(57)【要約】  本発明は、組織病理学などの従来の検出技術よりも感度および精度が良好の、結腸直腸癌（ＣＲＣ）におけるリンパ節（ＬＮ）のステータスに対する診断、モニタリング、予後診断および病期分類を行うための新規な方法を提供する。グアニリルシクラーゼＣ（ＧＣＣ）遺伝子は、十二指腸から直腸に至るＧＩ管の上皮細胞頂端側で特異的に発現され、またＬＮ中でのＧＣＣ  ｍＲＮＡの検出は、転移の存在を示唆する。ＬＮ中での結腸直腸癌（ＣＲＣ）細胞の存在を同定するためのＧＣＣ  ｍＲＮＡの定量ＲＴ−ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）検出は、ＣＲＣ病期分類に役立つ可能性を有する。ＧＣＣの正確な定量は、グルクロニダーゼＢ（ＧＵＳＢ）と併用される場合、無傷ＲＮＡ標本と著しく分解されたＲＮＡ標本との間で２倍に満たない変動で実施可能である。本発明はまた、ステージＩまたはＩＩ結腸癌患者における再発および無再発生存に対する時間において改善された予後値を有する相対定量を用いる新しく設計されたＧＣＣ／ＧＵＳＢアッセイに関する。ＧＣＣ／ＧＵＳＢアッセイはまた、再発および無再発生存に関する相対リスクにおける予後層別化の統計的検出力を改善する。
2012518389.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象から採取される試料中でのＧＣＣを検出するための方法であって、
・前記試料中でのグアニリルシクラーゼＣ（ＧＣＣ）を検出するステップと、
・同じ前記試料中でのβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）を検出するステップと、
・ＧＵＳＢの量に対するＧＣＣの量を計算するステップと、
を含む、方法。
【請求項２】
・前記試料中でのＧＣＣ  ｍＲＮＡの発現レベルを測定するステップと、
・前記同じ試料中でのＧＵＳＢ  ｍＲＮＡの発現レベルを測定するステップと、
・数学的計算を用い、ＧＵＳＢの前記発現レベルに対するＧＣＣ  ｍＲＮＡの前記発現レベルを正規化し、相対的なＧＣＣ発現（ＧＵＳＢレベル−ＧＣＣレベル）または（ＧＣＣレベル−ＧＵＳＢレベル）を決定するステップと、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
・試料中でのＧＣＣの前記発現レベルをＲＴ−ｑＰＣＲによって測定し、ＧＣＣにおけるサイクル閾値（ＣｔＧＣＣ）を決定するステップと、
・前記同じ試料中でのβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）をＲＴ−ｑＰＣＲによって測定し、ＧＵＳＢにおけるサイクル閾値（ＣｔＧＵＳＢ）を決定するステップと、
を含み、ここで、ＧＣＣの検出では、相対定量（Δ−Ｃｔ）を用い、試料中でのＧＣＣのｍＲＮＡレベルの変化を測定し、かつそれをβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）のｍＲＮＡレベルに対して表す（Δ−Ｃｔ＝ＣｔＧＵＳＢ−ＣｔＧＣＣ）、
請求項２に記載の方法。
【請求項４】
約−１２を超えるΔ−Ｃｔは、前記試料中でのＧＣＣ陽性細胞の存在を示唆する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＧＣＣの検出では、発現の倍率変化（Δ−Δ−Ｃｔ）を用い、前記試料中でのＧＣＣのｍＲＮＡレベルの変化を判定し、かつそれを前記同じ試料中でのβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）のｍＲＮＡレベルに対して表す、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記試料が腸／結腸直腸外試料であり、かつ前記対象がヒトである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ヒトが、結腸直腸癌、胃癌、小腸癌、食道癌および膵癌からなる群から選択される癌を有すると疑われる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記腸／結腸直腸外試料が、生検組織、１つ以上のリンパ節、および血液からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
癌を有すると疑われる患者における癌を診断する方法であって、請求項１〜５のいずれか一項に記載の前記患者の腸／結腸直腸外試料中でのＧＣＣを定量するステップと、前記試料がＧＣＣ陽性細胞を有するか否かを判定するステップと、を含み、ここで、ＧＣＣ陽性細胞の存在は、結腸直腸癌、胃癌、小腸癌、食道癌または膵癌を示唆する、方法。
【請求項１０】
既に癌であると診断されたヒト患者を病期分類する方法であって、
ａ）請求項１〜５のいずれか一項に記載のＧＣＣを検出または測定するステップと、
ｂ）ステップａの結果に基づいて、疾患ステージを決定するステップと、
を含む、方法。
【請求項１１】
・前記試料中でのＧＣＣをＲＴ−ｑＰＣＲによって測定し、前記患者由来の腸／結腸直腸外試料中でのＧＣＣにおけるサイクル閾値（ＣｔＧＣＣ）を決定するステップと、
・前記試料中でのβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）をＲＴ−ｑＰＣＲによって測定し、前記試料中でのＧＵＳＢにおけるサイクル閾値（ＣｔＧＵＳＢ）を決定するステップと、
・ＣｔＧＵＳＢ−ＣｔＧＣＣ（Δ−Ｃｔ）の相対定量を決定するステップと、
を含み、ここで約−１２を超えるΔ−Ｃｔは、前記試料中でのＧＣＣ陽性細胞の存在を示唆し、ここでＧＣＣ陽性細胞の存在は、転移性結腸直腸癌、胃癌、小腸癌、膵癌または食道癌を示唆する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
約−６より大きいΔ−Ｃｔは、前記試料中でのＧＣＣ陽性細胞の存在を示唆し、ここでＧＣＣ陽性細胞の存在は、前記患者の癌の再発リスクが増大していることを示唆する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記腸／結腸直腸外試料が、少なくとも１つのリンパ節である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
既に癌であると診断されたヒトにおける転移をモニタリングまたは診断する方法であって、
・前記試料中でのＧＣＣをＲＴ−ｑＰＣＲによって測定し、前記患者由来の腸／結腸直腸外試料中でのＧＣＣにおけるサイクル閾値（ＣｔＧＣＣ））を決定するステップと、
・前記試料中でのβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）をＲＴ−ｑＰＣＲによって測定し、前記試料中でのＧＵＳＢにおけるサイクル閾値（ＣｔＧＵＳＢ）を決定するステップと、
・ＣｔＧＵＳＢ−ＣｔＧＣＣ（Δ−Ｃｔ）の相対定量を決定するステップと、
を含み、ここで約−１２を超えるΔ−Ｃｔは、前記試料中でのＧＣＣ陽性細胞の存在を示唆し、ここでＧＣＣ陽性細胞の存在は、転移性結腸直腸癌、胃癌、小腸癌、膵癌または食道癌を示唆する、方法。
【請求項１５】
前記腸／結腸直腸外試料が血液である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
組織病理学的に陰性のリンパ節を有する癌患者の中で、連続処置から恩恵を受けうる患者を選択する方法であって、
・請求項１３に記載のステップを実施するステップと、
・連続処置を処方するステップと、
を含み、ここで少なくとも１つのリンパ節中にＧＣＣ陽性細胞を有する癌患者は、組織病理学的に、より高いリスクがあると見なされる患者の場合に匹敵する再発および生存率に関するリスクを有し、それにより、これらの患者がアジュバント化学療法による処置から恩恵を受けうることが示され、ここでＧＣＣ陰性リンパ節を有する癌患者は、疾患再発のリスクが低めであり、かつ前記処置を回避できる、方法。
【請求項１７】
ＧＣＣ陽性細胞の存在が、予後不良を示唆する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
原発不明癌（ｕｎｋｎｏｗｎ  ｏｒｉｇｉｎ）（ＣＵＰ）の転移を有する組織内でのＧＣＣ陽性細胞の存在の前記検出は、原発性癌が、結腸直腸癌、胃癌、小腸癌、膵臓または食道癌であることの確認である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
相対的なＧＣＣ発現がＧＵＳＢの検出限界より高い場合、前記試料中でのＧＣＣの絶対量が、試料中のＧＣＣの絶対量は、外部標準に対するＧＣＣコピーの数で計算され、表現される、請求項２に記載の方法。
【請求項２０】
患者における癌の検出、診断、予後、モニタリングおよび／または病期分類のためのキットであって、
・前記患者由来の腸／結腸直腸外試料中でのＧＣＣを検出するための試薬、
・同じ試料中でのＧＵＳＢを検出するための試薬、および
・ＧＵＳＢに対するＧＣＣをいかに測定するかについての使用説明書
を含む、キット。
【請求項２１】
患者における癌の検出、診断、予後、モニタリングおよび／または病期分類のためのキットであって、
・前記患者由来の腸／結腸直腸外試料中でのＧＣＣを検出するためのＰＣＲ試薬、
・ＧＣＣにおけるサイクル閾値（ＣｔＧＣＣ）をいかに決定するかについての使用説明書、
・前記同じ試料中でのＧＵＳＢを検出するためのＰＣＲ試薬、
・ＧＵＳＢにおけるサイクル閾値（ＣｔＧＵＳＢ）をいかに決定するかについての使用説明書、および
・ＣｔＧＣＣとＣｔＧＵＳＢの間での（Δ−Ｃｔ）または（Δ−Δ−Ｃｔ）をいかに計算するかについての使用説明書
を含む、キット。
【請求項２２】
前記試薬が、配列番号１７〜４３からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含む、請求項２０または２１に記載のキット。
【請求項２３】
前記試薬が、配列番号１７〜４３に対して９０％の同一性を有するポリヌクレオチドを含む、請求項２０または２１に記載のキット。
【請求項２４】
前記試薬が、配列番号１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９、３０、３２、３３、３５、３６、３８、３９、４１および４２からなる群から選択されるポリヌクレオチドプライマーを含む、請求項２０または２１に記載のキット。
【請求項２５】
前記試薬が、配列番号１９、２２、２５、２８、３１、３４、３７、４０および４３からなる群から選択されるポリヌクレオチドプローブを含む、請求項２０、２１または２４に記載のキット。
【請求項２６】
前記プライマーが、配列番号２０、２１、３８および３９のポリヌクレオチドを含み、かつ前記プローブが、配列番号２２および４０のポリヌクレオチドを含む、請求項２４または２５に記載のキット。
【請求項２７】
前記検出または測定ステップが、配列番号１７〜４３からなる群から選択されるポリヌクレオチドを用いて実施される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記検出または測定ステップが、配列番号１７〜４３に対して９０％の同一性を有するポリヌクレオチドを用いて実施される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
ＧＣＣまたはＧＵＳＢ  ｍＲＮＡの発現レベルの前記検出または測定ステップが、配列番号１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９、３０、３２、３３、３５、３６、３８、３９、４１および４２からなる群から選択されるポリヌクレオチドプライマーを用いて実施される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
ＧＣＣまたはＧＵＳＢ  ｍＲＮＡの発現レベルの前記検出または測定ステップが、配列番号１９、２２、２５、２８、３１、３４、３７、４０および４３からなる群から選択されるポリヌクレオチドプローブを用いて実施される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号２０、２１、２２、３８、３９および４０からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
配列番号１７〜４３からなる群から選択されるポリヌクレオチド。
【請求項３３】
配列番号１７〜４３に対して９０％の同一性を有する、請求項３２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３４】
前記ポリヌクレオチドプライマーが、配列番号１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９、３０、３２、３３、３５、３６、３８、３９、４１および４２からなる群から選択される、請求項３２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３５】
前記ポリヌクレオチドプローブが、配列番号１９、２２、２５、２８、３１、３４、３７、４０および４３からなる群から選択される、請求項３２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３６】
配列番号２０、２１、２２、３８、３９および４０からなる群から選択される、請求項３２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３７】
既に癌であると診断された患者における癌再発のリスクを予測する方法であって、請求項５に記載のステップを実施するステップを含み、ここで−６〜−３の間のΔ−Δ−Ｃｔが、前記試料中でのＧＣＣ陽性細胞の存在を示唆し、ここでＧＣＣ陽性細胞の存在が、前記患者の癌の再発リスクが増大していることを示唆する、方法。
【請求項３８】
前記患者が、結腸直腸癌、胃癌、小腸癌、膵癌および食道癌からなる群から選択される癌であると既に診断されている、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記患者が、結腸直腸癌であると既に診断されている、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記患者が、ステージＩまたはステージＩＩ結腸直腸癌を有する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記腸／結腸直腸外試料がリンパ節または血液である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
前記腸／結腸直腸外試料がリンパ節である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記腸／結腸直腸外試料が２つ以上のリンパ節である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記腸／結腸直腸外試料が少なくとも４つのリンパ節である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記腸／結腸直腸外試料が少なくとも１２のリンパ節である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
約−６に等しいかもしくはそれより大きいΔ−ＣｔはＧＣＣ陽性結果を示し、かつ約−６より小さいΔ−ＣｔはＧＣＣ陰性結果を示し、ここで前記結果は、ＧＣＣ陰性およびＧＣＣ陽性結果の間での再発および無再発生存（ＲＦＳ）に関するリスクにおける区別を可能にする、請求項３７に記載の方法。
【請求項４７】
前記陽性結果が、前記同じ患者の１〜３つのリンパ節中で見出され、ここで、前記ＧＣＣ／ＧＵＳＢ試験によると１〜３つの陽性ＬＮを有する前記患者における再発の相対リスクが中等度である、請求項４２または４４に記載の方法。
【請求項４８】
前記陽性結果が、前記同じ患者の４つ以上のリンパ節中で見出され、ここで、前記ＧＣＣ／ＧＵＳＢ試験によると４つ以上の陽性ＬＮを有する前記患者における再発の相対リスクが高度である、請求項４２または４４に記載の方法。
【請求項４９】
検出されるＧＣＣの量が、各個別のリンパ節に対して計算される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
ＧＣＣの量が、前記患者のすべてのリンパ節中でのＧＣＣの前記個別量の合計である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
−５．９に等しいかもしくはそれより大きいΔ−ＣｔはＧＣＣ陽性結果を示し、かつ−５．９より小さいΔ−Δ−ＣｔはＧＣＣ陰性結果を示し、ここで前記結果は、ＧＣＣ陰性およびＧＣＣ陽性結果の間での再発および無再発生存（ＲＦＳ）に関するリスクにおける区別を可能にする、請求項３７に記載の方法。
【請求項５２】
前記陽性結果が、前記同じ患者の１〜３つのリンパ節中で見出され、ここで、前記ＧＣＣ／ＧＵＳＢ試験よると１〜３つの陽性ＬＮを有する前記患者における再発の相対リスクが中等度である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記陽性結果が、前記同じ患者の４つ以上のリンパ節中で見出され、ここで、前記ＧＣＣ／ＧＵＳＢ試験によると４つ以上の陽性ＬＮを有する前記患者における再発の相対リスクが高度である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
癌であると診断された患者のＧＣＣ負荷を決定する方法であって、請求項３７に記載のステップを実施するステップを含み、ここで、Δ−Ｃｔが約−１２に等しいかもしくはそれより大きい場合、ＧＣＣ  ｍＲＮＡの量は、外部標準に対して、コピーの数を単位として計算され、それにより、前記ＧＣＣ負荷は、前記試料中でのＧＣＣコピーの数で表される、方法。
【請求項５５】
前記ＧＣＣ負荷が、各個別のリンパ節に対して決定される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記ＧＣＣ負荷が、前記患者のすべてのリンパ節中でのＧＣＣの総量に基づいて決定される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
癌であると診断された患者の癌再発のリスクを予測する方法であって、請求項５５または５６のいずれかに記載のＧＣＣ負荷を決定するステップを含み、ここで、１０コピーを超えるＧＣＣ負荷は、癌再発の可能性の増大を示唆する、方法。
【請求項５８】
癌であると診断された患者の癌再発のリスクを予測する方法であって、請求項５７に記載のＧＣＣ負荷を決定するステップを含み、ここで、２５コピーを超えるＧＣＣ負荷は、癌再発の可能性の増大を示唆する、方法。
【請求項５９】
癌であると診断された患者の癌再発のリスクを予測する方法であって、
・前記患者から採取された１つ以上のリンパ節中でのＧＣＣの量を測定するステップと、
・前記１つ以上のリンパ節の各々をＧＣＣ陰性またはＧＣＣ陽性として分類するステップと、
・前記リンパ節比を決定するステップと、
を含み、ここで前記リンパ節比は、ＧＣＣ陰性およびＧＣＣ陽性リンパ節の合計に対するＧＣＣ陽性リンパ節の数であり、ここで前記リンパ節比が大きくなると、癌再発の可能性が高まる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００９年２月２５日に出願された米国仮特許出願第６１／１５５，１７２号明細書および２００９年２月２８日に出願された米国仮特許出願第６１／２４６，１９７号明細書（これらの内容は、参照によりそれら全体が本明細書中に援用される）から優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、一般に、患者から得られる試料中のバイオマーカー標的を検出するための方法に関する。特に、本発明は、ＧＣＣが通常発現されないヒト組織内または体液中で、グアニリルシクラーゼＣ（ＧＣＣまたはＧＵＣＹ２Ｃ）発現細胞の存在を検出するための方法を提供する。より詳細には、本発明は、患者から得られるリンパ節、血液、または別の組織試料中の、胃腸（ＧＩ）管、特に結腸直腸癌型の癌病巣に由来する転移性癌細胞の存在を検出するための方法を提供する。また、本発明は、癌患者の病期分類または結腸直腸癌患者が根治手術後に再発する可能性を予測することを目的としたＧＣＣ  ｍＲＮＡの定量のためのＲＴ−ｑＰＣＲ法の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景に関する以下の考察は、あくまで読者に対して本発明を理解することを援助するために提供される。
【０００４】
結腸直腸癌（ＣＲＣ）は、疾患および処置への理解が有意に変化しているにもかかわらず、先進国における２番目に一般的な死因である。それに対し、初期ステージの結腸直腸癌における大部分の処置オプションは非効率的であり、現行の処置パラダイムは不透明である。ＣＲＣは、病期分類と転帰の間に緊密な関係がある多数の疾患の中の１つである。一旦患者がＣＲＣであると診断されると、再発の可能性は、腸壁を通過する腫瘍の浸潤度およびリンパ節転移の存在または不在に関連する。これらの特性は、Ａｍｅｒｉｃａ  Ｊｏｉｎｔ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ（ＡＪＣＣ）によって定義されたＣＲＣ病期分類システムの基盤である。リンパ節転移は多数の固形腫瘍における強力な予後因子であることから、病理学者、腫瘍学者および外科医は、リンパ節の転移を検出することに多大な関心を示している。組織病理学（ＨＰ）がＣＲＣ病期分類の中核であり続ける一方、リンパ節（ＬＮ）検査は、他の細胞種に由来する単一の腫瘍細胞または小さい腫瘍細胞塊の存在下であっても困難でありうる。ＬＮ中でのＣＲＣ転移の存在を同定するための現行の方法は、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色された組織切片の組織病理学的検査である。この技術は、ＣＲＣ転移の存在について、通常、各ＬＮの、非常に小さい割合、典型的には４〜５μｍの１つもしくは２つの組織切片が評価され、各リンパ節の大部分の体積（典型的には＞９９％）が未検査のままであるという事実によって制限を受ける。その結果、ＨＰ検査により、リンパ節転移がないものと見なされるＣＲＣ患者における転帰を予測することは、これらの患者の約２０％が疾患の再発を来すことから、相変わらず困難な状況である。ＧＩ管の転移性癌細胞の存在を同定するためのより優れた技術を見出す必要があることは明らかである。
