(57)【要約】  ＶＥＧＦ−ＡおよびＦＧＦの両方の生物学的活性を減少させる抗体／可溶性受容体二重特異的結合性タンパク質を含む二重特異的結合性タンパク質が開示される。ＦＧＦ結合部分は、一般に、可溶性ＦＧＦＲ３およびＦＧＦＲ２である。Ｆｃポリペプチドは、ペプチドまたはポリペプチドリンカー配列を用いて融合されるポリペプチドであるＦＧＦ結合部分およびＶＥＧＦ−Ａ結合部分のＣ末端に融合され、単一の二重特異的結合性タンパク質として発現されることができる。二重特異的抗体／可溶性受容体結合性タンパク質は、充実性腫瘍増殖によって特徴付けられる癌ならびに他の疾患の治療に用いることができる。
2012521768.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＶＥＧＦ−ＡおよびＦＧＦの両方の生物学的活性を減少させる、抗体部分および可溶性受容体部分を含む二重特異的結合性タンパク質。
【請求項２】
ＶＥＧＦ−ＡおよびＦＧＦの両方の生物学的活性を減少させる、ＶＥＧＦ−Ａ抗体部分およびＦＧＦ受容体のＦＧＦ結合部分を含む二重特異的結合性タンパク質。
【請求項３】
二重特異的結合性タンパク質の可溶性ＦＧＦ受容体部分がＦＧＦＲ３またはＦＧＦＲ２のＦＧＦ受容体部分を含む、請求項２記載の二重特異的結合性タンパク質。
【請求項４】
配列番号１３、配列番号２、配列番号１９、配列番号１０、配列番号１５および配列番号２２からなる群から選択されるＦＧＦＲ３であるＦＧＦ受容体部分、
配列番号４４、配列番号４６、配列番号５２および配列番号７０からなる群から選択されるＶＥＧＦ−Ａ抗体部分
を含むＶＥＧＦ−Ａ抗体／可溶性ＦＧＦ受容体二重特異的結合性タンパク質を含む二重特異的結合性タンパク質。
【請求項５】
ＦＧＦおよびＶＥＧＦ−Ａの活性を減少させる、請求項４記載の二重特異的結合性タンパク質。
【請求項６】
二重特異的タンパク質をコードしているポリヌクレオチドであって、
配列番号１３、配列番号２、配列番号１９、配列番号１０、配列番号１５および配列番号２２からなる群から選択されるＦＧＦＲ３ポリペプチド、および
配列番号４４、配列番号４６、配列番号５２および配列番号７０からなる群から選択されるＶＥＧＦ−Ａ抗体ポリペプチド
をコードするポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項６記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項８】
請求項７記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項９】
二重特異的結合性タンパク質が発現される条件下で、請求項８記載の宿主細胞を培養し、
該宿主細胞から該タンパク質を単離する
ことを含む、二重特異的結合性タンパク質を産生する方法。
【請求項１０】
請求項４記載の二重特異的結合性タンパク質および医薬上許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１１】
配列番号１３、配列番号２、配列番号１９、配列番号１０、配列番号１５および配列番号２２からなる群から選択されるＦＧＦＲ３であるＦＧＦ受容体部分、および
配列番号４８および配列番号５０、配列番号５４および配列番号５６、および配列番号６６および配列番号６８からなる群から選択されるＶＥＧＦ−Ａ抗体部分
を含むＶＥＧＦ−Ａ抗体／可溶性ＦＧＦ受容体二重特異的結合性タンパク質を含む二重特異的結合性タンパク質。
【請求項１２】
ＦＧＦおよびＶＥＧＦ−Ａの活性を減少させる、請求項１１記載の二重特異的結合性タンパク質。
【請求項１３】
配列番号１３、配列番号２、配列番号１９、配列番号１０、配列番号１５および配列番号２２からなる群から選択されるＦＧＦＲ３ポリペプチド、および
配列番号４８および配列番号５０、配列番号５４および配列番号５６、および配列番号６６および配列番号６８からなる群から選択されるＶＥＧＦ−Ａ抗体ポリペプチド
をコードする、二重特異的タンパク質をコードしているポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１３のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１４記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１６】
二重特異的結合性タンパク質が発現される条件下で、請求項１５記載の宿主細胞を培養し、
該宿主細胞から該タンパク質を単離する
ことを含む、二重特異的結合性タンパク質を産生する方法。
【請求項１７】
請求項１３記載の二重特異的結合性タンパク質および医薬上許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１８】
配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２および配列番号６４からなる群から選択されるＦＧＦＲ３部分およびＶＥＧＦ−Ａ抗体部分を含む二重特異的結合性タンパク質。
【請求項１９】
ＦＧＦおよびＶＥＧＦ−Ａの活性を減少させる、請求項１８記載の二重特異的結合性タンパク質。
【請求項２０】
配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２および配列番号６４からなる群から選択されるＦＧＦＲ３部分およびＶＥＧＦ−Ａ抗体部分をコードする、二重特異的タンパク質をコードしているポリヌクレオチド。
【請求項２１】
請求項２０のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項２２】
請求項２１記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２３】
二重特異的結合性タンパク質が発現される条件下で、請求項２２記載の宿主細胞を培養し、
該宿主細胞から該タンパク質を単離する
ことを含む、二重特異的結合性タンパク質を産生する方法。
【請求項２４】
請求項２０記載の二重特異的結合性タンパク質および医薬上許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項２５】
配列番号２４、配列番号２９、配列番号３３、配列番号３７、配列番号４０および配列番号４２からなる群から選択されるＦＧＦＲ２であるＦＧＦ受容体部分、および
配列番号４４、配列番号４６、配列番号５２および配列番号７０からなる群から選択されるＶＥＧＦ−Ａ抗体部分
を含むＶＥＧＦ−Ａ抗体／可溶性ＦＧＦ受容体二重特異的結合性タンパク質を含む二重特異的結合性タンパク質。
【請求項２６】
ＦＧＦおよびＶＥＧＦ−Ａの活性を減少させる、請求項２２記載の二重特異的結合性タンパク質。
【請求項２７】
配列番号２４、配列番号２９、配列番号３３、配列番号３７、配列番号４０および配列番号４２からなる群から選択されるＦＧＦＲ２ポリペプチド、および
配列番号４４、配列番号４６、配列番号５２および配列番号７０からなる群から選択されるＶＥＧＦ−Ａ抗体ポリペプチド
をコードする、二重特異的タンパク質をコードしているポリヌクレオチド。
【請求項２８】
請求項２７のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項２９】
請求項２８記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項３０】
二重特異的結合性タンパク質が発現される条件下で、請求項２９記載の宿主細胞を培養し、
該宿主細胞から該タンパク質を単離する
ことを含む、二重特異的結合性タンパク質を産生する方法。
【請求項３１】
請求項２５記載の二重特異的結合性タンパク質および医薬上許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項３２】
配列番号２４、配列番号２９、配列番号３３、配列番号３７、配列番号４０および配列番号４２からなる群から選択されるＦＧＦＲ２であるＦＧＦ受容体部分、および
配列番号４８および配列番号５０、配列番号５４および配列番号５６、および配列番号６６および配列番号６８からなる群から選択されるＶＥＧＦ−Ａ抗体部分
を含むＶＥＧＦ−Ａ抗体／可溶性ＦＧＦ受容体二重特異的結合性タンパク質を含む二重特異的結合性タンパク質。
【請求項３３】
ＦＧＦおよびＶＥＧＦ−Ａの活性を減少させる、請求項２９記載の二重特異的結合性タンパク質。
【請求項３４】
配列番号２４、配列番号２９、配列番号３３、配列番号３７、配列番号４０および配列番号４２からなる群から選択されるＦＧＦＲ２ポリペプチド、および
配列番号４８および配列番号５０、配列番号５４および配列番号５６、および配列番号６６および配列番号６８からなる群から選択されるＶＥＧＦ−Ａ抗体ポリペプチド
をコードする、二重特異的タンパク質をコードしているポリヌクレオチド。
【請求項３５】
請求項３４のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項３６】
請求項３５記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項３７】
二重特異的結合性タンパク質が発現される条件下で、請求項３６記載の宿主細胞を培養し、
該宿主細胞から該タンパク質を単離する
ことを含む、二重特異的結合性タンパク質を産生する方法。
【請求項３８】
請求項３４記載の二重特異的結合性タンパク質および医薬上許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項３９】
請求項１、２、４、１１、１８、２５または３２のいずれか１項記載の二重特異的結合性タンパク質の有効量を投与することを含む、対象において癌を治療する方法。
【請求項４０】
癌が充実性腫瘍である、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
癌が前立腺癌である、請求項３９記載の方法。
【請求項４２】
癌が肺癌、消化管癌、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、膵臓腺癌、膵腺房細胞癌腫、小腸の癌、肝臓の癌、乳癌、子宮頸癌、卵巣癌、腎臓癌、皮膚癌、グリア芽腫および骨癌からなる群から選択される、請求項３９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
脈管形成は、既存の血管からの新規な血管の形成である。それは、発達の間、必須の役割を果たす。成体において、脈管形成は、創傷治癒の間に起こって、損傷または傷害後の組織への血流を回復させる。脈管形成はまた、腫瘍形成、および関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症、乾癬、糖尿病性網膜症および黄斑変性を包含する他の疾患においても重要な役割を果たす（例えば、Fanら、Trends Pharmacol. Sci. 16:57, 1995; Folkman, Nature Med. 1:27, 1995参照）。
【０００２】
生理学的または病理学的状態下における新規な血管の成長は、脈管形成の活性化剤および阻害剤の共同作用を必要とする。脈管形成の活性化剤は、血管内皮成長因子−Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、胎盤成長因子（ＰＩＧＦ）、および肝細胞成長因子（ＨＧＦ）およびいくつかのサイトカイン、例えば、インターロイキン−８（ＩＬ−８）を包含する。脈管形成の内因性阻害剤は、トロンボスポンディン、エンドスタチン、アンジオスタチンおよびインターロイキン−１２を包含する。脈管形成の活性化剤と阻害剤との間のバランスは、生理学的および病理学的脈管形成の間、活性化剤の方に傾く。
【０００３】
ＶＥＧＦ−Ａは、生理学的脈管形成および病理学的脈管形成の両方の治療の重要な調節剤である。それは、内皮細胞の増殖、移動および生存を調節することによって、血管の特化、形態形成、分化およびホメオスタシスにおいて必須の役割を果たす（例えば、Ferraraら、Nat Med 9:669, 2003参照）。研究により、ＶＥＧＦ−Ａが種々のヒト腫瘍において高く発現されることが示された（例えば、EllisおよびHicklin, Nat. rev. Cancer 8:579, 2008参照）。ＶＥＧＦ−Ａ発現は、低酸素症誘導因子１（ＨＩＦ−１）転写因子によって調節される（例えば、WangおよびSemenza, J. Biol. Chem. 270:1230, 1995参照）。腫瘍細胞の迅速な増殖および乏しい血流は、腫瘍において低酸素症伝導性環境を引き起こし、ＶＥＧＦ−Ａの迅速なアップレギュレーションを導いた（例えば、Brahimi-HornおよびPouyssegur, Bull. Cancer 93:E73, 2006参照）。
【０００４】
別個のｍＲＮＡスプライス変種によってコードされる１２１、１４５、１６５、１８９または２０６アミノ酸長の５つのヒトＶＥＧＦ−Ａイソ型（ＶＥＧＦ−Ａ１２１−２０６）が記載されており、その全てが内皮細胞における有糸分裂誘発を刺激することができる。これらのイソ型は、生物学的活性、受容体特異性、ならびに細胞表面および細胞外マトリックス会合性ヘパラン硫酸プロテオグリカンに対するアフィニティーが相違し、ＶＥＧＦ−Ａに対する低いアフィニティー受容体として作用する。すなわち、ＶＥＧＦ−Ａ１２１は、ヘパリンまたはヘパラン硫酸のいずれにも結合せず、ＶＥＧＦ−Ａ１４５およびＶＥＧＦ−Ａ１６５（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ． Ｎｏ．Ｍ３２９７７）はどちらも、ヘパリンに結合することができ、ＶＥＧＦ−Ａ１８９およびＶＥＧＦ−Ａ２０６は、ヘパリンおよびヘパラン硫酸に対して最強のアフィニティーを示す。ＶＥＧＦ−Ａ１２１、ＶＥＧＦ−Ａ１４５、およびＶＥＧＦ−Ａ１６５は、可溶性形態で分泌するが、ＶＥＧＦ−Ａ１６５のほとんどは、細胞表面および細胞外マトリックスプロテオグリカンに限られるが、ＶＥＧＦ−Ａ１８９およびＶＥＧＦ−Ａ２０６は、細胞外マトリックスと結合したままである。ＶＥＧＦ−Ａ１８９およびＶＥＧＦ−Ａ２０６のどちらも、ヘパリンまたはヘパリナーゼでの処理によって遊離することができ、それにより、これらのイソ型がプロテオグリカンを介して細胞外マトリックスに結合していることが示される。細胞に結合したＶＥＧＦ−Ａ１８９は、プラスミンなどのプロテアーゼによって切断することもでき、その結果、活性な可溶性ＶＥＧＦ−Ａ１１０の放出がもたらされる。ヒトＶＥＧＦ−Ａ１６５は、最も豊富かつ生物学的に活性な形態であり、Ａｓｎ７４でグリコシル化され、典型的には、２３ｋＤａサブユニットからなる４６ｋＤａホモダイマーとして発現する。
【０００５】
ＶＥＧＦ−Ａと相互作用する４つの細胞表面受容体が同定された。これらは、ＶＥＧＦＲ−１／Ｆｌｔ−１（ｆｉｎｓ様チロシンキナーゼ−１；ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ． Ｎｏ．Ｘ５１６０２；DeVriesら、Science 255:989-991, 1992）、ＶＥＧＦＲ−２／ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１（キナーゼインサートドメイン含有受容体／胎児肝臓キナーゼ−１；ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ． Ｎｏ．Ｘ５９３９７（Ｆｌｋ−１）およびＬ０４９４７（ＫＤＲ）；Termanら、Biochem. Biophys. Res. Comm. Res. Comm. 187: 1579-1586, 1992；Matthewsら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 9026-9030, 1991）、ニューロピリン−１（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ． Ｎｏ．ＮＭ００３８７３）、およびニューロピリン−２（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ． Ｎｏ．ＮＭ００３８７２）を包含する。ＶＥＧＦ１２１およびＶＥＧＦ１６５はＶＥＧＦＲ−１を結合し、ＶＥＧＦ１２１およびＶＥＧＦ１４５およびＶＥＧＦ１６５はＶＥＧＦＲ−２を結合し、ＶＥＧＦ１６５およびＶＥＧＦ１４５はニューロピリン−１を結合し、ＶＥＧＦ１６５およびＶＥＧＦ１４５はニューロピリン２を結合する（例えば、Neufeldら、FASEB J. 13: 9-22, 1999; StackerおよびAchen, Growth Factors 17:1-11, 1999; Ortegaら、Fron. Biosci. 4: 141-152, 1999; Zachary, Intl. J. Biochem. Cell Bio. 30: 1169-1174, 1998; Petrovaら、Exp. Cell Res. 253: 117-130, 1999参照）。
【０００６】
いくつかの重要なクラスの癌の発現についてＶＥＧＦ−Ａの重要性の認識の結果、近年、ついに、転移性結腸直腸癌、非小細胞肺癌および転移性乳癌の化学治療との組合せ治療のために、ＶＥＧＦ−Ａに対するヒト化モノクローナル抗体ＡＶＡＳＴＩＮＴＭ（商標）が承認された（例えば、Hervitzら、N. Engl. J. Med. 350: 2335-2342, 2004；Sandlerら、N. Engl. J. Med. 355: 2542-2550, 2006; Millerら、2008参照）。同様に、血管新生眼障害の病理におけるＶＥＧＦ−Ａの重要性は、血管新生（湿潤）加齢黄斑変性（ＡＭＤ）の治療のために、ヒト化モノクローナル抗体フラグメントＬＵＣＥＮＴＩＳＴＭの近年の承認に反映される。
【０００７】
線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）は、哺乳動物における２２個のファミリーメンバー（ＦＧＦ１−１４、１６−２３）を有するヘパリン結合性成長因子のファミリーである。ＦＧＦは、細胞増殖、分化、移動、脈管形成および腫瘍形成などの種々の生物学的機能において重要な役割を果たす。それらは、細胞表面ＦＧＦ受容体を結合、二量体化および活性化することによって、その多面発現性生物学的作用を実行する（例えば、Eswarakumarら、Cytokine Growth Factor Rev. 16: 139-149, 2005参照）。哺乳動物において４つのＦＧＦ受容体遺伝子、ｆｇｆＲ１−ｆｇｆＲ４がある。ＦＧＦＲの細胞外ドメインは、３つの免疫グロブリン様ドメインを含む。ＦｇｆＲ１−ＦｇｆＲ３の膜近接Ｉｇループでのオルタネイティブ・スプライシングは、付加的な変種を生じる。該ループは、Ｎ末端側の半分について、変異していないエクソン（ＩＩＩａ）によってコードされ、他の半分について、ＩＩＩｂまたはＩＩＩｃと称するエクソンの選択によってコードされる。
【０００８】
ＦＧＦリガンドおよび受容体の過剰発現ならびにＦＧＦ受容体における変異体は、前立腺癌、卵巣癌、膀胱癌、結腸直腸癌、膵臓癌、肝臓癌、肺癌、グリア芽腫癌、多発性骨芽腫および白血病を包含する多くの種類の癌に関連する（例えば、Groseら、Cytokine Growth Factor Rev. 16: 179-186, 2005参照）。ＦＧＦ１、２、６、８ｂ、９および１７は、前立腺腫瘍組織において過剰発現し、ＦＧＦ８ｂおよび１７の発現レベルは、腫瘍病期、等級および予後不良と相関する（Dorkinら、Oncogene 18: 2755-2761, 1999; Gnanapragasamら、Oncogene 21: 5069-5080, 2002; Heerら、J Pathol. 204: 578-586, 2004参照）。ＦＧＦ９は、前立腺癌に誘導された新規な骨形成に寄与し、骨におけるアンドロゲン受容体陰性前立腺癌の骨芽細胞発達に関与しうる（Liら、J Clin Invest. 118: 2697-2710, 2008）。ＦＧＦＲ１およびＦＧＦＲ４は、前立腺腫瘍組織において過剰発現し、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ〜ＩＩＩｃイソ型スイッチは、前立腺癌開始および進行を促進する（Giriら、Clin Cancer Res. 5: 1063-1071, 1999; Wangら、Clin. Cancer Res. 5: 1063-1071, 1999; Wangら、Clin Cancer Res. 10: 6169-6178, 2004; Kwabi-Addoら、Prostate 46: 163-172, 2001）。ＦＧＦ１、２、８は、胸部腫瘍組織において過剰発現する。全乳癌の８．７％までがＦＧＦＲ１遺伝子増幅を有し、該増幅は、生存全体の独立した予測因子である。ＦＧＦＲ４過剰発現は、再発性乳癌患者におけるタモキシフェン治療における失敗と相関する（例えば、Elsheikhら、Breast Cancer Res. 9, 2007; Meijerら、Endocrine-Related Cancer 15: 101-111, 2008参照）。ＦＧＦ１、８、９、１８およびＦＧＦＲ１ＩＩＩｃ、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ、ＦＧＦＲ４は、卵巣腫瘍組織において過剰発現する。ＦＧＦＲ３過剰発現および活性化変異は、膀胱癌の尿路上皮細胞癌腫において報告された。非侵襲性の低等級および病期膀胱腫瘍におけるＦＧＦＲ３変異は、より高い再発率と有意に関連する（例えば、Knowles, World J. Urol. 25: 581-593, 2007参照）。ＦＧＦ−２、ＦＧＦＲ１およびＦＧＦＲ２は、しばしば、肺の扁平上皮細胞癌腫および腺癌において過剰発現する。ＦＧＦ−２シグナリング経路活性化は、扁平上皮細胞癌腫の病因における初期の現象でありうる（Behrensら、Clin Cancer Res. 14: 6014-6022, 2008）。
【０００９】
ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４およびＦＧＦ６を包含するＦＧＦファミリーの多くのメンバーは、また、イン・ビトロおよびイン・ビボで強力なプロ脈管形成活性を有し、腫瘍脈管化を調節することによって、腫瘍進行を促進することができる（Prestaら、Cytokine Growth Factor Rev. 16: 159-178, 2005）。脈管形成の間、親密なクロストークがＦＧＦファミリーおよびＶＥＧＦファミリーのメンバー間に存在する。自発性膵臓腫瘍を発現するＲｉｐ１−Ｔａｇ２トランスジェニックマウスにおいて、抗ＶＥＧＦＲ２モノクローナル抗体でのＶＥＧＦの遮断は、低酸素症を促進し、腫瘍組織においてＦＧＦ１、ＦＧＦ２およびＦＧＦ７の発現を誘導する（Casanovasら、Cancer Cell 8:299-309, 2005）。ＦＧＦのアップレギュレーションは、脈管形成の再誘導と一致し、ＶＥＧＦ遮断から逃れる。該モデルにおけるＶＥＧＦおよびＦＧＦシグナリングの合わせた阻害は、さらなる腫瘍抑制をもたらし、その結果、ＦＧＦシグナリング経路のアップレギュレーションが少なくとも部分的に、ＶＥＧＦ標的化治療後の逃避メカニズムに寄与することを実証する。さらに、Ｔ３Ｍ４、Ｐａｎｃ１およびＱＧ５６異種移植モデルを包含するいくつかのマウス腫瘍モデルにおけるＶＥＧＦおよびＦＧＦシグナリングの遮断は、相加的または相乗的抗腫瘍効果を示した（Ogawaら、Cancer Gene Ther. 9: 633-640, 2002）。近年、ｐａｎ−ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤で治療したグリア芽腫患者の臨床試験は、ＦＧＦ２の血清レベルが応答期の患者よりも再発患者において高いことを示し、それにより、ＦＧＦ２のアップレギュレーションを含む類似の補償メカニズムを示す（Batchelorら、Cancer Cell 11: 83-95, 2007）。
【００１０】
まとめると、上記の前臨床および臨床データは、ＶＥＧＦおよびＦＧＦの両方のシグナリング経路を遮断する組合せ治療が多くの充実性腫瘍において、ＶＥＧＦの単独遮断の場合よりも良好な抗腫瘍効果を奏することができたという概念を支持する。これらのデータは、腫瘍学における治療の経路を標的とするための強力な概念実証原理を提供する。また、これらの２つの経路を一緒に遮断すると、ＡＭＤを包含する他の脈管形成疾患において良好な効力が提供されうる。本発明は、これらの用途および本明細書中の教示から当業者に明らかな他の用途のための多特異的タンパク質を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、ＶＥＧＦ−ＡおよびＦＧＦの両方の生物学的活性を減少させる抗体／可溶性受容体二重特異的結合性タンパク質を含む二重特異性結合性タンパク質を提供する。本発明によると、該二重特異的結合性タンパク質は、本明細書に記載のように、抗−ＶＥＧＦ−Ａ抗体（ＶＥＧＦ−Ａ抗体）部分のＶＥＧＦ−Ａ結合性領域およびＦＧＦ受容体のＦＧＦ結合部分を含む。本明細書に記載のＦＧＦ結合部分は、一般に、可溶性ＦＧＦ受容体（ＦＧＦＲ）である。本発明は、ある特定の具体例において、該二重特異的結合性タンパク質の可溶性ＦＧＦ受容体部が本明細書に記載のＦＧＦＲ３またはＦＧＦＲ２のＦＧＦ受容体部分を含むことを提供する。他の具体例において、Ｆｃポリペプチドは、ＦＧＦＲのＣ末端に融合される。ある特定の具体例において、ＦＧＦ結合部分およびＶＥＧＦ−Ａ結合部分は、ペプチドまたはポリペプチドリンカー配列を用いて融合されたポリペプチドであり、これらの例において、該具体例をコードしているポリヌクレオチドは、単一の二重特異的結合性タンパク質として発現されることができる。
【００１２】
本発明はまた、二重特異的結合性タンパク質のある特定の具体例が、本明細書に記載されるように、ＶＥＧＦ−Ａ抗体部分を含むことを提供する。該ＶＥＧＦ−Ａ抗体部分は、さらに、本明細書に記載のｓｃＦＶポリペプチドまたはＶＬおよびＶＨポリペプチドから構成されることができる。
【００１３】
ある特定の具体例において、ＦＧＦ結合部分は、ＦＧＦ受容体部分であり、ＦＧＦＲ３であることができ、特に、本明細書に記載されるように、ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃである。ある特定の具体例において、二重特異的抗体／可溶性受容体タンパク質は、配列番号４４で示されるようなｃ８７０．１ｅ６  ｓｃＦＶ、配列番号４６で示されるようなｃ１０９４．１ｓｃＦＶ、配列番号５２で示されるようなｃ８７０  ｓｃＦＶ、および配列番号７０で示されるようなｃ１０３９  ｓｃＦＶからなる群から選択されるＶＥＧＦ−Ａ抗体部分と組み合わせた、配列番号１３で示されるようなＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ（２３−３７５）、配列番号２で示されるようなＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ（２３−３７５）（Ｓ２４９Ｗ）、配列番号１９で示されるようなＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ（１４３−３７５）、配列番号１０で示されるようなＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ（１４３−３７５）（Ｓ２４９Ｗ）、配列番号１５で示されるようなＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ（２３−３７５）（Ｐ２５０Ｒ）、配列番号２２で示されるようなＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ（１４３−３７５）（Ｐ２５０Ｒ）からなる群から選択されるＦＧＦＲ３であるＦＧＦ受容体部分を含む。他の具体例において、二重特異的抗体／可溶性受容体組合せは、配列番号１３で示されるようなＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ（２３−３７５）、配列番号２で示されるようなＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ（２３−３７５）（Ｓ２４９Ｗ）、配列番号１９で示されるようなＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ（１４３−３７５）、配列番号１０で示されるようなＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ（１４３−３７５）（Ｓ２４９Ｗ）、配列番号１５で示されるようなＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ（２３−３７５）（Ｐ２５０Ｒ）、配列番号２２で示されるようなＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ（１４３−３７５）（Ｐ２５０Ｒ）からなる群から選択されるＦＧＦＲ３であるＦＧＦ結合部分、および配列番号４８で示されるようなｃ８７０  ＶＬおよび配列番号５０で示されるようなＶＨ、配列番号５４で示されるようなｃ１０９４  ＶＬおよび配列番号５６で示されるようなＶＨ、および配列番号６６で示されるような１０３９  ＶＬおよび配列番号６８で示されるようなＶＨからなる群から選択されるＶＥＧＦ−Ａ結合部分を含む。
【００１４】
他の具体例において、本発明の二重特異的結合性タンパク質は、ＦＧＦＲ３（１４３−３７５）（Ｓ２４９Ｗ）Ｆｃ５  ｃ１０９４．１  ｐＺＭＰ３１（配列番号５８）、ＦＧＦＲ３（２３−３７５）（Ｓ２４９Ｗ）Ｆｃ５  ｃ１０９４．１  ｐＺＭＰ３１（配列番号６０）、ＦＧＦＲ３（１４３−３７５）（Ｓ２４９Ｗ）Ｆｃ５  ｃ８７０ｅ６  ｐＺＭＰ３１（配列番号６２）、およびＦＧＦＲ３（２３−３７５）（Ｓ２４９Ｗ）Ｆｃ５  ｃ８７０ｅ６  ｐＺＭＰ３１（配列番号６４）からなる群から選択されるＦＧＦＲ３部分およびＶＥＧＦ−Ａ抗体部分を具体化する。
【００１５】
他の具体例において、ＦＧＦ結合部分は、ＦＧＦＲ２である。ある特定の具体例において、ＦＧＦＲ２は、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｃを含む。ある特定の具体例において、二重特異的抗体／可溶性受容体組合せは、配列番号２４で示されるようなＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ（２２−３７７）、配列番号２９で示されるようなＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ（２２−３７７）（Ｓ２５２Ｗ）、配列番号３３で示されるようなＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ（２２−３７７）（Ｐ２５３Ｒ）、配列番号３７で示されるようなＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ（１４５−３７７）、配列番号４０で示されるようなＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ（１４５−３７７）（Ｓ２５２Ｗ）、および配列番号４２で示されるようなＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ（１４５−３７７）（Ｐ２５３Ｒ）からなる群から選択されるＦＧＦＲ２であるＦＧＦ結合部分、および配列番号４４で示されるようなｃ８７０．１ｅ６  ｓｃＦＶ、配列番号４６で示されるようなｃ１０９４．１  ｓｃＦＶ、配列番号５２で示されるようなｃ８７０  ｓｃＦＶ、および配列番号７０で示されるようなｃ１０３９  ｓｃＦＶからなる群から選択されるＶＥＧＦ−Ａ結合部分を含む。他の具体例において、二重特異的抗体／可溶性受容体組合せは、配列番号２４で示されるようなＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ（２２−３７７）、配列番号２９で示されるようなＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ（２２−３７７）（Ｓ２５２Ｗ）、配列番号３３で示されるようなＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ（２２−３７７）（Ｐ２５３Ｒ）、配列番号３７で示されるようなＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ（１４５−３７７）、配列番号４０で示されるようなＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ（１４５−３７７）（Ｓ２５２Ｗ）、および配列番号４２で示されるようなＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ（１４５−３７７）（Ｐ２５３Ｒ）からなる群から選択されるＦＧＦＲ２であるＦＧＦ結合部分、および配列番号４８で示されるようなｃ８７０  ＶＬおよび配列番号５０で示されるようなＶＨ、配列番号５４で示されるようなｃ１０９４  ＶＬおよび配列番号５６で示されるようなＶＨ、および配列番号６６で示されるような１０３９  ＶＬおよび配列番号６８で示されるようなＶＨからなる群から選択されるＶＥＧＦ−Ａ結合部分を含む。
【００１６】
他の態様において、本発明は、本明細書に記載の二重特異的抗体／可溶性受容体結合性タンパク質を使用する方法を提供する。ある特定の具体例において、該二重特異的抗体／可溶性受容体結合性タンパク質は、前立腺癌、乳癌、膵臓癌、腎細胞癌腫（ＲＣＣ）、結腸直腸癌、グリア芽腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、および消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）などの充実性腫瘍成長によって特徴付けられる癌を治療するために、対象に投与することができる。
【００１７】
本発明のこれらおよび他の態様は、下記の本発明の詳細な説明および添付図面を参照して明らかになろう。
【００１８】
定義
別記しないかぎり、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、記載の方法および組成物に関係する分野における通常の技術者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中で使用される場合、下記の用語および句は、別記しないかぎり、それらに与えられた意味を有する。
【００１９】
「ポリペプチド」は、天然または合成のいずれであっても、ペプチド結合によって結合されたアミノ酸残基のポリマーである。約１０アミノ酸残基よりも小さいポリペプチドは、通常、「ペプチド」と呼ばれる。
【００２０】
「タンパク質」は、１以上のポリペプチド鎖を含む巨大分子である。タンパク質は、また、非ペプチド成分、例えば、炭水化物基を含んでいてもよい。炭水化物および他の非ペプチドサブユニットは、タンパク質を生産する細胞によってタンパク質に付加されてもよく、細胞の種類によって変化するであろう。タンパク質は、本明細書において、そのアミノ酸骨格構造に関連して定義され、炭水化物基などの置換基は、一般に特定されていないが、存在していてもよい。
【００２１】
「アミノ末端」および「カルボキシル末端」は、本明細書で使用される場合、ポリペプチド内の位置を示す。文脈が許す場合、これらの用語は、ポリペプチドの特定の配列または部分を参照して使用されて、近接な位置または相対的な位置を示す。例えば、ポリペプチド内の参照配列に対してカルボキシル末端に位置するある特定の配列は、該参照配列のカルボキシル末端に近接に位置するが、必ずしも、完全なポリペプチドのカルボキシル末端にあるわけではない。
【００２２】
本明細書中で使用される場合、「核酸」または「核酸分子」は、ポリヌクレオチド、例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生じたフラグメント、およびライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用、およびエクソヌクレアーゼ作用のいずれかによって生じたフラグメントをいう。核酸分子は、天然ヌクレオチド（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）、または天然ヌクレオチドのアナログ（例えば、天然ヌクレオチドのα−エナンチオマー形態）、またはその組合せであるモノマーから構成されることができる。修飾されたヌクレオチドは、糖部分および／またはピリミジンまたはプリン塩基部分において改変を有することができる。糖修飾は、例えば、１以上のヒドロキシル基の、ハロゲン、アルキル基、アミン、およびジアゾ基での置換を包含し、または糖は、エーテルまたはエステルとして官能基化されることができる。さらに、糖部分全体は、アザ−糖類および炭素環糖類似体などの立体的および電子的に類似の構造で置き換えることができる。塩基部分の修飾の例は、アルキル化プリンおよびピリミジン、アシル化プリンまたはピリミジン、または他のよく知られた複素環置換基を包含する。核酸モノマーは、ホスホジエステル結合またはかかる結合の類似体によって連結することができる。ホスホジエステル結合の類似体は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニリデート、ホスホルアミデートなどを包含する。「核酸分子」なる語はまた、所謂「ペプチド核酸」を包含し、それは、ポリアミド骨格に結合した天然または修飾された核酸塩基を含む。核酸は、一本鎖または二本鎖のいずれかであることができる。
【００２３】
本明細書中で使用される場合、「アンタゴニスト」なる語は、生物学的設定において別の化合物の活性を減少させる化合物を示す。かくして、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは、ＶＥＧＦ−Ａの生物学的活性を減少させる化合物であり、ＦＧＦＲアンタゴニストは、ＦＧＦの生物学的活性を減少させる化合物である。ＶＥＧＦ−ＡおよびＦＧＦの両方の活性は、複数の分子（リガンド、受容体、およびシグナル伝達物質）の相互作用に依存するので、アンタゴニストは、ＶＥＧＦ−ＡまたはＦＧＦに直接作用することによって、または同族（cognate）生物学的経路における別の分子に作用することによって、活性を減少させることができる。例えば、ＦＧＦアンタゴニストは、例えば、その受容体に結合することによって、そのリガンドの１つに結合することによって、受容体二量体化に干渉することによって、または受容体リン酸化を干渉することによって、ＦＧＦ活性を減少させることができる。アンタゴニストは、限定するものではないが、抗体、可溶性受容体、およびリガンドまたはその受容体に結合するか、または別の方法でリガンド−受容体相互作用および／または他の受容体機能を干渉する非タンパク質化合物を包含する。
【００２４】
「受容体」なる語は、生物活性分子（すなわち、リガンド）に結合し、細胞上のリガンドの影響を仲介する細胞結合タンパク質を示す。膜結合受容体は、細胞外リガンド結合性ドメインおよび典型的にシグナル変換に関与する細胞内エフェクタードメインを含む多ドメインまたは多ペプチド構造によって特徴付けられる。リガンドの受容体への結合は、エフェクタードメインと細胞中の他の分子との間の相互作用を引き起こす受容体におけるコンホメーション変化をもたらす。該相互作用は、次いで、細胞の代謝における改変をもたらす。受容体−リガンド相互作用に関連する代謝事象は、遺伝子転写、リン酸化、脱リン酸化、サイクリックＡＭＰ産生の増加、細胞性カルシウムの流動化、膜脂質の流動化、細胞接着、イノシトール脂質の加水分解およびリン脂質の加水分解を包含する。一般に、受容体は、膜結合性の可溶性または核単量体（例えば、甲状腺刺激ホルモン受容体、ベータ−アドレナリン受容体）または多量体（例えば、ＰＤＧＦ受容体、成長ホルモン受容体、ＩＬ−３受容体、ＧＭ−ＣＳＦ受容体、Ｇ−ＣＳＦ受容体、エリトロポイエチン受容体およびＩＬ−６受容体）であることができる。
【００２５】
「可溶性受容体」は、細胞膜に結合しない受容体ポリペプチドである。可溶性受容体は、最も一般的には、膜貫通型および細胞質ドメインを欠くリガンド結合性受容体ポリペプチドである。可溶性受容体は、付加的なアミノ酸残基、例えば、ポリペプチドの精製を提供するか、またはポリペプチドの基質への接着のための部位を提供するアフィニティータグを含むことができる。多くの細胞表面受容体は、タンパク質分解によって産生されるか、またはオルタナティブスプライスｍＲＮＡから翻訳された天然の可溶性カウンターパートを有する。受容体ポリペプチドは、膜固定またはシグナル変換を提供するのに十分なセグメント部分を欠く場合、各々、実質的に膜貫通型および細胞内ポリペプチドセグメントを含有しないと言われる。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、「Ｆｃ−融合タンパク質」なる語は、異種タンパク質の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能とを組み合わせる抗体様分子を示す。構造的に、Ｆｃ−融合タンパク質は、抗体の抗原認識結合部位以外である（すなわち、「異種」である）所望の結合特異性を有するアミノ酸配列、および免疫グロブリン定常ドメイン配列の融合を含む。Ｆｃ−融合タンパク質分子は、典型的に、少なくとも受容体またはリガンドの結合部位を含む隣接アミノ酸配列を包含する。Ｆｃ−融合タンパク質中の免疫グロブリン定常ドメイン配列は、いずれかの免疫グロブリン、例えば、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、またはＩｇＧ−４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ−１およびＩｇＡ−２を包含する）、ＩｇＥ、ＩｇＤまたはＩｇＭから得ることができる。例えば、有用なＦｃ−融合タンパク質は、本発明によると、ＦＧＦＲ３受容体のＦＧＦ結合部分を含み、ＦＧＦＲ３受容体の膜貫通または細胞質配列を含まないポリペプチドである。一の具体例において、ＦＧＦＲ３の細胞外ドメインは、免疫グロブリン配列の定常ドメインに融合している。
【００２７】
「抗体」なる語は、本明細書中で使用される場合、抗原の存在に応答して体によって生産される、抗原に結合するタンパク質、ならびにその抗原結合性フラグメントおよび操作した変種を示す。したがって、「抗体」なる語は、ポリクローナル抗体、アフィニティー精製ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、および抗原結合性抗体フラグメント、例えば、Ｆ（ａｂ’）２およびＦａｂフラグメントを包含する。遺伝子操作した無傷抗体およびフラグメント、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖Ｆｖフラグメント、一本鎖抗体、ダイアボディ、ミニボディ、直鎖状抗体、多価または多特異的ハイブリッド抗体などを包含する。かくして、「抗体」なる語は、抗体の抗原結合部位を含み、その抗原に結合可能なあらゆるタンパク質を包含するよう幅広く使用される。
【００２８】
「遺伝子操作した抗体」なる語は、アミノ酸配列が天然抗体の配列から変化した抗体を意味する。抗体産生における組み換えＤＮＡ技術の関連性のために、天然抗体に見出されるアミノ酸の配列に制限する必要はなく、抗体は、所望の特徴を得るために再設計することができる。可能はバリエーションは多く、たった１つのアミノ酸または２、３個のアミノ酸の変化から、例えば、可変または定常領域の完全な再設計までの範囲である。定常領域の変化は、一般に、補体結合、細胞および他のエフェクター機能との相互作用などの特徴を改善または改変するために行われるであろう。典型的には、可変領域の変化は、抗原結合特徴を改善するために、可変領域安定性を改善するために、または免疫原性のリスクを減少するために行われるであろう。
【００２９】
「抗体の抗原結合部位」は、その抗原に結合するのに十分な抗体の部分である。最小のかかる領域は、典型的に、可変ドメインまたは遺伝子操作されたその変種である。単一ドメイン結合部位は、ラクダ科の抗体（MuyldermansおよびLauwereys, J. Mol. Recog. 12:131-140, 1999; Nguyenら、EMBO J. 19:921-930, 2000参照）または単一ドメイン抗体を産生するための他の種のＶＨドメイン（「ｄＡｂｓ」；Wardら、Nature 341:544-546, 1989;米国特許第6,248,516号、Winterら参照）から作成することができる。ある特定のバリエーションにおいて、抗原結合部位は、天然または非天然（例えば、変異誘発した）重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメイン、またはその組合せのたった２個の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有するポリペプチド領域である（例えば、Pessiら、Nature 362:367-369, 1993; Qiuら、Nature Biotechnol. 25:921-929, 2007参照）。より一般的には、抗体の抗原結合部位は、共通のエピトープに結合する重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインの両方を含む。本発明では、「抗体の抗原結合部位を含む」分子は、さらに、抗体の１以上の第２の抗原結合部位（同一または異なるエピトープあるいは同一または異なる抗原に結合しうる）、ペプチドリンカー、免疫グロブリン定常ドメイン、免疫グロブリンヒンジ、両親媒性ヘリックス（PackおよびPluckthun, Biochem. 31:1579-1584, 1992参照）、非ペプチドリンカー、オリゴヌクレオチド（Chaudriら、FEBS Letters 450:23-26, 1999参照）などを含んでいてもよく、単量体または多量体タンパク質であってもよい。抗体の抗原結合部位を含む分子の例は、当該分野で既知であり、例えば、Ｆｖフラグメント、一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂフラグメント、ダイアボディ、ミニボディ、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ融合、二重特異的（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧ、および二重特異的（ｓｃＦｖ）２−Ｆａｂを包含する（例えば、Huら、Cancer Res. 56:3055-3061, 1996; Atwellら、Molecular Immunology 33:1301-1312, 1996; CarterおよびMerchant, Curr. Opin. Biotechnol. 8:449-454, 1997; Zuo et al., Protein Engineering 13:361-367, 2000; and Lu et al., J. Immunol. Methods 267:213-226, 2002参照）。
