(57)【要約】  本発明は、分子薬学の分野、特に、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）分子の生物学的活性を阻害するために最適化されたインターロイキン−１５配列由来のペプチドに関する。本発明は、受容体のアルファサブユニット（ＩＬ−１５Ｒα）に結合すると、ペプチドが、ＩＬ−１５によって誘発されるＴ細胞の増殖、ＩＬ−１５による腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）の誘発、並びにＩＬ−１５ＲαによるＩＬ−８及びＩＬ−６の発現を阻害することを示す。本発明は更に、ＩＬ−１５又はＩＬ−１５Ｒαの異常発現が疾患の進行に関連する病状、例えば関節リウマチ（ＲＡ）及び前立腺癌の治療におけるペプチドの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１２として配列表に記載されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、ＩＬ−１５の活性に拮抗するペプチド。
【請求項２】
ＩＬ−１５の細胞受容体のアルファサブユニット（ＩＬ−１５Ｒα）又はその可溶性画分に結合できる、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
ＩＬ−１５Ｒαに依存するＩＬ−１５の生物学的活性を阻害する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
ＩＬ−１５Ｒαによって媒介されるＩＬ−８の発現を阻害する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
ＩＬ−１５Ｒαによって媒介されるＩＬ−６の発現を阻害する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項６】
ＩＬ−１５によって媒介される腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）の放出を阻害する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項７】
遺伝子操作又は化学合成によって得られる、請求項１から６までに記載のペプチド。
【請求項８】
２つのペプチド分子の二量体として得られ、配列番号１２として配列表に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項７に記載のペプチド。
【請求項９】
前記二量体は、前記ペプチドの２分子において遊離システインを介する二量体化によって得られる、請求項８に記載のペプチド。
【請求項１０】
配列番号１２として配列表に記載されるアミノ酸配列を含むペプチドをコードし、その発現産物が、ＩＬ−１５の細胞受容体のアルファサブユニット又はその可溶性画分に結合でき、ＩＬ−１５の生物学的活性を阻害することを特徴とする配列核酸鎖。
【請求項１１】
ＩＬ−１５の受容体のアルファサブユニットに依存するＩＬ−１５の生物学的活性を阻害でき、発現ベクターの一部である、請求項１０に記載の配列核酸鎖。
【請求項１２】
ＩＬ−１５の細胞受容体のアルファサブユニットに依存するＩＬ−１５の生物学的活性を阻害できる治療用医薬組成物であって、配列番号１２として配列表に記載されるアミノ酸配列を含むペプチドを含む上記治療用医薬組成物。
【請求項１３】
二量体として配列番号１２のペプチドを含む、請求項１２に記載の治療用医薬組成物。
【請求項１４】
単量体として、若しくはコンジュゲートされた二量体として配列番号１２のペプチドを含むか、又は許容可能な医薬賦形剤と混合される、請求項１２に記載の治療用医薬組成物。
【請求項１５】
ＩＬ−１５の細胞受容体のアルファサブユニットに依存するＩＬ−１５の生物学的活性を阻害できる、治療用医薬組成物であって、請求項１０に記載の核酸鎖を含む上記治療用医薬組成物。
【請求項１６】
関節リウマチを治療するための医薬を製造するための、配列番号１２として配列表に記載されるアミノ酸配列を含むペプチドの使用。
【請求項１７】
