(57)【要約】本発明は、毒素を例とする抗がん剤をコードする核酸配列に連結されたマイクロＲＮＡ−２１（ｍｉＲ−２１）に由来するプロモーター配列を含む核酸構造体を提供する。本発明の構造体は、ｍｉＲ−２１を発現している腫瘍を治療するのに特に有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｍｉＲ−２１プロモーター配列および抗がん剤をコードする少なくとも１種の核酸配列を含む核酸構造体であって、前記抗がん剤をコードする核酸配列は前記ｍｉＲ−２１プロモーター配列と作動可能に連結されている核酸構造体。
【請求項２】
前記ｍｉＲ−２１プロモーター配列が配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有する、請求項１に記載の構造体。
【請求項３】
前記ｍｉＲ−２１プロモーター配列が配列番号１を含む、請求項１に記載の構造体。
【請求項４】
前記抗がん剤が、毒素、毒素のフラグメント、薬物代謝酵素およびアポトーシス誘導剤からなる群から選択される、請求項１に記載の構造体。
【請求項５】
前記毒素が、細菌毒素、植物毒素、真菌毒素およびこれらの組み合わせからなる群から選択される；または
前記薬物代謝酵素が、キナーゼを含む；または
前記アポトーシス誘導剤が、ＰＵＭＡ；ＢＡＸ；ＢＡＫ；ＢｃＩ−ＸＳ；ＢＡＤ；ＢＩＭ；ＢＩＫ；ＢＩＤ；ＨＲＫ；Ａｄ  ＥｌＢ；ＩＣＥ−ＣＥＤ３プロテアーゼ；ＴＲＡＩＬ；ＳＡＲＰ；およびアポプチンからなる群から選択される、
請求項４に記載の構造体。
【請求項６】
前記細菌毒素が、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素、コレラ毒素、炭疽毒素、ボツリヌス毒素、百日咳毒素、大腸菌エンテロトキシンおよび志賀毒素からなる群から選択される；または
前記植物毒素が、リシン、モデシン、アブリン、ボルケンシンおよびビスキュミンからなる群から選択される；または
前記真菌毒素が、α−サルシン、レストリクトシン、ミトギリン、エノマイシン、ＲＮアーゼＴ１およびフェノマイシンからなる群から選択される、
請求項５に記載の構造体。
【請求項７】
前記ジフテリア毒素が、ジフテリア毒素のＡフラグメント（ＤＴ−Ａ）であり、配列番号１９のアミノ酸配列を有する、請求項６に記載の構造体。
【請求項８】
前記ｍｉＲ−２１プロモーター配列として配列番号１を含み、抗がん剤をコードする前記核酸配列として配列番号１８をさらに含む、請求項１に記載の構造体。
【請求項９】
前記ｍｉＲ−２１プロモーター配列が、天然のｍｉＲ−２１プロモーターの相同体、類似体およびフラグメントからなる群から選択される天然のｍｉＲ−２１プロモーターの変異形である、請求項１に記載の構造体。
【請求項１０】
前記核酸構造体が、ｍｉＲ−２１の一次転写産物（ｐｒｉ−ｍｉＲ−２１）；ｍｉＲ−２１の前駆体（ｐｒｅ−ｍｉＲ−２１）；ｍｉＲ−２１のＲＮＡ二本鎖、および成熟ｍｉＲ−２１からなる群から選択されるｍｉＲ−２１の形態に相当する、または相補的な核酸配列を実質的に欠いている、請求項１に記載の構造体。
【請求項１１】
配列番号７および配列番号８からなる群から選択される配列を含む、請求項１に記載の構造体。
【請求項１２】
請求項１に記載の核酸構造体を含むベクター。
【請求項１３】
配列番号９および配列番号１０からなる群から選択される、請求項１２に記載のベクター。
【請求項１４】
請求項１２に記載のベクターを含む単離された宿主細胞。
【請求項１５】
有効成分として、請求項１に記載の構造体、および少なくとも１種の薬学的に許容される担体、添加剤または賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１６】
治療上有効量の請求項１に記載の核酸構造体を、それを必要とするヒト被験体に投与し、それによって前記ヒト被験体のがんを治療するステップを含む、ヒト被験体のがんを治療する方法。
【請求項１７】
治療上有効量の請求項１に記載の核酸構造体を、それを必要とするヒト被験体に投与し、それによって前記ヒト被験体の腫瘍進行を抑制するステップを含む、ヒト被験体の腫瘍進行を抑制する方法。
【請求項１８】
治療上有効量の請求項１に記載の核酸構造体を、それを必要とするヒト被験体に投与し、それによって前記ヒト被験体の腫瘍進行を抑制するステップを含む、ヒト被験体の腫瘍転移を抑制する方法。
【請求項１９】
治療上有効量の請求項１に記載の核酸構造体を、それを必要とするヒト被験体に投与し、それによって前記ヒト被験体の新生物疾患に関連する症状を減少または緩和させるステップを含む、ヒト被験体の新生物疾患に関連する症状を減少または緩和させる方法。
【請求項２０】
前記被験体が、腫瘍細胞の少なくとも一部におけるｍｉＲ−２１の内在性発現によって特徴づけられる腫瘍で苦しんでいる、請求項１６から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記被験体が、乳がん、結腸がん、肝細胞癌、子宮頚がん、胆管癌、類内膜性卵巣癌、食道がん、神経膠芽種、頭頚部がん、白血病（例えば、慢性リンパ性白血病）、リンパ腫（例えば、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、活性化Ｂ細胞様リンパ腫）、肺がん、多発性骨髄腫、膵臓（例えば、内分泌および腺房）がん、骨肉種、下垂体腫瘍、前立腺がん、胃がんおよび子宮筋腫からなる群から選択されるがんで苦しんでいる、請求項１６から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記がんが、乳がん、結腸がん、肝細胞癌からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記投与が、注射、点滴および前記腫瘍への直接注射からなる群から選択される経路によって行われる、請求項１６から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記被験体からの生体試料中のｍｉＲ−２１転写活性のレベルを測定するステップをさらに含む、請求項１６から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記被験体への化学療法剤の投与に加えて行われる、請求項１６から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
ヒト被験体のがんを治療するための薬剤を調製するための請求項１に記載の核酸構造体の使用。
【請求項２７】
ヒト被験体の腫瘍進行を抑制するための薬剤を調製するための請求項１に記載の核酸構造体の使用。
【請求項２８】
新生物疾患に関連する症状を減少または緩和させるための薬剤を調製するための請求項１に記載の核酸構造体の使用。
【請求項２９】
ｉ）請求項１２に記載のベクターの単一投与量単位または複数投与量単位と、ｉｉ）前記核酸構造体を、それを必要とする被験体に投与するための説明書とを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がん治療の分野に関し、特にｍｉＲ−２１を発現している腫瘍の治療に有用な核酸構造体を提供する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、標的ｍＲＮＡと塩基対形成することによって遺伝子発現の転写後調節因子として働く豊富なクラスの短い（２０〜２４ヌクレオチド）内在性非コードＲＮＡである（概説については、例えば、Ｂａｒｔｅｌ、Ｃｅｌｌ  ２００４、１１６：２８１〜２９７参照）。一般に、ｍｉＲＮＡをコードする遺伝子は、タンパク質をコードするかまたはコードしないかのいずれかであり得るキャップ化され、ポリアデニル化された一次転写産物（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）の一部としてＲＮＡポリメラーゼＩＩによって転写される。一次転写産物は、ＤｒｏｓｈａリボヌクレアーゼＩＩＩ酵素によって切断されて約７０ヌクレオチドのステムループ前駆体ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）を産生し、それがさらに細胞質のＤｉｃｅｒリボヌクレアーゼによって切断されて、成熟ｍｉＲＮＡおよびアンチセンスｍｉＲＮＡスター（ｍｉＲＮＡ＊）産物を産生する。成熟ｍｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に取り込まれ、これはｍｉＲＮＡとの不完全な塩基対形成を通して標的ｍＲＮＡを認識し、最も一般的には標的ｍＲＮＡの翻訳抑制または不安定化をもたらす。
【０００３】
現在までに、ヒトにおいて数百のｍｉＲＮＡが記載されてきており、その多数ががんに関係があるとされてきた。腫瘍表現型（すなわち、形成）を直接誘発することが実験的に示されたｍｉＲＮＡは、「オンコミル（ｏｎｃｏｍｉｒ）」と名づけられた。ｍｉＲ−２１（ＭＩＲＮ２１、ｍｉＲＮＡ２１、ｈｓａ−ｍｉｒ−２１およびＭＩＲ２１としても知られている）は、複数の腫瘍／転移抑制遺伝子を標的にし、腫瘍の成長、浸潤および転移における役割を有することが示されたこのようなオンコミル（ｏｎｃｏｍｉｒ）である。種々の研究により、ｍｉＲ−２１がもっぱらがん性細胞系および固形ヒト腫瘍中で発現しているが、非形質転換細胞系または隣接する非がん性組織では発現していないことが示されている（例えば、Ｉｏｒｉｏ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、２００５．６５（１６）：７０６５〜７０７０；Ｓｉ等、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２００７．２６（１９）：２７９９〜２８０３；Ｖｏｌｉｎｉａ等、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、２００６．１０３（７）：２２５７〜２２６１参照）。したがって、がん診断においてｍｉＲ−２１発現の評価が提案されてきた（例えば、米国特許出願公開第２００６／０１０５３６０号参照）。
【０００４】
米国特許出願公開第２００８／０３０６０１８号は、被験体からの試験用試料中のｍｉＲ−２１を含む少なくとも１種のｍｉＲＮＡ遺伝子産物の濃度を測定するステップを含む、膵臓がんを診断する方法を開示している。この刊行物はさらに、特にｍｉＲ−２１ががん細胞中で上方制御されている場合に、対照細胞に対してがん細胞中で少なくとも１種のｍｉＲＮＡ遺伝子産物を下方制御または上方制御する、被験体の膵臓がんを治療する方法を開示しており、前記方法は、少なくとも１種のｍｉＲＮＡ遺伝子産物の発現を抑制するための有効量の少なくとも１種の化合物を被験体に投与して、被験体のがん細胞の増殖を抑制するステップを含む。また、少なくとも１種の単離されたｍｉＲＮＡ遺伝子産物またはその阻害因子を含む、膵臓がんを治療するための医薬組成物も開示されている。
【０００５】
肺がん（米国特許出願公開第２００８／０３０６０１７号）、乳がん（米国特許出願公開第２００８／０２６１９０８号）、ならびに前立腺がん、胃がん、膵臓がん、肺がん、乳がんおよび結腸がんなどの固形がん（米国特許出願公開第２００８／０３０６００６号）を治療するための同様の方法および組成物が開示されてきた。ｍｉＲ−２１の発現を増加させるまたは抑制することを示す他の代表的な刊行物としては、米国特許出願公開第２００８／０１７１７１５号、第２００８／０１９９９６１号および第２００８／００５０７４４号が挙げられる。ｍｉＲＮＡを使用して組織向性を制御しようという特定の試みも報告されてきた（例えば、Ｂａｒｎｅｓ等、Ｃｅｌｌ  Ｈｏｓｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅ、２００８．４（３）：２３９〜２４８参照）。
【０００６】
異なって発現する遺伝子を使用した特定のがんの選択的ターゲティングは、以前にうまく示されており、そこでは、膀胱がん中で異なって発現しているＨ１９遺伝子の調節配列を使用して、ジフテリア毒素の発現を調節した（Ｏｈａｎａ等、Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ、２００５．７（３）：３６６〜３７４）。
【０００７】
ＷＯ９９／１８１９５および米国特許第７０４１６５４号は、がん特異的プロモーター（例えば、Ｈ１９およびＩＧＦプロモーター）の調節下における、腫瘍細胞中の、異種性配列、特に細胞毒性産物（例えば、ジフテリア毒素）をコードする遺伝子の特異的発現を教示している。
【０００８】
ＷＯ２００７／０３４４８７号は、（ｉ）ＴＮＦアルファをコードする第１核酸配列と、（ｉｉ）ジフテリア毒素をコードする第２核酸配列と、（ｉｉｉ）がん特異的プロモーター（例えば、Ｈ１９およびＩＧＦプロモーター）を含む少なくとも１種の追加的核酸配列とを含み、ＴＮＦアルファおよびジフテリア毒素コード配列は、がん特異的プロモーターの発現調節下にある核酸構造体を開示している。また、構造体システムおよび方法およびその使用も開示されている。
【０００９】
ＷＯ２００８／０８７６４２は、抑制性ＲＮＡなどのＨ１９サイレンシング核酸剤をコードする構造体を利用する、がんおよびＨ１９遺伝子の発現増加に関連する他の状態を治療するための組成物および方法を開示している。
【００１０】
ＷＯ２００６／０６５９３８は、特に、ＳＰＡＮＸ−Ｎ１プロモーターと作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）抗がん剤をコードする有効量の核酸を哺乳類に投与するステップを含む、哺乳類のがんを治療する方法を開示している。
【００１１】
ＷＯ２００３／０９３４４１は、ステムループ構造を有するｍｉＲＮＡ前駆体をコードする核酸配列と作動可能に連結された細胞内で機能するプロモーターを含み、前記ステム中に遺伝子のＲＮＡ転写産物の一部と相補的な配列を含むＤＮＡ構造体を前記細胞内に導入するステップを含み、前記細胞内への前記構造体の導入後に、前記核酸は転写され、プロセシングされて前記ｍｉＲＮＡ前駆体が産生される、細胞内の遺伝子の発現を抑制する方法を開示している。さらに、ＣＭＶプロモーターと連結された前駆体ｍｉＰＮＡ−２１を含むプラスミド構造体が開示されている。
【００１２】
Ｃａｉ等は、Ｔ１転写開始点に関連する−９５９〜＋４９の領域に相当するｐｒｉ−ｍｉＲ−２１転写単位の約１ｋｂのＤＮＡ断片と連結されたホタルルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドを開示している（Ｃａｉ等、ＲＮＡ（２００４）１０：１９５７〜１９６６）。この開示によると、このようなプラスミドを形質移入された２９３Ｔ細胞中でホタルルシフェラーゼ活性が検出され、それによって著者等はｐｒｉ−ｍｉＲ−２１転写単位の５’に位置する配列がｍＲＮＡプロモーターとして機能し得ると結論づけた。
【００１３】
ＦｕｊｉｔａおよびＩｂａは、４６２ヌクレオチド長のｍｉＲ−２１の推定上のプロモーター領域を開示しており（ＦｕｊｉｔａおよびＩｂａ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２００８、２４（３）３０３〜３０８）、Ｆｕｊｉｔａ等は活性化タンパク質１およびＰＵ．１の結合部位を含むｍｉＲ−２１プロモーターを開示している（Ｆｕｊｉｔａ等、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２００８  ５月２日；３７８（３）４９２〜５０４）。
【００１４】
がん患者に遺伝子治療を利用したいくつかの治療手段が提案されてきたが、追加の効果的な抗がん剤およびベクターの必要性が存在する。腫瘍は有意なゲノムの不安定性および異質性を示すことが知られているので、従来知られている遺伝子治療ベクターの使用は、相当数の患者で失敗すると見られる。
【００１５】
従来技術のどこにもがん細胞で選択的に細胞毒性物質を発現する組換え核酸構造体においてｍｉＲ−２１プロモーターを使用することができることは教示または示唆されていない。また、ｉｎ  ｖｉｖｏで効果的かつ安全な抗がん治療としてのこのようなベクターの使用を示す技術もない。新生物疾患を治療するための増強された治療活性、最小化された毒性および幅広い標的範囲を有する遺伝子治療ベクターを開発する未だ対処されていない医学的必要性が残っている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、核酸構造体および標的がん治療を提供する方法に関する。特に、本発明の構造体は、ｍｉＲ−２１転写調節配列と作動可能に連結されている、毒素などの細胞毒性または細胞増殖抑制性抗がん分子をコードする少なくとも１種の核酸配列を含む。これらの構造体を含むベクター、これらの構造体を含む医薬組成物、ならびにがんおよび固形腫瘍を治療するためのその使用も提供される。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、抗がん剤の発現がｍｉＲ−２１プロモーター配列の転写調節下に置かれる新規核酸構造体およびベクターを初めて開示する。驚いたことに、本発明の発明者等は、このような構造体が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでがん細胞中での新規のタンパク質合成を抑制する活性を有し、さらにｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍の成長および転移を抑制することを示した。
【００１８】
本発明は、一部は、マウスに誘発させた腫瘍へジフテリア毒素をコードする核酸配列と作動可能に連結されているｍｉＲ−２１プロモーターを有する核酸構造体を直接注射することによって、腫瘍の完全な根絶または腫瘍の成長の実質的な抑制のいずれかがもたらされるという発見に基づく。
【００１９】
したがって、第１の態様では、本発明は、ｍｉＲ−２１プロモーター配列および抗がん剤をコードする少なくとも１種の核酸配列を含み、抗がん剤をコードする核酸配列はｍｉＲ−２１プロモーター配列と作動可能に連結されている核酸構造体を提供する。
【００２０】
特定の実施形態では、核酸構造体は、組換え法、化学合成またはこれらの組み合わせの産物である。
【００２１】
特定の実施形態では、ｍｉＲ−２１プロモーター配列は、配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有する。特定の実施形態では、ｍｉＲ−２１プロモーター配列は、配列番号１と少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する。特定の実施形態では、ｍｉＲ−２１プロモーター配列は、配列番号１を含む。
【００２２】
特定の実施形態では、抗がん剤は、標的細胞を死滅させるまたはその成長もしくは増殖を抑制することができる細胞毒性および細胞増殖抑制性タンパク質およびペプチドから選択される。特定の実施形態では、抗がん剤は、毒素、プロドラッグを細胞毒性活性を有する薬物に転換する薬物代謝酵素、アポトーシス誘導剤およびこれらの組み合わせから選択される。特定の実施形態では、毒素は、細菌毒素、植物毒素、真菌毒素およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。特定の実施形態では、細菌毒素は、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素、コレラ毒素、炭疽毒素、ボツリヌス毒素、百日咳毒素、大腸菌エンテロトキシンおよび志賀毒素からなる群から選択される。特定の実施形態では、植物毒素は、リシン、モデシン、アブリン、ボルケンシンおよびビスキュミンからなる群から選択される。特定の実施形態では、真菌毒素は、α−サルシン、レストリクトシン、ミトギリン、エノマイシン、ＲＮアーゼＴ１およびフェノマイシンからなる群から選択される。
【００２３】
特定の実施形態では、毒素は、天然起源の毒素の細胞毒性フラグメントを含む。特定の実施形態では、毒素の細胞毒性フラグメントは、ジフテリア毒素のＡフラグメント（ＤＴ−Ａ）である。特定の実施形態では、ＤＴ−Ａは、配列番号１９のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、ＤＴ−Ａをコードする核酸配列は、配列番号１８を含む。
【００２４】
特定の実施形態では、薬物代謝酵素はキナーゼである。特定の実施形態では、キナーゼは、チミジンキナーゼである。特定の実施形態では、チミジンキナーゼのプロドラッグ標的はガンシクロビルである。特定の実施形態では、キナーゼは、ウイルスチミジンキナーゼである。特定の実施形態では、アポトーシス誘導剤は、ＰＵＭＡ；ＢＡＸ；ＢＡＫ；ＢｃＩ−ＸＳ；ＢＡＤ；ＢＩＭ；ＢＩＫ；ＢＩＤ；ＨＲＫ；Ａｄ  ＥｌＢ；ＩＣＥ−ＣＥＤ３プロテアーゼ；ＴＲＡＩＬ；ＳＡＲＰ−２；およびアポプチンからなる群から選択される。
【００２５】
特定の実施形態では、構造体は、ｍｉＲ−２１プロモーター配列として配列番号１を含み、抗がん剤をコードする核酸配列として配列番号１８をさらに含む。特定の実施形態では、ｍｉＲ−２１プロモーター配列を含む核酸配列は、ｍｉＲ−２１転写産物またはプロセシング産物に相当する、または相補的な核酸配列を実質的に欠く。特定の実施形態では、核酸構造体は、ｍｉＲ−２１の一次転写産物（ｐｒｉ−ｍｉＲ−２１）；ｍｉＲ−２１の前駆体（ｐｒｅ−ｍｉＲ−２１）；ｍｉＲ−２１のＲＮＡ二本鎖および成熟ｍｉＲ−２１からなる群から選択されるｍｉＲ−２１の形態に相当する、または相補的な核酸配列を実質的に欠く。特定の実施形態では、核酸構造体は、配列番号２；配列番号３；配列番号４；配列番号５および配列番号２６からなる群から選択される核酸配列に相当する、または相補的な核酸配列を実質的に欠く。
【００２６】
特定の実施形態では、核酸構造体は、配列番号７および配列番号８からなる群から選択される配列を含む。
【００２７】
特定の実施形態では、ｍｉＲ−２１プロモーター配列は、天然のｍｉＲ−２１プロモーターの相同体、類似体またはフラグメントなどの天然のｍｉＲ−２１プロモーターの変異形である。
【００２８】
別の態様では、本発明は、本発明の組換え核酸構造体を含むベクターを提供する。
【００２９】
別の態様では、本発明は、本発明のベクターを含む単離された宿主細胞を提供する。
【００３０】
特定の実施形態では、ベクターは、配列番号９および配列番号１０からなる群から選択される。
【００３１】
特定の実施形態では、構造体は、抗がん剤を含む融合タンパク質をコードする。特定の実施形態では、構造体は、がん関連タンパク質に特異的な抗体、または少なくとも抗体の抗原結合部を含むそのフラグメントをコードする核酸配列をさらに含む。特定の実施形態では、構造体は、抗がん剤、および抗体または抗体フラグメントに相当するセグメントを含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含む。
【００３２】
別の態様では、本発明は、有効成分として、本発明の少なくとも１種の核酸構造体、および薬学的に許容される担体、添加剤または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【００３３】
別の実施形態では、本発明は、治療上有効量の本発明の核酸構造体を、それを必要とするヒト被験体に投与し、それによってヒト被験体のがんを治療するステップを含む、ヒト被験体のがんを治療する方法を提供する。
【００３４】
別の実施形態では、本発明は、治療上有効量の本発明の核酸構造体を、それを必要とするヒト被験体に投与し、それによってヒト被験体の腫瘍進行を抑制するステップを含む、ヒト被験体の腫瘍進行を抑制する方法を提供する。
【００３５】
別の実施形態では、本発明は、治療上有効量の本発明の核酸構造体を、それを必要とするヒト被験体に投与し、それによってヒト被験体の腫瘍転移を抑制するステップを含む、ヒト被験体の腫瘍転移を抑制する方法を提供する。
【００３６】
別の実施形態では、本発明は、治療上有効量の本発明の核酸構造体を、それを必要とするヒト被験体に投与し、それによってヒト被験体の新生物疾患に関連する症状を減少または緩和させるステップを含む、ヒト被験体の新生物疾患に関連する症状を減少または緩和させる方法を提供する。
【００３７】
本発明の方法では、前記被験体は、一実施形態では、その細胞の少なくとも一部におけるｍｉＲ−２１の内在性発現によって特徴づけられるがん、腫瘍または新生物疾患で苦しんでいる。
【００３８】
特定の実施形態では、投与は、注射、点滴および腫瘍への直接注射からなる群から選択される経路によって行われる。
【００３９】
特定の実施形態では、投与は、核酸構造体の単一用量または複数用量を投与することを含む。
【００４０】
特定の実施形態では、本方法は、被験体からの生体試料、例えば細胞または組織中のｍｉＲ−２１転写活性レベルを測定するステップをさらに含む。
【００４１】
特定の実施形態では、本方法は、少なくとも１つの追加のがん治療様式とともに行われる。特定の実施形態では、追加のがん治療様式は、骨髄移植、臍帯血細胞移植、外科手術、化学療法、放射線療法、免疫療法およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００４２】
別の態様では、本発明は、ヒト被験体のがんを治療するための薬剤を調製するための本発明の核酸構造体の使用を提供する。
【００４３】
別の態様では、本発明は、ヒト被験体の腫瘍進行を抑制するための薬剤を調製するための本発明の核酸構造体の使用を提供する。
【００４４】
別の態様では、本発明は、ヒト被験体の腫瘍転移を抑制するための薬剤を調製するための本発明の核酸構造体の使用を提供する。
【００４５】
別の態様では、本発明は、新生物疾患に関連する症状を減少または緩和させるための薬剤を調製するための本発明の核酸構造体の使用を提供する。
【００４６】
