【手続補正書】
【提出日】平成21年10月26日(2009.10.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸分子の標的集団を選択的に増幅する方法であって、オリゴヌクレオチドの集団を使用して、核酸分子のより大きな集団内の核酸分子の標的集団の増幅を開始する工程を含み、
（ａ）各オリゴヌクレオチドがハイブリダイズ部分を含み、該ハイブリダイズ部分が６個、７個又は８個のヌクレオチドの１つからなり、及び
（ｂ）オリゴヌクレオチドの集団が、６個、７個又は８個のヌクレオチドからなる前記ハイブリダイズ部分の全ての可能な配列を生成すること、及び所定の条件下で標的核酸集団の第二の亜集団にハイブリダイズするハイブリダイズ部分を除去することにより、前記所定の条件下で標的核酸集団の第一の亜集団にハイブリダイズするが、前記所定の条件下で標的核酸集団の前記第二の亜集団にハイブリダイズしないオリゴヌクレオチドの集団を生成するように選択される、前記方法。
【請求項２】
各オリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズ部分に対して５’に位置する所定の配列部分をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
所定の配列部分が転写プロモーターを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
所定の配列部分がＰＣＲ増幅用のプライマー結合部位を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
核酸分子の標的集団が哺乳動物の血液細胞から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
哺乳動物の血液細胞が、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、単球、赤血球及び血小板からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
核酸分子の標的集団が哺乳動物の血液細胞から得られるｍＲＮＡ分子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
標的核酸集団の第二の亜集団が、核酸分子の標的集団中の最も豊富に表現された核酸分子から実質的になり、前記最も豊富に表現された核酸分子の各々が、核酸分子の標的配列に存在する全てのｍＲＮＡの少なくとも０．１％を構成する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
標的核酸集団の第二の亜集団が、リボソームＲＮＡ、リボソームＤＮＡ，グロビンＤＮＡ及びグロビンＲＮＡ、又はこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
核酸分子の標的集団の増幅が、核酸分子の標的集団を逆転写することに続き、ＲＮＡ分子を生成するためのインビトロ転写の工程を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
標的集団の増幅が、核酸分子の標的集団を逆転写することに続き、二本鎖ＤＮＡ分子を生成するためのＰＣＲ増幅の工程をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１２】
逆転写工程がｄＮＴＰの存在下で実施され、ｄＮＴＰ濃度が５０〜５０００マイクロモルの範囲を含む、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
ｄＮＴＰ濃度が１０００〜２０００マイクロモルの範囲を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
所定のハイブリダイゼーション条件が４０℃〜５０℃の範囲のアニーリング温度を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
スペーサー部分が、各オリゴヌクレオチドの所定の配列部分とハイブリダイズ部分との間に配置されている、請求項２に記載の方法。
【請求項１６】
核酸分子の標的集団を選択的に増幅する方法であって、オリゴヌクレオチドの集団を使用して、核酸分子のより大きな集団内の核酸分子の標的集団の増幅を開始する工程を含み、
（ａ）各オリゴヌクレオチドがハイブリダイズ部分を含み、該ハイブリダイズ部分が６個、７個又は８個のヌクレオチドの１つ及び該ハイブリダイズ部分に対して５’に位置する所定の配列部分からなり、並びに
（ｂ）オリゴヌクレオチドの集団が、６個、７個又は８個のヌクレオチドからなる前記ハイブリダイズ部分の全ての可能な配列を生成すること、及び所定の条件下で標的核酸集団の第二の亜集団にハイブリダイズするハイブリダイズ部分を除去することにより、前記所定の条件下で標的核酸集団の第一の亜集団にハイブリダイズするが、前記所定の条件下で標的核酸集団の前記第二の亜集団にハイブリダイズしないオリゴヌクレオチドの集団を生成するように選択される、前記方法。