【００３０】
本明細書中で使用される場合、「免疫グロブリン」なる語は、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコード化される１以上のポリペプチドから成るタンパク質をいう。免疫グロブリンの１の形態は、抗体の基本構造単位を構成する。該形態は、四量体であり、免疫グロブリン鎖の２つの同一のペアからなり、各ペアは、１つの軽鎖および１つの重鎖を有する。各ペアにおいて、軽鎖および重鎖可変領域は一緒に、抗原に対する結合に関与し、定常領域は、抗体エフェクター機能に関与する。免疫グロブリンは、典型的に、脊椎生物において抗体として機能する。免疫グロブリンタンパク質の５つのクラス（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥ）は、高等脊椎動物において同定されている。ＩｇＧが主要なクラスを構成し、通常、血漿中に見出される二番目に豊富なタンパク質として存在する。ヒトにおいて、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４と呼ばれる４つのサブクラスからなる。ＩｇＧクラスの重鎖定常領域は、ギリシャ文字γで特定される。例えば、ＩｇＧ１サブクラスの免疫グロブリンは、γ１重鎖定常領域を含有する。各免疫グロブリン重鎖は、種における所定のサブクラスに対して本質的に不変性である定常領域タンパク質ドメイン（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３；ＩｇＧ３はまた、ＣＨ４ドメインも含有する）からなる定常領域を有する。ヒトおよび非ヒト免疫グロブリン鎖をコードしているＤＮＡ配列は、当該分野で既知である（例えば、Ellisonら、DNA 1:11-18, 1981; Ellisonら、Nucleic Acids Res. 10:4071-4079, 1982; Kentenら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6661-6665, 1982; Senoら、Nuc. Acids Res. 11:719-726, 1983; Riechmannら、Nature 332:323-327, 1988; Amsterら、Nuc. Acids Res. 8:2055-2065, 1980; RusconiおよびKohler, Nature 314:330-334, 1985; Bossら、Nuc. Acids Res. 12:3791-3806, 1984; Bothwellら、Nature 298:380-382, 1982; van der Looら、Immunogenetics 42:333-341, 1995; Karlinら、J. Mol. Evol. 22:195-208, 1985; Kindsvogelら、DNA 1:335-343, 1982; Breinerら、Gene 18:165-174, 1982; Kondoら、Eur. J. Immunol. 23:245-249, 1993;およびGenBankアクセッションNo. J00228参照）。免疫グロブリン構造および機能の概説については、Putnam, The Plasma Proteins, Vol V, Academic Press, Inc., 49-140, 1987;およびPadlan, Mol. Immunol. 31:169-217, 1994を参照のこと。「免疫グロブリン」なる語は、本明細書中において一般的な意味で使用され、文脈にもよるが、無傷抗体、その成分鎖、または鎖のフラグメントを示す。
【００３１】
全長免疫グロブリン「軽鎖」（約２５Ｋｄまたは２１４アミノ酸）は、ＮＨ２−末端にて可変領域遺伝子（約１１０アミノ酸をコードしている）によってコードされ、ＣＯＯＨ−末端にてカッパまたはラムダ定常領域遺伝子によってコードされる。全長免疫グロブリン「重鎖」（約５０Ｋｄまたは４４６アミノ酸）は、可変領域遺伝子（約１１６アミノ酸をコードしている）およびガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロン定常領域遺伝子（約３３０アミノ酸をコードしている）によってコードされ、後者は、各々、抗体のイソ型ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥとして定義される。軽鎖および重鎖内では、可変および定常領域が約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって結合されており、重鎖はまた、約１０個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を包含する（generally Fundamental Immunology (Paul, ed., Raven Press, N.Y., 2nd ed. 1989), Ch. 7参照）。
【００３２】
免疫グロブリン「Ｆｖ」フラグメントは、非共有相互作用によって結びついた重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含有する。免疫グロブリンＦｖフラグメントは、かくして、単一抗原結合部位を含有する。Ｆｖフラグメントの二量体構造は、さらに、変異誘発を介するジスルフィド結合の導入によって安定化することができる（Almogら、Proteins 31:128-138, 1998参照）。
【００３３】
本明細書中で使用される場合、「一本鎖Ｆｖ」および「一本鎖抗体」なる語は、単一ポリペプチド鎖内に、重鎖および軽鎖の両方から由来する可変領域を含むが、定常領域を欠く抗体フラグメントをいう。一般に、一本鎖抗体は、さらに、ＶＨおよびＶＬドメイン間のポリペプチドリンカーを含み、それにより、抗原結合を可能にする所望の構造を形成させる。一本鎖抗体は、例えば、Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113 (RosenburgおよびMoore編, Springer-Verlag, New York, 1994), pp. 269-315によって詳細に議論されている。（また、WIPO公開WO 88/01649; 米国特許第4,946,778号および第5,260,203号; Birdら、Science 242:423-426, 1988を参照のこと）。一本鎖抗体は、また、二重特異的および／またはヒト化されることができる。
【００３４】
「Ｆａｂフラグメント」は、１つの軽鎖ならびに１つの重鎖のＣＨ１および可変領域を含有する。Ｆａｂフラグメントの重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。
【００３５】
「Ｆａｂ’フラグメント」は、１つの軽鎖、およびＣＨ１およびＣＨ２ドメイン間に、いっそう多くの定常領域を含有する１つの重鎖を含有し、その結果、鎖内ジスルフィド結合が２つの重鎖間に形成されて、Ｆ（ａｂ’）２分子を形成する。
【００３６】
「Ｆ（ａｂ’）２フラグメント」は、２つの軽鎖、およびＣＨ１およびＣＨ２ドメイン間の定常領域の部分を含有する２つの重鎖を含有し、２つの重鎖の間に鎖内ジスルフィド結合が形成される。
【００３７】
「Ｆｃフラグメント」（またはＦｃドメイン）は、細胞上の抗体受容体および補体のＣ１ｑ成分への結合に関与する抗体の部分である。Ｆｃは、「フラグメント結晶」を表し、タンパク質結晶を容易に形成する抗体のフラグメントである。別個のタンパク質フラグメント（当初、タンパク質分解性消化によって記述された）は、免疫グロブリンタンパク質の全体的な一般構造を定義することができる。文献において当初定義されたように、Ｆｃフラグメントは、ジスルフィド結合された重鎖ヒンジ領域、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインからなる。しかしながら、より近年には、該用語は、ＣＨ３、ＣＨ２、および第２の鎖と共にジスルフィド結合二量体を形成するのに十分なヒンジの少なくとも一部からなる一本鎖にも使用されている。免疫グロブリン構造および機能の概説については、Putnam, The Plasma Proteins, Vol. V (Academic Press, Inc., 1987), pp. 49-140; および Padlan, Mol. Immunol. 31:169-217, 1994を参照のこと。本明細書中で使用される場合、Ｆｃなる語は、天然配列の変種を包含する。
【００３８】
免疫グロブリン軽鎖または重鎖可変領域は、３つの超可変領域によって中断された「フレームワーク」領域からなる。かくして、「超可変領域」なる語は、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基をいう。超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基（例えば、ヒトにおいて、軽鎖可変ドメイン中、残基２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）、および８９−９７（Ｌ３）、および重鎖可変ドメイン中、残基３１−３５（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）および９５−１０２（Ｈ３）（ＥＵインデックスに基づくアミノ酸配列番号；Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)参照）および／または「超可変ループ」由来のアミノ酸残基（ヒトにおいて、軽鎖可変ドメイン中、残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）および９１−９６（Ｌ３）および重鎖可変ドメイン中、２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）および９６−１０１（Ｈ３）；  ChothiaおよびLesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917, 1987）（どちらも、出典明示より、本明細書の一部とする）を含む。「フレームワーク領域」または「ＦＲ」は、本明細書中で定義されるように、超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、種内で比較的保存されている。かくして、「ヒトフレームワーク領域」は、天然ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域と実質的に同一（約８５％以上、通常９０−９５％以上）のフレームワーク領域である。抗体のフレームワーク領域、すなわち、構成的軽鎖および重鎖を合わせたフレームワーク領域は、ＣＤＲを配置し、並べるように働く。ＣＤＲは、主として、抗原のエピトープへの結合に関与する。ＶＬドメインのＣＤＲｓ  Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３は、また、各々、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３とも呼ばれ、ＶＨドメインのＣＤＲ  Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３は、また、各々、本明細書中において、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３とも呼ばれる。
【００３９】
「キメラ抗体」は、その軽鎖および重鎖遺伝子が典型的に遺伝子操作によって、異なる種に属する免疫グロブリン可変および定常領域遺伝子から構築されている抗体である。例えば、マウスモノクローナル抗体由来の遺伝子の可変セグメントをヒト定常領域コードセグメント（例えば、ヒトガンマ１またはガンマ３重鎖遺伝子、およびヒトカッパ軽鎖遺伝子）に結合させてもよい。治療的キメラ抗体は、かくして、典型的に、マウス抗体由来の可変または抗原結合ドメインおよびヒト抗体由来の定常ドメインからなるハイブリッドタンパク質であるが、他の種を用いてもよい。特に、キメラ抗体は、免疫グロブリン軽鎖、重鎖、または両方のヒンジおよび定常領域の全てまたは一部が、別の動物の免疫グロブリン軽鎖または重鎖由来の対応する領域に置換される組み換えＤＮＡ技術によって製造される。このようにして、親モノクローナル抗体の抗原結合部分を別の種の抗体の骨格上に移植する。キメラ抗体は、所望により、露出した残基の置換によって、ヒト様表面で「覆われて（cloaked）」いてもよく、その結果、「ベニヤ（veneered）抗体」が形成される。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、「ヒト抗体」なる語は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を包含し、例えば、Kucherlapatiらの米国特許第５，９３９，５９８号に記載されるような、ヒト免疫グロブリンライブラリーから、または１以上のヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックな動物であって、内在性免疫グロブリンを発現しない動物から単離された抗体を包含する。
【００４１】
「ヒト化免疫グロブリン」なる語は、ヒトフレームワーク領域および非ヒト（例えば、マウスまたはラット）免疫グロブリン由来の１以上のＣＤＲを含む免疫グロブリンをいう。ＣＤＲを提供する非ヒト免疫グロブリンは、「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを提供するヒト免疫グロブリンは、「アクセプター」と呼ばれる。定常領域は存在する必要はないが、もし存在するなら、ヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一、すなわち、少なくとも約８５−９０％、好ましくは約９５％以上同一でなければならない。したがって、ヒト化免疫グロブリンの全ての部分は、おそらくＣＤＲを除き、天然のヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同一である。いくつかの例において、ヒト化抗体は、ヒト可変領域フレームワークドメイン内に非ヒト残基を保持して、適当な結合特性を増加させうる（例えば、抗体がヒト化された場合、結合アフィニティーを保存するために、フレームワーク中の変異が必要とされうる）。「ヒト化抗体」は、ヒト化軽鎖およびヒト化重鎖免疫グロブリンを含む抗体である。例えば、ヒト化抗体は、例えば、キメラ抗体の全可変領域は非ヒトなので、上記で定義したような典型的なキメラ抗体を包含しないであろう。
【００４２】
「二重特異的抗体」または「二機能性抗体」は、２つの異なる重鎖／軽鎖ペアおよび２つの異なる結合部位を有するハイブリッド抗体である。二重特異的抗体は、限定するものではないが、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’フラグメントの連結を包含する種々の方法によって生産されうる。例えば、Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321, 1990; Kostelnyら、J. Immunol. 148:1547-1553, 1992を参照のこと。
【００４３】
「多特異的」または「多機能性」抗体以外の「二価抗体」は、ある特定の具体例において、同一の抗原特異性を有する２つの結合部位を含む抗体である。
【００４４】
「ダイアボディ」なる語は、２つの抗原結合部位を有する小型抗体フラグメントをいい、該フラグメントは、同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）において軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖において２つのドメイン間を対合できないほど短いリンカーを用いることによって、該ドメインを別の鎖の相補性ドメインと対合させ、２つの抗原結合部位を作出させる。ダイアボディは、例えば、ＥＰ  ４０４，０９７、ＷＯ  ９３／１１１６１、およびHollingerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, 1993に十分に記載されている。
【００４５】
「ミニボディ」なる語は、本明細書中、天然または非天然（例えば、変異させた）重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインまたはその組合せのたった２つの相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするポリペプチドをいう。ミニボディの例は、例えば、Pessiら、Nature 362:367-369, 1993、およびQiuら、 Nature Biotechnol. 25:921-929, 2007によって記載されている。
【００４６】
「直鎖状抗体」なる語は、Zapataら、Protein Eng. 8:1057-1062, 1995において記載される抗体をいう。簡単に言えば、これらの抗体は、抗原結合領域のペアを形成するタンデムＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）のペアを含む。直鎖状抗体は、二重特異的または単一特異的であることができる。
【００４７】
「モノクローナル抗体」なる語は、本明細書中で使用される場合、ハイブリドーマ技術によって産生された抗体に限定されない。「モノクローナル抗体」なる語は、単一クローン由来の抗体をいい、いずれかの真核生物、原核生物、またはファージクローンを包含し、その産生方法に言及しない。
【００４８】
「親抗体」なる語は、本明細書中で使用される場合、変種の調製のために使用されたアミノ酸配列によってコードされる抗体をいう。好ましくは、親抗体は、ヒトフレームワーク領域を有し、存在するならば、ヒト抗体定常領域を有する。例えば、親抗体は、ヒト化またはヒト抗体であってもよい。
【００４９】
「変種」抗−ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、親抗体配列における１以上のアミノ酸残基の付加、欠失および／または置換によって、「親」抗−ＶＥＧＦ−Ａ抗体アミノ酸配列とアミノ酸配列が異なる分子をいう。好ましい具体例において、変種は、親抗体の１以上の超可変領域における１以上のアミノ酸置換を含む。例えば、変種は、親抗体の１以上の超可変領域において、少なくとも１つ、例えば約１個〜約１０個、好ましくは約２個〜約５個の置換を含んでいてもよい。通常、変種は、親抗体重鎖または軽鎖可変ドメイン配列と少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有するであろう。該配列に関する同一性または相同性は、本明細書中において、最大パーセント配列同一性を達成するように配列を整列し、ギャップ（必要な場合）を導入した後、親抗体残基と同一の候補配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージとして定義付けられる。抗体配列中へのＮ−末端、Ｃ−末端、または内部伸長、欠失、または挿入のいずれも、配列同一性または相同性に影響を及ぼすものとして解釈されない。変種は、ヒトＶＥＧＦ−Ａに対する結合能を保持し、好ましくは、親受容体または抗体の特性よりも優秀な特性を有する。例えば、変種は、より強力な結合アフィニティー、増加したＶＥＧＦ−Ａ−誘導性生物学的活性（例えば、脈管形成または増殖）阻害能を有しうる。例えば、抗−ＶＥＧＦ−Ａ抗体のフォーマットは本明細書中に開示される生物学的活性アッセイにおいてその活性に影響を与えることが見出されたので、かかる特性を分析するために、変種のＦａｂ形態を親抗体のＦａｂ形態と比較し、または変種の全長形態を親抗体の全長形態と比較すべきである。本明細書中で特に目的とされる変種抗体は、親抗体と比べて、生物学的活性において少なくとも約３倍、５倍、１０倍、２０倍、または５０倍増加を示すものである。
【００５０】
「エピトープ」なる語は、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に対する特異的結合が可能ないずれかのタンパク質決定基を包含する。エピトープ決定基は、通常、分子の化学的に活性な表面群、例えば、アミノ酸または糖側鎖からなり、通常、特異的な三次元構造特徴、ならびに特異的な電荷特徴を有する。より詳細には、「ＶＥＧＦ−Ａエピトープ」なる語は、本明細書中で使用される場合、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはマウスまたはヒトにおいて、抗原性または免疫原性活性を有するＶＥＧＦ−Ａポリペプチドの部分をいう。免疫原性活性を有するエピトープは、動物において抗体応答を顕現させるＶＥＧＦ−Ａポリペプチドの部分である。抗原性活性を有するエピトープは、当該分野で周知のいずれかの方法によって、例えば、イムノアッセイによって決定される場合、抗体が免疫特異的に結合するＶＥＧＦ−Ａポリペプチドの部分である。抗原性エピトープは、必ずしも免疫原性である必要はない。
【００５１】
「ベクター」は、宿主細胞における自己複製能を有する核酸分子、例えば、プラスミド、コスミド、またはバクテリオファージである。クローニングベクターは、典型的に、ベクターの必須な生物学的機能を喪失することなく、決定可能な様式で核酸分子の挿入を可能にする１つまたは少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位、ならびにクローニングベクターで形質転換した細胞の同定および選択において使用するのに適当なマーカー遺伝子をコードしているヌクレオチド配列を含有する。マーカー遺伝子は、典型的に、テトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性を提供する遺伝子を包含する。
【００５２】
「発現ベクター」は、宿主細胞中で発現される遺伝子をコードしている核酸分子である。典型的には、発現ベクターは、転写プロモーター、遺伝子、および転写ターミネーターを含む。遺伝子発現は、通常、プロモーターの制御下に置かれており、かかる遺伝子は、該プロモーターに「作動可能に連結される」と言われる。同様に、調節エレメントおよびコアプロモーターは、調節エレメントがコアプロモーターの活性を変調する場合、作動可能に連結されている。
【００５３】
「発現」なる語は、遺伝子産物の生合成をいう。例えば、構造遺伝子の場合、発現は、構造遺伝子のｍＲＮＡへの転写およびｍＲＮＡの１以上のポリペプチドへの翻訳を含む。
【００５４】
本明細書中に記載されるようなタンパク質に関し、配列番号によって特定されるアミノ酸に対応するアミノ酸残基への言及は、かかる残基の翻訳後修飾を包含する。
【００５５】
「新血管形成」および「脈管形成」なる語は、本明細書中で交換可能に使用される。新血管形成および脈管形成は、細胞、組織、または生物中への新規な血管の生成をいう。脈管形成の調節は、典型的に、ある特定の病態において改変され、多くの場合、該疾患に関連する生理学的損傷が、改変された脈管形成または規制されない脈管形成に関連する。持続性の規制されない脈管形成は、内皮細胞による異常な成長によって特徴付けられる病態を包含する種々の病態において起こり、血管の漏れおよび透過性を包含するこれらの病態においてみられる生理学的損傷を支持する。
【００５６】
「血管新生障害」なる語は、本明細書中で使用される場合、増加した脈管形成活性、または規制されない脈管形成活性によって、少なくとも部分的に媒介される病理を有するいずれかの疾患または障害をいう。かかる疾患または障害の例は、充実性腫瘍を包含する種々の癌（例えば、膵臓癌、腎細胞癌腫（ＲＣＣ）、結腸直腸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、および消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ））ならびに新血管形成を含むある特定の眼疾患（「血管新生眼疾患」）を包含する。かかる疾患または障害は、本明細書中にさらに記載されるように、特に、脈管形成を阻害する特定の治療法に応じやすい。
【００５７】
「有効量」なる語は、本明細書中に記載されるように、ＦＧＦＲおよび／またはＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの対象への投与による血管新生障害の治療との関連において、血管新生障害の発症を阻害するように、または血管新生障害の１以上の症状を改善するように、対象において脈管形成を阻害するのに十分な薬剤の量をいう。薬剤の有効量は、「有効レジメ（regime）」における本発明の方法にしたがって投与される。「有効量」なる語は、疾患または障害の治療または予防を達成するのに十分な投与薬剤量および投与頻度の組合せをいう。
【００５８】
「患者」または「対象」なる語は、本明細書中で記載されるような疾患または障害を治療することとの関連において、哺乳動物、例えば、ヒトおよび他の霊長類を包含する。該用語は、また、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、イヌ、およびネコなどの飼い慣らした動物を包含する。
【００５９】
２つのアミノ酸配列は、最大に一致するように整列させた場合に２つのアミノ酸配列のアミノ酸残基が同じならば、「１００％アミノ酸配列同一性」を有する。同様に、２つのヌクレオチド配列は、最大に一致するように整列させた場合に２つのヌクレオチド配列のヌクレオチド残基が同じならば、「１００％ヌクレオチド配列同一性」を有する。配列比較は、ＤＮＡＳＴＡＲ（Madison, Wisconsin）によって製造されるＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティックコンピューティングスイートに包含されるような標準的なソフトウェアプログラムを用いて実施することができる。最適なアラインメントを決定することによって２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列を比較するための他の方法は、当業者によく知られている。（例えば、PeruskiおよびPeruski, The Internet and the New Biology: Tools for Genomic and Molecular Research (ASM Press, Inc. 1997); Wuら(編)、”Information Superhighway and Computer Databases of Nucleic Acids and Proteins,” in Methods in Gene Biotechnology 123-151 (CRC Press, Inc. 1997); Bishop (編), Guide to Human Genome Computing (2nd ed., Academic Press, Inc. 1998)参照のこと。）２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、該２つの配列が互いに少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％配列同一性を有する場合、「実質的に類似の配列同一性」または「実質的な配列同一性」を有するとみなされる。
【００６０】
パーセント配列同一性は、常法によって決定される。例えば、Altschulら、Bull. Math. Bio. 48:603, 1986、およびHenikoffおよびHenikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1992を参照のこと。例えば、２つのアミノ酸配列は、ギャップオープニングペナルティ１０、ギャップエクステンションペナルティ１、および表１（アミノ酸は、標準的な一文字コードによって示される）に示されるような、HenikoffおよびHenikoff（上掲）の「ＢＬＯＳＵＭ６２」スコアリングマトリックスを用いて、アラインメントスコアを最適化するように整列させることができる。次いで、パーセント同一性は、
（［完全な一致の総数］／［より長い配列の長さ  ＋  ２つの配列を整列させるために、より長い配列中に導入されたギャップの数］）（１００）
として計算される。
【００６１】
【表１】
2012521768.tif 000003
【００６２】
当業者は、２つのアミノ酸配列を整列させるために利用可能な多くの確立されたアルゴリズムが存在することを認める。PearsonおよびLipmanの「ＦＡＳＴＡ」類似性検索アルゴリズムは、本明細書中に開示されるアミノ酸配列および第２のアミノ酸配列によって共有される同一性のレベルを調べるための適当なタンパク質アラインメント方法である。ＦＡＳＴＡアルゴリズムは、PearsonおよびLipman，Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 85:2444, 1988およびPearson, Meth. Enzymol. 183:63, 1990によって記載されている。簡単に言うと、ＦＡＳＴＡは、まず、クエリー配列（例えば、配列番号２の残基２５−２６６）および同一性の最大密度（ｋｔｕｐ変数が１の場合）または同一性のペア（ｋｔｕｐ＝２の場合）のいずれかを有する試験配列によって共有される領域を同定することによって、保存的アミノ酸置換、挿入または欠失を考慮することなく、配列類似性を特徴付ける。次いで、同一性の最大密度を有する１０個の領域を、アミノ酸置換マトリックスを用いて全てのペアになったアミノ酸の類似性を比較することによって再スコア化し、最大スコアに寄与する残基だけを含むように該領域の末端を「そろえる（trimmed）」。「カットオフ（cutoff）」値（配列の長さおよびｋｔｕｐ値に基づく所定の式によって計算された）よりも大きいスコアを有するいくつかの領域が存在する場合、そろえた最初の領域を調べて、ギャップを用いておよそのアラインメントを形成するように該領域を連結できるか否かを決定する。最終的に、アミノ酸挿入および欠失を可能にするＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ−Ｓｅｌｌｅｒｓアルゴリズム（NeedlemanおよびWunsch, J. Mol. Biol. 48:444, 1970; Sellers, SIAM J. Appl. Math. 26:787, 1974）の修飾を用いて、２つのアミノ酸配列の最大スコア領域を整列させる。ＦＡＳＴＡ分析の説明的パラメーターは、ｋｔｕｐ＝１、ギャップオープニングペナルティ＝１０、ギャップエクステンションペナルティ＝１、および置換マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２である。これらのパラメーターは、PEARSON, METH. ENZYMOL. 183:63, 1990のAppendix 2に説明されるように、スコアリングマトリックスファイル（「ＳＭＡＴＲＩＸ」）を修飾することによって、ＦＡＳＴＡプログラム中に導入することができる。
【００６３】
ＦＡＳＴＡは、また、上記のような比率を用いて、核酸分子の配列同一性を決定するために使用することができる。ヌクレオチド配列比較の場合、ｋｔｕｐ値は、上記のような他のパラメーターセットと共に、１〜６、好ましくは３〜６、最も好ましくは３の範囲であることができる。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】図１Ａ−１Ｃは、ある特定の免疫グロブリンＦｃポリペプチドのアミノ酸配列を示す。アミノ酸配列数は、ＥＵインデックス（Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, Bethesda, 1991）に基づく。示された配列は、野生型ヒト配列（「ｗｔ」；配列番号７５）、およびＦｃ−４８８（配列番号７６）、Ｆｃ４（配列番号７７）、Ｆｃ５（配列番号７４）、Ｆｃ６（配列番号７８）およびＦｃ７（配列番号７９）と称する５つの変種配列を包含する。軽鎖定常領域（ＬＣ）および重鎖定常領域（ＨＣ）に対するジスルフィド結合に通常、関与するＣｙｓ残基を示す。「．」は、その位置にて、野生型に対する同一性を示す。＊＊＊は、終止コドンを示し、Ｃ−末端Ｌｙｓ残基は、Ｆｃ６から除去されている。ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインの境界が示される。
【００６５】
【図２】図２は、２つの異なる標的（本明細書中において、αＶＥＧＦ−ＡおよびＦＧＦＲのリガンド結合ドメインという）に対する特異性を有する四価の二重特異的抗体／可溶性受容体組合せを示す。
【００６６】
【図３】図３は、骨芽細胞のＦＧＦ−９−刺激性増殖の種々の阻害を示すＦＧＦＲ−Ｆｃ（R&D Systems）を示す。
【００６７】
【図４】図４Ａは、ＦＧＦＲ−Ｆｃ構築物（ZymoGenetics）によるＦＧＦ−９−刺激性増殖の阻害を示す。全長ＦＧＦＲ３−Ｆｃ野生型および変異構築物（ZymoGenetics）は、類似のＩＣ５０を有し、図４Ｂは、末端切断型ＦＧＦＲ３−Ｆｃ変異構築物（ZymoGenetics）は、類似のＩＣ５０を有する。
【００６８】
【図５】図５Ａは、ＦＧＦＲ−Ｆｃ（R&D Systems）によるＦＧＦ−８ｂの直接的結合を示し、図５Ｂは、ＦＧＦＲ−Ｆｃ構築物（ZymoGenetics）によるＦＧＦ−８ｂの直接的結合を示す。
【００６９】
【図６】図６Ａは、ＦＧＦＲ−Ｆｃ（R&D Systems）によるＦＧＦ−１７の直接的結合を示し、図６Ｂは、ＦＧＦＲ２−Ｆｃ構築物（ZymoGenetics）によるＦＧＦ−１７の直接的結合を示す。
【００７０】
【図７】図７は、ＦＧＦＲ３−Ｆｃ構築物（ZymoGenetics）によるＦＧＦ−１７の直接的結合を示す。
【００７１】
【図８】図８Ａは、ＦＧＦＲ−ＦｃがＣａｋｉ−１細胞の増殖を阻害することを示し、図８Ｂは、ＦＧＦＲ−ＦｃがＤＵ１４５細胞の増殖を阻害することを示す。
【００７２】
【図９】図９は、ＦＧＦ受容体ファミリーの第２および第３Ｉｇ−様ドメインを示す。
【発明を実施するための形態】
【００７３】
発明の記載
Ｉ．概観
本発明は、多特異的結合性タンパク質、特に二重特異的結合性タンパク質である新規なタンパク質を提供することによって、癌、特に充実性腫瘍を治療するためのより多くの治療薬を提供することに対する、当該分野における要望に向けられている。該タンパク質は、抗体部分に融合した可溶性受容体部分を含む。本明細書中で使用される場合、「二重特異的結合性タンパク質」なる語は、異なる結合特異性を有する少なくとも２つの結合部分を介して、少なくとも２つの異なる標的分子に特異的に結合することができるタンパク質をいう。該結合部分は、例えば、タンパク質（例えば、抗体または可溶性受容体）または小型分子であってもよい。二重特異的結合性タンパク質の結合部分は、物理的に連結されていてもよい。本発明は、本明細書中に記載されるように、可溶性受容体部分および抗体部分を含む二重特異的結合性タンパク質を提供する。
【００７４】
本発明において、本明細書中に記載されるように、可溶性受容体部分は、可溶性ＦＧＦ受容体またはその部分を含み、抗体部分は、ＶＥＧＦ−Ａ抗体またはその部分を含む。ある特定の具体例において、二重特異的結合性タンパク質の２以上の異なる部分は、リンカーを介して連結して多量体（例えば、二量体）を形成する。例えば、少なくとも２つのポリペプチド部分（例えば、可溶性ＦＧＦ受容体およびＶＥＧＦ−Ａ抗体）の融合物を含む二重特異的結合性タンパク質の場合、ペプチドリンカー配列を用いて、例えば、該ポリペプチド成分を、各ポリペプチドが確実にその二次および三次構造に折りたたまれるのに十分な間隔をあけて分離させてもよい。
【００７５】
ある特定の具体例において、本発明の二重特異的結合性タンパク質は、ＦＧＦおよびＶＥＧＦ−Ａの両方の生物学的活性を減少させる。特に、本発明は、ＶＥＧＦ−Ａ受容体およびＦＧＦ受容体を介するシグナリングを減少させるＶＥＧＦ−ＡおよびＦＧＦアンタゴニスト、特に、ＦＧＦ可溶性受容体と組み合わせた中和性抗−ＶＥＧＦ−Ａ抗体を提供する。かかるアンタゴニストを用いるＶＥＧＦ−Ａおよび／またはＦＧＦによる脈管形成シグナルの減少は、少なくとも部分的に新血管形成によって特徴付けられる病理を有する種々の障害の治療に有用である。例えば、腫瘍中および腫瘍周辺のＶＥＧＦ−Ａおよび／またはＦＧＦによる脈管形成シグナルの阻害は、腫瘍の血管形成、成長および転移する能力を減少させる。
【００７６】
ＦＧＦ受容体の活性化は、ホスホリパーゼＣ、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼおよびシグナル伝達および転写活性化因子（ＳＴＡＴ）経路を包含する複数のシグナル変換経路（その全てが前立腺癌進行において役割を果たす）を活性化することができる。増加したＦＧＦシグナリングの正味の結果は、増加した増殖、細胞死に対する耐性、増加した運動性および侵襲性、増加した脈管形成、強化した転移、化学治療および放射能照射に対する耐性およびアンドロゲン独立性を包含し、その全てが腫瘍進行および臨床的攻撃性を増加することができる。ＦＧＦ受容体および／またはＦＧＦシグナリングは、腫瘍細胞に直接的に影響を及ぼすことができ、また、腫瘍脈管形成に影響を及ぼすことができる（Kwabi-Addoら、 Endocrine-Related Cancer 11 (4) 709 -724, 2004）。
【００７７】
本発明は、ＶＥＧＦ−ＡおよびＦＧＦの両方の生物学的活性を減少させるＶＥＧＦ−ＡおよびＦＧＦアンタゴニストを提供する。ＦＧＦ−結合性部分は、可溶性ＦＧＦ受容体（ＦＧＦＲ）であり、該ＶＥＧＦ−Ａ−結合性部分は、ＶＥＧＦ−Ａ抗体である。本発明によると、ＶＥＧＦ−ＡおよびＦＧＦアンタゴニストは、ＶＥＧＦ−ＡおよびＦＧＦに特異的に結合し、その活性を減少させる二重特異的抗体／可溶性受容体結合性タンパク質である。本発明の二重特異的結合性タンパク質は、本明細書中に詳細に記載される。
【００７８】
ＩＩ．ＦＧＦ受容体、抗−ＶＥＧＦ−Ａ抗体、および関連する二重特異的結合性組成物
Ａ．ＦＧＦ受容体
該分子のＦＧＦＲ部分は、可溶性受容体である。ＦＧＦＲは、Ｄ１、Ｄ２およびＤ３と呼ばれる３つのＩｇ−様ドメインを含む。該受容体は、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３を含むことができるか、またはＦＧＦ受容体のＤ１伴わずに、Ｄ２、Ｄ３を含むことができる。さらに、該受容体は、天然受容体であってもよく、またはＤ２−Ｄ３領域中に変異を有していてもよい。ＦＧＦＲファミリーおよびドメインＤ２およびＤ３は、図１に示される。
【００７９】
Ｄ１の切断型（truncation）は、受容体のアフィニティーを増加させ、受容体／リガンド相互作用を増強させることができることが実証された（Olsenら、PNAS 101:935-940, 2004）。ＦＧＦＲ１−３は、Ｄ３のカルボキシ末端でのオルタネイティブ・スプライシングの結果として、イソ形態を有することが知られている。該知見から始めて、本発明者らは、３または２つのＩｇ−様ドメインを有する複数の変種の可溶性ＦＧＦ受容体を作成し、ＦＧＦリガンドに対する結合アフィニティーを特徴付けた。ＦＧＦＲ３およびＦＧＦＲ２イソ形態ＩＩＩｃは、対応するＩＩｂイソ形態よりも、ＦＧＦ２、６、８ｂ、９および１７に対して比較的高いアフィニティーを有するので、特に興味深いことが実証される。
【００８０】
ＦＧＦ受容体は、ＦＧＦリガンドに対する結合アフィニティーによって特徴付けることができる。会合速度定数（ｋａ（Ｍ−１ｓ−１））および解離速度定数（ｋｄ  （ｓ−１））は、所定の相互作用について測定される。会合速度定数は、リガンド−受容体複合体形成の速度を反映する値である。解離速度定数は、該複合体の安定性を反映する値である。平衡結合アフィニティーは、典型的に、平衡解離定数（ＫＤ（Ｍ））または平衡会合定数（ＫＡ（Ｍ−１））のいずれかとして表現される。ＫＤは、解離速度定数を会合速度定数で割ることによって得られ（ｋｄ／ｋａ）、一方、ＫＡは、会合速度定数を解離速度定数で割ることによって得られる（ｋａ／ｋｄ）。類似ＫＤ（または類似ＫＡ）を有する分子は、幅広く種々の会合および解離速度定数を有することができる。本発明の二重特異的結合性タンパク質に対する結合アフィニティーは、標準的なイン・ビトロアッセイ、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ結合分析で測定した場合、１００ｎＭ以下、好ましくは１０ｎＭ以下、より好ましくは１ｎＭ以下の範囲であろう。
【００８１】
ある特定の具体例において、ＦＧＦＲはＦＧＦＲ３ＩＩＩｃである。他の特定の具体例は、配列番号２のアミノ酸番号２６２または配列番号９のアミノ酸番号１４２をＳからＷへ変異させたＦＧＦＲ３ＩＩＩｃを包含する。他の特定の具体例は、配列番号１５のアミノ酸番号２６３または配列番号２２のアミノ酸番号１４３をＰからＲへ変異させたＦＧＦＲ３ＩＩＩｃを包含する。他の具体例において、ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃは、配列番号１０、１９および２２に示されるように、Ｎ末端で切断されていてもよい。
【００８２】
他の特定の具体例において、ＦＧＦＲはＦＧＦＲ２ＩＩＩｃである。他の特定の具体例は、配列番号２９のアミノ酸番号Ｘまたは配列番号４０のアミノ酸番号ＸａをＳからＷへ変異させたＦＧＦＲ２ＩＩＩｃを包含する。他の特定の具体例は、配列番号３３のアミノ酸番号Ｙまたは配列番号４２のアミノ酸番号ＹａをＰからＲへ変異させたＦＧＦＲ２ＩＩＩｃを包含する。他の具体例において、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｃは、配列番号３７および４２に示されるように、Ｎ末端で切断されていてもよい。
【００８３】
Ｂ．ＶＥＧＦ−Ａ抗体
本発明内で使用するためのＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは、ＶＥＧＦ−ＡまたはＶＥＧＦ−Ａ受容体に結合し、それにより、該受容体を発現する細胞上のＶＥＧＦ−Ａの活性を減少させる分子、例えば、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ニューロピリン−１、および／またはニューロピリン−２を包含する。特に、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは、抗−ＶＥＧＦ−Ａ抗体を包含する。他の適当なＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは、ＶＥＧＦＲ細胞外ドメインを含む可溶性ＶＥＧＦ−Ａ受容体、ならびにＶＥＧＦ−Ａとその受容体の相互作用を阻害することのできる、または別法で、ＶＥＧＦ−Ａ受容体を介するＶＥＧＦ−Ａ−誘導性細胞内シグナリングを阻害することができる小型分子アンタゴニストを包含する。さらに、非抗体足場（scaffold）に基づく結合性タンパク質を用いてもよい。（例えば、Koideら、J. Mol. Biol. 284:1141-1151, 1998; Hosseら、Protein Sci. 15:14-27, 2006、およびその引用文献を参照のこと。）本発明内で使用するための好ましいＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは、ＦＧＦのための結合部位も含む二重特異的抗体を包含するＶＥＧＦ−Ａに特異的に結合する抗体を包含する。ＶＥＧＦ−Ａに特異的な抗体は、少なくとも、ＶＥＧＦ−Ａの可溶性分泌形態を結合し、好ましくは、細胞表面結合形態も結合する。
【００８４】
抗体は、（１）結合活性の閾値を示す場合、および（２）対照ポリペプチド分子と有意に交差反応しない場合、特異的に結合しているとみなされる。例えば、結合の域値は、対照（非−ＶＥＧＦ−Ａ）ポリペプチドに対する結合アフィニティーよりも少なくとも１０倍高いアフィニティーで、抗−ＶＥＧＦ−Ａ抗体がＶＥＧＦ−Ａポリペプチド、ペプチドまたはエピトープに結合する場合に決定される。本発明内で使用される抗体は、１０６Ｍ−１以上、好ましくは１０７Ｍ−１以上、より好ましくは１０８Ｍ−１以上、最も好ましくは１０９Ｍ−１以上の結合アフィニティー（Ｋａ）を示すことが好ましい。抗体の結合アフィニティーは、通常、自動装置を用いる表面プラズモン共鳴によって、当業者によって容易に決定されることができる。他の方法、例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ分析が当該分野で知られている（Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51:660-672, 1949）。
【００８５】
本発明の抗体は、抗原−結合特異性を保持する無傷抗体の部分を含むか、または該部分からなる。適当な抗体は、例えば、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、抗体フラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ抗体フラグメント、一本鎖抗体、および抗体重鎖または軽鎖の一量体または二量体またはその混合物を包含する。本発明の好ましい抗体は、モノクローナル抗体である。軽鎖を含む抗体は、カッパまたはラムダ軽鎖を含みうる。
【００８６】
ある特定の具体例において、本発明の抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇＭ（そのサブタイプを包含する）を包含するいずれかのイソ型の無傷免疫グロブリンを包含する。本発明の無傷免疫グロブリンは、好ましくは、無傷ＩｇＧ（例えば、無傷ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、またはＩｇＡ２）を包含する。
【００８７】
ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、およびその抗原結合性抗体フラグメントを調製し、単離する方法は、当該分野で周知である。例えば、Current Protocols in Immunology(Cooliganら編、John Wiley and Sons, Inc. 2006); Sambrookら、 Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, NY, 2nd ed. 1989);およびMonoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications (Hurrell編、CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1982)を参照のこと。ｓｃＦｖを包含する抗原結合性フラグメントは、当該分野で既知の方法にしたがって、ファージディスプレーライブラリーを用いて調製できる。ファージディスプレーは、また、非抗体足場に基づく結合性タンパク質の調製に用いることもできる（Ｋｏｉｄｅら、上掲）。組み換えヒトポリクローナル抗体を調製する方法は、Wibergら、Biotechnol Bioeng. 94:396-405, 2006; Meijerら、J. Mol. Biol. 358:764-772, 2006; Haurumら、米国特許出願公開第2002/0009453号;およびHaurumら、米国特許出願公開第2005/0180967号によって開示される。
