４Ａ〜Ｂ）。また、血清アルブミンが、Ｃｉ及びＣｉ＋Ｌｕｃ動物と比較してＣｉ＋ＩＧＦ−Ｉラットにおいて顕著に増加し、健常対照と同様なレベルに到達した（図４Ｃ）。これらの変化は、ベクターを投与してから２週間後から顕著である。
【０２００】
これらの知見は、組織学的な著しい改善を伴うものであり、ｄｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉ処置ラットにおける線維症を著しく減少するとともに、肝硬変が解消した（図５Ａ）。線維症の定量化並びにｑＲＴ−ＰＣＲによるコラーゲンＩ及びＩＶ  ｍＲＮＡ発現の測定により、肝硬変対照と比較して、ｄｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉ処置動物において線維症が減少したことが確認された（図５Ｂ〜Ｄ）。線維症の減少はベクターを投与してから２週間後から顕著であり、処置の１６週間後には、線維症が解消し、健常肝臓となる。さらに、ベクターを投与してから１年後に肝臓を病理組織学的分析したところ、肝硬変がなかった。このことは、肝硬変が、肝臓毒物質を最終用量投与してから１年後に肝硬変対照においてでさえ退縮することを示している。肝臓切片をＳｉｒｉｕｓレッド染色ところ、肝硬変対照において多少の線維性病変を示した。Ｓｉｒｉｕｓレッド染色を定量化したところ、肝硬変対照が、健常動物又はｄｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉで処置した動物よりもより多くの線維症を示すことが分かった（図５Ｂ）。驚くことではないが、コラーゲンＩ及びＩＶ  ｍＲＮＡのレベルは、全ての実験群において、１年後同様である（図５Ｃ及び５Ｄ）。
【０２０１】
さらに、（データを図示せず）完全解剖と完全組織学的分析を、ベクターを投与してから１年後に動物の一部において実施した。結果から、ｄｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉで処置した動物は、健常なラット又は肝硬変対照と顕著な差はないことが明らかである。
【０２０２】
実施例４  硬変した肝臓内のＩＧＦ−Ｉ遺伝子発現はフィブロリシスを誘発する
ＩＧＦ−Ｉを投与した動物で観察される肝硬変の実質的な解消には、ＭＭＰなどのコラーゲンを除去することができる酵素の活性化が必要であろう。ＭＭＰ活性を測定するため機能アッセイを用いて、本発明者らは、Ｃｉ群及びＣｉ＋Ｌｕｃ群からの肝臓抽出物において、ＭＭＰ活性が健常対照と比較して減少したことを見出した（図６Ａ）。これに対して、ＩＧＦ−Ｉ処置動物におけるＭＭＰ活性は、健常動物におけるよりも顕著に高かった（図６Ａ）。ＭＭＰ活性は、ｄｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉを投与した肝臓におけるＭＭＰ１、２、９及び１４  ｍＲＮＡ並びにＭＭＰ２及びＭＭＰ９タンパク質の発現の顕著な増加と相関していた（図６Ｂ〜Ｇ）。ＭＭＰ発現の活性化及びｄｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉ処置動物における活性は、ベクターを投与してから２週間後から検出される。検討の終わりに、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９及びＭＭＰ１４は、全ての群において同様なレベルを示した（図６Ｂ〜Ｇ）。これとは反対に、ＩＧＦ−Ｉ処置動物は、ベクターを投与してから２週間後に最高のＭＭＰレベルを示す。次に、レベルは減少し、検討の終わりでは、健常動物及び肝硬変対照と同様なレベルに到達する。
【０２０３】
ＭＭＰのインヒビターであるＴＩＭＰ−２も、検討の終わりで、全ての群において同様なレベルを示す（図６Ｅ）。ＴＩＭＰ−２レベルは、健常動物において一定であり、全ての肝硬変群において経時的に減少した。ＩＧＦ−Ｉ処置動物は、肝硬変対照よりも早い減少を示すが、検討の終わりでは、肝硬変対照と同様なレベルを示す。
【０２０４】
実施例５  硬変した肝臓内でのＩＧＦ−Ｉ遺伝子発現は、プロフィブロジェニック因子の発現を減少させる
線維症は、活性化ＨＳＣの減少からも減少できるであろう。したがって、肝臓試料の免疫組織化学分析から、αＳＭＡ（ＨＳＣ活性化のマーカー）の発現は、ＩＧＦ−Ｉ処置動物ではほとんどなかったが、対照肝硬変動物（Ｃｉ及びＣｉ＋Ｌｕｃ）における結節を包囲している隔膜においては明らかに発現していた（図７Ａ）。この観察にしたがって、本発明者らは、ＩＧＦ−Ｉ処置肝臓においてαＳＭＡ  ｍＲＮＡレベルが顕著に減少することを見出した（図７Ｂ）。このことは、ＩＧＦ−Ｉ療法が、活性化ＨＳＣを減少することができたことを示している。驚くべきことに、活性化ＨＳＣの減少は、ベクターを投与した４日後には検出される。
【０２０５】
ベクターを投与してから１年後に、肝硬変対照において、健常動物及びＩＧＦ−Ｉ処置動物と比較して、αＳＭＡ  ｍＲＮＡレベルのわずかな増加が、未だ検出される。このときに、ベクター投与後、本発明者らは、Ｃｉ＋ＩＧＦ−ＩラットのＴＧＦβ発現が減少することも見出した（図７Ｃ〜Ｅ）。ＴＧＦβは、ＨＳＣの強力な活性剤であり且つ肝線維症の最も効力のある促進剤であるので、ＩＧＦ−Ｉ遺伝子療法によるダウンレギュレーションは、処置の抗線維形成効果の根底にある主要な要因である可能性がある。ＴＧＦβ  ｍＲＮＡとタンパク質の減少は、肝臓において（図７Ｃ及び７Ｄ）だけでなく、血清においても（図７Ｅ）検出できる。ＴＧＦβの他に、ＨＳＣ増殖を促進し、肝線維症の一因となる他の分子、例えば、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）及びアンフィレギュリン（ＡＲ）を、対照の硬変した肝臓においてアップレギュレーションしたが、対照肝硬変ラットと比較して、ｄｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉで処置してものにおいて著しく抑制された（図７Ｆ〜Ｉ）。損傷及び炎症の他のマーカー、例えば、ＩＬ６及びＴＮＦαも、対照肝硬変ラットと比較してｄｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉにおいて減少する（図７Ｊ及び７Ｋ）。これらのマーカーの多くは、ベクターを投与してから４日後に顕著に減少する。これらの因子のレベルは、健常動物において、評価した全ての時間で同様であった。肝硬変動物において、レベルは、経時的に減少した。ＩＧＦ−Ｉ処置動物は、肝硬変対照よりも早く減少したが、検討の終わりでは、肝硬変対照と同様のレベルであった。
【０２０６】
実施例６  硬変した肝臓内のＩＧＦ−Ｉ遺伝子発現は、抗線維形成及び肝臓保護因子の発現を増加し、増殖を刺激しない
これらの変化とともに、本発明者らは、対照動物と比較して、Ｃｉ＋ＩＧＦ−Ｉラットの肝臓において肝細胞成長因子（ＨＧＦ）の発現が顕著に増加することを見出した（図８Ａ）。ＨＧＦは強力な抗線維形成活性を示すので、この分子のアップレギュレーションは、ＩＧＦ−Ｉ処置ラットで観察される肝硬変の解消の一因となる可能性がある。また、ＨＧＦは、肝臓保護因子として作用し、ＨＮＦ４αとともに、肝細胞分化のためのマーカーとして作用する。また、ＨＮＦ４αは、ベクターを投与してから４日後にｄｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉ処置動物においてアップレギュレーションされる（図８Ｂ）。逆に、肝細胞分化のマーカーであるＷＴ−１は、処置動物で減少する（図８Ｃ）。最後に、ＩＧＦ−Ｉが成長因子であるにもかかわらず、ＰＣＮＡ発現及びＫｉ６７染色の定量化により測定された細胞増殖も、ｄｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉ処置動物では減少する（図９Ａ及び９Ｂ）。検討の終わりでは、ＨＮＦ４ａ、ＷＴ−１及びＰＣＮＡレベルは、全ての実験群で同様であった。しかしながら、ＩＧＦ−Ｉの存在下におけるＨＧＦの増加は、ＩＧＦ−Ｉベクターを投与してから１年後でもまだ検出される。
