(57)【要約】多発性硬化症（ＭＳ）における疾患の進行を監視するためのバイオマーカーとして、１５−オキシステロール、例えば、１５−ケトコレステン（１５−ＫＥ）、１５−ケトコレスタン（１５−ＫＡ）、および／または１５−ヒドロキシコレステン（１５−ＨＣ）を使用する方法、ならびに、ポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼ−１（ＰＡＲＰ−１）の阻害剤を使用して、二次性進行型ＭＳ（ＳＰＭＳ）を治療する方法。
2012515924.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における多発性硬化症（ＭＳ）を診断する方法であって、
前記対象由来の試料を得ることと、
前記試料中の１つ以上の１５−オキシステロールのレベルを評価することと、
前記レベルを基準レベルと比較することと、を含み、
前記基準と比較した前記試料中の前記１５−オキシステロールの前記レベルは、前記対象がＭＳを有するかどうかの指標となる、方法。
【請求項２】
前記１つ以上の１５−オキシステロールは、１５−ケトコレステン（１５−ＫＥ）、１５−ケトコレスタン（１５−ＫＡ）、および１５−ヒドロキシコレステン（１５−ＨＣ）からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記基準レベルは、前記１５−オキシステロールの正常レベルを表す対照基準である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記レベルは、非罹患対象におけるレベルである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記基準レベルは、ＭＳを有する基準対象における前記１５−オキシステロールのレベルを表す疾患基準である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記基準対象は、ＲＲＭＳまたはＳＰＭＳを有する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
対象が再発寛解型ＭＳ（ＲＲＭＳ）または二次性進行型ＭＳ（ＳＰＭＳ）を有するかどうかを判定する方法であって、
前記対象由来の試料を得ることと、
１５−ケトコレスタン（１５−ＫＥ）または１５−ケトコレスタン（１５−ＫＡ）のうちの１つまたは両方のレベルを評価し、かつ前記試料中の１５−ヒドロキシコレステン（１５−ＨＣ）の存在および／またはレベルを評価することと、
１５−ＫＥ、１５−ＫＡ、および１５−ＨＣの前記レベルを、対応する基準と比較することと、を含み、
前記対照基準と比較した前記試料中の１５−ＫＥ、１５−ＫＡ、および１５−ＨＣの前記レベルは、前記対象がＲＲＭＳまたはＳＰＭＳを有するかどうかを示す、方法。
【請求項８】
前記基準は、非罹患対象における前記１５−ＫＥもしくは１５−ＫＡ、および１５−ＨＣの正常レベルを表す対照基準であるか、または、ＲＲＭＳもしくはＳＰＭＳを有する対象におけるレベルを表す疾患基準である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
基準と比較した１５−ＫＥまたは１５−ＫＡのレベルの増加、および１５−ＨＣのレベルの増加が見られることは、前記対象がＳＰＭＳを有するか、またはＳＰＭＳを発症するリスクが増加していることを示し、一方前記基準と比較して、１５−ＫＥおよび１５−ＫＡのレベルは増加したが、１５−ＨＣのレベルが増加していない場合は、前記対象がＲＲＭＳを有するか、またはまだＳＰＭＳに進行していないことを示す、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
対象におけるＳＰＭＳを診断する方法であって、
前記対象由来の試料を得ることと、
前記試料中の１５−ヒドロキシコレステン（１５−ＨＣ）のレベルを評価することと、
前記試料中の前記１５−ＨＣのレベルを、対応する基準と比較することと、を含み、前記基準と比較した前記試料中の前記１５−ＨＣのレベルは、前記対象がＳＰＭＳを有するかどうかの指標となる、方法。
【請求項１１】
