(57)【要約】  好ましくは切断型西ナイルウイルスのエンベロープ糖タンパク質の組換えで作製した形態及びアルミニウムアジュバントを含有するヒト用の西ナイルウイルスワクチンについて記載する。本ワクチンは、免疫抑制者、免疫不全者、及び免疫老化者を含む一般個体群における使用に許容可能である。本ワクチンは、全ての健康な個体群及び危険な状態にある個体群における使用にとって安全であり効果的である。本ワクチンには、薬学的に許容可能なビヒクルが含まれてもよい。
2012528791.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
精製組換え西ナイルウイルスエンベロープ（「Ｅ」）タンパク質の有効量、ここで当該Ｅタンパク質はそのＮ末端のアミノ酸残基１から始まる野生型Ｅの長さの約８０％を構成し（ＷＮ−８０Ｅ）、その結果前記Ｅタンパク質は、宿主細胞において組換えで発現するとき増殖培地中に分泌可能となる；及びアルミニウムベースアジュバントの有効量を含むワクチンであって、ここでヒト対象において中和抗体の生産を誘導する当該ワクチン。
【請求項２】
Ｅタンパク質が昆虫宿主細胞において組換えで生産及び発現される請求項１記載のワクチン。
【請求項３】
Ｅタンパク質がキイロショウジョウバエシュナイダー２（Ｓ２）（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ２）宿主細胞において組換えで生産及び発現される請求項１記載のワクチン。
【請求項４】
薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含む請求項１、２又は３記載のワクチン。
【請求項５】
免疫不全個体群における使用のための請求項１、２又は３記載のワクチン。
【請求項６】
請求項１、２又は３記載のワクチンの治療的有効量を治療的に許容可能な方法で投与することを含む人間における防御免疫応答を高める方法。
【請求項７】
請求項１、２及び３記載のワクチンの有効量を投与しそれによって西ナイル病からの防御を提供することを含む西ナイルウイルス誘発疾病に対するヒト免疫防御を提供する方法。
【請求項８】
免疫不全の個体群における使用のための請求項４記載のワクチン。
【請求項９】
請求項４記載のワクチンの治療的有効量を治療的に許容可能な方法で投与することを含む人間における防御免疫応答を高める方法。
【請求項１０】
請求項４記載のワクチンの有効量を投与しそれによって西ナイル病からの防御を提供することを含む西ナイルウイルス誘発疾病に対するヒト免疫防御を提供する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
【０００２】
本出願は、米国仮特許出願第６１／１８２，７５４（出願日２００９年５月３１日）に基づく利益を主張するが、先出願の開示情報及び図面は、そっくりそのまま参照することにより、本明細書で援用する。
配列表
【０００３】
本出願において配列表は特許請求しない。
米国政府援助研究に関する陳述
【０００４】
本発明は、番号ＮＳ０５２１３９−０４及びＷ８１ＸＷＨ−０６−２−００３５の下それぞれＮＩＨ（アメリカ国立衛生研究所）及びＤｏＤ（米国国防総省）による米国政府の援助を受けた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
発明の分野
【０００５】
本発明は全体としてワクチンの分野に関する。本発明は、西ナイルウイルスによって引き起こされる疾病からヒトを防御するために設計されたワクチンに関する。特に、本ワクチンは、昆虫細胞生産系で生産された西ナイルウイルス由来の切断型組換えエンベロープ（Ｅ）糖タンパク質及びアルミニウムベースのアジュバントを含む。
発明の背景
【０００６】
フラビウイルス科には、プロトタイプの黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）、４種の血清型のデング熱ウイルス（ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３、およびＤＥＮＶ−４）、日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）、ダニ媒介性脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ）、西ナイルウイルス（ＷＮＶ）、セントルイス脳炎ウイルス（ＳＬＥＶ）、及び約７０種の他の病原性ウイルスが含まれる。フラビウイルスは、一本鎖プラス鎖ＲＮＡゲノムを有する小さなエンベロープをもつウイルスである。１０の遺伝子産物が、シングルオープンリーディングフレームによってコードされ、キャプシド（Ｃ）、「プレ膜」（又はｐｒＭ（細胞からのビリオン放出直前に膜（Ｍ）にプロセシングされる））、「エンベロープ」（Ｅ）、続いて非構造（ＮＳ）タンパク質ＮＳ１、ＮＳ２ａ、ＮＳ２ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ及びＮＳ５の順に構築されたポリタンパク質として翻訳される（Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（１９９０）４４：６４９−６８８（非特許文献１）；Ｈｅｎｃｈａｌ，Ｅ．Ａ．および  Ｐｕｔｎａｋ，Ｊ．Ｒ．，Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．（１９９０）３：３７６−３９６（非特許文献２）参照）。個々のフラビウイルスタンパク質は、その後ウイルスのコードするプロテアーゼと共に宿主によって介在される正確なプロセシング現象によって生産される。
【０００７】
フラビウイルスのエンベロープは宿主細胞膜由来であり、ウイルスのコードする膜結合型（membrane-anchored）膜（Ｍ）糖タンパク質及びエンベロープ（Ｅ）糖タンパク質を含有する。Ｅ糖タンパク質は、最大のウイルス性構造タンパク質であり、細胞表面接着及びエンドソーム内の融合活性の原因となる機能ドメインを有している。それはまた、防御免疫と関連するウイルス中和抗体の生産を含む宿主免疫系の主要な標的でもある。
【０００８】
西ナイルウイルスは、合衆国において新興感染症となった。本ウイルスはウイルスの天然貯蔵器として利用されるトリに感染し、加えて偶生宿主であるヒト及びウマにも感染する。それは、イエカ属を含む種々の属の４２種以上の蚊によって伝染される節足動物媒介ウイルスである。最初に確認されたＷＮＶの症例は、１９３７年にウガンダの西ナイル地域で発見された（Ｓｍｉｔｈｂｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｔｒｏｐ  Ｍｅｄ  Ｈｙｇ（１９４０）２０：４７１−４９２（非特許文献３））。その後、それは中東、オセアニア、ヨーロッパ及びアジアの一部に行き渡り、近年アメリカに出現した。１９９９年にニューヨーク市で合衆国初のヒト感染症例が確認されて以来、ウイルスは合衆国の東海岸の至る所に伝播し大陸を横切って西に広まった。それは、今ではもう合衆国本土４８州の全てにおいてトリ個体群に見出されている。ＷＮ病のヒト症例は５０州中４７州で確認されており、ヒト症例が報告されていないのはアラスカ州、ハワイ州及びメイン州だけである（ＮＭＷＲ，２００８，５７（２６）：７２０−２３（非特許文献４））。
【０００９】
ＷＮＶに感染した個体の大多数はインフルエンザ様症状を呈する。しかし若干数の感染個体は、３−１５％の致死率を有する重篤な症状を呈し、この致死率は高齢者で最も高くなる。さらに、死亡に至らなかったケースにおいても、高い割合で生涯型の神経障害となる。２００３年、９，８６２人の症候性感染個体中、２，８６６人（２９％）が神経浸潤性疾患（西ナイル髄膜炎、脳炎及び脊髄炎として定義された）神経浸潤性疾患を患い、２６４人が当該疾患により死亡した。神経浸潤性の合併症は、２００４年には３６％に増加した（ＭＭＷＲ，ｖｏｌ．５３Ｎｏｖ．１９，２００４（非特許文献５））。最近の研究は、ウイルス感染からの回復には最初に考えられたよりもかなり長い時間が要求されることを明らかにした。ある研究は、回復時間の中央値が６０日であると結論したが（Ｃｏｍｍｅｎｔ，Ａｎｎ  Ｉｎｔｅｒ．  Ｍｅｄ．（２００４），１４１：１５３（非特許文献６））、一方他の研究は、患者の３７％だけが１年後に完全に回復したと記載している（Ｋｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．（２００４）１０：１４０５−１４１１（非特許文献７））。ウイルス性の神経損傷は治癒が遅く、いくつかの症例では終身的である。近年、かなりの個体がポリオ様の急性弛緩性麻痺の症状を患った。臨床所見は、高齢患者において顕著に悪化する。イスラエルでの最近のＷＮＶ感染の大発生の研究において、入院中の患者２３３人のグループに関する研究内で、致死率が全体として１４％であった。しかし、７０歳以上の患者の間で致死率は２９％であった（Ｃｈｏｗｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．（２００１）７：６７５−７８（非特許文献８））。同様の所見が、ルーマニア（Ｔｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ（１９９８）３５２：７６７−７７１（非特許文献９））及びロシア（Ｐｌａｔｏｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．（２００１）７：１２８−３２（非特許文献１０））における最近の流行からも報告された。このように、特に高齢／免疫老化、免疫不全及び免疫抑制の個体群の間で、ＷＮ病に関連して著しい罹患率及び死亡率が存在する。
