【手続補正書】
【提出日】平成21年1月16日(2009.1.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
二鎖(dichain)型のポリペプチドまたはタンパク質を産生するための方法であって、2つの鎖が大腸菌(E. coli)宿主細胞内の組換え発現によってジスルフィド架橋され、以下である、方法：
(i)ポリペプチドまたはタンパク質が、二鎖のジスルフィド架橋ポリペプチドまたはタンパク質として、その生物学的活性を発揮し；
(ii)第一の鎖のC末端アミノ酸残基が、Arg残基またはLys残基であり；
(iii)タンパク質/ポリペプチドの第二の鎖が、N末端に1〜20のアミノ酸残基、およびPRSと呼ばれるペンタペプチド配列VPXGSを有し、式中Xが任意の天然のアミノ酸であり、VがVal、Leu、Ile、Ala、Phe、Pro、またはGlyであり、PがPro、Leu、Ile、Ala、Phe、Val、またはGlyであり、GがGly、Leu、Ile、Ala、Pro、Phe、またはValであり、SがSer、Tyr、Trp、またはThrであり；ならびに
(iv)以下の段階を含む：
(a)そのループ領域内でその改変形態でのポリペプチドまたはタンパク質が、X、V、P、G、およびSが上記の通りである配列VPXGSを有するような、核酸レベルでのポリペプチドまたはタンパク質の改変；
(b)核酸レベルで改変された構築物の大腸菌細胞への挿入；
(c)宿主細胞を培養し、その後溶解する段階；ならびに
(d)二鎖のジスルフィド架橋ペプチドまたはタンパク質を単離する段階。
【請求項２】
ポリペプチド/タンパク質の第一の鎖がポリペプチド/タンパク質の軽鎖であり、第二の鎖がポリペプチド/タンパク質の重鎖であり、特に、タンパク質がハイブリッドタンパク質である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
ポリペプチドまたはタンパク質がボツリヌス神経毒であり、特に、ポリペプチドまたはタンパク質が血清型Aのボツリヌス神経毒(BoNT(A))であり、特に、BoNT(A)のLHN断片である、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
PRS配列VPXGSが、アミノ酸443〜447の欠失を伴い、BoNT(A)のアミノ酸Leu442とLys448の間に挿入され、特に、PRS配列VPRGS、VPYGS、VPHGS、またはVPQGSが挿入される、請求項3記載の方法。
【請求項５】
PRS配列VPXGSが、少なくとも一つのアミノ酸の欠失を伴い、BoNT(B)のオクタペプチドLys438〜Ile445に、BoNT(C1)の15mer His438〜Asp452に、またはBoNT(E)の13mer Lys413〜Ile425に挿入され、特に、PRS配列VPXGSが、17mer GIITSKTKSLVPRGSKAまたは18mer RGIITSKTKSLVPRGSKAの形態で挿入される、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
ハイブリッドタンパク質が以下の成分A、B、およびCを有する、請求項102記載の方法：
−その酵素活性によって、標的細胞において分泌を阻害するか、もしくはそれらを死滅させることが可能であるエフェクタードメイン、または毒素ドメイン(成分A)；
−配列VPXGSを含むループ配列(成分B)；ならびに
−融合タンパク質またはハイブリッドタンパク質に細胞特異性を与える、細胞結合ドメイン(成分C) 
ならびに、成分Dとして以下のものを含んでもよい
−転位ドメイン。
【請求項７】
毒素ドメイン(A)が、ジフテリア毒素、シェードモナス外毒素、またはリシンのドメインであり、特に、毒素ドメイン(A)が、シェードモナス外毒素の断片PE40(ドメインIII、ドメインII、およびドメインIb)もしくは断片PE38(ドメインIIIおよびドメインII)、またはリシンのA鎖である、請求項6記載の方法。
【請求項８】
細胞結合ドメイン(C)が、モノクローナル抗体、アフィリン(affilin)、アンキリン反復タンパク質、アンチカリン(anticalin)、TGFα、FGF、VEGF、もしくはIGF-1のような増殖因子、またはIL2、IL4、もしくはIL6のようなサイトカインである、請求項6または7記載の方法。
【請求項９】
ハイブリッドタンパク質が以下の成分A、B、およびCを有する、請求項102記載の方法：
−融合タンパク質により良好な可溶性を与え、より高い発現率をもたらし、および/もしくはアフィニティ精製を可能にするタンパク質またはオリゴペプチド(成分A)；
−配列VPXGSを含むループ配列(成分B)；ならびに
−任意のタイプのポリペプチド(成分C)。
【請求項１０】
成分Aが、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)、マルトース結合タンパク質(MBP)、Hisタグ、StrepTag、またはFLAGタグである、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