クローン病を治療するための医薬を製造するための、配列番号１２として配列表に記載されるアミノ酸配列を含むペプチドの使用。
【請求項１８】
乾癬を治療するための医薬を製造するための、配列番号１２として配列表に記載されるアミノ酸配列を含むペプチドの使用。
【請求項１９】
前立腺癌を治療するための医薬を製造するための、配列番号１２として配列表に記載されるアミノ酸配列を含むペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子薬学の分野に関し、特に、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）の受容体のアルファサブユニット（ＩＬ−１５Ｒα）に対するこのサイトカインの結合を遮断するインターロイキン−１５由来のペプチドを記載し、そのペプチドは、ＩＬ−１５及び／又はＩＬ−１５Ｒαの異常発現が関与する疾患を進行中に治療するのに有用である。
【背景技術】
【０００２】
ＩＬ−１５として知られるサイトカインは、Ｔ細胞活性化因子として２つの研究グループにより同時に確認された１４〜１５ｋＤａのタンパク質である（Ｇｒａｂｓｔｅｉｎ，Ｋ．Ｈ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９４、２６４、９６５〜９６８；Ｂｕｒｔｏｎ，Ｊ．Ｄ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９４、９１、４９３５〜４９３９）。このサイトカインのメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）は、様々な細胞及び組織に存在するが、翻訳段階及び細胞間輸送レベルでの強力な転写後調節により、その転写産物を発現する培養細胞の上清中にそのタンパク質を見出すことは難しい（Ｂａｍｆｏｒｄ  ＲＮ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９８、１６０：４４１８〜４４２６；Ｋｕｒｙｓ  Ｇら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２０００、２７５：３０６５３〜３０６５９）。更に、ＩＬ−１５の活性型が膜タンパク質として存在する可能性があり（Ｍｕｓｓｏら、Ｂｌｏｏｄ  １９９９、９３：３５３１〜３５３９）、最近、それがリガンド及び受容体の両方として機能する可能性があることが報告されている。ＩＬ−１５は、内在性膜タンパク質として発現する場合、受容体として作用して、可溶性ＩＬ−１５Ｒαの結合を介して、ＩＬ−６及びＩＬ−８炎症性サイトカインの分泌、いわゆるＭＡＰＫ及びＦＡＫキナーゼの活性化を誘発し、細胞膜でＩＬ−１５を発現する前立腺癌細胞（ＰＣ−３）の移動を促進する（Ｂｕｄａｌｇｉａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００４、４０：４２１９２〜４２２０１）。
【０００３】
ＩＬ−１５の生物学的効果は、α、β及びγと名付けられた３種類のサブユニットを含む細胞膜中に見出される受容体に対するこのサイトカインの結合によって媒介される。これらのサブユニットは同じ細胞中で同時発現され得るか、又はαサブユニットが結合したＩＬ−１５が、β及びγサブユニットを発現する細胞に提示されて、トランスにおけるシグナル伝達として知られているプロセスによって細胞シグナル伝達が更に誘発され得る（Ｂｕｒｋｅｔｔら、Ｊ  Ｅｘｐ．Ｍｅｄ  ２００４、２００：８２５〜８３４）。ＩＬ−１５Ｒβサブユニットは、ＩＬ−１５と高い構造的相同性を示すサイトカインである、ＩＬ−２によって共有され、ＩＬ−１５Ｒβサブユニットは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−２１などの他のサイトカインとも共有される。ＩＬ−１５ＲαサブユニットはＩＬ−１５に特異的であり、非常に高い親和性の結合（Ｋｄ＝１０−１１）を媒介し、膜受容体又は可溶性型のいずれかとして見出すことができる（Ｂｕｄａｇｉａｎ  Ｖ．ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００４  ２４：４０３６８〜７５；Ｍｏｒｔｉｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００４、１７３：１６８１〜１６８８）。