【０２０７】
実施例７  ｄｓＡＡＶＩＧＦ−ＩとＳＶＩＧＦ−Ｉとの間の比較
肝硬変におけるＳＶＩＧＦ−Ｉの効果を独立的に検討するか（Ｖｅｒａら、前掲）又はｄｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉと並列で検討した。２つの独立した検討を、再現性のある結果を示したＩＧＦ−Ｉの唯一の源としてＳＶＩＧＦ−Ｉを用いて実施した。これらの結果は、ＳＶＩＧＦ−ＩをｄｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉと並列で分析したときにに得られたものと極めて類似している。この最後の場合、ＳＶＩＧＦ−Ｉは、ベクターを投与してから４日及び８週間後にのみ分析した。一般的に、ｄｓＡＡＶＩＧＦ−ＩとＳＶＩＧＦ−Ｉの両方は、肝硬変を解消する。どちらかのベクターを用いて、肝機能を回復させ、同様のトランスアミナーゼ、ビリルビン及びアルブミンレベルを生じる（データは図示せず）。トランスアミナーゼ及びビリルビンは、ＳＶＩＧＦ−Ｉで、ｄｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉでよりもわずかに高いが、差は顕著ではない（データは図示せず）。しかしながら、肝線維症は、ベクターを投与してから８週間後では、ＳＶＩＧＦ−Ｉ処置動物において、ｄｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉで処置したラットにおいてよりも、顕著に高い（図１０）。他に、線維症は、ｄｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉベクターを投与してから１６週間後に消失した。この減少は、動物を、ベクターを投与してから２５週間後に分析したときにＳＶＩＧＦ−Ｉ処置動物において観察されなかった（図１０Ｂ）。同様の差が、コラーゲンＩ及びＩＶ  ｍＲＮＡを測定することこにより観察される（上記図１０Ｃ及び１０Ｄ）。
【０２０８】
ＳＶＩＧＦ−Ｉに対してｄｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉの効率が高い理由はまだ明らかでない。ＩＧＦ−Ｉの発現レベルは、ＳＶＩＧＦ−Ｉ処置動物とｄｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉ処置動物の両方で増加し（図１１）、ＳＶ４０から発現したＩＧＦ−Ｉは、ＩＧＦ−ＩＢＰ３の発現を活性化するので、活性である（データは図示せず）。しかしながら、ｄｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉ投与により、ベクターを投与してから種々の時間で、ＳＶＩＧＦ−Ｉ注射よりもＩＧＦ−Ｉの発現レベルが高くなる（図１１）。ＩＧＦ−Ｉ発現におけるこれらの差は、ｄｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉ処置動物及びＳＶＩＧＦ−Ｉ処置動物において、ベクターを投与してから４日間又は８週間で、異なるＭＭＰ活性を生じることはない（データは図示せず）。ＥＬＩＳＡにより測定されるＭＭＰ２及びＭＭＰ９の量又はｑＲＴ−ＰＣＲにより測定されるＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９及びＭＭＰ１４  ｍＲＮＡのレベルは、ｄｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉ又はＳＶＩＧＦ−Ｉで処置した動物から単離した肝臓抽出物において同様である（データは図示せず）。しかしながら、ｄｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉ処置により、ベクターを投与してから４日後のαＳＭＡタンパク質及びｍＲＮＡレベルが減少し、一方、ＳＶＩＧＦ−Ｉは肝硬変対照と同様なレベルを示す（図１２）。ｄｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉ動物で観察される活性化ＨＳＣの減少は、ＳＶＩＧＦ−Ｉ投与ラットと比較して、これらの動物におけるプロフィブロジェニック因子のより大きな減少と相関している。したがって、ＴＧＦβ、ＣＴＧＦ及びＶＥＧＦは、ｄｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉ処置動物において、ベクターを投与してから４日後に、ＳＶＩＧＦ−Ｉ処置ラット及び肝硬変対照と比較して減少した（図１３）。また、ＨＧＦ及びＨＮＦ４αなどの肝臓保護因子は、対照又はＳＶＩＧＦ−Ｉ投与と比較して、ｄｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉを送達してから４日後に増加した（図１４）。Ｋｉ６７染色の定量化により検出したとき、ｄｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉ処置動物とＳＶＩＧＦ−Ｉ処置動物との間では、増殖において顕著な差は観察されなかった（データは図示せず）。
【０２０９】
実施例８  処置してから１年後のｄｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉ処置動物の毒物分析
ｄｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉ、ｄｓＡＡＶＬｕｃ又は食塩水で処置した肝硬変動物と、健常動物とを比較することにり、評価をおこなった。
【０２１０】
ウイルスを注射してから１年後に犠牲死した動物を解剖した。血液を採取して、いくつかのパラメータを評価した。腎臓、肺、小腸、肝臓、脳、小脳、骨格筋、睾丸、脾臓、胃、骨髄、リンパ節、胸腺及び心臓を、病理組織学的分析により評価した。
【０２１１】
脾臓、心臓、睾丸、腎臓及び肝臓の相対的重さは、検討した実験群の間では顕著な差を示さなかった。
【０２１２】
尿を、犠牲死する24時間前に、代謝ケージにおける全ての動物から採取した。密度、ｐＨ、色及び濁度などいくつかのパラメータ並びにケトン体、グルコース、ビリルビン、タンパク質及びウロビリノーゲンを含む分子を評価した。尿中の赤血球及び白血球の存在も、定量化した。結果から、全ての実験群間の全てのこれらのパラメータにおいて有意な差を示さない。一部の定量化においてでさえ、得られた値はばらつきが大きい。
【０２１３】
血清を使用して、赤血球細胞、血小板、白血球細胞、好中球、リンパ球、単球、好酸球及び好塩基球を定量化した。単球、好酸球及び好塩基球は、全ての実験群間で同様な値を示した。このことは、群の一部についてのばらつきが大きい場合であっても、赤血球細胞、血小板、白血球細胞及びリンパ球についても同様のことが言える。好中球の量は、健常動物及びｄｓＡＡＶＬｕｃで処置した肝硬変動物おいて同様であったが、ｄｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉで処置した動物においてよりも低かった。
【０２１４】
