(57)【要約】  本発明は、部分的には、タンパク質を高レベルで組換え発現させるための方法、およびそれを行うための細胞培養培地を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質を発現する宿主細胞を初期哺乳類細胞増殖培地に接種し、
グルコース；
Ｌ−グルタミン；
ダイズ水解物またはコムギ水解物またはそれらの両方；
硫酸アデニン；
アデノシン；
バナジン酸アンモニウム；
ビオチン；
塩化コリン；
塩化コバルト；
硫酸第二銅；
シチジン；
Ｄ−パントテン酸カルシウム；
エタノールアミンＨＣｌ；
フラビンアデニンジヌクレオチド；
葉酸；
グリシン；
グアノシン；
ヒポキサンチン；
ｉ−イノシトール；
Ｌ−アラニン；
Ｌ−アルギニン；
Ｌ−アスパラギン；
Ｌ−アスパラギン酸；
Ｌ−シトルリン；
Ｌ−システイン−ＨＣｌ；
Ｌ−シスチン；
Ｌ−グルタミン酸；
Ｌ−ヒスチジン；
リポ酸；
Ｌ−イソロイシン；
Ｌ−ロイシン；
Ｌ−リシン；
Ｌ−メチオニン；
Ｌ−オルニチン−ＨＣｌ；
Ｌ−フェニルアラニン；
Ｌ−プロリン；
Ｌ−セリン；
Ｌ−トレオニン；
Ｌ−トリプトファン；
Ｌ−チロシン；
Ｌ−バリン；
塩化マンガン四水和物；
ナイアシン；
二塩化ニッケル六水和物；
プロゲステロン；
プトレッシン２ＨＣｌ；
ピリドキシンＨＣｌ；
リボフラビン；
モリブデン酸ナトリウム脱水物；
リン酸ナトリウム（一塩基酸）；
亜セレン酸ナトリウム；
チアミンＨＣｌ；
チミジン；
塩化スズ脱水物；
ウリジン；
ビタミンＢ１２；
ビタミンＥ；および
硫酸亜鉛
を含む補足物を該培地に加えることを含む、該タンパク質の製造方法。
【請求項２】
該補足物から該培地に加えられる成分の最終濃度が、おおよそ以下に記載されているもの：
硫酸アデニン：１．６３２ｍｇ／リットル
アデノシン：１７．６ｍｇ／リットル
バナジン酸アンモニウム：０．０００７８ｍｇ／リットル
ビオチン：０．２８ｍｇ／リットル
塩化コリン：５０．２ｍｇ／リットル
塩化コバルト：０．００２５ｍｇ／リットル
硫酸第二銅：０．００３２ｍｇ／リットル
シチジン：１７．６ｍｇ／リットル
Ｄ−パントテン酸カルシウム：２３．８ｍｇ／リットル
エタノールアミンＨＣｌ：４．４ｍｇ／リットル
フラビンアデニンジヌクレオチド：０．０５ｍｇ／リットル
葉酸：４．６ｍｇ／リットル
グリシン：７２ｍｇ／リットル
グアノシン：１７．６ｍｇ／リットル
ヒポキサンチン：１１．８ｍｇ／リットル
ｉ−イノシトール：７３．２ｍｇ／リットル
Ｌ−アラニン：８．９ｍｇ／リットル
Ｌ−アルギニン：３１２．４ｍｇ／リットル
Ｌ−アスパラギン：８４２ｍｇ／リットル
Ｌ−アスパラギン酸：９７．６ｍｇ／リットル
Ｌ−シトルリン：１２．６ｍｇ／リットル
Ｌ−システイン−ＨＣｌ：２２４ｍｇ／リットル
Ｌ−シスチン：３４ｍｇ／リットル
Ｌ−グルタミン酸：１５５．４ｍｇ／リットル
Ｌ−ヒスチジン：１６７ｍｇ／リットル
リポ酸：０．５２ｍｇ／リットル
Ｌ−イソロイシン：４２２ｍｇ／リットル
Ｌ−ロイシン：３８４ｍｇ／リットル
Ｌ−リシン：３６５ｍｇ／リットル
Ｌ−メチオニン：１４７．２ｍｇ／リットル
Ｌ−オルニチン−ＨＣｌ：２５．６ｍｇ／リットル
Ｌ−フェニルアラニン：２０７ｍｇ／リットル
Ｌ−プロリン：２３９ｍｇ／リットル
Ｌ−セリン：２８１ｍｇ／リットル
Ｌ−トレオニン：２１１．６ｍｇ／リットル
Ｌ−トリプトファン：１０９．２ｍｇ／リットル
Ｌ−チロシン：２３４ｍｇ／リットル
Ｌ−バリン：３０８．８ｍｇ／リットル
塩化マグネシウム四水和物：０．０００３ｍｇ／リットル
ナイアシン：３１．４ｍｇ／リットル
二塩化ニッケル六水和物：０．０００４ｍｇ／リットル
プロゲステロン：０．０１５ｍｇ／リットル
プトレッシン２ＨＣｌ：０．４ｍｇ／リットル
ピリドキシンＨＣｌ：３ｍｇ／リットル
リボフラビン：１．８６ｍｇ／リットル
モリブデン酸ナトリウム脱水物：０．０００１６ｍｇ／リットル
リン酸ナトリウム（一塩基酸）：２８８．２ｍｇ／リットル
亜セレン酸ナトリウム：０．０１４２６ｍｇ／リットル
チアミンＨＣｌ：１６ｍｇ／リットル
チミジン：７．８ｍｇ／リットル
塩化スズ脱水物：０．００００８ｍｇ／リットル
ウリジン：１７．６ｍｇ／リットル
ビタミンＢ１２：３．４ｍｇ／リットル
ビタミンＥ：０．３７６ｍｇ／リットル
硫酸亜鉛：１．０８ｍｇ／リットル
グルコース：１．５ｇ／リットル
Ｌ−グルタミン：１５０ｍｇ／リットル
である、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
おおよそ以下の濃度のアミノ酸：
Ｌ−アルギニン：６．３２ｇ／リットル
Ｌ−シスチン：１．７ｇ／リットル
Ｌ−ヒスチジン：２．１ｇ／リットル
Ｌ−イソロイシン：２．６ｇ／リットル
Ｌ−ロイシン：２．６ｇ／リットル
Ｌ−リシン：３．６ｇ／リットル
Ｌ−メチオニン：０．７６ｇ／リットル
Ｌ−フェニルアラニン：１．６５ｇ／リットル
Ｌ−トレオニン：２．３８ｇ／リットル
Ｌ−トリプトファン：０．５１ｇ／リットル
Ｌ−チロシン：１．８ｇ／リットル
Ｌ−バリン：２．３４ｇ／リットル
を含むアミノ酸供給物から該補足物を加える、請求項１記載の製造方法。
【請求項４】
培地１リットル当たり約２０ｍｌのアミノ酸供給物を加える、請求項３記載の製造方法。
【請求項５】
おおよそ以下の濃度のアミノ酸：
Ｌ−アラニン：０．８９ｇ／リットル
Ｌ−アスパラギン：１．５ｇ／リットル
Ｌ−アスパラギン酸：１．３３ｇ／リットル
Ｌ−グルタミン酸：１．４７ｇ／リットル
グリシン：０．７５ｇ／リットル
Ｌ−プロリン：１．１５ｇ／リットル
Ｌ−セリン：１．０５ｇ／リットル
を含むアミノ酸供給物から該補足物を加える、請求項１記載の製造方法。
【請求項６】
培地１リットル当たり約１０ｍｌのアミノ酸供給物を加える、請求項５記載の製造方法。
【請求項７】
おおよそ以下の濃度の補足物：
Ｌ−アスパラギン：４０．６ｇ／リットル
Ｌ−プロリン：１０．８１ｇ／リットル
Ｌ−イソロイシン：１８．５３ｇ／リットル
Ｌ−システイン−ＨＣｌ：１１．１９ｇ／リットル
Ｌ−ロイシン：１６．５８ｇ／リットル
Ｌ−トレオニン：８．２ｇ／リットル
Ｌ−チロシン：９．９ｇ／リットル
Ｌ−アルギニン：９．２９ｇ／リットル
Ｌ−アスパラギン酸：３．５６ｇ／リットル
Ｌ−グルタミン酸：６．２８ｇ／リットル
グリシン：２．８３ｇ／リットル
Ｌ−ヒスチジン：６．２３ｇ／リットル
Ｌ−メチオニン：６．５８ｇ／リットル
Ｌ−トリプトファン：４．９３ｇ／リットル
Ｌ−リシン：１４．６６ｇ／リットル
Ｌ−フェニルアラニン：８．６４ｇ／リットル
Ｌ−バリン：１３．０８ｇ／リットル
Ｌ−セリン：１３ｇ／リットル
リン酸ナトリウム（一塩基酸）：１４．４１ｇ／リットル
硫酸亜鉛：０．０５４ｇ／リットル
硫酸第二銅：０．０００１６ｇ／リットル
バナジン酸アンモニウム：０．００００３９ｇ／リットル
塩化コバルト：０．０００１２５ｇ／リットル
二塩化ニッケル六水和物：０．００００２ｇ／リットル
モリブデン酸ナトリウム脱水物：０．０００００８ｇ／リットル
塩化スズ脱水物：０．０００００４ｇ／リットル
塩化マンガン四水和物：０．００００１５ｇ／リットル
を含む栄養供給物から該補足物を加える、請求項１記載の製造方法。
【請求項８】
培地１リットル当たり約２０ｍｌの栄養供給物を加える、請求項７記載の製造方法。
【請求項９】
おおよそ以下の濃度の補足物：
亜セレン酸ナトリウム：７．１３×１０−４ｇ／リットル
硫酸アデニン：０．０８１６ｇ／リットル
アデノシン：０．８８ｇ／リットル
シチジン：０．８８ｇ／リットル
グアノシン：０．８８ｇ／リットル
ウリジン：０．８８ｇ／リットル
ヒポキサンチン：０．５９ｇ／リットル
Ｌ−シトルリン：０．６３ｇ／リットル
Ｌ−オルニチン−ＨＣｌ：１．２８ｇ／リットル
ビオチン：０．０１４ｇ／リットル
フラビンアデニンジヌクレオチド：０．００２５ｇ／リットル
葉酸：０．２３ｇ／リットル
リポ酸：０．０２６ｇ／リットル
ナイアシン：１．５７ｇ／リットル
ピリドキシンＨＣｌ：０．１５ｇ／リットル
リボフラビン：０．０９３ｇ／リットル
チアミンＨＣｌ：０．８ｇ／リットル
ビタミンＥ：０．０１８８ｇ／リットル
ビタミンＢ１２：０．１７ｇ／リットル
塩化コリン：２．５１ｇ／リットル
エタノールアミンＨＣｌ：０．２２ｇ／リットル
ｉ−イノシトール：３．６６ｇ／リットル
チミジン：０．３９ｇ／リットル
プトレッシン２ＨＣｌ：０．０２ｇ／リットル
プロゲステロン：０．０００７５ｇ／リットル
Ｄ−パントテン酸カルシウム：１．１９ｇ／リットル
を含むビタミン／塩供給物から該補足物を加える、請求項１記載の製造方法。
【請求項１０】
培地１リットル当たり約２０ｍｌのビタミン／塩供給物を加える、請求項９記載の製造方法。
【請求項１１】
該タンパク質が該細胞から該培地内に分泌される場合、該宿主細胞から該培地を採取することを更に含む、請求項１記載の製造方法。
【請求項１２】
該細胞の生存率が約６０％未満である場合、該宿主細胞から該培地を採取する、請求項１３記載の製造方法。
【請求項１３】
該培地を遠心分離する、および／または該培地をデプス濾過する、および／または該培地を０．２ミクロンフィルターで濾過することにより、該細胞から該培地を精製することを更に含む、請求項１１記載の製造方法。
【請求項１４】
該タンパク質が、抗体の、１以上の免疫グロブリン鎖、またはそれらの抗原結合性フラグメントである、請求項１記載の製造方法。
【請求項１５】
該抗体またはフラグメントがＩＧＦ１Ｒに特異的に結合する、請求項１４記載の製造方法。
【請求項１６】
該抗体またはフラグメントが、配列番号１、３〜６、１３、２１および２６よりなる群から選択される要素において記載されているアミノ酸配列またはそれらの成熟フラグメントもしくはそれらからの１以上のＣＤＲを含む重鎖免疫グロブリン、ならびに／または配列番号２、７〜９、１７および２５よりなる群から選択されるアミノ酸配列またはそれらの成熟フラグメントもしくはそれらからの１以上のＣＤＲを含む軽鎖免疫グロブリンを含む、請求項１５記載の製造方法。
【請求項１７】
該宿主細胞から分泌される抗体またはフラグメントが、配列番号３、４、５または６のアミノ酸２０−１２８を含む軽鎖免疫グロブリンと、配列番号８または９のアミノ酸２０−１３７を含む重鎖免疫グロブリンとを含む抗体である、請求項１６記載の製造方法。
【請求項１８】
該軽鎖免疫グロブリンがカッパ定常免疫グロブリン鎖に連結されており、該重鎖免疫グロブリンがガンマ−１定常免疫グロブリン鎖に連結されている、請求項１７記載の製造方法。
【請求項１９】
該補足物が加えられる初期哺乳類細胞増殖培地が、ＨＥＰＥＳ、炭酸水素ナトリウムバッファー、無機塩、非必須アミノ酸、組換えヒトインスリン、微量元素および界面活性剤を含み、Ｌ−グルタミン、抗生物質、抗真菌物質または動物由来成分のいずれをも含まない、請求項１記載の製造方法。
【請求項２０】
約３７℃に予め加温された初期哺乳類細胞増殖培地（該初期培地は、ＨＥＰＥＳ、炭酸水素ナトリウムバッファー、無機塩、非必須アミノ酸、組換えヒトインスリン、微量元素および界面活性剤を含み、Ｌ−グルタミン、抗生物質、抗真菌物質または動物由来成分のいずれをも含まない）に、抗体軽鎖免疫グロブリンと重鎖免疫グロブリンとを発現するＣＨＯ  ＤＸＢ１１宿主細胞を約２．５〜５×１０５  細胞／ｍｌの細胞密度まで接種し、該接種の前、それと同時またはその直後に該培地に以下の補足物：
約１０ｇ／リットルの最終濃度までのダイズ水解物、
そして場合によっては、アミノ酸供給物（該アミノ酸供給物により加えられる成分の濃度は、おおよそ、以下に記載されているものである：
Ｌ−アルギニン：１２６．４ｍｇ／リットル
Ｌ−シスチン：３４ｍｇ／リットル
Ｌ−ヒスチジン：４２ｍｇ／リットル
Ｌ−イソロイシン：５２ｍｇ／リットル
Ｌ−ロイシン：５２ｍｇ／リットル
Ｌ−リシン：７２ｍｇ／リットル
Ｌ−メチオニン：１５．２ｍｇ／リットル
Ｌ−フェニルアラニン：３３ｍｇ／リットル
Ｌ−トレオニン：４７．６ｍｇ／リットル
Ｌ−トリプトファン：１０．２ｍｇ／リットル
Ｌ−チロシン：３６ｍｇ／リットル
Ｌ−バリン：４６．８ｍｇ／リットル
Ｌ−アラニン：８．９ｍｇ／リットル
Ｌ−アスパラギン：３０ｍｇ／リットル
Ｌ−アスパラギン酸：２６．６ｍｇ／リットル
Ｌ−グルタミン酸：２９．４ｍｇ／リットル
グリシン：１５ｍｇ／リットル
Ｌ−プロリン：２３ｍｇ／リットル
Ｌ−セリン：２１ｍｇ／リットル）
を加え、生細胞密度が約１．２×１０６  細胞／ｍｌ以上に達したら補足供給物を加え（ここで、該補足供給物により加えられる成分の濃度は、おおよそ、以下に記載されているものである：
亜セレン酸ナトリウム：０．０１４２６ｍｇ／リットル
硫酸アデニン：１．６３２ｍｇ／リットル
アデノシン：１７．６ｍｇ／リットル
シチジン：１７．６ｍｇ／リットル
グアノシン：１７．６ｍｇ／リットル
ウリジン：１７．６ｍｇ／リットル
ヒポキサンチン：１１．８ｍｇ／リットル
Ｌ−シトルリン：１２．６ｍｇ／リットル
Ｌ−オルニチン−ＨＣｌ：２５．６ｍｇ／リットル
ビオチン：０．２８ｍｇ／リットル
フラビンアデニンジヌクレオチド：０．０５ｍｇ／リットル
葉酸：４．６ｍｇ／リットル
リポ酸：０．５２ｍｇ／リットル
ナイアシン：３１．４ｍｇ／リットル
ピリドキシンＨＣｌ：３ｍｇ／リットル
リボフラビン：１．８６ｍｇ／リットル
チアミンＨＣｌ：１６ｍｇ／リットル
ビタミンＥ：０．３７６ｍｇ／リットル
ビタミンＢ１２：３．４ｍｇ／リットル
塩化コリン：５０．２ｍｇ／リットル
エタノールアミンＨＣｌ：４．４ｍｇ／リットル
ｉ−イノシトール：７３．２ｍｇ／リットル
チミジン：７．８ｍｇ／リットル
プトレッシン２ＨＣｌ：０．４ｍｇ／リットル
