(57)【要約】  下等真核宿主細胞を、少なくとも１つの末端α−ガラクトシルエピトープを有する糖タンパク質を産生するよう操作した。該糖タンパク質は、ワクチンの製造のための利点を有する高抗原性糖タンパク質組成物の製造に有用である。
2012503471.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの末端α−ガラクトシルエピトープを有するＮ−グリカンを有する組換え糖タンパク質を産生しうる酵母または糸状菌宿主細胞。
【請求項２】
該宿主細胞が、該糖タンパク質上の該グリカンに関するα−１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性の開始において損なわれている、請求項１記載の宿主細胞。
【請求項３】
該宿主細胞のドリチー−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ドリチルα−１，３−マンノシルトランスフェラーゼ活性が減少または消失している、請求項１記載の宿主細胞。
【請求項４】
該宿主細胞が、α−１，２−マンノシダーゼＩ活性、マンノシダーゼＩＩ活性、マノシダーゼＩＩｘ活性およびクラスＩＩＩマンノシダーゼ活性よりなる群から選択されるマンノシダーゼ活性を発現する、請求項１記載の宿主細胞。
【請求項５】
該宿主細胞が、Ｎ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼＩ（ＧｎＴ）活性、β−ガラクトシルトランスフェラーゼ（β−ＧａｌＴ）活性およびＵＤＰ−ガラクトース−４−エピメラーゼ活性を発現する、請求項１記載の宿主細胞。
【請求項６】
該宿主細胞が、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピチア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピチア・コクラメ（Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ）、ピチア・メンブラネファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピチア・ミヌタ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｉｎｕｔａ）（オガタエア・ミヌタ（Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ）、ピチア・リンドネリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｌｉｎｄｎｅｒｉ））、ピチア・オプンチエ（Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピチア・テルモトレランス（Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピチア・サリクタリア（Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピチア・グエルクウム（Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｕｍ）、ピチア・ピエペリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピチア・スチプティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クライベロミセス属種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、クライベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、クリソスポリウム・ルックノウエンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．）、フザリウム・グラミネウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅｕｍ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フィスコミトレラ・パテンス（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）およびニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）よりなる群から選択される、請求項１記載の宿主細胞。
【請求項７】
該宿主が、該宿主細胞のＥＲまたはゴルジに融合タンパク質を標的化する標的化ペプチドに連結されたα−ガラクトシルトランスフェラーゼの触媒ドメインを含む該融合タンパク質を発現する、請求項１記載の宿主。
【請求項８】
該宿主細胞が、末端α−ガラクトシルエピトープを含むＮ−グリカンを有する糖タンパク質を産生し、該主要Ｎグリカンが、
（α−Ｇａｌ）（β−Ｇａｌ）ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２；
（α−Ｇａｌ）（β−Ｇａｌ）２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；および
（α−Ｇａｌ）２（β−Ｇａｌ）２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２
よりなる群から選択される構造を有する、請求項１記載の宿主細胞。
【請求項９】
該宿主細胞が、ワクチンタンパク質を産生するよう操作されている、請求項１記載の宿主細胞。
【請求項１０】
該ワクチンタンパク質が、抗ウイルスワクチン糖タンパク質、抗細菌ワクチン糖タンパク質および抗癌ワクチン糖タンパク質よりなる群から選択される、請求項９記載の宿主細胞。
【請求項１１】
末端α−ガラクトシル残基を有するＮ−グリカンを産生しうる宿主細胞の製造方法であって、
（ａ）該Ｎ−グリカンの非還元性末端に少なくとも１つの末端α−ガラクトースを有するＮ−グリカンを産生しうる組換え酵母または糸状菌宿主細胞を得ることと、
（ｂ）該宿主細胞のＥＲまたはゴルジに融合タンパク質を標的化する標的化ペプチドに連結されたα−ガラクトシルトランスフェラーゼの触媒ドメインを含む該融合タンパク質をコードする核酸を該宿主細胞内に導入して、末端α−ガラクトシル残基を有するＮ−グリカンを産生する宿主細胞を得ることを含む、製造方法。
【請求項１２】
少なくとも１つの末端α−ガラクトシル残基を有するＮ−グリカンを有するポリペプチドの製造方法であって、
（ａ）該Ｎ−グリカンの非還元性末端に少なくとも１つの末端α−ガラクトースを有するＮ−グリカンを産生しうる組換え酵母または糸状菌宿主細胞を得ることと、
（ｂ）該ポリペプチドをコードする核酸を該宿主細胞内に導入し、
（ｃ）該宿主細胞において該ポリペプチドを発現させ、
（ｄ）末端α−ガラクトシル残基を有する少なくとも１つのＮ−グリカンを有する該ポリペプチドを該宿主細胞から回収することを含む、製造方法。
【請求項１３】
ヒト様糖タンパク質を産生する組換え下等真核、酵母または糸状菌宿主細胞であって、該宿主細胞が、該宿主細胞により産生される糖タンパク質のトリマンノースコアを有するＮ−グリカンのＮ結合オリゴ糖分枝の末端β−ガラクトース残基上へα−ガラクトース残基を転移しうる融合タンパク質をコードする核酸を含み、該Ｎ結合オリゴ糖分枝が、
Ｇａｌβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，２−Ｍａｎα１，３；
Ｇａｌβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−Ｍａｎα１，３；
Ｇａｌβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，２−Ｍａｎα１，６；
Ｇａｌβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４Ｍａｎα１，６；および
Ｇａｌβ１，４−ＧｌｃＮａｃβ１，６−Ｍａｎα１，６
よりなる群から選ばれる構造を有する、組換え下等真核、酵母または糸状菌宿主細胞。
【請求項１４】
酵母または糸状菌宿主細胞により産生される組換え糖タンパク質であって、該糖タンパク質のＮ−グリカンが、末端α−ガラクトシルエピトープを含む主要Ｎ−グリカンを含む、組換え糖タンパク質。
【請求項１５】
該主要Ｎ−グリカンが、
（α−Ｇａｌ）（β−Ｇａｌ）ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２；
（α−Ｇａｌ）（β−Ｇａｌ）２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；および
（α−Ｇａｌ）２（β−Ｇａｌ）２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２
よりなる群から選択される構造を有する、請求項１４記載の組換え糖タンパク質。
【請求項１６】
酵母または糸状菌宿主細胞により産生されるワクチン糖タンパク質を含むワクチン組成物であって、該糖タンパク質が、末端α−ガラクトシルエピトープを含む主要Ｎ−グリカンを含む、ワクチン組成物。
【請求項１７】
該主要Ｎ−グリカンが、
（α−Ｇａｌ）（β−Ｇａｌ）ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２；
（α−Ｇａｌ）（β−Ｇａｌ）２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；および
（α−Ｇａｌ）２（β−Ｇａｌ）２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２
よりなる群から選択される、請求項１６記載のワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は分子生物学の分野に関する。特に、本発明は、主要末端糖構造Ｇａｌ−α１，３−Ｇａｌ−β１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ｒを有するＮ−グリカンを産生するよう遺伝的に操作された酵母株に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトおよび或る他の霊長類を除く全ての哺乳動物は、酵素アルファ−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼの活性により生じる末端アルファ−１，３−ガラクトシル（アルファ−ｇａｌ）グリカン構造を有する糖タンパク質を含有する（Ｇａｌｉｌｉら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２６３：３３，１９８８）。該酵素は、末端に位置するベータ−１，４−結合ガラクトース残基にガラクトース残基を付加する。ベータ−１，４−結合ガラクトース残基は、哺乳動物の多数のＮ−グリカン（ヒトのものを含む）の末端に見出される。
【０００３】
ヒトの免疫系は、末端アルファ−ｇａｌ残基の存在に迅速に応答するよう、自然免疫を適合させる。循環ＩｇＧの約１％はアルファ−１，３−ガラクトースエピトープに対するものである（Ｇａｌｉｌｉら，Ｂｌｏｏｄ，８２：８，１９９３）。このエピトープを示す抗原は循環抗体により認識されて、補体活性化、Ｆｃγ受容体媒介経路を介した抗原提示細胞の効率的活性化、および細胞傷害性Ｔ細胞応答の刺激を引き起こす。抗原提示細胞への免疫複合体の標的化は、Ｔ細胞応答を惹起するのに要求される抗原の量を減少させることが示されている。
【０００４】
現在の組換えワクチンは、一般に、特異的免疫原性応答の欠如という欠点を有する。さらに、現在のワクチンは、しばしば、持続的な細胞傷害性Ｔ細胞応答を惹起するためには、アジュバントとして公知の普遍的免疫刺激物質を要する。ある限られた実例においては、末端α−１，３−ガラクトースを含有するＮ−グリカンを含有する、タンパク質に基づくワクチンは、そのような分子の免疫原性を改善することが報告されている（Ａｂｄｅｌ−Ｍｏｔａｌら，Ｊ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８０：１４，２００６；Ａｂｄｅｌ−Ｍｏｔａｌら，Ｊ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８１：１７，２００７）。これは、ヒトがα−１，３−ガラクトース残基に対する高レベルの循環抗体を有するからであろう。さらに、これらのタンパク質は抗体指向性Ｆｃガンマ媒介シグナリングにより抗原提示を刺激することが可能でありうるため、それらは非特異的アジュバントの必要性を軽減しうる。現在の最先端技術は、末端シアル酸構造（例えば、ＮＡＮＡ）を有するタンパク質を産生させ、ついで酵素的消化により該ＮＡＮＡ残基をインビトロで除去してβ−１，４結合ガラクトース残基を露出させ、ついで酵素的付加により末端α−１，３−ガラクトースを付加することにより、そのようなワクチンの製造を可能にするに過ぎない（Ｇａｌｉｌｉ，米国特許第６，３６１，７７５号を参照されたい）。この方法は高価であり、面倒であり、容易には規模改変できない。インフルエンザウイルス赤血球凝集素ウイルスタンパク質上（Ｈｅｎｉｏｎら，Ｖａｃｃｉｎｅ，１５：１１７４−１１８２（１９９７）；ｇｐｌ２０；Ａｂｄｅｌ−Ｍｏｔａｌら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８０：６９４３−６９５１（２００６））およびガン細胞上（Ｕｎｆｅｒら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６３：９８７−９９３（２００３））でアルファ−ｇａｌエピトープを産生させるための試みがなされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第６，３６１，７７５号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｇａｌｉｌｉら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２６３：３３，１９８８
【非特許文献２】Ｇａｌｉｌｉら，Ｂｌｏｏｄ，８２：８，１９９３
【非特許文献３】Ａｂｄｅｌ−Ｍｏｔａｌら，Ｊ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８０：１４，２００６
【非特許文献４】Ａｂｄｅｌ−Ｍｏｔａｌら，Ｊ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８１：１７，２００７
【非特許文献５】Ｈｅｎｉｏｎら，Ｖａｃｃｉｎｅ，１５：１１７４−１１８２（１９９７）、ｇｐ１２０
【非特許文献６】Ａｂｄｅｌ−Ｍｏｔａｌら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８０：６９４３−６９５１（２００６）
【非特許文献７】Ｕｎｆｅｒら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６３：９８７−９９３（２００３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、本発明の目的の１つは、免疫原性の増強を伴う、タンパク質に基づく有効なワクチンの製造のための、改良されたベクターおよび宿主細胞系に基づく、酵母および糸状菌、例えばピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）に関する更なるタンパク質発現系の開発である。
【０００８】
本発明は、酵母および糸状菌の遺伝的に操作された宿主系を使用するそのようなワクチンの製造のための改良された方法および物質を提供する。該宿主株は、ヒト様Ｎ−グリコシル化を有するタンパク質の製造のために遺伝的に修飾されている。
【発明の効果】
【０００９】
本発明は、タンパク質に基づくワクチンの現在の最先端技術を改良するために使用されうる。本明細書に記載されている遺伝的に操作された株において製造されるグリコシル化タンパク質ワクチンは、末端β−１，４ガラクトース、末端シアル酸または末端マンノースを含有するワクチンと比べて、抗原提示の改善により、増強された免疫応答を惹起すると予想されうる。この技術は、組換えタンパク質に基づく分子として開発されうる多数のワクチンに適用可能である。
【００１０】
最近の開発は、下等真核宿主生物、酵母および糸状菌、例えばピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）における完全にヒト化された治療物質の製造を可能にする（Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，米国特許第７，０２９，８７２号（その開示を参照により本明細書に組み入れることとする））。本発明者らは、製造されたタンパク質が少なくとも１つの末端α−１，３−ガラクトース糖形態を含有する、商業的規模のワクチン製造に使用されうる宿主生物を製造するための更なる修飾を開発した。
【００１１】
本発明者らは、細胞内に存在するグリコシル化装置を修飾することにより、末端α−１，３−ガラクトースを有するワクチン糖タンパク質が組換え宿主細胞から得られうることを見出した。驚くべきことに、本発明者らは、該宿主細胞により産生される抗原糖タンパク質上に末端α−１，３−ガラクトース残基を有するＮ−グリカンが存在するよう、グリコシル化タンパク質をコードする宿主細胞の内因性遺伝子を、グリコシル化酵素をコードする異種遺伝子で置換することにより、有益な結果が得られることを見出した。
【００１２】
本発明の好ましい実施形態においては、下等真核生物細胞、例えば酵母および糸状菌、例えばピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）のゲノムを修飾することが可能である。得られた形質転換下等真核生物宿主細胞は、得られるワクチン糖タンパク質の抗原性／免疫原性が改善されるのに十分な程度に高いＮ−グリカンの比率で、末端α−１，３−ガラクトース残基を有する抗原性ワクチン糖タンパク質を産生しうる。本発明は、下等真核生物宿主細胞、例えばピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）がワクチン糖タンパク質を高収率で産生しうるという追加的な利点を有し、糖タンパク質の主要種は、自らの内因性グリコシル化装置を保有する下等真核宿主細胞あるいは他の標準的なタンパク質産生宿主、例えば昆虫細胞またはＣＨＯもしくはＮＳ０のような哺乳類細胞におけるワクチンタンパク質の産生と比較して改善された抗原性を有する末端α−１，３−ガラクトース残基を有する。
【００１３】
特定の実施形態においては、エス・スクロファ（Ｓ．ｓｃｒｏｆａ）アルファ−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｇｅｎｅｂａｎｋ：Ｐ５０１２７）をコードする（ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）に関して）コドン最適化されたオープンリーディングフレームがピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）酵母株内に導入されている。好ましい実施形態においては、該酵素は、その活性を最適化するために、酵母ゴルジに特異的に局在化するよう操作されている。個々の標的化配列は、最も活性な融合タンパク質に関して融合タンパク質構築物をスクリーニングすることにより選択されうる。例示される実施形態においては、エス・スクロファ（Ｓ．ｓｃｒｏｆａ）アルファ−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼがＳｃＭｎｎ２ｐ膜貫通ゴルジ標的化局在化ドメインに融合されている。
【００１４】
本発明の実施形態は、末端α−ガラクトシルエピトープを含む主要Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生するよう操作されている下等真核宿主細胞、より好ましくは酵母または糸状菌宿主細胞を含む。
【００１５】
