(57)【要約】本発明は、青色光認識能力が増大または抑制された植物体の製造方法を開示する。【選択図】図１
2012518405.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ｉ）植物体において配列番号１の塩基配列からなる遺伝子、または配列番号１の塩基配列と類似の配列からなる遺伝子を過剰発現させる段階と、
（ＩＩ）その遺伝子が過剰発現されることにより青色光認識能力が増大した植物体を選別する段階とを含んでなる、青色光認識能力が増大した植物体の製造方法。
【請求項２】
前記配列番号１の塩基配列と類似の配列からなる遺伝子は、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドを暗号化する遺伝子であることを特徴とする、請求項１に記載の青色光認識能力が増大した植物体の製造方法。
【請求項３】
前記段階（Ｉ）の過剰発現させる段階は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを暗号化するポリヌクレオチドを植物体に導入する段階を含んでなることを特徴とする、請求項１に記載の青色光認識能力が増大した植物体の製造方法。
【請求項４】
前記段階（Ｉ）の過剰発現させる段階は、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを暗号化するポリヌクレオチドを、調節ヌクレオチド配列を含む発現ベクターに作動可能に挿入させて組み換え発現ベクターを製作する段階と、前記組み換えベクターをアグロバクテリウムバクテリアに形質転換させる段階と、前記形質転換されたアグロバクテリウムバクテリウムで植物体を形質転換させる段階とを含んでなることを特徴とする、請求項１に記載の青色光認識能力が増大した植物体の製造方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法によって得られた、青色光認識能力が増大した植物体。
【請求項６】
（Ｉ）植物体において配列番号１の塩基配列からなる遺伝子、または配列番号１の塩基配列と類似の配列からなる遺伝子の発現を抑制させる段階と、
（ＩＩ）その遺伝子の発現が抑制されることにより青色光認識能力が抑制された植物体を選別する段階とを含んでなる、青色光認識能力が抑制された植物体の製造方法。
【請求項７】
前記配列番号１の塩基配列と類似の配列からなる遺伝子は、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドを暗号化する遺伝子であることを特徴とする、請求項６に記載の青色光認識能力が抑制された植物体の製造方法。
【請求項８】
前記（Ｉ）の抑制段階は、配列番号１の塩基配列からなる遺伝子、配列番号１の塩基配列からなる遺伝子転写産物（ｍＲＮＡ）、配列番号１の塩基配列と類似の配列からなる遺伝子、および配列番号１の塩基配列と類似の配列からなる遺伝子転写産物（ｍＲＮＡ）から構成された群から選ばれたポリヌクレオチドに相補的に結合することが可能なアンチセンスヌクレオチドを植物体に形質転換させる段階を含んでなることを特徴とする、請求項６に記載の青色光認識能力が抑制された植物体の製造方法。
【請求項９】
前記アンチセンスヌクレオチドを植物体に形質転換させる段階は、そのアンチセンスヌクレオチドを、調節ヌクレオチド配列を含む発現ベクターに作動可能に挿入させて組み換え発現ベクターを製作する段階と、前記組み換え発現ベクターをアグロバクテリウムバクテリアに形質転換させる段階と、前記形質転換されたアグロバクテリウムバクテリアで植物体を形質転換させる段階とを含んでなることを特徴とする、請求項８に記載の青色光認識能力が抑制された植物体の製造方法。
【請求項１０】
前記（Ｉ）の抑制段階は、当業界における遺伝子除去(gene deletion)、遺伝子挿入(gene insertion)、Ｔ−ＤＮＡ導入、同種組み換え(homologous recombination)、トランスポゾン標識法(transposon tagging)、またはｓｉＲＮＡ(small interfering RNA)による方法によって行われることを特徴とする、請求項６に記載の青色光認識能力が抑制された植物体の製造方法。
【請求項１１】
請求項６〜１０のいずれか１項に記載の方法によって得られた、青色光認識能力が抑制された植物体。
【請求項１２】
（Ｉ）植物体において配列番号１の塩基配列からなる遺伝子、または配列番号１の塩基配列と類似の配列からなる遺伝子を過剰発現させる段階と、
（ＩＩ）その遺伝子が過剰発現されることによりアントシアニンが過蓄積された 植物体を選別する段階とを含んでなる、アントシアニンが過蓄積された植物体の製造方法。
【請求項１３】
前記配列番号１の塩基配列と類似の配列からなる遺伝子は、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドを暗号化する遺伝子であることを特徴とする、請求項１２に記載のアントシアニンが過蓄積された植物体の製造方法。
【請求項１４】