プロゲステロン：０．０１５ｍｇ／リットル
Ｄ−パントテン酸カルシウム：２３．８ｍｇ／リットル
Ｌ−アスパラギン：８１２ｍｇ／リットル
Ｌ−プロリン：２１６ｍｇ／リットル
Ｌ−イソロイシン：３７０ｍｇ／リットル
Ｌ−システイン−ＨＣｌ：２２４ｍｇ／リットル
Ｌ−ロイシン：３３２ｍｇ／リットル
Ｌ−トレオニン：１６４ｍｇ／リットル
Ｌ−チロシン：１９８ｍｇ／リットル
Ｌ−アルギニン：１８６ｍｇ／リットル
Ｌ−アスパラギン酸：７１ｍｇ／リットル
Ｌ−グルタミン酸：１２６ｍｇ／リットル
グリシン：５７ｍｇ／リットル
Ｌ−ヒスチジン：１２５ｍｇ／リットル
Ｌ−メチオニン：１３２ｍｇ／リットル
Ｌ−トリプトファン：９９ｍｇ／リットル
Ｌ−リシン：２９３ｍｇ／リットル
Ｌ−フェニルアラニン：１７４ｍｇ／リットル
Ｌ−バリン：２６２ｍｇ／リットル
Ｌ−セリン：２６０ｍｇ／リットル
リン酸ナトリウム（一塩基酸）：２８８．２ｍｇ／リットル
硫酸亜鉛：１．０８ｍｇ／リットル
硫酸第二銅：０．００３２ｍｇ／リットル
バナジン酸アンモニウム：０．０００７８ｍｇ／リットル
塩化コバルト：０．００２５ｍｇ／リットル
二塩化ニッケル六水和物：０．０００４ｍｇ／リットル
モリブデン酸ナトリウム脱水物：０．０００１６ｍｇ／リットル）、該培地内のグルコース濃度を約１．５ｇ／リットルに維持し、該培地内のＬ−グルタミン濃度を約１５０ｍｇ／リットルに維持し、細胞増殖中、Ｏ２濃度を約６０％に、ｐＨを約６．８±０．０２に、そして温度を約３６．５℃±０．５℃に維持し、場合によっては、細胞生存率が約６０％未満である場合には該培地から該宿主細胞を除去することを含む、抗体の製造方法。
【請求項２１】
該抗体が、配列番号１、３〜６、１３、２１および２６よりなる群から選択される要素において記載されているアミノ酸配列またはそれらの成熟フラグメントもしくはそれらからの１以上のＣＤＲを含む重鎖免疫グロブリン、ならびに／または配列番号２、７〜９、１７および２５よりなる群から選択されるアミノ酸配列またはそれらの成熟フラグメントもしくはそれらからの１以上のＣＤＲを含む軽鎖免疫グロブリンを含む、請求項２０記載の製造方法。
【請求項２２】
該抗体またはフラグメントが、配列番号３、４、５または６のアミノ酸２０−１２８を含む軽鎖免疫グロブリンと配列番号８または９のアミノ酸２０−１３７を含む重鎖免疫グロブリンとを含む該宿主細胞から分泌される抗体を含む、請求項２１記載の製造方法。
【請求項２３】
該軽鎖免疫グロブリンがカッパ定常免疫グロブリン鎖に連結されており、該重鎖免疫グロブリンがガンマ−１定常免疫グロブリン鎖に連結されている、請求項２２記載の製造方法。
【請求項２４】
該培地のディスク・スタック（ｄｉｓｋ−ｓｔａｃｋ）遠心分離、該培地のデプス濾過（ｄｅｐｔｈ  ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ）および約０．２ミクロンの細孔径を有するフィルターでの該培地の濾過により該細胞から該培地を回収することを更に含む、請求項２３記載の製造方法。
【請求項２５】
カラムクロマトグラフィー分画により該培地から該免疫グロブリンを精製する工程を更に含む、請求項２５記載の製造方法。
【請求項２６】
約１０ｇ／リットル  ダイズ水解物、
約１．５ｇ／リットル  グルコース、
約１５０ｍｇ／リットル  Ｌ−グルタミン、
約６．８±０．０２のｐＨ、
ＨＥＰＥＳ、
炭酸水素ナトリウムバッファー、
無機塩、
非必須アミノ酸、
組換えヒトインスリン、
微量元素、
界面活性剤、
アミノ酸供給物（ここで、該アミノ酸供給物により加えられる成分の濃度は、おおよそ、以下に記載されているものである：
Ｌ−アルギニン：１２６．４ｍｇ／リットル
Ｌ−シスチン：３４ｍｇ／リットル
Ｌ−ヒスチジン：４２ｍｇ／リットル
Ｌ−イソロイシン：５２ｍｇ／リットル
Ｌ−ロイシン：５２ｍｇ／リットル
Ｌ−リシン：７２ｍｇ／リットル
Ｌ−メチオニン：１５．２ｍｇ／リットル
Ｌ−フェニルアラニン：３３ｍｇ／リットル
Ｌ−トレオニン：４７．６ｍｇ／リットル
Ｌ−トリプトファン：１０．２ｍｇ／リットル
Ｌ−チロシン：３６ｍｇ／リットル
Ｌ−バリン：４６．８ｍｇ／リットル
Ｌ−アラニン：８．９ｍｇ／リットル
Ｌ−アスパラギン：３０ｍｇ／リットル
Ｌ−アスパラギン酸：２６．６ｍｇ／リットル
Ｌ−グルタミン酸：２９．４ｍｇ／リットル
グリシン：１５ｍｇ／リットル
Ｌ−プロリン：２３ｍｇ／リットル
Ｌ−セリン：２１ｍｇ／リットル）
を含み、抗生物質、抗真菌物質または動物由来成分のいずれをも含まない水性液体細胞培養培地。
【請求項２７】
約３７℃に予め加温された初期哺乳類細胞増殖培地（該培地は、ＨＥＰＥＳ、炭酸水素ナトリウムバッファー、無機塩、非必須アミノ酸、組換えヒトインスリン、微量元素および界面活性剤を含み、Ｌ−グルタミン、抗生物質、抗真菌物質または動物由来成分のいずれをも含まない）に、抗体軽鎖免疫グロブリンと重鎖免疫グロブリンとを発現するＣＨＯ  ＤＸＢ１１宿主細胞を約２．５〜５×１０５  細胞／ｍｌの細胞密度まで接種し、該接種の前、それと同時またはその直後に該培地に以下の補足物：
約１０ｇ／リットルの最終濃度までのダイズ水解物、
そして場合によっては、アミノ酸供給物（ここで、該アミノ酸供給物により加えられる成分の濃度は、おおよそ、以下に記載されているものである：
Ｌ−アルギニン：１２６．４ｍｇ／リットル
Ｌ−シスチン：３４ｍｇ／リットル
Ｌ−ヒスチジン：４２ｍｇ／リットル
Ｌ−イソロイシン：５２ｍｇ／リットル
Ｌ−ロイシン：５２ｍｇ／リットル
Ｌ−リシン：７２ｍｇ／リットル
Ｌ−メチオニン：１５．２ｍｇ／リットル
Ｌ−フェニルアラニン：３３ｍｇ／リットル
Ｌ−トレオニン：４７．６ｍｇ／リットル
Ｌ−トリプトファン：１０．２ｍｇ／リットル
Ｌ−チロシン：３６ｍｇ／リットル
Ｌ−バリン：４６．８ｍｇ／リットル
Ｌ−アラニン：８．９ｍｇ／リットル
Ｌ−アスパラギン：３０ｍｇ／リットル
Ｌ−アスパラギン酸：２６．６ｍｇ／リットル
Ｌ−グルタミン酸：２９．４ｍｇ／リットル
グリシン：１５ｍｇ／リットル
Ｌ−プロリン：２３ｍｇ／リットル
Ｌ−セリン：２１ｍｇ／リットル）を加え、生細胞密度が約１．２×１０６  細胞／ｍｌ以上に達したら補足供給物を加え（ここで、該補足供給物により加えられる成分の濃度は、おおよそ、以下に記載されているものである：
亜セレン酸ナトリウム：０．０１４２６ｍｇ／リットル
硫酸アデニン：１．６３２ｍｇ／リットル
アデノシン：１７．６ｍｇ／リットル
シチジン：１７．６ｍｇ／リットル
グアノシン：１７．６ｍｇ／リットル
ウリジン：１７．６ｍｇ／リットル
ヒポキサンチン：１１．８ｍｇ／リットル
Ｌ−シトルリン：１２．６ｍｇ／リットル
Ｌ−オルニチン−ＨＣｌ：２５．６ｍｇ／リットル
ビオチン：０．２８ｍｇ／リットル
フラビンアデニンジヌクレオチド：０．０５ｍｇ／リットル
葉酸：４．６ｍｇ／リットル
リポ酸：０．５２ｍｇ／リットル
ナイアシン：３１．４ｍｇ／リットル
ピリドキシンＨＣｌ：３ｍｇ／リットル
リボフラビン：１．８６ｍｇ／リットル
チアミンＨＣｌ：１６ｍｇ／リットル
ビタミンＥ：０．３７６ｍｇ／リットル
ビタミンＢ１２：３．４ｍｇ／リットル
塩化コリン：５０．２ｍｇ／リットル
エタノールアミンＨＣｌ：４．４ｍｇ／リットル
ｉ−イノシトール：７３．２ｍｇ／リットル
チミジン：７．８ｍｇ／リットル
プトレッシン２ＨＣｌ：０．４ｍｇ／リットル
プロゲステロン：０．０１５ｍｇ／リットル
Ｄ−パントテン酸カルシウム：２３．８ｍｇ／リットル
Ｌ−アスパラギン：８１２ｍｇ／リットル
Ｌ−プロリン：２１６ｍｇ／リットル
Ｌ−イソロイシン：３７０ｍｇ／リットル
Ｌ−システイン−ＨＣｌ：２２４ｍｇ／リットル
Ｌ−ロイシン：３３２ｍｇ／リットル
Ｌ−トレオニン：１６４ｍｇ／リットル
Ｌ−チロシン：１９８ｍｇ／リットル
Ｌ−アルギニン：１８６ｍｇ／リットル
Ｌ−アスパラギン酸：７１ｍｇ／リットル
Ｌ−グルタミン酸：１２６ｍｇ／リットル
グリシン：５７ｍｇ／リットル
Ｌ−ヒスチジン：１２５ｍｇ／リットル
Ｌ−メチオニン：１３２ｍｇ／リットル
Ｌ−トリプトファン：９９ｍｇ／リットル
Ｌ−リシン：２９３ｍｇ／リットル
Ｌ−フェニルアラニン：１７４ｍｇ／リットル
Ｌ−バリン：２６２ｍｇ／リットル
Ｌ−セリン：２６０ｍｇ／リットル
リン酸ナトリウム（一塩基酸）：２８８．２ｍｇ／リットル
硫酸亜鉛：１．０８ｍｇ／リットル
硫酸第二銅：０．００３２ｍｇ／リットル
バナジン酸アンモニウム：０．０００７８ｍｇ／リットル
塩化コバルト：０．００２５ｍｇ／リットル
二塩化ニッケル六水和物：０．０００４ｍｇ／リットル
モリブデン酸ナトリウム脱水物：０．０００１６ｍｇ／リットル）、該培地内のグルコース濃度を約１．５ｇ／リットルに維持し、該培地内のＬ−グルタミン濃度を約１５０ｍｇ／リットルに維持し、細胞増殖中、Ｏ２濃度を約６０％に、ｐＨを約６．８±０．０２に、そして温度を約３６．５℃±０．５℃に維持することを含む製造方法により製造された水性液体培地。
【請求項２８】
該宿主細胞が、該抗体の免疫グロブリンをコードするベクターを含み、該抗体が該培地内に分泌される、請求項２７記載の水性液体培地。
【請求項２９】
該宿主細胞の生存率が約６０％以下であり、および／または宿主細胞の増殖が約１４〜２４日間続行している、請求項２８記載の水性液体培地。
【請求項３０】
該宿主細胞が該培地から除去されている、請求項２９記載の水性液体培地。
【請求項３１】
該培地を遠心分離し、および／または該培地をデプス濾過し、および／または該培地を０．２ミクロンフィルターで濾過することにより、該宿主細胞が該培地から除去されている、請求項３０記載の水性液体培地。
【請求項３２】
該抗体がＩＧＦ１Ｒに特異的に結合する、請求項３１記載の水性液体培地。
【請求項３３】
重鎖免疫グロブリンが、配列番号１、３〜６、１３、２１および２６よりなる群から選択される要素において記載されているアミノ酸配列またはそれらの成熟フラグメントもしくはそれらからの１以上のＣＤＲを含み、軽鎖免疫グロブリンが、配列番号２、７〜９、１７および２５よりなる群から選択されるアミノ酸配列またはそれらの成熟フラグメントもしくはそれらからの１以上のＣＤＲを含む、請求項３２記載の水性液体培地。
【請求項３４】
該抗体またはフラグメントが、配列番号３、４、５または６のアミノ酸２０−１２８を含む軽鎖免疫グロブリンと配列番号８または９のアミノ酸２０−１３７を含む重鎖免疫グロブリンとを含む該宿主細胞から分泌される抗体である、請求項３３記載の水性液体培地。
【請求項３５】
該軽鎖免疫グロブリンがカッパ定常免疫グロブリン鎖に連結されており、該重鎖免疫グロブリンがガンマ−１定常免疫グロブリン鎖に連結されている、請求項３４記載の水性液体培地。
【請求項３６】
請求項２７記載の水性液体培地を含む容器。
【請求項３７】
フラスコ、バイオリアクター、タンクバイオリアクター、バッグバイオリアクターまたは使い捨てバイオリアクターである、請求項３６記載の容器。
【請求項３８】
バイオリアクターが、攪拌タンクバイオリアクター、バブルカラムバイオリアクター、エアリフトバイオリアクター、流動床バイオリアクターまたは充填層バイオリアクターである、請求項３７記載の容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般には、大量のタンパク質、例えば抗体を細胞培養内で製造するための製造方法、および該細胞培養自体に関する。
【背景技術】
【０００２】
治療用タンパク質の工業的製造のための細胞培養は、高い経費を要する方法である。必要な設備は高くつき、研究開発および製造コストは高い。細胞培養１リットル当たりの治療用タンパク質の量を最大にする細胞培養方法の開発は、与えられた量の該タンパク質を製造するのに必要な資源を最小にするであろう。したがって、大量のタンパク質を製造する商業的に実施可能な方法を用いることが望ましい。
【０００３】
天然に存在する多数の細胞は標準的な培養条件下で所望のタンパク質を大量には産生しない。したがって、培養内の細胞に大量の治療用タンパク質を産生させる細胞培養方法の広範な研究開発が行われる必要がある。典型的には、最適な細胞培養条件の特定は困難であり、相当量の創作力を要する。
【発明の概要】
【０００４】
発明の概括
本発明は、一般には、種々の培養補足物を及び培養条件に対する他の改変を用いることにより培養内の細胞から大量のタンパク質を製造するための方法および組成物を提供する。
【０００５】
本発明は、タンパク質を発現する宿主細胞を初期哺乳類細胞増殖培地に接種し、以下に記載のものを場合によってはおおよその記載濃度（他の起源からの、例えば初期哺乳類細胞培地からの各成分の量を含まない）で含む補足物を加えることを含む、タンパク質の製造方法を提供する：
硫酸アデニン：１．６３２ｍｇ／リットル
アデノシン：１７．６ｍｇ／リットル
バナジン酸アンモニウム：０．０００７８ｍｇ／リットル
ビオチン：０．２８ｍｇ／リットル
塩化コリン：５０．２ｍｇ／リットル
塩化コバルト：０．００２５ｍｇ／リットル
硫酸第二銅：０．００３２ｍｇ／リットル
シチジン：１７．６ｍｇ／リットル
Ｄ−パントテン酸カルシウム：２３．８ｍｇ／リットル
エタノールアミンＨＣｌ：４．４ｍｇ／リットル
フラビンアデニンジヌクレオチド：０．０５ｍｇ／リットル
葉酸：４．６ｍｇ／リットル
グリシン：７２ｍｇ／リットル
グアノシン：１７．６ｍｇ／リットル
ヒポキサンチン：１１．８ｍｇ／リットル
ｉ−イノシトール：７３．２ｍｇ／リットル
Ｌ−アラニン：８．９ｍｇ／リットル
Ｌ−アルギニン：３１２．４ｍｇ／リットル
Ｌ−アスパラギン：８４２ｍｇ／リットル
Ｌ−アスパラギン酸：９７．６ｍｇ／リットル
