(57)【要約】ＨＣＶ感染サンプル中のＨＣＶ核酸を増幅する方法は、２段階ＰＣＲによってサンプル由来のＨＣＶ  ＲＮＡゲノムに相補的なＤＮＡテンプレートのセグメントを増幅する工程であって、第１段階のＰＣＲが第１のアウタープライマーおよび第２のアウタープライマーを使用し、第２段階のＰＣＲが第１のインナープライマーおよび第２のインナープライマーを使用する、工程を含む。第１のアウタープライマーのヌクレオチド配列は、配列番号２または配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に１、２、または３個のヌクレオチドは配列番号９のヌクレオチド以外のヌクレオチドである。第２のアウタープライマーのヌクレオチド配列は配列番号３または４に記載のヌクレオチド配列または配列番号１０または１１に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に１、２、または３個のヌクレオチドは配列番号１０および１１のヌクレオチド以外のヌクレオチドである。
2012515534.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＣＶ感染サンプル由来のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）核酸を増幅する方法であって、前記方法は、２段階ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって前記サンプル由来のＨＣＶ  ＲＮＡのゲノムに相補的なＤＮＡテンプレートのセグメントを増幅する工程を含み、第１段階のＰＣＲは第１のアウタープライマーおよび第２のアウタープライマーを使用し、第２段階のＰＣＲは第１のインナープライマーおよび第２のインナープライマーを使用し、
ｉ）前記第１のアウタープライマーのヌクレオチド配列は配列番号２：
【化１９】
2012515534.tif 000024
を含み、
ｉｉ）前記第２のアウタープライマーのヌクレオチド配列は配列番号３または配列番号４：
【化２０】
2012515534.tif 000025
（式中、ＶはＡ、Ｃ、またはＧである）
を含み、
ｉｉｉ）前記第１のインナープライマーのヌクレオチド配列は配列番号５：
【化２１】
2012515534.tif 000026
を含み、および
ｉｖ）前記第２のインナープライマーのヌクレオチド配列は配列番号６または配列番号７：
【化２２】
2012515534.tif 000027
（式中、ＲはＡまたはＧである）
を含む、方法。
【請求項２】
前記インナープライマーおよびアウタープライマーがそれぞれ独立して１５〜５０merである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ａ）前記第１のアウタープライマーのヌクレオチド配列が配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号９の５’末端から１〜１４位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号９：
【化２３】
2012515534.tif 000028
のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｂ）前記第２のアウタープライマーのヌクレオチド配列が配列番号１０または配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１０および配列番号１１の５’末端から１〜１２位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１０および配列番号１１：
【化２４】
2012515534.tif 000029
（式中、ＹはＣ、Ｔ、またはＵであり、ＶはＡ、Ｃ、またはＧである）
のヌクレオチド以外のヌクレオチドである、
請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ａ）前記第１のインナープライマーのヌクレオチド配列が配列番号１２に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１２の５’末端から１〜１４位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１２：
【化２５】
2012515534.tif 000030
のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｂ）前記第２のインナープライマーのヌクレオチド配列が配列番号１３または配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１３および配列番号１４の５’末端から１〜１２位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１３および配列番号１４：
【化２６】
2012515534.tif 000031
（式中、ＲはＡまたはＧである）
のヌクレオチド以外のヌクレオチドである、
請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ａ）前記第１のインナープライマーのヌクレオチド配列が配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１５の５’末端から１〜１６位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１５：
【化２７】
2012515534.tif 000032
のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｂ）前記第２のインナープライマーのヌクレオチド配列が配列番号１６または配列番号１７に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１６および配列番号１７の５’末端から１〜１３位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１６および配列番号１７：
【化２８】
2012515534.tif 000033
（式中、ＲはＡまたはＧである）
のヌクレオチド以外のヌクレオチドである、
請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ａ）前記第１のアウタープライマーのヌクレオチド配列が配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号９の５’末端から１〜１４位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号９：
【化２９】
2012515534.tif 000034
のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｂ）前記第２のアウタープライマーのヌクレオチド配列が配列番号１０または配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１０および配列番号１１の５’末端から１〜１２位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１０および配列番号１１：
【化３０】
2012515534.tif 000035
（式中、ＹはＣ、Ｔ、またはＵであり、ＶはＡ、Ｃ、またはＧである）
のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｃ）前記第１のインナープライマーのヌクレオチド配列が配列番号１２に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１２の５’末端から１〜１４位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１２：
【化３１】
2012515534.tif 000036
のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｄ）前記第２のインナープライマーのヌクレオチド配列が配列番号１３または配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１３および配列番号１４の５’末端から１〜１２位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１３および配列番号１４：
【化３２】
2012515534.tif 000037
（式中、ＲはＡまたはＧである）
のヌクレオチド以外のヌクレオチドである、
請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ａ）前記第１のアウタープライマーのヌクレオチド配列が配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号９の５’末端から１〜１４位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号９：
【化３３】
2012515534.tif 000038
のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｂ）前記第２のアウタープライマーのヌクレオチド配列が配列番号１０または配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１０および配列番号１１の５’末端から１〜１２位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１０および配列番号１１：
【化３４】
2012515534.tif 000039
（式中、ＹはＣ、Ｔ、またはＵであり、ＶはＡ、Ｃ、またはＧである）
のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｃ）前記第１のインナープライマーのヌクレオチド配列が配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１５の５’末端から１〜１６位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１５：
【化３５】
2012515534.tif 000040
のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｄ）前記第２のインナープライマーのヌクレオチド配列が配列番号１６または配列番号１７に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１６および配列番号１７の５’末端から１〜１３位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１６および配列番号１７：
【化３６】
2012515534.tif 000041
（式中、ＲはＡまたはＧである）
のヌクレオチド以外のヌクレオチドである、
請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＨＣＶ核酸が遺伝子型１ａまたは１ｂである、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＨＣＶ核酸が遺伝子型１ａである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ａ）前記第１のアウタープライマーのヌクレオチド配列が配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号９の５’末端から１〜１４位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号９のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｂ）前記第２のアウタープライマーのヌクレオチド配列が配列番号１０に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１０の５’末端から１〜１２位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１０のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｃ）前記第１のインナープライマーのヌクレオチド配列が配列番号１２に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１２の５’末端から１〜１４位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１２のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｄ）前記第２のインナープライマーのヌクレオチド配列が配列番号１３に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１３の５’末端から１〜１２位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１３のヌクレオチド以外のヌクレオチドである、
請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ａ）前記第１のアウタープライマーのヌクレオチド配列が配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号９の５’末端から１〜１４位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号９のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｂ）前記第２のアウタープライマーのヌクレオチド配列が配列番号１０に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１０の５’末端から１〜１２位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１０のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｃ）前記第１のインナープライマーのヌクレオチド配列が配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１２の５’末端から１〜１６位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１５のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｄ）前記第２のインナープライマーのヌクレオチド配列が配列番号１６に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１３の５’末端から１〜１３位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１６のヌクレオチド以外のヌクレオチドである、
請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＨＣＶ核酸が遺伝子型１ｂである、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
ａ）前記第１のアウタープライマーのヌクレオチド配列が配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号９の５’末端から１〜１４位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号９のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｂ）前記第２のアウタープライマーのヌクレオチド配列が配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に５’末端から１〜１２位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１１のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｃ）前記第１のインナープライマーのヌクレオチド配列が配列番号１２に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１２の５’末端から１〜１４位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１２のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｄ）前記第２のインナープライマーのヌクレオチド配列が配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１４の５’末端から１〜１２位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１４のヌクレオチド以外のヌクレオチドである、
請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ａ）前記第１のアウタープライマーのヌクレオチド配列が配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号９の５’末端から１〜１４位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号９のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｂ）前記第２のアウタープライマーのヌクレオチド配列が配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に５’末端から１〜１２位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１１のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｃ）前記第１のインナープライマーのヌクレオチド配列が配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１２の５’末端から１〜１６位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１５のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｄ）前記第２のインナープライマーのヌクレオチド配列が配列番号１７に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１４の５’末端から１〜１３位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１３のヌクレオチド以外のヌクレオチドである、
