(57)【要約】  本発明は、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドをコードする核酸分子、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチド、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを含む医薬品組成物、およびこのような核酸、ポリペプチド、または医薬品組成物を使った代謝障害の治療方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４または８を含む単離ポリペプチドであって、
（ａ）
（ｉ）位置９８のロイシン残基；
（ｉｉ）位置１７１のプロリン残基；  
（ｉｉｉ）位置１８０のアラニン残基；
のうちの１つ以上について任意のアミノ酸の置換、さらに
（ｂ）表２〜１０の変異から選択される１つまたは複数の置換をさらに含む単離ポリペプチド。
【請求項２】
（ｂ）の１つまたは複数の置換が、
（ａ）  表２のシステイン変異；
（ｂ）  表３の操作されたジスルフィド結合；
（ｃ）  表４の安定性強化変異；
（ｄ）  表５のタンパク質分解耐性変異；
（ｅ）  表６の凝集変異；
（ｆ）  表７のＣ末端分解変異；
（ｇ）  表８のグリコシル化変異；
（ｈ）  表９から選択されたＯ−グリコシル化耐性変異；
（ｉ）  表１０から選択された変異；および
（ｊ）  （ａ）〜（ｉ）の組み合わせ；
からなる群より選択される１つまたは複数の変異を含む請求項１記載の単離ポリペプチド。
【請求項３】
（ａ）のシステイン変異が、１８〜３１、３３、３５〜５０、５４、５６〜６２、６４〜７３、７５〜１０４、１０６〜１３５、１３７〜１４０、１５２〜１５４、１６３および１６７、からなる群より選択される位置のシステインを含む請求項２記載の単離ポリペプチド。
【請求項４】
操作されたジスルフィド結合が、１９〜１３８、２０〜１３９、２１〜３３、２２〜１３７、２２〜１３９、２３〜２５、２３〜２８、２４〜１３５、２５〜１２２、２６〜１２２、２７〜１２３、２８〜４３、２８〜１２４、３１〜４３、３３〜２１、３５〜８４、４１〜８２、４２〜１２４、４２〜１２６、４３〜１２４、５０〜６９、５４〜６６、５８〜６２、６７〜７２、６７〜１３５、７２〜８４、７３〜９３、７５〜８５、７５〜９２、７６〜１０９、７７〜７９、７７〜８１、８０〜１２９、８２〜１１９、９４〜１１０、９５〜１０７、１００〜１０２、１０２〜１０４、１１５〜１１７、１１７〜１２９、１１７〜１３０、１１８〜１３２、１１８〜１３４、１２１〜１２７、１２３〜１２５、１２７〜１３２、および１５２〜１６３、からなる群より選択される１つまたは複数の位置に一対のシステイン残基を含む請求項２記載の単離ポリペプチド。
【請求項５】
安定性強化変異が、４２、５４、７７、８１、８６、８８、１２２、１２５、１２６、１３０、１３１、１３９、１４５、１４６、１５２、１５４、１５６、１６１、１６３、１７０、および１７２、からなる群より選択される１つまたは複数の位置にＤ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、ＮまたはＱを含む請求項２記載の単離タンパク質。
【請求項６】
蛋白質分解耐性変異が、  
（ａ）  位置１９のＱ、ＩまたはＫ；
（ｂ）  位置２０のＨ、ＬまたはＦ；
（ｃ）  位置２１のＩ、Ｆ、ＹまたはＶ；
（ｄ）  位置２２のＩ、ＦまたはＶ、
（ｅ）  位置１５０のＡまたはＲ；
（ｆ）  位置１５１のＡまたはＶ；
（ｇ）  位置１５２のＨ、Ｌ、ＦまたはＶ；
（ｈ）  位置１７０のＡ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｐ、またはＳ；
（ｉ）  位置１７１のＡ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、ＷまたはＹ；
（ｊ）  位置１７２のＬまたはＴ；および
（ｋ）  位置１７３のＲまたはＥ、
からなる群より選択される請求項２記載の単離タンパク質。
【請求項７】
凝集低減変異が、
（ａ）  位置２６のＥ、ＫまたはＲ；
（ｂ）  位置４５のＥＫ、Ｒ、Ｑ、またはＴ；
（ｃ）  位置５２のＴ；
（ｄ）  位置５８のＣ、ＥまたはＳ；
（ｅ）  位置６０のＡ、Ｅ、ＫまたはＲ；
（ｆ）  位置７８のＡ、Ｃ、ＨまたはＲ；
（ｇ）  位置８６のＣまたはＴ；
（ｈ）  位置８８のＡ、Ｅ、Ｋ、ＲまたはＳ；
（ｉ）  位置９８のＣ、Ｅ、Ｋ、Ｑ、またはＲ；
（ｊ）  位置９９のＣ、Ｄ、Ｅ、またはＲ；
（ｋ）  位置１１１のＫまたはＴ；
（ｌ）  位置１２９のＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、ＲまたはＱ；および
（ｍ）  位置１３４のＥ、Ｈ、ＫまたはＹ、からなる群より選択される請求項２記載の単離タンパク質。
【請求項８】
Ｃ末端分解変異が、
（ａ）  位置１８０のＧ、Ｅ、ＰまたはＳ；
（ｂ）  位置１８１のＧ、Ｐ、Ｋ、Ｔ、Ａ、ＬまたはＰ；および
（ｃ）  位置１７９のＡＰ、Ｇ、ＳまたはＡ
からなる群より選択される請求項２記載の単離ポリペプチド。
【請求項９】
Ｏ−グリコシル化耐性変異がＳ１６７Ａ、Ｓ１６７Ｅ、Ｓ１６７Ｄ、Ｓ１６７Ｎ、Ｓ１６７Ｑ、Ｓ１６７Ｇ、Ｓ１６７Ｖ、Ｓ１６７Ｈ、Ｓ１６７ＫおよびＳ１６７Ｙからなる群より選択される請求項２記載の単離ポリペプチド。
【請求項１０】
（ａ）  位置９８の変異が、Ｌ９８Ｒ、Ｌ９８Ｃ、Ｌ９８Ｅ、Ｌ９８Ｑ、Ｌ９８ＫおよびＬ９８Ｔ、からなる群より選択され；
（ｂ）  位置１７１の変異が、Ｐ１７１Ａ、Ｐ１７１Ｒ、Ｐ１７１Ｎ、Ｐ１７１Ｄ、Ｐ１７１Ｃ、Ｐ１７１Ｅ、Ｐ１７１Ｑ、Ｐ１７１Ｇ、Ｐ１７１Ｈ、Ｐ１７１Ｋ、Ｐ１７１Ｓ、Ｐ１７１Ｔ、Ｐ１７１ＷおよびＰ１７１Ｙ、からなる群より選択され；
（ｃ）  位置１８０の変異が、Ａ１８０Ｇ、Ａ１８０Ｅ、Ａ１８０ＰおよびＡ１８０Ｓ、からなる群より選択される、請求項１記載の単離ポリペプチド。
【請求項１１】
位置９８の変異がＬ９８Ｒであり、位置１７１の変異がＰ１７１Ｇであり、さらに位置１８０の変異がＡ１８０Ｅである請求項１０記載の単離ポリペプチド。
【請求項１２】
（ｉ）  ８以下の残基のＮ末端切断；
（ｉｉ）  １２以下の残基のＣ末端切断；
（ｉｉｉ）  ８以下の残基のＮ末端切断および１２以下の残基のＣ末端切断、
をさらに含む請求項１〜１１のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１３】
哺乳類動物の血糖を下げることができる請求項１２記載の単離ポリペプチド。
【請求項１４】
ポリペプチドが配列番号４または８のアミノ酸配列と少なくとも８５パーセントは同一であるが、該ポリペプチドがＬ９８Ｒ、Ｐ１７１ＧおよびＡ１８０Ｅ変異を含む場合は、Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１ＧおよびＡ１８０Ｅ変異はさらなる改変をされないアミノ酸配列を含む、請求項１または１１記載の単離ポリペプチド。
【請求項１５】
ポリペプチドのＣ末端に融合した１〜１０アミノ酸残基をさらに含む請求項１または１１のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１６】
１〜１０アミノ酸残基が、グリシン、プロリンおよびこれらの組み合わせからなる群より選択される請求項１５記載の単離ポリペプチド。
【請求項１７】
ポリペプチドが１つまたは複数のポリマーと共有結合している請求項１または１１記載の単離ポリペプチド。
【請求項１８】
ポリマーがＰＥＧである請求項１７記載の単離ポリペプチド。
【請求項１９】
異種のアミノ酸配列に融合している請求項１または１１のいずれか１項に記載の単離ポリペプチドを含む融合ポリペプチド。
【請求項２０】
異種のアミノ酸配列がＩｇＧ定常ドメインまたはその断片である請求項１９記載の融合ポリペプチド。
【請求項２１】
ＩｇＧ定常ドメインが配列番号１７１または配列番号１１のアミノ酸配列を含む請求項２０記載の融合ポリペプチド。
【請求項２２】
ポリペプチドがリンカーを介して異種のアミノ酸配列に融合している請求項２０記載の融合ポリペプチド。
【請求項２３】
リンカーが、ポリアラニン、（Ｇｌｙ）４（配列番号２９）、（Ｇｌｙ）５（配列番号３０）、（Ｇｌｙ）５−Ｓｅｒ−（Ｇｌｙ）３−Ｓｅｒ−（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒ（配列番号２８）、（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒ−（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒ−（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒ（配列番号３１）、（Ｇｌｙ）３−Ｌｙｓ−（Ｇｌｙ）４（配列番号３２）、（Ｇｌｙ）３−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−（Ｇｌｙ）２（配列番号３３）、（Ｇｌｙ）３−Ｃｙｓ−（Ｇｌｙ）４（配列番号３４）、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号３５）、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号１６６）、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４（配列番号１６７）、（Ｇｌｙ４Ｓ）２（配列番号１６８）、ＤＡＡＡＫＥＡＡＡＫＤＡＡＡＲＥＡＡＡＲＤＡＡＡＫ（配列番号１６９）、およびＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲ（配列番号１７０）、からなる群より選択される請求項２２記載の融合ポリペプチド。
【請求項２４】
２つ以上の請求項２３記載の融合ポリペプチドを含むマルチマー。
【請求項２５】
請求項１〜２４のいずれか１項に記載の単離ポリペプチドおよび薬学的に許容可能な処方剤を含む医薬品組成物。
【請求項２６】
治療を必要としているヒトの患者に請求項２５記載の医薬品組成物を投与することを含む代謝障害を治療する方法。
【請求項２７】
代謝障害が糖尿病である請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
代謝障害が肥満症である請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
請求項１〜２４のいずれか１項に記載のポリペプチドをコード単離核酸。
【請求項３０】
請求項２９記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項３１】
請求項２９記載の核酸分子を含む宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００９年１２月９日出願の米国特許仮出願第  ６１／２８５、１１８  号、２００９年１２月９日出願の米国特許仮出願第６１／２８５、１３３号および２００９年５月５日出願の米国特許仮出願第  ６１／１７５、７３６号の利益を主張し、その全ては参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドをコードする核酸分子、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチド、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを含む医薬品組成物、およびこのような核酸、ポリペプチド、または医薬品組成物を使って代謝傷害を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＦＧＦ２１は、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２１、およびＦＧＦ２３を含む繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）のサブファミリーに属する分泌ポリペプチドである（Ｉｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．、２００４、Ｔｒｅｎｄ  Ｇｅｎｅｔ．２０：５６３−６９）。ＦＧＦ２１は、ヘパリン非依存性の点ならびにグルコース、脂質、およびエネルギー代謝の調節においてホルモンとして機能するという点で非定型ＦＧＦである。
【０００４】
ＦＧＦ２１は、肝臓分泌因子として、肝臓ｃＤＮＡライブラリーから単離された。これは、肝臓および膵臓で高度に発現し、肝臓で主に発現する唯一のＦＧＦファミリーメンバーである。ＦＧＦ２１を高発現しているトランスジェニックマウスは、低成長速度、低血漿グルコースレベルおよび低トリグリセリドレベル、および加齢関連２型糖尿病、膵島過形成、および肥満症を有さないという代謝表現型を示す。げっ歯類および霊長類モデルでの組換え型ＦＧＦ２１タンパク質の薬理学的投与は、血漿グルコースレベルの正常化、トリグリセリドおよびコレステロールレベルの低下、ならびにグルコース耐性およびインスリン感度の改善がもたらされる。さらに、ＦＧＦ２１は、エネルギー消費、身体活動、および代謝速度を高めて、体重およ体脂肪を減らす。実験的研究により、ヒトの２型糖尿病、肥満症、脂質異常症、および他の代謝状態または傷害の治療を目的としたＦＧＦ２１の薬理学的投与に対して裏付けが得られている。
【０００５】
ヒトＦＧＦ２１はインビボでの半減期が短い。マウス中では、ヒトＦＧＦ２１の半減期は１〜２時間で、カニクイザルの場合は、その半減期は２．５〜３時間である。２型糖尿病の治療薬として使用するＦＧＦ２１タンパク質の開発に際しては、半減期の延長が望まれるであろう。長い半減期を有するＦＧＦ２１タンパク質であれば、そのタンパク質を投与される患者への投薬頻度を減らせることになる。このようなタンパク質が本明細書に記載される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｉｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．、２００４、Ｔｒｅｎｄ  Ｇｅｎｅｔ．２０：５６３−６９
【発明の概要】
【０００７】
単離ポリペプチドが開示される。一実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４または８を含み、単離ポリペプチドは、（ａ）（ｉ）位置９８のロイシン残基；（ｉｉ）位置１７１のプロリン残基；（ｉｉｉ）位置１８０のアラニン残基のうちの１つまたは複数の任意のアミノ酸に対する置換；および（ｂ）本明細書中で与えられる表２〜１０から選択される１つまたは複数の置換、をさらに含む。
【０００８】
別の実施形態では、ポリペプチドは、１つまたは複数の（ｂ）の置換を含み、また、（ａ）表２のシステイン変異；（ｂ）表３の操作ジスルフィド結合；（ｃ）表４の安定性強化変異；（ｄ）表５のタンパク質分解耐性変異；（ｅ）表６の凝集変異；（ｆ）表７のＣ末端分解変異；（ｇ）表８のグリコシル化変異；（ｈ）表９から選択されるＯ−グリコシル化耐性変異；（ｉ）表１０から選択される変異；および（ｊ）（ａ）〜（ｉ）の組み合わせからなる群より選択される１つまたは複数の変異を含む。
【０００９】
さらなる実施形態では、（ａ）のシステイン変異は、１８〜３１、３３、３５〜５０、５４、５６〜６２、６４〜７３、７５〜１０４、１０６〜１３５、１３７〜１４０、１５２〜１５４、１６３および１６７、からなる群  より選択される位置のシステインを含む。
【００１０】
またさらなる実施形態では、操作ジスルフィド結合は、19-138,  20-139,  21-33,  22-137,  22-139,  23-25,  23-28,  24-135,  25-122,  26-122,  27-123,  28-43,  28-124,  31-43,  33-21,  35-84,  41-82,  42-124,  42-126,  43-124,  50-69,  54-66,  58-62,  67-72,  67-135,  72-84,  73-93,  75-85,  75-92,  76-109,  77-79,  77-81,  80-129,  82-119,  94-110,  95-107,  100-102,  102-104,  115-117,  117-129,  117-130,  118-132,  118-134,  121-127,  123-125,  127-132,  および  152-163、からなる群  より選択される１つまたは複数の位置に一対のシステイン残基を含む。
【００１１】
他の実施形態では、安定性強化変異は、４２、５４、７７、８１、８６、８８、１２２、１２５、１２６、１３０、１３１、１３９、１４５、１４６、１５２、１５４、１５６、１６１、１６３、１７０、および１７２からなる群より選択される１つまたは複数の位置にＤ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、ＮまたはＱを含む。
【００１２】
他の実施形態では、蛋白質分解耐性変異は、（ａ）位置１９のＱ、ＩまたはＫ；（ｂ）位置２０のＨ、ＬまたはＦ；（ｃ）位置２１のＩ、Ｆ、ＹまたはＶ；（ｄ）位置２２のＩ、ＦまたはＶ、（ｅ）位置１５０のＡまたはＲ；（ｆ）位置１５１のＡまたはＶ；（ｇ）位置１５２のＨ、Ｌ、ＦまたはＶ；（ｈ）位置１７０のＡ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｐ、またはＳ；（ｉ）位置１７１のＡ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、ＷまたはＹ；（ｊ）位置１７２のＬまたはＴ；および（ｋ）位置１７３のＲまたはＥ、からなる群より選択される。
【００１３】
他の実施形態では、凝集低減変異は、（ａ）位置２６のＥ、ＫまたはＲ；（ｂ）位置４５のＥＫ、Ｒ、Ｑ、またはＴ；（ｃ）位置５２のＴ；（ｄ）位置５８のＣ、ＥまたはＳ；（ｅ）位置６０のＡ、Ｅ、ＫまたはＲ；（ｆ）位置７８のＡ、Ｃ、ＨまたはＲ；（ｇ）位置８６のＣまたはＴ；（ｈ）位置８８のＡ、Ｅ、Ｋ、ＲまたはＳ；（ｉ）位置９８のＣ、Ｅ、Ｋ、Ｑ、またはＲ；（ｊ）位置９９のＣ、Ｄ、Ｅ、またはＲ；（ｋ）位置１１１のＫまたはＴ；（ｌ）位置１２９のＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、ＲまたはＱ；および（ｍ）位置１３４のＥ、Ｈ、ＫまたはＹ、からなる群より選択される。
【００１４】
他の実施形態では、Ｃ末端分解変異は、（ａ）位置１８０のＧ、Ｅ、ＰまたはＳ；（ｂ）位置１８１のＧ、Ｐ、Ｋ、Ｔ、Ａ、ＬまたはＰ；および（ｃ）位置１７９のＡＰ、Ｇ、ＳまたはＡ、からなる群より選択される。他の実施形態では、Ｏ−グリコシル化耐性変異は、Ｓ１６７Ａ、Ｓ１６７Ｅ、Ｓ１６７Ｄ、Ｓ１６７Ｎ、Ｓ１６７Ｑ、Ｓ１６７Ｇ、Ｓ１６７Ｖ、Ｓ１６７Ｈ、Ｓ１６７ＫおよびＳ１６７Ｙ、からなる群より選択される。
【００１５】
さらに他の実施形態では、ポリペプチドは、（ａ）位置９８のＬ９８Ｒ、Ｌ９８Ｃ、Ｌ９８Ｅ、Ｌ９８Ｑ、Ｌ９８ＫおよびＬ９８Ｔからなる群より選択される変異；（ｂ）位置１７１のＰ１７１Ａ、Ｐ１７１Ｒ、Ｐ１７１Ｎ、Ｐ１７１Ｄ、Ｐ１７１Ｃ、Ｐ１７１Ｅ、Ｐ１７１Ｑ、Ｐ１７１Ｇ、Ｐ１７１Ｈ、Ｐ１７１Ｋ、Ｐ１７１Ｓ、Ｐ１７１Ｔ、Ｐ１７１ＷおよびＰ１７１Ｙからなる群より選択される変異；（ｃ）位置１８０のＡ１８０Ｇ、Ａ１８０Ｅ、Ａ１８０ＰおよびＡ１８０Ｓからなる群より選択される変異を含む。
【００１６】
特定の実施形態では、ポリペプチドは、位置９８のＬ９８Ｒの変異、位置１７１のＰ１７１Ｇの変異、および位置１８０のＡ１８０Ｅの変異を含む。  
【００１７】
別の実施形態では、ポリペプチドは、（ｉ）８以下の残基のＮ末端切断；（ｉｉ）１２以下の残基のＣ末端切断；（ｉｉｉ）８以下の残基のＮ末端切断および１２以下の残基のＣ末端切断、をさらに含む。切断型ポリペプチドの種々の実施形態では、ポリペプチドは、哺乳動物の血糖値を下げることができる。
【００１８】
他の実施形態では、単離ポリペプチドは、配列番号４または８のアミノ酸配列と少なくとも８５パーセント同一のアミノ酸配列を含むが、そのポリペプチドがＬ９８Ｒ、Ｐ１７１ＧおよびＡ１８０Ｅ変異を含む場合は、Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１ＧおよびＡ１８０Ｅ変異はそれ以上に改変されない。
【００１９】
他の実施形態では、単離ポリペプチドは、ポリペプチドのＣ末端に融合した１〜１０アミノ酸残基をさらに含み、これはグリシン、プロリンおよびその組み合わせからなる群より選択することができる。
【００２０】
さらに他の実施形態では、単離ポリペプチドは、ＰＥＧのような１つまたは複数のポリマーと共有結合している。
【００２１】
またさらなる実施形態では、異種のアミノ酸配列に融合した融合ポリペプチドが開示される。異種のアミノ酸配列は、ＩｇＧ定常ドメインまたはその断片であってもよく、また、例えば、配列番号１７１または配列番号１１のアミノ酸配列を含んでもよい。
【００２２】
他の実施形態では、ポリペプチドは、リンカー、例えば、ポリアラニン、  (Gly)4  （配列番号２９）、(Gly)5  （配列番号３０）、(Gly)5-Ser-(Gly)3-Ser-(Gly)4-Ser  （配列番号２８）、  (Gly)4-Ser-(Gly)4-Ser-(Gly)4-Ser（配列番号３１）、  (Gly)3-Lys-(Gly)4  （配列番号３２）、  (Gly)3-Asn-Gly-Ser-(Gly)2（配列番号３３）、  (Gly)3-Cys-(Gly)4  （配列番号３４）、Gly-Ser-(Gly4Ser)4  （配列番号１６６）、  (G4S)2  （配列番号１６８）、  (Gly4Ser)4  （配列番号１６７）、Asp-Ala-Ala-Ala-Lys-Glu-Ala-Ala-Ala-Lys-Asp-Ala-Ala-Ala-Arg-Glu-Ala-Ala-Ala-Arg-Asp-Ala-Ala-Ala-Lys  （配列番号１６９）、Asn-Val-Asp-His-Lys-Pro-Ser-Asn-Thr-Lys-Val-Asp-Lys-Arg（配列番号１７０）、および  Gly-Pro-Asn-Gly-Gly  （配列番号３５）を介して異種のアミノ酸配列に融合する。
【００２３】
２つ以上の融合ポリペプチドを含むマルチマーもまた提供される。
【００２４】
本明細書に開示されている単離ポリペプチドおよび薬学的に許容可能な処方薬を含む医薬品組成物もまた提供される。医薬品組成物を、それを必要とするヒトの患者に投与することを含む代謝傷害の治療方法もまた開示される。特定の例では、代謝傷害は糖尿病または肥満症である。
【００２５】
さらに、ポリペプチドをコードする核酸が開示され、また、核酸を含むベクターおよびそのベクターおよび／または核酸を含む宿主細胞が提供される。  
【００２６】
本発明の具体的実施形態は、下記の特定の実施形態および請求項のさらに詳細な説明から明らかになろう。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１Ａ】ＦＧＦ２１切断変異体７−１８１および８−１８１（図１Ａ）およびＦＧＦ２１切断変異体１−１７２、１−１７１、１−１６９、および１−１６４（図１Ｂ）に対し行ったＥＬＫルシフェラーゼ活性アッセイの結果で、各パネルは、ヒトＦＧＦ２１対照に対し得た結果を示している。
【図１Ｂ】ＦＧＦ２１切断変異体７−１８１および８−１８１（図１Ａ）およびＦＧＦ２１切断変異体１−１７２、１−１７１、１−１６９、および１−１６４（図１Ｂ）に対し行ったＥＬＫルシフェラーゼ活性アッセイの結果で、各パネルは、ヒトＦＧＦ２１対照に対し得た結果を示している。
【図２】ヒトＦＧＦ２１対照およびＦＧＦ２１切断変異体３−１８１、４−１８１、５−１８１、７−１８１、８−１８１、１−１８０、１−１７８、１−１７７、１−１７６、１−１７５、１−１７４、１−１７３、１−１７２、９−１８１、および１−１４９に対して行ったＥＬＫルシフェラーゼ活性アッセイの結果を示す。
【図３】ＰＢＳ（中実バー）、ヒトＦＧＦ２１対照（中空バー）、またはＦＧＦ２１切断変異体８−１８１（灰色バー）および９−１８１（点刻バー）を注入したマウスで測定した血糖値を示す。
【図４】ＰＢＳ（中実丸）、Ｆｃ−ＦＧＦ２１対照（野生型）（中空丸）、またはアミノ酸残基５−１８１（中実三角形）または７−１８１（中空三角形）を含む切断型Ｆｃ−ＦＧＦ２１融合タンパク質を注入したマウスで測定した血糖値の変化率（％）を示す。
【図５】ＰＢＳ（中実丸）、ＦＧＦ２１−Ｆｃ対照（野生型）（中空丸）、残基１−１７５（中実三角形）を含む切断型ＦＧＦ２１−Ｆｃ融合タンパク質、またはアミノ酸残基１−１７１（中空三角形）を含む切断型Ｆｃ−ＦＧＦ２１タンパク質を注入したマウスで測定した血糖値の変化率（％）を示す。
【図６Ａ】ヒトＦｃ−（Ｇ５）−ＦＧＦ２１（配列番号１０７）対照試料（図６Ａ）ならびに注入後６時間（試料Ｄ６；図６Ｂ）、２４時間（試料Ｄ２４；図６Ｃ）、および４８時間（試料Ｄ４８；図６Ｄ）時点でマウスから採取したＦｃ−（Ｇ５）−ＦＧＦ２１試料の液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）結果を示す。
【図６Ｂ】ヒトＦｃ−（Ｇ５）−ＦＧＦ２１（配列番号１０７）対照試料（図６Ａ）ならびに注入後６時間（試料Ｄ６；図６Ｂ）、２４時間（試料Ｄ２４；図６Ｃ）、および４８時間（試料Ｄ４８；図６Ｄ）時点でマウスから採取したＦｃ−（Ｇ５）−ＦＧＦ２１試料の液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）結果を示す。
【図６Ｃ】ヒトＦｃ−（Ｇ５）−ＦＧＦ２１（配列番号１０７）対照試料（図６Ａ）ならびに注入後６時間（試料Ｄ６；図６Ｂ）、２４時間（試料Ｄ２４；図６Ｃ）、および４８時間（試料Ｄ４８；図６Ｄ）時点でマウスから採取したＦｃ−（Ｇ５）−ＦＧＦ２１試料の液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）結果を示す。
【図６Ｄ】ヒトＦｃ−（Ｇ５）−ＦＧＦ２１（配列番号１０７）対照試料（図６Ａ）ならびに注入後６時間（試料Ｄ６；図６Ｂ）、２４時間（試料Ｄ２４；図６Ｃ）、および４８時間（試料Ｄ４８；図６Ｄ）時点でマウスから採取したＦｃ−（Ｇ５）−ＦＧＦ２１試料の液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）結果を示す。
【図７Ａ】哺乳類動物由来ヒトＦＧＦ２１−（Ｇ３）−Ｆｃ（配列番号１０５）対照試料（図７Ａ）ならびに注入後６時間（試料Ｅ６；図７Ｂ）、２４時間（試料Ｅ２４；図７Ｃ）、および４８時間（試料Ｅ４８；図７Ｄ）時点でマウスから採取したＦＧＦ２１−（Ｇ３）−Ｆｃの試料のＬＣ−ＭＳ分析結果を示す。
【図７Ｂ】哺乳類動物由来ヒトＦＧＦ２１−（Ｇ３）−Ｆｃ（配列番号１０５）対照試料（図７Ａ）ならびに注入後６時間（試料Ｅ６；図７Ｂ）、２４時間（試料Ｅ２４；図７Ｃ）、および４８時間（試料Ｅ４８；図７Ｄ）時点でマウスから採取したＦＧＦ２１−（Ｇ３）−Ｆｃの試料のＬＣ−ＭＳ分析結果を示す。
【図７Ｃ】哺乳類動物由来ヒトＦＧＦ２１−（Ｇ３）−Ｆｃ（配列番号１０５）対照試料（図７Ａ）ならびに注入後６時間（試料Ｅ６；図７Ｂ）、２４時間（試料Ｅ２４；図７Ｃ）、および４８時間（試料Ｅ４８；図７Ｄ）時点でマウスから採取したＦＧＦ２１−（Ｇ３）−Ｆｃの試料のＬＣ−ＭＳ分析結果を示す。
【図７Ｄ】哺乳類動物由来ヒトＦＧＦ２１−（Ｇ３）−Ｆｃ（配列番号１０５）対照試料（図７Ａ）ならびに注入後６時間（試料Ｅ６；図７Ｂ）、２４時間（試料Ｅ２４；図７Ｃ）、および４８時間（試料Ｅ４８；図７Ｄ）時点でマウスから採取したＦＧＦ２１−（Ｇ３）−Ｆｃの試料のＬＣ−ＭＳ分析結果を示す。
【図８Ａ】Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（配列番号４９）対照試料（図８Ａ）ならびに注入後６時間（図８Ｂ）、２４時間（図８Ｃ）、および４８時間（図８Ｄ）の時点でマウスから採取したＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１の試料のＬＣ−ＭＳ分析結果を示す。
【図８Ｂ】Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（配列番号４９）対照試料（図８Ａ）ならびに注入後６時間（図８Ｂ）、２４時間（図８Ｃ）、および４８時間（図８Ｄ）の時点でマウスから採取したＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１の試料のＬＣ−ＭＳ分析結果を示す。
【図８Ｃ】Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（配列番号４９）対照試料（図８Ａ）ならびに注入後６時間（図８Ｂ）、２４時間（図８Ｃ）、および４８時間（図８Ｄ）の時点でマウスから採取したＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１の試料のＬＣ−ＭＳ分析結果を示す。
【図８Ｄ】Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（配列番号４９）対照試料（図８Ａ）ならびに注入後６時間（図８Ｂ）、２４時間（図８Ｃ）、および４８時間（図８Ｄ）の時点でマウスから採取したＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１の試料のＬＣ−ＭＳ分析結果を示す。
【図９Ａ】ＦＧＦ２１−（Ｌ１５）−Ｆｃ（配列番号４１）対照試料（図９Ａ）ならびに注入後６時間（図９Ｂ）、２４時間（図９Ｃ）、および４８時間（図９Ｄ）時点でマウスから採取したＦＧＦ２１−（Ｌ１５）−Ｆｃ試料のＬＣ−ＭＳ分析結果を示す。
【図９Ｂ】ＦＧＦ２１−（Ｌ１５）−Ｆｃ（配列番号４１）対照試料（図９Ａ）ならびに注入後６時間（図９Ｂ）、２４時間（図９Ｃ）、および４８時間（図９Ｄ）時点でマウスから採取したＦＧＦ２１−（Ｌ１５）−Ｆｃ試料のＬＣ−ＭＳ分析結果を示す。
【図９Ｃ】ＦＧＦ２１−（Ｌ１５）−Ｆｃ（配列番号４１）対照試料（図９Ａ）ならびに注入後６時間（図９Ｂ）、２４時間（図９Ｃ）、および４８時間（図９Ｄ）時点でマウスから採取したＦＧＦ２１−（Ｌ１５）−Ｆｃ試料のＬＣ−ＭＳ分析結果を示す。
【図９Ｄ】ＦＧＦ２１−（Ｌ１５）−Ｆｃ（配列番号４１）対照試料（図９Ａ）ならびに注入後６時間（図９Ｂ）、２４時間（図９Ｃ）、および４８時間（図９Ｄ）時点でマウスから採取したＦＧＦ２１−（Ｌ１５）−Ｆｃ試料のＬＣ−ＭＳ分析結果を示す。
【図１０Ａ】Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（図１０Ａ、配列番号４９）および、マウスに注入したＦＧＦ２１−（Ｌ１５）−Ｆｃ（図１０Ｂ、配列番号４１）融合タンパク質のＬＣ−ＭＳ分析により特定された開裂部位を示す。
【図１０Ｂ】Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（図１０Ａ、配列番号４９）および、マウスに注入したＦＧＦ２１−（Ｌ１５）−Ｆｃ（図１０Ｂ、配列番号４１）融合タンパク質のＬＣ−ＭＳ分析により特定された開裂部位を示す。
【図１１】ＰＢＳ（中実バー）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（配列番号４９）（中空バー）、またはＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１変異体であるＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１Ｇ１７０Ｅ（配列番号５１）（灰色バー）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１Ｐ１７１Ａ（配列番号５３）（点刻バー）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１Ｓ１７２Ｌ（配列番号５５）（中空対角格子ハッチバー）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｇ１７０Ｅ、Ｐ１７１Ａ、Ｓ１７２Ｌ）（配列番号５９）（中実水平格子ハッチバー）、もしくはＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１Ｇ１５１Ａ（配列番号６１）（中空対角格子ハッチバー）を注入したマウスで測定した血糖値を示す。
【図１２】ＰＢＳ（中実丸）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（配列番号４９）（中空丸）、もしくはＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１変異体であるＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１Ｇ１７０Ｅ（配列番号５１）（中実三角形）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１Ｐ１７１Ａ（配列番号５３）（中空三角形）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１Ｓ１７２Ｌ（配列番号５５）（中実ダイア）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｇ１７０Ｅ、Ｐ１７１Ａ、Ｓ１７２Ｌ）（配列番号５９）（中空ダイア）、またはＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１Ｇ１５１Ａ（配列番号６１）（中実四角）を注入したマウスで測定した血糖値の変化率（％）を示す。
【図１３】ＰＢＳ（中実バー）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（配列番号４９）（中空バー）、またはＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１変異体であるＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｐ１５０Ａ、Ｇ１５１Ａ、Ｉ１５２Ｖ）（配列番号６５）（灰色バー）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１Ｇ１７０Ｅ（配列番号５１）（中空対角格子ハッチバー）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｇ１７０Ｅ、Ｐ１７１Ａ）（配列番号６３）（灰色対角格子ハッチバー）、もしくはＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｇ１７０Ｅ、Ｓ１７２Ｌ）（配列番号６７）（中空対角格子ハッチバー）を注入したマウスで測定した血糖値を示す。
【図１４】ＰＢＳ（中実四角）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（配列番号４９）（中空四角）、およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１変異体Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｐ１５０Ａ、Ｇ１５１Ａ、Ｉ１５２Ｖ）（配列番号６５）（中実逆三角形）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ（配列番号５１）（中空逆三角形）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｇ１７０Ｅ、Ｐ１７１Ａ）（配列番号６３）（中実丸）、もしくはＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｇ１７０Ｅ、Ｓ１７２Ｌ）（配列番号６７）（中空丸）を注入したマウスで測定した血糖値の変化率（％）を示す。
【図１５】ＰＢＳ（中実バー）またはＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１変異体であるＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ（配列番号５１）（中空バー）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ａ（配列番号６９）（灰色バー）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｃ（配列番号７１）（中空格子ハッチバー）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｄ（配列番号７３）（灰と白バー）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｎ（配列番号７５）（中実格子ハッチバー）、もしくはＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｓ（配列番号７７）（中空格子ハッチバー）を注入したマウスで測定した血糖値を示す。
【図１６】ＰＢＳ（中実丸）またはＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１変異体であるＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ（配列番号５１）（中空丸）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ａ（配列番号６９）（中実三角形）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｃ（配列番号７１）（中空三角形）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｄ（配列番号７３）（中実ダイア）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｎ（配列番号７５）（中空ダイア）、もしくはＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｓ（配列番号７７）（中実逆三角形）を注入したマウスで測定した血糖値の変化率（％）を示す。
【図１７】ＰＢＳ（中実バー）またはＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１変異体であるＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ（配列番号５１）（中空バー）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｅ（配列番号７９）（灰色バー）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｈ（配列番号８１）（中実格子ハッチバー）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｑ（配列番号８３）（中空格子ハッチバー）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｔ（配列番号８５）（点刻バー）、もしくはＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｙ（配列番号８７）（灰色格子ハッチバー）を注入したマウスで測定した血糖値を示す。
【図１８】ＰＢＳ（中実丸）またはＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１変異体であるＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ（配列番号５１）（中空丸）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｅ（配列番号７９）（中実三角形）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｈ（配列番号８１）（中空三角形）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｑ（配列番号８３）（中実ダイア）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｔ（配列番号８５）（中空ダイア）、もしくはＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｙ（配列番号８７）（中実四角）を注入したマウスで測定した血糖値の変化率（％）を示す。
【図１９Ａ】Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１対照試料（図１９Ａ、配列番号４９）ならびに注入後６時間（図１９Ｂ）、２４時間（図１９Ｃ）、および４８時間（図１９Ｄ）の時点でマウスから採取した試料のＬＣ−ＭＳ分析結果を示す。
【図１９Ｂ】Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１対照試料（図１９Ａ、配列番号４９）ならびに注入後６時間（図１９Ｂ）、２４時間（図１９Ｃ）、および４８時間（図１９Ｄ）の時点でマウスから採取した試料のＬＣ−ＭＳ分析結果を示す。
【図１９Ｃ】Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１対照試料（図１９Ａ、配列番号４９）ならびに注入後６時間（図１９Ｂ）、２４時間（図１９Ｃ）、および４８時間（図１９Ｄ）の時点でマウスから採取した試料のＬＣ−ＭＳ分析結果を示す。
【図１９Ｄ】Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１対照試料（図１９Ａ、配列番号４９）ならびに注入後６時間（図１９Ｂ）、２４時間（図１９Ｃ）、および４８時間（図１９Ｄ）の時点でマウスから採取した試料のＬＣ−ＭＳ分析結果を示す。
【図２０Ａ】Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ対照試料（図２０Ａ、配列番号５１）ならびに注入後６時間（図２０Ｂ）、２４時間（図２０Ｃ）、および４８時間（図２０Ｄ）の時点でマウスから採取したＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ試料のＬＣ−ＭＳ分析結果を示す。
【図２０Ｂ】Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ対照試料（図２０Ａ、配列番号５１）ならびに注入後６時間（図２０Ｂ）、２４時間（図２０Ｃ）、および４８時間（図２０Ｄ）の時点でマウスから採取したＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ試料のＬＣ−ＭＳ分析結果を示す。
【図２０Ｃ】Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ対照試料（図２０Ａ、配列番号５１）ならびに注入後６時間（図２０Ｂ）、２４時間（図２０Ｃ）、および４８時間（図２０Ｄ）の時点でマウスから採取したＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ試料のＬＣ−ＭＳ分析結果を示す。
【図２０Ｄ】Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ対照試料（図２０Ａ、配列番号５１）ならびに注入後６時間（図２０Ｂ）、２４時間（図２０Ｃ）、および４８時間（図２０Ｄ）の時点でマウスから採取したＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ試料のＬＣ−ＭＳ分析結果を示す。
【図２１Ａ】Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ａ対照試料（図２１Ａ、配列番号５３）ならびに注入後６時間（図２１Ｂ）、２４時間（図２１Ｃ）、および４８時間（図２１Ｄ）の時点でマウスから採取したＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ａ試料のＬＣ−ＭＳ分析結果を示す。
【図２１Ｂ】Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ａ対照試料（図２１Ａ、配列番号５３）ならびに注入後６時間（図２１Ｂ）、２４時間（図２１Ｃ）、および４８時間（図２１Ｄ）の時点でマウスから採取したＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ａ試料のＬＣ−ＭＳ分析結果を示す。