前記基準は、非罹患対象における１５−ＨＣの正常レベルを表す対照基準であるか、および／または、ＳＰＭＳを有する対象におけるレベルを表す疾患基準である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記基準は、非罹患対象における１５−ＨＣの正常レベルを表す対照基準であり、１５−ＨＣレベルの増加が見られることは、前記対象がＳＰＭＳを有することを示す、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記試料は、前記対象由来の血清を含む、請求項１〜１２のうちのいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
ＳＰＭＳを有する対象を治療する方法であって、
ＳＰＭＳを有することに基づいて対象を選択することと、
ポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼ−１（ＰＡＲＰ−１）の特異的阻害剤を含む治療的有効量の組成物を前記対象に投与することと、を含む、方法。
【請求項１５】
ＳＰＭＳを有することに基づいて対象を選択することは、
前記対象由来の試料を得ることと、
前記試料中の１５−ヒドロキシコレステン（１５−ＨＣ）のレベルを判定することと、
前記試料中の前記１５−ＨＣのレベルを、非罹患対象における１５−ＨＣのレベルを表す対応する基準と比較することと、
前記基準と比較して、前記試料中の前記１５−ＨＣのレベルが増加している場合に、前記対象を選択することと、を含む、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
本出願は、２００９年１月２１日に出願された米国特許仮出願第６１／１４６，１６０号の利益を主張するものであり、その内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
連邦政府による資金提供を受けた研究開発に関する記載
本発明は、米国国立衛生研究所により付与された承認番号ＡＩ４３４５８−０１およびＮＳ３８０３７の下、米国政府の支援によりなされたものである。米国政府は、本発明において特定の権利を有する。
本発明は、とりわけ、多発性硬化症（ＭＳ）における疾患の進行を監視するためのバイオマーカーとして１５−オキシステロールを使用する方法、ならびに、ポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼ−１（ＰＡＲＰ−１）の阻害剤を使用して、二次性進行型ＭＳ（ＳＰＭＳ）を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多発性硬化症（ＭＳ）は、中枢神経系（ＣＮＳ）の炎症性脱髄疾患である。ＭＳは、初めに再発寛解型疾患（ＲＲＭＳ）として顕在化し、続いて、ＭＳ患者の大半に神経学的障害の進行性蓄積（二次性進行型ＭＳ、ＳＰＭＳ）が起こる。いくつかの治療法は、ＲＲＭＳに対する好ましい効果を示すが、それらは、通常、ＳＰＭＳに対しては無効であり、また、ＳＰＭＳへの移行を監視するために利用可能なマーカーが存在しない。
多発性硬化症（ＭＳ）は、若年層における神経学的障害の主な原因である（Ｎｏｓｅｗｏｒｔｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４３，９３８−９５２（２０００））。患者の８５％において、ＭＳは、最初、中枢神経系（ＣＮＳ）に対する急性自己免疫発作に続いて完全回復が見られる、再発寛解型の経過（ＲＲＭＳ）をたどる（Ｃｏｍｐｓｔｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｌｅｓ，Ｌａｎｃｅｔ  ３７２，１５０２−１５１７（２００８））。ＲＲＭＳ患者の大半は、進行性、不可逆性の神経学的障害の蓄積によって特徴付けられる、二次性進行型ＭＳ（ＳＰＭＳ）を引き続き発症する（Ｒｏｖａｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌ  ５，３４３−３５４（２００６））。ＳＰＭＳを特徴付ける進行性および不可逆性の障害は、新しい炎症性病変の非存在下において生じることから、ＭＳのこの段階では、他の機構が作用している可能性が示唆される（Ｒｏｖａｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌ  ５，３４３−３５４（２００６））。