別の態様では、本発明は、ｉ）ｍｉＲ−２１を発現しているがん、腫瘍または新生物の治療の１つまたは複数のクールに十分な本発明の核酸構造体の単一投与量単位または複数投与量単位と、ｉｉ）前記核酸構造体を、それを必要とする被験体に投与するための説明書とを含むキットを提供する。
【００４７】
本発明の組成物、方法およびキットは、ｍｉＲ−２１の発現に関連する種々のがんおよび新生物疾患の治療に有用である。特定の実施形態では、がんは、肉腫、癌、腺癌、リンパ腫および白血病からなる群から選択される。特定の実施形態では、がんは、乳がん、結腸がん、肝細胞癌、子宮頚がん、胆管癌、類内膜性卵巣癌、食道がん、神経膠芽種、頭頚部がん、白血病、リンパ腫、肺がん、多発性骨髄腫、膵臓がん、骨肉種、下垂体腫瘍、前立腺がん、胃がんおよび子宮筋腫からなる群から選択される。特定の実施形態では、がんは、乳がん、結腸がんおよび肝細胞癌からなる群から選択される。
【００４８】
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の説明および図面から明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】抗がん剤をコードする核酸配列（「キラー遺伝子」）がｍｉＲ−２１プロモーター配列と作動可能に連結されている本発明の核酸構造体の概略図である。
【図２】異なる細胞系におけるレポーターレシフェラーゼ遺伝子のｍｉＲ−２１プロモーター駆動性発現を示す図である。ｍｉＲ−２１プロモーターの調節下のホタルルシフェラーゼ遺伝子（Ｌｕｃ）を含むベクター（ｍｉＲ−２１−Ｌｕｃ；配列番号１１；黒色の棒）およびｍｉＲ−２１プロモーターのＴＡＴＡボックス配列の調節下のホタルルシフェラーゼ遺伝子を含む対照ベクター（ＴＡＴＡ−Ｌｕｃ；配列番号２０；白色の棒）を、それぞれ異なる細胞系に形質移入させた。試験した細胞系には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ、右の棒）ならびにヒト結腸直腸がん細胞系ＨＣＴ１１６（左の棒）およびＣＯＬＯ３２０（中央の棒）が含まれた。Ｙ軸−相対的ルシフェラーゼ活性。
【図３】ジフテリア毒素のフラグメント（ＤＴ−Ａ）をコードする構造体によって誘発される新規のタンパク質合成の減少のモデルにおけるウミシイタケルシフェラーゼ発現の抑制を示す図である。細胞は、ＳＶ−４０プロモーターの調節下でウミシイタケルシフェラーゼをコードするプラスミド（配列番号２８）、およびｍｉＲ−２１プロモーターの調節下でＤＴ−Ａをコードするプラスミド（ｍｉＲ−２１  Ｐｒ  ＤＴ−Ａ；配列番号９）またはｍｉＲ−２１プロモーターのＴＡＴＡボックス配列の調節下でＤＴ−Ａをコードするプラスミド（配列番号１３）のいずれかを同時形質移入された。細胞は、形質移入の７２時間後に回収し、ルシフェラーゼアッセイに供した。
【図４】新規のタンパク質合成の減少のモデルにおけるウミシイタケルシフェラーゼまたは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現の抑制を示す図である。
【図４Ａ】（白色の棒）細胞が、ウミシイタケルシフェラーゼをコードするレポータープラスミドと共に、ｍｉＲ−２１  Ｐｒ  ＤＴ−Ａ（配列番号９）またはｍｉＲ−２１  ｐｒ  ＰＵＭＡ（ｍｉＲ−２１プロモーターの調節下でアポトーシスのｐ５３上方制御調節因子（ＰＵＭＡ）をコードするベクター；配列番号１０）を同時形質移入された、同時形質移入実験の結果を示す図である。（黒色の棒）細胞が、ウミシイタケルシフェラーゼをコードするプラスミドと共に、ｍｉＲ−２１  ＴＡＴＡボックス  ＤＴ−Ａ（配列番号１３）またはＴＡＴＡ  ＰＵＭＡ（ｍｉＲ−２１プロモーターのＴＡＴＡボックス配列の調節下でＰＵＭＡをコードするベクター；配列番号２９）を同時形質移入された、調節系における同時形質移入実験の結果を示す図である。
【図４Ｂ】ＧＦＰをコードするプラスミドをレポータープラスミドとして使用したことを除いては図４Ａに示したように行った同時形質移入実験の結果を示す図である。細胞は、形質移入の７２時間後に回収し、ルシフェラーゼアッセイ（図４Ａ）またはウエスタンブロット解析（図４Ｂ）に供した。
【図５】ｍｉＲ−２１  Ｐｒ  ＤＴ−Ａ発現がｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍形成を抑制することを示す図である。ヌードマウス（群当たりｎ＝３）に１×１０７個のＨＣＴ１１６細胞を注射した。腫瘍細胞注射２週間後、腫瘍内注射（２５μｇの用量）によってマウスに内毒素フリーのｍｉＲ−２１  Ｐｒ  ＤＴ−Ａ（配列番号９）を投与した。７日後に追加の注射を投与した。腫瘍サイズは、手動キャリパーを使用して腫瘍細胞注射の０、７および１４日後に記録した。対照処理マウスには、腫瘍内注射によってｍｉＲ−２１−Ｌｕｃ（配列番号１１）を投与した。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
本発明は、核酸構造体および標的がん治療を提供する方法に関する。特に、本発明の構造体は、ｍｉＲ−２１転写調節配列、特にｍｉＲ−２１プロモーター配列と作動可能に連結されている、異種性抗がん遺伝子産物をコードする少なくとも１種の核酸配列を含む。これらの構造体を含むベクター、これらの構造体を含む医薬組成物、およびその使用方法も提供される。
【００５１】
本発明の有効性は、ｍｉＲ−２１活性を抑制する薬剤の投与または発がんに関係する遺伝子を不活性化するためのｍｉＲ−２１の使用などによって、ｍｉＲ−２１が高度に発現しているがんを治療するためのｍｉＲ−２１駆動プロセスの抑制を教示している従来技術からは予測できないものである。すなわち、本発明によって教示される、殺腫瘍剤の発現を駆動するためのｍｉＲ−２１プロモーターの利用は、ｍｉＲ−２１に関連するがんの治療への従来技術のアプローチの逆転をもたらす。
定義
【００５２】
本明細書で使用する場合、「マイクロＲＮＡ」および「ｍｉＲＮＡ」という用語は、互換的に、ＲＮアーゼＩＩＩ型酵素が内在性一次転写産物（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）へ作用することによって産生される約２２〜２５ヌクレオチド長の一本鎖非コード調節ＲＮＡを指す。
【００５３】
本明細書で使用する場合、「ｍｉＲＮＡ生合成」、「ｍｉＲＮＡ経路」および「ｍｉＲＮＡプロセシング経路」という用語は、互換的に、一次ｍｉＲＮＡ転写産物（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）を転写すること、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡを切断して中間体である前駆体ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）を生成すること、およびその後にｐｒｅ−ｍｉＲＮＡをプロセシングして成熟ｍｉＲＮＡを生成することを含む、ｍｉＲＮＡ形成をもたらすＲＮＡ代謝プロセスを指す。
【００５４】
本明細書で使用する場合、「ｍｉＲ−２１」という用語は、配列番号５の配列を有するｍｉＲＮＡの成熟したプロセシングされた形態を指す。
【００５５】
本明細書で使用する場合、「ｍｉＲ−２１プロモーター」という用語は、ｍｉＲ−２１遺伝子の上流に位置し、ｍｉＲ−２１の一次転写産物（ｐｒｉ−ｍｉＲ−２１）を産生するためのその転写に必要とされる天然の核酸配列を指す。代表的なヒトｐｒｉ−ｍｉＲ−２１配列としては、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＢＣ０５３５６３（本明細書中、配列番号２として開示されている）；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＹ６９９２６５（本明細書中、配列番号３として開示されている）、およびＦｕｊｉｔａ等、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２００８  ５月２日；３７８（３）：４９２〜５０４に開示されているもの（本明細書中、配列番号２６として開示されている）が挙げられる。本明細書で使用する場合、「ｍｉＲ−２１プロモーター配列」という用語は、ｍｉＲ−２１プロモーターに由来し、配列番号１と少なくとも約８０％の同一性を有する核酸配列を指す。
【００５６】
本明細書で使用する場合、「ｍｉＲ−２１転写産物またはプロセシング産物」という用語は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＢＣ０５３５６３およびＡＹ６９９２６５を有するものなどのｍｉＲ−２１の一次転写産物（ｐｒｉ−ｍｉＲ−２１）；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＲ＿０２９４９３、ＡＦ＿４８０５４６およびＡＦ＿４８０５５７を有するものなどのｍｉＲ−２１の中間体である前駆体（ｐｒｅ−ｍｉＲ−２１）；ならびにＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＲ＿０２９４９３を有するものなどの成熟ｍｉＲ−２１を含む、ｍｉＲ−２１を成熟させる経路中のｍｉＲ−２１遺伝子に由来する核酸転写産物またはプロセシング産物を指す。
【００５７】
本明細書で使用する場合、「ｍｉＲ−２１転写産物またはプロセシング産物に相当するまたは相補的な核酸配列」という用語は、ｍｉＲ−２１転写産物またはプロセシング産物の配列と同一である、すなわち「相当する」、あるいはｍｉＲ−２１転写産物またはプロセシング産物と完全な塩基対形成を示し得る、すなわち「相補的である」かのいずれかであるＤＮＡまたはＲＮＡ配列を指す。例えば、被験体ＤＮＡおよびｃＤＮＡが同一であり、一方で同じ被験体ＤＮＡが上述のｍｉＲ−２１転写産物と「相補的である」ならば、被験体ＤＮＡはｍｉＲ−２１  ＲＮＡ転写産物から産生されるｃＤＮＡに「相当する」だろう。
【００５８】
本明細書で使用する場合、「核酸構造体」という用語は、つなぎ合わさって単一の単位を形成する少なくとも２つの異種性核酸配列を含む連続的ポリヌクレオチド分子を指す。構造体を含む核酸配列は、ポリペプチドコード配列および非コード配列を含み得る。
【００５９】
「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、「核酸」、「核酸配列」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、本明細書中では互換的に、デオキシリボヌクレオチド、リポヌクレオチドなどの任意の長さのヌクレオチドの多量体型、または一本鎖、二本鎖もしくは複数本鎖の、個々のフラグメント型もしくはより大きな構造体の成分としてのその修飾型を指すのに使用される。本発明で使用されるポリヌクレオチドには、ＤＮＡもしくはＲＮＡのセンスおよびアンチセンス配列、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、またはプリンおよびピリミジン塩基を含むポリマー、または他の天然、化学的もしくは生化学的に修飾された、非天然、または誘導体化ヌクレオチド塩基が含まれる。さらに、イントロン配列を含むｍＲＮＡまたはｃＤＮＡが含まれる。ポリヌクレオチドの主鎖は、糖およびリン酸基（典型的には、ＲＮＡまたはＤＮＡ中に見られる）、または修飾もしくは置換された糖もしくはリン酸基を含むことができる。あるいは、ポリヌクレオチドの主鎖は、ホスホラミダイトなどの合成サブユニットの多量体を含むことができ、したがって、オリゴヌクレオシドホスホラミダイトまたは混合ホスホラミダイト−リン酸ジエステルオリゴマーであり得る（例えば、Ｐｅｙｒｏｔｔｅｓ等（１９９６）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：１８４１〜１８４８；Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉ等（１９９６）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：２３１８〜２３２３参照）。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体、ウラシル、他の糖、ならびにフルオロリボースおよびチオアートなどの架橋基、ならびにヌクレオチド分岐を含んでもよい。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断されていてもよい。ポリヌクレオチドは、ラベル化成分との結合、キャッピング、類似体による１つまたは複数の天然型ヌクレオチドの置換、およびタンパク質、金属イオン、ラベル化成分、他のポリヌクレオチドまたは固体支持体にポリヌクレオチドを結合させるための手段の導入などによって、重合後にさらに修飾され得る。
【００６０】
ポリヌクレオチドは、本明細書に開示されているヌクレオチド配列を含むことができ、その中で、チミジン（Ｔ）はウラシル（Ｕ）であってもよい；この定義は、ＤＮＡとＲＮＡとの間の化学構造の違い、特に、ＲＮＡ中の４つの主要塩基の１つが、チミジン（Ｔ）の代わりにウラシル（Ｕ）であるという知見に関係する。
【００６１】
本明細書で使用する「組換え核酸構造体」という用語は、例えば、ライゲーションによって核酸配列を結合させるなど、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分子操作に供された核酸構造体を指す。
【００６２】
本明細書で使用する場合、「作動可能に連結されている」という用語は、同じポリヌクレオチド、一般的には調節配列およびタンパク質コード配列の一部として結合される２つ以上の核酸配列間の構造的および機能的関係を指す。例えば、転写がプロモーターから開始される場合、タンパク質をコードする核酸配列はプロモーターと作動可能に連結されており；または対応するｍＲＮＡの翻訳がリボソーム結合部位から開始される場合、タンパク質をコードする核酸配列はリボソーム結合部位と作動可能に連結されている。本発明では、抗がん活性を有するタンパク質をコードする核酸は、ｍｉＲ−２１転写調節配列、好ましくはｍｉＲ−２１プロモーター配列と作動可能に連結されており、結果として核酸の転写がもたらされる、または増強される。一般に、「作動可能に連結されている」とは、エンハンサーが隣接している必要はないが、連結されている核酸配列が隣接していることを意味する。連結は、好都合な制限部位でのライゲーションによって達成され、またはこのような部位が存在しない場合には、従来の慣習に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターもしくはリンカーが使用され得る。
【００６３】
転写調節配列は、転写の開始、伸長および終結を調節する配列である。特に重要な転写調節配列は、プロモーター、エンハンサー、オペレーターおよびリプレッサー配列などの転写開始を調節する配列である。
【００６４】
本明細書で使用する場合、「ベクター」という用語は、その中での複製および／または発現のために標的細胞に装入される異種性ポリヌクレオチドに連結された調節配列を含む核酸構造体を指す。ベクターは、ウイルス発現ベクター、プラスミドまたはネイキッドＤＮＡの構造体とすることができ、任意選択で、構成、選択、安定性、侵入等のために必要とされる追加の配列を含むことができる。
【００６５】
本明細書で使用する場合、「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、互換的に、ペプチド結合を通して結合された少なくとも約１０個のアミノ酸の多量体を指す。明細書を通して、アミノ酸の標準的な３文字または１文字名称を使用する。
【００６６】
本明細書で使用する場合、「組換えタンパク質」および「組換えポリペプチド」という用語は、互換的に、タンパク質を発現することができる核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の内在性コピーを、その自然の状態では有さない細胞を使用して産生されるタンパク質を指す。細胞は、例えば発現ベクターの成分としての適当な単離核酸配列の導入によって遺伝子改変されたので、組換えタンパク質を産生する。
【００６７】
本明細書で使用する場合、本明細書で使用する「融合タンパク質」という用語は、異なる機能のタンパク質および／または異なる生物からのタンパク質などの異種性タンパク質配列に相当するセグメント、すなわちアミノ酸配列からなるタンパク質配列を指す。セグメントは、ペプチド結合を通して、互いに直接的にまたは間接的に結合しており、全長タンパク質またはそのフラグメントのいずれかに相当し得る。間接的結合とは、ペプチドリンカーなどの介在性アミノ酸配列が、融合タンパク質を形成するセグメント間に併置されていることを意味する。融合タンパク質は、融合タンパク質の種々のセグメントをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドから組換え技術によって産生され得る。
【００６８】
本明細書で使用する場合、「薬物代謝酵素」という用語は、プロドラッグを細胞毒性産物へ転換する酵素を指す。
【００６９】
本明細書で使用する場合、「プロドラッグ」という用語は、親薬物と比較して腫瘍細胞への細胞毒性が少なく、酵素的に活性化するもしくはより活性な親型へ転換することが可能な、医薬活性物質の前駆体または誘導体型を指す。
【００７０】
本明細書で使用する場合、別個の核酸配列または別個のタンパク質配列に関して使用する場合の「異種性」という用語は、配列が、その配列、構造および／またはそれらが由来するもしくは産生される生物に関して異なることを意味する。
【００７１】
本明細書で使用する場合、「相同体」という用語は、対応する位置に同一のまたは類似の化学残基の配列を有することによって、別の分子との相同性を示す分子、一般的にはポリペプチドまたは核酸配列を指す。
【００７２】
配列類似性および配列同一性は、保存モチーフ、コード領域、隣接領域等のより大きい配列のサブセットであり得る参照配列に基づいて計算される。参照配列は、一般には少なくとも約１８ヌクレオチド長、より一般には少なくとも約３０ヌクレオチド長であり、比較されている全配列まで伸長し得る。一般に、パーセント配列同一性は、当技術分野で公知のように、クエリーとテスト配列との間の残基一致（例えば、ヌクレオチド残基またはアミノ酸残基）の数を数え、一致の総数を、最も強いアラインメントの領域中またはギャップの導入後の完全領域に沿って見られる個々の配列の残基の数で割ることによって計算される。コンピューターに基づいたアラインメントおよび配列解析のためのアルゴリズムは、当技術分野で公知であり（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ等、（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３〜１０参照）、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）等の一般に入手可能なソフトウェアツールは、当技術分野で周知である。
【００７３】
したがって、本明細書では、同定されるｍｉＲ−２１プロモーター核酸配列に関して「パーセント（％）核酸配列同一性」は、必要に応じて最大のパーセント配列同一性を達成するために配列をアラインメントし、ギャップを導入した後の、開示されたｍｉＲ−２１プロモーター核酸配列と同一である候補配列中のヌクレオチドの割合として定義される。パーセント核酸配列同一性を決定するためのアラインメントは、上述のコンピューターソフトウェアツールを使用して達成することができる。
【００７４】
本明細書で使用する場合、「変異形」という用語は、共通の質的な生物活性を有する実質的に類似の配列を指す。オリゴヌクレオチド変異形には、薬学的に許容される塩、相同体、類似体、ｍｉＲ−２１プロモーター配列などの本発明に有用なヌクレオチド配列の伸張またはフラグメントが含まれる。「変異形」という用語には、化学修飾された天然および合成のヌクレオチド分子が含まれる。「変異形」という用語には、必要とされる機能が十分に維持される限り、ヌクレオチド配列内の分子の置換（保存的または非保存的）、付加または欠失が含まれる。オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド変異形は、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を共有し得る。
【００７５】
本明細書で使用する場合、ポリヌクレオチドの文脈では、「ハイブリッド形成する（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ、ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ、ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｓ等）」という用語は、従来のハイブリダイゼーション条件を指す。
【００７６】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当技術分野における通常の技術の１つによって容易に決定可能であり、一般的に、プローブ長、洗浄温度および塩濃度に依存する経験的計算である。一般に、適当なアニーリングのためには、より長いプローブはより高温を要し、一方でより短いプローブはより低温を要する。相補鎖がその融解温度より低い環境中に存在する場合、ハイブリダイゼーションは一般的に変性ＤＮＡの再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリッド形成可能な配列との間の所望の相同性の程度が高いほど、使用することができる相対温度はより高くなる。結果として、より高い相対温度は、反応条件をよりストリンジェントにする傾向があり、一方でより低温はそうではないということになる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーの追加の詳細および説明については、Ａｕｓｕｂｅｌ等、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍｄ．、１９８８を参照されたい。
【００７７】
本明細書で定義される「ストリンジェント条件」または「高ストリンジェンシー条件」は、（１）洗浄に低イオン強度および高温を使用する、例えば、５０℃で０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウム；（２）ハイブリダイゼーション中に、ホルムアミドなどの変性剤を使用する、例えば、４２℃で７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムとともに、０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％ポリビニルピロリドン／ｐＨ６．５の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液とともに５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド；または（３）４２℃で、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０ｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳおよび１０％デキストラン硫酸を使用し、０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中で４２℃および５０％ホルムアミド中で５５℃で洗浄し、引き続いて５５℃でＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣからなる高ストリンジェンシー洗浄を行うという条件によって同定され得る。
【００７８】
本明細書で使用する場合、核酸分子に関して「単離された」という用語は、核酸分子が、異なる（配列または構造の点から）、不必要な核酸分子から最初に分離されて、単離された核酸の集団が、他のヌクレオチド分子に関して、少なくとも約９０％相同であり、少なくとも約９５、９６、９７、９８、９９または１００％相同であることを意味する。多くの実施形態では、核酸は、細胞中の内在性の核酸とは異なるｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成したことよって単離される。しかしながら、単離された核酸は、その後に混合され、または一緒にプールされ得ることが理解されよう。
【００７９】
本明細書で使用する場合、「抗がん剤」という用語は、直接的または間接的にがん細胞に抑制または細胞毒性効果を及ぼす、タンパク質またはペプチドを指す。例えば、がん細胞を死滅させる細胞毒性薬剤は、がん細胞に直接的な効果を及ぼし、一方でプロドラッグを、がん細胞を死滅させるその活性細胞毒性型に転換する酵素は、間接的な効果を及ぼす。
【００８０】
「がん」および「新生物」という用語は、本明細書では、互換的に、急速な増殖によって特徴づけられる異常な状態または状況にある細胞によって特徴づけられる疾患状態を指すのに使用される。このような細胞を含む「腫瘍」は、良性、前悪性または悪性のいずれかであり得る。これらの用語は、病理組織学的型または侵襲性の段階に関係なく、全ての種類の過剰増殖成長、過形成成長、がん性増殖、発がん性過程、転移組織、悪性形質転換細胞、組織または器官によって特徴づけられる疾患状態を含む。
【００８１】
「癌」という用語は、当業者によって認識され、呼吸器系癌、消化器系癌、泌尿生殖器系癌、精巣癌、乳癌、前立腺癌、内分泌系癌およびメラノーマを含む上皮または内分泌組織の悪性腫瘍を指す。代表的な癌としては、子宮頚部、肺、前立腺、乳房、頭頚部、結腸および卵巣の組織から形成するものが挙げられる。この用語はまた、例えば癌性および肉腫性組織から構成される悪性腫瘍を含む癌肉腫も含む。「腺癌」は、腺組織に由来する癌または腫瘍細胞が認識できる腺構造を形成する癌を指す。