【図２１Ｃ】Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ａ対照試料（図２１Ａ、配列番号５３）ならびに注入後６時間（図２１Ｂ）、２４時間（図２１Ｃ）、および４８時間（図２１Ｄ）の時点でマウスから採取したＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ａ試料のＬＣ−ＭＳ分析結果を示す。
【図２１Ｄ】Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ａ対照試料（図２１Ａ、配列番号５３）ならびに注入後６時間（図２１Ｂ）、２４時間（図２１Ｃ）、および４８時間（図２１Ｄ）の時点でマウスから採取したＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ａ試料のＬＣ−ＭＳ分析結果を示す。
【図２２Ａ】Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｓ１７２Ｌ対照試料（図２２Ａ、配列番号５５）ならびに注入後６時間（図２２Ｂ）、２４時間（図２２Ｃ）、および４８時間（図２２Ｄ）の時点でマウスから採取したＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｓ１７２Ｌ試料のＬＣ−ＭＳ分析結果を示す。
【図２２Ｂ】Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｓ１７２Ｌ対照試料（図２２Ａ、配列番号５５）ならびに注入後６時間（図２２Ｂ）、２４時間（図２２Ｃ）、および４８時間（図２２Ｄ）の時点でマウスから採取したＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｓ１７２Ｌ試料のＬＣ−ＭＳ分析結果を示す。
【図２２Ｃ】Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｓ１７２Ｌ対照試料（図２２Ａ、配列番号５５）ならびに注入後６時間（図２２Ｂ）、２４時間（図２２Ｃ）、および４８時間（図２２Ｄ）の時点でマウスから採取したＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｓ１７２Ｌ試料のＬＣ−ＭＳ分析結果を示す。
【図２２Ｄ】Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｓ１７２Ｌ対照試料（図２２Ａ、配列番号５５）ならびに注入後６時間（図２２Ｂ）、２４時間（図２２Ｃ）、および４８時間（図２２Ｄ）の時点でマウスから採取したＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｓ１７２Ｌ試料のＬＣ−ＭＳ分析結果を示す。
【図２３Ａ】マウスに注入したＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（図２３Ａ、配列番号４９）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ（図２３Ｂ、配列番号５１）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ａ（図２３Ｃ、配列番号５３）、およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｓ１７２Ｌ（図２３Ｄ、配列番号５５）融合タンパク質のＬＣ−ＭＳ分析により特定された開裂部位を示す。
【図２３Ｂ】マウスに注入したＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（図２３Ａ、配列番号４９）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ（図２３Ｂ、配列番号５１）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ａ（図２３Ｃ、配列番号５３）、およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｓ１７２Ｌ（図２３Ｄ、配列番号５５）融合タンパク質のＬＣ−ＭＳ分析により特定された開裂部位を示す。
【図２３Ｃ】マウスに注入したＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（図２３Ａ、配列番号４９）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ（図２３Ｂ、配列番号５１）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ａ（図２３Ｃ、配列番号５３）、およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｓ１７２Ｌ（図２３Ｄ、配列番号５５）融合タンパク質のＬＣ−ＭＳ分析により特定された開裂部位を示す。
【図２３Ｄ】マウスに注入したＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（図２３Ａ、配列番号４９）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ（図２３Ｂ、配列番号５１）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ａ（図２３Ｃ、配列番号５３）、およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｓ１７２Ｌ（図２３Ｄ、配列番号５５）融合タンパク質のＬＣ−ＭＳ分析により特定された開裂部位を示す。
【図２４Ａ】ＦＧＦ２１変異体であるＦＧＦ２１  Ｌ９９Ｒ（配列番号１０９）、ＦＧＦ２１  Ｌ９９Ｄ（配列番号１１１）、およびＦＧＦ２１  Ａ１１１Ｔ（配列番号１１３）（図２４Ａ）；ＦＧＦ２１変異体ＦＧＦ２１  Ａ１２９Ｄ（配列番号１１５）、ＦＧＦ２１  Ａ１２９Ｑ（配列番号１１７）、およびＦＧＦ２１  Ａ１３４Ｋ（配列番号１１９）（図２４Ｂ）；ならびにＦＧＦ２１変異体ＦＧＦ２１  Ａ１３４Ｙ（配列番号１２１）、ＦＧＦ２１  Ａ１３４Ｅ（配列番号１２３）、およびＦＧＦ２１  Ａ１２９Ｋ（配列番号１２５）（図２４Ｃ）を対象に実施したＥＬＫルシフェラーゼ活性アッセイの結果であり、各パネルはヒトＦＧＦ２１対照に対して得られた結果を示す。
【図２４Ｂ】ＦＧＦ２１変異体であるＦＧＦ２１  Ｌ９９Ｒ（配列番号１０９）、ＦＧＦ２１  Ｌ９９Ｄ（配列番号１１１）、およびＦＧＦ２１  Ａ１１１Ｔ（配列番号１１３）（図２４Ａ）；ＦＧＦ２１変異体ＦＧＦ２１  Ａ１２９Ｄ（配列番号１１５）、ＦＧＦ２１  Ａ１２９Ｑ（配列番号１１７）、およびＦＧＦ２１  Ａ１３４Ｋ（配列番号１１９）（図２４Ｂ）；ならびにＦＧＦ２１変異体ＦＧＦ２１  Ａ１３４Ｙ（配列番号１２１）、ＦＧＦ２１  Ａ１３４Ｅ（配列番号１２３）、およびＦＧＦ２１  Ａ１２９Ｋ（配列番号１２５）（図２４Ｃ）を対象に実施したＥＬＫルシフェラーゼ活性アッセイの結果であり、各パネルはヒトＦＧＦ２１対照に対して得られた結果を示す。
【図２４Ｃ】ＦＧＦ２１変異体であるＦＧＦ２１  Ｌ９９Ｒ（配列番号１０９）、ＦＧＦ２１  Ｌ９９Ｄ（配列番号１１１）、およびＦＧＦ２１  Ａ１１１Ｔ（配列番号１１３）（図２４Ａ）；ＦＧＦ２１変異体ＦＧＦ２１  Ａ１２９Ｄ（配列番号１１５）、ＦＧＦ２１  Ａ１２９Ｑ（配列番号１１７）、およびＦＧＦ２１  Ａ１３４Ｋ（配列番号１１９）（図２４Ｂ）；ならびにＦＧＦ２１変異体ＦＧＦ２１  Ａ１３４Ｙ（配列番号１２１）、ＦＧＦ２１  Ａ１３４Ｅ（配列番号１２３）、およびＦＧＦ２１  Ａ１２９Ｋ（配列番号１２５）（図２４Ｃ）を対象に実施したＥＬＫルシフェラーゼ活性アッセイの結果であり、各パネルはヒトＦＧＦ２１対照に対して得られた結果を示す。
【図２５Ａ】Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１変異体であるＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｇ（配列番号８９）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｓ（配列番号９１）、およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｔ（配列番号８５）（図２５Ａ）；Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１変異体Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｙ（配列番号８７）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｗ（配列番号９３）、およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｃ（配列番号９５）（図２５Ｂ）；Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（配列番号４９）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ａ４５Ｋ、Ｇ１７０Ｅ）（配列番号９７）、およびＦＧＦ２１  Ａ４５Ｋ（配列番号９９）（図２５Ｃ）；ならびにＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（配列番号４９）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｅ（配列番号７９）、およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ａ４５Ｋ、Ｇ１７０Ｅ）（配列番号９７）（図２５Ｄ）を対象に実施したＥＬＫルシフェラーゼ活性アッセイの結果で、各パネルはヒトＦＧＦ２１対照に対して得られた結果を示す。
【図２５Ｂ】Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１変異体であるＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｇ（配列番号８９）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｓ（配列番号９１）、およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｔ（配列番号８５）（図２５Ａ）；Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１変異体Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｙ（配列番号８７）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｗ（配列番号９３）、およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｃ（配列番号９５）（図２５Ｂ）；Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（配列番号４９）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ａ４５Ｋ、Ｇ１７０Ｅ）（配列番号９７）、およびＦＧＦ２１  Ａ４５Ｋ（配列番号９９）（図２５Ｃ）；ならびにＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（配列番号４９）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｅ（配列番号７９）、およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ａ４５Ｋ、Ｇ１７０Ｅ）（配列番号９７）（図２５Ｄ）を対象に実施したＥＬＫルシフェラーゼ活性アッセイの結果で、各パネルはヒトＦＧＦ２１対照に対して得られた結果を示す。
【図２５Ｃ】Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１変異体であるＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｇ（配列番号８９）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｓ（配列番号９１）、およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｔ（配列番号８５）（図２５Ａ）；Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１変異体Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｙ（配列番号８７）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｗ（配列番号９３）、およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｃ（配列番号９５）（図２５Ｂ）；Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（配列番号４９）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ａ４５Ｋ、Ｇ１７０Ｅ）（配列番号９７）、およびＦＧＦ２１  Ａ４５Ｋ（配列番号９９）（図２５Ｃ）；ならびにＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（配列番号４９）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｅ（配列番号７９）、およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ａ４５Ｋ、Ｇ１７０Ｅ）（配列番号９７）（図２５Ｄ）を対象に実施したＥＬＫルシフェラーゼ活性アッセイの結果で、各パネルはヒトＦＧＦ２１対照に対して得られた結果を示す。
【図２５Ｄ】Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１変異体であるＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｇ（配列番号８９）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｓ（配列番号９１）、およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｔ（配列番号８５）（図２５Ａ）；Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１変異体Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｙ（配列番号８７）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｗ（配列番号９３）、およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｃ（配列番号９５）（図２５Ｂ）；Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（配列番号４９）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ａ４５Ｋ、Ｇ１７０Ｅ）（配列番号９７）、およびＦＧＦ２１  Ａ４５Ｋ（配列番号９９）（図２５Ｃ）；ならびにＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（配列番号４９）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｅ（配列番号７９）、およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ａ４５Ｋ、Ｇ１７０Ｅ）（配列番号９７）（図２５Ｄ）を対象に実施したＥＬＫルシフェラーゼ活性アッセイの結果で、各パネルはヒトＦＧＦ２１対照に対して得られた結果を示す。
【図２６Ａ】野生型熟成ＦＧＦ２１および種々のＦＧＦ２１変異体について、凝集を時間の関数として示す。図２６Ａは、６５ｍｇ／ｍＬのタンパク質を４℃で１、２、および４日間インキュベートした後のＦＧＦ２１対照（野生型、配列番号４、中実ダイア）およびＦＧＦ２１  Ａ４５Ｋ（配列番号９９、中実丸）の凝集変化率（％）を示す。一方、図２６Ｂは、６５ｍｇ／ｍＬのタンパク質を４℃で１、６、および１０日間インキュベートした後のＦＧＦ２１対照（ＷＴ）（配列番号４）ならびにＦＧＦ２１  Ｐ７８Ｃ（  配列番号１２７）、ＦＧＦ２１  Ｐ７８Ｒ（  配列番号１２９）、ＦＧＦ２１  Ｌ８６Ｔ（  配列番号１３１）、ＦＧＦ２１  Ｌ８６Ｃ（  配列番号１３３）、ＦＧＦ２１  Ｌ９８Ｃ（  配列番号１３５）、ＦＧＦ２１  Ｌ９８Ｒ（  配列番号１３７）、ＦＧＦ２１  Ａ１１１Ｔ（  配列番号１１３）、ＦＧＦ２１  Ａ１２９Ｄ（  配列番号１１５）、ＦＧＦ２１  Ａ１２９Ｑ（  配列番号１１７）、ＦＧＦ２１  Ａ１２９Ｋ（  配列番号１２５）、ＦＧＦ２１  Ａ１３４Ｋ（  配列番号１１９）、ＦＧＦ２１  Ａ１３４Ｙ（  配列番号１２１）、およびＦＧＦ２１  Ａ１３４Ｅ（  配列番号１２３）（全てプロット上に名称を付した）の凝集変化率（％）を示す。
【図２６Ｂ】野生型熟成ＦＧＦ２１および種々のＦＧＦ２１変異体について、凝集を時間の関数として示す。図２６Ａは、６５ｍｇ／ｍＬのタンパク質を４℃で１、２、および４日間インキュベートした後のＦＧＦ２１対照（野生型、配列番号４、中実ダイア）およびＦＧＦ２１  Ａ４５Ｋ（配列番号９９、中実丸）の凝集変化率（％）を示す。一方、図２６Ｂは、６５ｍｇ／ｍＬのタンパク質を４℃で１、６、および１０日間インキュベートした後のＦＧＦ２１対照（ＷＴ）（配列番号４）ならびにＦＧＦ２１  Ｐ７８Ｃ（  配列番号１２７）、ＦＧＦ２１  Ｐ７８Ｒ（  配列番号１２９）、ＦＧＦ２１  Ｌ８６Ｔ（  配列番号１３１）、ＦＧＦ２１  Ｌ８６Ｃ（  配列番号１３３）、ＦＧＦ２１  Ｌ９８Ｃ（  配列番号１３５）、ＦＧＦ２１  Ｌ９８Ｒ（  配列番号１３７）、ＦＧＦ２１  Ａ１１１Ｔ（  配列番号１１３）、ＦＧＦ２１  Ａ１２９Ｄ（  配列番号１１５）、ＦＧＦ２１  Ａ１２９Ｑ（  配列番号１１７）、ＦＧＦ２１  Ａ１２９Ｋ（  配列番号１２５）、ＦＧＦ２１  Ａ１３４Ｋ（  配列番号１１９）、ＦＧＦ２１  Ａ１３４Ｙ（  配列番号１２１）、およびＦＧＦ２１  Ａ１３４Ｅ（  配列番号１２３）（全てプロット上に名称を付した）の凝集変化率（％）を示す。
【図２７】ヒトＦＧＦ２１対照ならびにＦＧＦ２１変異体であるＦＧＦ２１  Ａ４５Ｋ（配列番号９９）、ＦＧＦ２１  Ｌ５２Ｔ（配列番号１３９）、およびＦＧＦ２１  Ｌ５８Ｅ（配列番号１４１）を対象に実施したＥＬＫルシフェラーゼ活性アッセイの結果を示す。
【図２８Ａ】４℃で１、４、および８日間インキュベートした後の、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１変異体であるＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（６−１８１、Ｇ１７０Ｅ）（配列番号１０１）（中実ダイア）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ａ４５Ｋ、Ｇ１７０Ｅ）（配列番号９７）（中空四角）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１Ｐ１７１Ｅ（配列番号７９）（中実三角形）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ａ（配列番号５３）（ｘ印）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ（配列番号５１）（中空三角形）、およびＦＧＦ２１対照（中実丸）の凝集レベルの変化を示すプロットである。
【図２８Ｂ】この図も、また、インキュベーション結果を示す棒グラフである。
【図２９】ＰＢＳ（賦形剤）（中実丸）またはＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１変異体であるＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ａ４５Ｋ、Ｇ１７０Ｅ）（配列番号９７）（中空丸）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ａ４５Ｋ、Ｐ１７１Ｇ）（配列番号１０３）（中実三角形）、もしくはＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）（中空三角形）を注入したマウスで測定した血糖値を示す。
【図３０】ヒトＦＧＦ２１（配列番号４）（中実丸、実線）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（配列番号４９）（中空丸、実線）およびＦｃ−（Ｌ１５）ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）（中実三角形、点線）を対象に実施したＥＬＫルシフェラーゼ活性アッセイの結果を示すプロットである。
【図３１Ａ】室温（図３１Ａ）および４℃（図３１Ｂ）で９日間経過後に観察したＦＧＦ２１（配列番号４）（中実丸、実線）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（配列番号４９）（中空丸、実線）およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）（中実三角形、点線）の高分子量凝集体の割合（％）を示すプロットである。
【図３１Ｂ】室温（図３１Ａ）および４℃（図３１Ｂ）で９日間経過後に観察したＦＧＦ２１（配列番号４）（中実丸、実線）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（配列番号４９）（中空丸、実線）およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）（中実三角形、点線）の高分子量凝集体の割合（％）を示すプロットである。
【図３２】１６８時間の内のいくつかの時点で観察されたＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）の変化を示す一連のＭＡＬＤＩ質量分析結果である。
【図３３】ＰＢＳ賦形剤対照（中空丸）、野生型成熟ＦＧＦ２１（中実四角）、ならびにＦＧＦ２１変異体であるＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）（逆中実三角形）；Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、１８２Ｐ）（配列番号１４３）（中空ダイア）、およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、１８２Ｇ）（配列番号１４５）（中実丸）のそれぞれに対するｏｂ／ｏｂマウス中の血糖値の変化率（％）を示すプロットである。
【図３４】ＰＢＳ賦形剤対照（中実丸）、ならびにＦＧＦ２１変異体であるＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）（中実三角形）；Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、１８２Ｇ、１８３Ｇ）（配列番号１４７）（中空三角形）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、１８２Ｇ）（配列番号１４５）（中実ダイア）およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、１８２Ｐ）（配列番号１４３）（中空ダイア）のそれぞれに対するｏｂ／ｏｂマウス中の血糖値の変化率（％）を示すプロットである。
【図３５】ＰＢＳ賦形剤対照（中空丸）、ならびにＦＧＦ２１変異体であるＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）（中実四角）；Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ｙ１７９Ｓ）（配列番号１４９）（中空三角形）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ｙ１７９Ａ）（配列番号１５３）（逆中実三角形）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｓ）（配列番号１５５）（中空ダイア）およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｇ）（配列番号１５７）（中実丸）のそれぞれに対するｏｂ／ｏｂマウス中の血糖値の変化率（％）を示すプロットである。
【図３６】ＰＢＳ賦形剤対照（中実丸）、ならびにＦＧＦ２１変異体であるＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）（中空四角）；Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ｙ１７９Ｆ）（配列番号１５１）（中実三角形）、およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）（配列番号５７）（中空ダイア）のそれぞれに対するｏｂ／ｏｂマウス中の血糖値の変化率（％）を示すプロットである。
【図３７】アカゲザルで行った６週間用量漸増試験計画を図示したものである。この図で、斜線のシンボルは、空腹状態での血液採取を、点刻のシンボルは摂食状態での血液採取を示している。
【図３８Ａ】アカゲザルが、ＯＧＴＴプロファイル、ＯＧＴＴＡＵＣおよび体重に関して無作為化された状態であるかを示す一連のプロットである。図３８Ａは、化合物または賦形剤が各群に割り当てられる前の、ＯＧＴＴ１におけるベースライングルコースレベルを示し、中実四角はＡ群、中実丸、実線はＢ群および中空丸、点線はＣ群に対応する。図３８Ｂは、化合物または賦形剤が各群に割り当てられる前の、ＯＧＴＴ２におけるベースライングルコースレベルを示し、中実四角はＡ群、中実丸、実線はＢ群および中空丸、実線はＣ群に対応する。図３８Ｃは、ＡＵＣの観点からみたＯＧＴＴ１および２に対するベースライングルコースレベルを示し、点刻バーはＡ群に、斜線ハッチバーはＢ群に、中空バーはＣ群に対応する。さらに、図３８Ｄは、ベースライン体重を示し、点刻バーはＡ群、斜線バーはＢ群、中空バーはＣ群に相当する。
【図３８Ｂ】アカゲザルが、ＯＧＴＴプロファイル、ＯＧＴＴＡＵＣおよび体重に関して無作為化された状態であるかを示す一連のプロットである。図３８Ａは、化合物または賦形剤が各群に割り当てられる前の、ＯＧＴＴ１におけるベースライングルコースレベルを示し、中実四角はＡ群、中実丸、実線はＢ群および中空丸、点線はＣ群に対応する。図３８Ｂは、化合物または賦形剤が各群に割り当てられる前の、ＯＧＴＴ２におけるベースライングルコースレベルを示し、中実四角はＡ群、中実丸、実線はＢ群および中空丸、実線はＣ群に対応する。図３８Ｃは、ＡＵＣの観点からみたＯＧＴＴ１および２に対するベースライングルコースレベルを示し、点刻バーはＡ群に、斜線ハッチバーはＢ群に、中空バーはＣ群に対応する。さらに、図３８Ｄは、ベースライン体重を示し、点刻バーはＡ群、斜線バーはＢ群、中空バーはＣ群に相当する。
【図３８Ｃ】アカゲザルが、ＯＧＴＴプロファイル、ＯＧＴＴＡＵＣおよび体重に関して無作為化された状態であるかを示す一連のプロットである。図３８Ａは、化合物または賦形剤が各群に割り当てられる前の、ＯＧＴＴ１におけるベースライングルコースレベルを示し、中実四角はＡ群、中実丸、実線はＢ群および中空丸、点線はＣ群に対応する。図３８Ｂは、化合物または賦形剤が各群に割り当てられる前の、ＯＧＴＴ２におけるベースライングルコースレベルを示し、中実四角はＡ群、中実丸、実線はＢ群および中空丸、実線はＣ群に対応する。図３８Ｃは、ＡＵＣの観点からみたＯＧＴＴ１および２に対するベースライングルコースレベルを示し、点刻バーはＡ群に、斜線ハッチバーはＢ群に、中空バーはＣ群に対応する。さらに、図３８Ｄは、ベースライン体重を示し、点刻バーはＡ群、斜線バーはＢ群、中空バーはＣ群に相当する。
【図３８Ｄ】アカゲザルが、ＯＧＴＴプロファイル、ＯＧＴＴＡＵＣおよび体重に関して無作為化された状態であるかを示す一連のプロットである。図３８Ａは、化合物または賦形剤が各群に割り当てられる前の、ＯＧＴＴ１におけるベースライングルコースレベルを示し、中実四角はＡ群、中実丸、実線はＢ群および中空丸、点線はＣ群に対応する。図３８Ｂは、化合物または賦形剤が各群に割り当てられる前の、ＯＧＴＴ２におけるベースライングルコースレベルを示し、中実四角はＡ群、中実丸、実線はＢ群および中空丸、実線はＣ群に対応する。図３８Ｃは、ＡＵＣの観点からみたＯＧＴＴ１および２に対するベースライングルコースレベルを示し、点刻バーはＡ群に、斜線ハッチバーはＢ群に、中空バーはＣ群に対応する。さらに、図３８Ｄは、ベースライン体重を示し、点刻バーはＡ群、斜線バーはＢ群、中空バーはＣ群に相当する。
【図３９】アカゲザルにおけるベースラインに対する、賦形剤、ＦＧＦ２１（配列番号４）およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）の体重変化率（％）を示すプロットである。斜線バー１および２は低用量の１週と２週に対応し、中空バー３および４は中用量の３週と４週に対応し、中実バー５および６は高用量の５週と６週に対応し、さらに、点刻バーは７、８、９は休薬期間の７〜９週に対応する。
【図４０】ベースラインに対する、賦形剤、ＦＧＦ２１（配列番号４）およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）のアカゲザルの空腹時インスリンレベルに対する空腹時インスリンの変化率（％）を示すプロットである。斜線バー１と２は低用量の１週と２週に対応し、中空バー３および４は中用量の３週と４週に対応し、中実バー５および６は高用量の５週と６週に相当し、さらに、点刻バー７と８は休薬期間の７週および８週に対応する。
【図４１】試験の５週と６週の間に獲得したアカゲザルの摂食時インスリンレベルに対する高用量で与えられた賦形剤、ＦＧＦ２１（配列番号４）およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）の効果を示すプロットである。中実バーは５週に対応し、斜線バーは６週に対応する。
【図４２】Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）を使った２週間の高用量処置の最後に行ったＯＧＴＴ５のグルコースプロファイルを示すプロットである。中実丸、実線は賦形剤に対応し、中空四角、点線はＦＧＦ２１（配列番号４）に対応し、中実三角形、実線はＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）に対応する。
【図４３】Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）を使った２週間の高用量処置の最後に行ったＯＧＴＴ５のインスリンプロファイルを示すプロットである。中実丸、実線は賦形剤に対応し、中空四角、点線はＦＧＦ２１（配列番号４）に対応し、さらに、中実三角形、実線はＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）に対応する。
【図４４】アカゲザルの各用量期間（低、中および高用量）の最後に測定されたベースラインに対するグルコースＯＧＴＴＡＵＣ３〜５の変化率（％）を示すプロットである。中空バーはＯＧＴＴ３によるグルコース測定値から計算したＡＵＣ３に対応し、中実バーはＯＧＴＴ４によるグルコース測定値から計算したＡＵＣ４に対応し、さらに、斜線バーはＯＧＴＴ５によるグルコース測定値から計算したＡＵＣ５に対応する。
【図４５】各群のアカゲザルの空腹時血漿トリグリセリドレベルのベースラインからの変化率（％）に対する賦形剤、ＦＧＦ２１およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）の効果を示すプロットである。斜線バー１と２は低用量の週１および２に対応し、中空バー３と４は中用量の週３および週４に対応し、中実バー５と６は高用量の５週と６週に対応し、さらに、点刻バーの７、８および９は休薬期間の７〜９週に対応する。
【図４６】高用量の賦形剤、ＦＧＦ２１（配列番号４）またはＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）による第５、６週の処置の間に測定した各群のアカゲザルの摂食時血漿トリグリセリドレベルを示すグラフである。斜線バーは５週に対応し、中実バーは６週に対応する。
【図４７】各注入後、約２１時間の時点で得た試料について、注入前、ならびに５、１２、１９、および２６日目に測定した各アカゲザルのＦＧＦ２１（配列番号４）レベルを示すプロットである。
【図４８】各注入後、約５日の時点で得た試料について、注入前、ならびに５、１２、１９、および２６日目に測定した各アカゲザルのＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）レベルを示すプロットである。
【図４９】各低、中、高用量の後に行った３回のＯＧＴＴから測定したＦＧＦ２１（配列番号４）およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）の平均濃度レベルを示すプロットである。斜線バーは低用量のＯＧＴＴ３に対応し、中実バーは中用量のＯＧＴＴ４に対応し、さらに、中空バーは高用量のＯＧＴＴ５に対応する。
【図５０】Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）融合タンパク質（配列番号４７）のアミノ酸配列である。ＩｇＧ１Ｆｃ残基（配列番号１１）は、ボールド体、（Ｇ４Ｓ）３リンカー（配列番号３１）はイタリック体、また、ＦＧＦ２１配列（配列番号３９）の点変異は下線付きボールド体で示した。
【図５１】Ｅｒｋルシフェラーゼアッセイによる試験化合物の用量反応を示すプロットである。Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）（配列番号４７）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）（配列番号５７）、野生型ＦＧＦ２１、および野生型ＦＧＦ２１とのＦｃ融合体を試験した。
【図５２】ヒト（右）およびカニクイザルβ−Ｋｌｏｔｈｏ（左）に対するＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）（配列番号４７）およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）のＢｉａｃｏｒｅ溶解平衡結合アッセイ（ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｓｓａｙ）の結果を示すプロットである。
【図５３Ａ】ｄｂ／ｄｂマウスに対するＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）（配列番号４７）一回注入後の用量反応を示す一対のプロットである。図５３Ａは、賦形剤またはＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）注入後のいくつかの時点でのｄｂ／ｄｂマウスの血糖値を示す。一方、図５３Ｂは、ｄｂ／ｄｂマウスの体重に与えるＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）の一回注入後の効果を示す。
【図５３Ｂ】ｄｂ／ｄｂマウスに対するＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）（配列番号４７）一回注入後の用量反応を示す一対のプロットである。図５３Ａは、賦形剤またはＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）注入後のいくつかの時点でのｄｂ／ｄｂマウスの血糖値を示す。一方、図５３Ｂは、ｄｂ／ｄｂマウスの体重に与えるＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）の一回注入後の効果を示す。
【図５４】ＤＩＯマウスにおけるＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）（配列番号４７）およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）の投薬頻度試験を図示したものである。
【図５５】異なる投薬頻度で、賦形剤、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）（配列番号４７）またはＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）で処置したマウスのＧＴＴプロファイルを示すプロットである。
【図５６】異なる投薬頻度で、賦形剤、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）（配列番号４７）またはＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）で処置したマウスのベースライン（０日目）からの体重の変化を示すプロットである。
【図５７】ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ））（配列番号３７）ＦＧＦ２１変異体を含むヒドロゲルのインビトロ試験の結果を示すプロットである。
【図５８】種々のヒドロゲル製剤を投与した８週齢のｄｂ／ｄｂマウスの血糖値に対する効果を示すプロットである。
【図５９】種々のヒドロゲル製剤を投与した８週齢のｄｂ／ｄｂマウスの血糖値に対する効果を示すプロットである。
【図６０】種々のヒドロゲル製剤を投与した８週齢のｄｂ／Ｂ６マウスの血糖値に対する効果を示すプロットである。中実丸はヒドロゲル対照を投与したマウスを示し、中実四角はＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（配列番号３７）のヒドロゲル製剤１０ｍｇ／ｋｇを投与したマウスを示し、中実三角形はＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）のヒドロゲル製剤３０ｍｇ／ｋｇを投与したマウスを示し、さらに、逆三角形はＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）（配列番号５７）を単独で投与したマウスを示す。
【図６１】種々のヒドロゲル製剤を投与した８週齢のｄｂ／Ｂ６マウスの血糖値の変化率（％）を示すプロットである。中実丸はヒドロゲル対照を投与したマウスを示し、中実四角はＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（配列番号３７）のヒドロゲル製剤１０ｍｇ／ｋｇを投与したマウスを示し、中実三角形はＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）のヒドロゲル製剤３０ｍｇ／ｋｇを投与したマウスを示し、さらに、逆三角形はＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）（配列番号５７）を単独で投与したマウスを示す。
【図６２】種々のヒドロゲル製剤を投与した８週齢ｄｂ／Ｂ６マウスの体重に対する効果を示すプロットである。中実丸はヒドロゲル対照を投与したマウスを示し、中実四角はＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（配列番号３７）のヒドロゲル製剤１０ｍｇ／ｋｇを投与したマウスを示し、中実三角形はＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）のヒドロゲル３０ｍｇ／ｋｇを投与したマウスを示し、さらに、逆三角形はＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）（配列番号５７）を単独で投与したマウスを示す。
【図６３】種々のヒドロゲル製剤を投与した８週齢ｄｂ／Ｂ６マウス重量変化率（％）を示すプロットである。中実丸はヒドロゲル対照を投与したマウスを示し、中実四角はＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（配列番号３７）のヒドロゲル製剤１０ｍｇ／ｋｇを投与したマウスを示し、中実三角形はＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）のヒドロゲル製剤３０ｍｇ／ｋｇを投与したマウスを示し、さらに、逆三角形はＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）（配列番号５７）を単独で投与したマウスを示す。
【図６４】耐糖能障害（ＩＧＴ）のカニクイザルで行った９週用量漸増試験の計画を図示したものである。
【図６５】調査したＩＧＴカニクイザルの午前食物摂取量に与える賦形剤、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）およびＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）（配列番号４７）の効果を示すプロットである。
【図６６】調査したＩＧＴカニクイザルの果実摂取量に与える賦形剤、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）およびＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）（配列番号４７）の効果を示すプロットである。
【図６７】調査したＩＧＴカニクイザルの午後食物摂取量に与える賦形剤、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）およびＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）（配列番号４７）の効果を示すプロットである。
【図６８】調査したＩＧＴカニクイザルの体重に与える賦形剤、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）およびＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）（配列番号４７）の効果を示すプロットである。
【図６９】調査したＩＧＴカニクイザルの肥満度指数に与える賦形剤、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）およびＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）（配列番号４７）の効果を示すプロットである。
【図７０】調査したＩＧＴカニクイザルの皮下脂肪厚に与える賦形剤、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）およびＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）（配列番号４７）の効果を示すプロットである。
【図７１】調査したＩＧＴカニクイザルの腹囲に与える賦形剤、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）およびＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）（配列番号４７）の効果を示すプロットである。
【図７２】調査したＩＧＴカニクイザルの血漿グルコース値に与える賦形剤、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）およびＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）（配列番号４７）の効果を示すプロットである。
【図７３】調査したＩＧＴカニクイザルの耐糖能に与える賦形剤、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）およびＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）（配列番号４７）の効果を示すプロットである。