請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記増幅ＨＣＶ核酸が、Ｃ、Ｅ１、Ｅ２、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、およびＮＳ５Ｂタンパク質をコードする遺伝子を含む、請求項１から１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
ＲＴプライマーを使用した逆転写（ＲＴ）によって前記サンプル由来のＨＣＶ  ＲＮＡのゲノムに相補的な前記ＤＮＡテンプレートを形成する工程であって、前記ＲＴプライマーのヌクレオチド配列がその３’末端で配列番号１：
５’−（Ａ）ｎ−ＡＡＡＡ−３’（配列番号１）
（式中、ｎは１〜２６の整数である）
を含む、工程をさらに含む、請求項１から１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＲＴプライマーのｎが１０〜２０の整数である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＲＴプライマーが、その３’末端に、配列番号８：
【化３７】
2012515534.tif 000042
のヌクレオチド配列を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＤＮＡテンプレートを形成する工程が、前記増幅工程の前に、ポリ−Ａ  ＲＮＡおよび細菌ｔＲＮＡからなる群より選択されるキャリアＲＮＡを使用して前記ＨＣＶ感染サンプルから前記ＨＣＶ  ＲＮＡを単離する工程を含む、請求項１６から１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１段階のＰＣＲの後に前記第２段階のＰＣＲを行い、それぞれの前記第１段階および第２段階のＰＣＲ中に、各ＰＣＲ反応混合物を、独立して、
ａ）温度Ｔ１で時間Ｒ１、および
ｂ）その後の複数のタッチダウンＰＣＲサイクル
でインキュベートし、各タッチダウンサイクルは、
ｉ）温度Ｔ２で時間Ｒ２、
ｉｉ）続いてサイクルｍ回について温度［Ｔ３−（Ｖ℃×ｍ）］で時間Ｒ３、および
ｉｉｉ）続いて温度Ｔ４で時間Ｒ４
の前記ＰＣＲ反応混合物のインキュベーションを含み、ここで、
Ｔ１およびＴ２が、独立して、９０℃と１００℃との間の範囲であり、
Ｔ３およびＴ４が、独立して、６５℃と７０℃との間の範囲であり、
Ｒ１が、１分間と５分間との間の範囲であり、
Ｒ２が、５秒間と４５秒間との間の範囲であり、
Ｒ３が、１０秒間と４０秒間との間の範囲であり、
Ｒ４が、５分間と２０分間との間の範囲であり、
Ｖが、０．２℃と０．８℃との間の範囲である、
請求項１から１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
Ｒ１が、１分間と３分間との間の範囲であり、
Ｒ２が、１０秒間と２０秒間との間の範囲であり、
Ｒ３が、１５秒間と２５秒間との間の範囲であり、
Ｒ４が、８分間と１５分間との間の範囲であり、
タッチダウンＰＣＲサイクル数が２０と５０との間の範囲である、
請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
Ｔ１が９４℃であり、Ｔ２が９４℃であり、Ｔ２が６８℃であり、Ｔ３が６８℃であり、Ｖが０．５℃であり、タッチダウンＰＣＲサイクル数が３０である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１段階および第２段階のＰＣＲの各ＰＣＲ反応混合物が、独立して、Ｋｌｅｎｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよびＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを、１：１と３：１との間のＫｌｅｎｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ：Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ比で含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記第１段階のＰＣＲのＰＣＲ反応混合物が、２単位と３単位との間のＫｌｅｎｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよび１単位と１．５単位との間のＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記第２段階のＰＣＲのＰＣＲ反応混合物が、２．５単位と３．５単位との間のＫｌｅｎｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよび１単位と２単位との間のＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記第１および第２のＰＣＲ段階のそれぞれのＰＣＲ反応混合物が、独立して、０．７５Ｍと２Ｍとの間の量のベタインを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
ＨＣＶ感染サンプル由来のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）核酸を増幅する方法であって、前記方法は、２段階ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって前記サンプル由来のＨＣＶ  ＲＮＡのゲノムに相補的なＤＮＡテンプレートのセグメントを増幅する工程を含み、第１段階のＰＣＲは第１のアウタープライマーおよび第２のアウタープライマーを使用し、第２段階のＰＣＲは第１のインナープライマーおよび第２のインナープライマーを使用し、
ｉ）前記第１のアウタープライマーのヌクレオチド配列はその３’末端に、配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドは、独立して、配列番号９：
【化３８】
2012515534.tif 000043
のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｉｉ）前記第２のアウタープライマーのヌクレオチド配列はその３’末端に、配列番号１０または配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドは、独立して、配列番号１０および配列番号１１：
【化３９】
2012515534.tif 000044
（式中、ＹはＣ、Ｔ、またはＵであり、ＶはＡ、Ｃ、またはＧである）
のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｉｉｉ）前記第１のインナープライマーのヌクレオチド配列はその３’末端に、配列番号１２に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドは、独立して、配列番号１２：
【化４０】
2012515534.tif 000045
のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｉｖ）前記第２のインナープライマーのヌクレオチド配列はその３’末端に、配列番号１３または配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドは、独立して、配列番号１３および配列番号１４：
【化４１】
2012515534.tif 000046
（式中、ＲはＡまたはＧである）
のヌクレオチド以外のヌクレオチドである、
方法。
【請求項２８】
前記インナープライマーおよびアウタープライマーがそれぞれ独立して１５〜５０merである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＨＣＶ核酸が遺伝子型１ａまたは１ｂである、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＨＣＶ核酸が遺伝子型１ａである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ａ）前記第１のアウタープライマーのヌクレオチド配列がその３’末端に、配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号９のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｂ）前記第２のアウタープライマーのヌクレオチド配列がその３’末端に、配列番号１０に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１０のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｃ）前記第１のインナープライマーのヌクレオチド配列がその３’末端に、配列番号１２に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１２のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｄ）前記第２のインナープライマーのヌクレオチド配列がその３’末端に、配列番号１３に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１３のヌクレオチド以外のヌクレオチドである、
請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ａ）前記第１のアウタープライマーのヌクレオチド配列がその３’末端に、配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号９のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｂ）前記第２のアウタープライマーのヌクレオチド配列がその３’末端に、配列番号１０に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１０のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｃ）前記第１のインナープライマーのヌクレオチド配列がその３’末端に、配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１５のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｄ）前記第２のインナープライマーのヌクレオチド配列がその３’末端に、配列番号１６に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１６のヌクレオチド以外のヌクレオチドである、
請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＨＣＶ核酸が遺伝子型１ｂである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
ａ）前記第１のアウタープライマーのヌクレオチド配列がその３’末端に、配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号９のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｂ）前記第２のアウタープライマーのヌクレオチド配列がその３’末端に、配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１１のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｃ）前記第１のインナープライマーのヌクレオチド配列がその３’末端に、配列番号１２に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１２のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｄ）前記第２のインナープライマーのヌクレオチド配列がその３’末端に、配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１４のヌクレオチド以外のヌクレオチドである、
請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ａ）前記第１のアウタープライマーのヌクレオチド配列がその３’末端に、配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号９のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｂ）前記第２のアウタープライマーのヌクレオチド配列がその３’末端に、配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１１のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｃ）前記第１のインナープライマーのヌクレオチド配列がその３’末端に、配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１５のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｄ）前記第２のインナープライマーのヌクレオチド配列がその３’末端に、配列番号１７に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１７のヌクレオチド以外のヌクレオチドである、
請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記増幅ＨＣＶ核酸分子が、Ｃ、Ｅ１、Ｅ２、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、およびＮＳ５Ｂタンパク質をコードする遺伝子を含む、請求項２７から３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
ＲＴプライマーを使用した逆転写（ＲＴ）によって前記サンプル由来のＨＣＶ  ＲＮＡのゲノムに相補的な前記ＤＮＡテンプレートを形成する工程であって、前記ＲＴプライマーのヌクレオチド配列がその３’末端に配列番号１：
５’−（Ａ）ｎ−ＡＡＡＡ−３’（配列番号１）
（式中、ｎは１〜２６の整数である）
を含む、工程をさらに含む、請求項２７から３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＲＴプライマーのｎが１０〜２０の整数である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＲＴプライマーが、その３’末端に、配列番号８：
【化４２】
2012515534.tif 000047
のヌクレオチド配列を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＤＮＡテンプレートを形成する工程が、前記増幅工程の前に、ポリ−Ａ  ＲＮＡおよび細菌ｔＲＮＡからなる群より選択されるキャリアＲＮＡを使用して前記ＨＣＶ感染サンプルから前記ＨＣＶ  ＲＮＡを単離する工程を含む、請求項３７から３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＨＣＶ  ＲＮＡを、前記ＲＴプライマーを使用して、前記ＨＣＶゲノムの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）でプライムする、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記第１のインナープライマーおよびアウタープライマーは、独立して、前記ＨＣＶゲノムの５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）でプライムし、前記第２のインナープライマーおよびアウタープライマーは、独立して、前記ＨＣＶゲノムのＮＳ５Ｂ領域でプライムする、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記第１段階のＰＣＲの後に前記第２段階のＰＣＲを行い、それぞれの前記第１段階および第２段階のＰＣＲ中に、各ＰＣＲ反応混合物を、独立して、
ａ）温度Ｔ１で時間Ｒ１、および
ｂ）その後の複数のタッチダウンＰＣＲサイクル
でインキュベートし、各タッチダウンサイクルは、
ｉ）温度Ｔ２で時間Ｒ２、
ｉｉ）続いてサイクルｍ回について温度［Ｔ３−（Ｖ℃×ｍ）］で時間Ｒ３、および
ｉｉｉ）続いて温度Ｔ４で時間Ｒ４
の前記ＰＣＲ反応混合物のインキュベーションを含み、ここで、
Ｔ１およびＴ２が、独立して、９０℃と１００℃との間の範囲であり、
Ｔ３およびＴ４が、独立して、６５℃と７０℃との間の範囲であり、
Ｒ１が、１分間と５分間との間の範囲であり、
Ｒ２が、５秒間と４５秒間との間の範囲であり、
Ｒ３が、１０秒間と４０秒間との間の範囲であり、
Ｒ４が、５分間と２０分間との間の範囲であり、
Ｖが０．２℃と０．８℃との間の範囲である、
請求項２７から４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
Ｒ１が、１分間と３分間との間の範囲であり、
