(57)【要約】   マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）は、アテローム血栓性疾患、炎症、脈管形成、がんを初めとする正常なリモデリングプロセス及び病理的リモデリングプロセスにおいて多くの重要な役割を果たしている。本発明は血小板表面上の内因性血小板ＭＭＰ−１コラゲナーゼによるプロテアーゼ活性化受容体−１（ＰＡＲ−１）の活性化に関する。血小板が線維性コラーゲンに曝されると、表面結合ｐｒｏ−ＭＭＰ−１チモーゲンが、ＰＡＲ−１を介した凝集を促進する活性型ＭＭＰ−１に変換される。ＭＭＰ−１は、ＰＡＲ−１細胞外ドメインを新規な部位で切断し、これがその後、Ｒｈｏ−ＧＴＰシグナル伝達経路、細胞の形態変化及び運動性、並びにＭＡＰＫシグナル伝達を強く活性化することが示されている。ＭＭＰ−ＰＡＲ１を遮断すると、動脈流下で血栓形成が抑制され、動物の血栓症が抑制された。これらの研究は、メタロプロテアーゼのマトリックス依存性活性化と血小板−Ｇタンパク質シグナル伝達を関連付け、動脈血栓症及びその他の血栓性疾患を処置及び防止するための新規な標的としてＭＭＰ−１／ＰＡＲ−１を同定するものである。【選択図】図６Ｇ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の血栓性病態を処置する方法であって、血栓性病態であると診断された又は血栓性病態を発症する相当なリスクがある患者に、前記患者のプロテアーゼ活性化受容体−１（ＰＡＲ−１）の３９位のアスパラギン酸（Ｄ３９）と４０位のプロリン（Ｐ４０）の間でのタンパク質切断を実質的に阻害する治療有効量の薬剤を投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記タンパク質切断が、マトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）の酵素活性を必要とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記患者が、胸痛、息切れ、胸部圧迫感、左腕の圧迫感、左下顎角の圧迫感、発汗過多、嘔気、嘔吐、動悸、不安、及び異常な感覚からなる群から選択される少なくとも１つの症状を示す又は示した、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記患者が、前記血栓性病態に関連する１又は複数の危険因子を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記血栓性病態が、血小板凝集により生じる病状を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記病状が、急性冠動脈症候群、動脈血栓症、静脈血栓症、末梢動脈疾患、不安定狭心症、心房細動、最初の心筋梗塞、再発性心筋梗塞、虚血性突然死、一過性脳虚血発作、脳卒中、アテローム性動脈硬化症、深部静脈血栓症、血栓性静脈炎、動脈塞栓症、冠動脈血栓症、大脳動脈血栓症、脳塞栓症、腎塞栓症、及び肺塞栓症からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記患者が癌と診断されている、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記薬剤の前記投与が、前記患者の血小板活性化を実質的に阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記薬剤が、ＰＡＲ−１に結合するリガンド結合分子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記リガンド結合分子が、前記切断部位上に結合することによりＰＡＲ−１の前記切断を実質的に阻害する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記リガンド結合分子が、ＰＡＲ−１のコンホメーション変化を誘導することによりＰＡＲ−１の前記切断を実質的に阻害する、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記薬剤が、ＭＭＰ−１に結合するリガンド結合分子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記薬剤が、ＭＭＰ−１又はＰＡＲ−１に特異的な抗体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記薬剤が、ＭＭＰ−１又はＰＡＲ−１に結合する小分子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記薬剤が、マトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）の活性化又はＭＭＰ−１酵素活性を実質的に阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記薬剤が、プロテアーゼによるｐｒｏＭＭＰ−１の切断を実質的に阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記薬剤が、マトリックスメタロプロテアーゼ−２（ＭＭＰ−２）によるｐｒｏＭＭＰ−１の切断を実質的に阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記薬剤が、コラーゲンにより開始されるＭＭＰ−１活性化を実質的に阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記薬剤が、ＦＮ−４３９、組織メタロプロテアーゼ阻害剤（ＴＩＭＰ）、ＭＭＰ−２００、シペマスタット（Ｔｒｏｃａｄｅ）、プリノマスタット、ＢＡＹ  １２−９５６６、バチミスタット、ＢＭＳ−２７５２９１、マリマスタット、ＭＭＩ２７０（Ｂ）（メタスタット、Ｒｏ  ３２−３５５５、ＲＳ−１３０，８３０、ＰＤ  １６６７９３、及びアンコリノシドＢ〜Ｄからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記薬剤がテトラサイクリン化合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記テトラサイクリン化合物がドキシサイクリンを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記患者の血小板中のトロンボキサンシグナル伝達経路及びＡＤＰシグナル伝達経路の少なくとも１つを実質的に阻害する第２の薬剤を前記患者に投与することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
ＰＡＲ−１のシグナル伝達活性の少なくとも一部も実質的に阻害する第２の薬剤を前記患者に投与することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
トロンビン依存性のＰＡＲ１活性化を実質的に阻害する第２の薬剤を前記患者に投与することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記患者に第２の抗血栓剤を投与することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記第２の抗血栓剤が、抗血小板薬、抗凝固薬、及び血栓溶解薬からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記第２の抗血栓剤が、チエノピリジン、プロスタグランジン類似体、ＣＯＸ阻害剤、ビタミンＫアンタゴニスト、糖タンパク質ＩＩＢ／ＩＩＩＡ阻害剤、及びトロンビン阻害剤からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記第２の抗血栓剤が、アスピリン、クロピドグレル、チクロピジン、プラスグレル、ヘパリン、アブシキシマブ、エプチフィバチド、チロフィバン、及びビバリルジンからなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記第２の抗血栓剤が、ＰＡＲファミリーメンバーのｐｅｐｄｕｃｉｎリポペプチドを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＰＡＲファミリーメンバーのｐｅｐｄｕｃｉｎリポペプチドが、ＰＡＲ−１ｐｅｐｄｕｃｉｎリポペプチドを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＰＡＲ−１ｐｅｐｄｕｃｉｎリポペプチドが、Ｐ１ｉ３ｐａｌ−７、Ｐ１ｉ３ｐａｌ−１２、Ｐ１ｉ３ｐａｌ−１２Ｓ、Ｐ１ｉ３ｐａｌ−１０Ｓ、Ｐ１ｉ１ｐａｌ−１１、Ｐ１ｉ２ｐａｌ−７、Ｐ１ｉ２ｐａｌ−１１、Ｐ１ｉ２ｐａｌ−１６、Ｐ１ｉ２ｐａｌ−２１、Ｐ１ｉ４ｐａｌ１３、及びＰ１ｉ４ｐａｌ１３Ｒからなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記薬剤が、静脈内（Ｉ．Ｖ．）注射、皮下注射、筋肉内注射、経口摂取、経鼻、局所、直腸内、膣内、及び非経口摂取からなる群から選択される手段により投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
前記薬剤が、薬学的に許容される補形剤、キャリア、又は希釈剤と共に製剤化される、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
患者の血栓性病態を処置する方法であって、血栓性病態であると診断された又は血栓性病態を発症する相当なリスクがある患者に、３９位のアスパラギン酸（Ｄ３９）と４０位のプロリン（Ｐ４０）の間でのプロテアーゼ活性化受容体−１（ＰＡＲ−１）のタンパク質切断により生じる前記患者のＰＡＲ−１シグナル伝達活性を実質的に阻害する治療有効量の薬剤を投与することを含む、方法。
【請求項３５】
前記薬剤がＳＣＨ  ５３０３４８を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記薬剤が、ＰＡＲファミリーメンバーのｐｅｐｄｕｃｉｎリポペプチドを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＰＡＲファミリーメンバーのｐｅｐｄｕｃｉｎリポペプチドが、ＰＡＲ−１ｐｅｐｄｕｃｉｎリポペプチドを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＰＡＲ−１ｐｅｐｄｕｃｉｎリポペプチドが、Ｐ１ｉ３ｐａｌ−７、Ｐ１ｉ３ｐａｌ−１２、Ｐ１ｉ３ｐａｌ−１２Ｓ、Ｐ１ｉ３ｐａｌ−１０Ｓ、Ｐ１ｉ１ｐａｌ−１１、Ｐ１ｉ２ｐａｌ−７、Ｐ１ｉ２ｐａｌ−１１、Ｐ１ｉ２ｐａｌ−１６、Ｐ１ｉ２ｐａｌ−２１、Ｐ１ｉ４ｐａｌ１３、及びＰ１ｉ４ｐａｌ１３Ｒからなる群から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
血栓性病態を処置する方法であって、血栓性病態であると診断された又は血栓性病態を発症する相当なリスクがある患者に、マトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）の活性化又はＭＭＰ−１酵素活性を実質的に阻害する治療有効量の薬剤を投与することを含む、方法。
【請求項４０】
前記薬剤が、プロテイナーゼによるｐｒｏＭＭＰ−１の切断を実質的に阻害する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記薬剤が、マトリックスメタロプロテアーゼ−２（ＭＭＰ−２）によるｐｒｏＭＭＰ−１の切断を実質的に阻害する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記薬剤が、コラーゲンにより開始されるＭＭＰ−１活性化を実質的に阻害する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
前記薬剤が、ＦＮ−４３９、組織メタロプロテアーゼ阻害剤（ＴＩＭＰ）、ＭＭＰ−２００、シペマスタット（Ｔｒｏｃａｄｅ）、プリノマスタット、ＢＡＹ  １２−９５６６、バチミスタット、ＢＭＳ−２７５２９１、マリマスタット、ＭＭＩ２７０（Ｂ）、メタスタット、Ｒｏ  ３２−３５５５、ＲＳ−１３０，８３０、ＰＤ  １６６７９３、及びアンコリノシドＢ〜Ｄからなる群から選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
前記薬剤がテトラサイクリン化合物を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４５】
前記テトラサイクリン化合物がドキシサイクリンを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
アテローム性動脈硬化症を処置する方法であって、アテローム性動脈硬化症であると診断された又はアテローム性動脈硬化症を発症する相当なリスクがある患者に、前記患者のプロテアーゼ活性化受容体−１（ＰＡＲ−１）の３９位のアスパラギン酸（Ｄ３９）と４０位のプロリン（Ｐ４０）の間でのタンパク質切断を実質的に阻害する治療有効量の薬剤を投与することを含む、方法。
【請求項４７】
血管形成術、冠動脈バイパス術、及び直視下心臓手術からなる群から選択される少なくとも１つの手技が前記患者に行われた後に投与される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記患者に２週間以下の期間投与される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
アテローム性動脈硬化症を処置する方法であって、アテローム性動脈硬化症であると診断された又はアテローム性動脈硬化症を発症する相当なリスクがある患者に、３９位のアスパラギン酸（Ｄ３９）と４０位のプロリン（Ｐ４０）の間でのプロテアーゼ活性化受容体−１（ＰＡＲ−１）のタンパク質切断により生じる前記患者のＰＡＲ−１シグナル伝達活性を実質的に阻害する治療有効量の薬剤を投与することを含む、方法。
【請求項５０】
前記薬剤が、ＰＡＲファミリーメンバーのｐｅｐｄｕｃｉｎリポペプチドを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記ＰＡＲファミリーメンバーのｐｅｐｄｕｃｉｎリポペプチドが、ＰＡＲ−１ｐｅｐｄｕｃｉｎリポペプチドを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記ＰＡＲ−１ｐｅｐｄｕｃｉｎリポペプチドが、Ｐ１ｉ３ｐａｌ−７、Ｐ１ｉ３ｐａｌ−１２、Ｐ１ｉ３ｐａｌ−１２Ｓ、Ｐ１ｉ３ｐａｌ−１０Ｓ、Ｐ１ｉ１ｐａｌ−１１、Ｐ１ｉ２ｐａｌ−７、Ｐ１ｉ２ｐａｌ−１１、Ｐ１ｉ２ｐａｌ−１６、Ｐ１ｉ２ｐａｌ−２１、Ｐ１ｉ４ｐａｌ１３、及びＰ１ｉ４ｐａｌ１３Ｒからなる群から選択される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記薬剤が、前記患者の大動脈内のアテローム性プラークのサイズを減少させる、請求項４９に記載の方法。
【請求項５４】
前記薬剤がＳＣＨ  ５３０３４８を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５５】
アテローム性動脈硬化症を処置する方法であって、アテローム性動脈硬化症であると診断された又はアテローム性動脈硬化症を発症する相当なリスクがある患者に、マトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）の活性化又はＭＭＰ−１酵素活性を実質的に阻害する治療有効量の薬剤を投与することを含む、方法。
【請求項５６】
血小板の保存又は輸送のための媒体であって、前記媒体中に含まれる血小板上のプロテアーゼ活性化受容体−１（ＰＡＲ−１）の３９位のアスパラギン酸（Ｄ３９）と４０位のプロリン（Ｐ４０）の間でのタンパク質切断を実質的に阻害する有効濃度の薬剤を含む、媒体。
【請求項５７】
ＰＡＲファミリーメンバーのｐｅｐｄｕｃｉｎリポペプチドを更に含む、請求項５６に記載の媒体。
【請求項５８】
前記ＰＡＲファミリーメンバーのｐｅｐｄｕｃｉｎリポペプチドが、ＰＡＲ−１ｐｅｐｄｕｃｉｎリポペプチドを含む、請求項５７に記載の媒体。
【請求項５９】
前記ＰＡＲ−１ｐｅｐｄｕｃｉｎリポペプチドが、Ｐ１ｉ３ｐａｌ−７、Ｐ１ｉ３ｐａｌ−１２、Ｐ１ｉ３ｐａｌ−１２Ｓ、Ｐ１ｉ３ｐａｌ−１０Ｓ、Ｐ１ｉ１ｐａｌ−１１、Ｐ１ｉ２ｐａｌ−７、Ｐ１ｉ２ｐａｌ−１１、Ｐ１ｉ２ｐａｌ−１６、Ｐ１ｉ２ｐａｌ−２１、Ｐ１ｉ４ｐａｌ１３、及びＰ１ｉ４ｐａｌ１３Ｒからなる群から選択される、請求項５８に記載の媒体。
【請求項６０】
グルコースを更に含む水溶液である、請求項５６に記載の媒体。
【請求項６１】
その中に含まれる正常血小板の平均半減期が約５日以上である、請求項５６に記載の媒体。
【請求項６２】
その中に含まれる正常血小板の平均半減期が約１ヶ月以上である、請求項５６に記載の媒体。
【請求項６３】
その中に含まれる正常血小板の平均半減期が約６ヶ月以上である、請求項５６に記載の媒体。
【請求項６４】
血小板の保存又は輸送のための媒体であって、マトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）の活性化又はＭＭＰ−１酵素活性を阻害する有効濃度の薬剤を含む、媒体。
【請求項６５】
血小板の保存又は輸送のための媒体であって、３９位のアスパラギン酸（Ｄ３９）と４０位のプロリン（Ｐ４０）の間でのプロテアーゼ活性化受容体−１（ＰＡＲ−１）のタンパク質切断により生じるＰＡＲ−１シグナル伝達活性を実質的に阻害する有効濃度の薬剤を含む、媒体。
【請求項６６】
前記薬剤が、ＰＡＲファミリーメンバーのｐｅｐｄｕｃｉｎリポペプチドを含む、請求項６５に記載の媒体。
【請求項６７】
前記ＰＡＲファミリーメンバーのｐｅｐｄｕｃｉｎリポペプチドが、ＰＡＲ−１ｐｅｐｄｕｃｉｎリポペプチドを含む、請求項６６に記載の媒体。
【請求項６８】
前記ＰＡＲ−１ｐｅｐｄｕｃｉｎリポペプチドが、Ｐ１ｉ３ｐａｌ−７、Ｐ１ｉ３ｐａｌ−１２、Ｐ１ｉ３ｐａｌ−１２Ｓ、Ｐ１ｉ３ｐａｌ−１０Ｓ、Ｐ１ｉ１ｐａｌ−１１、Ｐ１ｉ２ｐａｌ−７、Ｐ１ｉ２ｐａｌ−１１、Ｐ１ｉ２ｐａｌ−１６、Ｐ１ｉ２ｐａｌ−２１、Ｐ１ｉ４ｐａｌ１３、及びＰ１ｉ４ｐａｌ１３Ｒからなる群から選択される、請求項６７に記載の媒体。
【請求項６９】
前記薬剤がＳＣＨ  ５３０３４８を含む、請求項６５に記載の媒体。
【請求項７０】
患者において出血性イベントが発現するリスクを診断する方法であって、前記患者の体内でマトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）の活性化又はＭＭＰ−１活性を実質的に阻害する遺伝的欠陥を前記患者が有するかどうかを決定することを含む、方法。
【請求項７１】
患者の血友病状態若しくは凝血異常状態又はそのリスクを診断する方法であって、前記患者の体内でマトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）の活性化又はＭＭＰ−１活性を過剰に刺激する遺伝的欠陥を前記患者が有するかどうかを決定することを含む、方法。
【請求項７２】
単離されたポリペプチドであって、配列が、ヒトプロテアーゼ活性化受容体−１（ＰＡＲ−１）の３９位のアスパラギン酸（Ｄ３９）と４０位のプロリン（Ｐ４０）の間でのタンパク質切断により生じる２つの断片の一方の連続する５個以上のアミノ酸残基を含み、前記ポリペプチドが更に、前記タンパク質切断により生じた切断部位で一方の末端が終わる、単離されたポリペプチド。
【請求項７３】
前記ポリペプチドが、Ｎ末端にプロリンを有する、請求項７２に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項７４】
ＰＲＳＦＬＬＲＮ（配列番号１）のポリペプチド配列である、請求項７２に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項７５】
患者から採った血小板中における請求項７２に記載のポリペプチドの量を測定することを含む、患者の血栓性病態を診断する方法。
【請求項７６】
ＰＡＲ−１アンタゴニストを同定する方法であって、
（ａ）請求項７２に記載の単離されたポリペプチドを用意する工程；
（ｂ）候補薬剤を用意する工程；
（ｃ）前記候補薬剤の存在下で血小板を前記単離されたポリペプチドに接触させる工程；
（ｄ）ＰＡＲ−１シグナル伝達活性を測定する工程；及び
（ｅ）前記候補薬剤存在下での前記ＰＡＲ−１シグナル伝達活性を前記候補薬剤非存在下での前記ＰＡＲ−１シグナル伝達活性と比較する工程
を含み、前記候補薬剤非存在下でのＰＡＲ−１シグナル伝達活性と比べた前記候補薬剤存在下でのＰＡＲ−１シグナル伝達活性の少なくとも１０％の低下により、前記候補薬剤がＰＡＲ−１アンタゴニストとして同定される、方法。
【請求項７７】
前記ＰＡＲ−１シグナル伝達活性が、Ｒｈｏ−ＧＴＰ経路のシグナル伝達又はＭＡＰＫ経路のシグナル伝達を含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
ＰＡＲ−１アンタゴニストを同定する方法であって、
（ａ）活性化ＭＭＰ−１を用意する工程；
（ｂ）候補薬剤を用意する工程；
（ｃ）ＭＭＰ−１がＰＡＲ−１を切断する条件下で前記候補薬剤存在下にて血小板を前記活性化ＭＭＰ−１に接触させる工程；
（ｄ）ＰＡＲ−１シグナル伝達活性を測定する工程；及び
（ｅ）前記候補薬剤存在下での前記ＰＡＲ−１シグナル伝達活性を前記候補薬剤非存在下での前記ＰＡＲ−１シグナル伝達活性と比較する工程；
を含み、前記候補薬剤非存在下でのＰＡＲ−１シグナル伝達活性と比べた前記候補薬剤存在下でのＰＡＲ−１シグナル伝達活性の少なくとも１０％の低下により、前記候補薬剤がＰＡＲ−１アンタゴニストとして同定される、方法。
【請求項７９】
前記ＰＡＲ−１シグナル伝達活性が、Ｒｈｏ−ＧＴＰ経路のシグナル伝達又はＭＡＰＫ経路のシグナル伝達を含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記患者のプロテアーゼ活性化受容体−１（ＰＡＲ−１）の３９位のアスパラギン酸（Ｄ３９）と４０位のプロリン（Ｐ４０）の間でのタンパク質切断を実質的に阻害する薬剤を含むマトリックス層でコーティングされた医療器具。
【請求項８１】
３９位のアスパラギン酸（Ｄ３９）と４０位のプロリン（Ｐ４０）の間でのプロテアーゼ活性化受容体−１（ＰＡＲ−１）のタンパク質切断により生じるＰＡＲ−１シグナル伝達活性を実質的に阻害する薬剤を含むマトリックス層でコーティングされた医療器具。
【請求項８２】
前記薬剤がＳＣＨ  ５３０３４８を含む、請求項８１に記載の医療器具。
【請求項８３】
前記マトリックス層が、生体適合性ペプチドマトリックスである、請求項８１に記載の医療器具。
【請求項８４】
前記器具が移植可能である、請求項８１に記載の医療器具。
【請求項８５】
前記薬剤が、ＰＡＲファミリーメンバーのｐｅｐｄｕｃｉｎリポペプチドを含む、請求項８１に記載の医療器具。
【請求項８６】
前記ＰＡＲファミリーメンバーのｐｅｐｄｕｃｉｎリポペプチドが、ＰＡＲ−１ｐｅｐｄｕｃｉｎリポペプチドを含む、請求項８５に記載の医療器具。
【請求項８７】
前記ＰＡＲ−１ｐｅｐｄｕｃｉｎリポペプチドが、Ｐ１ｉ３ｐａｌ−７、Ｐ１ｉ３ｐａｌ−１２、Ｐ１ｉ３ｐａｌ−１２Ｓ、Ｐ１ｉ３ｐａｌ−１０Ｓ、Ｐ１ｉ１ｐａｌ−１１、Ｐ１ｉ２ｐａｌ−７、Ｐ１ｉ２ｐａｌ−１１、Ｐ１ｉ２ｐａｌ−１６、Ｐ１ｉ２ｐａｌ−２１、Ｐ１ｉ４ｐａｌ１３、及びＰ１ｉ４ｐａｌ１３Ｒからなる群から選択される、請求項８６に記載の医療器具。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、どちらも２００９年４月１０日付で提出された同時係属中の米国仮特許出願第６１／１６８，３５３号及び第６１／１６８，３６０号の両方の優先権及び利益を主張するものであり、適用される法律により許される範囲でこれらの出願全体を参照により本明細書に援用する。
【０００２】
技術分野
本発明は、急性冠動脈症候群及びアテローム性動脈硬化症に関連する状態を含む血栓性状態の診断及び処置に関する。本発明は更に、研究又は臨床用途のために血小板を保存する手段に関する。
【０００３】
連邦政府の資金による研究及び開発に関する記載
本発明は、米国国立衛生研究所により認められた認可番号Ｒ０１  ＨＬ−５７９０５、Ｒ０１  ＨＬ−６４７０１、及びＲ０１  ＣＡ−１２２９９２に基づき政府の支援を受けてなされた。米国政府は本発明に対して一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
血小板の活性化及び凝集は、止血等の正常な生理機能に必要であるものの、その調節機構が正常に機能しない場合、多くの、しばしば致死的な非常に消耗性の状態及び病状を招き得る。これらの病的状態は、急性及び慢性のどちらもあり得、急性冠動脈症候群、心筋梗塞、不安定狭心症、脳卒中、冠動脈血栓症、静脈血栓症、アテローム血栓症、再狭窄等が含まれる。米国、欧州、及びその他の先進国では、アテローム性プラークの破綻による心筋梗塞が罹患率及び死亡率の主な原因である。急性のプラーク破綻は、血管損傷部位で血小板の活性化及び閉塞を起こし得る血栓の形成を促進する内皮下コラーゲンを露出させる（非特許文献１及び２）。内皮下コラーゲン及びマトリックスタンパク質に最初に繋ぎ止められた後、一時的に付着した血小板がオートクリン型メディエーターにより活性化されることが、形成中の血小板血栓の広がりに重要である。Ｇタンパク質依存性形態変化、顆粒放出、及びインテグリンを活性化することで一過性の付着接触を強化すると、剪断応力の大きい動脈血流に抵抗性の安定な血栓が成長する（非特許文献３及び４）。アスピリン、チエノピリジン等の血小板血栓形成の二次的オートクリン型メディエーターを標的とする薬物は、有益であることが証明されている。しかし、多くの患者が、それらの薬物を摂取していてもなお血栓性イベントを生じるため、マトリックス依存性血小板活性化を妨げる新規な治療薬の利益を享受するであろう（非特許文献５）。
【０００５】
２つの異なる経路が並行して働いて止血中に血小板を活性化する（非特許文献６）。血管壁が破れると、血中を循環している血小板が、内皮下マトリックス中に埋まっているコラーゲンと最初に遭遇する。防御の第一線として、露出されたコラーゲンは血小板の蓄積及び活性化を開始させ、血栓形成を開始させる。血液は、更に流出すると、第２の防御である血管壁の内膜及び外膜に配置された組織因子と遭遇し、第２の独立した経路が作動し、この経路も血小板を活性化して互いに付着させて発達中の血栓の一部を形成させる。組織因子により開始される経路はトロンビンを生成し、トロンビンはヒト血小板表面上のプロテアーゼ活性化受容体１（ＰＡＲ１）を切断してアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、セロトニン、及びトロンボキサンＡ２を放出させる。次に、これらのアゴニストが他の血小板を動員及び活性化し、血管壁の破損部を塞ぐためにシグナルを増幅する。しかし、本発明は、もう一方の、コラーゲンにより開始される血小板活性化経路、すなわち血栓性イベントにおける防御の第一線に焦点を当てた発見に基づく。
【０００６】
マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）は近年になって血小板機能及び血管生物学における重要なメディエーターとして現れた。ＭＭＰ及びその関連メタロプロテアーゼディスインテグリンは最初、組織修復及び癌浸潤に関与する細胞外マトリックスリモデリング酵素として記述された（非特許文献７）が、血管壁炎症（非特許文献８）及び血栓性血小板減少性紫斑病（非特許文献９）における重要性から新たに注目を集めている。内因性血小板メタロプロテアーゼは細胞表面受容体を切断することで血小板機能に損傷を与えることが示されており、メタロプロテアーゼ広域阻害剤は輸血後の血小板濃度の回復を改善する（非特許文献１０〜１２）。血小板は表面上にＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−１４等の複数のメタロプロテアーゼを発現する（非特許文献１３〜１６）。特に内因性ＭＭＰ−１及びＭＭＰ−２は、血小板凝集を実際に促進するが、細胞表面の標的及び活性化の機構は解明されていない（非特許文献１４及び１６）。２０００名の患者におけるＭＭＰ−１プロモーター多型の影響を調べた最近の研究で、高プロモーター活性ハプロタイプの患者では心筋梗塞のリスクが有意に上昇しており、低プロモーター活性ハプロタイプの患者ではリスクが有意に低下していることが見出された（非特許文献１７）。
【０００７】
線維芽細胞に由来するＭＭＰ−１により癌細胞表面でＧタンパク質共役受容体ＰＡＲ１が直接切断されて活性化されることが最近示された（非特許文献１８）。ＰＡＲ１はヒト血小板の主要なトロンビン受容体であり（非特許文献１９及び２０）、組織因子（ＴＦ）依存性トロンビン生成後の血小板凝集の重要なメディエーターである（非特許文献２１及び２２）。しかし、急性プラーク破綻の病態生理学的状態の下では、露出したコラーゲンが、血小板表面でのメタロプロテアーゼ活性化を引き起こし得る動脈流下での重要な初期事象である血小板の動員及び広がりを最も効率的に刺激する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｇｌａｓｓ，Ｃ．Ｋ．，ａｎｄ  Ｗｉｔｚｔｕｍ，Ｊ．Ｌ．（２００１）．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．ｔｈｅ  ｒｏａｄ  ａｈｅａｄ．Ｃｅｌｌ  １０４，５０３−５１６．
【非特許文献２】Ｒｕｇｇｅｒｉ，Ｚ．Ｍ．（２００２）．Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ  ｉｎ  ａｔｈｅｒｏｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ  ８，１２２７−１２３４．
【非特許文献３】Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｓ．Ｐ．，Ｎｅｓｂｉｔｔ，Ｗ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｋｕｌｋａｒｎｉ，Ｓ．（２００３）．Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｅｖｅｎｔｓ  ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ  ｔｈｒｏｍｂｕｓ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  １，１６０２−１６１２．
【非特許文献４】Ｍｏｅｒｓ，Ａ．，Ｎｉｅｓｗａｎｄｔ，Ｂ．，Ｍａｓｓｂｅｒｇ，Ｓ．，Ｗｅｔｔｓｃｈｕｒｅｃｋ，Ｎ．，Ｇｒｕｎｅｒ，Ｓ．，Ｋｏｎｒａｄ，Ｉ．，Ｓｃｈｕｌｔｅ，Ｖ．，Ａｋｔａｓ，Ｂ．，Ｇｒａｔａｃａｐ，Ｍ．Ｐ．，Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．（２００３）．Ｇ１３  ｉｓ  ａｎ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉａｔｏｒ  ｏｆ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ９，１４１８−１４２２．
【非特許文献５】Ｂｈａｔｔ，Ｄ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｔｏｐｏｌ，Ｅ．Ｊ．（２００３）．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｐｌａｔｅｌｅｔ  Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ２，１５−２８．
【非特許文献６】Ｆｕｒｉｅ，Ｂ．，ａｎｄ  Ｆｕｒｉｅ，Ｂ．Ｃ．（２００８）．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｔｈｒｏｍｂｕｓ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５９：９３８−４９．
【非特許文献７】Ｅｇｅｂｌａｄ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｗｅｒｂ．Ｚ．（２００２）．Ｎｅｗ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ２，１６１−１７４
【非特許文献８】Ｄｏｌｌｅｒｙ，Ｃ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｌｉｂｂｙ，Ｐ．（２００６）．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ  ６９，６２５−６３５．
【非特許文献９】Ｌｅｖｙ，Ｇ．Ｇ．，Ｎｉｃｈｏｌｓ，Ｗ．Ｃ．，ｌｉａｎ，Ｅ．Ｃ．，Ｆｏｒｏｕｄ，Ｔ．，ＭｃＣｌｉｎｔｉｃｋ，Ｊ．Ｎ．，ＭｃＧｅｅ，Ｂ．Ｍ．，Ｙａｎｇ，Ａ．Ｙ．，Ｓｉｅｍｉｅｎｉａｋ，Ｄ．Ｒ．，Ｓｔａｒｋ，Ｋ．Ｒ．，Ｇｒｕｐｐｏ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．（２００１）．Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＤＡＭＴＳ  ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｃａｕｓｅ  ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ  ｐｕｒｐｕｒａ．Ｎａｔｕｒｅ  ４１３，４８８−４９４
【非特許文献１０】Ｂｅｒｇｍｅｉｅｒ，Ｗ．，Ｂｕｒｇｅｒ，Ｐ．Ｃ．，Ｐｉｆｆａｔｈ，Ｃ．Ｌ．，Ｈｏｆｆｍｅｉｓｔｅｒ，Ｋ．Ｍ．，Ｈａｒｔｗｉｇ，Ｊ．Ｈ．，Ｎｉｅｓｗａｎｄｔ，Ｂ．，ａｎｄ  Ｗａｇｎｅｒ，Ｄ．Ｄ．（２００３），Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ｔｈｅ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｈｅｍｏｓｔａｔｉｃ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ−ａｇｅｄ  ｏｒ  −ｉｎｊｕｒｅｄ  ｍｏｕｓｅ  ｐｌａｔｅｌｅｔｓ．Ｂｌｏｏｄ  １０２，４２２９−４２３５．
【非特許文献１１】Ｂｅｒｇｍｅｉｅｒ，Ｗ．，Ｒａｂｉｅ，Ｔ．，Ｓｔｒｅｈｌ，Ａ．，Ｐｉｆｆａｔｈ，Ｃ．Ｌ．，Ｐｒｏｓｔｒｅｄｎａ，Ｍ．，Ｗａｇｎｅｒ，Ｄ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｎｉｅｓｗａｎｄｔ，Ｂ．（２００４）．ＧＰＶＩ  ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｕｒｉｎｅ  ｐｌａｔｅｌｅｔｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｈｅｄｄｉｎｇ．  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ９１，９５１−９５８．
【非特許文献１２】Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，Ｇ．，Ｙａｎ，Ｙ．，Ｊａｎｄｒｏｔ−Ｐｅｒｒｕｓ，Ｍ．，Ｖｉｌｌｅｖａｌ，Ｊ．Ｌ．，Ｃｌｅｍｅｔｓｏｎ，Ｋ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｄ．Ｒ．（２００４）．Ｐｌａｔｅｌｅｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ＧＰＶｌ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｔｏ  ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  ｃｏｌｌａｇｅｎ，Ｂｌｏｏｄ  １０５，１８６−１９１．
【非特許文献１３】Ｃｈａｃｋａｌａｍａｎｎｉｌ  Ｓ，Ｗａｎｇ  Ｙ，Ｇｒｅｅｎｌｅｅ  ＷＪ，Ｈｕ  Ｚ，Ｘｉａ  Ｙ，Ａｈｎ  ＨＳ，Ｂｏｙｋｏｗ  Ｇ，Ｈｓｉｅｈ  Ｙ，Ｐａｌａｍａｎｄａ  Ｊ，Ａｇａｎｓ−Ｆａｎｔｕｚｚｉ  Ｊ，Ｋｕｒｏｗｓｋｉ  Ｓ，Ｇｒａｚｉａｎｏ  Ｍ，Ｃｈｉｎｔａｌａ  Ｍ，Ｃｈｅｓｎｅｙ，Ｃ．Ｍ．，Ｈａｒｐｅｒ，Ｅ．，ａｎｄ  Ｃｏｌｍａｎ，Ｒ．Ｗ．（１９７４）．Ｈｕｍａｎ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ５３，１６４７−１６５４．
【非特許文献１４】Ｇａｌｔ，Ｓ．Ｗ．，Ｌｉｎｄｅｍａｎｎ，Ｓ．，Ａｌｌｅｎ，Ｌ．，Ｍｅｄｄ，Ｄ．Ｊ．，Ｆａｌｋ，Ｊ．Ｍ．，Ｍｃｌｎｔｙｒｅ，Ｔ．Ｍ．，Ｐｒｅｓｃｏｔｔ，Ｓ．Ｍ．，Ｋｒａｉｓｓ，Ｌ．Ｗ．，Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ，Ｇ．Ａ．，ａｎｄ  Ｗｅｙｒｉｃｈ，Ａ．Ｓ．（２００２）．Ｏｕｔｓｉｄｅ−ｉｎ  ｓｉｇｎａｌｓ  ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ｂｙ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−１  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ  ９０，１０９３−１０９９．
【非特許文献１５】Ｋａｚｅｓ，Ｉ．，Ｅｌａｌａｍｙ，Ｉ．，Ｓｒａｅｒ，Ｊ．Ｄ．，Ｈａｔｍｉ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｎｇｕｙｅｎ，Ｇ．（２０００）．Ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｔｒｉｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ＭＴ１−ＭＭＰ／ＴＩＭＰ２／ＭＭＰ２：ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ＭＭＰ２  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ．Ｂｌｏｏｄ  ９６，３０６４−３０６９．
【非特許文献１６】Ｓａｗｉｃｋｉ，Ｇ．，Ｓａｌａｓ，Ｅ．，Ｍｕｒａｔ，Ｊ．，Ｍｉｓｚｔａ−Ｌａｎｅ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｒａｄｏｍｓｋｉ，Ｍ．Ｗ．（１９９７）．Ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ  Ａ  ｄｕｒｉｎｇ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ３８６，６１６−６１９．
