(57)【要約】本発明は、哺乳動物（ヒトを含む）におけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染ならびにＨＣＶ関連疾患及び障害に対する医学的介入のための潜在的な標的としての細胞タンパク質キナーゼのいくつかのネットワークを提供する。本発明は、ＨＣＶにより引き起こされる感染及び疾患の予防及び／又は処置のためにこれらのタンパク質キナーゼの１つ又は複数の活性を阻害するように設計された治療プロトコール及び医薬組成物に関する。本発明は、また、ＨＣＶ感染及びＨＣＶ関連疾患を処置及び／又は予防するために使用されうるキナーゼ阻害剤の同定のための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染を予防するための薬剤であって、薬剤がＥＧＦＲ、ＰＲＫＡＧ２、ＳＴＫ１１、ＥＰＨＡ２、及びサイクリン依存性キナーゼからなる群より、又はＳＴＫ１１、ＰＲＫＡＧ２、ＭＡＧＩ−１、ＥｐｈＡ２、ＥＧＦＲ、ＣＳＫ、ＰＴＫ２、ＰＴＫ２Ｂ、ＩＬＫ、ＣＤＣ２、ＣＤＫ３、ＣＤＫ４、ＣＨＫＡ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＰＫＭＹＴ１及びＷＥＥ１からなる群より、又はＣＡＬＭ２、ＣＳＫ、ＭＡＧＩ１、ＡＤＫ、ＣＤＫ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＢ４、ＦＡＳＴＫ、ＦＧＲ、ＩＬＫ、ＩＲＡＫ２、ＰＡＣＳＩＮ２、ＰＤＩＫ１Ｌ、ＰＩＰ５Ｋ２Ｂ、ＰＫＭＹＴ１、ＰＬＫ３、ＰＲＫＤ２、ＳＴＫ２４、ＷＥＥ１、ＣＤＫＬ３、ＡＤＲＢＫ１、ＣＫＳ１Ｂ、ＤＣＡＭＫＬ１、ＤＤＲ２、ＥＰＳ８Ｌ１、ＧＡＫ、ＩＴＰＫＡ、ＭＡＰＫ７、ＰＡＫ４、ＳＴＫ１１、ＳＴＫ３８、及びＴＹＫ２からなる群より、又はＣＡＬＭ２、ＣＳＫ、ＭＡＧＩ１、ＡＤＫ、ＣＤＫ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＢ４、ＦＡＳＴＫ、ＦＧＲ、ＩＬＫ、ＩＲＡＫ２、ＰＡＣＳＩＮ２、ＰＤＩＫ１Ｌ、ＰＩＰ５Ｋ２Ｂ、ＰＫＭＹＴ１、ＰＬＫ３、ＰＲＫＤ２、ＳＴＫ２４、ＷＥＥ１、ＣＤＫＬ３、ＡＤＲＢＫ１、ＣＫＳ１Ｂ、ＤＣＡＭＫＬ１、ＤＤＲ２、ＥＰＳ８Ｌ１、ＧＡＫ、ＩＴＰＫＡ、ＭＡＰＫ７、ＰＡＫ４、ＳＴＫ１１、ＳＴＫ３８、ＴＹＫ２、ＡＣＶＲ２Ｂ、ＡＰＥＧ１、ＡＴＭ、ＡＵＲＫＢ、ＢＭＸ、ＢＲＡＦ、ＣＤＣ２、ＣＤＣ２Ｌ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫ８、ＣＨＫＡ、ＣＨＫＢ、ＣＩＢ２、ＣＫＭＴ１、ＤＧＫＢ、ＥＧＦＲ、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＢ１、ＦＥＲ、ＦＧＦＲ４、ＦＬＴ３ＬＧ、ＦＮ３Ｋ、ＧＣＫ、ＧＫＡＰ１、ＧＲＫ４、ＩＫＢＫＢ、ＭＡＰ３Ｋ７ＩＰ１、ＭＡＰＫＡＰ１、ＮＥＫ９、ＰＡＮＫ３、ＰＩ４ＫＩＩ、ＰＩＰ５Ｋ２Ａ、ＰＲＫＡＧ２、ＰＳＫＨ１、ＰＴＫ２、ＰＴＫ２Ｂ、ＲＩＯＫ１、ＲＰＳ６ＫＡ５、ＲＰＳ６ＫＬ１、Ｓｈａｒｐｉｎ、ＳＫＩＰ、ＳＴＫ２２Ｃ、ＴＮＫ２、及びＵＬＫ２からなる群より選択される少なくとも１つのタンパク質キナーゼの活性を阻害する薬剤。
【請求項２】
ＨＣＶ感染又はＨＣＶ関連疾患を被験体において予防又は処置するための薬剤であって、薬剤がＥＧＦＲ、ＰＲＫＡＧ２、ＳＴＫ１１、ＥＰＨＡ２、及びサイクリン依存性キナーゼからなる群より、又はＳＴＫ１１、ＰＲＫＡＧ２、ＭＡＧＩ−１、ＥｐｈＡ２、ＥＧＦＲ、ＣＳＫ、ＰＴＫ２、ＰＴＫ２Ｂ、ＩＬＫ、ＣＤＣ２、ＣＤＫ３、ＣＤＫ４、ＣＨＫＡ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＰＫＭＹＴ１、及びＷＥＥ１からなる群より、又はＣＡＬＭ２、ＣＳＫ、ＭＡＧＩ１、ＡＤＫ、ＣＤＫ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＢ４、ＦＡＳＴＫ、ＦＧＲ、ＩＬＫ、ＩＲＡＫ２、ＰＡＣＳＩＮ２、ＰＤＩＫ１Ｌ、ＰＩＰ５Ｋ２Ｂ、ＰＫＭＹＴ１、ＰＬＫ３、ＰＲＫＤ２、ＳＴＫ２４、ＷＥＥ１、ＣＤＫＬ３、ＡＤＲＢＫ１、ＣＫＳ１Ｂ、ＤＣＡＭＫＬ１、ＤＤＲ２、ＥＰＳ８Ｌ１、ＧＡＫ、ＩＴＰＫＡ、ＭＡＰＫ７、ＰＡＫ４、ＳＴＫ１１、ＳＴＫ３８、及びＴＹＫ２，からなる群より、又はＣＡＬＭ２、ＣＳＫ、ＭＡＧＩ１、ＡＤＫ、ＣＤＫ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＢ４、ＦＡＳＴＫ、ＦＧＲ、ＩＬＫ、ＩＲＡＫ２、ＰＡＣＳＩＮ２、ＰＤＩＫ１Ｌ、ＰＩＰ５Ｋ２Ｂ、ＰＫＭＹＴ１、ＰＬＫ３、ＰＲＫＤ２、ＳＴＫ２４、ＷＥＥ１、ＣＤＫＬ３、ＡＤＲＢＫ１、ＣＫＳ１Ｂ、ＤＣＡＭＫＬ１、ＤＤＲ２、ＥＰＳ８Ｌ１、ＧＡＫ、ＩＴＰＫＡ、ＭＡＰＫ７、ＰＡＫ４、ＳＴＫ１１、ＳＴＫ３８、ＴＹＫ２、ＡＣＶＲ２Ｂ、ＡＰＥＧ１、ＡＴＭ、ＡＵＲＫＢ、ＢＭＸ、ＢＲＡＦ、ＣＤＣ２、ＣＤＣ２Ｌ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫ８、ＣＨＫＡ、ＣＨＫＢ、ＣＩＢ２、ＣＫＭＴ１、ＤＧＫＢ、ＥＧＦＲ、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＢ１、ＦＥＲ、ＦＧＦＲ４、ＦＬＴ３ＬＧ、ＦＮ３Ｋ、ＧＣＫ、ＧＫＡＰ１、ＧＲＫ４、ＩＫＢＫＢ、ＭＡＰ３Ｋ７ＩＰ１、ＭＡＰＫＡＰ１、ＮＥＫ９、ＰＡＮＫ３、ＰＩ４ＫＩＩ、ＰＩＰ５Ｋ２Ａ、ＰＲＫＡＧ２、ＰＳＫＨ１、ＰＴＫ２、ＰＴＫ２Ｂ、ＲＩＯＫ１、ＲＰＳ６ＫＡ５、ＲＰＳ６ＫＬ１、Ｓｈａｒｐｉｎ、ＳＫＩＰ、ＳＴＫ２２Ｃ、ＴＮＫ２、及びＵＬＫ２からなる群より選択される少なくとも１つのタンパク質キナーゼの活性を阻害する薬剤。
【請求項３】
肝臓移植患者においてＨＣＶの再発を予防するための薬剤であって、薬剤がＥＧＦＲ、ＰＲＫＡＧ２、ＳＴＫ１１、ＥＰＨＡ２、及びサイクリン依存性キナーゼからなる群より、又はＳＴＫ１１、ＰＲＫＡＧ２、ＭＡＧＩ−１、ＥｐｈＡ２、ＥＧＦＲ、ＣＳＫ、ＰＴＫ２、ＰＴＫ２Ｂ、ＩＬＫ、ＣＤＣ２、ＣＤＫ３、ＣＤＫ４、ＣＨＫＡ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＰＫＭＹＴ１、及びＷＥＥ１からなる群より、又はＣＡＬＭ２、ＣＳＫ、ＭＡＧＩ１、ＡＤＫ、ＣＤＫ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＢ４、ＦＡＳＴＫ、ＦＧＲ、ＩＬＫ、ＩＲＡＫ２、ＰＡＣＳＩＮ２、ＰＤＩＫ１Ｌ、ＰＩＰ５Ｋ２Ｂ、ＰＫＭＹＴ１、ＰＬＫ３、ＰＲＫＤ２、ＳＴＫ２４、ＷＥＥ１、ＣＤＫＬ３、ＡＤＲＢＫ１、ＣＫＳ１Ｂ、ＤＣＡＭＫＬ１、ＤＤＲ２、ＥＰＳ８Ｌ１、ＧＡＫ、ＩＴＰＫＡ、ＭＡＰＫ７、ＰＡＫ４、ＳＴＫ１１、ＳＴＫ３８、及びＴＹＫ２からなる群より、又はＣＡＬＭ２、ＣＳＫ、ＭＡＧＩ１、ＡＤＫ、ＣＤＫ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＢ４、ＦＡＳＴＫ、ＦＧＲ、ＩＬＫ、ＩＲＡＫ２、ＰＡＣＳＩＮ２、ＰＤＩＫ１Ｌ、ＰＩＰ５Ｋ２Ｂ、ＰＫＭＹＴ１、ＰＬＫ３、ＰＲＫＤ２、ＳＴＫ２４、ＷＥＥ１、ＣＤＫＬ３、ＡＤＲＢＫ１、ＣＫＳ１Ｂ、ＤＣＡＭＫＬ１、ＤＤＲ２、ＥＰＳ８Ｌ１、ＧＡＫ、ＩＴＰＫＡ、ＭＡＰＫ７、ＰＡＫ４、ＳＴＫ１１、ＳＴＫ３８、ＴＹＫ２、ＡＣＶＲ２Ｂ、ＡＰＥＧ１、ＡＴＭ、ＡＵＲＫＢ、ＢＭＸ、ＢＲＡＦ、ＣＤＣ２、ＣＤＣ２Ｌ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫ８、ＣＨＫＡ、ＣＨＫＢ、ＣＩＢ２、ＣＫＭＴ１、ＤＧＫＢ、ＥＧＦＲ、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＢ１、ＦＥＲ、ＦＧＦＲ４、ＦＬＴ３ＬＧ、ＦＮ３Ｋ、ＧＣＫ、ＧＫＡＰ１、ＧＲＫ４、ＩＫＢＫＢ、ＭＡＰ３Ｋ７ＩＰ１、ＭＡＰＫＡＰ１、ＮＥＫ９、ＰＡＮＫ３、ＰＩ４ＫＩＩ、ＰＩＰ５Ｋ２Ａ、ＰＲＫＡＧ２、ＰＳＫＨ１、ＰＴＫ２、ＰＴＫ２Ｂ、ＲＩＯＫ１、ＲＰＳ６ＫＡ５、ＲＰＳ６ＫＬ１、Ｓｈａｒｐｉｎ、ＳＫＩＰ、ＳＴＫ２２Ｃ、ＴＮＫ２、及びＵＬＫ２からなる群より選択される少なくとも１つのタンパク質キナーゼの活性を阻害する薬剤。
【請求項４】
薬剤が、小分子、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、アンチセンス化合物、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＤＮＡ、及びその任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか一項記載の薬剤。
【請求項５】
薬剤がＥＧＦＲの活性を阻害し、エルロチニブ、バンデタニブ、ゲフィチニブ、及びラパチニブからなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか一項記載の薬剤。
【請求項６】
薬剤がＡＭＰＫの活性を阻害するドルソモルフィンである、請求項１〜３のいずれか一項記載の薬剤。
【請求項７】
薬剤がＥＰＨＡ２の活性を阻害するダサチニブである、請求項１〜３のいずれか一項記載の薬剤。
【請求項８】
薬剤がサイクリン依存性キナーゼの活性を阻害するフラボピリドールである、請求項１〜３のいずれか一項記載の薬剤。
【請求項９】
ＨＣＶ感染又はＨＣＶ関連疾患の処置及び／又は予防のための医薬の製造のための、請求項１〜８のいずれか一項記載の薬剤の使用。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか一項記載の有効量の薬剤、及び少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体又は賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１１】
少なくとも１つの生物学的に活性な薬剤をさらに含む、請求項１０記載の医薬組成物。
【請求項１２】
少なくとも１つの生物学的に活性な薬剤との組み合わせでの使用のために適応される、請求項１０記載の医薬組成物。
【請求項１３】
生物学的に活性な薬剤が抗ウイルス薬剤である、請求項１１又は請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
ウイルス薬剤が、インターフェロン、リバビリン、抗ＨＣＶモノクローナル抗体、抗ＨＣＶポリクローナル抗体、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、ＩＲＥＳ阻害剤、ヘリカーゼ阻害剤、アンチセンス化合物、リボザイム、及びその任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項１３記載の医薬組成物。
【請求項１５】
以下の工程を含む潜在的なＨＣＶ抗ウイルス薬剤を同定する方法：
（ａ）少なくとも１つのヒト細胞タンパク質キナーゼを発現する生物学的システムを候補化合物とインビトロで接触させること、ここで前記タンパク質キナーゼが、ＥＧＦＲ、ＰＲＫＡＧ２、ＳＴＫ１１、ＥＰＨＡ２、及びサイクリン依存性キナーゼからなる群より、又はＳＴＫ１１、ＰＲＫＡＧ２、ＭＡＧＩ−１、ＥｐｈＡ２、ＥＧＦＲ、ＣＳＫ、ＰＴＫ２、ＰＴＫ２Ｂ、ＩＬＫ、ＣＤＣ２、ＣＤＫ３、ＣＤＫ４、ＣＨＫＡ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＰＫＭＹＴ１、及びＷＥＥ１からなる群より、又はＣＡＬＭ２、ＣＳＫ、ＭＡＧＩ１、ＡＤＫ、ＣＤＫ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＢ４、ＦＡＳＴＫ、ＦＧＲ、ＩＬＫ、ＩＲＡＫ２、ＰＡＣＳＩＮ２、ＰＤＩＫ１Ｌ、ＰＩＰ５Ｋ２Ｂ、ＰＫＭＹＴ１、ＰＬＫ３、ＰＲＫＤ２、ＳＴＫ２４、ＷＥＥ１、ＣＤＫＬ３、ＡＤＲＢＫ１、ＣＫＳ１Ｂ、ＤＣＡＭＫＬ１、ＤＤＲ２、ＥＰＳ８Ｌ１、ＧＡＫ、ＩＴＰＫＡ、ＭＡＰＫ７、ＰＡＫ４、ＳＴＫ１１、ＳＴＫ３８、及びＴＹＫ２からなる群より、又はＣＡＬＭ２、ＣＳＫ、ＭＡＧＩ１、ＡＤＫ、ＣＤＫ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＢ４、ＦＡＳＴＫ、ＦＧＲ、ＩＬＫ、ＩＲＡＫ２、ＰＡＣＳＩＮ２、ＰＤＩＫ１Ｌ、ＰＩＰ５Ｋ２Ｂ、ＰＫＭＹＴ１、ＰＬＫ３、ＰＲＫＤ２、ＳＴＫ２４、ＷＥＥ１、ＣＤＫＬ３、ＡＤＲＢＫ１、ＣＫＳ１Ｂ、ＤＣＡＭＫＬ１、ＤＤＲ２、ＥＰＳ８Ｌ１、ＧＡＫ、ＩＴＰＫＡ、ＭＡＰＫ７、ＰＡＫ４、ＳＴＫ１１、ＳＴＫ３８、ＴＹＫ２、ＡＣＶＲ２Ｂ、ＡＰＥＧ１、ＡＴＭ、ＡＵＲＫＢ、ＢＭＸ、ＢＲＡＦ、ＣＤＣ２、ＣＤＣ２Ｌ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫ８、ＣＨＫＡ、ＣＨＫＢ、ＣＩＢ２、ＣＫＭＴ１、ＤＧＫＢ、ＥＧＦＲ、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＢ１、ＦＥＲ、ＦＧＦＲ４、ＦＬＴ３ＬＧ、ＦＮ３Ｋ、ＧＣＫ、ＧＫＡＰ１、ＧＲＫ４、ＩＫＢＫＢ、ＭＡＰ３Ｋ７ＩＰ１、ＭＡＰＫＡＰ１、ＮＥＫ９、ＰＡＮＫ３、ＰＩ４ＫＩＩ、ＰＩＰ５Ｋ２Ａ、ＰＲＫＡＧ２、ＰＳＫＨ１、ＰＴＫ２、ＰＴＫ２Ｂ、ＲＩＯＫ１、ＲＰＳ６ＫＡ５、ＲＰＳ６ＫＬ１、Ｓｈａｒｐｉｎ、ＳＫＩＰ、ＳＴＫ２２Ｃ、ＴＮＫ２、及びＵＬＫ２からなる群より選択され；
（ｂ）前記タンパク質キナーゼの活性を決定すること、ここで候補化合物が、工程（ｂ）において決定された活性が、候補化合物の非存在下の生物学的システムにおいて決定された前記タンパク質キナーゼの活性よりも低い場合、潜在的なＨＣＶ抗ウイルス薬剤として同定される。
【請求項１６】
候補化合物が、小分子、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、アンチセンス化合物、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＤＮＡ、及びその任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
候補化合物が候補化合物のコレクション又はライブラリーに属する、請求項１５又は請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
生物学的システムが細胞である、請求項１５〜１７のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２００８年９月２６日に出願された欧州特許出願ＥＰ  ０８  ３０５  ６０４．４に対する優先権を主張する。この欧州特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
発明の背景
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は主な世界的健康問題であり、全世界で推定１．５〜２億人が感染している（欧州連合内での少なくとも５００万の感染者を含む）（Pawlotsky, 2004）。世界保健機構によると、３００〜４００万の新たな感染が毎年生じている。感染はしばしば無症候である。しかし、ＨＣＶ感染者の大部分が慢性感染を発生する（Hoofnagle, 2002; Lauer, 2001; Seeff, 1995）。慢性ＨＣＶ感染は、重大な肝臓疾患（線維症及び脂肪症を含む）を招くことが多い（Chisari, 2005）。慢性ＨＣＶ感染患者の約２０%が肝硬変を発生し、その症例の５%が肝細胞癌に進行する（Hoofnagle, 2002）。
【０００３】
慢性ＨＣＶ感染は、肝臓移植の主要な適応である（Seeff, 2002）。残念なことに、肝臓移植はＣ型肝炎のための療法ではない；ウイルスの再発は不変の問題であり、移植片喪失の主要な原因である（Brown, 2005）。ＨＣＶを防ぐ利用可能なワクチンはない。現在の治療は、リバビリン及び／又はインターフェロンアルファ（ＩＦＮ−α）（２つの非特異的抗ウイルス薬剤）の投与を含む。ペグ化ＩＦＮ−α及びリバビリンの併用処置を使用して、ウイルスの永続的な除去が、慢性Ｃ型肝炎患者の約５０%〜８０%において達成される。しかし、多数の患者が、併用処置の成分の１つに対して禁忌を示し、処置を許容できず、ＩＦＮ治療に対して全く応答しない、又は、投与を止めた場合に再発が認められる。限定された効力及び実質的な副作用（例えば好中球減少、溶血性貧血、及び重度の抑鬱など）に加えて、現在の抗ウイルス治療は、また、高費用という特徴をもつ。
【０００４】
最近まで、ＨＣＶ感染に対するより効果的な治療法の開発は、ＨＣＶ複製を支持する細胞培養システムの欠如により妨げられてきた。現在、細胞培養における感染性ＨＣＶの急速な産生が、日本の劇症Ｃ型肝炎（ＪＦＨ−１）患者の血液由来の固有のＨＣＶゲノムを使用して達成されている（Wakita, 2005; Lindenbach, 2005; Zhong, 2005）。細胞培養において感染性粒子を放出するＨＣＶ（ＨＣＶｃｃ）のＪＦＨ−１株の能力及びレトロウイルスＨＣＶ擬似粒子（ＨＣＶｐｐ）の開発（Bartosch, 2003; Hsu, 2003）によって、完全なウイルスライフサイクルの調査が可能になっている。これにより、ＨＣＶタンパク質のプロセシング及び複製を標的にする新たな抗ウイルス薬剤の開発につながる。しかし、これらの薬剤の多くが、有毒で、ウイルス耐性を高頻度に生じさせることが証明されており、異なる戦略がＨＣＶ感染の処置のために必要であるを示唆している。
【０００５】
ＨＣＶは、フラビウイルス科のヘパシウイルス（Hepacivirus）属に分類されるプラス鎖ＲＮＡウイルスである。ＨＣＶゲノムの主なオープンリーディングフレームの翻訳は、約３０００アミノ酸長のポリタンパク質の産生をもたらし、それは翻訳と同時に及び翻訳後に細胞及びウイルスのプロテアーゼの協調作用により少なくとも１０個の熟成タンパク質（２つのエンベロープ糖タンパク質（Ｅ１及びＥ２）を含む）に切断される。ＨＣＶは、肝細胞表面の分子又は受容体に付着することにより感染を開始する。ＨＣＶ侵入がウイルス−宿主相互作用の最初の段階であるため、それは抗ウイルス治療のための有望な標的であることを示す。ウイルスの結合及び侵入の間にＨＣＶと相互作用するいくつかの細胞表面分子が同定されている。これらは、テトラスパニンＣＤ８１（Pileri, 1998）、スカベンジャー受容体クラスＢＩ型（ＳＢ−ＲＩ）（BScarselli, 2002）、タイトジャンクションタンパク質クローディン１（ＣＬＤＮ１）（Evans, 2007）及びオクルディン（Ploss, 2009）、高度に硫酸化されたヘパリン硫酸（Barth, 2003）、ならびに低密度リポタンパク（ＬＤＬ）受容体（概説については、Barth, 2006 及び Zeisel, 2008を参照のこと）を含む。これら全ての因子は、多くの組織において発現され、肝臓特異的ではない。ＣＤ８１、ＳＲ−ＢＩ、及びタイトジャンクションタンパク質の過剰発現が特定の細胞株にＨＣＶ感受性を付与することができるが、同定された侵入因子を発現する他の細胞株は非許容性のままである。これらの知見は、ＨＣＶ侵入を媒介又は調節する他の共侵入因子の存在を示唆する。
【０００６】
ウイルスは、そのライフサイクルの１つ又は複数の段階（侵入、内在化、複製、及び放出などの）の間に、それらが有利に働くように、標的細胞のシグナル伝達経路を利用することが知られている（Cirone, 1990; Constantinescu, 1991; Pelkmans, 2005; Root, 2000;及びSieckarski, 2003）。近年、ウイルス−宿主相互作用の最初の段階の間での侵入ウイルスと宿主細胞間の形成交換が、細胞によりウイルスに与えられる指示に限定されず、細胞結合及びウイルス侵入をもたらすことが明らかになっている。多くのウイルスについて、ウイルス−宿主相互作用は二方向のやりとりに似ており、それにおいてウイルスが細胞自体のシグナル伝達システムを利用して細胞にシグナルを伝える（Smith, 2004）。これらのシグナルは  −  通常、細胞表面で生成され−  侵入を促進する変化を誘導し、浸潤のために細胞を準備し、そして宿主の防御を無効にする。肝細胞癌細胞に結合するＨＣＶエンベロープ糖タンパク質に対する応答のゲノム分析を使用し、出願者らの研究室は、宿主細胞へのＨＣＶエンベロープ糖タンパク質の結合が、ウイルス増殖の支持のために細胞を調整しうる細胞の遺伝子発現を調節する細胞内シグナルのカスケードをもたらすことを以前に実証していた（Fang, 2006）。
【０００７】
発明の概要
本発明は、哺乳動物、特にヒトにおける、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染及びＨＣＶ関連疾患に対する医学的介入のための新規標的に関する。本発明は、ＨＣＶにより起こされる感染及び疾患の処置及び／又は予防のための新規治療プロトコールの標的として、ならびに、新たなＨＣＶ抗ウイルス薬剤の同定及び開発のために使用することができるヒト細胞タンパク質キナーゼの同定を提供する。
【０００８】
より具体的には、新規ＨＣＶ侵入因子を同定する目的で、本出願者らは、６９１個の細胞キナーゼ及び関連タンパク質を標的にする機能性ｓｉＲＮＡ（小分子干渉ＲＮＡ）スクリーニングを利用し、ＨＣＶ偽型粒子（ＨＣＶｐｐ）に基づくモデルシステムを使用してＨＣＶ侵入に及ぼすキナーゼ遺伝子サイレンシングの効果を研究した（Bartosch, 2003）。特定の実験において、ＨＣＶ特異的及び非特異的効果を識別するために、本出願者らは、また、比較実験において水疱性口内炎ウイルス擬似粒子（ＶＳＶｐｐ）の感染に及ぼすキナーゼ遺伝子サイレンシングの効果を試験した（Barth, 2006）。予備実験（実施例１を参照のこと）によって、対応する遺伝子のサイレンシングが細胞中へのＨＣＶ侵入の有意な低下をもたらす１０１個のタンパク質キナーゼの同定に至った。それらの内、６９個のタンパク質キナーゼについては、遺伝子サイレンシングによって、ＶＳＶｐｐ侵入に影響を与えることなく細胞中へのＨＣＶ特異的ウイルス侵入の低下がもたらされ（図１を参照のこと）、３２個のタンパク質キナーゼについては、対応する遺伝子のサイレンシングによって、ＶＳＶｐｐ侵入に対する遺伝子サイレンシングにより起こされる変化にかかわらず、細胞中へのＨＣＶウイルス侵入の顕著な低下がもたらされた（図２を参照のこと）。
【０００９】