【図７４】調査したＩＧＴカニクイザルの血漿トリグリセリドレベルに与える賦形剤、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）およびＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）（配列番号４７）の効果を示すプロットである。
【図７５】調査したＩＧＴカニクイザルの血漿中総コレステロールレベルに与える賦形剤、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）およびＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）（配列番号４７）の効果を示すプロットである。
【図７６】調査したＩＧＴカニクイザルの血漿ＨＤＬコレステロールレベルに与える賦形剤、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）およびＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）（配列番号４７）の効果を示すプロットである。
【図７７】１６８時間中のいくつかの時点でのＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（左パネル、配列番号４３）およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）（右パネル、配列番号５７）で観察された変化を示す一連のＭＡＬＤＩ質量分析結果である。
【図７８】アスパラギン酸Ｎ消化後にＭＲＭＬＣ／ＭＳ／ＭＳで分析した、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）（配列番号５７）の両方から得られた全Ｃ末端ペプチド断片中の完全長Ｃ末端ペプチドの相対存在量（％）を示すプロットである。
【図７９】マウスへの静脈内注射後２４０時間にわたる期間の無傷の完全長Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）（配列番号５７）の血漿中濃度を測定したＥＬＩＳＡアッセイの結果を示すプロットである。
【図８０】陰性対照、ヒトＦＧＦ２１（配列番号４）ならびにＦＧＦ２１グリコシル化変異体ＦＧＦ２１（Ｙ１７９Ｎ、Ｓ１８１Ｔ）（配列番号１６１）、ＦＧＦ２１  Ｙ１７９Ｎ（配列番号１６３）およびＦＧＦ２１  Ｐ１２４Ｓ（配列番号１６５）に対し行ったＥＬＫルシフェラーゼ活性アッセイの結果を示すプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
発明の詳細な説明
増加した半減期および／または低減された凝集等の改善された特性を有するヒトＦＧＦ２１タンパク質を、本明細書で開示の方法および標準的な分子生物学的方法を用いて調製することができる。任意選択として、抗体またはその一部を野生型ＦＧＦ２１配列のＮ末端またはＣ末端に融合することにより半減期をさらに延長することも可能である。また、タンパク質にアミノ酸置換基を導入することによって野生型タンパク質のさらなる半減期延長や凝集低減を行うことも可能である。このような改善タンパク質は、本明細書中では変異体、またはＦＧＦ２１変異体と呼び、本発明の実施形態を構成する。
【００２９】
実施例を含む本明細書で使われる組換え型核酸の製法は、通常、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、「分子クローニング：研究室マニュアル」（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９）または、「分子生物学の最新プロトコル」（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、ｅｄｓ．、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  １９９４）に記述されている方法であり、両文献はいかなる目的に対しても、参照により本明細書に組み込まれる。
【００３０】
１．一般的定義
「単離核酸分子」という用語は、（１）タンパク質、脂質、炭水化物、または全核酸がソース細胞から単離される際に元々共存している他の物質の少なくとも約５０パーセントからは分離されている、（２）「単離核酸分子」が元々結合しているポリヌクレオチドの全体または一部に結合していない、（３）本来結合していないポリヌクレオチドに機能的に連結されている、または（４）より大きなポリヌクレオチド配列の一部として天然に産生しない、という条件を満たす、本明細書で提供される核酸分子を指す。単離核酸分子は、他の任意の混入核酸分子または自然環境中に認められ、ポリペプチド産生またはその治療、診断、予防または研究用途での使用を妨げる他の混入物を実質的に含まないことが好ましい。
【００３１】
「ベクター」という用語は、コーディング情報を宿主細胞に移入するために使われる任意の分子（例えば、核酸、プラスミド、またはウイルス）を指すために使われる。
【００３２】
「発現ベクター」という用語は、宿主細胞の形質転換に適したベクターで、挿入された異種の核酸配列の発現を指示および／または制御する核酸配列を含むベクターを指す。発現には、これに限定されないが、転写、翻訳、およびイントロンが存在する場合はＲＮＡスプライシング、等のプロセスが含まれる。
【００３３】
本明細書では、「機能的に連結された」という用語は、その通常の機能を遂行するように配置され組み込まれている隣接配列の配置を指すために使われる。従って、コード配列に機能的に連結された隣接配列は、コード配列の複製、転写および／または翻訳を行わせることができ得る。例えば、そのプロモーターが連結されているコード配列の転写を指示することができる場合、コード配列はプロモーターに機能的に連結されている。隣接配列は、正しく機能してさえいれば、コード配列に近接している必要はない。従って、例えば、転写されているが未翻訳の配列は、プロモーター配列とコード配列の間に介在させることができ、プロモーター配列は、この場合も、コード配列に「機能的に連結された」と見なしうる。
【００３４】
用語の「宿主細胞」は、本明細書で提供される核酸等の核酸配列で形質転換された、または形質転換され得、選択された目的遺伝子の発現が可能な細胞を指すために使用される。この用語には、その子孫の形態学的または遺伝学的性質が元の親と同等であるか否かに関わらず、選択された遺伝子がある限り、親細胞の子孫が含まれる。
【００３５】
本明細書では、「単離ポリペプチド」という用語は、（１）ポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、またはソース細胞から単離される場合に元々存在する他の物質の少なくとも約５０パーセントから分離されている、（２）（共有結合または非共有結合的相互作用によって）「単離ポリペプチド」が本来結合しているポリペプチドの全体または一部と結合していない、（３）本来結合していないポリペプチドに機能的に連結されている（共有結合または共有結合的相互作用によって）、または（４）天然には産生しない、という条件を満たすポリペプチドを指す。単離ポリペプチドは、他の任意の混入ポリペプチドまたは自然環境中に認められ、その治療、診断、予防または研究用途での使用を妨げる他の混入物を実質的に含まないことが好ましい。
【００３６】
「天然に存在する」という用語は、核酸分子、ポリペプチド、宿主細胞、等の生物学的物質に関連して使われる場合、天然に見出され、人間により操作されていない物質を指す。同様に、本明細書で使われる「天然に存在しない」は、天然に見出されない、または人間により構造的に改変されたか合成された物質を指す。ヌクレオチドに関連して使われる場合、「天然に存在する」という用語は、塩基アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、およびウラシル（Ｕ）を指す。アミノ酸に関連して使われる場合、「天然に存在する」という用語は、２０アミノ酸のアラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、リシン（Ｋ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）、およびチロシン（Ｙ）を指す。
【００３７】
「ＦＧＦ２１ポリペプチド」という用語は、ヒトで発現した天然に存在する野生型ポリペプチドを指す。本開示の目的のために、「ＦＧＦ２１ポリペプチド」という用語は、同義で、任意の完全長ＦＧＦ２１ポリペプチドを指すために使用することができる。これには、例えば、２０９アミノ酸残基を含み、配列番号１および５のヌクレオチド配列によってそれぞれコードされる配列番号２および６；任意の成熟型のポリペプチド、例えば、１８１アミノ酸残基を含み、配列番号３および７のヌクレオチド配列によりそれぞれコードされる、完全長ＦＧＦ２１ポリペプチドのアミノ末端の２８アミノ酸残基が除去されている（すなわち、シグナルペプチドを構成する）配列番号４および８が挙げられる。完全長で成熟したＦＧＦ２１ポリペプチドは、アミノ末端メチオニンを含んでもよいが、それを必要とすることはない。このメチオニンは、操作または細菌性発現プロセスの結果として導入することができる。
【００３８】
「ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体」という用語および「ＦＧＦ２１変異体」は、同義で使用することができ、天然に存在するＦＧＦ２１アミノ酸配列（例えば、配列番号２、４、６、または８）が改変されているＦＧＦ２１ポリペプチドを指す。このような改変には、限定されないが、天然に存在しないアミノ酸および天然に存在しないアミノ酸類似体による置換を含む１つまたは複数のアミノ酸置換、および切断が含まれる。従って、ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体には、これに限定されないが、本明細書記載のような、部位特異的なＦＧＦ２１変異体、切断型ＦＧＦ２１ポリペプチド、タンパク質分解耐性ＦＧＦ２１変異体、凝集低減ＦＧＦ２１変異体、ＦＧＦ２１組み合わせ変異体、およびＦＧＦ２１融合タンパク質、が含まれる。本発明のＦＧＦ２１変異体特異的切断およびアミノ酸置換を特定するために、切断または変異アミノ酸残基の付番は、成熟１８１残基ＦＧＦ２１ポリペプチドの位置に対応する。ＦＧＦ２１変異体は、アミノ末端メチオニンを含んでもよいが、それを必要性とすることはない。このメチオニンは、操作または細菌性発現プロセスの結果として導入することができる。
【００３９】
本発明の他の実施形態では、ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体は、変異体ＦＧＦ２１のアミノ酸配列に対し少なくとも約８５パーセント同一であるが、ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体に所望の特性、例えば、蛋白質分解耐性、半減期延長または凝集低減特性、およびこれらの組み合わせを付与する特異的残基は、それ以上改変されていない、アミノ酸配列を含む。換言すれば、ＦＧＦ２１変異体配列中の蛋白質分解耐性、凝集低減、または他の特性を付与するために改変されている残基を除いて、ＦＧＦ２１変異体配列中の全ての他のアミノ酸残基の約１５％が改変可能である。例えば、ＦＧＦ２１変異体Ｑ１７３Ｅでは、位置１７３のグルタミンを置換したグルタミン酸残基以外の全アミノ酸残基は、最大１５％まで改変できる。さらなる他の実施形態では、ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体は、変異体ＦＧＦ２１のアミノ酸配列に対し少なくとも約９０パーセント、または約９５、９６、９７、９８、または９９パーセント同一であるが、ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体の蛋白質分解耐性または凝集低減特性を付与する特異的残基はこれ以上改変されていないアミノ酸配列を含む。このようなＦＧＦ２１ポリペプチド変異体は、野生型ＦＧＦ２１ポリペプチドの少なくとも１つの活性を有する。
【００４０】
また、本発明は、ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体をコードする核酸分子を包含し、この変異体は、変異体ＦＧＦ２１のアミノ酸配列に対し少なくとも約８５パーセント同一であるが、ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体の所望の特性、例えば、蛋白質分解耐性、半減期延長または凝集低減特性およびそれらの組み合わせを付与する特異的残基は、これ以上改変されていないアミノ酸配列を含む。換言すれば、ＦＧＦ２１変異体配列中の蛋白質分解耐性、凝集低減、または他の特性を付与するために改変されている残基を除いて、ＦＧＦ２１変異体配列中の全ての他のアミノ酸残基の約１５％が改変可能である。例えば、ＦＧＦ２１変異体Ｑ１７３Ｅでは、位置１７３のグルタミンを置換したグルタミン酸残基以外の全アミノ酸残基は、最大１５％まで改変できる。本発明は、ＦＧＦ２１変異体をコードしたヌクレオチド配列に対し少なくとも約９０パーセント、または約９５、９６、９７、９８、または９９パーセント同一であるが、コード化ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体の蛋白質分解耐性または凝集低減特性を付与するアミノ酸残基をコードしたヌクレオチドはこれ以上改変されていないヌクレオチド配列を含む核酸分子をさらに包含する。このような核酸分子は、野生型ＦＧＦ２１ポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するＦＧＦ２１変異体ポリペプチドをコードする。
【００４１】
「生物学的に活性なＦＧＦ２１ポリペプチド変異体」という用語は、ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体に導入された変異のタイプと数に拘わらず、血糖、インスリン、トリグリセリド、またはコレステロールレベルを低減させる能力；体重低減能力；およびグルコース耐性、エネルギー消費、またはインスリン感受性を改善する能力等の野生型ＦＧＦ２１ポリペプチドの活性を有する本明細書記載の任意のＦＧＦ２１ポリペプチド変異体を指す。野生型ＦＧＦ２１ポリペプチドに比べ幾分低いレベルのＦＧＦ２１活性ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体は、それでも、生物学的に活性なＦＧＦ２１ポリペプチド変異体と見なすことができる。
【００４２】
「有効量」および「治療有効量」という用語はそれぞれ、血糖、インスリン、トリグリセリド、またはコレステロールレベルを低減させる能力；体重低減能力；またはグルコース耐性、エネルギー消費、またはインスリン感受性を改善する能力等の観察可能なレベルの１つまたは複数の野生型ＦＧＦ２１ポリペプチドの生物学的活性を維持するために用いられるＦＧＦ２１ポリペプチド変異体の量を指す。
【００４３】
本明細書で用いられる、「薬学的に許容可能な担体」または「生理学的に許容可能な担体」という用語は、ヒトまたは非ヒトの患者の体内へのＦＧＦ２１ポリペプチド変異体の送達の遂行または促進に適した１つまたは複数の製剤用薬剤を指す。この用語には、生理学的に許容可能な、任意のあらゆる溶剤、分散剤、コーティング、抗菌および抗真菌性試薬、等張性および吸収遅延試薬等が含まれる。薬学的に許容可能な担体の例には、水、食塩水、リン酸塩緩衝食塩水、デキストロース、グリセリン、エタノール等のうちの１つ以上、ならびにこれらの組み合わせが含まれる。場合によっては、医薬品組成物中に、等張性試薬、例えば、糖類、マンニトール、ソルビトール等の多価アルコール、または塩化ナトリウムを含むのが好ましいこともある。ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体の保存可能期間または有効性を向上させる湿潤剤や乳化剤、防腐剤または緩衝液、等の湿潤物質または少量の補助物質のような薬学的に許容可能な物質も、担体としての役割をする、あるいは担体の成分となることができる。
【００４４】
「抗原」という用語は、抗体に結合されることができ、さらには、動物に対して使用してその抗原のエピトープに結合できる抗体を産生する分子または分子の一部を指す。抗原は１つまたは複数のエピトープを持つことが可能である。
【００４５】
「ネイティブＦｃ」という用語は、全抗体の消化により生じた、または他の方法で産生した、非抗原結合断片の配列を含む単量体または多量体の形の分子または配列を指し、ヒンジ部を含んでもよい。ネイティブＦｃの最初の免疫グロブリンソースは、必須ではないが、ヒト由来であることが好ましく、また、いずれの免疫グロブリンも使用可能であるがＩｇＧ１とＩｇＧ２が好ましい。ＩｇＧ４も採用可能である。ネイティブＦｃ分子は、単量体ポリペプチドから構成されており、これは共有結合性（すなわち、ジスルフィド結合）および非共有結合性会合によって２量体または多量体形式に結合することができる。ネイティブＦｃ分子の単量体サブユニット間の分子内ジスルフィド結合の数は、１〜４の範囲にあり、クラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥ）またはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＧＡ２）によって変化する。ネイティブＦｃの一例は、ＩｇＧのパパイン消化により生じたジスルフィド結合ダイマーである（Ｅｌｌｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９８２、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０：４０７１−９を参照）。本明細書で使われる「ネイティブＦｃ」という用語は、単量体、２量体、および多量体形式を含む、一般用語である。Ｆｃポリペプチド配列の例は、配列番号１１および１７１に示されており、これはそれぞれ、ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ４分子由来である。ネイティブＦｃは、アミノ末端メチオニンを含むことができるが、それが必要であるわけではない。このメチオニンは、操作または細菌性発現プロセスの結果として導入することができる。このようなＦｃ分子は、この状態でも「ネイティブＦｃ」分子とみなされる。
【００４６】
「Ｆｃ変異体」という用語は、ネイティブＦｃから改変されているが、サルベージ受容体（ｓａｌｖａｇｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）である、ＦｃＲｎ（新生児型Ｆｃ受容体）に対する結合部位をまだ有している分子または配列を指す。国際公開番号第ＷＯ９７／３４６３１号およびＷＯ９６／３２４７８号には、代表的Ｆｃ変異体、ならびに、サルベージ受容体との相互作用について記載されている。これらの特許は、本明細書により参照によって組み込まれる。従って、「Ｆｃ変異体」という用語は、非ヒトのネイティブＦｃからヒト化した分子または配列を含むことができる。さらに、ネイティブＦｃは、本発明のＦＧＦ２１変異体の融合分子には必要ない構造特性または生物活性を与えるという理由で除去されうる領域を含む。このように、「Ｆｃ変異体」用語は、１つまたは複数のネイティブＦｃ部位または残基が欠失しているか、または１つまたは複数のＦｃ部位または残基が改変されており、それらの残基は、（１）ジスルフィド結合形成、（２）選択宿主細胞との不適合、（３）選択宿主細胞中で発現時のＮ末端不均質性、（４）グリコシル化、（５）補体との相互作用、（６）サルベージ受容体以外のＦｃ受容体との結合、または（７）抗体依存細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）、に影響を及ぼすか、または関与する分子または配列を含む。Ｆｃ変異体は、以降でさらに詳細に記述される。Ｆｃ変異体は、アミノ末端メチオニンを含んでもよいが、それを必要とするわけではない。このメチオニンは、操作または細菌性発現プロセスの結果として導入することができる。このようなＦｃ分子は、この状態でも「Ｆｃ変異体」と見なされる。
【００４７】
「Ｆｃドメイン」という用語は、前に定義したネイティブＦｃおよびＦｃ変異体ならびに配列を包含する。Ｆｃ変異体およびネイティブＦｃ分子と同様に、「Ｆｃドメイン」という用語には、全長抗体（ｗｈｏｌｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）から消化されたか、または他の方法により産生された単量体または多量体形式の分子が含まれる。本発明の一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＦＧＦ２１またはＦＧＦ２１変異体（ＦＧＦ２１またはＦＧＦ２１変異体の切断型を含む）と、例えば、ＦｃドメインおよびＦＧＦ２１配列間の共有結合、を介して融合できる。このような融合タンパク質は、Ｆｃドメインの会合により多量体を形成可能であり、これら融合タンパク質とその多量体の両方が本発明の一態様である。Ｆｃドメインは、アミノ末端メチオニンを含んでもよいが、それを必要とするわけではない。このメチオニンは、操作または細菌性発現プロセスの結果として導入することができる。
【００４８】
２．ＦＧＦ２１変異体
「ＦＧＦ２１変異体」という用語は、ネイティブＦＧＦ２１ポリペプチド配列の１つまたは複数のアミノ酸によるアミノ酸配列、例えば、配列番号２、４、６または８、とは異なるアミノ酸配列を有するＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを指す。ＦＧＦ２１変異体は、天然または天然に存在しないアミノ酸を使って、保存的または非保存的に、ＦＧＦ２１ポリペプチドの特定の位置に、１つまたは複数のアミノ酸置換基を導入することにより作ることができる。
【００４９】
「保存的アミノ酸置換」は、ネイティブアミノ酸残基（すなわち、野生型ＦＧＦ２１ポリペプチド配列の特定の位置にある残基）を非ネイティブの残基（すなわち、野生型ＦＧＦ２１ポリペプチド配列の特定の位置にない残基）で置換し、その位置のアミノ酸残基の極性または電荷に対する効果がほとんど、または、全くないようにすることを含む。また、保存的アミノ酸置換は、通常、生物学的システムによる合成よりは、化学的ペプチド合成により組み込まれる、天然に存在しないアミノ酸残基を包含する。
【００５０】
ネイティブ残基は、共通の側鎖特性に基づいていくつかのクラスに分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン；
（２）中性で親水性：システイン、セリン、トレオニン；
（３）酸性：アスパラギン酸、グルタミン酸；
（４）塩基性：アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リシン、アルギニン；
（５）鎖の配向に影響を与える残基：グリシン、プロリン；および
（６）芳香族：トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン。
【００５１】
保存的置換には、これらのクラスの１つと同じクラスの他のメンバーとの交換を含むことができる。非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーと別のクラスのメンバーとの交換を含むことができる。
【００５２】
所望のアミノ酸置換（保存的または非保存的の）は、このような置換が必要なときに当業者が決定することができる。代表的（限定されないが）なアミノ酸置換リストを表１に示す。
【００５３】
【表１】
2012525847.tif 000002
【００５４】
３．切断型ＦＧＦ２１ポリペプチド
本発明の一実施形態は、成熟ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体の切断型に関する。本発明のこの実施形態は、非切断型の成熟ＦＧＦ２１ポリペプチドと類似の、また場合によっては、より優れた活性を提供することができる切断型ＦＧＦ２１ポリペプチドを特定する取り組みから生まれたものである。
【００５５】
本明細書に使われている「切断型ＦＧＦ２１ポリペプチド」という用語は、アミノ酸残基がＦＧＦ２１ポリペプチドのアミノ末端（Ｎ末端）から除去されているか、アミノ酸残基がＦＧＦ２１ポリペプチドのカルボキシル末端（Ｃ末端）から除去されているか、またはアミノ酸残基がＦＧＦ２１ポリペプチドのアミノ末端およびカルボキシル末端の両方から除去されているＦＧＦ２１ポリペプチドを指す。本明細書で開示されている種々の切断は、本明細書記載の実施例３と６として記載した。
【００５６】
Ｎ末端切断型ＦＧＦ２１ポリペプチドおよびＣ末端切断型ＦＧＦ２１ポリペプチドの活性は、実施例４で記載するように、インビトロＥＬＫルシフェラーゼアッセイで評価できる。切断型ＦＧＦ２１ポリペプチドの活性を試験するために使用できるインビトロアッセイの具体的な詳細は実施例４に示してある。
【００５７】
本発明の切断型ＦＧＦ２１ポリペプチドの活性は、また、実施例５と７で示すようにｄｂ／ｄｂマウス、またはｏｂ／ｏｂマウス等のインビボアッセイで評価できる。通常、切断型ＦＧＦ２１ポリペプチドのインビボ活性を評価するために、試験動物に切断型ＦＧＦ２１ポリペプチドを腹腔内投与することができる。所望のインキュベーション期間（例えば、１時間またはそれ以上）の後、血液サンプルが採取され血糖値を測定することができる。切断型ＦＧＦ２１ポリペプチドの活性を調べるために使用するインビボアッセイの具体的な詳細を実施例５と７で示す。
【００５８】
ａ．Ｎ末端切断
本発明の一部の実施形態では、Ｎ末端切断は、成熟ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体のＮ末端から１、２、３、４、５、６、７、または８アミノ酸残基を含む。例えば、実施例５および図３に示されるように、９アミノ酸残基より少ないＮ末端切断を有する切断型ＦＧＦ２１ポリペプチドは、個体の血糖を下げる成熟ＦＧＦ２１ポリペプチドの能力を保持している。従って、本発明の特定の実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、または８アミノ酸残基のＮ末端切断を有する切断型の成熟ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１ポリペプチド変異体を包含する。
【００５９】
ｂ．Ｃ末端切断
本発明の一部の実施形態では、Ｃ末端切断は、成熟ＦＧＦ２１ポリペプチドのＣ末端から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２アミノ酸残基を含む。例えば、実施例４および図１Ｂに示されるように、１３アミノ酸残基より少ないＣ末端切断を有する切断型ＦＧＦ２１ポリペプチドは、インビトロＥＬＫルシフェラーゼアッセイにおいて、野生型ＦＧＦ２１の有効性の少なくとも５０％の有効性を示し、これらのＦＧＦ２１変異体が個体中の血糖を下げる成熟ＦＧＦ２１ポリペプチドの能力を保持していることを示した。従って、本発明の特定の実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２アミノ酸残基のＣ末端切断を有する切断型の成熟ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１ポリペプチド変異体を包含する。
【００６０】
ｃ．Ｎ末端およびＣ末端切断
本発明の一部の実施形態では、切断型ＦＧＦ２１ポリペプチドは、Ｎ末端およびＣ末端切断の組み合わせを有することができる。Ｎ末端およびＣ末端切断の組み合わせを有する切断型ＦＧＦ２１ポリペプチドは、Ｎ末端単独またはＣ末端切断単独のいずれかを有する対応する切断型ＦＧＦ２１ポリペプチドと同じ活性を有する。換言すれば、９アミノ酸残基より少ないＮ末端切断と１３アミノ酸残基より少ないＣ末端切断の両方を有する切断型ＦＧＦ２１ポリペプチドは、９アミノ酸残基より少ないＮ末端切断を有する切断型ＦＧＦ２１ポリペプチドと、または１３アミノ酸残基より少ないＣ末端切断を有する切断型ＦＧＦ２１ポリペプチドと、類似またはより大きな生物活性、例えば、血糖低減活性を有する。従って、本発明の特定の実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、または８アミノ酸残基のＮ末端切断および１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２アミノ酸残基のＣ末端切断の両方を有する、切断型の成熟ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１ポリペプチド変異体を含む。
【００６１】
本発明の全てのＦＧＦ２１変異体と同様に、切断型ＦＧＦ２１ポリペプチドおよびＦＧＦ２１変異体は、任意選択として、アミノ末端メチオニン残基を含むことができる。これは、意図的変異により、または細菌性発現プロセスの結果として導入することができる。
【００６２】
本発明の切断型ＦＧＦ２１ポリペプチドは、実施例３と６に記載されるように調製できる。標準的分子生物学技術に通じている当業者であれば、その知識を本開示と組み合わせて用い、本発明の切断型ＦＧＦ２１ポリペプチドを作製し使用することができる。標準的な方法は、組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、組織培養、および形質転換（例えば、電気穿孔、リポフェクション法）用に使用できる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、「分子クローニング：研究室マニュアル」、前出、を参照。この参考文献は、いかなる目的のためにも、参照により本明細書に組み込まれる。酵素反応および精製技術は、メーカーの仕様書に従って、当技術分野で通常行われるように、または本明細書記載のように行うことができる。特に定めがなければ、本明細書に記載されている分析化学、合成有機化学、および医薬品化学に関連して使われている命名法および検査法と技術は当技術分野でよく知られ、通常使われているものである。標準的な方法を、化学合成；化学分析；製剤、処方、および送達；ならびに患者の治療のために使用することができる。
【００６３】
本発明の切断型ＦＧＦ２１ポリペプチドは、別の実体に融合することもでき、これにより追加の特性を切断型ＦＧＦ２１ポリペプチドに付与することができる。本発明の一実施形態では、切断型ＦＧＦ２１ポリペプチドは、Ｆｃ配列に融合できる。このような融合は、既知の分子生物学的手法および／または本明細書に提供される指針により実行可能である。融合ポリペプチドの利点、ならびにこのような融合ポリペプチドを作る方法については、本明細書でさらに詳細に検討する。
【００６４】
４．タンパク質分解耐性ＦＧＦ２１変異体
実施例８で記載されるように、成熟ＦＧＦ２１は、インビボで分解を受けることが明らかになり、これは、最終的には、タンパク質分解攻撃により起こることが確定された。成熟ＦＧＦ２１のインビボ分解は、より短い有効半減期につながることがわかったが、これは分子の治療薬としての可能性に悪影響を与える可能性がある。従って、指向研究（ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｓｔｕｄｙ）を行い、蛋白質分解に耐性を示すＦＧＦ２１変異体を特定した。この研究結果として、蛋白質分解に対し特に影響を受けやすいと確認された成熟ＦＧＦ２１ポリペプチド中の部位には、アミノ酸残基間の４−５、２０−２１、１５１−１５２、１７１−１７２および１７８−１８１の位置のペプチド結合が含まれる。
【００６５】
広範囲であるが焦点を絞った指向研究を行い、観察されたタンパク質分解効果を除去する一方で、受け入れられない程度にまではタンパク質の活性に影響を与えない特定の置換を特定した。表８および１１では、調製され試験された一部の変異体を強調している。例えば、実施例１３および１４で記載されているように、ＦＧＦ２１変異体がすべて理想的プロファイルを示した訳ではなかった。一部の変異体はタンパク質分解耐性を得たが、易感染性ＦＧＦ２１活性が犠牲になった。他の変異では、ＦＧＦ２１活性は維持されたが、蛋白質分解耐性は得られなかった。例えば、ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｇ、を含むいくつかの変異体では、野生型ＦＧＦ２１と類似の活性レベルを保持し、かつ、タンパク質分解耐性も示した。
【００６６】
所望のタンパク質分解耐性ＦＧＦ２１変異体を特定する１つの選択標準は、変異体の活性が、野生型ＦＧＦ２１に比べ基本的に同じか、またはより高いことである。それ故、本発明の別の実施形態では、蛋白質分解に耐性があり、それでもなお、野生型ＦＧＦ２１に比べ基本的に同じか、またはより高い活性を保持しているＦＧＦ２１変異体を対象とする。ある場合には、あまり望ましくないが、蛋白質分解には耐性があるが、幾分低下した活性を示すＦＧＦ２１変異体が、本発明の別の実施形態となっている。ときには、ある程度の蛋白質分解度を維持することが望ましい場合があり、その結果、ある程度の蛋白質分解の発生を許容するＦＧＦ２１変異体が、本発明の別の実施形態となる。
【００６７】
本明細書にあるすべてのＦＧＦ２１変異体と同様に、本発明のタンパク質分解耐性ＦＧＦ２１変異体は、本明細書の記載に従い調製することができる。当業者、例えば、標準的分子生物学技術に通じている人なら、本開示を結びつけてその知識を使い、本明細書で開示したタンパク質分解耐性ＦＧＦ２１変異体を作製し、使用することができる。標準的な方法を、組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、組織培養、および形質転換（例えば、電気穿孔、リポフェクション法）用に使用することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、「分子クローニング：研究室マニュアル」、前出、を参照。この文献は、目的に応じて、参照により本明細書に組み込まれる。酵素反応および精製技術は、メーカーの仕様書に従って、当技術分野で通常行われるように、または本明細書の記載に従い実施することができる。特に定めがなければ、本明細書に記載されている分析化学、合成有機化学、および医薬品化学に関連して使われている命名法および検査法と技術は当技術分野でよく知られ、通常使われているである。標準的な方法を、化学合成；化学分析；製剤、処方、および送達；ならびに患者の治療のために使用することができる。
【００６８】
本発明のタンパク質分解耐性ＦＧＦ２１変異体は、別の実体に融合することもでき、これにより追加の特性をタンパク質分解耐性ＦＧＦ２１変異体に付与することが可能となる。本発明の一実施形態では、タンパク質分解耐性ＦＧＦ２１変異体は、ＩｇＧ  Ｆｃ配列、例えば、配列番号１１または１７１に融合できる。このような融合は、既知の分子生物学的手法および／または本明細書にあるガイダンスにより実行可能である。融合ポリペプチドの利点、ならびにこのような融合ポリペプチドを作る方法については、本明細書でさらに詳細に検討する。
【００６９】
５．凝集低減ＦＧＦ２１変異体
実施例１５で記載のように、野生型ＦＧＦ２１ポリペプチドの１つの特性は凝集性向である。約５ｍｇ／ｍＬを超える濃度では、凝集速度は室温において大きい。本明細書で示し、また記載しているように、野生型ＦＧＦ２１ポリペプチドの凝集速度は、濃度と温度の両方に依存する。
【００７０】
野生型ＦＧＦ２１を使って治療薬処方におけるようなこれらの濃度で作業する場合、凝集が課題になる可能性がある。従って、指向研究を行い凝集の低減を示すＦＧＦ２１変異体を特定した。次に、得られたＦＧＦ２１変異体を、各種濃度に対して凝集性向を試験した。
【００７１】
広範囲であるが焦点を絞った指向研究を行い、野性型ＦＧＦ２１で観察された凝集効果を除去するか、または減らす一方で、受け入れられない程度にまではタンパク質の活性に影響を与えない特別の置換を特定した。適切な凝集低減変異体を特定する取り組みを実施例１５に記載する。表１６では、調製され試験された一部の変異体を強調している。例えば、実施例１７で記載されているように、ＦＧＦ２１変異体がすべて理想的プロファイルを示した訳ではなかった。ＦＧＦ２１  Ｌ５８Ｅ等の一部の変異体は、低下したＦＧＦ２１活性を有しており、これ以上調査しなかった。ＦＧＦ２１  Ａ１３４Ｅ等の他の変異では、ＦＧＦ２１活性は維持されたが、凝集特性の低減は得られなかった。ＦＧＦ２１  Ｌ９８Ｒ等のいくつかの変異体では、ＦＧＦ２１活性を維持し、かつ凝集の低減も示した。１つの変異体ＦＧＦ２１  Ａ４５Ｋでは、驚くべきことに、ＦＧＦ２１活性を高める一方で凝集低減特性をも示した。
【００７２】
所望の凝集低減ＦＧＦ２１変異体を特定する１つの選択標準は、変異体の活性が、野生型ＦＧＦ２１に比べ基本的に同じか、またはより高いことである。それ故、本発明の別の実施形態では、凝集低減特性があり、それでもなお、野生型ＦＧＦ２１に比べ基本的に同じか、またはより高い活性を保持しているＦＧＦ２１変異体を対象とする。ある場合にはあまり望ましくないが、凝集低減特性はあるが、幾分低下した活性を示すＦＧＦ２１変異体が、本発明の別の実施形態となっている。ときには、ある程度の凝集を維持することが望ましいことがあり、その結果、ある程度の凝集の発生を許容するＦＧＦ２１変異体も、また、本発明の別の実施形態となっている。
【００７３】
本明細書にあるすべてのＦＧＦ２１変異体と同様に、本明細書で提供される凝集低減ＦＧＦ２１変異体は、本明細書の記載に従い調製することができる。標準的分子生物学技術に通じている当業者なら、本開示を結びつけてその知識を使い、本発明の凝集低減ＦＧＦ２１変異体を作製し、使用することができる。標準的な方法を、組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、組織培養、および形質転換（例えば、電気穿孔、リポフェクション法）用に使用することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、「分子クローニング：研究室マニュアル」、前出、を参照。この文献は、いかなる目的にも、参照により本明細書に組み込まれる。酵素反応および精製技術は、メーカーの仕様書に従って、当技術分野で通常行われるように、または本明細書の記載に従って実施することができる。特に定めがなければ、本明細書に記載されている分析化学、合成有機化学、および医薬品化学に関連して使われている命名法および検査法と技術は当技術分野でよく知られ、通常使われているものである。標準的な方法を、化学合成；化学分析；製剤、処方、および送達；ならびに患者の治療のために使用することができる。
【００７４】
本発明の凝集低減ＦＧＦ２１変異体は、別の実体に融合することもでき、これにより追加の特性を凝集低減ＦＧＦ２１変異体に付与することが可能となる。本発明の一実施形態では、凝集低減ＦＧＦ２１変異体は、ＩｇＧＦｃ配列、例えば、配列番号１１または１７１に融合できる。このような融合は、既知の分子生物学的手法および／または本明細書にある指針により実行可能である。融合ポリペプチドの利点、ならびにこのような融合ポリペプチドを作る方法については、本明細書でさらに詳細に検討する。
【００７５】
６．その他のＦＧＦ２１変異体
本開示は、種々の変異型ＦＧＦ２１に関する。開示した変異は、種々の特性をＦＧＦ２１分子に付与することができる。例えば、一部の開示した変異は、ＦＧＦ２１の半減期を延長でき、それにより治療薬特性を高めることができる。
【００７６】
一実施形態では、Ａ１８０Ｅ変異は、成熟ＦＧＦ２１のＣ末端分解を最小化することが確認されている。従って、Ａ１８０Ｅ変異は、本明細書で記載のように、単一変異として、または他の変異と組み合わせて、変異体ＦＧＦ２１配列の１つの要素を構成することができる。
【００７７】
別の実施形態では、Ｌ９８Ｒ変異は、凝集を最小化し、成熟ＦＧＦ２１の溶解性を高めることが確認されている。従って、Ｌ９８Ｒ変異は、本明細書で記載のように、単一変異として、または他の変異と組み合わせて、変異体ＦＧＦ２１配列の１つの要素を構成することができる。
【００７８】
別の実施形態では、Ｐ１７１Ｇ変異は、成熟ＦＧＦ２１のタンパク質分解開裂を最小化することが確認されている。従って、Ｐ１７１Ｇ変異は、本明細書で記載のように、単一変異として、または他の変異と組み合わせて、変異体ＦＧＦ２１配列の１つの要素を構成することができる。
【００７９】
さらに、本明細書で開示されている他の変異は、ジスルフィド結合の形成部位を提供し、その結果、タンパク質の安定性、例えば、ＦＧＦ２１を製剤中に配合する場合の安定性、を高めることにより、ＦＧＦ２１の安定性を高めることができる。さらに他の開示変異は、ＦＧＦ２１が酵母中で発現した際の、Ｏ−グリコシル化レベルを増加または低下させることができる。また他の変異は、プロテアーゼまたは他の化学攻撃がＦＧＦ２１に作用し分解させる可能性がある、ＦＧＦ２１のＣ末端を含む位置での分解を中断させることができる。他の変異は、低減した脱アミド化特性を分け与えることができる。またされに他の変異は、ＦＧＦ２１の凝集度を低減することができ、その結果、溶解度を高めることができる。本明細書で記載のように、変異は、半減期延長成分、例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはＩｇＧ定常部のための付着点として役立つように導入することもできる。様々な手段を使って、これらの変異は、インビボまたはインビトロでＦＧＦ２１の活性をネイティブＦＧＦ２１よりも改善することができる。本明細書で記載のように、１つまたは複数の所望の特性を与える１つまたは複数の変異をＦＧＦ２１配列に導入し、所望特性の累積的増強を得ることができる。
【００８０】
１つの実施例では、単一または一対のシステイン残基をＦＧＦ２１配列のいくつかの位置に導入し、ジスルフィド結合の形成を促進することができる。導入されたシステイン残基は、また、ペグ化の部位としても役立たせることができる。Ｃ７５とＣ９３の間のネイティブジスルフィド結合を、インタクトのまま維持、または分断して、新しいジスルフィド結合をＣ７５またはＣ９３と導入したシステイン残基の間に形成することができる。システインが野性型残基を置換することができる位置の例を表２にまとめる。
【００８１】
【表２】
2012525847.tif 000003
2012525847.tif 000004
2012525847.tif 000005
【００８２】
導入されたシステイン残基は、操作されたジスルフィド結合の形成を促進することができる。このようなジスルフィド結合は、治療薬処方の場合のような濃縮状態下での分子の安定性を含むＦＧＦ２１ポリペプチドの安定性を促進することができる。操作されたジスルフィド結合対の例には、表３に示すものが含まれる。
【００８３】
【表３】
2012525847.tif 000006
2012525847.tif 000007
2012525847.tif 000008
【００８４】
野性型ＦＧＦ２１にはみられないジスルフィド結合操作を目的としたシステインに対する変異のための１つまたは複数の残基対の選択は、ＦＧＦ２１の３次元モデルの分析に基づいて行うことができる。例えば、合理的なタンパク質の操作手法を使い、変異のために適切なＦＧＦ２１中の残基を特定することができる。これは、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｎｋ（ＰＤＢ）から入手したＦＧＦ１９（１ＰＷＡ）の高解像度（１．３Å）Ｘ線結晶構造検査により行うことができる。次に、このＤａｔａｂａｎｋを利用して、例えば、ＭＯＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ；Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ；Ｍｏｎｔｒｅａｌ、Ｑｕｅｂｅｃ、Ｃａｎａｄａ）モデリングソフトウェアを用いて、ＦＧＦ２１の３Ｄ相同性モデルを作製することができる。ＰＤＢに登録されているタンパク質の中で、アミノ酸配列相同性の観点からＦＧＦ１９が最もＦＧＦ２１と関係が深いということから、ＦＧＦ１９は、有用なテンプレートである。
【００８５】
別の態様では、別の変異がＦＧＦ２１配列に導入され、高濃縮液またはフェノール、ｍ−クレゾール、メチルパラベン、レゾルシノールおよびベンジルアルコール、等の通常の製剤成分の条件下、ＦＧＦ２１の安定性を促進することができる。安定性を増大することができる変異の例には、表４に示されるものが含まれる。
【００８６】
【表４】
2012525847.tif 000009
【００８７】