【０００４】
高レベルのＩＬ−１５発現は、クローン病（Ｋｉｒｍａｎ  Ｉ．、Ａｍ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１９９６、９１：１７８９〜１７９４）、乾癬（Ｒｕｃｋｅｒｔ  Ｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０００、１６５：２２４０〜２２５０）、白血病（Ｙａｍａｄａ  Ｙ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ａｎｄ  Ｌｉｍｐｈｏｍａ  １９９９、３５：３７〜４５）及び関節リウマチ（ＲＡ）（Ｍｃｌｎｎｅｓ  Ｉ．Ｂ．、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  １９９８、１９：７５〜７９）のような自己免疫疾患及び炎症性疾患の病因と関連がある。
【０００５】
ＲＡにおいて、Ｍｃｌｎｎｅｓらは、異常なＩＬ−１５発現である、滑液中の高濃度のＩＬ−１５及び滑膜細胞中のＩＬ−１５発現を見出した。彼らは、ＩＬ−１５がサイトカインカスケードにおいて腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）に先行することを示唆しており、マクロファージ中のＴＮＦα合成のＩＬ−１５活性化Ｔ細胞による誘発に関する細胞接触媒介性機構を提案している。彼らはまた、ＩＬ−１５が、滑液に対するＴ細胞移動における非常に関連のある因子として作用することを提案している（Ｍｃｌｎｎｅｓら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １９９７、３：１８９〜１９５）。Ｚｉｏｌｋｏｗｓｋａらは、ＩＬ−１５が、ＲＡ患者の関節中でＩＬ−１７の発現を誘発することを報告し、このサイトカインが、ＩＬ−６及びＩＬ−８などの炎症メディエーター、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子及び滑膜細胞によるＥ２プロスタグランジンの分泌を刺激することも知られており、ＲＡ病因におけるＩＬ−１５についての重要な役割を示唆している（Ｚｉｏｌｋｏｗｓｋａら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２０００、１６４：２８３２〜２８３８）。最近、ＩＬ−１５が、このサイトカインを遺伝子導入したマウスにおいてコラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）を悪化させることが実証された（Ｙｏｓｈｉｈａｒａら、Ｅｕｒ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７、３７：２７４４〜２７５２）。これらの要素は全て、ＩＬ−１５のアンタゴニストが、ＲＡ並びに他の自己免疫疾患及び炎症性疾患を治療するための有力な治療薬であり得ることを示唆している。
【０００６】
ＩＬ−１５分子中の５６位のアスパラギン酸残基は、ＩＬ−１５Ｒβに対する結合に関連があり、１５６位のグルタミンはＩＬ−１５Ｒγサブユニットに対する結合に関連があることが以前に報告されている。ムテインとも呼ばれる変異タンパク質は、ＩＬ１５−Ｒαに結合するＩＬ−１５に拮抗する分子として挙動し、ＩＬ−１５Ｒβ及びγサブユニットからのシグナル伝達を妨げる。これらのアミノ酸（ａａ）を認識する抗体はまた、ＩＬ−１５アンタゴニストとして作用する（米国特許第６１７７０７９号、米国特許第６１６８７８３号、米国特許第６０１３４８０号、米国特許第６００１９７３号、米国特許第９７０６９３１号、国際公開第９７４１２３２号）。
【０００７】
