(57)【要約】  本発明は、プライマーおよび／またはプローブを提供し、この標的配列は、遺伝子型変異と呼ばれる１つの非保存ヌクレオチド、または同一遺伝子型内の１つのヌクレオチド変異のいずれかと定義される少なくとも１つの変異を含有し、プライマーおよび／またはプローブは、前記標的配列と相補的である核酸配列を、この変異の少なくとも相補的な塩基を除いて含み、この塩基はプライマーおよび／またはプローブ中には存在しない。本発明は、診断、予防および治療に適用するための方法において特に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸配列を増幅するように設計されたプライマーであって、前記標的配列は、遺伝子型変異と呼ばれる１つの非保存ヌクレオチド、または同一遺伝子型内の１つのヌクレオチド変異のいずれかと定義される少なくとも１つの変異を含有し、前記プライマーは、前記標的配列と相補的である核酸配列を、前記変異の少なくとも相補的な塩基を除いて含み、前記塩基は前記プライマー中には存在しない、プライマー。
【請求項２】
少なくとも２つの変異を含有する標的配列と相補的であり、各変異が少なくとも１つの保存ヌクレオチドによって互いに分離されている、請求項１に記載のプライマー。
【請求項３】
標的核酸配列を増幅するためのプライマー対であって、前記標的配列は、遺伝子型変異と呼ばれる１つの非保存ヌクレオチド、または同一遺伝子型内の１つのヌクレオチド変異のいずれかと定義される少なくとも１つの変異を含有し、前記プライマー対を形成するプライマーのうちの少なくとも１つは請求項１または２に従って設計されている、プライマー対。
【請求項４】
標的核酸配列を検出するように設計されたプローブであって、前記標的配列は、遺伝子型変異と呼ばれる１つの非保存ヌクレオチド、または同一遺伝子型内の１つのヌクレオチド変異のいずれかと定義される少なくとも１つの変異を含有し、前記プローブは、前記標的配列と相補的である核酸配列を、前記変異の少なくとも相補的な塩基を除いて含み、前記塩基は前記プローブ中には存在しない、プローブ。
【請求項５】
少なくとも１つの標識を含む、請求項４に記載のプローブ。
【請求項６】
標的配列がＲＮＡ標的である、請求項１若しくは請求項２に記載のプライマーまたは請求項３に記載のプライマー対または請求項４に記載のプローブ。
【請求項７】
１つのプライマーがプロモーター配列を備えている、請求項１若しくは請求項２に記載のプライマーまたは請求項３に記載のプライマー対。
【請求項８】
遺伝子型変異と呼ばれる１つの非保存ヌクレオチド、または同一遺伝子型内の１つのヌクレオチド変異のいずれかと定義される少なくとも１つの変異を含有する核酸標的配列を試料中で増幅する方法であって、
１）前記標的配列のある領域において特異的にハイブリダイズすることができ、伸長条件下で、第２のプライマーのハイブリダイズする領域に向かって伸長することができる第１のプライマー、および
２）前記標的配列の別の領域の相補的配列に特異的にハイブリダイズすることができ、伸長条件下で、前記第１のプライマーのハイブリダイズする領域の相補的配列に向かって伸長することができる第２のプライマー
を使用して、前記標的配列の存在を増幅する増幅反応を試料に対して実施することを含み、
前記少なくとも１つの変異は、前記第１のプライマーおよび前記第２のプライマーのうちの少なくとも１つのハイブリダイズする領域内に位置し、
前記第１のプライマーおよび前記第２のプライマーのうちの少なくとも１つは、前記標的配列と相補的である核酸配列を、前記変異の少なくとも相補的な塩基を除いて含み、前記塩基は存在しない、方法。
【請求項９】
遺伝子型変異と呼ばれる１つの非保存ヌクレオチド、または同一遺伝子型内の１つのヌクレオチド変異のいずれかと定義される少なくとも１つの変異を含有する核酸標的配列を試料中で検出する方法であって、
（ａ）１）前記標的配列のある領域において、または前記標的配列の相補的なある領域に特異的にハイブリダイズすることができ、伸長条件下で、第２のプライマーのハイブリダイズする領域に向かって伸長することができる第１のプライマー、および
２）前記標的配列の別の領域において、または前記標的配列の相補的な別の領域に特異的にハイブリダイズすることができ、伸長条件下で、前記第１のプライマーのハイブリダイズする領域の相補的配列に向かって伸長することができる第２のプライマー
を使用して、前記標的配列の存在を検出する増幅反応を試料に対して実施すること、および
（ｂ）前記第１のプライマーがハイブリダイズすることができる領域と前記第２のプライマーがハイブリダイズすることができる領域との間の、前記標的配列のある領域に特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも１つのプローブを用いて、前記標的配列の存在を検出する検出反応を試料に対して実施すること
を含み、
前記少なくとも１つの変異は、前記第１のプライマーおよび前記第２のプライマーのうちの少なくとも１つのハイブリダイズする領域内に位置し、
前記第１のプライマーおよび前記第２のプライマーのうちの少なくとも１つは、前記標的配列と相補的である核酸配列を、前記変異の少なくとも相補的な塩基を除いて含み、前記塩基は存在しない、方法。
【請求項１０】
前記増幅反応が、転写に基づく増幅およびＰＣＲからなる群から選択される、請求項８および９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記転写に基づく増幅がＮＡＳＢＡである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記標的配列がＲＮＡ標的である、請求項８又は請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
遺伝子型変異と呼ばれる１つの非保存ヌクレオチド、または同一遺伝子型内の１つのヌクレオチド変異のいずれかと定義される少なくとも１つの変異を含有する核酸標的配列を試料中で検出する方法であって、
（ａ）前記標的配列のある領域に特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも１つのプローブ
を含み、
（ｂ）前記標的配列の存在を検出し、
前記少なくとも１つの変異は、前記プローブのうちの少なくとも１つのハイブリダイズする領域内に位置し、
前記プローブのうちの少なくとも１つは、前記標的配列と相補的である核酸配列を、前記変異の少なくとも相補的な塩基を除いて含み、前記塩基は存在しない、方法。
【請求項１４】