実際に、適応性の炎症反応を停止させる治療は、ＲＲＭＳの管理に対する好ましい効果を示すが、通常、ＳＰＭＳに対しては無効である（Ｌｏｐｅｚ−Ｄｉｅｇｏ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｅｒ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  ７，９０９−９２５（２００８））。よって、進行性ＭＳの新しい治療法およびＲＲＭＳからＳＰＭＳへの移行を監視するためのバイオマーカーを同定するために、ＳＰＭＳへの移行に関与するプロセスを特徴付けることが重要である。
急性および慢性の両方のＣＮＳの炎症および脱髄は、軸索損傷を引き起こすが（Ｔｒａｐｐ  ａｎｄ  Ｎａｖｅ，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ３１，２４７−２６９（２００８）において考察される）、それはＲＲＭＳ過程の初期に検出することができる（Ｔｒａｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３３８，２７８−２８５（１９９８））。しかしながら、進行性  そして不可逆性の障害は、おそらく脳内で作用する代償的機構の結果として、ＲＲＭＳのこれらの早期段階を特徴付けない（Ｔｒａｐｐ  ａｎｄ  Ｎａｖｅ，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ３１，２４７−２６９（２００８））。よって、ＳＰＭＳへの臨床的移行は、ニューロンの欠損が蓄積されて、ＣＮＳの可塑性によって補完することができない閾値に到達したときに生じることが示唆されている。
【０００３】
また、ＣＮＳの炎症の性質における変化も、ＳＰＭＳへの移行と関連付けられている。健常対照またはＲＲＭＳ患者由来の樹状細胞（ＤＣ）と比較すると、ＳＰＭＳ患者由来のＤＣは、より高いレベルのＩＬ−１２およびＩＬ−１８を分泌する（Ｂａｌａｓｈｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ５５，１９２−１９８（２０００）；Ｂａｌａｓｈｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４，５９９−６０３（１９９７）、Ｃｏｍａｂｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １０２，６７１−６７８（１９９８）、Ｋａｒｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ  １２５，１３４−１４０（２００２））。さらに、ＳＰＭＳ患者由来のＤＣは、より高いレベルの共刺激分子ＣＤ８０、減少したレベルの抑制分子ＰＤＬ１を発現し、Ｔｈ１細胞の活性化においてより効率的である（Ｋａｒｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７７，４１９６−４２０２（２００６））。これらの観察およびＳＰＭＳに対する順応免疫応答を標的とする治療法の限られた有効性に基づいて、順応免疫応答および天然性免疫応答の両方が初期ＲＲＭＳを促進する一方で、持続性の天然性免疫がＳＰＭＳに関与していると提案されている（Ｗｅｉｎｅｒ，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ  ２５５  Ｓｕｐｐｌ  １，３−１１（２００８））。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、ＳＰＭＳ患者において１５−オキシステロール１５α−ヒドロキシコレステン（１５−ＨＣ）の血清レベルが高いという発見に少なくとも一部基づいている。１５−ＨＣは、ポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼ−１（ＰＡＲＰ−１）に関与するＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）２依存性のシグナル伝達経路によって、ミクログリア、マクロファージ、および星状細胞を活性化した。単球におけるＰＡＲＰ−１の活性は、ＲＲＭＳにおいて上方制御されたが、ＳＰＭＳではより高いレベルを示した。ＰＡＲＰ−１の阻害は、実験的ＳＰＭＳにおいて軸索消失および進行性障害を抑制した。よって、１５−ＨＣは、ＭＳにおける疾患の進行を監視するためのバイオマーカーであり、ＰＡＲＰ−１は、ＳＰＭＳの新しい治療標的である。