このサイトカインに対するアンタゴニストの使用は、乾癬（Ｖｉｌｌａｄｓｅｎ  Ｌ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００３、１１２：１５７１〜１５８０）及びＲＡ（Ｆｅｒｒａｒｉ−Ｌａｃｒａｚ  Ｓ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００４、１７３：５８１８〜５８２６）の動物モデルにおいて有用であることが証明されている。
【０００８】
Ｒｕｃｈａｔｚらは、ＤＢＡ／１マウスに投与するとＣＩＡを阻害するマウスＩＬ−１５Ｒαの可溶性断片を生成した（Ｒｕｃｈａｔｚ  Ｈ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １９９８、１６０：５６５４〜５６６０）。続いて、ＩＬ−１５Ｒαが、ＩＬ−１５の生物学的機能の有力なアゴニストとして作用できることも見出された（Ｍｏｒｔｉｅｒ  Ｅ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００６、２８１：１６１２〜１６１９；Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ  ＭＰ、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ２００６、１０３：９１６６〜９１７１）。
【０００９】
Ｇｅｎｍａｂは、４種類の抗体を記載している、ＩＬ−１５に特異的な抗体についての特許（国際公開第０３０１７９３５号）を所有している。１４６Ｂ７及び１４６Ｈ５と名付けられた、それらのうちの２種は、ＩＬ−１５Ｒγと相互作用するＩＬ−１５領域を標的とし、ＣＴＬＬ−２細胞系及び末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中のＩＬ−１５誘発細胞増殖を阻害する。その特許はまた、細胞増殖を阻害しない４０４Ａ８及び４０４Ｅ４抗体を記載している。これらの４種類の抗体のうち、１４６Ｂ７は、ＡＭＧ７１４と命名され、Ａｍｇｅｎ  ｃｏｍｐａｎｙによってＲＡに関する第ＩＩ相臨床試験で試験されている。
【００１０】
Ｂｅｒｎａｒｄらは、２００４年に、ＩＬ１５−Ｒαに対する結合に関するＩＬ−１５分子の２つの配列を同定した。これらの配列は、成熟タンパク質中のアミノ酸４４〜５２及び６４〜６８を含み、彼らはまた、ＩＬ−１５のアゴニスト又はアンタゴニストとして作用できるムテインを記載している（Ｂｅｒｎａｒｄ  Ｊ．ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００４、２７９：２４３１３〜２４３２２）。
【００１１】
Ｓａｎｔｏｓらは、ＩＬ−１５アンタゴニストペプチドを記載している（国際公開第２００６／０２９５７８号）。ＩＬ−１５のアンタゴニストとしての小さいサイズ（１０アミノ酸）のペプチドの使用は、ＩＬ−１５Ｒαに対するＩＬ−１５結合を選択的に遮断し、さらにはその相互作用の効果を媒介又は回避するために利点がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかしながら、以前に報告されているペプチドと比べて可溶性が高く、ＩＬ−１５に拮抗する生物学的活性が増強されたペプチド配列の同定が特に関係する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、国際公開第２００６／０２９５７８号に記載されるものよりも可溶性及び活性が高いペプチドを提供することによって上述の問題の解決策を示し、２番目のＬｙｓをＴｈｒに置換し、ペプチド二量体を得ることによって、５０％の阻害を生じる物質の濃度である、その阻害濃度５０（ＩＣ５０）を１３０μＭから８μＭに減少させる。前記配列である、配列番号１２は１０アミノ酸の直鎖ペプチドとして合成され、ＩＬ−１５Ｒαと相互作用し、ＩＬ−１５アンタゴニストの能力を示す）。
【００１４】
前記ペプチドを、ＩＬ−１５に対するそのアンタゴニスト活性に必須のアミノ酸を同定するために点アミノ酸置換によって最適化した。具体的には、２番目のＬｙｓに関して、電荷に影響を及ぼす置換、例えばＬｙｓを中性のＴｈｒ残基又は負に帯電したＧｌｕアミノ酸と置き換えることにより、１０倍のアンタゴニスト活性をこのペプチドに対して得た。更に、遊離システインを介して連結された２つのペプチド分子間で形成される二量体は、単量体よりも活性が７倍高いことを見出した。