Ｌ−シトルリン：１２．６ｍｇ／リットル
Ｌ−システイン−ＨＣｌ：２２４ｍｇ／リットル
Ｌ−シスチン：３４ｍｇ／リットル
Ｌ−グルタミン酸：１５５．４ｍｇ／リットル
Ｌ−ヒスチジン：１６７ｍｇ／リットル
リポ酸：０．５２ｍｇ／リットル
Ｌ−イソロイシン：４２２ｍｇ／リットル
Ｌ−ロイシン：３８４ｍｇ／リットル
Ｌ−リシン：３６５ｍｇ／リットル
Ｌ−メチオニン：１４７．２ｍｇ／リットル
Ｌ−オルニチン−ＨＣｌ：２５．６ｍｇ／リットル
Ｌ−フェニルアラニン：２０７ｍｇ／リットル
Ｌ−プロリン：２３９ｍｇ／リットル
Ｌ−セリン：２８１ｍｇ／リットル
Ｌ−トレオニン：２１１．６ｍｇ／リットル
Ｌ−トリプトファン：１０９．２ｍｇ／リットル
Ｌ−チロシン：２３４ｍｇ／リットル
Ｌ−バリン：３０８．８ｍｇ／リットル
塩化マグネシウム四水和物：０．０００３ｍｇ／リットル
ナイアシン：３１．４ｍｇ／リットル
二塩化ニッケル六水和物：０．０００４ｍｇ／リットル
プロゲステロン：０．０１５ｍｇ／リットル
プトレッシン２ＨＣｌ：０．４ｍｇ／リットル
ピリドキシンＨＣｌ：３ｍｇ／リットル
リボフラビン：１．８６ｍｇ／リットル
モリブデン酸ナトリウム脱水物：０．０００１６ｍｇ／リットル
リン酸ナトリウム（一塩基酸）：２８８．２ｍｇ／リットル
亜セレン酸ナトリウム：０．０１４２６ｍｇ／リットル
チアミンＨＣｌ：１６ｍｇ／リットル
チミジン：７．８ｍｇ／リットル
塩化スズ脱水物：０．００００８ｍｇ／リットル
ウリジン：１７．６ｍｇ／リットル
ビタミンＢ１２：３．４ｍｇ／リットル
ビタミンＥ：０．３７６ｍｇ／リットル
硫酸亜鉛：１．０８ｍｇ／リットル
グルコース：１．５ｇ／リットル
Ｌ−グルタミン：１５０ｍｇ／リットル。
【０００６】
本発明の１つの実施形態においては、おおよそ以下の濃度のアミノ酸を含むアミノ酸供給ストック溶液（例えば、５０×ストック溶液）から幾つかの補足物を加える：
Ｌ−アルギニン：６．３２ｇ／リットル
Ｌ−シスチン：１．７ｇ／リットル
Ｌ−ヒスチジン：２．１ｇ／リットル
Ｌ−イソロイシン：２．６ｇ／リットル
Ｌ−ロイシン：２．６ｇ／リットル
Ｌ−リシン：３．６ｇ／リットル
Ｌ−メチオニン：０．７６ｇ／リットル
Ｌ−フェニルアラニン：１．６５ｇ／リットル
Ｌ−トレオニン：２．３８ｇ／リットル
Ｌ−トリプトファン：０．５１ｇ／リットル
Ｌ−チロシン：１．８ｇ／リットル
Ｌ−バリン：２．３４ｇ／リットル。
【０００７】
本発明の１つの実施形態においては、培養１リットル当たり約２０ｍｌのアミノ酸供給ストック溶液を加える。本発明の１つの実施形態においては、おおよそ以下の濃度のアミノ酸を含むアミノ酸供給ストック溶液（例えば、１００×ストック溶液）から以下の補足物を加える：
Ｌ−アラニン：０．８９ｇ／リットル
Ｌ−アスパラギン：１．５ｇ／リットル
Ｌ−アスパラギン酸：１．３３ｇ／リットル
Ｌ−グルタミン酸：１．４７ｇ／リットル
グリシン：０．７５ｇ／リットル
Ｌ−プロリン：１．１５ｇ／リットル
Ｌ−セリン：１．０５ｇ／リットル。
【０００８】
本発明の１つの実施形態においては、培養１リットル当たり約１０ｍｌの該アミノ酸供給ストック溶液を加える。本発明の１つの実施形態においては、おおよそ以下の濃度の補足物を含む栄養供給ストック溶液（例えば、５０×ストック溶液）から該補足物のいくつかを加える：
Ｌ−アスパラギン：４０．６ｇ／リットル
Ｌ−プロリン：１０．８１ｇ／リットル
Ｌ−イソロイシン：１８．５３ｇ／リットル
Ｌ−システイン−ＨＣｌ：１１．１９ｇ／リットル
Ｌ−ロイシン：１６．５８ｇ／リットル
Ｌ−トレオニン：８．２ｇ／リットル
Ｌ−チロシン：９．９ｇ／リットル
Ｌ−アルギニン：９．２９ｇ／リットル
Ｌ−アスパラギン酸：３．５６ｇ／リットル
Ｌ−グルタミン酸：６．２８ｇ／リットル
グリシン：２．８３ｇ／リットル
Ｌ−ヒスチジン：６．２３ｇ／リットル
Ｌ−メチオニン：６．５８ｇ／リットル
Ｌ−トリプトファン：４．９３ｇ／リットル
Ｌ−リシン：１４．６６ｇ／リットル
Ｌ−フェニルアラニン：８．６４ｇ／リットル
Ｌ−バリン：１３．０８ｇ／リットル
Ｌ−セリン：１３ｇ／リットル
リン酸ナトリウム（一塩基酸）：１４．４１ｇ／リットル
硫酸亜鉛：０．０５４ｇ／リットル
硫酸第二銅：０．０００１６ｇ／リットル
バナジン酸アンモニウム：０．００００３９ｇ／リットル
塩化コバルト：０．０００１２５ｇ／リットル
二塩化ニッケル六水和物：０．００００２ｇ／リットル
モリブデン酸ナトリウム脱水物：０．０００００８ｇ／リットル
塩化スズ脱水物：０．０００００４ｇ／リットル
塩化マンガン四水和物：０．００００１５ｇ／リットル。
【０００９】
本発明の１つの実施形態においては、培養１リットル当たり約２０ｍｌの該栄養供給ストック溶液を加える。本発明の１つの実施形態においては、おおよそ以下の濃度の補足物を含むビタミン／塩供給ストック溶液（例えば、５０×ストック溶液）から該補足物の幾つかを加える：
亜セレン酸ナトリウム：７．１３×１０−４ｇ／リットル
硫酸アデニン：０．０８１６ｇ／リットル
アデノシン：０．８８ｇ／リットル
シチジン：０．８８ｇ／リットル
グアノシン：０．８８ｇ／リットル
ウリジン：０．８８ｇ／リットル
ヒポキサンチン：０．５９ｇ／リットル
Ｌ−シトルリン：０．６３ｇ／リットル
Ｌ−オルニチン−ＨＣｌ：１．２８ｇ／リットル
ビオチン：０．０１４ｇ／リットル
フラビンアデニンジヌクレオチド：０．００２５ｇ／リットル
葉酸：０．２３ｇ／リットル
リポ酸：０．０２６ｇ／リットル
ナイアシン：１．５７ｇ／リットル
ピリドキシンＨＣｌ：０．１５ｇ／リットル
リボフラビン：０．０９３ｇ／リットル
チアミンＨＣｌ：０．８ｇ／リットル
ビタミンＥ：０．０１８８ｇ／リットル
ビタミンＢ１２：０．１７ｇ／リットル
塩化コリン：２．５１ｇ／リットル
エタノールアミンＨＣｌ：０．２２ｇ／リットル
ｉ−イノシトール：３．６６ｇ／リットル
チミジン：０．３９ｇ／リットル
プトレッシン２ＨＣｌ：０．０２ｇ／リットル
プロゲステロン：０．０００７５ｇ／リットル
Ｄ−パントテン酸カルシウム：１．１９ｇ／リットル。
【００１０】
本発明の１つの実施形態においては、培養１リットル当たり約２０ｍｌのビタミン／塩供給物を加える。本発明の１つの実施形態においては、該タンパク質が該細胞から該培地内に分泌される場合、該方法は更に、該細胞から該培地を採取することを含む。例えば、本発明の１つの実施形態においては、該細胞の生存率が約６０％未満である場合、該細胞から該培地を採取する。例えば、該培地を遠心分離し、および／または該培地をデプス濾過（ｄｅｐｔｈ  ｆｉｌｔｅｒ）し、および／または該培地を０．２ミクロンフィルターで濾過することにより、該培地を該細胞から採取することが可能である。本発明の方法を用いて発現されたタンパク質は、任意のタンパク質、例えばＩＧＦ１Ｒに特異的に結合する例えば抗体またはその抗原結合性フラグメントであることが可能であり、例えば、ここで、該抗体またはフラグメントは、配列番号１、３〜６、１３、２１および２６よりなる群から選択される要素において記載されているアミノ酸配列、それらの成熟フラグメントまたはそれらからの１以上のＣＤＲを含む重鎖免疫グロブリン、ならびに配列番号２、７〜９、１７および２５よりなる群から選択されるアミノ酸配列またはそれらの成熟フラグメントもしくはそれらからの１以上のＣＤＲを含む軽鎖免疫グロブリンを含み、例えば、ここで、該抗体またはフラグメントは、配列番号３、４、５または６のアミノ酸２０−１２８を含む軽鎖免疫グロブリンと、配列番号８または９のアミノ酸２０−１３７を含む重鎖免疫グロブリンとを含む完全抗体であり、例えば、ここで、該軽鎖免疫グロブリンはカッパ定常免疫グロブリン鎖に連結されており、該重鎖免疫グロブリンはガンマ−１定常免疫グロブリン鎖に連結されている。本発明の１つの実施形態においては、該補足物が加えられる初期哺乳類細胞増殖培地は、ＨＥＰＥＳ、炭酸水素ナトリウムバッファー、無機塩、非必須アミノ酸、組換えヒトインスリン、微量元素および界面活性剤を含み、Ｌ−グルタミン、抗生物質、抗真菌物質または動物由来成分のいずれをも含まない。
【００１１】
本発明は、抗体（例えば、モノクローナル、組換え、および／または完全ヒト）の製造方法をその範囲内に含み、該製造方法は、約３７℃に予め加温された初期哺乳類細胞増殖培地（該培地は、ＨＥＰＥＳ、炭酸水素ナトリウムバッファー、無機塩、非必須アミノ酸、組換えヒトインスリン、微量元素および界面活性剤を含み、Ｌ−グルタミン、抗生物質、抗真菌物質または動物由来成分のいずれをも含まない）に、抗体軽鎖免疫グロブリンと重鎖免疫グロブリンとを発現するＣＨＯ  ＤＸＢ１１宿主細胞を約２．５〜５×１０５  細胞／ｍｌの細胞密度まで接種し、該接種の前、それと同時またはその直後に該培地に以下の補足物：
約１０ｇ／リットルの最終濃度までのダイズ水解物、
そして場合によっては、おおよそ以下の最終濃度（他の起源からの、例えば該初期哺乳類細胞培地からの該アミノ酸の量を含まない）までのアミノ酸：
Ｌ−アルギニン：１２６．４ｍｇ／リットル
Ｌ−シスチン：３４ｍｇ／リットル
Ｌ−ヒスチジン：４２ｍｇ／リットル
Ｌ−イソロイシン：５２ｍｇ／リットル
Ｌ−ロイシン：５２ｍｇ／リットル
Ｌ−リシン：７２ｍｇ／リットル
Ｌ−メチオニン：１５．２ｍｇ／リットル
Ｌ−フェニルアラニン：３３ｍｇ／リットル
Ｌ−トレオニン：４７．６ｍｇ／リットル
Ｌ−トリプトファン：１０．２ｍｇ／リットル
Ｌ−チロシン：３６ｍｇ／リットル
Ｌ−バリン：４６．８ｍｇ／リットル
Ｌ−アラニン：８．９ｍｇ／リットル
Ｌ−アスパラギン：３０ｍｇ／リットル
Ｌ−アスパラギン酸：２６．６ｍｇ／リットル
Ｌ−グルタミン酸：２９．４ｍｇ／リットル
グリシン：１５ｍｇ／リットル
Ｌ−プロリン：２３ｍｇ／リットル
Ｌ−セリン：２１ｍｇ／リットル
を加え、生細胞密度が約１．２×１０６  細胞／ｍｌ以上に達する場合には補足供給物を加え［ここで、該補足供給物（他の供給物からの各成分の量を含まない）からの成分は、以下に記載されているおおよその最終培養濃度に達する：
亜セレン酸ナトリウム：０．０１４２６ｍｇ／リットル
硫酸アデニン：１．６３２ｍｇ／リットル
アデノシン：１７．６ｍｇ／リットル
シチジン：１７．６ｍｇ／リットル
グアノシン：１７．６ｍｇ／リットル
ウリジン：１７．６ｍｇ／リットル
ヒポキサンチン：１１．８ｍｇ／リットル
Ｌ−シトルリン：１２．６ｍｇ／リットル
Ｌ−オルニチン−ＨＣｌ：２５．６ｍｇ／リットル
ビオチン：０．２８ｍｇ／リットル
フラビンアデニンジヌクレオチド：０．０５ｍｇ／リットル
葉酸：４．６ｍｇ／リットル
リポ酸：０．５２ｍｇ／リットル
ナイアシン：３１．４ｍｇ／リットル
ピリドキシンＨＣｌ：３ｍｇ／リットル
リボフラビン：１．８６ｍｇ／リットル
チアミンＨＣｌ：１６ｍｇ／リットル
ビタミンＥ：０．３７６ｍｇ／リットル
ビタミンＢ１２：３．４ｍｇ／リットル
塩化コリン：５０．２ｍｇ／リットル
エタノールアミンＨＣｌ：４．４ｍｇ／リットル
ｉ−イノシトール：７３．２ｍｇ／リットル
チミジン：７．８ｍｇ／リットル
プトレッシン２ＨＣｌ：０．４ｍｇ／リットル
プロゲステロン：０．０１５ｍｇ／リットル
Ｄ−パントテン酸カルシウム：２３．８ｍｇ／リットル
Ｌ−アスパラギン：８１２ｍｇ／リットル
Ｌ−プロリン：２１６ｍｇ／リットル
Ｌ−イソロイシン：３７０ｍｇ／リットル
Ｌ−システイン−ＨＣｌ：２２４ｍｇ／リットル
Ｌ−ロイシン：３３２ｍｇ／リットル
Ｌ−トレオニン：１６４ｍｇ／リットル
Ｌ−チロシン：１９８ｍｇ／リットル
Ｌ−アルギニン：１８６ｍｇ／リットル
Ｌ−アスパラギン酸：７１ｍｇ／リットル
Ｌ−グルタミン酸：１２６ｍｇ／リットル
グリシン：５７ｍｇ／リットル
Ｌ−ヒスチジン：１２５ｍｇ／リットル
Ｌ−メチオニン：１３２ｍｇ／リットル
Ｌ−トリプトファン：９９ｍｇ／リットル
Ｌ−リシン：２９３ｍｇ／リットル
Ｌ−フェニルアラニン：１７４ｍｇ／リットル
Ｌ−バリン：２６２ｍｇ／リットル
Ｌ−セリン：２６０ｍｇ／リットル
リン酸ナトリウム（一塩基酸）：２８８．２ｍｇ／リットル
硫酸亜鉛：１．０８ｍｇ／リットル
硫酸第二銅：０．００３２ｍｇ／リットル
バナジン酸アンモニウム：０．０００７８ｍｇ／リットル
塩化コバルト：０．００２５ｍｇ／リットル
二塩化ニッケル六水和物：０．０００４ｍｇ／リットル
モリブデン酸ナトリウム脱水物：０．０００１６ｍｇ／リットル］、細胞増殖中、グルコースレベルが約１．５ｇ／リットル未満に低下した場合には該培地にグルコースを加え、Ｌ−グルタミンレベルが約１５０ｍｇ／リットル未満に低下した場合にはＬ−グルタミンを加え、細胞増殖中、Ｏ２濃度を約６０％に、ｐＨを約６．８±０．０２に、そして温度を約３６．５℃±０．５℃に維持することを含む。本発明の１つの実施形態においては、該抗体は、配列番号１、３〜６、１３、２１および２６よりなる群から選択される要素において記載されているアミノ酸配列またはそれらの成熟フラグメントもしくはそれらからの１以上のＣＤＲを含む重鎖免疫グロブリン、ならびに配列番号２、７〜９、１７および２５よりなる群から選択されるアミノ酸配列またはそれらの成熟フラグメントもしくはそれらからの１以上のＣＤＲを含む軽鎖免疫グロブリンを含み、例えば、ここで、該抗体は、配列番号３、４、５または６のアミノ酸２０−１２８を含む軽鎖免疫グロブリンと、配列番号８または９のアミノ酸２０−１３７を含む重鎖免疫グロブリンとを含む。例えば、本発明の１つの実施形態においては、該軽鎖免疫グロブリンはカッパ定常免疫グロブリン鎖に連結されており、該重鎖免疫グロブリンはガンマ−１定常免疫グロブリン鎖に連結されている。該方法は更に、場合によっては、該培地のディスク・スタック（ｄｉｓｋ−ｓｔａｃｋ）遠心分離、該培地のデプス濾過（ｄｅｐｔｈ  ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ）および０．２ミクロンの細孔径を有するフィルターでの該培地の濾過により該細胞から該培地を回収すること、ならびに場合によっては、カラムクロマトグラフィー分画により該培地から該免疫グロブリン鎖を精製する工程を含む。