【非特許文献１７】Ｐｅａｒｃｅ，Ｅ．，Ｔｒｅｇｏｕｅｔ，Ｄ．Ａ．，Ｓａｍｎｅｇａｒｄ，Ａ．，Ｍｏｒｇａｎ，Ａ．Ｒ．，Ｃｏｘ，Ｃ．，Ｈａｍｓｔｅｎ，Ａ．，Ｅｒｉｋｓｓｏｎ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｙｅ，Ｓ．（２００５）．Ｈａｐｌｏｔｙｐｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−１  ｇｅｎｅ  ｏｎ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ  ９７，１０７０−１０７６．
【非特許文献１８】Ｂｏｉｒｅ，Ａ．，Ｃｏｖｉｃ，Ｌ．，Ａｇａｒｗａｌ，Ａ．，Ｊａｃｑｕｅｓ，Ｓ．，Ｓｈａｒｉｆｉ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｋｕｌｉｏｐｕｌｏｓ，Ａ．（２００５）．ＰＡＲ１  ｉｓ  ａ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ−１  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｈａｔ  Ｐｒｏｍｏｔｅｓ  Ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ  １２０，３０３−３１３．
【非特許文献１９】Ｃｏｕｇｈｌｉｎ，Ｓ．Ｒ．（２０００）．Ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４０７，２５８−２６４．
【非特許文献２０】Ｌｅｇｅｒ，Ａ．Ｊ．，Ｃｏｖｉｃ，Ｌ．，ａｎｄ  Ｋｕｌｉｏｐｕｌｏｓ，Ａ．（２００６ｂ）．Ｐｒｏｔｅａｓｅ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １１３，１０７０−１０７７．
【非特許文献２１】Ｍａｃｋｍａｎ，Ｎ．（２００４）．Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ，ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ，ａｎｄ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ  ２４，１０１５−１０２２．
【非特許文献２２】Ｓｃｈｗｅｒｔｚ，Ｈ．，Ｔｏｌｌｅｙ，Ｎ．Ｄ．，Ｆｏｕｌｋｓ，Ｊ．Ｍ．，Ｄｅｎｉｓ，Ｍ．Ｍ．，Ｒｉｓｅｎｍａｙ，Ｂ．Ｗ．，Ｂｕｅｒｋｅ，Ｍ．，Ｔｉｌｌｅｙ，Ｒ．Ｅ．，Ｒｏｎｄｉｎａ，Ｍ．Ｔ．，Ｈａｒｒｉｓ，Ｅ．Ｍ．，Ｋｒａｉｓｓ，Ｌ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．（２００６）．Ｓｉｇｎａｌ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡ  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｔｈｒｏｍｂｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｔｅｌｅｔｓ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０３，２４３３−２４４０．
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、ＰＡＲ１を介した血小板血栓形成の新規なメタロプロテアーゼ依存性経路に基づく。血小板がコラーゲンに曝されると、ＭＭＰ−１が活性化され、これが今度は血小板表面上のＰＡＲ１を直接切断する。予想外に、ＭＭＰ−１はトロンビン切断部位とは異なる部位でＰＡＲ１のＮ末端細胞外ドメインを切断した。この切断により、血小板活性化及びＰＡＲ１シグナル伝達のアゴニストである、より長いテザーペプチドリガンドが生じた。ＭＭＰ１−ＰＡＲ１経路をブロックすると、コラーゲン依存性血栓形成、動脈血栓、血餅退縮等の生理学的事象が阻害された。そこで、本発明は、急性冠動脈症候群等の血栓性病態であると診断された又は血栓性病態を発症するリスクがある患者の処置においてこのメタロプロテアーゼ受容体系を標的とする方法及び治療法を提供する。
【００１０】
一態様では、本発明は、血栓性病態であると診断された又は血栓性病態を発症する相当なリスクがある患者を、前記患者のプロテアーゼ活性化受容体−１（ＰＡＲ−１）の３９位のアスパラギン酸（Ｄ３９）と４０位のプロリン（Ｐ４０）の間でのタンパク質切断を実質的に阻害する治療有効量の薬剤を投与することで処置する方法を提供する。タンパク質切断は、マトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）による酵素活性を必要とし得る。
【００１１】
患者は、胸痛、息切れ、胸部圧迫感、左腕の圧迫感、左下顎角の圧迫感、発汗過多、嘔気、嘔吐、動悸、不安、又は異常な感覚等の１又は複数の症状を示す又は示した患者であり得る。患者は、血栓性病態に関連する１又は複数の確認可能な又は診断可能な危険因子を有し得る。
【００１２】
血栓性病態は、血小板凝集により生じる任意の病状であり得、例えば、限定されるものではないが、急性冠動脈症候群、動脈血栓症、静脈血栓症、末梢動脈疾患、不安定狭心症、心房細動、最初の心筋梗塞、再発性心筋梗塞、虚血性突然死、一過性脳虚血発作、脳卒中、アテローム性動脈硬化症、深部静脈血栓症、血栓性静脈炎、動脈塞栓症、冠動脈血栓症、大脳動脈血栓症、脳塞栓症、腎塞栓症、又は肺塞栓症が含まれる。
【００１３】
一実施形態では、本発明の方法は、癌であると診断された患者を処置するために使用される。
【００１４】
特徴の１つでは、薬剤の投与は患者の血小板活性化を実質的に阻害する。薬剤は、ＰＡＲ−１に結合するか、切断部位に結合することでＰＡＲ−１の切断を実質的に阻害するか、ＰＡＲ−１のコンホメーション変化を誘導することでＰＡＲ−１の切断を実質的に阻害する、リガンド結合分子であり得る。薬剤には、ＭＭＰ−１に結合するリガンド結合分子又はＭＭＰ−１若しくはＰＡＲ−１に特異的な抗体が含まれ得る。薬剤には、ＭＭＰ−１又はＰＡＲ−１に結合する小分子も含まれ得る。
【００１５】
いくつかの実施形態では、薬剤は、マトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）の活性化又はＭＭＰ−１酵素活性、プロテアーゼによるｐｒｏＭＭＰ−１の切断、マトリックスメタロプロテアーゼ−２（ＭＭＰ−２）によるｐｒｏＭＭＰ−１の切断、又はコラーゲンにより開始されるＭＭＰ−１活性化を実質的に阻害する。薬剤は、ＦＮ−４３９、組織メタロプロテアーゼ阻害剤（ＴＩＭＰ）、ＭＭＰ−２００、シペマスタット（Ｔｒｏｃａｄｅ）、プリノマスタット、ＢＡＹ  １２−９５６６、バチミスタット、ＢＭＳ−２７５２９１、マリマスタット、ＭＭＩ２７０（Ｂ）、メタスタット、Ｒｏ  ３２−３５５５、ＲＳ−１３０，８３０、ＰＤ  １６６７９３、アンコリノシドＢ〜Ｄ、テトラサイクリン化合物、又はドキシサイクリンであり得る。
【００１６】
本発明の方法は更に、患者の血小板中のトロンボキサン伝達経路及びＡＤＰシグナル伝達経路の少なくとも１つ、ＰＡＲ−１の酵素活性の少なくとも一部、又はトロンビン依存性のＰＡＲ１活性化を実質的に阻害する第２の薬剤を患者に投与することを提供する。第２の薬剤は、例えば組織因子により開始される止血経路を阻害することで、第１の薬剤を補完する。
【００１７】
方法は更に、抗血小板薬、抗凝固薬、血栓溶解薬等の第２の抗血栓剤の投与を提供する。第２の抗血栓剤は、チエノピリジン、プロスタグランジン類似体、ＣＯＸ阻害剤、ビタミンＫアンタゴニスト、糖タンパク質ＩＩＢ／ＩＩＩＡ阻害剤、又はトロンビン阻害剤であり得る。
【００１８】
別の実施形態では、第２の薬剤は、アスピリン、クロピドグレル、チクロピジン、プラスグレル、ヘパリン、アブシキシマブ、エプチフィバチド、チロフィバン、及びビバリルジンであり得る。
【００１９】
別の実施形態では、第２の薬剤は、ＰＡＲファミリーメンバーのｐｅｐｄｕｃｉｎリポペプチド又はＰＡＲ−１ｐｅｐｄｕｃｉｎリポペプチド、例えばＰ１ｉ３ｐａｌ−７、Ｐ１ｉ３ｐａｌ−１２、Ｐ１ｉ３ｐａｌ−１２Ｓ、Ｐ１ｉ３ｐａｌ−１０Ｓ、Ｐ１ｉ１ｐａｌ−１１、Ｐ１ｉ２ｐａｌ−７、Ｐ１ｉ２ｐａｌ−１１、Ｐ１ｉ２ｐａｌ−１６、Ｐ１ｉ２ｐａｌ−２１、Ｐ１ｉ４ｐａｌ１３、又はＰ１ｉ４ｐａｌ１３Ｒであり得る。
【００２０】
方法は更に、静脈内（Ｉ．Ｖ．）注射、皮下注射、筋肉内注射、経口摂取、経鼻、局所、直腸、腟内、又は非経口摂取による薬剤の投与を提供する。薬剤は、薬学的に許容される補形剤、キャリア、又は希釈剤と共に製剤化され得る。
【００２１】
第２の態様では、本発明は、３９位のアスパラギン酸（Ｄ３９）と４０位のプロリン（Ｐ４０）の間での患者のプロテアーゼ活性化受容体−１（ＰＡＲ−１）のタンパク質切断により生じるＰＡＲ−１シグナル伝達活性を実質的に阻害する治療有効量の薬剤を血栓性病態であると診断された又は血栓性病態を発症する相当なリスクがある患者に投与することにより患者の血栓性病態を処置する方法を提供する。一実施形態では、薬剤はＳＣＨ  ５３０３４８を含む。
【００２２】
別の実施形態では、薬剤は、ＰＡＲファミリーメンバーのｐｅｐｄｕｃｉｎリポペプチド又はＰＡＲ−１ｐｅｐｄｕｃｉｎリポペプチド、例えばＰ１ｉ３ｐａｌ−７、Ｐ１ｉ３ｐａｌ−１２、Ｐ１ｉ３ｐａｌ−１２Ｓ、Ｐ１ｉ３ｐａｌ−１０Ｓ、Ｐ１ｉ１ｐａｌ−１１、Ｐ１ｉ２ｐａｌ−７、Ｐ１ｉ２ｐａｌ−１１、Ｐ１ｉ２ｐａｌ−１６、Ｐ１ｉ２ｐａｌ−２１、Ｐ１ｉ４ｐａｌ１３、又はＰ１ｉ４ｐａｌ１３Ｒを含む。
【００２３】
第３の態様では、本発明は、血栓性病態であると診断された又は血栓性病態を発症する相当なリスクがある患者を、マトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）の活性化又はＭＭＰ−１酵素活性を実質的に阻害する治療有効量の薬剤を投与することにより処置する方法を提供する。
【００２４】
薬剤は、プロテイナーゼによるｐｒｏＭＭＰ−１の切断、マトリックスメタロプロテアーゼ−２（ＭＭＰ−２）によるｐｒｏＭＭＰ−１の切断、又はコラーゲンにより開始されるＭＭＰ−１活性化を実質的に阻害する。薬剤は、ＦＮ−４３９、組織メタロプロテアーゼ阻害剤（ＴＩＭＰ）、ＭＭＰ−２００、シペマスタット（Ｔｒｏｃａｄｅ）、プリノマスタット、ＢＡＹ  １２−９５６６、バチミスタット、ＢＭＳ−２７５２９１、マリマスタット、ＭＭＩ２７０（Ｂ）、メタスタット、Ｒｏ  ３２−３５５５、ＲＳ−１３０，８３０、ＰＤ  １６６７９３、アンコリノシドＢ〜Ｄ、テトラサイクリン化合物、又はドキシサイクリンであり得る。
【００２５】
第４の態様では、本発明は、アテローム性動脈硬化症であると診断された又はアテローム性動脈硬化症を発症する相当なリスクがある患者を、前記患者のプロテアーゼ活性化受容体−１（ＰＡＲ−１）の３９位のアスパラギン酸（Ｄ３９）と４０位のプロリン（Ｐ４０）の間でのタンパク質切断を実質的に阻害する治療有効量の薬剤を投与することにより処置する方法を提供する。
【００２６】
薬剤は、血管形成術、冠動脈バイパス術、又は直視下心臓手術を患者に行った後に、好ましくは２週間以内の期間で、投与され得る。
【００２７】
第５の態様では、本発明は、アテローム性動脈硬化症であると診断された又はアテローム性動脈硬化症を発症する相当なリスクがある患者に３９位のアスパラギン酸（Ｄ３９）と４０位のプロリン（Ｐ４０）の間でのプロテアーゼ活性化受容体−１（ＰＡＲ−１）のタンパク質切断により生じる患者のＰＡＲ−１シグナル伝達活性を実質的に阻害する治療有効量の薬剤を投与することによりアテローム性動脈硬化症を処置する方法を提供する。
【００２８】
一態様では、薬剤は、患者の大動脈内のアテローム性プラークのサイズを減少させる。
【００２９】
一実施形態では、薬剤はＳＣＨ  ５３０３４８を含む。
【００３０】
別の実施形態では、薬剤は、ＰＡＲファミリーメンバーのｐｅｐｄｕｃｉｎリポペプチド又はＰＡＲ−１ｐｅｐｄｕｃｉｎリポペプチド、例えばＰ１ｉ３ｐａｌ−７、Ｐ１ｉ３ｐａｌ−１２、Ｐ１ｉ３ｐａｌ−１２Ｓ、Ｐ１ｉ３ｐａｌ−１０Ｓ、Ｐ１ｉ１ｐａｌ−１１、Ｐ１ｉ２ｐａｌ−７、Ｐ１ｉ２ｐａｌ−１１、Ｐ１ｉ２ｐａｌ−１６、Ｐ１ｉ２ｐａｌ−２１、Ｐ１ｉ４ｐａｌ１３、又はＰ１ｉ４ｐａｌ１３Ｒを含む。
【００３１】
第６の態様では、本発明は、トリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）の活性化又はＭＭＰ−１酵素活性を実質的に阻害する治療有効量の薬剤を投与することによりアテローム性動脈硬化症であると診断された又はアテローム性動脈硬化症を発症する相当なリスクがある患者を処置する方法を提供する。
【００３２】
別の態様では、本発明は更に、含まれる血小板上のプロテアーゼ活性化受容体−１（ＰＡＲ−１）の３９位のアスパラギン酸（Ｄ３９）と４０位のプロリン（Ｐ４０）の間でのタンパク質切断を実質的に阻害する有効濃度の薬剤を含む、血小板の保存又は輸送のための媒体（ｍｅｄｉｕｍ）を提供する。媒体は、グルコースを更に含む水溶液であってもよく、この媒体に含まれる正常血小板の平均半減期は約５日以上、又は１ヶ月以上、又は６ヶ月以上である。媒体は、マトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）の活性化又はＭＭＰ−１酵素活性を阻害する有効濃度の薬剤を含み得る。媒体は、ＰＡＲファミリーメンバーのｐｅｐｄｕｃｉｎリポペプチド又はＰＡＲ−１ｐｅｐｄｕｃｉｎリポペプチド、例えばＰ１ｉ３ｐａｌ−７、Ｐ１ｉ３ｐａｌ−１２、Ｐ１ｉ３ｐａｌ−１２Ｓ、Ｐ１ｉ３ｐａｌ−１０Ｓ、Ｐ１ｉ１ｐａｌ−１１、Ｐ１ｉ２ｐａｌ−７、Ｐ１ｉ２ｐａｌ−１１、Ｐ１ｉ２ｐａｌ−１６、Ｐ１ｉ２ｐａｌ−２１、Ｐ１ｉ４ｐａｌ１３、又はＰ１ｉ４ｐａｌ１３Ｒを含み得る。
【００３３】
別の態様では、本発明は、血小板の保存又は輸送のための媒体であって、３９位のアスパラギン酸（Ｄ３９）と４０位のプロリン（Ｐ４０）の間でのプロテアーゼ活性化受容体−１（ＰＡＲ−１）のタンパク質切断により生じるＰＡＲ−１シグナル伝達活性を実質的に阻害する有効濃度の薬剤を含む媒体を提供する。
【００３４】
一実施形態では、薬剤はＳＣＨ  ５３０３４８を含む。
【００３５】
更に別の態様では、本発明は患者体内のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ−１）の活性化又はＭＭＰ−１活性を実質的に阻害する遺伝的欠陥を患者が有するかどうかを決定することにより患者が出血性イベントを発現するリスクを診断する方法を提供する。
【００３６】
別の態様では、本発明は、患者体内のマトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）の活性化又はＭＭＰ−１酵素活性を過剰に刺激する遺伝的欠陥を患者が有するかどうかを決定することにより患者の血友病状態若しくは凝血異常状態又はそのリスクを診断する方法を提供する。
【００３７】
本発明は更に、ヒトプロテアーゼ活性化受容体−１（ＰＡＲ−１）ポリペプチドの３９位のアスパラギン酸（Ｄ３９）と４０位のプロリン（Ｐ４０）の間でのタンパク質切断により生じる２つの断片の一方の連続する５個以上のアミノ酸残基を含む配列を有し、タンパク質切断により生じた切断部位で一方の末端が終わる、単離されたポリペプチドを提供する。本発明のポリペプチドは、Ｎ末端にプロリンを有し得、例えばＰＲＳＦＬＬＲＮ（配列番号１）のポリペプチド配列を有し得る。あるいは、本発明のポリペプチドは、Ｃ末端にアスパラギン酸を有し得、ヒトＰＡＲ−１の全長ポリペプチド配列を示し且つ切断部位にまたがるＤ３９及びＰ４０が太字にされ下線が引かれている図９Ｂ中のＤ３９の左に示すような少なくとも別の４アミノ酸残基を有し得る。
【００３８】
本発明は更に、患者から採った血小板中における本発明のポリペプチドの量を測定することにより患者の血栓性病態を診断する方法を提供する。
【００３９】
更に別の態様では、ＰＡＲ−１アンタゴニストを同定する方法であって、ヒトプロテアーゼ活性化受容体−１（ＰＡＲ−１）ポリペプチドの３９位のアスパラギン酸（Ｄ３９）と４０位のプロリン（Ｐ４０）の間でのタンパク質切断により生じる２つの断片の一方の連続する５個以上のアミノ酸残基を含む配列を有し且つタンパク質切断により生じた切断部位で一方の末端が終わる本発明の単離されたポリペプチドを用意する工程；候補薬剤を用意する工程；前記候補薬剤の存在下で、単離されたポリペプチドに血小板を接触させる工程；ＰＡＲ−１シグナル伝達活性を測定する工程；及び候補薬剤存在下でのＰＡＲ−１シグナル伝達活性を候補薬剤非存在下でのＰＡＲ−１シグナル伝達活性と比較する工程；を含み、候補薬剤非存在下でのＰＡＲ−１シグナル伝達活性と比べた候補薬剤存在下でのＰＡＲ−１シグナル伝達活性の少なくとも１０％の低下により候補薬剤がＰＡＲ−１アンタゴニストとして同定される、方法が開示されている。
【００４０】
ＰＡＲ−１シグナル伝達活性には、Ｒｈｏ−ＧＴＰ経路のシグナル伝達又はＭＡＰＫ経路のシグナル伝達が含まれ得る。
【００４１】
別の態様では、ＰＡＲ−１アンタゴニストを同定する方法であって、活性化ＭＭＰ−１を用意する工程；候補薬剤を用意する工程；ＭＭＰ−１がＰＡＲ−１を切断する条件下で候補薬剤存在下にて血小板を活性化ＭＭＰ−１に接触させる工程；ＰＡＲ−１シグナル伝達活性を測定する工程；及び候補薬剤存在下でのＰＡＲ−１シグナル伝達活性を候補薬剤非存在下でのＰＡＲ−１シグナル伝達活性と比較する工程；を含み、候補薬剤非存在下でのＰＡＲ−１シグナル伝達活性と比べた候補薬剤存在下でのＰＡＲ−１シグナル伝達活性の少なくとも１０％の低下により候補薬剤がＰＡＲ−１アンタゴニストとして同定される、方法が開示されている。
【００４２】
ＰＡＲ−１シグナル伝達活性には、Ｒｈｏ−ＧＴＰ経路のシグナル伝達又はＭＡＰＫ経路のシグナル伝達が含まれ得る。
【００４３】
一態様では、本発明は前記患者のプロテアーゼ活性化受容体−１（ＰＡＲ−１）の３９位のアスパラギン酸（Ｄ３９）と４０位のプロリン（Ｐ４０）の間でのタンパク質切断を実質的に阻害する薬剤を含むマトリックス層でコーティングされた医療器具を開示する。
【００４４】
別の態様では、本発明は３９位のアスパラギン酸（Ｄ３９）と４０位のプロリン（Ｐ４０）の間でのプロテアーゼ活性化受容体−１（ＰＡＲ−１）のタンパク質切断により生じるＰＡＲ−１シグナル伝達活性を実質的に阻害する薬剤を含むマトリックス層でコーティングされた医療器具を開示する。一実施形態では、薬剤はＳＣＨ  ５３０３４８を含む。
【００４５】
別の実施形態では、薬剤は、ＰＡＲファミリーメンバーのｐｅｐｄｕｃｉｎリポペプチド又はＰＡＲ−１ｐｅｐｄｕｃｉｎリポペプチド、例えばＰ１ｉ３ｐａｌ−７、Ｐ１ｉ３ｐａｌ−１２、Ｐ１ｉ３ｐａｌ−１２Ｓ、Ｐ１ｉ３ｐａｌ−１０Ｓ、Ｐ１ｉ１ｐａｌ−１１、Ｐ１ｉ２ｐａｌ−７、Ｐ１ｉ２ｐａｌ−１１、Ｐ１ｉ２ｐａｌ−１６、Ｐ１ｉ２ｐａｌ−２１、Ｐ１ｉ４ｐａｌ１３、又はＰ１ｉ４ｐａｌ１３Ｒを含む。
【００４６】
マトリックス層は生体適合性ペプチドマトリックスであり得る。医療器具は移植可能であり得る。マトリックスは、ＰＡＲファミリーメンバーのｐｅｐｄｕｃｉｎリポペプチド又はＰＡＲ−１ｐｅｐｄｕｃｉｎリポペプチド、例えばＰ１ｉ３ｐａｌ−７、Ｐ１ｉ３ｐａｌ−１２、Ｐ１ｉ３ｐａｌ−１２Ｓ、Ｐ１ｉ３ｐａｌ−１０Ｓ、Ｐ１ｉ１ｐａｌ−１１、Ｐ１ｉ２ｐａｌ−７、Ｐ１ｉ２ｐａｌ−１１、Ｐ１ｉ２ｐａｌ−１６、Ｐ１ｉ２ｐａｌ−２１、Ｐ１ｉ４ｐａｌ１３、又はＰ１ｉ４ｐａｌ１３Ｒを更に含んでもよい。
【００４７】
ＭＭＰ−１により仲介されるＰＡＲ−１シグナル伝達経路を阻害する薬剤を発見及び投与する方法を初めとする上記に記載した実施形態には多くの利点がある。したがって、本明細書に開示する方法、組成物、及びキットは、血栓性病態であると診断された又は血栓性病態になるリスクがある患者の処置に特に有用である。
【００４８】
本願は、この発明を実施するための形態に開示されている実施形態に限定されないと理解されるべきであり、当業者の知識の範囲内の改変及び変更を含み、請求項によって定義されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１−１】図１Ａは、ＡＤＰ、Ｕ−４６６１９、又はＩ型コラーゲンで処置した後のヒト血小板におけるＭＭＰ活性を示す図である。図１Ｂは、図１の血小板から回収したペレット及び上清中の、放出されたＭＭＰ−１プロドメイン及び血小板に会合しているＭＭＰ−１プロドメインのＥＬＩＳＡ測定を示す図である。図１Ｃは、フローサイトメトリーで決定した血小板表面上でのＭＭＰ−１の発現を示す図である。
【図１−２】図１Ｄは、休止ヒト血小板中でｐｒｏＭＭＰ−１がインテグリンに会合することを示す図である。図１Ｅは、ＭＭＰ−１及びコラーゲンがＰＡＲ１の細胞外ドメインからＮ末端トロンビン切断断片を放出させることを示す図である。図１Ｆは、ＭＭＰ−３及びＭＭＰ−７が休止血小板からＮ末端ＰＡＲ−１ペプチドを放出させることができないことを示すドットブロット解析を示す図である。図１Ｇは、コラーゲンにより誘導される休止血小板からのＮ末端ＰＡＲ−１ペプチドの放出をＭＭＰ−１特異的抗体がブロックできることを示すドットブロット解析を示す図である。図１Ｈは、休止血小板からのＮ末端ＰＡＲ−１ペプチドの放出をＡＤＰ及びＵ−４６６１９が促進できることを示すドットブロット解析を示す図である。図１Ｉは、ＡＲ−Ｃ６９９３１ＭＸ（ＡＲＣ）を用いたＰ２Ｙ１２  ＡＤＰ受容体のブロック又はアスピリン（ＡＳＡ）を用いたトロンボキサンのブロックのいずれもコラーゲン依存性のＰＡＲ１Ｎ末端ペプチドの放出に影響を与えなかったことを示すドットブロット解析を示す図である。
【図２−１】図２Ａは、ＰＡＲ１のＴＲ２６Ｎ末端ペプチド領域上のＭＭＰ−１切断部位の同定を示す図である。図２Ｂは、トロンビン及びＭＭＰ−１によるＰＡＲ１Ｎ末端細胞外変異体の切断位置を示す図である。
【図２−２】図２Ｃは、トロンビンによるＰＡＲ１Ｎ末端細胞外変異体の切断を示す図である。図２Ｄは、ＭＭＰ−１によるＰＡＲ１Ｎ末端細胞外変異体の切断を示す図である。図２Ｅは、トロンビン又はＭＭＰ−１存在下における種々のＰＡＲ−１変異体によるＲｈｏＡシグナル伝達を示す図である。図２Ｆは、トロンビン切断部位変異体及びＭＭＰ１切断部位変異体を発現するＭＣＦ−７細胞の走化性移動を示す図である。
【図２−３】図２Ｇは、ＣＯＳ７細胞上で発現されたＰＡＲ１Ｎ末端細胞外ドメイン変異体の、別の起源から精製したＭＭＰ−１を用いた切断を示す図である。図２Ｈは、ＣＯＳ７細胞上で発現された野生型ＰＡＲ−２のＭＭＰ−１又はトリプシンによる切断を示す図である。図２Ｉは、ＣＯＳ７細胞上で発現された野生型ＰＡＲ−３のＭＭＰ−１又はトロンビンによる切断を示す図である。図２Ｊは、ＣＯＳ７細胞上で発現された野生型ＰＡＲ−４のＭＭＰ−１又はトロンビンによる切断を示す図である。
【図３】図３Ａは、ＰＲＳＦＬＬＲＮペプチド（ＰＲ−ＴＲＡＰ）が血小板中でＰＡＲ１依存性ＲｈｏＡ活性化を誘導することを示す図である。図３Ｂは、ＰＲＳＦＬＬＲＮペプチド（ＰＲ−ＴＲＡＰ）が血小板中でｐ３８ＭＡＰＫを活性化することを示す図である。図３Ｃは、ＰＲＳＦＬＬＲＮペプチド（ＰＲ−ＴＲＡＰ）によって誘導される血小板の形態変化を示す図である。
【図４】図４Ａは、ＭＭＰ−１が血小板中のＲｈｏ−ＧＴＰを活性化することを示す図である。図４Ｂは、ＭＭＰ−１が血小板の形態変化を誘導できることを示す図である。図４Ｃは、ＭＭＰ−１が血小板中でＰＡＲ１依存性カルシウム流動を誘導することを示す図である。図４Ｄは、ＭＭＰ−１が血小板凝集を誘導することを示す図である。図４Ｅは、ＭＭＰ−１が血小板中でｐ３８ＭＡＰＫを活性化することを示す図である。図４Ｆは、ＭＭＰ−１が血小板中で下流のＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２を活性化することを示す図である。
【図５−１】図５Ａは、５ｍｇ／ｍｌコラーゲン存在下での血小板凝集に対するメタロプロテアーゼ又はＰＡＲ１の薬理学的遮断の影響を示す図である。図５Ｂは、５ｍｇ／ｍｌコラーゲン存在下での血小板ｐ３８ＭＡＰＫ活性に対するメタロプロテアーゼ又はＰＡＲ１の薬理学的遮断の影響を示す図である。図５Ｃは、５ｍｇ／ｍｌコラーゲン存在下での血小板Ｒｈｏ−ＧＴＰ活性に対するメタロプロテアーゼ又はＰＡＲ１の薬理学的遮断の影響を示す図である。図５Ｄは、５ｍｇ／ｍｌのコラーゲン単独存在下又はＭＭＰ−１（カルビオケム社製；又はバイオモル社製のＳ２）との存在下での血小板Ｒｈｏ−ＧＴＰ活性に対する、種々の阻止抗体（抗ＭＭＰ−１、抗ＭＭＰ−８、及び抗ＭＭＰ−１３）及び種々の阻害剤（ＡＲＣ（Ｐ２Ｙ１２アンタゴニストＡＲ−Ｃ６９９３１ＭＸ、ＡＳＡ（アスピリン））の影響を示す図である。
【図５−２】図５Ｅは、５ｍｇ／ｍｌコラーゲン存在下での血小板凝集に対する特定のｐｅｐｄｕｃｉｎ（Ｐ１ｐａｌ−７、「ＰＺ−１２８」と表記）の影響を示す図である。
【図６−１】図６Ａは、ＭＭＰ−１又はＰＡＲ１を阻害することでヘパリン存在下においてコラーゲン表面上での初期微小血栓形成が防止されることを示す図である。図６Ｂは、ＭＭＰ−１又はＰＡＲ１を阻害することでヘパリン存在下においてコラーゲン表面上での初期微小血栓形成が防止されることを示す図である。図６Ｃは、ＭＭＰ−１又はＰＡＲ１を阻害することでトロンビンとは独立してコラーゲン表面上での初期血小板微小血栓形成が防止されることを示す図である。図６Ｄは、ＭＭＰ−１又はＰＡＲ１を阻害することでトロンビンとは独立してコラーゲン表面上での初期血小板微小血栓形成が防止されることを示す図である。図６Ｅは、モルモットにおいてコラーゲンにより誘導される全身性の血小板活性化に対してＰ１ｐａｌ−７及びＦＮ４３９が保護効果を有することを示す図である。図６Ｆは、ＰＡＲ１及び／又はＭＭＰ−１の阻害がモルモットの頸動脈の閉塞を防止することを示す図である。
【図６−２】図６Ｇは、ＰＡＲ１及び／又はＭＭＰ−１の阻害がモルモットの頸動脈の閉塞を防止することを示す図である。図６Ｈは、モルモット血小板上清中のＭＭＰ−１活性及びコラーゲンにより誘導される動脈血栓の検出を示す図である。
【図６−３】図６Ｉは、多血小板ヒト血漿に種々の薬剤を添加した血餅退縮アッセイを示す写真である。上のブロックは９０分のインキューション後に撮った写真であり、下のブロックは２４０分のインキューション後に撮った写真である。
【図７】図７Ａは、フローサイトメトリーにより測定したモルモット血小板表面上でのＭＭＰ−１の発現を示す図である。図７Ｂは、ＦＮ−４３９、対照ＩｇＧ、又はＭＭＰ−１阻止抗体の存在下又は非存在下でのモルモット血小板溶解物中及び上清中における活性型ＭＭＰ−１の酵素活性を示す図である。図７Ｃは、１０ｍｇ／ｍｌコラーゲン存在下でのモルモット血小板凝集に対するメタロプロテアーゼ又はＰＡＲ１の薬理学的遮断の影響を示す図である。図７Ｄは、図７Ｃで使用した血小板中でのＲｈｏＧＴＰ活性を示す図である。
【図８−１】図８Ａは、マトリックスメタロプロテアーゼ−２（ＭＭＰ−２）の薬理学的阻害がコラーゲン依存性血小板凝集をＭＭＰ−１の遮断と同程度に低減することを示す図である。図８Ｂは、マトリックスメタロプロテアーゼ−２（ＭＭＰ−２）の薬理学的阻害がコラーゲン依存性血小板凝集をＭＭＰ−１の遮断と同程度に低減することを示す図である。図８Ｃは、マトリックスメタロプロテアーゼ−２（ＭＭＰ−２）の薬理学的阻害がコラーゲン依存性血小板凝集をＭＭＰ−１の遮断と同程度に低減することを示す図である。図８Ｄは、マトリックスメタロプロテアーゼ−２（ＭＭＰ−２）の薬理学的阻害がコラーゲン依存性血小板凝集をＭＭＰ−１の遮断と同程度に低減することを示す図である。
【図８−２】図８Ｅは、マトリックスメタロプロテアーゼ−２（ＭＭＰ−２）の薬理学的阻害がコラーゲン依存性血小板凝集をＭＭＰ−１の遮断と同程度に低減することを示す図である。図８Ｆは、マトリックスメタロプロテアーゼ−２（ＭＭＰ−２）の薬理学的阻害がコラーゲン依存性血小板凝集をＭＭＰ−１の遮断と同程度に低減することを示す図である。
【図９】図９Ａは、ＰＡＲ−１のテザーリガンドによる、ＭＭＰ−１に仲介されるＰＡＲ−１活性化についての提唱されるモデルを示す図である。図９Ｂは、ヒトＰＡＲ−１ポリペプチド配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１９８３）を示す図である。
【図１０】図１０Ａは、欧米の餌を１５週間与えた後のＡｐｏＥ欠損マウスの平均体重を示す図である。図１０Ｂは、欧米の餌を１５週間与えた後のＡｐｏＥ欠損マウスの全血漿コレステロールを示す図である。
【図１１】図１１Ａは、ビヒクル、ＭＭＰ  Ｉｎｈ−Ｉ（ＦＮ−４３９）、又はＰ１ｐａｌ−７ｐｅｐｄｕｃｉｎリポペプチドで処置したＡｐｏＥ欠損マウスのアテローム性動脈硬化病変領域を示す図である。図１１Ｂは、腹部／腸骨大動脈におけるアテローム性動脈硬化病変領域を示す図である。
【図１２】図１２Ａは、ＡｐｏＥ−／−マウスの腹部大動脈における脈管形成を示す図である。図１２Ｂは、ＡｐｏＥ−／−マウスの腹部大動脈における脈管形成を示す図である。図１２Ｃは、ＡｐｏＥ−／−マウスの腹部大動脈における脈管形成を示す図である。
【図１３】図１３Ａは、Ｐ１ｐａｌ−７及びＭＭＰ−１阻害剤がＡｐｏＥ欠損マウスの腹部大動脈における脈管形成を低減することを示す図である。図１３Ｂは、Ｐ１ｐａｌ−７及びＭＭＰ−１阻害剤がＡｐｏＥ欠損マウスの腹部大動脈における脈管形成を低減することを示す図である。図１３Ｃは、Ｐ１ｐａｌ−７及びＭＭＰ−１阻害剤がＡｐｏＥ欠損マウスの腹部大動脈における脈管形成を低減することを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
特に断りのない限り、本明細書中で使用される全ての科学技術用語は、当業者に一般的に理解されているのと同じ意味である。以下の定義は、本願の開示及び請求項を解釈する助けとするために提供するものである。本セクションの定義が他での定義と一致しない場合、本セクションに記載した定義に従うものとする。
【００５１】
本発明において、「約」又は「およそ」という用語は、数字と共に使用される場合、言及されている数字の５、１０、又は１５％以内の任意の数字を意味する。
【００５２】
本発明において、「投与」、「投与する」等の用語は、薬学的組成物又は栄養補助組成物を対象に与える文脈で使用される場合、通常、適切な送達ビヒクルと組み合わせた薬剤（例えばＭＭＰ−１により仲介されるＰＡＲ−１シグナル伝達経路のアゴニスト又はアンタゴニスト）を含む１又は複数の医薬組成物を、その化合物の投与が意図する生物学的効果の１又は複数が投与化合物によって達成されるように任意の手段により対象に与えることを意味する。例えば、限定されるものではないが、組成物は非経口、皮下、静脈内、冠動脈内、直腸、筋肉内、腹腔内、経皮、又は頬側の送達経路で投与され得る。
【００５３】
一実施形態では、薬剤、例えばＭＭＰ−１により仲介されるＰＡＲ−１シグナル伝達経路のアゴニスト又はアンタゴニスト、の患者への「投与」では、徐放性放出、すなわち、同じ量の活性成分を含む即効型の製剤が同じ期間に放出するよりも長い期間にわたり製剤から活性成分が調節されて持続的に放出されることが必要となり得る。投与される用量は、レシピエントの年齢、健康、体重、及び／若しくは血栓性病態、並びに／又はその他の関連する危険因子、併用療法の種類（あれば）、処置の頻度、並びに／又は所望する効果の性質に応じて変わる。
【００５４】
本発明において、「アゴニスト」は、標準的なバイオアッセイ又はインビボにおいて又は治療有効量で使用された時に、生物学的活性を少なくとも又は少なくとも約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約７倍、約１０倍、約２０倍、約５０倍、又は約１００倍以上上昇させる、任意の天然又は合成の、分子又は分子の組合せを意味する。一実施形態では、「アゴニスト」は、ＭＭＰ−１により仲介されるＰＡＲ−１シグナル伝達を活性化する、任意の天然又は合成の、分子又は分子の組合せを意味する。
【００５５】
「アンタゴニスト」又は「阻害剤」は本発明において同義で使用され得、標準的なバイオアッセイ又はインビボにおいて又は治療有効量で使用された時に、生物学的活性を少なくとも又は少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％妨げる、任意の天然又は合成の、分子又は分子の組合せを意味する。一実施形態では、「アンタゴニスト」又は「阻害剤」は、ＭＭＰ−１により仲介されるＰＡＲ−１シグナル伝達を妨げる、任意の天然又は合成の、分子又は分子の組合せを意味する。別の実施形態では、「アンタゴニスト」又は「阻害剤」は、ＭＭＰ−１により仲介されるＰＡＲ−１の活性化を阻害する、任意の天然又は合成の、分子又は分子の組合せを意味する。
【００５６】
別の実施形態では、「アンタゴニスト」又は「阻害剤」は、プロテアーゼ活性化受容体−１（ＰＡＲ−１）の３９位のアスパラギン酸（Ｄ３９）と４０位のプロリン（Ｐ４０）の間での切断を、少なくとも又は少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％阻害する化合物を意味する。
【００５７】
一実施形態では、ＭＭＰ−１により仲介されるＰＡＲ−１シグナル伝達経路の「アンタゴニスト」は、例えばＰＡＲ１依存性のＲｈｏ及びｐ３８ＭＡＰＫシグナル伝達によって測定されるＰＡＲ−Ｉにより仲介されるシグナル伝達活性を完全に又は部分的に阻害する能力によって同定され得る。本発明の「薬剤」に曝されたＰＡＲ−Ｉ受容体からのＰＡＲ−Ｉ細胞内シグナル伝達が、「アンタゴニスト」に曝されていない対照ＰＡＲ−Ｉからの細胞内シグナル伝達と比べて少なくとも又は少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％低減される時、阻害が起こっているとする。
【００５８】
本発明において、「アゴニスト」又は「アンタゴニスト」化合物は、保護されていない官能基が関与する望ましくない反応（タンパク質分解等）を防ぐ１又は複数の保護基を含み得る。一実施形態では、本発明は、保護基がアシル又はアミドであることを予期する。一実施形態では、アシルはアセタートである。別の実施形態では、保護基はベンジル基である。別の実施形態では、保護基はベンゾイル基である。本発明はかかる保護基の組合せも予期する。
【００５９】
本発明において、「抗凝固」薬とは、凝固を防止する薬物、すなわち血液の凝固を止める薬物を意味する。本発明で使用され得る抗凝固剤の非限定的な例としては、例えばクマリン（ビタミンＫアンタゴニスト、ワルファリン（クマジン、アセノクマロール、フェンプロクーモン）、及び第Ｘａ因子の合成五糖阻害剤（フォンダパリヌクス又はイドラパリナックス）が含まれる。
【００６０】
本発明において、「抗血小板薬」とは、血小板凝集を低減するクラスの医薬品のメンバーを意味する。抗血小板薬の非限定的な例としては、例えば、シクロオキシゲナーゼ阻害剤（アスピリン）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）受容体阻害剤（クロピドグレル（プラビックス）、チクロピジン（Ｔｉｃｌｉｄ））、ホスホジエステラーゼ阻害剤（シロスタゾール（プレタール）、糖タンパク質ＩＩＢ／ＩＩＩＡ阻害剤、及びアデノシン再取り込み阻害薬（ジピリダモール（Ｐｅｒｓａｎｔｉｎｅ））が含まれる。一実施形態では、抗血小板薬はＳＣＨ  ５３０３４８を含む。
【００６１】
本明細書において、「糖タンパク質ＩＩＢ／ＩＩＩＡ阻害剤」とは、限定されるものではないが、（アブシキシマブ（ＲｅｏＰｒｏ）、エプチフィバチド（Ｉｎｔｅｇｒｉｌｉｎ）、及びチロフィバン（Ａｇｇｒａｓｔａｔ）、デフィブロチドを含む。ＲｅｏＰｒｏの商標でセントコア社（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）が製造してイーライリリー社（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）が販売するアブシキシマブ（従来ｃ７Ｅ３  Ｆａｂとして知られる）は、冠動脈内で血小板が互いに固着して血栓（血餅）を形成するのを防ぐために、血管形成術等の冠動脈手術の最中又は後に主に使用される、血小板凝集阻害剤である。エプチフィバチド（Ｉｎｔｅｇｒｉｌｉｎ、ミレニアム・ファーマシューティカルズ社（Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）製、シェリング・プラウ社（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ）／エセックス社（Ｅｓｓｅｘ）からも販売促進されている）は、血小板糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体を選択的にブロックする抗血小板薬である。エプチフィバチドは、南東部のピグミーガラガラヘビ（Ｓｉｓｔｒｕｒｕｓ  ｍｉｌｉａｒｉｕｓ  ｂａｒｂｏｕｒｉ）の毒液中に見られるタンパク質に由来する環状ヘプタペプチドであり、いわゆるアルギニン−グリシン−アスパラギン酸模倣薬のクラスに属し、血小板に可逆的に結合する。エプチフィバチドの半減期は短い。この薬物は、特異的抗体アブシキシマブ及び非ペプチド性チロフィバンが世界市場に入った後に広く受け入れられたＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａの第３の阻害剤である。チロフィバンは、ヒト血小板中の糖タンパク質（ＧＰ）ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体に作用する合成非ペプチド性阻害剤である。したがって、この薬物は抗凝固剤、特に血小板凝集阻害剤を構成する。この薬物は、米国ではメディキュア・ファーマ社（Ｍｅｄｉｃｕｒｅ  Ｐｈａｒｍａ）から、米国以外ではイロコ・ファーマシューティカルズ（Ｉｒｏｋｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）から、ＡＧＧＲＡＳＴＡＴの商品名で販売されている。
【００６２】
本発明において、「結合された（ａｔｔａｃｈｅｄ）」という用語は、媒体（又はキャリア）と薬剤（例えば、ＭＭＰ−１により仲介されるＰＡＲ−１シグナル伝達経路のアゴニスト又はアンタゴニスト）との任意の相互作用を意味する。結合は可逆的であってもよく、不可逆的であってもよい。そのような結合としては、限定されるものではないが、共有結合、及び非共有結合、例えば、限定されるものではないが、イオン結合、ファンデルワールス力、又は摩擦、等が含まれる。薬剤は、含浸されるか、組み込まれるか、コーティングされるか、一緒に濁液中にあるか、一緒に溶液中にあるか、一緒に混合されている等の場合に、媒体（又はキャリア）に結合しているという。
【００６３】