【００１５】
ＣＴＬＬ−２細胞系のＩＬ−１５依存性増殖アッセイにおいて、活性が１０倍高いペプチドを得た。これは上述の置換から生じたペプチドである。このペプチドはまた、ＩＬ−１５αに結合する能力を保持する。
【００１６】
本発明の目的である、得られたペプチドは、配列表で配列番号１２として記載されるペプチド配列を含む。示したＬｙｓからＴｈｒへのアミノ酸変化の後に見出された活性の増加は驚くべきものであった。ペプチドの生物学的活性がその一次配列上の変化の後にこのように増加することは、本発明の実施形態の例において実証するように、以前の知見に基づいて当該技術分野における当業者が誰も予期しないものであった。
【００１７】
遊離Ｃｙｓを介する、配列番号１２として配列表で識別される単量体の連結によって得られる、化学的に合成されたペプチド二量体は、単量体よりも活性が７倍高く、国際公開第２００６／０２９５７８号に記載される元のペプチドよりも活性が１５倍高かった。
【００１８】
配列番号１２として記載されるアミノ酸配列として識別されるペプチドは、前記ペプチドの可溶性アルファ鎖に対する結合により、２００４年にＢｕｄａｌｇｉａｎら（Ｂｕｄａｌｇｉａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００４、４０：４２１９２〜４２２０１）によって報告されている膜ＩＬ−１５を介する逆シグナル伝達作用を阻害できる。
【００１９】
本発明は、単独で、又はステロイド抗炎症性薬（例えばコルチコステロイド）及び疾患の経過を改善する薬物（例えばメトトレキサート）などの任意の他の適切な分子と併用して、ＲＡを治療するための前記ペプチドの使用を含む。
【００２０】
本発明の別の実施形態は、乾癬及び皮膚Ｔ細胞性リンパ腫などの、その病変においてＩＬ−１５が疾患の経過の間に検出される皮膚疾患を治療するためのこのペプチドの局所使用を含む。
【００２１】
本発明の別の実施形態において、このペプチドは、腫瘍細胞膜において発現されるＩＬ−１５に対する可溶性ＩＬ−１５Ｒαの結合を阻害し、腫瘍細胞移動を阻害するために使用される。
【００２２】
本発明のペプチド対象物は、直鎖ペプチドであってもよく、又は二量体を形成してもよく、主に、ＩＬ−１５に拮抗するその活性によって特徴付けられる。一方で、本発明のペプチド対象物のインビトロでの効果は、ＣＴＬＬ−２マウス細胞系及びヒトリンパ球Ｋｉｔ２２５白血病細胞系の細胞増殖アッセイにおいて実証される。
【００２３】
本発明に記載されるペプチドは、国際公開第２００６／０２９５７８号に記載されるペプチドのＡｌａスキャニングによって同定した。各々の変異ペプチドを、固相合成法によって化学的に合成した。得られたペプチドを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製し、９５％より高い純度について、質量分析により分析した。各ペプチドを、ＩＬ−１５の生物学的活性を阻害する有効性について評価した。
【００２４】
本発明のペプチド対象物は、ＩＬ−１５Ｒαによって誘発されるＩＬ−８の発現を阻害する。この同じペプチドは、ＩＬ−１５Ｒαによって誘発されるＩＬ−６の発現及び腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）の放出を阻害する。
【００２５】
本発明の別の実施形態において、このペプチドは遺伝子操作又は化学合成によって得られる。本発明の一実施形態において、このペプチドは、配列番号１２として識別されるアミノ酸配列を含むペプチドの２分子間で形成される二量体として得られる。特定の実施形態において、この二量体は、遊離システインを介して二量体化された２つのペプチド分子から得られる。
【００２６】
また、本発明の対象物は、配列番号１２として記載される配列を有するペプチドをコードするデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）であり、その発現産物はＩＬ−１５Ｒα又はその可溶性画分に結合でき、ＩＬ−１５の生物学的活性を阻害する。本発明の一実施形態において、前記ＤＮＡ配列を有するベクターがこのペプチド配列の発現に使用され得る。得られた結果から、ＩＬ−１５の過剰発現によって特徴付けられる、上述のような疾患を治療するための治療手段として、本発明において請求されるペプチドの使用が示唆され、ＩＬ−１５アンタゴニストの使用が証明される。