第２組の実験（実施例２を参照のこと）によって、ＨＣＶ侵入及びＨＣＶ感染の開始に対し影響を及ぼす７８個のヒトキナーゼの同定に至った（図５を参照のこと）。これらの７８のヒトキナーゼは以下である：ＣＡＬＭ２、ＣＳＫ、ＭＡＧＩ１、ＡＤＫ、ＣＤＫ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＢ４、ＦＡＳＴＫ、ＦＧＲ、ＩＬＫ、ＩＲＡＫ２、ＰＡＣＳＩＮ２、ＰＤＩＫ１Ｌ、ＰＩＰ５Ｋ２Ｂ、ＰＫＭＹＴ１、ＰＬＫ３、ＰＲＫＤ２、ＳＴＫ２４、ＷＥＥ１、ＣＤＫＬ３、ＡＤＲＢＫ１、ＣＫＳ１Ｂ、ＤＣＡＭＫＬ１、ＤＤＲ２、ＥＰＳ８Ｌ１、ＧＡＫ、ＩＴＰＫＡ、ＭＡＰＫ７、ＰＡＫ４、ＳＴＫ１１、ＳＴＫ３８、ＴＹＫ２、ＡＣＶＲ２Ｂ、ＡＰＥＧ１、ＡＴＭ、ＡＵＲＫＢ、ＢＭＸ、ＢＲＡＦ、ＣＤＣ２、ＣＤＣ２Ｌ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫ８、ＣＨＫＡ、ＣＨＫＢ、ＣＩＢ２、ＣＫＭＴ１、ＤＧＫＢ、ＥＧＦＲ、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＢ１、ＦＥＲ、ＦＧＦＲ４、ＦＬＴ３ＬＧ、ＦＮ３Ｋ、ＧＣＫ、ＧＫＡＰ１、ＧＲＫ４、ＩＫＢＫＢ、ＭＡＰ３Ｋ７ＩＰ１、ＭＡＰＫＡＰ１、ＮＥＫ９、ＰＡＮＫ３、ＰＩ４ＫＩＩ、ＰＩＰ５Ｋ２Ａ、ＰＲＫＡＧ２、ＰＳＫＨ１、ＰＴＫ２、ＰＴＫ２Ｂ、ＲＩＯＫ１、ＲＰＳ６ＫＡ５、ＲＰＳ６ＫＬ１、Ｓｈａｒｐｉｎ、ＳＫＩＰ、ＳＴＫ２２Ｃ、ＴＮＫ２、及びＵＬＫ２（これらのキナーゼのフルネーム及び対応する遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ登録番号を図５に提示する）。
【００１０】
上記７８個のヒトキナーゼの内、ＨＣＶｐｐ侵入及びＨＣＶｃｃ感染に対して機能的影響を有するが、しかし、３４個がＶＳＶ侵入に対する効果はないことが明らかになった（実験の詳細については、図５Ａ及び実施例２を参照のこと）。これらの３４個のヒトキナーゼは以下である：ＣＡＬＭ２、ＣＳＫ、ＭＡＧＩ１、ＡＤＫ、ＣＤＫ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＢ４、ＦＡＳＴＫ、ＦＧＲ、ＩＬＫ、ＩＲＡＫ２、ＰＡＣＳＩＮ２、ＰＤＩＫ１Ｌ、ＰＩＰ５Ｋ２Ｂ、ＰＫＭＹＴ１、ＰＬＫ３、ＰＲＫＤ２、ＳＴＫ２４、ＷＥＥ１、ＣＤＫＬ３、ＡＤＲＢＫ１、ＣＫＳ１Ｂ、ＤＣＡＭＫＬ１、ＤＤＲ２、ＥＰＳ８Ｌ１、ＧＡＫ、ＩＴＰＫＡ、ＭＡＰＫ７、ＰＡＫ４、ＳＴＫ１１、ＳＴＫ３８、及びＴＹＫ２（これらのキナーゼのフルネーム及び対応する遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ登録番号を図５Ａに提示する）。
【００１１】
ＳＴＲＩＮＧデータベースを使用した７８個のヒトキナーゼのバイオインフォマティクス分析によって、細胞形態（細胞極性、タイトジャンクション透過性、及びインテグリンシグナル伝達を含む）を調節するキナーゼネットワークならびに細胞周期に関与するキナーゼのネットワークが明らかになった（図６Ｃ）。合計２３個のヒトキナーゼがこのように同定された。特に、細胞極性を調節する２個のキナーゼ：ＳＴＫ１１及びＰＲＫＡＧ２；タイトジャンクションを調節する３個のキナーゼ：ＭＡＧＩ−１、ＥｐｈＡ２、及びＥＧＦＲ；インテグリンシグナル伝達に関与する４個のキナーゼ：ＣＳＫ、ＰＴＫ２、ＰＴＫ２Ｂ、及びＩＬＫ；ならびに細胞周期に関与する８個のキナーゼ：ＣＤＣ２、ＣＤＫ３、ＣＤＫ４、ＣＨＫＡ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＰＫＭＹＴ１、及びＷＥＥ１を含む。
【００１２】
出願者らは、次に、細胞培養由来の感染性ＨＣＶ（ＨＣＶｃｃ）（Wakita, 2005）を使用し、ウイルスのライフサイクルについて同定された候補キナーゼの関連性を検証し、抗ＨＣＶ処置のための既に認可されたキナーゼ阻害薬物の潜在能力を評価した。この方法を使用して検証されているヒトキナーゼは以下を含む：ＳＴＫ１１、ＰＲＫＡＧ２、ＥＰＨＡ２、ＥＧＦＲ、及びサイクリン依存性キナーゼ（即ち、ＣＤＣ２、ＣＤＫ３、ＣＤＫ４、ＣＨＫＡ、ＣＤＫＮ１Ｂ、及びＣＤＫＮ２Ｃの１つ又は複数）。
【００１３】
全ての同定された細胞タンパク質キナーゼが、新規抗ウイルス介入のための潜在的な標的であることを示す。したがって、一態様において、本発明は、ＨＣＶ感染及びＨＣＶ関連疾患に対する抗ウイルス治療のための標的としてこれらのタンパク質キナーゼを提供する。
【００１４】
別の態様において、本発明は、ＨＣＶ感染及び／又はＨＣＶ関連疾患の予防及び／又は処置のために有用な化合物の同定のための方法を提供する。具体的には、これらの方法は、本明細書に開示する少なくとも１つのタンパク質キナーゼを発現する又は発現することができる生物学的システム（例、細胞）を候補化合物と接触させること、及び、前記タンパク質キナーゼ又は前記キナーゼの活性を表す因子の活性を決定することを含む。候補化合物は、タンパク質キナーゼの活性が候補化合物の非存在においてより候補化合物の存在において低い場合に、潜在的ＨＣＶ抗ウイルス薬剤（即ち、ＨＣＶにより起こされる感染又は疾患を処置及び／又は予防するために潜在的に有用な化合物）として認められる。あるいは、候補化合物は、キナーゼの活性を表す因子が候補化合物の存在において及び候補化合物の非存在において異なる（因子と活性の間での関係に依存して低い又は高い）場合に、潜在的なＨＣＶ抗ウイルス薬剤として認められる。
【００１５】
特定の実施態様において、本発明の方法は、個々の候補化合物をスクリーニングするために使用される。別の実施態様において、本発明の方法は、候補化合物のライブラリーをスクリーニングするために使用される。候補化合物は、分子の多種多様なファミリーのいずれかに属しうる。特定の実施態様において、候補化合物は、小分子、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、アンチセンス化合物、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＤＮＡ、及びその任意の組み合わせからなる群より選択される。
【００１６】
本明細書に記載されるスクリーニング方法により同定される任意の潜在的なＨＣＶ抗ウイルス薬剤が、本発明により包含される。特に、本発明は、細胞のＨＣＶ感染を予防するための薬剤を提供し、それにおいて薬剤は、本明細書に開示する少なくとも１つのタンパク質キナーゼの活性を阻害し、それにより細胞中へのＨＣＶ侵入を予防、遮断、又は阻害する。本発明は、また、被験体においてＨＣＶ感染又はＨＣＶ関連疾患を予防又は処置するための薬剤を提供し、それにおいて薬剤は、本明細書に開示される少なくとも１つのタンパク質キナーゼの活性を阻害し、それにより被験体の感受性細胞中へのＨＣＶ侵入を予防、遮断、又は阻害する。本発明は、肝臓移植患者においてＨＣＶの再発を予防するための薬剤をさらに提供し、それにおいて薬剤は、本明細書に開示される少なくとも１つのタンパク質キナーゼの活性を阻害し、それにより被験体の感受性細胞中へのＨＣＶ侵入を予防、遮断、又は阻害する。これらの薬剤（又はキナーゼ阻害剤）は、小分子、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、アンチセンス化合物、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＤＮＡ、リボザイムなどでありうる。特定の実施態様において、これらの薬剤は、本明細書に開示されるタンパク質キナーゼの少なくとも１つの活性を阻害する当技術分野において既に公知の化合物である。少なくとも１つのタンパク質キナーゼの活性を阻害する当技術分野において既に公知の化合物は、メチル−２−シアノ−３，１２−ジオキソラン（dioxoolean）−１，９−ジエン−２８−オエート、セツキシマブ、ＡＥＥ７８８、パニツムマブ、ＢＭＳ−５９９６２６、ＡＲＲＹ−３３４５４３、ＸＬ６４７、カネルチニブ、ゲフィチニブ、ＨＫＩ−２７２、ＰＤ１５３０３５、ラパチニブ、バンデタニブ、エルロチニブ、ＢＭＳ−３８７０３２、フラボピリドール、ＸＬ６４７、ダサチニブ、ＡＺＭ−４７５２７１、イマチニブ、ＡＺＤ−１１５２、ソラフェニブ、ＰＤ−０３３２９９１、その誘導体、その生理学的に許容可能な塩、及びその任意の組み合わせを含む。
【００１７】
本発明は、また、ＨＣＶ感染及びＨＣＶ関連疾患の予防及び／又は処置のための標的化システム及び戦略に関する。本発明は、特に、本明細書に開示されるキナーゼの活性を阻害することにより、ＨＣＶ−宿主細胞相互作用、特に、ＨＣＶ侵入に干渉する薬剤に関する。これらのキナーゼ阻害剤は、ＨＣＶ感染（急性又は慢性ＨＣＶ感染）及びＨＣＶ関連の疾患又は障害（例、肝臓炎症、肝硬変、及び肝細胞癌）の予防的又は治療的な処置において使用することができる。キナーゼ阻害剤（例えば細胞中へのＨＣＶ侵入を阻害する本明細書に提供するキナーゼ阻害剤など）は、抗ウイルス治療薬として特に魅力的である。
【００１８】
本発明のキナーゼ阻害剤は、種々の予防的及び治療的処置において適用することができる。したがって、別の態様において、本発明のキナーゼ阻害剤は；細胞（例、感受性細胞又は感受性細胞の集団）のＨＣＶ感染を予防するため；被験体においてＨＣＶ感染又はＨＣＶ関連疾患を予防又は処置するため；及び肝臓移植患者においてＨＣＶの再発を予防するために提供される。
【００１９】
関連する態様において、本発明は、ＨＣＶとの接触の結果としてＨＣＶに感染する感受性細胞の可能性を低下させる方法を提供し、感受性細胞と有効量の本発明のキナーゼ阻害剤を接触させることを含む。また、ＨＣＶとの接触の結果として被験体の感受性細胞がＨＣＶに感染する可能性を低下させる方法を提供し、被験体に有効量の本発明のキナーゼ阻害剤を投与することを含む。本発明は、また、それを必要とする被験体においてＨＣＶ感染又はＨＣＶ関連疾患（例、肝臓疾患又は病変）を処置又は予防する方法を提供し、被験体に有効量の本発明のキナーゼ阻害剤を投与することを含む。また、肝臓移植患者におけるＨＣＶの再発を予防する方法を提供し、患者に有効量の本発明のキナーゼ阻害剤を投与することを含む。本発明のキナーゼ阻害剤の被験体への投与は、任意の適した経路（例えば、非経口、エアゾル、経口、及び局所経路を含む）によって行ってもよい。本発明のキナーゼ阻害剤は、単独で又は治療用薬剤（例えば抗ウイルス薬剤など）と組み合わせて投与してもよい。
【００２０】
このように、本発明のキナーゼ阻害剤は、本明細書に記載される少なくとも１つの標的キナーゼの活性の阻害剤である当技術分野において既に公知の薬剤及び本明細書に開示するスクリーニングアッセイのいずれか１つにより同定される薬剤を含む。
【００２１】
特に、一実施態様において、本発明は、ＨＣＶ感染の予防又は処置のためのドルソモルフィン、ダサチニブ、エルロチニブ、フラボピリドール、バンデタニブ、ゲフィチニブ、又はラパチニブの使用を提供する。別の実施態様において、本発明は、肝臓移植患者においてＨＣＶの再発を予防するためのダサチニブ又はエルロチニブの使用を提供する。
【００２２】
本発明のキナーゼ阻害剤は、それ自体で又は医薬組成物として投与してもよい。したがって、別の態様において、本発明は、ＨＣＶ感染及びＨＣＶ関連疾患の処置及び／又は予防のための医薬、医薬組成物、又は薬学的キットの製造のための本発明のキナーゼ阻害剤の使用を提供する。
【００２３】
関連する態様において、本発明は、有効量の本発明のキナーゼ阻害剤及び少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体又は賦形剤を含む医薬組成物を提供する。特定の実施態様において、医薬組成物は、追加の治療用薬剤（例えば抗ウイルス薬剤など）との併用投与に適応される。他の実施態様において、医薬組成物は、追加の治療用薬剤（例えば抗ウイルス薬剤など）をさらに含む。本発明の方法及び医薬組成物における使用に適した抗ウイルス薬剤は、限定はされないが、インターフェロン（例、インターフェロン−アルファ、ペグ化インターフェロン−アルファ）、リバビリン、抗ＨＣＶ（モノクローナル又はポリクローナル）抗体、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、ＩＲＥＳ阻害剤、ヘリカーゼ阻害剤、アンチセンス化合物、リボザイム、及びその任意の組み合わせを含む。
【００２４】
本発明のこれらの及び他の目的、利点、及び特性は、以下の好ましい実施態様の詳細な説明を読んだ当業者には明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１Ａ】図１は、予備実験において（実施例１を参照のこと）、ＨＣＶ感染に対する抗ウイルス治療のための潜在的な標的として同定された６９個のヒトタンパク質キナーゼを提示する表である。ｓｉＲＮＡを使用して発現停止された場合、これらのタンパク質キナーゼをコードする遺伝子は、細胞中へのウイルス侵入に及ぼすＨＣＶ特異的効果を示した（即ち、ＨＣＶｐｐを使用したＨＣＶ感染の低下、しかし、コントロール偽型ＶＳＶｐｐに及ぼす類似の効果はない）。タンパク質キナーゼの各々のフルネーム及び対応する遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ登録番号も表に示す。
【図１Ｂ】図１は、予備実験において（実施例１を参照のこと）、ＨＣＶ感染に対する抗ウイルス治療のための潜在的な標的として同定された６９個のヒトタンパク質キナーゼを提示する表である。ｓｉＲＮＡを使用して発現停止された場合、これらのタンパク質キナーゼをコードする遺伝子は、細胞中へのウイルス侵入に及ぼすＨＣＶ特異的効果を示した（即ち、ＨＣＶｐｐを使用したＨＣＶ感染の低下、しかし、コントロール偽型ＶＳＶｐｐに及ぼす類似の効果はない）。タンパク質キナーゼの各々のフルネーム及び対応する遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ登録番号も表に示す。
【図２】図２は、予備実験において（実施例１を参照のこと）、ＨＣＶ感染に対する抗ウイルス治療のための潜在的な標的として同定された３２個のヒトタンパク質キナーゼを提示する表である。ｓｉＲＮＡを使用して発現停止された場合、これらのタンパク質キナーゼをコードする遺伝子は、ＶＳＶｐｐ侵入に対して遺伝子サイレンシングにより起こされた変化にかかわらず、細胞中へのウイルス侵入の顕著な低下を示した。タンパク質キナーゼの各々のフルネーム及び対応する遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ登録番号も表に示す。
【図３】図３は、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）の阻害剤がＨＣＶｐｐ侵入及びＨＣＶｃｃ感染を顕著に阻害することを実証する（実験の詳細については実施例１を参照のこと）。エルロチニブ（Erlotenib）（図３Ａ）、ゲフィチニブ（図３Ｂ）、ラパチニブ（図３Ｃ）、及びバンデタニブ（図３Ｄ）とのインキュベーションに続き、ＨＣＶｐｐ侵入（ＨＣＶｐｐ  Ｈ７７Ｃ、遺伝子型１ａ）及びＨＣＶｃｃ  ＪＦＨ１感染を、Ｈｕｈ７．５．１細胞におけるルシフェラーゼレポーター遺伝子発現又はＨＣＶ  ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲにより評価した。細胞を、感染前の１時間から感染後の３時間に、溶媒（ＣＴＲＬ）、１μM又は１０μMの阻害剤とインキュベートした。ルシフェラーゼ活性を感染後７２時間に評価し、全タンパク質含量に対して標準化した。データを、コントロール細胞の%ＨＣＶｐｐ侵入又はＨＣＶｃｃ感染として表わした（ＣＴＲＬ＝１００%、平均値±ＳＤを示す）。
【図４】図４は、２回目の実験において、宿主細胞由来のＨＣＶ侵入補助因子を同定するために使用される機能性ＲＮＡｉ  ＨＣＶｐｐ侵入スクリーニングの概略図を示す。スクリーニングの詳細を実施例２に示す。
【図５Ａ】図５は、第２組の実験において（実施例２を参照のこと）、ＨＣＶ侵入及びＨＣＶ感染の開始に対し影響を及ぼすとして同定される７８個のヒトタンパク質キナーゼを提示する表である。表に提示する最初の３４個のヒトタンパク質キナーゼは、ＨＣＶｐｐ侵入及びＨＣＶｃｃ感染に対して機能的な影響を有するが、しかし、ＶＳＶ侵入に及ぼす効果は有さないことが見出されている（図５Ａ）。タンパク質キナーゼの各々のフルネーム及び対応する遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ登録番号も表に示す。
【図５Ｂ】図５は、第２組の実験において（実施例２を参照のこと）、ＨＣＶ侵入及びＨＣＶ感染の開始に対し影響を及ぼすとして同定される７８個のヒトタンパク質キナーゼを提示する表である。表に提示する最初の３４個のヒトタンパク質キナーゼは、ＨＣＶｐｐ侵入及びＨＣＶｃｃ感染に対して機能的な影響を有するが、しかし、ＶＳＶ侵入に及ぼす効果は有さないことが見出されている（図５Ａ）。タンパク質キナーゼの各々のフルネーム及び対応する遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ登録番号も表に示す。
【図６】図６は、第２組の実験においてＨＣＶ侵入に対する顕著な影響を有するとして同定された細胞キナーゼでの生物学的プロセス及びタンパク質会合ネットワーク分析での結果を示す。ＨＣＶ侵入に関与する７８個の同定された細胞キナーゼ（Ａ）及びＨＣＶ侵入に対し影響を及ぼすが、しかし、ＶＳＶ侵入に対しては影響を及ぼさない３４個の同定されたキナーゼ（Ｂ）を、Ingenuity Pathwaysデータベースを使用して分析した。この分析によって、生物内の同定された候補キナーゼに関連する最もよく見られる生物学的プロセスを伴う項目が特定された（閾値ｐ＜１０−５）。生物学的機能の最も有意な項目は、上昇するｐ値により順序付けられた。（Ｃ）ＳＴＲＩＮＧ分析により同定されたＨＣＶ侵入に関与する７８個のキナーゼのタンパク質会合ネットワーク。キナーゼを連結する線は、多数の供給源（実験レポジトリ、コンピューター予測方法、及び公的テキスト収集）に由来する直接的（物理的）及び間接的（機能的）会合を示す。細胞形態、タイトジャンクション及び細胞極性（緑色）、細胞付着（濃緑色）、ならびに細胞周期進行（青色）の調節に関与するキナーゼが強調されている。（Ｄ）ＨＣＶ侵入機構に対するＲＮＡｉスクリーニングにおいて同定された細胞キナーゼの影響のモデル。ＨＣＶ侵入因子はオレンジで描写され、侵入スクリーニングにおいて同定された細胞キナーゼは赤色で描写されている。
【図７】図７は、肝臓キナーゼＢ１（ＳＴＫ１１）のサイレンシング及びＡＭＰ活性化タンパク質キナーゼサブユニットガンマ２（ＰＲＫＡＧ２）発現がＨＣＶｐｐ侵入及びＨＣＶｃｃ感染の阻害をもたらすことを実証する（実施例２を参照のこと）。Ｈｕｈ７．５細胞における特異的な個々のｓｉＲＮＡによるＳＴＫ１１（Ａ）又はＰＲＫＡＧ２（Ｂ）のサイレンシングが、遺伝子型１ａ、１ａ、２ａ、３ａ、及び４ａに由来するＨＣＶｐｐの侵入（左パネル）ならびにＨＣＶｃｃ感染（ＨＣＶｃｃ  Ｌｕｃ−Ｊｃ１；遺伝子型２ａ／ａ２）（右パネル）の阻害をもたらした。対照的に、コントロールｓｉＲＮＡトランスフェクション（ＣＴＲＬ）はＨＣＶ感染に影響を与えなかった。タンパク質キナーゼ阻害剤ドルソモルフィンによりＡＭＰＫ活性の阻害が、Ｈｕｈ７．５細胞におけるＨＣＶｐｐ侵入（ＨＣＶｐｐ  Ｈ７７Ｃ；遺伝子型１ａ）（Ｃ）及びＨｕｈ７．５．１細胞におけるＨＣＶｃｃ感染（ＨＣＶｃｃ  Ｌｕｃ−Ｊｃ１；遺伝子型２ａ／２ａ）（Ｄ）を阻害した。細胞の生存は、Ｈｕｈ７．５細胞において減少しなかったが、しかし、Ｈｕｈ７．５．１において少し低下した（ＭＴＴアッセイにより示される）（Ｃ〜Ｄ）。細胞を１時間にわたり前処理し、６時間にわたる感染の間に１０μＭドルソモルフィンを用いて処理した。データを、ＣＴＲＬ  ｓｉＲＮＡトランスフェクト細胞又は溶媒コントロール処理細胞のパーセントＨＣＶｐｐ侵入、ＨＣＶｃｃ感染、又は細胞生存として表わす（ＣＴＲＬ＝１００%；平均値±ＳＤを示す）。
【図８】図８は、ヒト肝細胞癌細胞におけるＥｐｈＡ２及びＥＧＦＲ発現のサイレンシングが、ＨＣＶｐｐ侵入及びＨＣＶｃｃ感染の遺伝子型非依存的な阻害をもたらすことを実証する。（Ａ）個々のｓｉＲＮＡを使用したＨｕｈ７．５細胞におけるＥｐｈＡ２又はＥＧＦＲ遺伝子転写のサイレンシングは、対応するタンパク質の発現の低下をもたらす。発現を、免疫沈降及びウエスタンブロットにより示される通り、コントロールｓｉＲＮＡ（ＣＴＲＬ）を用いてトランスフェクトされた細胞と比較する。模擬＝未処理細胞。（Ｂ）特異的な個々のｓｉＲＮＡによるＥｐｈＡ２、ＥＧＦＲ、又はＣＤ８１発現のサイレンシングは、遺伝子型１ａ、１ｂ、２ａ、３ａ、及び４ａに由来するＨＣＶｐｐの侵入の阻害をもたらした。ＥＧＦＲとは対照的に、ＥｐｈＡ２サイレンシングは、ＶＳＶｐｐコントロール粒子の侵入に対して効果を有さなかった。（Ｃ）個々のｓｉＲＮＡによるＥｐｈＡ２、ＥＧＦＲ、又はＣＤ８１発現のサイレンシングは、ＨＣＶｃｃ感染（ＨＣＶｃｃ  Ｌｕｃ−Ｊｃ１、遺伝子型２ａ／２ａ）の顕著な阻害をもたらした。対照的に、コントロールｓｉＲＮＡトランスフェクション（ＣＴＲＬ）は、ＨＣＶ感染に影響を与えなかった。データを、ＣＴＲＬ−ｓｉＲＮＡトランスフェクト細胞の%ＨＣＶｐｐ侵入又はＨＣＶｃｃ感染として表わす（ＣＴＲＬ＝１００%；平均値±ＳＤを示す）。
【図９】図９は、タンパク質キナーゼ阻害剤ダサチニブ及びエルロチニブによるＨＣＶｃｃ感染及びＨＣＶｐｐ侵入の用量依存的な阻害を示す。ダサチニブ又はエルロチニブとのインキュベーションに続き、Ｈｕｈ７．５細胞のＨＣＶｃｃ感染（ＨＣＶｃｃ  Ｌｕｃ−Ｊｃ１、遺伝子型２ａ／２ａ）（Ａ）及び初代ヒト肝細胞におけるＨＣＶｐｐ侵入（ＨＣＶｐｐ  ＪＦＨ１；遺伝子型２ａ）（Ｂ）をルシフェラーゼレポーター遺伝子発現により評価した。ダサチニブ及びエルロチニブは、初代ヒト肝細胞におけるＨＣＶｃｃ感染（Ａ）及びＨＣＶｐｐ侵入（Ｂ）を用量依存的な様式で阻害した。キナーゼ阻害剤を感染前１時間に加えた。処理細胞の生存を、ＭＴＴアッセイを使用して評価し、灰色破線として示す。データを、溶媒処理コントロール細胞に対するパーセントＨＣＶｃｃ感染又はＨＣＶｐｐ侵入として表わす（ＣＴＲＬ＝１００%；平均値±ＳＤを示す）。（Ｃ）ダサチニブ及びエルロチニブは、パーセントＨＣＶｃｃ複製としてＨＣＶ複製を阻害しなかった。Ｈｕｈ７．５細胞を、実施例２に記載するように、サブゲノムＨＣＶ  ＪＦＨ１レプリコンからのＨＣＶ  ＲＮＡを用いてトランスフェクトした。電気穿孔に続く４時間、細胞を、溶媒ＣＴＲＬ、ダサチニブ、又はエルロチニブを用いて２４時間にわたりインキュベートした。ＨＣＶ  ＲＮＡ及びＧＡＰＤＨ  ＲＮＡをノーザンブロットにより分析した。