本発明において、薬剤（例えば、ＭＭＰ−１により仲介されるＰＡＲ−１シグナル伝達経路のアゴニスト又はアンタゴニスト）を含む媒体が医療器具の表面に結合される時、医療器具が「コーティングされる」という。この結合は、永久的であってもよく、一時的であってもよい。一時的である場合、この結合により、薬剤の徐放性放出が実現され得る。医療器具は、血小板の活性化を阻害する薬剤を充填されたポリマー薄膜でコーティングされ得る。コーティングは、溶媒蒸発法等の当該技術分野で周知の方法を用いて、血管に挿入する前に医療器具に塗布される。溶媒蒸発法では、溶媒中でポリマー及び薬剤を混合する。その後、ポリマー、薬剤、及び溶媒を含む溶液は、浸漬又は噴霧により医療器具の表面に塗布することができる。次いで、医療器具は、乾燥プロセスに供され、このプロセス中に溶媒を蒸発させ、中に薬剤が分散されたポリマー材料が医療器具上に薄膜層を形成する。Ｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，８３７，３１３号は、ヘパリン含有コーティング組成物を調製する方法を記載している。米国特許第５，５２５，３４８号（Ｗｈｉｔｂｏｕｒｎｅ）は、抗血栓性コーティング組成物として、（ヘパリンを含む）医薬品を第四アンモニウム成分又はその他のイオン界面活性剤と複合体化させ、非水溶性ポリマーに結合させる方法を開示している。全てＨｓｕ，Ｌｉ−Ｃｈｉｅｎ，ｅｔ  ａｌ．のものである米国特許第２００５／０１９１３３３（Ａ１）号、同第２００６／０２０４５３３（Ａ１）号、及び国際公開公報第２００６／０９９５１４（Ａ２）号に開示されているように、医療器具をコーティングする一般的なアプローチは、ヘパリンと対イオンの低分子量複合体（ステアリルコニウムヘパリン（ｓｔｅａｒｙｌｋｏｎｉｕｍ  ｈｅｐａｒｉｎ））又は高分子量多価電解質複合体、例えばデキストラン、ペクチンを用いて複合体を形成する。
【００６４】
本発明において、「コラーゲンにより誘導される血小板凝集」という用語は、コラーゲンタンパク質の存在に応答する血小板凝集を意味する。
【００６５】
ＭＭＰ−１ポリペプチドの「ホモログ」とは、参照により本明細書に援用するアミノ酸配列ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ｐ０３９５６（ＭＭＰ１＿ＨＵＭＡＮ）のヒトＭＭＰ−１と少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを指す。一実施形態では、例えば、ＭＭＰ−１ホモログは、３９位のアスパラギン酸（Ｄ３９）と４０位のプロリン（Ｐ４０）の間でＰＡＲ−１を切断できるバリアントを含む。
【００６６】
ＰＡＲ−１ポリペプチドの「ホモログ」とは、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１９８３のヒトＰＡＲ−１ポリペプチド配列と少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを指す。一実施形態では、例えば、ＰＡＲ−１ホモログは、３９位のアスパラギン酸（Ｄ３９）と４０位のプロリン（Ｐ４０）の間で切断され得るＰＡＲ−１バリアントを含む。
【００６７】
本発明において、「血小板活性化を阻害する」という用語は、血小板凝集を完全に消失及び／又は防止することだけでなく、血小板凝集を低減する又は遅延させることも意味する。
【００６８】
本発明において、「リガンド結合（性）」という用語は、結合対のメンバー、すなわち化学的又は物理的に分子の一方が第２の分子に特異的に結合する２つの異なる分子のメンバーを指す。抗原及び抗体の結合対メンバーに加えて、他の結合対メンバーとしては、例えば、限定されるものではないが、ビオチンとアビジン、炭水化物とレクチン、相補的ヌクレオチド配列、相補的ペプチド配列、エフェクターと受容体分子、酵素補因子と酵素、酵素阻害剤と酵素、ペプチド配列とその配列又はタンパク質全体に特異的な抗体、ポリマー酸と塩基、色素とタンパク質バインダー、ペプチドと特異的タンパク質バインダー（例えば、リボヌクレアーゼ，Ｓ−ペプチドとリボヌクレアーゼＳ−タンパク質）等が含まれる。更に、結合対には、元の結合メンバーの類似体であるメンバー、例えば検体類似物、又は組換え技術若しくは分子工学によって作製された結合メンバーが含まれ得る。結合メンバーが免疫反応物質である場合、結合メンバーは、例えばモノクローナル又はポリクローナル抗体、組換えタンパク質又は組換え抗体、キメラ抗体、又は上記の混合物若しくは断片であってよく、また、そのような抗体、ペプチド、及びヌクレオチドの、結合メンバーとしての使用に適していることが当業者に周知な調製物であってもよい。リガンド結合メンバーは、ポリペプチドアフィニティーリガンドであり得る（例えば、その内容全体を参照により本明細書に援用する米国特許第６，３２６，１５５号参照）。一実施形態では、リガンド結合メンバーは標識されている。標識は、蛍光標識、化学発光標識、又は生物発光標識、酵素−抗体コンストラクト、又は当該技術分野で公知のその他の同様な好適な標識から選択することができる。
【００６９】
いくつかの実施形態では、リガンド結合分子は、ポリクローナル及びモノクローナル抗体の両方を含む「抗体」を指し、インタクトな分子、その断片（例えばＦｖ、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ）’２断片、又はインタクトな分子及び／若しくは断片の多量体又は凝集体であってもよく；自然に生じたものであってもよく、例えば免疫化、合成、又は遺伝子操作によって作製されたものであってもよい。抗体は、当該技術分野で周知の方法に従ってヒト化されてもよい。
【００７０】
別の実施形態では、「リガンド結合分子」は、「アプタマー」、すなわち塩基対ハイブリダイゼーション以外の方法で関心のある標的に結合できるオリゴヌクレオチドを指すことがある。
【００７１】
本発明において、「マトリックス層」とは、本明細書に記載の「アゴニスト」又は「アンタゴニスト」に結合するのに適し且つ医療器具の表面に塗布することができる、ポリマー等の物質を指す。医療器具のコーティング方法は、その内容全体を参照により本明細書に援用する米国特許公開第２００９／００１８６４６号に記載されている。
【００７２】
本発明において、「医療器具」という用語は、医学的手技に関連して使用される全ての装置を幅広く指す。具体的には、医学的手技又は治療中に患者の血液に接触するあらゆる装置が本発明において医療器具と考えられる。同様に、医学的手技又は治療中に薬物又は化合物を患者に投与するあらゆる装置が本発明において医療器具と考えられる。「直接的医療移植片（Ｄｉｒｅｃｔ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｉｍｐｌａｎｔ）」としては、限定されるものではないが、尿路カテーテル、血管内カテーテル、透析カテーテル、創傷ドレーンチューブ、皮膚の縫合糸、血管移植片、移植可能なメッシュ、眼内器具、移植可能な薬物送達システム、心臓弁等が含まれる。「創傷ケア用の器具」としては、限定されるものではないが、一般的な創傷被覆材、非接着性の包帯、熱傷用包帯、生体移植材料、テープ状の閉塞材（ｃｌｏｓｕｒｅ）及び包帯、手術用被布、スポンジ、並びに吸収性止血薬が含まれる。「手術器具」としては、限定されるものではないが、手術用具、内視鏡システム（すなわち、カテーテル、血管カテーテル、手術道具、例えばメス、開創器等）、及び媒体（ｍｅｄｉｕｍ）を投与するための薬物ポート、注射針等の一時的薬物送達デバイスが含まれる。
【００７３】
マトリックスメタロプロテイナーゼ−１（ＭＭＰ−１、別名：ＣＬＧ、ＣＬＧＮ、ＥＣ３．４．２４．７）は、線維芽細胞コラゲナーゼ、間質コラゲナーゼ、マトリックスメタロペプチダーゼ−１、又はマトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＨＧＮＣ：７１５５１；Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ：４３１２２；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０３９５６３；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１９６６１１７；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００２４２１）としても知られる。ＭＭＰ−１遺伝子は、Ｉ型、ＩＩ型、及びＩＩＩ型の間質コラーゲンを分解できる分泌型酵素をコードする。この遺伝子は、ヒト染色体１１ｑ２２．３に位置するＭＭＰ遺伝子クラスターの一部である。
【００７４】
マトリックスメタロプロテアーゼ−２（ＭＭＰ−２；別名：ＣＬＧ４、ＣＬＧ４Ａ、ＥＣ３．４．２４．２４、ＭＭＰ−ＩＩ、ＭＯＮＡ、ＴＢＥ−１）は、７２ｋＤａのゼラチナーゼ、ゼラチナーゼＡ、マトリックスメタロプロテイナーゼ−２、ＩＶ型コラゲナーゼタイプＡ、マトリックスメタロペプチダーゼ２、７２ｋＤａのＩＶ型コラゲナーゼ、又は好中球ゼラチナーゼ（ＨＧＮＣ：７１６６１；Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ：４３１３２；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０８２５３３；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ００００００８７２４５７）としても知られる。
【００７５】
本発明において、「メタロプロテアーゼ」又は「ＭＭＰ」とは、アミノ酸配列、構造ドメイン、及び重複した基質を共有するカルシウム依存性及び亜鉛依存性のエンドペプチダーゼファミリーを指す。これらの酵素はチモーゲンとして分泌され、そのタンパク質分解活性には活性化ペプチドの除去が必要である。ＭＭＰは、アグリカン、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ゼラチン、ラミニン等の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）及び基底膜の構成要素の分解に関与する。ＭＭＰがＥＣＭの構成要素を分解する能力は、細胞成長、細胞分裂、骨成長、創傷治癒、胚発生、及び脈管形成に不可欠である。ＭＭＰは、複数の異なるクラスに分けられる。これらはＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２等の数字で言及され、一般名でも言及される。ＭＭＰは、複数の構造的及び機能的特性を共有するが、基質特異性が異なる。ＭＭＰファミリーには少なくとも２５のメンバーがあり、そのドメイン構造及び高分子基質への優先性に基づいて分類される（Ｎｅｌｓｏｎ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，（２０００）．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１８，１１３５−１１４９；Ｗｏｅｓｓｎｅｒ，Ｊ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｎａｇａｓｅ，Ｈ．（２０００）．Ｍａｔｒｉｘ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ  ａｎｄ  ＴＩＭＰｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）。ほとんどのＭＭＰは、プロペプチドドメイン、触媒ドメイン、及びヘモペキシン／ビトロネクチン様ドメインを含む（上記Ｗｏｅｓｓｎｅｒ，Ｊ，Ｆ．，ａｎｄ  Ｎａｇａｓｅ，Ｈ．）。ＭＭＰファミリーには、ＭＭＰ−１（間質コトラゲナーゼ、コラゲナーゼ１）、ＭＭＰ−２（ゼラチナーゼＡ）、ＭＭＰ−３（ストロメライシン１）、ＭＭＰ−７（ｐｕｍｐ  １、マトリライシン）、ＭＭＰ−８（好中球コラゲナーゼ、コラゲナーゼ２）、ＭＭＰ−９（ゼラチナーゼＢ）、ＭＭＰ−１０（ストロメライシン２）、ＭＭＰ−１１（ストロメライシン３）、ＭＭＰ−１２（メタロエラスターゼ、マクロファージエラスターゼ）、ＭＭＰ−１３（コラゲナーゼ３）、５個の膜型ＭＭＰ（ＭＴ−ＭＭＰ）（ＭＭＰ−１４、ＭＭＰ−１５、ＭＭＰ−１６、ＭＭＰ−１７、ＭＭＰ−２１）、ＭＭＰ−１８（アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）コラゲナーゼ４）、ＭＭＰ−１９、ＭＭＰ−２０（エナメライシン）、ＭＭＰ−２２（ニワトリＣＭＭＰ）、ＭＭＰ−２３、ＭＭＰ−２４、ＭＭＰ−２５、ＭＭＰ−２６（エンドメターゼ（ｅｎｄｏｍｅｔａｓｅ））、ＭＭＰ−２７、及びＭＭＰ−２８（エピライシン（ｅｐｉｌｙｓｉｎ））が含まれる。ＭＭＰファミリーメンバーの番号付にはいくつかの重複がある。すなわち、後にＭＭＰ−４と命名されたテロペプチダーゼはＭＭＰ−３であり、３／４コラゲナーゼ（ＭＭＰ−５）はＭＭＰ−２であり、ＭＭＰ−６（酸メタロプロテイナーゼ）はＭＭＰ−３であることが示された。
【００７６】
本開示では、メタロプロテアーゼ全般又はＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２等のＭＭＰファミリーの任意の個々のメンバーへの言及は、その全てのスプライスバリアント、変異体（限定されるものではないが、欠失、挿入、又は多型又はアミノ酸置換を含む）、アイソフォーム、及びホモログを意味すると理解される。
【００７７】
本発明において、「修飾する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）」とは、アンタゴニストとして作用すること、すなわち、部分的に又は完全に阻害、低減、軽減、ブロック、又は防止すること；又は増加させるか刺激すること、すなわちアゴニストとして作用することを意味する。修飾は直接であってもよく、間接的であってもよい。
【００７８】
非コードアミノ酸としては、限定されるものではないが、α−アミノ酸、β−アミノ酸、γ−アミノ酸、δ−アミノ酸、及びω−アミノ酸が含まれ、任意のキラル原子においてＲキラリティーであってもＳキラリティーであってよい。非コードアミノ酸としては、コードアミノ酸のアイソマー、例えば、コードアミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸及びアロアミノ酸、例えばアロスレオニン及びアロイソロイシン、を含む）及び構造異性体（例えばβ−アラニンを含む）が含まれる。非コードアミノ酸にはＮ−メチル化アミノ酸も含まれる。一般的に、α−アミノ酸について特定の立体配置が示されていない場合、当業者は、アミノ酸はＬ−アミノ酸であると理解する。しかし、特定の実施形態では、非コードアミノ酸は、ラセミ混合物、非ラセミ混合物、及びジアステレオマー混合物の形態であってもよい。非コードアミノ酸は、ペプチド分野で周知であり、例えば、限定されるものではないが、Ｎ−アセチルセリン、α／／ｏ−イソロイシン、α／／ｏ−スレオニン、β−アラニン（３−アミノプロピオン酸）、α−アミノアジピン酸、２−アミノブタン酸、４−アミノブタン酸、３−アミノ−１−カルボキシメチルバレロラクタム、１−アミノシクロペンタンカルボン酸、６−アミノヘキサン酸、２−アミノヘプタン二酸、７−アミノヘプタン酸、２−アミノイソ酪酸、アミノメチルピロールカルボン酸、８−アミノ−３，６−ジオキサ−オクタン酸、アミノピペリジンカルボン酸、アミノセリン、アミノテトラヒドロピラン−４−カルボン酸、アゼチジンカルボン酸、ベンゾチアゾリルアラニン、ブチルグリシン、カルニチン、４−クロロフェニルアラニン、シトルリン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルスタチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、ジヒドロキシフェニルアラニン、ジメチルチアゾリジンカルボン酸、４−グアニル−フェニルアラニン、ホモアルギニン、ホモシトルリン、ホモシステイン、ホモフェニルアラニン、ホモプロリン、ホモセリン、４−ヒドラジノ安息香酸、４−ヒドロキシプロリン、イソニペコチン酸、メタノプロリン、ノルロイシン、ノルバリン、オルニチン、ｐ−アミノ安息香酸、ペニシラミン、フェニルグリシン、（９−ホスホセリン、ピペリジニルアラニン、ピペリジニルグリシン、ピロリジニルアラニン、サルコシン、スタチン、テトラヒドロピラングリシン、チエニルアラニン、［ｅｐｓｉｖ］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジンが含まれる。
【００７９】
ヒトＰＡＲファミリーには、その配列を参照により本明細書に援用するＰＡＲ−１（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ０１９６１６）；ＰＡＲ２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＸＭ＿００３６７１）；ＰＡＲ３（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００４１１０１）；及びＰＡＲ４（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３９５０．１）が含まれる。
【００８０】
ＰＡＲ−１すなわちプロテアーゼ活性化受容体１（別名：ＣＦ２Ｒ、ＨＴＲ２、ＰＡＲ１、又はＴＲ）は、当該技術分野でトロンビン受容体又は凝固第ＩＩ因子（トロンビン）受容体（ＨＧＮＣ：３５３７１；Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ：２１４９２；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ２５１１６３；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１８１１０４７）としても知られる。ヒトＰＡＲ−１ポリペプチド配列はＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１９８３であり、これを参照により本明細書に援用すると共に図９Ｂに示す。
【００８１】
本開示において、ＰＡＲファミリーメンバー全般又はＰＡＲ−１等のＰＡＲファミリーメンバーの任意の個々のメンバーへの言及は、その全てのスプライスバリアント、変異体（限定されるものではないが、欠失、挿入、又は多型又はアミノ酸置換を含む）、アイソフォーム、及びホモログを意味すると理解される。
【００８２】
本発明において、「患者」という用語は、任意の個々の生物を指す。例えば、生物は霊長類等の哺乳動物（すなわち、例えばヒト）であり得る。更に、生物は、飼われている動物（すなわち、例えばネコ、イヌ等）、家畜（すなわち、例えばウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ等）、又は実験動物（すなわち、例えばマウス、ウサギ、ラット、モルモット等）であり得る。
【００８３】
本発明において、「血小板活性化」とは、最終的に血小板凝集及び安定な止血栓又は「血栓」の形成につながる血小板機能の一連の変化を指す。血小板活性化は、例えばアテローム性プラークの破綻により生じる血管の損傷によって引き起こされ得る。その後、循環血小板が内皮組織及び種々の血小板活性化因子、例えばコラーゲン、トロンボキサン、又はＡＤＰに曝されると、血小板の代謝の生化学、形態、表面受容体、及び膜リン脂質の配向の変化、並びに血栓形成を生じる一連のイベントが開始される。
【００８４】
「薬学的に許容される」という語句は、本発明において、適切な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、又はその他の問題若しくは合併症がなく、合理的な利益／リスク比に見合った、ヒト及び動物の組織と接触する使用に適した化合物、材料、組成物、及び／又は剤形を指して使用される。
【００８５】
本発明において、「ｐｅｐｄｕｃｉｎリポペプチド」とは、受容体からＧタンパク質へのシグナル伝達の細胞内阻害剤として働く細胞透過性ペプチドである。ｐｅｐｄｕｃｉｎリポペプチドは、細胞内Ｇタンパク質共役受容体ループの脂質化断片を利用して、標的の細胞シグナル伝達経路におけるＧＰＣＲの作用を修飾する。ｐｅｐｄｕｃｉｎリポペプチド分子は、疎水性部分に繋ぎ止められたＧＰＣＲ細胞内ループに由来する短いペプチドを含む。この構造により、ｐｅｐｄｕｃｉｎリポペプチドは、細胞膜脂質二重層中にアンカーされ、固有の細胞内アロステリック機構を介してＧＰＣＲ／Ｇタンパク質界面を標的にすることができる。ｐｅｐｄｕｃｉｎリポペプチドの例は、その内容全体を参照により本明細書に援用する米国特許公開第２００７／０１７９０９０号に記載されている。
【００８６】
本発明において、「ペプチド」又は「ポリペプチド」という用語は、単一の「ポリペプチド」及び複数の「ポリペプチド」を含むことが意図され、アミド結合（ペプチド結合としても知られる）によって直鎖状に連結されたモノマー（アミノ酸）から構成される分子を指す。「ポリペプチド」という用語は、２つ以上のアミノ酸の任意の鎖を指し、特定の長さの産物を指すものではない。本発明において、「ペプチド」又は「ポリペプチド」は、天然の生物学的起源に由来してもよく、組換え技術によって作製されてもよいが、指定される核酸配列から翻訳される必要はない。「ペプチド」又は「ポリペプチド」は、化学合成等の任意の方法で作製され得る。この定義によれば、本発明で使用される「ペプチド」又は「ポリペプチド」のサイズは、約３以上、約５以上、約１０以上、約２０以上、約２５以上、約５０以上、約７５以上、約１００以上、約２００以上、約５００以上、約１，０００以上、又は約２，０００以上のアミノ酸であり得る。本発明のポリペプチドのアミノ酸の１又は複数は、例えば炭水化物基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、アシル基（例えばアセチル基）；コンジュゲーション、機能付与のためのリンカー；又はその他の保護／ブロック基等の化学的実体（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｅｎｔｉｔｙ）の付加によって、修飾され得る。好ましい実施形態では、ペプチドの修飾はペプチドをより安定にする（例えばインビボでの半減期が長い）。
【００８７】
本発明において、「ペプチド」又は「ポリペプチド」は、上記ポリペプチドの断片、誘導体、類似体、又はバリアント、及びその任意の組合せであり得る。ポリペプチドの断片は、この用語又は語句が本発明で使用される場合、タンパク質分解断片、及び欠失断片を含む。本発明に有用なポリペプチドのバリアントには、アミノ酸の置換、欠失、又は挿入によってアミノ酸配列が変化された断片及びポリペプチドが含まれる。バリアントは、天然に生じてもよく、非天然に生じてもよい。非天然バリアントは、当該技術分野で公知の突然変異誘発技術を用いて作製され得る。例としては、融合タンパク質、官能的側基の反応により化学的に誘導体化された１又は複数の残基を有するポリペプチド、及び２０個の標準アミノ酸の１又は複数の天然アミノ酸誘導体を含むペプチドが含まれる。これらの修飾には、ペプチドの環化、Ｄ−アミノ酸又はその他の非コードアミノ酸の導入も含まれる。どの修飾も、ペプチドの所望の生物学的活性を実質的に妨げるべきではない。
【００８８】
本発明において、「アテローム性プラークのサイズの減少」とは、処置開始前のアテローム性プラークのサイズと比べた、ＭＭＰ−１により仲介されるＰＡＲ−１シグナル伝達経路のアンタゴニストを用いた処置によるアテローム性プラークのサイズの減少を指す。減少が処置開始前のアテローム性プラークのサイズと比べて少なくとも又は少なくとも約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約１００％、約２００％、又は約５００％以上である場合、アテローム性プラークのサイズが減少しているものとする。
【００８９】
本発明において、静脈血栓塞栓症に対する「危険因子」としては、限定されるものではないが、がん、以前のＶＴＥ（ＤＶＴ／ＰＥ）、凝固性亢進（血餅の遺伝的素因）、手術、高齢（＞７０歳）、肥満（ＢＭＩ＞２９）、床上安静、又は長期の静止及び経口避妊薬、又はホルモン置換療法が含まれる。
【００９０】
本発明において、心筋梗塞、脳卒中、又はＰＡＤ（末梢動脈疾患）の「危険因子」としては、限定されるものではないが、高血圧、糖尿病、高コレステロール（高コレステロール血症に対する遺伝的素因を含む）、年齢（５５歳を超えると１０年毎にリスクは２倍になる）、脳卒中の家族歴、喫煙、経口避妊薬、心房細動、心不全、過度のアルコール、以前の脳卒中又は心臓発作、人種（例えば、アフリカ系アメリカ人は白人と比べて最初の脳卒中のリスクがほぼ２倍である）、及び性別（毎年、米国では男性よりも約４６，０００人多くの女性が脳卒中になる）が含まれる。
【００９１】
別の実施形態では、血栓症の「危険因子」は、プロテーゼ、例えば、限定されるものではないが、人工の心臓、肺、及びステント等の医療器具を体内に移植することで生じるリスクをも意味する。
【００９２】
本発明において、「小分子」及びその類似の用語は、限定されるものではないが、分子量が約１０，０００グラム／分子未満のペプチド、ペプチド模倣薬、アミノ酸、アミノ酸類似体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、その他の有機・無機化合物（すなわち、ヘテロ有機化合物及び有機金属化合物を含む）を含む。いくつかの実施形態では、この用語は、分子量が約５，０００グラム／分子未満、約１，０００グラム／分子未満、約５００グラム／分子未満、約１００グラム／分子未満の有機又は無機化合物を指す。そのような化合物の塩、エステル、及びその他の薬学的に許容される形態も包含される。
【００９３】
本発明において、「血栓溶解薬」とは、血栓溶解と名付けられた方法において血栓を溶解するために薬中で使用される薬物を指す。血栓溶解薬の非限定的な例としては、＃組織プラスミノーゲンアクチベーター−ｔ−ＰＡ−アルテプラーゼ（Ａｃｔｉｖａｓｅ）、レテプラーゼ（Ｒｅｔａｖａｓｅ）、テネクテプラーゼ（ＴＮＫａｓｅ）、アニストレプラーゼ（Ｅｍｉｎａｓｅ）、ストレプトキナーゼ（Ｋａｂｉｋｉｎａｓｅ、Ｓｔｒｅｐｔａｓｅ）、及びウロキナーゼ（Ａｂｂｏｋｉｎａｓｅ）が含まれる。
【００９４】
本発明において、「血栓性病態」とは、血栓症、すなわち血管の内側で血餅又は「血栓」を形成して循環系の血流が塞がれること、につながり得る患者の任意の医学的状態を指す。血栓症には、静脈血栓症及び動脈血栓症の２つの異なる形態がある。静脈血栓塞栓症（ＶＴＥ）は、深部静脈血栓症（ＤＶＴ）及び肺塞栓症（ＰＥ）からなり、静脈血栓症の例として胸郭出口症候群が挙げられる。動脈血栓症の例としては脳卒中、心発作、及び末梢動脈疾患が挙げられる。血栓塞栓障害の更なる例としては、限定されるものではないが、不安定狭心症、急性冠動脈症候群、心房細動、最初の心筋梗塞、再発性心筋梗塞、虚血性突然死、一過性脳虚血発作、脳卒中、アテローム性動脈硬化症、閉塞性末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、静脈血栓症、深部静脈血栓症、血栓性静脈炎、動脈塞栓症、冠動脈血栓症、大脳動脈血栓症、脳塞栓症、腎塞栓症、肺塞栓症；冠動脈インターベンション法、心臓手術、又は血管手術の後の血栓性再閉塞；及び医療移植片、医療器具、又は血栓症を促進する人工的表面に血液が曝される医学的手技により生じる血栓症が含まれる。「血栓性病態」は、限定されるものではないが、糖尿病、症候群Ｘ（メタボリックシンドローム）、がん等を含む全身性疾患から生じる循環器疾患も指す。
【００９５】
本発明において、「治療有効量」という用語は、研究者、獣医、医師、又はその他の臨床家が探求している組織、システム、動物、又はヒトにおいて生物学的又は医学的応答を惹起する活性化合物又は薬学的「薬剤」の量を意味する。
【００９６】
本発明において、「トロンビン依存性のＰＡＲ−１活性化」とは、４１位のアルギニン残基と４２位のセリン残基の間でＰＡＲ−１のＮ末端を切断するセリンプロテアーゼ（トロンビン又はプラスミン又はＡＰＣ等）によるＰＡＲ−１シグナル伝達の活性化を指す。
【００９７】
本発明において、「処置する」又は「処置」とは、哺乳動物、特にヒトにおける血栓性病態の処置を含み、限定されるものではないが、（ａ）哺乳動物において、特にその哺乳動物が病態の素因を有しているがまだ病態を有すると診断されていない時に、病態の発生を防止すること；（ｂ）病態を阻害すること、すなわちその発達を止めること；及び／又は（ｃ）病態を緩和すること、すなわち病態を後退させること、を含む。
【００９８】
本発明において、「血栓性病態を処置する」という用語は、血小板凝集を修飾すること、例えば、限定されるものではないが、血小板凝集の量を低減すること及び／又は血小板凝集を遅らせること、並びに血小板凝集を完全になくすこと及び／又は防止することを指す。血小板凝集を修飾することで処置することができる疾患及び／又は状態としては、限定されるものではないが、塞栓形成、血栓溶解性の合併症、血栓症、冠動脈心疾患、血栓塞栓性合併症、心筋梗塞、再狭窄、心房細動の心房血栓症誘発、慢性不安定狭心症、一過性の脳虚血発作及び脳卒中、末梢血管疾患、動脈血栓症、子癇前症、塞栓症、再狭窄、及び／又は血管形成術、頸動脈血管内膜切除術、移植血管の吻合、及び心血管装置への慢性的暴露の後の血栓症が含まれる。かかる状態は、血栓溶解療法の最中又は後、血管形成術の後、及び冠動脈バイパス術の後の血栓塞栓症及び再閉塞によっても生じ得る。
【実施例】
【００９９】
Ｉ  ＭＭＰ−１−ＰＡＲ−１シグナル伝達経路
Ｉ−（Ａ）コラーゲンはＰＡＲ−１を切断する活性型ＭＭＰ−１を血小板上に生じさせる
ヒト血小板はかなりの量のコラゲナーゼ活性を含み、これは種々のアゴニストに曝されることで放出され得る。主要な血小板コラゲナーゼであるＭＭＰ−１は他のアゴニストに対する凝集反応を刺激して細胞周辺へのβ３インテグリンの再分布を引き起こすことができると考えられる。血小板ＭＭＰ−１の凝集促進効果がＰＡＲ１受容体に仲介されているかを調べるために、一次（ｐｒｉｍａｒｙ）アゴニストであるコラーゲンで刺激した後と、二次的なメディエーターであるＡＤＰ及びトロンボキサンで刺激した後に、血小板表面上での内因性ｐｒｏＭＭＰ−１のｉｎ  ｓｉｔｕ活性化の量を測定した。
【０１００】
血小板ペレット及びその上清を以下のように調製した。タフツ・メディカル・センターのＩＲＢが、所定のインフォームド・コンセント手順後、２０名の健康なボランディアドナーに対して静脈切開術を行った。３．２％クエン酸ナトリウム溶液３ｍｌ（最終的に０．３２ｖ／ｖ％）を含む３０ｃｃのシリンジに装着した１８ゲージの針を用いて血液２７ｍｌを抜き取った。１ｍＭのＥＤＴＡ及び０．１Ｕ／ｍｌのアピラーゼ存在下で、セファロース２Ｂ（ファルマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）製）を含む改変ＰＩＰＥＳバッファー（２５ｍＭ  ＰＩＰＥＳ、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＫＣｌ、０．１％グルコース、ｐＨ６．６）を用いたゲル濾過により多血小板血漿（ＰＲＰ）から血小板を分離した。あるいは、Ｈａｒｔｌｅｙ  Ｓｐｒａｇｕｅモルモットから、１０Ｕ／ｍｌのヘパリンを含む３％シトラート中に全血を採った（大静脈から採血）。洗浄したモルモット血小板をＰＩＰＥＳバッファー中に調製した。改変ＰＩＰＥＳバッファーをブランクとしてＣｈｒｏｎｏｌｏｇ  ５６０ＶＳ／４９０−２Ｄ血小板凝集計を用いて血小板凝集を測定した。アゴニストを添加する前に、阻害剤及び１．８ｍＭのＣａＣｌ２の存在下でサンプルを５分間インキュベートした。全ての反応は、９００ｒｐｍで撹拌しながら最終体積２５０μｌ、３７℃で行った。
【０１０１】
次いで、上清中及び血小板溶解物中の活性型ＭＭＰ−１の酵素活性を測定した。７００ｇで２５分間、室温で遠心し、その後、１ｍＭのＥＤＴＡを含む０．２５倍体積のＰＩＰＥＳ中に再懸濁することにより、ヒト又はモルモットのＰＲＰから血小板を４倍に濃縮した（最終的な血小板数は１０９／ｍＬ）。血小板を、２．５ｍＭのＣａＣｌ２の存在下で、ＰＢＳ（バッファー）、２０μＭのＡＤＰ、２０μＭのＵ−４６６１９、又は２０μｇ／ｍｌのコラーゲンで処理した。血小板を、時々穏やかに混合しながら３７℃で１５分間インキュベートした。１０，０００ｇ、５分間、４℃で遠心し、溶解バッファー（５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＮａＦ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００、１００μＭ  ＰＭＳＦ、ｐＨ７．４）に懸濁し、その後、２７ゲージの針で剪断することで、血小板を回収した。
【０１０２】
図示するようにＡＰＭＡ活性化ＭＭＰ−１（図１Ａ、縞のバー）を対照として、３μＭのＦＮ−４３９、又はそれぞれ２０μｇ／ｍｌの対照ＩｇＧ、ＭＭＰ−１阻止抗体、ＭＭＰ−８阻止抗体、若しくはＭＭＰ−１３阻止抗体（３７℃で２時間プレインキュベート）の存在下又は非存在下で、ＤＱコラーゲンＩ（モレキュラー・プローブ社製）を蛍光発生基質及びコラゲナーゼ活性基質のレポーターとして用いて（Ｂｏｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）、上清中及び血小板溶解物中の活性型ＭＭＰ−１の酵素活性を測定した。ＡＰＭＡ活性化ＭＭＰ−１で作製した標準曲線（Ｂｏｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）及びコラゲナーゼ活性を１ミリリットル当たりのユニットで示す。１ユニットは、１分当たり１μｇのコラーゲンを分解するＭＭＰ−１の量である。
【０１０３】
血小板をコラーゲンで刺激すると、上清中に血小板コラゲナーゼ活性が放出される（図１Ａ）。ＭＭＰ−１阻害剤のＦＮ−４３９は、蛍光発生コラーゲン基質の切断を完全にブロックした。ＭＭＰ−１に対する阻止抗体も、コラーゲンによって放出される血小板コラゲナーゼ活性を完全に阻害し、２つの別のコラゲナーゼＭＭＰ−８及びＭＭＰ−１３に対する阻止抗体又はＩｇＧ対照は影響を与えなかった。しかし、ゲルろ過された血小板をＡＤＰ又はトロンボキサン模倣薬Ｕ−４６６１９で刺激すると、大部分のＭＭＰ−１コラゲナーゼ活性が血小板に結合したままとなった。
【０１０４】
１２，０００ｇで２分間溶解物を遠心することで、上記及び図１Ａに示すアゴニスト又はコンバルキシン（１μｇ／ｍｌ）で刺激した血小板（２５０，０００個／μｌ）からペレット及び上清を回収した。次いで、ＭＭＰ−１のプロドメインを認識する抗体を用いたＥＬＩＳＡにより、放出されたＭＭＰ−１プロドメイン及び血小板会合ＭＭＰ−１プロドメインの濃度を測定した（図１Ｂ）。洗浄した血小板をコラーゲンで処理するとｐｒｏＭＭＰ−１ドメイン（及び／又はｐｒｏＭＭＰ−１）が効率的に放出されたが、ＡＤＰ又はＵ−４６６１９で刺激した場合には放出されなかった。
【０１０５】
次いで、フローサイトメトリーにより、全血小板ＭＭＰ−１の表面発現を調べた（図１Ｃ；灰色の破線：二次抗体のみ；実線：記載濃度のコラーゲンで３７℃にて１５分間処理した後に一次抗体（ＡＢ８０６）及び二次抗体で染色した血小板のＦＡＣＳプロフィール）。ＦＡＣＳ分析により、休止血小板の表面上でＭＭＰ−１が発現しており、これがコラーゲンに曝されることで放出され得ることが確認された。ＧＰＶＩ／ＦｃγＲコラーゲン受容体の特異的リガンドであるレクチンコンバルキシンも、血小板表面からｐｒｏＭＭＰ−１ドメインを完全に放出させた（図１Ｂ）。したがって、コラーゲン原線維自体は血小板表面からのｐｒｏ−ＭＭＰ−１の放出に必須ではない。その他の強力な血小板アゴニストでもこの放出機構は作動し得る。
【０１０６】
血小板会合ｐｒｏＭＭＰ−１の結合部位の候補の１つはα２β１コラーゲン受容体である。ｐｒｏＭＭＰ−１が休止ヒト血小板中のインテグリンと会合するかどうかを決定するために、ゲル濾過した血小板由来の溶解物を４〜５μｇ／ｍｌの抗α２（Ｇｉ９又はＡＫ７）、抗β１（ＭＡＢ１９８７）、抗β３（ＭＡＢ１９５７）、抗ＧＰＶＩ（ＳＣ２０１４９）、抗ＧＰＩＢα（ＭＭ２／１７４）、又はマウスＩｇＧ対照と４℃で２〜４時間インキュベートした。プロテインＧセファロースを添加し、更に１時間インキュベートした。ビーズを回収し、２００ｍＭのＮａＣｌを添加した溶解バッファー中で４回洗浄した。１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより溶解物から血小板タンパク質を分離し、ＭＭＰ−１のＣ末端に対するポリクローナル抗体（ＡＢ８１０５）又はヒンジ領域に対するポリクローナル抗体（ＡＢ８０６）を用いてウェスタン解析を行った。どちらの抗体も同様な結果を示した。これらの共免疫沈降実験は、ｐｒｏＭＭＰ−１が血小板上のα２β１インテグリンと安定な複合体を形成することを示している（図１Ｄ参照）。以前の共焦点顕微鏡を用いた研究により示唆されたように、ＭＭＰ−１（主にｐｒｏ形態）もαＩＩｂβ３インテグリンと会合することが見出された。逆に、ｐｒｏＭＭＰ−１はＧＰＩｂα又はＧＰＶＩと会合しなかった。したがって、ｐｒｏＭＭＰ−１は休止血小板中のコラーゲン受容体及びフィブリノーゲン受容体の両方と予め会合すると考えられる。
【０１０７】
コラーゲンが血小板表面上のかなりの量の内因性ＭＭＰ−１コラゲナーゼ活性をどのように活性化することができるのかを更に理解するために、ＰＡＲ−１がコラーゲン暴露後にオートクリン様式又はパラクリン様式のいずれで切断されるのかを決定するための実験を組んだ。ＰＡＲ１のアミノ末端トロンビン切断ペプチド領域、残基３２〜４６、に対して産生されたモノクローナル抗体を用いて（Ｌｏｅｗ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）、トロンビン、ＭＭＰ−１、及びコラーゲンが血小板ＰＡＲ１の切断を生じさせる相対的能力を評価した。ゲル濾過した血小板を、０．０００１３Ｕのヒルジン又は５μＭのＦＮ−４３９の存在下又は非存在下（ＰＢＳバッファー）にて、トロンビン（３ｎＭ）、ＭＭＰ−１（３ｎＭ）、コラーゲン（５μｇ／ｍｌ）を用いて３７℃で１０分間処理した。上清を２０倍に濃縮し、ニトロセルロース膜にアプライした後、ＩＩａＲ−Ａモノクローナル抗体を用いて探索した。ＰＡＲ１のＮ末端トロンビン切断ペプチド（Ａ２６−Ｒ４１）及びＰＡＲ１可動性リンカーペプチド（Ｎ−アセチル−Ｔ６７−Ｌ８４−Ｃ）（Ｋｕｌｉｏｐｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９）をそれぞれポジティブコントロール及びネガティブコントロール（１００ｎｇ）とした。図１Ｅに示されるように、血小板をトロンビン又はＭＭＰ−１とインキュベートすることで、ＰＡＲ１のＮ末端切断ペプチドを上清中に放出させることができ、これはそれぞれヒルジン又はＦＮ−４３９でブロックされた。
【０１０８】
ＭＭＰ−３及びＭＭＰ−７がＰＡＲ１のＮ末端ペプチドを放出させるかどうかを決定するために、ゲル濾過したヒト血小板を、ＡＰＭＡ透析バッファー、又はＡＰＭＡにより活性化されたＭＭＰ−３（ケミコン社（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）製、３ｎＭ）、ＭＭＰ−７（ケミコン社製、３ｎＭ）、若しくはＭＭＰ−１（バイオモル社（Ｂｉｏｍｏｌ）製、３ｎＭ）で１０分間処理した。血小板のペレット及び上清を前述したように分離した。上清を２０倍に濃縮し、ニトロセルロース膜にアプライした後、ＩＩａＲ−Ａモノクローナル抗体を用いて探索して、切断されたＰＡＲ−１ペプチドを検出した。図１Ｆに示されるように、ＭＭＰ−３及びＭＭＰ−７は、処理された血小板からＰＡＲ１のＮ末端ペプチドを放出させることができなかった（図１Ｆ）。
【０１０９】
