(57)【要約】  組換え防御抗原（ｒＰＡ）を含む安定な凍結乾燥タンパク質製剤が開示され、この凍結乾燥タンパク質製剤は、適切な希釈剤を用いて再構成され、哺乳類のとりわけヒトにおける炭疽菌感染に対するワクチンとしての使用に適する、高い効力のタンパク質濃度の再構成製剤を形成することができる。この製剤は、トレハロースのような還元糖の存在下でｒＰＡを凍結乾燥することによって調製され、こうした凍結乾燥方法も開示される。得られた凍結乾燥混合物又は組成物は、次いで再構成され、ｒＰＡタンパク質の明らかな安定性の低下を生じることなく、高い免疫原性を与える。ワクチン接種における該製剤の使用方法もまた開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭疽菌抗原と薬学的に許容される担体を含む安定な再構成されたワクチン製剤であって、前記炭疽菌抗原と凍結乾燥保護量の非還元糖の凍結乾燥組成物から調製された、安定な再構成されたワクチン製剤。
【請求項２】
前記炭疽菌抗原が組換え炭疽菌防御抗原（ｒＰＡ）を含む、請求項１に記載の安定な再構成されたワクチン製剤。
【請求項３】
前記製剤が、前記凍結乾燥の前の前記組成物と実質的に同じ効力を保持する、請求項２に記載の安定な再構成されたワクチン製剤。
【請求項４】
前記製剤が、前記凍結乾燥前の前記組成物の少なくとも８０％の効力を保持する、請求項１に記載の安定な再構成されたワクチン製剤。
【請求項５】
前記製剤が、前記凍結乾燥前の前記組成物の少なくとも８５％の効力を保持する、請求項１に記載の安定な再構成されたワクチン製剤。
【請求項６】
前記製剤が、前記凍結乾燥前の前記組成物の少なくとも９０％の効力を保持する、請求項１に記載の安定な再構成されたワクチン製剤。
【請求項７】
前記製剤が、前記凍結乾燥前の前記組成物の少なくとも９５％の効力を保持する、請求項１に記載の安定な再構成されたワクチン製剤。
【請求項８】
前記ｒＰＡが、前記再構成された製剤中に、約１００〜３００μｇ／ｍｌの範囲で存在する、請求項３に記載の安定な再構成されたワクチン製剤。
【請求項９】
前記ｒＰＡが、前記再構成された製剤中に、約１５０〜２５０μｇ／ｍｌの範囲で存在する、請求項３に記載の安定な再構成されたワクチン製剤。
【請求項１０】
前記ｒＰＡが、前記再構成された製剤中に、約２００μｇ／ｍｌの量で存在する、請求項３に記載の安定な再構成されたワクチン製剤。
【請求項１１】
前記非還元糖がトレハロースである、請求項３に記載の安定な再構成されたワクチン製剤。
【請求項１２】
前記トレハロースが、前記再構成された製剤中に、約３％〜７％（ｗ／ｖ）の範囲で存在する、請求項１１に記載の安定な再構成されたワクチン製剤。
【請求項１３】
前記トレハロースが、約４％〜６％（ｗ／ｖ）の範囲で存在する、請求項１１に記載の安定な再構成されたワクチン製剤。
【請求項１４】
前記トレハロースが、約４．５％〜５．５％（ｗ／ｖ）の範囲で存在する、請求項１１に記載の安定な再構成されたワクチン製剤。
【請求項１５】
前記トレハロースが、前記再構成された製剤中に、約５％（ｗ／ｖ）の量で存在する、請求項１１に記載の安定な再構成されたワクチン製剤。
【請求項１６】
前記凍結乾燥組成物が、再構成の前に、少なくとも３箇月の期間にわたって少なくとも２５℃の温度に維持された、請求項３に記載の安定な再構成されたワクチン製剤。
【請求項１７】
前記温度が少なくとも４０℃である、請求項１６に記載の安定な再構成されたワクチン製剤。
【請求項１８】
前記温度が少なくとも５５℃である、請求項１６に記載の安定な再構成されたワクチン製剤。
【請求項１９】
前記温度が少なくとも７０℃である、請求項１６に記載の安定な再構成されたワクチン製剤。
【請求項２０】
前記期間が少なくとも３箇月である、請求項１６に記載の安定な再構成されたワクチン製剤。
【請求項２１】
前記期間が少なくとも７箇月である、請求項１６に記載の安定な再構成されたワクチン製剤。
【請求項２２】
前記期間が少なくとも８箇月である、請求項１６に記載の安定な再構成されたワクチン製剤。
【請求項２３】
前記期間が少なくとも１６箇月である、請求項１６に記載の安定な再構成されたワクチン製剤。
【請求項２４】
前記安定な製剤がアジュバンドを含む、請求項３に記載の安定な再構成されたワクチン製剤。
【請求項２５】
前記アジュバンドが、アルハイドロゲル（ミョウバン）、キトサン、ｍｐｌ、及びＣｐＧから選択された、請求項２４に記載の安定な再構成されたワクチン製剤。
【請求項２６】
前記アジュバンドがアルハイドロゲル（ミョウバン）である、請求項２４に記載の安定な再構成されたワクチン製剤。
【請求項２７】
前記再構成された製剤が、２００μｇ／ｍｌのｒＰＡ、２ｍｇ／ｍｌのＣｐＧ１０１８、５％のトレハロース、５．２５ｍＭのホスフェート、０．３９％のＮａＣｌ、０．０２％のツイーン２０、及び０．２６％ｗ／ｖのアルハイドロゲルを含む、請求項３に記載の安定な再構成されたワクチン製剤。
【請求項２８】
以下の工程：
（ａ）ｒＰＡを含む炭疽菌抗原と凍結乾燥保護量の還元糖の組成物を形成し、及び
（ｂ）前記組成物を凍結乾燥して、安定な凍結乾燥されたワクチン組成物を形成する、
を含む、安定な凍結乾燥されたワクチン製剤の調製方法。
【請求項２９】
工程（ａ）の組成物が、約３００〜５００μｇ／ｍｌの範囲のｒＰＡを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
工程（ａ）の組成物が、約３５０〜４５０μｇ／ｍｌの範囲のｒＰＡを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
工程（ａ）の組成物が、約４００μｇ／ｍｌの量のｒＰＡを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
工程（ａ）の還元糖がトレハロースである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記トレハロースが約８〜１２％の範囲で存在する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記トレハロースが約１０％（ｗ／ｖ）の量で存在する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
工程（ａ）の組成物がアジュバンドを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
前記アジュバンドが、アルハイドロゲル（ミョウバン）、キトサン、ｍｐｌ、及びＣｐＧからなる群より選択された、請求項２８に記載の方法。
【請求項３７】
前記アジュバンドがアルハイドロゲル（ミョウバン）である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３８】
工程（ａ）の組成物がさらにＣｐＧを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＣｐＧが約４ｍｇ／ｍｌの量で存在する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
工程（ａ）の組成物がさらにホスフェート緩衝剤を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項４１】
前記ホスフェートが約０．５ｍＭの量で存在する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
