【手続補正書】
【提出日】平成23年6月16日(2011.6.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、５、７、または11のうちの一つと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、かつ、配列番号１として示されるシュードモナス・サッカロフィリア（Pseudomonas  saccharophilia）の配列の位置番号付けに関して、307位における置換を含む、マルトース非生成性エクソアミラーゼ（non-maltogenic  exoamylase）。
【請求項２】
前記アミノ酸配列が、配列番号１と少なくとも９５％同一である請求項1に記載のエクソアミラーゼ。
【請求項３】
前記アミノ酸配列が、配列番号５と少なくとも９５％同一である請求項1に記載のエクソアミラーゼ。
【請求項４】
前記アミノ酸配列が、配列番号７と少なくとも９５％同一である請求項1に記載のエクソアミラーゼ。
【請求項５】
前記アミノ酸配列が、配列番号１１と少なくとも９５％同一である請求項1に記載のエクソアミラーゼ。
【請求項６】
配列番号2-4,13,14、または8-10または15のうちの少なくとも一つと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、かつ、配列番号１として示されるシュードモナス・サッカロフィリア（Pseudomonas  saccharophilia）の配列の位置番号付けに関して、３０７位における置換を含む、マルトース非生成性エクソアミラーゼ。
【請求項７】
G4D, N33Y, D34N, G70D, K71R, G87S, A99V,K108R,V113I,G121D,G134R,A141P,I157L,G158D,Y171S,L178F,A179T,G188A,Y198F,A199V,G223A,V290I,I315V,S334P,D343E,S399P,A405FおよびA405Eから選択される少なくとも一つの置換をさらに含む、請求項1または６に記載のエクソアミラーゼ。
【請求項８】
33,34,71,87,121,134,141,157,178,179,  223,334および343から選択される少なくとも一つのさらなる位置をさらに含む、請求項1または６に記載のエクソアミラーゼ。
【請求項９】
少なくとも一つのさらなる置換がN33Y, D34N, K71R, G87S, G121D, G134R, A141P, I157L, L178F,A179T,G223A,S334P,および D343Eから選択される請求項８に記載のエクソアミラーゼ。
【請求項１０】
前記108、158、171、および188から選択される位置において、さらに少なくとも一つのさらなる置換を含む請求項８に記載のエクソアミラーゼ。
【請求項１１】
少なくとも一つのさらなる置換がＫ108Ｒ、Ｇ158Ｄ、Ｙ171Ｓ、およびＧ188Ａから選択される請求項１０に記載のエクソアミラーゼ。
【請求項１２】
以下：
【化１−１】
2011041575.tif 000001
【化１−２】
2011041575.tif 000002
【化１−３】
2011041575.tif 000003
の中から選択される置換の組み合せを含む、請求項1または６に記載のエクソアミラーゼ。
【請求項１３】
以下：
【化２】
2011041575.tif 000004
の中から選択される置換の組み合わせを含む、請求項３に記載のエクソアミラーゼ。
【請求項１４】
以下：
【化３】
2011041575.tif 000005
の中から選択される置換の組み合わせを含む、請求項３に記載のエクソアミラーゼ。
【請求項１５】
アミラーゼが、配列番号2,3,4,13,14,15,8,9,および10から選択される一つのアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のエクソアミラーゼ。
【請求項１６】
エクソアミラーゼが、シュードモナス属（Pseudomonas  sp.）に由来する請求項1または６に記載のエクソアミラーゼ。
【請求項１７】
シュードモナス属が、シュードモナス・サッカロフィリア（Pseudomonas  saccharophilia）、およびシュードモナス・ストツェリ（Pseudomonas  stutzeri）から選択される請求項１６に記載のエクソアミラーゼ。
【請求項１８】