【００８２】
「肉腫」という用語は、当業者によって認識され、骨または軟骨などの結合組織の悪性腫瘍を指す。
【００８３】
本明細書で使用する場合、「白血病」および「白血病性がん」という用語は、造血系および免疫系（血液およびリンパ系）の全てのがんを指す。これらの用語は、血液および骨髄中の白血球およびその前駆体の無秩序な増殖および発達によって特徴づけられる造血器官の進行性の悪性疾患を指す。骨髄腫は、血液、骨髄細胞の他の種類の腫瘍を指す。リンパ腫は、リンパ組織の腫瘍を指す。
【００８４】
本明細書で使用する場合、「医薬組成物」という用語は、１つまたは複数の医薬有効成分、例えば抗がん剤をコードする核酸構造体を含み、一般的には少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤、担体または添加剤をさらに含む製剤を指す。医薬組成物の目的は、被験体への医薬有効成分の投与を促進することである。
【００８５】
本明細書で使用する場合、「有効成分」という用語は、一般的に医学的有益性をもたらさないと認識される「不活性成分」と対照的に、主要な医学的有益性をもたらす医薬組成物の成分を指す。
【００８６】
本明細書で使用する場合、「担体、添加剤または賦形剤」という用語は、有効医薬成分の処方および／または投与を促進する不活性成分、例えば等張化剤、湿潤剤または保存剤を指す。
【００８７】
本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される」という用語は、ヒトまたは他の哺乳類に生理学的に適合性の無毒性で不活性な物質を指す。
【００８８】
本明細書で使用する場合、「被験体」という用語は、がんを有する任意の年齢の任意の哺乳類、特にヒト被験体を指すが、霊長類、イヌ、ネコ、ウシ、ウマおよびマウス種などのヒト以外の哺乳類も含む。
【００８９】
「抗体」（「免疫グロブリン」とも呼ばれる）という用語は、最も広い意味で使用され、特定の抗原に結合特異性を示すポリペプチドを指す。この用語は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を含み、所望の生物活性を示す限り全長抗体および抗体フラグメントの両方を含む。
【００９０】
本明細書で使用する「天然抗体」および「全長抗体」という用語は、互換的に、２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一の重（Ｈ）鎖から構成される約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質を指す。各々の軽鎖は、共有ジスルフィド結合によって重鎖と結合しており、一方でジスルフィド結合の数は異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で異なる。各々の重鎖および軽鎖はまた、規則的な間隔をあけた鎖内のジスルフィド架橋を有する。各々の重鎖は、一端に、いくつかの定常領域を伴う可変領域（ＶＨ）を有する。各々の軽鎖は、一端に可変領域（ＶＬ）および他端に定常領域を有する；軽鎖の定常領域は重鎖の第１の定常領域と一直線に並んでおり、軽鎖可変領域は重鎖の可変領域と一直線に並んでいる。
【００９１】
重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて、抗体を異なるクラスに帰属させることができる。ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ抗体の５つの主要クラスがあり、これらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４に分けられ得る。
【００９２】
「抗体フラグメント」は、全長抗体の一部、一般的にはその抗原結合領域または可変領域を含む。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント；二重特異性抗体；直線状抗体；一本鎖抗体分子；ならびに抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が挙げられる。
【００９３】
本明細書で使用する「ポリクローナル抗体」および「ポリクローナル抗血清」という用語は、Ｂ細胞の集団によって合成される抗体分子の集団を指す。ポリクローナル抗体は、特定の抗原に特異的に結合する異なる抗体分子の集団を含み、ここでは混合物中の種々の抗体は異なるエピトープ（抗原決定基とも呼ばれる）を認識する。
【００９４】
本明細書で使用する「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の抗体の集団から得られた抗体を指す。すなわち、その集団を含む個々の抗体は、少量存在し得る自然に発生し得る変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、非常に特異的であり、単一の抗原部位に向かう。さらに、ポリクローナル抗体製剤と対照的に、各々のモノクローナル抗体は、抗原の単一のエピトープに向かう。修飾語の「モノクローナル」は、実質的に同種の抗体の集団から得られているものとしての抗体の性質を示しており、任意の特定の方法による抗体の産生を要するものと解釈されるべきではない。例えば、モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ等、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製され得る、または組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４８１６５６７号参照）によって作製され得る。「モノクローナル抗体」は、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ等、Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４〜６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１〜５９７（１９９１）に記載のものなどの技術を使用して、当技術分野で公知であるファージ抗体ライブラリーからも単離され得る。
【００９５】
「特異的に相互作用する」、「特異的に結合する」および「特異性を有する」という用語は、本明細書では、互換的に、抗原またはそのエピトープ、例えばがん細胞のエピトープに抗体が結合する高結合活性および／または高親和性を指す。抗体のそのエピトープとの結合は、同じ抗体の任意の他のエピトープとの結合よりも強力である。対象のポリペプチドに特異的に結合する抗体は、弱いが検出可能なレベル（例えば、対象のポリペプチドに示す結合の１０％以下）で、他のポリペプチドに結合することができる。このような弱い結合または目立たない結合は、例えば適当な調節を使用することによって、対象の化合物またはポリペプチドに結合している特異的な抗体と容易に識別可能である。
【００９６】
文脈上そうでないとする明確な指示がない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「構造体（ａ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）」は、１つまたは複数のこのような構造体を含み、以下同様である。
ｍｉＲ−２１プロセシング経路
【００９７】
ｍｉＲ−２１の転写を含む、ｍｉＲＮＡ遺伝子の転写は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌＩＩ）によって媒介され、多くの場合数キロベース長の長い一次転写産物（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）を産生する。ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ転写産物は、５’末端キャップ構造および３’末端ポリ（Ａ）テールの両方を含む。ｍｉＲＮＡ配列および隣接するｍＲＮＡの領域の両方を含むいくつかのポリ（Ａ）含有転写産物が特徴づけられてきた。３４６３ヌクレオチド長のヒトｐｒｉ−ｍｉＲ−２１は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＹ６９９２６５の下に開示されており、３４０４ヌクレオチド長のヒトｃＤＮＡクローンからの非常に類似の配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＢＣ０５３５６３の下に開示されている。ヒトｐｒｉ−ｍｉＲ−２１は、Ｆｕｊｉｔａ等、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２００８  ５月２日；３７８（３）４９２〜５０４によって開示されている。
【００９８】
例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＹ８６５９６５（Ｐａｎ  ｐａｎｉｓｃｕｓ由来）；ＡＹ８６５９６４（Ａｔｅｌｅｓ  ｇｅｏｆｆｒｏｙｉ由来）；ＡＹ８６５９６３（Ｍａｃａｃａ  ｎｅｍｅｓｔｒｉｎａ由来）；ＡＹ８６５９６２（Ｐｏｎｇｏ  ｐｙｇｍａｅｕｓ由来）；ＡＹ８６５９６１（Ｇｏｒｉｌｌａ  ｇｏｒｉｌｌａ由来）；ＡＹ８６５９６０（Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ由来）およびＡＹ８６５９５９（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ由来）の下で入手可能なものを含む、ヒト以外の種の相同性ｍｉＲ−２１遺伝子も公知である。
【００９９】
ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡからのｍｉＲＮＡの成熟化は、前駆体ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）と呼ばれるヘアピン中間体へのｐｒｉ−ｍｉＲＮＡのトリミングを含み、前駆体ｍｉＲＮＡはその後に成熟ｍｉＲＮＡへと切断される。ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ分子のステムループ構造は、核ＲＮアーゼＩＩＩ酵素Ｄｒｏｓｈａによって切断されて、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ分子を放出する。Ｄｒｏｓｈａは、約１６０ｋＤａの大きなタンパク質であり、ヒトでは、マイクロプロセッサー複合体として知られる約６５０ｋＤａのさらに大きな複合体を形成する。この酵素は、二本鎖ＲＮＡ結合領域（ｄｓＲＢＤ）を有するクラスＩＩ  ＲＮアーゼＩＩＩ酵素である。
【０１００】
ヒトのｐｒｅ−ｍｉＲ−２１の配列には、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＲ＿２９４９３；ＡＦ４８０５４６およびＡＦ４８０５５７の下で入手可能なものが含まれる。非常に相同性のヒト以外のｐｒｅ−ｍｉＲ−２１の配列には、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＲ＿０３２０９４（Ｅｑｕｕｓ  ｃａｂａｌｌｕｓ）；ＮＲ＿０３０８８０（Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ）；ＮＲ＿０２９７３８（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）；およびＮＲ＿０３２１５１（Ｍｏｎｏｄｅｌｐｈｉｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）の下で入手可能なものが含まれる。
【０１０１】
ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ分子の細胞質への搬出の後、「Ｄｉｃｅｒ」と呼ばれる別のＲＮアーゼＩＩＩ酵素がｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを切断して成熟ｍｉＲＮＡを産生する。成熟ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ含有ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体またはｍｉＲＩＳＣとして知られているエフェクター複合体の中に取り込まれる。
【０１０２】
成熟ヒトｍｉＲ−２１は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＲ＿２９４９３の下で入手可能であり、本明細書で配列番号５として開示されている。同一のまたはほとんど同一のヒト以外のｍｉＲ−２１配列には、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＲ＿０３２０９４（Ｅｑｕｕｓ  ｃａｂａｌｌｕｓ）；ＮＲ＿０３０８８０（Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ）；ＮＲ＿０２９７３８（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）；およびＮＲ＿０３２１５１（Ｍｏｎｏｄｅｌｐｈｉｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）の下で入手可能なものが含まれる。
【０１０３】
ｍｉＲＮＡならびに関連するｐｒｉ−ｍｉＲＮＡおよびｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列に関する追加の情報は、ｍｉＲＢａｓｅ（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ等  ２００８  Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ３６、Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｉｓｓｕｅ：Ｄ１５４〜Ｄ１５８）およびＮＣＢＩヒトゲノムデータベースなどのｍｉＲＮＡデータベースで入手可能である。
【０１０４】
本明細書で言及され開示される配列は、例えば成熟ｍｉＲ−２１など、天然の配列がＲＮＡである場合ですら、対応するＲＮＡウラシル（Ｕ）塩基よりむしろＤＮＡチミン塩基（Ｔ）で表現されることに注意すべきである。
核酸構造体、ベクターおよび宿主細胞
【０１０５】
本発明の核酸構造体は、ｍｉＲ−２１プロモーター配列と作動可能に連結された抗がん剤をコードする核酸配列を含む。
【０１０６】
ｍｉＲ−２１プロモーター配列は、対応するｐｒｉ−ｍｉＲ−２１転写産物の転写で機能するｍｉＲ−２１遺伝子の上流に位置する領域に相当する。本発明のために使用されるｍｉＲ−２１プロモーター配列は、それが作動可能に連結されている核酸配列の転写を駆動する能力を保持している限りは天然の配列またはそのフラグメントであり得る。
【０１０７】
本発明で使用するためのｍｉＲ−２１プロモーターは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＹ６９９２６５およびＢＣ０５３５６３ならびにＦｕｊｉｔａ等、Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２００８  ５月２日；３７８（３）：４９２〜５０４の下で開示されているｐｒｉ−ｍｉＲ−２１転写産物などのｐｒｉ−ｍｉＲ−２１の任意の公知形態の転写を駆動するものであり得る。ｍｉＲ−２１の転写産物は、当技術分野で公知の方法、例えばＣａｉ等、ＲＮＡ（２００４）１０：１９５７〜１９６６に記載されている、例えばｃＤＮＡ末端の迅速増幅法（ＲＡＣＥ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびプライマー伸長法によって特徴づけることができる。
【０１０８】
公知のまたは同定されたｐｒｉ−ｍｉＲ−２１転写単位の上流、すなわち５’に位置する推定上のプロモーター配列は、適当なプライマーを使用してゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅され、当技術分野で公知の標準的方法を使用して単離および精製され得る。次いで、このような精製されたフラグメントは、レポータータンパク質、例えばホタルルシフェラーゼをコードする異種性核酸配列を含むベクター中に結合され得る。次いで、このようなベクターは細胞内に形質移入され、レポータータンパク質の存在を分析され、それによってテスト配列がレポーター配列の発現を駆動することができるｍＲＮＡプロモーターとして機能しているかどうか示される。プロモーター活性を有する最小の領域を同定するために、並列系において、１つまたは複数のより短いサブフラグメントが同じベクター内に別々にクローニングされ、レポーター配列発現を評価される。推定上のＴＡＴＡボックスなどの短いサブフラグメントならびに種々のテスト配列のアンチセンス配向は、負の対照として働くよう同様にプロセシングされ得る。
【０１０９】
この種の代表的な実験は、本明細書の実施例２に開示されており、それは配列番号１のｍｉＲ−２１プロモーター配列がルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を駆動するが、ＴＡＴＡボックスにのみ相当するｍｉＲ−２１プロモーターの短いフラグメント（配列番号６）は同じレポーター配列の発現を駆動することができないことを示している。
【０１１０】
したがって、本明細書で使用するための代表的なｍｉＲ−２１プロモーター配列は、Ｆｕｊｉｔａ等、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２００８  ５月２日；３７８（３）４９２〜５０４に開示されているｐｒｉ−ｍｉｒ−２１  Ｔ１転写開始点に対して−１３２６〜−６０８ヌクレオチドに相当する配列番号１である。他の実施形態では、ｍｉＲ−２１プロモーター配列は、配列番号１と少なくとも８５％または少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性など、配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有する。特定の実施形態では、ｍｉＲ−２１プロモーター配列は、配列番号１を含む。
【０１１１】
特定の実施形態では、ｍｉＲ−２１プロモーター配列は、真核生物のプロモーター中に典型的に存在する認識配列、特にＴＡＴＡボックスを含む。ｍｉＲ−２１プロモーター配列中に存在し得る他のプロモーターエレメントには、イニシエーター、ＣＣＡＡＴボックスおよびＧＣボックス部位が含まれる。典型的には転写開始点の２５〜３０塩基対上流に位置するＴＡＴＡボックスは、ＲＮＡポリメラーゼにＲＮＡ合成を開始するよう指示するのに関係していると考えられる。他の上流プロモーターエレメントは、転写が開始される速度を決定する。好ましくは、本発明の核酸構造体で利用されるｍｉＲ−２１プロモーター配列は、特定の標的細胞集団中で活性である。本発明の構造体では、ｍｉＲ−２１プロモーター配列を、抗がん剤をコードする天然の遺伝子中で起こるように、抗がん剤をコードする配列に対して、ＴＡＴＡボックスが転写開始点から等距離になるように配置することが好ましい。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−２１プロモーター配列を含む核酸配列は、ｍｉＲ−２１転写産物またはプロセシング産物に相当するまたは相補的な核酸配列を実質的に欠いていてよい。さらに、核酸構造体は、ｍｉＲ−２１の一次転写産物（ｐｒｉ−ｍｉＲ−２１）；ｍｉＲ−２１の前駆体（ｐｒｅ−ｍｉＲ−２１）；ｍｉＲ−２１のＲＮＡ二本鎖、および成熟ｍｉＲ−２１などのｍｉＲ−２１の前駆体または中間体形態に相当するまたは相補的な核酸配列を実質的に欠いていてよい。特定の実施形態では、本発明の核酸構造体は、配列番号２；配列番号３；配列番号４；および配列番号５からなる群から選択される核酸配列に相当するまたは相補的な核酸配列を実質的に欠いている。
【０１１３】
特定の実施形態では、核酸構造体は、配列番号７および配列番号８からなる群から選択される配列を含む。
【０１１４】
本発明の構造体、ベクターおよび核酸配列は、当技術分野で周知の標準的な組換え、酵素的および化学的合成法を使用して産生され得る。このような技術の組み合わせを使用してもよい。単離された核酸配列は、全体（すなわち、完全な）遺伝子またはその部分のいずれかとして、その天然源から得ることができる。所望の核酸分子は、適当なプライマー配列を使用してゲノム鋳型からポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅によって産生され得る。増幅されたフラグメントは、伝播可能な特定のベクター内へのクローンニングおよび／またはさらなる操作および／または特定の核酸配列の発現のために合成制限エンドヌクレアーゼ部位、リンカー等の添加によって操作され得る。このような手順は、特定の異種性核酸配列を並置することによって特徴づけられ、構造体の所望の機能性を可能にする適当な隣接配列を含む単一分子、例えば構造体またはベクターの構築を可能にする。さらに、少なくともいくつかの所望の核酸分子は、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドの会合によって産生され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、２００１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ａｕｓｕｂｅｌ等、ｓｕｐｒａ参照）。例えば、オリゴヌクレオチドの会合によって産生された核酸配列は、ＰＣＲ増幅によって産生された異種性配列に結合され、結果として生じる分子は、当技術分野で周知のように、特定の発現ベクター内へのクローンニングのために合成制限エンドヌクレアーゼ部位、リンカー等の添加によって操作され得る。
【０１１５】
本発明に有用な核酸配列には、それだけに限定されないが、天然の対立遺伝子変異形ならびに抗がん剤をコードするまたはその転写のためのプロモーターとして働くなどの核酸の所期の機能を実質的に妨げないようにヌクレオチドが装入され、欠失され、置換され、および／または反転された修飾核酸配列を含む、天然核酸配列およびその相同体が含まれる。
【０１１６】
本発明に使用されるｍｉＲ−２１プロモーター配列のいずれも、付加、置換または欠失によって変えることができ、がん細胞中で、それと作動可能に連結された配列の発現レベルを分析することができる。同様に、例えばその毒性、標的能力、ｉｎ  ｖｉｖｏ安定性等のレベルなどの任意のいくつかの特性を操作するために、抗がん剤をコードする配列を変えることができる。
【０１１７】
配列変化は、当業者に公知の種々の化学的および酵素的方法を使用して引き起こすことができる。例えば、制限部位によって規定される配列の領域を欠失させることができる。オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発を使用して一定の方法で配列を変えるおよび／または配列内の特定領域に制限部位を導入することができる。さらに、Ｂａｌ３１またはＥｘｏＩＩＩおよびＳ１ヌクレアーゼなどのＤＮＡヌクレアーゼを使用して欠失変異体を生じさせることができる。調節配列中の連続的により大きな欠失は、より長期間ヌクレアーゼとともにＤＮＡをインキュベートすることによって引き起こす（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ等、突然変異誘発技術の概説のために前出、参照）。
【０１１８】
配列多様性は、当技術分野で公知の種々の突然変異誘発スキームによって導入することができる。突然変異を導入するランダムの非特異的方法には、放射線もしくは化学突然変異原への生物全体の曝露またはトランスポゾンの使用などの古典的なｉｎ  ｖｉｖｏ突然変異誘発技術が含まれる。ｉｎ  ｖｉｖｏでの微生物におけるより局所的な突然変異は、細菌の突然変異誘発遺伝子株、形質導入ファージ、エピソームまたは相同的組換えを使用することによって行うことができる。
【０１１９】
突然変異は、欠失解析、リンカー変異、レポーター遺伝子融合、制限／ライゲーションアセンブリー、オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発およびカセット突然変異誘発を含む相同的組換えおよびランダム突然変異誘発に加えて、他の多くの方法によってｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘発することができる。エラープローンＰＣＲおよびアセンブリーＰＣＲ（並列ＰＣＲとしても知られている）などの配列多様性を導入することができるＰＣＲをベースとする方法も利用できる。さらに、上記技術の種々の組み合わせは、性的ＰＣＲ（ＤＮＡシャフリングとしても知られている）、再帰的アンサンブル突然変異誘発および指数アンサンブル突然変異誘発を含む専門的な方法をもたらした。
【０１２０】
相同的組換えは、生細胞中で自然に起こる。真核生物では、相同的組換えは減数分裂時に起こり、固有の進化的機構の１つであると考えられている。いくつかの特許は、ＤＮＡ配列を操作するためのｉｎ  ｖｉｖｏでの相同的組換えの使用を記載している（例えば、米国特許第５０９３２５７号；第５４１３９２３号；第５５２１０７７号；第５２０２２３８号；第５７６３２４０号；および第６０１５７０８号参照）。
【０１２１】