Ｒ２が、１０秒間と２０秒間との間の範囲であり、
Ｒ３が、１５秒間と２５秒間との間の範囲であり、
Ｒ４が、８分間と１５分間との間の範囲であり、
タッチダウンＰＣＲサイクル数が２０と５０との間の範囲である、
請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
Ｔ１が９４℃であり、Ｔ２が９４℃であり、Ｔ２が６８℃であり、Ｔ３が６８℃であり、Ｖが０．５℃であり、タッチダウンＰＣＲサイクル数が３０である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記第１段階および第２段階のＰＣＲの各ＰＣＲ反応混合物が、独立して、Ｋｌｅｎｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよびＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを、１：１と３：１との間のＫｌｅｎｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ：Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ比で含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記第１段階のＰＣＲのＰＣＲ反応混合物が、２単位と３単位との間のＫｌｅｎｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよび１単位と１．５単位との間のＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記第２段階のＰＣＲのＰＣＲ反応混合物が、２．５単位と３．５単位との間のＫｌｅｎｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよび１単位と２単位との間のＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記第１および第２のＰＣＲ段階のそれぞれのＰＣＲ反応混合物が、独立して、０．７５Ｍと２Ｍとの間の量のベタインを含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記ＤＮＡテンプレート増幅工程が、ｉ）前記第１のＰＣＲによって前記ＤＮＡテンプレートのセグメントを増幅して第１のアンプリコンを産生する工程、およびｉｉ）前記第２のＰＣＲによって前記第１のアンプリコンの少なくとも一部を増幅して前記増幅ＨＣＶ核酸を含む第２のアンプリコンを産生する工程、を含む、請求項１から４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
ＨＣＶ感染サンプル中のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）核酸をアッセイする方法であって、
ａ）請求項１から５０のいずれか１項に記載の２段階ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって前記サンプル由来のＨＣＶ  ＲＮＡのゲノムに相補的なＤＮＡテンプレートを増幅して増幅ＨＣＶ核酸を産生する工程、および
ｂ）前記増幅ＨＣＶ核酸を配列決定する工程、
を含む、方法。
【請求項５２】
ＨＣＶ感染サンプル中のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）核酸をアッセイする方法であって、
ａ）請求項１から５０のいずれか１項に記載の２段階ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって前記サンプル由来のＨＣＶ  ＲＮＡのゲノムに相補的なＤＮＡテンプレートを増幅してアンプリコンを産生する工程、
ｂ）前記アンプリコンをクローニングする工程、および
ｃ）前記クローニングしたアンプリコンの前記ＨＣＶ核酸を配列決定する工程、
を含む、方法。
【請求項５３】
ＨＣＶに感染した患者の耐性プロフィールをモニタリングする方法であって、
ａ）前記患者からＨＣＶ感染サンプルを得る工程、
ｂ）請求項１から５０のいずれか１項に記載の２段階ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって前記サンプル由来のＨＣＶ  ＲＮＡのゲノムに相補的なＤＮＡテンプレートを増幅する工程、および
ｃ）前記増幅ＨＣＶ核酸を配列決定する工程、
を含む、方法。
【請求項５４】
第１のアウタープライマーおよび第２のアウタープライマーを含むアウターＰＣＲプライマー対を含む、ＨＣＶ感染サンプル由来のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）核酸をアッセイするためのキットであって、
ｉ）前記第１のアウタープライマーのヌクレオチド配列は配列番号２：
【化４３】
2012515534.tif 000048
を含み、
ｉｉ）前記第２のアウタープライマーのヌクレオチド配列は配列番号３または配列番号４：
【化４４】
2012515534.tif 000049
（式中、ＶはＡ、Ｃ、またはＧである）
を含む、キット。
【請求項５５】
ｉ）前記第１のアウタープライマーのヌクレオチド配列がその３’末端に、配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号９：
【化４５】
2012515534.tif 000050
のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｉｉ）前記第２のアウタープライマーのヌクレオチド配列がその３’末端に、配列番号１０または配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１０および配列番号１１：
【化４６】
2012515534.tif 000051
（式中、ＹはＣ、Ｔ、またはＵであり、ＶはＡ、Ｃ、またはＧである）
のヌクレオチド以外のヌクレオチドである、
請求項５４に記載のキット。
【請求項５６】
第１のインナープライマーおよび第２のインナープライマーを含むインナーＰＣＲプライマー対を含む、ＨＣＶ感染サンプル由来のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）核酸をアッセイするためのキットであって、
ｉ）前記第１のインナープライマーのヌクレオチド配列は配列番号５：
【化４７】
2012515534.tif 000052
を含み、
ｉｉ）前記第２のインナープライマーのヌクレオチド配列は配列番号６または配列番号７：
【化４８】
2012515534.tif 000053
（式中、ＲはＡまたはＧである）
を含む、キット。
【請求項５７】
ｉ）前記第１のインナープライマーのヌクレオチド配列がその３’末端に、配列番号１２に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１２：
【化４９】
2012515534.tif 000054
のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｉｉ）前記第２のインナープライマーのヌクレオチド配列がその３’末端に、配列番号１３または配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１３および配列番号１４：
【化５０】
2012515534.tif 000055
（式中、ＲはＡまたはＧである）
のヌクレオチド以外のヌクレオチドである、
請求項５６に記載のキット。
【請求項５８】
ｉ）前記第１のインナープライマーのヌクレオチド配列が配列番号１５：
【化５１】
2012515534.tif 000056
を含み、
ｉｉ）前記第２のインナープライマーのヌクレオチド配列が配列番号１６または配列番号１７：
【化５２】
2012515534.tif 000057
（式中、ＲはＡまたはＧである）
を含む、
請求項５７に記載のキット。
【請求項５９】
ＲＴプライマーをさらに含み、前記ＲＴプライマーのヌクレオチド配列が配列番号１：
５’−（Ａ）ｎ−ＡＡＡＡ−３’（配列番号１）（式中、ｎは１〜２６の整数である）
を含む、請求項５４から５８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項６０】
ＨＣＶ感染サンプル由来のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）核酸をアッセイするためのキットであって、
ａ）第１のアウタープライマーおよび第２のアウタープライマーを含むアウターＰＣＲプライマー対であって、
ｉ）前記第１のアウタープライマーのヌクレオチド配列はその３’末端に、配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドは、独立して、配列番号９：
【化５３】
2012515534.tif 000058
のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｉｉ）前記第２のアウタープライマーのヌクレオチド配列はその３’末端に、配列番号１０または配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドは、独立して、配列番号１０および配列番号１１：
【化５４】
2012515534.tif 000059
（式中、ＹはＣ、Ｔ、またはＵであり、ＶはＡ、Ｃ、またはＧである）
のヌクレオチド以外のヌクレオチドである、
アウターＰＣＲプライマー対、および
ｂ）第１のインナープライマーおよび第２のインナープライマーを含むインナーＰＣＲプライマー対であって、
ｉ）前記第１のインナープライマーのヌクレオチド配列はその３’末端に、配列番号１２に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドは、独立して、配列番号１２：
【化５５】
2012515534.tif 000060
のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｉｉ）前記第２のインナープライマーのヌクレオチド配列はその３’末端に、配列番号１３または配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドは、独立して、配列番号１３および配列番号１４：
【化５６】
2012515534.tif 000061
（式中、ＲはＡまたはＧである）
のヌクレオチド以外のヌクレオチドである、
インナーＰＣＲプライマー対
を含む、キット。
【請求項６１】
ＲＴプライマーをさらに含み、前記ＲＴプライマーのヌクレオチド配列が配列番号１：
５’−（Ａ）ｎ−ＡＡＡＡ−３’（配列番号１）（式中、ｎは１〜２６の整数である）
を含む、請求項６０に記載のキット。
【請求項６２】
前記ＲＴプライマーのヌクレオチド配列が配列番号８：
【化５７】
2012515534.tif 000062
を含む、請求項６１に記載のキット。
【請求項６３】
ＨＣＶ感染サンプル由来のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）核酸をアッセイするためのキットであって、
ａ）ＲＴプライマーであって、前記ＲＴプライマーのヌクレオチド配列は配列番号８：
【化５８】
2012515534.tif 000063
を含む、ＲＴプライマー、
ｂ）第１のアウタープライマーおよび第２のアウタープライマーを含むアウターＰＣＲプライマー対であって、
ｉ）前記第１のアウタープライマーのヌクレオチド配列は配列番号９：
【化５９】
2012515534.tif 000064
を含み、
ｉｉ）前記第２のアウタープライマーのヌクレオチド配列は配列番号１０または配列番号１１：
【化６０】
2012515534.tif 000065
（式中、ＹはＣ、Ｔ、またはＵであり、ＶはＡ、Ｃ、またはＧである）
を含む、
アウターＰＣＲプライマー対、および
ｃ）第１のインナープライマーおよび第２のインナープライマーを含むインナーＰＣＲプライマー対であって、
ｉ）前記第１のインナープライマーのヌクレオチド配列は配列番号１５：
【化６１】
2012515534.tif 000066
を含み、
ｉｉ）前記第２のインナープライマーのヌクレオチド配列は配列番号１６または配列番号１７：
【化６２】
2012515534.tif 000067
（式中、ＲはＡまたはＧである）
を含む、
インナーＰＣＲプライマー対、
を含む、キット。
【請求項６４】
ＨＣＶ感染サンプル由来のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）核酸をアッセイするためのキットであって、
ａ）ＲＴプライマーであって、前記ＲＴプライマーのヌクレオチド配列はその３’末端に配列番号１：
５’−（Ａ）ｎ−ＡＡＡＡ−３’（配列番号１）
（式中、ｎは１〜２６の整数である）
を含む、ＲＴプライマー、
ｂ）第１のアウタープライマーおよび第２のアウタープライマーを含むアウターＰＣＲプライマー対であって、
ｉ）前記第１のアウタープライマーのヌクレオチド配列はその３’末端に、配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドは、独立して、配列番号９：
【化６３】
2012515534.tif 000068
のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｉｉ）前記第２のアウタープライマーのヌクレオチド配列はその３’末端に、配列番号１０または配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドは、独立して、配列番号１０および配列番号１１：
【化６４】
2012515534.tif 000069
（式中、ＹはＣ、Ｔ、またはＵであり、ＶはＡ、Ｃ、またはＧである）
のヌクレオチド以外のヌクレオチドである、
アウターＰＣＲプライマー対、および
ｃ）第１のインナープライマーおよび第２のインナープライマーを含むインナーＰＣＲプライマー対であって、
ｉ）前記第１のインナープライマーのヌクレオチド配列はその３’末端に、配列番号１２に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドは、独立して、配列番号１２：
【化６５】
2012515534.tif 000070
のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｉｉ）前記第２のインナープライマーのヌクレオチド配列はその３’末端に、配列番号１３または配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドは、独立して、配列番号１３および配列番号１４：
【化６６】
2012515534.tif 000071
（式中、ＲはＡまたはＧである）
のヌクレオチド以外のヌクレオチドである、
インナーＰＣＲプライマー対、
を含む、キット。
【請求項６５】
ＨＣＶ感染サンプル由来のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）核酸をアッセイするためのキットであって、
ａ）ＲＴプライマーであって、前記ＲＴプライマーのヌクレオチド配列は配列番号８：
【化６７】
2012515534.tif 000072
を含む、ＲＴプライマー、
ｂ）第１のアウタープライマーおよび第２のアウタープライマーを含むアウターＰＣＲプライマー対であって、
ｉ）前記第１のアウタープライマーのヌクレオチド配列は配列番号９：
【化６８】
2012515534.tif 000073
を含み、
ｉｉ）前記第２のアウタープライマーのヌクレオチド配列は配列番号１０または配列番号１１：
【化６９】
2012515534.tif 000074
（式中、ＹはＣ、Ｔ、またはＵであり、ＶはＡ、Ｃ、またはＧである）
を含む、
アウターＰＣＲプライマー対、および
ｃ）第１のインナープライマーおよび第２のインナープライマーを含むインナーＰＣＲプライマー対であって、
ｉ）前記第１のインナープライマーのヌクレオチド配列は配列番号１２：
【化７０】
2012515534.tif 000075
を含み、
ｉｉ）前記第２のインナープライマーのヌクレオチド配列は配列番号１３または配列番号１４：
【化７１】
2012515534.tif 000076
（式中、ＲはＡまたはＧである）
を含む、
インナーＰＣＲプライマー対、
を含む、キット。
【請求項６６】
ＨＣＶ感染サンプル由来のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）核酸をアッセイするためのキットであって、
ａ）ＲＴプライマーであって、前記ＲＴプライマーのヌクレオチド配列は配列番号８：
【化７２】
2012515534.tif 000077
を含む、ＲＴプライマー、
ｂ）第１のアウタープライマーおよび第２のアウタープライマーを含むアウターＰＣＲプライマー対であって、
ｉ）前記第１のアウタープライマーのヌクレオチド配列は配列番号９：
【化７３】
2012515534.tif 000078
を含み、
ｉｉ）前記第２のアウタープライマーのヌクレオチド配列は配列番号１０または配列番号１１：
【化７４】
2012515534.tif 000079
（式中、ＹはＣ、Ｔ、またはＵであり、ＶはＡ、Ｃ、またはＧである）
を含む、
アウターＰＣＲプライマー対、および
ｃ）第１のインナープライマーおよび第２のインナープライマーを含むインナーＰＣＲプライマー対であって、
ｉ）前記第１のインナープライマーのヌクレオチド配列は配列番号１５：
【化７５】
2012515534.tif 000080
を含み、
ｉｉ）前記第２のインナープライマーのヌクレオチド配列は配列番号１６または配列番号１７：
【化７６】
2012515534.tif 000081
（式中、ＲはＡまたはＧである）
を含む、
インナーＰＣＲプライマー対、
を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
【化１】
2012515534.tif 000003
（関連出願）