【０００５】
ＣＲＣ患者の術後転帰を改善するため、グアニリルシクラーゼＣ（ａｋａ  ＧＵＣＹ２Ｃ、より一般的にはＧＣＣ、ＳＴ受容体としても知られる）とその代替の転写産物ＣＲＣＡ−１の双方が、腸／結腸直腸外組織内または体液中での転移性結腸直腸癌細胞の存在の優れた指標であることが示されている。ＧＣＣ遺伝子の転写産物は、腸上皮によって特異的に発現され、また転写因子ＣＤＸ２の内因性の下流標的である。ＧＣＣの発現は、結腸直腸組織内での腺腫から癌への移行を通じて認められる。より最近では、原発性および／または転移性の胃癌または食道癌におけるグアニリルシクラーゼＣまたはＣＲＣＡ−１に基づくスクリーニングおよび診断方法は開示されている。特に、米国特許第５，６０１，９９０号明細書、米国特許第５，７３１，１５９号明細書、米国特許第５，９２８，８７３号明細書；米国特許第６、０６０，０３７号明細書；米国特許第６，１２０，９９５号明細書；米国特許第６，６０２，６５９号明細書；米国特許第６，７６７，７０４号明細書；米国特許第７，１３５，３３３号明細書；米国特許第７，３１６，９０２号明細書および米国特許第７，４０２，４０１号明細書を参照のこと。
【０００６】
臨床試験では、逆転写および定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ｑＰＣＲ）によるＧＣＣの検出が、結腸直腸癌（ＣＲＣ）を有する患者において組織病理学的に陰性であるリンパ節（ＬＮ）中での転移性癌細胞の存在を示唆することが示されている。Ｓｃｈｕｌｚによって記載された試験（Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００６年８月１日；１２（１５）：４５４５−５２頁）およびＷａｌｄｍａｎによって最近公表された試験（ＪＡＭＡ、２００９年；３０１（７）：７４５−７５２頁）を含むこれらの試験は、一部の（例えば約半数の）リンパ節の凍結標本中でのＧＣＣバイオマーカー（「標的」）の検出に基づく。
【０００７】
癌の診断、病期分類およびモニタリングにおけるＧＣＣおよび他の標的の使用には、新鮮または保管組織試料を使用する有効かつ効率的なシステム、プロセスおよび方法の開発が必要とされる。現在、病理学的試料は、長年にわたる周囲温度での組織形態の保護を可能にする標準の保管方法として、固定パラフィン包埋（ＦＰＥ）組織ブロック中で保護される。バイオマーカー標的としてＧＣＣを使用する試験が臨床管理に影響を与えるように、かかる試験は、ＦＰＥ組織保護に適合する必要がある。しかし、固定プロセスは、モノメチル基の核酸塩基への付加が原因で、経時的にタンパク質架橋または酸化を通じて核酸を分解することが知られていることから、かかる試料は大きな技術的課題を呈する。それ故、転移性癌細胞を検出するための方法は、例えば逆転写および定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ｑＰＣＲ）を可能にする、より強固な臨床プラットフォームに移行されなければならない。ＦＰＥ臨床試料中で生じるＲＮＡ分解および化学的修飾は、ＲＴ−ｑＰＣＲにおける標的検出の精度に影響しうる。
【０００８】
出願人は、分解ＲＮＡを伴う標本をもたらす微小なＧＣＣ  ｍＲＮＡの断片に対するＲＴ−ｑＰＣＲの検出能を用いた、結腸直腸癌の病期分類を目的とする臨床試験を過去に開発している。内部対照ＲＮＡとしてのベータ−アクチン（β−アクチンもしくはＡＣＴＢ）を伴う、ｑＰＣＲ反応をモニタリングするためのＳｃｏｒｐｉｏｎｓ（商標）技術を用いるＧＣＣ二重アッセイは、絶対定量に伴う頻発する問題の大部分を、逆転写酵素およびＰＣＲ反応の効率を考慮し、逆転写酵素およびＰＣＲ阻害剤の存在についてモニタリングすることによって回避する。しかし、その存在度が高いことから、ＡＣＴＢは、二重アッセイにおけるＧＣＣとの競合を阻止するように調整する必要がある。したがって、ＲＮＡ分解またはＲＮＡインプットをモニタリングするための参照遺伝子としてのＡＣＴＢの使用は、時間依存性分解などの変動および厳しい固定条件に対するアッセイの感度が欠如していることから、現在のところ限界がある。これに関連し、著しく分解された試料および／または高度に阻害された試料および／または極めて低いＲＮＡ濃度を有する試料だけが、確立された検出限界（ＬＯＤ）に満たないＡＣＴＢのＣｔ値をもたらす。ＧＣＣが、ＡＣＴＢよりも、これらすべてのストレス条件による影響を受けることから、現行の絶対定量では、すべての試料が、阻害剤を全く含有せず、同様の分解状態およびＲＮＡインプットを有し、それ故にアッセイの感度および精度を低下させることになる。
【０００９】
したがって、感度良好な、および／または高精度な、および／または再現可能な、および／または費用効果的な、患者から得られる試料中での標的、例えばＧＣＣを検出するための方法およびシステムに対して需要がある。
【００１０】
残念なことに、１つ以上の予後ＲＮＡ転写産物の転写産物レベルの単なる測定は、分子マーカーに関連した臨床転帰を判定するだけの十分な感度および特異度のある診断試験をもたらすものではない。リアルタイムＰＣＲから得られる生データは処理され、標的ｍＲＮＡの相対量が得られる必要がある。絶対定量は、既知量の合成ＤＮＡもしくはＲＮＡ転写産物に対する、所与の試料中のｍＲＮＡコピーの数を内挿によって判定するため、各実験において標準曲線を必要とする。相対定量（デルタＣｔ（ΔＣｔ））を用い、試料を通じての標的遺伝子（すなわちＧＣＣ）のｍＲＮＡレベルの変化を、内部対照ＲＮＡとして使用される、内因性参照遺伝子（ＲＧ；往々にしてハウスキーピング遺伝子と称される）のレベルに対するこの変化を表すことにより、判定することが可能である。１つのかかる周知の使用頻度が多い参照遺伝子が、ＡＣＴＢである。あるいは、標的試料の平均デルタＣｔ（ΔＣｔ）値と、対応する対照試料における平均デルタＣｔ（ΔＣｔ）との間の差異（デルタ−デルタＣｔ（ΔΔＣｔ））は、発現の倍率変化値を計算するために用いられる。
【００１１】
臨床試料中の安定な内因性参照遺伝子の評価は、ＲＴ−ｑＰＣＲプラットフォームまたは他の関連の増幅方法を用いる相対的遺伝子発現の高精度かつ正確な正規化に向けての前提条件である。単一のいわゆる「ユニバーサル（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）」参照遺伝子の使用は、ＧＣＣ遺伝子の発現の解釈を誤ることになりうる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
患者の試料中でのＣＲＣ細胞の検出のため、ＧＣＣとともに使用されるべき参照遺伝子の同定に対しても需要があり、この参照遺伝子では、発現が、リンパ節中での癌細胞の存在による影響を受けず、試料中でのＧＣＣに類似した挙動が、長い保管期間、劣悪な保管条件または他のストレス因子が原因で劣化する。多数のかかる参照遺伝子については、検討がなされ、異なる状況下で有用であることが見出されている。しかし、現在、最適なユニバーサル参照遺伝子が存在しないというのが大方の見解である（Ｇｒｅｅｎら、２００９年、Ｄｉａｇｎ  Ｍｏｌ  Ｐａｔｈｏｌ  １８（４）、２４３−２４９頁およびその中の参考文献１１）。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）がＰＣＲデータの正規化のための参照遺伝子として特に有用であることが見出されている。ＧＩ管癌の診断および／または予後のためにＧＣＣを評価するという特定の状況下では、ＧＵＳＢは、他の参照遺伝子の場合に取得可能と思われるよりもはるかに低い検出限界（ＬＯＤ）を測定することを可能にする等といった予期しない利点をもたらす。
【００１４】
本発明は、試料中での癌細胞またはＧＣＣ発現細胞を検出するための方法を提供し、同方法は、処理された採取組織または体液からＧＣＣを検出し、および／または測定／定量し、それは同じ試料中での１つ以上の参照遺伝子の検出および／または定量と組み合わされる。ＧＵＳＢ（β−グルクロニダーゼ）は、優れた参照遺伝子であることが見出された。特に、ＧＵＳＢは、リンパ節中でのＣＲＣ細胞の検出において、ＧＣＣの補完として使用されるべき優れた参照遺伝子であることが見出された。ＲＴおよびＰＣＲ反応は、ＧＣＣおよびＧＵＳＢ  ｍＲＮＡを同時に増幅する、効率的な二重試験を得るように設計された。この試験の分析性能は検証され、ＧＣＣ／ＡＣＴＢ試験に対して強度が改善されることが示された。ＧＣＣ／ＧＵＳＢ試験のこれらの改善された分析特性（より高い情報の速度（ｉｎｆｏｒｍａｔｉｖｅ  ｒａｔｅ）、より高い分析感度および相対定量）は、ステージＩＩのＣＲＣであると診断された患者の集団の場合に試験される場合、再発リスク（ＲＲ）のより正確な層別化をもたらしうる。
【００１５】
本発明はまた、患者から採取された試料中でのＧＣＣを検出するための診断方法であって、試料中でのＧＣＣを検出するステップと、同じ試料中でのβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）を（同時または順次）検出するステップと、ＧＣＣ対ＧＵＳＢの相対定量を決定するステップと、を含み、ここで、一定の閾値を超えるＧＣＣ対ＧＵＳＢの存在は、試料中にＧＣＣ陽性細胞が存在することを示唆する、診断方法を提供する。
【００１６】
一般的態様によると、患者から採取された試料中でのＧＣＣを測定する方法であって、試料中でのＧＣＣをＲＴ−ｑＰＣＲによって測定し、ＣｔＧＣＣを決定するステップと、同じ試料中でのＧＵＳＢをＲＴ−ｑＰＣＲによって測定し、ＣｔＧＵＳＢを決定するステップと、ＣｔＧＵＳＢ−ＣｔＧＣＣ（Δ−Ｃｔ）の相対定量を決定するステップと、を含み、ここで、約−１２を超えるΔ−Ｃｔは、試料中にＧＣＣ陽性細胞が存在することを示唆する、方法が提供される。
【００１７】
本発明はまた、倍率変化（ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ）（Δ−Δ−Ｃｔ）の表現を用いて、試料中でのＧＣＣのｍＲＮＡレベルの変化を、ＧＵＳＢのＲＮＡレベルに対するこの変化を表すことによって判定する、ＧＣＣを検出するための診断方法を提供する。
【００１８】
本発明の別の態様によると、ＧＩ管癌であると既に診断された患者を病期分類またはモニタリングする方法であって、（ＧＣＣが通常発現されないヒト組織または体液、例えば特に結腸直腸外／腸組織から構成される）試料中でのＧＣＣを検出するステップと、同じ試料中でのＧＵＳＢを検出するステップと、ＣｔＧＵＳＢ−ＣｔＧＣＣ（Δ−Ｃｔ）の相対定量を決定するステップと、を含み、ここで、−１２を超えるΔ−Ｃｔは、試料中にＧＣＣ陽性細胞が存在することを示唆し、ＧＣＣ陽性細胞の存在は、転移性結腸直腸癌、胃癌、小腸癌、膵癌または食道癌を示唆する、方法が提供される。
【００１９】
本発明の別の態様によると、原発性胃癌、食道癌または膵癌を有すると疑われる患者を診断する方法であって、腸／結腸直腸外試料中でのＧＣＣを測定するステップと、同じ試料中でのＧＵＳＢを測定するステップと、ＣｔＧＵＳＢ−ＣｔＧＣＣ（Δ−Ｃｔ）の相対定量を決定するステップと、を含み、ここで、−１２を超えるΔ−Ｃｔは、試料中にＧＣＣ陽性細胞が存在することを示唆し、ＧＣＣ陽性細胞の存在は、原発性胃癌、食道癌または膵癌を示唆する、方法が提供される。
【００２０】
本発明の方法は、胃、小腸、食道、膵臓または結腸直腸の切除後に採取されるリンパ節中でのＧＣＣの存在または不在の検出を可能にし、それによって癌の分子病期分類が可能になる。本発明の別の態様によると、組織病理学的に陰性のリンパ節を有する癌患者と組織病理学的に陽性のリンパ節を有する癌患者とを区別するための、上記ステップを含む方法が提供される。
【００２１】
本方法によると、１つ以上のリンパ節中にＧＣＣ陽性細胞を有する癌患者は、組織病理学的により高いリスクを有すると考えられる患者に対して、再発および生存に関するリスクを有することから、これらの患者であれば、アジュバント化学療法による処置から恩恵を受けうることが示される。本方法によると、すべてのＬＮでＧＣＣ陰性である癌患者は、疾患再発のリスクがより低く、その場合、アジュバント化学療法を必要とせず、結果的にこれらの処置の負の副作用を回避することになる。
【００２２】
本発明の方法は、癌患者であると過去に診断された患者由来の血液中でのＧＣＣの存在を検出し、再発のリスクを予測し、癌の抗癌療法に対する再発および応答をモニタリングする。本発明の別の態様によると、癌を有する患者を予測する方法であって、上で規定されたステップを含み、ここでＧＣＣ陽性細胞の存在は予後不良を示唆する、方法が提供される。
【００２３】
本発明の別の態様によると、既にＧＩ管癌であると診断された患者が処置から恩恵を受けることになるか否かを判定する方法であって、患者から採取された腸／結腸直腸外試料中でのＧＣＣの発現レベルを測定するステップと、同じ腸／結腸直腸外試料中でのＧＵＳＢの発現レベルを測定するステップと、腸／結腸直腸外試料中でのＧＵＳＢの量に対するＧＣＣの量を測定するステップと、を含み、ここで、腸／結腸直腸外試料中でのＧＣＣの量が、ＧＵＳＢと比較される際に所与のレベルを超える場合、患者は処置から恩恵を受けることになる、方法が提供される。
【００２４】
特に、本発明は、既にＧＩ管癌であると診断された患者から採取された腸／結腸直腸外試料中でのＧＣＣの量を測定する方法であって、試料中でのＧＣＣ  ｍＲＮＡの発現レベルを測定するステップと、同じ試料中でのＧＵＳＢ  ｍＲＮＡの発現レベルを測定するステップと、数学的計算を用い、ＧＵＳＢ  ｍＲＮＡの発現レベルに対するＧＣＣ  ｍＲＮＡの発現レベルを正規化し、次に相対的ＧＣＣ発現（ＧＵＳＢレベル−ＧＣＣレベル）を決定するステップと、を含み、ここで、相対的ＧＣＣ発現が外部標準の検出限界より高い場合、試料中のＧＣＣの絶対量は、ＧＣＣコピーの数で計算され、表現される、方法を提供する。
【００２５】
特に、本発明は、既にＧＩ管癌であると診断された患者における癌再発の可能性を予測する方法であって、患者から採取された１つ以上のリンパ節中での上で規定されたＧＣＣの量を測定するステップと、１つ以上のリンパ節の各々をＧＣＣ陰性またはＧＣＣ陽性として分類するステップと、リンパ節比を決定するステップと、を含み、ここで、リンパ節比は、ＧＣＣ陰性およびＧＣＣ陽性リンパ節の合計に対するＧＣＣ陽性リンパ節の数であり、それにより、リンパ節比の増加は癌再発の可能性の増大を意味する、方法を提供する。
【００２６】
特に、本発明は、既にＧＩ管癌であると診断された患者における癌再発の可能性を予測する方法であって、患者から採取された１つ以上のリンパ節中でのＧＣＣの発現レベルを測定するステップと、同じ１つ以上のリンパ節中でのＧＵＳＢの発現レベルを測定するステップと、各リンパ節中でのＧＵＳＢの量に対するＧＣＣの量を測定するステップと、を含み、ここで、予め確定されたカットオフを超える相対的なＧＣＣの量は、リンパ節中でのＧＣＣの存在を示唆し、それにより、ＧＣＣが１つ以上のリンパ節中に存在する場合、患者は癌再発の可能性の増大を有する、方法を提供する。
【００２７】
特に、予め確定されたカットオフレベルは、約−６〜−３である。より詳細には、カットオフレベルは、−５．９、−５．５、−５．０；−４．５；−４．０；−３．５；および−３．０からなる群から選択される。
【００２８】
特に、本発明は、既にＧＩ管癌であると診断された患者における癌再発の可能性を予測する方法であって、患者から採取された腸／結腸直腸外試料中でのＧＣＣのＲＮＡレベルをＲＴ−ｑＰＣＲによって定量し、ＧＣＣにおけるサイクル閾値（ＣｔＧＣＣ）を決定するステップと、同じ試料中でのＧＵＳＢのＲＮＡレベルをＲＴ−ｑＰＣＲによって定量し、ＧＵＳＢにおけるサイクル閾値（ＣｔＧＵＳＢ）を決定するステップと、ＣｔＧＵＳＢ−ＣｔＧＣＣ（Δ−Ｃｔ）の相対定量を計算するステップと、を含み、ここで、約−６に等しいかもしくはそれより大きいΔ−Ｃｔは、試料中でのＧＣＣ陽性細胞の存在を示唆し、ここでＧＣＣ陽性細胞の存在は、患者の癌の再発リスクが増大していることを示唆する、方法を提供する。
【００２９】
特に、本発明は、既に癌であると診断された患者がＧＣＣリンパ節関与を有するか否かを判定する方法であって、患者から採取されたリンパ節中でのＧＣＣの発現レベルを測定し、ＧＣＣにおけるサイクル閾値（ＣｔＧＣＣ）を決定するステップと、患者から採取された同じリンパ節中でのＧＵＳＢの発現レベルを測定し、ＧＵＳＢにおけるサイクル閾値（ＣｔＧＣＣ）を決定するステップと、ＣｔＧＵＳＢ−ＣｔＧＣＣ（Δ−Ｃｔ）の相対定量を判定するステップと、を含み、ここで、Δ−Ｃｔが約−６に等しいかもしくはそれより大きい場合、リンパ節はＧＣＣ陽性である、方法を提供する。
【００３０】
特に、本発明は、既に癌であると診断された患者のＧＣＣ負荷を決定する方法であって、患者から採取された腸／結腸直腸外試料中でのＧＣＣ  ｍＲＮＡの発現レベルを測定し、ＧＣＣにおけるサイクル閾値（ＣｔＧＣＣ）を決定するステップと、患者から採取された同じ腸／結腸直腸外試料中でのＧＵＳＢの発現レベルを測定し、ＧＵＳＢにおけるサイクル閾値（ＣｔＧＵＳＢ）を決定するステップと、ＣｔＧＵＳＢ−ＣｔＧＣＣ（Δ−Ｃｔ）の相対定量を計算するステップと、を含み、ここで、Δ−Ｃｔが約−１２に等しいかもしくはそれより大きい場合、ＧＣＣ  ｍＲＮＡの量はコピーの数を単位として計算可能であり、それにより、ＧＣＣ負荷は試料中のＧＣＣコピーの数で表される、方法を提供する。
【００３１】
特に、本発明は、既に結腸直腸癌であると診断された患者を病期分類またはモニタリングする方法であって、患者から採取された腸／結腸直腸外試料を得るステップと、試料中でのＧＣＣを測定し、ＧＣＣにおけるサイクル閾値（ＣｔＧＣＣ）を決定するステップと、同じ試料中でのＧＵＳＢを測定し、ＧＵＳＢにおけるサイクル閾値（ＣｔＧＵＳＢ）を決定するステップと、ＣｔＧＵＳＢ−ＣｔＧＣＣ（Δ−Ｃｔ）の相対定量を決定するステップと、を含み、ここで、約−６より大きいΔ−Ｃｔは試料中でのＧＣＣ陽性細胞の存在を示唆し、ＧＣＣ陽性細胞の存在は転移性結腸直腸癌を示唆する、方法を提供する。
【００３２】
本発明の別の態様によると、原発不明癌（ｕｎｋｎｏｗｎ  ｏｒｉｇｉｎ）（ＣＵＰ）の転移を有する組織内でのＧＣＣ陽性細胞の存在の検出は、原発性癌が、結腸直腸癌、胃癌、腸癌、膵臓または食道癌であることの確認である。
【００３３】
本発明のさらに別の態様では、本発明の方法において使用される材料は、キットの調製に適している。本発明の別の態様によると、患者における癌の検出、診断、予後および／または病期分類のためのキットであって、試料中でのＧＣＣを検出するためのＰＣＲ試薬、同じ試料中でのＧＵＳＢを検出するためのＰＣＲ試薬、およびＧＣＣとＧＵＳＢの間での（Δ−Ｃｔ）または（Δ−Δ−Ｃｔ）を計算する仕方に関する説明書を含む、キットが提供される。
【００３４】
本発明はまた、試薬を含むキットであって、疾患再発を来す可能性を予測することを目的とした、開示される遺伝子の発現を定量するための遺伝子特異的プローブおよび／またはプライマーを含みうる、キットを提供する。かかるキットは、場合により、試料、特に固定パラフィン包埋組織試料からＲＮＡを抽出するための試薬および／またはＲＮＡ増幅のための試薬を有してもよい。
【００３５】
本願中に包含され、かつその一部を構成する添付の図面は、本発明の様々な実施形態を例示し、また、説明文とともに、本発明の原理を説明するのに役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】適合する新鮮凍結（ＦＦ）およびＦＦＰＥ結腸癌ＬＮにおける平均Ｃｔ値として示される、推定上の参照遺伝子の発現レベルを示す。
【図２】ＧＣＣ陰性および陽性ＦＦＰＥ  ＬＮにおける平均Ｃｔ値として示される、推定上の参照遺伝子の発現レベルを示す。標的のＣｔ範囲は、２つの点線によって定められた。
【図３】対照遺伝子の平均発現安定性値を示す。
【図４】正規化のための対照遺伝子の最適数の決定を示す。
【図５】ＧＣＣ陽性および陰性ＬＮ中での選択される参照遺伝子の発現特性を示す。ＦＦＰＥ試料中でのＧＣＣ、ＧＵＳＢ、ＨＰＲＴ１、ＰＧＫ１およびＴＢＰにおけるＣｔ値は、３１２．５ｎｇのｃＤＮＡとの一重反応において試験された。マイナスＲＴ実験では、ｃＤＮＡ合成ステップの間、ＲＴ酵素は全く添加されなかった。
【図６】ＲＮＡの質および遺伝子発現の測定に対するＮａＯＨ処理の効果を示す。ＮａＯＨ処理後のＲＮＡ分解の範囲は、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを使用するキャピラリー電気泳動によって測定された。パネルＡ）は、新鮮凍結結腸組織および適合するＦＦＰＥ材料から単離された無傷ＲＮＡに対する代表的なＲＮＡ断片化特性を示す。Ｂ）ＡＣＴＢ  Ｓｃｏｒｐｉｏｎｓ（商標）を含む、ＧＣＣおよび５つの参照遺伝子アッセイにおけるＣｔ値が、加水分解の各時点で測定された。
