【手続補正書】
【提出日】平成21年2月10日(2009.2.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下：
（ｉ）配列番号４〜６よりなる群から選択される配列を含む１５〜３０ヌクレオチド長の第１の鎖；及び、
（ｉｉ）１５〜３０ヌクレオチド長の第２の鎖；
を含む核酸であって、
ここで該第１及び第２の鎖の少なくとも１２ヌクレオチドは相互に相補であり、そして生理学的条件下にて２本鎖核酸を形成し、そしてここで、該２本鎖核酸はＲＮＡ干渉機序により細胞内でリボヌクレオチドレダクターゼサブユニット２（Ｒ２）の発現を低減できる、核酸。
【請求項２】
前記核酸が２本鎖ＲＮＡである請求項１記載の核酸。
【請求項３】
前記核酸がヘアピンＲＮＡである請求項１記載の核酸。
【請求項４】
前記ヘアピンＲＮＡのループ領域が４〜１０ヌクレオチド長である請求項３記載の核酸。
【請求項５】
前記ＲＮＡの２本鎖部分が約１５〜約３０ヌクレオチド長である請求項１記載の核酸。
【請求項６】
前記第１の鎖がＤＮＡポリヌクレオチドであり、そして第２の鎖がＲＮＡポリヌクレオチドである請求項１記載の核酸。
【請求項７】
前記第１及び／又は第２の鎖が更に３’オーバーハング領域、５’オーバーハング領域又は３’オーバーハング領域及び５’オーバーハング領域の両方を含む請求項１記載の核酸。
【請求項８】
前記オーバーハング領域が１〜１０ヌクレオチド長である請求項７記載の核酸。
【請求項９】
前記核酸が１つ以上の改変された骨格又は塩基部分を含む請求項１記載の核酸。
【請求項１０】
前記改変された骨格又は塩基部分が、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホロチオエート、ホスホロアミデート、ホスフェートエステル、カルバメート、アセトアミデート、カルボキシルメチルエステル、カーボネート及びホスフェートトリエステルの１つ以上である請求項９記載の核酸。
【請求項１１】
前記核酸が少なくとも１つの２’−Ｏ−アルキル化リボヌクレオチドを含む請求項９記載の核酸。
【請求項１２】
前記第１の鎖が配列番号７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３及び９５よりなる群から選択される配列を含む請求項１記載の核酸。
【請求項１３】
前記第２の鎖が配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４及び９６よりなる群から選択される配列を含む請求項１記載の核酸。
【請求項１４】
１０ナノモルの濃度において生理学的条件下にて細胞と接触した場合に、前記核酸が該細胞によるＲ２発現を５０％以上阻害する請求項１記載の核酸。
【請求項１５】
生理学的条件下にて配列番号１のヌクレオチド４２２〜４８５、６１６〜６６７又は９０７〜９６８に相当するＲ２転写物の領域にハイブリダイズし、そして、細胞内のＲ２の発現を低減する配列を含む、単離された核酸。
【請求項１６】
前記核酸が配列番号１のヌクレオチド４３２〜４７５、６２６〜６５７又は９１７〜９５８に相当するＲ２転写物の領域にハイブリダイズする配列を含む請求項１５記載の単離された核酸。
【請求項１７】
前記核酸が配列番号１のヌクレオチド４３７〜４７０、６３１〜６５２又は９２１〜９５３に相当するＲ２転写物の領域にハイブリダイズする配列を含む請求項１５記載の単離された核酸。
【請求項１８】
前記核酸がＲ２の前記領域の１つに相補的な少なくとも１０連続ヌクレオチドを含む請求項１５記載の核酸。
【請求項１９】
前記核酸が約１４〜約５０ヌクレオチド長である請求項１５記載の核酸。
【請求項２０】
前記核酸が１本鎖である請求項１５記載の核酸。
【請求項２１】
前記核酸が２本鎖である請求項１５記載の核酸。
【請求項２２】
前記核酸が改変された骨格又は塩基部分１つ以上を場合により含むＤＮＡ分子である請求項１５記載の核酸。
【請求項２３】
前記核酸が改変された骨格又は塩基部分１つ以上を場合により含むＲＮＡ分子である請求項１５記載の核酸。
【請求項２４】
前記核酸がＤＮＡ鎖及びＲＮＡ鎖を含み、そして改変された骨格又は塩基部分１つ以上を場合により含む請求項１５記載の核酸。
【請求項２５】
前記核酸がＲＮＡｉコンストラクトである請求項１５記載の核酸。
【請求項２６】
前記ＲＮＡｉコンストラクトが改変された骨格又は塩基部分１つ以上を場合により含むｄｓＲＮＡである請求項２５記載の核酸。
【請求項２７】
前記ＲＮＡｉコンストラクトが改変された骨格又は塩基部分１つ以上を場合により含むヘアピンＲＮＡである請求項２５記載の核酸。