【００１０】
ＷＮＶエンベロープタンパク質は、他のフラビウイルス、特に日本脳炎（ＪＥ）血清型群、即ちＪＥＶ、セントルイス脳炎ウイルス（ＳＬＥＶ）、及びマレー渓谷脳炎ウイルス（ＭＶＥＶ）のエンベロープタンパク質と著しく高い相同性を有している。エンベロープタンパク質内に含まれる特定のエピトープに対する抗体は、インビトロでウイルスの中和、即ち感受性細胞のウイルス感染を阻害することができる。中和抗体のエピトープが、ＷＮＶを含むフラビウイルスのＥ糖タンパク質の全ての三つのドメインにマッピングされた（Ｄｉａｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．（２００８）２２５：２１２−２５（非特許文献１１））。ウイルス中和抗体の高い力価は、フラビウイルス感染及びそれに起因する疾病に対するインビボでの防御のインビトロでの最良の相関物として一般的に認められている（Ｍａｒｋｏｆｆ  Ｖａｃｃｉｎｅ（２０００）１８：２６−３２（非特許文献１２）；Ｂｅｎ−Ｎａｔｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓｅａｓｅ（２００３）１８８：５−１２（非特許文献１３）；Ｋｒｅｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９８）７２：３０７６−３０８１（非特許文献１４）；Ｂｅａｓｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ（２００４）２２：３７２２−２６（非特許文献１５））。従って、高い力価のＷＮＶ中和抗体応答を誘導するワクチンは、おそらくＷＮＶによって誘発される疾病からワクチン接種患者を防御することができる。
【００１１】
現在までフラビウイルスワクチンの開発は、雑多な成功を経験してきた。フラビウイルスによって引き起こされる疾病から防御するワクチン候補を生産する取り組みにおいて実施されてきた４つの基本的なアプローチがある。４つの方法とは、生弱毒ウイルス、不活化全ウイルス、組換えサブユニットタンパク質、及びＤＮＡである。ＹＦＶ用に開発された生弱毒ウイルスワクチンは、数十年間にわたり有用であり続け、本アプローチの有用性を証明している。不活化全ウイルスワクチンの使用は、本アプローチに基づくＴＢＥＶ及びＪＥＶの両方の疾病標的に対し有用な登録製品によりＴＢＥＶ及びＪＥＶに対し証明された。
【００１２】
上記の通り、ＹＦＶ、ＪＥＶ、及びＴＢＥＶ用のワクチン開発に成功してきた。しかし、他のフラビウイルス用ワクチンを開発するための生弱毒ウイルス及び不活化ウイルス法の利用は、重要な課題に立ち向かうこととなった。例えば、弱毒デングワクチン株の候補を開発するためにかなりの努力が費やされたが、しかし試験された多くの株は満足のいくものではないと証明された（参照、例えば、Ｅｃｋｅｌｓ，Ｋ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．  Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．（１９８４）３３：６８４−６８９（非特許文献１６）；Ｂａｎｃｒｏｆｔ，Ｗ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ（１９８４）１４９：１００５−１０１０（非特許文献１７）；ＭｃＫｅｅ，Ｋ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．（１９８７）３６：４３５−４４２（非特許文献１８））。これら初期の不十分な結果にもかかわらず、デング生弱毒候補ワクチン株を開発し試験する取り組みが続いた（Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．（２００３）６９：１−６０（非特許文献１９）の総説）。伝統的な生弱毒法を利用するＷＮＶワクチンを開発するための取組は、さほどされてこなかった。
【００１３】
フラビウイルスワクチンを開発するための伝統的な生弱毒法の代替法として、組換えキメラ法が利用されてきた。この方法は、ベースとして既知の生弱毒フラビウイルス株を利用し、対象となる関連ウイルス由来の適切な遺伝子（フラビウイルスに関してはｐｒＭ及びＥ）がベースウイルスの相当する遺伝子に置換されている。ＷＮＶ及びＤＥＮＶワクチン開発のために利用された一つのアプローチは、弱毒ＤＥＮＶ−４株に基づく内部型キメラの使用である（Ｂｒａｙ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９６）７０：４１６２−４１６６（非特許文献２０）；Ｃｈｅｎ，Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９５）６９：５１８６−５１９０（非特許文献２１）；Ｂｒａｙ，Ｍ．ａｎｄ  Ｌａｉ，Ｃ．−Ｊ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）８８：１０３４２−１０３４６（非特許文献２２）；Ｌａｉ，Ｃ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）１０：１７３−１７９（非特許文献２３））。もう一つのアプローチは、ＪＥＶ、ＤＥＮＶ、及びＷＮＶ用の組換えキメラワクチンを開発するためのベースとしてＹＦＶ１７Ｄ弱毒株を使用することであった（Ｌａｉ，Ｃ．Ｊ．ａｎｄ  Ｍｏｎａｔｈ  Ｔ．Ｐ．，Ａｄｖ  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ（２００３）６１：４６９−５０９（非特許文献２４）；Ｍｏｎａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２００６）１０３：６６９４（非特許文献２５））。生弱毒キメラ法の使用が伝統的な生弱毒法に対し優位性を有しているとは言え、キメラ法は、適正に弱毒した株の開発をするうえで、及びＤＥＮＶワクチンの場合には４つのデングウイルスに対するバランスのとれた四価の応答を達成するうえで直面する困難に未だに悩まされている。さらに生弱毒アプローチは、高められた危険因子のために脳炎性疾患を標的とするワクチンにとって適せつではなく、又は易感染性の免疫系を有する標的個体群にとって適切でないかもしれない。これらの因子の双方は、ＷＮＶワクチンの開発に当てはまる。
【００１４】
現在、不活化全ウイルス法を利用してＪＥ及びＴＢＥ用に生産されたワクチンが市販されている。生弱毒ウイルス法と同様に、一定のフラビウイルスへの不活化ウイルス法の利用は、他のフラビウイルスでの成功を保証しなかった。例えば、不活化ＤＥＮＶ又はＷＮＶワクチンを開発する取り組みは、限られた成功しか受けられなかった。この方法は、細胞培養系から十分なウイルス収量を獲得する能力によって制限されている。Ｃ６／３６細胞等の昆虫細胞からのウイルス収量は、一般的に１０４から１０５ｐｆｕ／ｍｌの範囲であり、対費用効果の高い不活化ウイルスワクチンを生産するために必要なレベルよりかなり低い。ＬＬＣ−ＭＫ２及びベロ細胞を含む哺乳動物細胞からの収量はかなり高いが、しかし最高の収量、ユニークなベロ細胞株では約１０６ｐｆｕ／ｍｌ、でも対費用効果の高いワクチン製造を達成するために必要な収量よりもまだ低いのである。
【００１５】
裸のＤＮＡ法の利用もまた、ＤＥＮＶ、ＪＥＶ、ＴＢＥＶ及びＷＮＶ用の非複製型フラビウイルスワクチンの開発の取り組みにおいて評価されてきた（Ｐｕｔｎａｋ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ａｄｖ．Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．６１：４４５−６８（非特許文献２６）の総説）。ＤＮＡ法は、生産の容易さ、決定された配列の使用、インビボでウイルス抗原が発現するために体液性免疫及び細胞性免疫の双方を誘導することが可能であるという点において優位性を提供する。これらの優位性にもかかわらず、一貫した頑強な免疫応答、特に抗体反応をヒト体内で誘導する能力がこのアプローチにとって大きな障害であり続けている。加えて、ＤＮＡワクチンは、プラスミド配列の宿主ゲノムへの組込み及び二本鎖ＤＮＡに対する自己抗体を生じる可能性についての懸念のために付加的な規制上の調査に直面している。現在、ヒト用のＤＮＡワクチンは承認されていないが、このアプローチがヒト用の予防ワクチンとしていずれ適切と認められるかどうか明確でない。