ＭＭＰ−１の役割を実証するために、ゲルろ過した血小板をＩｇＧ（２０μｇ／ｍｌ）又はＭＭＰ−１阻止抗体（２０μｇ／ｍｌ）と３７℃で２時間プレインキュベートした。次いで、これらの血小板をコラーゲン（５μｇ／ｍｌ）を用いて３７℃で１０分間刺激した。上清を２０倍に濃縮し、ニトロセルロース膜にアプライした後、ＩＩａＲ−Ａモノクローナル抗体を用いて探索した。図１Ｇに示されるように、休止血小板をコラーゲンで処理するとＮ末端ペプチドが放出された。この放出は、ＭＭＰ−１阻害剤であるＦＮ−４３９又はＭＭＰ１阻止抗体（２０μｇ／ｍｌ）とインキュベートすることで特異的にブロックされたが、トロンビン阻害剤ヒルジンではブロックされなかった。（図１Ｅ、図１Ｇ参照）。
【０１１０】
ゲルろ過した血小板を種々の濃度のＡＤＰ（０．３〜３０ｎＭ）、Ｕ４６６１９（０．３〜３０ｎＭ）を用いて３７℃で１０分間処理した後、コラーゲン（５μｇ／ｍｌ）と３７℃で１０分間インキュベートした結果、低い効率ではあるがＡＤＰ及びＵ４６６１９もＰＡＲ１のＮ末端ペプチドを放出させることができることが示された（図１Ｈ参照）。
【０１１１】
一方、ゲルろ過した血小板を、ＡＲＣ（０．５μＭ）又はアスピリン（ＡＳＡ、１ｍＭ、３０分間プレインキュベーション）の存在下又は非存在下（ＰＢＳバッファー）にて３７℃でコラーゲン（５μｇ／ｍｌ）を用いて１０分間処理しても、ＰＡＲ１のＮ末端ペプチドは放出されなかった（図１Ｉ参照）。したがって、ＡＲ−Ｃ６９９３１ＭＸ（ＡＲＣ）によるＰ２Ｙ１２  ＡＤＰ受容体のブロック又はアスピリン（ＡＳＡ）によるトロンボキサンのブロックは、コラーゲン依存性のＰＡＲ１Ｎ末端ペプチド放出に影響を与えなかった（図１Ｉ参照）。
【０１１２】
総合すると、これらのデータは、内因的に生じたＭＭＰ−１コラゲナーゼ活性がトロンビンとは独立してヒト血小板表面上のＰＡＲ１を切断できることの直接的証拠となる。
【０１１３】
Ｉ−（Ｂ）ＰＡＲ１上のＭＭＰ−１切断部位の同定
トロンビン、プラスミン、ＡＰＣ等のセリンプロテアーゼがＰＡＲ１をＬＤＰＲ４１↓Ｓ４２ＦＬ（Ｐ４Ｐ３Ｐ２Ｐ１↓Ｐ１’Ｐ２’Ｐ３’）で直接加水分解してＳ４２ＦＬＬＲＮテザーリガンド（ＴＲＡＰ）を生成し、これが細胞内形態のＰＡＲ１を活性化することが複数の研究により示されている（Ｋｕｌｉｏｐｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｌｏｅｗ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｐａｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｓｅｅｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｖｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）。しかし、ＭＭＰ−１等のマトリックスメタロプロテアーゼは一般的にＰ１’部位に疎水性アミノ酸を、Ｐ２’に塩基性又は疎水性アミノ酸を、Ｐ３’に小残基（アラニン、グリシン、又はセリン）を好む（Ｎｅｔｚｅｌ−Ａｒｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｔｕｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。したがって、ＭＭＰ−１はＲ４１↓Ｓ４２ＦＬトロンビン部位で効率的に切断しない可能性がある。ＭＭＰ−１切断部位を決定するために、ＰＡＲ１のＮ末端ドメインに相当する２６アミノ酸ペプチド（ＴＲ２６、ＰＡＲ１の残基３６〜６１）を合成した（図２Ａ〜Ｂ）。トロンビン切断部位領域及び隣接領域を含む合成２６マーペプチドＴＲ２６（Ａ３６−Ｓ６１）又はＴＲ２６−Ｐ４０Ｎ（Ａ３６−Ｋ６１）を、１０ｎＭのトロンビン、１０ｎＭのＭＭＰ−１（ＡＰＭＡで活性化したもの、ヒト線維芽細胞から精製）、又はＰＢＳバッファーと３７℃で１０分間インキュベートした。、記載されているようにペプチド切断混合物をＲＰ−ＨＰＬＣによって分離しＭＡＬＤＩ−質量分析により切断産物を同定した（Ｋｕｌｉｏｐｕｌｏｓ  １９９９）。ＴＲ２６ペプチドとトロンビンのインキュベーションは、質量分析による測定で、予想された切断ペプチドＴＲ２０（残基４２〜６１）を生じた。一方、ＴＲ２６ペプチドとＭＭＰ−１のインキュベーションは、ＰＡＲ１残基４０〜６１に相当するＴＲ２２を生じた（図２Ａ〜Ｂ）。このことは、ＭＭＰ−１が、トロンビン切断部位Ｒ４１−Ｓ４２から２アミノ酸残基分Ｎ末端側にある部位のＬＤ３９↓Ｐ４０ＲＳＦＬでＰＡＲ１細胞外ドメインを切断することを示している。
【０１１４】
全長受容体中におけるこの推定ＭＭＰ−１切断部位の位置を検証するために、ＭＭＰ−１切断部位及びトロンビン切断部位の両方の重要なＰ１’残基を変異させた。
【０１１５】
ＭＭＰ−１による切断を阻害するために、推定Ｐ１’プロリンをアスパラギンで置換した（Ｐ４０Ｎ  ＰＡＲ１）。この置換は、α１コラーゲンペプチドの切断を１０％未満にまで減少させることが以前に示されている（Ｂｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。トロンビンによるタンパク質分解を阻害するために、トロンビン切断部位のＰ１’セリンをアスパラギン酸に変異させた（Ｓ４２Ｄ  ＰＡＲ１）。この変異はトロンビンによる切断を抑制すると予想されている（Ｃｈａｎｇ，１９８５）。ヒトＰＡＲ１を以前に報告されているようにｐｃＤＥＦ３にクローニングし（Ｋｕｌｉｏｐｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）、全ての変異体の作製に用いた。ＰＡＲ１変異体Ｐ４０Ｎ及びＳ４２Ｄを、Ｑｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（ストラタジーン社製）を用いて作製し、シークエンシングを行って突然変異誘発のフィデリティーを検証した。次いで、Ｔ７タグ化受容体の切断率に対するこれらの変異の影響を測定した。
【０１１６】
図２Ｄでは、Ｔ７でタグ化したＷＴ、Ｐ４０Ｎ、又はＳ４２Ｄ  ＰＡＲ１で一過性にトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞を、０．３〜３０ｎＭのトロンビン（図２Ｃ）又はＡＰＭＡ活性化ＭＭＰ−１と共にＰＢＳ中で３７℃にて３０分間インキュベートした。
【０１１７】
図２Ｇでは、Ｔ７でタグ化したＷＴ、Ｐ４０Ｎ、又はＳ４２Ｄ  ＰＡＲ１で一過性にトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞を、０．３〜１０ｎＭのＡＰＭＡ活性化ＭＭＰ−１（バイオモル社製、カタログ番号ＳＥ３６１）と共にＰＢＳ中で３７℃にて３０分間インキュベートした。
【０１１８】
図２Ｈ〜２Ｊでは、Ｔ７でタグ化したＰＡＲ−２、ＰＡＲ−３、及びＰＡＲ−４で一過性にトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞を、０．３〜１０ｎＭのトロンビン（ＰＡＲ３又はＰＡＲ４に対して）若しくは０．３〜１０ｎＭのトリプシン（ＰＡＲ２に対して）又はＡＰＭＡ活性化ＭＭＰ−１と共にＰＢＳ中で３７℃にて６０分間インキュベートした。以前に記載されているようにフローサイトメトリーによってＴ７エピトープの消失を解析した（Ｂｏｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ，２００５；Ｋｕｌｉｏｐｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。
【０１１９】
その結果、Ｐ４０Ｎ  ＰＡＲ１変異体はトロンビンでは完全に切断されたが、２つの独立したＭＭＰ−１供給元によるＭＭＰ−１ではほとんど切断されなかった（図２Ｃ〜Ｄ、図２Ｇ）。逆に、Ｓ４２Ｄ  ＰＡＲ１変異体はＭＭＰ−１ではかなり切断されたが、トロンビンではほとんど切断されなかった。変異体ＴＲ２６−Ｐ４０Ｎペプチドの切断においても同じ結果が見られ、このペプチドはトロンビンによってＲ４１−Ｓ４２結合で切断されたがＭＭＰ−１では切断されなかった（図２Ａ）。機能的研究により、トロンビン及びＭＭＰ−１に対するＰ４０Ｎ及びＳ４２Ｄ変異体の相対的切断特異性を検証した。
【０１２０】
次いで、トロンビン又はＭＭＰ−１の存在下で種々のＰＡＲ−１変異体のＲｈｏＡシグナル伝達レベルを測定した（図２Ｅ参照）。Ｔ７でタグ化したＷＴ、Ｓ４２Ｄ、又はＰ４０Ｎ  ＰＡＲ１で４８時間一過性にトランスフェクトされたＭＣＦ−７細胞を、１０ｎＭのトロンビン、１０ｎＭのＭＭＰ−１、又はＰＢＳバッファーを用いて３７℃で１５分間刺激した。血小板溶解物中に存在するＲｈｏ−ＧＴＰ（平均値±ＳＤ、ｎ＝３）を、記載されているように（Ｋａｎｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−ｒｈｏｔｅｋｉｎ−還元型グルタチオン−アガロースビーズを用いて沈殿させ、抗ＲｈｏＡ（２６Ｃ４  Ａｂ）モノクローナル抗体を用いたウェスタンブロットによりＲｈｏ−ＧＴＰを測定した。血小板溶解物も別のゲルで流し、抗ＲｈｏＡでイムノブロットを行い、全ＲｈｏＡを評価した。
【０１２１】
図２Ｆに示されるように、トロンビン切断部位変異体及びＭＭＰ−１切断部位変異体を発現するＭＣＦ−７細胞の走化性移動も評価した。ＰＡＲ１切断変異体でトランスフェクトしたＭＣＦ−７細胞を、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ装置（８μｍの細孔）中で３ｎＭのトロンビン又は３ｎＭのＭＭＰ−１を含むＤＭＥＭ／０．１％ＢＳＡ（バッファー）に向かって一晩移動させた。膜の底側に移動した細胞を計測し、ＷＴ  ＰＡＲ１及びトロンビンに対する相対率で表した。
【０１２２】
トロンビンは、Ｐ４０Ｎ変異体を発現するＭＣＦ−７細胞中でＲｈｏシグナル伝達及び走化性移動を完全に活性化することができたが、Ｓ４２Ｄ変異体に対する活性は本質的になかった（図２Ｅ〜Ｆ）。逆に、ＭＭＰ−１は、Ｓ４２Ｄ変異体を発現するＭＣＦ−７細胞におけるＲｈｏシグナル伝達及び走化性を誘導することができたが、Ｐ４０Ｎ変異体に対してはほとんど活性がなかった。比較すると、０．３〜１０ｎＭのＭＭＰ−１では、ＣＯＳ７細胞上で発現されたＴ７タグ化ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、又はＰＡＲ４の切断は検出されなかった（図２Ｈ〜２Ｊ）。総合すると、これらの切断及びシグナル伝達データは、ＭＭＰ−１が、ＬＤＰＲ４１↓Ｓ４２ＦＬトロンビン切断部位ではなくＬＤ３９↓Ｐ４０ＲＳＦＬで切断することで、ＰＡＲ１を特異的に活性化し、他のＰＡＲは切断しないことを示している。
【０１２３】
Ｉ−（ｃ）ＭＭＰ−１により生成されるテザーリガンドによるＰＡＲ１シグナル伝達の活性化
ＭＭＰ−１によるＬＤ↓Ｐ４０ＲＳでのＰＡＲ１の切断は、トロンビンにより生じるものよりも長いテザーリガンドＰ４０ＲＳＦＬＬＲＮ−を生成する。ＭＭＰ−１により生成されるテザーリガンドがＰＡＲ１を活性化することができることの更なる証拠を得るために、合成ペプチドＰＲ−ＳＦＬＬＲＮ（ＰＲ−ＴＲＡＰ）がＰＡＲ１シグナル伝達を刺激する能力を試験した。
【０１２４】
図３Ａに示されるように、血小板中におけるＰＡＲ１依存性ＲｈｏＡ活性化に対するＰＲＳＦＬＬＲＮペプチド（ＰＲ−ＴＲＡＰ）の影響を測定した。０．３ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲンを添加したゲル濾過ヒト血小板を、１μＭのＲＷＪ−５６１１０存在下又は非存在下で、０．２％ＤＭＳＯビヒクル又は３０μＭのＳＦＬＬＲＮ（ＴＲＡＰ）、ＰＲ−ＴＲＡＰ、若しくは逆方向ペプチド（ＲＰ−ＴＲＡＰ）を用いて３７℃で５分間処理した。実験方法に記載したように、血小板を溶解させ、Ｒｈｏ−ＧＴＰ及び全Ｒｈｏをウェスタン解析によって調べた。ウェスタンのバンドをデンシトメトリーで定量し、結果を基準に対する倍率で表した。
【０１２５】
図３Ｂでは、血小板中のｐ３８ＭＡＰＫに対するＰＲＳＦＬＬＲＮペプチド（ＰＲ−ＴＲＡＰ）の影響を測定した。記載されている種々の濃度のＰＲ−ＴＲＡＰ、ＲＰ−ＴＲＡＰ、又はＴＲＡＰを用いて血小板を３７℃で５分間刺激した。Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファーを用いて血小板を溶解し、リン酸化部位特異的ｐ３８ＭＡＰＫ抗体又は全ｐ３８ＭＡＰＫ抗体を用いたｐ３８ＭＡＰＫ活性のウェスタンブロットによりタンパク質を評価した。
【０１２６】
図３Ｃでは、ＰＲＳＦＬＬＲＮペプチド（ＰＲ−ＴＲＡＰ）が血小板の形態変化を誘導する能力を求めた。洗浄したヒト血小板を２ｍＭのＥＧＴＡで前処理し、その後、１１００ｒｐｍで撹拌しながら、１μＭのＲＷＪ−５６１１０の存在下又は非存在下で記載されているアゴニストで処理した。光透過率の低下を血小板形態変化反応の指標とした。
【０１２７】
結果は、ＰＲ−ＴＲＡＰが血小板中におけるＰＡＲ１依存性のＲｈｏシグナル伝達及びｐ３８ＭＡＰＫシグナル伝達の完全なアゴニストであることを示している（図３Ａ〜Ｂ）。ＰＡＲ１アンタゴニストＲＷＪ−５６１１０を添加すると、ＰＲ−ＴＲＡＰにより誘導されるシグナル伝達が完全にブロックされた。ＰＲ−ＴＲＡＰリガンドはまた、Ｇ１２／１３−Ｒｈｏシグナル伝達により仲介される血小板活性化の重要な初期イベントである血小板形態変化（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｏｆｆｅｒｍａｎｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）を活性化した（図３Ｃ参照）。ここでも、ＰＲ−ＴＲＡＰにより誘導される血小板形態変化はＰＡＲ１アンタゴニストＲＷＪ−５６１１０によって完全にブロックされた（図３Ｃ）。
【０１２８】
隣接するペプチド結合での推定される切断により生じる２つのその他のペプチド、すなわち、ＬＤＰ４０↓Ｒ４１ＳＦＬＬＲＮでの切断に対応するＲ−ＴＲＡＰペプチド及びＬ３８↓Ｄ３９ＰＲＳＦＬＬＲＮでの切断に対応するＤＰＲ−ＴＲＡＰペプチド（図２Ｂ）をアゴニスト活性について試験した。Ｒ−ＴＲＡＰペプチドはＰＡＲ１依存性の血小板形態変化に対するアゴニスト活性を一部維持していたが、ＤＰＲ−ＴＲＡＰペプチドは活性をほとんど有さなかった（図３Ｃ）。同様に、最初の２個のアミノ酸残基を逆向きにした対照ペプチドＲＰ−ＴＲＡＰも、Ｒｈｏ又はｐ３８ＭＡＰＫを刺激せず、血小板形態変化も刺激しなかった。（図３Ａ〜Ｃ）。
【０１２９】
外部から添加したＭＭＰ−１が血小板中のＰＡＲ１依存性シグナル伝達を活性化する能力も確認した。
【０１３０】
図４Ａでは、血小板中のＲｈｏ−ＧＴＰに対するＭＭＰ−１の影響を測定した。ゲル濾過したヒト血小板を、記載されているように３ｎＭのトロンビン又は３ｎＭのＡＰＭＡ活性化ＭＭＰ−１に３７℃で５分間曝し、Ｒｈｏ−ＧＴＰ及び全Ｒｈｏを前述のように測定した。
【０１３１】
図４Ｂでは、ＭＭＰ−１が血小板の形態変化を誘導する能力を測定した。洗浄したヒト血小板を２ｍＭのＥＧＴＡで前処理し、その後、１１００ｒｐｍで撹拌しながら１μＭのＲＷＪ−５６１１０の存在下又は非存在下でＭＭＰ−１に曝した。前述したように形態変化を測定した。
【０１３２】
図４Ｃでは、ＭＭＰ−１によるＰＡＲ１依存性カルシウム流動の誘導を測定した。記載されているように（Ｋｕｌｉｏｐｕｌｏｓ，１９９９）、ゲル濾過した血小板をＲＷＪ−５６１１０の存在下又は非存在下でＭＭＰ−１に曝した後のカルシウム流動測定を２５℃で行い、３４０ｎｍ及び３８０ｎｍの二重励起で５１０ｎｍの発光を記録した。
【０１３３】
図４Ｄでは、ＭＭＰ−１による血小板凝集の誘導を測定した。ゲルろ過した血小板を、ＰＡＲ１阻害剤である１μＭのＲＷＪ−５６１１０の存在下又は非存在下（０．２％ＤＭＳＯビヒクル）でＭＭＰ−１に暴露した。
【０１３４】
最後に、図４Ｅ〜４Ｆでは、ＭＭＰ−１により誘導される血小板のＰＡＲ１依存性ＭＡＰＫシグナル伝達を測定した。ゲルろ過した血小板を、図４Ａと同様に、記載されている濃度のトロンビン（Ｔｈｒ）又はＭＭＰ−１に５分間暴露し、ｐ３８ＭＡＰＫ（図４Ｅ）又は下流のＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２（図４Ｆ）の活性化をそれぞれリン酸化ｐ３８ＭＡＰＫ抗体又はリン酸化ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２抗体を用いたウェスタンブロットのデンシトメトリーにより定量した。ブロットをｐ３８ＭＡＰＫ又はＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２で再検出することで各レーンのローディング量が等しいことを確認した（データ示さず）。
【０１３５】
結果は、ＭＭＰ−１（３ｎＭ）が等モル濃度のトロンビンと同じ程度にＲｈｏ−ＧＴＰ活性を刺激できることを示している（図４Ａ）。ＭＭＰ−１は、血小板の形態変化、カルシウム移動、及び凝集を惹起することもでき、これはＰＡＲ１アンタゴニストＲＷＪ−５６１１０によって阻害された（図４Ｂ〜Ｄ）。外部から添加したＭＭＰ−１も、リン酸化ｐ３８ＭＡＰＫ及びその基質ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２を活性化し、その活性特性はトロンビンと同様であった（図４Ｅ〜Ｆ）。ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２は、細胞骨格の再構築に関与する小さなヒートショックタンパク質ＨＳＰ２７をリン酸化すること（Ｓｕｎｄａｒｅｓａｎ  ａｎｄ  Ｆａｒｎｄａｌｅ，２００２）から、ＭＭＰ−１が、血小板形態変化につながる初期のイベントにおいて役割を果たしていること及び血小板の凝集刺激を促進することが更に示唆される。
【０１３６】
Ｉ−（Ｄ）コラーゲンはＭＭＰ−１−ＰＡＲ１を介してｐ３８ＭＡＰＫシグナル伝達、Ｒｈｏ活性化、及び血小板凝集を引き起こす
次いで、コラーゲン依存性血小板凝集に対するメタロプロテアーゼ又はＰＡＲ１の薬理学的遮断の影響を調べた（図５参照）。健常固体に由来するゲルろ過血小板（０．３ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲンを補充）を、図示した阻害剤の存在下又は非存在下（０．２％ＤＭＳＯビヒクル）で５μｇ／ｍｌのコラーゲンに暴露し、血小板凝集計キュベット（２５０μｌ）中で３７℃、９００ｒｐｍで撹拌させた。血小板を、トロンビン阻害剤ＰＰＡＣＫ（２００μＭ）又はヒルジン（１Ｕ／ｍｌ）、Ｚｎキレート剤１，１０−フェナントロリン（１，１０−ＰＡ；１００μＭ）、メタロプロテアーゼ広域阻害剤ＭＭＰ−２００（２００ｎＭ）、ＭＭＰ−１阻害剤ＦＮ−４３９（３μＭ）、ＰＡＲ１リガンド結合部位阻害剤ＲＷＪ−５６１１０（１μＭ）、ＰＡＲ１阻止抗体（７５μｇ／ｍｌ）、ＰＡＲ１ｐｅｐｄｕｃｉｎリポペプチドＰ１ｐａｌ−１２（３μＭ）若しくはＰ１ｐａｌ−７（３μＭ）、ＰＡＲ４ｐｅｐｄｕｃｉｎリポペプチドＰ４ｐａｌ−１０（３μＭ）、ＭＭＰ−８阻害剤（２５ｎＭ）、又はＭＭＰ９／１３阻害剤（１０ｎＭ）と５分間プレインキュベートした。
【０１３７】
図５Ａでは、血小板凝集を光透過率によってモニタリングした。
【０１３８】
図５Ｂでは、血小板を図５Ａと同様に処理し、その後、コラーゲン添加後、Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファーで５分間溶解した。次いで、ｐ３８ＭＡＰＫリン酸化型特異的抗体を用いたウェスタンブロットによってｐ３８ＭＡＰＫ活性を評価し、ｐ３８ＭＡＰＫ抗体を用いて全ｐ３８ローディング量を測定した。
【０１３９】
図５Ｃでは、血小板を図５Ｂと同様に処理し、その後、ＲｈｏＧＴＰ活性をウェスタンブロットによって評価した。
【０１４０】
図５Ｄでは、図示されているように、血小板を種々の阻止抗体で２時間、又は阻害剤（ＡＲＣ：０．５μＭ  Ｐ２Ｙ１２アンタゴニストＡＲ−Ｃ６９９３１ＭＸ；ＡＳＡ：１ｍＭアスピリン、３０分間）で前処理し、図示されているように５μｇ／ｍｌのコラーゲン、１０ｎＭのＭＭＰ−１（カルビオケム社）、又は第２の供給元からの１０ｎＭのＭＭＰ−１（Ｓ２、バイオモル社製）のいずれかで刺激し、図５Ｃと同様にＲｈｏ−ＧＴＰ活性を評価した。代表的なブロットを図５Ｂ〜Ｄの最下部に示す。データは３回の実験の平均値±ｓ．ｄ．である。Ｐ＊＜０．０１、＃＜０．０５。
【０１４１】
図５Ｅでは、血小板を、種々の濃度のＰ１ｐａｌ−７（図中では「ＰＺ−１２８」として表す。Ｐ１ｉ３ｐａｌ−７としても知られる）を含む０．２％ＤＭＳＯビヒクルで前処理し、記載されているようにＳＦＬＬＲＮ、コラーゲン、ＡＤＰ、及びリストセチンで活性化した。アゴニスト添加後７〜１５分における最大点で凝集率を定義した。
【０１４２】
結果は、可溶性Ｉ型線維性コラーゲンが５μｇ／ｍｌをＥＣ５０として血小板凝集を刺激することを示している。亜鉛キレート剤１，１０−フェナントロリンを用いてメタロプロテアーゼを阻害すると、５μｇ／ｍｌのコラーゲンに対して凝集が８０％低減された（図５Ａ）。同様に、メタロプロテアーゼの広域ヒドロキサマート阻害剤ＭＭＰ−２００（ＩＣ５０は、ＭＭＰ−１に対しては７ｎＭ、ＭＭＰ−２に対しては２．３ｎＭ、ＭＭＰ−３に対しては１３５ｎＭ、ＭＭＰ−７に対しては１０〜１００ｎＭ、ＭＭＰ−１３に対しては１〜１０ｎＭ）は、コラーゲンにより開始される凝集を有意に５０〜６０％阻害した。ＭＭＰ−１阻害剤であるＦＮ−４３９を用いた処理は、コラーゲンにより誘導される凝集をＭＭＰ−２００と同じ程度に阻害した。逆に、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、及びＭＭＰ−１３に対する阻害剤はコラーゲンにより誘導される凝集に何ら影響しなかった（データ示さず）。特異的なトロンビン阻害剤ヒルジン又は広域セリンプロテアーゼ阻害剤ＰＰＡＣＫは、コラーゲンの凝集に何ら影響しなかった（図５Ａ）。ＰＡＲ１を３つの直交的アプローチで阻害してコラーゲン依存性凝集へのＰＡＲ１の寄与を評価した。小分子阻害剤ＲＷＪ−５６１１０又はＰＡＲ１阻止抗体はコラーゲン（５μｇ／ｍｌ）により誘導される凝集を５０％低減した。これはＭＭＰ−１阻害剤と同程度であった。同様に、細胞内Ｇタンパク質へのＰＡＲ１シグナル伝達を阻害する細胞透過性ＰＡＲ１ｐｅｐｄｕｃｉｎリポペプチドであるＰ１ｐａｌ−１２及びＰ１ｐａｌ−７（Ｐ１ｉ３ｐａｌ−７としても知られる）（Ｂｏｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｃｏｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ａ；Ｋａｎｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）は、ＭＭＰ−１のブロックと同レベルに阻害した（図５Ａ及び５Ｅ）。Ｐ４ｐａｌ−１０ｐｅｐｄｕｃｉｎリポペプチド（３μＭ）を用いたＰＡＲ４トロンビン受容体の阻害はコラーゲンにより誘導される凝集にほんのわずかに影響（約１０％）を与えた（図５Ａ）。
【０１４３】
コラーゲンは、ヒト血小板中で未知の機構によりｐ３８ストレス活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）経路を誘導することが知られている（Ｋｕｌｉｏｐｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｓｕｎｄａｒｅｓａｎ  ａｎｄ  Ｆａｒｎｄａｌｅ，２００２）。図５Ｂに示すように、コラーゲンを添加するとｐ３８ＭＡＰＫが強力にリン酸化される。コラーゲン（５μｇ／ｍｌ）により誘導されるリン酸化ｐ３８ＭＡＰＫシグナルは、ＰＡＲ１阻害剤及びＭＭＰ−１によって効率的にブロックされたが、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９／１３、又はトロンビンの阻害剤ではブロックされなかった。コラーゲン依存性のｐ３８ＭＡＰＫ基質ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２の活性化もＰＡＲ１及びＭＭＰ−１の両方に依存する。リン酸化ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２のコラーゲンによる活性化は、ＰＡＲ１アンタゴニストＲＷＪ−５６１１０、Ｐ１ｐａｌ−７、及びＦＮ−４３９ではブロックされたが、ＭＭＰ８阻害剤ではブロックされなかった（データ示さず）。
【０１４４】
コラーゲンがＭＭＰ１−ＰＡＲ１経路を介してＲｈｏ−ＧＴＰ活性を刺激する能力についても調べた。コラーゲンはＲｈｏ−ＧＴＰを強く活性化し、これはＰＡＲ１及びＭＭＰ−１のアンタゴニストで７５％低減されたが、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９／１３、又はトロンビンの阻害剤又は阻止抗体ではブロックされなかった（図５Ｃ〜Ｄ）。
【０１４５】
しかし、血小板の完全な凝集を惹起するのに十分な飽和レベルのコラーゲン（２０μｇ／ｍｌ）では、ＰＡＲ１阻害剤及びＭＭＰ−１阻害剤のいずれも、コラーゲン依存性の凝集、リン酸化ｐ３８ＭＡＰＫシグナル、又はＲｈｏ−ＧＴＰ活性に対して大きな影響を及ぼさなかった（≦２５％；データ示さず）。このことは、ＭＭＰ１−ＰＡＲ１経路がＥＣ５０を超えるレベルのコラーゲンでは迂回され得ることを示している。
【０１４６】
この観察されたＭＭＰ−１の効果がコラーゲン刺激後のＡＤＰ又はトロンボキサンの二次的分泌によるものであるかどうかを調べるために、Ｐ２Ｙ１２  ＡＤＰ経路及びトロンボキサン経路をそれぞれＡＲＣ及びアスピリン（ＡＳＡ）で阻害した（図５Ｄ）。ＡＲＣ又はアスピリンによる血小板の処理は、５若しくは２０μｇ／ｍｌのコラーゲン又は１０ｎＭのＭＭＰ−１がＲｈｏ−ＧＴＰを活性化する能力（図５Ｄ、５Ｅ、及び５Ｈ）又はリン酸化ｐ３８ＭＡＰＫを活性化する能力に影響を与えなかったが、これらの阻害剤はコラーゲンに対する凝集は抑制することができた（図５Ｅ、５Ｇ、及び５Ｈ）。一方、ＭＭＰ１−ＰＡＲ１経路の遮断は、５μｇ／ｍｌのコラーゲンに対して、ｐ３８及びＲｈｏ−ＧＴＰの活性化をほぼ完全に阻害した（図５Ｂ〜Ｄ）。このことは、ＥＣ５０コラーゲン暴露では、ＭＭＰ１−ＰＡＲ１がｐ３８及びＲｈｏ−ＧＴＰの活性化に必須であり且つ凝集に重要であるが、一方、二次的なＡＤＰ経路及びトロンボキサン経路はどのコラーゲン濃度範囲でもｐ３８及びＲｈｏ−ＧＴＰを活性化しないことを示している。飽和コラーゲンでは、ＡＤＰ及びトロンボキサンの寄与が、ｐ３８又はＲｈｏ−ＧＴＰのシグナル伝達が関与しない機構により、血小板凝集におけるＭＭＰ１−ＰＡＲ１経路を補償するようである。
【０１４７】
Ｉ−（Ｅ）コラーゲン表面上での初期血小板血栓形成はＭＭＰ−１及びＰＡＲ１により促進される
破綻したアテローム性プラークにおける血小板の活性化は、高剪断応力条件下で、コラーゲン原線維の豊富な内皮下表面上で起こる。コラーゲン表面上での血小板−血小板血栓の初期形成及び広がりにおけるＭＭＰ−１及びＰＡＲ−１の役割を、ＭＭＰ−１又はＰＡＲ１を特異的に阻害することで調べた（図６Ａ〜６Ｂ参照）。
【０１４８】
ヒト全血を、記載されているように、ヘパリン（１０Ｕ／ｍｌ）又はトウモロコシトリプシン阻害剤（ＣＴＩ、最終３０μｇ／ｍｌ）で抗凝固処理した後、ビヒクル（０．２％ＤＭＳＯ）、ＭＭＰ−２００（２００ｎＭ）、ＭＭＰ−１阻害剤ＦＮ−４３９（３μＭ）、ＰＡＲ１リガンド結合部位阻害剤ＲＷＪ−５６１１０（１μＭ）、ＰＡＲ１ｐｅｐｄｕｃｉｎリポペプチドＰ１ｐａｌ−１２若しくはＰ１ｐａｌ−７（３μＭ）で１０分間又は１ｍＭのアスピリンで３０分間前処理し、その後、アッセイを行った。阻害剤と一緒にインキュベートした後、Ｉ型繊維性コラーゲンでコーティングされたスライドガラス上で血液を灌流した。
【０１４９】
Ｉ型繊維性コラーゲンでコーティングされたスライドガラス及びフローチャンバー（グリコテック社（Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈ）製）を、Ｒｅｔｉｇａ１３００デジタルカメラ（Ｑイメージング社（Ｑｌｍａｇｉｎｇ）製）及び４０倍の対物レンズを備えたＩＭＴ−２倒立顕微鏡（オリンパス社製）のステージ上にマウントした。フローチャンバーの入口の１つを、剪断速度が１，０００ｓ−１となるように較正したシリンジポンプ（ハーバード・アパラタス社（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）製）に連結した。次いで、種々の薬理学的阻害剤で前処理した全血を、コラーゲンでコーティングされたスライドガラス上で灌流した。２〜１５分間灌流した後、ＰＩＰＥＳバッファーで穏やかに置換することでフローチャンバーから血液を除去し、ＯｐｅｎＬａｂソフトウェア（インプロヴィジョン社（Ｉｍｐｒｏｖｉｓｉｏｎ）製）を用いて８〜１０フィールドの画像を得た。得られた画像を、ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ  １．６３ソフトウェアを用いて更に解析した。画像を最初に鮮明にし、ばらばらの血小板及び血小板凝集体の縁を決定した。閾値を調整した後、画像を二値化し、単一の粘着性血小板に合わせて感度を設定して粒子解析機能を作動させて、血小板により覆われた領域を強調した。ピクセルを平方マイクロメートルに変換するために、実験と同じ取得条件で２．５、６、２０、２５、及び４５μｍのポリスチレンビーズ（ポリサイエンス社（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ）製）を用いて較正曲線を作成した。形成された血栓の平均面積は７分の時点で決定した。図６Ｂに示す面積測定値は、５名の異なる血液ドナーを用いた３つの別々の実験の平均値±ｓ．ｅを表す。
【０１５０】
ＭＭＰ−１阻害剤又はＰＡＲ１阻害剤を用いた処理は、固定化されたコラーゲン原線維への血小板の一次付着に影響を与えなかった。しかし、血小板凝集体「糸」の成長速度及びサイズは、ＭＭＰ−１阻害剤ＦＮ−４３９、又はＰＡＲ１阻止剤Ｐ１ｐａｌ−１２、Ｐ１ｐａｌ−７若しくはＲＷＪ−５６１１０で有意に約７５％低減された（図６Ａ〜Ｂ）。比較すると、アスピリン前処理は血小板血栓の成長にほとんど又は全く影響を与えなかった。この結果は、動脈剪断応力条件下の血栓形成においてトロンボキサンが果たす役割がＭＭＰ１−ＰＡＲ１経路と比べて比較的小さいことと一致する（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。
【０１５１】
コラーゲンで活性化された血小板は、凝固促進性表面も提供し、また、トロンビンの産生を促進する組織因子を産生する（Ｇｉｅｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｍａｃｋｍａｎ，２００４；Ｓｃｈｗｅｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。トロンビン活性が阻害されない条件下でＭＭＰ１−ＰＡＲ１による初期血小板血栓形成の活性化が関連するかどうかを評価するために、全血中で第ＸＩＩａ因子及び凝固の接触経路をブロックするがトロンビン形成は阻害しないトウモロコシトリプシン阻害剤（ＣＴＩ；Ｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）存在下で動脈流実験を行った。
【０１５２】
ＣＴＩ（３０μｇ／ｍｌ）を用いて全血を抗凝固処理して接触経路をブロックしたこと以外は図６Ａと同様に実験を行った。図に示すようにヒルジンを０．００１３Ｕ／ｍｌで用いた。
【０１５３】
ＣＴＩ抗凝固剤を用いた結果はヘパリンを用いて行ったものと非常に似ていた。図６Ｃ及び６Ｄに示すように、ＭＭＰ−１又はＰＡＲ−１の阻害は、コラーゲン表面上の血小板微小血栓のサイズを有意に低減させ、一方、トロンビン阻害剤ヒルジンの添加は影響を与えなかった。同様に、全血のアスピリン前処理は、コラーゲン表面上での血小板血栓形成の程度に影響を与えなかった。したがって、動脈剪断応力条件下では、ＭＭＰ１−ＰＡＲ１はコラーゲン表面上での初期血栓形成を有意に促進する。
【０１５４】
次いで、血餅退縮アッセイを行い、大きな多血小板血餅の構造へのＭＭＰ−１の経時的な潜在的役割を調べた。血小板受容体は、細胞骨格のミオシン依存性収縮を活性化し、細胞骨格が接着斑を介して細胞外マトリックス（フィブリノーゲン）に連結されることで、血餅退縮が引き起こされる（図６Ｉ）。
【０１５５】
４％クエン酸ナトリウムで抗凝固処理したヒト全血から多血小板血漿（ＰＲＰ）を単離した。８００μｌのＰＢＳ及び２００μｌのＰＲＰにコントラストを強めるための１０μｌの赤血球を添加した１ｍｌ体積で血餅退縮アッセイを行った。サンプルをＦＮ−４３９（５μＭ）、ＭＭＰ９／１３  Ｉｎｈ（１０ｎＭ）、又はＲＷＪ−５６１１０（１μＭ）で１５分間前処理し、１〜２０μｇ／ｍｌのＩ型繊維性コラーゲンを用いて血餅形成を開始させた。サンプルを３７℃で９０分又は２４０分インキュベートし、その後、デジタルカメラで撮影した。図６Ｉ中の各写真は３つの独立した実験の代表例である。
【０１５６】
図６Ｉに示されるように、ＭＭＰ−１阻害剤ＦＮ−４３９は、２．５〜５μｇ／ｍｌのコラーゲンで誘導される血餅の形成及び退縮を完全に阻害した。ＲＷＪ−５６１１０によるＰＡＲ１の遮断もほぼ同じ阻害パターンを示したが、全コラーゲン滴定でネガティブコントロールであるＭＭＰ９／１３阻害剤はほとんど影響しなかった。したがって、ＭＭＰ−１及びＰＡＲ１は、コラーゲンにより開始される大きな多血小板血栓の形成及び退縮において重要な役割を果たす。
【０１５７】
Ｉ−（Ｆ）マトリックスメタロプロテアーゼ−２（ＭＭＰ−２）の薬理学的阻害はＭＭＰ−１の遮断と同じ程度にコラーゲン依存性血小板凝集を低減する。
ＭＭＰ−１の阻害がコラーゲン誘導血小板活性化を抑止することを更に実証するために、一連の実験を行い、ｐｒｏ−ＭＭＰ−１の切断及び活性化を阻害することが知られているＭＭＰ−２阻害剤存在下で血小板の凝集能を調べた。
【０１５８】
セファロース２Ｂカラム及び改変ＰＩＰＥＳバッファーを用いた多血小板血漿のゲル濾過クロマトグラフィーによってヒト血小板を単離した。２．０ｍＭのＣａＣｌ２及び３００μｇ／ｍｌのフィブリノーゲンを添加した後、血小板をビヒクル（０．２％ＤＭＳＯ）、５μｍｏｌ／ＬのＭＭＰ２阻害剤Ｉ（図８Ａ）、５１μｍｏｌ／ＬのＭＭＰ２／３阻害剤Ｉ（図８Ｂ）、１５μｍｏｌ／ＬのＭＭＰ３阻害剤ＩＩＩ（図８Ｃ）、５μｍｏｌ／ＬのＦＮ−４３９（図８Ｄ）、２００ｎＭのＭＭＰ−２００と２分間プレインキュベートし、その後、種々の濃度のコラーゲンで刺激した。Ｃｈｒｏｎｏｌｏｇ  ５６０ＶＳ／４９０−２Ｄ血小板凝集計を用いて凝集を１５分間測定した。凝集アッセイは３〜６名の健康な血液ドナーで繰り返した。
【０１５９】
図８Ｅでは、血小板を、トロンビン阻害剤ヒルジン（１Ｕ／ｍｌ）、メタロプロテアーゼ阻害剤１，１０−フェナントロリン（１，１０−Ｐ；１００μＭ）若しくはＭＭＰ−２００（２００ｎＭ）、ＭＭＰ−１阻害剤ＦＮ−４３９（３μＭ）、ＰＡＲ１リガンド結合部位阻害剤ＲＷＪ−５６１１０（１μＭ）、ＰＡＲ１阻止抗体（７５μｇ／ｍｌ）、ＰＡＲ１ｐｅｐｄｕｃｉｎリポペプチドであるＰ１ｐａｌ−１２（３μＭ）若しくはＰ１ｐａｌ−７（３ｍＭ）、又はＰＡＲ４ｐｅｐｄｕｃｉｎリポペプチドＰ４ｐａｌ−１０（３μＭ）と５分間プレインキュベートした。データは３回の実験の平均値±ｓ．ｄ．である。Ｐ＊＜０．０１、＃＜０．０５。
【０１６０】
ＭＭＰ−２の阻害はコラーゲンにより誘導される血小板凝集を阻害したが、ＭＭＰ−３の阻害はコラーゲンにより誘導される血小板凝集を阻害しなかった。
【０１６１】
Ｉ−（Ｇ）モルモットにおけるＭＭＰ−１及びＰＡＲ１による全身性の血小板活性化及び動脈血栓症
次いで、ＭＭＰ１−ＰＡＲ１経路をブロックすることで、インビボでコラーゲンにより仲介される全身性の血小板活性化から保護することができるかどうかを決定するために一連の実験を行った。モルモットはヒト同様に血小板上にＰＡＲ１を発現し（Ｌｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６ａ）、モルモットＭＭＰ−１はヒトＭＭＰ−１と９０％の同一性を有する（Ｈｕｅｂｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）ことから、モルモットを血小板機能を試験する関連モデルとした。
【０１６２】
動物実験は、米国国立衛生研究所の指針に従い、タフツ・メディカル・センターの施設内動物実験委員会の承認を得て行った。２〜４週齢のＨａｒｔｌｅｙモルモット（１７０〜２６０ｇ）に、キシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）及びケタミン（５０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射することで麻酔をかけ、その後、左頸静脈からカテーテルを挿入し、ビヒクル（２０％ＤＭＳＯ／８０％水）、Ｐ１ｐａｌ−７、又はＦＮ−４３９を注入した（２００μＬ）。コラーゲン依存性の全身性血小板活性化を測定するために、阻害剤を投与した１０分後に、２００μｇのコラーゲンを含む２００μＬのＰＢＳを頸静脈から送達した。コラーゲン注入１０分後に、反対側の頸静脈からクエン酸ナトリウム中に血液を採り（最終１％（ｖ／ｖ））、Ｈｅｍａｖｅｔ８５０を用いて血小板を測定した。図示されている通り、３μＭのＦＮ−４３９又は２０μｇ／ｍｌの対照ＩｇＧ若しくはＭＭＰ−１阻止抗体（３７℃で２時間プレインキュベート）の存在下又は非存在下でＤＱコラーゲンＩを蛍光発生基質として用いて上清中及び血小板溶解物中の活性型ＭＭＰ−１の酵素活性を測定した。
【０１６３】
図７Ａは、フローサイトメトリーで測定したモルモット血小板上でのＭＭＰ−１の表面発現を示す。灰色の破線：二次抗体のみ；実線：記載の濃度のコラーゲンで３７℃にて１５分間処理した後、一次ＭＭＰ−１抗体（ＡＢ８０６）及び二次抗体で染色した血小板のＦＡＣＳプロフィール。図７Ｂは、上記の阻害剤の存在下で２０μｇ／ｍｌのＩ型コラーゲンで１５分間処理したモルモット血小板の活性化を示す。
【０１６４】
図７Ａ及び７Ｂに示されるように、モルモット血小板のＦＡＣＳ分析は、ｐｒｏＭＭＰ−１が表面で発現していること及びコラーゲンの添加でコラゲナーゼ活性が放出され、これはＦＮ−４３９又はＭＭＰ１中和抗体で完全にブロックされることを示した。同様に、ＭＭＰ−１又はＰＡＲ１の阻害は、モルモット血小板中で１０μｇ／ｍｌのコラーゲンによる凝集を３５〜５０％抑制し且つＲｈｏ−ＧＴＰ活性を完全に阻害し（図７Ｃ〜Ｄ）、ヒト血小板を用いた先の結果と一致した。
【０１６５】
次いで、モルモットにコラーゲンを静脈内注射することで血管内の血小板活性化を誘導した。ビヒクル、Ｐ１ｐａｌ−７（３ｍｇ／ｋｇ）、又はＦＮ−４３９（１０ｍｇ／ｋｇ）をモルモット（ｎ＝６）の内頸静脈に静脈内（ｉ．ｖ．）送達し、１０分間循環させた。血小板の全身性活性化をコラーゲン（２００μｇ）で誘導する前及び誘導した１０分後に血液を採取した。注入されたコラーゲンは、平均全身血小板数を基準レベルの３０９，０００±５０，０００／ｍｌから１９４，０００±２０，０００／ｍｌに大幅に減少させた。驚いたことに、ＰＡＲ１ｐｅｐｄｕｃｉｎリポペプチドＰ１ｐａｌ−７を事前投与することで、モルモットにおいてコラーゲン誘導血小板減少症がほぼ完全に防がれた（図６Ｅ）。ＭＭＰ−１阻害剤ＦＮ−４３９も血管内血小板活性化に対して有意な保護効果を発揮した。
