【手続補正書】
【提出日】平成21年9月8日(2009.9.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＭ−ＣＳＦ受容体と特異的に結合して細胞の生存を高めるキメラペプチドであって、ＧＭ−ＣＳＦ受容体リガンド及びＢｃｌ−ｘＬポリペプチドを含んでなる、単離されたキメラペプチド。
【請求項２】
前記ＧＭ−ＣＳＦ受容体リガンドが、少なくとも１つのＧＭ−ＣＳＦの断片又はＧＭ−ＣＳＦ受容体抗体の断片である、請求項１に記載のキメラポリペプチド。
【請求項３】
１：１、１：２、又は１：３の比でＧＭ−ＣＳＦ及びＢｃｌ−ＸＬを包含する、請求項１又は２に記載のキメラポリペプチド。
【請求項４】
ＧＭ−ＣＳＦ受容体と特異的に結合して細胞の生存を高めるキメラペプチドであって、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチド及びＢｃｌ−ｘＬポリペプチドを含んでなる、単離されたキメラペプチド。
【請求項５】
細胞死を抑制する、請求項１から４のいずれかに記載の単離されたキメラポリペプチド。
【請求項６】
細胞死が、低酸素、虚血、再灌流、脳卒中、パーキンソン病、ルー・ゲーリック病、ハンチントン舞踏病、脊髄性筋萎縮症、脊髄損傷、幹細胞移植の処置、化学療法の治療又は放射線治療に関連するものである請求項５に記載のキメラペプチド。
【請求項７】
キメラポリペプチドが、造血細胞、樹枝状細胞、神経細胞及び幹細胞よりなる群から選ばれる細胞の生存を高めるものである、請求項１から６のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
【請求項８】
キメラペプチドが、Ｂｃｌ−ｘＬの全長を包含する、請求項１から７のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
【請求項９】
キメラペプチドが、細胞死を抑制できるＢｃｌ−ｘＬの断片の少なくとも１つを包含する、請求項１から７のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
【請求項１０】
ｉ．ＧＶＶＬＬＧＳＬＦＳＲＫ（配列番号８）、
ｉｉ．ＦＥＬＲＹＲＲＡＦＳ（配列番号７）、及び
ｉｉｉ．ＳＡＩＮＧＮＰＳＷＨＬＡＤＳＰＡＶＮＧＡＴＧ（配列番号６）、
よりなる群から選ばれるＢｃｌ−ｘＬの断片を含有してなる請求項９に記載のキメラポリペプチド。
【請求項１１】
ＧＭ−ＣＳＦ受容体に結合するＧＭ−ＣＳＦポリペプチドの断片の少なくとも１つを含有してなる請求項１から１０のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
【請求項１２】
ｉ．ＡＰＡＲＳＰＳＰＳＴＱＰＷＥＨＶＮＡＩＱＥＡＲＲＬＬＮＬＳＲＤＴＡＡＥＭＮＥＴＶＥＶＩＳＥＭＦＤＬＱＥＰ
ＴＣＬＱＴＲＬＥＬＹＫＱＧＬＲＧＳＬＴＫＬＫＧＰＬＴＭＭＡＳＨＹＫＱＨＣＰＰＴＰＥＴＳＣＡＴＱＴＩＴＦＥＳ
ＦＫＥＮＬＫＤＦＬＬＶＩＰＦＤＣＷＥＰＶＱＥ（配列番号１９）、
ｉｉ．ＥＡＲＲＬＬＮＬＳＲＤ（配列番号２０）、及び
ｉｉｉ．ＴＭＭＡＳＨＹＫＱＨＣＰＰＴＰＥＴ（配列番号４）、
よりなる群から選ばれる断片を含有してなる請求項１から１１のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
【請求項１３】
キメラペプチドが、血液脳関門を通過するポリペプチドの移送を増強するドメインを更に含有してなる請求項１〜１２のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項１４】
