【手続補正書】
【提出日】平成21年8月18日(2009.8.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コハク酸塩生成を微生物の増殖と強制的に連動させる代謝改変の組で構成される非自然発生的な微生物であって、前記代謝改変の組は、
【化１】
2009507493.tif 000001
またはそのオーソログを含む１つ以上の遺伝子の組で構成され、前記微生物は安定的な増殖連動型のコハク酸塩の生成を示す。
【請求項２】
前記代謝改変（ｃ）ａｃｋＡ−ｐｔａ、ｐｙｋＦ、ａｔｐＦ、ｓｄｈＡをコード化している前記遺伝子は、ｐｙｋＡ、ａｔｐＨ、ｓｄｈＢ、またはｄｈａＫＬＭから選択される少なくとも１つの遺伝子破壊をさらに備える、請求項１の非自然発生的な微生物。
【請求項３】
前記代謝改変（ｄ）ａｃｋＡ−ｐｔａ、ｐｙｋＦ、ｐｔｓＧをコード化している前記遺伝子が、ｐｙｋＡまたはｄｈａＫＬＭから選択される少なくとも１つの遺伝子破壊でさらに構成される請求項１の非自然発生的な微生物。
【請求項４】
前記代謝改変（ｅ）ａｃｋＡ−ｐｔａ、ｐｙｋＦ、ｐｔｓＧ、ａｄｈＥ、ｌｄｈＡをコード化している前記遺伝子が、ｐｙｋＡまたはｄｈａＫＬＭから選択される少なくとも１つの遺伝子破壊でさらに構成される請求項１の非自然発生的な微生物。
【請求項５】
前記１つ以上の遺伝子破壊が、欠損で構成される請求項１の非自然発生的な微生物。
【請求項６】
前記微生物が、細菌、酵母、または菌で構成される請求項１の非自然発生的な微生物。
【請求項７】
前記細菌が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、アナエロビオスピルリム・サクシニシプロデュセンス（Ａ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）、アクチノバチルス・スクシノゲネス（Ａ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、マンヘミア・サクシニシプロデュセンス（Ｍ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）、インゲン根粒菌（Ｒ．ｅｔｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、グルコノバクテル・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ストレプトマイセス・コエリコロル（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、およびシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）から選択される種で構成される請求項６の非自然発生的な微生物。
【請求項８】
前記酵母が、サッカロマイセス・ケレウィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、クリベロマイセスラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、クリベロマイセス・マルキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）、クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、およびピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）から選択される種で構成される請求項６の非自然発生的な微生物。
【請求項９】
（ａ）  指数増殖中にコハク酸塩の生成を要する代謝改変の組をコンピュータで同定するステップであって、前記代謝改変の組は、（１）ＡＤＨＥｒ、ＬＤＨ＿Ｄ；（２）ＰＦＬ、ＬＤＨ＿Ｄ、ＡＤＨＥｒ；（３）ＰＴＡｒ、ＰＹＫ、ＡＴＰＳ４ｒ、ＳＵＣＤ１ｉ；（４）ＰＴＡｒ、ＰＹＫ、ＧＬＣｐｔｓ；（５）ＰＴＡｒ、ＰＹＫ、ＧＬＣｐｔｓ、ＡＤＨＥｒ、ＬＤＨ＿Ｄを含むステップと、
（ｂ）  前記コハク酸塩の生成を要する代謝改変の組における各酵素のポリペプチドをコード化する１以上の遺伝子を破壊するように、微生物を遺伝子改変するステップ
で構成される、安定的な増殖連動型のコハク酸塩の生成を有する非自然発生的な微生物を生成する方法。
【請求項１０】
前記代謝改変の組は、ＯｐｔＫｎｏｃｋまたはＳｉｍＰｈｅｎｙから選択されるコンピュータを利用した方法により同定される、請求項９の方法。
【請求項１１】
前記代謝改変の組は、１つ以上の代謝反応の機能破壊で構成される請求項９の方法。
【請求項１２】
前記代謝改変は、遺伝子欠損により破壊されている、請求項１１の方法。
【請求項１３】
前記代謝改変（３）ＰＴＡｒ、ＰＹＫ、ＡＴＰＳ４ｒ、ＳＵＣＤ１ｉ；（４）ＰＴＡｒ、ＰＹＫ、ＧＬＣｐｔｓ；または（５）ＰＴＡｒ、ＰＹＫ、ＧＬＣｐｔｓ、ＡＤＨＥｒ、ＬＤＨ＿Ｄは、代謝改変ＤＨＡＰＴをさらに含む請求項９の方法。
【請求項１４】
前記遺伝子改変された微生物を培養するステップをさらに含む、請求項９の方法。
【請求項１５】
コハク酸塩の生成を要する条件下で、前記遺伝子改変された微生物を適応進化させるステップをさらに含む、請求項１４の方法。
【請求項１６】
前記非自然発生的な微生物は、細菌、酵母、または菌で構成される請求項９の方法。
【請求項１７】
