(57)【要約】  本発明は、哺乳動物細胞内でのより高い発現を目指して最適化されたヒトポルホビリノゲンデアミナーゼをコードするヌクレオチド配列に関する。本発明は、ポルホビリノゲンデアミナーゼが欠損することにより引き起こされる状態、例えば急性間欠性ポルフィリン症の遺伝子療法で使用するための、かかる最適化された合成コード配列を含むＤＮＡ構築物にも更に関する。従って、本発明は、ヒトポルホビリノゲンデアミナーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、又は核酸構築物に関し、ヒトポルホビリノゲンデアミナーゼをコードするコドンのうち少なくとも３２０個が配列番号１のコドンと同一である、又はヒトポルホビリノゲンデアミナーゼをコードするコドンのうち少なくとも３０５個が配列番号３のコドンと同一である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトポルホビリノゲンデアミナーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、ヒトポルホビリノゲンデアミナーゼをコードするコドンのうち少なくとも３２０個が配列番号１のコドンと同一である、又はヒトポルホビリノゲンデアミナーゼをコードするコドンのうち少なくとも３０５個が配列番号３のコドンと同一である、上記核酸。
【請求項２】
ヒトポルホビリノゲンデアミナーゼをコードするヌクレオチド配列が、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのグローバルアラインメントアルゴリズムにより決定したときに、配列番号１又は３の全長に対して少なくとも９５％の同一性を有する、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
前記ヌクレオチド配列が、配列番号２又は４のアミノ酸配列をコードする、請求項１又は２に記載の核酸。
【請求項４】
前記ヌクレオチド配列が、配列番号１又は３のヌクレオチド配列を有する、請求項３に記載の核酸。
【請求項５】
ヒトポルホビリノゲンデアミナーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物であって、ヒトポルホビリノゲンデアミナーゼをコードするコドンのうち少なくとも３２０個が配列番号１のコドンと同一である、又はヒトポルホビリノゲンデアミナーゼをコードするコドンのうち少なくとも３０５個が配列番号３のコドンと同一である、上記核酸構築物。
【請求項６】
ヒトポルホビリノゲンデアミナーゼをコードするヌクレオチド配列が、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのグローバルアラインメントアルゴリズムにより決定したときに、配列番号１又は３の全長に対して少なくとも９５％の同一性を有する、請求項５に記載の核酸構築物。
【請求項７】
前記ヌクレオチド配列が、配列番号２又は４のアミノ酸配列をコードする、請求項５又は６に記載の核酸構築物。
【請求項８】
前記ヌクレオチド配列が、配列番号１又は３のヌクレオチド配列を有する、請求項７に記載の核酸構築物。
【請求項９】
ヒトポルホビリノゲンデアミナーゼをコードするヌクレオチド配列が、ヒト細胞内で発現させるためのプロモーターに作動可能に連結している、請求項５〜８のいずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項１０】
前記プロモーターが肝臓特異的プロモーターである、請求項９に記載の核酸構築物。
【請求項１１】
前記肝臓特異的プロモーターが、α１−アンチ−トリプシン（ＡＡＴ）プロモーター、甲状腺ホルモン結合グロブリンプロモーター、アルブミンプロモーター、チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、肝制御領域（ＨＣＲ）−アポＣＩＩハイブリッドプロモーター、ＨＣＲ−ｈＡＡＴハイブリッドプロモーター、マウスアルブミン遺伝子エンハンサー（Ｅａｌｂ）エレメントと結合したＡＡＴプロモーター、及びアポリポタンパク質Ｅプロモーターからなる群より選択される、請求項１０に記載の核酸構築物。
【請求項１２】
前記プロモーターが配列番号５の配列を有する、請求項１１に記載の核酸構築物。
【請求項１３】
ウイルス遺伝子療法ベクター、好ましくはパルボウイルスベクターの形態である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項１４】
請求項１から４までのいずれか一項に記載の核酸、又は請求項５〜１３のいずれか一項に記載の核酸構築物を含む、パルボウイルスビリオン。
【請求項１５】
薬剤として使用するための、又は治療によるヒト又は動物の身体の処置で使用するための、請求項１４に記載のパルボウイルスビリオン。
【請求項１６】
ポルホビリノゲンデアミナーゼの欠損によって引き起こされる状態の処置で使用するための、請求項１４又は１５に記載のパルボウイルスビリオン。
【請求項１７】
前記状態が急性間欠性ポルフィリン症である、請求項１６に記載のパルボウイルスビリオン。
【請求項１８】
請求項１４に記載のパルボウイルスビリオン、及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項１９】
ポルホビリノゲンデアミナーゼの欠損によって引き起こされる状態の処置で使用される薬剤の製造で使用するための、請求項１４に記載のパルボウイルスビリオンの使用。
【請求項２０】
ポルホビリノゲンデアミナーゼをコードするヌクレオチド配列を哺乳動物に送達するための方法であって、
ａ．請求項１４に記載のパルボウイルスビリオン、又は請求項１８に記載の医薬組成物を提供するステップと、
ｂ．哺乳動物において治療効果をもたらすレベルでタンパク質発現させるような条件下で、前記パルボウイルスビリオンを前記哺乳動物に投与するステップとを含む、
上記方法。
【請求項２１】
ポルホビリノゲンデアミナーゼの欠損によって引き起こされる状態を処置する方法であって、請求項１４に記載のパルボウイルスビリオン、又は請求項１８に記載の医薬組成物の有効量を、ポルホビリノゲンデアミナーゼを欠損した対象に投与するステップを含み、好ましくは前記状態が急性間欠性ポルフィリン症である、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はヒトポルホビリノゲンデアミナーゼをコードするヌクレオチド配列、及びかかる配列を内包する核酸構築物に関する。本発明は、新規遺伝子療法ベクター、並びにポルホビリノゲンデアミナーゼの欠損により引き起こされる状態の処置及び予防でかかるベクターを使用する方法に更に関する。より具体的には、本発明の遺伝子療法ベクターは、急性間欠性ポルフィリン症を含むかかる状態の症状を軽減する方法で使用できる。
【背景技術】
【０００２】
急性間欠性ポルフィリン症（ＡＩＰ）は、ヘム合成経路の３番目の酵素であるポルホビリノゲンデアミナーゼ（ＰＢＧＤ）の欠損を特徴とする遺伝性代謝疾患である。遺伝形質を受け継いだ者では、酵素活性が正常値の約５０％である。当該疾患は、常染色体優性形式で受け継がれ、急性ポルフィリン症で最も一般的である。この疾患は全ての人種に生ずるが、主としてスウェーデン、英国、及びアイルランド等の北部ヨーロッパで最も一般的である。米国及びその他の国々では、５／１００，０００であり、北部スウェーデンでは、推定有病率は６０〜１００／１００，０００と高い。今日まで、ＰＢＧＤ遺伝子では２２５個以上の突然変異が記載されている。主な臨床的特徴として、腹痛、並びに内臓神経障害及び循環障害を含む神経系の障害に起因する急性間欠性発作が挙げられる。腹痛は８５〜９５％の症例で報告されており、また最も一般的な特徴であり、神経学的変化がこれに続く、又は伴う。ＡＩＰに気付かず、また有害な薬物、例えば発作を促進するおそれのある、肝臓のチトクロームＰ４５０酵素により代謝される薬物を中止しなければ、呼吸麻痺及び球麻痺に進行し、死に至る場合がある。心不整脈の結果として突然死も生ずる可能性がある。時に、原発性肝癌及び腎機能障害も生ずる。
【０００３】
ＰＢＧＤの遺伝的欠損のみでは、症状の発現に十分でない。ＰＢＧＤ突然変異を受け継いだ対象のうち多くの割合は、ポルフィリン症の症状を発現せず、すなわち臨床的浸透度は非常に低い。ＡＩＰキャリアーの臨床症状は、急性発作を誘発する薬物又はその他の促進因子によりヘム合成の要求が高まり、その結果、ポルフィリン前駆体であるδ−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）、及びポルフィリノゲン（ＰＢＧ）の生成及び分泌が増加することに関連している。かかる条件においては、ＰＢＧＤの欠損はヘム合成を制限し、その結果、ＡＬＡシンテターゼ（ＡＬＡＳ１）のヘム媒介の抑制が損なわれる。肝臓が過剰なポルフィリン前駆体の主たる供給源であることを示唆する証拠がある。ポルフィリン症発症を繰り返しやすいそのような対象では、かかる化合物は、発作と発作との間で上昇したままであり、発症中に更に増加する。当該疾患が長期間不活性のままである場合には、かかる化合物は正常値まで減少し得る。
【０００４】
急性発作は通常思春期後に発生し、また内分泌因子、及びステロイドホルモン、及び薬物、栄養因子、炭水化物やカロリー摂取の制限、喫煙、ステロイドホルモンや経口避妊薬、鉛中毒、併発感染、手術、及び精神的ストレスを含む様々な環境因子により保因者において誘発され得る。薬物は、急性発作を誘発する因子の中でも最も重要な因子であり、安全な薬物のリストは、ｗｗｗ．ｄｒｕｇｓ−ｐｏｒｐｈｙｒｉａ．ｃｏｍより入手可能である。喫煙、ＣＹＰ４５０により代謝されるエタノール及び薬物は、肝臓でのヘムの要求量を大きく増加させ、その結果ＡＬＡＳ１を誘発し、こうしてポルフィリン前駆体の生成が増し、急性発作を引き起こす。また、ＡＬＡＳ１はペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γコアクティベーター１α（ＰＧＣ１α）により正の調節を受けるが、これは絶食時に肝臓で誘発される。促進因子の中でも、ステロイドホルモンは重要な役割を演じていると考えられる。この概念は、当該疾患は思春期前にはほとんど発現しない、及びＰＢＧＤが欠損している一部の女性では、経口避妊薬が発作を悪化させる可能性がある、という事実により支持される。また、女性（８０％）は男性（２０％）よりも高頻度で罹患する。
【０００５】
急性発作は、グルコース及びヘミン（ｈｅｍｉｎ）（Ｎｏｒｍｏｓａｎｇ、Ｏｒｐｈａｎ  Ｅｕｒｏｐｅ）の輸液で処置される。グルコースは、ＰＧＣ−１αを媒介としたＡＬＡＳ１の誘導に拮抗するようである。ヘミンは調節性ヘムプールを回復させ、肝臓によるＡＬＡＳ１の誘導を抑制する。一部の女性は、月経前発作を発症するが、ゴナドトロピン遊離ホルモン（ＧｎＲＨ）類似体により予防可能である。一部の患者は急性発作の再発、及び顕著で障害性の神経学的機能不全を示す。進行した神経学的損傷、並びに亜急性及び慢性の症状は、一般的にヘム療法に対して無反応性である。これは、同種異系の肝臓移植によってのみ治癒可能な生命を脅かす状態であり、かかる移植は、今日までのところ３人の患者において、神経毒性のＡＬＡ及びＰＢＧの蓄積を阻止している。しかしながら、肝臓移植は適合ドナーからの入手可能性に制約があり、顕著な有病率及び死亡率を有する。
【０００６】
従って、肝臓機能がＰＢＧＤ欠損を除き全く正常である患者では、遺伝子置換療法が肝臓移植に代わる代替候補である。遺伝子療法とは、ベクターを利用して、疾患を制御するように細胞内に特定の遺伝子を導入することからなる手順である。肝臓酵素の欠損の是正を目指した遺伝子送達療法の実現可能性がＡＩＰの実験モデル（ＡＩＰマウス）で調べられている。ポルフィリン症のマウスに、アデノウイルスベクターを媒介としたＰＢＧＤ遺伝子導入を行うことにより、肝臓でＰＢＧＤが発現する結果としての短期治療効果が明らかとなった（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ、２００４年、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、第１０巻（２）：３３７〜４３頁）。これらの結果は原理証明（ｐｒｏｏｆ−ｏｆ−ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ）の実現であり、ウイルス性ベクターを媒介としたＰＢＧＤ遺伝子送達によって、ＡＩＰマウスにおけるフェノバルビタール誘発性ポルフィリン症発作の重い症状が一時的に改善し得ることを実証した。
【０００７】
欧州特許第１  ０４９  ４８９号は、概念レベルに過ぎないヒトＰＢＧＤ  ｃＤＮＡを含むｒＡＡＶベクター構築物を開示する。
【０００８】