【図７】正規化のための５つの参照遺伝子（ＧＵＳＢ、ＨＰＲＴ１、ＰＧＫ１、ＴＢＰおよびＡＣＴＢ）を使用する、ＮａＯＨ分解の間でのＧＣＣ発現変動（Δ−Δ−Ｃｔ）を示す。ΔＣｔ値における変動（Δ−Δ−Ｃｔ＝［（ＣｔＧＣＣ−ＣｔＲＧ）ｔｘ−（ＣｔＧＣＣ−ＣｔＲＧ）ｔ０］）が、加水分解の各時点で測定された。誤差のバーは、３つの独立したＲＮＡプールからのＳＤを示す。３つの実験間での比較を行うため、各遺伝子における閾値は、マニュアルで０．１０に固定された。
【図８】ＲＮＡの質および遺伝子発現パターンに対する炭酸塩緩衝液でのアルカリ処理の効果を示す。指定時点で単離されたＲＮＡの質が、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを使用するキャピラリー電気泳動によって測定された。Ａ）新鮮凍結結腸組織から単離された無傷ＲＮＡに対する代表的なＲＮＡ断片化特性。Ｂ）ＲＮＡ試料の電気泳動図。各時点では、同量の材料が含まれた。Ｃ）ＧＣＣ／ＡＣＴＢ二重アッセイを含む、ＧＣＣおよび５つの参照遺伝子アッセイにおけるＣｔ値。
【図９】炭酸塩緩衝液でのアルカリ性条件下で制御されたＲＮＡ分解後のＧＣＣ発現変動（Δ−Δ−Ｃｔ）を示す。ΔＣｔ値における変動（Δ−Δ−Ｃｔ＝［（ＣｔＧＣＣ−ＣｔＲＧ）ｔｘ−（ＣｔＧＣＣ−ＣｔＲＧ）ｔ０］）が、加水分解の各時点で測定された。
【図１０】ＴａｑＭａｎ一重アッセイおよびＧＣＣ／ＡＣＴＢ二重アッセイを使用する、凍結および固定パラフィン包埋（ＦＰＥ）組織における遺伝子発現プロファイリングを示す。各条件から単離されたＲＮＡの質は、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを使用するキャピラリー電気泳動によって測定された（条件ＡおよびＥはＴＲＩｚｏｌ（商標）抽出物、Ｂ：中性緩衝ホルマリン１０％、Ｃ：非緩衝ホルマリン１０％；Ｄ：ブアン液）。ＴａｑＭａｎ一重反応におけるＧＣＣおよび４つの参照遺伝子（ＧＵＳＢ、ＨＰＲＴ１、ＰＧＫ１およびＴＢＰ）の発現（Ｃｔ値）は、ＧＣＣ／ＡＣＴＢ二重アッセイの場合と比較された。
【図１１】固定または非固定の結腸癌組織試料の凍結切片中でのＧＣＣ発現レベル（Δ−Ｃｔ）の比較を示す。ΔＣｔ値における変動（Δ−Ｃｔ＝（ＣｔＧＣＣ−ＣｔＲＧ））が、各ＲＮＡ抽出物について測定された。逆転写反応は、Ｑｕａｎｔ−ＩＴデータに基づく、遺伝子特異的プライマー（２μＭ）および５００ｎｇの全ＲＮＡを使用する、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、製造業者の推奨に従って行われた。リアルタイムＰＣＲは、ＴａｑＭａｎ一重またはＧＣＣ／ＡＣＴＢ二重アッセイのいずれかを用いる、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７９００ＨＴ  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍｓで、２０μｌの反応容量において行われた。各一重アッセイにおけるプライマーおよびプローブ濃度は、それぞれ９００ｎＭおよび２５０ｎＭであった。すべての反応が、二重に行われた。
【図１２】ＦＦＰＥ結腸組織から抽出されたＲＮＡにおけるＧＣＣ  Ｔａｑｍａｎ一重および二重増幅の比較を示す。上部パネルは、２μＭでの遺伝子特異的リバースプライマーおよび１．２５μｇのＲＮＡを使用する一重および二重反応において試験されたＦＦＰＥ試料におけるＧＣＣおよび様々なＲＧ  ＰＣＲ増幅を示す。下部パネルは、一重および二重反応におけるＧＣＣおよび様々な参照遺伝子に対するマイナスＲＴ−ＰＣＲ増幅の比較を示す。
【図１３】二重および一重反応の間でのＧＣＣおよびＧＵＳＢ  Ｃｔ値の比較を示す。リアルタイムＰＣＲは、ＴａｑＭａｎ  Ｆａｓｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを使用する、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７９００ＨＴ  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍｓで、２０μｌの二重または一重反応において行われた。ｃＤＮＡの合成が、１×１０６個のＧＣＣ  ＩＶＴによるスパイクを伴うまたは伴わない、２５０ｎｇ／μｌ（Ａ）もしくは２５ｎｇ／μｌ（Ｂ）のｕＲＮＡを用いて行われた。一重でのリアルタイムＰＣＲ反応においては、プライマー濃度は９００ｎＭであり、ＦＡＭまたはＶＩＣ標識プローブ濃度は２５０ｎＭであった。二重反応においては、４つの濃度のリバースおよびフォワードプライマーが試験された一方、ＦＡＭおよびＶＩＣ標識プローブの双方は、２０μｌのＰＣＲ反応において２００ｎＭで固定された。
【図１４】ＮａＯＨ分解の間での二重および一重アッセイにおけるＧＣＣおよびＲＧ  Δ−Ｃｔ変動を示す。ＧＣＣの発現は、ＧＵＳＢまたはＨＰＲＴ１のいずれかで正規化された。ＧＣＣ相対定量における変動（Δ−Δ−Ｃｔ＝［（ＣｔＧＣＣ−ＣｔＲＧ）ｔｘ−（ＣｔＧＣＣ−ＣｔＲＧ）ｔ０］）が、ＮａＯＨ加水分解の間、指定時点で測定された。非分解および分解試料の間での変動であれば、有意でないと見なされるように、１Δ−Ｃｔより低い必要がある。
【図１５】マイナスＲＴ条件下でのＴａｑＭａｎおよびＳｃｏｒｐｉｏｎｓ（商標）二重アッセイで試験されたＦＦＰＥ結腸癌ＬＮの比較を示す。パネルＡおよびＣは、二重反応において３１２．５ｎｇのｃＤＮＡを用いて試験された８つのＦＦＰＥ試料中でのＡＣＴＢ、ＧＵＳＢ、ＨＰＲＴ１およびＧＣＣにおけるＣｔ値を示す。マイナスＲＴ実験（ＢおよびＤ）では、ＲＴ酵素は、ｃＤＮＡ合成ステップの間、全く添加されなかった。
【図１６】固定または非固定の結腸癌組織試料の凍結切片中でのＧＣＣ発現レベル（Δ−Ｃｔ）の比較を示す。ΔＣｔ値ΔＣｔ＝（ＣｔＧＣＣ−ＣｔＲＧ）が、ＧＵＳＢ（ＡおよびＢ）またはＨＰＲＴ１（ＣおよびＤ）のいずれかを用い、各ＲＮＡ抽出物について測定された。逆転写反応は、２μＭでの遺伝子特異的プライマーを使用する一重において、また指定されたプライマー濃度での二重において行われた。リアルタイムＰＣＲは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）一重または二重アッセイのいずれかを用いる、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７９００ＨＴ  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍｓで、２０μｌの反応容量において行われ、Ｓｃｏｒｐｉｏｎｓ（商標）二重反応の場合と比較された。すべての反応が、三重に行われた。凍結および固定試料の間での１Δ−Ｃｔ未満の変動は、有意でないと見なされた。
【図１７】１か月から２２年にわたる異なる保管時間を有する５５のＦＰＥ結腸周囲リンパ節組織から抽出されたＲＮＡ中の参照遺伝子の増幅を示す。Ａ）保管ＦＰＥ組織から抽出されたＲＮＡのキャピラリー電気泳動プロファイル。１μｌの各ＲＮＡ抽出物（１５０ｎｇ／μＬ）は、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  ＢｉｏａｎａｌｙｓｅｒおよびＲＮＡ  Ｎａｎｏ  Ｃｈｉｐｓを使用して分析された。Ｂ）ＦＰＥ結腸リンパ節組織中でのＡＣＴＢおよびＧＵＳＢにおけるＣｔ値。リアルタイムＰＣＲは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７９００ＨＴ  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ＳｙｓｔｅｍｓおよびＴａｑＭａｎ  Ｆａｓｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを使用する、２０μｌの一重反応において行われた。
【図１８】異なる保管時間を有するブロック群中で認められるＡＣＴＢおよびＧＵＳＢ  Ｃｔ値の比較を示す。ＦＰＥ結腸リンパ節組織内でのＡＣＴＢ（Ａ）およびＧＵＳＢ（Ｂ）ｍＲＮＡ発現（Ｃｔ値）の箱ヒゲ図（Ｂｏｘ−ａｎｄ−Ｗｈｉｓｋｅｒ  ｐｌｏｔｓ）。複数の比較においては、一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）およびテューキーの事後検定（ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  Ｔｕｒｋｅｙ’ｓ  ｔｅｓｔ）が用いられ、Ｐ＜０．０５が統計的に有意であると見なされた。
【図１９】ＴａｑＭａｎ  ＧＣＣ／ＧＵＳＢアッセイで試験された、組織病理学的陰性およびＧＣＣ／ＡＣＴＢ陰性（ｐＮ０（ｍｏｌ−））およびステージＩＩＩ  ＧＣＣ／ＡＣＴＢ陽性（ｐＮ１−２（ｍｏｌ＋））ＬＮにおけるＧＣＣ相対的発現レベルを示す。Δ−Ｃｔ（ＣｔＧＵＳＢ−ＣｔＧＣＣ）を用いる相対定量の受信者動作特性（ｒｅｃｅｉｖｅｒ  ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）（ＲＯＣ）分析は、ＧＣＣ／ＧＵＳＢ二重アッセイにおけるカットオフ値を測定するために用いられた。
【図２０】ＴａｑＭａｎ  ＧＣＣ／ＧＵＳＢ二重アッセイで評価されたＧＣＣ相対的発現レベルを示す。結腸癌ステージＩ、ＩＩおよびＩＩＩの組織病理学的陰性（ＨＰ−）およびステージＩＩＩの陽性（ＨＰ＋）のＬＮにおけるＧＣＣ相対的発現ΔＣｔ（ＣｔＧＵＳＢ−ＣｔＧＣＣ）。ＧＣＣ  ｍＲＮＡ陽性状態は、５．９の分析カットオフ値に基づいた。
【図２１】ｇｅＮｏｒｍを用いた、血液試料中での対照遺伝子の平均発現安定性値を示す。
【図２２】ｇｅＮｏｒｍを用いた、正規化のための参照遺伝子の最適数の判定を示す。
【図２３】血液試料中でのＧＣＣ発現レベルを示す。ＧＣＣ  ｍＲＮＡ陽性状態は、７５ＧＣＣ単位／ｍＬの分析カットオフ値に基づいた。
【図２４】２名の異なる患者コホートにおけるＡ）ＡＣＴＢ  Ｃｔ値およびＢ）グルクロニダーゼＧＵＳＢ  Ｃｔ値の分布を示す。ウィルコクソンランク検定（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔ）のｐ値：０．０００１。
【図２５】連続型変数として、症例の任意の所与のＬＮの最高のＧＣＣコピーを採用するＧＣＣ／ＡＣＴＢおよびＧＣＣ／ＧＵＳＢアッセイの双方におけるＨＤＱおよびＵＭａｓｓコホート（ｎ＝７３）ＲＯＣ曲線分析の組み合わせを示す。感度は、（３６か月後の）再発症例の検出率として定義される一方、特異度は、再発のない陰性症例の割合として定義される。
【図２６】ＧＣＣ陽性試験結果を有する患者における再発のリスクと試験の陽性を判定するために用いられるＧＣＣ発現レベルとの関係を図示する。
【図２７】ＧＣＣ陽性に基づく時間対再発のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒグラフィック分析である。Ａ）１００コピーカットオフの場合でのＧＣＣ／ＡＣＴＢ試験；Ｂ）１００コピーカットオフの場合でのＧＣＣ／ＧＵＳＢ試験；Ｃ）２５コピーカットオフの場合でのＧＣＣ／ＡＣＴＢ試験；Ｄ）２５コピーの場合でのＧＣＣ／ＧＵＳＢ試験。ＧＣＣ陰性症例は黒直線、ＧＣＣ陽性症例は灰色鎖線によって表される。追跡不能の患者は、打ち切られ（ｃｅｎｓｏｒｅｄ−ｏｕｔ）、上方直線（ｓｔｒａｉｇｈｔ  ｕｐ）印によって表される。
【図２８】カットオフにおいて−５．９ΔＣｔを有するＧＣＣ／ＧＵＳＢ試験におけるＧＣＣ陽性に基づくＲＦＳのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒグラフィック分析である。ＧＣＣ陰性症例は直線、ＧＣＣ陽性症例は鎖線によって表される。打ち切り症例は、上方直線印によって表される。
【図２９】ＧＣＣ陽性患者に対する２レベルの層別化を伴う、時間対再発のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒグラフィック分析である。Ａ）１００コピーカットオフの場合でのＧＣＣ／ＡＣＴＢ試験；Ｂ）１００コピーカットオフの場合でのＧＣＣ／ＧＵＳＢ試験；Ｃ）２５コピーカットオフの場合でのＧＣＣ／ＡＣＴＢ試験；Ｄ）２５コピーの場合でのＧＣＣ／ＧＵＳＢ試験。また、リスクのある患者数は、各群に対して示される。
【図３０】ＧＣＣ陽性患者に対する２レベルの層別化を伴う、時間対再発のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒグラフィック分析である。Ａ）カットオフにおいて−５．９ΔＣｔを有するＧＣＣ／ＧＵＳＢ試験。また、リスクのある患者数は、各群に対して示される。Ｂ）ＧＣＣ／ＧＵＳＢ（Δ−Ｃｔ＝−５．９）とＧＣＣ／ＡＣＴＢ（ＧＣＣコピー＝２５）の間の全再発率の比較。
【図３１】患者当たりのＧＣＣ陽性ＬＮの数に対する層別化を伴う、時間対再発のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒグラフィック分析である。Ａ）２５コピーカットオフの場合でのＧＣＣ／ＡＣＴＢ試験；Ｂ）２５コピーカットオフの場合でのＧＣＣ／ＧＵＳＢ試験。また、リスクのある患者数は、各群に対して示される。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
定義
本発明の理解を容易にするため、多数の用語が下記に定義される。
【００３８】
下記に使用される用語「約」は、指定される数の＋もしくは−５％の誤差範囲を示す。精度を目的として、用語「約」は、例えば整数１０とともに用いられる場合、１０＋／−５％すなわち９．５〜１０．５を意味する。
【００３９】
本明細書で使用される用語「ＧＣＣ」は、細胞タンパク質グアニル酸シクラーゼ２Ｃ（ＧＵＣＹ２Ｃ、熱安定性エンテロトキシン受容体もしくはＳＴ受容体とも称される）を発現する遺伝子転写産物（ＲＮＡ）を示すことを意味し、それは、正常な結腸直腸細胞、ならびに原発性および転移性結腸直腸癌、腸癌、胃癌および食道癌細胞によって発現される。正常な個体では、ＧＣＣは、腸の細胞内、特に十二指腸、小腸（空腸および回腸）、結腸（盲腸、上行結腸、横行結腸、下行結腸およびＳ字結腸）および直腸の細胞内に特異的に見出される。用語「ＧＣＣ」はまた、完全長配列を有する核酸分子に関して機能的であるＧＣＣ遺伝子転写産物の断片、例えばオリゴヌクレオチドまたは核酸プローブ、プライマー、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは核酸分子またはコード配列として有用でありうる機能断片を含む。用語「ＧＣＣ」はまた、ＣＲＣＡ−１代替転写産物を含む。
【００４０】
本明細書で使用される用語「結腸直腸癌」は、結腸直腸癌を、小腸より下方の腸管（すなわち大腸（結腸）、例えば盲腸、上行結腸、横行結腸、下行結腸、およびＳ字結腸、および直腸）における癌細胞の存在によって特徴づけられる病状として定義する、一般に認められた医学的定義を含むことを意味する。さらに、本明細書で使用される用語「結腸直腸癌」は、十二指腸および小腸（空腸および回腸）における癌細胞の存在によって特徴づけられる病状をさらに含むことを意味する。本明細書で使用される結腸直腸癌の定義は、一般の医学的定義より拡張的であるが、十二指腸および小腸の細胞もまたＧＣＣを有することから、そのようなものとして提供される。
【００４１】
本明細書で使用される用語「ＧＩ管癌」または「胃腸癌」は、食道、胃、膵臓、小腸、ならびに結腸および直腸における癌細胞の存在によって特徴づけられる病状を含むことを意味する。さらに、本明細書で使用される用語「ＧＩ管癌」は、肝臓および胆嚢のようにＧＩ管の付属器官である膵臓における癌細胞の存在によって特徴づけられる病状をさらに含むことを意味する。本明細書で使用されるＧＩ管癌の定義は、一般の医学的定義より拡張的であるが、膵癌細胞がＧＣＣを発現することは知られていることから、そのようなものとして提供される。
【００４２】
本明細書で使用される用語「上部ＧＩ管」は、口腔、唾液腺、咽頭、食道、横隔膜、胃、胆嚢、胆管、肝臓、および十二指腸から構成される。本明細書で使用される用語「上部ＧＩ管癌」は、特に、食道、胃および膵臓を示す。
【００４３】
本明細書で使用される用語「下部ＧＩ管」は、腸（ｂｏｗｅｌ）または腸（ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）および直腸を意味し、十二指腸、空腸、回腸を含む小腸、ならびに盲腸（および虫垂）；結腸（上行、横行および下行）および直腸（肛門）を含む大腸または結腸を含む。
【００４４】
本明細書で使用される用語「胃癌」は、胃癌を、胃における癌細胞の存在によって特徴づけられる病状として定義する、一般に認められた医学的定義を含むことを意味する。
【００４５】
本明細書で使用される用語「食道癌」は、食道癌を、食道における癌細胞の存在によって特徴づけられる病状として定義する、一般に認められた医学的定義を含むことを意味する。
【００４６】
本明細書で使用される用語「膵癌」は、膵癌を、膵臓における癌細胞の存在によって特徴づけられる病状として定義する、一般に認められた医学的定義を含むことを意味する。
【００４７】
本明細書で使用される用語「転移」は、身体の一器官または一部に由来する癌細胞が、体液による輸送の有無にかかわらず、身体の別の部分に移動し、複製し続けるプロセスを示すことを意味する。その後、転移性細胞は、腫瘍を形成する可能性があり、それはさらに転移する場合がある。それ故、転移は、癌の、それが最初に発生した身体の部分から身体の他の部分への浸潤を示す。
【００４８】
本明細書で使用される用語「転移性結腸直腸癌細胞」は、転移性を有する結腸直腸癌細胞を示すことを意味する。転移性結腸直腸癌細胞は、十二指腸、小腸（空腸および回腸）、大腸（結腸）、例えば盲腸、上行結腸、横行結腸、下行結腸、およびＳ字結腸、ならびに直腸以外の身体の一部または体液に局在化される。
【００４９】
本明細書で使用される用語「転移性胃癌細胞」は、転移性を有する胃癌細胞を示すことを意味する。転移性胃癌細胞は、胃以外の身体の一部に局在化される。
【００５０】
本明細書で使用される用語「転移性食道癌細胞」は、転移性を有する食道癌細胞を示すことを意味する。転移性食道癌細胞は、食道以外の身体の一部に局在化される。
【００５１】
本明細書で使用される用語「転移性膵癌細胞」は、転移性を有する膵癌細胞を示すことを意味する。転移性膵癌細胞は、膵臓以外の身体の一部に局在化される。
【００５２】
本明細書で使用される用語「非腸／直腸」および「腸／結腸直腸外」は、本明細書中で交換可能に使用され、腸（小腸および結腸）および直腸組織以外の供給源に由来する組織または体液の試料を示すことを意味する。一部の好ましい実施形態では、腸／結腸直腸外試料は、リンパ節などの組織の試料である。一部の好ましい実施形態では、非腸／直腸試料は、腸／結腸直腸外組織の試料であり、それは未確認起源（ｕｎｃｏｎｆｉｒｍｅｄ  ｏｒｉｇｉｎ）の腺癌である。一部の好ましい実施形態では、非腸／直腸組織は、疑わしい胃癌、膵癌または食道癌の生検である。一部の好ましい実施形態では、非腸／直腸試料は、血液試料である。
【００５３】
本明細書で使用される「未確認起源の腺癌または原発不明癌（ＣＵＰ）を患う個体」は、起源が確実に同定されていない腫瘍を有する個体を示すことを意味する。
【００５４】
本明細書で使用される用語「対象」および「患者」は、任意の動物、例えば家畜のような哺乳動物、ペット、および好ましくはヒトを示す。「対象」および「患者」の具体例は、限定はされないが、医学的支援を必要とする個体、および特に癌を有する患者を含む。
【００５５】
本明細書で使用される用語「標的」または「標的マーカー」または「バイオマーカー標的」は、真核細胞に由来しうる任意の分子を示す。標的は、限定はされないが、タンパク質または核酸分子を含む。本発明では、胃腸起源の細胞内で特異的に発現されるメッセンジャーＲＮＡのレベルが測定される。あるいは、組織特異的タンパク質またはＤＮＡ改変（例えば、メチル化または突然変異）とは、同等の標的でありうる。本発明の好ましい実施形態では、ｍＲＮＡなどの単一の標的が個別に検出される。本発明の他の実施形態では、複数の標的が併せて検出される。
【００５６】
本明細書で使用される用語「参照遺伝子」または「参照マーカー」または「参照標的」または「対照」または「対照マーカー」または「対照標的」は、潜在的なプロセス干渉因子に対して制御し、かつ／または制御するために使用可能であり、かつ／または試料の質、有効な試料調製および／もしくは試料中でのＲＴ−ＰＣＲ反応の集合についての１つ以上の兆候を提供する参照分子を示す。対照は、標的と同時検出されるかまたは別々に検出される場合がある。
【００５７】
本明細書で使用される用語「試料」は、細胞を含有する生物学的材料または患者から採取される他の材料を示す。試料材料は、限定はされないが、リンパ節組織などの組織；生検材料；呼気；または（血清または血漿を含む）血液などの液体；尿；精液；喀痰、唾液；およびこれらの組み合わせを含む。本発明の方法を実行するため、試料は、処理される（例えばリンパ節は、他の組織から分離され、および／または複数の切片もしくはコアに切断され、化学反応に暴露され（または暴露されない）、分離プロセスが施されるか、あるいは血液が循環腫瘍細胞内に満たされる）。各プロセスは、残存する試料（以降、「残存試料」または単に「試料」と称される）の一部をもたらしうる。試料の一部は、無作為に、または所定のスキームもしくは数式の決定に応じ、サイジング可能である。試料は、単一の組織試料、例えば単一リンパ節として規定されうるか、または試料は、複数の試料、例えば複数のリンパ節もしくはリンパ節鎖を規定しうる。本発明の好ましい実施形態では、単一リンパ節などの単一の試料は、個別に処理される。本発明の他の実施形態では、複数の試料は、共に「プールされる」かまたは処理される。別の好ましい実施形態では、試料は、少なくとも１つの全リンパ節を含む。
