(57)【要約】  本発明は、生物活性プレチューブリシン誘導体、その調製および薬理学的使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式ＩまたはＩＩを有するプレチューブリシン化合物
【化３４】
2012503621.tif 000038
［式中、
Ｒ１は、フェニル、ハロゲン、Ｃ１〜３アルコキシおよびフェノキシから独立に選択される１〜３個の置換基を有していてもよい分岐または直鎖、飽和または不飽和のＣ１〜６アルキル基であり、
Ｒ２はＨ、またはフェニル、ハロゲン、Ｃ１〜３アルコキシおよびフェノキシから独立に選択される１〜３個の置換基を有していてもよい分岐または直鎖、飽和もしくは不飽和のＣ１〜１６アルキル基であり、
Ｒ３はＨ、またはフェニル、ハロゲン、Ｃ１〜３アルコキシおよびフェノキシから独立に選択される１〜３個の置換基を有していてもよい分岐もしくは直鎖、飽和または不飽和のＣ１〜６アルキル基であり、
ＡｒはＣ１〜３アルキル、Ｃ１〜３アルケニル、ハロゲン、Ｃ１〜３アルコキシおよびＣ１〜３アルケノキシから独立に選択される１〜３個の置換基を有していてもよいフェニル基またはナフチル基であり、
ｎは０〜２の整数であり、
【化３５】
2012503621.tif 000039
は単結合または二重結合を示す。］
もしくはＣ末端カルボキシ基のエステルおよび／またはその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
Ｒ１がメチル基、エチル基、プロピル基、ベンジル基もしくはアリル基である、および／または
Ｒ２がＨ、Ｃ１〜１２アルキル基、ベンジル基もしくはアリル基である、および／または
Ｒ３がＨ、メチル基、エチル基、アリル基もしくはベンジル基である、および／または
Ａｒが、非置換フェニル基、基Ｘにより４位で置換されているフェニル基もしくは基Ｘにより６位で置換されている２−ナフチル基（Ｘは−ＣＨ３、−ＯＣＨ３、−アリル、−Ｏアリルおよびハロゲンから選択される）である、および／または
ｎが１もしくは２である、および／または
前記エステルのアルコール成分が一価および多価のアルコールから選択され、好ましくはＣ１〜６アルカノール、Ｃ１〜６アルケノール、Ｃ２〜６アルキレンジオールおよびグリセロールから選択される、および／または
【化３６】
2012503621.tif 000040
が単結合である、
請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
【化３７】
2012503621.tif 000041
が単結合であり、
（ｉ）Ｒ１、Ｒ２およびＲ３がＣＨ３であり、Ａｒが非置換フェニル基であり、ｎが２である、もしくは
（ｉｉ）Ｒ１およびＲ２がＣＨ３であり、Ｒ３がＨであり、Ａｒが非置換フェニル基であり、ｎが２である、構造式Ｉを有する
請求項１に記載の化合物またはそのグリセロールエステル。
【請求項４】
【化３８】
2012503621.tif 000042
が単結合であり、Ｒ１およびＲ２がＣＨ３であり、Ｒ３がＨであり、Ａｒが非置換フェニル基である、構造式ＩＩを有する
請求項１に記載の化合物またはそのグリセロールエステル。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物を含む医薬組成物または医薬。
【請求項６】
癌の治療に適した請求項５に記載の医薬組成物または医薬。
【請求項７】
「チューブバリン」および「チューブフェニルアラニン」ビルディングブロック（２）および（３）
【化３９】
2012503621.tif 000043
（式中、ＳＧ、ＲおよびＲ’は適当な保護基である。）
またはそれらの各誘導体を縮合することを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物を調製する方法。
【請求項８】
癌の治療用の医薬を製造するための請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項９】
前記医薬が、アポトーシスの誘導に適している、または抗有糸分裂剤として適している、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
患者に請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物を適当量投与することを含む、患者の癌を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生物活性プレチューブリシン誘導体、その調製および薬理学的使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
チューブリシンＡおよびＤは、粘液細菌株Ａｒｃｈａｎｇｉｕｍ  ｇｅｐｈｙｒａおよびＡｎｇｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｉｓｃｉｆｏｒｍｉｓから元は単離された抗有糸分裂ペプチド群の構成要素である。化合物はいずれも、非常に低い濃度で癌細胞株の増殖を抑制し、チューブリシンＤは、チューブリシンＡの約１０倍強力である。チューブリシンで哺乳動物細胞を処理することにより、細胞周期停止がＧ２Ｍ期で誘導され、次いでアポトーシスが誘導される（Ｋｈａｌｉｌ，Ｍ．ら、Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．７、６７８〜６８３（２００６）；Ｓａｓｓｅ，Ｆ．ら、Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．３、８７〜８９（２００７））。薬物はいずれも、インビトロでの精製微小管タンパク質の重合を抑制し、プレアセンブルした微小管の脱重合を誘導する。以前の報告では、チューブリシンＡが、非競合的に、ビンブラスチンのチューブリンへの結合を強く阻害することが証明された（Ｋｈａｌｉｌ，Ｍら、Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．７、６７８〜６８３（２００６））。
【０００３】
当技術分野で公知の「プレチューブリシン」と称されるある種のチューブリシン誘導体は、最初に、粘液細菌からの抽出物中で観察された（構造式は下記参照）。その後、それらはＵＤＳにてＫａｚｍａｉｅｒのグループにより化学的に合成できた。例えば、国際公開第２００８／１０６０８０号は、中心のチアゾール含有アミノ酸残基中に場合によりアシル化されたヒドロキシル残基を有する、および／または不飽和Ｃ末端アミノ酸残基を有するこのようなプレチューブリシンについて開示しており、国際公開第２００４／０４６１７０号は、完全飽和プレチューブリシンについて言及している。しかし、これらのプレチューブリシンのアポトーシス活性および細胞毒性活性は、チューブリシンＡおよびＤより著しく劣る。チューブリシンＡおよびＤの天然の存在度は中程度であり、合成プロセスは利用できないため、チューブリシンＡおよびＤに匹敵する活性を有する代替物質に対する需要は高い。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
低濃度で種々の癌細胞株に対して強力な抗有糸分裂活性および抗増殖効果を示す新しい部類のプレチューブリシンが見出された。前記プレチューブリシンは、ＰｔＫ２細胞の微小管、さらに精製微小管タンパク質の脱重合を誘導し、濃度依存的にインビトロでの精製微小管タンパク質の重合を抑制する。さらに、プレチューブリシン８１６または８２７で頸癌細胞株ＫＢ３−１またはヒト急性骨髄性白血病細胞株ＨＬ−６０を処理すると、細胞周期のＧ２Ｍ期で細胞が蓄積され、アポトーシスが誘導される。しかし、免疫蛍光研究から、それらの作用様式と、天然物であるチューブリシンＡおよびＤの作用様式との間でいくつかの細かい相違が示唆された。これらの化合物は、これまでに知られているプレチューブリシンよりもはるかに強力である。したがって、本発明は下記（１）〜（６）の発明を提供する。
（１）式Ｉまたは式ＩＩを有するプレチューブリシン化合物
【０００５】
【化１】
2012503621.tif 000002
［式中、
Ｒ１は、フェニル、ハロゲン、Ｃ１〜３アルコキシおよびフェノキシから独立に選択される１〜３個の置換基を有していてもよい分岐または直鎖、飽和または不飽和のＣ１〜６アルキル基であり、
Ｒ２はＨ、またはフェニル、ハロゲン、Ｃ１〜３アルコキシおよびフェノキシから独立に選択される１〜３個の置換基を有していてもよい分岐または直鎖、飽和もしくは不飽和のＣ１〜１６アルキル基であり、
Ｒ３はＨ、またはフェニル、ハロゲン、Ｃ１〜３アルコキシおよびフェノキシから独立に選択される１〜３個の置換基を有していてもよい分岐または直鎖、飽和もしくは不飽和のＣ１〜６アルキル基であり、
ＡｒはＣ１〜３アルキル、Ｃ１〜３アルケニル、ハロゲン、Ｃ１〜３アルコキシおよびＣ１〜３アルケノキシから独立に選択される１〜３個の置換基を有していてもよいフェニル基またはナフチル基であり、
ｎは０〜２の整数であり、
【０００６】
【化２】
2012503621.tif 000003
は単結合または二重結合を示す。］
もしくはＣ末端カルボキシ基のエステルおよび／またはその薬学的に許容される塩。
（２）
【０００７】
【化３】
2012503621.tif 000004
が単結合を示し、化合物がプレチューブリシン８２７、８１６もしくは８２５またはそれらのグリセロールエステル、とりわけ以下の化合物
【０００８】
【化４】
2012503621.tif 000005
であることが好ましい、上記（１）の好ましい実施形態。
（３）上記（１）または（２）の化合物を含む医薬組成物または医薬。
（４）「チューブバリン」および「チューブフェニルアラニン」ビルディングブロック（２）および（３）
【０００９】
【化５】
2012503621.tif 000006
（式中、ＳＧ、ＲおよびＲ’が適当な保護基である。）
もしくはそれらの各誘導体を縮合することを含む、上記（１）または（２）の化合物を調製する方法。
（５）癌の治療用の医薬を調製するための、上記（１）または（２）の化合物の使用。
（６）患者に上記（１）または（２）の化合物を適当量投与することを含む、患者の癌を治療する方法。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】チューブリシンＡと比較した、ＨＬ−６０細胞の増殖に対するプレチューブリシン８１６および８２７の効果を示す図である。
【図２】ＨＬ−６０細胞の増殖に対するプレチューブリシン８１４、８１５および８２５の効果を示す図である。
【図３】リンパ腫細胞株Ｕ９３７の増殖に対するグリセロール誘導体の効果を示す図である。
【図４】間期のＰｔＫ２細胞（Ａ）および有糸分裂期の対照ＰｔＫ２細胞（Ｂ）の微小管を示す図である。
【図５】ＰｔＫ２細胞の微小管構造に対するチューブリシンＡ（Ａ）およびチューブリシンＤ（Ｂ）の効果を示す図である。細胞を、５００ｐｇ／ｍｌのチューブリシンＡまたは５０ｐｇ／ｍｌのチューブリシンＤのいずれかで２４時間処理した。次いで、微小管（緑）を、免疫蛍光法を用いて可視化させた。核をＤＡＰＩ染色した（青）。
【図６】ＰｔＫ２細胞の微小管および紡錘体装置に対するプレチューブリシン８１６の効果を示す図である。ＰｔＫ２細胞を、０．５μｇ／ｍｌ（Ａ）、１μｇ／ｍｌ（Ｂ）、２．５μｇ／ｍｌ（Ｃ）および５μｇ／ｍｌ（Ｄ）のプレチューブリシン８１６で２４時間処理した。微小管は、特に細胞末端付近でより短く、より密になった。１００ｎｇ／ｍｌの濃度では、処理した細胞の紡錘体プールは形態学的変化を示さなかった（Ｅ）。２５０ｎｇ／ｍｌの濃度では、一部の紡錘体装置は依然として正常に見え（Ｆ）、他はプールを２つを超えて有している（Ｇ）。５００ｎｇ／ｍｌ以上の濃度では、有糸分裂細胞の大部分が異常な紡錘体装置を示した（Ｈ）。
【図７】ＰｔＫ２細胞の微小管および紡錘体装置に対するプレチューブリシン８２７の効果を示す図である。ＰｔＫ２細胞を、５０ｎｇ／ｍｌで２４時間処理した。（Ａ）および（Ｂ）は、ＰｔＫ２細胞の間期微小管に対するプレチューブリシン８２７の効果を示しており、（Ｃ）は、異常な紡錘体装置を示している。
【図８】ＰｔＫ２細胞の間期微小管に対するプレチューブリシン８２７（１μｇ／ｍｌ）の効果を示す図である。
【図９】インビトロでの微小管タンパク質の重合に対するプレチューブリシン８１６の効果を示す図である。微小管タンパク質（１０μＭ）を不在下（Ａ）、ならびに１．７μＭ（Ｂ）、３．２μＭ（Ｃ）および６．７μＭ（Ｄ）のプレチューブリシン８１６の存在下で重合した。
【図１０】対照のパーセントとして、微小管タンパク質の重合に対する種々の濃度のプレチューブリシン８１６の効果を示す図である。ここで示された値は、先の曲線（図９）から計算し、種々の濃度の薬物と共に３７℃にて１０分間インキュベートした後に測定した値を示している。
【図１１】インビトロでの微小管タンパク質の重合に対するプレチューブリシン８２７の効果を示す図である。微小管タンパク質（１０μＭ）を、不在下（Ａ）、ならびに１μＭ（Ｂ）、１．７μＭ（Ｃ）および３．４μＭ（Ｄ）のプレチューブリシン８２７の存在下で重合させた。
【図１２】対照のパーセントとして、微小管タンパク質の重合に対する種々の濃度のプレチューブリシン８２７の効果を示す図である。ここで示された値は、先の曲線（図１１）から計算し、種々の濃度の薬物と共に３７℃にて１０分間インキュベートした後に測定した値を示している。
【図１３】プレチューブリシン８２７は、プレアセンブルした微小管の脱重合を誘導する。微小管タンパク質を３７℃で５分間重合させた。０μＭ（Ａ）、１．５μＭ（Ｂ）、２．２５μＭ（Ｃ）、３μＭ（Ｄ）および３．７５μＭのプレチューブリシン８２７を加え、微小管の安定性をさらに１０分間モニターした。
【図１４】プレチューブリシン８１６は、ＫＢ３−１細胞のＧ２Ｍ停止を誘導する。細胞を０μｇ／ｍｌ（Ａ）、０．２μｇ／ｍｌ（Ｂ）、０．５μｇ／ｍｌ（Ｃ）、０．７５μｇ／ｍｌ（Ｄ）および１μｇ／ｍｌ（Ｅ）で２４時間処理した。
【図１５】ＫＢ３−１細胞の細胞周期分布に対するプレチューブリシン８２７の効果を示す図である。細胞を種々の濃度の薬物で２４時間処理した。約３０％の対照細胞が、細胞周期のＧ２Ｍ期内に分布した。１００ｎｇ／ｍｌのプレチューブリシン８２７で２４時間細胞を処理した後、６５％の細胞がＧ２Ｍ期に蓄積された。
【図１６】プレチューブリシン８１６および８２７は、ＤＮＡラダリングにより特徴付けられるＨＬ−６０細胞のアポトーシスを誘導する。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の態様（１）のプレチューブリシンにおいて、変数は以下の意味を有する。
【００１２】
Ｒ１およびＲ３の定義において「分岐または直鎖、飽和または不飽和のＣ１〜６アルキル基」としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉｓｏ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基などが挙げられ、各不飽和基は、１個、２個または３個の二重結合を有する。前記Ｃ１〜６アルキル基の中で、Ｃ１〜３アルキル基およびＣ１〜３アルケニル基が特に好ましい。Ｒ２の定義において「分岐または直鎖、飽和または不飽和のＣ１〜１６アルキル基」としては、上記Ｃ１〜６アルキル基と同様の基が挙げられるが、二重結合の数はより多くてもよい。前記Ｃ１〜１６アルキル基の中で、Ｃ１〜１２アルキル基およびＣ１〜１２アルケニル基が特に好ましい。Ｃ１〜６アルキル基およびＣ１〜６アルケニル基がさらにより好ましい。
【００１３】
前記Ｃ１〜６アルキル基およびＣ１〜１６アルキル基の任意選択の置換基は、フェニル、ハロゲン、Ｃ１〜３アルコキシおよびフェノキシから選択される。「ハロゲン」としては、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩが挙げられ、「Ｃ１〜３アルコキシ」としては、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基およびｉｓｏ−プロポキシ基が挙げられる。
【００１４】