前記ドメインが、ＴＡＴドメインである、請求項１３に記載のキメラポリペプチド。
【請求項１５】
ＧＭ−ＣＳＦ−ＢＣＬ−ＸＬアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有している、請求項１〜１４の何れか一項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項１６】
プロテアーゼ抵抗を増強するアミノ酸配列において、変更、翻訳後の修飾又はその他の修飾を包含する、請求項１〜１５の何れか一項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項１７】
二量体の形成を促進するアミノ酸配列において、変更、翻訳後の修飾又はその他の修飾を包含する、請求項１〜１６の何れか一項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項１８】
変更が、野生型参照配列に関するＧＭ−ＣＳＦ又はＢｃｌ−ｘＬのポリペプチドのアミノ酸配列において、挿入、欠失、ミスセンス又はアンチセンス変異である、請求項１６又は１７に記載のキメラポリペプチド。
【請求項１９】
融合タンパク質である、請求項１〜１８の何れか一項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項２０】
親和性標識を含有してなる請求項１９に記載のキメラポリペプチド。
【請求項２１】
検出可能なアミノ酸配列を含有してなる請求項１９に記載のキメラポリペプチド。
【請求項２２】
請求項１〜２１の何れか一項に記載のキメラポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
【請求項２３】
核酸分子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に記載の核酸配列を有している核酸分子である請求項２２に記載の単離された核酸分子。
【請求項２４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に対して少なくとも８０％の核酸配列同一性を有している、請求項２３に記載の単離された核酸分子。
【請求項２５】
キメラポリペプチドをコードする核酸分子が、異種プロモーターの制御下にある、請求項２２〜２４の何れか一項に記載の核酸分子。
【請求項２６】
請求項２２〜２５の何れか一項に記載の核酸分子を含んでなる、ベクター。
【請求項２７】
前記ベクターが、発現ベクターである、請求項２６に記載のベクター。
【請求項２８】
請求項２６又は２７に記載のベクターを包含する、宿主細胞。
【請求項２９】
請求項１〜２１の何れか一項に記載のキメラポリペプチド又はその断片の有効量、及び薬学的に許容される賦形剤を含有してなる医薬組成物。
【請求項３０】
請求項１〜２１の何れか一項に記載のキメラポリペプチドをコードする核酸分子の有効量、及び薬学的に許容される賦形剤を含有してなる医薬組成物。
【請求項３１】
化学療法剤、放射線療法剤、ホルモン剤、生物学的製剤、抗炎症剤、ドーパミン産生の増強薬剤、抗コリン作用薬、ドーパミン様薬、アマンタジン、抗血栓薬及び血栓溶解剤よりなる群から選ばれる薬剤を更に含んでなる、請求項２９又は３０に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