【００５８】
本明細書で使用される用語「外部標準」は、試験試料とは別々に試験される、既知の量または濃度での合成ＤＮＡまたはＲＮＡ転写産物（すなわち標準曲線に対する内挿または外挿によるもの）を意味する。
【００５９】
本明細書で使用される用語「パラメータ」（「プロセスパラメータ」としても知られる）は、１つ以上の標的を検出するための、本発明の方法およびシステムにおいて使用される１つ以上の変数を含む。パラメータは、限定はされないが、プライマータイプ；プローブタイプ；アンプリコンタイプ；物質の濃度；物質の質量もしくは重量；プロセスにおける時間；プロセスにおける温度；サイクル閾値（Ｃｔ）；遠心分離、回転、振とう、切断、粉砕、液化、沈殿、溶解、電気的変更、化学的変更、機械的変更、加熱、冷却、保護（例えば、数日間、数週間、数か月間およびさらに数年間）および静止（未撹拌）状態での維持などのプロセスの間での活性を含む。パラメータは、本発明の方法において用いられる１つ以上の数式における変数をさらに含んでもよい。パラメータは、本発明の方法の後続するステップにおける、１つ以上のパラメータの値を決定するために用いられる閾値を含んでもよい。好ましい実施形態では、閾値は、サイクルカウント閾値である。
【００６０】
本明細書で使用される用語「サイクル閾値」（Ｃｔ）は、反応中に発生する蛍光が確立された閾値またはカットオフレベルを十分に超える、ｑＰＣＲにおける閾値を示す。サイクル閾値は、製品差別化の理由で、リアルタイムＰＣＲ機器の競合する製造業者によって使用される用語「交差点（ｃｒｏｓｓｉｎｇ  ｐｏｉｎｔ）」（Ｃｐ）および「離散点（ｔａｋｅ−ｏｆｆ  ｐｏｉｎｔ）（ＴＯＰ）と同じ値を示す。標準化の目的で、ＭＩＱＥ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ（Ｂｕｓｔｉｎら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５５：４、６１１−６２２頁（２００９年））では、用語「定量サイクル」（Ｃｑ）の使用がすべての代替案よりも好ましいことが提起されている。
【００６１】
用語「ハイブリダイゼーション」は、二本鎖構造を形成する、試料ＤＮＡ中でのワトソン−クリック塩基対合の線沿いの相補的配列に対するオリゴヌクレオチドの結合として理解されるべきである。
【００６２】
本明細書で定義される「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、５×ＳＳＣ／５×デンハルト溶液／１．０％ＳＤＳ中、６８℃でのハイブリダイズと、０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、室温での洗浄とを含むか、あるいは当業者に既知のそれと等価な条件（例えば、ハイブリダイゼーションが２．５×ＳＳＣ緩衝液中、６０℃で行われ、その後、低い緩衝液濃度、３７℃での数回の洗浄ステップが実施され、安定に維持される場合の条件）を含む。本明細書で定義される中等度のストリンジェントな条件は、例えば３×ＳＳＣ、４２℃での洗浄、または当業者に既知のそれと等価な条件を含む。塩濃度および温度のパラメータは、プローブと標的核酸との間の同一性の最適なレベルを得るために、変更されうる。かかる条件に関する指針は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．；およびＡｕｓｕｂｅｌら（編）、１９９５年、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．）、Ｕｎｉｔ  ２．１０により、当該技術分野で利用可能である。
【００６３】
本明細書で使用される表現「臨床評価」は、癌患者のスクリーニング、診断、病期分類、予後、処置計画、モニタリングおよび監視のために使用される潜在的範囲または連続値もしくは離散値を含むことを意味する。
【００６４】
本明細書で使用される表現「臨床転帰」または「転帰」は、Ｐｕｎｔ  Ｃ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．（２００７年）９９（１３）：９９８−１００３頁の推奨に従い、無疾患生存（ＤＦＳ）、無再発生存（ＲＦＳ）、時間対再発（ＴＲ）、癌特異的生存（ＣＳＳ）または全生存（ＯＳ）などの異なるエンドポイントの観点で表現されることを意味する。
【００６５】
本明細書で使用される「時間対再発」（ＴＲ）は、同じ癌についての任意のイベントに対する時間として定義される。すべての同じ癌の再発および同じ癌による死亡がイベントである。同じ二次原発性癌および他の原発性癌は無視される。他の癌による死亡、非癌関連死、処置関連死、および追跡不能（ｌｏｓｓ  ｔｏ  ｆｏｌｌｏｗ−ｕｐ）は、打ち切られた観測値である。
【００６６】
本明細書で使用される表現「無再発生存（Ｒｅｌａｐｓｅ−Ｆｒｅｅ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ）」または「無再発生存（Ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ−Ｆｒｅｅ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ）」（ＲＦＳ）は、任意のイベントに対する時間として定義され、これは任意の二次原発性癌を除き、このイベントの原因とは無関係である。同じ癌の再発もしくはそれによる死亡およびすべての処置関連死または他の原因による死亡がイベントである。同じ癌からの二次原発性および他の原発性癌は無視され、追跡不能は打ち切られる。
【００６７】
本明細書で使用される「癌特異的生存」（ＣＳＳ）は、死亡が原発性腫瘍または同じ二次原発性癌によって引き起こされるか否かに無関係に、同じ癌によって引き起こされる死亡に対する時間として定義される。局所再発、遠隔転移、同じ二次原発性癌、および他の二次原発性癌は無視される。他の癌による死亡、非癌関連死、処置関連死、および追跡不能は打ち切られる。
【００６８】
本明細書で使用される表現「無疾患生存」（ＤＦＳ）は、任意のイベントに対する時間として定義され、それはこのイベントの原因とは無関係である。打ち切られる追跡不能以外のすべてのイベントが含められる。
【００６９】
本明細書で使用される「全生存」（ＯＳ）は、死亡が癌に起因するか否かといった原因とは無関係に、死亡に対する時間として定義される。局所再発、遠隔転移、二次原発性結腸直腸癌、および他の二次原発性癌は無視される。追跡不能は打ち切られる。
【００７０】
本明細書で使用される癌の「病期分類」または「ステージ」は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｉｎｔ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ（ＡＪＣＣ）（Ｇｒｅｅｎｅら、（編）、「ＡＪＣＣ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔａｇｉｎｇ  Ｍａｎｕａｌ」、第６版、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ；２００２年）からのＴＮＭ（腫瘍／リンパ節／転移に対応）システムを示し、それは局所浸潤の程度、リンパ節関与度、および遠隔転移があるか否かに依存する。病期分類は、手術が行われ、病理報告がレビューされた後になされる。ＴＮＭシステムでは、「Ｔ」は腸壁の浸潤度、「Ｎ」はリンパ節関与度、また「Ｍ」は転移の程度を示す。癌のより広義のステージは通常、予後によって分類されたＴＮＭ値から導かれる数字Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶとして引用され、数字が大きくなると、癌がより進行し、転帰悪化の可能性が高いことを示す。結腸直腸癌におけるこのシステムの詳細は、以下の通りである。
【００７１】
【表１】
2012518389.tif 000003
【００７２】
ステージはまた、上の表中に示されるように、デュークスおよびアストラー−コラー病期分類システム（異なるＡＪＣＣステージ分類を組み合わせることが多く、正確なものではない）に従い、数字ではなく文字で報告することが可能である。
【００７３】
本明細書で使用される結腸癌における生存率は、１９９１年から２０００年の間に結腸癌であると診断された約１２０，０００名を調査対象とする、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｍｃｅｒ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＳＥＥＲデータベースに関する試験から得られる。この試験では、ステージＩＩＢよりもステージＩＩＩＡにおいて生存率が改善された。
【００７４】
【表２】
2012518389.tif 000004
【００７５】
本明細書で使用される用語「リンパ節関与」は、組織病理学的手順を通じて視覚的に判定される、リンパ節における転移の存在についての定性的概念を示す。リンパ節関与を全く有しない患者は、「Ｎ０」またはｐＮ０と称される。転移が１〜３つのリンパ節において検出される場合、リンパ節関与は「Ｎ１」または「ｐＮ１」と称される。「Ｎ２」または「ｐＮ２」は、４つ以上の局所リンパ節におけるリンパ節関与、または転移の存在を示すために用いられる。リンパ節関与は、患者がアジュバント化学療法を受けるべきか否かを判定するために臨床医によって用いられる基準である。
【００７６】
本明細書で使用される用語「ＧＣＣリンパ節関与」は、各リンパ節中でのグアニリルシクラーゼＣ（ＧＣＣもしくはＧＵＣＹ２Ｃ）ｍＲＮＡの存在または不在についての定性的概念を示し、それは、不顕性転移、すなわち組織病理学的に検出できない転移または一群の癌細胞を含むリンパ節転移の存在または不在を示唆する。リンパ節がＧＣＣ発現細胞によって浸潤される、すなわち検出可能な量のＧＣＣ  ｍＲＮＡを示す場合、それは「リンパ節陽性」と称される。ＧＣＣが全く検出できない場合、リンパ節は「陰性」である。少なくとも１つのＧＣＣ陽性リンパ節を有する患者が「ＧＣＣ陽性」と称される一方、ＧＣＣ陽性リンパ節を全く有しない患者または症例は「ＧＣＣ陰性」と称される。
【００７７】
本明細書で使用される用語「ＧＣＣ負荷（ＧＣＣ  ｂｕｒｄｅｎ）」または「ＧＣＣ負荷（ＧＣＣ  ｌｏａｄ）」は、特定のリンパ節中で見出されるＧＣＣ発現細胞の量の定量、あるいは患者のリンパ節群中でのＧＣＣ  ｍＲＮＡの総量を示す。ＧＣＣ負荷は、所与のリンパ節または集合的にすべてのリンパ節におけるＧＣＣ  ｍＲＮＡの検出可能な量が所与のレベルに満たない場合、有意でないかまたは臨床的に有意でない。しかし、所与のリンパ節または患者のリンパ節の群もしくはそのすべてにおいて検出されるＧＣＣ  ｍＲＮＡの量が所与のレベルを超える場合、ＧＣＣ負荷は、有意であるかまたは臨床的に有意であり、また再発のリスクが低い方の患者とリスクが高い方の患者とを区別するために使用されうる。所与のリンパ節中またはリンパ節群中でのＧＣＣ  ｍＲＮＡのレベルは、多数の方法で、例えばコピーまたはコピー／リンパ節質量（絶対定量）を単位として、またはデルタＣｔ（ΔＣｔ）、デルタ−デルタＣｔ（ΔΔＣｔ）、もしくは倍率変化（２−ΔΔＣｔ）（２ｅｘｐ（Δ−ΔＣｔ））を単位として表すことが可能であり、これら最後の３つのパラメータは、参照遺伝子、例えば限定はされないが同じリンパ節中のＧＵＳＢの発現レベルに対するＧＣＣの発現レベル（相対定量）に基づく。
【００７８】
本明細書で使用される用語「リンパ節比」または「ＬＮＲ」は、所与の患者に対して試験される測定可能なリンパ節の総数に対するＧＣＣ陽性リンパ節の数を示す。
【００７９】
特定の実施形態の説明
特に、本発明は、本明細書で規定される、より詳細には上で規定される方法から選択される方法を提供し、ここで１つ以上の参照遺伝子は通常、腸／結腸直腸外試料の正常細胞内で発現される。特に、参照遺伝子は、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）である。より詳細には、発現レベルの測定は、ＲＴ−ｑＰＣＲを用いて行われる。
【００８０】
検出
一般的態様によると、患者から採取される試料中でのＧＣＣを検出する方法であって、次の連続的ステップ、すなわち、
・患者から試料を得るステップと、
・試料を均質化するステップと、
・試料から核酸を抽出するステップと、
・試料中のＧＣＣ  ｍＲＮＡを、例えばそのＣｔレベルを測定することによって検出するステップと、
・同じ試料中でのβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）ｍＲＮＡを、例えばそのＣｔレベルを測定することによって検出するステップと、
・ＣｔＧＵＳＢ−ＣｔＧＣＣ（Δ−Ｃｔ）の相対定量を決定するステップと、
を含み、ここで、所定の閾値を超えるΔ−Ｃｔは、試料中でのＧＣＣ陽性細胞の存在を示唆する、方法が提供される。
【００８１】
特定の態様によると、対象から採取された腸／結腸直腸外試料中でのＧＣＣを検出するための方法であって、
・前記試料中でのグアニリルシクラーゼＣ（ＧＣＣ）を検出するステップと、
・同じ前記試料中でのβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）を検出するステップと、
・ＧＵＳＢの量に対するＧＣＣの量を計算するステップと、
を含む、方法が提供される。
【００８２】
測定
特定の態様によると、試料中でのＧＣＣを測定するための方法であって、
・前記試料中でのＧＣＣ  ｍＲＮＡの発現レベルを測定するステップと、
・同じ前記試料中でのＧＵＳＢ  ｍＲＮＡの発現レベルを測定するステップと、
・数学的計算を用い、ＧＣＣ  ｍＲＮＡの発現レベルをＧＵＳＢの発現レベルに対して正規化し、相対的なＧＣＣ発現（ＧＵＳＢレベル−ＧＣＣレベル）または（ＧＣＣレベル−ＧＵＳＢレベル）を決定するステップと、
を含む、方法が提供される。
【００８３】
特定の態様によると、試料中でのＧＣＣを測定するための方法であって、
・試料中でのＧＣＣの発現レベルをＲＴ−ｑＰＣＲによって測定し、ＧＣＣにおけるサイクル閾値（ＣｔＧＣＣ）を決定するステップと、
・同じ試料中でのβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）をＲＴ−ｑＰＣＲによって測定し、ＧＵＳＢにおけるサイクル閾値（ＣｔＧＵＳＢ）を決定するステップと、
を含み、ここで、ＧＣＣの検出では、相対定量（Δ−Ｃｔ）を用い、試料中でのＧＣＣのｍＲＮＡレベルの変化を測定し、かつそれをβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）のｍＲＮＡレベルに対して表す（Δ−Ｃｔ＝ＣｔＧＵＳＢ−ＣｔＧＣＣ）、方法が提供される。
【００８４】
特に、上で規定される方法では、倍率変化（Δ−Δ−Ｃｔ）の表現を用い、前記試料中でのＧＣＣのｍＲＮＡレベルの変化を判定し、またそれを同じ試料中でのβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）のｍＲＮＡレベルに対して表す。
【００８５】
さらに詳細には、癌であると診断された患者のＧＣＣ負荷を測定する方法であって、本明細書で規定された方法のステップを含み、ここで、Δ−Ｃｔが約−１２に等しいかもしくはそれより大きい場合、ＧＣＣ  ｍＲＮＡの量は、外部標準に対するコピーの数を単位として計算され、それにより、ＧＣＣ負荷は試料中でのＧＣＣコピーの数で表現される、方法が提供される。
【００８６】
診断
特に、癌を有すると疑われる患者における癌を診断する方法であって、本発明の方法に従い、前記患者の腸／結腸直腸外試料中でのＧＣＣを定量するステップと、前記試料がＧＣＣ陽性細胞を有するか否かを判定するステップと、を含み、ここで、ＧＣＣ陽性細胞の存在は、結腸直腸癌、胃癌、小腸癌、食道癌または膵癌を示唆する、方法が提供される。
【００８７】
病期分類
さらに、特に、既に癌であると診断されたヒト患者を病期分類する方法であって、
ａ）本発明の方法に従い、ＧＣＣを検出または測定するステップと、
ｂ）ステップａ）の結果に基づき、疾患のステージを決定するステップと、
を含む、方法が提供される。
【００８８】
モニタリング
さらに、特に、既に癌であると診断されたヒトにおける転移をモニタリングまたは診断する方法であって、
・前記試料中でのＧＣＣをＲＴ−ｑＰＣＲによって測定し、前記患者由来の腸／結腸直腸外試料中でのＧＣＣにおけるサイクル閾値（ＣｔＧＣＣ））を決定するステップと、
・前記試料中でのβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）をＲＴ−ｑＰＣＲによって測定し、前記試料中でのＧＵＳＢにおけるサイクル閾値（ＣｔＧＵＳＢ）を決定するステップと、
・ＣｔＧＵＳＢ−ＣｔＧＣＣ（Δ−Ｃｔ）の相対定量を決定するステップと、
を含み、ここで約−１２を超えるΔ−Ｃｔは、試料中にＧＣＣ陽性細胞が存在することを示唆し、ここでＧＣＣ陽性細胞の存在は、転移性結腸直腸癌、胃癌、小腸癌、膵癌または食道癌を示唆する、方法が提供される。
【００８９】
処置から恩恵を受けうる癌患者の選択
さらに、特に、組織病理学的に陰性のリンパ節を有する癌患者の中から連続処置から恩恵を受けうる癌患者を選択するための方法であって、
・本発明の方法に記載のステップを実施するステップと、
・連続処置を処方するステップと、
を含み、それにより、少なくとも１つのリンパ節中にＧＣＣ陽性細胞を有する癌患者は、組織病理学によると、より高いリスクがあると考えられる患者の場合に対して、再発および生存率に関するリスクを有し、それにより、これらの患者は、アジュバント化学療法による処置から恩恵を受けうることが示され、それにより、ＧＣＣ陰性のリンパ節を有する癌患者は、疾患再発のリスクが低下し、前記処置を回避することができる、方法が提供される。
【００９０】
再発のリスクの予測
特に、既に癌であると診断された患者における癌再発のリスクを予測する方法であって、本発明の方法に記載のステップを実施するステップを含み、ここで、−６〜−３の間のΔ−Δ−Ｃｔは、試料中でのＧＣＣ陽性細胞の存在を示唆し、ここでＧＣＣ陽性細胞の存在は、患者の癌の再発リスクが増大していることを示唆する、方法も提供される。
【００９１】
腫瘍負荷の決定
癌であると診断された患者のＧＣＣ負荷を決定する方法であって、本明細書で規定される方法のステップを実施するステップを含み、ここで、Δ−Ｃｔが約−１２に等しいかもしくはそれより大きい場合、ＧＣＣ  ｍＲＮＡの量は、外部標準に対して、コピーの数を単位として計算され、それにより、ＧＣＣ負荷は、試料中でのＧＣＣコピーの数で表される、方法がさらに提供される。
【００９２】
閾値およびカットオフ
特に、ＧＣＣ陽性細胞の陽性同定における閾値またはカットオフは、約−１２を超えるΔ−Ｃｔである。より詳細には、ＧＣＣ陽性細胞の陽性同定における閾値は、約−１０を超えるΔ−Ｃｔである。より詳細には、ＧＣＣ陽性細胞の陽性同定における閾値は、約−８を超えるΔ−Ｃｔである。さらにより詳細には、ＧＣＣ陽性細胞の陽性同定における閾値は、約−６を超えるΔ−Ｃｔである。さらにより詳細には、ＧＣＣ陽性細胞の陽性同定における閾値は、約−４を超えるΔ−Ｃｔである。最も詳細には、ＧＣＣ陽性細胞の陽性同定における閾値は、−２を超えるΔ−Ｃｔである。
【００９３】
特に、本明細書で規定される方法は、標的を検出するかまたは少なくとも２つの標的（ＧＣＣおよびＧＵＳＢ）の検出に基づいて分析を行うために使用される１つ以上の分析またはアルゴリズムを含みうる。かかる分析またはアルゴリズムは、バイアス、例えば偽陽性または偽陰性のバイアスを含みうる。例えば、分析またはアルゴリズムでは、年齢、人種、現在の患者の症状、アジュバント処置の使用、遺伝などの疾患要因または臨床学的因子の組み合わせを考慮に入れる場合がある。
【００９４】
より詳細には、本方法は、ＧＵＳＢに加えて検出され、測定される複数の参照遺伝子などの、手順のステップを実施するために使用されるか、または手順のアルゴリズムによって使用される複数のパラメータの導入を含みうる。
【００９５】
癌および患者
本発明が、多種多様なステージ、悪性度、疾患のレベル、症候性もしくは無症候性、または他の悪条件の癌、特にＧＩ管癌を有する患者由来の試料の場合での実施に適用可能であることは理解されるべきである。特定の実施形態では、患者は、上部もしくは下部ＧＩ管に由来するＧＩ管癌を有する。より詳細には、癌は、結腸直腸癌、小腸癌、胃癌、膵癌、または食道癌から選択してもよい。
【００９６】
特に、患者は、ステージＩまたはステージＩＩの癌を有する。より詳細には、癌は、結腸直腸癌である。
【００９７】
本願を通して、患者は、結腸直腸癌患者などの癌患者と称してもよい。この用語は、癌の存在が現在または過去に確認されている患者と、何らかの原因で癌を有すると疑われうるかまたは別な面では本発明の癌診断試験を受ける可能性がある患者を含むものとする。標的の陽性検出は、癌の存在；癌の特定の予後または診断；または他の臨床評価または勧告と相関する場合がある。
【００９８】
試料
本発明の方法が、限定はされないが組織または体液を含む腸／結腸直腸外試料などの極めて多数の形態の試料に対して実施可能であることは理解されるべきである。特に、試料は、通常、ＧＣＣを発現しない器官から採取される。特に、試料は、保護されているかまたはそれ以外では保管されている組織であってもよい。試料は、単一の患者から、特に切除術の間に採取された１つ以上のリンパ節であってもよい。より詳細には、リンパ節は、結腸直腸、食道、胃または膵臓切除の間に採取される。
【００９９】