【００１６】
フラビウイルスワクチン開発のための組換えサブユニットタンパク質の使用は、非複製型ウイルスアプローチのもう一つの例である。このアプローチは明確に定義された産物の生産及び特異的免疫応答を誘導する潜在能力において有利である。関連する強い免疫応答を誘導する潜在能力が存在する一方で、組換えサブユニットタンパク質ワクチンの使用に関連した課題がある。これはタンパク質の品質（天然様構造）及び目的の免疫応答を誘導するうえでのアジュバントの必要性の双方のためである。組換えサブユニットタンパク質ワクチンは、組換えサブユニットＢ型肝炎ワクチン（例えば、Ｅｎｇｅｒｉｘ  Ｂ（エンジェリックスＢ）（登録商標）及びＲｅｃｏｍｂｉｖａｘ  ＨＢ（登録商標））によって、さらにより最近ではヒトパピローマウイルスワクチン（例えば、Ｇａｒｄａｓｉｌ（ガーダシル）（登録商標）及びＣｅｒｖａｒｉｘ（サーバリックス）（登録商標））によって最も効果的に説明される、安全性及び防御効果に関する長い歴史を有する。生産中のどの時期にも複製型ウイルスが存在しないという事実は、予防的な設定で健康な又は免疫不全の個体へのサブユニットワクチンの投与に関連して非常に限られた危険性しかないということを保証するのに役立つ。さらに、Ｂ型肝炎ワクチン及びヒトパピローマウイルスワクチンは、高度に免疫原性であり効果的であることが明らかにされてきた。
【００１７】
組換えフラビウイルスタンパク質の発現は、構造タンパク質Ｃ、ｐｒＭ及びＥ並びに非構造タンパク質ＮＳ１に焦点が当てられてきた。Ｅタンパク質がウイルス表面に露出し、ウイルスのライフサイクルの重要な生物学的側面（例えば、受容体への結合及び融合の媒介）に関係しており、感染宿主における中和抗体の標的であるために、本タンパク質は最も取り組まれる研究対象であった（Ｃｈａｍｂｅｒｓ，前掲書；Ｍａｓｏｎ，Ｐ．Ｗ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ（１９８９）７０：２０３７−２０４８（非特許文献２７））。さらに、精製フラビウイルスＥタンパク質に対して作られたモノクローナル抗体がインビトロで中和し、いくつかはインビボで受動感染防御を与えることが明らかにされた（Ｈｅｎｃｈａｌ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．（１９８５）３４：１６２−１６９（非特許文献２８）；Ｈｅｉｎｚ，Ｆ．Ｘ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８３）１３０：４８５−５０１（非特許文献２９）；Ｋｉｍｕｒａ−Ｋｉｒｏｄａ，Ｊ．ａｎｄ  Ｙａｓｕｉ，Ｋ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８８）  １４１：３６０６−３６１０（非特許文献３０）；Ｔｒｉｒａｗａｔａｎａｐｏｎｇ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ（１９２２）１１６：１３９−１５０（非特許文献３１）；Ｍｏｒｒｅｙ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ（２００６）１９４：１３００−８（非特許文献３２））。
【００１８】
大腸菌、酵母、及びバキュロウイルス等の種々の発現系が、ワクチンに使用するための組換えフラビウイルスタンパク質の生産のために利用されてきた。これらの試みは、低収量、フラビウイルスタンパク質の不適当なプロセシング、及び中程度ないし低い免疫原性によって悩まれてきた（Ｅｃｋｅｌｓ，ＫＨ  ａｎｄ  Ｐｕｔｎａｋ，Ｒ，Ａｄｖ．Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．（２００３）６１：３９５−４１８（非特許文献３３））。組換えＥサブユニットタンパク質の発現に関するＨａｗａｉｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（ＨＢＩ）での研究は、組換えタンパク質が強力な免疫原として役立つためには、Ｅタンパク質の未変性様構造を維持する必要があることを立証した。未変性様構造を有する組換えＥタンパク質を生産する能力は、利用する発現系に高度に依存する。米国特許第６，１６５，４７７号（特許文献１）は、酵母細胞でのＤＥＮＶ  Ｅタンパク質サブユニットの発現プロセスを開示している。酵母細胞で発現されたＥサブユニットは細菌系にまさる改良された構造であることを証明したが、しかし高グリコシル化（ｈｙｐｅｒ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）、収量、及び製品の均一性に関する課題になお直面した。
【００１９】
かなり最近の研究で、安定して形質転換された昆虫細胞を使用して切断型のＥタンパク質を発現することにより、Ｘ線結晶解析法によって決定された未変性様構造を維持する均一な製品が得られることが立証された（Ｍｏｄｉｓ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２００３）１００：６９８６−９１（非特許文献３４）；Ｍｏｄｉｓ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２００４）４２７：３１３−１９（非特許文献３５）；及びＺｈａｎｇ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（２００４）１２：１６０７−１８（非特許文献３６））。安定して形質転換された昆虫細胞系を使用することが、ＤＥＮＶ−１、−２、−３、−４、ＪＥＶ、ＴＢＥＶ及びＷＮＶ由来の切断型組換えＥサブユニットタンパク質の発現を成功裏にもたらした。米国特許第６，１３６，５６１号（特許文献２）は、安定して形質転換された昆虫細胞でのＤＥＮＶ、ＪＥＶ、ＴＢＥＶ及びＹＦＶ組換えＥサブユニットタンパク質の発現プロセスを開示している。米国特許６，４３２，４１１号（特許文献３）は、安定して形質転換された昆虫細胞で発現されたフラビウイルスＥ組換えサブユニットタンパク質の、ＩＳＣＯＭ様構造を含むサポニンと併用されたときの候補ワクチンとしての有用性を開示している。安定して形質転換された昆虫細胞株によって生産された、切断型組換えＷＮＶエンベロープサブユニットタンパク質（ＷＮ−８０Ｅ）及び非構造１タンパク質（ＷＮ−ＮＳ１）の前臨床評価が最近報告された（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ（２００８）２５：４１４−４２３（非特許文献３７）；Ｗａｔｔｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｖａｃｃｉｎｅ（２００７）２５：２９１３−２９１８（非特許文献３８）；Ｓｉｉｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．（２００８）  ７９：９５５−９６２（非特許文献３９））。これらの報告において、サポニンを含むアジュバントとともに製剤化したＥ及びＮＳ１の組合せが、防御効率を評価するためにマウス及びハムスターモデルで評価されている。これらの特許及び刊行物は、動物モデルにおいて、で適切な抗体応答を発生させるためにサポニンをふくむアジュバントと併用して適切な抗体応答を発生させる場合における、安定して形質転換された昆虫細胞から発現されたフラビウイルス組換えサブユニットタンパク質の有用性を証明している。Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．２００７（前掲書）及びＷａｔｔｓ  ｅｔ  ａｌ．２００７（前掲書）に加えて米国特許６，４３２，４１１号（特許文献３）は、また動物モデルでワクチン製剤に組換えＮＳ１を含める利益をも証明している。しかし、これらの特許及び刊行物は、ヒト使用への適用性が証明されたＥ単独に基づくワクチン製剤を提示も予想もしていない。
【００２０】
一般的に不活化ウイルス、組換えサブユニットタンパク質、及びＤＮＡ等の非複製型ウイルスワクチンのアプローチ法の利用は、生弱毒ウイルスワクチンのアプローチ法にまさるいくつかの長所を有する。これらの長所は主に、生ウイルスが患者に送達されないことから安全性に関連し、さらに投与量の調整による免疫応答を調節し釣り合いをとる能力に関連する。
【００２１】