工程（ａ）の組成物がさらに洗浄剤を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項４３】
前記洗浄剤がツイーン２０である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記ツイーン２０が約０．０４％の量で存在する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
工程（ａ）の組成物が、４００μｇ／ｍｌのｒＰＡ、４ｍｇ／ｍｌのＣｐＧ１０１８、１０％のトレハロース、０．５ｍＭのホスフェート、１０ｍＭのＮａＣｌ、及び０．０４％のツイーン２０を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項４６】
微生物感染の恐れのある哺乳類に、請求項１に記載の安定なワクチン製剤の治療的有効量を投与することを含む、微生物感染に対する保護方法。
【請求項４７】
前記微生物感染が炭疽菌感染である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記哺乳類がヒトである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記製剤が、請求項２７に記載の安定なワクチン製剤である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
微生物感染の恐れのある哺乳類に、請求項２８に記載の方法にしたがって凍結乾燥したワクチン組成物から再構成した安定なワクチン製剤の治療的有効量を投与することを含む、微生物感染に対する保護方法。
【請求項５１】
前記微生物感染が炭疽菌感染である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記哺乳類がヒトである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
微生物感染した哺乳類に、請求項１に記載の安定なワクチン製剤の治療的有効量を投与することを含む、哺乳類における微生物感染の治療方法。
【請求項５４】
前記微生物感染が炭疽菌感染である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記哺乳類がヒトである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記ワクチンが、請求項２７に記載の安定なワクチン製剤である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
微生物感染した哺乳類に、請求項２８に記載の方法にしたがって凍結乾燥したワクチン組成物から再構成した安定なワクチン製剤の治療的有効量を投与することを含む、微生物感染の治療方法。
【請求項５８】
前記微生物感染が炭疽菌感染である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記哺乳類がヒトである、請求項５７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、広くは、タンパク質貯蔵の分野に関し、より詳しくは、工業的規模の調製後のタンパク質貯蔵の分野に関し、そのタンパク質は、哺乳類、とりわけヒトに投与される目的のワクチン組成物の一部を形成する。
【背景技術】
【０００２】
ワクチンは、通常、アジュバントを用いて処方される。一般的なアジュバントの種類は、アルミニウムを主成分とするコロイドであり、一般に、ミョウバン（アルム）と称される。より詳しくは、これらは、通常、水酸化アルミニウム（オキシ水酸化アルミニウム）（アルハイドロゲルとも称される）とリン酸アルミニウム（アジュホスとも称される）である。例えば、炭疽菌（バチルス・アントラシス）などの生命体に対して有用なワクチンは、通常、こうしたワクチン（いわゆる、サブユニットワクチン）に使用される炭疽菌抗原を結合するアルハイドロゲルを用いて処方される。
【０００３】
最近、ワクチン療法における進展は、ワクチンに使用する種々のタンパク質の産生を可能にし、例えば、組換えＤＮＡ技術を用いた炭疽菌からの組換体防御抗原（ｒＰＡ）の使用が挙げられる。タンパク質の比較的大きいサイズと複雑な性質のため、一般に、ワクチンにおけるこうしたタンパク質の製剤は、いくつかのユニークな問題を生じる。抗原性活性を維持するためには、タンパク質製剤は、ワクチンにおける基本的抗原構造を示すタンパク質の立体配座完全性を保持しなければならない。タンパク質の分解は、化学的不安定性（例えば、結合生成又は開裂が新たな抗原構造を生じる場合）又は物理的不安定性（例えば、タンパク質の高次構造における変化）を伴うことがある。物理的不安定性は、例えば、ワクチンに存在するタンパク質の変性又は凝集から生じることがあり、一方、化学的不安定性は、タンパク質のアミノ酸鎖を壊す、あるいはタンパク質に存在する１つ又は複数のアミノ酸側鎖（例えば、免疫原性活性に必須な基）の改質に寄与する化学反応から生じることがある。
【０００４】
低温下での乾燥（通常「凍結乾燥」と称される）は、タンパク質を保存しながら問題のタンパク質組成物から水を除去する作用をする。このプロセスによって、乾燥されるべき材料は、先ず凍結され、次いで凍結した溶媒（水の場合は氷）が、高真空下の昇華によって除去される。凍結乾燥プロセスの際の安定性を高める及び／又は貯蔵時の凍結乾燥品の安定性を改良するために、凍結乾燥される前の処方に添加剤が含められることがある。不都合なことに、これまでに、こうした方法は、ワクチン、とりわけ炭疽病ワクチンにとって有用な特定の抗原性タンパク質の凍結乾燥と貯蔵に対して信頼性が欠け、凍結乾燥された粉末の安定性が、再構成後の活性の大きな低下をもたらすことが実証されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、タンパク質製剤、とりわけ炭疽菌（バチルス・アントラシス）の組換え保護抗原体（ｒＰＡ）を含む製剤の凍結乾燥において生じていた従来の問題の少なくとも一部を、凍結乾燥状態における長期間の貯蔵であっても、抗原活性、したがってワクチンとしての有用性を保持する処方を提供することによって解決するものであり、この結果、再構成されたワクチン組成物は、炭疽菌の感染に対し、ヒトなどの哺乳類を保護するにおいて、依然として非常に有用である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
１つの局面において、本発明は、安定な再構成された製剤又はワクチン組成物に関するものであり、この製剤又は組成物は、等張性であってもよく、約５０μｇ／ｍｌ〜約４００μｇ／ｍｌ、好ましくは、約２００μｇ／ｍｌの量で、ワクチンに使用される抗原又は免疫原、好ましくは、炭疽菌に対するワクチンに使用される炭疽菌抗原、より好ましくは、炭疽菌防御抗原、最も好ましくは、組換え防御抗原（ｒＰＡ）、及び薬学的に許容される担体を含み、この製剤は、炭疽菌又は他の抗原の凍結乾燥された混合物又は組成物から再構成される。１つの態様において、再構成された製剤は、凍結乾燥された混合物又は組成物の凍結乾燥保護を与える量で、トレハロースなどの成分を含んでもよい。
【０００７】
再構成製剤の１つの好ましい態様において、この製剤は、ホスフェートやＮａＣｌ又は両方などの塩、ツイーンなどの洗浄剤、及びアルハイドロゲル（ミョウバン）、キトサン、ＭＰＬ、又はＣｐＧなどのアジュバントを含む。好ましい態様において、アジュバントは、ＣｐＧ１０１８又はアルハイドロゲルであり、特に好ましくは、これらの両方である。
【０００８】