現在、リンパ節の組織病理学的評価は、典型的には１〜３つのヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）スライドを使用して実施される。サンプリング上の問題、目視検査の欠陥、人為的エラーおよび他の複雑性に起因し、転移性細胞を「欠損させる（ｍｉｓｓｉｎｇ）」という実証された高いリスクが認められる。本発明の方法は、これらの問題を回避し、および／または低減し、また、限定はされないが、転移；微小転移；不顕性転移；単離腫瘍細胞；腫瘍細胞群およびこれらの組み合わせの存在を含む、極めて多数の患者の増悪状態を示唆する１つ以上の標的の検出が可能である。本発明の分子評価は、高い精度、感度および再現性で実施可能である、より系統的で再現可能な自動化可能な試験を提供する。
【０１００】
試料は、特に、保管されたリンパ節（例えば、１つ以上のリンパ節を含むホルマリン固定包埋試料）であるが、新鮮または凍結組織であってもよい。試料は、次の解剖学的部位／器官、すなわち、乳房、前立腺、胃、食道、膵臓、腎臓、脾臓、頸部、膣、卵巣、膀胱、甲状腺、結腸、直腸、小腸、脳、皮膚、肝臓および肺のうちの１つ以上に由来する組織を含みうる。
【０１０１】
別の特定の実施形態では、試料は、併せて「プール」または処理される複数のリンパ節を含む。検出されるコピーの数は、限定はされないが癌ステージまたは治療転帰を含む、患者の症状の特定の評価に相関する。
【０１０２】
本願の大部分において、結腸周囲（ｐｅｒｉｃｏｌｏｎｉｃ）リンパ節を含む試料に関する記載がなされているが、それ以外にまたはそれに加え、他のリンパ節、他の組織および他の試料を、本明細書に記載の方法によって処理してもよい。
【０１０３】
本発明の方法は、未知の起源の癌である試料の分析を提供しうる。特定の実施形態では、脳、肺または肝腫瘍などの癌試料は、処理され、ＧＣＣが検出され、癌の起源が、結腸または直腸または胃、食道、小腸または膵臓（加えて、例えば、肺、肝臓、脳または他の位置）であることが判定される。
【０１０４】
本発明の方法は、１つ以上の分子試験、例えば患者の結腸の一部を除去する外科手術中に採取されるリンパ節中でのＧＣＣについての試験から結果をもたらす。特定の実施形態では、リンパ節または他の組織はまた、組織学的に分析され、分子試験および組織学的試験の双方の結果は組み合わされ、その後の評価が行われる。
【０１０５】
特定の実施形態では、ＧＣＣコピーの数は、組織学的分析において癌として同定される細胞の数と相関する。同相関は、第１の患者、または第１の患者集団に対してなされうる。その後、検出されるコピーの数は、分子試験を介して測定され、組織学的試験の場合に同定されることになる、予測される細胞数と相関しうる。この予測される数は、細胞における組織学的試験と組み合わされるか否かにかかわらず、限定はされないが癌ステージまたは治療転帰を含む患者の症状のより詳細な評価をもたらすために使用される。
【０１０６】
特に、試料は、他の体内組織、または呼気、血液、尿、痰、唾液および／もしくは精液などの体液を含んでもよい。特に、試料は血液である。
【０１０７】
特定の実施形態では、組織の交差汚染、例えば患者から受け取られる組織試料（例えば２つのリンパ節）間の汚染、または第１の患者と第２の患者の間の汚染を回避するため、各ステップを通じて注意が払われる。別の特定の実施形態では、試料は、病院などの臨床の場（ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｅｔｔｉｎｇ）において患者から採取され、１つ以上のさらなる処理ステップが、そこでかまたはさらなる臨床の場でも実施される。次いで、試料は、さらなる処理のため、臨床検査室または医学研究所、例えばＣＬＩＡ研究所に移される。さらなる処理の結果は、（例えば患者の臨床医によって）研究所および／または臨床の場で分析してもよい。特定の実施形態では、試料は、結腸直腸切除術において採取された複数の患者のリンパ節からなり、それは典型的にはセンチネルリンパ節を含む、１２のリンパ節か、場合によって１〜最大で１００もしくはそれ以上からなる。
【０１０８】
本発明の方法の様々なステップでは、試料は、処理される（例えば、他の組織から分離されたリンパ節および／または複数の切片もしくはコアにおいてメスで切断されたリンパ節など、物理的に分離される；脱パラフィン化および／または沈降法などの物理化学的反応に暴露される；遠心分離での分離などの分離プロセスに暴露される；洗浄手順に暴露されるなど）。各プロセスは、残存する試料（以降、「残存試料」または単に「試料」と称される）の一部をもたらしうる。試料の一部は、無作為に、または所定のスキームもしくは数式の判定に従い、サイジング可能である。試料は、単一の組織試料、例えば単一リンパ節として規定されうるか、または試料は、複数の試料、例えば複数のリンパ節を規定しうる。本発明の好ましい実施形態では、単一リンパ節などの単一の試料は、個別に処理される。本発明の他の実施形態では、複数の試料は、併せて処理される。別の好ましい実施形態では、試料は、少なくとも１つの全リンパ節を含み、例えば標的を含まないリンパ節の第１の部分（ここで第２の部分は標的を確かに含む）の試験を回避する。試料は、保護され（「保管試料」）、例えば経時的分解が阻止されうる。保護方法は、限定はされないが、凍結などの冷蔵；組織保護溶液の仕様；脱水；およびこれらの組み合わせを含む。特定の組織保護溶液は、限定はされないが、ホルマリン（ホルムアルデヒドの緩衝または非緩衝水溶液）；ブアン固定液（ピクリン酸とホルムアルデヒドの混合物からなる）；ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｆｉｘ、ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ、ＲＮＡＲｅｔａｉｎ（商標）溶液；ＲＮＡＬａｔｅｒ（商標）溶液；非水溶液（例えば米国特許第７，１３８，２２６号明細書中に記載）；およびこれらの組み合わせなどの市販品を含む。パラフィン埋め込みおよび／または他の類似の材料埋め込みは、組織固定後に行っても行わなくてもよいが、それは、例えば、スライド切片などの切片の作成を援助し、輸送および非有害な保管を容易にする。
【０１０９】
特に、本発明の方法については、腸／結腸直腸外試料は、リンパ節または血液である。特に、腸／結腸直腸外試料は、リンパ節、より詳細には、１つの単一リンパ節、最も詳細には２つ以上のリンパ節、さらに最も詳細には少なくとも４つのリンパ節、およびさらに最も詳細には少なくとも１２のリンパ節である。
【０１１０】
特に、本発明の方法については、陽性結果が同じ患者の１〜３つのリンパ節中で見出される場合、ＧＣＣ／ＧＵＳＢ試験による、この患者における再発の相対リスクは中等度である。より詳細には、陽性結果が同じ患者の４つ以上のリンパ節中で見出される場合、ＧＣＣ／ＧＵＳＢ試験による、この患者における再発の相対リスクは高い。さらにより詳細には、本方法は、組織病理学的に陰性のリンパ節を有する癌患者の間で区別することが可能であり、ここで、少なくとも１つのリンパ節中にＧＣＣ陽性細胞を有する癌患者は、組織病理学的により高いリスクがあると見なされた患者の場合に匹敵する再発および生存率に関するリスクを有し、それによると、これらの患者はアジュバント化学療法による処置から恩恵を受けうることが示唆される。それに対し、すべてのリンパ節がＧＣＣ陰性である癌患者は、疾患再発のリスクが低下し、アジュバント化学療法による処置の負の副作用を回避しうる。最も詳細には、ＧＣＣ陽性細胞の存在は、予後不良を示唆する。
【０１１１】
特に、本発明の方法については、検出されるＧＣＣの量は、各個別のリンパ節について計算される。より詳細には、ＧＣＣの量は、患者のすべてのリンパ節中でのＧＣＣの各量の合計である。
【０１１２】
特に、本発明の方法については、ＧＣＣ負荷は、各個別のリンパ節について計算される。より詳細には、ＧＣＣ負荷は、患者のすべてのリンパ節中でのＧＣＣの総量に基づいて決定される。さらにより詳細には、ＧＣＣ負荷は決定され、所与のＧＣＣコピーの数を超えるＧＣＣ負荷は、癌再発の可能性の増大を示唆する。
【０１１３】
ＰＣＲ法
本発明の一態様によると、ＧＣＣ  ＲＴ−ｑＰＣＲ試験を用い、結腸癌、直腸癌、食道癌、小腸癌、膵癌、または胃癌患者から得られるリンパ節、組織または体液中でのＧＣＣの存在が検出され、検出は患者の癌に対する１つ以上の臨床評価と相関がある。
【０１１４】
特定の実施形態では、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）リンパ節は処理され、ＲＴ−ｑＰＣＲアッセイを用い、ＧＣＣが定量的に検出される。処理は、リンパ節組織の均質化と、その後の核酸（例えばＲＮＡ）抽出とを含む。ＲＴ−ｑＰＣＲアッセイでは、非特異的（例えば、ＳＹＢＲグリーン）または特異的（例えば、Ｓｃｏｒｐｉｏｎｓ（商標）、分子ビーコン、固定化核酸（ＬＮＡ）蛍光プローブ、Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒ、またはＴａｑｍａｎ）検出化学物質を使用する場合がある。
【０１１５】
特定の実施形態では、ＧＣＣは、参照もしくは対照遺伝子としてのβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）の平均発現について定量される。他の実施形態では、ＰＣＲ効率補正が用いられる。特定の実施形態では、アッセイは、参照遺伝子としてのＧＣＣおよびＧＵＳＢを検出する二重アッセイである。他の実施形態では、ＧＣＣおよびＧＵＳＢは、一重アッセイから検出される。他の実施形態では、アッセイは、ＧＣＣ、ＧＵＳＢおよび別の参照マーカー、例えば、ＧＡＰＤＨ、ＨＰＲＴ１、ＰＧＫ１およびＴＢＰおよび／またはスパイクされた内部対照を検出する三重アッセイである。参照遺伝子として使用可能な内因性遺伝子の具体例は、配列番号２〜１６に関連するものであり、表１に列挙される。固定（例えばホルマリン固定）およびリンパ節の支持培地中への埋め込みによって分解が引き起こされるにもかかわらず、高い精度および／または感度および／または再現性が得られる。典型的な支持材料は、パラフィンろうである。しかし、他の材料、例えば特定の不活性プラスチックもしくはエポキシ、または試料との反応性が欠如した他の支持材料を使用してもよい。
【０１１６】
【表３】
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【０１１７】
ＰＣＲ法、およびより詳細にはＲＴ−ｑＰＣＲは好ましいが、ローリングサークル増幅法（ＲＣＡ）、分岐鎖ＤＮＡ増幅（ＢＣＡ）、リガーゼ連鎖反応法（ＬＣＲ）、鎖置換増幅法（ＳＤＡ）、核酸配列に基づく増幅法（ＮＡＳＢＡ）、転写介在増幅法（ＴＭＡ）など、他の同様に信頼でき、感度がよく、特異的な増幅および検出方法もまた使用してもよい。検出技術は、核酸増幅に準じるかまたは準じない場合もあるが、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析、キャピラリー電気泳動、および同様の検出方法を含んでもよい。
【０１１８】
逆転写酵素プライマー
別の実施形態では、ＧＣＣは、参照もしくは対照遺伝子としてのＧＵＳＢの平均発現について定量される。本発明の別の態様によると、ＧＣＣおよびＧＵＳＢに対するプライマーは、ＲＴプライマーであり、各マーカーの検出をそれだけでまた他のマーカーとの関連で最適化するため、同じアッセイにおいて所定の比で加えられる。特に、１．２５μｇの量の抽出全ＲＮＡを含むアッセイでは、ＧＣＣ用のＲＴプライマーが、ＮＭ＿００４９６３（配列番号１）に対してハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドから選択され、約１０μＭ〜３０μＭの量でアッセイに加えられる。より詳細には、ＧＵＳＢ用のプライマーは、ＮＭ＿０００１８１（配列番号２）に対してハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドから選択され、約１μＭ〜３μＭの量でアッセイに加えられる。特に、かかるプライマーは、ＧＣＣまたはＧＵＳＢコード領域上の位置に対してハイブリダイズ可能であり、好ましくはかかるプライマーは、２つのエクソンに及んでいる。より詳細には、かかるプライマーは、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を有しない。
【０１１９】
特に、本方法にとって有用なプライマーおよびプローブは、配列番号１７〜４３に対して９０％の同一性を有するポリヌクレオチドを含む。より詳細には、配列番号：１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２６、２９、３０、３２、３３、３５、３６、３８、３９、４１および４２に対して９０％の同一性を有するポリヌクレオチドを含むプライマーは、本方法にとって有用でありうる。本発明のポリヌクレオチドプライマーおよびプローブの具体例は、配列番号１７〜４３として示され、表２に列挙される。より詳細には、配列番号：２０、２１、２２、３８、３９および４０のプライマーおよびプローブは、本方法にとって有用である。
【０１２０】
【表４】
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【０１２１】
【表５】
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【０１２２】
特に、ＧＣＣ用のＲＴプライマーは、約１０〜２０μＭで存在し、ＧＵＳＢ用のプライマーは、約１〜４μＭでアッセイに加えられる。
【０１２３】
より詳細には、ＧＣＣ：ＧＵＳＢ用のＲＴプライマーは、アッセイにおいて約１０：１の比で存在する。
【０１２４】
プローブ
本発明の別の態様によると、ＧＣＣまたはＧＵＳＢに特異的なプローブは、ストリンジェントな条件下で、ＧＣＣの短いコード配列またはＧＵＳＢの短いコード配列に対してハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドからなる群から選択される。これらのプローブの具体例が、表２に列挙される。
【０１２５】
特に、ＧＣＣに特異的なプローブは、約２００ｎＭの量でアッセイに加えられる。
【０１２６】
特に、ＧＵＳＢに特異的なプローブは、約２００ｎＭの量でアッセイに加えられる。
【０１２７】
アンプリコン
本発明の別の態様によると、短いＧＣＣアンプリコン長および短いＧＵＳＢアンプリコン長を使用し、ＧＣＣ発現細胞が検出される。特定の実施形態では、本発明の試験は、試料中の１００ヌクレオチド未満のＲＮＡを分析する。別の特定の実施形態では、本発明の試験は、８０ヌクレオチド未満のＲＮＡを分析する。さらに別の特定の実施形態では、本発明の試験は、７０ヌクレオチド未満のＲＮＡを分析する。
【０１２８】
【表６】
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【０１２９】
検出
特定の実施形態によると、本方法は、試料中でのＧＣＣ遺伝子転写産物の検出を提供する。検出という用語は、特に、同定、探索（ｌｏｃａｔｉｎｇ）、陽性シグナルの取得、測定、または定量を示す。
【０１３０】
標的の陽性検出は、１つ以上の標的の検出を含んでもよい。標的の陽性検出は、閾値を超える標的の検出を必要とすることがある。陽性検出は、癌細胞を見出す直接的手段（例えば標的が癌細胞）、および／または癌の診断もしくは予後を提供する直接的手段であってもよい。あるいは、マーカーの陽性検出は、評価に対する代理（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ）、癌細胞を見出す手段の代理、および／または癌の診断もしくは予後を提供する代理手段に関連しうる。
【０１３１】
Δ−Ｃｔ
本発明は、患者から採取される試料中でのＧＣＣを検出するための方法を提供する。ＧＣＣの検出は、同じ試料中でのＧＵＳＢの定量に対するＧＣＣの定量を含み、それを用い、癌の存在などの悪い患者の症状の処置に対して診断し、病期分類し、予後診断し、モニタリングし、および／または管理することが可能である。
【０１３２】
本発明の方法は、標的を検出するかまたは少なくとも２つの標的（ＧＣＣおよびＧＵＳＢ）の検出に基づく分析を行うために使用される１つ以上の分析またはアルゴリズムを含む。ｑＰＣＲにおけるサイクル閾値（Ｃｔ）またはサイクル数は、反応中に発生する蛍光が確立された閾値またはカットオフレベルを超える閾値である。陽性および陰性シグナルは、確立されたカットオフレベル（閾値）を超えるものおよびそれを下回るものとしてそれぞれ定義される。カットオフレベルは、既知の条件下で、試料の２つの集団（一方は条件を有するドナー（陽性）から採取され、もう一方は条件を有しないドナー（陰性）から採取される）を試験することによって確立される。例えば、陽性試料の集団は、結腸直腸癌患者から採取され、組織病理学的にｐＮ１もしくはｐＮ２として同定されているリンパ節であってもよく、陰性試料の集団は、結腸直腸癌以外の症状、例えば乳癌、肺癌、胃腸炎症症状を有する患者から採取されるリンパ節であってもよく、あるいは、陽性試料の集団は、原発性腫瘍の切除後の５年間に疾患を再発している結腸直腸癌患者から採取され、組織病理学的にｐＮ１もしくはｐＮ２として同定されているリンパ節であってもよく、陰性試料の集団は、原発性腫瘍の切除後の５年間に疾患を再発していないかもしくはそれから死亡していない結腸直腸癌患者から採取され、組織病理学的にｐＮ０として同定されているリンパ節であってもよい。あるいは、陽性試料の集団は、原発性腫瘍の切除後の５年間に疾患を再発しているかもしくはそれから死亡している結腸直腸癌患者から採取された血液試料であってもよく、陰性試料の集団は、原発性腫瘍の切除後の５年間に疾患を再発していない結腸直腸癌患者から採取された血液試料であってもよい。
【０１３３】
分析またはアルゴリズムは、バイアス、例えば偽陽性または偽陰性のバイアスを有する場合がある。分析またはアルゴリズムは、例えば上で記載されている既存の患者の症状によって変更されうる。
【０１３４】
本発明の方法は、手順のステップを実施するのに使用されるか、または手順のアルゴリズムによって使用される複数のパラメータを含む。パラメータは、本発明の患者に由来しない様々なタイプの組織、例えば他のヒト、ブタおよびウシから採取されるリンパ節または他の組織の試験を通じて決定し、および／または変更してもよい。
【０１３５】
特に、本発明の方法については、−６に等しいかもしくはそれより大きいΔ−Ｃｔ（ＣｔＧＵＳＢ−ＣｔＧＣＣの場合）または＋６に等しいかもしくはそれより小さいΔ−Ｃｔ（ＣｔＧＣＣ−ＣｔＧＵＳＢの場合）は、試料中でのＧＣＣ陽性細胞の存在を示唆し、ここでＧＣＣ陽性細胞の存在は、患者の癌の再発リスクが増大していることを示唆する。より詳細には、−５．９に等しいかもしくはそれより大きいΔ−ＣｔはＧＣＣ陽性結果を示し、かつ−５．９より小さいΔ−ＣｔはＧＣＣ陰性結果を示し、ここで前記結果は、ＧＣＣ陰性およびＧＣＣ陽性結果の間での再発および無再発生存（ＲＦＳ）に関するリスクにおける区別を可能にする。
【０１３６】
特に、本発明の方法については、約−６に等しいかもしくはそれより大きいΔ−ＣｔはＧＣＣ陽性結果を示し、かつ約−６より小さいΔ−ＣｔはＧＣＣ陰性結果を示し、ここで結果は、ＧＣＣ陰性およびＧＣＣ陽性結果の間での再発および無再発生存（ＲＦＳ）に関するリスクにおける区別を可能にする。より詳細には、本発明の方法については、−５．９に等しいかもしくはそれより大きいΔ−ＣｔはＧＣＣ陽性結果を示し、かつ−５．９より小さいΔ−ＣｔはＧＣＣ陰性結果を示し、ここで結果は、ＧＣＣ陰性およびＧＣＣ陽性結果の間での再発および無再発生存（ＲＦＳ）に関するリスクにおける区別を可能にする。
【０１３７】
特に、約−６〜−３の間のΔ−Ｃｔに対して予め決定されたカットオフレベルは、ＧＣＣ陽性またはＧＣＣ陰性細胞の状態を判定するのに好適である。より詳細には、カットオフレベルは、−５．９、−５．５、−５．０；−４．５；−４．０；−３．５；および−３．０からなる群から選択される。
【０１３８】
キット
極めて多数のキット構成についても、本願の範囲内で検討されるべきである。キットは、本明細書中で詳述されるように、１つ以上の部品、支持体、バイアル、物質または試薬、ならびに使用説明書のブックレットを含んでもよい。
【０１３９】
特に、患者における癌の検出、診断、予後、モニタリングおよび／または病期分類のためのキットは、患者由来の腸／結腸直腸外試料中でのＧＣＣを検出するための試薬、同じ試料中でのＧＵＳＢを検出するための試薬、およびＧＵＳＢに対するＧＣＣをいかに定量するかについての使用説明書を含む。
【０１４０】
より詳細には、患者における癌の検出、診断、予後、モニタリングおよび／または病期分類のためのキットは、患者由来の腸／結腸直腸外試料中でのＧＣＣを検出するためのＰＣＲ試薬、ＧＣＣにおけるサイクル閾値（ＣｔＧＣＣ）をいかに決定するかについての使用説明書；同じ試料中でのＧＵＳＢを検出するためのＰＣＲ試薬、ＧＵＳＢにおけるサイクル閾値（ＣｔＧＵＳＢ）をいかに決定するかについての使用説明書、およびＣｔＧＣＣとＣｔＧＵＳＢの間での（Δ−Ｃｔ）または（Δ−Δ−Ｃｔ）をいかに計算するかについての使用説明書を含む。
【０１４１】
本方法および本明細書中に記載されるキットの極めて多数の他の構成が、本願の精神または範囲を逸脱しない限り、使用可能であることは理解されるべきである。上記の本方法の一部は、個別に固有の発明として考慮してもよい。本発明の他の実施形態は、本明細書で開示される本発明の仕様および実行を考慮すると、当業者には明らかであろう。本明細書および実施例が、以下の特許請求の範囲によって示される本発明の真の範囲および精神に加え、あくまで例示的なものとして考慮されることが意図されている。さらに、本願において方法または手順のステップが特定の順序で列挙されている場合、特定の状況下では、一部のステップが実施され、および／または１つ以上のステップを組み合わせる場合の順序を変更することは、可能であるか、またはさらに好都合でありえ、また、本明細書中の下で示される特許請求の範囲の方法または手順の特定のステップが、順序が固有のものとして、かかる順序の固有性が（例えば「連続的）なものとして）明示されない限り、解釈されないことが意図されている。