【請求項２８】
前記ＲＮＡｉコンストラクトのデュプレックス部分が約１５〜約３０ヌクレオチド長である請求項２５記載の核酸。
【請求項２９】
前記ＲＮＡｉコンストラクトが改変された骨格又は塩基部分１つ以上を場合により含む配列番号４〜６よりなる群から選択される配列を含む請求項２５記載の核酸。
【請求項３０】
前記ＲＮＡｉコンストラクトが改変された骨格又は塩基部分１つ以上を場合により含む配列番号７〜９６よりなる群から選択される配列を含む請求項２５記載の核酸。
【請求項３１】
前記ＲＮＡｉコンストラクトが改変された骨格又は塩基部分１つ以上を含む請求項２５記載の核酸。
【請求項３２】
前記ＲＮＡｉコンストラクトがアルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホロチオエート、ホスホロアミデート、ホスフェートエステル、カルバメート、アセトアミデート、カルボキシルメチルエステル、カーボネート及びホスフェートトリエステルよりなる群から選択されるヌクレオチド間連結少なくとも１つを含む請求項３１記載の核酸。
【請求項３３】
前記改変されたＲＮＡｉコンストラクトが２’−Ｏ−アルキル化リボヌクレオチド少なくとも１つを含む請求項３１記載の核酸。
【請求項３４】
前記核酸が酵素的核酸である請求項１５記載の核酸。
【請求項３５】
前記酵素的核酸がリボザイムである請求項３４記載の核酸。
【請求項３６】
前記酵素的核酸がＤＮＡ酵素である請求項３４記載の核酸。
【請求項３７】
１０ナノモルの濃度において生理学的条件下にて細胞と接触した場合に前記核酸が該細胞によるＲ２発現を５０％以上阻害する請求項１５記載の核酸。
【請求項３８】
請求項１または請求項１５記載の核酸及び製薬上許容しうる担体を含む医薬組成物。
【請求項３９】
前記製薬上許容しうる担体がカチオン性重合体を含有する請求項３８記載の医薬組成物。
【請求項４０】
前記製薬上許容しうる担体がシクロデキストリン重合体を含有する請求項３８記載の医薬組成物。
【請求項４１】
前記シクロデキストリン構造が図２７に示すｉｍ−ＣＤＰである請求項４０記載の医薬組成物。
【請求項４２】
シクロデキストリン重合体及び請求項１又は１５記載の核酸を含有し、そしてＰＥＧ化されている粒子を含む請求項３８記載の医薬組成物。
【請求項４３】
前記粒子が更にアダマンタンを含む請求項４２記載の医薬組成物。
【請求項４４】
更に特定の組織又は細胞型をターゲティングするリガンドを含む請求項３８記載の医薬組成物。
【請求項４５】
前記リガンドがガラクトースを含む請求項４４記載の医薬組成物。
【請求項４６】
ナノ粒子を含み、そして該ナノ粒子が直径１０〜１００ｎｍである請求項３８記載の医薬組成物。
【請求項４７】
前記ナノ粒子が直径約５０〜７０ｎｍである請求項４６記載の医薬組成物。
【請求項４８】
ナノ粒子が直径約５０ｎｍである請求項４７記載の医薬組成物。
【請求項４９】
請求項３８記載の医薬組成物であって、ここで前記製薬上許容しうる担体が、以下：
イミダゾール改変シクロデキストリン含有カチオン性重合体、及び、
アダマンタン−ＰＥＧ−リガンドを含むターゲティング部分、
を含み、
ここで該重合体及びターゲティング部分が前記核酸をカプセル化するナノ粒子を形成する、医薬組成物。
【請求項５０】
前記ナノ粒子が約５０〜１２０ｎｍの直径を有する請求項４９記載の医薬組成物。
【請求項５１】
前記ナノ粒子が約５０〜１００ｎｍの直径を有する請求項５０記載の医薬組成物。
【請求項５２】
ナノ粒子が約５０〜７０ｎｍの直径を有する請求項５１記載の医薬組成物。
【請求項５３】
前記ナノ粒子が約５０ｎｍの直径を有する請求項４９記載の医薬組成物。
【請求項５４】
前記ターゲティングリガンドがガラクトースを含む請求項４９記載の医薬組成物。
【請求項５５】
前記ターゲティングリガンドがトランスフェリンを含む請求項４９記載の医薬組成物。
【請求項５６】
細胞の望ましくない増殖に関連する疾患又は症状の治療のための医薬の製造における請求項１又は１５記載の核酸の使用。
【請求項５７】
前記細胞が癌性又は腫瘍の細胞である請求項５６記載の使用。
【請求項５８】
前記細胞が病原体細胞である請求項５６記載の使用。
【請求項５９】
前記細胞が正常細胞であり、該細胞の前記望ましくない増殖が疾患状態をもたらす、請求項５６記載の使用。
【請求項６０】
請求項１又は１５記載の２本鎖核酸を含む癌を有する患者を治療するための組成物。
【請求項６１】
前記核酸が製薬上許容しうる担体とともに製剤される請求項６０記載の組成物。
【請求項６２】
前記核酸が癌細胞をターゲティングするリガンドとともに製剤される請求項６０記載の組成物。