本発明の実施形態は、末端α−ガラクトシルエピトープを含むＮ−グリカンを有する糖タンパク質を産生する下等真核宿主細胞、より好ましくは酵母または糸状菌宿主細胞を含み、ここで、主要Ｎグリカンは、（α−Ｇａｌ）（β−Ｇａｌ）ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２；（α−Ｇａｌ）（β−Ｇａｌ）２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；および（α−Ｇａｌ）２（β−Ｇａｌ）２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２よりなる群から選択される。
【００１６】
本発明の実施形態は、ワクチンタンパク質を産生するよう操作されている下等真核宿主細胞、より好ましくは酵母または糸状菌宿主細胞を含む。
【００１７】
本発明の実施形態は、ワクチン糖タンパク質が、抗ウイルスワクチンタンパク質、抗細菌ワクチンタンパク質または抗癌ワクチンタンパク質に由来する下等真核宿主細胞、より好ましくは酵母または糸状菌宿主細胞を含む。
【００１８】
本発明の実施形態は、抗ウイルスワクチンタンパク質がインフルエンザウイルスに由来する下等真核宿主細胞、より好ましくは酵母または糸状菌宿主細胞を含む。より好ましくは、該インフルエンザタンパク質は赤血球凝集素（ＨＡ）またはノイラミニダーゼ（ＮＡ）である。
【００１９】
本発明の実施形態は、抗ウイルスワクチンタンパク質が単純ヘルペスウイルスに由来する下等真核宿主細胞、より好ましくは酵母または糸状菌宿主細胞を含む。より好ましくは、ヘルペスエンベロープ糖タンパク質ｇＢ、ｇＣおよびｇＤが使用される。
【００２０】
本発明の実施形態は、抗ウイルスワクチンタンパク質が呼吸器シンシチウムウイルス（ＲＳＶ）に由来する下等真核宿主細胞、より好ましくは酵母または糸状菌宿主細胞を含む。より好ましくは、ウイルスワクチン糖タンパク質は、ＲＳＶ赤血球凝集素糖タンパク質（Ｈ）および融合糖タンパク質Ｆよりなる群から選ばれる。
【００２１】
本発明の実施形態は、抗細菌ワクチン糖タンパク質が細菌ワクチンタンパク質に由来する下等真核宿主細胞、より好ましくは酵母または糸状菌宿主細胞を含む。より好ましくは、該細菌ワクチンタンパク質は内在性膜タンパク質であるか、または外膜タンパク質であるか、または外表面タンパク質であるか、またはマイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に由来し、またはサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）に由来し、またはボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）に由来し、またはヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）に由来する。
【００２２】
本発明の実施形態は、抗癌ワクチン糖タンパク質が癌細胞由来エピトープペプチド、例えばＨｅｒ−２エピトープ、ｎｅｕエピトープまたは前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）エピトープに由来する、下等真核宿主細胞、より好ましくは酵母または糸状菌宿主細胞を含む。
【００２３】
配列の説明
配列番号１および２は、推定膜貫通ゴルジ局在化ドメインを欠くマウスα−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＭｍαＧａｌＴ）のクローニングのためのプライマーであるＲＣＤ４４６およびＲＣＤ４４７のヌクレオチド配列である。
【００２４】
配列番号１  ＲＣＤ４４６プライマー
【００２５】
【化１】
2012503471.tif 000003
【００２６】
配列番号２  ＲＣＤ４４７プライマー
【００２７】
【化２】
2012503471.tif 000004
【００２８】
配列番号３は、インフルエンザＡ（香港）由来のＨ３型ＨＡタンパク質のエクトドメイン（すなわち、Ｃ末端膜貫通ドメインを欠くもの）のアミノ酸配列である。
【００２９】
配列番号３
【００３０】
【化３】
2012503471.tif 000005
【００３１】
配列番号４は、インフルエンザＡ（Ａ／サウスカロライナ／１／１８）由来のＨ３型ＨＡタンパク質のエクトドメイン（すなわち、Ｃ末端膜貫通ドメインを欠くもの）のヌクレオチドの配列である。
【００３２】
配列番号４
【００３３】
【化４】
2012503471.tif 000006
配列番号５および６は、ＨＳＶ−２  Ｇ株ｇＤタンパク質エクトドメインの２つの異なる形態のアミノ酸配列である。
【００３４】
配列番号５  ＨＳＶ−２  Ｇ株ｇＤ３３９タンパク質エクトドメイン
【００３５】
【化５】
2012503471.tif 000007
【００３６】
配列番号６  ＨＳＶ−２  Ｇ株ｇＤ３０６ＮＱタンパク質エクトドメイン
【００３７】
【化６】
2012503471.tif 000008
【００３８】
配列番号７は、ＨＳＶ−２  Ｇ株ｇＣタンパク質エクトドメインのアミノ酸配列である。
【００３９】
配列番号７  ＨＳＶ−２  Ｇ株ｇＣタンパク質エクトドメイン
【００４０】
【化７】
2012503471.tif 000009
【００４１】
（発明の詳細な説明）
本明細書中で特に定められていない限り、本発明に関して用いる科学技術用語および表現は、当業者に一般に理解されている意義を有するものとする。さらに、文脈に矛盾しない限り、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。一般に、本明細書に記載の生化学、酵素学、分子細胞生物学、微生物学、遺伝学ならびにタンパク質および核酸の化学およびハイブリダイゼーションに関して用いる名称、ならびにそれらの技術は、当技術分野においてよく知られており一般に用いられているものである。一般に、本発明の基本的遺伝的構築物を製造するために用いる方法および技術は、特に示さない限り、当技術分野でよく知られている通常の方法に従い、ならびに本明細書中に引用され記載されている種々の全般的およびより具体的な参考文献に記載されているとおりに行われる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２，ａｎｄ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ  ｔｏ  ２００２）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）；ＴａｙｌｏｒおよびＤｒｉｃｋａｍｅｒ，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（２００３）；Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．，Ｆｒｅｅｈｏｌｄ，ＮＪ；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ  Ｉ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（１９７６）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ  ＩＩ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（１９７６）；Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９）を参照されたい。
【００４２】
本明細書に記載の全ての刊行物、特許および他の参考文献の全体を、参照により本明細書に組み入れることとする。
【００４３】
以下の用語は、特に示さない限り、以下の意義を有すると理解されるものとする。
【００４４】
本明細書中で用いる「Ｎ−グリカン」および「糖形態」なる語は互換的に用いられ、Ｎ−結合オリゴ糖を意味し、例えば、該オリゴ糖のＮ−アセチルグルコサミン残基とポリペプチドのアスパラギン残基との間のアスパラギン−Ｎ−アセチルグルコサミン結合により結合しているオリゴ糖を意味する。糖タンパク質上で見出される主な糖としては、グルコース（Ｇｌｃ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）、フコース（Ｆｕｃ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびシアル酸（例えば、Ｎ−アセチル−ノイラミン酸（ＮＡＮＡ）およびＮ−グリコリル−ノイラミン酸（ＮＧＮＡ））が挙げられる。Ｎ−結合糖タンパク質の場合、糖基のプロセシングは翻訳と共に小胞体の内腔（ＥＲルーメン）で生じ、ゴルジ装置内で継続する。
【００４５】
Ｎ−グリカンはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の共通の五糖コアを有する。Ｎ−グリカンは、「トリマンノースコア」、「五糖コア」または「小マンノース（ｐａｕｃｉｍａｎｎｏｓｅ）コア」とも称されるＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（「Ｍａｎ３」）コア構造に付加される末梢糖（例えば、ＧｌｃＮＡｃ、ガラクトース、フコースおよびシアル酸）を含む分枝（アンテナ）の数に関して異なる。Ｎ−グリカンは、それらの分枝構成成分に従い分類される（例えば、高マンノース、複合またはハイブリッド）。「高マンノース」型Ｎ−グリカンは５以上のマンノース残基を有する。「複合」型Ｎ−グリカンは、典型的には、α−１，３マンノース・アームに結合した少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃ、および「トリマンノース」コアのα−１，６マンノース・アームに結合した少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃを有する。複合Ｎ−グリカンはまた、ガラクトース（「Ｇａｌ」）またはＮ−アセチルガラクトサミン（「ＧａｌＮＡｃ」）残基を有することが可能であり、該残基は、場合によっては、シアル酸または誘導体（例えば、「ＮＡＮＡ」または「ＮｅｕＡｃ」；ここで、「Ｎｅｕ」はノイラミン酸を意味し、「Ａｃ」はアセチルを意味する）で修飾されうる。「α−Ｇａｌ」はα−１，３−結合ガラクトースを意味し、「β−Ｇａｌ」はβ−１，４−結合ガラクトースを意味する。複合Ｎ−グリカンはまた、コア・フコース（「Ｆｕｃ」）および「二分岐（ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ）」ＧｌｃＮＡｃを含む鎖内置換を有しうる。複合Ｎ−グリカンはまた、「トリマンノース・コア」上に複数の分枝を有することが可能であり、これは、しばしば、「多分枝グリカン」と称される。「ハイブリッド」Ｎ−グリカンは、該トリマンノース・コアのα−１，３マンノース・アームの非還元性末端に結合した少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃを、そして該トリマンノース・コアのα−１，６マンノース・アーム上に０個以上のマンノースを有する。これらの種々のＮ−グリカンは「糖形態（ｇｌｙｃｏｆｏｒｍ）」とも称される。
【００４６】
本明細書中で用いる略語は、当技術分野で一般に用いられているものである。例えば、前記の糖の略語を参照されたい。他の一般的な略語には、「ＰＮＧアーゼ」または「グリカナーゼ」または「グルコシダーゼ」が含まれ、これらは全て、ペプチドであるＮ−グリコシダーゼＦ（ＥＣ３．２．２．１８）を意味する。
【００４７】
「マーカー配列」または「マーカー遺伝子」なる語は、宿主細胞内の配列の存在または非存在に関する正または負の選択を可能にする活性を発現しうる核酸配列を意味する。例えば、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子はマーカー遺伝子である。なぜなら、該遺伝子を含有する細胞がウラシルの非存在下で増殖しうることにより、その存在が選択されうるからである。その存在は、該遺伝子を含有する細胞が５−ＦＯＡの存在下で増殖し得ないことによっても選択されうる。マーカー配列または遺伝子は、正および負の両方の選択性を示すことを必ずしも要しない。ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）由来のマーカー配列または遺伝子の非限定的な具体例には、ＡＤＥ１、ＡＲＧ４、ＨＩＳ４およびＵＲＡ３が含まれる。抗生物質耐性マーカー遺伝子の場合、カナマイシン、ネオマイシン、ゲネティシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）（またはＧ４１８）、パロモマイシンおよびヒグロマイシン耐性遺伝子が、これらの抗生物質の存在下での増殖を可能にするために一般に使用される。
【００４８】
「機能的に連結」された発現制御配列は、関心のある遺伝子を制御するよう、関心のある遺伝子に隣接して連結された発現制御配列、ならびにが関心のある遺伝子を制御するよう、トランスで又は或る距離を隔てて作用する発現制御配列を意味する。
【００４９】
「発現制御配列」または「調節配列」なる語は互換的に用いられ、本明細書中で用いられる場合には、それが機能的に連結されているコード配列の発現に影響を及ぼすのに必要なポリヌクレオチド配列を意味する。発現制御配列は、核酸配列の転写、転写後事象および翻訳を制御する配列である。発現制御配列には、適当な転写開始配列、終結配列、プロモーター配列およびエンハンサー配列；効率的なＲＮＡプロセッシングシグナル、例えばスプライシングおよびポリアデニル化シグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を増加させる配列（例えば、リボソーム結合部位）；タンパク質安定性を増強する配列；ならびに望ましい場合には、タンパク質分泌を促進する配列が含まれる。そのような制御配列の性質は宿主生物によって異なり、原核生物においては、そのような制御配列には、一般に、プロモーター、リボソーム結合部位および転写終結配列が含まれる。「制御配列」なる語は、少なくとも、発現のために存在が必須である全ての成分を含むと意図され、存在することが有利である追加的な成分、例えばリーダー配列および融合相手の配列をも含みうる。
【００５０】
本明細書中で用いる「組換え宿主細胞」（「発現宿主細胞」、「発現宿主系」、「発現系」または単に「宿主細胞」）なる語は、組換えベクターが導入された細胞を意味すると意図される。そのような用語は、その特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の後代をも意味すると意図されると理解されるべきである。突然変異または環境の影響により、後の世代において、ある修飾が生じうるため、そのような後代は実際には親細胞と同一でない可能性があるが、本明細書中で用いる「宿主細胞」なる語の範囲内に尚も含まれる。組換え宿主細胞は、培養内で増殖した単離された細胞または細胞系であることが可能であり、あるいは、生きた組織または生物に存在する細胞でありうる。
【００５１】
「真核生物」なる語は有核細胞または生物を意味し、昆虫細胞、植物細胞、哺乳類細胞、動物細胞および下等真核細胞を意味する。
【００５２】
「下等真核細胞」なる語は、酵母、真菌、カラー（ｃｏｌｌａｒ）有鞭毛類、微胞子虫類、胞状虫類（ａｌｖｅｏｌａｔｅ）（例えば、渦鞭毛虫類）、ストラメノピル（ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅ）（例えば、褐藻類、原虫類）、紅色植物（例えば、紅藻類）、植物（例えば、緑藻類、植物細胞、コケ）および他の原生生物を含む。酵母および糸状菌は、限定的なものではないが、以下のものを含む：ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピチア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピチア・コクラメ（Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ）、ピチア・メンブラネファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピチア・ミヌタ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｉｎｕｔａ）（オガタエア・ミヌタ（Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ）、ピチア・リンドネリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｌｉｎｄｎｅｒｉ））、ピチア・オプンチエ（Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピチア・テルモトレランス（Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピチア・サリクタリア（Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピチア・グエルクウム（Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｕｍ）、ピチア・ピエペリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピチア・スチプティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クライベロミセス属種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、クライベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、クリソスポリウム・ルックノウエンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．）、フザリウム・グラミネウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅｕｍ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フィスコミトレラ・パテンス（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）およびニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、ピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．）、任意のサッカロミセス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、任意のクライベロミセス属種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、任意のアスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、トリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、クリソスポリウム・ルックノウエンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、任意のフザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．）およびニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）。
【００５３】
本明細書中で用いる「ペプチド」なる語は、短いポリペプチド、例えば、典型的には約５０アミノ酸長未満、より典型的には約３０アミノ酸長未満のポリペプチドを意味する。本明細書中で用いる該用語は、ポリペプチドおよびタンパク質の構造的、ひいては生物学的機能を模倣した類似体および模倣体を含む。
【００５４】
「ポリペプチド」なる語は、天然で生じるタンパク質および非天然で生じるタンパク質の両方、ならびに使用の状況により示されるそれらの断片、突然変異体、誘導体および類似体を含む。ポリペプチドは単量体または重合体でありうる。さらに、ポリペプチドは、１以上の異なる活性をそれぞれが有する多数の異なるドメインを含みうる。