【図１０】図１０は、マルチキナーゼ阻害剤を用いた宿主細胞キナーゼの標的化が、肝臓移植を受けている患者からのＨＣＶ単離株の感染の阻害をもたらすことを実証する。４人の異なるＨＣＶ感染患者からの肝臓移植の間に単離されたＨＣＶ株ＶＤ、ＶＨ、ＶＫ、ＶＮからのエンベロープ糖タンパク質を持つＨＣＶｐｐ（遺伝子型１ｂ）。全ての株の侵入が、Ｈｕｈ７．５においてＥｐｈＡ２、ＥＧＦＲ、又はＣＤ８１を標的とする特異的な個々のｓｉＲＮＡを使用した遺伝子サイレンシングにより（Ａ）及び感染１時間前に濃度１０μMのダサチニブ又はエルロチニブを用いたＨｕｈ７．５細胞（Ｂ）又は初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）（Ｃ）の処理により阻害された。対照的に、ワートマニン（１０μM）はＨＣＶｐｐ侵入を阻害しなかった。細胞生存は、遺伝子サイレンシング（非特異的コントロールｓｉＲＮＡと比較して）又は阻害剤処理（溶剤コントロールと比較して）（Ｂ〜Ｃ）のいずれにおいても低下しなかった。データを、ＣＴＲＬ  ｓｉＲＮＡトランスフェクト細胞又は溶媒コントロール処理細胞のパーセントＨＣＶｐｐ侵入又は細胞生存として表わした（ＣＴＲＬ＝１００%；平均値±ＳＤを示す）。
【００２６】
定義
本明細書を通して、以下のパラグラフにおいて定義されるいくつかの用語を用いる。
【００２７】
「キナーゼ」及び「タンパク質キナーゼ」という用語は本明細書において互換的に使用される。それらは、ヌクレオシド三リン酸から、シグナル伝達経路に関与する別の分子（本明細書において「基質」又は「キナーゼ基質」と呼ぶ）の特定のアミノ酸残基へのリン酸基の転移を触媒する酵素を指す。リン酸基は、例えば、ＡＴＰ又はＧＴＰ（アデノシン又はグアニン三リン酸）分子から転移されうる。キナーゼは、膜貫通又は細胞内タンパク質でありうる。真核生物タンパク質キナーゼは、触媒（キナーゼ）ドメインを構成する約２５０のアミノ酸の一連のストレッチの配列により特徴付けられる。キナーゼは、チロシンキナーゼ、セリン／スレオニンキナーゼ、ヒスチジンキナーゼ、又は二重特異性キナーゼでありうる。
【００２８】
「キナーゼ活性」及び「キナーゼの活性」という用語は、本明細書において互換的に使用され、基質分子の特定のアミノ酸残基のリン酸化を触媒するタンパク質キナーゼの能力を指す。
【００２９】
「キナーゼ活性の阻害剤」という用語は、化合物を指す場合、ヌクレオシド三リン酸から、基質分子の特定のアミノ酸残基へのリン酸基の転移を触媒するタンパク質キナーゼの能力を阻害する（例、完全に抑制する又は部分的に減少する）化合物の能力を指す。本発明の実施において、キナーゼ活性の阻害は、多種多様な機構のいずれかにより達成することができる。しかし、機構とは無関係に、キナーゼ活性阻害は、その基質のリン酸化を触媒するキナーゼの能力の低下をもたらす。このように、「阻害」とは、基質のリン酸化のレベルが、化合物の存在におけるインキュベーション後に、例えば、本発明のアッセイにおいて少なくとも５０%低下することを意味する。好ましくは、基質のリン酸化のレベルは、化合物により少なくとも９０%低下される。より好ましくは、基質のリン酸化のレベルは、化合物により少なくとも９５%低下される。本発明のキナーゼアッセイでの基質分子のリン酸化のレベルにおけるそのような減少を誘導する候補化合物が、キナーゼの活性の阻害剤として「同定される」。このように、特定の実施態様において、「キナーゼ活性の阻害剤」は、所与のキナーゼの活性を阻害／抑制するとして、本発明のスクリーニング方法により同定された化合物である。
【００３０】
「タンパク質キナーゼシグナル伝達経路」及び「タンパク質キナーゼカスケード」という用語は、本明細書において互換的に使用される。それらは、キナーゼタンパク質シグナル伝達カスケードの上流及び下流の成分の両方を指す。
【００３１】
「基質」及び「キナーゼ基質」という用語は、本明細書において互換的に使用される。それらは、１つ又は複数のシグナル伝達経路に関与する分子を指し、それはキナーゼの作用を通じてリン酸化されることができ、そのリン酸化は最終的に１つ又は複数の細胞応答の修飾をもたらす。例示的な基質は、限定はされないが、代謝酵素、遺伝子調節タンパク質、細胞骨格タンパク質、又は他のタンパク質キナーゼ（例、同じシグナル伝達経路に関与する下流のキナーゼ）を含む。
【００３２】
「キナーゼアクチベーター」という用語は、本明細書で使用される通り、キナーゼの活性化を誘発する任意の細胞外又は他の型の刺激を指し、それは基質分子のリン酸化を誘導する。キナーゼアクチベーターの例は、環境ストレスシグナル（例えば浸透圧ショック、熱ショック、低酸素、及びＵＶ照射など）、化学的ストレスシグナル（例えば酸化ストレス、ヒト発癌性物質、及び環境汚染物質など）、及び生化学的刺激（例えば増殖因子、サイトカイン、成長ホルモン、及び神経伝達物質など）を含む。生化学的刺激は、一般的に、他の細胞の機能に影響を与える、細胞により天然で分泌される分子である。
【００３３】
「構成的に活性な」という用語は、タンパク質キナーゼに適用される場合、キナーゼアクチベーターの非存在において基質リン酸化を触媒する能力を有するキナーゼを指す。構成的に活性なキナーゼは、本発明のスクリーニングアッセイで使用される細胞において内因性発現されうる又は、あるいは、細胞が形質転換され、構成的に活性なキナーゼを発現しうる。
【００３４】
本明細書で使用する「遺伝子」という用語は、別々の産物（ＲＮＡ又はタンパク質を問わず）をコードするポリヌクレオチドを指し、コード配列の前（５’非コード配列）又は後（３’非コード配列）の調節配列を含みうる。２個以上のポリヌクレオチドが別々の産物をコードしうるため、この用語は、また、同じ産物をコードする遺伝子の対立遺伝子及び多型、又は機能的に関連する（機能の獲得、喪失、又は調節を含む）そのアナログを含む。
【００３５】
本明細書で使用する「実質的に同種の集団」という用語は、細胞に適用された場合、細胞の集団を指し、それにおいて集団における細胞の少なくとも約８０%、好ましくは少なくとも約９０%が同じ細胞型である。細胞型の例は、限定はされないが、血小板、リンパ球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、内皮細胞、腫瘍細胞、上皮細胞、顆粒球、単球、肥満細胞、神経細胞などを含む。
【００３６】
「システム」及び「生物学的システム」という用語は、本明細書において互換的に使用される。それらは、インビトロ、インビボ、又はエクスビボでの生物学的要素、例えば細胞、生物学的液体、又は生物学的組織を指す。システムは、例えば、生きた被験体（例、それは生検又は採血により得てもよい）又は死亡した被験体（例、それは剖検で得てもよい）に由来しうる。生物学的システムが得られる被験体は、ＨＣＶ感染の動物モデルであってもよい。あるいは、それはヒトであってもよい。
【００３７】
本明細書で使用する「被験体」という用語は、ヒト又は別の哺乳動物（例、霊長類、イヌ、ネコ、ヤギ、ウマ、ブタ、マウス、ラット、ウサギなど）を指し、それらはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の宿主でありうるが、しかし、ウイルスに感染していてもしていなくてもよく、及びＨＣＶ関連疾患を患っていてもいなくてもよい。非ヒト被険体はトランスジェニック又は他の改変動物でありうる。本発明の多くの実施態様において、被験体はヒトである。そのような実施態様において、被験体はしばしば「個体」といわれる。「個体」という用語は特定の年齢を意味せず、そのため新生児、小児、十代の若者、及び成人を包含する。
【００３８】
本明細書で使用する「ＨＣＶ」という用語は、任意の主なＨＣＶ遺伝子型、サブタイプ、単離株及び／又は疑似種を指す。ＨＣＶ遺伝子型は、限定はされないが、遺伝子型１、２、３、４、５、及び６を含む；ＨＣＶサブタイプは、限定はされないが、サブタイプ１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、２ｃ、３ａ、４ａ−ｆ、５ａ、及び６ａを含む。
【００３９】
「ＨＣＶに羅患する」及び「ＨＣＶに感染した」という用語は、本明細書において互換的に使用される。被験体に関連して使用される場合、それらは、ＨＣＶにより感染された少なくとも１つの細胞を有する被験体を指す。「ＨＣＶ感染」という用語は、標的細胞中へのＨＣＶ遺伝情報の導入（例えば標的細胞膜とＨＣＶ又はＨＣＶエンベロープ糖タンパク質陽性細胞との融合などによる）を指す。
【００４０】
「ＨＣＶ関連疾患（HCV-related disease）」及び「ＨＣＶ関連疾患（HCV-associated disease）」という用語は、本明細書において互換的に使用される。それらは、ＨＣＶと関連する及び／又は直接的もしくは間接的に引き起こされることが知られる又は疑われる任意の疾患又は障害を指す。ＨＣＶ関連（HCV-related）（又はＨＣＶ関連（HCV-associated））疾患は、限定はされないが、多種多様な肝臓疾患、例えば急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変、及び肝細胞癌の無症状性キャリア状態などを含む。これら用語は、感染が臨床的に明らかになるか否かにかかわらず、任意のＨＣＶ感染の症状及び副作用（潜在性、持続性、及び無症状性の感染を含む）を含む。
【００４１】
「処置」という用語を本明細書において使用し、（１）疾患又は状態（例、ＨＣＶ感染又はＨＣＶ関連疾患）の発症を遅延又は予防する；（２）疾患又は状態の症状の進行、増悪、又は悪化を減速又は停止させる；（３）疾患又は状態の症状の寛解をもたらす；あるいは（４）疾患又は状態を治癒させることを目的とする方法又はプロセスを特徴付ける。処置を、予防的（prophylactic）又は予防的（preventing）措置で、疾患又は状態の発症前に施してもよい。あるいは又は加えて、処置を、治療措置で、疾患の開始後に施してもよい。
【００４２】
「医薬組成物」は、本明細書において、有効量の少なくとも１つの生物学的に活性な成分（例えば、タンパク質キナーゼ阻害剤）及び少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体又は賦形剤を含むと定義される。
【００４３】
本明細書で使用する「有効量」という用語は、その意図する目的（例、細胞、組織、系、又は被験体における所望の生物学的又は薬理応答）を満たすために十分である化合物又は組成物の任意の量を指す。例えば、本発明の特定の実施態様において、目的は以下でありうる：キナーゼの活性を阻害すること；ＨＣＶ感染を予防すること；ＨＣＶ関連疾患の発症を予防すること；ＨＣＶ関連疾患（例、慢性Ｃ型肝炎、肝硬変など）の症状の進行、増悪、又は悪化を減速、軽減、又は停止させること；疾患の症状の寛解をもたらすこと；及び／又はＨＣＶ関連疾患を治癒すること。
【００４４】
「薬学的に許容可能な担体又は賦形剤」という用語は、活性成分の生物学的活性の有効性に干渉せず、それが投与される濃度で宿主に対して過度の毒性がない担体媒質を指す。この用語は、溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤、ならびに吸着遅延剤などを含む。薬学的活性物質のためのそのような媒質及び薬剤の使用は、当技術分野において周知である（例えば、"Remington's Pharmaceutical Sciences", E. W. Martin, 18th Ed., 1990, Mack Publishing Co.: Easton, PAを参照のこと。その全体が参照により本明細書に組み入れられる）。
【００４５】
「感受性細胞」及び「ＨＣＶ感受性細胞」という用語は、本明細書において互換的に使用される。それらは、ＨＣＶに感染されうる任意の細胞を指す。感受性細胞は、しかし、限定されないが、肝臓細胞又は肝細胞、初代細胞、肝細胞癌細胞、ＣａＣｏ２細胞、樹状細胞、胎盤細胞、子宮内膜細胞、リンパ節細胞、リンパ球様細胞（Ｂ及びＴ細胞）、末梢血単核球、及び単球／マクロファージを含む。
【００４６】
「ＨＣＶ感染を予防、阻害、又は遮断する」という用語は、薬剤（例、タンパク質キナーゼ阻害剤）を指して使用される場合、感受性細胞又は感受性細胞集団中に導入されたＨＣＶ遺伝情報の量を、薬剤の非存在において導入されるであろう量と比較し、低下させることを意味する。
【００４７】
「候補化合物」という用語は、任意の天然又は非天然の分子、例えば生物学的高分子（例、核酸、ポリペプチド、又はタンパク質）、有機又は無機分子、あるいは目的の活性についてテストするために生物学的材料、例えば細菌、植物、真菌、又は動物（特に哺乳動物、ヒトを含む）細胞又は組織などから作製される抽出物などを指す。本発明のスクリーニング方法において、候補化合物は、所与のタンパク質キナーゼの活性を阻害する能力について評価される。
【００４８】
「小分子」という用語は、本明細書で使用される通り、低分子量の任意の天然もしくは合成の有機もしくは無機化合物又は因子を指す。好ましい小分子は、５０ダルトン超及び２，５００ダルトン未満の分子量を有する。より好ましくは、小分子は、６００〜７００ダルトン未満の分子量を有する。さらにより好ましくは、小分子は、３５０ダルトン未満の分子量を有する。
【００４９】
本明細書で使用する「生理学的に許容可能な塩又はプロドラッグ」という用語は、適切な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー応答などを伴わず、患者の組織と接触させるうえで使用に適した、妥当な利益／リスク比に相応であり、それらの意図された使用のために効果的である塩又はプロドラッグを指す。
【００５０】
「塩」という用語は、対応する遊離塩基又は遊離酸の生物学的活性及び特性を保持し、生物学的にも又は他の点でも望ましい任意の酸付加又は塩基付加塩を指す。酸付加塩は、無機酸（例、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸など）；及び有機酸（例えば、酢酸、プロピオン酸、ピルビン酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸など）と形成される。塩基付加塩は、無機塩基（例、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、亜鉛塩、アルミニウム塩など）及び有機塩基（例、一級、二級、及び三級アミンの塩、天然の置換アミンを含む置換アミン、環状アミン及び塩基性イオン交換樹脂、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、２−ジメチル−アミノエタノール、２−ジエチルアミノエタノール、トリメチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、メチルグルカミン、テオブロミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、Ｎ−エチルピペリジン、ポリアミン樹脂など）と形成することができる。
【００５１】
「プロドラッグ」という用語は、インビボでの投与時に、代謝される又はそうでなければその化合物の生物学的、薬学的、又は治療的に活性な形態に変換される化合物を指す。プロドラッグは、化合物の代謝安定性又は輸送特性を変え、副作用又は毒性をマスクし、化合物の香りを改善する、及び／又は化合物の他の特徴もしくは特性を変えるように設計してもよい。インビボでの薬力学的プロセス及び薬物代謝の知識に基づき、薬学的に活性な化合物が同定されると、薬学的技術分野の当業者は、一般的に、化合物のプロドラッグを設計することができる（Nogrady, "Medicinal Chemistry A Biochemical Approach", 1985, Oxford University Press: N.Y., pages 388-392）。適切なプロドラッグの選択及び調製のための手順も、当技術分野において公知である。
【００５２】
「約（approximately）」及び「約（about）」という用語は、数を指すために使用される通り、一般的に、別に記載されない又はそうでなければ文脈から明らかではない限り（そのような数が可能な値の１００%を超えうる場合を除く）、その数のいずれかの方向で（その数より大きい又は小さい）１０%の範囲内に入る数を含む。
【００５３】
特定の好ましい実施態様の詳細な説明
上記の通り、本発明は、６９１個の細胞キナーゼ及び関連タンパク質を標的化する機能的ｓｉＲＮＡスクリーニングを適用し、ＨＣＶ侵入に及ぼすキナーゼ遺伝子サイレンシングの効果を研究することにより同定された抗ウイルス物質のための推定標的としての新たなＨＣＶ侵入因子のパネルを提供する。ＨＣＶ侵入及び感染において直接的又は間接的に役割を果たす同定されたタンパク質キナーゼは、とりわけ、新規治療プロトコール、有用な抗ウイルス治療、ならびに新たな抗ウイルス薬剤を発見及び開発するための新たなスクリーニング方法（例、アッセイ）及び材料を提供する。
【００５４】
Ｉ  −  宿主細胞のタンパク質キナーゼ
それらの精密な一連の実験において（実施例２及び図３を参照のこと）、出願者らは、ＨＣＶ侵入及びＨＣＶ感染の開始に対して影響を与えるヒトキナーゼ遺伝子を同定するための１次及び２次スクリーニングを実施している。より具体的には、これらの遺伝子のサイレンシングは、細胞中へのＨＣＶｐｐ及びＨＣＶｃｃ侵入において顕著な低下をもたらした。これらのスクリーニングよって、以下のＧｅｎＢａｎｋ登録番号を有する７８個のキナーゼ遺伝子の同定に至った：ＮＭ＿００１７４３、ＮＭ＿００４３８３、ＮＭ＿１７３５１５、ＮＭ＿００１１２３、ＮＭ＿００１２５８、ＮＭ＿００４０６４、ＮＭ＿００１２６２、ＮＭ＿００４４３１、ＮＭ＿００４４４４、ＮＭ＿００６７１２、ＮＭ＿００５２４８、ＮＭ＿００４５１７、ＮＭ＿００１５７０、ＮＭ＿００７２２９、ＮＭ＿１５２８３５、ＮＭ＿００３５５９、ＮＭ＿００４２０３、ＮＭ＿００４０７３、ＮＭ＿０１６４５７、ＮＭ＿００３５７６、ＮＭ＿００３３９０、ＮＭ＿０１６５０８、ＮＭ＿００１６１９、ＮＭ＿００１８２６、ＮＭ＿００４７３４、ＮＭ＿００６１８２、ＮＭ＿０１７７２９、ＮＭ＿００５２５５、ＮＭ＿００２２２０、ＮＭ＿００２７４９、ＮＭ＿００５８８４、ＮＭ＿０００４５５、ＮＭ＿００７２７１、ＮＭ＿００３３３１、ＮＭ＿００１１０６、ＮＭ＿００５８７６、ＮＭ＿００００５１、ＮＭ＿００４２１７、ＮＭ＿００１７２１、ＮＭ＿００４３３３、ＮＭ＿００１７８６、ＮＭ＿０３３４８７、ＮＭ＿００００７５、ＮＭ＿００１２６０、ＮＭ＿００１２７７、ＮＭ＿００５１９８、ＮＭ＿００６３８３、ＮＭ＿０２０９９０、ＮＭ＿００４０８０、ＮＭ＿００５２２８、ＮＭ＿００５２３３、ＮＭ＿００４４４１、ＮＭ＿００５２４６、ＮＭ＿００２０１１、ＢＦ６８８７２２、ＮＭ＿０２２１５８、ＮＭ＿０００１６２、ＮＭ＿０２５２１１、ＮＭ＿１８２９８２、ＮＭ＿００１５５６、ＮＭ＿００６１１６、ＮＭ＿０２４１１７、ＮＭ＿０３３１１６、ＮＭ＿０２４５９４、ＮＭ＿０１８４２５、ＮＭ＿００５０２８、ＮＭ＿０１６２０３、ＮＭ＿００６７４２、ＮＭ＿１７３１７６、ＮＭ＿０３１４８０、ＮＭ＿００４７５５、ＮＭ＿０３１４６４、ＮＭ＿０３０９７４、ＸＭ＿０５１２２１、ＮＭ＿０５２８４１、ＮＭ＿００５７８１、及びＮＭ＿０１４６８３。
【００５５】
したがって、本発明は、ＨＣＶ感染及びＨＣＶ関連疾患に対する医学的介入のための新規標的として７８個のヒト細胞タンパク質キナーゼを提供する。これらのタンパク質キナーゼは、上記の７８個の遺伝子によりコードされる。より具体的には、これらのキナーゼは以下である：ＣＡＬＭ２、ＣＳＫ、ＭＡＧＩ１、ＡＤＫ、ＣＤＫ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＢ４、ＦＡＳＴＫ、ＦＧＲ、ＩＬＫ、ＩＲＡＫ２、ＰＡＣＳＩＮ２、ＰＤＩＫ１Ｌ、ＰＩＰ５Ｋ２Ｂ、ＰＫＭＹＴ１、ＰＬＫ３、ＰＲＫＤ２、ＳＴＫ２４、ＷＥＥ１、ＣＤＫＬ３、ＡＤＲＢＫ１、ＣＫＳ１Ｂ、ＤＣＡＭＫＬ１、ＤＤＲ２、ＥＰＳ８Ｌ１、ＧＡＫ、ＩＴＰＫＡ、ＭＡＰＫ７、ＰＡＫ４、ＳＴＫ１１、ＳＴＫ３８、ＴＹＫ２、ＡＣＶＲ２Ｂ、ＡＰＥＧ１、ＡＴＭ、ＡＵＲＫＢ、ＢＭＸ、ＢＲＡＦ、ＣＤＣ２、ＣＤＣ２Ｌ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫ８、ＣＨＫＡ、ＣＨＫＢ、ＣＩＢ２、ＣＫＭＴ１、ＤＧＫＢ、ＥＧＦＲ、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＢ１、ＦＥＲ、ＦＧＦＲ４、ＦＬＴ３ＬＧ、ＦＮ３Ｋ、ＧＣＫ、ＧＫＡＰ１、ＧＲＫ４、ＩＫＢＫＢ、ＭＡＰ３Ｋ７ＩＰ１、ＭＡＰＫＡＰ１、ＮＥＫ９、ＰＡＮＫ３、ＰＩ４ＫＩＩ、ＰＩＰ５Ｋ２Ａ、ＰＲＫＡＧ２、ＰＳＫＨ１、ＰＴＫ２、ＰＴＫ２Ｂ、ＲＩＯＫ１、ＲＰＳ６ＫＡ５、ＲＰＳ６ＫＬ１、Ｓｈａｒｐｉｎ、ＳＫＩＰ、ＳＴＫ２２Ｃ、ＴＮＫ２、及びＵＬＫ２。タンパク質キナーゼ（及び対応する遺伝子）のフルネーム及び遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ登録番号を、図５に提示する表に示す。
【００５６】
比較スクリーニングを実施し、ｓｉＲＮＡを使用して発現停止された場合に細胞中へのＨＣＶｐｐ及びＨＣＶｃｃ侵入において顕著な低下を示したが、しかし、細胞中へのＶＳＶｐｐ侵入においては任意の変化を起こさなかったキナーゼ遺伝子を同定した。これによって、以下のＧｅｎＢａｎｋ登録番号を有する３４個のキナーゼ遺伝子の同定に至った：ＮＭ＿００１７４３、ＮＭ＿００４３８３、ＮＭ＿１７３５１５、ＮＭ＿００１１２３、ＮＭ＿００１２５８、ＮＭ＿００４０６４、ＮＭ＿００１２６２、ＮＭ＿００４４３１、ＮＭ＿００４４４４、ＮＭ＿００６７１２、ＮＭ＿００５２４８、ＮＭ＿００４５１７、ＮＭ＿００１５７０、ＮＭ＿００７２２９、ＮＭ＿１５２８３５、ＮＭ＿００３５５９、ＮＭ＿００４２０３、ＮＭ＿００４０７３、ＮＭ＿０１６４５７、ＮＭ＿００３５７６、ＮＭ＿００３３９０、ＮＭ＿０１６５０８、ＮＭ＿００１６１９、ＮＭ＿００１８２６、ＮＭ＿００４７３４、ＮＭ＿００６１８２、ＮＭ＿０１７７２９、ＮＭ＿００５２５５、ＮＭ＿００２２２０、ＮＭ＿００２７４９、ＮＭ＿００５８８４、ＮＭ＿０００４５５、ＮＭ＿００７２７１、及びＮＭ＿００３３３１。
【００５７】
したがって、本発明は、ウイルス感染、特にＨＣＶ感染及びＨＣＶ関連疾患に対する医学的介入のための新規標的として３４個のヒト細胞タンパク質キナーゼを提供する。これらのタンパク質キナーゼは、上記の３４個の遺伝子によりコードされる。より具体的には、これらのキナーゼは以下である：ＣＡＬＭ２、ＣＳＫ、ＭＡＧＩ１、ＡＤＫ、ＣＤＫ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＢ４、ＦＡＳＴＫ、ＦＧＲ、ＩＬＫ、ＩＲＡＫ２、ＰＡＣＳＩＮ２、ＰＤＩＫ１Ｌ、ＰＩＰ５Ｋ２Ｂ、ＰＫＭＹＴ１、ＰＬＫ３、ＰＲＫＤ２、ＳＴＫ２４、ＷＥＥ１、ＣＤＫＬ３、ＡＤＲＢＫ１、ＣＫＳ１Ｂ、ＤＣＡＭＫＬ１、ＤＤＲ２、ＥＰＳ８Ｌ１、ＧＡＫ、ＩＴＰＫＡ、ＭＡＰＫ７、ＰＡＫ４、ＳＴＫ１１、ＳＴＫ３８、及びＴＹＫ２。キナーゼ（及び対応する遺伝子）のフルネーム及び遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ登録番号を、図５Ａに提示する表に示す。