医薬組成物が、細胞死又はアポトーシスのリスクがある細胞の細胞死を抑制及び／又は生存を高めるものである請求項２９〜３１のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項３３】
細胞死又はアポトーシスのリスクが、低酸素、虚血、再灌流、脳卒中、パーキンソン病、ルー・ゲーリック病、ハンチントン舞踏病、脊髄性筋萎縮症、脊髄損傷、幹細胞移植の処置、化学療法の治療又は放射線治療に関連するものである請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
核酸分子が請求項２６又は２７に記載のベクターに挿入されている請求項３０〜３３の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
患者からの生体サンプルの治療前の１つ又はそれ以上の表現型を測定すること、
請求項１〜２１の何れか一項に記載のキメラポリペプチド又はそのポリペプチドをコードする核酸の治療有効量を患者に投与した後の患者からの生体サンプルを採取すること、そして
細胞死の抑制剤による初期治療後の１つ又はそれ以上の表現型を測定すること（ここにおける１つ又はそれ以上の表現型の変化が、細胞死の抑制剤治療の効果を示す）、
を含んでなる、対象における細胞の生存を高める治療の効果を評価する方法。
【請求項３６】
患者からの生体サンプルの治療前の１つ又はそれ以上の表現型を測定すること、
請求項１〜２１の何れか一項に記載のキメラポリペプチド又はそのポリペプチドをコードする核酸の治療有効量を患者に投与した後の患者からの生体サンプルを採取すること、そして
細胞死の抑制剤による初期治療後の１つ又はそれ以上の表現型を測定すること（ここにおける１つ又はそれ以上の表現型の変化が、疾患が細胞死の抑制剤による治療に対する好ましい臨床応答を有しているであろうことの表れである）、
を含んでなる、細胞死の抑制剤による治療を行うために、細胞死によって特徴付けられる疾患又は障害を有している対象を選択する方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
前記態様の何れかの一態様では、キメラポリペプチドは、アポトーシスを抑制する。前記態様の何れかの更なる別の態様では、このポリペプチドは、造血細胞、樹枝状細胞、神経細胞及び幹細胞よりなる群から選ばれる細胞の生存を高める。別の態様では、細胞は、インビトロ又はインビボに存在する。前記態様のその他の態様では、このポリペプチドは、全長のＢｃｌ−ｘＬ、又はアミノ酸配列ＧＶＶＬＬＧＳＬＦＳＲＫ（配列番号８）、ＦＥＬＲＹＲＲＡＦＳ（配列番号７）又はＳＡＩＮＧＮＰＳＷＨＬＡＤＳＰＡＶＮＧＡＴＧ（配列番号６）を含有するか又はこれより構成されている断片のような、細胞におけるアポトーシスを抑制することが可能なＢｃｌ−ｘＬの断片の少なくとも１つを含有する。更なる別の態様では、このポリペプチドは、アミノ酸は配列ＡＰＡＲＳＰＳＰＳＴＱＰＷＥＨＶＮＡＩＱＥＡＲＲＬＬＮＬＳＲＤＴＡＡＥＭＮＥＴＶＥＶＩＳＥＭＦＤＬＱＥＰＴＣＬＱＴＲＬＥＬＹＫＱＧＬＲＧＳＬＴＫＬＫＧＰＬＴＭＭＡＳＨＹＫＱＨＣＰＰＴＰＥＴＳＣＡＴＱＴＩＴＦＥＳＦＫＥＮＬＫＤＦＬＬＶＩＰＦＤＣＷＥＰＶＱＥ（配列番号１９）、ＥＡＲＲＬＬＮＬＳＲＤ（配列番号２０）又はＴＭＭＡＳＨＹＫＱＨＣＰＰＴＰＥＴ（配列番号４）を含有するか又はこれより構成されている断片のような、ＧＭ−ＣＳＦ受容体に結合するＧＭ−ＣＳＦポリペプチドの断片の少なくとも１つを含有し、ここにおける断片は、ＧＭ−ＣＳＦ受容体に結合するか又はＧＭ−ＣＳＦ生物活性を有している。