一態様において、本発明は、対象における多発性硬化症（ＭＳ）を診断するための方法、例えば、診断の補助となるインビトロ法を提供する。方法は、対象から試料、例えば、対象由来の血清を含む試料を得ることと、試料中の１つ以上の１５−オキシステロール、例えば、１５−ケトコレステン（１５−ＫＥ）、１５−ケトコレスタン（１５−ＫＡ）、および／または１５−ヒドロキシコレステン（１５−ＨＣ）のレベルを評価することと、そのレベルを基準レベルと比較することと、を含む。基準と比較した試料中の１５−オキシステロールのレベルは、対象がＭＳを有するかどうかの指標となる。いくつかの実施形態において、基準レベルは、１５−オキシステロールの正常レベル、例えば、非罹患対象におけるレベルを表す対照基準であり、対照基準を超える試料中のレベルは、対象がＭＳ、例えば、ＲＲＭＳまたはＳＰＭＳを有することを示す。いくつかの実施形態において、基準レベルは、ＭＳ、例えば、ＲＲＭＳまたはＳＰＭＳを有する対象における１５−オキシステロールのレベルを表す疾患基準であり、試料中のレベルと疾患基準との間の統計的類似性は、対象がＭＳを有することを示す。
【０００５】
別の態様において、本発明は、対象が再発寛解型ＭＳ（ＲＲＭＳ）または二次性進行型ＭＳ（ＳＰＭＳ）を有するかどうかを判定するための方法、例えば、その判定を行う際の補助となるインビトロ法を特徴とする。方法は、対象から試料、例えば、対象由来の血清を含む試料を得ることと、１５−ケトコレステン（１５−ＫＥ）または１５−ケトコレスタン（１５−ＫＡ）のうちの１つまたは両方のレベルを評価し、ならびに試料中の１５−ヒドロキシコレステン（１５−ＨＣ）の存在および／またはレベルを評価することと、１５−ＫＥ、１５−ＫＡ、および１５−ＨＣのレベルを、対応する基準と評価することと、を含む。対照基準と比較した試料中の１５−ＫＥ、１５−ＫＡ、および１５−ＨＣのレベルは、対象がＲＲＭＳまたはＳＰＭＳを有するかどうかを示す。いくつかの実施形態において、基準は非罹患対象における１５−ＫＥもしくは１５−ＫＡ、および１５−ＨＣの正常レベルを表す対照基準であるか、および／またはＲＲＭＳもしくはＳＰＭＳを有する対象におけるレベルを表す疾患基準である。いくつかの実施形態において、対照基準と比較した１５−ＫＥまたは１５−ＫＡのレベルの増加、および１５−ＨＣのレベルの増加が見られることは、対象がＳＰＭＳを有するか、またはＳＰＭＳを発症するリスクが増加していることを示し、対照基準と比較して、１５−ＫＥおよび１５−ＫＡのレベルは増加したが、１５−ＨＣのレベルが増加していない場合は、対象がＲＲＭＳを有すること、例えば、まだＳＰＭＳに進行していないことを示す。
さらなる態様において、本発明は、対象におけるＳＰＭＳを診断する方法、例えば、診断の補助となるインビトロ法を提供する。方法は、対象から試料、例えば、対象由来の血清を含む試料を得ることと、試料中の１５−ヒドロキシコレステン（１５−ＨＣ）のレベルを評価することと、試料中の１５−ＨＣのレベルを対応する基準と比較することと、を含み、基準と比較した試料中の１５−ＨＣのレベルは、対象がＳＰＭＳを有するかどうかの指標となる。いくつかの実施形態において、基準は、非罹患対象における１５−ＨＣの正常レベルを表す対照基準であるか（その場合、対照基準のレベルより高い試料中のレベルは、対象がＳＰＭＳを有するか、またはＳＰＭＳを発症する高いリスクを有することを示す）、および／またはＳＰＭＳを有する対象におけるレベルを表す疾患基準である（その場合、疾患基準に統計的に類似する試料中のレベルは、対象がＳＰＭＳを有するか、またはＳＰＭＳを発症する高いリスクを有することを示す）。いくつかの実施形態において、例えば、対照基準と比較して１５−ＨＣの増加が見られることは、対象がＳＰＭＳを有することを示す。
【０００６】