【００１２】
本発明はまた、
約１０ｇ／リットル  ダイズ水解物、
約１．５ｇ／リットル  グルコース、
約１５０ｍｇ／リットル  Ｌ−グルタミン、
約６．８±０．０２のｐＨ、
ＨＥＰＥＳ、
炭酸水素ナトリウムバッファー、
無機塩、
非必須アミノ酸、
組換えヒトインスリン、
微量元素、
界面活性剤、
アミノ酸供給物（ここで、該アミノ酸供給物により加えられる成分の濃度は、おおよそ、以下に記載されているものである：
Ｌ−アルギニン：１２６．４ｍｇ／リットル
Ｌ−シスチン：３４ｍｇ／リットル
Ｌ−ヒスチジン：４２ｍｇ／リットル
Ｌ−イソロイシン：５２ｍｇ／リットル
Ｌ−ロイシン：５２ｍｇ／リットル
Ｌ−リシン：７２ｍｇ／リットル
Ｌ−メチオニン：１５．２ｍｇ／リットル
Ｌ−フェニルアラニン：３３ｍｇ／リットル
Ｌ−トレオニン：４７．６ｍｇ／リットル
Ｌ−トリプトファン：１０．２ｍｇ／リットル
Ｌ−チロシン：３６ｍｇ／リットル
Ｌ−バリン：４６．８ｍｇ／リットル
Ｌ−アラニン：８．９ｍｇ／リットル
Ｌ−アスパラギン：３０ｍｇ／リットル
Ｌ−アスパラギン酸：２６．６ｍｇ／リットル
Ｌ−グルタミン酸：２９．４ｍｇ／リットル
グリシン：１５ｍｇ／リットル
Ｌ−プロリン：２３ｍｇ／リットル
Ｌ−セリン：２１ｍｇ／リットル）
を含む水性液体細胞培養培地を提供し、ここで、該培地は、抗生物質、抗真菌物質または動物由来成分のいずれをも含まない。さらに、本発明は、関心のある免疫グロブリンを発現する細胞が培養された細胞培養を提供する。
【００１３】
例えば、本発明は、約３７℃に予め加温された初期哺乳類細胞増殖培地（該培地は、ＨＥＰＥＳ、炭酸水素ナトリウムバッファー、無機塩、非必須アミノ酸、組換えヒトインスリン、微量元素および界面活性剤を含み、Ｌ−グルタミン、抗生物質、抗真菌物質または動物由来成分のいずれをも含まない）に、抗体軽鎖免疫グロブリンと重鎖免疫グロブリンとを発現するＣＨＯ  ＤＸＢ１１宿主細胞を約２．５〜５×１０５  細胞／ｍｌの細胞密度まで接種し、該接種の前、それと同時またはその直後に該培地に以下の補足物：
約１０ｇ／リットルの最終濃度までのダイズ水解物、
そして場合によっては、アミノ酸供給物（ここで、該アミノ酸供給物により加えられる成分の濃度は、おおよそ、以下に記載されているものである：
Ｌ−アルギニン：１２６．４ｍｇ／リットル
Ｌ−シスチン：３４ｍｇ／リットル
Ｌ−ヒスチジン：４２ｍｇ／リットル
Ｌ−イソロイシン：５２ｍｇ／リットル
Ｌ−ロイシン：５２ｍｇ／リットル
Ｌ−リシン：７２ｍｇ／リットル
Ｌ−メチオニン：１５．２ｍｇ／リットル
Ｌ−フェニルアラニン：３３ｍｇ／リットル
Ｌ−トレオニン：４７．６ｍｇ／リットル
Ｌ−トリプトファン：１０．２ｍｇ／リットル
Ｌ−チロシン：３６ｍｇ／リットル
Ｌ−バリン：４６．８ｍｇ／リットル
Ｌ−アラニン：８．９ｍｇ／リットル
Ｌ−アスパラギン：３０ｍｇ／リットル
Ｌ−アスパラギン酸：２６．６ｍｇ／リットル
Ｌ−グルタミン酸：２９．４ｍｇ／リットル
グリシン：１５ｍｇ／リットル
Ｌ−プロリン：２３ｍｇ／リットル
Ｌ−セリン：２１ｍｇ／リットル）を加え、生細胞密度が約１．２×１０６  細胞／ｍｌ以上に達する場合には補足供給物を加え（ここで、該補足供給物により加えられる成分の濃度は、おおよそ、以下に記載されているものである：
亜セレン酸ナトリウム：０．０１４２６ｍｇ／リットル
硫酸アデニン：１．６３２ｍｇ／リットル
アデノシン：１７．６ｍｇ／リットル
シチジン：１７．６ｍｇ／リットル
グアノシン：１７．６ｍｇ／リットル
ウリジン：１７．６ｍｇ／リットル
ヒポキサンチン：１１．８ｍｇ／リットル
Ｌ−シトルリン：１２．６ｍｇ／リットル
Ｌ−オルニチン−ＨＣｌ：２５．６ｍｇ／リットル
ビオチン：０．２８ｍｇ／リットル
フラビンアデニンジヌクレオチド：０．０５ｍｇ／リットル
葉酸：４．６ｍｇ／リットル
リポ酸：０．５２ｍｇ／リットル
ナイアシン：３１．４ｍｇ／リットル
ピリドキシンＨＣｌ：３ｍｇ／リットル
リボフラビン：１．８６ｍｇ／リットル
チアミンＨＣｌ：１６ｍｇ／リットル
ビタミンＥ：０．３７６ｍｇ／リットル
ビタミンＢ１２：３．４ｍｇ／リットル
塩化コリン：５０．２ｍｇ／リットル
エタノールアミンＨＣｌ：４．４ｍｇ／リットル
ｉ−イノシトール：７３．２ｍｇ／リットル
チミジン：７．８ｍｇ／リットル
プトレッシン２ＨＣｌ：０．４ｍｇ／リットル
プロゲステロン：０．０１５ｍｇ／リットル
Ｄ−パントテン酸カルシウム：２３．８ｍｇ／リットル
Ｌ−アスパラギン：８１２ｍｇ／リットル
Ｌ−プロリン：２１６ｍｇ／リットル
Ｌ−イソロイシン：３７０ｍｇ／リットル
Ｌ−システイン−ＨＣｌ：２２４ｍｇ／リットル
Ｌ−ロイシン：３３２ｍｇ／リットル
Ｌ−トレオニン：１６４ｍｇ／リットル
Ｌ−チロシン：１９８ｍｇ／リットル
Ｌ−アルギニン：１８６ｍｇ／リットル
Ｌ−アスパラギン酸：７１ｍｇ／リットル
Ｌ−グルタミン酸：１２６ｍｇ／リットル
グリシン：５７ｍｇ／リットル
Ｌ−ヒスチジン：１２５ｍｇ／リットル
Ｌ−メチオニン：１３２ｍｇ／リットル
Ｌ−トリプトファン：９９ｍｇ／リットル
Ｌ−リシン：２９３ｍｇ／リットル
Ｌ−フェニルアラニン：１７４ｍｇ／リットル
Ｌ−バリン：２６２ｍｇ／リットル
Ｌ−セリン：２６０ｍｇ／リットル
リン酸ナトリウム（一塩基酸）：２８８．２ｍｇ／リットル
硫酸亜鉛：１．０８ｍｇ／リットル
硫酸第二銅：０．００３２ｍｇ／リットル
バナジン酸アンモニウム：０．０００７８ｍｇ／リットル
塩化コバルト：０．００２５ｍｇ／リットル
二塩化ニッケル六水和物：０．０００４ｍｇ／リットル
モリブデン酸ナトリウム脱水物：０．０００１６ｍｇ／リットル）、細胞増殖中、グルコースレベルが約１．５ｇ／リットル未満に低下した場合には該培地にグルコースを加え、Ｌ−グルタミンレベルが約１５０ｍｇ／リットル未満に低下した場合にはＬ−グルタミンを加え、細胞増殖中、Ｏ２濃度を約６０％に、ｐＨを約６．８±０．０２に、そして温度を約３６．５℃±０．５℃に維持する（ここで、細胞生存率は約６０％以下である）ことを含む製造方法により製造された液体培地を提供する。本発明の１つの実施形態においては、該培地は、抗体またはその抗原結合性フラグメントをコードするベクターを含む宿主細胞を含み、ここで、宿主細胞により分泌された抗体またはフラグメントは該培地内に存在する。例えば、本発明の１つの実施形態においては、該免疫グロブリンは、ＩＧＦ１Ｒに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントを形成し、例えば、ここで、該抗体またはフラグメントは、配列番号１、３〜６、１３、２１および２６よりなる群から選択される要素において記載されているアミノ酸配列またはそれらの成熟フラグメントもしくはそれらからの１以上のＣＤＲを含む重鎖免疫グロブリン、ならびに／または配列番号２、７〜９、１７および２５よりなる群から選択されるアミノ酸配列またはそれらの成熟フラグメントもしくはそれらからの１以上のＣＤＲを含む軽鎖免疫グロブリンを含み、例えば、ここで、該抗体またはフラグメントは、配列番号３、４、５または６のアミノ酸２０−１２８を含む軽鎖免疫グロブリンと、配列番号８または９のアミノ酸２０−１３７を含む重鎖免疫グロブリンとを含む完全抗体である。本発明のもう１つの実施形態においては、該軽鎖免疫グロブリンはカッパ定常免疫グロブリン鎖に連結されており、該重鎖免疫グロブリンはガンマ−１定常免疫グロブリン鎖に連結されている。例えば、該宿主細胞は、抗体の免疫グロブリンまたはその抗原結合性フラグメントをコードするベクターを含み、ここで、該抗体またはフラグメントは該培地内に分泌される。本発明の１つの実施形態においては、該宿主細胞の生存率は約６０％以下であり、および／または、例えば該培地および細胞を遠心分離し、該培地から該細胞を除去することにより、細胞増殖は約１４〜２４日間（約１４日間、約１５日間、約１６日間、約１７日間、約１８日間、約１９日間、約２０日間、約２１日間、約２２日間、約２３日間または約２４日間）続行し、例えば、ここで、該培地はまた、遠心分離後に、デプス濾過され、および／または０．２ミクロンフィルターで濾過される。前記のとおりに得られる培地の特徴を含むいずれの培地も、該培地が実際に得られた方法には無関係に、本発明の一部を構成する。
【００１４】
本発明はまた、本発明のいずれかの培地を含む容器（例えば、フラスコ、バイオリアクター、タンクバイオリアクター、バッグバイオリアクターまたは使い捨てバイオリアクター、攪拌タンクバイオリアクター、バブルカラムバイオリアクター、エアリフトバイオリアクター、流動床バイオリアクターまたは充填層バイオリアクター）を提供する。
【００１５】
発明の詳細な説明
本出願は、哺乳類細胞、例えばＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞からの抗体（例えば、抗ＩＧＦ１Ｒ）の製造方法を含む。該方法は、攪拌タンクバイオリアクター、バッグおよび使い捨てバイオリアクターならびに振とうフラスコを含む種々のバイオリアクター培養系において実施される。「レベル３」製造方法は、平均して、約１．２ｇ／Ｌの抗体の力価、および約２２ｐｇ／細胞／日の培養比生産性をもたらす。「増強」方法は、平均して、約２．３ｇ／Ｌの抗体の力価、および約３０ｐｇ／細胞／日の比生産性をもたらす。どちらの方法も、培養比生産性、力価、バイオマスおよび培養生存性を増加させるために、接種前に又は製造過程中の供給として製造バイオリアクター培養に特定の補足物を加えることを含む。レベル３方法においては、培養比生産性を増加させるために、３つの補足物を加え、コムギおよび／またはダイズ水解物（水解物供給）を加える（例えば、２００ｇ／Ｌ（水性）溶液として）。典型的には、両方の水解物、またはダイズ水解物供給物のみを該培養に加える。培養バイオマスを増加させプロセス力価を増加させるために、２つのアミノ酸濃縮供給溶液（アミノ酸供給物）を加える。培養生存性を安定させバイオマスを増加させるために、濃縮ビタミンおよび塩溶液（ビタミン／塩供給物）を加える。該ビタミン供給溶液は、例えばビオチン、プロゲステロン、イノシトール、核酸、シトルリン、ヒポキサンチン、リポ酸リボフラビン、チアミン、コリン、エタノールアミン、葉酸、フラビンおよびビタミンＢ１２を含む。
【００１６】
増強方法においては、追加的な濃縮栄養溶液（栄養供給物）と共に該供給溶液を加える。「栄養供給物」は、例えばアミノ酸、硫酸亜鉛、硫酸第二銅、バナジン酸アンモニウム、塩化コバルト、二塩化ニッケル、塩化スズおよび塩化マンガンを含む。それは、プロセス力価を改善し生存性を増加させるために、接種前に又は製造過程中の供給として加えることが可能である。
【００１７】
また、場合によっては、濃縮塩溶液、ダイズ水解物溶液または二酸化炭素および水酸化ナトリウム（該バイオリアクターのためのｐＨ制御の一部として）の添加による、製造過程中の（４００〜５００ｍＯｓｍへの）浸透圧重量モル濃度変化を利用する。該浸透圧重量モル濃度変化は、培養比生産性を増加させ回収生存性を改善するために利用される。さらに、場合によっては、高い生細胞数での培養生存性を安定化させるために、約３６℃〜３７℃から３３〜３５℃への製造過程中の温度低下を用いる。
【００１８】
本発明の目的においては、「製造過程中」なる語は、初期細胞接種後の製造細胞培養（例えば、マスター細胞バンクまたは実施細胞バンクのために増殖される細胞）の成長中に生じる事象を意味する。
【００１９】
「製造細胞培養」は、最終産物、例えば抗体（例えば抗ＩＧＦ１Ｒ抗体）が単離される細胞培養を意味する。
【００２０】
「増殖細胞培養」は、製造細胞培養の初期接種のために使用される細胞または細胞培養を意味する。
【００２１】
補足物の「ｎ×」ストック溶液（ここで、ｎは数字、例えば５０である）は、該ストック溶液が、該培養に加えられる場合に１／ｎの濃度に希釈されることを示す。例えば、５０×ストック溶液は、通常、培養に加えられる場合に１／５０の濃度に希釈される。
【００２２】
供給物
本発明の方法は、初期哺乳類細胞増殖培地に種々の供給物を加える工程を含む。これらの供給物には、水解物供給物、ビタミン／塩供給物、アミノ酸供給物および栄養供給物が含まれる。用いる細胞培養方法のタイプ、レベル３方法であるか増強方法であるかに応じて、異なる時点で該供給物は加えられうる。
【００２３】