Ｃ１〜３アルキル、Ｃ１〜３アルケニル、ハロゲン、Ｃ１〜３アルコキシおよびＣ１〜３アルケノキシから独立に選択される１〜３個の置換基を有していてもよいＡｒ基は、意味に関してＣ末端カルボキシ基のエステルのアルコール成分としては、一価および多価のアルコールが挙げられ、アルコール成分はＣ１〜６アルカノール（すなわち、上に定義したＣ１〜６アルキル基のアルコール）、Ｃ１〜６アルケノール（すなわち、各不飽和基のアルコール）、Ｃ２〜６アルキレンジオール（エチレングリコール、１，２−および１，３−プロピレングリコール、１，４−ブチレングリコールなどを含む）およびグリセロールから選択されることが好ましい。
【００１５】
「薬学的に許容される塩」としては、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、アンモニウム塩などが挙げられる。
【００１６】
本発明の態様（１）の特に好ましい化合物は、Ｒ１がメチル基、エチル基、プロピル基、ベンジル基またはアリル基である化合物である。本発明の態様（１）のさらに好ましい化合物は、Ｒ２がＨ、Ｃ１〜１２アルキル基、ベンジル基またはアリル基である化合物である。
【００１７】
本発明の態様（１）のいっそうさらに好ましい化合物は、Ｒ３がＨ、メチル基、エチル基、アリル基またはベンジル基である化合物である。
【００１８】
本発明の態様（１）のいっそうさらに好ましい化合物は、
Ａｒが非置換フェニル基
【００１９】
【化６】
2012503621.tif 000007
置換フェニル基
【００２０】
【化７】
2012503621.tif 000008
または、置換ナフチル基
【００２１】
【化８】
2012503621.tif 000009
（式中、Ｘは−ＣＨ３、−ＯＣＨ３、−アリル、−Ｏアリルおよびハロゲンから選択される）
である。
【００２２】
本発明の態様（１）のいっそうさらに好ましい化合物は、ｎが１または２である化合物である。
【００２３】
本発明の態様（３）および（５）の医薬組成物または医薬は、薬学的に許容される担体、結合剤、賦形剤などをさらに含有できる。
【００２４】
本発明の態様（４）の合成をプレチューブリシン（１）
【００２５】
【化９】
2012503621.tif 000010
に関連して以下に示す。
【００２６】
中核となるステップとして、ビルディングブロック「チューブバリン」および「チューブフェニルアラニン」成分（２）および（３）
【００２７】
【化１０】
2012503621.tif 000011
の合成を含む。
【００２８】
「チューブバリン」（２）を以下の反応スキームに従って調製する。
【００２９】
【化１１】
2012503621.tif 000012
【００３０】
チューブフェニルアラニン（３）を以下の反応スキームに従って調製する。
【００３１】
【化１２】
2012503621.tif 000013
【００３２】
次いで、テトラペプチドプレチューブリシン（１）の合成を以下の反応スキームに従って行う。
【００３３】
【化１３】
2012503621.tif 000014
【００３４】
添付の実施例において、種々の癌細胞株の増殖ならびにインビトロでの精製微小管タンパク質に対する種々のプレチューブリシン誘導体の効果を試験した。結果から、２つの試験した物質（プレチューブリシン８１６および８２７）が、大部分の試験した細胞株に対して高い抗増殖活性を示し、プレチューブリシン８２７は、プレチューブリシン８１６よりも少なくとも５〜１０倍強力であることが示された。プレチューブリシン８１５および８２５も活性であったが、より高い薬物濃度で活性であった。それに対し、プレチューブリシン８１４は、最大１１μｇ／ｍｌの濃度で細胞毒性活性を全く示さなかった。免疫蛍光調査から、プレチューブリシンでＰｔＫ２細胞を処理すると、高い濃度（μｇレベル）で間期微小管の脱重合が誘導されることが示された。この特徴的形態は、チューブリシンＡまたはＤにより、はるかに低い濃度（ｐｇ〜ｎｇレベル）で生じた形態に匹敵した。
【００３５】
しかし、より低い薬物濃度（ｎｇレベル）では、プレチューブリシンは、間期微小管の独特の形態を誘導する。ここで微小管は、特に細胞末端周辺でより短く、より密になると思われる。我々の知る限りでは、これらの形態は、微小管の脱重合を誘導する他の抗有糸分裂薬物（例えば、ジソラゾール、チューブリシンおよび／またはビンブラスチン）では見られなかった。これらの知見は、プレチューブリシンが、チューブリンおよび／または微小管と相互作用する新規の機構を示唆している。
【００３６】
他の抗有糸分裂剤と同様に、プレチューブリシンは、細胞周期のＧ２Ｍ停止を誘導し、次いでアポトーシスを誘導する。これは、処理した細胞のＤＮＡラダリングを介して示されよう。プレチューブリシンは、化学的に合成でき、大量に製造できる有望な抗有糸分裂薬である。特にプレチューブリシン８２７は、天然物であるチューブリシンＡおよびＤと効果については同等である。
【００３７】
本発明を以下の実施例でさらに説明するが、これらは本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。
［実施例］
【００３８】
材料および方法
細胞培養：細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎおよびＧｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓから入手した。細胞株を、それらの各寄託者の条件下で培養した。細胞培養試薬はＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）から購入した。プラスチックウェアはＮｕｎｃ  ａｎｄ  Ｓａａｒｓｔｅｄｔから入手した。
【００３９】
細胞染色：ＰｔＫ２細胞を、４ウェルプレート中の丸いガラスカバースリップ（直径１３ｍｍ）上に播種した。細胞を、各実験に対して示された所与の時間まで薬物と共にインキュベートした。微小管および核の染色については、最初に細胞を冷（−２０℃）アセトン／メタノール（１：１）で１０分間固定した。微小管の標識については、細胞を、αチューブリンに対する一次モノクローナル抗体（１：５００  シグマ）と共に３７℃にて４５分間インキュベートし、次いで、Ａｌｅｘａ４８８とコンジュゲートした抗マウスＩｇＧ二次抗体（１：２０００；分子プローブ）と共に同じインキュベーション条件下でインキュベートした。核をＤＡＰＩ（ＰＢＳ中１μｇ／ｍｌ）で染色した。インキュベーションとインキュベーションの間には、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。Ｐｒｏｌｏｎｇ  Ａｎｔｉｆａｄｅ（分子プローブ）を用いてカバースリップを載せ、適当なフィルターセットを有する蛍光顕微鏡（ＬＳＭ−Ｚｅｉｓｓ）により撮像した。
【００４０】
細胞周期分析：約１０６個の細胞を、遠心分離により採取し、−２０℃の冷８０％メタノール中に固定した。３０分間氷上でインキュベートした後、細胞をＰＢＳ、次いでサポニン含有ＰＢＳ（０．１％）で洗浄した。ＤＮＡ染色については、細胞をヨウ化プロピジウム２０μｇ／ｍｌ−１およびＲＮａｓｅ１ｍｇ／ｍｌ−１を含有する溶液中で３７℃にて３０分間インキュベートした。試料をＦａｃＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で分析した。
【００４１】
ＤＮＡラダリングの検出：アポトーシスＤＮＡ断片化を、Ｇｏｎｇらにより示された方法を用いて調査した。ＤＮＡ１〜２μｇを、１．７％アガロースゲルのウェルに充填し、０．５×ＴＢＥバッファー（０．０４５Ｍ  ｔｒｉｓホウ酸塩、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を用いて４ボルト／ｃｍで約４時間の電気泳動により分離した。得られたバンドを、臭化エチジウムで染色し、紫外線下で検出した。
【００４２】
チューブリンの精製：微小管タンパク質を、他の部分に示したように、温度依存的な重合および脱重合の３サイクルを含む標準的な手順を用いてブタ脳から精製した。
【００４３】
重合アッセイ：チューブリンの重合を、比濁アッセイ（ｌｉｔ）を用いてモニターした。ＰＥＭ重合バッファー（０．１Ｍ  ＰＩＰＥＳ、ｐＨ６．６、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４および１ｍＭ  ＧＴＰ）中の試料（２００μｌ、１０μＭチューブリン）を、ダイオードアレイ光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ分光光度計ＤＵ７５００）のウォータージャケットキュベットホルダーで３７℃まで急速に昇温した。３５０ｎｍでの吸光度を薬物の不在下および存在下でモニターした。
【００４４】
電子顕微鏡検査：ＰＥＭ重合バッファー中のチューブリン試料（１０μＭ）を薬物の存在下および不在下で３７℃にてインキュベートした。次いで、試料を、ホルムアルデヒドを用いて最終濃度２％に固定し、試料（１０μｌ）を炭素被覆した銅グリッドに吸着させ、グルタルアルデヒド（０．５％）中に６０秒間固定し、次いで蒸留水で洗い流した。グリッドを、酢酸ウラニル水溶液（２％）でネガティブコントラストとした。ブロットし、乾燥させた。試料をＺｅｉｓｓ  ＣＥＭ９０２透過電子顕微鏡で調べた。
【００４５】
【化１４】
2012503621.tif 000015
【００４６】
実施例２／図３で言及したプレチューブリシンのグリセロールエステルは、以下の構造式を有する。
【００４７】
【化１５】
2012503621.tif 000016
【００４８】
薄層クロマトグラフィー：Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ製のポリグラムＳＩＬ  Ｇ／ＵＶ２５４既製シートを使用した。検出は、紫外線およびディッピング剤として過マンガン酸カリウムを用いて行った。
【００４９】
カラムクロマトグラフィー：シリカ充填カラムを使用した（ＭＮ  Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ  ６０、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ製のＡＳＴＭ  ０．０６３〜０．２ｍｍ／７０〜２３０メッシュ）
【００５０】
１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを、５００ＭＨｚ核磁気共鳴分光計（Ｂｒｕｋｅｒ  ＤＲＸ５００およびＢｒｕｋｅｒ  ＡＶ５００）および４００ＭＨｚ装置（Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＶ４００）を用いて記録した。別段の指示がない限り、重水素化クロロホルムを溶媒として使用した。較正は、溶媒（ＣＤＣＩ３：δ＝７．２４）に基づくものであり、評価は、Ｂｒｕｋｅｒ製のＷｉｎＮＭＲソフトウェアを用いて一次元処理で行った。略語は以下の意味を有する：ｓ＝シングレット、ｄ＝ダブレット、ｔ＝トリプレット、ｑ＝カルテット、ｍ＝マルチプレット、ｓｈ＝シグナルクラスター、ｂｓ＝ブロードシングレット、およびそれらの組合せ、例えばｄｄｔ＝ダブルダブルトリプレット。化学シフトは、δ値であり、ｐｐｍで示される。
【００５１】
１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルも、上記の分光計（ＤＲＸ５００およびＡＶ５００：測定周波数１２５ＭＨｚ；ＡＶ４００：測定周波数１００ＭＨｚ）を用いて記録した。較正は溶媒シグナル（ＣＤＣｌ３：７７．０ｐｐｍ）に基づくものであった。化学シフトはｐｐｍで示し、測定はブロードバンドデカップリングで行った。略語は以下の意味を有する：ｓ＝シングレット（第４級炭素原子）、ｄ＝ダブレット（ＣＨ基）、ｔ＝トリプレット（ＣＨ２基）、ｑ＝カルテット（ＣＨ３基）。＊で標識されたシフトは、１３ＣスペクトルまたはＨＳＱＣスペクトルから推定された。
【００５２】
融点は修正せず、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｄｅｖｉｃｅ製の融点測定器ＭＥＬ−ＴＥＭＰＩＩを用いて開放型のガラス毛細管で測定した。
【００５３】
旋光度は、恒温（２０℃±０．１℃）１ｄｍキュベット中でＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（Ｍｏｄｅｌ３４１）製の旋光計で測定した。ナトリウム灯（λ＝５８９ｎｍ）を放射源として利用した。濃度を入力した後で、特定の旋光度（［α］２０Ｄ）値を測定器で計算した。
【００５４】
元素分析は、Ｈｅｉｋｅ  ＲｏｅｓｅｒによりＩｎｓｔｉｔｕｔ  ｆｕｒ  Ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓａａｒｌａｎｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙで行われた。
【００５５】
高分解質量スペクトル（ＨＲＭＳ）は、Ｆｉｎｎｉｇａｎ製のＭＡＴ９０装置を用いてＲｕｄｉ  ＴｈｏｍｅｓによりＳａａｒｌａｎｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙで記録した。断片化は、化学イオン化（ＣＩ）により実現した。
【００５６】
溶媒は、Ｓａａｒｌａｎｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙのｃｅｎｔｒａｌ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ｓｔｏｒｅより供給され、使用前に蒸留した。
【００５７】
無水溶媒は、通常の方法で無水とした：ＴＨＦに対して水素化アルミニウムリチウム、ジエチルエーテルおよびトルエンに対してナトリウム、ジクロロメタンに対して水素化カルシウム。原則として、無水溶媒での実験は、真空下で既に加熱したガラス装置中で窒素雰囲気下で行い、揮発性物質を除去した。
【００５８】
略語：ＢＥＰ  ２−ブロモ−１−エチルピリジニウムテトラフルオロホウ酸塩；ＤＣＣ  ジシクロヘキシルカルボジイミド；ＤＩＢＡＩＨ  水素化ジイソブチルアルミニウム；ＤＩＰＥＡ  ジイソプロピルエチルアミン；ＤＭＡＰ  ジメチルアミノピリジン；ＤＭＦ  ジメチルホルムアミド；ＤＭＰ  ジメトキシプロパン；ＥＥ  酢酸エチル；ＮＭＭ  Ｎ−メチルモルホリン；Ｐｙｒ  ピリジン；ＴＦＡ  トリフルオロ酢酸；ＴＦＡＡ  無水トリフルオロ酢酸；およびＴＨＦ  テトラヒドロフラン。
【実施例１】
【００５９】
プレチューブリシンの合成
１．１．（４Ｓ，２Ｅ）−４−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−５−メチル−２−ヘキセンニトリル（４）：無水トルエン２０ｍｌ中のＬ−Ｂｏｃ−バリンメチルエステル（７．５２ｍｍｏｌ、１．０当量）１．７４ｇの溶液に、１Ｍ  ＤＩＢＡＩＨ溶液（１５ｍｍｏｌ、２．０当量）１５ｍｌを−７８℃で徐々に滴下する。反応混合物を−７８℃で３０分間撹拌しながら、イリド溶液を、無水トルエン１５ｍｌ中の塩化シアノメチルトリフェニルホスホニウム（１３．８ｍｍｏｌ、１．８当量）４．６７ｇおよびＫＯｔＢｕ（１３．８ｍｍｏｌ、１．８当量）１．５５ｇから室温で調製する。イリドをアルデヒド溶液に−７８℃で滴下し、１時間後、冷浴を除去し、室温で終夜撹拌する。
【００６０】
反応混合物を、飽和酒石酸カリウムナトリウム溶液１００ｍｌ中に注入し、３０分間勢いよく撹拌する。水相を酢酸エチルで抽出し、合わせた有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥させる。カラムクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥＥ  ９：１、８：２）により精製すると、ウィッティヒ生成物（４）（５．３５ｍｍｏｌ、理論の７１％）１．２０ｇが白色固体として生じる。
Ｒｆ（４）＝０．２９（ヘキサン：ＥＥ  ８：２）
【００６１】
【化１６】
2012503621.tif 000017
1H NMR (500MHz, CDCl3): δ = 0.90 (d, 3J6,5= 6.7H, 3H, 6-H), 0.93 (d,3J6',5 = 6.7Hz, 1H, 6'-H), 1.43 (s, 9H, 9-H), 1.84 (m, 1H, 5-H), 4.11 (bs, 1H, 4-H), 4.50 (bs, 1H, NH), 5.47 (dd, 3J2,3 = 16.5Hz, 4J2,4 = 1.6Hz, 1H, 2-H), 6.62 (dd, 3J3,2 = 16.5Hz, 3J3,4= 5.5Hz, 1H, 3-H).
