【手続補正書】
【提出日】平成21年6月5日(2009.6.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の病原因子からの標的配列の多重プライマーに基づく増幅のための方法であって、
前記標的配列は各病原因子で異なっており、並びに
ａ．増幅される各標的配列に対する第一増幅反応［前記第一増幅反応は、
ｉ）鋳型としての、前記複数の病原因子各々からの核酸（前記核酸は前記標的配列を含む。）；
ｉｉ）前記核酸にハイブリダイズし、前記標的配列を囲う標的富化プライマーの第一対；
ｉｉｉ）前記核酸にハイブリダイズし、前記標的配列を囲う標的富化プライマーの第二対（前記標的富化プライマーの第二対は前記標的配列に近接して位置し、前記標的富化プライマーの第二対の一方は５’末端に標的増幅プライマー対の一方の配列に対応する結合タグを含み、前記標的富化プライマーの第二対の他方は５’末端に前記標的増幅プライマー対の他方の配列に対応する結合タグを含む。）；及び
ｉｖ）第一増幅反応が複数の第一増幅産物を生産するような、第一増幅反応のための増幅試薬と条件（前記第一増幅産物の少なくとも部分は、前記標的配列、及び、前記標的増幅プライマーの少なくとも１つに対する少なくとも１つの結合部位を含む。）
を使用する。］を行い、及び
ｂ．増幅される各標的配列に対する第二増幅反応［前記第二増幅反応は、
ｉ）鋳型としての、前記標的増幅プライマーの少なくとも１つに対する少なくとも１つの前記結合部位を含む第一増幅産物の前記部分；
ｉｉ）第一増幅産物の前記部分上の対応結合部位に結合する、少なくとも１つの前記標的増幅プライマーの第一対；及び
ｉｉｉ）第二増幅反応が標的配列を含む複数の第二増幅産物を生産するような、第二増幅反応のための増幅試薬と条件
を使用する。］を行うこと
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記標的富化プライマーの第一対がＲｏ及びＦｏプライマーを含み、前記標的富化プライマーの第二対がＦｉ及びＲｉプライマーを含み、及び前記標的増幅プライマーの第一対がＦＳＰとＲＳＰを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｆｉ上の前記結合タグが、ＦＳＰが前記Ｆｉプライマー上の結合タグの相補物に結合するように、ＦＳＰの配列と同一であり、及びＲｉ上の前記結合タグが、ＲＳＰが前記Ｒｉプライマー上の結合タグの相補物に結合するように、ＲＳＰの配列と同一である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
標的富化プライマーの第一対の各々の長さが、１０−４０ヌクレオチド、１０−３０ヌクレオチド及び１０−２０ヌクレオチドから成る群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
標的富化プライマーの第二対の各々の長さが、１０−４０ヌクレオチド、１０−３０ヌクレオチド及び１０−２０ヌクレオチドから成る群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
標的富化プライマーの第一対の各々の長さが１０−２０ヌクレオチドであり、及び標的富化プライマーの第二対の各々の長さが３０−４０ヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
標的増幅プライマーの第一対の各々の長さが１０−２０ヌクレオチドであり、及び標的富化プライマーの第二対の各々の長さが３０−４０ヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
標的富化プライマーが低濃度で存在し、及び標的増幅プライマーが高濃度で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記低濃度が０．００２μＭ−０．２μＭの濃度であり、及び前記高濃度が０．２μＭ−１．０μＭの濃度である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
標的富化プライマーが標的配列の指数増幅には十分でない濃度で存在し、及び標的増幅プライマーが標的配列の指数増幅に十分な濃度で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
標的富化プライマーの各々が同じ濃度で使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
標的富化プライマーの少なくとも１つを他の標的富化プライマーより高い濃度で使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
標的増幅プライマーの各々が同じ濃度で使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
標的増幅プライマーの少なくとも１つが、他の標的増幅プライマーより高い濃度で使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
より高濃度の前記標的増幅プライマーが検出のための手段を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記第一増幅反応についての条件が標的富化工程の少なくとも２回の完全なサイクルを含み、及び前記第二増幅反応についての条件が標的増幅工程の少なくとも２回の完全なサイクルを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
標的富化工程が増幅に関する以下の条件：９２−９４℃における０．５−１分間、５０−５５℃における１−２．５分間及び７０−７２℃における０．５−１分間を含み、及び標的増幅工程が増幅に関する以下の条件：９４℃における１５−３０秒間、５０−５５℃における１５−３０秒間及び７２℃における１５−３０秒間を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記第一増幅反応についての条件が標的富化工程の少なくとも２回の完全なサイクル及び選択的増幅工程の少なくとも２回の完全なサイクルを含み、及び前記第二増幅反応についての条件が標的増幅工程の少なくとも２回の完全なサイクルを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