配列番号1,5,7,11,2-4,13,14,8-10または15のいずれかと９０％の同一性を有し、かつ、配列番号１として示されるシュードモナス・サッカロフィリア（Pseudomonas  saccharophilia）の配列の位置番号付けに関して、３０７位における少なくとも一つの置換を含むアミノ酸配列を含むエクソ特異的・マルトース非生成性エクソアミラーゼ（exo-specific  non-maltogenic  exoamylase）をコードする核酸と少なくとも９０％同一である核酸。
【請求項１９】
請求項18に記載の核酸を含むベクター。
【請求項２０】
請求項19に記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項２１】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載のエクソアミラーゼを含む組成物。
【請求項２２】
さらなる成分、または、さらなる酵素、あるいはその両方を含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記さらなる酵素が、オキシドレダクターゼ、ヒドロラーゼ、リパーゼ、エステラーゼ、グリコシダーゼ、アミラーゼ、プルラナーゼ、キシラナーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、でんぷん分解酵素、プロテアーゼおよびリポキシゲナーゼからなる群より選択される、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２４】
前記酵素がバシラス種に由来するマルトース生成性アミラーゼである、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２５】
前記酵素が、ＥＰ  １２０  ６９３に開示されるバシラス由来のマルトース生成性α−アミラーゼ、または、α−アミラーゼ活性を有するその変異体、相同物もしくは変異種、あるいは、これらを含む組成物である、請求項２２〜２４に記載の組成物。
【請求項２６】
小麦粉、水を含む任意のパン生地成分、または、他の成分、もしくは添加物、もしくはパン生地を改良する組成物が追加される、請求項２１〜２５に記載の組成物。
【請求項２７】
食品製品の製造における、または、食品成分としての、請求項１〜１７に記載のエクソアミラーゼの使用。
【請求項２８】
前記食品製品がパン生地製品を含む、請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
前記食品製品が油で焼いた、油で揚げた（deep  fried）、ローストした、焼いた、蒸気で蒸した、または茹でたパン生地製品を含む、請求項２７または２８に記載の使用。
【請求項３０】
前記食品製品がパン製品を含む、請求項２７に記載の使用。
【請求項３１】
食品製品を製造するための方法であって、以下：
（ａ）でんぷん媒体を準備する工程；
（ｂ）該でんぷん媒体に、請求項１〜１７のいずれかに記載のエクソアミラーゼを加える工程
を包含する、方法。
【請求項３２】
パン製品を作るためのプロセスであって、以下：
（ａ）でんぷん媒体を準備する工程；
（ｂ）該でんぷん媒体に、請求項１〜１７に記載のＰＳ４変異エクソアミラーゼを加える工程；および
（ｃ）工程（ｂ）の間または後に、該でんぷん媒体に熱を適用して、パン製品を製造する工程
を包含する、プロセス。
【請求項３３】
請求項１〜１７のいずれかに記載のＰＳ４変異エクソアミラーゼと、少なくとも一つのさらなるパン生地成分またはパン生地添加物とを含む、パン生地改良組成物。
【請求項３４】
パン製品の容積を増すための、請求項１〜１７に記載のエクソアミラーゼの使用。
【請求項３５】
でんぷんの有害な老化を遅らせまたは速度を遅らせるための、食品製品における請求項１〜１７に記載のエクソアミラーゼの使用。
【請求項３６】
適合性のある宿主細胞に請求項１９に記載のベクターを導入し、そして、該ベクターの複製を引き起こす条件下で該宿主細胞を増殖させる工程を包含する、請求項１〜１７に記載のエクソアミラーゼを発現させる方法。
【請求項３７】
ＰＣＲを用いて親ポリペプチドにアミノ酸置換を導入することによる、請求項１〜１７に記載のエクソアミラーゼを作る方法。
【請求項３８】
マルトース非生成性エクソアミラーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列における、一つ以上の対応するコドンの変化を誘導することによる、請求項１〜１７に記載のエクソアミラーゼを作る方法。