本発明によるワクチンは、ミョウバンに加えてアジュバントを含んでもよい。このようなアジュバントの例は、当該技術分野でよく知られており、オリゴヌクレオチドが挙げられ、とりわけ、いわゆる「ＣｐＧ」オリゴヌクレオチド、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが挙げられ、最も好ましくは、トール様受容体９受容体を標的にするオリゴヌクレオチドである。存在してもよいその他の付加的なアジュバントには、サポニン、ＰＣＰＰポリマー、リポ多糖類誘導体、ＭＰＬ［モノホスホリルリピドＡ］、ＭＤＰムラミールジペプチド（ＭＤＰ）、ｔ−ＭＤＰ、フラジェリンタンパク質、フラジェリン融合タンパク質、ＩＣ３１、ＯＭ−１７４、リーシュマニア属伸長因子、ＩＳＣＯＭＳ、キトサン、ＳＢ−ＡＳ２、ＡＳ０２、ＳＢ−ＡＳ４、非イオン系ブロックコポリマー、及びＳＡＦ（シンテックスアジュバンド製剤）が挙げられる。
【０００９】
付加的アジュバンドが使用される場合、その付加的アジュバンドは、安定化されたサブユニットワクチンに組み込まれることが好ましいが、あるいは、その付加的アジュバンドは、別個のアジュバンド及び／又は希釈組成物に存在してもよい。
【００１０】
特定の態様において、安定なサブユニットワクチンの組成物又は製剤は、保存中の凝集を低減又は防止するための薬剤をさらに含むことができ、この薬剤には、例えば、少量の非イオン系界面活性剤、とりわけエトキシル化ソルビタンエステルが挙げられ、例えば、典型的に約２０エチレンオキシ単位を含むポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートである。
【００１１】
もう１つの局面において、本発明は、安定な凍結乾燥されたワクチン製剤の調製方法に関するものであり、以下の工程を含む。
（ａ）ｒＰＡを含む炭疽菌抗原と凍結乾燥保護量の還元糖の組成物を形成し、及び
（ｂ）その組成物を凍結乾燥して、安定な凍結乾燥されたワクチン組成物を形成する。
【００１２】
好ましい態様において、凍結乾燥された混合物又は組成物は、ホスフェートなどの緩衝剤、ＮａＣｌなどの塩、ツイーンなどの洗浄剤、及びアルハイドロゲル（ミョウバン）、キトサン、ｍｐｌ、又はＣｐＧなどのアジュバントをさらに含み、ＣｐＧ１０１８とアルハイドロゲルが特に好ましい。
【００１３】
１つの態様において、凍結乾燥された組成物は、質量をその凍結乾燥された組成物に与え、凍結乾燥バルク剤の物理的構造に寄与するのに十分な量で添加された増量剤をさらに含む。
【００１４】
さらなる局面において、本発明は、ｒＰＡ、トレハロース、及び薬学的に許容される担体を含む炭疽菌又は他のワクチンの凍結乾燥された混合物又は組成物を保持する容器を含むキット、及び希釈剤を用いて約２００μｇ／ｍｌのｒＰＡ濃度に凍結乾燥組成物を再構成する説明書のセットに関する。１つの態様において、希釈剤がキットに備えられる。好ましくは、希釈剤は、アルハイドロゲルなどのアジュバントを含む。
【００１５】
また、本発明は、微生物、とりわけ細菌に対して保護する、哺乳類における感染を治療する方法に関するものであり、こうした感染を発現した又は患う恐れのある哺乳類に、本発明のワクチン組成物の治療的有効量を投与することを含む。さらなる態様において、細菌感染は、炭疽菌（バチルス・アントラシス）感染であり及び／又は哺乳類はヒトである。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】バチルス・アントラシス（炭疽菌）からの組換え防御抗原（ｒＰＡ）のアミノ酸配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
−定義−
本願における用語「安定な」製剤は、ｒＰＡなどの抗原性タンパク質が、凍結乾燥された粉末、固体、又はケーキなどの形態において、貯蔵時にその物理的化学的な安定性と完全性を保持するものをいう。タンパク質の安定性を測定するための分析技術は、当該技術分野で公知であり、本願においては詳しく記載しない。例えば、Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991)、及びJones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993)を参照されたい。例えば、「安定な」製剤は、タンパク質の約１０％未満、好ましくは約５％未満が、その製剤において凝集として存在するものであることができる。別な態様において、凍結乾燥後や凍結乾燥製剤の貯蔵後における凝集製剤の何らかの増加を測定することができる。例えば、「安定な」凍結乾燥製剤は、少なくとも６箇月、好ましくは９箇月、より好ましくは１年、又はそれ以上の少なくとも約１６箇月にわたって凍結乾燥製剤が、２〜８℃で貯蔵されたとき、凍結乾燥製剤における凝集の増加が、約５％未満、好ましくは、約３％未満のものであることができる。
【００１８】
本願における用語「約」は、言及されている成分の有効性が、１０％を超えて実質的に低減することのない量を意味する。用語「約」を用いて量又は範囲が言及される場合、用語「約」が用いられなかった場合と同じ範囲又は量を本発明は具体的に考慮しているものと理解すべきである。即ち、「約」を付記した範囲と「約」を付記しない範囲は、本発明の方法と製剤の選択的態様である。
【００１９】
本願における用語「再構成された」製剤は、凍結乾燥されたタンパク質製剤を希釈剤に溶解させ、タンパク質を再構成された製剤に分散させることによって調製した製剤である。再構成された製剤は、患者に投与するのに適切である。
【００２０】
本願における用語「等張性」は、ヒト血液と同じ浸透圧を実質的に有する本発明の製剤又は組成物を指称する。等張性製剤は、一般に、約２５０〜３５０ｍＯｓｍ／Ｋｇの浸透圧を有すると考えられる。等張性は、例えば、蒸気圧又は製氷型の浸透圧計を用いて測定することができる。
【００２１】
本願における用語「リオプロテクタント」は、ｒＰＡなどの本発明の免疫原性タンパク質と混合されたとき、凍結乾燥時と以降の貯蔵時において、そのタンパク質の化学的及び／又は物理的不安定性を防止しないにせよ実質的に低減し、そのタンパク質の免疫特性を維持するのに十分で、それによって、ワクチンとしての継続した有用性を確実にする分子を意味する。こうしたリオプロテクタントの例には、サッカロースやトレハロースなどの非還元糖、グルタミン酸１ナトリウムやヒスチジンのなどのアミノ酸、ベタインのようなメチルアミン、硫酸マグネシウムのような離液性塩、三価以上の糖アルコールのようなポリオール類、例えば、グリセリン、エリトリトール、グリセロール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、及びマンニトール、プロピレングリコールやポリエチレングリコールのようなグリコール類、及びこれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【００２２】
本願における用語「凍結乾燥保護量」は、本発明のｒＰＡなどの免疫原に添加されたとき、凍結乾燥時と貯蔵時において、その免疫原の物理的化学的安定性と完全性を実質的に保護する結果、再構成されたとき、その免疫原がその免疫特性を保持し、ワクチンにおけるその使用を十分に許容する、例えば、トレハロースのようなリオプロテクタントの量を指称する。
【００２３】
本願における用語「希釈剤」は、薬学的に許容され（ヒトに投与するのに安全で毒性がない）、再構成製剤の調製に有用な担体を意味する。典型的な希釈剤には、滅菌水、注射用の静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、無菌食塩水、リンガー溶液、又はデキストロース溶液が挙げられる。