安定性増大変異のための１つまたは複数の残基対の選択は、ＦＧＦ２１の３次元モデルの分析に基づいて行うことができる。例えば、合理的なタンパク質の操作手法を使い、変異のために適切なＦＧＦ２１中の残基を特定することができる。これは、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｎｋ（ＰＤＢ）から入手したＦＧＦ１９（１ＰＷＡ）の高解像度（１．３Å）Ｘ線結晶構造検査により行うことができる。次に、このＤａｔａｂａｎｋを利用して、例えば、ＭＯＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ；Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ；Ｍｏｎｔｒｅａｌ、Ｑｕｅｂｅｃ、Ｃａｎａｄａ）モデリングソフトウェアを用いて、ＦＧＦ２１の３Ｄ相同性モデルを作製することができる。ＰＤＢに登録されているタンパク質の中で、アミノ酸配列相同性の観点からＦＧＦ１９が最もＦＧＦ２１と関係が深いということから、ＦＧＦ１９は、有用なテンプレートである。
【００８８】
別の態様では別の変異がＦＧＦ２１配列に導入され、いくつかの条件下の、ＦＧＦ２１ポリペプチドのタンパク質分解開裂の程度を減らすことができる。タンパク質分解開裂に対する耐性を与えることができる変異の例には、表５で示されるものが含まれる。
【００８９】
【表５】
2012525847.tif 000010
【００９０】
さらなる態様では、別の変異がＦＧＦ２１配列に導入され、高濃度等のいくつかの条件下、ＦＧＦ２１ポリペプチドの凝集を防止することができる。ＦＧＦ２１の凝集防止特性を与えることのできる例は、表６に示すものを含む。
【００９１】
【表６】
2012525847.tif 000011
【００９２】
さらなる態様では、別の変異が、ＦＧＦ２１配列に導入されＦＧＦ２１ポリペプチドのＣ末端分解を抑制できる。一部の実施形態では、Ｃ末端分解に耐性を示すＦＧＦ２１変異体は、位置１８１にセリンを加え、その結果、ＦＧＦ２１変異体の長さを野性型の１８１残基の長さを超えて延長する１つまたは複数の残基を含む「キャップ」を含む。キャップは、任意の数の残基、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０残基を含むことができる。ロイシン、グリシン、セリンおよびプロリンを含む任意の残基をキャップとして用いることができる。キャップはただ１つの単一アミノ酸の残基である必要はなく、１、２、３、４、または５グリシン残基および／または１、２、３、４、または５セリン残基および／または１、２、３、４、または５プロリン残基および／または１、２、３、４、または５ロイシン残基、等の残基の組み合わせであってもよい。ＦＧＦ２１のＣ末端分解耐性を与えることができる変異の例には、表７で示すものが含まれる。
【００９３】
【表７】
2012525847.tif 000012
【００９４】
さらなる態様では、別の変異がＦＧＦ２１配列に導入され、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ媒介グリコシル化のための部位を与えることができる。ここに、ＧａｌＮＡｃが付加され、Ｏ−グリコシル化用の位置としての役目を果たす。下記の変異リストには、連続的および非連続的変異の点変異体ならびに配列の両方が含まれ、ＧａｌＮＡｃがＳまたはＴ残基に付加されることになる。ＦＧＦ２１のＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ媒介グリコシル化のための部位を与える変異の例には、表８に示すものが含まれる。同表中、複数のアミノ酸配列がある場合は、点変異体を下線付き太字で示した。
【００９５】
【表８】
2012525847.tif 000013
2012525847.tif 000014
2012525847.tif 000015
2012525847.tif 000016
【００９６】
表８とは対照的に、追加の変異がＦＧＦ２１配列に導入され、ＦＧＦ２１が酵母中で発現した場合に、野性型ＦＧＦ２１配列に比べてＯ−グリコシル化能力を低下させることができる。下記の変異リストには、連続的および非連続的変異の点変異体ならびに配列の両方が含まれる。ＦＧＦ２１配列が酵母中で発現した場合の、野性型ＦＧＦ２１配列に比べてＯ−グリコシル化能力の低下した変異の例には、Ｓ１６７Ａ、Ｓ１６７Ｅ、Ｓ１６７Ｄ、Ｓ１６７Ｎ、Ｓ１６７Ｑ、Ｓ１６７Ｇ、Ｓ１６７Ｖ、Ｓ１６７Ｈ、Ｓ１６７ＫおよびＳ１６７Ｙが含まれる。
【００９７】
【表９】
2012525847.tif 000017
【００９８】
７．ＦＧＦ２１組み合わせ変異体
本明細書に記載のように、野性型ＦＧＦ２１配列は、ＦＧＦ２１が治療用分子として用いられる場合、大きな課題を生ずる可能性があるいくつかの特性を有している。これらの課題の中には、タンパク質の分解感受性と高濃度での凝集性向がある。これらの各課題を克服できるＦＧＦ２１ポリペプチドを特定する種々の試みの後に、指向研究を行って、蛋白質分解耐性を与え、また、凝集低減特性を与えるアミノ酸置換が、単一ポリペプチド配列中で、野性型ＦＧＦ２１と比べ同等か、またはそれ以上の活性レベルを維持しながら、付加的な形で組み合わされるのか、あるいは相乗的な形で組み合わされるのかを特定した。特定のポリペプチドへの複数の変異の導入が、発現、活性、およびその結果のタンパク質製造に悪影響を及ぼす可能性があることは当技術分野では既知であるので、これは大きな課題となる。
【００９９】
驚くべきことに、例えば、実施例１９と２０に示されるように、いくつかのＦＧＦ２１変異体の所望の特性が付加的または相乗的な形で組み合わされ、実際に、強化された医薬品特性を有するＦＧＦ２１変異体を生成させうることが明らかになった。蛋白質分解に耐え、凝集速度を低下させ、しかも、野性型ＦＧＦ２１と比べ同等か、またはそれ以上の活性レベルを維持しているＦＧＦ２１変異体が本明細書で開示される。
【０１００】
所望のＦＧＦ２１組み合わせ変異体を特定する１つの選択標準は、ＦＧＦ２１変異体の活性が、野生型ＦＧＦ２１の活性に比べ類似しているか、またはより高いことである。それ故、本発明の別の実施形態では、タンパク質分解耐性と低減した凝集特性を有し、それでもなお、野生型ＦＧＦ２１に比べ類似しているか、またはより高い活性を保持しているＦＧＦ２１変異体を対象とする。ある場合にはあまり望ましくないが、タンパク質分解耐性と低減した凝集特性を有しているが、幾分低下した活性を示すＦＧＦ２１変異体が、本発明の別の実施形態となっている。ときには、ある程度の蛋白質分解および／または凝集を維持することが望ましいことがあり、その結果、ある程度の蛋白質分解および／または凝集の発生を許容するＦＧＦ２１変異体も、また、本発明の別の実施形態となっている。
【０１０１】
本明細書にあるすべてのＦＧＦ２１変異体と同様に、本発明のＦＧＦ２１組み合わせ変異体は、本明細書の記載に従い調製することができる。標準的分子生物学技術に通じている当業者なら、本開示を結びつけてその知識を使い、本発明のＦＧＦ２１組み合わせ変異体を作製し、使用することができる。標準的な方法を、組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、組織培養、および形質転換（例えば、電気穿孔、リポフェクション法）用に使用することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、「分子クローニング：研究室マニュアル」、前出、を参照。この文献は、いかなる目的にも、参照により本明細書に組み込まれる。酵素反応および精製技術は、メーカーの仕様書に従って、当技術分野で通常行われるように、または本明細書の記載に従って実施することができる。特に定めがなければ、本明細書に記載されている分析化学、合成有機化学、および医薬品化学に関連して使われている命名法および検査法と技術は当技術分野でよく知られ、通常使われているものである。標準的な方法を、化学合成；化学分析；製剤、処方、および送達；ならびに患者の治療のために使用。
【０１０２】
本発明のＦＧＦ２１組み合わせ変異体は、別の実体に融合することもでき、これにより追加の特性をＦＧＦ２１組み合わせ変異体に付与することができる。本発明の一実施形態では、ＦＧＦ２１組み合わせ変異体は、ＩｇＧ  Ｆｃ配列、例えば、配列番号１１または１７１に融合できる。このような融合は、既知の分子生物学的手法および／または本明細書にあるガイダンスにより実行可能である。融合ポリペプチドの利点、ならびにこのような融合ポリペプチドを作る方法については、本明細書でさらに詳細に検討する。
【０１０３】
ＦＧＦ２１配列に導入可能な変異の例を、点変異または２つ以上の点変異体の組み合わせとして、表１０にまとめる。
【０１０４】
【表１０】
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【０１０５】
８．ＦＧＦ２１融合タンパク質
本明細書で使われる「ＦＧＦ２１融合ポリペプチド」または「ＦＧＦ２１融合タンパク質」という用語は、本明細書記載の任意のＦＧＦ２１ポリペプチド変異体のＮ末端またはＣ末端にある１つまたは複数のアミノ酸残基（異種のタンパク質またはペプチド等）の融合体を指す。
【０１０６】
異種のペプチドおよびポリペプチドには、これに限定されないが、ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体の検出および／または単離を可能にさせるエピトープ；膜貫通型受容体タンパク質またはその一部、例えば、細胞外ドメインまたは膜貫通型の細胞内ドメイン；膜貫通型受容体タンパク質に結合するリガンドまたはその一部；触媒活性のある酵素またはその一部；オリゴマー化を促進するポリペプチドまたはペプチド、例えば、ロイシンジッパードメイン；安定性を高めるポリペプチドまたはペプチド、例えば、免疫グロブリン定常ドメイン（例えば、Ｆｃドメイン）；２つ以上の組み合わせ（例えば、２、５、１０、１５、２０、２５、等）の天然または天然に存在しない電荷のあるおよび／または電荷のないアミノ酸（例えば、セリン、グリシン、グルタミン酸またはアスパラギン酸酸）を含み、ＦＧＦ２１変異体のために、親水性主体のまたは疎水性主体の融合パートナーを形成するように考案された半減期延長配列；機能的または非機能的抗体、またはその重鎖または軽鎖；および本発明のＦＧＦ２１ポリペプチド変異体とは異なる治療活性、等の活性を有するポリペプチド、が含まれる。また、本発明には、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に融合したＦＧＦ２１変異体が含まれる。
【０１０７】
ＦＧＦ２１融合タンパク質は、異種の配列をＦＧＦ２１ポリペプチド変異体のＮ末端またはＣ末端に融合することにより作ることができる。本明細書の記載のように、異種の配列は、アミノ酸配列でも、非アミノ酸含有ポリマーであってもよい。異種の配列は、直接的に、またはリンカーもしくはアダプター分子を介してＦＧＦ２１ポリペプチド変異体に融合可能である。リンカーまたはアダプター分子は、１つまたは複数のアミノ酸残基（またはマー（ｍｅｒ））、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、または９残基（またはマー）、好ましくは１０〜５０アミノ酸残基（またはマー）、例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０残基（またはマー）、また、さらに好ましくは１５〜３５アミノ酸残基（またはマー）であってもよい。リンカーまたはアダプター分子は、融合成分の分離を可能にするＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼまたはプロテアーゼのための開裂部位を考慮して計画することも可能である。
【０１０８】
ａ．Ｆｃ融合体
本発明の一実施形態では、ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体は、Ｆｃドメイン、例えば、１つまたは複数のヒトＩｇＧのＦｃ領域ドメインに融合される。抗体は、２つの機能的に独立した部位の、抗原に結合する「Ｆａｂ」として知られる可変ドメイン、および補体活性化や食細胞による攻撃等のエフェクター機能に関与する「Ｆｃ」として知られる定常ドメイン、を含む。Ｆｃは、長い血清中半減期を有し、一方Ｆａｂは短命である（Ｃａｐｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ  ３３７：５２５−３１）。治療タンパク質と一緒に結合する場合、Ｆｃドメインは、より長い半減期を与えることができる、またはＦｃ受容体結合、タンパク質Ａ結合、補体固定機能、およびおそらく胎盤通過の機能をも組み込むことができる（Ｃａｐｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９８９）。
【０１０９】
インビボ薬物動態学的分析で、マウス中では、ヒトＦＧＦ２１は、高速クリアランスとインビボ分解により約１時間の短い半減期を有することが示された。従って、ＦＧＦ２１の半減期を延長するため、ネイティブＦｃ配列をＦＧＦ２１ポリペプチドのＮまたはＣ末端に融合した。Ｆｃ配列の野性型ＦＧＦ２１への融合、特に、野性型ＦＧＦ２１のＮ末端へ融合したＦｃでは、予期したようには半減期を延長できなかった。しかし、この観察が、ｌＦＧＦ２１のタンパク質のインビボ分解の研究、およびこのような分解に耐性を示すＦＧＦ２１変異体の特定につながった。このような変異体は、例えば、実施例９と１１に記載されており、野性型ＦＧＦ２１よりも長い半減期を示す。これらおよび他のＦＧＦ２１融合タンパク質は、本発明の実施形態を構成する。
【０１１０】
本開示全体を通して、Ｆｃ−ＦＧＦ２１は、Ｆｃ配列がＦＧＦ２１のＮ末端に融合した融合タンパク質を指す。同様に、本開示全体を通して、ＦＧＦ２１−Ｆｃは、Ｆｃ配列がＦＧＦ２１のＣ末端に融合した融合タンパク質を指す。
【０１１１】
得られたＦＧＦ２１融合タンパク質は、例えば、タンパク質Ａアフィニティカラムを使って精製することができる。Ｆｃ領域にに融合したペプチドおよびタンパク質は、インビボで実質的に非融合カウンターパートより長い半減期を示すことが明らかになった。また、Ｆｃ領域への融合により、融合ポリペプチドの二量体化／多量体化を生じさせる。Ｆｃ領域は、ネイティブＦｃ領域、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のＦｃ、であってもよく、改変して、特定の品質、例えば、治療薬品質、循環時間、または凝集低減品質、を改善してもよい。一例では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１  Ｆｃ、例えば、配列番号１１であり、また、別の例では、Ｆｃ領域はＩｇＧ４  Ｆｃ、例えば、配列番号１７１である。
【０１１２】
抗体の「Ｆｃ」ドメインとの融合によるタンパク質治療薬の有用な改変については、国際公開番号ＷＯ００／０２４７８２号で詳細に検討されている。この文献は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１１３】
ｂ．融合タンパク質リンカー
本発明の融合タンパク質の形成に際し、必ずしも必要ではないが、リンカーを採用できる。リンガーがある場合、単なるスペーサーとしての役目をするだけのため、そのリンカーの化学構造は重要ではない可能性がある。リンカーは、ペプチド結合によって数珠つなぎにしたアミノ酸から作り上げることができる。本発明の一部の実施形態では、リンカーは、ペプチド結合で結合した１〜２０アミノ酸から作られ、このアミノ酸は２０天然アミノ酸から選択される。いくつかの実施形態では、１〜２０アミノ酸は、アミノ酸のグリシン、セリン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、およびリシンから選択される。一部の実施形態では、リンカーは、その大部分が、グリシンやアラニン等の立体障害のないアミノ酸から作られる。一部の実施形態では、リンカーは、ポリグリシン（（Ｇｌｙ）４（配列番号２９）および（Ｇｌｙ）５（配列番号３０）、等の）、ポリアラニン、グリシンとアラニンの組み合わせ（ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）、等の）、またはグリシンとセリンの組み合わせ（ポリ（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）等の）である。他の適切なリンカーには、(Gly)5-Ser-(Gly)3-Ser-(Gly)4-Ser（配列番号２８）、(Gly)4-Ser-(Gly)4-Ser-(Gly)4-Ser（配列番号３１）、(Gly)3-Lys-(Gly)4（配列番号３２）、(Gly)3-Asn-Gly-Ser-(Gly)2（配列番号３３）、(Gly)3-Cys-(Gly)4（配列番号３４）、Gly-Pro-Asn-Gly-Gly  （配列番号３５）、Gly-Ser(Gly4Ser)3（配列番号１６６）、(Gly4Ser)4（配列番号１６７）、(Gly4S)2（配列番号１６８）、DAAAKEAAAKDAAAREAAARDAAAK（配列番号１６９）、NVDHKPSNTKVDKR（配列番号１７０）、が含まれる。１５アミノ酸残基のリンカーがＦＧＦ２１融合タンパク質には特に良好に機能することがわかったが、本発明では、任意の長さ、または組成物のリンカーを意図している。本開示では、リンカーが、Ｆｃドメインのような異種の配列、およびＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体を結合するために採用される場合、リンカーを括弧で表した。
【０１１４】
本明細書記載のリンカーは代表的なものであり、ずっと長いリンカーや他の残基を含むリンカーも本発明で意図されている。非ペプチドリンカーもまた、本発明で意図されている。例えば、−ＮＨ−（ＣＨ２）Ｓ−Ｃ（Ｏ）−（ｓ＝２〜２０）のようなアルキルリンカーが使用可能であろう。これらのアルキルリンカーは、任意の非立体障害基によりさらに置換可能である。この非立体障害基には、これに限定されないが、低級アルキル（例えば、Ｃ１〜Ｃ６）、低級アシル、ハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ）、ＣＮ、ＮＨ２、またはフェニルが含まれる。代表的非ペプチドリンカーはポリエチレングリコールリンカーであり、この場合、リンカーは、１００〜５０００ｋＤ、例えば、１００〜５００ｋＤ、の分子量を有する。
【０１１５】
８．化学修飾ＦＧＦ２１変異体
本明細書記載の切断型ＦＧＦ２１を含む本明細書記載のＦＧＦ２１ポリペプチド変異体の化学修飾型は、本明細書に記載された本開示を考慮すれば、当業者には調製可能である。このような化学修飾ＦＧＦ２１変異体は、化学修飾ＦＧＦ２１変異体が元々結合しているＦＧＦ２１変異体の種類または位置の点で非修飾ＦＧＦ２１変異体とは異なるように改変される。化学修飾ＦＧＦ２１変異体には、１つまたは複数の元々結合している化学基の欠損によりできた分子を含むことができる。
【０１１６】
一実施形態では、本発明のＦＧＦ２１ポリペプチド変異体は、１つまたは複数のポリマーの共有結合により修飾できる。例えば、ポリマーは、通常、結合しているタンパク質が、生理的環境等の水性環境中で沈殿しないように水可溶性のものが選択される。適切なポリマーの範囲には、ポリマー混合物が含まれる。好ましくは、最終製剤の治療薬への使用のために、ポリマーは薬学的に許容可能なものとする。本発明のＧＦ２１ポリペプチド変異体に結合した非水溶性ポリマーもまた、本発明の一態様となる。
【０１１７】
典型的なポリマーは、それぞれ、任意の分子量でよく、また、分岐でも非分岐でもよい。各ポリマーは、通常、約２ｋＤａ〜約１００ｋＤａの平均分子量を有する（用語の「約」は水可溶ポリマーの調製で、一部の分子が出発時の分子量より重くなる、および軽くなることを示している）。各ポリマーの平均分子量は、好ましくは、約５ｋＤａと約５０ｋＤａの間であり、さらに好ましくは、約１２ｋＤａと約４０ｋＤａの間、最も好ましくは、約２０ｋＤａと約３５ｋＤａの間である。
【０１１８】
適切な水可溶ポリマーまたはこれらの混合物には、限定されないが、Ｎ結合型またはＯ結合型炭水化物、糖、リン酸塩、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（モノ−（Ｃ１〜Ｃ１０）、アルコキシ−、またはアリールオキシ−ポリエチレングリコールを含む誘導体タンパク質に使用されているＰＥＧの形を含む）、モノメトキシポリエチレングリコール、デキストラン（例えば、約６ｋＤの低分子量デキストラン等の）、セルロース、または他の炭水化物ベースポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレン酸化物／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化されたポリオール（例えば、グリセリン）、およびポリビニルアルコール、が含まれる。また、本発明には、共有結合ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体多量体の調製に使われる二官能性架橋分子が含まれる。また、本発明には、ポリシアル酸に共有結合したＦＧＦ２１変異体も含まれる。
【０１１９】
本発明の一部の実施形態では、ＦＧＦ２１変異体は、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリオキシエチレングリコール、またはポリプロピレングリコールを含む１つまたは複数の水可溶ポリマーを含むように、共有結合的または化学的に修飾される。例えば、米国特許第４、６４０、８３５；４、４９６、６８９；４、３０１、１４４；４、６７０、４１７；４、７９１、１９２；および４、１７９、３３７を参照。本発明の一部の実施形態では、ＦＧＦ２１変異体は、限定されないが、モノメトキシポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、別の炭水化物ベースポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）−ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレン酸化物／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化されたポリオール（例えば、グリセリン）、ポリビニルアルコール、またはこのようなポリマーの混合物、を含む１つまたは複数のポリマーを含む。
【０１２０】
本発明の一部の実施形態では、ＦＧＦ２１変異体は、ＰＥＧサブユニットにより共有結合修飾される。一部の実施形態では、１つまたは複数の水可溶ポリマーが１つまたは複数のＦＧＦ２１変異体の特定の位置（例えば、Ｎ末端に）に結合される。一部の実施形態では、１つまたは複数の水可溶のポリマーが１つまたは複数のＦＧＦ２１変異体の側鎖に無作為的に結合される。一部の実施形態では、ＰＥＧを使ってＦＧＦ２１変異体の治療能力を改善する。例えば、米国特許第６、１３３、４２６で、このような特定の方法が考察されている。この文献は、目的に応じ、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１２１】
ポリマーがＰＥＧである本発明の実施形態では、ＰＥＧ基は任意の好都合な分子量でよく、また、直鎖であっても分岐であってもよい。ＰＥＧ基の平均分子量は、好ましくは、約２ｋＤ〜約１００ｋＤａの範囲であり、さらに好ましくは、約５ｋＤａ〜約５０ｋＤａの範囲、例えば、１０、２０、３０、４０、または５０ｋＤａである。ＰＥＧ基は通常、ＰＥＧ成分上の反応基（例えば、アルデヒド、アミノ、チオール、またはエステル基）によるＦＧＦ２１変異体上の反応基（例えば、アルデヒド、アミノ、またはエステル基）に対するアシル化または還元性アルキル化を経由してＦＧＦ２１変異体と結合する。
【０１２２】
本発明のＦＧＦ２１変異体を含むポリペプチドのペグ化は、当技術分野で既知のペグ化反応のどれかを使って特定的に行うことができる。このような反応は、例えば、次の文献：Ｆｒａｎｃｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９９２、「増殖因子へのフォーカス」３：４〜１０；欧州特許第０１５４３１６号および０４０１３８４；ならびに米国特許第４、１７９、３３７号、に記載されている。例えば、本明細書で記載のように、反応性ポリエチレングリコール分子（または類似の反応性水可溶ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応を経由してペグ化を行うことができる。アシル化反応のために、選択したポリマーは、単一の反応性エステ基を持つ必要がある。還元的アルキル化のために、選択したポリマーは、単一の反応性アルデヒド基を持つ必要がある。反応性アルデヒドは、例えば、水に安定なポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、またはモノＣ１〜Ｃ１０アルコキシまたはそのアリールオキシ誘導体である（例えば、米国特許第５、２５２、７１４号参照）。
【０１２３】
本発明の一部の実施形態では、ＰＥＧ基のポリペプチドへの結合に関する有用な戦略として、溶液中での複合体結合の形成を介して、それぞれが相互に相手に対し反応性を有する特別な官能基を持つ、ペプチドとＰＥＧ成分を結合することが含まれる。ペプチドは、通常の固相合成により容易に調製可能である。ペプチドは、特異的部位の適切な官能基で「あらかじめ活性化」されている。前駆物質は、ＰＥＧ成分と反応させる前に精製され、完全に特徴付けられる。ペプチドとＰＥＧの連結反応は通常、水相で起こり、分析用逆相ＨＰＬＣにより容易にモニターできる。ペグ化ペプチドは、分取ＨＰＬＣにより容易に精製でき、分析用ＨＰＬＣ、アミノ酸分析およびレーザー脱離質量分析により容易に特徴付けることができる。
【０１２４】
多糖ポリマーは、タンパク質修飾に使うことができる別のタイプの水可溶ポリマーである。従って、多糖ポリマー型に融合した本発明のＦＧＦ２１変異体は、本発明の実施形態となる。デキストラン多糖ポリマーは、大部分はアルファ１〜６連結により結合されているグルコースの各サブユニットからなる。デキストランそれ自体は、多くの分子量の範囲で入手可能であり、約１ｋＤ〜約７０ｋＤの分子量で容易に入手可能である。デキストランは、それ自体で賦形剤として、または別の賦形剤（例えば、Ｆｃ）と組み合わせて使用するための適切な水可溶ポリマーである。例えば、国際公開第ＷＯ  ９６／１１９５３を参照。この特許は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明はまた、約１ｋＤ〜約２０ｋＤのデキストランの使用も包含する。
【０１２５】
通常、化学的修飾は、タンパク質を活性化したポリマー分子と反応させるのに使われる任意の適切な条件の下で行うことができる。化学修飾ポリペプチドを調製する方法は、一般的には、（ａ）ポリペプチドを、ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体が１つまたは複数のポリマー分子と結合する条件下で、活性化したポリマー分子（ポリマー分子の反応性エステルまたはアルデヒド誘導体、等の）と反応させるステップと、（ｂ）反応生成物を得るステップを含む。最適反応条件は、既知のパラメーターと希望する結果に基づいて決定される。例えば、タンパク質に対するポリマー分子の比率が大きいほど、結合ポリマー分子のパーセンテージが大きくなる。本発明の一実施形態では、化学修飾ＦＧＦ２１変異体は、アミノ末端に単一ポリマー分子成分を持つことができる（例えば、米国特許第５、２３４、７８４を参照）。
【０１２６】
本発明の別の実施形態では、ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体は、ビオチンに化学的に結合できる。次に、ビオチン／ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体を、アビジンに結合させ、四価のアビジン／ビオチン／ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体ができる。ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体は、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）またはトリニトロフェノール（ＴＮＰ）に共有結合可能で、得られた複合体は、抗ＤＮＰまたは抗ＴＮＰ−ＩｇＭで沈殿し、１０価の十量体複合物を形成する。
【０１２７】
一般的に、開示の化学修飾ＦＧＦ２１変異体の投与により緩和または調節される状態には、ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体のために本明細書に記載される状態が含まれる。しかし、本明細書で開示の化学修飾ＦＧＦ２１変異体は、非修飾ＦＧＦ２１変異体に比べて、追加の活性、強化されたまたは低減した生物活性、または他の特性、例えば、延長した、又は短縮された半減期の延長や短縮を有することができる。
【０１２８】
９．ＦＧＦ２１変異体の医薬品組成物およびその投与
ＦＧＦ２１変異体を含む医薬品組成物は、本発明の範囲内であり、強化特性を示すいくつかの変異体ＦＧＦ２１配列の特定の観点から特に考慮されている。このようなＦＧＦ２１変異体医薬品組成物は、治療有効量のＦＧＦ２１ポリペプチド変異体を、薬学的にまたは生理学的に受容可能な、投与形態と適合するように選択した処方剤と組み合わせて含むことができる。受容可能な処方剤は、使用する用量と濃度で、受容者に対し非毒性であることが好ましい。
【０１２９】
医薬品組成物は、例えば、ｐＨ、モル浸透圧濃度、粘度、清澄性、色、等張性、匂い、無菌、安定性、溶解速度または放出、吸着、または組成物の浸透を改変、維持、または保存するための処方剤を含んでもよい。適切な処方剤には、これに限定されないが、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリシン、等）、抗菌剤、抗酸化剤（アスコルビン酸、ナトリウム亜硫酸塩、またはナトリウム水素亜硫酸塩、等）、緩衝剤（ホウ酸塩、重炭酸塩、トリス塩酸、クエン酸塩、リン酸塩、または他の有機酸、等）、増量剤（マンニトールまたはグリシン、等）、キレート化剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等）、錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータシクロデキストリン、またはヒドロキシプロピルベータシクロデキストリン、等）、充填剤、単糖類、二糖類、および他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリン、等）、タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン、等）、着色剤、香料および希釈剤、乳化剤、親水性高分子（ポリビニルピロリドン等）、低分子量ポリペプチド、塩成形対イオン（ナトリウム等）、防腐剤（ベンズアルコニウム塩化物、安息香酸酸、サリチル酸酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸酸、または水素過酸化物、等）、溶剤（グリセリン、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコール、等）、糖アルコール（マンニトールまたはソルビトール、等）、懸濁剤、界面活性剤または湿潤剤（プルロニック；ＰＥＧ；ソルビタンエステル；ポリソルベート２０またはポリソルベート８０等のポリソルベート；トリトン；トロメタミン；レシチン；コレステロールまたはチロキサポール）、安定性増大剤（ショ糖またはソルビトール、等）、浸透圧増強剤（アルカリ金属ハライド−おそらく、ナトリウムまたは塩化カリウム−またはマンニトールソルビトール、等）、送達賦形剤、希釈剤、賦形剤および／または医薬品アジュバント、が含まれる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１８ｔｈＥｄ．、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ、ｅｄ．、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ  １９９０）、および続版を参照。この文献は、いかなる目的でも、参照により本明細書に組み込まれる。）。
【０１３０】
最適な医薬品組成物は、例えば、目的の投与経路、送達形式、および所望の投与量に従って当業者により決定される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、前出、を参照）。このような組成物は、ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体の物理的状態、安定性、インビボ放出速度、およびインビボクリアランス速度に影響を与え得る。
【０１３１】
医薬品組成物中の主要な賦形剤または担体は、本性として、水性または非水性であってもよい。例えば、注入用に適切な賦形剤または担体は、水、生理的な食塩水溶液、または人工脳脊髄液であり得、非経口投与の組成物でよく使われる他の物質で補充され得る。中性の緩衝食塩水または血清アルブミンと混合した食塩水がさらなる代表的賦形剤である。他の代表的医薬品組成物は、ｐＨ約７．０〜８．５のトリス緩衝液、またはｐＨ約４．０〜５．５の酢酸塩緩衝液であり、これらはさらにソルビトールまたは適切な代用品を含んでもよい。本発明の一実施形態では、ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体組成物は、所望の程度の純度を有する選択した組成物を任意選択の処方剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、前出）と共に混合し、凍結乾燥したケーキまたは水溶液の形で貯蔵するために調製することもできる。さらに、ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体生成物は、ショ糖のような適切な賦形剤を使って、凍結乾燥物として処方できる。
【０１３２】
ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体医薬品組成物は、非経口送達用として選択できる。あるいは、組成物は、吸入用または経口等の消化管経由送達用として選択できる。このような薬学的に許容可能な組成物は、当業者の技術範囲内にある。
【０１３３】
製剤成分は、投与部位に受容可能な濃度で含まれる。例えば、緩衝剤は組成物を生理的なｐＨに、またはそれよりわずかに低いｐＨに、通常は、約５〜約８のｐＨ領域内に維持するために用いられる。
【０１３４】
非経口の投与が意図される場合は、本発明で用いる治療組成物は、薬学的に許容可能な賦形剤中に所望のＦＧＦ２１ポリペプチド変異体を含む、発熱性物質の入らない、非経口的に受容可能な水溶液の形とすることができる。非経口注入用として特に好適な賦形剤は、無菌の蒸留水であり、その蒸留水中でＦＧＦ２１ポリペプチド変異体が無菌の、等張性溶液として処方され、適切に保存される。さらに別の調製には、所望の分子と、次のステップで蓄積注入により送達できる生成物の制御放出または徐放を可能とする試薬、例えば、注入可能微粒子、生体内分解性粒子状物質、重合体化合物（ポリ乳酸またはポリグリコール酸、等）、ビーズ、またはリポソーム、との製剤を含んでもよい。ヒアルロン酸も使用でき、循環血液中の持続期間を延長する効果を有し得る。所望の分子の導入のための他の適切な手段には、埋め込み型薬剤送達装置が含まれる。
【０１３５】
一実施形態では、医薬品組成物は、吸入用として処方できる。例えば、ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体は、吸入用乾燥粉として処方できる。また、ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体吸入溶液を、エアロゾル送達のために噴霧剤と共に処方できる。さらに別の実施形態では、溶液が噴霧できる。肺内投与は国際公開第ＷＯ９４／２００６９号でさらに記載されており、これには、化学修飾タンパク質の肺内送達について記載されている。
【０１３６】
特定の製剤は、経口で投与できることも意図される。本発明の一実施形態では、この方式で投与されるＦＧＦ２１ポリペプチド変異体は、錠剤およびカプセル剤のような固形の剤形に使われている配合で通例使用される担体を使用して、または使用しないで処方できる。例えば、カプセルを、胃腸管でバイオアベイラビリティが最大になり、前全身性分解（ｐｒｅ−ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）が最小になる時点で製剤の有効部を放出するように計画できる。追加の試薬を加え、ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体の吸収を促進することができる。希釈剤、香料、低融点ろう、植物油、滑剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤、および結合剤もまた用いることができる。
【０１３７】
別の医薬品組成物では、有効量のＦＧＦ２１ポリペプチド変異体を、錠剤の製造に適した非毒性賦形剤との混合物として含むことができる。錠剤を無菌の水、または別の適切な溶剤に溶解して、溶液を単位用量剤形として調製できる。適切な賦形剤には、限定されないが、不活性希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムもしくは重炭酸ナトリウム、ラクトース、もしくはリン酸カルシウム；または結合剤、例えば、デンプン、ゼラチン、もしくはアラビアゴム；または滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、もしくは滑石が含まれる。
【０１３８】
別のＦＧＦ２１ポリペプチド変異体医薬品組成物は、徐放または制御放出製剤中のＦＧＦ２１ポリペプチド変異体含有製剤も含めて、当業者には自明であろう。種々の他の徐放または制御放出手段を構築するための技術、例えば、リポソーム担体、生体内分解性微小粒子または多孔性ビーズおよび蓄積注入は当業者には既知である（例えば、国際公開第ＷＯ９３／１５７２２号（医薬品組成物の送達のための多孔性重合体微小粒子の徐放について記載）、ならびにＷｉｓｃｈｋｅ＆Ｓｃｈｗｅｎｄｅｍａｎ、２００８、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．３６４：２９８−３２７、およびＦｒｅｉｂｅｒｇ＆Ｚｈｕ、２００４、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２８２：１−１８（微粒子／微小粒子の調製と使用について考察）、を参照）。本明細書で記載のように、ヒドロゲルは、徐放または制御放出製剤の一例である。
【０１３９】
徐放剤の別の例には、フィルム、またはマイクロカプセル、等の造形品の形をした半透性ポリマー基質が含まれる。徐放基質には、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリ乳酸（米国特許第３、７７３、９１９号および欧州特許第００５８４８１号）、Ｌ−グルタミン酸とガンマエチル−Ｌ−グルタメートの共重合体（Ｓｉｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９８３、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７−５６）、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリル酸塩）（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、１９８１、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７およびＬａｎｇｅｒ、１９８２、Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５）、エチレンビニル酢酸塩（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、前出）またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許第０１３３９８８号）を含んでもよい。また、徐放組成物には、当技術分野で既知のいくつかの方法の内のいずれかを使って調製できるリポソームを含んでもよい。例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：３６８８−９２；および欧州特許第００３６６７６、００８８０４６、および０１４３９４９号を参照。
【０１４０】
インビボ投与に使われるＦＧＦ２１ポリペプチド変異体医薬品組成物は、通常無菌である必要がある。これは、細菌濾過膜を通して濾過することにより達成することができる。組成物を凍結乾燥する場合は、この方法による滅菌は、凍結乾燥と再構成の前、あるいは後で行うことができる。非経口投与用の組成物は、凍結乾燥した形または溶液で貯蔵可能である。さらに、非経口組成物は、通常、無菌のアクセスポートを有する容器、例えば、静脈内溶液バッグまたは皮下組織注射針により貫通可能な栓を有するバイアル、中に入れる。
【０１４１】
医薬品組成物を処方するとすぐに、無菌のバイアル中に、溶液、懸濁液、ゲル、乳剤、固体として、または脱水もしくは凍結乾燥した粉末として保存できる。このような製剤は、すぐに使える形、または投与前に再構成が必要な形（例えば、凍結乾燥した）で保存できる。
【０１４２】
特定の実施形態では、本発明は、一回用量投与ユニットを作製するためのキットに関する。各キットは、乾燥したタンパク質を入れた第１の容器および水性製剤を入れた第２の容器の両方を含むことができる。また、単一および多室薬剤充填済み注射器（例えば、液体注射器およびリオシリンジ（ｌｙｏｓｙｒｉｎｇｅ））を含むキットも本発明の範囲に含まれる。
【０１４３】
治療目的で採用されるＦＧＦ２１ポリペプチド変異体医薬品組成物の有効量は、例えば、治療の状況と目的によって決まる。当業者なら、治療のための適切な投与量は、１つには、送達される分子、ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体が使われる適応症、投与経路、および患者の大きさ（体重、体表面、または器官サイズ）および状態（年齢および総体的な健康）によって変化することを理解できる。従って、臨床医は、投与量を決め、投与経路を変更して最適治療効果を得ることができる。通常の投与量は、上述の因子に依存して、約０．１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上までの範囲にすることができる。他の実施形態では、投与量は、０．１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇまで；または１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇまで；または５μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、１５μｇ／ｋｇ、２０μｇ／ｋｇ、２５μｇ／ｋｇ、３０μｇ／ｋｇ、３５μｇ／ｋｇ、４０μｇ／ｋｇ、４５μｇ／ｋｇ、５０μｇ／ｋｇ、５５μｇ／ｋｇ、６０μｇ／ｋｇ、６５μｇ／ｋｇ、７０μｇ／ｋｇ、７５μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇまでの範囲にすることができる。さらに別の実施形態では、投与量は、５０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、１５０μｇ／ｋｇ、２００μｇ／ｋｇ、２５０μｇ／ｋｇ、３００μｇ／ｋｇ、３５０μｇ／ｋｇ、４００μｇ／ｋｇ、４５０μｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ、５５０μｇ／ｋｇ、６００μｇ／ｋｇ、６５０μｇ／ｋｇ、７００μｇ／ｋｇ、７５０μｇ／ｋｇ、８００μｇ／ｋｇ、８５０μｇ／ｋｇ、９００μｇ／ｋｇ、９５０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、２００μｇ／ｋｇ、３００μｇ／ｋｇ、４００μｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ、６００μｇ／ｋｇ、７００μｇ／ｋｇ、８００μｇ／ｋｇ、９００μｇ／ｋｇ、１０００μｇ／ｋｇ、２０００μｇ／ｋｇ、３０００μｇ／ｋｇ、４０００μｇ／ｋｇ、５０００μｇ／ｋｇ、６０００μｇ／ｋｇ、７０００μｇ／ｋｇ、８０００μｇ／ｋｇ、９０００μｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇとすることができる。