13C NMR (125MHz, CDCl3): δ = 18.0 (q, C-6), 18.8 (q, C-6'), 28.3 (q, C-9), 32.0 (d, C-5), 57.4 (d, C-4), 80.2 (s, C-8), 100.4 (d, C-2), 117.1 (s, C-1), 154.0 (d, C-3), 155.1 (s, C-7).
旋光度: [α]20D = -0.3°(c = 1.0g/100ml, CHCl3)
融点: 62℃
元素分析:
C12H20N2O2     計算値 C 64.26     H 8 .99     N 12 .49
(224.30)     実測値 C 64.04     H 9.25      N 12 .86
HRMS (CI)         計算値           実測値
C12H21N2O2[M+H]+    225.1603         225.1536
【００６２】
１．２．（４Ｒ）−４−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−５−メチルヘキサンニトリル（５）：（４）（１２．３ｍｍｏｌ）２．７７ｇを、反応が完了するまで（ＤＣ対照）水素雰囲気下でＰｄ／Ｃ（１０％）１３８ｍｇと共に撹拌する。触媒をセライトを介して濾過して除去し、溶液をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥＥ  ８：２）により精製した後、（５）（１０．６ｍｍｏｌ、理論の８７％）２．４１ｇが白色固体として得られる。
Ｒｆ（５）＝０．１９（ヘキサン：ＥＥ  ８：２）
【００６３】
【化１７】
2012503621.tif 000018
1H NMR (400MHz, CDCl3): δ = 0.88 (d, 3J6,5= 6.8Hz, 3H, 6-H), 0.91 (d3J6',5 =6.8Hz, 3H, 6'-H), 1.42 (s, 9H, 9-H), 1.59 (m, 1H, 3-Ha), 1.71 (m, 1H, 5-H), 1.89 (m, 1H, 3-Hb), 2.35 (ddd, 2J2a,2b = 16.9Hz, 3J2a,3a/b= 8.3Hz, 3J2a,3a/b = 7.0Hz, 1H, 2-Ha), 2.41 (ddd, 2J2b,2a = 16.9Hz, 3J2b,3a/b = 8.8Hz, 3J2a,3a/b = 6.4Hz, 1H, 2-Hb), 3.43 (dddd, 3J4,3a/b≒3J4,NH = 10.3Hz, 3J4,5 = 5.5Hz, 3J4,3a/b = 3.5Hz, 1H, 4-H), 4.32 (d, 3JNH,4 = 8.8Hz, 1H, NH). 
13C NMR (125MHz, CDCl3): δ = 14.6 (t, C-2), 17.8 (q, C-6), 19.1 (q, C-6'), 28.3 (q, C-9), 29.2 (t, C-3), 32.3 (d, C-5), 55.2 (d, C-4), 79.6 (s, C-8), 119.8 (s, C-1), 156.0 (s, C-7).
旋光度: [α]20D =+5.1 (c = 1.0g/100ml, CHCl3)
融点: 65℃
元素分析:
C13H24N2O2     計算値 C 63.69     H 9.80     N 12.38
(226.32)     実測値 C 63.62     H 9.36     N 12.59
HRMS (CI)         計算値          実測値
C12H23N2O2[M+H]+    227.1759        227.1814
【００６４】
１．３．（４Ｒ）−４−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメチルアミノ）−５−メチルヘキサンニトリル（６）：無水ＤＭＦ４０ｍｌ中の（５）（１０．６ｍｍｏｌ）２．３９ｇの溶液を、ヨウ化メチル（４１．８ｍｍｏｌ、３．９当量）２．６ｍｌと混合する。無水ＤＭＦ１０ｍｌ中の水素化ナトリウム（５５〜６５％、２２．１〜２６．１ｍｍｏｌ、２．１〜２．５当量）９６４ｍｇの懸濁液を０℃にて滴下する。反応混合物を、室温まで終夜昇温させ、水２００ｍｌおよび飽和塩化アンモニウム溶液５０ｍｌを注入し、勢いよく撹拌し、次いで酢酸エチルで抽出する。カラムクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥＥ  ８：２）により精製すると、生成物（６）（１０．４ｍｍｏｌ、９８％）２．５１ｇが無色油として生じる。
Ｒｆ（６）＝０．１８（へキサン：ＥＥ  ８：２）。
【００６５】
【化１８】
2012503621.tif 000019
1H NMR (400MHz, CDCl3): 室温での回転異性体の比: 約1:1 δ = 0.83 (d, 3J6,5= 7.0Hz, 3H, 6-H), 0.85 (d, 3J6,5 = 6.8Hz, 3H, 6-H), 0.93 (d, 3J6',5 = 6.5Hz, 3H, 6'-H), 0.94 (d, 3J6',5= 6.5Hz, 3H, 6'-H), 1.43 (s, 9H, 10-H), 1.45 (s, 9H, 10-H), 1.62-1.75 (sh, 4H, 3-Ha, 5-H), 1.91-2.03 (sh, 2H, 3-Hb), 2.12-2.34 (sh, 4H, 2-Ha, 2-Hb), 2.64 (s, 6H, 7-H), 3.62 (bs, 1H, 4-H), 3.68 (td, 3J4,3 = 10.8Hz, 3J4,5 = 3.3Hz, 1H, 4-H).
13C NMR (100MHz, CDCl3): δ = 14.5 (t, C-2), 19.6, 19.8, 20.0, 20.1 (4 q, C-6, C-6'), 25.9 (t, C-3), 28.4 (q, C-10), 28.8 (q, C-7), 30.3, 30.5 (2 d, C-5), 60.8, 61.1 (2 d, C-4), 79.7, 80.2 (2 s, C-9), 119.3, 119.7 (2 s, C-1), 156.3, 156.6 (2 s, C-8).
旋光度: [α]20D =+4.7°(c = 1.0g/100ml, CHCl3)
HRMS (CI)          計算値        実測値
C13H25N2O2[M+H]+     241.1916      241.1903
【００６６】
１．４．（４Ｒ）−４−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメチルアミノ）−５−メチルヘキサンチオアミド（７）：クロロホルム１５ｍｌ中のニトリル（６）（７．７０ｍｍｏｌ）１．８５ｇおよびトリエチルアミン（３８．４ｍｍｏｌ、５．０当量）５．４ｍｌの溶液にＨ２Ｓを−７８℃で１時間バブリングさせる。反応混合物をしっかり密閉し、室温まで終夜昇温させて、室温で数日間撹拌する。その間、反応混合物は黄色から緑に変化する。処理については、混合物を１Ｍ  ＨＣｌ溶液、飽和ＮａＨＣＯ３溶液および水で洗浄し、有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥させる。カラムクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥＥ  １：１）により精製すると、チオアミド１．９４ｇ（７）（７．０７ｍｍｏｌ、理論の９２％）が白色固体として生じる。
Ｒｆ（７）＝０．３３（へキサン：ＥＥ  １：１）。
【００６７】
【化１９】
2012503621.tif 000020
1H NMR (400MHz, CDCl3):
主回転異性体: δ = 0.82 (d, 3J6,5 = 6.5Hz, 3H, 6-H), 0.93 (d, 3J6',5= 6.8Hz, 3H, 6'-H), 1.44 (s, 9H, 10-H), 1.60 (m, 1H, 5-H), 1.70 (dddd, 2J3a,3b= 14.6Hz, 3J3a,4 = 12.3Hz, 3J3a,2b= 6.8Hz, 3J3a,2a = 3.5Hz, 1H, 3-Ha), 2.04 (dddd, 2J3b,3a = 14.6Hz, 3J3b,2a = 11.0Hz, 3J3b,2b≒3J3b,4 = 3.0Hz, 1H, 3-Hb), 2.39 (ddd, 2J2a,2b= 12.6Hz, 3J2a,3b = 11.0Hz, 3J2a,3a= 3.5Hz, 1H, 2-Ha), 2.61 (s, 3H, 7-H), 2.73 (dddd, 2J2b,2a= 12.6Hz, 3J2b,3a = 6.8HzHz, 3J2b,3b= 3.5Hz, 4J2b,4 = 1.5Hz, 1H, 2-Hb), 3.68 (ddd, 3J4,3a = 12.3Hz, 3J4,5 = 10.3Hz, 3J4,3b= 2.5Hz, 1H, 4-H), 7.48 (bs, 1H, NH), 8.71 (bs, 1H, NH').
副回転異性体の選択されたシグナル: δ= 1.42 (s, 9H, 10-H), 2.24 (m, 1H, 3-Hb), 2.43-2.57 (sh, 2H, 2-Ha, 2-Hb), 2.65 (s, 3H, 7-H), 3.61 (bs, 1H, 4-H).
13C NMR (100MHz, CDCl3):
主回転異性体: δ = 19.9 (q, C-6), 20.2 (q, C-6'), 27.9 (q, C-7), 28.4 (q, C-10), 28.7 (t, C-3), 29.8 (d, C-5), 41.9 (t, C-2), 60.0 (d, C-4), 80.2 (s, C-9), 158.0 (s, C-8), 210.4 (s, C-1).
副回転異性体の選択されたシグナル: δ= 19.9 (q, C-6), 28.5 (q, C-10), 41.5 (t, C-2), 79.8 (s, C-9), 153.3 (s, C-8), 211.6 (s, C-1).
旋光度: [α]20D =+19.7°(c = 1.0g/100ml, CHCl3)
HRMS (CI)            計算値        実測値
C13H27N2O2S [M+H]+      275.1793      275.1769
【００６８】
１．５．（Ｒ）−２−［３（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメチルアミノ）−４−メチルペンチル］チアゾール−４−カルボン酸エチルエステル（２）：乾燥アセトン７．５ｍｌ中のチオアミド（７）（４．９９ｍｍｏｌ、１．０当量）１．３７ｇの溶液に、ブロモピルビン酸エチルエステル（９０％、５，５２ｍｍｏｌ、１．１当量）７７０μｌを−１０℃で滴下する。１．５時間後、反応混合物を、勢いよく撹拌しながら、ジクロロメタンおよび飽和ＫＨＣＯ３溶液（各２５ｍｌ）の混合物中に注入し、水相をジクロロメタンで抽出する。合わせた有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、ジクロロメタンを回転蒸発器で除去する。
【００６９】
ヒドロキシチアゾリン中間体を、乾燥ジクロロメタン６ｍｌに溶解させ、ピリジン（１１．０ｍｍｏｌ、２．２当量）８９０μｌと−２０℃で混合し、次いで無水トリフルオロ酢酸（５．４９ｍｍｏｌ、１．１当量）１．０５ｍｌを滴下する。反応混合物を０℃にて２時間以内に加熱し、室温で終夜撹拌する。それをジクロロメタンで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液で２回洗浄する。水相をジクロロメタンで抽出し、合わせた有機相を１Ｍ  ＫＨＳＯ４溶液で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させる。カラムクロマトグラフィー（８：２、７：３、１：１）により精製した後、チアゾール２（１．５６ｇ、４．２２ｍｍｏｌ、理論の８４％）が黄色油として得られる。
Ｒｆ（２）＝０．４９（ヘキサン：ＥＥ  １：１）、０．２３（ヘキサン：ＥＥ  ７：３）。
【００７０】
【化２０】
2012503621.tif 000021
1H NMR (400MHz, CDCl3): 室温での回転異性体の比 54:46
第1の回転異性体: δ = 0.83 (d, 3J9,8 = 6.8Hz, 3H, 9-H), 0.93 (d, 3J9',8= 6.5Hz, 3H, 9'-H), 1.38 (t, 3J15,14 = 7.2Hz, 3H, 15-H), 1.44 (s, 9H, 13-H), 1.65 (m, 1H, 8-H), 1.82 (m, 1H, 6-Ha), 2.12 (m, 1H, 6-Hb), 2.63 (s, 3H, 10-H), 2.95 (t,3J5,6 = 8.1Hz, 2H, 5-H), 3.82 (m, 1H, 7-H), 4.40 (q, 3J14,15 = 7.2Hz, 2H, 14-H), 8.03 (s, 1H, 3-H).