しかし、ｈＰＢＧＤを、これを必要とする対象にＡＡＶ媒介送達を行うための改良されたベクター及びプロトコールに対するニーズが、当技術分野においてなおも存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明によれば、ヒトポルホビリノゲンデアミナーゼ（ＰＢＧＤ）をコードするヌクレオチド配列であって、ヒトポルホビリノゲンデアミナーゼをコードするコドンのうち少なくとも約３２０個のコドンが配列番号１のコドンと同一である、又はヒトポルホビリノゲンデアミナーゼをコードするコドンのうち少なくとも約３０５個のコドンが配列番号３のコドンと同一である、上記ヌクレオチド配列、すなわち核酸又はポリヌクレオチドが提供される。好ましくは、ヒトポルホビリノゲンデアミナーゼをコードするヌクレオチド配列は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのグローバルアラインメントアルゴリズムにより決定したときに、配列番号１又は３の全長に対して少なくとも９５％の同一性を有する。
【００１０】
配列番号１及び３の「コドン」とは、配列番号１及び３のヌクレオチド２又は３で始まるフレームではなく、配列番号１及び３のヌクレオチド１で開始するフレームにおけるコドンを指す。つまり、配列番号１及び３の最初のコドンは、ヌクレオチド番号１から３で示される。
【００１１】
別の態様では、本発明は、ヒトポルホビリノゲンデアミナーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物であって、ヒトポルホビリノゲンデアミナーゼをコードするコドンのうち少なくとも約３２０個のコドンが配列番号１のコドンと同一である、又はヒトポルホビリノゲンデアミナーゼをコードするコドンのうち少なくとも約３０５個のコドンが配列番号３のコドンと同一である上記核酸構築物に関する。好ましくは、当該核酸構築物において、ヒトポルホビリノゲンデアミナーゼをコードするヌクレオチド配列は、ヒト細胞内で発現させるためのプロモーター、好ましくは肝臓特異的プロモーターに作動可能に連結している。
【００１２】
本発明の更なる態様は、ヒト細胞内で発現させるためのプロモーターに作動可能に連結している、ヒトポルホビリノゲンデアミナーゼをコードするヌクレオチド配列を含むウイルス遺伝子療法ベクターに関する。好ましくは、当該ベクターはリコンビナントパルボウイルスベクター、又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。
【００１３】
更なる態様では、本発明は、ヒトポルホビリノゲンデアミナーゼをコードするヌクレオチド配列を含む、リコンビナントパルボウイルスベクター、又はＡＡＶベクターを含む、核酸、核酸構築物、又はパルボウイルスビリオンに関する。
【００１４】
なおも更なる態様では、本発明は、かかる核酸、核酸構築物、又はパルボウイルスビリオン、及び薬学的に許容される担体等を含む医薬組成物に関する。
【００１５】
本発明の更なる態様は、薬剤として使用するため、及びポルホビリノゲンデアミナーゼの欠損によって引き起こされる状態の処置で使用するための、かかる核酸、核酸構築物、又はパルボウイルスビリオンに関し、好ましくは、当該状態は急性間欠性ポルフィリン症（ＡＩＰ）である。
【００１６】
また、本発明は、本発明の核酸、核酸構築物、又はパルボウイルスビリオンを、ポルホビリノゲンデアミナーゼの欠損によって引き起こされる状態の処置で使用される薬剤の製造で使用するための使用にも関する。
【００１７】
ポルホビリノゲンデアミナーゼをコードするヌクレオチド配列を哺乳動物に送達するための方法であって、
ａ．本発明の核酸、核酸構築物、又はパルボウイルスビリオンを提供するステップと、
ｂ．哺乳動物において治療効果をもたらすレベルでタンパク質を発現させるような条件下で、前記核酸、核酸構築物、又はパルボウイルスビリオンを前記哺乳動物に投与するステップ
とを含む上記方法も提供する。
【００１８】
また、本発明は、ポルホビリノゲンデアミナーゼの欠損によって引き起こされる状態を処置する方法であって、ヒトポルホビリノゲンデアミナーゼをコードするヌクレオチド配列を有する核酸、核酸構築物、又はパルボウイルスビリオンを含む医薬組成物の有効量を、ポルホビリノゲンデアミナーゼが欠損している対象に投与するステップを含み、好ましくは当該状態が急性間欠性ポルフィリン症である上記方法にも関する。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
定義
「核酸」として、単量体ヌクレオチドから構成される、又はこれを含む任意の分子が挙げられる。用語「ヌクレオチド配列」は、本明細書の「核酸」と交換可能に用いられる場合がある。核酸はオリゴヌクレオチド、又はポリヌクレオチドであり得る。核酸はＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。核酸は化学的に修飾され得る、又は人工的であり得る。人工的な核酸として、ペプチド核酸（ＰＮＡ）モルホリノ（Ｍｏｒｐｈｏｒｉｎｏ）及びロックド核酸（ＬＮＡ）の他、グリコール核酸（ＧＮＡ）、及びトレオース核酸（ＴＮＡ）が挙げられる。これらはそれぞれ、分子骨格に変更を加えることにより、天然に生じたＤＮＡ又はＲＮＡと異なる。また、ホスホロチオエートヌクレオチドも利用可能である。本発明の核酸で利用可能なその他のデオキシヌクレオチド類似体として、メチルホスホネート、ホスホルアミデート、ホスホロジチオエート、Ｎ３’Ｐ５’−ホスホルアミデート、及びオリゴリボヌクレオチドホスホロチオエートとその２’−０−アリル類似体、及び２’−０−メチルリボヌクレオチドメチルホスホネートが挙げられる。
【００２０】
「核酸構築物」とは、本明細書では、リコンビナントＤＮＡ技術の利用により生み出された人工の核酸分子を意味するものと理解される。核酸構築物は一本鎖又は二本鎖のいずれかの核酸分子であって、核酸のセグメントを含むように修飾されている、ある方法で組み合わされ併置されている、それ以外では自然には存在しないであろう核酸分子である。核酸構築物は、通常「ベクター」、すなわち外生的に生み出されたＤＮＡを宿主細胞内に送達するために用いられる核酸分子である。
【００２１】
核酸構築物の１つのタイプは、「発現カセット」、又は「発現ベクター」である。これらの用語は、かかる配列に適合性を有する宿主細胞又は宿主生物内で遺伝子の発現を引き起こす能力を有するヌクレオチド配列を意味する。発現カセット又は発現ベクターは通常、少なくとも適した転写制御配列、及び任意選択により３’転写終結シグナルを含む。発現を引き起こすのに必要な、又は役立つ、発現エンハンサーエレメント等の更なる因子も存在し得る。
【００２２】
用語「ホモロガス」とは、所与の（リコンビナント）核酸又はポリペプチド分子と、所与の宿主生物又は宿主細胞との間の関係を表すのに用いられる場合には、当該核酸又はポリペプチド分子が、天然では同種の宿主細胞又は生物により産生されることを意味するものと理解される。用語「ヘテロロガス」とは、核酸又はポリペプチド分子が、天然では異種の宿主細胞又は生物により産生されることを表すために使用され得る。
【００２３】
本明細書で用いる場合、用語「作動可能に連結した」とは、機能的な関係でポリヌクレオチド（又はポリペプチド）エレメントが連結していることを指す。核酸は、別の核酸配列と機能的な関係を有すように配置している場合に、「作動可能に連結した」状態にある。例えば、転写制御配列がコード配列の転写に影響を及ぼす場合には、当該転写制御配列はコード配列に作動可能に連結している。作動可能に連結したとは、通常、連結対象ＤＮＡ配列が隣接していること、また２つのタンパク質をコードする領域を結び付ける必要がある場合には、隣接し、且つリーディングフレームがインフレームであることを意味する。
【００２４】
「発現制御配列」とは、それが作動可能に連結しているヌクレオチド配列の発現を制御する核酸配列を指す。発現制御配列は、それがヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳を制御及び調節する場合に、当該ヌクレオチド配列に「作動可能に連結して」いる。従って、発現制御配列は、プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、転写ターミネーター、タンパク質コード遺伝子の前に位置する開始コドン、イントロンに関するスプライシングシグナル、及び終始コドンを含み得る。用語「発現制御配列」は、少なくとも、その存在が発現に影響を与えるように設計された配列を含むことが意図されており、また追加の好都合な構成要素も含み得る。例えば、リーダー配列及び融合パートナー配列は発現制御配列である。当該用語は、フレーム内外にある望ましくない潜在的開始コドンが配列から取り除かれるような核酸配列の設計も含み得る。当該用語は、望ましくない潜在的スプライス部位が取り除かれるような核酸配列の設計も含み得る。この配列には、ポリＡ尾部、すなわち、ｍＲＮＡの３’−末端にある、ポリＡ配列と呼ばれることもあるアデニン残基のストリングを付加するように指示する配列又はポリアデニレーション配列（ｐＡ）が含まれる。またこの配列は、ｍＲＮＡの安定性を高めるようにも設計され得る。転写安定性及び翻訳安定性に影響を及ぼす発現制御配列、例えばプロモーター、並びに翻訳に影響を及ぼす配列、例えばＫｏｚａｋ配列等の昆虫細胞で用いるのに適する配列は、当業者には周知である。発現制御配列は、これが作動可能に連結したヌクレオチド配列を、より低い発現レベル、又はより高い発現レベルを実現すべく調節する性質のものであり得る。
【００２５】
本明細書で用いる場合、用語「プロモーター」又は「転写制御配列」とは、１つ又は複数のコード配列の転写を制御するように機能し、且つ当該コード配列の転写開始部位の転写方向に対して上流に位置し、且つＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ結合部位、転写開始部位、及び任意のその他のＤＮＡ配列、例えば非限定的に転写因子結合部位、リプレッサー及びアクティベータータンパク質結合部位、及び、例えばアテニュエーター又はエンハンサー、それからサイレンサーを含む、プロモーターからの転写量を直接的又は間接的に制御するように作用するような当業者にとって公知の任意のその他のヌクレオチド配列の存在により構造的に識別される。「構成的」プロモーターとは、ほとんどの生理的及び発生条件下で、ほとんどの組織内でアクティブなプロモーターである。「誘導性」プロモーターとは、例えば化学誘導物質の適用によって生理的又は発生的に調節されたプロモーターである。「組織特異的」プロモーターとは、特定の種類の組織又は細胞においてのみアクティブである。
【００２６】
「３’ＵＴＲ」又は「３’非翻訳配列」（３’非翻訳領域、又は３’末端と呼ばれることも多い）とは、遺伝子のコード配列の下流に見出される核酸配列を指し、例えば転写終結部位、及び（ほとんどの、但し全てではない真核生物ｍＲＮＡにおいて）ポリアデニレーションシグナル（例えば、ＡＡＵＡＡＡ又はその変異体）を含む。転写終結後、ｍＲＮＡ転写物はポリアデニレーションシグナルの下流で切断され、ポリ（Ａ）尾部が付加される場合があるが、これは細胞質（翻訳が行われる場所）へのｍＲＮＡの輸送に関連している。
【００２７】
用語「実質的に同一の」、「実質的同一性」、又は「本質的に類似の」、又は「本質的類似性」は、２つのペプチド又は２つのヌクレオチド配列が、例えば、デフォルトパラメーターを用いてプログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴによって、最適に整列している場合に、これらが、本明細書の他の場所で定義するように、少なくともある割合の配列同一性を共有することを意味する。ＧＡＰは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのグローバルアラインメントアルゴリズムを使用して、それらの全長にわたって２つの配列を整列させ、マッチ数を最大にし、ギャップ数を最小にする。一般に、ＧＡＰデフォルトパラメーターが用いられ、ギャップ生成ペナルティー＝５０（ヌクレオチド）／８（タンパク質）、及びギャップ伸長ペナルティー＝３（ヌクレオチド）／２（タンパク質）である。ヌクレオチドの場合、使用するデフォルトスコアリングマトリックスは、ｎｗｓｇａｐｄｎａであり、タンパク質の場合には、デフォルトスコアリングマトリックスは、Ｂｌｏｓｕｍ６２である（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、１９９２年、ＰＮＡＳ、第８９巻、９１５〜９１９頁）。ＲＮＡ配列が、ＤＮＡ配列と実質的に類似している、又はある程度の配列同一性を有するといわれる場合には、ＤＮＡ配列におけるチミン（Ｔ）は、ＲＮＡ配列におけるウラシル（Ｕ）に等しいと考えられることは明らかである。配列アラインメント、及び配列同一性の割合（％）を表すスコアは、Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．、９６８５  Ｓｃｒａｎｔｏｎ  Ｒｏａｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ  ９２１２１−３７５２、米国から入手可能なＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ、１０．３版、又はオープンソースソフトウェアＥｍｂｏｓｓ  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）（最新版２．７．１−０７）等のコンピュータプログラムを使用して決定可能である。或いは、類似性又は同一性の割合（％）を、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ等のデータベースについて検索することによって決定可能である。