本出願は、２００９年１月２１日に出願された米国仮出願第６１／１４６，０８３号の利益を主張し、上記米国仮出願の全ての教示は、参照によって本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、フラビウイルス科（ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｆｌａｖｉｒｉｖｉｄａｅ）のポジティブセンス一本鎖ＲＮＡウイルスである。ＨＣＶは、世界的な慢性肝疾患の主な原因であり、依然として輸血後非Ａ型非Ｂ型肝炎の最も一般的な原因の１つである。ＨＣＶに感染したヒトのうちの２０〜２５％は、急性感染後にウイルスを除去することができる場合があるが、７５〜８０％は慢性Ｃ型肝炎感染を引き起こす（例えば、非特許文献１の序文を参照のこと）。これにより、通常、再発性および進行性に肝炎が悪化し、しばしば、肝硬変および肝細胞癌腫などのより重篤な状態になる。
【０００３】
ＨＣＶゲノムの情報を得て定量することにより、患者のＨＣＶ感染の診断および／または処置のための多数のアプローチを開発を容易にすることができる。一般に、ＨＣＶゲノムの比較的長いフラグメントの分析により、複数の比較的短いフラグメントからでは得ることができない、より多数の配列情報が得られる。しかし、一般に、従来のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用してＰＣＲ増幅の前に逆転写（ＲＴ）工程が必要な長いＲＮＡゲノム（例えば、５キロベースを超える）を増幅することは困難であった。かかる状況は、例えば、８，０００塩基対を超えるＨＣＶゲノムまたは全長ＨＣＶゲノムを増幅しようとする場合にさらにより困難である。また、一般に、臨床研究および疫学研究から得た検体由来のかかる長いＨＣＶゲノムを比較的高い再現性で増幅することは困難であった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｒ．Ｆ．Ｃｈｉｎａｚｉ，Ｊ．−Ｐ．Ｓｏｍｍａｄｏｓｓｉ，およびＣ．Ｍ．Ｒｉｃｅ編，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｖｉｒａｌ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（２００３），ｐ．ｘｉ．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、ＨＣＶゲノムの新規の増幅およびアッセイ方法が必要である。特に、８，０００塩基対を超えるＨＣＶ核酸（例えば、全長ＨＣＶ）を比較的高い再現性（例えば、８０％超、８５％超、または９０％超）で増幅およびアッセイする新規の方法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の概要）
本発明は、一般に、ＨＣＶ核酸の増幅方法、ＨＣＶ核酸のアッセイ方法、およびそのためのキットおよびプライマーを提供する。
【０００７】
１つの態様では、本発明は、ＨＣＶ感染サンプル由来のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）核酸を増幅する方法を提供する。本方法は、２段階ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってサンプル由来のＨＣＶ  ＲＮＡのゲノムに相補的なＤＮＡテンプレートのセグメントを増幅する工程であって、第１段階のＰＣＲは第１のアウタープライマーおよび第２のアウタープライマーを使用し、第２段階のＰＣＲは第１のインナープライマーおよび第２のインナープライマーを使用する、増幅する工程を含む。１つの実施形態では、本方法は、さらに、ＲＴプライマーを使用した逆転写（ＲＴ）によってサンプル由来のＨＣＶ  ＲＮＡのゲノムに相補的なＤＮＡテンプレートを形成する工程を含む。
【０００８】
別の態様では、本発明は、ＨＣＶ感染サンプル由来のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）核酸をアッセイする方法を提供する。本方法は、２段階ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってサンプル由来のＨＣＶ  ＲＮＡのゲノムに相補的なＤＮＡテンプレートのセグメントを増幅する工程であって、第１段階のＰＣＲは第１のアウタープライマーおよび第２のアウタープライマーを使用し、第２段階のＰＣＲは第１のインナープライマーおよび第２のインナープライマーを使用する、増幅する工程を含む。本方法は、さらに、増幅ＨＣＶ核酸を配列決定する工程を含む。１つの実施形態では、本方法は、さらに、ＲＴプライマーを使用した逆転写（ＲＴ）によってサンプル由来のＨＣＶ  ＲＮＡゲノムに相補的なＤＮＡテンプレートを形成する工程を含む。
【０００９】
さらに別の態様では、本発明は、ＨＣＶ感染サンプル中のＨＣＶ核酸を増幅および／またはアッセイするためのキットを提供する。１つの実施形態では、キットは、第１のアウタープライマーおよび第２のアウタープライマーを含むアウターＰＣＲプライマー対を含む。別の実施形態では、キットは、第１のインナープライマーおよび第２のインナープライマーを含むインナーＰＣＲプライマー対を含む。さらに別の実施形態では、キットは、ＲＴプライマー、第１のアウタープライマーおよび第２のアウタープライマーを含むアウターＰＣＲプライマー対、ならびに第１のインナープライマーおよび第２のインナープライマーを含むインナーＰＣＲプライマー対を含む。
【００１０】
１つの実施形態では、ＲＴプライマーのヌクレオチド配列は配列番号１を含み、第１のアウタープライマーのヌクレオチド配列は配列番号２を含み、第２のアウタープライマーのヌクレオチド配列は配列番号３または配列番号４を含み、第１のインナープライマーのヌクレオチド配列は配列番号５を含み、第２のインナープライマーのヌクレオチド配列は配列番号６または配列番号７を含む：
【００１１】
【化２】
2012515534.tif 000004
（式中、ＶはＡ、Ｃ、またはＧであり、ＲはＡまたはＧである）。
【００１２】
別の実施形態では、ＲＴプライマーのヌクレオチド配列はその３’末端に配列番号１を含み、第１のアウタープライマーのヌクレオチド配列はその３’末端に配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドは、独立して、配列番号９のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、第２のアウタープライマーのヌクレオチド配列はその３’末端に、配列番号１０または配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドは、独立して、配列番号１０および配列番号１１のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、第１のインナープライマーのヌクレオチド配列はその３’末端に、配列番号１２に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドは、独立して、配列番号１２のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、第２のインナープライマーのヌクレオチド配列はその３’末端に、配列番号１３または配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドは、独立して、配列番号１３および配列番号１４のヌクレオチド以外のヌクレオチドである：
【００１３】
【化３】
2012515534.tif 000005
【００１４】
【化４】
2012515534.tif 000006
（式中、ＶはＡ、Ｃ、またはＧであり、ＲはＡまたはＧであり、ＹはＣ、Ｔ、またはＵである）。
【００１５】
さらに別の実施形態では、ＲＴプライマーのヌクレオチド配列はその３’末端に配列番号１を含み、第１のアウタープライマーのヌクレオチド配列はその３’末端に配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドは、独立して、配列番号９のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、第２のアウタープライマーのヌクレオチド配列はその３’末端に、配列番号１０または配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドは、独立して、配列番号１０および配列番号１１のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、第１のインナープライマーのヌクレオチド配列はその３’末端に、配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドは、独立して、配列番号１５のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、第２のインナープライマーのヌクレオチド配列はその３’末端に、配列番号１６または配列番号１７に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドは、独立して、配列番号１６および配列番号１７のヌクレオチド以外のヌクレオチドである：
【００１６】
【化５】
2012515534.tif 000007
（式中、ＶはＡ、Ｃ、またはＧであり、ＲはＡまたはＧであり、ＹはＣ、Ｔ、またはＵである）。
【００１７】
さらに別の実施形態では、ＲＴプライマーのヌクレオチド配列は配列番号１を含み、第１のアウタープライマーのヌクレオチド配列は配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号９の５’末端から１〜１４位の１、２、または３個のヌクレオチドは、独立して、配列番号９のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、第２のアウタープライマーのヌクレオチド配列は配列番号１０または１１に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１０および１１の５’末端から１〜１２位の１、２、または３個のヌクレオチドは、独立して、配列番号１０および１１のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、第１のインナープライマーのヌクレオチド配列は配列番号１２に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１２の５’末端から１〜１４位の１、２、または３個のヌクレオチドは、独立して、配列番号１２に記載のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、第２のインナープライマーのヌクレオチド配列は配列番号１３または１４に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１３および１４の５’末端から１〜１２位の１、２、または３個のヌクレオチドは、独立して、配列番号１３および１４のヌクレオチド以外のヌクレオチドである。
【００１８】
さらに別の実施形態では、ＲＴプライマーのヌクレオチド配列は配列番号８を含み、第１のアウタープライマーのヌクレオチド配列は配列番号９を含み、第２のアウタープライマーのヌクレオチド配列は配列番号１０または配列番号１１を含み、第１のインナープライマーのヌクレオチド配列は配列番号１２を含み、第２のインナープライマーのヌクレオチド配列は配列番号１３または配列番号１４を含む：
【００１９】
【化６】
2012515534.tif 000008
（式中、ＶはＡ、Ｃ、またはＧであり、ＲはＡまたはＧであり、ＹはＣ、Ｔ、またはＵである）。
【００２０】
さらに別の実施形態では、ＲＴプライマーのヌクレオチド配列は配列番号８を含み、第１のアウタープライマーのヌクレオチド配列は配列番号９を含み、第２のアウタープライマーのヌクレオチド配列は配列番号１０または配列番号１１を含み、第１のインナープライマーのヌクレオチド配列は配列番号１５を含み、第２のインナープライマーのヌクレオチド配列は配列番号１６または配列番号１７を含む：
【００２１】
【化７】
2012515534.tif 000009
（式中、ＶはＡ、Ｃ、またはＧであり、ＲはＡまたはＧであり、ＹはＣ、Ｔ、またはＵである）。
【００２２】
本発明を、例えば、臨床分離株（ＨＣＶに感染した患者の組織由来の臨床分離株など）由来のＨＣＶ核酸の増幅のために使用することができる。本発明のＰＣＲ法を使用して、例えば、８，０００塩基対超のＨＣＶゲノム配列を、１０３〜１０４ＩＵ／ｍｌのＨＣＶサンプルを使用した場合でさえ比較的高い再現性で（例えば、成功率８０％超、８５％超、または９０％超）増幅および配列決定することができる。本発明のＰＣＲ法を、１０３ＩＵ／ｍｌ未満のＨＣＶサンプル中のＨＣＶゲノムの増幅および配列決定のために使用することもできる。ＨＣＶゲノムの配列情報を、患者におけるＨＣＶ感染の診断および／または処置の開発のためにに使用することができ、他の種々の実験目的（例えば、ＨＣＶゲノムまたはそのフラグメントを含むベクターの生成）のために使用することもできる。例えば、本発明を、ＨＣＶ患者の耐性プロフィールまたは特定の療法に対する応答（例えば、特定の多形性の表示）のモニタリングまたは追跡およびそのための診断キットのために使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、当該分野で公知のＨＣＶゲノムを示す略図である。
【図２】図２は、本発明の１つの実施形態におけるＨＣＶゲノムおよびプライマーの位置を示す略図である。
【図３】図３および４は、本発明のＲＴ−ＰＣＲ法の感度を示す電気泳動の画像を示す。
【図４】図３および４は、本発明のＲＴ−ＰＣＲ法の感度を示す電気泳動の画像を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ＨＣＶ核酸分子の特定の核酸配列の増幅、アッセイ、同定、配列決定、および／または定量に有用な方法およびキットを提供する。
【００２５】
ＨＣＶは、約９６００ヌクレオシド塩基のポジティブセンスＲＮＡゲノムを有する。図１は、およそ９．５ｋｂのＨＣＶ  ＲＮＡの略図である。図１に示すように、ＲＮＡの５’末端および３’末端は、それぞれ、５’ＵＴＲ領域および３’ＵＴＲ領域である。５’ＵＴＲ領域から３’ＵＴＲ領域へ前進するにつれて、活性な構造タンパク質（コア（Ｃ）、エンベロープ（Ｅ１およびＥ２）およびＰ７タンパク質）ならびに非構造タンパク質（ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ、およびＮＳ５ｂタンパク質）をコードする配列が存在する。ＲＮＡの３’末端は、ＨＣＶの型に依存して、ポリ（Ａ）テールまたはポリ（Ｕ）テールのいずれかを含む。５’ＵＴＲ領域および３’ＵＴＲ領域は、タンパク質に翻訳されないが、ウイルスＲＮＡの翻訳および複製に重要である。特に、５’ＵＴＲは、３０００個のアミノ酸を含むタンパク質の翻訳を開始させるリボゾーム結合部位（ＩＲＥＳ−内部リボゾーム進入部位）を有し、このタンパク質は、後に、細胞プロテアーゼおよびウイルスプロテアーゼによって活性な構造タンパク質（コア（Ｃ）、エンベロープ（Ｅ１およびＥ２）、およびＰ７タンパク質）ならびにより小さな非構造タンパク質（ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ、およびＮＳ５ｂタンパク質が含まれる）に切断される。ＨＣＶ非構造（ＮＳ）タンパク質は、ウイルス複製に不可欠な触媒機構を提供すると考えられている。ＮＳタンパク質は、ポリタンパク質のタンパク質分解性切断に由来する。ＨＣＶ  ＮＳタンパク質３（ＮＳ３）は、大部分のウイルス酵素のプロセシングを補助するセリンプロテアーゼ活性を含み、したがって、ウイルスの複製および感染力に不可欠と考えられる。ＮＳ３の最初の１８１アミノ酸（ウイルスポリタンパク質の残基１０２７〜１２０７）は、ＨＣＶポリタンパク質の４つ全ての下流部位をプロセシングするＮＳ３のセリンプロテアーゼドメインを含むことが示されている。ＨＣＶ  ＮＳ３  セリンプロテアーゼおよびその関連補因子ＮＳ４Ａは、全てのウイルス酵素のプロセシングを補助する。５’ＵＴＲはＨＣＶゲノムの最も高度に保存された部分であるのに対して、２つのエンベロープタンパク質（Ｅ１およびＥ２）の配列は異なるＨＣＶ分離株間で非常に変動する。
【００２６】
典型的には、ＨＣＶの遺伝的異質性は、疑似種(quasispecies)および遺伝子型によって分類されている。本明細書中で使用する場合、用語「疑似種」は、感染個体内のＨＣＶ集団の遺伝的異質性をいう。本明細書中で使用する場合、用語「遺伝子型」および「亜型」は、異なるＨＣＶ分離菌間で認められるゲノム異質性をいう。ＨＣＶの複数の型および亜型が当該分野で公知であり、例えば、遺伝子型１ａ、１ｂ、１ｃ、２ａ、２ｂ、２ｃ、３ａ、３ｂ、４ａ、５ａ、および６ａ（Ｓｉｍｍｏｎｄｓら、１９９４，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  １９：１３２１−２４；Ｚｅｉｎ，２０００，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１３：２２３−２３５の分類系を使用）が含まれる。
【００２７】
本明細書中で使用する場合、用語「ＨＣＶ」には、ＨＣＶの任意の型および亜型（遺伝子型１ａ、１ｂ、１ｃ、２ａ、２ｂ、２ｃ、３ａ、３ｂ、４ａ、５ａ、および６ａが含まれる）ならびにその変種が含まれる。一般に、「変種」には、参照ウイルス、遺伝子、またはタンパク質と比較して１つまたは複数が変化している配列が含まれる。変種の起源には、例えば、遺伝子の変異および多形が含まれる。また、用語「ＨＣＶ核酸」には、全長ＨＣＶおよび配列の一部を有するＨＣＶのフラグメントが含まれる。
【００２８】
１つの態様では、本発明は、ＨＣＶ感染サンプル由来のＨＣＶ  ＲＮＡゲノムに相補的なＤＮＡテンプレート（ｃＤＮＡ）を調製するためのＲＴの使用によるサンプルから得たＨＣＶ核酸の増幅方法を提供する。次いで、ＤＮＡテンプレートのセグメントを、２段階ＰＣＲの使用によって増幅する。ＤＮＡテンプレートセグメントには、増幅に供した標的ＨＣＶ核酸分子が含まれ、標的ＨＣＶ核酸分子のアンプリコンを２段階ＰＣＲによって産生する。ＲＴおよびＰＣＲ過程は、それぞれ独立して、本明細書中に開示の１つまたは複数のプライマー（例えば、配列番号１〜１７）を使用する。