前記増幅反応が、前記標的配列に由来するアンプリコンの存在を検出する検出反応の前に実施される、請求項１３に記載の検出方法。
【請求項１５】
前記増幅反応が、
（ａ）前記標的配列のある領域において、または前記標的配列の相補的なある領域に特異的にハイブリダイズすることができ、伸長条件下で、第２のプライマーのハイブリダイズする領域に向かって伸長することができる第１のプライマーを添加すること、
（ｂ）前記第１のプライマーの添加と可能であれば同時に、前記標的配列の別の領域において、または前記標的配列の相補的な別の領域に特異的にハイブリダイズすることができ、伸長条件下で、前記第１のプライマーのハイブリダイズする領域の相補的配列に向かって伸長することができる第２のプライマーを添加すること、および
（ｃ）前記プライマーのハイブリダイゼーションおよび伸長、ならびにこうして得られたアンプリコンの放出を可能にするために、酵素、ヌクレオチド三リン酸等の試薬および温度、ｐＨ等の物理的条件に試料をさらすこと
からなる、請求項１４に記載の検出方法。
【請求項１６】
前記プローブのハイブリダイズする領域が、前記標的配列上または前記標的配列の相補的配列上の、前記第１のプライマーがハイブリダイズすることができる領域と前記第２のプライマーがハイブリダイズすることができる領域との間に位置する、請求項１３から１５のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項１７】
前記プローブが、少なくとも１つの標識を含有する、請求項１３から請求項１６のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項１８】
前記プローブが、その末端のそれぞれに１つの標識を担持する核酸である、請求項１７に記載の検出方法。
【請求項１９】
前記検出反応がリアルタイムの検出である、請求項１３および請求項１５から１８のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項２０】
少なくとも１つの請求項３に記載のプライマー対および少なくとも１つの請求項４または請求項５に記載のプローブを含有するキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的核酸配列の非保存ヌクレオチド、例えば、異なる遺伝子型間の変異によってプライマー結合性が変動することに特に起因する、増幅効率の差を解消するように設計されたプライマーに関する。非保存ヌクレオチドの相補的塩基を欠失させることによって、欠失プライマーと呼ばれるプライマーの結合性が全ての標的（遺伝子型）について同じになる。本発明は、定量アッセイの場合の内部対照および／または検出核酸配列および／または標的と競合する他の核酸配列等の、他の技術的局面において取って代わることができ、その場合、欠失プライマーによる標的、内部対照および／または競合配列の増幅は、標的核酸の変異体の間でも同等となる。
【背景技術】
【０００２】
分子生物学の進歩によって、増幅技術を使用することにより、核酸の高感度な検出が可能となっている。増幅方法は、極めて少量の核酸を比較的短時間で指数関数的に増幅することを可能にするので、非常に強力なツールとなっている。それにより、ＲＮＡまたはＤＮＡの単一コピーにまで至る感度を有する、非常に強力なアッセイが可能となった。
【０００３】
ＰＣＲ、ＬＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＴＭＡおよびＳＤＡ等の種々の増幅技法が開発され、当業者によく知られている。これらの方法はそれぞれ異なる作用機構に基づいているが、全てが、標的核酸配列またはその相補的配列に対する１つまたは複数のプライマーのアニーリングに依存する。
【０００４】
標的または標的の一部の増幅の間または後に、生成したアンプリコンの存在または量を検出すべきである。この検出は、ゲルにおける試料の分離、それに続くブロッティングおよびプロービング等、種々の既知の技法を用いて実施することができる。検出は、増幅が終了して初めて行うことができる。均一手順においては、増幅および検出が、反応成分を分離することなく行われる。アンプリコンは、増幅が進む間に検出される。したがって、アンプリコンの生成をリアルタイムでモニターすることができ、こうして得られたデータを使用して、アンプリコンの有無および／または量を決定することができる。
【０００５】
核酸配列の増幅および検出においてプライマーおよびプローブとして使用すべきオリゴヌクレオチドの選択は、アッセイの感度および特異性のために重要な意味をもつ。増幅すべき配列は通常、試料（例えば、ウイルス感染したことが疑われる患者から得られた血液試料）中に微量でしか存在しない。プライマーは、試料中に存在するウイルス核酸の効率的な増幅を可能にするのに十分に、標的配列に対して相補的であるべきである。プライマーが標的配列に適切にアニーリングしない（両鎖中のヌクレオチドの塩基の誤対合に起因する）場合、増幅は著しく妨げられる。標的が直鎖状ではなく特定の構造を有する場合には、プライマーが標的に接近しにくくなり、さらには増幅の低下がもたらされる。それにより、アッセイの感度は悪影響を受け、偽陰性の試験結果が生じる恐れがある。
【０００６】
プライマーの効率的なハイブリダイゼーションは一般に、少なくとも１５個の連続する相補的ヌクレオチドを必要とする。１５個より少ないヌクレオチドしか存在しない場合には、プライマーの特異的アニーリングと非特異的アニーリングの比が、標的核酸の有効な増幅がもはや起こり得ない程度にまで減少する。標的ヌクレオチド配列のいくつかの遺伝子変異が知られている場合には、ヌクレオチドの保存ストレッチを同定し、プライマー設計のために使用することができる。しかし、ＲＮＡウイルスのような一部の種における好ましい保存ストレッチ、例として、ヒトＣ型肝炎ウイルスのコード領域の部分が、短過ぎて効率的なプライマーを設計するためには使用できないことがある。さらに、これらの保存セグメントでさえ、突然変異する傾向があり、未知の多型が連続的に発生する。このことは、ウイルスおよび細菌のような分裂の速い生物において最も顕著であり、その結果、プライマーのハイブリダイゼーション効率が低下する。結果として、増幅が生じない恐れがあり、このことは、偽陰性の増幅結果が当該の患者にとって重大な結果をもたらす恐れがあるので、例えば、ルーチンの診断においては非常に望ましくない。また、定量的アッセイの場合には、標的中の配列変異（多型）が、標的の過小定量化をもたらす恐れもある。
【０００７】