前記段階（Ｉ）の過剰発現させる段階は、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを暗号化するポリヌクレオチドを植物体に導入する段階を含んでなることを特徴とする、請求項１２に記載のアントシアニンが過蓄積された植物体の製造方法。
【請求項１５】
前記段階（Ｉ）の過剰発現させる段階は、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを暗号化するポリヌクレオチドを、調節ヌクレオチド配列を含む発現ベクターに作動可能に挿入させて組み換え発現ベクターを製作する段階と、前記組み換えベクターをアグロバクテリウムバクテリアに形質転換させる段階と、前記形質転換されたアグロバクテリウムバクテリウムで植物体を形質転換させる段階とを含んでなることを特徴とする、請求項１２に記載のアントシアニンが過蓄積された植物体の製造方法。
【請求項１６】
請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の方法によって得られたアントシアニンが過蓄積された植物体。
【請求項１７】
（Ｉ）発現させようとする目的遺伝子、アントシアニンを過蓄積させる機能を有する配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび調節ヌクレオチド配列を含む発現ベクターを植物体に形質転換させる段階と、（ＩＩ）アントシアニンの過蓄積された植物体を選別する段階とを含んでなる、植物体の選別方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、青色光認識能力が増大または抑制された植物体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
環境的要因として、光は唯一のエネルギー源泉であって、植物の成長と発達において非常に重要な役目を果たす。よって、植物は光信号を波長、強度、方向などによって正確に感知するための様々な種類の光受容体を進化させてきた。
現在解明されている光受容体としては、赤／遠赤色光を吸収するフィトクロム(phytochromes)(Botto et al. 1996; Chory et al. 1996)、青色光を吸収するクリプトクロム(cryptochromes)(Ahmad et al. 1998; Christie et al. 1998; Cashmore et al. 1997)、および紫外線を吸収するＵＶ Ａ／Ｂ光受容体(Christie et al. 1996)である。
【０００３】
フィトクロムは、赤／遠赤色光を吸収して植物の発芽、苗種の発達および開花に至るまで様々な生理学的反応に関与する。クリプトクロムは、青色光を認識する光受容体であって、バクテリア、植物および動物に存在し、植物ではフィトクロムと同様の役目を果たす。
【０００４】
一方、植物における光信号の認識能力は、特に耕作植物において重要な意味を持つ。それは光信号の認識能力が収穫量と直結できるためである。光信号の認識能力が増大すると、同じ光量でもより多量の収穫が可能となる。このような理由により、植物生物工学分野の従事者は遺伝子操作の方法で光信号の認識能力を調節するために努力している。
【０００５】
本発明はこのような背景の下で行われたものである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、青色光認識能力が増大または抑制された植物体の製造方法を提供することにある。
本発明の他の目的や本発明の具体的な様態などは以下に提示される。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一側面において、本発明は、青色光認識能力が増大した植物体の製造方法に関する。
【０００８】
本発明の青色光認識能力が増大した植物体の製造方法は、（Ｉ）植物体において配列番号１の塩基配列からなる遺伝子、または配列番号１の塩基配列と類似の配列からなる遺伝子を過剰発現させる段階と、（ＩＩ）その遺伝子が過剰発現されることにより青色光認識能力が増大した植物体を選別する段階とを含んでなる。
【０００９】
本明細書において、前記「過剰発現」とは、温度や、昼と夜の長さなど栽培条件が同一の場合において、野生型植物体で発現される水準以上の発現を意味する。
【００１０】
本明細書において、「配列番号１の塩基配列と類似の配列からなる遺伝子」とは、配列番号１の塩基配列からなる遺伝子の同族体(homologue)であって、青色光認識機能に関連して、植物の種類による進化的経路の相違により配列番号１の塩基配列とは異なる塩基配列からなる全ての遺伝子を含む意味である。ここで、配列番号１の塩基配列と類似の配列からなる遺伝子は、配列番号１の塩基配列と配列相同性が高いほど好ましく、最も好ましくは当然１００％の配列相同性を持つときである。一方、配列相同性の下限においては前記遺伝子が配列番号１の塩基配列と６０％以上の配列相同性を持つ場合が好ましい。よりさらに具体的には、前記配列相同性が６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％の順に高くなるほど好ましい。
【００１１】