造血細胞のいくつかの特性を分析した。これらには、ヘモグロビン（ＨＧＢ）、ヘマトクリット（ＨＣＴ）、総濃厚赤血球細胞数を総赤血球細胞（ＭＣＶ）数により割ることにより算出される平均血球体積、赤血球細胞内の酸素担持ヘモグロビンの平均量の計算値である平均血球ヘモグロビン（ＭＣＨ）及び平均細胞ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）などがある。これらのパラメータでは、値のばらつきが小さく、全ての実験群間での有意な差はなかった。
【０２１５】
全ての実験群間に有意の差がないことは、ベクターを投与してから１年後に、トランスアミナーゼ、ビリルビン及びアルブミンについて観察された。さらに、いくつかのパラメータを、ベクターを投与してから１年後に血清において分析した（データは図示せず）。クレアチンフォスフォキナーゼ、トリグリセリド、ナトリウム、クロラム、クレアチニン、カリウム、カルシウム、マグネシウム及びプロトロンビン時間などのこれらのパラメータのほとんどは、全ての実験群間での値のばらつきが小さく、極めて類似しており、統計分析では、差は有意ではなかった。全ての実験群間での差が有意ではないことは、トランスアミナーゼ及びＬＤＨについても観察されたが、これらの場合においては、ばらつきが大きかった。差が有意でない同様の結果が総タンパク質、グルコース、リン及びＴＣＡについて観察されたが、これらのパラメータはｄｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉ処置動物においてわずかに増加した（総タンパク質及びＴＣＡ）又は減少した（グルコース及びリン）。
【０２１６】
上記で示したように、肝臓の病理組織学的分析では、肝硬変を示さなかった。このことは、肝硬変が、肝臓毒物質の最終用量投与をしてから１年後に肝硬変対照においてであっても退縮することを示している。肝臓切片のＳｉｒｉｕｓレッド染色から、肝硬変対照において多少の線維形成病変が明らかとなった。Ｓｉｒｉｕｓレッド染色の定量化から、肝硬変対照が、健常動物又はｄｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉで処置した動物よりも線維症の程度が大きかったことがわかる。しかしながら、線維化対照における線維症の百分率は、より早い時点で１５％であり、肝臓毒物質の最終用量投与と処理してから１年後に、約５％まで減少した。驚くことではないが、コラーゲンＩ及びＩＶ  ｍＲＮＡのレベルは、全ての実験群で同様である。
【０２１７】
腎臓、肺、小腸、肝臓、脳、小脳、骨格筋、睾丸、脾臓、胃、骨髄、リンパ節、胸腺及び心臓を、病理組織学的分析により評価した。睾丸、胸腺、脳及び小脳、骨髄、リンパ節並びに胃は、顕著な組織病理学的変化を示さなかった。一部の肝硬変対照は、健常又はｄｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉ処置動物においては観察されなかった心臓、筋肉及び脾臓において変更を示した。ｄｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉ処置動物で観察された全ての変更は、対照動物においても観察された。例外は、腎臓、肺、肝臓及び小腸だけであった。半分又は半分より少ない数の動物が、肺気管支における出血、軽実質性炎症及び肝臓における小領域の壊死又は小腸のパイアー斑におけるリンパ球の減少を示す。ｄｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉ処置動物の腎臓において、より大きな程度の変更が観察された。半分又は半分より少ない数の動物が、糸球体サイズの増加、ボーマン嚢への時折のアシドフィルス菌の含有、腎炎又は再生糸球体周囲の増殖を示した。全ての動物は、おそらく血清におけるＧＧＴレベルの増加の一因である多少の尿細管壊死を示した。外因性肝臓ＩＧＦ−Ｉ発現を観察された変更と相関することは困難である。この結果が統計的に有意であり関連性があるかどうかをみきわめるには、より多くの動物を評価する必要がある。
【０２１８】
結論として、１年間外因性肝臓ＩＧＦ−Ｉを発現する肝硬変動物は、健常及び肝硬変対照と類似している。分析されたほとんどの血清及び尿パラメータ及び組織病理学的検討によれば、ＡＡＶＩＧＦ−Ｉ処置動物と対照との間には再現性のある有意な差がない。しかしながら、ＧＧＴの血清レベルなどのあるパラメータ及び腎臓における組織病理学的変化は、臨床試験の前の毒物学的検討においてより大きな群で再評価される必要がある。
【０２１９】
興味深いことに、ＩＧＦ−Ｉ発現は、ｄｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉを投与してから１年後にもまだ検出されることができる。ＩＧＦ−Ｉ発現は、健常動物において観察されるように、ＩＧＦＩＢＰ３及びＨＧＦレベルの増加と相関している。しかしながら、この時点では、メタロプロテイナーゼ、炎症及びプロフィブロジェニック因子の変化は検出されない。
【０２２０】
肝硬変におけるＩＧＦ−Ｉ（ｓｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉ）をコードする一本鎖ＡＡＶベクターの効果の評価
材料及び方法
一本鎖ＡＡＶベクターの構築及び製造
ＡＡＶ２のゲノムを使用し、ウイルスをＡＡＶ１で偽型化した。ｓｓＡＡＶベクターは、遺伝子構造において、ＩＧＦ−Ｉベクターのものと同一のａ１ＡＴプロモーターを有するルシフェラーゼカセットを除いて、ｄｓＡＡＶベクター（上記した）と同一である。さらに、発現カセットの５’及び３’ＩＴＲ隣接領域は、ＡＡＶ２野生型である。
【０２２１】
プラスミドｐＶＤ２０４の構築  ｐＶＤ２０４を生成するために、ＩＧＦ−Ｉ遺伝子配列を、Ａｃｃｕｐｒｉｍｅ（商標）ｐｆｘＤＮＡポリメラーゼキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；参照番号１２３４４−０２４）を用いて、ＰＣＲクローニングをおこなった。遺伝子配列の増幅に使用したプライマーは、前方向プライマー３７３（５’−ＧＧＴＡＣＣＡＴＧＴＣＧＴＣＴＴＣＡＣＡＴＣＴＣ−３’）（配列番号：５６）及び後方向プライマー３７４（５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＡＴＧＴＴＴＡＣＴＴ−３’）（配列番号：５７）であった。プライマー３７３は、５’側にＫｐｎＩ部位を含み、プライマー３７４は５’側にＮｏｔＩ部位を含む。鋳型プラスミドｓｃＡＡＶ−ＩＧＦ１（外部から得られる）を、増幅に使用した。ＰＣＲ産物を、１％アガロースゲルで視覚化し、直接使用してＰＣＲ産物を、Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＴＯＰＯ（登録商標）ＰＣＲクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのｐＣＲ（登録商標）ＩＩ−Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクターに結紮した。結紮反応後、組み換えＴＯＰＯベクターをＳｔａｂｌＩＩＩ細胞に導入して化学的形質転換をおこない、カナマイシンＬＢ−アガープレートで一晩増殖させた。次の日に、６つの単一コロニーを選び、直接コロニーＰＣＲに使用して、組み換えＴＯＰＯ−ＩＧＦベクターを担持している株のスクリーニングをおこなった。このＰＣＲのために、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲキット（ＱＩＡＧＥＮ）及びプライマー３７３及び３７４を使用して、ＴＯＰＯベクター内のＰＣＲ産物の存在について検証した。次に、１つの陽性コロニーを選択し、カナマイシンを含有するＬＢ培地２５０ｍｌにおいて一晩増殖させた。