【００８８】
当業者に明らかなように、本発明内で使用するためのポリクローナル抗体は、種々の恒温動物、例えば、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ニワトリ、ウサギ、マウスおよびラットのいずれかに、免疫原性ポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントを接種することによって作成することができる。免疫原性ポリペプチドの免疫原性は、アジュバント、例えば、アラム（alum）（水酸化アルミニウム）またはフロイントの完全もしくは不完全アジュバントによって増加させることができる。免疫化に有用なポリペプチドは、また、融合ポリペプチド、例えば、ＶＥＧＦ−Ａまたはその一部と免疫グロブリンポリペプチドまたはマルトース結合性タンパク質との融合物を包含する。ポリペプチド免疫原は、全長分子またはその一部であってもよい。ポリペプチド部分がハプテン様である場合、それは、免疫化のために、巨大分子担体（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）または破傷風トキソイド）に有利に結合または連結させてもよい。
【００８９】
さらに、抗体は、抗体標的（例えば、オルソログ、パラログ、または配列変種）に関連する既知のポリペプチドに対してスクリーンして、例えば、該標的タンパク質またはポリペプチドに高度に特異的な抗体の集団を単離することができる。かかる高度に特異的な集団は、例えば、ヒトＶＥＧＦ−Ａに結合するが、マウスＶＥＧＦ−Ａに結合しない抗体を包含する。かかる関連するポリペプチド分子との交差反応性の欠如は、例えば、標準的なウェスタンブロット分析（Current Protocols in Molecular Biology (Ausubelら編、Green and Wiley and Sons, NY 1993)）またはＥＬＩＳＡ（酵素免疫アッセイ）（Immunoassay, A Practical Guide (Chan編、Academic Press, Inc. 1987)）を用いて、ＶＥＧＦ−Ａポリペプチドを検出するが、未知の関連するポリペプチドを検出しない抗体によって示される。別の例において、ＶＥＧＦ−Ａポリペプチドに対して生じた抗体は、不溶性マトリックスに接着した関連するポリペプチドに吸着され、該ＶＥＧＦ−Ａポリペプチドに高度に特異的な抗体は、適当なバッファー条件下で該マトリックス中を流れる。スクリーニングは、既知の密接に関連したポリペプチドに対して非交差反応性のポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の単離を可能にする（Antibodies: A Laboratory Manual (HarlowおよびLane編、Cold Spring Harbor Laboratory Press 1988); Current Protocols in Immunology (Cooliganら編、National Institutes of Health, John Wiley and Sons, Inc. 1995）。特異的抗体のスクリーニングおよび単離は、当該分野で周知である。Fundamental Immunology (Paul編、Raven Press 1993); Getzoffら、Adv. in Immunol. 43:1-98, 1988; Monoclonal Antibodies:  Principles and Practice (Goding編、Academic Press Ltd. 1996); Benjaminら、Ann. Rev. Immunol. 2:67-101, 1984参照のこと。
【００９０】
天然モノクローナル抗体（「ｍＡｂｓ」）は、例えば、対象動物（例えば、ラットまたはマウス）を精製した免疫原性タンパク質またはそのフラグメントで免疫化することによって、調製することができる。典型的な手法において、動物に各々、典型的にはアジュバント（例えば、完全フロイントのアジュバントまたはＲＩＢＩアジュバント（Sigma-Aldrich, St. Louis, MOから入手可能））と共に、精製タンパク質またはそのフラグメントの開始腹腔内（ＩＰ）注射し、次いで、例えば二週間間隔で、該精製タンパク質の追加免疫ＩＰ注射をする。３回目の追加免疫注射の７〜１０日後、動物を出血させ、血清を回収した。付加的な追加免疫を必要に応じて行うことができる。脾細胞およびリンパ節細胞を高タイター動物から採取し、常法を用いて、ミエローマ細胞（例えば、マウスＳＰ２／０またはＡｇ８細胞）に融合させる。次いで、該融合混合物を胸腺細胞のフィーダー層上で培養するか、または適当な培地補足物（市販の補足物、例えば、Hybridoma Fusion and Cloning Supplement; Roche Diagnostics, Indianapolis, INを包含する）と共に培養する。融合の約１０日後、標準的なアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）を用いて、特異的抗体産生ハイブリドーマプールを同定する。陽性プールをさらに、標的タンパク質の活性を遮断または減少させる能力について分析してもよい。限界希釈によって、陽性プールをクローン化する。
【００９１】
ある特定の態様において、本発明は、また、単一標的分子の異なるエピトープに特異的な複数のモノクローナル抗体の使用を包含する。かかる複数の抗体を組み合わせた使用は、単一の抗体で見られた担体効果を減少させることができ、また、Ｆｃ受容体を介するクリアランスの速度を増加させ、ＡＤＣＣを改善しうる。２、３またはそれ以上のモノクローナル抗体を組み合わせて用いることができる。
【００９２】
天然抗体のアミノ酸配列は、組み換えＤＮＡ技術の適用によって変化させることができる。かくして、抗体は、所望の特徴を得るように再設計することができる。修飾した抗体は、その非修飾抗体と比べて、例えば、改善された安定性および／または治療効果を提供することができる。可能な変化は多く、例えば、可変または定常領域のたった１個または２、３個のアミノ酸の変化から完全な再設計までの範囲である。定常領域の変化は、一般に、特徴、例えば、補体結合、膜との相互作用、および他のエフェクター機能を改善または改変するために行う。典型的には、可変領域の変化は、抗原結合性特徴を改善するために、可変領域安定性を改善するために、または免疫原性のリスクを減少させるために行う。ファージディスプレー技術もまた、用いることができる。例えば、Huseら、Science 246:1275-1281, 1989; Ladnerら、米国特許第5,571,698号参照のこと。
【００９３】
ヒトにおいて使用するための治療抗体の場合、通常、既知の手法にしたがって、抗体の非ヒト領域をヒト化することが望ましい。ヒト化抗体を作成する方法は、例えば、米国特許第5,530,101号、第5,821,337号、第5,585,089号、第5,693,762号、および第6,180,370号に開示される。典型的には、ヒト化抗−ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、マウスドナー免疫グロブリンの相補性決定領域（ＣＤＲｓ）、およびヒトアクセプター免疫グロブリンの重鎖および軽鎖フレームワークを含む。しばしば、ヒトフレームワーク領域中のフレームワーク残基は、抗原結合を改変、好ましくは改善するために、ＣＤＲドナー抗体由来の対応する残基で置換されるであろう。これらのフレームワーク置換は、当該分野で周知の方法によって、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するためのＣＤＲおよびフレームワーク残基の相互作用および特定の位置の異常なフレームワーク残基を同定するための配列比較のモデリングによって、同定される。（例えば、Queenら、米国特許第5,585,089号;Riechmannら、Nature 332:323, 1988参照のこと。）
【００９４】
非ヒト化キメラ抗体もまた、治療上使用することができる（例えば、免疫抑制患者において）。したがって、いくつかのバリエーションにおいて、本発明の抗体は、特に、非ヒト抗−ＶＥＧＦ−Ａ抗体から由来する、キメラ抗体である。好ましくは、キメラ抗体は、長い半減期を有し、かつ、ヒト対象に投与時にあまり免疫原性とならないように、マウスまたはラット抗体由来の可変領域およびヒト由来の定常領域を含む。キメラ抗体を製造する方法は、当該分野で既知である。（例えば、Morrison, Science 229:1202, 1985; Oiら、BioTechniques 4:214, 1986; Gilliesら、J. Immunol. Methods 125:191-202, 1989;米国特許第5,807,715号;第4,816,567号;および第4,816,397号参照のこと。）
【００９５】
本発明は、また、卵巣癌、乳癌、腎癌、結腸直腸癌、肺癌、子宮内膜癌または脳癌患者の末梢血単球由来のような完全ヒト抗体を包含する。かかる細胞は、例えば、ＶＥＧＦ−Ａに対する完全ヒト抗体を産生するハイブリドーマ細胞を形成させるために、ミエローマ細胞と融合させてもよい。ヒト抗体は、また、トランスジェニック非ヒト動物、通常はマウスにおいて作成することができる。例えば、Tomizukaら、米国特許第7,041,870号参照のこと。一般に、非ヒト哺乳動物は、ヒト重鎖座およびヒト軽鎖座についてトランスジェニックにされ、対応する内在性免疫グロブリン座は不活性化される。
【００９６】
本発明の抗体は、抗体が認識または特異的に結合するＶＥＧＦ−Ａポリペプチドのエピトープまたは部分に関して特定されうる。エピトープまたはポリペプチド部分は、例えば、配列番号７２に示されるＶＥＧＦ−Ａポリペプチドのエピトープまたは他の部分のＮ−末端およびＣ−末端位置によって、特定されうる。
【００９７】
本発明の抗体は、解離定数（Ｋｄ）５ｘ１０−２Ｍ未満、１０−２Ｍ未満、５ｘ１０−３Ｍ未満、１０−３Ｍ未満、５ｘ１０−４Ｍ未満、１０−４Ｍ未満、５ｘ１０−５Ｍ未満、１０−５Ｍ未満、５ｘ１０−６Ｍ未満、１０−６Ｍ未満、５ｘ１０−７Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、５ｘ１０−８Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、５ｘ１０−９Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、５ｘ１０−１０Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、５ｘ１０−１１Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満、５ｘ１０−１２Ｍ未満、１０−１２Ｍ未満、５ｘ１０−１３Ｍ未満、１０−１３Ｍ未満、５ｘ１０−１４Ｍ未満、１０−１４Ｍ未満、５ｘ１０−１５Ｍ未満、または１０−１５Ｍ未満を包含する結合アフィニティーを有する。
【００９８】
本発明の抗体は、さらに、例えば、いずれかの型の分子の抗体に対する共有結合によって（該共有結合は、該抗体がそのエピトープに結合するのを妨害しない）、修飾された誘導体を包含する。適当な修飾は、例えば、フコシル化、グリコシル化、アセチル化、ペグ化（pegylation）、リン酸化、およびアミド化を包含する。抗体およびその誘導体は、既知の保護／ブロッキング基、タンパク質分解性切断、細胞性リガンドまたは他のタンパク質への結合などによって誘導体化されたそれら自体であってもよい。本発明のいくつかの具体例において、抗体の少なくとも１つの重鎖がフコシル化されている。特定のバリエーションにおいて、フコシル化はＮ−連結されている。いくつかの特定の好ましい具体例において、抗体の少なくとも１つの重鎖は、フコシル化され、Ｎ−連結されたオリゴ糖を含む。
【００９９】
本発明の抗体は、単独で使用してもよく、または細胞傷害剤との免疫コンジュゲートとして使用されうる。いくつかの具体例において、該剤は、化学治療剤である。他の具体例において、該剤は、放射性同位元素、例えば、鉛−２１２、ビスマス−２１２、アスタチン−２１１、ヨウ素−１３１、スカンジウム−４７、レニウム−１８６、レニウム−１８８、イットリウム−９０、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１２５、臭素−７７、インジウム−１１１、またはホウ素−１０もしくはアクチニドなどの核分裂性核種である。また別の具体例において、該剤は、毒素または細胞毒薬、例えば、リシン、修飾シュードモナスエンテロトキシンＡ、カリケアミシン、アドリアマイシン、５−フルオロウラシル、オウリスタチン（auristatin）（例えば、オウリスタチンＥ）、マイタンシン（maytansin）などである。抗体および抗体フラグメントのかかる剤に対するコンジュゲーションの方法は、当該分野で既知である。
【０１００】
本発明の抗体は、参照抗体（例えば、表２または表３に示されるようなＶＬおよび／またはＶＨ配列を有する参照抗体）と比べて、単一または複数のアミノ酸置換、欠失、付加、または置き換え（replacement）を有する変種であって、その結果、該変種が、参照抗体の１以上の生物学的特性を保持するような（例えば、その各々のカウンター構造（ＶＥＧＦ−Ａ受容体）に対するＶＥＧＦ−Ａの結合を遮断する、ＶＥＧＦ−Ａの生物学的活性、結合アフィニティーを遮断する）変種を包含する。当業者は、単一または複数のアミノ酸置換、欠失、付加または置き換えを有する変種を作成することができる。これらの変種は、例えば、（ａ）１以上のアミノ酸残基が保存的または非保存的アミノ酸で置換された変種、（ｂ）１以上のアミノ酸が該ポリペプチドに付加された、または該ポリペプチドから欠失された変種、（ｃ）１以上のアミノ酸が置換基を含む変種、および（ｄ）該ポリペプチドが、融合パートナー、タンパク質タグまたは他の化学基のような、該ポリペプチドに有用な特性を付与しうる別のペプチドまたはポリペプチド、例えば、抗体のエピトープ、ポリヒスチジン配列、ビオチン基などと融合した変種を包含しうる。本発明の抗体は、１の種由来のアミノ酸残基が保存的または非保存的位置で、別の種の対応する残基の代わりに用いられた変種を包含しうる。別の具体例において、非保存的位置のアミノ酸残基は、保存的または非保存的残基で置換される。これらの変種を得るための技術は、遺伝的（抑制、欠失、変異など）、化学的、および酵素的技術を包含し、当業者に既知である。
【０１０１】
ＶＥＧＦ−Ａに結合する例示的抗体は、ファージディスプレーライブラリーをスクリーニングすることによって同定された。ファージディスプレーをスクリーニングする方法は、標準的な参考テキスト、例えば、Babas, Phage Display: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Lab Press, 2001)およびLo, Benny K.C., A., Antibody Engineering (2004)に詳細に記載されている。かかるファージディスプレーライブラリーは、相補的結合エンティティー（entity）が機能的に単離できるように、細胞または他の物質の表面上の発現タンパク質を展示するために使用することができる。一のかかるファージディスプレーライブラリーにおいて、抗体軽鎖可変領域および重鎖可変領域の一部を、ヒト抗体配列をコードしている合成ＤＮＡと組合せ、次いでそれをファージおよびファージミドライブラリー上に、Ｆａｂ抗体フラグメントとして展示する（ＤｙａｘＲ（登録商標）Human Antibody Libraries, Dyax Corp., Cambridge, MA.）。かくして、抗体の可変軽鎖および重鎖フラグメントをＦａｂフォーマットにおいて単離することができる。これらの可変領域を次いで、抗体結合フラグメント、例えば、ｓｃＦｖ、二重特異的ｓｃＦｖ、およびＶＥＧＦ−Ａに対する二重特異的な多機能的アンタゴニストを包含する抗体を作成するために操作することができる。
【０１０２】
該技術を用いて、例示的Ｆａｂの可変領域が、本明細書中に記載のアッセイにおいてＶＥＧＦ−Ａを結合および／または中和するその特徴について同定された。（下記の実施例を参照のこと。）これらの可変領域は、ＶＥＧＦ−Ａを結合および／または中和するｓｃＦｖｓを包含する種々の結合エンティティーを作成するために操作された。下記の表２は、ＶＥＧＦ−Ａを結合し、中和する能力について同定された抗−ＶＥＧＦ−Ａ抗体クラスターのためのヌクレオチドおよびアミノ酸配列番号指定を示し、一方、表３は、表２に挙げられた抗−ＶＥＧＦ−Ａ抗体のフレームワークおよびＣＤＲ領域に対応するアミノ酸残基位置を列挙する。
【０１０３】
【表２】
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【０１０４】
いくつかの具体例において、本発明の抗−ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、表２に挙げられた抗−ＶＥＧＦ−Ａ抗体の１以上のＣＤＲを含む（各々、表３に示される対応するＣＤＲ領域の境界）。例えば、ある特定の変種において、該抗体は、表２に挙げられた抗体の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３領域の少なくとも１つ）および／または対応する軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３領域の少なくとも１つ）を含む。典型的な具体例において、抗−ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、表２に挙げられた抗体の２または３個の重鎖ＣＤＲおよび／または２または３個の軽鎖ＣＤＲを有する。いくつかの変種において、抗−ＶＥＧＦ−Ａ抗体が表２に挙げられた抗体の少なくとも１つの重鎖ＣＤＲを有する場合、該抗体は、さらに、少なくとも１つの対応する軽鎖ＣＤＲを含む。
【０１０５】
特定の変種において、抗−ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、重および／または軽鎖可変ドメインを含み、該重または軽鎖可変ドメインは、（ａ）表２に挙げられた抗体について示されるような重または軽鎖ＣＤＲに対応する３つのＣＤＲのセット、および（ｂ）４つのフレームワーク領域のセットを有する。例えば、抗−ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、重および／または軽鎖可変ドメインを含むことができ、ここに、該重または軽鎖可変ドメインは、（ａ）３つのＣＤＲのセットであって、該ＣＤＲのセットが表２に挙げられた抗体由来であるセット、および（ｂ）４つのフレームワーク領域のセットであって、該フレームワーク領域のセットが表２に挙げられた同じ抗体のフレームワーク領域のセットと同一または異なるセットを有する。
【０１０６】
特定の具体例において、抗−ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、表２に挙げられた抗体の重および／または軽鎖可変領域と実質的に同一の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を含む。
【０１０７】
本発明にしたがう抗−ＶＥＧＦ−Ａ抗体のいくつかの具体例において、ＬＣＤＲ１は、配列番号６６の残基２４−３４に示されるアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ２は、配列番号６６の残基５０−５６に示されるアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ３は、配列番号６６の残基８９−９７に示されるアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１は、抗体ｃ１０３９のＨＣＤＲ１アミノ酸配列（配列番号６８の残基３１−３５）を有し、ＨＣＤＲ２は、抗体ｃ１０３９のＨＣＤＲ２アミノ酸配列（配列番号６８の残基５０−６６）を有し、ＨＣＤＲ３は、配列番号６８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
【０１０８】
本発明にしたがう抗−ＶＥＧＦ−Ａ抗体の他の例において、ＬＣＤＲ１は、ｃ８７０およびｃ１０９４からなる群から選択される抗体のＬＣＤＲ１アミノ酸配列（各々、配列番号４８および５４の残基２３−３５）を有し、ＬＣＤＲ２は、ｃ８７０およびｃ１０９４からなる群から選択される抗体のＬＣＤＲ２アミノ酸配列（各々、配列番号４８および５４の残基５１−５７）を有し、ＬＣＤＲ３は、ｃ８７０およびｃ１０９４からなる群から選択される抗体のＬＣＤＲ３アミノ酸配列（各々、配列番号４８および５４の残基９０−１００）を有し、ＨＣＤＲ１は、ｃ８７０およびｃ１０９４からなる群から選択される抗体のＨＣＤＲ１アミノ酸配列（各々、配列番号４８および５４の残基３１−３５）を有し、ＨＣＤＲ２は、ｃ８７０およびｃ１０９４からなる群から選択される抗体のＨＣＤＲ２アミノ酸配列（各々、配列番号４８および５４の残基５０−６６）を有し、ＨＣＤＲ３は、各々、配列番号４８および５４の残基９９−１０２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。特定のバリエーションにおいて、抗−ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、ｃ８７０、ｃ１０３９およびｃ１０９４からなる群から選択される抗体のＣＤＲｓ  ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を有する。例えば、特定の具体例において、抗−ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、ｃ８７０、ｃ１０３９およびｃ１０９４からなる群から選択される抗体の軽および重鎖可変ドメイン（ＶＬおよびＶＨ）を有する。
【０１０９】
他の具体例において、本発明のしたがう抗−ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、ＣＤＲｓ  ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含むＶＬドメイン、およびＣＤＲｓ  ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含むＶＨドメインを含み、ここに、該ＶＬおよびＶＨ  ＣＤＲのセットは、ＣＤＲの第２のセットと比べて３個以下のアミノ酸置換を有し、ここに、該第２のＣＤＲのセットは、ｃ８７０、ｃ１０３９およびｃ１０９４からなる群から選択される抗体のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３アミノ酸配列を有する。特定のバリエーションにおいて、該抗体は、該ＣＤＲのセットにおいて、０、１または２個のアミノ酸置換を含む。
【０１１０】
本発明の抗−ＶＥＧＦ−Ａ抗体によって認識されるエピトープは、典型的に、ヒトＶＥＧＦ−Ａ１６５（配列番号７２の残基２７−１９１）の５またはそれ以上のアミノ酸を含む。好ましいエピトープは、ＶＥＧＦ−Ａの下記のポリペプチド領域：ＨＥＶＶＫＦＭＤＶＹＱＲＳＹＣＨＰＩＥＴＬ（配列番号７２のアミノ酸残基３８−５８）、ＥＹＩＦＫＰＳＣＶＰＬＭＲＣＧ（配列番号７２のアミノ酸残基７０−８４）、ＥＥＳＮＩＴＭＱＩＭＲＩＫＰＨＱＧ（配列番号７２のアミノ酸残基９８−１１４）、およびＰＣＧＰＣＳＥＲＲＫＨＬＦ（アミノ酸残基１４２−１５４）の１以上内に含まれる少なくとも１個のアミノ酸を含む。ある特定の具体例において、エピトープは、配列番号７２の残基３８−５８、７０−８４、９８−１１４および１４２−１５４に示されるようなＶＥＧＦ−Ａポリペプチド領域の１以上から由来する少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、または少なくとも７個のアミノ酸を含む。いくつかのバリエーションにおいて、かかるＶＥＧＦ−Ａエピトープは、重複するＶＥＧＦ−Ａペプチド（例えば、連続したペプチドの各ペア間の２個のアミノ酸シフトを伴う、例えば、１３−ｍｅｒペプチド）の使用を含むペプチドマイクロアレイエピトープマッピングによって決定されるようなエピトープである。
【０１１１】
上記の抗−ＶＥＧＦ−Ａ抗体の特定のバリエーションにおいて、抗−ＶＥＧＦ−Ａエピトープは、ＶＥＧＦ−Ａの下記のポリペプチド領域：ＫＦＭＤＶＹＱＲＳＹＣ（配列番号７２のアミノ酸残基４２−５２）、ＩＦＫＰＳＣＶＰＬＭＲ（配列番号７２のアミノ酸残基７２−８２）、ＩＭＲＩＫＰＨＱＧ（配列番号７２のアミノ酸残基１０６−１１４）、およびＰＣＧＰＣＳＥＲＲＫＨＬＦ（アミノ酸残基１４２−１５４）の１以上内に含まれる少なくとも１つのアミノ酸を含む。ある特定の具体例において、エピトープは、配列番号７２の残基４２−５２、７２−８２、１０６−１１４および１４２−１５４に示されるようなＶＥＧＦ−Ａポリペプチド領域の１以上から由来する少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、または少なくとも７個のアミノ酸を含む。
【０１１２】
いくつかの関連するバリエーションにおいて、本発明にしたがう抗−ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、（ａ）配列番号７２のアミノ酸残基３８−５８または４２−５２に示されるようなＶＥＧＦ−Ａの第１のポリペプチド領域内に含まれる１以上のアミノ酸および（ｂ）配列番号７２のアミノ酸残基７０−８４または７２−８２に示されるようなＶＥＧＦ−Ａの第２のポリペプチド領域内に含まれる１以上のアミノ酸を含むエピトープに結合する。
【０１１３】
上記の（ａ）および（ｂ）を含むエピトープに結合する抗−ＶＥＧＦ−Ａ抗体のある特定の具体例において、エピトープは、配列番号７２の残基９０〜１３２に示されるようなＶＥＧＦ−Ａのポリペプチド領域（ＥＧＬＥＣＶＰＴＥＥＳＮＩＴＭＱＩＭＲＩＫＰＨＱＧＱＨＩＧＥＭＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣＲＰ）内に含まれるアミノ酸を含まない。
【０１１４】
上記（ａ）および（ｂ）を含むエピトープに結合する抗−ＶＥＧＦ−Ａ抗体の他の具体例において、該エピトープは、さらに、（ｃ）配列番号７２の残基９６−１１４または１０６−１１４において示されるＶＥＧＦ−Ａの第３のポリペプチド領域に含まれる１以上のアミノ酸を含む。
【０１１５】
上記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含むエピトープに結合する抗−ＶＥＧＦ−Ａ抗体のいくつかの具体例において、該抗体は、ヒトおよびマウスＶＥＧＦ−Ａに対し、他の１０倍以内のＫｄ値で結合しない。
【０１１６】
上記（ａ）および（ｂ）を含むエピトープに結合する抗−ＶＥＧＦ−Ａ抗体のまた他のバリエーションにおいて、該エピトープは、さらに、（ｄ）配列番号７２の残基１４２−１５４に示されるＶＥＧＦ−Ａの第４のポリペプチド領域に含まれる１以上のアミノ酸を含む。
【０１１７】
ある特定の具体例において、抗−ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、抗体フラグメント、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、またはダイアボディである。いくつかの好ましい具体例において、抗−ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、ｓｃＦｖである。ＶＥＧＦ−Ａを結合するｓｃＦｖエンティティーは、可変軽鎖（ＶＬ）領域のアミノ末端を可変重鎖（ＶＨ）領域に配向するか、またはカルボキシル末端をＶＨ領域に配向させることができる。いくつかのバリエーションにおいて、抗−ＶＥＧＦ−Ａ  ｓｃＦｖは、表Ｘに列挙した抗−ＶＥＧＦ−Ａ抗体のＣＤＲを有する。特定のバリエーションにおいて、抗−ＶＥＧＦ−Ａ  ｓｃＦｖは、表２に列挙した抗−ＶＥＧＦ−Ａ抗体のＶＬおよびＶＨドメインを有する。ある特定の具体例において、抗−ＶＥＧＦ−Ａ  ｓｃＦｖのＶＬおよびＶＨドメインのＣＤＲは、ｃ８７０  ｃ１０３９およびｃ１０９４から選択される抗−ＶＥＧＦ−Ａ抗体のものである。抗−ＶＥＧＦ−Ａ  ｓｃＦｖの特定のバリエーションにおいて、該ｓｃＦｖは、配列番号７０（ｃ１０３９  ｓｃＦｖ；配列番号６９に示されるヌクレオチド配列）、配列番号４４（ｃ８７０．１ｅ６  ｓｃＦｖ；配列番号４３に示されるヌクレオチド配列）、または配列番号４６（ｃ１０９４．１  ｓｃＦｖ；配列番号４５に示されるヌクレオチド配列）に示されるアミノ酸配列を含む。さらに、ｓｃＦｖｓは、種々の二重特異的抗体フォーマット、例えば、タンデムｓｃＦｖ（ｔａｓｃＦｖ）、ビ−一本鎖Ｆｖ（ｂｉｓｃＦｖ）、およびカルボキシル末端に融合した一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を有する全モノクローナル抗体（ｂｉＡｂ）において提供されうる（下記参照）。
【０１１８】
Ｃ．Ｆｃタンパク質を用いてコンジュゲートされた二重特異的抗体／可溶性受容体組合せ
二重特異的結合性タンパク質は、図２に例示されるように、本発明の結合性タンパク質を免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域を介して組み合わせる。該Ｆｃ−融合タンパク質は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域を含む。さらなる具体例において、Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１分子由来である。いくつかの具体例において、該免疫グロブリン融合物は、ＩｇＧｌ分子のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３、またはヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３領域を包含する。
【０１１９】
免疫グロブリン融合物の製造について、米国特許第5,428,130号、米国特許第5,843,725号、米国特許第6,018,026号、およびChamowら、TIBTECH, 14: 52-60 (1996)も参照のこと。
【０１２０】
最も単純かつ率直なＦｃ−融合タンパク質設計は、しばしば、本発明のアンタゴニストポリペプチドの結合性ドメインを、免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域を介して組み合わせる。本発明のＦｃ−融合タンパク質において、結合成分をコードする核酸は、Ｃ末端に、免疫グロブリン定常ドメイン配列のＮ末端をコードする核酸を融合するが、Ｎ末端融合物もまた可能である。
【０１２１】
典型的には、かかる融合物において、コードされたキメラポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖の定常領域の少なくとも機能的に活性なヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを保持するであろう。融合は、また、定常ドメインのＦｃ部分のＣ末端に対して行われるか、または重鎖のＣＨ１もしくは軽鎖の対応する領域のＮ末端に隣接して行われる。融合が行われる正確な部位は重大ではなく、特定の部位がよく知られており、Ｆｃ融合タンパク質の生物学的活性、分泌、または結合特性を最適化するために選択されうる。
【０１２２】
好ましい具体例において、結合性ドメイン配列は、免疫グロブリンＧｌ（ＩｇＧｌ）のＦｃ領域のＮ末端に融合される。重鎖定常領域全体を結合性ドメイン配列に融合することが可能である。しかしながら、より好ましくは、ＩｇＧ  Ｆｃを化学的に定義付けるパパイン切断部位（すなわち、重鎖定常領域の最初の残基が１１４であるとして、残基２１６）または他の免疫グロブリンの類似部位のすぐ上流のヒンジ領域において開始する配列が該融合において使用される。特に好ましい具体例において、結合性ドメインアミノ酸配列は、ＩｇＧ重鎖の（ａ）ヒンジ領域およびＣＨ２およびＣＨ３または（ｂ）ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインに融合される。
【０１２３】
二重特異的Ｆｃ−融合タンパク質の場合、該Ｆｃ−融合タンパク質は、多量体として、特に、ヘテロ二量体またはヘテロ四量体として集合（assembled）される。一般に、これらの集合された免疫グロブリンは、既知の単位構造を有する。基本的な４鎖構造単位は、ＩｇＧ、ＩｇＤおよびＩｇＥが存在する形態である。４鎖単位は、高分子量免疫グロブリンにおいて繰り返され、一般に、ＩｇＭは、ジスルフィド結合によって結合された４つの基本単位からなる５量体として存在する。ＩｇＡグロブリン、および場合によりＩｇＧグロブリンもまた、血清中に多量体形態で存在しうる。多量体の場合、４単位の各々は同じであってもよく、または異なっていてもよい。
【０１２４】
別法では、Ｆｃ配列は、免疫グロブリン重鎖および軽鎖配列間に挿入でき、その結果、キメラ重鎖を含む免疫グロブリンが得られる。該具体例において、Ｆｃ配列は、免疫グロブリンの各アームにおいて、ヒンジおよびＣＨ２ドメイン間またはＣＨ２およびＣＨ３ドメイン間で、免疫グロブリン重鎖の３’末端に融合される。類似の構築物がHoogenboomら、Mol. Immunol., 28: 1027-1037 (1991)によって報告されている。
【０１２５】
免疫グロブリン軽鎖の存在は、本発明のＦｃ−融合タンパク質において必要とされないが、免疫グロブリン軽鎖は、結合性ドメイン−免疫グロブリン重鎖融合ポリペプチドに共有結合するか、または結合性ドメインに直接融合して存在するかもしれない。前者の場合、免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡは、典型的に、結合性ドメイン−免疫グロブリン重鎖融合タンパク質をコードしているＤＮＡと共発現する。分泌時、該ハイブリッド重鎖および軽鎖は、共有結合して、２つのジスルフィド結合された免疫グロブリン重鎖−軽鎖ペアを含む免疫グロブリン様構造を提供するであろう。かかる構造の調製に適当な方法は、例えば、米国特許第4,816,567号に開示されている。
【０１２６】
Ｆｃ−融合タンパク質は、最も好都合には、結合性ドメイン部分をフレーム内でコードしているｃＤＮＡ配列を免疫グロブリンｃＤＮＡ配列に融合することによって構築される。しかしながら、ゲノム免疫グロブリンフラグメントに対する融合もまた、使用できる（例えば、Aruffoら、Cell, 61: 1303-1313 (1990);およびStamenkovicら、Cell, 66: 1133-1144 (1991)参照）。後者のタイプの融合は、発現のためのＩｇ調節配列の存在を必要とする。ＩｇＧ重鎖定常領域をコードしているｃＤＮＡは、公開された配列に基づいて、脾臓または末梢血リンパ球由来のｃＤＮＡライブラリーから、ハイブリダイゼーションまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術によって単離できる。Ｆｃ−融合タンパク質の結合性ドメインおよび免疫グロブリン部分をコードしているｃＤＮＡは、選択された宿主細胞における効率の良い発現を指示するプラスミドベクター中にタンデムに挿入される。
【０１２７】
特定の修飾は、本発明において使用するためのＦｃ融合分子を作成するために有用なＦｃ配列を製造するために行われた。特に、Ｆｃ融合タンパク質を作成するために、修飾されたヒトＩｇＧ１  Ｆｃの６つのバージョンを生じ、Ｆｃ−４８８（配列番号７６）、ならびにＦｃ４（配列番号７７）、Ｆｃ５（配列番号７４）、Ｆｃ６（配列番号７８）、およびＦｃ７（配列番号７９）と名付けた。Ｆｃ４、Ｆｃ５およびＦｃ６は、ＦｃγＲＩ結合および補体Ｃ１ｑ結合を減少させることによってＦｃによって媒介されるエフェクター機能を減少させるための変異を含む。Ｆｃ４は、Ｆｃ−４８８中に導入されたのと同じアミノ酸置換を含有する。付加的なアミノ酸置換は、可能性のあるＦｃ媒介性エフェクター機能を減少させるために導入された。特に、ＦｃγＲＩ結合を減少させるために、３つのアミノ酸置換が導入された。これらは、ＥＵインデックス位置２３４、２３５、および２３７にある置換である。これらの位置の置換は、ＦｃγＲＩに対する結合を減少させることが示された（Duncanら、Nature 332:563 (1988)）。これらのアミノ酸置換は、また、ＦｃγＲＩＩａ結合、ならびにＦｃγＲＩＩＩ結合を減少させうる（Sondermannら、Nature 406:267 (2000); Winesら、J. Immunol. 164:5313 (2000)）。
【０１２８】
いくつかのグループは、補体Ｃ１ｑ結合および続く補体結合におけるＥＵインデックス位置３３０および３３１の関連性を記載している（CanfieldおよびMorrison, J. Exp. Med. 173:1483 (1991); Taoら、J. Exp. Med. 178:661 (1993)）。これらの位置のアミノ酸置換は、補体結合を減少させるためにＦｃ４に導入された。Ｆｃ４のＣＨ３ドメインは、クローン化ＤＮＡをイー・コリ（E. coli）のdamプラス株中で増殖させる場合に、可能性のあるｄａｍメチル化部位を排除するためにＴＧＡからＴＡＡへ変化させた終止コドンを除き、対応する野生型ポリペプチドにおいて見出されるドメインと同一である。
【０１２９】
Ｆｃ５において、ＢｇｌＩＩクローニングスキームは、該特定のＦｃを含有する融合タンパク質において使用しなかったので、ＥＵインデックス位置２１８にてアルギニン残基はリジンに復帰変異した。Ｆｃ５配列の残りは、Ｆｃ４の上記の記載と合致する。
【０１３０】
Ｆｃ６は、カルボキシル末端リジンコドンが排除されたことを除き、Ｆｃ５と同一である。成熟免疫グロブリンのＣ−末端リジンは、しばしば、Ｂ細胞からの分泌前に、翻訳後に成熟免疫グロブリンから除去されるか、または血清循環の間に除去される。結果的に、Ｃ末端リジン残基は、典型的に、循環している抗体において見出されない。上記のＦｃ４およびＦｃ５におけるように、Ｆｃ６配列中の終止コドンは、ＴＡＡに変化された。
【０１３１】
Ｆｃ７は、ＣＨ２ドメインに配置されたＥＵインデックス位置２９７のアミノ酸置換を除き、野生型γ１  Ｆｃと同一である。ＥＵインデックス位置Ａｓｎ−２９７は、Ｎ−連結された炭水化物結合の部位である。Ｎ−連結された炭水化物は、炭水化物構造中の可能性のあるバッチ間変異のため、組み換え発現されたタンパク質中において、変異性の可能性のある発生源を導入する。該可能性のある変異性を排除する試みにおいて、Ａｓｎ−２９７をグルタミン残基に変異させて、該残基位置でのＮ−連結された炭水化物の結合を防ぐ。残基２９７での炭水化物は、また、ＦｃＲＩＩＩに対するＦｃ結合に関与する（Sondermannら、Nature 406:267 (2000)）。したがって、炭水化物の除去は、一般に、ＦｃγＲｓに対する組み換えＦｃ７含有融合タンパク質の結合を減少させるものである。上記のように、Ｆｃ７配列中の終止コドンは、ＴＡＡに変化された。
【０１３２】
これらの分子のロイシンジッパー形態もまた、本発明によって意図される。「ロイシンジッパー」は、その融合パートナー（例えば、ロイシンジッパーが融合または連結する配列または分子）の二量体化または三量体化を増加、促進または駆動するロイシンに富む配列を示すために当該分野で使用される用語である。種々のロイシンジッパーポリペプチドが当該分野で記載されている。例えば、Landschulzら、Science, 240: 1759 (1988); 米国特許第5,716,805号; WO 94/10308; Hoppeら、FEBS Letters, 344: 1991 (1994); Maniatisら、Nature, 341: 24 (1989)を参照のこと。本発明のポリペプチドの５’または３’末端にロイシンジッパー配列を融合してもよいことは、当業者に明らかであろう。
【０１３３】
融合タンパク質は、一般に、化学的コンジュゲーションを包含する標準的な技術を用いて調製されうる。融合タンパク質は、また、標準的な技術によって、発現系において組み換えタンパク質として発現させることもできる。適当なリンカーは、さらに、本明細書中、下記に記載される。
【０１３４】
リンカーは、天然、合成、またはその両方の組合せであることができる。例えば、合成リンカーは、例えば配列およびサイズの両方において、ランダム化リンカーであることができる。一の態様において、ランダム化リンカーは、完全にランダムな配列を含むことができ、または所望により、ランダム化リンカーは、天然リンカー配列に基づくことができる。該リンカーは、例えば、非ポリペプチド部分（例えば、ポリヌクレオチド）、ポリペプチドなどを含むことができる。
【０１３５】
リンカーは、強固（rigid）であることができ、あるいは柔軟であることができ、またはその両方の組合せであることができる。リンカー柔軟性は、リンカーおよびリンカーと相互作用するサブユニットの両方の組成の機能であることができる。リンカーは、２つの選択された結合エンティティー（例えば、２つの分離したポリペプチドまたはタンパク質、例えば、２つの異なる抗体）を結合し、該エンティティーを分離かつ別個に維持する。リンカーは、別個の特性、例えば、多量体において、同じ標的に対する複数の分離した結合部位、または例えば、多量体において、異なる標的に対する複数の分離した結合部位を維持したまま、該分離した別個のドメインを協力させることができる。いくつかの場合、ジスルフィド架橋は、２つの連結した結合エンティティー間またはリンカーと結合エンティティーとの間に存在する。
【０１３６】
２つ以上の結合エンティティーが連結しうる特定の場合に適当なリンカーの選択は、例えば、該結合エンティティーの性質、該二重特異的組成物が結合すべき標的の構造および性質、および／またはリンカー（例えば、ペプチドリンカー）のタンパク質分解および酸化に対する安定性を包含する種々のパラメーターに依存しうる。
【０１３７】
特に適当なリンカーポリペプチドは、主に、グリシン（Ｇｌｙ）、セリン（Ｓｅｒ）、アラニン（Ａｌａ）、およびスレオニン（Ｔｈｒ）から選択されるアミノ酸残基を包含する。例えば、該ペプチドリンカーは、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、ＡｌａおよびＴｈｒから選択されたアミノ酸残基を少なくとも７５％（該ペプチドリンカーに存在する残基の総数に基づいて計算される）、例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、または少なくとも９０％含有しうる。該ペプチドリンカーは、また、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａおよび／またはＴｈｒ残基のみからなってもよい。該ペプチドリンカーは、２つの結合エンティティーを、それらが互いに正確なコンホメーションを取って、所望の活性、例えば、標的分子に対する結合ならびにかかる標的結合に関連しうる他の活性（例えば、所定の生物分子に関するアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性）を保持するように連結するのに十分な長さを有するべきである。
【０１３８】
該目的のために適当な長さは、例えば、少なくとも１個、典型的には約５０個未満のアミノ酸残基、例えば、２−２５アミノ酸残基、５−２０アミノ酸残基、５−１５アミノ酸残基、８−１２アミノ酸残基または１１残基の長さである。他の適当なポリペプチドリンカーサイズは、例えば、約２〜約１５アミノ酸、約３〜約１５アミノ酸、約４〜約１２、約１０、約８、または約６アミノ酸を包含しうる。リンカーポリペプチドに含まれるための選択されたアミノ酸残基は、ポリペプチド多量体の活性または機能を有意に干渉しない特性を示すべきである。かくして、該ペプチドリンカーは、全体として見ると、該多量体の活性または機能と矛盾する電荷を示さない、または内部フォールディングを干渉しない、または目的の標的に対する該多量体の結合を深刻に妨害する１以上のドメインにおけるアミノ酸残基との結合もしくは他の相互作用を形成しないものである。
【０１３９】
ポリペプチドを新規な連結された融合ポリペプチド中に連結するための天然ならびに合成ペプチドリンカーの使用は、当該分野で周知である。（例えば、Hallewellら、J. Biol. Chem. 264, 5260-5268, 1989; Alfthanら、Protein Eng. 8, 725-731, 1995; Robinson and Sauer, Biochemistry 35, 109-116, 1996; Khandekarら、J. Biol. Chem. 272, 32190-32197, 1997; Faresら、Endocrinology 139, 2459-2464, 1998; Smallshawら、Protein Eng. 12, 623-630, 1999; U.S. Patent No. 5,856,456参照のこと。）
【０１４０】
ペプチドリンカーが幅広く使用される一例は、軽鎖可変領域（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）の可変領域が合成リンカーによって結合された一本鎖抗体の製造についてであり、多数の出版物が該特定の分野内に存在する。幅広く使用されるペプチドリンカーは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒアミノ酸配列の３回繰り返しからなる１５ｍｅｒ（（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３）（配列番号７３）である。他のリンカーが使用されており、ファージディスプレー技術、ならびに選択的感染性ファージ技術が適当なリンカー配列を多様化し、選択するために使用されている（Tangら、J. Biol. Chem. 271, 15682-15686, 1996; Henneckeら、Protein Eng. 11, 405-410, 1998）。ペプチドリンカーは、Ｔ細胞受容体、ラムダＣｒｏレプレッサー、Ｐ２２ファージＡｒｃレプレッサー、ＩＬ−１２、ＴＳＨ、ＦＳＨ、ＩＬ−５、およびインターフェロン−γなどのヘテロ−およびホモ−二量体タンパク質において個々の鎖を連結するために使用された。ペプチドリンカーは、また、融合ポリペプチドを作成するために使用された。種々のリンカーが用いられており、Ａｒｃレプレッサーの場合、ファージディスプレーを用いて、一本鎖タンパク質の安定性増加のためのリンカーの長さおよび組成を最適化した（RobinsonおよびSauer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5929-5934, 1998参照）。