前記細菌が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、アナエロビオスピルリム・サクシニシプロデュセンス（Ａ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）、アクチノバチルス・スクシノゲネス（Ａ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、マンヘミア・サクシニシプロデュセンス（Ｍ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）、インゲン根粒菌（Ｒ．ｅｔｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、グルコノバクテル・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ストレプトマイセス・コエリコロル（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、およびシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）から選択される種で構成される請求項１６の方法。
【請求項１８】
前記酵母が、サッカロマイセス・ケレウィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、クリベロマイセスラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、クリベロマイセス・マルキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）、クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、およびピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）から選択される種で構成される請求項１６の非自然発生的な微生物。
【請求項１９】
請求項９または１５の方法により生成される微生物。
【請求項２０】
（ａ）  前記コハク酸塩生成を微生物の増殖と強制的に連動させる代謝改変の組であって、
【化２】
2009507493.tif 000002
またはそのオーソログを含む１つ以上の遺伝子の組を備える前記代謝改変の組で構成される非自然発生的な微生物を、指数増殖相のもとで十分な量の栄養物と培地の中で培養するステップであり、前記微生物は安定的な増殖連動型のコハク酸塩の生成を示すステップと、
（ｂ）  前記非自然発生的な微生物から生成されたコハク酸塩を単離するステップ
で構成される微生物の増殖に共役するコハク酸塩を生成する方法。
【請求項２１】
前記代謝改変（３）ａｃｋＡ−ｐｔａ、ｐｙｋＦ、ａｔｐＦ、ｓｄｈＡをコード化する前記遺伝子が、ｐｙｋＡ、ａｔｐＨ、ｓｄｈＢ、またはｄｈａＫＬＭから選択される少なくとも１つの遺伝子破壊でさらに構成される請求項２０の方法。
【請求項２２】
前記代謝改変（４）ａｃｋＡ−ｐｔａ、ｐｙｋＦ、ｐｔｓＧをコード化する前記遺伝子が、ｐｙｋＡまたはｄｈａＫＬＭから選択される少なくとも１つの遺伝子破壊でさらに構成される請求項２０の方法。
【請求項２３】
前記代謝改変（５）ａｃｋＡ−ｐｔａ、ｐｙｋＦ、ｐｔｓＧ、ａｄｈＥ、ｌｄｈＡをコード化する前記遺伝子が、ｐｙｋＡまたはｄｈａＫＬＭから選択される少なくとも１つの遺伝子破壊でさらに構成される請求項２０の方法。
【請求項２４】
前記１つ以上の遺伝子の破壊は欠損を含む、請求項２０の方法。
【請求項２５】
前記微生物は、細菌、酵母、または菌を含む、請求項２０の方法。
【請求項２６】
前記細菌が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、アナエロビオスピルリム・サクシニシプロデュセンス（Ａ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）、アクチノバチルス・スクシノゲネス（Ａ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、マンヘミア・サクシニシプロデュセンス（Ｍ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）、インゲン根粒菌（Ｒ．ｅｔｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、グルコノバクテル・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ストレプトマイセス・コエリコロル（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、およびシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）から選択される種で構成される請求項２５の方法。
【請求項２７】
前記酵母が、サッカロマイセス・ケレウィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、クリベロマイセスラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、クリベロマイセス・マルキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）、クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、およびピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）から選択される種で構成される請求項２５の非自然発生的な微生物。