標的富化工程が増幅に関する以下の条件：９２−９４℃における０．５−１分間、５０−５５℃における１−２．５分間及び７０−７２℃における０．５−１分間を含み、選択的増幅工程が増幅に関する以下の条件：９２−９４℃における１５−３０秒間、７０−７２℃における１−２分間を含み、及び標的増幅工程が増幅に関する以下の条件：９４℃における１５−３０秒間、５０−５５℃における１５−３０秒間及び７２℃における１５−３０秒間を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記選択的増幅が、前記標的富化プライマーの少なくとも１つに対する結合部位を含む第一増幅産物の生産の方に偏る、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
標的富化プライマーの第一対の各々の長さが１０−２０ヌクレオチドであり、及び標的富化プライマーの第二対の各々の長さが３０−４０ヌクレオチドである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
３又はそれ以上の標的富化プライマー対をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
２又はそれ以上の標的増幅プライマー対をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記病原因子が、ウイルス及び細菌から成る群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記病原因子が、アデノウイルス、インフルエンザＡ型、インフルエンザＢ型、パラインフルエンザ１型、パラインフルエンザ３型及び呼吸器合胞体ウイルス、ＳＡＲＳ、及び（コクサッキーウイルスＡ型、コクサッキーウイルスＢ型、ライノウイルス及びエコーウイルスを含む）エンテロウイルスから成る群より選択されるウイルスである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記病原因子が、マイコプラスマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）種及びクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）種から成る群より選択される細菌である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記病原因子が、標的富化プライマーの第一対及び第二対の適切な設計によって選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記標的増幅プライマーの少なくとも１つが、検出のための手段をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記検出のための手段が、化学的エレメント、酵素エレメント、蛍光エレメント又は放射標識エレメントから成る群より選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記標的配列を検出することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
検出方法が直接検出方法である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記検出方法が、
ａ．検出される各標的配列に対する検出オリゴヌクレオチドを提供すること（各検出オリゴヌクレオチドはシグナル生成のための第一手段を含む。）；
ｂ．前記検出オリゴヌクレオチドを、前記第二増幅産物と接触させ、インキュベートすること；
ｃ．シグナル生成のための前記第一手段を刺激して、第一シグナルを生産すること；及び
ｄ．前記第一シグナルを検出すること
を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記第一シグナルが検出される標的配列に特有であり、及び前記第一シグナルが前記病原因子を特定するために使用される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
第一シグナル生成のための前記手段が、蛍光標識、化学標識、酵素標識又は放射標識である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
第一シグナル生成のための前記手段が蛍光ミクロスフェアである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記方法が間接検出方法である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３７】
複数の病原因子からの標的配列の多重プライマーに基づく増幅のための方法であって、
前記標的配列は各病原因子で異なっており、並びに
ａ．増幅される各標的配列に対する第一増幅反応［前記第一増幅反応は、
ｉ）鋳型としての、前記複数の病原因子の各々からの核酸（前記核酸は前記標的配列を含む。）；
ｉｉ）前記核酸にハイブリダイズし、前記標的配列を囲う標的富化プライマーの第一対（前記標的富化プライマーの第一対の一方は５’末端に標的増幅プライマー対の一方の配列に対応する結合タグを含み、前記標的富化プライマーの第一対の他方は５’末端に前記標的増幅プライマー対の他方の配列に対応する結合タグを含む。）；及び
ｉｉｉ）第一増幅反応が複数の第一増幅産物を生産するような、第一増幅反応のための増幅試薬と条件（第一増幅産物の少なくとも部分は、前記標的配列、及び、前記標的増幅プライマーの少なくとも１つに対する少なくとも１つの結合部位を含む。）；
を使用する。］を行い、及び
ｂ．増幅される各標的配列に対する第二増幅反応［前記第二増幅反応は、
ｉ）鋳型としての、前記標的増幅プライマーの少なくとも１つに対する少なくとも１つの前記結合部位を含む第一増幅産物の前記部分；
ｉｉ）第一増幅産物の前記部分上の対応結合部位に結合する、少なくとも１つの前記標的増幅プライマーの第一対；及び
ｉｉｉ）第二増幅反応が標的配列を含む複数の第二増幅産物を生産するような、第二増幅反応のための増幅試薬と条件；
を使用する。］を行うこと
を含む、前記方法。
【請求項３８】
前記標的富化プライマーの第一対がＦｉ及びＲｉプライマーを含み、及び前記標的増幅プライマーの第一対がＦＳＰとＲＳＰを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
Ｆｉ上の前記結合タグが、ＦＳＰが前記Ｆｉプライマー上の結合タグの相補物に結合するように、ＦＳＰの配列と同一であり、及びＲｉ上の結合タグが、ＲＳＰが前記Ｒｉプライマー上の結合タグの相補物に結合するように、ＲＳＰの配列と同一である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