Ｍａｘｉｐｒｅｐをおこなった後、単離したＴＯＰＯ−ＩＧＦプラスミド２０μｇをＮｏｔＩ１００単位で切断し、ｐＶＤ１５８  ２０μｇをＮｈｅＩ１００単位で切断した。８０℃で２０分間熱不活性化した後、両方の線状化構築物を、Ｋｌｅｎｏｗ  ４μＬ添加することにより平滑末端とした。大断片（Ｗｅｓｔｂｕｒｇ）を、両反応に添加し、２５℃で１５分間、インキュベーションした。ＥＤＴＡ（１００μＭ）２０μＬを添加し、２０分間、７５℃で熱不活性化した後、両方の反応でのＤＮＡ単離を、Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットを用いておこなって、線状ＴＯＰＯ−ＩＧＦ  １１．４μｇ及び線状ｐＶＤ１５７  ７．２μｇを得た。次に、第二の消化反応を、ＴＯＰＯ−ＩＧＦ  １１．４μｇ及びｐＶＤ１５７  ７．２μｇをＫｐｎＩ１００単位で切断することによりおこなった。断片の分離をアガロースゲル電気泳動（１．０％）によりおこない、ＴＯＰＯ−ＩＧＦベクターから６００ｂｐインサート断片、及び１０９００ｂｐ  ｐＶＤ１５７ベクター断片を、ＱｉａＱｕｉｃｋゲル抽出キットを用いてゲルから単離した。ベクター及びインサートＤＮＡの結紮を、３：１ベクター／インサートモル比に基づく迅速結紮（ＮＥＢ）を用いることによりおこなった。室温で１５分間のインキュベーションをおこなった後、化学的コンピテントＳＵＲＥＩＩ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に導入して形質転換することを、業者のマニュアルに記載されているようにしておこなった。２つの陽性コロニーを選択��、コロニーＰＣＲによりスクリーニングした。次に、陽性クローンを、増幅し、大量調製して、−２０℃で保存した。
【０２２２】
バキュロウイルスストックの生成  バキュロウイルスストックを、バキュロウイルス発現システムを用いて製造する：標的プラスミドｐＶＤ２０４には、セルフェクチンを用いて、線状化バキュロウイルスゲノムＤＮＡが導入され、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  Ｓｆ９昆虫細胞に共トランスフェクションされる。ここで、意図する配列は、相同的組み換えを介してバキュロウイルスゲノムに移入させる。生成された組み換えバキュロウイルスは、標準プラークアッセイ法を用いて同定し、精製した。うまく単離されたウイルスプラークを選び、それを使用して、昆虫細胞の培養を次第に大きくし、Ｐ２以上に到達させ、感染させてウイルスストックを作成し、−１７０℃で保存した。これらのストックを、挿入したＤＮＡの安定性及び野生型バキュロウイルス不純物の存在についてスクリーニングした。ｒＡＡＶの産生のために、３つの異なるバキュロウイルスストックを使用する：１）ＡＡＶ２−Ｒｅｐ７８／５２発現カセットを採取するバキュロウイルス；Ｂａｃ．Ｒｅｐ、２）ＡＡＶ−Ｃａｐ血清型１発現カセットを採取するバキュロウイルス；Ｂａｃ．Ｃａｐ、及び３）ＡＡＶ２  ＩＴＲが横に位置するベクターゲノムを提示し、ＡＡＶ粒子にパッケージングされるバキュロウイルス（Ｂａｃ．ＶＤ２０４）。
【０２２３】
１Ｌ  ｒＡＡＶ産生のためのバキュロウイルスの増幅  凍結したバキュロウイルスストックを３７℃で解凍した後、１．７ｘ１０６Ｓｆ９細胞培養液に添加する（細胞培養液１ｍＬ当たり３μＬ）。７２±５時間後、感染懸濁液を、１９００Ｇで１５分間遠沈させることにより採取する。上清を、単離し、使用するまで暗所に、４℃で保存する。ｒＡＡＶ  １．０Ｌ産生のために、３つのバキュロウイルス増幅を準備し、等量のＢａｃ．Ｒｅｐ  Ｐ５；Ｂａｃ．Ｃａｐ  Ｐ５及びＢａｃ．ＶＤ２０４  Ｐ３を、産生細胞に投与した。
【０２２４】
ｒＡＡＶの産生  各々Ｓｆ９培養液４００ｍＬ（１．０ｘ１０６細胞）を入れた２つのシェーカーを、感染させる２０時間前に起動する。感染の日に、細胞密度を監視すると、２．０ｘ１０６細胞／ｍＬであり、生存率が９８％超である。採取したバキュロウイルス（Ｂａｃ．Ｒｅｐ、Ｂａｃ．Ｃａｐ（ＡＡＶ１ウイルスタンパク質）及びＢａｃ．ＶＤ２０４（ＡＡＶ−ＩＧＦ１発現カセット））を、シェーカーの培養液に添加した。７２±５時間後、各シェーカーフラスコに（１０Ｘ）Ｔｒｉｓ−Ｌｙｓｉｓ緩衝液４５ｍＬを添加することにより、ｒＡＡＶを採取する。２８℃で１時間のインキュベーションをおこなった後、ベンゾナーゼ４０００単位を、各シェーカーに添加し、シェーカーインキュベーター中、３７℃、１２８ｒｐｍで１時間インキュベーションする。
【０２２５】
ｒＡＡＶの精製：粗製溶解バルクを３０００ｇで遠心分離し、上清をＭｉｌｌｉｐａｋ６０フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて濾過した（０．４５μｍ）。アフィニティークロマトグラフィーを、５ｍＬ床容積のＡＶＢセファロース高速アフィニティー媒体を充填した、ＸＫ−１６カラムを備えたＡＫＴＡ−Ｅｘｐｌｏｒｅｒクロマトグラフィーシステム（これらは、全てＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いておこなった。処理に続いて、溶離画分（約５０ｍｌ）を、２５ｍＬ  ［０．１］Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７．５）が入った容器に集めた。続いて、緩衝液交換を、交差流ダイアフィルトレーションモジュールを用いておこなった。溶離液をダイアフィルトレーションし、０．２２μＭ濾過した。産物を−８０℃で凍結保存した。
【０２２６】
肝硬変のモデル  肝硬変を、上記したｄｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉの検討のようにして、雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに、ＣＣｌ４を１週間に１回、８週間にわたって胃内投与して誘発させた。
【０２２７】
ウイルスベクターの投与  健常動物を未処置（健常）にするか、又は肝硬変を誘発するのに使用した。食塩水で処置した健常なラット群（健常）及び肝硬変未処置ラット（Ｃｉ）も、対照に含めた。肝硬変の誘発の終わりから１週間後、肝硬変動物を、以下のもので処置した：
−食塩水（Ｃｉ）；
−用量９．７ｘ１０９ｖｐ／ラット（極低用量）、４．８ｘ１０１０ｖｐ／ラット（低用量）、２．４ｘ１０１１ｖｐ／ラット（中用量）、あるいは１．２×１０１２ｖｐ／ラット（高用量）でのルシフェラーゼ（ｓｓＡＡＶ−Ｌｕｃ）をコードする組み換え一本鎖アデノ関連ウイルスベクター（ｓｓＡＡＶ）；
−この場合も９．７ｘ１０９ｖｐ／ラット（極低用量）、４．８ｘ１０１０ｖｐ／ラット（低用量）、２．４ｘ１０１１ｖｐ／ラット（中用量）、あるいは１．２ｘ１０１２ｖｐ／ラット（高用量）での、ＩＧＦ−Ｉをコードする組み換えｓｓＡＡＶ（ｓｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉ）；
−用量３．４ｘ１０９ｖｐ／ラットでの、ルシフェラーゼをコードする二本鎖アデノ関連ウイルスベクター（ｄｓＡＡＶ）（ｄｓＡＡＶＬｕｃ）；又は
−用量３．４ｘ１０９ｖｐ／ラットでの、ＩＧＦ−ＩをコードするｄｓＡＡＶ（ｄｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉ）。
【０２２８】
処置のために、動脈内投与ルートを選択した。ｄｓＡＡＶＬｕｃを用いた先の実験では、動脈内注射をおこなったときに、良好な発現レベルが得られた。おそらく、肝動脈のカテーテル法による投与も、患者に使用するのに最も適当な方法である。
【０２２９】