【００２９】
いくつかの実施形態では、増幅した標的ＨＣＶ核酸分子は、８，０００塩基対を超える。他の実施形態では、増幅した標的ＨＣＶ核酸分子は、９，０００塩基対を超える。さらに他の実施形態では、増幅した標的ＨＣＶ核酸分子は、Ｃ、Ｅ１、Ｅ２、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、およびＮＳ５Ｂタンパク質をコードするゲノムを含む。さらに他の実施形態では、増幅した標的ＨＣＶ核酸分子は、全長ヌクレオチドを有する。
【００３０】
標的ＨＣＶ核酸分子を検出することができるサンプルは、任意のＨＣＶに感染した体液、細胞、または細胞片である。ＨＣＶの存在を決定すべき患者由来のサンプルは、例えば、血液、血清、血漿、および他の体液または組織であり得る。「ＨＣＶ感染サンプル」は、任意の量のＨＣＶ  ＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＨＣＶ感染サンプルは、ＨＣＶ陽性サンプルに由来する。本明細書中で使用する場合、語句「ＨＣＶ陽性」サンプルは、サンプルが１０００ＩＵ／ｍＬを超える量のＨＣＶ  ＲＮＡを含むことを意味する。いくつかの実施形態では、ＨＣＶ感染サンプルは、１０００ＩＵ／ｍＬ以下の量（例えば、１０ＩＵ／ｍＬと１０００ＩＵ／ｍＬとの間、１００ＩＵ／ｍＬと１０００ＩＵ／ｍＬとの間、５００ＩＵ／ｍＬと１０００ＩＵ／ｍＬとの間、または７００ＩＵ／ｍＬと１０００ＩＵ／ｍＬとの間の範囲）のＨＣＶ  ＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、標的ＨＣＶ核酸分子が得られるＨＣＶ感染サンプルは、ＨＣＶ感染患者の血漿である。
【００３１】
「プライマー」は、テンプレート核酸分子へのハイブリッド形成の際に、例えば、増幅またはＲＴ反応中の合成開始点として作用することができるオリゴヌクレオチドである。本発明のプライマーの長さは重要ではない。典型的には、プライマーの長さは、５〜１５０ヌクレオチド（１０〜１００ヌクレオチド、１５〜８０ヌクレオチド、１５〜５０ヌクレオチド、２５〜８０ヌクレオチド、２８〜８０ヌクレオチド、２０〜４５ヌクレオチド、１５〜３５ヌクレオチド、または２５〜３５ヌクレオチドなど）の範囲である。例えば、１〜１００ヌクレオチド（１〜５０、１〜３０、または１〜２０ヌクレオチドを有するＴａｑなど）のさらなる配列を、配列番号１〜１７のいずれか１つおよびその変種の５’末端に付加することができる。いくつかの実施形態では、１〜１００ヌクレオチドのランダム配列（１〜５０、１〜３０、または１〜２０ヌクレオチドのランダム配列など）を、本明細書中に開示のプライマー（例えば、配列番号１〜１４のオリゴヌクレオチドおよびその変種）の５’末端に付加するが、その３’末端には付加しない。いくつかの実施形態では、本発明のプライマーは、配列番号１〜１７またはその変種をその３’末端に含む。
【００３２】
用語「核酸」、「ヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」を、全体を通して交換可能に使用する。他に断らない限り、ポリヌクレオチド配列を一連の一文字表記および／または三文字表記で示す場合、配列を、慣習にしたがって、５’→３’方向で示す。特異的核酸塩基配列を含む核酸をいうために本明細書を通して使用した略語は、従来の一文字表記である。したがって、核酸中に含まれる場合、天然に存在するコード核酸塩基は、以下のように省略する：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、およびウラシル（Ｕ）。
【００３３】
本発明では、ＲＴ工程を、そのヌクレオチド配列が配列番号１または配列番号８を含むＲＴプライマーを使用して行う。
【００３４】
【化８】
2012515534.tif 000010
配列番号１の「ｎ」は、典型的には１〜２６の整数、より典型的には４〜２０の整数、さらにより典型的には１０〜２０の整数である。
【００３５】
いくつかの実施形態では、ＲＴプライマーは１０〜８０merである。他の実施形態では、ＲＴプライマーは１５〜８０merである。さらに他の実施形態では、ＲＴプライマーは１５〜５０merである。さらに他の実施形態では、ＲＴプライマーは１５〜３０merである。さらに他の実施形態では、ＲＴプライマーは１８〜３０merである。
【００３６】
いくつかの実施形態では、ＲＴプライマーは、その３’末端に配列番号１または配列番号８を含む。
【００３７】
いくつかの実施形態では、標的ＨＣＶ  ＲＮＡを、ＨＣＶゲノムの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）で上記のＲＴプライマーを使用してプライム（prime）する。
【００３８】
一般に、ＲＴ工程を個別の工程として行うことができる。任意選択的に、組み合わせた逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）で行うことができる。ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ増幅は当該分野で周知であり、例えば、米国特許第５，３２２，７７０号および同第５，３１０，６５２号；Ｍｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｇｅｌｆａｎｄ，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０（３１）：７６６１−７６６６；米国特許第５，５２７，６６９号；Ｙｏｕｎｇら、１９９３，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３１（４）：８８２−８８６；およびＹｏｕｎｇら、１９９５，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３３（３）：６５４−６５７に記載されている。
【００３９】
ＲＴ工程中、一般に、標的核酸を含むＨＣＶ  ＲＮＡを、研究所で典型的に行われる様式でＨＣＶ感染サンプルから単離してＲＮＡテンプレートを調製する。いくつかの実施形態では、ＨＣＶ  ＲＮＡを、キャリアＲＮＡを使用してＨＣＶ感染サンプルから単離する。本発明で使用することができるキャリアＲＮＡの例には、ポリ−Ａ  ＲＮＡおよび細菌ｔＲＮＡが含まれる。特定の実施形態では、細菌ｔＲＮＡを使用する。相補的ＤＮＡテンプレートを、ＲＴプライマーおよび１つまたは複数のＲＴ酵素を使用してＨＣＶ  ＲＮＡテンプレートから調製する。当該分野で公知の任意の適切なＲＴ条件およびＲＴ酵素を、本発明で使用することができる。本発明で使用することができるＲＴ酵素の具体例には、Ｍ−ＭｕＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ，ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ，ＰｏｗｅｒＳｃｒｉｐｔ，Ａｃｃｕｓｃｒｉｐｔ，ＡｒｒａｙＳｃｒｉｐｔ、およびＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅなど）；ＡＭＶ（トリ骨髄芽球症ウイルス）、およびＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス（Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｅｎｃｙ  Ｖｉｒｕｓ））が含まれる。
【００４０】
次いで、ｃＤＮＡテンプレートを、２段階ＰＣＲを使用した増幅のために使用することができる。一般に、２段階ＰＣＲは、第１段階のＰＣＲおよび第２段階のＰＣＲを使用する。第１段階のＰＣＲでは、標的ＨＣＶ核酸を含むＨＣＶ  ｃＤＮＡテンプレート（またはＨＣＶ  ｃＤＮＡテンプレートのセグメント）を、アウタープライマー対（すなわち、第１のアウタープライマーおよび第２のアウタープライマー）を使用して増幅して、第１の増幅産物（アンプリコン）を産生する。次いで、例えば、第１段階のＰＣＲの増幅産物の少なくとも一部（または増幅産物のセグメント）を、その後にインナープライマー対（すなわち、第１のインナープライマーおよび第２のインナープライマー）を使用した第２段階のＰＣＲによってさらに増幅して、第２の増幅産物（アンプリコン）を産生する。従来のＰＣＲのように、各増幅反応サイクルにおいて、サンプル中の任意の二本鎖核酸分子を変性によって一本鎖にすることができる。次いで、プライマーと標的核酸分子との間でハイブリッド形成させることができる。
【００４１】
典型的には、インナープライマー対またはアウタープライマー対の長さは同一でも異なっていてもよい。例えば、各インナープライマー対およびアウタープライマー対について、第１のプライマーを２９個のヌクレオチドで構成することができる一方で、第２のプライマーを２２個のヌクレオチドで構成することができる。いくつかの実施形態では、各アウタープライマーおよびインナープライマーは、独立して、１５〜８０merである。他の実施形態では、各アウタープライマーおよびインナープライマーは、独立して、１５〜５０merである。さらに他の実施形態では、各アウタープライマーおよびインナープライマーは、独立して、２５〜８０merである。さらに他の実施形態では、各アウタープライマーおよびインナープライマーは、独立して、２８〜８０merである。さらに他の実施形態では、各アウタープライマーおよびインナープライマーは、独立して、２５〜５０merである。
【００４２】
１つの実施形態では、第１のインナープライマーおよびアウタープライマーを、独立して、ＨＣＶゲノムの５’ＵＴＲでプライムし、第２のインナープライマーおよびアウタープライマーを、独立して、ＨＣＶゲノムのＮＳ５Ｂ領域でプライムする。特定の実施形態では、第１のインナープライマーおよびアウタープライマーをプライムする５’ＵＴＲ領域は、Ｆ１およびＦ２プライマーについては、独立して、図２に示す領域を含み、第２のインナープライマーおよびアウタープライマーをプライムするＮＳ５Ｂ領域は、Ｒ１およびＲ２プライマーについては、独立して、図２に示す領域を含む。
【００４３】
１つの実施形態では、第１のアウタープライマーは、配列番号２のヌクレオチド配列を含む。
【００４４】
【化９】
2012515534.tif 000011
別の実施形態では、第１のアウタープライマーは配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号９の５’末端から１〜１４位の１、２、または３個（あるいは、１または２個）のヌクレオチドは、独立して、配列番号９のヌクレオチド以外のヌクレオチドである。
【００４５】
【化１０】
2012515534.tif 000012
さらに別の実施形態では、第１のアウタープライマーは、その３’末端に、配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個（あるいは、１または２個）のヌクレオチドは、独立して、配列番号９のヌクレオチド以外のヌクレオチドである。
【００４６】
さらに別の実施形態では、第１のアウタープライマーは、配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含む。さらに別の実施形態では、第１のアウタープライマーは、その３’末端に、配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含む。
【００４７】
１つの実施形態では、第２のアウタープライマーは、配列番号３または配列番号４に記載のヌクレオチド配列を含む。
【００４８】
【化１１】
2012515534.tif 000013
別の実施形態では、第２のアウタープライマーは配列番号１０または１１に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１０および１１の５’末端から１〜１２位の１、２、または３個（あるいは、１または２個）のヌクレオチドは、独立して、配列番号１０および１１のヌクレオチド以外のヌクレオチドである。
【００４９】
【化１２】
2012515534.tif 000014
さらに別の実施形態では、第２のアウタープライマーは、その３’末端に、配列番号１０または１１に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個（あるいは、１または２個）のヌクレオチドは、独立して、配列番号１０および１１のヌクレオチド以外のヌクレオチドである。
【００５０】
さらに別の実施形態では、第２のアウタープライマーは、配列番号１０または１１に記載のヌクレオチド配列を含む。さらに別の実施形態では、第２のアウタープライマーは、その３’末端に、配列番号１０または１１に記載のヌクレオチド配列を含む。
【００５１】
１つの実施形態では、第１のインナープライマーは、配列番号５に記載のヌクレオチド配列を含む。
【００５２】
【化１３】
2012515534.tif 000015
別の実施形態では、第１のインナープライマーは配列番号１２に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１２の５’末端から１〜１４位の１、２、または３個（あるいは、１または２個）のヌクレオチドは、独立して、配列番号１２のヌクレオチド以外のヌクレオチドである。
【００５３】
【化１４】
2012515534.tif 000016
さらに別の実施形態では、第１のインナープライマーは、その３’末端に、配列番号１２に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個（あるいは、１または２個）のヌクレオチドは、独立して、配列番号１２のヌクレオチド以外のヌクレオチドである。
【００５４】
さらに別の実施形態では、第１のインナープライマーは、配列番号１２に記載のヌクレオチド配列を含む。さらに別の実施形態では、第１のインナープライマーは、その３’末端に、配列番号１２に記載のヌクレオチド配列を含む。
【００５５】
さらに別の実施形態では、第１のインナープライマーは配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１５の５’末端から１〜１６位の１、２、または３個（あるいは、１または２個）のヌクレオチドは、独立して、配列番号１５のヌクレオチド以外のヌクレオチドである。
【００５６】
【化１５】
2012515534.tif 000017
さらに別の実施形態では、第１のインナープライマーは、その３’末端に、配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個（あるいは、１または２個）のヌクレオチドは、独立して、配列番号１５のヌクレオチド以外のヌクレオチドである。
【００５７】
さらに別の実施形態では、第１のインナープライマーは、配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含む。さらに別の実施形態では、第１のインナープライマーは、その３’末端に、配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含む。
【００５８】
１つの実施形態では、第２のインナープライマーは、配列番号６または７に記載のヌクレオチド配列を含む。
【００５９】
【化１６】
2012515534.tif 000018
別の実施形態では、第２のインナープライマーは配列番号１３または１４に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１３および１４の５’末端から１〜１２位の１、２、または３個（あるいは、１または２個）のヌクレオチドは、独立して、配列番号１３および１４のヌクレオチド以外のヌクレオチドである。
【００６０】
【化１７】
2012515534.tif 000019
さらに別の実施形態では、第２のインナープライマーは、その３’末端に、配列番号１３または１４に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個（あるいは、１または２個）のヌクレオチドは、独立して、配列番号１３および１４のヌクレオチド以外のヌクレオチドである。
【００６１】
別の実施形態では、第２のインナープライマーは配列番号１６または１７に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１６および１７の５’末端から１〜１３位の１、２、または３個（あるいは、１または２個）のヌクレオチドは、独立して、配列番号１６および１７のヌクレオチド以外のヌクレオチドである。
【００６２】
【化１８】
2012515534.tif 000020
さらに別の実施形態では、第２のインナープライマーは、その３’末端に、配列番号１６または１７に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個（あるいは、１または２個）のヌクレオチドは、独立して、配列番号１６および１７のヌクレオチド以外のヌクレオチドである。
【００６３】
さらに別の実施形態では、第２のインナープライマーは、配列番号１６または１７に記載のヌクレオチド配列を含む。さらに別の実施形態では、第２のインナープライマーは、その３’末端に、配列番号１６または１７に記載のヌクレオチド配列を含む。
【００６４】
第１の特定の実施形態では、第１のアウタープライマーは配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号９の５’末端から１〜１４位の１、２、または３個（あるいは、１または２個）のヌクレオチドは、独立して、配列番号９のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、第２のアウタープライマーは配列番号１０または１１に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１０および１１の５’末端から１〜１２位の１、２、または３個（あるいは、１または２個）のヌクレオチドは、独立して、配列番号１０および１１のヌクレオチド以外のヌクレオチドである。
