【手続補正書】
【提出日】平成21年8月11日(2009.8.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式：
【化１】
2009511423.tif 000001
［式中、Ｒは、Ｒ1又はＲ2を表し；
Ａｃは、アセチル基を表し；
Ｒ1は、ＯＭ又はＯＨを表し（ここで、Ｍは、薬剤学的に許容しうる塩を形成する金属を表す）；
Ｒ2は、Ｐｈ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯＯ−（ＣＨ2）1-18−ＮＨ−を表す（ここで、Ｐｈは、フェニルを表す）］で表される構造単位の繰り返し構造を基本骨格として有するヒアルロン酸又はその塩（ただし、該ヒアルロン酸又はその塩において、すべてのＲがＲ1を表すことはない）を有効成分として含有する角膜上皮層障害予防又は治療剤。
【請求項２】
Ｍが、Ｎａである、請求項１記載の角膜上皮層障害予防又は治療剤。
【請求項３】
ヒアルロン酸又はその塩の二糖繰り返し単位のモル当量に対する、ＲがＲ2を表す構造単位のモル当量の割合が、５〜３０％である、請求項１又は２記載の角膜上皮層障害予防又は治療剤。
【請求項４】
有効成分の濃度が、０．０２〜５重量％である、請求項１〜３のいずれか１項記載の角膜上皮層障害予防又は治療剤。
【請求項５】
有効成分の濃度が、０．１〜０．６重量％である、請求項１〜４のいずれか１項記載の角膜上皮層障害予防又は治療剤。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
７）  好ましいＧＡＧ構成単位
本発明の粘膜適用剤に含まれる、結合鎖を介して疎水基が導入されたＧＡＧの代表例としては、具体的には、Ｐｈ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯＯ−（ＣＨ2）m−ＮＨ−；Ｐｈ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯＯ−ＣＨ2−（ＯＣＨ2）n−ＮＨ−；Ｐｈ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯＮＨ−（ＣＨ2）m−ＮＨ−；Ｐｈ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯＮＨ−ＣＨ2−（ＯＣＨ2）n−ＮＨ−；Ｐｈ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯＯ−（ＣＨ2）m−Ｏ−；Ｐｈ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯＯ−ＣＨ2−（ＯＣＨ2）n−Ｏ−；Ｐｈ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯＮＨ−（ＣＨ2）m−Ｏ−；Ｐｈ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯＮＨ−ＣＨ2−（ＯＣＨ2）n−Ｏ−；ＣＨ3−（ＣＨ2）l−ＣＯＯ−Ｐｈ−ＣＯＮＨ−（ＣＨ2）m−ＮＨ−又はＣＨ3−（ＣＨ2）l−ＣＯＯ−Ｐｈ−ＣＯＮＨ−ＣＨ2−（ＯＣＨ2）n−ＮＨ−（ここで、Ｐｈは、フェニル基を表し、ｍ及びｎは、それぞれ１〜１８の整数を表し、そしてｌは、０又は１〜１８の整数を表す）が導入されたＧＡＧを有効成分として含む粘膜適用剤を挙げることができる。
下記のＧＡＧは、代表例として挙げることができる。
化学式１：
【化２】
2009511423.tif 000002
［式中、Ｒは、Ｒ1又はＲ2を表し；
Ａｃは、アセチル基を表し；
Ｒ1は、ＯＮａ又はＯＨを表し；
Ｒ2は、（１）  Ｐｈ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯＯ−（ＣＨ2）m−ＮＨ−；