ヒト用フラビウイルスワクチンの開発において、動物モデルでの前臨床データに基づいてヒト対象における候補ワクチンの安全性及び免疫原性を予想することは困難であった。ヒト臨床試験に進んだ多数の生弱毒ウイルスワクチン候補にとって、このことは骨の折れることであることが判明した。最も目立った大失敗の例は、非ヒトの霊長目では非常に魅力的な安全性プロファイルを示したが、香港のワクチンレシピエントにおいてデング熱を誘発した、クローン化デングウイルス３型の単離株によって示された安全性プロファイルであった（Ｓａｎｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２００６）２４：４９１４−２６（非特許文献４０））。この課題は、ワクチンの有効性を達成するために複製型ウイルスワクチンと同じレベルのウイルス／宿主の相互作用を要求しない非複製型ウイルスワクチンの使用によって困難さが減少するかもしれない。けれども、前臨床モデルでは良好な安全性及び防御効率を示したが、ヒトで安全かつ効果的なワクチンとして機能し損なった、多数の非複製型ウイルスワクチン候補の例がある（例えば、不活化ＲＳＶワクチン；Ｍｕｒｐｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９８６）２４：１９７−２０２（非特許文献４１））。このようにフラビウイルス用の安全で効果的なワクチンを開発することに関連して多数の課題があり、開発にはしばしば何年もの試行錯誤が要求される。さらに、動物モデルに基づく前臨床研究は、ワクチンのヒト対象における成績の予測とはできず、それ故に候補ワクチンの有用性の証明においてはヒトでのデータが決定的である。
【００２２】
前臨床研究及び開発の種々の段階にあるいくつかの治験のＷＮＶワクチンがあるものの、ヒト臨床試験に進展したと以前に報告されたのは３つのワクチン候補だけである。臨床試験で試験された３つのワクチンは、（１）生弱毒デング血清型４−西ナイルキメラ（Ｐｌｅｔｎｅｖ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２００２）９９：３０３６−４１（非特許文献４２））；（２）生弱毒黄熱−西ナイルキメラ（Ｃｈｉｍｅｒｉｖａｘ；Ｍｏｎａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２００６）１０３：６６９４（非特許文献４３））；及び（３）ｐｒＭ及びＥ遺伝子をコードした「裸の」ＤＮＡワクチン（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．（２００７）１９６：１７３２−４０（非特許文献４４））である。各々の３つの候補ワクチンに関連する内因性の困難さと潜在的な弱点がある。
【００２３】
臨床的に試験された最初の２つのワクチンは、双方とも生弱毒ワクチンである。健康な被験者に与えられる全ての生ウイルスワクチンに関しては、安全性への懸念が最重要事項である。ウイルスの不十分な弱毒化は結果としてウイルス関連の有害事象に帰するかもしれず、他方では過剰な弱毒化はワクチンの有効性を抑制するかもしれない。また、野生型への復帰変異又は高病原性への突然変異（又は有効性の減少）が起きるかもしれない。さらに、適切に弱毒化されたとしても、生ウイルスワクチンは、免疫不全又は免疫抑制患者等の特定の患者個体群及び妊婦又は高齢者等の標準個体群の特定のセグメントにとって禁忌である。Ｃｈｉｍｅｒｉｖａｘテクノロジーに関する特別な厄事は、高齢者及び免疫不全者における（キメラのバックボーンとして貢献する）ＹＦ１７Ｄワクチンの安全性プロファイルである。１９９０年代末以来、特に高齢者及び免疫不全者の間で、致死性、びまん性、内臓指向性及び向神経性のワクチンウイルス感染のかなりの症例が確認されてきた。このことが、ＹＦウイルス感染の危険性がそれほど高くない限り、これらの個体群におけるＹＦ１７Ｄワクチンの使用に対する勧告へと導いた（Ｂａｒｒｅｔｔ，ＡＤＴ  ａｎｄ  Ｔｅｕｗｅｎ，ＤＥ（２００９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：３０８−１３（非特許文献４５））。高齢対象者でのＷＮＶ感染の罹患率と死亡率との間の重要な関連を考慮すれば、この疾病標的への弱毒ワクチンアプローチの適用は、安全の観点からかなり疑問であり、従って最初の２つのワクチン候補は西ナイルワクチンの必要性への安全な解決策を提供していない。
【００２４】
臨床試験で試験された三番目の西ナイルワクチンはＤＮＡワクチンである。裸のＤＮＡワクチンは、現時点ではいかなる感染症に対しても有効性が試されておらず、長期にわたるＤＮＡに対する自己免疫反応の誘導による潜在的な免疫病理学の問題は解決されていない。ＷＮＶ  ＤＮＡワクチンの臨床試験の結果が最近報告された（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ（２００７）１９６；１７３２（非特許文献４６））。低レベルの中和抗体が誘導されたが、しかしながら、おそらく安全性の課題に関連づけられて、このＤＮＡワクチンの臨床開発は中止されたらしい。従って、ＤＮＡワクチンは、ヒト用のＷＮＶワクチン開発に対する安全で効果的な解決策を提供しない。
【００２５】
上記の通り、ＷＮＶ感染により引き起こされる疾病からヒトを防御する、安全かつ十分に免疫原性を有するワクチンを生産するための取り組みがなされてきた。これらの取り組みにもかかわらず、これらの条件を完全に満たすヒト用のＷＮＶワクチンはいまだ確立されていない。従って、本発明によって解決すべき技術的課題は、２つの重要な条件、即ち（１）ワクチン接種された個体（ヒト対象）において適切な防御免疫応答を誘導する能力、及び（２）高齢者及び免疫不全者を含む危険状態にある重要な個体群を考慮したヒト被験者における特別な安全性プロファイルを維持する能力、を満たすＷＮＶワクチンを見出すことである。このことはＷＮＶワクチン開発における重要な課題を表しており、現在までこの技術課題の全ての側面に十分に対処するためのワクチンアプローチは示されていない。西ナイルウイルス感染の流行が広まっているために、解決のための満たされていない要望が存在し増大している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２６】
【特許文献１】米国特許第６，１６５，４７７号
【特許文献２】米国特許第６，１３６，５６１号
【特許文献３】米国特許６，４３２，４１１号
【非特許文献】
【００２７】
【非特許文献１】Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（１９９０）４４：６４９−６８８
【非特許文献２】Ｈｅｎｃｈａｌ，Ｅ．Ａ．および  Ｐｕｔｎａｋ，Ｊ．Ｒ．，Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．（１９９０）３：３７６−３９６
【非特許文献３】Ｓｍｉｔｈｂｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｔｒｏｐ  Ｍｅｄ  Ｈｙｇ（１９４０）２０：４７１−４９２
【非特許文献４】ＮＭＷＲ，２００８，５７（２６）：７２０−２３
【非特許文献５】ＭＭＷＲ，ｖｏｌ．５３Ｎｏｖ．１９，２００４
【非特許文献６】Ｃｏｍｍｅｎｔ，Ａｎｎ  Ｉｎｔｅｒ．  Ｍｅｄ．（２００４），１４１：１５３
【非特許文献７】Ｋｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．（２００４）１０：１４０５−１４１１
【非特許文献８】Ｃｈｏｗｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．（２００１）７：６７５−７８
【非特許文献９】Ｔｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ（１９９８）３５２：７６７−７７１
【非特許文献１０】Ｐｌａｔｏｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．（２００１）７：１２８−３２
【非特許文献１１】Ｄｉａｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．（２００８）２２５：２１２−２５
【非特許文献１２】Ｍａｒｋｏｆｆ  Ｖａｃｃｉｎｅ（２０００）１８：２６−３２
【非特許文献１３】Ｂｅｎ−Ｎａｔｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓｅａｓｅ（２００３）１８８：５−１２
【非特許文献１４】Ｋｒｅｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９８）７２：３０７６−３０８１
【非特許文献１５】Ｂｅａｓｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ（２００４）２２：３７２２−２６
【非特許文献１６】Ｅｃｋｅｌｓ，Ｋ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．  Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．（１９８４）３３：６８４−６８９