【００５５】
「単離（された）タンパク質」または「単離（された）ポリペプチド」なる語は、その由来または誘導の起源に基づいて、（１）その天然状態でそれに付随する天然で結合している成分に結合していない、または（２）天然で見出されない純度（純度は他の細胞物質の存在に関して判断されうる）で存在する（例えば、同一種の他のタンパク質を含有しない）、または（３）異なる種の細胞により発現される、または（４）天然に存在しない（例えば、それは、天然で見出されるポリペプチドの断片であるか、あるいはそれは、天然で見出されないアミノ酸類似体もしくは誘導体、または標準的なペプチド結合以外の連結を含む）タンパク質またはポリペプチドを意味する。したがって、化学合成されたポリペプチド、または天然における産生由来細胞とは異なる細胞系内で合成されたポリペプチドは、その天然で付随する成分から「単離」されている。ポリペプチドまたはタンパク質は、当技術分野でよく知られたタンパク質精製技術を用いる単離により、天然で付随する成分を実質的に含有しないものにされることが可能である。このような定義においては、「単離」は、そのように示されているタンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたはオリゴペプチドがその天然環境から物理的に取り出されていることを必ずしも要さない。
【００５６】
本明細書中で用いる「ポリペプチド断片」なる語は、完全長ポリペプチドと比較した場合に、欠失、例えばアミノ末端および／またはカルボキシ末端欠失を有するポリペプチドを意味する。好ましい実施形態においては、ポリペプチド断片は、該断片のアミノ酸配列が、天然に存在する配列における対応位置と同一である、連続配列である。断片は、典型的には、少なくとも５、６、７、８、９または１０アミノ酸長、好ましくは少なくとも１２、１４、１６または１８アミノ酸長、より好ましくは少なくとも２０アミノ酸長、より好ましくは少なくとも２５，３０、３５、４０または４５アミノ酸長、より一層好ましくは少なくとも５０または６０アミノ酸長、より一層好ましくは少なくとも７０アミノ酸長である。断片は、特有の活性を有するドメインを含みうる。
【００５７】
「修飾誘導体」は、一次構造配列において実質的に相同であるが例えばインビボもしくはインビトロの化学的および生化学的修飾を含むか又は天然ポリペプチドにおいて見出されないアミノ酸を含むポリペプチドまたはその断片を意味する。当業者に容易に理解されるとおり、そのような修飾には、例えば、アセチル化、カルボキシル化、リン酸化、グリコシル化、ユビキチン化、標識（例えば、放射性核種での標識）、および種々の酵素的修飾が含まれる。ポリペプチド標識するための種々の方法、およびそのような目的に有用な種々の置換基または標識が、当技術分野でよく知られており、それらには、放射性同位元素、例えば１２５Ｉ、３２Ｐ、３５Ｓおよび３Ｈ、標識された抗リガンド（例えば、抗体）に結合するリガンド、発蛍光団、化学発光物質、酵素、ならびに標識リガンドに対する特異的結合ペアメンバーとして働きうる抗リガンドが含まれる。標識の選択は、要求される感度、プライマーとの結合の容易さ、安定性要件、および利用可能な装置に左右される。ポリペプチドを標識するための方法は当技術分野でよく知られている。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２，およびＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ  ｔｏ  ２００２）（これを参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい。
【００５８】
「キメラ遺伝子」または「キメラヌクレオチド配列」なる語は、１以上の異種ヌクレオチド配列に結合したヌクレオチド配列または断片を含むヌクレオチド配列を意味する。キメラ配列は融合タンパク質の発現に有用である。キメラ遺伝子またはキメラヌクレオチド配列は、異種組換えタンパク質の製造のための有益な特性を有しうる、意図される宿主細胞にとって異種である１以上の断片またはドメインをも含みうる。一般に、キメラヌクレオチド配列は、遺伝子からの少なくとも３０個の連続的ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも６０個または９０個以上のヌクレオチドを含む。意図される宿主細胞にとって異種であるが意図される組換えタンパク質と相同である少なくとも１つの断片またはドメインを有するキメラヌクレオチド配列は本発明において特に有用である。例えば、組換えヒト糖タンパク質を発現させるためのピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞を使用する発現系における使用で意図されるキメラ遺伝子は、好ましくは、ヒト由来の少なくとも１つの断片またはドメインであり、一方、該キメラ遺伝子の残部は、好ましくは、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）由来のものである。
【００５９】
「融合タンパク質」なる語は、異種アミノ酸配列に結合したポリペプチドまたは断片を含むポリペプチドを意味する。融合タンパク質は、２以上の異なるタンパク質からの２以上の所望の機能要素を含有するよう構築されうるため、有用である。融合タンパク質は、ポリペプチドからの少なくとも１０個の連続的アミノ酸、好ましくは少なくとも２０または３０アミノ酸、より好ましくは少なくとも４０、５０または６０アミノ酸、より好ましくは少なくとも７５、１００または１２５アミノ酸を含む。本発明のタンパク質の全体を含む融合体が特に有用である。本発明の融合タンパク質内に含まれる異種ポリペプチドは少なくとも６アミノ酸長、しばしば、少なくとも８アミノ酸長、有用なものとしては、少なくとも１５、２０および２５アミノ酸長である。融合体は、より大きなポリペプチド、または更にはタンパク質全体、例えば緑色蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）、特定の有用性を有する発色団含有タンパク質をも含む。融合タンパク質は、異なるタンパク質またはペプチドをコードする核酸配列とインフレームで該ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸配列を構築し、該融合タンパク質を発現させることにより、組換え的に製造されうる。あるいは、融合タンパク質は、該ポリペプチドまたはその断片を別のタンパク質に架橋することにより、化学的に製造されうる。
【００６０】
本明細書中で用いる、２０種の通常のアミノ酸およびそれらの略語は通常の用法に準拠している。Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＧｏｌｕｂおよびＧｒｅｎ編，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．，２ｎｄｅｄ．１９９１）（これを参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい。２０種の通常のアミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）、非天然アミノ酸、例えばα−，α−ジ置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸および他の通常でないアミノ酸も、本発明のポリペプチドのための適当な成分でありうる。通常でないアミノ酸の具体例には、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタマート、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリシン、ε−Ｎ−アセチルリシン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリシン、Ｎ−メチルアルギニンならびに他の類似アミノ酸およびイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）が含まれる。本明細書中で用いるポリペプチド表記においては、標準的な用法および慣例に従い、左側の末端はアミノ末端に対応し、右側の末端はカルボキシ末端に対応する。
【００６１】
本明細書中で用いる「領域」なる語は、生体分子の一次構造の物理的に連続した部分を意味する。タンパク質の場合、領域は、そのタンパク質のアミノ酸配列の連続的部分により定められる。
【００６２】
本明細書中で用いる「ドメイン」なる語は、生体分子の既知または推定機能に寄与する、該生体分子の構造を意味する。ドメインはその領域または部分と同じ位置に存在することが可能であり、ドメインは、生体分子の、異なる不連続領域を含むことも可能である。
【００６３】
本明細書中で用いる「分子」なる語は、小分子、ペプチド、タンパク質、糖、ヌクレオチド、核酸、脂質など（これらに限定されるものではない）を含む任意の化合物を意味し、そのような化合物は天然物または合成物でありうる。
【００６４】
本明細書中で用いる「含む」なる語、またはその派生語、例えば「含んでなる」もしくは「含み」は、示されている整数または整数群の包含を示唆するが、いずれの他の整数または整数群の排除をも示唆するものではないと理解される。
【００６５】
本明細書中で用いる「主に」なる語、またはその派生語、例えば「主要」または「主な」は、糖タンパク質をＰＮＧアーゼで処理し、遊離したグリカンを質量分析、例えばＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにより分析した後で特定されうる、全Ｎ−グリカンに対する最高モル百分率（％）を有するグリカン種に関して用いられると理解される。言い換えると、「主要」なる語は、他のいずれの個々の実体より大きなモル％で存在する個々の実体（例えば、特定の糖形態）として定められる。例えば、ある組成物が、４０モル％の種Ａ、３５モル％の種Ｂおよび２５モル％の種Ｃからなる場合、種Ａが「主要」であり、該組成物は種Ａを「主に」含む。
【００６６】
本明細書中で用いる「ワクチンタンパク質」または「ワクチン糖タンパク質」なる語は、該「ワクチンタンパク質」または「ワクチン糖タンパク質」がワクチンとして使用されると意図されることを意味すると理解され、該ワクチンはヒトに投与されることが可能であり、「ワクチンタンパク質」または「ワクチン糖タンパク質」として使用されるタンパク質または糖タンパク質に対する免疫応答を惹起すると意図される。該ワクチンタンパク質またはワクチン糖タンパク質は完全長天然タンパク質または糖タンパク質を含むことが可能であり、あるいはそれは、天然タンパク質または糖タンパク質から単離された１以上のドメインを含みうる。該ワクチンタンパク質またはワクチン糖タンパク質はワクチン中で他のワクチンタンパク質またはワクチン糖タンパク質と共に使用されることが可能であり、追加的な活性物質および／または医薬担体を含む製剤中で使用されることが可能である。また、「ワクチンタンパク質」または「ワクチン糖タンパク質」なる語は「標的タンパク質」または「標的糖タンパク質」と互換的に使用されうる。
【００６７】
本明細書中で用いる「エピトープ」なる語は、免疫応答を惹起しうる又は抗体により認識されうる、抗原の部分を意味する。エピトープは、しばしば、複数のアミノ酸、炭水化物部分またはそれらの両方の結合体よりなる。直鎖状と称されるエピトープは、しばしば、タンパク質の適切なフォールディングに左右されない。タンパク質の適切なフォールディングに左右されるエピトープはコンホメーション的と称される。なぜなら、該エピトープは、該タンパク質がその適切にフォールディングしたコンホメーション状態にある場合にのみ存在するからである。
【００６８】
本明細書中で用いる「α−ガラクトシルエピトープ」なる語は、第２のガラクトース残基にα−１，３−結合した末端ガラクトース残基を意味し、この第２のガラクトース残基はＮ−アセチルグルコサミン残基にβ−１，４結合している。α−ガラクトシルエピトープを有するグリカンの具体例には以下の分枝グリカン構造体が含まれる：（α−Ｇａｌ）（β−Ｇａｌ）ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２；（α−Ｇａｌ）（β−Ｇａｌ）２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；および（α−Ｇａｌ）２（β−Ｇａｌ）２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２。図３におけるＧＳ５．７、ＧＳ５．８およびＧＳ５．９を参照されたい。本明細書中で用いる「アジュバント」なる語は、特異的抗原作用自体を何ら引き起こすことなくワクチンまたはワクチンタンパク質に対する免疫原性応答を増強しうる化合物または物質を意味する。アジュバントには、細菌リポ多糖、リポソーム、アルミニウム塩および油が含まれうる。
【００６９】
特に示さない限り、本明細書中で用いる全ての科学技術用語は、本発明に関連する分野の当業者により一般に理解されているのと同じ意義を有する。典型的な方法および物質（材料）を以下に説明するが、本明細書に記載されているものと類似または同等の方法および物質も本発明の実施において使用可能であり、当業者に明らかであろう。本明細書に記載されている全ての刊行物および他の参考文献の全体を参照により本明細書に組み入れることとする。矛盾する場合には、定義を含めて本明細書が優先される。該物質、方法および実施例（具体例）は例示に過ぎず、何ら限定的なものではない。
【００７０】
Ｉ．概論
本発明は、ワクチンタンパク質をコードするベクターで形質転換されている組換え宿主細胞からのα−結合ガラクトースを有するワクチン糖タンパク質の発現のための方法および物質を提供する。該ワクチン糖タンパク質は、該宿主細胞から産生される組換え糖タンパク質の質の改善、特に、これらのベクターで形質転換された組換え宿主細胞において産生されるワクチン糖タンパク質から得られる免疫応答の増強をもたらす。
【００７１】
該方法は、下等真核生物、特に酵母における発現に関して例示されているが、それらは高等真核生物および細菌においても実施されうる。該方法は、改善されたワクチンタンパク質、特にワクチン糖タンパク質をコードする核酸分子で宿主細胞を形質転換することを含み、それにより、該宿主細胞が、分泌性糖タンパク質をコードする発現ベクターで形質転換されると、該α−結合ガラクトースは該組換え分泌糖タンパク質の質の改善、特に、産生される抗原性糖タンパク質に対する免疫応答の増強に寄与しうる。
【００７２】
したがって、好ましい実施形態においては、本発明の方法は、改善された分泌性ワクチン糖タンパク質の産生のために操作された細胞を使用する組換え発現系において使用されうる。
【００７３】
ＩＩ．ワクチンタンパク質の発現
ワクチンタンパク質または糖タンパク質をコードする核酸
前記の糖タンパク質は核酸によりコードされる。該核酸はＤＮＡまたはＲＮＡ、典型的にはＤＮＡでありうる。該糖タンパク質をコードする核酸は、該糖タンパク質の発現および分泌を可能にする調節配列に機能的に連結されている。そのような調節配列には、該タンパク質をコードする核酸の上流（すなわち５’側）のプロモーターおよび場合によってはエンハンサー、ならびに該糖タンパク質をコードする核酸の３’側（すなわち下流）の転写終結部位が含まれる。該糖タンパク質は融合タンパク質でありうる。分泌性糖タンパク質の場合、該核酸は、典型的には、リーダーまたはシグナルペプチドをコードするリーダー配列を含む。該リーダーまたはシグナルペプチドは、グリコシル化および分泌のための分泌経路の適当な細胞区画（典型的には小胞体またはゴルジ装置）に該タンパク質を標的化することをもたらす。該核酸はまた、典型的には、リボソーム結合部位を有する５’非翻訳領域および３’非翻訳領域をコードしている。該核酸は、しばしば、該糖タンパク質が発現される細胞において複製可能なベクターの成分である。該ベクターはまた、形質転換細胞の認識を可能にするマーカーを含有しうる。しかし、いくつかの細胞型、特に酵母は、外来性ベクター配列を欠く核酸で成功裏に形質転換されうる。
【００７４】
所望の糖タンパク質をコードする核酸は幾つかの入手源から入手されうる。保存領域に対するプライマーを使用して、糖タンパク質を発現することが公知の細胞系から、ｃＤＮＡ配列を増幅することが可能である（例えば、Ｍａｒｋｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５８１−５９６（１９９１）を参照されたい）。また、核酸は、科学文献中の配列に基づいてデノボ（ｄｅ  ｎｏｖｏ）で合成されうる。核酸は、所望の配列にわたる重複オリゴヌクレオチドの伸長によっても合成されうる（例えば、Ｃａｌｄａｓら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１３，３５３−３６０（２０００）を参照されたい）。所望により、核酸配列は、本発明の宿主細胞における発現を改善するために、好ましいコドン使用頻度の表に従いコドン最適化されうる（Ｃｈａｎｇら，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．５４：８１５−８２２（２００６））。活性糖タンパク質の製造は、それが該細胞により産生され分泌される場合、該タンパク質の適切なフォールディングを要しうる。しかし、そのようなフォールディングは、例えば関心のあるエピトープが直鎖状である場合には、該タンパク質をワクチンタンパク質として使用するために必須でないかもしれない。末端アルファ−１，３−ガラクトース残基の存在はワクチン糖タンパク質の免疫原性のために必要である可能性があり、あるいは産生されているワクチン糖タンパク質の免疫原生を増強する可能性がある。
【００７５】
ＩＩＩ．ウイルスおよび他のワクチン標的
本発明に適したワクチン標的には、抗原の末端へのアルファ−ｇａｌ部分の結合により抗原応答が増強されうるものが含まれる。好ましい実施形態においては、該ワクチンタンパク質は、該標的に由来するペプチドまたはタンパク質を含む。該標的は、好ましくは、疾患媒介体、例えばウイルス、真菌、細菌または他の微生物である。他の実施形態においては、該標的は、標的タンパク質として使用されうる既知エピトープペプチドを発現する特定のタイプの細胞、例えば癌細胞でありうる。例えば、好ましいエピトープペプチドは、Ｈｅｒ−２エピトープ、ｎｅｕエピトープまたは前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）エピトープよりなる群から選択されうる。
【００７６】
好ましいウイルス標的には、ヒトおよび／または動物において疾患を引き起こすことが知られているウイルス、例えばインフルエンザウイルス（例えば、インフルエンザＡ、ＢまたはＨＮ５１）；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ、例えば、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２（これは性器ヘルペスに関連づけられる））；肝炎ウイルス、呼吸器性シンシチウムウイルス（ＲＳＶ）、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ、例えば、ＰＩＶ  ＩＩＩ型）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ、例えば、ＨＰＶ−１６（これは子宮頸癌に関連づけられうる））、エプスタインバーウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ（これはエイズに関連づけられる））およびヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、パラモキシウイルス（例えば、流行性耳下腺炎および麻疹に関連づけられるもの）、ポックスウイルス、レオウイルス科ウイルス（ロタウイルス、レオウイルスおよびコロラドダニ熱ウイルスを含む）およびポリオウイルスが含まれる。
【００７７】