（２）  Ｐｈ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯＯ−ＣＨ2−（ＯＣＨ2）n−ＮＨ−；
（３）  Ｐｈ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯＮＨ−（ＣＨ2）m−ＮＨ−；
（４）  Ｐｈ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯＮＨ−ＣＨ2−（ＯＣＨ2）n−ＮＨ−；
（５）  Ｐｈ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯＯ−（ＣＨ2）m−Ｏ−；
（６）  Ｐｈ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯＯ−ＣＨ2−（ＯＣＨ2）n−Ｏ−；
（７）  Ｐｈ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯＮＨ−（ＣＨ2）m−Ｏ−；
（８）  Ｐｈ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯＮＨ−ＣＨ2−（ＯＣＨ2）n−Ｏ−；
（９）  ＣＨ3−（ＣＨ2）l−ＣＯＯ−Ｐｈ−ＣＯＮＨ−（ＣＨ2）m−ＮＨ−；又は
（１０）  ＣＨ3−（ＣＨ2）l−ＣＯＯ−Ｐｈ−ＣＯＮＨ−ＣＨ2−（ＯＣＨ2）n−ＮＨ−を表す（ここで、Ｐｈは、フェニル基を表し、ｍ及びｎは、それぞれ１〜１８の整数を表し、そしてｌは、０又は１〜１８の整数を表す）］で表される構造単位の繰り返し構造を基本骨格として有するＧＡＧ［ここで、ＧＡＧの二糖繰り返し単位のモル当量に対する、ＲがＲ2を表す上記構造単位のモル当量の割合は、５〜３０％である］。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
＜実施例５＞
ウサギ角膜上皮の治癒に及ぼすケイ皮酸誘導体導入ＨＡの効果
外科的切除をしたウサギ角膜上皮の治癒に及ぼす、実施例１で調製したケイ皮酸誘導体導入ＨＡの効果（外科的モデル）。
（５−１）  方法
１）  角膜上皮の外科的切除（外科的モデル）
５mg/kgのケタミン及び２mg/kgのキシラジンの静脈内注射、並びに０．４％オキシブプロカイン塩酸塩の局所投与による麻酔後、角膜上皮の中央部を、トレフィン（内径８mm）、２３Ｇ注射針及びマイクロ剪刀を用いることにより切除した。
２）  局所投与
角膜上皮を剥離して１時間及び４時間後、生理食塩水１５０μlを対照物質として左眼に投与し、上記実施例（１−２）で調製した０．５重量％のケイ皮酸誘導体導入ＨＡ溶液１５０μlを被験物質として右眼に投与した。剥離の１日及び２日後、３時間間隔で全部で４回、そして剥離の３日後、３時間間隔で、上記と同じ投与を実施した。投与には、１mlの注射シリンジを使用した。上記１）に記載された角膜上皮層障害のモデルウサギ６羽を投与対象として使用した。
３）  角膜上皮欠損部の撮影
ウサギに５mg/kgのケタミン及び２mg/kgのキシラジンの静脈内注射により全身麻酔をかけ、次に角膜上皮消失部位を、ＰＢＳに溶解した０．２％フルオレセインナトリウムで染色して、紫外線下で撮影した。撮影は、角膜を剥離して１時間後の被験物質の投与の直前、及び剥離の３日後の最終投与の３時間後に実施した。撮影時、焦点距離は、写真の倍率が一定になるように一定にした。
４）  角膜上皮欠損部の測定