【非特許文献１７】Ｂａｎｃｒｏｆｔ，Ｗ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ（１９８４）１４９：１００５−１０１０
【非特許文献１８】ＭｃＫｅｅ，Ｋ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．（１９８７）３６：４３５−４４２
【非特許文献１９】Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．（２００３）６９：１−６０
【非特許文献２０】Ｂｒａｙ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９６）７０：４１６２−４１６６
【非特許文献２１】Ｃｈｅｎ，Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９５）６９：５１８６−５１９０
【非特許文献２２】Ｂｒａｙ，Ｍ．ａｎｄ  Ｌａｉ，Ｃ．−Ｊ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）８８：１０３４２−１０３４６
【非特許文献２３】Ｌａｉ，Ｃ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）１０：１７３−１７９
【非特許文献２４】Ｌａｉ，Ｃ．Ｊ．ａｎｄ  Ｍｏｎａｔｈ  Ｔ．Ｐ．，Ａｄｖ  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ（２００３）６１：４６９−５０９
【非特許文献２５】Ｍｏｎａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２００６）１０３：６６９４
【非特許文献２６】Ｐｕｔｎａｋ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ａｄｖ．Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．６１：４４５−６８
【非特許文献２７】Ｍａｓｏｎ，Ｐ．Ｗ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ（１９８９）７０：２０３７−２０４８
【非特許文献２８】Ｈｅｎｃｈａｌ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．（１９８５）３４：１６２−１６９
【非特許文献２９】Ｈｅｉｎｚ，Ｆ．Ｘ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８３）１３０：４８５−５０１
【非特許文献３０】Ｋｉｍｕｒａ−Ｋｉｒｏｄａ，Ｊ．ａｎｄ  Ｙａｓｕｉ，Ｋ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８８）  １４１：３６０６−３６１０
【非特許文献３１】Ｔｒｉｒａｗａｔａｎａｐｏｎｇ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ（１９２２）１１６：１３９−１５０
【非特許文献３２】Ｍｏｒｒｅｙ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ（２００６）１９４：１３００−８
【非特許文献３３】Ｅｃｋｅｌｓ，ＫＨ  ａｎｄ  Ｐｕｔｎａｋ，Ｒ，Ａｄｖ．Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．（２００３）６１：３９５−４１８
【非特許文献３４】Ｍｏｄｉｓ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２００３）１００：６９８６−９１
【非特許文献３５】Ｍｏｄｉｓ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２００４）４２７：３１３−１９
【非特許文献３６】Ｚｈａｎｇ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（２００４）１２：１６０７−１８
【非特許文献３７】Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ（２００８）２５：４１４−４２３
【非特許文献３８】Ｗａｔｔｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｖａｃｃｉｎｅ（２００７）２５：２９１３−２９１８
【非特許文献３９】Ｓｉｉｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．（２００８）  ７９：９５５−９６２
【非特許文献４０】Ｓａｎｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２００６）２４：４９１４−２６
【非特許文献４１】Ｍｕｒｐｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９８６）２４：１９７−２０２
【非特許文献４２】Ｐｌｅｔｎｅｖ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２００２）９９：３０３６−４１
【非特許文献４３】Ｃｈｉｍｅｒｉｖａｘ；Ｍｏｎａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２００６）１０３：６６９４
【非特許文献４４】Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．（２００７）１９６：１７３２−４０
【非特許文献４５】Ｂａｒｒｅｔｔ，ＡＤＴ  ａｎｄ  Ｔｅｕｗｅｎ，ＤＥ（２００９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：３０８−１３
【非特許文献４６】Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ（２００７）１９６；１７３２
【発明の概要】
【００２８】
本発明は、ＷＮＶ感染に関連する疾病から防御するためのユニークなヒト用ワクチンを提供する。本ワクチンは、ＷＮＶエンベロープタンパク質由来の組換えサブユニットタンパク質及び水酸化アルミニウムアジュバントの組み合せによって形成される。本ワクチンは適切な防御免疫応答を誘導することができ、ワクチン接種されたヒトボランティアで許容可能な安全性プロファイルを明らかに示している。このユニークなワクチン製剤は、ワクチン製剤ＨＢＶ−００２を生産するためにアルミニウムベースアジュバントと組み合わせた適切に折りたたまれた新規な組換えエンベロープサブユニットタンパク質（「西ナイル８０Ｅ」又は「ＷＮ−８０Ｅ」）に依存している。本ワクチンは、（１）健康なヒトボランティアにおいてウイルス中和抗体等の適切な防御免疫応答を誘導し、（２）健康な個体及び免疫不全者への投与に関し許容可能な安全性プロファイルを維持している。
【００２９】
本発明の他の側面には、ＷＮＶ感染によって引き起こされる疾病に対する免疫予防としての使用のための許容可能な担体中のワクチンの治療的有効量、並びに許容可能な担体中の医薬組成物としてのワクチンの治療的有効量の使用が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１−１】ＷＮ−８０Ｅ組換えサブユニットタンパク質のアミノ酸配列。アミノ酸番号はタンパク質のアミノ末端から始めて示した。
【図１−２】ＷＮ−８０Ｅ組換えサブユニットタンパク質のアミノ酸配列。アミノ酸番号はタンパク質のアミノ末端から始めて示した。
【図１−３】ＷＮ−８０Ｅ組換えサブユニットタンパク質のアミノ酸配列。アミノ酸番号はタンパク質のアミノ末端から始めて示した。
【図２】精製西ナイル８０Ｅのクマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ａ）及びウェスタンブロット（Ｂ）。全てのサンプルは非還元条件下１０％ゲルで泳動した。ウェスタンブロットは、西ナイルウイルスに対し免疫したウサギポリクローナル抗血清を使用して展開した。分子量マーカー（ＫＤ）のサイズはゲル及びブロットの左に示す。試料の負荷量（μｇ）は各レーンの上に示す。
【図３】西ナイルＨＢＶ−００２ワクチン製剤を接種されたヒトボランティアで誘導されたウイルス中和抗体応答。発明の詳細な説明
【００３１】
本明細書に記載された発明は、西ナイルウイルス感染から生じる疾病から防御するヒト用のワクチンを提供する。本ワクチンは、ＷＮＶ組換えサブユニットエンベロープ糖タンパク質（ＷＮ−８０Ｅ）及びアルミニウムアジュバントを含んでいる。記載したヒト用のワクチン製剤はＨＢＶ−００２と称する。ＨＢＶ−００２は、ヒトボランティアにおける強いウイルス中和抗体応答を誘導するうえで有効である。さらにＨＢＶ−００２は、健常人及び危険な状態にあるヒト対象に対し許容可能な安全性プロファイルを有している。