さらに別の態様において、本発明は、ＳＰＭＳを有する対象を治療するための方法を提供する。方法は、ＳＰＭＳを有することに基づいて対象を選択することと、ポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼ−１（ＰＡＲＰ−１）の特異的阻害剤を含む治療的有効量の組成物を対象に投与することと、を含む。ＳＰＭＳを有することに基づいて対象を選択することは、例えば、対象由来の試料を得ることと、試料中の１５−ヒドロキシコレステン（１５−ＨＣ）のレベルを判定することと、試料中の１５−ＨＣのレベルを非罹患対象における１５−ＨＣのレベルを表す対応する基準と比較することと、基準と比較して、試料中の前記１５−ＨＣのレベルが増加している場合に、対象を選択することと、を含むことができる。対象がＳＰＭＳを有することを判定するため、およびそれに基づいて対象を選択するための他の方法も、当該技術分野において既知である。また、ＰＡＲＰ−１の特異的阻害剤を含む組成物、ＳＰＭＳの治療におけるＰＡＲＰ−１の特異的阻害剤の使用、およびＳＰＭＳの治療のための薬物の製造におけるＰＡＲＰ−１の特異的阻害剤の使用も、本明細書に含まれる。
【０００７】
別途規定のない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。本発明における使用のために本明細書に記載される方法および材料、当該技術分野において既知である他の好適な方法および材料もまた、使用することができる。材料、方法、および実施例は、例示のみを目的としており、限定的であることを意図するものではない。全ての刊行物、特許出願、特許、順序、データベースエントリーおよび本明細書で述べる他の参考文献は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。矛盾がある場合は、定義を含む本明細書が優先される。
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および図、ならびに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ】ヒトおよび実験的ＳＰＭＳにおける１５−ＨＣの血清レベルの増加を示す３つの棒グラフの各組である。１Ａ．健常対照（ｎ＝１０）、ＲＲＭＳ患者（ｎ＝１２）、およびＳＰＭＳ患者（ｎ＝１０）において、ＧＣ／ＭＳを使用して１５−オキシステロールの濃度を測定した。ＲＲＭＳ患者では、１５−ＫＥ（左パネル）および１５−ＫＡ（中央パネル）のレベルは増加したが、１５−ＨＣ（右パネル）のレベルには増加が見られず、ＳＰＭＳ患者では、健常対照およびＲＲＭＳ患者と比較して、すべての１５−オキシステロールのレベルが増加した。
【図１Ｂ】ヒトおよび実験的ＳＰＭＳにおける１５−ＨＣの血清レベルの増加を示す３つの棒グラフの各組である。１Ｂ．実験的ＮＯＤ  ＳＰＭＳの急性発作のピーク時（１８日目）または進行段階において（５５日目）、１５−オキシステロール（１５−ＫＥ（左パネル）、１５−ＫＡ（中央パネル）、および１５−ＨＣ（右パネル）の濃度を測定した。データを平均値±ＳＥＭとして表す。
【図２Ａ】ＰＡＲＰ−１の阻害が、実験的ＳＰＭＳにおける軸索消失および進行性障害を抑制することを示している。２Ａ．免疫化の時点および４８時間後に、ＣＦＡ中のＭＯＧ３５−５５（１５０ｍｇ）および百日咳毒素（マウス１匹当たり１５０ｎｇ）が投与される皮下免疫化によって、実験的ＳＰＭＳが１０週齢ＮＯＤマウスに導入されたときの、ＡＩＱ処理の結果を示す線グラフである。０日目から開始して、毎日ＡＩＱ（３ｍｇ／体重１Ｋｇ）を投与した（ｎ＝１群当たり１０匹の動物）。対照群はＰＢＳで処理した。
【図２Ｂ】ＰＡＲＰ−１の阻害が、実験的ＳＰＭＳにおける軸索消失および進行性障害を抑制することを示している。２Ｂ．ＥＡＥの進行の回帰分析の結果を示す一対の線グラフである（上パネル＝急性段階、下パネル＝慢性段階）。
【図２Ｃ】ＰＡＲＰ−１の阻害が、実験的ＳＰＭＳにおける軸索消失および進行性障害を抑制することを示している。２Ｃ．ＮＯＤマウスにおけるＥＡＥの病理組織学的分析からの４つの画像である。５５日目に撮影した各群からの代表的な脊髄部分を、脱髄または軸索消失を分析するために、それぞれ、ルクソールファストブルー（上２つの画像）またはＢｉｅｌｓｃｈｏｗｓｋｙの銀染色（下２つの画像）で染色した。図の右側にある棒グラフは、ＡＩＱ処理後に、脱髄の割合（上）および軸索消失の割合（下）における有意な減少を示す。