血清タンパク質及び因子の生化学的分析のための血液試料を、感染（処置）してから、４日、２週間、３週間、４週間、８週間、１２週間及び１年後に採取した。ｄｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉ又は中用量のｓｓＡＡＶＬｕｃで処置した一部の動物（ｎ＝４）を、２カ月間評価した後、犠牲死して種々の集団の肝臓細胞を単離し、ルシフェラーゼ発現を測定した。感染後の種々の時間で、一部の動物を選択し、犠牲死し、肝臓試料を採取して評価した：
ベクターを投与してから、
−４日後（健常ｎ＝４、食塩水ｎ＝４、ｄｓＡＡＶＬｕｃ  ｎ＝４、ｄｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉ  ｎ＝５、ｓｓＡＡＶＬｕｃ、高用量ｎ＝４、中用量ｎ＝４、低用量ｎ＝４及び極低用量ｎ＝４並びにｓｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉ、高用量ｎ＝６、中用量ｎ＝５、低用量ｎ＝４及び極低用量ｎ ＝５）；
−８週間後（健常ｎ＝５、食塩水ｎ＝４、ｄｓＡＡＶＬｕｃ  ｎ＝３、ｄｓＡＡＶＩＧＦ  −Ｉ  ｎ＝６、ｓｓＡＡＶＬｕｃ、高用量ｎ＝５、中用量ｎ＝４、低用量ｎ＝６及び極低用量ｎ＝６並びにｓｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉ、高用量ｎ＝６、中用量ｎ＝４、低用量ｎ＝６及び極低用量ｎ＝６）；
−１６週間後（健常ｎ＝６、食塩水ｎ＝６、ｓｓＡＡＶＬｕｃ低用量ｎ＝６、ｓｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉ低用量ｎ＝６）；並びに
−１年後（健常ｎ＝４、食塩水ｎ＝４、ｓｓＡＡＶＬｕｃ高用量ｎ＝４、ｓｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉ高用量ｎ＝６）。  
【０２３０】
全ての手順及び分析方法は、ｄｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉの効果の評価について述べたようにしておこなった。
【０２３１】
実施例９  硬変した肝臓へのＩＧＦ−Ｉ遺伝子の移入
ベクターを接種してから４日、８週間後に、ｑＲＴ−ＰＣＲにより、肝臓抽出物で評価した（図１５Ａ）。より低用量のｓｓＡＡＶＬｕｃ及びｓｓＡＶＶＩＧＦ−Ｉでの処置については、ＩＧＦ−Ｉ  ｍＲＮＡを、さらにベクターを投与してから１６週間後に評価した（図１５Ｃ）。ベクターを投与してから４日及び８週間後に、総肝臓ＩＧＦ−Ｉタンパク質を、ＥＬＩＳＡにより評価した（図１５Ｂ）。
【０２３２】
得られた結果から、ＩＧＦ−Ｉ  ｍＲＮＡは、健常対照と比較して、肝硬変動物で減少したことが分かった。ＩＧＦ−Ｉレベルは、健常及び肝硬変対照と比較して、ＩＧＦ−Ｉ処置動物（ｓｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉ又はｄｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉ）で増加した。ＩＧＦ−Ｉレベルの増加は、ＩＧＦ−Ｉ発現ベクターを投与してから４日後には既に明らかであった。次に、ＩＧＦ−Ｉタンパク質レベルが、ＡＡＶＩＧＦ−Ｉを投与しから８週間後に増加し、検討の終わりまで一定のまま維持した。また、より高用量のｓｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉを使用したときには、より高レベルのＩＧＦ−Ｉが観察された。
【０２３３】
ＩＧＦ−Ｉを、ベクターを投与してから４日、２週間及び８週間後に血清において評価した。結果から、処置してから４日後、総ＩＧＦ−Ｉレベルは、全ての肝硬変群において、健常動物におけるよりも低いことが分かった（図１５Ｄ）。しかしながら、遊離ＩＧＦ−Ｉタンパク質は、高及び中用量のｓｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉを注射した動物の血清で増加する。ベクターを投与してから２週間及び８週間後、総及び遊離（データは図示されず）ＩＧＦ−Ｉの両方が、全ての群において同様である。最高用量のｓｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉで処置した動物における増加した無血清ＩＧＦ−Ｉは、ＩＧＦ−Ｉ結合タンパク質の発現の増加を誘発することによるより後の時点での総ＩＧＦ−Ｉとなることが可能でろう。
【０２３４】
さらに、ベクターから発現されたＩＧＦ−Ｉは、４日間、８週間及び１６週間ベクターを注射したＩＧＦ−Ｉ発現動物において増加するＩＧＦ−ＩＢＰ３及びＩＧＦ−ＩＲの発現を活性化できるので、活性である（図１５Ｆ〜Ｈ）。
【０２３５】
実施例１０  硬変した肝臓へのＩＧＦ−Ｉ遺伝子移入により、肝機能が改善され、肝線維症が著しく減少する
ベクターを接種してから４日目でのトランスアミナーゼは、全ての肝硬変群で同様であり、健常動物においてよりも高かった（図１６Ａ）。しかしながら、ｓｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉ又はｄｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉベクターで処置した動物は、ベクターを投与してから２週間後に肝硬変対照よりも低いトランスアミナーゼレベルを示した。より後の時点で、トランスアミナーゼレベルは、ＩＧＦ−Ｉ処置動物においてさらに減少し、ベクターを投与してから８週間後では、ｓｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉ又はｄｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉベクターで処置した動物におけるトランスアミナーゼレベルは健常動物と同様であった（図１６Ｂ）。同様のことが、低用量のｓｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉで処置した動物において、ベクターを投与してから１２週間後に観察された（図１６Ｃ）。興味深いことに、同様の効果が、ｄｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉで処置した動物及び低用量のｓｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉで処置した動物において観察された。しかしながら、この効果は、最高の用量のｓｓ−ＡＡＶ１−ＩＧＦ−Ｉで処置した動物ではより低かった（図１６Ｄ）。
【０２３６】
ビリルビンは、ベクターを接種してから４日目で、全ての肝硬変動物において同様であり、健常対照においてよりも高かった（図１７Ａ）。しかしながら、ｄｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉで処置した動物とｓｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉで処置した動物の両方は、ベクターを投与してから２週間後で、肝硬変対照よりもビリルビンレベルが低かった。より後の時点で、ビリルビンレベルは、ＡＡＶＩＧＦ−Ｉ（一本鎖と二本鎖の両方）で処置した動物においてさらに減少し、ベクターを投与してから８週間後では、ＡＡＶＩＧＦ−Ｉで処置した動物におけるビリルビンレベルは、健常動物と同様であった（図１７Ｂ）。同じことが、低用量のｓｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉで処置した動物において、ベクターを投与してから１２週間後で観察された（図１７Ｃ）。同様の結果が、高用量のｓｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉで処置した動物において投与してから１年後にみられ、その統計的分析では、有意な差はなかった。興味深いことに、同様の効果が、ｄｓＡＡＶ１ＩＧＦ−Ｉで処置した動物又は低用量のｓｓＡＡＶ１ＩＧＦ−Ｉで処置した動物において観察された。しかしながら、この効果は、高用量のｓｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉで処置した動物においては低かった（図１７Ｄ）。