西ナイルウイルスエンベロープタンパク質サブユニット（ＷＮ−８０Ｅ）
【００３２】
本発明のＷＮＶワクチンは、ショウジョウバエシュナイダー２（Ｓ２）細胞に基づく細胞培養発現系を用いて生産するＷＮ−８０Ｅ組換えサブユニットタンパク質を利用する。この系を使用すると、結果として未変性様構造を維持する組換えエンベロープサブユニットタンパク質が得られる。ＷＮＶ組換えエンベロープタンパク質は、未変性エンベロープタンパク質の８０％を残し（「８０Ｅ」）Ｃ末端で切断する。従ってＷＮ−８０Ｅは、Ｎ末端の最初のアミノ酸から初めてＥの連続したアミノ酸の最初のほぼ８０％として定義される。Ｃ末端の切断は、ＷＮＥタンパク質の膜アンカー部分（全長Ｅタンパク質のカルボキシ末端からほぼ５０アミノ酸又は１０％、換言すれば、そのＮ末端のアミノ酸１から始めてＷＮＥタンパク質の連続したアミノ酸の最初の９０％に至るまで）を除去するように設計され、従って細胞外の培地に分泌することが可能になり回収を促進する。Ｅタンパク質の９０％超、しかし１００％未満はクローン化し分泌することが可能である。すなわちタンパク質は、長さが９０％＋であり、カルボキシ切断が可能である。そして、切断型Ｅタンパク質が分泌可能である限り膜貫通ドメイン部分を含むことができる。「分泌可能」とは分泌される、典型的には発現系の形質転換された細胞から分泌される能力を意味する。８０Ｅ切断により、Ｅの外部ドメインを膜アンカー部分と連接するＷＮＥタンパク質の「基部」をさらに除去する。基部は注目すべき抗原のエピトープを含有しておらずそれ故に含められない。
【００３３】
ＷＮＶワクチンの中への導入にとって好ましい抗原はＷＮ−８０Ｅである。ショウジョウバエＳ２発現系で発現したＷＮ−８０Ｅ組換えサブユニットタンパク質は、培養液に分泌され、適切にグルコシル化されており、立体構造的に感受性のモノクローナル抗体４Ｇ２との反応性によって決定された通り未変性様の立体構造を維持している。本発明で立証された通り、ヒト用の組換えＷＮ−８０Ｅサブユニットタンパク質の適切な製剤は、結果としてヒト対象において強力なウイルス中和抗体を誘導する能力を有する。従って、本発明のＷＮＶワクチン製剤は、ヒト対象における高レベルの安全性及び免疫原性の双方を示す西ナイルワクチンの生産という、重要な技術的問題に対する新規な解決策を提供する。
【００３４】
本発明の好ましいワクチン製剤には、ヒト用に適したアジュバントが含まれる。好ましいアジュバントは、アルミニウムベースアジュバントである（例えば、アルハイドロゲル（登録商標））。アルミニウムを含む製剤は添加剤を含んでおり、これにより抗原の７５％以上が水酸化アルミニウムに結合しているようにＷＮ−８０Ｅ抗原がアルハイドロゲルに結合することができる。
【００３５】
好ましい一実施態様においてＷＮ−８０Ｅタンパク質は、ＷＮＶ株ＮＹ９９のアミノ酸１−４０１を含んでいる。ＷＮ−８０Ｅのアミノ酸配列を図１に示す。ＷＮ−８０Ｅタンパク質は、好ましくは８０Ｅタンパク質と共にＷＮＶのｐｒＭタンパク質をコードする適切なＤＮＡ断片を含有するベクターから生産される。コードされたｐｒＭセグメントは、宿主細胞内の細胞酵素によってプロセシングされ、天然のＷＮＶの成熟中に起きるのと類似の態様で成熟ＷＮ−８０Ｅタンパク質（図１）を遊離する。Ｓ２細胞から発現した精製ＷＮ−８０Ｅ産物を図２に示す。
【００３６】
本発明のさらなる一実施態様においてＷＮ−８０Ｅは、Ｃｙｓ１−Ｃｙｓ２、Ｃｙｓ３−Ｃｙｓ８、Ｃｙｓ４−Ｃｙｓ６、Ｃｙｓ５−Ｃｙｓ７、Ｃｙｓ９−Ｃｙｓ１０及びＣｙｓ１１−Ｃｙｓ１２で６個のジスルフィド架橋を含む西ナイルウイルスエンベロープタンパク質サブユニットとしてより広く定義される。その実施態様においてポリペプチドは、ショウジョウバエ細胞から組換えタンパク質として分泌され、ポリペプチドはヒト対象に投与されたときに西ナイルウイルスに対する中和抗体反応を引き起こした。
【００３７】
より好ましい一実施態様において、組換えＷＮＶエンベロープタンパク質サブユニットは、既述のジスルフィドパターン及び天然型ＷＮＶエンベロープタンパク質のＮ末端の最初のアミノ酸から始まりエンベロープタンパク質の相同な８０％の部分（８０Ｅ）の親水性プロファイル特性をさらに含んでいる。換言すれば、組換えサブユニットタンパク質が天然様構造及び適切な免疫原性（ウイルス中和抗体を誘導する能力）を保持することを保証するために、ジスルフィド及び親水性プロファイルが維持される限り、アミノ酸はＷＮ−８０Ｅを含む配列の中で置換することができる。
【００３８】
好ましくはＷＮ−８０Ｅ組換えサブユニットタンパク質はマスターセルバンクを使用して無血清培地中で発現され、既述の通り（Ｉｖｙ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第６，４３２，４１１号）モノクローナル抗体（例えば４Ｇ２）を使用して免疫アフィニティークロマトグラフィーによって精製される。これは結果としてヒト用に適したワクチン製剤に使用可能であるＷＮ−８０Ｅ製品をもたらす。
【００３９】
驚くべきことに、しかも他のフラビウイルス製剤における非構造タンパク質１（ＮＳ１）等の非構造タンパク質の導入に関する既述の追加の利益（ＭｃＤｏｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第６，４１６，７６３号）とは対照的に、ＷＮ−８０Ｅタンパク質のみを含有する本発明のワクチン製剤は、非ヒト霊長目（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００９）１６：１３３２−３７）及びヒト対象においてＮＳ１の封入なしで強力な免疫原性のワクチンとして役立つ。アラムベースのアジュバントと共にＷＮ−８０Ｅタンパク質を含有するＨＢＶ−００２ワクチン製剤を接種されたヒトボランティアにおいて誘導されたウイルス中和抗体応答を図３に示す。
アラム
【００４０】
好ましい一実施態様において、本発明のＷＮＶワクチンは、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、又はそれらの混合物等のアルミニウムベースアジュバント（集合的には「アラム」又は「アラムベースアジュバント」）と共に製剤化したＷＮ−８０Ｅ組換えサブユニットタンパク質を含む。水酸化アルミニウム（「アルハイドロゲル（登録商標）」として市販されている）は、臨床材料の調製に使用されたので、従ってアラムの好ましい形態である。アルミニウムベースアジュバントは、合衆国及び世界でヒト用として登録された最初のアジュバントであり、その効果は世界的に認められている。アルミニウムベースアジュバントは、少なくとも部分的に持効性製剤機序及び天然様構造を有する組換えＷＮ−８０Ｅ抗原の組合せにより機能すると信じられており、アラムのアジュバント効果は、免疫不全個体群の構成員を含むワクチンを接種された個体で強力な免疫応答を誘導するために十分である。アラムを有する製剤は、抗原の７５％以上が水酸化アルミニウムに結合するようにＷＮ−８０Ｅ抗原がアルハイドロゲル（登録商標）に結合することが可能な混合物から成っている。
【００４１】
好ましくは、ＷＮ−８０Ｅ＋アルハイドロゲルのＷＮＶワクチン製剤化及び好ましいワクチン製剤（ＨＢＶ００２）によるバイアル充填はｃＧＭＰ下で行われる。これは、結果としてヒト用に適したＷＮ−８０Ｅ及びアラムを含むＷＮＶワクチン製剤をもたらす。
投与法及び使用法
【００４２】
本発明は、ＷＮＶ感染に起因する疾病を予防又は減弱するための方法を提供する。本明細書で用いるとき、ワクチンは、もしワクチンの個体への投与が結果として疾病に対する個体の完全免疫又は部分免疫となるか、又は疾病に関連する症状又は健康状態の完全減弱又は部分減弱（即ち、抑制）となるならば、疾病を予防又は減弱すると言われる。
【００４３】
組成物は、もしその投与がレシピエント患者によって許容可能ならば「薬学的に許容可能」であると言われる。このような薬剤は、もし投与量が生理学的に意味あるならば「治療的有効量」で投与されたと言われる。もしその存在がレシピエント患者の生理機能に検出可能な変化を生じるならば、薬剤は生理学的に意味がある。本発明においてレシピエント患者での検出可能な変化は、ＷＮＶに対する中和抗体の誘導である。
【００４４】
本発明の有効なワクチンは、単独で又は利用可能となる限り他の有効なサブユニットを含む有効なワクチン等の他の有効なワクチンと組み合わせて使用することができる。一又は数種類のウイルス又は血清型由来の対応する又は異なるサブユニットを特別な製剤に含有してもよい。本発明の有効なワクチンは、薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含んでもよい。
【００４５】
記載の本発明の治療組成物は、非経口的に皮下、筋肉内、又は皮内注射によって投与することができるが、しかし他の全身モードの投与を採用してもよい。本発明の好ましい投与法は筋肉内経路である。