【請求項３９】
マルトース非生成性エクソアミラーゼ中に存在する一つ以上のドメインを欠く、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のエクソアミラーゼ。
【請求項４０】
前記でんぷん結合ドメインを欠く請求項１〜１７のいずれか１項に記載のエクソアミラーゼであって、ここで、該でんぷん結合ドメインは、配列番号１として示されるシュードモナス・サッカロフィリア（Pseudomonas  saccharophilia）の配列の位置番号付けに関して、４２９位の後のアミノ酸に対応する、エクソアミラーゼ。
【請求項４１】
前記親ポリペプチドと比較してより高い熱安定性を有する、請求項１〜１７、３９または４０のいずれかに記載のエクソアミラーゼ。
【請求項４２】
請求項１〜１７または３９〜４１のいずれかに記載のエクソアミラーゼであって、ここで、５５℃〜９５℃またはそれ以上、好ましくは約８０℃の高温にて、半減期が前記親酵素と比較して、好ましくは１０％またはそれ以上、好ましくは５０％またはそれ以上、好ましくは１００％またはそれ以上延長される、エクソアミラーゼ。
【請求項４３】
前記半減期が８０℃において前記親酵素と比較して延長される、請求項４２に記載のエクソアミラーゼ。
【請求項４４】
前記親ポリペプチドと比較してより高いｐＨ安定性を有する、請求項１〜１７または３９〜４３のいずれかに記載のエクソアミラーゼ。
【請求項４５】
同一のｐＨ条件下で前記親ポリペプチドと比較した場合に、１０％またはそれ以上、好ましくは５０％またはそれ以上、好ましくは１００％またはそれよりも長い半減期を有する、請求項１〜１７または３９〜４４のいずれかに記載のエクソアミラーゼ。
【請求項４６】
前記親酵素と比較して増加したエクソ特異性を有する、請求項１〜１７または３９〜４５のいずれかに記載のエクソアミラーゼ。
【請求項４７】
同一の条件下で前記親ポリペプチドと比較した場合に、１０％またはそれ以上、好ましくは５０％またはそれ以上、好ましくは１００％またはそれよりも高いエクソ特異性を有する、請求項１〜１７または３９〜４６のいずれかに記載のエクソアミラーゼ。
【請求項４８】
配列番号1,5,7または11と９５％の同一性を有し、かつ、配列番号１として示されるシュードモナス・サッカロフィリア（Pseudomonas  saccharophilia）の配列の位置番号付けに関して、３０７位における少なくとも一つの置換を含むアミノ酸配列を含むエクソ特異的・マルトース非生成性エクソアミラーゼ（exo-specific  non-maltogenic  exoamylase）をコードする核酸と少なくとも９５％同一である核酸。
【請求項４９】
でんぷん結合ドメインのようなドメインを欠く、請求項３９または４０に記載のエクソアミラーゼをコードする核酸に対して少なくとも９０％同一な核酸。
【請求項５０】
明細書中に記載の発明。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
配列番号１，５，７,または11と少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を有し、かつ,4,33,34,70,71,87,99,108,113,121,134,141,157,158,171,178,179,188, 198,199,223,290,307,315,334,343,399, および405からなる群から選択される少なくともひとつの置換を有するエクソ特異的・マルトース非生成性エクソアミラーゼ（exo-specific  non-maltogenic
exoamylase）。
（項目２）
前記アミノ酸配列が、配列番号１と少なくとも７５％同一である項目1に記載のエクソアミラーゼ。
（項目３）
前記アミノ酸配列が、配列番号５と少なくとも７５％同一である項目1に記載のエクソアミラーゼ。
（項目４）
前記アミノ酸配列が、配列番号７と少なくとも７５％同一である項目1に記載のエクソアミラーゼ。
（項目５）
前記アミノ酸配列が、配列番号１１と少なくとも７５％同一である項目1に記載のエクソアミラーゼ。
（項目６）
前記アミノ酸配列が、配列番号2-4,13,14、または8-10と少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を有する項目1に記載のエクソアミラーゼ。
（項目７）