ランダムまたは局所的ランダムｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異誘発の手段は、ｉｎ  ｖｉｖｏ突然変異誘発で使用され得るもの、例えば放射線、化学突然変異原、トランスポゾン突然変異誘発と本質的に類似している。ランダム突然変異誘発法は別として、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで特異的突然変異をもたらすことができる種々の技術のいずれも、部位特異的突然変異誘発の形であると考えることができる（Ｋｅｎｄｒｅｗ，Ｊ．、１９９４、Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ中、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．、ロンドン）。ＰＣＲをベースとしないｉｎ  ｖｉｔｒｏの部位特異的突然変異誘発へのアプローチは、一般的に、オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発、ＤＮＡのフラグメントを再構築する方法（例えば、カセット突然変異誘発、遺伝子アセンブリー）および局所的ランダム突然変異誘発（ＢｏｔｓｔｅｉｎおよびＳｈｏｒｔｌｅ、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ２２９、１１９３  １２０１）のカテゴリーに分類することができる。
【０１２２】
オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発は、所望の突然変異をコードするオリゴヌクレオチドが、対象のＤＮＡの一本鎖とアニールし、ＤＮＡ合成の開始のためのプライマーとして働いて、突然変異を含む鎖を産生するという原理に基づく。単一のまたは複数の、置換、挿入または欠失を含む種々の形の基本的技術は、Ｋｒａｍｅｒ等、１９８２、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０：６４７５  ６４８５；ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ、１９８２、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０：６４８７  ６５００；Ｓｍｉｔｈ等、１９８２、「Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．、７：４４０  ４４２；およびＮｏｒｒｉｓ等、１９８３、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１１：５１０３  ５１１２によって記載されている。
【０１２３】
カセット突然変異誘発は、典型的には制限／ライゲーションによる、通常は合成ヌクレオチドである「カセット」による内在性遺伝子の一部の置換によって特徴づけられる（例えば、Ｅｓｔｅｌｌ等、１９８５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０（１１）：６５１８  ６５２１；Ｗｅｌｌｓ等、１９８５、Ｇｅｎｅ  ３４：３１５  ３２３；Ｂｅｃｋ  ｖｏｎ  Ｂｏｄｍａｎ等、１９８６、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．８３：９４４３  ９４４７；Ｒｅｉｄｈａａｒ−ＯｌｓｏｎおよびＳａｕｅｒ、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：５３  ５７；米国特許第４９８４３３１号；第５１５５０３３号；および第５１８２２０４号参照）。
【０１２４】
遺伝子アセンブリーは、合成オリゴマーおよび断片化天然配列の混合物であり得るオリゴヌクレオチドの使用を必要とする。ＤＮＡリガーゼによる処理によるオリゴヌクレオチドプールの確率的重合は、新規のポリヌクレオチド配列のアセンブリーをもたらす（例えば、米国特許第５７２３３２３号参照）。
【０１２５】
エラープローンＰＣＲは、低い忠実度を示すＤＮＡポリメラーゼを使用する結果としてＰＣＲ産物中に数点の突然変異をランダムに導入する手段である（例えば、Ｌｅｕｎｇ等、１９８９、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  １：１１  １５、１９８９；米国特許第５２２３４０８号参照）。
【０１２６】
アセンブリーＰＣＲは、オリゴヌクレオチドのプールを使用した、多くの異なるＰＣＲ反応が同じ反応混合物中で並列に起こり、あるＰＣＲ反応の産物が別の反応の産物を刺激する過程を指す（Ｓｔｅｍｍｅｒ等、１９９５、Ｇｅｎｅ  １６４：４９〜５３）。この方法は、アセンブリー過程中にますますより長いＤＮＡフラグメントを構築するために、ＤＮＡリガーゼよりもむしろＤＮＡポリメラーゼに依存する（例えば、米国特許第５６０５７９３号および第５８３０６９６号参照）。
【０１２７】
ＤＮＡシャフリングとも呼ばれる性的ＰＣＲでは、関連するが同一ではないＤＮＡ配列がランダムに断片化され、その後、フラグメントは、相同的組換えを可能にする条件下でアセンブリーＰＣＲによって再構成される（Ｓｔｅｍｍｅｒ、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ  ３７０：３８９  ３９１）。繰り返されるサイクルの点突然変異、組換えおよび選択は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分子進化を生み出す。この過程は、所望の特性または機能を得るために必要とされるだけのサイクルで繰り返される（Ｓｔｅｍｍｅｒ、１９９４、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．９１：１０７４７  １０７５１）。
【０１２８】
再帰的アンサンブル突然変異誘発（「ＲＥＭ」）は、所与のタンパク質中の標的位置の「最適な」アミノ酸を同定するために複数サイクルのカセット突然変異誘発を使用するタンパク質工学法である。ＲＥＭは、配列空間をより効率的に探すために組み合わせのカセット突然変異誘発の以前の反復から得られた情報を使用する。複数ラウンドの最適化された点突然変異および組換えを通して、ＤＮＡ配列の急速な進化が達成される（ＡｒｋｉｎおよびＹｏｕｖａｎ、１９９２、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．８９：７８１１  ７８１５；Ｄｅｌａｇｒａｖｅ等、１９９３、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ６：３２７  ３３１）。
【０１２９】
指数アンサンブル突然変異誘発では、機能的タンパク質をもたらす各々変更された位置にあるアミノ酸を同定するために、いくつかのヌクレオチドが並列にランダム化される。それによって本方法は高い割合の最適化タンパク質を有する組み合わせライブラリーを産生する。多くの残基を同時に変えることが望ましい場合に指数アンサンブル突然変異誘発は有利となり得る。この方法によって得られる機能的突然変異体の頻度はより高いので、タンパク質全体は組み合わせ的に突然変異誘発され得る（ＤｅｌａｇｒａｖｅおよびＹｏｕｖａｎ、１９９３、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：１５４８  １５５２；米国特許第５５２１０７７号）。
【０１３０】
本明細書で開示されているものを含む、配列多様性を導入するための当技術分野で公知の任意の技術の使用によって作り出される変更配列は、適当な宿主細胞、特にｍｉＲ−２１発現がん由来細胞、例えば膵臓癌細胞中の異種性ポリヌクレオチドの発現を指示する能力を評価される。組換え発現ベクターを作り出すために腫瘍特異的発現を指示することができる任意の変更ｍｉＲ−２１プロモーター配列を使用することは本発明の範囲内である。
【０１３１】
核酸分子を調製するのに適した合成法には、例えば、オリゴヌクレオチドのアセンブリー（例えば、米国特許第５５８３０１３号参照）、あるいはリン酸トリエステル、亜リン酸エステルもしくはホスホライミダイト化学およびＥＰ２６６０３２に記載のものなどの固相技術を使用した、またはデオキシヌクレオシドＨ−ホスホナート中間体を経由したｉｎ  ｖｉｔｒｏ化学合成（例えば、米国特許第５７０５６２９号参照）が含まれる。本発明では、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドを使用して種々の核酸分子を調製することができる。オリゴヌクレオチド合成の種々の異なる機構は、例えば、米国特許第４６５９７７４号；第４８１６５７１号；第５１４１８１３号；第５２６４５６６号；第４９５９４６３号；第５４２８１４８号；第５５５４７４４号；第５５７４１４６号および第５６０２２４４号に開示されてきた。
【０１３２】
抗がん剤をコードするヌクレオチド配列は、以下でさらに記載するように、それだけに限定されないが、毒性遺伝子産物、細胞増殖抑制性遺伝子産物、ウイルス複製に不可欠な遺伝子産物をコードする遺伝子、薬物代謝酵素をコードする遺伝子およびアポトーシス誘導剤をコードする遺伝子などの多種多様なタンパク質をコードするものから選択することができる。
【０１３３】
本発明の構造体は、抗がん剤をコードするものに加えて、追加の異種性タンパク質コード配列をさらに含んでもよい。これらの配列は、それだけに限定されないが、酵素または抗原マーカーなどのクローニング、伝播、操作、細胞導入等の過程で所望の構造体によって形質転換された細胞の選択または検出に有用なマーカーをコードしてもよい。しかしながら、本発明は、当技術分野で公知であるように、ルシフェラーゼなどのレポータータンパク質をコードする核酸配列と作動可能に連結されたｍｉＲ−２１プロモーター配列を含む構造体を特異的に除外することが明確に理解されるべきである。
【０１３４】
本発明は、がん細胞を標的にする異種性ポリヌクレオチドの細胞特異的発現に関するが、本発明のベクターのがん特異的送達を使用することによって治療のより高い特異性を達成することができる。例えば、がん細胞に独特の細胞表面抗原を認識する、または正常細胞と比較してがん細胞でより優勢の抗体は、当技術分野で公知であり、腫瘍細胞を特異的に標的にし、死滅させるために本発明のベクターと共に使用することができる（例えば、Ｄｉｌｌｍａｎ、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ」Ｏｌｄｈａｍ（編）、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．、ニューヨーク、１９８７参照）。したがって、本発明による構造体は、抗がん剤を標的がん細胞に向けるよう働くことができる抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸配列を含んでもよい。特定の実施形態では、構造体は、融合タンパク質、すなわち、あるセグメントが抗がん剤であり、他のセグメントががん特異的マーカーもしくはがん関連タンパク質に特異的な抗体または抗体フラグメントである異種性タンパク質セグメントを含む単一タンパク質をコードする。
【０１３５】
本発明の核酸構造体は、ベクター、特に真核生物の発現ベクターに含まれ得る。特定の実施形態では、本発明に有用なベクターは、配列番号９または配列番号１０の核酸配列を有し得る。
【０１３６】
「ベクター」という用語は、複製され得る細胞中へ導入するために核酸配列または構造体を挿入することができる担体核酸分子を指すのに使用される。核酸配列は、「外来性」であることができ、これは核酸配列がベクターが導入される細胞に対して外来性であること、または核酸配列が細胞内の配列と相同性であるが、その配列が通常見つからない宿主細胞核酸内の位置にあることを意味する。ベクターには、プラスミド、コスミド、ウイルス（バクテリオファージ、動物ウイルスおよび植物ウイルス）、および人工染色体（例えば、ＹＡＣｓ）が含まれる。本発明のベクターは、ベクターを、特定の種類の宿主細胞、例えば原核生物または真核生物中での複製および組み込みに適したものにする配列を含んでもよく、２種以上の種類の宿主中で伝播することができるもの、例えば原核生物および真核生物の両方の中で伝播することができるシャトルベクターであってもよい。
【０１３７】
細菌細胞（例えば、大腸菌）中での対象ポリヌクレオチドの培養に適したベクターには、それだけに限定されないが、以下の種類のプラスミドが含まれる：ｐＢＲ３２２由来プラスミド、ｐＥＭＢＬ由来プラスミド、ｐＥＸ由来プラスミド、ｐＢＴａｃ由来プラスミドおよびｐＵＣ由来プラスミド。酵母中での複製については、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに遺伝子構造体を導入するのに有用なクローニングおよび発現媒体には、それだけに限定されないが、ＹＥＰ２４、ＹＩＰ５、ＹＥＰ５１、ｐＹＥＳ２およびＹＲＰ１７プラスミドが含まれる（例えば、Ｂｒｏａｃｈ等、１９９３、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ中、Ｍ．Ｉｎｏｕｙｅ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、８３ページ参照）。これらのベクターは、大腸菌中ではｐＢＲ３２２複製開始点の存在のために、酵母中では酵母２μｍ環状プラスミドの複製決定因子のために複製することができる。さらに、アンピシリンなどの薬剤耐性マーカーを使用することができる。
【０１３８】
同様に、本発明のポリヌクレオチドのための哺乳類ベクターは、細菌中でのベクターの伝播を促進するための原核生物の配列を含んでもよい。このようなベクターは、哺乳類細胞へ形質移入される場合に、連鎖性の選択可能なマーカー遺伝子を使用して長期安定性のために哺乳類染色体に組み込むよう設計することができる。あるいは、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ−１）またはエプスタイン−バーウイルスなどのウイルスの誘導体を一過性発現のために使用することができる。
【０１３９】
「発現ベクター」という用語は、転写され得る遺伝子産物の少なくとも一部をコードする核酸配列を含むベクターを指す。発現ベクターは、特に宿主生物中の作動可能に連結されたコード配列の転写および翻訳に必要な核酸配列を指す、種々の「調節配列」を含むことができる。転写および翻訳を支配する調節配列に加えて、ベクターおよび発現ベクターは、他の機能も果たす核酸配列を含んでもよい。
【０１４０】
発現ベクター中に典型的に見られる調節配列には、転写および翻訳開始配列、転写および翻訳終結配列、ならびにポリアデニル化シグナルが含まれる。
【０１４１】
エンハンサーエレメントは、連結した相同性または非相同性プロモーターから１０００倍まで転写を増大させることができる。エンハンサーは、転写開始点から下流または上流に置かれた場合に活性である。ウイルスに由来する多くのエンハンサーエレメントは、広範な宿主範囲を有し、種々の組織中で活性である。例えば、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサーは、多くの細胞型に適している。本発明に適した他のエンハンサー／プロモーターの組み合わせには、ポリオーマウイルス、ヒトまたはマウスサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、マウス白血病ウイルス、マウスまたはラウス肉腫ウイルスおよびＨＩＶなどの種々のレトロウイルスからの長期反復に由来するものが含まれる。Ｅｎｈａｎｃｅｒｓ  ａｎｄ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．１９８３を参照されたい。
【０１４２】
発現ベクターの構築において、プロモーターは、好ましくは、その自然状態の転写開始点からの距離とほぼ同じ非相同性転写開始点からの距離に位置する。しかしながら、当技術分野で公知のように、プロモーター機能の喪失なしにこの距離のいくらかの変動が許容され得る。
【０１４３】
ＲＮＡ安定性を高めるために、発現ベクターにポリアデニル化配列を付加することもできる。正確で効率的なポリアデニル化のためには、２つの異なる配列エレメントが必要とされる：ポリアデニル化部位から下流に位置するＧＵまたはＵリッチ配列、および１１〜３０ヌクレオチド上流に位置する６ヌクレオチド、ＡＡＵＡＡＡの高度保存配列である。本発明に適した代表的な終結配列およびポリアデニル化シグナルには、ＳＶ４０に由来するものが含まれる。
【０１４４】
本発明によるｍｉＲ−２１プロモーター配列は、上述のエレメントの少なくともいくつかを含んでもよいが、ｍｉＲ−２１プロモーター配列を含む構造体またはベクターは追加の種類のこのようなエレメントを含んでもよいことが理解されるべきである。すでに記載したエレメントに加えて、本発明の発現ベクターは、典型的には、クローン化核酸の発現レベルを増加させる、または組換えＤＮＡを運ぶ細胞の同定を容易にすることを意図した他の専門化されたエレメントを含んでもよい。例えば、いくつかの動物ウイルスは、許容細胞型中でウイルスゲノムの染色体外複製を促進するＤＮＡ配列を含む。これらのウイルスレプリコンを有するプラスミドは、適当な因子が、プラスミド上に運ばれる遺伝子または宿主細胞のゲノムを伴う遺伝子によって提供される限り、エピソーム的に複製される。
【０１４５】
本発明の特定の実施形態では、発現ベクターは、ウイルスまたはウイルスゲノムに由来する設計されたベクターを含む。特定のウイルスが受容体媒介エンドサイトーシスを介して細胞へ入り、宿主細胞ゲノム中に組み込み、ウイルス遺伝子を安定的かつ効率的に発現する能力は、そのウイルスを、外来性遺伝子を哺乳類細胞中へ移すための魅力的な候補にした（例えば、ＮｉｃｏｌａｓおよびＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１９８８；１０：４９３〜５１３；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．１９８８  ５月；２（５）：４６１〜７；ＧｅｌｉｎａｓおよびＴｅｍｉｎ  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９８６  １２月；８３（２３）：９２１１〜５；Ｃｏｕｐａｒ等、Ｇｅｎｅ．１９８８  ８月１５日；６８（１）１〜１０参照）。核酸構造体は、それだけに限定されないが、パポーバウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルスまたはヘルペスウイルスなどのウイルスベクター中に挿入することができる（概説については、例えばＶｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＫａｐｌｉｔｔおよびＬｏｅｗｙ（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（１９９５）参照）。
【０１４６】
ウイルスおよびウイルスベースのベクターの感染スペクトルは、ウイルス粒子上のウイルスパッケージングタンパク質を修飾することによって制限することができる（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９３／２５２３４およびＷＯ９４／０６９２０参照）。レトロウイルスベクターの感染スペクトルを修正するための戦略には、それだけに限定されないが、細胞表面抗原に特異的な抗体をウイルスｅｎｖタンパク質に結合させる（Ｒｏｕｘ等、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：９０７９  ９０８３；Ｊｕｌａｎ等、１９９２、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．ｕ３：３２５１  ３２５５；Ｇｏｕｄ等、１９８３、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １６３：２５１  ２５４）または細胞表面受容体リガンドをウイルスｅｎｖタンパク質に結合させる（Ｎｅｄａ等、１９９１、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２６６：１４１４３  １４１４６）ことが含まれる。結合は、タンパク質または他の化合物との化学的架橋の形（例えば、ｅｎｖタンパク質をアシアロ糖タンパク質に転換するラクトース）、または融合タンパク質の形（例えば、一本鎖抗体／ｅｎｖ融合タンパク質）をとることができる。したがって、がん細胞は、例えば、腫瘍関連分子に向けられた結合抗体を使用することによって、またはがん細胞表面タンパク質を使用することによって、組換えウイルスの表面に向けることができる。このような技術は、特定の組織型への感染を制限する、または指示するのに有用であるが、狭宿主性（ｅｃｏｔｒｏｐｉｃ）ベクターを広宿主性ベクターに転換するのに使用することもできる。
【０１４７】
特定の実施形態では、本発明においてアデノウイルス由来ベクターを使用してもよい。アデノウイルスのゲノムは、対象の遺伝子産物をコードし発現するように操作することができるが、正常な溶解性ウイルス生活環におけるその複製能力に関して不活性化される（例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒ等、１９８８、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６１６；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ等、１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：４３１  ４３４；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ等、１９９２、Ｃｅｌｌ  ６８：１４３  １５５参照）。アデノウイルス株ＡＤ５型ｄ１３２４またはアデノウイルスの他の株（例えば、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７等）に由来する適当なアデノウイルスベクターは当業者に周知である。
【０１４８】
組換えアデノウイルスは、気道上皮（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ等、１９９２、Ｃｅｌｌ  ６８：１４３  １５５）、内皮細胞（Ｌｅｍａｒｃｈａｎｄ等、１９９２、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．８９：６４８２  ６４８６）、肝細胞（ＨｅｒｚおよびＧｅｒａｒｄ、１９９３、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．９０：２８１２  ２８１６）および筋細胞（Ｑｕａｎｔｉｎ等、１９９２、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．８９：２５８１  ２５８４）を含む多種多様な細胞型に感染するのに使用することができる特定の環境で有利となり得る。さらに、ウイルス粒子は、比較的安定で、精製および濃縮を受けることができ、感染力のスペクトルに影響を及ぼすよう修飾することができる。
【０１４９】
さらに、導入されたアデノウイルスＤＮＡ（およびその中に含まれる外来性ＤＮＡ）は、一般的に宿主細胞のゲノム中に組み込まれないが、エピソームのままであり、それによって導入されるＤＮＡ（例えば、レトロウイルスＤＮＡ）が宿主ゲノムに組み込まれる際に生じる可能性のある問題（例えば、挿入突然変異誘発）を避ける。
【０１５０】
その上、アデノウイルスゲノムの外来性ＤＮＡを送達する能力は、他の遺伝子送達ベクターと比べて大きい（８キロベースまで）（Ｂｅｒｋｎｅｒ等、１９８８、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６１６；Ｈａｊ−ＡｈｍａｎｄおよびＧｒａｈａｍ、１９８６、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７：２６７）。本発明の方法に有用な複製欠損アデノウイルスベクターは、ウイルスＥ１およびＥ３遺伝子の全部または一部が欠失しているが、アデノウイルス遺伝物質の８０％程度を保持している（例えば、Ｊｏｎｅｓ等、１９７９、Ｃｅｌｌ  １６：６８３；Ｂｅｒｋｎｅｒ等、上記；Ｇｒａｈａｍ等  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ中、第７巻、Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ（編）、Ｈｕｍａｎａ、Ｃｌｉｆｔｏｎ  Ｎ．Ｊ．（１９９１）ｐｐ．１０９〜１２７参照）。
【０１５１】
本発明にしたがって、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を使用することもできる（例えば、Ｗａｌｓｈ等、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２０４：２８９〜３００；米国特許第５４３６１４６号参照）。アデノ随伴ウイルスは、効率的な複製および増殖的生活環のためのヘルパーウイルスとしてのアデノウイルスまたはヘルペスウイルスなどの他のウイルスを必要とする天然起源の欠損ウイルスである（例えば、Ｍｕｚｙｃｚｋａ等、１９９２、Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７〜１２９参照）。また、ＡＡＶは、そのＤＮＡを非分裂細胞に組み込むことができるわずかなウイルスのうちの１つであり、高頻度の安定な組み込みを示す（例えば、Ｆｌｏｔｔｅ等、１９９２、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．７：３４９  ３５４；Ｓａｍｕｌｓｋｉ等、１９８９、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２  ３８２８；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ等、１９８９、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：１９６３  １９７３参照）。