【００２８】
本文書、及びその特許請求の範囲では、「含む」という動詞及びその活用形は、その言葉に続く事項が含まれるが、具体的に記載されていない事項も除外されないことを意味するように、非限定的な意味合いで使用される。更に、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」により要素を引用する場合、これは、文脈によって、要素が１つ、且つ１つしか存在しないことが明らかに求められない限り、要素が２つ以上存在する可能性を排除しない。従って、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」は、通常、「少なくとも１つ」を意味する。
【００２９】
発明の詳細な説明
本発明はポルホビリノゲンデアミナーゼをコードするヌクレオチド配列に関する。ポルホビリノゲンデアミナーゼをコードするヌクレオチド配列は、好ましくは合成ヌクレオチド配列である。用語「合成ヌクレオチド配列」とは、本明細書においては、当該ヌクレオチド配列は天然には生じることはなく、むしろヒトが介入することによって設計、工学操作、及び／又は構築されることを意味するものと理解される。従って、用語「合成」は、もっぱら及び／又は全てが化学合成を通じて得られる配列を必ずしも意味しない。むしろ、当該合成配列の一部は、１つの段階において化学合成を通じて得られたものであり得るが、本発明の合成配列を含む分子は、通常、（培養された、例えばリコンビナント）細胞等の生物学的起源から取得される。
【００３０】
本発明のヌクレオチド配列は、赤血球又は非赤血球のポルホビリノゲンデアミナーゼをコードし得る。好ましくは、ヌクレオチド配列は、ヒト起源のポルホビリノゲンデアミナーゼをコードする。従って、当該ヌクレオチド配列は、対立形質のヒトポルホビリノゲンデアミナーゼに関する任意の天然のアミノ酸配列をコードし得る。但し、本発明に明確に含まれるものとして、例えば天然に生じているヒトアミノ酸配列と比較して、１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠損、及び／又は挿入を有するポルホビリノゲンデアミナーゼの工学操作された突然変異タンパク質をコードするヌクレオチド配列が挙げられる。好ましくは、当該ヌクレオチド配列は、例えばＷｒｉｇｈｔ及びＬｉｍ（１９８３年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、第２１３巻：８５〜８８頁）が記載するアッセイ法により決定され得るような、ポルホビリノゲンデアミナーゼ活性（ＥＣ２．５．１．６１）を有するタンパク質をコードする。
【００３１】
本発明の好ましい実施形態では、ポルホビリノゲンデアミナーゼをコードするヌクレオチド配列は、デアミナーゼをコードする天然に生じているヌクレオチド配列と比較して、ヒト細胞に対してコドンの利用において改善した偏りを有する。ヒト細胞のコドン利用に対するポルホビリノゲンデアミナーゼをコードするヌクレオチド配列の適応性は、コドン適応性インデックス（ＣＡＩ）として表現され得る。コドン適応性インデックスは、本明細書においては、高度に発現しているヒト遺伝子のコドン利用に対する、ある遺伝子のコドン利用の相対的適応性の尺度として定義される。各コドンの相対的適応性（ｗ）は、同一のアミノ酸について最も多く存在するコドンの利用に対する各コドンの利用の比である。ＣＡＩはそのような相対的適応性の値の幾何平均として定義される。非同義コドン及び終始コドン（遺伝子コードに依存する）は除外される。ＣＡＩ値は０から１の範囲であり、高い値ほど、最も多く存在するコドンの割合が高いことを表す（Ｓｈａｒｐ及びＬｉ、１９８７年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第１５巻：１２８１〜１２９５頁を参照；またＫｉｍら、Ｇｅｎｅ、１９９７年、第１９９巻：２９３〜３０１頁；ｚｕｒ  Ｍｅｇｅｄｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２０００年、第７４巻：２６２８〜２６３５頁も参照）。好ましくは、ポルホビリノゲンデアミナーゼをコードするヌクレオチド配列は、少なくとも０．８、０．８５、０．９０、０．９２、０．９４、０．９５、０．９６、又は０．９７のＣＡＩを有する。
【００３２】
本発明の好ましいヌクレオチド配列では、非赤血球ポルホビリノゲンデアミナーゼをコードする全てのコドンのうち、少なくとも３２０、３３０、３４０、３４５、３５０、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、又は３６１個が、配列番号１のコドン（対応する位置にある）と同一である。より好ましくは、当該ヌクレオチド配列は配列番号２のアミノ酸配列をコードする。
【００３３】
或いは、本発明の好ましいヌクレオチド配列では、赤血球ポルホビリノゲンデアミナーゼをコードするコドンのうち、少なくとも３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４１、３４２、３４３、又は３４４個が、配列番号３のコドン（対応する位置にある）と同一である。より好ましくは、当該ヌクレオチド配列は配列番号４のアミノ酸配列をコードする。
【００３４】
配列番号１及び３の「コドン」とは、配列番号１及び３のヌクレオチド１で始まるフレーム内のコドンを指し、すなわち、配列番号１及び３のヌクレオチド２又は３で始まるフレーム内のコドンではない。つまり、配列番号１及び３の最初のコドンはヌクレオチド番号１から３で表される。
【００３５】
本発明の別の好ましいヌクレオチド配列は、ポルホビリノゲンデアミナーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、これに基づき、当該ヌクレオチド配列は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのグローバルアラインメントアルゴリズムにより求めたときに、その全長に対して配列番号１又は３と少なくとも９５、９６、９７、９８、又は９９％のヌクレオチド配列同一性を有する。より好ましくは、ヌクレオチド配列は、配列番号２又は４のアミノ酸配列をコードする。
【００３６】
本発明の特に好ましい実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１又は３のヌクレオチド配列を有する。
【００３７】
更なる態様では、本発明は、本明細書においてこれまでに定義したような本発明のヌクレオチド配列を含む核酸構築物に関する。当該核酸構築物では、ポルホビリノゲンデアミナーゼをコードするヌクレオチド配列は、好ましくは哺乳動物細胞に適合性のある発現制御配列、例えばプロモーターに作動可能に連結している。多くのかかるプロモーターは、当技術分野で公知である（上記Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ、２００１年を参照）。多くの細胞型で幅広く発現している構成的プロモーター、例えばＣＭＶプロモーターが利用可能である。しかし、誘導性、組織特異的、細胞型特異的、又は細胞サイクル特異的であるプロモーターが好ましい場合がある。好ましい実施形態では、ポルホビリノゲンデアミナーゼをコードするヌクレオチド配列は、肝臓特異的プロモーターに作動可能に連結している。肝臓特異的プロモーターは、非赤血球デアミナーゼと共に用いるのに特に好ましい。好ましくは、本発明の構築物では、肝臓特異的発現に対する発現制御配列は、例えばα１−アンチ−トリプシン（ＡＡＴ）プロモーター、甲状腺ホルモン結合グロブリンプロモーター、アルブミンプロモーター、チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、肝制御領域（ＨＣＲ）−アポＣＩＩハイブリッドプロモーター、ＨＣＲ−ｈＡＡＴハイブリッドプロモーター、マウスアルブミン遺伝子エンハンサー（Ｅａｌｂ）エレメントと結合したＡＡＴプロモーター、及びアポリポタンパク質Ｅプロモーターからなる群より選択される。その他の例として、腫瘍選択的、及び特に、神経細胞腫瘍選択的発現に関するＥ２Ｆプロモーター（Ｐａｒｒら、１９９７年、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．第３巻：１１４５〜９頁）、又は単核血球で用いられるＩＬ−２プロモーター（Ｈａｇｅｎｂａｕｇｈら、１９９７年、Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ；第１８５巻：２１０１〜１０頁）が挙げられる。本発明の特に好ましい実施形態では、プロモーターは配列番号５の配列を有する。
【００３８】
本発明の核酸構築物の更に好ましい実施形態では、３’ＵＴＲ（又は３’非翻訳配列）は、ポルホビリノゲンデアミナーゼをコードするヌクレオチド配列の下流に位置し得る。適する３’ＵＴＲ配列は、当業者には入手可能である。これらの配列は、任意の哺乳動物、そして好ましくはヒト遺伝子に由来することができ、また通常、転写終結部位、及びポリアデニレーションシグナル（例えば、ＡＡＵＡＡＡ又はその変異体）を含む。特に好ましい実施形態では、核酸構築物は、例えば配列番号６等のヒトＰＢＧＤ遺伝子に由来する３’ＵＴＲを含む。
【００３９】
本発明の核酸構築物の別の好ましい実施形態では、発現制御配列はポルホビリノゲンデアミナーゼをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結し、上流転写ユニットと考えられるユニットからのランスルー転写を終結するように、ポリＡインシュレーターがこの上流に位置する。上記のような、そして好ましくは少なくとも転写終結配列を含む３’ＵＴＲは、かかる目的で利用可能である。好ましいポリＡインシュレーターは、配列番号７の配列を有する合成ポリＡインシュレーターである。
【００４０】
１つの好ましい実施形態では、本発明の核酸構築物は、ポルホビリノゲンデアミナーゼをコードするヌクレオチド配列の開始コドン周辺にＫｏｚａｋ配列を含む。本明細書では、Ｋｏｚａｋ配列をＧＣＣＲＣＣ（ＡＵＧ）Ａ（配列番号８）として定義するが、Ｒはプリン（すなわちＡ，アデノシン、又はＧ，グアノシン）であり、また（ＡＵＧ）は、ポルホビリノゲンデアミナーゼをコードする配列の開始コドンを意味する。通常のＫｏｚａｋ配列では、ＡＵＧ開始コドンの直後のヌクレオチドはＧ（グアノシン）であるが、本発明においては、かかるヌクレオチドは、赤血球及び非赤血球ポルホビリノゲンデアミナーゼをコードする配列のいずれにおいても好ましくはＡ（アデノシン）である。好ましい実施形態では、Ｋｏｚａｋ配列に対してもう１つ別のＧＣＣトリプレットが先行し得る。
【００４１】
更なる態様では、本発明は、本明細書でこれまでに定義した発現制御配列に作動可能に連結している、ポルホビリノゲンデアミナーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物に関連し、前記構築物は哺乳動物の遺伝子治療、好ましくはヒトの遺伝子治療に好適な発現ベクターである。本発明による好ましい核酸構築物は、ウイルス遺伝子治療ベクターである。ウイルス遺伝子治療ベクターは当技術分野で公知であり、例えばアデノウイルスに基づくベクター、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）等のパルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）のメンバー、又はヘルペスウイルス、ポックスウイルス、又はレトロウイルスが含まれる。好ましいウイルス遺伝子治療ベクターは、ＡＡＶ、アデノウイルス、又はレンチウイルスのベクターである。
【００４２】
本発明において特に好ましい遺伝子療法ベクターは、パルボウイルスベクターである。従って、かかる好ましい態様では、本発明は、ポルホビリノゲンデアミナーゼをコードするヌクレオチド配列を哺乳動物細胞内に導入し、及び／又は発現させるためのベクターとしての利用を目的とした、動物パルボウイルス、特に感染性ヒト又は類人猿ＡＡＶ等のディペンドウイルス（ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓｅｓ）及びその構成要素（例えば、動物パルボウイルスゲノム）の利用に関する。
【００４３】