前記配列番号１の塩基配列と類似の配列からなる遺伝子の別の好ましい例としては、コドン縮退性(codon degeneracy)によって配列番号１の塩基配列からなる遺伝子の機能的等価物を挙げることができる。この機能的等価物は、換言すると、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドを暗号化するポリヌクレオチドである。
【００１２】
本発明の方法において、前記段階（Ｉ）の過剰発現させる段階は、好ましくは配列番号２に示されるアミノ酸配列を暗号化するポリヌクレオチド、特に配列番号１に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドを植物体に形質転換させる段階を含んでなる場合である。
【００１３】
本明細書において、前記「形質転換」とは、外来性ポリヌクレオチド（青色光認識能力を持つポリペプチドを暗号化するポリヌクレオチドを意味する。以下同じ）の導入による宿主植物の遺伝子型の変形を意味し、その形質転換に使用された方法と関係なく外来性ポリヌクレオチドが宿主植物、さらに正確には宿主植物の細胞内に導入されたことを意味する。宿主植物内に導入された外来性ポリヌクレオチドは、宿主植物のゲノム内に統合されて維持されるか、或いは統合されずに維持できるが、本発明は両者ともを含む。
【００１４】
一方、外来性ポリヌクレオチドで植物を形質転換させる方法は、当業界における公知の方法(Methods of Enzymology, Vol. 153, 1987, Wu and Grossman編集, Academic Press)を使用することができる。
外来性ポリヌクレオチドをプラスミドやウイルスなどのベクターの運搬体に挿入して植物を形質転換させることができ、アグロバクテリウムバクテリアを媒介体として使用することができ(Chilton et al., 1977, Cell 11:263:271)、直接外来性ポリヌクレオチドを植物細胞内に導入させて植物を形質転換させることができる(Lorz et al., 1985, Mol. Genet. 199:178-182)。
【００１５】
一般に植物の形質転換に多く用いられる方法は、外来性ポリヌクレオチドで形質転換されたアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)によって幼植物体、植物細胞、種子、成熟植物などを感染させる方法である。ここで、形質転換された幼植物体、植物細胞、種子などは、当業者が公知の適切な条件の下で培養または栽培して、成熟した植物に成長および発育させることができる。
【００１６】
一方、前記形質転換させる段階は、（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを暗号化するポリヌクレオチドを、調節ヌクレオチド配列を含む発現ベクターに作動可能に挿入させて組み換え発現ベクターを製作する段階と、（ｂ）前記組み換えベクターを植物体に導入する段階とを含んでなることが好ましい。
【００１７】
さらに好ましくは、前記形質転換させる段階は、本発明のポリペプチドを暗号化するポリヌクレオチドを、調節ヌクレオチド配列を含む発現ベクターに作動可能に挿入させて組み換え発現ベクターを製作する段階と、前記組み換え発現ベクターをアグロバクテリウムバクテリアに形質転換させる段階と、前記形質転換されたアグロバクテリウムバクテリアで植物体を形質転換させる段階とを含む場合である。特に、前記形質転換されたアグロバクテリウムバクテリアは形質転換されたアグロバクテリウム・ツメファシエンスであることが好ましい。
【００１８】
前記「調節ヌクレオチド配列」とは、その存在がそれに連結された遺伝子の発現に影響を及ぼすことが可能な全ての配列を含む意味として理解される。このような調節ヌクレオチド配列はリーダー配列、エンハンサー配列、プロモーター配列、転写開始配列、転写終結配列、複製開始点、リボソーム結合部位などを含む。
【００１９】
前記「作動可能に挿入する」とは、ある遺伝子の転写および／または翻訳が影響を受けるように挿入することを意味する。例えば、あるプロモーターがそれと共に挿入された遺伝子の転写に影響を与えるならば、その遺伝子は作動可能に挿入されるのである。
【００２０】
プロモーター配列は、誘導性プロモーター(inducible promoter sequence)と構造性プロモーター(constitutive promoter sequence)の両方とも使用可能である。構造性プロモーターとしては、例えばＣａＭＶプロモーター、ＣｓＶＭＶプロモーター、Ｎｏｓプロモーターなどを挙げることができる。