【０１５２】
ＡＡＶのわずか３００塩基対を含むベクターは、パッケージされ、組み込むことができる。外来性ＤＮＡを挿入する能力は、約４．５ｋｂに制限される。ＤＮＡを細胞に導入するために、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ等（１９８５、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１〜３２６０）に記載のもののようなＡＡＶベクターを使用することができる。ＡＡＶベクターを使用して、種々の核酸が異なる細胞型に導入されてきた（例えば、Ｈｅｒｍｏｎａｔ等、１９８４、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．８１：６４６６〜６４７０；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ等、１９８５、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２〜２０８１；Ｗｏｎｄｉｓｆｏｒｄ等、１９８８、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２：３２  ３９；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ等、１９８４、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１：６１１〜６１９；Ｆｌｏｔｔｅ等、１９９３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：３７８１〜３７９０参照）。
【０１５３】
本発明の構造体のためのベクターバックボーンとして働くことができる哺乳類発現ベクターには、それだけに限定されないが、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）から入手可能なｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／−）、ρＧＬ３、ｐＺｅｏＳＶ２（＋／−）、ｐＳｅｃＴａｇ２、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＳｉｎＲｅｐ５、ＤＨ２６Ｓ、ＤＨＢＢ、ｐＮＭＴ１、ｐＮＭＴ４１およびｐＮＭＴ８１；Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標）から入手可能なｐＣＩ；Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ（登録商標）から入手可能なｐＭｂａｃ、ｐＰｂａｃ、ｐＢＫ−ＲＳＶおよびｐＢＫ−ＣＭＶ；ならびにＣｌｏｎｔｅｃｈ（登録商標）から入手可能なｐＴＲＥＳが含まれる。
【０１５４】
他の代表的なベクターには、ｐＳＶＴ７およびｐＭＴ２（ＳＶ４０由来）；ｐＢＶ−１ＭＴＨＡ（ウシパピローマウイルス由来）；ｐＨＥＢＯおよびｐ２Ｏ５（エプスタイン−バーウイルス由来）；ｐＭＳＧ；ｐＡＶ００９／Ａ＋；ｐＭＴＯ１０／Ａ＋；ｐＭＡＭｎｅｏ−５、ならびにバキュロウイルスｐＤＳＶＥが含まれる。
【０１５５】
本発明のベクターを形質移入される宿主細胞は、任意の原核生物または真核生物細胞とすることができる。ベクターを、真核生物（例えば、酵母、鳥類、昆虫または哺乳類）または原核生物（例えば、細菌細胞）のいずれかの宿主細胞へ形質転換する、または形質移入することは、微生物または組織培養技術で広く使用される標準的手順である。
【０１５６】
本発明による抗がん剤の発現をもたらすための核酸送達に適した方法には、本明細書に記載の、または当業者に公知の、核酸（例えば、ウイルスおよび非ウイルスベクターを含むＤＮＡ）を細胞小器官、細胞、組織または生物中に導入することができる事実上いずれの方法も含まれる。このような方法には、それだけに限定されないが、マイクロインジェクション（米国特許第５７８９２１５号）を含む注入（例えば、米国特許第５９９４６２４号、第５９８１２７４号、第５９４５１００号、第５７８０４４８号、第５７３６５２４号、第５７０２９３２号、第５６５６６１０号、第５５８９４６６号および第５５８０８５９号参照）；エレクトロポレーション（米国特許第５３８４２５３号）；リン酸カルシウム沈殿（ＣｈｅｎおよびＯｋａｙａｍａ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、７（８）：２７４５〜２７５２、１９８７）；ＤＥＡＥ−デキストラン、引き続いてポリエチレングリコールの使用（Ｇｏｐａｌ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、５：１１８８〜１１９０、１９８５）；直接音波負荷（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４：８４６３〜８４６７、１９８７）；リポソーム媒介性形質移入（ＮｉｃｏｌａｕおよびＳｅｎｅ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、７２１：１８５〜１９０、１９８２；Ｋａｎｅｄａ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４３：３７５〜３７８、１９８９；Ｋａｔｏ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６：３３６１〜３３６４、１９９１）；微粒子銃（ＰＣＴ出願第ＷＯ９４／０９６９９および第９５／０６１２８；米国特許第５６１００４２号；第５３２２７８３号  第５５６３０５５号  第５５５０３１８号  第５５３８８７７号および第５５３８８８０号）；炭化ケイ素繊維による攪拌（米国特許第５３０２５２３号および第５４６４７６５号）；アグロバクテリウム媒介性形質転換（米国特許第５５９１６１６号および第５５６３０５５号）；またはプロトプラストのＰＥＧ媒介性形質転換（米国特許第４６８４６１１号および第４９５２５００号）；乾燥／抑制媒介性ＤＮＡ取込（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ等、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、１９９（２）：１６９〜７７、１９８５）などのＤＮＡの直接送達が含まれる。これらのような技術の適用を通して、細胞小器官、細胞、組織または生物は、安定的に、または一過性で形質転換され得る。
抗がん剤をコードする核酸配列
【０１５７】
抗がん剤をコードする核酸配列は、それだけに限定されないが、細胞毒性遺伝子産物、細胞増殖抑制性遺伝子産物、ウイルス複製タンパク質、薬物代謝酵素およびアポトーシス誘導剤などの多種多様なタンパク質をコードするものから選択することができる。
【０１５８】
抗がん剤は、細菌毒素、植物毒素または真菌毒素などの毒素であってよく、全長タンパク質であってよいが、より好ましくは天然起源の毒素の細胞毒性フラグメントである。代表的な細菌毒素には、それだけに限定されないが、ジフテリア毒素Ａフラグメント（ＤＴ−Ａ）などのジフテリア毒素、緑膿菌外毒素（ＰＥ）、コレラ毒素、炭疽毒素、ボツリヌス毒素、百日咳毒素、大腸菌エンテロトキシンおよび志賀毒素が含まれる。代表的な植物毒素には、それだけに限定されないが、リシン、モデシン、アブリン、ボルケンシンおよびビスキュミンが含まれる。真菌毒素の例としては、α−サルシン（例えば、Ｎａｇａｎｏ等、Ｊ  Ａｎｔｉｂｉｏｔ（東京）．１９９６  １月；４９（１）：８１〜５参照）；レストリクトシン（例えば、Ｒａｔｈｏｒｅ等  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ２  Ｓｅｐｔ  １９９６、３９２（３）：２５９〜２６２参照）；ミトギリン（例えば、Ｂｅｔｔｅｒ等、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ８月１５日；１９９２  ２６７、１６７１２〜１６７１８参照）；エノマイシン（例えば、Ｔａｋｅｕｃｈｉ等、Ｊ  Ａｎｔｉｂｉｏｔ（東京）．１９９７  １月；５０（１）：２７〜３１参照）；真菌リボトキシン、例えばＲＮアーゼＴ１（概説については、例えばＬａｃａｄｅｎａ等、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．２００７  ３月；３１（２）：２１２〜３７参照）およびフェノマイシン（例えば、Ｓａｋａｔａ等、Ｊ  Ａｎｔｉｂｉｏｔ（東京）．１９９４  ３月；４７（３）：３７０〜１参照）が挙げられる。
【０１５９】
本発明で使用するための毒素は、例えば、米国特許第７３７５１８６号に開示されている、リシン様タンパク質のＡ鎖であってもよい。
【０１６０】
本発明で使用するためのジフテリア毒素は、ジフテリア菌によって分泌される全長５３５アミノ酸ポリペプチドに相当してもよく、またはその細胞毒性フラグメント、特にＮ末端触媒ドメインを含むＡフラグメントであってもよい（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ａ０４６４６およびＡＹ８２０１３２；Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ等、１９８３  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：６８５３〜６８５７；Ｔｗｅｔｅｎ等、１９８３  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５６：６８０〜６８５；Ｋａｃｚｏｒｅｋ等、１９８３  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２１：８５５〜８５８；Ｌｅｏｎｇ等、１９８３  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２０：５１５〜５１７参照）。
【０１６１】
本明細書の実施例３および４は、ｍｉＲ−２１プロモーター配列と作動可能に連結されたジフテリア毒素Ａフラグメントをコードする核酸配列を含む構造体、ならびにｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでのがん細胞に対するその細胞毒性効果を開示している。
【０１６２】
特定の実施形態では、ジフテリア毒素をコードする核酸配列は、配列番号１８を含む。特定の実施形態では、構造体は、配列番号１９のアミノ酸配列を含むジフテリア毒素をコードしている。
【０１６３】
他の実施形態では、例えば、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）によって分泌される６１３アミノ酸の全長タンパク質に相当する、またはドメインＩＩＩ、すなわちアミノ酸残基４００〜６１３に相当する細胞毒性フラグメントなどのその細胞毒性フラグメントをコードするものなど、緑膿菌外毒素（ＰＥ）をコードする核酸配列が本発明で使用され得る（例えば、米国特許第５６０２０９５号；Ｓｉｅｇａｌｌ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１４２５６〜１４２６１、１９８９参照）。本発明の構造体によってコードされ、発現され得るＰＥの他の形態には、例えば、配列番号２１として本明細書に開示されているＰＥ３８（例えば、米国特許第５６０８０３９号およびＰａｓｔａｎ等、１９９７、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １３３３：Ｃ１〜Ｃ６参照）；配列番号２２として本明細書に開示されているＰＥ３８  ＫＤＥＬ（例えば、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ等  １９９１、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８：８６１６〜８６２１参照）；配列番号２３として本明細書に開示されているＰＥ３７（例えば、米国特許第５６０２０９５号参照）；および配列番号２４として本明細書に開示されているＰＥ４０（例えば、米国特許第６０５１４０５号参照）が含まれる。
【０１６４】
本発明は、プロドラッグを細胞毒性産物に転換する薬物代謝酵素をコードする核酸の使用をさらに含む。
【０１６５】
特定の実施形態では、薬物転換酵素はチミジンキナーゼ（例えば、単純ヘルペスウイルスまたは水痘帯状疱疹ウイルス由来）であり、これはガンシクロビル（２−アミノ−９−｛［（１，３−ジヒドロキシプロパン−２−イル）オキシ］メチル｝−６，９−ジヒドロ−３Ｈ−プリン−６−オン）のプロドラッグ型を、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）類似体であるその活性リン酸化型に転換する能力を有する。この類似体は、ｄＧＴＰの細胞内ＤＮＡへの取り込みを競合的に阻害し、細胞死をもたらす。
【０１６６】
プロドラッグを細胞毒性産物に転換する薬物代謝酵素には、それだけに限定されないが、チミジンキナーゼ（例えば、単純ヘルペスウイルスまたは水痘帯状疱疹ウイルス由来）、シトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、チトクロムｐ−４５０  ２Ｂ１、チミジンホスホリラーゼ、大腸菌グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、アルカリホスファターゼ、カルボキシペプチダーゼＡおよびＧ２、リナマラーゼ、ベータラクタマーゼ、キサンチンオキシダーゼならびにその変異形が含まれる（例えば、Ｐａｎｄｈａ等、１９９９、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．１７：２１８０  ２１８９；ＲｉｇｇおよびＳｉｋｏｒａ、１９９７、Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  Ｔｏｄａｙ．３：３５９  ３６６参照）。
【０１６７】
抗がん剤は、さらに、ＰＵＭＡ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ３５４６５４参照）；ＢＡＸ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＹ２１７０３６参照）；ＢＡＫ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＲ＿０２７８８２参照）；ＢｃＩ−ＸＳ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００１１９１参照）；ＢＡＤ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＢＣＯ０１９０１参照）；ＢＩＭ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＢＣ０３３６９４参照）；ＢＩＫ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ３４５８４参照）；ＢＩＤ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＢＣ０３６３６４参照）；ＨＲＫ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＨＳＵ７６３７６参照）；Ａｄ  Ｅ１Ｂ；ＩＣＥ−ＣＥＤ３プロテアーゼ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００１０８０１２４およびＮＰ＿００１０７３５９３参照）；ＴＲＡＩＬ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００３８１０およびＮＰ＿００３８０１参照）；ＳＡＲＰ−２（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００３０１２およびＮＰ＿００３００３参照）；およびアポプチン（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０１２２３４およびＮＰ＿０３６３６６参照）などのアポトーシス誘導剤であってもよい。
【０１６８】
このようなアポトーシス誘導剤をコードする核酸配列を調製するのに有用なオリゴヌクレオチド配列は、例えば、米国特許出願公開第２００９／０２９８０７１号に開示されている。
【０１６９】
本明細書の実施例３および４は、抗がん治療に使用するための、ＰＵＭＡをコードする配列を含む構造体およびベクターの構築および使用を開示している。
【０１７０】
細胞成長および増殖を抑制する細胞増殖抑制剤をコードするポリヌクレオチドは本発明に有用である。これらには、それだけに限定されないが、ｐ２１（Ｗａｆ１）、ｐ２７（Ｋｉｐ１）、ｐ５３、ｐ５３１７５Ｐ、ｐ５７（Ｋｉｐ２）、ｐ１５（ＩＮＫ４ｂ）、ｐ１６（ＩＮＫ４ａ）、ｐ１８（ＩＮＫ４ｃ）、ｐ１９（Ａｒｆ）、ｐ７３、ＧＡＤＤ４５、ＡＰＣ１、ｐ７３ＲＢ１、ＷＴ１、ＮＦ１、ＶＨＬおよびこれらの変異形が含まれる（例えば、Ｋｏｇａ等、Ｈｅｐａｔｐｌｏｇｙ．３３：１０８７  １０９７；Ｈｕａｎｇ等、２００１、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１：３３７３  ３３８１；Ｌｉ等、２００１、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１：１４９３  １４９９；Ｍａｚｕｒ等、１９９８、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ．１４：７０５  ７１３；Ｔｓｕｇｕ等、２０００、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．１５７：９１９  ９３２；Ｄｙｅｒ等、２００１、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２１：４２５９  ４５７１；Ｋｏｖａｌｅｖ等、２００１、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：３２８５  ３２９２；Ｍｏｄｅｓｉｔｔ等、２００１、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７：１７６５  １７７２；Ｗｏｎｇ等、２００１、Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．１９４：３５  ４２；Ｓｈａｐｉｒｏ等、２０００、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．３３：１８９  １９７；Ｆｕｘｅ等、２０００、Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．１１：３７３  ３８４；Ｌａｔｒｅｓ等、２０００、ＥＭＢＯ  Ｊ．１９：３４９６  ３５０６；Ｗｅｂｅｒ等、２０００、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１４：２３５８  ２３６５；Ｓａｓａｋｉ等、２００１、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８：１４０１  １４０８；Ｚｈｕ等、１９９８、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：５０６１  ５０６５；Ｍｕｌｌａｎ等、２００１、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２０：６１２３  ６１３１；Ｖｅｌａｓｃｏ−Ｍｉｇｕｅｌ等、１９９９、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．１８：１２７  １３７；Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ等、２００１、Ｇｅｎｅ．２６２：５１  ５９；ＫｕｒａｓａｗａおよびＴｏｄｏｋｏｒｏ、１９９９、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １８：５１３１  ５１３７；Ｂａｓｕ等、１９９９、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ．１５：７０１  ７０８；Ｙａｍａｇａｍｉ等、１９９８、Ｌｅｕｋ  Ｒｅｓ．２２：３８３  ３８４；Ｍｕｒａｔａ等、１９９７、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４０９：４１  ４５；Ｕｈｌｍａｎｎ等、２００１、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．３４：６１  ７８；Ｚｈａｎｇ等、１９９８、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１８７：１８９３  １９０２；Ｎｏｒｔｏｎ等、１９９６、Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ．７：６０１  ６０４；Ｂａｂａ等、２００１、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２０：２７２７  ２７３６；Ｄａｖｉｄｏｗｉｔｚ等、２００１、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２１：８６５  ８７４参照）。
医薬組成物、製剤形態および投与様式
【０１７１】
本発明の核酸構造体およびベクターは、単独でまたは医薬組成物の形態で、被験体に投与され得る。医薬組成物は、核酸の薬学的に使用することができる製剤へのプロセシングを促進する１つまたは複数の生理学的に許容される担体、賦形剤、添加剤または助剤を使用して従来の方法で製剤化され得る。適当な製剤形態は、選択される投与経路に依存する。
【０１７２】
全身性製剤には、注射、例えば、皮下、静脈内、筋肉内、髄腔内または腹腔内注射による投与用に設計されたもの、ならびに経皮、経粘膜、吸入、経口または肺内投与用に設計されたものが含まれる。注射のためには、本発明の核酸は、水溶液、好ましくはハンクス液、リンガー液または生理食塩水緩衝液などの生理学的に適合性の緩衝液に製剤化され得る。この溶液は、懸濁剤、安定剤および／または分散剤などの製剤化剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ  ａｇｅｎｔ）を含んでもよい。あるいは、核酸分子は、使用前には、適当な媒体、例えば滅菌発熱性物質除去蒸留水による再構成のために散剤形態であってもよい。経粘膜投与のためには、製剤中に、透過すべきバリアに適した浸透剤が使用される。吸入による投与のためには、本発明による使用のための分子は、適当な噴霧剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適当なガスを使用することによって、加圧パックまたは噴霧器からエアロゾルスプレーの形態で好都合に送達される。加圧エアロゾルの場合、投与量単位は、計量された量を送達するためのバルブを与えることによって決定され得る。吸入器または注入器で使用するためのゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、核酸とラクトースまたはデンプンなどの適当な粉末基剤の粉末混合物を含んで製剤化してもよい。核酸分子は、例えば、カカオ脂もしくは他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を含む坐剤または停留浣腸などの、直腸または膣組成物に製剤化してもよい。経口投与のためには、核酸は、核酸分子と当技術分野で周知の薬学的に許容される担体を結合させることによって容易に製剤化することができる。このような担体は、治療される患者による経口摂取のために、本発明の核酸を、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして製剤化することを可能にする。例えば、散剤、カプセルおよび錠剤などの経口固体製剤のためには、適当な添加剤は、糖、例えばラクトース、スクロース、マンニトールおよびソルビトールなどのフィラー；トウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などのセルロース製剤；造粒剤；ならびに結合剤を含む。所望であれば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはアルギン酸ナトリウムなどのその塩などの崩壊剤を添加してもよい。所望であれば、固体剤形は、標準的技術を使用して、糖コーティングまたは腸溶コーティングしてもよい。例えば、懸濁液、エリキシル剤および溶液などの経口液体製剤のために、適当な担体、添加剤または賦形剤は、水、グリコール、油、アルコール等を含む。さらに、香味剤、保存剤、着色剤などを添加してもよい。頬側投与のために、核酸分子は、従来の方法で製剤化された錠剤、ロゼンジ等の形態をとってもよい。
【０１７３】
