【手続補正書】
【提出日】平成21年9月2日(2009.9.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血清学的タイピングによって判定される、免疫優性のB型エピトープを欠くB型赤血球またはAB型赤血球を含む、修飾された赤血球。
【請求項２】
血液細胞が、免疫優性のB型エピトープを欠くが、α1,3Galエピトープまたはα1,4Galエピトープのいずれかを保持する、請求項1記載の修飾された赤血球。
【請求項３】
以下の段階を含む方法で調製される、修飾された赤血球：B型赤血球またはAB型赤血球を得る段階、赤血球を中性pHの緩衝液に懸濁する段階、ならびに赤血球に、α3ガラクトシダーゼ活性を有するポリペプチドを接触させることで、赤血球から免疫優性のB型エピトープを実質的に切断するが、α1,3Galエピトープまたはα1,4Galエピトープを切断しない段階。
【請求項４】
赤血球の処理に使用される酵素が、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、もしくはSEQ ID NO: 9によって特定される酵素のポリペプチド配列、またはこれをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項3記載の修飾された赤血球。
【請求項５】
赤血球の酵素的処理が約6.0〜8.0のpHで行われる、請求項4記載の修飾された赤血球。
【請求項６】
赤血球の酵素的処理が約6.5〜7.5のpHで行われる、請求項5記載の修飾された赤血球。
【請求項７】
赤血球の酵素的処理が約7.0〜7.5のpHで行われる、請求項5記載の修飾された赤血球。
【請求項８】
赤血球の酵素的処理が、血液細胞1 mlあたり1〜10μgの酵素を使用して行われる、請求項5記載の修飾された赤血球。
【請求項９】
以下の段階を含む、赤血球を修飾する方法：B型またはAB型の赤血球を得る段階、これを中性pHの緩衝液に懸濁する段階、ならびにこれに、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、もしくはSEQ ID NO: 9によって特定される配列を有するポリペプチドを接触させることで、血清学的タイピングまたは赤血球凝集アッセイによって決定される、B型またはAB型の赤血球上の分岐状の免疫優性のB型エピトープを切断する段階。
【請求項１０】
以下の段階を含む、対象を治療する方法：抗B型抗体に対して血清反応陽性である、血液を必要とするヒト対象を同定する段階；請求項1記載の修飾された血液細胞調製物、または請求項3記載の方法で得られた血液細胞調製物を得る段階、ならびに；血液細胞調製物を対象に輸血する段階であって、対象は輸血された血液細胞を免疫学的に拒絶しない、段階。
【請求項１１】
SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、またはSEQ ID NO: 9によって特定される配列を含むポリペプチドを含み、アルファガラクトシダーゼの分岐基質特異性および中性の至適pHを示す、精製された酵素。
【請求項１２】
以下を含む、精製された酵素：
(a)SEQ ID. NO: 2とのアラインメントに従って番号が付された、以下の配列中の少なくとも10アミノ酸を有するポリペプチド：
残基10におけるM；残基47におけるG；残基84におけるG；残基86におけるY；残基99におけるY；残基102におけるN；残基114におけるK；残基127におけるT；残基130におけるG；残基132におけるG；残基139におけるG；残基156におけるN；残基160におけるD；残基164におけるP；残基205におけるG；残基277におけるR；残基281におけるR；残基287におけるF；残基308におけるG；残基312におけるQ；残基317におけるI；残基333におけるR；残基340におけるD；残基346におけるG；残基349におけるG；残基360におけるG；残基363におけるD；残基364におけるD；残基367におけるN；残基369におけるH；残基370におけるG；残基371におけるT；残基396におけるG；残基462におけるE；残基463におけるN；残基465におけるT；残基467におけるT；残基468におけるP；残基483におけるR；残基484におけるG；残基486におけるL；残基489におけるT；残基498におけるN；残基508におけるI；残基513におけるD；残基517におけるW；残基519におけるE；残基521におけるG；残基525におけるD；残基528におけるI；残基531におけるN；残基533におけるF；残基549におけるI；残基553におけるP；残基573におけるI；残基590におけるA；残基595におけるG；残基601におけるN；および残基629におけるI；