【０１４１】
適当なリンカーを得るためのまた別の方法は、ランダム変異誘発によって、単純なリンカー（例えば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ）を最適化することによる。
【０１４２】
上記のように、一般的に、ペプチドリンカーは、少なくともある程度の柔軟性を有することが好ましい。したがって、いくつかのバリエーションにおいて、ペプチドリンカーは、１−２５個のグリシン残基、５−２０個のグリシン残基、５−１５個のグリシン残基、または８−１２個のグリシン残基を含有する。特に適当なペプチドリンカーは、典型的に、少なくとも５０％グリシン残基、例えば少なくとも７５％グリシン残基を含有する。いくつかの具体例において、ペプチドリンカーは、グリシン残基のみを含む。ある特定のバリエーションにおいて、ペプチドリンカーは、グリシンのほかに他の残基を含む。グリシン以外の好ましい残基は、Ｓｅｒ、Ａｌａ、およびＴｈｒ、特にＳｅｒを包含する。
【０１４３】
いくつかの場合、ある程度の強固性をペプチドリンカー中に提供することが望ましい、または必要な場合がある。これは、ペプチドリンカーのアミノ酸配列中にプロリン残基を含ませることによって達成されうる。かくして、別の具体例において、ペプチドリンカーは、少なくとも１つのプロリン残基をペプチドリンカーのアミノ酸配列中に含む。例えば、ペプチドリンカーは、アミノ酸残基の少なくとも２５％（例えば、少なくとも５０％または少なくとも７５％）がプロリン残基であるアミノ酸配列を有することができる。本発明のある特定の具体例において、ペプチドリンカーは、プロリン残基のみを含む。
【０１４４】
いくつかの具体例において、ペプチドリンカーは、非−ポリペプチド部分のための結合基を含むアミノ酸残基が導入されるように修飾される。かかるアミノ酸残基の例は、システインまたはリジン残基でありうる（次いで、該残基に非−ポリペプチド部分が結合する）。別法では、イン・ビボでのＮ−グリコシル化部位を有するアミノ酸配列を含むことである（それにより、糖部分が（イン・ビボで）ペプチドリンカーに結合する）。さらなる選択肢は、生じたｔＲＮＡおよびｔＲＮＡシンセターゼ（例えば、米国特許出願公開第2003/0082575号）を用いて非天然アミノ酸を遺伝学的にポリペプチド結合エンティティーまたはペプチドリンカー中に組み込むことである。例えば、ケト−チロシンの挿入は、発現したポリペプチドに対する部位特異的カップリングを可能にする。
【０１４５】
ある特定のバリエーションにおいて、ペプチドリンカーは、少なくとも１つのシステイン残基、例えば、１つのシステイン残基を含む。例えば、いくつかの具体例において、ペプチドリンカーは、少なくとも１つのシステイン残基ならびにＧｌｙ、Ｓｅｒ、ＡｌａおよびＴｈｒからなる群から選択されるアミノ酸残基を含む。いくつかのかかる具体例において、ペプチドリンカーは、グリシン残基およびシステイン残基を含み、例えば、グリシン残基およびシステイン残基のみを含む。典型的には、１つのペプチドリンカーにつき、たった１つのシステイン残基が含まれるであろう。システイン残基を含む特定のペプチドリンカーの一例は、アミノ酸配列Ｇｌｙｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙｍ（ここに、ｎおよびｍは、各々、１−１２、例えば、３−９、４−８、または４−７の整数である）を有するペプチドリンカーを包含する。
【０１４６】
上記のように、本発明は、ＦＧＦＲおよび抗−ＶＥＧＦ−Ａ抗体の二重特異的抗体／可溶性受容体の組合せを含む二重特異的結合性タンパク質を含む。いくつかのかかる具体例において、ＦＧＦＲおよび抗−ＶＥＧＦ−Ａ抗体が共有結合して（例えば、ペプチドリンカーを介して）、二重特異的結合性タンパク質を形成する。いくつかのバリエーションにおいて、該二重特異的結合性タンパク質は、免疫グロブリン重鎖定常領域、例えば、Ｆｃフラグメントを含む。特に適当なＦｃフラグメントは、例えば、１以上のエフェクター機能を減少または排除するように修飾されたＦｃ領域を含むＦｃフラグメント（例えば、配列番号７４に示されるアミノ酸配列を有するＦｃ５）を包含する。
【０１４７】
例えば、いくつかの具体例において、本発明にしたがうＶＥＧＦ−ＡおよびＦＧＦの両方の活性を減少させるＶＥＧＦ−Ａ抗体／可溶性ＦＧＦ受容体二重特異的結合性タンパク質は、本明細書中に記載の抗−ＶＥＧＦ−Ａ抗体部分の結合領域および本明細書に記載のＦＧＦＲ３のＦＧＦ結合部分を含む。ある特定の具体例において、ＦＧＦ結合部分は、本明細書中に記載のＦＧＦＲ３ＩＩＩｃである。ある特定の具体例において、ＦＧＦ結合部分は、ＦＧＦ受容体部分であり、ＦＧＦＲ３であることができ、特に、本明細書に記載のＦＧＦＲ３ＩＩＩｃである。ある特定の具体例において、二重特異的抗体／可溶性受容体タンパク質は、配列番号１３に示されるようなＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ（２３−３７５）、配列番号２に示されるようなＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ（２３−３７５）（Ｓ２４９Ｗ）、配列番号１９に示されるようなＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ（１４３−３７５）、配列番号１０に示されるようなＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ（１４３−３７５）（Ｓ２４９Ｗ）、配列番号１５に示されるようなＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ（２３−３７５）（Ｐ２５０Ｒ）、および配列番号２２に示されるようなＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ（１４３−３７５）（Ｐ２５０Ｒ）からなる群から選択されるＦＧＦＲ３であるＦＧＦ受容体部分を、配列番号４４に示されるようなｃ８７０．１ｅ６  ｓｃＦＶ、配列番号４６に示されるようなｃ１０９４．１  ｓｃＦＶ、配列番号５２に示されるようなｃ８７０  ｓｃＦＶ、および配列番号７０に示されるようなｃ１０３９  ｓｃＦＶからなる群から選択されるＶＥＧＦ−Ａ抗体部分と組み合わせて含む。他の具体例において、二重特異的抗体／可溶性受容体の組み合わせは、配列番号１３に示されるようなＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ（２３−３７５）、配列番号２に示されるようなＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ（２３−３７５）（Ｓ２４９Ｗ）、配列番号１９に示されるようなＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ（１４３−３７５）、配列番号１０に示されるようなＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ（１４３−３７５）（Ｓ２４９Ｗ）、配列番号１５に示されるようなＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ（２３−３７５）（Ｐ２５０Ｒ）、配列番号２２に示されるようなＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ（１４３−３７５）（Ｐ２５０Ｒ）からなる群から選択されるＦＧＦＲ３であるＦＧＦ結合部分、および配列番号４８に示されるようなｃ８７０  ＶＬおよび配列番号５０に示されるようなＶＨ、配列番号５４に示されるようなｃ１０９４  ＶＬおよび配列番号５６に示されるようなＶＨ、および配列番号６６に示されるような１０３９  ＶＬおよび配列番号６８に示されるようなＶＨからなる群から選択されるＶＥＧＦ−Ａ結合部分を含む。
【０１４８】
他の具体例において、本発明の二重特異的結合性タンパク質は、ＦＧＦＲ３（１４３−３７５）（Ｓ２４９Ｗ）Ｆｃ５  ｃ１０９４．１  ｐＺＭＰ３１（配列番号５８）、ＦＧＦＲ３（２３−３７５）（Ｓ２４９Ｗ）Ｆｃ５  ｃ１０９４．１  ｐＺＭＰ３１（配列番号６０）、ＦＧＦＲ３（１４３−３７５）（Ｓ２４９Ｗ）Ｆｃ５  ｃ８７０ｅ６  ｐＺＭＰ３１（配列番号６２）、およびＦＧＦＲ３（２３−３７５）（Ｓ２４９Ｗ）Ｆｃ５  ｃ８７０ｅ６  ｐＺＭＰ３１（配列番号６４）からなる群から選択されるＦＧＦＲ３部分およびＶＥＧＦ−Ａ抗体部分を具体化する。
【０１４９】
他の具体例において、ＦＧＦ結合性部分は、ＦＧＦＲ２である。ある特定の具体例において、ＦＧＦＲ２はＦＧＦＲ２ＩＩＩｃを含む。ある特定の具体例において、二重特異的抗体／可溶性受容体の組み合わせは、配列番号２４に示されるようなＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ（２２−３７７）、配列番号２９に示されるようなＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ（２２−３７７）（Ｓ２５２Ｗ）、配列番号３３に示されるようなＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ（２２−３７７）（Ｐ２５３Ｒ）、配列番号３７に示されるようなＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ（１４５−３７７）、配列番号４０に示されるようなＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ（１４５−３７７）（Ｓ２５２Ｗ）、および配列番号４２に示されるようなＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ（１４５−３７７）（Ｐ２５３Ｒ）からなる群から選択されるＦＧＦＲ２であるＦＧＦ結合性部分、および配列番号４４に示されるようなｃ８７０．１ｅ６  ｓｃＦＶ、配列番号４６に示されるようなｃ１０９４．１  ｓｃＦＶ、配列番号５２に示されるようなｃ８７０  ｓｃＦＶ、および配列番号７０に示されるようなｃ１０３９  ｓｃＦＶからなる群から選択されるＶＥＧＦ−Ａ結合性部分を含む。他の具体例において、二重特異的抗体／可溶性受容体の組み合わせは、配列番号２４に示されるようなＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ（２２−３７７）、配列番号２９に示されるようなＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ（２２−３７７）（Ｓ２５２Ｗ）、配列番号３３に示されるようなＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ（２２−３７７）（Ｐ２５３Ｒ）、配列番号３７に示されるようなＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ（１４５−３７７）、配列番号４０に示されるようなＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ（１４５−３７７）（Ｓ２５２Ｗ）、および配列番号４２に示されるようなＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ（１４５−３７７）（Ｐ２５３Ｒ）からなる群から選択されるＦＧＦＲ２であるＦＧＦ結合性部分、および配列番号４８に示されるようなｃ８７０  ＶＬおよび配列番号５０に示されるようなＶＨ、配列番号５４に示されるようなｃ１０９４  ＶＬおよび配列番号５６に示されるようなＶＨ、および配列番号６６に示されるような１０３９  ＶＬおよび配列番号６８に示されるようなＶＨからなる群から選択されるＶＥＧＦ−Ａ結合性部分を含む。
【０１５０】
ＩＩＩ．  ＶＥＧＦ−ＡおよびＦＧＦ二重特異的抗体／可溶性受容体の組み合わせタンパク質を製造するための核酸、宿主細胞、および方法
本発明の可溶性ＦＧＦＲポリペプチドは、細胞外ドメインまたはその部分をコードするＤＮＡを発現させることによって調製することができる。例えば、配列番号１３の残基３６−３８８を含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を用いて、ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃを調製することができる。Ｎ−末端切断型ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃは、配列番号１９の残基３６−２６８をコードするポリヌクレオチドを用いて調製することができる。ＦＧＦＲ２ＩＩＩｃを調製するために、配列番号２４の残基３６−３９１をコードするポリヌクレオチドを用いることができる。別の例において、配列番号３７の残基３６−２６８を含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を用いて、Ｎ−末端切断型ＦＧＦＲ２ＩＩＩｃを調製することができる。細胞外ドメインポリペプチドは、膜貫通型の細胞内ポリペプチドセグメントを実質的に含まない形態で調製されることが好ましい。宿主細胞からの受容体ドメインの輸送を指示するために、受容体ＤＮＡを、受容体の天然シグナル配列などの分泌ペプチドをコードする第２のＤＮＡセグメントに連結する。使用可能な他のシグナル配列は、ｔＰＡシグナル配列（下記の実施例に記載）、ＣＤ３３シグナル配列またはヒト成長ホルモンシグナル配列を包含する。分泌される受容体ドメインの精製を容易にするために、Ｃ−末端伸長、例えば、ポリ−ヒスチジンタグ、物質Ｐ、ＦｌａｇＴＭ（商標）ペプチド（Hoppら、Biotechnology 6:1204-1210, 1988；Eastman Kodak Co., New Haven, CTから入手可能）または抗体もしくは他の特異的結合剤を利用可能な別のポリペプチドまたはタンパク質を受容体ポリペプチドに融合することができる。
【０１５１】
本発明は、また、本発明の抗体の重鎖および／または軽鎖をコードする核酸を包含する。本発明の核酸は、表２（上掲）に列挙されるＶＬ−および／またはＶＨ−コードポリヌクレオチドと実質的に同一の領域を有する核酸を包含する。本発明の核酸は、また、相補的な核酸を包含する。いくつかの例において、該配列は、整列（align）させた場合、完全に相補的（ミスマッチがない）であろう。他の例において、該配列において、約２０％までのミスマッチが存在しうる。本発明のいくつかの具体例において、本発明の抗体の重鎖および軽鎖の両方をコードする核酸が提供される。本明細書中に提供される核酸配列は、コドン最適化、縮重配列、サイレント変異、および特定の宿主中での発現を最適化するための他のＤＮＡ技術を用いて活用することができ、本発明はかかる配列修飾を包含する。
【０１５２】
かくして、いくつかの態様において、本発明は、本明細書中に記載のＦＧＦＲおよび／またはＶＥＧＦ−Ａ抗体をコードする１以上のポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を提供する。いくつかのバリエーションにおいて、本発明のポリヌクレオチドは、ＦＧＦおよびＶＥＧＦ−Ａの両方に結合し、その活性を減少させるＶＥＧＦ−Ａ抗体／可溶性ＦＧＦ受容体二重特異的結合性タンパク質をコードする。当業者は、遺伝コードの縮重を考慮し、これらのポリヌクレオチド分子のなかで、相当数の配列バリエーションが可能なことを容易に認識するであろう。
【０１５３】
本発明の核酸は、その中に別の遺伝子配列またはエレメント（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を挿入して、その結合した配列またはエレメントの複製をもたらしうるベクター、例えば、プラスミド、コスミド、バクミド（bacmid）、ファージ、合成染色体（ＢＡＣ、ＹＡＣ）またはウイルス中にクローン化することができる。いくつかの具体例において、発現ベクターは、構造的に活性なプロモーターセグメント（例えば、限定するものではないが、ＣＭＶ、ＳＶ４０、伸長因子またはＬＴＲ配列）または誘導性プロモーター配列、例えば、ステロイド誘導性ｐＩＮＤベクター（Invitrogen）を含有し、ここに、該核酸の発現を調節することができる。本発明の発現ベクターは、さらに、調節配列、例えば、内部リボソーム侵入部位を含んでいてもよい。発現ベクターは、例えば、トランスフェクションによって、細胞中に導入することができる。
【０１５４】
したがって、本発明内で使用するためのタンパク質は、従来の技術にしたがって遺伝子操作された宿主細胞において生産することができる。適当な宿主細胞は、外来性ＤＮＡで形質転換またはトランスフェクトされることができ、培養により増殖することができる細胞型であり、細菌、真菌細胞、および培養された高等真核生物細胞（多細胞生物の培養細胞を包含する）、特に、培養胞乳動物細胞を包含する。クローン化ＤＮＡ分子を操作し、外来性ＤＮＡを種々の宿主細胞中に導入する技術は、Sambrookら、Molecular Cloning:  A Laboratory Manual (2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989）およびAusubelら（上掲）によって開示されている。
【０１５５】
一般に、目的のタンパク質をコードしているＤＮＡ配列は、発現ベクター内で、その発現に必要な他の遺伝子エレメント（一般的に、転写プロモーターおよびターミネーターを包含する）に操作可能に連結される。ベクターは、また、一般に、１以上の選択マーカーおよび１以上の複製起点を含有するが、当業者は、ある特定の系内で、選択マーカーを別々のベクターに提供してもよく、外来性ＤＮＡの複製は、宿主細胞ゲノム中への組み込みによって提供されうることを認識するであろう。プロモーター、ターミネーター、選択マーカー、ベクターおよび他のエレメントの選択は、当業者のレベル内のルーチンな設計の事柄である。多くのかかるエレメントは、文献に記載されており、商業的供給元を介して入手可能である。
【０１５６】
宿主細胞の分泌経路中に組み換えタンパク質を向けるために、分泌シグナル配列（リーダー配列、プレプロ配列またはプレ配列としても知られる）を発現ベクター中に提供する。分泌シグナル配列は、組み換えタンパク質の天然形態のものであってもよく、または別の分泌されたタンパク質由来であってもよく（例えば、ｔ−ＰＡ；米国特許第5,641,655号参照）、またはデノボ合成されたものであってもよい。分泌シグナル配列は、タンパク質コード化ＤＮＡ配列に操作可能に連結され、すなわち、該２つの配列は、正しいリーディングフレーム中で結合され、該新たに合成されたポリペプチドが宿主細胞の分泌経路中に向けられるように配置される。分泌シグナル配列は、一般に、目的のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に対し５’に配置されるが、ある特定のシグナル配列は、目的のＤＮＡ配列のどこに配置されていてもよい（例えば、Welchら、米国特許第5,037,743号; Hollandら、米国特許第5,143,830号参照）。特定のバリエーションにおいて、本発明にしたがって使用するための分泌シグナル配列は、配列番号２、１０、１３、１５、１９、２２、２４、２９、３３、３７、４０、４２、５８、６０、６２、および６４の残基１−３５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
【０１５７】
培養哺乳動物細胞は、本発明内で使用するための組み換えタンパク質の生産に適当な宿主である。外来性ＤＮＡを哺乳動物宿主細胞中に導入するための方法は、リン酸カルシウム媒介性トランスフェクション（Wiglerら、Cell 14:725, 1978; CorsaroおよびPearson, Somatic Cell Genetics 7:603, 1981: GrahamおよびVan der Eb, Virology 52:456, 1973）、エレクトロポレーション（Neumannら、EMBO J. 1:841-845, 1982）、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション（Ausubelら、上掲）、およびリポソーム媒介性トランスフェクション（Hawley-Nelsonら、Focus 15:73, 1993; Ciccaroneら、Focus 15:80, 1993）を包含する。培養哺乳動物細胞における組み換えポリペプチドの生産は、例えば、Levinsonら、米国特許第4,713,339号; Hagenら、米国特許第4,784,950号; Palmiterら、米国特許第4,579,821号;およびRingold, 米国特許第4,656,134号によって開示されている。適当な哺乳動物宿主細胞の例は、アフリカミドリザル腎臓細胞（Vero; ATCC CRL 1587）、ヒト胚性腎臓細胞（293-HEK; ATCC CRL 1573）、ベビーハムスター腎臓細胞（BHK-21, BHK-570; ATCC CRL 8544, ATCC CRL 10314）、イヌ腎臓細胞（MDCK; ATCC CCL 34）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO-K1; ATCC CCL61; CHO DG44; CHO DXB11（Hyclone, Logan, UT）；例えば、Chasinら、Som. Cell. Molec. Genet. 12:555, 1986参照））、ラット下垂体細胞（GH1; ATCC CCL82）、ＨｅＬａ  Ｓ３細胞（ATCC CCL2.2）、ラット肝癌細胞（H-4-II-E; ATCC CRL 1548）、ＳＶ４０−形質転換サル腎臓細胞（COS-1; ATCC CRL 1650）およびネズミ胚細胞（NIH-3T3; ATCC CRL 1658）を包含する。さらなる適当な細胞系は、当該分野で知られており、American Type Culture Collection, Manassas, Virginiaなどの公共の受託機関から入手可能である。強力な転写プロモーター、例えば、ＳＶ−４０またはサイトメガロウイルス由来のプロモーターを使用することができる。例えば、米国特許第4,956,288号を参照のこと。他の適当なプロモーターは、メタロチオネイン遺伝子由来のもの（米国特許第4,579,821号および第4,601,978号）およびアデノウイルス主要後期プロモーターを包含する。
【０１５８】
薬剤選択は、一般的に、外来性ＤＮＡを挿入した培養哺乳動物細胞を選択するために使用される。かかる細胞は、一般に、「トランスフェクタント」と呼ばれる。選択剤の存在下で培養し、目的の遺伝子をその子孫に伝えることのできる細胞は、「安定なトランスフェクタント」と呼ばれる。例示的な選択マーカーは、抗生物質ネオマイシンに対する耐性をコードしている遺伝子（ネオマイシンの存在下で選択を実施することが可能になる）、例えば、Ｇ−４１８など、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼのｇｐｔ遺伝子（ミコフェノール酸／キサンチンの存在下で宿主細胞成長が可能となる）、およびゼオシン（zeocin）、ブレオマイシン（bleomycin）、ブラストシジン（blastocidin）およびハイグロマイシン（hygromycin）に対する耐性を提供するマーカー（例えば、Gatignolら、Mol. Gen. Genet. 207:342, 1987; Drocourtら、Nucl. Acids Res. 18:4009, 1990参照）を包含する。選択系は、また、目的の遺伝子の発現レベルを増加させるために使用することができる（「増幅」と呼ばれるプロセス）。増幅は、低レベルの選択剤の存在下でトランスフェタントを培養し、次いで、選択剤の量を増やして、高レベルの導入遺伝子生産物を産生する細胞を選択することによって実施される。例示的な増幅選択マーカーは、ジヒドロ葉酸還元酵素であり、それはメトトレキサートに対する耐性を付与する。他の薬剤耐性遺伝子（例えば、ハイグロマイシン耐性、多剤耐性、ピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ）も使用できる。
【０１５９】
他の高等真核細胞もまた、宿主として使用でき、昆虫細胞、植物細胞および鳥類細胞を包含する。植物細胞中で遺伝子を発現するためのベクターとしてのアグロバクテリウム・ライゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）の使用は、Sinkarら、J. Biosci. (Bangalore) 11:47-58, 1987によって概説されている。昆虫細胞の形質転換およびその外来性ポリペプチドの産生は、Ｇｕａｒｉｎｏら、米国特許第5,162,222号およびWIPO公開第WO 94/06463号によって開示されている。
【０１６０】
昆虫細胞は、一般にオートグラファ・カリフォルニカ（Autographa californica）核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）から由来する、組み換えバキュロウイルスに感染させることができる。KingおよびPossee, The Baculovirus Expression System:  A Laboratory Guide (Chapman＆Hall, London); O’Reillyら、 Baculovirus Expression Vectors:  A Laboratory Manual (Oxford University Press., New York 1994);およびBaculovirus Expression Protocols. Methods in Molecular Biology (Richardson ed., Humana Press, Totowa, NJ, 1995)を参照のこと。組み換えバキュロウイルスは、また、Luckowら(J. Virol. 67:4566-4579, 1993）によって記載されるトランスポゾンに基づく系によって生産することができる。該系は、トランスファーベクターを利用するが、キット形態で市販されている（ＢＡＣ−ＴＯ−ＢＡＣキット； Life Technologies, Gaithersburg, MD）。トランスファーベクター（例えば、ＰＦＡＳＴＢＡＣ１； Life Technologies）は、目的のタンパク質をコードするＤＮＡを、「バクミド」と呼ばれる大きなプラスミドとしてイー・コリ中に維持されたバキュロウイルスゲノム中に移動させるためのＴｎ７トランスポゾンを含有する。Hill-PerkinsおよびPossee, J. Gen. Virol. 71:971-976, 1990; Bonningら、J. Gen. Virol. 75:1551-1556, 1994;およびChazenbalkおよびRapoport, J. Biol. Chem. 270:1543-1549, 1995を参照のこと。さらに、トランスファーベクターは、上記のようなポリペプチド伸長またはアフィニティータグをコードするＤＮＡとのフレーム内融合を包含することができる。当該分野で既知の技術を用いて、タンパク質コード化ＤＮＡ配列を含有するトランスファーベクターをイー・コリ宿主細胞中に形質転換し、該細胞を、組み換えバキュロウイルスを示す遮断されたｌａｃＺ遺伝子を含有するバクミドについてスクリーンする。組み換えバキュロウイルスゲノムを含有するバクミドＤＮＡを通常の技術を用いて単離し、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞、例えばＳｆ９細胞をトランスフェクトするために使用する。次いで、目的のタンパク質を発現する組み換えウイルスが産生する。組み換えウイルスストックは、当該分野で通常使用される方法によって作成される。
【０１６１】
タンパク質生産のために、組み換えウイルスを用いて宿主細胞を、典型的には、シマジロクサヨトウ（fall armyworm）、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）（例えば、Ｓｆ９またはＳｆ２１細胞）またはトリコプラジア・ニ（Trichoplusia ni）（例えば、ＨＩＧＨ  ＦＩＶＥ細胞； Invitrogen, Carlsbad, CA）由来の細胞系を感染させる。一般的に、GlickおよびPasternak, Molecular Biotechnology, Principles & Applications of Recombinant DNA (ASM Press, Washington, D.C., 1994)を参照のこと。また、米国特許第5,300,435号も参照のこと。無血清培地を用いて、細胞を増殖および維持する。適当な培地処方は、当該分野で既知であり、商業的供給元から得ることができる。細胞は、約２−５ｘ１０５細胞の接種密度から約１−２ｘ１０６細胞密度まで増殖させ、該時点で、組み換えウイルスストックを感染多重度（ＭＯＩ）０．１〜１０、より典型的には約３で加える。使用される手法は、一般的に、入手可能な研究室マニュアル（例えば、KingおよびPossee（上掲）；  O’Reillyら（上掲）；  Richardson（上掲））に記載されている。
【０１６２】
酵母細胞を包含する真菌細胞もまた、本発明内で使用することができる。この点で特に興味深い酵母種は、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、ピチア・パストリス（Pichia pastoris）、およびピチア・メタノリカ（Pichia methanolica）を包含する。エス・セレビシエ細胞を外来性ＤＮＡで形質転換し、そこから組み換えポリペプチドを産生する方法は、例えば、Kawasaki、米国特許第4,599,311号; Kawasakiら、米国特許第4,931,373号; Brake,米国特許第4,870,008号; Welchら、米国特許第5,037,743号;およびMurrayら、米国特許第4,845,075号によって開示されている。形質転換細胞は、選択マーカー、一般的には、薬剤耐性または特定の栄養素（例えば、ロイシン）の不在下での増殖能によって決定される表現型によって選択される。サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）において使用するための例示的なベクター系は、Ｋａｗａｓａｋｉら（米国特許第4,931,373号）によって開示されるＰＯＴ１ベクター系であり、形質転換細胞をグルコース含有培地中での増殖によって選択することができる。酵母において使用するための適当なプロモーターおよびターミネーターは、糖分解酵素遺伝子（例えば、Kawasaki, 米国特許第4,599,311号; Kingsmanら、米国特許第4,615,974号;およびBitter,米国特許第4,977,092号参照）およびアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子由来のものを包含する。米国特許第4,990,446号; 第5,063,154号; 第5,139,936号; および第4,661,454号を参照のこと。ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、クルイベロマイセス・フラギリス（Kluyveromyces fragilis）、ウスティラゴ・マイディス（Ustilago maydis）、ピチア・パストリス（Pichia pastoris）、ピチア・メタノリカ（Pichia methanolica）、ピチア・グイレルモンディイ（Pichia guillermondii）、およびカンディダ・マルトサ（Candida maltosa）を包含する他の酵母のための形質転換系は、当該分野で既知である。例えば、Gleesonら、J. Gen. Microbiol. 132:3459-3465, 1986; Cregg, 米国特許第4,882,279号; およびRaymondら、Yeast 14:11-23, 1998を参照のこと。アスペルギルス（Aspergillus）細胞は、ＭｃＫｎｉｇｈｔら、米国特許第４，９３５，３４９号の方法にしたがって利用されうる。アクレモニウム・クリソゲナム（Acremonium chrysogenum）を形質転換する方法は、Suminoら、米国特許第5,162,228号によって開示される。ニューロスポラ（Neurospora）を形質転換する方法は、Lambowitz, 米国特許第4,486,533号によって開示される。ピチア・メタノリカ（Pichia methanolica）における組み換えタンパク質の生産は、米国特許第5,716,808号; 第5,736,383号; 第5,854,039号; および第5,888,768号において開示される。
【０１６３】
細菌エシェリキア・コリ（Escherichia coli）、バチルス（Bacillus）、および他の属を包含する原核生物宿主細胞もまた、本発明内の有用な宿主細胞である。これらの宿主を形質転換し、そこでクローン化した外来性ＤＮＡ配列を発現させる技術は、当該分野で周知である（例えば、Sambrookら（上掲）参照）。イー・コリなどの細菌中で組み換えタンパク質を発現する場合、該タンパク質は、細胞質中で、典型的には不溶性顆粒として保持されてもよく、または細菌分泌配列によって細胞周辺腔に向けられてもよい。前者の場合、細胞を溶解し、顆粒を回収し、例えば、グアニンイソチオシアネートまたは尿素を用いて、変性させる。次いで、変性させたタンパク質は、変性剤を希釈することによって、例えば、尿素ならびに還元および酸化グルタチオンの組み合わせの溶液に対する透析、次いで、緩衝化セーライン溶液に対する透析によって、リフォールディングおよび二量体化することができる。別法では、該タンパク質を可溶性形態で細胞質から回収し、変性剤を使用することなく、単離してもよい。該タンパク質は、細胞から、例えば、リン酸緩衝化セーライン中の水性抽出物として回収される。目的のタンパク質を捕獲するために、該抽出物を直接、クロマトグラフィー媒体、例えば、固定化抗体またはヘパリン−セファロースカラムに付す。分泌されるタンパク質は、細胞周辺腔から、（例えば、超音波処理または浸透圧衝撃によって）細胞を破壊して細胞周辺腔の内容物を放出させ、該タンパク質を回収することによって、可溶性の機能的形態で回収することができ、それにより、変性およびリフォールディングの必要性を回避する。一本鎖抗体を包含する抗体は、既知の方法にしたがって、細菌性宿主細胞中で産生することができる。例えば、Birdら、Science 242:423-426, 1988; Hustonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883, 1988; and Pantolianoら、Biochem. 30:10117-10125, 1991参照のこと。
【０１６４】
形質転換またはトランスフェクト宿主細胞は、栄養素および選択した宿主細胞の増殖に必要な他の成分を含有する培養培地中で常法にしたがって培養する。規定培地および複合培地を包含する種々の適当な培地が当該分野で知られており、一般的に、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミンおよびミネラルを包含する。培地は、また、必要に応じて、成長因子または血清のような成分も含有しうる。増殖培地は、一般的に、例えば、発現ベクター上で運搬されるか、または宿主細胞中に共トランスフェクトされた選択マーカーによって、薬剤選択または補足された必須栄養素の欠失によって、外から加えられたＤＮＡを含有する細胞について選択するであろう。
【０１６５】
ＶＥＧＦ−Ａ抗体／可溶性ＦＧＦ受容体二重特異的結合性タンパク質を含む二重特異的結合性タンパク質は、通常のタンパク質精製法によって、典型的には、クロマトグラフィー技術の組み合わせによって精製される。一般的に、Affinity Chromatography:  Principles & Methods (Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden, 1988); Scopes, Protein  Purification:  Principles and Practice (Springer-Verlag, New York 1994)を参照のこと。免疫グロブリン重鎖ポリペプチドを含むタンパク質は、固定化タンパク質Ａ上のアフィニティークロマトグラフィーによって精製することができる。付加的な精製工程、例えば、ゲルろ過を用いて、所望のレベルの純度を得るか、または脱塩、バッファー交換などを提供することができる。
【０１６６】
抗体は、既知の方法、例えば、従来のカラムおよび他の装置を用いるアフィニティークロマトグラフィーによって、細胞培養培地から精製することができる。典型的な手法において、馴化培地を得、５日まで４℃で保存してもよい。コンタミネーションを回避するために、静菌剤（例えば、アジ化ナトリウム）を一般的に添加する。培地のｐＨは、例えば、氷酢酸滴下によって、（典型的にはｐＨ〜５．５に）低下させる。より低いｐＨは、タンパク質Ｇ樹脂を介する最適なＩｇＧ捕獲を提供する。タンパク質Ｇカラムサイズは、馴化培地の容量に基づいて決定される。パックしたカラムを適当なバッファー、例えば、３５ｍＭ  ＮａＰＯ４、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．２で中和する。次いで、該培地を中和タンパク質ｇ樹脂に、培地の容量およびカラムサイズの容量の両方によって決定された流速で通過させる。付加的にカラムを通過させる可能性のために、通過物（flowthrough）を保持する。次いで、捕獲抗体を有する樹脂を中和バッファー中に洗浄する。酸性溶出バッファー、例えば、０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．７または等価物を用いて、カラムをフラクションに溶出する。各フラクションを、例えば、ｔｒｉｓ：グリシン  １：２０比の２Ｍ  ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０を用いて、中和する。タンパク質含有フラクション（例えば、Ａ２８０に基づく）をプールする。脱塩カラムを用いて、プールしたフラクションを適当なバッファー、例えば、３５ｍＭ  ＮａＰＯ４、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．２中にバッファー交換する。１．４４の吸光係数を用いて、Ａ２８０によって濃度を決定する。内毒素レベルは、ＬＡＬアッセイによって決定してもよい。精製タンパク質は、典型的には−８０℃にて、凍結保存してもよい。
【０１６７】
機能的ＶＥＧＦ−Ａ抗体／可溶性ＦＧＦ受容体二重特異的結合性タンパク質を発現する細胞は、スクリーニングアッセイ内で使用される。種々の適当なアッセイは、当該分野で既知である。これらのアッセイは、標的細胞中での生物学的応答の検出に基づく。１のかかるアッセイは、細胞増殖アッセイである。細胞は、試験化合物の存在下または非存在下で培養し、細胞増殖を、例えば、トリチウム化チミジンの取り込みを測定することによって、または３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）の代謝的分解に基づく比色アッセイによって、検出される（Mosman, J. Immunol. Meth. 65: 55-63, 1983）。別のアッセイフォーマットは、レポーター遺伝子を発現するようにさらに操作した細胞を用いる。該レポーター遺伝子は、受容体関連経路に応答するプロモーターエレメントに連結し、該アッセイは、該レポーター遺伝子の転写活性を検出する。この点において、好ましいプロモーターエレメントは、血清応答エレメント、またはＳＲＥである。（例えば、Shawら、Cell 56:563-572, 1989参照のこと。）好ましいかかるレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ遺伝子である。（de Wetら、 Mol. Cell. Biol. 7:725, 1987参照のこと。）ルシフェラーゼ遺伝子の発現は、当該分野で既知の方法を用いてルミネスセンスによって検出される。（例えば、Baumgartnerら、J. Biol. Chem. 269:29094-29101, 1994; SchenbornおよびGoiffin, Promega Notes 41:11, 1993参照のこと。）ルシフェラーゼ活性アッセイキットは、例えば、Promega Corp., Madison, WIから、市販されている。該型の標的細胞系統は、化学物質のライブリラー、細胞馴化培養培地、真菌ブロス、土壌試料、水試料などをスクリーンするために使用できる。例えば、細胞馴化培地試料のバンクを標的細胞上でアッセイして、リガンドを生産する細胞を同定することができる。次いで、陽性細胞は、プールに分け、宿主細胞中にトランスフェクトし、発現させる哺乳動物発現ベクターにおけるｃＤＮＡライブラリーを製造するために使用される。次いで、トランスフェクト細胞由来の培地試料をアッセイし、次いでプールに分け、再トランスフェクションし、二次培養し、陽性細胞を再アッセイして、リガンドをコードしているクローン化ｃＤＮＡを単離する。
【０１６８】
ＩＶ．  治療方法
Ａ．  全般
別の態様において、本発明は、脈管形成を阻害する方法、特に、脈管形成に関連する疾患または障害を治療する方法を提供する。一般的に、かかる方法は、脈管形成を阻害するのに有効な量で二重特異的抗体／可溶性受容体の組み合わせを含む二重特異的結合性タンパク質を対象に投与することを含む。より特別には、治療的使用のために、該二重特異的結合性タンパク質は、脈管形成の増加によって特徴付けられる疾患または障害（「血管新生障害」）に罹患しているか、または該疾患または障害を発症するリスクが高い対象に投与される。本発明にしたがう治療に応じやすい血管新生障害は、例えば、充実性腫瘍成長によって特徴付けられる癌（例えば、膵臓癌、腎細胞癌（ＲＣＣ）、結腸直腸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、グリア芽腫、および消化管間質主要（ＧＩＳＴ））ならびに種々の血管新生眼障害（例えば、加齢黄斑変性、糖尿病性網膜症、虹彩新生血管、および血管新生緑内障）を包含する。本発明にしたがう治療に応じやすい他の血管新生障害は、例えば、関節リウマチ、乾癬、アテローム性動脈硬化症、慢性炎症、肺炎症、子癇前症、心外膜液（例えば、心膜炎に関連する）、および胸水を包含する。
【０１６９】
本明細書中に記載の治療の各具体例において、ＶＥＧＦ−Ａ抗体／可溶性ＦＧＦ受容体二重特異的結合性タンパク質を含む二重特異的結合性タンパク質は、その治療が求められる疾患または障害の管理に関連する通常の方法と合致する方法でデリバリーされる。本明細書中の開示にしたがって、有効量のアンタゴニストを、疾患または障害を予防または治療するのに十分な時間および条件下で、かかる治療を必要とする対象に投与する。
【０１７０】
本明細書中に記載の二重特異的結合性タンパク質の投与対象は、脈管形成に関連する特定の疾患または障害を発症するリスクの高い患者、ならびに既存の血管新生障害を示す患者を包含する。ある特定の具体例において、対象は、その治療が求められる疾患または障害を有すると診断されている。さらに、疾患または障害におけるいずれかの変化について（例えば、疾患または障害の臨床症状の増加または減少について）、治療クールの間、対象をモニターすることができる。
【０１７１】
予防的応用において、医薬組成物または医薬は、特定の疾患のリスクを排除または減少させるか、または疾患の発症を遅らせるの十分な量において、該疾患に罹りやすい、または該疾患のリスクのある患者に投与される。治療的応用において、組成物または医薬は、かかる疾患およびその合併症の症状を治癒するか、または少なくとも部分的に阻止するのに十分な量において、該疾患に罹患している疑いがあるか、またはすでに罹患している患者に投与される。これを達成するのに十分な量は、治療上または医薬上有効な投与量または量と呼ばれる。予防的および治療的の両方のレジメンにおいて、薬剤は、通常、十分な応答（例えば、不適切な脈管形成活性の阻害）が達成されるまで、数回の用量で投与される。典型的には、応答をモニターし、所望の応答が消え始めたら、反復投与量を与える。
【０１７２】
本発明の方法にしたがう治療の対象患者を同定するために、許容されるスクリーニング方法を用いて、特定の血管新生障害に関連するリスク因子を決定し、または対象において同定された既存の障害の状態を決定してもよい。かかる方法は、例えば、個体に、特定の疾患と診断された親類がいるかどうかを決定することを包含することができる。スクリーニング方法は、また、例えば、遺伝性成分を有することが知られた特定の疾患について家族の状況を決定するための通常の精密検査を包含することができる。例えば、種々の癌はまた、ある特定の遺伝性成分を有することが知られている。癌の遺伝性成分は、例えば、形質転換している複数の遺伝子の変異（例えば、Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＥＧＦＲ、ｃＭｅｔなど）、ある特定のＨＬＡおよびキラー阻害受容体（ＫＩＲ）分子の存在または非存在、または癌細胞がＮＫ細胞およびＴ細胞などの細胞の免疫抑制を直接または間接的に変調することができるメカニズムを包含する（例えば、Ljunggren and Malmberg, Nature Rev. Immunol. 7:329-339, 2007; Boyton and Altmann, Clin. Exp. Immunol. 149:1-8, 2007参照）。このような目的で、目的の特定疾患に関連する遺伝子マーカーを有する個体を同定するために、ヌクレオチドプローブをルーチンに使用できる。さらに、特定の疾患のマーカーを同定するのに有用な幅広い種類の免疫学的方法が当該分野で知られている。例えば、モノクローナル抗体プローブを用いて特定の腫瘍に関連する抗原を検出する種々のＥＬＩＳＡ免疫アッセイ法が利用可能であり、当該分野で周知である。スクリーニングは、既知の患者の徴候学、年齢因子、関連リスク因子などによって示される場合、実行してもよい。これらの方法により、臨床医は、本明細書中に記載の治療方法を必要とする患者をルーチンに選択することができる。これらの方法にしたがって、独立した治療計画として、または他の治療に対するフォローアップ、補助、または同等の治療レジメンとして、脈管形成の阻害を実行してもよい。
【０１７３】