核酸分子は、デポ製剤として製剤化してもよい。このような長期作用型製剤は、埋め込み（例えば、皮下または筋肉内に）によって、または筋肉内注射によって投与してもよい。したがって、例えば、核酸分子は、適当な高分子材料もしくは疎水性材料（例えば、許容される油中の乳剤として）またはイオン交換樹脂によって、あるいはやや難溶の誘導体、例えばやや難溶の塩として製剤化してもよい。
【０１７４】
本発明の核酸は、細胞の取り込みを増加させるために担体または脂質と組み合わせて投与してもよい。例えば、核酸は、陽イオン脂質と組み合わせて投与してもよい。陽イオン脂質の例としては、それだけに限定されないが、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥおよびＤＯＴＡＰ、ならびにＴ字形コレステロールエステル誘導体が挙げられる（例えば、Ｌｅｅ等  Ｂｉｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ  １４（２００４）：２６３７〜２６４１参照）。種々の核酸製剤および投与方法は、例えば、米国特許第７４７０６７５号；第５８４４１０７号；第５８７７３０２号；第６００８３３６号；第６０７７８３５号；第６２００８０１号および第５９７２９００号、ならびに米国特許出願公開第２００３／０２０３８６５号；第２００２／０１５０６２６号；第２００３／００３２６１５号および第２００４／００４８７８７号に開示されている。
【０１７５】
さらに、リポソームおよび乳剤は、本発明の核酸を送達するために使用することができる送達媒体の周知の例である。適当なリポソームは、一般に中性のまたは負に帯電したリン脂質およびコレステロールなどのステロールを含む標準的な媒体形成脂質から形成することができる。脂質の選択は、一般的に、所望のリポソームサイズおよび血流中でのリポソームの半減期などの因子を考慮することによって導かれる。リポソームを調製するための種々の方法は、例えば、Ｓｚｏｋａ等（１９８０）、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７；ならびに米国特許第４２３５８７１号、第４５０１７２８号、第４８３７０２８号および第５０１９３６９号に記載されており、公知である。
【０１７６】
本方法で使用するためのリポソームは、リポソームをがん細胞に向けるリガンド分子、例えば、腫瘍細胞抗原に結合するモノクローナル抗体を含むことができる。
【０１７７】
リポソーム（Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ）は、単核マクロファージ系（「ＭＭＳ」）および細網内皮系（「ＲＥＳ」）による排除を避けるために修飾することもできる。このような修飾されたリポソームは、その表面上にある、またはリポソーム構造に組み込まれたオプソニン作用抑制成分を有する。特定の実施形態では、本発明のリポソームは、オプソニン作用抑制成分およびリガンドの両方を含むことができる。
【０１７８】
本発明のリポソームの調製において使用するためのオプソニン作用抑制成分は、典型的には、リポソーム膜に結合する大きな親水性ポリマーである。本明細書で使用する場合、オプソニン作用抑制成分は、例えば、脂質可溶性アンカーの膜自体へのインターカレーションによって、または膜脂質の活性基に直接結合することによって、化学的または物理的に膜に付着している場合に、リポソーム膜に「結合」している。これらのオプソニン作用抑制親水性ポリマーは、例えば、米国特許第４９２００１６号に記載されているように、ＭＭＳおよびＲＥＳによるリポソームの取り込みを著しく減少させる保護表面膜を形成する。
【０１７９】
リポソームを修飾するのに適したオプソニン作用抑制成分の例としては、約２０００〜約２００００ダルトンなどの約５００〜約４００００ダルトンの数平均分子量を有する水溶性ポリマーが挙げられる。このようなポリマーには、カルボキシル基またはアミノ基が化学的に連結した、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）誘導体；例えば、メトキシＰＥＧまたはＰＰＧ、およびＰＥＧまたはＰＰＧステアリン酸塩；ポリアクリルアミドまたはポリＮ−ビニルピロリドンなどの合成ポリマー；直鎖、分枝またはデンドリマー状ポリアミドアミン；ポリアクリル酸；ポリアルコール、例えばポリビニルアルコールおよびポリキシリトール、ならびにガングリオシドＧＭ１などのガングリオシドが含まれる。ＰＥＧ、メトキシＰＥＧもしくはメトキシＰＰＧ、またはその誘導体の共重合体も適している。さらに、オプソニン作用抑制ポリマーは、ＰＥＧ、およびポリアミノ酸、多糖類、ポリアミドアミン、ポリエチレンアミンまたはポリヌクレオチドのいずれかのブロック共重合体であってもよい。オプソニン作用抑制ポリマーは、アミノ酸もしくはカルボン酸を含む天然の多糖類、例えば、ガラクツロン酸、グルクロン酸、マンヌロン酸、ヒアルロン酸、ペクチン酸、ノイラミン酸、アルギン酸、カラゲナン；アミノ化された多糖類もしくはオリゴ糖（直鎖もしくは分枝状）；または、例えば炭酸の誘導体と反応させて、結果として得られるカルボキシル基の連結を有するカルボキシル化された多糖類もしくはオリゴ糖であってもよい。好ましくは、オプソニン作用抑制成分は、ＰＥＧ、ＰＰＧまたはその誘導体である。ＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体によって修飾されたリポソームは、時々、「ＰＥＧ化リポソーム」と呼ばれる。
【０１８０】
オプソニン作用抑制成分は、多数の周知の技術の任意の１つによってリポソーム膜に結合させることができる。例えば、ＰＥＧのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルは、ホスファチジルエタノールアミン脂溶性アンカーに結合させ、次いで膜に結合させることができる。同様に、デキストランポリマーは、６０℃で、Ｎａ（ＣＮ）ＢＨ３ならびに３０：１２の比率のテトラヒドロフランおよび水などの溶媒混合物を使用して、還元性アミノ化を通して、ステアリルアミン脂溶性アンカーによって誘導体化することができる。
【０１８１】
オプソニン作用抑制成分によって修飾されたリポソームは、修飾されていないリポソームよりもずっと長く血行中に残っている。この理由のため、このようなリポソームは、時々、「ステルス」リポソームと呼ばれる。ステルスリポソームは、多孔性のまたは「漏出性の」微小血管系によって送り込まれる組織中に蓄積することが知られている。したがって、このような微小血管系の欠損によって特徴づけられる組織、例えば、固形腫瘍は、これらのリポソームを効率的に蓄積するであろう；Ｇａｂｉｚｏｎ等（１９８８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ．、１８：６９４９〜５３参照。さらに、ＲＥＳによる取り込みの減少は、肝臓および脾臓中のリポソームの著しい蓄積を予防することによって、ステルスリポソームの毒性を下げる。したがって、オプソニン作用抑制成分によって修飾されたリポソームは、本発明の核酸を腫瘍細胞に送達するのに特に適している。
【０１８２】
核酸はまた、ポリ（Ｌ−リジン）などの陽イオン性アミンと組み合わせて投与してもよい。核酸はまた、トランスフェリンおよびコレステリルなどの化学成分と結合させてもよい。さらに、特定の化学基をオリゴヌクレオチドに結合させることによって、オリゴヌクレオチドを特定の細胞小器官に向かせてもよい。例えば、オリゴヌクレオチドをマンノース残基の適当な配列と結合させると、オリゴヌクレオチドは肝臓に向くだろう。
【０１８３】
さらに、核酸分子は治療剤を含む固体ポリマーの半透性基質などの徐放性システムを使用して送達してもよい。種々の徐放性材料が確立されてきており、当業者に周知である。徐放性カプセルは、その化学的性質に応じて、分子を数週間から１００日を超えるまでの間放出することができる。キメラ分子の化学的性質および生物学的安定性に応じて、分子の安定化のための追加の戦略を使用してもよい。
【０１８４】
核酸は、遊離の酸もしくは塩基として、または薬学的に許容される塩として、上記製剤のいずれにも含まれ得る。薬学的に許容される塩は、実質的に遊離塩基の生物学的活性を保持しており、無機酸との反応によって調製される塩である。薬学的塩は、対応する遊離塩基型よりも、水性および他のプロトン性溶媒に可溶性である傾向がある。
【０１８５】
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される担体に溶解または分散した、有効量の１つまたは複数の核酸分子またはベクターを含む。「薬学的に許容される」という語は、例えば、適例としてヒトなどの動物に投与した場合に、有害な、アレルギー性の、または他の不都合な反応をもたらさない分子実体および組成物を指す。少なくとも１種の核酸成分を含む医薬組成物の調製は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版  Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０によって例示されている本開示に照らして当業者に公知であろう。その上、動物（例えば、ヒト）の投与については、製剤は、ＦＤＡの生物学的基準局などの健康規制機関によって要求される無菌性、発熱性、一般的安全性および純度基準を満たすべきであることが理解されよう。
【０１８６】
本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される担体、賦形剤または添加剤」には、当業者に公知であるような、任意のかつ全ての溶媒、分散媒、コーティング、界面活性剤、酸化防止剤、保存剤（例えば、抗細菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、保存剤、薬物、薬物安定剤、ゲル、結合剤、添加剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、色素などの材料、およびこれらの組み合わせが含まれる。任意の従来の担体は、有効成分に不適合である場合を除いては、治療または医薬組成物へのその使用が期待される。
【０１８７】
核酸分子を含む医薬組成物は、それが固体、液体またはエアロゾルの形態で投与されるかどうかに応じて、および注射などの投与経路のための無菌性の一般的必要性にしたがって、異なる種類の担体を含んでもよい。本発明は、当業者に公知であるような、静脈内に、皮内に、動脈内に、腹腔内に、病巣内に、頭蓋内に、関節内に、前立腺内に、胸腔内に、気管内に、鼻腔内に、硝子体内に、膣内に、直腸内に、局所的に、腫瘍内に、筋肉内に、腹腔内に、皮下に、結膜下に、小胞内に、粘膜に、心膜内に、臍帯内に、眼球内に、経口的に、局所的に、部分的に、吸入（例えば、エアロゾル吸入）、注射、点滴、持続点滴、カテーテルを通して、洗浄を通して、脂質組成物（例えば、リポソーム）中に標的細胞を直接的にひたす局所的潅流で、または他の方法により、または前記の任意の組み合わせにより投与することができる。
【０１８８】
ヒト患者などの被験体に投与される本発明の組成物の実際の投与量は、患者の体重、状態の重症度、治療する疾患の種類、以前のまたは同時の治療介入、突発性疾患などの物理的および生理学的因子により、ならびに投与経路に基づいて決定することができる。投与の責任がある開業医は、いずれにしても、個々の被験体のために、組成物中の有効成分の濃度および適当な用量を決定するだろう。
【０１８９】
特定の実施形態では、医薬組成物は、例えば、少なくとも約０．１％の活性化合物を含んでもよい。他の実施形態では、活性化合物は、約２％〜約７５％の単位重量、または約２５％〜約６０％、例えば、その中の任意の導き出せる範囲を含んでもよい。他の非限定的な例では、投与量はまた、投与当たり、約５、約１０、約５０、約１００、約２００、約３５０、約５００マイクログラム／ｋｇ／体重を含む少なくとも約１マイクログラム／ｋｇ／体重；または約５、約１０、約５０、約１００、約２００、約３５０、約５００など少なくとも約１ミリグラム（ｍｇ）／ｋｇ／体重〜約１０００ｍｇ／ｋｇ／体重以上、およびその中の任意の導き出せる範囲を含んでもよい。
【０１９０】
組成物は、１つまたは複数の成分の酸化を遅延させるための種々の酸化防止剤を含んでもよい。さらに、組成物は、それだけに限定されないが、パラベン（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールまたはこれらの組み合わせを含む種々の抗細菌剤および抗真菌剤などの保存剤を含んでもよい。
【０１９１】
組成物が液体形態である実施形態では、担体は、それだけに限定されないが、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、脂質（例えば、トリグリセリド、植物油、リポソーム）およびこれらの組み合わせを含む溶媒または分散媒であることができる。例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって；例えば、液体ポリオールまたは脂質などの担体中に分散させることによる必要とされる粒度の維持によって；例えば、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤の使用によって；あるいはこのような方法の組み合わせによって、適当な流動性を維持することができる。多くの場合、例えば、糖、塩化ナトリウムまたはこれらの組み合わせなどの等張剤を含むことが好ましいだろう。
【０１９２】
他の実施形態では、本発明において、点鼻液もしくはスプレー、エアロゾルまたは吸入剤を使用してもよい。このような組成物は、一般的に、標的組織型に適合するよう設計される。非限定的な例では、点鼻液は、通常、滴剤またはスプレーで鼻腔に投与されるよう設計された水溶液である。点鼻液は、多くの点で鼻分泌物と類似であるように調製されるので、正常な線毛作用は維持される。したがって、好ましい実施形態では、水溶性点鼻液は、通常、約５．５〜約６．５のｐＨを維持するよう等張である、またはわずかに緩衝されている。
【０１９３】
組成物は、製造および貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。内毒素汚染は、安全なレベルで最小限に、例えば、０．５ｎｇ／ｍｇタンパク質未満に保たれるべきであることが認識されよう。
治療用途および治療方法
【０１９４】
本発明の核酸構造体およびベクターは、腫瘍進行を抑制するため、腫瘍転移を抑制するため、あるいは新生物疾患に関連する症状を減少または緩和させるためなど、がんを有する被験体を治療するために使用され得る。
【０１９５】
本発明は、特にその細胞の少なくとも一部におけるｍｉＲ−２１の内在性発現によって特徴づけられるがん、腫瘍または新生物疾患の種類を治療するのに特に有用である。
【０１９６】
がん、腫瘍または新生物疾患は、肉腫、癌、腺癌、リンパ腫および白血病であり得る。本発明の範囲内に含まれるものとしては、乳がん、結腸がん、肝細胞癌、子宮頚がん、胆管癌、類内膜性卵巣癌、食道がん、神経膠芽腫、頭頚部がん、白血病（例えば、慢性リンパ性白血病）、リンパ腫（例えば、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、活性化Ｂ細胞様リンパ腫）、肺がん、多発性骨髄腫、膵臓（例えば、内分泌および腺房）がん、骨肉腫、下垂体腫瘍、前立腺がん、胃がんおよび子宮筋腫がある。
【０１９７】
本発明の構造体およびベクターは、がん細胞の増殖を抑制することによって、および／またはがん細胞の成長を停止もしくは遅延させることによって、および／または腫瘍進行を抑制することによって、および／または腫瘍転移を抑制することによってがんを治療する。上記の効果のいずれも、永久的または一時的であり得る。構造体およびベクターの投与後に被験体中のがん細胞の数が一定のままであるか減少している場合に、がん細胞の増殖の抑制が推測され得る。がん細胞の絶対数は増加しているが腫瘍成長の速度が減少している場合にも、がん細胞の増殖の抑制が推測され得る。
【０１９８】
被験体の体内のがん細胞の数は、直接的な測定によって、または原発腫瘍もしくは転移性腫瘍の塊の大きさからの推定によって決定することができる。例えば、被験体中のがん細胞の数は、免疫組織学的方法、フリーサイトメトリー、またはがん細胞の特徴的な表面マーカーを検出するよう設計された他の技術によって測定することができる。
【０１９９】
腫瘍塊の大きさは、直接的目視観察によって、またはＸ線、磁気共鳴画像診断、超音波およびシンチグラフィなどの画像診断法によって確認することができる。腫瘍塊の大きさを確認するために使用する画像診断法は、当技術分野で公知である造影剤を用いて、または用いずに使用することができる。腫瘍塊の大きさは、組織塊の触診またはキャリパーなどの測定機器による組織塊の測定などの物理的手段によっても確認することができる。
【０２００】
治療的および／または予防的に有効であるために十分な量で、所望の組織中で抗がん剤の発現をもたらす限りは、構造体およびベクターの投与の任意の様式を使用することができる。構造体およびベクターを含むｍｉＲ−２１プロモーターは、任意の適当な経腸または非経口投与経路によって被験体に投与することができる。本方法のための適当な経腸投与経路には、例えば、経口、直腸、または鼻腔内送達が含まれる。適当な非経口投与経路には、例えば、血管内投与（例えば、静脈内ボーラス注射、静脈内注入、動脈内ボーラス注射、動脈内注入および脈管系へのカテーテル注入）；組織周囲および組織内注射（例えば、腫瘍周囲および腫瘍内注射、網膜内注射または網膜下注射）；皮下注入（浸透圧ポンプなどによる）を含む皮下注射または沈着；例えば、カテーテルまたは他の留置装置（例えば、網膜ペレットまたは坐薬、または多孔性、非多孔性もしくはゼラチン状材料、例えばゲルフォームスポンジデポ；ヒドロゲルを含む移植片）による対象の組織への直接適用、あるいは外科手術中の局所的適用；ならびに吸入が含まれる。特に適した投与経路は、注射、点滴および腫瘍内への直接注射である。
【０２０１】
注射の手段には、Ｍｅｄ−Ｅ−Ｊｅｔ（商標）（Ｖａｈｌｓｉｎｇ，Ｈ.等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １７１、１１〜２２（１９９４））、Ｂｉｏｊｅｃｔｏｒ（商標）（Ｄａｖｉｓ，Ｈ．等、Ｖａｃｃｉｎｅ  １２、１５０３〜１５０９（１９９４）；Ｇｒａｍｚｉｎｓｋｉ，Ｒ．等、Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．４、１０９〜１１８（１９９８））、ＡｄｖａｎｔａＪｅｔ（商標）（Ｌｉｎｍａｙｅｒ，Ｉ．等、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  ９：２９４〜２９７（１９８６））、およびＭｅｄｉ−Ｊｅｃｔｏｒ（商標）（Ｍａｒｔｉｎｓ，Ｊ．およびＲｏｅｄｌ，Ｅ．Ｊ．Ｏｃｃｕｐ．Ｍｅｄ．２１：８２１〜８２４（１９７９））として市販されているものなどの、微粒子銃注射器および粒子加速器（例えば、「遺伝子銃」または空気式「無針」注射器）が含まれる。
【０２０２】
核酸構造体およびベクターは、単一用量または複数用量として投与してもよく、適当な時間間隔で投与してもよい。
【０２０３】
「治療上有効量」という用語は、投与後に所望の結果を達成するのに有効な本発明の構造体またはベクターの量を指す。
【０２０４】
構造体およびベクターは、それだけに限定されないが、骨髄移植、臍帯血細胞移植、外科手術、化学療法、放射線療法および免疫療法を含む１つまたは複数の追加のがん治療様式と共に投与してもよい。本発明のポリヌクレオチド構造体または医薬組成物は、１つまたは複数の追加のがん治療様式の開始前、１つまたは複数の追加のがん治療様式の実施中、および１つまたは複数の追加のがん治療様式の終了後に投与することができる。
【０２０５】
骨髄移植の種類には、それだけに限定されないが、自家骨髄移植および異種性（すなわち、ドナーからの）骨髄移植が含まれる。
【０２０６】
化学療法剤には、それだけに限定されないが、メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ダカルバジン（ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ）、ストレプトゾシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｃｉｎｅ）、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、クロロゾトシン、ブスルファン、トリエチレンメラミン、チオテパ、ヘキサメチルメラミンを含むアルキル化剤；メトトレキサートを含む代謝拮抗剤；フルオロウラシル、５−フルオロウラシル、フロクスウリジン（５’−フルオロ−２’−デオキシウリジン）、イドクスウリジン、シタラビン、Ｎ−ホスホノアセチル−Ｌ−アスパラギン酸塩、５−アザシチジン、アザリビン、６−アザウリジン、ピラゾフラン、３−デアザウリジン、アクチビンを含むピリミジン類似体；チオグアニン、メルカプトプリン、アザチオプリン、ペントスタチン、エリスロヒドロキシノニルアデニンを含むプリン類似体；ビンクリスチンおよびビンブラスチンを含むビンカアルカロイド；エトポシドおよびテニポシドを含むエピポドフィロトキシン；ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、硫酸ブレオマイシン、プリカマイシン、マイトマイシンを含む抗生物質；Ｌ−アスパラギナーゼを含む酵素；シスプラチン、カルボプラチンを含む白金配位錯体；ヒドロキシ尿素、プロカルバジン、ミトタン；ならびにプレドニソンおよびプレドニソロンなどの副腎皮質ステロイドを含むホルモンまたは関連物質；アミドグルテチミド；カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール（ｍｅｇｅｓｔｒｏｌ  ａｃｅｔａｔｅ）などのプロゲスチン、ジエチルスチルベストロール、フルオキシメステロン、エチニルエストラジオールなどのエストロゲンおよびアンドロゲン、タモキシフェンなどの抗エストロゲン剤、ならびにリュープロリドなどのゴナドトロピン放出ホルモン類似体が含まれる。
【０２０７】
本発明の方法は、生体試料、例えば、被験体からの細胞または組織中のｍｉＲ−２１転写活性レベルを測定するステップをさらに含んでもよい。試料中の少なくとも１種のｍｉＲ−２１遺伝子産物の存在または濃度は、がんまたは腫瘍または新生物が本発明の方法によって治療可能であることを示し得る。
【０２０８】
ｍｉＲ−２１遺伝子産物の濃度は、被験体から得られる生体試料中で測定することができる。例えば、従来の生検技術によって乳がんを有することが疑われる被験体から組織試料を取り出すことができる。別の実施例では、被験体から血液試料を取り出すことができ、標準的技術によってＤＮＡ抽出のために白血球を単離することができる。血液または組織試料は、好ましくは、本発明による治療または放射線療法、化学療法もしくは他の療法などの任意の他の種類の治療介入の開始前に、被験体から得られる。対応する対照組織または血液試料は、被験体の影響されない組織から、正常なヒト個体もしくは正常な個体の集団から、または被験体の試料中の細胞の大半に相当する培養細胞から得ることができる。次いで、対照組織または血液は、被験体からの試料と共に処理され、被験体の試料からの細胞中のｍｉＲ−２１遺伝子から産生されるｍｉＲ−２１遺伝子産物の濃度を、対応する対照試料の細胞からのｍｉＲ−２１遺伝子産物濃度と比較することができる。
【０２０９】
いくつかのがんは、対応する対照試料中のｍｉＲ−２１遺伝子産物の濃度に対する、被験体から得られた試料中のｍｉＲ−２１遺伝子産物の濃度における変化、特に増加によって特徴づけられる。テスト試料中の少なくとも１種のｍｉＲ−２１遺伝子産物の濃度が、対応する対照試料中のｍｉＲ−２１遺伝子産物の濃度よりも大きい場合、ｍｉＲ−２１遺伝子産物の発現は、「上方制御」されている。
【０２１０】
対照試料および正常試料中の相対的ｍｉＲ−２１遺伝子発現は、１つまたは複数のＲＮＡ発現基準に関して決定することができる。基準は、例えば、ゼロｍｉＲ−２１遺伝子発現レベル、標準細胞系中のｍｉＲ−２１遺伝子発現レベル、または正常なヒト対照の集団に関して前に得られたｍｉＲ−２１遺伝子発現の平均レベルを含むことができる。
【０２１１】
試料中のｍｉＲ−２１遺伝子産物の濃度は、生体試料中のＲＮＡ発現レベルを検出するのに適した任意の技術を使用して測定することができる。生体試料からの細胞中のＲＮＡ発現レベルを測定するための適当な技術（例えば、ノーザンブロット解析、ＲＴ−ＰＣＲ、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）は、当業者に周知である。特定の実施形態では、少なくとも１種のｍｉＲ−２１遺伝子産物の濃度は、ノーザンブロット解析を使用して検出される。例えば、総細胞内ＲＮＡは、核酸抽出緩衝液の存在下で均質化によって細胞から精製し、引き続いて遠心分離することができる。核酸は沈殿し、ＤＮＡはＤＮアーゼによる処理および沈殿によって除去される。次いで、ＲＮＡ分子は、標準的技術にしたがって、アガロースゲル上でゲル電気泳動によって分離され、ニトロセルロースフィルターに移される。次いで、ＲＮＡは、加熱によってフィルター上に固定化される。特定のＲＮＡの検出および定量は、当のＲＮＡに相補的な適当な標識ＤＮＡまたはＲＮＡプローブを使用して達成される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、上記  Ｃｈａｐｔｅｒ７を参照されたい。
【０２１２】
所与のｍｉＲ−２１遺伝子産物のノーザンブロットハイブリダイゼーションに適したプローブは、本明細書に開示されており、一般に入手可能なデータベース中のその公知の核酸配列から作り出すことができる。標識ＤＮＡおよびＲＮＡプローブの調製方法、ならびに核酸配列を標的にするそのハイブリダイゼーションの条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、上記、に記載されている。