パルボウイルス科のウイルスは、小型のＤＮＡ動物ウイルスである。パルボウイルス科は２つの亜科に分割可能である：脊椎動物に感染するパルボウイルス亜科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｎａｅ）、及び昆虫に感染するデンソウイルス亜科（Ｄｅｎｓｏｖｉｒｉｎａｅ）。パルボウイルス亜科のメンバーは、本明細書においてパルボウイルスと呼び、またディペンドウイルス属（Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ）を含む。その属名から推定され得るように、ディペンドウイルスのメンバーは、これが細胞培養で増殖的に感染するために、通常アデノウイルス、又はヘルペスウイルス等のヘルパーウイルスと同時感染する必要があることから独特である。ディペンドウイルス属には、通常ヒト（例えば、血清型１、２、３Ａ、３Ｂ、４、５、及び６）、又は霊長類（例えば、血清型１及び４）に感染するＡＡＶ、及び他の温血動物に感染する関連ウイルス（例えば、ウシ、イヌ、ウマ、及びヒツジのアデノ随伴ウイルス）が含まれる。パルボウイルス、及びパルボウイルス科のその他のメンバーに関する更なる情報は、Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ｉ．Ｂｅｒｎｓ、「パルボウイルス科：ウイルス及びその複製（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ  Ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，）」Ｃｈａｐｔｅｒ  ６９  ｉｎ  Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（３ｄ  Ｅｄ．１９９６）に記載されている。便宜上、本発明は、本明細書では、以降、ＡＡＶと呼ぶことによって、例示され、記載される。但し、本発明は、ＡＡＶに限定されることなく、同様に他のパルボウイルスにも適用可能であることが理解される。
【００４４】
全ての既知のＡＡＶ血清型のゲノム構造は非常に類似している。ＡＡＶのゲノムは、長さが約５，０００ヌクレオチド（ｎｔ）未満である、直線状の一本鎖ＤＮＡ分子である。逆方向末端反復（ＩＴＲ）は、非構造的複製（Ｒｅｐ）タンパク質及び構造（ＶＰ）タンパク質に関する独特なコードヌクレオチド配列に隣接する。ＶＰタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３）は、キャプシドを形成する。末端側１４５ｎｔは自己相補的であり、Ｔ型ヘアピンを形成するエネルギー的に安定な分子内二本鎖を形成し得るように組織化される。これらのヘアピン構造は、ウイルスＤＮＡ複製の開始点として機能し、細胞性ＤＮＡポリメラーゼ複合体のプライマーとしての役割を果たす。野生型（ｗｔ）ＡＡＶが哺乳動物細胞に感染し、これに続いてＲｅｐ遺伝子（すなわち、Ｒｅｐ７８、及びＲｅｐ５２）が、それぞれＰ５プロモーター及びＰ１９プロモーターから発現し、両方のＲｅｐタンパク質は、ウイルスゲノムの複製においてある１つの機能を有する。Ｒｅｐ  ＯＲＦにおけるスプライシング事象は、実際には４つのＲｅｐタンパク質（すなわち、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０）を発現する。しかし、哺乳動物細胞においてＲｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質をコードするスプライスされていないｍＲＮＡは、ＡＡＶベクターを産生するのに十分であることが示された。また、昆虫細胞においても、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質は、ＡＡＶベクターを産生するのに十分である。
【００４５】
「リコンビナントパルボウイルス又はＡＡＶベクター」（又は「ｒＡＡＶベクター」）は、本明細書において、１つ又は複数の対象とするポリヌクレオチド配列、対象とする遺伝子、又は少なくとも１つのパルボウイルス若しくはＡＡＶの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接する「導入遺伝子」を含むベクターを指す。ＡＡＶ  ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子産物（すなわち、ＡＡＶ  Ｒｅｐ、及びＣａｐタンパク質）を発現している昆虫宿主細胞内に存在する場合には、かかるｒＡＡＶベクターは複製可能、及び感染性ウイルス粒子中にパッケージング可能である。ｒＡＡＶベクターが、より大きい核酸構築物（例えば、染色体、又はクローニング若しくはトランスフェクションに使用するプラスミド若しくはバキュロウイルス等の別のベクター内にある）中に組み込まれた場合、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶパッケージング機能及び必要なヘルパー機能の存在下で複製及びキャプシド形成することによって「救出」可能な「プロベクター」と一般的に呼ばれる。従って、本発明の更なる態様は、本明細書でこれまでに定義したポルホビリノゲンデアミナーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物に関連し、当該核酸構築物はリコンビナントパルボウイルス、又はＡＡＶのベクターであり、従って少なくとも１つのパルボウイルスＩＴＲ又はＡＡＶ  ＩＴＲを含む。好ましくは、当該核酸構築物では、ポルホビリノゲンデアミナーゼをコードするヌクレオチド配列は、いずれかの末端においてパルボウイルスＩＴＲ又はＡＡＶ  ＩＴＲと隣接する。ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、及び／又はＡＡＶ９に由来するＩＴＲを含め、任意のパルボウイルスＩＴＲ又はＡＡＶ  ＩＴＲを本発明の構築物で利用可能である。ＡＡＶ２のＩＴＲが最も好ましい。本発明の好ましい核酸構築物で用いられる好ましいＩＴＲ配列の例として、配列番号９（左側、又は上流のＩＴＲ）、及び配列番号１０（右側、又は下流のＩＴＲ）が挙げられる。
【００４６】
ＡＡＶはいくつかの哺乳動物細胞に感染することができる。例えばＴｒａｔｓｃｈｉｎら（１９８５年、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、第５巻：３２５１〜３２６０頁）、及びＧｒｉｍｍら（１９９９年、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、第１０巻：２４４５〜２４５０頁）。しかし、ヒト滑膜線維芽細胞にＡＡＶを形質導入する場合、それは類似するマウス細胞より顕著に効果的であり、Ｊｅｎｎｉｎｇｓら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ、３：１（２００１年）、またＡＡＶの細胞トロピシティー（ｔｒｏｐｉｃｉｔｙ）は、血清型間で異なる。例えば、哺乳動物ＣＮＳ細胞向性、及び形質導入効率について、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、及びＡＡＶ５の間の相違を議論しているＤａｖｉｄｓｏｎら、（２０００年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９７巻：３４２８〜３４３２頁）、及びＡＡＶ向性を改変するアプローチについて議論しているＧｏｎｃａｌｖｅｓ、２００５年、Ｖｉｒｏｌ  Ｊ．、第２巻（１）：４３頁を参照。肝臓細胞に形質導入する場合には、ＡＡＶ１、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ５キャプシドタンパク質を含むｒＡＡＶビリオンが好ましく（Ｎａｔｈｗａｎｉら、２００７年、Ｂｌｏｏｄ、第１０９巻（４）：１４１４〜１４２１頁；Ｋｉｔａｊｉｍａら、２００６年、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、第１８６巻（１）：６５〜７３頁）、これらの中で、ＡＡＶ５キャプシドタンパク質を含むｒＡＡＶビリオンが最も好ましい。
【００４７】
昆虫細胞内でｒＡＡＶベクターを産生させるために、本発明で用いることができるＡＡＶ配列は、任意のＡＡＶ血清型のゲノムに由来することができる。一般的に、ＡＡＶ血清型は、アミノ酸レベル及び核酸レベルでかなり相同性の高いゲノム配列を有する。これは、等しい一連の遺伝機能をもたらして、物理的にまた機能的に本質的に等しいビリオンを生成する。様々なＡＡＶ血清型のゲノム配列、及びゲノム類似性の概要については、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｕ８９７９０；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｊ０１９０１；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ０４３３０３；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ０８５７１６；Ｃｈｌｏｒｉｎｉら（１９９７年、Ｊ．Ｖｉｒ．第７１巻：６８２３〜３３頁）；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら（１９８３年、Ｊ．Ｖｉｒ．第４５巻：５５５〜６４頁）；Ｃｈｌｏｒｉｎｉら（１９９９年、Ｊ．Ｖｉｒ．第７３巻：１３０９〜１３１９頁）；Ｒｕｔｌｅｄｇｅら（１９９８年、Ｊ．Ｖｉｒ．第７２巻：３０９〜３１９頁）；及びＷｕら（２０００年、Ｊ．Ｖｉｒ．第７４巻：８６３５〜４７頁）を参照。ｒＡＡＶ血清型１、２、３、４、及び５は、本発明において用いられるＡＡＶヌクレオチド配列の好ましい供給源である。好ましくは、本発明において用いられるＡＡＶ  ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、及び／又はＡＡＶ４に由来する。同様に、Ｒｅｐ（Ｒｅｐ７８／６８、及びＲｅｐ５２／４０）をコードする配列は、好ましくはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、及び／又はＡＡＶ４に由来する。しかし、本発明において用いられる、ウイルスタンパク質（ＶＰ）ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３キャプシドタンパク質をコードする配列は、公知の４２種類の血清型のうちの任意の血清型から選択されるが、より好ましくはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、若しくはＡＡＶ９、又は例えばキャプシドシャッフリング技術、及びＡＡＶキャプシドライブラリーにより得られる、新規に開発されたＡＡＶ様粒子から選択される。
【００４８】
ＡＡＶ  Ｒｅｐ配列及びＩＴＲ配列は、ほとんどの血清型の中でも特別に保存されている。様々なＡＡＶ血清型のＲｅｐ７８タンパク質は、例えば８９％を超えて一致しており、またＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、及びＡＡＶ６間のゲノムレベルにおける総合的なヌクレオチド配列の同一性は、約８２％である（Ｂａｎｔｅｌ−Ｓｃｈａａｌら、１９９９年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、第７３巻（２）：９３９〜９４７頁）。更に、多くのＡＡＶ血清型のＲｅｐ配列、及びＩＴＲは、哺乳動物細胞内でＡＡＶ粒子を産生する際に、その他の血清型由来の対応する配列と十分に相互相補的である（すなわち、機能的に置き換わる）ことが公知である。米国特許第２００３１４８５０６号は、ＡＡＶ  Ｒｅｐ配列及びＩＴＲ配列も、昆虫細胞内のその他のＡＡＶ  Ｒｅｐ配列及びＩＴＲ配列と、十分に相互に相補的であることを報告している。
【００４９】
ＡＡＶ  ＶＰタンパク質は、ＡＡＶビリオンの細胞トロピシティーを決定づけることが公知である。ＶＰタンパク質をコードする配列は、異なるＡＡＶ血清型のＲｅｐタンパク質及び遺伝子よりも、有意に保存性が低い。Ｒｅｐ配列及びＩＴＲ配列は、その他の血清型の対応する配列と相互に相補的となり得るので、これにより１つの血清型（例えば、ＡＡＶ５）のキャプシドタンパク質、及び別のＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ２）のＲｅｐ及び／又はＩＴＲ配列を含む、シュードタイピングしたｒＡＡＶ粒子の産生が可能となる。かかるシュードタイピングしたｒＡＡＶ粒子は、本発明の一部である。本明細書では、シュードタイピングしたｒＡＡＶ粒子をタイプ「ｘ／ｙ」と呼ぶ場合があるが、その場合、ｘはＩＴＲの起源を表し、また「ｙ」は、キャプシドの血清型を表し、例えば２／５ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２に由来するＩＴＲ、及びＡＡＶ５に由来するキャプシドを有する。
【００５０】