【００２４】
本願における用語「保存料」は、希釈剤に添加し、再構成製剤における細菌作用を本質的に低下させることができる化合物を意味し、したがって、例えば、多用途の再構成製剤の産生を容易にすることができる。例としては、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム（アルキル基が長鎖化合物であるアルキルベンジルジメチル塩化アンモニウムの混合物）、及び塩化ベンゼトニウムが挙げられる。その他の種類の保存料には、芳香族アルコール類、例えば、フェノール、２−フェノキシエタノール、チメロサール、塩化ベンゼトニウム、ホルムアルデヒド、ブチルアルコール、ベンジルアルコール、アリルパラベン類、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン、カテコール、レソルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、及びｍ−クレゾールが挙げられる。本願において最も好ましい保存料は２−フェノキシエタノールである。
【００２５】
本願における用語「増量剤」は、その凍結乾燥された混合物又は組成物に質量を付加し、凍結乾燥ケーキの物理的構造に寄与する化合物を指称する（例えば、開気孔構造を維持する本質的に均一な凍結乾燥ケーキの産生を促進）。代表的な増量剤に、マンニトール、グリセリン、デキストラン、ポリエチレングリコール、及びキソルビトールが挙げられる。「処置」は、治療上の処置と予防又は保全上の対処の双方を指称する。処置を必要とするものには、既に疾患のあるもの及び疾患を防止すべきものを含む。
【００２６】
本願における用語「有効量」又は「治療的有効量」は、細菌感染、とりわけ炭疽菌感染の１つ又は複数の症状を処置、抑制、又は軽減するのに十分な用量を意味する。正確な用量は、患者の年齢、免疫系状況、全体的健康、及び環境的状況、感染（又は予想される感染）の性質と範囲、及び以降の処置／ワクチン接種の利用性などの因子によって変動することがある。
【００２７】
製剤される抗原は、一般に、生物からの分離、及び組換え技術による合成又は抗原に使用されるポリペプチドの直接的化学合成などの当該技術分野でよく知られた技術を用いて調製される。本発明に使用される防御抗原は、組換え技術によって調製され、本願においては、組換え防御抗原（ｒＰＡ）と称される。
【００２８】
本発明によると、安定な再構成された製剤が提供され、この再構成製剤は、例えば、抗微生物抗原のようなサブユニットワクチン抗原の、組換え防御抗原（ｒＰＡ）を含む炭疽菌抗原など、及び薬学的に許容される担体を含み、その炭疽菌抗原と凍結乾燥保護量のトレハロースの凍結乾燥された組成物から調製される。ワクチンとしての使用を目的とするこうした製剤又は組成物の別な好ましい態様において、ｒＰＡは、約１００〜３００μｇ／ｍｌ、好ましくは、約１５０〜２５０μｇ／ｍｌ、最も好ましくは、約２００μｇ／ｍｌの量で再構成製剤の中に存在する。
【００２９】
また、本発明の再構成された炭疽菌ワクチン製剤は、トレハロースを含むことができる。１つの態様において、トレハロースは、再構成製剤の中に、約３％〜７％、好ましくは約４％〜６％の範囲、より好ましくは約４．５％〜５．５％の範囲、最も好ましくは、約５％（ｗ／ｖ）の量で存在する。
【００３０】
本発明の安定な再構成されたワクチン製剤は、再構成の前に少なくとも５℃の温度に少なくとも１箇月の期間、又は再構成の前に少なくとも２５℃の温度に少なくとも１箇月の期間にわたって保持された凍結乾燥組成物から再構成されたものであり、又はその温度は、少なくとも３０℃、３５℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、又はそれ以上であり、その期間は、少なくとも１箇月、２箇月、３箇月、４箇月、５箇月、６箇月、７箇月、８箇月、９箇月、１０箇月、又はそれ以上であり、１年間、１６箇月、又は少なくとも２年間などである。
【００３１】
本発明の再構成された炭疽菌ワクチン製剤は、緩衝剤をさらに含んでもよい。その特定の態様において、緩衝剤（又は塩）は、３ｍＭ〜７ｍＭの範囲、好ましくは４ｍＭ〜６ｍＭの範囲、より好ましくは４．５ｍＭ〜５．５ｍＭの範囲の濃度のホスフェートであり、約４ｍＭ〜約５．２５ｍＭの範囲が特に好ましい。別の好ましい態様において、再構成された製剤は、例えば、約０．３９％のＮａＣｌを含む。また、本発明の再構成された製剤は、ツイーン２０のような洗浄剤を含むことができる。限定されない１つの例において、ツイーン２０は約０．０２％の量で存在する。
【００３２】
本発明の再構成された炭疽菌ワクチン製剤は、アジュバントをさらに含んでもよく、とりわけ、アルハイドロゲル（ミョウバン）、キトサン、ｍｐｌ、及びＣｐＧから選択された１つであり、ＣｐＧとアルハイドロゲルが好ましい。１つの態様において、アジュバンドはＣｐＧ１０１８であり、例えば、約２ｍｇ／ｍｌ存在する。別の態様において、アジュバンドはアルハイドロゲルであり、例えば、約０．２６％（ｗ／ｖ）存在する。
【００３３】
こうした製剤の完全であるが限定されない例は、２００μｇ／ｍｌのｒＰＡ、２ｍｇ／ｍｌのＣｐＧ１０１８、５％のトレハロース、５．２５ｍＭのホスフェート、０．３９％のＮａＣｌ、０．０２％のツイーン２０、０．２６％ｗ／ｖのアルハイドロゲルを含むものである（実施例１参照）。本発明のワクチン製剤の１つの態様において、再構成された製剤は等張性である。
【００３４】
また、本発明は、安定な再構成された製剤の調製方法を提供し、以下の工程を含む。
（ａ）サブユニットのワクチン抗原、例えば、ｒＰＡを含む炭疽菌抗原のような抗微生物抗原及び凍結乾燥保護量のトレハロースの混合物又は組成物を凍結乾燥し、及び
（ｂ）再構成された製剤が、安定であって、凍結乾燥前の混合物又は組成物中のｒＰＡ濃度の約０．１〜約１０倍のｒＰＡ濃度を有するようにして、希釈剤中で工程（ａ）の凍結乾燥された混合物又は組成物を再構成する。
【００３５】
本発明の方法の別の例において、工程（ａ）の混合物を再構成するための工程（ｂ）で使用される希釈剤は、アジュバントを含み、好ましくは、アルハイドロゲル（ミョウバン）、キトサン、ＭＰＬ、又はＣｐＧから選択されたアジュバントであり、最も好ましくは、アルハイドロゲルである。限定されない例において、アルハイドロゲルは、約０．２％〜約０．３％の範囲で存在し、又は約０．２５％〜約０．３％の範囲で存在し、又は好ましくは、約０．２６％の量で存在する。
【００３６】
別のこうした例において、希釈剤は、ホスフェート及び／又はＮａＣｌのような塩を含む。選択された例において、ホスフェートは、約３〜７ｍＭの範囲で存在し、又は約４〜６ｍＭの範囲で存在し、又は約４．５〜５．５ｍＭの範囲で存在し、又は好ましくは、ホスフェートは約５ｍＭの量で存在する。別のこうした例において、ＮａＣｌは、約０．３％〜約０．５％の範囲で存在し、又は約０．３５％〜約０．４５％の範囲で存在し、又は好ましくは、約０．３９％存在する。好ましい態様において、希釈剤は約７．４のｐＨを有する。
【００３７】
好ましい態様において、希釈剤は、５ｍＭのホスフェート中に０．２６％のアルハイドロゲル、及び０．３９％のＮａＣｌを含み、ｐＨ７．４である。
【００３８】