さらに、増幅された標的配列と検出に使用するプローブとの配列の差によっても、検出効率がさらに低下する。したがって、多型を有する標的は、プローブのコンセンサス配列と完全に一致する標的ほど十分には検出されない。
【０００８】
文献ＥＰ−Ａ−１４２６４４８は、核酸プローブを使用して、増幅された核酸分析対象を検出する診断用ハイブリダイゼーションアッセイにおける配列変異の影響を低下させるための方法について言及している。この方法は、親和性を増加させる改変を有する１つまたは複数のヌクレオチドの導入、より具体的には、分子ビーコンのループからなる。多型を有する分析対象に対するプローブの親和性が増加することから、多型に対する感受性が低下する。
【０００９】
にもかかわらず、この方法はもっぱらプローブに関するものであり、プライマーと、少なくとも１つのヌクレオチド変異を含有する標的とのミスマッチの問題は解消されない。さらに、プローブの設計に関しては、提案されている解決法は、高価であり特異的な製造プロセスが必要となる改変ヌクレオチドを必要とする。
【００１０】
文献ＥＰ−Ｂ−０２４６８６４は、異なるヌクレオチド配列同士を区別するための方法に関し、２つのヌクレオチドプローブを使用し、相補的な標的配列とのスプリットプローブハイブリッドを形成させる。これらの２つのプローブは、標的配列中の潜在的なミスマッチが前記プローブ間に存在するようになされる。上記の文献と同様、この方法の１つの欠点は、この方法がもっぱらプローブに関するものであるに過ぎず、プライマーに関するものではないことである。さらに、この方法は、２つのプローブの使用および設計も必要とする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、標的配列のうちのハイブリダイズするセグメントの突然変異または遺伝子変異に影響されにくい増幅方法が必要であることは明らかである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、均一アッセイにおける標的の配列変異に対する依存性を低下させるための非常に用途の広いツールであるプライマーおよび／またはプローブを提供する。第１の実施形態によれば、本発明は、標的核酸配列を増幅するように設計されたプライマーであって、この標的配列は、遺伝子型変異と呼ばれる１つの非保存ヌクレオチド、または同一遺伝子型内の１つのヌクレオチド変異のいずれかと定義される少なくとも１つの変異を含有し、前記プライマーは、前記標的配列と相補的である核酸配列を、この（１つまたは複数の）変異の少なくとも相補的な塩基を除いて含み、こうした塩基はプライマー中には存在しない、プライマーを提供する。
【００１３】
特定の実施形態では、プライマーは、互いに隣接する少なくとも２つの変異を含有する標的と相補的である。
【００１４】
一実施形態によれば、プライマーは、少なくとも２つの変異を含有する標的配列と相補的であり、各変異が少なくとも１つの保存ヌクレオチドによって互いに分離されている。
【００１５】
別の実施形態によれば、このプライマーは、もう１つのプライマーと、プライマー対を形成することができる。したがって、本発明は、標的核酸配列を増幅するためのプライマー対であって、この標的配列は、遺伝子型変異と呼ばれる１つの非保存ヌクレオチド、または同一遺伝子型内の１つのヌクレオチド変異のいずれかとして定義される少なくとも１つの変異を含有し、プライマー対を形成するプライマーのうちの少なくとも１つは本発明に従って設計されている、プライマー対を提供する。したがって、ＮＡＳＢＡアプローチにおいては、試料と、それぞれ順方向プライマーＰ１および逆方向プライマーＰ２と呼ぶ一対のプライマーとを接触させることによって、増幅を実施する。ＮＡＳＢＡプロセスを実施する場合、Ｐ１プライマーは目的の配列の下流でハイブリダイズし、Ｐ２プライマーは順方向プライマーの伸長によって生成された鎖に対して相補性を示し、前記目的の配列の上流に位置する。ＰＣＲ増幅を実施する場合、目的の配列に対して、順方向プライマーは上流に位置し、逆方向プライマーは下流に位置する。
【００１６】
本発明の別の目的は、標的核酸配列を検出するように設計されたプローブであって、この標的配列は、遺伝子型変異と呼ばれる１つの非保存ヌクレオチド、または同一遺伝子型内の１つのヌクレオチド変異のいずれかと定義される少なくとも１つの変異を含有し、プローブは、前記標的配列と相補的である核酸配列を、この（１つまたは複数の）変異の少なくとも相補的な塩基を除いて含み、この塩基はプローブ中には存在しない、プローブである。
【００１７】
一実施形態によれば、プローブは、少なくとも１つの標識を含む。種々の標識部分が、当技術分野で知られている。前記部分は、例えば、放射性化合物、検出可能な酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ））、ビオチンのようなハプテン、または比色分析シグナル、蛍光シグナル、化学発光シグナルもしくは電気化学発光シグナル等の検出可能なシグナルを発生させることができる任意のその他の部分のいずれであってもよい。
【００１８】
プライマーまたはプローブのいずれかの実施形態によれば、標的配列はＲＮＡ標的である。
【００１９】
さらに、別の実施形態によれば、プライマーはプロモーター配列を備えている。用語「プロモーター配列」は、ＲＮＡポリメラーゼが特異的に認識する核酸配列の領域と定義し、ＲＮＡポリメラーゼは認識配列に結合して転写プロセスを開始し、それによってＲＮＡ転写物が産生される。原則として、開始配列を認識することができるポリメラーゼが知られており、利用可能である任意のプロモーター配列を利用することができる。既知であり、有用なプロモーターは、バクテリオファージＴ３、Ｔ７またはＳＰ６等、特定のバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼが認識するプロモーターである。プロモーター配列に連結したオリゴヌクレオチドは通常、「プロモータープライマー」と呼ばれる。しかし、プライマー、例えば、伸長反応のための開始点としてのその機能は、すでに上記で言及した通り遮断されてもよく、または転写に基づく増幅反応のいくつかの実施形態では存在しなくてもよい。
【００２０】
本発明はさらに、遺伝子型変異と呼ばれる１つの非保存ヌクレオチド、または同一遺伝子型内の１つのヌクレオチド変異のいずれかと定義される少なくとも１つの変異を含有する核酸標的配列を試料中で増幅する方法であって、
１）標的配列のある領域において特異的にハイブリダイズすることができ、伸長条件下で、第２のプライマーのハイブリダイズする領域に向かって伸長することができる第１のプライマー、および