【０２１３】
プローブは、例えば、放射性ヌクレオチド、重金属；標識リガンドの特定の結合対メンバーとして機能することができるリガンド（例えば、ビオチン、アビジンまたは抗体）、蛍光分子、化学発光分子、酵素などから当技術分野で周知の方法を使用した高特異的活性により標識化することができる。ハイブリダイゼーションのオートラジオグラフィー検出は、実体を標識化するのに適した手段、例えば、放射標識プローブのためのオートラジオグラフィー；ビオチン化プローブと、呈色反応をもたらすビオチン結合タンパク質との反応によって行われる。
【０２１４】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、細胞全体を顕微鏡カバーガラスに定着させること、および放射性または標識核酸プローブを含む溶液で細胞の核酸内容物を調べることを含む。この技術は、被験体からの組織生検試料を分析するのに特によく適している（例えば、米国特許第５４２７９１６号参照）。
【０２１５】
細胞中のｍｉＲ−２１遺伝子転写産物の相対数は、ｍｉＲ−２１遺伝子転写産物の逆転写およびその後のポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）による逆転写された転写産物の増幅によって測定することもできる。ｍｉＲ−２１遺伝子転写産物の濃度は、内部標準、例えば、同試料中に存在する「ハウスキーピング」遺伝子からのｍＲＮＡの濃度と比較して定量化することができる。内部標準としての使用に適した「ハウスキーピング」遺伝子には、例えば、ミオシンまたはグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）が含まれる。定量的ＲＴ−ＰＣＲおよびその変形に関する方法は、当技術分野の技術の範囲内である。
【０２１６】
いくつかの例では、試料中の複数の異なるｍｉＲＮＡ遺伝子産物の発現レベルを同時に測定することが望ましい。他の例では、がんと相互に関係する全ての既知ｍｉＲＮＡ遺伝子の転写産物の発現レベルを測定することが望ましい。例えば、米国特許出願公開第２００８／０３０６０１８号に記載のような、適当なマイクロアレイ技術が当技術分野で公知である。
キット
【０２１７】
本発明はまた、本発明の組成物または本発明の方法を実施するための組成物を含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは、治療用途用であり、構造体またはベクターの複数投与量単位およびがんを有する被験体に投与するために使用するための説明書を含む。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、キットは、例えば１つまたは複数のｍｉＲ−２１を発現している標的細胞の、本発明の構造体の細胞毒性効果に対する感受性を評価するための予後用途用である。
【０２１９】
キットの個々の成分は、濃縮した量で提供される；いくつかの実施形態では、成分は、個々に、他の成分を含む溶液中と同じ濃度で提供される。
【０２２０】
いくつかのキット実施形態には、負のおよび／または正の対照ベクターが含まれる。対照分子は、形質移入効率を検証し、および／または細胞中の形質移入誘導変化を調節するために使用することができる。キットはまた、構造体またはベクターの細胞への送達を促進するための１つまたは複数のトランスフェクション試薬を含む。
【０２２１】
キットの成分は、水性媒体中にまたは凍結乾燥形態に詰めてもよい。キットの容器手段には、一般的に、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ビン、シリンジまたは他の容器手段が含まれ、その中に成分が入れられ、好ましくは適当にアリコートに分割される。キット中に２種以上の成分が存在する場合、キットはまた、一般的に、追加の成分を別々に入れることができる第２、第３または他の追加の容器を含むだろう。しかしながら、成分の種々の組み合わせがバイアル中に含まれてもよい。本発明のキットはまた、典型的には、核酸を含むための手段および商業販売のために閉じ込めた状態の任意の他の試薬容器を含むだろう。このような容器には、所望のバイアルが保持される射出成形またはブロー成形プラスチック容器が含まれ得る。
【０２２２】
キットの成分が、１つおよび／または複数の溶液中に与えられる場合、溶液は水溶液であり、無菌水溶液が特に好ましい。
【０２２３】
しかしながら、キットの成分は、乾燥粉末として与えられ得る。試薬および／または成分が乾燥粉末として与えられる場合、その粉末は、適当な溶媒の添加により再構成することができ、別々の容器手段中に与えられる。
【０２２４】
キットはまた、構造体およびベクターを保存もしくは維持する、またはその分解から保護する成分を含んでもよい。
【０２２５】
キットはまた、キット成分を使用するため、さらにはキットに含まれていない任意の他の試薬の使用のための説明書を含むだろう。説明書は、実施することができる変形を含んでもよい。
【０２２６】
以下の実施例は、本発明のいくつかの実施形態をより十分に説明するために提供される。しかしながら、これらは決して本発明の広範な範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
実施例
実施例１．がん細胞および組織中の内在性ｍｉＲ−２１の差次的発現
【０２２７】
表１は、がん性対非がん性組織および細胞における差次的ｍｉＲ−２１発現を要約している（ＮＳ＝特定されない）。
【表１】
2012515532.tif 000002
2012515532.tif 000003
実施例２．ｍｉＲ−２１プロモーター調節下における異種遺伝子の発現
【０２２８】
ｍｉＲ−２１プロモーター配列の調節下にあるホタルルシフェラーゼ遺伝子（Ｌｕｃ）を発現する組換えベクター（ｍｉＲ−２１−Ｌｕｃ；配列番号１１）を、本明細書に詳細する標準的な組換え手順によって作製した。負の対照として、ｍｉＲ−２１プロモーターではなく、ｍｉＲ−２１プロモーターのＴＡＴＡボックスを含むベクター（ＴＡＴＡ−Ｌｕｃ；配列番号２０）を調製した。
【０２２９】
以下のプライマーを使用して、ヒト肝細胞癌細胞系Ｈｕｈ７を配列番号１のｍｉＲ−２１プロモーター配列の増幅用のゲノムＤＮＡ鋳型として使用した：ｆｗ５’−ＧＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＧＧＡＧＣＴＣＣＧＡＧＴＡ  ＣＡＴＡＡＡＴ−３’（配列番号１４）およびｒｅｖ５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＴＡＣＴＣＴＧＧＴＡＴＧＧＣＡＣＡＡＡＧ３’（配列番号１５）。ＰＣＲ産物を、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を運ぶｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）ベクター中にクローニングした。
【０２３０】
ｍｉＲ−２１プロモーターのＴＡＴＡボックスに相当するＤＮＡ配列（配列番号６）を、以下のオリゴヌクレオチドをアニーリングすることによって構築した；ｆｗ５’−ＣＣＴＡＧＴＧＧＴＧＡＴＡＡＡＴＧＴＧＧＧＡＣＴＴＣＴＧＡＧＡＡＧＴＣＡＴＴＣＡＴＴＴＴＡＴＴＣＴＴＴＧＴＧＣＣＡＴＡＣＣＡＧＡＧＴＡＣＡＡ−３’（配列番号１６）および５’−ＴＣＧＡＡＡＣＡＴＧＡＧＡＣＣＡＴＡＣＣＧＴＧＴＴＴＣＴＴＡＴＴＴＴＡＣＴＴＡＣＴＧＡＡＧＡＧＴＣＴＴＣＡＧＧＧＴＧＴＡＡＡＴＡＧＴＧＧＴＧＡＴＣＣＣＡＴＧ−３’（配列番号１７）。結果として生じるフラグメントをｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ中に直接クローニングして、ベクターＴＡＴＡ−Ｌｕｃ（配列番号２０）を得た。
【０２３１】
がん性細胞におけるｍｉＲ−２１プロモーター調節下の異種遺伝子産物の選択的発現を調査するために、ｍｉＲ−２１−Ｌｕｃおよびその対照ＴＡＴＡ−Ｌｕｃを異なる形質転換および非形質転換細胞中に形質移入し、形質移入した細胞系のルシフェラーゼ発現レベルを比較した。
【０２３２】
図２は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）ならびにヒト結腸直腸がん細胞系ＨＣＴ１１６およびＣＯＬＯ３２０中のルシフェラーゼ遺伝子のｍｉＲ−２１プロモーター駆動性発現を示している。図２から分かるように、対照ベクターＴＡＴＡ−Ｌｕｃを形質移入されたがん細胞と比較して、ｍｉＲ−２１−Ｌｕｃを形質移入されたヒトがん細胞系は、著しく高いルシフェラーゼの発現を示した。さらに、いずれかのベクターを形質移入されたＣＨＯ細胞は、対照ベクターＴＡＴＡ−Ｌｕｃを形質移入されたがん細胞によって示されるレベルと同様に、低いルシフェラーゼの発現レベルを示した。これらの結果は、ｍｉｒ−２１プロモーター配列の調節下で異種遺伝子をコードする構造体を使用して、異種遺伝子産物が特定のがんなどのｍｉＲ−２１発現細胞中で、高レベルで発現し得ることを示している。
実施例３．ｍｉＲ−２１プロモーター駆動性「キラー遺伝子」発現
【０２３３】
ｍｉＲ−２１の調節プロモーター配列が「キラー遺伝子」の発現を特異的に駆動する能力を測定するために、レポーターおよび実施例２に記載の対照ベクターのルシフェラーゼコード領域をジフテリア毒素の細胞毒性Ａフラグメント（ＤＴ−Ａ）をコードする核酸配列に置換した。ＤＴ−Ａは、タンパク質合成を阻害し、アポトーシスおよび細胞の脱離を誘発するので、以前からがん細胞を標的化するための「キラー遺伝子」として使用されてきた。
【０２３４】
ＤＴ−ＡをコードするＤＮＡ配列および対応するアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１８および配列番号１９として本明細書で提供される。配列番号１のｍｉＲ−２１プロモーター配列または配列番号６のそのＴＡＴＡボックスを含む構築されたプラスミドは、それぞれ、ｍｉＲ−２１  Ｐｒ−ＤＴ−Ａ（配列番号９）およびｍｉＲ−２１  ＴＡＴＡボックス  ＤＴ−Ａ（配列番号１３）と命名された。
【０２３５】
ＤＴ−ＡのｍｉＲ−２１プロモーター駆動性発現を確認するために、アポトーシスレベルおよびタンパク質合成速度を測定した。新規のタンパク質合成の減少を測定するために、ＳＶ−４０プロモーターの調節下で、ｍｉＲ−２１  Ｐｒ  ＤＴ−Ａおよびウミシイタケルシフェラーゼを含む発現ベクターを細胞に同時形質移入した。図３に示すように、ｍｉＲ−２１  Ｐｒ  ＤＴ−Ａを含む３種の異なるがん細胞型（Ｈｕｈ７、ヒト肝細胞癌；ＭＣＦ７、ヒト乳がん；ＨＣＴ１１６、ヒト結腸癌）の形質移入体は、対応するｍｉＲ−２１  ＴＡＴＡボックス  ＤＴ−Ａを含む形質移入体と比較して、ルシフェラーゼ活性の強い減少を示し、これはｍｉＲ−２１プロモーター駆動性アプローチの効率を示している。
【０２３６】
次の一連の実験は、アポトーシスのｐ５３上方制御モジュレーター（ＰＵＭＡ）をコードする核酸配列が、実施例２に記載のプラスミド中のＬｕｃ配列と置換したプラスミドを使用して行った。したがって、配列番号１のｍｉＲ−２１プロモーター配列の調節下でＰＵＭＡ配列を有するプラスミドｍｉＲ−２１  ｐｒ  ＰＵＭＡ（配列番号１０）を作製した。ルシフェラーゼ発現プラスミドと共に、ｍｉＲ−２１  ｐｒ  ＰＵＭＡおよびｍｉＲ−２１  Ｐｒ  ＤＴ−Ａを細胞に同時形質移入した。形質移入の４８時間後、細胞を回収し、ルシフェラーゼ活性を測定した。ｍｉＲ−２１プロモーター駆動性プラスミドを形質移入された細胞中では、ＤＴ−Ａによる新規のタンパク質合成の減少およびＰＵＭＡによるアポトーシスの誘導が観察されたが、ＴＡＴＡボックス対照プラスミドを形質移入された細胞中では観察されなかった（図４Ａ）。
【０２３７】
緑色蛍光タンパク質をコードするプラスミド（ＧＦＰ；配列番号２５）をｍｉＲ−２１プロモーター駆動性プラスミド（ｍｉＲ−２１  Ｐｒ  ＤＴ−ＡまたはｍｉＲ−２１  ｐｒ  ＰＵＭＡ）またはＴＡＴＡボックス対照プラスミド（ｍｉＲ−２１  ＴＡＴＡボックス  ＤＴ−ＡまたはｍｉＲ−２１  ＴＡＴＡボックス  ＰＵＭＡ）と共に同時形質移入させた同様の実験を行った。４８時間後、細胞を溶解し、溶解産物を、抗ＧＦＰ抗体を使用してウエスタンブロット解析に供した（図４Ｂ）。図４Ｂから分かるように、ｍｉＲ−２１  ＤＴ−ＡおよびｍｉＲ−２１  ＰＵＭＡによる形質移入系ではＧＦＰシグナルは完全に除去されたが、ＴＡＴＡボックス駆動性対照による系では除去されなかった。
実施例４．ｍｉＲ−２１プロモーター駆動性ＤＴ−Ａ発現は、ｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍形成を抑制する。
【０２３８】
ヌードマウス（各々の群においてｎ＝３）に１×１０７ＨＣＴ１１６細胞を注射した。注射の２週間後、腫瘍開始サイズを測定した。腫瘍細胞注射の２週間後、トランスフェクション試薬ＪＥＴＰＥＩ（商標）（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ、フランス）と複合体を形成した内毒素フリーのｍｉＲ−２１  Ｐｒ  ＤＴ−Ａ（２５μｇ）を腫瘍内に注射した。７日後に追加の注射を投与した。手動キャリパーを使用して、腫瘍サイズを０、７および１４日に記録した。ｍｉＲ−２１−Ｌｕｃ（実施例２に記載）の注射が対照として機能した。ｍｉＲ−２１  Ｐｒ  ＤＴ−Ａを注射したあるマウス中では、腫瘍が完全に消滅した。ｍｉＲ−２１  Ｐｒ  ＤＴ−Ａで同様に処理した別のマウス中では、腫瘍成長は抑制されたが、そのサイズは減少しなかった。全体では、図５に示すように、処理マウスについての平均倍率変化は、対照マウスにおける１．６と比較して１であった。
【０２３９】
追加の実験では、ヒト肝細胞癌、結腸直腸がんおよび乳がんの細胞系などのがん細胞中でｍｉＲ−２１の発現レベルが調査され得る。特に好ましいのは、中にコードされている抗がん剤の形質移入および発現時に、本発明の構造体およびベクターの細胞毒性効果に感受性であることを示したがん細胞である。ｍｉＲ−２１の発現レベルの測定は、例えば、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用して行ってもよい。
参照
【０２４０】
１．Ｏｈａｎａ，Ｐ．、Ｐ．Ｓｃｈａｃｈｔｅｒ、Ｂ．Ａｙｅｓｈ、Ａ．Ｍｉｚｒａｈｉ、Ｔ．Ｂｉｒｍａｎ、Ｔ．Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ、Ｉ．Ｍａｔｏｕｋ、Ｓ．Ａｙｅｓｈ、Ｐ．Ｊ．Ｋｕｐｐｅｎ、Ｎ．ｄｅ  Ｇｒｏｏｔ、Ａ．ＣｚｅｒｎｉａｋおよびＡ．Ｈｏｃｈｂｅｒｇ、結腸直腸ラット肝転移のＤＮＡベースの治療におけるＨ１９およびＩＧＦ遺伝子の調節配列（Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｈ１９  ａｎｄ  ＩＧＦ２  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ＤＮＡ−ｂａｓｅｄ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｒａｔ  ｌｉｖｅｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）。Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ、２００５．７（３）：ｐ．３６６〜３７４。
２．Ｖａｒｄａ−Ｂｌｏｏｍ，Ｎ．、Ｉ．Ｈｏｄｉｓｈ、Ａ．Ｓｈａｉｓｈ、Ｓ．Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇｅｒ、Ｒ．Ｔａｌ、Ｂ．Ｆｅｄｅｒ、Ｊ．Ｒｏｉｔｅｌｍａｎ、Ｅ．Ｂｒｅｉｔｂａｒｔ、Ｌ．Ｂａｎｇｉｏ、Ｉ．Ｂａｒｓｈａｃｋ、Ｒ．ＰｆｅｆｆｅｒおよびＤ．Ｈａｒａｔｓ、ＨＳＶ−ＴＫを与えた修飾マウスＰＰＥ−１プロモーターによる腫瘍新血管死の特異的誘導（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ  Ｄｅａｔｈ  ｂｙ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｍｕｒｉｎｅ  ＰＰＥ−１  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  Ａｒｍｅｄ  ｗｉｔｈ  ＨＳＶ−ＴＫ）。Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００８．７５（６）：ｐ．３４６〜３５５。
３．Ｇｉｌａｄｉ，Ｎ．、Ｈ．Ｄｖｏｒｙ−Ｓｏｂｏｌ、Ｅ．Ｓａｇｉｖ、Ｄ．Ｋａｚａｎｏｖ、Ｅ．ＬｉｂｅｒｍａｎおよびＮ．Ａｒｂｅｒ、活性化Ｗｎｔシグナルを使用した前立腺がん細胞への遺伝子治療アプローチ（Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｉｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ａｎ  ａｃｔｉｖｅ  Ｗｎｔ  ｓｉｇｎａｌ）。Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ＆Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ、２００７．６１（９）：ｐ．５２７〜５３０。
４．Ｂａｒｎｅｓ，Ｄ．、Ｍ．Ｋｕｎｉｔｏｍｉ、Ｍ．Ｖｉｇｎｕｚｚｉ、Ｋ．ＳａｋｓｅｌａおよびＲ．Ａｎｄｉｎｏ、弱毒化ウイルスワクチン開発のための戦略としてのウイルス組織向性を調節するための内在性ｍｉＲＮＡの利用（Ｈａｒｎｅｓｓｉｎｇ  Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｍｉＲＮＡｓ  ｔｏ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｖｉｒｕｓ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｒｏｐｉｓｍ  ａｓ  ａ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  Ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  Ｖｉｒｕｓ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ）。Ｃｅｌｌ  Ｈｏｓｔ＆Ｍｉｃｒｏｂｅ、２００８．４（３）：ｐ．２３９〜２４８。
５．Ｃｈａｎ，Ｊ．Ａ．、Ａ．Ｍ．ＫｒｉｃｈｅｖｓｋｙおよびＫ．Ｓ．Ｋｏｓｉｋ、マイクロＲＮＡ−２１はヒト膠芽腫細胞における抗アポトーシス因子である（ＭｉｃｒｏＲＮＡ−２１  ｉｓ  ａｎ  ａｎｔｉｉａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｃｅｌｌｓ）。Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、２００５．６５（１４）：ｐ．６０２９〜６０３３。
６．Ｇａｂｒｉｅｌｙ，Ｇ．、Ｔ．Ｗｕｒｄｉｎｇｅｒ、Ｓ．Ｋｅｒａｒｉ、Ｃ．Ｃ．Ｅｓａｕ、Ｊ．Ｂｕｒｃｈａｒｄ、Ｐ．Ｓ．ＬｉｎｓｌｅｙおよびＡ．Ｍ．Ｋｒｉｃｈｅｖｓｋｙ、マイクロＲＮＡ２１は、マトリックスメタロプロテイナーゼ調節因子を標的にすることによって神経膠腫浸潤を促進する（ＭｉｃｒｏＲＮＡ  ２１  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｇｌｉｏｍａ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ｂｙ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ）。Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、２００８．２８（１７）：ｐ．５３６９〜５３８０。
７．Ｉｏｒｉｏ，Ｍ．Ｖ．、Ｍ．Ｆｅｒｒａｃｉｎ、Ｃ．Ｇ．Ｌｉｕ、Ａ．Ｖｅｒｏｎｅｓｅ、Ｒ．Ｓｐｉｚｚｏ、Ｓ．Ｓａｂｂｉｏｎｉ、Ｅ．Ｍａｇｒｉ、Ｍ．Ｐｅｄｒｉａｌｉ、Ｍ．Ｆａｂｂｒｉ、Ｍ．Ｃａｍｐｉｇｌｉｏ、Ｓ．Ｍｅｎａｒｄ、Ｊ．Ｐ．Ｐａｌａｚｚｏ、Ａ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、Ｐ．Ｍｕｓｉａｎｉ、Ｓ．Ｖｏｌｉｎｉａ、Ｉ．Ｎｅｎｃｉ、Ｇ．Ａ．Ｃａｌｉｎ、Ｐ．Ｑｕｅｒｚｏｌｉ、Ｍ．ＮｅｇｒｉｎｉおよびＣ．Ｍ．Ｃｒｏｃｅ、ヒト乳がんにおけるマイクロＲＮＡ遺伝子発現調節解除（ＭｉｃｒｏＲＮＡ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｄｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ）。Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、２００５．６５（１６）：ｐ．７０６５〜７０７０。
８．Ｓｅｍｐｅｒｅ，Ｌ．Ｆ．、Ｍ．Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ、Ａ．Ｓｉｌａｈｔａｒｏｇｌｕ、Ｍ．Ｂａｋ、Ｃ．Ｖ．Ｈｅａｔｈ、Ｇ．Ｓｃｈｗａｒｔｚ、Ｗ．Ｗｅｌｌｓ、Ｓ．ＫａｕｐｐｉｎｅｎおよびＣ．Ｎ．Ｃｏｌｅ、乳がん中の特異的上皮細胞亜集団に限局している異常マイクロＲＮＡ発現（Ａｌｔｅｒｅｄ  ＭｉｃｒｏＲＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｏｎｆｉｎｅｄ  ｔｏ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｓｕｂｐｕｐｏｌａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ）。Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、２００７．６７（２４）：ｐ．１１６１２〜１１６２０。
９．Ｓｉ，Ｍ．Ｌ．、Ｓ．Ｚｈｕ、Ｈ．Ｗｕ、Ｚ．Ｌｕ、Ｆ．ＷｕおよびＹ．Ｙ．Ｍｏ、ｍｉＲ−２１媒介性腫瘍成長（ｍｉＲ−２１−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ）。Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２００７．２６（１９）：ｐ．２７９９〜２８０３。
１０．Ｑｉａｎ，Ｂ．、Ｄ．Ｋａｔｓａｒｏｓ、Ｌ．Ｌｕ、Ｍ．Ｐｒｅｔｉ、Ａ．Ｄｕｒａｎｄｏ、Ｒ．Ａｒｉｓｉｏ、Ｌ．ＭｕおよびＨ．Ｙｕ、初期疾患における短い無病生存期間および高ＴＧＦ−ベータ１に関連した乳がんにおける高いｍｉＲ−２１発現（Ｈｉｇｈ  ｍｉＲ−２１  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｂｒｅａｔ  ｃａｎｃｅｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｏｏｒ  ｄｉｓｅａｓｅ−ｆｒｅｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  ｅａｒｌｙ  ｓｔａｇｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ｈｉｇｈ  ＴＧＦ−ｂａｔａｌ）。Ｂｒｅａｓｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｔｒｅａｔ、２００８。
１１．Ｙａｎ，Ｌ．Ｘ．、Ｘ．Ｆ．Ｈｕａｎｇ、Ｑ．Ｓｈａｏ、Ｍ．Ｙ．Ｈｕａｎｇ、Ｌ．Ｄｅｎｇ、Ｑ．Ｌ．Ｗｕ、Ｙ．Ｘ．ＺｅｎｇおよびＪ．Ｙ．Ｓｈａｏ、ヒト乳がんにおけるマイクロＲＮＡｍｉＲ−２１過剰発現は、進行した臨床病期、リンパ節転移および患者の予後不良と関連する（ＭｉｃｒｏＲＮＡ  ｍｉＲ−２１  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｔａｇｅ，  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ａｎｄ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｐｏｏｒ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）。ＲＮＡ、２００８．１４（１１）：ｐ．２３４８〜２３６０。
１２．Ｋｕｔａｙ，Ｈ．、Ｓ．Ｂａｉ、Ｊ．Ｄａｔｔａ、Ｔ．Ｍｏｔｉｗａｌａ、Ｉ．Ｐｏｇｒｉｂｎｙ、Ｗ．Ｆｒａｎｋｅｌ、Ｓ．Ｔ．ＪａｃｏｂおよびＫ．Ｇｈｏｓｈａｌ、齧歯類およびヒト肝細胞癌におけるｍｉＲ−１２２の下方制御（Ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉＲ−１２２  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｏｄｅｎｔ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ）。Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、２００６．９９（３）：ｐ．６７１〜６７８。