少なくとも一つの置換がG4D, N33Y, D34N, G70D, K71R, G87S,A99V,K108R,V113I,G121D,G134R,A141P,I157L,G158D,Y171S,L178F,A179T,G188A,Y198F,Y198L,A199V,G223A,V290I,H307L,I315V,S334P,D343E,S399P,A405FおよびA405Eから選択される項目1に記載のエクソアミラーゼ。
（項目８）
少なくとも一つの位置が33,34,71,87,121,134,141,157,178,179,  223,207,334および343から選択される項目1に記載のエクソアミラーゼ。
（項目９）
少なくとも一つの置換がN33Y, D34N, K71R, G87S, G121D G134R,A141P, I157L, L178F, A179T,G223A,H307L, S334P,および D343Eから選択される項目８に記載のエクソアミラーゼ。
（項目１０）
前記108、158、171、および188から選択される位置において、さらに少なくとも一つの置換を有する項目８に記載のエクソアミラーゼ。
（項目１１）
さらに少なくとも一つの置換がＫ108Ｒ、Ｇ158Ｄ、Ｙ171Ｓ、およびＧ188Ａから選択される項目１０に記載のエクソアミラーゼ。
（項目１２）
少なくとも一つの置換が、次の組み合わせ、
【化１】
2011041575.tif 000006
2011041575.tif 000007
の中から選択される一の組み合せを有する項目1に記載のエクソアミラーゼ。
（項目１３）
少なくとも一つの置換が、次の組み合わせ、
【化２】
2011041575.tif 000008
の中から選択される一の組み合わせを含む項目３に記載のエクソアミラーゼ。
（項目１４）
少なくとも一つの置換が、次の組み合わせ、
N33Y, D34N, G134R, A141P, I157L, L178F, A179T, G223A,H307L および S334P;
N33Y, D34N, G87S, G121D, G134R, A141P, I157L,L178F, A179T, G223A, H307L および、S334P;
および
N33Y, D34N, G87S, G121D, G134R, A141P, I157L,L178F, A179T, G223A, H307L および  S334P
の中から選択される一の組み合わせを有する項目３に記載のエクソアミラーゼ。
（項目１５）
アミラーゼが、配列番号2,3,4,13,14,8,9, および10から選択される一つのアミノ酸配列を含む、項目1に記載のエクソアミラーゼ。
（項目１６）
エクソアミラーゼが、シュードモナス属（Pseudomonas  sp.）に由来する項目1に記載のエクソアミラーゼ。
（項目１７）
シュードモナス属が、シュードモナス・サッカロフィリア（Pseudomonas  saccharophilia）、およびシュードモナス・ストツェリ（Pseudomonas  stutzeri）から選択される項目１６に記載のエクソアミラーゼ。
（項目１８）
項目1に記載のエクソアミラーゼをコードする核酸配列と少なくとも75％同一である核酸配列。
（項目１９）
項目18に記載の核酸配列を有するベクター。
（項目２０）
項目19に記載の核酸配列を有する宿主細胞。
（発明の要旨）
まず、第一の特徴として、本発明は、親ポリペプチドに由来するPS4変異体（PS4  variant）を有するポリペプチドを提供する。親酵素は、配列番号1または、配列番号５に記載のアミノ酸配列を持つエクソアミラーゼのような、シュードモナス  サッカロフィリア  （Pseudomonas  saccharophilia）マルトース非生成性エクソアミラーゼ（non-maltogenic  exoamylase）である。親酵素は、好ましくは、配列番号７,または１１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドのようなシュードモナス  ストチェリ（Pseudomonas  stutzeri）マルトース非生成性エクソアミラーゼである。PS4ファミリーの他のメンバーも親酵素として用いることができる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