前記態様の何れかの更なる他の態様では、このポリペプチドは、血液脳関門を通過するポリペプチドの移送を増強するドメイン（例えば、ＴＡＴドメイン）を更に含有する。更なる別の態様では、このポリペプチドは、ＧＭ−ＣＳＦ−ＢＣＬ−ＸＬアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）に対して少なくとも８０％、９０％又は９５％のアミノ酸配列同一性を有している。前記態様の更なる他の態様では、このポリペプチドは、プロテアーゼ抵抗を増強する又は二量体の形成を促進する、変更（例えば、参照配列に関するＧＭ−ＣＳＦ又はＢｃｌ−ｘＬのポリペプチドのアミノ酸配列における、挿入、欠失、ミスセンス又はアンチセンス変異）を含有する。更なる別の態様では、このポリペプチドは、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチド及びＢｃｌ−ｘＬポリペプチドを含有する。更なる別の態様では、このポリペプチドは融合タンパク質である。前記態様の更なる他の態様では、このポリペプチドは、親和性標識又は検出可能なアミノ酸配列を含有する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９８】
Ｈｉｓ−結合クロマトグラフィー
ポリヒスチジン（６×Ｈｉｓ（配列番号２１））配列を含有する組み換えタンパク質の精製に用いられるニッケル添加の親和性樹脂である、ＰＲＯＢＯＮＤ  Ｒｅｓｉｎ（Invitrogen）の２．５ｍｌを、０．５×５ｃｍのカラムに重力流で詰めた。樹脂を、５倍容量の発熱性物質及びヌクレアーゼを含まない超高純度の水、及び６Ｍ塩酸グアニジンを含有する５倍容量の結合緩衝液で洗浄した。カラムに調製した抽出液を詰めて、６Ｍグアニジンを含有する５倍容量の結合緩衝液及び６Ｍ塩酸グアニジンを含有する１０倍容量の洗浄緩衝液（６０ｍＭのイミダゾール、２０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．９）、０，５ＭのＮａＣｌ）で洗浄した。結合タンパク質を６Ｍ塩酸グアニジンを含有する４倍容量の溶出緩衝液（１Ｍのイミダゾール、２０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．９）、０，５ＭのＮａＣｌ）で溶出した。クロマトグラフィー時の流速は、０．５ｍｌ／ｍｉｎであった。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１２】
【図１】図１Ａ〜１Ｃは、ＧＭ−ＣＳＦ−Ｂｃｌ−ＸＬキメラタンパク質の構築物、発現及び活性を説明する。  図１Ａは、ＧＭ−ＣＳＦ−Ｂｃｌ−ＸＬキメラタンパク質をコードする発現ベクターの構築物を説明する略図である。Ｎｄｅ Ｉ及びＢａｍ ＨＩで分解されるヒトＧＭ−ＣＳＦをコードするｃＤＮＡを、ＢＧＩ ＩＩ及びＥｃｏ ＲＩで分解されるヒト全長Ｂｃｌ−ＸＬをコードするｃＤＮＡと融合した。２つのｃＤＮＡの連結に、グリシン、セリン及びスレオニンを２つのタンパク質間のリンカーとして導入した。融合遺伝子を、ＧＭ−ＣＳＦ−Ｂｃｌ−ＸＬｃＤＮＡのＮ−末端にＨｉｓ標識配列をコードする配列を含む大腸菌のベクターｐＥＴ２８（＋）に挿入した。  図１Ｂは、クーマシーブリリアントブルー染色によって可視化したＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜２０％）上で精製したタンパク質を示す。抗Ｈｉｓ−Ｔａｇモノクローナル抗体を用いるウェスタンブロット分析を実施した。