【０２３７】
アルブミンは、ベクターを接種してから４日及び２週間後で、全ての肝硬変動物において同様であり、健常対照におけるよりは低かった（図１８Ａ、１８Ｂ）。しかしながら、ＡＡＶＩＧＦ−Ｉ（一本鎖又は二本鎖）で処置した動物は、ベクターを投与してから８週間後で、肝硬変対照と比較して、アルブミンレベルが増加した（図１８Ｂ）。同じことが、低用量のｓｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉで処置した動物において、ベクターを投与してから１２週間後に観察された（図１８Ｃ）。同様の結果が高用量のｓｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉで処置した動物において、投与してから１年後にみられ、統計的分析では、有意の差はみられなかった（図１８Ｄ）。
【０２３８】
肝臓試料をＳｉｒｉｕｓレッドで染色し、肝線維症を定量化した（図１９Ａ）。結果から、硬変した肝臓は線維化していることと、線維症はＡＡＶＩＧＦ−Ｉ  （一本鎖又は二本鎖）で処置した動物において減少することが分かった。驚くべきことに、高用量のＡＡＶＩＧＦ−Ｉは、残りよりも効率が低い。コラーゲンＩ及びＩＶ  ｍＲＮＡ発現レベルをｑＲＴ−ＰＣＲにより定量化したときに、同様の結果が観察された（図１９Ｂ、１９Ｃ）。低用量のｓｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉで処置してから１６週間後では、線維症及びコラーゲンｍＲＮＡ発現レベルは、健常動物におけるものと同一であった。このことは、肝硬変が完全に解消されたことを示している（図１９Ｄ〜Ｆ）。コラーゲンＩＩ  ｍＲＮＡは検出されず、コラーゲンＩＩＩ  ｍＲＮＡレベルは群間での差はなかった（データは図示せず）。これから、肝線維症において蓄積しないものと予想された。
【０２３９】
実施例１１  硬変した肝臓内のＩＧＦ−Ｉ遺伝子発現はフィブロリシスを誘発する
ＡＡＶＩＧＦ−Ｉベクターでの線維症の減少は、既存のマトリックス堆積物の分解から生じる。ＭＭＰは細胞外コラーゲンを分解するので、本発明者らは全ての実験群の肝臓におけるＭＭＰ発現を評価した。
【０２４０】
ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９及びＭＭＰ１４  ｍＲＮＡ発現レベル（図２０Ａ〜Ｄ及びＩ〜Ｍ）並びにＭＭＰ２及びＭＭＰ９タンパク質レベル（図２０Ｆ、２０Ｇ）を、ベクターを接種してから８週間及び１６週間後に、それぞれｑＲＴ−ＰＣＲ及びＥＬＩＳＡにより測定した。結果から、全てのこれらのＭＭＰの発現は、健常対照と比較して、肝硬変動物において減少する。しかしながら、これらの因子のレベルは、ＡＡＶＩＧＦ−Ｉベクター（一本鎖又は二本鎖）で処置したラットにおいて、肝硬変動物と健常動物の両方と比較して、著しく増加する。この増加は、処置してから４日後には検出されないが、ＡＡＶＩＧＦ−Ｉベクターを投与してから８週間又は１６週間で検出される。たとえ、ＡＡＶＩＧＦ−Ｉ処置動物におけるＭＭＰレベルが経時的に減少しても、ＡＡＶＩＧＦ−Ｉベクターを投与してから１６週間で健常動物において観察されるよりもまだ高い。
【０２４１】
ＴＩＭＰ−２発現については、逆パターンが観察された（図２０Ｅ及び２０Ｍ）。ＴＩＭＰタンパク質は、ＭＭＰ活性のインヒビターである。したがって、高ＭＭＰ活性のためにＴＩＭＰレベルが減少することが必須である。ＴＩＭＰ−２  ｍＲＮＡ発現は、健常対照と比較して、肝硬変動物において増加した。ＴＩＭＰ−２のレベルは、ＡＡＶＩＧＦ−Ｉベクターで処置したラットにおいて、肝硬変対照と比較して減少した。この減少は、ＡＡＶＩＧＦ−Ｉベクターを投与してから８週間後に検出され、ＴＩＭＰ−２レベルは経時的にさらに減少したが、処置してから１６週間後で、健常動物において観察されるレベルよりもまだ高かった。増加したＭＭＰと減少したＴＩＭＰとのバランスは、増加したＭＭＰ活性と相関する。驚くべきことに、最高用量のＡＡＶＩＧＦ−Ｉでは、ＭＭＰ発現の誘発が少なく、残りよりも活性が低い。
【０２４２】
実施例１２  硬変した肝臓内でのＩＧＦ−Ｉ遺伝子発現は、プロフィブロジェニック因子の発現を減少する
線維症の減少は、プロフィブロジェニック細胞の減少からも生じる。平滑筋アクチン（αＳＭＡ）により特徴付けられる活性化肝臓星細胞（ＨＳＣ）は、細胞外コラーゲンの主要な生成源である。したがって、本発明者らは、αＳＭＡに対する抗体を用いた免疫組織化学によるか（図２１Ａ）、又はαＳＭＡ  ｍＲＮＡの定量化により（図２１Ｂ、２１Ｃ）、活性化したＨＳＣの量を評価した。
【０２４３】
結果から、肝硬変動物に高レベルのαＳＭＡ発現細胞があることが分かった。ＡＡＶＩＧＦ−Ｉベクター（一本鎖又は二本鎖）を投与してから８週間後、αＳＭＡ  ｍＲＮＡ発現レベル及びαＳＭＡ発現細胞が著しく減少した。８週間後、αＳＭＡ  ｍＲＮＡ発現が肝硬変動物で減少したが、健常対照よりも高かった。しかしながら、ｓｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉで処置した動物におけるαＳＭＡ  ｍＲＮＡのレベルは、健常動物において観察されるレベルと同様であった。高用量のｓｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉで処置した動物におけるαＳＭＡの減少は、それほど大きくなかった。
【０２４４】
活性化、増殖、移動及びＨＳＣからのコラーゲン合成は、プロフィブロジェニック因子、例えば、ＴＧＦβ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、アンフィレギュリン（ＡＲ）又は  ＣＴＧＦにより介在される。この応答は、ＩＬ−６及びＴＮＦα発現により標識される炎症環境が都合がよい。したがって、これらの因子の肝臓発現を、ベクターを接種してから８週間後及び１６週間後に評価した（図２２）。これらの因子は、健常動物と比較して、全ての肝硬変対照において大きく増加し、経時的に減少する傾向があった。しかしながら、これらの因子の全ては、ＡＡＶＩＧＦ−Ｉ処置肝硬変動物において著しく減少し、健常動物において観察されるよりも有意差は小さかった。唯一の例外は、ＩＬ６であり、全ての動物において同様であった。プロフィブロジェニック及び炎症因子の減少は、高用量のｓｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉを使用したとき、それほど明らかでなかった。
【０２４５】
実施例１３  硬変した肝臓内のＩＧＦ−Ｉ遺伝子発現により、抗線維形成及び肝臓保護因子の発現が増加し、増殖を刺激しない
ＡＡＶＩＧＦ−Ｉ処置で改善された肝機能は、ＨＧＦ又はＨＮＦ４αなどの肝臓保護因子の活性化から得ることができるであろう。したがって、本発明者らは、まずｍＲＮＡ、及びＨＧＦのタンパク質発現を測定した（図２３）。
【０２４６】