抗微生物抗原を含んで使用可能なサブユニットワクチンは、通常、組換えタンパク質に基づく抗原である。こうした抗微生物抗原の例には、Ｂ型肝炎防御抗原、単純ヘルペスウイルス抗原、インフルエンザ抗原、先天性サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）抗原、結核菌抗原、ＨＩＶ抗原、ジフテリア抗原、破傷風抗原、百日咳抗原、及びペスト菌防御抗原、並びに、参照して取り入れられている特許出願ＷＯ９６／２８５５１に開示の保護タンパク質の１つ、２つ、又はそれ以上を含む抗原が挙げられる。最も好ましくは、抗原は、組換え保護抗原（ｒＰＡ）のような炭疽菌保護抗原、とりわけ配列識別番号１のアミノ酸配列を有するものである。
【００３９】
本発明は、さらに、以下の工程を含む、安定な凍結乾燥されたワクチン製剤の調製方法を提供する。
（ａ）サブユニットのワクチン抗原、例えば、ｒＰＡを含む炭疽菌抗原のような抗微生物抗原及び凍結乾燥保護量の還元糖の混合物又は組成物を形成し、及び
（ｂ）その混合物又は組成物を凍結乾燥して、安定な凍結乾燥されたワクチン組成物を形成する。
【００４０】
本発明の方法の特定の例において、工程（ａ）の組成物は、約２００〜６００μｇ／ｍｌ、又は約３００〜５００μｇ／ｍｌ、又は約３５０〜４５０μｇ／ｍｌの範囲、好ましくは約４００μｇ／ｍｌのｒＰＡを含む。本発明の方法の別の例において、工程（ａ）の組成物は、約２〜２０％の範囲、あるいは、約４〜１８％、又は約６〜１６％、又は約８〜１４％、又は約８〜１２％、又は約９〜１２％の範囲、又は好ましくは、約１０％（ｗ／ｖ）の量で存在するトレハロースを含む。
【００４１】
本方法の別の態様において、工程（ａ）の組成物又は混合物は、塩、好ましくは、ホスフェート及び／又はＮａＣｌ（又は生理食塩水）を含む。その例において、ホスフェートは、約０．３〜０．７ｍＭの範囲、又は約０．３５〜０．６５ｍＭの範囲、又は約０．４〜０．６ｍＭの範囲、又は約０．４５〜０．５５ｍＭの範囲で存在し、又は好ましくは、約０．５ｍＭの量で存在する。さらに、こうした例において、ＮａＣｌは、約７〜１３ｍＭ、又は約８〜１２ｍＭ、又は約９〜１１ｍＭ、又は約９．５〜１０．５ｍＭの範囲で存在し、又は好ましくは、約１０ｍＭの量で存在する。
【００４２】
本発明の方法の別の例において、工程（ａ）の混合物又は組成物はアジュバントを含み、好ましくは、そのアジュバントは、アルハイドロゲル（ミョウバン）、キトサン、ＭＰＬ、又はＣｐＧから選択される。その好ましい態様において、アジュバントは、ＣｐＧ１０１８のようなＣｐＧである。その例において、ＣｐＧ１０１８は、約２ｍｇ／ｍｌ〜約６ｍｇ／ｍｌの範囲、又は約３ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌの範囲、又は約３．５ｍｇ／ｍｌ〜約４．５ｍｇ／ｍｌの範囲で存在し、又は好ましくは、ＣｐＧ１０１８は、約４ｍｇ／ｍｌの量で存在する。
【００４３】
付加的なアジュバントとして採用され得る適切なオリゴヌクレオチドの例には、米国特許第６２０７６４８号、同６５８９９４０号、同７２５５８６８、及び同７２７６４８９号（これらの特許の開示事項は、本願でも参照して取り入れられる）に記載のものが挙げられる。
【００４４】
特定の態様において、安定化されたワクチン組成物は、保存中の凝集を低下又は防止させる薬剤をさらに含むことができ、例えば、少量の非イオン系界面活性剤、とりわけエトキシル化ソルビタンエステルが挙げられ、典型的に、約２０のエチレンオキシ単位を含むポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートが例示される。
【００４５】
本方法の付加的な例において、工程（ａ）の混合物又は組成物は、例えば、ツイーン２０のような洗浄剤をさらに含むことができる。限定されない例において、ツイーン２０は、約０．３〜約０．５％の範囲で存在し、又は約０．３５〜約０．４５％の範囲で存在し、又は好ましくは、約０．０４％の量で存在する。
【００４６】
本発明の方法の特に好ましい態様において、工程（ａ）の混合物又は組成物は、４００μｇ／ｍｌのｒＰＡ、４ｍｇ／ｍｌのＣｐＧ１０１８、１０％のトレハロース、０．５ｍＭのホスフェート、１０ｍＭのＮａＣｌ、及び０．０４％のツイーン２０を含む。
【００４７】
また、本発明は、凍結乾燥に適する組成物を提供するものであり、本組成物は、組換え防御抗原（ｒＰＡ）と凍結乾燥保護量のトレハロースを含む炭疽菌抗原を含んでなる。本組成物の限定されない態様において、ｒＰＡは、約１００μｇ／ｍｌ〜約７００μｇ／ｍｌの範囲で存在し、又は約２００〜６００μｇ／ｍｌの範囲で存在し、又は約２５０〜５５０μｇ／ｍｌの範囲で存在し、又は約３００〜５００μｇ／ｍｌの範囲で存在し、又は約３５０〜４５０μｇ／ｍｌの範囲で存在し、好ましくは、約４００μｇ／ｍｌの量で存在する。本発明の方法の別な例において、工程（ａ）の混合物又は組成物は、約２〜２０％の範囲、又は約４〜１８％の範囲、又は約６〜１６％、又は約８〜１４％、又は約９〜１２％、又は好ましくは、約１０％（ｗ／ｖ）の量で存在するトレハロースを含む。
【００４８】
本発明において、適切には、リオプロテクタントが、凍結乾燥される前の製剤又は凍結乾燥されるべき組成物に添加される。好ましい態様において、この添加剤は非還元糖、例えば、サッカロース又はトレハロースであり、後者がとりわけ好ましい。１つの態様において、添加されるリオプロテクタントの量は、再構成のとき、得られる製剤が等張性である量である。また、等の量は、タンパク質の凍結乾燥時に生じることが多い、例えば、ｒＰＡのような抗原タンパク質の不都合な分解や凝集を防ぐのに十分な量でなければならない。
【００４９】
本発明の好ましい態様において、凍結乾燥される前の組成物及び／又は再構成された製剤に、界面活性剤、洗浄剤を添加することが望ましいことがある。有用な界面活性剤の例としては、非イオン系界面活性剤のポリソルベートなど（例えば、ポリソルベート２０（又はツイーン２０）又は８０）；トリトン；ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）；ラウレル硫酸ナトリウム；オクチル配糖体ナトリウム；ラウリル−、ミスチリル−、リノレイル−、又はステアリルスルフォベタイン；ラウリル−、ミスチリル−、リノレイル−、又はステアリルサルコシン；リノレイル−、ミリスチリル−、又はセチルベタイン；ラウロアミドプロピル−、コカミドプロピル−、リノレアミドプロピル−、ミリスタミドプロピル−、パルミドプロピル−、又はイソステラミドプロピル−ベタイン（例えば、ラウロアミドプロピル）；ミリスタミドプロピル−、パルミドプロピル−、又はイソステラミドプロピル−ジメチルアミン；メチルココイルナトリウム−，又はメチルオレイル−タウレート二ナトリウム塩；モナクアト（登録商標）シリーズ（モナクアインダストリーズ社、パターソン、ニュージャージ州）、ポリエチレングリコール、ポリプロピルグリコール、及びエチレンとプロピレングリコールのコポリマー（例えば、プルロニック、ＰＦ６８など）が挙げられる。ツイーン２０は、好ましい界面活性剤又は洗浄剤である。添加量は、再構成されたタンパク質の凝集を低減し、再構成後の粒子の生成を最小限にするのに十分である。例えば、界面活性剤又は洗浄剤は、約０．００１〜０．５％、好ましくは、約０．００５〜０．０５％の量で、凍結乾燥前の組成物に存在することができる。
【００５０】
本発明の特定の態様において、リオプロテクタント（トレハロースなど）は、凍結乾燥前の製剤を調製するために、増量剤（例えば、マンニトール又はグリセリン）と組み合わせて使用することができる。こうした増量剤の使用は、より均一な凍結乾燥されたケーキ（即ち、過剰なポケットなどが無い）の産生を容易にさせることができる。
【００５１】