標的富化プライマーの第一対の各々の長さが、１０−４０ヌクレオチド、１０−３０ヌクレオチド及び１０−２０ヌクレオチドから成る群より選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
標的富化プライマーが低濃度で存在し、及び標的増幅プライマーが高濃度で存在する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
前記低濃度が０．００２μＭ−０．２μＭの濃度であり、及び前記高濃度が０．２μＭ−１．０μＭの濃度である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
標的富化プライマーが標的配列の指数増幅には十分でない濃度で存在し、及び標的増幅プライマーが標的配列の指数増幅に十分な濃度で存在する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４４】
標的富化プライマーの各々が同じ濃度で使用される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４５】
標的富化プライマーの少なくとも１つが他の標的富化プライマーより高い濃度で使用する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４６】
標的増幅プライマーの各々が同じ濃度で使用される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４７】
標的増幅プライマーの少なくとも１つが、他の標的増幅プライマーより高い濃度で使用される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４８】
より高濃度の前記標的増幅プライマーが検出のための手段を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記第一増幅反応についての条件が標的富化工程の少なくとも２回の完全なサイクルを含み、及び前記第二増幅反応についての条件が標的増幅工程の少なくとも２回の完全なサイクルを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項５０】
標的富化工程が増幅に関する以下の条件：９２−９４℃における０．５−１分間、５０−５５℃における１−２．５分間及び７０−７２℃における０．５−１分間を含み、及び標的増幅工程が増幅に関する以下の条件：９４℃における１５−３０秒間、５０−５５℃における１５−３０秒間及び７２℃における１５−３０秒間を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記第一増幅反応についての条件が標的富化工程の少なくとも２回の完全なサイクル及び選択的増幅工程の少なくとも２回の完全なサイクルを含み、及び前記第二増幅反応についての条件が標的増幅工程の少なくとも２回の完全なサイクルを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項５２】
標的富化工程が増幅に関する以下の条件：９２−９４℃における０．５−１分間、５０−５５℃における１−２．５分間及び７０−７２℃における０．５−１分間を含み、選択的増幅工程が増幅に関する以下の条件：９２−９４℃における１５−３０秒間、７０−７２℃における１−２分間を含み、及び標的増幅工程が増幅に関する以下の条件：９４℃における１５−３０秒間、５０−５５℃における１５−３０秒間及び７２℃における１５−３０秒間を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記選択的増幅が、前記標的富化プライマーの少なくとも１つに対する結合部位を含む第一増幅産物の生産の方に偏る、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
標的富化プライマーの第一対の各々の長さが１０−２０ヌクレオチドであり、及び標的富化プライマーの第二対の各々の長さが３０−４０ヌクレオチドである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
２又はそれ以上の標的増幅プライマー対をさらに含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項５６】
前記病原因子が、ウイルス及び細菌から成る群より選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項５７】
前記病原因子が、アデノウイルス、インフルエンザＡ型、インフルエンザＢ型、パラインフルエンザ１型、パラインフルエンザ３型及び呼吸器合胞体ウイルス、ＳＡＲＳ、及び（コクサッキーウイルスＡ型、コクサッキーウイルスＢ型、ライノウイルス及びエコーウイルスを含む）エンテロウイルスから成る群より選択されるウイルスである、請求項３７に記載の方法。
【請求項５８】
前記病原因子が、マイコプラスマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）種及びクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）種から成る群より選択される細菌である、請求項３７に記載の方法。
【請求項５９】
前記病原因子が、標的富化プライマーの第一対及び第二対の適切な設計によって選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項６０】
前記標的増幅プライマーの少なくとも１つが、検出のための手段をさらに含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項６１】
前記検出のための手段が、化学的エレメント、酵素エレメント、蛍光エレメント又は放射標識エレメントから成る群より選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記標的配列を検出することをさらに含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項６３】
検出方法が直接検出方法である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記検出方法が、
ａ．検出される各標的配列に対する検出オリゴヌクレオチドを提供すること（各検出オリゴヌクレオチドはシグナル生成のための第一手段を含む。）；