【０１４２】
情報の速度
認められるＧＣＣ／ＧＵＳＢ試験の興味深い特徴の１つが、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織試料により、情報の速度を高める可能性である。ＧＵＳＢにおける３５のカットオフＣｔ値を使用することで、ＧＣＣ／ＧＵＳＢ試験は、参照ＧＣＣ／ＡＣＴＢ試験の場合に得られる情報の速度を上回るとともに、不適切なＬＮは５つに過ぎず（それぞれ、１２６４／１２６９もしくは９９．６％、ＣＩ９５％  ９９．３〜１００対１２５３／１２６９もしくは９８．７％、ＣＩ９５％  ９８．１〜９９．４）、１１適切なＬＮは全部で１１得られた（表４）。２つの独立コホートからの１２６９のＦＦＰＥ  ＬＮ組織の場合に検出された情報の速度のこの増加は、我々の初期の観察結果を確認した。
【０１４３】
【表７】
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【０１４４】
ＡＣＴＢからＧＵＳＢへ参照遺伝子（ＲＧ）を変更する別の理由は、各ＬＮ中でのＧＣＣ  ｍＲＮＡのレベルを測定するため、相対定量を利用することであった。過去に、ＦＦＰＥブロック中でのより長い保管時間が、遺伝子発現の定量を損なわせる可能性があることを示していた。ＧＣＣがこれらの条件下でＡＣＴＢより影響を受けることが理由で、アッセイが小さい変動に対して反応しないことから、ＡＣＴＢを参照遺伝子として使用し、ＲＮＡ分解をモニタリングすることができなかった。ブロックの経年（核酸抽出による手術からの年数）は、部位ごとに分析された。Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＵＭａｓｓ）の患者コホート由来の試料は、Ｈｏｔｅｌ−Ｄｉｅｕ  ｄｅ  Ｑｕｅｂｅｃ（ＨＤＱ）の場合よりはるかに時間が経過していた（平均で１２年対６年）。ＡＣＴＢおよびＧＵＳＢ  Ｃｔ値の分布は、図２４Ａ中に示される。ＨＤＱと比較される場合、ＵＭａｓｓ症例において、ＧＵＳＢ  Ｃｔ値における有意な増加が認められ（ｐ＜０．０００１）（図２４Ｂ）、これはＧＵＳＢ  ｍＲＮＡの分解が時間に依存することを示唆する。最終的には、ＧＣＣの相対的発現が、参照遺伝子としてＧＵＳＢを用いて測定される場合、ＨＤＱおよびＵＭａｓｓからの陽性症例におけるＧＣＣの相対レベルの間に差異が全く認められなかった（平均Δ−Ｃｔ：−２．７対−３．０；ｐ値：０．５６８２）。逆に、Δ−Ｃｔが、ＧＣＣ／ＡＣＴＢアッセイにおいて１００コピーの外部標準を用いて計算される（ＣｔＳｔｄ１００−Ｃｔ試料）場合、ＵＭａｓｓ症例において、ＨＤＱ試料よりも、標本当たりのＧＣＣ  Δ−Ｃｔにおける大幅な増加が認められた（平均Δ−Ｃｔ：−４対−２）。しかし、この差異は、おそらくは試験される試料の数が不十分であることに起因し、統計的優位性（ｐ＝０．０７２）に達しなかった。
【実施例】
【０１４５】
臨床試料中での安定な内因性参照遺伝子の評価は、定量的リアルタイム逆転写−ＰＣＲを使用する、相対的な遺伝子発現の正確な正規化にとっての前提条件である。単一のいわゆる「ユニバーサル」参照遺伝子の使用は、ＧＣＣ遺伝子の発現の解釈を誤ることになりうる。ａ）ＦＰＥ  ＬＮ中のＡＣＴＢほど豊富に存在しない参照遺伝子を同定し、リンパ節のＧＣＣ状態による影響を受けない、安定な発現を確認する；ｂ）必要な場合、ＦＰＥ試料に適合したアンプリコンを伴うカスタムアッセイを開発する；かつｃ）５つの最も安定な遺伝子を選択し、二重アッセイをさらに開発することに着手した。
【０１４６】
１．新鮮凍結（ＦＦ）およびホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）を施した結腸周囲リンパ節中での推定上の参照遺伝子の評価
定量的リアルタイム逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）においては、参照遺伝子を使用する相対定量は、一般的なアプローチであるが、好適な参照遺伝子の決定には、まず検討中の組織内で評価されるべきである。「ユニバーサル」参照遺伝子の使用は、標的遺伝子の発現の解釈を誤ることになりうる。本試験の目的は、ＧＣＣリンパ節結腸癌病期分類試験において、正規化に適した５つの安定的に発現される参照遺伝子を同定することであった。異なる存在度および機能クラス（表３）を有する１５の参照遺伝子を、安定な発現について評価した。基本的に、好適な正規化遺伝子候補は、目的の組織内で安定的に発現され、かつバックグラウンドを超える発現レベルを有する必要がある。本発明のＧＣＣアッセイフォーマットにおいては、好適な正規化遺伝子は、ＧＣＣ陽性およびＧＣＣ陰性ＬＮの間で別個に発現されるべきではなく、ＡＣＴＢより高い４〜８サイクルの発現値（Ｃｔ）を有し、かつ９０〜１１０％のＰＣＲ効率を有する必要がある。
【０１４７】
参照遺伝子分析のための信頼できる定量的発現手段を得るため、初期試料量、ＲＮＡ完全性およびｃＤＮＡ合成の効率を含む、いくつかのパラメータが標準化されている。逆転写反応は、ランダムヘキサマー（５０ｎｇ／μｌ）および１μｇの全ＲＮＡを使用し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、製造業者の推奨に従って行った。リアルタイムＰＣＲは、ＴａｑＭａｎ  Ｆａｓｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘおよび５０ｎｇのｃＤＮＡプライマーを使用し、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７９００ＨＴ  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍｓで、２０μｌの反応容量で行い、各ＰＣＲアッセイにおけるＦＡＭ標識プローブ濃度は、それぞれ９００ｎＭおよび２５０ｎＭであった。すべての反応は二重に行い、結果は平均化した。各試料におけるＰＣＲ効率は、ＬｉｎＲｅｇソフトウェアを使用し、各遺伝子について評価した。
【０１４８】
第１の実験では、内因性参照遺伝子のサブセット（ＡＣＴＢ、Ｂ２Ｍ、ＧＵＳＢ、ＵＢＣ、ＰＯＬＲ２Ｌ、ＰＧＫ１およびＴＲＦＣ）は、２つの適合する新鮮凍結（ＦＦ）およびホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）が施された結腸癌ＬＮにおいて評価した。これらの７つの内因性参照遺伝子においては、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから利用可能な予め設計されたＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイのアンプリコン長は、６９〜８１ｂｐであった（表１）。すべての遺伝子は、Ｃｔ値＜３５で増幅し（図１）、ＰＣＲ効率は、ＦＦＰＥおよびＦＦ試料の双方で９０〜１１０％であった。ＦＦＰＥ試料は、同様のＰＣＲ効率でＦＦ組織より少ない変動を示した（図１）。第２の実験では、ＧＡＰＤＨ、ＨＰＲＴ１、ＰＭＭ１、ＰＰＩＡ、ＰＳＭＢ６、ＲＰＬＰ０、ＴＢＰ、ＴＰＴ１とＦＦＰＥ試料に適合するアンプリコンに対してカスタムＴａｑｍａｎアッセイを設計した。カスタム設計アッセイのアンプリコン長は、７５ｂｐに制限し、１つのエクソン−エクソン結合部に及んだ（表１）。これらのカスタムＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイの評価は、同じデータセットに対して行った。これらのカスタムアッセイを用いて選択される参照遺伝子の発現レベルは、１９〜３５の間のＣｔ値であった。同様に、ＦＦＰＥ試料間でＦＦ組織より変動が少ないことを認めた。８つのうち７つのカスタムＴａｑＭａｎアッセイが、我々の初期基準を満たし、９０〜１１０％の間のＰＣＲ効率を有した。ＰＭＭ１アッセイのみが、ＦＦおよびＦＦＰＥ試料の双方において９０％未満のＰＣＲ効率を有した。これは、ＬＮ中のＰＭＭ１遺伝子の低レベルの発現（３４．５の平均Ｃｔ）に起因する可能性が最も高い。
【０１４９】
ｇｅＮｏｒｍ基準に基づくと、試験された遺伝子のすべてが、ＧＣＣ陰性およびＧＣＣ陽性ＬＮの間で安定な発現を有した。同定された最も安定な参照遺伝子は、ＧＡＰＤＨ、ＰＧＫ１、ＨＰＲＴ１、ＴＢＰおよびＧＵＳＢであった。ＡＣＴＢは、１１番目にランク付けされた。最も安定な参照遺伝子は、９０〜１１０％の間のＰＣＲ効率と、ＡＣＴＢより２−６サイクル少ない発現レベルを有した。
【０１５０】
我々の結果によると、任意の組織タイプまたは条件において単一のユニバーサル参照遺伝子が存在しないことが確認され、任意の実験条件において潜在的な参照遺伝子の特定の評価の重要性が強調される。同定された安定な参照遺伝子は、ＧＣＣ  ＩＶＴに基づく標準曲線に依存しない相対定量アプローチを確立するための、Ｂｅａｕｌｉｅｕらによって記載されたアッセイフォーマット（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、２０１０年）（すなわち、ＧＣＣ／ＡＣＴＢ  Ｓｃｏｒｐｉｏｎｓ（商標）二重アッセイ）におけるＡＣＴＢの代わりとなる推定上の候補である。
【０１５１】
２．ＲＴ−ｑＰＣＲ正規化に適した参照遺伝子の確認
結腸癌ＬＮにおける安定な発現を有する内因性参照遺伝子を同定するため、１５のすべての候補内因性参照遺伝子の発現が、３２のＧＣＣ陰性および３１ＧＣＣ陽性のＦＦＰＥ結腸ＬＮにおいて判定された。ＲＴ−ｑＰＣＲを上の実施例１に記載のように行い、各プレートは、商用のヒトユニバーサルＲＮＡを用いる対照反応を含んだ。ステージＩＩ〜ＩＩＩ  ＣＲＣ患者由来の陽性ＬＮ中でのＧＣＣレベルは、２００〜３５０００超のＧＣＣコピー／ウェルの範囲である一方、陰性ＬＮは、所定のカットオフ（１００ＧＣＣコピー／ウェル）未満のＧＣＣレベルを有した。選択される各参照遺伝子における発現レベルの平均値および標準誤差は、ＧＣＣ陰性およびＧＣＣ陽性ＦＦＰＥ結腸ＬＮについては図２に示す。認められる相対的発現レベルは、図１中に示される予備結果と十分に対応した。理想的な参照遺伝子であれば、試験したＧＣＣ陰性およびＧＣＣ陽性ＦＦＰＥ  ＬＮの双方において一定の発現を維持する必要がある。６３の個別の標本を使用して試験したすべての遺伝子から、両集団における平均発現が１回に満たないサイクルによる変動を受けることを認めた（図２）。さらに、商用のヒトユニバーサルＲＮＡを使用し、プレートとプレートの間の変動をモニタリングした。試験した各内因性参照遺伝子においては、ユニバーサルＲＮＡにおけるＣｔ値は、一定であり、プレート内のＣｔの標準偏差＜０．２およびプレート間の変動の係数（ＣＶ）＜４％であった。
【０１５２】
発現安定性を、ｇｅＮｏｒｍソフトウェアを使用して分析した。ＧｅＮｏｒｍでは、ペアワイズ比較モデルを使用し、試料を通じての発現比において最小の変動を示す遺伝子ペアを選択する。ソフトウェアは、各内因性参照遺伝子における遺伝子安定性の大きさ（Ｍ）を計算する。図３は、試験したすべての遺伝子におけるＭ値を示す。１５の参照遺伝子の発現レベルに関する我々の分析は、すべての遺伝子がｇｅＮｏｒｍデフォルト閾値の１．５より小さいＭ値を示すことを示し、文献からの遺伝子のこの選択が十分安定な参照遺伝子に対応することが確認された。選択したすべての参照遺伝子が安定な発現を有するが、それらは同等に安定ではない。ＧＡＰＤＨおよびＰＧＫ１が最も安定な遺伝子ペアであり、それにＨＰＲＴ１、ＴＢＰおよびＧＵＳＢが続くことが同定された（図３）。ＡＣＴＢは、ＧＣＣ／ＡＣＴＢ  Ｓｃｏｒｐｉｏｎｓ（商標）二重アッセイに基づくと、１１番目の位置にあり、ＰＰ１Ａは、ＦＦＰＥ結腸ＬＮ中での発現において最大の変動性を示した。
【０１５３】
ＲＮＡ発現の正規化において単一の参照遺伝子を用いることは、定量ＰＣＲにおける標準的慣行であった。しかし、我々の予備試験では、参照遺伝子発現が著しく変動しうることが文書化されており、これは、複数の参照遺伝子の使用により、相対定量試験における精度が改善されうることが示唆される。したがって、試験される組織向けに使用される参照遺伝子の適切な組み合わせを同定することは重要である。定量ＰＣＲの正規化にとって必要とされる参照遺伝子の最適数を決定するため、ｇｅＮｏｒｍソフトウェアは、加えられる参照遺伝子の連続的に増加するそれぞれの数におけるペアワイズ変動Ｖを計算する。図４は、ｇｅＮｏｒｍソフトウェアによって計算されるペアワイズ変動のグラフを示す。ｇｅＮｏｒｍのデフォルトＶ値０．１５をカットオフとして使用し、遺伝子の最適数を決定した。この分析によると、ＦＦＰＥ結腸癌ＬＮから抽出されるＲＮＡを使用する場合、参照遺伝子の最適数が３である（ＧＡＰＤＨ、ＰＧＫ１およびＨＰＲＴ１）ことが示された（図４）。
【０１５４】
ＦＦＰＥ結腸癌ＬＮを用い、ＧＣＣ相対定量分析について試験した参照遺伝子の中での最適なものは、ＧＡＰＤＨ、ＰＧＫ１、ＨＰＲＴ１、ＴＢＰおよびＧＵＳＢであった。その上、これら５つの内因性参照遺伝子は、ＦＰＥ  ＬＮ中でのＡＣＴＢほど豊富に存在せず、ＬＮ中でのＧＣＣ  ｍＲＮＡの存在によって作用を受けない。これらの参照遺伝子がＡＣＴＢより少ない３−６サイクルの発現レベルを有することから、それらは逆転写反応においてＧＣＣと競合する可能性は比較的少ない。これは、ＡＣＴＢに対し、ＲＴ反応におけるプライマー濃度が制限されるべきでないことを示唆する。ＡＣＴＢは、その高い発現故に、相対定量にとって最適でないが、その発現が結腸周囲ＬＮ中で安定であることを見出した。その理由で、ＡＣＴＢ単独でなく、３つの遺伝子の組み合わせは、標準曲線に基づく定量と異なり、相対定量を用いる試験フォーマットの開発において考慮した。
【０１５５】
３．選択される各参照遺伝子についての２つのＴａｑＭａｎ（登録商標）一重アッセイの開発および評価
過去に同定された５つの参照遺伝子（ＧＡＰＤＨ、ＰＧＫ１、ＨＰＲＴ１、ＴＢＰおよびＧＵＳＢ）の各々において、ＰｒｉｍｅｒＥｘｐｒｅｓｓを使用する、ＧＣＣと同様のアンプリコン長（６５〜７５ｂｐ）を伴う２つの設計物を開発した（表２）。２つの異なるエクソンとそれらのプローブおよびプライマーに及ぶ各参照遺伝子用に開発されたアッセイは、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を有しなかった（表２）。商用のヒトユニバーサルＲＮＡ（ｕＲＮＡ）の連続希釈により、アッセイ設計のＰＣＲ効率の初期認定を行うことができた。逆転写反応は、遺伝子特異的リバースプライマー（２μＭ）および１２５０ｎｇ〜０．１２５ｎｇの範囲のＲＮＡインプットを使用し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、製造業者の推奨に従って行った。リアルタイムＰＣＲは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  ＭｉｘプライマーおよびＦＡＭもしくはＶＩＣ標識プローブを使用し、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７９００ＨＴ  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍｓで、２０μｌの一重反応で行い、各ＰＣＲアッセイにおける濃度は、推奨通りに、それぞれ９００ｎＭおよび２５０ｎＭであった。１つのＨＰＲＴ１設計以外では、すべての他のアッセイは、９０〜１１０％の間のＰＣＲ効率をもたらした（表１）。ＧＵＳＢ、ＨＰＲＴ１、ＰＧＫ１およびＴＢＰの発現レベル（Ｃｔ値）は、１２５０ｎｇの場合に２１〜２３、０．１２５ｎｇの場合に３４〜３６の範囲であった。両方のＧＡＰＤＨ設計は、我々の主要仕様より低いＣｔ値を有した（２３〜３６のＣｔ値）。
【０１５６】
４．結腸周囲リンパ節試料中での参照遺伝子の発現
最低のＣｔの変動および標準偏差を有する参照遺伝子を選択するため、５つの選択される参照遺伝子を、ＧＣＣ陽性および陰性ＬＮから抽出したＦＦＰＥ  ＲＮＡにおいて評価した。まず、参照遺伝子の発現レベルを、１０の異なるＴａｑＭａｎ  ＭＧＢアッセイを使用し、ＧＣＣ陽性ＬＮ由来のＲＮＡの連続希釈で測定した（表２）。全部で１０の参照遺伝子アッセイにおけるＣｔ値は、１８〜３４の範囲であった（表５）。ＧＡＰＤＨアッセイは、我々の仕様より低いＣｔ値を示し、ＧＵＳＢ＿Ｔｑ２およびＨＰＲＴ１＿Ｔｑ２の双方は、９０〜１１０％の範囲外のＰＣＲ効率を有した。同時にマイナスＲＴ反応も行い、ＴＢＰ＿Ｔｑ１およびＴｑ２、ＧＡＰＤＨ＿Ｔｑ１およびＨＰＲＴ１＿Ｔｑ２に対して３５未満のＣｔ値を常に得て（表５）、これは、これらのアッセイによるゲノムＤＮＡまたはＰＣＲ副産物の非特異的増幅を示唆する。ＧＣＣと各参照遺伝子との間でのＲＮＡインプットに依存しない安定な相対的発現レベルを、ＲＮＡ連続希釈で得た。最後に、最小のアンプリコンは、より大きいものより低いＣｔの変動を有する傾向があった（表５）。
【０１５７】
【表８】
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【０１５８】
ｕＲＮＡおよびＦＦＰＥ  ＲＮＡを用いる先の実験で得られた結果を用い、参照遺伝子ごとに１つの設計を選択した。また、ＧＡＰＤＨの相対的存在度が高すぎると結論づけ、２つのＧＡＰＤＨ  Ｔａｑｍａｎアッセイ設計のさらなる特徴づけを行わないように意図した。
【０１５９】
次いで、残り４つの参照遺伝子アッセイの発現レベルを、結腸癌患者のＦＦＰＥ  ＬＮから抽出され、ＧＣＣ  ｍＲＮＡの相対的発現を測定するために使用されるＲＮＡにおいて確認した。３つのＧＣＣ陽性（Ｃｙｂｒｄｉ）および３つのＧＣＣ陰性（ＡＢＳ、ＭｃＧｉｌｌおよびＴｒｉｓｔａｒ）ＬＮ由来のＲＮＡを試験した。３つのＧＣＣ陰性リンパ節由来の核酸の残骸（ｒｅｍａｉｎｓ）を、ＡＣＴＢの発現をマイナスＲＴ対照において検出することができた先行実験から選択した。また、マイナスＲＴ反応を同時に行った。Ｓｃｏｒｐｉｏｎｓ（商標）二重アッセイを用い、各参照遺伝子に対して測定したＣｔ値は、ＡＣＴＢにおける２０に対して２２〜２６サイクルであった（図５）。ＴａｑＭａｎ（登録商標）一重アッセイの場合に得られたＧＣＣ  Ｃｔ値は、ＧＣＣ／ＡＣＴＢ  Ｓｃｏｒｐｉｏｎｓ（商標）二重反応の場合に得られたものに匹敵した。ＧＣＣ、ＨＰＲＴ１またはＰＧＫ１の増幅は、試験したマイナスＲＴ条件下で全く検出されなかった（図１）。しかし、ＴＢＰおよびＧＵＳＢは、すべてのマイナスＲＴ対照において、測定可能なＣｔ値を有した。
【０１６０】
５．部分加水分解ＲＮＡにおける定量ＲＴ−ＰＣＲ
２つの分解モデルを開発し、ＦＦＰＥ試料中でのＲＮＡ断片化をシミュレートした。ＧＵＳＢ、ＨＰＲＴ１、ＰＧＫ１およびＴＢＰを評価し、分解試料中でのＧＣＣに類似のシグナルの低下を有する参照遺伝子を同定した。提起されたモデルを開発するため、分解実験を最適化し、ＧＣＣ／ＡＣＴＢ  Ｓｃｏｒｐｉｏｎｓ（商標）二重アッセイのダイナミックレンジに及ぶＧＣＣレベルを得た（すなわち、５つの分解点でＧＣＣレベルが測定可能）。
【０１６１】
ａ．水酸化ナトリウム分解
一定分量２０μｇのＴＲＩｚｏｌ（商標）で抽出された新鮮凍結結腸組織試料由来のＲＮＡを、６０℃、０．１Ｎ  ＮａＯＨで処理した。様々な時点で（３０分、１時間、２時間、３時間、４時間および５時間）、等容量の氷冷０．１Ｍ  ＨＣｌを試料に添加し、ＮａＯＨを中和し、かつＲＮＡ分解を停止させた。得られた分解ＲＮＡを、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒで特徴抽出した。上昇したｐＨで制御された核酸分解により、加水分解の時間に依存して、５０〜３００ヌクレオチドのＲＮＡ断片が生成された。１５０ヌクレオチド未満の５０％を超えるＲＮＡ断片を伴う実質的なＲＮＡ分解が、処理の３時間後に認められた（図６Ａ）。各時点から得られＲＮＡを、ＧＣＣ  ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイおよび４つの選択された参照遺伝子設計（ＧＵＳＢ、ＨＰＲＴ１、ＰＧＫ１およびＴＢＰ）を使用して増幅した。比較のため、ＡＣＴＢとのＧＣＣ  Ｓｃｏｒｐｉｏｎｓ（商標）二重についても試験した。短いアンプリコンを伴うＧＣＣおよびＲＧアッセイを設計したことから、処理の５時間後であっても測定可能な発現を検出することができた。予想通り、処理を通してＧＣＣ値の一定の増加が認められた一方、ＡＣＴＢ  Ｃｔ値についてはわずかな増加を観察できるにすぎない（図６Ｂ）。４つの他の参照遺伝子のＣｔ値の増加は、このモデルにおけるＧＣＣ  ｍＲＮＡの場合に酷似した（図６Ｂ）。ＧＵＳＢ、ＨＰＲＴ１およびＴＢＰの場合に計算した、得られたＧＣＣの相対的発現レベル（ＧＣＣのＣｔ−参照遺伝子候補のＣｔ）は、ほとんどの場合、断片化に誘発されるＧＣＣ  Ｃｔ値の増加を相殺するとともに、無傷ＲＮＡ標本と著しく分解されたＲＮＡ標本の間のΔ−Ｃｔ変動が２倍未満であった（図７）。
【０１６２】
ｂ．炭酸塩分解