【００６５】
第２の特定の実施形態では、第１のインナープライマーは配列番号１２に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１２の５’末端から１〜１４位の１、２、または３個（あるいは、１または２個）のヌクレオチドは、独立して、配列番号１２のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、第２のインナープライマーは配列番号１３または１４に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１３および１４の５’末端から１〜１２位の１、２、または３個（あるいは、１または２個）のヌクレオチドは、独立して、配列番号１３および１４のヌクレオチド以外のヌクレオチドである。
【００６６】
第３の特定の実施形態では、第１のアウタープライマーは配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号９の５’末端から１〜１４位の１、２、または３個（あるいは、１または２個）のヌクレオチドは、独立して、配列番号９のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、第２のアウタープライマーは配列番号１０または１１に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１０および１１の５’末端から１〜１２位の１、２、または３個（あるいは、１または２個）のヌクレオチドは、独立して、配列番号１０および１１のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、第１のインナープライマーは配列番号１２に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１２の５’末端から１〜１４位の１、２、または３個（あるいは、１または２個）のヌクレオチドは、独立して、配列番号１２のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、第２のインナープライマーは配列番号１３または１４に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１３および１４の５’末端から１〜１２位の１、２、または３個（あるいは、１または２個）のヌクレオチドは、独立して、配列番号１３および１４のヌクレオチド以外のヌクレオチドである。本実施形態の１つの態様では、標的ＨＣＶ核酸分子は８，０００塩基対を超える。本実施形態の別の態様では、標的ＨＣＶ核酸分子は遺伝子型１ａまたは１ｂである。本実施形態のさらに別の態様では、標的ＨＣＶ核酸分子は、８，０００塩基対を超える遺伝子型１ａまたは１ｂである。
【００６７】
第４の特定の実施形態では、第１のアウタープライマーはその３’末端に配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に１、２、または３個（あるいは、１または２個）のヌクレオチドは、独立して、配列番号９のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、第２のアウタープライマーはその３’末端に配列番号１０または１１に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に１、２、または３個（あるいは、１または２個）のヌクレオチドは、独立して、配列番号１０および１１のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、第１のインナープライマーはその３’末端に配列番号１２に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に１、２、または３個（あるいは、１または２個）のヌクレオチドは、独立して、配列番号１２のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、第２のインナープライマーはその３’末端に配列番号１３または１４に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に１、２、または３個（あるいは、１または２個）のヌクレオチドは、独立して、配列番号１３および１４のヌクレオチド以外のヌクレオチドである。本実施形態の１つの態様では、標的ＨＣＶ核酸分子は８，０００塩基対を超える。本実施形態の別の態様では、標的ＨＣＶ核酸分子は遺伝子型１ａまたは１ｂである。本実施形態のさらに別の態様では、標的ＨＣＶ核酸分子は、８，０００塩基対を超える遺伝子型１ａまたは１ｂである。
【００６８】
第５の特定の実施形態では、標的ＨＣＶ核酸分子は、８，０００塩基対を超える遺伝子型１ａである。本実施形態の１つの態様では、アウタープライマーは配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号９の５’末端から１〜１４位の１、２、または３個（あるいは、１または２個）のヌクレオチドは、独立して、配列番号９のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、第２のアウタープライマーは配列番号１０に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１０の５’末端から１〜１２位の１、２、または３個（あるいは、１または２個）のヌクレオチドは、独立して、配列番号１０のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、第１のインナープライマーは配列番号１２に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１２の５’末端から１〜１４位の１、２、または３個（あるいは、１または２個）のヌクレオチドは、独立して、配列番号１２のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、第２のインナープライマーは配列番号１３に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１３の５’末端から１〜１２位の１、２、または３個（あるいは、１または２個）のヌクレオチドは、独立して、配列番号１３のヌクレオチド以外のヌクレオチドである。本実施形態の別の態様では、アウタープライマーはその３’末端に配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に１、２、または３個（あるいは、１または２個）のヌクレオチドは、独立して、配列番号９のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、第２のアウタープライマーはその３’末端に配列番号１０に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に１、２、または３個（あるいは、１または２個）のヌクレオチドは、独立して、配列番号１０のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、第１のインナープライマーはその３’末端に配列番号１２に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に１、２、または３個（あるいは、１または２個）のヌクレオチドは、独立して、配列番号１２のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、第２のインナープライマーはその３’末端に配列番号１３に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に１、２、または３個（あるいは、１または２個）のヌクレオチドは、独立して、配列番号１３のヌクレオチド以外のヌクレオチドである。本実施形態のさらに別の態様では、第１のアウタープライマーは配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含み、第２のアウタープライマーは配列番号１０に記載のヌクレオチド配列を含み、第１のインナープライマーは配列番号１２に記載のヌクレオチド配列を含み、第２のインナープライマーは配列番号１３に記載のヌクレオチド配列を含む。本実施形態のさらに別の態様では、第１のアウタープライマーはその３’末端に配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含み、第２のアウタープライマーはその３’末端に配列番号１０に記載のヌクレオチド配列を含み、第１のインナープライマーはその３’末端に配列番号１２に記載のヌクレオチド配列を含み、第２のインナープライマーはその３’末端に配列番号１３に記載のヌクレオチド配列を含む。
【００６９】
第６の特定の実施形態では、標的ＨＣＶ核酸分子は８，０００塩基対を超える遺伝子型１ｂである。本実施形態の１つの態様では、第１のアウタープライマーは配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号９の５’末端から１〜１４位の１、２、または３個（あるいは、１または２個）のヌクレオチドは、独立して、配列番号９のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、第２のアウタープライマーは配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１１の５’末端から１〜１２位の１、２、または３個（あるいは、１または２個）のヌクレオチドは、独立して、配列番号１１のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、第１のインナープライマーは配列番号１２に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１２の５’末端から１〜１４位の１、２、または３個（あるいは、１または２個）のヌクレオチドは、独立して、配列番号１２のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、第２のインナープライマーは配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１４の５’末端から１〜１２位の１、２、または３個（あるいは、１または２個）のヌクレオチドは、独立して、配列番号１４のヌクレオチド以外のヌクレオチドである。本実施形態の別の態様では、第１のアウタープライマーはその３’末端に配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に１、２、または３個（あるいは、１または２個）のヌクレオチドは、独立して、配列番号９のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、第２のアウタープライマーはその３’末端に配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に１、２、または３個（あるいは、１または２個）のヌクレオチドは、独立して、配列番号１１のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、第１のインナープライマーはその３’末端に配列番号１２に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に１、２、または３個（あるいは、１または２個）のヌクレオチドは、独立して、配列番号１２のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、第２のインナープライマーはその３’末端に配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に１、２、または３個（あるいは、１または２個）のヌクレオチドは、独立して、配列番号１４のヌクレオチド以外のヌクレオチドである。本実施形態のさらに別の態様では、第１のアウタープライマーは配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含み、第２のアウタープライマーは配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含み、第１のインナープライマーは配列番号１２に記載のヌクレオチド配列を含み、第２のインナープライマーは配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含む。本実施形態のさらに別の態様では、第１のアウタープライマーはその３’末端に配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含み、第２のアウタープライマーはその３’末端に配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含み、第１のインナープライマーはその３’末端に配列番号１２に記載のヌクレオチド配列を含み、第２のインナープライマーはその３’末端に配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含む。
【００７０】
いくつかの特定の実施形態では、第１のアウタープライマーおよび第２のアウタープライマーは、上記の各第１〜第４の特定の実施形態の通りであり、第１のインナープライマーは配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に１、２、または３個（あるいは、１または２個）のヌクレオチドは、独立して、配列番号１５のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、第２のインナープライマーは配列番号１６または１７に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に１、２、または３個（あるいは、１または２個）のヌクレオチドは、独立して、配列番号１６および１７のヌクレオチド以外のヌクレオチドである。いくつかのさらなる特定の実施形態では、任意選択的に配列番号１５のヌクレオチドと異なるヌクレオチドは、独立して、配列番号１５の５’末端から１〜１６位に存在し、任意選択的に配列番号１６および１７のヌクレオチドと異なるヌクレオチドは、独立して、配列番号１６および１７の５’末端から１〜１３位に存在する。いくつかのさらなる特定の実施形態では、第１のインナープライマーは配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含み、第２のインナープライマーは、配列番号１６または１７に記載のヌクレオチド配列を含む。
【００７１】
いくつかの特定の実施形態では、標的ＨＣＶ核酸分子は、８，０００塩基対を超える遺伝子型１ａであり、第１のアウタープライマーおよび第２のアウタープライマーは、上記の第５の特定の実施形態に記載の通りであり、第１のインナープライマーは配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に１、２、または３個（あるいは、１または２個）のヌクレオチドは、独立して、配列番号１５のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、第２のインナープライマーは配列番号１６に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に１、２、または３個（あるいは、１または２個）のヌクレオチドは、独立して、配列番号１６のヌクレオチド以外のヌクレオチドである。いくつかのさらなる特定の実施形態では、任意選択的に配列番号１５のヌクレオチドと異なるヌクレオチドは、独立して、配列番号１５の５’末端から１〜１６位に存在し、任意選択的に配列番号１６のヌクレオチドと異なるヌクレオチドは、独立して、配列番号１６の５’末端から１〜１３位に存在する。いくつかのさらなる特定の実施形態では、第１のインナープライマーは配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含み、第２のインナープライマーは配列番号１６に記載のヌクレオチド配列を含む。
【００７２】
いくつかの特定の実施形態では、標的ＨＣＶ核酸分子は８，０００塩基対を超える遺伝子型１ｂであり、第１のアウタープライマーおよび第２のアウタープライマーは、上記の第５の特定の実施形態に記載の通りであり、第１のインナープライマーは配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に１、２、または３個（あるいは、１または２個）のヌクレオチドは、独立して、配列番号１５のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、第２のインナープライマーは配列番号１７に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に１、２、または３個（あるいは、１または２個）のヌクレオチドは、独立して、配列番号１７のヌクレオチド以外のヌクレオチドである。いくつかのさらなる特定の実施形態では、任意選択的に配列番号１５のヌクレオチドと異なるヌクレオチドは、独立して、配列番号１５の５’末端から１〜１６位に存在し、任意選択的に配列番号１７のヌクレオチドと異なるヌクレオチドは、独立して、配列番号１７の５’末端から１〜１３位に存在する。いくつかのさらなる特定の実施形態では、第１のインナープライマーは配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含み、第２のインナープライマーは配列番号１７に記載のヌクレオチド配列を含む。
【００７３】
