【手続補正書】
【提出日】平成21年8月14日(2009.8.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）第１の蛍光タンパク質コード配列と、
ｂ）前記第１の蛍光タンパク質と異なる蛍光タンパク質をコードする第２の蛍光タンパク質コード配列と、
ｃ）前記第１および第２の蛍光タンパク質コード配列の間に挿入されるリンカー配列と、
を含み、ここで前記第１の蛍光タンパク質コード配列および前記第２の蛍光タンパク質コード配列は、相互にフレーム外であるが、リコーディングされると単一の融合ポリペプチドとして共発現され、前記リンカー配列は、前記共発現された蛍光タンパク質を物理的に分離可能なポリペプチドをコードし、その結果各タンパク質からの蛍光出力が増加する、翻訳リコーディングレポーター構築物。
【請求項２】
前記コードされたリンカーが、前記共発現された蛍光タンパク質間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を低下させる、請求項１に記載の翻訳リコーディングレポーター構築物。
【請求項３】
前記リンカーが、モチーフＡ（ＥＡＡＡＫ）ｎＡ（式中、ｎは１〜１０の数である）を含むポリペプチドをコードする、請求項１または２に記載の翻訳リコーディングレポーター構築物。
【請求項４】
ｎ＝２である、請求項３に記載の翻訳リコーディングレポーター構築物。
【請求項５】
前記リンカーが配列番号１に記載の配列をコードする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の翻訳リコーディングレポーター構築物。
【請求項６】
前記リンカーが、クローニングを容易にするための追加のヌクレオチドを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の翻訳リコーディングレポーター構築物。
【請求項７】
前記リンカーが配列番号２に記載の配列を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の翻訳リコーディングレポーター構築物。
【請求項８】
前記蛍光タンパク質が赤色蛍光タンパク質および緑色蛍光タンパク質である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の翻訳リコーディングレポーター構築物。
【請求項９】
前記赤色蛍光タンパク質コード配列が、前記緑色蛍光タンパク質コード配列の下流にある、請求項８に記載の翻訳リコーディングレポーター構築物。
【請求項１０】
前記第１の蛍光タンパク質コード配列と前記第２の蛍光タンパク質コード配列との間に挿入されるリコーディングシグナル配列を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の翻訳リコーディングレポーター構築物。
【請求項１１】
前記リコーディングシグナル配列が前記第１の蛍光タンパク質コード配列と前記リンカー配列との間に挿入される、請求項１０に記載の翻訳リコーディングレポーター構築物。
【請求項１２】
前記リコーディングシグナル配列がフレームシフトシグナル配列である、請求項１１に記載の翻訳リコーディングレポーター構築物。
【請求項１３】
前記フレームシフトシグナル配列が−１フレームシフトシグナル配列である、請求項１２に記載の翻訳リコーディングレポーター構築物。
【請求項１４】
前記−１フレームシフトシグナル配列がＨＩＶ−１  ｇａｇ／ｐｏｌフレームシフトシグナル配列である、請求項１３に記載の翻訳リコーディングレポーター構築物。
【請求項１５】
前記フレームシフトシグナル配列が配列番号４に記載の配列を含む、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の翻訳リコーディングレポーター構築物。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の翻訳リコーディングレポーター構築物を含む、ベクター。
【請求項１７】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の翻訳リコーディングレポーター構築物を含む、宿主細胞。
【請求項１８】
請求項１６に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１９】
前記構築物またはベクターで安定的に形質転換された請求項１７または１８に記載の宿主細胞。
【請求項２０】
翻訳リコーディングを調節する条件をアッセイする方法であって、
ａ）リコーディング配列を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の翻訳リコーディングレポーター構築物を提供する工程と、
ｂ）試験条件下で
ｉ）前記構築物を転写し、前記第１および第２の蛍光タンパク質に対応する転写産物を生成する工程と、
ｉｉ）ｉ）の前記転写産物を翻訳し、前記第１の蛍光タンパク質ならびに前記第１および第２の蛍光タンパク質を含む融合タンパク質を生成する工程と、
ｉｉｉ）前記蛍光タンパク質の各々に由来しかつｉｉ）で生成された蛍光シグナルを測定する工程と、
ｃ）対照条件下で
ｉ）前記構築物を転写し、前記第１および第２の蛍光タンパク質に対応する転写産物を生成する工程と、
ｉｉ）ｉ）の前記転写産物を翻訳し、前記第１の蛍光タンパク質ならびに前記第１および第２の蛍光タンパク質を含む融合タンパク質を生成する工程と、
ｉｉｉ）前記蛍光タンパク質の各々に由来しかつｉｉ）で生成された蛍光シグナルを測定する工程と、