別な態様において、本組成物は、塩、好ましくは、ホスフェート及び／又はＮａＣｌ（又は生理食塩水）を含む。この例において、ホスフェートは、約０．３〜０．７ｍＭの範囲、又は約０．３５〜０．６５ｍＭの範囲、又は約０．４〜０．６ｍＭの範囲、又は約０．４５〜０．５５ｍＭの範囲で存在し、又は好ましくは、約０．５ｍＭの量で存在する。さらに、こうした例において、ＮａＣｌは、約７〜１３ｍＭ、又は約８〜１２ｍＭ、又は約９〜１１ｍＭ、又は約９．５〜１０．５ｍＭの範囲で存在し、又は好ましくは、約１０ｍＭの量で存在する。
【００５２】
別の例において、本組成物はアジュバントを含み、好ましくは、そのアジュバントは、アルハイドロゲル（ミョウバン）、キトサン、ＭＰＬ、又はＣｐＧから選択される。その好ましい態様において、アジュバントは、ＣｐＧ１０１８のようなＣｐＧである。その例において、ＣｐＧ１０１８は、約２ｍｇ／ｍｌ〜約６ｍｇ／ｍｌの範囲、又は約３ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌの範囲、又は約３．５ｍｇ／ｍｌ〜約４．５ｍｇ／ｍｌの範囲で存在し、又は好ましくは、ＣｐＧ１０１８は、約４ｍｇ／ｍｌの量で存在する。
【００５３】
付加的な例において、本組成物は、例えば、ツイーン２０のような洗浄剤をさらに含む。限定されない例において、ツイーン２０は、約０．３〜約０．５％の範囲で存在し、又は約０．３５〜約０．４５％の範囲で存在し、又は好ましくは、約０．０４％の量で存在する。
【００５４】
特に好ましい態様において、凍結乾燥に適する本組成物は、４００μｇ／ｍｌのｒＰＡ、４ｍｇ／ｍｌのＣｐＧ１０１８、１０％のトレハロース、０．５ｍＭのホスフェート、１０ｍＭのＮａＣｌ、及び０．０４％のツイーン２０を含む。
【００５５】
また、本組成物は、こうした組成物の調製方法を提供するものであり、本方法は、本発明の方法について上述した工程（ａ）の手順を基本的に含む。
【００５６】
凍結乾燥される本組成物に存在するホスフェートは、本組成物と同時に再構成後に産生されるワクチン製剤の緩衝の目的に有用であることができる。ここで、ホスフェートは、限定された緩衝剤ではなく、ホスフェートに代えて又はホスフェートと組み合わせて、別な緩衝剤を使用してもよい。こうした緩衝剤の例には、ヒスチジン、ホスフェート、トリス、クエン酸塩、コハク酸塩、及び他の有機酸が挙げられる。緩衝剤の濃度は、約１ｍＭ〜約２０ｍＭ、又は約３ｍＭ〜約１５ｍＭでよく、例えば、その緩衝剤、及びワクチン製剤（例えば、再構成される製剤）の所望の等張性によって決まる。また、こうした緩衝剤は、トレハロースに加えて、凍結乾燥保護効果を与えることがある。
【００５７】
また、本発明は、以下のものを含むキットを提供する。
（ａ）ｒＰＡ、トレハロース、及び薬学的に許容される担体を含む炭疽菌ワクチンの凍結乾燥組成物を保持する容器、及び
（ｂ）及び希釈剤を用いて約２００μｇ／ｍｌのｒＰＡ濃度に凍結乾燥組成物を再構成する説明書。
【００５８】
こうしたキットは、凍結乾燥組成物を再構成するために適切な希釈剤の容器をさらに含むことができる。こうした希釈剤の具体的な態様は、本発明の方法に用いる希釈剤に関する説明に関して記載している。
【００５９】
本発明のキットは、通常、バイアルその他の適切な容器、例えば、瓶、バイアル類（例えば、二重チャンバーバイアル）、注射器類（例えば、二重チャンバー注射器）、及び試験管などに凍結乾燥組成物を収容する。容器は、ガラスやプラスチックのような種々の材料から形成することができる。その容器は、凍結乾燥製剤とその上のラベルを保持し、あるいは付随して、その容器は、再構成及び／又は使用の説明を示すことができる。例えば、そのラベルは、凍結乾燥製剤が、上述のようなタンパク質濃度に再構成されることを指示することができる。さらに、そのラベルは、その製剤が皮下投与を目的とする又は有用であることを示すことができる。製剤を保持する容器は、再構成製剤の反復投与を可能にする多用途バイアルであることもできる。製造物品であるキットは、本願に開示の種類の適切な希釈剤を入れた第２容器をさらに備えることもできる。希釈剤と凍結乾燥製剤を混合すると、再構成された製剤中の最終的なｒＰＡ濃度は、一般に、上述の範囲であるが、概して、約２００μｇ／ｍｌと考えられる。このキットは、さらに、別な緩衝材、希釈剤、フィルター、針、注射器、及び使用説明書を含む添付書などの商業的視点及びユーザー視点から望まれる別な材料を含むことができる。
【００６０】
一般に、ワクチンは、水系の溶液又は懸濁液の形態の注射可能なものとして調製される。油系のワクチンは、吸入用などとしてよく知られている。また、使用前に溶解又は懸濁される固体を製剤することもできる。活性成分と適合し、製剤用途に適する薬学的に許容される担体、希釈剤、及び賦形剤が一般に添加される。
【００６１】
本発明に有用な医薬組成物及び／又は製剤は、任意の適切な希釈剤又は賦形剤を含む薬学的に許容される担体を含み、この担体には、その組成物を受け入れる個体に有害な抗体の産生をそれ自体が引き起こさず、過度の毒性なしに投与され得る任意の医薬品が挙げられる。薬学的に許容される担体には、限定されるものではないが、水、生理食塩水、グリセロール、エタノールなどの液体のほか、経鼻その他の気道搬送や眼系への搬送用のスプレーを形成するのに有用な担体が含まれる。薬学的に許容される担体、希釈剤、及び賦形剤の詳細な説明が、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ（マック出版社、ニュージャージ州、現行版）に示されている。そこに記載されているものは、本発明の製剤、組成物、方法、及びキットに使用するのに特に好ましい。
【００６２】
ワクチン組成物は、ｐＨを安定化させ、アジュバンド、湿潤剤、又は乳化剤として機能し、ワクチンの効果を改良するのに役立つ付加的な物質をさらに取り入れることができる。
【００６３】
ワクチンは、一般に、非経口投与用に製剤され、皮下又は筋肉内に注射される。また、こうしたワクチンは、当該技術分野で知られる方法を用い、座薬として又は経口投与用に、あるいは鼻又は気道経路を通した投与用に製剤することもできる。
【００６４】
病原菌、ウイルス、又は他の微生物に対する免疫を与えるのに十分なワクチンの量は、本願に記載の説明を吟味して、当業者がよく知る方法によって決定することができる。この量は、ワクチン接種者の特徴と必要な免疫レベルに基づいて決定されると考えられる（上述のように）。ワクチンが、皮下又は筋肉注射によって投与される場合、０．５〜５００μｇの範囲の精製タンパク質が与えられる。本発明に有用なものとして、約１μｇ、場合により、１０μｇ、さらには５０μｇ、多くは１００μｇ、最大で５００μｇの免疫原性タンパク質、又は免疫原性ポリペプチド、又はその免疫原性的活性フラグメントを与える用量が、通常は十分である。また、こうした物質の複数のものがワクチン中に存在してもよい。即ち、複数の抗原構造を使用し、本願に開示の方法に使用されるワクチン又はワクチン組成物の製剤に用いることができる。これは、複数の個々に免疫原性のタンパク質もしくはポリペプチド、又は組み合わされたときのみ免疫原性活性を示すタンパク質もしくはポリペプチドを含んでもよく、それぞれの濃度において量的に同じ、又は比に存在するように製剤してもよく、限定的又は非限定的でもよい。
【００６５】