【請求項１７】
所定の配列部分がインビトロ転写に適した転写プロモーターを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
所定の配列部分がＰＣＲ増幅用のプライマー結合部位を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
標的細胞から得られた核酸分子の標的集団を選択的に増幅する方法であって、オリゴヌクレオチドの集団を使用して、核酸分子のより大きな集団内の核酸分子の標的集団の増幅を開始する工程を含み、オリゴヌクレオチドの前記集団内の各オリゴヌクレオチドがハイブリダイズ部分及び該ハイブリダイズ部分に対して５’に位置する所定の配列部分を含み、前記ハイブリダイズ部分が所定の条件下で前記標的細胞から得られたｍＲＮＡ核酸分子にハイブリダイズするが、前記所定の条件下で前記標的細胞から得られたリボソームＲＮＡ、リボソームＤＮＡ、グロビンＤＮＡ又はグロビンＲＮＡの少なくとも１つにはハイブリダイズしないように選択される、前記方法。
【請求項２０】
所定の配列部分がインビトロ転写に適した転写プロモーターを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
核酸分子の標的集団を選択的に増幅する方法であって、
（ａ）オリゴヌクレオチドの集団（各オリゴヌクレオチドはハイブリダイズ部分及び該ハイブリダイズ部分に対して５’に位置する転写プロモーター部分を含み、前記ハイブリダイズ部分は６〜８ヌクレオチド長であり、前記オリゴヌクレオチドの集団は６個、７個又は８個のヌクレオチドからなる前記ハイブリダイズ部分の全ての可能な配列を生成すること、及び所定の条件下で標的核酸集団の第二の亜集団にハイブリダイズするハイブリダイズ部分を除去することにより、前記所定の条件下で標的核酸集団の第一の亜集団にハイブリダイズするが、前記所定の条件下で標的核酸集団の前記第二の亜集団にハイブリダイズしないオリゴヌクレオチドの集団を生成するように選択される）を準備する工程と；
（ｂ）哺乳動物対象から単離されたｍＲＮＡを含む試料に、前記オリゴヌクレオチドの集団をアニールする工程と；
（ｃ）逆転写酵素を用いて、前記ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成する工程と；及び
（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼを用いて二本鎖ｃＤＮＡを合成する工程と、
を含む、前記方法。
【請求項２２】
核酸分子の標的集団を選択的に増幅する方法であって、
（ａ）オリゴヌクレオチドの第一の集団（各オリゴヌクレオチドはハイブリダイズ部分、該ハイブリダイズ部分に対して５’に位置する第一のＰＣＲプライマー結合部位、及び前記第一ＰＣＲプライマー結合部位と前記ハイブリダイズ部分との間に配置されたスペーサー部分を含み、前記ハイブリダイズ部分は６個、７個又は８個のヌクレオチドからなり、６個、７個又は８個のヌクレオチドからなる前記ハイブリダイズ部分の全ての可能な配列を生成すること、及び標的核酸集団の第二の亜集団にハイブリダイズするハイブリダイズ部分を除去することにより、所定の条件下で標的核酸集団の第一の亜集団にハイブリダイズするが、前記所定の条件下で標的核酸集団の前記第二の亜集団にハイブリダイズしないオリゴヌクレオチドの前記第一の集団を生成するように選択される）を準備する工程と；
（ｂ）哺乳動物対象から単離されたｍＲＮＡを含む試料に、前記オリゴヌクレオチドの集団をアニールする工程と；
（ｃ）逆転写酵素を用いて、前記ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成する工程と；
（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ及びオリゴヌクレオチドの第二の集団（各オリゴヌクレオチドは、ランダムなハイブリダイズ部分及び該ハイブリダイズ部分に対して５’に位置する第二のＰＣＲ結合部位を含む）を用いて二本鎖ｃＤＮＡを合成する工程と；並びに
（ｅ）熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、第一のＰＣＲプライマー結合部位に結合する第一のＰＣＲプライマー及び第二のＰＣＲプライマー結合部位に結合する第二のＰＣＲプライマーを用いて、二本鎖ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅して、増幅された二本鎖ＤＮＡを生成させる工程と、
を含む、前記方法。
【請求項２３】
スペーサー部分が、１〜６ヌクレオチド長を有する、請求項１５又は２２に記載に記載の方法。。