【請求項６３】
前記リガンドがトランスフェリンである請求項６２記載の組成物。
【請求項６４】
前記癌細胞が肝細胞であり、そして前記リガンドがガラクトースを含む請求項６２記載の組成物。
【請求項６５】
前記核酸が重合体ナノ粒子の成分として製剤される請求項６０記載の組成物。
【請求項６６】
前記ナノ粒子が直径１０〜１２０ｎｍである請求項６５記載の組成物。
【請求項６７】
前記ナノ粒子が直径５０〜１２０ｎｍである請求項６５記載の組成物。
【請求項６８】
前記ナノ粒子が直径５０〜１００ｎｍである請求項６７記載の組成物。
【請求項６９】
前記ナノ粒子が直径５０ｎｍである請求項６５記載の組成物。
【請求項７０】
全身投与により投与される請求項６０記載の組成物。
【請求項７１】
肝動脈内投与により投与される請求項６０記載の組成物。
【請求項７２】
前記癌が肝臓癌である請求項７１記載の組成物。
【請求項７３】
前記癌細胞が比較可能な組織に由来する非癌性の細胞と比較してより高レベルのＲ２を発現する請求項６０記載の組成物。
【請求項７４】
前記核酸と相加的又は相乗的な態様において癌細胞を阻害する追加的抗癌化学療法剤少なくとも１つを更に含有する請求項６０記載の組成物。
【請求項７５】
化学療法剤がフルオロウラシル（５ＦＵ）である請求項７４記載の組成物。
【請求項７６】
以下：
肝臓治療薬、及び、
（ｉ）イミダゾール改変シクロデキストリン含有カチオン性重合体、及び（ｉｉ）アダマンタン−ＰＥＧ−リガンドを含むターゲティング部分を含む送達ビヒクルであって、ここで該重合体及びターゲティング部分が核酸をカプセル化するナノ粒子を形成する、送達ビヒクル、
を含む肝特異的送達医薬組成物。
【請求項７７】
前記ナノ粒子が直径１０〜１００ｎｍである請求項７６記載の医薬組成物。
【請求項７８】
前記ナノ粒子が直径約５０〜７０ｎｍである請求項７７記載の医薬組成物。
【請求項７９】
前記ナノ粒子が直径約５０ｎｍである請求項７７記載の医薬組成物。
【請求項８０】
前記肝臓治療薬が小分子、ポリペプチド又は核酸である請求項７６記載の医薬組成物。
【請求項８１】
前記肝臓治療薬が請求項１又は１５記載の核酸である請求項８０記載の医薬組成物。
【請求項８２】
以下：
肝臓治療薬、及び、
（ｉ）イミダゾール改変シクロデキストリン含有カチオン性重合体、及び（ｉｉ）アダマンタン−ＰＥＧ−リガンドを含むターゲティング部分を含む送達ビヒクルであって、ここで該重合体及びターゲティング部分が核酸をカプセル化するナノ粒子を形成する、送達ビヒクル、
を含む、肝臓の疾患又は障害を治療するための組成物。
【請求項８３】
前記肝臓の疾患又は障害が肝細胞癌である請求項８２記載の組成物。
【請求項８４】
肝動脈内投与により投与される請求項８２記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
Ｒ２の阻害は細胞におけるＲ２の生物学的活性、例えばその酵素活性を阻害することにより達成してよい。或いは、Ｒ２の阻害は細胞におけるＲ２遺伝子の発現を阻害することにより達成してよい。小分子及び核酸はＲ２の活性及び／又は発現をダウンレギュレーションするために使用される。例示されるものは、ペプチド又はペプチド誘導体である２量化阻害剤（例えば米国特許第６，０３０，９４２号又は米国特許第４，８４５，１９５号に記載のペンタペプチドＶａｌ  Ｖａｌ  Ａｓｎ  Ａｓｐ  Ｌｅｕ（配列番号１１７））、触媒性阻害剤（例えばフリーラジカルスカベンジャー又は鉄キレート形成剤）、アンチセンス分子（例えばＧＴＩ−２０４０、Ｌｏｒｕｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）、Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：２７０３０及びＤｕｘｂｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ２８：１５３９に記載のｓｉＲＮＡ分子を含む。しかしなお、新規で向上したＲ２阻害剤はＲ２をダウンレギュレートするための新しい手段として必要とされ続けている。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８１】
【図１】図１はヒトリボヌクレオチドレダクターゼＭ２に関するｃＤＮＡ配列を示す（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１０３４）（配列番号１）。下線を付した太字の３つの１１塩基ストレッチは配列番号４〜６により示されるコア標的配列に相当する。