第2の回転異性体 (そのシグナルが第1の回転異性体のシグナルに部分的に隠れている): δ = 0.94 (d, 3J9',8 = 6.8Hz, 3H, 9'-H), 1.38 (t, 3J15,14 = 7.0Hz, 3H, 15-H), 1.41 (s, 9H, 13-H), 2.68 (s, 3H, 10-H), 2.94 (t, 3J5,6 = 7.9Hz, 2H, 5-H), 3.63 (bs, 1H, 7-H), 4.39 (q, 3J14,15 = 7.0Hz, 2H, 14-H), 8.01 (s, 1H, 3-H).
13C NMR (100MHz, CDCl3):
第1の回転異性体: δ = 14.4 (q, C-15), 19.6 (q, C-9), 19.9 (q, C-9'), 28.2 (q, C-10), 28.5 (q, C-13), 30.0 (t, C-6), 30.5 (d, C-8), 30.7 (t, C-5), 60.3 (d, C-7), 61.4 (t, C-14), 79.6 (s, C-12), 128.6 (d, C-3), 147.0 (s, C-2), 156.6 (s, C-11), 161.4 (s, C-1), 171.7 (s, C-4).
第2の回転異性体の選択されたシグナル: δ = 20.1 (q, C-9), 20.3 (q, C-9'), 30.1 (t, C- 6), 30.7 (t, C-5), 30.8 (d, C-8), 61.4 (t, C-14), 79.2 (s, C-12), 126.9 (d, C-3), 146.8 (s, C-2), 156.4 (s, C-11), 161.5 (s, C-1), 171.4 (s, C-4). 
旋光度: [α]20D = -12.1°(c = 1.0g/100ml, CHCl3)
HRMS (CI)            計算値        実測値
C18H31N2O4S [M+H]+      371.2004      371.1964
【００７１】
１．６．（４Ｓ，２Ｅ）−４−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−２−メチル−５−フェニル−２−ペンテン酸エチルエステル（８）：無水ジクロロメタン５０ｍｌ中のＬ−Ｂｏｃ−フェニルアラニンメチルエステル（１７．５ｍｍｏｌ、１．０当量）４．９０ｇの溶液に、１Ｍ  ＤＩＢＡＩＨ溶液（３５ｍｍｏｌ、２．０当量）３５ｍｌを−７８℃で徐々に滴下する。反応混合物を−７８℃で３０分間撹拌しながら、イリド溶液を、無水ジクロロメタン４０ｍｌ中の（１−エトキシカルボニルエチル）トリフェニルホスホニウムブロミド（３５．０ｍｍｏｌ、２．０当量）１５．５ｇおよびＫＯｔＢｕ（３５．９ｍｍｏｌ、２．１当量）４．０３ｇから室温で調製する。イリドをアルデヒド溶液に−７８℃で滴下し、１時間後、冷浴を除去し、室温で終夜撹拌する。
【００７２】
反応混合物を、飽和酒石酸カリウムナトリウム溶液８００ｍｌ中に注入し、３０分間勢いよく撹拌する。水相を酢酸エチルで抽出し、合わせた有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥させる。カラムクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥＥ  ９５：５、次いで９：１）により精製すると、ウィッティヒ生成物（８）（１４．３ｍｍｏｌ、理論の８２％）４．７８ｇが無色油として生じ、それを終夜凝固させると、白色固体が得られる。
Ｒｆ（８）＝０．３１（ヘキサン：ＥＥ  ８：２）。
【００７３】
【化２１】
2012503621.tif 000022
1H NMR (500MHz, CDCl3): δ = 1.26 (t, 3J15,14= 7.3Hz, 3H, 15-H), 1.38 (s, 9H, 13-H), 1.68 (d, 4J10,3 = 1.5Hz, 3H, 10-H), 2.76 (dd, 2J5a,5b = 13.3Hz, 3J5a,4= 7.0Hz, 1H, 5-Ha), 2.90 (m, 1H, 5-Hb), 4.16 (q, 3J14,15= 7.3Hz, 2H, 14-H), 4.55 (bs, 1H, NH), 4.64 (bs, 1H, 4-H), 6.49 (dd, 3J3,4= 9.1Hz, 4J3,10 = 1.5Hz, 1H, 3-H), 7.15 (d, 3J7,8= 7.0Hz, 2H, 7-H), 7.20 (t, 3J9,8 = 7.3Hz, 1H, 9-H), 7.26 (dd, 3J8,7≒3J8,9 = 7.2Hz, 2H, 8-H).
13C NMR (100MHz, CDCl3): δ = 12.5 (q, C-10), 14.2 (q, C-15), 28.3 (q, C-13), 41.1 (t, C-5), 50.1 (d, C-4), 60.6 (t, C-14), 79.6 (s, C-12), 126.6 (d, C-9), 128.4 (d, C-8), 129.2 (s, C-2), 129.5 (d, C-7), 136.7 (s, C-6), 140.2 (d, C-3), 154.9 (s, C-11), 167.7 (s, C-1).
融点:            68℃
【００７４】
１．７．（４Ｓ，２Ｅ）−４−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメチルアミノ）−２−メチル−５−フェニル−２−ペンテン酸（９）：ジオキサン２０ｍｌ中の（８）（２．００ｍｍｏｌ）６６８ｇの溶液を、１Ｍ  ＮａＯＨ溶液（２．４ｍｍｏｌ、１．２当量）２．４ｍｌと０℃で混合する。反応は一晩で完了しないため、反応混合物を８０℃にて２時間加熱する。処理については、ジオキサンを回転蒸発器で除去し、残渣を水に溶解させ、酢酸エチルで抽出する。酢酸エチル相を廃棄し、水相を１Ｍ  ＨＣｌでｐＨ２にし、酢酸エチルで抽出する。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、溶媒を回転蒸発器で除去する。遊離酸９（１．９１ｍｍｏｌ、理論の９５％）５８２ｍｇが白色固体として単離される。
【００７５】
【化２２】
2012503621.tif 000023
1H NMR (400MHz, CDCl3): δ = 1.39 (s, 9H, 13-H), 1.66 (s, 3H, 10-H), 2.76 (dd, 2J5a,5b = 13.1Hz, 3J5a,4= 7.3Hz, 1H, 5-Ha), 2.92 (dd, 2J5b,5a = 13.1Hz, 3J5b,4 = 5.2Hz, 1H, 5-Hb), 4.53-4.73 (sh, 2H, 4-H, NH), 6.63 (d, 3J3,4 = 8.8Hz, 1H, 3-H), 7.15 (m, 2H, 7-H), 7.21 (tt, 3J9,8 = 7.3Hz, 4J9,7= 1.5Hz, 1H, 9-H), 7.27 (dddd, 3J8,7≒3J8,9 = 7.2Hz, 4J8,8'≒5J8,7' = 1.5Hz, 2H, 8-H).
13C NMR (100MHz, CDCl3): δ = 12.2 (q, C-10), 28.3 (q, C-13), 41.0 (t, C-5), 50.3 (d, C-4), 79.8 (s, C-11), 126.8 (d, C-9), 128.5 (d, C-8), 129.5 (d, C-7), 136.5 (s, C-6), 142.6 (d, C-3), 172.5 (s, C-1). 
C-2のシグナルは見えない。
旋光度: [α]20D =+44.9°(c = 1.0g/100ml, CHCl3)
融点:       138℃
元素分析:
C17H23NO4            計算値 C 66.86     H 7.59            N 4.59
(305.37)           実測値 C 66.55     H 7.57             N 4.45
HRMS (CI)          計算値           実測値
C17H24NO4[M+H]+      306.1705        306.1699
【００７６】
１．８．（４Ｓ，２Ｅ）−４−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−２−メチル−５−フェニル−２−ペンテン酸［（１Ｒ，２Ｓ，５Ｒ）−（−）−メチル］エステル（１０）：ジエチルエーテル２１．５ｍｌ中の（９）（２．１５ｍｍｏｌ）６５７ｍｇ、（−）−メタノール（５．３８ｍｍｏｌ、２．５当量）８４０ｍｇおよびＤＭＡＰ（０．２１３ｍｍｏｌ、０．１当量）２６ｍｇの溶液に、ジエチルエーテル３ｍｌに溶解させたＤＣＣ（２．３４ｍｍｏｌ、１．１当量）４８３ｍｇを０℃で加える。反応混合物を室温まで終夜昇温させ、沈殿したジシクロヘキシル尿素をセライトを介して濾過して除去し、濾液を回転蒸発器で濃縮する。カラムクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥＥ  ９５：５）により精製すると、白色固体（１．５６ｍｍｏｌ、理論の７２％）６９０ｍｇが生じる。
Ｒｆ（１０）＝０．４３（ヘキサン：ＥＥ  ８：２）。
【００７７】
【化２３】
2012503621.tif 000024
1H NMR (400MHz, CDCl3): δ = 0.74 (d, 3J21,20 = 6.8Hz, 3H, 21-H), 0.85 (dddd, 2J17ax,17eq≒3J17ax,16ax≒3J17ax,18(ax) = 11.8Hz, 3J17ax,16eq= 2.8Hz, 1H, 17-Hax), 0.88 (d, 3J22,18 = 6.3Hz, 3H, 22-H), 0.89 (d, 3J21'20 = 6.8Hz, 3H, 21'-H), 0.93 (ddd, 2J19ax,19eq≒3J19ax,18ax≒3J19ax,14(ax) = 11.6Hz, 1H, 19-Hax), 1.05 (dddd, 2J16ax,16eq≒3J16ax,15(ax)≒3J16ax,17ax = 12.9Hz, 3J16ax,17eq = 3.0Hz, 1H, 16-Hax), 1.39 (dddd, 3J15(ax),14(ax)≒3J15(ax),16ax = 10.0Hz, 3J15(ax),16eq≒3J15(ax),20 = 3.0Hz, 1H, 15-H(ax)), 1.39 (s, 9H, 13-H), 1.48 (m, 1H, 18-H(ax)), 1.63-1.71 (sh, 2H, 16-Heq, 17-Heq), 1.69 (d, 4J10,3= 1.5Hz, 3H, 10-H), 1.83 (qqd, 3J20,21 = 3J20,21'= 6.8Hz, 3J20,15(ax) = 2.8Hz, 1H, 20-H), 1.98 (m, 1H, 19-Heq), 2.77 (dd, 2J5a,5b = 13.3Hz, 3J5a,4= 7.0Hz, 1H, 5-Ha), 2.91 (dd, 2J5b,5a = 13.3Hz, 3J5b,4 = 5.5Hz, 1H, 5-Hb), 4.54 (bs, 1H, NH), 4.64 (bs, 1H, 4-H), 4.68 (ddd, 3J14(ax),15(ax)≒3J14(ax),19ax = 10.8Hz, 3J14(ax),19eq= 4.5Hz, 1H, 14-H(ax)), 6.44 (dd, 3J3,4 = 9.2Hz,  4J3,10= 1.5Hz, 1H, 3-H), 7.12 (m, 2H, 7-H), 7.19 (tt, 3J9,8 = 7.3Hz, 4J9,7 = 1.9Hz, 1H, 9-H), 7.25 (dddd, 3J8,7≒3J8,9 = 7.1Hz, 4J8,8'≒5J8,7' = 1.8Hz, 2H, 8-H).
13C NMR (100MHz, CDCl3): δ = 12.7 (q, C-10), 16.4 (q, C-21), 20.8 (q, C-21'), 22.0 (q, C-22), 23.5 (t, C-16), 26.4 (d, C-20), 28.3 (q, C-13), 31.4 (d, C-18), 34.3 (t, C-17), 40.9 (t, C-19), 41.2 (t, C-5), 47.2 (d, C-15), 50.0 (d, C-4), 74.5 (d, C-14), 79.7 (s, C-12), 126.7 (d, C-9), 128.4 (d, C-8), 129.6 (d, C-7), 139.6 (d, C-3), 154.9 (s, C-11), 167.1 (s, C-1). 