【０１４４】
投薬頻度は、使われる製剤中のＦＧＦ２１ポリペプチド変異体の薬物動態学的パラメーターによって決まる。通常、臨床医は、所望の効果が得られる投与量までその組成物を投与する。従って、組成物は、１回用量として、２回またはそれ以上の用量（同じ量の所望の分子が含まれていても含まれていなくてもよい）として、または埋め込み装置またカテーテル経由の連続注入により時間をかけて投与できる。適切な投与量のさらなる微調整は、当業者により日常的に行われており、日常的に行われている作業の範囲内である。適切な用量は、適切な用量反応データを使って確認することができる。
【０１４５】
医薬品組成物の投与経路は、既知の方法、例えば、経口；静脈内、腹腔内、大脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内、または病巣内経路の注入による；徐放製剤（注射してもよい）による；または埋め込み装置による方法に従う。所望なら、ボーラス注射もしくは連続注入により、または埋め込み装置により組成物を投与できる。
【０１４６】
代替として、または追加で、所望の分子が吸収、またはカプセル化された膜、スポンジ、または他の適切な材料の埋め込みによって局所的に組成物を投与できる。埋め込み手段が使われる場合は、その手段は任意の適切な組織または器官に埋め込むことができ、所望の分子の送達は、拡散、持続放出急速投与、または連続投与経由であってもよい。
【０１４７】
長期間にわたり所望の治療効果を得るレベルで薬剤濃度を維持することができるように、既定の速度で薬剤、例えば、本明細書で開示のＦＧＦ２１変異体を送達するために、種々の異なる方式を用いることができる。一例では、ゼラチン（例えば、ウシゼラチン、ヒトゼラチン、または別のソース由来のゼラチン）等、または天然もしくは合成ポリマーを含むヒドロゲルを使うことができる。任意の割合、例えば、５、１０、１５または２０％、のポリマー（例えば、ゼラチン）をヒドロゲル中に入れることができる。適切な濃度の選択は、種々の因子、例えば、所望の治療薬プロファイルおよび治療薬分子の薬物動態学的プロファイル、に依存し得る。
【０１４８】
ヒドロゲル中に組み込むことができるポリマーの例には、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）、ポリエチレンオキシド、ポリエチレンオキシド−コポリプロピレン酸化物、コポリエチレンオキシドブロックまたはランダム共重合体、ポリビニルアルコール、ポリ（ビニルピロリジノン）、ポリ（アミノ酸）、デキストラン、ヘパリン、多糖類、ポリエーテル、等が含まれる。
【０１４９】
ヒドロゲル製剤作製時に考慮されるべき別の因子は、ヒドロゲル中の架橋度と架橋剤である。一実施形態では、架橋はメタクリル酸無水物を使うメタクリル化反応経由で得ることができる。ある場合には、高度の架橋が望ましく、他の場合には、低架橋度が好ましいことがある。いくつかの場合では、高度の架橋により、より長い持続放出が得られる。より高度の架橋によりより堅固なヒドロゲルが得られ、より長い期間にわたって薬剤が放出されうる。
【０１５０】
任意の架橋剤（例えば、メタクリル酸無水物）に対するポリマーの比率を用いて所望の特性を有するヒドロゲルを作製できる。例えば、ポリマーの架橋剤に対する比率は、例えば、８：１、１６：１、２４：１、または３２：１であってもよい。例えば、ヒドロゲルポリマーがゼラチンで架橋剤がメタクリル酸塩の場合は、メタクリル酸無水物：ゼラチンの比率として８：１、１６：１、２４：１、または３２：１を用いることができる。
【０１５１】
１０．ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体の治療上の使用
ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体は、代謝障害を含むがそれに限定されない多くの疾患、障害、または状態の治療、診断、回復または予防のために使用できる。一実施形態では、治療される代謝障害は糖尿病、例えば、２型糖尿病である。別の実施形態では、代謝障害は肥満症である。他の実施形態では、脂質異常症、等の代謝状態または障害；高血圧症；非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）等の肝脂肪症；アテローム性動脈硬化等の心臓血管疾患；および老化が含まれる。
【０１５２】
適用に際しては、糖尿病もしくは肥満症のような障害または状態は、本明細書で記載のように、ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体の治療有効量を、それを必要としている患者に投与することにより治療できる。投与は、本明細書に記載のように、例えば、錠剤または液体の形で、ＩＶ注入、腹腔内注入、筋肉内注入、または経口により行うことができる。大抵の場合は、所望の投与量は、本明細書に記載のように、臨床医が決定することができ、治療効果のある量のＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを表し得る。ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドの治療有効量は、とりわけ、投与スケジュール、投与される試薬の単位用量、核酸分子またはポリペプチドが他の治療薬と組み合わせて投与されるか否か、受容者の免疫状態および健康に依存することは当業者には明らかであろう。本明細書に使われている「治療有効量」という用語は、研究者、医師、または他の臨床医により研究されている組織系、動物、またはヒトの、治療している疾患または障害の症状の緩和を含む、生物学的または医薬的反応を誘導するＦＧＦ２１変異体ポリペプチドの量を意味する。
【０１５３】
１１．抗体
本発明のＦＧＦ２１変異体ポリペプチドに特異的に結合するが、野性型ＦＧＦ２１ポリペプチドには特異的に結合しない抗体および抗体断片が意図されており、これは本発明の範囲内にある。抗体は、単一特異性ポリクローナルを含むポリクローナル；モノクローナル（ＭＡｂ）；組換え型；キメラ；相補性決定領域（ＣＤＲ）グラフト化のようなヒト化、；ヒト；一本鎖；および／または二重特異性；ならびに断片；変異体；の抗体またはその化学修飾分子であってもよい。抗体断片には、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドのエピトープに特異的に結合する抗体の一部が含まれる。このような断片の例には、完全長抗体の酵素的開裂により生じるＦａｂおよびＦ（ａｂ’）断片が含まれる。他の結合断片には、抗体変数領域をコードする核酸配列を含む組換えプラスミドの発現等の組換ＤＮＡ技術により作製したものが含まれる。
【０１５４】
「特異的に結合する」という用語は、抗体との関連で使われる場合、異種のタンパク質集団および／または他の生物学的物質の存在下、抗体がその標的と結合することを意味する。さらに具体的には、抗体が特異的にその標的に結合する場合、このことは、所定のイムノアッセイ条件下、抗体がその標的に結合し、また、試料中に存在する他のタンパク質に対し有意な量で結合しないことを意味する。任意の好都合なイムノアッセイ形態、例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイを使って特異的にその標的に結合している抗体を特定することができる。例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）「抗体：研究室マニュアル」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照。ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドに結合するポリクローナル抗体は、通常、動物（例えば、ウサギまたはマウス）へのＦＧＦ２１変異体ポリペプチドとアジュバントの複数回の皮下または腹腔内注射によって産生される。ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを、免役される種に対して免疫原性である担体タンパク質に複合化することが有用でありうる。担体タンパク質には、例えば、スカシ貝ヘモシアニン、血清、アルブミン、ウシチログロブリン、または大豆トリプシン阻害剤がある。また、ミョウバンのような凝集剤が免疫応答を促進するために使われる。免疫化後、動物から採血し、血清をアッセイし抗ＦＧＦ２１変異体抗体力価を求める。
【０１５５】
ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドに結合するモノクローナル抗体は、培養下の連続継代性細胞株による抗体分子の産生を行う任意の方法を使って産生することができる。モノクローナル抗体を調製する適切な方法の例には、ハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５−９７）およびヒトハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ、１９８４、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１；Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．、「モノクローナル抗体産生技術と適用」５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、１９８７）がある。また、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドと反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株も、本発明により提供される。
【０１５６】
本発明のモノクローナル抗体は、治療薬として使用するために修飾することができる。一実施形態では、モノクローナル抗体は、「キメラ」抗体であり、重（Ｈ）鎖および／または軽（Ｌ）鎖の一部が、特定の種由来の、または特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体に対応する配列に同じか、または相同であり、一方、残りの鎖は、別の種由来の、または別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体に対応する配列に同じか、または相同である。このような抗体断片も、所望の生物活性を示す限り、本発明に含まれる。例えば、米国特許第４、８１６、５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６８５１−５５を参照。
【０１５７】
別の実施形態では、本発明のモノクローナル抗体は、「ヒト化」抗体である。非ヒト抗体をヒト化する方法は当技術分野でよく知られている。例えば、米国特許第５、５８５、０８９号および５、６９３、７６２号参照。一般的に、ヒト化抗体は、非ヒトの供給源から導入した１つまたは複数のアミノ酸残基を有する。ヒト化を、例えば、技術的に記載された方法（例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−３６を参照）を使って、ヒト抗体の対応する領域をげっ歯類の相補性決定領域の少なくとも一部で置換することにより、行うことができる。
【０１５８】
また、本発明のＦＧＦ２１変異体ポリペプチドに結合するヒト抗体も本発明に含まれる。内在性免疫グロブリン産生なしで、ヒト抗体のレパートリーを作製できるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を使って、このような抗体は、ＦＧＦ２１変異体由来の抗原（すなわち、少なくとも６近接アミノ酸を有する）での免疫化により産生され、また、任意選択として、担体に複合化される。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：２５５１−５５；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９９３、Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−５８；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９３、Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．７：３３を参照。１つの方法では、このようなトランスジェニック動物は、免疫グロブリン重軽鎖をコードする内在性座位を無能力化し、ゲノム中のヒト重鎖と軽鎖タンパク質をコードした座位を挿入することにより作られる。部分的改変動物、すなわち、改変の完全補完に満たない動物、が、次のステップで交雑されて、すべての所望の免疫系改変を有する動物が得られる。免疫原を投与すると、これらのトランスジェニック動物は、これらの抗原に対して免疫特異的な可変領域を含む、（例えば、マウスではなく）ヒトアミノ酸配列を有する抗体を産生する。例えば、国際公開第ＷＯ９６／３３７３５号およびＷＯ９４／０２６０２号参照。さらなる方法が、米国特許第５、５４５、８０７号、国際公開第ＷＯ９１／１０７４１号およびＷＯ９０／０４０３６号、ならびに欧州特許第０５４６０７３号に記載されている。ヒト抗体は、本明細書に記載のように、宿主細胞中での組換えＤＮＡの発現、またはハイブリドーマ細胞中での発現によっても産生できる。
【０１５９】
別の実施形態では、ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーからも産生できる（例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．、１９９１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９９１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１を参照）。これらのプロセスは、繊維状バクテリオファージの表面に抗体レパートリーを提示し、その後の、選択した抗原に対する結合によるファージの選択を介して、免疫選択を模倣する。
【０１６０】
キメラ、ＣＤＲグラフト化、およびヒト化抗体は、通常、組換え法により産生される。抗体をコードする核酸が、本明細書に記載の材料およびプロセスを使って、宿主細胞に導入され、発現される。一実施形態では、抗体は、ＣＨＯ細胞のような哺乳類動物宿主細胞で産生される。モノクローナル（例えば、ヒト）抗体は、本明細書に記載のように、宿主細胞中での組換えＤＮＡの発現、またはハイブリドーマ細胞中での発現により産生できる。
【０１６１】
本発明の抗ＦＧＦ２１変異体抗体は、変異体ポリペプチドの検出と定量ＦＧＦ２１のための既知の任意のアッセイ方法、例えば、競合結合試験、直接および間接サンドイッチ法、ならびに免疫沈降アッセイで使用可能である（例えば、Ｓｏｌａ、モノクローナル抗体：技術マニュアル１４７−１５８（ＣＲＣＰｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、１９８７）を参照。この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。抗体は、採用したアッセイ方法に適した親和性でＦＧＦ２１変異体ポリペプチドに結合する。  
【０１６２】
特定の実施形態では、診断への適用の目的で、抗ＦＧＦ２１変異体抗体を検出可能成分で標識付けできる。検出可能成分は、直接、または間接的に検出可能信号を生成できる任意の成分であってよい。例えば、検出可能成分は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、または６７Ｇａ等の放射性同位元素；フルオレセインイソチオシアン酸塩、ローダミン、またはルシフェリン等の蛍光または化学発光化合物；または、アルカリフォスファターゼ、βガラクトシダーゼ、または西洋わさびペルオキシダーゼ等の酵素であってもよい（Ｂａｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、１９９０、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１８４：１３８−６３）。
【０１６３】
競合結合試験は、標識付けした標準（例えば、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチド、またはその免疫的に反応する部分）が、限られた量の抗ＦＧＦ２１変異体抗体との結合に対して、試料分析物（例えば、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチド）との間で競合する能力に依存している。試料中のＦＧＦ２１変異体ポリペプチドの量は、抗体に結合する標準の量に逆比例する。結合した標準の量の測定を早めるため、抗体は、通常、競合の前、または後で不溶化され、抗体に結合している標準および分析試料を非結合で残っている標準と分析試料から簡単に分離できるようにする。
【０１６４】
サンドイッチ法は、通常、２つの抗体が使用され、それぞれが、検出および／または定量されるタンパク質の異なる免疫原性部分、またはエピトープと結合できる。サンドイッチ法では、試験試料分析物は、通常、固体支持体に固定された最初の抗体により結合され、その後、第２の抗体が試料分析物に結合し、不溶性の３つの部分から構成される複合体を生成する。例えば、米国特許第４、３７６、１１０号参照。第２の抗体は、それ自身に検出可能成分で標識付けしてもよく（直接サンドイッチ法）または検出可能成分で標識付けした抗免疫グロブリン抗体を使って（間接サンドイッチ法）、測定できる。例えば、１つのタイプのサンドイッチ法は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）であり、この場合、検出可能成分は酵素である。
【０１６５】
本発明の抗ＦＧＦ２１変異体抗体は、インビボ画像処理にも有用である。検出可能成分で標識付けした抗体は、動物に、好ましくは、血流中に投与でき、宿主中の標識付けした抗体の存在と位置がアッセイされる。抗体は、動物中で、当技術分野で既知の核磁気共鳴、放射線医学、または他の検出手段によって検出可能な任意の成分で標識付けできる。
【０１６６】
本発明のＦＧＦ２１変異体抗体は、治療薬として使用できる。これらの治療薬は、通常、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドの少なくとも１つの生物活性を、それぞれ強化または低減する点でアゴニストまたはアンタゴニストである。一実施形態では、本発明のアンタゴニスト抗体は、インビボまたはインビトロで、特異的にＦＧＦ２１変異体ポリペプチドに結合でき、また、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドの機能活性を抑制または除去できる抗体またはその結合断片である。一部の実施形態では、アンタゴニスト抗体は、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドの機能活性を少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約８０％抑制する。別の実施形態では、抗ＦＧＦ２１変異体抗体は、インビトロまたはインビボで、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドとＦＧＦ受容体間の相互作用に干渉し、これによりＦＧＦ２１変異体ポリペプチド活性を抑制または除去できる。アゴニストおよびアンタゴニスト抗ＦＧＦ２１変異体抗体は、当技術分野でよく知られたスクリーニングアッセイにより特定される。
【０１６７】
また、本発明は、生物試料中のＦＧＦ２１変異体ポリペプチドレベルを検出するためのＦＧＦ２１変異体抗体および有用な他の試薬を含むキットに関する。そのような試薬には、検出可能な標識、ブロッキング血清、陽性および陰性対照試料、ならびに検出試薬が含まれうる。
【０１６８】
（実施例）
以下の実施例は、本発明の具体的実施形態、およびその種々の使用の説明のためのものである。これらは、説明の目的にのみ記述されており、本発明の範囲を多少なりとも制限すると解釈すべきではない。
【実施例１】
【０１６９】
ＦＧＦ２１発現構築物の調製
成熟ＦＧＦ２１ポリペプチドをコードする核酸配列を、成熟ＦＧＦ２１配列の５’および３’末端に対応するヌクレオチド配列を有するプライマーを使って、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅により得た。表１１に成熟ＦＧＦ２１配列を増幅するために使用したプライマーを示す。
【０１７０】
【表１１】
2012525847.tif 000025
【０１７１】
成熟ＦＧＦ２１発現構築物を調製するために使われるプライマーが、配列の定方向クローニングのための、制限エンドヌクレアーゼ部位（ＮｄｅＩ部位には、細菌発現用のＮ末端メチオニンも含まれる）を適切な発現ベクター（例えば、ｐＥＴ３０（Ｎｏｖａｇｅｎ／ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）またはｐＡＭＧ３３（Ａｍｇｅｎ；Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ、ＣＡ））に組み込んだ。発現ベクターｐＡＭＧ３３は、低複製数Ｒ−１００複製起点、改変ラックプロモーター、およびカナマイシン耐性遺伝子を含む。発現ベクターｐＥＴ３０は、ｐＢＲ３２２由来複製起点、誘導性Ｔ７プロモーター、およびカナマイシン耐性遺伝子を含む。ｐＡＭＧ３３からの発現が高いことが認められたが、ｐＥＴ３０の方が信頼性の高いクローニングベクターであることが見出された。従って、本開示で記載された大抵の構築物は、まず、ｐＥＴ３０で作製し、次いで有効性について選別した。さらに増幅するため、選択した配列をｐＡＭＧ３３に移した。
【０１７２】
ＦＧＦ２１配列を、４０．６５μＬのｄＨ２Ｏ、５μＬのＰｆｕＵｌｔｒａ  ＩＩ反応緩衝液（１０ｘ）、１．２５μＬのｄＮＴＰ  Ｍｉｘ（４０ｍＭ−４ｘ１０ｍＭ）、０．１μＬテンプレート（１００ｎｇ／ｍＬ）、１μＬプライマー１（１０μＭ）、１μＬプライマー２（１０μＭ）、および１μＬのＰｆｕＵｌｔｒａ  ＩＩ融合ＨＳＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を含む反応混合物中で増幅した。増幅反応は、９５℃で２分加熱；次に９５℃で２０秒間、６０℃で２０秒間を１０サイクル（サイクル毎に１℃ずつ下げて）、さらに７２℃で１５秒間／所望の産物のキロベース；次に９４℃で２０秒間を２０サイクル、５５℃で２０秒間、さらに７２℃で１５秒間／所望の産物のキロベース；次に７２℃で３分間、の条件で行った。増幅産物を、制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩ、ＤｐｎＩ、およびＥｃｏＲＩで消化し；適切なベクターに連結し；次にコンピテント細胞に転換した。
【実施例２】
【０１７３】
細菌からのＦＧＦ２１タンパク質の精製
以下の実施例では、野性型ＦＧＦ２１ポリペプチド、切断型ＦＧＦ２１ポリペプチド、ＦＧＦ２１変異体、およびＦＧＦ２１融合タンパク質を含む種々のＦＧＦ２１タンパク質が、細菌発現システムで発現された。特に別段の指定がなければ、以下で記載の発現の後、ＦＧＦ２１タンパク質を、この実施例に示すように精製した。
【０１７４】
細菌封入体から野性型ＦＧＦ２１ポリペプチド、切断型ＦＧＦ２１ポリペプチド、およびＦＧＦ２１変異体を精製するために、２回洗浄封入体（ＤＷＩＢ）を塩酸グアニジンおよびｐＨ８．５のトリス緩衝液中のＤＴＴを含む可溶化緩衝液に溶解した。これを次に室温で１時間混合し、可溶化混合物を尿素、アルギニン、システイン、およびシスタミン塩酸塩を含むｐＨ９．５のリフォールディング緩衝液に加え、５℃で２４時間混合した（例えば、Ｃｌａｒｋｅ、１９９８、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：１５７−６３；Ｍａｎｎａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、２００７、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９７：１５２３−３４；Ｒｕｄｏｌｐｈ  ｅｔ  ａｌ．、１９９７、「折り畳み構造タンパク質」タンパク質の機能：実践的アプローチ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、ｅｄ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）５７−９９；およびＩｓｈｉｂａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．、２００５、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．４２：１−６を参照）。
【０１７５】
可溶化とリフォールディングに続いて、この混合物を０．４５ミクロンフィルターを通して濾過した。次に２０ｐｓｉの膜間差圧（ＴＭＰ）で１０ｋＤ分子量カットオフＰａｌｌ  Ｏｍｅｇａカセットを用い、リフォールディングプールを約１０倍に濃縮し、さらに２０ｐｓｉのＴＭＰで３カラム容量の２０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）を用いて透析濾過した。
【０１７６】
次に、浄化した試料をＱセファロースＨＰ樹脂を使った陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィーに供した。５℃、ｐＨ８．０で、２０ｍＭトリス中の０〜２５０ｍＭＮａＣｌ線形塩傾斜の条件で実施した。ピーク画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析しプールした。
【０１７７】
次に、ＡＥＸ溶出液プールをフェニルセファロースＨＰ樹脂を使った疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）に供した。室温、ｐＨ８．０で０．７Ｍ〜０Ｍアンモニウム硫酸塩の漸減線形勾配を使ってタンパク質を溶出した。ピーク画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し（Ｌａｅｍｍｌｉ、１９７０、Ｎａｔｕｒｅ  ２２７：６８０−８５）、プールした。
【０１７８】
ＨＩＣプールを２０ｐｓｉのＴＭＰの１０ｋＤ分子量カットオフＰａｌｌ  Ｏｍｅｇａ０．２ｍ２カセットを使って７ｍｇ／ｍＬに濃縮した。この濃縮液を５カラム容量の製剤緩衝液、２０ｐｓｉのＴＭＰを使って透析濾過し、次に、回収した濃縮液を５ｍｇ／ｍＬに希釈した。最後にこの溶液をＰａｌｌ  ｍｉｎｉ−Ｋｌｅｅｎｐａｃ０．２μＭポジダインメンブレンを通して濾過した。
【０１７９】
細菌封入体からＦＧＦ２１融合タンパク質およびＦＧＦ２１融合変異体タンパク質を精製するために、２回洗浄封入体（ＤＷＩＢ）を、ｐＨ８．５でトリス緩衝液中に塩酸グアニジンおよびＤＴＴを含む可溶化緩衝液に溶解し、次に室温で１時間混合した。さらに、可溶化混合物を尿素、アルギニン、システイン、およびシスタミン塩酸塩を含むｐＨ９．５のリフォールディング緩衝液に加え、５℃で２４時間混合した（例えば、Ｃｌａｒｋｅ、１９９８、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：１５７−６３；Ｍａｎｎａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、２００７、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９７：１５２３−３４；Ｒｕｄｏｌｐｈ  ｅｔ  ａｌ．、１９９７、「折り畳み構造タンパク質」タンパク質の機能：実践的アプローチ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、ｅｄ．、ＮｅｗＹｏｒｋ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）５７−９９；およびＩｓｈｉｂａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．、２００５、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．４２：１−６を参照）。
【０１８０】
可溶化とリフォールディングに続いて、この混合物を１０ｋＤ透析チューブを使って５倍容量の２０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）に対して透析した。透析リフォールディング物のｐＨを５０％酢酸で５．０に調整し、次に、遠心分離を４Ｋで３０分間行い浄化した。
【０１８１】
次に、浄化した試料をＱセファロースＨＰ樹脂を使った陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィーに供した。５℃、ｐＨ８．０で、２０ｍＭトリス中の０〜２５０ｍＭ  ＮａＣｌ線形塩勾配の条件で実施した。ピーク画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析しプールした。
【０１８２】
次に、ＡＥＸ溶出液プールをフェニルセファロースＨＰ樹脂を使った疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）に供した。室温、ｐＨ８．０で０．６Ｍ〜０Ｍアンモニウム硫酸塩の漸減線形傾斜を使ってタンパク質を溶出した。ピーク画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し（Ｌａｅｍｍｌｉ、１９７０、Ｎａｔｕｒｅ  ２２７：６８０−８５）、プールした。
【０１８３】
ＨＩＣステップ後、プールを６０倍容量の製剤緩衝液で透析した。透析したプールをＰａｌｌ  Ｊｕｍｂｏｓｅｐを使って５ｍｇ／ｍＬに濃縮した。最後にこの溶液をＰａｌｌｍｉｎｉ−Ｋｌｅｅｎｐａｃ０．２μＭポジダインメンブレンを通して濾過した。
【実施例３】
【０１８４】
切断型ＦＧＦ２１タンパク質の調製と発現
表１２に挙げた切断型ＦＧＦ２１タンパク質をコードした構築物を下記のように野性型ＦＧＦ２１発現ベクター（野性型ＦＧＦ２１発現ベクターの構築については実施例１に記載している）のＰＣＲ増幅により調製した。
【０１８５】
【表１２】
2012525847.tif 000026
【０１８６】
切断型ＦＧＦ２１タンパク質構築物を、削除される（切断が起きている）コドン（１つまたは複数コドン）の上流と下流領域に対し相同である配列を有するプライマーを使って調製した。また、このような増幅反応に使われたプライマーは、約１５ヌクレオチドの重複配列を備え、増幅産物を再環状化させる。すなわち、この段階でベクター全体が所望の変異体または切断を有する。
【０１８７】
成熟ＦＧＦ２１配列の位置１のヒスチジン残基の欠失したＦＧＦ２１タンパク質（すなわち、２−１８１切断変異体）をコードする代表的切断型ＦＧＦ２１構築物を、表１３のプライマーを使って調製した。
【０１８８】
【表１３】
2012525847.tif 000027
【０１８９】
表４のプライマーは、下記に示すようにヒスチジン残基の欠失を許容し、上流配列（配列番号９）はＮ末端メチオニンを含む成熟ＦＧＦ２１ポリペプチドの一部であり、２番目の配列はセンスプライマー（配列番号１４）で、３番目、４番目の配列（配列番号１７と１８）はＦＧＦ２１発現構築物の一部であり、また、５番目の配列はアンチセンスプライマー（配列番号１６）である。
【０１９０】
【化１】
2012525847.tif 000028
【０１９１】
切断型ＦＧＦ２１タンパク質構築物を、基本的に実施例１のＰＣＲ条件で調製した。増幅産物を制限エンドヌクレアーゼＤｐｎＩで消化し、次にコンピテント細胞に転換した。得られたクローンの配列を決定し、ポリメラーゼ生成エラーの存在しないことを確認した。
【０１９２】
切断型ＦＧＦ２１タンパク質を、コンピテントＢＬ２１（ＤＥ３）またはＢＬ２１Ｓｔａｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）細胞を特定の切断型ＦＧＦ２１タンパク質をコードした構築物で形質転換して発現させた。形質転換体を４０μｇ／ｍＬカナマイシンを補充したＴＢ培地中で制限曝気下、一晩成長させ、翌朝曝気し、短回復期間の後、０．４ｍＭＩＰＴＧ培地中で誘導した。誘導後、ＦＧＦ２１変異体を１８〜２０時間の遠心分離により回収した。
【実施例４】
【０１９３】
切断型ＦＧＦ２１タンパク質のインビトロ活性
野性型ＦＧＦ２１活性を保持している切断型ＦＧＦ２１タンパク質を特定する実験を、ＥＬＫルシフェラーゼインビトロアッセイで行った。表５は、Ｎ末端またはＮ末端とＣ末端の両方に切断を有するＦＧＦ２１タンパク質で得られた結果をまとめたものである。組換え型ヒト２９３Ｔ腎臓細胞系を使って、ＥＬＫルシフェラーゼアッセイを行った。２９３Ｔ細胞は、β−Ｋｌｏｔｈｏおよびルシフェラーゼレポーター構築物を過剰発現している。また、これらの構築物は、Ｇａｌ４結合部位の５個のタンデム複写物を含むプロモーターにより駆動されるルシフェラーゼレポーターのＧＡＬ４−ＥＬＫ１および５ｘＵＡＳ−Ｌｕｃをコードする配列を含む。β−Ｋｌｏｔｈｏは、ＦＧＦ受容体の活性化および細胞内シグナル伝達の誘導を行い、その後、ＥｒｋおよびＥＬＫリン酸化に導くためにＦＧＦ２１にとって必要な共受容体である。ルシフェラーゼ活性はＥｒｋ／ＥＬＫ１のリン酸化レベルにより調節されており、間接的にモニターし、ＦＧＦ２１活性を定量するために使用される。
【０１９４】
２９３Ｔ細胞を種々の濃度の野性型ＦＧＦ２１またはＦＧＦ２１変異体ポリペプチドと共に６時間培養し、次にルシフェラーゼ活性について細胞溶解物を試験することによりＥＬＫルシフェラーゼアッセイを行った。図１Ａ〜１Ｂは、ＦＧＦ２１切断変異体７−１８１および８−１８１（図１Ａ）、ならびにＦＧＦ２１切断変異体１−１７２、１−１７１、１−１６９、および１−１６４（図１Ｂ）に対し行ったＥＬＫルシフェラーゼ活性アッセイの結果を示す。３−１８１、４−１８１、５−１８１、７−１８１、８−１８１、１−１８０、１−１７８、１−１７７、１−１７６、１−１７５、１−１７４、１−１７３、１−１７２、９−１８１、および１−１４９の各ＦＧＦ２１切断変異体に対しＥＬＫルシフェラーゼアッセイで得られた発光を図２に示す。
【０１９５】
ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを野性型ＦＧＦ２１標準と比較し、野性型ＦＧＦ２１の有効性の少なくとも５０％の有効性を示す変異体をＦＧＦ２１活性を失っていないと見なして表１４で「＋」のマークをつけた。
【０１９６】
【表１４】
2012525847.tif 000029
【０１９７】
まとめると、表１４の結果は、１４以上のアミノ酸残基のＣ末端欠失（すなわち、１−１６７以下のアミノ酸残基を含むＣ末端切断型ＦＧＦ２１タンパク質）によりＦＧＦ２１活性が失われることを示している。さらに、表１４は、７以上のアミノ酸残基のＮ末端欠失（すなわち、アミノ酸残基８−１８１以下のタンパク質を含むＮ末端切断型ＦＧＦ２１タンパク質）によりＦＧＦ２１活性が失われることを示している。当然のことながら、８〜１４残基のＮ末端切断および１２または３２残基のＣ末端切断の両方を有する切断型ＦＧＦ２１タンパク質は、ＥＬＫルシフェラーゼアッセイの活性に欠けることが明らかになった。
【０１９８】
表１４に示したデータと一致して、７アミノ酸残基未満のＮ末端切断を有する切断型ＦＧＦ２１ポリペプチドは、本発明の実施形態を構成する。同様に、１３アミノ酸残基未満のＣ末端切断を有する切断型ＦＧＦ２１ポリペプチドも本発明の実施形態を構成する。
【実施例５】
【０１９９】
切断型ＦＧＦ２１タンパク質のインビボ活性
ＦＧＦ２１は多くの生物学的活性を有し、これには、血糖、インスリン、トリグリセリド、またはコレステロールレベルを下げる能力；体重を減らす能力；またはグルコース耐性、エネルギー消費、またはインスリン感受性を改善する能力、が含まれる。切断型ＦＧＦ２１ポリペプチドに対し、インスリン耐性ｏｂ／ｏｂマウスに切断型ＦＧＦ２１ポリペプチドを導入し、特定の切断型ＦＧＦ２１ポリペプチドの血糖を下げる能力を測定することにより、さらにインビボＦＧＦ２１活性を分析した。試験する切断型ＦＧＦ２１ポリペプチドを、８週齢ｏｂ／ｏｂマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）の腹腔内に注入し、血液サンプルを、一回注入後の種々の時間点、例えば、注入後０、６、２４、７２、１２０、および１６８時間後、に採血した。血糖値をＯｎｅＴｏｕｃｈ  Ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ（ＬｉｆｅＳｃａｎ、Ｉｎｃ．Ｍｉｌｐｉｔａｓ、ＣＡ）で測定し、結果を、ベースライン血糖値（すなわち、時間０での値）に対する血糖の変化率（％）として表した。
【０２００】
一実験の結果を図３に示すが、これは、ＦＧＦ２１切断型変異体８−１８１と９−１８１を注入したマウスで得られた血糖値を示す。この実験では、アミノ酸残基８−１８１を含む切断型ＦＧＦ２１融合タンパク質は、注入後３時間と６時間で、血糖を下げるインビボ活性を示すが、その活性は野性型ＦＧＦ２１の活性より少し低いことが示された。しかし、アミノ酸残基９−１８１を含む切断型ＦＧＦ２１融合タンパク質は、このような活性を示さないこともわかった。従って、切断型ＦＧＦ２１ポリペプチドのインビボ分析により、成熟ＦＧＦ２１のＮ末端から７アミノ酸までの欠失では、分子の生物活性を消滅させないことが示された（成熟ＦＧＦ２１のＮ末端から７アミノ酸の欠失が活性を消滅させるであろうことを示唆している、インビトロ分析とは対照的に）。
【０２０１】
特定のＮ末端切断型ＦＧＦ２１ポリペプチド（例えば、ＦＧＦ２１８−１８１）のインビトロおよびインビボアッセイで得られた異なる結果は、シグナル伝達時のＦＧＦ２１のβ−ＫｌｏｔｈｏおよびＦＧＦ受容体との相互作用により説明できる。特に、ＦＧＦ２１は、チロシンキナーゼを含むシグナル伝達カスケードを開始する共受容体β−ＫｌｏｔｈｏおよびＦＧＦ受容体（ＦＧＦＲ）を含む二重受容体複合体を活性化する。ＦＧＦ２１のＮ末端、ＦＧＦＲの結合と活性化に関与し、一方、ＦＧＦ２１のＣ末端は、β−Ｋｌｏｔｈｏの相互作用に必要であることが示されている（Ｙｉｅ  ｅｔ  ａｌ．、２００９  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５８３：１９−２４）。ＥＬＫルシフェラーゼインビトロアッセイを、共受容体β−Ｋｌｏｔｈｏが過剰発現し、ＦＧＦＲが正常レベルで発現している２９３腎臓細胞を使って行った。ＦＧＦＲの量は、β−Ｋｌｏｔｈｏの量に比べ少なく、従って、２９３細胞中のβ−ＫｌｏｔｈｏのＦＧＦＲに対する比率は非生理学的であり、受容体複合体形成、最終的リガンド結合およびＦＧＦＲの活性化に影響する。２９３インビトロ系は、Ｎ末端切断型ＦＧＦ２１ポリペプチドに対して、より脆弱のように見え、故に、いくつかの試験したＮ末端切断型変異体、例えば、ＦＧＦ２１８−１８１で活性結果の減少が生じている可能性がある。このため、特定のＮ末端切断型ＦＧＦ２１変異体が野性型ＦＧＦ２１活性を保持しているか否かを判定する際、インビボアッセイの場合は、そのＦＧＦ２１変異体の活性は、傾向を示すものであると考えられた。従って、８アミノ酸残基未満のＮ末端切断を有する切断型ＦＧＦ２１ポリペプチドは、本発明に包含される。
【実施例６】
【０２０２】
切断型ＦＧＦ２１融合タンパク質の調製と発現
タンパク質の半減期は、そのタンパク質をＦｃ配列に融合することにより延長することが可能であることから、切断型ＦＧＦ２１ポリペプチドを含む融合タンパク質を調製し分析、した。表１５に挙げた切断型ＦＧＦ２１融合タンパク質をＳＯＥｉｎｇ（重複伸長による遺伝子スプライシング）ＰＣＲにより増幅したＦＧＦ２１配列から調製した。ＦＧＦ２１融合タンパク質を調製し、ヒト免疫グロブリンＩｇＧ１遺伝子のＦｃ部（配列番号１１）がＦＧＦ２１タンパク質のＮ末端またはＣ末端に融合するようにした。
【０２０３】
【表１５】
2012525847.tif 000030
【０２０４】
特に、ＦＧＦ２１融合タンパク質構築物（切断型ＦＧＦ２１融合タンパク質をコードしたものを含む）を基本的には実施例１で使用した反応条件を使って一連の３つの増幅反応で調製した。最初の反応では、一対のプライマーをＮｄｅＩクローニング部位（細菌発現のためのＮ末端メチオニンを含む）、Ｆｃ領域、およびリンカー配列を含む配列を産生するように設計した。第２の反応では、一対のプライマーをリンカーの重畳部分、ＦＧＦ２１コード配列の一部、およびＥｃｏＲＩクローニング部位を含む配列を産生するように設計した。最後に、第３の反応で、一対のプライマーを前の２つの反応の産物を結合するように設計した。Ｆｃ−ＦＧＦ２１１−１８１の構築用の代表的プライマーセットを表１６に挙げる。
【０２０５】
【表１６】
2012525847.tif 000031
【０２０６】
第１の反応の産物を制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化させ、ベクター中に連結した後、コンピテント細胞に転換した。得られたクローンを配列決定し、ポリメラーゼで生じたエラーがないことを確認した。
【実施例７】
【０２０７】
切断型ＦＧＦ２１融合タンパク質のインビボ活性
Ｆｃ配列に融合した切断型ＦＧＦ２１配列を含む融合タンパク質を作製し、インビボ活性試験を行った。切断型ＦＧＦ２１融合タンパク質をＩｇＧ１Ｆｃ分子を切断型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ末端またはＣ末端に融合し単一の連続配列を形成することにより調製した。Ｎ末端とＣ末端融合体の間の区別をするために、Ｆｃ分子がＦＧＦ２１タンパク質のＮ末端に融合したＦＧＦ２１融合タンパク質をＦｃ−ＦＧＦ２１と名付け、Ｆｃ分子がＦＧＦ２１タンパク質のＣ末端に融合したＦＧＦ２１融合タンパク質をＦＧＦ２１−Ｆｃと名付ける。
【０２０８】
ＦＧＦ２１は多くの生物学的活性を有し、これには、血糖、インスリン、トリグリセリド、またはコレステロールレベルを下げる能力；体重を下げる能力；またはグルコース耐性、エネルギー消費、またはインスリン感受性を改善する能力が含まれる。インビボＦＧＦ２１活性を評価するため、ＦＧＦ２１ポリペプチド、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチド、およびＦＧＦ２１融合ポリペプチドをインスリン耐性ｏｂ／ｏｂマウスに導入し、特定のＦＧＦ２１タンパク質の血糖値を下げる能力を測定した。試験するＦＧＦ２１ポリペプチド、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチド、またはＦＧＦ２１融合ポリペプチドを８週齢ｏｂ／ｏｂマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）の腹腔内に注入し、血液サンプルを、一回注入後の種々の時間点、例えば、注入後０、６、２４、７２、１２０、および１６８時間後、に採血した。血糖値をＯｎｅＴｏｕｃｈ  Ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ（Ｌｉｆｅ  Ｓｃａｎ、Ｉｎｃ．Ｍｉｌｐｉｔａｓ、ＣＡ）で測定し、結果を、ベースライン血糖値（すなわち、時間０での値）に対する血糖の変化率（％）として表した。
【０２０９】
一実験結果を図４に示すが、これは、ＰＢＳ対照、アミノ酸残基１−１８１を含む野性型Ｆｃ−ＦＧＦ２１対照、またはアミノ酸残基５−１８１もしくは７−１８１を含む切断型Ｆｃ−ＦＧＦ２１融合タンパク質を注入したマウスで観察された血糖値の変化率（％）を示す。この実験では、注入の６時間後にアミノ酸残基５−１８１または７−１８１を含む切断型Ｆｃ−ＦＧＦ２１融合タンパク質が、野性型Ｆｃ−ＦＧＦ２１の活性に類似した血糖低減活性を示すことが示された。従って、切断型ＦＧＦ２１ポリペプチドのインビボ分析では、成熟ＦＧＦ２１のＮ末端から６アミノ酸までの欠失は分子の生物活性に影響しないことが示された。また、インビボ分析では、しかしながら、切断型ＦＧＦ２１ポリペプチドの血糖低減能力が低下し、注入後２４時間で血糖値がベースラインに戻ったことも示された（類似の結果は野性型ＦＧＦ２１でも得られた）。短時間インビボ活性は、実施例８に記載のようにＦＧＦ２１のタンパク質分解の結果であることが明らかになった。
【０２１０】