フルオレセインナトリウムで染色した角膜上皮欠損部の面積は、プリントした写真上で画像解析装置を用いて測定した。角膜上皮の剥離を実施してから１時間後の被験物質の投与の直前の剥離部位の面積（剥離面積）から、剥離の３日後の最終投与の３時間後の剥離部位の面積を差し引くことにより得られた値を「治癒面積」とした。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
＜実施例６＞
ウサギ角膜上皮の治癒に及ぼす０．５％ケイ皮酸誘導体導入ＨＡの効果
外科的切除をしたウサギ角膜上皮の治癒に及ぼす、実施例１で調製したケイ皮酸誘導体導入ＨＡの効果（外科的モデル）。
（６−１）  方法
１）  角膜上皮の外科的切除（外科的モデル）
５mg/kgのケタミン及び２mg/kgのキシラジンの静脈内注射、並びに０．４％オキシブプロカイン塩酸塩の局所投与による麻酔後、角膜上皮の中央部を、トレフィン（内径８mm）、２３Ｇ注射針及びマイクロ剪刀を用いることにより切除した。
２）  局所投与
角膜上皮を剥離して１時間及び４時間後、生理食塩水１５０μlを対照物質として左眼に投与し、上記実施例（１−２）で調製した０．５重量％のケイ皮酸誘導体導入ＨＡ溶液１５０μlを被験物質として右眼に投与した。剥離の１日及び２日後、３時間間隔で全部で４回、そして剥離の３日後、３時間間隔で、上記と同じ投与を実施した。投与には、１mlの注射シリンジを使用した。上記１）に記載された角膜上皮層障害のモデルウサギ１４羽を投与対象として使用した。
３）  角膜上皮欠損部の撮影
ウサギに５mg/kgのケタミン及び２mg/kgのキシラジンの静脈内注射により全身麻酔をかけ、次に角膜上皮消失部位を、ＰＢＳに溶解した０．２％フルオレセインナトリウムで染色して、紫外線下で撮影した。撮影は、角膜を剥離して１時間後の被験物質の投与の直前、及び剥離の１〜３日後の２回目投与の３時間後に実施した。撮影時、焦点距離は、写真の倍率が一定になるように一定にした。
４）  角膜上皮欠損部の測定
フルオレセインナトリウムで染色した角膜上皮欠損部の面積は、プリントした写真上で画像解析装置を用いて測定した。角膜上皮を剥離してから１時間後の被験物質の投与の直前の剥離部位の面積（剥離面積）から、剥離の３日後の最終投与の３時間後の剥離部位の面積を差し引くことにより得られた値を「治癒面積」とした。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
＜実施例７＞
ウサギ角膜上皮の治癒に及ぼす０．３％ケイ皮酸誘導体導入ＨＡの効果
外科的切除をしたウサギ角膜上皮の治癒に及ぼす、実施例１で調製したケイ皮酸誘導体導入ＨＡの効果（外科的モデル）。
（７−１）  方法
１）  角膜上皮の外科的切除（外科的モデル）
５mg/kgのケタミン及び２mg/kgのキシラジンの静脈内注射、並びに０．４％オキシブプロカイン塩酸塩の局所投与による麻酔後、角膜上皮の中央部を、トレフィン（内径８mm）、２３Ｇ注射針及びマイクロ剪刀を用いることにより切除した。
２）  局所投与
角膜上皮を剥離して１時間及び４時間後、生理食塩水１５０μlを対照物質として左眼に投与し、上記実施例（１−２）で調製した０．３重量％のケイ皮酸誘導体導入ＨＡ溶液１５０μlを被験物質として右眼に投与した。剥離の１日及び２日後、３時間間隔で全部で４回、そして剥離の３日後、３時間間隔で、上記と同じ投与を実施した。投与には、１mlの注射シリンジを使用した。上記１）に記載された角膜上皮層障害のモデルウサギ１４羽を投与対象として使用した。
３）  角膜上皮欠損部の撮影
ウサギに５mg/kgのケタミン及び２mg/kgのキシラジンの静脈内注射により全身麻酔をかけ、次に角膜上皮消失部位を、ＰＢＳに溶解した０．２％フルオレセインナトリウムで染色して、紫外線下で撮影した。撮影は、角膜を剥離して１時間後の被験物質の投与の直前、及び剥離の１〜３日後の２回目投与の３時間後に実施した。撮影時、焦点距離は、写真の倍率が一定になるように一定にした。