誘導性プロモーター（誘導因子の存在により、それに連結された遺伝子の発現が活発になることを可能とするプロモーター）としては、例えば、銅イオンによって活性化される酵母メタロチオネインプロモーター(Mett et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 90:4567, 1993)、置換ベンゼンスルホンイミドによって活性化されるＩｎ２−１およびＩｎ２−２プロモーター(Hershey et al., Plant Mol. Biol., 17:679, 1991)、グルココルチコイドによって調節されるＧＲＥ調節配列(Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 88:10421, 1991)、エタノール調節性プロモーター(Caddick et al., Nature Biotech., 16:177, 1998)、リブロースビスリン酸カルボキシラーゼ（ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ）の小サブユニットに由来した光調節性プロモーター(Coruzzi et al., EMBO J., 3:1671, 1984; Broglie et al., Science, 224:838, 1984)、マンノピンシンターゼプロモーター(Velten et al., EMBO J., 3:2723, 1984)、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）およびオクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）プロモーター、熱衝撃プロモーター(Gurley et al., Mol. Cell. Biol., 6:559, 1986; Severin et al., Plant Mol. Biol., 15:827, 1990)などを挙げることができる。
【００２１】
一方、前記組み換えベクターは選別マーカー遺伝子を含むことができる。ここで、「マーカー遺伝子」とは、そのようなマーカー遺伝子を含む形質転換体の選別を可能とする形質を暗号化する遺伝子を意味する。マーカー遺伝子は抗生物質耐性遺伝子であってもよく、除草剤耐性遺伝子であってもよい。適した選別マーカー遺伝子の例としてはアデノシンデアミナーゼの遺伝子、ジヒドロ葉酸リダクターゼ、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼの遺伝子、チミジンキナーゼの遺伝子、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼの遺伝子、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子などを挙げることができる。
【００２２】
一方、本発明の実施例では、配列番号１に示される塩基配列からなる遺伝子を発現ベクターｐＣｓＶＭＶ−ＧＦＰベクターに挿入させて組み換えベクターｐＣｓＶＭＶ−ＧＦＰ：：ＢＩＴ１を製作した後、前記組み換えベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンスに形質転換させ、その形質転換されたアグロバクテリウム・ツメファシエンスをシロイヌナズナに形質転換させた。
【００２３】
このような本発明の実施様態を考慮するとき、前記形質転換させる段階は、配列番号１に示される塩基配列からなる遺伝子を植物に形質転換させる段階を含むことが好ましく、さらに好ましくは前記遺伝子を含む組み換えベクター、特にｐＣｓＶＭＶ−ＧＦＰ：：ＢＩＴ１を植物に形質転換させる段階を含むときである。最も好ましくは前記組み換えベクター、特にｐＣｓＶＭＶ−ＧＦＰ：：ＢＩＴ１で形質転換されたアグロバクテリウム・ツメファシエンスを植物に形質転換させる段階を含むときである。
【００２４】
一方、前記（ＩＩ）選別段階は、（Ｉ）段階を行った後、青色光認識能力が増大した植物体を青色光の光源下で栽培して下胚軸の長さを比較することにより肉眼で選別するか、或いは形質転換の際に選別マーカー遺伝子が共に形質転換される場合には選別マーカー遺伝子を用いて選別することができる。場合によっては、下記の実施例に示すように、アントシアニンの蓄積程度を比較することにより選別することもでき、当該遺伝子の過剰発現有無を確認することにより選別することもできる。青色光認識能力が増大する場合に下胚軸の成長が阻害されるというのは本発明の実施例から確認されるうえ、[Chentao Lin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 95, pp. 2686-2690, 1998]などの文献からも確認されるところである（上記文献は本明細書の一部として看做される）。
【００２５】
他の側面において、本発明は、青色光認識能力が抑制された植物体の製造方法に関するものである。
【００２６】
本発明の青色光認識能力が抑制された植物体の製造方法は、（Ｉ）植物体において配列番号１の塩基配列からなる遺伝子、または配列番号１の塩基配列と類似の配列からなる遺伝子の発現を抑制させる段階と、（ＩＩ）その遺伝子の発現が抑制されることにより青色光認識能力が抑制された植物体を選別する段階とを含んでなる。
【００２７】
本発明の方法において、配列番号１の塩基配列と類似の配列からなる遺伝子の意味とその好適な様態については、前述したとおりである。
【００２８】
本発明の方法において、前記（Ｉ）の抑制段階は、好ましくは配列番号１の塩基配列からなる遺伝子、またはその転写産物（ｍＲＮＡ）または配列番号１の塩基配列と類似の配列からなる遺伝子、またはその転写産物（ｍＲＮＡ）に相補的に結合することが可能なアンチセンスヌクレオチドを植物体に形質転換させる段階を含んで構成できる。
【００２９】