【図３Ａ】ＰＡＲＰ−１の阻害は、実験的ＳＰＭＳにおける適応性の脳炎誘発性反応を妨げないことを示している。３Ａ．ビヒクルで処理したマウスまたはＡＩＱで処理したマウス由来の脾細胞を、ＭＯＧ３５−５５（右パネル）または抗ＣＤ３（左パネル）に対する増殖性リコール反応について検定したときの結果を示す、２つの棒グラフである。２群間で統計学的な差異は見られなかった（一元配置分散分析、Ｐ＞０．０５、平均値±ＳＥＭ）。
【図３Ｂ】ＰＡＲＰ−１の阻害は、実験的ＳＰＭＳにおける適応性の脳炎誘発性反応を妨げないことを示している。３Ｂ．Ｉｂａ−１に対する抗体で染色したミクログリア細胞およびＣＮＳ浸潤マクロファージ（左上）、ＧＦＡＰに対する抗体で染色した星状細胞（左下）、およびその後のＰＡＲに対する抗体を用いたＰＡＲＰ−１の活性化（中央列）の一セットの６枚の顕微鏡写真である（合体した画像を右側に示す）。
【図３Ｃ】ＰＡＲＰ−１の阻害は、実験的ＳＰＭＳにおける適応性の脳炎誘発性反応を妨げないことを示している。３Ｃ．５５日目にＡＩＱで処理したマウスまたは対照で処理したマウスから単離したＣＮＳのＣＤ１１ｂ＋細胞におけるＰＡＲＰ−１酵素活性の測定結果を示す棒グラフである（一元配置分散分析、Ｐ＜０．０１、平均値±ＳＥＭ）。
【図３Ｄ】ＰＡＲＰ−１の阻害は、実験的ＳＰＭＳにおける適応性の脳炎誘発性反応を妨げないことを示している。３Ｄ．ＨＣ、ＲＲＭＳ患者、およびＳＰＭＳ患者から単離した末梢血単球におけるＰＡＲＰ−１酵素活性を示す棒グラフである（平均値±ＳＥＭ）。
【０００９】
【図４Ａ】１５−ＨＣによるミクログリア、マクロファージ、および星状細胞の活性化の結果を示す。４Ａ．組み換えＰＡＲＰ−１を１５−ＨＣまたは７−ＫＣで事前処理したＤＮＡとともにインキュベートした、無細胞系におけるＰＡＲＰ−１の活性を示す棒グラフである。事前処理を行わなかったＤＮＡを陰性対照として、ｓｓｂ−ＤＮＡを陽性対照として使用した。データを平均値±ＳＥＭとして表す。
【図４Ｂ】１５−ＨＣによるミクログリア、マクロファージ、および星状細胞の活性化の結果を示す。４Ｂ．１５−ＨＣまたは７−ＫＣでインキュベートしたミクログリア、マクロファージ、または星状細胞において測定したＰＡＲＰ−１の活性を示す一対の棒グラフである。データを、ビヒクルで処理した細胞と脂肪で処理した細胞との間の倍率変化として表す（平均値ＳＥＭ）。
【図４Ｃ】１５−ＨＣによるミクログリア、マクロファージ、および星状細胞の活性化の結果を示す。４Ｃ．５−ＡＩＱの存在下で１５−ＨＣまたは７−ＫＣ（１０ｍｇ／ｍＬ）で活性化したミクログリア、マクロファージ、または星状細胞におけるＰＡＲＰ−１の活性の阻害の割合を示す一対の棒グラフである。
【図４Ｄ】１５−ＨＣによるミクログリア、マクロファージ、および星状細胞の活性化の結果を示す。４Ｄ．１５−ＨＣまたは７−ＫＣで処理したミクログリア、マクロファージ、または星状細胞によるＴＮＦ−α、ＣＣＬ−２、およびＮＯの分泌レベルを示す表である（平均値±ＳＥＭ）。
【００１０】
【図５Ａ】１５−ＨＣによるＰＡＲＰ−１の活性化を媒介するシグナル伝達イベントを示す棒グラフであり、１５−オキシステロールは、ＤＮＡ損傷を介してＰＡＲＰ−１を活性化することができることを示している。５Ａ．１５−オキシステロールまたは７−ＫＣによるミクログリアのＰＡＲＰ−１活性化の時間的経過を示す棒グラフである。ＰＡＲＰ−１の活性を平均値±ＳＥＭとして示す。
【図５Ｂ】１５−ＨＣによるＰＡＲＰ−１の活性化を媒介するシグナル伝達イベントを示す棒グラフであり、１５−オキシステロールは、ＤＮＡ損傷を介してＰＡＲＰ−１を活性化することができることを示している。５Ｂ．１５−ＨＣによって活性化されたシグナル伝達経路を示す一セットの８つの棒グラフである。ミクログリア細胞を１５−ＨＣで刺激し、１分、５分、および１５分溶解させた。溶解物でシグナル伝達アレイを作製し、リン特異的抗体でプローブした。１５ａ−ＨＣは、ＴＡＫ１（右上）、ＩＲＡＫ（左上）、Ａｋｔ（２列目左）、ｐ３８  ＭＡＰＫ（２列目右）、Ｐｙｋ２（３列目左）、ＰＫＣ（３列目右）、ＰＩ３Ｋ（下列左）、およびＥｒｋ１／２（下列右）のリン酸化を増加させる（平均値±ＳＥＭ）。
【図５Ｃ】１５−ＨＣによるＰＡＲＰ−１の活性化を媒介するシグナル伝達イベントを示す棒グラフであり、１５−オキシステロールは、ＤＮＡ損傷を介してＰＡＲＰ−１を活性化することができることを示している。５Ｃ．キナーゼ阻害剤の存在下における、１５−ＨＣによるミクログリアのＰＡＲＰ−１の活性化を示す棒グラフである（平均値±ＳＥＭ）。