４）  角膜上皮欠損部の測定
フルオレセインナトリウムで染色した角膜上皮欠損部の面積は、プリントした写真上で画像解析装置を用いて測定した。角膜上皮を剥離してから１時間後の被験物質の投与の直前の剥離部位の面積（剥離面積）から、剥離の３日後の最終投与の３時間後の剥離部位の面積を差し引くことにより得られた値を「治癒面積」とした。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
＜実施例８＞
ウサギ角膜上皮の治癒に及ぼす０．１％ケイ皮酸誘導体導入ＨＡの効果（０．１重量％のケイ皮酸誘導体導入ＨＡ水溶液及び０．１重量％のＨＡ水溶液、１日４回の点眼）
外科的切除をしたウサギ角膜上皮の治癒に及ぼす、実施例１で調製したケイ皮酸誘導体導入ＨＡの効果（外科的モデル）。
（８−１）  方法
１）  角膜上皮の外科的切除（外科的モデル）
５mg/kgのケタミン及び２mg/kgのキシラジンの静脈内注射、並びに０．４％オキシブプロカイン塩酸塩の局所投与による麻酔後、角膜上皮の中央部を、トレフィン（内径８mm）、２３Ｇ注射針及びマイクロ剪刀を用いることにより切除した。
２）  局所投与
角膜上皮を剥離して１時間及び４時間後、重量平均分子量６００，０００〜１，２００，０００のＨＡの０．１重量％水溶液１５０μlを対照物質として左眼に投与し、上記実施例（１−２）で調製した０．１重量％のケイ皮酸誘導体導入ＨＡ溶液１５０μlを被験物質として右眼に投与した。剥離の１日及び２日後、３時間間隔で全部で４回、そして剥離の３日後、３時間間隔で、上記と同じ投与を実施した。投与には、１mlの注射シリンジを使用した。上記１）に記載された角膜上皮層障害のモデルウサギ８羽を投与対象として使用した。
３）  角膜上皮欠損部の撮影
ウサギに５mg/kgのケタミン及び２mg/kgのキシラジンの静脈内注射により全身麻酔をかけ、次に角膜上皮消失部位を、ＰＢＳに溶解した０．２％フルオレセインナトリウムで染色して、紫外線下で撮影した。撮影は、角膜を剥離して１時間後の被験物質の投与の直前、及び剥離の１〜３日後の２回目投与の３時間後に実施した。撮影時、焦点距離は、写真の倍率が一定になるように一定にした。
４）  角膜上皮欠損部の測定
フルオレセインナトリウムで染色した角膜上皮欠損部の面積は、プリントした写真上で画像解析装置を用いて測定した。角膜上皮を剥離してから１時間後の被験物質の投与の直前の剥離部位の面積（剥離面積）から、剥離の３日後の最終投与の３時間後の剥離部位の面積を差し引くことにより得られた値を「治癒面積」とした。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
＜実施例９＞
ウサギ角膜上皮の治癒に及ぼす０．１％ケイ皮酸誘導体導入ＨＡの効果（０．１重量％のケイ皮酸誘導体導入ＨＡ水溶液及び０．１重量％のＨＡ水溶液、１日１回の点眼）
外科的切除をしたウサギ角膜上皮の治癒に及ぼす、実施例１で調製したケイ皮酸誘導体導入ＨＡの効果（外科的モデル）。
（９−１）  方法
１）  角膜上皮の外科的切除（外科的モデル）
５mg/kgのケタミン及び２mg/kgのキシラジンの静脈内注射、並びに０．４％オキシブプロカイン塩酸塩の局所投与による麻酔後、角膜上皮の中央部を、トレフィン（内径８mm）、２３Ｇ注射針及びマイクロ剪刀を用いることにより切除した。
２）  局所投与
角膜上皮を剥離して１時間後、重量平均分子量６００，０００〜１，２００，０００のＨＡの０．１重量％水溶液１５０μlを対照物質として左眼に投与し、上記実施例（１−２）で調製した０．１重量％のケイ皮酸誘導体導入ＨＡ溶液１５０μlを被験物質として右眼に投与した。更には、剥離の１〜３日後に１日１回、上記と同じ投与を実施した。投与には、１mlの注射シリンジを使用した。上記１）に記載された角膜上皮層障害のモデルウサギ８羽を投与対象として使用した。