C-2のシグナルは見えない。
旋光度: [α]20D = -27.8°(c = 1.0g/100ml, CHCl3)
融点:       89-90℃
元素分析:
C27H41NO4       計算値 C 73.10     H 9.32     N 3.16
(443.63)      実測値 C 73.15     H 9.08     N 3.21
HRMS(CI)           計算値          実測値
C27H42NO4[M+H]+      444.3114        444.3077 
【００７８】
１．９．（２Ｒ，４Ｒ）−および（２Ｓ，４Ｒ）−４−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−２−メチル−５−フェニルペンタン酸［（１Ｒ，２Ｓ，５Ｒ）−（−）−メチル］エステル（１１）：メタノール１３．５ｍｌに溶解させた（１０）（１．３５ｍｍｏｌ）５９９ｍｇを、反応が完了するまで（ＤＣ対照）水素雰囲気下でＰｄ／Ｃ（５％）６０ｍｇと共に撹拌する。触媒をセライトを介して濾過して除去し、濾液を回転蒸発器で濃縮する。
【００７９】
粗生成物のＮＭＲスペクトルにおいて、（ｅｐｉ−１１）および（１１）は、１：３の比率で形成されたことがわかる。カラムクロマトグラフィー（ヘキサン：Ｅｔ２Ｏ  ９：１、ヘキサン：ＥＥ  ８：２）により精製した後、（ｅｐｉ−１１）（０．２００ｍｍｏｌ、理論の１５％）８９ｍｇ、（１１）（０．８１０ｍｍｏｌ、理論の６０％）３６１ｍｇおよび（１１）／（ｅｐｉ−１１）混合画分（０．２７２ｍｍｏｌ、理論の２０％）１２１ｍｇが単離できる。
Ｒｆ（ｅｐｉ−１１）＝０．４２（ヘキサン：ＥＥ  ８：２）、Ｒｆ（１１）＝０．３８（ヘキサン：ＥＥ  ８：２）。
【００８０】
【化２４】
2012503621.tif 000025
1H NMR (400MHz, CDCl3): δ = 0.72 (d, 3J21,20 = 6.8Hz, 3H, 21-H), 0.84 (dddd, 2J17ax,17eq≒3J17ax,16ax≒3J17ax,18(ax) = 12.9Hz, 3J17ax,16eq= 3.6Hz, 1H, 17-Hax), 0.86 (d, 3J21',20 = 7.0Hz, 3H, 21'-H), 0.87 (d, 3J22,18 = 6.5Hz, 3H, 22-H), 0.90 (ddd, 2J19ax,19eq≒3J19ax,18ax≒3J19ax,14(ax) = 11.8Hz, 1H, 19-Hax), 1.02 (dddd, 2J16ax,16eq≒3J16ax,15(ax)≒3J16ax,17ax = 13.0Hz, 3J16ax,17eq = 3.3Hz, 1H, 16-Hax), 1.11 (d, 3J10,2 = 7.3Hz, 3H, 10-H), 1.29-1.47 (sh, 2H, 15-H(ax), 18-H(ax)), 1.38 (s, 9H, 13-H), 1.49 (ddd, 2J3a,3b = 14.2Hz, 3J3a,2/4= 8.5Hz, 3J3a,2/4 = 4.0Hz, 1H, 3-Ha), 1.61-1.69 (sh, 2H, 16-Heq, 17-Heq), 1.73 (ddd, 2J3b,3a= 14.2Hz, 3J3b/2/4 =11.0Hz, 3J3b,2/4= 5.5Hz, 1H, 3-Hb), 1.80 (qqd, 3J20,21 = 3J20,21'= 6.9Hz, 3J20,15(ax) = 2.8Hz, 1H 20-H), 1.93 (m, 1H, 19-Heq), 2.44 (m, 1H, 2-H), 2.73 (dd, 2J5a,5b = 13.5Hz, 3J5a,4= 6.5Hz, 1H, 5-Ha), 2.79 (dd, 2J5b,5a = 13.5Hz, 3J5b,4 = 5.0Hz, 1H, 5-Hb), 3.87 (bs, 1H, 4-H), 4.33 (d, 3JNH,4 = 7.8Hz, 1H, NH), 4.62 (ddd, 3J14(ax),15(ax)≒3J14(ax),19ax = 10.9Hz, 3J14(ax),19eq= 4.3Hz, 1H, 14-H(ax)), 7.14 (d, 3J7,8 = 7.0Hz, 2H, 7-H), 7.19 (tt, 3J9,8 = 7.4Hz, 4J9,7= 1.3Hz, 1H, 9-H), 7.26 (dddd, 3J8,7≒3J8,9 = 7.2Hz, 4J8,8'≒5J8,7' = 1.4Hz, 2H, 8-H).
13C NMR (100MHz, CDCl3): δ = 16.2 (q, C-21), 16.8 (q, C-10), 20.8 (q, C-21'), 22.0 (q, C-22), 23.3 (t, C-16), 26.2 (d, C-20), 28.4 (q, C-13), 31.4 (d, C-18), 34.3 (t, C-17), 36.9 (d, C-2), 37.2 (t, C-3), 40.8 (t, C-19), 41.2 (t, C-5), 47.0 (d, C-15), 49.8 (d, C-4), 74.1 (d, C-14), 79.2 (s, C-12), 126.3 (d, C-9), 128.3 (d, C-8), 129.5 (d, C-7), 137.9 (s, C-6), 155.4 (s, C-11), 176.1 (s, C-1).
【００８１】
【化２５】
2012503621.tif 000026
1H NMR (400MHz, CDCl3): δ = 0.72 (d, 3J21,20 = 7.0Hz, 3H, 21-H), 0.84 (dddd, 2J17ax,17eq≒3J17ax,16ax≒3J17ax,18(ax) = 12.9Hz, 3J17ax,16eq= 3.5Hz, 1H, 17-Hax), 0.87 (d, 3J21',20 = 7.0Hz, 3H, 21'-H), 0.88 (d, 3J22,18 = 6.5Hz, 3H, 22-H), 0.91 (ddd, 2J19ax,19eq≒3J19ax,18ax≒3J19ax,14(ax) = 11.7Hz, 1H, 19-Hax), 1.03 (dddd, 2J16ax,16eq≒3J16ax,15(ax)≒3J16ax,17ax=13.0Hz, 3J16ax,17eq = 3.4Hz, 1H, 16-Hax), 1.13 (d, 3J10,2 = 7.3Hz, 3H, 10-H), 1.30-1.54 (sh, 3H, 3-Ha, 15-H(ax), 18-H(ax)), 1.37 (s, 9H, 13-H), 1.61-1.69 (sh, 2H, 16-Heq, 17-Heq), 1.78-1.91 (sh, 2H, 3-Hb, 20-H), 1.97 (d, 2J19eq,19ax= 11.5Hz, 1H, 19-Heq), 2.54 (m, 1H, 2-H), 2.75 (dd, 2J5a,5b= 13.2Hz, 3J5a,4 = 6.1Hz, 1H, 5-Ha), 2.79 (m, 1H, 5-Hb), 3.85 (bs, 1H, 4-H), 4.32 (bs, 1H, NH), 4.65 (ddd, 3J14(ax),15(ax)≒3J14(ax),19ax = 10.9Hz, 3J14(ax),19eq= 4.3Hz, 1H, 14-H(ax)), 7.15 (d, 3J7,8 = 7.3Hz, 2H, 7-H), 7.19 (tt, 3J9,8 = 7.3Hz, 4J9,7= 1.2Hz, 1H, 9-H), 7.26 (dddd, 3J8,7≒3J8,9 = 7.3Hz, 4J8,8'≒5J8,7' = 1.3Hz, 2H, 8-H). 
13C NMR (100MHz, CDCl3): δ = 16.1 (q, C-21), 17.7 (q, C-10), 20.8 (q, C-21'), 22.0 (q, C-22), 23.3 (t, C-16), 26.2 (d, C-20), 28.4 (q, C-13), 31.4 (d, C-18), 34.3 (t, C-17), 36.7 (d, C-2), 37.6 (t, C-3), 40.8 (t, C-19), 41.2 (t, C-5), 47.1 (d, C-15), 49.9 (d, C-4), 74.1 (d, C-14), 79.0 (s, C-12), 126.3 (d, C-9), 128.3 (d, C-8), 129.5 (d, C-7), 137.9 (s, C-6), 155.1 (s, C-11), 175.7 (s, C-1).
旋光度:   [α]20D= -36.0°(c = 1.0g/100ml, CHCl3 , epi-11)
[α]20D = -17.2°(c = 1.0g/100ml, CHCl3, 11)
融点:    110-111℃ (epi-11), 91-92℃ (11)
HRMS (CI)           計算値             実測値
C27H44NO4[M+H]+       446.3270           446.3280
【００８２】
１．１０．（２Ｓ，４Ｒ）−４−アミノ−２−メチル−５−フェニルペンタン酸メチルエステル（３）：合成は、Ｚａｎｄａら（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．２００７、１１９、３５９６〜３５９９）に記載されているように行った。しかし、（１１）（０．７５０ｍｍｏｌ）３３４ｍｇから、わずか１３８ｍｇの（３）（０．５３５ｍｇ、理論の７１％）しか得ることができなかった（参照：９９％）。
【００８３】
【化２６】
2012503621.tif 000027
1H NMR (400MHz, CDCl3): δ = 1.13 (d, 3J10,2= 7.0Hz, 3H, 10-H), 1.78 (ddd, 2J3a,3b = 13.8Hz, 3J3a,2/4= 8.9Hz, 3J3a,2/4 = 3.8Hz, 1H, 3-Ha), 1.97 (ddd, 2J3b,3a = 13.8Hz, 3J3b,2/4 = 10.7Hz, 3J3b,2/4 = 3.0Hz, 1H, 3-Hb), 2.90 (dd, 2J5a,5b = 13.6Hz, 3J5a,4 = 8.9Hz, 1H, 5-Ha), 2.92 (m, 1H, 2-H), 3.27 (dd, 2J5b,5a= 13.6Hz, 3J5b,4 = 5.3Hz, 1H, 5-Hb), 3.58 (s, 3H, 11-H), 3.60 (bs, 1H, 4-H), 7.20-7.26 (sh, 3H, 7-H, 9-H), 7.30 (dd, 3J8,7≒3J8,9 = 7.2Hz, 2H, 8-H), 8.52 (bs, 3H, NH3+). 
13C NMR (100MHz, CDCl3): δ = 17.7 (q, C-10), 35.9 (d, C-2), 36.0 (t, C-3), 39.7 (t, C-5), 51.9 (q, C-11), 52.2 (d, C-4), 127.3 (d, C-9), 128.9 (d, C-8), 129.3 (d, C-7), 135.4 (s, C-6), 175.7 (s, C-1).
【００８４】
１．１１．（Ｒ）−２−｛３−［（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−（Ｓ）−イソロイシル）メチルアミノ］−４−メチルペンチル｝チアゾール−４−カルボン酸エチルエステル（１２）：Ｂｏｃ保護チアゾールアミノ酸（２）（３．００ｍｍｏｌ）１．１１ｇをジオキサン（３０．０ｍｌ、１０当量）中の４Ｍ  ＨＣｌ溶液７．５ｍｌと０℃で混合する。Ｂｏｃ保護基を完全に除去した後（ＤＣ対照）、溶媒を回転蒸発器で除去する。次いで、塩酸塩ならびにＺ−Ｌ−イソロイシン（３．３０ｍｍｏｌ、１．１当量）８７６ｍｇおよびＢＥＰ（３．３０ｍｍｏｌ、１．１当量）９０５ｍｇを無水ＣＨ２Ｃｌ２３０ｍｌに溶解させる。ＤＩＰＥＡ（１２．０ｍｍｏｌ、４．０当量）２．０４ｍｌを−１０℃で滴下し、２０分後、冷浴を除去し、反応混合物を室温で終夜撹拌する。溶媒を回転蒸発器で除去する。カラムクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥＥ  ７：３、１：１）により精製すると、ジペプチド（１２）（２．６４ｍｍｏｌ、理論の８８％）１．４２ｇが黄色油として生じる。
Ｒｆ（１２）＝０．３４（ヘキサン：ＥＥ  １：１）。
【００８５】
【化２７】
2012503621.tif 000028
1H NMR (400MHz, CDCl3):
主回転異性体: δ = 0.75 (d, 3J9,8 = 6.5Hz, 3H, 9-H), 0.86 (t, 3J15,14= 7.4Hz, 3H, 15-H), 0.95 (d, 3J16,13 = 6.5Hz, 3H, 16-H), 0.96 (d, 3J9',8 = 6.5Hz, 3H, 9'-H), 1.11 (ddq, 2J14a,14b= 13.6Hz, 3J14a,13 = 9.7Hz, 3J14a,15= 7.3Hz, 1H, 14-Ha), 1.37 (t, 3J24,23 = 7.0Hz, 3H, 24-H), 1.57 (dqd, 2J14b,14a = 13.6Hz, 3J14b,15= 7.6Hz, 3J14b,13 = 3.0Hz, 1H, 14-Hb), 1.63-1.79 (sh, 2H, 8-H, 13-H), 1.88 (m, 1H, 6-Ha), 2.14 (m, 1H, 6-Hb), 2.83 (dt, 2J5a,5b = 15.2Hz, 3J5a,6= 6.3Hz, 1H, 5-Ha), 2.89 (dt, 2J5b,5a = 15.2Hz, 3J5b,6 = 6.3Hz, 1H, 5-Hb), 2.94 (s, 3H, 10-H), 4.32 (m, 1H, 7-H), 4.39 (q, 3J23,24 = 7.0Hz, 1H, 23-H), 4.52 (dd, 3J12,NH = 9.5Hz, 3J12,13= 6.8Hz, 1H, 12-H), 5.05 (d, 2J18a,18b = 12.4Hz, 1H, 18-Ha), 5.08 (d, 2J18b,18a = 12.4Hz, 1H, 18-Hb), 5.40 (d, 3JNH,12 = 9.5Hz, 1H, NH), 7.18-7.36 (sh, 5-H, arom. H), 8.01 (s, 1H, 3-H). 
副回転異性体の選択されたシグナル: δ= 1.04 (d, 3J9',8 = 6.8Hz, 3H, 9'-H), 2.23 (m, 1H, 6-Ha), 2.74 (s, 3H, 10-H), 3.58 (ddd, 3J7,6a/b≒3J7,8 = 10.2Hz, 3J7,6a/b= 3.3Hz, 1H, 7-H), 4.57 (dd, 3J12,NH = 9.6Hz, 3J12,13= 6.3Hz, 1H, 12-H), 7.98 (s, 1H, 3-H). 
13C NMR (100MHz, CDCl3): 
主回転異性体: δ = 11.2 (q, C-15), 14.3 (q, C-24), 16.0 (q, C-16), 19.5 (q, C-9), 20.0 (q, C-9'), 23.8 (t, C-14), 29.4 (q, C-10), 29.7 (t, C-6), 30.1 (d, C-8), 30.6 (t, C-5), 37.4 (d, C-13), 55.7 (d, C-12), 59.1 (d, C-7), 61.3 (t, C-23), 66.7 (t, C-18), 126.9 (d, C-3), 127.8 (d, C-20/21), 128.0 (d, C-22), 128.4 (d, C-20/21), 136.4 (t, C-19), 146.9 (s, C-2), 156.4 (s, C-17), 161.3 (s, C-1), 170.9 (s, C-4), 173.3 (s, C-11). 
副回転異性体の選択されたシグナル: δ= 11.3 (q, C-15), 16.1 (q, C-16), 20.3 (q, C-9), 20.4 (q, C-9'), 23.5 (t, C-14), 27.3 (q, C-10), 29.8 (t, C-6), 31.3 (t, C-5), 37.8 (d, C-13), 55.2 (d, C-12), 62.6 (d, C-7), 66.9 (t, C-18), 128.4 (d, C-20/21), 136.3 (t, C-19), 156.2 (s, C-17), 170.5 (s, C-4), 172.5 (s, C-11). 