【００５８】
７８個のヒトキナーゼで実施されたＳＴＲＩＮＧデータベースを使用したバイオインフォマティクス分析によって、細胞形態（細胞極性、タイトジャンクション透過性、及びインテグリンシグナル伝達を含む）を調節するキナーゼネットワークならびに細胞周期に関与するキナーゼのネットワークが明らかになった（図６Ｃ）。合計２３個のヒトキナーゼがこのように同定された。特に、細胞極性を調節する２個のキナーゼ；タイトジャンクションを調節する３個のキナーゼ；インテグリンシグナル伝達に関与する４個のキナーゼ；及び細胞周期に関与する８個のキナーゼを含む。
【００５９】
したがって、本発明は、ウイルス感染、特にＨＣＶ感染及びＨＣＶ関連疾患に対する医学的介入のための新規標的として１７個のヒト細胞タンパク質キナーゼを提供する。これらの１７個のタンパク質キナーゼは以下である：ＳＴＫ１１、ＰＲＫＡＧ２、ＭＡＧＩ−１、ＥｐｈＡ２、ＥＧＦＲ、ＣＳＫ、ＰＴＫ２、ＰＴＫ２Ｂ、ＩＬＫ、ＣＤＣ２、ＣＤＫ３、ＣＤＫ４、ＣＨＫＡ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＰＫＭＹＴ１、及びＷＥＥ１。
【００６０】
出願者らは、次に、認可されたキナーゼ阻害薬物を使用して、ＨＣＶ感染に対する医学的介入のための標的としての同定されたタンパク質キナーゼを検証してきた（実施例１及び２を参照のこと）。出願者らは、ドルソモルフィン（ＡＭＰＫ活性の阻害剤）を用いたＨｕｈ７．５細胞のプレインキュベーションによってＨＣＶｐｐ侵入が顕著に阻害されることを見出し、これによりＳＴＫ１１及びＰＲＫＡＧ２の役割を確認した。同様に、ダサチニブ（ＥｐｈＡ２機能の阻害剤）を用いたプレインキュベーションによって、初代ヒト肝細胞におけるＨＣＶｐｐ侵入及びＨｕｈ７．５．１細胞のＨＣＶｃｃ感染が顕著に阻害され、ＥｐｈＡ２機能がＨＣＶ侵入のために重要であることが確認された。また、出願者らは、エルロチニブを使用したＥＧＦＲ活性の阻害が、ＨＣＶ侵入及びＨＣＶ感染を用量依存的に阻害することを見出し、これによりＥＧＦＲの役割を確認した。同様の結果が、他のＥＧＦＲ阻害剤（例えばバンデタニブ、ゲフィチニブ、及びラパチニブなど）を使用して得られた。最後に、フラボピリドール（ＣＤＫファミリーの十分に特徴付けられた阻害剤）が、初代ヒト肝細胞においてＨＣＶｐｐ侵入を顕著に阻害し、サイクリン依存性キナーゼ、特にＣＤＫ３の役割を確認した。
【００６１】
したがって、本発明は、ウイルス感染、特にＨＣＶ感染及びＨＣＶ関連疾患に対する医学的介入のための新規標的として以下のタンパク質キナーゼを提供する。これらのタンパク質キナーゼは以下である：ＳＴＫ１１、ＰＲＫＡＧ２、ＥＰＨＡ２、ＥＧＦＲ、及びサイクリン依存性キナーゼ、特にＣＤＫ３。
【００６２】
ＩＩ  −  ＨＣＶ抗ウイルス薬剤としてのキナーゼ阻害剤
本発明者らにより同定されたヒト細胞タンパク質キナーゼを、新たなＨＣＶ抗ウイルス薬剤の同定、設計、及び開発のための標的として使用することができる。ＨＣＶ抗ウイルス薬剤として有用なキナーゼ阻害剤は、多種多様な分子のファミリーのいずれかに属しうる。限定はされないが、有機化合物（例、小分子、サッカライド、ステロイドなど）、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体（例、キナーゼに結合する抗体）、ペプチド、ポリペプチド、核酸分子（例、アンチセンス化合物、リボザイム、三重らせん分子、ＳＥＬＥＸ  ＲＮＡなど）を含む。既に上で言及した通り、本発明のキナーゼ阻害剤は、その基質のリン酸化を触媒する対象のタンパク質キナーゼの能力の阻害（例、完全な抑制又は部分的な減少）をもたらす種々の機構の１つ又は複数によりその効果を発揮しうる。このように、キナーゼ阻害剤は、例えば、対象のキナーゼをコードする遺伝子の発現を阻害、遮断、もしくは妨害することにより（遺伝子治療アプローチ）、及び／又は酵素活性を阻害、遮断、もしくは妨害することにより（キナーゼの基質の活性又は機能の競合又は調節を通じて、あるいはキナーゼ又はその触媒／酵素ドメインへの競合的結合を通じて、キナーゼ基質への及び／又はキナーゼエフェクターの上流及び／又は下流への競合的結合を通じて、を含む）その効果を発揮しうる。
【００６３】
本発明は、本明細書に開示するキナーゼの少なくとも１つの活性を阻害する能力について候補化合物をスクリーニングすることにより、ＨＣＶ感染を予防及び／又は処置するために有用な化合物を同定するための方法を提供する（以下参照）。本発明は、本発明のスクリーニング方法によりキナーゼ阻害剤として同定された化合物のいずれかを包含する。しかし、本発明は、また、本明細書に開示するタンパク質キナーゼの少なくとも１つの活性を阻害する当技術分野において既に公知である化合物の使用を包含する。これらのタンパク質キナーゼ阻害剤は、しばしば、抗癌剤として設計され、様々な企業（限定はされないが、Genetech、Boehringer Ingelheim、Imclone、Novartis、Roche、AstraZeneca、OSI、Onyx、Bayer、Pfizer、BMS、Sanofi、GSK、及びAmgenを含む）により開発される。
【００６４】
公知のキナーゼ阻害剤の例は、限定はされないが、メチル−２−シアノ−３，１２−ジオキソラン−１，９−ジエン−２８−オエート（ＣＨＵＫの阻害用）；セツキシマブ（ＥＧＦＲの阻害用）、ＡＥＥ７８８、パニツムマブ、ＢＭＳ−５９９６２６、ＡＲＲＹ−３３４５４３、ＸＬ６４７、カネルチニブ、ゲフィチニブ、ＨＫＩ−２７２、ＰＤ１５３０３５、ラパチニブ、バンデタニブ、及びエルロチニブ（ＥＧＦＲの阻害用）；ＢＭＳ−３８７０３２及びフラボピリドール（ＣＤＫ２、ＣＤＫ３、ＣＤＫ４、及びＣＤＫ８の阻害用）；ＸＬ６４７（ＥＰＨＢ４の阻害用）；ダサチニブ及びＡＺＭ−４７５２７１（ＳＲＣの阻害用）；イマチニブ（ＢＣＲの阻害用）；ダサチニブ（ＥＰＨＡ２の阻害用）；及びＡＺＤ−１１５２（ＡＵＲＫＢの阻害用）を含む。公知のキナーゼ阻害剤の他の例は、限定はされないが、ソラフェニブ（ＢＲＡＦの阻害用）；ＢＭＳ−５９９６２６（ＥＲＢＢ４の阻害用）；ＰＤ−０３３２９９１及びフラボピリドール（ＣＤＫ４の阻害用）を含む。
【００６５】
上記の通り、本出願者らは、同定されたキナーゼの一部の公知の阻害剤が、ＨＣＶ侵入及びＨＣＶ感染を顕著に阻害したことを示している（実施例１及び２を参照のこと）。したがって、本発明は、エルロチニブ（Tarceva（登録商標））、バンデタニブ（Zactima（登録商標））、ゲフィチニブ（Iressa（登録商標））、又はラパチニブ（Tyverb（登録商標））の使用を提供し、全てがＨＣＶ感染の予防及び／又は処置のためのＥＧＦＲ活性の阻害剤である。本発明は、また、ドルソモルフィン（ＡＭＰＫ活性の阻害剤）、ダサチニブ（Sprycel（登録商標））（ＥｐｈＡ２機能の阻害剤）、又はフラボピリドール（Alvocidib（登録商標））（ＣＤＫファミリー（ＣＤＫ３、ＣＤＣ２、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、及びＣＤＫ８を含む）の十分に特徴付けられた阻害剤）のＨＣＶ感染の予防及び／又は処置のための使用を提供する。
【００６６】
本出願者らは、また、エルロチニブ及びダサチニブによるＥＧＦＲ及びＥｐｈＡ２機能の阻害が、全ての主なＨＣＶ遺伝子型の及び肝臓移植の間でのＨＶＣ感染患者から単離されたウイルス株の大パネルの侵入を遮断したことを示している（実施例２を参照のこと）。したがって、本発明は、肝臓移植患者においてＨＣＶの再発を予防するためのエルロチニブ又はダサチニブの使用を提供する。
【００６７】
関連する態様において、本発明は、ＨＣＶ感染及びＨＣＶ関連疾患の予防又は処置のための医薬の製造のためのこれらの公知のキナーゼ阻害剤のいずれかの使用を提供する。
【００６８】
ＩＩＩ  −  ＨＣＶ抗ウイルス薬剤としてのキナーゼ阻害剤の同定の方法
上記の通り、本発明は、本発明の少なくとも１つのキナーゼの活性を阻害することにより、細胞中へのＨＣＶ侵入及び／又はＨＣＶ感染を低下、阻害、又は抑制する化合物の同定のための方法を提供する。種々のアッセイプロトコール及び検出技術が、当技術分野において周知であり、この目的のために当業者は容易に適応することができる。そのような方法は、限定はされないが、ハイスループットアッセイ（例、マイクロアレイ技術、ファージディスプレイ技術）ならびにインビトロ及びインビボでの細胞及び組織アッセイを含む。
【００６９】
特定の好ましい実施態様において、本発明の方法は、本発明の少なくとも１つのキナーゼを発現する（発現することができる）生物学的システムを、候補化合物と、候補化合物がキナーゼ活性を調節するために十分な条件下及び時間にわたりインキュベートすること；及びキナーゼの活性を測定することを含む。キナーゼの活性を減少させる候補化合物が、キナーゼ阻害剤及び潜在的なＨＣＶ抗ウイルス薬剤として同定されている。特定の実施態様において、本発明の方法は、より具体的には、本発明の少なくとも１つのキナーゼを発現する（発現することができる）生物学的システムを、候補化合物と、候補化合物がキナーゼの活性を調節するために十分な条件下及び時間にわたりインキュベートし、それによりテストシステムを得ること；生物学的システムを候補化合物が存在しない同じ条件下及び同じ時間にわたりインキュベートし、それによりコントロールシステムを得ること；テストシステムにおいて、キナーゼ活性を表す少なくとも１つの因子を測定すること；コントロールシステムにおいてその因子を測定すること；テストシステム及びコントロールシステムにおいて測定された因子を比較すること；ならびにテストシステムにおいて測定された因子がコントロールシステムにおいて測定された因子よりも小さい又は大きい場合に、候補化合物がキナーゼの活性を阻害することを決定することを含む。
【００７０】
本明細書において提供するスクリーニング方法は、本発明の１つ又は複数のキナーゼの活性を阻害することにより、それらの効果を発揮するＨＣＶ抗ウイルス薬剤の発見及び開発につながるであろう。これらの薬剤は、ＨＣＶ感染及び／又はＨＣＶ関連疾患及び症状の処置及び／又は予防において潜在的に有用でありうる。
【００７１】
Ａ．生物学的システム
本発明のアッセイ及びスクリーニング方法は、任意のタイプの生物学的システム（即ち、細胞、生体液、生体組織、又は動物）を使用して行われうる。特定の実施態様において、システムは、本発明の少なくとも１つのキナーゼを発現する（又は発現することができる）生物学的要素である（例、細胞、血液試料、組織サンプル、臓器の全体又は部分、例、肝臓、又は動物モデル）。特定の実施態様において、生物学的システムをＨＣＶに感染させてもよい（例、ＨＣＶ感受性細胞）。
【００７２】
特定の実施態様において、本発明のアッセイ及びスクリーニング方法を、標準的な組織培養プラスチックウェア中で増殖させることができる細胞を使用して行う。そのような細胞は、任意のいずれかの既知起源に由来する全ての正常な及び形質転換された細胞を含む。好ましくは、細胞は哺乳動物（ヒト又は動物、例えば齧歯類又はサルなど）由来である。より好ましくは、細胞はヒト由来である。哺乳動物細胞は、任意の臓器又は組織由来（例、脳、肝臓、肺、心臓、腎臓、皮膚、筋肉、骨組織、骨髄、又は血液など）及び任意の細胞タイプでありうる。適した細胞型は、限定はされないが、基底細胞、上皮細胞、血小板、リンパ球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、網状赤血球、顆粒球、単球、肥満細胞、神経細胞、神経芽細胞、巨大細胞、樹状細胞、マクロファージ、内皮細胞、腫瘍細胞、間質細胞、クッパー細胞、ランゲルハンス細胞、沿岸細胞、組織細胞（例えば筋細胞及び脂肪細胞など）、除核細胞などを含む。特定の実施態様において、本発明のアッセイ及びスクリーニング方法は、ＨＣＶ感受性であり、本発明の少なくとも１つのキナーゼを発現する細胞を使用して実施される。そのような細胞の例は、限定されないが、肝臓細胞又は肝細胞、初代ヒト肝細胞、ヒト又は他の種由来の初代細胞、肝細胞癌細胞、ＣａＣｏ２細胞、樹状細胞、胎盤細胞、子宮内膜細胞、リンパ節細胞、リンパ球様細胞（Ｂ及びＴ細胞）、末梢血単核球、及び単球／マクロファージを含む。
【００７３】
本発明のアッセイ及びスクリーニング方法を実施する際に使用される細胞は、初代細胞、二次細胞、又は不死化細胞（例、樹立細胞株）でありうる。それらは、当技術分野において周知の技術により調製してもよく（例えば、細胞を、患者又は健康なドナーからの採血により又は生検により得てもよい）、又は免疫及び微生物供給業者（例えば、American Type Culture Collection, Manassas, VA）から購入してもよい。あるいは又は加えて、細胞を遺伝子操作したもの、例えば、対象の遺伝子、例えば対象のキナーゼを発現する遺伝子などを含んでもよい。
【００７４】
特定の実施態様において、本発明のスクリーニング方法において使用される細胞は、２種以上の細胞タイプである。別の実施態様において、細胞は単一の細胞タイプである。好ましくは、細胞は、実質的に同種の細胞集団由来であり、それにおいて集団中の細胞の少なくとも約８０%、好ましくは少なくとも約９０%が同じ細胞タイプである。本発明の方法において使用される細胞は、同じ種の異なる被険体又は個体に由来しうる。しかし、好ましくは、細胞は単一の被験体又は個体に由来する。
【００７５】
本発明のアッセイを実施するための特定の細胞型及び／又は細胞株の選択は、いくつかの因子（例えばその活性が研究中であるキナーゼの性質など）及びアッセイの用途により影響されるであろう。例えば、一次薬物スクリーニング（即ち、スクリーニングの第１ラウンド）のために開発されたアッセイは、好ましくは、樹立細胞株を使用して実施してもよく、それは市販品であり、通常、比較的増殖が容易であり、一方、薬物開発プロセスにおいて後に使用されるアッセイは、好ましくは、初代細胞又は二次細胞を使用して実施してもよく、それはしばしば、不死化細胞よりも入手、維持、及び／又は増殖が困難であるが、インビボの場合より良好な実験モデルである。
【００７６】
本発明のアッセイ及びスクリーニング方法の実施の際に使用することができる樹立細胞株の例は、ＨｅｐＧ２肝臓肝細胞癌細胞、Ｈｅｐ３Ｂ肝臓肝細胞癌細胞、初代肝細胞、Ｈｕｈ７由来細胞株、及び不死化肝細胞を含む。本発明のスクリーニング方法において使用することができる初代細胞及び二次細胞は、限定はされないが、上皮細胞、血小板、リンパ球、単球、筋細胞、マクロファージ、肝細胞、内皮細胞などを含む。
【００７７】
本発明のアッセイにおいて使用される細胞は、標準的な細胞培養技術に従って培養してもよい。例えば、細胞を、適した容器中で、加湿９５%空気−５%ＣＯ２雰囲気を含むインキュベータに入れて３７℃の無菌環境において増殖させる。容器は撹拌又は静置培地を含みうる。種々の細胞培養液を使用してもよく、不明確の生体液（例えばウシ胎児血清など）を含む培地ならびに完全に確定されている培地、例えば293 SFM無血清培地（Invitrogen Corp., Carlsbad, CA）を含む。細胞培養技術は、当技術分野において周知であり、確立されたプロトコールを多様な細胞タイプの培養のために利用可能である（例えば、R.I. Freshney, "Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique", 2nd Edition, 1987, Alan R. Liss, Inc.を参照のこと）。
【００７８】
特定の実施態様において、スクリーニング方法を、マルチウェルアッセイプレートの複数のウェルに含まれる細胞を使用して実施する。そのようなアッセイプレートは、例えば、Strategene Corp.（La Jolla, CA）及びCorning Inc.（Acton, MA）の市販品であり、例えば、４８ウェル、９６ウェル、３８４ウェル、及び１５３６ウェルプレートを含む。
【００７９】
所望ならば、細胞生存を、アッセイの前に、例えば、標準的な技術（組織学、ラジオアイソトープを用いた定量的評価、光学もしくは走査電子顕微鏡又は蛍光顕微鏡を使用した視覚的観察を含む）を使用して決定することができる。あるいは、細胞生存を蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）により評価してもよい。
【００８０】
対象のキナーゼが非構成的に活性なキナーゼである実施態様において、基質分子のリン酸化が、細胞外又は他のタイプの刺激（本明細書において「キナーゼアクチベーター」と呼ぶ）に応答して起こる。したがって、特定の実施態様において、本発明のアッセイは、細胞を、キナーゼの活性化が起こり、基質のリン酸化（阻害剤の非存在において）をもたらすことができる条件及びそのような時間にわたりキナーゼアクチベーターに対して暴露することを含む。本発明の方法の実施で使用するキナーゼアクチベーターは、種々の刺激（環境ストレスシグナル、化学的ストレスシグナル、生化学的刺激、及びそのような刺激の任意の組み合わせを含む）のいずれかでありうる。当業者により十分理解される通り、本発明のアッセイの開発のためのキナーゼアクチベーターの選択は、その活性が候補化合物の存在において評価されるキナーゼの性質により影響されるであろう。
【００８１】
構成的に活性であるキナーゼ、即ち、刺激が無い場合に基質分子のリン酸化を触媒する能力を示すキナーゼに関連する実施態様において、本発明の方法は、キナーゼアクチベーターを使用したキナーゼ刺激を含まないであろう。
【００８２】
本発明の特定の方法において、細胞を試薬に暴露させること、細胞を試薬と接触させること、又は細胞を試薬とインキュベートすることは、試薬を、細胞を含む容器（例、マルチウェルプレートのウェル）に加えること、及び、細胞を、特定の試薬の意図される役割を達成する又は達成することができる条件及び期間にわたり適した培養液中に試薬を加えインキュベートすることを含む。より具体的には、細胞をキナーゼアクチベーターに暴露することは、好ましくは、対象の（非構成的に活性である）タンパク質キナーゼを活性化し、基質分子を阻害剤の非存在下でリン酸化することを可能にする条件下で行う。細胞を候補化合物に暴露し、所与のキナーゼの活性に及ぼすその効果について試験することは、好ましくは、そのようなキナーゼ活性の公知の阻害剤がその効果を発揮することを可能にする条件下で行われる。そのような条件は、当技術分野において周知であるか、又は、例えば、経験的に、当業者により容易に決定されうる。
【００８３】
特定の実施態様において、本発明のアッセイ及びスクリーニング方法は、細胞を飢餓状態にする段階を、それらを様々な試薬に暴露する前に含みうる。細胞の飢餓は、対象のタンパク質キナーゼが構成的に活性ではない場合に特に有用でありうる。細胞の飢餓は、任意の適した方法により、例えば、細胞を、血清又は増殖サプリメントを含まない培地中で培養することにより実施してもよい。特定の実施態様において、本発明のアッセイ及びスクリーニング方法は、細胞を固定することを含みうる。この段階を一般的に実施して、特定の状態に細胞を保存又は「凍結」し、好ましくは、細胞の構造の正確な表示が保持されるようにする。例えば、細胞の本来の大きさ及び形状を保持し、細胞材料の喪失を最小限にし、及び／又はその細胞内構成物の反応性及び／又は状態を保持することがしばしば望ましい。細胞を、当技術分野において周知である種々の適した化学的及び物理的方法のいずれかにより固定してもよい。特定の実施態様において、本発明のアッセイ及びスクリーニング方法は、細胞の透過化の段階を含む。透過化を実施して、細胞の細胞質又は細胞内分子、細胞の成分又は構造への接近を促進させる。特に、透過化によって、薬剤が細胞に侵入し、通常そのような透過化処理の非存在において細胞中へ浸透しうるよりも大きい細胞内の濃度に達することを可能にしうる。細胞の透過化を、任意の方法（限定はされないが、界面活性剤又は有機アルコールへの暴露を含む）により実施してもよい。
【００８４】
Ｂ．候補化合物
本発明のスクリーニング方法を、本発明において同定される少なくともキナーゼの活性を阻害する能力を有する化合物又は薬剤を同定するために使用してもよい。本発明のスクリーニング方法を、一般的に、ＨＣＶ感染及び／又はＨＣＶ関連疾患の予防及び／又は処置において有用な治療薬を開発するという目的で実施する。
【００８５】
当業者により理解される通り、化合物又は薬剤のいずれかの種類を、本発明の方法を使用して試験することができる。候補化合物は合成又は天然の化合物でありうる；それは、単一の分子又は異なる分子の混合物もしくは複合体でありうる。特定の実施態様において、本発明の方法を、１つ又は複数の化合物を試験するために使用する。他の実施態様において、本発明の方法を、化合物のコレクション又はライブラリーをスクリーニングするために使用する。本明細書で使用する「コレクション」という用語は、化合物、分子、又は薬剤の任意の組を指し、「ライブラリー」という用語は、構造類似体である化合物、分子、又は薬剤の任意の組を指す。
【００８６】
新規で有用な薬物候補の同定及び特徴付けへの従来のアプローチは、一般的に、化合物の大きなコレクション及び／又はライブラリーの生成、それに続く既知の又は未知の標的に対する試験を含む。天然産物及び化学的化合物の両方を、本発明の方法により試験してもよい。
【００８７】
天然産物のコレクションは、一般的に、微生物、動物、植物、又は海洋生物に由来する；それらは、ポリケチド、非リボゾームペプチド、及び／又はそのバリアント（非天然）を含む。化学的ライブラリーは、しばしば、既知の化合物又は天然産物スクリーニングを介した「ヒット」又は「リード」として同定される化合物の構造類似体からなる。化学的ライブラリーは、従来の自動合成、ＰＣＲ、クローニング、又は独自の合成方法により比較的簡単に調製される。
【００８８】
細菌、真菌、植物、及び動物の抽出物の形態での天然化合物のコレクションは、例えば、Pan Laboratories（Bothell, WA）又はMycoSearch（Durham, NC）から入手可能である。本発明の実施において使用することができる候補化合物のライブラリーを調製する又は多くの企業から購入してもよい。合成化合物ライブラリーは、例えば、Comgenex（Princeton, NJ）、Brandon Associates（Merrimack, NH）、Microsource（New Milford, CT）、及びAldrich（Milwaukee, WI）から市販品として入手可能である。候補化合物のライブラリーは、また、化学系大企業（例えば、Merck、Glaxo Welcome、Bristol-Meyers-Squibb、Novartis、Monsanto/Searle、及びPharmacia UpJohnを含む）により開発されており、市販品として入手可能である。加えて、天然コレクション、合成的に作製されたライブラリー及び化合物を、従来の化学的、物理的、及び生化学的な手段を通じて容易に修飾する。
