【手続補正書】
【提出日】平成21年10月15日(2009.10.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）ピルビン酸からアセト乳酸へ（経路ステップａ）、
ii）アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸へ（経路ステップｂ）、
iii）２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸からα−ケトイソ吉草酸へ（経路ステップｃ）、
iv）α−ケトイソ吉草酸からイソブチルアルデヒドへ（経路ステップｄ）、および
ｖ）イソブチルアルデヒドからイソブタノールへ（経路ステップｅ）
よりなる群から選択される基質から産物への変換を触媒するポリペプチドをコードする、少なくとも１つのＤＮＡ分子を含んでなる組換え微生物宿主細胞であって、少なくとも１つのＤＮＡ分子が前記微生物宿主細胞に対して異種であり、前記微生物宿主細胞がイソブタノールを生成する組換え微生物宿主細胞。
【請求項２】
ｉ）ピルビン酸からアセト乳酸へ（経路ステップａ）、
ii）アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸へ（経路ステップｂ）、
iii）２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸からα−ケトイソ吉草酸へ（経路ステップｃ）、
iv）α−ケトイソ吉草酸からイソブチリル−ＣｏＡへ（経路ステップｆ）、
ｖ）イソブチリル−ＣｏＡからイソブチルアルデヒドへ（経路ステップｇ）、および
vi）イソブチルアルデヒドからイソブタノールへ（経路ステップｅ）
よりなる群から選択される基質から産物への変換を触媒するポリペプチドをコードする、少なくとも１つのＤＮＡ分子を含んでなる組換え微生物宿主細胞であって、少なくとも１つのＤＮＡ分子が前記微生物宿主細胞に対して異種であり、前記微生物宿主細胞がイソブタノールを生成する組換え微生物宿主細胞。
【請求項３】
ｉ）ピルビン酸からアセト乳酸へ（経路ステップａ）、
ii）アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸へ（経路ステップｂ）、
iii）２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸からα−ケトイソ吉草酸へ（経路ステップｃ）、
iv）α−ケトイソ吉草酸からバリンへ（経路ステップｈ）、
ｖ）バリンからイソブチルアミンへ（経路ステップｉ）、
vi）イソブチルアミンからイソブチルアルデヒドへ（経路ステップｊ）、および
vii）イソブチルアルデヒドからイソブタノールへ（経路ステップｅ）
よりなる群から選択される基質から産物への変換を触媒するポリペプチドをコードする、少なくとも１つのＤＮＡ分子を含んでなる組換え微生物宿主細胞であって、少なくとも１つのＤＮＡ分子が前記微生物宿主細胞に対して異種であり、前記微生物宿主細胞がイソブタノールを生成する組換え微生物宿主細胞。
【請求項４】
ピルビン酸からアセト乳酸への基質から産物への変換を触媒するポリペプチドがアセト乳酸シンターゼである請求項１、２または３のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項５】
アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸への基質から産物への変換を触媒するポリペプチドが、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼである請求項１、２または３のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項６】
２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸からα−ケトイソ吉草酸への基質から産物への変換を触媒するポリペプチドが、アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼである請求項１、２または３のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項７】
イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの基質から産物への変換を触媒するポリペプチドが、分枝アルコールデヒドロゲナーゼである請求項１、２または３のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項８】
α−ケトイソ吉草酸からイソブチルアルデヒドへの基質から産物への変換を触媒するポリペプチドが、分枝α−ケト酸脱炭酸酵素である請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項９】
α−ケトイソ吉草酸からイソブチリル−ＣｏＡへの基質から産物への変換を触媒するポリペプチドが、分枝ケト酸デヒドロゲナーゼである請求項２に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
イソブチリル−ＣｏＡからイソブチルアルデヒドへの基質から産物への変換を触媒するポリペプチドが、アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼである請求項２に記載の宿主細胞。
【請求項１１】
α−ケトイソ吉草酸からバリンへの基質から産物への変換を触媒するポリペプチドが、アミノ基転移酵素である請求項３に記載の宿主細胞。
【請求項１２】
バリンからイソブチルアミンへの基質から産物への変換を触媒するポリペプチドが、バリン脱炭酸酵素である請求項３に記載の宿主細胞。
【請求項１３】
イソブチルアミンからイソブチルアルデヒドへの基質から産物への変換を触媒するポリペプチドが、ωアミノ基転移酵素である請求項３に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
細胞が、細菌、シアノ細菌、糸状菌、および酵母よりなる群から選択される請求項１、２または３のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
細胞が、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、パエニバシラス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、およびサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）よりなる群から選択される属の一員である請求項１４に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
細胞が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、アルカリゲネス・ユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）、バシラス・リチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、パエニバシラス・マセランス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ）、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ラクトバシラス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス・ガリナラム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）およびサッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）よりなる群から選択される請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
アセト乳酸シンターゼが、配列番号２、配列番号１７８、および配列番号１８０よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項４に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼが、配列番号４３、配列番号１８１、配列番号１８３、および配列番号１８５よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項５に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼが、配列番号６、配列番号１８６、配列番号１８８、および配列番号１９０よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項６に記載の宿主細胞。
【請求項２０】
分枝アルコールデヒドロゲナーゼが、配列番号１０、配列番号１９９、配列番号２０１、配列番号２０３、および配列番号２０４よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項２１】
分枝α−ケト酸脱炭酸酵素が、配列番号８、配列番号１９３、配列番号１９５、および配列番号１９７よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項８に記載の宿主細胞。
【請求項２２】
分枝ケト酸デヒドロゲナーゼが４つのサブユニットを含んでなり、前記サブユニットのアミノ酸配列が、配列番号２１４、配列番号２１６、配列番号２１８、配列番号２２０、配列番号２１０、配列番号２０８、配列番号２０６、および配列番号２１２よりなる群から選択される請求項９に記載の宿主細胞。
【請求項２３】
アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼが、配列番号２２２、配列番号２２４、配列番号２２６、配列番号２２８、および配列番号２３０よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項１０に記載の宿主細胞。
【請求項２４】
アミノ基転移酵素が、配列番号２３２、配列番号２３４、配列番号２３６、配列番号２３８、および配列番号２４０よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項に１１記載の宿主細胞。
【請求項２５】
バリンデヒドロゲナーゼが、配列番号２４２および配列番号２４４よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項１１に記載の宿主細胞。
【請求項２６】
バリン脱炭酸酵素が配列番号２４６で示されるアミノ酸配列を有する請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項２７】
ωアミノ基転移酵素が、配列番号２４８、配列番号２５０、配列番号２５２、および配列番号２５４よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項１３に記載の宿主細胞。
【請求項２８】
宿主細胞が通性嫌気性菌である請求項１、２または３のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項２９】
１）請求項１〜２８のいずれか１項に記載の組換え微生物宿主細胞を提供するステップと、
２）イソブタノールが生成される条件下において発酵培地中で上記の宿主細胞を発酵性炭素基質と接触させるステップと
を含む、イソブタノールの製造方法。
【請求項３０】
発酵性炭素基質が、単糖類、オリゴ糖類、および多糖類よりなる群から選択される請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
炭素基質が、グルコース、スクロース、およびフルクトースよりなる群から選択される請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
それによってイソブタノールが生成される条件が嫌気性である請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
それによってイソブタノールが生成される条件が微好気性である請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
宿主細胞を最少培地中で炭素基質に接触させる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
請求項２９に記載の方法によって生成されるイソブタノール含有発酵培地。