２）標的配列の別の領域の相補的配列に特異的にハイブリダイズすることができ、伸長条件下で、前記第１のプライマーのハイブリダイズする領域の相補的配列に向かって伸長することができる第２のプライマー
を使用して、前記標的配列の存在を増幅する増幅反応を試料に対して実施することを含み、
前記少なくとも１つの変異は、第１のプライマーおよび第２のプライマーのうちの少なくとも１つのハイブリダイズする領域内に位置し、
第１のプライマーおよび第２のプライマーのうちの少なくとも１つは、前記標的配列と相補的である核酸配列を、この（１つまたは複数の）変異の少なくとも相補的な塩基を除いて含み、この塩基は存在しない、方法を提供する。
【００２１】
別の実施形態によれば、本発明の方法は、プライマーおよびプローブを使用して核酸分析対象を検出するいずれの種類の方法であってもよい。そのようなアッセイは、ＰＣＲ、ＴＭＡまたはＮＡＳＢＡに基づくアッセイ等、増幅された分析対象の検出に基づくことができる。しかし、プライマーおよびプローブをアレイとして使用することもできる。本発明は、標的の配列多型がアッセイの信頼性に影響を及ぼす、定量的および定性的の両方の診断アッセイにおいて使用することができる。
【００２２】
本発明の別の目的は、遺伝子型変異と呼ばれる１つの非保存ヌクレオチド、または同一遺伝子型内の１つのヌクレオチド変異のいずれかと定義される少なくとも１つの変異を含有する核酸標的配列を試料中で検出する方法であって、
（ａ）１）標的配列のある領域において、または標的配列の相補的なある領域に特異的にハイブリダイズすることができ、伸長条件下で、第２のプライマーのハイブリダイズする領域に向かって伸長することができる第１のプライマー、および
２）標的配列の別の領域において、または標的配列の相補的な別の領域に特異的にハイブリダイズすることができ、伸長条件下で、前記第１のプライマーのハイブリダイズする領域の相補的配列に向かって伸長することができる第２のプライマー
を使用して、前記標的配列の存在を検出する増幅反応を試料に対して実施すること、および
（ｂ）第１のプライマーがハイブリダイズすることができる領域と第２のプライマーがハイブリダイズすることができる領域との間の、標的配列のある領域に特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも１つのプローブを用いて、前記標的配列の存在を検出する検出反応を試料に対して実施すること
を含み、
前記少なくとも１つの変異は、第１のプライマーおよび第２のプライマーのうちの少なくとも１つのハイブリダイズする領域内に位置し、
第１のプライマーおよび第２のプライマーのうちの少なくとも１つは、前記標的配列と相補的である核酸配列を、この（１つまたは複数の）変異の少なくとも相補的な塩基を除いて含み、この塩基は存在しない、方法である。
【００２３】
この方法の別の実施形態によれば、増幅反応は、転写に基づく増幅およびＰＣＲからなる群から選択される。
【００２４】
この方法の特定の実施形態では、転写に基づく増幅反応は、ＮＡＳＢＡ反応である。ＮＡＳＢＡプロセスは、欧州特許第ＥＰ−Ｂ−０３２９８２２号に記載されている。このプロセスによって、ＲＮＡの増幅が可能になるが、欧州特許出願第ＥＰ−Ａ−１３６６１７９号の記載の通り、この方法を使用して二本鎖核酸を増幅することができる。これらの方法のＰＣＲを上回る主要な利点は、等温で実施されることである。
【００２５】
この方法の別の実施形態によれば、標的配列はＲＮＡ標的である。
【００２６】
本発明の別の目的は、遺伝子型変異と呼ばれる１つの非保存ヌクレオチド、または同一遺伝子型内の１つのヌクレオチド変異のいずれかと定義される少なくとも１つの変異を含有する核酸標的配列を試料中で検出する方法であって、
（ａ）標的配列のある領域に特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも１つのプローブ
を含み、
（ｂ）前記標的配列の存在を検出し、
前記少なくとも１つの変異は、（１つまたは複数の）プローブのうちの少なくとも１つのハイブリダイズする領域内に位置し、
プローブのうちの少なくとも１つは、前記標的配列と相補的である核酸配列を、この（１つまたは複数の）変異の少なくとも相補的な塩基を除いて含み、この塩基は存在しない、方法である。
【００２７】
この方法の最後の実施形態によれば、増幅反応は、標的配列に由来するアンプリコンの存在を検出する検出反応の前に実施する。
【００２８】
この方法の別の実施形態によれば、増幅反応は、
（ａ）標的配列のある領域において、または標的配列の相補的なある領域に特異的にハイブリダイズすることができ、伸長条件下で、第２のプライマーのハイブリダイズする領域と呼ぶ、第２のプライマーがハイブリダイズすることができる標的配列の相補的領域に向かって伸長することができる第１のプライマーを添加すること、
（ｂ）第１のプライマーの添加と可能であれば同時に、標的配列の別の領域において、または標的配列の相補的な別の領域に特異的にハイブリダイズすることができ、伸長条件下で、第１のプライマーのハイブリダイズする領域と呼ぶ、第１のプライマーがハイブリダイズすることができる標的配列の相補的領域に向かって伸長することができる第２のプライマーを添加すること、および
（ｃ）前記プライマーのハイブリダイゼーションおよび伸長、ならびにこうして得られたアンプリコンの放出を可能にするために、酵素、ヌクレオチド三リン酸等の試薬および温度、ｐＨ等の物理的条件に試料をさらすこと
からなる。
【００２９】
この方法の別の実施形態によれば、プローブのハイブリダイズする領域は、標的配列上または前記標的配列の相補的配列上の、第１のプライマーがハイブリダイズすることができる領域と第２のプライマーがハイブリダイズすることができる領域との間に位置する。
【００３０】
この方法の別の実施形態によれば、プローブは、少なくとも１つの標識を含有する。
【００３１】