【図２】図２はマイコバクテリウム・ツベルクロシスＨ３７Ｒｖのリボヌクレオチドレダクターゼ小型サブユニット（図２Ａ）（配列番号２）及びヒトヘルペスウィルス４のリボヌクレオチドレダクターゼ小型サブユニット（図２Ｂ）（配列番号３）に関するｃＤＮＡ配列を示す。
【図３】図３は正常ヒト肝臓組織（図３Ａ）及び肝細胞癌（ＨＣＣ）組織（図３Ｂ）におけるＲ２の免疫組織化学的染色を示す。画像は４００Ｘの倍率で撮影した。Ｒ２発現はＨＣＣ肝臓組織においては検出可能にアップレギュレートされていた。新しく切除されたヒトＨＣＣ組織を４％パラホルムアルデヒド中に固定し、パラフィン包埋し、そして２〜５μｍ切片を切り出した。脱パラフィンし、等級付けされたアルコールを介して再水和した後、スライドをマイクロ波抗原回復（抗原脱マスキング溶液；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）に付し、そしてマウスＩｇＭ（１：４００希釈、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いながらマウス抗ヒト抗ＲＲＭ２抗体（１：４０希釈、Ｃｏｖａｎｃｅ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）及び二次抗体で標識した。画像は冷却した電荷結合デバイスカメラ（Ｍａｇｎａｆｉｒｅ；Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を用いてキャプチャーし、そしてＴＩＦＦファイルとしてＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）にインポートし、そしてＸｅｒｏｘ  Ｐｈａｓｅｒ  ８６０ＤＰプリンター上に印刷した。ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色は標準的なプロトコルを用いて実施した。
【図４】図４はＲ２をターゲティングするｓｉＲＮＡの設計を示す。ヒトＲ２（ｈＲＲＭ２）ｍＲＮＡ内の標的部位の位置は本出願による新規な標的部位に関してはＡ、Ｂ及びＣで、そして公開されている標的部位に関してはＸ、Ｙ及びＺで標記する。
【図５】図５はＲ２標的に対するｓｉＲＮＡの結合を試験するゲルシフト試験を示す。レーン３、４及び５は図４に示す通り、それぞれ領域Ａ、Ｂ及びＣに対するｓｉＲＮＡ標的を用いたＲ２のゲルシフトを示す。使用したｓｉＲＮＡの配列は配列番号７及び８（標的部位Ａ）、配列番号９及び１０（標的部位Ｂ）及び配列番号１１及び１２（標的部位Ｃ）とした。部位ＡにターゲティングされたｓｉＲＮＡデュプレックスは強力な結合（レーン３）を示していた。
【図６】図６Ａ及び６ＢはｓｉＲＮＡの細胞内力価（図６Ａ）が標的に対するそれらの結合親和性（図６Ｂ）に相関することを示している。図６ＣはＥＧＦＰをターゲティングしている種々のｓｉＲＮＡを示す（配列番号１０６〜１１６は、それぞれ、見た目の順序で開示される）。
【図７】図７は本出願の特定のｓｉＲＮＡによる種々の細胞系統におけるＲ２のダウンレギュレーションを示す。図７Ａは記載した種々のｓｉＲＮＡを投与したＨｅＬａ細胞由来のｈＲＲＭ２蛋白のレベルのウエスタンブロットを示す。図７ＢはＡ、Ｂ及びＣ部位にターゲティングされたｓｉＲＮＡ、対照ｓｉＲＮＡ及びｈＲＲＭ２に対するアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドでトランスフェクトされた種々の細胞型由来の溶解物を用いたウエスタンブロット実験の結果を示す。
【図８】図８はＲ２に対するｓｉＲＮＡのスクリーニングのためのＲ２ルシフェラーゼ融合コンストラクト（「ｐＲ２Ｌｕｃプラスミド」）を示す。細胞はｐＲ２ＬｕｃプラスミドとＲ２に対するｓｉＲＮＡで同時トランスフェクトしてよい。ルシフェラーゼレベルの定量はＲ２発現のダウンレギュレーションと相関していた。
【図９】図９はタイリング実験の結果を示す。図９Ａ、９Ｂ及び９Ｃはそれぞれ標的部位Ａ、Ｂ及びＣにおいて実施されたタイリング実験の結果を示す。各標的部位に関し、３つの元来発見されている標的部位の各々に隣接（＋又は−）する８つ以上の異なる２１量体の配列を合成し、そして３用量の各々（１０ｎＭ、１ｎＭ及び０．２ｎＭ）において比較した。図９Ｄはタイリング実験の実験設計を示す。
