(57)【要約】  哺乳動物細胞において、哺乳動物細胞膜結合型ヒトＣＣＮ１又はそのＣＣＮ１ドメインを組換え発現させる方法において、ＣＣＮ１、又は哺乳動物細胞膜貫通ドメインにＣ末端で融合したそのＣＣＮ１ドメイン（ＣＣＮ１融合タンパク質）をコードするベクターで、哺乳動物宿主細胞を形質転換させ、前記宿主細胞において前記ＣＣＮ１又はＣＣＮ１ドメイン融合タンパク質を発現させ、前記膜結合ＣＣＮ１又は前記ＣＣＮ１ドメインを回収することを特徴とする方法。そして抗体の産生のための、そのような膜結合ＣＣＮ１及びドメインの使用。ヒトＣＣＮ１に対する抗体は疾患の治療に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物細胞において、哺乳動物細胞膜結合型ヒトＣＣＮ１又はそのＣＣＮ１ドメインを組換え発現させる方法において、ＣＣＮ１、又は哺乳動物細胞膜貫通ドメインにＣ末端で融合したそのＣＣＮ１ドメイン(ＣＣＮ１融合タンパク質)をコードする核酸ベクターで、哺乳動物宿主細胞を形質転換させ、前記宿主細胞において前記ＣＣＮ１又はＣＣＮ１ドメイン融合タンパク質を発現させ、前記膜結合ＣＣＮ１又は前記ＣＣＮ１ドメインを回収することを特徴とする方法。
【請求項２】
前記ＣＣＮ１ドメインが、ＣＣＮ１の可変ドメインであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ヒトＣＣＮ１に対する抗体を産生させるための、哺乳動物細胞膜結合型ヒトＣＣＮ１又はＣＣＮ１ドメインの使用。
【請求項４】
前記ＣＣＮ１ドメインが、ＣＣＮ１の可変ドメインであることを特徴とする、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
哺乳動物細胞膜結合型ＣＣＮ１又はＣＣＮ１ドメインで非ヒト動物を免疫し、前記ＣＣＮ１に対する又は前記ＣＣＮ１ドメインに対する抗体を回収することを特徴とする、請求項３又は４に記載の使用。
【請求項６】
ＣＣＮ１可変ドメインのアミノ酸２１０から２２８と、ＰＤＧＦ-レセプター（ヒトベータ型血小板由来増殖因子レセプター）の膜貫通ドメインにＣ末端で融合したＣＣＮ１可変ドメインからなる融合タンパク質に特異的に結合し、前記融合タンパク質がヒト細胞の表面に発現されることを特徴とする、ヒトＣＣＮ１に対する抗体。
【請求項７】
重鎖ＣＤＲ領域として配列番号：１のＣＤＲ３領域、配列番号：２のＣＤＲ２領域及び配列番号：３のＣＤＲ１領域を含み、かつ軽鎖可変ドメインとして配列番号：４のＣＤＲ３領域、配列番号：５のＣＤＲ２領域及び配列番号：６のＣＤＲ１領域を含むことを特徴とする、ヒトＣＣＮ１に対する抗体。
【請求項８】
重鎖可変ドメインが配列番号：７を含むことを特徴とする、請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
軽鎖可変ドメインが配列番号：８を含むことを特徴とする、請求項７に記載の抗体。
【請求項１０】
モノクローナル抗体４２０が結合する同じＣＣＮ１エピトープ（配列番号：７及び８）に結合することを特徴とする、ＣＣＮ１に対する抗体。
【請求項１１】
疾患の治療のための、請求項６から１０のいずれか一項に記載のヒトＣＣＮ１に対する抗体の使用。
【請求項１２】
疾患が腫瘍疾患である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
医薬の製造のための、請求項６から１１のいずれか一項に記載のヒトＣＣＮ１に対する抗体の使用。
【請求項１４】
請求項６から１１のいずれか一項に記載のヒトＣＣＮ１に対する抗体を含有せしめることを特徴とする、疾患の治療のための医薬の製造方法。
【請求項１５】
請求項６から１０のいずれか一項に記載の抗体を含有する薬学的組成物。
【請求項１６】
疾患の治療において使用される、請求項６から１０のいずれか一項に記載のヒトＣＣＮ１に対する抗体。
【請求項１７】
疾患が腫瘍疾患であることを特徴とする、請求項１６に記載の抗体。
【請求項１８】
医薬の製造における使用のための、請求項６から１０のいずれか一項に記載のヒトＣＣＮ１に対する抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＣＣＮ１に対する抗体（ＣＣＮ１抗体）、その製造方法、該抗体を含む薬学的組成物、及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＣＮ１（ＣＹＲ６１、ＧＩＧ-１、ＩＧＦＢＰ-１０、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｏ００６２２）は、増殖因子誘導性前初期遺伝子で、ＣＣＮタンパク質ファミリーのメンバーであり、細胞接着、血管新生、アポトーシス、及び増殖停止又は増殖刺激のいずれかに関与している（Chen Y. 及び Xiao-Yan D., J. Cell. Biochem. 100 (2007) 1337-1345, 及びKubota, K. 及び Tagikawa, M., Angiogenesis 10 (2007) 1-11に概説）。ＣＣＮ１はモジュラー構造からなり、３８の保存システイン残基を含む。ＣＣＮ１は他のＣＣＮタンパク質（Ｃ末端モジュールを欠くＣＣＮ５を除く）と共通のモジュラー構造を共有する。ＣＣＮ１は、インスリン様増殖因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）様モチーフ（ドメインＩ、ＩＧＦ-ＢＰ、アミノ酸２６−９７）、フォン・ヴィルブランドＣ型ドメイン（ドメインＩＩ、ＶＷＣ、アミノ酸９８−１６４）、トロンボスポンジンＩ型ドメイン（ドメインＩＩＩ、ＴＳＰ、アミノ酸２２８−２７３）、及びＣ末端モジュール（ドメインＩＶ、ＣＴ、アミノ酸２８６−３６０）を含む。ドメインＩＩとＩＩＩとの間には、可変ドメイン（Ｖａｒ、アミノ酸１６５−２２７）が位置する。ＣＣＮ１は、インテグリンαｖβ３に結合し、またこれを介して、血管新生促進活性を促進するように機能する（Chen, Nら, J. Biol. Chem. 42 (2004) 44166-44176）。ＣＣＮ１のインテグリンαｖβ３結合部位は、アミノ酸１１６−１３５（Chen Nら,J. Biol. Chem. 42 (2004) 44166-44176）の間と、ドメインＩＩＩ（Leu, S.Jら, J. Biol.Chem. 278 (2003) 33801-33808）中に存在する。インテグリンα６β１とヘパリン結合部位は、細胞性媒介ドメインＩＩＩ及びＩＶに位置する（Chenら,  J. Biol. Chem. 276 (2001) 47329-47337）。
【０００３】
ＣＣＮタンパク質が、Ｎ末端近傍にインスリン様増殖因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）様モチーフを共有しているが、ＩＧＦシグナル伝達経路における機能を示唆する明確な実験的な有意性は存在しない（Grotendorst, G.Rら, Endocrinology 141 (2000) 2254-2256）。フォン・ヴィルブランドＣ型ドメイン（ＶＷＣ）、トロンボスポンジンＩ型ドメイン、及びＣ末端モジュール（ＷＩＳＰ２／ＣＣＮ５には存在していない）は、タンパク質−タンパク質相互作用、オリゴマー化（ＶＷＣ）又は細胞外マトリックス分子及びレセプターとの相互作用にとって重要であると考えられている。
【０００４】