別の実験結果を図５に示すが、これは、ＰＢＳ対照、アミノ酸残基１−１８１を含む野性型ＦＧＦ２１−Ｆｃ対照、アミノ酸残基１−１７５を含む切断型ＦＧＦ２１−Ｆｃ融合タンパク質、またはアミノ酸残基１−１７１を含む切断型Ｆｃ−ＦＧＦ２１タンパク質を注入したマウスで観察された血糖値の変化率（％）を示す。この実験は、アミノ酸残基１−１８１を含む野性型ＦＧＦ２１−Ｆｃがグルコース低減活性を維持し、注入後２４時間〜１２０時間の期間にわたって約３０％の血糖値の低下を生じることを示す。アミノ酸残基１−１７１を含む切断型Ｆｃ−ＦＧＦ２１タンパク質では、注入後７２時間にのみ明らかな、遅延した血糖低減活性が示されている。しかし、観察されたこの活性は、野性型ＦＧＦ２１−Ｆｃの活性と同じである。残基１−１７５を含む切断型ＦＧＦ２１−Ｆｃ融合タンパク質はインビボ血糖低減に関して、活性ではない。
【０２１１】
まとめると、本明細書記載の切断実験では、Ｎ末端切断を有する切断型ＦＧＦ２１融合タンパク質は、野性型ＦＧＦ２１融合タンパク質に類似した血糖低減活性を示し、さらに、Ｆｃ分子が切断型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ末端に融合した切断型ＦＧＦ２１融合タンパク質は、切断型ＦＧＦ２１タンパク質のＣ末端に融合した融合タンパク質より高い活性を示すことが示されている。
【実施例８】
【０２１２】
ＦＧＦ２１のインビボ分解の観察
ＦＧＦ２１分解は、実施例７に記載のように、最初、ＦＧＦ２１Ｆｃ融合タンパク質構築物で観察された。インビボ薬物動態学的分析により、マウス中でヒトＦＧＦ２１は急速クリアランスとインビボ分解により、約１時間の短い半減期を有することが示された。従って、ＦＧＦ２１の半減期を延長するため、Ｆｃ配列をＦＧＦ２１ポリペプチドのＮまたはＣ末端に融合した。しかし、Ｆｃ領域の融合は、半減期の課題を完全には解決しなかった。こう言えるのは、Ｆｃ配列をＦＧＦ２１ポリペプチドのＮまたはＣ末端に融合した融合タンパク質（またＦｃ−ＦＧＦ２１融合体、すなわち、Ｆｃ配列が成熟ＦＧＦ２１のＮ末端に融合した場合は特に）では、予期したインビボ有効性が示されず、代わりにｏｂ／ｏｂマウス中でたかだか２４時間の間の血糖低減活性を維持することが認められたためである。図４に記載のように、Ｆｃ−ＦＧＦ２１融合タンパク質は、注入後６時間で約３０〜４０％血糖値を低下させたが、２４時間では血糖値がベースラインレベルまで戻った。
【０２１３】
野性型ＦＧＦ２１のタンパク質分解は、その後研究された結果、Ｆｃ−ＦＧＦ２１融合タンパク質のインビボ活性の急速消滅はＦＧＦ２１のインビボ分解の結果であることが明らかになった。タンパク質分解は、分子のインビボ生物活性の減少およびその結果の短い有効半減期につながる。また、このような分解は、その分子の治療での使用に悪影響を与える。このように、ＦＧＦ２１Ｆｃ融合タンパク質の分解の観察を契機として、ＦＧＦ２１タンパク質のインビボ分解の調査およびこのような分解に耐性のあるＦＧＦ２１変異体の特定が行われるようになった。
【０２１４】
分解の部位を決めるために、雄Ｃ５７Ｂ６マウスに注入後の種々の時点で得た野性型ヒトＦＧＦ２１およびＦＧＦ２１Ｆｃ融合タンパク質についてＬＣ−ＭＳ分析およびエドマン分解法を行った。エドマン分解法は、タンパク質のＮ末端またはＣ末端末端のどちらが分解しているかを確認するのに有益であった。Ｆｃ配列がヒトＦＧＦ２１のＮ末端に融合された場合は、分解が融合分子のヒトＦＧＦ２１部のアミノ酸残基１５１および１５２の間、ならびにアミノ酸残基１７１および１７２の間のペプチド結合で起こることが明らかとなった（上記残基の付番は、融合タンパク質の成熟ＦＧＦ２１配列に基づき、Ｆｃ部は含まれない）。１７１−１７２の位置の分解が最初に起こり、続いて１５１−１５２位置の分解が起こることが見出された。１７１−１７２の分解が律速ステップであり、分子の半減期に関与していると考えられる。Ｆｃ配列がＦＧＦ２１のＣ末端に融合した場合は、分解がアミノ酸残基４および５ならびにアミノ酸残基２０および２１の間のペプチド結合で起こることが明らかとなった。これらの実験の結果として、Ｆｃ配列がＦｃ配列に隣接するＦＧＦ２１配列の部分を分解から保護すると考えられることが明確になった。野性型ＦＧＦ２１およびＦｃ−ＦＧＦ２１融合タンパク質のインビボ分解の分析をカニクイザルを使ってさらに進めた。これらの調査により、アミノ酸残基１７１−１７２のＦＧＦ２１の開裂部位は、カニクイザルにおける分解の主要部位であり、この分解の部位はマウスと霊長類の間で保存されていることが確認された。
【実施例９】
【０２１５】
ＦＧＦ２１タンパク質分解耐性変異体の特定
主要タンパク質分解活性部位である野性型ＦＧＦ２１配列の位置の実験的決定により、適切なＦＧＦ２１変異体が特定され、特異的アミノ酸置換がこれら部位に導入された。アミノ酸置換は、他の種との間のＦＧＦ２１配列保存（実施例８に記載のように）、および他のアミノ酸残基との生化学的保存に基づいた。野性型ＦＧＦ２１タンパク質に導入した、または導入可能なアミノ酸置換のリストを表１７に示す（しかし表１７は代表的なものに過ぎず、他の置換も可能である）。表１７の位置の数字は、成熟ＦＧＦ２１タンパク質（１８１アミノ酸残基から成る）中の残基の位置に対応する。
【０２１６】
【表１７】
2012525847.tif 000032
【実施例１０】
【０２１７】
Ｆｃ−ＦＧＦ２１およびＦＧＦ２１−Ｆｃ分解のインビボ分析
ＦＧＦ２１Ｆｃ融合タンパク質のインビボ安定性を、融合タンパク質をマウスに注入して、種々の時点でマウスから採血し、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）により血清を分析することにより測定した。特に、マウスの腹腔内に、１０ｍｇ／ｋｇのＦｃ−（Ｇ５）−ＦＧＦ２１（配列番号１０７）（大腸菌中で発現し、実施例２に記載のように精製）またはＦＧＦ２１−（Ｇ３）−Ｆｃ（配列番号１０５）（哺乳動物細胞中で発現し、標準的な手法で精製）を注入した。血液を、注入後６、２４、および４８時間の時点でマウスから採取し（表１８）、プロテアーゼ阻害剤混合物（Ｒｏｃｈｅ診断薬）で前処理したＥＤＴＡチューブに集めた。試料を１２、０００ｘｇで１０分間遠心処理して血漿を分離した。ＦＧＦ２１タンパク質を、抗ヒトＦｃアガロース樹脂を使って血液からアフィニティー精製した。
【０２１８】
【表１８】
2012525847.tif 000033
【０２１９】
ＬＣ−ＭＳによる分析に先立ち、Ｆｃ−（Ｇ５）−ＦＧＦ２１およびＦＧＦ２１−（Ｇ３）−Ｆｃタンパク質標準を参照として、アフィニティー精製試料を分析した。タンパク質標準はトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）で還元したものと還元しないものを用意した。還元および非還元標準に対して、ＬＣＱ古典的イオントラップ質量分析計に注入したカラム溶出物を加えたＡＣＥシアノ０．３ｍｍｘ３０ｃｍカラムを使ってＬＣ−ＭＳ分析を行った。還元試料のデコンボリューションスペクトルの方が不純物が少なかったので、ＬＣ−ＭＳ分析の前にアフィニティー精製試料を還元した。
【０２２０】
還元Ｆｃ−（Ｇ５）−ＦＧＦ２１標準ならびに試料Ｄ６、Ｄ２４、およびＤ４８で観察された質量を図６Ａ〜６Ｄに示す。還元ＦＧＦ２１−（Ｇ３）−Ｆｃ標準ならびに試料Ｅ６、Ｅ２４、およびＥ４８で観察された質量を図７Ａ〜７Ｄに示す。一部の標準および試料溶出物をエドマン分解法を使いＬＣ−ＭＳで計測されたタンパク質のＮ末端および断片を確認した。標準および試料のＬＣ−ＭＳ分析結果を表１９に示す。
【０２２１】
【表１９】
2012525847.tif 000034
【０２２２】
表１９で示すように、全アフィニティー精製試料は、わずか６時間の循環後にもある程度の分解を示した。２４時間の循環後、Ｆｃ−（Ｇ５）−ＦＧＦ２１の主要生成物は、アミノ酸残基１−４０４を含む断片で、これはＤとＥの両方の試料で認められた。しかし、Ｅ試料では、ＦＧＦ２１−（Ｇ３）−Ｆｃの主要生成物はアミノ酸残基５−４１０を含む断片であった。試験したこの両方の融合タンパク質に対し、融合タンパク質のＦＧＦ２１部は、タンパク質のＦｃ部に比べ、より分解しやすかった。
【実施例１１】
【０２２３】
タンパク質分解耐性ＦＧＦ２１変異体  および融合タンパク質の調製と発現
表２０のＦＧＦ２１変異体をコードする構築物を以下のように野性型ＦＧＦ２１発現ベクターのＰＣＲ増幅により調製した（野性型ＦＧＦ２１発現ベクターの構築については、実施例１で記載）。リンカーを構築物に含んだ場合は、使われたリンカーは、ＧＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（「Ｌ１５」、配列番号２８）であった。これらの実験の目的は、蛋白質分解に耐性があり、さらに長い半減期を示すＦＧＦ２１変異体を作製することであった。
【０２２４】
【表２０】
2012525847.tif 000035
2012525847.tif 000036
2012525847.tif 000037
【０２２５】
ＦＧＦ２１変異体構築物を、変異させるコドン（単数または複数）の上流および下流の領域に相同な配列を有するプライマーを使って調製した。このような増幅反応に使ったプライマーは、また、約１５ヌクレオチドの重畳配列を提供し、増幅産物の再環状化をさせるものでもあり、すなわち、ベクター全体としては、その時点で所望の変異体を持つことになった。
【０２２６】
位置１７０にネイティブグリシン残基の代わりにグルタミン酸残基を有するＦＧＦ２１変異体をコードするＦＧＦ２１代表的変異体構築物（すなわち、Ｇ１７０Ｅ変異体）を、表２１に示すプライマーを使って調製した。
【０２２７】
【表２１】
2012525847.tif 000038
【０２２８】
表２１に示すプライマーは、以下に示すようにグリシン残基のグルタミン酸残基による置換を可能とし、上流配列がセンスプライマー（配列番号２３）、第２、第３配列（配列番号２５および２７）がＦＧＦ２１発現構築物の一部であり、第４配列がアンチセンスプライマー（配列番号２６）である。
【０２２９】
【化２】
2012525847.tif 000039
【０２３０】
ＦＧＦ２１変異体構築物を、基本的には実施例１に記載のＰＣＲ条件を使って調製した。増幅産物を制限エンドヌクレアーゼＤｐｎＩで消化させ、次にコンピテント細胞に転化させた。得られたクローンを配列決定し、ポリメラーゼ生じたエラーの存在しないことを確認した。本明細書、例えば、実施例６に記載のようにしてＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１およびＦＧＦ２１−（Ｌ１５）−Ｆｃ融合タンパク質を得た。
【０２３１】
ＦＧＦ２１変異体を、コードした特定の変異体をコードした構築物でコンピテントＢＬ２１（ＤＥ３）またはＢＬ２１  Ｓｔａｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）細胞を形質転換することにより発現した。形質転換体を、制限曝気下４０μｇ／ｍＬカナマイシンを補充したＴＢ培地中で一晩成長させ、翌朝通気して短い回復期間の後、０．４ｍＭＩＰＴＧ中で誘導した。ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを誘導の１８〜２０時間後、遠心分離して採取した。
【０２３２】
また、ＦＧＦ２１変異体を予想された免疫原性について分析した。タンパク質に対する免疫応答が、抗原処理、および主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ結合部位での提示により強化される。この相互作用は、タンパク質を認識する抗体の成熟時のＴ細胞の助けのために必要である。ＭＨＣクラスＩＩ分子の結合部位は特徴が解析されているので、一連の共通のヒト対立遺伝子に結合できる特異的配列を有するかどうかを予測することが可能である。参考文献およびＭＨＣクラスＩＩ結晶構造に基づいてコンピュータアルゴリズムを作成し、直鎖アミノ酸ペプチド配列が、免疫耐性を壊す可能性を有するかどうかを判定した。ＴＥＰＩＴＯＰＥコンピュータプログラムを用いて、点変異、特に、ＦＧＦ２１変異体が大部分のヒトで抗原特異的Ｔ細胞を増やすかどうかを判定した。各ＦＧＦ２１変異体の直鎖タンパク質配列の分析では、いずれの変異体に対しても、免疫原性を強化するということは予測されなかった。
【実施例１２】
【０２３３】
ＦＧＦ２１分解のリンカー配列に及ぼす影響
Ｆｃ配列とＦＧＦ２１配列の間のさらに長いアミノ酸リンカーの存在がＦＧＦ２分解に影響するかどうかを判定するために、Ｆｃ領域がＦＧＦ２１配列から、配列ＧＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（「Ｌ１５」と命名：配列番号２８）を有する１５アミノ酸リンカーにより離されているＦＧＦ２１融合タンパク質をマウスに注入し、マウスから血液を種々の時点で採取して、血清をＬＣ−ＭＳで分析した。特に、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１またはＦＧＦ２１−（Ｌ１５）−Ｆｃ（大腸菌から入手）の２３ｍｇ／ｋｇをマウスに注入し、血液を６、２４、および４８時間で採血後、抗ヒトＦｃアガロース樹脂を使って採取血液をアフィニティー精製した。
【０２３４】
精製試料のＬＣ−ＭＳ分析の前に、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１およびＦＧＦ２１−（Ｌ１５）−Ｆｃタンパク質標準を参照として分析した。タンパク質標準をＴＣＥＰで還元したものと還元しないものを用意した。還元および非還元の両標準に対して、ＬＣＱ古典的イオントラップ質量分析計に注入したカラム溶出物を加えたＡＣＥシアノ０．３ｍｍｘ３０ｃｍカラムを使ってＬＣ−ＭＳ分析を行った。還元試料のデコンボリューションスペクトルの方が不純物が少なかったので、ＬＣ−ＭＳ分析の前にアフィニティー精製試料を還元した。
【０２３５】
種々の時点で採血された還元Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１標準および対応するアフィニティー精製試料に対する観察された質量を図８Ａ〜８Ｄに示す。種々の時点で採血された還元ＦＧＦ２１−（Ｌ１５）−Ｆｃ標準および対応するアフィニティー精製試料に対する観察された質量を図９Ａ〜９Ｄに示す。一部の標準および試料溶出物をエドマン分解法を適用し、ＬＣ−ＭＳで観察されたタンパク質のＮ末端を確認し、断片が何であるかを予測するのに役立てた。標準および試料のＬＣ−ＭＳ分析結果、および予測断片の目安を表２２に示す。
【０２３６】
【表２２】
2012525847.tif 000040
【０２３７】
表２２で示すように、全アフィニティー精製試料は、わずか６時間の循環後にもある程度の分解を示した。２４時間の循環後、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１の主要生成物は、アミノ酸残基１−４１４（試料の８５％）と１−３９４（試料の１５％）を含む断片で、ＦＧＦ２１（１５）Ｆｃの主要生成物は、アミノ酸残基１−４２３（試料の４０％）、６−４２３（試料の３５％）、および２２−４２３（試料の２５％）を含む断片であった。Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１とＦＧＦ２１−（Ｌ１５）−Ｆｃタンパク質の特定された開裂点を、図１０Ａおよび１０Ｂにそれぞれ示す。
【実施例１３】
【０２３８】
注入１〜７日後のタンパク質分解耐性Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１変異体のインビボ活性
本明細書に記載のように、ＦＧＦ２１Ｆｃ融合タンパク質のタンパク質開裂は、Ｆｃ配列の向きに依存し、融合タンパク質のＦｃ末端は融合タンパク質のＦＧＦ２１末端よりも安定性が高い（すなわち、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１融合タンパク質のＮ末端部分およびＦＧＦ２１−（Ｌ１５）−Ｆｃ融合タンパク質のＣ末端部分が、より安定であることが見出された）。例えば、開裂は、ＦＧＦ２１−（Ｌ１５）−Ｆｃの位置５と２１およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１の位置１５１と１７１で特定された。
【０２３９】
観察の結果に基づき、調査を行い、タンパク質分解耐性ＦＧＦ２１変異体を特定した。Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１のＬＣ−ＭＳ分析では、インビボでのタンパク質分解は、最初、アミノ酸残基１７１−１７２の間で起こり、次いで、アミノ酸残基１５１−１５２間で分解が起こることが示されている。位置１７１のタンパク質分解を阻止することにより、位置１５１での開裂を抑制でき、効果的に分子の半減期を延長できる。しかし、位置１５１で開裂を防いだタンパク質分解耐性変異体は、いまだプロテアーゼの攻撃を受けやすい位置１７１に残基があり、そのため、終端部の１０アミノ酸の欠失がある分子が生成しており、これが、共受容体β−Ｋｌｏｔｈｏの結合に関与し、また、β−Ｋｌｏｔｈｏがリガンド受容体親和性ならびにインビトロおよびインビボ効力の決定因子であることが知られている。従って、成熟ＦＧＦ２１の位置１７１周辺のアミノ酸残基の変異生成は、分子のインビボ安定性、効力、および有効性を改善するためにさらに重要であるようである。
【０２４０】
特定のタンパク質分解耐性Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１変異体のインビボ活性を、ＦＧＦ２１変異体をｏｂ／ｏｂマウスに腹腔内投与し、注入から０、０．２５、１、３、５、および７日後の時点で注入したマウスから試料を採血した後、試料の血糖値を測定することにより試験した。一実験の結果を図１１に示すが、これには、ＰＢＳ対照、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（配列番号４９）対照、またはＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１変異体のＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ（配列番号５１）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ａ（配列番号５３）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｓ１７２Ｌ（配列番号５５）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｇ１７０Ｅ、Ｐ１７１Ａ、Ｓ１７２Ｌ）（配列番号５９）、またはＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１５１Ａ（配列番号６１）を注入したマウスで測定した血糖値を示す。図１２には、この実験で得られた血糖値の変化率（％）を示す。この実験では、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ａ、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｓ１７２Ｌ、およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｇ１７０Ｅ、Ｐ１７１Ａ、Ｓ１７２Ｌ）変異体は、５日目まで血糖低減活性の維持を示し、これは、野性型Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１の活性より優れている。Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１５１Ａ変異体は、野性型Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１融合タンパク質に比べ血糖低減活性持続時間をわずかに改善した。驚くべきことに、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｓ１７２Ｌ変異体はタンパク質分解耐性変異体ではなく、しかもそのため野性型Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１ポリペプチドと類似の分解プロファイルを有するにも拘わらず、この変異体は、野性型Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１ポリペプチドに比べ、インビボ効力の改善を示すことが明らかとなった。
【０２４１】
別の実験の結果を図１３に示すが、これは、ＰＢＳ対照、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１対照、またはＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１変異体のＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｐ１５０Ａ、Ｇ１５１Ａ、Ｉ１５２Ｖ）（配列番号６５）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ（配列番号５１）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｇ１７０Ｅ、Ｐ１７１Ａ）（配列番号６３）、もしくはＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｇ１７０Ｅ、Ｓ１７２Ｌ）（配列番号６７）を注入したマウスで測定した血糖値を示す。図１４は、この実験で得られた血糖値の変化率（％）を示す。上述の実験と同様に、野性型Ｆｃ−ＦＧＦ２１融合タンパク質およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｐ１５０Ａ、Ｇ１５１Ａ、Ｉ１５２Ｖ）変異体は、血糖低減活性の維持を示さず、これはおそらく１７１部位での分解がまだ起こっている可能性があるためと思われ、また、これらのタンパク質を注入した動物の血糖値は、注入後２４時間でベースラインに戻った。しかし、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｇ１７０Ｅ、Ｐ１７１Ａ）、またはＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｇ１７０Ｅ、Ｓ１７２Ｌ）は、注入後５日までは最大の血糖低減活性を示し、これは、野性型Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１融合タンパク質およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｐ１５０Ａ、Ｇ１５１Ａ、Ｉ１５２Ｖ）変異体より優れている。
【０２４２】
別の実験の結果を図１５に示すが、これは、ＰＢＳ対照またはＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１変異体のＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ（配列番号５１）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ａ（配列番号６９）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｃ（配列番号７１）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｄ（配列番号７３）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｎ（配列番号７５）、もしくはＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｓ（配列番号７７）を注入したマウスで測定した血糖値を示す。図１６は、この実験で得られた血糖値の変化率（％）を示す。この実験で試験した全てのＦＧＦ２１変異体が、注入後５日まで血糖低減活性の維持を示した。
【０２４３】
別の実験の結果を図１７に示すが、これは、ＰＢＳまたはＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１変異体のＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ（配列番号５１）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｅ（配列番号７９）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｈ（配列番号８１）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｑ（配列番号８３）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｔ（配列番号８５）、もしくはＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｙ（配列番号８７）を注入したマウスで測定した血糖値を示す。図１８は、この実験で得られた血糖値の変化率（％）をしめす。この実験で試験した全てのＦＧＦ２１変異体が、野性型Ｆｃ−ＦＧＦ２１に比べ血糖低減活性の改善を示した。
【実施例１４】
【０２４４】
注入後６〜１２０時間でのタンパク質分解耐性Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１変異体のインビボ分解
選択ＦＧＦ２１変異体のインビボ安定性をＦＧＦ２１変異体をマウスに注入し、種々の時点でマウスから採血した後、血清をＬＣ−ＭＳで分析することにより解析した。特に、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ａ、またはＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｓ１７２Ｌ変異体（実施例２に示すように大腸菌から入手）を、それぞれを注入前に約１８０μＬの１０ｍＭＨＣｌ中に希釈して注入し、血液を６、２４、４８、７２、および１２０時間目に採取した。ＦＧＦ２１タンパク質を抗ヒトＦｃアガロース樹脂カラムを使って採取血液からアフィニティー精製した。試料を１０ｍＭ  ＨＣｌを使ってカラムから溶出した。全てのＦＧＦ２１構築物は、ＦＧＦ２１タンパク質のアミノ末端にＦｃ領域および１５アミノ酸リンカーを含んでいる。また、マウスに野性型ＦＧＦ２１対照も注入した。
【０２４５】
アフィニティー精製試料をＬＣ−ＭＳで分析する前に、未処理野性型ＦＧＦ２１および未処理ＦＧＦ２１変異体を参照として分析した。全ての標準および各時点の試料をＴＣＥＰで還元し、次に、ＬＣＱ古典的イオントラップ質量分析計に注入したカラム溶出物を加えたＡＣＥシアノ０．３ｍｍｘ３０ｃｍカラムを使ってＬＣ−ＭＳ分析を行った。アフィニティー精製試料をアンモニウム酢酸塩で希釈し、ＴＣＥＰで還元した後、上述のようにＬＣ−ＭＳで分析した。
【０２４６】
野性型Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１に対する注入後０、６、２４、および４８時間時点で観察された質量を図１９Ａ〜１９Ｄに、それぞれ示す。Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅに対する注入後０、６、２４、および４８時間時点で観察された質量を図２０Ａ〜２０Ｄに、それぞれ示す。Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ａに対する注入後０、６、２４、および４８時間時点で観察された質量を図２１Ａ〜２１Ｄに、それぞれ示す。Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｓ１７２Ｌに対する注入後０、６、２４、および４８時間時点で観察された質量を図２２Ａ〜２２Ｄに、それぞれ示す。
【０２４７】
７２および１２０時間で採血された全ての試料は高分子量（非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使って測定２００ｋＤａ超）のフィブリノーゲン成分を残りのＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１融合タンパク質よりも遙かに豊富に含んでいることが明らかになった。他の標準および試料のＬＣ−ＭＳ分析の結果を表２３に示す。
【０２４８】
【表２３】
2012525847.tif 000041
【０２４９】
表２３に示されるように、野性型Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１およびＳ１７２Ｌ変異体の分解は、２４時間の循環後、融合タンパク質の主要生成物が、アミノ酸残基１−４１４を含む断片である点で類似しているように見える。Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０ＥおよびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ａ変異体の分解生成物は、また、２４時間の循環後の採血試料が、７０〜８０％のインタクトタンパク質（アミノ酸１−４２４）および２０〜３０％のアミノ酸残基１−４２１を含む断片を含む点で類似しているように見える。４８時間後でも、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０ＥおよびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ａ変異体は、まだ、インタクトタンパク質を保持しているが、一方、アミノ酸残基１−４２１を含む断片の量は増加を示している。Ｆｃ−ＦＧＦ２１構築物の前の分析で観察されたように、融合タンパク質のＦＧＦ２１部の分解が検出され、Ｆｃ部が安定な状態で残されることがわかった。野性型、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ａ、およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｓ１７２Ｌに対して特定された開裂部位を図２３Ａ〜２３Ｄに、それぞれ示す。
【実施例１５】
【０２５０】
凝集低減ＦＧＦ２１変異体の特定
野性型ＦＧＦ２１の１つの特性は、凝集傾向である。この特性の観点から、凝集低減ＦＧＦ２１変異体を作製することが望ましい。凝集低減ＦＧＦ２１変異体を、２つの仮説に基づいて特定した。第１の仮説は、ＦＧＦ２１に関して、凝集（または二量体化）は、親水性の水ベース溶媒環境に曝された疎水性の残基に起因するＦＧＦ２１分子間の疎水性の相互作用およびファンデルワールス相互作用が引き金になっているということである。第２の仮説は、これらの曝された疎水性の残基が置換されて、ＦＧＦ２１活性を損なうことなくＦＧＦ２１アミノ酸配列中の凝集低減点変異を生成することができるということである。
【０２５１】
系統的、合理的なタンパク質工学の取り組みによりＦＧＦ２１の疎水性残基を特定した。曝された疎水性残基を特定するのに使える既知のＸ−線またはＮＭＲのＦＧＦ２１構造がないので、タンパク質Ｄａｔａｂａｎｋ（ＰＤＢ）から入手したＦＧＦ１９（１ＰＷＡ）の高解像度（１．３Å）Ｘ−線結晶構造とＭＯＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ；Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ；Ｍｏｎｔｒｅａｌ、Ｑｕｅｂｅｃ、Ｃａｎａｄａ）モデリングソフトウェアを使って、ＦＧＦ２１の３Ｄ相同性モデルを作成した。ＰＤＢに寄託されているタンパク質の中でＦＧＦ１９がアミノ酸配列相同性の観点からＦＧＦ２１と最も密接に関係するタンパク質であることから、ＦＧＦ１９をテンプレートとして選択した。
【０２５２】
溶媒露出度をＭＯＥを用いて次の方法で計算した。最初の表面積の測定値（ＳＡ１）は、残基の接触可能表面積（Å２の単位）として定義された。特定のアミノ酸残基がタンパク質の一次配列中に繰り返し出現するが、特に、残基のタンパク質表面への近接度、残基側鎖の配向性、および隣接アミノ酸残基の空間的位置の差によって、出現のたび毎に残基が異なる表面積を有する可能性がある。従って、第２の表面積（ＳＡ２）の測定は、目的残基をその残基の近接、または隣接残基と共にタンパク質構造から抽出して行った。これら空間的に隣接した残基は、コンピュータシミュレーションによりグリシンに変異させて側鎖を除去し、次に目的残基のＳＡ２を計算して、特定の配置にある残基に対する可能性のある全体表面積の測定値を求める。次に、ＳＡ１のＳＡ２に対する比率（ＳＡ１／ＳＡ２）から、その残基が実際に曝される面積比率（％）の測定値を得ることができる。
【０２５３】
さらなる分析のために、高度に溶媒に曝されるいくつかの疎水性残基を選択し、コンピュータシミュレーションによりこれらの残基に対し点変異を作り、選択した残基を他の天然アミノ酸残基と置換した。異なる置換から得られるタンパク質熱安定性の変化を、ＦＧＦ２１モデルおよびＣＵＰＳＡＴウエブサイトで提供されている使用説明に従って対話型ウエブベースプログラムＣＵＰＳＡＴ（Ｃｏｌｏｇｎｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｔｏｏｌｓ）を使って計算した。Ｐａｒｔｈｉｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００６、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３４：Ｗ２３９−４２；Ｐａｒｔｈｉｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００７、ＢＭＣ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：５４を参照。大きな不安定化または疎水性の変異は、凝集低減点変異ＦＧＦ２１変異体の設計では排除された。親水性および／またはイオン特性の改善を導入する安定化（または、希なケースの、わずかな不安定化）置換を凝集低減ＦＧＦ２１変異体の候補として考慮に入れた。
【０２５４】
この合理的なタンパク質工学の取り組みにより得られたデータの要約を表２４に示すが、これには、また、タンパク質凝集低減と安定性改善が図られたと期待される代表的ＦＧＦ２１変異体も挙げる。
【０２５５】
【表２４】
2012525847.tif 000042
2012525847.tif 000043
【実施例１６】
【０２５６】
凝集低減ＦＧＦ２１変異体および融合タンパク質の調製と発現
表２５の挙げたＦＧＦ２１変異体をコードした構築物を、実施例１１で記載したように野性型ＦＧＦ２１発現ベクターのＰＣＲ増幅により調製した（野性型ＦＧＦ２１発現ベクターの構築については実施例１に記載）。融合タンパク質を本明細書、例えば、実施例６に記載のように、作製した。リンカーを用いた場合は、ＧＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（「Ｌ１５」：配列番号２８）であった。
【０２５７】
【表２５】
2012525847.tif 000044
2012525847.tif 000045
【０２５８】
野性型ＦＧＦ２１、切断型ＦＧＦ２１ポリペプチド、ＦＧＦ２１変異体、およびＦＧＦ２１融合タンパク質を含む種々のＦＧＦ２１タンパク質の凝集をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により試験した。分析する試料を４℃、室温、または３７℃で種々の時間インキュベートした後、ＳＥＣ分析に供した。ＳＥＣカラムを備えたＢｅｃｋｍａｎ  ＨＰＬＣシステムで実験を行った。野性型ＦＧＦ２１に対しては、ＴＯＳＯＨＡＡＳ  ＴＳＫゲル  Ｇ２０００  ＳＥＣカラムと、移動相として２％イソプロピルアルコール含有２ｘＰＢを使った。ＦＧＦ２１  Ｆｃ融合タンパク質およびＦＧＦ２１変異体ポリペプチドに対しては、ＴＯＳＯＨＡＡＳ  ＴＳＫゲル  Ｇ３０００  ＳＥＣカラムと移動相として２ｘＰＢＳを使った。
【実施例１７】
【０２５９】
凝集低減ＦＧＦ２１変異体のインビトロ活性
ＥＬＫルシフェラーゼインビトロアッセイで野性型ＦＧＦ２１活性を維持する凝集低減変異体を特定する実験を行った。ＥＬＫルシフェラーゼアッセイは、実施例４に記載のように行った。図２４Ａ〜２４Ｃは、ＦＧＦ２１変異体のＦＧＦ２１  Ｌ９９Ｒ（配列番号１０９）、ＦＧＦ２１  Ｌ９９Ｄ（配列番号１１１）、およびＦＧＦ２１  Ａ１１１Ｔ（配列番号１１３）（図２４Ａ）；ＦＧＦ２１変異体のＦＧＦ２１  Ａ１２９Ｄ（配列番号１１５）、ＦＧＦ２１  Ａ１２９Ｑ（配列番号１１７）、およびＦＧＦ２１  Ａ１３４Ｋ（配列番号１１９）（図２４Ｂ）；ならびにＦＧＦ２１変異体のＦＧＦ２１  Ａ１３４Ｙ（配列番号１２１）、ＦＧＦ２１  Ａ１３４Ｅ（配列番号１２３）、およびＦＧＦ２１  Ａ１２９Ｋ（配列番号１２５）（図２４Ｃ）に対し行ったＥＬＫルシフェラーゼ活性アッセイの結果を示す。これらの実験の結果では、ＥＬＫルシフェラーゼアッセイの試験によれば、一部の凝集低減変異はＦＧＦ２１活性に悪影響を与えなかったことが示されている。
【実施例１８】
【０２６０】
半減期延長と低レベル凝集を示すＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１組み合わせ変異体の調製と発現
凝集低減ならびにタンパク質分解を阻害して半減期延長を示す変異を含む多くのＦＧＦ２１組み合わせ変異体を調製し、ＩｇＧ１Ｆｃ分子（配列番号１１）に複合化した。これらのＦＧＦ２１変異体は、基本的に実施例１１記載のように調製した。
【実施例１９】
【０２６１】
半減期延長と低レベル凝集を示すＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１変異体のインビトロ調査
ＥＬＫルシフェラーゼインビトロアッセイで野性型ＦＧＦ２１活性を維持するＦＧＦ２１組み合わせ変異体を特定する実験を行った。ＥＬＫルシフェラーゼアッセイは、実施例４に記載のように行った。
【０２６２】
図２５Ａ〜２５Ｄは、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１変異体のＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｇ、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｓ、およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｔ（図２５Ａ）；Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１変異体のＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｙ、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｗ、およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｃ（図２５Ｂ）；Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ａ４５Ｋ、Ｇ１７０Ｅ）、およびＦＧＦ２１  Ａ４５Ｋ（図２５Ｃ）；ならびにＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｅ、およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ａ４５Ｋ、Ｇ１７０Ｅ）（図２５Ｄ）に対し行ったＥＬＫルシフェラーゼ活性アッセイの結果を示す。これらの実験の結果では、安定性、または安定性と溶解性両方の改善を狙った変異は、野性型Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１に比べて、インビトロ活性を損なうことはなかったことが示されている。興味深いことには、ＦＧＦ２１  Ａ４５Ｋ変異体は、野性型Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１に比べて効力改善を示した。
【０２６３】
図２６Ａは、６５ｍｇ／ｍＬタンパク質の４℃での１、２、および４日間のインキュベーション後のＦＧＦ２１対照（ＷＴ）およびＦＧＦ２１  Ａ４５Ｋに対する凝集割合の変化を示す。データでは、Ａ４５Ｋ変異が、野性型タンパク質に比べて、タンパク質の凝集低減につながっていることが示された。
【０２６４】
図２６Ｂは、６５ｍｇ／ｍＬタンパク質の４℃での１、６、および１０日間のインキュベーション後のＦＧＦ２１対照（ＷＴ）ならびにＦＧＦ２１  Ｐ７８Ｃ、ＦＧＦ２１  Ｐ７８Ｒ、ＦＧＦ２１  Ｌ８６Ｔ、ＦＧＦ２１  Ｌ８６Ｃ、ＦＧＦ２１  Ｌ９８Ｃ、ＦＧＦ２１  Ｌ９８Ｒ、ＦＧＦ２１  Ａ１１１Ｔ、ＦＧＦ２１  Ａ１２９Ｄ、ＦＧＦ２１  Ａ１２９Ｑ、ＦＧＦ２１  Ａ１２９Ｋ、ＦＧＦ２１  Ａ１３４Ｋ、ＦＧＦ２１  Ａ１３４Ｙ、およびＦＧＦ２１  Ａ１３４Ｅの凝集割合の変化を示す。このデータでは、ＦＧＦ２１  Ｌ８６Ｃ、ＦＧＦ２１  Ｌ９８Ｃ、ＦＧＦ２１  Ｌ９８Ｒ、ＦＧＦ２１  Ａ１１１Ｔ、ＦＧＦ２１  Ａ１２９Ｑ、およびＦＧＦ２１  Ａ１２９Ｋ変異が、野性型タンパク質に比べて、タンパク質凝集低減につながることが示された。
【０２６５】
図２７は、ヒトＦＧＦ２１対照、ならびにＦＧＦ２１変異体のＦＧＦ２１  Ａ４５Ｋ、ＦＧＦ２１  Ｌ５２Ｔ、およびＦＧＦ２１  Ｌ５８Ｅに対し行ったＥＬＫルシフェラーゼ活性アッセイの結果を示す。この実験では、ＦＧＦ２１  Ａ４５Ｋ変異体は野性型ＦＧＦ２１の全効力を保持し、野性型ＦＧＦ２１よりも高い効力さえも示すことが示されている。しかし、ＦＧＦ２１  Ｌ５２Ｔ、およびＦＧＦ２１  Ｌ５８Ｅ変異体では、野性型ＦＧＦ２１に比べ、効力と有効性の低下が示されている。
【０２６６】
図２８Ａ〜２８Ｂは、４℃で１、４、および８日間のインキュベーション後の、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１変異体のＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（６−１８１、Ｇ１７０Ｅ）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ａ４５Ｋ、Ｇ１７０Ｅ）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１Ｐ１７１Ｅ、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ａ、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ、およびＦＧＦ２１対照に対する凝集レベルの変化を示す。この実験では、８日間にわたって、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ａ４５Ｋ、Ｇ１７０Ｅ）変異体がＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０ＥまたはＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｅ変異体より少ない凝集を示したが、この３つの変異体の全てが、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１対照より少ない凝集であったことが示されている。表２６は、４℃または室温で０、２、３、４、または７日間のインキュベーション後の、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１対照およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ａ４５Ｋ、Ｇ１７０Ｅ）変異体で得られた凝集割合を示す。
【０２６７】
【表２６】
2012525847.tif 000046
【実施例２０】
【０２６８】
Ｆｃ−ＦＧＦ２１融合組み合わせ変異体の調製と発現
上述のように、ＦＧＦ２１の安定性と溶解性は、特異的切断およびアミノ酸置換を導入して調節可能である。さらに、ＦＧＦ２１安定性は、このように改変したＦＧＦ２１タンパク質をヒト免疫グロブリンＩｇＧ１遺伝子のＦｃ部と融合させることによりさらに強化できる。その上、上記改変の組み合わせを導入することにより、安定性と溶解性の両方を強化したＦＧＦ２１分子を作製することができる。配列表２７のＦＧＦ２１組み合わせ変異体をコードする核酸を前述の技術を使って調製した。リンカーを採用した場合には、Ｌ１５リンカー、ＧＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２８）を用いた。