旋光度:   [α]20D= -22.9°(c = 1.0g/100ml, CHCl3)
元素分析:
C27H39N3O5S     計算値 C 62.64     H 7.59      N 8.12
(517.68)      実測値 C 62.30     H 7.61      N 8.24
HRMS (CI)        計算値           実測値
C27H40N3O5S[M+H]+   518.2689         518.2721
【００８６】
１．１２．（Ｒ）−２−｛３−［（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−（Ｒ）−ピペコリル−（Ｓ）−イソロイシル）メチルアミノ］−４−メチルペンチル｝チアゾール−４−カルボン酸エチルエステル（１３）：Ｚ保護ジペプチド（１２）（１．５０ｍｍｏｌ）７７９ｍｇに、氷酢酸（１５ｍｍｏｌ、１０当量）中のＨＢｒ溶液３３重量％２．５９ｍｌを０℃にて加える。室温で２．５時間撹拌した後、ジエチルエーテルを反応混合物に加え、橙色固体として形成された臭化水素酸塩を沈殿させる。エーテルをデカンテーションにより除去し、残渣をエーテルと再び混合する。この手順を２回繰り返す。さらなる反応のために遊離アミンを得るために、臭化水素酸塩を飽和ＮａＨＣＯ３溶液と混合し、水相をエーテルで繰り返し抽出する。合わせた有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、回転蒸発器で濃縮する。
【００８７】
無水ＴＨＦ１５ｍｌ中のＺ−（Ｒ）−ピペコリン酸（９８．８％ｅｅ、１．６５ｍｍｏｌ、１．１当量）４３４ｍｇおよびＮＭＭ（１．８０ｍｍｏｌ、１．２当量）１９８μｌの溶液に、クロロギ酸イソブチルエステル（１．６５ｍｍｏｌ、１．１当量）２１４μｌを−２０℃で滴下する。１０分後、脱保護したばかりのアミンを、無水ＴＨＦ３ｍｌに溶解させ、滴下する。反応混合物を室温まで終夜昇温させる。処理については、沈殿したＮＭＭ塩酸塩を濾過除去し、濾液を回転蒸発器で濃縮する。残渣をＨ２Ｏ／ＥＥに溶解させ、水相をＥＥで抽出し、合わせた有機相を飽和ＮａＨＣＯ３溶液で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させる。カラムクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥＥ  ６：４、１：１、３：７）により精製した後、生成物（１３）（１．１５ｍｍｏｌ、理論の７６％）７２０ｍｇが白色泡状物として得られる。
Ｒｆ（１３）＝０．１８（ヘキサン：ＥＥ  １：１）。
【００８８】
【化２８】
2012503621.tif 000029
1H NMR (400MHz, CDCl3):
主回転異性体: δ = 0.73 (d, 3J9,8 = 6.8Hz, 3H, 9-H), 0.81 (m, 3H, 15-H), 0.90 (m, 3H, 16-H), 0.93 (d, 3J9',8 = 6.8Hz, 3H, 9'-H), 1.01 (m, 1H, 14-Ha), 1.25-1.41 (sh, 2H, 20-Hax, 21-Hax),1.36 (t, 3J30,29 = 7.2Hz, 3H, 30-H), 1.41-1.63 (sh, 4H, 14-Hb, 19-Hax, 20-Heq, 21-Heq), 1.67 (m, 1H, 8-H), 1.73 (m, 1H, 13-H), 1.87 (m, 1H, 6-Ha), 2.14 (m, 1H, 6-Hb), 2.27 (d, 2J19eq,19ax = 12.8Hz, 1H, 19-Heq), 2.77-2.86 (sh, 2H, 5-Ha, 22-Hax), 2.89 (ddd, 2J5b,5a= 15.1Hz, 3J5b,6a/b = 6.2Hz, 3J5b,6a/b= 3.3Hz, 1H, 5-Hb), 2.96 (s, 3H, 10-H), 4.07 (bs, 1H, 22-Heq), 4.32 (m, 1H, 7-H), 4.37 (q, 3J29,30 = 7.2Hz, 2H, 29-H), 4.78 (dd, 3J12,NH≒3J12,13 = 8.3Hz, 1H, 12-H), 4.87 (bs, 1H, 18-H), 5.11 (d, 2J24a,24b= 11.6Hz, 1H, 24-Ha), 5.15 (d, 2J24b,24a = 12.3Hz, 1H, 24-Hb), 6.55 (bs, 1H, NH), 7.22-7.40 (sh, 5H, arom. H), 8.00 (s, 1H, 3-H).
副回転異性体の選択されたシグナル: δ= 1.03 (d, 3J9',8 = 6.3Hz, 3H, 9'-H), 2.73 (s, 3H, 10-H), 3.61 (m, 1H, 7-H), 4.17 (bs, 1H, 22-Heq), 4.92 (dd, 3J12,NH= 9.6Hz, 3J12,13 = 6.0Hz, 1H, 12-H), 5.06 (d, 2J24a,24b= 12.6Hz, 1H, 24-Ha), 7.95 (s, 1H, 3-H).
13C NMR (100MHz, CDCl3):
主回転異性体: δ = 11.0 (q, C-15), 14.3 (q, C-30), 15.9 (q, C-16), 19.5 (q, C-9), 19.9 (q, C-9'), 20.4 (t, C-20), 24.1 (t, C-14), 24.7* (t, C-21), 25.9* (t, C-19), 29.3 (q, C-10), 29.7 (t, C-6), 30.1 (d, C-8), 30.6 (t, C-5), 37.1 (d, C-13), 42.2* (t, C-22), 53.6 (d, C-12), 55.2* (d, C-18), 58.9 (d, C-7), 61.3 (t, C-29), 67.6 (t, C-24), 126.9 (d, C-3), 127.8 (d, C-26/27), 128.0 (d, C-28), 128.5 (d, C-26/27), 136.3 (s, C-25), 146.9 (s, C-2), 156.4 (s, C-23), 161.3 (s, C-1), 170.3 (s, C-17), 170.8 (s, C-4), 173.2 (s, C-11).
副回転異性体の選択されたシグナル: δ= 11.2 (q, C-15), 15.2 (q, C-30), 16.2 (q, C-16), 20.3 (q, C-9), 20.5 (q, C-9'), 23.4 (t, C-14), 27.4 (q, C-10), 29.9 (d, C-8), 31.3 (t, C-5), 53.0 (d, C-12), 61.3 (t, C-29), 62.7 (d, C-7), 67.5 (t, C-24), 126.9 (d, C-3), 146.8 (s, C-2), 171.0 (s, C-4/11/17).
旋光度:     [α]20D =+3.8°(c = 1.0g/100ml, CHCl3)
HRMS (CI)          計算値       実測値
C33H49N4O6S [M+H]+    629.3373     629.3327
【００８９】
１．１３．（Ｒ）−２−｛３−［（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−（Ｒ）−ピペコリル−（Ｓ）−イソロイシル）メチルアミノ］−４−メチルペンチル｝チアゾール−４−カルボン酸（１４）：ジオキサン８．８ｍｌ中のトリペプチド（１３）（０．８８１ｍｍｏｌ）５５４ｍｇの溶液を１Ｍ  ＮａＯＨ（１．３２ｍｍｏｌ、１．５当量）１．３２ｍｌと０℃で混合し、脱保護が完了するまで（ＤＣ対照）撹拌する。処理については、ジオキサンを回転蒸発器で除去し、残渣を水に溶解させ、酢酸エチルで抽出する。酢酸エチル相を廃棄し、水相を１Ｍ  ＨＣｌでｐＨ２にし、酢酸エチルで抽出する。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、溶媒を回転蒸発器で除去し、遊離酸（１４）（０．８６２ｍｍｏｌ、理論の９８％）５１８ｍｇが無色のガラス状固体として得られる。
【００９０】
【化２９】
2012503621.tif 000030
1H NMR (400MHz, CDCl3):
主回転異性体: δ = 0.74 (d, 3J9,8 = 6.5Hz, 3H, 9-H), 0.81 (m, 3H, 15-H), 0.88-0.98 (sh, 6H, 9'-H, 16-H), 1.06 (m, 1H, 14-Ha), 1.24-1.74 (sh, 7H, 8-H, 14-Hb, 19-Hax, 20-H, 21-H), 1.78-1.95 (sh, 2H, 6-Ha, 13-H), 2.13 (m, 1H, 6-Hb), 2.29 (d, 2J19eq,19ax= 13.3Hz, 1H, 19-Heq), 2.83 (m, 1H, 22-Hax), 2.87 (t, 3J5,6= 7.8Hz, 2H, 5-H), 3.02 (s, 3H, 10-H), 4.07 (bs, 1H, 22-Heq), 4.37 (m, 1H, 7-H), 4.81 (dd, 3J12,NH≒3J12,13 = 8.7Hz, 1H, 12-H), 4.90 (bs, 1H, 18-H), 5.12 (d, 2J24a,24b = 12.5Hz, 1H, 24-Ha), 5.17 (d, 2J24b,24a = 12.5Hz, 1H, 24-Hb), 6.85 (bs, 1H, NH), 7.23-7.37 (sh, 5H, arom. H), 8.10 (s, 1H, 3-H).
副回転異性体の選択されたシグナル: δ= 1.03 (d, 3J9',8 = 6.5Hz, 3H, 9'-H), 2.73 (s, 3H, 10-H), 3.64 (m, 1H, 7-H), 4.14 (bs, 1H, 22-Heq), 6.95 (bs, 1H, NH), 8.06 (s, 1H, 3-H). 
13C NMR (100MHz, CDCl3):
主回転異性体: δ = 10.8 (q, C-15), 15.8 (q, C-16), 19.5 (q, C-9), 19.9 (q, C-9'), 20.4 (t, C-20), 24.3 (t, C-14), 24.8* (t, C-21), 26.0* (t, C-19), 29.6 (t, C-6), 30.2 (d, C-8), 30.4 (t, C-5), 36.7* (d, C-13), 42.1* (t, C-22), 53.8 (d, C-12), 55.1* (d, C-18), 59.1 (d, C-7), 67.6 (t, C-24), 127.6, 127.8, 128.0 (3 d, C-26, C-27, C-28), 128.4 (d, C-3), 136.4 (s, C-25), 146.5 (s, C-2), 163.2 (s, C-1), 170.5 (s, C-5), 170.8 (s, C-17), 174.0 (s, C-11).
C-10およびC-23のシグナルは見えない。
副回転異性体の選択されたシグナル:
δ = 11.2 (q, C-15), 16.1 (q, C-16), 20.2 (q, C-9), 20.5 (q, C-9'), 23.6 (t, C-14), 27.6 (q, C-10), 53.1 (d, C-12), 62.8 (d, C-7). 
旋光度: [α]20D =+6.5°(c = 1.0g/100ml, CHCl3)
融点: 78-80℃
元素分析:
C31H44N4O6S       計算値     C 61.98     H 7.38     N 9.33
(600.78)        実測値     C 61.92     H 7.47     N 9.39
HRMS (CI)             計算値           実測値
C30H45N4O4S [M-CO2+H]+   557.3162          557.3186
【００９１】
１．１４．（２Ｓ，４Ｒ）−４−［（（Ｒ）−２−｛３−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−（Ｒ）−ピペコリル−（Ｓ）−イソロイシル）メチルアミノ｝−４−メチルペンチル）チアゾール−４−カルボニル］アミノ］−２−メチル−５−フェニルペンタン酸メチルエステル（１５）：無水ＴＨＦ２ｍｌ中のトリペプチド（１４）（０．２００ｍｍｏｌ）１２０ｍｇおよびＮＭＭ（０．２１８ｍｍｏｌ、１．１当量）２４μｌの溶液に、クロロギ酸イソブチルエステル（０．２１６ｍｍｏｌ、１．１当量）２８μｌを−２０℃で滴下する。１０分後、反応混合物をさらに２４μｌのＮＭＭ（０．２１８ｍｍｏｌ、１．１当量）、次いで（３）（０．２２１ｍｍｏｌ、１．１当量）５７ｍｇと混合する。混合物を終夜室温まで昇温させる。
【００９２】
処理については、沈殿したＮＭＭ塩酸塩を濾過除去し、濾液を回転蒸発器で除去する。残渣をＨ２Ｏ／ＥＥに溶解させ、水相をＥＥで抽出し、合わせた有機相を飽和ＮａＨＣＯ３溶液で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させる。カラムクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥＥ  １：１、３：７）により精製した後、（１５）（０．１６０ｍｍｏｌ、理論の８０％）１２９ｍｇが無色の高粘性油として得られる。
Ｒｆ（１５）＝０．１９（ヘキサン：ＥＥ  １：１）。
【００９３】
【化３０】
2012503621.tif 000031
1H NMR (400MHz, CDCl3):
主回転異性体: δ = 0.76 (d, 3J19,18 = 6.5Hz, 3H, 19-H), 0.82 (m, 3H, 25-H), 0.92 (d, 3J26,23 = 6.0Hz, 3H, 26-H), 0.95 (d, 3J19',18= 6.5Hz, 3H, 19'-H), 1.03 (m, 1H, 24-Ha), 1.12 (d, 3J10,2= 7.0Hz, 3H, 10-H), 1.21-1.65 (sh, 7H, 3-Ha, 24-Hb, 29-Hax, 30-H, 31-H), 1.66-1.91 (sh, 3H, 16-Ha, 18-H, 23-H), 1.99 (ddd, 2J3b,3a= 13.5Hz, 3J3b,2/4 = 9.4Hz, 3J3b,2/4= 4.0Hz, 1H, 3-Hb), 2.11 (m, 1H, 16-Hb), 2.29 (d, 2J29eq,29ax= 12.8Hz, 1H, 29-Heq), 2.58 (m, 1H, 2-H), 2.69-3.02 (sh, 5H, 5-H, 15-H, 32-Hax), 2.98 (s, 3H, 20-H), 3.59 (s, 3H, 39-H), 4.08 (bs, 1H, 32-Heq), 4.29-4.44 (sh, 2H, 4-H, 17-H), 4.80 (dd, 3J22,NH≒3J22,23 = 8.0Hz, 1H, 22-H), 4.89 (bs, 1H, 28-H), 5.11 (d, 2J34a,34b = 12.0Hz, 1H, 34-Ha), 5.16 (d, 2J34b,34a = 12.0Hz, 1H, 34-Hb), 6.56 (bs, 1H, NHIle), 7.10-7.38 (sh, 11H, arom. H, NHTup), 7.88 (s, 1H, 13-H).
副回転異性体の選択されたシグナル: δ= 1.05 (d, 3J19',18 = 6.5Hz, 3H, 19'-H), 2.77 (s, 3H, 20-H), 4.18 (bs, 1H, 32-Heq), 4.97 (dd, 3J22,NH= 9.0Hz, 3J22,23 = 7.0Hz, 1H, 22-H), 5.06 (d, 2J34a,34b= 12.6Hz, 1H, 34-Ha), 7.86 (s, 1H, 13-H).