マウスＣＣＮ１は、ヒトＣＣＮ１と９１％のアミノ酸配列同一性を共有する。マウスＣＣＮ１、及びマウスＣＣＮ１に対する抗体は、O'Brien, T.Pら, Mol. Cell. Biol. 10 (1990) 3569-3577)から知られている。また、ＣＣＮ１と結合組織増殖因子-ＩＩ（ＣＴＧＦ２／ＣＴＧＨ２）との間には高度な相同性が存在する。さらなる（しかしより低い）相同性が、ＮＯＶ及びＦＩＳＢ-１２とに見出されている。Babic, A.Mら, Proc. Natl. Acad. Sci.USA 95 (1998) 6355-6360には、ヒトＣＣＮ１に対する抗体が、ＦＩＳＢ-１２ではなく、マウスＣＣＮ１と交差反応性を示すことが記載されている。
【０００５】
ＣＣＮ１とＣＣＮ１に対する抗体は、結合組織増殖因子-ＩＩ''（ＣＴＧＦ-２）に関する国際公開第９６／００１８９６号、ヒトＣＣＮ１に関する国際公開第９７／０３３９９５号、ＣＣＮ１組成物及び方法に関する国際公開第０１／５５２１０号、ＣＣＮ１組成物及び方法に関する国際公開第２００５／０４０１９１号、結合組織増殖因子-ＩＩ’’（ＣＴＧＦ-２）に関する国際公開第０２／０４４８０号、乳癌の治療及び診断用の標的としてのＣＣＮ１に関する国際公開第０１／９８３５９号、ヒト子宮筋腫の治療及び診断におけるＣＣＮ１の使用に関する国際公開第０２／２６１９３号に記載されている。Grotendorst, G.R. 及び Duncan, M.R., FASEB J. 19 (2005) 729-738には、ＣＴＧＦのドメインに対する抗体が記載されており、Ｎ末端及びＣ末端ドメインに対する抗体へのある種の活性が見出されている。ドメインがプラスミン切断により産生された場合、この切断は可変ドメイン内で生じ、該ドメインは破壊された。
【０００６】
Dong Xieら, J. Biol. Chem. 276 (2001) 14187-14194には、ＣＣＮ１がより進行した疾患に関連していること、Cancer Res. 64 (2004) 1987-199には、ＣＣＮ１が神経膠腫で過剰発現し、インテグリン関連キナーゼ媒介性ａｋｔ及びβ-カテニン-ＴＣＦ／Ｌｅｆシグナル伝達経路に関与していることが記載されている。
【０００７】
Schuetze, Nら, Protein Expr. Purif. 42 (2005) 219-225は、組換えＣＣＮ１の発現、精製及び機能試験に関する。Schuetzeは、バキュロウイルス発現ベクター中にオープンリーディングフレームをクローニングし、ＳＦ-２１昆虫細胞にコンストラクトを形質移入した。組換えＣＣＮ１は、ヒトＩｇＧのＦｃ-ドメインとの融合タンパク質として発現され、プロテインＧ-セファロースカラムでのアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製された。ＣＣＮ１が１０％のシステイン残基を有しているので、精製及び取扱い中に容易に失われうるおそれのある非常に接着性のタンパク質である。また、該タンパク質は凝集体を形成し、精製中又は精製後に沈殿する傾向がある。Ｆｃ-タグの付加により、これらの困難は最小化された。筆者は、ｒＣＣＮ１タンパク質のＦｃ-タグが、タンパク質の生化学的特性を変えるか又はそれに影響を与えるかどうかについて、はっきりしなかった。Leu, S.Jら, J. Biol. Chem. 278 (2003) 33801-33808には、ドメインＩ（ＩＧＦＢＰ）、ドメインＩＩ（ＶＷＣ）及びドメインＩＩＩ（ＴＳＰ１）のヘキサヒスチジンタグ化ＣＣＮ１断片の組換え発現が記載されている。天然の非タグ化タンパク質は入手できない。
【０００８】
Jedsadayanmata, Aら, J. Biol. Chem. 274 (1999) 24321-24327には、ヒト血小板の活性化依存性接着の研究のための、ＣＣＮ１の可変ドメイン(ａ．ａ．１６３−２２９)及びＴＳＰ１ドメイン(ａ．ａ．２２８−２７３)の一部を有するペプチドに対して産生された抗ペプチドポリクローナル抗体が記載されている。ポリクローナル抗血清は、大腸菌中で組換え的に生産されたＶａｒ-ＧＳＴ融合タンパク質でウサギを免疫化することにより産生された（Kireevaら, Exp. Cell Res. 233 (1997) 63-77）。米国特許第７５２１５４０号には、ヒトＣｙｒ６１のアミノ酸１６３−２２９と２１０−２２５に結合する抗体が特許請求されている。米国特許第７５２１５４０によれば、ＧＳＴにＣｙｒ６１のアミノ酸１６３−２２９を融合させたコンストラクトを使用し、ポリクローナルＣｙｒ６１特異的抗血清が、ニュージーランドホワイトウサギの免疫化により作製された。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、哺乳動物細胞膜結合型ヒトＣＣＮ１、又はそのＣＣＮ１ドメインを哺乳動物細胞において組換え発現させる方法において、ＣＣＮ１、又は哺乳動物細胞膜貫通ドメインにＣ末端的に融合したそのＣＣＮ１ドメイン（ＣＣＮ１融合タンパク質）をコードする核酸ベクターを用いて哺乳動物細胞を形質転換させ、該宿主細胞において前記ＣＣＮ１又はＣＣＮ１ドメイン融合タンパク質を発現させ、前記膜結合ＣＣＮ１又はその前記ＣＣＮ１ドメインを回収することを特徴とする方法を含む。好ましくは、前記ＣＣＮ１ドメインは、ＣＣＮ１の可変ドメインである。
【００１０】
本発明は、ＣＣＮ１に対する抗体を生じさせるための、哺乳動物細胞膜結合型ＣＣＮ１又はＣＣＮ１ドメインの使用をさらに含む。膜結合ＣＣＮ１又はＣＣＮ１ドメインは、免疫源として、及び／又は本発明に係る抗体の選択のために使用することができる。好ましくは、前記ＣＣＮ１ドメインは、ＣＣＮ１の可変ドメインである。
【００１１】
本発明は、ＣＣＮ１可変ドメインのアミノ酸２１０から２２８、及びＰＤＧＦレセプター（ヒトベータ型血小板由来増殖因子レセプター）の膜貫通ドメインにＣ末端的に融合するＣＣＮ１の可変ドメインからなる融合タンパク質に特異的に結合することを特徴とする、ヒトＣＣＮ１に対する抗体をさらに含み、該融合タンパク質は、哺乳動物、好ましくはヒト細胞の表面で発現される。このような細胞は、例えば、ＨＥＫ２９３又はＮＩＨ３Ｔ３等の哺乳動物細胞系の細胞とできる。好ましくは、細胞はＨＥＫ２９３である。
【００１２】
本発明は、重鎖可変ドメインＣＤＲ３領域として配列番号：１のＣＤＲ３領域を含むことを特徴とする、ＣＣＮ１に特異的に結合する抗体を含む。
【００１３】
好ましくは、ＣＣＮ１に特異的に結合する抗体は、重鎖可変ドメインが、配列番号：１のＣＤＲ３領域と配列番号：２のＣＤＲ２領域を含むことを特徴とする。
【００１４】
好ましくは、ＣＣＮ１に特異的に結合する抗体は、重鎖可変ドメインが、配列番号：１のＣＤＲ３領域、配列番号：２のＣＤＲ２領域、及び配列番号：３のＣＤＲ１領域を含むことを特徴とする。
【００１５】
好ましくは、ＣＣＮ１に特異的に結合する抗体は、重鎖可変ドメインが、配列番号：１のＣＤＲ３領域、配列番号：２のＣＤＲ２領域、及び配列番号：３のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが、配列番号：４のＣＤＲ３領域、配列番号：５のＣＤＲ２領域、及び配列番号：６のＣＤＲ１領域を含むことを特徴とする。
【００１６】
好ましくは、ＣＣＮ１に特異的に結合する抗体は、重鎖可変ドメインが配列番号：７を含むことを特徴とする。好ましくは、抗体は、重鎖可変ドメインが配列番号：７を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号：８を含むことを特徴とする。重鎖可変ドメイン配列番号：７及び軽鎖可変ドメイン配列番号：８は、ヒトラムダアイソタイプのものである。
【００１７】
好ましくは、ＣＣＮ１に特異的に結合する抗体は、重鎖可変ドメインが重鎖可変ドメイン配列番号：７のＣＤＲグラフト化ＩｇＧ１サブタイプ型であり、軽鎖可変ドメインが軽鎖可変ドメイン配列番号：８のＣＤＲグラフト化ラムダアイソタイプ型であることを特徴とする。
【００１８】