【０２６９】
【表２７】
2012525847.tif 000047
【０２７０】
図２９は、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１組み合わせ変異体Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ａ４５Ｋ、Ｇ１７０Ｅ）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ａ４５Ｋ、Ｐ１７１Ｇ）、またはＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）を注入したマウスで測定した血糖値を示す。
【０２７１】
別の実験では、ＦＧＦ２１変異体のＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）を野性型成熟ＦＧＦ２１およびＦｃ−ＦＧＦ２１と一緒に調査した。一実験では、組換え型２９３Ｔ細胞株を異なる濃度のＦＧＦ２１、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１、またはＦｃ−（Ｌ１５）ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）の存在下、６時間培養した。次に、細胞溶解液のルシフェラーゼ活性アッセイを行った。図３０に示すように、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）は、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１と類似の活性を有し、２つの点変異の導入による分子のインビトロ活性の変化がなかったことが示された。
【０２７２】
また別の実験では、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）の６５ｍｇ／ｍＬでの安定性を２つの異なる温度、すなわち、室温と４℃で９日間、ＦＧＦ２１およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１と一緒に評価した。インキュベーション期間後、細胞溶解液をＳＥＣ−ＨＰＬＣで分析し、種々の温度で時間に対する凝集プロファイルを測定した。図３１Ａと３１Ｂのデータは、凝集形成速度がＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）において、室温（図３１Ａの中実三角形、点線）および４℃（図３１Ｂの中実三角形、点線）で大きく減少したことを示している。
【実施例２１】
【０２７３】
Ｃ末端変異を含むタンパク質分解耐性ＦＧＦ２１変異体
また、組み合わせ変異体のインビボ安定性を調査した。特定的には、マウスおよびカニクイザルモデルにおけるＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）のインビボ安定性をＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１の安定性と比較した。その結果から両種が類似していることがわかった。カニクイザルの調査では、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１を２３．５ｍｇ／ｋｇで静脈注入し、一定分量の血清と血漿を投与後８４０時間の時点まで採取した。１６８時間までの時点の試料を分析した。各時点での試料を抗Ｆｃ試薬を使いアフィニティー精製した後、ＭＡＬＤＩ質量分析を使って分析した。両分析の結果の間でよい相関が得られた。
【０２７４】
免疫親和性ＭＡＬＤＩを使っで得たデータの解析から、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）分子では、Ｐ１７１からＰ１７１Ｇへの変異の結果として、Ｐ１７１部位でのクリッピングがなくなっていることが認められた。しかし、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（図３２）に対して、３Ｃ末端残基までの欠失を生じる、少数のゆっくりとした分解が観察された。他のＦＧＦ２１変異体では、１７１と１７２のアミノ酸残基間のより感受性の高い切断部位が図２０および２１に示すようにブロックされた後で、３つのＣ末端残基位置での少数の切断も観察された。３つのＣ末端残基の切断は、カルボキシペプチダーゼによる連続的な、残基から残基への形での、またはアミノ酸残基１７９−１８０および１８０−１８１位置での非特異的クリッピングを伴うアミノ酸残基１７８および１７９での特異的プロテアーゼ攻撃による、分子のＣ末端からの切断の停止を示している可能性がある。Ｃ末端での２〜３アミノ酸の欠失は、β−Ｋｌｏｔｈｏ結合の減少を引き起こし、最終的に、分子の効力とインビボ活性を低下させる可能性がある。例えば、Ｙｉｅ  ｅｔａｌ．、２００９、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５８３：１９−２４を参照。明らかなＣ末端のカルボキシペプチダーゼ分解に対処するために、種々のＦＧＦ２１変異体ポリペプチドに対するアミノ酸残基「キャップ」付加の影響を調査した。表２８に示したものを含む種々の構築物を作製し、本明細書に記載の技術を使って試験した。表２８には、インビトロＥＬＫルシフェラーゼアッセイの結果をまとめている。
【０２７５】
適切なアミノ酸キャップは、１と１５アミノ酸長さの間、例えば、１、２、３、４、５、１０または１５アミノ酸長さであり得る。任意の数とタイプのアミノ酸をキャップとして採用してよく、例えば、単一プロリン残基、および単一グリシン残基、２つのグリシン残基、５つのグリシン残基、ならびに他の組み合わせでもよい。追加のキャップの実施例をこの実施例および表１９に示す。
【０２７６】
さらに、アミノ酸残基１７８および１７９の明らかなプロテアーゼ攻撃に対処するために、１７９、１８０および１８１の位置のアミノ酸残基の変異を調べた。再度、表２８に示したものを含む種々の構築物を作製し、本明細書に記載の技術を使って試験した。これらの部位で、キャップと変異の組み合わせの影響も調査した。表２８には、代表的構築物を作製し、インビトロＥＬＫ−ルシフェラーゼアッセイ（本明細書に記載のように実施）で調査した結果をまとめている。本明細書で使われている用語に従って、ｈＦｃは、ヒトＦｃ配列（すなわち、配列番号１１）を意味し、Ｌ１５は、１５残基を有するリンカーを指す（すなわち、ＧＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、配列番号２８）。
【０２７７】
【表２８】
2012525847.tif 000048
【０２７８】
図３３は、ＰＢＳ対照、野性型ネイティブＦＧＦ２１、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）ならびにプロリンまたはグリシン残基がＣ末端に付加された、すなわち、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、１８２Ｐ）およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、１８２Ｇ）である２つのキャップ付加分子を注入した糖尿病性ｄｂ／ｄｂマウス（Ｃ５７Ｂ６バックグラウンド）で観察された血糖値の変化率（％）を示す。この実施例では、野性型または変異体ＦＧＦ２１ポリペプチドのＣ末端に残基が付加された場合、残基は、生成タンパク質中のその位置によって参照される。従って、「１８２Ｇ」は、グリシン残基が成熟１８１残基野性型または変異体タンパク質のＣ末端に付加されたことを示す。図３３は、ネイティブＦＧＦ２１が血糖値を６時間低下させたが、調査した３つの全てのＦｃ−ＦＧＦ２１変異体は、血糖低減活性を少なくとも１２０時間持続したことを示す。Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、１８２Ｐ）、すなわち、融合分子のＦＧＦ２１成分のＣ末端にプロリン残基の付加を含む分子、がＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、１８２Ｇ）に比較して、最も効力があるように思われ、最低の血糖値を示した。
【０２７９】
続く実験で、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、１８２Ｇ）およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、１８２Ｐ）のインビボ活性を調査し、Ｃ末端に２つのグリシン付加、すなわち、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、１８２Ｇ、１８３Ｇ）、を含むキャップ付加分子のインビボ活性と比較した。図３４は、ＰＢＳ対照、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、１８２Ｇ、１８３Ｇ）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、１８２Ｇ）およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、１８２Ｐ）を注入したｏｂ／ｏｂマウスで観察された血糖値の変化率（％）を示す。
【０２８０】
図３４に示すように、全ての調査した分子は、ＰＢＳ対照に比べグルコース低減活性を持続した。この実験で、プロリンキャップのない分子、例えば、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）と比較して、Ｃ末端へのプロリン付加のあるＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、１８２Ｐ）がわずかにグルコース低減効力の強化を示したという前の結果（図３３）を確認した。しかし、２つのグリシン残基のＣ末端への付加、例えば、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、１８２Ｇ１８３Ｇ）は、分子のインビボ効力を低減させるようであり、インビボのグルコース低減効果の持続期間を短くした。
【０２８１】
図３５は、ＰＢＳ対照またはＦＧＦ２１変異体ポリペプチドＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ｙ１７９Ｓ）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ｙ１７９Ａ）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｓ）、およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｇ）を注入した糖尿病性ｄｂ／ｄｂマウス（Ｃ５７Ｂ６バックグラウンド）で測定した血糖値の変化率（％）を示す。全ての変異体が、類似の活性持続期間を有する類似のグルコース低減活性を示した。
【０２８２】
図３６は、賦形剤対照、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ｙ１７９Ｆ）、およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）を注入した糖尿病性ｄｂ／ｄｂマウス（Ｃ５７Ｂ６バックグラウンド）で観察した血糖値の変化率（％）を示す。Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）と比較して、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ｙ１７９Ｆ）は、血糖低下に関し効力が低かった。しかし、アミノ酸位置１８０のアラニンがグルタミン酸に変異しているＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）は、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）よりも効力が高く、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）と比較して、さらなる２０％の血糖値の減少を生じさせた。これらのデータは、Ａ１８０Ｅ変異がインビボＣ末端分解を低減させ、そのため、分子のインビボ効力と有効性を改善した可能性があることを示唆している。
【実施例２２】
【０２８３】
アカゲザルを使った研究
Ｆｃ−リンカー−ＦＧＦ２１構築物を本明細書に記載の方法を使って作製した。この構築物は、Ｃ末端でＬ１５：（Ｇｌｙ）５−Ｓｅｒ−（Ｇｌｙ）３−Ｓｅｒ−（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒのリンカー配列（配列番号２８）に融合したＩｇＧ１  Ｆｃ配列（配列番号１１）を含み、さらに、このリンカーがＣ末端で成熟ＦＧＦ２１配列（配列番号４）のＮ末端に融合しており、この融合体に２つの変異、すなわちＬ９８ＲとＰ１７１Ｇが導入されている。次に本明細書に記載のようにこの構築物を発現させ、精製した。２量体型のタンパク質を単離し、分子間ジスルフィド結合により各モノマーのＦｃ領域の間で結合させた。この分子は本実施例２２中では「Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）」と呼び、配列番号４３のアミノ酸配列を有し、配列番号４２によりコードされている。この実施例では、ＦＧＦ２１は成熟型のＦＧＦ２１、すなわち、配列番号４を指す。
【０２８４】
２２．１    研究デザイン
Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）構築物を長期にわたって非糖尿病性雄アカゲザル（ＢＭＩ＞３５）に皮下（「ＳＣ」）投与した。２つの他の群のアカゲザル（群当たりｎ＝１０）を成熟ＦＧＦ２１（すなわち、配列番号４）または賦形剤対照で処置した。
【０２８５】
動物は、いずれの試験化合物の投与の前にも４２日間順化され、次に１０群に分割し、図３７に図示しすように、盲検方式で試験複数の化合物または対照品を皮下注入投与された。要するに、各動物は１日一回、化合物または賦形剤の注入を受けた。ＦＧＦ２１は毎日投与され、他方、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）は毎週投与された。Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）およびＦＧＦ２１用量は、図３７に示すように、２週毎に増やした。体重および食物摂取量を全調査期間にわたりモニターした。委託機関は処置については知らされなかった。
【０２８６】
処置の開始に先立ち、２回の経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）を行った。ＯＧＴＴ１を使って、曲線下面積（ＡＵＣ）と体重に基づいて、動物の分布が類似している３つの等価な群に動物を選別した。２回目のＯＧＴＴ（ＯＧＴＴ２）の結果を使い、最初のＯＧＴＴ（ＯＧＴＴ１）の選別を確認した。最初の試験（ＯＧＴＴ１）と次の試験（ＯＧＴＴ２）が一致しないＯＧＴＴプロファイルを有するアカゲザルは除外した。ＯＧＴＴ１と２の結果を図３８Ａおよび３８Ｂに、ＡＵＣ測定値を図３８Ｃに示す。ベースライン体重を図３８Ｄおよび表２９に示す。
【０２８７】
ＯＧＴＴ３、４、および５を、低、中、高用量の各用量処理の終わりに、２週毎に行った。血液サンプルを空腹動物から毎週集め、グルコース、インスリン、トリグリセリドレベル、ならびに試験化合物レベルの測定に使用した。また、血液サンプルを３週間の休薬期間中に毎週集めた。
【０２８８】
ベースラインＯＧＴＴ１およびＯＧＴＴ２は、正常動物で期待されるグルコースプロファイルを示し、また、３０分で最大血漿グルコースが得られ、３つの異なる群で安定なＡＵＣを示した。
【０２８９】
血漿化学のための空腹時ベースライン値を表２９に示す。血漿化学測定を処置の開始前に集めた血液サンプルで行った。
【０２９０】
【表２９】
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【０２９１】
３つの異なる用量レベルを選択し、ＦＧＦ２１およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）に対し、それぞれ、低用量を０．１および０．３ｍｇ／ｋｇ、中用量を０．３および１ｍｇ／ｋｇ、ならびに高用量を１および５ｍｇ／ｋｇとした。用量レベルを、マウスで観察された用量反応に基づいて、また、投薬治療法をヒトの注射の期待頻度に基づいて選択した。低および中用量に対しては、等モル用量のＦＧＦ２１を使用し、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）の高用量に対しては、５ｍｇ／ｋｇに増やした（すなわち、１ｍｇ／ｋｇＦＧＦ２１用量と等モルとなるであろう３ｍｇ／ｋｇではなく）。
【０２９２】
２２．２  体重に及ぼす試験化合物の効果
この実験では、体重に対する試験化合物の効果を調べるために、３つの異なるアカゲザル群に対し、毎週測定した体重のベースラインからの変化割合を毎週計算した。３週間の休薬期間中にも体重を測定した。各群のベースライン体重値は、表２９に含まれる。
【０２９３】
体重は、試験化合物投与前と後の両方で全調査期間にわたり追調査された。担体動物のベースラインからの体重変化率（％）は時間と共に増加したが、一方、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）およびＦＧＦ２１で処置した動物の体重は、図３９に示すように、６週間の処置期間にわたり用量依存型で減少した。げっ歯類で前に観察されたように（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５８（１）：２５０−９（２００９））、ＦＧＦ２１の処置により統計的に有意に体重が減少した。Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）に曝されている時間がＦＧＦ２１の場合より長く（それぞれ、図４８および図４７）、このことがＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）がＦＧＦ２１より明らかな体重減少を示したという観察に対する可能な説明を提供している。
【０２９４】
２２．３  インスリンレベルに与える試験化合物の効果
インスリンレベルを一晩の絶食または午後の食事の後集めた血液サンプルで測定した。
空腹時血漿のインスリンレベルを、賦形剤、ＦＧＦ２１またはＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）で処置したアカゲザルで毎週および３週間の休薬期間中に測定した。空腹時血液サンプルを、最後のＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）注入の約５日後および最後のＦＧＦ２１注入の約２１時間後、採取した。
【０２９５】
摂食時血漿インスリンレベルを、賦形剤またはＦＧＦ２１高用量処置の第５週と第６週の間のアカゲザルで測定した。摂食時血液サンプルを、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）注入の約３日後、および最後のＦＧＦ２１注入の約２時間後に採取した。図４０は、賦形剤、ＦＧＦ２１およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）の空腹時インスリンレベルに対する全９週間の調査期間にわたる効果を示す。一方、図４１は、５週と６週の間に採取した試料で求めた摂食時インスリンレベルを示す。
【０２９６】
まとめると、２つの最も高い用量では、ＦＧＦ２１およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）の両方が空腹時および摂食時血漿インスリンレベルを統計的に有意に減少させた。グルコースレベルの増加が観察されずにＦＧＦ２１およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）で処置した動物のインスリンレベルが減少したという観察により、インスリン感受性の増加が示唆される。  
【０２９７】
２２．４  試験化合物のＯＧＴＴ（グルコースおよびインスリン）に与える効果
処置開始後、３回のＯＧＴＴ（ＯＧＴＴ３、４および５）を行った。ＯＧＴＴ５グルコースおよびインスリンレベルプロファイルを、最後の２週間の高用量漸増計画に対応する６週間の間、賦形剤、ＦＧＦ２１またはＦｃ−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）で処置した動物で測定した。ＯＧＴＴ５を最後のＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）注入の約７日後、および最後のＦＧＦ２１注入の約２１時間後に行った。ＯＧＴＴ５グルコースおよびインスリンプロファイルを、それぞれ、図４２と図４３に示す。Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）で処置した動物は、図４２に示すように、最高用量および最後の測定時点でのみ、賦形剤処置動物に比較してグルコースクリアランスの改善を示した。最後の投与の終わりに、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）は、グルコースクリアランスの最高の改善を示した。ＦＧＦ２１では、グルコースクリアランスの改善は示されなかった。Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）に曝されている時間は、ＦＧＦ２１に比べ長く（それぞれ、図４８および図４７）、このことが、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）がＦＧＦ２１より明らかなグルコースクリアランス効果を示したという観察に対する可能な説明を提供した。ＯＧＴＴ５の間のインスリンベルは、賦形剤で処置した場合よりＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）で処置した動物で測定した最後の時点で統計的に有意に低下した。
【０２９８】
ベースラインからのグルコースＡＵＣ変化率（％）を、図４４に示すように３つの異なる群のアカゲザルに対して、各低、中、高用量の終わりに行った３回のＯＧＴＴ（ＯＧＴＴｓ３、４および５）について計算した。ＯＧＴＴ５を、最後のＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）注入の約７日後、および最後のＦＧＦ２１注入の約２１時間後に行い、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）が統計的に有意にＡＵＣ５を減少させたことを示した。各群に対するベースラインＯＧＴＴ値を、図３８Ｃに示す。
【０２９９】
空腹時血漿グルコース値をＯＧＴＴが行われなかった日に測定した。３つの群の動物で測定した空腹時血漿グルコース値に統計的に有意な差は認められなかった。
【０３００】
２２．５  試験化合物のトリグリセリドレベルに与える効果
空腹時血漿トリグリセリドレベルの変化率（％）を、賦形剤、ＦＧＦ２１またはＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）で処置したアカゲザルに対し毎週および３週間の休薬期間の間計算した。空腹時血液サンプルを最後のＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）注入の約５日後および最後のＦＧＦ２１注入の約２１時間後に採取した。トリグリセリドレベルを処置の開始後毎週測定した。ベースラインからの変化（％）を図４５に、空腹時ベースライン値を表２９に示す。
【０３０１】
図４５に示すように、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）またはＦＧＦ２１で処置した動物はトリグリセリドレベルの用量依存性減少を示し、ＦＧＦ２１に比べてＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）が最大の低下効果を示した。
【０３０２】
図４６は、賦形剤またはＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）またはＦＧＦ２１で処置した第５週と第６週の間に摂食状態のアカゲザルから得られた試料の血漿トリグリセリドレベルを示す。摂食時血液サンプルをＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）注入の約３日後、および最後のＦＧＦ２１注入の約２時間後に採取した。ＦＧＦ２１およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）で処置した動物の摂食時血漿トリグリセリドレベルは、賦形剤で処置した動物のトリグリセリドレベル（図４６）に比べ、統計的に有意に減少した。  
【０３０３】
２２．６  試験化合物の濃度
およそ当量モル用量レベルを投与した試験化合物の暴露を全調査期間にわたり評価した。Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）の濃度を投与前、および最後の注入の約５日後に測定した。ＦＧＦ２１レベルを投与前、ならびに５、１２、１９、および２６日に測定した。血液サンプルを最後の注入の約２１時間後に採取した。
【０３０４】
各カニクイザル中の試験した化合物の個々の濃度を図４７と４８に示す。図４７に示すように、ＦＧＦ２１処置群の大抵の動物は定量限界未満の濃度であった。図４８は、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）処置群の動物は各投薬段階（同じ用量を２週毎投与）の間で検出可能レベルのＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）を有していたことを示す。Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）に関して、各投薬段階からの平均濃度は、大略、投与量に比例して０．３から５ｍｇ／ｋｇに増加した。各用量漸増段階内の１回目と２回目の毎週投与後の定常濃度からわかるように、両化合物には最小限の蓄積がある。処置なし段階の間（休薬期間）Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）レベルは、約４７日目（最後の投与後１２日）まで検出可能であり、それ以降、定量下限値（ＬＬＯＱ）を下まわった。
【０３０５】
また、試験化合物の暴露を各ＯＧＴＴの間、モニターした。ＦＧＦ２１は、低および中用量ＦＧＦ２１処置後のＯＧＴＴ３および４の間、検出不能であった。しかし、高用量処置後のＯＧＴＴ５の間は、測定可能なレベルが認められた。図４９に示すように、漸増用量レベルに従ってＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）レベルの用量比例的増加がＯＧＴＴ３〜４で観察された。
【０３０６】
化合物レベルデータにより、用量漸増方法で、動物が期待量の各化合物、すなわち、ＦＧＦ２１およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）に曝されたことが確認できる。ＦＧＦ２１測定量で大きなばらつきが観察されたが、最後の投与後約２１時間目でサンプリングしたこと、およびＦＧＦ２１の半減期が約１時間であることを考慮すると、これは予期された結果であった。
【０３０７】
２２．７  結論
ＦＧＦ２１は、空腹時および摂食時血漿トリグリセリドおよびインスリンレベルを低減させ、また、最高用量で体重を減少させた。Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）はＯＧＴＴを改善し、最高用量でインスリンレベルを低減させ、また、空腹時および摂食時血漿トリグリセリドレベルならびに体重を用量依存的に低減させた。ＦＧＦ２１およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）の両方は、非糖尿病性アカゲザルの多くの代謝パラメーターを低減させた。摂食条件下、循環化合物レベルが類似の範囲内にある場合、インスリンおよびトリグリセリドレベルの減少は、ＦＧＦ２１とＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）の間で同等であった。その改善された特性の故に、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）は、大抵の測定パラメーターに関してＦＧＦ２１より優れており、週１回投与して代謝パラメーターに対する有効性を観察することが可能であろう。
【実施例２３】
【０３０８】
Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）Ｆｃ融合分子
リンカーを介してＩｇＧ１Ｆｃ成分に結合しているＦＧＦ２１変異体を含むＦｃ融合体を作製した。Ｆｃ融合体のＦＧＦ２１成分は、ＦＧＦ２１のポリペプチド配列中に操作により作った３つの点変異、すなわち、Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ（付番は成熟型ＦＧＦ２１に基づき、配列番号４とした）を含む。ヒトＦｃ（配列番号１１）をＬ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ変異体ＦＧＦ２１（配列番号３９）のＮ末端にＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３１）の配列を含む１５アミノ酸リンカーを介して複合化することによりこの分子を構築した。この分子を「Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）」と命名し、その完全長アミノ酸配列を図５０の配列番号４７に示す。これは、配列番号４６の核酸によりコードされる。Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）のインビトロ試験で、これが組換え型細胞株過剰発現β−ＫｌｏｔｈｏのＥｒｋリン酸化の強力な刺激薬であることが示された。Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）は、また、野性型ＦＧＦ２１のＦｃ融合体またはＦＧＦ２１−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）のＦｃ融合体（配列番号４５）に比べて強化されたβ−Ｋｌｏｔｈｏ結合親和性を示した。糖尿病性動物モデルに注入した場合、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）は血糖値を低減させ、体重を減らし、さらに、隔週の注入に適した。  
【０３０９】
２３．１  Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）のインビトロ活性
ＥＬＫルシフェラーゼインビトロアッセイにより、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）が野性型ＦＧＦ２または野性型ネイティブＦＧＦ２１のＦｃ融合体と類似の活性を保持しているか否かを調べる実験を行った。  
【０３１０】
ＥＬＫルシフェラーゼアッセイを、組換え型ヒト２９３Ｔ腎臓細胞系を使って行った。この細胞系では、２９３Ｔ細胞がβ−Ｋｌｏｔｈｏおよびルシフェラーゼレポーター構築物を過剰発現している。β−ｋｌｏｔｈｏは、ＦＧＦ２１がＦＧＦ受容体を活性化し、Ｅｒｋリン酸化を含む細胞内のシグナル伝達を誘導するのに必要な共受容体である。Ｅｒｋルシフェラーゼ受容体レポーター構築物は、ＧＡＬ４−ＥＬＫ１および５ｘＵＡＳルシフェラーゼレポーターをコードした配列を含む。５ｘＵＡＳルシフェラーゼレポーターはＧａｌ４結合部位の５つの縦列コピーを含むプロモーターにより駆動される。レポーター活性はリン酸化Ｅｒｋのレベルにより調節されており、ＦＧＦ２１活性を間接的にモニターし定量するために使用される。
【０３１１】
ＥＬＫルシフェラーゼアッセイを、いくつかの濃度の野性型ＦＧＦ２１、野性型ＦＧＦ２１のＦｃ融合体、Ｆｃ−Ｌ１５−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）およびＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）の存在下、２９３Ｔ細胞を６時間培養し、次いで、その細胞溶解液をルシフェラーゼ活性に関し試験することにより行った。各ＦＧＦ２１構築物に対しＥＬＫルシフェラーゼアッセイで得られた発光をｙ軸で示し、化合物濃度をｘ軸で示した。
【０３１２】
図５１は、Ｅｒｋルシフェラーゼアッセイにおける試験化合物の用量反応特性を示す。Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）は、ＦＧＦ２１野性型のＦｃ融合体と比べて類似の活性を保持し、変異のＬ９８Ｒ、Ｐ１７１ＧおよびＡ１８０Ｅとの組み合わせでは、ＦＧＦ２１の生物活性が変化しないことを示唆している。過剰発現共受容体β−Ｋｌｏｔｈｏの細胞ベースアッセイで、ネイティブ野性型ＦＧＦ２１に比較して、Ｆｃ融合体構築物は、効力および最大活性のわずかな低減を示した。
【０３１３】
２３．２異なるリンカー配列を有するＦｃ−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）融合体のインビトロ活性
類似のＦｃ融合類似体を、ヒトＩｇＧ１Ｆｃを異なるリンカー配列、ＧＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２８）を介してＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）に融合することにより作製した。このリンカーをＬ１５と名付け、得られた融合分子を、Ｆｃ−Ｌ１５−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）（配列番号５７）と命名した。この実験では、異なるリンカー配列のＦｃ−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）融合体の活性に与える効果を調査した。
【０３１４】
ＥＬＫルシフェラーゼアッセイを、異なる濃度のＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）およびＦｃ−Ｌ１５−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）の存在下、２９３Ｔ細胞を６時間培養した後、その細胞溶解液のルシフェラーゼ活性を試験することにより行った。Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）は、Ｆｃ−Ｌ１５−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）に類似の活性を示し、異なるリンカー配列、例えば、（Ｇ４Ｓ）３またはＬ１５リンカー、は、Ｆｃ−ＦＧＦ２１融合体の生物活性に大きな影響を与えないことがわかった。  
【０３１５】
２３．３  結合アッセイでのＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）のβ−Ｋｌｏｔｈｏに対するインビトロ結合親和性
Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）のヒトおよびカニクイザルβ−Ｋｌｏｔｈｏに対する結合をＢｉａｃｏｒｅ溶液平衡結合アッセイで試験した。また、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）の親和性を、Ｌ９８ＲおよびＰ１７１Ｇ変異のみを有するＦｃ−融合ＦＧＦ２１類似体、すなわち、Ｆｃ−Ｌ１５−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）と比較した。
【０３１６】
ニュートラアビジンを、アミン結合を使ってＣＭ５チップに固定化した。ビオチン−ＦＧＦ２１を第２フローセルに約１５００ＲＵまで捕捉した。第１フローセルをバックグラウンド対照として使用した。５ｘ希釈（０．０３〜２０００ｎＭ）のＦＧＦ２１変異体を、１０ｎＭヒトまたは２５ｎＭカニクイザルβ−Ｋｌｏｔｈｏと共にＰＢＳ＋０．１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ、０．００５％Ｐ２０中、室温で１時間インキュベートした。ビオチン−ＦＧＦ２１表面上に注入することにより溶液中の遊離β−Ｋｌｏｔｈｏの結合を測定した。１００％β−Ｋｌｏｔｈｏ結合シグナルを、溶液中にＦＧＦ２１変異体が無い状態で測定した。ＦＧＦ２１変異体の濃度増加と共にβ−Ｋｌｏｔｈｏ結合応答が減少することが、β−Ｋｌｏｔｈｏが溶液中でＦＧＦ２１変異体に結合し、β−Ｋｌｏｔｈｏの固定化ビオチン−ＦＧＦ２１表面への結合を阻止していることを示した。その混合物のＦＧＦ２１のモル濃度に対する相対的結合をＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｚｍ  ５を使ってプロットした。ＥＣ５０を同一ソフトに含まれるワンサイト競合非線形フィット（ｏｎｅ  ｓｉｔｅ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ  ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  ｆｉｔ）を使って計算した。
【０３１７】
図５２は、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）およびＦｃ−Ｌ１５−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）のヒト（右）およびカニクイザル（左）β−Ｋｌｏｔｈｏに対するＢｉａｃｏｒｅ溶液平衡結合アッセイの結果を示す。Ｆｃ−Ｌ１５−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）に比較して、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）は、ヒトおよびカニクイザルβ−Ｋｌｏｔｈｏの両方に対する少なくとも２倍の結合活性改善効果を示した。
【０３１８】
２３．４  糖尿病性ｄｂ／ｄｂマウスを使ったＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）のインビボ有効性
Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）が、糖尿病性ｄｂ／ｄｂマウスの血糖低減や体重減等の薬効を発揮することができるのかどうかという疑問について調査した。調査は、また、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）の単回注入後の持続期間および用量反応を調べることも意図されていた。Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）を０．１、０．３、１および３ｍｇ／ｋｇの用量で糖尿病性ｄｂ／ｄｂマウスに腹腔内注入を行った。賦形剤（１０ｍＭトリス、２．２％ショ糖、３．３％ソルビトール、ｐＨ８．５）処置した群もこの調査に含めた。血液サンプルをベースライン（注入前）、ならびに注入後６、２４、７２、１２０、および１６８時間後の時点で各動物（群当たりｎ＝１０）から採取した。血糖値をＯｎｅＴｏｕｃｈ  Ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ（ＬｉｆｅＳｃａｎ、Ｉｎｃ．Ｍｉｌｐｉｔａｓ、ＣＡ）で測定した。体重を、ベースライン（時間０）、ならびに注入後２４、７２、１２０、および１６８時間の時点で測定した。
【０３１９】
図５３Ａは、賦形剤またはＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）注入後の種々の時点でのｄｂ／ｄｂマウス中の血糖値を示す。Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）がｄｂ／ｄｂマウスの血糖値の用量依存的低減をもたらした。最大グルコース減少は、ベースラインから、または賦形剤処置群と比較して、約５０％であった。最大効果は、注入後６時間以内に得られ、注入後１２０時間持続した。約１６８時間で血糖値がベースラインに戻り始めた。Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）の推定ＥＤ５０（最大効果の半分を達成するのに必要な用量）は、ｄｂ／ｄｂマウスで約１ｍｇ／ｋｇであった。
【０３２０】
図５３Ｂは、ｄｂ／ｄｂマウスに単回注入後の、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）の体重に与える効果を示す。結果を時間０（注入前）からの体重の変化で表した。賦形剤処置マウスは、７日間の調査期間の間に、漸進的かつ安定な体重増加を示した。しかし、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）で処置したマウスでは、体重増加速度は、用量依存的に抑制された。用量が多くなればなるほど、増加抑制は長くなった。一実施例では、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）は、体重増加を鈍らせて、５日間で３ｍｇ／ｋｇ、３日間で１ｍｇ／ｋｇ、または１日で０．３ｍｇ／ｋｇとなった。増加速度はその後回復した。Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）の体重減少に対する推定ＥＤ５０は、この実験では、約１ｍｇ／ｋｇであった。
【０３２１】
２３．５異なる注入頻度でのＤＩＯマウスを用いたＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）の有効性比較
この調査は、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）でＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）よりも注入頻度を少なくでき、しかも類似の有効性を達成できるか否かを判断するため行った。この調査は、ＤＩＯマウスにＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）を週一回（Ｑ７Ｄ）もしくは２週に一回（Ｑ１４Ｄ）投与、またはＦｃ−Ｌ１５−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）を週２回（ＢＩＷ）、Ｑ７ＤもしくはＱ１４Ｄ投与して行った。
【０３２２】
ＤＩＯマウスは、４週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスに飽和脂肪酸（Ｄ１２４９２、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、ＮＪ）を多く含んだ脂肪由来のエネルギーが６０％になる高脂肪食を与えることにより調製した。高脂肪食を与えて１２週後、体重と血糖値を測定した。次に、ＤＩＯマウスを、無作為化し、賦形剤または処置群に分け、類似のベースライン平均血糖値と体重になるようにした。全体で７群をこの調査に含めた：Ｑ７Ｄで賦形剤投与；Ｑ７ＤもしくはＱ１４ＤでＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）投与；またはＢＩＷ、Ｑ７ＤもしくはＱ１４ＤでＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）投与。注入を腹腔内に、また調査を３１日間行った。  体重は毎週測定した。ＧＴＴを調査の２８日目に行い、調査を３１日目に終了した。  研究デザインを図５４に図示する。
【０３２３】