(b)ポリペプチドは、SEQ ID NO: 2と少なくとも20%の同一性を有し、ならびにα3ガラクトシダーゼ活性を有する。
【請求項１３】
配列DD(P/A)(V/I)N(V/I)HGT（SEQ ID NO: 10）を有する9個の隣接アミノ酸を含む、α3ガラクトシダーゼ活性を有するポリペプチドを含む、精製された酵素。
【請求項１４】
配列：
2009516504.tif 000001
（SEQ ID NO: 11）(Xは任意のアミノ酸)を有する21個の隣接アミノ酸を含む、α3ガラクトシダーゼ活性を有するポリペプチドを含む、精製された酵素。
【請求項１５】
機能的等価物をさらに含む、請求項11、12、13、または14の精製された酵素。
【請求項１６】
シグナル配列を含まない短縮型バリアントを含む、請求項15記載の精製された酵素。
【請求項１７】
請求項12、13、14、15、または16のアルファガラクトシダーゼ酵素を使用して、赤血球が酵素的に処理され、免疫優性のB型エピトープが除去される、請求項3記載の修飾された赤血球。
【請求項１８】
以下の段階を含む、組換え酵素を作製する方法：SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、またはSEQ ID NO: 8をコードする核酸を得る段階；核酸を、それをトランスフェクトした細胞で発現させる段階；酵素をコードする核酸の発現を誘導する段階；ならびに、発現された酵素を細胞から精製する段階であって、酵素はα3ガラクトシダーゼ活性を有する、段階。
【請求項１９】
以下を含む、非天然の原核細胞：野生型の原核細胞中には見られない発現ベクターであって、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、またはSEQ ID NO: 9によって特定される配列を含む、α3ガラクトシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を有する発現ベクター。
【請求項２０】
Galα1-3結合の切断に対しては限定的な特異性を有するが、Galα1-4結合の切断に対しては有さない、請求項11または請求項12の精製された原核生物α-ガラクトシダーゼ。
【請求項２１】
血液型B型構造におけるような、分岐状Galα1-3結合の切断に対する特異性を有する、請求項20記載の精製された原核生物α-ガラクトシダーゼ。
【請求項２２】
直鎖状B型構造および血液型B型構造におけるような、直鎖状および分岐状のGalα1-3結合の切断に対する特異性を有する、請求項20記載の精製された原核生物α-ガラクトシダーゼ。
【請求項２３】
直鎖状および分岐状のGalα1-3結合を5.0〜7.5のpH範囲で切断する、請求項11、12、20、および22の精製された原核生物α-ガラクトシダーゼ。
【請求項２４】
以下の段階を含む、異種移植用の組織を調製する方法：非ヒト動物供給源から組織を得る段階；組織を、α3-ガラクトシダーゼ活性を有するポリペプチドとともにインキュベートすることで、免疫優性のα1-3結合末端ガラクトース残基を組織から除去する段階；ならびに、ポリペプチドおよび酵素的に除去されたガラクトースから組織を単離することで、組織をヒトへの異種移植に適切な状態にする段階。
【請求項２５】
組織がブタの結合組織である、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
ブタの結合組織が靱帯である、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
組織が、肝臓、腎臓、または心臓を含む器官である、請求項24記載の方法。
【請求項２８】
組織が、非免疫原性の注射可能なコラーゲン；骨の異種移植片；軟部組織およびプロテオグリカン低減軟部組織の異種移植片；異種移植心臓弁；半月板の異種移植片；ならびに組織マトリックスであって、SEQ ID NO: 2〜9のいずれかのα3ガラクトシダーゼを使用して修飾されたα1,3-ガラクトース欠損組織である、請求項24記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2009516504000001.app