【００４６】
多数の投与レジメンが利用される場合には、免疫感作のタイミングに関しては多数の異なる技術が存在する。接種対象によって発現される免疫グロブリンレパートリー発現のレベル及び多様性を増加するためには、本発明の組成物を何回も使用するのが好ましい。典型的には、複数回の免疫感作を施すならば、１ないし２月の間隔で施すことができる。本発明の好ましい免疫感作のスケジュールは、対象を０、１及び２月に免疫感作することである。他の免疫感作スケジュールを利用することもできる。例えば、０、１及び３月、又は０、１及び６月、又は０、１、１２月等の代わりの免疫感作スケジュールを使用してもよい。追加のブースターワクチン接種を前述のインターバルで５ないし１０年ごと等のように投与してもよい。
【００４７】
例えば、ＷＮＶ起因性疾病に対し対象を免疫するために、組換えサブユニットタンパク質及びアジュバントを含有するワクチン製剤は、通常複数のワクチン投与を含む従来の免疫感作プロトコルで患者に投与される。投与は典型的には注射、典型的には筋肉内注射又は皮下注射によるが、しかし他の全身モードの投与を採用してもよい。
【００４８】
記載の本発明によれば治療組成物の「有効量」とは、所期の生物学的効果を達成するために十分な量をいう。一般的に、組成物の有効量を供するために必要な投与量は、患者の年齢、症状、性別、及び（もしあれば）病気の程度及び当業者によって調整することのできる他の変異要素等の要因に依存して変化するものである。本発明の抗原性の調製品は、単回か又は複数回の有効量の投与量によって投与することができる。本発明の組成物の有効量は、１回分の投与量当たり０．０１〜１００μｇ、より好ましくは５〜５０μｇ、最も好ましくは１５〜５０μｇで変化することがある。本発明の組成物は薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含んでもよい。
実施例
【００４９】
以下の実施例は本発明の基盤を提供する。実施例は、ヒト対象への投与を支援するための組換えＷＮ−８０Ｅタンパク質及びＨＢＶ−００２ワクチン製剤を大規模かつｃＧＭＰ下で製造する能力を示している（実施例１−３）。実施例は、健康な成人ボランティアにおけるワクチンの安全性及び免疫原性（有効性）をさらに示している（実施例４）。ＨＢＩ  ＷＮＶワクチンの安全性及び有効性は、二つの異なる側面の新規な組合せに依存している。一つの側面において、アルミニウムベースアジュバントと組み合わせた組換えサブユニットタンパク質の固有の安全性は、重篤な疾病に関し特に脆弱で危険な状態にある個体群である、高齢者及び免疫不全者を標的とする疾病の予防のための最適のアプローチを提供する。第二の側面において、立体構造的に適切な（天然様構造）組換えＷＮ−８０Ｅ抗原のｃＧＭＰ下での量的に実用に十分な生産は、結果が疾病に対する防御の機構を備えた、ヒト対象においてウイルス中和抗体を誘導するワクチンとなる。これらの側面のユニークな組合せは、結果がヒト対象において安全かつ有効なＷＮＶワクチンという新規な発明となる。これらのワクチン製剤は、非構造タンパク質ＮＳ１の封入が有効な変異原性及び予防のために要求されないという予期せぬ発見によってさらに特徴づけられる。さらに開示する西ナイルワクチンは、特に重症となる最も危険な状態の被験者である高齢者及び免疫不全者にとって許容可能な安全性プロファイルを維持する一方で、接種された個体において適切な防御免疫応答を誘導するという技術的課題に対処するための比類ない所に位置している。
【００５０】
以下の実施例は説明することを意図しており発明を限定するものではない。
実施例１
ショウジョウバエＳ２系における西ナイル８０Ｅタンパク質の発現及び精製
発現プラスミドｐＭｔｔｂｎｓ（ｐＭｔｔＰＡ由来）は、次のエレメント：キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｅｒ）のメタロチオネインプロモーター、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子分泌リーダー（ｔＰＡＬ）及びＳＶ４０初期ポリアデニル化信号を有している。Ｈａｗａｉｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈにおいて、現存するユニークなＢｇｌＩＩサイトに加えてユニークなＸｈｏＩサイトを含むｐＭｔｔΔＸｈｏを産生するために、ｐＭｔｔｂｎｓベクターから１４塩基対のＢａｍＨＩ断片を切除した。この発現ベクターは、発現タンパク質の培養液への分泌を促進する。これらのユニークなＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩサイトを使用して、西ナイル配列をｐＭｔｔΔＸｈｏベクターに導入した。カルボキシ切断西ナイルエンベロープタンパク質を発現するために、西ナイルウイルス由来のｐｒＭタンパク質全体及びＥタンパク質のアミノ酸１−４０１をコードする合成遺伝子を合成した（Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｓ  Ｃｏ．社製，ミッドランド、テキサス州）。合成遺伝子のヌクレオチド配列は、１９９９年にニューヨーク市で単離された西ナイルウイルスの公表された配列に従っている。Ｅタンパク質のアミノ酸４０１でのＥタンパク質のＣ末端切断は、膜貫通ドメインを除去しており、それ故に培地に分泌することができる。最終のｐｒＭ８０Ｅプラスミド構築物はｐＭｔｔＷＮｐｒＭ８０Ｅと命名した。Ｓ２細胞内で発現するとすぐｐｒＭ配列は、宿主のプロテアーゼによって８０Ｅ配列から切断される。４０１のアミノ酸からなるＷＮ−８０Ｅ組換えサブユニットタンパク質は培養液に分泌される。ＷＮ−８０Ｅタンパク質のアミノ酸配列を図１に示す。
【００５１】
Ｓ２細胞を、ｐＭｔｔＷＮｐｒＭ８０Ｅ発現プラスミド及びハイグロマイシン耐性をコードするｐＣｏＨｙｇｒｏ選択プラスミドの双方により、（ｉ）リン酸カルシウム共沈殿法、又は（ｉｉ）製造元の推奨に従ってセルフェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製製キット、カールスバド、カリフォルニア州）を利用して、同時形質転換した。発現プラスミド対選択プラスミドの比率２０：１の全ＤＮＡ２０μｇで細胞を同時形質転換した。形質転換細胞は、３００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製、インディアナポリス、インディアナ州）により選択した。選択の後に、細胞を無血清培地Ｅｘｃｅｌ４２０（ＪＲＨ社製、レネックサ、カンサス州）で培養するために馴化した。発現研究のために、細胞をハイグロマイシンを４２０，３００μｇ／ｍｌ含有するＥｘｃｅｌで培養し、２００μＭのＣｕＳＯ４で誘導した。細胞を密度２Ｘ１０６細胞／ｍｌで播種し、６〜７日間培養した。至適条件下で培養６〜７日後に２Ｘ１０７細胞／ｍｌ以上の細胞密度を達成した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットによって培養液上清の発現タンパク質を調べた。
【００５２】
ウェスタンブロットでのＷＮ−８０Ｅ検出のために、ウサギポリクローナル抗西ナイルウイルス抗体（ＢｉｏＲｅｌｉａｎｃｅ  Ｃｏｒｐ社製．，ロックビル、メリーランド州）又は西ナイルウイルスＥタンパク質と交差反応するウサギポリクローナル抗ＤＥＮ精製不活化ウイルスを使用し、その後、抗ウサギＩｇＧ−アルカリホスファターゼ標識二次抗体によって検出した。ブロットは、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．社製）個相アルカリホスファターゼ基質により発色させた。
【００５３】
ＷＮ−８０Ｅタンパク質の精製は、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）４Ｇ２を使用して免疫アフィニティークロマトグラフィー（ＩＡＣ）によって行った。手短に言えば、手順には発現後培養液の清澄化が含まれる。それから粗製物質をＮ−ヒドロキシスクシンイミドの化学作用によって共有結合している固定化ＭＡｂを含有するＩＡＣカラムに負荷する。試料を負荷した後、マトリクスを０．０５％（ｖ／ｖ）のツイーン２０を含有するｐＨ７．２の１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳＴ、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ）により洗浄する。結合したタンパク質をｐＨ２．５の２０ｍＭグリシン緩衝液によりＩＡＣカラムから溶離する。溶離液を中和しそれから緩衝液をＰＢＳに交換する。精製産物は、それぞれ純度、同一性、含量、及び生物活性を測定するために、クマシー又は銀染色のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、ウェスタンブロット、紫外吸収、及びＥＬＩＳＡ（サンドイッチ法）によって規定通りに分析する。加えて、試料は、Ｎ末端アミノ酸配列決定及びアミノ酸分析によって分析した。これらの分析は精製産物の同一性及び含量の裏付けを与えた。