投与のために、ＶＥＧＦ−Ａ抗体／可溶性ＦＧＦ受容体二重特異的結合性タンパク質を含む二重特異的結合性タンパク質を医薬組成物として処方する。二重特異的ＶＥＧＦ−Ａ抗体／ＦＧＦＲ可溶性受容体の組み合わせを含む医薬組成物は、医薬上有用な組成物を調製するための既知の方法にしたがって処方でき、それにより、治療分子を医薬上許容される担体との混合物中に配合する。組成物は、その投与がレシピエント患者によって許容される場合、「医薬上許容される担体」であると言われる。滅菌リン酸緩衝化セーラインは、医薬上許容される担体の一例である。他の適当な担体は、当業者に周知である。（例えば、Gennaro (ed.), Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, 19th ed. 1995)参照のこと。）処方は、さらに、１以上の賦形剤、保存料、安定化剤、緩衝化剤、バイアル表面上でのタンパク質喪失を防止するためのアルブミンなどを含んでいてもよい。単一特異的アンタゴニストは、個別に処方することができ、または組み合わせた処方において提供することができる。
【０１７４】
ＶＥＧＦ−Ａ抗体／可溶性ＦＧＦ受容体二重特異的結合性タンパク質を含む二重特異的結合性タンパク質を含む医薬組成物は、有効量で対象に投与される。本発明の方法によると、アンタゴニストは、例えば、筋内、皮下、静脈内、心房内、関節内、非経口、鼻腔内、肺内、経皮、胸膜内、髄腔内、および経口投与形路を包含する種々の投与様式によって対象に投与されうる。血管新生眼障害の治療のための医薬的使用の場合、二重特異的結合性タンパク質は、典型的に、通常の方法にしたがって、硝子体内注射のために処方される。予防および治療目的のために、アンタゴニストは、継続的なデリバリー（例えば、継続的な経皮デリバリー）を介して長期間、または反復される投与プロトコール（例えば、時間、日または週単位で）において、単一ボーラスデリバリーにおいて対象に投与されうる。
【０１７５】
組成物の「治療上有効量」は、統計学的に有意な効果、例えば、疾患進行における統計学的に有意な減少または器官機能における統計学的に有意な改善をもたらす量である。正確な投与量は、治療されるべき疾患の性質および重篤度、患者の形質などを考慮して、許容される標準にしたがって臨床医によって決定されるであろう。投与量の決定は、当業者のレベル内である。
【０１７６】
これに関連して、有効量の決定は、典型的に、ヒト臨床試験によって追跡される動物モデル研究に基づくものであり、モデル対象における対象疾患または障害の発生または重篤度を有意に減少させる有効量および投与プロトコールを決定することによって導かれる。本発明の組成物の有効量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトであるか動物であるか、投与される他の医薬、処置が予防であるか治療であるか、ならびに組成物自体の比活性および個体において所望の応答を顕現させる能力を包含する多くの異なる因子によって変化する。通常、患者はヒトであるが、いくつかの疾患において、患者が非ヒト哺乳動物であることができる。典型的には、投与レジメンは、最適な治療応答を提供するように、すなわち、安全性および効力を最適化するように調整される。したがって、治療上または予防上有効量は、脈管形成を阻害する有益な効果がいずれかの望まれない副作用を上回る量でもある。ＶＥＧＦ−Ａ抗体／可溶性ＦＧＦ受容体二重特異的結合性タンパク質を含む二重特異的結合性タンパク質の投与の場合、投与量は、典型的に、対象の体重１ｋｇあたり、約０．１μｇ〜１００ｍｇ／ｋｇまたは１μｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、より普通には１０μｇ〜５ｍｇ／ｋｇの範囲である。より具体的な例において、該薬剤の有効量は、約１μｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、または約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇである。該範囲内の投与量は、一回または例えば、１日に複数回の投与または毎日、毎週、週に２回、または毎月の投与を包含する複数回の投与によって達成することができる。例えば、ある特定のバリエーションにおいて、レジメンは、開始の投与、次いで、毎週または週２回の間隔での複数回の投与からなる。別のレジメンは、開始の投与、次いで、毎月または月２回の間隔で複数回の投与からなる。別法では、投与は、ＮＫ細胞活性および／または疾患もしくは障害の臨床症状のモニタリングによって示される場合、不定期であることができる。
【０１７７】
医薬組成物の投与量は、標的部位での所望の濃度を維持するように、担当医によって変更されうる。例えば、静脈内デリバリー様式を選択する場合、血流中の薬剤の標的組織での局所的濃度は、患者の状態および予測測定応答にもよるが、１リットル当たり約１−５０ナノモルの組成物、時折、１リットル当たり約１．０ナノモル〜１０、１５または２５ナノモルであってもよい。デリバリー様式、例えば、経表皮デリバリー 対 粘膜面へのデリバリーに基づいて、高または低濃度を選択してもよい。投与量は、また、投与された処方、例えば、鼻スプレー 対 粉末、持続性放出経口または注射粒子、経皮処方などの放出速度に基づいて調整すべきである。同じ血清濃度レベルを達成するために、例えば、（標準条件下で）５ナノモルの放出速度を有する低放出粒子は、１０ナノモルの放出速度を有する粒子の投与量の約２倍で投与されるであろう。
【０１７８】
ＶＥＧＦ−Ａ抗体／可溶性ＦＧＦ受容体二重特異的結合性タンパク質を含む二重特異的結合性タンパク質を含む医薬組成物は、液体形態、エーロゾル、または固体形態で供給することができる。液体形態は、注射溶液、エーロゾル、滴、トポロジー（topological）溶液または経口懸濁液によって説明される。例示的固体形態は、カプセル、錠剤および放出制御形態を包含する。後者の形態は、ミニオスモティックポンプおよびインプラントによって説明される。（例えば、Bremerら、Pharm. Biotechnol. 10:239, 1997; Ranade, ”Implants in Drug Delivery,” in Drug Delivery Systems 95-123 (RanadeおよびHollinger編、CRC Press 1995); Bremerら、”Protein Delivery with Infusion Pumps,”in Protein Delivery: Physical Systems 239-254（SandersおよびHendren編、Plenum Press 1997); Yeweyら、”Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant,”in Protein Delivery: Physical Systems 93-117 (SandersおよびHendren編、Plenum Press 1997)参照のこと。）他の固体形態は、クリーム、ペースト、他のトポロジー応用などを包含する。
【０１７９】
リポソームは、治療的ポリペプチドを対象に、例えば、静脈内、腹腔内、髄腔内、筋内、皮下または経口投与、吸入、または鼻腔内投与を介して、デリバリーするための一の手段を提供する。リポソームは、水性コンパートメトの周囲にある１以上の脂質二重層からなる顕微鏡的小胞である。（一般的に、Bakker-Woudenbergら、Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 12 (Suppl. 1):S61, 1993; Kim, Drugs 46:618, 1993; Ranade, ”Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers,” in Drug Delivery Systems 3-24 (Ranade and Hollinger, eds., CRC Press 1995)を参照のこと。）リポソームは、細胞膜と組成が類似し、結果として、リポソームは、安全に投与することができ、生物分解性である。調製方法に依存して、リポソームは、単層または多層であってもよく、リポソームは、０．０２μｍ〜１０μｍの範囲で直径サイズを変化することができる。種々の薬剤をリポソーム中に被包することができ、疎水性薬剤は二重層中に分配され、親水性薬剤は内部水性スペース内に分配される。（例えば、Machyら、Liposomes In Cell Biology And Pharmacology (John Libbey 1987); Ostroら、 American J. Hosp. Pharm. 46:1576, 1989参照のこと。）さらに、リポソームのサイズ、二重層の数、脂質組成、ならびにリポソームの電荷および表面特徴を変化させることによって、被包された薬剤の治療的有用性を調節することができる。
【０１８０】
リポソームは、事実上あらゆる型の細胞に吸着することができ、次いで、ゆっくりと被包薬剤を放出することができる。別法では、吸着したリポソームは、食細胞によって取り込まれうる。エンドサイトーシスの次に、リポソーム脂質のリソソーム内分解および被包された薬剤の放出が起こる（Scherphofら、 Ann. N.Y. Acad. Sci. 446:368, 1985参照）。静脈内投与後、小型リポソーム（０．１〜１．０μｍ）は、典型的に、主として肝臓および脾臓に配置される網内系の細胞によって取り込まれ、一方、３０．μｍより大きいリポソームは、肺に沈澱する。該網内系の細胞による小型リポソームの優先的取り込みは、化学治療剤をマクロファージへ、および肝臓の腫瘍へデリバリーするために使用されきた。
【０１８１】
網内系は、高用量のリポソーム粒子での飽和、または薬理学的手段による選択的マクロファージ不活性化を包含するいくつかの方法によって、回避することができる。（Claassenら、Biochim. Biophys. Acta 802:428, 1984参照。）さらに、糖脂質−またはポリエチレングリコール−誘導体化リン脂質のリポソーム膜中への組み込みは、網内系による取り込みを有意に減少させることが示された（Allenら、Biochim. Biophys. Acta 1068:133, 1991; Allenら、Biochim. Biophys. Acta 1150:9, 1993参照）。
【０１８２】
リポソームは、また、リン脂質組成を変化させることによって、または受容体もしくはカウンター受容体をリポソーム中に挿入することによって、特定の細胞または器官を標的とするように調製することができる。例えば、高含量の非イオン性界面活性剤を用いて調製されたリポソームは、肝臓を標的化するために用いられている（例えば、日本特許第04-244,018号、Hayakawaら; Katoら、Biol. Pharm. Bull. 16:960, 1993参照）。これらの処方は、ダイズホスファチジルコリン、α−トコフェロール、およびエトキシ化水素化ヒマシ油（ＨＣＯ−６０）をメタノール中で混合し、該混合物を真空下で濃縮し、次いで、該混合物を水で再構成することによって調製された。ダイズ由来ステリルグルコシド混合物（ＳＧ）およびコレステロール（Ｃｈ）を用いるジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）のリポソーム処方は、肝臓を標的化することが示された。（Shimizuら、Biol. Pharm. Bull. 20:881, 1997参照。）
【０１８３】
別法では、抗体、抗体フラグメント、炭水化物、ビタミンおよび輸送タンパク質などの種々の標的化カウンター受容体をリポソームの表面に結合することができる。例えば、肝臓を標的化するために、リポソームを側鎖型ガラクトシルリピド誘導体で修飾して、肝臓細胞の表面上に排他的に発現されるアシアロ糖蛋白（ガラクトース）受容体を標的化することができる。（KatoおよびSugiyama, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14:287, 1997; Murahashiら、Biol. Pharm. Bull.20:259, 1997参照。）組織標的化へのより一般的なアプローチにおいて、標的細胞によって発現されるカウンター受容体に特異的なビオチン化抗体で標的細胞を予め標識する。（Harasymら、Adv. Drug Deliv. Rev. 32:99, 1998参照。）遊離抗体の血漿除去後、ストレプトアビジンにコンジュゲートされたリポソームを投与する。別のアプローチにおいて、標的化抗体を直接リポソームに結合させる。（Harasymら、（上掲）参照。）
【０１８４】
ポリペプチドおよび抗体は、タンパク質マイクロカプセル化の標準的な技術を用いて、リポソーム内に被包することができる。（例えば、Andersonら、 Infect. Immun. 31:1099, 1981; Andersonら、 Cancer Res. 50:1853, 1990; Cohenら、 Biochim. Biophys. Acta 1063:95, 1991; Alvingら、”Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies,”in Liposome Technology (Vol. III) 317 (Gregoriadis, ed., CRC Press, 2nd ed. 1993); Wassefら、 Meth. Enzymol. 149:124, 1987参照。）上記のように、治療上有用なリポソームは、種々の成分を含有しうる。例えば、リポソームは、ポリ（エチレングリコール）の脂質誘導体を含みうる。（Allenら、 Biochim. Biophys. Acta 1150:9, 1993参照。）
【０１８５】
分解性ポリマーマイクロスフェアは、治療タンパク質の高い全身性レベルを維持するように設計された。マイクロスフェアは、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧ）、ポリアンヒドリド、ポリ（オルトエステル）、非生物分解性エチルビニルアセテートポリマーなどの分解性ポリマーから調製され、ここに、タンパク質はポリマー中に捉えられる。（例えば、GombotzおよびPettit, Bioconjugate Chem. 6:332, 1995; Ranade,”Role of Polymers in Drug Delivery,”in Drug Delivery Systems 51-93 (Ranade and Hollinger, eds., CRC Press 1995); RoskosおよびMaskiewicz,”Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery,”in Protein Delivery: Physical Systems 45-92 (Sanders and Hendren, eds., Plenum Press 1997); Bartusら、 Science 281:1161, 1998; Putney and Burke, Nature Biotechnology 16:153, 1998; Putney, Curr. Opin. Chem. Biol. 2:548, 1998参照。）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でコートされたナノスフェアもまた、治療タンパク質の静脈内投与のための担体を提供することができる。（例えば、Grefら、Pharm. Biotechnol. 10:167, 1997参照。）
【０１８６】
他の投与形態は、例えば、Anselおよび Popovich, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (Lea & Febiger, 5th ed. 1990); Gennaro (ed.), Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, 19th ed. 1995)および Ranade and Hollinger, Drug Delivery Systems (CRC Press 1996)に示されるように、当業者によって工夫されることができる。
【０１８７】
本明細書に記載の医薬組成物は、また、組み合わせ治療との関係でも使用されうる。「組み合わせ治療」なる語は、本明細書中で使用される場合、対象に少なくとも１の治療上有効量のＶＥＧＦ−Ａ抗体／可溶性ＦＧＦ受容体二重特異的結合性タンパク質および別の治療剤を含む二重特異的結合性タンパク質を投与することを示す。例えば、癌免疫治療との関連で、ＶＥＧＦ−Ａ抗体／可溶性ＦＧＦ受容体二重特異的結合性タンパク質を含む二重特異的結合性タンパク質を含む組成物は、化学治療または放射線と組み合わせて、脈管形成阻害剤として使用できる。ＶＥＧＦ−Ａ抗体／可溶性ＦＧＦ受容体二重特異的結合性タンパク質を含む二重特異的結合性タンパク質は、通常の型の化学治療または放射線と相乗作用することができる。該二重特異的結合性タンパク質は、さらに、腫瘍負荷を減少させることができ、化学治療剤による有効な死滅を可能にする。
【０１８８】
脈管形成阻害活性を実証する本発明の組成物は、種々のサイトカインおよび共同刺激／阻害分子を包含する免疫調節化合物と共に使用することができる。これらは、限定するものではないが、抗−癌免疫応答を刺激するサイトカインの使用を包含する。例えば、ＩＬ−２およびＩＬ−１２の併用は、Ｔ細胞リンパ腫、扁平上皮細胞癌腫、および肺癌において有益な効果を示す。（Zakiら、J. Invest. Dermatol. 118:366-71, 2002; Liら、 Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 127:1319-24, 2001; Hirakiら、 Lung Cancer 35:329-33, 2002参照。）さらに、ＶＥＧＦ−Ａ抗体／可溶性ＦＧＦ受容体二重特異的結合性タンパク質は、ＣＤ１３７の活性化（Wilcoxら、 J. Clin. Invest. 109:651-9, 2002参照）またはＣＴＬＡ４の阻害（Chambersら、 Ann. Rev. Immunol. 19:565-94, 2001）などの、免疫に基づくエフェクター細胞上に見出される種々の細胞表面分子を共同刺激する試薬と組み合わせることができた。別法では、ＶＥＧＦ−Ａ抗体／可溶性ＦＧＦ受容体二重特異的結合性タンパク質を含む二重特異的結合性タンパク質は、ＴＲＡＩＬ関連受容体と相互作用することによって腫瘍細胞アポトーシスを誘導する試薬と共に使用することができた。（例えば、Takedaら、 J. Exp. Med. 195:161-9, 2002; Srivastava, Neoplasia 3:535-46, 2001参照。）かかる試薬は、ＴＲＡＩＬリガンド、ＴＲＡＩＬリガンド−Ｉｇ融合物、抗−ＴＲＡＩＬ抗体などを包含する。
【０１８９】
他のバリエーションにおいて、ＶＥＧＦ−Ａ抗体／可溶性ＦＧＦ受容体二重特異的結合性タンパク質を含む二重特異的結合性タンパク質は、脈管形成を特異的に標的化しないモノクローナル抗体治療と組み合わせて使用される。かかる組み合わせ治療は、癌の治療に特に有用であり、ここに、モノクローナル抗体の使用、特に腫瘍発現抗原に対する抗体の使用は、乳腺細胞癌腫（トラスツツマブ（trastuzumab）またはＨＥＲＣＥＰＴＩＮＲ（登録商標））および大腸癌腫（セツキシマブ（cetuximab）またはＥＲＢＩＴＵＸＲ）を包含する多くの腫瘍のための標準的なプラクティスとなっている。
【０１９０】
医薬組成物は、本明細書に記載の治療組成物を含む容器を含むキットとして供給されうる。治療組成物は、例えば、単一または複数回投与のための注射溶液の形態で、または注射前に復元される滅菌粉末として、提供することができる。別法では、かかるキットは、治療組成物の投与のための乾燥粉末ディスペンサー、液体エーロゾル発生器、またはネブライザーを含むことができる。かかるキットは、さらに、医薬組成物の指示および用法について書かれた情報を含んでいてもよい。
【０１９１】
Ｂ．癌治療
１．癌の種類
本発明にしたがう治療に応じやすい癌は、充実性腫瘍の存在によって特徴付けられる癌を包含する。以前に議論したように、腫瘍組織中の血管の量は、充実性腫瘍形成を含む癌の強力な負の予後指標であり（例えば、Weidnerら、 (1992)(上掲); Weidnerら、 (1993)(上掲); Liら、(上掲); Fossら、（上掲）参照）、シグナル分子のＶＥＧＦおよびＦＧＦの両方のファミリーが充実性腫瘍に関連する新規な血管の発達において重要な役割を果たすようである。下記の表４は、標的組織によって優勢に組織化された充実性腫瘍形成によって特徴付けられるいくつかの癌を挙げる。
【０１９２】
【表３】
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2012521768.tif 000007
【０１９３】
したがって、ある特定の具体例において、本発明に記載のＶＥＧＦ−Ａ抗体／可溶性ＦＧＦ受容体二重特異的結合性タンパク質を含む二重特異的結合性タンパク質は、充実性腫瘍、例えば、表４に挙げられる癌のいずれかの存在によって特徴付けられる癌を治療するために使用される。例えば、いくつかの具体例において、本発明にしたがって治療されるべき癌は、下記のものから選択される。頭頸部癌（例えば、口腔、中咽頭、鼻咽頭、下咽頭、鼻腔および副鼻腔、咽頭、唇、または唾液腺の癌）、肺癌（例えば、非小細胞肺癌、小細胞癌腫、または中皮腫）、消化管癌（例えば、結腸直腸癌、胃癌、食道癌、または肛門癌）、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、膵臓腺癌、膵腺房細胞癌腫、小腸の癌、肝臓または胆道系の癌（例えば、肝細胞アデノーマ、肝細胞癌腫、血管肉腫、肝外または肝内胆管肉腫、ファーター膨大部の癌、または胆嚢癌）、乳癌（例えば、転移性乳癌または炎症性乳癌）、婦人科癌（例えば、子宮頸癌、卵巣癌、卵管癌、腹膜癌腫、膣癌、外陰癌、妊娠性絨毛性新生物、または子宮内膜癌もしくは子宮肉腫を包含する子宮癌）、尿路の癌（例えば、前立腺癌、膀胱癌、陰茎癌、尿道癌、または腎臓癌、例えば、腎孟および尿管を包含する腎細胞癌腫または移行細胞癌腫）、精巣癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の癌、例えば、頭蓋内腫瘍（例えば、星状細胞腫、未分化星状細胞腫、グリア芽腫、乏突起膠腫、未分化乏突起膠腫、上衣細胞腫、原発性ＣＮＳリンパ腫、髄芽腫、胚細胞腫瘍、松果腺新生物、髄膜腫、下垂体腫瘍、神経鞘の腫瘍（例えば、神経鞘腫）、脊索腫、頭蓋咽頭腫、脈絡叢腫瘍（例えば、脈絡叢癌腫）、またはニューロンまたはグリア起源の他の頭蓋内腫瘍、または脊髄の腫瘍（例えば、神経鞘腫、髄膜腫）、内分泌腺新生物（例えば、甲状腺癌、例えば、甲状腺癌腫、髄様癌、または甲状腺リンパ腫、膵臓内分泌腺腫瘍、例えば、インスリノーマまたはグルカゴノーマ、副腎癌腫、例えば、褐色細胞腫、カルチノイド腫瘍、または副甲状腺癌腫）、皮膚癌（例えば、扁平上皮細胞癌腫、基底細胞癌腫、カポジ肉腫、または悪性黒色腫、例えば、眼球内黒色腫）、骨癌（例えば、骨肉腫、例えば、オステオサルコーマ、骨軟骨腫、またはユーイング肉腫）、多発性骨髄腫、緑色腫、軟組織肉腫（例えば、線維腫または線維組織球腫瘍）、平滑筋または骨格筋の腫瘍、血管またはリンパ管周囲の腫瘍（例えば、カポジ肉腫）、滑液腫瘍、中皮腫瘍、神経索腫瘍、傍神経節腫瘍、骨外性軟骨性または骨性腫瘍、および多能性間葉性腫瘍。
【０１９４】
いくつかのバリエーションにおいて、治療されるべき癌は、小児癌、例えば、脳癌、神経芽細胞腫、ウィルムス腫瘍（腎芽細胞腫）、黄紋筋肉腫、網膜芽腫、または肝芽腫である。
【０１９５】
他のバリエーションにおいて、癌は、免疫治療感受性癌、例えば、黒色腫、腎臓癌、乳癌、前立腺癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、卵巣癌、または肺癌である。
【０１９６】
上記の癌のいくつかは、ＶＥＧＦ−Ａ抗体／可溶性ＦＧＦ受容体二重特異的結合性タンパク質の腫瘍応答に対する効果を評価するための関連する動物モデルのいくつかを含め、下記でさらに詳細に論じる。
【０１９７】
ａ．前立腺癌
前立腺癌は、膀胱の下および直腸の前に見られる男性生殖器系における腺内の異常成長である。ほとんど全ての前立腺癌は、前立腺における分泌性腺細胞から生じるので、前立腺腺癌である。アメリカ合衆国において、前立腺の癌は、男性における一般的な悪性の癌であり、肺癌に次いで２番目に多い。前立腺の癌腫は、主に、年輩の男性の腫瘍であり、しばしば、広がっているときは治療に応答し、局在化しているときは治癒しうる。男性の１７％が生涯で前立腺癌と診断されると見積もられる。該腫瘍は、一般的に、小さく、よく定義付けられた病変として生じ、しばしば、多重腫として存在することができる（Villersら、1992）。進行は、典型的には精嚢、射精管および骨盤リンパ節、およびより進行したステージでは、肝臓および肺に、局所的かつ遠隔である。いったん転移が起これば、癌細胞増殖速度が加速する。
【０１９８】
可溶性ＦＧＦ受容体および抗−ＶＥＧＦ−Ａ抗体を含む二重特異的結合性組成物の腫瘍応答に対する効果は、実施例１２に提供されるように、前立腺癌のために利用可能なマウスモデルにおいて評価できる（Ahmadら、Expert Rev Mol Med, 10:e16 (2008)によって概説される）。
【０１９９】
ｂ．黒色腫
表在拡大型黒色腫は、最も一般的な黒色腫の型である。１０個のうち約７個（７０％）がこの型である。それらは、主として、中年の人々に起こる。女性における最も一般的な場所は足であるが、男性においては、胴体、特に背中において、より一般的である。それらは、皮膚の表面を介して広がることによって開始する傾向があり、このことは、肥大生長期（radial growth phase）として知られている。黒色腫が該ステージで除去されれば、治癒の可能性が非常に高い。黒色腫が除去されなければ、皮膚の層の深くに向かって成長し始めるであろう。次いで、血流またはリンパ系において、体の他の部分へ広がる危険性がある。結節型黒色腫は、ほとんどの場合、腰または背中に起こる。中年の人々に最も一般的に見られる。それは、除去されなければ、皮膚の深くに向かって非常に迅速に成長する傾向がある。該型の黒色腫は、しばしば、皮膚表面の残部上に隆起し、瘤のように感じる。非常に暗い茶色−黒色または黒色でありうる。悪性黒子型黒色腫は、特に年輩の人々において、顔に最も一般的に見られる。それは、ゆっくりと成長し、数年かけて発現することもある。末端型黒色腫は、通常、手のひら、足の裏または足指の爪の周辺に見られる。他の非常に稀な型の皮膚の黒色腫は、メラニン欠乏性黒色腫（黒色腫がその色素を失い、白色領域として現れる）および線維形成性黒色腫（線維性瘢痕組織を含有する）を包含する。悪性黒色腫は、皮膚以外の体の部分において始まることができるが、非常に稀である。影響を及ぼされうる体の部分は、眼、口、指の爪の下（爪下黒色腫として知られる）、外陰または膣組織、または内部である。
【０２００】
ほとんどの黒色腫は、正常な皮膚の外見に変化を伴って始まる。これは、異常な新しい黒子のように見える。３分の１未満が既存の黒子において発現する。黒子と黒色腫の違いを示すことは困難であるが、下記のチェックリストを用いて手助けすることができる。それは、ＡＢＣＤリストとして知られている。非対称−通常の黒子は、普通、形状が対称的である。黒色腫は、不規則または非対称になりやすい。境界−黒子は通常、よく定義付けられた規則的な境界を有する。黒色腫は、ギザギザになった縁を有する不規則な境界を有する傾向が強い。色−黒子は、通常、一様な茶色である。黒色腫は、多色を有する傾向がある。黒色腫は、クロ、赤、ピンク、白または青みを帯びた色と混合した茶色の様々に代わる色合いでありうる。直径−黒子は、通常、鉛筆の平滑末端（直径で約６ｍｍ）以下である。黒色腫は、通常、直径が７ｍｍよりも大きい。通常の黒子は、皮膚から隆起することができ、および／または毛で覆われることもある。黒色腫では、掻痒、瘡蓋形成または出血も起こる。これらは、あまり一般的ではない徴候ではあるが、無視するべきではない（ｃａｎｃｅｒｂａｃｕｐインターネットウェブサイト）。ＶＥＧＦ−Ａ抗体／可溶性ＦＧＦ受容体二重特異的結合性タンパク質を含む二重特異的結合性タンパク質の腫瘍応答に対する効果は、Hermansら、Cancer Res. 63:8408-13, 2003; Ramontら、Exp. Cell Res. 29:1-10, 2003; Safwatら、J. Exp. Ther. Oncol. 3:161-8, 2003; およびFidler, Nat New Biol. 242:148-9, 1973に記載のモデルに類似するネズミ黒色腫モデルにおいて評価することができる。
【０２０１】
ｃ．腎細胞癌腫
腎細胞癌腫（尿細管の細胞における癌性変化を含む腎臓癌の形態）は、成人において最も一般的な腎臓癌の型である。なぜ細胞が癌になるのかは分かっていない。喫煙歴は、腎細胞癌腫を発症するリスクを大いに増加させる。幾人かの人々は、腎細胞癌腫を発症する高いリスクを遺伝しているかもしれない場合があり、腎臓癌の家族歴はリスクを増加する。脳の毛細管に影響を及ぼす遺伝病であるフォン・ヒッペル・リンドウ病の人々は、一般に、腎細胞癌腫を発症する。透析治療を必要とする腎臓障害もまた、腎細胞癌腫を発症するリスクを増加する。最初の症状は、通常、尿中の血液である。時折、治療の腎臓が関与する。癌は、ほとんどの場合、肺および他の器官に、容易に転移し、または広がり、患者の約３分の１が診断時に転移している（Medline Plus Medical Encyclopediaインターネットウェブサイト）。ＶＥＧＦ−Ａ抗体／可溶性ＦＧＦ受容体二重特異的結合性タンパク質を含む二重特異的結合性タンパク質の腫瘍応答に対する影響は、Sayersら、Cancer Res. 50:5414-20, 1990; Salupら、 Immunol. 138:641-7, 1987; およびLuanら、 Transplantation 73:1565-72, 2002に記載のモデルに類似したネズミ腎細胞癌腫モデルにおいて評価できる。
【０２０２】
ｄ．子宮頸癌
子宮頸は、膣へ通じる子宮の頸部である。子宮頸癌（「cervical carcinoma」ともいう）は、子宮頸の表面にある異常な細胞から発症する。子宮頸癌は、女性を襲う最も一般的な癌の１つである。子宮頸癌は、通常、子宮頸の表面にある細胞における形成異常、前癌状態の変化が先立つ。これらの異常な細胞は、侵襲性癌に進行することができる。いったん癌が発症すれば、それは４つのステージを経て進行することができる。ステージは、癌の広がりの程度によって定義付けられる。癌が広がれば広がるほど、治療が大規模になる傾向にある。２つの主要な型の子宮頸癌がある。すなわち、（１）扁平上皮（squamous）型（類表皮癌）：最も一般的な型であり、子宮頸癌の約８０％〜８５％を占める。該癌は、性感染症によって引き起こされうる。一のかかる性疾患は、ヒトパピローマウイルスであり、性病いぼを引き起こす。癌性腫瘍は、子宮頸上または中に成長する。該癌は、一般に、子宮頸の表面において始まり、パップスメア（Pap smear）によって初期に診断されうる。（２）腺癌：該型の子宮頸癌は、子宮頸管における頸管腺中の組織から発症する。初期の子宮頸癌は、通常、症状がない。該癌は、通常、パップスメアおよび骨盤内診察によって検出される。したがって、性的活動を始めるとすぐにパップスメアおよび骨盤内診察を受け始めるべきである。性交経験のない健康な若い女性は、１８才で最初の骨盤内診察を受けるべきである。子宮頸癌の後期では、例えば、月経期の間、性交の後、または月経閉止後などの予想外の時期に異常な膣出血または血痕のある分泌物が引き起こされる。異常な膣分泌物は、濁っていたり、血に染まっていることがあり、または異臭を伴う粘液を含んでいることもある。該癌の進行したステージでは、痛みが引き起こされうる（University of Michigan Health Systemインターネットウェブサイト）。ＶＥＧＦ−Ａ抗体／可溶性ＦＧＦ受容体二重特異的結合性タンパク質を含む二重特異的結合性タンパク質の腫瘍応答に対する効果は、Ahnら、 Hum. Gene Ther. 14:1389-99, 2003; Hussainら、 Oncology 49:237-40, 1992; およびSenguptaら、 Oncology 48:258-61, 1991に記載のモデルに類似したネズミ子宮頸癌モデルにおいて評価できる。
【０２０３】
ｅ．頭頸部腫瘍
頭頸部のほとんどの癌は、癌腫と呼ばれる型である（特に、扁平上皮細胞癌腫）。頭頸部の癌腫は、口、鼻、喉または耳の粘膜（lining）、または舌を覆う表層を形成する細胞において始まる。しかしながら、頭頸部の癌は、他の型の細胞から始まることもできる。リンパ腫は、リンパ系の細胞から発症する。肉腫は、筋肉、軟骨または血管を形成する支持細胞（supportive cell）から発症する。黒色腫は、眼および皮膚に色を与えるメラノサイトと呼ばれる細胞から始まる。頭頸部癌の症状は、その場所に依存し、例えば、舌の癌は、不明瞭な発語を引き起こしうる。最も一般的な症状は、２、３週間以内で回復しない頭頸部における潰瘍またはヒリヒリする領域、嚥下が困難なこと、または咀嚼もしくは嚥下時の疼痛、呼吸または発語のトラブル、例えば、持続的なゼーゼーとした呼吸、不正確な発語またはしわがれた声、口内の麻痺した感覚、持続的な鼻詰まり、または鼻血、持続的な耳痛、耳鳴り、または難聴、口または首の腫れ物または塊、顔または上顎の痛みであり、喫煙または噛みタバコを噛む人々において、前癌状態の変化は、口の粘膜または舌上で起こることができる。これらは、持続性の白色斑点（白板症）または赤色斑点（紅板症）として現れることができる。それらは、通常、痛みがないが、時折、ヒリヒリすることがあり、出血しうる（Cancerbacupインターネットウェブサイト）。ＶＥＧＦ−Ａ抗体／可溶性ＦＧＦ受容体二重特異的結合性タンパク質を含む二重特異的結合性タンパク質の腫瘍応答に対する効果は、Kuriakoseら、 Head Neck 22:57-63, 2000; Cao et al., Clin. Cancer Res. 5:1925-34, 1999; Hierら、 Laryngoscope 105:1077-80, 1995; Braakhuisら、 Cancer Res. 51:211-4, 1991; Baker, Laryngoscope 95:43-56, 1985; およびDongら、, Cancer Gene Ther. 10:96-104, 2003に記載のモデルに類似したネズミ頭頸部腫瘍モデルにおいて評価できる。
【０２０４】
ｆ．脳癌
脳組織において始まる腫瘍は、脳の原発性腫瘍として知られている。原発性脳腫瘍は、それらが始まる細胞の型または脳の部位にしたがって名付けられる。最も一般的な原発性脳腫瘍は、グリオーマである。それらは、グリア細胞において始まる。多くの型のグリオーマがある。（１）星状細胞腫−該腫瘍は、星状細胞と呼ばれる星の形状をしたグリア細胞から生じる。成人において、星状細胞腫は、ほとんどの場合、大脳において生じる。子供において、それらは、脳幹、大脳、および小脳において起こる。グレードＩＩＩの星状細胞腫は、時折、未分化星状細胞腫と呼ばれる。グレードＩＶの星状細胞腫は、通常、多形グリア芽細胞腫と呼ばれる。（２）脳幹グリオーマ−該腫瘍は、脳の最も低部で起こる。脳幹グリオーマは、ほとんどの場合、幼児および中年の成人において診断される。（３）上衣腫−該腫瘍は、心室または脊髄の中心管の内壁を覆う細胞から生じる。それらは、子供および若い成人において最も一般的に見られる。（４）オリゴデンドログリオーマ−この稀な腫瘍は、神経を覆い、保護する脂肪物質を形成する細胞から生じる。これらの腫瘍は、通常、大脳において起こる。それらは、ゆっくりと成長し、通常、脳組織の周囲に広がらない。それらは、ほとんどの場合、中年の成人に起こる。脳腫瘍の症状は、腫瘍のサイズ、型、および場所に依存する。症状は、腫瘍が神経を圧迫し、脳のある特定の領域を損傷させる場合に生じる。それらは、また、脳が膨張し、頭蓋内で流体が増加する場合にも生じる。これらは、脳腫瘍の最も一般的な症状である：頭痛（通常、朝に激しい）、吐き気または嘔吐、発語、視覚または聴覚の変化、平衡または歩行の問題、感情、性格または集中力の変化、記憶の問題、筋肉の引きつりまたは単収縮（発作または痙攣）、および腕または足の無感覚またはうずき（National Cancer Instituteのインターネットウェブサイト）。ＶＥＧＦ−Ａ抗体／可溶性ＦＧＦ受容体二重特異的結合性タンパク質を含む二重特異的結合性タンパク質の腫瘍応答に対する効果は、Schuenemanら、 Cancer Res. 63:4009-16, 2003; Martinetら、 Eur. J. Surg. Oncol. 29:351-7, 2003; Belloら、 Clin. Cancer Res. 8:3539-48, 2002; Ishikawaら、 Cancer Sci. 95:98-103, 2004; Degenら、 J. Neurosurg. 99:893-8, 2003; Engelhardら、 Neurosurgery 48:616-24, 2001; Watanabeら、 Neurol. Res. 24:485-90, 2002; and Lumniczkyら、 Cancer Gene Ther. 9:44-52, 2002に記載のモデルに類似するグリオーマ動物モデルにおいて評価できる。
【０２０５】
ｇ．甲状腺癌
乳頭および濾胞性甲状腺癌は、全ての甲状腺癌の８０〜９０パーセントを占める。両型は、甲状腺の濾胞性細胞において始まる。ほとんどの乳頭および濾胞性甲状腺癌は、ゆっくりと成長する傾向にある。それらが初期に検出されれば、治療はほとんど成功する。甲状腺髄様癌は、甲状腺癌事象の５〜１０パーセントを占める。それは、Ｃ細胞に生じ、濾胞性細胞に生じない。甲状腺髄様癌は、体の他の部分に広がる前に見出され、治療された場合、制御が容易である。未分化甲状腺癌は、極めて稀な型の甲状腺癌である（事象のたった１〜２パーセント）。それは、濾胞性細胞に生じる。該癌細胞は、大変異常であり、認識するのが困難である。該癌細胞は非常に速く成長し、広がるので、該型の癌は、通常、制御が非常に困難である。初期の甲状腺癌は、しばしば、症状を引き起こさない。しかしながら、癌が成長すると、症状は、のど仏近くの首の全部にある塊または小瘤、しゃがれ声または正常な声で話すことが困難、（特に首の）腫れたリンパ節、嚥下または呼吸が困難、または喉もしくは首の痛みを包含しうる（National Cancer Instituteのインターネットウェブサイト）。ＶＥＧＦ−Ａ抗体／可溶性ＦＧＦ受容体二重特異的結合性タンパク質を含む二重特異的結合性タンパク質の腫瘍応答に対する効果は、Quidvilleら、Endocrinology 145:2561-71, 2004 （マウスモデル）; Cranstonら、Cancer Res. 63:4777-80, 2003  （マウスモデル）; Zhangら、Clin Endocrinol (Oxf). 52:687-94, 2000 （ラットモデル）; およびZhangら、Endocrinology 140:2152-8, 1999 （ラットモデル）に記載のモデルに類似のネズミまたはラット甲状腺腫瘍モデルにおいて評価できる。
【０２０６】
ｈ．肝臓癌
２つの異なる型の原発性肝臓癌がある。最も一般的な種類は、肝癌（hepatoma）または肝細胞癌腫（ＨＣＣ）であり、肝臓の主要細胞（肝細胞）から生じる。該型は、通常、肝臓に制限されるが、時折、他の器官に広がる。それは、主に、肝硬変と呼ばれる肝臓病の人々において起こる。また、線維層板肝癌（Fibrolamellar hepatoma）と呼ばれる稀なサブタイプもあり、若い人々に起こることがあり、以前の肝臓病に関連しない。他の型の原発性肝臓癌は、胆管の内壁を覆う細胞において開始するので、胆管癌腫（cholangiocarcinoma）または胆管癌（bile duct cancer）と呼ばれる。肝癌を発症するほとんどの人々は、通常、肝臓の肝硬変とよばれる症状も有する。これは、感染および長期間にわたる大量のアルコール摂取を包含する種々の原因のために、肝臓中に残る微細な傷である。しかしながら、肝硬変を有する人のほんの一部が原発性肝臓癌を発症する。Ｂ型肝炎またはＣ型肝炎のいずれかのウイルス感染が肝臓癌を引き起こすことができ、また、肝硬変の原因にもなり、肝癌を発症するリスクを増加させる。体内に過剰な鉄の蓄積をもたらすヘマクロマトーシス（haemochromatosis）と呼ばれる稀な症状を有する人々は、肝癌を発症する機会が多い。かくして、本発明のＶＥＧＦ−Ａ抗体／可溶性ＦＧＦ受容体二重特異的結合性タンパク質を含む二重特異的結合性タンパク質は、肝細胞癌腫に関連する状態または症状の少なくとも１つを治療、予防、該状態または症状の進行を阻害、発症を遅延、および／または重篤度を減少させ、または阻害するために使用されうる。肝細胞癌腫は、肝炎（例えば、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎およびＤ型肝炎）感染に関連していてもよく、または関連していなくてもよい。
【０２０７】
ＶＥＧＦ−Ａ抗体／可溶性ＦＧＦ受容体二重特異的結合性タンパク質を含む二重特異的結合性タンパク質の腫瘍応答に対する効果は、形質転換成長因子α（ＴＦＧ−α）単独の（Jhappanら、Cell, 61:1137-1146, 1990; Sandgrenら、Mol. Cell Biol., 13:320-330, 1993; Sandgrenら、Oncogene 4:715-724, 1989; およびLeeら、Cancer Res. 52:5162:5170, 1992）、またはｃ−ｍｙｃと組み合わせた（Murakamiら、 Cancer Res., 53:1719-1723, 1993）過剰発現、変異したＨ−ｒａｓ（Saitohら、Oncogene 5:1195-2000, 1990）、ＨｂｓＡｇおよびＨＢｘをコードしているＢ型肝炎ウイルス遺伝子（Toshkovら、Hepatology 20:1162-1172, 1994; Koikeら、Hepatology 19:810-819, 1994）、ＳＶ４０大型Ｔ抗原（Sepulvedaら、Cancer Res. 49:6108-6117, 1989; Schirmacherら、Am. J. Pathol., 139:231-241, 1991）およびＦＧＦ１９（Nicholesら、American Journal of Pathology, 160:2295-2307, 2002）を包含する肝細胞癌腫トランスジェニックマウスモデアルにおいて評価できる。
【０２０８】
ｉ．肺癌
ＶＥＧＦ−Ａ抗体／可溶性ＦＧＦ受容体二重特異的結合性タンパク質を含む二重特異的結合性タンパク質の腫瘍応答に対する効果は、ヒト小／非小細胞肺癌腫異種移植片モデルにおいて評価できる。簡単に言うと、ヒト腫瘍を免疫欠損マウス中に移植し、これらのマウスを、ＶＥＧＦ−Ａ抗体／可溶性ＦＧＦ受容体二重特異的結合性タンパク質を単独で含むか、または腫瘍成長を評価することによって治療の効力を明らかにするために使用することができる他の薬剤と共に含む二重特異的結合性タンパク質で処理する（Nematiら、Clin Cancer Res. 6:2075-86, 2000; およびHuら、Clin. Cancer Res. 10:7662-70, 2004）。
【０２０９】
２．充実性腫瘍のための終点および抗腫瘍活性
各プロトコールは、異なる腫瘍応答評価を定義しうるが、ＲＥＣＩＳＴ（充実性腫瘍における応答評価基準（Response evaluation Criteria in solid tumors））基準は、近年、ナショナル・キャンサー・インスティチュート（National Cancer Institute）による腫瘍応答の評価のための推奨されるガイドラインであると考えられる（Therasseら、J. Natl. Cancer Inst. 92:205-216, 2000参照）。ＲＥＣＩＳＴ基準にしたがうと、腫瘍応答は、全ての測定可能な病変または転移の減少または排除を意味する。疾患は、一般的に、医学的写真またはＸ線、コンピューター断層撮影（ＣＴ）、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）、または臨床検査（病変が表在性である場合）によって明白に定義された縁を有し、少なくとも１次元で、通常の技術で＞２０ｍｍまたはスパイラルＣＴスキャンで＞１０ｍｍと正確に測定できる病変を含む場合、測定可能とみなされる。測定不可能疾患は、通常の技術で＜２０ｍｍまたはスパイラルＣＴスキャンで＜１０ｍｍの病変、および本当に測定できない病変（小さすぎて正確に測定できない病変）を含む疾患を意味する。測定不可能疾患は、胸膜滲出、腹水、および間接的な形跡によって記録される疾患を包含する。
【０２１０】
客観的状態の基準は、充実性腫瘍応答を評価するためにプロトコールに必要とされる。代表的な基準は、下記のものを包含する。（１）全ての検出可能な疾患の完全な消失、新たな病変無し、関連する症状無し、測定不可能疾患の形跡無しとして定義される、完全応答（ＣＲ）、（２）標的病変の最長直径の合計で３０％の減少として定義される、部分的応答（ＰＲ）、（３）標的病変の最長直径の合計で２０％の増加またはいずれかの新規な病変の出現として定義される、進行性疾患（ＰＤ）、（４）ＣＲ、ＰＲまたは進行性疾患にふさわしくないものとして定義される、安定または応答無し。（Therasseら、（上掲）参照）。
【０２１１】
腫瘍学の分野内で許容されるさらなる終点は、全生存（ＯＳ）、疾患のない生存（ＤＦＳ）、客観的応答率（ＯＲＲ）、進行までの時間（ＴＴＰ）、および進行しない生存（ＰＦＳ）を包含する（Guidance for Industry: Clinical Trial Endpoints for the Approval of Cancer Drugs and Biologics, April 2005, Center for Drug Evaluation and Research, FDA, Rockville, MD参照）。
【０２１２】
３．組み合わせ癌治療
以前に論じたように、ある特定の具体例において、二重特異的ＶＥＧＦ−Ａ抗体／ＦＧＦＲ可溶性受容体の組み合わせは、血管新生障害の治療のための第２の薬剤と組み合わせて使用される。癌を治療するために使用する場合、本発明のアンタゴニストは、通常の癌治療、例えば、外科手術、放射線治療、化学治療、またはその組み合わせと組み合わせて使用されうる。ある特定の態様において、ＶＥＧＦ−Ａ抗体／可溶性ＦＧＦ受容体二重特異的結合性タンパク質を含む二重特異的結合性タンパク質との組み合わせ癌治療に有用な他の治療剤は、他の抗脈管形成剤を包含する。いくつかの他の態様において、ＶＥＧＦ−Ａ抗体／可溶性ＦＧＦ受容体二重特異的結合性タンパク質を含む二重特異的結合性タンパク質との組み合わせ治療に有用な他の治療剤は、腫瘍成長に関与する他の因子、例えば、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（Ｈｅｒ２）、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、またはＴＮＦのアンタゴニストを包含する。いくつかの態様において、ＶＥＧＦ−Ａ抗体／可溶性ＦＧＦ受容体二重特異的結合性タンパク質を含む二重特異的結合性タンパク質は、サイトカイン（例えば、腫瘍に対する免疫応答を刺激するサイトカイン）と共に投与される。癌治療に特に応じやすい例示的な組み合わせ治療は、下記においてさらに詳細に記載する。