改変された「ＡＡＶ」配列も、本発明において、例えばｒＡＡＶベクターを昆虫細胞内で産生するために利用可能である。かかる改変された配列は、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、又はＡＡＶ９  ＩＴＲ、Ｒｅｐに対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又はこれ以上のヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列の同一性（例えば、約７５％から約９９％のヌクレオチド配列の同一性）を有する配列を含み、又はＶＰを野生型ＡＡＶ  ＩＴＲ、Ｒｅｐ、又はＶＰ配列の代わりに利用することができる。
【００５１】
多くの点でその他のＡＡＶ血清型と類似するが、ＡＡＶ５は、その他の公知のヒト及び類人猿の血清型よりも、その他のヒト及び類人猿のＡＡＶ血清型と異なる。こうしたことから、ｒＡＡＶ５を産生する場合、それは昆虫細胞内でその他の血清型を産生する場合と異なる可能性がある。ｒＡＡＶ５を産生するために本発明の方法を用いる場合において、ＡＡＶ５  ＩＴＲを含むヌクレオチド配列を含む１つ又は複数の構築物は、２つ以上の構築物の場合には集合的に、ヌクレオチド配列がＡＡＶ５  Ｒｅｐをコードする配列を含む（すなわち、ヌクレオチド配列はＡＡＶ５  Ｒｅｐ７８を含む）ことが好ましい。かかるＩＴＲ配列及びＲｅｐ配列は、ｒＡＡＶ５又はシュードタイピングしたｒＡＡＶ５ベクターを昆虫細胞内で十分に産生できるように望み通りに改変可能である。例えば、Ｒｅｐ配列の開始コドンを改変することができ、ＶＰスプライス部位を改変又は除去することができ、及び／又は昆虫細胞内でｒＡＡＶ５ベクターの産生を改善するように、ＶＰ１開始コドン及び近傍のヌクレオチドを改変することができる。
【００５２】
Ｒｕｓｓｅｌｌがレビューするように（２０００年、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、第８１巻：２５７３〜２６０４頁）、又はＵＳ２００８０００８６９０で、及びＺａｌｄｕｍｂｉｄｅ及びＨｏｅｂｅｎが記載するように（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、２００８年：２３９〜２４６頁）、好ましいアデノウイルスベクターは、宿主反応を抑えるために改変される。
【００５３】
従って、本発明は、本明細書においてこれまでに定義した核酸構築物、及び本明細書においてこれまでに定義したパルボウイルスキャプシドタンパク質を含むパルボウイルスビリオンにも関連する。
【００５４】
更なる態様では、本発明は、昆虫細胞内でリコンビナントパルボウイルス（例えば、ｒＡＡＶ）ビリオン（これまでに定義したリコンビナントパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを含む）を産生する方法に関する。好ましくは、当該方法は、（ａ）リコンビナントパルボウイルス（例えば、ｒＡＡＶ）ベクターが産生するような条件下で、本明細書で定義する昆虫細胞を培養するステップ；及び（ｂ）当該リコンビナントパルボウイルス（例えば、ｒＡＡＶ）ベクターを回収するステップを含む。本方法で産生されるリコンビナントパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターは、好ましくはリコンビナントパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター核酸を含む、感染性パルボウイルスビリオン又はＡＡＶビリオンであると本明細書では理解される。培養物中の昆虫細胞の増殖条件、及び培養物中の昆虫細胞内でヘテロロガス生成物を産生させるステップは当技術分野で公知であり、昆虫細胞の分子工学に関する上記参考資料に記載されている。本発明のｒＡＡＶビリオンを産生するための好ましい方法及び構築物は、例えば国際公開第２００７／０４６７０３号及び同第２００７／１４８９７１号に開示されている。
【００５５】
好ましくは、リコンビナントパルボウイルスビリオンを産生する方法は、リコンビナントパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター（を含むビリオン）を、抗ＡＡＶ抗体、好ましくは固定化抗体を用いてアフィニティー精製するステップを更に含む。当該抗ＡＡＶ抗体は、好ましくはモノクロナール抗体である。特に適する抗体は、例えばラクダ又はラマから入手可能な一本鎖のラクダ科抗体又はその断片である（例えば、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ、２００１年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．第７４巻：２７７〜３０２頁を参照）。ｒＡＡＶのアフィニティー精製用の抗体は、好ましくはＡＡＶキャプシドタンパク質上のエピトープに特異的に結合する抗体であり、好ましくは当該エピトープは、２つ以上のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質上に存在するエピトープである。例えば、抗体はＡＡＶ２キャプシドへの特異的結合に基づき産生又は選択可能であるが、同時にＡＡＶ１、ＡＡＶ３、及びＡＡＶ５キャプシドとも特異的に結合し得る。
【００５６】
また、本発明は、本明細書においてこれまでに定義したパルボウイルスビリオンの薬剤としての使用に関する。すなわち、本発明は、治療によりヒト又は動物の身体を処置する方法で使用するための本発明のパルボウイルスビリオンを提供する。
【００５７】
本発明は、ポルホビリノゲンデアミナーゼの欠損により引き起こされる状態の処置で使用するための、本明細書でこれまでに定義したパルボウイルスビリオンに更に関する。好ましくは、かかる状態は急性間欠性ポルフィリン症である。本発明の核酸又は核酸構築物は、かかる使用にも適する。
【００５８】
従って、本発明は、ポルホビリノゲンデアミナーゼの欠損により引き起こされる状態を処置する方法で使用するための薬剤の調製で使用するための、本発明の核酸、核酸構築物、又はパルボウイルスビリオンに関する。好ましくは、かかる状態は急性間欠性ポルフィリン症である。かかる処置は、１つ又は複数のＡＩＰの重症度を緩和し、改善し、軽減し得るが、例えば発作の発生率又は重症度を低減する。例えば、本発明による処置は、神経系の障害、腹痛、又は内臓神経及び／又は循環系の障害の重症度を緩和し、改善し、軽減し得る。
【００５９】
更に、本発明は、本明細書においてこれまでに定義したパルボウイルスビリオンを含む医薬組成物に関する。当該医薬組成物は、好ましくは更に、薬学的に許容される担体を含む。任意の適した薬学的に許容される担体又は添加剤が、本組成物で利用可能である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ（編集者）Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９７年４月を参照）。好ましい医薬品形態は、滅菌生理食塩水、デキストロース溶液、又は緩衝溶液、又はその他の薬学的に許容される滅菌液と併用される。或いは、固体担体、例えばマイクロキャリアビーズ等も利用可能である。
【００６０】
医薬組成物は、製造及び貯蔵の条件下では、一般的に滅菌状態にありまた安定である。医薬組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、又は高い薬物濃度を実現するのに適したその他の秩序構造物として処方可能である。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、及び液状のポリエチレングリコール等）、及びこれらの適する混合物を含む溶媒又は分散媒体であり得る。例えば、レシチン等のコーティング物を用いることにより、分散物の場合には、必要な粒子サイズを維持することにより、及び界面活性剤を使用することにより、適当な流動性を維持することができる。多くの場合、事例として、砂糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール等、又は塩化ナトリウム等の等張剤を組成物に含むのが好ましいであろう。組成物中に吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸塩及びゼラチンを含めることにより、注射組成物が持続的に吸収されるようにすることができる。パルボウイルスビリオンは、例えば、低速放出ポリマー、又は急速な放出から化合物を保護するその他の担体、例えばインプラント及びマイクロカプセル化された送達システム等を含む組成物として、ある時間内で、又は制御された放出処方で投与可能である。例えば、エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸、及びポリ乳酸、ポリグリコール酸コポリマー（ＰＬＧ）等の生分解性、生体適合性ポリマーを利用することができる。
【００６１】
本発明は、ポルホビリノゲンデアミナーゼをコードするヌクレオチド配列を哺乳動物に送達する方法であって、
ａ．本明細書において定義した核酸、核酸構築物、パルボウイルスビリオン、又は医薬組成物を提供するステップと、
ｂ．哺乳動物において治療効果をもたらすレベルでタンパク質発現させるような条件下で、前記核酸、核酸構築物、パルボウイルスビリオン、又は医薬組成物を前記哺乳動物に投与するステップ
とを含む上記方法も提供する。
【００６２】
また、本発明は、ポルホビリノゲンデアミナーゼの欠損によって引き起こされる状態を処置する方法であって、本明細書において定義した核酸、核酸構築物、パルボウイルスビリオン、又は医薬組成物の有効量を、ポルホビリノゲンデアミナーゼを欠損した対象に投与するステップを含む。好ましくは、当該対象は急性間欠性ポルフィリン症の病気に罹患している。
【００６３】
本発明による処置又は治療では、ポルホビリノゲンデアミナーゼの欠損によって引き起こされる状態は、本明細書において定義した核酸、核酸構築物、パルボウイルスビリオン、又は医薬組成物の有効量を、対象に投与することにより処置される。
【００６４】
かかる病気に罹患した患者の状態は、本発明の核酸、核酸構築物、パルボウイルスビリオン、又は医薬組成物を投与することにより改善可能である。本発明の核酸、核酸構築物、パルボウイルスビリオン、又は医薬組成物の治療上有効な量が、これを必要とする患者に投与され得る。
【００６５】
核酸、核酸構築物、パルボウイルスビリオン、又は医薬組成物は通常、任意選択により医薬担体、賦形剤、及び／又はアジュバンドと併用して、医薬組成物内に含まれる。かかる組成物は、所望の治療効果又は予防効果を実現するのに十分な有効量の核酸、核酸構築物、パルボウイルスビリオン、又は医薬組成物、及び薬学的に許容される担体又は添加剤を含む。「有効量」には、治療上有効量、又は予防上有効量が含まれる。
【００６６】
「治療上有効量」とは、所望の治療結果、例えばＰＢＧＤ活性の上昇等を実現するのに必要な用量及び期間において有効な量を指す。核酸、核酸構築物、パルボウイルスビリオン、又は医薬組成物の治療上有効な量は、病状、年齢、性別、及び個体の体重等の諸要因、並びに核酸、核酸構築物、パルボウイルスビリオン、又は医薬組成物が、個体内で所望の反応を発現させる能力により変化し得る。投与計画は、最適な治療反応を実現するように調節可能である。治療上有効な量は、一般的に、核酸、核酸構築物、パルボウイルスビリオン、又は医薬組成物の毒性効果、又は有害効果よりも、治療上有益な効果が勝る量でもある。
【００６７】
「予防上有効な量」とは、所望の予防結果、例えばＰＢＧＤレベルの低下に関連した状態を含む様々な状態の予防又は阻止を実現するのに必要な用量及び期間において有効な量を指す。予防量は、疾患に先立ち、又は疾患の初期段階で対象において利用可能であり、予防上有効な量は、場合によって治療上有効な量よりも多くも、少なくもあり得る。
【００６８】
特定の実施形態では、核酸、核酸構築物、パルボウイルスビリオン、又は医薬組成物の治療上又は予防上有効な量の範囲は、１×１０１２から１×１０１３ゲノムコピー（ｇｃ）／ｋｇ、例えば１×１０１１から１×１０１２ｇｃ／ｋｇであり得る。用量値は緩和すべき状態の重症度に応じて変化し得ることに留意されたい。任意の特定の対象について、個体のニーズ、及び当該組成物を投与し、又は投与を監督する者の専門的判断に基づき特別な投与計画を、時間をかけて調整し得る。本明細書に記載する用量範囲は例示目的に限られ、開業医により選択され得る用量範囲を限定するものではない。
【００６９】
本発明のパルボウイルスビリオン等の遺伝子療法ベクターの場合、投与すべき用量は処置される対象の状態及びサイズの他、治療処方、処置頻度、及び投与経路に大きく依存し得る。用量、処方、及び頻度を含む、治療を継続するための投薬計画は、初期反応及び臨床判断に基づくことができる。組織の間質腔への注入による非経口経路が好適であり得るが、特別な投与では、その他の非経口経路、例えばエアゾール処方の吸入が必要な場合もある。いくつかのプロトコールでは、水性担体中に遺伝子及び遺伝子送達系を含む処方が、組織内に適当量注入される。
【００７０】
組織標的、例えば肝臓組織は特異的であり得、又はこれはいくつかの組織の組合せ、例えば筋肉と肝臓組織であり得る。典型的な組織標的として、肝臓、骨格筋、心筋、脂肪沈着物、腎臓、肺、血管内皮、上皮、及び／又は造血性細胞を挙げることができる。