３）  角膜上皮欠損部の撮影
ウサギに５mg/kgのケタミン及び２mg/kgのキシラジンの静脈内注射により全身麻酔をかけ、次に角膜上皮消失部位を、ＰＢＳに溶解した０．２％フルオレセインナトリウムで染色して、紫外線下で撮影した。撮影は、角膜を剥離して１時間後の被験物質の投与の直前、及び剥離の１〜３日後の投与の６時間後に実施した。撮影時、焦点距離は、写真の倍率が一定になるように一定にした。
４）  角膜上皮欠損部の測定
フルオレセインナトリウムで染色した角膜上皮欠損部の面積は、プリントした写真上で画像解析装置を用いて測定した。角膜上皮を剥離してから１時間後の被験物質の投与の直前の剥離部位の面積（剥離面積）から、剥離の３日後の最終投与の３時間後の剥離部位の面積を差し引くことにより得られた値を「治癒面積」とした。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
＜実施例１１＞
紫外線に曝露後のウサギの眼に及ぼす０．３％ケイ皮酸誘導体導入ＨＡの効果
角膜表層の障害を有するウサギに及ぼす、実施例１で調製したケイ皮酸誘導体導入ＨＡの保護作用
（１１−１）  試験手順
１）  ウサギの麻酔及び眼の開瞼
ウサギに、５mg/kgのケタミン及び２mg/kgのキシラジンの静脈内注射により麻酔を導入して、イソフルランの吸入により麻酔を維持した。次に、小児用開瞼器を用いて眼瞼を常に開かせた。
２）  被験物質及び対照物質の投与
眼を開かせた状態で、重量平均分子量６００，０００〜１，２００，０００のＨＡの０．３重量％水溶液１５０μlを対照物質として右眼に投与し、上記実施例（１−２）で調製した０．３重量％のケイ皮酸誘導体導入ＨＡ  １５０μlを被験物質として左眼に投与した。投与には、１mlの注射シリンジを使用した。上記１）に記載されたウサギ１羽を投与対象として使用した。
３）  ウサギ角膜への紫外線の照射
紫外線は、ウサギの眼球から約１０cm離した距離から、１５kWの殺菌灯を用いて両眼に照射した。照射は３時間実施した。
４）  紫外線照射部位の撮影
ウサギの継続麻酔下で眼球を０．２％フルオレセインナトリウムで染色して、紫色灯下で撮影した。撮影時、焦点距離は、写真の倍率が一定になるように一定にした。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７４】
（１５−２）  ヘキサデシルアミン導入ヒアルロン酸ナトリウムの調製
ヘキサデシルアミンの３０mg/３mL溶液（エタノール：０．１Ｍ  ＨＣｌ＝１：１）、ＤＭＴ−ＭＭ（和光純薬工業株式会社）の０．１Ｍ溶液（エタノール：水＝１：１）１．２５mLを、水（５０mL）／エタノール（５０mL）中のヒアルロン酸ナトリウム（５０１mg、１．２５mmol／二糖単位、重量平均分子量９００，０００）の溶液に加えた。この混合物を一晩撹拌して、炭酸水素ナトリウム（日本薬局方）の３８１mg/５mL水溶液を加えた。更に５時間撹拌後、酢酸（１０７mg）及び塩化ナトリウム（４９７mg）で反応を停止させた。エタノール（２５０mL）を加えて、生じた沈殿物を濾別して、順に８０％エタノール、エタノールで２回洗浄した。固体を真空で乾燥することにより、白色の固体（４９７mg）を得た。ヘキサデシルアミンの導入率は、ＨＰＬＣによると１２％であった。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７６】
＜実施例１６＞
ウサギ角膜上皮の治癒に及ぼす０．１％ケイ皮酸誘導体導入ＨＡの効果
外科的切除をしたウサギ角膜上皮の治癒に及ぼす、実施例１で調製したケイ皮酸誘導体導入ＨＡの効果（外科的モデル）。
（１６−１）  方法