【図１０】図１０はタイリング実験におけるｐＲ２Ｌｕｃの使用が高度に強力なｓｉＲＮＡの発見をもたらしたことを示している。ｓｉＲＲＭ２Ａ、ｓｉＲＲＭ２Ｂ、ｓｉＲＲＭ２Ｃはそれぞれ標的部位Ａ（配列番号７及び８を有する）、標的部位Ｂ（配列番号９及び１０を有する）及び標的部位Ｃ（配列番号１１及び１２を有する）に対して指向されたｓｉＲＮＡであり；ｓｉＲＲＭ２Ｂ＋３及びｓｉＲＲＭ２Ｂ＋５は元の部位ＢｓｉＲＮＡデュプレックスと比較した場合に増大した力価を有する標的部位Ｂからタイリングされたデュプレックスであり；ＧＴＩ−２０４０はＲ２に対してターゲティングされたアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドであり；ｓｉ（ＧＴＩ−２０４０）はＧＴＩ−２０４０アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドと同様の部位にターゲティングされたｓｉＲＮＡであり；ｓｉ（ＪＢＣ，２００４）はＲ２に対する以前に公開されたｓｉＲＮＡである。
【図１１】図１１は標的部位Ｂの周囲（タイリングＢ＋３〜Ｂ＋１０）のデュプレックスを用いた追加的タイリング実験の結果を示す。Ｂ＋５デュプレックスは検討対象として最も強力なデュプレックスのままであり続け、そしてＢ＋９デュプレックスは二番目に強力なデュプレックスとして出現した。
【図１２】図１２は２１量体及び２７量体のＲＮＡによるＲ２−ルシフェラーゼ融合蛋白の用量依存的ダウンレギュレーションを示す。
【図１３】図１３はＲ２−ルシフェラーゼ融合のｓｉＲＮＡ誘導ダウンレギュレーションが内因性Ｒ２のダウンレギュレーションに相関することを示している。ｓｉＲＲＭ２Ｂ＋５デュプレックスはｐＲ２Ｌｕｃを用いた同時トランスフェクション試験において高度に強力であるものとして発見された。図に示される通り、Ｈｅｐ３Ｂ細胞におけるｓｉＲＲＭ２Ｂ＋５デュプレックス単独のトランスフェクションはトランスフェクション後１日、２日及び３日において、内因性Ｒ２の配列特異的ノックダウンをもたらした。細胞をｓｉＲＲＭ２Ｂ＋５又はｓｉＣＯＮ１（Ｄｈａｒａｍａｃｏｎの非ターゲティング対照デュプレックス＃１）２０ｎＭでトランスフェクトした。
【図１４】図１４はＲ２に対するｓｉＲＮＡがリポフェクションされた細胞のアポトーシスを誘導することを示している。培養されたヒトＨＣＣ細胞（ＨｅｐＧ２）をＲ２に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＲＭ２Ｂ＋５）又は非ターゲティング対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＮ１）でトランスフェクトし、次にトランスフェクションの１、２又は３日後にアポトーシスについて分析した。
【図１５】図１５はＲ２に対するｓｉＲＮＡがヒトＨＣＣ細胞の薬剤誘導アポトーシスを増強することを示している。培養されたヒトＨＣＣ細胞（ＨｅｐＧ２）をＲ２に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＲＭ２Ｂ＋５）又は非ターゲティング対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＮ１）でトランスフェクトし、その後、３日間アドリアマイシン（１００ｎＭ）を投与した。次にアポトーシスのレベルを測定した。
【図１６】図１６はＲ２に対するｓｉＲＮＡがインビボのＲ２発現を低減することを示している。Ｒ２−ルシフェラーゼ融合遺伝子をコードするプラスミド（ｐＲ２Ｌｕｃ）をＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてＲ２に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＲＭ２Ｂ＋５）又は非ターゲティング対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＮ１）と同時注射した。融合遺伝子発現は全動物バイオルミネセンス画像化により追跡した。図１６Ａは１７日間に渡る融合遺伝子発現の総括的プロットを示す。図１６Ｂは注射後２日において撮影された代表的画像を示す。