【００７１】
１つの実施形態では、筋肉内注射後の小動物（マウス）の有効用量範囲は、１×１０１２及び１×１０１３ゲノムコピー（ｇｃ）／ｋｇの間、またより大型の動物（ネコ）及びヒト対象の場合では、１×１０１１及び１×１０１２ｇｃ／ｋｇの範囲であり得る。
【００７２】
本発明の組成物内の核酸、核酸構築物、パルボウイルスビリオン、又は医薬組成物の活性な量は、病状、年齢、性別、及び個体の体重等の諸要因により変化し得る。投与計画は、最適な治療反応を実現するように調節可能である。例えば、単回ボーラスで投与可能、いくつかに分割した用量で時間をかけて投与可能、又は用量は治療状況の緊急性の指標に従い比例的に減少又は増加可能である。
【００７３】
投与を容易にし、用量を一定化するために、単位投与剤形で非経口組成物を処方するのが有利な場合がある。本明細書で用いる場合、「単位投与剤形」とは、処置される対象に単位用量として適する、物理的に分離した単位を指し、各単位は、必要な医薬担体に関連して所望の治療効果を生み出すように計算された事前に決定された量の活性な化合物を含む。本発明の単位投与剤形に関する仕様は、活性な化合物の固有の特徴、及び実現すべき具体的な治療効果により、また個体の状態を処置するためにかかる活性な化合物を混合するステップに関する当技術分野に固有の制限事項により決定され得る。
【００７４】
本明細書で用いる場合、「薬学的に許容される担体」、又は「添加剤」として、生理的に適合する、任意の全ての溶媒、分散媒体、コーティング物、抗菌剤及び抗真菌剤、等張化剤及び吸収遅延剤等が挙げられる。１つの実施形態では、担体は非経口投与に適し、かかる投与として静脈内、腹腔内、又は筋内投与が挙げられる。或いは、舌下又は経口投与用として適当であり得る。薬学的に許容される担体として、滅菌水溶液又は分散物、及び滅菌注射溶液又は分散物を即時調製するための滅菌粉末が挙げられる。薬学的に活性な物質のためのかかる媒体及び薬剤の使用については、当技術分野で周知である。従来型の媒体又は薬剤が活性化合物と適合性を有さない場合には、それら全てを排除するが、本発明の医薬組成物でそれらを使用することが意図されている。
【００７５】
補助的な活性化合物も、本発明の医薬組成物中に組み込むことができる。更なる治療薬の同時投与に関する指針は、例えばカナダ薬剤師協会（Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｉｓｔｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）のＣｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ（医薬品及び特殊品大要）（ＣＰＳ）に見出すことができる。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】オスＡＩＰマウスにおけるヘム前駆体排泄に対するＡＡＶ２／８−ｈＰＢＧＤ注射の用量効果を示す図である。ＡＩＰマウスは、正常なＰＢＧＤ活性の２５〜３０％を有するが、それはＰＢＧＤの一方の対立遺伝子が破壊し、またもう一方の対立遺伝子が部分的に破壊したことに起因する。ＬＵＣはルシフェラーゼレポーター構築物である。ＰＢＧＤは様々な用量のｒＡＡＶ−ＰＢＧＤベクターである。１ｋｇ当たりのゲノムコピー数として表される。Ｐｂはフェノバルビタールである。
【図２】治療ベクターｓｓＡＡＶ２／８−ｈＰＢＧＤ、又は対照ベクターｓｓＡＡＶ２／８−Ｌｕｃを５×１０１２ｖｇ／ｋｇで投与した後に、フェノバルビタールで誘発された急性発作を生じたメスＡＩＰマウスにおけるＰＢＧ及びＡＬＡの尿中排泄を示す図である。ＬＵＣはルシフェラーゼレポーター構築物である。ＰＢＧＤは様々な用量のｒＡＡＶ−ＰＢＧＤ構築物である。Ｐｂはフェノバルビタールである。
【図３】ウェスタンブロット分析により測定した、オスＡＩＰマウス肝臓におけるＰＢＧＤ導入遺伝子の発現を示す図である。
【図４】ウェスタンブロット分析により測定した、メスＡＩＰマウス肝臓におけるＰＢＧＤ導入遺伝子の発現を示す図である。
【図５】注射後３カ月目の、異なる用量でｓｓＡＡＶ２／８を形質導入されたオスＡＩＰマウスにおける肝臓ＰＢＧＤ活性を示す図である。
【図６】注射後３カ月目の、ルシフェラーゼ又はＰＢＧＤ遺伝子を担持するｓｓＡＡＶ２／８ベクターを形質導入されたメスＡＩＰマウスにおける肝臓ＰＢＧＤ活性を示す図である。
【図７】野生型ＰＢＧＤコード配列（ＰＢＧＤ）、及び合成、すなわちコドンが最適化された配列番号１（ｃｏＰＢＧＤ）のＰＢＧＤコード配列を含むプラスミドＤＮＡ構築物を流体力学注射したときの、野生型（ＷＴマウス）及びＡＩＰマウス（ＡＩＰマウス）におけるＰＢＧＤのｉｎ  ｖｉｖｏ酵素活性の比較を示す図である。肝臓中に存在するベクターＤＮＡのレベルは、導入遺伝子にハイブリダイズするプライマーを用いて確認された。内因性ハウスキーピング遺伝子ＧＡＤＰＨのＤＮＡコピー数、及びＰＢＧＤ導入遺伝子のＤＮＡコピー数間のＱ−ＰＣＲに基づく比を、ＰＢＧＤ酵素活性の上に示すが、有意な差は認められない。
【図８】ＡＡＶ２／５−ＰＢＧＤが、フェノバルビタールで誘発された急性ポルフィリン症発作に対してオスのマウス（図８）及びメスのマウス（図９）を保護していることを示す図である。ＡＩＰマウスにおけるＡＬＡ及びＰＢＧの基底レベル、並びに第１回目、第２回目、及び第３回目のフェノバルビタール誘発急性ポルフィリン症発作後のＡＬＡ及びＰＢＧレベルを、５ｅ１２ｇｃ／ｋｇの対照ベクター（ＡＡＶ２／５−ＥａｌｂＡＡＴ−ルシフェラーゼ）で処置したマウス、並びに５ｅ１２ｇｃ／ｋｇのＡＡＶ８−ＰＢＧＤベクター及びＡＡＶ５−ＰＢＧＤベクターで処置したマウスについて示す。
【図９】ＡＡＶ２／５−ＰＢＧＤが、フェノバルビタール誘発急性ポルフィリン症発作に対してオスのマウス（図８）及びメスのマウス（図９）を保護していることを示す図である。ＡＩＰマウスにおけるＡＬＡ及びＰＢＧの基底レベル、並びに第１回目、第２回目、及び第３回目のフェノバルビタール誘発急性ポルフィリン症発作後のＡＬＡ及びＰＢＧレベルを、５ｅ１２ｇｃ／ｋｇの対照ベクター（ＡＡＶ２／５−ＥａｌｂＡＡＴ−ルシフェラーゼ）で処置したマウス、並びに５ｅ１２ｇｃ／ｋｇのＡＡＶ８−ＰＢＧＤベクター及びＡＡＶ５−ＰＢＧＤベクターで処置したマウスについて示す。
【図１０】ＡＡＶ８−ＰＢＧＤ及びＡＡＶ５−ＬＵＣ投与後の肝臓ホモジェネート中のＰＢＧＤ酵素活性を示す図である（ｎ＝４〜６）。
【図１１】Ａ．ヒト（ｗｔＰＢＧＤ）由来のＰＢＧＤｃＤＮＡ、又はコドンが最適化されたＰＢＧＤ（ｃｏＰＢＧＤ；配列番号１）を担持するｓｓＡＡＶ２／５を１．２５×１０１１ｇｃで単回注射した後の１、２、又は３カ月経過したオスＡＩＰマウスの肝臓ホモジェネート中のＰＢＧＤ酵素活性を示す図である。Ｂ．注射後１、２、又は３カ月経過したときのベクターコピーレベルの半定量ＰＣＲ分析結果を示す図である。Ｃ．ｗｔＰＢＧＤ又はｃｏＰＢＧＤ導入遺伝子を担持するｓｓＡＡＶ２／５ベクターを注射したオスの動物に由来する肝臓について、肝臓特異的プロモーターを制御して行われた代表的な免疫組織化学分析の結果を示す図である。Ｄ．動物の各コホートから得られたＰＢＧＤ抗体で染色された細胞の割合を示す図である。
【図１２】ＡＩＰマウスの末梢神経障害に関する神経学的評価結果を示す図である。３つの異なる用量のｒＡＡＶ２／８−ＰＢＧＤが投与されたオス、メス両方のＡＩＰマウスにおいて、大型軸索（直径５μｍ）の割合（％）、及び軸索密度について実施した。未処置及び野生型（ＷＴ）を対照とする。
【図１３】ＡＩＰマウスの運動神経のロータロッド（Ｒｏｔａｒｏｄ）分析結果、及び筋肉能力を示す図である。オス及びメスのＡＩＰマウスが回転棒（ｒｏｔａｔｉｎｇ  ｄｏｗｅｌ）上に留まることができた時間の長さを、本試験開始時、及びＡＡＶ２／８−ＰＢＧＤ投与後９０日を経過してポルフィリン症の発作を誘発した時に測定した。ポルフィリン症の発作は、４日間にわたり、２４時間毎に、フェノバルビタールの用量を増加させて腹腔内注射することにより誘発した。
【実施例】
【００７７】
（例１）
ポルホビリノゲンデアミナーゼのＡＡＶ介在型肝臓特異的発現は、急性間欠性ポルフィリン症のマウスモデルにおいて、生化学的変化を回復させ、運動神経障害から保護する。
１．１  材料及び方法
１．１．１  動物モデル
急性間欠性ポルフィリン症（ＡＩＰ）マウスは、Ｌｉｎｄｂｅｒｇら（Ｎａｔｕｒｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１９９６年）が記載する遺伝子標的法により生み出された。Ｔ１及びＴ２トランスジェニック血統はバーゼル（Ｂａｓｅｌ）大学のＵｒｓ  Ｍｅｙｅｒ教授より親切により提供され、またナバラ（Ｎａｖａｒｒａ）大学の動物設備は、上記動物のコロニーを確立した。Ｔ１トランスジェニック動物では、ネオマイシン遺伝子がＰＢＧＤ遺伝子の最初のエクソンに挿入され、またホモ接合動物は、肝臓においてＰＢＧＤ活性の４５％を失っている。Ｔ２マウスでは、ネオマイシン遺伝子がＰＢＧＤ遺伝子の最初のイントロンに挿入された。ホモ接合状態は致命的であり、またヘテロ接合動物は、肝臓においてＰＢＧＤ活性の４３％を失っている。いずれの血統も、フェノバルビタール（Ｐｂ）及び／又はエストラジオールで処置後、ポルフィリン症の兆候も、ヘム前駆体の尿中排泄増加も認められなかった（データは示さない）。ＰＢＧＤ活性を更に下げるために、当該２種類の血統を異種交配した。Ｔ１及びＴ２の両方についてノックアウト対立遺伝子を担持する複合ヘテロ接合体動物を、ＡＩＰ疾患モデルとして用いた。かかるマウスはヒトポルフィリン症の典型的な生化学的特徴を示し、特にフェノバルビタール等の薬物で処置した後に、肝臓ＰＢＧＤ活性が低下し、またヘム前駆体の尿中排泄が顕著に増加した。ほとんどがウロポルフィリン及びコプロポルフィリンであるが、ポルフィリンもＡＩＰで増加するが、尿中ポルフィリンの増加は、ＰＢＧレベル及びＡＬＡレベルの増加よりも特異性がかなり低い特徴である。ロータロッド試験等の行動試験により、Ｐｂ投与後の運動機能低下が明らかとなり、また組織病理学的知見には、軸索神経障害及び老化に伴う神経伝導低下が含まれる。
【００７８】
１．１．２  ＡＡＶベクター
プラスミド及び配列
本試験で用いたＡＡＶプラスミドは、ＡＡＶ２に由来する２つのＩＴＲが隣接する発現カセット、及びＡＡＶについて記載された最適なパッケージング容量にＡＡＶゲノムのサイズを調節するように適当なスタッファー配列（ｓｔｕｆｆｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含む。導入遺伝子発現カセットは、次の要素を有する：ＡＡＶ２に由来する５’ＩＴＲ、アルブミンエンハンサーに由来する調節配列を含む肝臓特異的プロモーターＥａｌｂＡＡＴｐ（Ｋｒａｍｅｒら、２００３年、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．、第７巻（３）：３７５〜８５頁）、ハウスキーピングＰＢＧＤ  ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ０４８０８）、又はルシフェラーゼレポーター遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｍ１５０７７）。ウシ成長ホルモンポリアデニレーション配列［ｂＧＨポリ（Ａ）］（塩基２３２６〜２５３３、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｍ５７７６４）、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）（塩基１０２１〜１７５０、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｊ０４５１４）、及びＡＡＶ２由来の３’ＩＴＲを、転写を強化するために添加した（Ｄｏｎｅｌｌｏら、１９９８年、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．第７２巻（６）：５０８５〜９２）。上記２つのＡＡＶプラスミドは、ｓｓＡＡＶ−ポリＡ−ＥａｌｂＡＡＴ−ＰＢＧＤ−ＷＰＲＥ（治療遺伝子を発現）、及びｓｓＡＡＶ−ポリＡ−ＥａｌｂＡＡＴ−ルシフェラーゼ−ＷＰＲＥ（レポーター遺伝子ＧＦＰを発現）と命名された。
ＡＡＶベクターの調製
【００７９】