好ましい実施の態様においては、PS4変異体は配列番号2, 配列番号3, 配列番号4, 配列番号13,配列番号14, 配列番号15, 配列番号8, 配列番号9,または配列番号10のいずれかの配列を含むアミノ酸である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
好ましい実施の態様においては、ポリペプチドは先端を切断した形を持っている。切断はN-先端、またはC-先端に起きる。親酵素、またはPS4変異体は、活性であるか否かを問わず、サブ配列、シグナル配列、ドメイン，部分、のような一部またはそれ以上の部分を欠くこともある。例えば、親酵素、またはPS4変異ポリペプチドは、本明細書に記載のとおり、シグナル配列を欠いていることもある。選択的に、または追加的に、親酵素は、またはPS4変異体は１又は２以上の触媒もしくは結合ドメインを欠いていることもある。好ましい実施の態様においては、親酵素、またはPS4変異体は、でんぷん結合ドメインのようにマルトース非生成性エクソアミラーゼに存在するドメインの１又は２以上のドメインを欠いていてもよいかも知れない。例えば、PS4ポリペプチドは配列番号1に示すシュードモナス  サッカロフィリアのマルトース非生成性エクソアミラーゼの番号の429の位置までの配列しか持っていないこともある。好ましい実施の態様においては、図面に記載のアミノ酸配列を持っている変異体、PS4変異体、pSac-d34(配列番号15,FIG.8c)、pSac-D20(配列番号13, FIG.8a), およびpSac-D14(配列番号14, FIG.8b)が提供される。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
好ましい実施の態様においては、機能等価物は、PS4ファミリーメンバーの少なくとも一つと配列相同性を持っている。機能等価物は、上で述べたシュードモナス  サッカロフィリアおよびシュードモナス  ストチェリのマルトース非生成性エクソアミラーゼのいずれかと、または、好ましくは、その両方と配列相同である。機能等価物はまた配列番号1-12および13-15,好ましくは、配列番号1,または 配列番号7、またはその両方に規定する配列のいずれかと配列相同性である。配列相同性は、好ましくは少なくとも60%以上、好ましくは65%以上、好ましくは75%以上、好ましくは80%以上、好ましくは85%以上、好ましくは90%以上、好ましくは95%以上、である。配列相同は、ここに記載されたプログラムのいずれか、またはそのすべてにより生成される。他の実施の態様においては機能等価物は、上に規定する配列のいずれかと特異的にハイブリッド形成することができる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
好ましい実施の態様においては、PS4変異体をコードする核酸は、配列配列番号2, 配列番号3, 配列番号4, 配列番号13, 配列番号14,配列番号15, 配列番号8,配列番号9, または 配列番号10のいずれか一つを含むアミノ酸をコードする。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
好ましい実施の態様においては、核酸にコードされる機能等価物は、PS4ファミリーメンバーの少なくとも一つと相同配列である。好ましい実施の態様において、機能等価物は、上述したシュードモナス  サッカロフィリア、およびシュードモナス  ストチェリのマルトース非生成性エクソアミラーゼ  のいずれか、または、好ましくは、その双方と配列相同である。機能等価物は、また配列番号1〜配列番号12および配列番号13〜配列番号15、好ましくは配列番号１、または配列番号７、またはその双方と配列相同である。配列相同は、好ましくは少なくとも60％、好ましくは少なくとも65％以上、好ましくは少なくとも75％以上、好ましくは少なくとも80％以上、好ましくは少なくとも85％以上、好ましくは少なくとも90％以上、好ましくは少なくとも95％以上ある。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
【図１】図面1（図１、以下同様）は、PS4変異体の熱安定性の改良を示すグラフである。PS4cclはシュードモナス  サッカロフィリアに由来する、シグナル配列、およびでんぷん結合ドメインを持たない発現比較例酵素である。PS4cc1,pSac-D3,pSac-D20, およびpSac-D14についての分単位表示の半減期を，摂氏温度に対しプロットしてある。