【図２】図２Ａ〜２Ｃは、ヒト血液単核細胞に対するＧＭ−ＣＳＦ−Ｂｃｌ−ＸＬの効果を示す。  単球アフェレーシスから接着によって精製したマクロファージ／単球を、５μｇ／ｍｌのヒトＧＭ−ＣＳＦ、異なる濃度のＧＭ−ＣＳＦ−Ｂｃｌ−ＸＬ、及びＬｆｎ−Ｂｃｌ−ＸＬ△Ｃ（３０μｇ／ｍｌ）、炭疽菌致死因子の保護抗原結合ドメインを含むキメラタンパク質、ヒトＢｃｌ−ＸＬ、及び炭疽菌保護抗原（２８μｇ／ｍｌ）で処理して、これをスタウロスポリン（０．１μＭ）及びＪａｋ２キナーゼ抑制因子であるＴｒｙＡｇ−４９０（０．５μＭ）の存在下又は非存在下で７２時間培養した。細胞の生存能を代謝活性細胞中のＡＴＰ存在量を定量して測定した。３回測定して平均値を計算した。ＰＢＳで処理した対照細胞に対するパーセントとして、値を示した。  図２Ｂは、細胞毒性薬である、シタラビン、ダウノルビシン又はスタウロスポリンの存在下で培養した単球／マクロファージの測定したカスパーゼ３／７活性を示すグラフである。細胞は、異なる濃度のＧＭ−ＣＳＦ−Ｂｃｌ−ＸＬの存在下でも４８時間培養した。カスパーゼに対する蛍光発生基質である、１Ｘローダミン１１０、ビス（Ｎ−ＣＢＺ−Ｌアスパルチル−Ｌ−グルタミル−Ｌ−バリル−Ｌ−アスパラギン酸アミド（Ｚ−ＤＥＶＤ−Ｒ１１０）（Songzhu et al., J. Biol Chem 275, 288(2000)）をそれぞれのウェルに加えて、プレートを室温で１時間培養した。各ウェルの蛍光発光を、Ｗａｌｌａｃｋ  Ｖｉｃｔｏｒ２ １４２０  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒを用いて、励起波長４８５ｎｍ及び放出波長５３５ｎｍで測定した。
【図３Ａ】図３Ａ及び３Ｂは、大腸菌で発現するＧＭ−ＣＳＦ−Ｂｃｌ−ＸＬの異なる組み換え変異体の効果を示すグラフである。  図３Ａは、以下の試薬の存在下で、０．１μＭのスタウロスポリン（ＳＴＳ）と培養したＨＬ−６０細胞におけるタンパク質合成（対照に対するパーセントで計算した）を示す：ＳＴＳ＋ヒトＧＭ−ＣＳＦ（５μｇ／ｍｌ）；ＳＴＳ＋大腸菌ＧＭ−ＣＳＦ−Ｂｃｌ−ＸＬ；ＳＴＳ＋Ｃ−末端に欠失がある（△Ｃ）大腸菌ＧＭ−ＣＳＦ−Ｂｃｌ−ＸＬ；ＳＴＳ＋ＧＭ−ＣＳＦ−Ｂｃｌ−ＸＬ（△Ｌ）（１００μｇ／ｍｌ）；及びＳＴＳ＋Ｂｃｌ−ＸＬ△Ｌ−ＧＭ−ＣＳＦ。次いで、細胞を、１４Ｃ−ロイシンと１時間パルス振動させ、そして採取した。ロイシンの取り込みを測定して、ＰＢＳで処理した細胞と比べたパーセントで示した。誤差バーは、平均値の標準誤差を示す。
【図３Ｂ】図３Ａ及び３Ｂは、大腸菌で発現するＧＭ−ＣＳＦ−Ｂｃｌ−ＸＬの異なる組み換え変異体の効果を示すグラフである。  図３Ｂは、０．１μＭのスタウロスポリンで処理したＨＬ−６０細胞における細胞の増殖をロイシンの取り込みとして測定したグラフであり、細胞は以下の試薬と培養する；ＰＢＳ；スタウロスポリン（０．１μＭ）；ヒトＧＭ−ＣＳＦ（５μｇ／ｍｌ）；ヒトＧＭ−ＣＳＦ−Ｂｃｌ−ＸＬ（−Ｈｉｓ  ｔａｇ）（１００μｇ／ｍｌ）；ヒトＧＭ−ＣＳＦ−Ｂｃｌ−ＸＬ（−Ｈｉｓ  ｔａｇ）（１０μｇ／ｍｌ）；ヒトＧＭ−ＣＳＦ−Ｂｃｌ−ＸＬ（＋Ｈｉｓ  ｔａｇ）（１００μｇ／ｍｌ）；ヒトＧＭ−ＣＳＦ−Ｂｃｌ−ＸＬ（＋Ｈｉｓ  ｔａｇ）（１０μｇ／ｍｌ）；Ｌｆｎ−Ｂｃｌ−ＸＬ△Ｃ。３回の測定値からの平均値を、ロイシンの取り込みに対してプロットしてある。誤差バーは、平均値の標準誤差を示す。