図５５は、賦形剤、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）またはＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）により異なる投薬頻度で処置したマウスのＧＴＴプロファイルを示す。グルコース耐性は、賦形剤投与に比較して、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）をＱ７ＤまたはＱ１４Ｄ投与したマウスで統計的に有意に改善されたが、これはＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）が有効であり、ＤＩＯマウスへのＱ１４Ｄ投与に適していることを示唆している。Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）をＢＩＷまたはＱ７Ｄで投与した場合はグルコース耐性を改善したが、Ｑ１４Ｄ投与では改善しなかった。これは、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）のマウスへのＱ１４Ｄ注入の適合性が低い可能性があることを示唆している。Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）のＱ７ＤまたはＱ１４Ｄ投与での有効性は、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）のＢＩＷまたはＱ７Ｄ投与とそれぞれ同等であったが、これはＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）がＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）よりも２倍少ない頻度で投与することが可能であることを示唆している。
【０３２４】
図５６は、賦形剤、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）またはＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）の異なる投薬頻度で処置したマウスのベースライン（ｄａｙ０）からの体重の変化を示す。Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）のＱ７Ｄ投与で処置したマウスは、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）のＢＩＷ投与マウスと同様に、大きく体重減少した。Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）のＱ１４Ｄ投与またはＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）のＱ７Ｄ投与により処置したマウスで体重が中程度に減少した。Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）のＱ１４Ｄ投与処置マウスでは、有意な体重効果が観察されなかった。体重に対する効果は、上述のＧＴＴに対する効果と一致し、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）４−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）のＱ１４Ｄでの投薬が有効であり、同じ効果を得るために、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）よりおよそ２倍少ない頻度の注入で十分であることを示唆している。
【実施例２４】
【０３２５】
ＦＧＦ２１変異体を含むヒドロゲル製剤
タンパク質ベース治療薬の処方剤として、ヒドロゲルは、多くの望ましい特性を提供する。例えば、ヒドロゲルは、ヒドロゲルに組み込まれたタンパク質のネイティブな構造と機能を保存する。さらに、耐容性良好で、また、ポリマーと架橋のタイプによっては、生分解性ともなり得る。さらに、ヒドロゲルは、以前、タンパク質の徐放に使われ成功している。従って、ヒドロゲルを本明細書に開示のＦＧＦ２１変異体に適用可能な１つの送達方法として調査した。
【０３２６】
この実施例中に記載の全ての実験で、ヒドロゲルを以下のように調製した。１．２５％ウシゼラチン（Ｓｉｇｍａ）のＰＢＳ溶液を調製した。架橋剤のメタクリル酸無水物を１６：１、２４：１または３２：１のモル比率（ＭＡのゼラチンに対する比率）で添加した。得られた溶液を水に対して透析して全ての非重合メタクリルアミドを除去し、ヒドロゲル賦形剤を作製した。最終的に、ヒドロゲル賦形剤を凍結乾燥してＦＧＦ２１変異体を含むヒドロゲルを作るまで４℃で貯蔵した。この調製物は、引き続いて本明細書に開示されたいずれかのＦＧＦ２１変異体を含むよう適応させ得るゼラチンベースヒドロゲル賦形剤の調製に使用できる。
【０３２７】
次に、特異的ＦＧＦ２１変異体を含むヒドロゲルを調製した。１０％凍結乾燥メタクリル酸ゼラチンヒドロゲル賦形剤からはじめて、溶液を調製した。ヒドロゲル賦形剤を暖めた後、遠心分離して、凍結乾燥したＭＡゼラチンヒドロゲル賦形剤を溶かし、液化した。次に、選択したＦＧＦ２１タンパク質、（本実施例では、ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）、（配列番号３７））、を液化したゼラチン溶液に所定の濃度まで添加した。ＴＥＭＥＤストック溶液を次に添加した。次に、ＫＰＳストック溶液を添加し、この溶液を穏やかに攪拌した。１ｍｌシリンジに２００μｌまで満たし、１．５〜２時間、室温で固化させた。シリンジを−２０℃で貯蔵し、使用に先立ち４℃で一晩解答した。１０ｍＭトリス、９％ショ糖（ｐＨ８．５）を含み、ＦＧＦ２１変異体が添加されていないヒドロゲル賦形剤を対照として使った。
【０３２８】
インビボ実験の場合は、動物に注入する前に、シリンジを３７℃の加熱パッド上に約１０分間置いた。  
【０３２９】
２４．１  種々の架橋比を有する１０％ヒドロゲルから放出されたＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）のインビトロで活性
実験の目的は、ヒドロゲルから放出されたＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）が、ネイティブ型のＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）と比較して生物学的に活性であるか否かをＥＬＫルシフェラーゼインビトロアッセイにより試験することであった。  
【０３３０】
ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）を調製し、記載のように、１６：１、２４：１および３２：１の架橋比の、メタクリル酸ゼラチンを含む１０％メタクリル酸ゼラチン溶液中に組み込んだ。次に、ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）を放出させるために、ヒドロゲルをインビトロ緩衝液に分散させた。１００または１５０時間後、媒質を集め、ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）活性のインビトロアッセイに供した。分析的アッセイ（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ排除ＨＰＬＣ、および逆相ＨＰＬＣ）により放出されたＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）は、全ての時点で、そのまま無傷であることが示された。
【０３３１】
ＥＬＫルシフェラーゼアッセイを組換え型ヒト２９３Ｔ腎臓細胞系を使って行った。この細胞系では、２９３Ｔ細胞がβ−Ｋｌｏｔｈｏおよびルシフェラーゼレポーター構築物を過剰発現している。β−Ｋｌｏｔｈｏは、ＦＧＦ２１がＦＧＦ受容体を活性化するのに必要な共受容体である。このアッセイに使われるＦＧＦ受容体は２９３Ｔ腎臓細胞内で発現した内在性ＦＧＦ受容体である。ルシフェラーゼレポーター構築物は、ＧＡＬ４−ＥＬＫ１およびルシフェラーゼレポーターをコードした配列を含み、このルシフェラーゼレポーターはＧａｌ４結合部位の５つの縦列コピー（５ｘＵＡＳ−Ｌｕｃ）を含むプロモーターにより駆動される。ルシフェラーゼ活性はＥｒｋ／ＥＬＫ１のリン酸化レベルにより調節され、ＦＧＦ２１活性を間接的にモニターし定量するために使用される。
【０３３２】
ＥＬＫルシフェラーゼアッセイを、異なる濃度のネイティブ型ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）またはヒドロゲルから放出されたＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）の存在下、２９３Ｔ細胞を６時間培養した後、細胞溶解液をルシフェラーゼ活性試験することにより行った。図５７は、インビトロＥＬＫルシフェラーゼアッセイ結果を示す。メタクリル酸ゼラチン架橋比１６：１、２４：１および３２：１のヒドロゲルから放出されたＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）は、生物学的に活性で、ネイティブ型のＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）と同等の活性を有していた。このデータにより、ヒドロゲルが、組み込まれたタンパク質の構造と機能を保存し、放出されたＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）は媒質中で１０〜１５時間経過後も活性で安定であることが示された。
【０３３３】
２４．２  ｏｂ／ｏｂマウスにおける異なる架橋比のヒドロゲルＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）のインビボ有効性
この実験の目的は、メタクリル酸ゼラチン架橋比２４：１および３２：１で調製されたＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）ヒドロゲルが、生物学的に活性なＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）のインビボ徐放を可能とし、最終的に、ネイティブ型のＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）に比較して、より長期間のインビボ有効性を生じるか否かを判断することであった。さらに、インビトロ放出速度の評価に基づいて、より高い架橋比のメタクリル酸ゼラチンが、組み込まれたＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）のより優れた徐放を可能とすることが明らかになった。従って、この実験の別の目的は、メタクリル酸ゼラチン架橋比２４：１および３２：１で調製した２つのＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）ヒドロゲルを比較することであった。
【０３３４】
ＦＧＦ２１は多くの生物学的活性を有し、これには、血糖、インスリン、トリグリセリド、またはコレステロールレベルを下げる能力；体重を減らす能力；またはグルコース耐性、エネルギー消費、またはインスリン感受性を改善する能力が含まれる。ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）ヒドロゲルをインスリン耐性ｏｂ／ｏｂマウスに導入し、ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）ヒドロゲルの血糖低減および体重減少能力を測定した。インビボでの作業の方法は以下の通りに行った。
【０３３５】
ヒドロゲルを上述の方法で調製した。８週齢のｏｂ／ｏｂマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）の注入部位を剪毛し、注入直前にイソフルランとＯ２で麻酔をかけた。ヒドロゲル（０．２ｍｌ）をゆっくり皮下に注入し、注入後、注入部位にＶｅｔｂｏｎｄを適用した。賦形剤（１０ｍＭトリス、９％ショ糖ｐＨ８．５）またはネイティブＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）もこの実験に含め、ヒドロゲルと同様に注入した。麻酔から覚めた後で動物をケージに戻した。血液サンプルを、注入前と注入後の種々の時点、例えば、注入後、０、３、６、２４、７２、１２０、１９２および２６４時間目に、採取した。血糖値を、ＯｎｅＴｏｕｃｈ  Ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ（ＬｉｆｅＳｃａｎ、Ｉｎｃ．Ｍｉｌｐｉｔａｓ、ＣＡ）で測定した。体重もまたモニターした。
【０３３６】
図５８と５９で、実験の結果をまとめる。賦形剤または対照ヒドロゲルに比較して、ネイティブ型のＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）は、注入の３時間と６時間で急速に血糖値を下げた。しかし、ネイティブ型のＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）のインビボ活性は徐々に弱まり、血糖値は注入後２４時間でベースラインに戻った。ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）ヒドロゲルは、早くも注入後３時間で血糖減少を生じ、活性は８日目まで維持された。架橋比２４：１と３２：１の間で有意差はなかった。ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）ヒドロゲル群は、また、賦形剤またはヒドロゲル単独で処置したマウスよりゆっくりした体重増加を示した。これらの結果は、架橋比２４：１および３２：１のメタクリル酸ゼラチンで調製したＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）ヒドロゲルは、生物学的に活性なＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）のインビボ徐放を可能とし、最終的に、ネイティブ型のＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）に比べて、より長い期間にわたるインビボ有効性を生じることを示した。
【０３３７】
２４．３  ｄｂ／Ｂ６マウスにおける異なる架橋比のヒドロゲルＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）およびＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）のインビボ有効性  
ヒドロゲル製剤を、ウシゼラチン（Ｓｉｇｍａ）、いくつかのＦＧＦ２１変異体および構築物、すなわち、ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）およびＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）、を使って調製した。また、ヒドロゲル対照も調製した。０．２ｍＬのヒドロゲルを２１Ｇ針を有する１ｍｌシリンジに入れた。
【０３３８】
上述のように、ヒドロゲル対照およびＦＧＦ２１変異体を含むヒドロゲルを調製した。８週齢のｄｂ／Ｂ６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）の注入部位を剪毛し、注入の直前にイソフルランおよびＯ２で麻酔をかけた。ヒドロゲル（０．２ｍｌ）をゆっくり皮下に注入し、注入後、注入部位にＶｅｔｂｏｎｄを適用した。賦形剤（１０ｍＭトリス、９％ショ糖ｐＨ８．５）またはネイティブＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）もこの実験に含め、ヒドロゲルと同様に注入した。動物を、麻酔から覚めた後、ケージに戻した。血液サンプルを注入前、および注入後の種々の時点、例えば、注入後、０、２４、９６、１６８、２４０、３１２時間の時点で、採取した。血糖値をＯｎｅＴｏｕｃｈ  Ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ（ＬｉｆｅＳｃａｎ、Ｉｎｃ．Ｍｉｌｐｉｔａｓ、ＣＡ）で測定した。また、体重もモニターした。
【０３３９】
実験計画は、以下の通りとした：
動物の群（各群ｎ＝９）
Ａ．  対照ヒドロゲル３２：１（１０％）ＭＡ：ＨＵ４            ２００μｌ
Ｂ．  ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）ヒドロゲル３２：１（１０％）ＭＡ：ＨＵ４    
０．５ｍｇ／マウス（２００μｌ、約１０ｍｇ／ｋｇ）
Ｃ．  ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）ヒドロゲル３２：１（１０％）ＭＡ：ＨＵ４
１．５ｍｇ／マウス（２００μｌ、約３０ｍｇ／ｋｇ）
Ｄ．  Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）（ヒドロゲルなし）    ３ｍｇ／ｋｇ
【０３４０】
種々のパラメーターを測定し、実験結果を図６０〜６３に示す。図６０は、１４日間の実験期間の血糖の変化を示し、図６１は、同じ期間にわたる血糖の変化率（％）を示す。図６２は、１４日間の実験期間での体重の変化を示し、図６３は、同期間の体重変化率（％）を示す。
【０３４１】
図６０〜６３で図示され実験結果は以下のようにまとめることができる。
【０３４２】
１０ｍｇ／ｋｇ投与のＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）３２：１（１０％）ＭＡ：ＨＵ４は、注入後２４時間の血糖低減に有効で、血糖値は４〜７日後にベースラインに戻った。
【０３４３】
３０ｍｇ／ｋｇ投与のＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）３２：１（１０％）ＭＡ：ＨＵ４は、血糖低減に対し１０ｍｇ／ｋｇ投与よりさらに有効で、血糖値は、４〜７日後にベースラインに戻ることが認められた。
【０３４４】
３ｍｇ／ｋｇ投与のＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）は、それだけで、ヒドロゲルから３０ｍｇ／ｋｇで放出のＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）と類似の程度に、注入２４時間後の血糖を低減した。
【０３４５】
ヒドロゲル対照（これはＦＧＦ２１変異体を含まない）は、血糖低減に対し、何の効果も無かった。
【０３４６】
ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）ヒドロゲル群およびＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）（これは、ヒドロゲル中には入れなかった）は、ヒドロゲル対照で処置したマウスに比べ、少ない体重増加を示した。
【実施例２５】
【０３４７】
カニクイザルの調査
２つのＦｃ−リンカー−ＦＧＦ２１構築物を本明細書に記載の方法を使って作製した。１つの構築物は、ＩｇＧ１  Ｆｃ配列（配列番号１１）を含み、このＦｃ配列はＣ末端で（Ｇｌｙ）５−Ｓｅｒ−（Ｇｌｙ）３−Ｓｅｒ−（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒリンカー配列（配列番号２８）に融合し、今度はこのリンカーが成熟ＦＧＦ２１配列（配列番号４）のＮ末端に融合しており、このＦＧＦ２１配列中に２つの変異、Ｌ９８ＲとＰ１７１Ｇ、が導入されている。この分子は、本実施例中では、「Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）」（配列番号４３）と呼ぶ。２つ目の構築物は、ＩｇＧ１  Ｆｃ配列（配列番号１１）を含み、このＦｃ配列はＣ末端で（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒ−（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒ−（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒリンカー配列（配列番号３１）に融合し、今度はこのリンカーが成熟ＦＧＦ２１配列（配列番号４）のＮ末端に融合しており、このＦＧＦ２１配列中に３つの変異、Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、およびＡ１８０Ｅ、が導入されている。この分子は、本実施例中では、「Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）」（配列番号４７）と呼ぶ。次に、本明細書に記載のように、これらの構築物を発現させ、精製して、２量体型のタンパク質として単離した。このタンパク質の各モノマーは、各モノマーのＦｃ領域の間の分子間ジスルフィド結合を介して結合している。
【０３４８】
２５．１  研究デザイン
調査は、耐糖能障害（ＩＧＴ）の特徴があるカニクイザルを使って行った。サルは８〜１８才であった。体重は、５〜１５ｋｇ、ＢＭＩは、３２〜７０ｋｇ／ｍ２の範囲であった。４４匹のサルを化合物投与に先立ち、６週間順化させた。環境順化期間の間、サルを週４回の訓練を４週間行い、椅子拘束、皮下注入（ＰＢＳ、０．１ｍｌ／ｋｇ）、経管栄養（水、１０ｍｌ／ｋｇ）、非ＯＧＴＴおよびＯＧＴＴ試料用採血を含む、手続きに慣れさせた。４週間の訓練後、ベースラインＯＧＴＴおよび血漿代謝パラメーターを測定した。４４匹のサルから４０匹を選択し、３群に分けて無作為化し、体重、ＯＧＴＴ  ＡＵＣ応答、ならびに血漿グルコースおよびトリグリセリドについて、類似のベースラインレベルとなるようにした。
【０３４９】
調査は盲検方式で行った。賦形剤（ｎ＝１４）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（ｎ＝１３）およびＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）（ｎ＝１３）を化合物Ａ、ＢおよびＣとして標識をつけ、週１回、皮下注入により投与した。化合物を用量漸増方式で、低（０．３ｍｇ／ｋｇ）、中（１ｍｇ／ｋｇ）から高（３ｍｇ／ｋｇ）レベルまで投与し、用量を３週毎に増加した。化合物による処置を９週行った後、動物を化合物の洗い流しと処置からの回復のため、さらに３週間モニターした。全調査期間にわたり、食物摂取量、体重、臨床化学およびＯＧＴＴをモニターした。食物摂取量を毎食毎に測定した。体重は、毎週測定した。血液サンプルを、各用量注入５日目以降毎週採取し、グルコース、トリグリセリド、総コレステロール、ＨＤＬ−およびＬＤＬ−コレステロールレベルを測定した。ＯＧＴＴを処置開始後３週毎（各用量レベルの終了時点）に行った。処置の開始日を０として、詳細  研究デザインを図６４に示す。
【０３５０】
本実施例で示した結果は、９週間の処置の終了時点で採取したデータである。
【０３５１】
２５．２  食物摂取量に及ぼす試験化合物の効果
動物に１日２回給餌し、各動物は、１２０ｇの環境順化期間中に確立した処方食を摂取した。残った食物を取り除き、各食事後秤量し食物摂取量を計算した。給餌時間は、８：００ＡＭ〜８：３０ＡＭ（±３０分）および４：３０ＰＭ〜５：００ＰＭ（±３０分）であった。おやつにするため、毎日１１：３０〜１２：３０ＰＭ（±３０分）に、リンゴ（１５０ｇ）を各動物に与えた。
【０３５２】
賦形剤投与と比較して、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）およびＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）の両方ともサルの食物摂取量が減少した（図６５、６６および６７）。Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）は、０．３ｍｇ／ｋｇ投与量の場合、午前、果実および午後の食事を含む毎食事時に食物摂取量を抑制した。しかし、用量を１ｍｇ／ｋｇに増やすと、効果は減少し、処置のおよそ３０日後、食物摂取量はベースライン近く、または対照のレベルまで戻った。Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）は、用量を１および３ｍｇ／ｋｇに増量した場合、午前食物摂取量に対し有意な効果がなく、午後の食事に対しわずかに食物摂取量を減らしたに過ぎなかった。しかし、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）は、果実摂取量を、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）と同程度に減らした。全体としては、食物摂取量の抑制に関しＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）がＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）より強力な効果を示した。食物摂取量に対する効果は、短期的であると思われ、食物摂取量は処置の約３０日後に元に戻った。
【０３５３】
２５．３  体重に及ぼす試験化合物の効果
全調査期間を通し、体重を毎週モニターした。９週間の処置の期間にわたり、賦形剤処置の動物の体重は一定のまま維持され、他方、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）およびＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）で処置した動物の体重は、少しずつ減少した。図６８に示すように、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）は、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）より際立った体重減少をもたらした。  
【０３５４】
２５．４  肥満度指数（ＢＭＩ）、皮下脂肪厚（ＳＦＴ）および腹囲（ＡＣ）に及ぼす試験化合物の効果
全調査期間にわたり、体重を測定した際に試験化合物の投与の前後の両方で、ＢＭＩ、ＳＦＴおよびＡＣを毎週モニターした。ＢＭＩを個体の体重を身長の２乗で割った値として定義した。ＳＦＴは、測定部位に一定の張力を与える特殊カリパスを使って測定した皮膚と皮膚の下の脂肪の二重層の厚さである。ＢＭＩ、ＳＦＴおよびＡＣは、比較的正確、簡単、安価な体組成、特に皮下脂肪の測定法である。賦形剤で処置した動物は、全調査期間にわたり比較的安定なＢＭＩ、ＳＦＴおよびＡＣを示した。Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）およびＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）で処置した動物は、９週間の調査期間にわたり、低いレベルのＢＭＩ、ＳＦＴおよびＡＣを示したが、これは、両化合物が体脂肪量の減少をもたらしたことを示唆している。Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）は、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）より有効で、ＢＭＩ、ＳＦＴおよびＡＣのさらに際立った減少をもたらした。結果を図６９、７０および７１にぞれぞれ示す。  
【０３５５】
２５．５  空腹時血糖値に及ぼす試験化合物の効果
一晩絶食した動物から血液を採取した。採血を注入５日後毎週行った。Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）の両方が空腹時血糖値を低減した。Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）は、０．３ｍｇ／ｋｇの用量時に空腹時血糖値を低減し、用量を１ｍｇ／ｋｇに増やした場合に、最大グルコース減少が達せされた。しかし、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）のみが、試験した最高用量（３ｍｇ／ｋｇ）で中程度の血糖値減少をもたらした。従って、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）がＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）より効果的で、さらに際だった血糖減少が得られた。低血糖は、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）またはＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）で処置したいずれのサルにも観察されなかった。図７２は、調査期間中の空腹時血漿グルコースのレベルを示す。
【０３５６】
２５．６  経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）に与える試験化合物の効果
ＯＧＴＴを処置開始の前後で行った。投与後ＯＧＴＴを３週毎に行い、各用量レベルでの化合物の効果の試験を行った。Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）は、０．３〜３ｍｇ／ｋｇの全試験用量でグルコース耐性を改善した。グルコースレベルは、減少し、グルコース大量投与後のグルコース変動幅は、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）処置に応じて増加した。用量反応が観察されなかったことは、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）が０．３ｍｇ／ｋｇの用量でその最大効果に達したことを示唆している。Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）のみが、１ｍｇ／ｋｇ用量でグルコース耐性の改善をもたらし、用量を３ｍｇ／ｋｇに増やしたときになぜ効果が減少したかは明らかでない。図７３は、ＯＧＴＴ前後の曲線プロファイルおよびＯＧＴＴ曲線下面積を示す。
【０３５７】
２５．７トリグリセリドレベルに与える試験化合物の効果
一晩絶食した動物から血液を採取した。採血を、各注入の５日後毎週行った。トリグリセリドレベルはＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）またはＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）で処置した動物で有意に減少した。しかし、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）がＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）より有効であった。Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）は、０．３ｍｇ／ｋｇで血漿トリグリセリドレベルの最大減少をもたらしたが、一方、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）のみが、最高試験投与量（３ｍｇ／ｋｇ）でトリグリセリドレベルの中程度の減少をもたらした。図７４は、調査期間中の空腹時血漿トリグリセリドのレベルを示す。
【０３５８】
２５．８  総コレステロールおよびＨＤＬコレステロールレベルに及ぼす試験化合物の効果
一晩絶食した動物から血液を採取した。採血を、各注入の５日後毎週行った。血漿総コレステロールおよびＨＤＬコレステロールレベルは、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）またはＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）処置後、増加傾向であった。図７５と７６は、調査期間中の総コレステロールおよびＨＤＬコレステロールレベルを示す。  
【０３５９】
２５．９  結論
雄ＩＧＴカニクイザルで行った用量漸増試験では、Ｆｃ複合化ＦＧＦ２１変異体、すなわち、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）で処置した動物は、代謝パラメーターの改善を示した。体重は減少し、体組成は改善された。短期間の食物摂取量の減少が観察され、食物摂取量は、調査中に、ベースラインまたは対照レベルまで戻った。空腹時血糖およびトリグリセリドレベルもまた、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）またはＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）の両化合物により低減した。ＯＧＴＴは改善され、ＨＤＬコレステロールレベルは、わずかに上昇した。Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）に比較して、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）は、全ての試験用量で測定した全てのパラメーテーでＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）より優れてるように思われた。Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）は、ほとんどのパラメーターに対し、０．３ｍｇ／ｋｇの投与の場合に最大効果に達した。従って、より高度な種に対する、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）の治療効果のある用量は、０．３ｍｇ／ｋｇ未満である可能性がある。
【実施例２６】
【０３６０】
カニクイザルを使った安定性調査
この調査は、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）（配列番号５７）がＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）よりプロテアーゼ耐性が高いか否かを判定することを意図した。マウスまたはサルにＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇを注入後、実施例２１に示すように、カルボキシ末端処理過程を観察した。分解によりＣ末端からの１〜３アミノ酸残基の連続的欠失を生じた。Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）のＣ末端をキャッピングまたは追加の変異をそのＣ末端に導入する試みにより優れた分子Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）を得た。この調査は、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）が、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）に比べて、インビボ安定性を有するか否かを評価するために計画された。
【０３６１】
Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）構築物を作製した。これらの構築物は、ＩｇＧ１  Ｆｃ配列（配列番号１１）を含み、このＦｃ配列がＣ末端で（Ｇｌｙ）５−Ｓｅｒ−（Ｇｌｙ）３−Ｓｅｒ−（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒリンカー配列（配列番号２８）に融合し、今度はこのリンカーが成熟ＦＧＦ２１配列（配列番号４）のＮ末端に融合しており、これには、２つの変異、Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、または３つの変異、Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、およびＡ１８０Ｅ、が導入されている。これらの構築物を本明細書に記載のように、発現させ、精製して、２量体型のタンパク質として単離した。この２量体タンパク質では、各モノマーが、そのＦｃ領域の間にある分子間ジスルフィド結合を介して結合している。
【０３６２】
Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）のインビボ安定性を雄カニクイザルを使って比較した。Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）をカニクイザルの静脈内に２３．５ｍｇ／ｋｇ注入した。血液サンプルを、単回ＩＶ注入後、種々の時点で採取した。免疫親和性ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を使って注入後の各時点で代謝物をモニターした。結果を図７７に示す。
【０３６３】
Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）に比較して、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）は、Ｃ末端分解の有意な減少を示し、インタクト分子の親ピークに隣接した、より少ない検出可能な質量ピークが認められた。これは、Ａ１８０Ｅ変異がＣ末端のペプチダーゼ分解を減速させたことを示唆している。［１−３７６］、［１−３９４］および［１−４０１］に質量損失が想定される、より大きな切断もまた、観察され、その部位は、ＦＧＦ２１ポリペプチド配列の１３３−１３４、１５３−１５４および１５８−１５９に相当した。内部エンドペプチダーゼクリッピングがＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）の両方の全体代謝に寄与し、Ａ１８０Ｅ変異は、内部エンドペプチダーゼ分解の速度に有意に影響しないように思われた。
【０３６４】
分解を増やし、分解混合物の詳細を把握するために、ＭＲＭ（多重反応モニタリング）ＬＣ−ＭＳ質量分析も行い、種々の形のＣ末端分解断片をモニターした。サルの試料を親和性精製し、次に、Ａｓｐ−Ｎ消化に供した。次に、Ｃ末端消化ペプチドをＭＲＭでモニターした。種々の形のＣ末端分解断片の結果を、完全長ペプチド種に対する相対量（％）として図７８で表している。ＭＡＬＤＩスペクトルと一致して、Ｃ末端断片のＭＲＭ判定量分析もまた、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）を投与したサル中で、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）投与に比べ、１〜３アミノ酸がＣ末端から欠失したペプチド断片の相対的存在量の減少、およびインタクト分子の相対的存在量の増加を示した。
【０３６５】
要約すると、カニクイザルにおいて、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）は、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）に比べて、Ｃ末端分解の減少およびインビボ安定性の強化を示した。  
【実施例２７】
【０３６６】
マウス中のＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）の薬物動態
この調査は、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）（配列番号５７）およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスへの単回静脈内投与後の薬物動態を評価するために計画された。
【０３６７】
Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）の２０ｍｇ／ｋｇを静脈内注入により投与した。血液サンプルを投与後０．０８３（５分）、１、４、８、１６、２４、４８、７２、９６、１６８、および２４０時間の時点で採取した。無傷完全長分子の血漿中濃度を測定するため、Ｎ末端およびＣ末端ＦＧＦ２１を対象とした免疫反応性を使ったＥＬＩＳＡアッセイを行った。このアッセイは、他の分解生成物の混入はほとんどなく完全長インタクト分子を追跡する。マウスへの注入後２４０時間までのインタクトＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）の血漿中濃度を図７９に示す。
【０３６８】
Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）の血漿中濃度は、注入から２４〜１６８時間の間、同量投与のＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）の濃度より有意に高かった。マウスへの投与後１６８時間で、かなりの量のＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）が測定可能であった。結果として、マウスにおいて、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）は、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）に比べてＡＵＣ適用範囲の増加、および血漿循環半減期の２倍の増加を示した。Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）の半減期は１６．６時間で、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）の半減期は９．４時間であった。注入後２４０時間では、両化合物は、検出可能レベル以下であった。
【実施例２８】
【０３６９】
溶解度を改善またはＣ末端クリッピンを低減して半減期を延長するためのＮ結合グリコシル化変異体の作製
ネイティブアミノ酸配列に対して最小限の破損しか含まない哺乳類動物発現のために有望なＮ結合グリコシル化部位を作るために、ＦＧＦ２１変異体を計画し、作成した。この構築変異体は、ＦＧＦ２１（Ｙ１７９Ｎ、Ｓ１８１Ｔ）（配列番号１６１）、ＦＧＦ２１  Ｙ１７９Ｎ（配列番号１６３）およびＦＧＦ２１  Ｐ１２４Ｓ（配列番号１６５）を含む。
【０３７０】
２９３−６Ｅ細胞中で一次的に変異体の発現を行い、順化培地をＥＬＫルシフェラーゼインビトロアッセイにより活性試験した。ＥＬＫルシフェラーゼアッセイは、異なる濃度の精製タンパク質ではなく、順化培地の系列希釈を使ったことを除いては、実施例４で記載のように実施した。
【０３７１】
順化培地分析により、野性型よりもグリコシル化を増加されることは、一次的発現系では達成されないことが示された。図８０は、ＥＬＫルシフェラーゼ活性アッセイの結果を示す。図８０の結果は、ＥＬＫルシフェラーゼアッセイの試験により、ＦＧＦ２１  Ｐ１２４Ｓ変異体はＦＧＦ２１活性に対し悪影響を及ぼさないが、ＦＧＦ２１  Ｙ１７９ＮおよびＦＧＦ２１（Ｙ１７９Ｎ、Ｓ１８１Ｔ）変異体は、グリコシル化が無い場合は、活性の低下を生じたことを示している。
【０３７２】
本発明を種々の実施形態を使って記載してきたが、当業者が変形および変更を思いつくであろうことは理解されたい。従って、添付の請求項は、請求範囲にある本発明の範囲内にある全てのこのような等価の変形を包含するものとする。さらに、本明細書で使われている節の標題は構成上の目的のみのために使用されているのであり、記載された対象を限定するものと解釈されるべきではない。
【０３７３】
本出願で引用されている全ての参照は、目的に応じ、参照によって明示的に本明細書に組み込まれる。
【図１Ａ】
2012525847.tif 000050
【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
2012525847.tif 000053
【図４】
2012525847.tif 000054
【図５】
2012525847.tif 000055
【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２５Ｄ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３８Ｃ】
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【図３８Ｄ】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３Ａ】
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【図５３Ｂ】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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