３つの異なるプラスミドｐＡｄＤｅｌｔａＦ６、ｐ５Ｅ１８−ＶＤ２／８、及び治療遺伝子（ＡＡＶ−ポリＡ−ＥａｌｂＡＡＴ−ＰＢＧＤ−ＷＰＲＥ）又はレポーター遺伝子（ＡＡＶ−ポリＡ−ＥａｌｂＡＡＴ−ルシフェラーゼ−ＷＰＲＥ）のリン酸カルシウム介在型同時トランスフェクションにより、２９３個の細胞においてＡＡＶ２／８ベクターが生成された（Ｈｅｒｍｅｎｓら、１９９９年、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、第１０巻（１１）：１８８５〜９１頁；及びＧａｏら、２００２年、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、第９９巻（１８）：１１８５４〜９頁）。要するに、２９３個の細胞が、リン酸カルシウム法により、ｐＡｄＤｅｌｔａＦ６、ｐ５Ｅ１８−ＶＤ２／８、及び標的ベクターで同時に核酸導入され、そしてウイルスは、トランスフェクション後４８時間経過して細胞を凍結−解凍することにより捕集された。当該ウイルスは、イオン交換カラムクロマトグラフィー、及びイオジキサノールグラジエント遠心分離とこれに続くろ過、及びリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）−５％スクロースに対して更に濃縮することにより精製された。ゲノムコピー数／ｍｌで表されるウイルス力価は、３重測定のＱ−ＰＣＲ、すなわちｈＡＡＴプロモーター領域の９５ｂｐ断片を増幅するプライマーｐｒ３００ｆｗ５’ＣＣＣＴＧＴＴＴＧＣＴＣＣＴＣＣＧＡＴＡＡ３’ｐｒ３０１ｒｖ５’ＧＴＣＣＧＴＡＴＴＴＡＡＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＣＡ３’を用いたＴａｑＭａｎ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｃｈｅｍ）分析により決定された。タンパク質組成及び純度はドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により決定された。
【００８０】
１．１．３  実験構成
予備試験
ＡＡＶ２／８ベクターの感染能力を試験し、及びＰＢＧＤ発現を評価するために、ＡＡＶ２／８−ＰＢＧＤを９×１０１２ｖｇの用量で２匹のＡＩＰ動物に注射し、６日目に殺処分した。
【００８１】
原理証明分析
ＡＡＶ２／８−ｈＢＧＤ注射後ＡＩＰマウス肝臓中のＰＢＧＤ発現レベルを比較することにより、ＡＡＶ２／８を媒介とした肝臓形質導入を評価した。１２〜２５週齢に達したＣ５７Ｂ１／６バックグラウンド内の複合ヘテロ接合体ＡＩＰマウス（１群当たり１０マウス、オス５匹、メス５匹）に、ＡＡＶ２／８−ｈＰＢＧＤベクター又はＡＡＶ２／８−ルシフェラーゼ対照ベクターとして５ｅ１２ｖｇ／ｋｇに相当する総量１００〜２００μｌを尾静脈経由で静脈内注射した。オスＡＩＰマウス５匹からなる２つの追加の群（上記マウスと同じ週齢）には、ＡＡＶ２／８−ｈＰＢＧＤを５ｅ１１ｖｇ／ｋｇ、又は５ｅ１０ｖｇ／ｋｇ注射した。野生型マウス及びＡＩＰマウスからなる別の群も含まれる。投与スキームを表２に示す。
【表１】
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【００８２】
ｒＡＡＶベクター注射後１５日、２８日、及び９０日の時点で、フェノバルビタール注射により誘発された急性発作の前及び後のマウスについて運動障害、及びポルフィリン前駆体の蓄積を測定した。この場合、フェノバルビタール（Ｐｂ、生理食塩水で稀釈）を腹腔内に１日１回、４日連続して用量を増加させながら（７５、８０、８５、９０ｍｇ／ｋｇ体重）投与した。
【００８３】
神経伝導測定
軸索変性、及び坐骨神経内にあるミエリンの喪失を実証するために、電気生理学試験を実施した。生後６カ月のオスＡＩＰマウス２匹に、１ｅ１２ｇｃ／ｋｇを注射した。運動障害を促進するようにＰｂを２週間毎に繰返し投与して処置した。生後１１カ月及び１４カ月の動物について、Ｐｂにより誘発された急性発作の前後で神経伝導測定を実施した。
【００８４】
１．２．結果
１．２．１  原理証明分析
試験全体を通じて、処置がヘム前駆体レベルに与える効果
ウイルス注射後、１５日目、２８日目、及び９０日目に、ＡＩＰマウスをＰｂの用量を増加させながら４日間処置し、そしてヘム前駆体の尿中レベルを測定した。
【００８５】
期待した通り、対照群のオスＡＩＰマウス（ＡＡＶ−Ｌｕｃ、図１）は、Ｐｂ注射後に前駆体の排泄が増加したが、ＡＡＶ２／８−ＰＢＧＤを高用量で注射されたマウスでは、前駆体の排泄に変化はなかった（図１）。オスのＡＩＰマウスでは、５ｅ１１ｖｇ／ｋｇから、フェノバルビタール誘発後のＡＬＡ及びＰＢＧの蓄積を完全に防ぐことができた（図１）。ＡＡＶ−ＰＢＧＤを５ｅ１０ｖｇ／ｋｇで処置したオスＡＩＰでは、部分的に保護されることが認められた。ＡＡＶ投与後２週間及び試験終了時において、フェノバルビタールに誘発されたＡＬＡ及びＰＢＧの排泄プロファイルに変化はなかった（図１）。
【００８６】
メスの動物に治療ベクターを投与しても（ＡＡＶ２／８−ＰＢＧＤを５ｅ１２ｖｇ／ｋｇで）、尿中ポルフィリン前駆体の異常な蓄積がないことから明らかなように、やはりＰｂで誘発された急性発作は防止された（図２）。対照群（ＡＡＶ−Ｌｕｃを用いて注射）においては、オスのＡＩＰマウスと比較した時に、メスでは律速酵素ＡＬＡＳ１の肝臓における活性が低いことから、メスのＡＩＰマウス（図２）はオスのＡＩＰ動物（図１）よりも、ポルフィリン前駆体の蓄積は少なかった（データは示さない）。
【００８７】
本試験全体を通じてＡＡＶ投与が運動障害に与える効果：ロータロッド試験
期待した通りに、ＡＩＰマウスは、野生型動物と比較した時に運動障害を示した。対照ベクター（ＡＡＶ−Ｌｕｃ）で処置したＡＩＰマウスの運動障害は、オス及びメスの両方において、フェノバルビタール投与後に悪化した（データは示さない）。オスＡＩＰマウスのＰｂで誘発された運動障害は、本試験の開始時（ＡＡＶ注射後１５日目及び２８日目、データは示さない）及び最後の両方の時点において、治療ベクターで処置された動物ではほぼ完全に消散した。ｓｓＡＡＶ２／８−ｈＰＢＧＤで処置されたオス及びメスのＡＩＰ動物は、本試験の全期間を通じてＰｂで誘発された運動障害に対して完全に防御されることが示された（ＡＡＶ注射後１５日目及び２８日目、及び本試験の最後の時点）（図１３）。オスでは、ルシフェラーゼベクターの投与を受けたマウスが棒上に留まることができた平均時間は、約２００秒であった。しかし、ポルフィリン症の発作が生ずると、この時間は約１００秒まで半減した。ＰＢＧＤベクターを異なる全３用量で投与されたオスでは、マウスは発作を経験しなかった時とほぼ同じ長さで棒上に留まることができたが、攻撃されていない野生型のレベルには達しなかった。やはり同じことがメスでも判明した。
【００８８】
ｓｓＡＡＶ−ｈＰＢＧＤ投与が殺処分時の肝臓ＰＢＧＤレベルに与える効果：ウェスタンブロット分析
期待した通り、対照ベクター（ｓｓＡＡＶ−Ｌｕｃ）を投与すると、オスのマウス（図３）及びメスのマウス（図４）の両方でＰＢＧＤ発現は増加しなかった。オスでは、ウェスタンブロット分析により、肝臓ＰＢＧＤ発現について用量依存性の増加が認められた（図３）。内因性ＰＢＧＤ及びヒトＰＢＧＤ間での移動パターンの相違から、内因性ＰＢＧＤの同定が可能となる（図３）。
【００８９】
メスでは、ＰＢＧＤの高度な発現が、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇのｓｓＡＡＶ−ｈＰＢＧＤで処置されたマウスの肝臓に認められた（図４）。
【００９０】
ＡＡＶ−ＰＢＧＤ投与が殺処分時の肝臓ＰＢＧＤ活性に与える効果
酵素活性測定により、治療ベクターにより発現したＰＢＧＤタンパク質が機能的に活性であることを確認する（図５及び図６）。治療ベクター（ＡＡＶ−ＰＢＧＤ）を高用量で注射されたオス（図５）及びメス（図６）の間で、ＰＢＧＤ活性に有意な相違は認められなかった（ｐ＝０．３５）。オスでは、肝臓ＰＢＧＤ活性について用量依存性の増加が認められる（図５）。治療ベクターを低用量で投与されたマウス（５ｅ１０ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ−ＰＢＧＤ）では、野生型動物と同じＰＢＧＤ活性が認められる。
【００９１】
免疫組織化学分析：肝臓中でのＰＢＧＤ発現の分布
個々の細胞内でのＰＢＧＤタンパク質レベルを求めるために免疫組織化学を用い、各処置群について２枚のスライドを用いてこれを実施した。ＰＢＧＤ免疫組織化学染色では、ＣＩＭＡで抗ＰＢＧＤポリクロナール抗体を開発した。抗ＰＢＧＤ抗体は、内因性のタンパク質、及びｓｓＡＡＶ２／８−ｈＰＢＧＤを媒介としたことによる外因性のヒトタンパク質を認識する（データは示さない）。
【００９２】
対照ウイルスを注射されたＡＩＰ動物の肝臓では、免疫組織化学分析により検出されるように、全肝細胞の細胞質内でＰＢＧＤの低い発現が認められる（データは示さない）。細胞質内のかかる弱いシグナルは、内因性ＰＢＧＤに相当する。細胞核はヘマトキシリンにより対比染色されて、陽性反応を示す茶色とは対照的な青色のバックグラウンドを与える（データは示さない）。
【００９３】
治療ベクターを注射されたオスＡＩＰマウスでは、ＰＢＧＤ発現について用量依存性の増加が認められた。治療ウイルスを最高用量で注射されたオスのマウスでは、高いＰＢＧＤ発現が認められた。ＰＢＧＤが強く発現している領域は、治療ウイルスを中間用量で注射された動物では減少したが、治療ウイルスを低用量で注射された動物では、孤立細胞まで減少した。かかる結果は、同じ動物についてウェスタン（ブロット）及び酵素活性測定によりこれまでに得られた結果とよく相関している。
【００９４】
同じ用量の治療ベクター（５ｅ１２ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ−ＰＢＧＤ）を注射されたオス及びメスの間では、ＰＢＧＤ免疫組織化学染色について有意な差は認められなかった。高用量の治療ベクターを投与されたオス及びメスは、実質及び血管周辺の両方においてＰＢＧＤの高い発現を示した（データは示さない）。
【００９５】
ＰＢＧＤは細胞の細胞質内に局在することが報告されたが、ＰＢＧＤが様々な細胞系、及び一次細胞の核内に取り込まれることもこれまでに報告されている（Ｇｒｕｎｂｅｒｇ−Ｅｔｋｏｖｉｔｚら、２００６年、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．、第１７６２巻（９）：８１９〜２７頁）。対照ウイルスを注射した本発明のマウスでは、核のほとんどが特徴的な青色染色（ヘマトキシリンによる）を示し、免疫染色された茶色（ＤＡＢによる；データは示さない）を示した核はほとんど得られなかった。しかし、ＡＡＶ−ＰＢＣＤを注射された本発明のマウスでは、ＰＢＧＤタンパク質が核内に多く分布することを反映して、高い割合で茶色が認められた。ＰＢＧＤについて高い陽性を示す核の割合は、異なる群においても測定された。やはり、高濃度核内ＰＢＧＤタンパク質を発現する肝細胞の用量依存性の増加が、オスで認められた。
【００９６】
末梢神経障害の神経学的評価
別の態様では、坐骨神経の組織学的分析を含んだＡＩＰマウスの末梢神経障害の神経学的評価（データは示さない）、及び坐骨神経の近傍を刺激することにより誘発される運動能力の機能試験を実施した（データは示さない）。正常な軸索密度がｒＡＡＶ２／８−ＰＢＧＤベクターを形質導入されたＡＩＰ動物に認められることから、肝臓でのｈＰＢＧＤの過剰な発現が、ＡＩＰマウスの坐骨神経の軸索再生を促進することが示唆された（図１２）。
【００９７】
軸索の変性及び坐骨神経内のミエリンの喪失を実証するために電気生理学試験を実施した。これは、ＰＢＧＤ導入遺伝子が長期間発現すると、フェノバルビタール投与により誘発される機能的ブロックから保護されることを明らかにする。ｒＡＡＶ２／８−ＰＢＧＤを形質導入された野生型、若年ＡＩＰ、老齢ＡＩＰ、及びＡＩＰマウスにおいて坐骨神経近傍を刺激することにより誘発される運動能力では、フェノバルビタールにより誘発されたポルフィリン症の急性発作の前と７回経験した後では、レイテンシー、期間、及びアンプリチュードにおいて機能の回復が認められる（データは示さない）。
【００９８】
（例２）
コドン最適化ＰＢＧＤ  ｃＤＮＡに由来するｉｎ  ｖｉｖｏ酵素活性の増加
２．１  流体力学注射で用いられるプラスミドの構築、及びｗｔＰＢＧＤ及びｃｏＰＢＧＤによるＡＡＶ遺伝子送達
本試験で用いられるプラスミドは、５’から３’の順番で下記エレメントを有する発現カセットを含む：アルブミンエンハンサーに由来する調節配列を有する肝臓特異的プロモーターＥａｌｂＡＡＴｐ（Ｋｒａｍｅｒら、２００３年、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．、第７巻（３）：３７５〜８５頁）、ハウスキーピング（すなわち、非赤血球）ＰＢＧＤ  ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ０４８０８）。ＰＢＧＤ由来の３’ＵＴＲ（塩基１４６３〜１４８７、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿０００１９０）、及びＰＢＧＤポリアデニレーション配列［ポリ（Ａ）ＰＢＧＤ］（塩基９５８６〜９６２６、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｍ９５６２３）。上記発現カセットを含む２つのプラスミドは、ｐｓｌ１１８０−ｐＡＡＴ−ＰＢＧＤ−ポリＡ  ＰＢＧＤ、及びｐｓｌ１１８０−ｐＡＡＴ−ｃｏＰＢＧＤ−ポリＡ  ＰＢＧＤと命名され、以下に説明するようにＰＢＧＤをコードする配列のみが異なる。
【００９９】