13C NMR (100MHz, CDCl3):
主回転異性体: δ = 11.0 (q, C-25), 15.8 (q, C-26), 17.7 (q, C-10), 19.6 (q, C-19), 20.0 (q, C-19'), 20.4 (t, C-30), 24.1 (t, C-24), 24.8* (t, C-31), 25.5* (t, C-29), 29.3 (t, C-16), 29.3* (q, C-20), 30.1 (t, C-15), 30.2 (d, C-18), 36.4 (d, C-2), 37.2 (d, C-23), 37.8 (t, C-3), 41.2 (t, C-5), 42.2* (t, C-32), 48.4 (d, C-4), 51.6 (q, C-39), 53.6 (d, C-22), 54.9* (d, C-28), 58.8* (d, C-17), 67.6 (t, C-34), 122.3 (d, C-13), 126.4 (d, C-9), 127.8 (d, C-36/37). 128.1 (d, C-38), 128.3 (d, C-8), 128.5 (d, C-36/37), 129.4 (d, C-7), 136.3 (s, C-35), 137.6 (s, C-6), 149.8 (s, C-12), 156.2* (s, C-33), 160.6 (s, C-11), 169.6 (s, C-14), 170.4 (s, C-27), 173.2 (s, C-21), 176.5 (s, C-1).
副回転異性体の選択されたシグナル: δ= 11.2 (q, C-25), 16.2 (q, C-26), 20.3 (q, C-19), 20.5 (q, C-19'), 23.5 (t, C-24), 27.3 (q, C-20), 62.7 (d, C-17), 122.6 (d, C-13).
旋光度: [α]20D =+19.3°(c = 1.0g/100ml, CHCl3)
HRMS (CI)        計算値          実測値 
C44H62N5O7[M+H]+   804.4370        804.4331
【００９４】
１．１５．（２Ｓ，４Ｒ）−４−［（（Ｒ）−２−｛３−［メチル−（Ｎ−メチル−（Ｒ）−ピペコリル−（Ｓ）−イソロイシル）アミノ］−４−メチルペンチル｝チアゾール−４−カルボニル）アミノ］−２−メチル−５−フェニルペンタン酸メチルエステル（１６）：テトラペプチド（１５）（０．１４２ｍｍｏｌ）１１４ｍｇに、ＨＢｒ／ＡｃＯＨ（３３重量％、１．３９ｍｍｏｌ、９．８当量）２４０μｌを０℃で加える。室温で２時間撹拌した後、ジエチルエーテルを反応混合物に加え、橙色固体として形成された臭化水素酸塩を沈殿させる。エーテルをデカンテーションにより除去し、残渣をエーテルと再び混合する。この手順を２回繰り返す。さらなる反応のために遊離アミンを得るために、臭化水素酸塩を飽和ＮａＨＣＯ３溶液と混合し、水相をエーテルで繰り返し抽出する。合わせた有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、回転蒸発器で濃縮する。
【００９５】
遊離アミンを、ＭｅＯＨ１．４ｍｌに溶解させ、パラホルムアルデヒド（０．１４２ｍｍｏｌ、１．０当量）１２．８ｍｇと共に室温で４５分間予め撹拌したら、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（０．１５０ｍｍｏｌ、１．０６当量）９．４ｍｇを加える。反応が完了した後（ＤＣ対照、透明な溶液）、メタノールを回転蒸発器で除去し、残渣をジクロロメタンに溶解させ、飽和ＮａＨＣＯ３溶液で洗浄する。水相をジクロロメタンで抽出し、合わせた有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥させる。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ  ９９：１、９８：２、９５：５、９：１）により精製すると、生成物（１６）（０．０９３６ｍｍｏｌ、理論の６６％）６４ｍｇがわずかに黄色がかった油として得られる。
Ｒｆ（１６）＝０．３９（ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ  ９：１）。
【００９６】
【化３１】
2012503621.tif 000032
1H NMR (400MHz, CDCl3):
主回転異性体: δ = 0.75 (d, 3J19,18 = 6.5Hz, 3H, 19-H), 0.86 (t, 3J25,24= 7.4Hz, 3H, 25-H), 0.94 (d, 3J19',18 = 6.5Hz, 3H, 19'-H), 0.96 (d, 3J26,23 = 6.8Hz, 3H, 26-H), 1.08-1.25 (sh, 2H, 24-Ha, 30-Hax), 1.13 (d, 3J10,2= 7.3Hz, 3H, 10-H), 1.35 (ddd, 2J29ax,29eq≒3J29ax,28≒3J29ax,30ax = 12.1Hz, 1H, 29-Hax), 1.43-1.72 (sh, 6H, 3-Ha, 18-H, 24-Hb, 30-Heq, 31-H), 1.74-1.91 (sh, 3H, 16-Ha, 23-H, 29-Heq), 1.94- 2.03 (sh, 2H, 3-Hb, 32-Hax), 2.08 (dtd, 2J16b,16a= 14.5Hz, 3J16b,15 = 8.3Hz, 3J16b,17= 3.6Hz, 1H, 16-Hb), 2.22 (s, 3H, 33-H), 2.47 (d, 3J28,29ax= 9.0Hz, 1H, 28-H), 2.60 (m, 1H, 2-H), 2.76-2.93 (sh, 4H, 5-Ha, 15-H, 32-Heq), 2.94 (dd, 2J5b,5a = 13.8Hz, 3J5b,4= 6.0Hz, 1H, 5-Hb), 2.99 (s, 3H, 20-H), 3.60 (s, 3H, 34-H), 4.30-4.46 (sh, 2H, 4-H, 17-H), 4.76 (dd, 3J22,NH = 9.3Hz, 3J22,23 = 8.3Hz, 1H, 22-H), 7.04 (bs, 1H, NHIle), 7.15-7.27 (sh, 11H, arom. H), 7.35 (d, 3JNH,4 = 9.3Hz, NHTup), 7.87 (s, 1H, 13-H).
副回転異性体の選択されたシグナル: δ= 0.87 (t, 3J25,24 = 7.3Hz, 3H, 25-H), 1.06 (d, 3J19',18= 6.5Hz, 3H, 19'-H), 2.77 (s, 3H, 20-H), 3.64 (m, 1H, 17-H), 4.95 (dd, 3J22,NH= 9.7Hz, 3J22,23 = 6.2Hz, 1H, 22-H), 7.86 (s, 1H, 13-H). 
13C NMR (100MHz, CDCl3):
主回転異性体: δ = 11.0 (q, C-25), 15.9 (q, C-26), 17.8 (q, C-10), 19.6 (q, C-19), 20.1 (q, C-19'), 23.2 (t, C-30), 24.6 (t, C-24), 25.1 (t, C-31), 29.4 (t, C-16), 29.3* (q, C-20), 30.0 (t, C-15), 30.2 (d, C-18), 30.4 (t, C-29), 36.5 (d, C-2), 37.2 (d, C-23), 37.8 (t, C-3), 41.4 (t, C-5), 44.9 (q, C-33), 48.5 (d, C-4), 51.6 (q, C-34), 53.0 (d, C-22), 55.4 (t, C-32), 58.5* (d, C-17), 69.7 (d, C-28), 122.2 (d, C-13), 126.4 (d, C-9), 128.3 (d, C-8), 129.5 (d, C-7), 137.7 (s, C-6), 149.9 (s, C-12), 160.7 (s, C-11), 169.6 (s, C-14), 173.2 (s, C-21), 174.3 (s, C-27), 176.6 (s, C-1). 
副回転異性体の選択されたシグナル: δ= 16.5 (q, C-26), 17.6 (q, C-10), 22.7 (t, C-30), 41.1 (t, C-5), 49.2 (d, C-4), 122.5 (d, C-13). 
旋光度: [α]20D =+22.9°(c = 1.0g/100ml, CHCl3)
HRMS (CI)          計算値          実測値
C37H58N5O5S [M+H]+    684.4159         684.4153
【００９７】
１．１６．（２Ｓ，４Ｒ）−４−［（（Ｒ）−２−｛３−メチル（Ｎ−メチル−（Ｒ）−ピペコリル−（Ｓ）−イソロイシル）アミノ｝−４−メチルペンチル）チアゾール−４−カルボニル］アミノ］−２−メチル−５−フェニルペンタン酸トリフルオロ酢酸塩（１）：ジオキサン１．４ｍｌ中のＮ−メチル化テトラペプチド（１６）（０．１３６ｍｍｏｌ）９３ｍｇの溶液を、１Ｍ  ＮａＯＨ（０．２７ｍｍｏｌ、２．０当量）２７０μｌと混合し、８０℃で３時間加熱する。処理については、ジオキサンを回転蒸発器で除去し、残渣を水に溶解させる。混合物をトリフルオロ酢酸でｐＨ１に酸性化し、生成物をＴＦＡ塩として酢酸エチルで抽出する。合わせた有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、次いで濃縮する。カラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ  ９：１、８：２）により精製した後、１が定量的収率で白色固体として得られる。
Ｒｆ（１）＝０．１１（ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ  ９：１）。
【００９８】
【化３２】
2012503621.tif 000033
1H NMR (400MHz, MeOD):
主回転異性体: δ = 0.81 (d, 3J19,18 = 6.3Hz, 3H, 19-H), 0.93 (t, 3J25,24= 7.1Hz, 3H, 25-H), 0.99 (d, 3J19',18 = 6.3Hz, 3H, 19'-H), 1.02 (d, 3J26,23 = 6.5Hz, 3H, 26-H), 1.23 (m, 1H, 24-Ha), 1.53-1.86 (sh, 6H, 3-Ha, 18-H, 24-Hb, 29-Hax, 30-Hax, 31-Hax), 1.86-2.08 (sh, 5H, 3-Hb, 16-Ha, 23-H, 30-Heq, 31-Heq), 2.11-2.27 (sh, 2H, 16-Hb, 29-Heq), 2.56 (m, 1H, 2-H), 2.74 (s, 3H, 33-H), 2.81-3.02 (sh, 4H, 5-H, 15-H), 3.09 (dd, 2J32ax,32eq≒3J32ax,31ax = 12.3Hz, 1H, 32-Hax), 3.11 (s, 3H, 20-H), 3.49 (d, 2J32eq,32ax= 11.5Hz, 1H, 32-Heq), 3.76 (d, 3J28,29ax = 10.8Hz, 1H, 28-H), 4.24-4.47 (sh, 2H, 4-H, 17-H), 4.70 (d, 3J22,23= 7.8Hz, 1H, 22-H), 7.16 (m, 1H, 9-H), 7.19-7.29 (sh, 4H, 7-H, 8-H), 7.95 (s, 1H, 12-H). 
副回転異性体の選択されたシグナル: δ= 2.78 (s, 1H, 20-H). 
13C NMR (100MHz, MeOD, 5k):
主回転異性体: δ = 11.3 (q, C-25), 16.0 (q, C-26), 18.5 (q, C-10), 20.3 (q, C-19), 20.5 (q, C-19'), 22.3 (t, C-30), 24.0 (t, C-31), 25.5 (t, C-24), 30.2 (2 t, C-16, C- 29), 30.3* (q, C-20), 30.9 (t, C-15), 31.4 (d, C-18), 37.5 (d, C-23), 37.9 (d, C-2), 39.2 (t, C-3), 42.4 (t, C-5), 42.9 (q, C-33), 50.7 (d, C-4), 56.0 (d, C-22), 56.2 (t, C-32), 60.6* (d, C-17), 68.1 (d, C-28), 118.2 (q, 1J35,F= 290.6Hz, C-35), 124.0 (d, C-13), 127.4 (d, C-9), 129.3 (d, C-8), 130.4 (d, C-7), 139.5 (s, C-6), 150.5 (s, C-12), 163.1 (q, 2J34,F = 32.8Hz, C-34), 163.1 (s, C-11), 169.2 (s, C-27), 171.9 (s, C-14), 174.6 (s, C-21), 180.0 (s, C-1). 
副回転異性体の選択されたシグナル: δ= 11.8 (q, C-25), 16.4 (q, C-26), 18.4 (q, C-10), 31.2 (d, C-18), 42.1 (t, C-5), 43.1 (q, C-33), 178.5 (s, C-1). 