【００２７】
したがって、本発明の対象物はまた、ＩＬ−１５Ｒαに依存するＩＬ−１５の生物学的活性を阻害できる治療用医薬組成物であり、前記医薬組成物は、配列番号１２として配列表に記載されるアミノ酸配列を含む。本発明の一実施形態において、治療用医薬組成物は二量体化されたペプチドを含む。本発明の別の実施形態において、ＩＬ−１５のＩＬ−１５Ｒα依存性生物学的活性を阻害できる治療用医薬組成物は、許容可能な医薬賦形剤とコンジュゲートした、又は混合した、単量体又は二量体としてのペプチドを含む。別の実施形態において、ＩＬ−１５のＩＬ−１５Ｒα依存性生物学的活性を阻害できる治療用医薬組成物は、前記ペプチド（配列番号１２）をコードする核酸鎖を含む。
【００２８】
本発明の対象はまた、関節リウマチ、クローン病、乾癬及び前立腺癌を治療するための医薬を製造するための、配列番号１２として配列表に記載されるアミノ酸配列を含むペプチドの使用である。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】ＣＴＬＬ−２細胞系のＩＬ−１５誘発性増殖に対するペプチドの異なる濃度の効果を示すグラフである。ＣＴＬＬ−２細胞を、ペプチドの連続希釈物と混合した３００ｐｇ／ｍＬのＩＬ−１５とインキュベートした。増殖を、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）でミトコンドリア染色を使用することによって測定した。図１Ａ：配列番号４及び配列番号５のペプチドの評価；図１Ｂ：配列番号２及び配列番号３のペプチドの評価；図１Ｃ：配列番号７、配列番号８及び配列番号９のペプチドの評価。
【図２】ヒトＩＬ−１５Ｒαのペプチド結合を表すグラフである。ペプチドによるＩＬ−１５のＩＬ−１５Ｒαへの結合の置換をＥＬＩＳＡによって評価した。
【図３】ＫｉＴ２２５細胞系のＩＬ−１５誘発性増殖に対する異なるペプチド濃度の効果を示すグラフである。Ｋｉｔ２２５細胞を、ペプチドの連続希釈物と混合した３００ｐｇ／ｍＬのＩＬ−１５とインキュベートした。増殖を、ＭＴＴミトコンドリア染色を使用することによって測定した。
【図４】一定のペプチド濃度にてＩＬ−１５の異なる濃度によって誘発されるＣＴＬＬ−２細胞系の増殖に対するペプチドの効果を示すグラフである。ＩＬ−１５の濃度は７５ｐｇ／ｍＬ（１）；１５０ｐｇ／ｍＬ（２）；３００ｐｇ／ｍＬ（３）であった。
【図５】ＩＬ−１５ＲαとインキュベートしたＰＣ−３細胞系の細胞中のＩＬ−８（図５Ａ）及びＩＬ−６（図５Ｂ）のｍＲＮＡの誘発に対するペプチドの阻害効果を示すグラフである。
【図６】ペプチドと滑液細胞とをインキュベートすることによるＴＮＦαの放出の阻害を示すグラフである。ＲＡ患者由来の滑液細胞を、ＩＬ−１５（１００ｎｇ／ｍＬ）及びペプチド（６５μＭ）と同時に４８時間インキュベートした。ＴＮＦαの量をＥＬＩＳＡによって測定した。外傷によって引き起こされる滑膜炎を示すコントロールのデータを示す。
【実施例】
【００３０】
本発明を以下の具現化した例により説明する。
（例１）
ＩＬ−１５Ｒαに結合し、ＩＬ−１５の生物学的機能を阻害するＩＬ−１５ペプチドの最適化
設計
ペプチドのパネルを、国際公開第２００６／０２９５７８号で請求されているペプチドの配列上の各アミノ酸をアラニン（Ａｌａ）アミノ酸で置換することによって設計した。別のペプチドのセットにおいて、システイン（Ｃｙｓ）をＳｅｒで置換し、ＬｙｓをＴｈｒ又はＧｌｕで置換した。
【００３１】
ペプチド合成
ペプチドを、シリンジ中でＦｍｏｃ／ｔＢｕ戦略を使用することによって合成した。Ｆｍｏｃ−Ａｍ−ＭＢＨＡ樹脂を０．５４ｍｍｏｌ／ｇにて使用し、合成手順を機械的攪拌下で実施した。ペプチドをトリフルオロ酢酸で処理し、凍結乾燥し、ＨＰＬＣ及び質量分析によって更に特徴付けた。全てのペプチドを９５％より高い純度で得、それらの対応する質量はそれらのアミノ酸配列について予想される通りであった。