【０１６６】
トロンビン、ＭＭＰ−１、又はＰＡＲ１を遮断することの動脈血栓症に対する有効性を評価するために、標準的な頸動脈ＦｅＣｌ３損傷モデルをモルモットに用いた。ＦｅＣｌ３は動脈の裸出及びＩ型コラーゲン及びその他の内皮下マトリックスタンパク質の露出を引き起こす。次いで、動脈血栓症に対する、ビバリルジンでトロンビンをブロックする効果、ＦＮ−４３９でＭＭＰ−１をブロックする効果、及び小分子アンタゴニストＲＷＪ−５６１１０又はＰ１ｐａｌ−７ｐｅｐｄｕｃｉｎでＰＡＲ１をブロックする効果をドップラープローブを用いて比較した。
【０１６７】
これらの動脈血栓症実験では、ビヒクル（−）、ビバリルジン、ＲＷＪ−５６１１０、Ｐ１ｐａｌ−７、又はＦＮ−４３９（ｎ＝４〜５）を頸静脈から記載の濃度でｉ．ｖ．投与した１０分後に、２０％ＦｅＣｌ３に浸した２４ｍｍ２片のバイオラッド社製Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ紙を用いて右頸動脈を２０分間損傷させた。損傷部から５ｍｍ遠位側の動脈流を０．５Ｖのドップラープローブ（トランソニック・システムズ社（Ｔｒａｎｓｏｎｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）製）を用いて測定した。５分間以上にわたって流速が＜０．０１Ｖである場合に動脈閉塞とした。ドップラー測定は損傷から３０分後の時点で終了した（＊はｐ＜０．０５を意味する）。
【０１６８】
ビバリルジン単独（０．１８ｍｇ／ｋｇ）は、平均動脈閉塞時間を１３分から２０分に延長した（図６Ｆ）。０．５ｍｇ／ｋｇの小分子ＰＡＲ１アンタゴニストＲＷＪ−５６１１０は、平均閉塞時間に明らかな影響は与えなかったが、等モル量のＰ１ｐａｌ−７（０．１３ｍｇ／ｋｇ、７５％リポペプチド、２５％塩）はビバリルジンと同様な保護傾向を生じた（ｐ＝０．１０）（図６Ｆ）。０．１３ｍｇ／ｋｇのＰ１ｐａｌ−７と０．１８ｍｇ／ｋｇのビバリルジンを添加しても動脈閉塞時間の相加的延長はなかったが、わずかに投与量の多いＰ１ｐａｌ−７単独（０．３ｍｇ／ｋｇ）は平均閉塞時間を有意に（ｐ＜０．０５）８０％延長した（図６Ｆ）。更に、１００％水中に含まれるＰ１ｐａｌ−７の酢酸アンモニウム塩は、同様なＩＣ５０値を示し、ＰＡＲ１特異性を維持している。ＭＭＰ−１アンタゴニストＦＮ−４３９単独投与（２．０ｍｇ／ｋｇ）は、平均動脈閉塞時間を同様に延長した（９０％、図６Ｆ）。ＰＡＲ１阻害剤及びＭＭＰ−１阻害剤を同時投与しても平均閉塞時間は更に延長されず、このことはＭＭＰ−１がＰＡＲ１と同じ経路で作用していることと一致する。同様な効果を図６Ｇにも示した。これらの例により、ＭＭＰ１−ＰＡＲ１を阻害することで、トロンビンのブロックとは独立して、コラーゲン依存性の血小板活性化及び急性動脈血栓症に対する実質的な保護を提供することができるという本発明の原理の１つが検証された。
【０１６９】
血餅のＭＭＰ−１活性をコラーゲンザイモグラフィーにより決定した（図６Ｈ参照）。モルモットから血小板を単離し、２０μｇ／ｍｌのコラーゲンで１５分間刺激し、血小板の上清及びペレット又は全休止血小板（対照）を前述のように調製した。サンプルを８％Ｉ型コラーゲン／アクリルアミドザイモグラフィーゲル上で分離し、（Ｇｏｇｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）に記載されているようにコラゲナーゼのザイモグラムを現像するか、ＭＭＰ１−抗体であるＡＢ８０６でイムノブロットした。６Ｆ及び６Ｇ同様にＦＮ−４３９又はビヒクルで処理した動物（ｎ＝５）のＦｅ−Ｃｌ損傷頸動脈から動脈血栓を取り（それぞれ、ＦＮ４３９  ｃｌｏｔ及びｖｅｈ  ｃｌｏｔ）、血栓を溶解バッファーに溶解して２１ゲージ針に５回通した。溶解物を遠心し、上清をザイモグラフィーゲル上で分離した。ウェスタンブロットの左の２レーンは２０ｎｇのｐｒｏＭＭＰ−１又は２０ｎｇのＡＰＭＡ活性化ＭＭＰ−１であり、ザイモグラムの右側のレーンは０．５μｇのＡＰＭＡ活性化ヒトＭＭＰ−１である。
【０１７０】
コラーゲンザイモグラフィーは、ビヒクル処理動物の損傷された頸動脈から単離した多血小板血栓（ｖｅｈ  ｃｌｏｔ）が、有意なＭＭＰ−１活性を有し、ＡＰＭＡ活性化ＭＭＰ−１及びコラーゲン活性化血小板の上清のＭＭＰ−１活性と一緒に泳動されることを示した（図６Ｈ）。逆に、全血由来の休止血小板（対照）又はＭＭＰ１阻害剤で処理した動物の動脈血栓（ＦＮ４３９  ｃｌｏｔ）は活性型ＭＭＰ−１を含まなかった。これらのデータは、以前の結果と合わせ、ＭＭＰ１−ＰＡＲ１の阻害が、動物においてコラーゲン依存性の血小板活性化及び急性動脈血栓症に対する実質的な保護を提供し得ることを示している。
【０１７１】
材料
クエン酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、アピラーゼ、１，１０−フェナントロリン、Ａ−２３１８７、及びＵ−４６６１９はシグマ社から入手した。ＡＤＰ及び繊維性Ｉ型コラーゲンはクロノログ社（Ｃｈｒｏｎｏｌｏｇ  Ｃｏｒｐ）から入手した。ＭＭＰ−２００はエンザイム・システムズ・プロダクツ社（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）から入手した。
【０１７２】
ＰｒｏＭＭＰ−１（≧９０％純度、ヒト滑液線維芽細胞由来）、ｐｒｏＭＭＰ−３、ｐｒｏＭＭＰ−７、ＦＮ−４３９（ＭＭＰ  ｉｎｈ−１）、ＭＭＰ８  ｉｎｈ、ＭＭＰ９／１３  ｉｎｈ、ヒルジン、及びＰＭＡはカルビオケム社から入手した。ＲＷＪ−５６１１０は、ジョンソン・エンド・ジョンソン・ファーマスーティカルズ・リサーチ・アンド・ディベロップメント社のＣｌａｕｄｉａ  Ｄｅｒｉａｎ及びＰａｒｔｉｃｉａ  Ａｎｄｒａｄｅ−Ｇｏｒｄｏｎの好意により寄贈された。ＡＲ−Ｃ６９９３１ＭＸはアストラゼネカ社から寄贈された。
【０１７３】
ｐｅｐｄｕｃｉｎリポペプチド、Ｐ１ｐａｌ−１２、Ｐ４ｐａｌ−１０、及びＰ１ｐａｌ−７は、以前同様（Ｃｏｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ａ）、Ｃ末端アミドと共に合成し、ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。
【０１７４】
ＳＦＬＬＲＮ、ＴＦＬＬＲＮ、ＰＲＳＦＬＬＲＮ、ＲＰＳＦＬＬＲＮ、ＰＳＦＬＬＲＮ、ＤＰＲＳＦＬＬＲＮ、ＰＡＲ１Ｎ末端トロンビン切断ペプチド（Ｎ２６−Ｒ４１）、ＰＡＲ１可動性リンカーペプチド（Ｎ−アセチル−Ｔ６７−Ｌ８４−Ｃ）、及びＴＲ２６（Ａ３６−Ｅ６０−Ｓ）、及びＴＲ２６−Ｐ４０Ｎ（Ａ３６−Ｋ６１）は、タフツ・ペプチド・コア・ファシリティー（Ｔｕｆｔｓ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）によってＣ末端アミドと共に合成され、ＲＰ−ＨＰＬＣによって≧９５％の純度に精製された。
【０１７５】
ＰＡＲ１のアミノ末端トロンビン切断ペプチドと反応するＩＩａＲ−Ａモノクローナル抗体はバイオデザイン社（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ；メーン州ケネバンク）から入手した。
【０１７６】
残基Ｓ４２ＦＬＬＲＮＰＮＤＫＹＥＰＦ５５Ｃに対して産生させたＰＡＲ１阻止抗体は、以前に記載されているようにウサギから生成された（Ｋｕｌｉｏｐｕｌｏｓ  １９９９）。Ｒ＆Ｄシステムズ社の固相ｐｒｏＭＭＰ−１ＥＬＩＳＡシステム（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＤＭＰ１００）は、ＭＭＰ−１のｐｒｏドメインを認識する２つのモノクローナル抗体を使用する。
【０１７７】
このＥＬＩＳＡアッセイは、ｐｒｏＭＭＰ−１及び可溶性プロドメインを検出するが、活性型ＭＭＰ−１は認識しない。保存されているＣ末端に対して産生されたＭＭＰ−１阻止抗体（ウサギポリクローナル抗体ＡＢ８１０５）は、ＭＭＰ−１のプロ型及び活性型の両方を認識するが、他のＭＭＰファミリーのメンバーとは交差反応せず、ケミコン社（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）から入手した。ＭＭＰ−８（ＩＭ３８Ｌ）及びＭＭＰ−１３（ＩＭ４４Ｌ）阻止抗体はオンコジーン社（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）、抗α２（Ｇｉ９又はＡＫ７）、抗β１（ＭＡＢ１９８７）、抗β３（ＭＡＢ１９５７）はケミコン社、抗ＧＰＶＩ（ＳＣ２０１４９）はサンタクルーズ社（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、抗ＧＰＩＢα（ＭＭ２／１７４）はＡｂＤセロテック社（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）のものであり、ＭＭＰ−１のＭＭＰ−１プロドメインに対する抗体のＥＬＩＳＡキット（ＤＭＰ１００、Ｒ＆Ｄシステムズ社製）はメーカーの取扱説明書に従って使用した。
【０１７８】
抗リン酸化ｐ３８ＭＡＰＫ、ｐ３８ＭＡＰＫ、抗リン酸化ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２、及び抗ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２はセル・シグナリング社（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗ＲｈｏＡ（クローン２６Ｃ４）はサンタクルーズ・バイオテクノロジー社のものである。
【０１７９】
トウモロコシトリプシン阻害剤及びトロンビンはヘマトロジック・テクノロジー社（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から入手し、Ｑｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキットはストラタジーン社から入手した。
【０１８０】
ＩＩ  ＭＭＰ−１−ＰＡＲ−１シグナル伝達経路の阻害剤
ＩＩ−（Ａ）血栓性状態を防止するための新規な標的としてのＭＭＰ１−ＰＡＲ１
マトリックスメタロプロテアーゼは、間質コラーゲンの切断及び脆弱なアテローム性プラークの発生を招く慢性的な炎症促進性且つ組織再構築性のイベントに関与する（Ｓｕｋｈｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。ヒトアテローム性動脈硬化病変の病理解剖学的研究から、大きなプラークが虚血症状を引き起こし得ることが示唆されているが、アテローム性動脈硬化症に関連する罹患率及び死亡率の主な寄与因子は、急性ラーク破綻後の露出したコラーゲン表面上での過剰な血小板血栓形成である（Ｇｌａｓｓ  ａｎｄ  Ｗｉｔｚｔｕｍ，２００１；Ｒｕｇｇｅｒｉ，２００２）。
【０１８１】
本発明は、ＰＡＲ１受容体への血小板ＭＭＰ−１のオートクリン的作用により仲介される、コラーゲンにより開始される新規な血栓形成経路を開示する。血小板がコラーゲンに曝されると、血小板表面上のＭＭＰ−１が強く活性化され、これがトロンビンとは独立してＰＡＲ１を直接切断及び活性化する。これらの研究は、メタロプロテアーゼのマトリックス依存性活性化と血小板Ｇタンパク質シグナル伝達を関連付け、動脈血栓症防止のための新規な潜在的標的としてＭＭＰ１−ＰＡＲ１を同定するものである。
【０１８２】
予想外にも、ＭＭＰ−１はＰＡＲ１を細胞外ドメインの特徴的な部位で切断し、トロンビンによって生成するものよりも長いテザーリガンドを生成した。ＭＭＰ１によって切断された受容体又は可溶性ペプチド類似体は、血小板及びその他の細胞におけるＧ１２／１３−Ｒｈｏ依存性経路、走化性、及びＭＡＰＫシグナル伝達を強く刺激した。ＰＡＲ１上のＭＭＰ−１切断部位を、混合物に基づく指向性ペプチドライブラリー（ｍｉｘｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ  ｏｒｉｅｎｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ；Ｔｕｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）及び基質切断実験（Ｂｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２；Ｎｅｔｚｅｌ−Ａｒｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）により決定された最適化されたＭＭＰ−１切断部位モチーフと整列させた。各Ｐ１’残基の変異は、ＭＭＰ−１切断とトロンビン切断を区別し、プロテアーゼ特異的活性を示すＰＡＲ１受容体を生じさせた。
【０１８３】
α２β１及びＧＰＶＩ／ＦｃγＲコラーゲン受容体を介したヒト血小板中のコラーゲンシグナル伝達は十分に解明されていないが、ＡＤＰ及びトロンボキサンの受容体のオートクリン刺激を介したＧタンパク質シグナル伝達に依存する（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。Ｐ２Ｙ１２  Ｇｉ共役ＡＤＰ受容体を遮断すると動脈流条件下でのコラーゲン依存性血栓形成が阻害されることから、下流ＡＤＰ−Ｇｉシグナル伝達の重要な役割が証明された。トロンボキサンはＧｑ及びＧ１２／１３共役ＴＸＡ２受容体を活性化するが、アスピリンは動脈剪断応力下においてコラーゲン表面上での血栓形成を防止せず、重度の動脈狭窄患者における閉塞性血栓形成を防止しない（Ｖｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。本研究は、ＭＭＰ−１が、血小板形態変化及びＲｈｏ活性化に関与するＰＡＲ１−Ｇ１２／１３経路の強力な活性化物質であり、したがって、Ｐ２Ｙ１２−Ｇｉシグナル伝達と協同することを示している。
【０１８４】
薬理学的阻害剤によるＭＭＰ−１又はＰＡＲ１の遮断は動脈剪断応力条件下におけるコラーゲン表面での血栓形成及び動物の血栓症を有意に低減した。ＭＭＰ−１阻害と比べて、トロンビンのアンタゴニストは高速動脈流下においてコラーゲン表面上での初期血栓形成にほとんど影響しなかった。トロンビンは、後期の血小板血栓の広がり及び安定性に対してより重要な役割を果たし得るが、組織因子レベルが極めて高くない限り、高い動脈剪断応力での初期血栓成長の開始には関与しない（Ｆｒｅｓｓｉｎａｕｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２；Ｇａｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｉｎａｕｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０；Ｏｋｏｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。同様に、ヘパリン等のトロンビン阻害剤は、高速動脈流での血小板血栓形成への影響は不完全であるが、低又は中程度の剪断速度では血小板血栓の成長及び全体的安定性に、より顕著な阻害効果を有する（Ｉｎａｕｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）。
【０１８５】
ＭＭＰ−１又はトロンビンの直接遮断とは異なり、ＰＡＲ１の下流阻害は、初期のＭＭＰ１依存性イベントである血管コラーゲン上での血小板血栓の広がり並びに後期のトロンビン依存性の広がり及び安定化の両方を防止する可能性を有しており、急性の状態における動脈血栓症防止に有益であることが証明され得る。このことを証明するために、本発明は、種々の薬剤、例えば細胞透過性ＰＡＲ１ｐｅｐｄｕｃｉｎが、トロンビン仲介性及びコラーゲン−ＭＭＰ１仲介性の両方のＰＡＲ１活性化を効率的に遮断できることを示す。これはアテローム血栓性の心疾患及び虚血性脳卒中の処置を受けている大きな患者集団に有益であり得る。
【０１８６】
ＩＩ−（Ｂ）新規なＭＭＰ１−ＰＡＲ１阻害剤のスクリーニング
ＭＭＰ−１／ＰＡＲ−１シグナル伝達経路に作用する薬剤は、当該技術分野で周知の方法を用いて発見することができる。最初の工程では、ＭＭＰ−１−ＰＡＲ−１シグナル伝達経路内の標的分子に結合する薬剤を同定する。次いで、選択された薬剤の有効性を、本明細書に記載されているようにインビトロのＰＡＲ−１シグナル伝達アッセイ又は切断アッセイを用いて評価し、その後、血栓性病態のモデル動物を用いてインビボで評価する。ＭＭＰ−１／ＰＡＲ−１特異的薬剤は、ＭＭＰ−１−ＰＡＲ−１シグナル伝達経路のアゴニスト又はアンタゴニストとして作用し得る。
【０１８７】
好ましい実施形態では、薬剤はＭＭＰ−１−ＰＡＲ−１シグナル伝達経路の直接的又は間接的なアンタゴニストとして作用する。直接的なアンタゴニストとは、ＭＭＰ−１又はＰＡＲ−１等の標的分子と直接結合してその標的分子の生物学的活性を阻害する化合物である。
【０１８８】
例えば、ＭＭＰ−１アンタゴニストは、ＭＭＰ−１酵素活性、すなわちプロテアーゼ活性化受容体−１（ＰＡＲ−１）の３９位のアスパラギン酸（Ｄ３９）と４０位のプロリン（Ｐ４０）の間でのタンパク質切断に結合してこれを阻害する化合物であり得る。一実施形態では、ＭＭＰ−１アンタゴニストは、ＭＭＰ−１活性部位に直接結合してＭＭＰ−１酵素活性を阻害し得る。別の実施形態では、ＭＭＰ−１アンタゴニストは、活性部位以外の部位に結合して、ＭＭＰ−１のコンホメーション変化を誘導するか、リン酸化、脱リン酸化、グリコシル化、アシル化、アルキル化、リポイル化等のタンパク質の翻訳後状態を変えることにより、ＭＭＰ−１活性を阻害し得る。
【０１８９】
別の例では、ＰＡＲ−１アンタゴニストは、ＰＡＲ−１に結合して、プロテアーゼ活性化受容体−１（ＰＡＲ−１）の３９位のアスパラギン酸（Ｄ３９）と４０位のプロリン（Ｐ４０）の間でのタンパク質切断を防止する化合物であり得る。一実施形態では、ＰＡＲ−１アンタゴニストは、ＰＡＲ−１のＮ末端ドメインのＭＭＰ−１切断部位ＬＤ３９↓Ｐ４０ＲＳＦＬ上に直接結合してその部位でのタンパク質切断を防止する、抗体等の化合物であり得る。別の実施形態では、ＰＡＴ−１アンタゴニストは、ＭＭＰ−１切断部位ＬＤ３９↓Ｐ４０ＲＳＦＬでのタンパク質切断が防止されるように、ＰＡＲ−１のコンホメーション変化を誘導するか、リン酸化、脱リン酸化、グリコシル化、アシル化、アルキル化、リポイル化等のＰＡＲ−１の翻訳後修飾を変化させることで、ＰＡＲ−１のタンパク質切断を阻害し得る。
【０１９０】
更に別の実施形態では、ＰＡＲ−１アンタゴニストは、ＭＭＰ−１によって生じるテザーリガンドがＰＡＲ−１内の別のドメインと相互作用する能力に干渉することで、ＭＭＰ−１が仲介するＰＡＲ−１シグナル伝達の活性化を阻害し得る。更に別の実施形態では、ＰＡＲ−１アンタゴニストは、ＰＡＲ−１又はＭＭＰ−１を含むタンパク質複合体の組立てに干渉するかＰＡＲ−１と他のＰＡＲファミリーメンバーとの二量体化に干渉することでＰＡＲ−１シグナル伝達を防止し得る。
【０１９１】
一実施形態では、薬剤はＰＡＲ−１ｐｅｐｄｕｃｉｎリポペプチドである。別の実施形態では、薬剤は、シェリング・プラウ社が開発したＰＡＲ−１アンタゴニストであるＳＣＨ  ５３０３４８又はその誘導体である。
【０１９２】
別の実施形態では、阻害剤は、ＰＡＲ−１と種々のヌクレオチド、例えば、限定されるものではないがＧＴＰ、ＧＤＰ、又はＧＭＰとの複合体形成に干渉し得る。
【０１９３】
更に別の実施形態では、ＭＭＰ−１又はＰＡＲ−１薬剤は、ＭＭＰ−１により仲介されるＰＡＲ−１活性化に必要なその他の因子の遺伝子発現を修飾し得る。この態様では、「薬剤」として、ＭＭＰ−１により仲介されるＰＡＲ−１活性化に必要な因子の遺伝子の転写又は翻訳の修飾因子（ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）が含まれ得る。
【０１９４】
間接的アンタゴニストとは、ＭＭＰ−１により仲介されるＰＡＲ−１シグナル伝達活性の活性化に必要な補助的標的分子に結合する化合物である。例えば、ＭＭＰ−１アンタゴニストは、ｐｒｏ−ＭＭＰ−１から活性型ＭＭＰ−１へのタンパク質切断を阻害することでＭＭＰ−１活性を阻害し得る。例えば、ＭＭＰ−１アンタゴニストは、ｐｒｏ−ＭＭＰ−１のタンパク質切断部位に結合して切断を防止し得る。
【０１９５】
別の実施形態では、ＰＡＲ−１アンタゴニストは、ＭＭＰ−１と会合因子又はＰＡＲ−１と会合因子の間のタンパク質複合体形成を防止することでＰＡＲ−１シグナル伝達活性を阻害し得る。更に別の実施形態では、ＰＡＲ−１アンタゴニストは、ＭＭＰ−１により仲介されるＰＡＲ−１シグナル伝達活性に必要な下流ＰＡＲ−１エフェクター分子の生物学的活性に干渉し得る。
【０１９６】
直接的阻害剤は、ＭＭＰ−１により仲介されるＰＡＲ−１シグナル伝達に必要な活性を有する精製標的分子を必要とするインビトロでのスクリーニングアッセイを用いた化合物のスクリーニングにより同定され得る。好ましい実施形態では、標的タンパク質は天然ＰＡＲ−１タンパク質又はＮ末端残基１〜３９が欠失されたＰＡＲ−１欠失変異体である。しかし、本明細書に開示する実験法は、ＰＡＲ−１の機能に必要な任意の標的タンパク質に適用され得る。例えば、標的分子は、ＭＭＰ−１であってもよく、ＭＭＰ−１の活性化に必要な因子であってもよい。更に別の例では、標的分子は、ＰＡＲ−１又はＭＭＰ−１の翻訳後修飾を変化させることでＰＡＲ−１活性を修飾する、キナーゼ又はホスファターゼ等の因子であり得る。
【０１９７】
ＩＩ−（ｃ）組換えＰＡＲ−１ポリペプチドの原核生物による発現
一実施形態では、本発明は標的タンパク質又はその断片（例えばＰＡＲ−１）の精製を必要とする。
【０１９８】
ＰＡＲ−１は、ヒト血小板等の生物学的起源から直接精製され得る。あるいは、ＰＡＲ−１をコードするＤＮＡ又はその断片を、遺伝子コンストラクト、例えば原核生物宿主中での発現用ベクター及びプラスミドに作動可能に連結してもよい。場合によっては、発現ベクター中の転写及び／又は翻訳配列に核酸を作動可能に連結してＰＡＲ−１ポリペプチドの発現を可能にしてもよい。「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」とは、選択された核酸、例えばコード配列が、配列の転写及び／又は翻訳を方向付ける１又は複数の配列因子、例えばプロモーター及び／又はリボソーム結合部位（シャイン・ダルガノ配列）に影響を与えるように（例えば隣接して）配置されることを意味する。一部の配列因子は、選択された核酸の転写及び／又は翻訳が選択的に誘導されるように制御することができる。例示的な配列因子としては、誘導性プロモーター、例えばｔａｃ、Ｔ７、Ｐ（ＢＡＤ）（ａｒａＢＡＤ）、及びベータ−Ｄ−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）プロモーターをベースとするベクターが含まれる。大腸菌中での誘導性プロモーターの制御は、ｌａｃオペロンリプレッサー（ｌａｃ（Ｒ））等の抑制エレメントにプロモーターを作動可能に連結することで強化することができる。抑制エレメントの具体的なケースでは、「作動可能に連結された」とは、（抑制条件下で）リプレッサーがプロモーターからの転写を阻害するように、選択されたプロモーター配列が抑制エレメントに十分近く配置されることを意味する。典型的には、発現プラスミド及びベクターは選択マーカー（例えば、Ｔｅｔ（Ｒ）又はＡｍｐ（Ｒ）等の抗生物質耐性遺伝子）を含む。選択マーカーは、ベクター又はプラスミドを含む宿主細胞形質転換体のセレクションに有用である。選択マーカーは、宿主細胞中にベクター又はプラスミドを（例えば高いコピー数で）維持するためにも使用され得る。あるいは、組換え発現ベクターは、例えばＴ７プロモーター調節配列及びＴ７ポリメラーゼを用いて、インビトロで転写及び翻訳することができる。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、興味のあるポリペプチド配列は、組換えＤＮＡ技術を用いて融合タンパク質の一部として発現され得る。融合ベクターは、ベクター中にコードされているタンパク質に、典型的には組換えタンパク質のアミノ末端に、複数のアミノ酸を付加する。そのような融合ベクターは通常、３つの目的を果たす。すなわち、１）組換えタンパク質の発現を増やし；２）組換えタンパク質の溶解度を高め；３）アフィニティー精製におけるリガンドとして働くことで組換えタンパク質を精製し易くする。しばしば、融合部分と組換えタンパク質の連結部にタンパク質切断部位を導入し、融合タンパク質の精製後に融合部分から組換えタンパク質を分離することができるようにする。そのような酵素及びその同族認識配列としては、第Ｘａ因子又はエンテロキナーゼが含まれる。典型的な融合発現ベクターとしては、標的組換えタンパク質にグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を融合するｐＧＥＸ（ファルマシア・バイオテク社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ）製；Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．（１９８８）．Ｇｅｎｅ  ６７：３１−４０）、マルトースＥ結合タンパク質を融合するｐＭＡＬ（マサチューセッツ州ビバリーのニューイングランド・バイオラボ社（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）製）、及びプロテインＡを融合するｐＲＩＴ５（ニュージャージー州ピスカタウェイのファルマシア社製）が含まれる。
【０２００】
ＰＡＲ−１ポリペプチドは、Ｎ末端又はＣ末端に融合されたアフィニティータグを有するように設計されてもよい。例えば、標的タンパク質をＨｅｘａ−Ｈｉｓペプチド又はＨＡエピトープタグ（インフルエンザヘマグルチニン）合成ペプチドＹＰＹＤＶＰＤＹＡ等の短いタグペプチドに融合してもよい。これらのタグタンパク質又はペプチドも、その後のアフィニティークロマトグラフィーによるタンパク質精製を容易にする。
【０２０１】
その他の一般的に使用される細菌宿主プラスミドとしては、ｐＵＣシリーズのプラスミド及び市販のベクター、例えばｐＡＴ１５３、ｐＢＲ、ＰＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ、ｐＢＳ、ｐＧＥＭ、ｐＣＡＴ、ｐＥＸ、ｐＴ７、ｐＭＳＧ、ｐＸＴ、ｐＥＭＢＬが含まれる。もう１つの例示的プラスミドはｐＲＥＶ２．１である。本明細書に記載の核酸を含むプラスミドは、ＰＡＲ−１ポリペプチドを発現させるために細菌宿主細胞中にトランスフェクト又は形質転換することができる。形質転換のための技術は当該技術分野で公知であり、塩化カルシウム法又はエレクトロポレーションが含まれる。別の実施形態では、組換えＤＮＡ配列はバクテリオファージベクター中にクローニングされる。特定の実施形態では、形質転換された宿主細胞は、組換えタンパク質を大量に発現することができる非病原性の原核生物を含む。例示的な原核宿主細胞には、ＢＬ２１、Ｋ１２由来株（例えば、Ｃ６００、ＤＨ１α、ＤＨ５α、ＨＢＩＯＩ、ＩＮＶＩ、ＪＭ１０９、ＴＢＩ、ＴＧＩ、及びＸ−ＩＢｌｕｅ）等の実験室用及び／又は産業用の大腸菌細胞株が含まれる。このような株は、ＡＴＣＣ又はＢＤバイオサイエンス・クロンテック社（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；カリフォルニア州パロアルト）、ストラタジーン社（カリフォルニア州ラ・ホーヤ）等の商業ベンダーから入手可能である。核酸操作技術の詳細な説明についてはＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，２００６及びＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，２００１を参照されたい。
【０２０２】
ＩＩ−（Ｄ）真核生物を用いた組換えＰＡＲ−１ポリペプチドの発現
別の実施形態では、ＰＡＲ−１タンパク質又はその断片は、真核細胞中で発現され得る。標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて、ＰＡＲ−１核酸を宿主細胞中での核酸の発現に適した形態のベクター中にクローニングする。好ましくは、組換え発現ベクターは、核酸配列に作動可能に連結された真核細胞内での発現を容易化する１又は複数の調節配列を含む。「調節配列（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」という用語は、プロモーター、エンハンサー、及びその他の発現制御領域（例えばポリアデニル化シグナル）を含む。調節配列としては、ヌクレオチド配列の構成的発現を方向付けるもの並びに組織特異的な調節及び／又は誘導性配列が含まれる。発現ベクターのデザインは、形質転換する宿主細胞の選択、所望するタンパク質の発現レベル等の要素に応じて変わり得る。本発明の発現ベクターは、本明細書に記載されているような核酸にコードされる融合タンパク質又はポリペプチドを初めとするタンパク質又はポリペプチド（例えば、ＰＡＲ−１タンパク質、ＰＡＲ−１タンパク質の変異体形態、融合タンパク質等）を生産するように、宿主細胞に導入することができる。例えば、ＰＡＲ−１ポリペプチドは、昆虫細胞（例えばバキュロウイルス発現ベクターを用いる）、酵母細胞、又は哺乳動物細胞中で発現させることができる。好適な宿主細胞についてはＧｏｅｄｄｅｌ，（１９９０）．Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．に更に詳細に記載されている。
【０２０３】
哺乳動物細胞中で、発現ベクターの制御機能はウイルスの調節エレメントによって付与されてもよい。例えば、一般的に使用されているプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、及びサルウイルス４０に由来する。いくつかの実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーター、例えば、ステロイドホルモンによって、又はポリペプチドホルモンによって（例えばシグナル伝達経路を利用）、又は異種ポリペプチド（例えば、テトラサイクリン誘導性システムの「Ｔｅｔ−Ｏｎ」及び「Ｔｅｔ−Ｏｆｆ」；例えばカリフォルニア州クロンテック社；Ｇｏｓｓｅｎ  ａｎｄ  Ｂｕｊａｒｄ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５５４７；及びＰａｉｌｌａｒｄ（１９８９）．Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ９：９８３参照）によって調節されるプロモーターであってよい。いくつかの実施形態では、ＰＡＲ−１ポリペプチド配列は、ＰＡＲ−１ポリペプチドの分泌を促進するシグナルペプチド配列を含む。
【０２０４】
タンパク質発現に適した哺乳動物細胞系としては、限定されるものではないが、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）又はＣＯＳ細胞（アフリカミドリザル腎細胞ＣＶ−１起源ＳＶ４０細胞；Ｇｌｕｚｍａｎ（１９８１）．Ｃｅｌｌ  １２３：１７５−１８２）が含まれる。その他の好適な宿主細胞は当業者に公知である。
【０２０５】
ベクターＤＮＡは、従来のトランスフェクション技術によって宿主細胞中に導入することができる。本発明において、「形質転換」及び「トランスフェクション」という用語は、宿主細胞に外来核酸（例えばＤＮＡ）を導入するための当該技術分野で認識される種々の技術を意味し、リン酸カルシウム共沈殿法、ＤＥＡＥ−デキストランにより仲介されているトランスフェクション、リポフェクション、又はエレクトロポレーションを含む。
【０２０６】
ＩＩ−（Ｅ）スクリーニングアッセイ−ＰＡＲ−１／ＭＭＰ−１リガンド結合分子の同定
本発明は、修飾因子（ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）、すなわち、ＰＡＲ−１又はＭＭＰ−１タンパク質に結合し、例えばＰＡＲ−１若しくはＭＭＰ−１の発現又はＰＡＲ−１若しくはＭＭＰ−１の活性に対する阻害効果を有する候補化合物若しくは候補薬剤又は被験化合物若しくは被験薬剤（例えば、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣薬、ペプトイド、小分子、又はその他の薬物）を同定する方法（本発明では「スクリーニングアッセイ」ともいう）を提供する。そのようにして同定された化合物は、治療プロトコール中で、標的遺伝子産物（例えばＰＡＲ−１又はＭＭＰ−１遺伝子）の活性を修飾するため、標的遺伝子産物の生物学的機能を変化させるため、又は標的遺伝子の正常な相互作用を乱す化合物を同定するために使用することができる。
【０２０７】
一実施形態では、本発明は、ＰＡＲ−１又はＭＭＰ−１のタンパク質、ポリペプチド、又はその生物学的活性部分に結合するかその活性を修飾する候補化合物又は被験化合物をスクリーニングするアッセイを提供する。
【０２０８】
本発明の被験化合物は、生物学的ライブラリー；ペプトイドライブラリー（ペプチドの機能性を有するが、新規な非ペプチド骨格を有し、酵素分解に抵抗性であり、しかも生物活性を維持している分子のライブラリー；例えばＺｕｃｋｅｒｍａｎｎ，Ｒ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８−８５参照）：空間的にアドレス可能な並行な固相又は液相ライブラリー；デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー法；「ｏｎｅ−ｂｅａｄ  ｏｎｅ−ｃｏｍｐｏｕｎｄ」ライブラリー法；及びアフィニティークロマトグラフィーによるセレクションを用いる合成ライブラリー法を含む当該技術分野で公知のコンビナトリアルライブラリー法における多くのアプローチのいずれかを用いて得ることができる。生物学的ライブラリー及びペプトイドライブラリーによるアプローチはペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つのアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマー、又は化合物の小分子ライブラリーに適用可能である（Ｌａｍ（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｄｒｕｇ  ｄｅｓ．１２：１４５）。
【０２０９】
一実施形態では、被験化合物はＰＲ−ＴＲＡＰペプチド、ＰＲＳＦＬＬＮＲＮ、又はそのバリアントのペプチド模倣化合物であり得る。
【０２１０】
別の実施形態では、被験化合物は、組換えＤＮＡ技術を用いて作製された「組換え抗体」、例えばバクテリオファージによって発現された抗体を指す。この用語は、抗体又はその一部をコードするＤＮＡ分子の合成によって作製された抗体であって、そのＤＮＡ分子が抗体タンパク質又はその一部又は抗体を特定するアミノ酸配列を発現するものであり、ＤＮＡ又はアミノ酸配列が当該技術分野で利用可能な周知の合成ＤＮＡ技術又は合成アミノ酸配列技術を用いて得られたものである、抗体を意味するとも解釈されるべきである。組換え抗体は、ストリンジェントな結合条件下でコンビナトリー抗体ライブラリーをスクリーニングすることにより、増加された又は向上されたアフィニティーに関して選択され得る。例えば、キメラ鎖又はヒト化鎖をコードする核酸を発現させて近接するタンパク質を産生させることができる。例えば、Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第４，８１６，５６７号；Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．の欧州特許第０１２５０２３（Ｂ１）号；Ｂｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第４，８１６，３９７号；Ｂｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ，の欧州特許第０１２０６９４（Ｂ１）号；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．の国際公開公報第８６／０１５３３号；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．の欧州特許第０１９４２７６（Ｂ１）号；Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．に発行された米国特許第５，２２５，５３９号；Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．に発行された欧州特許第０２３９４００（Ｂ１）号；Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．の欧州特許第０４５１２１６（Ｂ１）号；及びＰａｄｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．の欧州特許第０５１９５９６（Ａ１）号参照。また、霊長類化（ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ）抗体に関してはＮｅｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：１４５５−１４６０（１９９２）、単鎖抗体に関してはＬａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第４，９４６，７７８号及びＢｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：４２３−４２６（１９８８））を参照されたい。これらの特許文献及び参照文献の内容全体を参照により本明細書に援用する。
【０２１１】
別の実施形態では、被験化合物はアプタマーを指す。アプタマーは、通常、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ヌクレオチド類似体、修飾ヌクレオチド、又は上記のいずれかの混合物を含む。アプタマーは、天然であってもよく、合成手段又は組換え手段によって作製されてもよい。アプタマー配列は、典型的には、ＳＥＬＥＸ（試験管内進化法（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ））によって見出される。この方法は、標的分子に高い特異性で結合することができる核酸分子のインビトロでの選択を提供するものであり、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ」という名称の米国特許第５，４７５，０９６号、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ」という名称の米国特許第５，２７０，１６３号（国際公開公報第９１／１９８１３号も参照されたい）及びより最近の「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ａｐｔａｍｅｒｓ  ｗｉｔｈ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｏｆｆ−ｒａｔｅｓ」という米国特許出願第２００９／０００４６６７号に更に詳細に記載されており、これらのそれぞれを参照により本明細書に援用する。核酸アプタマーは、その内容全体を参照により本明細書に援用する米国特許出願第２００８／０１８８３７７号「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｈａｔ  ｔａｒｇｅｔ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｍｏｔｉｆｓ」に記載されているように、構造的に定義されたＲＮＡモチーフ又はＤＮＡモチーフのライブラリーをスクリーニングすることでも選択され得る。