前記アンチセンスヌクレオチドは、配列番号１の塩基配列からなる遺伝子、または配列番号１の塩基配列と類似の配列からなる遺伝子に相補的に結合し、転写(transcription)または翻訳(translation)を阻害することができる全てのポリ（またはオリゴ）ヌクレオチドを含む。
【００３０】
このようなアンチセンスヌクレオチドは、前記遺伝子またはその転写産物に相補的に結合して転写または翻訳を阻害することができれば、その長さまたはその相補的な配列相同性は特に問題にはならない。前記アンチセンスヌクレオチドが短い長さ、例えば３０個のヌクレオチド程度のポリヌクレオチドであるとしても、それの該当遺伝子（ＤＮＡおよびＲＮＡを含む）に１００％の相補的な配列相同性を有し、その他の条件、例えば濃度やｐＨなどが適切に備えられるならば、本発明の方法においてアンチセンスヌクレオチドとして作用することができる。また、配列においても、それの該当遺伝子と１００％の相補的な配列相同性を持たなくても、適切な大きさの長さを有するならば、同様にアンチセンスヌクレオチドとして作用することができる。よって、アンチセンスヌクレオチドの長さ、相補的な配列相同性の度合いに関係なくアンチセンスヌクレオチドとして作用することができるならば、すなわち該当遺伝子の転写または翻訳を阻害することが可能な能力を保有しているならば、いずれも本発明のアンチセンスヌクレオチドに含まれるものと看做されるべきである。ここで、アンチセンスヌクレオチドとして必要な長さの決定、該当遺伝子と相補的な配列相同性の度合い、およびそのようなアンチセンスヌクレオチドの製造方法などは、本明細書が開示している配列番号１の塩基配列、配列番号２のアミノ酸配列、および当業界における公知の技術に基づく当業者の通常の能力範囲内に属するであろう。
【００３１】
一方、好ましくは、前記アンチセンスヌクレオチドは、配列番号１の塩基配列の一部分に相補的な部分を含むアンチセンスヌクレオチドである。ここで、「配列番号１の塩基配列の一部分に相補的な部分」とは、配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡまたはそれから転写されたＲＮＡと相補的に結合してその転写または翻訳を妨害するのに十分な長さを含むものと理解できる。
【００３２】
アンチセンスヌクレオチドから植物体への形質転換は、一般に、これを含む発現ベクターを製作し、この発現ベクターをアグロバクテリウムバクテリアに形質転換させ、その形質転換されたアグロバクテリウムバクテリアを植物体に導入する段階を含んでなる。
【００３３】
アンチセンスの植物体への形質転換に関連しては、前記本発明の青色光認識能力が増大した植物体の製造方法に関連して説明したところが適用できる。
【００３４】
一方、本発明の方法において、前記（Ｉ）段階は当業界における公知の他の方法で可能であるが、そのような方法としては、例えば遺伝子除去(gene deletion)、遺伝子挿入(gene insertion)、Ｔ−ＤＮＡ導入、同種組み換え(homologous recombination)またはトランスポゾン標識法(transposon tagging)、ｓｉＲＮＡ(small interfering RNA)などの方法を挙げることができる。
【００３５】
本発明の青色光認識能力が抑制された植物体の製造方法においても、前記本発明の青色光認識能力が増大した植物体の製造方法と同様に、前記（ＩＩ）選別段階は植物体の下胚軸の長さ、選別マーカー遺伝子、アントシアニンの蓄積程度、該当遺伝子の発現抑制程度などを比較することにより可能である。
【００３６】
別の側面において、本発明は、前述したような青色光認識能力が増大または抑制された植物体の製造方法によって得られた植物体に関するものである。
【００３７】
別の側面において、本発明は、アントシアニンが過蓄積された植物体の製造方法に関するものである。
【００３８】
本発明のアントシアニンが過蓄積された植物体の製造方法は、（Ｉ）植物体において配列番号１の塩基配列からなる遺伝子、または配列番号１の塩基配列と類似の配列からなる遺伝子を過剰発現させる段階、および（ＩＩ）その遺伝子が過剰発現されることによりアントシアニンが過蓄積された植物体を選別する段階を含んでなる。
【００３９】
本明細書において、「過蓄積」とは、温度や、昼と夜の長さなど栽培条件が同一の場合において、野生型植物体で蓄積された水準以上に蓄積された場合を意味する。
【００４０】
本発明のアントシアニンが過蓄積された植物体の製造方法において、配列番号１の塩基配列と類似の配列からなる遺伝子の意味、前記段階（Ｉ）、段階（ＩＩ）の好適な様態などに対しては、前記本発明の青色光認識能力が増大した植物体の製造方法に関連して説明したところがそのまま適用できる。
【００４１】
別の側面において、本発明は、アントシアニンが未蓄積された植物体の製造方法に関するものである。
【００４２】
本発明のアントシアニンが未蓄積された植物体の製造方法は、（Ｉ）植物体において配列番号１の塩基配列からなる遺伝子、または配列番号１の塩基配列と類似の配列からなる遺伝子の発現を抑制する段階と、（ＩＩ）その遺伝子の発現が抑制されることによりアントシアニンが未蓄積された植物体を選別する段階とを含んでなる。
【００４３】