【００３２】
（例２）
ＣＴＬＬ−２及びＫｉＴ２２５細胞系の増殖に対する記載されるペプチドの効果
ＣＴＬＬ−２及びＫｉＴ２２５細胞系は、ＩＬ−１５のサイトカインが存在する場合、ＩＬ−１５に依存し、増殖する。ＩＬ−１５に結合でき、ＩＬ−１５Ｒ由来のシグナル伝達を遮断する上記の分子は、それらの２種の細胞系の増殖を阻害する。
【００３３】
本発明のペプチドの中和能力を評価するために、それらのペプチドの連続希釈を、１０％のウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）を添加した２５μＬ体積のＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ）入りの９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ，ＵＳＡ）中で実施した。予め洗浄したＣＴＬＬ−２又はＫｉＴ２２５細胞を５×１０３細胞／ウェルにて加え、３０分間インキュベートし、飽和量の３００ｐｇ／ｍＬのＩＬ−１５をウェルごとに加えた。
【００３４】
ペプチドのアンタゴニスト活性もまた、各ペプチドを２６０μＭの一定濃度にしてＩＬ−１５の濃度を変化させることにより評価した。インキュベーションを、３７℃及び５％ＣＯ２にて７２時間実施した。増殖を、ＭＴＴミトコンドリア染色法（Ｃｏｓｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  １９８４、３１２：７６８−７７１）を使用することにより評価した。ＭＴＴは生細胞のミトコンドリアデヒドロゲナーゼにより赤色のホルマザンに還元する。ＩＣ５０を、３００ｐｇ／ｍＬのＩＬ−１５濃度にて各ペプチドについて測定した。
【００３５】
【表１】
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【００３６】
このアッセイを全てのペプチドを評価するために使用して、表１に示すＩＣ５０値を得ることができた。ＩＣ５０値は、Ｃｙｓ−Ａｌａ、Ｃｙｓ−Ｓｅｒ、Ｐｈｅ−Ａｌａ及びＧｌｙ−Ｇｌｕ変異体においてペプチドの阻害効果の損失を示し、この効果はＬｕｅ−Ａｌａ変異体において約５０％の影響を受ける。Ｌｙｓ−Ｔｈｒ変異体に関して５倍の阻害活性を得て、Ｌｙｓ−Ｔｈｒ変異体の二量体型において１５倍の阻害活性を得た。
【００３７】
図１Ａ、１Ｂ及び１Ｃは、Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ｃｙｓ−Ａｌａ、Ｌｅｕ１−Ａｌａ、Ｌｅｕ２−Ａｌａ、Ｍｅｔ−Ａｌａ、Ｔｈｒ−Ａｌａ及びＶａｌ−Ａｌａ変異体の異なるペプチド濃度についての５７６ｎｍにおける吸光度（Ｏ．Ｄ．）の挙動を表す。図３は、単量体及び二量体としてのＬｙｓ−Ｔｈｒ変異体の挙動を示し、ペプチドの濃度に依存する阻害効果及びＬｙｓ−Ｔｈｒ変異体の二量体についてのより高い阻害効果を示す。
【００３８】
ペプチドのアンタゴニスト活性もまた、一定のペプチド濃度にてＩＬ−１５濃度を変化させることにより評価した。図４は、ＩＬ−１５濃度における変異体Ｌｙｓ−Ｔｈｒペプチドのアンタゴニスト活性の依存を示す。
【００３９】
（例３）
ＩＬ−１５Ｒａに対する結合を置換するペプチドの能力を試験するための競合ＥＬＩＳＡ
ＩＬ１５−Ｒαに対するペプチド結合をＥＬＩＳＡによって特徴付けた。つまり、９６ウェルプレートを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で精製したＩＬ−１５でコーティングし、ＰＢＳ中で１％にてウシアルブミンを用いて遮断した。各ペプチドの希釈物をウェルに加え、プレートを３７℃にて１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、３７℃にて１時間、ＩＬ−１５Ｒα−Ｆｃとインキュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で再び洗浄し、抗Ｆｃ−ヒトＩｇＧペルオキシダーゼコンジュゲートを３７℃にて１時間、更にインキュベートした。洗浄後、抗原−抗体反応を、基質及び３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を加えることによって実施し、Ｏ．Ｄ．を４５０ｎｍにて読み取った。結果を図２に示し、Ｃｙｓ−Ａｌａ変異体（配列番号５）が、ＩＬ−１５のＩＬ１５−Ｒαへの結合を置換せず、変異体Ｐｈｅ−Ａｌａ（配列番号４）がＩＬ−１５を１０％のみ置換することを示す。