この方法の別の実施形態によれば、プローブは、その末端のそれぞれに１つの標識を担持する核酸である。本発明によるプローブは、いわゆる分子ビーコン（ＭＢ）であり得る。これらのプローブは、その標的を、直鎖状のプローブよりも高い特異性で認識する。分子ビーコンと呼ばれている、特異的な核酸標的配列の均一検出を促進するクラスのオリゴヌクレオチドプローブが記載されている（Ｐｉａｔｅｋら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６：３５９〜３６３；ＴｙａｇｉおよびＫｒａｍｅｒ（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：３０３〜３０８）。分子ビーコンは、ステムループ構造を有する一本鎖オリゴヌクレオチドである。ループ部分は、アンプリコンと相補的である（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかの）配列を含有する。ステムは、３’末端と５’末端との相補的配列のハイブリダイゼーションによって形成される。ステムは、アンプリコンとは無関係であり得、二本鎖である。ステムの一方のアームは、その遊離の末端において、蛍光染料（フルオロフォア）で標識されており、また、他方のアームも、その遊離の末端において、消光部分に結合している。ステムループの状態では、フルオロフォアのエネルギーが消光分子に伝達されるので、プローブはわずかな蛍光を発生させるに過ぎない。分子ビーコンがアンプリコンとハイブリダイズすると、ステムループ構造が喪失し、クエンチャーとフルオロフォアとが分離状態となる。その段階では、フルオロフォアによって放出される蛍光はもはや消光されず、これを検出および定量化することができる。
【００３２】
この方法の別の実施形態によれば、検出反応はリアルタイムの検出である。
【００３３】
さらに、本発明は、上記した少なくとも１つのプライマー対および少なくとも１つのプローブを含有するキットも提供する。
【００３４】
定義
本発明によれば、用語「核酸」（ＮＡ）は、任意の可能な立体構造、すなわち、二本鎖（ｄｓ）核酸の形態もしくは一本鎖（ｓｓ）核酸の形態のいずれか、またはそれらの組合せとしてのＤＮＡおよびＲＮＡの両方を意味する。そのような核酸は、少なくとも１つの改変ヌクレオチドを場合により含む、一連の少なくとも２つのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドに対応する。
【００３５】
また、このポリヌクレオチドを、例えば、ホスホロチオエート、Ｈ−ホスホネート、アルキルホスホネート等のヌクレオチド間の結合レベル、例えば、アルファ−オリゴヌクレオチド（ＦＲ−Ａ−２６０７５０７）またはＰＮＡ（Ｍ．Ｅｇｈｏｌｍら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１４、１８９５〜１８９７、１９９２）または２’−Ｏ−アルキルリボース等の骨格レベルにおいて修飾することもできる。少なくとも１つのリン酸が核酸中に存在する限り、これらの修飾のそれぞれを組み合わせて用いることができる。
【００３６】
核酸は、天然または合成のオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸断片、リボゾームＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、トランスファーＲＮＡであっても、
−米国特許第４６８３１９５号、米国特許第４６８３２０２号および米国特許第４８００１５９号に記載されているＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、ならびにその派生形態であるＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）、特に、特許第ＥＰ−Ｂ−０５６９２７２号に記載されているワンステップフォーマットの形態、
−特許出願第ＷＯ−Ａ−９０／０１０６９号に記載されているＲＣＲ（修復連鎖反応）、
−特許出願第ＷＯ−Ａ−９０／０６９９５号に関する３ＳＲ（自家持続配列複製法）、
−特許出願第ＷＯ−Ａ−９１／０２８１８号に関するＮＡＳＢＡ（核酸配列に基づく増幅）、さらに
−米国特許第５３９９４９１号に関するＴＭＡ（転写媒介型増幅）等、
酵素による増幅技法によって得られる核酸であってもよい。
【００３７】
そのような「核酸」を、標的、プライマーまたはプローブとして使用することができる。
【００３８】
「標的配列」を、検出しようとする核酸分子の部分と定義する。標的配列を、プライマーおよび増幅関連酵素によって増幅する。増幅により、「アンプリコン」が形成され、アンプリコンは、プローブとのハイブリダイゼーションによって物理的に検出される核酸分子である。アンプリコンの長さは、３０ヌクレオチド長まで、好ましくは、１００〜３００の間のヌクレオチド長であるが、より長いポリヌクレオチド、１５００ヌクレオチド長までを考慮することができる。
【００３９】
本明細書で使用する場合、用語「プライマー」は、天然に（例えば、制限断片として）存在するオリゴヌクレオチドまたは合成により生成したオリゴヌクレオチドのいずれかを指し、プライマーは、ヌクレオチドおよび酵素、例えば、ＤＮＡ依存性ポリメラーゼまたはＲＮＡ依存性ポリメラーゼ等の核酸重合のための薬剤の存在下で、適切な条件（例えば、緩衝液、塩、温度およびｐＨ）下に置かれた場合、核酸鎖（鋳型または標的の配列）の一部と相補的であるプライマー伸長産物の合成開始点として働くことができる。通常、１セットのプライマーは、少なくとも２つのプライマー、すなわち、１つの「上流」プライマーと１つの「下流」プライマーとからなり、１セットのプライマーが一緒になって、アンプリコン（前記プライマーを使用して増幅され、標的配列の一部であるかまたは標的配列の一部と相補的である配列）を画定する。プライマーのうちの１つは標的の（＋）鎖とハイブリダイズし、第２のプライマーは標的の（−）鎖とハイブリダイズする。プライマーの長さは、１０〜５０の間、好ましくは、１５〜３０の間のヌクレオチド長であるべきである。プライマーをさらに、プロモーター配列、例えば、Ｔ７プロモーターに結合させることもできるであろう。
【００４０】
本明細書で使用する場合、用語「プローブ」は、アンプリコンとハイブリダイズする一続きのヌクレオチドを含むものとする。好ましくは、ハイブリダイズする部分は、一続きの１０〜５０、より好ましくは１５〜３５、最も好ましくは、１５〜３０ヌクレオチドである。
【００４１】
本出願では、用語「分析対象」、「アンプリコン」、および「標的」または「標的配列」を互換的に使用することができる。分析対象は、検出しようとする元々の核酸分子である。標的配列は、プライマーによって増幅される分析対象の部分である。増幅により、アンプリコンが形成され、アンプリコンは、プローブとのハイブリダイゼーションによって物理的に検出される核酸分子である。アンプリコンの配列は、分析対象内部の標的配列と同じであるかまたはそれと相補的である。
【００４２】
用語「非保存ヌクレオチド」または「遺伝子型変異」または「１つのヌクレオチド変異」または「変異」は、任意の単一または複数のヌクレオチドの置換、欠失または挿入を指す。これらのヌクレオチド変異は、突然変異体であっても、多型を有する対立遺伝子変異であってもよい。