本願に開示のプロセスに使用されるワクチン組成物は、１つ複数の免疫原性タンパク質、１つ又は複数の免疫原性ポリペプチド、及び／又はその免疫原性タンパク質又はポリペプチドの抗原フラグメントを含む１つ又は複数の免疫原性活性の免疫原を含むことができ、このフラグメントは、本発明の使用によって選択される任意の割合で存在する。本発明の方法に有用なワクチン、及びワクチン組成物を構成する正確な成分とそれぞれの量は、とりわけ、治療又は防止されるべき疾患の性質、既に存在する症状の重症度、年齢、性別、及び受給者の全体的健康、並びに、これらの方法を用いる研究者及び／又は医師の個人的・職業的な経験と意向によって決定される。
【００６６】
炭疽菌に対して使用されるサブユニットワクチンのような本発明のワクチンに関し、このワクチン組成物の特定の限定されない例として、ｒＰＡが、約１０〜３００μｇ／ｍｌ、好ましくは５０〜３００μｇ／ｍｌ存在し、又はｒＰＡが、約１００〜３００μｇ／ｍｌ、より好ましくは約１５０〜２５０μｇ／ｍｌ存在し、最も好ましくは、ｒＰＡが約２００μｇ／ｍｌの量で存在する。
【００６７】
別の例において。投与される抗原、好ましくは、ｒＰＡの用量は、少なくとも約５μｇ、又は少なくとも約１０μｇ、又は少なくとも約２５μｇ、又は少なくとも約５０μｇ、又は少なくとも約７５μｇ、又は少なくとも約１００μｇ、又は少なくとも約１５０μｇ、又は少なくとも約２００μｇであり、好ましい用量は約１００μｇである。好ましい用量体積は約０．５ｍｌである。
【００６８】
本発明は、さらに、アジュバンド、好ましくは、ミョウバンを主成分とするアジュバンドに結合した、精製抗原、好ましくは炭疽菌抗原、より好ましくは炭疽菌防御抗原（ＰＡ）、最も好ましくは組換え炭疽菌防御抗原（ｒＰＡ）（例えば、２００７年１１月１日に公開のＷＯ２００７／１２２３７３に記載、この開示事項は本願においても全体として参照して取り入れられる）を含むワクチンに関するものである。好ましい態様において、本発明は、ミョウバンに結合したｒＰＡと少なくとも約２ｍＭのホスフェート塩を含み、ｐＨが約７．１のサブユニットワクチンに関する。
【００６９】
インビボ投与に使用されるワクチン製剤は、通常、無菌であり、これは、凍結乾燥と再構成の前又は後で、無菌濾過膜を通して濾過することによって達成することができる。全体の組成物の無菌は、１つの限定されない例であるが、約１２０℃で約３０分間以下にわたって、タンパク質以外の成分をオートクレーブ処理することによって達成することができる。
【００７０】
実際の凍結乾燥手順そのものに関し、Ｈｕｌｌ５０（商標、Ｈｕｌｌ、米国）、ＧＴ２０（商標、レイボルトヘラオイス社、ドイツ）、ＢＯＣエドワード、クリストＧＴＳ、ＦＴＳロイスター凍結乾燥器などの種々の市販の装置が利用可能である。凍結乾燥は、製剤を凍結した後、一次乾燥に適切な温度で凍結物から氷を昇華させることによって達成される。この条件下で、製品温度は、製剤の共融点又は崩壊温度を下回る。典型的に、一次乾燥の棚温度は、典型的に約５０〜２５０ミリトールの範囲の適切な圧力において、約−３０〜２５℃の範囲と考えられる（一次乾燥の間に製品が凍結を維持するとする）。製剤、サンプルを保持する容器のサイズと種類（例えば、ガラスバイアル）、及び液体の体積は、主として、乾燥に必要な時間に影響すると考えられ、この時間は、数時間から数日間でよい（例えば、４０〜６０時間）。二次乾燥の段階は、約０〜４０℃で行うことができ、主として、容器の種類とサイズ、及び使用されるタンパク質の種類に依存する。ここで、二次乾燥工程は、不要であり得ることが見出されている。例えば、凍結乾燥の全体水除去段階の全体を通した棚温度は、約１５〜３０℃（例えば、約２０℃）であってよい。二次乾燥に必要な温度と圧力は、適切な凍結乾燥ケーキを生成するものと考えられ、例えば、温度その他のパラメーターに依存する。二次乾燥時間は、製品中の所望の残存水分レベルに影響され、典型的に、少なくとも約５時間を要する（例えば、１０〜１５時間）。圧力は、一次乾燥工程に使用されるものと同じでもよい。凍結乾燥条件は、製剤とバイアルサイズによって変化することがある。得られた凍結乾燥粉末は、通常、約５％未満、好ましくは、約３％未満の水分を有すると考えられる。
【００７１】
本発明の方法に有用な凍結−乾燥サイクルの例を表１と表２に示す。
【００７２】
【表１】
2012515752.tif 000002
【００７３】
【表２】
2012515752.tif 000003
【００７４】
各サイクルにおいて、チャンバーに空気を導入する前に、製品に栓が施される。次いで、凍結乾燥器から取り出すときに、アルミニウムのシールがバイアルに施され、クリンプされる。
【００７５】
再構成された製剤は、そのタンパク質での治療を必要とする患者、好ましくはヒトに、公知の方法、例えば、急速投与のような静脈内投与又は時間をかけた持続注入によって、また、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液内、髄腔内、経口、局所、又は吸入ルートで投与される。
【００７６】
本発明の方法によって調製された凍結乾燥されたワクチン組成物は、一般に、使用時までに凍結乾燥状態に維持される。患者への投与の用意が整ったとき、凍結乾燥製剤は、本願に記載の希釈剤を用いて再構成される。
【００７７】
再構成は、通常、完全水和を確保するために室温で行われるが、所望により、別な温度が採用されてもよい。再構成に必要な時間は、例えば、希釈剤の種類、賦形剤の量、及びｒＰＡのようなタンパク質によって決まると考えられる。希釈剤の例には、滅菌水、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝液（例えば、ホスフェート緩衝生理食塩水が特に好ましい）、無菌食塩水、リンガー溶液、又はデキストロース溶液が挙げられる。希釈剤は、所望により、保存料を含む。ベンジルアルコール又はフェノールアルコールのような芳香族アルコールが好ましい保存料である。使用される保存料の量は、タンパク質との適合性及び保存効力試験について、種々の保存料の濃度を評価することによって求められる。例えば、保存料が芳香族アルコール（例えば、ベンジルアルコール）の場合、約０．１〜２．０％、好ましくは約０．５〜１．５％、最も好ましくは約１．０〜１．２％の量で存在することができる。
【００７８】
本発明は、さらに、微生物感染、好ましくは、バクテリア感染に対する保護方法、又は治療方法を提供するものであり、こうした感染の恐れのある哺乳類に、上述した安定圧力ワクチン製剤の治療的有効量を投与することを含む。感染する生命体は、本願に記載のものの任意の１つ又は複数であってよく、製剤は本願に記載の製剤、及び／又は本発明の方法によって凍結乾燥したワクチン組成物又は混合物から再構成した製剤である。好ましい態様において、バクテリア感染は、炭疽菌感染である（即ち、バチルス・アントラシスから引き起こされる）。１つの例において、保護されるべき動物は、哺乳類であり、とりわけヒトの患者である。こうした治療に使用される好ましい製剤は、２００μｇ／ｍｌのｒＰＡ、２ｍｇ／ｍｌのＣｐＧ１０１８、５％のトレハロース、５．２５ｍＭのホスフェート、０．３９％のＮａＣｌ、０．０２％のツイーン２０、０．２６％ｗ／ｖのアルハイドロゲルを含むワクチン組成物である。
【００７９】
本発明の手順を実施するにおいて、特定の緩衝剤、媒体、試薬などに対する言及は、当然ながら、限定することを意図しているものではなく、当業者が、記載の説明における特定の内容において、関心がある又は価値があると認識する関連材料の全てを包含すると理解すべきである。例えば、１つの緩衝系を別のものに置換し、同一ではないにせよ類似の結果を依然として得られることが多い。当業者は、こうした系とあり得る方法論について十分な知識を有していると考えられ、過度の実験をすることなく、その材料が本発明にとって本質的でなければ、本願に開示の方法と手順を用いて目的を最適に果たす代替を行い得るものと考えられる。