【０２１２】
被験化合物は、配列特異的なＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）を仲介することができる短いオリゴヌクレオチド等の核酸分子、例えば低分子（又は小分子）干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉オリゴヌクレオチド、低分子干渉核酸、低分子干渉修飾オリゴヌクレオチド、化学修飾ｓｉＲＮＡ、転写後遺伝子サイレンシングＲＮＡ（ｐｔｇｓＲＮＡ）、翻訳サイレンシング等であってもよい。
【０２１３】
分子ライブラリーを合成する方法の例は当該技術分野に見出すことができ、例えば、ＤｅＷｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６９０９；Ｅｒｂ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８；Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．ｌｎｔ  Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１；及びＧａｌｌｏｐ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３に見出すことができる。
【０２１４】
化合物のライブラリーが提示されるのは、溶液中（例えばＨｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２−４２１）、ビーズ上（Ｌａｍ（１９９１）．Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４）、チップ上（Ｆｏｄｏｒ（１９９３）．Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５５５−５５６）、細菌上（Ｌａｄｎｅｒの米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子上（Ｌａｄｎｅｒの米国特許第５，２２３，４０９号）、プラスミド上（Ｃｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：１８６５−１８６９）、又はファージ上（Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ（１９９０）．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０；Ｄｅｖｌｉｎ（１９９０）．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４−４０６；Ｃｗｉｒｌａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：６３７８−６３８２；Ｆｅｌｉｃｉ（１９９１）．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１−３１０；前述のＬａｄｎｅｒ）であり得る。
【０２１５】
一実施形態では、アッセイは、ＰＡＲ−１及び／又はＭＭＰ−１タンパク質、又はその生物学的活性部分を発現する細胞を被験化合物と接触させ、被験化合物がＰＡＲ−１及び／又はＭＭＰ−１の活性を修飾する能力を測定する、細胞ベースのアッセイである。被験化合物がＰＡＲ−１活性を修飾する能力の測定は、例えば前述したようにＲｈｏ又はＭＡＰＫのシグナル伝達活性をモニタリングすることで達成することができる。別の実施形態では、ＭＭＰ−１活性は、ＭＭＰ−１切断部位ＬＤ３９↓Ｐ４０ＲＳＦＬでの切断レベルを測定することでモニタリングされ得る。細胞は、例えば哺乳動物起源、例えばヒト起源のものであり得る。好ましい実施形態では、細胞はヒト血小板である。ＰＡＲ−１又はＭＭＰ−１への被験化合物のインビボ結合が評価され得る。これは、例えば、化合物をラジオアイソトープ又は酵素標識にカップリングさせて、複合体中の標識化合物を検出することでＰＡＲ−１及び／又はＭＭＰ−１への化合物の結合を測定できるようにすることで達成することができる。あるいは、ＰＡＲ−１又はＭＭＰ−１をラジオアイソトープ又は酵素標識にカップリングさせて、ＭＭＰ−１によるＰＡＲ−１の切断を被験化合物が修飾する能力をモニタリングしてもよい。例えば、化合物を直接又は間接的に１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、又は３Ｈで標識し、放射性放出の直接計数又はシンチレーション計数によってラジオアイソトープを検出してもよい。あるいは、化合物を、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、又はルシフェラーゼで酵素標識し、適切な基質の生成物への変換を測定することで酵素標識を検出してもよい。
【０２１６】
相互作用物質（ｉｎｔｅｒａｃｔａｎｔ）のいずれかを標識して、又は標識せずに、被験化合物がＰＡＲ−１又はＭＭＰ−１と相互作用する能力を評価することができる。例えば、マイクロフィジオメーターを用いることで、化合物又はＰＡＲ−１若しくはＭＭＰ−１を標識せずに、化合物とＰＡＲ−１又はＭＭＰ−１との相互作用を検出することができる（ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ，Ｈ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：１９０６−１９１２）。本発明において、「マイクロフィジオメーター」（例えばＣｙｔｏｓｅｎｓｏｒ）とは、細胞がその環境を酸性化する速度を光処理可能な電位差センサー（ｌｉｇｈｔ−ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ  ｐｏｔｅｎｔｉｏｍｅｔｒｉｃ  ｓｅｎｓｏｒ：ＬＡＰＳ）を用いて測定する分析機器である。この酸性化速度の変化は、化合物とＰＡＲ−１又はＭＭＰ−１の相互作用の指標として使用することができる。
【０２１７】
更に別の実施形態では、ＰＡＲ−１又はＭＭＰ−１タンパク質又はその生物学的活性部分を被験化合物と接触させ、被験化合物がＰＡＲ−１又はＭＭＰ−１タンパク質又はその生物学的活性部分に結合する能力を評価する、無細胞アッセイが提供される。本発明のアッセイに使用されるＰＡＲ−１又はＭＭＰ−１タンパク質の好ましい生物学的活性部分としては、ＰＡＲ−１又はＭＭＰ−１分子の間の相互作用に関与する断片が含まれる。
【０２１８】
無細胞アッセイでは、標的遺伝子タンパク質と被験化合物との反応混合物を、この２つの要素が相互作用及び結合することで除去及び／又は検出可能な複合体が形成されのに十分な条件及び時間で調製する。２分子間の相互作用は、例えば蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）（例えば、Ｌａｋｏｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，６３１，１６９号；Ｓｔａｖｒｉａｎｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第４，８６８，１０３号参照）を用いても検出することができる。第１の「ドナー」分子上の蛍光団標識の選択は、それが放射した蛍光エネルギーが第２の「アクセプター」分子上の蛍光標識によって吸収され、それが今後は吸収したエネルギーによって蛍光を発することができるようになされる。あるいは、「ドナー」タンパク質分子は、単純にトリプトファン残基の自然蛍光エネルギーを利用してもよい。異なる波長の光を放出する標識を選ぶことで、「アクセプター」分子標識を「ドナー」分子標識と区別することができる。標識間のエネルギー移動の効率は分子を隔てる距離に関係することから、分子間の空間関係を評価することができる。分子間で結合が起こる状況下で、アッセイ中の「アクセプター」分子標識の蛍光発光は最大となるはずである。ＦＲＥＴの結合事象は、当該技術分野で周知の標準的な蛍光検出手段によって（例えば蛍光光度計を使用して）容易に測定することができる。
【０２１９】
別の実施形態では、ＰＡＲ−１又はＭＭＰ−１タンパク質が被験化合物に結合する能力の測定は、リアルタイム生体分子相互作用解析（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：ＢＩＡ）を用いて実現することができる（例えばＳｊｏｌａｎｄｅｒ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｕｒｂａｎｉｃｚｋｙ，Ｃ．（１９９１）．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６３：２３３８−２３４５及びＳｚａｂｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：６９９−７０５参照）。「表面プラズモン共鳴」又は「ＢＩＡ」は、相互作用物質を全く標識せずにリアルタイムで生体特異的相互作用を検出する（例えばＢＩＡｃｏｒｅ）。結合表面で質量が変化する（結合事象を示す）と、表面近くの光の屈折率が変化し（表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の光学現象）、生体分子間リアルタイム反応の指標として用いることができる検出可能なシグナルが生じる。
【０２２０】
一実施形態では、標的遺伝子産物又は被験化合物は、固相にアンカーされる。固相にアンカーされた標的遺伝子産物／被験化合物複合体は、反応終了時に検出することができる。好ましくは、標的遺伝子産物は、固体表面にアンカーすることができ、被験化合物（アンカーされていない）は、本明細書に記載の検出可能な標識で直接又は間接的に標識することができる。
【０２２１】
ＰＡＲ−１、ＭＭＰ−１、ＰＡＲ−１の抗体、ＭＭＰ−１の抗体、又はその標的化合物のいずれかを固定化して、タンパク質の一方又は両方の非複合体形態から複合体形態を分離することを容易化すると共にアッセイの自動化に適応させることが望まれ得る。ＰＡＲ−１若しくはＭＭＰ−１への被験化合物の結合又はＰＡＲ−１若しくはＭＭＰ−１タンパク質と候補化合物の相互作用は、反応物を入れるのに適した任意の容器中で達成することができる。そのような容器の例としては、マイクロタイタープレート、試験管、及び微小遠心管が含まれる。一実施形態では、タンパク質の一方又は両方をマトリックスに結合させるドメインが付加された融合タンパク質を作製してもよい。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとＰＡＲ−１又はＭＭＰ−１との融合タンパク質は、グルタチオンセファロースビーズ（ミズーリ州セントルイスのシグマケミカル社製）又はグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレートに吸着させることができ、次いでこれを、被験化合物と、又は被験化合物及び非吸着標的タンパク質若しくはＰＡＲ−１タンパク質若しくはＭＭＰ−１タンパク質のいずれかと混合し、この混合物を複合体形成をもたらす条件下（例えば、生理的条件の塩及びｐＨ）でインキュベートする。インキュベーション後、ビーズ又はマイクロタイタープレートのウェルを洗浄して未結合成分を全て除去し、ビーズの場合にはマトリックスを固定化し、例えば上記のように直接又は間接的に複合体を測定する。あるいは、複合体をマトリックスから解離させ、ＰＡＲ−１又はＭＭＰ−１の結合又は活性のレベルを標準的な技術を用いて測定することができる。
【０２２２】
ＰＡＲ−１タンパク質若しくはＭＭＰ−１タンパク質又は被験化合物を固定化するためのその他の技術として、当該技術分野で公知の技術を用いたビオチンＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）からの調製（例えばビオチン化キット、イリノイ州ロックフォードのピアース・ケミカル社（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）製）及びストレプトアビジンでコーティングされた９６ウェルプレート（ピアース・ケミカル社（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）製）のウェル中での固定化を挙げることができる。
【０２２３】
アッセイを行うために、アンカーされた構成要素を含むコーティングされた表面に、固定化されていない構成要素を添加する。反応が完了した後、形成された全ての複合体が固体表面上に固定化されたまま維持される条件下で未反応の構成要素を除去する（例えば洗浄による）。固体表面にアンカーされた複合体の検出は、いくつかの方法で実現することができる。前もって固定化されていない構成要素が予め標識されている場合、表面に固定化された標識の検出は、複合体の形成を意味する。前もって固定化されていない構成要素が予め標識されていない場合、間接標識を用いて、表面にアンカーされた複合体を検出することができ、例えば、固定化構成要素に特異的な標識抗体を使用して検出することができる（この抗体は直接標識されてもよく、例えば、標識抗Ｉｇ抗体で間接標識されてもよい）。
【０２２４】
一実施形態では、このアッセイは、ＰＡＲ−１又はＭＭＰ１タンパク質と反応性であるが被験化合物へのＰＡＲ−１又はＭＭＰ−１タンパク質の結合には干渉しない抗体を用いて行われる。そのような抗体をプレートのウェルに誘導体化し、結合していない標的又はＰＡＲ−１若しくはＭＭＰ−１タンパク質を抗体のコンジュゲーションによりウェルに捕捉することができる。そのような複合体を検出する方法には、ＧＳＴ固定化複合体についての上記の方法に加えて、ＰＡＲ−１又はＭＭＰ−１タンパク質と反応性の抗体を用いた複合体の免疫検出及びＰＡＲ−１若しくはＭＭＰ−１タンパク質又は標的分子に関連する酵素活性を検出することによる酵素結合アッセイが含まれる。
【０２２５】
あるいは、無細胞アッセイを液相で行ってもよい。そのようなアッセイでは、いくつかの標準的な技術のいずれかにより、未反応構成要素から反応産物が分離され、そのような技術としては、限定されるものではないが分画遠心分離（例えばＲｉｖａｓ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｍｉｎｔｏｎ，Ａ．Ｐ．（１９９３）．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  １８：２８４−７参照）；クロマトグラフィー（ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー）；電気泳動（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９９９，Ｊ，Ｗｉｌｅｙ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照）；及び免疫沈降（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９９）．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照）が含まれる。そのような樹脂及びクロマトグラフィー技術は当業者に公知である（例えば、Ｈｅｅｇａａｒｄ，Ｎ．Ｈ．（１９９８）．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ  １１：１４１−８；Ｈａｇｅ，Ｄ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｔｗｅｅｄ，Ｓ．Ａ．（１９９７）．Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｂ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｓｃｉ  Ａｐｐｌ．６９９：４９９−５２５参照）。更に、本明細書に記載されているように、溶液から複合体を更に精製することなく結合を検出するために、蛍光エネルギー移動も便利に使用することができる。
【０２２６】
好ましい実施形態では、アッセイは、ＰＡＲ−１タンパク質又はその生物学的活性部分とＭＭＰ−１を接触させてアッセイ混合物を形成する工程、アッセイ混合物を被験化合物と接触させる工程、及び被験化合物がＰＡＲ−１又はその生物学的活性部分に優先的に結合するかＰＡＲ−１の活性を修飾する能力を測定する工程を含む。
【０２２７】
本発明の標的遺伝子産物は、タンパク質等の１又は複数の細胞性又は細胞外高分子とインビボで相互作用し得る。このことを議論するに当たり、本明細書中ではそのような細胞性及び細胞外高分子を「結合パートナー」と呼ぶ。そのような相互作用を撹乱する化合物は、標的遺伝子産物の活性調節に有用であり得る。そのような化合物としては、限定されるものではないが、抗体、ペプチド、小分子等の分子が含まれ得る。この実施形態での使用に好ましい標的遺伝子／産物は、本明細書で特定されるＰＡＲ−１又はＭＭＰ−１遺伝子である。別の実施形態では、本発明は、被験化合物が、ＰＡＲ−１又はＭＭＰ−１標的分子の上流エフェクターの活性修飾を介してＰＡＲ−１又はＭＭＰ−１タンパク質の活性を修飾する能力を測定する方法を提供する。例えば、既に記載したように、適切な標的に対するエフェクター分子の活性を測定してもよく、適切な標的へのエフェクターの結合を測定してもよい。
【０２２８】
標的遺伝子産物とその細胞性又は細胞外結合パートナーとの相互作用に干渉する化合物を同定するには、標的遺伝子産物と結合パートナーとを含む混合物を、これら２つの産物が複合体を形成できる条件下で、そのために十分な時間かけて、調製する。阻害剤を試験するために、被験化合物の存在下又は非存在下で反応混合物を用意する。被験化合物は最初から反応混合物に含めてもよく、標的遺伝子及びその細胞性又は細胞外結合パートナーを添加した後の時点で添加してもよい。対照の反応混合物を、被験化合物なしで又はプラセボと一緒にインキュベートする。次いで、標的遺伝子産物と細胞性又は細胞外結合パートナーの間の任意の複合体形成を検出する。被験化合物を含む反応混合物中では複合体が形成されずに対照反応中で複合体が形成された場合、このことは被験化合物が標的遺伝子産物と相互作用性結合パートナーとの相互作用に干渉することを示している。更に、被験化合物と正常標的遺伝子産物とを含む反応混合物内での複合体形成を、被験化合物と変異標的遺伝子産物とを含む反応混合物内での複合体形成と比較してもよい。この比較は、変異標的遺伝子産物の相互作用は撹乱させるが正常な標的遺伝子産物の相互作用は撹乱させない化合物を同定することが望ましい場合に重要であり得る。
【０２２９】
更に別の態様では、ＰＡＲ−１又はＭＭＰ−１タンパク質をツーハイブリッドアッセイ又はスリーハイブリッドアッセイ（例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）．Ｃｅｌｌ  ７２：２２３−２３２；Ｍａｄｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２０４６−１２０５４：Ｂａｒｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．１４：９２０−９２４；Ｉｗａｂｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ８：１６９３−１６９６；及びＢｒｅｎｔの国際公開公報第９４／１０３００号参照）における「ベイトタンパク質」として用いて、ＰＡＲ−１又はＭＭＰ−１に結合又は相互作用してＰＡＲ−１／ＭＭＰ−１機能を妨げる他のタンパク質又はペプチドを同定することができる。
【０２３０】
ツーハイブリッドシステムは、ほとんどの転写因子がモジュール式であって分離可能なＤＮＡ結合ドメイン及び活性化ドメインからなることに基づく。簡潔には、このアッセイは、２つの異なるＤＮＡコンストラクトを用いる。一方のコンストラクトでは、ＰＡＲ−１又はＭＭＰ−１タンパク質をコードする遺伝子が、既知の転写因子（例えばＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合されている。もう一方のコンストラクトでは、非特定タンパク質（「プレイ」又は「サンプル」）をコードする、ＤＮＡ配列ライブラリーからのＤＮＡ配列が、既知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合されている（あるいは、ＰＡＲ−１又はＭＭＰ−１タンパク質を活性化ドメインに融合させてもよい）。「ベイト」タンパク質及び「プレイ」タンパク質がインビボで相互作用してＰＡＲ−１依存性の複合体を形成することができる場合、転写因子のＤＮＡ結合ドメインと活性化ドメインが近接する。この近接により、転写因子応答性の転写調節部位に作動可能に連結されたレポーター遺伝子（例えばｌａｃＺ）の転写が可能になる。レポーター遺伝子の発現は検出することができ、機能的転写因子を含む細胞コロニーを単離して用い、ＰＡＲ−１タンパク質と相互作用するタンパク質／ペプチドをコードするクローニングされた遺伝子を得ることができる。
【０２３１】
別の実施形態では、ＰＡＲ−１発現の修飾因子（ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）を同定する。例えば、細胞又は無細胞混合物を候補化合物と接触させ、候補化合物非存在下でのＰＡＲ−１のｍＲＮＡ又はタンパク質の発現レベルに対するＰＡＲ−１のｍＲＮＡ又はタンパク質の発現を評価する。候補化合物非存在下よりも存在下でＰＡＲ−１又はＭＭＰ−１のｍＲＮＡ又はタンパク質の発現が少ない（統計的に有意に少ない）場合、候補化合物がＰＡＲ−１／ＭＭＰ−１のｍＲＮＡ又はタンパク質発現の阻害剤として同定される。ＰＡＲ−１／ＭＭＰ−１のｍＲＮＡ又はタンパク質発現レベルは当該技術分野で公知の方法によって測定することができる。一実施形態では、被験化合物は、ＰＡＲ−１又はＭＭＰ−１遺伝子発現を阻害するＲＮＡｉ又はマイクロＲＮＡであり得る。
【０２３２】
更に別の実施形態では、本明細書に記載のアッセイは、ＭＭＰ−１によって生じるテザーリガンドの結合部位を特定するために使用され得る（図９Ａ参照）。ＰＲ−ＴＲＡＰペプチドがＰＡＲ−１の１又は複数の細胞外ループと相互作用するかどうかが調べられるように細胞ベースのアッセイ又は無細胞アッセイを設計することができる。次いで、標的ポリペプチド配列のアイデンティティーを当該技術分野で確立されている方法を用いた標的配列の部位特異的突然変異誘発によって検証することができる。次いで、被験化合物存在下でのツーハイブリッドアッセイ等のインビボ結合アッセイを用いて、テザーリガンドとこの標的配列の相互作用を特異的に撹乱する化合物について薬剤のライブラリーをスクリーニングすることができる。あるいは、候補化合物を、前述したように、活性化ＭＭＰ−１又はＰＲ−ＴＲＡＰペプチドリガンドの存在下で血小板ＰＡＲ−１シグナル伝達を抑止する能力についてスクリーニングしてもよい。例えば、候補被験化合物を、上記で詳細に説明したように、ヒト血小板中でのＲｈｏ−ＧＴＰ又はリン酸化ｐ３８ＭＡＰＫのシグナル伝達活性を阻害する能力についてスクリーニングしてもよい。別の実施形態では、前述したように候補被験化合物が血小板凝集を阻害する能力もアッセイされ得る。ＰＡＲ−１シグナル伝達活性に応答性であるＧＦＰ等のレポーター分子は関連化合物のスクリーニングを容易にする。
【０２３３】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載したアッセイの２つ以上の組合せに関する。例えば、細胞ベースのアッセイ又は無細胞アッセイを用いて修飾剤（ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）を同定することができ、この修飾剤がＰＡＲ−１タンパク質の活性を修飾する能力をインビボで、例えば血栓性病態のモデル動物等の動物中で、確認することができる。前述したモルモット血栓症モデルに加えて、例えばその内容全体を参照により本明細書に援用する米国特許出願第２００５／００２５７０５号及び同第２００５／０１２０３９２号に記載されているように、種々の公知の血栓症モデル動物を用いて、血栓症に対するインビボでの被験化合物の有効性を評価することができる。
【０２３４】
本発明は更に、上記のスクリーニングアッセイにより同定される新規な薬剤に関する。したがって、本明細書中に記載したようにして同定された薬剤（例えばＰＡＲ−１若しくはＭＭＰ−１修飾剤、アンチセンスＰＡＲ−１若しくはＭＭＰ−１核酸分子、ＰＡＲ−１特異的若しくはＭＭＰ−１特異的抗体、又はＰＡＲ−１若しくはＭＭＰ−１の結合パートナー）を適切なモデル動物中で更に使用してそのような薬剤を用いた処置の有効性、毒性、副作用、又は作用機序を決定することも本発明の範囲に含まれる。更に、上記のスクリーニングアッセイによって同定された新規な薬剤は、本明細書に記載するように、処置に使用することができる。
【０２３５】
ＩＩ−（Ｆ）アポリポタンパク質Ｅ（ａｐｏＥ）欠損マウスにおけるアテローム性動脈硬化病変の発症及び脈管の脈管の血管新生に対するＭＭＰ１−ＰＡＲ１の遮断の効果
アテローム性動脈硬化病変の発症におけるＭＭＰ−１及びＰＡＲ１の役割は、アポリポタンパク質Ｅ（ａｐｏＥ）欠損マウス等のアテローム性動脈硬化症のモデル動物を用いて研究することができる。
【０２３６】
７週齢のＢ６．１２９Ｐ２−Ａｐｏｅｔｍ１Ｕｎｃ／Ｊマウス２５頭を３群に分け、１５週間にわたり高脂質／高コレステロール食（脂質２１％、コレステロール０．２１％）（Ｄ１２０７９Ｂ、リサーチ・ダイエット社（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ）製）を適宜与えた。第１群には、対照群として用いられ且つビヒクル（２０％ＤＭＳＯを含む１×ＰＢＳ）を投与された８頭のマウス（ｎ＝８）が含まれる。第ＩＩ群には、５ｍｇ／ｋｇの投与量のＭＭＰ阻害剤Ｉ、ＦＮ−４３９（カルビオケム社製）で処置された８頭のマウス（ｎ＝８）が含まれる。最後に、第ＩＩＩ群には、１０ｍｇ／ｋｇのＰ１ｐａｌ−７ｐｅｐｄｕｃｉｎリポペプチドで処置された９頭のマウス（ｎ＝９）が含まれる。ＭＭＰ阻害剤Ｉ（ＦＮ−４３９）は、ＭＭＰ−１及びＭＭＰ−８の阻害剤（ＩＣ５０＝１μＭ）であり、これよりはるかに高い濃度が必要であるがＭＭＰ−９及びＭＭＰ−３も阻害することができる（それぞれＩＣ５０＝３０μＭ及び１５０μＭ）。Ｐ１−ｐａｌ７は、ヒトＰＡＲ１の３番目の細胞内ループ（ｉ３）に基づく細胞透過性ｐｅｐｄｕｃｉｎリポペプチドであり、ＰＡＲ１シグナル伝達のアンタゴニストとして作用する。全てのマウスは、１週間に６日、１００μｌの対応する処置を皮下注射された。処置の最後、絶食４時間後に、マウスをケタミン／キシラジンで麻酔し、１０％ホルマリンで圧力固定（ｐｒｅｓｓｕｒｅ−ｆｉｘ）した。各マウスの心臓及び大動脈を単離して取り出し、１０％ホルマリン中で２日間固定し、外膜脂肪を取った。大動脈の腹部領域を切断し、ホールマウント免疫組織化学的検査に用いた。「大動脈弓／胸部」領域及び大動脈の残りの「腹部／腸骨」領域を切開し、解剖用黒色ワックス（ｄｉｓｓｅｃｔｉｎｇ  ｂｌａｃｋ  ｗａｘ）上にピン止めし、オイルレッドＯによる「ｅｎ  ｆａｃｅ」染色に用いた。
【０２３７】
１５週間の期間中、各マウスの体重を４時間の絶食後に毎週測定した。３つの異なる処置群の間でマウスの体重に有意な差はなかった（図１０Ａ）。このことは、処置がマウスの摂食又は健康に影響を与えなかったであろうことを示している。ａｐｏＥ欠損マウスにおけるアテローム性動脈硬化病変の発症は、血流中のコレステロールの蓄積によって誘導した。したがって、異なる処置を受けているマウスの脂質プロフィールを追跡することは非常に重要である。図１０Ｂに示すように、マウスの全血漿コレステロールは処置の最初の１週間に３５０ｍｇ／ｄｌから約６００〜８００ｍｇ／ｄｌに上昇し、処置の残りの期間、９００ｍｇ／ｄｌ近くに留まった。摂食による変動の可能性を排除するために、１週間毎の同じ日の朝に、４時間の絶食期間後に血漿サンプルを採った。異なる処置群の間で有意な差は観察されず、このことは、ＭＭＰ又はＰＡＲ１の阻害がマウスの脂質代謝に影響しなかったことを示している。
【０２３８】
アテローム性プラーク形成の程度を調べるために、ピン止めした大動脈を最初に１０％ホルマリン中で固定して１×ＰＢＳ中に維持した。次いで、マウスの大動脈を、脂質を赤色に染色するオイルレッドＯを用いた「ｅｎ  ｆａｃｅ」染色に供した。簡潔には、サンプルからＰＢＳを排液し、染色液を４５分間添加した。染料を排液し、バックグラウンドを除くためにサンプルを最初に７０％エタノールで、次いで水で洗浄した。染色された大動脈のデジタル写真を撮り、ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓソフトウェア（モレキュラー・デバイス社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）製）を用いて全大動脈領域及び病変領域を決定して定量した。「大動脈弓／胸部」及び「腹部／腸骨」領域について、病変領域と全大動脈領域の比を計算した。各マウスの大動脈を単離して３つのセクションに分けた。腹部セクション（腎動脈の前及び後）を分離し、ホールマウント免疫組織化学的検査に用いた。残りのセクションは、１つは大動脈弓から腸間膜動脈のもの（大動脈部）であり、もう１つは腎臓動脈の後ろから腸骨動脈のもの（腹部）である。大動脈のこれらのセクションを「ｅｎ  ｆａｃｅ」染色及びアテローム性動脈硬化病変領域の評価に用いた。
【０２３９】
セクションの全領域に対する割合で表した、大動脈の大動脈部セクション中及び腹部セクション中の病変領域を図１１に示す。大動脈部セクションでは、平均病変領域は、対照（ビヒクル）群で全領域の１２．９％、ＦＮ−４３９群で全領域の１０．７％、Ｐ１ｐａｌ−７群で全領域の８．１％である。Ｐ１ｐａｌ−７群の病変領域は対照群と比べて有意に小さい（ｐ＜０．００５）。
【０２４０】
大動脈の腹部セクションでは、平均病変領域は対照群で８．９％、ＦＮ−４３９群で４．１％、Ｐ１ｐａｌ−７群で２．３％である。Ｐ１ｐａｌ−７群の病変領域は対照群と比べて有意に小さい（ｐ＜０．０５）。両方のセクションにおいて、ＦＮ−４３９群は対照群と比べて病変が小さい傾向があるが、今回のサンプルサイズでは有意でなかった。
【０２４１】
全体として、Ｐ１ｐａｌ−７ｐｅｐｄｕｃｉｎリポペプチドを用いたＰＡＲ１シグナル伝達の阻害は、ａｐｏＥ欠損マウスにおけるアテローム性動脈硬化の負担を有意に低減し、一方、ＭＭＰ活性を阻害するとアテローム性動脈硬化病変が小さくなる傾向が見られた。これらの知見は、大動脈血管中でのアテローム性動脈硬化の進行においてＰＡＲ１が重要な役割を果たしていることを強く示唆している。ヒト血小板と異なりマウス血小板はＰＡＲ１を発現しないことから、上記の観察が、ｐｅｐｄｕｃｉｎリポペプチドの抗血栓作用によるものではなく、血管組織における特定の経路の不活性化によるものであるという結論が導かれる。
【０２４２】
ＩＩ−（Ｇ）血管新生
脈管形成は、アテローム性動脈硬化症の進行を促進し得、プラークの不安定性及び破綻に寄与し得る。したがって、ＭＭＰ−ＰＡＲ１シグナル伝達は、脈管形成を刺激することでアテローム性動脈硬化の形成に寄与し得る。そこで、高脂肪食を１５週間与え、ＭＭＰ−１コラゲナーゼ阻害剤ＭＭＰ  Ｉｎｈ−１（ＦＮ−４３９）又はＰＡＲ１アンタゴニストＰ１ｐａｌ−７のいずれかで処置したａｐｏＥ−／−マウスの大動脈外膜における脈管形成を評価した。次いで、マウスをケタミン／キシラジンで麻酔し、１０％ホルマリンで圧力固定した。腹部大動脈を単離して取り出し、１０％ホルマリンで１時間固定し、外膜脂肪を取った。その後、以下の手法を用いて、腹部大動脈を内皮細胞マーカーであるＣＤ３１についてホールマウント免疫染色し、複数の共焦点セクションから３次元投影画像を構築した。簡潔には、組織を０．３％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含む５％ヤギ血清のＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳＴ）で１時間ブロッキングし、ＴＢＳＴで１０００倍希釈した一次抗体と一緒に４℃で一晩インキュベートした。ＴＢＳＴで複数回洗浄した後、ＴＢＳＴで希釈した蛍光タグ化二次抗体と一緒に組織を４時間インキュベートした。組織を洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで１０分間後固定した。次いで、大動脈を縦方向に切断し、外膜側を上側にして顕微鏡用スライド上に広げた。組織を、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入剤を用いてホールマウントし、Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ２共焦点顕微鏡（ツァイス社製）を用いて画像化した。共焦点画像から、Ｚ軸方向に積み重ねた３次元投影画像を構築した。ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ  Ｊを用いて画像の定量を行った。使用した抗体は、ハムスター抗マウスＰＥＣＡＭ−１（ケミコン社製）及びＣｙ３−抗ハムスター（ジャクソン・イムノラボ社（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌａｂｓ）製）である。
【０２４３】
図１２は、図１０と同様にビヒクル（図１２Ａ）、Ｐ１ｐａｌ−７（図１２Ｂ）、ＭＭＰ  Ｉｎｈ−Ｉ（ＦＮ−４３９）（図１２Ｃ）で処置したＡｐｏＥ−／−マウスの腹部大動脈におけるＣＤ３１についてのマウント免疫染色を示す図である。Ｐ１ｐａｌ−７処置及びＦＮ−４３９処置は両方ともＣＤ３１陽性の血管の量を有意に減少させた（図１２Ｂ及び１２Ｃ）。ＣＤ３１染色の定量（図１３Ａ）を、図１０と同様にビヒクル、Ｐ１ｐａｌ−７、又はＭＭＰ１  Ｉｎｈ−Ｉ（ＦＮ−４３９）で処置したＡｐｏＥ−／−マウスの腹部大動脈の血管束（図１３Ｂ）及び分岐点（図１３Ｃ）において評価した。脈管形成は、大動脈の外膜全体及び別個の位置に現れる血管束で均一ではなく、アテローム性プラークの位置に対応していると思われる。Ｐ１ｐａｌ−７処置及びＦＮ−４３９処置はどちらも大動脈外膜中の血管束の数を有意に減少させた（図１３）。新生血管の構造を評価するために、分岐点を数えた。Ｐ１ｐａｌ−７及びＦＮ−４３９処置は、血管単位面積当たりの分岐点の数を有意に抑えた。これらの知見は、ＭＭＰ−１及びＰＡＲ１の両方がプラーク脈管形成を促進することを示唆している。
【０２４４】
ＩＩ−（Ｈ）その他のＭＭＰ−１／ＰＡＲ−１シグナル伝達阻害剤
ＭＭＰ−１／ＰＡＲ−１シグナル伝達経路は、限定されるものであるがＭＭＰ−１又はＭＭＰ−２の阻害剤等の、ＭＭＰ−１  ＰＡＲ−１シグナル伝達経路のその他の潜在的阻害剤を用いて、血小板中で阻害され得る。血小板凝集阻害におけるこれらの化合物の有効性は、本明細書に記載の細胞ベースのアッセイ及び血栓性病態のモデル動物を用いて評価することができる。
【０２４５】
ＭＭＰは触媒ドメインに亜鉛原子を含み、機能するためにはカルシウムが必要であるため、キレート化化合物がＭＭＰ活性を阻害し得る。更に、天然基質を模倣した合成誘導体がＭＭＰ阻害剤として設計されている。カルボン酸誘導体；複素環構造；ペプチド骨格、ペプチド模倣骨格、又は非ペプチド骨格を有するヒドロキサマート部分；非ペプチド骨格を有するビフェニル部分；テトラサイクリン類似体等の複数のクラスの構造体が、ＭＭＰに対してインビトロ阻害活性を有する最も一般的な低分子量化合物である。
【０２４６】
ＭＭＰ−１阻害剤の非限定的な例としては、ＦＮ−４３９、組織メタロプロテアーゼ阻害剤（ＴＩＭＰ）、ＭＭＰ−２００、シペマスタット（ｒＩＮＮ、Ｒｏ  ３２−３５５５として及びロシュ社から販売されている仮商標Ｔｒｏｃａｄｅでも知られる）、アンコリノシドＢ〜Ｄ（Ｆｕｊｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，Ｖｏｌ．５７，Ｉｓｓｕｅ  ７，１２２９−１２３４，２００１）が含まれる。
【０２４７】
腫瘍適応症について臨床試験に入ったマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤としてはプリノマスタット（ＡＧ３３４０；アゴウロン社（Ａｇｏｕｒｏｎ）／ファイザー社）、ＢＡＹ  １２−９５６６（バイエル社）、バチミスタット（ＢＢ−９４；ブリティッシュ・バイオテク社（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｌｔｄ，））、ＢＭＳ−２７５２９１（以前のＤ２１６３；セルテック社（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）／ブリストル・マイヤーズ・スクイブ社（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ））、マリマスタット（ＢＢ２５１６；ブリティッシュ・バイオテク社、シェリング・プラウ社）、ＭＭＩ２７０（Ｂ）（以前のＣＧＳ−２７０２３Ａ；ノバルティス社）、及びメタスタット（ＣＯＬ−３；コラジェネックス社（ＣｏｌｌａＧｅｎｅｘ））、及びＲｏ  ３２−３５５５＆ＲＳ−１３０，８３０（ロシュ・バイオサイエンス社）が含まれる。
【０２４８】
本願の化合物及び治療応用物と共に使用され得る更なるＭＭＰ阻害剤は、その内容全体を参照により本明細書に援用するＤｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，Ｍａｒｋ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｆｌｏｙｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ，１９９９，９９（９），２７３５−２７７６及びＰｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｊｏｉｎｔ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｉｎ  ｒａｔｓ  ｂｙ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ＦＲ２５５０３１，Ｉｓｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（２００５）．１４４，１３３−１４３に開示されている。
【０２４９】