【図５Ｄ】１５−ＨＣによるＰＡＲＰ−１の活性化を媒介するシグナル伝達イベントを示す棒グラフであり、１５−オキシステロールは、ＤＮＡ損傷を介してＰＡＲＰ−１を活性化することができることを示している。５Ｄ．ＥＲＫおよびＰＡＲＰ−１の共免疫沈降の結果を示す免疫ブロットおよび棒グラフである。ミクログリア細胞を１５−ＨＣで処理し、溶解させ、リン酸化Ｅｒｋに対する抗体で免疫沈降させ、次いで、プルダウンした物質をＰＡＲＰ−１に対する抗体でプローブした。
【００１１】
【図６Ａ】１５−ＨＣによるＰＡＲＰ−１の活性化がＴＬＲ２  Ａによって媒介されることを示す棒グラフである。ＴＬＲ２遮断抗体は、１５ａ−ＨＣによるＰＡＲＰ−１の活性化を無効にする。６Ａ．ＴＬＲ２もしくはＴＬＲ４に対する遮断抗体、またはアイソタイプ対照の存在下で１５−ＨＣで活性化したミクログリア、マクロファージ、または星状細胞におけるＰＡＲＰ−１の活性を示す一セットの３つの棒グラフである（平均値±ＳＥＭ）。
【図６Ｂ】１５−ＨＣによるＰＡＲＰ−１の活性化がＴＬＲ２  Ａによって媒介されることを示す棒グラフである。６Ｂ．ＴＬＲ２をコードするプラスミドでトランスフェクトしたかまたはしていない、１５−ＨＣで活性化したＨＥＫ−２９３細胞におけるＰＡＲＰ−１の活性を示す棒グラフである（平均値±ＳＥＭ）。
【図７】適応性の脳炎誘発性免疫応答は、ＰＡＲＰ−１の阻害によって影響を受けないことを示す一セットの８つの棒グラフである。対照で処理したマウスまたはＡＩＱで処理したマウスから調製した脾細胞を、ＭＯＧ３５−５５（右カラム）またはＣＤ３に対する抗体（左カラム）を用いてインビトロで活性化し、４８時間で上清のサイトカインレベルをテストした。上列：ＩＦＮ−γ、２列目：ＩＬ−１７、３列目；ＩＬ−１０、下列：ＴＧＦ−β
【図８】１５−ＨＣで誘発したシグナル伝達経路が、ＴＬＲ２に対する遮断抗体を用いて封鎖されたことを示す、一セットの８対のボルトおよび棒グラフである。培地に１５−ＨＣを添加する前に、１０ｍｇ／ｍＬのＴＬＲ２遮断抗体またはアイソタイプ対照でミクログリア細胞を４５分間インキュベートし、ウエスタンブロットによりシグナル伝達イベントを分析した。
【図９】１５−ＨＣによって活性化し、ウエスタンブロットにより検証したシグナル伝達経路を示す一セットの８つの棒グラフである。ＲＰＡの構築のために使用したのと同様の条件において調製した細胞溶解物をウエスタンブロットにより分析し、ＲＰＡで同定された該当する標的の総タンパク質レベルおよびリン酸化タンパク質レベルを検出した。リン酸化タンパク質／総タンパク質の比率が示される。
【００１２】
【図１０Ａ】ＴＬＲ２が媒介した１５−ＨＣによるＰＡＲＰ−１の活性化を示す棒グラフである。１５−ＨＣ単独で、またはＡＩＱ、ＴＬＲ２に対する遮断抗体、もしくはＩＣ対照でインキュベートしたＰＢＭＣのＰＡＲＰ−１酵素活性（１０Ａ）ならびにＴＮＦαおよびＣＣＬ２（１０Ｂ）。
【図１０Ｂ】ＴＬＲ２が媒介した１５−ＨＣによるＰＡＲＰ−１の活性化を示す棒グラフである。１５−ＨＣ単独で、またはＡＩＱ、ＴＬＲ２に対する遮断抗体、もしくはＩＣ対照でインキュベートしたＰＢＭＣのＰＡＲＰ−１酵素活性（１０Ａ）ならびにＴＮＦαおよびＣＣＬ２（１０Ｂ）。
【図１１Ａ】ＰＡＲＰ−１活性のＦＡＣＳに基づく検出結果を示す。１１A.１５−ＨＣ単独で、またはＡＩＱと兼てＴＬＲ２に対する遮断抗体（ＴＬＲ２  ＢＬ）、もしくはＩＣ対照（ＴＬＲ２  ＩＣ）でインキュベートしたＰＢＭＣのＰＡＲ染色（ＦＡＣＳによって検出された）を示す一セットの５つのヒストグラムである。
【図１１Ｂ】ＰＡＲＰ−１活性のＦＡＣＳに基づく検出結果を示す。１１Ｂ．ＦＡＣＳによって検出されたＰＡＲ染色と、異なる濃度の１５−ＨＣで活性化したＰＢＭＣ上で検出されたＰＡＲＰ−１酵素活性との相関を示す線グラフである。
【図１２Ａ】ＳＰＭＳ患者の天然性免疫系の細胞におけるＰＡＲＰ−１活性の増加を示す３つのヒストグラムと対になった各棒グラフである。健常対照（ＨＣ）、ＲＲＭＳ患者、およびＳＰＭＳ患者の炎症性単球（１２Ａ）、古典的単球（図１２Ｂ）、および樹状細胞（１２Ｃ）において、ＦＡＣＳによって検出された平均ＰＡＲＰ−１活性。５つの試料／群の平均蛍光強度（ＭＦＩ）±ＳＤとしてデータを示す。ＰＡＲ染色の代表的なＦＡＣＳプロットも示される。