【００８９】
本発明のキナーゼの活性の有用な阻害剤は、化学物質の多数のクラス（小分子、抗体、ペプチド、核酸分子、サッカライド、ステロイドなどを含む）内に見出されうる。特定の実施態様において、本発明の方法は、小分子である化合物又は薬剤を同定するために使用される。別の実施態様において、本発明の方法は、小分子ライブラリーをスクリーニングするために使用される。好ましい小さな有機分子は、約５０ダルトンを上回る及び約２，５００ダルトン未満；好ましくは６００〜７００ダルトン未満；より好ましくは約３５０ダルトン未満の分子量を有する。
【００９０】
本発明のアッセイにより試験及びスクリーニングされる候補化合物は、任意の薬理学的活性を有することが以前に未知である化合物でありうる、又は、当技術分野において既に公知の薬剤でありうる。特に、上記の通り、候補化合物は、当技術分野においてキナーゼ活性を阻害することが既に公知である薬剤又は薬剤の誘導体の中から選択することができる。例えば、プリン環は、種々のタンパク質キナーゼの阻害剤についての調査における良好な開始点と考えられ、２，６，９−三置換プリンライブラリーがそのような目的で開発されてきた（例えば、P. Shultz, Science, 1998, 281: 533-538；及びY. T. Chang et al., Chem Biol. 1999, 6: 361-375を参照のこと）。同様に、ＡＴＰ結合ポケットの保存された極めて十分に特徴付けられた性質は、キナーゼ阻害についての最も一般的で成功した標的の１つである。このように、ＡＴＰを標的にする化合物のライブラリーが生成されており、本発明のスクリーニング方法において使用することができる。あるいは、候補化合物は、キナーゼ媒介性事象により誘発される異常な細胞応答に関連する又は関連することが疑われる疾患又は病態生理学的状態の処置において有用であることが当技術分野において公知である薬物又は薬物の誘導体の中から選択することができる。
【００９１】
本発明の方法に従ったライブラリーのスクリーニングは、「ヒット」又は「リード」、即ち、所望の、しかし、最適化されていない生物学的活性を持つ化合物を提供する。有用な薬物候補の開発における次の段階は、通常、ヒット化合物の化学構造とその生物学的又は薬理学的活性の間での関係の分析を含む。分子構造及び生物学的活性は、定義された生物学的指標についての全体的な構造修飾の結果を観察することにより関連付ける。第１ラウンドのスクリーニングから利用可能な構造−活性関係の情報を次に使用し、小さな第二のライブラリーを生成することができ、それは、続いて、より高い親和性を伴う化合物についてスクリーニングされる。臨床的有用性のために要求される立体電子的、物理化学的、薬物動態学的、及び毒物学的要因を満たすために生物学的に活性な化合物の合成修飾を実施するプロセスは、リード最適化と呼ばれる。本発明のスクリーニング方法により同定される候補化合物は、同様に、構造−関係分析に供することができ、化学的に修飾され、改善された薬物候補を提供することができる。本発明は、また、これらの改善された薬物候補を包含する。
【００９２】
Ｃ．キナーゼ活性の阻害剤の同定
本発明のスクリーニング方法に従い、対象のキナーゼの活性を阻害する候補化合物の能力の決定は、キナーゼ又はキナーゼ活性を表す少なくとも１つの因子の活性の測定を含む。キナーゼの活性の決定のための方法は、当技術分野において公知である。キナーゼの活性を表す因子は、任意の適した因子（限定はされないが、発現されたキナーゼの量、リン酸化されたキナーゼ基質の量、キナーゼ基質のリン酸化に起因する細胞特性の修飾などを含む）でありうる。
【００９３】
本発明のスクリーニング方法において、候補化合物は、キナーゼ活性が候補化合物の存在において候補化合物の非存在においてよりも低い場合、又はキナーゼ活性を表す因子が候補化合物の存在及び非存在において異なる（因子とキナーゼ活性の間での関係に依存してより高い又はより低い）場合、対象のキナーゼの阻害剤として同定される。
【００９４】
結果の再現性は、同じ濃度の同じ候補化合物を用いて細胞を（例えば、アッセイプレートの２個以上ウェルにおいて）インキュベートすることにより試験してもよい。加えて、候補化合物が、化合物の性質及びその作用機構の性質に依存して、異なる濃度で効果的でありうるため、濃度を変えた候補化合物を、細胞を含む異なるウェルに加えてもよい。一般的に、約１fM〜約１０mMの濃度をスクリーニングのために使用する。好ましいスクリーニング濃度は約１０pM〜約１００μMである。さらに、本発明に従って異なる濃度の候補化合物をスクリーニングすることによって、その化合物についてＩＣ５０値を決定することが可能になる。
【００９５】
特定の実施態様において、本発明の方法は、１つ又は複数のネガティブ又はポジティブコントロール化合物の使用をさらに含む。ポジティブコントロール化合物は、スクリーニング方法において調査中のキナーゼの活性を阻害することが公知である任意の分子、薬剤、又は薬物でありうる。ネガティブコントロール化合物は、調査中のキナーゼの活性に対して効果を有さないことが公知である任意の分子、薬剤、又は薬物でありうる。これらの実施態様において、本発明の方法は、候補化合物の効果を、ポジティブ又はネガティブコントロール化合物（又はその非存在）の効果と比較することをさらに含む。そのようなネガティブ及びポジティブコントロール化合物は、当技術分野において公知であるが、又は、本明細書に記載する方法によりもしくは任意の他のキナーゼアッセイにより同定してもよい。
【００９６】
既に上で言及した通り、対象のキナーゼの阻害剤として同定された化合物は、単一の作用機構を通じてキナーゼ活性を阻害しうる。あるいは、それは、異なる作用機構の組み合わせを通じてキナーゼ活性を阻害しうる。例えば、化合物は、その細胞表面受容体へのキナーゼアクチベーターの結合を（例、妨げる、拮抗させる、又は破壊することにより）阻害しうる。あるいは、化合物は、その細胞表面受容体へのキナーゼアクチベーターの結合を促進又は刺激しうる。化合物は、追加で又はあるいは、下流の細胞内タンパク質キナーゼの活性化を予防又は促進し、及び／又は、それは基質分子へのリン酸基の転移に影響を与えうる。
【００９７】
Ｄ．キナーゼ活性の候補阻害剤の特徴付け
当業者により理解される通り、本発明のスクリーニング方法により同定されるキナーゼ阻害剤又は当技術分野において既に公知のキナーゼ阻害剤をさらに特徴付けることが一般的に望ましい。
【００９８】
例えば、候補化合物が、細胞培養システム（例、樹立細胞株）において対象のキナーゼの活性の阻害剤として同定されている場合、異なる細胞培養システム（例、初代又は二次細胞）においてこの能力を試験することが望まれうる。あるいは又は加えて、細胞中へのＨＣＶ侵入及び／又は細胞のＨＣＶ感染に及ぼす化合物の効果を直接的に試験することが望まれうる（例えば、ＨＣＶｐｐシステム及びＨＣＶｃｃシステムの使用を記載する実施例２を参照のこと）。薬物動態試験及び毒性試験を実施することも望まれうる。
【００９９】
本発明のスクリーニング方法によりキナーゼ阻害剤として同定された候補化合物を、また、インビボでの化合物の特性の決定を可能にするアッセイにおいてさらに試験してもよい。適した動物モデルは、しかし、限定はされないが、ＨＣＶ感染の試験のために開発されているヒト肝細胞を用いて再居住されたキメラトランスジェニックマウスを含む（Mercer, 2001）。これらの動物は、プラスミノーゲンアクチベータートランスジーン（Ａｌｂ−ｕＰＡ）を保有するＳＣＩＤマウス中への正常なヒト肝細胞の移植に由来する。Ａｌｂ−ｕＰＡトランスジーンの発現は、肝細胞の生着を促進するマウス肝細胞に対して細胞毒性がある。ＳＣＩＤマウスとの戻し交配によって、異種肝細胞による生着及び再増殖が可能になる。一旦、ヒト肝細胞がＳＣＩＤ／Ａｌｂ−ｕＰＡマウスにおいて安定的に生着されると、これらの動物は、Ｃ型肝炎を含むヒト向肝性（hepatotrophic）ウイルスに感染しうる。ヒトＳＣＩＤ／Ａｌｂ−ｕＰＡマウスモデルが、ＨＣＶ感染の制御のための中和抗体（Law, 2008）ならびに抗ウイルス剤（Vanwolleghem, 2007）の効力を試験するために成功裏に使用されてきた。他のマウスモデルは、ＨＣＶタンパク質を発現するトランスジェニックマウス（概説については、Barth, 2008を参照のこと）及びチンパンジー（Kato, 2008）を含む。
【０１００】
本明細書に記載するシステムは、キットにすることができる。例えば、本明細書で開示するキナーゼの１つ又は複数を発現する細胞又は本明細書で開示するキナーゼの１つ又は複数を発現し、ＨＣＶ複製を保持することが可能である細胞、あるいはその細胞ライセートを、種々の容器（例、バイアル、チューブ、マイクロタイターウェルプレート、ボトルなど）中にパッケージすることができる。他の試薬を、別々の容器中に含め、キット（例、ポジティブコントロールサンプル又は化合物、ネガティブコントロールサンプル又は化合物、緩衝液、細胞培養液、特異的検出プローブなど）として提供することができる。
【０１０１】
ＩＶ  −  ＨＣＶ感染及びＨＣＶ関連疾患の処置又は予防
本発明は、ＨＣＶ感染及び／又はＨＣＶ関連疾患の処置及び／又は予防のための新規治療プロトコールに関し、それは、出願者らにより標的として同定されたヒトタンパク質キナーゼの少なくとも１つを標的化するように設計される。より具体的には、本発明は、被験体のＨＣＶ感染又はＨＣＶ関連疾患を処置又は予防するための方法を提供し、被験体に本発明において同定されたキナーゼの活性を阻害する有効量の薬剤を投与する段階を含む。
【０１０２】
Ａ．適応
本発明のタンパク質キナーゼ阻害剤を治療的及び予防的方法において使用して、ＨＣＶ感染を処置及び／又は予防し、あるいは肝臓疾患又はＨＣＶ感受性細胞（例えば肝臓細胞、リンパ球様細胞、又は単球／マクロファージなど）に影響を与える病理学的状態を処置及び／又は予防してもよい。本発明の実施において、タンパク質キナーゼ阻害剤が、本発明のキナーゼの活性を阻害又は抑制することによりＨＣＶ−宿主細胞相互作用に干渉し、それにより細胞中へのＨＣＶ侵入及び／又は細胞のＨＣＶ感染を低下、阻害、遮断、又は予防する。
【０１０３】
本発明の処置の方法は、本発明のタンパク質キナーゼ阻害剤又は本発明のタンパク質キナーゼ阻害剤を含む医薬組成物を使用して達成されうる（以下を参照のこと）。これらの方法は、一般的に、有効量の少なくとも１つのタンパク質キナーゼ阻害剤、又はその医薬組成物の、それを必要とする被験体への投与を含む。投与は、当業者に公知の方法のいずれかを使用して実施されうる。特に、タンパク質キナーゼ阻害剤又はその組成物は、種々の経路（限定はされないが、エアゾル、非経口、経口、又は局所経路を含む）により投与されうる。
【０１０４】
一般的に、本発明のタンパク質キナーゼ阻害剤又は組成物を、有効量、即ち、その意図する目的を満たすために十分な量で投与する。投与されるキナーゼ阻害剤又は医薬組成物の正確な量は、被験体間で、処置される被験体の年齢、性別、体重、及び全体的な健康状態、所望の生物学的又は医学的応答（例、ＨＣＶ感染の予防又はＨＣＶ関連肝臓疾患の処置）などに依存して変動しうる。多くの実施態様において、有効量は、キナーゼの活性を阻害する量であり、ＨＣＶが被験体の感受性細胞に侵入すること及び／又は被験体の細胞に感染することを阻害又は予防し、それによりＨＣＶ感染を予防し、肝臓疾患又は別のＨＣＶ関連病理を被験体において処置又は予防する量である。
【０１０５】
本発明のタンパク質キナーゼ阻害剤及び組成物を、種々の治療的又は予防的方法において使用してもよい。特に、本発明は、ＨＣＶ関連の肝臓疾患又は病状を被験体において処置又は予防するための方法を提供し、それは被験体に、本発明のキナーゼの活性を阻害する有効量の本発明のタンパク質キナーゼ阻害剤（又はその組成物）を投与することを含み、それはＨＣＶが被験体の細胞に侵入又は感染することを阻害し、それにより肝臓疾患又は病状を被験体において処置又は予防する。肝臓疾患又は病状は、肝臓の炎症、肝線維症、肝硬変、及び／又は肝細胞癌（即ち、ＨＣＶ感染に関連する肝臓癌）でありうる。
【０１０６】
本発明は、また、ＨＣＶ関連疾患又は状態（肝臓疾患を含む）を被験体において処置又は予防するための方法を提供し、それは被験体に、本発明のキナーゼの活性を阻害する有効量の本発明のタンパク質キナーゼ阻害剤（又はその組成物）を投与することを含み、ＨＣＶが被験体の細胞に侵入又は感染することを阻害し、それによりＨＣＶ関連疾患又は状態を被験体において処置又は予防する。本発明の特定の実施態様において、タンパク質キナーゼ阻害剤又は組成物を急性Ｃ型肝炎と診断された被験体に投与する。本発明の別の実施態様において、タンパク質キナーゼ阻害剤を慢性Ｃ型肝炎と診断された被験体に投与する。
【０１０７】
そのような方法に従った本発明のタンパク質キナーゼ阻害剤又は組成物の投与は、個体により経験される症状（限定はされないが、急性Ｃ型肝炎の症状、例えば食欲減衰、疲労、腹痛、黄疸、そう痒、及びインフルエンザ様症状など；慢性Ｃ型肝炎の症状、例えば疲労、顕著な体重減少、インフルエンザ様症状、筋肉痛、関節痛、間欠性微熱、そう痒、睡眠障害、腹痛、食欲変化、嘔気、下痢、消化不良、認知変化、抑うつ、頭痛、及び気分変動など；肝硬変の症状、例えば腹水症、挫傷及び出血傾向、骨痛、静脈瘤（特に胃及び食道における）、脂肪下痢、黄疸及び肝性脳症など；ならびにＨＣＶに関連する肝外病変の症状、例えば甲状腺炎、晩発性皮膚ポルフィリン症、クリオグロブリン血症、糸球体腎炎、乾燥症候群、血小板減少症、扁平苔癬、糖尿病、及びＢ細胞リンパ増殖症候群などを含む）の少なくとも１つの寛解をもたらしうる。
【０１０８】
あるいは又は加えて、本発明の方法に従った本発明のタンパク質キナーゼ阻害剤又は組成物の投与は、ＨＣＶ感染又はＨＣＶ関連疾患の進行を減速、低下、停止、又は軽減する、あるいは感染又は疾患がなくなるまで進行を戻しうる。そのような方法に従った本発明のタンパク質キナーゼ阻害剤又は組成物の投与は、また、ウイルス感染数の低下、感染性ウイルス粒子数の低下、及び／又はウイルス感染細胞数の低下をもたらしうる。
【０１０９】
本発明に従った処置の効果を、ＨＣＶ感染及び／又は肝臓疾患の診断のための当技術分野において公知のアッセイのいずれかを使用してモニターしてもよい。そのようなアッセイは、限定はされないが、血清学的血液テスト、アルブミン、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）、及びガンマグルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）の１つ又は複数を測定するための肝機能テスト、ならびに異なる技術、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、転写介在増幅法（ＴＭＡ）、又は分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）などを使用した分子核酸テストを含む。
【０１１０】
本発明のタンパク質キナーゼ阻害剤及び組成物は、また、免疫療法において使用してもよい。したがって、本発明は、ＨＣＶとの接触による感受性細胞がＨＣＶに感染する可能性を低下させる方法を提供する。この方法は、感受性細胞を、ＨＣＶが感受性細胞に侵入又は感染することを阻害するように、本発明のキナーゼの活性を阻害する有効量の本発明のキナーゼ阻害剤又は組成物と接触させることを含み、それによりＨＣＶとの接触による細胞がＨＣＶに感染する可能性を低下させる。本発明は、また、ＨＣＶとの接触による被験体の感受性細胞がＨＣＶに感染する可能性を低下させる方法を提供する。この方法において、感受性細胞を本発明のタンパク質キナーゼ阻害剤又はその組成物と接触させることは、キナーゼ阻害剤又は組成物を被験体に投与することにより実施してもよい。
【０１１１】
感受性細胞又は被験体がＨＣＶに感染する可能性を低下させることは、ＨＣＶとの接触による感受性細胞又は被験体がＨＣＶに感染する確率を減少させることを意味する。この減少は、任意の有意な量、例えば、少なくとも２倍の減少、２倍を超える減少、少なくとも１０倍の減少、１０倍を超える減少、少なくとも５０倍の減少、５０倍を超える減少、少なくとも１００倍の減少、又は１００倍を超える減少でありうる。
【０１１２】
特定の実施態様において、被験体は、本発明のタンパク質キナーゼ阻害剤又は組成物の投与前にＨＣＶに感染している。他の実施態様において、被験体は、本発明のキナーゼ阻害剤又は組成物の投与前にＨＣＶに感染していない。さらに別の実施態様において、被験体はＨＣＶに感染していないが、しかし、暴露されている。特定の実施態様において、被験体はＨＩＶ又はＨＢＶに感染している。
【０１１３】
例えば、本発明の方法を使用して、肝臓移植の結果による被験体の感受性細胞がＨＣＶに感染する可能性を低下させることができる。既に上で言及した通り、罹患肝臓がＨＣＶ感染患者から摘出された場合、血清ウイルスレベルが急落する。しかし、健康な肝臓移植片を受けた後、ウイルスレベルがリバウンドし、数日以内に移植前レベルを超える可能性がある（Powers, 2006）。肝臓移植患者は、細胞中へのＨＣＶ侵入を低下、阻害、遮断、又は予防する本発明のタンパク質キナーゼ阻害剤の投与により効果が得られる。投与は、肝臓移植前、肝臓移植の間、及び／又は肝臓移植後に実施してもよい。
【０１１４】
本発明のキナーゼ阻害剤又は組成物の投与により効果が得られる他の被険体は、限定はされないが、ＨＣＶ感染した母親から生まれた乳児（特に、母親もＨＩＶ陽性である場合）；ＨＣＶ汚染血液又は血液汚染した医療機器に接触してきたヘルスケアワーカー；薬物を注射又はそうでなければ投与するための器具を共有することによりＨＣＶに暴露されてきた薬物使用者；ならびに不適切な予防方法を用いた刺青、耳／ボディーピアス、及び針治療を通じてＨＣＶに暴露されてきた人々を含む。
【０１１５】
本発明のタンパク質キナーゼ阻害剤又は組成物の投与により効果が得られる他の被険体は、限定はされないが、ＨＣＶ疾患進行の速度を増加させることが公知である１つ又は複数の因子を示す被険体を含む。そのような因子は、特に、年齢、性別（男性は、一般的に、女性よりも速い疾患進行を示す）、アルコール消費、ＨＩＶ同時感染（疾患進行の速度が顕著に増加する）、及び脂肪肝を含む。
【０１１６】
特定の実施態様において、本発明のタンパク質キナーゼ阻害剤又は組成物は、本発明の処置の方法に従って単独で投与される。他の実施態様において、本発明のキナーゼ阻害剤又は組成物は、少なくとも１つの追加の治療用薬剤と組み合わせて投与される。本発明のキナーゼ阻害剤又は組成物は、治療用薬剤の投与前、治療用薬剤と同時に、及び／又は治療用薬剤の投与後に投与されうる。
【０１１７】
本発明のキナーゼ阻害剤又は組成物との組み合わせで投与されうる治療用薬剤は、ＨＣＶ感染、又はＨＣＶ関連疾患もしくは状態の処置、管理又は予防において有益な効果を有することが当技術分野において公知である多種多様な生物学的に活性な化合物の中から選択されうる。そのような薬剤は、特に、抗ウイルス薬剤を含み、限定はされないが、インターフェロン（例、インターフェロンアルファ、ペグ化インターフェロンアルファ）、リバビリン、抗ＨＣＶ（モノクローナル又はポリクローナル）抗体、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、ＩＲＥＳ阻害剤、ヘリカーゼ阻害剤、アンチセンス化合物、リボザイム、及びその任意の組み合わせを含む。
【０１１８】
Ｂ．投与
本発明のタンパク質キナーゼ阻害剤を、（場合により、１つ又は複数の適切な薬学的に許容可能な担体又は賦形剤との製剤化後）、所望の投与量で、それを必要とする被験体に任意の適した経路により投与することができる。種々の送達システムが公知であり、本発明のキナーゼ阻害剤を投与するために使用することができる（錠剤、カプセル、注射溶液、リポソーム中のカプセル化、微粒子、マイクロカプセルなどを含む）。投与の方法は、限定はされないが、経皮、皮内、筋肉内、腹腔内、病巣内、静脈内、皮下、鼻腔内、肺、硬膜外、眼内（ocural）、及び経口経路を含む。本発明のキナーゼ阻害剤又は組成物は、任意の簡便な又は他の適切な経路により、例えば、点滴又はボーラス注射により、上皮内層又は粘膜皮膚内層（例、経口、粘膜、直腸、及び腸粘膜など）を通じた吸収により投与してもよい。投与は全身的又は局所的でありうる。非経口投与は、優先的に患者の肝臓に向けられ、例えば肝動脈への又は胆管中へのカテーテル法などによりうる。当業者により理解される通り、本発明のタンパク質キナーゼ阻害剤が追加の治療用薬剤との組み合わせで投与される実施態様において、キナーゼ阻害剤及び治療用薬剤は同じ経路（例、静脈内）により又は異なる経路（例、静脈内及び経口）により投与されうる。
【０１１９】
Ｃ．投与量
本発明の本発明のキナーゼ阻害剤（又は組成物）の投与は、送達される量が意図される目的のために効果的であるような投与量でありうる。投与経路、製剤化、及び投与量は、所望の治療効果、処置されるＨＣＶ感染又はＨＣＶ関連状態の重症度（既に存在する場合）、任意の他の感染の存在、患者の年齢、性別、体重、及び全体的な健康状態ならびに使用されるキナーゼ阻害剤又は組成物の効力、バイオアベイラビリティ、及びインビボでの半減期、併用治療の使用（又は未使用）、及び他の臨床因子に依存しうる。これらの因子は、治療の経過において主治医により容易に決定可能である。あるいは又は加えて、投与量は、動物モデル（例、チンパンジー又はマウス）を使用した試験から決定することができる。これらの又は他の方法に基づいて用量を調整して、最大効力を達成することは、当技術分野において周知であり、訓練を受けた医師の能力の範囲内である。試験が本発明のキナーゼ阻害剤を使用して行われるにつれて、さらなる情報が、適切な投与量レベル及び処置時間に関して出現するであろう。
【０１２０】
本発明の処置は、単回用量又は複数回用量からなりうる。このように、本発明のキナーゼ阻害剤、又はその組成物の投与は、特定の期間にわたり一定、又は定期的、及び特定の間隔、例えば、１時間１回、１日１回、週１回（又は他の複数日間隔）、月１回、年１回（例、時間放出形態）でありうる。あるいは、送達は、所与の期間の間に複数回（例、１週間に２回又はそれ以上；１ヶ月に２回又はそれ以上など）行われる。送達は、一定期間にわたる持続的送達（例、静脈内送達）でありうる。
【０１２１】