本明細書において、「未蓄積」とは、温度や、昼と夜の長さなど栽培条件が同一の場合において、野生型植物体で蓄積された水準以下に蓄積された場合を意味する。
【００４４】
本発明のアンオシアニンが未蓄積された植物体の製造方法において、配列番号１の塩基配列と類似の配列からなる遺伝子の意味、前記段階（Ｉ）、段階（ＩＩ）の好適な様態などについては、前記本発明の青色光認識能力が抑制された植物体の製造方法に関連して説明したところがそのまま適用できる。
【００４５】
別の側面において、配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドなどをマーカー遺伝子として用いて形質転換植物体を選別する方法に関するものである。
本発明の形質転換された植物体の選別方法は、（Ｉ）目的遺伝子、アントシアニンを過蓄積させる機能を持つ配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび調節ヌクレオチド配列を含む発現ベクターを植物体に形質転換させる段階と、（ＩＩ）アントシアニンが過蓄積された植物体を選別する段階とを含んでなる。
本明細書において、「目的遺伝子」とは、発現させようとする遺伝子であって、目的する生成物（すなわち、ＲＮＡまたはポリペプチド）を暗号化する一定長さのポリヌクレオチド配列として定義できるが、このようなポリヌクレオチド配列は、切断された形態、融合された形態、タグされた形態であってもよく、ｃＤＮＡまたはｇＤＮＡであってもよく、天然形態の生成物を暗号化する配列または所望の突然変異形態の生成物を暗号化する配列であってもよい。
【００４６】
前記（Ｉ）発現ベクターを植物体に形質転換させる段階は、その発現ベクターをアグロバクバクテリウムバクテリアに形質転換させる段階、および前記形質転換されたアグロバクテリウムバクテリアで植物体を形質転換させる段階を含んで構成できる。ここで、アグロバクテリウムバクテリアはアグロバクテリウム・ツメファシエンスであることが好ましい。
【００４７】
前記（ＩＩ）段階の選別段階は、紫色を呈するアントシアニンの過蓄積された度合いを肉眼で確認することにより可能である。肉眼ではアントシアニンの過蓄積された度合いの確認が不分明な場合には当業界における公知の方法を用いてアントシアニンを抽出・定量して確認することができる。
【００４８】
前記本発明の方法は青色光受容体を持つ全ての植物に適用できる。例えば、稲、小麦、大麦、トウモロコシ、大豆、ジャガイモ、小麦、小豆、オート麦、モロコシキビ、シロイヌナズナ、白菜、大根、唐辛子、イチゴ、トマト、スイカ、キュウリ、キャベツ、マクワウリ、南瓜、ネギ、玉ねぎ、ニンジン、高麗人参、タバコ、棉、胡麻、砂糖黍、砂糖大根、荏胡麻、落花生、油菜、リンゴの木、梨の木、棗の木、桃の木、キーウィー、ブドウ、柑橘、柿、スモモ、満州杏、バナナ、バラ、グラジオラス、ガーベラ、カネーション、菊、ユリ、チューリップ、ライグラス、レッドクローバー、オーチャードグラス、アルファルファ、トールフェスク、ペレニアルライグラスなどに適用できる。好ましくは下記の実施例で使用されたシロイヌナズナと同様にアブラナ科に属する植物を意味する。アブラナ科に属する植物としては、白菜、油菜、ハクサイ(Brassica campestris L. ssp. penkinensisまたはBrassica rapa L. ssp. pekinensis)、キャベツ(Brassica oleracea L.)、ブロッコリー(broccoli)、カリフラワー(cauliflower)、ケール(kale)、芥子菜、カブ(turnip or Brassica rapa)、油菜、大根(radish)などを挙げることができる。
【００４９】
一方、本明細書において、「植物体」とは、成熟した植物だけでなく、成熟した植物に発育することが可能な植物細胞、植物組織、植物の種子などを全て含む意味として理解される。
【発明の効果】
【００５０】
前述したように、本発明によれば、青色光認識能力が増大または抑制された植物体の製造方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】図１は本発明の実施例で使用されたＢＩＴ１遺伝子およびそれのポリペプチドの模式図である。  Ｇｒａｙ Ｂｏｘｅｓ：Ｒ３Ｒ４ ＴＹＰＥ ＭＹＢ ｄｏｍａｉｎ  Ｔｈｉｎ ｌｉｎｅ：Ｉｎｔｒｏｎ  Ａｒｒｏｗ：Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｌｉｎｅの製造のために使用された部位
【図２】図２はシロイヌナズナコロンビア野生型（Ｃｏｌ）、青色光認識能力が抑制されたシロイヌナズナ形質転換体（ＢＩＴ１ ＡＳ−１）および陽性対照区植物体としてのクリプトクロム変異体（ｃｒｙ１）を暗所および１０μｍｏｌ ｍ-2ｓｅｃ-1青色光の下で５日間放置した後の下胚軸の長さを比較して示す。
【図３】図３はシロイヌナズナコロンビア野生型、青色光信号伝達調節シロイヌナズナ形質転換体（ＢＩＴ１ ＡＳ−１、ＢＩＴ１ ＡＳ−１１、ＢＩＴ１ ＧＦＰ−２およびＢＩＴ１ ＧＦＰ−１６）、および陽性対照区植物体としてのクリプトクロム変異体（ｃｒｙ１）の多様な強さの青色光下での下胚軸の長さを比較して示す。