この第２の分解モデルでは、ＴＲＩｚｏｌ（商標）で抽出された新鮮凍結結腸組織試料由来のＲＮＡを、等容量のＮａＨＣＯ３／Ｎａ２ＣＯ３緩衝液（ｐＨ１０）に溶解し、６０℃で様々な時間（３０分、１時間、２時間、３時間および４時間）インキュベートした。加水分解を停止させるため、１／１０容量の３Ｍ  ＣＨ３ＣＯＯＮａ（ｐＨ５．２）を氷上で添加後、３容量の９９％エタノールで沈降させた。小さい断片化ＲＮＡを、５０μｌで回収し、ｍｉｎｉ  Ｑｕｉｃｋ  Ｓｐｉｎ  ＲＮＡ  Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＩＮ）で精製した。Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  ＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒおよびＲＴ−ＰＣＲ分析に先立ち、ＲＮＡに対してＴＵＲＢＯ  ＤＮＡ  ｆｒｅｅキット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用してＤＮａｓｅ処理を行った。
【０１６３】
無傷ＲＮＡを、高いｐＨおよび温度でのインキュベーションによって部分加水分解した（図８Ａ）。３０分後、ＲＮＡ試料の電気泳動図は、約５００ヌクレオチドの断片を示し、１２０分後、２００ヌクレオチド未満の平均サイズが認められた（図８Ｂ）。次いで、ＲＮＡ試料にＲＴ−ｑＰＣＲを施し、代表的実験におけるＧＣＣおよび５つの参照遺伝子に対するＣｔ値を示す（図８Ｃ）。このモデルでは、処理の４時間後、ＧＣＣ  Ｃｔ値が、６サイクル超だけ増加した。ＡＣＴＢを含む、試験した参照遺伝子の大部分が、このモデルでは、ＧＣＣと同様の挙動を示す（図８Ｃ）。しかし、処理を通じてΔ−Ｃｔ値の変動（Δ−Δ−Ｃｔ）を比較した際、ＧＵＳＢ、ＨＰＲＴ１およびＴＢＰのみが安定な発現レベルを示し、ここで無傷および炭酸塩分解ＲＮＡ試料の間での変動は２倍に満たなかった（図９）。この結果は、制御されたＲＮＡ分解におけるＧＣＣ  Ｃｔ値の増加が、強固な相対定量を可能にする同様の挙動を有する参照遺伝子の選択によって相殺されうることを強く示唆する。
【０１６４】
ｃ．ＯＣＴ−化合物（最適な切断温度）包埋組織からの固定方法の比較
予め固定の（ｐｒｅ−ｆｉｘａｔｉｏｎ）パラメータがＲＮＡの質にとって重要であり、また、一旦組織が固定され、脱水され、かつパラフィンで包埋されると、さらなる分解が制限されることは知られている。予め固定の変数による影響が最小限の参照遺伝子を選択するため、１つのＯＣＴ−包埋結腸腫瘍組織を、２０μｍで４０スライスの切片にした。８つの非連続切片をプールし、ＴＲＩｚｏｌ（商標）試薬で固定または抽出した。ＲＮＡの質に対する組織固定液の効果を、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを使用し、中性緩衝ホルマリン、非緩衝ホルマリンまたはブアン固定液のいずれかで１６時間固定した凍結切片において測定した（図１０）。予想通り、各条件は固有のＲＮＡ特性をもたらした。ＴＲＩｚｏｌ（商標）試薬で抽出した両ＲＮＡは、典型的な１８Ｓおよび２８Ｓ断片を示した。中性緩衝ホルマリンで固定した切片から抽出したＲＮＡは、４００ｂｐより小さいように見られる一方、非緩衝ホルマリンは、全体的にあまり断片化されていないＲＮＡ分子とともにゲノムＤＮＡを保持しているように見られた。ブアン固定液は、最も破壊的な固定液であり、大部分のＲＮＡ分子が１５０ｂｐ未満であった。
【０１６５】
次いで、無傷ＲＮＡおよび固定−分解ＲＮＡに由来するＧＣＣ、ＡＣＴＢおよび参照遺伝子のｍＲＮＡレベルを、ＲＴ−ｑＰＣＲアッセイを用いて測定した。図６は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）一重アッセイで検出されたＧＣＣおよび４つの参照遺伝子におけるＣｔ値を、ＧＣＣ／ＡＣＴＢ  Ｓｃｏｒｐｉｏｎｓ（商標）二重アッセイの場合と比較して示す。試料を凍結または固定する前にＲＮＡにおいて初期の生物学的変動が全くないことから、ＧＣＣ  Ｃｔの増加は、特にＲＮＡの質に起因する。Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒの結果から想定されるように、ブアン固定液は、試験したすべての遺伝子において、最大のＣｔの増加をもたらした。選択した参照遺伝子がＧＣＣと同様の挙動を示すことから、Δ−Ｃｔはむしろ安定であり、ＧＵＳＢ、ＨＰＲＴ１およびＴＢＰで正規化される場合、新鮮凍結および中性緩衝ホルマリン固定試料の間での変動は０．５Δ−Ｃｔ未満であった（図１１）。これは、分析前ストレス因子によって引き起こされるＣｔ値の変動が好適な正規化方法によって相殺されうることを示唆する。
【０１６６】
我々の結果によると、新規に特徴づけられた参照遺伝子を使用するＧＣＣの相対定量により、組織固定およびＲＮＡ分解に対する感度が低下しうることが確認される。ＦＰＥ分解を再現するＲＮＡ分解モデルに基づき、新鮮凍結試料由来のＲＮＡと同じ試料由来の著しく分解されたＲＮＡの間の変動が２倍未満であることを示す、３つの参照遺伝子（ＧＵＳＢ、ＨＰＲＴ１およびＴＢＰ）を選択することができた。また、参照遺伝子発現に対する組織固定剤の効果を、緩衝ホルマリン、非緩衝ホルマリンおよびブアンで固定された凍結切片中で測定した。ＦＰＥ試料から抽出したＲＮＡは、同じ組織の新鮮凍結切片から単離された無傷ＲＮＡに対して１Δ−Ｃｔ未満の変動を示した。ＧＣＣと、ＧＵＳＢ、ＨＰＲＴ１またはＴＢＰのいずれかを同時に増幅する二重アッセイであれば、ＲＮＡインプットに依存しない、可変の分析前条件下で過去に処理した臨床標本における強固な相対定量（Δ−Ｃｔ）が可能になる。
【０１６７】
６．選択される参照遺伝子によるＧＣＣ  ＴａｑＭａｎ（登録商標）二重アッセイの評価
組織固定およびＲＮＡ分解モデルに基づき、著しく分解されたＲＮＡ試料および非分解ＲＮＡ試料中で、ＧＣＣと同様の挙動を示す３つの参照遺伝子（ＧＵＳＢ、ＨＰＲＴ１およびＴＢＰ）を同定した。ＧＣＣとこれら参照遺伝子の各々との二重設計を、ヒトｕＲＮＡおよびＦＦＰＥ結腸材料を使用するＴａｑＭａｎアッセイで試験した（図１２）。逆転写反応を、２μＭおよび１．２５μｇの全ＲＮＡでのＧＣＣおよび参照遺伝子リバースプライマーの双方を使用する、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、製造業者の推奨に従って行った。プライマーの３つの濃度（９００ｎＭ、６００ｎＭおよび３００ｎＭ）およびＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭＧＢプローブの１つの濃度（２００ｎＭ）を、リアルタイムＰＣＲによって試験した。ＧＣＣプローブをＦＡＭで標識する一方、ＶＩＣを使用し、参照遺伝子を検出した。初期の二重試験後、すべての試験遺伝子（ＧＣＣ、ＧＵＳＢ、ＨＰＲＴ１およびＴＢＰ）における一重反応に対し、ＦＦＰＥ結腸試料中で、０．５Ｃｔ未満の変動でＧＣＣ二重シグナルを得た（図１２Ａ）。ＧＵＳＢおよびＨＰＲＴ１のみが、試験した条件のいずれかに対する二重反応において、マイナスＲＴ増幅シグナル（Ｃｔ＝４０）を全く有しなかった。逆に、３５サイクルに満たないＣｔでのＴＢＰの増幅が、一重および二重の双方の条件下で認められた（図１２Ｂ）。
【０１６８】
７．ＨＰＲＴ１およびＧＵＳＢの比較および最適な参照遺伝子の選択
ａ．ＧＣＣ  ＬＮ相対定量．における２つのＴａｑＭａｎ（登録商標）二重アッセイの開発
第１の実験セットでは、ｑＰＣＲ反応におけるプライマーの濃度を二重アッセイにおいて調整し、ＧＣＣプライマーと参照遺伝子プライマーの間での競合を最小化した。プライマーの適定を、１×１０６個のインビトロ転写（ＩＶＴ）ＧＣＣ分子によるスパイクを伴う場合または伴わない場合で、ヒトユニバーサルＲＮＡ（ｕＲＮＡ）において行った。参照遺伝子発現の高い場合と低い場合のそれぞれのデータを得るため、２つのｕＲＮＡインプット（２５０ｎｇ／μｌおよび２５ｎｇ／μｌ）を使用した。逆転写反応を、２μＭでのＧＣＣおよび参照遺伝子の双方に特異的なリバースプライマーを伴うＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用する二重反応で行った。スパイク実験と組み合わせたこのアプローチにより、ＧＣＣ陽性およびＧＣＣ陰性ＬＮの試験に密接に関連する条件下で、ＧＣＣおよび参照遺伝子発現の互いに対する相互の影響を評価することができた。各遺伝子に対して試験したプライマーの濃度は１５０〜９００ｎＭで可変であった一方、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭＧＢプローブは２００ｎＭで一定であった。
【０１６９】
ｑＰＣＲプライマー適定の分析により、二重増幅にとっての最も好ましい条件を決定することができた。選択された条件は、ＧＵＳＢおよびＨＰＲＴ１の双方の二重アッセイの場合と同じであり、９００ｎＭでのＧＣＣフォワードおよびリバースプライマーと３００ｎＭでの参照遺伝子フォワードおよびリバースプライマーとともに、いずれも２００ｎＭでのＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭＧＢプローブを伴った（図１３〜１４）。これらの新規に決定した条件を用い、ＲＴプライマーを二重アッセイにおいて調節し、各遺伝子に対して飽和ＲＴ反応を提供した。ＲＴプライマー適定を、ＮａＯＨで処理した新鮮凍結結腸ＲＮＡを使用する二重反応において行った。１つの目標はまた、ＲＮＡ分解に起因するΔＣｔ変動を低減することであった。その理由から、各遺伝子リバースプライマーについて、２μＭから最大で２０μＭへと増加するＲＴプライマー濃度について試験した。最高の条件では、二重におけるＧＣＣおよび参照遺伝子の性能は、一重の場合と同様である必要がある（変動＜１Ｃｔ）。試験した条件の中で、最高の性能は、２０μＭでのＧＣＣリバースプライマーおよび２μＭでの参照遺伝子リバースプライマーの場合に得られた（図１４）。
【０１７０】
ｂ．マイナスＲＴ反応における増幅のモニタリング
ＴａｑＭａｎ（登録商標）およびＳｃｏｒｐｉｏｎｓ（商標）二重アッセイをマイナスＲＴ条件下で比較するため、マイナスＲＴ下で検出可能なＡＣＴＢシグナルを生成することが過去に見出された８つの試料を、新しいアッセイで試験した。重要なことに、マイナスＲＴ下で、ＧＣＣについても選択された参照遺伝子についても増幅が全く検出されなかった一方、ＡＣＴＢ増幅は、参照Ｓｃｏｒｐｉｏｎｓ（商標）アッセイで試験した同じ試料中で継続的に認められた（図１５）。さらに、試験した２つのＧＣＣ陽性試料においては、新しいアッセイで得られたＧＣＣ  Ｃｔ値は、Ｓｃｏｒｐｉｏｎｓ（商標）アッセイのＧＣＣ  Ｃｔ値に対して１Ｃｔに満たない差異を有し、選択された条件がＧＣＣ／ＡＣＴＢ  Ｓｃｏｒｐｉｏｎｓ（商標）アッセイの性能に一致していることが確認された。まとめると、これらの結果は、両ＴａｑＭａｎ（登録商標）二重アッセイがそれらの標的遺伝子に対して特異的であることを示唆する。
【０１７１】
ｃ．ＧＣＣ相対定量に対する組織固定剤の効果
予め固定のパラメータがＲＮＡの質にとって重要であり、かつ一旦組織が固定され、パラフィン包埋されると、ＲＮＡ分解プロセスが低下することは知られている。実験を行い、ＧＣＣ  ｍＲＮＡ結果に対する固定液タイプの効果を評価した。参照遺伝子発現に対する組織固定剤の効果を、緩衝ホルマリン、非緩衝ホルマリンまたはブアン固定液で固定された凍結切片において判定した。ＧＣＣ／ＧＵＳＢおよびＧＣＣ／ＨＰＲＴ１二重アッセイの双方を用い、ＦＰＥ試料から抽出したＲＮＡを、同じ組織の新鮮凍結切片から単離された無傷ＲＮＡと比較した。新しい二重アッセイは、新鮮凍結および固定組織の間で、ＧＣＣ／ＡＣＴＢ  Ｓｃｏｒｐｉｏｎｓ（商標）二重に対して安定なΔ−Ｃｔ定量をもたらした（図１６）。すべての組織固定剤の間でのΔ−Ｃｔ変動が１に満たないことで、ＧＣＣ／ＧＵＳＢ二重の組み合わせが、組織固定液によって変動を低減するために最も有効なものであった。
【０１７２】
ｄ．断片化ＲＮＡの定量に対する保管時間の効果
固定およびパラフィン包埋（ＦＰＥ）ブロックにおけるＴａｑＭａｎ（登録商標）およびＳｃｏｒｐｉｏｎｓ（商標）アッセイを比較するため、１か月〜２２年の範囲の異なる保管時間を有する５５のＦＰＥ結腸周囲リンパ節組織を選択した。保管から１年が経過し、試料は同様のＲＮＡ断片化特性を有し（図１７）、分解プロセスは著しく低下するように見られた。したがって、１年を超える期間保管された試料由来のＧＵＳＢ  Ｃｔ値においては変動が低減することを認めた。また、ＧＵＳＢにおけるＣｔ値が、標本の経年とは無関係に、ＡＣＴＢの場合より高いことを認めた。興味深いことに、ＡＣＴＢ  Ｃｔ値は、異なるブロック群の間で有意に増加しなかった（図１８Ａ）。これらの条件により、ＧＣＣがＡＣＴＢよりも影響を受けたことが理由で、アッセイが小さい変動に対して反応しなかったことから、ＡＣＴＢを参照遺伝子として使用し、ＲＮＡ分解をモニタリングすることができなかった。それに対し、ＧＵＳＢ  Ｃｔ値と保管時間との間に直接的関係を認めた（図１８Ｂ）。その結果、１０年より古い標本におけるＧＵＳＢ  Ｃｔ値は、６か月未満の標本の場合よりも有意に高かった（２６．４［９５％ＣＩ：２６．０〜２６．８］対２４．５［９５％ＣＩ：２３．８〜２５．３］）。したがって、保管材料中の標的アンプリコンのように振る舞う参照遺伝子を用い、ｉｔｉｓｐｏｓｓｉｂｌｅｔｏｔｅｓｔ数十年経過した標本を試験し、さらに有益な結果を得ることは可能である。
【０１７３】
８．ＧＵＳＢはＧＣＣアッセイにおける優れた参照遺伝子である
ａ．検出下限（ＬＯＤ）
検出限界（ＬＯＤ）を決定するため、各遺伝子特異的プライマー／プローブセットを、連続希釈を用い、感度について試験した。二重反応は、１×１０５個のＧＣＣ  ＩＶＴでスパイクされ、理論上のＧＣＣコピー数が１未満に達するまで連続希釈された商用のＬＮ  ＲＮＡ（２５０ｎｇ／μｌ）において行った。これらの実験は、５複製／希釈点を用いて行った。ＧＣＣコピーの定量は、ＧＣＣ標準曲線を用いたＣｔ値の内挿によって得られた。これらのアッセイにおいて得られた較正曲線の性能特性を、表６に示す。ＧＣＣ  ＩＶＴの各対数希釈を、ＧＣＣ／ＧＵＳＢ二重における１０２％およびＧＣＣ／ＨＰＲＴ１二重における９７％の効率に対応するｑＰＣＲのさらなる３つのサイクルによって検出した。通常、１００％を超える効率の数字は、ＲＴの飽和を示し、それはまさに上で選択された条件であった。
【０１７４】
【表９】
2012518389.tif 000011
【０１７５】
ＬＯＤは、少なくとも５中４の複製に対し、バックグラウンドとは異なるシグナルを生成する最低希釈点として定義された一方、定量限界（ＬＯＱ）は、すべての標本中で常に蛍光を検出可能な最低濃度として定義された。概要を表６に示す。ＬＯＤを用い、適切なＲＮＡ試料におけるカットオフＣｔ値を決定した。ＬＯＤでのＧＵＳＢおよびＨＰＲＴ１のＣｔ値は、それぞれ３６．４および３５．１であった。したがって、参照遺伝子の３５より大きいＣｔ値を有する任意の試料は、非情報的（ｎｏｎ−ｉｎｆｏｒｍａｔｉｖｅ）と見なされた。ＧＣＣ／ＧＵＳＢ二重アッセイを用い、ＬＯＱでのＧＵＳＢのＣｔ値（０．０２５ｎｇ／μｌのＲＮＡインプット）は３３．３であった一方、ＧＣＣのＣｔ値は３２．９であり、それは９つのＧＣＣコピーに対応する。ＧＣＣおよびＧＵＳＢ  Ｃｔ値の双方は、ＬＯＱでＣＶ＜１．５％を有した。ＧＣＣ／ＨＰＲＴ１の場合に決定されたＬＯＱは、０．２５ｎｇ／μｌのＲＮＡインプットでより高く、ＧＣＣ  Ｃｔ値は３０．５に達し、それは８２のＧＣＣコピーに対応する。ＧＵＳＢまたはＨＰＲＴ１のいずれかの場合に計算されたＧＣＣの相対的発現は、安定であり、Δ−ＣｔがＬＯＱ範囲内の１に満たないことが見出された。予想に反し、ＧＣＣ／ＧＵＳＢ二重は、ＧＣＣ／ＡＣＴＢ  Ｓｃｏｒｐｉｏｎｓ（商標）アッセイと比較すると、ＬＯＱを約１０ＧＣＣコピー／反応に低下させうる（それに対し、ＧＣＣ／ＡＣＴＢ二重アッセイにおいては９５コピー）ことから、より良好な分析性能を示した。
【０１７６】
９．選択されたＧＣＣ／ＧＵＳＢ二重アッセイの分析性能
追加実験を行い、ＧＣＣ／ＧＵＳＢ二重アッセイの分析性能を確認した。その定量下限の決定およびＲＮＡ分解における安定な発現および固定モデルは、結腸直腸癌を有する患者由来のＦＰＥ  ＬＮにおいて、強固な相対定量（ＲＱ）測定値を提供しうる。本試験の主目的は、参照ＧＣＣ／ＡＣＴＢ  Ｓｃｏｒｐｉｏｎｓ（商標）アッセイの場合に得られる分析感度および特異度を再現することであった。核酸は、ステージＩ（１２）、ステージＩＩ（６５）およびステージＩＩＩ（９５）の結腸癌疾患を有する患者か採取した１７２のＦＦＰＥ結腸ＬＮから抽出した。それら試料のうち、１４がＧＣＣ／ＡＣＴＢ参照アッセイの場合に不適切であることが見出され（ＡＣＴＢ  Ｃｔ＞２９）、かつ３７が報告可能な範囲に満たないＧＣＣレベル（＜１００コピー／反応）を有する一方、１７の組織学的陽性ＬＮがＧＣＣに対して陰性であった。ＧＣＣおよびＧＵＳＢ  ｍＲＮＡ発現（Ｃｔ値）を、３５のステージＩ〜ＩＩ組織学的およびＧＣＣ陰性試料（ｐＮ０（ｍｏｌ−）および３８のステージＩＩＩ組織学的およびＧＣＣ陽性試料（ｐＮ１−２（ｍｏｌ＋）に由来するＦＦＰＥ  ＬＮにおいて最初に評価し、新しい二重アッセイについての分析カットオフを決定した。受信者動作特性（ＲＯＣ）分析を用い、最適なカットオフ（−５．９のΔ−Ｃｔ）を決定した。図１９は、選択されたカットオフとして−５．９Δ−Ｃｔ値を用い、ＧＣＣ  Δ−Ｃｔ（ＣｔＧＵＳＢ−ＣｔＧＣＣ）として表されるシグナルの箱ヒゲ図を示す。３８のＧＣＣ−ＡＣＴＢ陽性試料におけるそのアッセイの評価される検出率（感度）が９７％であった（３７／３８；９５％ＣＩ：８６．１〜９９．６）一方、３５のＧＣＣ／ＡＣＴＢ陰性試料におけるそれが１４％であった（５／３５；９５％ＣＩ：６．６〜３３．７）。
【０１７７】
次に、相対的なＧＣＣ  ｍＲＮＡ発現を、残存試料において評価した。ＧＣＣ／ＧＵＳＢアッセイで試験した試料の情報の速度は２％増加し、全体として、不適切なＧＵＳＢ増幅を有したのは、ＧＣＣ／ＡＣＴＢアッセイにおいてはＬＮの８％であったのに対して６％に過ぎなかった（表７）。ＧＣＣ／ＧＵＳＢおよびＧＣＣ／ＡＣＴＢアッセイの比較により、ＧＵＳＢでのｑＰＣＲ相対定量から、試験した４９すべての真陽性（ｐＮ１−２（ｍｏｌ＋））試料において一致した結果が得られることが示された。ＧＣＣ  ｍＲＮＡ対ＧＵＳＢ  ｍＲＮＡの相対定量が、ステージＩＩＩ  ＬＮの正確な同定を、Ｓｃｏｒｐｉｏｎｓ（商標）アッセイによる絶対定量を用いての５２％に対し、６６％に高めた（表７および図２０）。ステージＩおよびＩＩ患者由来のＬＮ（すなわち、ＨＰによってＬＮ転移を全く示さない）を試験する場合、ＧＣＣ  ｍＲＮＡ陽性は、ＧＣＣ／ＧＵＳＢアッセイの場合にリンパ節の３９％であったのに対し、Ｓｃｏｒｐｉｏｎｓ（商標）アッセイを用いると１９％であった。ＧＣＣ／ＡＣＴＢ  Ｓｃｏｒｐｉｏｎｓ（商標）アッセイに匹敵する性能を得るための一方法は、その報告可能な範囲を２５コピー／反応（ΔＣｔ＜−２）に低下させることである。ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＧＣＣ／ＧＵＳＢアッセイは、たとえこの低下したカットオフを用いるＧＣＣ／ＡＣＴＢアッセイと比較しても、ＧＣＣ／ＡＣＴＢアッセイで陰性である６つのステージＩおよびＩＩ患者をやはり検出したが、差異は統計的に有意でなかった。また、ＧＣＣ／ＡＣＴＢアッセイのカットオフ値を低下させることは、ＧＣＣ  Ｃｔ値が、結果の受入れのために用いられるＡＣＴＢ  Ｃｔ値と独立であることから、その情報の速度に対して全く効果を有しなかった。
【０１７８】
【表１０】
2012518389.tif 000012
【０１７９】
次に、ＧＣＣ／ＧＵＳＢ二重アッセイは、４３の直腸癌ＬＮ（新アジュバント療法および／または化学療法で処置された患者から採取された２４のＬＮを含む）由来の核酸抽出物を用いて試験した。再び、この選択された集団における情報の速度は、試料をＧＣＣ／ＧＵＳＢ二重アッセイで試験した場合より高かった（表８；８１％（８／４３）対７０％（１３／４３））。不適切であると見なされたＲＮＡ抽出物は、ＧＣＣ／ＡＣＴＢ  Ｓｃｏｒｐｉｏｎｓ（商標）アッセイの場合の１３に対し、ＧＣＣ／ＧＵＳＢアッセイの場合には８つのみであり、これは３８％の減少に対応する。さらに、組織病理学およびＧＣＣ（ＧＣＣ／ＧＵＳＢアッセイの場合）の双方において陽性であることが見出されたＬＮの数は、常に高めであり（６〜１２％）、一部の患者が新アジュバント療法を受けていたという事実による影響を受けなかった。
【０１８０】
【表１１】
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【０１８１】
試験結果
ＧＵＳＢを、ＬＮ中でのＧＣＣ発現細胞の存在による影響を受けてず、かつＲＮＡの完全性に作用する分析前条件と無関係にＧＣＣと同様の分析的挙動を有する参照遺伝子として同定することに奏功した。ＲＴおよびＰＣＲ反応を最適化し、ＧＣＣおよびＧＵＳＢ  ｍＲＮＡを同時増幅する効率的な二重アッセイを得た。様々な予め固定の条件下で予め処理した選択された標本を、この新しいアッセイで試験し、その結果は、強固な相対定量（Δ−Ｃｔ）が得られうることを示した。ＧＣＣ／ＧＵＳＢアッセイの感度および線形ダイナミックレンジが、カットオフ値として０のΔ−Ｃｔを用いるＧＣＣ／ＡＣＴＢアッセイと比較する場合に改善された。我々の予備結果は、最適化された核酸抽出プロセスと組み合わせたＧＣＣ／ＧＵＳＢアッセイが、情報の速度を高めることを強く示唆する。
【０１８２】
１０．血液中を循環するＧＣＣ陽性細胞の検出
循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）は、癌を有する患者の末梢血中に超低濃度で存在することが知られている。それら細胞の有効な検出は、治療に対する応答をモニタリングし、早期再発を検出するのに最も有用である。結腸癌を有する患者における臨床転帰は、かかる試験を用いれば、実質的に改善されうる。
【０１８３】