一般的に、投与されるキナーゼ阻害剤の量は、好ましくは、被験体の体重の約１ng/kg〜約１００mg/kg、例えば、被験体の体重の約１００ng/kg〜約５０mg/kg；又は被験体の体重の約１μg/kg〜約１０mg/kg；又は被験体の体重の約１００μg/kg〜約１mg/kgの範囲でありうる。
【０１２２】
Ｖ  −  医薬組成物
上で述べた通り、本発明のタンパク質キナーゼ阻害剤は、それ自体で又は医薬組成物として投与されうる。したがって、本明細書に記載する有効量のキナーゼ阻害剤及び少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体又は賦形剤を含む医薬組成物を提供する。特定の実施態様において、組成物は、１つ又は複数の追加の生物学的に活性な薬剤をさらに含む。
【０１２３】
本発明のキナーゼ阻害剤及び医薬組成物は、任意の量で、及び所望の予防的及び／又は治療的効果を達成するために効果的な任意の投与経路を使用して投与されうる。最適な医薬製剤は、投与の経路及び所望の投与量に依存して変動しうる。そのような製剤は、身体の状態、安定性、インビボでの放出速度、及び投与される活性成分のインビボでのクリアランス速度に影響を与えうる。
【０１２４】
本発明の医薬組成物は、投与の簡単さ及び投与量の均一性のために投与単位形態で製剤化してもよい。「単位投与形態」という表現は、本明細書で使用される通り、処置される患者のための本発明のキナーゼ阻害剤の物理的に分離した単位を指す。しかし、組成物の全１日投与量が、適切な医学的判断の範囲内で主治医により決定されうることが理解されるであろう。
【０１２５】
Ａ．製剤化
注射用調製物、例えば、無菌注射用水又は油性懸濁剤を、公知の技術に従い、適した分散剤又は湿潤剤、及び懸濁剤を使用して製剤化してもよい。無菌注射用調製物は、また、非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤又は溶剤中の、例えば、２，３−ブタンジオール溶液としての無菌注射用溶液、懸濁液、又はエマルジョンでありうる。用いてもよい許容可能なビヒクル及び溶剤の内、水リンゲル液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．、及び等張塩化ナトリウム溶液がある。また、無菌の固定油が、溶液又は懸濁媒質として慣習的に用いられる。この目的のために、任意の無菌固定油を用いることができる（合成モノ又はジグリセリドを含む）。脂肪酸、例えばオレイン酸なども注射用製剤の調製において使用してもよい。無菌液体担体は、非経口投与のための無菌液体形態の組成物において有用である。
【０１２６】
注射用製剤を、例えば、細菌保持フィルターを通じたろ過により、又は使用前に滅菌水もしくは他の無菌注射用媒質に溶解もしくは分散することができる無菌固形組成物の形態で滅菌薬剤を取り込ませることにより滅菌することができる。無菌の溶液又は懸濁液である液体の医薬組成物は、例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、又は皮下注射により投与することができる。注入は、単回又は段階的注入によりうる。必要又は所望である場合、組成物は、注入の部位で疼痛を和らげるための局部麻酔薬を含んでもよい。
【０１２７】
活性成分（本明細書においてキナーゼ阻害剤）の効果を延長するために、皮下又は筋肉内注射からの成分の吸収を減速させることがしばしば望ましい。非経口投与された活性成分の吸収を遅延させることは、成分を油ビヒクル中に溶解又は懸濁させることにより達成されうる。注射用デポー形態が、生分解性ポリマー（例えばポリラクチド−ポリグリコリドなど）中で活性成分のマイクロカプセル化マトリックスを形成することにより作られる。活性成分とポリマーの比率及び用いられる特定のポリマーの性質に依存して、成分放出の速度を制御することができる。他の生分解性ポリマーの例は、ポリ（オルトエステル）及びポリ（無水物）を含む。デポー注射用製剤は、また、身体組織と適合性があるリポソーム又はマイクロエマルジョン中に活性成分を捕捉することにより調製することができる。
【０１２８】
経口投与のための液体投与形態は、限定はされないが、薬学的に許容可能なエマルジョン、マイクロエマルジョン、溶剤、懸濁剤、シロップ、エリキシル、及び加圧組成物を含む。キナーゼ阻害剤に加えて、液体投与形態は、当技術分野において一般に使用される不活性な希釈剤、例えば、水又は他の溶剤、可溶化剤及び乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実油、落花生油、コーン油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、及びゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、及びソルビタン脂肪酸エステル、ならびにその混合物を含みうる。不活性な希釈剤の他、経口組成物は、また、アジュバント、例えば湿潤剤、懸濁剤、保存剤、甘味剤、香味剤、及び香料剤、増粘剤、着色剤、粘性調整剤、安定剤、又は浸透圧調整剤などを含みうる。経口投与のための適した液体担体の例は、水（潜在的に上の添加剤、例、セルロース誘導体、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース溶液などを含む）、アルコール（一価アルコール及び多価アルコール、例えばグリコールなどを含む）及びそれらの誘導体、ならびに油（例、分画されたヤシ油及びラッカセイ油）を含む。加圧組成物については、液体担体はハロゲン化炭化水素又は他の薬学的に許容可能な噴霧剤でありうる。
【０１２９】
経口投与のための固形投与形態は、例えば、カプセル、錠剤、丸剤、粉末剤、及び果粒剤を含む。そのような固形投与形態において、本発明のキナーゼ阻害剤を、少なくとも１つの不活性な、生理学的に許容可能な賦形剤又は担体、例えばクエン酸ナトリウム又はリン酸カルシウム及び以下の１つ又は複数と混合してもよい：（ａ）充填剤又は増量剤、例えばデンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、及びケイ酸など；（ｂ）結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、及びアカシアなど；（ｃ）保湿剤、例えばグリセロールなど；（ｄ）崩壊剤、例えば寒天−寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモデンプン又はタピオカデンプン、アルギン酸、特定のケイ酸塩、及び炭酸ナトリウムなど；（ｅ）溶液遅延剤、例えばパラフィンなど；吸収促進剤、例えば四級アンモニウム化合物など；（ｇ）湿潤剤、例えば、セチルアルコール及びグリセロールモノステアレートなど；（ｈ）吸収剤、例えばカオリン及びベントナイト粘土など；ならびに（ｉ）潤滑剤、例えばタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固形ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、及びその混合物など。固形製剤のために適した他の賦形剤は、表面修飾剤、例えば非イオン性及び陰イオン性表面修飾剤を含む。表面修飾剤の代表的な例は、限定はされないが、ポロキサマー１８８、塩化ベンザルコニウム、ステアリン酸カルシウム、セトステアリルアルコール、セトマクロゴール乳化ワックス、ソルビタンエステル、コロイド状二酸化ケイ素、リン酸塩、ドデシル硫酸ナトリウム、ケイ酸アルミウニムマグネシウム、及びトリエタノールアミンを含む。カプセル、錠剤、及び丸剤の場合において、投与形態は、また、緩衝剤を含んでもよい。
【０１３０】
類似の型の固形組成物を、ラクトース又は乳糖などならびに高分子量ポリエチレングリコールなどの賦形剤を使用した軟質及び硬質充填ゼラチンカプセル中の充填剤として用いてもよい。錠剤、糖衣丸、カプセル、丸剤、及び果粒剤の固形投与形態は、コーティング剤及びシェル、例えば腸溶コーティング剤、放出制御コーティング剤、及び製剤処方分野において周知の他のコーティング剤を用いて調製することができる。それらは、場合により、乳白剤を含んでもよく、また、活性成分だけを、又は好ましくは、腸管の特定の部分において、場合により、遅延様式で放出するようにする。組成物であることもでき、使用することができる包埋組成物の例は、ポリマー物質及びワックスを含む。
【０１３１】
特定の実施態様において、処置を必要とする部位（例、肝臓）に局所的に本発明の組成物を投与することが望まれうる。これは、例えば、限定はされないが、外科手術（例、肝臓移植）中での局所注入により、局所適用、注射により、カテーテルを用いて、坐剤を用いて、あるいは皮膚パッチ又はステント又は他のインプラントを使用して達成されうる。
【０１３２】
局所投与のために、組成物は、好ましくは、担体（例えば水、グリセロール、アルコール、プロピレングリコール、脂肪アルコール、トリグリセリド、脂肪酸エステル、又は鉱油など）を含むことができるゲル、軟膏、ローション、又はクリームとして製剤化される。他の局所担体は、液化石油、パルミチン酸イソプロピル、ポリエチレングリコール、エタノール（９５%）、ポリオキシエチレンモノラウレート水溶液（５%）、又はラウリル硫酸ナトリウム水溶液（５%）を含む。他の材料、例えば抗酸化剤、保湿剤、粘性安定剤、及び類似の薬剤などを必要に応じて加えてもよい。
【０１３３】
また、特定の実例において、本発明の組成物を、皮膚の上、中、又は下に置いた経皮デバイス内に配置してもよい。そのようなデバイスは、受動的又は能動的な放出機構により活性成分を放出するパッチ、インプラント、及び注射を含む。経皮投与は、身体の表面ならびに上皮組織及び粘膜組織を含む体内の管の内膜にわたる全ての投与を含む。そのような投与は、ローション、クリーム、フォーム、パッチ、懸濁剤、溶剤、及び坐剤（直腸及び膣）中に本組成物を使用して行ってもよい。
【０１３４】
経皮投与は、活性成分（即ち、キナーゼ阻害剤）及び皮膚に非毒性である担体を含む経皮パッチの使用を通じて達成されうるが、皮膚から血流中への全身吸収のために成分の送達を可能にする。担体は、任意の数の形態、例えばクリーム及び軟膏、ペースト、ゲル、閉鎖デバイスなどであってよい。クリーム及び軟膏は、粘性液体又は水中油型又は油中水型のいずれかの半固形エマルジョンでありうる。活性成分を含む石油又は親水性石油中に分散された吸収性粉末剤からなるペーストが適しうる。種々の閉鎖デバイスを使用して、血流中に活性成分を放出してもよい（例えば担体を含有又は含有しない活性成分を含むレザバーを覆う半透膜、又は活性成分を含むマトリクスなど）。
【０１３５】
坐剤製剤は、従来の材料（カカオ脂、坐剤の融点を変えるためのワックスの添加を行う又は行わない、及びグリセリンを含む）から作られうる。水溶性の坐剤の基剤（例えば種々の分子量のポリエチレングリコールなど）も使用してもよい。
【０１３６】
本発明の医薬組成物が、ＨＣＶ感受性細胞がＨＣＶに感染することを予防するための「ワクチン」として使用される場合、医薬組成物は、当技術分野において公知のワクチン担体、例えばサイログロブリン、アルブミン、破傷風トキソイド、及びポリアミノ酸（例えばＤ−リジン及びＤ−グルタミン酸塩のポリマーなど）をさらに含みうる。ワクチンは、また、種々の周知のアジュバント、例えば、不完全フロイントアジュバント、ミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、モノホスホリル脂質Ａ（MPL、GlaxoSmithKline）、サポニン、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、モンタニド、ビタミンＡ、ならびに生分解性油、例えばスクアレン及び／又はトコフェロール、Ｑｕｉｌ  Ａ、Ｒｉｂｉ  Ｄｅｔｏｘ、ＣＲＬ−１００５、Ｌ−１２１、及びその組み合わせなどから調製される種々の油中水型エマルジョンなどのいずれかを含んでもよい。
【０１３７】
種々の製剤を製造するための材料及び方法は、当技術分野において公知であり、対象発明を実施するために適応してもよい。抗体の送達のための適した製剤は、例えば、"Remington's Pharmaceutical Sciences", E. W. Martin, 18th Ed., 1990, Mack Publishing Co.: Easton, PA.に見出すことができる。
【０１３８】
Ｂ．追加の生物学的に活性な薬剤
特定の実施態様において、キナーゼ阻害剤は、本発明の医薬組成物における唯一の活性成分である。他の実施態様において、医薬組成物は、１つ又は複数の生物学的に活性な薬剤をさらに含む。適した生物学的に活性な薬剤の例は、限定はされないが、ワクチンアジュバント及び治療用薬剤、例えば抗ウイルス薬剤（上記）、抗炎症剤、免疫調節剤、鎮痛剤、抗微生物剤、抗菌剤、抗生物質、抗酸化剤、防腐剤、及びその組み合わせなどを含む。
【０１３９】
本発明の実施における使用のために適した抗ウイルス薬剤は、限定はされないが、同じタンパク質キナーゼに対して効果を有するもの、異なる標的分子（即ち、タンパク質キナーゼではなく又は同じタンパク質キナーゼではない）に対する効果を有するもの（ウイルス侵入、ウイルス内在化、ウイルス複製及び／又はウイルス放出に関与する標的分子を含む）、ウイルス耐性の発生を予防又は低下させるものなどを含む。本発明のキナーゼ阻害剤は、また、ＩＦＮ発現を誘導する薬剤との組み合わせで使用してもよい。
【０１４０】
本発明の抗ウイルス剤の組み合わせは、抗ウイルス活性のために要求されるいずれかの薬物の効果的な用量を低下させ、それにより毒性を低下させるだけでなく、また、複数の機構を通じてウイルスを攻撃することによる絶対的な抗ウイルス効果を改善しうる処置の手段を提供する。同様に、組み合わせは、単剤治療に対するウイルス耐性の発生を回避するための手段を提供し、それによりより効率的な処置を提供する。
【０１４１】
本発明の医薬組成物において、キナーゼ阻害剤及び追加の治療用薬剤を、キナーゼ阻害剤及び治療用薬剤の同時、別々、又は連続投与のための１つ又は複数の調製物において組み合わせてもよい。より具体的には、本発明の組成物を、キナーゼ阻害剤及び治療用薬剤を一緒に又は互いに独立して投与することができるような方法で製剤化してもよい。例えば、キナーゼ阻害剤及び治療用薬剤を、単一の組成物中で一緒に製剤化することができる。あるいは、それらを別々に保持（例、異なる組成物及び／又は容器中）及び投与してもよい。
【０１４２】
Ｃ．キットの医薬包装
別の態様において、本発明は、本発明の医薬組成物の１つ又は複数の成分を含む１つ又は複数の容器（例、バイアル、アンプル、テストチューブ、フラスコ、又はボトル）を含む医薬包装又はキットを提供し、本発明のキナーゼ阻害剤の投与を可能にする。
【０１４３】
医薬包装又はキットの異なる成分は、固体（例、凍結乾燥）又は液体形態で供給してもよい。各々の成分は、一般的に、そのそれぞれの容器中での一定分量として適しておりあるいは濃縮形態で提供される。医薬包装は、凍結乾燥成分の再構成のための媒体を含んでもよい。キットの個々の容器は、好ましくは、商業販売のために厳重に密封される。
【０１４４】
特定の実施態様において、医薬包装又はキットは、１つ又は複数の追加の治療用薬剤（例、上記の１つ又は複数の抗ウイルス薬剤）を含む。場合により、容器に関連する通知又は添付文書が、医薬的又は生物学的製品の製造、使用、又は販売を規制する政府機関により規定される形式でありうるが、その通知は、ヒト投与のための製造、使用、又は販売の機関による認可を反映する。添付文書の通知は、本明細書に開示する処置の方法に従った医薬組成物の使用のための説明書を含みうる。
【０１４５】
認証標識（例、バーコード、ラジオ周波、ＩＤタグなど）がキット中又は上に存在しうる。認証標識を使用して、例えば、品質管理、在庫管理、ワークステーションの間での追跡移動などの目的のためのキットを独自に特定することができる。
【０１４６】
実施例
以下の実施例は、本発明を構成し、実施する好ましい様式の一部を記載する。しかし、実施例が例示目的だけのためであり、本発明の範囲を限定することを意味しないことを理解すべきである。さらに、実施例における記載が過去時制で提示されない場合、テキストは、明細書と同様に、実験が実際に実施されたこと又はデータが実際に得られたことを示唆しているわけではない。
【０１４７】
下で報告する結果の一部が、15th International Symposium on Hepatitis C Virus and Related Viruses（San Antonio, Texas, USA, 5-9 October, 2008）で提示され、"Identification of cellular kinases as co-factors for hepatitis C virus entry using a functional high-throughput siRNA screen"（J. Lupberger et al.による）と表題の付けられた要約にまとめられている。下で報告する他の結果は、Molecular Systems Biologyに提出された原稿（J. Lupberger et al., "Genome-wide analysis of human kinases as host factors for hepatitis C virus entry"）の題目である。
【０１４８】
実施例１：ＨＣＶ侵入のための補助因子としての宿主細胞キナーゼの予備同定
１．材料及び方法
細胞及びレプリコン    本試験で使用されるＨＥＫ  ２９３Ｔ、Ｈｕｈ７、及びＨｕｈ７．５．１細胞が以前に記載されている（Bartosch, 2003; Barth, 2003; Zhong, 2005）。初代ヒト肝細胞を、以前に記載された通りに単離及び培養した（David, 1998、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）。本明細書で使用するサブゲノムＨＣＶレプリコンＪＦＨ１−ＳＧＲも以前に記載されている（Kato, 2005）。
レトロウイルスＨＣＶ及びＶＳＶ擬似粒子の産生    Ｈ７７に由来するＨＣＶｐｐ及び由来するＶＳＶｐｐを、以前に記載された通りに生成した（Bartosch, 2003; Barth, 2006）。エンベロープ糖タンパク質をもたない擬似粒子（ｐｐ）（コントロールｐｐ）をネガティブコントロールとして使用した（Barth, 2003）。ＨＣＶｐｐ及びＶＳＶｐｐ調製物を、Ｈｕｈ７感染後に等しいルシフェラーゼ活性を得るために調整した。
組換えＨＣＶの産生及び感染アッセイ    バイシストロニックプラスミドｐＦＫ−Ｌｕｃ−Ｊｃ１（Koutsoudakis, 2006）は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子ならびにＪ６ＣＦ及びＪＦＨ１セグメントからなるキメラＨＣＶゲノム（Ｊｃ１と名付けられる）をコードする。インビトロでのＨＣＶ  ＲＮＡ合成及びＲＮＡトランスフェクションを、以前に記載された通りに行った（Wakita, 2005）。トランスフェクト細胞からの培養上清を、以前に記載された通りに、Amicon Ultra 15（Millipore, USA）を使用して精製及び濃縮し、そのまま使用した、又は４℃もしくは−８０℃で保存した。ウイルスを、少数の小さな改変を伴うＨｕｈ７．５．１細胞での限界希釈アッセイを使用することにより滴定し、ＴＣＩＤ５０値を以前に記載された方法（Lindenbach, 2005）に基づき算出した。
ｓｉＲＮＡを使用したハイスループット遺伝子サイレンシング    Human Kinase siRNA Set Version 2.0（Qiagen, Germany）が、４つの独立したｓｉＲＮＡ／標的遺伝子の６９１プールからなり、Ｈｕｈ７細胞において６９１の細胞キナーゼ及び関連タンパク質を発現停止させるために適用された。５，０００個細胞／０．３cm２を、３．５pmol  ｓｉＲＮＡを用いて、１μLのInterferrinトランスフェクション試薬（Polyplus, France）を使用してリバーストランスフェクトした。トランスフェクションから７２時間後、上清を除去し、細胞を５０μLのＨＣＶｐｐ及びＶＣＶｐｐを用いて比較感染させた。１００μLの新鮮培養液を６時間のインキュベーション後に３７℃で加え、感染から４８時間後、細胞培養上清を全て除去し、細胞を１００μLのGlo溶解バッファー（Promega, USA）を使用して溶解した。ホタルルシフェラーゼ活性を、細胞溶解から１０分後に、２５%（ｖ／ｖ）Bright-Gloルシフェラーゼ基質（Promega, USA）を使用して、ハイスループットルミノメーター（Berthold, Germany）により測定した。特定の感染性を、Ｄｃタンパク質アッセイキット（Biorad, USA）を使用した全タンパク質の標準化により評価した。
新規ＨＣＶ侵入因子の同定    遺伝子サイレンシングの効果を、非特異的ｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトされた細胞と比較したＨＣＶｐｐ侵入の増加又は減少により定義した。詳細には、統計分析を、以前に記載された通りに実施し（Ploner, 2006; Raffelsberger, 2008; Wettenhall, 2004）、真の陽性テスト結果（第二種の過誤）にペナルティーを科すことなく偽陽性（第一種の過誤）の最大の低下を確実にする。ＨＣＶ侵入に対するＨＣＶ特異的な効果を、比較実験において実施されたコントロールウイルス（ＶＳＶｐｐ）の侵入に及ぼす有意な類似の効果の非存在として決定した（ＨＣＶ特異的な効果：ＨＣＶ侵入は有意に減少し、ＶＳＶｐｐ侵入は有意に不変又は増加した。及び逆もまた同様）。加えて、ウイルス侵入機構に対して潜在的で一般的な重要性を有するタンパク質キナーゼを同定し、それについて、対応する遺伝子のサイレンシングが、ＶＳＶｐｐ侵入に対する遺伝子サイレンシングにより引き起こされる変化にかかわらず、細胞中へのＨＣＶウイルス侵入の顕著な低下をもたらした（再現性が統計的に有意な場合、ＨＣＶ侵入の＞８０%阻害と等価である）。感染性ＨＣＶのライフサイクルに及ぼす同定された候補キナーゼの効果を、上のｐｐ−ｓｉＲＮＡスクリーニングについて記載された通りに、ＨＣＶｃｃ感染に対する候補遺伝子サイレンシングの効果を測定する第２のｓｉＲＮＡスクリーニングにより検証した。さらに、第２のＨＣＶｃｃ−ｓｉＲＮＡスクリーニングの特異性を確実にするために、トランスフェクトされたｓｉＲＮＡのＭＴＴ細胞毒性テストを、以前に記載された通りに（Cole, 1986）比較実施した。