ウイルスに関する好ましい標的タンパク質には、カプシドタンパク質、表面コートタンパク質、構造タンパク質、および免疫系に接近可能でありうる他のタンパク質、特に、天然でグリコシル化されているタンパク質が含まれる。１以上の追加的なグリコシル化部位が、該標的タンパク質をコードするＤＮＡ配列内に設けられうる。天然グリコシル化部位が存在しない場合には、１以上の人工グリコシル化部位が、該標的タンパク質をコードするＤＮＡ配列内に設けられうる。該標的タンパク質をコードするＤＮＡ配列はクローニングまたは合成されることが可能であり、本発明の宿主細胞における発現に関して最適化されうる。
【００７８】
本発明において有用なワクチンタンパク質は以下のウイルスタンパク質の１以上の全て又は断片を含みうる。当業者は、絶えず増大しつつあるウイルスゲノムデータベース、例えばＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ｏｆ  Ｖｉｒｕｓｅｓ：Ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｖｉｒｕｓ  Ｄａｔａｂａｓｅ，ｖｅｒｓｉｏｎ  ３のウェブサイト；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＩＣＴＶｄｂ／ＩＣＴＶｄＢ／およびｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖｉｒｏｌｏｇｙ．ｎｅｔ／ｇａｒｒｙｆａｖｗｅｂｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ＃ｓｐｅｃｉｆｉｃを参照することにより、追加的な適当なウイルスタンパク質を位置づけ又は特定しうる。
【００７９】
好ましい実施形態においては、１以上のウイルスタンパク質または糖タンパク質が化合物ワクチンの一部として一緒に使用されうる。該化合物ワクチンは、同じ標的ウイルスからの複数のワクチンタンパク質、および異なる標的ウイルスからの複数のワクチンタンパク質を含みうる。以下は、本発明におけるワクチンタンパク質として役立ちうる標的ウイルスおよびウイルスタンパク質の非限定的な具体例である。
【００８０】
インフルエンザウイルス（赤血球凝集素（ＨＡ））糖タンパク質；ノイラミニダーゼ（ＮＡ）糖タンパク質；マトリックスタンパク質；Ｍ１タンパク質；Ｍ２タンパク質；Ｍ３タンパク質；核タンパク質（ＮＰ）ペプチド；ＰＡタンパク質；ＰＢ１タンパク質およびＰＢ２タンパク質；Ｒｅｖタンパク質。ＭｃＣａｕｌｅｙおよびＭａｈｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２１１：２８１−２９４（１９８３）；Ｌａｍｂら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．，７８：４１７０−４１７４（１９８１））を参照されたい。
【００８１】
ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルスおよびサイトメガロウイルスを含む）：エンベロープ糖タンパク質：糖タンパク質Ｂ（ＶＰ７とも称される）；糖タンパク質Ｃ／ＶＰ７．５；糖タンパク質Ｄ／ＶＰ１７／１８；エンベロープ糖タンパク質Ｅ；エンベロープ糖タンパク質Ｇ；エンベロープ糖タンパク質Ｈ；エンベロープ糖タンパク質Ｉ；エンベロープ糖タンパク質Ｊ；エンベロープ糖タンパク質Ｋ；エンベロープ糖タンパク質Ｌ；エンベロープ糖タンパク質Ｍ；エンベロープ糖タンパク質Ｎ；小カプシドタンパク質；外皮タンパク質；ＶＰ１１／１２；ＶＰ１３／１４；ＶＰ２２；およびＶＰ−５／ＩＣＰ５；ＶＰ１９ｃ；ＶＰ２３；ＶＰ２６；ＩＣＰ１−２；ＩＣＰ３５；ＩＣＰ４７。Ｒｏｉｚｍａｎ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３：１１３０７−１１３１２（１９９６）；ＷｈｉｔｌｅｙおよびＲｏｉｚｍａｎ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１０（２）：１４５−１５１（２００２）；Ｄｕｎｎら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，１００：１４２２３−１４２２８（２００３）を参照されたい。ヘルペスウイルスには、水痘・帯状疱疹ウイルス（水痘の原因）；およびエプスタインバーウイルスも含まれる。
【００８２】
フラビウイルス属（デングウイルス；ウエストナイル熱ウイルス；肝炎ウイルス；およびＧＢウイルスを含みうる）；デング：タンパク質Ｃ；タンパク質Ｍ；タンパク質Ｅ。Ｃｈａｍｂｅｒｓら，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ；４４：６４９−６８８（１９９０）を参照されたい。肝炎ウイルス：（ＧＢウイルスを含む）表面抗原、例えばＨＢｓＡｇ；ｐ１７ｅ／ＨＢｅＡｇ；ＨＢｅ１；ＨＢｅ２；ｐ２１ｃ／ＨＢｃＡｇ；Ｐ３９／ＧＰ４２；ｐ２４／ＧＰ２７；ＧＰ３３／ＧＰ３６；ｐｒｅＳｌ；ｐｒｅ−Ｓ２；Ｓタンパク質；ｐ７４（ＮＳ３）；ｐ６８（ＮＳ５Ｂ）；ｐ２０（コアタンパク質）；ＨＤＡｇ−ｐ２４；ＨＤＡｇ−ｐ２７。Ｓｅｌｌｓら，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８４：１００５−１００９（１９８７）；Ｈｅｅｒｍａｒｍら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：３９６−４０２（１９８４）；Ｓｖｉｔｋｉｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；７９：６８６８−６８８１（２００５）；Ｓａｌｆｅｌｄら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６３：７９８−８０８（１９８９）；Ｇｒｏｔｔｏｌａら，Ｌｉｖｅｒ  Ｔｒａｎｓｐｌ．８：４４３−４４８（２００２）；Ｃａｓｅｙら，ＰＮＡＳ，ＵＳＡ；９０：９０１６−９０２０（１９９３）。ＧＢウイルス：エンベロープタンパク質：Ｅ１糖タンパク質；Ｅ２。Ｍｕｅｒｈｏｆｆら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７１：６５０１−６５０８；Ｂｕｋｈら．，ＷＯ２０００／０７５３３７。
【００８３】
パラミクソウイルス／パラモキシウイルス；例えば、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）、例えば、ヒトＰＩＶ−１（レスピロウイルス）およびヒトＰＩＶ−２および−４（ルブラウイルス）；ニューモウイルス、例えば、呼吸器性シンシチウムウイルス（ＲＳＶ）；モルビリウイルス、例えば、ムンプスウイルスおよび麻疹ウイルス；ヘニパウイルス、例えば、ヘンドラウイルスおよびニパー（Ｎｉｐａｈ）ウイルス；およびメタニューモウイルス。典型的には、該ゲノムは、ヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質およびヌクレオカプシドリン酸化タンパク質（Ｐ）（それらは共に、該ウイルスワクチンタンパク質として働きうる）の両方をコードする遺伝子を含む。を参照されたい。Ｃｏｌｌｉｎｓ，米国特許第６，２６４，９５７号を参照されたい。パラミクソウイルスの或るものも、本発明におけるウイルスワクチンタンパク質として働きうるノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質を含有する。また、該ウイルスは、しばしば、赤血球凝集素（Ｈ）および融合（Ｆ）糖タンパク質をその表面に含有し、これらはウイルスワクチンタンパク質を構成しうる。
【００８４】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ、例えば、ＨＰＶ−１６（これは子宮頸癌に関連づけられうる））、Ｌ１およびＬ２によりコードされるカプシドタンパク質；Ｅ７抗原ペプチド。Ｃａｒｔｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８０：４６６４−７２（２００６）；Ｐａｓｔｒａｎａら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３３７：３６５−７２（２００５）を参照されたい。
【００８５】
フィロウイルス（エボラウイルスを含む）。ＶＰ３０；ＶＰ３５；ポリメラーゼＬタンパク質；ＶＰ４０；ＶＰ２４；およびＧＰ／ＳＧＰ糖タンパク質。Ｆｏｌｋｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４：１６−１７（１９９８）；およびＦｅｌｄｍａｎｎ，Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２４：１−１９（１９９２）を参照されたい。
【００８６】
アデノウイルス：タンパク質ＩＩ（ヘキソン単量体Ｓ）；カプシドタンパク質Ｓ（ＩＩＩ）およびＩＩＩａ（ペントンベースタンパク質）；線維タンパク質ＩＶ；タンパク質ＶＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸ（ヘキソンマイナーポリペプチド）。Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｊ．Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８１：２５７３−２６０４（２０００）；Ｒｏｕｌｓｔｏｎら，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ５３：５７７−６２８（１９９９）；ならびにＹｅｗｄｅｌｌおよびＢｅｒｍｉｎＪｋ；Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．１５：５７９−６０６（１９９９）を参照されたい。
【００８７】
レンチウイルス、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（後天性免疫不全症候群（エイズ）に関連づけられる）；エンベロープ糖タンパク質（ＧＰ１２０およびＧＰ４１）；ウイルスカプシドタンパク質（ｐ２４）；ヌクレオカプシドタンパク質（ｐ６およびｐ７）；およびマトリックスタンパク質（ｐ１７）；ＨＩＶ調節タンパク質（Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｎｅｆ）。Ｗａｉｎ−Ｈｏｂｓｏｎ，Ｓ．，１９８９．ＨＩＶ  ｇｅｎｏｍｅ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．ＡＩＤＳ  ３：ｓｕｐｐ  １；１３−９（１９８９）；およびＲａｔｎｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：２７７−８４（１９８５）を参照されたい。
【００８８】
ブニヤウイルス科（ハンタウイルスを含む）エンベロープ糖タンパク質（糖タンパク質ＧＰ１；ＧＰ２）；ヌクレオカプシドタンパク質（タンパク質Ｎ）。Ｓｃｈｍａｌｊｏｈｎら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９：１９４９−１９５５（１９８８）を参照されたい。
【００８９】
ニドウイルス（コロナウイルスおよび動脈炎ウイルス）：（重症急性呼吸症候群（ＳＡＲＳ）に関連づけられるウイルスを含む）。Ｓ（スパイク糖タンパク質）；Ｅ（エンベロープタンパク質）；Ｍ（膜糖タンパク質）；およびＨＥ（赤血球凝集素−エステラーゼ）；Ｎ（リン酸化タンパク質）。Ｐｙｒｅら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  Ｊ．，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖｉｒｏｌｏｇｙｊ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｌ／ｌ／７（２００４）を参照されたい。
【００９０】
レオウイルス科（ロタウイルス、レオウイルスおよびコロラドダニ熱ウイルス）；σ１、σ２およびσ３；μ１ｃ；ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７。ＪＪｏｋｌｉｋ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，４５：４８３−５０１（１９８１）を参照されたい。
【００９１】
ピコルナウイルス科（ポリオウイルスを含む）：ウイルスカプシドタンパク質：ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４。ＫｏｃｈおよびＫｏｃｈ，Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ／Ｗｅｉｎ（ＮＹ，１９８５）を参照されたい。
【００９２】
ＩＶ．細菌および他のワクチン標的
本発明における好ましい細菌標的には、ヒトおよび／または動物において疾患を引き起こすことが知られているもの、例えば、以下のものが含まれる：マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（結核；らい；慢性感染症）；ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）（呼吸器感染症、髄膜炎、結膜炎、軟性下疳）；マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）（非定型肺炎；尿路性器感染症）；バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（炭疽、食中毒）；サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）（腸チフス、腸炎、食中毒）；クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）（破傷風、ボツリヌス症、ガス壊疽、菌血症）；トレポネマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）（梅毒）；ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）（回帰熱、ライム病）；ウレアプラズマ（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）（日和見尿路性器感染症）；スタヒロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）（皮膚膿瘍、日和見感染症）；ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（ストレプ（Ｓｔｒｅｐ）咽頭および他の呼吸器感染症、皮膚および他の膿瘍、産褥熱、日和見感染症）；レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）（レプトスピラ症）；カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）（尿路性器／消化管感染症）；ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒ）（消化性潰瘍）；シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（尿路感染症、熱傷、創傷）；レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）（肺炎、呼吸器感染症）；ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）（淋病、髄膜炎、鼻咽頭感染症）；モラキセラ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）（結膜炎）；ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）（ブルセラ症）；ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）（百日咳）；フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）（野兎病）；エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）（結腸および他の部位の日和見感染症）；シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）（細菌性赤痢）；クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）（呼吸器および尿路感染症）；エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）（日和見感染症）；セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）（日和見感染症）；プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）（尿路感染症）；プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）（創傷および熱傷感染症、尿路感染症）；モルガネラ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）（夏季下痢、日和見感染症）；エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）（ペスト、腸間膜リンパ節炎、敗血症）；ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）（コレラ、急性胃腸炎）；パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）（ネコおよびイヌ咬傷に関連した感染症）；カリマトバクテリウム（Ｃａｌｙｍｍａｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（肉芽腫）；ガードネレラ（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ）（膣炎）；エイケネラ（Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ）（創傷感染症）；ストレプトバシラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）（ラットの咬みつきに関連した感染症）；バクテロイデス／フゾバクテリウム（口腔、消化器、呼吸器および尿路性器感染症、創傷および膿瘍）；ベイヨネラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ）（口腔微生物叢および膿瘍）；リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）（チフス、ロッキー山紅斑熱）；ロシャリメア（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ）（塹壕熱）；コ���シエラ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ）（Ｑ熱）；バルトネラ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）（オロヤ熱）；クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）（トラコーマ、封入体結膜炎、非淋菌性尿道炎、パロー熱）；ペプトコッカス（Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（産後敗血症、内臓病変）；ペプトストレプトコッカス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（産褥熱、発熱性感染症）；ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）（消化管および膣の微生物叢）；リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）（リステリア症）；エリジペロスリックス（Ｅｒｙｓｉｐｏｌｏｔｈｒｉｘ）（類丹毒）；コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（ジフテリアおよび皮膚日和見感染）；プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（創傷感染症および疾患）；ユウバクテリウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（口腔および他の感染症）；アクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）（アクチノミセス症）；ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）（ノカルジア症、菌腫、膿瘍）；およびデルマトフィルス（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ）（皮膚病変）。