【０２１３】
ａ．二重特異的抗体／可溶性受容体結合性タンパク質を含む二重特異的結合性タンパク質と組み合わせた腫瘍関連抗原を標的とする抗体
抗体治療は、ある特定の腫瘍が独特の抗原、系統特異的抗原または正常細胞と比べて過剰量で存在する抗原のいずれかを展示するので、癌治療において特に成功的であった。モノクローナル抗体治療の抗腫瘍活性に関連するメカニズムの１つは、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）である。ＡＤＣＣにおいて、モノクローナル抗体は、標的細胞（例えば、癌細胞）に結合し、該モノクローナル抗体の受容体を発現する特異的エフェクター細胞（例えば、ＮＫ細胞、単球、顆粒球）が該モノクローナル抗体／標的細胞複合体に結合して、標的細胞死をもたらす。本発明のある特定のバリエーションにおいて、ＶＥＧＦ−Ａ抗体／可溶性ＦＧＦ受容体二重特異的結合性タンパク質を含む二重特異的結合性タンパク質は、腫瘍関連抗原に対するモノクローナル抗体と共に投与される。ＭＡｂの投与量および計画は、共投与される特異的抗体に帰する薬物動力学的および毒物動力学的特性に基づき、ＶＥＧＦ−Ａ抗体／可溶性ＦＧＦ受容体二重特異的結合性タンパク質を含む二重特異的結合性タンパク質の投与に不随しうるいずれの毒性も最小限にしながら、これらの効果を最適化すべきである。
【０２１４】
ＶＥＧＦ−Ａ抗体／可溶性ＦＧＦ受容体二重特異的結合性タンパク質を含む二重特異的結合性タンパク質および腫瘍関連抗原に対するモノクローナル抗体との組み合わせ治療は、一次治療が失敗した場合に指示されることがあり、二次治療とみなされうる。本発明は、また、新規に診断され、かつ、以前に抗癌剤で治療されていない患者集団（「デ・ノボ患者」）および以前にいずれのモノクローナル抗体治療も受けていない患者（「ネイティブ患者」）における一次治療として該組み合わせを用いることを提供する。
【０２１５】
二重特異的結合性タンパク質は、また、腫瘍細胞のいずれもの直接的な抗体媒介性ＡＤＣＣの不在下で、腫瘍関連抗原に対するモノクローナル抗体との組み合わせ治療において有用である。例えば、免疫系における阻害シグナルを遮断する抗体は、免疫応答増加を導くことができる。例えば、（１）阻害機能を有するＢ７Ｒファミリーの分子、例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ−４）、プログラムされた死−１（ＰＤ−１）、ＢおよびＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）に対する抗体、（２）ＩＬ−１０、ＴＧＦβのような阻害性サイトカインに対する抗体、および（３）抗−ＣＤ２５またはＣＴＬＡ−４のような抑制細胞の機能を消耗または阻害する抗体が包含される。例えば、マウスおよびヒトの両方における抗−ＣＴＬＡ４  ＭＡｂは、免疫抑制調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）の機能を抑制するか、またはＴ細胞上のＣＴＬＡ−４のＡＰＣもしくは腫瘍細胞上のＢ７−１もしくはＢ７−２分子への結合を介して伝達される阻害シグナルを阻害すると考えられる。
【０２１６】
表８は、ＶＥＧＦ−Ａ抗体／可溶性ＦＧＦ受容体二重特異的結合性タンパク質を含む二重特異的結合性タンパク質との組み合わせ治療が可能であることが承認または試験されているモノクローナル抗体の非限定的なリストである。
【表４】
2012521768.tif 000008
【０２１７】
ｂ．ＶＥＧＦ−Ａ抗体／可溶性ＦＧＦ受容体二重特異的結合性タンパク質を含む二重特異的結合性タンパク質
いくつかの具体例において、本明細書に記載のＶＥＧＦ−Ａ抗体／可溶性ＦＧＦ受容体二重特異的結合性タンパク質を含む二重特異的結合性タンパク質は、チロシンキナーゼ阻害剤と組み合わせて使用される。チロシンキナーゼは、アデノシン三リン酸から標的タンパク質へのγリン酸基の移動を触媒する酵素である。チロシンキナーゼは、受容体および非受容体タンパク質チロシンキナーゼとして分類することができる。それらは、成長因子による活性化を包含する種々の正常細胞プロセスにおいて重要な役割を果たし、種々の細胞型の増殖、生存および成長に影響を及ぼす。さらに、それらは、腫瘍細胞増殖を促進すると考えられ、抗アポトーシス効果を誘導し、脈管形成および転移を促進する。成長因子による活性化のほかに、体細胞変異によるタンパク質キナーゼ活性化が腫瘍発生の一般的なメカニズムである。同定される変異のいくつかは、Ｂ−Ｒａｆキナーゼ、ＦＬｔ３キナーゼ、ＢＣＲ−ＡＢＬキナーゼ、ｃ−ＫＩＴキナーゼ、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦＲ）およびＰＤＧＦＲ経路にある。Ｈｅｒ２、ＶＥＧＦＲおよびｃ−Ｍｅｔは、癌進行および腫瘍発生に関連する他の重要な受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）経路である。多数の細胞プロセスがチロシンキナーゼによって開始するので、それらは、阻害剤の重要な標的として同定されている。
【０２１８】
チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）は、細胞内で作用する小型分子であり、受容体および非受容体チロシンキナーゼの両方の触媒性チロシンキナーゼドメインへの結合について、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）と競合する。該競合的結合は、成長、生存および脈管形成のようなシグナリング事象に関連するエフェクター機能を導く下流シグナリングの開始を遮断する。構造およびコンピューター的アプローチを用いて、多くの医学化学コンビナトリアルライブラリーから、チロシンキナーゼを阻害するいくつかの化合物が同定された。
【０２１９】
ほとんどのＴＫＩは、腫瘍細胞の直接的阻害により、または脈管形成の阻害により、腫瘍の成長を阻害すると考えられる。さらに、ソラフェニブ（sorafenib）およびスニチニブ（sunitinib）を包含するある特定のＴＫＩは、ＶＥＧＦファミリー受容体によりシグナリングに影響を及ぼす。いくつかの場合において、ＴＫＩは、樹状細胞および他の内在的免疫細胞、例えば、ＮＫ細胞の機能を活性化させることが示された。このことは、近年、イマチニブ（imatinib）について動物モデルにおいて報告された。イマニチブは、樹状細胞およびＮＫ細胞によってキナー活性を増加させることが示されたＴＫＩである（概説について、Smythら、 NEJM 354:2282, 2006参照）。
【０２２０】
ＢＡＹ  ４３−９００６（ソラフェニブ，Nexavar（登録商標））およびＳＵ１１２４８（スニチニブ，Sutent（登録商標））は、転移性腎細胞癌腫（ＲＣＣ）における使用が近年承認されたＴＫＩである。いくつかの他のＴＫＩが種々の型の癌の治療について、後期および初期の開発段階にある。他のＴＫＩは、限定するものではないが、イマニチブメシラート（Gleevec(登録商標), Novartis）、ゲフィチニブ（Gefitinib）（Iressa(登録商標), AstraZeneca）、エルロチニブ（Erlotinib）塩酸塩（Tarceva(登録商標), Genentech）、ヴァンデタニブ（Vandetanib）（Zactima(登録商標), AstraZeneca）、チピニファニブ（Tipifarnib）（Zarnestra(登録商標), Janssen-Cilag）、ダサチニブ（Dasatinib）（Sprycel(登録商標), Bristol Myers Squibb）、ロナファルニブ（Lonafarnib）（Sarasar(登録商標), Schering Plough）、バタラニブ（Vatalanib）スクシナート（Novartis, Schering AG）、ラパニチブ（Lapatinib）（Tykerb(登録商標), GlaxoSmithKline）、ニロチニブ（Nilotinib）（Novartis）、レスタウロチニブ（Lestaurtinib）（Cephalon）、パゾパニブ（Pazopanib）塩酸塩（GlaxoSmithKline）、アクシチニブ（Axitinib）（Pfizer）、カネルチニブ（Canertinib）二塩酸塩（Pfizer）、ペルチニブ（Pelitinib）（National Cancer Institute, Wyeth）、タンデゥチニブ（Tandutinib）（Millennium）、ボスチニブ（Bosutinib）（Wyeth）、セマキサニブ（Semaxanib）（Sugen, Taiho）、ＡＺＤ−２１７１（AstraZeneca）、ＶＸ−６８０（Merck, Vertex）、ＥＸＥＬ−０９９９（Exelixis）、ＡＲＲＹ−１４２８８６（Array BioPharma, AstraZeneca）、ＰＤ−０３２５９０１（Pfizer）、ＡＭＧ−７０６（Amgen）、ＢＩＢＦ−１１２０（Boehringer Ingelheim）、ＳＵ−６６６８（Taiho）、ＣＰ−５４７６３２（OSI）、ＡＥＥ−７８８（Novartis）、ＢＭＳ−５８２６６４（Bristol-Myers Squibb）、ＪＮＫ−４０１（Celgene）、Ｒ−７８８（Rigel）、ＡＺＤ−１１５２  ＨＱＰＡ（AstraZeneca）、ＮＭ−３（Genzyme Oncology）、ＣＰ−８６８５９６（Pfizer）、ＢＭＳ−５９９６２６（Bristol-Myers Squibb）、ＰＴＣ−２９９（PTC Therapeutics）、ＡＢＴ−８６９（Abbott）、ＥＸＥＬ−２８８０（Exelixis）、ＡＧ−０２４３２２（Pfizer）、ＸＬ−８２０（Exelixis）、ＯＳＩ−９３０（OSI）、ＸＬ−１８４（Exelixis）、ＫＲＮ−９５１（Kirin Brewery）、ＣＰ−７２４７１４（OSI）、Ｅ−７０８０（Eisai）、ＨＫＩ−２７２（Wyeth）、ＣＨＩＲ−２５８（Chiron）、ＺＫ−３０４７０９（Schering AG）、ＥＸＥＬ−７６４７（Exelixis）、ＢＡＹ−５７−９３５２（Bayer）、ＢＩＢＷ−２９９２（Boehringer Ingelheim）、ＡＶ−４１２（AVEO）、ＹＮ−９６８Ｄ１（Advenchen Laboratories）、ミドスタウリン（Midostaurin）（Novartis）、ペリホシン（Perifosine）（AEterna Zentaris, Keryx, National Cancer Institute）、ＡＧ−０２４３２２（Pfizer）、ＡＺＤ−１１５２（AstraZeneca）、ＯＮ−０１９１０Ｎａ（Onconova）、およびＡＺＤ−０５３０（AstraZeneca）を包含する。
【０２２１】
ｃ．化学治療の組み合わせ
ある特定の具体例において、ＶＥＧＦ−Ａ抗体／可溶性ＦＧＦ受容体を含む二重特異的結合性タンパク質は、１以上の化学治療剤と組み合わせて投与される。化学治療剤は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡに影響を及ぼし、細胞周期複製に干渉することによって、種々の様式の作用を有する。ＤＮＡレベルまたはＲＮＡレベルで作用する化学治療剤の例は、抗代謝物（例えば、アザチオプリン（Azathioprine）、シタラビン（Cytarabine）、フルダラビン（Fludarabine）ホスフェート、フルダラビン、ゲムシタビン（Gemcitabine）、シタラビン、クラドリビン（Cladribine）、カペシタビン（capecitabine）６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、メトトレキサート（methotrexate）、５−フルオロウラシルおよびヒロキシ尿素（hyroxyurea））、アルキル化剤（例えば、メルファラン（Melphalan）、ブスルファン（Busulfan）、シス−プラチン（Cis-platin）、カルボプラチン（Carboplatin）、シクロホスファミド、イソスファミド（Ifosphamide）、デカラバザン（Dacarabazine）、プロカルバジン（Procarbazine）、クロラムブシル（Chlorambucil）、チオテパ（Thiotepa）、ロムスチン（Lomustine）、テモゾラミド（Temozolamide））、抗有糸分裂剤（例えば、ビノレルビン（Vinorelbine）、ニンクリスチン（Vincristine）、ビンブラスチン（Vinblastine）、ドセタキセル（Docetaxel）、パクリタキセル（Paclitaxel））、トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、ドクソルビシン（Doxorubincin）、アムサクリン（Amsacrine）、イリノテカン（Irinotecan）、ダウノルビシン（Daunorubicin）、エピルビシン（Epirubicin）、マイトマイシン（Mitomycin）、ミトキサントロン（Mitoxantrone）、イダルビシン（Idarubicin）、テニポシド（Teniposide）、エトポシド（Etoposide）、トポテカン（Topotecan））、抗生物質（例えば、アクチオマイシンおよびブレオマイシン）、アスパラギナーゼ、およびアントラサイクリン類、またはタキサン類である。
【０２２２】
ｄ．放射線治療の組み合わせ
いくつかのバリエーションにおいて、ＶＥＧＦ−Ａ抗体／可溶性ＦＧＦ受容体二重特異的結合性タンパク質を含む二重特異的結合性タンパク質は、放射線治療と組み合わせて投与される。ある特定の腫瘍は、放射線照射または放射線医薬で治療することができる。放射線照射治療は、一般的に、切除不能または手術不可能な腫瘍および／または腫瘍転移を治療するために使用される。放射線治療は、典型的に、３つの方法でデリバリーされる。遠隔照射は、体から離れて施され、ガンマ線（６０Ｃｏ）およびＸ線を包含する。小線源治療は、線源、例えば、６０Ｃｏ、１３７Ｃｓ、１９２Ｉｒ、または１２５Ｉを標的組織と一緒に、または標的組織と接触させて用いる。
【０２２３】
ｅ．ホルモン剤の組み合わせ
いくつかの具体例において、ＶＥＧＦ−Ａ抗体／可溶性ＦＧＦ受容体二重特異的結合性タンパク質を含む二重特異的結合性タンパク質は、ホルモンまたは抗ホルモンと組み合わせて投与される。ある特定の癌は、ホルモン依存性に関連し、例えば、卵巣癌、乳癌および前立腺癌を包含する。ホルモン依存性癌治療は、抗アンドロゲンまたは抗エストロゲン化合物の使用を含みうる。癌治療に使用されるホルモンおよび抗ホルモンは、エストラムスチン（Estramustine）ホスフェート、ポリエストラジオールホスフェート、エストラジオール、アナストロゾール（Anastrozole）、エキセメスタン（Exemestane）、レトロゾール（Letrozole）、タモキシフェン（Tamoxifen）、メゲストロール（Megestrol）アセテート、メドロキシプロゲステロン（Medroxyprogesterone）アセテート、オクトレオチド（Octreotide）、シプロテロン（Cyproterone）アセテート、ビカルツミド（Bicaltumide）、フルタミド（Flutamide）、トリトレリン（Tritorelin）、ロイプロレリン（Leuprorelin）、ブセレリン（Buserelin）およびゴセレリン（Goserelin）を包含する。
【実施例】
【０２２４】
本発明は、さらに、下記の非限定的な実施例によって説明される。
【０２２５】
実施例１：ＶＥＧＦ−Ａを結合する抗体のパンニング（panning）
ＶＥＧＦ−Ａに結合する抗体は、Ｄｙａｘ  Ｆａｂ  ３１０ファージライブラリー（Dyax Corp., Cambridge, MA）をスクリーニングすることによって同定された。該ファージ抗体ライブラリーの選ばれた選択およびスクリーニング方法は、抗原（ＶＥＧＦ−Ａ１６５， R&D Systems）でコートされたポリスチレンイムノチューブ（NUNC, Denmark）を利用した。該抗体は、２、３ラウンドの選択後、ストリンジェンシーを増加させることによって単離された。第一世代の抗体は、Ｆａｂ様式であった。該可溶性Ｆａｂ抗体は、ＭｌｕＩ（#R0198S, New England Biolabs, Beverly, MA）酵素消化によって、Ｍ１３ファージからｇｅｎｅＩＩＩスタンプ（stump）を除去することによって生じた。同じ選択、スクリーニングおよび可溶化法をｓｃＦｖ様式の抗体に適用した。
【０２２６】
実施例２：ＶＥＧＦ−Ａ−結合性Ｆａｂクローンの同定
ＶＥＧＦ−Ａを結合するＦａｂクローンは、プレートに基づく結合アッセイによって同定された。Ｃｏｓｔａｒ（#9018）９６−ウェルプレートを５０μｌのＶＥＧＦ−Ａ（R&D Systems）またはＰＤＧＦ−Ｄ（配列番号：８０）ホモダイマーで、０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６中０．６μｇ／ｍｌにて、４℃で一晩コートした。次の日に、プレートを０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で３回洗浄した。室温にて１時間、ブロッキングのために各ウェルを１００μｌの２％ミルク（#170-6404, Bio-Rad）／ＰＢＳＴで満たした。アッセイプレートを次いで、ＰＢＳＴで３回洗浄した。各ウェルを２５μｌの２％ミルク／ＰＢＳＴで満たし、次いで、２５μｌのＦａｂ上清で添加した。次いで、ウェルを混合し、室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。Ｆａｂ検出のために、５０μｌの２％ミルク／ＰＢＳＴ中における（１：４０００）抗−ヒトＦａｂ特異的ｐＡｂ−ＨＲＰ（#31482, Pierce）を各ウェルに、室温で１時間加えた。次いで、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。５０μｌのＴＭＢ（TMBW-1000-01, BioFX Laboratories）を各ウェルに加えて１５分間展開させ、次いで、５０μｌの終止バッファー（STPR-1000-01, BioFX Laboratories）を添加して反応をクエンチした。次いで、プレートをプレートリーダー上、４５０ｎｍで読み取った。
【０２２７】
実施例３：ＶＥＧＦ−Ａ−結合性ｓＦａｂのｓｃＦｖへの変換
ラムダ、カッパおよび重鎖可変領域を、ラウンド２、Ａｒｍ  ＡおよびＡｒｍ  Ｂ  ＶＥＧＦ−Ａ−パンニングしたＦａｂ  ＤｙａｘファージＤＮＡのプールから、各サブタイプのためのフレームワーク配列に対して向けられたプライマーを用いて３工程プロセスで増幅させた。最初のラウンドのＰＣＲは、可変フレームワーク領域の各々を増幅し、ラウンド２ＰＣＲ反応を容易にするための適当な突出部を付加する。ラウンド２ＰＣＲ反応は、適当なｇｌｙ／ｓｅｒリンカー配列を適切なラウンド１ＰＣＲ産物の末端に加え、ラウンド３ＰＣＲ反応は、可変軽鎖ラムダ、可変軽鎖カッパ、および可変重鎖産物をオーバーラップさせて、ＬＨおよびＨＬの両方の方向においてｓｃＦｖ産物を生じ、次いで、それをＡｐａＬＩ／ＮｏｔＩ−消化したＰＩＭＤ２１ファージディスプレーベクター中にクローン化した。
【０２２８】
実施例４：ｓＶＥＧＦＲ２に結合するＶＥＧＦを阻害するｓＦａｂおよびｓｃＦｖの同定
ＶＥＧＦ−Ａ  ＦａｂおよびｓｃＦｖクローンは、プレートに基づく中和アッセイによってスクリーンした。Ｃｏｓｔａｒ（#9018）９６−ウェルプレートを１００μｌの抗−ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ−特異的抗体（#109-005-098, Jackson Immunology）で、０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６中１μｇ／ｍｌにて、４℃で一晩コートした。次の日に、プレートを４００ｕｌ  ０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で３回洗浄した。ブロッキングのために、各ウェルを室温（ＲＴ）で１時間、１００μｌの１％ＢＳＡ（#A3059-100G, SIGMA）／ＰＢＳＴで満たした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。１００μｌのＶＥＧＦＲ２−Ｆｃ（配列番号：８１）を１％ＢＳＡ／ＰＢＳＴ中０．２μｇ／ｍｌにて、室温で１時間各ウェルに加えた。同時に、別の９６ウェルプレート（Costar 3357）中、６５μｌのＦａｂまたはｓｃＦｖ上清を６５μｌの１％ＢＳＡ／ＰＢＳＴ中のビオチン化ＶＥＧＦ−Ａに、２０ｎｇ／ｍｌにて、室温で１時間加えた。ブロックされたアッセイプレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。各ウェルを室温で１時間、１００μｌの上清／ビオチン化ＶＥＧＦ−Ａ複合体で満たした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。１００μｌの１％ＢＳＡ／ＰＢＳＴ中の（１：４０００）ストレプトアビジン−ＨＲＰ（#21124, Pierce）を室温で１時間、各ウェルに加えた。次いで、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。１００μｌのＴＭＢ（TMBW-1000-01, BioFX Laboratories）を各ウェルに加えて２０分間展開させ、次いで、１００μｌの終止バッファー（STPR-1000-01, BioFX Laboratories）を加えて反応をクエンチした。次いで、プレートをプレートリーダー上、４５０ｎｍで読み取った。
【０２２９】
実施例５：表面プラズモン共鳴（Biacore）によるヒトＶＥＧＦ−ＡアンタゴニストとヒトＶＥＧＦ−Ａとの相互作用の解離速度定数の測定
ヒトＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを、ヒトＶＥＧＦ−Ａに対する結合アフィニティーについて評価した。
【０２３０】
表面プラズモン共鳴を用いる解離速度定数にしたがうＶＥＧＦ−Ａ。解離速度定数は、ＶＥＧＦ−ＡアンタゴニストとＶＥＧＦ−Ａとの相互作用について、表面プラズモン共鳴によって測定された。解離速度定数（ｋｄ（ｓ−１））は、該複合体の安定性を反映する値である。それは濃度から独立しており、したがって、未知濃度の試料をスクリーニングおよびランキングするのに適当である。
【０２３１】
材料および方法：一連の実験は、ＶＥＧＦ−Ａに対するＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの結合アフィニティーを測定するために完成された。結合速度論およびアフィニティー研究は、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ−１００（商標）システム（GE Healthcare, Piscataway, NJ）上で実施された。方法は、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００（商標）コントロールソフトウェア、ｖ１．１．１を用いてプログラムされた。ヒトＶＥＧＦ−Ａは、アミンカップリング化学（ＥＤＣ：ＮＨＳ）を用いて、約２００ＲＵの密度まで、ＣＭ５センサーチップ上に共有結合により固定化された。ＶＥＧＦ−Ａは、活性なフローセル（flow cell）にだけ固定化された。固定化手法後、フローセル上の残りの活性部位をエタノールアミンでブロックした。５０ｍＭ  ＮａＯＨでの洗浄によって、非特異的に結合したタンパク質を除去した。参照セルを活性化させ、次いで、エタノールアミンでブロックした。
【０２３２】
ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニスト上清（Ｄｙａｘファージライブラリースクリーニングから選択された）をランニングバッファー中で１：３希釈し、表面にインジェクトし、結合時間５分および解離時間５分で、センサーチップ上のＶＥＧＦ−Ａに特異的に結合させた。１００ｎＭ  ＶＥＧＦＲ−２−Ｆｃ５および１００ｎＭ抗−ＶＥＧＦ−Ａモノクローナル抗体（Avastin（商標）, Genentech）の２回のインジェクションを陽性対照として用いた。速度論結合研究は、流速３０ｕｌ／分を用いて実施した。全結合実験は、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ  ０．０５％界面活性剤Ｐ２０、１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、ｐＨ７．４のランニングバッファー中、２５℃で実施した。また、バッファーインジェクションを行って、装置ノイズおよびドリフトの控除を可能にした。サイクルとサイクルの間に、フローセルを１０ｍＭグリシン、ｐＨ１．５で洗浄して、結合したＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを表面から除去した。
【０２３３】
データは、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００（商標）評価ソフトウェア（バージョン１．１．１）を用いてまとめた。データは、参照フローセルおよびブランクインジェクションを差し引くことによって処理した。再生工程が一連のインジェクションを通して一定の結合表面を提供したことを確実にするために、ベースライン安定性を評価した。ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの出発濃度が分からなかったので、得られた結合曲線を全体的に１：１解離結合モデルにフィットさせて、解離速度定数（ｋｄ（ｓ−１））を算出した。
【０２３４】
結果：ヒトＶＥＧＦ−Ａに対するＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの解離速度分析を決定した。得られた結合曲線は、１：１解離モデルによくフィットする。ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの出発濃度は分かっておらず、したがって、ｋｄは濃度に依存しないので、解離速度定数（ｋｄ（ｓ−１））のみを報告した。算出した解離速度定数は、最も遅いものから最速のものまでランク付けした。これらのアッセイ条件下、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは、ＶＥＧＦ−Ａに対する相互作用について、幅広い範囲の解離速度定数を展示する（１．Ｅ−５  −  ２．Ｅ−２ （ｓ−１））（表５参照）。比較すると、ＶＥＧＦＲ−２−Ｆｃ５  −  ＶＥＧＦ−Ａ相互作用のｋｄは、約２．Ｅ−４ ｓ−１であり、抗−ＶＥＧＦ−Ａモノクローナル抗体Ａｖａｓｔｉｎ（商標）Ｆａｂ−ＶＥＧＦ−Ａ相互作用では、約８．Ｅ−５ ｓ−１であった。
【０２３５】
【表５】
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【０２３６】
実施例６：イー・コリ細胞周辺質（periplasmic）画分由来のタンパク質の精製
ｓｃＦｖ、タンデムｓｃＦｖ、およびｓＦａｂタンパク質は、イー・コリ細胞の細胞周辺腔において発現される。発酵スケールは、２５ｍＬ振盪フラスコ培養から２Ｌバッチ投入系までの範囲であった。イー・コリ細胞を遠心機を用いてペレット中にスピンダウンした。湿った細胞ペレットを周辺質化（periplasting）バッファー［０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ，２０％（ｗ／ｖ）シュークロース，完全ＥＤＴＡ不含プロテアーゼインヒビターカクテル（Roche）  ｐＨ７．５］中、湿潤細胞重量１グラムあたり２ｍＬの比率で、完全に再懸濁した。該手法において、細胞壁の分解を容易にする酵素であるリソチームは、含まれていても、含まれていなくてもよい。リソチームを使用するか否かを決定するために、５００ｕＬの再懸濁化ペレットをエッペンドルフチューブに移し、使用した周辺質化バッファー１μＬあたり３０ＵのＲｅａｄｙ−Ｌｙｓｅリソチーム（Epicentre）を加え、懸濁を室温で５分間インキュベートした。インキュベーション後、該溶液を逆さまにすることによって粘性増加についてチェックした。該溶液がチューブの壁にくっついて離れない場合、早期の細胞溶解が起こっている可能性があり、リソチームは調製溶液に含まれない。該溶液がチューブの壁にくっつかない場合、リソチームは調製溶液に含まれる。リソチームを用いる場合、使用した周辺質化バッファー１μＬあたり３０ＵのＲｅａｄｙ−Ｌｙｓｅリソチーム（Epicentre）を加え、懸濁を室温で４−６分インキュベートした。元々の湿潤細胞ペレット重量１グラムあたり３ｍＬの比率で氷冷水を加え、該溶液を少なくとも１０分間（しかしながら、３０分を超えない）インキュベートした。残ったスフェロプラストを１５，０００ｘｇ（または１０，０００〜２０，０００ＲＰＭ，速い方）の遠心分離により、少なくとも１５分間（しかしながら４５分を超えない）、室温にてペレット化した。細胞周辺質画分を含有する上清を新しい容器に注ぎ入れ、検量した固体を用いて、２５ｍＭイミダゾール、５００ｍＭ  ＮａＣｌに調整した。該溶液を０．２２ｕｍフィルターでろ過した後、ボトルトップフィルター（Nalgene）を用いて精製した。
【０２３７】
固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）捕獲
伝統的に、５ｍＬ  ＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰカラム（GE Healthcare）をＩＭＡＣ工程に用いたが、該カラムサイズは、分析的ＩＭＡＣ−ＳＥＣアッセイによって決定される細胞周辺質画分中のｓｃＦｖ標的の量に依存して、スケールアップまたはスケールダウンすることができる。該ＩＭＡＣ樹脂の結合能は、少なくとも２０ｍｇ／ｍＬ充填層であることが示された。１０ｍＬよりも大きなサイズのカラムを用いる場合、内径が２および５ｃｍのＷａｔｅｒｓガラスカラム（Millipore）が好ましかった。適当なクロマトグラフィーステーション（ＵＮＩＣＯＲＮソフトウェア４．１以上を用いるＡｋｔａ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ［GE Healthcare］またはＢｉｏＣＡＤ  Ｓｐｒｉｎｔ，７００Ｅ、またはＰｅｒｆｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙソフトウェアバージョン３．００以上を用いるＶｉｓｉｏｎ［Applied Biosystems］）を用いて、ＩＭＡＣカラムを５０ｍＭ  ＮａＰＯ４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．５中で平衡化し、細胞周辺質画分を涸渇するまで、１９０ｃｍ／時間以下の速度で該カラムに負荷した。ＵＶ  Ａ２５４ｎｍおよびＵＶ  Ａ２８０ｎｍでのモニターが１９０ｃｍ／時間を超えない流速で、少なくとも２ＣＶについて安定なベースラインになるまで、カラムを平衡化バッファーで洗浄した。結合したタンパク質は、５０ｍＭ  ＮａＰＯ４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、４００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．５を１９０ｃｍ／時間以下の速度で用いて競合的に溶出させた。溶出フラクションを、Ａ２８０ｎｍでのＵＶ、分析的サイズ排除クロマトグラフィー、およびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、タンパク質含量について評価した。
【０２３８】
他のクロマトグラフィー技術
ＩＭＡＣプールの純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよび分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって評価された。プールがＳＥＣによる最終的な浄化に応じなかった場合、他のクロマトグラフィー技術を用いて、残存する宿主細胞夾雑物および凝集物から標的ｓｃＦｖタンパク質をさらに精製した。これらの従来技術は、アニオン交換、カチオン交換、および疎水性相互作用を包含した。他のアフィニティーに基づくアプローチもまた使用され、限定するものではないが、抗−ｍｙｃ樹脂によるｃ末端ｍｙｃタグの利用または、堅固なビーズに共有結合した適当なリガンドを用いるリガンドに基づくアフィニティーアプローチを包含した。これらの他の技術の有用性は、タンパク質 対 タンパク質に基づいて決定された。
【０２３９】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
Ａ２８０ｎｍでのＵＶおよび分析的ＳＥＣ法によって評価されるタンパク質量は、使用されるゲルろ過カラムのサイズを決定した：  ＜１ｍｇ＝１０／３００  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ＧＬカラム、１−１０ｍｇ＝１６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００、＞１０ｍｇ＝２６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００（全て、GE Healthcare）。ＩＭＡＣ溶出プールは、１０ｋＤ  ＭＷＣＯ  Ｕｌｔｒａｃｅｌ遠心濃縮器（Millipore）を用いて濃縮され、最終濃縮容量は、使用したゲルろ過カラムの容量の３％以下であった。濃縮物をカラム上に注入し、７６ｃｍ／時間を超えず、かつ３４ｃｍ／時間以上の流速で、タンパク質を定組成溶出した。溶出フラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、適当なプールを得た。
【０２４０】
内毒素除去
内毒素レベルに関する最終産物の明細は、特定のクラスターの状態によって決定された。ＳＥＣプールをＡ２８０ｎｍでのＵＶにより決定した場合、＞０．２５ｍｇ／ｍＬになるまで、１０ｋＤ  ＭＷＣＯ  Ｕｌｔｒａｃｅｌ遠心濃縮器（Millipore）を用いて濃縮した。Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｅ  ０．２２ｕｍフィルター（PALL）をＳＥＣ移動相バッファーで予め湿らせ、ＳＥＣ濃縮物を手動のシリンジデリバリーシステムにより、〜１ｍＬ／分の流速で、該フィルターでろ過した。ＰＴＳ  ＥｎｄｏＳａｆｅシステム（Charles River）を用いて、最終ろ過産物を内毒素についてアッセイし、Ａ２８０ｎｍでのＵＶにより濃度測定し、保存のためにアリコートに分けた。
【０２４１】
実施例７：２９３／ＫＤＲ／ＫＺ１３６／ｃ２２  ＶＥＧＦ−Ａ−誘導性細胞に基づくルシフェラーゼアッセイを用いる中和性抗−ヒトＶＥＧＦ  ｓｃＦｖの同定
候補分子（ｓｃＦｖ’ｓ）をヒトＶＥＧＦ−Ａの活性中和能についてスクリーンするために、細胞に基づくルシフェラーゼアッセイを行った。１００μｌ完全培地（ＤＭＥＭ，１０％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）、１Ｘピルビン酸ナトリウム、１Ｘ  ＧｌｕｔａＭａｘ（Invitrogen））中、９６−ウェル不透明白色組織培養処理プレート（Costar #3917）の１ウェルあたり１０，０００細胞の播種密度で、２９３／ＫＤＲ／ＫＺ１３６／ｃ２２細胞を播種し、３７℃加湿５％ＣＯ２インキュベーター中、４８時間インキュベートした。４８時間後、完全培地を真空吸引によって除去し、１００μｌの無血清培地（ＤＭＥＭ，１Ｘピルビン酸ナトリウム，１Ｘ  ＧｌｕｔａＭａｘ（Invitrogen））と置き換え、一晩インキュベートした。
【０２４２】
次の日に、候補ＶＥＧＦ−Ａ中和分子（ｓｃＦｖ’ｓ，Ｆａｂｓ）、陽性対照（ベバシツマブ（bevacizumab）（抗−ＶＥＧＦ−Ａモノクローナル抗体，Genentech）、ラニビツマブ（ranibizumab）（抗−ＶＥＧＦ−Ａアフィニティー−成熟Ｆａｂ，Genentech）、および社内で作成したベバシツマブＦａｂ）を２００ｎＭから１２ｐＭへ、１：５希釈にて、非中和剤（培地のみ）と共に、無血清培地中で連続希釈した。これらに、等容量のＶＥＧＦ−Ａ１６５を、最終濃度０．２６ｎＭ  ＶＥＧＦ−Ａおよび１００ｎＭ〜６ｐＭ中和分子または陽性対照に対し、０．５４ｎＭで加えた。これらを３７℃で６０分間インキュベートした。インキュベーション後、培地から血清飢餓細胞を吸引し、１００μｌの上記複合体を加え、３７℃で４時間インキュベートした。
【０２４３】
４時間インキュべーション後、製造者の指示に従ってＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Promega, E1501）を用いて、ルシフェラーゼアッセイを行った。簡単に言うと、培地を吸引し、２５μｌの１Ｘ  ｉｓバッファー（Promega, E153A）を各ウェルに加えた。プレートを室温で２０−３０分間インキュベートして平衡化した。ルシフェラーゼ活性は、マイクロプレートルミノメーター（Berthold Technologies）、４０μｌ基質インジェクション、１秒置換（integration）時間を用いて測定された。分析ソフトウェア（Spotfire）を用いてデータを分析し、各候補および対照について、ＩＣ５０値を算出した。
【０２４４】
ＶＥＧＦ−Ａ１６５のその受容体、ＶＥＧＦ−Ｒ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）に対する結合作用は、ＳＴＡＴ（転写のシグナルトランスデューサーおよびアクチベーター（signal transducer and activator of transcription））および／またはルシフェラーゼ受容体遺伝子の転写を駆動するＳＲＥ（血清応答エレメント（serum-response element））を活性化するシグナリングカスケードを誘導する。ルシフェラーゼ活性の減少は、該ＶＥＧＦ−Ａ−媒介性シグナリングが中和されていることを示す。
【０２４５】
結果：下記の表６に示すｓｃＦｖは、ルシフェラーゼアッセイにおいて、ＶＥＧＦ−誘導性活性の中和についてスクリーンされた。スクリーンされた多くのｓｃＦｖを用いて、有意な阻害が実証された（表６においてＩＣ５０値として報告される）。ＩＣ５０値は、ＶＥＧＦ−活性を５０％中和するのに必要なｓｃＦｖのｎＭ濃度として示される。ベバシツマブ（Avastin（商標））、Lucentis（商標）およびAvastin（商標）  Ｆａｂ（社内で作成）を活性の対照として用いた。
【０２４６】
【表６】
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【０２４７】
実施例８：ヒトＶＥＧＦ−Ａ−刺激性ＨＵＶＥＣ細胞におけるＶＥＧＦＡ  ｓｃＦｖの中和活性を決定するための増殖アッセイ
ＶＥＧＦ−Ａに対して中程度のアフィニティーを有する中和性ＶＥＧＦ−Ａ  ｓｃＦｖをスクリーンするために、３Ｈ−チミジンアッセイを行った。組み換えヒトＶＥＧＦ−Ａ１６５を２．６ｎＭで陽性対照として用いた。１ｘインスリン−トランスフェリン−セレニウムを含有するＤＭＥＭ−Ｆ１２（１：１）培地（無血清培地，ＳＦＭ；  Invitrogen, Carlsbad, CA）を陰性対照として用いた。ヒトＶＥＧＦ−Ａ  ｓｃＦｖをＳＦＭ中、５００ｎＭ、５０ｎＭ、５ｎＭ、０．５ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．００５ｎＭ、および０．０００５ｎＭにて連続希釈した。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を９６−ウェル平底プレート中に、１００μＬ容量において、１ウェル当たり９００−１０００細胞の密度で播種した。ＨＵＶＥＣ細胞を完全ＥＧＭ−２  ＭＶ培地（Lonza, Walkersville, MD）中、３７℃、５％ＣＯ２にて２日間培養した。該細胞をＳＦＭを用いて２４時間、血清飢餓にし、２．６ｎＭの連続希釈ＶＥＧＦ−Ａ  ｓｃＦｖを用いて、または用いないで、２４時間刺激し、１ウェル当たり１μＣｉの３Ｈ−チミジン（増殖細胞中に組み込まれる）で２４時間パルスした（全て、３７℃、５％ＣＯ２）。該細胞を収穫し、Ｔｏｐｃｏｕｎｔ装置（Hewlett Packard）を用いてカウントした。
【０２４８】
結果：アッセイにおいてスクリーンした多数のｓｃＦｖは、表７に示される低いｎＭ  ＩＣ５０値によって分かるように、ヒトＶＥＧＦ−誘導性ＨＵＶＥＣ増殖の強力な中和を示した。
【０２４９】
【表７】
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【０２５０】
実施例９：ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストのエピトープ結合
どのＶＥＧＦ−ＡアンタゴニストがヒトＶＥＧＦ−Ａに同時に結合できるかを決定するために、エピトープ結合実験を実施した。抗原上の同一またはオーバーラップする結合部位（エピトープ）に対して競合するＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは、同時に結合することができず、単一のファミリーまたは「エピトープ・ビン（bin）」に機能的に分類される。抗原上の同じ結合部位について競合しないＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは、同時に結合することができ、別々のファミリーまたはエピトープ・ビンに分類される。実験は、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００（商標）装置を用いて実施した。Ｂｉａｃｏｒｅは、抗体フラグメントおよびモノクローナル抗体のパネルをエピトープ・ビンに割り当てるためにルーチンに使用される種々のアッセイフォーマットのうちの単なる１つである。多くの参考文献（例えば、The Epitope Mapping Protocols, Methods in Molecular Biology, Volume 6,6 Glenn E. Morris ed.）が抗体フラグメントを「ビン」に分類するために使用でき、ヒトＶＥＧＦ−Ａに対するＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの結合特徴に関して比較可能なデータを提供すると予測される別法を記載する。エピトープ結合実験は、可溶性の天然ヒトＶＥＧＦ−Ａを抗原として用いて実施した。
【０２５１】
材料および方法：２つの別々のエピトープ結合実験をＢＩＡＣＯＲＥ  Ｔ１００（商標）システム（GE Healthcare, Piscataway, NJ）上で実施した。両方の実験において、一次ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは、アミンカップリング化学（ＥＤＣ：ＮＨＳ）を用いて、約８００−１０００ＲＵの密度まで、ＣＭ５センサーチップ上に共有結合により固定化された。固定化手法後、フローセル上の残りの活性部位をエタノールアミンでブロックした。非特異的に結合したタンパク質を５０ｍＭ  ＮａＯＨでの洗浄によって除去した。参照セルもまた、活性化させ、次いで、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを用いることなく、エタノールアミンを用いてブロックした。
【０２５２】
第１セットの実験において、二次ＶＥＧＦ−ＡアンタゴニストおよびＶＥＧＦ−Ａ抗原を１００ｎＭに希釈した。ＶＥＧＦ−Ａ抗原をインジェクトし、センサーチップ上に固定化したＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストに特異的に結合させた。ＶＥＧＦ−Ａはダイマーであるので、あらゆるＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストに対する２つの潜在的な結合部位がある。全ての結合部位が占められたことを確認するために、以前に固定化した一次ＶＥＧＦ−ＡアンタゴニストをＶＥＧＦ−Ａ上にインジェクトした。該工程後、二次ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストをインジェクトして、ＶＥＧＦ−Ａに対する同時結合を観察した。
【０２５３】
結合実験の第２のセットにおいて、一次ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを再び共有結合により固定化して、ＢＩＡＣＯＲＥ  ＣＭ５センサーチップのフローセルを分離した。該実験において、しかしながら、１０ｎＭ  ＶＥＧＦ−Ａ抗原は、１ｍＭの二次ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストと予め混合し、次いで、固定化した一次ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニスト上に競合様式でインジェクトした。全ての結合実験は、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ  ０．０５％界面活性剤Ｐ２０、１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、ｐＨ７．４のバッファー中、２５℃で実施した。バッファーインジェクションもまた実施して、装置ノイズおよびドリフトの控除を可能にした。サイクルとサイクルの間に、各インジェクションサイクル後に、１０ｍＭグリシン、ｐＨ１．５の５０ｕｌ／分での６０秒インジェクションにより、捕獲表面を再生した。これにより、結合したＶＥＧＦ−Ａを表面から除去した。Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００（商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（バージョン１．１．１）を用いて、データをまとめた。
【０２５４】
両方のセットの実験結果を下記のように解釈した。二次ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストが一次アンタゴニストと同時にＶＥＧＦ−Ａ抗原に結合できない場合、それは、機能的に、単一のファミリーまたはエピトープ・ビンに分類された。しかしながら、二次ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストが、チップ表面上の質量の増加を示すことによって、一次アンタゴニストと同時に該抗原に結合できた場合、それは、別のファミリーまたはエピトープ・ビンに分類された。各ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは、陰性対照としてそれ自体に対して試験され、バックグラウンド（非結合）シグナルのレベルを確立した。