【図２】図2はモデルパン生地システム試験における、pSac-D34の投与効果を示すグラフである。パンの身の固くなった分量はNMRにより測定した。固くなった部分の分量で測定した堅さを、コントロール、D34の0.5,  1,  2ppmの各ケースについて、焼いた後の経過日に対してプロットしたものである。
【図３】図3 は小麦粉1kg当たり1mgのPSac-D3, およびPsac-D14, を投与した場合の堅さの減少、および堅くなる度合を示すパン焼き試験の結果を示すグラフである。hPaで測定した堅さの数値をコントロールについてプロットしたものである。
【図４】図4は、半減期が、75℃で、９．３分であるPSac-D3 （G134R, A141P, I157L, G223A,  A307L,S334P,K71R, D343E, N33Y,  D34N,  L178F,  A179T）に対し、75℃で３．６分のPsac-D3 (N33Y,D34N,K71R,L178F,A179Tを持たない)と比較した、PSac-D3のソフト化効果の増加を示すベーキング試験の結果を表したものである。
【図５】図5は、シュードモナス  サッカロフィリア  マルトテトラヒドロラーゼ  アミノ酸配列に由来するPS4（配列番号1）参照配列を示す。
【図６】図６は、PS4変異体の配列（配列番号２）；G134R, A141P, I157L, G223A, H307L,S334P,N33Y,D34N,L178F,及びA179T置換を持つシュードモナス  サッカロフィリア  マルトテトラヒドロラーゼ  アミノ酸配列を示す。
【図７】図７は、PS4変異体の配列（配列番号３）；G134R, A141P, I157L, G223A, H307L, S334P, N33Y,D34N,L178F, 179T, 及びG121D置換を持つシュードモナス  サッカロフィリア  マルトテトラヒドロラーゼ  アミノ酸配列を示す。
【図８Ａ】図８Ａは、PS4変異体配列（配列番号４）；G134R, A141P, I157L, G223A,H307L, S334P, N33Y,D34N,L178F, A179T, G121D及びP87S置換を持つシュードモナス  サッカロフィリア  マルトテトラヒドロラーゼ  アミノ酸配列を示す。
【図８Ｂ】図8Ｂは、PSac-D20の配列（配列番号13）； 13置換及びでんぷん結合ドメインの欠失を持つシュードモナス  サッカロフィリア  マルトテトラヒドロラーゼ  アミノ酸配列を示す。
【図８Ｃ】図8Ｃは、Psac-D14の配列（配列番号14）の配列；1４置換及びでんぷん結合ドメインの欠失を持つシュードモナス  サッカロフィリア  マルトテトラヒドロラーゼ  アミノ酸配列を示す。
【図８Ｄ】図8Ｄは、Psac-D34の配列（配列番号15）の配列；11置換及びでんぷん結合ドメインの欠失を持つシュードモナス  サッカロフィリア  マルトテトラヒドロラーゼ  アミノ酸配列を示す。
【図９】図９は、シュードモナス  サッカロフィリア  マルトテロラヒドロラーゼ（配列番号5）のアミノ酸配列を示す。シュードモナス  サッカロフィリア  グルカン  1,4-α−マルトテトラヒドロラーゼ  前駆体(E.C.3.2.1.60)(G4-アミラーゼ)（マルトテトラオース形成アミラーゼ）（エクソマルトテトラオヒドロラーゼ  ）（マルトテトラオース形成エクソアミラーゼ）SWISS-PROTアクセッション番号P22963。
【図１０Ａ】図10Aはシュードモナス  サッカロフィリア  マルトテトラヒドロラーゼ  の核酸配列（配列番号６）を示す。マルトテトラヒドロラーゼ  をコードするシュードモナス  サッカロフィリア  mta  遺伝子(E.C.番号3.2.1.60）。ジーンバンク（GenBank）アクセッション番号X16732。
【図１０Ｂ】図10Ｂはシュードモナス  サッカロフィリア  マルトテトラヒドロラーゼ  の核酸配列（配列番号６）を示す。マルトテトラヒドロラーゼ  をコードするシュードモナス  サッカロフィリア  mta  遺伝子(E.C.番号3.2.1.60）。ジーンバンク（GenBank）アクセッション番号X16732。
【図１１】図11はシュードモナス  ストチェリ  マルトテトラヒドロラーゼ  （配列番号７）のアミノ酸配列を示す。
【図１２】図12は、PStu-D34の配列(配列番号８)を示す。 G134R, A141P, I157L, G223A, H307L,S334P,N33Y, D34N置換を持つ、シュードモナス  ストチェリ  マルトテトラヒドロラーゼ  アミノ酸。
