【手続補正書】
【提出日】平成21年2月25日(2009.2.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトにおける神経変性疾患を判定する方法であって、前記神経変性疾患はＫＣＮＣ３遺伝子の変異に起因し、前記方法は、前記ヒトからのＤＮＡを含む試料において、電位依存性カリウムチャネルＫＣＮＣ３をコードする遺伝子内の点突然変異を検出することを含み、そして、前記変異が、前記カリウムチャネルの遺伝子構造を変えて該カリウムチャンネルの機能を障害し、神経変性疾患を惹起する、方法。
【請求項２】
前記変異がドットブロットハイブリダイゼーションによって検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記変異がサザンブロットハイブリダイゼーションによって検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記試料が増幅され、前記変異が前記増幅産物を配列決定することによって検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記変異が前記電位依存性カリウムチャネルの保存ドメイン内に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記保存ドメインがイオン選択孔および電圧センサドメインからなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記変異がＲ４２０Ｈ、Ｒ４１７Ｈ、およびＦ４４８Ｌからなる群から選択されるアミノ酸置換を引き起こす、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ヒトが、てんかん、精神遅滞、小脳性運動失調、錐体外路症状、構音障害、動眼異常、運動ニューロン徴候、認知減退、自律神経障害、感覚障害および精神医学的症状からなる群から選択される表現型の１以上を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記神経変性疾患が、脊髄小脳失調である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ヒトにおける脊髄小脳失調を判定する方法であって、前記ヒト由来のＤＮＡを含む試料において、電位依存性カリウムチャネルＫＣＮＣ３をコードする遺伝子内の変異を検出することを含み、そして、前記変異が、ＫＣＮＣ３遺伝子におけるＲ４２０Ｈのアミノ酸置換を惹起する、方法。
【請求項１１】
前記変異がドットブロットハイブリダイゼーションによって検出される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記変異がサザンブロットハイブリダイゼーションによって検出される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記試料が増幅され、前記変異が前記増幅産物を配列決定することによって検出される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
核酸試料中でＫＣＮＣ３遺伝子の変異を検出する方法であって、以下の工程：
ａ）個体から得た試料中のＫＣＮＣ３遺伝子のＤＮＡシークエンスを解析すること；および
ｂ）試料中のＫＣＮＣ３遺伝子のＤＮＡシークエンスと野生型ＫＣＮＣ３遺伝子のＤＮＡシークエンスとを比較すること、
を含み、個体より得た試料のＤＮＡシークエンスと野生型ＤＮＡシークエンスとの間の違いが、個体より得た試料のＫＣＮＣ３遺伝子の変異を示す、方法。
【請求項１５】