更なるＭＭＰ阻害剤としては、ＰＤ１６６７９３（アクソン・メドケム社（Ａｘｏｎ  ＭｅｄＣｈｅｍ）から入手可能；Ｈ  Ｌｅｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（２００８）．１５３，６７６−６８３が含まれる。
【０２５０】
本発明は更に、コラーゲンにより誘導される血小板活性化を妨げ、前記患者のプロテアーゼ活性化受容体−１（ＰＡＲ−１）の３９位のアスパラギン酸（Ｄ３９）と４０位のプロリン（Ｐ４０）の間でのＭＭＰ−１により仲介されるＰＡＲ−１の切断を修飾する本明細書に記載の薬剤と組み合わせることができるその他のペプチドアンタゴニストも想定する。合成三重らせんペプチド（ＴＨＰ）に基づくＭＭＰペプチド阻害剤が米国特許出願第２００８／０１２５３５４号に記載されている。ＰＡＲ−１抗体又はペプチドアンタゴニストがＰＣＴ出願国際公開公報第２００８／０１１１０７号に記載されている。これらの特許文献の内容全体を参照により本明細書に援用する。
【０２５１】
本発明はまた、本明細書に記載のＭＭＰ−１により仲介されるＰＡＲ−１切断の修飾因子と、１又は複数のＰＡＲ１ｐｅｐｄｕｃｉｎリポペプチド、例えばその内容全体を参照により本明細書に援用する米国特許公開第２００７／０１７９０９０に記載されているｐｅｐｄｕｃｉｎリポペプチド、との組合せも提供する。
【０２５２】
ＰＡＲ１ｐｅｐｄｕｃｉｎリポペプチドの例としては、ＰＡＲ−１の細胞内ループｉ１、ｉ２、ｉ３、又はｉ４から取られたポルペプチド配列を含むｐｅｐｄｕｃｉｎリポペプチドが含まれる。一実施形態では、本発明で使用されるｐｅｐｄｕｃｉｎリポペプチドは、パルミタート、ミリスタート、リトコラート、脂肪酸、ステロイド等であり得るＮ末端脂質を有し得る。別の実施形態では、本発明で使用されるｐｅｐｄｕｃｉｎリポペプチドは、パルミタート、ミリスタート、リトコラート、脂肪酸、ステロイド等であり得るＣ末端脂質を有し得る。
【０２５３】
ＰＡＲ１ｐｅｐｄｕｃｉｎリポペプチドの例を表１に示す。
【表１】
2012523438.tif 000003
【０２５４】
別の実施形態では、本発明は、ＰＡＲ−１シグナル伝達活性の小分子阻害剤を提供し、そのようなものとして、限定されるものであるが、化合物ＳＣＨ  ５３０３４８が含まれる。ＳＣＨ  ５３０３４８は、トロンビンが結合する血小板ＰＡＲ−１受容体をブロックするので、トロンビンにより誘導される血小板活性化を阻害する。そのため、トロンビン受容体アンタゴニスト（ＴＲＡ）に分類される。ＳＣＨ  ５３０３４８は、その内容全体を参照により本明細書に援用するＣｈｉｎｔａｌａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ  １０８，４３３−４３８（２００８）；Ｃｈａｃｋａｌａｍａｎｎｉｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００８，５１，３０６１−３０６４、及び公開されている米国特許出願第２００８／０２３４２３６号に更に記載されている。本開示中、化合物ＳＣＨ  ５３０３４８への参照は、ＳＣＨ  ５３０３４８の全ての異性体、エナンチオマー、及び化学的誘導体を含む。
【０２５５】
更に別の実施形態では、ＭＭＰ−１により仲介されるＰＡＲ−１シグナル伝達経路のアンタゴニストは、テトラサイクリン化合物又はドキシサイクリン等のテトラサイクリン誘導体であり得る。テトラサイクリンは広域抗生物質の一群である。これらは、４つの（「ｔｅｔｒａ−」）炭化水素環（「−ｃｙｃｌ−」）誘導体（「−ｉｎｅ」）からこのように名付けられた。より具体的には、これらは、「オクタヒドロテトラセン−２−カルボキサミド骨格を有するポリケチドのサブクラス」と定義される。これらはまとめて、基本構造：
【化１】
2012523438.tif 000004
を有する多環ナフタセンカルボキサミドの誘導体として知られる。ＭＭＰ−１により仲介されるＰＡＲ−１シグナル伝達経路の阻害活性について試験され得るテトラサイクリン誘導体の例としては、限定されるものではないが、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、リメサイクリン、メクロサイクリン、メタサイクリン、ミノサイクリン、ロリテトラサイクリン、及びチゲサイクリンが含まれる。テトラサイクリン誘導体の非限定的な例は、その内容を参照により本明細書に援用する米国特許第２，９８０，５８４号；同第２，９９０，３３１号；同第３，０６２，７１７号；同第３，１６５，５３１号；同第３，４５４，６９７号；同第３，５５７，２８０号；同第３，６７４，８５９号；同第３，９５７，９８０号；同第４，０１８，８８９号；同第４，０２４，２７２号；及び同第４，１２６，６８０号に記載されている。
【０２５６】
ＩＩＩ  薬物投与
ＭＭＰ−１により仲介されるＰＡＲ−１活性化の阻害剤は、標準的な薬学的実務に従い、単独で又は薬学的に許容されるキャリア、補形剤、若しくは希釈剤と共に医薬組成物に含めてヒトを含む哺乳動物に投与され得る。化合物は、経口投与されてよく、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、直腸、局所経路等による非経口投与でもよい。
【０２５７】
ＭＭＰ−１仲介ＰＡＲ−１活性化の阻害剤としては、本明細書に定義されるような公知のＭＭＰ−１又はＰＡＲ−１阻害剤が含まれる。
【０２５８】
化合物又は「（薬）剤（ａｇｅｎｔ）」は、１又は複数の他の公知の抗血栓剤と、又は例えばＴＰアンタゴニスト、トロンボキサンアンタゴニスト、ＡＤＰ受容体アンタゴニスト、第Ｘａ因子アンタゴニスト等の医薬品と併用され得る。併用する場合、２種以上の抗血栓剤が相加的又は相乗的に作用し得るので、組み合わせた抗血栓剤の１又は複数をより少ない用量で用いて所望の効果を得ることができると理解される。したがって、１又は複数の組み合わせた抗血栓剤の治療有効量は、抗血栓「薬剤」が単独で投与された場合の治療有効量の９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、又は２０％未満に相当し得る。２種以上の抗血栓剤は、同時に投与してもよく、異なる時点で投与してもよく、同じ投与経路で投与してもよく、異なる投与経路で投与してもよい。例えば、投与計画を調整するために、抗血栓剤は個別の用量単位で同時に又は協調的に異なる時点で別個に投与され得る。各物質は、上記と同様に別個の単位剤形に個々に製剤化してもよい。しかし、抗血栓剤の固定配合剤（ｆｉｘｅｄ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）が、特に経口投与のための錠剤又はカプセル剤の形態で、より便利であり、好ましい。したがって、本発明は、組み合わせて投与された時に各血栓「薬剤」が治療有効量存在する、２種以上の抗血栓剤を含む単位投与量製剤も提供する。
【０２５９】
活性成分を含む医薬組成物は、経口使用に適した形態、例えば錠剤、トローチ、ロゼンジ、水性若しくは油性の懸濁液、分散性の散剤若しくは顆粒剤、乳剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、又はシロップ剤若しくはエリキシル剤であってよい。経口使用が意図される組成物は、医薬組成物を製造するための当該技術分野で公知の任意の方法に従って調製することができ、そのような組成物は、薬学的に上品で口当たりの良い製剤を提供するために、甘味剤、香味剤、着色剤、及び保存剤からなる群から選択される１又は複数の薬剤を含み得る。錠剤は、錠剤の製造に適した非毒性の薬学的に許容される補形剤と混合した活性成分を含む。これらの補形剤は、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム、リン酸ナトリウム等の不活性希釈剤；造粒剤及び崩壊剤、例えば結晶性セルロース、クロスカルメロースナトリウム、コーンスターチ、又はアルギン酸；結合剤、例えばでんぷん、ゼラチン、ポリビニル−ピロリドン、又はアカシア；及び平滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、又はタルク、であり得る。錠剤は、コーティングされてなくてもよく、公知の技術でコーティングして薬物の不快な味を隠すか消化管での分解及び吸収を遅らせることでより長い期間作用が持続するようにしてもよい。例えば、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の水溶性の矯味材料又はエチルセルロース、酢酸酪酸セルロース等の時間遅延材料が使用され得る。
【０２６０】
経口使用のための製剤は、活性成分が不活性固体希釈剤、例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、カオリン等と混合された、硬ゼラチンカプセル剤として提供されてもよく、活性成分がポリエチレングリコール等の水溶性キャリアと又は例えばピーナッツ油、流動パラフィン、オリーブオイル等の油性溶媒と混合された、軟ゼラチンカプセル剤として提供されてもよい。
【０２６１】
水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に適した補形剤と混合された活性材料を含む。そのような補形剤としては、懸濁剤、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム、及びアラビアゴム（ｇｕｍ  ａｃａｃｉａ）並びに分散・湿潤剤が挙げられ、分散・湿潤剤は、天然のホスファチド、例えばレシチン、又はアルキレンオキシドと脂肪酸との縮合物、例えばステアリン酸ポリオキシエチレン、又はエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合物、例えばヘプタデカエチレン−オキシセタノール（ｏｘｙｃｅｔａｎｏｌ）、又はエチレンオキシドと脂肪酸に由来する部分エステル及びヘキシトールとの縮合物、例えばポリオキシエチレンソルビトールモノオレアート、又はエチレンオキシドと脂肪酸に由来する部分エステルと及びヘキシトール無水物との縮合物、例えばポリエチレンソルビタンモノオレアートであり得る。水性懸濁液は、１又は複数の保存剤、例えば、エチル又はｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾアート、１又は複数の着色剤、１又は複数の香味剤、及び１又は複数の甘味剤、例えばスクロース、サッカリン、又はアスパルテームも含み得る。
【０２６２】
油性懸濁液は、ラッカセイ油、オリーブオイル、ゴマ油、ヤシ油等の植物油中又は流動パラフィン等の鉱油中に活性成分を懸濁させることで製剤化され得る。油性懸濁液は、増粘剤、例えば蜜蝋、固形パラフィン、又はセチルアルコールを含み得る。前述したように甘味剤及び香味剤を添加して口当たりの良い経口剤を提供してもよい。これらの組成物は、ブチル化ヒドロキシアニソール、α−トコフェロール等の酸化防止剤を添加することで保存され得る。
【０２６３】
水の添加による水性懸濁液の調製に適した分散性の粉末及び顆粒は、分散・湿潤剤、懸濁「剤」、及び１又は複数の保存剤と混合された活性成分を提供する。好適な分散・湿潤剤及び懸濁剤は上記に例示されている。更なる補形剤、例えば甘味剤、香味剤、及び着色剤が存在してもよい。これらの組成物は、アスコルビン酸等の酸化防止剤を添加することで保存され得る。
【０２６４】
本発明の医薬組成物は、水中油型エマルションの形態であってもよい。油相は、植物油、例えばオリーブオイル若しくはラッカセイ油、又は流動パラフィン等の鉱油、又はこれらの混合物であってよい。好適な乳化剤は、天然のホスファチド、例えば大豆レシチン、並びに脂肪酸及びヘキシトール無水物に由来するエステル又は部分エステル、例えばソルビタンモノオレアート、並びに前記部分エステルとエチレンオキシドの縮合物、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレアートであり得る。エマルションは甘味剤、香味剤、保存剤、及び酸化防止剤も含み得る。
【０２６５】
シロップ剤及びエリキシル剤は、甘味剤、例えばグリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、又はスクロースと一緒に製剤化され得る。そのような製剤は、粘滑剤、保存剤、香味剤、着色剤、及び酸化防止剤を含んでもよい。
【０２６６】
医薬組成物は、無菌の注射可能な水溶液の形態であってよい。使用され得る許容可能なビヒクル及び溶媒には水、リンゲル液、及び等張塩化ナトリウム水が含まれる。
【０２６７】
無菌注射製剤は、油相に活性成分が溶解された無菌の注射可能な水中油型マイクロエマルションであってもよい。例えば、活性成分は最初に大豆油とレシチンとの混合物に溶解され得る。次いで、油性溶液を水とグリセロールとの混合物に入れて処理することでマイクロエマルションが形成される。
【０２６８】
注射可能な溶液又はマイクロエマルションは、局所ボーラス投与によって患者の血流に導入され得る。あるいは、本発明の化合物の循環濃度が一定に維持されるように溶液又はマイクロエマルションを投与することが有益であり得る。そのような一定濃度を維持するために、連続静脈内送達器具を用いてもよい。そのような器具の例としては、Ｄｅｌｔｅｃ  ＣＡＤＤ−ＰＬＵＳ（商標）モデル５４００静脈内ポンプが挙げられる。
【０２６９】
医薬組成物は、筋肉内投与及び皮下投与用の、注射可能な水性又は油性の無菌懸濁液の形態であってもよい。この懸濁液は、上記の好適な分散・湿潤剤及び懸濁剤を用いて公知の技術に従って処方され得る。無菌注射製剤は、例えば１，３−ブタンジオール溶液のように、非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤又は溶媒中の無菌注射液又は無菌注射懸濁液であってもよい。更に、無菌の不揮発性油が溶媒又は懸濁媒体として以前から使用されている。この目的のために、合成のモノ又はジグリセリドを初めとする任意の無味の不揮発性油を使用することができる。更に、オレイン酸等の脂肪酸を注射剤の調製に使用することができる。
【０２７０】
本発明のための化合物は、好適な鼻腔内用のビヒクル及び送達デバイスの局所的使用によって鼻腔内用の形態で投与してもよく、又は、当業者に周知の経皮用皮膚パッチの形態を用いて経皮経路で投与してもよい。経皮送達システムの形態での投与では、用量の投与は当然ながら、投与計画中、断続的ではなく連続的である。本発明の化合物は、カカオバター、グリセリン化ゼラチン、水素化植物油、種々の分子量のポリエチレングリコールの混合物、ポリエチレングリコールの脂肪酸エステル等の基剤を用いた坐剤としても送達され得る。本発明の化合物は、小さな単層小胞（ｓｍａｌｌ  ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）、大きな単層小胞（ｌａｒｇｅ  ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）、多重膜小胞等のリポソーム送達システムの形態でも投与することができる。リポソームは、コレステロール、ステアリルアミン、又はホスファチジルコリン等の種々のリン脂質から形成することができる。本発明の化合物は、化合物分子がカップリングされた個々のキャリアとしてモノクローナル抗体を用いて送達することもできる。本発明の化合物は、標的化可能な薬物キャリアとしての可溶性ポリマーともカップリングされ得る。そのようなポリマーとしては、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド−フェノール、ポリヒドロキシ−エチルアスパルトアミド−フェノール、又はパルミトイル残基で置換されたポリエチレンオキシド−ポリリジンが含まれ得る。更に、本発明の化合物は、薬物の放出制御を達成するのに有用なクラスの生分解性ポリマー、例えばポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸（ｐｏｌｙａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ）とポリグリコール酸のコポリマー、ポリイプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリラート、及び架橋された又は両親媒性のハイドロゲルのブロックコポリマーにカップリングさせてもよい。
【０２７１】
本発明に係る組成物をヒト対照に投与する場合、処方する医師は通常、個々の患者の年齢、体重、及び反応、並びに患者の症状の重症度に従って一般的に用量を変えて、１日の用量を決定する。実施形態では、血栓症に対する処置を受けている哺乳動物に、好適な量の「薬剤」が投与される。投与は、１日に約０．１〜６０ｍｇ／ｋｇ体重又は１日に０．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ体重の量の「薬剤」で行われる。本発明の組成物を含む別の治療用量は、約０．０１〜約１０００ｍｇの薬剤を含む。別の実施形態では、用量は、約１〜約５０００ｍｇの薬剤を含む。
【０２７２】
ＩＶ  併用療法
本明細書に記載のＰＡＲ−１シグナル伝達薬剤の用途の１つは、血栓性病態のリスク又はアテローム性動脈硬化症等の血栓性病態再発のリスクがある患者の予防的処置である。高血圧や高コレステロールレベル等の危険因子を示す患者に、医師が処方する１日の処方に従って治療有効量の薬剤が与えられる。処置により何らかの望ましくない副作用が生じないように、患者の密な監視が必要である。適切な用量は、任意の危険因子の重症度及び患者の年齢、性別、並びに患者が血栓性病態の家族歴又は血栓性病態に対するその他の遺伝的素因を有するかどうかに応じて変わる。一実施形態では、本明細書に記載の薬剤は、血栓症のリスクが高い患者に、例えば手術の後又はステント等の医療器具若しくは人工心臓等の人工臓器の移植の後に、予防的に投与され得る。
【０２７３】
本願は更に、本明細書に記載の「薬剤」と、血栓性病態の１又は複数の危険因子を処置するための公知の１又は複数の薬物との併用療法も包含する。
【０２７４】
一実施形態では、薬物は、血小板の活性化及び凝集に対するその他の公知の阻害剤、例えば、限定されるものではないが、プロテアーゼ活性化（ＰＡＲ）受容体の阻害剤、ＭＭＰ−１又はＭＭＰ−２活性の阻害剤、及びトロンビンに仲介されるＰＡＲ−１活性化の阻害剤、及びその組合せであり得る。
【０２７５】
例えば、併用療法は、その内容全体を参照により本明細書に援用する米国特許第４，５２９，５９６号；同第４，８４７，２６５号；同第６，４２９，２１０（Ｂ１）号；同第５，２８８，７２６号；同第６，６９３，１１５号、及び米国特許出願第２００８／０２１４５９９号、又は同第２００３／０２２４９９９号に記載されているような公知の血小板凝集阻害剤を含み得る。
【０２７６】
別の例では、本明細書に記載の「薬剤」を用いる併用療法は、公知のマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤、例えば、限定されるものではないが、ＦＮ−４３９、ＭＭＰ−２００、及び組織メタロプロテアーゼ阻害剤（ＴＩＭＰ１、ＴＩＭＰ２、ＴＩＭＰ３、及びＴＩＭＰ４を含むＴＩＭＰ）を含み得る。ＭＭＰ阻害剤は米国特許第３，７８４，７０１号及び国際公開公報第９６／１５０９６号に更に記載されている。ＭＭＰペプチド阻害剤は、参照により本明細書に援用する米国特許第５，３００，５０１号；同第５，５３０，１２８号；同第５，４５５，２５８号；同第５，５５２，４１９号；国際公開公報第９５／１３２８９号；同第９６／１１２０９号、及び米国特許公開第２００４／０１２７４２０号に更に記載されている。
【０２７７】
別の例では、本明細書に記載の「薬剤」を用いる併用療法は抗凝固剤を含み得る。そのような抗凝固剤としては、例えば、限定されるものではないが、トロンビン阻害剤（例えば、メラガトラン、Ｅ−５５５５、ＭＣＣ−９７７、及びビバリルジン（Ａｎｇｉｏｍａｘ商標））、第Ｘａ因子阻害剤、組織因子阻害剤、第ＶＩＩａ因子阻害剤、第ＩＸａ因子阻害剤、第Ｖａ因子阻害剤、第ＸＩａ因子阻害剤、第ＸＩＩａ因子阻害剤、ＴＡＦＩα阻害剤、α２−抗プラスミン阻害剤、ＰＡＩ−１阻害剤、ＰＡＩ−２阻害剤、ＰＡＩ−３阻害剤、プロトロンビナーゼ阻害剤、ダニ抗凝固ペプチド、プロテインＣ、ワルファリン、ヘパリン、レピルジン、アスピリン、チクロピジン、クロピドグレル、チロフィバン、及びエプチフィバチドが含まれる。
【０２７８】
別の実施形態では、本明細書に記載の「薬剤」を用いる併用療法は血小板機能の阻害剤を含み得る。そのような阻害剤としては、限定されるものではないが、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体阻害剤、ＡＤＰ受容体（例えば、Ｐ２Ｙ．ｓｕｂ．１及びＰ２Ｙ．ｓｕｂ．１２）阻害剤、トロンビン受容体（例えば、ＰＡＲ−１及びＰＡＲ−４）阻害剤、ＣＤ４０阻害剤、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ４０リガンド）阻害剤、Ｇａｓ６阻害剤、Ｇａｓ６受容体ａｘｌの阻害剤、Ｇａｓ６受容体阻害剤Ｓｋｙ、Ｇａｓ６受容体Ｍｅｒの阻害剤、Ｐ−セレクチン阻害剤、Ｐ−セレクチン受容体ＰＳＧＬ−１阻害剤、トロンボキサン阻害剤、シンテターゼ阻害剤、フィブリノーゲン受容体アンタゴニスト、プロスタサイクリン模倣薬、ホスホジエステラーゼ阻害剤、ＲＡＮＴＥＳ阻害剤、ホスホイノシチド−３−キナーゼ（ＰＩ（３）Ｋ）アイソフォームβ阻害剤、ホスホイノシチド−３−キナーゼ（ＰＩ（３）Ｋ）アイソフォームγ阻害剤、エプチフィバチド、チロフィバン、チクロピジン、及びクロピドグレルが含まれる。
【０２７９】
別の実施形態では、本明細書に記載の「薬剤」を、心血管系疾患のリスクを高めることが知られている病状を処置するために医師に使用され得る公知の薬物と組み合わせてもよい。例えば、本明細書に記載の「薬剤」は、スタチンとしても知られるＨＭＢ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤、例えば、限定されるものではないが、シンバスタチン、プラバスタチン、リバスタチン、メバスタチン、フルインドスタチン、セリバスタチン、ベロスタチン（ｖｅｌｏｓｔａｔｉｎ）、フルバスタチン、ダルバスタチン、ジヒドロコンパクチン、コンパクチン、又はロバスタチン；又はシンバスタチン、プラバスタチン、リバスタチン、セリバスタチン、メバスタチン、フルインドスタチン、ベロスタチン、フルバスタチン、ダルバスタチン、ジヒドロコンパクチン、コンパクチン、ロバスタチンの薬学的に許容される塩又はその薬学的に許容される塩と組み合わせられ得る。スタチンを用いた同様な併用療法計画が、その内容全体を参照により本明細書に援用する米国特許公開第２００５／００２０６０７号に開示されている。
【０２８０】
特定の実施形態では、本明細書に記載の「薬剤」を用いる併用療法は、血栓性病態を防止又は処置するために使用される公知の薬物を含み得る。好ましくは、必須ではないが、薬物は、適当な行政機関又は取締機関によりヒト又は動物での使用に対して安全且つ効果的であると見なされているものであり得る。例えば、ヒトでの使用が承認されている薬物は、参照により本明細書に援用する米国連邦規則集２１条のセクション３３０．５、３３１〜３６１及び４４０〜４６０に基づきＦＤＡにより記載されており、獣医用途の薬物は、参照により本明細書に援用する米国連邦規則集２１条のセクション５００〜５８９に基づきＦＤＡにより記載されている。
【０２８１】
Ｖ  診断キット
患者から採った血小板中の活性化ＰＡＲ−１レベルを測定するために種々の方法を用いることができる。一般的に、そのような方法は、ＭＭＰ−１に仲介されるＰＡＲ−１ペプチド（残基１〜３９）に選択的に結合する薬剤（例えば抗体）をサンプルと接触させてサンプル中のペプチドレベルを評価することを含む。別の実施形態では、方法は、ＭＭＰ−１によって切断されたＰＡＲ−１又はＰＡＲ−１活性化に関連するパラメータを検出する。好ましい実施形態では、抗体は検出可能なラベルを有する。抗体は、ポリクローナル抗体であってもよく、更に好ましくはモノクローナル抗体であってもよい。インタクトな抗体又はその断片（例えば、Ｆａｂ又はＦ（ａｂ）２）を使用してもよい。プローブ又は抗体に関して、「標識された」という用語は、検出可能な物質をプローブ又は抗体にカップリングさせる（すなわち物理的に連結する）ことによるプローブ又は抗体の直接標識及び検出可能な物質との反応性によるプローブ又は抗体の間接的標識を包含することが意図される。
【０２８２】
ＰＡＲ−１（１〜３９）ペプチド又はＭＭＰ−１によって切断されたＰＡＲ−１を検出するためのインビトロ技術には、酵素結合性免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降、免疫蛍光法、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、及びウェスタンブロット解析が含まれる。
【０２８３】
本発明は、生体試料中の活性化ＰＡＲ−１の存在を検出するキットも含む。例えば、キットは、生体試料中及び標準試料中でＰＡＲ−１ペプチド（１〜３９）又はＭＭＰ−１によって切断されたＰＡＲ−１を検出できる化合物又は薬剤を含み得る。化合物又は薬剤は好適な容器にパッケージ化することができる。キットは更に、キットを用いてＰＡＲ−１ペプチド（１〜３９）又はＭＭＰ−１によって切断されたＰＡＲ−１を検出するための説明書も含んでよい。
【０２８４】
抗体に基づくキットでは、キットは、（１）ＰＡＲ−１（１〜３９）ペプチドに結合する第１の抗体（例えば固体支持体に結合している）；及び、必要に応じて、（２）ペプチド又は第１の抗体に結合し、検出可能な薬剤にコンジュゲートしている、第２の異なる抗体、を含んでよい。キットは更に緩衝剤、保存剤、又はタンパク質安定化剤を含んでよい。キットは更に、検出可能な薬剤を検出するために必要な構成要素（例えば酵素又は基質）を含んでよい。キットは更に、アッセイして含まれる被験サンプルと比較することができる、対照サンプル又は一連の対照サンプルを含んでよい。キットの各構成要素は、個々の容器に封入されてよく、このキットを用いて行われたアッセイの結果を解釈するための説明書と共に種々の容器全てを単一のパッケージ内に含めてよい。
【０２８５】
本明細書に記載の診断方法は、血栓性病態を有する又は血栓性病態を発症するリスクがある対象を同定することができる。本明細書に記載の予後アッセイを用いて、対象に薬剤（例えば、アンタゴニスト、ペプチド模倣薬、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子、又はその他の薬物候補）を投与することができるかどうかを決定することができる。
【０２８６】
別の態様では、本発明は、複数のデジタルコード化されたデータレコードを含むコンピュータ媒体に関する。各データレコードは、サンプル中の活性化ＰＡＲ−１のレベルを表す値及びサンプルの記述子を含む。サンプルの記述子は、サンプル、サンプルが由来する対象（例えば患者）、診断、又は処置（例えば、好ましい処置）の識別子であり得る。
【０２８７】
好ましい実施形態では、データレコードは更に、血栓性病態に関連するその他の危険因子のレベルを表す値を含み、データレコードは、表、例えばリレーショナルデータベース（例えば、オラクルのｓｑｌデータベース又はサイベースデータベース環境）等のデータベースの一部である表として構築され得る。
【０２８８】
本発明はサンプル評価方法にも関する。方法は、サンプルを、例えば対象から、用意する工程及びＰＡＲ−１活性化を測定する工程を含む。方法は更に、値又はプロフィール（すなわち複数の値）を参照値又は参照プロフィールと比較する工程を含んでもよい。
【０２８９】
方法は、対象の血栓性病態を診断及び監視するために用いることができ、ＰＡＲ−１活性化の上昇又は低減が、対象が血栓性病態を有する又はその素因があることの指標となる。方法は、対象の血栓性病態の処置を監視するために用いることもできる。ＰＡＲ−１活性化プロフィールは参照プロフィール又は処置前若しくは疾患発症前に対象から得られたプロフィールと比較され得る。
【０２９０】
別の態様では、本発明は対象を評価する方法に関する。方法は、ａ）対象から、例えば介護者から、例えば対象からサンプルを得る介護者から、サンプルを得る工程；ｂ）サンプルのＰＡＲ−１活性化プロフィールを測定する工程、を含む。必要に応じて、方法は更に、ｃ）対象プロフィールを１又は複数の参照プロフィールと比較する工程；及びｄ）対象参照プロフィールに最も類似する参照プロフィールを選択する工程、の一方又は両方を含む。種々の日常的な統計的測定を用いて２つの参照プロフィールを比較することができる。
【０２９１】
本発明は、患者を血栓性病態に罹りやすくするＭＭＰ−１遺伝子の多型及び関連因子（例えばＴＩＭＰ等の天然ＭＭＰ−１阻害剤）を検出するためのキットも含む。ＭＭＰ−１を含むいくつかのＭＭＰ遺伝子プロモーター中の複数の多型がよく解析されている。これらの多型は、アレル特異的な様式で各ＭＭＰの産生に影響を与えると考えられている。例えば、ＭＭＰ−１遺伝子のプロモーター領域は、ＡＰ−１、ＡＰ−２、Ｅｔｓ／ＰＥＡ−３等のＤＮＡ結合タンパク質のコンセンサス配列と、グルココルチコイド、レチノイン酸、及び環状ＡＭＰに対して応答性のエレメントとを含む（Ｒｕｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９９７）。ＭＭＰ−１プロモーター領域内の１６０７ｂｐの位置に一塩基多型（ＳＮＰ）が同定されており、これにより、更なるグアニン（Ｇ）残基を挿入することで追加のＥｔｓ結合部位が作出される（Ｒｕｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５８：５３２１−５３２５）。このＳＮＰを含むプロモーター（２Ｇ遺伝子型を生じる）は、正常細胞及び悪性細胞において、転写活性が「より低い」１Ｇアレルを有する細胞よりも有意に「高い」転写活性を示す（Ｒｕｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９９８；Ｗｙａｔｔ  ｅｔ  ａｌ，（２００２）．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６２：７２００−７２０２）。したがって、このＭＭＰ−１多型は、血栓性病態に対する生まれつきの罹患しやすさを予測するものとなり得る。
【０２９２】
多型を検出するためのキット構成要素は、当該技術分野で周知であり、ＰＣＴ増幅用の多型特異的プライマー及び試薬を含み得る。
【０２９３】
ＶＩ  血小板保存媒体
血小板は、全血献血による副産物として又は血小板フェレーシスから得ることができる。献血された血液は通常、別々に使用することができる血小板を初めとする種々の血液成分を分離するための処理を受ける。例えば、単位量の献血された全血を処理して（通常は濃縮赤血球（ｐｒｃ）として濃縮された）赤血球、（通常は血小板濃縮液（ＰＣ）として濃縮された）血小板、及び血漿に分離することができる。典型的な処理プロトコールによれば、血液は、画分の中でもとりわけ、血小板含有液、例えば多血小板血漿（ＰＲＰ）又はバフィーコートを形成するように処理することができ、これは更に処理（遠心を含む）されてＰＣを形成する。更に、最終輸血製品を生成する前に、複数単位の血小板又はバフィーコートをプールすることができる。
【０２９４】
現行の従来の血液保存の慣習によれば、閉鎖（無菌）システム中で生成されたｐｃは輸血製品として使用される前に最大で５日間しか保存することができない。一部の処理プロトコールでは、大部分の血漿を除去した後、血小板含有液（例えばバフィーコート）に血小板添加剤溶液を添加し、添加剤溶液中に血小板を再懸濁した後に血小板を保存する。あるいは、血小板は自身の血漿中に保存することもできる。
【０２９５】
保存中の最適な血小板機能及び生存率を実現するために、保存期間中、血小板含有液（添加剤溶液を含んでも含まなくてもよい）をｐＨ６．８〜７．４に維持するか（欧州の慣習）、ｐＨ６．２以上（米国の慣習）に維持することが推奨されている。血小板の品質を維持するために血小板をグルコース又はデキストロース存在下で保存することも推奨される。更に、血小板は、血液を血小板に濃縮する処理の間（その後の添加剤溶液への血小板の再懸濁期間も含む）に活性化され得、これは血小板凝集及び生存能力の消失を招く。したがって、血小板保存媒体に添加される一般的な成分には抗凝固剤、典型的にはクエン酸塩が含まれる。
【０２９６】
献血、血液の調製、保存、及び輸送に一般的に使用される媒体及び方法の更なる例は種々の文献、例えば“Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｂｌｏｏｄ  Ｂａｎｋｉｎｇ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｃｉａｎｅ”ｗｒｉｔｔｅｎ  ｂｙ  Ｓａｌｌｙ  ｖ．Ｒｕｄｍａｎｎ，ａｎｄ  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２００５に記載されている。
【０２９７】
ＭＭＰ−１により活性化されたＰＡＲ−１の血小板凝集における役割についての本発明の発見に基づき、本発明の態様は、血小板含有媒体中に、かかる媒体の調製、保存、又は輸送中の任意の時点において、血小板表面上のＰＡＲ−１の３９位のアスパラギン酸（ｄ３９）と４０位のプロリン（ｐ４０）の間でのタンパク質切断を実質的に阻害する本発明の「薬剤」を提供することである。実施形態では、本発明の「薬剤」はＭＭＰ−１の活性化又はＭＭＰ−１酵素活性を阻害する。別の実施形態では、「薬剤」は、ＰＡＲ−１の３９位のアスパラギン酸（ｄ３９）と４０位のプロリン（ｐ４０）の間でのタンパク質切断後のＰＡＲ−１シグナル伝達活性を阻害し得る。本発明の「薬剤」は、従来の抗凝固剤に加えて、又はその代わりに、血小板保存媒体中に添加され得る。実施形態では、本発明の「薬剤」を含む保存媒体は、液中に含まれる血小板の有効期間を、現在の室温（約２２℃）で５日間よりも、例えば０．５、１、２、３、４、５、６、又は７日も長くする。
【０２９８】
ＶＩＩ  医療器具
ステント等の移植可能な医療器具の表面
【０２９９】
本明細書に記載の化合物は、医療器具をコーティングするために単独又は他の公知の抗血栓剤と組み合わせて使用され得る。
【０３００】
コーティング方法は当該技術分野で周知である。例えば、ＰＣＴ出願国際公開公報第２００５／０９７２２３（Ａ１）号（Ｓｔｕｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ）は、光活性架橋剤をコンジュゲートさせたヘパリンと、同じコーティング溶液中に溶解又は分散させたポリ（ブチルメタクリラート）、ポリ（ビニルピロリドン）等のその他の耐久性ポリマーとの混合物を溶液中で又はコーティング塗布後に紫外光を用いて架橋する方法を開示している。
【０３０１】
別の一般的なアプローチでは、全てＨｓｕ，Ｌｉ−Ｃｈｉｅｎ，ｅｔ  ａｌ．による米国特許第２００５／０１９１３３３（Ａ１）号、同第２００６／０２０４５３３（Ａ１）号、及び国際公開公報第２００６／０９９５１４（Ａ２）号に開示されているように、ヘパリンと対イオンとの低分子量複合体（ステアリルコニウムヘパリン）又は高分子量多価電解質複合体、例えばデキストラン、ペクチンを用いて、抗血栓物質の複合体形態を形成する。これらの抗血栓性複合体は、薬物を更に含んでもよいポリマーマトリックス中に更に分散される。
【０３０２】
米国特許出願公開第２００８／０２６９８７５号も、複数層のポリマー組成物を医療器具に塗布する方法を開示している。層の１つは、そこに追加層が接着することを可能にするベースコートを含み得る。追加層は、そのポリマーマトリックス内に生理活性薬剤を有し得る。
【０３０３】
これらの特許文献の内容全体を参照により本明細書に援用する。
【０３０４】
ＶＩＩＩ  その他の治療的応用
本明細書に記載されているＭＭＰ−１／ＰＡＲ−１被験化合物は、ＰＡＲ−１活性化に関連する他の医学的状態の診断及び処置にも使用され得る。例えば、本明細書に記載の化合物の恩恵を受け得る医学的状態としては、限定されるものではないが、以下が含まれる：慢性的炎症性腸疾患、例えば炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、及び潰瘍性大腸炎、並びに線維性疾患（ｆｉｂｒｏｔｉｃ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、例えば肝線維症及び肺線維症（例えば、Ｖｅｒｇｎｏｌｌｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ（２００４）．１１４（１０）：１４４４；Ｙｏｓｈｉｄａ，ｅｔ  ａｌ，Ａｌｉｍｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ（２００６）．２４（Ｓｕｐｐｌ  ４）：２４９；Ｍｅｒｃｅｒ，ｅｔ  ａｌ，Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ（２００７）．１０９６：８６−８８；Ｓｏｋｏｌｏｖａ  ａｎｄ  Ｒｅｉｓｅｒ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ（２００７）．ＰＭＩＤ：１７５３２４７２参照）、虚血再灌流障害、例えば心筋、腎臓、脳、及び腸の虚血再灌流障害（例えば、Ｓｔｒａｎｄｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｓｉｃ  Ｒｅｓ．Ｃａｒｄｒｏｌ（２００７）．１０２（４）：３５０−８；Ｓｅｖａｓｔｏｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ（２００７）．１０９（２）：５７７−５８３；Ｊｕｎｇｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．（２００３）．１００（２２）：１３０１９−２４；及びＴｓｕｂｏｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ  Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ（２００７）．２９２（２）：Ｇ６７８−８３参照。ＰＡＲＩ細胞内シグナル伝達の阻害は、細胞の単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶＩ及びＨＳＶ２）感染（Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ（２００７）．５（５）：１０５５−６１参照）を抑制するため並びに神経変性疾患、例えばアルツハイマー病（ＡＤ）及びパーキンソン病（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．１１６，Ｉｓｓｕｅ  ５，６７１−６８２，（２００４）；Ｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ  Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ．２００６．Ｊａｎ，６５（１）：６６−７７；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（２００９）．Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．８，２０５−２１６参照）、敗血症（Ｋａｎｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ８，１３０３−１３１２（２００７））、又は子宮内膜症（Ｈｉｒｏｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ２００５，９０（６）：３６７３−３６７９）、がん及び脈管形成（Ｔｓｏｐａｎｏｇｌｏｕ  ＮＥ  ａｎｄ  Ｍａｒａｇｏｕｄａｋｉｓ  ＭＥ．  Ｓｅｍｉｎ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈｅｍｏｓｔ．２００７，Ｏｃｔ，３３（７）：６８０−７に概説）の発生においても使用することができる。