【図４】図４はシロイヌナズナコロンビア野生型、青色光信号伝達調節シロイヌナズナ形質転換体（ＢＩＴ１ ＡＳ−１、ＢＩＴ１ ＡＳ−１１、ＢＩＴ１ ＧＦＰ−２およびＢＩＴ１ ＧＦＰ−１６）、および陽性対照区植物体としてのクリプトクロム変異体（ｃｒｙ１）を１０μｍｏｌ ｍ-2ｓｅｃ-1青色光の下で５日間放置した後の下胚軸の長さを示すための写真である。
【図５】図５はシロイヌナズナコロンビア野生型（Ｃｏｌ）および青色光認識能力が抑制または増大したシロイヌナズナ形質転換体（ＢＩＴ１ ＡＳ−１、ＢＩＴ１ ＡＳ−１１、ＢＩＴ１ ＧＦＰ−２およびＢＩＴ１ ＧＦＰ−１６）における、本発明の実施例で使用されたＢＩＴ１遺伝子の発現程度をＲＴ−ＰＣＲ分析で検出した結果である。
【図６】図６はシロイヌナズナコロンビア野生型、青色光信号伝達調節シロイヌナズナ形質転換体（ＢＩＴ１ ＡＳ−１、ＢＩＴ１ ＡＳ−１１、ＢＩＴ１ ＧＦＰ−２およびＢＩＴ１ ＧＦＰ−１６）、および陽性対照区植物体としてのクリプトクロム変異体（ｃｒｙ１）の青色光下でのアントシアニン生合成量を比較して示す。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
以下、本発明について実施例および実験例を参照して説明する。ところが、これらの実施例および実験例は本発明の範囲を限定するものではない。
【００５３】
<実施例１>青色光信号伝達が抑制されたシロイヌナズナ形質転換体の製作および選抜
青色光信号伝達が抑制されたシロイヌナズナ形質転換体の製作および選抜は、Ｗｅｉｇｅｌ等(Weigel et al., (2000) Plant Physiology, Vol 122 1003-1013)の方法によって行われた。
【００５４】
まず、ＢＩＴ１遺伝子（その塩基配列とそのアミノ酸配列はそれぞれ配列番号１と配列番号２であり、その遺伝子およびその遺伝子が暗号化するポリペプチドの模式図は図１に示されている）のＣ末端部分（ＢＩＴ１ ｃＤＮＡの３４９〜８９４部分の５４６塩基対）をｐＮＢ９６ベクター(Jun et al., Planta (2002) 214: 668-674)に制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩとの間にアンチセンス方向にクローニングして、ＢＩＴ１遺伝子のＣ末端部分を含むｐＮＢ９６：：ＢＩＴ１−Ｃ組み換えベクターを製作した。結果的に構築されたｐＮＢ９６：：ＢＩＴ１−Ｃベクターは、大腸菌またはアグロバクテリウム・ツメファシエンスに導入するときに形質転換体を選別し得るカナマイシン(kannmycin)抵抗性遺伝子を含み、シロイヌナズナに導入するときに形質転換体を選別し得るカナマイシン抵抗性遺伝子を含む。ｐＮＢ９６：：ＢＩＴ１−Ｃをエレクトロポレーション方法でアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens strain AGL1;Lazo et al., (1991) Biotechnology 9:963-967)に導入させ、カナマイシンに対して抵抗性を示す形質転換菌株を選別した後、その菌株をシロイヌナズナコロンビア野生型（Ｃｏｌ−０（ｗｔ））にフローラルディッピング方法(floral dipping method; Clough et al., Plant J(1998)16: 735-743)で形質転換させた。形質転換されたシロイヌナズナから得られた種子を、３０μｇ／ｍＬのカナマイシンが含まれた培地で栽培して、抵抗性を示すシロイヌナズナ形質転換体を１次的に選抜した。その後、選抜されたシロイヌナズナ形質転換体とシロイヌナズナコロンビア野生型（Ｃｏｌ−Ｏ（ｗｔ））を２２℃の温度で１６／８時間の明暗周期で調節される生長調節器内で栽培した。形質転換体と野生型シロイヌナズナを１０μｍｏｌ ｍ-2ｓｅｃ-1青色光の下に５日間放置して植物の下胚軸の長さを比較することにより、青色光認識能力の抑制有無を判断した。その結果、図２から確認されるように、シロイヌナズナ形質転換体（ＢＩＴ１ ＡＳ）は、コロンビア野生型（Ｃｏｌ−Ｏ（ｗｔ））に比べて青色光認識能力が抑制された表現型を示した。青色光認識能力の抑制されたクリプトクロム変異体（ｃｒｙ１）が陽性対照区植物体として使用された。ＢＩＴ１ ＡＳ形質転換体の開花時期における表現型は野生型との大きい相違点は無かった。
【００５５】
<実施例２>青色光信号伝達が増大した表現型を示す形質転換植物体の製作および選抜
【００５６】
実施例１で得られた形質転換シロイヌナズナの表現型に対してＢＩＴ１遺伝子の発現が抑制されて見えたのかを確認するために、ＢＩＴ１遺伝子を過剰発現させて形質転換シロイヌナズナの表現型を観察した。まず、ＢＩＴ１遺伝子をｐＣｓＶＭＶ−ＧＦＰベクター（本ベクターは強い発現を誘導する−４４３ｔｏ＋７２のＣｓＶＭＶ(Cassava vein mosaic virus)プロモーターを含む(Verdaguer et al., (1998) Plant Mol Biol. 37: 1055-67)を制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩとの間にクローニングすることにより、ＢＩＴ１遺伝子を含むｐＣｓＶＭＶ−ＧＦＰ：：ＢＩＴ１組み換えベクターを製作した。 結果的に構築されたｐＣｓＶＭＶ−ＧＦＰ：：ＢＩＴ１ベクターは、大腸菌またはアグロバクテリウム・ツメファシエンスに導入するときに形質転換体を選別し得るカナマイシン(kannmycin)抵抗性遺伝子を含み、シロイヌナズナに導入するときに形質転換体を選別し得るハイグロマイシン(hygromycine)抵抗性遺伝子を含む。