「初期哺乳類細胞増殖培地」は、当技術分野で公知の幾つかのタイプの水性培地のいずれかであることが可能であり、この用語の意味はいずれの当業者にも容易に認識されるであろう。具体例には、ＥＸ−ＣＥＬＬ  ＡＣＦ  ＣＨＯ培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）；後記で更に詳しく記載する）、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２、Ｆ−１０栄養混合物（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ）、ＲＰＭＩ培地１６４０、Ｆ−１２栄養混合物（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ）、培地（Ｍｅｄｉｕｍ）１９９、イーグル（Ｅａｇｌｅ）ＭＥＭ、ＲＰＭＩ、２９３倍地およびイスコブ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｅｄｉａ）が含まれる。例えば、イーグル最少必須培地（ＭＥＭ）は、塩酸Ｌ−アルギニン（１２６ｍｇ／ｌ）、Ｌ−シスチン２ＨＣｌ（３１ｍｇ／ｌ）、塩酸Ｌ−ヒスチジン−Ｈ２Ｏ（４２ｍｇ／ｌ）、Ｌ−イソロイシン（５２ｍｇ／ｌ）、Ｌ−ロイシン（５２ｍｇ／ｌ）、塩酸Ｌ−リシン（７３ｍｇ／ｌ）、Ｌ−メチオニン（１５ｍｇ／ｌ）、Ｌ−フェニルアラニン（３２ｍｇ／ｌ）、Ｌ−トレオニン（４８ｍｇ／ｌ）、Ｌ−トリプトファン（１０ｍｇ／ｌ）、Ｌ−チロシン二ナトリウム塩脱水物（５２ｍｇ／ｌ）、Ｌ−バリン（４６ｍｇ／ｌ）、塩化コリン（１ｍｇ／ｌ）、Ｄ−パントテン酸カルシウム（１ｍｇ／ｌ）、葉酸（１ｍｇ／ｌ）、ナイアシンアミド（１ｍｇ／ｌ）、塩酸ピリドキサール（１ｍｇ／ｌ）、リボフラビン（０．１ｍｇ／ｌ）、塩酸チアミン（１ｍｇ／ｌ）、ｉ−イノシトール（２ｍｇ／ｌ）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）（無水物）（２００ｍｇ／ｌ）、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）（無水物）（９７．６７ｍｇ／ｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）（４００ｍｇ／ｌ）、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）（２２００ｍｇ／ｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）（６８００ｍｇ／ｌ）、リン酸ナトリウム（一塩基酸）（ＮａＨ２ＰＯ４−Ｈ２Ｏ）（１４０ｍｇ／ｌ）、Ｄ−グルコース（デキストロース）（１０００ｍｇ／ｌ）およびフェノールレッド（１０ｍｇ／ｌ）を含む。
【００２４】
変法イーグル培地（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）（ＭＥＭ）（２×）は、Ｌ−塩酸アルギニン（５０４ｍｇ／ｌ）、Ｌ−シスチン（９６ｍｇ／ｌ）、Ｌ−グルタミン（８７０ｍｇ／ｌ）、塩酸Ｌ−ヒスチジン−Ｈ２Ｏ（１６８ｍｇ／ｌ）、Ｌ−イソロイシン（２０８ｍｇ／ｌ）、Ｌ−ロイシン（２０８ｍｇ／ｌ）、塩酸Ｌ−リシン（２９０ｍｇ／ｌ）、Ｌ−メチオニン（６０ｍｇ／ｌ）、Ｌ−フェニルアラニン（１２８ｍｇ／ｌ）、Ｌ−トレオニン（１９２ｍｇ／ｌ）、Ｌ−トリプトファン（４０ｍｇ／ｌ）、Ｌ−チロシン二ナトリウム塩脱水物（２０８ｍｇ／ｌ）、Ｌ−バリン（１５５ｍｇ／ｌ）、塩化コリン（４ｍｇ／ｌ）、Ｄ−パントテン酸カルシウム（４ｍｇ／ｌ）、葉酸（４ｍｇ／ｌ）、ナイアシンアミド（４ｍｇ／ｌ）、塩酸ピリドキサール（４ｍｇ／ｌ）、リボフラビン（０．４ｍｇ／ｌ）、塩酸チアミン（４ｍｇ／ｌ）、ｉ−イノシトール（８ｍｇ／ｌ）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）（無水物）（２８５ｍｇ／ｌ）、硝酸第二鉄（Ｆｅ（ＮＯ３）３・９Ｈ２Ｏ）（１ｍｇ／ｌ）、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）（無水物）（１９５ｍｇ／ｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）（８００ｍｇ／ｌ）、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）（８４００ｍｇ／ｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）（１２８００ｍｇ／ｌ）、リン酸ナトリウム（一塩基酸）（ＮａＨ２ＰＯ４−Ｈ２Ｏ）（２５０ｍｇ／ｌ）およびＤ−グルコース（デキストロース）（９０００ｍｇ／ｌ）を含む。
【００２５】
ＲＰＭＩ培地１６４０（１×）は、グリシン（１０ｍｇ／ｌ）、Ｌ−アルギニン（２００ｍｇ／ｌ）、Ｌ−アスパラギン（５０ｍｇ／ｌ）、Ｌ−アスパラギン酸（２０ｍｇ／ｌ）、Ｌ−シスチン２ＨＣｌ（６５ｍｇ／ｌ）、Ｌ−グルタミン酸（２０ｍｇ／ｌ）、Ｌ−グルタミン（３００ｍｇ／ｌ）、Ｌ−ヒスチジン（１５ｍｇ／ｌ）、Ｌ−ヒドロキシプロリン（２０ｍｇ／ｌ）、Ｌ−イソロイシン（５０ｍｇ／ｌ）、Ｌ−ロイシン（５０ｍｇ／ｌ）、塩酸Ｌ−リシン（４０ｍｇ／ｌ）、Ｌ−メチオニン（１５ｍｇ／ｌ）、Ｌ−フェニルアラニン（１５ｍｇ／ｌ）、Ｌ−プロリン（２０ｍｇ／ｌ）、Ｌ−セリン（３０ｍｇ／ｌ）、Ｌ−トレオニン（２０ｍｇ／ｌ）、Ｌ−トリプトファン（５ｍｇ／ｌ）、Ｌ−チロシン二ナトリウム塩脱水物（２９ｍｇ／ｌ）、Ｌ−バリン（２０）、ビオチン（０．２ｍｇ／ｌ）、塩化コリン（３ｍｇ／ｌ）、Ｄ−パントテン酸カルシウム（０．２５ｍｇ／ｌ）、葉酸（１ｍｇ／ｌ）、ナイアシンアミド（１ｍｇ／ｌ）、パラ−アミノ安息香酸（１ｍｇ／ｌ）、塩酸ピリドキシン（１ｍｇ／ｌ）、リボフラビン（０．２ｍｇ／ｌ）、塩酸チアミン（１ｍｇ／ｌ）、ビタミンＢ１２（０．００５ｍｇ／ｌ）、ｉ−イノシトール（３５ｍｇ／ｌ）、硝酸カルシウム（Ｃａ（ＮＯ３）２４Ｈ２Ｏ）（１００ｍｇ／ｌ）、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）（無水物）（４８．８４ｍｇ／ｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）（４００ｍｇ／ｌ）、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）（２０００ｍｇ／ｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）（６０００ｍｇ／ｌ）、リン酸ナトリウム（二塩基酸）（Ｎａ２ＨＰＯ４）無水物（８００ｍｇ／ｌ）、Ｄ−グルコース（デキストロース）（２０００ｍｇ／ｌ）およびグルタチオン（還元型）（１ｍｇ／ｌ）を含む。
【００２６】
一般に、本発明の目的においては、「水解物供給物」には、コムギおよび／またはダイズ水解物が含まれる。一般に、ダイズまたはコムギ水解物はダイズまたはコムギの酵素消化の産物であり、商業的に購入可能である。典型的には、該水解物は細胞培養等級の水中に存在し、無菌である。本発明の１つの実施形態においては、該水解物は２００ｇ／リットルにおけるストック溶液である。本発明の１つの実施形態においては、該水解物を、約１０ｇ／リットルの最終濃度に達するよう培地に加える。本発明の１つの実施形態において、レベル３方法または増強方法を用いる場合、最初に、または接種の前、途中もしくは後に、または接種の約３日後に、または生細胞密度が約１×１０６  細胞／ｍｌ以上に達したら、該水解物を該培地に加える。
【００２７】
「生細胞密度」は、生存可能な、例えば、増殖（成長）および複製可能な（例えば、液体培養または固体培地に接種するために使用される場合）または色素排除アッセイにおいて色素、例えばトリプタンブルー、エオシンまたはプロピジウミンを排除しうる、分析されている培地内の細胞の濃度（例えば、細胞／ｍｌ）を意味する。そのようなアッセイは当技術分野で広く知られている。
【００２８】
一般に、本発明の目的においては、「ビタミン／塩供給物」は以下のものを含む：
亜セレン酸ナトリウム：例えば、約７．１３×１０−４ｇ／リットルの濃度
硫酸アデニン：例えば、約０．０８１６ｇ／リットルの濃度
アデノシン：例えば、約０．８８ｇ／リットルの濃度
シチジン：例えば、約０．８８ｇ／リットルの濃度
グアノシン：例えば、約０．８８ｇ／リットルの濃度
ウリジン：例えば、約０．８８ｇ／リットルの濃度
ヒポキサンチン：例えば、約０．５９ｇ／リットルの濃度
Ｌ−シトルリン：例えば、約０．６３ｇ／リットルの濃度
Ｌ−オルニチン−ＨＣｌ：例えば、約１．２８ｇ／リットルの濃度
ビオチン：例えば、約０．０１４ｇ／リットルの濃度
フラビンアデニンジヌクレオチド：例えば、約０．００２５ｇ／リットルの濃度
葉酸：例えば、約０．２３ｇ／リットルの濃度
リポ酸：例えば、約０．０２６ｇ／リットルの濃度
ナイアシン：例えば、約１．５７ｇ／リットルの濃度
ピリドキシンＨＣｌ：例えば、約０．１５ｇ／リットルの濃度
リボフラビン：例えば、約０．０９３ｇ／リットルの濃度
チアミンＨＣｌ：例えば、約０．８ｇ／リットルの濃度
ビタミンＥ：例えば、約０．０１８８ｇ／リットルの濃度
ビタミンＢ１２：例えば、約０．１７ｇ／リットルの濃度
塩化コリン：例えば、約２．５１ｇ／リットルの濃度
エタノールアミンＨＣｌ：例えば、約０．２２ｇ／リットルの濃度
ｉ−イノシトール：例えば、約３．６６ｇ／リットルの濃度
チミジン：例えば、約０．３９ｇ／リットルの濃度
プトレッシン２ＨＣｌ：例えば、約０．０２ｇ／リットルの濃度
プロゲステロン：例えば、約０．０００７５ｇ／リットルの濃度、および
Ｄ−パントテン酸カルシウム：例えば、約１．１９ｇ／リットルの濃度。
【００２９】
本発明の１つの実施形態においては、該ビタミン／塩供給物は５０×ストック溶液である。本発明の１つの実施形態においては、該ビタミン／塩供給物を、約２０ｍｌ／リットルの最終濃度に達するように該培地に加える。レベル３方法を用いる場合には、第３〜５日、接種後または生細胞密度が約１×１０６  細胞／ｍｌ以上に達した際に該ビタミン／塩供給物を該培養に加える。本発明の１つの実施形態において、増強方法を用いる場合には、第３〜５日、接種後または生細胞密度が約１．２×１０６  細胞／ｍｌ以上に達した際に該ビタミン／塩供給物を該培養に加える。
【００３０】
一般に、本発明の目的においては、「アミノ酸供給物」は以下のものを含む：
Ｌ−アルギニン：例えば、約６．３２ｇ／リットルの濃度
Ｌ−シスチン：例えば、約１．７ｇ／リットルの濃度
Ｌ−ヒスチジン：例えば、約２．１ｇ／リットルの濃度
Ｌ−イソロイシン：例えば、約２．６ｇ／リットルの濃度
Ｌ−ロイシン：例えば、約２．６ｇ／リットルの濃度
Ｌ−リシン：例えば、約３．６ｇ／リットルの濃度
Ｌ−メチオニン：例えば、約０．７６ｇ／リットルの濃度
Ｌ−フェニルアラニン：例えば、約１．６５ｇ／リットルの濃度
Ｌ−トレオニン：例えば、約２．３８ｇ／リットルの濃度
Ｌ−トリプトファン：例えば、約０．５１ｇ／リットルの濃度
Ｌ−チロシン：例えば、約１．８ｇ／リットルの濃度
Ｌ−バリン：例えば、約２．３４ｇ／リットルの濃度
Ｌ−アラニン：例えば、約０．８９ｇ／リットルの濃度
Ｌ−アスパラギン：例えば、約１．５ｇ／リットルの濃度
Ｌ−アスパラギン酸：例えば、約１．３３ｇ／リットルの濃度
Ｌ−グルタミン酸：例えば、約１．４７ｇ／リットルの濃度
グリシン：例えば、約０．７５ｇ／リットルの濃度
Ｌ−プロリン：例えば、約１．１５ｇ／リットルの濃度、および
Ｌ−セリン：例えば、約１．０５ｇ／リットルの濃度。
【００３１】
本発明の１つの実施形態においては、以下の２つの別々のアミノ酸供給ストック溶液を調製する：Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−プロリンおよびＬ−セリンを前記の濃度で含む１００×ストック溶液；ならびにＬ−アルギニン、Ｌ−シスチン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシンおよびＬ−バリンを前記の濃度で含む５０×溶液。これらのストックは別々に調製され、別々に該培地に加えられうる。本発明の１つの実施形態においては、該アミノ酸ストック溶液を第０日、細胞接種の前、途中または後に該初期培地に加える。
【００３２】
一般に、本発明の目的においては、「栄養供給物」は以下のものを含む：
Ｌ−アスパラギン：例えば、約４０．６ｇ／リットルの濃度
Ｌ−プロリン：例えば、約１０．８１の濃度
Ｌ−イソロイシン：例えば、約１８．５３の濃度
Ｌ−システイン−ＨＣｌ：例えば、約１１．１９の濃度
Ｌ−ロイシン：例えば、約１６．５８の濃度
Ｌ−トレオニン：例えば、約８．２の濃度
Ｌ−チロシン：例えば、約９．９の濃度
Ｌ−アルギニン：例えば、約９．２９の濃度
Ｌ−アスパラギン酸：例えば、約３．５６の濃度
Ｌ−グルタミン酸：例えば、約６．２８の濃度
グリシン：例えば、約２．８３の濃度
Ｌ−ヒスチジン：例えば、約６．２３の濃度
Ｌ−メチオニン：例えば、約６．５８の濃度
Ｌ−トリプトファン：例えば、約４．９３の濃度
Ｌ−リシン：例えば、約１４．６６の濃度
Ｌ−フェニルアラニン：例えば、約８．６４の濃度
Ｌ−バリン：例えば、約１３．０８ｇ／リットルの濃度
Ｌ−セリン：例えば、約１３ｇ／リットルの濃度
リン酸ナトリウム（一塩基酸）：例えば、約１４．４１ｇ／リットルの濃度
硫酸亜鉛：例えば、約０．０５４ｇ／リットルの濃度
硫酸第二銅：例えば、約０．０００１６ｇ／リットルの濃度
バナジン酸アンモニウム：例えば、約０．００００３９ｇ／リットルの濃度
塩化コバルト：例えば、約０．０００１２５ｇ／リットルの濃度
二塩化ニッケル六水和物：例えば、約０．００００２ｇ／リットルの濃度
モリブデン酸ナトリウム脱水物：例えば、約０．０００００８ｇ／リットルの濃度
塩化スズ脱水物：例えば、約０．０００００４ｇ／リットルの濃度
塩化マンガン四水和物：例えば、約０．００００１５ｇ／リットルの濃度。
【００３３】
本発明の実施形態においては、該栄養供給物は５０×ストック溶液である。本発明の１つの実施形態においては、該栄養供給物を、約２０ｍｌ／リットルの最終濃度に達するように該培地に加える。増強方法を用いる場合には、該栄養供給物を、第３〜５日、接種後または生細胞密度が約約１．２×１０６  細胞／ｍｌに達した際に該培地に加える。
【００３４】