大腸菌細胞が、大腸菌K12細胞、特に菌株M15[pREP4]、XL1-BLUE、またはUT5600の大腸菌K12細胞である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
二鎖のジスルフィド架橋ポリペプチド/タンパク質として存在し、生物学的に活性であるポリペプチドまたはタンパク質であって、ポリペプチド/タンパク質の第一の鎖のC末端終末が、Arg残基またはLys残基であり、ポリペプチド/タンパク質の第二の鎖が、N末端に1〜20アミノ酸残基、およびPRSと呼ばれるペンタペプチド配列VPXGSを含む点で特徴付けられ、式中、Xが任意の天然のアミノ酸であり、VがVal、Leu、Ile、Ala、Phe、Pro、またはGlyであり、PがPro、Leu、Ile、Ala、Phe、Val、またはGlyであり、GがGly、Leu、Ile、Ala、Pro、Phe、またはValであり、SがSer、Tyr、Trp、またはThrである、ポリペプチドまたはタンパク質。
【請求項１３】
ポリペプチド/タンパク質の第一の鎖がポリペプチド/タンパク質の軽鎖であり、第二の鎖がポリペプチド/タンパク質の重鎖であり、特に、第一の鎖のC末端終末がLys残基である、請求項12記載のポリペプチドまたはタンパク質。
【請求項１４】
第二の鎖が、N末端にペンタペプチド配列VPXGS、ヘキサペプチド配列XVPXGS、またはヘプタペプチド配列XXVPXGSを有する、請求項12または13記載のポリペプチドまたはタンパク質。
【請求項１５】
ボツリヌス神経毒、ボツリヌス神経毒の誘導体もしくは断片、特にLHN断片を含むか、またはボツリヌス神経毒の生物学的活性を有し、特に、血清型Aのボツリヌス神経毒(BoNT(A))を含むか、または BoNT(A)の生物学的活性を有し、特に、BoNT(A)のLHN断片であるか、または BoNT(A)の生物学的活性を有する、請求項12または14記載のポリペプチドまたはタンパク質。
【請求項１６】
第二の鎖が、N末端にヘプタペプチド配列SLVPXGSを有し、XがR、Y、H、またはQである、請求項12〜15のいずれか一項記載のポリペプチドまたはタンパク質。
【請求項１７】
タンパク質がハイブリッドタンパク質である、請求項12〜14、または16のいずれか一項記載のポリペプチドまたはタンパク質であり、特に、ハイブリッドタンパク質が以下の成分A、B、およびCを有する：
−その酵素活性によって、標的細胞において分泌を阻害するか、もしくはそれらを死滅させることが可能であるエフェクタードメイン、または毒素ドメイン(成分A)；
−配列VPXGSを含むループ配列(成分B)；ならびに
−融合タンパク質またはハイブリッドタンパク質に細胞特異性を与える、細胞結合ドメイン(成分C)
ならびに、以下のものを含んでもよい
−転位ドメインとして成分D。
【請求項１８】
毒素ドメイン(A)が、ジフテリア毒素、シェードモナス外毒素、またはリシンのドメインであり、特に、毒素ドメイン(A)が、シェードモナス外毒素の断片PE40(ドメインIII、ドメインII、およびドメインIb)もしくは断片PE38(ドメインIIIおよびドメインII)、またはリシンのA鎖である、請求項17記載のポリペプチドまたはタンパク質。
【請求項１９】
細胞結合ドメイン(C)が、モノクローナル抗体、アフィリン、アンキリン反復タンパク質、アンチカリン、TGFα、FGF、VEGF、もしくはIGF-1のような増殖因子、またはIL2、IL4、もしくはIL6のようなサイトカインである、請求項17もしくは18記載のポリペプチドまたはタンパク質。
【請求項２０】
ハイブリッドタンパク質が以下の成分A、B、およびCを有する、請求項2817記載のポリペプチドまたはタンパク質：
−融合タンパク質により良好な可溶性を与え、より高い発現率をもたらし、および/もしくはアフィニティ精製を可能にするタンパク質またはオリゴペプチド(成分A)；
−配列VPXGSを含むループ配列(成分B)；ならびに
−任意のタイプのポリペプチド(成分C)
特に、成分Aが、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)、マルトース結合タンパク質(MBP)、Hisタグ、StrepTag、またはFLAGタグである。
【請求項２１】
請求項12〜20のいずれか一項記載のポリペプチドまたはタンパク質をコードする核酸、特に、DNA。
【請求項２２】
請求項21記載の核酸を含むベクター。
【請求項２３】
請求項22記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２４】
原核生物、特に大腸菌細胞、特に大腸菌K12細胞であり、特に、宿主細胞がM15[pREP4]であり、ベクターがpQE系列のプラスミドである、請求項23記載の宿主細胞。
【請求項２５】
請求項12〜20のいずれか一項記載のポリペプチドまたはタンパク質を含む、薬学的調製物。