当該分野で公知の任意の適切なＰＣＲ条件を、本発明で使用することができる。例えば、当該分野で多数のガイダンスを見出すことができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｗｅｔｍｕｒ，１９９１，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６（３／４）：２２７−２５９；Ａｕｓｕｂｅｌ  ら（編），１９９５，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），Ｕｎｉｔ  ２．１０；および米国特許第５，７８９，５５０号）。また、かかるガイダンスを、ＰＣＲ試薬の製造者および／または供給元（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ）など）によって公開されたＰＣＲプロトコールに見出すことができる。具体的には、適切なＰＣＲ条件を、当該分野で提供されたガイダンスにしたがって、例えば、多数の変数（オリゴヌクレオチドの長さおよび塩基対の濃度、イオン強度、ミスマッチ塩基対の発生率、ならびにオリゴヌクレオチドアニーリングのために選択した温度が含まれる）を考慮して決定することができる。
【００７４】
一般に、ＤＮＡテンプレートを含むＰＣＲ増幅反応混合物は、増幅反応の実施に必要な試薬を含む。典型的には、混合物は、重合剤（熱安定性ＤＮＡポリメラーゼなど）を含む。より典型的には、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに加えて、混合物は、適切な緩衝液中にデオキシヌクレオシド５’三リン酸（ｄＮＴＰ’ｓ）および２価の金属陽イオンを含む。本発明で使用することができる典型的な熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの例には、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｗｏ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ、およびＴｆｌ  ＤＮＡポリメラーゼが含まれる。
【００７５】
１つの特定の実施形態では、ＫｌｅｎｔａｑおよびＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを本発明で使用する。別の特定の実施形態では、ＫｌｅｎｔａｑおよびＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを、本発明で１：１と３：１との間のＫｌｅｎｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ：Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ比で使用する。２つの終点の「間」に関する本明細書中に記載の範囲には終点も含むことに留意すべきである。本発明のさらに別の特定の実施形態では、第１段階のＰＣＲのＰＣＲ反応混合物は、２単位と３単位との間のＫｌｅｎｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよび１単位と１．５単位との間のＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを含む。本発明のさらに別の特定の実施形態では、第２段階のＰＣＲのＰＣＲ反応混合物は、２．５単位と３．５単位との間のＫｌｅｎｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよび１単位と２単位との間のＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを含む。
【００７６】
本発明のさらに別の特定の実施形態では、ベタインを、第１および第２のＰＣＲ段階でそれぞれ独立して使用する。本発明のさらに別の特定の実施形態では、各第１および第２のＰＣＲ段階のためのＰＣＲ反応混合物は、独立して、０．７５Ｍと２Ｍとの間の量のベタインを含む。
【００７７】
１つの実施形態では、それぞれの第１段階および第２段階のＰＣＲ中に、各ＰＣＲ反応混合物を、独立して、温度Ｔ１で時間Ｒ１でインキュベートし、その後の複数のタッチダウンＰＣＲサイクルが続く。各タッチダウンサイクルは、温度Ｔ２で時間Ｒ２、続いてサイクルｍ回について温度［Ｔ３−（Ｖ℃×ｍ）］で時間Ｒ３、および続いて温度Ｔ４で時間Ｒ４のＰＣＲ反応混合物のインキュベーションを含む。典型的には、Ｔ１およびＴ２は、独立して、９０℃と１００℃との間の範囲であり、Ｔ３およびＴ４は、独立して、６５℃と７０℃との間の範囲であり、Ｒ１は、１分間と５分間との間の範囲であり、Ｒ２は５秒間と４５秒間の範囲であり、Ｒ３は、１０秒間と４０秒間との間の範囲であり、Ｒ４は、５分間と２０分間との間の範囲であり、Ｖは、０．２℃と０．８℃との間の範囲（例えば、０．５℃）である。より典型的には、Ｒ１は、１分間と３分間との間の範囲であり、Ｒ２は１０秒間と２０秒間の範囲であり、Ｒ３は、１５秒間と２５秒間との間の範囲であり、Ｒ４は８分間と１５分間との間の範囲である。特定の実施形態では、Ｒ１は、１分間と３分間との間の範囲であり、Ｒ２は１０秒間と２０秒間の範囲であり、Ｒ３は、１５秒間と２５秒間との間の範囲であり、Ｒ４は、８分間と１５分間との間の範囲であり、Ｔ１は９４℃であり、Ｔ２は９４℃であり、Ｔ３は６８℃であり、Ｔ４は６８℃であり、Ｖは０．５℃である。
【００７８】
典型的には、タッチダウンＰＣＲサイクル数は、２０と５０との間（２０と４０との間等）の範囲である。特定の実施形態では、タッチダウンＰＣＲサイクル数は３０である。
【００７９】
上記のように、典型的には、ＲＴ段階およびＰＣＲ段階を組み合わせ逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）で行うことができる。いくつかの特定の実施形態では、ＲＴおよびＰＣＲ工程を、逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、好ましくは、ネステッドＲＴ−ＰＣＲで組み合わせる。
【００８０】
別の態様では、本発明は、ＨＣＶ感染サンプル中のＨＣＶ核酸分子のアッセイ方法を提供する。アッセイ方法では、上記の増幅方法によって調製した増幅ＨＣＶ核酸分子を、当該分野で公知の任意の適切な方法によって配列決定する。決定したＨＣＶ核酸分子配列は、例えば、患者におけるＨＣＶ感染の診断および／または処置のための新規のアプローチの開発に有用であり得る。
【００８１】
さらに別の態様では、本発明は、ＨＣＶ感染サンプル由来のＨＣＶ核酸分子の増幅および／またはアッセイのためのキットを提供する。典型的には、本発明のキットは、上記のＲＴプライマー、上記のアウターＰＣＲプライマー対（第１のアウタープライマーおよび第２のアウタープライマー）、および上記のインナーＰＣＲプライマー対（第１のアウタープライマーおよび第２のアウタープライマー）を含む。いくつかの実施形態では、本発明のキットは、逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼをさらに含む。かかるＲＴおよびＰＣＲプライマー、逆転写酵素、およびＤＮＡポリメラーゼの具体例は上記の通りである。キットは、キットの使用方法を説明した書面での説明書（例えば、ＨＣＶの増幅および／またはアッセイ方法を記載した説明書）およびこの方法に必要な化学試薬、ならびに任意の他の構成要素をさらに含むことができる。これらのキットは、例えば、サンプル採取（例えば、血液サンプルの採取）のための試薬およびＨＣＶ感染サンプルからのＨＣＶ  ＲＮＡの収集および精製のための試薬をさらに含むことができる。
【００８２】
本発明はまた、ＰＣＲプライマーを提供する。１つの実施形態では、本発明のプライマーは、配列番号９に記載のヌクレオチド配列（任意選択的に配列番号９の５’末端から１〜１４位の１、２、または３個（あるいは、１または２個）のヌクレオチドは、独立して、配列番号９のヌクレオチド以外のヌクレオチドである）、配列番号１０に記載のヌクレオチド配列（任意選択的に配列番号１０の５’末端から１〜１２位の１、２、または３個（あるいは、１または２個）のヌクレオチドは、独立して、配列番号１０のヌクレオチド以外のヌクレオチドである）、配列番号１１に記載のヌクレオチド配列（任意選択的に配列番号１１の５’末端から１〜１２位の１、２、または３個（あるいは、１または２個）のヌクレオチドは、独立して、配列番号１１のヌクレオチド以外のヌクレオチドである）、配列番号１２に記載のヌクレオチド配列（任意選択的に配列番号１２の５’末端から１〜１４位の１、２、または３個（あるいは、１または２個）のヌクレオチドは、独立して、配列番号１２のヌクレオチド以外のヌクレオチドである）、配列番号１３に記載のヌクレオチド配列（任意選択的に配列番号１３の５’末端から１〜１２位の１、２、または３個（あるいは、１または２個）のヌクレオチドは、独立して、配列番号１３のヌクレオチド以外のヌクレオチドである）、配列番号１４に記載のヌクレオチド配列（任意選択的に配列番号１４の５’末端から１〜１２位の１、２、または３個（あるいは、１または２個）のヌクレオチドは、独立して、配列番号１４のヌクレオチド以外のヌクレオチドである）、配列番号１５に記載のヌクレオチド配列（任意選択的に配列番号１５の５’末端から１〜１６位の１、２、または３個（あるいは、１または２個）のヌクレオチドは、独立して、配列番号１５のヌクレオチド以外のヌクレオチドである）、配列番号１６に記載のヌクレオチド配列（任意選択的に配列番号１６の５’末端から１〜１３位の１、２、または３個（あるいは、１または２個）のヌクレオチドは、独立して、配列番号１６のヌクレオチド以外のヌクレオチドである）、または配列番号１７に記載のヌクレオチド配列（任意選択的に配列番号１７の５’末端から１〜１３位の１、２、または３個（あるいは、１または２個）のヌクレオチドは、独立して、配列番号１７のヌクレオチド以外のヌクレオチドである）を含む。別の実施形態では、本発明のプライマーは、その３’末端に配列番号９に記載のヌクレオチド配列（任意選択的に１、２、または３個（あるいは、１または２個）のヌクレオチドは、独立して、配列番号９のヌクレオチド以外のヌクレオチドである）、その３’末端に配列番号１０に記載のヌクレオチド配列（任意選択的に１、２、または３個（あるいは、１または２個）のヌクレオチドは、独立して、配列番号１０のヌクレオチド以外のヌクレオチドである）、その３’末端に配列番号１１に記載のヌクレオチド配列（任意選択的に１、２、または３個（あるいは、１または２個）のヌクレオチドは、独立して、配列番号１１のヌクレオチド以外のヌクレオチドである）、その３’末端に配列番号１２に記載のヌクレオチド配列（任意選択的に１、２、または３個（あるいは、１または２個）のヌクレオチドは、独立して、配列番号１２のヌクレオチド以外のヌクレオチドである）、配列番号１３に記載のヌクレオチド配列（任意選択的に１、２、または３個（あるいは、１または２個）のヌクレオチドは、独立して、配列番号１３のヌクレオチド以外のヌクレオチドである）、またはその３’末端に配列番号１４に記載のヌクレオチド配列（任意選択的に１、２、または３個（あるいは、１または２個）のヌクレオチドは、独立して、配列番号１４のヌクレオチド以外のヌクレオチドである）を含む。さらに別の実施形態では、本発明のプライマーは、配列番号９に記載のヌクレオチド配列、配列番号１０に記載のヌクレオチド配列、配列番号１１に記載のヌクレオチド配列、配列番号１２に記載のヌクレオチド配列、配列番号１３に記載のヌクレオチド配列、配列番号１４に記載のヌクレオチド配列、配列番号１５に記載のヌクレオチド配列（任意選択的に配列番号１５の１、２、または３個（あるいは、１または２個）のヌクレオチドは、独立して、配列番号１５のヌクレオチド以外のヌクレオチドである）、配列番号１６に記載のヌクレオチド配列（任意選択的に配列番号１６の１、２、または３個（あるいは、１または２個）のヌクレオチドは、独立して、配列番号１６のヌクレオチド以外のヌクレオチドである）、または配列番号１７に記載のヌクレオチド配列（任意選択的に配列番号１７の１、２、または３個（あるいは、１または２個）のヌクレオチドは、独立して、配列番号１７のヌクレオチド以外のヌクレオチドである）を含む。さらに別の実施形態では、本発明のプライマーは、その３’末端に配列番号９に記載のヌクレオチド配列、その３’末端に配列番号１０に記載のヌクレオチド配列、その３’末端に配列番号１１に記載のヌクレオチド配列、その３’末端に配列番号１２に記載のヌクレオチド配列、その３’末端に配列番号１３に記載のヌクレオチド配列、その３’末端に配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含む。さらに別の実施形態では、本発明のプライマーはその３’末端に配列番号１５に記載のヌクレオチド配列、その３’末端に配列番号１６に記載のヌクレオチド配列、またはその３’末端に配列番号１７に記載のヌクレオチド配列を含む。これらのプライマーの任意の組み合わせも本発明に含まれる。本発明の増幅方法のための本発明のプライマーの特定の長さは、上記の通りである。
【００８３】
本発明はまた、ＨＣＶ核酸のアッセイ用キットを提供する。１つの実施形態では、本発明のキットは、上記の本発明のＰＣＲプライマーを含む。１つの特定の実施形態では、キットは、上記のアウターＰＣＲプライマー対を含む。別の特定の実施形態では、キットは、インナーＰＣＲプライマー対を含む。さらに別の実施形態では、本発明のキットは、上記の本発明のＰＣＲプライマーおよびＲＴプライマーを含む。キットに含まれるＲＴおよびＰＣＲプライマーの具体例は上記の通りである。
【００８４】
いくつかの実施形態では、本発明の方法およびキットで使用される各ＰＣＲプライマーは、それぞれ、配列番号２〜７および９〜１７と少なくとも８０％、８５％、８９％、または９０％同一のヌクレオチド配列を含む。
【００８５】
上記のＲＴ−ＰＣＲ法によって得たＰＣＲアンプリコン集団の配列を、直接配列決定することができる。あるいは、増幅ＤＮＡ集団由来のＰＣＲアンプリコンを分子的にクローン化（またはサブクローン化）することができ、次いで、クローン化（またはサブクローン化）産物をヌクレオチド配列決定のために使用することができる。
【００８６】
１つの実施形態では、上記のＲＴ−ＰＣＲ法によって調製したアンプリコンを、クローン化（またはサブクローン化）する。かかるクローニングを、当該分野で公知の任意の適切な方法によって行うことができる。インナーＰＣＲプライマーを、制限エンドヌクレアーゼ部位に相補的になるように修飾し、産物を適切な制限エンドヌクレアーゼで消化したベクターにライゲーションすることができる。あるいは、平滑末端クローニングを使用して、ＰＣＲアンプリコンを非産物特異的ベクター配列に直接挿入することができる。ＰＣＲで一般的に使用されるＤＮＡポリメラーゼはＰＣＲアンプリコンの３’末端でさらなるデオキシアデノシンを重合することができるので、ＴＡクローニングを使用して、アンプリコンを同様にサブクローン化することができる。ＰＣＲアンプリコンの３’末端へのデオキシアデノシン（ｄｅｏｘｙａｄｅｎｓｉｎｅ）のこの非特異的付加の効率を、５’末端デオキシアデノシン残基が３’デオキシアデノシンオーバーハングを保有するＰＣＲアンプリコン画分を増加させるようなＰＣＲプライマーの５’末端での配列の修飾によって調整し、それにより、ＴＡクローニング効率を改善することができる（Ｐｅｎｇら、Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ａｄｄｅｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｐｒｉｍｅｒ  ５’  ｅｎｄ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ３６３，Ｉｓｓｕｅ  １，１  Ａｐｒｉｌ  ２００７，Ｐａｇｅｓ  １６３−１６５を参照のこと）。
【００８７】
１つの特定の実施形態では、クローン化産物を、上記のＲＴ−ＰＣＲ法（第１のインナープライマーは配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含み、第２のインナープライマーは配列番号１６または１７に記載のヌクレオチド配列を含む）によって調製されたアンプリコンから調製する。別の特定の実施形態では、第１のインナープライマーは配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１５の１、２、または３個のヌクレオチドは、独立して、配列番号１５のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、第２のインナープライマーは配列番号１６または１７に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１６および配列番号１７の１、２、または３個のヌクレオチドは、独立して、配列番号１６および配列番号１７のヌクレオチド以外のヌクレオチドである。さらに別の特定の実施形態では、第１のインナープライマーは配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１５の５’末端から１〜１６位の１、２、または３個のヌクレオチドは、独立して、配列番号１５のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、第２のインナープライマーは配列番号１６または１７に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１６および配列番号１７の５’末端から１〜１３位の１、２、または３個のヌクレオチドは、独立して、配列番号１６および配列番号１７のヌクレオチド以外のヌクレオチドである。
【００８８】
次いで、クローン化（またはサブクローン化）産物を、複数の下流適用（ヌクレオチド配列決定が含まれる）で使用することができる。例えば、クローン化産物を宿主生物のトランスフェクションのために使用することができ、宿主生物由来のプラスミドをｉｎ  ｖｉｖｏで増幅し、各ウイルス変種を配列分析することができる。クローン化アンプリコンまたはそのフラグメントを、他のベクターにクローン化することもできる。多数の方法を使用して、アンプリコンを適切なベクターに導入することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｗｅｔｍｕｒ，１９９１，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照のこと）。
【００８９】