【００４０】
（例４）
前立腺癌細胞系ＰＣ−３におけるＩＬ−６及びＩＬ−８の発現に対するペプチド（配列番号１２）の効果の評価
ＰＣ−３細胞の細胞膜におけるＩＬ１５−Ｒαに対するＩＩ−１５の結合によって媒介される発現（Ｂｕｄａｇｉａｎ  Ｖ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２００４  ２７９：４２１９２〜４２２０１）である、ＩＬ−６及びＩＩ−８の発現に対するペプチド（配列番号１２）の効果を評価した。
【００４１】
２４ウェルプレート中で１．５×１０６細胞を、１００μｇ／ｍＬの配列番号１と配列番号１２のペプチド、及びＩＬ１５−Ｒα（１ｎｇ／ｍＬ）、さらには、ＩＬ１５−Ｒαと配列番号１と配列番号１２のペプチドの組合せとインキュベートすることにより実験を実施した。ＲＮＡを、ＴｒｉＲｅａｇｅｎｔ法（Ｓｉｇｍａ）により単離し、Ｏ．Ｄ．２６０／２８０ｎｍ比を測定し、アガロースゲル電気泳動により分析した。リアルタイム逆転写及びポリメラーゼ連鎖反応を、Ｒｏｔｏｒ  Ｇｅｎｅ６０００機器においてＱｕａｎｔｉｔｅｃｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ及びＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用することにより実施した。
【００４２】
図５Ａ及び５Ｂは、配列番号１２のペプチドが、炎症性サイトカインＩＬ−６及びＩＬ−８のＩＬ１５−Ｒαによって媒介される転写を阻害することを示す。
【００４３】
（例５）
ＲＡ患者の滑液細胞において、二量体としての配列番号１２のペプチドによって誘発されるＩＬ−１５媒介性ＴＮＦα産生の阻害
文書でインフォームドコンセントを取得後、ＲＡ患者から滑液を抽出し、３７℃にて４５分間、１０μｇ／ｍＬの液にてヒアルロニダーゼとインキュベートした。滑液細胞を、１０分間１２００ｒｐｍでの遠心分離後に取得した。細胞を、２×１０５細胞／ウェルにて播種した９６ウェル中で、５０μｇ／ｍＬのペプチド及び６０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１５及びまたペプチドとＩＬ−１５の組合せとインキュベートした。４８時間のインキュベーション後、上清を回収し、評価するまで−７０℃で保存した。ＴＮＦαの量をＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  ＤＴＡ５０）により定量した。
【００４４】
図６は、配列番号１２のペプチドが、ＲＡ患者の滑液細胞中でＴＮＦα分泌を阻害することを示す。
【００４５】
（例６）
ヒト乾癬の異種移植ＳＣＩＤマウスモデル
２〜３ヶ月齢のＳＣＩＤマウスに、乾癬患者からの１．５ｃｍ×１．５ｃｍの植皮を移植した。３週間後、マウスを無作為化し、３群に分けた：２週間隔日で、プラセボ、１０ｍｇ／ｋｇ体重の配列番号１２のペプチドで処置したマウス、及び１０ｍｇ／ｋｇのシクロスポリンＡで処置したマウス。最後の注射から１週間後にマウスを屠殺し、４ｍｍの生検を各々の異種移植から取得した。生検をパラフィンで包埋するためにホルマリンで固定し、ヘマトキシリンエオシン色素（Ｈ＆Ｅ）で染色した。
【００４６】
結果として、配列番号１２又は二量体としてのペプチドで処置したマウスに由来する乾癬患者からの植皮が、疾患の重症度の減少、表皮の厚さの著しい減少、著しく減少した数の炎症細胞及びケラチノサイトの周期並びに乾癬病巣において低い悪性度の錯角化を示すことを観察した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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