【００９３】
細菌に関する好ましい標的タンパク質には、膜タンパク質、構造タンパク質、および免疫系に接近可能でありうる他のタンパク質、特に、天然でグリコシル化されるタンパク質が含まれる。１以上の追加的なグリコシル化部位が、該標的タンパク質をコードするＤＮＡ配列内に設けられうる。天然グリコシル化部位が存在しない場合には、１以上の人工グリコシル化部位が、該標的タンパク質をコードするＤＮＡ配列内に設けられうる。該標的は、多糖または脂質に融合したペプチドをも含みうる。この場合、該多糖または脂質は、最適には、該標的細菌を天然で包囲または被包する多糖または脂質から誘導されうる。該標的タンパク質をコードするＤＮＡ配列はクローニングまたは合成されることが可能であり、本発明の宿主細胞における発現に関して最適化されうる。
【００９４】
本発明において有用なワクチンタンパク質は該標的細菌タンパク質の１以上の全て又は断片を含みうる。当業者は、絶えず増大しつつある細菌ゲノムデータベース、例えばＳａｎｇｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒのウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｐｒｏｊｅｃｔｓ／Ｍｉｃｒｏｂｅｓ／）において入手可能なものを参照することにより、追加的な適当な細菌タンパク質を位置づけ又は特定しうる。好ましい実施形態においては、１以上の細菌タンパク質または糖タンパク質が化合物ワクチンの一部として一緒に使用されうる。該化合物ワクチンは、同じ標的細菌からの複数のワクチンタンパク質、および異なる標的細菌からの複数のワクチンタンパク質、および標的ウイルスからのワクチンタンパク質、または他のエピトープペプチド、例えば、癌細胞に対するエピトープを含みうる。以下は、本発明におけるワクチンタンパク質として役立ちうる標的細菌および細菌タンパク質の非限定的な具体例である。
【００９５】
サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）（腸チフス、腸炎、食中毒）。エンベロープタンパク質（ｅｎｖＡ、ｅｎｖＤ、ｅｎｖＺ／ｏｍｐＢ／ｔｐｐＡ／ｔｐｐＢ）、外膜タンパク質（ｏｍｐＡ、ｏｍｐＣ、ｏｍｐＤ、ｏｍｐＦ、ｏｍｐＨ、ｏｍｐＲ、ｐｅｆＣ、ｐｓｓ、ｒｃｋ、ｓｐｖＡ、ｔｃｔＡ、ｔｃｔＢ）；外膜ポリンタンパク質（ｎｍｐＣ）；外膜プロテアーゼＥ（ｐｇｔＥ）；外膜ホスホリパーゼＡ（ｐｌｄＡ）；リン酸限定誘導性外膜孔タンパク質（ｐｈｏＥ）；スペルミジンおよびプトレシン輸送体（ｐｏｔＡ）；膜結合アシルアミノ酸エステラーゼ（ａｐｅＥ）；膜結合センサー（ａｒｃＢ）；膜結合付着部位（ａｔｄＡ）。Ｗｕら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８７：４７２０−４７２７（２００５）を参照されたい；また、ｗｗｗ．ｓａｌｍｏｎｅｌｌ．ｏｒｇ／ｇｅｎｏｍｉｃｓ／も参照されたい。
【００９６】
マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（結核；らい；慢性感染症）。内在性膜タンパク質（ａｍｔ；ａｒｓＡ；ａｒｓＢ１；ａｒｓＢ２；ａｒｓＣ；ｂｅｔＰ；ｃｈａＡ；ｃｙｓＴ；ｃｙｓＷ；ｄｐｐＢ；ｄｐｐＣ；ｄｒｒＢ；ｄｒｒＣ）。Ｃａｍｕｓら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４８：２９６７−２９７３（２００２；Ｃｏｌｅら，Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：５３７−５４４（１９９８）。
【００９７】
ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）（呼吸器感染症、髄膜炎、結膜炎、軟性下疳）。外膜タンパク質Ｐ１；Ｐ２（ｂ／ｃ）；Ｐ４（ｅ）；Ｐ５（ｄ）；Ｐ６（ＰＡＬ；タンパク質ｇ）；ＰＣＰ；ＯＭＰ２６；Ｄ１５；トランスフェリン結合タンパク質（Ｔｂｐ）；ヘム；ヘモペキシン結合タンパク質（ＨｘｕＡ）。ワクチンタンパク質は、該ワクチンタンパク質の抗原性を増強するために、リポオリゴ糖（ＬＯＳ）に連結されうる。Ｆｏｘｗｅｌｌら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｖ，６２：２９４−３０８（１９９８）を参照されたい；ＧＴＰ結合タンパク質（ｌｅｐＡ）；外膜受容体媒介輸送エネルギー付与タンパク質（ＴｏｎＢ）；タンパク質輸出膜タンパク質（ＳｅｃＤ：ＳｅｃＦ）；ＨａｐおよびＨＷＭ１／ＨＭＷ２接着性タンパク質；ＩｇＡ１プロテアーゼ。ｈｔｔｐ：／／ｃｍｒ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／ｔｉｇｒ−ｓｃｒｉｐｔｓ／ＣＭＲ／ｓｈａｒｅｄ／ＡＨＧｅｎｅＬｉｓｔ．ｃｇｉ？ｓｕｂ  ｏｒｇ  ｖａｌ＝ｇｈｉ＆ｆｅａｔ  ｔｙｐｅ＝ＯＲＦ；Ｗｅｂｓｔｅｒら，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ  ５４：８２９−８４２（２００６）を参照されたい；ＦｌｅｉｓｃｈｍａｎｎおよびＡｄａｍｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６９：４９６−５１２（１９９５）；Ｂｅｒｅｎｓｏｎら，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，７３：２７２８−２７３５（２００５）；Ｇｒｅｅｎら，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ５９：３１９１−３１９８（１９９１）を参照されたい。
【００９８】
マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）（非定型肺炎；尿路性器感染症）。膜タンパク質ｐ５２、ｐ６７（ｐＭＧＡ）およびｐ７７；Ｊａｎら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ；７：１６０−１６６（１９９６）；脂質結合膜タンパク質（ＬＡＭＰ）；Ｌｏら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，３６：１２４６−５３（２００３）を参照されたい。
【００９９】
トレポネマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）（梅毒）：膜タンパク質（ｔｍｐＡ）；Ｔｐ３３タンパク質；膜抗原、病原体特異的（ｔｐｄ）；基本膜タンパク質（ｔｐｎ３９ｂ）；外膜タンパク質（ｔｐｎ５０；ｔｍｐＢ；ｏｍｐＨ）；膜リポタンパク質（ｔｍｐＣ）；リポタンパク質（ｔｐｐ５０；ｔｐｐ１７；ｔｐｎ３２）；鞭毛フックタンパク質ｆｌｇＥ；鞭毛フック基部体桿体複合タンパク質ｆｌｉＥ；鞭毛基部体桿体タンパク質ｆｌｇＢ；ｆｌｇＣ；ｆｌｇＦ；ｆｌｇＧ；鞭毛基部体桿体修飾タンパク質ｆｌｇＤ；鞭毛Ｐリングタンパク質ｆｌｇＩ；鞭毛タンパク質ｆｌｇＪ；鞭毛フック結合タンパク質ｆｌｇＫおよびｆｌｇＬ；鞭毛Ｍリングタンパク質ｆｌｉＦ；鞭毛タンパク質ｆｌｉＪ。ＭｃＫｅｖｉｔｔら，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，７３：４４４５−４４５０（２００５）。
【０１００】
ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）（回帰熱、ライム病）：外表面タンパク質（ＯｓｐＡ；ＯｓｐＢ；ＯｓｐＣ）。Ａｎｄｅｒｔｏｎら，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，７２：２０３５−２０４４（２００４）を参照されたい。
【０１０１】
ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）（ブルセラ症）。外膜タンパク質３１（Ｏｍｐ３１）；Ｃａｓｓａｔａｒｏら，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ；７３：８０７９−８０８８（２００５）を参照されたい；主要ＯＭＰ  Ｏｍｐ２５  ＯＭＰ３１およびＯｍｐ２ｂ；それほど豊富に存在しないＯＭＰ  Ｏｍｐ１０、Ｏｍｐ１６およびＯｍｐ１９；ならびに平滑リポ多糖（Ｓ−ＬＰＳ）。Ｃｌｏｅｃｋａｅｒｔら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；６：６２７−６２９（１９９９）。酸性ｐＨ誘導性外膜タンパク質（Ａｏｐ）。Ｂｒｕｃｅｌｌａ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｏｐｅｚ−ＧｏｎｉおよびＩｇｎａｃｉｏ  Ｍｏｒｉｙｏｎ編）；Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｐｒｅｓｓ（２００４）を参照されたい。
【０１０２】
ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（ストレプ（Ｓｔｒｅｐ）咽頭および他の呼吸器感染症、皮膚および他の膿瘍、産褥熱、日和見感染症）。Ｍ１タンパク質、コラーゲン様表面タンパク質；ｌｅｐＡ。Ｚｈａｎｇら，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ；７：１３７９−１３９０（２００７）。
【０１０３】
細菌に関する好ましい標的ワクチンタンパク質には、該細菌により産生されることが知られているペプチドまたはタンパク質、特に、該標的ペプチドまたは標的タンパク質を認識するよう適合化された抗体または細胞傷害性Ｔ細胞に該標的ペプチドまたはタンパク質が接近可能となりうるよう細菌外膜の表面上またはその付近に存在しうるものが含まれうる。
【０１０４】
Ｖ．宿主細胞
糖タンパク質の発現のためには、下等真核生物、例えば酵母が好ましい。なぜなら、それらは高収率で経済的に培養可能であり、適当に修飾されると、適当なグリコシル化をもたらしうるからである。酵母は特に、迅速な形質転換、試験タンパク質局在化法および簡便な遺伝子ノックアウト技術を可能にする確立された遺伝的現象をもたらす。適当なベクターは、所望により、発現制御配列、例えばプロモーター、例えば３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖酵素、および複製起点、終結配列などを有する。細胞培養には、種々の酵母、例えばクライベロミセス・ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）およびハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）が好ましい。なぜなら、それらは高い細胞密度まで増殖可能であり、多量の組換えタンパク質を分泌可能だからである。同様に、本発明の糖タンパク質を工業的規模で製造するためには、糸状菌、例えばアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、フザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）などが使用されうる。他の適当な宿主には以下のものが含まれる：ピチア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｆｌｎｌａｎｄｉｃａ）、ピチア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピチア・コクラメ（Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ）、ピチア・メルンブラネファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｒｎｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピチア・ミヌタ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｉｎｕｔａ）（オガタエア・ミヌツ（Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔｓ）、ピチア・リンドネリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｌｉｎｄｎｅｒｉ））、ピチア・オプンチエ（Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピチア・テルモトレランス（Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピチア・サリクタリア（Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピチア・グエルクーム（Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｕｍ）、ピチア・ピェペリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピチア・スチプチス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｆｉｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、ハンゼヌラ属種（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｓｐ．）、クライベロミセス属種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、クリソスポリウム・ルックノウエンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フザリウム・グラミネウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅｕｍ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）およびフィスコミトレラ��パテンス（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）。
【０１０５】
下等真核生物、特に酵母および糸状菌は、グリコシル化パターンがヒト様であるか又はヒト化されている糖タンパク質をそれらが発現するよう、遺伝的に修飾されうる。それは、選択された内因性グリコシル化酵素を排除すること及び／又は外因性酵素を供給すること［Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓら，ＵＳ  ２００４／００１８５９０（その開示を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている］により達成されうる。例えば、宿主細胞は、糖タンパク質上のＮ−グリカンに関する１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性の開始（外鎖開始）が妨げられるよう選択または操作されることが可能であり、あるいはドリチー−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ドリチルα−１，３−マンノシルトランスフェラーゼ活性が減少または消失する（そうでなければ、該活性は糖タンパク質上のＮ−グリカン上にマンノース残基を付加するであろう）。さらに、そのような宿主細胞、特に酵母または糸状菌宿主細胞は、例えばα−１，２−マンノシダーゼＩ活性、マンノシダーゼＩＩ活性、マノシダーゼＩＩｘおよびクラスＩＩＩマンノシダーゼ活性のようなマンノシダーゼ活性を発現するべきであり、あるいは該活性を発現するよう操作されるべきである。宿主細胞、特に酵母および真菌宿主細胞は、Ｎ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼＩ（ＧｎＴ）活性、例えばＧｎＴＩ、ＧｎＴＩＩ、ＧｎＴＩＩＩ、ＧｎＴＩＶ、ＧｎＴＶ、ＧｎＴＶＩおよびＧｎＴＩＸを発現するよう操作される。最後に、ＵＤＰ−ガラクトース、適当なゴルジ膜輸送体、およびβ−ガラクトシルトランスフェラーゼ（例えば、β−ＧａｌＴ）をコードする遺伝子のプールを生成する酵素は、末端β−１，４−ガラクトースを有する複合型ヒトＮ−グリカンを転移しうる宿主株を与える（Ｂｏｂｒｏｗｉｃｚら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ；１４：７５７−６６（２００４））。
【０１０６】
ＶＩ．糖操作ハイブリッドＮ−グリカン産生酵母株内へのα−ＧａｌＴの導入
ＰＢＰ３のような末端ＧｌｃＮＡｃを含有する哺乳類ハイブリッドＮ−グリカンを有するタンパク質を分泌する糖操作されたピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）株は、酵母型Ｎ−グリコシル化の部分（例えば、ＰｐＯＣＨ１）の除去ならびに小胞体内に適切に局在化したα−１，２−ＭＮＳ１およびＧｎＴＩ酵素の発現により作製される（Ｃｈｏｉら，ＰＮＡＳ，２００３；Ｂｏｂｒｏｗｉｃｚら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ；１４：７５７−６６（２００４））。さらに、ＲＤＰ３９−６のような末端β−１，４−ガラクトースを有するハイブリッド哺乳類Ｎ−グリカンを分泌する株はｈβ−ＧａｌＴＩおよびＵＤＰ−ガラクトース４−エピメラーゼの更なる発現により作製される（Ｄａｖｉｄｓｏｎら，米国特許出願第２００６／００４０３５３号（その開示を参照により本明細書に組み入れることとする））。ＵＤＰ−Ｇａｌ輸送体の発現はβ−１，４−ガラクトース転移を更に増強しうる（Ｄａｖｉｄｓｏｎら，米国特許出願第２００６／００４０３５３号）。末端α−１，３−ガラクトシルエピトープ発現株を得るためには、小胞体に適切に標的化されるα−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼを発現する他のプラスミドを、このβ−１，４−ガラクトース末端ハイブリッドＮ−グリカン産生株内に形質転換する。標準的な酵母選択培地（例えば、該プラスミドが含有する耐性遺伝子の対象であるナーセオスリシン（Ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）またはヒグロマイシンを含有するもの）上で形質転換体を選択し、正しい組込み体を酵母細胞ライセートＰＣＲによりスクリーニングした。ついで、マトリックス支援レーザー脱着／イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）により、分泌性レポータータンパク質（例えば、Ｋ３）のＰＮＧアーゼＦ消化により遊離したＮ−グリカンを分析することにより、適切に標的化されたα−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼの機能的発現に関して、組換え体をスクリーニングする。ＧＦＩ５．７（α−Ｇａｌ）（β−Ｇａｌ）ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを与える、ＲＤＰ３９−６のＧＦＩ３．５  Ｎ−グリカン（β−Ｇａｌ）ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２への単一α結合ガラクトース残基の付加と合致して観察される質量により、ハイブリッドβ−１，４−ガラクトース末端アクセプターＮ−グリカンへのα−１，３−ガラクトースの適切な付加が確認される。