【図１７】図１７はＲ２に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＲ２Ｂ＋５）が培養ヒトＨＣＣ細胞（Ｈｅｐ３Ｂ細胞）の成長能力を低減することを示している。ヒト肝細胞癌（ＨＣＣ）の細胞（Ｈｅｐ３Ｂ）を希釈しながらプレーティングし、そして次に非ターゲティング対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＮ１）又はＲ２に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＲ２Ｂ＋５）（５ｎＭ）でトランスフェクトする。トランスフェクションの５日後、細胞を固定し、染色（メチレンブルー）し、そしてコロニー（−５０以上の細胞）を計数する。記載する通り、Ｒ２に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＲ２Ｂ＋５）は非ターゲティング対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＮ１）と比較してＨｅｐ３Ｂ細胞のコロニー形成能力を有意に低減する。コラムはｎ＝３連のウエルの平均を示し；エラーバーは標準偏差を示す。
【図１８】図１８はＲ２に対するｓｉＲＮＡの力価は培養ヒトＨＣＣ細胞（Ｈｅｐ３Ｂ細胞）の成長能力を低減する能力と相関していることを示している。ヒト肝細胞癌（ＨＣＣ）の細胞（Ｈｅｐ３Ｂ）を希釈しながらプレーティングし、そして次にＲ２に対して種々の力価を有することが予めわかっている５種のｓｉＲＮＡ（ｓｉＲ２Ｂ＋３、ｓｉＲ２Ｂ＋５、ｓｉＲ２Ｂ＋６、ｓｉＲ２Ｂ＋７、ｓｉＲ２Ｂ＋９）（５ｎＭ）の１つでトランスフェクトした（例えば図１１参照）。トランスフェクションの５日後、細胞を固定し、染色（メチレンブルー）し、そしてコロニー（−５０以上の細胞）を計数する。記載する通り、コロニー形成を低減するｓｉＲＮＡの能力（本図）はＲ２のダウンレギュレーションに関するその力価に強力に相関しており（図１１参照）、例えばｓｉＲ２Ｂ＋３、ｓｉＲ２Ｂ＋５、ｓｉＲ２Ｂ＋９＞＞ｓｉＲ２Ｂ＋６、ｓｉＲ２Ｂ＋７であった。コラムはｎ＝３連のウエルの平均を示し；エラーバーは標準偏差を示す。
【図１９】図１９はＲ２に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＲ２Ｂ＋５）によるＨｅｐ３Ｂ細胞の成育能力の低減が５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）曝露により増強されることを示している。ヒト肝細胞癌（ＨＣＣ）の細胞（Ｈｅｐ３Ｂ）を希釈しながらプレーティングし、そして次に（１）４時間ルシフェラーゼターゲティングｓｉＲＮＡ（Ｌｕｃ１０５−２１）又はＲ２に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＲ２Ｂ＋５）（５ｎＭ）でトランスフェクト、及び／又は（２）トランスフェクション後４８時間から開始して３日間５ｍＭの５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）に曝露する。トランスフェクションの５日後、細胞を固定し、染色（メチレンブルー）し、そしてコロニー（−５０以上の細胞）を計数する。前に観察された通り、ｓｉＲ２Ｂ＋５は非Ｒ２ターゲティング対照と比較してコロニー数を低減している（今回Ｌｕｃ１０５−２１）。５−ＦＵ単独（ｓｉＲＮＡ曝露を伴わない）は未投与細胞と比較してコロニー数を低減し、そしてｓｉＲ２Ｂ＋５投与後の５−ＦＵ曝露は更にコロニー数を低減する。コラムはｎ＝３連のウエルの平均を示し；エラーバーは標準偏差を示す。
【図２０】図２０はＲ２に対するｓｉＲＮＡがマウスにおいて皮下Ｈｅｐ３Ｂ腫瘍内のＲ２蛋白レベルを低下させることを示している。皮下ヒト肝細胞癌（Ｈｅｐ３Ｂ）腫瘍を有するマウスに重合体系の送達系内において２．５ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡ（非ターゲティング対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＮ１）又はＲ２に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＲ２Ｂ＋５）の何れか）を３回連続で毎日腫瘍内（ＩＴ）に注射する。３回目の注射の２日後、マウスを屠殺し、腫瘍を固定し、パラフィン包埋し、切片化し、そして免疫組織化学的（ＩＨＣ）に操作して腫瘍Ｒ２蛋白レベルを試験する。Ｒ２に対するｓｉＲＮＡを含有する製剤を投与されたマウス３匹中２匹において、腫瘍Ｒ２蛋白レベルは、非ターゲティング対照ｓｉＲＮＡを投与したマウスの場合と比較して急激に低下する。このことは、ｓｉＲ２Ｂ＋５を含有する製剤の３回連続毎日腫瘍内注射はこれ等の腫瘍内においてＲ２蛋白のダウンレギュレーションを達成することを示唆している。採点は以下の尺度、即ち、＋＝低Ｒ２蛋白レベル、＋＋＝中等度Ｒ２蛋白レベル、及び＋＋＋＝高Ｒ２蛋白レベルを用いて実施した。