さらに、本発明の１つの実施形態において、レベル３方法または増強方法を用いる場合には、グルコース（２．５Ｍ  ストック溶液からのもの）およびＬ−グルタミン（０．２Ｍ  ストック溶液からのもの）を、任意の時点、例えば、該栄養物の濃度が１．５ｇ／リットル  グルコースおよび１５０ｍｇ／リットル  Ｌ−グルタミン未満に低下した際に該培地に加える。
【００３５】
浸透圧重量モル濃度および温度変化
本発明はまた、場合によっては該培養の浸透圧重量モル濃度および／または温度を変化させる、方法を含む。該浸透圧重量モル濃度または温度変化は製造過程中の任意の時点で行われうる。
【００３６】
該浸透圧重量モル濃度変化は培養比生産性および細胞生存性を増加させることが示されている。典型的には、該初期哺乳類細胞増殖培地は約３００ｍＯｓｍの出発浸透圧重量モル濃度を有する。しかし、本発明の「浸透圧重量モル濃度変化」は、培養の浸透圧重量モル濃度を約４００ｍＯｓＭから約５００ｍＯｓｍへと変化させることを含む。
【００３７】
浸透圧重量モル濃度は溶媒１キログラム当たりの溶質のオスモルの尺度である。浸透圧重量モル濃度は、例えば凝固点降下、蒸気圧または沸点上昇のような束一性を測定する浸透圧計を使用して測定されうる。
【００３８】
細胞培養の浸透圧重量モル濃度は幾つかの手段のいずれかにより変化されうる。例えば、濃縮塩溶液（例えば、８〜１２ｍＬ／Ｌで加えられる５Ｍ  ＮａＣｌ塩ストックを含む）、ダイズ水解物溶液（５０〜８０ｍＬ／Ｌで加えられる２００ｇ／Ｌ  ストック）または二酸化炭素が加えられうる。本発明の１つの実施形態においては、該培地への該栄養供給物の添加は該浸透圧重量モル濃度を変化させる。
【００３９】
本発明の１つの実施形態においては、該培養の温度は、場合によっては、例えば段階変化において、約３６．５℃（＋０．５℃）から約３３℃〜３５℃へ変化される。
【００４０】
タンパク質
本発明は、タンパク質、例えば免疫グロブリン鎖の組換え製造方法を含む実施形態を含む。本発明の１つの実施形態においては、該免疫グロブリンは、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体）、あるいはその抗原結合性フラグメント、例えば、免疫グロブリン定常領域に場合によっては連結された免疫グロブリン軽鎖および／または重鎖可変領域を含む。
【００４１】
例えば、本発明は、発現されるタンパク質（例えば、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体軽鎖または重鎖免疫グロブリン）がプラスミドベクターにおいてポリヌクレオチドによりコードされている、例えば、ここで、該ポリヌクレオチドがプロモーター、例えばＣＭＶプロモーターに機能的に連結されている、方法を含む。本発明の１つの実施形態においては、該軽鎖および重鎖は単一のプラスミドベクター内に含まれる。
【００４２】
本発明の１つの実施形態においては、該免疫グロブリン鎖は、後記のもののいずれか、例えば、以下の免疫グロブリン軽鎖および／もしくは重鎖のいずれか、ならびに／またはそれらのＣＤＲ（例えば、単一の軽鎖または重鎖からの全３個）のいずれかをコードしている。点線下線付きの記号はシグナルペプチドをコードしている。実線下線付きの記号はＣＤＲをコードしている。無修飾記号はフレームワーク領域をコードしている。本発明の１つの実施形態においては、該鎖は該シグナルペプチドと共に発現され、それは該宿主細胞からの分泌に際して切断されて該鎖の成熟フラグメントが産生される。
【００４３】
以下の標的免疫グロブリンアミノ酸配列またはその成熟フラグメントのいずれを製造するための組成物および方法も本発明の一部を構成する。
【００４４】
１９Ｄ１２／１５Ｈ１２軽鎖（配列番号１）
【化１】
2012503487.tif 000002
2012503487.tif 000003
【００４５】
１９Ｄ１２／１５Ｈ１２重鎖（配列番号２）
【化２】
2012503487.tif 000004
【００４６】
１９Ｄ１２／１５Ｈ１２軽鎖−Ｃ（ＬＣＣ）（配列番号３）
【化３】
2012503487.tif 000005
【００４７】
１９Ｄ１２／１５Ｈ１２軽鎖−Ｄ（ＬＣＤ）（配列番号４）
【化４】
2012503487.tif 000006
【００４８】
１９Ｄ１２／１５Ｈ１２軽鎖Ｅ（ＬＣＥ）（配列番号５）
【化５】
2012503487.tif 000007
2012503487.tif 000008
【００４９】
１９Ｄ１２／１５Ｈ１２軽鎖−Ｆ（ＬＣＦ）（配列番号６）
【化６】
2012503487.tif 000009
【００５０】
１９Ｄ１２／１５Ｈ１２重鎖−Ａ（ＨＣＡ）（配列番号７）
【化７】
2012503487.tif 000010
【００５１】
１９Ｄ１２／１５Ｈ１２重鎖−Ｂ（ＨＣＢ）（配列番号８）
【化８】
2012503487.tif 000011
【００５２】
国際出願公開第ＷＯ２００３／１００００８（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい。
【００５３】
２Ｃ６重鎖
【化９】
2012503487.tif 000012
【００５４】
２Ｃ６軽鎖
【化１０】
2012503487.tif 000013
【００５５】
９Ｈ２重鎖
【化１１】
2012503487.tif 000014
【００５６】
９Ｈ２軽鎖
【化１２】
2012503487.tif 000015
2012503487.tif 000016
【００５７】
重鎖免疫グロブリン可変領域＃１．０配列
【化１３】
2012503487.tif 000017
【００５８】
軽鎖免疫グロブリン可変領域＃１．０配列
【化１４】
2012503487.tif 000018
【００５９】
本発明の実施形態は、本明細書に記載されているもの（例えば、重鎖Ｉｇ．＃１．０および軽鎖Ｉｇ＃１．０；ＬＣＣおよびＨＣＡ；またはＬＣＦおよびＨＣＡ；またはＬＣＣおよびＨＣＢ）のいずれかと共に該免疫グロブリンを発現させる実施形態を含む。軽鎖と重鎖とのペア形成は抗体またはその抗原結合性フラグメントの生成をもたらしうる。
【００６０】
本発明の１つの実施形態においては、該軽鎖は免疫グロブリン定常鎖、例えばカッパ鎖に融合されている。本発明の１つの実施形態においては、該重鎖は免疫グロブリン定常鎖、例えばガンマ−１、ガンマ−２、ガンマ−３またはガンマ−４鎖に融合されている。
【００６１】
本発明の方法および組成物を用いて発現されうる関心のある他のタンパク質には、受容体、リガンド、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、ホルモンおよび酵素が含まれる。
【００６２】
製造方法および材料
本発明の方法により発現されるべき遺伝子を含む例えばプラスミドのようなベクターは、当技術分野で公知の幾つかの方法のいずれかにより宿主細胞内に導入されうる。形質転換は、例えば、ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：５４６（１９７８）に記載されているリン酸カルシウム沈殿法により行われうる。ＤＮＡを細胞内に導入するための他の方法、例えば核注入またはプロトプラスト融合も用いられうる。形質転換のための方法には、エレクトロポレーション、リポソーム形質転換およびＤＥＡＥ−デキストラン形質転換も含まれる。
【００６３】
本発明の１つの実施形態においては、宿主細胞は哺乳類細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）である。ＣＨＯ−Ｋ１細胞はプロリン要求性であり、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）遺伝子に関して二倍体である。本発明の１つの実施形態においては、該細胞系はＤＸＢ１１  ＣＨＯ細胞系（Ｕｒｌａｕｂら  （１９８３）Ｃｅｌｌ  ３３：４０５−４１２）である。他の細胞系には、例えばＨＥＫ２９３が含まれる。
【００６４】
本発明の方法を用いて発現されるべき遺伝子を含む宿主細胞は、標的遺伝子の発現のための必要な特性を有するクローンを特定するために選択されスクリーニングされうる。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞においては、最大発現を達成するための１つの一般的なアプローチは、突然変異細胞系の使用、およびコトランスフェクトされた選択マーカー、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）に関する数ヶ月にわたる選択圧の漸増の利用を含む（Ｋａｕｆｍａｎら（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１；Ｓｃｈｉｍｋｅら（１９８２）Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．Ｍｏｎｏｇｒ．６０：７９−８６）。高い生産率を達成するためには、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）陰性細胞系（例えば、ＣＨＯ細胞系）（Ｕｒｌａｕｂら（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０）を、発現されるべき標的遺伝子と共に機能性ＤＨＦＲ遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換する。該ベクター挿入標的遺伝子の増幅は該培地への漸増量のＤＨＦＲアンタゴニスト  メトトレキセート（ＭＴＸ）の添加に応答して生じ、該組換え遺伝子の複数のコピーを含有するクローンまたは亜集団が生じ、選択されうる（Ｗｕｒｍ（１９９０）Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  １８：１５９−１６４）。該遺伝子増幅方法は、典型的には、高い標的遺伝子コピー数および所望のタンパク質の高い生産率を示す安定細胞系が得られるまでに数ヶ月を要する。
【００６５】
本発明の１つの実施形態においては、本発明のポリヌクレオチドは宿主細胞（例えば、ＣＨＯ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ  ＤＸＢ１１）染色体ＤＮＡ内に組込まれるか、または異所的および自律的に複製される。本発明の１つの実施形態においては、本発明のポリヌクレオチドは１細胞当たり数コピー（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０コピー）で細胞内に存在する。安定性を改善するために発現ベクターが宿主細胞のゲノムＤＮＡ内に組込まれている場合、該ベクターＤＮＡのコピー数、ひいては、発現されうる産物の量は、該宿主細胞のＤＮＡ内への組込みの後で該ベクター配列が増幅された細胞系に関して選択することにより増加されうる。組込まれた遺伝子は、染色体に組込まれたＤＮＡならびに対応ｍＲＮＡおよびポリペプチド合成の存在および相対量に関して、標準的な方法によりスクリーニングされうる。例えば、所望の組込み体の存在は、標準的な方法、例えばＤＮＡ配列決定、サザンブロット法、ノーザンブロット法および／またはウエスタンブロット法により検出されうる。
【００６６】
当技術分野で公知の幾つかの細胞培養培地のいずれもが、標的遺伝子を発現する細胞を増殖させるために使用されうる。幾つかの商業的に入手可能な培地が利用可能である。治療用に使用されるタンパク質を発現させる場合には、動物産物非含有培地（例えば、無血清培地（ＳＦＭ））が望ましいかもしれない。無血清培地内での増殖に細胞を適応させることが可能な幾つかの方法が当技術分野で公知である。例えば、直接適応は、細胞を血清補足培地から無血清培地へと単に移すことを含む。逐次適応またはウィーニング（ｗｅａｎｉｎｇ）は、細胞を血清補足培地から無血清培地へと幾つかの段階（例えば、２５％  ＳＦＭ、５０％  ＳＦＭ、７５％  ＳＦＭ、ついで９０％  ＳＦＭ（約３継代）、ついで１００％  ＳＦＭ）で移すことを含む。逐次適応は、細胞に対する過酷さが直接適応より低い傾向にある。一般に、細胞を無血清培地に適応させるためには、該培養は中期対数期にあるべきであり、９０％を超える生存率を示すべきであり、直接適応の場合より高い初期細胞接種物数で接種されるべきである。本発明の１つの実施形態においては、該初期哺乳類細胞増殖培地は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から商業的に入手可能であるＥＸ−ＣＥＬＬ  ＡＣＦ  ＣＨＯ培地である。この培養は動物成分を含有せず、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸）を含有し、Ｌ−グルタミンを含有せず、液体であり、滅菌濾過されており、細胞培養が試験されている。該培地はまた、無機塩、炭酸水素ナトリウムバッファー、必須および非必須アミノ酸、ビタミン、組換えヒトインスリン、植物水解物、他の有機化合物、微量元素および界面活性剤をも含む。該培地はまた、抗生物質、抗真菌物質またはトランスフェリンのいずれをも含有せず、また、動物由来タンパク質も他の成分も含有しない。典型的には、該培地の還元（再構成）のために、実施者は、使用前に、培地１リットル当たり２０〜４０ｍｌの２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン溶液を無菌的に加えるべきである。
【００６７】