【０１０７】
ＶＩＩ．ワクチン組成物
本発明の下等真核宿主細胞は、ワクチンタンパク質、好ましい実施形態においてはワクチン糖タンパク質を発現させるために使用されうる。該ワクチンタンパク質または糖タンパク質は、ワクチン糖タンパク質組成物を得るために、他の製薬上許容される活性物質および／または不活性賦形剤と共に製剤化されうる。本発明のワクチン糖タンパク質組成物は、末端α−ガラクトシル残基を含むＮ−グリカンを含む。ある実施形態においては、末端α−ガラクトシル残基を含むＮ−グリカンが主要Ｎ−グリカンである。好ましい実施形態においては、該主要Ｎ−グリカンは、該組成物中の糖タンパク質上に存在するＮ−グリカンの少なくとも３０モル％、好ましくは少なくとも４０モル％、より好ましくは少なくとも５０モル％を構成する。特定の好ましい実施形態においては、該主要Ｎ−グリカンは、（α−Ｇａｌ）（β−Ｇａｌ）ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、（α−Ｇａｌ）（β−Ｇａｌ）２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、および（α−Ｇａｌ）２（β−Ｇａｌ）２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２よりなる群から選択される。
【０１０８】
本発明のワクチン組成物は、好ましくは、ウイルス由来または細菌由来のワクチン糖タンパク質を含む。該ワクチン糖タンパク質は、好ましくは、天然でグリコシル化された糖タンパク質である。あるいは、該ワクチン糖タンパク質は、合成的に製造された糖タンパク質を含むことが可能であり、特に、天然タンパク質においては本来存在しない１以上のＮ−グリコシル化部位を生成するよう遺伝的に操作された糖タンパク質を含むことが可能である。ある実施形態においては、該ワクチン組成物は、癌細胞に由来するエピトープペプチドを含みうる。これらの実施形態においては、該ワクチン組成物は、癌細胞または腫瘍細胞抗原からのエピトープペプチドに由来するエピトープ糖ペプチド配列を含みうる。好ましい実施形態においては、該エピトープペプチドは、Ｈｅｒ−２エピトープ、ｎｅｕエピトープまたは前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）エピトープよりなる群から選択される。ある好ましい実施形態においては、該ワクチン組成物は、複数のワクチンタンパク質またはワクチン糖タンパク質を含む化合物ワクチン組成物を含みうる。そのような場合、該ワクチンタンパク質またはワクチン糖タンパク質は、同じ標的ウイルス、細菌または他のエピトープペプチドに対する複数のワクチン糖タンパク質を含むことが可能であり、あるいは、複数の異なるウイルス、細菌および／またはエピトープペプチド（例えば、癌細胞または腫瘍細胞に対するエピトープペプチド）に対するワクチン糖タンパク質を含むことが可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】酵母と哺乳動物との、Ｎ−グリコシル化装置の比較。どちらも、タンパク質フォールディングおよびＥＲ成熟の後、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２前駆体を産生する。Ｎ−グリコシル化経路はゴルジにおいて異なり、哺乳動物はマンノースを除去し、追加的な糖、例えばＧｌｃＮＡｃおよびガラクトースを付加して複合Ｎ−グリカンを産生する。これとは対照的に、酵母は、多数のマンノース残基から構成されうる外部鎖を含む種々の連結で追加的なマンノースを付加する。
【図２】ヒトとほとんどの他の哺乳動物との、Ｎ−グリカン上で見出される末端糖の比較。ほとんどの哺乳動物は、ヒトのＮ−グリカンには完全に欠けている構造体である、少量の割合の末端α−１，３−結合ガラクトースを示す。
【図３】酵母Ｎ−グリコシル化装置の逐次的修飾。酵母Ｎ−結合グリカンのヒト化は、ヒト／哺乳類中間体Ｎ−グリカン構造体を産生しうる一連の酵母株をもたらす。そのようなＧＳ５．０中間体Ｎ−グリカン（β−Ｇａｌ）２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を産生しうる酵母株は、シアリルトランスフェラーゼの非存在下での適切に局在化した活性α−ＧａｌＴの操作により、均一なＧＳ５．９Ｎ−グリカン（α−Ｇａｌ）２（β−Ｇａｌ）２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を産生するよう修飾されうる。
【図４Ａ】α−ＧａｌＴを発現するＧＦＩ５．０糖操作酵母株は、末端α−ｇａｌを有するＮ−グリカンを産生する。この場合、未最適化マウスα−１，３−ＧａｌＴを未最適化ＧＦＩ５．０ヒト化ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）酵母株内に導入した。この株は、強力な誘導性ＡＯＸ１プロモーターの制御下、ヒトプラスミノーゲンのクリングル３ドメインを発現する。分泌性Ｋ３タンパク質をメタノール含有培地内での誘導により産生させ、Ｎｉ＋＋アフィニティークロマトグラフィーにより精製し、Ｎ−グリカンをＰＮＧアーゼＦ消化により遊離させ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳに付した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにおけるα−Ｇａｌ含有ピーク（ＧＳ５．８およびＧＳ５．９）の出現により、α−ＧａｌＴ活性が観察されうる。２．０，Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２；５．０，（β−Ｇａｌ）２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；５．８，（α−Ｇａｌ）（β−Ｇａｌ）２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；５．９，（α−Ｇａｌ）２（β−Ｇａｌ）２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２。
【図４Ｂ】α−ＧａｌＴを発現するＧＦＩ５．０糖操作酵母株は、末端α−ｇａｌを有するＮ−グリカンを産生する。この場合、未最適化マウスα−１，３−ＧａｌＴを未最適化ＧＦＩ５．０ヒト化ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）酵母株内に導入した。この株は、強力な誘導性ＡＯＸ１プロモーターの制御下、ヒトプラスミノーゲンのクリングル３ドメインを発現する。分泌性Ｋ３タンパク質をメタノール含有培地内での誘導により産生させ、Ｎｉ＋＋アフィニティークロマトグラフィーにより精製し、Ｎ−グリカンをＰＮＧアーゼＦ消化により遊離させ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳに付した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにおけるα−Ｇａｌ含有ピーク（ＧＳ５．８およびＧＳ５．９）の出現により、α−ＧａｌＴ活性が観察されうる。２．０，Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２；５．０，（β−Ｇａｌ）２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；５．８，（α−Ｇａｌ）（β−Ｇａｌ）２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；５．９，（α−Ｇａｌ）２（β−Ｇａｌ）２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２。
【図５Ａ】α−ＧａｌＴを発現するＧＦＩ５．０糖操作酵母株における上流グリコシル化装置の最適化はＮ−グリカンの均一性を増加させる。この場合、コドン最適化または局在化最適化されていないマウスα−１，３−ＧａｌＴを最適化ＧＦＩ５．０ヒト化ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）酵母株内に導入した。この株は、強力なＡＯＸ１プロモーターの制御下、ラット組換えＥＰＯを発現する。分泌性Ｈｉｓタグ付きｒｒＥＰＯタンパク質をメタノール含有培地内での誘導により産生させ、Ｎｉ＋＋アフィニティークロマトグラフィーにより精製し、Ｎ−グリカンをＰＮＧアーゼＦ消化により遊離させ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳに付した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにおけるα−Ｇａｌ含有ピーク（ＧＳ５．８およびＧＳ５．９）の出現により、活性なα−ＧａｌＴが観察されうる。２．０，Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２；５．０，（β−Ｇａｌ）２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；５．８，（α−Ｇａｌ）（β−Ｇａｌ）２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；５．９，（α−Ｇａｌ）２（β−Ｇａｌ）２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２。
【図５Ｂ】α−ＧａｌＴを発現するＧＦＩ５．０糖操作酵母株における上流グリコシル化装置の最適化はＮ−グリカンの均一性を増加させる。この場合、コドン最適化または局在化最適化されていないマウスα−１，３−ＧａｌＴを最適化ＧＦＩ５．０ヒト化ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）酵母株内に導入した。この株は、強力なＡＯＸ１プロモーターの制御下、ラット組換えＥＰＯを発現する。分泌性Ｈｉｓタグ付きｒｒＥＰＯタンパク質をメタノール含有培地内での誘導により産生させ、Ｎｉ＋＋アフィニティークロマトグラフィーにより精製し、Ｎ−グリカンをＰＮＧアーゼＦ消化により遊離させ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳに付した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにおけるα−Ｇａｌ含有ピーク（ＧＳ５．８およびＧＳ５．９）の出現により、活性なα−ＧａｌＴが観察されうる。２．０，Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２；５．０，（β−Ｇａｌ）２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；５．８，（α−Ｇａｌ）（β−Ｇａｌ）２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；５．９，（α−Ｇａｌ）２（β−Ｇａｌ）２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２。
【図６Ａ】α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質の比較は高度な類似性を示している。ボス・タウルス（Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ）、スス・スクロファ（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ）、ムス・ムスクルス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、カニス・ファミリアリス（Ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）α−ＧａｌＴタンパク質配列を、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ（ＤＮＡｓｔａｒ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用するＣｌｕｓｔａｌＶ解析を行うことにより比較した。
【図６Ｂ】α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質の比較は高度な類似性を示している。ボス・タウルス（Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ）、スス・スクロファ（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ）、ムス・ムスクルス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、カニス・ファミリアリス（Ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）α−ＧａｌＴタンパク質配列を、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ（ＤＮＡｓｔａｒ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用するＣｌｕｓｔａｌＶ解析を行うことにより比較した。
【図７Ａ】α−ＧａｌＴのライブラリーの発現およびピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）に関するコドン最適化はα−Ｇａｌ転移を改善する。この場合、コドン最適化されているが局在化最適化されていないムス・ムスクルス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）α−１，３−ＧａｌＴ、スス・スクロファ（Ｓ．ｓｃｒｏｆａ）α−１，３−ＧａｌＴ、カニス・ファミリアリス（Ｃ．ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）α−１，３−ＧａｌＴを最適化ＧＦＩ５．０ヒト化ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）酵母株内に導入した。この株は、強力な誘導性ＡＯＸ１プロモーターの制御下、ｒｒＥＰＯを発現する。分泌性Ｈｉｓタグ付きｒｒＥＰＯタンパク質をメタノール含有培地内での誘導により産生させ、Ｎｉ＋＋アフィニティークロマトグラフィーにより精製し、Ｎ−グリカンをＰＮＧアーゼＦ消化により遊離させ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳに付した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにおけるα−Ｇａｌ含有ピーク（ＧＳ５．８およびＧＳ５．９）の出現により、α−ＧａｌＴ活性が観察されうる。２．０，Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２；５．０，（β−Ｇａｌ）２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；５．８，（α−Ｇａｌ）（β−Ｇａｌ）２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；５．９，（α−Ｇａｌ）２（β−Ｇａｌ）２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２。
【図７Ｂ】α−ＧａｌＴのライブラリーの発現およびピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）に関するコドン最適化はα−Ｇａｌ転移を改善する。この場合、コドン最適化されているが局在化最適化されていないムス・ムスクルス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）α−１，３−ＧａｌＴ、スス・スクロファ（Ｓ．ｓｃｒｏｆａ）α−１，３−ＧａｌＴ、カニス・ファミリアリス（Ｃ．ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）α−１，３−ＧａｌＴを最適化ＧＦＩ５．０ヒト化ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）酵母株内に導入した。この株は、強力な誘導性ＡＯＸ１プロモーターの制御下、ｒｒＥＰＯを発現する。分泌性Ｈｉｓタグ付きｒｒＥＰＯタンパク質をメタノール含有培地内での誘導により産生させ、Ｎｉ＋＋アフィニティークロマトグラフィーにより精製し、Ｎ−グリカンをＰＮＧアーゼＦ消化により遊離させ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳに付した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにおけるα−Ｇａｌ含有ピーク（ＧＳ５．８およびＧＳ５．９）の出現により、α−ＧａｌＴ活性が観察されうる。２．０，Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２；５．０，（β−Ｇａｌ）２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；５．８，（α−Ｇａｌ）（β−Ｇａｌ）２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；５．９，（α−Ｇａｌ）２（β−Ｇａｌ）２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２。
【図７Ｃ】α−ＧａｌＴのライブラリーの発現およびピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）に関するコドン最適化はα−Ｇａｌ転移を改善する。この場合、コドン最適化されているが局在化最適化されていないムス・ムスクルス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）α−１，３−ＧａｌＴ、スス・スクロファ（Ｓ．ｓｃｒｏｆａ）α−１，３−ＧａｌＴ、カニス・ファミリアリス（Ｃ．ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）α−１，３−ＧａｌＴを最適化ＧＦＩ５．０ヒト化ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）酵母株内に導入した。この株は、強力な誘導性ＡＯＸ１プロモーターの制御下、ｒｒＥＰＯを発現する。分泌性Ｈｉｓタグ付きｒｒＥＰＯタンパク質をメタノール含有培地内での誘導により産生させ、Ｎｉ＋＋アフィニティークロマトグラフィーにより精製し、Ｎ−グリカンをＰＮＧアーゼＦ消化により遊離させ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳに付した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにおけるα−Ｇａｌ含有ピーク（ＧＳ５．８およびＧＳ５．９）の出現により、α−ＧａｌＴ活性が観察されうる。２．０，Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２；５．０，（β−Ｇａｌ）２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；５．８，（α−Ｇａｌ）（β−Ｇａｌ）２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；５．９，（α−Ｇａｌ）２（β−Ｇａｌ）２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２。
