【手続補正書】
【提出日】平成21年5月11日(2009.5.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
雄性不稔性植物のホモ接合体劣性状態を維持する方法であって、
（ａ）Ｍｓ２６遺伝子のホモ接合体劣性対立遺伝子を含み、雄性不稔性である第１植物を準備すること；
（ｂ）Ｍｓ２６遺伝子のホモ接合体劣性対立遺伝子を含む第２植物に、ヘミ接合性状態の構築体を導入することであって、該構築体は、
（ｉ）該第１植物において発現されると雄性稔性を回復する、Ｍｓ２６ヌクレオチド配列を含む第１ヌクレオチド配列；
（ｉｉ）Ｍｓ２６の劣性対立遺伝子を含み、かつ該構築体を含まない該第２植物において生存可能な雄性配偶子が生産されるように、発現されると、該第２植物における生存可能な雄性配偶子の機能または形成を抑制する、第２ヌクレオチド配列
を含むことと；
（ｃ）該第２植物の雄性配偶子によって該第１植物を受精させ、該第１植物の該ホモ接合体劣性状態を維持する子孫を生産することと、
を含む、方法。
【請求項２】
前記第１ヌクレオチド配列が、雄性植物細胞に発現を優先的に指向させる第３ヌクレオチド配列に作動可能に連結されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１ヌクレオチド配列が、
ａ）配列番号２、４、または１８のアミノ酸配列のいずれか一つをコードする配列；
ｂ）配列番号１、３、７、または１７のうちのいずれかの配列；
ｃ）該配列のいずれかに対し少なくとも９０％の同一性を有する配列；
ｄ）６５℃における０．１ＳＳＣ、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳの洗浄の非常にストリンジェントな条件下で該配列のいずれかにハイブリダイズする配列；および、
ｅ）植物の雄性稔性にとって重要である機能的配列である、該配列のうちのいずれかの配列の断片、
から成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第１ヌクレオチド配列が、雄性植物細胞に発現を優先的に指向させる第３ヌクレオチド配列に作動可能に連結されている、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記第３ヌクレオチド配列が、誘発性の物質または状態の存在下においてのみ機能する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記第３ヌクレオチド配列が、５１２６、Ｍｓ２６、およびＭｓ４５の雄性組織調節配列から成る群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記第２ヌクレオチド配列が、雄性植物細胞に発現を優先的に指向させる第４ヌクレオチド配列に連結される、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記第２ヌクレオチド配列が、ＤＡＭメチラーゼ遺伝子、Ｚｅａ  ｍａｙｓアルファアミラーゼ遺伝子、および細胞毒素コード遺伝子のヌクレオチド配列から成る群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記第２ヌクレオチド配列が、植物の雄性配偶子に発現を優先的に指向させる第３ヌクレオチド配列に作動可能に連結されている、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記第４ヌクレオチド配列が、ポリガラクツロナーゼ４７遺伝子、Ｚｍ１３遺伝子、ペクチンメチルエステラーゼ遺伝子、カルモジュリン結合タンパク質遺伝子、アクチン脱重合因子遺伝子、プロルフィリン遺伝子、および硫化ペンタペプチドフィトスルフォキン遺伝子の調節領域から成る群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記構築体を有する植物細胞の選択のために使用することが可能な産物をコードする第５ヌクレオチド配列をさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１２】
前記第５ヌクレオチド配列が、赤色蛍光遺伝子、シアン蛍光タンパク質遺伝子、黄色蛍光タンパク質遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、緑色蛍光タンパク質遺伝子、アントシアニンｐ１遺伝子、およびフォスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼコード遺伝子から成る群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第５ヌクレオチド配列が、ポリガラクツロナーゼ４７遺伝子、Ｚｍ１３遺伝子、ペクチンメチルエステラーゼ遺伝子、カルモジュリン結合タンパク質遺伝子、アクチン脱重合因子遺伝子、プロルフィリン遺伝子、および硫化ペンタペプチドフィトスルフォキン遺伝子から成る群から選択される調節領域に作動可能に連結されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記構築体を有する植物を特定することによって前記第２植物を選択することをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１５】
前記第３ヌクレオチド配列が、
（ａ）配列番号５；
（ｂ）配列番号６；
（ｃ）配列番号７の塩基１から１０８８；
（ｄ）配列番号７の塩基８３０から９６２；
（ｅ）配列番号７の塩基８３０から９１４；
（ｆ）配列番号７の塩基９１７から９６２；
（ｇ）配列番号７の塩基８７５から９５４；
（ｈ）配列番号７の塩基９３５から９５４；
（ｉ）配列番号７の塩基８７５から９２４；
（ｊ）配列番号１９；
（ｋ）配列番号２０；および、
（ｌ）連結された配列の雄性組織発現にとって必須の機能的断片である、該配列のうちのいずれかの配列の断片、
から成る群から選択される、請求項２に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１２】
実施例５
配列と発現分析
ＳＢＭｕ２００−３．１ゲノムクローンおよびＭｓ２６−８．１ｃＤＮＡクローを、Ｌｏｆｔｓｔｒａｎｄ  Ｌａｂｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄに配列決定してもらった。Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．，Ｎｉｃｋｅｎ，Ｓ．，Ｃｏｕｌｓｏｎ  Ａ．Ｒ．（１９７７）“ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｃｈａｉｎ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５４６３−５４６７。これらの配列を図４と５に記載する。比較は図６に載せる。ｃＤＮＡ／ゲノム比較は、ゲノムクローンの中には５個のイントロンがあることを明らかにする。Ｍｕ８の挿入はエキソン１で起こっている。各コドンの第３位置におけるコドンの優勢および非ランダム性について試験したところ、ｃＤＮＡの主要ＯＲＦは、予想されるタンパク質コードＯＲＦと一致した。ゲノムクローンの位置１０８９にＭｅｔ開始コドン候補が存在する。ゲノムクロー
ンに関するｃＤＮＡ相同性は、ヌクレオチド１０９４から開始する。したがって、Ｍｓ２６−８．１は、完全長クローンを表すものではなく、Ｍｅｔ開始コドン候補までの５塩基を欠く。データベース探索から、酵母、植物、および哺乳類に見出されるＰ４５０に対し有意の相同性を示した。Ｐ４５０酵素は、広く研究され、三つの特徴的タンパク質ドメインが明らかにされている。Ｍｓ２６タンパク質は、真核細胞のＰ４５０に特徴的な、いくつかの構造的モチーフを含む。その中には、ヘム結合ドメインＦｘｘＧｘＲｘＣｘＧ（ドメインＤ、配列番号２４）、ドメインＡ  Ａ／ＧＧＸＤ／ＥＴＴ／Ｓ（ジオキシゲン−結合性）、ドメインＢ（ステロイド−結合性）、およびドメインＣが含まれる。ＭＳ２６では、高度に保存されるヘム結合性モチーフが、Ｃ末端から５１アミノ酸離れたところにＦＱＡＧＰＲＩＣＬＧ（配列番号２５）として見つかった。ジオキシゲン結合ドメインＡＧＲＤＴＴ（配列番号３５）は、アミノ酸３２０−３２５の間に配されていた。ステロイド結合性ドメインは、ＬＶＹＬＨＡＣＶＴＥＴＬＲ（配列番号２７）アミノ酸３９７−４０９と認められた。Ｇｅｎｅｂａｎｋデータベースにおいて検出されたもっとの有意性の高い相同配列は、コメから演繹されたタンパク質配列である（Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセス番号、１９０７１６５１）。２番目に相同性が高い配列は、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＰ４５０遺伝子候補（ＣＹＰ７０４Ｂ１）である。この機能も未知である。図１７Ａは、ＣＹＰ７０４Ｂ１（配列番号１２）と、Ｍｓ２６（配列番号１３）との配列整列を示す。いくつかのＰ４５０遺伝子の系統樹分析を行ったところ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａおよびＶｉｃｉａ  ｓａｔｉｖａに認められる、脂肪酸オメガ−ヒドロキシル化に与るＰ４５０にもっとも近縁であることが明らかになった。ｍｓ２６’−０４０６欠失突然変異において誘発された翻訳フレームシフトが、ヘム結合ドメインの活性を破壊し、不稔性をもたらしたと考えられる。図１８の比較を参照されたい（Ｍｓ２６  ｃＤＮＡは配列番号１４；稔性エキソン５領域は配列番号１５、および、不稔性エキソン５領域は、配列番号１６）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３０】
実施例８
選択可能なマーカー、雄性不稔遺伝子Ｍｓ４５、および花粉傷害性遺伝子を含む植物形質転換ベクターの構築
図２２に示す、ＰＨＰ１８０９１と表示される構築体を、下記のＤＮＡ成分を集合することによって作製する。
１．  プラスミドｐＳＢ１１バックボーンＤＮＡ（３５ＳＧＵＳおよび３５ＳＢＡＲ遺伝子を担うＥｃｏＲＩ断片を欠くｐＳＢ３１、Ｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．(１９９６)１４：７４５−７５０）。このＤＮＡバックボーンは、ｐＢＲ３２２由来のＴ−ＤＮＡ境界部配列、および複製起点を含む。
２．  カリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、およびターミネーター（Ｆｒａｎｋ  ｅｔ  ａｌ．１９８０，Ｃｅｌｌ２１：２８５−２９４のそれぞれ、ヌクレオチド６９０８−７４３２および７４３９−７６３２）の転写調節の下における、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｒｉｄｏｃｈｏｍａｇｅｎｅｓの、酵素フォスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）（アクセス番号Ａ０２７７４のヌクレオチド６−５５７、Ｓｔｒａｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，欧州特許出願公開第０２７５９５７−Ａ）をコードする３５Ｓ：ＰＡＴ遺伝子。
３．  トウモロコシ葯特異的プロモーター５１２６（ヌクレオチド９８５−１４９０、アクセス番号Ｉ７５２０４）の調節の下における、トウモロコシ雄性稔性遺伝子のコード領域を含む５１２６：Ｍｓ４５遺伝子（ヌクレオチド１３９２−３３４３、アクセス番号ＡＦ３６０３５６、Ａｌｂｅｒｔｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｂｏｔ．（１９９３）８０：１６）。
４．  トウモロコシ花粉特異的プロモーターＰＧ４７（ヌクレオチド１−２８７０、アクセス番号Ｘ６６６９２、Ａｌｌｅｎ  ａｎｄ  Ｌｏｎｓｄａｌｅ，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．(１
９９３)３：２６１−２７１）によって駆動される、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮ
Ａ（アデノシン−Ｎ６）メチルトランスフェラーゼ（ＤＡＭ）のコード領域を含むＰＧ４７：ＤＡＭ（ヌクレオチド１９５−１１３２、Ｂｒｏｏｋｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９８３）１１：８３７−８５１）。この遺伝子の転写は、じゃがいもプロテイナーゼ阻害剤ＩＩ（ＰｉｎＩＩ）ターミネーター（ヌクレオチド２−３１０、Ａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ（１９８９）１：１１５−１２２）によって終結される。
５．  Ｍｓ４５：Ｍｓ４５を含む、３．３４ｋｂ  ＮｃｏＩ  ＤＮＡ断片が、ｐＵＣ８において３５Ｓ：ＰＡＴの上流においてクローンされ、ＰＨＰ６６４１を作製した。ＰＨＰ６６４１から得られたＭｓ４５：Ｍｓ４５−３５Ｓ：ＰＡＴを含む、４．７ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ  ＤＮＡ断片をｐＳＢ１１にクローンして、ＰＨＰ１０８９０を作製した（Ｃｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｘ．Ｐｌａｎｔ  Ｒｅｐｒｏｄ．（２００１）１４：１３５−１４２）。ＰＨＰ１０８９０における、天然のＭｓ４５プロモーターを、トウモロコシ５１２６プロモーターを含む、５２８ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｃｏＩ断片と置換して、ＰＨＰ１１９４３を作製した。
６．  ＰＧ４７プロモーターを含む２．８７ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｃｏＩ断片を、ＤＡＭコード領域、ＰｉｎＩＩターミネーター、および、ＰＨＰ１０４０４から得られた３５Ｓエンハンサー（Ｕｎｇｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．（２００１）１０：４０９−４２２）を含む、０．８ｋｂのＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片と連結し、ＰＧ４７：ＤＡＭ遺伝子融合（３５Ｓエンハンサーと共に）を含む、３．６７ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断片を作製した。次に、この３．６７ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ断片を、ＰＨＰ１１９４３のＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローンし、ＰＨＰ１８０７１を作製した。このＰＨＰ１８０７１を、プラスミドｐＳＢ１を担うＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株ＬＢ
Ａ４４０４の中に、３親交配によって導入した（Ｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９６）１４：７４５−７５０）。この、ＰＨＰ１８０７１およびｐＳＢ１の共同組み込み体をＰＨＰ１８０９１と名づけた。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１】図１は、雄性稔性遺伝子Ｍｓ２６の配座マップである。
【図２】図２Ａは、Ｍｕ８プローブとハイブリダイズする、ｍｓ２６：：Ｍｕ８ファミリーのサザーンブロットであり、図２Ｂは、ｍｓ２６から単離したＰｓｔｌ断片とハイブリダイズするｍｓ２６−ｍ２：：Ｍｕ８ファミリーのサザーンブロットである。
【図３】図３は、Ｍｓ２６遺伝子から単離されたＰｓｔＩ断片とハイブリダイズさせたノーザンブロット分析ゲルである。
【図４】図４Ａ−４Ｄは、Ｍｓ２６の配列である（ｃＤＮＡは配列番号１、タンパク質は配列番号２および３４である）。
【図５】図５Ａ−５Ｃは、Ｍｓ２６のゲノム配列である（また、配列番号７とも呼ばれる）。
【図６】図６Ａ−６Ｄは、Ｍｓ２６のゲノム配列（配列番号７の残基１０５１−１４５０、１５０１−２１００、および２２０１−３３２６）と、Ｍｓ２６のｃＤＮＡ（配列番号１）との比較である。
【図７】図７Ａは、種々の植物組織における発現を示すノーザン分析ゲルを示し、図７Ｂは、小胞子発生の発現段階を示すゲルである。
【図８】図８は、Ｍｓ２６のプロモーター全長である（配列番号５）。
【図９】図９は、Ｍｓ２６プロモーターの選ばれた領域の欠失の後に見られるルシフェラーゼ活性を示す棒グラフである。
【図１０】図１０は、Ｍｓ２６プロモーターの必須領域（配列番号６）を示す。
【図１１】図１１は、Ｍｓ２６の必須プロモーター断片の選ばれた小（９−１０ｂｐ）領域において、制限酵素リンカー走査による置換後に見られる、ルシフェラーゼ活性を示す棒グラフである。
【図１２Ａ】図１２Ａおよび１２Ｂは、ソルガム円錐花序のＭｓ２６オーソログのヌクレオチド配列（配列番号３）と、トウモロコシＭｓ２６  ｃＤＮＡ（配列番号１の残基２０１−７５０）との比較、および、ソルガムタンパク質配列（配列番号４）と、トウモロコシＭｓ２６タンパク質（配列番号２の残基８７−２４４）との比較である。
【図１２Ｂ】図１２Ａおよび１２Ｂは、ソルガム円錐花序のＭｓ２６オーソログのヌクレオチド配列（配列番号３）と、トウモロコシＭｓ２６  ｃＤＮＡ（配列番号１の残基２０１−７５０）との比較、および、ソルガムタンパク質配列（配列番号４）と、トウモ
ロコシＭｓ２６タンパク質（配列番号２の残基８７−２４４）との比較である。
【図１３】図１３は、雄性不稔性遺伝子ｍｓ２６のマッピングを表す。
【図１４】図１４は、ｍｓ２６−ｒｅｆ（配列番号８）の欠損領域と、野生型Ｍｓ２６（配列番号９）との配列比較を示す。
【図１５】図１５は、ｍｓ−ｒｅｆ内部のトランスポゾン配列を示す（配列番号１０）。
【図１６】図１６は、ｍｓ２６−ｒｅｆの全体配列（配列番号１１）を示す。
【図１７】図１７Ａは、ＣＹＰ７０４Ｂ１、Ｐ４５０遺伝子（配列番号１２）の領域と、Ｍｓ２６（配列番号１３）の領域の間の、翻訳タンパク質配列の整列を示す。図１７Ｂは、選ばれたＰ４５０遺伝子の系統樹分析を示す。
【図１８】図１８は、ヘム結合ドメインのフレームシフトを示す。ここには、Ｍｓ２６  ｃＤＮＡの領域（配列番号１４、および２８−２９）、稔性植物（配列番号１５、および３０−３１）および不稔性植物（配列番号１６、および３２−３３）のエキソン５のゲノム領域の、翻訳配列の整列が示される。
【図１９】図１９は、コメのＭｓ２６  ｃＤＮＡ（配列番号１７）およびタンパク質（配列番号１８）を示す。
【図２０】図２０は、トウモロコシ（配列番号５の残基６５０−１０９１）、ソルガム（配列番号１９）、およびコメ（配列番号２０）の整列を示す。
【図２１】図２１は、トウモロコシＭｓ２６タンパク質（配列番号２１）、コメＭｓ２６タンパク質（配列番号１８）、ソルガムＭｓ２６タンパク質（配列番号２２）の整列を、共通配列と共に示す。
【図２２】図２２は、花粉プロモーター、細胞傷害性遺伝子、および選択可能マーカーと共にＭｓ４５稔性遺伝子を含むＰＨＰ１８０９１のプラスミドマップである。
【図２３】図２３は、花粉プロモーターを有するＭｓ２６稔性遺伝子、細胞傷害性遺伝子、および選択可能マーカーを含むＰＨＰ２４１０１のプラスミドマップである。
【図２４】図２４は、Ｚｅａ  ｍａｙｓのα−アミラーゼ１コード領域の配列（配列番号２６（ＤＮＡ）および３６（タンパク質））を示す。