【図１２Ｂ】ＳＰＭＳ患者の天然性免疫系の細胞におけるＰＡＲＰ−１活性の増加を示す３つのヒストグラムと対になった各棒グラフである。健常対照（ＨＣ）、ＲＲＭＳ患者、およびＳＰＭＳ患者の炎症性単球（１２Ａ）、古典的単球（図１２Ｂ）、および樹状細胞（１２Ｃ）において、ＦＡＣＳによって検出された平均ＰＡＲＰ−１活性。５つの試料／群の平均蛍光強度（ＭＦＩ）±ＳＤとしてデータを示す。ＰＡＲ染色の代表的なＦＡＣＳプロットも示される。
【図１２Ｃ】ＳＰＭＳ患者の天然性免疫系の細胞におけるＰＡＲＰ−１活性の増加を示す３つのヒストグラムと対になった各棒グラフである。健常対照（ＨＣ）、ＲＲＭＳ患者、およびＳＰＭＳ患者の炎症性単球（１２Ａ）、古典的単球（図１２Ｂ）、および樹状細胞（１２Ｃ）において、ＦＡＣＳによって検出された平均ＰＡＲＰ−１活性。５つの試料／群の平均蛍光強度（ＭＦＩ）±ＳＤとしてデータを示す。ＰＡＲ染色の代表的なＦＡＣＳプロットも示される。
【００１３】
【図１３Ａ】ＲＲＭＳおよびＳＰＭＳ患者の順応免疫系の細胞におけるＰＡＲＰ−１活性の増加を示す３つのヒストグラムと対になった各棒グラフである。健常対照（ＨＣ）、ＲＲＭＳ患者、およびＳＰＭＳ患者のＣＤ８＋Ｔ細胞（１３Ａ）、Ｂ細胞（１３Ｂ）、およびＣＤ４＋Ｔ細胞（１３Ｃ）において、ＦＡＣＳによって検出された平均ＰＡＲＰ−１活性。５つの試料／群の平均蛍光強度（ＭＦＩ）±ＳＤとしてデータを示す。ＰＡＲ染色の代表的なＦＡＣＳプロットも示される。
【図１３Ｂ】ＲＲＭＳおよびＳＰＭＳ患者の順応免疫系の細胞におけるＰＡＲＰ−１活性の増加を示す３つのヒストグラムと対になった各棒グラフである。健常対照（ＨＣ）、ＲＲＭＳ患者、およびＳＰＭＳ患者のＣＤ８＋Ｔ細胞（１３Ａ）、Ｂ細胞（１３Ｂ）、およびＣＤ４＋Ｔ細胞（１３Ｃ）において、ＦＡＣＳによって検出された平均ＰＡＲＰ−１活性。５つの試料／群の平均蛍光強度（ＭＦＩ）±ＳＤとしてデータを示す。ＰＡＲ染色の代表的なＦＡＣＳプロットも示される。
【図１３Ｃ】ＲＲＭＳおよびＳＰＭＳ患者の順応免疫系の細胞におけるＰＡＲＰ−１活性の増加を示す３つのヒストグラムと対になった各棒グラフである。健常対照（ＨＣ）、ＲＲＭＳ患者、およびＳＰＭＳ患者のＣＤ８＋Ｔ細胞（１３Ａ）、Ｂ細胞（１３Ｂ）、およびＣＤ４＋Ｔ細胞（１３Ｃ）において、ＦＡＣＳによって検出された平均ＰＡＲＰ−１活性。５つの試料／群の平均蛍光強度（ＭＦＩ）±ＳＤとしてデータを示す。ＰＡＲ染色の代表的なＦＡＣＳプロットも示される。
【図１４Ａ】ＨＣ、ＲＲＭＳ、およびＳＰＭＳにおいて、１５−ＨＣが、ＴＬＲ２により同様のレベルのＰＡＲＰ−１活性化を誘発することを示す。１４Ａ．ＨＣ（左カラム）、ＲＲＭＳ患者（中央カラム）、またはＳＰＭＳ患者（右カラム）から採取し、無刺激のままか（上列）、あるいは１５−ＨＣ単独で（２列目）、またはＡＩＱ、ＴＬＲ２に対する遮断抗体（４列目）、もしくはＩＣ対照（下列）で活性化した（３列目）ＰＢＭＣのＰＡＲ染色を示す一セットの１５個のヒストグラムである。
【図１４Ｂ】ＨＣ、ＲＲＭＳ、およびＳＰＭＳにおいて、１５−ＨＣが、ＴＬＲ２により同様のレベルのＰＡＲＰ−１活性化を誘発することを示す。１４Ｂは、１４Ａのヒストグラムの５つの試料／群の平均蛍光強度（ＭＦＩ）±ＳＤを示す棒グラフである。
【図１５Ａ】ＨＣ、ＲＲＭＳ、およびＳＰＭＳにおいて、同様のレベルのＰＡＲＰ−１の活性化がＴＬＲアゴニストによって誘発されることを示す。１５Ａは、ＨＣ（左カラム）、ＲＲＭＳ患者（中央カラム）、またはＳＰＭＳ患者（右カラム）から採取し、刺激を与えないか（上列）、またはｐｇＬＰＳ（２列目）、ｐｏｌｙＩＣ（３列目）、ｅｃＬＰＳ（４列目）、フラジェリン（５列目）、イミキモド（６列目）、ｓｓＲＮＡ（７列目）、またはＣｐＧ（８列目）で活性化したＰＢＭＣのＰＡＲ染色を示す、一セットの２４個のヒストグラムである。
【図１５Ｂ】ＨＣ、ＲＲＭＳ、およびＳＰＭＳにおいて、同様のレベルのＰＡＲＰ−１の活性化がＴＬＲアゴニストによって誘発されることを示す。１５Ｂは、１４Ａのヒストグラムの５つの試料／群の平均蛍光強度（ＭＦＩ）±ＳＤを示す棒グラフである。
【図１６Ａ】ＲＲＭＳ患者におけるＴＬＲ２アゴニストＨＳＰ６０（１６Ａ）、およびＳＰＭＳ患者における１５−ＨＣ（１６Ｂ）のレベルの増加をそれぞれ示す点グラフおよび棒グラフである。ＨＳＰ６０（１６Ａ）および１５−ＨＣ（１６Ｂ）のレベルは、ＨