【手続補正書】
【提出日】平成21年7月13日(2009.7.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
昆虫細胞において機能的ペプチドを発現する方法であって、
昆虫の分泌型シグナルペプチドをコードする核酸と共に少なくともＮＥＬＬ１ペプチドをコードする少なくとも核酸をフレーム内に包含する核酸構築物を提供すること；
前記核酸構築物により昆虫細胞に形質移入を行なうこと；
ＮＥＬＬ１ペプチドを発現できるような条件下で前記昆虫細胞を培養すること；
任意選択で、細胞株から分泌されたＮＥＬＬ１ペプチドを回収すること；
任意選択で、ＮＥＬＬ１ペプチドを実質的に精製すること；及び
任意選択で、ＮＥＬＬ１ペプチドの活性を調べること、
を含む方法。
【請求項２】
前記昆虫細胞がハイファイブ細胞である請求項１の方法。
【請求項３】
前記昆虫の分泌型シグナルペプチドがメリチンのシグナル配列である請求項１の方法。
【請求項４】
ＮＥＬＬ１をコードする核酸が、配列番号１、配列番号３又は配列番号５を含む群から選択される請求項１の方法。
【請求項５】
ＮＥＬＬ１ペプチドが、配列番号２、配列番号４又は配列番号６を含む群から選択される請求項１の方法。
【請求項６】
昆虫細胞においてＮＥＬＬ１ペプチドを発現するための核酸構築物であって、昆虫の分泌型シグナルペプチドをコードする核酸と共に少なくともＮＥＬＬ１ペプチドをコードする少なくとも核酸をフレーム内に含む核酸構築物。
【請求項７】
前記昆虫の分泌型シグナルペプチドがメリチンのシグナル配列である請求項６の核酸。
【請求項８】
ＮＥＬＬ１をコードする核酸が、配列番号１、配列番号３又は配列番号５を含む群から選択される請求項６の核酸。
【請求項９】
ＮＥＬＬ１ペプチドが、配列番号２、配列番号４又は配列番号６を含む群から選択される請求項６の核酸。
【請求項１０】
機能的ＮＥＬＬ１ペプチドを発現する細胞株であって、昆虫の分泌型シグナルペプチドをコードする核酸と共に少なくともＮＥＬＬ１ペプチドをコードする少なくとも核酸をフレーム内に含む核酸構築物を包含する前記細胞株。
【請求項１１】
前記細胞が昆虫細胞である請求項１０の細胞。
【請求項１２】
前記細胞がハイファイブ細胞である請求項１１の細胞。
【請求項１３】
前記細胞がＮＥＬＬ１ペプチドを分泌する請求項１０の細胞。
【請求項１４】
前記分泌型シグナルペプチドがメリチンのシグナル配列である請求項１０の細胞。
【請求項１５】
ＮＥＬＬ１をコードする核酸が、配列番号１、配列番号３又は配列番号５を含む群から選択される請求項１０の細胞。
【請求項１６】
ＮＥＬＬ１ペプチドが、配列番号２、配列番号４又は配列番号６を含む群から選択される請求項１０の細胞。
【請求項１７】
ＮＥＬＬ１ペプチド及び昆虫の分泌型シグナルペプチドを含むポリペプチド。
【請求項１８】
ＮＥＬＬ１ペプチドが、配列番号２、配列番号４又は配列番号６を含む群から選択される請求項１７のポリペプチド。
【請求項１９】
前記分泌型シグナルペプチドがメリチンのシグナル配列である請求項１７のポリペプチド。
【請求項２０】
哺乳類細胞において機能的ペプチドを発現する方法であって、
分泌型シグナルペプチドをコードする核酸と共に少なくともＮＥＬＬ１ペプチドをコードする少なくとも核酸をフレーム内に包含する核酸構築物を提供すること；
前記核酸構築物により哺乳類細胞に形質移入を行なうこと；
ＮＥＬＬ１ペプチドを発現できるような条件下で前記哺乳類細胞を培養すること；
任意選択で、細胞株から分泌されたＮＥＬＬ１ペプチドを回収すること；
任意選択で、ＮＥＬＬ１ペプチドを実質的に精製すること；及び
任意選択で、骨形成を誘導するＮＥＬＬ１ペプチドの活性を調べること、
を含む方法。
【請求項２１】
前記哺乳類細胞がＣＯＳ７細胞である請求項２０の方法。
【請求項２２】
前記哺乳類の分泌型シグナルペプチドがＮＥＬＬペプチドのシグナル配列である請求項２０の方法。
【請求項２３】
ＮＥＬＬ１をコードする核酸が、配列番号１、配列番号３又は配列番号５を含む群から選択される請求項２０の方法。
【請求項２４】
ＮＥＬＬ１ペプチドが、配列番号２、配列番号４又は配列番号６を含む群から選択される請求項２０の方法。
【請求項２５】
哺乳類細胞においてＮＥＬＬ１ペプチドを発現するための核酸構築物であって、分泌型シグナルペプチドをコードする核酸と共に少なくともＮＥＬＬ１ペプチドをコードする少なくとも核酸をフレーム内に含む前記核酸構築物。
【請求項２６】
前記哺乳類の分泌型シグナルペプチドがＮＥＬＬペプチドのシグナル配列である請求項２５の核酸。
【請求項２７】
ＮＥＬＬ１をコードする核酸が、配列番号１、配列番号３又は配列番号５を含む群から選択される請求項２５の核酸。
【請求項２８】
ＮＥＬＬ１ペプチドが、配列番号２、配列番号４又は配列番号６を含む群から選択される請求項２５の核酸。
【請求項２９】
機能的ＮＥＬＬ１ペプチドを発現する細胞株であって、分泌型シグナルペプチドをコードする核酸と共に少なくともＮＥＬＬ１ペプチドをコードする少なくとも核酸をフレーム内に含む核酸構築物を包含する細胞株。
【請求項３０】
前記細胞が哺乳類細胞である請求項２９の細胞。
【請求項３１】
前記細胞がＣＯＳ７細胞である請求項３０の細胞。
【請求項３２】
前記細胞がＮＥＬＬ１ペプチドを分泌する請求項２９の細胞。
【請求項３３】
前記分泌型シグナルペプチドがＮＥＬＬペプチドのシグナル配列である請求項２９の細胞。
【請求項３４】
ＮＥＬＬ１をコードする核酸が、配列番号１、配列番号３又は配列番号５を含む群から選択される請求項２９の細胞。
【請求項３５】
ＮＥＬＬ１ペプチドが、配列番号２、配列番号４又は配列番号６を含む群から選択される請求項２９の細胞。
【請求項３６】
ＮＥＬＬ１ペプチド及び分泌型シグナルペプチドを含むポリペプチド。
【請求項３７】
ＮＥＬＬ１ペプチドが、配列番号２、配列番号４又は配列番号６を含む群から選択される請求項３６のポリペプチド。
【請求項３８】
前記分泌型シグナルペプチドがＮＥＬＬペプチドのシグナル配列である請求項３６のポリペプチド。
【請求項３９】
昆虫細胞において機能的ペプチドを発現する方法であって、
少なくともＮＥＬＬ２ペプチド及び昆虫の分泌型シグナルペプチドををコードする少なくとも核酸をＮＥＬＬ２ペプチドのフレーム内に包含する核酸構築物を提供すること；
前記核酸構築物により昆虫細胞に形質移入を行なうこと；
ＮＥＬＬ２ペプチドを発現できるような条件下で前記昆虫細胞を培養すること；
任意選択で、細胞株から分泌されたＮＥＬＬ２ペプチドを回収すること；
任意選択で、ＮＥＬＬ２ペプチドを実質的に精製すること；及び
任意選択で、ＮＥＬＬ２ペプチドの活性を調べること、
を含む方法。
【請求項４０】
前記昆虫細胞がハイファイブ細胞である請求項３９の方法。
【請求項４１】
前記昆虫の分泌型シグナルペプチドがメリチンのシグナル配列である請求項３９の方法。
【請求項４２】
ＮＥＬＬ２をコードする核酸が、配列番号７、配列番号９、配列番号１１又は配列番号１３を含む群から選択される請求項３９の方法。
【請求項４３】
ＮＥＬＬ２ペプチドが、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２又は配列番号１４を含む群から選択される請求項３９の方法。
【請求項４４】
昆虫細胞においてＮＥＬＬ２ペプチドを発現するための核酸構築物であって、昆虫の分泌型シグナルペプチドをコードする核酸と共に少なくともＮＥＬＬ２ペプチドをコードする少なくとも核酸をフレーム内に含む前記核酸構築物。
【請求項４５】
前記昆虫の分泌型シグナルペプチドがメリチンのシグナル配列である請求項４４の核酸。
【請求項４６】
ＮＥＬＬ２をコードする核酸が、配列番号７、配列番号９、配列番号１１又は配列番号１３を含む群から選択される請求項４４の核酸。
【請求項４７】
ＮＥＬＬ２ペプチドが、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２又は配列番号１４を含む群から選択される請求項４４の核酸。
【請求項４８】
機能的ＮＥＬＬ２ペプチドを発現する細胞株であって、昆虫の分泌型シグナルペプチドをコードする核酸と共に少なくともＮＥＬＬ２ペプチドをコードする少なくとも核酸をフレーム内に含む核酸構築物を包含する前記細胞株。
【請求項４９】
前記細胞が昆虫細胞である請求項４８の細胞。
【請求項５０】
前記細胞がハイファイブ細胞である請求項４９の細胞。
【請求項５１】
前記細胞がＮＥＬＬ２ペプチドを分泌する請求項４８の細胞。
【請求項５２】
前記分泌型シグナルペプチドがメリチンのシグナル配列である請求項４８の細胞。
【請求項５３】
ＮＥＬＬ２をコードする核酸が、配列番号７、配列番号９、配列番号１１又は配列番号１３を含む群から選択される請求項４８の細胞。
【請求項５４】
ＮＥＬＬ２ペプチドが、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２又は配列番号１４を含む群から選択される請求項４８の細胞。
【請求項５５】
ＮＥＬＬ２ペプチド及び昆虫の分泌型シグナルペプチドを含むポリペプチド。
【請求項５６】
ＮＥＬＬ２ペプチドが、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２又は配列番号１４を含む群から選択される請求項５５のポリペプチド。
【請求項５７】
前記分泌型シグナルペプチドがメリチンのシグナル配列である請求項５５のポリペプチド。
【請求項５８】
哺乳類細胞において機能的ペプチドを発現する方法であって、
少なくともＮＥＬＬ２ペプチドをコードする少なくとも核酸及び分泌型シグナルペプチドをコードする核酸をＮＥＬＬ２ペプチドのフレーム内に包含する核酸構築物を提供すること；
前記核酸構築物により哺乳類細胞に形質移入を行なうこと；
ＮＥＬＬ２ペプチドを発現できるような条件下で前記哺乳類細胞を培養すること；
任意選択で、細胞株から分泌されたＮＥＬＬ２ペプチドを回収すること；
任意選択で、ＮＥＬＬ２ペプチドを実質的に精製すること；及び
任意選択で、神経細胞の生き残りを促進するＮＥＬＬ２ペプチドの活性を調べること、を含む方法。
【請求項５９】
前記哺乳類細胞がＣＯＳ７細胞である請求項５８の方法。
【請求項６０】
前記哺乳類の分泌型シグナルペプチドがＮＥＬＬペプチドのシグナル配列である請求項５８の方法。
【請求項６１】
ＮＥＬＬ２をコードする核酸が、配列番号７、配列番号９、配列番号１１又は配列番号１３を含む群から選択される請求項５８の方法。
【請求項６２】
ＮＥＬＬ２ペプチドが、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２又は配列番号１４を含む群から選択される請求項５８の方法。
【請求項６３】
哺乳類細胞においてＮＥＬＬ２ペプチドを発現するための核酸構築物であって、分泌型シグナルペプチドをコードする核酸と共に少なくともＮＥＬＬ２ペプチドをコードする少なくとも核酸をフレーム内に含む前記核酸構築物。
【請求項６４】
前記哺乳類の分泌型シグナルペプチドがＮＥＬＬペプチドのシグナル配列である請求項６３の核酸。
【請求項６５】
ＮＥＬＬ２をコードする核酸が、配列番号７、配列番号９、配列番号１１又は配列番号１３を含む群から選択される請求項６３の核酸。
【請求項６６】
ＮＥＬＬ２ペプチドが、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２又は配列番号１４を含む群から選択される請求項６３の核酸。
【請求項６７】
機能的ＮＥＬＬ２ペプチドを発現する細胞株であって、分泌型シグナルペプチドをコードする核酸と共に少なくともＮＥＬＬ２ペプチドをコードする少なくとも核酸をフレーム内に含む核酸構築物を包含する前記細胞株。
【請求項６８】
前記細胞が哺乳類細胞である請求項６７の細胞。
【請求項６９】
前記細胞がＣＯＳ７細胞である請求項６８の細胞。
【請求項７０】
前記細胞がＮＥＬＬ２ペプチドを分泌する請求項６７の細胞。
【請求項７１】
前記分泌型シグナルペプチドがＮＥＬＬペプチドのシグナル配列である請求項６７の細胞。
【請求項７２】
ＮＥＬＬ２ペプチドをコードする核酸が、配列番号７、配列番号９、配列番号１１又は配列番号１３を含む群から選択される請求項６７の細胞。
【請求項７３】
ＮＥＬＬ２ペプチドが、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２又は配列番号１４を含む群から選択される請求項６７の細胞。
【請求項７４】
骨形成細胞の分化を増大させる方法であって、
骨形成細胞においてＮＥＬＬ１遺伝子産物の濃度を高めること；
任意選択で、第２の骨形成剤を添加すること；及び
骨芽細胞分化の細胞性マーカーの発現を誘導すること、
を含む方法。
【請求項７５】
ＮＥＬＬ１遺伝子産物の濃度を高めることが、骨形成細胞にＮＥＬＬ１ペプチドを適用することを含む請求項７４の方法。
【請求項７６】
ＮＥＬＬ１ペプチドが、配列番号２、配列番号４又は配列番号６を含む群から選択される請求項７４の方法。
【請求項７７】
ＮＥＬＬ１遺伝子産物の濃度を高めることが、内因性ＮＥＬＬ１遺伝子の発現を誘導することを含む請求項７４の方法。
【請求項７８】
ＮＥＬＬ１遺伝子産物の濃度を高めることが、Ｃｂｆａ１の細胞性レベルを高めることを含む請求項７７の方法。
【請求項７９】
ＮＥＬＬ１遺伝子産物の濃度を高めることが、ＮＥＬＬ１ペプチドをコードする核酸構築物により骨形成細胞に形質移入することを含む請求項７４の方法。
【請求項８０】
ＮＥＬＬ１ペプチドをコードする核酸構築物が、群：配列番号１、配列番号３又は配列番号５から選択される少なくとも１つを含む請求項７４の方法。
【請求項８１】
骨形成細胞が、骨芽細胞、間葉細胞、線維芽細胞、胎児性胚細胞、幹細胞(単数）、骨
髄細胞、硬膜細胞、軟骨細胞、軟骨芽細胞、一次頭蓋冠細胞、幹細胞（複数）、脂肪幹細胞を含む群から選択される請求項７４の方法。
【請求項８２】
第２の骨形成ペプチドが、ＴＧＦ−β、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７、ｂＦＧＦ、コラーゲンを含む群から選択される請求項７４の方法。
【請求項８３】
骨芽細胞分化の誘導される細胞性マーカーが、アルカリホスファターゼ活性、オステオカルシンｍＲＮＡの発現、オステオポニンｍＲＮＡの発現、デコリンの発現及びラミニンＢの発現を含む群から選択される請求項７４の方法。
【請求項８４】
骨芽細胞の石灰化を高める方法であって、
骨形成細胞においてＮＥＬＬ１遺伝子産物の濃度を高めること；
任意選択で、骨形成細胞に作用剤を適用すること；及び
石灰化の細胞性マーカーの発現を誘導すること、
を含む方法。
【請求項８５】
ＮＥＬＬ１遺伝子産物の濃度を高めることが、骨形成細胞にＮＥＬＬ１ペプチドを適用することを含む請求項８４の方法。
【請求項８６】
ＮＥＬＬ１ペプチドが、配列番号２、配列番号４又は配列番号６を含む群から選択される請求項８４の方法。
【請求項８７】
ＮＥＬＬ１遺伝子産物の濃度を高めることが、内因性ＮＥＬＬ１遺伝子の発現を誘導することを含む請求項８４の方法。
【請求項８８】
ＮＥＬＬ１遺伝子産物の濃度を高めることが、Ｃｂｆａ１の細胞性レベルを高めることを含む請求項８７の方法。
【請求項８９】
ＮＥＬＬ１遺伝子産物の濃度を高めることが、ＮＥＬＬペプチドをコードする核酸構築物により骨形成細胞に形質移入することを含む請求項８４の方法。
【請求項９０】
ＮＥＬＬ１をコードする核酸構築物が、群：配列番号１、配列番号３又は配列番号５から選択される少なくとも１つを含む請求項８４の方法。
【請求項９１】
骨形成細胞が、骨芽細胞、間葉細胞、線維芽細胞、胎児性胚細胞、幹細胞（単数）、骨髄細胞、硬膜細胞、軟骨細胞、軟骨芽細胞、一次頭蓋冠細胞、幹細胞(複数）、脂肪幹細
胞を含む群から選択される請求項８４の方法。
【請求項９２】
第２の骨形成剤が、ＴＧＦ−β、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７、ｂＦＧＦ、コラーゲンを含む群から選択される請求項８４の方法。
【請求項９３】
石灰化の誘導される細胞性マーカーがカルシウムの取り込みを含む群から選択される請求項８４の方法。
【請求項９４】
膜内骨形成を増大させる方法であって、
骨形成が所望される領域におけるＮＥＬＬ１遺伝子産物の濃度を高めること；
任意選択で、骨形成が所望されるほぼ同一領域に第２の作用剤を適用すること；及び
膜内骨形成の形成を誘導すること、
を含む方法。
【請求項９５】
ＮＥＬＬ１遺伝子産物の濃度を高めることが、骨形成が所望される領域にＮＥＬＬ１ペプチドを適用することを含む請求項９４の方法。
【請求項９６】
ＮＥＬＬ１ペプチドが、配列番号２、配列番号４又は配列番号６を含む群から選択される請求項９４の方法。
【請求項９７】
ＮＥＬＬ１遺伝子産物の濃度を高めることが、内因性ＮＥＬＬ１遺伝子の発現を誘導することを含む請求項９４の方法。
【請求項９８】
ＮＥＬＬ１遺伝子産物の濃度を高めることが、ＮＥＬＬペプチドをコードする核酸構築物により細胞に形質移入すること、及び該細胞を骨形成が所望される領域の近傍に適用することを含む請求項９４の方法。
【請求項９９】
ＮＥＬＬ１をコードする核酸構築物が、群：配列番号１、配列番号３又は配列番号５から選択される少なくとも１つを含む請求項９４の方法。
【請求項１００】
作用剤が、ＴＧＦ−β、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７、ｂＦＧＦ、コラーゲン、骨、基質、靭帯基質、腱基質、骨形成細胞又は骨芽細胞を含む群から選択される請求項９４の方法。
【請求項１０１】
膜内骨の形成が、ＣＴ、遺伝子発現、組織学、機械的試験によって評価される請求項９４の方法。
【請求項１０２】
軟骨内の骨形成を増大させる方法であって、
骨形成、及び／又は骨の治癒又は骨の再生が所望される領域でＮＥＬＬ１遺伝子産物の濃度を高めること；
任意選択で、骨形成が所望される領域に作用剤を適用すること；及び
骨形成が所望される領域で少なくとも軟骨芽細胞の肥大を誘導すること、
を含む方法。
【請求項１０３】
骨形成が骨の治癒又は骨の再生を含む請求項１０２の方法。
【請求項１０４】
ＮＥＬＬ１遺伝子産物の濃度を高めることが、骨形成が所望される領域にＮＥＬＬ１ペプチドを適用することを含む請求項１０２の方法。
【請求項１０５】
ＮＥＬＬ１ペプチドが、配列番号２、配列番号４又は配列番号６を含む群から選択される請求項１０２の方法。
【請求項１０６】
ＮＥＬＬ１遺伝子産物の濃度を高めることが、内因性ＮＥＬＬ１遺伝子の発現を誘導することを含む請求項１０２の方法。
【請求項１０７】
ＮＥＬＬ１遺伝子産物の濃度を高めることが、ＮＥＬＬペプチドをコードする核酸構築物により細胞に形質移入すること、及び該細胞を骨形成が所望される領域の近傍に適用することを含む請求項１０２の方法。
【請求項１０８】
ＮＥＬＬ１ペプチドをコードする核酸構築物が、群：配列番号１、配列番号３又は配列番号５から選択される少なくとも１つを含む請求項１０７の方法。
【請求項１０９】
ＮＥＬＬ１ペプチドが、配列番号２、配列番号４又は配列番号６を含む群から選択される請求項１０７の方法。
【請求項１１０】
作用剤が、ＴＧＦ−β、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７、ｂＦＧＦ、コラーゲン、骨、基質、靭帯基質、腱基質、骨形成細胞又は骨芽細胞を含む群から選択される請求項１０２の方法。
【請求項１１１】
軟骨芽細胞の肥大を誘導することがアポトーシスの軟骨芽細胞の増加を起こす請求項１０２の方法。
【請求項１１２】
椎骨の近傍で骨形成を増大させる方法であって
脊椎固定が所望される椎骨の最も近くでのＮＥＬＬ１遺伝子産物の濃度を高めること；任意選択で、脊椎固定が所望される椎骨の最も近くに追加の活性剤を適用すること；及び
脊椎固定が所望される領域で軟骨芽細胞の肥大又は骨芽細胞の分化を誘導すること、
を含む方法。
【請求項１１３】
骨芽細胞の分化を増大させることをさらに含む請求項１１２の方法。
【請求項１１４】
骨芽細胞の石灰化を増大させることをさらに含む請求項１１２の方法。
【請求項１１５】
膜の骨形成を誘導することをさらに含む請求項１１２の方法。
【請求項１１６】
ＮＥＬＬ１遺伝子産物の濃度を高めることが、脊椎固定が所望される領域にＮＥＬＬ１ペプチドを適用することを含む請求項１１２の方法。
【請求項１１７】
ＮＥＬＬ１ペプチドが、配列番号２、配列番号４又は配列番号６を含む群から選択される請求項１１２の方法。
【請求項１１８】
ＮＥＬＬ１遺伝子産物の濃度を高めることが、内因性ＮＥＬＬ１遺伝子の発現を誘導することを含む請求項１１２の方法。
【請求項１１９】
ＮＥＬＬ１遺伝子産物の濃度を高めることが、ＮＥＬＬペプチドをコードする核酸構築物により細胞に形質移入すること、及び該細胞を脊椎固定が所望される領域の近傍に適用することを含む請求項１１２の方法。
【請求項１２０】
ＮＥＬＬ１をコードする核酸構築物が、群：配列番号１、配列番号３又は配列番号５から選択される少なくとも１つを含む請求項１１９の方法。
【請求項１２１】
ＮＥＬＬ１ペプチドが、配列番号２、配列番号４又は配列番号６を含む群から選択される請求項１１９の方法。
【請求項１２２】
作用剤が、ＴＧＦ−β、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７、ｂＦＧＦ、コラーゲン、骨、基質、靭帯基質、腱基質、骨形成細胞又は骨芽細胞を含む群から選択される請求項１１２の方法。
【請求項１２３】
骨形成を誘導するための組成物であって、
ＮＥＬＬ１ペプチド、及びＮＥＬＬ１ペプチドの発現を変化させる作用剤、又はＮＥＬＬ１ペプチドの活性を変化させる作用剤を含む群から選択される、骨形成を誘導するための、有効量の第１の作用剤、並びに任意選択でキャリアを含む組成物。
【請求項１２４】
ＮＥＬＬ１ペプチドが、配列番号２、配列番号４又は配列番号６を含む群から選択される請求項１２３の組成物。
【請求項１２５】
作用剤が、ＴＧＦ−β、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７、ｂＦＧＦ、コラーゲンを含む群から選択される請求項１２３の組成物。
【請求項１２６】
作用剤が、骨基質、腱基質又は靭帯基質、骨形成細胞又は骨芽細胞を含む群から選択される請求項１２３の組成物。
【請求項１２７】
前記キャリアが酵素的メカニズム又は加水分解のメカニズムで分解可能である請求項１２３の組成物。
【請求項１２８】
前記キャリアが、ポリ（Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリグリコリド、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（トリメチレンカーボネート）、ポリ（ｐ−ジオキサノン）、ポリ（カプロラクトン−コ−グリコリド）、ポリ（グリコリド−コ−トリメチレンカーボネート）ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−トリメチレンカーボネート）のようなポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリアリーレート類、ポリヒドロキシブチラート、ポリ無水物、ポリ（無水物−コ−イミド）、プロピレン−コ−フマレート類、ポリラクトン類、ポリエステル類、ポリカーボネート類、ポリアニオン系ポリマー類、ポリエステルアミド類、ポリ（アミノ酸）、ホモポリペプチド類、ポリ（ホスファゼン類）、ポリ（グラクサノン）、多糖類、及びポリ（オルソエステル類）、ポリグラチン、ポリグラチン酸、ポリアルドン酸、ポリアクリル酸、ポリアルカノエート類を含む群から選択される合成ポリマーから構成される請求項１２３の組成物。
【請求項１２９】
前記キャリアが、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピル−メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース及びそれらのカチオン系塩から構成される請求項１２３の組成物。
【請求項１３０】
前記キャリアが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、アパタイト、生体活性ガラス材料、及びサンゴ由来のアパタイトを含む群から選択される合成の又は天然のバイオセラミックから構成される請求項１２３の組成物。
【請求項１３１】
前記キャリアが、コラーゲン、ヒアルロナン、フィブリン、キトサン、アルギネート及びゼラチンを含む群から選択される請求項１２３の組成物。
【請求項１３２】
デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸、硫酸ヘパリン、フカン、アルギネートを含む群から選択されるヘパリン結合剤をさらに含む請求項１２３の組成物。
【請求項１３３】
前記キャリアが流動性ゲルの形態である請求項１２３の組成物。
【請求項１３４】
前記キャリアが光重合性である請求項１２３の組成物。
【請求項１３５】
前記キャリアが温度感受性である請求項１２３の組成物。
【請求項１３６】
組成物が、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸、アルギネート、ポリ（エチレングリコール）、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピル−メチルセルロース及びカルボキシメチルセルロースを含むアルキルセルロース（ヒドロキシアルキルセルロースを含む）、血液、フィブリン、ポリオキシエチレンオキシド、硫酸カルシウム半水化物、アパタイト類、カルボキシビニルポリマー、又はポリ（ビニルアルコール）を含む群から選択される金属イオン封鎖剤をさらに含む請求項１２３の組成物。
【請求項１３７】
組成物が、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０又はプルロニックＦ−６８を含む群から選択される界面活性剤をさらに含む請求項１２３の組成物。
【請求項１３８】
組成物が、グリシン、グルタミン酸塩酸塩、塩化ナトリウム、グアニジン、ヘパリン、酢酸、コハク酸、ポリソルベート、デキストラン硫酸、スクロース及びアミノ酸を含む群から選択される緩衝剤をさらに含む請求項１２３の組成物。
【請求項１３９】
膜内の骨形成を増大させるために患者を治療する方法であって、骨形成を増すために選択された間隔で、有効な投与形態で、治療上有用な用量にてＮＥＬＬペプチドを投与することを含む方法。
【請求項１４０】
骨形成が所望される領域に、ＴＧＦ−β、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７、ｂＦＧＦ、コラーゲン、骨基質、腱基質又は靭帯基質を含む群から選択される少なくとも１種の作用剤を投与することをさらに含む請求項１３９の方法。
【請求項１４１】
骨形成を誘導するために患者を治療する方法であって、哺乳類の骨形成細胞を回収すること；該骨形成細胞に接触するＮＥＬＬ１ペプチドの濃度を高めること；骨形成が所望される領域に該骨形成細胞を投与することを含む方法。
【請求項１４２】
骨形成細胞に接触するＮＥＬＬ１ペプチドの発現の濃度を高めることが、ＮＥＬＬ１ペプチドを含む組成物を骨形成細胞に適用することを含む請求項１４１の方法。
【請求項１４３】
骨形成細胞に接触するＮＥＬＬ１ペプチドの発現の濃度を高めることが、ＮＥＬＬ１ペプチドの内因性の発現を誘導することを含む請求項１４１の方法。
【請求項１４４】
骨形成細胞に接触するＮＥＬＬ１ペプチドの発現の濃度を高めることが、ＮＥＬＬ１ペプチドをコードする核酸構築物により細胞に形質移入することを含む請求項１４１の方法。
【請求項１４５】
ＮＥＬＬ１ペプチドが、配列番号２、配列番号４又は配列番号６を含む群から選択される請求項１４２、１４３又は１４４の方法。
【請求項１４６】
骨形成が所望される領域に、ＴＧＦ−β、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７、ｂＦＧＦ、コラーゲン、骨、基質、靭帯基質、腱基質、骨形成細胞又は骨芽細胞を含む群から選択される少なくとも１種の作用剤を投与することをさらに含む請求項１４２、１４３又は１４４の方法。
【請求項１４７】
人体で使用するためのインプラントであって、基材がインプラントの近傍で骨形成を誘導するのに十分な量のＮＥＬＬ１を含む基材を含むインプラント。
【請求項１４８】
人体で使用するためのインプラントであって、表面の少なくとも一部がインプラントの近傍で骨形成を誘導するのに十分な量のＮＥＬＬ１を含む表面を有する基材を含むインプラント。
【請求項１４９】
人体で使用するためのインプラントであって、表面の少なくとも一部が骨形成細胞を含む表面を有する基材を含み、該基材が骨形成を誘導するのに十分な量のＮＥＬＬ１を含むインプラント。
【請求項１５０】
前記基材がメッシュ、ピン、ネジ、プレート又は人工装具の継ぎ目の形状に形成される請求項１４２、１４３又は１４４のインプラント。
【請求項１５１】
前記基材が吸収性である請求項１４２、１４３又は１４４のインプラント。
【請求項１５２】
前記基材がコラーゲンを含む請求項１４２、１４３又は１４４のインプラント。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５６】
【図１Ａ】核酸配列をコードするヒトＮＥＬＬ１ｃＤＮＡ（配列番号１）である。
【図１Ｂ】核酸配列をコードするヒトＮＥＬＬ１ｃＤＮＡ（配列番号１）である。
【図１Ｃ】核酸配列をコードするヒトＮＥＬＬ１ｃＤＮＡ（配列番号１）である。
【図１Ｄ】核酸配列をコードするヒトＮＥＬＬ１ｃＤＮＡ（配列番号１）である。
【図２Ａ】アミノ酸配列をコードするヒトＮＥＬＬ１（配列番号２）である。
【図２Ｂ】アミノ酸配列をコードするヒトＮＥＬＬ１（配列番号２）である。
【図３Ａ】核酸配列をコードするラットＮＥＬＬ１ｃＤＮＡ（配列番号３）である。
【図３Ｂ】核酸配列をコードするラットＮＥＬＬ１ｃＤＮＡ（配列番号３）である。
【図３Ｃ】核酸配列をコードするラットＮＥＬＬ１ｃＤＮＡ（配列番号３）である。
【図３Ｄ】核酸配列をコードするラットＮＥＬＬ１ｃＤＮＡ（配列番号３）である。
【図４Ａ】アミノ酸配列をコードするラットＮＥＬＬ１（配列番号４）である。
【図４Ｂ】アミノ酸配列をコードするラットＮＥＬＬ１（配列番号４）である。
【図５Ａ】核酸配列をコードするマウスＮＥＬＬ１ｃＤＮＡ（配列番号５）である。
【図５Ｂ】核酸配列をコードするマウスＮＥＬＬ１ｃＤＮＡ（配列番号５）である。
【図５Ｃ】核酸配列をコードするマウスＮＥＬＬ１ｃＤＮＡ（配列番号５）である。
【図６Ａ】アミノ酸配列をコードするマウスＮＥＬＬ１（配列番号６）である。
【図６Ｂ】アミノ酸配列をコードするマウスＮＥＬＬ１（配列番号６）である。
【図６Ｃ】アミノ酸配列をコードするマウスＮＥＬＬ１（配列番号６）である。
【図７Ａ】核酸配列をコードするヒトＮＥＬＬ２ｃＤＮＡ（配列番号７）である。
【図７Ｂ】核酸配列をコードするヒトＮＥＬＬ２ｃＤＮＡ（配列番号７）である。
【図７Ｃ】核酸配列をコードするヒトＮＥＬＬ２ｃＤＮＡ（配列番号７）である。
【図７Ｄ】核酸配列をコードするヒトＮＥＬＬ２ｃＤＮＡ（配列番号７）である。
【図８Ａ】アミノ酸配列をコードするヒトＮＥＬＬ２（配列番号８）である。
【図８Ｂ】アミノ酸配列をコードするヒトＮＥＬＬ２（配列番号８）である。
【図９Ａ】核酸配列をコードするラットＮＥＬＬ２ｃＤＮＡ（配列番号９）である。
【図９Ｂ】核酸配列をコードするラットＮＥＬＬ２ｃＤＮＡ（配列番号９）である。
【図９Ｃ】核酸配列をコードするラットＮＥＬＬ２ｃＤＮＡ（配列番号９）である。
【図９Ｄ】核酸配列をコードするラットＮＥＬＬ２ｃＤＮＡ（配列番号９）である。
【図１０Ａ】アミノ酸配列をコードするラットＮＥＬＬ２（配列番号１０）である。
【図１０Ｂ】アミノ酸配列をコードするラットＮＥＬＬ２（配列番号１０）である。
【図１１Ａ】核酸配列をコードするマウスＮＥＬＬ２ｃＤＮＡ（配列番号１１）である。
【図１１Ｂ】核酸配列をコードするマウスＮＥＬＬ２ｃＤＮＡ（配列番号１１）である。
【図１１Ｃ】核酸配列をコードするマウスＮＥＬＬ２ｃＤＮＡ（配列番号１１）である。
【図１１Ｄ】核酸配列をコードするマウスＮＥＬＬ２ｃＤＮＡ（配列番号１１）である。
【図１２Ａ】アミノ酸配列をコードするマウスＮＥＬＬ２（配列番号１２）である。
【図１２Ｂ】アミノ酸配列をコードするマウスＮＥＬＬ２（配列番号１２）である。
【図１３Ａ】核酸配列をコードするニワトリＮＥＬＬ２（配列番号１３）である。
【図１３Ｂ】核酸配列をコードするニワトリＮＥＬＬ２（配列番号１３）である。
【図１３Ｃ】核酸配列をコードするニワトリＮＥＬＬ２（配列番号１３）である。
【図１３Ｄ】核酸配列をコードするニワトリＮＥＬＬ２（配列番号１３）である。
【図１４Ａ】アミノ酸配列をコードするニワトリＮＥＬＬ２（配列番号１４）である。
【図１４Ｂ】アミノ酸配列をコードするニワトリＮＥＬＬ２（配列番号１４）である。
【図１５Ａ】機能的ＮＥＬＬペプチドを産生させる方法の１つのフローチャートである。
【図１５Ｂ】機能的ＮＥＬＬペプチドを産生させる方法の１つのフローチャートである。
【図１６Ａ】シグナルペプチド−ＮＥＬＬ１−ＦＬＡＧの核酸構築物（配列番号１５）の説明である。下線のアミノ酸配列はメリチンのシグナルペプチドに由来する。アラニンとプロリンとの間の結合は、ハイファイブ細胞による分泌のための推定上の切断部位である。ＲＴＶＬＧＦＧの残基（配列番号１６の３８〜４４残基）は、ラット／ヒトＮＥＬＬ１タンパク質の成熟タンパク質に由来する。
【図１６Ｂ】シグナルペプチド−ＮＥＬＬ１−ＦＬＡＧの核酸構築物（配列番号１５）の説明である。
【図１６Ｃ】シグナルペプチド−ＮＥＬＬ１−ＦＬＡＧの核酸構築物（配列番号１５）の説明である。
【図１６Ｄ】シグナルペプチド−ＮＥＬＬ１−ＦＬＡＧの核酸構築物（配列番号１５）の説明である。
【図１７ＡＢ】ＮＥＬＬ１−ＦＬＡＧの細胞外発現の生成物の説明である。図１７Ａは、無血清培地においてハイファイブ細胞により産生された精製ＮＥＬＬ１ペプチド（生産性：３ｍｇ／Ｌ培地）を含有するＵｎｏＱ溶出物のＣＢＢ染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。図１７Ｂは、抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウエスタンブロットである。
【図１７ＣＤ】ＮＥＬＬ１−ＦＬＡＧの細胞外発現の生成物の説明である。図１７Ｃは、無血清培地においてＣＯＳ７細胞により産生された精製ＮＥＬＬ１ペプチド（生産性：＜０．１ｍｇ／Ｌ培地）を含有するＵｎｏＱ溶出物のＣＢＢ染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。図１７Ｄは、抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウエスタンブロットである。
【図１８】無血清培地における昆虫細胞によるＮＥＬＬ２−ＦＬＡＧペプチドの細胞外の発現を説明するウエスタンブロットである。
【図１９】２種類の無血清培地（ファイブＳＦＭ及びＥＳＦ９２１における発現）におけるハイファイブ細胞によるＮＥＬＬ−１及びＮＥＬＬ２−ＦＬＡＧペプチドの細胞外の発現を説明するウエスタンブロットである。
【図２０】ＮＥＬＬ−１（１ｎｇ、１０ｎｇ、１００ｎｇ／ｍＬ）及びＢＭＰ４（１００ｎｇ／ｍＬ）に暴露したラット胎児の頭蓋冠細胞におけるアルカリホスファターゼの誘導を示す棒グラフである。
【図２１】ＮＥＬＬ１（Ａ及びＢ：５ｎｇ／ｍＬ；Ｃ及びＤ：５０ｎｇ／ｍＬ）で処理した骨芽細胞の顕微鏡写真である。
【図２２】アスコルビン酸非存在下で微小小体を形成するＮＥＬＬ１ＭＣ３Ｔ３微小小体の顕微鏡写真である。Ｂはアルカリホスファターゼの染色である。
【図２３】Ａ〜Ｃは、（Ａ）抗ＮＥＬＬ、（Ｂ）β−Ｇａｌ及び（Ｃ）ＮＥＬＬアデノウイルス構築物における石灰化を示す顕微鏡写真である。Ｄ及びＥは各群のオステオカルシン及びオステオポニンの経時的レベルを表す棒グラフである。
【図２４】は、頭蓋冠の過剰増殖を示す石灰化を表すように染色されたＮＥＬＬ１を過剰発現するトランスジェニックマウスの顕微鏡写真である。
【図２５】（Ａ）ＮＥＬＬ１過剰発現のトランスジェニックマウス及び（Ｂ）正常な同腹仔において石灰化について染色された頭蓋冠の顕微鏡写真である。
【図２６】（Ａ）Ｃｂｆａ１で処理した又は（Ｂ）対照のラット胎児の頭蓋冠細胞においてＮＥＬＬ１遺伝子の発現を示す逆転写ポリメラーゼ鎖反応のブロットである。
【図２７】（Ａ）野生型、（Ｂ）Ｃｂｆａ１＋／−、及び（Ｃ）Ｃｂｆａ１＋／−＋ＮＥＬＬ１過剰発現のマウスの頭蓋(上）、鎖骨（中）の骨格染色及び頭蓋のマイクロＣＴの写真である。
【図２８】（Ａ）ＢＭＰ処理した、及び（Ｂ）ＮＥＬＬ１処理した頭蓋冠欠損の処理(右）及び対照（左）のマイクロＣＴの写真である。
【図２９】頭蓋冠欠損におけるＮＥＬＬ１処理（右）及びＢＭＰ処理（左）のマイクロＣＴの写真である。
【図３０】口蓋欠損におけるＮＥＬＬ１処理（左）及び対照（右）のマイクロＣＴの写真である。
【図３１】（Ａ）ＮＥＬＬ１過剰発現のマウス及び（Ｂ）野生型マウスにおけるＴＵＮＥＬ染色した軟骨組織の顕微鏡写真である。
【図３２】選択された位置において骨を形成するために患者を治療する方法の１つのフローチャートである。
【図３３】Ａはインプラントの実施態様の１つを模式的に表し、Ｂは、選択された位置において骨を形成するために患者を治療する実施態様の１つを模式的に表す。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2007524360000001.app
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１Ａ】
2007524360.tif 000001
【図１Ｂ】
2007524360.tif 000002
【図１Ｃ】
2007524360.tif 000003
【図１Ｄ】
2007524360.tif 000004
【図２Ａ】
2007524360.tif 000005
【図２Ｂ】
2007524360.tif 000006
【図３Ａ】
2007524360.tif 000007
【図３Ｂ】
2007524360.tif 000008
【図３Ｃ】
2007524360.tif 000009
【図３Ｄ】
2007524360.tif 000010
【図４Ａ】
2007524360.tif 000011
【図４Ｂ】
2007524360.tif 000012
【図５Ａ】
2007524360.tif 000013
【図５Ｂ】
2007524360.tif 000014
【図５Ｃ】
2007524360.tif 000015
【図６Ａ】
2007524360.tif 000016
【図６Ｂ】
2007524360.tif 000017
【図６Ｃ】
2007524360.tif 000018
【図７Ａ】
2007524360.tif 000019
【図７Ｂ】
2007524360.tif 000020
【図７Ｃ】
2007524360.tif 000021
【図７Ｄ】
2007524360.tif 000022
【図８Ａ】
2007524360.tif 000023
【図８Ｂ】
2007524360.tif 000024
【図９Ａ】
2007524360.tif 000025
【図９Ｂ】
2007524360.tif 000026
【図９Ｃ】
2007524360.tif 000027
【図９Ｄ】
2007524360.tif 000028
【図１０Ａ】
2007524360.tif 000029
【図１０Ｂ】
2007524360.tif 000030
【図１１Ａ】
2007524360.tif 000031
【図１１Ｂ】
2007524360.tif 000032
【図１１Ｃ】
2007524360.tif 000033
【図１１Ｄ】
2007524360.tif 000034
【図１２Ａ】
2007524360.tif 000035
【図１２Ｂ】
2007524360.tif 000036
【図１３Ａ】
2007524360.tif 000037
【図１３Ｂ】
2007524360.tif 000038
【図１３Ｃ】
2007524360.tif 000039
【図１３Ｄ】
2007524360.tif 000040
【図１４Ａ】
2007524360.tif 000041
【図１４Ｂ】
2007524360.tif 000042
【図１５Ａ】
2007524360.tif 000043
【図１５Ｂ】
2007524360.tif 000044
【図１６Ａ】
2007524360.tif 000045
【図１６Ｂ】
2007524360.tif 000046
【図１６Ｃ】
2007524360.tif 000047
【図１６Ｄ】
2007524360.tif 000048
【図１７ＡＢ】
2007524360.tif 000049
【図１７ＣＤ】
2007524360.tif 000050
【図１８】
2007524360.tif 000051
【図１９】
2007524360.tif 000052
【図２０】
2007524360.tif 000053
【図２１】
2007524360.tif 000054
【図２２】
2007524360.tif 000055
【図２３】
2007524360.tif 000056
【図２４】
2007524360.tif 000057
【図２５】
2007524360.tif 000058
【図２６】
2007524360.tif 000059
【図２７】
2007524360.tif 000060
【図２８】
2007524360.tif 000061
【図２９】
2007524360.tif 000062
【図３０】
2007524360.tif 000063
【図３１】
2007524360.tif 000064
【図３２】
2007524360.tif 000065
【図３３】
2007524360.tif 000066