【００５４】
精製ＷＮ−８０Ｅタンパク質の代表的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットプロファイルを図２に示す。試料の分析は非還元条件下で行った。ＷＮ−８０Ｅ分子は、アミノ酸組成から決定したものと一致する相対分子量（即ち、４３ｋＤ）を有する単一バンドで移動した。
実施例２
臨床試験を支援するためのｃＧＭＰ下でのＷＮ−８０Ｅの生産
【００５５】
ｐＭｔｔｐｒＭＷＮ８０Ｅプラスミドにより形質転換したＳ２細胞から、ｃＧＭＰ条件下でマスターセルバンクを調整した。ｃＧＭＰ製造プロセスには、撹拌タンク型バイオリアクターでのＳ２ＭＣＢ細胞株の培養及びその後の分泌タンパク質を含有する培養液の採取が含まれる。デプスフィルターを利用する濾過によって細胞を培養液から分離する。それから、４Ｇ２モノクローナル抗体を使用する免疫アフィニティークロマトグラフィーによって、生じた澄明な上清からＷＮ−８０Ｅを精製する。引き続いて免疫アフィニティー精製産物を低ｐＨのウイルス不活性化段階及び２０ｎｍ粒子除去可能な孔径を有するＰＶＤＦ膜を使用するウイルス濾過段階に運ぶ。ＷＮ−８０Ｅタンパク質の最終加工には、緩衝液交換及び限外濾過による濃縮その後の０．２μｍフィルテーによる濾過が含まれる。
【００５６】
ｃＧＭＰ下でのＷＮ−８０Ｅの代表的なロットの製造は下記の通り行った。ＭＣＢのバイアルを解凍し、１０ｍＬ容のＥＸ−ＣＥＬＬ培地中２６℃で５日間培養した。各培養液を使い捨ての振盪フラスコへ拡大した。培養液は、１．５Ｘ１０７／ｍＬの細胞密度に達するまで増殖した。フラスコをプールし、使い捨ての振盪フラスコ中のより大規模な培養液に接種するために使用し、当該培養液は２ｘ１０７細胞／ｍＬの密度に達するまで増殖した。当該培養液は、使い捨て振盪フラスコの多数の培養液に拡大した。これらの培養液は、平均１．６Ｘ１０７細胞／ｍＬの細胞密度に達するまで増殖した。フラスコの細胞はプールし、２０Ｌのステンレス製バイオリアクターを接種するために使用した。当該培養液は、１．２Ｘ１０７細胞／ｍＬの細胞密度に達するまで増殖した。２０Ｌバイオリアクターの適量の細胞を、２Ｘ１０６細胞／ｍＬの初期細胞密度を達成するように、１００Ｌのステンレス製バイオリアクターに移植した。４．０Ｘ１０６細胞／ｍＬの細胞密度に達するまで当該培養液を増殖した。それから終濃度が０．２ｍＭとなるように培養液へ硫酸銅を添加することによって培養液を誘導した。その後培養液を５日間増殖した。０．２μｍのフィルターカートリッジを備えた０．４５μｍのフィルターカートリッジを使用するデプス（深層）濾過によって１００Ｌの培養液を採取した。濾液を１０Ｌ容の一回使用製品（シングルユースバッグ）に採取し−２０℃で保管した。
【００５７】
ＷＮ−８０Ｅ採取物原体を解凍し、５μｍ孔径のフィルターを通す物質通過によって微粒子を除去した。濾過した採取物原体を直接４Ｇ２−セファロースカラムに負荷した。負荷後、カラムを０．０５％ツイーン２０を含有するｐＨ７．１の１１ｍＭ  ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）により洗浄し、それから保持されたＷＮ−８０Ｅをグリシン緩衝液によりｐＨを低下することによって溶離した。サブバッチはプールし、その後ウイルスの不活性化のためにｐＨを最終ｐＨ３．８に低下し、物質を雰囲気温度（１５〜２５℃）で１６〜２４時間インキュベートすることによって処理し、その後ｐＨを７．０±０．５に調整した。物質はわずかな微粒子を除去するために０．２μｍのプレフィルターを通し、それから２０ｎｍ孔径の膜を使用して濾過した。物質はそれから濃縮し、限外濾過によって緩衝液を交換し、最終の濾過滅菌は０．２μｍのフィルター通過によって直接殺菌済みバッグに行った。精製ＷＮ−８０Ｅ生体物質は、ＨＢＶ−００２ワクチンへの製剤化用に開放するに先立って広範にわたる安全性、同一性、強度、及び純度の影響評価を受けた。
実施例３
臨床試験用ＨＢＶ−００２ワクチンの製剤化
【００５８】
実施例２記載の精製ＷＮ−８０Ｅ生体物質を解凍し、クラス１００の層流域に移した。ＷＮ−８０Ｅを殺菌容器に加え、標的タンパク質の終濃度が０．２０ｍｇ／ｍＬとなるようにダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）をその中に添加した。希釈したＷＮ−８０Ｅ溶液を濾過滅菌した。ＤＰＢＳを含有する殺菌容器に、１４．０ｍｇ／ｍＬのアルハイドロゲルの最終濃度が１４．０ｍｇ／ｍＬとなるまで、アルハイドロゲル‘８５を容量的に添加した。それからＷＮ−８０Ｅタンパク質溶液をアルハイドロゲル懸濁液に定量的に移し、２−８℃で一晩ゆっくりと撹拌した。
【００５９】
一晩吸着後、吸着されなかったＷＮ−８０Ｅタンパク質含量を測定した。充分なＨＢＶ−００２ワクチンを得るためには、最低限７５％の吸着が必要であった。ＨＢＶ−００２ワクチンは準備した殺菌バイアルに分注した。充填されたバイアルは栓をし、密封し、圧着した。ＨＢＶ−００２を充填したバイアルは、２から８℃に保管した。臨床試験におけるＨＢＶ−００２ワクチンの使用に先立って、広範な安全性、強度、同一性、有効性、及び純度の試験を実施した。
実施例４
ＨＢＶ−００２西ナイル組換えサブユニットワクチンの臨床試験
【００６０】
実施例３に記載した通り、ｃＧＭＰ下で製造したＨＢＶ−００２ワクチンを治験で試験した。健康な成人ボランティアにおけるＨＢＶ−００２生体産物の比盲検の第Ｉ相の臨床試験により、同量のアルハイドロゲル‘８５アジュバントを含むワクチンの活性原料（ＷＮ−８０Ｅ）の異なる三段階の服用レベル、又はアルハイドロゲル‘８５を含まないＷＮ−８０Ｅの最高服用レベルを評価した。被験者は、試験ワクチンの単回の筋肉内注射を０、４、及び８週目に受けた。試験計画を下記の表１に要約する。
【００６１】
2012528791.tif 000003
【００６２】
安全性及び耐用性は、試験の間ずっと、特定の身体的検査、規定の実験室試験（血液学、臨床化学及び尿分析）及び治験ボランティアの生命徴候（バイタルサイン）及び有害事象の記録によって評価した。加えて被験者は、各接種後１４＋／−２日間、特別な有害事象と同様に反応原性及び耐用性データを記録するために日誌カードを使用した。本試験の有効性評価には、１：１０以上のＰＲＮＴ５０（プラーク減少中和試験）分析によって定量される通り、ウイルス中和抗体価（即ち、免疫原性）の割合及び範囲の定量を含んでいた。
【００６３】
臨床安全性評価は、投与期間の間を通して重篤な有害事象が現れずワクチンが耐容性を示すことを明らかにした。注意すべき主な副作用は、一般的に短期間（１〜３日）である軽い注射部位反応（例えば、疼痛、腫脹）であった。ワクチンに関連する全身性の有害事象は殆ど存在せず、ワクチンに関連する当該事象（例えば、頭痛）はあっても本質的に軽度であり極めて短期間（数時間）のものであった。このことはＨＢＶ−００２ワクチンが極めて許容可能な安全性プロファイルを有し、高齢者及び免疫不全者等の脆弱で危険な状態にある個体群のために適切であろうことを証明している。
【００６４】
有効性評価（ウイルス中和抗体測定）は、アルハイドロゲル‘８５を含有するＨＢＶ−００２ワクチン製剤を受けた全ての対象（１００％）が、投与量に関わらず、ポスト投与３の２週間目の試験で１０倍以上ウイルス中和抗体価を発達させることを明らかにした。投与量１５又は５０μｇのワクチンを受けた多くの被験者は、ポスト投与２によってウイルス中和抗体価を発達させた。ＨＢＶ−００２ワクチンによって誘導されるウイルス中和抗体応答を図３で説明する。
【００６５】
このことは、この特別安全なワクチンが特別効果的でもあり、しかも、高齢者及び免疫不全者にとって許容可能な安全性プロファイルを維持する一方で、ワクチンを接種された個体において適切な防御免疫応答を誘導するうえでの技術的問題を克服することを証明している。さらに、この適切な防御免疫応答は、強力な防御作用のためにＮＳ１が要求されるとの予測（ＭｃＤｏｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第６，４１６，７６３号）にも関わらず、製剤中へのＮＳ１封入なしでワクチン接種された個体において誘導された。
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【図１−１】
2012528791.tif 000004
【図１−２】
2012528791.tif 000005
【図１−３】
2012528791.tif 000006
【図２】
2012528791.tif 000007
【図３】
2012528791.tif 000008
【国際調査報告】
2012528791.tif 000009