ｄ）ｂ）における前記蛍光タンパク質の各々からの蛍光シグナルの比を、ｃ）における前記蛍光タンパク質の各々からの蛍光シグナルの比と比較する工程と、
を含み、ここで前記比の差異は前記試験条件がリコーディングを調節することを示す、方法。
【請求項２１】
前記試験条件下では、試験組成物を、該組成物がリコーディングを調節するか否かを評価するために前記構築物と接触させ、かつ、前記対照条件下では、前記試験組成物を前記構築物と接触させない、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記対照条件下では、適切な対照組成物が前記構築物と接触させられる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
翻訳リコーディングをｉｎ  ｖｉｖｏで調節する条件をアッセイする方法であって、
ａ）リコーディング配列を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の翻訳リコーディングレポーター構築物を含む宿主細胞を提供する工程と、
ｂ）試験条件下で少なくとも１つの宿主細胞をインキュベートし、
ｉ）前記構築物を転写し、前記第１および第２の蛍光タンパク質に対応する転写産物を生成する工程と、
ｉｉ）ｉ）の前記転写産物を翻訳し、前記第１の蛍光タンパク質ならびに前記第１および第２の蛍光タンパク質を含む融合タンパク質を生成する工程と、
ｉｉｉ）前記蛍光タンパク質の各々からの蛍光シグナルを測定する工程と、
ｃ）対照条件下で少なくとも１つの宿主細胞をインキュベートし、
ｉ）前記構築物を転写し、前記第１および第２の蛍光タンパク質に対応する転写産物を生成する工程と、
ｉｉ）ｉ）の前記転写産物を翻訳し、前記第１の蛍光タンパク質ならびに前記第１および第２の蛍光タンパク質を含む融合タンパク質を生成する工程と、
ｉｉｉ）前記蛍光タンパク質の各々からの蛍光シグナルを測定する工程と、
ｄ）ｂ）における前記蛍光タンパク質の各々からの蛍光シグナルの比を、ｃ）における前記蛍光タンパク質の各々からの蛍光シグナルの比と比較する工程と、
を含み、ここで前記比の差異は前記試験条件がリコーディングを調節することを示す、方法。
【請求項２４】
ｂ）における前記「試験条件」下では、試験組成物を、該組成物がリコーディングを調節するか否かを評価するために前記構築物を含む宿主細胞と接触させ、かつ、ｃ）における前記「対照条件」下では、前記試験組成物を前記構築物を含む前記宿主細胞と接触させない、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ｃ）における前記対照条件下では、適切な対照組成物が、前記構築物を含む前記宿主細胞と接触させられる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
リコーディングの調節因子を同定するための方法であって、
ａ）リコーディングシグナルを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の翻訳リコーディングレポーター構築物を含む宿主細胞を提供する工程と、
ｂ）スクリーニング対象の化合物の存在下で少なくとも１つの宿主細胞をインキュベートする工程と、
ｉ）前記構築物を転写して、前記第１および第２の蛍光タンパク質に対応する転写産物を生成し、
ｉｉ）ｉ）の前記転写産物を翻訳して、前記第１の蛍光タンパク質ならびに前記第１および第２の蛍光タンパク質を含む融合タンパク質を生成し、
ｉｉｉ）前記蛍光タンパク質の各々からの蛍光シグナルを測定し、
ｃ）対照条件下で少なくとも１つの宿主細胞をインキュベートし、
ｉ）前記構築物を転写し、前記第１および第２の蛍光タンパク質に対応する転写産物を生成する工程と、
ｉｉ）ｉ）の前記転写産物を翻訳し、前記第１の蛍光タンパク質ならびに前記第１および第２の蛍光タンパク質を含む融合タンパク質を生成する工程と、
ｉｉｉ）前記蛍光タンパク質の各々からの蛍光シグナルを測定する工程と、
ｄ）ｂ）における前記蛍光タンパク質の各々からの蛍光シグナルの比をｃ）における前記蛍光タンパク質の各々からの蛍光シグナルの比と比較する工程と、
を含み、ここで前記比の変化は化合物がリコーディングの調節因子であることを示す、方法。
【請求項２７】
前記宿主細胞が真核細胞である、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記宿主細胞が哺乳類細胞である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記宿主細胞が、ＣＯＳ−７細胞、ジャーカット細胞、ヒト血液から単離されたＴリンパ球細胞、２９３Ｔ細胞、及びＨＥＫ細胞を含む群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記宿主細胞がＣＯＳ−７細胞である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記宿主細胞が部位特異的な形質転換によって形質転換可能であるように適応される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の構築物に類似するが、前記第１および第２の蛍光タンパク質が常にフレーム内であり、かつリコーディングの必要なく融合タンパク質として共発現されるように構成される対照構築物もまた試験条件と対照条件の双方に供される、請求項２０〜３１のいずれか一項に記載の方法。