好ましくは、抗体は、モノクローナル抗体４２０が結合するのと同じＣＣＮ１エピトープ（配列番号：７及び８）に結合することを特徴とする。
【００１９】
好ましくは、本発明に係る抗体は、上述のアミノ酸配列又はアミノ酸配列断片及び特性により特徴付けられる。本発明に係る抗体は、好ましくはヒト由来のＦｃ部分を含む。好ましくは、本発明に係る抗体は、ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ４アイソタイプのものである。ＩｇＧ１及びＩｇＧ４定常鎖の例は、以下の配列表に提供する。好ましくは、抗体はヒトＩｇＧ１クラスのものである。好ましくは、抗体はヒト化されるか、又はヒト抗体である。
【００２０】
本発明に係る抗体は、好ましくは少なくとも１０−７Ｍ−１〜１０−１２Ｍ−１の親和性で、ＣＣＮ１、及び膜結合ＣＣＮ１可変領域に特異的に結合する。本発明に係る抗体は、１０μｇ／ｍｌで５０％以上、ＥＡ-Ｈｙ-９２６細胞と組換えＣＣＮ１との間の相互作用を阻害する（接着アッセイ）。
【００２１】
本発明は、疾患、好ましくは腫瘍疾患の治療のための、本発明に係る抗体を使用をさらに含む。
【００２２】
本発明は、疾患、好ましくは腫瘍疾患の治療のための医薬の製造のための、本発明に係る抗体の使用をさらに含む。
【００２３】
本発明は、本発明に係る抗体を含有せしめることを特徴とする、疾患、好ましくは腫瘍疾患（特に、乳癌、原発性神経膠腫、膵臓癌、膀胱乳頭腫、結腸腺癌、メラノーマ、髄芽種、小児腫瘍、線維肉腫）の治療のための医薬を製造する方法をさらに含む。
【００２４】
本発明は、本発明の抗体を含有する薬学的組成物をさらに含む。本発明は、疾患の治療における使用のための本発明の抗体の使用をさらに含む。本発明は、医薬の製造における使用のための本発明に係る抗体の使用をさらに含む。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
「抗体」なる用語は、限定されるものではないが、全抗体及び抗体断片を含む種々の形態の抗体構造を包含する。本発明に係る抗体は、好ましくはヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、又は本発明の特徴的特性が保持されている限りは、さらに遺伝子的に改変された抗体である。「抗体断片」は完全長抗体の一部、好ましくはその可変ドメイン、又は少なくともその抗原結合部位を含む。抗体断片の例には、ダイアボディ、単鎖抗体分子、及び多重特異性抗体で、抗体断片から形成されたものが含まれる。ｓｃＦｖ抗体は、例えばHouston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-96に記載されている。また、抗体断片は、ＶＨドメインの特性を有する、すなわちＶＬドメインと共にアセンブリ可能であるか、又はＣＣＮ１に結合するＶＬドメインの特性を有する、すなわち機能的抗原結合部位にＶＨドメインと共にアセンブリ可能であり、それによって本発明に係る抗体の特徴を提供する単鎖ポリペプチドを含む。ここで使用される「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」なる用語は、単一のアミノ酸組成物の抗体分子の調製物を意味する。「ヒト化抗体」なる用語は、フレームワーク及び／又は「相補性決定領域」(ＣＤＲ)が、親免疫グロブリンのものと比較して、異なる種の免疫グロブリンのＣＤＲを含むように修飾されている抗体を意味する。好ましい実施態様では、マウスＣＤＲは、ヒト抗体のフレームワーク領域にグラフトされ、「ヒト化抗体」が調製される。Riechmann, Lら, Nature 332 (1988) 323-327；及び Neuberger, M.Sら, Nature 314 (1985) 268-270を参照。
【００２６】
膜結合ＣＣＮ１ドメインを組換え発現させるための方法、及びＣＣＮ１に対する抗体を産生させるための前記膜結合ＣＣＮ１ドメインの使用に関し、ここで使用される「ＣＣＮ１ドメイン」なる用語は、インスリン様増殖因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）様モチーフ（ドメインＩ、ＩＧＦ-ＢＰ、アミノ酸２６−９７）、フォン・ヴィルブランドＣ型ドメイン（ドメインＩＩ、ＶＷＣ、アミノ酸９８−１６４）、トロンボスポンジンＩ型ドメイン（ドメインＩＩＩ、ＴＳＰ、アミノ酸２２８−２７３）、Ｃ末端モジュール（ドメインＩＶ、ＣＴ、アミノ酸２８６−３６０）、及び可変ドメイン（Ｖａｒ、アミノ酸１６５−２２７）を含む群から選択されるＣＣＮ１ドメインを意味する。膜結合ＣＣＮ１ドメインを組換え発現させるための方法、及びＣＣＮ１に対する抗体を生じさせるための前記膜結合ＣＣＮ１ドメインの使用に関し、ＣＣＮ１ドメインなる用語は、１から８のアミノ酸がＮ末端で及び／又はＣ末端で欠失しているＣＣＮ１ドメイン断片もまた含む。
【００２７】
ここで使用される「ＣＣＮ１に特異的に結合する」なる用語は、細胞当たり＞１００．０００分子ＣＣＮ１の量で、その膜結合ＣＣＮ１を組換え的に発現する細胞、及び検出用抗体としてＦＩＴＣ標識された抗ヒトＩｇＧ抗体を使用するＦＡＣＳにより、測定される細胞結合アッセイにおける、ヒトＣＣＮ１に対する抗体の結合性を意味する。１０μｇ／ｍｌの抗体濃度で、検出抗体単独（抗ヒトＩｇＧ抗体、ＦＩＴＣ標識、同濃度、１０μｇ／ｍｌ）でのバックグラウンド染色に関し、抗体が、蛍光を少なくとも１０倍増加させるならば、結合が見出される。
【００２８】
ここで使用される「ＣＣＮ１可変ドメインに特異的に結合する」なる用語は、細胞当たり＞１００．０００分子可変ドメインの量で、膜結合可変ドメインを組換え的に発現する細胞、及び検出抗体としてＦＩＴＣ標識された抗ヒトＩｇＧ抗体を使用するＦＡＣＳにより、測定される細胞結合アッセイにおける、ヒトＣＣＮ１の可変ドメイン（Ｖａｒ、アミノ酸１６５−２２７）に対する抗体の結合性を意味する。１０μｇ／ｍｌの抗体濃度で、検出用抗体単独（抗ヒトＩｇＧ抗体、ＦＩＴＣ標識、同濃度、１０μｇ／ｍｌ）でのバックグラウンド染色に関し、抗体が、蛍光を少なくとも８倍増加させるならば、結合が見出される。
【００２９】
ＦＡＣＳシグナルは、ポジティブ及びネガティブ（コントロール、ノイズシグナル）蛍光試料間の領域オーバーラップを形態測定学的に測定することにより定量される。有用なツールは、「Measuring Colocalization」MetaMorph Imaging softwareからのアルゴリズム(www.moleculardevices.com)である。
【００３０】
ＣＣＮ１の直鎖状断片への結合は、ＶＡＲドメイン（１６３．ａａから２４０．ａａ）を包含する合成ペプチドを使用するＥＬＩＳＡにより測定される。重複ペプチドを用いた測定に基づき、 Ｍａｂ４２０は、ヒトＣＣＮ１のアミノ酸２１０から２２８からなるＣＣＮ１エピトープに結合する。
【００３１】
本発明に係るＣＣＮ１抗体は、ＣＣＮ１の膜結合可変ドメインに、また抗体Ｍａｂ４２０が結合するＣＣＮ１の可変ドメイン上の同じエピトープに特異的に結合する。本発明のＣＣＮ１抗体のエピトープ結合特性は、膜結合ＣＣＮ１又は膜結合可変ドメインへの試験抗体の結合を妨害するＭａｂ４２０抗体の能力を測定するための、ＦＡＣＳインビトロ交差ブロッキング結合アッセイにより測定される細胞結合アッセイによって決定される。このようなアッセイでは、Ｍａｂ４２０は、膜結合ＣＣＮ１又はＣＣＮ１の膜結合可変ドメインを組換え的に発現する細胞に予め結合されており、試験抗体が続いて添加される。同濃度（１０μｇ／ｍｌ）で、試験抗体の結合が、（同じ濃度であるが予め結合されたＭａｂ４２０のない試験抗体の結合性に関して）少なくとも１５％阻害されているならば、エピトープは「同じ」である。