本発明の方法を用いて発現されるべき遺伝子を含む宿主細胞を含有する細胞系はマスター細胞バンク（ＭＣＢ）および／または実施用細胞バンク（ＷＣＢ）中で保存されうる。典型的には、細胞系が多数の製造サイクルにわたって使用される場合には、マスター細胞バンクまたはマスターシードバンク（ＭＳＢ）と実施細胞バンクとからなる２段式細胞保存系が確立されうる。細胞系は単一宿主細胞クローンから樹立され、この細胞系は、ＭＣＢを形成するために使用される。一般に、このＭＣＢは、汚染物、例えば細菌、真菌、ウイルスおよびマイコプラズマに関して特徴づけられ、徹底的に試験されなければならない。ＭＣＢからの細胞のサンプルは、ＷＣＢを形成するために増殖されることが可能であり、これは、製造方法において使用される前に細胞生存性に関して特徴づけられる。ＭＣＢまたはＷＣＢにおける細胞はバイアル内で、例えば低温（例えば０℃以下、−２０℃または−８０℃）で保存されうる。
【００６８】
典型的には、該実施用細胞バンクは、保存前に数継代にわたって増殖された、該マスターバンクのバイアルの１つからの細胞を含む。一般に、将来の細胞が必要な場合には、それらは該実施細胞バンクから採取され、一方、該マスター細胞バンクは、必要な場合だけ使用され、該細胞培養内の遺伝的変異を回避するために、低い継代数を有する細胞のストックが確保される。
【００６９】
本発明は、細胞を増殖させタンパク質を組換え製造するための２つの方法、すなわち、「レベル３」方法および「増強方法」を提供する。どちらの方法も高レベルの対象タンパク質を産生するが、増強方法は特に高いレベルをもたらす。
【００７０】
本発明の１つの実施形態においては、タンパク質、例えば抗体（例えば抗ＩＧＦ１Ｒ）を製造するためのレベル３方法は以下の工程を含む。
【００７１】
１−標準的な初期哺乳類増殖培地（例えば、Ｌ−グルタミン（４ｍＭ）が添加されたＳｉｇｍａ  ＣＨＯ培地）内で、該タンパク質を発現する細胞を増殖させる。
【００７２】
この増殖は、例えば、振とうフラスコ内で行われうる。本発明の１つの実施形態においては、約１〜２×１０６  細胞／ｍｌへの増殖、それらの細胞のサンプルの希釈（例えば、約２．５〜５×１０５  細胞／ｍｌの密度へ）、およびそれに続く約１０〜３０継代にわたる約１〜２×１０６  細胞／ｍｌへの再増殖により増殖を行う。
【００７３】
２−工程（１）からの増殖細胞を約２．５〜５×１０５  細胞／ｍｌの細胞密度まで初期哺乳類細胞増殖培地に接種し、該培地に補足物を加える。該補足物はコムギおよび／またはダイズ水解物、アミノ酸供給物、ビタミン／塩供給物、グルコースならびにＬ−グルタミンである。
【００７４】
接種の日が「第０日」、次の日が「第１日」、次の日が「第２日」、以下同様である。
【００７５】
ダイズまたはコムギ水解物は、例えば、第０日または生細胞密度が約１０６  細胞／ｍｌ以上に達した後で加えられる。本発明の１つの実施形態においては、該水解物は、生細胞密度が典型的には１０６  細胞／ｍｌに達する第３日に単に加えられる。
【００７６】
アミノ酸供給物（前記）は、例えば、以下に示すおおよその最終培養濃度（例えば初期哺乳類細胞増殖培地のような他の起源からの示されているいずれの成分の濃度をも含まない）に達するように、例えば第０日に加えられる。
【００７７】
成分：培養内の最終濃度（ｍｇ／リットル）
Ｌ−アルギニン：１２６．４
Ｌ−シスチン：３４
Ｌ−ヒスチジン：４２
Ｌ−イソロイシン：５２
Ｌ−ロイシン：５２
Ｌ−リシン：７２
Ｌ−メチオニン：１５．２
Ｌ−フェニルアラニン：３３
Ｌ−トレオニン：４７．６
Ｌ−トリプトファン：１０．２
Ｌ−チロシン：３６
Ｌ−バリン：４６．８
Ｌ−アラニン：８．９
Ｌ−アスパラギン：３０
Ｌ−アスパラギン酸：２６．６
Ｌ−グルタミン酸：２９．４
グリシン：１５
Ｌ−プロリン：２３
Ｌ−セリン：２１。
【００７８】
本発明の１つの実施形態においては、アミノ酸供給物を該培地に加えない。
【００７９】
ビタミン／塩供給物溶液（前記）は、例えば、以下に示すおおよその最終培養濃度（例えば初期哺乳類細胞増殖培地のような他の起源からの示されているいずれの成分の濃度をも含まない）に達するように、例えば、第３日〜第５日または生細胞密度が約１０６  細胞／ｍｌに達する際に加えられる。
【００８０】
成分：最終培養濃度（ｍｇ／リットル）
亜セレン酸ナトリウム：０．０１４２６
硫酸アデニン：１．６３２
アデノシン：１７．６
シチジン：１７．６
グアノシン：１７．６
ウリジン：１７．６
ヒポキサンチン：１１．８
Ｌ−シトルリン：１２．６
Ｌ−オルニチン−ＨＣｌ：２５．６
ビオチン：０．２８
フラビンアデニンジヌクレオチド：０．０５
葉酸：４．６
リポ酸：０．５２
ナイアシン：３１．４
ピリドキシンＨＣｌ：３
リボフラビン：１．８６
チアミンＨＣｌ：１６
ビタミンＥ：０．３７６
ビタミンＢ１２：３．４
塩化コリン：５０．２
エタノールアミンＨＣｌ：４．４
ｉ−イノシトール：７３．２
チミジン：７．８
プトレッシン２ＨＣｌ：０．４
プロゲステロン：０．０１５
Ｄ−パントテン酸カルシウム：２３．８。
【００８１】
グルコースは、例えば、該培地内のグルコース濃度が約１．５ｇ／リットル未満に低下した際に加えられ、Ｌ−グルタミンは、例えば、該培地内のグルタミン濃度が約１５０ｍｇ／リットル未満に低下した際に加えられる。
【００８２】
３−場合によっては、例えば生存率が６０％未満である場合に、該培地から該細胞を取り出すことにより（例えば、該細胞の温度を約１５℃に低下させ、リン酸ナトリウムバッファーを加えてｐＨを約６．８に安定化させ、該培地を遠心分離してそれを細胞から除去することにより）、該製造細胞培養培地から該細胞を回収する。該タンパク質が分泌される場合には、該培地が更なる加工のために保持されることが可能であり、該タンパク質が分泌されない場合には、該細胞が更なる加工のために保持されることが可能である。
【００８３】
該培地から該細胞を除去する（取り出す）ためには、幾つかの方法のいずれか、例えば遠心分離が用いられうる。例えば、連続的ディスクスタック（ｄｉｓｋ−ｓｔａｃｋ）遠心機、例えば、約９．２７×１０−７の流量／シグマ（ｃｍ／秒）を有するものが使用される。
【００８４】
さらに、該培地は、細胞を除去するために、例えば、遠心機を使用する又は使用しないデプス濾過により濾過されうる。例えば、遠心機を使用する場合には、本発明の１つの実施形態においては、該方法は８±２Ｌブロス／ｆｔ２のフィルター（例えば、荷電セルロースフィルター）の使用を含むことが可能であり、遠心機を使用しない場合には、本発明の１つの実施形態においては、該方法は２０±３Ｌブロス／ｆｔ２のフィルターの使用を含むことが可能である。
【００８５】
また、該培地は、微細フィルター、例えば０．２ミクロンの細孔径を有するフィルター（例えば、ＰＶＤＦフィルター）により濾過されうる。
【００８６】
４−場合によっては、該タンパク質、例えば抗体を、例えばクロマトグラフィーにより更に精製する。
【００８７】
本発明の１つの実施形態においては、タンパク質、例えば抗体（例えば抗ＩＧＦ１Ｒ）を製造するための増強方法は以下の工程を含む。
【００８８】
１−標準的な初期哺乳類増殖培地内で、該タンパク質を発現する細胞を増殖させる。
【００８９】
この増殖は、例えば、振とうフラスコ内で行われうる。本発明の１つの実施形態においては、約１〜２×１０６  細胞／ｍｌへの増殖、それらの細胞のサンプルの希釈（例えば、約２．５〜５×１０５  細胞／ｍｌの密度へ）、およびそれに続く約１０〜３０サイクルにわたる約１〜２×１０６  細胞／ｍｌへの再増殖により増殖を行う。
【００９０】
２−該増殖細胞を約２．５〜５×１０５  細胞／ｍｌの細胞密度まで初期哺乳類細胞増殖培地に接種し、該培地に補足物を加える。該補足物はダイズおよび／またはコムギ水解物、アミノ酸供給物、ビタミン／塩供給物、栄養物供給物、グルコースならびにＬ−グルタミンである。
【００９１】
接種の日が「第０日」、次の日が「第１日」、次の日が「第２日」、以下同様である。
【００９２】
ダイズおよび／またはコムギ水解物は、例えば、第０日または生細胞密度が約１０６  細胞／ｍｌ以上に達した後で加えられる。本発明の１つの実施形態においては、該水解物は第３日に単に加えられる。
【００９３】
アミノ酸供給物（前記）は、例えば、以下に示すおおよその最終培養濃度（例えば初期哺乳類細胞増殖培地のような他の起源からの示されているいずれの成分の濃度をも含まない）に達するように、例えば第０日に加えられる。
【００９４】
成分：培養内の最終濃度（ｍｇ／リットル）
Ｌ−アルギニン：１２６．４
Ｌ−シスチン：３４
Ｌ−ヒスチジン：４２
Ｌ−イソロイシン：５２
Ｌ−ロイシン：５２
Ｌ−リシン：７２
Ｌ−メチオニン：１５．２
Ｌ−フェニルアラニン：３３
Ｌ−トレオニン：４７．６
Ｌ−トリプトファン：１０．２
Ｌ−チロシン：３６
Ｌ−バリン：４６．８
Ｌ−アラニン：８．９
Ｌ−アスパラギン：３０
Ｌ−アスパラギン酸：２６．６
Ｌ−グルタミン酸：２９．４
グリシン：１５
Ｌ−プロリン：２３
Ｌ−セリン：２１。
【００９５】
本発明の１つの実施形態においては、アミノ酸供給物を該培地に加えない。
【００９６】
ビタミン／塩供給物溶液（前記）は、例えば、以下に示すおおよその最終培養濃度（例えば初期哺乳類細胞増殖培地のような他の起源からの示されているいずれの成分の濃度をも含まない）に達するように、例えば、第３日〜第５日または生細胞密度が約１．２×１０６  細胞／ｍｌに達する際に加えられる。
【００９７】
成分：最終培養濃度（ｍｇ／リットル）
亜セレン酸ナトリウム：０．０１４２６
硫酸アデニン：１．６３２
アデノシン：１７．６
シチジン：１７．６
グアノシン：１７．６
ウリジン：１７．６
ヒポキサンチン：１１．８
Ｌ−シトルリン：１２．６
Ｌ−オルニチン−ＨＣｌ：２５．６
ビオチン：０．２８
フラビンアデニンジヌクレオチド：０．０５
葉酸：４．６
リポ酸：０．５２
ナイアシン：３１．４
ピリドキシンＨＣｌ：３
リボフラビン：１．８６
チアミンＨＣｌ：１６
ビタミンＥ：０．３７６
ビタミンＢ１２：３．４
塩化コリン：５０．２
エタノールアミンＨＣｌ：４．４
ｉ−イノシトール：７３．２
チミジン：７．８
プトレッシン２ＨＣｌ：０．４
プロゲステロン：０．０１５
Ｄ−パントテン酸カルシウム：２３．８。
【００９８】
該ビタミン／塩供給物の幾つかの成分は、他の供給物、例えば該アミノ酸供給物中にも存在する。これらの最終培養濃度は該ビタミン／塩供給物からの成分のものであり、該アミノ酸供給物と該ビタミン／塩供給物との両方からの示されている成分の累積濃度を示すものではない。
【００９９】
栄養供給物（前記）は、例えば、以下に示すおおよその最終培養濃度（例えば初期哺乳類細胞増殖培地またはアミノ酸供給物のような他の起源からの示されているいずれの成分の濃度をも含まない）に達するように、例えば、第３日〜第５日または生細胞密度が約１．２×１０６  細胞／ｍｌに達する際に加えられる。
【０１００】
成分：最終培養濃度（ｍｇ／リットル）
Ｌ−アスパラギン：８１２ｍｇ／リットル
Ｌ−プロリン：２１６ｍｇ／リットル
Ｌ−イソロイシン：３７０ｍｇ／リットル
Ｌ−システイン−ＨＣｌ：２２４ｍｇ／リットル
Ｌ−ロイシン：３３２ｍｇ／リットル
Ｌ−トレオニン：１６４ｍｇ／リットル
Ｌ−チロシン：１９８ｍｇ／リットル
Ｌ−アルギニン：１８６ｍｇ／リットル
Ｌ−アスパラギン酸：７１ｍｇ／リットル
Ｌ−グルタミン酸：１２６ｍｇ／リットル
グリシン：５７ｍｇ／リットル
Ｌ−ヒスチジン：１２５ｍｇ／リットル
Ｌ−メチオニン：１３２ｍｇ／リットル
Ｌ−トリプトファン：９９ｍｇ／リットル
Ｌ−リシン：２９３ｍｇ／リットル
Ｌ−フェニルアラニン：１７４ｍｇ／リットル
Ｌ−バリン：２６２ｍｇ／リットル
Ｌ−セリン：２６０ｍｇ／リットル
リン酸ナトリウム（一塩基酸）：２８８．２ｍｇ／リットル
硫酸亜鉛：１．０８ｍｇ／リットル
硫酸第二銅：０．００３２ｍｇ／リットル
バナジン酸アンモニウム：０．０００７８ｍｇ／リットル
塩化コバルト：０．００２５ｍｇ／リットル
二塩化ニッケル六水和物：０．０００４ｍｇ／リットル
モリブデン酸ナトリウム脱水物：０．０００１６ｍｇ／リットル
塩化スズ脱水物：０．００００８ｍｇ／リットル
塩化マグネシウム四水和物：０．０００３ｍｇ／リットル。
【０１０１】
該栄養供給物の幾つかの成分は、他の供給物、例えば該アミノ酸供給物中にも存在する。これらの最終培養濃度は該栄養供給物からの成分のものであり、該アミノ酸供給物と該栄養供給物との両方からの示されている成分の累積濃度を示すものではない。
【０１０２】
グルコースは、例えば、該培地内のグルコース濃度が約１．５ｇ／リットル未満に低下した際に加えられ、Ｌ−グルタミンは、例えば、該培地内のグルタミン濃度が約１５０ｍｇ／リットル未満に低下した際に加えられる。
【０１０３】
３−場合によっては、例えば生存率が６０％未満である場合に、該培地から該細胞を取り出すことにより（例えば、該細胞の温度を約１５℃に低下させ、リン酸ナトリウムバッファーを加えてｐＨを約６．８に安定化させ、該培地を遠心分離してそれを細胞から除去することにより）、該製造細胞培養培地から該細胞を回収する。該タンパク質が分泌される場合には、該培地が更なる加工のために保持されることが可能であり、該タンパク質が分泌されない場合には、該細胞が更なる加工のために保持されることが可能である。
【０１０４】
該培地から該細胞を除去する（取り出す）ためには、幾つかの方法のいずれか、例えば遠心分離が用いられうる。例えば、連続的ディスクスタック（ｄｉｓｋ−ｓｔａｃｋ）遠心機、例えば、約９．２７×１０−７の流量／シグマ（ｃｍ／秒）を有するものが使用される。
【０１０５】