【図４】図４Ａ及び４Ｂは、ＧＭ−ＣＳＦ−Ｂｃｌ−ＸＬの存在下又は非存在下で行った造血細胞コロニーアッセイの結果を示すグラフである。  図４Ａは、添加培地でＣＤ３４陽性細胞を用いた造血細胞コロニーアッセイの結果を示す。  図４Ｂは、必須培地に置いた細胞に対するアッセイ結果を示す。どちらの場合も、細胞をシタラビンの存在下（右のパネル）に異なる濃度のＧＭ−ＣＳＦ−Ｂｃｌ−ＸＬと培養した。ＣＦＵ−ＧＭ及びＢＦＵ−Ｅコロニーの数を、カウントした。これらの結果は、異なる３つの実験のコロニー数の平均を示す。ＣＤ３４陽性細胞単独又はＰＢＳと一緒での培養は、対照生育値を設定するために用いた。
【図５】Ｌｆｎ−Ｂｃｌ−ＸＬの存在下又は非存在下で行った造血細胞コロニーアッセイを示す。ＣＤ３４陽性細胞を添加培地に置いて、シタラビンの存在下（右のパネル）で異なる濃度のＬｆｎ−Ｂｃｌ−ＸＬと培養した。ＣＦＵ−ＧＭ及びＢＦＵ−Ｅコロニーは、添加培地中のみで見出され、これらをカウントした。結果は、異なる３つの実験のコロニー数の平均を示す。ＣＤ３４細胞単独又はＰＢＳと一緒での培養は、正常な生育値を設定するために用いた。
【図６】図６Ａ及び６Ｂは、ヒト血液単核細胞に対するＧＭ−ＣＳＦ−Ｂｃｌ−ＸＬの効果を示すグラフである。  図６Ａでは、単球アフェレーシスからの接着によって精製したマクロファージ／単球を、スタウロスポリン（０．１μＭ）の存在下（黒及び灰色の棒）又は非存在（白色の棒）に、以下の試薬；ヒトＧＭ−ＣＳＦ（５μｇ／ｍｌ）；ＧＭ−ＣＳＦ−Ｂｃｌ−ＸＬ（０．１ｍｇ／ｍｌ）；ＧＭ−ＣＳＦ−Ｂｃｌ−ＸＬ（０．０１ｍｇ／ｍｌ）；又はＧＭ−ＣＳＦ−Ｂｃｌ−ＸＬ（０．００１ｍｇ／ｍｌ）；及び炭疽菌致死因子（ＬＦ）の保護抗原結合ドメインを含有するキメラタンパク質及びヒトＢｃｌ−ＸＬ（３０μｇ／ｍｌ）プラス炭疽菌保護抗原（２８μｇ／ｍｌ）で処理した。  図６Ｂでは、精製したマクロファージ／単球を、Ｊａｋ２キナーゼ抑制因子であるＴｒｙＡｇ−４９０（０．５μＭ）の非存在下（白棒）又は存在下（縞の棒）で７２時間処理した。細胞を、１４Ｃ−ロイシンと１時間パルス振動させ、そして回収した。ロイシンの取り込みを測定して、ＰＢＳで処理した対照細胞に対するパーセントで示した。３回の測定から平均値を決定して、融合タンパク質の濃度に対してプロットした。
【図７】図７Ａ、７Ｂ及び７Ｃは、０．１μＭのスタウロスポリンの存在下又は非存在下での、５μｇ／ｍｌのヒトＧＭ−ＣＳＦ、各種濃度のＧＭ−ＣＳＦ−Ｂｃｌ−ＸＬで、２４、４８又は７２時間処理したＨＬ−６０細胞における、細胞増殖（対照に対するパーセントで表現）を示すグラフである。それぞれのウェルにＭＴＳを加えて、プレートを３７℃で１時間培養した。ＥＩＡ  Ｍｕｌｔｉｗｅｌｌ  Ｒｅａｄｅｒ（Sigma Diagnostics) を用いて４９０ｎｍにおける吸収を測定した、ＰＢＳ処理細胞と比較したパーセントとして示した。３回の測定から平均値を決定して、融合タンパク質の濃度に対してプロットした。誤差バーは、平均値の標準誤差を示す。
【図８】図８は、ｐＰＩＣＺ−Ａベクターの概略図を示し、そしてピキア・パストリスでのＧＭ−ＣＳＦ−Ｂｃｌ−ＸＬ融合タンパク質発現及びウェスタンブロット（左）及びＳＤＳ ＰＡＧＥゲル（右）の写真を描写する。培養２４、４８、及び７２時間後のタンパク質発現レベルを、抗Ｈｉｓ−Ｔａｇ（配列番号２１）抗体を用いるウェスタンブロットで測定した。右側のＳＤＳ ＰＡＧＥゲルは、クーマシーブリリアントブルーで可視化した適当な大きさのＧＭ−ＣＳＦ−Ｂｃｌ−ＸＬ精製タンパク質を示す。