ＨＧＦのレベルは、健常ラットと比較して、肝硬変対照において減少した。しかしながら、ＡＡＶＩＧＦ−Ｉ（一本鎖又は二本鎖）で処置した動物は、このベクターを投与してから４日後で、健常なラットと同様なＨＧＦレベルを示した。これらの動物におけるＨＧＦレベルは、健常対照において観察されるレベルと比較して、より後の時点でより高く、大きく増加した。高用量のｓｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉを使用したとき、ＨＧＦの増加はそれほど明らかでなかった。
【０２４７】
ＨＧＦについて観察された結果は、ＨＮＦ４α  ｍＲＮＡについて観察されたものと極めて類似していた（図２４Ａ〜Ｃ）。ＨＮＦ４ａは成熟因子であるので、このことは非常に興味深いことである。実際に、ＩＧＦ−Ｉは、成長因子であり、したがって、ＩＧＦ−Ｉ受容体で細胞の増殖を活性化できるであろう。他に、ＩＧＦ−Ｉは、これも成長因子であるＨＧＦを活性化する。たとえ、肝細胞が健常肝臓においてＩＧＦ−Ｉ受容体を発現しない場合であっても、本発明者らは、ＡＡＶＩＧＦ−Ｉ処置による肝臓細胞の増殖及び分化を評価しようとした。本発明者らは、肝臓分化マーカーとして、胎児肝臓において発現し、成人組織では発現しないＷＴ−１を使用した。ＷＴ−１  ｍＲＮＡレベルは、健常ラットと比較して、肝硬変動物において著しく増加した（図２４Ｄ、２４Ｅ）。興味深いことに、ＡＡＶＩＧＦ−Ｉで処置したラットは、健常動物と同様のＷＴ−１のｍＲＮＡレベルを示した。これらの効果は、高用量のｓｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉを使用したときに、それほど明らかでなかった。
【０２４８】
増殖を、ＰＣＮＡ  ｍＲＮＡ発現レベルの定量化及び増殖マーカーＫｉ６７での染色により評価した（図２５）。染色後、陽性細胞を、全ての実験群でカウントし、結果を、肝臓細胞の増殖を測定するグラフにプロットした。増殖レベルは、肝硬変対照において、健常対照又はＡＡＶＩＧＦ−Ｉで処置した動物と比較して、最も高かった。ベクターを投与してから４日後で、肝硬変動物とＡＡＶＩＧＦ−Ｉ処置動物との間にはＫｉ６７レベルの差は観察されなかった。しかしながら、ＩＧＦ−Ｉを発現する動物は、ベクターを投与してから８週間後に、より低いＫｉ６７レベルを示し（図２５Ａ）、ベクターを投与してから４日、８週間又は１６週間後により低いＰＣＮＡ  ｍＲＮＡレベルを示した（図２５Ｂ〜Ｄ）。ＩＧＦ−Ｉ処置動物におけるこれらの増殖因子レベルは、健常対照において観察されるものと同様であった。唯一の例外は、最高用量のＡＡＶＩＧＦ−Ｉで処置した動物において観察され、健常動物よりも高い増殖レベルを示したが、肝硬変対照よりも低かった。
【０２４９】
実施例１４  処置してから１年後におけるｓｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉ処置動物  （高用量）の毒物学的評価
高用量のｓｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉ若しくはｓｓＡＡＶＬｕｃ又は食塩水で処置した肝硬変動物を、健常動物と比較することにより、評価をおこなった。ウイルスを注射してから１年後に犠牲死した動物を解剖した。血液を採取して、いくつかのパラメータを評価した。腎臓、肺、小腸、肝臓、脳、小脳、骨格筋、睾丸、脾臓、胃、骨髄、リンパ節、胸腺及び心臓を、組織病理学的分析により評価した。
【０２５０】
脾臓、心臓、睾丸、腎臓及び肝臓の相対的重さは、検討した実験群間では有意な差はなかった。
【０２５１】
血清を使用して、赤血球細胞、血小板、白血球細胞、好中球、リンパ球、単球、好酸球及び好塩基球を定量した。全ての細胞は、全ての実験群間で同様の値を示した。
【０２５２】
造血細胞のいくつかの特性を分析した。これらには、ヘモグロビン（ＨＧＢ）、ヘマトクリット（ＨＣＴ）、総濃厚赤血球細胞数を総赤血球細胞（ＭＣＶ）数により割ることにより算出される平均血球体積、赤血球細胞内の酸素担持ヘモグロビンの平均量の計算値である平均血球ヘモグロビン（ＭＣＨ）及び平均細胞ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）などがある。これらのパラメータでは、値のばらつきが小さく、全ての実験群間での有意な差はなかった。
【０２５３】
いくつかのパラメータを、血清で分析した。これらには、トランスアミナーゼ（ＡＳＴ、ＡＬＴ及びＡＬＰ）（図１６Ｄ）、ビリルビン（図１７Ｄ）、アルブミン（図１８Ｄ）、ガンマグルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）、クレアチニン、カリウム、カルシウム、リン、マグネシウム、ナトリウム及びクロラム（ｃｈｌｏｒｕｍ）などがある。これらのパラメータは、全ての実験群間で同様の値を示し、統計的分析では、有意な差はなかった。場合によっては、ビリルビン、アルブミン又はＧＧＴなどの測定では、ばらつきが大きかった。
【０２５４】
プロトロンビン時間（ＰＴ）、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）及びフィブリノゲンを測定することにより、凝集を評価した。これらの測定では、ばらつきが大きかったが、全ての実験群間では平均は同様であった。統計的分析をしたところ、有意な差はなかった。
【０２５５】
肝臓切片のＳｉｒｉｕｓレッド染色の定量化により、肝線維症を評価した（図１９Ｄ）。その結果及び肝臓の組織病理学的分析では、実験群のいずれにおいても肝硬変はなかった。このことは、肝硬変は肝臓毒物質を最終用量投与してから１年後に、肝硬変対照においてでさえ退縮することを示している。
【０２５６】
腎臓、肺、小腸、肝臓、脳、小脳、骨格筋、睾丸、脾臓、胃、骨髄、リンパ節、胸腺及び心臓を、組織病理学的分析により評価した。脳、小脳、骨格筋、睾丸、胃、骨髄、リンパ節及び胸腺は、顕著な組織病理学的変化を示さなかった。一部の肝硬変対照は、健常動物又はｓｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉ処置動物において観察されない、肺、小腸、肝臓及び脾臓において変化を示す。興味深いことに、肝硬変動物には２つの腫瘍、肝臓に１つの腫瘍、肺に１つの腫瘍がある。ｓｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉ処置動物に観察された全ての変更は、対照動物にも観察される。唯一の例外は、ｓｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉで処置された６匹の動物のうち２匹の動物において軽度の腸炎があったことである。
【０２５７】
結論として、ｓｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉでの処置により外因性肝臓ＩＧＦ−Ｉを発現した肝硬変動物は、処置してから１年後で、健常動物及び肝硬変対照と同様である。分析された全ての血清パラメータ及び組織病理学的検討は、ｓｓＡＡＶＩＧＦ−Ｉ処置動物と対照との間では再現可能な有意な差はなかった。
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【図１ＡＢ】
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【図１ＣＤ】
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【図２】
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【図３ＡＢ】
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【図３ＣＤ】