旋光度:   [α]20D= -17.1°(c = 1.0g/100ml, CHCl3) 
融点: 60-62℃
【実施例２】
【００９９】
プレチューブリシンの抗増殖効果
プレチューブリシンの予想される抗増殖効果を証明するために、ＨＬ−６０細胞株の増殖に対する種々のプレチューブリシンの効果を試験した。所与の数の細胞を９６ウェルプレートで培養し、薬物は１００ｎｇ／ｍｌまで連続希釈した。チューブリシンＡを陽性対照として使用し、メタノールを陰性対照として使用する。５日間インキュベーションした後、細胞の代謝活性を、方法の項に記載したＭＴＴアッセイを用いて測定した。
【０１００】
結果から、プレチューブリシン８１６および８２７はいずれもこの濃度範囲内で細胞増殖を抑制できることが証明された。しかし、細胞毒性活性は、同じ実験条件下でチューブリシンＡよりも低かった。測定したＩＣ５０値は、チューブリシンＡ、プレチューブリシン８２７および８１６で各々１．９ｐｇ／ｍｌ、１７ｐｇ／ｍｌおよび１５０ｐｇ／ｍｌであった（図１）。
【０１０１】
対照的に、抗増殖効果は、同じ実験条件下および同じ濃度範囲内で他のプレチューブリシン誘導体８１４、８１５および８２５については観察されなかった（データは図示せず）。３つの上記誘導体が、より高い濃度下で依然として不活性であるかどうか証明するために、同じ条件下であるが、最大１１μｇ／ｍｌのプレチューブリシンの濃度で実験を繰り返した。結果を図２に示す。
【０１０２】
図２に示されているように、プレチューブリシン８１５および８２５は、より高い濃度でＨＬ−６０細胞に対して活性であった。プレチューブリシン８１５および８２５のＩＣ５０測定値は、各々７００ｎｇ／ｍｌおよび６００ｎｇ／ｍｌであった。プレチューブリシン８１４のみ、１１μｇ／ｍｌ以下の濃度では細胞毒性活性を示さなかった。
【０１０３】
プレチューブリシン８１６および８２７の効果を、ヒト骨髄性白血病細胞株ＨＬ−６０に加えて、マウス結合組織線維芽細胞Ｌ９２９、ヒト肺癌細胞株Ａ５４９、ヒト結腸腺癌細胞株ＳＷ−４８０およびヒト組織球性リンパ腫細胞株Ｕ９３７を含む他の細胞株の増殖に関して試験した。結果を表１に要約する。結果は、ＨＬ−６０細胞株およびＵ９３７細胞株が、実験で試験した最も感受性の高い細胞株であることを示唆している。対照的に、ヒト肺癌細胞株は、プレチューブリシンに対して（相対的に）最も低い感受性を示した。さらに、プレチューブリシン８２７は、プレチューブリシン８１６よりも約５〜１０倍毒性が強い（薬物に対して２つの細胞株の感受性が異常に高いため、Ａ５４９細胞株およびＳＷ−４８０細胞株におけるチューブリシンＡのＩＣ５０値は決定できなかった）。
【０１０４】
【表１】
2012503621.tif 000034
【０１０５】
要約すると、試験したプレチューブリシンの大部分が、試験した細胞株に対して活性であった。プレチューブリシン８１４のみが、最大１１μｇ／ｍｌの濃度で処理した細胞の増殖に影響を与えなかった。最も強力なプレチューブリシンはプレチューブリシン８２７である。しかし、他のプレチューブリンもかなりの増殖抑制活性を示した。プレチューブリシンのグリセロールエステルの活性を図３に示す。
【実施例３】
【０１０６】
ＰｔＫ２細胞微小管の形態に対するプレチューブリシン８１６および８２７の効果
チューブリシンＡおよびＤは、哺乳動物細胞の間期微小管の脱重合を誘導し、さらに有糸分裂細胞の多極紡錘体プールを誘導することが知られている（Ｋｈａｌｉｌ，Ｍら、Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．７、６７８〜６８３（２００６）；Ｓａｓｓｅ，Ｆ．、Ｍｅｎｃｈｅ，Ｄ．Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．３、８７〜８９（２００７））。ここで、ＰｔＫ２細胞の微小管および微小管関連構造の形態に対するプレチューブリシン処理の効果を試験した。ＰｔＫ２細胞を４ウェルプレート中のガラスカバースリップ上に播種し、増殖条件下で２４時間または４８時間培養した。次いで、細胞を種々の濃度のチューブリシンＡ、チューブリシンＤ、プレチューブリシン８１６またはプレチューブリシン８２７で処理した。対照細胞を、当量のメタノール（溶媒）でのみ処理した。次いで、細胞を、方法の項に記載されているように固定する前に、さらに２４時間インキュベートした。次いで、固定した細胞をＰＢＳで洗浄し、抗αチューブリン一次抗体、次いで抗マウスＡｌｅｘａ４８８二次抗体で最終的に標識し、微小管を可視化させた。核をＤＡＰＩで染色した。
【０１０７】
図４は、正常な形態の間期微小管を有する対照細胞が示されており、糸状構造のように見える（図４Ａ）。核も正常な形態（断片化および／または縮合なし）を示している。さらに図４Ｂは、有糸分裂期の細胞内の正常な形態の紡錘体プールを示している。
【０１０８】
図５Ａおよび図５Ｂに示されているように、チューブリシンＤ５０ｐｇ／ｍｌ（図５Ａ）またはチューブリシンＡ５００ｐｇ／ｍｌ（図５Ｂ）での細胞の処理により、微小管構造の完全な消失が誘導される。これらの細胞の核の大部分は断片化される（データは図示せず）。
【０１０９】
最大２５０ｎｇ／ｍｌの濃度のプレチューブリシン８１６でのＰｔＫ２細胞の処理では、間期微小管に対する任意の明白な効果が示されなかった。しかし、いくつかの有糸分裂細胞は、異常な紡錘体プールを示した。異常な紡錘体装置の数は、５００ｎｇ／ｍｌ以上の濃度で明らかに増加した。さらに、これらの濃度で、間期微小管の種々の特徴的形態も観察できた。微小管は、細胞末端周辺でより密になり、微小管の長さは、対照細胞よりも短いようであった。この形態は、いくつかの微小管安定化剤（例えば、ジスコデルモリド）により生じた形態と（同一ではないが）類似している。約５μｇ／ｍｌの濃度で微小管は完全に消失した。細胞質内にいくつかの蛍光点が残る場合がある。図６は、上記の観察結果の一部を示している。
【０１１０】
プレチューブリシン８２７で細胞を処理した後も、同様の観察結果を得ることができた。しかし、微小管および紡錘体プールの形態に対する効果は、はるかに低い濃度（５０ｎｇ／ｍｌ）（図７）で既に始まっていた。１μｇ／ｍｌ以上の濃度で、微小管は完全に脱保護された（図８）。
【０１１１】
結果は、ＰｔＫ２細胞が、一般に、チューブリシンＡまたはＤよりもプレチューブリシンに対して感受性が低いことを示唆している。各々５μｇ／ｍｌまたは１μｇ／ｍｌのプレチューブリシン８１６および８２７と共に２４時間インキュベートした後、ＰｔＫ２細胞の間期微小管の完全な脱保護を最初に観察できた。対照的に、２４時間のインキュベーション後、５００ｐｇ／ｍｌのチューブリシンＡまたは５０ｐｇ／ｍｌのチューブリシンＤは、ＰｔＫ２間期微小管において同等の形態学的効果を誘導するには十分であった。しかし、２つのプレチューブリシンは、間期微小管の完全な脱保護に必要とされるより低い濃度で、微小管に対する独特の効果、すなわち、核付近、ならびに細胞末端周辺での短く密な微小管束の形成を示した。ＰｔＫ２細胞をチューブリシンＡまたはＤで処理した後のこれらの特徴的形態は、以前は観察されていない。さらに、同様の効果が、ジスコデルモリドなどのいくつかの微小管安定化剤により生じることが知られている。しかし、有糸分裂紡錘体に対する効果は、チューブリシンＡまたはＤにより生じた効果に匹敵する。結果は、プレチューブリシンとチューブリンおよび／または微小管タンパク質との間での分子間相互作用に関して、異なる作用機構を示唆している。一方で、結果は、微小管およびチューブリンが、プレチューブリシンの細胞内標的であるという証拠を提供している。しかし、プレチューブリシンとチューブリンとの間での直接的な相互作用は、さらに調査する必要がある。プレチューブリシンの効果をさらに調査するために、インビトロでのチューブリン重合に対するそれらの効果を試験することを決定した。
【０１１２】
免疫蛍光研究は、プレチューブリシンが、細胞微小管の形成および安定性を損なうことを示唆しているため、比濁アッセイを用いて、ブタ脳から単離した精製微小管タンパク質の重合に対するプレチューブリシンの効果を測定した。精製微小管タンパク質１０μＭを、氷上で０μＭ、１．７μＭ、３．２μＭおよび６．７μＭのプレチューブリシン８１６と混合した。次いで、微小管タンパク質の重合を３５０ｎｍおよび３７℃で１０分間モニターした。図９および図１０に示されているように、プレチューブリシン８１６は、濃度依存的に半化学量論量でインビトロでの微小管タンパク質の重合を抑制できた。１．７μＭの薬物は、タンパク質の重合を約２０％抑制できた。薬物濃度を６．７μＭまで増加することにより、重合の抑制が６０％になる。
【０１１３】
プレチューブリシン８２７は、この報告の前の部分で証明されているようにＭＴＴ試験ならびに免疫蛍光アッセイにおいて最も強力なプレチューブリシンであった。したがって、インビトロでの微小管の重合に対するその活性を試験することに関心を抱いた。最初に、微小管の重合に対するその重合抑制の可能性を研究した。精製微小管タンパク質１０μＭを氷上で０μＭ、１μＭ、１．７μＭおよび３．４μＭのプレチューブリシン８２７と混合した。次いで、微小管タンパク質の重合を、３５０ｎｍおよび３７℃で１０分間モニターした。結果を図１１および図１２に要約する。
【０１１４】
予想どおり、インビトロでの微小管タンパク質の重合に対するプレチューブリシン８２７の抑制効果は、プレチューブリシン８１６よりもはるかに高かった。１μＭのプレチューブリシン８２７は、１０μＭの微小管タンパク質の重合を約４５％抑制するのに十分であった。薬物濃度を３．４μＭまで増加することにより、重合の抑制が８５％超になる。
【０１１５】
プレアセンブルした微小管に対する薬物の効果を調べるために、最初に、微小管タンパク質を３７℃で約５分間重合した。次いで、薬物を加え、微小管の安定性を３５０ｎｍでさらに１０分間測定した。図１３に示されているように、プレチューブリシン８２７は、半化学量論濃度で微小管の重合を誘導した。同様の効果が、プレチューブリシン８１６でも観察できた（データは図示せず）。
【０１１６】
要約すると、プレチューブリシン８１６および８２７はいずれも微小管タンパク質の重合を抑制でき、半化学量論濃度でインビトロでのプレアセンブルした微小管の脱重合も誘導できた。そこで、プレチューブリシン８２７の効果は、プレチューブリシン８１６の効果よりもはるかに高い。第１の薬物の有効性は、チューブリシンＤの有効性に匹敵していた（データは図示せず）。
【実施例４】
【０１１７】
ＫＢ３−１細胞のＧ２Ｍ停止を誘導するプレチューブリシン
微小管を標的とするすべての薬物は、種々の細胞株のＧ２Ｍ期での細胞周期停止を誘導することが知られている。頸癌細胞株ＫＢ３−１の細胞周期の進行に対するプレチューブリシン８１６および８２７の能力を試験した。細胞を種々の濃度の薬物で処理し、培養条件下で２４時間インキュベートした。インキュベーション時間が終了した後、細胞を遠心分離で収集し、固定して、ＤＮＡを方法の項に記載されているように標識した。細胞のＤＮＡ含有量をＦＡＣＳ分析により検出した。得られたデータをＤｅａｎ−Ｊｅｔｔ−Ｆｏｘアルゴリズムを用いて計算した。
【０１１８】
予想どおり、２つの薬物は、ＫＢ３−１細胞のＧ２Ｍ期細胞周期停止を誘導できた。図１４に示されているように、プレチューブリシン８１６は、細胞周期のＧ２Ｍ期での細胞の蓄積を誘導した。同様の結果が、プレチューブリシン８２７について観察できた（図１５）。しかし、図１５に示されているように、細胞周期停止効果ははるかに低い濃度の薬物では観察できた。
【０１１９】
要約すると、プレチューブリシン８１６および８２７はいずれもＫＢ３−１において細胞周期停止を誘導した。この停止は、Ｇ２Ｍ期での細胞の蓄積により特徴付けられる。
【実施例５】
【０１２０】
アポトーシス誘導およびＤＮＡラダリング
エポチロン（Ｔｒｉｖｅｄｉ，Ｍ．ら、Ｆｕｔｕｒｅ  Ｏｎｃｏｌ．４、４８３〜５００（２００８））、ジソラゾール（Ｅｌｎａｋａｄｙ，Ｙ．Ａ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６７、９２７〜９３５（２００４）；Ｉｒｓｃｈｉｋ，Ｈ．ら、Ａｎｔｉｂｉｏｔ．（Ｔｏｋｙｏ）４８、３１〜３５（１９９５））およびチューブリシン（Ｋｈａｌｉｌ，Ｍ．ら、Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．７、６７８〜６８３（２００６））などの抗有糸分裂剤は、種々の癌細胞株においてアポトーシスを誘導することが知られている。抗有糸分裂剤により誘導されるアポトーシスの特質は、染色体ＤＮＡを別個の断片に切断することであり、それはゲル電気泳動により分離でき、いわゆるＤＮＡラダーが得られる。ＨＬ−６０細胞株においてアポトーシスを誘導するプレチューブリシン８１６および８２７の能力を試験した。増殖細胞を、種々の濃度の薬物で２４時間および４８時間処理した。その後、細胞を遠心分離で収集し、染色体ＤＮＡを、方法の項に記載されているようにアガロースゲル電気泳動法を用いて分離した。得られたＤＮＡバンドを、臭化エチジウムで染色し、紫外線で可視化させた。図１６に示されているように、プレチューブリシン８１６および８２７はいずれも、処理の２４時間後、ＨＬ−６０細胞株においてアポトーシスを誘導できた。しかし、ＨＬ−６０細胞においてアポトーシスを誘導するのに必要とされるプレチューブリシン８１６の濃度は、同じ実験条件下でプレチューブリシン８２７よりも約１０倍高かった。要約すると、プレチューブリシン８１６および８２７は、癌細胞株において微小管を標的とし、Ｇ２Ｍ停止を誘導し、アポトーシスを誘導する新規の抗有糸分裂薬である。しかし、これらの薬物により生じたアポトーシス誘導の分子詳細は、依然として調査するべきである。
【実施例６】
【０１２１】
プレチューブリシンに対する比較細胞毒性研究
プレチューブリシン（ＡＵ８２７）、Ｎ−デスメチルプレチューブリシン（ＡＵ８１６）およびチューブリシンＡおよびＤの細胞毒性試験を以下のように行った：細胞を、１８０μｌの完全培地中の９６ウェルプレート１ウェル当たり６×１０３個播種し、メタノール中で希釈した様々な濃度の（プレ）チューブリシンで直接処理した。各化合物を２組および内部メタノール対照を試験した。５日間インキュベートした後、各ウェルにＰＢＳ中のＭＴＴ（臭化チアゾリルブルーテトラゾリウム）５ｍｇ／ｍｌを２０μｌ加え、それを３７℃で２時間さらにインキュベートした。次いで、培地を廃棄し、細胞をＰＢＳ１００μｌで洗浄してから、２−プロパノール／１０Ｎ  ＨＣｌ（２５０：１）１００μｌを加えてホルマザン顆粒を溶解した。
【０１２２】
マイクロプレートリーダー（ＥＬ８０８、Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．）を用いて５７０ｎｍでの吸光度を測定し、細胞生存性を、各メタノール対照に対するパーセンテージとして示した。対数目盛で化合物濃度に対して相対増殖抑制を％でプロットすることによりＩＣ５０値を得た。Ｓ字形曲線フィッティング後、ＩＣ５０値を決定できる。ＩＣ５０［ｍｌ当たり］を以下の表に示す（値は２つの測定値の平均を示している）。
【０１２３】
【表２】
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【０１２４】
同様に、Ｕ−２  ＯＳヒト骨肉腫細胞においてプレチューブリシン関連化合物の細胞毒性試験を行い、国際公開第２００８／１０６０８０号および国際公開第２００４／０４６１７０号に言及されている化合物であるＡＵ３３９およびＡＵ９５４とさらに比較した。ＩＣ５０値を以下の表に示す（値は２つの測定値の平均を示している）。
【０１２５】
【表３】
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【０１２６】
本出願の化合物ＡＵ８１６およびＡＵ８２７は、チューブリシンに匹敵し、先行技術の化合物を上回る活性を有することが明らかである。
【０１２７】
【化３３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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