【図９】図９は、以下の試薬；ＰＢＳ（陰性対照）；スタウロスポリン（ＳＴＳ）；アポトーシス促進性の試薬；ヒトＧＭ−ＣＳＦ（５μｇ／ｍｌ）；ＳＴＳ及びヒトＧＭ−ＣＳＦ；大腸菌からのＧＭ−ＣＳＦ−Ｂｃｌ−ＸＬ（１００μｇ／ｍｌ）；ＳＴＳ及び大腸菌からのＧＭ−ＣＳＦ−Ｂｃｌ−ＸＬ；ピキアからのＧＭ−ＣＳＦ−Ｂｃｌ−ＸＬ（１００μｇ／ｍｌ）；ピキアからのＧＭ−ＣＳＦ−Ｂｃｌ−ＸＬ及びＳＴＳ：で４８時間培養したＨＬ−６０細胞のカスパーゼ３／７活性のパーセントを示すグラフである。アポトーシス細胞におけるカスパーゼ３／７活性を測定するために用いられる試薬（１Ｘ Ｚ−ＤＥＶＤ−Ｒ１１０）を、それぞれのウェルに加えた。次いでプレートを室温で１時間培養した。カスパーゼ活性を、各ウェルの蛍光発生をＷａｌｌａｃｋ  Ｖｉｃｔｏｒ２  １４２０  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒを用い、励起波長４８５ｎｍ及び及び放出波長５３５ｍｍで測定して検出した。
【図１０】図１０Ａ及び１０Ｂは、ＧＭ−ＣＳＦ−Ｂｃｌ−ＸＬキメラタンパク質及びその断片のアミノ酸配列を描く。  図１０Ａは、ＧＭ−ＣＳＦ−Ｂｃｌ−ＸＬキメラタンパク質の配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を提供する。タンパク質の全長Ｂｃｌ−ＸＬは、太字で示す。タンパク質の活性な断片は、下線で示す（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜８）。図１０Ｂは、ＧＭ−ＣＳＦの別の活性な断片を提供する（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）。
【図１１】図１１Ａ及び１１Ｂは、核酸配列を提供する。  図１１Ａは、ＧＭ−ＣＳＦ−Ｂｃｌ−ＸＬポリペプチドをコードする核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）である。Ｂｃｌ−ＸＬの配列は、太字であり、ＧＭ−ＣＳＦ又はＢｃｌＸＬの活性な断片をコードする配列は、下線を引いてある（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１〜１５）。ＧＭ−ＣＳＦ−Ｂｃｌ−ＸＬの拡張された活性な断片をコードする核酸配列には、灰色の陰を付けて示す。図１１Ｂは、全長Ｂｃｌ−ＸＬ核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）である。
【図１２Ａ−１】図１２Ａは、ｐｅｔ２８（＋）のベクター配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）を提供し、図１２Ａ−１は、ｐｅｔ２８（＋）のベクター配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）の前半部を示す。
【図１２Ａ−２】図１２Ａは、ｐｅｔ２８（＋）のベクター配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）を提供し、図１２Ａ−２は、ｐｅｔ２８（＋）のベクター配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）の後半部を示す。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、ｐＰＩＣＺＡのベクター配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）を提供する。