１）  角膜上皮の外科的切除（外科的モデル）
５mg/kgのケタミン及び２mg/kgのキシラジンの静脈内注射、並びに０．４％オキシブプロカイン塩酸塩の局所投与による麻酔後、角膜上皮の中央部を、トレフィン（内径８mm）、２３Ｇ注射針及びマイクロ剪刀を用いることにより切除した。
２）  局所投与
角膜上皮を剥離して１時間及び４時間後、生理食塩水１５０μlを対照物質として左眼に投与し、上記実施例（１−２）で調製した０．１重量％のケイ皮酸誘導体導入ＨＡ溶液１５０μlを被験物質として右眼に投与した。剥離の１日及び２日後、３時間間隔で全部で４回、そして剥離の３日後、３時間間隔で、上記と同じ投与を実施した。投与には、１mlの注射シリンジを使用した。上記１）に記載された角膜上皮層障害のモデルウサギ１４羽を投与対象として使用した。
３）  角膜上皮欠損部の撮影
ウサギに５mg/kgのケタミン及び２mg/kgのキシラジンの静脈内注射により全身麻酔をかけ、次に角膜上皮消失部位を、ＰＢＳに溶解した０．２％フルオレセインナトリウムで染色して、紫外線下で撮影した。撮影は、角膜を剥離して１時間後の被験物質の投与の直前、及び剥離の１〜３日後の２回目投与の３時間後に実施した。撮影時、焦点距離は、写真の倍率が一定になるように一定にした。
４）  角膜上皮欠損部の測定
フルオレセインナトリウムで染色した角膜上皮欠損部の面積は、プリントした写真上で画像解析装置を用いて測定した。角膜上皮を剥離してから１時間後の被験物質の投与の直前の剥離部位の面積（剥離面積）から、剥離の３日後の最終投与の３時間後の剥離部位の面積を差し引くことにより得られた値を「治癒面積」とした。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７８】
＜実施例１７＞
ウサギ角膜上皮の治癒に及ぼす０．１％オクチルアミン導入ＨＡ及びヘキサデシルアミン導入ＨＡの効果
外科的切除をしたウサギ角膜上皮の治癒に及ぼす、実施例１５で調製したオクチルアミン導入ＨＡ及びヘキサデシルアミン導入ＨＡの効果（外科的モデル）。
（１７−１）  方法
１）  角膜上皮の外科的切除（外科的モデル）
５mg/kgのケタミン及び２mg/kgのキシラジンの静脈内注射、並びに０．４％オキシブプロカイン塩酸塩の局所投与による麻酔後、角膜上皮の中央部を、トレフィン（内径８mm）、２３Ｇ注射針及びマイクロ剪刀を用いることにより切除した。
２）  局所投与
角膜上皮を剥離して１時間及び４時間後、生理食塩水１５０μlを対照物質として左眼に投与し、上記実施例（１５−２）で調製した０．１重量％のオクチルアミン導入ＨＡ及びヘキサデシルアミン導入ＨＡ溶液１５０μlを被験物質として右眼に投与した。剥離の１日及び２日後、３時間間隔で全部で４回、そして剥離の３日後、３時間間隔で、上記と同じ投与を実施した。投与には、１mlの注射シリンジを使用した。上記１）に記載された角膜上皮層障害のモデルウサギ８羽を投与対象として使用した。
３）  角膜上皮欠損部の撮影
ウサギに５mg/kgのケタミン及び２mg/kgのキシラジンの静脈内注射により全身麻酔をかけ、次に角膜上皮消失部位を、ＰＢＳに溶解した０．２％フルオレセインナトリウムで染色して、紫外線下で撮影した。撮影は、角膜を剥離して１時間後の被験物質の投与の直前、及び剥離の１〜３日後の２回目投与の３時間後に実施した。撮影時、焦点距離は、写真の倍率が一定になるように一定にした。
４）  角膜上皮欠損部の測定
フルオレセインナトリウムで染色した角膜上皮欠損部の面積は、プリントした写真上で画像解析装置を用いて測定した。角膜上皮を剥離してから１時間後の被験物質の投与の直前の剥離部位の面積（剥離面積）から、剥離の３日後の最終投与の３時間後の剥離部位の面積を差し引くことにより得られた値を「治癒面積」とした。