１３．Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，Ｅ．、Ｍ．Ｍｅｌｅｇａｒｉ、Ｐ．Ｌａｎｄｇｒａｆ、Ｔ．Ｔｃｈａｉｋｏｖｓｋａｙａ、Ｂ．Ｃ．Ｔｅｎｎａｎｔ、Ｂ．Ｌ．Ｓｌａｇｌｅ、Ｌ．Ｅ．Ｒｏｇｌｅｒ、Ｍ．Ｚａｖｏｌａｎ、Ｔ．ＴｕｓｃｈｌおよびＣ．Ｅ．Ｒｏｇｌｅｒ、ヘパドナウイルス関連肝細胞癌におけるｍｉＲ−１７〜９２ポリシストロンおよびｍｉＲ−２１の発現高進は、悪性形質に寄与する（Ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｉＲ−１７−９２  ｐｏｌｙｃｉｓｔｒｏｎ  ａｎｄ  ｍｉＲ−２１  ｉｎ  ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｕｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）。Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ、２００８．１７３（３）：ｐ．８５６〜８６４。
１４．Ｊｉａｎｇ，Ｊ．、Ｙ．Ｇｕｓｅｖ、Ｉ．Ａｄｅｒｃａ、Ｔ．Ａ．Ｍｅｔｔｌｅｒ、Ｄ．Ｍ．Ｎａｇｏｒｎｅｙ、Ｄ．Ｊ．Ｂｒａｃｋｅｔｔ、Ｌ．Ｒ．ＲｏｂｅｒｔｓおよびＴ．Ｄ．Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ、肝炎、肝硬変および患者の生存と肝細胞癌におけるマイクロＲＮＡ発現の関連（Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＭｉｃｒｏＲＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ｗｉｔｈ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，  ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ，  ａｎｄ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｓｕｒｖｉｖａｌ）。Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００８．１４（２）：ｐ．４１９〜４２７。
１５．Ｌａｄｅｉｒｏ，Ｙ．、Ｇ．Ｃｏｕｃｈｙ、Ｃ．Ｂａｌａｂａｕｄ、Ｐ．Ｂｉｏｕｌａｃ−Ｓａｇｅ、Ｌ．Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ、Ｓ．ＲｅｂｏｕｉｓｓｏｕおよびＪ．Ｚｕｃｍａｎ−Ｒｏｓｓｉ、肝細胞腫瘍のマイクロＲＮＡプロファイリングは、臨床的特徴およびがん遺伝子／腫瘍抑制遺伝子突然変異と関連する（ＭｉｃｒｏＲＮＡ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｉｎ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｕｍｏｒｓ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ／ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｇｅｎｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）。Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、２００８．４７（６）：ｐ．１９５５〜１９６３。
１６．Ｍｅｎｇ，Ｆ．、Ｒ．Ｈｅｎｓｏｎ、Ｍ．Ｌａｎｇ、Ｈ．Ｗｅｈｂｅ、Ｓ．Ｍａｈｅｓｈｗａｒｉ、Ｊ．Ｔ．Ｍｅｎｄｅｌｌ、Ｊ．Ｊｉａｎｇ、Ｔ．Ｄ．ＳｃｈｍｉｔｔｇｅｎおよびＴ．Ｐａｔｅｌ、ヒト胆管癌細胞系の成長および化学療法に対する反応へのヒトマイクロＲＮＡの関与（Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｉｃｒｏ−ＲＮＡ  ｉｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｈｏｌａｎｇｉｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ）。Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、２００６．１３０（７）：ｐ．２１１３〜２１２９。
１７．Ｒｏｌｄｏ，Ｃ．、Ｅ．Ｍｉｓｓｉａｇｌｉａ、Ｊ．Ｐ．Ｈａｇａｎ、Ｍ．Ｆａｌｃｏｎｉ、Ｐ．Ｃａｐｅｌｌｉ、Ｓ．Ｂｅｒｓａｎｉ、Ｇ．Ａ．Ｃａｌｉｎ、Ｓ．Ｖｏｌｉｎｉａ、Ｃ．Ｇ．Ｌｉｕ、Ａ．ＳｃａｒｐａおよびＣ．Ｍ．Ｃｒｏｃｅ、膵臓内分泌および腺房腫瘍のマイクロＲＮＡ発現異常は、特徴的な病的特徴および臨床行動と関連する（ＭｉｃｒｏＲＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ａｎｄ  ａｃｉｎａｒ  ｔｕｍｏｒｓ  ａｒｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｄｉｎｓｔｉｎｃｔｉｖｅ  ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｂｅｈａｖｉｏｒ）。Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ、２００６．２４（２９）：ｐ．４６７７〜４６８４。
１８．Ｌｅｅ，Ｅ．Ｊ．、Ｙ．Ｇｕｓｅｖ、Ｊ．Ｊｉａｎｇ、Ｇ．Ｊ．Ｎｕｏｖｏ、Ｍ．Ｒ．Ｌｅｒｎｅｒ、Ｗ．Ｌ．Ｆｒａｎｋｅｌ、Ｄ．Ｌ．Ｍｏｒｇａｎ、Ｒ．Ｇ．Ｐｏｓｔｉｅｒ、Ｄ．Ｊ．ＢｒａｃｋｅｔｔおよびＴ．Ｄ．Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ、発現プロファイリングは、膵臓がんのマイクロＲＮＡサインを同定する（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）。Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ、２００７．１２０（５）：ｐ．１０４６〜１０５４。
１９．Ｄｉｌｌｈｏｆｆ，Ｍ．、Ｊ．Ｌｉｕ、Ｗ．Ｆｒａｎｋｅｌ、Ｃ．ＣｒｏｃｅおよびＭ．Ｂｌｏｏｍｓｔｏｎ、マイクロＲＮＡ−２１は膵臓がん中で過剰発現しており、生存の潜在的予測因子である（ＭｉｃｒｏＲＮＡ−２１  ｉｓ  Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ａ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ  ｏｆ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ）。Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ  Ｓｕｒｇ、２００８。
２０．Ｖｏｌｉｎｉａ，Ｓ．、Ｇ．Ａ．Ｃａｌｉｎ、Ｃ．Ｇ．Ｌｉｕ、Ｓ．Ａｍｂｓ、Ａ．Ｃｉｍｍｉｎｏ、Ｆ．Ｐｅｔｒｏｃｃａ、Ｒ．Ｖｉｓｏｎｅ、Ｍ．Ｉｏｒｉｏ、Ｃ．Ｒｏｌｄｏ、Ｍ．Ｆｅｒｒａｃｉｎ、Ｒ．Ｌ．Ｐｒｕｅｉｔｔ、Ｎ．Ｙａｎａｉｈａｒａ、Ｇ．Ｌａｎｚａ、Ａ．Ｓｃａｒｐａ、Ａ．Ｖｅｃｃｈｉｏｎｅ、Ｍ．Ｎｅｇｒｉｎｉ、Ｃ．Ｃ．ＨａｒｒｉｓおよびＣ．Ｍ．Ｃｒｏｃｅ、ヒト固形腫瘍のマイクロＲＮＡ発現サインはがん遺伝子標的を規定する（Ａ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒｓ  ｄｅｆｉｎｅｓ  ｃａｎｃｅｒ  ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｓ）。Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、２００６．１０３（７）：ｐ．２２５７〜２２６１。
２１．Ｆｕｌｃｉ，Ｖ．、Ｓ．Ｃｈｉａｒｅｔｔｉ、Ｍ．Ｇｏｌｄｏｎｉ、Ｇ．Ａｚｚａｌｉｎ、Ｎ．Ｃａｒｕｃｃｉ、Ｓ．Ｔａｖｏｌａｒｏ、Ｌ．Ｃａｓｔｅｌｌａｎｏ、Ａ．Ｍａｇｒｅｌｌｉ、Ｆ．Ｃｉｔａｒｅｌｌａ、Ｍ．Ｍｅｓｓｉｎａ、Ｒ．Ｍａｇｇｉｏ、Ｎ．Ｐｅｒａｇｉｎｅ、Ｓ．Ｓａｎｔａｎｇｅｌｏ、Ｆ．Ｒ．Ｍａｕｒｏ、Ｐ．Ｌａｎｄｇｒａｆ、Ｔ．Ｔｕｓｃｈｌ、Ｄ．Ｂ．Ｗｅｉｒ、Ｍ．Ｃｈｅｉｎ、Ｊ．Ｊ．Ｒｕｓｓｏ、Ｊ．Ｊｕ、Ｒ．Ｓｈｅｒｉｄａｎ、Ｃ．Ｓａｎｄｅｒ、Ｍ．Ｚａｖｏｌａｎ、Ａ．Ｇｕａｒｉｎｉ、Ｒ．ＦｏａおよびＧ．Ｍａｃｉｎｏ、定量的技術は、慢性リンパ性白血病の新規マイクロＲＮＡプロファイルを確立する（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）。Ｂｌｏｏｄ、２００７．１０９（１１）：ｐ．４９４４〜４９５１。
２２．Ｇａｏ，Ｊ．、Ｔ．Ｔ．Ｙａｎｇ、Ｘ．Ｃ．Ｑｉｕ、Ｂ．Ｙｕ、Ｊ．Ｗ．Ｈａｎ、Ｑ．Ｙ．ＦａｎおよびＢ．Ａ．Ｍａ、［ヒト骨肉腫細胞系ＳＯＳＰ−９６０７からのマイクロＲＮＡのクローニングおよび同定（Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ＳＯＳＰ−９６０７）］。
Ａｉ  Ｚｈｅｎｇ、２００７．２６（６）：ｐ．５６１〜５６５。
２３．Ｉｏｒｉｏ，Ｍ．Ｖ．、Ｒ．Ｖｉｓｏｎｅ、Ｇ．Ｄｉ  Ｌｅｖａ、Ｖ．Ｄｏｎａｔｉ、Ｆ．Ｐｅｔｒｏｃｃａ、Ｐ．Ｃａｓａｌｉｎｉ、Ｃ．Ｔａｃｃｉｏｌｉ、Ｓ．Ｖｏｌｉｎｉａ、Ｃ．Ｇ．Ｌｉｕ、Ｈ．Ａｌｄｅｒ、Ｇ．Ａ．Ｃａｌｉｎ、Ｓ．ＭｅｎａｒｄおよびＣ．Ｍ．Ｃｒｏｃｅ、ヒト卵巣がんにおけるマイクロＲＮＡサイン（ＭｉｃｒｏＲＮＡ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ）。Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、２００７．６７（１８）：ｐ．８６９９〜８７０７。
２４．Ｌａｗｒｉｅ，Ｃ．Ｈ．、Ｓ．Ｓｏｎｅｊｉ、Ｔ．Ｍａｒａｆｉｏｔｉ、Ｃ．Ｄ．Ｃｏｏｐｅｒ、Ｓ．Ｐａｌａｚｚｏ、Ｊ．Ｃ．Ｐａｔｅｒｓｏｎ、Ｈ．Ｃａｔｔａｎ、Ｔ．Ｅｎｖｅｒ、Ｒ．Ｍａｇｅｒ、Ｊ．Ｂｏｕｌｔｗｏｏｄ、Ｊ．Ｓ．ＷａｉｎｓｃｏａｔおよびＣ．Ｓ．Ｈａｔｔｏｎ、マイクロＲＮＡ発現は、胚中心Ｂ細胞様サブタイプと活性化Ｂ細胞様サブタイプのびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫を識別する（ＭｉｃｒｏＲＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｄｉｎｓｔｉｎｇｕｉｓｈｅｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｇｅｒｍｉｎａｌ  ｃｅｎｔｅｒ  Ｂ  ｃｅｌｌ−ｌｉｋｅ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｂ  ｃｅｌｌ−ｌｉｋｅ  ｓｕｂｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ｄｉｆｆｕｓｅ  ｌａｒｇｅ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）。Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ、２００７．１２１（５）：ｐ．１１５６〜１１６１。
２５．Ｌａｗｒｉｅ，Ｃ．Ｈ．、Ｓ．Ｇａｌ、Ｈ．Ｍ．Ｄｕｎｌｏｐ、Ｂ．Ｐｕｓｈｋａｒａｎ、Ａ．Ｐ．Ｌｉｇｇｉｎｓ、Ｋ．Ｐｕｌｆｏｒｄ、Ａ．Ｈ．Ｂａｎｈａｍ、Ｆ．Ｐｅｚｚｅｌｌａ、Ｊ．Ｂｏｕｌｔｗｏｏｄ、Ｊ．Ｓ．Ｗａｉｎｓｃｏａｔ、Ｃ．Ｓ．ＨａｔｔｏｎおよびＡ．Ｌ．Ｈａｒｒｉｓ、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫の患者の血清中の腫瘍関連マイクロＲＮＡの上昇レベルの検出（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｔｕｍｏｕｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ  ｉｎ  ｓｅｒｕｍ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｄｉｆｆｕｓｅ  ｌａｒｇｅ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）。Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ、２００８．１４１（５）：ｐ．６７２〜６７５。
２６．Ｌｕｉ，Ｗ．Ｏ．、Ｎ．Ｐｏｕｒｍａｎｄ、Ｂ．Ｋ．ＰａｔｔｅｒｓｏｎおよびＡ．Ｆｉｒｅ、ヒト子宮頚がんにおける公知のおよび新規の低分子ＲＮＡのパターン（Ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｏｆ  ｋｎｏｗｎ  ａｎｄ  ｎｏｖｅｌ  ｓｍａｌｌ  ＲＮＡｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ）。Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、２００７．６７（１３）：ｐ．６０３１〜６０４３。
２７．Ｌｏｆｆｌｅｒ，Ｄ．、Ｋ．Ｂｒｏｃｋｅ−Ｈｅｉｄｒｉｃｈ、Ｇ．Ｐｆｅｉｆｅｒ、Ｃ．Ｓｔｏｃｓｉｔｓ、Ｊ．Ｈａｃｋｅｒｍｕｌｌｅｒ、Ａ．Ｋ．Ｋｒｅｔｚｓｃｈｍａｒ、Ｒ．Ｂｕｒｇｅｒ、Ｍ．Ｇｒａｍａｔｚｋｉ、Ｃ．Ｂｌｕｍｅｒｔ、Ｋ．Ｂａｕｅｒ、Ｈ．Ｃｖｉｊｉｃ、Ａ．Ｋ．Ｕｌｌｍａｎｎ、Ｐ．Ｆ．ＳｔａｄｌｅｒおよびＦ．Ｈｏｒｎ、多発性骨髄腫細胞のインターロイキン−６依存性生存は、高度保存エンハンサーを通したマイクロＲＮＡ−２１のＳｔａｔ３−媒介性誘導を伴う（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｓ  ｔｈｅ  Ｓｔａｔ３−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ−２１  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｅｎｈａｎｃｅｒ）。Ｂｌｏｏｄ、２００７．１１０（４）：ｐ．１３３０〜１３３３。
２８．Ｐｉｃｈｉｏｒｒｉ，Ｆ．、Ｓ．Ｓ．Ｓｕｈ、Ｍ．Ｌａｄｅｔｔｏ、Ｍ．Ｋｕｅｈｌ、Ｔ．Ｐａｌｕｍｂｏ、Ｄ．Ｄｒａｎｄｉ、Ｃ．Ｔａｃｃｉｏｌｉ、Ｎ．Ｚａｎｅｓｉ、Ｈ．Ａｌｄｅｒ、Ｊ．Ｐ．Ｈａｇａｎ、Ｒ．Ｍｕｎｋｅｒ、Ｓ．Ｖｏｌｉｎｉａ、Ｍ．Ｂｏｃｃａｄｏｒｏ、Ｒ．Ｇａｒｚｏｎ、Ａ．Ｐａｌｕｍｂｏ、Ｒ．Ｉ．ＡｑｅｉｌａｎおよびＣ．Ｍ．Ｃｒｏｃｅ、マイクロＲＮＡは、多発性骨髄腫発病に関連する重要な遺伝子を調節する（ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｇｅｎｅｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ  ｐａｔｈｐｇｅｎｅｓｉｓ）。Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、２００８．１０５（３５）：ｐ．１２８８５〜１２８９０。
２９．Ｓｌａｂｙ，Ｏ．、Ｍ．Ｓｖｏｂｏｄａ、Ｐ．Ｆａｂｉａｎ、Ｔ．Ｓｍｅｒｄｏｖａ、Ｄ．Ｋｎｏｆｌｉｃｋｏｖａ、Ｍ．Ｂｅｄｎａｒｉｋｏｖａ、Ｒ．ＮｅｎｕｔｉｌおよびＲ．Ｖｙｚｕｌａ、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−３１、ｍｉＲ−１４３およびｍｉＲ−１４５の異常発現は、結腸直腸がんの臨床病理学的特徴に関連する（Ａｌｔｅｒｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉＲ−２１，  ｍｉＲ−３１，  ｍｉＲ−１４３  ａｎｄ  ｍｉＲ−１４５  ｉｓ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ｃｌｉｎｉｃｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ）。Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、２００７．７２（５６）：ｐ．３９７〜４０２。
３０．Ｃｈａｎ，Ｓ．Ｈ．、Ｃ．Ｗ．Ｗｕ、Ａ．Ｆ．Ｌｉ、Ｃ．Ｗ．ＣｈｉおよびＷ．Ｃ．Ｌｉｎ、ヒト胃癌におけるｍｉＲ−２１マイクロＲＮＡ発現およびその臨床的関連性（ｍｉＲ−２１  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）。Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、２００８．２８（２Ａ）：ｐ．９０７〜９１１。
３１．Ｓｃｈｅｔｔｅｒ，Ａ．Ｊ．、Ｓ．Ｙ．Ｌｅｕｎｇ、Ｊ．Ｊ．Ｓｏｈｎ、Ｋ．Ａ．Ｚａｎｅｔｔｉ、Ｅ．Ｄ．Ｂｏｗｍａｎ、Ｎ．Ｙａｎａｉｈａｒａ、Ｓ．Ｔ．Ｙｕｅｎ、Ｔ．Ｌ．Ｃｈａｎ、Ｄ．Ｌ．Ｋｗｏｎｇ、Ｇ．Ｋ．Ａｕ、Ｃ．Ｇ．Ｌｉｕ、Ｇ．Ａ．Ｃａｌｉｎ、Ｃ．Ｍ．ＣｒｏｃｅおよびＣ．Ｃ．Ｈａｒｒｉｓ、結腸腺癌における予後および治療成績と関連するマイクロＲＮＡ発現プロファイル（ＭｉｃｒｏＲＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｉｎ  ｃｏｌｏｎ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）。ＪＡＭＡ、２００８．２９９（４）：ｐ．４２５〜４３６。
３２．Ｚｈａｎｇ，Ｚ．、Ｚ．Ｌｉ、Ｃ．Ｇａｏ、Ｐ．Ｃｈｅｎ、Ｊ．Ｃｈｅｎ、Ｗ．Ｌｉｕ、Ｓ．ＸｉａｏおよびＨ．Ｌｕ、ｍｉＲ−２１は、胃がん発病および進行における重要な役割を果たす（ｍｉＲ−２１  ｐｌａｙｓ  ａ  ｐｉｖｏｔａｌ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ）。Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ、２００８。
３３．Ｔｒａｎ，Ｎ．、Ｔ．ＭｃＬｅａｎ、Ｘ．Ｚｈａｎｇ、Ｃ．Ｊ．Ｚｈａｏ、Ｊ．Ｍ．Ｔｈｏｍｓｏｎ、Ｃ．Ｏ’ＢｒｉｅｎおよびＢ．Ｒｏｓｅ、頭頸部がん細胞系におけるマイクロＲＮＡ発現プロファイル（ＭｉｃｒｏＲＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｉｎ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ）。
Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ、２００７．３５８（１）：ｐ．１２〜１７。
３４．Ｃｈａｎｇ，Ｓ．Ｓ．、Ｗ．Ｗ．Ｊｉａｎｇ、Ｉ．Ｓｍｉｔｈ、Ｌ．Ｍ．Ｐｏｅｔａ、Ｓ．Ｂｅｇｕｍ、Ｃ．Ｇｌａｚｅｒ、Ｓ．Ｓｈａｎ、Ｗ．Ｗｅｓｔａ、Ｄ．ＳｉｄｒａｎｓｋｙおよびＪ．Ａ．Ｃａｌｉｆａｎｏ、頭頸部扁平上皮癌におけるマイクロＲＮＡ異常（ＭｉｃｒｏＲＮＡ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）。Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ、２００８．１２３（１２）：ｐ．２７９１〜２７９７。
３５．Ｆｅｂｅｒ，Ａ．、Ｌ．Ｘｉ、Ｊ．Ｄ．Ｌｕｋｅｔｉｃｈ、Ａ．Ｐｅｎｎａｔｈｕｒ、Ｒ．Ｊ．Ｌａｎｄｒｅｎｅａｕ、Ｍ．Ｗｕ、Ｓ．Ｊ．Ｓｗａｎｓｏｎ、Ｔ．Ｅ．ＧｏｄｆｒｅｙおよびＶ．Ｒ．Ｌｉｔｌｅ、食道がんにおけるマイクロＲＮＡ発現プロファイル（ＭｉｃｒｏＲＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｏｆ  ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ  ｃａｎｃｅｒ）。Ｊ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｓｕｒｇ、２００８．１３５（２）：ｐ．２５５〜２６０；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ２６０。
３６．Ｗａｎｇ，Ｔ．、Ｘ．Ｚｈａｎｇ、Ｌ．Ｏｂｉｊｕｒｕ、Ｊ．Ｌａｓｅｒ、Ｖ．Ａｒｉｓ、Ｐ．Ｌｅｅ、Ｋ．Ｍｉｔｔａｌ、Ｐ．ＳｏｔｅｒｏｐｏｕｌｏｓおよびＪ．Ｊ．Ｗｅｉ、ヒト子宮筋腫におけるレース、腫瘍サイズおよび標的遺伝子活性に関連するマイクロＲＮＡサイン（Ａ  ｍｉｃｒｏ−ＲＮＡ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｒａｃｅ，  ｔｕｍｏｒ  ｓｉｚｅ，  ａｎｄ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｕｔｅｒｉｎｅ  ｌｅｉｏｍｙｏｍａｓ）。Ｇｅｎｅｓ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ、２００７．４６（４）：ｐ．３３６〜３４７。
３７．Ａｍａｒａｌ，Ｆ．Ｃ．、Ｎ．Ｔｏｒｒｅｓ、Ｆ．Ｓａｇｇｉｏｒｏ、Ｌ．Ｎｅｄｅｒ、Ｈ．Ｒ．Ｍａｃｈａｄｏ、Ｗ．Ａ．Ｓｉｌｖａ，Ｊｒ．、Ａ．Ｃ．ＭｏｒｅｉｒａおよびＭ．Ｃａｓｔｒｏ、ＡＣＴＨ分泌下垂体腫瘍で差次的に発現するマイクロＲＮＡ（ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ＡＣＴＨ−ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  ｔｕｍｏｒｓ）。Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ、２００８。
３８．Ｍａｒｋｏｕ，Ａ．、Ｅ．Ｇ．Ｔｓａｒｏｕｃｈａ、Ｌ．Ｋａｋｌａｍａｎｉｓ、Ｍ．Ｆｏｔｉｎｏｕ、Ｖ．ＧｅｏｒｇｏｕｌｉａｓおよびＥ．Ｓ．Ｌｉａｎｉｄｏｕ、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによる非小細胞肺がんにおける成熟マイクロＲＮＡ−２１およびマイクロＲＮＡ−２０５過剰発現の予後値（Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｖａｌｕｅ  ｏｆ  ｍａｔｕｒｅ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ−２１  ａｎｄ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ−２０５  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｂｙ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ）。Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ、２００８．５４（１０）：ｐ．１６９６〜１７０４。
３９．Ｎａｍ，Ｅ．Ｊ．、Ｈ．Ｙｏｏｎ、Ｓ．Ｗ．Ｋｉｍ、Ｈ．Ｋｉｍ、Ｙ．Ｔ．Ｋｉｍ、Ｊ．Ｈ．Ｋｉｍ、Ｊ．Ｗ．ＫｉｍおよびＳ．Ｋｉｍ、漿液性卵巣癌におけるマイクロＲＮＡ発現プロファイル（ＭｉｃｒｏＲＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｉｎ  ｓｅｒｏｕｓ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）。Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、２００８．１４（９）：ｐ．２６９０〜２６９５。
４０．Ｎｅｅｌｙ，Ｌ．Ａ．、Ｋ．Ｍ．Ｒｉｅｇｅｒ−Ｃｈｒｉｓｔ、Ｂ．Ｓ．Ｎｅｔｏ、Ａ．Ｅｒｏｓｈｋｉｎ、Ｊ．Ｇａｒｖｅｒ、Ｓ．Ｐａｔｅｌ、Ｎ．Ａ．Ｐｈｕｎｇ、Ｓ．ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ、Ｊ．Ａ．Ｌｉｂｅｒｔｉｎｏ、Ｄ．ＷｈｉｔｎｅｙおよびＩ．Ｃ．Ｓｕｍｍｅｒｈａｙｅｓ、膀胱腫瘍における浸潤表現型を規定するマイクロＲＮＡ発現比率（Ａ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｒａｔｉｏ  ｄｅｆｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｉｎ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｔｕｍｏｒｓ）。
Ｕｒｏｌ  Ｏｎｃｏｌ、２００８。
４１．Ｂｅｔｅｌ，Ｄ．、Ｍ．Ｗｉｌｓｏｎ、Ａ．Ｇａｂｏｗ、Ｄ．Ｓ．ＭａｒｋｓおよびＣ．Ｓａｎｄｅｒ、マイクロＲＮＡ。生物資源：標的および発現（Ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ．ｏｒｇ  ｒｅｓｏｕｒｃｅ：ｔａｒｇｅｔｓ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）。Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２００８．３６（ｓｕｐｐｌ＿１）：ｐ．Ｄ１４９〜１５３。
【０２４１】
特定の実施形態の前述の説明は、本発明の一般的性質を十分に明らかにしているので、現状の知識を適用することによって、不当な実験を要することなく、かつ一般的概念から逸脱することなく、このような特定の実施形態を種々の用途のために容易に修正および／または適合させることができ、それゆえ、このような適合および修正は、開示の実施形態と同等の意味および範囲内にあると理解されるべきであり、そのように意図されている。本明細書で使用される用語および専門用語は、説明を目的とするものであって、限定を目的とするものではない。種々の開示されている機能を実施するための手段、材料およびステップは、本発明から逸脱することなく、種々の代替形態をとることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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