【００４３】
本明細書で使用する場合、用語「多型」は、ＤＮＡまたはＲＮＡ中の特定の部位において２つ以上の異なるヌクレオチド配列が存在することができる状態を指す。
【００４４】
以下の実施例において本発明をさらに例示するが、実施例は本発明を制限するものでは決してない。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】欠失ｐ１プライマーを用いたＨＣＶ  ＮＡＳＢＡの増幅を示すグラフである。２つのグラフ、すなわち、通常のｐ１ａ／ｐ２ｂプライマー対による増幅に対応するグラフ（図１Ａ）と、ｐ１ｄが１つの欠失を含有する、本発明によるｐ１ｄ／ｐ２ｂプライマー対による増幅に対応するグラフ（図１Ｂ）との比較。
【図２】種々の欠失ｐ１プライマーを用いたＨＣＶのＮＡＳＢＡ増幅を示すグラフである。通常のｐ２プライマー（ＨＣＶ−Ｅ２  ｐ２ｂ）と以下のｐ１とを組み合わせたプライマー対による増幅に対応する４つのグラフの比較：−図２Ａに示す、１つの欠失を含有する欠失プライマーＨＣＶ−Ｅ２−ｐ１ｄ、−図２Ｂに示す、２つの欠失を含有する欠失プライマーＨＣＶ−Ｅ２−ｐ１ｅ、−図２Ｃに示す、２つの欠失を含有する欠失プライマーＨＣＶ−Ｅ２−ｐ１ｆ、および−図２Ｄに示す、３つの欠失を含有する欠失プライマーＨＣＶ−Ｅ２−ｐ１ｇ。
【図３】種々の欠失ｐ１プライマーを用いたＨＩＶ  ＲＮＡの増幅を示すグラフである。通常のｐ２プライマー（ＨＩＶ−Ｅ２  ｐ２ｂ）と以下のｐ１とを組み合わせたプライマー対による増幅に対応する４つのグラフの比較：−図３Ａに示す、欠失を含有しない通常のプライマーＨＩＶ．２７、−図３Ｂに示す、１つの欠失を含有する欠失プライマーＨＩＶ．５５、−図３Ｃに示す、１つの欠失を含有する欠失プライマーＨＩＶ．５６、および−図３Ｄに示す、２つの欠失を含有する欠失プライマーＨＩＶ．５７。
【図４】欠失ｐ１プライマーおよび欠失ｐ２プライマーを用いたＨＩＶ  ＲＮＡのＮＡＳＢＡ増幅を示す２つのグラフである。共に２つの欠失を含むＨＩＶ欠失ｐ１ＨＩＶ．５７とＨＩＶ欠失ｐ２の欠失プライマーのセット（表１）とを用いて、ＨＩＶの増幅を実施した（図４ｂ）。使用した参照プライマーのセットは、共に欠失を有さないＨＩＶ  ｒｅｆ  ｐ１  ＨＩＶ．２７とＨＩＶ  ｒｅｆ  ｐ２との組合せである（表１）（図４ａ）。増幅は、ＨＩＶに特異的な分子ビーコン（ＨＩＶ  ＷＴ  ＭＢ、Ｍｅ２３）の存在下で実施した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて転写したＨＩＶサブタイプＢ  ＲＮＡの５０００、５００、５０および５コピーを、増幅のための投入材料として使用した。鋳型を有さない試料（ＮＴ）を、負の対照として使用した。
【図５】欠失分子ビーコンの存在下におけるＨＩＶ  ＲＮＡのＮＡＳＢＡ増幅を示す２つのグラフである。「ＨＩＶ  ＷＴ参照ビーコン」として示される、ＨＩＶに特異的な分子ビーコン（ＨＩＶ  ＷＴ  ＭＢ、ＯＴＭＢ８４７２、表１）の存在下（図５ａ）、または「ＨＩＶ  ＷＴ欠失ビーコン」として示される、２つの欠失を含むＨＩＶ欠失ビーコン（ＨＩＶ  ＷＴ欠失ＭＢ、表１）の存在下（図５ｂ）において、参照プライマーのセット（ＨＩＶ  ｒｅｆ  ｐ１  ＨＩＶ．２７とＨＩＶ  ｒｅｆ  ｐ２）を用いたＨＩＶの増幅を実施した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて転写したＨＩＶサブタイプＢ  ＲＮＡの５０００、５００、５０および５コピーを、増幅のための投入材料として使用した。鋳型を有さない試料（ＮＴ）を、負の対照として使用した。
【図６】欠失プライマーを用いたＨＩＶ  ＤＮＡのＰＣＲ増幅を示すグラフである。欠失を有するプライマーおよび欠失を有さないプライマーの種々の組合せを使用して、ＨＩＶに特異的な分子ビーコン（ＨＩＶ  ＷＴ  ＭＢ（ＭＢ４１、表１））の存在下で、ＨＩＶのＰＣＲ増幅を実施した。共に２つの欠失を含むＨＩＶ  ＰＣＲ欠失ｐ１とＨＩＶ欠失ｐ２の２つの欠失プライマーを使用した。４つの異なるプライマーの組合せを試験した：図６ａ：参照プライマーのセット、ＨＩＶ  ＰＣＲ  ｒｅｆ  ｐ１とＨＩＶ  ｒｅｆ  ｐ２、図６ｂ：ＨＩＶ  ＰＣＲ欠失ｐ１とＨＩＶ  ｒｅｆ  ｐ２、図６ｃ：ＨＩＶ  ＰＣＲ  ｒｅｆ  ｐ１とＨＩＶ欠失ｐ２、および図６ｄ：ＨＩＶ  ＰＣＲ欠失ｐ１とＨＩＶ欠失ｐ２。ＨＩＶサブタイプＢ配列を部分的に含有するプラスミドＤＮＡのおよそ１０６、１０４および１００コピーの希釈系列を、増幅のための投入材料として使用した。鋳型を有さない試料（ＮＴ）を負の対照として使用した。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
以下に提示する実施例１〜６において使用するｐ１プライマー、ｐ２プライマー、および分子ビーコンの配列は、ＮＡＳＢＡ増幅用のものであり、表１に要約する。
【００４７】
【表１】
2012503472.tif 000002
【００４８】
標的に特異的な配列は太字で示し、Ｔ７プロモーター配列は斜体で示し、２’−Ｏ−メトキシヌクレオチドは下線付きであり、最後に、標的に特異的な配列とＴ７プロモーター配列との間に存在する、太字でも斜体でもないヌクレオチドはリンカーである。最後に、星印「＊」は、１つのヌクレオチドが欠失している位置を示す。
【実施例１】
【００４９】
欠失ｐ１プライマーを用いたＨＣＶ  ＲＮＡの増幅
２つの異なるｐ１プライマー、ＨＣＶ−Ｅ２  ｐ１ａまたはＨＣＶ−Ｅ２  ｐ１ｄ（表１）を使用し、ｐ２プライマーであるＨＣＶ−Ｅ２  ｐ２ｂ（表１）と組み合わせて、ＨＣＶに特異的な分子ビーコンであるＨＣＶ−Ｅ２  ｒｅｆ  ＭＢ（表１）の存在下で、ＨＣＶのＥ２領域の部分を増幅した。プライマーＨＣＶ−Ｅ２  ｐ１ｄは、異なるＨＣＶサブタイプ間でヌクレオチド変異が生じる位置において１つのヌクレオチドが欠失している点以外は、プライマーｐ１ａと同じである。このプライマーＨＣＶ−Ｅ２  ｐ１ｄを「欠失プライマー」と呼ぶ。
