【手続補正書】
【提出日】平成21年9月3日(2009.9.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
該薬剤は、ペプチド、ペプチド様小型分子、またはそれらの組み合わせのいずれかであってもよい。ある実施態様では、薬剤は、アミノ酸配列LGIPEQEY（配列番号１）を含むペプチドである。別の実施態様では、薬剤は、アミノ酸配列LGIPEQEY（配列番号１）を含むペプチド様分子であって、標的部位においてcaPCNA分子と相互作用する分子である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
ある実施態様では、薬剤は、標識配列をさらに含むペプチドである。標識配列は、アミノ酸配列RYIRS（配列番号３８）を含んでもよい。どのような転位配列であっても、本実施態様において使用するのに好適である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
caPCNA細胞相互作用の特異的抑制因子を獲得するには、caPCNA由来ペプチド、例えば、アミノ酸配列LGIPEQEY（配列番号１）を持つペプチドの構造または配列情報に基づく合理的薬剤設計方法論の導入も可能である。ある実施態様では、薬剤は、細胞内タンパクに由来するペプチド断片である。ある実施態様では、この細胞内タンパクは、caPCNAと相互作用することが知られる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
増殖性細胞核抗原の癌特異的イソ型(caPCNA)を発現する悪性細胞の、インビボ細胞増殖を抑えるための治療用組成物であって、該組成物は、アミノ酸配列LGIPEQEY（配列番号１）、またはそれと機能的に等価な構造またはペプチド様分子を含み、該ペプチド分子は、caPCNAのアミノ酸配列に由来することを特徴とする。ある実施態様では、このペプチド分子はさらに、細胞を横切るペプチド取り込みを促進するペプチドドメインを含む。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
増殖性細胞核抗原の癌特異的イソ型(caPCNA)を発現する悪性細胞の、インビボにおける細胞増殖を抑えるためのリポソーム組成物であって、該組成物は、アミノ酸配列LGIPEQEY（配列番号１）を有するペプチド分子、またはそれと機能的に等価な構造またはペプチド様分子を含み、該ペプチド分子は、caPCNAのアミノ酸配列に由来することを特徴とする。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
癌細胞におけるタンパク-タンパク相互作用を選択的に阻害する、caPCNA由来ペプチドを発現する組み換え細胞。ある実施態様では、該caPCNA由来ペプチドは、アミノ酸配列LGIPEQEY（配列番号１）を含む。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
アミノ酸配列LGIPEQEY（配列番号１）およびペプチド転位配列を含む、合成ペプチド。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
増殖性細胞核抗原の癌特異的イソ型(caPCNA)を発現する悪性細胞の、細胞増殖を抑えるための治療用組成物であって、アミノ酸配列LGIPEQEY（配列番号１）を有するペプチド分子を含む。このペプチド分子は、細胞透過性であって、ペプチド転位配列を含む。このペプチドは、プロテアーゼ耐性を持つ。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
他の、好適なPCNA由来ペプチド阻害剤としては、VEQLGIPEQEY（配列番号２）、 LGIPEQEYSCVVK（配列番号３）、LGIPEQEYSCVVKMPSG（配列番号４）、EQLGIPEQEY（配列番号５）、QLGIPEQEY（配列番号６）、LGIPEQEYSCVVKMPS（配列番号７）、LGIPEQEYSCVVKMP（配列番号８）、LGIPEQEYSCVVKM（配列番号９）、LGIPEQEYSCVV（配列番号１０）、LGIPEQEYSCV（配列番号１１）、LGIPEQEYSC（配列番号１２）、LGIPEQEYS（配列番号１３）、および、LGIPEQEY（配列番号１）に隣接するさらに別のNH2およびCOOH末端アミノ酸の組み合わせ、が上げられる。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
本明細書に開示されるペプチドは、標準的ペプチド合成手順および装置を用いて合成するか、または市販のものを購入することが可能である（例えば、United Biochemical Research Co., Seattle WA）。ヒトのPCNA分子のアミノ酸126-133(LGIPEQEY)（配列番号１）を含み、次いで該ペプチドの細胞への取り込みを促進するための、インスリン受容体配列（RYIRS）（配列番号３８）を含む、caPCNA由来ペプチドは、インビトロにおいて癌細胞を選択的に抑制する。このペプチドの取り込みは、リン酸バッファー生食液（PBS）、または0.2-2% DMSOを含む無血清培地中で、ジメチルスルフォキシ(DMSO)の存在下に、このペプチドを、癌細胞と共に約4-24時間インキュベートすることによって開始した。このペプチドの取り込みはさらに、該ペプチドを、リポソーム処方の中に封入し、次いで、37℃で約4-24時間、癌細胞と共にインキュベートすることによっても効率的に仲介された。このペプチドはさらに、ドキソルビシンなどの化学療法用薬剤の細胞傷害作用を増強する。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
「caPCNA由来ペプチド」および「PCNA由来ペプチド」という用語は、ペプチド、PCNAの対応する領域と比べ、アミノ酸置換、アミノ酸類縁体、またはアミノ酸欠失を有する、修飾されたペプチド配列、および、PCNAの特定領域に対応するペプチド様分子、を意味する。PCNA由来ペプチドは、約5-50アミノ酸長、約5-20アミノ酸長、または約5-10アミノ酸長の範囲を持つことが可能である。PCNA由来ペプチドはさらに、精製タグ、例えば、his-タグ、FLAG-エピトープ、RYIRSタグ、および、細胞膜を横断するペプチド転位を促進する配列、を含むことが可能である。PCNA-由来ペプチドはさらに、癌細胞へのペプチド輸送を強化するために、その親油性に影響を及ぼすように修飾することも可能である。ペプチドは合成することが可能であり（「合成ペプチド」）、あるいはまた、組み換え技術によって生産することも可能である（「組み換えペプチド」）。これらのペプチドはさらに、caPCNA-タンパク相互作用の抑制効力にあまり影響を与えずに、そのインビボでの安定性を増すように加工することも可能である。本明細書に開示されるペプチドの抑制活性に事実上影響を及ぼさない突然変異、例えば、挿入、欠失、置換、アミノ酸修飾を含む突然変異、も含まれる。実質的に126-133番目の配列LGIPEQEY（配列番号１）から成るペプチドは、他の特異的、または非特異的配列を含んでもよい。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
このPCNA-由来ペプチドはさらに、癌細胞に存在する細胞表面受容体に対するリガンドに対して、融合されるか、または、他のやり方で連結させることが可能である。例えば、細胞増殖のマーカーである、ヒトのトランスフェリン受容体（hTfR）は、治療剤の標的として使用されるが、口内、肝臓、すい臓、前立腺、および他の癌において少なくとも100倍高く発現される(Lee et al., (2001) 「ヒトのトランスフェリン受容体に結合するペプチドの、受容体介在性の取り込み(“Receptor mediated uptake of peptides that bind the human transferrin receptor,”)」、Eur. J. Biochem., 268:2004-2012)。ペプチドHAIYPRH（配列番号１４）およびTHRPPMWSPVWP（配列番号１５）は、hTfRに特異的に結合するが、これらのペプチドは、hTfRに結合した巨大分子を標的とすることが可能であった(Lee、上記)。これらのペプチドは、生得リガンドであるTfとは重複しない部位に結合し、インビボでhTfR陽性細胞における細胞内経路にむけて巨大分子を標的とさせるのに有用である（Lee、上記）。このペプチドはさらに、ペプチド輸送を強化し、さらに、特異的輸送を強化するよう、PCNA-由来ペプチドを標的とするために使用することも可能である。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
caPCNA由来ペプチドと連結または融合するのに好適な、細胞透過性ペプチドまたはペプチドドメインの例としては、例えば、ある種のタンパクの形質導入ドメインに由来する小型のポリ塩基ペプチド、例えば、Antennapedia（Antp）ホメオドメインの第3ヘリックス、RYIRSタグ配列、ペネトラチン(RQIKIWFQNRRMKWKK)（配列番号１６）、Tat (GRKKRRQRRRPQ)（配列番号１７）、Transportan (GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL)（配列番号１８）、VP22
(DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVD)（配列番号１９）、両親媒性ペプチド（二級および一級）、MAP（KLALKLALKALKAALKLA）（配列番号２０）、KALA (WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA)（配列番号２１）、ppTG20 (GLFRALLRLLRSLWRLLLRA)（配列番号２２）、トリマー(VRLPPP)（配列番号２３）、P1 (MGLGLHLLVLAAALQGAWSQPKKKRKV)（配列番号２４）、MPG (GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV)（配列番号２５）、Pep-1 (KETWWETWWTEWSQPKKKRKV)（配列番号２６）、hGT (LGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP)（配列番号２７）、などが挙げられる。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
別の実施態様では、ca(cs)PCNA相互作用を阻害することが可能なペプチドとして、LGIPEQEY)（配列番号１）のNH2末端において、約+3個の連続的または非連続的な追加のアミノ酸を含むアミノ酸配列、および、LGIPEQEY（配列番号１）のCOOH末端において、約+9個の連続的または非連続的なアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するペプチドが挙げられる。例えば、これらのペプチドの内のいくつかとして、VEQLGIPEQEY（配列番号２）(+3-NH2末端)、LGIPEQEYSCVVK（配列番号３）（+5-COOH末端）、LGIPEQEYSCVVKMPSG（配列番号４）（+9-COOH末端）、EQLGIPEQEY（配列番号５）（+2-NH2末端）、QLGIPEQEY（配列番号６）(+1-NH2末端)、LGIPEQEYSCVVKMPS（配列番号７）（+8-COOH末端）、LGIPEQEYSCVVKMP（配列番号８）(+7-COOH末端)、LGIPEQEYSCVVKM（配列番号９）(+6-COOH末端)、LGIPEQEYSCVV（+4-COOH末端）（配列番号１０）、LGIPEQEYSCV（配列番号１１）（+3-COOH末端）、LGIPEQEYSC（配列番号１２）(+2-COOH末端)、LGIPEQEYS（配列番号１３）(+1-COOH末端)、およびLGIPEQEY（配列番号１）に隣接する、追加のNH2およびCOOH末端アミノ酸の組み合わせから成るアミノ酸配列、が挙げられる。これらのペプチドの特異性に影響を及ぼさない置換を含むアミノ酸突然変異で、csPCNA特異的抗体を生成するものは、本開示の範囲内にある。このペプチドのアミノ酸残基の内の一つ以上は、アミノ酸類縁体、または非天然アミノ酸によって置換されてもよい。さらに、本明細書に開示されるペプチドの配列に基づいて開発されるペプチド様分子も、csPCNAイソ型に対する抗体を生成するために使用することが可能である。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
リポソームは、p21waf1タンパクのカルボキシル領域、および／または、caPCNA抗原部位ペプチド（LGIPEQEY）（配列番号１）を含んでいた。24時間後、細胞を、ヨウ化プロピジウム、および蛍光標識アネキシンV抗体によって染色した。健康な増殖細胞は、図１の下段左パネルに示すように、抗体に対して不透過性であるが、一方、透過処理された健康細胞は、トランスフェクション試薬に対して感受性を持つが、依然として増殖し、ヨウ化プロピジウムによって染色された。アネキシンVによって染色される細胞は、アポトーシス細胞の誘発と関連した、あるレベルの傷害（図１の、下段右4分の1）、および／または、アポトーシスか壊死のどちらかによって死んだ細胞（図１、上段右4分の1）を示す。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６８】
図５に記載されるアッセイを用いて、PCNA aa126-133によって定義されるエピトープに対する、抗体結合部位の特異性を試験した（図６）。このELISAアッセイは、目標1に記載するように実行されたが、ただし、B1ペプチド、または、酵母のミオシンタンパク内部から取られたペプチド配列(H-Ser-Ala-Cys-Glu-Gln-Ile-Leu-Lys-Asp-Thr-OH)（配列番号２８）を、精製caPCNAの存在下に抗体に対する競合に用いた。図５に示すように、B1ペプチドは、抗体結合部位に対し効率的に競合するが、一方、無関係の酵母ミオシンペプチド（MAL4）は、caPCNAと、caPCNAabに対する結合について競合せず、プレートに結合した固定化caPCNAabに結合するPCNAの量を減少させない。これらのデータは、B1ペプチドによって定義される、caPCNA上のエピトープに対する抗体結合部位の特異性を示す。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６９】
本明細書に記載するELISAを、結合caPCNA抗体に対するcaPCNAの結合を阻害する、二つのペプチドの能力を監視するために用いた。このアッセイで評価された、一つのペプチド(H-Gly-Arg-Lys-Arg-Arg-Gln-Thr-Ser-Met-Thr-Asp-Arg-Tyr-His-Ser-Lys-Arg-Arg-Leu-Ile-Phe-Ser-OH)（配列番号２９）は、p21cip/waf1タンパクの、PCNAとの相互作用部位に対応するものであるが、このELISAアッセイでは、caPCNAの、結合caPCNA抗体に対する結合に対し全く作用を及ぼさないことが示される（図７）。他方のペプチド(H-Gln-Thr-Gln-Leu-Arg-Ile-Asp-Ser-Phe-Phe-Arg-OH)（配列番号３０）は、XPGタンパクのXPG-PCNA相互作用部位に対応するものであるが、cPCNA抗体に対する結合について、精製caPCNAと有効に競合し、本競合アッセイに使用したXPGペプチド量に直接比例して、アッセイにおける有色基質の発生を著明に抑えた。XPGペプチド自身は、抗原ペプチドとは無関係なので、caPCNA抗体とは相互作用しない。したがって、XPGペプチドは、PCNAタンパクの、caPCNA抗体に対する結合を阻止するために、その認識PCNA結合部位と相互作用する。このことは、抗体によって認識されるエピトープが、このXPGペプチドに特異的に結合することによってマスクされた場合に起こる。このデータは、caPCNAペプチド(aa126-133)、および、PCNA内の特定部位と相互作用するペプチド、例えば、XPGペプチド、および他の既知のPCNA結合パートナーの両方が、通常の結合パートナーによってPCNAが認識されることを阻害することが可能であり、かつ、そのようなタンパク-タンパク相互作用に依存する細胞機能を阻害する可能性のあることを示す。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７１】
〔表１：PCNA aa126-133領域を含むペプチドドメイン〕
2009527498.tif 000001
【手続補正１９】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
増殖性細胞核抗原の癌特異的イソ型(caPCNA)を発現する悪性細胞の細胞増殖を抑えるための治療用組成物であって、アミノ酸配列LGIPEQEY（配列番号１）を含むペプチドを含み、前記ペプチドが、PCNAと一つ以上のタンパクとの相互作用を特異的に抑制することを特徴とする、組成物。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2009527498000001.app