ｂ．前記検出オリゴヌクレオチドを、前記第二増幅産物と接触させ、インキュベートすること；
ｃ．シグナル生成のための前記第一手段を刺激して、第一シグナルを生産すること；及び
ｄ．前記第一シグナルを検出すること
を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
前記第一シグナルが検出される各標的配列に特有であり、及び前記第一シグナルが前記病原因子を特定するために使用される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
第一シグナル生成のための前記手段が、蛍光標識、化学標識、酵素標識又は放射標識である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
第一シグナル生成のための前記手段が蛍光ミクロスフェアである、請求項６４に記載の方法。
【請求項６８】
前記方法が間接検出方法である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６９】
ａ．診断を必要とする被験者から、疾患因子を含むことが疑われる試料を提供すること；
ｂ．前記試料から、前記疾患因子からの標的配列を含む核酸を単離すること；
ｃ．前記核酸を、請求項１又は３７のいずれかに記載のプライマーに基づく増幅方法に供すること；
ｄ．前記疾患因子からの前記標的配列を検出すること
を含む、被験者において疾患因子の存在を診断する方法。
【請求項７０】
疾患因子が、ウイルス及び細菌から成る群より選択される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記疾患因子が、アデノウイルス、インフルエンザＡ型、インフルエンザＢ型、パラインフルエンザ１型、パラインフルエンザ３型及び呼吸器合胞体ウイルス、ＳＡＲＳ、及び（コクサッキーウイルスＡ型、コクサッキーウイルスＢ型、ライノウイルス及びエコーウイルスを含む）エンテロウイルスから成る群より選択されるウイルスである、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
前記疾患因子が、マイコプラスマ菌種及びクラミジア菌種から成る群より選択される細菌である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７３】
検出方法が直接検出方法である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７４】
前記検出方法が、
ａ．検出される各標的配列に対する検出オリゴヌクレオチドを提供すること（各検出オリゴヌクレオチドはシグナル生成のための第一手段を含む。）；
ｂ．前記検出オリゴヌクレオチドを、前記第二増幅産物と接触させ、インキュベートすること；
ｃ．シグナル生成のための前記第一手段を刺激して、第一シグナルを生産すること；及び
ｄ．前記第一シグナルを検出すること
を含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７５】
前記第一シグナルが前記疾患因子に特有であり、及び前記第一シグナルが前記疾患因子を特定するために使用される、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
第一シグナル生成のための前記手段が、蛍光標識、化学標識、酵素標識又は放射標識である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７７】
第一シグナル生成のための前記手段が蛍光ミクロスフェアである、請求項７４に記載の方法。
【請求項７８】
前記方法が間接検出方法である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７９】
ａ．診断を必要とする被験者から、疾患因子又は二次疾患因子を含むことが疑われる試料を提供すること；
ｂ．前記試料から、前記疾患因子又は二次疾患因子又はこの両方からの標的配列を含む核酸を単離すること；
ｃ．前記核酸を、請求項１又は３８のいずれかに記載のプライマーに基づく増幅方法に供すること；
ｄ．前記疾患因子又は二次疾患因子又はこの両方からの前記標的配列を検出すること
を含む、被験者において疾患因子及び二次疾患因子の存在を鑑別的に診断するための方法。
【請求項８０】
疾患因子又は二次疾患因子が、ウイルス及び細菌から成る群より選択される、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記疾患因子又は二次疾患因子が、アデノウイルス、インフルエンザＡ型、インフルエンザＢ型、パラインフルエンザ１型、パラインフルエンザ３型及び呼吸器合胞体ウイルス、ＳＡＲＳ、及び（コクサッキーウイルスＡ型、コクサッキーウイルスＢ型、ライノウイルス及びエコーウイルスを含む）エンテロウイルスから成る群より選択されるウイルスである、請求項７９に記載の方法。
【請求項８２】
前記疾患因子又は二次疾患因子が、マイコプラスマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）種及びクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）種から成る群より選択される細菌である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８３】
検出方法が直接検出方法である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８４】
前記検出方法が、
ａ．検出される各標的配列に対する検出オリゴヌクレオチドを提供すること（各検出オリゴヌクレオチドはシグナル生成のための第一手段を含む。）；
ｂ．前記検出オリゴヌクレオチドを、前記第二増幅産物と接触させ、インキュベートすること；
ｃ．シグナル生成のための前記第一手段を刺激して、第一シグナルを生産すること；及び
ｄ．前記第一シグナルを検出すること
を含む、請求項７９に記載の方法。
【請求項８５】
前記第一シグナルが前記疾患因子及び二次疾患因子に特有であり、及び前記第一シグナルが前記疾患因子を特定するために使用される、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
第一シグナル生成のための前記手段が、蛍光標識、化学標識、酵素標識又は放射標識である、請求項８４に記載の方法。
【請求項８７】
第一シグナル生成のための前記手段が蛍光ミクロスフェアである、請求項８４に記載の方法。
【請求項８８】
前記方法が間接検出方法である、請求項７９に記載の方法。