【００５７】
前記ｐＣｓＶＭＶ−ＧＦＰ：：ＢＩＴ１組み換えベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンスＡｇｌ１菌株(Lazo et al., 1991) Biotechnology 9:963-967)にエレクトロポレーション方法で導入させ、カナマイシン抵抗性を有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスを培養してフローラルディッピング方法(Clough et al., (1998) Plant J. 16: 735-743)でシロイヌナズナに形質転換させた。形質転換されたシロイヌナズナを、１５μｇ／ｍＬのハイグロマイシンが含まれた培地で選別した。図３および図４に示すように、形質転換されたシロイヌナズナ（ＢＩＴ１ ＧＦＰ）は、対照群としてのシロイヌナズナとは異なり、青色光認識が増大した表現型を示すことを確認することができた。ＢＩＴ１ ＧＦＰ形質転換体の表現型は、苗木状態のときには非常に小さい状態であるが、成長しながら益々回復して開花時期における表現型は野生型との大きい相違点は無かった。
【００５８】
<実施例３>ＲＴ−ＰＣＲによる形質転換植物体におけるＢＩＴ１遺伝子の発現程度の確認
【００５９】
ＢＩＴ１遺伝子が形質転換シロイヌナズナで低発現或いは過剰発現されるか否かを確認するために、ＲＴ−ＰＣＲを行った。まず、シロイヌナズナコロンビア野生型（Ｃｏｌ−Ｏ（ｗｔ））と実施例１および２で得られたシロイヌナズナ形質転換体からＲＮｅａｓｙ ｐｌａｎｔ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、ＵＳＡ）を用いて製造社の指針に従って全体ＲＮＡをそれぞれ抽出した。得られた全体ＲＮＡを１μｇずつＩｍＰｒｏｍｅ−ＩＩ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）を用いて製造社の指針に従ってｃＤＮＡをそれぞれ生成した。こうしに作られたｃＤＮＡを鋳型ＤＮＡにして下記のＰＣＲ条件で行った。
【００６０】
全体反応溶液の量は５０μＬである。ＰＣＲ反応における最終濃度および行われたサイクルの回数および条件は次のとおりである。
【００６１】
（最終濃度）
鋳型ＤＮＡ：１μＬ
ＢＩＴ１正方向プライマー（配列番号３）：０．２μＭ
ＢＩＴ１逆方向プライマー（配列番号４）：０．２μＭ
ＡＣＴ正方向プライマー（配列番号５）：０．２μＭ
ＡＣＴ逆方向プライマー（配列番号６）：０．２μＭ
ｄＮＴＰ ｍｉｘ：０．８ｍＭ
Ｔａｑ ｂｕｆｆｅｒ：１ｘ
Ｔａｑ酵素：１Ｕ
【００６２】
（サイクルの回数および条件）
９４℃で１０秒、５６℃で３０秒、７２℃で１分間各３０回繰り返し行い、７２℃で１０分間反応する。
【００６３】
その結果、図５に示すように、野性型（Ｃｏｌ−０）に比べてＢＩＴ１アンチセンス形質転換体（ＢＩＴ１ ＡＳ）では前記遺伝子が殆ど発現されず、逆にＢＩＴ１遺伝子過剰発現形質転換体（ＢＩＴ１ ＧＦＰ）では前記遺伝子が相当高い水準に発現されることを確認することができた。
【００６４】
<実施例４>形質転換植物体におけるアントシアニン(Anthocyanin)蓄積程度の確認
【００６５】
強い青色光によって、蓄積されるアントシアニンが野生型（Ｃｏｌ−０）に比べて形質転換シロイヌナズナで低発現或いは過剰発現されるか否かを確認するために、アントシアニンを測定した。まず、シロイヌナズナコロンビア野生型（Ｃｏｌ−Ｏ（ｗｔ））と実施例１、２で得られたシロイヌナズナ形質転換体の種子を消毒し、３日間低温処理を施した後、１／２ Ｂ５倍値に５０個ずつ播いて１２時間白色光の下で発芽を誘導した後、青色光の下で５日間育てた。５日間青色光の下で成長した個体をサンプリングしてその重さを測った後、アントシアニン抽出法(Kim et al., (2003) Plant Cell, 15: 23992407)を用いて３００μＬの１％（ｖ／ｖ）ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｍｅｔｈａｎｏｌに浸し、しかる後に、一晩中４℃で保管した。相対的なアントシアニン濃度は５３０ｎｍ〜６５７ｎｍ値にそれぞれのサンプル重量で割って計算した。
その結果、図６に示すように、野性型（Ｃｏｌ−０）に比べてＢＩＴ１アンチセンス形質転換体（ＢＩＴ１ ＡＳ）ではアントシアニンの蓄積が低く、逆にＢＩＴ１遺伝子過剰発現形質転換体（ＢＩＴ１ ＧＦＰ）ではアントシアニンが相当高い水準に蓄積されることを確認することができた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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