【図８Ａ】ＳｃＭｎｔ１１−５８と共に局在化しているスス・スクロファ（Ｓ．ｓｃｒｏｆａ）α−１，３−ＧａｌＴを含有する株におけるクリングル３の発現は、ｒｒＥＰＯで観察されるものに類似したＮ−グリカンを与える。この場合、コドン最適化されているが局在化最適化されていないヒツジα−１，３−ＧａｌＴを最適化ＧＦＩ５．０ヒト化ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）酵母株内に導入した。この株は、強力な誘導性ＡＯＸ１プロモーターの制御下、ヒトプラスミノーゲンのクリングル３ドメインを発現する。分泌性Ｈｉｓタグ付きＫ３タンパク質をメタノール含有培地内での誘導により産生させ、Ｎｉ＋＋アフィニティークロマトグラフィーにより精製し、Ｎ−グリカンをＰＮＧアーゼＦ消化により遊離させ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳに付した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにおけるα−Ｇａｌ含有ピーク（ＧＳ５．８およびＧＳ５．９）の出現により、α−ＧａｌＴ活性が観察されうる。２．０，Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２；５．０，（β−Ｇａｌ）２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；５．８，（α−Ｇａｌ）（β−Ｇａｌ）２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；５．９，（α−Ｇａｌ）２（β−Ｇａｌ）２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２。
【図８Ｂ】ＳｃＭｎｔ１１−５８と共に局在化しているスス・スクロファ（Ｓ．ｓｃｒｏｆａ）α−１，３−ＧａｌＴを含有する株におけるクリングル３の発現は、ｒｒＥＰＯで観察されるものに類似したＮ−グリカンを与える。この場合、コドン最適化されているが局在化最適化されていないヒツジα−１，３−ＧａｌＴを最適化ＧＦＩ５．０ヒト化ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）酵母株内に導入した。この株は、強力な誘導性ＡＯＸ１プロモーターの制御下、ヒトプラスミノーゲンのクリングル３ドメインを発現する。分泌性Ｈｉｓタグ付きＫ３タンパク質をメタノール含有培地内での誘導により産生させ、Ｎｉ＋＋アフィニティークロマトグラフィーにより精製し、Ｎ−グリカンをＰＮＧアーゼＦ消化により遊離させ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳに付した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにおけるα−Ｇａｌ含有ピーク（ＧＳ５．８およびＧＳ５．９）の出現により、α−ＧａｌＴ活性が観察されうる。２．０，Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２；５．０，（β−Ｇａｌ）２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；５．８，（α−Ｇａｌ）（β−Ｇａｌ）２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；５．９，（α−Ｇａｌ）２（β−Ｇａｌ）２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２。
【図９】ＧＦＩ５．０株内に導入されたα−ＧａｌＴのリーダー局在化の最適化は、Ｎ−グリカンに転移した末端α−ｇａｌの量を増加させる。この場合、コドン最適化されておりＳｃＭｎｎ２１−３６に関して局在化最適化されているヒツジα−１，３−ＧａｌＴを最適化ＧＦＩ５．０ヒト化ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）酵母株内に導入した。この株は、強力なＡＯＸ１プロモーターの制御下、ヒトプラスミノーゲンのクリングル３ドメインを発現する。分泌性Ｈｉｓタグ付きＫ３タンパク質をメタノール含有培地内での誘導により産生させ、Ｎｉ＋＋アフィニティークロマトグラフィーにより精製し、Ｎ−グリカンをＰＮＧアーゼＦ消化により遊離させ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳに付した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにおけるα−Ｇａｌ含有ピーク（ＧＳ５．９）の出現により、α−ＧａｌＴ活性が観察されうる。この成熟ＧＦＩ５．９株においては、ＧＳ５．９は主要Ｎ−グリカンとして観察されうる。２．０，Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２；５．９，（α−Ｇａｌ）２（β−Ｇａｌ）２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２。
【図１０】ＧＦＩ５．９糖操作ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）酵母株におけるインフルエンザＨＡエクトドメインタンパク質の発現。この株は、最適化ＧＦＩ５．０ヒト化ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）酵母株内に導入されたコドン最適化されているが局在化最適化されていないヒツジα−１，３−ＧａｌＴを含有する。Ｈｉｓタグ付きインフルエンザＨＡ（Ａ／香港／１／５８変異体）エクトドメインの発現を培養上清のウエスタンブロット分析により実証し、ついで、Ｎｉ＋＋アフィニティークロマトグラフィーにより精製したタンパク質をＰＮＧアーゼＦ消化およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析に付した。２．０，Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２；５．０，（β−Ｇａｌ）２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；５．８，（α−Ｇａｌ）（β−Ｇａｌ）２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；５．９，（α−Ｇａｌ）２（β−Ｇａｌ）２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２。
【図１１】ＧＦＩ５．９糖操作ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）酵母株におけるインフルエンザＨＡエクトドメインタンパク質の発現。この株は、最適化ＧＦＩ５．０ヒト化ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）酵母株内に導入されたコドン最適化され局在化最適化されているヒツジα−１，３−ＧａｌＴを含有する。Ｈｉｓタグ付きインフルエンザＨＡ（Ａ／サウスカロライナ／１／１８変異体）エクトドメインの発現を培養上清のウエスタンブロット分析により実証し、ついで、Ｎｉ＋＋アフィニティークロマトグラフィーにより精製したタンパク質をＰＮＧアーゼＦ消化およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析に付した。２．０，Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２；５．９，（α−Ｇａｌ）２（β−Ｇａｌ）２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２。
【図１２】最適化ＧＦＩ５．９糖操作ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）酵母株におけるＨＳＶ−２  ｇＤエクトドメインタンパク質の発現。この株は、最適化ＧＦＩ５．０ヒト化ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）酵母株内に導入されたコドン最適化され局在化最適化されているヒツジα−１，３−ＧａｌＴを含有する。Ｈｉｓタグ付きＨＳＶ−２  ｇＤエクトドメインの発現を培養上清のウエスタンブロット分析により実証し、ついで、Ｎｉ＋＋アフィニティークロマトグラフィーにより精製したタンパク質をＰＮＧアーゼＦ消化およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析に付した。２．０，Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２；５．０，（β−Ｇａｌ）２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；５．８，（α−Ｇａｌ）（β−Ｇａｌ）２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；５．９，（α−Ｇａｌ）２（β−Ｇａｌ）２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２。
【図１３】最適化ＧＦＩ５．９糖操作ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）酵母株におけるＨＳＶ−２  ｇＣエクトドメインタンパク質の発現。この株は、最適化ＧＦＩ５．０ヒト化ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）酵母株内に導入されたコドン最適化され局在化最適化されているヒツジα−１，３−ＧａｌＴを含有する。Ｈｉｓタグ付きＨＳＶ−２  ｇＣエクトドメインの発現を培養上清のウエスタンブロット分析により実証し、ついで、Ｎｉ＋＋アフィニティークロマトグラフィーにより精製したタンパク質をＰＮＧアーゼＦ消化およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析に付した。２．０，Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２；５．０，（β−Ｇａｌ）２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；５．８，（α−Ｇａｌ）（β−Ｇａｌ）２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；５．９，（α−Ｇａｌ）２（β−Ｇａｌ）２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２。
【０１１０】
以下の実施例においては、種ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）の宿主細胞においてウイルスワクチン糖タンパク質を発現させる。これらの実施例は本発明の特定の好ましい実施形態に関して本発明を実証するものであり、何ら限定的なものではない。本明細書における開示および実施例を読んだ当業者は、記載されている方法および物質に対する多数の変形、修飾および改良が、本発明の実施から逸脱することなく可能であると認識するであろう。
【０１１１】
実施例：
Ｉ．アルファ１，３−ガラクトーストランスフェラーゼのクローニング
ムス・ムスクルス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼをコードするが推定膜貫通ゴルジ局在化ドメインを欠く遺伝子（ＭｍαＧａｌＴ）を、鋳型としてのマウス腎ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）ならびにプライマーＲＣＤ４４６（ＴＴＧＧＣＧＣＧＣＣＡＡＣＡＧＣＣＣＡＧＡＣＧＧＣＴＣＴＴＴＣＴＴＧ）（配列番号１）およびＲＣＤ４４７（ＧＧＴＴＡＡＴＴＡＡＴＣＡＧＡＣＡＴＴＡＴＴＴＣＴＡＡＣＣＡＡＡＴＴ）（配列番号２）を使用するポリメラーゼ連鎖反応により増幅した。得られた産物をｐＣＲ２．１  Ｔｏｐｏベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にクローニングし、配列決定し、ｐＲＣＤ６８０と命名した。ＭｍαＧａｌＴ遺伝子を、ＡｓｃＩ／ＰａｃＩを使用してｐＲＣＤ６８０から消化し、ＡｓｃＩ／ＰａｃＩ部位に隣接したヒトβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼＩ触媒ドメイン（該ヒトドメインはこの構築物において切り出された）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＭＮＮ２遺伝子の５’側１０８ヌクレオチドであって以下のものをインフレームでコードするもの：Ｎ末端膜貫通ゴルジ局在化ドメイン、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＡＰＤＨプロモーターおよびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ１転写ターミネーター、組込み部位としてのピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＲＧ１遺伝子をノックアウトするためのフランキング領域、ならびに選択マーカーとしてのピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＨＩＳ１遺伝子を含有する、ｐＵＣ１９に基づくプラスミドであるプラスミドｐＲＣＤ５０８内にクローニングした。このプラスミドはｐＲＣＤ６８３と称され、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｍｎｎ２ｐの酵母局在化ドメインとＭｍａＧａｌＴタンパク質の触媒ドメインとをコードする融合遺伝子を含有するＰｐａｒｇ１：ＨＩＳ１発現構築物を与える。ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）内への形質転換のためにｐＵＣ１９細菌配列を線状化し遊離させるために、プラスミドｐＲＣＤ６８３をＳｆｉＩで消化する。
【０１１２】
ＩＩ．α−ＧａｌＴのための適当な受容宿主株の作製
末端α−１，３−ガラクトースを含有する非ヒトＮ−グリカンは、末端β−１，４−ガラクトースを含有する哺乳類Ｎ−グリカン中間体構造へのα−１，３−結合ガラクトース残基の付加により生じる複合型Ｎ−グリカンである。これらのグリカンはＳｉａｌＴおよびα−ＧａｌＴによる末端β−１，４−ガラクトースに関する競合から生じる。そのような競合を排除するために、出発株として糖操作酵母株を選択した。該株は、β−１，４−ガラクトースを有するがＳｉａｌＴを特異的に欠く複合型ヒトＮ−グリカンを産生するのに必要な酵素を含有していた。
【０１１３】
代わりに完全シアル酸化ヒトＮ−グリカンを産生するよう典型的な酵母型Ｎ−グリコシル化が修飾された糖操作ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）酵母株を作製した。まず、酵母遺伝子ＯＣＨ１の欠失は、「外鎖」グリコシル化をもたらす酵素活性を消失させた（Ｃｈｏｉら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳ；１００：５０２２−７（２００３））。ついでマンノシダーゼＩ（ＭＮＳＩ）遺伝子およびＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ（ＧｎＴＩ）遺伝子をこの株内に導入し、分泌経路に適切に局在化させて、哺乳類ハイブリッド型Ｎ−グリカンを効率的に得た（Ｃｈｏｉら，２００３）。もう１つの工程において、マンノシダーゼＩＩ（ＭＮＳＩＩ）遺伝子およびＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ（ＧｎＴＩＩ）遺伝子を該株内に導入し、分泌経路に適切に局在化させて、哺乳類複合型Ｎ−グリカンを効率的に得た（Ｈａｍｉｌｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ；３０１：１２４４−６（２００３））。最後に、ＵＤＰ−ガラクトース、適当なゴルジ膜輸送体、およびβ−ガラクトシルトランスフェラーゼ（β−ＧａｌＴ）をコードする遺伝子のプールを生成する酵素をこの株内に更に導入することにより、末端β−１，４−ガラクトースを有する複合型ヒトＮ−グリカンを転移しうる酵母株を得た（Ｂｏｂｒｏｗｉｃｚら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ；１４：７５７−６６（２００４））。末端β−１，４−ガラクトースを主に産生する酵母株は、適切に局在化した触媒的に活性なα−ＧａｌＴを受容するための適当な宿主株である。
【０１１４】
ＩＩＩ．糖操作酵母株内へのα−ＧａｌＴの導入
ＲＤＰ１０９は、末端β−１，４−ガラクトースを含有する哺乳類複合体Ｎ−グリカンを有するタンパク質を分泌するｈｉｓＩ突然変異体糖操作ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）株である。酵母マンノシルトランスフェラーゼＯｃｈ１ｐならびにホスホマンノシルトランスフェラーゼＭｎｎ４ｂｐおよびＰｎｏ１ｐを除去し、哺乳類酵素ＭＮＳ１、ＧｎＴＩ、ＭＮＳＩＩ、ＧｎＴＩＩ、β−ＧａｌＴＩをコードする分泌経路局在化遺伝子融合体、ならびにゴルジＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃおよびＵＤＰ−Ｇａｌ輸送体ならびにＵＤＰ−ガラクトース４−エピメラーゼをコードする遺伝子を導入することにより、ＲＤＰ１０９を作製した（Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，米国特許第７，０２９，８７２号；Ｄａｖｉｄｓｏｎら，米国特許出願第２００６／００４０３５３号；およびＢｏｂｒｏｗｉｃｚ，米国特許出願第２００６／０２１１０８５号（それらの開示のそれぞれを参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい）。ＲＤＰ１０９は分泌性レポータータンパク質としてヒトプラスミノーゲンのクリングル３ドメイン（Ｋ３）をも発現する（Ｃｈｏｉら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳ；１００：５０２２−７（２００３））。ヒスチジンを欠く培地上で形質転換体を選択し、アルギニンを欠く培地へ形質転換体をレプリカ・プレーティングすることにより適切な組込み体をスクリーニングした。ついで、分泌性レポータータンパク質Ｋ３のＰＮＧアーゼＦ消化により遊離したＮ−グリカンをマトリックス支援レーザー脱着／イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）により分析することにより、適切に標的化されたα−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼの機能的発現に関してＨＩＳ＋／ａｒｇ−組換え体をスクリーニングした。それぞれＧＦＩ５．８（α−Ｇａｌ）（β−Ｇａｌ）２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＧＦＩ５．９（α−Ｇａｌ）２（β−Ｇａｌ）２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを与える、ＲＤＰ１０９のＧＦＩ５．０  Ｎ−グリカン（β−Ｇａｌ）２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２への１つ又は２つのα結合ガラクトース残基の付加と合致して観察される質量により、ＲＤＰ２４１およびＲＤＰ２４２と称される２つの形質転換体が特定された。
【０１１５】
ＩＶ．組合せライブラリーによるβ−１，４−ＧａｌＴに関するリーダー局在化配列の最適化