【図２１】図２１はＲ２に対するｓｉＲＮＡが培養ラットヘパトーマ細胞（ＭｃＡ−ＲＨ７７７７）におけるＲ２蛋白レベルを低下させることを示している。ラットヘパトーマ細胞（ＭｃＡ−ＲＨ７７７７）をプレーティングし、次にＲ２に対するアンチセンス分子（ＧＴＩ−２０４０；１ｎＭ又は２０ｎＭ）、ルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡ（Ｌｕｃ１０５−２１；２０ｍＭのみ）、Ｒ２に対する２１量体のｓｉＲＮＡ（ｓｉＲ２Ｂ＋５；１ｎＭ又は２０ｎＭ）又はＲ２に対する２５／２７量体（ｓｉＲ２Ｂ＋５−２７；１ｎＭ又は２０ｎＭ）でトランスフェクトする。トランスフェクション後４８時間において、細胞を溶解し、Ｒ２蛋白レベルをウエスタンブロットで測定し、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウエアを用いて定量する。Ｒ２に指向された全ての分子（ＧＴＩ−２０４０アンチセンス、ｓｉＲ２Ｂ＋５の２１量体及び２５／２７量体）は陰性対照（Ｌｕｃ１０５−２１、ルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡ）の場合よりも優れたＲ２蛋白レベルの用量依存的低下を示す。ｓｉＲ２Ｂ＋５の２１量体及び２５／２７量体からのＲ２の低下は相互に同等であり、そしてＧＴＩ−２０４０アンチセンス分子で観察されたものより優れている。
【図２２】図２２は肝細胞への送達のためのモデル粒子を製造するための方法の模式図である。ガラクトース−ＰＥＧ化合物の存在又は非存在によりガラクトース含有又は単にＰＥＧ化されたビーズがそれぞれ形成される。
【図２３】図２３はｓｉＲＮＡの送達の為に製造された粒子の動的光散乱（ＤＬＳ）による粒径分布を示す。図２３（ａ）はモデルビーズＧａｌ−５０に関する粒径分布を示す。図２３（ｂ）は線状シクロデキストリン含有ポリカチオン及びガラクトース含有ＰＥＧ系モディファイアーを用いた自己組立により形成された製剤化ｓｉＲＮＡ粒子に関する粒径分布を示す。
【図２４】図２４は注射後２０分にマウス尾静脈を介して注入したＧａｌ−５０、ＭｅＯ−５０、Ｇａｌ−１４０及びＭｅＯ−１４０粒子の肝取り込みを示す。
【図２５】図２５は種々の粒径の粒子の尾静脈注射に付されたマウスに由来する肝切片を示す。左側パネルはＧａｌ−１４０ビーズ（直径１４０ｎｍ）は大部分が肝臓切片には非存在であることを示している（図２５Ａ）。右側パネルはＧａｌ−５０ビーズ（直径５０ｎｍ）は肝臓切片に存在していることを示している（図２５Ｂ）。
【図２６】図２６はＧａｌ−１４０粒子がクプファー細胞内に位置し、肝細胞内部には到達しないことを示しているＴＥＭ画像である。
【図２７】図２７はｉｍ−ＣＤＰ（イミダゾール含有ＣＤＰ）を生成するためのＣＤＰ末端基官能性付与の模式図である。
【図２８】図２８は毒性に対するポリカチオンの疎水性の影響を示す。図示されるＡＰ５のシクロデキストリン成分が細胞毒性を低減している。
【図２９】図２９はインビトロの細胞へのｓｉＲＮＡ送達のための送達ビヒクルとしてのｉｍ−ＣＤＰを示す。培養されたヒトユーイング肉腫（ＴＣ−７１）細胞を４時間オリゴフェクタミン（ＯＦＡ）又はシクロデキストリン含有ポリカチオン（ｉｍ−ＣＤＰ）を用いて作成したｓｉＥＦＢＰ２含有製剤（ＥＷＳ−ＦＬＩ１融合蛋白をターゲティングするための配列）に曝露した。感染の４８時間後、細胞を溶解し、全細胞蛋白を変性し、電気泳動に付し、そしてＰＶＤＦメンブレンに転移させ、これをＥＷＳ−ＦＬＩ１又はアクチンに対する抗体でプロービングし、そしてウエスタンブロット分析による定量を行った。平均バンド強度は密度測定により求め、そしてＥＷＳ−ＦＬＩ１のアクチンに対する強度の比を計算した。ｓｉＥＦＢＰ２ｍｕｔは陰性対照として使用したスクランブルドｓｉＥＦＢＰ２ｓｉＲＮＡである。
【図３０】図３０はＣＤＰ／ｐＤＮＡ（パネルａ、ｃ及びｄ）又はｉｍ−ＣＤＰ／ｐＤＮＡ（パネルｂ、ｅ及びｆ）のポリプレックスに曝露したＢＨＫ細胞のＴＥＭ画像である。（ａ）及び（ｂ）において、細胞内小胞は細胞膜に接近し、低ｐＨではない。（ｃ〜ｆ）においては、小胞は核膜の近傍にあり、ｆに近似したｐＨ値にある。（ｅ）及び（ｆ）においては、複合体脱パッケージングが観察されるのに対し、（ｃ）及び（ｄ）においては観察されない。
【図３１】図３１はシクロデキストリン含有ポリプレックス表面改変（例えばＰＥＧ化又はターゲティング）及びアダマンタン（ＡＤ）−ＰＥＧコンジュゲート及びβ−シクロデキストリンを用いた封入複合体形成の模式図である。図３１Ａはシクロデキストリン含有ポリプレックス表面改変の模式図を示す。図３１Ｂはアダマンタン（ＡＤ）−ＰＥＧコンジュゲート（系の第２の成分）及びβ−シクロデキストリンを用いた封入複合体形成の模式図である。リガンド（Ｌ）は細胞表面受容体との相互作用に供する。改変された粒子は明確に識別され、インビトロのトランスフェクション並びにインビボの試験の為に使用される条件に対して安定である。