コドン最適化ＰＢＧＤを作製するために、ヒトＰＢＧＤ非赤血球ｃＤＮＡに相当する遺伝子バンク番号ＮＭ＿０００１９０を、ホモサピエンスの偏りにコドンの利用を適応させた（コドン適応性インデックス値０．９７）。ｃｏＰＢＧＤをコードする配列における更なる改変として：１）翻訳の開始を増加させるためにＫｏｚａｋ配列を導入した；２）効果的な終結を保証するために２つの終始コドンを追加した；及び３）ＣＧ含量を５５％から６５％に高めた。最適化した後の最終的なｃｏＰＢＧＤ  ｃＤＮＡは、１９５ｂｐの変更、及びオリジナルのｃＤＮＡ配列番号ＮＭ＿０００１９０と８２．１％の相同性を有する。かかる配列（配列番号１）が合成され、ＷＴ  ＰＢＧＤ  ｃＤＮＡの配列と置換するプラスミドｐｓｌ１１８０−ｐＡＡＴ−ＰＢＧＤ−ポリＡ  ＰＢＧＤ内にサブクローニングされた。新規精製プラスミドは、ｐｓｌ１１８０−ｐＡＡＴ−ｃｏＰＢＧＤ−ポリＡ  ＰＢＧＤと命名された。
【０１００】
プラスミドｐｓｌ１１８０−ｐＡＡＴ−ＰＢＧＤ−ポリＡ  ＰＢＧＤ、及びｐｓｌ１１８０−ｐＡＡＴ−ｃｏＰＢＧＤ−ポリＡ  ＰＢＧＤに由来する全発現カセット配列を、ＡＡＶ２に由来する２つのＩＴＲを含むプラスミドであるプラスミドｐＶＤ１５５内にサブクローニングした。得られたプラスミドはｐＶＤ１５３及びｐＶＤ１９１と命名され、そこでは親バキュロウイルスゲノムと共に各プラスミドがＳＦ９細胞内に同時導入されて、リコンビナントバキュロウイルスＢａｃ．ＶＤ１５３及びＢａｃ．ＶＤ１９１が生成した。かかるバキュロウイルスは、昆虫細胞内でＡＡＶ５ベクターを生み出すために用いられた。要するに、ＳＦ９＋細胞を、３つの異なるリコンビナントバキュロウイルスで同時感染させた：Ｂａｃ．ＶＤ９２、Ｂａｃ．ＶＤ８８、及びＢａｃ．ＶＤ１５３（治療ＥａｌｂＡＡＴ−ＰＢＧＤ−ポリＡを含むバキュロウイルス）。発現カセットＥａｌｂＡＡＴ−ｃｏＰＢＧＤ−ポリＡを含むＡＡＶ５ベクターを産生する場合には、バキュロウイルスＢａｃ．ＶＤ１９１がＢａｃ．ＶＤ１５３の代わりに用いられた。
【０１０１】
感染後７２時間経過して、細胞を凍結−解凍することによりＡＡＶ５ベクターを捕集した。アフィニティーカラムクロマトグラフィーとこれに続くろ過、及び更に濃縮することにより当該ベクターを精製した。ゲノムコピー数／ｍｌとして表すウイルス力価を、プライマーｈＡＡＴｔａｑリバース、５’ＣＡＧＣＧＴＣＣＴＧＴＧＴＣＣＡＡＧＧＴ３’、プライマーｈＡＡＴ  ｔａｑフォアワード５’ＡＧＧＣＣＡＡＣＴＴＧＴＣＴＡＣＧＴＴＴＡＧＴＡＴＧ３’（両方ともＭＷＧ−Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＧより）、及びプローブｈＡＡＴ  ５’ＣＴＧＴＡＧＡＴＣＴＧＴＡＣＣＣＧＣＣＡＣＣＣＣＣ３’（ＭＷＧ−Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＧ）を用いてＴａｑＭａｎ  Ｑ−ＰＣＲ、（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）分析により求めた。タンパク質組成及び純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥで求めた。
【０１０２】
２．２  ＰＢＧＤ酵素アッセイ
組織ホモジネート中のＰＢＧＤ活性を、Ａｎｄｅｒｓｏｎ及びＤｅｎｓｎｉｃｋの方法に基づき、ＰＢＧのウロポルフィリンへの変換を測定することにより求めた（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ＰＭ、及びＤｅｎｓｎｉｃｋ  ＲＪ．、１９８２年、Ｅｎｚｙｍｅ、第２８巻（２〜３）：１４６〜５７）。要するに、１ｇの組織を４℃、４倍容量の１．１５％のＫＣｌ溶液中でホモジネーションした。ホモジネートを、１２，０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離し、そして細胞残屑を全く含まない上清を、その日のうちにタンパク質測定（アルブミン標準品を用いたＢｒａｄｆｏｒｄ法）、及びＰＢＧＤ活性に用いた。
【０１０３】
上清サンプルをリン酸バッファー（ｐＨ７．６）、ＤＴＴ、Ｃｌ２Ｍｇ、及びトリトンＸ−１００で１：３に稀釈し、そしてかかる混合物のうちの１００μｌを０．１Ｍトリス−塩酸（ｐＨ８．１）、１．８ｍｌを用いて３７℃で３分間プレインキュベーションした。次に、当該混合物を１ｍＭのＰＢＧ基質、０．５ｍｌを用いて遮光、３７℃で６０分間インキュベーションした。冷４０％ＴＣＡ、３５０μｌを用いて反応を停止し、そして露光後に生成したウロポルフィリノーゲンを酸化してウロポルフィリンにした。ウロポルフィリンを、４０５ｎｍに励起ピーク（λｅｘｔ）を、また５５０〜６６０ｎｍの放出ピークウィンドウ（λｅｍ）値を有する分光蛍光光度計を用いて測定した。適当な標準品を用いて、ＰＢＧＤ活性をｐｍｏｌ（ウロポルフィリン）／ｍｇ（タンパク質）／時として表した。
【０１０４】
２．３  ＰＢＧＤ及びｃｏＰＢＧＤプラスミドの流体力学注射
各プラスミド、ｐｓｌ１１８０−ｐＡＡＴ−ＰＢＧＤ−ポリＡ  ＰＢＧＤ、又はｐｓｌ１１８０−ｐＡＡＴ−ｃｏＰＢＧＤ−ポリＡ  ＰＢＧＤ、５０μｌをＰＢＳ、２．５ｍｌに溶解し、これをＡＩＰマウス（ｎ＝４）の尾部側静脈に流体力学的に注射して、肝臓に当該プラスミドを送達した。注射後１週間経過してマウスを殺処分し、そして肝臓及び腎臓ホモジネート中のＰＢＧＤ酵素活性を測定した。
【０１０５】
ｐｓｌ１１８０−ｐＡＡＴ−ｃｏＰＢＧＤ−ポリＡ  ＰＢＧＤプラスミドを流体力学的に送達し、その後に肝細胞が発現したｃｏＰＢＧＤ酵素は、野生型（ｗｔＰＢＧＤ）ｐｓｌ１１８０−ｐＡＡＴ−ＰＢＧＤ−ポリＡ  ＰＢＧＤプラスミドを投与されたマウスと比較して、肝臓ホモジネート中において３０％活性の高いＰＢＧＤをもたらした。ＰＢＧＤ活性値をｐｍｏｌ（ウロポルフィリン）／ｍｇ（タンパク質）／時として表すと、その値は、ｗｔＰＢＧＤ及びｃｏＰＢＧＤについて、それぞれ５．５４±１．６４、及び７．３０±０．９１３であった（ｐ＝０．０３１７、両側、Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ検定）。肝臓中に存在するベクターＤＮＡのレベルは、導入遺伝子にハイブリダイズするプライマーを用いたＱ−ＰＣＲにより確認された。各マウスにおいて、内因性ハウスキーピング遺伝子ＧＡＤＰＨのＤＮＡコピー数、及びＰＢＧＤ導入遺伝子のＤＮＡコピー数間の比を計算した。ＤＮＡ比（ＰＢＧＤ及びｃｏＰＢＧＤについて、それぞれ２．９５０±２．２５、及び１．７６０±０．６８０４）は、有意な差を示さず、そしてほぼ同数のコピー数からなる治療ベクターが、流体力学注射によって肝臓に送達されたことが実証された。データを図７に示す。
【０１０６】
２．４  ＡＩＰマウスにおいてＰＢＧＤ−ＡＡＶ２／５ベクターを用いたＰＢＧＤ遺伝子療法の原理証明
ＡＡＶ２／５−ＥａｌｂＡＡＴ−ＰＢＧＤ−ポリＡの治療効果を証明するために、セクション１．１．１ですでに記載したＡＩＰマウスを用いた。
【０１０７】
ＡＡＶ２／５−ＥａｌｂＡＡＴ−ＰＢＧＤを５ｅ１２ｇｃ／ｋｇの用量で、ＡＩＰマウス（オス及びメス）に静脈注射した。対照動物には、同一のベクターであるがルシフェラーゼレポーター遺伝子を担持するベクターを投与した。ＡＡＶ２／５−ＥａｌｂＡＡＴ−ＰＢＧＤ投与後、２、４、及び１３週間経過して、ポルフィリン症発作を誘発するために、Ｐｂの用量を増加させながら４日間にわたり動物を処置した。Ｐｂを最後に投与した後２４時間経過して、ヘム前駆体のレベルを２４時間−尿サンプルについて測定し、及び運動神経を、ロータロッド試験を用いて分析した。ＡＡＶ投与後３カ月を経過したら、肝臓に生成したＰＢＧＤの量を定量するためにマウスを殺処分した。
【０１０８】
ＡＩＰマウスにおけるＡＬＡ及びＰＢＧの基底レベルは、オスではクレアチニン１ｍｇ当たり８８±２４及び１６±５μｇ、メスではクレアチニン１ｍｇ当たり８７±１９及び１４±８μｇであった。５ｅ１２ｇｃ／ｋｇの用量は、図８（オス）及び図９（メス）に示すように、オス（クレアチニン１ｍｇ当たり１１８±３４及び１１±４μｇ）、メス（クレアチニン１ｍｇ当たり５２±５及び５１±２４μｇ）の両方において、前駆体ＡＬＡ及びＰＢＧ中のＰｂ効果を防止することができた。同一用量のＡＡＶ２／５−ＥａｌｂＡＡＴ−ルシフェラーゼで処置された動物では、Ｐｂ注射後ＡＬＡ及びＰＢＧ前駆体の高排泄が認められた（オスで、クレアチニン１ｍｇ当たり１４１８±６５９及び１１８４±５８５μｇ、及びメスで、クレアチニン１ｍｇ当たり２９５±９１及び２９８±１８１μｇ）。
【０１０９】
ＡＩＰマウスにおいてＰｂ処置により誘発された運動障害は、ロータロッド試験で測定されたように、治療ベクターで処置された動物ではほぼ完全に消散した（データは示さない）。
【０１１０】
ＡＡＶ投与後３カ月目に、全ての動物を殺処分し、全ての動物の肝臓からＰＢＧＤ酵素活性を測定した（図１０）。ＡＡＶ５−ＥａｌｂＡＡＴ−ＰＢＧＤを５ｅ１２ｇｃ／ｋｇの用量で注射されたオスは、肝臓でＰＢＧＤを２６．１±７．３ｐｍｏｌ（ＵＲＯ）／ｍｇ（タンパク質）／時で発現した。かかる量は、レポーター遺伝子Ｌｕｃの投与を受けたＡＩＰマウス（２．４±０．４ｐｍｏｌ（ＵＲＯ）／ｍｇ（タンパク質）／時）と比較した時には１０倍、また野生型マウス（７．９±１．６ｐｍｏｌ（ＵＲＯ）／ｍｇ（タンパク質）／時）のレベルについて３倍の過剰発現に相当する。５ｅ１２ｇｃ／ｋｇの用量では、メスにおいて肝臓ＰＢＧＤ酵素活性に相違があることが明らかになった（１８．５±６．３ｐｍｏｌ（ＵＲＯ）／ｍｇ（タンパク質）／時）。
【０１１１】
２．５  ＡＩＰマウスにおけるＡＡＶ５を媒介としたＰＢＧＤ及びｃｏＰＢＧＤの肝臓特異的発現
ＡＡＶ２／５−ＰＢＧＤ又はＡＡＶ２／５−ｃｏＰＢＧＤの注射後に、ＡＩＰマウス肝臓中のＰＢＧＤ発現レベルを比較することにより、ＡＡＶ２／５を媒介とした肝臓形質導入を評価した。１２〜２５週齢に達したＣ５７Ｂ１／６バックグラウンド内のオスＡＩＰマウスに、ＡＡＶ２／５−ＰＢＧＤ（ｎ＝２０）、又はＡＡＶ２／５−ｃｏＰＢＧＤ（ｎ＝２４）として１．２５ｅ１１ｖｇに相当する総量２００μｌを静脈内注射した。ウイルス注射後１、２、３カ月目にマウスを殺処分し、そして肝臓ホモジネート中のＰＢＧＤ酵素活性を求めるために肝臓を収集した。結果を、ＰＢＧＤの平均値±ＳＥＭとして表し、Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を用いて平均値間の比較を行った（図１１Ａ）。ＬｉｎｄｂｅｒｇらのＮａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第１２巻：１９５〜１９９頁、１９９６年と一致して、ＡＩＰマウスは、ＷＴマウスと比較した時に、肝臓中ではＰＢＧＤ酵素活性の３０％しか発現しなかった（それぞれ２．５３±０．１５に対して７．９４±０．９４ｐｍｏｌ（ＵＲＯ）／ｍｇ（タンパク質）／時）。その上、ＡＡＶ２／５−ＰＢＧＤ及びＡＡＶ２／５−ｃｏＰＢＧＤ遺伝子導入後のＰＢＧＤ発現レベルは、投与後の全ての時点で統計的に異なった。感染１カ月後では、ＡＡＶ２／５−ＰＢＧＤ及びＡＡＶ２／５−ｃｏＰＢＧＤについて、それぞれ６４．００±５．９９に対して８６．２３±６．８２（ｐ＝０．０１９）、及び感染２カ月後では、ＡＡＶ２／５−ＰＢＧＤ及びＡＡＶ２／５−ｃｏＰＢＧＤについて、それぞれ７８．９８±９．６９に対して１１１．５０±１０．２０（ｐ＝０．０３８）。マウス肝臓内の酵素活性値を図１１Ａに示す。
【０１１２】
ＡＡＶベクターゲノムの半定量的ＰＣＲ分析を実施した。注射後１、２、及び３カ月目にレベルを求め、図１１Ｂに示すが、Ｑ−ＰＣＲデータはウイルスプラスミドの量は両動物コホートで類似していたことを裏付けている。ＰＢＧＤ特異的抗体を用いた肝臓の免疫組織化学分析により、ＡＡＶ２／５−ＰＢＧＤ及びＡＡＶ２／５−ｃｏＰＢＧＤに感染したマウスでは、ＰＢＧＤを発現する細胞はそれぞれ１７％及び２１％であることが明らかとなり（図１１Ｃ及びＤ）、実質的に類似した形質導入効率を表し、これは本試験が行われた３カ月間維持された。
【図１１ｃ】
2012503980.tif 000004
【図１】
2012503980.tif 000005
【図２】
2012503980.tif 000006
【図３】
2012503980.tif 000007
【図４】
2012503980.tif 000008
【図５】
2012503980.tif 000009
【図６】
2012503980.tif 000010
【図７】
2012503980.tif 000011
【図８】
2012503980.tif 000012
【図９】
2012503980.tif 000013
【図１０】
2012503980.tif 000014
【図１１】
2012503980.tif 000015
【図１２】
2012503980.tif 000016
【図１３】
2012503980.tif 000017
【配列表】
2012503980000001.app
【国際調査報告】
2012503980.tif 000018
2012503980.tif 000019
2012503980.tif 000020
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