Ｃａｒｒｉｔｈｅｒｓら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９６年；９３（２５）：１４８２７−３２頁）およびＦａｖａら（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、２００１年；１９（１９）：３９５１−５９頁）によるネスト化ＲＴ−ＰＣＲを用い、ＧＣＣが、デュークスＤ（ステージＩＶ）患者由来の、血液中を循環する結腸直腸癌細胞を検出するのに有用でありうることが示された。他方では、Ｆａｖａらはまた、ＣＤ３４＋細胞が、異所的に発現される、上皮細胞に特異的なマーカーの供給源であり、それは、ＧＣＣなどのマーカーが、ＲＴ−ＰＣＲによって希少なＣＴＣを検出するのに使用される場合に一般に認められる高い偽陽性率に潜在的に寄与することを示した。健常ドナーにおけるＣＤ３４＋先祖細胞によるＧＣＣの低レベルの異所性転写は、ネスト化ＲＴ−ＰＣＲにおいて制限量の単核球全ＲＮＡ（≦０．８μｇ）を使用することにより、検出不能なレベルまで低下した。
【０１８４】
ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号７６２１６４）は、（１）血液採取、保管およびＲＮＡ安定化が意図された血液採取チューブと、（２）後のＲＴ−ＰＣＲによる試験用の、全血由来の細胞内ＲＮＡの抽出および精製のための核酸精製キットとからなる。
【０１８５】
ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  Ｓｙｓｔｅｍは、凍結標本において認められる８．９のＲＮＡ完全性数（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  Ｎｕｍｂｅｒ）（ＲＩＮ）および高い２６０／２８０比によって示される、高品質のＲＮＡ（ＲＮＡ２．７±１．１μｇ／血液ｍＬ）の抽出を可能にする。認められるゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）汚染は全く有意でなかった。さらに、収量（全体でｐ＝０．１９４）およびＲＴ−ｑＰＣＲ結果（ＧＣＣコピー／血液ｍＬにおいてｐ＝０．３００）における全く有意でない変動が、新鮮および凍結血液標本の間にも、同じドナーから別の日に採取した２つの血液標本の間にも認められなかった（ｐ＝０．０６６）。
【０１８６】
ＧＵＳＢおよびＧＡＰＤＨは、試験した７つの遺伝子（ＨＰＲＴ１、ＡＣＴＢ、Ｂ２Ｍ、ＰＧＫ１、ＲＰＬＰＯ、ＴＢＰ、ＧＡＰＤＨおよびＧＵＳＢ）の中で、血液中で最も安定な参照または参照遺伝子（ＲＧ）であることが見出された（図２１）。
【０１８７】
ｇｅＮｏｒｍペアワイズ変動Ｖを用い、定量ＰＣＲ正規化にとって必要とされる参照遺伝子の最適数を計算した（図２２）。０．１５のｇｅＮｏｒｍデフォルトＶ値カットオフを用いる分析によると、参照遺伝子の最適数が、血液試料から採取したＲＮＡを使用する場合、２である（ＧＵＳＢおよびＧＡＰＤＨ）ことが示される。
【０１８８】
臨床血液標本
１４すべての健常ドナーの場合、３４〜３６Ｃｔの範囲のバックグラウンドＧＣＣレベルが認められた。結腸癌患者の場合に認められるＧＣＣ  Ｃｔ値はまた、健常ドナーと結腸癌患者の間でのｍＲＮＡ  ＧＣＣコピーの差異が非常に小さいことを示す範囲内に該当した。それら差異は、ＧＣＣ  Ｃｔ滴定濃度がＧＣＣ単位／血液ｍＬ（μｇ単位のＧＣＣコピー／血液ｍＬ）に変換される場合、より良好に視覚化される。ＧＵＳＢ一重アッセイを使用すると、すべての標本が適切であることが見出された。
【０１８９】
ＧＣＣの任意カットオフ＞７５単位／ｍＬを用いると、結腸癌患者の場合に認められる％ＧＣＣ陽性（感度）は、次の通りである。
・ステージＩＶに対して７８％（７／９）；
・ステージＩＩＩに対して８０％（４／５）；
・ステージＩＩに対して３３％（３／９）；
・ステージＩに対して０％（０／２）
【０１９０】
その同じカットオフを用いると、健常ドナーの場合に認められる特異度は９３％（１３／１４）であった。図２３に示されるように、健常ドナーとステージＩＶ結腸癌患者の間に有意な差異が得られた（ＧＣＣ単位／血液ｍＬを用いてｐ＝０．００１）。
【０１９１】
循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）は末梢血中に非常に低い濃度で存在し、健常ドナーと転移性結腸癌患者の間での発現のＧＣＣレベルにおける差異は極めて少なかった。それに対し、我々の結果によると、ＲＮＡの安定化および精製用のＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して結腸癌患者における転移性循環癌細胞を検出するというＧＣＣ  ＲＴ−ｑＰＣＲアッセイの潜在性が確認される。
【０１９２】
１１．ＧＣＣはＧＩ管の他の組織内で発現される
ＧＩ管に対するＧＣＣ  ｍＲＮＡマーカーの特異度を確認するため、１８の器官に由来する９１のＦＦＰＥ正常および腫瘍に適合した標本を試験した。これらの標本のＦＦＰＥ切片に対して、ＧＣＣ／ＡＣＴＢ二重アッセイを実施した。試験した非腫瘍組織の中で、試験した２つのうち１つの胃組織ならびに大腸（８）、直腸（２）および小腸（１）組織の全部が陽性であった（表９）。肝臓（１）、食道（２）、肺（４）、膵臓（１）、副腎（２）、甲状腺（２）、脳（１）、乳房（１）、脾臓（１）、骨格筋（１）、皮膚（２）、前立腺（２）、卵巣（２）、膀胱（２）、および腎臓（２）を含む、試験したすべての他の非腫瘍を有する器官は、ＧＣＣ  ｍＲＮＡ陰性であった。上掲の器官の各々に対し、適合する腫瘍組織についても試験した。予想通り、試験した結腸および直腸腫瘍組織の全部とともに転移性肝臓標本から、強いＧＣＣ  ｍＲＮＡシグナルが検出され、それは明らかに原発性結腸癌に由来するものとして同定された（表４）。試験した４つのうち３つの膵癌組織が、有意なＧＣＣシグナルを生成した。試験した１つのタイプの肺癌（扁平上皮細胞癌）および２つの胃癌組織もまた、低度から中等度のＧＣＣ  ｍＲＮＡシグナルを生成した。これらの観察結果についての生物学的関与は、結腸および直腸以外の器官におけるＧＣＣの検出が、特に膵癌または胃癌などの器官における癌であるという診断を示唆しうることを示唆する。特に、膵癌および胃癌細胞内でのＧＣＣ  ｍＲＮＡの存在が、先に報告されている（Ｂｉｒｂｅ  Ｒ．ら：Ｈｕｍ  Ｐａｔｈｏｌ  ２００５年、３６：１７０−１７９頁；およびＫｌｏｅｔｅｒｓ  Ｏ．ら、Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  ２００８年、４３：４４７−４５５頁）。
【０１９３】
【表１２】
2012518389.tif 000014
【０１９４】
【表１３】
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【０１９５】
１２．ＧＵＳＢと併せて測定される場合でのＧＣＣの予後の可能性の評価
リンパ節陰性（ｐＮ０）結腸癌と診断された患者の２つの独立コホートを、ＲＴ−ｑＰＣＲ法を用いるＧＣＣ  ｍＲＮＡ発現分析について試験した。第１のＦＦＰＥ（ホルマリン固定パラフィン包埋）ＬＮ組織セットを、ステージＩＩＡ（Ｔ３／Ｎ０／Ｍ０）結腸癌を有する患者９８名（その全員が１９９１年〜１９９８年の間に治療としての外科的切除を受けていた）から採取した。これらの患者由来のＦＦＰＥ  ＬＮ組織を、Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ（ＵＭａｓｓ（Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡ，ＵＳＡ））のアーカイブから入手した。１９９９年〜２００５年の間にステージＩおよびＩＩ結腸癌であると診断された患者２５名の第２のコホートを、Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｏｔｅｌ−Ｄｉｅｕ  ｄｅ  Ｑｕｅｂｅｃ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ（ＨＤＱ（Ｑｕｅｂｅｃ，Ｑｃ，Ｃａｎａｄａ））のアーカイブから入手した。腫瘍の外科的切除後、これら２つのコホートからの患者１２３名の中で、アジュバント処置を受けた者はいなかった。彼らの中で、選択された７３の症例（１２８３のＬＮ）は、少なくとも、（１）遠位もしくは近位での再発または非再発症例においては３６か月の追跡の場合と、（２）ｑＲＴ−ｑＰＣＲによって試験された最低で１０のＬＮの場合での症例のみを含むように構成した。
【０１９６】
ＧＣＣ  ｍＲＮＡ発現レベルの測定に用いられる方法は、ＲＴ−ｑＰＣＲである。ＧＣＣリバースプライマーおよびヒトＡＣＴＢもしくはヒトβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）リバースプライマーを用いる遺伝子特異的二重ｃＤＮＡ合成を含む第１のステップは、核酸抽出物およびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ））を使用し、製造業者によって推奨される２０μＬの反応容量で実施した。次に、ｃＤＮＡ産物（試料、外部標準および対照に由来するものを含む）を三重に使用し、二重リアルタイムＰＣＲを行い、ＧＣＣ、ＡＣＴＢおよびＧＵＳＢにおけるサイクル閾値（Ｃｔ）を決定した。ここで、ＧＣＣ  Ｃｔ値は、標準曲線を用いる内挿により、ＧＣＣコピーに変換することができた。
【０１９７】
ＲＴ−ｑＰＣＲプレート設定は、限定はされないが、少なくとも、ヒトリンパ節全ＲＮＡに加えられた３つの異なる濃度のＧＣＣインビトロ転写産物（ＩＶＴ）で作製される対照材料、酵母ＲＮＡで希釈された精製ＧＣＣ  ＩＶＴの連続希釈から作成される較正曲線および非鋳型対照を含むように設計した。各プレート内で使用される対照材料は、各実行を実証し、かつ変動性をモニタリングするのに役立った。
【０１９８】
１３．検出率および転帰との相関
ＧＧＣ  ｍＲＮＡ検出率とＧＣＣ陽性リンパ節関与を有する患者において疾患再発を来す可能性との間の関係を、ＧＣＣ／ＧＵＳＢおよびＧＣＣ／ＡＣＴＢ試験の間で比較した。この比較を可能にするため、ＲＴ−ｑＰＣＲによって得られるすべてのＧＣＣ  Ｃｔ測定値を、標準曲線に対する内挿により、ＧＣＣコピーに変換した。受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線分析を行い、ＧＣＣ陽性試験結果を判定するのに用いられる感度、特異度およびカットオフ値を決定し（図２５）、ここで感度は、限定はされないが、試験による３６か月の追跡後の再発症例の検出率として本実施例中で定義されている。図２５に示されるように、ＧＣＣ／ＧＵＳＢアッセイによると、曲線下面積（ＡＵＣ）指数が、参照ＧＣＣ／ＡＣＴＢ試験の場合に対して１１％増加し（０．６９２対０．６２３）、それは所与のカットオフにおける感度が向上したことと相関する。例えば、２５ＧＣＣコピーのカットオフを適用する場合、ＧＣＣ／ＧＵＳＢアッセイでの感度は、ＧＣＣ／ＡＣＴＢ参照試験の場合の６５％（９５％ＣＩ：３８％〜８６％）に対して８２％（９５％ＣＩ：５７％〜９６％）になる。
【０１９９】
表１０は、予め選択されたカットオフでの検出率と再発疾患を来すリスクのある患者の割合との間の関連性を示す。それに続く分析は、２つの異なるカットオフ値、すなわち（１）１００ＧＣＣコピーおよび（２）２５ＧＣＣコピーを用いて行った。１００ＧＣＣコピーのカットオフ値を用い、患者３２名（４４％）がＧＣＣ／ＧＵＳＢの場合にＧＣＣ陽性であったが、ＧＣＣ／ＡＣＴＢ試験においては１２名（１６％）であった。２５ＧＣＣコピーのカットオフ値の場合に、同様の差異が認められ、４３の症例（５９％）がＧＣＣ／ＧＵＳＢアッセイの場合にＧＣＣ陽性であったが、ＧＣＣ／ＡＣＴＢアッセイの場合、２７（３７％）であった（表１０）。これらの結果は、ＧＣＣ／ＧＵＳＢ試験の場合にＧＣＣ検出率の明らかな増加を示す。さらに、図２６に図示されるように、ＧＣＣ／ＧＵＳＢ試験の優れた感度は、疾患再発をさらに予測する閾値でのＬＮにおけるＧＣＣ  ｍＲＮＡレベルの同定を可能にする。ＧＣＣ陽性試験を受ける患者における再発のリスクとＧＣＣ陽性試験結果について判定するのに用いられるＧＣＣ  ｍＲＮＡレベルとの間の強い相関（ｒ２＞０．９５）が、ＧＣＣ／ＧＵＳＢアッセイの場合に限って得られうる（図２６）。
【０２００】
【表１４】
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【０２０１】
１３．ＧＣＣステータスおよび無再発生存分析
ＧＣＣステータスに基づく再発の相対リスクの層別化を、異なるカットオフ値について評価した（表１１）。すべての分析によると、両方のＲＴ−ｑＰＣＲアッセイで試験したＧＣＣ陰性およびＧＣＣ陽性結果の間での再発のリスクと再発または無再発生存（ＲＦＳ）との区別が示された。ＧＣＣ／ＧＵＳＢ試験の性能を、１００ＧＣＣコピーおよび２５ＧＣＣコピーカットオフ値を用い、ＧＣＣ／ＡＣＴＢ参照試験の場合と比較した。表１１は、ＧＣＣ／ＧＵＳＢ試験で試験したＧＣＣ陰性患者が、１００および２５コピーそれぞれのカットオフ値で、参照ＧＣＣ／ＡＣＴＢ試験が用いられる場合（８０％および８５％）より高いＲＦＳ（８８％および９０％）を有することを示す。本実施例は、ＧＣＣ／ＧＵＳＢ試験が、陰性予測値（すなわち、疾患を発症することのない、ＧＣＣ陰性試験結果を有する患者の割合）を判定するのに、参照試験に対していかに有益でありうるかを例示する。
【０２０２】
Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ分析は、両方のＲＴ−ｑＰＣＲアッセイによって評価した患者７３名を用いて実現した（図２７）。ＲＦＳにおいて認められるように、ＧＣＣ／ＧＵＳＢ試験の主な効果は、ＧＣＣ陰性群において再発率を低下させることである［１００コピーで１２％（５／４１）対２０％（１２／６１）および２５コピーで１０％（３／３０）対１５％（７／４６）］。
【０２０３】
ＧＣＣ／ＧＵＳＢ試験の別の改善が、反応における異なる量および質のＲＮＡインプットの場合に認められる変動を補う信頼できる参照遺伝子に基づいて相対定量を利用するという可能性であり、これは、ＡＣＴＢの場合には、その高い発現が、この参照遺伝子を、ＧＣＣとの二重アッセイにおいて試験される場合にバイアスを生じる様々なストレス因子（年数、固定液のタイプ、温度など）に対して安定性をもたらしたことが理由で、利用できない特徴である。相対定量に基づく方法を用い、−５．９のΔＣｔ（ＣｔＧＵＳＢ−ＣｔＧＣＣ）に対応するカットオフを用い、再発のリスクを計算し（表１１）、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ分析を行った（図２８）。そのカットオフを用いて得られたＧＣＣ陽性結果の比率（５５％；４０／７３）は、２５コピーカットオフを用いて得られたものと酷似しており（５９％；４３／７３）、唯一の差異は、２５コピーカットオフの場合に微陽性であるが、ＧＵＳＢレベルが高いことからΔＣｔにおいて陰性である、再発を有しない３つの標本であった。その結果、Δ−Ｃｔの計算を用いる、ＧＣＣステータスに基づくハザード比（ＨＲ）は、ＧＣＣ陽性ステータスを分離するのに用いられる任意の他の方法の場合よりさらに高かった（表１２）。全体として、これらの結果は、ＧＣＣ／ＧＵＳＢ試験がさらなるＧＣＣ陽性試料を同定できるだけでなく、ＧＣＣ陽性群および陰性群の間を区別する統計的検出力を高めうることを示す。−５．９のΔ−Ｃｔのカットオフを用いて分類されたＧＣＣ陰性ステージＩＩ患者が９％の再発率（ＲＲ）を有し、これはＳＥＥＲデータベース内の標準のステージＩ患者の場合に認められるものに酷似する（７％）一方、ＧＣＣ陽性患者はむしろステージＩＩＩＢ患者（３６％）により近い再発率（３５％）を示すことは明白である。
【０２０４】
このコホートの２つの部位に由来する標本を個別に分析することにより（表１３）、ＧＵＳＢおよびＧＣＣΔ−Ｃｔカットオフ点を調節することで、再発予測および陰性予測値（ＮＰＶ）または陽性予測値（ＰＰＶ）の精度を高めうることが明示されうる。
【０２０５】
【表１５】
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【０２０６】
【表１６】
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【０２０７】
【表１７】
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【０２０８】
１４．不一致および一致症例における再発リスクの評価
異なるカットオフレベルを用い、両アッセイの場合に見られる検出率を比較した。この比較の主目的は、ＧＣＣ／ＧＵＳＢアッセイの場合にＧＣＣ陽性であると同定されたが、過去にＧＣＣ／ＡＣＴＢアッセイを用いてＧＣＣ陰性であることが見出された患者に関連した再発のリスクが有意であるか否かを判定することであった。表１４は、ＧＣＣ／ＡＣＴＢおよびＧＣＣ／ＧＵＳＢ試験からの組み合わされた結果を伴う検出率および関連する再発のリスクを示す。興味深いことに、２５ＧＣＣコピーのカットオフ値で、不一致患者の中での再発のリスク（すなわち、ＧＣＣ／ＧＵＳＢ試験の場合にＧＣＣ  ｍＲＮＡで陽性であるが、ＧＣＣ／ＡＣＴＢの場合に陰性であると見なされた患者（１９％；９５％ＣＩ：１０％〜２８％））は、両試験を用いて一致するＧＣＣ陰性結果を有する患者の場合に認められる比率（１０％；９５％ＣＩ：３％〜１７％）より２倍高く、これは、ＧＣＣ／ＧＵＳＢアッセイの場合に認められる検出率の増加が、結腸癌患者における疾患再発のリスクの増大にも関連することを示唆する。それに対し、ＧＣＣ／ＡＣＴＢアッセイで陽性試験応答であってもＧＣＣ／ＧＵＳＢで陰性応答の場合に関連した再発のリスクは、２５ＧＣＣコピーの同じカットオフ値を用いると０である。
【０２０９】
【表１８】
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【０２１０】
１５．再発リスクとＧＣＣ陽性リンパ節の数との相関
ＧＣＣ／ＧＵＳＢ試験を用い、症例ごとのＧＣＣ陽性ＬＮの数に基づき、再発のリスクを層別化できるか否かを判定するため、単一のＧＣＣ陽性ＬＮを有する場合または２つ以上のＧＣＣ陽性ＬＮを有する場合で二分されたＧＣＣ陽性患者を用いてＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ分析を行った（図２９）。ＧＣＣ／ＡＣＴＢでの比較についても、１００ＧＣＣコピーおよび２５ＧＣＣコピーのカットオフ値を用いて検討された。１００ＧＣＣコピーのカットオフ値を用い、少なくとも２つのＧＣＣ陽性ＬＮを有する患者の数は、ＧＣＣ／ＧＵＳＢアッセイの場合より４倍高く、これは、ＧＣＣ陽性患者の数だけでなく、所与の患者におけるＧＣＣ陽性ＬＮの数が増加することを示す。再発に対する平均時間における差異が、ＧＣＣ／ＧＵＳＢアッセイの場合に、ＧＣＣ陽性群とＧＣＣ陰性群の間でより重要であっても（ｐ＝０．００６３対ｐ＝０．０３２６（ＧＣＣ／ＡＣＴＢアッセイの場合））、ＧＣＣ陽性患者における全再発率は、再発疾患を発症することのない陽性症例の数の大幅な増加に起因して依然として低めである。さらに、ＧＣＣ陽性状態が相対定量（ΔＣｔ値）に基づいて判定された際、各群において認められた全再発率は、２５ＧＣＣコピーのカットオフ値を用いるＧＣＣ／ＡＣＴＢアッセイの場合に認められたものと類似した（図３０）。最後に、ｐＮ１およびｐＮ２に関するＡＪＣＣの標準的定義の局所ＬＮ関与への適用によると、ＧＣＣ／ＡＣＴＢアッセイの場合に＞４のＬＮ陽性を有する患者が、１〜３の陽性ＬＮを有する患者に類似した予後リスクを示す（それぞれ４３％対４０％）ことが示された（表１５）。図３１は、ＧＣＣ／ＧＵＳＢ試験による、１〜３の陽性ＬＮを有する患者における再発の相対リスクが、＞４のＬＮ陽性を有する患者の場合より明らかに低い（２６％対４４％）ことを示す。まとめると、これらの結果は、ＧＣＣ／ＧＵＳＢ試験が、関与するＬＮの数を統合することにより、予後リスク層別化を改善しうることを示す。
【０２１１】
【表１９】
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【０２１２】
試験結果
先行試験では、再発および無再発生存に対する時間におけるＧＣＣ／ＡＣＴＢ試験の予後値が、ステージＩおよびＩＩ結腸癌患者から採取された新鮮凍結ＬＮにおいて示された（Ｗａｌｄｍａｎら、ＪＡＭＡ、３０１（７）、７４５−７５２頁（２００９年））。それに関連し、標準曲線に対する外挿によって得られる絶対定量の代わりに相対定量を用いる、新規に設計されたＧＣＣ／ＧＵＳＢアッセイによるこれらの成果を確認しようとした。最初に、ＧＣＣ／ＧＵＳＢが、１０〜１５年経過した臨床試料の情報の速度を高めることを確認した。再発症例の検出率もまた、一部には相対定量が確実に安定な参照遺伝子によって確定されたことが理由で、高めることができた。リンパ節陰性患者の割合が高い方が、新規アッセイでＧＣＣ陽性であると分類されたが、予後層別化全体もまた、実際に再発したＧＣＣ陰性患者が１０％未満、すなわちＣＲＣステージＩ患者について報告された比率に近いもの（５〜８％）であったことから、改善された。ＧＣＣ／ＧＵＳＢアッセイの場合に得られる情報の速度の改善および検出率の改善を超えて、ここに示される結果はまた、ＧＣＣ／ＧＵＳＢアッセイが、再発および無再発生存に関する相対リスクにおける予後層別化の統計的検出力を改善しうることを示す。最後に、関与ＬＮの数が考慮される場合、層別化が、ＧＣＣ／ＧＵＳＢアッセイを用いる分子病期分類により、参照試験の場合よりも改善される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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