さらに、該培地は、細胞を除去するために、例えば、遠心機を使用する又は使用しないデプス濾過により濾過されうる。例えば、遠心機を使用する場合には、本発明の１つの実施形態においては、該方法は８±２Ｌブロス／ｆｔ２のフィルター（例えば、荷電セルロースフィルター）の使用を含むことが可能であり、遠心機を使用しない場合には、本発明の１つの実施形態においては、該方法は２０±３Ｌブロス／ｆｔ２のフィルターの使用を含むことが可能である。
【０１０６】
また、該培地は、微細フィルター、例えば０．２ミクロンの細孔径を有するフィルター（例えば、ＰＶＤＦフィルター）により濾過されうる。
【０１０７】
４−場合によっては、該タンパク質、例えば抗体を、例えばクロマトグラフィーにより更に精製する。
【０１０８】
場合によっては、レベル３方法または増強方法のいずれかを用いる場合、該培養の浸透圧重量モル濃度を約４００ｍＯｓｍから約５００ｍＯｓｍに変化させる（前記）。本発明の１つの実施形態においては、この変化は、該細胞が１×１０６  細胞／ｍｌ以上の密度である場合に生じる。
【０１０９】
場合によっては、レベル３方法または増強方法のいずれかを用いる場合、該培養の温度を３３℃から約３５℃に変化させる（前記）。本発明の１つの実施形態においては、この変化は、本発明の１つの実施形態においては、第４日〜第８日、例えば、２４時間にわたる生細胞密度における変化が１０％未満である場合に生じる。
【０１１０】
本発明の１つの実施形態においては、レベル３方法または増強方法のいずれかを用いる場合、細胞増殖中に細胞培養Ｏ２濃度、ｐＨおよび温度条件を連続的にモニターし、調節する。本発明の１つの実施形態においては、細胞増殖中にＯ２濃度をモニターし、約６０％に維持し、および／または細胞増殖中にｐＨを連続的にモニターし、約６．８（例えば、±０．０２）に維持し、および／または細胞増殖中に温度を連続的にモニターし、約３６．５℃（例えば、約±０．５℃）に維持する。
【０１１１】
細胞増殖は幾つかの系のいずれかにおいて行われうる。例えば、細胞増殖は、単純なフラスコ、例えばガラス振とうフラスコ内で行われうる。他の系には、タンクバイオリアクター、バッグバイオリアクターおよび使い捨てバイオリアクターが含まれる。タンクバイオリアクターは、典型的には、細胞を液体培地内で増殖させる金属容器（例えば、ステンレス鋼ジャケット付き容器）を含む。タンクバイオリアクターは広範な培養体積（例えば、１００Ｌ、１５０Ｌ、１００００Ｌ、１５０００Ｌ）で使用されうる。タンクバイオリアクターは、しばしば、温度制御、培地攪拌、スパージガス濃度の制御、ｐＨの制御、Ｏ２濃度の制御、培地からのサンプルの除去、リアクター重量表示および制御、ハードウェアの清掃、ハードウェアの滅菌、全供給を送るための配管またはチューブ配置、培地の添加、ｐＨの制御、溶液の制御および気体の制御、増殖溶液内への無菌流体の送出し、ならびに管理上の制御およびデータ収集のための手段を含む、細胞増殖条件を制御するための追加的な特徴を有する。タンクバイオリアクターの分類は、熱および材料（例えば、酸素および基質）を分配するためにリアクターを混合するために機械的攪拌装置（例えば、羽根車）が使用される攪拌タンクリアクターを含む。バブルカラムリアクターは、内容物を混合するために空気のみを使用する背の高いリアクターである。エアリフトリアクターはバブルカラムリアクターに似ているが、それがドラフトチューブを含有する点で異なる。該ドラフトチューブは、典型的には、循環および酸素移動を改善し該リアクター内のせん断力を均等化する内部チューブである。流動床リアクターにおいては、細胞は、流体と共に移動する小粒子上に「固定化」される。該小粒子は、細胞が付着するための並びに該細胞への酸素および栄養物の高率の移動を可能にする大きな表面積をもたらす。充填床リアクターにおいては、細胞は大粒子上に固定化される。これらの粒子は液体と共には移動しない。充填床リアクターは、構築および運転が簡単であるが、閉塞および酸素移動不良を被りうる。使い捨てバイオリアクターは、使い捨て可能な１回使用のためのバイオリアクターである。しばしば、使い捨てバイオリアクターは、非使い捨てバイオリアクターに類似した特徴（例えば、攪拌系、スパージ、プローブ、出入口など）を有する。
【０１１２】
本発明は更に、本明細書に記載の製造方法のいずれかにより製造された任意の液体培地を含む。例えば、約３７℃に予め加温された初期哺乳類細胞増殖培地（該培地は、ＨＥＰＥＳ、炭酸水素ナトリウムバッファー、無機塩、非必須アミノ酸、組換えヒトインスリン、微量元素および界面活性剤を含み、Ｌ−グルタミン、抗生物質、抗真菌物質または動物由来成分のいずれをも含まない）に、抗体軽鎖免疫グロブリンと重鎖免疫グロブリンとを発現するＣＨＯ  ＤＸＢ１１宿主細胞を約２．５〜５×１０５  細胞／ｍｌの細胞密度まで接種し、該接種の前、それと同時またはその直後に該培地に以下の補足物：
約１０ｇ／リットルの最終濃度までのダイズ水解物、
そして場合によっては、アミノ酸供給物（ここで、該アミノ酸供給物により加えられる成分の濃度は、おおよそ、以下に記載されているものである：
Ｌ−アルギニン：１２６．４ｍｇ／リットル
Ｌ−シスチン：３４ｍｇ／リットル
Ｌ−ヒスチジン：４２ｍｇ／リットル
Ｌ−イソロイシン：５２ｍｇ／リットル
Ｌ−ロイシン：５２ｍｇ／リットル
Ｌ−リシン：７２ｍｇ／リットル
Ｌ−メチオニン：１５．２ｍｇ／リットル
Ｌ−フェニルアラニン：３３ｍｇ／リットル
Ｌ−トレオニン：４７．６ｍｇ／リットル
Ｌ−トリプトファン：１０．２ｍｇ／リットル
Ｌ−チロシン：３６ｍｇ／リットル
Ｌ−バリン：４６．８ｍｇ／リットル
Ｌ−アラニン：８．９ｍｇ／リットル
Ｌ−アスパラギン：３０ｍｇ／リットル
Ｌ−アスパラギン酸：２６．６ｍｇ／リットル
Ｌ−グルタミン酸：２９．４ｍｇ／リットル
グリシン：１５ｍｇ／リットル
Ｌ−プロリン：２３ｍｇ／リットル
Ｌ−セリン：２１ｍｇ／リットル）を加え、生細胞密度が約１．２×１０６  細胞／ｍｌ以上に達する場合には補足供給物を加え（ここで、該補足供給物により加えられる成分の濃度は、おおよそ、以下に記載されているものである：
亜セレン酸ナトリウム：０．０１４２６ｍｇ／リットル
硫酸アデニン：１．６３２ｍｇ／リットル
アデノシン：１７．６ｍｇ／リットル
シチジン：１７．６ｍｇ／リットル
グアノシン：１７．６ｍｇ／リットル
ウリジン：１７．６ｍｇ／リットル
ヒポキサンチン：１１．８ｍｇ／リットル
Ｌ−シトルリン：１２．６ｍｇ／リットル
Ｌ−オルニチン−ＨＣｌ：２５．６ｍｇ／リットル
ビオチン：０．２８ｍｇ／リットル
フラビンアデニンジヌクレオチド：０．０５ｍｇ／リットル
葉酸：４．６ｍｇ／リットル
リポ酸：０．５２ｍｇ／リットル
ナイアシン：３１．４ｍｇ／リットル
ピリドキシンＨＣｌ：３ｍｇ／リットル
リボフラビン：１．８６ｍｇ／リットル
チアミンＨＣｌ：１６ｍｇ／リットル
ビタミンＥ：０．３７６ｍｇ／リットル
ビタミンＢ１２：３．４ｍｇ／リットル
塩化コリン：５０．２ｍｇ／リットル
エタノールアミンＨＣｌ：４．４ｍｇ／リットル
ｉ−イノシトール：７３．２ｍｇ／リットル
チミジン：７．８ｍｇ／リットル
プトレッシン２ＨＣｌ：０．４ｍｇ／リットル
プロゲステロン：０．０１５ｍｇ／リットル
Ｄ−パントテン酸カルシウム：２３．８ｍｇ／リットル
Ｌ−アスパラギン：８１２ｍｇ／リットル
Ｌ−プロリン：２１６ｍｇ／リットル
Ｌ−イソロイシン：３７０ｍｇ／リットル
Ｌ−システイン−ＨＣｌ：２２４ｍｇ／リットル
Ｌ−ロイシン：３３２ｍｇ／リットル
Ｌ−トレオニン：１６４ｍｇ／リットル
Ｌ−チロシン：１９８ｍｇ／リットル
Ｌ−アルギニン：１８６ｍｇ／リットル
Ｌ−アスパラギン酸：７１ｍｇ／リットル
Ｌ−グルタミン酸：１２６ｍｇ／リットル
グリシン：５７ｍｇ／リットル
Ｌ−ヒスチジン：１２５ｍｇ／リットル
Ｌ−メチオニン：１３２ｍｇ／リットル
Ｌ−トリプトファン：９９ｍｇ／リットル
Ｌ−リシン：２９３ｍｇ／リットル
Ｌ−フェニルアラニン：１７４ｍｇ／リットル
Ｌ−バリン：２６２ｍｇ／リットル
Ｌ−セリン：２６０ｍｇ／リットル
リン酸ナトリウム（一塩基酸）：２８８．２ｍｇ／リットル
硫酸亜鉛：１．０８ｍｇ／リットル
硫酸第二銅：０．００３２ｍｇ／リットル
バナジン酸アンモニウム：０．０００７８ｍｇ／リットル
塩化コバルト：０．００２５ｍｇ／リットル
二塩化ニッケル六水和物：０．０００４ｍｇ／リットル
モリブデン酸ナトリウム脱水物：０．０００１６ｍｇ／リットル）、細胞増殖中、グルコースレベルが約１．５ｇ／リットル未満に低下した場合には該培地にグルコースを加え、Ｌ−グルタミンレベルが約１５０ｍｇ／リットル未満に低下した場合にはＬ−グルタミンを加え、細胞増殖中、Ｏ２濃度を約６０％に、ｐＨを約６．８±０．０２に、そして温度を約３６．５℃±０．５℃に維持する（例えば、ここで、該培地は、生存率６０％に達した細胞を含む）ことを含む製造方法により製造された液体培地が含まれる。
【０１１３】
実施例
以下の情報は、本発明をより明瞭に説明するために記載されており、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。以下に記載する組成物および方法の全ては全体的または部分的に本発明の範囲内に含まれる。
【実施例１】
【０１１４】
レベル３方法および増強方法を用いる抗ＩＧＦ１Ｒの発現
増強方法およびレベル３方法を用いる幾つかの実施を行った。これらの実施においては、抗ＩＧＦ１Ｒ  ＬＣＦ（カッパ）およびＨＣＡ（ガンマ−１）鎖を発現するＣＨＯ  ＤＸＢ１１細胞を増殖させた。補足物を添加した初期哺乳類細胞増殖培地はＥＸ−ＣＥＬＬ  ＡＣＦ  ＣＨＯ培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）であった。
【０１１５】
供給物の添加を行わない（製造過程中のグルタミンおよびグルコース以外）類似した一連の実施を行った。これらの条件下、４３５ｍｇ／Ｌの力価が得られた。この力価は、プロテインＡに特異的に付着した産生免疫グロブリンを定量することにより推定された。以下のレベル３方法および増強方法の実施において得られた力価は、逆相クロマトグラフィー基質に付着した免疫グロブリンを定量することにより推定された。逆相法の定量を用いた場合の供給物の添加を伴わない実施においては約３００ｍｇ／Ｌの推定力価が得られたであろう。
【０１１６】
供給物の添加を行わない実施において得られる力価と比較して、レベル３方法および増強方法（後記）は遥かに優れた力価を与える。
【０１１７】
増強方法
３７℃に予め加温されｐＨ６．８に調節されたＥＸ−ＣＥＬＬ  ＡＣＦ  ＣＨＯ培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に、まず、細胞を３〜４×１０５  細胞／ｍｌで接種した。
【表１】
2012503487.tif 000019
【０１１８】
グルコースを、例えば、該培養内のグルコース濃度が１．５ｇ／リットル未満に低下した場合に加え、Ｌ−グルタミンを、例えば、該培養内のグルタミン濃度が１５０ｍｇ／リットル未満に低下した場合に加えた。浸透圧重量モル濃度を該栄養供給物の添加により４００ｍＯｓｍ以上に変化させた。該細胞を第２１〜２４日に回収した。ただし、バッチ３および４に関しては、それより早く（第１４〜１８日）細胞を回収し、一般には、細胞生存率が約６０％に低下した際に細胞を回収した。
【表２】
2012503487.tif 000020
【０１１９】
該増強方法において該栄養供給物が使用される場合には、アミノ酸供給物の添加は省略されうる。
【０１２０】
レベル３方法
３７℃に予め加温されｐＨ６．８に調節されたＥＸ−ＣＥＬＬ  ＡＣＦ  ＣＨＯ培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に、まず、細胞を３〜４×１０５  細胞／ｍｌで接種した。
【表３】
2012503487.tif 000021
【０１２１】
グルコースを、例えば、該培養内のグルコース濃度が１．５ｇ／リットル未満に低下した場合に加え、Ｌ−グルタミンを、例えば、該培養内のグルタミン濃度が１５０ｍｇ／リットル未満に低下した場合に加えた。
【表４】
2012503487.tif 000022
【０１２２】
使用した供給物および各供給物の成分の最終濃度を以下に示す。
【表５】
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【表６】
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【表７】
2012503487.tif 000025
【表８】
2012503487.tif 000026
【０１２３】
本発明は、本明細書に記載の具体的な実施形態により範囲において限定されるものではない。実際、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載されている実施形態、および本明細書に具体的に記載されていない他の実施形態を含み、本明細書に具体的に記載されている実施形態は必ずしも包括的なものではない。本明細書に記載されているものに加えて本発明の種々の修飾が前記説明から当業者に明らかとなるであろう。そのような修飾は特許請求の範囲の範囲内に含まれると意図される。
【０１２４】
本出願の全体にわたり特許、特許出願、刊行物、産物説明およびプロトコールが引用されているが、それらの開示の全体をあらゆる目的のために参照により本明細書に組み入れることとする。
【配列表】
2012503487000001.app
【国際調査報告】
2012503487.tif 000027
2012503487.tif 000028
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