【００５０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて転写したＨＣＶ  ＲＮＡの希釈系列５×１０５〜５０コピーを、増幅のための投入材料として使用した。標準的なＥａｓｙＱ  Ｂａｓｉｃ  Ｋｉｔ  ＮＡＳＢＡ試薬（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ  Ｂ．Ｖ．、Ｂｏｘｔｅｌ、オランダ）（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．５、１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、８０ｍＭ  ＫＣｌ、１５％ｖ／ｖ  ＤＭＳＯ、５ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭの各ｄＮＴＰ、２ｍＭ  ＡＴＰ、２ｍＭ  ＣＴＰ、２ｍＭ  ＵＴＰ、１．５ｍＭ  ＧＴＰ、０．５ｍＭ  ＩＴＰ、０．２μＭの各プライマー、および０．０１μＭ分子ビーコンプローブ）を使用して、増幅を実施した。混合物を６５℃で２分間インキュベートして、ＲＮＡを変性させ、Ｐ１プライマーを標的と４１℃で２分間ハイブリダイズさせた。次いで、ＮＡＳＢＡ酵素を添加し、反応混合物を、穏やかなボルテックスおよび短時間の遠心分離によって混合し、増幅およびリアルタイムの検出を開始した。反応混合物を、ＮｕｃｌｉＳｅｎｓ  ＥａｓｙＱ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＮｕｃｌｉＳｅｎｓ、ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）中で、蛍光を３０秒毎にモニターしながら、４１℃で９０分間インキュベートした。反応を４８５ｎｍで励起し、発光シグナルを５１８ｎｍで測定した。結果を図１に示す。
【００５１】
これらの結果から、図１Ｂに示すように、ｐ１欠失プライマーＨＣＶ−Ｅ２−ｐ１ｄを用いた増幅が可能であり、さらには図１Ａに示すように、欠失ｐ１プライマーを用いた場合、参照ｐ１プライマーＨＣＶ−Ｅ２−ｐ１ａと比較して良好なアッセイの感度が得られたことが示される。
【実施例２】
【００５２】
種々の欠失ｐ１プライマーを用いたＨＣＶ  ＲＮＡの増幅
ｐ２プライマーであるＨＣＶ−Ｅ２  ｐ２ｂ（表１）と組み合わせて種々のＨＣＶ−Ｅ２  ｐ１欠失プライマーを使用して、ＨＣＶに特異的な分子ビーコンであるＨＣＶ−Ｅ２  ｒｅｆ  ＭＢ（表１）の存在下、ＨＣＶの増幅を実施した。ＨＣＶ−Ｅ２−ｐ１ｄ以外は、新しい欠失プライマーであるＨＣＶ−Ｅ２  ｐ１ｅ、ＨＣＶ−Ｅ２  ｐ１ｆおよびＨＣＶ−Ｅ２  ｐ１ｇを試験した。ＨＣＶ−Ｅ２  ｐ１ｄは１つの欠失を、ＨＣＶ−Ｅ２  ｐ１ｅおよびＨＣＶ−Ｅ２  ｐ１ｆは２つの欠失を、ＨＣＶ−Ｅ２  ｐ１ｇは３つの欠失を、いずれも、異なるＨＣＶサブタイプ間でヌクレオチド変異が生じる位置において含む（表１）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写したＨＣＶ  ＲＮＡの希釈系列５×１０５〜５０コピーを、増幅のための投入材料として使用した。実施例１の記載に従って増幅を実施した。結果を図２に示す。
【００５３】
これらの結果から、３つまでの欠失を含むｐ１プライマーを用いた増幅が可能であり、プライマーであるＨＣＶ−Ｅ２  ｐ１ｄプライマーと比較して、得られたアッセイの感度は同等であるか、さらには良好であることが示される。２つの欠失を含むＨＣＶ−Ｅ２  ｐ１ｆ（図２Ｃ）が、最も良好なアッセイの動態を示している。
【実施例３】
【００５４】
種々の欠失ｐ１プライマーを用いたＨＩＶ  ＲＮＡの増幅
種々のＨＩＶ欠失ｐ１プライマーを用いた増幅を、ｐ２プライマーであるＨＩＶ−ｒｅｆ  ｐ２（表１）と組み合わせて、ＨＩＶに特異的な分子ビーコン（ＨＩＶ  ＷＴ  ＭＢ（Ｍｅ２３）、表１）の存在下で実施した。使用したｐ１プライマーは、異なるＨＩＶサブタイプ間でヌクレオチド変異が生じる位置において１つのヌクレオチドの欠失を含むＨＩＶ．５５およびＨＩＶ．５６（表１）、ならびに２つの欠失を含むＨＩＶ．５７（表１）である。欠失を有さないＰ１プライマーＨＩＶ．２７を、参照として使用した。細胞培養物からのＨＩＶ粒子を、溶解用緩衝液（ＮｕｃｌｉＳｅｎｓ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ試薬、ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、Ｂｏｘｔｅｌ、オランダ）を用いて溶解させ、これを、増幅のための投入材料として使用した。このＨＩＶサブタイプＢ試料（ＷＲＳ：Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ）の５００、５０および５国際単位（ＩＵ）の投入量を使用した。より低いＫＣｌ濃度（７０ｍＭ）を使用し、ソルビトール希釈液の代わりに水を使用して酵素を溶解させた以外は、実施例１の記載に従って増幅を実施した。結果を図３に示す。
【００５５】
これらの結果から、２つまでの欠失を含むｐ１欠失プライマー用いたＨＩＶの増幅が可能であり（図３Ｄ）、参照ｐ１プライマーと比較して同程度のアッセイの感度が得られる（図３Ａ）ことが示される。
【実施例４】
【００５６】
欠失ｐ１プライマーおよび欠失ｐ２プライマーを用いたＨＩＶ  ＲＮＡのＮＡＳＢＡ増幅
２つの異なるプライマーの組合せ、すなわち、参照プライマー（ＨＩＶ  ｒｅｆ  ｐ１（ＨＩＶ．２７）とＨＩＶ  ｒｅｆ  ｐ２、表１）、および異なるＨＩＶサブタイプ間でヌクレオチド変異が生じる位置において、共に２つの欠失を含む欠失プライマー（ＨＩＶ欠失ｐ１（ＨＩＶ．５７）とＨＩＶ欠失ｐ２、表１）を使用して、ＨＩＶのｇａｇ領域の部分を増幅した。増幅は、ＨＩＶに特異的な分子ビーコン（ＨＩＶ  ＷＴ  ＭＢ（Ｍｅ２３）、表１）の存在下で実施した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて転写したＨＩＶサブタイプＢ  ＲＮＡの５０００、５００、５０および５コピーの希釈系列を、増幅のための投入材料として使用した。標準的なＥａｓｙＱ  Ｂａｓｉｃ  Ｋｉｔ  ＮＡＳＢＡ試薬（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．５、１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、７０ｍＭ  ＫＣｌ、１５％ｖ／ｖ  ＤＭＳＯ、５ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭの各ｄＮＴＰ、２ｍＭ  ＡＴＰ、２ｍＭ  ＣＴＰ、２ｍＭ  ＵＴＰ、１．５ｍＭ  ＧＴＰ、０．５ｍＭ  ＩＴＰ、０．２μＭの各プライマー、および０．０１μＭ分子ビーコンプローブ）を使用して、増幅を実施した。混合物を、６５℃で２分間インキュベートしてＲＮＡを変性させ、４１℃で２分間インキュベートしてＰ１プライマーを標的にハイブリダイズさせた。それに続いて、ＮＡＳＢＡ酵素を添加し、反応混合物を、穏やかなボルテックスおよび短時間の遠心分離によって混合し、増幅およびリアルタイムの検出を開始した。反応混合物を、ＮｕｃｌｉＳｅｎｓ  ＥａｓｙＱ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＮｕｃｌｉＳｅｎｓ、ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）中で、蛍光を１分毎にモニターしながら、４１℃で１２０分間インキュベートした。反応を４８５ｎｍで励起し、発光シグナルを５１８ｎｍで測定した。結果を図４に示す。