【００３２】
ここで使用される「本発明に係る抗体の可変ドメイン」（軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）、重鎖の可変ドメイン（ＶＨ））は、抗原への抗体の結合に直接関与している軽鎖及び重鎖ドメイン対のそれぞれを示す。軽鎖及び重鎖の可変ドメインは同じ一般構造を有し、各ドメインは、その配列が広範囲に保存されており、３つの「高頻度可変領域」（又は相補性決定領域、ＣＤＲ）により結合される４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を含む。フレームワーク領域はβシート立体構造を採り、ＣＤＲはβシート構造を連結するループを形成しうる。各鎖のＣＤＲは、フレームワーク領域によりその３次元構造で保持され、他の鎖のＣＤＲと共に抗原結合部位を形成する。抗体の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ３領域は、本発明に係る抗体の結合特異性／親和性において特に重要な役割を担っており、よって本発明のさらなる目的を提供する。
【００３３】
ここで使用される場合、「抗体の抗原結合部分」なる用語は、抗原結合の原因となる抗体のアミノ酸残基を意味する。抗体の抗原結合部分は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」又は「ＦＲ」領域は、ここで定められるような高頻度可変領域残基以外の可変ドメイン領域である。よって、抗体の軽鎖及び重鎖可変ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４を含む。特に、重鎖のＣＤＲ３は、抗原結合に最も寄与し、抗体の特性を定める領域である。ＣＤＲ及びＦＲ領域は、Kabatら, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)の標準的定義に従い決定され、及び／又は「高頻度可変ループ」からの残基である。
【００３４】
この出願中で使用される「アミノ酸」なる用語は、アラニン（３文字コード：ａｌａ、１文字コード：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）、及びバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む自然に生じるカルボキシα-アミノ酸の群を示す。
【００３５】
ここで使用される「核酸」又は「核酸分子」なる用語は、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子を含むことを意図している。核酸分子は一本鎖又は二本鎖であってよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。核酸は、他の核酸と機能的関係に配されている場合、「作用可能に結合」している。例えば、プレ配列又は分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参画するプレタンパク質として発現されるならば、そのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したＤＮＡ配列が共直線性であり、分泌リーダーの場合には近接していて読み枠にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが常套的な手法に従って使用される。ここで使用される場合、「細胞」、「細胞株」及び「細胞培養」なる表現は交換可能に使用され、そのような標記の全てが子孫を含む。よって、「形質転換体」及び「形質転換細胞」なる語は、初代の主題細胞、及び移行の回数に関係なくそこから得られた培養物も含まれる。また、全ての子孫は、計画的又は偶発的変異により、ＤＮＡ量が厳密には同一でない場合もあることが理解される。最初に形質転換された細胞に対してスクリーニングされたものと同じ機能又は生物活性を有する変異体子孫も含まれる。
【００３６】
本発明に係る抗体は、好ましくは、定常鎖がヒト由来のものであることを特徴とする。このような定常鎖は従来からよく知られており、例えばKabatら, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)に記載されている。
【００３７】
例えば、有用なヒト軽鎖定常領域は、配列番号：９のラムダ軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含む。例えば、有用なヒト重鎖定常領域は配列番号：１０から１３を含む。
【００３８】
本発明のさらなる実施態様は、本発明に係る抗体の重鎖及び軽鎖をコードする核酸である。
【００３９】
本発明は、本発明に係る抗体の治療的有効量を患者に投与することを特徴とする、治療を必要とする患者を治療する方法を含む。本発明は、本発明の抗体の治療のための使用を含む。本発明は、腫瘍疾患の治療のための医薬を調製するための、本発明に係る抗体の使用を含む。本発明は、腫瘍疾患の治療のための本発明に係る抗体の使用を含む。
【００４０】
本発明に係る抗体は、さらに「保存配列修飾」、つまり本発明に係る抗体の上述した特徴に影響を与えないか又はそれを改変しないヌクレオチド及びアミノ酸配列修飾を有するかかる抗体（変異抗体）を含む。修飾は、当該技術分野で知られている標準的技術、例えば部位特異的変異誘発及びＰＣＲ媒介性変異誘発により導入することができる。保存的アミノ酸置換には、アミノ酸残基が、類似した側鎖を有するアミノ酸残基と置き換えられるものが含まれる。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で定まっている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷の極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分枝状側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。よって、ヒト抗ＣＣＮ１抗体中の予測される非必須アミノ酸残基は、好ましくは、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基で置き換えることができる。よって、「変異」抗ＣＣＮ１抗体は、ここでは、親抗体の一又は複数の可変領域において、１０まで、好ましくは約２から約５の付加、欠失及び／又は置換により、「親」抗ＣＣＮ１抗体アミノ酸配列とはアミノ酸配列が異なっている分子を意味する。アミノ酸置換は、Riechmann, Lら, Nature 332 (1988) 323-327 及びQueen, Cら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-1003により記載されているように、分子モデリングに基づく変異誘発により実施することができる。
【００４１】
配列に関する同一性又は相同性は、最大のパーセント配列同一性を達成するために、必要ならば、配列をアラインさせ、間隙を導入した後、親配列と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとしてここで定義される。抗体配列中へのＮ末端、Ｃ末端、又は内部の伸展、欠失、又は挿入のいずれも、配列同一性又は相同性に影響を与えると解釈すべきではない。変異体は、ヒトＣＣＮ１の可変ドメインに結合する能力を保持しており、好ましくは親抗体のものよりも優れている性質を有する。例えば、変異体は治療中の副作用を低減させる場合がある。
【００４２】
例示的な「親」抗体は、抗体Ｍａｂ４２０のＣＤＲ領域を含み、好ましくは、変異体の調製に使用される。好ましくは、親抗体はヒトフレームワーク領域を有しており、存在するならば、ヒト抗体定常ドメインを有する。例えば、親抗体はヒト化又はヒト抗体でありうる。
【００４３】
本発明に係る抗体は、好ましくは組換え手段により生産される。このような方法は従来から広く知られており、原核生物及び真核生物細胞中でのタンパク質発現と、続く抗体ポリペプチドの単離と、通常は薬学的に許容可能な純度までの精製を含む。タンパク質発現では、軽鎖及び重鎖又はその断片をコードする核酸を、標準的な方法で発現ベクター中に挿入する。発現は、適切な原核生物又は真核生物宿主細胞、例えばＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、酵母、又は大腸菌細胞において実施され、抗体は細胞から（上清から又は細胞溶解後に）回収される。抗体の組換え生産は従来からよく知られており、例えば、Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202；Geisse, Sら, Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282；Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-161；Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880の概説文献に記載されている。抗体は、全細胞中に、細胞可溶化物中に、又は部分的に精製され、又は実質的に純粋な形態で存在しうる。カラムクロマトグラフィー及び当該技術分野でよく知られている他のものを含む標準的な技術により、他の細胞成分又は他の汚染物質、例えば他の細胞核酸又はタンパク質を除去するために、精製が実施される（Ausubel, Fら編 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)を参照）。ＮＳ０細胞における発現は、例えばBarnes, L.Mら, Cytotechnology 32 (2000) 109-123；Barnes, L.Mら, Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270に記載されている。一過性発現は、例えばDurocher, Yら, Nucl. Acids. Res. 30(2002) E9に記載されている。可変ドメインのクローニングは、Orlandi, Rら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837；Carter, Pら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289；Norderhaug, Lら, J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87に記載されている。好ましい一過性発現系（ＨＥＫ２９３）は、Schlaeger, E.-J. 及び Christensen, K., Cytotechnology 30 (1999) 71-83、及びSchlaeger, E.-J., J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199に記載されている。モノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ-セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィー等、一般的な免疫グロブリン精製手順により、培養培地から適切に分離される。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡ及びＲＮＡは、従一般的な手順を使用し、容易に単離し配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡ及びＲＮＡの供給源となりうる。単離されると、ＤＮＡは発現ベクター内に挿入され得、ついで、宿主細胞、例えばそうでないと免疫グロブリンタンパク質を生産しないＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、又は骨髄腫細胞に形質移入され、宿主細胞において組換えモノクローナル抗体の合成が達成される。前記細胞株から得ることができる抗体は、本発明の好ましい実施態様である。
【００４４】
ヒトＣＣＮ１抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするＤＮＡに適切なヌクレオチド変化を導入することにより、又はペプチド合成により調製される。しかしながら、このような修飾は、例えば上述したように、非常に限られた範囲でしか実施することができない。例えば、修飾により、上述の抗体の特徴、例えばＩｇＧアイソタイプ及びエピトープ結合性を変化させることはできないが、組換え生産の収率、タンパク質安定性を改善し、又は精製を容易にすることができる。また、抗ＣＣＮ１抗体の適切な立体構造の維持に関与していない任意のシステイン残基を、一般にはセリンで置換し、分子の酸化安定性を改善し、異常な架橋を防止することができる。反対に、システイン結合（類）を抗体に付加して、その安定性を改善することができる（特に、抗体がＦｖ断片等の抗体断片である場合）。抗体の他の種類のアミノ酸変異体は、抗体の元来のグリコシル化パターンを変化させる。「変化させる」とは、抗体に見出される一又は複数の炭水化物部分の除去、及び／又は抗体に存在しない一又は複数のグリコシル化部位の付加を意味する。抗体のグリコシル化は典型的にはＮ結合である。Ｎ結合は、アスパラギン残基の側鎖に炭水化物部分が結合することを意味する。Ｘがプロリン以外の任意のアミノ酸であるトリペプチド配列アスパラギン-Ｘ-セリン及びアスパラギン-Ｘ-スレオニンは、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合のための認識配列である。よって、ポリペプチドにこれらのトリペプチド配列のいずれかが存在すると、潜在的グリコシル化部位が生じる。抗体へのグリコシル化部位の付加は、それが一又は複数の上述のトリペプチド配列を含むように（Ｎ結合グリコシル化部位の場合）、アミノ酸配列を変化させることによって簡便に達成される。
【００４５】
抗ＣＣＮ１抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当該技術で知られている様々な方法で調製される。これらの方法には、限定されるものではないが、天然源（自然に生じるアミノ酸配列変異体の場合）からの単離、又はオリゴヌクレオチド媒介性（又は部位特異的）変異誘発、ＰＣＲ変異誘発、ヒト化抗ＣＣＮ１抗体の前もって調製された変異体又は非変異型のカセット変異誘発が含まれる。
【００４６】
抗体の他のタイプの共有結合的修飾は、米国特許第４６４０８３５号；同４４９６６８９号；同４３０１１４４号；同４６７０４１７号；同４７９１１９２号；同４１７９３３７号に記載されたように、種々の非タンパク質性ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリアルキレンの一つに抗体を結合させることを含む。
【００４７】
本発明に係る重鎖及び軽鎖可変ドメインは、発現ベクターコンストラクトが形成されるように、プロモーター、翻訳開始、定常領域、３'非翻訳領域、ポリアデニル化、及び転写終結の配列と組合わされる。重鎖及び軽鎖発現コンストラクトは単一ベクターに組み込まれ、宿主細胞中に、同時形質移入、連続的形質移入、又は別々に形質移入され、これがついで融合されて、双方の鎖を発現する単一の宿主細胞が形成される。
【００４８】
他の態様において、本発明は、薬学的に許容可能な担体と共に処方された、モノクローナル抗体、又はその抗原結合部分の一つ又は組合せを含む、本発明の組成物、例えば薬学的組成物を提供する。ここで使用される場合、「薬学的に許容可能な担体」には、任意の及び全ての溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤、及び吸収／再吸収遅延剤等で、生理学的に適合性があるものが含まれる。好ましくは、担体は注射又は注入に適している。本発明の組成物は当該分野で知られている様々な方法により投与することができる。当業者に理解されるように、投与の経路及び／又は方式は、所望される結果に応じて変わるであろう。薬学的に許容可能な担体には、滅菌水溶液又は分散液、及び注射可能な滅菌溶液又は分散液を調製するための滅菌パウダーが含まれる。薬学的に活性な物質用のこのような媒体又は薬剤の使用は、当該分野で知られている。水に加えて、担体は、例えば等張に緩衝された生理食塩水である。選択された投与経路にかかわらず、本発明の化合物は、適切な水和形態で使用され得、及び／又は本発明の薬学的組成物は、当業者に知られている一般的な方法により、薬学的に許容可能な投与形態に処方される。本発明の薬学的組成物における活性成分の実際の投与レベルは、患者に対して毒性がなく、特定の患者、組成物、及び投与方式に対して所望される治療的応答を達成するのに効果的な量（有効量）が得られるように変えてもよい。選択された投与レベルは、用いられる本発明の特定の組成物の活性、投与経路、投与時間、用いられる特定の化合物の排出速度、用いられる特定の組成物と組合せて使用される他の薬剤、化合物及び／又は物質、年齢、性別、体重、状態、一般的健康状態、及び治療される患者の以前の病歴、及び医療技術においてよく知られている類似の要因を含む、様々な薬物動態学的要因に依存するであろう。
【００４９】
本発明は、腫瘍に罹患している患者の治療のための、本発明に係る抗体の使用を含む。
【００５０】
本発明は、薬学的に許容可能な担体と共に、本発明に係る抗体の有効量を含有せしめることを含む薬学的組成物の製造方法、及びそのような方法のための本発明に係る抗体の使用をさらに提供する。本発明は、好ましくは薬学的に許容可能な担体と共に、乳癌、原発性神経膠腫、膀胱乳頭腫、結腸腺癌、メラノーマ、髄芽種、小児腫瘍、線維肉腫、卵巣癌、膵臓癌、又は前立腺癌等の癌に罹患した患者の治療のための薬剤を製造するための、有効量での本発明の抗体の使用を提供する。
【００５１】
また本発明は、好ましくは薬学的に許容可能な担体と共に、腫瘍に罹患している患者を治療するための薬剤を製造するための、有効量での本発明に係る抗体の使用を提供する。
【００５２】
次の実施例及び配列表は、本発明の理解を助けるために提供されるものであり、発明の真の範囲は、添付する特許請求の範囲に記載されている。本発明の精神を逸脱することなく、記載された手順において変更をなすことができることが理解される。
【００５３】
配列表の説明
配列番号：１      重鎖ＣＤＲ３ Ｍａｂ４２０
配列番号：２      重鎖ＣＤＲ２ Ｍａｂ４２０
配列番号：３      重鎖ＣＤＲ１ Ｍａｂ４２０
配列番号：４      軽鎖ＣＤＲ３ Ｍａｂ４２０
配列番号：５      軽鎖ＣＤＲ２ Ｍａｂ４２０
配列番号：６      軽鎖ＣＤＲ１ Ｍａｂ４２０
配列番号：７      可変重鎖 Ｍａｂ４２０
配列番号：８      可変軽鎖 Ｍａｂ４２０
配列番号：９      ヒトラムダ軽鎖
配列番号：１０    ヒトγ１（アロタイプＧ１ｍ１，１７）定常領域
配列番号：１１    ヒトγ１（アロタイプＧ１ｍ１７）定常領域）
配列番号：１２    ヒトＩｇＧ４
配列番号：１３    ヒトＩｇＧ４ ＳＰＬＥ-変異体
【実施例】
【００５４】
実施例１
免疫化
ａ）ヒト変異体ＣＣＮ１でのマウスの免疫化
Ｂａｌｂ／ｃ及びＮＭＲＩマウスを、腹腔内注射により、０日目には完全フロイントアジュバントと共に、２８日目及び５６日目には（双方とも不完全フロイントアジュバントと共に）単一のアミノ酸交換Ｅ１７３Ｄ又はＦ１８５Ｌを含む５０μｇの組換えヒトＣＣＮ１を用いて、８４日目に不完全フロイントアジュバントと共に５０μｇの組換えタンパク質を用いて、免疫した。血液を９１日目と１０８日目に採取し、血清を調製し、これを、ＥＬＩＳＡによる力価決定のために使用した（以下を参照）。最も高い力価を有する動物を、５０μｇの組換えヒトＣＣＮ１の静脈内注射により、１１２日目における追加免疫のために選択した。
【００５５】
ｂ）ヒト変異体ＣＣＮ１でのＮＺＷウサギの免疫化
ニュージーランドホワイトウサギを、０日目には完全フロイントアジュバントと共に、単一のアミノ酸交換Ｅ１７３Ｄ又はＦ１８５Ｌを含む１００μｇの組換えヒトＣＣＮ１で、２１、４３、６５及び８５日目には不完全フロイントアジュバントと共に１００μｇのタンパク質を用いて免疫した。全ての免疫化は、いくつかの部位に皮下的に実施した。力価決定のために、７７と９８日目に、血清を調製した。最終的な追加免疫を、１００μｇの組換えタンパク質を静脈注射することにより実施した。
【００５６】
ハイブリドーマの産生及びスクリーニング
ハイブリドーマを、標準的な手順に従い、マウス又はウサギの脾臓細胞を、マウスＰ３Ｘ６３-Ａｇ８６５３骨髄腫細胞又は２４０Ｅ-Ｗ２ウサギ形質細胞腫細胞に融合させることにより産生せしめた。ハイブリドーマを、単一アミノ酸交換Ｅ１７３Ｄ又はＦ１８５Ｌを含むヒト組換えＣＣＮ１及びマウス組換えＣＣＮ１への結合性について、ＥＬＩＳＡ（以下を参照）によりスクリーニングした。ＣＣＮ１結合抗体を、ドメイン結合アッセイにおいて、及び可変ドメインからの２つのペプチドでのペプチドＥＬＩＳＡにおいてさらに特徴付けした（表１）。
2012528812.tif 000002
１）：ペプチド３への結合性を欠くため、本発明に係る抗体ではない
【００５７】
ファージディスプレイ：
単一のアミノ酸交換Ｆ１８５Ｌを担持する組換え変異ヒトＣＣＮ１タンパク質に対して選択を適用することにより、ファージディスプレイを実施した。多量のヒトＣＣＮ１特異性Ｆａｂクローンを単離し、そのいくつかは、哺乳動物細胞の細胞表面に組換え的に発現される膜結合ＣＣＮ１にまた結合可能であると同定した。それらのいくつかは、ヒトＣＣＮ１へのＥＡ-Ｈｙ９２６細胞の接着を有意に阻害することができた。１３の異なるＦａｂ抗体を全長ＩｇＧ１抗体に転換させ、異種移植マウス腫瘍モデルにおいてインビボで試験した。
【００５８】
ＣＣＮ１-結合抗体（Ｍａｂ３９５、Ｍａｂ３９６、Ｍａｂ４２０、Ｍａｂ４３４、及びＭａｂ９７１）を、例えばドメイン結合アッセイにおいて、及び可変ドメインからの４つのペプチドでのペプチドＥＬＩＳＡにおいて、さらに特徴付けした（以下の実施例を参照）。
【００５９】
実施例２
膜結合ＣＣＮ１及びＣＣＮ１ドメインの組換え発現
付着して増殖しているマウスＮＩＨ ３Ｔ３細胞（ＣＲＬ-１６５８ＴＭ）又は懸濁適合したヒトＨＥＫ２９３（ＣＲＬ-１５７３ＴＭ）細胞を、ＣＣＮ１をコードする組換えベクター、又はＰＤＧＦ-レセプター（ヒトベータ型血小板由来増殖因子レセプター、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０９６１９、アミノ酸５１３から５６１）の膜貫通ドメインにＣ末端的に融合したそれぞれのＣＣＮ１で形質移入した。
【００６０】
懸濁適合したＨＥＫ２９３細胞を、ＦＡＣＳにより測定される細胞結合アッセイに使用した。付着して増殖しているＮＩＨ ３Ｔ３細胞を、蛍光顕微鏡において分析される細胞結合アッセイに使用した。
【００６１】
実施例３
ＥＬＩＳＡによるヒトＣＣＮ１及び断片に対する抗体の結合の測定
ヒト及びマウスＣＣＮ１ ＥＬＩＳＡ
ヒト及びマウスＣＣＮ１への抗体の結合をＥＬＩＳＡにより測定した。単一のアミノ酸交換Ｅ１７３Ｄ又はＦ１８５Ｌを含む組換えヒトＣＣＮ１、又はマウス組換えＣＣＮ１を、２−８℃で一晩インキュベートすることにより、ＰＢＳ中、２．５μｇ／ｍｌ、２５μｌ／ウェルで、３８４ウェルのヌンク・マキシソーププレート（Nunc Maxisorpplate）に固定した。室温で１時間、ＰＢＳ／１％のＢＳＡを用いてプレートをブロッキングし、その後、２回の洗浄工程（ＰＢＳに０．１％のトゥイーン-２０）を施し、室温で１時間、ブロッキングバッファー又はハイブリドーマ上清中、異なる濃度の抗ＣＣＮ１抗体と共にインキュベートした。さらに４回洗浄した後、抗体を、室温で１時間、ブロッキングバッファーに１：５０００で希釈した抗マウスＨＲＰ（Amersham #NA9310）、抗ウサギＨＲＰ（Jackson Immunoresearch #711-036-152）、又は抗ヒトＩｇＧ-ＨＲＰ（(Jackson Immunoresearch #109-036-097）で検出した。さらに４回の洗浄工程の後、１０分、２５μｌのＴＭＢ（Calbiochem #CL07）を添加することにより、シグナルを生じさせた。１ＮのＨＣｌを２５μｌ添加した後、吸光度を４５０ｎｍで読み取った。
【００６２】
可変ドメインペプチドＥＬＩＳＡ
ビオチン化された可変ドメインペプチド１−４及び成熟ヒトＣＣＮ１を、室温で１時間、０．５ＭのＮａ２ＣＯ３、ｐＨ９．５中、５ｎｇ／ｍｌのストレプトアビジンプレコートマイクロタイタープレート（ヌンク）に被覆した。室温で１時間、ＰＢＳ／１％のＢＳＡを用いてプレートをブロッキングし、その後、２つの洗浄工程（ＰＢＳに０．１％のトゥイーン-２０）を施し、室温で１時間、ブロッキングバッファー又はハイブリドーマ上清中、異なる濃度の抗ＣＣＮ１抗体と共にインキュベートした。さらに４回洗浄した後、抗体を、室温で１時間、ブロッキングバッファーに１：５０００で希釈した抗マウス-ＨＲＰ（Amersham #NA9310）、抗ウサギＨＲＰ（Jackson Immunoresearch #711-036-152）、又は抗ヒトＩｇＧ-ＨＲＰ（(Jackson Immunoresearch #109-036-097）で検出した。さらに６回の洗浄工程の後、１０分、２５μｌのＴＭＢ（Calbiochem #CL07）を添加することにより、シグナルを生じさせた。１ＮのＨＣｌを２５μｌ添加した後、吸光度を４５０ｎｍで読み取った。結果を表２に示す：
2012528812.tif 000003
【００６３】
実施例３
アフィニティー測定（ＢＩＡｃｏｒｅ）
捕捉抗体（抗ヒト-ＩｇＧ）を、アミンカップリング化学を使用し、ＣＭ５バイオセンサーチップの表面に固定した。５μｌ／分の流量で、０．１ＭのＮ-ヒドロキシスクシンイミドと０．４Ｍの１-エチル-３-(３-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドの１：１混合物を用い、フローセルを活性化させた。抗ヒトＩｇＧを酢酸ナトリウムｐＨ５．０で希釈し、約１０００ＲＵの表面密度になるように、特定量の固定化抗体（ここでは１０００ＲＵ）を意図して注入した。フローセル１を参照（ＦＣ１＝参照フローセル）としてブランクのままにしておいた。１Ｍのエタノールアミン／ＨＣｌ、ｐＨ８．５を注入することにより、表面をブロックした。
【００６４】
抗ＣＣＮ１抗体（分析物１）及びヒトＣＣＮ１（分析物２）を、ＰＢＳＴ＋０．８ＭのＮａＣｌに希釈し、それぞれ１０及び３０μｌ／分の流量で注入した。接触時間(結合相)を、１００ｎＭの濃度の抗ＣＣＮ１抗体で６分、０ｎＭから５００ｎＭの８種の増加濃度のヒトＣＣＮ１で５分とした。ついで、チップ表面を１０分、ＰＢＳＴ＋０．８ＭのＮａＣｌで洗浄した（解離相）。全ての相互作用は正確に２５℃（標準的温度）で実施した。再生溶液として、４０μｌの０．８５％のＨ３ＰＯ４を注入し、各結合サイクルの後に、任意の非共有結合タンパク質を除去した。１秒当たり１シグナルの検出速度で、シグナルを検出した。参照用フローセル、ブランクバッファー注入からのシグナルを引き（「二重参照」）、ソフトウェアＢＩＡ評価版４．１、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ版２ｂ＋ＢｉａＦｉｔ１．６を使用し、データを評価した。全ての結合曲線を、結合モデルＡ＋Ｂ＝ＡＢに対応する、この結合モデルに適合させた。意味のある速度定数をｋａ（結合速度定数）、ｋｄ（解離速度定数）及びＫＤ（解離平衡定数）について算出した。結果を表３に示す。
2012528812.tif 000004
【００６５】
実施例４
細胞結合アッセイ（ＦＡＣＳ及び蛍光顕微鏡）
ＮＩＨ ３Ｔ３又は懸濁適合化ＨＥＫ２９３細胞に、ＣＣＮ１又は膜貫通ドメインに結合したそのドメインの発現を促進させる発現プラスミドを一過性に形質移入した。４８時間後、上清を除去し、１０μｇ／ｍｌの試験抗体を、形質移入細胞が１０×１０６になるまで、染色バッファー（ＰＢＳ、３％のＦＣＳ、０．０１％のＮａ-アジド）に添加した。氷上で２時間後、抗体を含まない染色バッファーで、細胞を３回洗浄した。二次（検出用）抗体（ＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体）を染色バッファーに１０μｇ／ｍｌで添加し、氷上で３０分インキュベートした。抗体を含まない染色バッファーで、細胞を３回洗浄し、染色バッファー中に維持し、蛍光顕微鏡で顕微鏡観察するか（ＮＩＨ  ３Ｔ３）、又はＦＡＣＳにより分析した（ＨＥＫ２９３；４８８ｎｍで励起、５２０ｎｍで発光）。
【００６６】
暴露された融合タンパク質に抗体が強く結合すると、細胞の外膜が非常に明るい緑色蛍光になる（＋＋＋）。非形質移入細胞は完全に黒であり、バックグラウンド染色を示さない。中程度の陽性細胞は、細胞膜が明るい蛍光を示す（＋＋及び＋）。暴露された融合タンパク質に抗体が結合しないと、蛍光は完全にない（−）。結果を表４ａ及び４ｂに示す。
2012528812.tif 000005
2012528812.tif 000006
【００６７】
２９３＋ヒトＣＣＮ１：ＨＥＫ２９３細胞を膜結合全長ＣＣＮ１融合体で一過性に形質移入
２９３＋ヒトＣＣＮ１の可変ドメイン：ＨＥＫ２９３細胞をＣＣＮ１の膜結合可変ドメインで一過性に形質移入
２９３＋ｐｍａｘＧＦＰ：ＨＥＫ２９３を緑色蛍光タンパク質の発現を生じせしめる発現ベクターを用いて一過性に形質移入
【００６８】
実施例５
エピトープ結合アッセイ（Ｂｉａｃｏｒｅ）
エピトープ領域を決定するために、様々な抗ＣＣＮ１抗体を、アミンカップリング化学を使用して、ＣＭ５バイオセンサーチップの表面に固定した。５μｌ／分の流量で、０．１ＭのＮ-ヒドロキシスクシンイミドと０．４Ｍの１-エチル-３-(３-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドの１：１混合物を用いて、フローセルを活性化させた。１０μｇ／ｍｌで１２分、抗ＣＣＮ１抗体を、酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０に注入し、約１５０００ＲＵの表面密度になった。１Ｍのエタノールアミン／ＨＣｌ、ｐＨ８．５を注入することにより、表面をブロックした。可溶性ヒトＣＣＮ１（分析物１）及び抗ＣＣＮ１抗体（分析物２）を、ＰＢＳＴ＋０．８ＭのＮａＣｌで希釈し、３０μｌ／分の流量で注入した。接触時間（結合相）を、２５０ｎＭの濃度のヒトＣＣＮ１で１５０秒、１００ｎＭの濃度の抗ＣＣＮ１抗体で３００秒とした。ついで、チップ表面を１０分、ＰＢＳＴ＋０．８ＭのＮａＣｌで３分洗浄した（解離相）。全ての相互作用は正確に２５℃（標準的温度）で実施した。１０ｍＭのグリシン、ｐＨ２．０の再生溶液を１５０秒注入し、各結合サイクルの後に、任意の非共有結合タンパク質を除去した。１秒当たり１シグナルの検出速度で、シグナルを検出した。種々のエピトープ領域を決定するために、ヒトＣＣＮ１を注入し、固定抗体に結合させた。結合の少し後に、未知のエピトープを有する抗体を注入した。結合シグナルを示さない（阻害）抗体は、同じエピトープ群に属する。結合シグナルは種々のエピトープ領域を示す。３つの異なるエピトープ領域が、ＳＰＲ技術により見出された（表５を参照）。
2012528812.tif 000007
１）：Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓの抗ＣＣＮ１抗体ＭＡＢ４０５５(ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｎｄｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ)
【００６９】
実施例６
カニクイザルＣＣＮ１に対するＭａｂ４２０の交差反応性
カニクイザルＣＣＮ１に対するＭａｂ４２０の交差反応性を、膜結合カニクイザルＣＣＮ１を組換え的に発現させ、Ｍａｂ４２０で染色する、ＦＡＣＳにおいて証明した。結果を表６に示す。
2012528812.tif 000008
【００７０】
実施例７
ＣＣＮ１媒介性接着アッセイ
該接着アッセイは、ＣＣＮ１に対する抗体又はＦａｂ断片が、組換えＣＣＮ１のこの特定の活性をブロック可能かどうかを調査するためのものである。
９６ウェル平底プレート（ＮＵＮＣカタログ番号４３９４５４）を、ＰＢＳ（ＧＩＢＣＯカタログ番号２００１２）中の０、０．６２５、１．２５、２．５、５、１０μｇ／ｍｌでの組換えＣＣＮ１タンパク質５０μｌ／ウェルで、３７℃にて一晩被覆した。２００μｌ／ウェルの洗浄バッファー（ＰＢＳ／０．１％のＢＳＡ）でプレートを３回洗浄した。ＥＡ-Ｈｙ-９２６細胞を収集し、接着培地（（Ｆ１２の栄養剤ＨＡＭ、Ｇｉｂｃｏカタログ番号２１７６５０２９７）／０．０５％のＢＳＡ）で洗浄し、１ｍｌあたり２×１０５細胞の濃度で同じ培地に懸濁させた。１００μｌの細胞懸濁液を、最終的にウェル当たり２００００細胞になるまで、３組、ウェルに添加した。５％のＣＯ２と共に３７℃で２−３時間、プレートをインキュベートし、２００μｌ／ウェルのＰＢＳで２回洗浄し、排出させた。１００μｌのカルセイン-ＡＭ（Molecular Probe カタログ番号Ｃ-３１００、分子量＝９９４．８７、原液、ＤＭＳＯ中に１ｍＭ、５０μｇ／５０μｌ）を接着培地に２μＭで添加し、５％のＣＯ２と共に３７℃で０．５−１時間、混合物をインキュベートした。分析は４８５／５３５ｎｍで実施した。
【００７１】
組換えＣＣＮ１でプレートをコーティングし、洗浄バッファーでプレートを洗浄した後、抗体を添加した。抗体は０．５から１０μｇ／ｍｌの濃度で添加し、３７℃で１時間、プレートでインキュベートした。続いて、洗浄バッファーでプレートを２回洗浄した。ＥＡ-Ｈｙ-９２６細胞を、上述したようにして添加した。ＣＣＮ１へのＥＡ-Ｈｙ-９２６細胞の接着を阻害する抗体により、カルセイン染色が低減される。
【００７２】
結果：
カルセイン染色は、ＣＣＮ１に接着している細胞の数と相関する。細胞培養プレートに被覆されたＣＣＮ１へのいくつかの抗体の結合は、ＣＣＮ１に接着する細胞を低減させた。ほとんどの強力な抗体を表７に示す。該抗体は、ＣＣＮ１へのＥＡ-Ｈｙ-９２６細胞の接着を５４％から８３％まで低減させた。
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【００７３】
実施例８
ＭＤＡ-ＭＢ-２３１（ＡＴＣＣ ＨＴＢ-２６）ヒト乳癌異種移植片増殖に対する抗ＣＣＮ１抗体の抗腫瘍効果
研究設計：ＭＤＡ-ＭＢ-２３１細胞（１×１０７細胞／マウス）を、マトリゲル（１：１）を用い、研究０日目に、ＳＣＩＤ-べージュマウスの乳房脂肪体の領域に移植した。移植２２日後に処置を開始し、５１日目に研究を終了した。表８にはＴＧＩ（ビヒクル処置動物と比較した腫瘍増殖阻害性）を示す。
群
・ビヒクル、ｉｐ、２ｘ／ｗｋ、ｎ＝１０
・２０ｍｇ／ｋｇのＭａｂ４２０、ｉｐ、２ｘ／ｗｋ、ｎ＝１０
・２０ｍｇ／ｋｇのＭａｂ９７１、ｉｐ、２ｘ／ｗｋ、ｎ＝１０
・２０ｍｇ／ｋｇのＭａｂ３９６、ｉｐ、２ｘ／ｗｋ、ｎ＝１０
・２０ｍｇ／ｋｇのＭａｂ３９５、ｉｐ、２ｘ／ｗｋ、ｎ＝１０
・２０ｍｇ／ｋｇのＭａｂ４３４、ｉｐ、２ｘ／ｗｋ、ｎ＝１０
2012528812.tif 000010
【００７４】
実施例９
ＳＫＯＶ-３（ＡＴＣＣ ＨＴＢ-７７）卵巣癌異種移植片増殖に対する抗ＣＣＮ１抗体の抗腫瘍効果
研究設計：ＳＫＯＶ３細胞（１×１０７細胞／マウス）を、マトリゲル（１：１）を用い、研究０日目に、ＳＣＩＤ-べージュマウスにｓｃ移植した。移植１７日後に処置を開始し、４４日目に研究を終了した。
群
・ビヒクル、ｉｐ、２ｘ／ｗｋ、ｎ＝１０
・２０ｍｇ／ｋｇのＭａｂ４２０、ｉｐ、２ｘ／ｗｋ、ｎ＝１０
・２０ｍｇ／ｋｇのＭａｂ３９５、ｉｐ、２ｘ／ｗｋ、ｎ＝１０
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【００７５】
実施例１０
ＳＣＩＤベージュマウスのＰａｎｃ-１膵臓癌モデルにおける抗ＣＣＮ１抗体の研究
研究設計：Ｐａｎｃ-１細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ-１４６９、５×１０６細胞／マウス）を、マトリゲル（１：１）を用い、研究０日目に、ＳＣＩＤ-べージュマウスにｓｃ移植した。移植１４日後に処置を開始し、４６日目に研究を終了した。
群
・ビヒクル、ｉｐ、２ｘ／ｗｋ、ｎ＝１０
・２０ｍｇ／ｋｇのＭａｂ３９５、ｉｐ、２ｘ／ｗｋ、ｎ＝１０
・２０ｍｇ／ｋｇのＭａｂ３９６、ｉｐ、２ｘ／ｗｋ、ｎ＝１０
・２０ｍｇ／ｋｇのＭａｂ４２０、ｉｐ、２ｘ／ｗｋ、ｎ＝１０
・２０ｍｇ／ｋｇのＭａｂ４３４、ｉｐ、２ｘ／ｗｋ、ｎ＝１０
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【００７６】
実施例１１
ＣＣＮ１陰性細胞株ＭＤＡ-ＭＢ-４３５(ＡＴＣＣ ＨＴＢ-１２９)乳癌異種移植片増殖に対する抗ＣＣＮ１抗体の抗腫瘍効果
研究デザイン：ＭＤＡ-ＭＢ-４３５細胞（１×１０７細胞／マウス）を、マトリゲル（１：１）を用い、研究０日目に、ＳＣＩＤ-べージュマウスにｓｃ移植した。移植１５日後に処置を開始し、４４日目に研究を終了した。
群
・ビヒクル、ｉｐ、２ｘ／ｗｋ、ｎ＝１０
・２０ｍｇ／ｋｇ Ｍａｂ４２０、ｉｐ、２ｘ／ｗｋ、ｎ＝１０
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【００７７】
実施例１２
Ｐａｎｃ１動物モデルにおける抗ＣＣＮ１抗体のインビボ画像解析
Ｐａｎｃ１マウスモデルにおいて、研究の開始時に、動物に１×１０７のＰａｎｃ１細胞を皮下注射した。マエストロ(Maestro)ＴＭインビボ画像システム(LOT-Oriel GmbH & Co. KG,Germany)を使用し、Ｃｙ５標識抗体の静脈注射(ＳＣＩＤマウス(２ｍｇ／ｋｇ)への静脈注射)から２４時間後に、近赤外蛍光(ＮＩＲＦ)を測定した。Ｍａｂ４２０は最も顕著な蛍光シグナルをもたらした。
【配列表】
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【国際調査報告】
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