前記変異がドットブロットハイブリダイゼーションによって検出される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記変異がサザンブロットハイブリダイゼーションによって検出される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記試料が増幅され、前記変異が前記増幅産物を配列決定することによって検出される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記変異がＲ４２０Ｈ、Ｒ４１７Ｈ、およびＦ４４８Ｌからなる群から選択されるアミノ酸置換を引き起こす、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記変異が、ヌクレオチド位置１５５４でグアニンをアデニンにする置換、ヌクレオチド位置１６３９でシトシンをアデニンにする置換からなる群から選択される、ヌクレオチド置換を惹起する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
ヒトにおけるＳＣＡ１３を判定する方法であって、前記方法は、前記ヒトからのＤＮＡを含む試料において、電位依存性カリウムチャネルＫＣＮＣ３をコードする遺伝子内の変異を検出することを含み、そして、前記変異が、ＫＣＮＣ３遺伝子のヌクレオチド位置１５５４のグアニンをアデニンに置換することを惹起する、方法。
【請求項２１】
ヒトにおけるＳＣＡ１３を判定する方法であって、前記方法は、前記ヒトからのＤＮＡを含む試料において、電位依存性カリウムチャネルＫＣＮＣ３をコードする遺伝子内の変異を検出することを含み、そして、前記変異が、ＫＣＮＣ３遺伝子のヌクレオチド位置１６３９のシトシンをアデニンに置換することを惹起する、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
ＫＣＮＣ３がＫ＋チャネルのＳｈａｗサブファミリーに属する電位依存性カリウムチャネルをコードすることから、ここで、神経変性疾患に関与する、カリウムチャネルと同じまたは関連するファミリーに属する他の電位依存性カリウムチャネルにおける変異を同定することが可能になる。例えば、電位依存性カリウムチャネルのＳｈａｋｅｒ、Ｓｈａｂ、Ｓｈａｗ、Ｓｈａｌファミリーは、本発明で神経発達および神経変性疾患に関与するものとして示されている機能ドメイン全体にわたる有意な相同性を共有する。したがって、ここでは、染色体１２ｐ１３、ＫＣＮＡ１（Ｋｖ１．１）、ＫＣＮＡ２（Ｋｖ１．２）、ＫＣＮＡ３（Ｋｖ１．３）、ＫＣＮＡ４（Ｋｖ１．４）、ＫＣＮＡ４Ｌ、ＫＣＮＡ５（Ｋｖ１．５）、ＫＣＮＡ６（Ｋｖ１．６）、ＫＣＮＡ７、ＫＣＮＡ８／ＫＣＮＡ９（ＫＣＮＱ１）、ＫＣＮＡ１０、ＫＣＮＡＢ１（Ｋｖ−β−１．１）、ＫＣＮＡＢ２（Ｋｖ−β−１．２）、ＫＣＮＡＢ３、ＫＣＮＢ（Ｓｈａｂ）、ＫＣＮＢ１（Ｋｖ２．１）、ＫＣＮＢ２（Ｋｖ２．２）、ＫＣＮＣ（Ｓｈａｗ）、ＫＣＮＣ１（Ｋｖ３．１）、ＫＣＮＣ２（Ｋｖ３．２）、ＫＣＮＣ３（Ｋｖ３．３）、ＫＣＮＣ４（Ｋｖ３．４）、ＫＣＮＤ（Ｓｈａｌ）、ＫＣＮＤ１（Ｋｖ４．１）、ＫＣＮＤ２（Ｋｖ４．２）、ＫＣＮＤ３（Ｋｖ４．３）上のクラスタ内に位置するＫＣＮＡ（Ｓｈａｋｅｒ）すなわちＫＣＮＡ１、５および６の遺伝子における変異を、神経発達および神経変性疾患において検出しかつ診断してもよい。上記のすべての電位依存性カリウムチャネルは周知であり、それらのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は公開されている。さらに、図８に示されるように、ＫＣＮＣチャネル１〜４は、互いに有意な配列相同性を共有し、Ｒ４２０、Ｒ４１７およびＦ４４８などの多数の高度に保存された残基を含む。さらに、異なる電位依存性カリウムチャネルファミリーの一部のメンバーは、ヘテロ多量体形成などの場合、互いに相互作用する。例えば、ＫＣＮＣ３はＫＣＮＣファミリーの他のメンバーとヘテロニ量体を形成することが多い。したがって、ＫＣＮＣファミリーの密接に関連するメンバーのいずれかの機能ドメイン内の変異が、本明細書にて特徴づけられるＲ４２０Ｈ、Ｒ４１７Ｈ、およびＦ４４８Ｌの変異によって生成される表現型に類似するものを生成すると予測される。優性脊髄小脳失調（ＳＣＡ）は、小脳性運動失調、錐体外路症状（extrapyramidial sign）、構音障害、動眼異常、運動ニューロン徴候（motor neuron sign）、認知減退、てんかん、自律神経障害（autonomic dysfunction）、感覚障害、および精神医学的症状（psychiatric manifestation）からなる表現型を有する異種の神経変性疾患群である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