【０２５５】
結果：精製したＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは、上記の２セットの実験由来の結合データを用いて、エピトープ・ビンに割り当てられた。ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）によって報告されるシグナル（ＲＵ、応答単位）は、直接、センサーチップ表面上の質量に相関する。いったん、陰性対照に関連するバックグラウンドシグナル（ＲＵ）のレベルが確立されると（一次および二次アンタゴニストの両方として使用される同じＶＥＧＦ−Ａアンタゴニスト）、結合結果は、陽性または陰性結合のいずれかとして報告された。陽性結合は、２つの異なるＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストが該抗原に同時に結合できることを示す。陰性結合は、２つの異なるＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストが該抗原に同時に結合できないことを示す。
【０２５６】
これらの実験における陽性応答値と陰性応答値との間の差を用いて、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを３つのファミリーまたはエピトープ・ビンに分類した（表８参照）。第１のエピトープ・ビンは、クローンｃ６３６によって産生されるＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを代表とする。第２のエピトープ・ビンは、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストｃ８６８、ｃ１０３９、および  ｃ１０８１を代表とする。注目すべきは、ｃ６３６を最初にＶＥＧＦ−Ａと相互作用させた場合、ｃ８６８およびｃ１０３９はどちらも、同時結合を示したことである。ｃ８６８またはｃ１０３９のいずれかが最初にＶＥＧＦ−Ａと相互作用した場合、ｃ６３６はいずれの結合も示さなかったので、ｃ８６８およびｃ１０３９は、ｃ６３６エピトープとオーバーラップしている。さらに、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストｃ８７０がビン＃１およびビン＃２とオーバーラップした。第３のエピトープ・ビンは、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストｃ８２０および陽性対照ＶＥＧＦ−Ａ抗体（マウス抗ＶＥＧＦ−Ａモノクローナル抗体， R&D Systems）を代表とする。これらのＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストはどちらも、全ての他のＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの存在下で同時結合を示した。結合実験において試験したアンタゴニストの全ては、ある程度までＶＥＧＦ−Ａ有糸分裂促進活性を中和することが示された。
【０２５７】
【表８】
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【０２５８】
実施例１０：表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）によるヒトＶＥＧＦ−ＡアンタゴニストのＶＥＧＦ−Ａに対する結合アフィニティーの測定
クローンｃ８７０およびｃ１０３９によって産生された一価のヒトＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは、表面プラズモン共鳴を用いて、ヒトＶＥＧＦ−Ａに対する結合アフィニティーについて評価された。アフィニティー決定運動速度定数および平衡解離定数は、表面プラズモン共鳴により、ＶＥＧＦ−ＡアンタゴニストとＶＥＧＦ−Ａとの相互作用について測定された。会合速度定数（ｋａ（Ｍ−１ｓ−１））は、抗原−アンタゴニスト複合体形成の速度を反映する値である。解離速度定数（ｋｄ（ｓ−１））は、該複合体の安定性を反映する値である。会合速度定数を解離速度定数で割ることによって（ｋａ／ｋｄ）、平衡会合定数（ＫＡ  （Ｍ−１））が得られる。解離速度定数を会合速度定数で割ることによって（ｋｄ／ｋａ）、平衡解離定数（ＫＤ  （Ｍ））が得られる。該値は、相互作用の結合アフィニティーを表す。同じＫＤとの相互作用は、幅広く変化可能な会合および解離速度定数を有することができる。結果として、ｋａおよびｋｄの両方を測定することは、相互作用のアフィニティーをより独特に表す助けとなる。
【０２５９】
材料および方法：一連の実験は、クローンｃ８７０およびｃ１０３９によって産生される精製ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの結合アフィニティーを測定するために完了した。結合速度論およびアフィニティー研究は、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００（商標）システム（GE Healthcare, Piscataway, NJ）上で実施された。方法は、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００（商標）コントロール・ソフトウェア  ｖ  １．１．１を用いてプログラム化された。ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは、Ｈｉｓ６／Ｍｙｃエピトープタグを用いて生産された。アフィニティー分析は、ＣＭ５チップ上に固定化された抗−Ｈｉｓ６／Ｍｙｃ抗体を用いてＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを捕獲することによって実施された。抗−Ｈｉｓ６および抗−Ｍｙｃ抗体は、１：１モル比で混合し、アミンカップリング化学を用いて、約７５００ＲＵの密度まで、ＣＭ５センサーチップに共有結合により固定化した。１０ｎＭのＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを分離したフローセル上に、１０ｕｌ／分にて１分間インジェクトし、次いで、１分安定化期間をおいた。ＶＥＧＦ−Ａの３３．３ｎＭ〜０．１４ｎＭの連続１：３希釈物を該表面にインジェクトし、センサーチップ上に捕獲されたＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストに特異的に結合させた。各ＶＥＧＦ−Ａ濃度について２回のインジェクションを、会合時間５分および解離時間１０分で行った。速度論的結合研究は、流速３０μＬ／分で行った。全ての結合実験は、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ  ０．０５％界面活性剤Ｐ２０、０．１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、ｐＨ７．４のバッファー中、２５℃で実施した。サイクルとサイクルの間に、フローセルを５０ｍＭ  Ｈ３ＰＯ４で洗浄して、該表面を再生した。該洗浄工程は、捕獲したＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを固定化抗体表面から除去し、次の試料のその後の結合を可能にした。
【０２６０】
データは、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００（商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（バージョン１．１．１）を用いてまとめた。データは、参照フローセルおよびブランクインジェクションを差し引くことによって処理した。再生工程が一連のインジェクションを通して一定の結合表面を提供したことを確実にするために、ベースライン安定性を評価した。２回のインジェクション曲線を再現性についてチェックした。ＶＥＧＦ−Ａ抗原は二量体を形成するので、得られる結合曲線は、二価分析相互作用モデルに全体的にフィットした。
【０２６１】
結果：２つのＶＥＧＦＡアンタゴニストが、ＶＥＧＦ−Ａに対する結合アフィニティーについて特徴付けられた（表９にまとめられた結果）。会合速度定数（ｋａ（Ｍ−１ｓ−１））および解離速度定数（ｋｄ （ｓ−１））は、これらのヒトＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストについて測定された。ＫＤおよびＫＡは、ｋａおよびｋｄ値から算出した。データは、二価分析モデルによくフィットした。該モデルは、ｋａ（ｋａ１およびｋａ２）およびｋｄ（ｋｄ１およびｋｄ２）について２つの値を測定する。第１セットの値（ｋａ１およびｋｄ１）は、表９に報告される相互作用の一価の反応速度論を表す。これらの試料に関して報告されたアフィニティーは、これらの値に由来し、ＫＤ１と称する。ＫＤおよびＫＡは、ｋａおよびｋｄ値から算出された。全３つのＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは、ＶＥＧＦ−Ａ抗原に対して類似のアフィニティーを示し（ＫＤ＝０．７−１．０Ｅ−９Ｍ）、これらの結果は２つの独立したランにおいて一致した。
【０２６２】
【表９】
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【０２６３】
実施例１１：抗−ＶＥＧＦ−Ａ抗体のエピトープマッピング
クローンｃ８７０およびｃ１０３９によって産生されたモノクローナルヒトＶＥＧＦ−Ａ抗体は、ＪＰＴ  ＶＥＧＦ−Ａ  ＲｅｐｌｉＴｏｐｅ（商標）スライドを用いて、ヒトＶＥＧＦ−Ａに対するペプチド結合について評価された。
【０２６４】
材料および方法：各ＪＰＴスライドは、下記のアレイの３つの複製物から構成された。各アレイは、ＶＥＧＦ−Ａの連続的なオーバーラップする１３ａａフラグメント（スポット１−７８）、次いで、ＶＥＧＦ−Ａの連続的なオーバーラップする２０ａａフラグメント（スポット８５−１１５）から構成された。さらに、各試験抗体ならびにマウスおよびヒトＩｇＧの対照スポットは、各アレイの上面、底面および側面に位置した。一連の実験は、ヒトＶＥＧＦ−Ａタンパク質の合成直鎖ペプチドに対するｓｃＦｖ  ｃ８７０およびｃ１０３９の結合能を決定するために完了させた。抗−ヒトＶＥＧＦ−Ａ  ｓｃＦｖは、Ｈｉｓ／Ｍｙｃエピトープタグで標識された。１０−１００μｇ／ｍｌの抗体溶液を該ペプチドスライドにアプライした。抗−Ｈｉｓおよび／または抗−Ｍｙｃ抗体を次いで、該スライドにアプライした。ビオチン化チラミド（Biotinylated Tyramide）（Renaissance（登録商標） TSA（商標）ビオチンシステム， PerkinElmer, #NEL700A）を用い、該キットに説明された方法にしたがって、シグナルを増幅した。ストレプトアビジンアルカリホスファターゼおよびＤＡＫＯ  Ｐｅｒｍａｎｅｎｔ  Ｒｅｄ染料を用いて、結合した抗体を視覚化した。
【０２６５】
Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ２０００Ｕ倒立顕微鏡、ＡＳＩ  ＭＳ−２０００モーター駆動ステージ、Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ  Ｃａｓｃａｄｅ  ＩＩ  ５１２カメラおよびＸ−ｃｉｔｅ  １２０蛍光イルミネーションシステムからなる自家製顕微鏡スライドスキャナーを用いて、データをまとめた。シグナル強度は、ＭｅｔａＭｏｒｐｈ  ｖ７．１イメージングソフトウェアを用いて分析した。
【０２６６】
結果：結合ペプチドの位置および配列を下記表１０に示す。数字は、全シグナル強度に対する該ペプチドのシグナル強度パーセンテージを示す。
【０２６７】
【表１０】
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＊  領域「ｐｏｓｔ  β７」は、ＶＥＧＦ分子のヘパリン結合ドメインである。
【０２６８】
全抗体は、α２−β２領域の周辺に特異的結合部位を示した。データは、試験抗体を２つのカテゴリーに分類できることを示し、すなわち、抗体ｃ８７０は、ＶＥＧＦのｃ末端側が好ましく、一方、抗体ｃ１０３９は、該タンパク質のｎ末端側に向かってより強力な結合を有した。抗体ｃ８７０は、最少の結合ペプチドを有したが、抗体ｃ１０３９は、最も分散した結合パターンを有した。各抗体由来のトップ２つの結合部位を下記の表に示す。
【０２６９】
【表１１】
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【０２７０】
実施例１２：ＶＥＧＦＲ２リン酸化アッセイを用いる、ＶＥＧＦ−Ａ−結合性ｓｃＦｖおよびネズミＶＥＧＦ−Ａの活性に対する二重特異的抗体の交差反応性試験
ネズミＶＥＧＦ−Ａを中和する能力についての候補分子（ｓｃＦｖ、Ｆａｂおよび二重特異的）をスクリーンするために、ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）リン酸化を測定する細胞に基づくルミネックス（luminex）アッセイを行った。ｍＶＥＧＦ−Ａ１６４は、ヒトＶＥＧＦＲ２と交差反応するので、ヒトＶＥＧＦＲ２に基づくレポーターシステムを利用することができる。２９３／ＫＤＲ／ＫＺ１３６／ｃ２２細胞を透明９６ウェル組織培養プレート中、１００μｌ完全培地（ＤＭＥＭ、１０％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）、１Ｘピルビン酸ナトリウム、１Ｘ  ＧｌｕｔａＭａｘ（Invitrogen））中１ウェル当たり２０，０００細胞の密度で播種し、一晩接着させた。次の日に、完全培地を真空吸引によって除去し、１００μｌの無血清培地（ＤＭＥＭ、１Ｘピルビン酸ナトリウム、１Ｘ  ＧｌｕｔａＭａｘ）に交換した。細胞を一晩インキュベートした。
【０２７１】
次の日に、候補ＶＥＧＦ−Ａ中和性分子（ｓｃＦｖｓ、Ｆａｂｓ）を、無血清培地中において非中和剤（培地のみ）と共に１：５希釈で、２００ｎＭから１２ｐＭに連続希釈した。ＶＥＧＦＲ２−Ｆｃを中和の陽性対照として用いた。これらに、等容量のｍＶＥＧＦ−Ａ１６４（493-MV-005, R&D Systems）を、０．２６ｎＭ  ＶＥＧＦ−Ａおよび１００ｎＭ〜６ｐＭ中和分子または陽性対照の最終濃度に対して、０．５４ｎＭで加えた。これらを３７℃で６０分間インキュベートした。
【０２７２】
インキュベーション後、真空吸引によって培地を血清飢餓細胞から除去し、１００μｌの上記複合体に交換した。細胞を３７℃で１０分間インキュベートした。インキュベーション後、培地を真空吸引によって除去し、細胞を１００μｌの氷冷したリン酸緩衝化セーライン（ＰＢＳ， Invitrogen）で優しく洗浄した。ＰＢＳを真空吸引によって除去し、細胞を、１ｍＭ  ＰＭＳＦ（Sigma, ＤＭＳＯ中のP-2714）および１０ｍＬにつき１個のＣｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｉｎｉタブレット（Roche, 11836153001）を含有する２５μｌのＮＰ−４０溶解バッファー（Invitrogen Cat.# FNN0021）中で溶解した。溶解物をプラットホーム振盪機上、４℃で２０分間インキュベートし、３０００ｒｐｍにて、４℃で１０分間遠心分離して溶解物を浄化した。溶解物を新しい９６ウェルマイクロタイタープレートに移し、アッセイするまで−２０℃で置いた。
【０２７３】
ＶＥＧＦＲ２リン酸化ルミネックスアッセイのために、Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（Invitrogen LHB0002）およびＶＥＧＦＲ２［pY1059］  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｂｅａｄ  Ｋｉｔ（Invitrogen LHO0601）を製造者の指示にしたがって用いた。溶解物を解凍し、８０μｌの  Ａｓｓａｙ  Ｄｉｌｕｅｎｔと１：５で混合した。ルミネックス真空ろ過プレートのウェルを２００μｌのＷｏｒｋｉｎｇ  Ｗａｓｈ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで予め湿らせた。希釈したビーズを１ウェル当たり２５μｌで加え、２００μｌのＷｏｒｋｉｎｇ  Ｗａｓｈ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで２回洗浄した。洗浄後、５０μｌの希釈した溶解物、および５０μｌの希釈したデテクター抗体を各ウェルに加え、プレートをホイルで覆い、プラットホーム振盪機上、５００ｒｐｍにて、室温（ＲＴ）で３時間インキュベートした。インキュベーション後、ビーズを２００μｌのＷｏｒｋｉｎｇ  Ｗａｓｈ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで２回洗浄し、次いで、１００μｌの希釈した抗ウサギＩｇＧ−ＲＰＥを各ウェルに加え、プレートをホイルで覆い、プラットホーム振盪機上５００ｒｐｍにて、ＲＴで３０分間インキュベートした。インキュベーション後、ビーズを２００μｌのＷｏｒｋｉｎｇ  Ｗａｓｈ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで３回洗浄し、１２５μｌのＷｏｒｋｉｎｇ  Ｗａｓｈ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ中で再懸濁した。ビーズをプラットホーム振盪機上５００ｒｐｍにて３０秒間再懸濁し、Ｌｕｍｉｎｅｘ−１００装置（BioRad）中で読み取った。分析ソフトウェア（Spotfire）を用いてデータを分析し、各候補および対照についてＩＣ５０値を計算した。
【０２７４】
結果：ヒト受容体、ＶＥＧＦ−Ｒ２  （ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）に結合するｍＶＥＧＦ−Ａ１６４の作用は、該受容体のリン酸化を誘導する。該ルミネックスに基づくアッセイは、全ＶＥＧＦ−Ｒ２を、抗−ＶＥＧＦＲ２抗体にコンジュゲートした蛍光標識したビーズに結合させる。［ｐＹ１０５９］でのリン酸化を検出する二次抗体を用いて、どれだけ多くのＶＥＧＦＲ２がリン酸化されたかを検出する。下記の表１２に示されるように、ヒトＶＥＧＦ−Ａ活性を中和した多くのｓｃＦｖが、該アッセイにおいて、マウスＶＥＧＦ活性も阻害した。これらの同じｓｃＦｖを含有した二重特異的抗体もまた、マウスＶＥＧＦ−Ａ活性を中和した。
【０２７５】
【表１２】
2012521768.tif 000016
【０２７６】
実施例１３：マウスＶＥＧＦＡ（ＶＥＧＦ−Ａ１６４）で刺激されたＨＵＶＥＣ細胞上のｓｃＦｖｓの中和活性を測定するための増殖アッセイ
マウスＶＥＧＦ−Ａ中和性ｓｃＦｖをスクリーンするために、３Ｈ−チミジンアッセイを行った。組み換えマウスＶＥＧＦ−Ａ１６４を陽性対照として、２．６ｎＭで用いた。１ｘインスリン−トランスフェリン−セレニウムを含有するＤＭＥＭ−Ｆ１２（１：１）培地（無血清培地，ＳＦＭ； Invitrogen, Carlsbad, CA）を陰性対照として用いた。ｓｃＦｖ分子は、ＳＦＭ中、５００ｎＭ、５０ｎＭ、５ｎＭ、０．５ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．００５ｎＭ、および０．０００５ｎＭで連続希釈した。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を９６ウェル平底プレート中に、容量１００μＬ、１ウェル当たり９００−１０００細胞の密度で播種した。ＨＵＶＥＣ細胞を完全ＥＧＭ−２ＭＶ培地（Lonza, Walkersville, MD）中、３７℃、５％ＣＯ２にて２日間培養した。細胞をＳＦＭで２４時間血清飢餓にし、２．６ｎＭで、連続希釈したＶＥＧＦ−Ａ  ｓｃＦｖを用いて、または用いないで、２４時間刺激し、１ウェル当たり１μＣｉの３Ｈチミジン（増殖する細胞中に組み込まれる）で２４時間パルスした（全て、３７℃、５％ＣＯ２）。細胞を採取し、Ｔｏｐｃｏｕｎｔ装置（Hewlett Packard）を用いてカウントした。
【０２７７】
結果：該アッセイにおいてスクリーンされた多くのｓｃＦｖｓは、下記の表１３において示される低いｎＭ  ＩＣ５０値によって分かるように、マウスＶＥＧＦ誘導性ＨＵＶＥＣ増殖の強力な中和を示した。
【０２７８】
【表１３】
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【０２７９】
実施例１４：第１、第２および第３の細胞外Ｉｇ様ドメインまたは第２および第３の細胞外Ｉｇ様ドメインを含む切断型を発現するための可溶性ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ  Ｃ−末端Ｆｃ５発現プラスミドの構築
ヒトＦＧＦＲ３ＩＩＩｃの第１、２および３の細胞外Ｉｇ様ドメインまたはヒトＦＧＦＲ３ＩＩＩｃの第２および第３細胞外Ｉｇ様ドメインを有する切断型を含有する一連の発現構築物を作成した。これらのヒトＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ配列スパンを下流Ｃ末端Ｆｃ５配列に融合した。該一連の構築物は、上記の配列スパンおよび配列番号２のアミノ酸残基２６２および配列番号１０のアミノ酸残基１４２にて、セリンの代わりにトリプトファンを生じる点変異を含んだ。（２４９位の該変異は、天然ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃアミノ酸配列に関する。）該変異は、Ｓ２４９Ｗと記す。これらの構築物、ＰＣＲおよび相同組み換えにより、上記のＦＧＦＲ３ＩＩＩｃドメインをコードするＤＮＡフラグメント、Ｆｃ５フラグメントおよび発現ベクターｐＺＭＰ３１を用いて、作成された。
【０２８０】
ＭＰＥＴ構築物＃１９１７（配列番号１および２）と称する全長可溶性ヒトＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ（Ｓ２４９Ｗ）Ｆｃ５構築物を作成するために、３つのＰＣＲフラグメントを作成し、酵母組み換えにより、一緒にｐＺＭＰ３１ベクター中に導入した。最初のフラグメントは、ｐＺＭＰ３１ベクター配列中の最適化ＴＰＡリーダーとの５’オーバーラップ、次いで、Ｓ２４９Ｗ点変異をコードするヒトＨｕｍａｎ  ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃの配列および下流ヒトＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ配列との３’オーバーラップを示した。該フラグメントの場合、ＰＣＲ増幅反応は、５’オリゴヌクレオチドｚｃ６２５５２（（配列番号３）（ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃを鋳型として用いてＰＣＲフラグメントを作成するためのフォワードプライマー。ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃは、配列番号２のＥ３６で開始する。））を使用した。ｐＺＭＰ３１中でクローン化されるべきフラグメントは、ｏｐＴＰＡリーダー配列（配列番号２の残基１−３５）を用いた。ＰＣＲは、３’オリゴヌクレオチドｚｃ６２５５７（配列番号４）（ＦＧＦＲ３  ＩＩＩｃを鋳型として用いてＰＣＲフラグメントを作成するためのリバースプライマー。フラグメントはＳ２４９Ｗ変異を生じるであろう。Ｒｅｃ配列の５’末端でネスト化したフォワードプライマーと共に使用されるべき）を用いて行い、クローントラックＩＤ＃１０２５５１ヒトＦＧＦＲ３ＩＩＩｃを鋳型として用いた。
【０２８１】
第２のフラグメントは、上流ヒトＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ配列との５’オーバーラップ、次いで、Ｓ２４９Ｗ点変異をコードするヒトＦＧＦＲ３ＩＩＩｃの配列およびＦｃ５配列（配列番号２の残基３８９−６２０）との３’オーバーラップを示した。該フラグメントの場合、ＰＣＲ増幅反応は、５’オリゴヌクレオチドｚｃ６２５５６（配列番号８２）（ＦＧＦＲ３  ＩＩＩｃを鋳型として用いてＰＣＲフラグメントを作成するためのフォワードプライマー。フラグメントはＳ２４９Ｗ変異を生じるであろう。ｓｏｌ．Ｒｅｃ配列の３’末端でネスト化されたリバースプライマーと共に使用されるべき）を使用した。ＰＣＲは、３’オリゴヌクレオチドｚｃ６２５５３（配列番号６）（ＦＧＦＲ３  ＩＩＩｃを鋳型として用いてＰＣＲフラグメントを作成するためのリバースプライマー。ｓｏｌ．ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃないしＧ３７５の配列。フラグメントは、オーバーラップしているＦｃ５配列を有するであろう。）を用いて行い、クローントラックＩＤ＃１０２５５１ヒトＦＧＦＲ３ＩＩＩｃを鋳型として用いた。
【０２８２】
第３のフラグメントは、Ｆｃ５配列を含有し、ヒトＦＧＦＲ３ＩＩＩｃとの５’オーバーラップおよびｐＺＭＰ３１ベクター配列との３’オーバーラップを示した。該フラグメントの場合、ＰＣＲ増幅反応は、５’オリゴヌクレオチドｚｃ６２５５４（配列番号７）を使用した。（Ｆｃ５を鋳型として用いてＰＣＲフラグメントを作成するためのフォワードプライマー。フラグメントは、ｓｏｌ．ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃないしＧ３７５のオーバーラップしている配列を有するであろう。）ＰＣＲは、３’オリゴヌクレオチドｚｃ６２５５５（配列番号８）（Ｆｃ５を鋳型として用いてＰＣＲフラグメントを作成するためのリバースプライマー。フラグメントは、ｐＺＭＰ３１のオーバーラップする配列を有するであろう。）を用いて行い、鋳型としてＭＰＥＴ構築物＃１６９９、ＩＬ１７ＲＥＦｃ５を用いた。
【０２８３】
上記の３つのフラグメントを作成するためのＰＣＲ増幅反応条件は、下記の通りであった。１サイクル、９５℃、５分；２５サイクル、９５℃、３０秒、次いで、５５℃、３０秒、次いで、６８℃、１分３０秒；１サイクル、７２℃、７分。ＰＣＲ反応混合物は、１％アガロースゲル上に流し、予想サイズに対応するＤＮＡフラグメントをＱＩＡｑｕｉｃｋ（商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Qiagen, Cat. No. 28704）を用いてゲルから抽出した。
【０２８４】
プラスミドｐＺＭＰ３１は、キメラＣＭＶエンハンサー／ＭＰＳＶプロモーターを有する発現カセット、酵母組み換え前の線状化のためのＦｓｅ１、Ｎａｒ１およびＢｇｌＩＩ部位、イー・コリ複製起点；ＳＶ４０プロモーター、エンハンサーおよび複製起点、ＤＨＦＲ遺伝子、およびＳＶ４０ターミネーターを含む哺乳動物選択マーカー発現単位；およびエス・セレビシエ（S. cerevisiae）中での選択および複製に必要なＵＲＡ３およびＣＥＮ−ＡＲＳ配列を含有する哺乳動物発現ベクターである。
【０２８５】
酵母中での組み合え前に、プラスミドｐＺＭＰ３１をＢｇｌＩＩで消化し、次いで、上記のＰＣＲフラグメントをゲル抽出した。５０μｌのコンピート酵母（S. cerevisiae）細胞を３μｌの各ＰＣＲフラグメントインサートＤＮＡおよび約５０ｎｇのＢｇｌＩＩ消化ｐＺＭＰ３１ベクターと合わせた。該混合物を０．２ｃｍエレクトロポレーションキュベットに移した。該酵母／ＤＮＡ混合物を、０．７５ｋＶ（５ｋＶ／ｃｍ）、∞オームおよび２５μＦにセットしたパワーサプライ（BioRad Laboratories, Hercules, CA）を用いて電気パルスした。３００μｌの１．２Ｍソルビトールをキュベットに加え、酵母を７５μｌおよび２００μｌアリコートで、２つのＵＲＡ−ＤＳプレート上に播種し、３０℃でインキュベートした。約７２時間後、単一プレート由来のＵｒａ＋酵母形質転換体を１００ｕｌの酵母溶解バッファー（自家製：  ．１Ｍ  ＮａＣＬ、  ．００６２Ｍ  Ｔｒｉｓ  ＨＣＬ、  ．００３８Ｍ  Ｔｒｉｓ塩基、  ．００１Ｍ  ＥＤＴＡ、２％（ｖ／ｖ）ポリソルベート２０、１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ）および１０Ｕ  Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ／１００ｕｌを含有する１００ｕｌのＱｉａｇｅｎ  ＭｉｎｉＰｒｅｐキットバッファーＰ１中で再懸濁した。次いで、該混合物を３７℃で約１５分間インキュベートし、Ｑｉａｇｅｎ  ｍｉｎｉｐｒｅｐキットプロトコールの残りを製造者の指示にしたがって実施した。
【０２８６】
エレクトロコンピーテントなイー・コリ宿主細胞（ＤＨ１２Ｓ）の形質転換を、４μｌの酵母ＤＮＡ調製物および５０μｌのイー・コリ細胞を用いて行った。細胞を１．７５ｋＶ、２５μＦ、および４００オームで電気パルスした。エレクトロポレーション後、  ．５ｍｌのＬＢを加え、次いで、細胞を１０μｌおよび３０μｌのアリコートで、２つのＬＢ  ＡＭＰプレート（ＬＢブロス（Lennox）、１．８％  Ｂａｃｔｏ（商標）  Ａｇａｒ（Difco）、１００ｍｇ／Ｌアンピシリン）上に播種した。
【０２８７】
インサートＤＮＡクローンを配列分析に付した。正しい配列を含有する１つのクローンを選択する。大規模プラスミドＤＮＡを市販のキット（QIAGEN Plasmid Mega Kit, Qiagen, Valencia, CA）を用いて、製造者の指示に従って単離する。
【０２８８】
同じプロセスを用いて、ＭＰＥＴ構築物＃１９２０（配列番号９および１０）と称する切断型可溶性ヒトＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ（Ｓ２４９Ｗ）Ｆｃ５構築物を調製した。第１のフラグメントは、ｐＺＭＰ３１ベクター配列中の最適化ＴＰＡリーダー配列との５’オーバーラップ、次いで、Ｓ２４９Ｗ点変異をコードしているヒトＦＧＦＲ３ＩＩＩｃの配列および下流ヒトＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ配列との３’オーバーラップを示した。該フラグメントの場合、ＰＣＲ増幅反応は、５’オリゴヌクレオチドｚｃ６２５６０（（配列番号１１）（ＦＧＦＲ３  ＩＩＩｃを鋳型として用いてＰＣＲフラグメントを作成するためのフォワードプライマー。フラグメントはＩｇＤ２Ｄ３形態を生じるであろう。切断型ＦＧＦＲ３  ＩＩＩｃの配列は、ＩｇＤ２の上流の配列番号２のＤ１５６で開始する。ｏｐＴＰＡリーダー配列を用いてｐＺＭＰ３１中にクローン化されるべきフラグメント））を用いた。ＰＣＲは、３’オリゴヌクレオチドｚｃ６２５５７（配列番号４）（ＦＧＦＲ３  ＩＩＩｃを鋳型として用いてＰＣＲフラグメントを作成するためのリバースプライマー。フラグメントはＳ２４９Ｗ変異を生じるであろう。Ｒｅｃ配列の５’末端でネストかされたフォワードプライマーとともに使用されるべき））を用いて行い、鋳型として、クローントラックＩＤ  ＃１０２５５１ヒトＦＧＦＲ３ＩＩＩｃを用いた。該フラグメントは、上記の同じＰＣＲサーモサイクルを用いて作製し、上記の第２および第３フラグメントと共に、ＢｇｌＩＩ消化したｐｚＭＰ３１ベクター中に導入して、切断型可溶性ヒトＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ（Ｓ２４９Ｗ）Ｆｃ５構築物を生じた。
【０２８９】
メガｐｒｅｐ  ＤＮＡをＱｉａｇｅｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｅｇａ  Ｋｉｔ（Qiagen, Valencia, CA）を用いて各プラスミドについて調製した。各々、ＭＰＥＴ構築物＃１９１７（配列番号１および２）および＃１９２０（配列番号９および１０）と称する、全長可溶性ヒトＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ（Ｓ２４９Ｗ）Ｆｃ５および切断型可溶性ヒトＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ（Ｓ２４９Ｗ）Ｆｃ５構築物の場合、２００μｇの各発現構築物メガｐｒｅｐプラスミドを約２４０単位のＢｓｔＢ１制限酵素で、３７℃で２時間消化し、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールで洗浄し、次いで、クロロホルム／イソアミルで洗浄し、次いで、エタノールで一晩沈澱させ、１．５ｍＬ微量遠心チューブ中で遠心分離した。上清をデカントし、ペレットを１ｍＬの７０％エタノールで洗浄し、室温で５分間インキュベートした。該チューブを微量遠心分離機（microfuge）中、１４，０００ＲＰＭで１０分間スピンし、上清をペレットからデカントした。滅菌環境中、組織培養フード上、ペレットを解放空気中で約５分間乾燥させ、次いで、３７℃の予め温めたＣＨＯ細胞組織培養培地０．４ｍｌ中に再懸濁し、３７℃で１０分間インキュベートした。ＤＮＡペレットを可溶化させた一方で、エレクトロポレートすべき各ベクターのために、約９ｘ１０６ＣＨＯ細胞をペレット化し、  ．４ｍｌのＣＨＯ細胞組織培養培地中に再懸濁し、最終容量８００μｌになるよう再懸濁したプラスミドＤＮＡと合わせた。ＤＮＡ／細胞混合物を０．４ｃｍのギャップキュベット中に置き、下記のパラメーターを用いてエレクトロポレートした。３００Ｖにて、９５０μＦ、大容量。各プラスミドエレクトロポレーションセットの場合、次いで、キュベットの中身を除去し、プールし、ＣＨＯ細胞組織培養培地で２５ｍＬに希釈し、１２５ｍＬの振盪フラスコ中に置いた。フラスコを振盪機上、３７℃、５％ＣＯ２にて、１２０ＲＰＭで振盪しながら、インキュベーター中に置いた。
【０２９０】
ＣＨＯ細胞を、５００ｎＭメトトレキサート（ＭＴＸ）に対する栄養選択および増幅に付した。選択されたＣＨＯ系統をＭＥＣＬ１３３４（ｓｏｌＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ（２３ ３７５）（Ｓ２４９Ｗ）Ｆｃ５）およびＭＥＣＬ１３３７（ｓｏｌＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ（１４３ ３７５）（Ｓ２４９Ｗ）Ｆｃ５）と称する。
【０２９１】
発現試験のために、培養物を継代３エレクトロポレーション後プールを用いて設定した。細胞を遠心分離し、５０ｍｌ容量中、  ．５ｅ６  ｃ／ｍｌにて、選択せずに新鮮な培地中に再懸濁し、上記のとおり、９６時間進行させた。タンパク質発現は、ウェスタンブロットによって確認した。
【０２９２】
大規模スピナー（spinner）フラスコは、精製のためにタンパク質を生成するために開始させた。２００ｍｌ種培養物を継代６のトランスフェクト後ＣＨＯ細胞プールのＭＥＣＬ  １３３４およびＭＥＣＬ  １３３７上で、５ｍＭ  Ｌ−グルタミン（２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン由来， Gibco catalog #25030-081）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（１００ｍＭピルビン酸ナトリウム由来， Gibco catalog #11360-070）および５００ｎＭメトトレキサートを添加したＺＭ２培地（SAFC Biosciences Ex-CELL catalog # 68041）を用いて開始した。フラスコを３７℃、１２０ｒｐｍおよび６％ＣＯ２で培養した。６日後、各ＣＨＯプールフラスコを３Ｌスピナーフラスコ中に播種して、  ．５ｅ６ｃ／ｍｌにて、５ｍＭ  Ｌ−グルタミン（２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン由来， Gibco catalog #25030-081）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（１００ｍＭピルビン酸ナトリウム由来， Gibco catalog #11360-070）を添加したＺＭ２培地（SAFC Biosciences Ex-CELL catalog # 68041）を用いて、選択を用いずに１Ｌの可動容量（working volume）を達成した。スピナーフラスコは、３７℃、９５ｒｐｍおよび６％ＣＯ２で培養した。播種の約２４時間後、  ．５Ｌの培地を各スピナーに加えて、最終容量１．５Ｌを達成し、培養を続けた。播種の約８日後、馴化培地を収集し、０．２μＭろ過し、タンパク質精製に付した。
【０２９３】
同様の方法を用いて、点変異のない、または配列番号１５の位置２６３および配列番号２２の位置１４３におけるプロリン残基をアルギニンに変化させるような配列変異（Ｐ２５０Ｒと記す）（２５０位の該変異は、天然ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃアミノ酸配列に関する。）を有する可溶性全長および切断型バージョンを包含するＦＧＦＲ３  Ｆｃ５分野に対する付加的な構築物を作成した。該オリゴヌクレオチドおよび得られる構築物は、対応する配列識別子と共に下記に示される。
【０２９４】
【表１４】
2012521768.tif 000018
【０２９５】
【表１５】
2012521768.tif 000019
【０２９６】
【表１６】
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【０２９７】
【表１７】
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【０２９８】
【表１８】
2012521768.tif 000022
【０２９９】
【表１９】
2012521768.tif 000023
【０３００】
類似の方法を用いて、点変異のない、または配列番号２９の位置２６６および配列番号４０の位置１４３のセリン残基がトリプトファンに変化するような配列変異（Ｓ２５２Ｗと記す）または配列番号３３の位置２６７および配列番号４２の位置１４４のプロリン残基がアルギニンに変化するような配列変異（Ｐ２５３Ｒと記す）（該変異の位置は、天然ＦＧＦＲ２ａｌｐｈａＩＩＩｃアミノ酸配列に関する。）を有する可溶性全長および切断型バージョンの両方を包含するＦＧＦＲ２ａｌｐｈａＩＩＩｃ  Ｆｃ５の可溶性形態の構築物の分野を生成した。
【０３０１】
【表２０】
2012521768.tif 000024
【０３０２】
【表２１】
2012521768.tif 000025
【０３０３】
【表２２】
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【０３０４】
【表２３】
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【０３０５】
【表２４】
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【０３０６】
【表２５】
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【０３０７】
実施例１５：多特異的可溶性ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ  Ｆｃ５  ＶＥＧＦＡ  ｓｃＦｖ発現プラスミドの構築
ヒトＦＧＦＲ３ＩＩＩｃの第１、第２および第３の細胞外Ｉｇ様ドメインまたはヒトＦＧＦＲ３ＩＩＩｃの第２および第３の細胞外Ｉｇ様ドメインを有する切断型を含有する一連の発現構築物を作成した。これらのヒトＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ配列スパンは、下流のＣ末端Ｆｃ５、リンカーおよびＶＥＧＦ−Ａに対する結合に特異的な下流のｃ末端ｓｃＦｖ配列に融合された。該一連の構築物は、上記のヒトＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ配列スパンおよび配列番号６４のアミノ酸位置１６２および配列番号６２の位置１４２にセリンの代わりにトリプトファン残基を生じる点変異を包含した。該変異は、Ｓ２４９Ｗと記される。（該変異の位置は、天然ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃアミノ酸配列に関する。）これらの構築物を、Ｆｃ５配列を有するＦＧＦＲ３ＩＩＩｃドメインをコードしているＤＮＡフラグメントおよびＶＥＧＦ−Ａ  ｓｃＦｖ配列８７０ｅ６および１０９４．１を含有する発現ベクターｐＺＭＰ３１を用いて、ＰＣＲおよび相同組み換えによって作成した。
【０３０８】
全長可溶性ヒトＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ（Ｓ２４９Ｗ）Ｆｃ５  ｃ８７０ｅ６および全長可溶性ヒトＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ（Ｓ２４９Ｗ）Ｆｃ５  ｃ１０９４．１構築物を作成するために、ＰＣＲフラグメントを作成し、酵母組み換えにより、リンカーおよび下流ＶＥＧＦＡ  ｓｃＦｖ配列８７０ｅ６または１０９４．１（ＭＶＣ  ７０９−配列番号４３および４４；およびＭＶＣ  ７１０−配列番号４５および４６と称する）を含有するｐＺＭＰ３１に基づくベクター中に導入した。ＰＣＲフラグメントは、ｐＺＭＰ３１に基づくベクター配列中の最適化ＴＰＡリーダー配列との５’オーバーラップ、次いで、Ｓ２４９Ｗ点変異をコードしているヒトＦＧＦＲ３ＩＩＩｃの配列、Ｆｃ５配列およびリンカー配列との３’オーバーラップを示した。該フラグメントの場合、ＰＣＲ増幅反応は、５’オリゴヌクレオチドｚｃ６２５５２（配列番号３）（鋳型としてＦＧＦＲ３ＩＩＩｃを用いてＰＣＲフラグメントを作成するためのフォワードプライマー。ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃの配列は、ＩｇＤ１のＥ２３上流で開始する。ｏｐＴＰＡリーダー配列を用いてｐＺＭＰ３１中にクローン化されるべきフラグメント）を用いた。ＰＣＲは、３’オリゴヌクレオチドｚｃ６０５６６（配列番号８２）を用いて行い、ＭＰＥＴ構築物＃１９１７（配列番号１）を鋳型として用いた。
【０３０９】
上記の３つのフラグメントを作成するためのＰＣＲ増幅反応条件は、下記の通りである。１サイクル、９５℃、５分；２５サイクル、９５℃、３０秒、次いで、５５℃、３０秒、次いで、６８℃、２分；１サイクル、７２℃、７分。ＰＣＲ反応混合物は、１％アガロースゲル上に流し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（商標）  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Qiagen, Cat. No. 28704）を用いて、予想サイズに対応するＤＮＡフラグメントをゲルから抽出した。
【０３１０】
プラスミドＭＶＣ７０９およびＭＶＣ７１０は、ネズミＦｃ２、リンカー、および８７０ｅ６（配列番号４３）または１０９４．１  ｓｃＦｖ（配列番号４５）の下流配列、ＶＥＧＦ−Ａ結合性配列を含有するｐＺＭＰ３１に基づく哺乳動物発現ベクターである。これらのベクターは、キメラＣＭＶエンハンサー／ＭＰＳＶプロモーターを有する発現カセット、酵母組み換え前の線状化のためのＦｓｅ１、Ｎａｒ１およびＢｇｌＩＩ部位、イー・コリ複製起点；ＳＶ４０プロモーター、エンハンサーおよび複製起点を含む哺乳動物選択マーカー発現単位、ＤＨＦＲ遺伝子、およびＳＶ４０ターミネーター；およびエス・セレビシエ（S. cerevisiae）における選択および複製に必要なＵＲＡ３およびＣＥＮ−ＡＲＳ配列を含有する。
【０３１１】
プラスミドＭＶＣ７０９およびＭＶＣ７１０は、酵母における組み換え前にＢｇｌＩＩ制限酵素で消化し、次いで、上記のＰＣＲフラグメントをゲル抽出した。６０μｌのコンピート酵母（S. cerevisiae）細胞を５μｌの各ＰＣＲフラグメントインサートＤＮＡおよび約５０ｎｇのＢｇｌＩＩ消化ＭＶＣ７０９およびＭＶＣ７１０ベクターと合わせた。該混合物を０．２ｃｍエレクトロポレーションキュベットに移した。酵母／ＤＮＡ混合物を、０．７５ｋＶ（５ｋＶ／ｃｍ）、∞オームおよび２５μＦにセットしたパワーサプライ（BioRad Laboratories, Hercules, CA）を用いて電気パルスした。４００μｌの１．２Ｍソルビトールをキュベットに加え、酵母を７５μｌおよび２００μｌアリコートで、２つのＵＲＡ−ＤＳプレート上に播種し、３０℃でインキュベートした。約７２時間後、単一プレート由来のＵｒａ＋酵母形質転換体を１００ｕｌの酵母溶解バッファー（自家製：  ．１Ｍ  ＮａＣＬ、  ．００６２Ｍ  Ｔｒｉｓ  ＨＣＬ、  ．００３８Ｍ  Ｔｒｉｓ塩基、  ．００１Ｍ  ＥＤＴＡ、２％（ｖ／ｖ）ポリソルベート２０、１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ）および１０Ｕ  Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ／１００ｕｌを含有する１００ｕｌのＱｉａｇｅｎ  ＭｉｎｉＰｒｅｐキットバッファーＰ１中で再懸濁した。次いで、該混合物を３７℃で約１５分間インキュベートし、Ｑｉａｇｅｎ  ｍｉｎｉｐｒｅｐキットプロトコールの残りを製造者の指示にしたがって実施した。
【０３１２】
エレクトロコンピーテントなイー・コリ宿主細胞（ＤＨ１２Ｓ）の形質転換を、４μｌの抽出した酵母プラスミドＤＮＡ調製物および５０μｌのイー・コリ細胞を用いて行った。細胞を１．７５ｋＶ、２５μＦ、および４００オームで電気パルスした。エレクトロポレーション後、  ．５ｍｌのＬＢを加え、次いで、細胞を１０μｌおよび３０μｌのアリコートで、２つのＬＢ  ＡＭＰプレート（ＬＢブロス（Lennox）、１．８％  Ｂａｃｔｏ（商標）  Ａｇａｒ（Difco）、１００ｍｇ／Ｌアンピシリン）上に播種した。
【０３１３】
インサートＤＮＡクローンを配列分析に付した。正しい配列を含有する１つのクローンを選択する。大規模プラスミドＤＮＡを市販のキット（QIAGEN Plasmid Mega Kit, Qiagen, Valencia, CA）を用いて、製造者の指示に従って単離する。
【０３１４】