【００５７】
これらの結果から、欠失プライマーのセット（ＨＩＶ欠失ｐ１（ＨＩＶ．５７）とＨＩＶ欠失ｐ２、表１）を用いたＨＩＶの増幅が可能であり（図４Ｂ）、参照プライマーのセット（ＨＩＶ  ｒｅｆ  ｐ１（ＨＩＶ．２７）とＨＩＶ  ｒｅｆ  ｐ２、表１）と比較して同等の感度が得られる（図４Ａ）ことが示される。
【実施例５】
【００５８】
欠失分子ビーコンの存在下におけるＨＩＶ  ＲＮＡのＮＡＳＢＡ増幅
「ＨＩＶ  ＷＴ参照ビーコン」として示される、ＨＩＶに特異的な分子ビーコン（ＨＩＶ  ＷＴ  ＭＢ、ＯＴＭＢ８４７２、表１）の存在下、または「ＨＩＶ  ＷＴ欠失ビーコン」として示される、異なるＨＩＶサブタイプ間でヌクレオチド変異が生じる位置において２つの欠失を含むＨＩＶ欠失ビーコン（ＨＩＶ  ＷＴ欠失ＭＢ、表１）の存在下で、参照プライマーのセット（ＨＩＶ  ｒｅｆ  ｐ１（ＨＩＶ．２７）とＨＩＶ  ｒｅｆ  ｐ２、表１）を使用して、ＨＩＶのｇａｇ領域の部分を増幅した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて転写したＨＩＶサブタイプＢ  ＲＮＡの５０００、５００および５０コピーの希釈系列を、増幅のための投入材料として使用した。蛍光を３０秒毎にモニターしながら、増幅物を６０分間インキュベートした以外は、実施例１の記載に従って増幅を実施した。結果を図５に示す。
【００５９】
これらの結果から、欠失分子ビーコンの存在下におけるＨＩＶの増幅が可能であり（図５Ｂ）、参照分子ビーコンと比較して同等の感度が得られる（図５Ａ）ことが示される。
【実施例６】
【００６０】
欠失プライマーを用いたＨＩＶ  ＤＮＡのＰＣＲ増幅
欠失を有するプライマーおよび欠失を有さないプライマーの種々の組合せを使用して、ＨＩＶに特異的な分子ビーコン（ＨＩＶ  ＷＴ  ＭＢ（ＭＢ４１、表１））の存在下で、ＨＩＶのｇａｇ領域の部分を増幅した。増幅領域は、実施例１および２に記載したものと同じであるが、ここでは、標的としてＤＮＡを用いるＰＣＲ増幅およびＴ７プロモーターテイルを有さないｐ１プライマーを使用する。２つの欠失プライマー、すなわち、逆方向プライマーとしてのＨＩＶ  ＰＣＲ欠失ｐ１と、順方向プライマーとしてのＨＩＶ欠失ｐ２を使用し、２つの欠失プライマーは共に、異なるＨＩＶサブタイプ間でヌクレオチド変異が生じる位置において２つの欠失を含むものであった。４つの異なるプライマーの組合せを試験した：
１）参照プライマーのセット、ＨＩＶ  ＰＣＲ  ｒｅｆ  ｐ１とＨＩＶ  ｒｅｆ  ｐ２、
２）ＨＩＶ  ＰＣＲ欠失ｐ１とＨＩＶ  ｒｅｆ  ｐ２、
３）ＨＩＶ  ＰＣＲ  ｒｅｆ  ｐ１とＨＩＶ欠失ｐ２、および
４）ＨＩＶ  ＰＣＲ欠失ｐ１とＨＩＶ欠失ｐ２。
【００６１】
ＨＩＶサブタイプＢ配列を部分的に含有するプラスミドＤＮＡのおよそ１０６、１０４および１００コピーの希釈系列を、増幅のための投入材料として使用した。Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ製の標準的なＰＣＲ  ＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ｑＰＣＲ  ＭａｓｍａｓｔｅｒＭｉｘ  Ｎｏ  ＲＯＸ）を使用して、０．３μＭの両方のプライマーおよび０．１μＭ分子ビーコンと組み合わせて、ＰＣＲ増幅を実施した。５０μｌの反応混合物を、穏やかなボルテックスおよび短時間の遠心分離によって混合した。それに続いて、混合物を、５０℃で２分間インキュベートし（ＵＮＧ（ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ）ステップ）、ＵＮＧの不活性化およびＨｏｔＧｏｌｄＳｔａｒ  ＤＮＡポリメラーゼの活性化のために、９５℃で１０分間インキュベートし、続いて、４０回の増幅サイクルを行った。各サイクルは、９５℃で１５秒間の変性、４１℃で３０秒間および６０℃で２０秒間のプライマーとビーコンとのアニーリング、ならびに７２℃で４０秒間のプライマーの伸長からなる。各サイクルの４１℃で３０秒間のアニーリングのステップの終わりに蛍光（ＦＡＭ）シグナルを測定する。ＰＣＲ増幅およびリアルタイム検出を、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製のＭｘ３０００ｐ  ＰＣＲサイクラーにおいて実施した。結果を図６に示す。これらの結果から、欠失プライマーのセット（ＨＩＶ  ＰＣＲ欠失ｐ１とＨＩＶ欠失ｐ２（表１））を用いたＰＣＲ増幅が可能であり、参照プライマーのセット（ＨＩＶ  ＰＣＲ  ｒｅｆ  ｐ１とＨＩＶ  ｒｅｆ  ｐ２、表１）と比較して同等の感度が得られることが示される。
【図１Ａ】
2012503472.tif 000003
【図１Ｂ】
2012503472.tif 000004
【図２Ａ】
2012503472.tif 000005
【図２Ｂ】
2012503472.tif 000006
【図２Ｃ】
2012503472.tif 000007
【図２Ｄ】
2012503472.tif 000008
【図３Ａ】
2012503472.tif 000009
【図３Ｂ】
2012503472.tif 000010
【図３Ｃ】
2012503472.tif 000011
【図３Ｄ】
2012503472.tif 000012
【図４Ａ】
2012503472.tif 000013
【図４Ｂ】
2012503472.tif 000014
【図５Ａ】
2012503472.tif 000015
【図５Ｂ】
2012503472.tif 000016
【図６Ａ−Ｂ】
2012503472.tif 000017
【図６Ｃ−Ｄ】
2012503472.tif 000018
【配列表】
2012503472000001.app
【国際調査報告】
2012503472.tif 000019
2012503472.tif 000020
2012503472.tif 000021