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【図４Ａ】
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【図４ＢＣ】
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【図５ＡＢ】
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【図５ＣＤ】
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【図６ＡＢ】
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【図６ＣＤ】
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【図６ＥＦ】
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【図６ＧＨ】
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【図７ＡＢ】
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【図７ＣＤ】
2012521750.tif 000020
【図７ＥＦ】
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【図７ＧＨ】
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【図７Ｉ】
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【図７ＪＫ】
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【図８ＡＢ】
2012521750.tif 000025
【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０ＡＢ】
2012521750.tif 000028
【図１０ＣＤ】
2012521750.tif 000029
【図１１】
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【図１２】
2012521750.tif 000031
【図１３Ａ−Ｃ】
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【図１３ＤＥ】
2012521750.tif 000033
【図１４】
2012521750.tif 000034
【図１５ＡＢ】
2012521750.tif 000035
【図１５Ｃ】
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【図１５ＤＥ】
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【図１５ＦＧ】
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【図１５Ｈ】
2012521750.tif 000039
【図１６ＡＢ】
2012521750.tif 000040
【図１６ＣＤ】
2012521750.tif 000041
【図１７ＡＢ】
2012521750.tif 000042
【図１７ＣＤ】
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【図１８ＡＢ】
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【図１８ＣＤ】
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【図１９ＡＢ】
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【図１９ＣＤ】
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【図１９ＥＦ】
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【図２０ＡＢ】
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【図２０ＣＤ】
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【図２０ＥＦ】
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【図２０ＧＨ】
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【図２０ＩＪ】
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【図２０ＫＬ】
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【図２０Ｍ】
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【図２１Ａ】
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【図２１ＢＣ】
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【図２２ＡＢ】
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【図２２ＣＤ】
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【図２２ＥＦ】
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【図２２ＧＨ】
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【図２２ＩＪ】
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【図２２ＫＬ】
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【図２２ＭＮ】
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【図２３ＡＢ】
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【図２３ＣＤ】
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【図２３Ｅ】
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【図２４ＡＢ】
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【図２４Ｃ】
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【図２４ＤＥ】
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【図２５ＡＢ】
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【図２５ＣＤ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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