【０３０５】
種々の組織、細胞、及び種におけるＰＡＲ活性化の生物学及び病理生理学は、Ｓｔｅｉｎｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２００５，２６（１）：１−４３に最近概説された。
【０３０６】
本明細書中で特定される全ての特許、特許出願、刊行物、又はその他の開示物の全体を参照により本明細書に援用する。参照により本明細書に援用すると述べた全ての内容又はその一部のうち、本明細書に記載した定義、記載、又はその他の開示内容と矛盾するものは、組み込まれた内容と本開示の内容の間で矛盾が生じない程度に組み込まれる。
参照文献
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Ｃｈａｃｋａｌａｍａｎｎｉｌ  Ｓ，Ｗａｎｇ  Ｙ，Ｇｒｅｅｎｌｅｅ  ＷＪ，Ｈｕ  Ｚ，Ｘｉａ  Ｙ，Ａｈｎ  ＨＳ，Ｂｏｙｋｏｗ  Ｇ，Ｈｓｉｅｈ  Ｙ，Ｐａｌａｍａｎｄａ  Ｊ，Ａｇａｎｓ−Ｆａｎｔｕｚｚｉ  Ｊ，Ｋｕｒｏｗｓｋｉ  Ｓ，Ｇｒａｚｉａｎｏ  Ｍ，Ｃｈｉｎｔａｌａ  Ｍ．（２００８）．Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ，  ｏｒａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｈｉｍｂａｃｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ（ＳＣＨ  ５３０３４８）ｗｉｔｈ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｔｉｐｌａｔｅｌｅｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．Ｊｕｎ  １２；５１（１１）：３０６１−４
Ｃｈａｃｋａｌａｍａｎｎｉｌ  Ｓ，Ｗａｎｇ  Ｙ，Ｇｒｅｅｎｌｅｅ  ＷＪ，Ｈｕ  Ｚ，Ｘｉａ  Ｙ，Ａｈｎ  ＨＳ，Ｂｏｙｋｏｗ  Ｇ，Ｈｓｉｅｈ  Ｙ，Ｐａｌａｍａｎｄａ  Ｊ，Ａｇａｎｓ−Ｆａｎｔｕｚｚｉ  Ｊ，Ｋｕｒｏｗｓｋｉ  Ｓ，Ｇｒａｚｉａｎｏ  Ｍ，Ｃｈｉｎｔａｌａ  Ｍ，Ｃｈｅｓｎｅｙ，Ｃ．Ｍ．，Ｈａｒｐｅｒ，Ｅ．，ａｎｄ  Ｃｏｌｍａｎ，Ｒ．Ｗ．（１９７４）．Ｈｕｍａｎ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ５３，１６４７−１６５４．
Ｃｈｉｎｔａｌａ  Ｍ．，Ｓｈｉｍｉｚｕ  Ｋ．，Ｏｇａｗａ  Ｍ．，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  Ｈ．，Ｄｏｉ  Ｍ．，ａｎｄ  Ｊｅｎｓｅｎ  Ｐ．，（２００８）．Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：Ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １  ｆｏｒ  Ｔｈｒｏｍｂｉｎ，ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ａｎｔｉｐｌａｔｅｌｅｔ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ａｔｈｅｒｏｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ  １０８，４３３−４３８
Ｃｏｎａｎｔ，Ｋ．，Ｈｉｌｌａｉｒｅ，Ｃ．Ｓ．，Ｎａｇａｓｅ，Ｈ．，Ｖｉｓｓｅ，Ｒ．，Ｇａｒｙ，Ｄ．，Ｈａｕｇｈｅｙ，Ｎ．，Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｃ．，Ｔｕｒｃｈａｎ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｎａｔｈ，Ａ．（２００４）．Ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  １  ｉｎｔｅｒａｃｔｓ  ｗｉｔｈ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ  ａｎｄ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ｄｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｋｔ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９，８０５６−８０６２．
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Ｆｒｅｓｓｉｎａｕｄ，Ｅ．，Ｓａｋａｒｉａｓｓｅｎ，Ｋ．Ｓ．，Ｒｏｔｈｓｃｈｉｌｄ，Ｃ．，Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒ，Ｈ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｍｅｙｅｒ，Ｄ．（１９９２）．Ｓｈｅａｒ  ｒａｔｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｒｏｍｂｕｓ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｎ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｉｎ  ｎｏｎａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｔｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｆｒｏｍ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ  Ａ．  Ｂｌｏｏｄ  ８０，９８８−９９４．
Ｆｕｒｉｅ，Ｂ．，ａｎｄ  Ｆｕｒｉｅ，Ｂ．Ｃ．（２００８）．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｔｈｒｏｍｂｕｓ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５９：９３８−４９．
Ｇａｌｔ，Ｓ．Ｗ．，Ｌｉｎｄｅｍａｎｎ，Ｓ．，Ａｌｌｅｎ，Ｌ．，Ｍｅｄｄ，Ｄ．Ｊ．，Ｆａｌｋ，Ｊ．Ｍ．，Ｍｃｌｎｔｙｒｅ，Ｔ．Ｍ．，Ｐｒｅｓｃｏｔｔ，Ｓ．Ｍ．，Ｋｒａｉｓｓ，Ｌ．Ｗ．，Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ，Ｇ．Ａ．，ａｎｄ  Ｗｅｙｒｉｃｈ，Ａ．Ｓ．（２００２）．Ｏｕｔｓｉｄｅ−ｉｎ  ｓｉｇｎａｌｓ  ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ｂｙ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−１  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ  ９０，１０９３−１０９９．
Ｇａｓｔ，Ａ．，Ｔｓｃｈｏｐｐ，Ｔ．Ｂ．，ａｎｄ  Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒ，Ｈ．Ｒ．（１９９４）．Ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｐｌａｙｓ  ａ  ｋｅｙ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｌａｔｅ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｔｈｒｏｍｂｕｓ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ／ｏｒ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｎ  ｔｈｒｏｍｂｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ａｏｒｔｉｃ  ｓｕｂｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ  ｅｘｐｏｓｅｄ  ｔｏ  ｆｌｏｗｉｎｇ  ｒａｂｂｉｔ  ｂｌｏｏｄ．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  １４，１４６６−１４７４，
Ｇｉｅｓｅｎ，Ｐ．Ｌ，Ｒａｕｃｈ，Ｕ．，Ｂｏｈｒｍａｎｎ，Ｂ．，Ｋｌｉｎｇ，Ｄ．，Ｒｏｑｕｅ，Ｍ．，Ｆａｌｌｏｎ，Ｊ．Ｔ．，Ｂａｄｉｍｏｎ，Ｊ．Ｊ．，Ｈｉｍｂｅｒ，Ｊ．，Ｒｉｅｄｅｒｅｒ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ  Ｎｅｍｅｒｓｏｎ，Ｙ．（１９９９）．Ｂｌｏｏｄ−ｂｏｒｎｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ：ａｎｏｔｈｅｒ  ｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９６，２３１１−２３１５．
Ｇｌａｓｓ，Ｃ．Ｋ．，ａｎｄ  Ｗｉｔｚｔｕｍ，Ｊ．Ｌ．（２００１）．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．ｔｈｅ  ｒｏａｄ  ａｈｅａｄ．Ｃｅｌｌ  １０４，５０３−５１６．
Ｇｏｇｌｙ，Ｂ．，Ｇｒｏｕｌｔ，Ｎ．，Ｈｏｒｎｅｂｅｃｋ，Ｗ．，Ｇｏｄｅａｕ，Ｇ．，  ｎｄ  Ｐｅｌｌａｔ  Ｂ．（１９９６）．Ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｚｙｍｏｇｒａｐｈｙ  ａｓ  ａ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｂｐｉｃｏｇｒａｍ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ．Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２５５，２１１−２１６．
Ｈｅ，Ｌ．，Ｐａｐｐａｎ，Ｌ．Ｋ．，Ｇｒｅｎａｃｈｅ，Ｄ．Ｇ．，Ｌｉ，Ｚ．，Ｔｏｌｌｅｆｓｅｎ，Ｄ．Ｍ．，Ｓａｎｔｏｒｏ，Ｓ．Ａ．，ａｎｄ  Ｚｕｔｔｅｒ，Ｍ．Ｍ．（２００３）．Ｔｈｅ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａ２ｂ１  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｔｏ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｂｌｏｏｄ  １０２，３６５２−３６５７．
Ｈｕａｎｇ，Ｊ．Ｓ．，Ｄｏｎｇ，Ｌ．，Ｋｏｚａｓａ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｌｅ  Ｂｒｅｔｏｎ，Ｇ．Ｃ．（２００７）．Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｇ（ａｌｐｈａ）１３  ｓｗｉｔｃｈ  ｒｅｇｉｏｎ  Ｉ  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １  −ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｓｈａｐｅ  ｃｈａｎｇｅ，ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８２，１０２１０−１０２２２．
Ｈｕｅｂｎｅｒ，Ｊ．Ｌ，Ｏｔｔｅｒｎｅｓｓ，Ｉ．Ｇ．，Ｆｒｅｕｎｄ，Ｅ．Ｍ．，Ｃａｔｅｒｓｏｎ，Ｂ．，ａｎｄ  Ｋｒａｕｓ，Ｖ．Ｂ．（１９９８）．Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  １  ａｎｄ  ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  ３  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｇｕｉｎｅａ  ｐｉｇ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ４１，８７７−８９０．
Ｉｎａｕｅｎ，Ｗ．，Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒ，Ｈ．Ｒ．，Ｂｏｍｂｅｌｉ，Ｔ．，Ｈａｅｂｅｒｌｉ，Ａ．，ａｎｄ  Ｓｔｒａｕｂ，Ｐ．Ｗ．（１９９０）．Ｄｏｓｅ−ａｎｄ  ｓｈｅａｒ  ｒａｔｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｈｅｐａｒｉｎ  ｏｎ  ｔｈｒｏｍｂｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｒａｂｂｉｔ  ａｏｒｔａ  ｓｕｂｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ  ｅｘｐｏｓｅｄ  ｔｏ  ｆｌｏｗｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｂｌｏｏｄ．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒσｓｉｓ  １０，６０７−６１５．
Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｓ．Ｐ．，Ｎｅｓｂｉｔｔ，Ｗ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｋｕｌｋａｒｎｉ，Ｓ．（２００３）．Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｅｖｅｎｔｓ  ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ  ｔｈｒｏｍｂｕｓ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  １，１６０２−１６１２．
Ｋａｎｅｉｄｅｒ，Ｎ．Ｃ．，Ｌｅｇｅｒ，Ａ．Ｊ．，Ａｇａｒｗａｌ，Ａ．，Ｎｇｕｙｅｎ，Ｎ．，Ｐｅｒｉｄｅｓ，Ｇ．，Ｄｅｒｉａｎ，Ｃ．，Ｃｏｖｉｃ，Ｌ．，ａｎｄ  Ｋｕｌｉｏｐｕｌｏｓ，Ａ．（２００７）．Ｒｏｌｅ  ｒｅｖｅｒｓａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＰＡＲ１  ｉｎ  ｓｅｐｓｉｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｄａｍａｇｅ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍ  ８，１３０３−１３１２．
Ｋａｚｅｓ，Ｉ．，Ｅｌａｌａｍｙ，Ｉ．，Ｓｒａｅｒ，Ｊ．Ｄ．，Ｈａｔｍｉ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｎｇｕｙｅｎ，Ｇ．（２０００）．Ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｔｒｉｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ＭＴ１−ＭＭＰ／ＴＩＭＰ２／ＭＭＰ２：ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ＭＭＰ２  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ．Ｂｌｏｏｄ  ９６，３０６４−３０６９．
Ｋｕｌｉｏｐｕｌｏｓ，Ａ．，Ｃｏｖｉｃ，Ｌ．，Ｓｅｅｌｅｙ，Ｓ．Ｋ．，Ｓｈｅｒｉｄａｎ，Ｐ．Ｊ．，Ｈｅｌｉｎ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｃｏｓｔｅｌｌｏ，Ｃ．Ｅ．（１９９９）．Ｐｌａｓｍｉｎ  Ｄｅｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＰＡＲ１  Ｔｈｒｏｍｂｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ；Ｋｉｎｅｔｉｃｓ，Ｓｉｔｅｓ  ｏｆ  Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｔｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３８，４５７２−４６８５．
Ｋｕｌｉｏｐｕｌｏｓ，Ａ．，Ｍｏｈａｎｌａｌ，Ｒ．，ａｎｄ  Ｃｏｖｉｃ．Ｌ．（２００４）．Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐ３８  ＭＡＰ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｐａｔｈｗａｙ  ｏｎ  Ｐｌａｔｅｌｅｔ  Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ．Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ９２，１３８７−１３９３．
Ｌｅｇｅｒ，Ａ．，Ｊａｃｑｕｅｓ，Ｓ．Ｌ．，Ｂａｄａｒ，Ｊ．，Ｋａｎｅｉｄｅｒ，Ｎ．Ｃ．，Ｄｅｒｉａｎ，Ｃ．Ｋ．，Ａｎｄｒａｄｅ−Ｇｏｒｄｏｎ，Ｐ．，Ｃｏｖｉｃ，Ｌ．，ａｎｄ  Ｋｕｌｉｏｐｕｌｏｓ，Ａ．（２００６ａ）．Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １−４  Ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ  ｉｎ  Ｐｌａｔｅｌｅｔ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １１３，１２４４−１２５４．
Ｌｅｇｅｒ，Ａ．Ｊ．，Ｃｏｖｉｃ，Ｌ．，ａｎｄ  Ｋｕｌｉｏｐｕｌｏｓ，Ａ．（２００６ｂ）．Ｐｒｏｔｅａｓｅ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １１３，１０７０−１０７７．
Ｌｅｖｙ，Ｇ．Ｇ．，Ｎｉｃｈｏｌｓ，Ｗ．Ｃ．，Ｌｉａｎ，Ｅ．Ｃ．，Ｆｏｒｏｕｄ，Ｔ．，ＭｃＣｌｉｎｔｉｃｋ，Ｊ．Ｎ．，ＭｃＧｅｅ，Ｂ．Ｍ．，Ｙａｎｇ，Ａ．Ｙ．，Ｓｉｅｍｉｅｎｉａｋ，Ｄ．Ｒ．，Ｓｔａｒｋ，Ｋ．Ｒ．，Ｇｒｕｐｐｏ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．（２００１）．Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＤＡＭＴＳ  ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｃａｕｓｅ  ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ  ｐｕｒｐｕｒａ．Ｎａｔｕｒｅ  ４１３，４８８−４９４．
Ｌｏｅｗ，Ｄ．，Ｐｅｒｒａｕｌｔ，Ｃ．，Ｍｏｒａｌｅｓ，Ｍ．，Ｍｏｏｇ，Ｓ．，Ｒａｖａｎａｔ，Ｃ．，Ｓｃｈｕｈｌｅｒ，Ｓ．，Ａｒｃｏｎｅ，Ｒ．，Ｐｉｅｔｒｏｐａｏｌｏ，Ｃ．，Ｃａｚｅｎａｖｅ，Ｊ．Ｐ．，ｖａｎ  Ｄｏｒｓｓｅｌａｅｒ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（２０００）．Ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｘｏｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｒ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＭＡＬＤＩ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９，１０８１２−１０８２２．
Ｍａｃｋｍａｎ，Ｎ．（２００４）．Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ，ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ，ａｎｄ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ  ２４，１０１５−１０２２．
Ｍａｎｎ，Ｋ．Ｇ．，Ｗｈｅｌｉｈａｎ，Ｍ．Ｆ．，Ｂｕｔｅｎａｓ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｏｒｆｅｏ，Ｔ．（２００７）．Ｃｉｔｒａｔｅ  ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ５，２０５５−２０６１．
Ｍｏｅｒｓ，Ａ．，Ｎｉｅｓｗａｎｄｔ，Ｂ．，Ｍａｓｓｂｅｒｇ，Ｓ．，Ｗｅｔｔｓｃｈｕｒｅｃｋ，Ｎ．，Ｇｒｕｎｅｒ，Ｓ．，Ｋｏｎｒａｄ，Ｉ．，Ｓｃｈｕｌｔｅ，Ｖ．，Ａｋｔａｓ，Ｂ．，Ｇｒａｔａｃａｐ，Ｍ．Ｐ．，Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．（２００３）．Ｇ１３  ｉｓ  ａｎ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉａｔｏｒ  ｏｆ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ９，１４１８−１４２２．
Ｎｅｔｚｅｌ−Ａｒｎｅｔｔ，Ｓ．，Ｆｉｅｌｄｓ，Ｇ．Ｂ．，Ｂｉｒｋｅｄａｌ−Ｈａｎｓｅｎ，Ｈ．，Ｖａｎ  Ｗａｒｔ，Ｈ．Ｅ．，ａｎｄ  Ｆｉｅｌｄｓ，Ｇ．（１９９１），Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ａｎｄ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅｓ［ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｅｒｒａｔｕｍ  ａｐｐｅａｒｓ  ｉｎ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９１  Ｎｏｖ  ５；２６６（３１）：２１３２６］．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６６，６７４７−６７５５．
Ｎｉｅｓｗａｎｄｔ，Ｂ．，ａｎｄ  Ｗａｔｓｏｎ，Ｓ．Ｐ．（２００３）．Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：ｉｓ  ＧＰＶＩ  ｔｈｅ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ？  Ｂｌｏｏｄ  １０２，４４９−４６１．
Ｏｄａｋｅ，Ｓ．，Ｍｏｒｉｔａ，Ｙ．，Ｍｏｒｉｋａｗａ，Ｔ．，Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｎ．，Ｈｏｒｉ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｎａｇａｉ，Ｙ．（１９９４）．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ  ｂｙ  ｐｅｐｔｉｄｙｌ  ｈｙｄｒｏｘａｍｉｃ  ａｃｉｄｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １９９，１４４２−１４４６．
Ｏｆｆｅｒｍａｎｎｓ，Ｓ．，Ｌａｕｇｗｉｔｚ，Ｋ．−Ｌ．，Ｓｐｉｃｈｅｒ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｃ．（１９９４）．Ｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇ１２  Ｆａｍｉｌｙ  ａｒｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｖｉａ  Ｔｈｒｏｍｂｏｘａｎｅ  Ａ２  ａｎｄ  Ｔｈｒｏｍｂｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ（ＵＳＡ）９１，５０４−５０８．
Ｏｋｏｒｉｅ，Ｕ．Ｍ．，Ｄｅｎｎｅｙ，Ｗ．Ｓ．，Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ，Ｍ．Ｓ．，Ｎｅｅｖｅｓ，Ｋ．Ｂ．，ａｎｄ  Ｄｉａｍｏｎｄ，Ｓ．Ｌ．（２００８）．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｓ  ｔｈａｔ  ｔｒｉｇｇｅｒ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｔ  ｖｅｎｏｕｓ  ａｎｄ  ａｒｔｅｒｉａｌ  ｓｈｅａｒ  ｒａｔｅｓ：ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  １００  ｆＭ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ｆｌｏｗ．Ｂｌｏｏｄ  １１１，３５０７−３５１３．
Ｐａｒｒｙ，Ｍ  Ａ．Ａ．，Ｍｙｌｅｓ，Ｔ．，Ｔｓｃｈｏｐｐ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｓｔｏｎｅ，Ｓ．Ｒ．（１９９６）．Ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｈｒｏｍｂｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ：Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｉｎａｃｔｉｖａｔｏｒｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３２０，３３５−３４１．
Ｐｅａｒｃｅ，Ｅ．，Ｔｒｅｇｏｕｅｔ，Ｄ．Ａ．，Ｓａｍｎｅｇａｒｄ，Ａ．，Ｍｏｒｇａｎ，Ａ．Ｒ．，Ｃｏｘ，Ｃ．，Ｈａｍｓｔｅｎ，Ａ．，Ｅｒｉｋｓｓｏｎ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｙｅ，Ｓ．（２００５）．Ｈａｐｌｏｔｙｐｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−１  ｇｅｎｅ  ｏｎ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ  ９７，１０７０−１０７６．
Ｒａｎｄ，Ｍ．Ｄ．，Ｌｏｃｋ，Ｊ．Ｂ．，Ｖｅｅｒ，Ｃ．Ｖ．ｔ，Ｇａｆｆｎｅｙ，Ｄ．Ｐ．，ａｎｄ  Ｍａｎｎ，Ｋ．Ｇ．（１９９６）．Ｂｌｏｏｄ  Ｃｌｏｔｔｉｎｇ  ｉｎ  Ｍｉｎｉｍａｌｌｙ  Ａｌｔｅｒｅｄ  Ｗｈｏｌｅ  Ｂｌｏｏｄ．Ｂｌｏｏｄ  ８８，３４３２−３４４５．
Ｒｕｇｇｅｒｉ，Ｚ．Ｍ．（２００２）．Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ  ｉｎ  ａｔｈｅｒｏｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ  ８，１２２７−１２３４．
Ｒｕｔｔｅｒ  ＪＬ，Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  ＴＩ，Ｂｕｔｔｉｃｅ  Ｇ，Ｍｅｙｅｒｓ  Ｊ，Ｇｕｓｅｌｌａ  ＪＦ，Ｏｚｅｌｉｕｓ  ＬＪ，Ｂｒｉｎｃｋｅｒｈｏｆｆ  ＣＥ（１９９８）Ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−１  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｃｒｅａｔｅｓ  ａｎ  Ｅｔｓ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ  ａｎｄ  ａｕｇｍｅｎｔｓ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５８：５３２１−５３２５
Ｓａｗｉｃｋｉ，Ｇ．，Ｓａｌａｓ，Ｅ．，Ｍｕｒａｔ，Ｊ．，Ｍｉｓｚｔａ−Ｌａｎｅ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｒａｄｏｍｓｋｉ，Ｍ．Ｗ．（１９９７）．Ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ  Ａ  ｄｕｒｉｎｇ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ３８６，６１６−６１９．
Ｓｃｈｗｅｒｔｚ，Ｈ．，Ｔｏｌｌｅｙ，Ｎ．Ｄ．，Ｆｏｕｌｋｓ，Ｊ．Ｍ．，Ｄｅｎｉｓ，Ｍ．Ｍ．，Ｒｉｓｅｎｍａｙ，Ｂ．Ｗ．，Ｂｕｅｒｋｅ，Ｍ．，Ｔｉｌｌｅｙ，Ｒ．Ｅ．，Ｒｏｎｄｉｎａ，Ｍ．Ｔ．，Ｈａｒｒｉｓ，Ｅ．Ｍ．，Ｋｒａｉｓｓ，Ｌ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．（２００６）．Ｓｉｇｎａｌ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡ  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｔｈｒｏｍｂｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｔｅｌｅｔｓ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０３，２４３３−２４４０．
Ｓｅｅｌｅｙ，Ｓ．，Ｃｏｖｉｃ．Ｌ．，Ｊａｃｑｕｅｓ，Ｓ．Ｌ．，Ｓｕｄｍｅｉｅｒ，Ｊ．，Ｂａｌｅｊａ，Ｊ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｋｕｌｉｏｐｕｌｏｓ，Ａ．（２００３）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｒｏｍｂｉｎ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ：Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｔｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌｉｇａｎｄｉｎｇ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０，１０３３−１０４１．
Ｓｔｅｉｎｈｕｂｌ，Ｓ．Ｒ．，Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｄ．Ｊ．，Ｂｅｒｇｅｒ，Ｐ．Ｂ．，ａｎｄ  Ｂｅｃｋｅｒ，Ｒ．Ｃ．（２００７）．Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ａｎｔｉｐｌａｔｅｌｅｔ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ：ｌｅｓｓｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌｓ．Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓ．
Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，Ｇ．，Ｙａｎ，Ｙ．，Ｊａｎｄｒｏｔ−Ｐｅｒｒｕｓ，Ｍ．，Ｖｉｌｌｅｖａｌ，Ｊ．Ｌ．，Ｃｌｅｍｅｔｓｏｎ，Ｋ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｄ．Ｒ．（２００４）．Ｐｌａｔｅｌｅｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ＧＰＶｌ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｔｏ  ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  ｃｏｌｌａｇｅｎ，Ｂｌｏｏｄ  １０５，１８６−１９１．
Ｓｕｋｈｏｖａ，Ｇ．Ｋ．，Ｓｃｈｏｎｂｅｃｋ，Ｕ．，Ｒａｂｋｉｎ，Ｅ．，Ｓｃｈｏｅｎ，Ｒ．Ｊ．，Ｐｏｏｌｅ，Ａ．Ｒ．，Ｂｉｌｌｉｎｇｈｕｒｓｔ，Ｒ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｌｉｂｂｙ，Ｐ．（１９９９）．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  Ｃｏｌｌａｇｅｎｏｌｙｓｉｓ  ｂｙ  Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅｓ−１  ａｎｄ  −３  ｉｎ  Ｖｕｌｎｅｒａｂｌｅ  Ｈｕｍａｎ  Ａｔｈｅｒｏｍａｔｏｕｓ  Ｐｌａｑｕｅｓ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９９．
Ｓｕｎｄａｒｅｓａｎ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｆａｒｎｄａｌｅ，Ｒ．Ｗ．（２００２）．ｐ３８  ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｄｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｉｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ２Ａ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｔｅｌｅｔｓ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｂｙ  ｃｏｌｌａｇｅｎ．ＦＥＢＳ  ｌｅｔｔｓ  ５２８，１３９−１４４．
Ｓｕｚｕｋｉ，Ｈ．，Ｋｕｓｕｙａｍａ，Ｔ．，Ｓａｔｏ，Ｒ．，Ｙｏｋｏｔａ，Ｙ．，Ｔｓｕｎｏｄａ，Ｆ．，Ｓａｔｏ，Ｔ．，Ｓｈｏｊｉ，Ｍ．，Ｉｓｏ，Ｙ．，Ｋｏｂａ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｋａｔａｇｉｒｉ，Ｔ．（２００８）．Ｅｌｅｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｕｌｐｒｉｔ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｙ  ｏｆ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ３８，１６６−１７３．
Ｔｕｒｋ，Ｂ．Ｅ．，Ｈｕａｎｇ，Ｌ．Ｌ．，Ｐｉｒｏ，Ｅ．Ｔ．，ａｎｄ  Ｃａｎｔｌｅｙ，Ｌ．Ｃ．（２００１）．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｓｉｔｅ  ｍｏｔｉｆｓ  ｕｓｉｎｇ  ｍｉｘｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ  ｏｒｉｅｎｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １９，６６１−６６７．
Ｖｅｅｎ，Ｇ．，Ｍｅｙｅｒ，Ａ．，Ｖｅｒｈｅｕｇｔ，Ｆ．Ｗ．，Ｗｅｒｔｅｒ，Ｃ．Ｊ．，ｄｅ  Ｓｗａｒｔ，Ｈ．，Ｌｉｅ，Ｋ．Ｉ．，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｏｌ，Ｊ．Ｍ．，Ｍｉｃｈｅｌ，Ｈ．Ｒ．，ａｎｄ  ｖａｎ  Ｅｅｎｉｇｅ，Ｍ．Ｊ．（１９９３）．Ｃｕｌｐｒｉｔ  ｌｅｓｉｏｎ  ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｓｔｅｎｏｓｉｓ  ｓｅｖｅｒｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｏｃｃｌｕｓｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓ：ａｎｇｉｏｇｒａｐｈｉｃ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＰＲＩＣＯＴ  ｓｔｕｄｙ．Ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｏｃｃｌｕｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｏｒｏｎａｒｙ  Ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓ．Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ  ２２，１７５５−１７６２．
Ｖｕ，Ｔ．−Ｋ．Ｈ．，Ｈｕｎｇ，Ｄ．Ｔ．，Ｗｈｅａｔｏｎ，Ｖ．Ｉ．，ａｎｄ  Ｃｏｕｇｈｌｉｎ，Ｓ．Ｒ．（１９９１）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｔｈｒｏｍｂｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａｃｔｉｏｎ，Ｃｅｌｌ  ６４，１０５７−１０６８．
Ｗｙａｔｔ  ＣＡ，Ｃｏｏｎ  Ｃｌ，Ｇｉｂｓｏｎ  ＪＪ，Ｂｒｉｎｃｋｅｒｈｏｆｆ  ＣＥ（２００２）．Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ２Ｇ  ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｏｆ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｔｏ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６２：７２００−７２０２．
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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