タンパク質キナーゼ阻害剤を使用したＨＣＶ感染の阻害    本試験において使用された全ての阻害剤をLC Laboratories（USA）から得た。使用前に、それらをＤＭＳＯに溶解し、Ｈｕｈ７．５．１細胞培養液で希釈した（Zhong, 2005）。インキュベーションに続き、細胞でのＨＣＶｐｐ侵入及びＨＣＶｃｃ感染を、以前に報告された通りに（Pestka, 2007; Zeisel, 2007）ルシフェラーゼレポーター遺伝子発現又はＨＣＶ  ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲにより評価した。
ノーザンブロッティング    Ｘｂａｌ及びＥｃｏＲＩを用いて消化されたプラスミドＪＫＨ１（Wakita, 2005）に由来する９．７kbフラグメントを、α３２Ｐ−ＣＴＰを用いて、NEBlotキット（NEB, USA）を使用して標識した。ノーザンブロッティングを標準的なプロトコール（F. M. Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley 1 Sons, Inc., 2007）に従って実施した。
【０１４９】
２．ＨＣＶ侵入のための補助因子としての宿主細胞キナーゼの同定
最先端の機能的なハイスループットｓｉＲＮＡ  ＨＣＶｐｐ侵入スクリーニングを使用し、本出願者らは、宿主細胞キナーゼの２つのパネルを同定している。第１パネルのキナーゼは、無関係のコントロールウイルス（ＶＳＶｐｐ）の侵入に影響を与えることなく、ＨＣＶｐｐ侵入の有意な特異的阻害を示す。第２パネルのキナーゼは、ＶＳＶｐｐ侵入に対する遺伝子サイレンシングにより引き起こされる変化にかかわらず、ＨＣＶｐｐ侵入／感染の顕著な阻害を示す。
【０１５０】
選択基準を適用することにより、キナーゼ及び関連タンパク質の６９１個の遺伝子の内の６９個のサイレンシングが、無関係なコントロールウイルス（ＶＳＶｐｐ）の侵入に影響を与えることなく、ＨＣＶｐｐ侵入に対して特異的かつ機能的な影響をもたらした。これらの６９個のキナーゼは、図１に提示され、以下である：ＦＧＲ、ＣＨＵＫ、ＰＳＫＨ１、ＤＧＫＢ、ＩＬＫ、ＣＫＳ１Ｂ、ＰＬＫ３、ＧＫＡＰ１、ＣＡＬＭ２、ＲＰＳ６ＫＡ５、ＭＡＧＩ１、ＬＴＫ、ＩＴＰＫＡ、ＰＩＰ５Ｋ２Ａ、ＡＤＫ、ＳＴＫ１１、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＨＫＢ、ＢＵＢ１Ｂ、ＳＴＫ３８、ＴＹＫ２、ＰＲＫＣＡＢＰ、ＥＧＦＲ、ＣＳＫ、ＡＫ３、ＦＥＲ、ＰＲＫＤ２、ＣＤＫＬ３、ＰＤＩＫ１Ｌ、ＣＫＭＴ１、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＣＤＫ２、ＣＡＭＫ２Ｇ、ＥＰＨＢ４、ＧＡＫ、ＰＡＣＳＩＮ２、ＳＧＫ２、ＤＣＡＭＫＬ１、ＭＡＰ３Ｋ１３、ＩＲＡＫ２、ＡＲＡＦ、ＰＡＫ４、ＭＡＰＫ７、ＡＴＲ、ＳＲＣ、ＰＴＫ２Ｂ、ＥＰＨＢ１、ＢＣＲ、ＥＰＨＡ２、ＰＩＰ５Ｋ２Ｂ、ＣＤＫ３、ＳＴＫ２４、ＭＫＮＫ２、ＰＫＭＹＴ１、ＦＥＳ、ＡＣＶＲ２Ｂ、ＭＡＰ２Ｋ１ＩＰ１、ＡＰＥＧ１、ＪＡＫ１、ＡＵＲＫＢ、ＣＨＫＡ、ＰＲＫＡＣＧ、ＤＤＲ２、ＰＩＫ３Ｃ２Ａ、ＡＤＲＢＫ１、ＣＡＬＭ３、ＦＡＳＴＫ、ＷＥＥ１、及びＪＡＫ２。選択基準に一致する同定されたキナーゼの数は、研究された遺伝子の総数の１０%に相当する。興味深いことに、同定された分子は、確立された薬物による治療的介入に有用な９つのキナーゼを含む。これらの９つのキナーゼは以下である：ＣＨＵＫ、ＥＧＦＲ、ＣＤＫ２、ＥＰＨＢ４、ＳＲＣ、ＢＣＲ、ＥＰＨＡ２、ＣＤＫ３、及びＡＵＲＫＢ。
【０１５１】
６９１個のキナーゼの内の３２個のサイレンシングが、ＶＳＶｐｐ侵入に対する遺伝子サイレンシングにより引き起こされる変化にかかわらず、ＨＣＶ侵入の極端な阻害をもたらした。これらの３２個のキナーゼは、図２に提示され、以下である：ＦＮ３Ｋ、ＣＩＢ２、ＢＣＫＤＫ、ＮＥＫ９、ＳＴＫ３３、ＢＲＡＦ、ＳＴＫ２２Ｃ、ＰＩ４ＫＩＩ、ＲＩＯＫ１、ＣＫＢ、Ｓｈａｒｐｉｎ、ＲＰＳ６ＫＬ１、ＦＬＴ３ＬＧ、ＨＩＰＫ３、ＣＤＣ２、ＥＲＢＢ４、ＣＤＣ２Ｌ１、ＰＡＮＫ３、ＳＫＩＰ、ＭＡＰ４Ｋ５、ＡＴＭ、ＣＤＫ４、ＫＩＡＡ１４４６、ＢＭＰ２Ｋ、ＢＭＸ、ＣＤＫ８、ＴＮＫ２、ＮＥＫ４、ＥＰＨＡ３、ＦＧＦＲ４、ＭＡＰ３Ｋ７ＩＰ１、及びＭＡＰＫＡＰ１。選択基準に一致する同定されたキナーゼの数は、研究された遺伝子の総数の約５%に相当する。同定された分子は、確立された薬物による治療的介入に有用な５つのキナーゼを含む（即ち、ＢＲＡＦ、ＣＤＣ２、ＥＲＢＢ４、ＣＤＫ４、及びＣＤＫ８）。
【０１５２】
ＨＣＶ侵入についてのスクリーニングにより同定された候補分子の機能的な効果を確認するために、出願者らは、様々な遺伝子型のＨＣＶｐｐならびに細胞培養に由来する感染性ＨＣＶ（ＨＣＶｃｃ）を使用して、肝細胞癌細胞の感染に及ぼす同定された遺伝子産物の効果を分析した。ｓｉＲＮＡ  ＨＣＶｐｐ侵入スクリーニングによるＨＣＶ補助侵入因子の同定の信頼性および実用性の例として、出願者らは、キナーゼＥｐｈＡ２のサイレンシングが全ての主な遺伝子型に由来するＨＣＶｐｐの侵入を顕著かつ有意に阻害し、Ｈｕｈ７．５ヒト肝細胞癌細胞のＨＣＶｃｃ感染を顕著に阻害することを実証している。
【０１５３】
興味深いことに、タンパク質キナーゼＥｐｈＡ２は、クローディン（ＣＬＤＮ）タンパク質ファミリーのメンバーのリン酸化により細胞のタイトジャンクションの透過性を調節することが示されている（Tanaka, 2005）。ＨＣＶ非構造タンパク質ＮＳ４ＢはＥｐｈＡ２発現をアップレギューションする（Zheng, 2005）。ＥｐｈＡ２は、肝臓ならびに初代ヒト肝細胞及びヒト肝細胞癌細胞株において発現される。これは、ＨＣＶ侵入の分子的理解のための主な関心事である。なぜなら、クローディンファミリーのメンバーがＨｕｈ７肝細胞癌細胞におけるＨＣＶ感染のための重要な宿主補助因子を表すことが示されているからである（Evans, 2007; Meertens, 2008）。
【０１５４】
３．ＨＣＶ侵入及び感染の阻害のためのキナーゼ阻害剤
推定ＨＣＶ補助侵入因子としてのＥｐｈＡ２の同定も、ＨＣＶ侵入を標的化する新規抗ウイルス薬戦略の開発についての関心事である。なぜなら、ＥｐｈＡ２がダサチニブ（慢性骨髄性白血病の処置のための臨床的に許可されたキナーゼ阻害剤）の標的であることが示されているからである（Huang, 2007）。
【０１５５】
ダサチニブ（ＥｐｈＡ２を標的化するタンパク質キナーゼ阻害剤）がＨＣＶ侵入及び感染の阻害をもたらすか否かを試験するために、出願者らは、ダサチニブを用いて肝細胞癌細胞をインキュベートし、続いてＨＣＶｐｐ侵入及びＨＣＶｃｃ感染に及ぼすその効果を試験している。ダサチニブが、ＨＣＶｐｐ侵入（Ｈ７７ｃ株  −  遺伝子型１ａ）及びＨＣＶｃｃ感染（ＪＦＨ−１株  −  遺伝子型２ａ）を、用量依存的な様式で、血液悪性腫瘍の処置のための臨床使用の間に達成される濃度と類似の濃度で顕著に阻害することが見出された。  
【０１５６】
ＨＣＶサブゲノムレプリコン（ＪＦＨ１株、Kato, 2005）を使用したさらなる分析によって、ダサチニブがＨＣＶ侵入を実際に特異的に標的化し、ウイルス複製の間にウイルス−宿主相互作用が起こらないことが実証された。
【０１５７】
類似の結果が、本試験によりＨＣＶ侵入のための補助因子としても同定された上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）を標的化する阻害剤を使用して得られた。エルロチニブ、バンデタニブ、ゲフィチニブ、又はラパチニブが、ｈｕｈ７．５．１細胞のＨＣＶｃｃ感染を、用量依存的な様式で、臨床使用の間に達成される治療濃度と類似の濃度で顕著に阻害することが見出された（図３を参照のこと）。
【０１５８】
結論として、宿主細胞キナーゼのパネルが、新規のＨＣＶ補助因子（ＥｐｈＡ２及びＥＧＦ受容体ファミリーのメンバーを含む）として同定されている。さらに、ＨＣＶ−キナーゼ相互作用が、タンパク質キナーゼ阻害剤ダサチニブによるＨＣＶ侵入及び感染の効率的な阻害により示される通り、ＨＣＶ感染に対する治療介入のために新規で独創的な標的を表す。
【０１５９】
実施例２：ＨＣＶ侵入のための補助因子としての宿主細胞キナーゼの精密な同定
１．材料及び方法
試薬及び抗体    ヒトキナーゼsiRNA Set Version 2.0（４つのｓｉＲＮＡのプール）及び個々のｓｉＲＮＡをQiagenから購入した。エルロチニブ（Tarceva（登録商標））、ダサチニブ（Sprycel（登録商標））、ゲフィチニブ（Iressa（登録商標））、バンデタニブ（Zactima（登録商標））、及びラパチニブ（Tykerb（登録商標））をIC Laboratoriesから、ＴｐＩＩＩキナーゼ阻害剤及びワートマニンをCalbiochemから、フラボピリドール及びドルソモルフィンをSigma-Aldrichから購入した。抗ＥｐｈＡ２  Ｃ−２０及びプロテインＡ／Ｇ−アガロースビーズをSanta Cruz Biotechnologiesから、ＥＧＦＲをMilliporeから、及びアルカリホスファターゼ標識二次抗体をGE Healthcareから購入した。
細胞株、初代肝細胞、及びレプリコン。同上。
ゲノムレベルＲＮＡｉキナーゼＨＣＶ侵入スクリーニング    スクリーニングを、Transfected Cell Array（ＴＣＡ）プラットフォーム（Institut de Genetique et de Biologie Moleculaire et Cellulaire（IGBMC），Illkirch, France）で実施した。このスクリーニングのために使用したライブラリーは、Qiagenから購入のHuman Kinase siRNA Set Version 2.0（４つのｓｉＲＮＡのプール）であった。個々のｓｉＲＮＡをQiagenから購入した。６９１個の細胞キナーゼ及び関連タンパク質を標的化する機能性ＨＣＶ侵入ｓｉＲＮＡスクリーニングを、図４に概説する通りに確立した。各標的について、３．５pmolのｓｉＲＮＡを、５，０００個のＨｕｈ７細胞／０．３cm2においてInterferrin（Polyplus）を使用してリバーストランスフェクトした。ウイルス侵入に及ぼす遺伝子サイレンシングの効果を、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を持つＨＣＶ偽型粒子（ＨＣＶｐｐ  Ｈ７７Ｃ；遺伝子型１ａ）（Bartosh, 2003; Pestka, 2007）を使用し、ｓｉＲＮＡトランスフェクションの３日後に研究した。ＶＳＶｐｐ侵入に与える影響を比較分析した。ウイルス侵入を、感染の２日後に、Mithras LB940ルミノメーター（Berthold Technologies）を使用しBright Glo Luciferaseアッセイシステム（Promega）により、細胞ライセート中のレポーター遺伝子ルシフェラーゼ活性を測定することにより評価した。ヒットを、同じ標的ｍＲＮＡを発現停止させる同じｓｉＲＮＡライブラリー（Qiagen）からの４つの異なる単一ｓｉＲＮＡを使用し、独立して検証した。ＨＣＶｃｃ株Ｌｕｃ−Ｊｃ１（Dimitrova, 2008;Pietschmann, 2006）（ＴＣＩＤ５０、約１０３/mL）を使用した検証を、Ｈｕｈ７．５．１細胞において上に記載する同じプロトコールを使用して実施した。全てのｓｉＲＮＡスクリーニングを９６ウェル細胞培養プレート中で実施した。ルシフェラーゼの結果を、Ｄｃタンパク質アッセイ（Bio-Rad）を使用し、ライセートのタンパク質含量により標準化した。蒸発に起因する非特異的な効果を最小限にするために、外のウェルをスクリーニングに使用せず、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を用いて満たした。細胞増殖における変化に起因する遺伝子サイレンシングの非特異的な効果を、個々のウェルのタンパク質含量を測定することにより標準化した。確立されたハイスループットスクリーニングの品質、個々のプレート設計ならびに複製物の量を、パイロット実験において、Ｚ因子（Zhang, 1999）を算出することにより評価した。ＨＣＶｐｐスクリーニング（Ｚ＝０．３７）を、スクリーニングのために使用される９６の中央プレート位置の６０を用いて２連で実施する。ＨＣＶｃｃ検証スクリーニング（Ｚ＝０．４７）を、スクリーニングのために使用される９６の中央プレート位置の３２を用いて３連で実施した。遺伝子サイレンシングならびにＨＣＶｐｐ及びＨＣＶｃｃ感染の内部品質コントロールとして、ポジティブ及びネガティブコントロールｓｉＲＮＡ（ＧＦＰ、ＣＤ８１）を各プレート上に並列でトランスフェクトした。細胞に対する細胞毒性効果を、下に記載する通りに、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）を代謝する能力を分析することにより３連で評価した。
ハイスループットスクリーニング：ヒット選択    遺伝子サイレンシングの効果を、コントロールトランスフェクト（ＧＦＰを標的化するｓｉＲＮＡ）中への侵入の実験的な平均値と比較した侵入の比率として表わしたＨＣＶｐｐ侵入の増加又は減少により定義した。ＨＣＶの特異性を、ＶＳＶｐｐコントロールウイルスの侵入に対する有意な類似の効果の非存在として決定した。ログ２比率を、真の陽性テスト結果（第二種の過誤）にペナルティーを科すことなく偽陽性（第一種の過誤）の最大の低下を確実にするために、Bioconductor（Gentleman, 2004）パッケージlimma（Wettenhall, 2004）において実施された経験ベイズ手順を使用して０に対する差についてテストした（Allison, 2006）。経験ベイズテストからの結果として得られるＢ値を、有意のカットオフを定義するために、それらの分布について検証した（データ示さず）。最後に、ＨＣＶｐｐについて閾値−３．５（最高ｐ値４×１０−４に対応する）、ＨＣＶｐｐについて閾値−４．４（最高ｐ値３×１０−６に対応する）、及びＶＳＶｐｐについて閾値−３．６（最高ｐ値１．１×１０−３に対応する）を、基礎となる頻度分布に基づくストリンジェントなパラメーターとして選んだ（データ示さず）。ＶＳＶｐｐの侵入にかかわらず、ＨＣＶｐｐ侵入に対する強い効果（Ｂ値＞５）を示す遺伝子（合計２９個）も、さらなる検証のために含めた。また、各遺伝子についての全ての比較のための局所的な過誤発見率（fdr:false discovery rate）を、ライブラリー「fdrtool」を使用して決定した（Strimmer, 2008）。検証のために、１０個の追加遺伝子も含めた。それらは、ＨＣＶ侵入をプレート平均値から≧２ＳＤだけ減少させたが（即ち、Brass, 2008により使用された戦略）、しかし、高い内部変動が高いｐ値又は低い対応するＢ値だけを与えるとの事実に起因して、本発明者らに続くアプローチにより同定されなかったであろう。プールされたｓｉＲＮＡによるオフターゲットの効果を除外するために、候補を、ＨＣＶ侵入が、コントロールトランスフェクト細胞と比較し、少なくとも２つの個々のｓｉＲＮＡにより≧５０%だけ低下されるか否かを検証した。
遺伝子オントロジー及び遺伝子アノテーション    遺伝子オントロジー項目及び遺伝子関連性を、Ingenuity Pathwaysデータベース（Mountainview, CA, USA）により検証されたHuman Kinase siRNA Set Version 2.0から得た。同定されたキナーゼの生物学的機能解析を、Ingenuity Pathwaysデータベース（Krishnan, 2008; Tuvin, 2009）を使用して実施した。生物学的機能項目を、それらがｐ値＜１０−５を伴い有意に高められた場合に受け入れられた。加えて、同定されたヒットを、公知の予測されたタンパク質相互作用について、ゲノム及びタンパク質の一般的な組で全ての相互作用の証拠をマップするＳＴＲＩＮＧメガデータベースを使用して解析した（Jensen, 2009）。
免疫沈降及び免疫ブロットによるキナーゼ発現の分析    ＥｐｈＡ２の免疫沈降を、トランスフェクト細胞の溶解後に、５０mM  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ８）、１５０mM  ＮａＣｌ、１%  ＮＰ−４０、及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を含む緩衝液を使用して実施した。免疫沈降のために、２．５μgの抗ＥｐｈＡ２  Ｃ−２０抗体（１８０μgのタンパク質含量）及び２５μLのプロテインＡ／Ｇビーズ（Santa Cruz Biotechnologies）を使用した。ウエスタンブロットを、GE Healthcareのプロトコールに従い、Hybond-Pメンブランを使用して実施し、ＥＣＦ基質及びTyphoon Trio高性能蛍光スキャナー（GE Healthcare）を使用して可視化した。
ＨＣＶｐｐ及びＨＣＶｃｃを用いたＨｕｈ７由来細胞株及び初代ヒト肝細胞の感染    ＨＣＶｐｐ（株Ｈ７７Ｃ、ＨＣＶ−Ｊ、ＵＫＮ２Ａ．２．４、ＵＫＮ３Ａ、ＵＫＮ４Ａ．２１．１６、ＶＤ、ＶＨ、ＶＫ、ＶＮ）、ＶＳＰｐｐ及びＨＣＶｃｃ（株Ｊｃ１、Ｌｕｃ−Ｊｃ１）を、以前に記載された通りに作製した（Bartosch, 2003; Dimitrova, 2008; Fati-Kremer, 2009; Pestka, 2007; Pietschmann, 2006; Tarr, 2006;及びZeisel, 2007）。株Ｈ７７Ｃ（１ａ）に由来するＨＣＶｐｐ、ならびに株Ｊｃ１（２ａ／２ａ）及びＬｕｃ−Ｊｃ１（２ａ／２ａ）に由来するＨＣＶｃｃを用いた（ＴＣＩＤ５０  １０３/mL）Ｈｕｈ７細胞、Ｈｕｈ７．５細胞、及びヒト肝細胞の感染を、記載された通りに実施した（Dimitrova, 2008; Fati-Kremer, 2009; Lan, 2008; Meunier, 2008；及びZeisel, 2007）。遺伝子サイレンシングを、感染の３日前に、ＲＮＡｉスクリーニングについて記載された通りに実施した。タンパク質キナーゼ阻害剤（例外ワートマニン、最終１%  ＤＭＳＯ）を、最終溶媒濃度０．２５%  ＤＭＳＯでアプライした。阻害剤を、ＨＣＶｐｐ又はＨＣＶｃｃ感染の１時間前に細胞培養液に加えた。
ＨＣＶ複製の分析    プラスミドｐＳＧＲ−ＪＦＨ１に由来するＲＮＡの電気穿孔を、以前に記載された通りに実施した（Lan, 2008）。電気穿孔から４時間後、細胞を、細胞培養上清中で２４時間にわたりタンパク質キナーゼ阻害剤とインキュベートした。全ＲＮＡを単離し、記載された通りにＨＣＶ  ＲＮＡのノーザンブロット分析により分析した（Lohmann, 1999）。
毒性アッセイ    細胞に対する細胞毒性効果を、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）を代謝する能力を分析することにより３連で評価した（Lan, 2008）。ｓｉＲＮＡ実験のために、ＭＴＴを、ｓｉＲＮＡを用いた５時間にわたるトランスフェクションの３日後に加えた。ＭＴＴの最終濃度は０．６mg/mLであった。細胞により産生されたホルマザン結晶を可溶化し、記載された通りに測定した（Mosmann, 1983）。
【０１６０】
２．ゲノムレベルＲＮＡｉキナーゼＨＣＶ侵入スクリーニングを使用したＨＣＶ侵入に関与する細胞キナーゼの同定
ｓｉＲＮＡベースのスクリーニングを実施し、Ｈｕｈ７細胞において６９１個のヒトキナーゼを発現停止し、ＨＣＶ侵入に関連しうるヒトゲノム中の全ての細胞キナーゼを包括的に同定した。感染の後期段階における欠損（例えば複製、集合、又は分泌など）を、このアッセイにおいて検討しなかった。アッセイの計測は、ルシフェラーゼレポーターを含むＨＣＶｐｐ又はＨＣＶｃｃを用いた遺伝子発現停止された細胞の感染からなった。これには、感染から７２時間後にレポーター遺伝子発現をアッセイすることによるウイルス侵入の定量化が続いた。スクリーニングは３段階を含んだ：無関係なコントロールウイルスとしての役割を果たす水胞性口炎ウイルスに由来する偽型粒子（ＶＳＶｐｐ）を用いたＨＣＶｐｐを比較使用した一次スクリーニング。感染性ウイルスのライフサイクルについて同定されたヒットの関連性を検証するために、一次スクリーニングにおいて同定されたヒットを、組換えＨＣＶｃｃ及びＨｕｈ７．５．１細胞に基づく感染性ＨＣＶ細胞培養モデルを使用した二次スクリーニングにおいて確認した（図４）。一次及び二次スクリーニングを、同じ遺伝子を標的化する４つのｓｉＲＮＡのプールを使用して実施した。二次スクリーニングからの候補遺伝子を、三回目のスクリーニングに供し、それにおいて各プール中の４つの成分ｓｉＲＮＡを個々に再スクリーニングした（図４）。
【０１６１】
まとめると、１０７個のキナーゼが一次ＨＣＶｐｐスクリーニングにより同定され、これらの内、８２個を組換えＨＣＶｃｃを用いた感染により検証した。この差異は、ＨＣＶｐｐ及びＨＣＶｃｃの侵入機構がわずかに異なりうるとの事実に起因しうる。あるいは、一部のキナーゼは、続いて、ＨＣＶライフサイクルにおける侵入後の事象（例えば複製など）に対する拮抗効果を有しうる。これは、ＮＥＫ４キナーゼ（複製を増強することが示されている（Tai, 2009））のサイレンシングが、ＨＣＶｃｃ感染を増強したが、しかし、ＨＣＶｐｐの侵入を阻害した（データ示さず）との知見により例示される。ＨＣＶｐｐ侵入及びＨＣＶｃｃ感染の開始に類似の効果を有する８２個のキナーゼの７８（９５%）が個々のｓｉＲＮＡにより検証され（図１０）、観察された表現型を引き起こした個々のｓｉＲＮＡ配列のオフターゲットの効果よりもむしろ実際に遺伝子サイレンシングであることが実証された。
【０１６２】
このように、ゲノムレベルＲＮＡｉキナーゼスクリーニングによって、感染性細胞培養モデルにおいて確認された通り、ＨＣＶｐｐ侵入及びＨＣＶｃｃ感染の開始に効果を及ぼす７８個のキナーゼが同定された（図１０）。ＨＣＶ侵入に特異的に関与しうるキナーゼを同定するために、無関係のコントロールウイルスＶＳＶの侵入に及ぼすサイレンシングの効果を試験した。この比較分析を使用し、３４個の遺伝子が同定され、それらは、ＨＣＶｐｐ侵入及びＨＣＶｃｃ感染に対する機能的な効果を有したが、しかし、ＶＳＶ侵入に対する効果を有さなかった（図１０Ａ）。
【０１６３】
このＲＮＡｉスクリーニング方法の妥当性は、コントロールウイルスＶＳＶの侵入のために必須であることが公知であるキナーゼの同定により確認される。一次スクリーニングならびにPelkmans及び共同研究者（Pelkmans, 2005）により実施されたスクリーニングにおけるＶＳＶｐｐ侵入の同一性についてのヒットの比較分析によって、ＨＳＶ侵入についてのカドヘリン媒介性ウイルスエンドサイトーシスに関与するキナーゼの機能的な関連性が確認された。さらに、一次ＨＣＶｐｐスクリーニングによって、Farquhar et al.（Farquhar, 2008）により最近示された通り、ＨＣＶｐｐ侵入についてのタンパク質キナーゼＡの関連性が確認された。ＶＳＶ及びＨＣＶ侵入のための補助因子としてのこれらのキナーゼの同定によって、本スクリーニングアプローチの妥当性が確認される。