同じプロセスを用いて、切断型可溶性ヒトＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ（Ｓ２４９Ｗ）Ｆｃ５構築物を調製した。フラグメントは、ｐＺＭＰ３１ベクター配列中の最適化ＴＰＡリーダーとの５’オーバーラップ、次いで、Ｓ２４９Ｗ点変異をコードしているヒトＦＧＦＲ３ＩＩＩｃの配列、Ｆｃ５配列およびリンカー配列との３’オーバーラップを示した。該フラグメントの場合、ＰＣＲ増幅反応は、５’オリゴヌクレオチドｚｃ６２５６０（配列番号２０）を用いた。（ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃを鋳型として用いてＰＣＲフラグメントを作成するためのフォワードプライマー。フラグメントは、ＩｇＤ２Ｄ３形態を生じるであろう。ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃの配列は、ＩｇＤ２の上流の配列番号６０のＤ１５６で開始する。ｏｐＴＰＡリーダー配列を用いてｐＺＭＰ３１中にクローン化されるべきフラグメント。）ＰＣＲは、３’オリゴヌクレオチドｚｃ６０５６６（配列番号８２）を用いて行い、鋳型として、ＭＰＥＴ構築物＃１９２０（配列番号９）を用いた。
【０３１５】
該フラグメントは、上記のＰＣＲサーモサイクルを用いて作製され、ＢｇｌＩＩで消化したＭＶＣ７０９およびＭＶＣ７１０ベクター中に導入されて、切断型可溶性ヒトＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ（Ｓ２４９Ｗ）Ｆｃ５、およびリンカーおよび上記のＶＥＧＦＡ構築物への結合に特異的な下流のｃ末端ｓｃＦｖ配列を生じた。
【０３１６】
全長および切断型可溶性ヒトＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ（Ｓ２４９Ｗ）Ｆｃ５、リンカーおよびＶＥＧＦ−Ａへの結合に特異的な下流のｃ末端ｓｃＦｖ配列をコードしているプラスミドは、配列番号５７および５８に示されるＦＧＦＲ３（１４３−３７５）（Ｓ２４９Ｗ）Ｆｃ５  ｃ１０９４．１  ｐＺＭＰ３１（ＭＶＣ７８１）、配列番号５９および６０に示されるＦＧＦＲ３（２３−３７５）（Ｓ２４９Ｗ）Ｆｃ５  ｃ１０９４．１  ｐＺＭＰ３１（ＭＶＣ７８２）、配列番号６１および６２に示されるＦＧＦＲ３（１４３−３７５）（Ｓ２４９Ｗ）Ｆｃ５  ｃ８７０ｅ６  ｐＺＭＰ３１（ＭＶＣ７８３）、および配列番号６３および６４に示されるＦＧＦＲ３（２３−３７５）（Ｓ２４９Ｗ）Ｆｃ５  ｃ８７０ｅ６  ｐＺＭＰ３１（ＭＶＣ７８４）と称する。これらのプラスミドは、２９３Ｆ細胞（Invitrogen, Carlsbad, CA Cat# R790-07）中に一時的に発現した。Ｍｅｇａ  ｐｒｅｐ  ＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｅｇａ  Ｋｉｔ（Qiagen, Valencia, CA）を用いて、各プラスミドについて調製された。２９３Ｆ懸濁細胞は、２９３  Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ培地（Invitrogen, Carlsbad, CA Cat# 12338-018）中、３７℃、６％ＣＯ２にて、３Ｌスピナーフラスコ中、９５ＲＰＭにて培養された。トランスフェクションの直前に新しい培地を加えて、１．５Ｌの可動容量を最終密度１ｘ１０Ｅ６細胞／ｍＬで得た。各スピナーについて、２ｍＬのリポフェクタミン２０００（Invitrogen, Carlsbad, CA Cat# 11668-019）を２０ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Invitrogen, Carlsbad, CA Cat# 31985-070）に加え、１．５ｍｇの全プラスミドＤＮＡを２０ｍＬ  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭの入った別のチューブで希釈した。各チューブを室温にて５分間、別々にインキュベートし、次いで、合わせて、室温にてさらに３０分間、時折穏やかに混合しながら、一緒にインキュベートした。該脂質−ＤＮＡ混合物を２９３Ｆ細胞の各スピナーに加え、次いでそれを３７℃、６％ＣＯ２、７５ＲＰＭに戻した。約９６時間後、馴化培地を採取し、０．２μＭろ過し、タンパク質精製に付した。
【０３１７】
実施例１６：精製プロセス
馴化培地を、０．０２％アジ化ナトリウムを含有する０．２μ滅菌ろ過成果物（deliverable）として精製に付した。培地をアフィニティーカラムに負荷する前に、さらなる調整は行わなかった。
【０３１８】
〜１０リットルの成果物のような大規模精製の場合、ＰＯＲＯＳ  Ａ５０（タンパク質Ａアフィニティー樹脂）の直径２ｃｍのカラムによる８７ｍＬ床を捕獲プロセス目的で用いた。小規模精製（〜１−１．５リットル成果物）の場合、４ｍＬ床のＰＯＲＯＳ  ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ  Ａパーヒュージョンクロマトグラフィー樹脂を利用した。
【０３１９】
試料負荷の前に、カラムを２０カラム容量の０．０２％アジ化ナトリウム（Ｗ／ｖ）を含有するバッファーＡ：１０ｍＭリン酸一ナトリウム、１０ｍＭクエン酸一水和物、２５０ｍＭ  ［ＮＨ４］２Ｓ０４、ｐＨ７．３で平衡化した。平衡化するとすぐに、馴化培地を１分当たり２０ｍＬ（大規模プロセスの場合）または１分当たり１０ｍＬ（小規模プロセスの場合）で負荷した。負荷プロセスを完了すると、１０−２０カラム容量の平衡化バッファーを用いて、非結合タンパク質フラクションをカラムから洗い流した。結合したタンパク質の溶出は、平衡化バッファーＡと溶出バッファーＢ（下記の組成からなる：０．０２％アジ化ナトリウム（ｗ／ｖ）を含有する、１０ｍＭリン酸一ナトリウム、１０ｍＭクエン酸一水和物、２５０ｍＭ  ［ＮＨ４］２Ｓ０４、ｐＨ３．０）との間に形成されるｐＨ減少勾配によって達成された。大規模プロセスの溶出は、流速３０ｍＬ／分であり、同時に、バッファーＡおよびバッファーＢとの間に３カラム容量勾配を形成した。フラクション（１０ｍＬ）を０．５ｍＬ  ２Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０バッファーで収集し、内容物をすぐに混合した。小規模プロセスの溶出では、同じバッファーおよびバッファーＡからバッファーＢへの４カラム容量勾配を流速５ｍＬ／分で用いた。フラクション（４ｍＬ）を０．２５ｍＬ  ２Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０バッファーで収集した。全溶出フラクションをすぐに混合して、迅速なｐＨ中和を確実にした。
【０３２０】
２８０ｎｍ波長で陽性の吸収を有する全てのフラクションをプールし、サイズ排除クロマトグラフィー工程に進めた。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）のために、プールしたタンパク質を７ｍｌ（大規模プロセス）または１．５ｍＬ（小規模プロセス）に濃縮した。ＳＥＣクロマトグラフィーは、バッファー交換目的で利用され、ならびに、少量の多重結合種または凝集した種の最終産物からの区別を提供する。ＳＥＣおよび最終タンパク質処方のための移動相は、３５ｍＭリン酸ナトリウム、１２０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．３であった。大規模ＳＥＣは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｐｒｅｐ等級ＳＥＣカラム（３２１ｍＬ床容量で２６／６０様式）上で実施した。小規模ＳＥＣは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｐｒｅｐ等級ＳＥＣカラム（１２０ｍＬ床容量で１６／６０様式）上で実施した。プロセス規模にもよるが、２．５ｍＬ／分または１．５ｍＬ／分の流速（各々、大規模または小規模の場合）をＳＥＣ工程に用いた。主要な対称ピーク下のフラクションをプールし、いずれかの少量レベルの高分子量物質を最終産物から排除することに重点を置いた。最終的なプールを０．２μでフィルター滅菌し、アリコートに分け、−８０℃で保管した。この同じ方法を、全てのＦＧＦＲ受容体および可溶性ＦＧＦ受容体（ＦＧＦＲ）およびＶＥＧＦ−Ａ抗体の二重特異的結合性組成物を処理するために使用する。
【０３２１】
実施例１７：ＦＧＦ−刺激ＨＵＶＥＣ細胞上での可溶性ＦＧＦ受容体の中和活性を決定するための３Ｈ−チミジン増殖アッセイ
種々のＦＧＦの活性を阻害する中和性可溶性ＦＧＦ受容体（ＦＧＦＲ）についてスクリーンするために、ヒト臍帯内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を用いる３Ｈ−チミジン増殖アッセイを行った。組み換えヒトＦＧＦ１、２、４および６（R&D Systems, Inc.）をアッセイ培地（ＲＰＭＩ−１６４０、１％ＦＢＳ、１単位／ｍｌヘパリンおよびピルビン酸塩）中１０ｎｇ／ｍｌで用いた。次いで、可溶性ヒトＦＧＦＲ（R&D Systems and ZymoGenetics）を０．５−４ｕｇ／ｍｌ（受容体に依存する）から漸増し、アッセイ培地中３２−４ｎｇ／ｍｌに連続希釈した。ＨＵＶＥＣを９６−ウェル平底プレート（Costar）中に、容量１００μＬ、密度２０００細胞／ウェルにて播種した。ＨＵＶＥＣ増殖アッセイは、３７℃、５％ＣＯ２で２日間培養した。次いで、ＨＵＶＥＣを１μＣｉ／ウェルの３Ｈ−チミジン（Amersham, TRK120）（増殖細胞中に組み込まれる）で１８時間パルスした（全て、３７℃、５％ＣＯ２）。細胞を採取し、Ｐａｃｋａｒｄ  ＴｏｐＣｏｕｎｔ  ＮＸＴプレートリーダー上でカウントした。
【０３２２】
結果：試験された全てのＦＧＦＲは、予想通り類似の活性でＦＧＦ１を中和した。ＦＧＦＲ１およびＦＧＦＲ２（R&D Systems）は、全てのＦＧＦを強力に中和した。一方、ＦＧＦＲ３およびＦＧＦＲ４（R&D Systems）は、ＦＧＦ２、４および６活性の阻害において、あまり強力ではない。ＦＧＦＲ３  Ａ２２５８Ｆ（１４３ ３７５，  Ｓ２４９Ｗ）（配列番号１０）およびＦＧＦＲ３  Ａ２２５６Ｆ（２２ ３７５，  Ｓ２４９Ｗ）（配列番号２）は、ＦＧＦ１、２、４および６を、ＦＧＦＲ１に類似するＩＣ５０値で、強力に中和した。
【０３２３】
【表２６】
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【０３２４】
実施例１８：ＦＧＦ８ｂ−刺激ＬＮＣａｐ細胞上の可溶性ＦＧＦ受容体の中和活性を決定するための３Ｈ−チミジン増殖アッセイ
ＦＧＦ８ｂの活性を阻害する中和性可溶性ＦＧＦ受容体（ＦＧＦＲ）についてスクリーンするために、ヒトＬＮＣａｐ細胞を用いる３Ｈ−チミジン増殖アッセイを行った。組み換えヒトＦＧＦ８ｂ（R&D Systems, Inc.）をアッセイ培地（ＲＰＭＩ−１６４０、１％ＢＳＡ、ＩＴＳ［インスリン−トランスフェリンおよびセリニウム］、Ｌ−グルタミン酸塩およびピルビン酸塩［全てInvitrogenから入手］）中２００〜１０００ｎｇ／ｍｌで用いた。次いで、R&D Systems由来の可溶性ヒトＦＧＦＲ（Ｒ１−Ｒ４）およびZymoGenetics由来のＦＧＦＲ３および２を１−２ｕｇ／ｍｌから漸増（titrate）し、アッセイ培地中３１−１５ｎｇ／ｍｌに連続希釈した。ＬＮＣａｐ細胞を９６−ウェル平底プレート（Costar）中に、容量１００μＬ、密度２５００細胞／ウェルにて播種した。ＬＮＣａｐ増殖アッセイは、３７℃、５％ＣＯ２で３日間培養した。次いで、ＬＮＣａｐを１μＣｉ／ウェルの３Ｈ−チミジン（Amersham, TRK120）（増殖細胞中に組み込まれる）で８時間パルスした（全て、３７℃、５％ＣＯ２）。細胞を採取し、Ｐａｃｋａｒｄ  ＴｏｐＣｏｕｎｔ  ＮＸＴプレートリーダー上でカウントした。
【０３２５】
結果：Ｒ１を除くR&D SystemのＦＧＦＲ  Ｒ２−Ｒ４は、ＦＧＦ８ｂを中和した。全長ＦＧＦＲ２  Ａ２５５６Ｆ（２２ ３７７）配列番号２４、Ａ２５５７Ｆ（２２ ３７７）（Ｓ２５２Ｗ）配列番号２９、およびＡ２５５８Ｆ（２２ ３７７）（Ｐ２５３Ｒ）配列番号３３は、ＦＧＦ８ｂを中和しなかった。一方、切断型ＦＧＦＲ２  Ａ２５５９Ｆ（１４５ ３７７）配列番号３７、Ａ２５６０Ｆ（１４５ ３７７）（Ｓ２５２Ｗ）配列番号４０、およびＡ２５６１Ｆ（１４５ ３７７）（Ｐ２５３Ｆ）配列番号４２は、R&D SystemsのＦＧＦＲ２と同様にＦＧＦ８ｂを中和した。ＦＧＦＲ３  Ａ２５１９Ｆ（１４３ ３７５）（Ｐ２５０Ｒ）配列番号２２、Ａ２２５６Ｆ（２３ ３７５）（Ｓ２４９Ｗ）配列番号２、およびＡ２２５８Ｆ（１４３ ３７５）（Ｓ２４９Ｗ）配列番号１０は、ＦＧＦ８ｂを中和したが、Ａ２５１８Ｆ（１４３ ３７５）配列番号１９、Ａ２２５７Ｆ（２３ ３７５）配列番号１３、およびＡ２２５９Ｆ（２３ ３７５）（Ｐ２５０Ｒ）配列番号１５は中和しなかった。
【０３２６】
【表２７】
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ＮＤ，測定せず。
【０３２７】
実施例１９：ＦＧＦ８ｂ−刺激ＭＣＦ−７細胞上の可溶性ＦＧＦ受容体の中和活性を測定するための３Ｈ−チミジン増殖アッセイ
ＦＧＦ８ｂの活性を阻害する中和性可溶性ＦＧＦ受容体（ＦＧＦＲ）についてスクリーンするために、ヒトＭＣＦ−７細胞を用いる３Ｈ−チミジン増殖アッセイを行う。組み換えヒトＦＧＦ８ｂ（R&D Systems, Inc.）をアッセイ培地（ＲＰＭＩ−１６４０、５％ＦＢＳ、Ｌ−グルタミン酸塩およびピルビン酸塩）中１００ｎｇ／ｍｌで用いる。次いで、R&D Systems由来の可溶性ヒトＦＧＦＲ−Ｆｃ（Ｒ１−Ｒ４）およびZymoGenetics由来のＦＧＦＲ３および２を１０ｕｇ／ｍｌから漸増し、アッセイ培地中７８ｎｇ／ｍｌに連続希釈する。ＭＣＦ−７細胞を９６−ウェル平底プレート（Costar）中に、容量１００μＬ、密度１２５０細胞／ウェルにて播種する。ＭＣＦ−７増殖アッセイは、３７℃、５％ＣＯ２で４日間培養する。次いで、細胞を１μＣｉ／ウェルの３Ｈ−チミジン（Amersham, TRK120）（増殖細胞中に組み込まれる）で８時間パルスする（全て、３７℃、５％ＣＯ２）。細胞を採取し、Ｐａｃｋａｒｄ  ＴｏｐＣｏｕｎｔ  ＮＸＴプレートリーダー上でカウントする。
【０３２８】
実施例２０：ＦＧＦ９−刺激ＨＣＯ骨芽細胞上のｓＦＧＦＲ−Ｆｃの中和活性を測定するための３Ｈ−チミジン増殖アッセイ
ＦＧＦ９−刺激骨芽細胞増殖に対するｓＦＧＦＲ−Ｆｃ構築物の中和効果を決定するために、３Ｈ−チミジン増殖アッセイを行った。ヒト骨芽細胞をヒトＦＧＦ−９で刺激して生育させた。ＦＧＦＲ−Ｆｃタンパク質をアッセイ培地に０．０２ｎＭ〜６ｎＭの濃度で加えた。骨芽細胞に対する有意な阻害が観察され、各タンパク質についてＩＣ５０が計算された。
【０３２９】
研究計画：ヒト頭蓋冠骨芽細胞（ＨＣＯ； ScienCell, Carlsbad, CA）を１．２ｎＭのヒトＦＧＦ−９（R&D Systems, Minneapolis, MN）で刺激した。ＯｂＭアッセイ培地［０．５％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）、２ｍＭ  ＧｌｕｔａＭａｘ（Invitrogen, Carlsbad, CA）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、および１ｘインスリン−トランスフェリン−セリニウム（Invitrogen）を含有する骨芽細胞基礎培地（ObM, ScienCell）］を陰性対照として用いた。ヒトＦＧＦＲ１−Ｆｃ、ＦＧＦＲ２−Ｆｃ、ＦＧＦＲ３−Ｆｃ、およびＦＧＦＲ４−Ｆｃ（R&D Systems）をＯｂＭアッセイ培地中、６ｎＭ、２ｎＭ、０．６７ｎＭ、０．２２ｎＭ、０．０７ｎＭ、および０．０２ｎＭにて連続希釈した。ＦＧＦＲ３−Ｆｃ変異体（ZymoGenetics, Seattle, WA）もまた、同様に希釈した。ＨＣＯ細胞を、５％ＦＢＳおよび骨芽細胞成長サプリメント（ObGS, ScienCell）を補足したＯｂＭ中、９６ウェル平底プレート中において、容量１００μＬ、密度１０００細胞／ウェルで播種した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。細胞をＯｂＭアッセイ培地で２４時間血清飢餓にし、連続希釈したＦＧＦＲ−Ｆｃを用いて、または用いないで、１．２ｎＭ  ＦＧＦ−９で２４時間刺激し、１μＣｉ／ウェルの３Ｈ−チミジン（GE Healthcare Biosciences, Piscataway, NJ）（増殖細胞中に組み込まれる）で２４時間パルスした（全て、３７℃、５％ＣＯ２）。細胞を採取し、Ｐａｃｋａｒｄ  ＴｏｐＣｏｕｎｔ  ＮＸＴ上でカウントした。
【０３３０】
結果は、図３に示されるように、変異体ＦＧＦＲ３−Ｆｃ構築物がヒト骨芽細胞増殖を有意に阻害し、R&D Systems由来のＦＧＦＲ３−Ｆｃの３倍の範囲のＩＣ５０を有したことを明らかにし、図２は、全長ＦＧＦＲ３−Ｆｃ野生型および変異体構築物（ZymoGenetics）が類似のＩＣ５０を有することを示す。
【０３３１】
【表２８】
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【０３３２】
実施例２１：ＦＧＦＲ−Ｆｃ野生型および変異体構築物のＦＧＦ−８ｂおよびＦＧＦ−１７に対する結合
ＦＧＦＲ−Ｆｃの各リガンドに対する結合能を決定するために、ＥＬＩＳＡを行った。組み換えヒトＦＧＦ−８ｂまたはＦＧＦ−１７（R&D Systems）を１００ｎＭにて、Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ９６−ウェルプレート上、振盪しながら室温で１時間培養した。プレートを室温で１時間、ＢＬＯＴＴＯ（Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL）でブロックし、次いで、ＥＬＩＳＡ  Ｃバッファー（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ，２．７ｍＭ  ＫＣｌ，７．２ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４，１．５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４，０．０５％（ｖ／ｗ）ポリソルベート２０，ｐＨ７．２）で５回洗浄した。ＦＧＦＲ−ＦｃをＰＢＳ／０．１ｘＢＬＯＴＴＯ／１０ｕｇ／ｍｌブタヘパリン（Sigma, St. Louis, MO）で１００ｎＭに希釈し、次いで、０．１０ｎＭで終了する１：２連続希釈を行った。１００μＬのＦＧＦＲ−Ｆｃを播種し、４℃で一晩インキュベートした。次の日に、プレートをＥＬＩＳＡ  Ｃで５回洗浄し、次いで、２．５μｇ／ｍＬ西洋ワサビペルオキシダーゼ結合型抗−ヒトＦｃ抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA）と共に、振盪しながら室温で１時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡ  Ｃで５回洗浄後、クエン酸バッファー（６３ｍＭクエン酸ナトリウム中の５ｍｇ  ｏ−フェニレンジアミン、３７ｍＭクエン酸、ｐＨ５．０、０．０３％Ｈ２Ｏ２）中における１００μＬのＯＰＤを検出のために加えた。２−５分後、１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４で反応を止めた。ＳｏｆｔＭａｘＰｒｏソフトウェアを用いて、プレートを４９０ｎｍで読み取った。
【０３３３】
結果：野生型および変異体ＦＧＦＲ２−Ｆｃｓは、ＦＧＦ−８ｂまたは−１７に有意に結合しなかったが、図５Ａ、５Ｂ、６Ａ、６Ｂおよび７に示されるように、いくつかの変異体ＦＧＦＲ３−Ｆｃ構築物は、野生型ＦＧＦＲ３−Ｆｃよりも高い程度まで、ＦＧＦ−８ｂおよびＦＧＦ−１７の両方に結合した。
【０３３４】
【表２９】
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【０３３５】
実施例２２：表面プラズモン共鳴によるＦＧＦ受容体のＦＧＦリガンドに対する結合アフィニティーの測定
運動速度定数、平衡会合定数および平衡解離定数は、可溶性ＦＧＦ受容体（ＦＧＦＲ）とＦＧＦリガンドとの相互作用について、表面プラズモン共鳴によって測定された。種々の形態のＦＧＦＲ３が該研究において調べられた。ＦＧＦＲ３は、２または３個のＩｇ様ドメイン、および２つの可能な点変異（Ｓ２４９ＷまたはＰ２５０Ｒ）と共に生産された。各ＦＧＦＲ３は、二量体Ｆｃ−融合タンパク質として生産された。これらの研究のために、Ｆｃ−タグを用いて、タンパク質Ａを予め固定化したＢｉａｃｏｒｅチップ上にＦＧＦＲ分子を捕獲した。ＦＧＦリガンドは、ヘパリン含有バッファー中で表面にフローさせた。ＦＧＦリガンドは単量体であるが、それらは、ヘパリンの存在下で二量体に会合すると考えられている。結果として、二価の分析モデルがこれらの相互作用に適すると決定された。
【０３３６】
アフィニティー測定：ＦＧＦ受容体は、ＦＧＦリガンドに対する結合アフィニティーについて特徴付けられた。会合速度定数（ｋａ（Ｍ−１ｓ−１））および解離速度定数（ｋｄ（ｓ−１））は、各相互作用について測定された。会合速度定数は、リガンド−受容体複合体形成の速度を反映する値である。解離速度定数は、該複合体の安定性を反映する値である。平衡結合アフィニティーは、典型的に、平衡解離定数（ＫＤ（Ｍ））または平衡会合定数（ＫＡ（Ｍ−１））として表される。ＫＤは、解離速度定数を会合速度定数で割ることによって得られ（ｋｄ／ｋａ）、一方、ＫＡは、会合速度定数を解離速度定数で割ることによって得られる（ｋａ／ｋｄ）。類似のＫＤ（または類似のＫＡ）を有する分子は、幅広く変化可能な会合および解離速度定数を有することができる。結果として、ｋａおよびｋｄならびにＫＡまたはＫＤを測定することは、リガンド−受容体相互作用のアフィニティーをより独特に表す助けとなる。
【０３３７】
材料および方法：結合速度論およびアフィニティー研究は、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００（商標）システム（GE Healthcare, Piscataway, NJ）上で実施された。Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００（商標）のための方法は、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００（商標）Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，ｖ２．０を用いてプログラム化された。ＦＧＦ受容体分子の各々がヒトＦｃドメインを含有したので、ビオチン化タンパク質−Ａ（Thermo Fisher Scientific Inc, Rockford, IL）をこれらの研究の捕獲試薬として用いた。ビオチン化タンパク質−Ａは、ＨＢＳ−ＥＰバッファー（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０； GE Healthcare, Piscataway, NJ）中５０μｇ／ｍＬの濃度に希釈し、次いで、ＳＡ（ストレプトアビジン）センサーチップの全部で４つのフローセルに捕獲した。約１１００ＲＵの密度を各フローセルについて得た。各ＦＧＦ受容体分子は、次に、タンパク質−Ａを介して、ＳＡチップの分離したフローセル上に、約１５０−２５０ＲＵの密度で捕獲された。Ｂｉａｃｏｒｅ装置は、センサーチップ表面に結合したタンパク質の質量を測定し、かくして、各サイクルについて、受容体の捕獲を証明した。
【０３３８】
速度論的（kinetic）結合研究のために、ＦＧＦリガンドの連続１：５希釈物を２００ｎＭ〜０．０６ｎＭで調製した。これらの試料を表面にインジェクトし、センサーチップ上に捕獲されたＦＧＦ受容体への特異的結合を可能にした。各リガンド濃度のインジェクションは、会合時間７分および解離時間１５分を用いて実施された。速度論的結合研究は、流速５０μＬ／分で実施された。全ての結合実験は、５０μｇ／ｍＬヘパリン（Calbiochem, La Jolla, Ca ）を含有するＨＢＳ−Ｐバッファー（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４；GE Healthcare, Piscataway, NJ）中、２５℃で実施された。
【０３３９】
サイクルとサイクルの間に、２０ｍＭ塩酸でフローセルを洗浄して、該表面を再生した。該洗浄工程は、捕獲したＶＥＧＦ受容体およびいずれかの結合したＦＧＦリガンドの両方をタンパク質−Ａ表面から除去し、次の試験試料のその後の結合を可能にした。データは、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００（商標）評価ソフトウェア（バージョン２．０）を用いてまとめた。データは、参照フローセルおよびブランクインジェクションを差し引くことによって処理した。再生工程が一連のインジェクションを通して一定の結合表面を提供したことを確実にするために、ベースライン安定性を評価した。２回のインジェクション曲線を再現性についてチェックした。結合曲線は、二価分析相互作用モデルに全体的にフィットした。
【０３４０】
結果：二価の分析モデルは、これらの相互作用に最も適当であることが決定された。該モデルは、ｋａ（ｋａ１およびｋａ２）およびｋｄ（ｋｄ１およびｋｄ２）について２つの値を測定する。第１セットの値（ｋａ１およびｋｄ１）は、相互作用の一価の反応速度論を表す。これらの試料に関して報告されたアフィニティーは、これらの値に由来し、ＫＤ１およびＫＡ１と称する。第２のセットの値（ｋａ２およびｋｄ２）は、相互作用のアビディティ（avidity）を示し、報告されていない。残留物にある程度の傾向があるが、モデルに対するフィットは、結合アフィニティーを評価するのに十分であった。種々のＦＧＦＲ３分子とＦＧＦ６との結合相互作用の反応速度論は、表３０に詳述する。全長ＦＧＦＲ分子（２３ ３７５）のアフィニティーは、２ドメインＦＧＦＲ分子（１４３ ３７５）と類似した。点変異は、Ｓ２４９Ｗ  ＞  Ｐ２５０Ｒ  ＞  野生型のアフィニティーで、ＦＧＦ６に対するアフィニティーを増加させた。一般的に、該アフィニティー増加は、主として、より遅い解離速度定数に起因した。
【０３４１】
【表３０】
2012521768.tif 000034
【０３４２】
実施例２３：腫瘍細胞上のＦＧＦＲ−Ｆｃによる増殖の阻害を決定するための３Ｈ−チミジン増殖アッセイ
ＦＧＦＲ−Ｆｃの腫瘍細胞増殖阻害能を決定するために、３Ｈ−チミジンアッセイを行った。Ｃａｋｉ−１およびＤＵ１４５腫瘍細胞を９６ウェル平底プレート中に、２０００細胞／ウェルの密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。次の日に、ＦＧＦＲ−Ｆｃ構築物をＲＰＭＩ１６４０（０．５％ＦＢＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、および２ｍＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸを含有する）中で、２０、１０、および５μｇ／ｍＬにて連続希釈し、３７℃、５％ＣＯ２で３日間、細胞上に播種した。細胞を１μＣｉ／ウェルの３Ｈ−チミジン（GE Healthcare Biosciences, Piscataway, NJ）（増殖細胞中に組み込まれる）で２４時間パルスした。細胞を採取し、Ｐａｃｋａｒｄ  ＴｏｐＣｏｕｎｔ  ＮＸＴ上でカウントした。
【０３４３】
結果：２０μｇ／ｍＬにて、切断型ＦＧＦＲ３−ＦＣ  Ｓ２４９Ｗ変異体は、Ｃａｋｉ−１およびＤＵ１４５細胞の両方を、野生型ＦＧＦＲ２−ＦｃまたはＦＧＦＲ３−Ｆｃよりも僅かに大きい程度まで阻害した。図８Ａは、ＦＧＦＲ−ＦｃがＣａｋｉ−１細胞の増殖を阻害することを示し、図８Ｂは、ＦＧＦＲ−ＦｃがＤＵ１４５細胞の増殖を阻害することを示す。
【０３４４】
【表３１】
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【０３４５】
実施例２４：ｓＦＧＦＲ−ＶＥＧＦ  ｓｃＦｖタンパク質による内皮細胞発芽（sprouting）の阻害
ＶＥＧＦ−Ａ抗体／可溶性ＦＧＦ受容体二重特異的結合性タンパク質を含む二重特異的結合性タンパク質の効力を試験するために、内皮細胞および周皮細胞のイン・ビトロ共培養系を記載のように（Darlandら、Dev Biol 264 (2003), 275）確立した。該共培養において、Ｃｙｔｏｄｅｘビーズ上にコートされたＨＵＶＥＣをヒト間葉幹細胞（Lonzo）と共に、ＥＧＭ−２完全培地およびＤ５５１繊維芽細胞馴化培地の存在下、フィブリンゲル中で共培養した。実験開始時または実験７日目に、０．０４−５０ｎＭの対照アンタゴニスト、ＶＥＧＦ−ＡアンタゴニストまたはＶＥＧＦ−Ａ抗体／可溶性ＦＧＦ受容体二重特異的結合性タンパク質を含む二重特異的結合性タンパク質を培養物に加える。ＰＦＡを用いるアンタゴニストの添加後、８日目に細胞を固定化する。次いで、抗−平滑筋細胞アクチン（ａＳＭＡ）または抗−ＰＥＣＡＭ抗体を用いて、細胞をＩＨＣによって染色して、各々、周皮細胞および内皮細胞を同定する。対照アンタゴニスト処理したウェル中、これらの細胞は、周皮細胞のカバーによって保護された内皮細胞の萌芽（sprout）を形成する。抗−ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ａ抗体／可溶性ＦＧＦ受容体二重特異的結合性タンパク質を含む二重特異的結合性タンパク質で処理された細胞中、萌芽の数および萌芽の長さが減少し、アンタゴニストがイン・ビトロでの共培養モデルにおいて効力を示すことを示唆する。
【０３４６】
研究計画：１日目に、Ｃｙｔｏｄｅｘ−３ビーズをＨＵＶＥＣでコートし、３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートする。２日目に、２４ウェルプレートのウェル中において、ＨＵＶＥＣビーズ（２００ビーズ／ウェル）をヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣ）（４０，０００細胞／ウェル）と共に、フィブリンゲル中に包埋させる。ＥＧＭ−２完全培地およびＤ５５１線維芽細胞培地の１：１混合物を、２ｎｇ／ｍＬのＨＧＦと共に、これらの細胞に加える。実験の最後まで、培地を２日毎に取り替える。２日目（共培養の開始から）または７日目（共培養形成後）に、培養物にアンタゴニストを加える。アンタゴニストの添加６日後に、細胞を４％ＰＦＡ中で一晩固定化する。細胞を抗−ＰＥＣＡＭまたは抗−ＳＭＡ抗体、次いで、二次抗体（蛍光コンジュゲート）で染色する。次いで、細胞を顕微鏡で観察し、１０ビーズ／ウェルの代表的セットについて、萌芽の数および長さを手動でカウントする。次いで、ウェルの平均を計算する。
【０３４７】
結果：対照アンタゴニスト処理したウェル中、細胞は、周皮細胞のカバーによって保護された内皮細胞の萌芽を形成する。抗−ＶＥＧＦ−ＡまたはＶＥＧＦ−Ａ抗体／可溶性ＦＧＦ受容体二重特異的結合性タンパク質を含む二重特異的結合性タンパク質で処理した細胞中、萌芽の数および萌芽の長さの減少は、アンタゴニストが該イン・ビトロ共培養モデルにおいて効力を示すことを示唆する。
【０３４８】
実施例２５：ｓＦＧＦＲ−Ｆｃタンパク質での予防的処置は、Ｎｕ／ＮｕマウスにおけるＡ５４９肺癌細胞の増殖を阻害する
ｓＦＧＦＲタンパク質がマウスにおける腫瘍成長に対して活性を有するか否かを試験するために、０日目に、マウス群にＡ５４９肺癌腫瘍をｓ．ｃ．注射する。マウス群（ｎ＝１０／群）には、次いで、０．０１ｍｇ／Ｋｇ〜１０ｍｇ／Ｋｇの対照試薬、ｓＦＧＦＲ−Ｆｃタンパク質２−３Ｘ／週を４週間注射し、腫瘍接種後１日目に開始する。腫瘍体積は、３Ｘ／週で４週間モニターする。対照試薬を注射したマウスと比べて、ｓＦＧＦＲタンパク質を注射したマウスにおいて有意に小さい腫瘍は、腫瘍成長の阻害に対するアンタゴニストの効力を示す。
【０３４９】
研究計画：８〜１０週齢雌Ｎｕ／Ｎｕマウス（Charles River Laboratories）の右脇腹に、２ｘ１０６  Ａ５４９細胞を０日目にｓ．ｃ．注射する。開始１日目に、マウス群（ｎ＝１０／群）に、０．０１ｍｇ／Ｋｇ〜１０ｍｇ／Ｋｇ濃度の対照試薬またはｓＦＧＦＲ−Ｆｃタンパク質を２−３Ｘ／週で４週間、ｉ．ｐ．注射した。腫瘍成長は、カリパス測定を用いて、３Ｘ／週で４週間モニターする。腫瘍体積は、式  １／２＊（Ｂ）２＊Ｌ（ｍｍ３）を用いて計算する。研究の最後に（最後の投与後２４時間）、マウスを殺し、腫瘍の重量を量り、組織学に付す。腫瘍は、ＮＢＦ中に固定化し、次いで、マウス内皮細胞に特異的なＭＥＣＡ−３２抗体を用いて、免疫組織化学によって血管密度について試験する。
【０３５０】
結果：対照試薬を注射したマウスと比べて、ｓＦＧＦＲタンパク質を注射したマウスにおいて有意に小さい腫瘍は、腫瘍成長の阻害に対するアンタゴニストの効力を示す。
【０３５１】
実施例２６：ｓＦＧＦＲ−Ｆｃタンパク質での治療的処置は、Ｎｕ／ＮｕマウスにおけるＡ５４９肺癌細胞の増殖を阻害する
ｓＦＧＦＲタンパク質がマウスにおける腫瘍成長に対して活性を有するか否かを試験するために、０日目に、マウス群にＡ５４９肺癌腫瘍をｓ．ｃ．注射する。腫瘍が２００ｍｍ３のサイズに達したとき、マウス群（ｎ＝１０／群）に、０．０１ｍｇ／Ｋｇ〜１０ｍｇ／Ｋｇの対照試薬、またはｓＦＧＦＲ−Ｆｃタンパク質２−３Ｘ／週を４週間注射する。腫瘍体積は、３Ｘ／週でモニターする。対照試薬を注射したマウスと比べて、ｓＦＧＦＲタンパク質を注射したマウスにおいて有意に小さい腫瘍は、腫瘍成長の阻害に対するアンタゴニストの効力を示す。
【０３５２】
研究計画：８〜１０週齢雌Ｎｕ／Ｎｕマウス（Charles River Laboratories）の右脇腹に、２ｘ１０６  Ａ５４９細胞を０日目にｓ．ｃ．注射する。腫瘍が２００ｍｍ３のサイズに達したとき、マウス群（ｎ＝１０／群）に、０．０１ｍｇ／Ｋｇ〜１０ｍｇ／Ｋｇの対照試薬またはｓＦＧＦＲ−Ｆｃタンパク質を２−３Ｘ／週で４週間、ｉ．ｐ．注射する。腫瘍成長は、カリパス測定を用いて、３Ｘ／週で４週間モニターする。腫瘍体積は、式  １／２＊（Ｂ）２＊Ｌ（ｍｍ３）を用いて計算する。研究の最後に（最後の投与後２４時間）、マウスを殺し、腫瘍の重量を量る。腫瘍はまた、微小血管密度について組織学的分析に付す。
【０３５３】
結果：対照試薬を注射したマウスと比べて、ｓＦＧＦＲタンパク質を注射したマウスにおいて有意に小さい腫瘍は、腫瘍成長の阻害に対するアンタゴニストの効力を示す。
【０３５４】
実施例２７：ｓＦＧＦＲ−Ｆｃタンパク質での予防的処置は、Ｎｕ／ＮｕマウスにおけるＤＵ１４５前立腺癌細胞の増殖を阻害する
ｓＦＧＦＲタンパク質がマウスにおける腫瘍成長に対して活性を有するか否かを試験するために、０日目に、マウス群にＤＵ１４５前立腺癌腫瘍をｓ．ｃ．注射する。マウス群（ｎ＝１０／群）には、次いで、０．０１ｍｇ／Ｋｇ〜１０ｍｇ／Ｋｇの対照試薬、ｓＦＧＦＲ−Ｆｃタンパク質２−３Ｘ／週を４週間注射し、腫瘍接種後１日目に開始する。腫瘍体積は、３Ｘ／週で４週間モニターする。対照試薬を注射したマウスと比べて、ｓＦＧＦＲタンパク質を注射したマウスにおいて有意に小さい腫瘍は、腫瘍成長の阻害に対するアンタゴニストの効力を示す。
【０３５５】
研究計画：８〜１０週齢雌Ｎｕ／Ｎｕマウス（Charles River Laboratories）の右脇腹に、２ｘ１０６  ＤＵ１４５細胞を０日目にｓ．ｃ．注射する。開始１日目に、マウス群（ｎ＝１０／群）に、０．０１ｍｇ／Ｋｇ〜１０ｍｇ／Ｋｇ濃度の対照試薬またはｓＦＧＦＲ−Ｆｃタンパク質を２−３Ｘ／週で４週間、ｉ．ｐ．注射した。腫瘍成長は、カリパス測定を用いて、３Ｘ／週で４週間モニターする。腫瘍体積は、式  １／２＊（Ｂ）２＊Ｌ（ｍｍ３）を用いて計算する。研究の最後に（最後の投与後２４時間）、マウスを殺し、腫瘍の重量を量り、組織学に付す。腫瘍は、ＮＢＦ中に固定化し、次いで、マウス内皮細胞に特異的なＭＥＣＡ−３２抗体を用いて、免疫組織化学によって血管密度について試験する。
【０３５６】
結果：対照試薬を注射したマウスと比べて、ｓＦＧＦＲタンパク質を注射したマウスにおいて有意に小さい腫瘍は、腫瘍成長の阻害に対するアンタゴニストの効力を示す。
【０３５７】
実施例２８：ｓＦＧＦＲ−Ｆｃタンパク質での治療的処置は、Ｎｕ／ＮｕマウスにおけるＤＵ１４５前立腺癌細胞の増殖を阻害する
ｓＦＧＦＲタンパク質がマウスにおける腫瘍成長に対して活性を有するか否かを試験するために、０日目に、マウス群にＤＵ１４５前立腺癌腫瘍をｓ．ｃ．注射する。腫瘍が２００ｍｍ３のサイズに達したとき、マウス群（ｎ＝１０／群）に、０．０１ｍｇ／Ｋｇ〜１０ｍｇ／Ｋｇの対照試薬、またはｓＦＧＦＲ−Ｆｃタンパク質２−３Ｘ／週を４週間注射する。腫瘍体積は、３Ｘ／週でモニターする。対照試薬を注射したマウスと比べて、ｓＦＧＦＲ−Ｆｃタンパク質を注射したマウスにおいて有意に小さい腫瘍は、腫瘍成長の阻害に対するアンタゴニストの効力を示す。
【０３５８】
研究計画：８〜１０週齢雌Ｎｕ／Ｎｕマウス（Charles River Laboratories）の右脇腹に、２ｘ１０６  ＤＵ１４５細胞を０日目にｓ．ｃ．注射する。腫瘍が２００ｍｍ３のサイズに達したとき、マウス群（ｎ＝１０／群）に、０．０１ｍｇ／Ｋｇ〜１０ｍｇ／Ｋｇ濃度の対照試薬またはｓＦＧＦＲ−Ｆｃタンパク質を２−３Ｘ／週で４週間、ｉ．ｐ．注射した。腫瘍成長は、カリパス測定を用いて、３Ｘ／週でモニターする。腫瘍体積は、式  １／２＊（Ｂ）２＊Ｌ（ｍｍ３）を用いて計算する。研究の最後に（最後の投与後２４時間）、マウスを殺し、腫瘍の重量を量る。腫瘍はまた、微小血管密度について組織学的分析に付す。
【０３５９】
結果：対照試薬を注射したマウスと比べて、ｓＦＧＦＲタンパク質を注射したマウスにおいて有意に小さい腫瘍は、腫瘍成長の阻害に対するアンタゴニストの効力を示す。
【０３６０】
実施例２９：二重特異的結合性タンパク質での予防的処置は、Ｎｕ／ＮｕマウスにおけるＡ５４９肺癌細胞の増殖を阻害する
ＶＥＧＦ−Ａ抗体／可溶性ＦＧＦ受容体二重特異的結合性タンパク質を含む二重特異的結合性タンパク質がマウスにおける腫瘍成長に対して活性を有するか否かを試験するために、０日目に、マウス群にＡ５４９肺癌腫瘍をｓ．ｃ．注射する。マウス群（ｎ＝１０／群）には、次いで、０．０１ｍｇ／Ｋｇ〜１０ｍｇ／Ｋｇの対照試薬、ｓＦＧＦＲ−ＶＥＧＦ  ｓｃＦｖ融合タンパク質２−３Ｘ／週を４週間注射し、腫瘍接種後１日目に開始する。腫瘍体積は、３Ｘ／週で４週間モニターする。対照試薬を注射したマウスと比べて、ＶＥＧＦ−Ａ抗体／可溶性ＦＧＦ受容体二重特異的結合性タンパク質を含む二重特異的結合性タンパク質を注射したマウスにおいて有意に小さい腫瘍は、腫瘍成長の阻害に対するアンタゴニストの効力を示す。
【０３６１】
研究計画：８〜１０週齢雌Ｎｕ／Ｎｕマウス（Charles River Laboratories）の右脇腹に、２ｘ１０６  Ａ５４９細胞を０日目にｓ．ｃ．注射する。開始１日目に、マウス群（ｎ＝１０／群）に、０．０１ｍｇ／Ｋｇ〜１０ｍｇ／Ｋｇの対照試薬またはｓＦＧＦＲ−ＶＥＧＦ  ｓｃＦｖ融合タンパク質を２−３Ｘ／週で４週間、ｉ．ｐ．注射した。腫瘍成長は、カリパス測定を用いて、３Ｘ／週で４週間モニターする。腫瘍体積は、式  １／２＊（Ｂ）２＊Ｌ（ｍｍ３）を用いて計算する。研究の最後に（最後の投与後２４時間）、マウスを殺し、腫瘍の重量を量り、組織学に付す。腫瘍は、ＮＢＦ中に固定化し、次いで、マウス内皮細胞に特異的なＭＥＣＡ−３２抗体を用いて、免疫組織化学によって血管密度について試験する。
【０３６２】
結果：対照試薬を注射したマウスと比べて、ｓＦＧＦＲ−ＶＥＧＦ  ｓｃＦｖ融合タンパク質を注射したマウスにおいて有意に小さい腫瘍は、腫瘍成長の阻害に対するアンタゴニストの効力を示す。
【０３６３】
実施例３０：二重特異的結合性タンパク質での治療的処置は、Ｎｕ／ＮｕマウスにおけるＡ５４９肺癌細胞の増殖を阻害する
ＶＥＧＦ−Ａ抗体／可溶性ＦＧＦ受容体二重特異的結合性タンパク質を含む二重特異的結合性タンパク質がマウスにおける腫瘍成長に対して活性を有するか否かを試験するために、０日目に、マウス群にＡ５４９肺癌腫瘍をｓ．ｃ．注射する。腫瘍が２００ｍｍ３サイズに達したとき、マウス群（ｎ＝１０／群）には、０．０１ｍｇ／Ｋｇ〜１０ｍｇ／Ｋｇの対照試薬、またはＶＥＧＦ−Ａ抗体／可溶性ＦＧＦ受容体二重特異的結合性タンパク質を含む二重特異的結合性タンパク質２−３Ｘ／週を４週間注射する。腫瘍体積は、３Ｘ／週でモニターする。対照試薬を注射したマウスと比べて、ＶＥＧＦ−Ａ抗体／可溶性ＦＧＦ受容体二重特異的結合性タンパク質を含む二重特異的結合性タンパク質を注射したマウスにおいて有意に小さい腫瘍は、腫瘍成長の阻害に対するアンタゴニストの効力を示す。
【０３６４】
研究計画：８〜１０週齢雌Ｎｕ／Ｎｕマウス（Charles River Laboratories）の右脇腹に、２ｘ１０６  Ａ５４９細胞を０日目にｓ．ｃ．注射する。腫瘍が２００ｍｍ３サイズに達したとき、マウス群（ｎ＝１０／群）に、０．０１ｍｇ／Ｋｇ〜１０ｍｇ／Ｋｇの対照試薬、またはＶＥＧＦ−Ａ抗体／可溶性ＦＧＦ受容体二重特異的結合性タンパク質を含む二重特異的結合性タンパク質を２−３Ｘ／週で４週間、ｉ．ｐ．注射する。腫瘍成長は、カリパス測定を用いて、３Ｘ／週でモニターする。腫瘍体積は、式  １／２＊（Ｂ）２＊Ｌ（ｍｍ３）を用いて計算する。研究の最後に（最後の投与後２４時間）、マウスを殺し、腫瘍の重量を量る。腫瘍はまた、微小血管密度について組織学的分析に付す。
【０３６５】
結果：対照試薬を注射したマウスと比べて、ＶＥＧＦ−Ａ抗体／可溶性ＦＧＦ受容体二重特異的結合性タンパク質を含む二重特異的結合性タンパク質を注射したマウスにおいて有意に小さい腫瘍は、腫瘍成長の阻害に対するアンタゴニストの効力を示す。
【０３６６】
実施例３１：二重特異的結合性タンパク質での予防的処置は、Ｎｕ／ＮｕマウスにおけるＤＵ１４５前立腺癌細胞の増殖を阻害する
ＶＥＧＦ−Ａ抗体／可溶性ＦＧＦ受容体二重特異的結合性タンパク質を含む二重特異的結合性タンパク質がマウスにおける腫瘍成長に対して活性を有するか否かを試験するために、０日目に、マウス群にＤＵ１４５前立腺癌腫瘍をｓ．ｃ．注射する。マウス群（ｎ＝１０／群）には、次いで、０．０１ｍｇ／Ｋｇ〜１０ｍｇ／Ｋｇの対照試薬、ＶＥＧＦ−Ａ抗体／可溶性ＦＧＦ受容体二重特異的結合性タンパク質を含む二重特異的結合性タンパク質を２−３Ｘ／週を４週間注射し、腫瘍接種後１日目に開始する。腫瘍体積は、３Ｘ／週で４週間モニターする。対照試薬を注射したマウスと比べて、ＶＥＧＦ−Ａ抗体／可溶性ＦＧＦ受容体二重特異的結合性タンパク質を含む二重特異的結合性タンパク質を注射したマウスにおいて有意に小さい腫瘍は、腫瘍成長の阻害に対するアンタゴニストの効力を示す。
【０３６７】
研究計画：８〜１０週齢雌Ｎｕ／Ｎｕマウス（Charles River Laboratories）の右脇腹に、２ｘ１０６  ＤＵ１４５細胞を０日目にｓ．ｃ．注射する。開始１日目に、マウス群（ｎ＝１０／群）に、０．０１ｍｇ／Ｋｇ〜１０ｍｇ／Ｋｇ濃度の対照試薬またはＶＥＧＦ−Ａ抗体／可溶性ＦＧＦ受容体二重特異的結合性タンパク質を含む二重特異的結合性タンパク質を２−３Ｘ／週で４週間、ｉ．ｐ．注射した。腫瘍成長は、カリパス測定を用いて、３Ｘ／週で４週間モニターする。腫瘍体積は、式  １／２＊（Ｂ）２＊Ｌ（ｍｍ３）を用いて計算する。研究の最後に（最後の投与後２４時間）、マウスを殺し、腫瘍の重量を量り、組織学に付す。腫瘍は、ＮＢＦ中に固定化し、次いで、マウス内皮細胞に特異的なＭＥＣＡ−３２抗体を用いて、免疫組織化学によって血管密度について試験する。
【０３６８】
結果：対照試薬を注射したマウスと比べて、ＶＥＧＦ−Ａ抗体／可溶性ＦＧＦ受容体二重特異的結合性タンパク質を含む二重特異的結合性タンパク質を注射したマウスにおいて有意に小さい腫瘍は、腫瘍成長の阻害に対するアンタゴニストの効力を示す。
【０３６９】
実施例３２：二重特異的結合性タンパク質での治療的処置は、Ｎｕ／ＮｕマウスにおけるＤＵ１４５前立腺癌細胞の増殖を阻害する
ＶＥＧＦ−Ａ抗体／可溶性ＦＧＦ受容体二重特異的結合性タンパク質を含む二重特異的結合性タンパク質がマウスにおける腫瘍成長に対して活性を有するか否かを試験するために、０日目に、マウス群にＤＵ１４５前立腺癌腫瘍をｓ．ｃ．注射する。腫瘍が２００ｍｍ３サイズに達したとき、マウス群（ｎ＝１０／群）に、０．０１ｍｇ／Ｋｇ〜１０ｍｇ／Ｋｇの対照試薬、またはＶＥＧＦ−Ａ抗体／可溶性ＦＧＦ受容体二重特異的結合性タンパク質を含む二重特異的結合性タンパク質２−３Ｘ／週を４週間注射する。腫瘍体積は、３Ｘ／週でモニターする。対照試薬を注射したマウスと比べて、ＶＥＧＦ−Ａ抗体／可溶性ＦＧＦ受容体二重特異的結合性タンパク質を含む二重特異的結合性タンパク質を注射したマウスにおいて有意に小さい腫瘍は、腫瘍成長の阻害に対するアンタゴニストの効力を示す。
【０３７０】
研究計画：８〜１０週齢雌Ｎｕ／Ｎｕマウス（Charles River Laboratories）の右脇腹に、２ｘ１０６  ＤＵ１４５細胞を０日目にｓ．ｃ．注射する。腫瘍が２００ｍｍ３サイズに達したとき、マウス群（ｎ＝１０／群）に、０．０１ｍｇ／Ｋｇ〜１０ｍｇ／Ｋｇの対照試薬、またはＶＥＧＦ−Ａ抗体／可溶性ＦＧＦ受容体二重特異的結合性タンパク質を含む二重特異的結合性タンパク質を２−３Ｘ／週で４週間、ｉ．ｐ．注射する。腫瘍成長は、カリパス測定を用いて、３Ｘ／週でモニターする。腫瘍体積は、式  １／２＊（Ｂ）２＊Ｌ（ｍｍ３）を用いて計算する。研究の最後に（最後の投与後２４時間）、マウスを殺し、腫瘍の重量を量る。腫瘍はまた、微小血管密度について組織学的分析に付す。
【０３７１】
結果：対照試薬を注射したマウスと比べて、ＶＥＧＦ−Ａ抗体／可溶性ＦＧＦ受容体二重特異的結合性タンパク質を含む二重特異的結合性タンパク質を注射したマウスにおいて有意に小さい腫瘍は、腫瘍成長の阻害に対するアンタゴニストの効力を示す。
【０３７２】
上記から、本発明の特定の具体例を説明目的で記載しているが、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、種々の修飾を施してもよいことは明らかである。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲によるものを除き、限定されない。本明細書中に挙げられた全ての出版物、特許、および特許出願は、全ての目的において、出典明示により、全体として本明細書の一部とされる。
【図１Ａ】
2012521768.tif 000036
【図１Ｂ】
2012521768.tif 000037
【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2012521768.tif 000042
【図６】
2012521768.tif 000043
【図７】
2012521768.tif 000044
【図８】
2012521768.tif 000045
【図９】
2012521768.tif 000046
【手続補正書】
【提出日】平成23年11月28日(2011.11.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2012521768000001.app
【国際調査報告】
2012521768.tif 000047
2012521768.tif 000048
2012521768.tif 000049