【図３２】図３２は図３１に示した成分の改変の例を示す。グルコースモディファイアーをガラクトースターゲティング試験のための対照として使用する。
【図３３】図３３は５０ｍＭ塩溶液中のポリプレックス粒子の安定化を示す。完全な安定化はＡＤ−ＰＥＧ５Ｋ（ＰＥＧ５Ｋは分子量５０００のＰＥＧを意味する）を用いた場合に達成される。ＰＥＧ５Ｋの添加（対照）は如何なる安定化ももたらさない。粒径の増大は粒子の再構造化に起因するものではなく、むしろ６０ｎｍ原料粒子の凝集である（ＴＥＭ画像により確認）。
【図３４】図３４はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）の添加前にＣＤＰとＡＤ−ＰＥＧ５０００（ＡＤ−ＰＥＧ５Ｋ）を組み合わせることにより形成される粒子の粒径を示す。粒子はＰＢＳ中に希釈された１ｍｇＤＮＡ／ｍＬにおいて製剤した。１０００倍超の希釈度による１５０ｍＭ塩中の完全な安定化はＡＤ−ＰＥＧ５Ｋを用いた場合に達成される。
【図３５】図３５は記載した種々のポリプレックスを用いたルシフェラーゼ遺伝子の送達を示す。（ａ）表面アシアロ糖蛋白（ＡＳＧＰ）受容体を含有するＨｅｐＧ２細胞。（ｂ）表面受容体を含有しないＨｅＬａ細胞。細胞の取り込みは表面受容体を介して媒介され得る。
【図３６】図３６は改変剤においてアニオン性のセグメントを使用することによる粒子上のチューニング可能な表面電荷の例を示す。１００％ＡＤ−アニオン性ＰＥＧは系におけるアダマンタン（ＡＤ）のシクロデキストリン（ＣＤ）に対する１：１モル比を示す。
【図３７】図３７はポリプレックス粒子の自己組立の模式図である。
【図３８】図３８は１時間後の種々のポリプレックス粒子の培地（Ａ）又は１００％ＦＢＳ（Ｂ）中の濁度試験を示す。未ＰＥＧ化ポリプレックスが凝集するのに対し、ＰＥＧ化ポリプレックスは製剤時又は未結合成分除去後に凝集しない。
【図３９】図３９は完全に製剤された粒子が補体系を活性化しないことを示す。ＣＤＰＰＥＧＴｆは３．１８又は５．３（＋／−）の何れかの電荷比を有する完全に製剤された粒子を指す。
【図４０】図４０はＣＤＰが培養中の細胞にｓｉＲＮＡを送達することを示す。図４０ＡはＨｅＬａ細胞におけるネイキッド及びＣＤＰ製剤のＦＩＴＣ標識ｓｉＲＮＡのＦＡＣＳ分析を示す（１００ｎＭのｓｉＲＮＡを２時間ＨｅＬａ細胞に曝露した）。図４０ＢはＨｅＬａ細胞におけるＦＩＴＣ標識ｓｉＲＮＡのＣＤＰ送達の共焦点画像を示す（１００ｎＭのｓｉＲＮＡを４時間ＨｅＬａ細胞に曝露した）。
【図４１】図４１は高圧尾静脈注射（ＨＰＴＶ；２ｍＬ容量を注射）又は低圧尾静脈注射（ＬＰＴＶ；０．２ｍＬ容量を注射）による異なる送達製剤中のｓｉＲＮＡ５０μｇを注射したＢＡＬＢ／ｃマウスから得られた定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果を比較したものである。
【図４２】図４２はｓｉＲＮＡの送達のためのトランスフェリン（Ｔｆ）−ターゲティング粒子の組立を示す。図４２Ａは送達系の成分を示す。図４２Ｂは未ターゲティング及びターゲティングされた粒子の組立を示す。
【図４３】図４３はトランスフェリン（Ｔｆ）−含有粒子によるルシフェラーゼに対抗したｓｉＲＮＡの送達を示す。
【図４４】図４４は記載した種々の投与に付したＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスにおける移植された腫瘍の成長曲線を示す。各投与群［ｎ＝８〜１０］に関するメジアン積分腫瘍バイオルミネセントシグナル（光子／秒）を注射後の時間に対してプロットしている（全て５０μｇ  ｓｉＲＮＡにおいて）。群：（Ａ）対照Ｄ５Ｗ、（Ｂ）ネイキッドｓｉＥＦＢＰ２、（Ｃ）対照配列を用いて完全に製剤（ＣＯＮ＃１）、（Ｄ）ｓｉＥＦＢＰ２を用いて完全に製剤、及び（Ｅ）ｓｉＥＦＢＰ２を用いてトランスフェリンリガンドは使用せずに製剤。
【図４５】図４５はｓｉＲＮＡによるＴｆ含有粒子（左側パネル）における腫瘍成長の阻害及びｓｉＲＮＡによる標的ｍＲＮＡの配列特異的阻害を示す。図４５ＡはＴｆ含有粒子におけるＥＷＳ−ＦＬＩ１に関する５０μｇ  ｓｉＲＮＡの３回毎日注射（第３４日、３５日、３６日）を用いた樹立ＴＣ−７１腫瘍を用いた腫瘍成長の阻害を示す。図４５ＢはＥＷＳ−ＦＬＩ１−ｍＲＮＡの配列特異的阻害を示す２回毎日注射後の腫瘍から得られたＰＣＲデータを示す。