【手続補正書】
【提出日】平成21年9月3日(2009.9.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
従って、第一の局面において、本発明は以下の式のモチーフを含む6から22の連続したアミノ酸残基配列を有するペプチドに関する：
Xa-(x)-Xb-Xc-Xd-Xf
［式中、
Xaは、アミノ酸残基D、E、AまたはGであり、
(x)は、アミノ酸残基A、D、E、G、I、K、L、P、Q、S、TおよびVからなる群から選択される2-3のアミノ酸残基または単一のアミノ酸残基配列であり、
Xbはアミノ酸残基YもしくはH、または疎水性アミノ酸残基であり、
Xc、XdまたはXfのうち少なくとも１つは荷電性または疎水性アミノ酸残基である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
従って、以下の配列のいずれかからなるペプチドは本発明の好ましい実施態様の１つである：
LNVTDLGLGYETKEE（配列番号1）
VPVRALGLGHRSDEL（配列番号2）
VRVSELGLGYASDET（配列番号3）
LSVAELGLGYASEEK（配列番号4）
IDFRKDLGWKWIHEPK（配列番号5）
IDFKRDLGWKWIHEPKG（配列番号6）
IDFRQDLGWKWVHEPKG（配列番号7）
IDLQGMKWAKNWVLEPPG（配列番号8）
ETTYDKILKNLSRNR（配列番号9）
RSPHDLSLASLLGAG（配列番号10）
ARVYDLGLRRLRQRR（配列番号11）
RTQHGLALARLQGQ（配列番号12）
WSLDTQYSKVLALYN（配列番号13）
WSSDTQHSRVLSLYN（配列番号14）
RSADTTHSTVLGLYN（配列番号15）
DDLSFLDDNLVY（配列番号16）
EAVSFMDVNSTWR（配列番号17）
DEVSFLDAHSRY（配列番号18）
DVAFLDDRHRWQ（配列番号19）
EPLPIVYYVGRK（配列番号20）
EPLTILYYIGKT（配列番号21）または
EPLTILYYVGRT（配列番号22）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
本出願において、アミノ酸残基の標準的３文字コードに加え、標準的一文字コードも適用する。アミノ酸の略号は、生化学命名法のIUPAC-IUB合同委員会（IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature）の勧告に従っている（Eur. J. Biochem, 1984, vol. 184, pp 9-37）。明細書および特許請求の範囲を通して、天然アミノ酸についての３文字コードまたは１文字コードのいずれかを用いている。LまたはD型を特定していない場合、問題のアミノ酸は、天然のL型（Pure ＆ Appl. Chem. Vol. (56(5) pp 595-624 (1984)を参照）またはD型を有し、形成されたペプチドがL型、D型のアミノ酸、またはL型とD型の混合配列で構成され得ると解釈されたい。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
一実施態様において、変異体とは、挿入、欠失および保存的置換を含む置換の数および範囲が増加するにつれ、好ましい既定の配列から徐々に異なっていくアミノ酸配列を示すと解することができる。この差異は、既定の配列と変異体との間の相同性の減少として測定される。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
別の局面において、本発明によるペプチドフラグメントの変異体は、同じ変異体もしくはそのフラグメント中に、または別の変異体もしくはそのフラグメント間に、少なくとも１つの置換、例えば互いに独立して導入された複数の置換を含み得る。従って、複合体の変異体またはそのフラグメントは互いに独立して保存的置換を含んでもよく、ここで、複合体の変異体またはそのフラグメントの少なくとも１つのグリシン（Gly）はAla、Val、LeuおよびIleからなるアミノ酸群から選択されるアミノ酸により置換され、それぞれ独立した変異体もしくはそのフラグメントであり、複合体の変異体もしくはそのフラグメントの少なくとも１つのアラニン（Ala）はGly、Val、LeuおよびIleからなるアミノ酸群から選択されるアミノ酸により置換され、それぞれ独立した変異体もしくはそのフラグメントであり、複合体の変異体もしくはそのフラグメントの少なくとも１つのバリン（Val）はGly、Ala、LeuおよびIleからなるアミノ酸群から選択されるアミノ酸により置換され、それぞれ独立した変異体もしくはそのフラグメントであり、複合体の変異体もしくはそのフラグメントの少なくとも１つのロイシン（Leu）はGly、Ala、ValおよびIleからなるアミノ酸群から選択されるアミノ酸により置換され、それぞれ独立した変異体もしくはそのフラグメントであり、複合体の変異体もしくはそのフラグメントの少なくとも１つのイソロイシン（Ile）はGly、Ala、ValおよびLeuからなるアミノ酸群から選択されるアミノ酸により置換され、それぞれ独立した変異体もしくはそのフラグメントであり、複合体の変異体もしくはそのフラグメントの少なくとも１つのアスパラギン酸（Asp）はGlu、AsnおよびGlnからなるアミノ酸群から選択されるアミノ酸により置換され、それぞれ独立した変異体もしくはそのフラグメントであり、複合体の変異体もしくはそのフラグメントの少なくとも１つのアスパラギン（Asn）はAsp、GluおよびGlnからなるアミノ酸群から選択されるアミノ酸により置換され、それぞれ独立した変異体もしくはそのフラグメントであり、複合体の変異体もしくはそのフラグメントの少なくとも１つのグルタミン（Gln）はAsp、GluおよびAsnからなるアミノ酸群から選択されるアミノ酸により置換され、複合体の変異体もしくはそのフラグメントの少なくとも１つのフェニルアラニン（Phe）はTyr、Trp、His、Proからなるアミノ酸群から選択される、好ましくはTyrおよびTrpからなるアミノ酸群から選択されるアミノ酸により置換され、それぞれ独立した変異体もしくはそのフラグメントであり、複合体の変異体もしくはそのフラグメントの少なくとも１つのチロシン（Tyr）はPhe、Trp、His、Proからなるアミノ酸群から選択されるアミノ酸、好ましくはPheおよびTrpからなるアミノ酸群から選択されるアミノ酸により置換され、それぞれ独立した変異体もしくはそのフラグメントであり、複合体のフラグメントの少なくとも１つのアルギニン（Arg）はLysおよびHisからなるアミノ酸群から選択されるアミノ酸により置換され、それぞれ独立した変異体もしくはそのフラグメントであり、複合体の変異体もしくはそのフラグメントの少なくとも１つのリシン（Lys）はArgおよびHisからなるアミノ酸群から選択されるアミノ酸により置換され、それぞれ独立した変異体もしくはそのフラグメントであり、それぞれ独立した変異体もしくはそのフラグメントであり、複合体の変異体もしくはそのフラグメントの少なくとも１つのプロリン（Pro）はPhe、Tyr、TrpおよびHisからなるアミノ酸群から選択されるアミノ酸により置換され、それぞれ独立した変異体もしくはそのフラグメントであり、複合体の変異体もしくはそのフラグメントの少なくとも１つのシステイン（Cys）はAsp、Glu、Lys、Arg、His、Asn、Gln、Ser、ThrおよびTyrからなるアミノ酸群から選択されるアミノ酸により置換される。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
保存的アミノ酸群は以下の通りである：
P、A、G（中性、弱疎水性）、
S、T（中性、親水性）
Q、N（親水性、酸アミン）
E、D（親水性、酸性）
H、K、R（親水性、塩基性）
A、L、I、V、M、F、Y、W（疎水性、芳香族性）
C（架橋結合形成）。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
化合物は上記のいずれかから選択される個々のアミノ酸配列の単一コピーを含有してもよく、またはそのようなアミノ酸配列の２以上のコピーを含有してもよい。このことは、本発明の化合物を、単一の個々のペプチド配列を含有するなど、ペプチド配列の単量体として形成してもよく、またはペプチド配列の多量体、つまり２以上の個々のペプチド配列を含有するものとして形成してもよいということを意味する（個々のペプチド配列は、同じ配列の２以上のコピー、または２以上の異なる個々のペプチド配列と表すことができる）。多量体はまた、完全長配列および１以上のそのフラグメントの組み合わせを含み得る。一実施態様において、化合物は2つのアミノ酸配列を含み得るが、そのような化合物は本明細書において二量体と記載し、別の実施態様において、化合物は２より多いアミノ酸配列、例えば３、４またはそれ以上の配列を含み得る。本発明は好ましくは、本発明の２または４のペプチド配列を含有する化合物に関する。しかしながら、3、5、6、7、8又それ以上の配列を含む化合物も本発明の範囲内にある。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０４】
本発明の組換えペプチドを得るために、コードDNA配列を第２のペプチドコード配列およびプロテアーゼ切断部位コード配列と効果的に融合させて、融合タンパク質をコードするDNAコンストラクトを得ることができる（ここでプロテアーゼ切断部位コード配列はHBPフラグメントおよび第２のペプチドコードDNA間に位置し、組換え発現ベクターに導入され、組換え宿主細胞において発現される）。一実施態様において、第２のペプチドは、グルタチオン-S-レダクターゼ、仔ウシチモシン、細菌チオレドキシンまたはヒトユビキチンの天然もしくは合成変異体あるいはそれらのペプチドを含む群から選択されるがこれらに限定されない。別の実施態様において、プロテアーゼ切断部位を含むペプチド配列は、切断部位アミノ酸配列IEGRを有するXa因子、アミノ酸配列DDDDKを有するエンテロキナーゼ、アミノ酸配列LVPR/GSを有するトロンビン、またはアミノ酸配列XKXを有するアクロモバクターリティカス（Acharombacter lyticus）であり得る。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１６】
抗体分子は、免疫グロブリンと呼ばれる血漿タンパク質ファミリーに属し、基本構成要素である免疫グロブリン折畳みまたはドメインは免疫系や他の生物学的認識系の多くの分子において様々な形態で用いられる。典型的な免疫グロブリンは、可変領域として知られる抗原結合領域および定常領域として知られる非可変領域を含む4つのポリペプチド鎖を有する。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８７】
単培養において、神経細胞をプラスチック上で直接培養し、神経突起生成の刺激は唯一添加物質により与えられる。共培養において、神経細胞はNCAM-140を発現する線維芽細胞（LBN110）またはNCAM陰性対照線維芽細胞（LVN212）のコンフルエントな単層の上において培養する。神経細胞上のNCAMはLBN110細胞上のNCAMと相互作用し、これにより神経細胞からの神経突起伸長が刺激される。従って、この系により、NCAM-NCAM相互作用およびNCAMと他の分子との相互作用の研究が可能となる。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９０】
共培養において、8ウェルLabTek（登録商標）Permanox Chamber slideに100000細胞/ウェルの密度でL細胞を播種し、ただしトランスフェクション実験においては4ウェルLabTek（登録商標）Permanox Chamber slideに200000細胞/ウェルの密度で細胞を播種した。10％（v/v）FCS、1％（v/v）グルタマックス（glutamax）、100 U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、2.5μg/mlファンギゾン（fungizone）および567μg/mlネオマイシン（G418）を補足したDMEMにおいてL細胞を24時間培養し、次いで補助剤を加えた神経細胞基礎培地にて2回洗浄し、その後8ウェルスライドに7000細胞/ウェルまたは4ウェルスライドに20000細胞/ウェルの密度で初代海馬神経細胞を播種した。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９６】
この研究における一時的なトランスフェクションは全て、EGFPをコードするプラスミドとの共トランスフェクションを含み、これによりトランスフェクトされた細胞の同定が可能となる。EGFP発現細胞も全て目的のプラスミドによって確実にトランスフェクトされるようにするために、EGFPコードプラスミドと目的のプラスミドの割合を1:5とした（つまり各トランスフェクションに0.5μgのEGFPコードプラスミドを用いた）。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１５】
【図５】図5：対照線維芽細胞またはNCAM発現線維芽細胞との共培養にて培養した海馬神経細胞におけるGDNF誘導性の神経突起伸長。神経細胞を対照線維芽細胞（黒の曲線）またはNCAM発現線維芽細胞（赤の曲線）のいずれかの上で培養し、GDNF（1、5、10、50および100 ng/ml）により24時間刺激した。培地のみにて培養した神経細胞を対照として用いた。結果を対照（対照線維芽細胞上の非刺激神経細胞）に対する比率で示し、平均±S.E.Mで表した。対照線維芽細胞上の対照における神経突起伸長の絶対的な長さは38.97μm±0.21μmであった。図は独立した4回の実験結果に基づいている。one-way ANOVAを個別に用いて、平均の神経突起伸長の長さを、繰り返した測定の結果と比較した。F(5, 18)＝27.33、p＜0.0001は、対照線維芽細胞上にて培養した神経細胞に対するGDNF処理には有意な総合的効果があることを示す。F(5, 18)＝9.967、p＜0.001は、NCAM発現線維芽細胞上にて培養した神経細胞に対するGDNF処理には有意な総合的効果があることを示す。チューキーの多重比較試験による事後試験を用いて個々のGDNF濃度における効果を対応する対照と比較した。黒＊は対照線維芽細胞上にて培養した非刺激細胞と比較したp値を示し、一方、赤＊はNCAM発現線維芽細胞上にて培養した非刺激細胞と比較したp値を示す。2つの対照を対応のあるt検定（paired t-test）を用いて比較したところ、それらは統計学的に有意に異なっていることが示された（p値は黒＋により示す）。各濃度において、対照線維芽細胞上にて培養した神経細胞およびNCAM発現線維芽細胞上にて培養した神経細胞の間の神経突起伸長の差異を計算し、対照（対照線維芽細胞上の非刺激神経細胞）に対する比率で示した（青の曲線）。繰り返した測定の結果に対するOne-way ANOVAでは、平均の差異は全て同じではないことが示された（F(5, 18)＝5.835, p＜0.05）。チューキーの多重比較試験による事後試験を用いて個々のGDNF濃度における差異を2つの対応する対照の差異（NCAM媒介性の神経突起伸長）と比較した。青＊はp値を示す。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１７】
2009504689.tif 000001
【手続補正１５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１８】
2009504689.tif 000002
【手続補正１６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１９】
2009504689.tif 000003
【手続補正１７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２０】
2009504689.tif 000004
【手続補正１８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２１】
2009504689.tif 000005
【手続補正１９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２２】
2009504689.tif 000006
【手続補正２０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２３】
2009504689.tif 000007
【手続補正２１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２４】
2009504689.tif 000008
【手続補正２２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２６】
2009504689.tif 000009
【手続補正２３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２７】
2009504689.tif 000010
【手続補正２４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２８】
2009504689.tif 000011
【手続補正２５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２９】
2009504689.tif 000012
【手続補正２６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３０】
2009504689.tif 000013
【手続補正２７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３１】
2009504689.tif 000014
【手続補正２８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３２】
2009504689.tif 000015
【手続補正２９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３３】
2009504689.tif 000016