優性脊髄小脳失調（ＳＣＡ）は、小脳性運動失調、錐体外路症状、構音障害、動眼異常、運動ニューロン徴候、認知減退、てんかん、自律神経障害、感覚障害、および精神医学的症状からなる表現型を有する異種の神経疾患である７，８。２６個のＳＣＡ遺伝子座については記載がなされており、１０においては原因遺伝子または変異体が決定されている。大部分のＳＣＡ遺伝子の正常機能についてはほとんど知られていないが、その大半はポリグルタミン（ポリＱ）拡大疾患を示す。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７３】
配列分析：ＡＢＩ（フォスターシティ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ）、カリフォルニア州）「ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１」サイクル配列決定キットおよび以下のプロトコルを用い、ＤＮＡ配列決定を行った。５ｎｇ（５ｍｌ）の精製ＰＣＲアンプリコン、反応予備混合物４ｍｌ、５倍の配列決定緩衝液２ｍｌ、３．２ｐモル（２ｍｌ）の適切なプライマー、および脱イオン水７ｍｌを９６ウェルのマイクロタイタープレートに添加し、ＰＣＲサーモサイクラー（ＭＪリサーチ（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）  ＰＴＣ−２００）に移し、１）９６℃で１分間、２）９６℃で１０秒間、５０℃で５秒間、次いで６０℃で４分間からなるＸ２５サイクル、および３）エクソン１−５’ＴＡＧ  ＧＴＧ  ＡＧＧ  ＧＣＧ  ＴＧＣ  ＧＡＴ  ＣＴＧ  ＴＴ、３’ＧＣＣ  ＣＧＣ  ＧＧＡ  ＡＧＧ  ＡＣＧ  ＡＧＡ  Ｃ、５’ＣＴＣ  ＣＣＡ  ＣＣＣ  ＡＡＴ  ＣＣＣ  ＧＴＣ  ＧＧＴ  Ｃ、３’ＧＣＧ  ＡＴＧ  ＣＴＧ  ＣＣＧ  ＧＴＡ  ＧＧＴ  ＣＡＴ  ＣＣ、５’ＴＣ  ＧＣＧ  ＴＡＣ  ＧＴＧ  ＣＴＣ  ＡＡＣ  ＴＡＣ  ＴＡ、３’ＴＧＧ  ＧＧＡ  ＡＧＡ  ＧＧＣ  ＴＴＣ  ＴＡＧ  ＧＡＧ、エクソン２−５’ＧＧＧ  ＣＡＣ  ＴＧＧ  ＡＡＧ  ＧＧＴ  ＣＴＴ、３’ＡＴＧ  ＧＧＧ  ＡＴＧ  ＴＴＣ  ＴＴＧ  ＡＡＧ  ＴＡＧ  ＧＴ、５’ＣＧＣ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＧＡＴ  ＴＴＡ  ＣＴＡ  ＣＧＣ、３’ＴＴＴ  ＴＴＣ  ＴＣＣ  ＣＴＣ  ＡＣＣ  ＴＣＴ  ＴＣＧ  ＡＣ、エクソン３／４−５’ＡＴＣ  ＴＴＧ  ＣＣＣ  ＣＡＣ  ＣＧＣ  ＧＴＧ  ＴＴＣ  Ａ、３’ＣＧＧ  ＴＣＡ  ＧＴＧ  ＧＧＧ  ＧＣＴ  ＧＣＡ  ＴＧＴ  ＴＣ、エクソン５−５’ＧＡＡ  ＡＴＧ  ＡＴＣ  ＣＣＧ  ＧＣＧ  ＧＣＧ  ＴＴＴ  ＣＴ、３’ＧＧＣ  ＡＧＣ  ＡＡＧ  ＧＣＧ  ＧＧＡ  ＴＧＧ  ＴＧのような配列決定プライマーに従って繰り返した。次いで、ＡＢＩ  Ｃｅｎｔｒｉ−Ｓｅｐ’ｍスピンカラムを使用して配列決定産物を精製した。次いで、再懸濁試料を、製造業者のプロトコルに従い、ＡＢＩ  ３７７  ＤＮＡシーケンサーにおける４．５％アクリルアミドゲル上で電気泳動させた。すべての配列を、バイオエディット（ＢｉｏＥｄｉｔ）の生物学的配列アラインメントエディタのバージョン５．０．９．１を用いて分析した。