プライマーは天然または合成であり得る。ＰＣＲのために、プライマーは、好ましくは、一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドである。典型的には、本明細書中に開示のプライマーを、当該分野で公知の任意の適切な方法によって合成することができる（例えば、Ｏｚａｋｉ  ら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：５２０５−５２１４（１９９２）；Ａｇｒａｗａｌ  ら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：５４１９−５４２３（１９９０）など）。便宜上、オリゴヌクレオチドプライマーを、ホスホルアミダイト化学（Ｂｅａｕｃａｇｅ  ａｎｄ  Ｉｙｅｒ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４８：２２２３−２３１１（１９９２），米国特許第４，９８０，４６０号、同第４，７２５，６７７号、同第４，４１５，７３２号、同第４，４５８，０６６号、および同第４，９７３，６７９号）などの標準的な化学を使用して自動化ＤＮＡ合成機（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．モデル３９２、３９４、または３９００  ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機）で合成するか、販売者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ  ＵＳＡ）から入手する。
【００９０】
引用した全書類は、本明細書中で参考として援用される。
【００９１】
本発明をより十分に理解するために、以下の調製例および試験例を記載する。これらの例は、例示のみを目的とし、本発明の範囲を制限すると決して解釈すべきではない。
【実施例】
【００９２】
（実施例）
（１．方法と材料）
（血漿からのＲＮＡの抽出）
血漿からのＲＮＡ（ＨＣＶウイルスＲＮＡが含まれる）の抽出を、製造者の説明書を手作業での単離のために修正したことを除いて、ＱＩＡａｍｐ  Ｖｉｒｕｓ  ＢｉｏＲｏｂｏｔ  ９６０４キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ  ＵＳＡ）を使用して行った。簡潔に述べれば、血漿（２２０〜６６０μｌ）を、プロテアーゼ（４０〜１２０μｌ）およびカラムあたり２０μｇのキャリアＲＮＡを補充したＱＩＡａｍｐ  ＡＬ緩衝液（２４０〜７２０μｌ）と混合した。混合物を、５６℃で１５分間インキュベートした。無水エタノール（２９３〜８７５μｌ）を各ウェルに添加し、十分に混合した。混合物をＱＩＡａｍｐカラムにロードし、蠕動マイクロポンプ（ＩＰＳ−１６；Ｉｓｍａｔｅｃ，Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）での吸引によってカラムを通過させた。カラムを、上記のように真空を適用することによって１０００μｌのＡＷ１緩衝液および１０００μｌのＡＷ２緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）でそれぞれ洗浄した。６，０００×ｇで１０分間のスピンによってカラムを１０００μｌのＡＷ２緩衝液で洗浄し、次いで、６，０００×ｇで１５分間のスピンによって乾燥させた。４０μｌのＲＮＡ保存液（Ａｍｂｉｏｎ）を各カラムにロードし、ＲＴで５分間インキュベートした。ＲＮＡを、６，０００×ｇで１０分間の遠心分離によって溶離した。溶離を１回繰り返して収率を増加させた。単離したＲＮＡを、好ましくは直接使用するか、−８０℃で保存した。９６検体までを１つのＱＩＡａｍｐ９６プレートから処理することができ、複数のプレートを使用して処理量を増加させることができる。
【００９３】
（患者の血漿由来のＨＣＶポリタンパク質コード領域の増幅および配列決定）
ＨＣＶの配列分析を、ＨＣＶポリタンパク質コード領域にわたるおよそ８９９１ヌクレオチドのＨＣＶ  ＲＮＡフラグメント（残基２８６〜９２７７、ＨＣＶ参照配列Ｈ７７、ＮＣＢＩアクセッションＮＣ＿００４１０２）のネステッド逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）増幅によって行った。ＨＣＶポリタンパク質コード領域にわたる相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）フラグメントを、２．５ｍＭオリゴ−ｄＡ２０でプライムし、修正したＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩ  ＲＮアーゼＨ−逆転写酵素キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）を使用して、ウイルスＲＮＡから合成した。修正には、４００単位のＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩ、４０単位のＲＮＡｓｅＯＵＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＰＣ２反応緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．１）、１６ｍＭ硫酸アンモニウム、３．５ｍＭ塩化マグネシウム、および１５０ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ；ＡＢ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ＭＯ）、およびＲＴ反応における伸長温度の段階的な上昇（２５℃で１０分間、４２℃で６０分間、５０℃で３０分間、および５５℃で３０分間）の使用が含まれる。完了したＲＴ反応物を、第１のＰＣＲ反応物（４０μｌ）（ＰＣ２反応緩衝液、２００ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＣＡ）、１．５Ｍベタイン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）、２．５６単位のＫｌｅｎｔａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＡＢ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ＭＯ）、１．２８単位のＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＣＡ）、および４００ｍＭの各プライマーを含む）へ１：１に希釈した。
【００９４】
【表１】
2012515534.tif 000021
ＨＣＶ遺伝子型１ＡのためにＧＥＮ１．Ｆ１およびＧＥＮ１Ａ．Ｒ１を使用し、ＨＣＶ遺伝子型１ＢのためにＧＥＮ１．Ｆ１およびＧＥＮ１Ｂ．Ｒ１を使用した。特定のプライマー位置を図２に示す。ＰＣＲ反応物を９４℃で２分間インキュベートし、その後に９４℃で１５秒間、６８℃−０．５℃／サイクル（「タッチダウン」ＰＣＲ）で２０秒間、および６８℃で１２分間にて３０サイクル、その後に６８℃で１２分間インキュベートした。完了したＰＣＲ反応物を第２のＰＣＲ反応物（５０μｌ）へ１：１０希釈した。第２のＰＣＲ反応物は３．２単位のＫｌｅｎｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、１．６単位のＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、およびネステッドプライマーを使用した（ＨＣＶ遺伝子型１ＡについてはＧＥＮ１．Ｆ２およびＧＥＮ１Ａ．Ｒ２、ＨＣＶ遺伝子型１ＢについてはＧＥＮ１．Ｆ２およびＧＥＮ１Ｂ．Ｒ２）ことを除いて、第１のＰＣＲ反応物と同一の組成およびＰＣＲサイクルパラメーターを使用した。このＰＣＲ由来のＤＮＡ（およそ８９９１ｂｐ）を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ９６  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ）を使用して精製し、アガロースゲル電気泳動によって分析し、ＵＶ分光計Ｕ−６４（Ｂｅｃｋｍａｎ）で定量した。
【００９５】
（アンプリコンのＴＡクローニング）
ＰＣＲ産物を、ＲＴプライマーとしてのオリゴｄ（Ａ）およびＨＣＶ遺伝子型１ａのためのインナープライマーとしてのＧＥＮ１．Ｃｌ．Ｆ２およびＧＥＮ１Ａ．Ｃｌ．Ｒ２またはＨＣＶ遺伝子型１ｂのためのインナープライマーとしてのＧＥＮ１．Ｃｌ．Ｆ２およびＧＥＮ１Ｂ．Ｃｌ．Ｒ２を使用して上記のように調製した。調製したＰＣＲ産物を、０．８％アガロースゲルにて８０Ｖで電気泳動した。アガロースゲルを、ゲル調製において１ｍｌのＴＡＥ緩衝液あたり１．２μｇのクリスタルバイオレットを使用して調製した。ゲルを、「可視光」ライトボックスを使用して可視化した。約８９９１ｂｐの産物を示す適切なサイズのバンドを、ゲルから切り出した。標準的なゲル抽出キット（例えば、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ，カタログ番号２８７０４）を使用して、ゲルスライスからＤＮＡを単離した。精製した産物を、ｐＣＲ（登録商標）−ＸＬ−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）に挿入した。プラスミドをエレクトロコンピテント大腸菌にエレクトロポレーションし、ＳＯＣ培地中にて３６℃で１時間培養し、次いで、選択剤としてＬｕｒｉａブロス１ｍｌあたり５０μｇのカナマイシンを含むＬｕｒｉａブロスを使用して培養した。
【００９６】
（２．結果）
（２．１  ＨＣＶ  ＲＮＡ希釈物を使用したＲＴ−ＰＣＲアッセイの感度の決定）
本研究では、ＨＣＶ感染血漿（Ｐｒｏｍａｘ）から単離したＲＮＡを使用して、本明細書中に記載のＲＴ−ＰＣＲ法の推定上の感度を決定した。ＲＮＡを、異なる量のキャリアＲＮＡを使用して、２２０、３３０、および６６０μｌの血漿から単離した。相対検出限界（ＨＣＶコピー数／反応として示す）を決定するために、単離したＲＮＡを、図３に示すようにＲＴ−ＰＣＲのために希釈した。２２０μｌの血漿を２０ｕｇのポリ（ｒＡ）キャリアＲＮＡと共に使用した場合、感度は約６３コピー／反応であった。しかし、ＲＴ−ＰＣＲのバンド密度は変動し、これは、ポリ（ｒＡ）キャリアＲＮＡまたは検体中のＨＣＶ  ＲＮＡ量のいずれかが最適でないことを意味していた。４４０μｌの血漿を４０μｇのポリ（ｒＡ）キャリアＲＮＡと共に使用した場合、感度は約５０コピー／反応であった。さらに、バンド密度は一定であった。６６０μｌの血漿を６０μｇのポリ（ｒＡ）キャリアＲＮＡと共に使用した場合、感度は３０コピー／反応より良好であった。６０μｇのキャリアＲＮＡを使用した６６０μｌの血漿は最良の感度が得られたが、２．５倍希釈ではＲＴ−ＰＣＲ産物が得られず、サンプル中に阻害物質が存在する可能性が示唆された。さらなる分析により、６６０μｌの血漿を使用した４０μｇのキャリアＲＮＡによって最良の結果が得られることが示された（データ示さず）。図３中のコピー数はＱｉａｇｅｎカラムからの回収率１００％に基づいて計算した一方で、実際に、回収効率は約８０％であることに留意すべきである。したがって、ＲＴ−ＰＣＲ工程の感度を、それぞれ、５０、４０、および２４コピー／反応と見積もることができる。
【００９７】
（２．２  ＨＣＶ  ＲＮＡ単離に最良のキャリアＲＮＡの決定）
ＨＣＶウイルスＲＮＡ単離で使用したキャリアＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎキットの場合ポリ（ｒＡ））は、ポリ（Ｕ）領域とのその相補性に起因してＲＴ−ＰＣＲに影響し得る。キャリアＲＮＡとして可能性のある異なるＲＮＡ（ポリ（ｒＡ）、細菌ｔＲＮＡ、および細菌リボゾームＲＮＡが含まれる）を試験して、どれが本明細書中に記載のＲＴ−ＰＣＲ法に最良のキャリアＲＮＡとして役立ち得るかどうかを決定した（図４および第２．３項の考察を参照のこと）。結果は、本アッセイでは細菌リボゾームＲＮＡ（データ示さず）が細菌ｔＲＮＡおよびポリ（ｒＡ）より適切でないことを示す。ｑＲＴ−ＰＣＲによって評価したところ、ポリ（ｒＡ）をキャリアＲＮＡとして使用した場合、２０、４０、または６０μｇのキャリアを使用した場合のＨＣＶ  ＲＮＡの収量に有意差はなかったのに対して、ｔＲＮＡを使用した場合、ＨＣＶ  ＲＮＡの収量はキャリア量の増大につれて増加した（表２を参照のこと）。一貫して、ＲＴ−ＰＣＲの結果は、６０μｇ／カラムのｔＲＮＡの量が４０μｇ／カラムよりも良好であることが確認された（図４および第２．３項の考察を参照のこと）。血漿から単離されたＨＣＶ分子のコピー数がキャリアＲＮＡ間で類似しているにもかかわらず（例えば、４０μｇ／カラムのポリ（ｒＡ）および６０μｇ／カラムの細菌ｔＲＮＡ）、ＲＴ−ＰＣＲの結果は、細菌ｔＲＮＡをキャリアＲＮＡとして使用した場合にＰＣＲ産物の収量が改善されることを示し、これはおそらくポリ（ｒＡ）によるＲＴ反応の干渉に起因する。
【００９８】
【表２】
2012515534.tif 000022
（２．３  ＨＣＶ感染血清の希釈物を使用したＲＴ−ＰＣＲアッセイの感度の決定）
第２．１項では、ＨＣＶ感染血清から単離した一連の希釈ＲＮＡに基づいて、ＲＴ−ＰＣＲ感度は２４コピー／反応の低さであり得る。低力価検体から単離したＲＮＡを使用した方法の感度を決定するために、ＨＣＶ感染血漿サンプルを、健康なドナー血漿で希釈し、前述のようにＲＮＡを単離した。図４に示すように、ＨＣＶ感染血漿を、異なるキャリアＲＮＡの存在下でウイルスＲＮＡを単離するために８２０ＩＵ／ｍｌほどの低濃度に希釈した。単離したＲＮＡを、１：２、１：４、および１：８に希釈し、次いで、本明細書中に記載のようにＲＴ−ＰＣＲ法を行った。サンプルを８２０ＩＵ／ｍｌに希釈した場合、３サンプルのうちの１つをＲＴ−ＰＣＲによって１：２希釈したＲＮＡから増幅した一方で、３サンプルのうちの２つをＲＴ−ＰＣＲによって１：４希釈のＲＮＡから増幅した（図４を参照のこと）。図４（ａ）〜４（ｆ）に示す全てのサンプルでは、ＲＮＡ単離のための血漿の容積は６６０μＬであった（およそ、サンプルＡ１〜Ｈ１およびＡ２〜Ｄ２についてのＨＣＶ陽性血漿の５０倍希釈に相当し、サンプルＥ２〜Ｇ２についてのＨＣＶ陽性血漿の２００倍希釈に相当し、サンプルＨ２についてはネガティブコントロールとしての希釈した健康なドナー血漿）。Ａ１〜Ｈ１およびＡ２〜Ｄ２の各サンプルのＨＣＶ濃度は約３２８０ＩＵ／ｍＬであった。Ｅ２〜Ｇ２の各サンプルのＨＣＶ濃度は約８２０ＩＵ／ｍＬであった。次いで、希釈した血漿サンプルを使用して、キャリアＲＮＡの存在下で上記のようにウイルスＲＮＡを単離した。図４（ａ）〜４（ｃ）では、サンプルＡ１〜Ｄ１は、４０μｇのｔＲＮＡをキャリアＲＮＡとして使用した場合の結果を示し、サンプルＥ１〜Ｈ１は、６０μｇのｔＲＮＡをキャリアＲＮＡとして使用した結果を示す。図４（ｄ）〜４（ｆ）では、サンプルＡ２〜Ｄ２は、４０μｇのポリ−ＡをキャリアＲＮＡとして使用した結果を示し、サンプルＥ２〜Ｈ２は、４０μｇのｔＲＮＡをキャリアＲＮＡとして使用した結果を示す。図４（ａ）および４（ｄ）、図４（ｂ）および４（ｅ）、ならびに図４（ｃ）および４（ｆ）中のサンプルについて、単離ＨＣＶ  ＲＮＡを、それぞれ１：２、１：４、および１：８に希釈し、次いで、希釈したＨＣＶ  ＲＮＡサンプルのＲＴ−ＰＣＲを上記のように行った。図４に示すように、結果は、８２０ＩＵ／ｍｌのＨＣＶを含む血清の４倍希釈物でさえもＲＴ−ＰＣＲアッセイで首尾よく使用することができることを示す。したがって、この新規の方法の感度は、８２０ＩＵ／ｍｌ以下であり得る。上記項に記載のように、６０μｇ／ｍｌのキャリアｔＲＮＡによって４０μｇ／ｍｌのキャリアｔＲＮＡよりも改善された結果が得られるので、感度をさらに改善することができると考えられる。
【００９９】
（２．４  ＲＴ−ＰＣＲアッセイの成功率は遺伝子型１ａおよび１ｂの両方について９０％を超える）
新規に開発した方法の性能、特に、本方法を様々なＨＣＶ  １ａ／１ｂ分離菌に適用することができるかどうかを評価するために、臨床試験由来の血漿サンプルを調査した。結果を以下の表３にまとめる。例えば、血漿サンプルの力価は、８９０ＩＵ／ｍｌから１０ｅ７ＩＵ／ｍｌ超の範囲であった。力価が５０，０００ＩＵ／ｍｌ以上のサンプルについては２２０μｌの血漿を使用し、力価が５０，０００ＩＵ／ｍｌ未満のサンプルについては６６０μｌの血漿を使用した。表３に示すように、ＨＣＶゲノムを、本明細書中に記載のＲＴ−ＰＣＲ法を使用して首尾よく増幅し、９０％超の成功率でさらに配列決定した。失敗したサンプルがいくつか存在するが、この失敗がウイルス力価とほとんど相関しないようであり、ＲＴ−ＰＣＲの感度が失敗の理由でないことを示す。失敗したサンプルからの配列決定はないので、可能性のある失敗理由は不正確なジェノタイピング（genotyping）に起因し得る。
【０１００】
【表３】
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（２．５  ＲＴ−ＰＣＲアンプリコンのＴＡクローン化産物の配列分析）
ＨＣＶインサートを含むクローン画分を決定するために、ベクタープライマーおよびＮＳ３プロテアーゼに特異的な配列決定プライマーの両方を使用した。平均して、各クローニング反応由来のクローンの９０％が標的インサートを含んでいた。
【０１０１】
上記に示す結果は、上記のＲＮＡ単離、ＲＴ、およびＰＣＲをＨＣＶ遺伝子型１ａおよび１ｂに感染した患者の大部分で有効に使用することができ、ＨＣＶ分離菌の遺伝的多様性を分析することができることを示す。
【０１０２】
多数の本発明の実施形態および実施例を本明細書中に示しているが、これらの実施形態および実施例を本発明の薬学的処方物および薬物レジメンを使用するさらなる実施形態および実施例を得るために変更することができることが明らかである。したがって、本発明の範囲が、上記の実施例によって示された特定の実施形態によるのではなく、添付の特許請求の範囲によって定義されるべきであることが認識される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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