【０１６４】
３．バイオインフォマティクス分析によるＨＣＶ侵入に関与するキナーゼネットワークの同定
同定されたキナーゼ及び関連タンパク質の公知の生理学的機能の分類を得るために、Ingenuity Pathwaysデータを使用したバイオインフォマティクス分析を、他のＲＮＡｎ  ｓｉＲＮＡベースのスクリーニングについて記載された通りに実施した（Krishnan, 2008 and Tuvim, 2009）。この分析によって、癌及び細胞死に関与する遺伝子の高い提示が明らかになった（図６Ａ）。ＨＣＶに対する影響を与えるが、しかし、ＶＳＶ侵入に対しては与えないキナーゼを分類する際、５つの最も高度に提示されるカテゴリーは以下を含んだ：アミノ酸代謝、翻訳後修飾、小分子生化学、細胞形態、細胞発生、細胞周期、細胞シグナル伝達、及び癌（図６Ｂ）。
【０１６５】
次に、同定されたヒットを、公知の及び予測されたタンパク質相互作用についてＳＴＲＩＮＧデータベースを使用して分析した（Jensen, 2009）。検証される相互作用は、多数の供給源（実験レポジトリ、コンピューター予測方法、及び公的テキスト収集）に由来する直接的（物理的）及び間接的（機能的）関連性を含んだ（Jensen, 2009）。ＳＴＲＩＮＧは、ゲノム及びタンパク質の一般的な組での全ての公知のタンパク質−タンパク質相互作用のメタ−データベースマッピングを表す。ＲＮＡｉスクリーニングにおいて同定された７８のキナーゼの分析によって、細胞形態（細胞極性、タイトジャンクション透過性、及びインテグリンシグナル伝達を含む）を調節するキナーゼネットワークならびに細胞周期に関与するキナーゼのネットワークが明らかになった（図６Ｃ）。
ａ）細胞極性を調節する宿主細胞キナーゼ    最初に、ＲＮＡｉスクリーニング続くＳＴＲＩＮＧ分析によって、肝臓キナーゼＢ１（ＳＴＫ１１）及びＡＭＰ活性化タンパク質キナーゼ（ＡＭＰ、γ２非触媒サブユニットＰＲＫＡＧ２）がＨＣＶ侵入のための宿主因子として同定された（図６〜７）。ＰＲＫＡＧ２サブユニットが、ＡＭＰＫのためのアクチベーターとしての役割を果たす。図７に示す通り、ＳＴＫ１１又はＡＭＰＫサブユニットＰＲＫＡＧ２についての遺伝子の発現のサイレンシングから、全ての主な遺伝子型に由来するＨＣＶｐｐの侵入の顕著な阻害が生じた（図７Ａ〜Ｂ、左パネル）。同様の結果が組換えＨＣＶを用いた感染について得られ、同定されたキナーゼが増殖性感染の開始のために重要であることを示唆する（図７Ａ〜Ｂ、右パネル）。対照的に、コントロールｓｉＲＮＡを用いた細胞のインキュベーションは、ＨＣＶ侵入又はＨＣＶ感染を有意に修飾しなかった（図７）。２つの対応する阻害性ＡＭＰＫサブユニット、即ち、β１（ＰＲＫＡＢ１）及びβ２（ＰＲＫＡＢ２）のサイレンシングが、ＨＣＶｐｐ侵入を刺激し、ＡＭＰＫ活性がＨＣＶ侵入及び感染のために極めて重要であることを示唆する。この経路の影響が、ドルソモルフィン（ＡＭＰＫ活性の阻害剤）の使用によりさらに確認された（Zhou, 2001）。ドルソモルフィンを用いたＨｕｈ７．５細胞のプレインキュベーションが、ＨＣＶｐｐ侵入を顕著に阻害し（図７Ｃ）、ＡＭＰＫ機能がＨＣＶ侵入のために実際に重要であることが確認された。
【０１６６】
ＳＴＫ１１及びその下流の基質ＡＭＰＫが、上皮細胞（肝細胞を含む）における極性の確立において主な役割を果たすことが示されている（Williams, 2008）。他の試験が、ＡＭＰＫがＳＴＫ１１の極性及び有糸分裂の制御機能を媒介することを示唆する（Lee, 2007）。これはＨＣＶ侵入についての特別な関心事である。なぜなら、細胞極性は、ＨＣＶ侵入のための重要な宿主因子であることが示されているからである（Brazzoli, 2008; Evans, 2007; Mee, 2008; Meertens, 2008; Ploss, 2009）。細胞極性は、ＨＣＶ侵入因子クローディン１の細胞内局在化を変え、ＨｅｐＧ２肝細胞癌細胞におけるウイルス侵入を調節すると思われる（Mee, 2009）。さらに、Brazzoli及び共同研究者（Brazzoli, 2008）は、ＣＤ８１へのＨＣＶ  Ｅ２糖タンパク質の結合が、細胞‐細胞接触面へのＨＣＶ  Ｅ２／ＣＤ８１複合体のアクチン依存的な再局在化を誘発し、そこではＣＤ８１がタイトジャンクションタンパク質（オクルディン、ＺＯ−１、及びクローディン１）と接触することを示している。ドルソモルフィンによるＡＭＰＫの阻害が、非筋ミオシン調節軽鎖（ＭＲＬＣ）のリン酸化を遮断することが示されている（Lee, 2007）。まとめると、これらの結果は、ＳＴＫ１１／ＡＭＰＫ機能が、細胞表面上又は細胞内でのＨＣＶ侵入因子複合体のアクチン‐ミオシン依存的トランスポート又は輸送のために要求されうるモデルを支持する（図６Ｄ）。
ｂ）タイトジャンクション機能を調節する宿主細胞キナーゼ    ＲＮＡｉスクリーニングによって、タイトジャンクション（ＴＪ）機能の調節に関与するいくつかのキナーゼが同定された。これらは、ＭＡＧＩ−１、ＥｐｈＡ２、及びＥＧＦＲを含む（図６Ｃ）。極性化肝細胞において、ＴＪが、それらの原形質膜を頂端ドメインと側底ドメインに分離する。これはＨＣＶ侵入についての関心事及び関連性である。なぜなら、いくつかのＴＪタンパク質、即ち、クローディン１、６、及び９（Evans, 2007; Harris, 2008; Meertens, 2008）ならびにオクルディン（Benedicto, 2009; Ploss, 2009）が、ＨＣＶ侵入のための補助因子であることが示されているからである。別々の細胞表面分布を有するいくつかの取込み因子の使用は、ＨＣＶが、コクサッキーウイルスＢのものと類似の協調侵入経路（肝細胞ＴＪに依存的である）に従いうるとの仮説と一致する（Ploss, 2009）。あるいは、ＨＣＶは、ＴＪに関連しないクローディン１の形態を利用しうる（Mee, 2009）。ＴＪの破壊は、ＣａＣｏ−２細胞におけるＨＣＶ侵入を増強することが示されており、外側及び側底細胞ドメイン上で発現されるＨＣＶ侵入因子へのウイルスアクセスに対する物理的バリアを提供するモデルを支持する（Mee, 2008）。
【０１６７】
ＭＡＧＩ−１は、ジャンクション複合体の形成に関与する膜会合性グアニル酸キナーゼである（Laura, 2002）。Ｅｐｈｒｉｎ受容体Ａ２（ＥｐｈＡ２）は、受容体チロシンキナーゼの最も大きなクラスのメンバーであり、細胞位置決め、細胞形態及び移動性ならびに傍細胞ＴＪ透過性に関与する（Lackmann, 2008）。図８に示す通り、ＥｐｈＡ２遺伝子発現のサイレンシング（図８Ａ）は、全ての主な遺伝子型１〜４に由来するＨＣＶｐｐの侵入（図８Ｂ）、及び組換えＨＣＶとの感染の顕著な阻害を生じ、同定されたキナーゼが増殖性感染の開始のために重要であることを示唆する（図８Ｃ）。対照的に、コントロールｓｉＲＮＡ（ＣＴＲＬ）を用いた細胞のインキュベーションによって、ＨＣＶ侵入又はＨＣＶ感染は有意に修飾されなかった（図８）。この経路の影響が、ダサチニブ（ＥｐｈＡ２機能の阻害剤）の使用によりさらに確認された（Huang, 2007）。ダサチニブを用いたプレインキュベーションは、初代ヒト肝細胞のＨＣＶｐｐ侵入及びＨｕｈ７．５．１細胞のＨＣＶｃｃ感染を顕著に阻害し（図９）、ＥｐｈＡ２機能がＨＣＶ侵入のために実際に重要であることが確認された。ＥｐｈＡ４が、ｇ  ＴＪタンパク質クローディン４により内皮組織における傍細胞透過性に関与することが示されている（Tanaka, 2005）。
【０１６８】
さらに、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）が、ＨＣＶ侵入のための補助因子として同定された。図８に示す通り、ＥＧＦＲ発現のサイレンシング（図８Ａ）は、全ての主な遺伝子型１〜４に由来するＨＣＶｐｐの侵入（図８Ｂ）ならびに組換えＨＣＶを用いた感染の顕著な阻害を生じた。これらの知見は、このキナーゼが増殖性感染の開始のために重要であることを示唆する（図８Ｃ）。ＥｐｈＡ２のように、ＥＧＦＲは、細胞生物学の重要なプロセス（増殖、生存、分化、発生段階、組織ホメオスタシス、及び腫瘍形成を含む）を調節するチロシンキナーゼ受容体である（Schneider and Wolf, 2009）。インビボでは、ＥＧＦＲはＲａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ及びＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達を主に活性化する（Lackmann, 2008; Schneider, 2009）。興味深いことに、使用された一次スクリーニングは、ＥＧＦＲシグナル伝達を媒介するキナーゼのサイレンシングがＨＣＶ侵入を顕著に阻害することも実証した：これらは、ｂ−Ｒａｆ（ＢＲＡＦ）、ＭＥＫ１（ＭＡＰ２Ｋ１）、及びＥＲＫ１（ＭＡＰＫ３）を含む（図６Ｄ）。ＨＣＶ侵入のためのＲａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路の関連性は、ＥＧＦＲならびにＥＧＦＲの下流のキナーゼを阻害する既定の阻害剤の使用によりさらに支持される。エルロチニブを使用したＥＧＦＲ活性の阻害は、ＨＣＶ侵入及びＨＣＶ感染を用量依存的に阻害した（図９）。対照的に、ワートマニンを使用したＰＩ３Ｋ活性の阻害（Arcaro, 1993）は、起こらなかった（図１０Ｂ）。ＨＣＶ侵入のためのＲａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫシグナル伝達経路の関連性は、ＣＤ８１の関与がＲａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫシグナル伝達カスケードを活性化すること及びこの経路がウイルスライフサイクルの侵入後の事象に影響を与えることを示す最近の試験によりさらに支持される（Brazzoli, 2008）。まとめると、これらのデータは、ＭＡＰキナーゼ経路を介したＥＧＦＲ活性化及びシグナル伝達がＨＣＶ侵入のために要求されるモデルを支持する。
【０１６９】
ＨＣＶ侵入プロセスの間でのＥＧＦＲの分子機能は何か？ＥＧＦＲ活性化が細胞再分布を誘導し、クローディン１の発現を増加させることが示されており（Flores-Benitez, 2007; Singh, 2004）、ＥＧＦ媒介性ＭＡＰキナーゼシグナル伝達がＭＡＰキナーゼＥＲＫ−１とオクルディンのＣ末端領域との相互作用をもたらすことが示されており、それによってＥＧＦによるタイトジャンクションのＨ２Ｏ２誘導性の破壊が予防される（Basuroy, 2006）。まとめると、これらのデータ及び本ＲＮＡｉスクリーニングでの結果は、ＨＣＶ侵入のためのＴＪタンパク質の機能的な役割をさらに支持し、ＭＡＰキナーゼ経路により媒介される、ＥＧＦＲとＴＪタンパク質クローディン１又はオクルディンの間での機能的な結び付きを実証する（図６Ｄ）。
【０１７０】
ＨＣＶ非構造タンパク質の発現が、ＥｐｈＡ２及びＥＧＦＲ発現のアップレギュレーションをもたらすことが示されていることに注目することは興味深い。実際に、ＨＣＶ非構造タンパク質ＮＳ４Ｂが、ＥｐｈＡ２の全レベルにおける同時増加を引き起こすことが示されている（Zheng, 2005）。ＮＳ５Ｂは、ＥＧＦＲ発現の増加及びＥＧＦＲの輸送プロファイルの変化をもたらすことが示されている（Mankouri, 2008）。この試験の著者らは、ＭＡＰキナーゼシグナル伝達がＨＣＶ持続性のための最適な環境を保持しうることを示唆していた（Mankouri, 2008）。まとめると、これらのデータ及び本ＲＮＡｉスクリーニングでの結果は、ＨＣＶ複製ならびに非構造タンパク質ＮＳ４Ｂ及びＮＳ５Ａの発現が、ＨＣＶ同時侵入因子ＥｐｈＡ２及びＥＧＦＲのアップレギュレーションをもたらし、それによりＨＣＶ侵入及びウイルス増殖を促進するポジティブなフィードバックループを示唆する。
ｃ）インテグリンシグナル伝達に関与する宿主細胞キナーゼ    ＳＴＲＩＮＧ分析では細胞接着及びインテグリンシグナル伝達に関与する４つのキナーゼのネットワークが同定された：ｃ−Ｓｒｃ（ＣＳＫ）、焦点接着キナーゼ（ＰＴＫ２）、焦点接着キナーゼ２（ＰＴＫ２Ｂ）、及びインテグリン結合キナーゼ（ＩＬＫ）。これらの全てが細胞接着及び細胞マトリックス相互作用を調節する（D Nichila, 1999; Harburger, 2009）（図６Ｃ）。ＣＤ８１（重要なＨＣＶ侵入因子）及び他のテトラスパニンが、インテグリンファミリーの接着受容体に会合し、インテグリン依存的な細胞遊走を調節することが示されている（Berditchevski, 2001）。従って機能的なインテグリンシグナル伝達が、ＨＣＶ侵入因子輸送及び細胞表面上での局在化、ひいてはＨＣＶ侵入のために必須でありうることが考えられる。これに関連して、多くのテトラスパニン（ＣＤ８１を含む）が、ＩＩ型ホスファチジルイノシトール４キナーゼと会合し、これが、インテグリンヘテロ二量体へこれらの酵素を繋ぎ止めることによりシグナル伝達複合体の集合を促進しることが示唆される（Berditchevski, 2001）。これは、ホスファチジルイノシトール４キナーゼ２型アルファ（ＰＩ４ＫＩＩ）のサイレンシングがＨＣＶ侵入及び感染を特異的に損なったが、しかし、ＶＳＶ侵入に影響を与えなかったとの本知見により支持される。さらに、インテグリンシグナル伝達が、他のウイルス、例えばアデノウイルス、ハンタウイルス、及びヘルペスウイルスなどの侵入において中枢的役割を果たすことが公知である（概説については、Stewart, 2007を参照のこと）：ＨＣＶは、従って、別のインテグリン依存的な侵入機構を有しうる。
ｄ）細胞周期に関与する宿主細胞キナーゼ    ＳＴＲＩＮＧ分析は、細胞周期調節に関与する８つのキナーゼ（細胞分裂周期２キナーゼ（ＣＤＣ２）、サイクリン依存性キナーゼ３（ＣＤＫ３）、サイクリン依存性キナーゼ４（ＣＤＫ４）、コリンキナーゼアルファ（ＣＨＫＡ）、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤１Ｂ（ＣＤＫＮ１Ｂ）、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤２Ｃ（ＣＤＫＮ２Ｃ）、膜会合チロシン／スレオニンタンパク質キナーゼ１（ＰＫＭＹＴ１）、及びＷＥＥ１ホモログS.pombe（ＷＥＥ１）を含む）を含むネットワークを示した（図６Ｃ）。これらのＣＤＫが細胞分裂依存的な肝細胞癌モデルシステムの内因性の特性のために同定されたという可能性を除外することはできないが、いくつかの観察がＨＣＶ侵入のためのＣＤＫの特定の役割を支持する。第１に、ＣＤＫ３のサイレンシングが、全ての主なＨＣＶ遺伝子型１〜４に由来するＨＣＶｐｐの侵入を顕著に阻害するが、しかし、ＶＳＶｐｐは阻害しなかった。ＨＣＶ侵入に及ぼす特異的な効果も、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＷＥＥ１、及びＰＫＭＹＴ１が発現停止された場合に観察された。第２に、遺伝子サイレンシング後（ＣＨＫＡを用いた実験とは別に）、細胞毒性が、ＭＴＴの細胞代謝により測定された通りに観察されなかった。これは、キナーゼのサイレンシングが非特異的な毒性効果に起因しなかったことを示唆する。第３に、フラボピリドール（十分に特徴付けられたＣＤＫ３阻害剤）が、任意の検出可能な細胞毒性効果の非存在において初代ヒト肝細胞中でＨＣＶｐｐ侵入を顕著に阻害した。これらのデータは、ＣＤＫの効果が、モデル標的細胞株又は擬似粒子侵入アッセイのいずれにも関連せず、ＨＣＶ侵入に関連しうることを示唆する。ＣＤＫがヒト免疫不全及びヘルペスウイルスのライフサイクルにおいて重要な役割を果たすことが周知である。これらは、ＣＤＫ９によるＨＩＶ転写の調節（Zhou, 2009）ならびにマイクロフィラメント組織化及び細胞形態を調節するＣＤＫ４及びＣＤＫ６のカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスによる活性化（Cuomo, 2005）を含む。このように、類似の機構がＨＣＶについて適用されることが考えられる。
【０１７１】
４．定義された阻害剤による宿主細胞キナーゼの阻害によるＨＣＶ侵入に及ぼす同定されるキナーゼの特異的の効果の確認
ＨＣＶライフサイクルに及ぼす同定されたキナーゼの効果をさらに試験するために、ＥｐｈＡ２及びＥＧＦＲの機能的な効果を特徴付けた。これらのキナーゼが選択された。なぜなら、それらは同定されたネットワーク中の成分であるからである（図６Ｃ）。さらに、ＥｐｈＡ２及びＥＧＦＲは、臨床的に認可されたキナーゼ阻害剤ダサチニブ（ＥｐｈＡ２用）及びエルロチニブ（ＥＧＦＲ用）により強力に阻害され、ウイルスライフサイクルの様々な段階でこれらのキナーゼの機能的な効果を研究することを可能にしている。ＨＣＶ侵入、複製、及び感染に及ぼすキナーゼ阻害剤の効果を試験した。図９に示す通り、ダサチニブ及びエルロチニブはＨＣＶ感染を顕著に阻害した。エルロチニブは、ＨＣＶ侵入及び感染の最も強力な阻害剤であり（ＩＣ５０、約０．５μM）、ダサチニブがその次であった（ＩＣ５０、２μM）。観察されたＩＣ５０値は、精製されたＥｐｈＡ２（Huang, 2007）又はＥＧＦＲ（Minami, 2007）の記載されたＩＣ５０値より高かった。肝細胞又は肝細胞由来の細胞株において観察されたより高いＩＣ５０値は、肝細胞又は肝細胞癌細胞における阻害剤の迅速な代謝に起因する。それにもかかわらず、追加のキナーゼがダサチニブ及びエルロチニブの抗ウイルス効果に寄付する可能性を除外することはできず、しかし、ＥＧＦＲの場合において、この結果（図９）は、類似のＩＣ５０でＨＣＶ感染を阻害した３つの追加のＥＧＦＲ阻害剤（ゲフィチニブ、バンデタニブ、ラパチニブ）を用いて確認された（示さず）。ＨＣＶｃｃ感染に及ぼすダサチニブ及びエルロチニブの阻害効果は、ルシフェラーゼレポーターの翻訳に及ぼす薬物の非特異的な影響を除き、ＲＴ−ＰＣＲを使用したウイルスＲＮＡの検出により確認された（データ示さず）。
【０１７２】
ＨＣＶ感染に及ぼすこれらの分子の阻害効果が実際にウイルス侵入に対することを確認するために、ＨＣＶ単離株ＪＦＨ１の侵入及び複製に及ぼすそれらの効果を試験した。図９に示す通り、ダサチニブ及びエルロチニブは、サブゲノムＪＦＨ１レプリコンの複製を顕著に調節することなく、ＪＦＨ１由来のＨＣＶｐｐの侵入を阻害した。対照的に、ワートマニン（ウイルス複製を阻害するタンパク質キナーゼ阻害剤（Tai, 2009））は、ＪＦＨ１由来のＨＣＶｐｐの侵入にいかなる効果も有さなかった（データ示さず）。これらのデータによって、ダサチニブ及びエルロチニブにより選択的に阻害されるキナーゼがＨＣＶ侵入において重要であるが、しかし、ウイルス複製においては重要ではないことが確認される。これらの知見によって、ダサチニブ及びエルロチニブにより選択的に阻害されるキナーゼがＨＣＶ侵入において重要であるが、しかし、ウイルス複製においては重要ではないことがさらに確認される。これらの知見によって、ＨＣＶ侵入について同定されたキナーゼの影響がさらに確認され、認可された化合物を使用して宿主キナーゼを阻害することが、ＨＣＶに対する有用な治療戦略でありうることを示唆する。
【０１７３】
５．マルチキナーゼ阻害剤を使用して宿主細胞キナーゼを標的化することによる、肝臓移植を受けている患者に由来するＨＣＶ単離株の侵入の阻害
エルロチニブが達成可能な血漿濃度（平均血漿濃度〜４μM、Hidalgo and Bloedow, 2003）に対応する用量範囲（ＩＣ５０、０．５μM）においてＨＣＶ侵入及び感染を強力に阻害したため、その影響を患者由来の分離株を用いた感染で評価した。初代ヒト肝細胞及び肝臓移植を受けている４人のＨＣＶ感染患者に由来するウイルスエンベロープ糖タンパク質を持つＨＣＶ偽型を使用し、本出願者らは、増強したウイルス侵入及び抗体媒介性中和からの回避が、肝臓移植片のＨＣＶ再感染の間でのウイルスバリアントの選択のための重要な決定要因であることを実証している（Fafi-Kremer, 2009）。この以前の試験での結果は、ウイルス侵入が肝臓移植片のＨＣＶ再感染の予防のための実行可能な標的であることを示唆している（Fafi-Kremer, 2009）。本試験において、多種キナーゼ阻害剤の効果を、４人の異なる患者における移植及び肝臓移植片の再感染の間に選択されたＨＣＶ株（ＨＣＶ株ＶＤ、ＶＨ、ＶＫ、ＶＮ）からのエンベロープ糖タンパク質を持つＨＣＶｐｐの侵入について試験した。図９に示す通り、同定された宿主細胞キナーゼのサイレンシングならびにキナーゼ阻害剤ダサチニブ及びエルロチニブを用いた細胞のプレインキュベーションが、Ｈｕｈ７．５細胞及び初代ヒト肝細胞において患者由来のＨＣＶｐｐの侵入を顕著に阻害した。エルロチニブは、Ｈｕｈ７．５細胞においてダサチニブより強力であると思われたが、しかし、初代ヒト肝細胞においてはそうではなかった。対照的に、ワートマニン（図１０）又はナフチリジンベースのＴｐＩ２キナーゼ阻害剤（データ示さず）は、ＨＣＶｐｐ感染の再現性のある阻害をもたらさなかった。これらのデータは、エルロチニブ（Erlotininb）及びダサチニブが、肝臓移植片に感染する患者由来の単離株でのＨＣＶ侵入を特異的に阻害することを示唆する。毒性効果は、ＭＴＴテストに基づく細胞生存の比較分析において検出されなかった（図１０）。
【０１７４】
まとめると、これらの結果は、ＨＣＶ侵入を調節する宿主細胞キナーゼが抗ウイルス治療のための実行可能な標的であることを示唆する。タンパク質キナーゼ阻害剤の臨床開発は、ウイルス感染のために要求される特異的な宿主細胞キナーゼの標的化に基づく抗ウイルス戦略のための新たな展望を提供する。このアプローチは、ウイルスタンパク質を標的化する抗ウイルス戦略に対して補完的であるため、それはウイルス耐性を克服する有用な方法を表わしうる。さらに、許可されたキナーゼ阻害剤を使用したＨＣＶ侵入の阻害は、特に肝臓移植後に、一次ＨＣＶ感染を予防するための新規治療アプローチを成し、また、慢性感染患者におけるウイルス拡散を減弱しうる。
【表１】
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【０１７５】
他の実施態様
本発明の他の実施態様は、本明細書に開示する本発明の明細書又は実施の考察から当業者には明らかであろう。明細書及び実施例は、例示的であるとだけ見なされることを意図し、本発明の真の範囲は以下の特許請求の範囲により示される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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