【図１３】図13は、PStu-D20の配列  (配列番号9)を示す。置換G134R, A141P, I157L, G223A, H307L,S334P,N33Y, D34N,  及びG121Dを持つ、シュードモナス  ストチェリ  マルトテトラヒドロラーゼ  アミノ酸配列。
【図１４】図14は、PStu-D14の配列(配列番号10)を示す。 G134R, A141P, I157L, G223A, H307L,S334P,N33Y, D34N,G121D,及びG87S置換を持つ、シュードモナス  ストチェリ  マルトテトラヒドロラーゼ  アミノ酸配列。
【図１５】図15は、シュードモナス  ストチェリ（シュードモナス  ペルフェクトマリナ）の配列（配列番号11）を示す。グルカン1，4−α−マルトテトラヒドロラーゼ  先駆体(E.C.3.2.1.60)(G４-アミラーゼ)（マルトテトラオース形成アミラーゼ）（エクソマルトテロラオヒドロラーゼ  ）（マルトテトラオース形成アミラーゼ）SWISS-PROTアクセッション番号P13507。
【図１６】図.16は、シュードモナス  ストチェリ  マルトテトラヒドロラーゼ  核酸配列を示す。シュードモナス  ストチェリ  マルトテトラオース形成アミラーゼ（amyP）遺伝子、完全cds.  ジーンバンク（GeneBank）アクセッション番号M24516(配列番号12)。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９２】
好ましい実施の態様においては、PS4変異体は、配列番号2, 配列番号 3, 配列番号4, 配列番号13, 配列番号14, 配列番号15, 配列番号8 配列番号9または配列番号10のいずれかを含むアミノ酸配列である。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０７】
好ましい実施の態様においては、機能等価物はPS4ファミリーメンバーの少なくとも一つと相同の配列を持つ。機能等価物は、上に述べたシュードモナス  サッカロフィリア、およびシュードモナス  ストチェリ  マルトース非生成性エクソアミラーゼのいずれかと、好ましくは両方と配列相同性をもつ。機能等価物は、配列番号1から１２および配列番号１３から１５、好ましくは、配列番号1、または配列番号7、またはその両方に示された配列とも配列相同性をもつ。そのような配列間の配列相同性は、好ましくは、少なくとも、60％以上、好ましくは65％以上、好ましくは75％以上、好ましくは80％以上、好ましくは85％以上、好ましくは90％以上、または好ましくは95％以上、ある。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７３】
ここに記載された方法、およびシステムの種々の改変、および変形は本発明の範囲および趣旨から外れることなく、当業者にとって明白なものである。本発明は、特定の好ましい実施の態様について記述されているが、請求の範囲に記載された発明は、かかる実施の態様に限定されるものではない。事実、分子生物学、または関係する分野の当業者にとり明らかにである本発明の態様の種々の改変を実施することは、請求の範囲に属する発明を実施することを意味する。
【表１６】
2011041575.tif 000009
2011041575.tif 000010
2011041575.tif 000011
2011041575.tif 000012
2011041575.tif 000013
2011041575.tif 000014
【手続補正１２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８Ｂ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図８Ｂ】
2011041575.tif 000015
【手続補正１３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８Ｃ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図８Ｃ】
2011041575.tif 000016
【手続補正１４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８Ｄ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図８Ｄ】
2011041575.tif 000017