株ＲＤＰ１０９、ＲＤＰ２４１およびＲＤＰ２４２により産生されるＮ−グリカンは相当な量のハイブリッド型Ｎ−グリカンを含む（図１、４Ａ−４Ｂ）。したがって、ヒトβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼＩ（ｈβ−ＧａｌＴＩ）に関する最適リーダー局在化配列に関してスクリーニングするために株のライブラリーを作製した（Ｃｈｏｉら，２００３において用いられている方法と同様）。株ＰＢＰ２３５は、末端ＧｌｃＮＡｃを有する複合三分枝哺乳類Ｎ−グリカンを産生するよう糖操作された酵母株である。酵母Ｎ−グリコシル化装置（ＰｐＯＣＨ１（Ｐｐ＝ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ））、ＰｐＰＮＯ１、ＰｐＭＮＮ４ＢおよびＰｐＰＢＳ２）が除去された株内に局在化ｍＭＮＳ１（ｍ＝マウス）、ｈＧｎＴＩ（ｈ−ヒト）、ｄＭＮＳＩＩ（ｄ＝ショウジョウバエ）、ｈＧｎＴＩＩおよびｈＧｎＴＩＶｂ遺伝子融合体を導入することにより、この株を作製した。ｈβＧａｌＴＩにインフレームで融合した種々のリーダー／局在化ドメインの融合遺伝子を含有する一連の構築物で、この株を形質転換した。過去には（Ｄａｖｉｄｓｏｎら，ＵＳ  ２００６００４０３５３）、ｈβＧａｌＴＩの局在化のため、およびｈＧｎＴＩＩ、ｄＭＮＳＩＩのため、そしてまた、ここではｈＧｎＴＩＶのために、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｍｎｎ２ｐのＮ末端の３６アミノ酸をコードする融合遺伝子が利用された。これは相当な割合のハイブリッド型グリカン、そしてまた、二分枝Ｎ−グリカンを与えた。本発明者らは、これが、ｈβＧａｌＴＩと、ｄＭＮＳＩＩ、ｈＧｎＴＩＩおよびｈＧｎＴＩＶのいずれか又は全てとの間の競合による可能性があると仮定した。ｈβＧａｌＴＩ構築物のライブラリーのスクリーニングは、ハイブリッドＮ−グリカンおよび二分枝Ｎ−グリカンが減少している幾つかのものを示した。ハイブリッドおよび二分枝Ｎ−グリカンの減少を示したこれらの構築物の１つは、ｈβＧａｌＴＩに融合したサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｍｎｔ１ｐのＮ末端の５８アミノ酸（ＳｃＭｎｔＩ１−５８）（Ｓｃ＝サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））をコードする融合遺伝子を含有していた。
【０１１６】
ｈβＧａｌＴＩリーダー配列の組合せライブラリーのスクリーニングからのデータを用いて、ほぼ相同な末端β−１，４−結合ガラクトースを有する複合哺乳類Ｎ−グリカンを有するタンパク質を分泌する株ＲＤＰ６９９−２を作製した（ＧＳ５．０、図３、５Ａ）。この株は、酵母方Ｎ−グリコシル化を排除するよう糖操作されており、ｍＭＮＳＩ、ｈＧｎＴＩ、ｄＭＮＳＩＩ、ｈＧｎＴＩＩおよびｈβＧａｌＴＩの局在化融合体を発現する。組合せライブラリースクリーニングに基づけば、ｈβＧａｌＴＩは、局在化ドメインとしてＳｃＭｎｔＩ１−５８をコードする融合遺伝子である。リーダー局在化が改善されているため、この株は、ＲＤＰ１０９、ＲＤＰ２４１およびＲＤＰ２４２のような前世代の株と比較して有意に減少したハイブリッド型Ｎ−グリカンを有する。株ＲＤＰ６９９−２は分泌性レポータータンパク質としてラットエリスロポエチン（ｒＥｐｏ）をも産生し、ＰｐＡＲＧ１遺伝子が欠失しているためａｒｇ−である。プラスミドｐＧＬＹ１４４３は、前記の（ｐＲＣＤ６８０からの）ｍαＧａｌＴの触媒ドメインに融合したＳｃＭｎｔＩ１−５８をコードする融合遺伝子を含有し、選択マーカーとしてＰｐＡＲＧ１を含有する。プラスミドｐＧＬＹ１４４３を株ＲＤＰ６９９−２内に形質転換し、アルギニンを欠く培地上で形質転換体を選択して株ＲＤＰ１０３０を得た。ＲＤＰ１０３０からＰＮＧアーゼＦ消化により遊離したＮ−グリカンの、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによる分析は、ＧＦＩ５．０（β−Ｇａｌ）２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造への１つ及び２つのα−１，３−ガラクトース残基の付加によるＧＦＩ５．８（α−Ｇａｌ）（β−Ｇａｌ）２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＧＦＩ５．９（α−Ｇａｌ）２（β−Ｇａｌ）２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンの両方の存在を示した（図５Ｂ）。しかし、図４Ａ−４Ｂにおいて存在するハイブリッドＮ−グリカンはほとんど検出不可能であり（図４Ａ−４Ｂと図５Ａ−５Ｂとを比較されたい）、これはｈβＧａｌＴＩ局在化の改善によるものであり、そしておそらくは、ハイブリッド基質に関するｄＭＮＳＩＩおよびｈＧｎＴＩＩとのｈβＧａｌＴＩの競合の減少によるものであろう。
【０１１７】
Ｖ．α−１，３−ＧａｌＴのライブラリーのスクリーニングはα−Ｇａｌ転移を改善する
ＲＤＰ６９９−２に類似した株であるピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＹＧＬＹ１１６９を作製した。これは、末端β−１，４−結合ガラクトースを有する複合哺乳類Ｎ−グリカン（（β−Ｇａｌ）２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  ＧＳ５．０，図３）を有するタンパク質を分泌する。この株は、酵母型Ｎ−グリコシル化を除去するよう糖操作されており、ｍＭＮＳＩ、ｈＧｎＴＩ、ｄＭＮＳＩＩ、ｈＧｎＴＩＩおよびｈβＧａｌＴＩの局在化融合体を発現する。組合せライブラリースクリーニングに基づけば、ｈβＧａｌＴＩは、局在化ドメインとしてＳｃＭｎｔＩ１−５８をコードする融合遺伝子である。リーダー局在化が改善されているため、この株は、ＲＤＰ１０９のような前世代の株と比較して有意に減少したハイブリッド型Ｎ−グリカンを有し、したがって、ＲＤＰ６９９−２に類似している（非表示）。また、この株は、ＰｐＵＲＡ５遺伝子が欠失しているため、ｕｒａ−である。ムス・ムスクルス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）（ｐＧＬＹ１８９２）、スス・スクロファ（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ）（ｐＧＬＹ１８９３）およびカニス・ファミリアリス（Ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）（ｐＧＬＹ１８９４）からのものを含む種々のα−ＧａｌＴ（図６Ａ−６Ｂ）の触媒ドメインに融合したＳｃＭｎｔ１−５８をコードする遺伝子融合体を含有するプラスミドを作製した。これらのプラスミドは全て、選択マーカーとしてＰｐＵＲＡ５遺伝子を含有する。プラスミドｐＧＬＹ１８９２，１８０３および１８９４を株ＹＧＬＹ１１６９内に形質転換し、ウラシルを欠く培地上で形質転換体を選択して、それぞれ株ＹＧＬＹ１７８３，ＹＧＬＹ１７８５およびＹＧＬＹ１７８７を得た。これらの株をそれぞれ、分泌レポーターとしてのｒＥＰＯをコードする遺伝子および選択マーカーとしてのｓｈＢＬＥ遺伝子を含有するプラスミドｐＳＨ６９２で形質転換した。プラスミドｐＳＨ６９２を株ＹＧＬＹ１７８３，ＹＧＬＹ１７８５およびＹＧＬＹ１７８７内に形質転換し、得られた形質転換体からのＰＮＧアーゼＦ消化により遊離したＮ−グリカンをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより分泌ｒＥＰＯから分析した。該Ｎ−グリカンは、株ＲＤＰ１０３０から得られたものに類似していた（図７Ａ−７Ｃ）。しかし、ＧＦＩ５．０（β−Ｇａｌ）２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧＦＩ５．８（α−Ｇａｌ）（β−Ｇａｌ）２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＧＦＩ５．９（α−Ｇａｌ）２（β−Ｇａｌ）２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２に対応するピークの相対強度から判断すると、ＭｍαＧａｌＴと比較して、スス・スクロファ（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ）αＧａｌＴ（ＳｓαＧａｌＴ）の導入からα−ｇａｌ転移における増量的改善が観察された（図７Ｂ）。
【０１１８】
ＶＩ．組合せ融合ライブラリーによるＳｓαＧａｌＴに関するリーダー局在化配列の最適化はα−Ｇａｌ転移を改善する
α−ガラクトース転移を改善するために、プラスミドｐＧＬＹ２１６９に基づいて、ＳｓαＧａｌＴに関する最適リーダー局在化配列に関してスクリーニングするためのプラスミドのライブラリーを作製した。プラスミドｐＧＬＹ２１６９は、酵母局在化ドメインを有さないがその代わりに一対の制限部位ＮｏｔＩおよびＡｓｃＩを有する、ＳｓαＧａｌＴの触媒ドメインをコードする遺伝子を含有し、選択マーカーとしてのＮＡＴ遺伝子（アミノグリコシドであるナーセオスリシン（Ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）に対する耐性をコードする）をも含有する。このベクター内に、酵母局在化ドメイン（３３−６７および７４５−７５６と番号付けされている）をコードするＤＮＡ配列のライブラリーを、ＮｏｔＩ／ＡｓｃＩを用いてクローニングし、得られたプラスミドをｐＧＬＹ２１６９−３３  −  ｐＧＬＹ２１６９−７５６と命名した。このライブラリーのプラスミドをピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＲＤＰ１４８２内に形質転換し、ウラシルを欠く培地上で形質転換体を選択した。株ＲＤＰ１４８２は、末端β−１，４−結合ガラクトースを有する複合哺乳類Ｎ−グリカン（ＧＦＩ５．０（β−Ｇａｌ）２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、図３）を有するタンパク質を分泌するよう操作されており、ｍＭＮＳＩ、ｈＧｎＴＩ、ｄＭＮＳＩＩ、ｈＧｎＴＩＩおよびｈβＧａｌＴＩの局在化融合体を発現する。この場合もまた、該組合せライブラリースクリーニングに基づけば、該ｈβＧａｌＴＩは、局在化ドメインとしてＳｃＭｎｔＩ１−５８をコードする融合遺伝子である。株ＲＤＰ１４８２はまた、ＡＯＸ１プロモーターの制御下、レポータータンパク質としてのヒトプラスミノーゲンのＫ３ドメインを分泌するよう操作されている。唯一の炭素源としてのメタノール上で培養を誘導することによりＫ３を産生させ、形質転換体から上清タンパク質を精製し、ＰＮＧアーゼ消化物により遊離したＮ−グリカンをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより分析した。ＳｃＭｎｔＩ１−５８  −  ＳｓａＧａｌＴ融合遺伝子を発現させた場合、株ＹＧＬＹ１７８５の形質転換体と比較して類似した比率のＧＦＩ５．０、ＧＦＩ５．８およびＧＦＩ５．９  Ｎ−グリカンが観察されることを、結果は示した（図８Ａ−８Ｂ）。しかし、観察されたＧＦＩ５．０、ＧＦＩ５．８およびＧＦＩ５．９の質量の比率から判断すると、幾つかのリーダー／局在化ドメイン−ＳｓａＧａｌＴ融合体はα−ｇａｌ転移における有意な増強を示した。１つのリーダー−ＳｓαＧａｌＴ融合体（ＳｃＭｎｎ２１−３６−ＳｓａＧａｌＴ）に関しては、ＧＦＩ５．９が、観察された唯一のピークであったが、これはβ−１，４−ガラクトース基質へのα−ｇａｌのほぼ定量的な転移を示している（図９）。
【０１１９】
ＶＩＩ．ＧＦＩ５．９株におけるインフルエンザＡ  ＨＡタンパク質の発現
ＨＡ香港（ｐＧＬＹ２７６６）［配列番号３］、ＨＡパナマ（ｐＧＬＹ２７６４）、ＨＡシドニー（ｐＧＬＹ２７６５）、ＨＡニューヨーク（ｐＧＬＹ２７６２）およびＨＡモスクワ（ｐＧＬＹ２７６３）を含む幾つかの代表的なインフルエンザＡ  Ｈ３型ＨＡタンパク質ならびにＨＡ北京（ｐＧＬＹ２７６０）、ＨＡニューカレドニア（ｐＧＬＹ２７５９）、ＨＡプエルトリコ（ｐＧＬＹ２７６１）およびＨＡサウスカロライナ（ｐＧＬＹ２７６７）［配列番号４］を含む幾つかの代表的なＨ１型ＨＡタンパク質のエクトドメイン（すなわち、Ｃ末端膜貫通ドメインを欠くもの）をコードするＤＮＡ配列を合成し、クローニングした（ＧｅｎｅＡｒｔ，ＬＬＣ）。これらのプラスミドのそれぞれを、ＡＯＸ１プロモーターとＳｈＢＬＥ薬物耐性マーカーとを含有するピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）発現ベクター内にサブクローニングし、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α接合因子プレプロ分泌シグナルを含む分泌シグナルペプチドのライブラリーにインフレームで融合させた。ＧＦＩ５．９糖操作ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＹＧＬＹ２２２９を該インフルエンザＨＡ含有発現プラスミドのそれぞれで形質転換し、３００ｍｇ／Ｌ  ゼオシンを含有する最少培地上でコロニーを選択した。幾つかの形質転換体を選択し、唯一の炭素源としてグリセロールを含有する液体培地中、９６ウェル深ウェルプレート内で２６℃で７２時間培養し、ついで遠心分離し、唯一の炭素源としてメタノールを含有する培地に再懸濁させ、２６℃で２４時間インキュベートした。細胞を遠心分離し、７μｌの上清を非還元条件下の標準的なウエスタンブロット分析、および予め標識された抗ＨＩＳ（Ｈ３  ＨＩＳプローブ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）抗体でのプロービングに付した。発現された各ＨＡに関して、適当なサイズのバンドが観察された。約６００μｌの上清をＮｉ−アフィニティ精製、Ｎ−グリカンを取り出すためのＰＮＧアーゼ消化、およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析に付した。試験した全てのインフルエンザＨＡタンパク質で、ＧＳ５．０、ＧＳ５．８およびＧＳ５．９糖形態に対応するＮ−グリカンの質量が観察された。一例としては、ＹＧＬＹ２２２９において発現されたサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルファ接合因子プレプロ分泌シグナル（ｐＧＬＹ２９２２）にインフレームで融合したインフルエンザＡ  ＨＡ香港からのＮ−グリカンを示す（図１０）。
【０１２０】
同様に、もう１つの最適化ＧＦＩ５．９糖操作ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＹＧＬＹ３８１２をインフルエンザＨＡ含有発現プラスミドのそれぞれで形質転換し、３００ｍｇ／Ｌ  ゼオシンを含有する最少培地上でコロニーを選択した。前記と同様にして、幾つかの形質転換体を選択し、培養した。Ｎｉ−アフィニティータンパク質精製の後、Ｎ−グリカンを取り出すためのＰＮＧアーゼ消化およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析を行った。試験した全てのインフルエンザＨＡタンパク質において、他のレポータータンパク質に類似した比率で、ＧＳ５．０、ＧＳ５．８およびＧＳ５．９糖形態に対応するＮ−グリカンの質量が観察された。一例として、ＹＧＬＹ３８１２において発現されたインフルエンザＡ  ＨＡサウスカロライナからのＮ−グリカンを示す（図１１）。
【０１２１】
ＶＩＩＩ．ＧＦＩ５．９株におけるＨＳＶ−２  ｇＤタンパク質の発現
ＨＳＶ−２  Ｇ株ｇＤタンパク質エクトドメインの２つの異なる形態をコードするＤＮＡ配列を合成し、クローニングし、ｐＧＬＹ２７５７およびｐＧＬＹ２７５８（Ｇｅｎｅ  Ａｒｔ，ＬＬＣ）［配列番号５−６］と命名した。それらの２つの構築物はＣ末端の長さが異なっていた。１つは、エクトドメイン全体であるアミノ酸２６−３３９（ｇＤ  ３３９，ｐＧＬＹ２７５７）をコードしており、もう１つは、Ｌｅｕ３０６の後のＣ末端に結合した２つの非相同アミノ酸ＡｓｎおよびＧｌｎを含みＣ末端ドメインを有さない、より短い形態であるアミノ酸２６−３０６（ｇＤ  ３０６ＮＱ，ｐＧＬＹ２７５８）をコードしている。これらのプラスミドのそれぞれを、ＡＯＸ１プロモーターとＳｈＢＬＥ薬物耐性マーカーとを含有するピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）発現ベクター内にサブクローニングし、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α接合因子プレ分泌シグナル（ｐＧＬＹ２９２２）にインフレームで融合させ、それぞれｐＧＬＹ２９６０およびｐＧＬＹ２９６１と命名した。ＧＦＩ５．９糖操作ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＹＧＬＹ３８１２をＨＳＶ−２  ｇＤ含有発現プラスミドのそれぞれで形質転換し、３００ｍｇ／Ｌ  ゼオシンを含有する最少培地上でコロニーを選択した。幾つかの形質転換体を選択し、唯一の炭素源としてグリセロールを含有する液体培地中、９６ウェル深ウェルプレート内で２６℃で７２時間培養し、ついで遠心分離し、唯一の炭素源としてメタノールを含有する培地に再懸濁させ、２６℃で２４時間インキュベートした。細胞を遠心分離し、７μｌの上清を還元条件下の標準的なウエスタンブロット分析、および予め標識された抗ＨＩＳ（Ｈ３  ＨＩＳプローブ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）抗体でのプロービングに付した。発現されたｇＤの形態の両方に関して、適当なサイズのバンドが観察された。約６００μｌの上清をＮｉ−アフィニティ精製、Ｎ−グリカンを取り出すためのＰＮＧアーゼ消化、およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析に付した。ｇＤの両方の形態で、ＧＳ５．８およびＧＳ５．９糖形態に対応するＮ−グリカンの質量が、ＧＳ５．９糖形態を主要形態として観察された（図１２）。
【０１２２】
ＩＸ．ＧＦＩ５．９株におけるＨＳＶ−２  ｇＤタンパク質の発現
ＨＳＶ−２  Ｇ株ｇＣタンパク質エクトドメインをコードするＤＮＡ配列を合成し、クローニングし、ｐＧＬＹ３６４０［配列番号７］（ＧｅｎｅＡｒｔ，Ｉｎｃ．，Ｔｏｒｏｎｔｏ，ＣＡ）と命名した。このプラスミドからのＤＮＡ配列を、ＡＯＸ１プロモーターとＳｈＢＬＥ薬物耐性マーカーとを含有するピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）発現ベクター内にサブクローニングし、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α接合因子プレ分泌シグナルにインフレームで融合させ、ｐＧＬＹ３６５３と命名した。ＧＦＩ５．９糖操作ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＹＧＬＹ３８１２をＨＳＶ−２  ｇＤ含有発現プラスミドのそれぞれで形質転換し、３００ｍｇ／Ｌ  ゼオシンを含有する最少培地上でコロニーを選択した。幾つかの形質転換体を選択し、唯一の炭素源としてグリセロールを含有する液体培地中、９６ウェル深ウェルプレート内で２６℃で７２時間培養し、ついで遠心分離し、唯一の炭素源としてメタノールを含有する培地に再懸濁させ、２６℃で２４時間インキュベートした。細胞を遠心分離し、７μｌの上清を還元条件下の標準的なウエスタンブロット分析、および予め標識された抗ＨＩＳ（Ｈ３  ＨＩＳプローブ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）抗体でのプロービングに付した。適当なサイズのバンドが観察された。約６００μｌの上清をＮｉ−アフィニティ精製、Ｎ−グリカンを取り出すためのＰＮＧアーゼ消化、およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析に付した。ＧＳ５．８およびＧＳ５．９糖形態に対応するＮ−グリカンの質量が、ＧＳ５．９糖形態を主要形態として観察された（図１３）。
【０１２３】
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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