【００８０】
本発明を以下の限定されない例によって、より詳細に説明する。これらの方法と実施例は、本発明をその態様に限定するものでは決してなく、別な態様と用途が、恐らく自ずと当業者には示唆されるものと考えられる。
【実施例】
【００８１】
実施例１．トレハロース含有凍結乾燥ワクチンの安定性
４００μｇ／ｍｌのｒＰＡ、１０％トレハロース中の４ｍｇ／ｍｌのＣｐＧ１０１８、０．５ｍＭのホスフェート、１０ｍＭのＮａＣｌ、０．０４％のツイーン２０を凍結乾燥した。この製剤組成物は、凍結乾燥の前に、再構成材料の濃度の２倍であった。次いで、この製剤を、５ｍＭのホスフェート中の０．２６％アルハイドロゲル、０．３９％の生理食塩水、ｐＨ７．４を用いて再構成した。再構成された製剤は、２００μｇ／ｍｌのｒＰＡ、５％トレハロース中の２ｍｇ／ｍｌのＣｐＧ１０１８、５．２５ｍＭのホスフェート、０．３９％のＮａＣｌ、０．０２％のツイーン２０、０．２６％のアルハイドロゲルであった。％値は全てｗ／ｖである。
【００８２】
７０℃において、ｒＰＡは、８箇月もの後に効力を保持した。７０℃はＴｇ（ガラス転移温度、トレハロース糖ガラスが、軟化し始める温度であり、もはや脆くない）よりも高いため、高分解が見られるとも予想されたが、そのような分解の促進は観察されなかった。即ち、この凍結乾燥された製剤は、トレハロースの存在下で予想外に安定であった。
【００８３】
実施例２．凍結乾燥ワクチンの安定性
雌の成体Ａ／Ｊマウスを、表３に示す各サンプルの０．１ｍｌを用いて第０日に筋肉注射（ｉ．ｍ．）で免疫を与え、ここで、各サンプルは、投与前に希釈剤を用いて製剤した。全てのマウスは、炭疽菌ＳＴＩ株胞子に２１日暴露され、１１日に生存を判定した。
【００８４】
表３の結果から、凍結乾燥されたワクチンが、こうしたワクチンの先の経験から予想されるよりもはるかに高い安定性を示すことが分かる（例えば、５℃と７０℃での貯蔵結果を比較）。希釈剤は、ｐＨ７．４の５ｍＭホスフェートで緩衝された０．３９％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム中の０．２６％（ｗ／ｗ）アルハイドロゲル（０．４％Ａｌ（ＯＨ）３）からなった。未処理動物は、負の対照であり、治療は何ら受けなかったが、試験動物と同じ胞子用量で、２１日の暴露を受けた。
【００８５】
【表３】
2012515752.tif 000004
【図１】
2012515752.tif 000005
【手続補正書】
【提出日】平成24年1月20日(2012.1.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療的有効量の炭疽菌抗原と凍結乾燥保護量の非還元糖を含む組成物を凍結乾燥することによって調製されたワクチン製剤であって、前記組成物がアジュバンドを含まない、安定な凍結乾燥されたワクチン製剤。
【請求項２】
前記炭疽菌抗原が組換え炭疽菌防御抗原（ｒＰＡ）を含む、請求項１に記載の安定な凍結乾燥されたワクチン製剤。
【請求項３】
前記製剤が、薬学的に許容される担体とともに再構成されたとき、前記凍結乾燥の前の前記組成物と実質的に同じ効力を保持する、請求項２に記載の安定な凍結乾燥されたワクチン製剤。
【請求項４】
前記製剤が、薬学的に許容される担体とともに再構成されたとき、前記凍結乾燥前の前記組成物の少なくとも８０％の効力を保持する、請求項１に記載の安定な凍結乾燥されたワクチン製剤。
【請求項５】
前記製剤が、薬学的に許容される担体とともに再構成されたとき、前記凍結乾燥前の前記組成物の少なくとも８５％の効力を保持する、請求項１に記載の安定な凍結乾燥されたワクチン製剤。
【請求項６】
前記製剤が、薬学的に許容される担体とともに再構成されたとき、前記凍結乾燥前の前記組成物の少なくとも９０％の効力を保持する、請求項１に記載の安定な再構成されたワクチン製剤。
【請求項７】
前記製剤が、薬学的に許容される担体とともに再構成されたとき、前記凍結乾燥前の前記組成物の少なくとも９５％の効力を保持する、請求項１に記載の安定な凍結乾燥されたワクチン製剤。
【請求項８】
前記製剤が、少なくとも約５０μｇのｒＰＡを含む、請求項２に記載の安定な凍結乾燥されたワクチン製剤。
【請求項９】
前記製剤が、少なくとも約１００μｇのｒＰＡを含む、請求項２に記載の安定な凍結乾燥されたワクチン製剤。
【請求項１０】
前記製剤が、少なくとも約２００μｇのｒＰＡを含む、請求項２に記載の安定な凍結乾燥されたワクチン製剤。
【請求項１１】
前記非還元糖がトレハロースである、請求項２に記載の安定な凍結乾燥されたワクチン製剤。
【請求項１２】
前記トレハロースが、凍結乾燥前の組成物中に、約２％〜２０％（ｗ／ｖ）の範囲で存在する、請求項１１に記載の安定な凍結乾燥されたワクチン製剤。
【請求項１３】
前記トレハロースが、凍結乾燥前の組成物中に、約６％〜１６％（ｗ／ｖ）の範囲で存在する、請求項１１に記載の安定な凍結乾燥されたワクチン製剤。
【請求項１４】
前記トレハロースが、凍結乾燥前の組成物中に、約８％〜１２％（ｗ／ｖ）の範囲で存在する、請求項１１に記載の安定な凍結乾燥されたワクチン製剤。
【請求項１５】
前記トレハロースが、凍結乾燥前の組成物中に、約１０％（ｗ／ｖ）存在する、請求項１１に記載の安定な凍結乾燥されたワクチン製剤。
【請求項１６】
前記凍結乾燥組成物が、少なくとも３箇月の期間にわたって少なくとも２５℃の温度に維持された、請求項３に記載の安定な凍結乾燥されたワクチン製剤。
【請求項１７】
前記温度が少なくとも４０℃である、請求項１６に記載の安定な凍結乾燥されたワクチン製剤。
【請求項１８】
前記温度が少なくとも５５℃である、請求項１６に記載の安定な凍結乾燥されたワクチン製剤。
【請求項１９】
前記温度が少なくとも７０℃である、請求項１６に記載の安定な凍結乾燥されたワクチン製剤。
【請求項２０】
前記期間が少なくとも３箇月である、請求項１６に記載の安定な凍結乾燥されたワクチン製剤。
【請求項２１】
前記期間が少なくとも７箇月である、請求項１６に記載の安定な凍結乾燥されたワクチン製剤。
【請求項２２】
前記期間が少なくとも８箇月である、請求項１６に記載の安定な凍結乾燥されたワクチン製剤。
【請求項２３】
前記期間が少なくとも１６箇月である、請求項１６に記載の安定な凍結乾燥されたワクチン製剤。
【請求項２４】
前記製剤が、４００μｇ／ｍｌのｒＰＡ、１０％のトレハロース、０．５ｍＭのホスフェート、１０ｍＭのＮａＣｌ、及び０．０４％のツイーン２０を含む組成物を凍結乾燥することによって調製された、請求項２に記載の安定な凍結乾燥されたワクチン製剤。
【請求項２５】
以下の工程：
（ａ）抗微生物抗原と凍結乾燥保護量の還元糖の組成物を形成し、及び
（ｂ）前記組成物を凍結乾燥して、安定な凍結乾燥されたワクチン製剤を形成する、
を含む、安定な凍結乾燥されたワクチン製剤の調製方法。
【請求項２６】
前記抗微生物抗原がｒＰＡである請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記非還元糖がトレハロースである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記製剤が約５％未満の水分を有する請求項２に記載の安定な凍結乾燥されたワクチン製剤。
【請求項２９】
前記製剤が約３％未満の水分を有する請求項２に記載の安定な凍結乾燥されたワクチン製剤。
【国際調査報告】
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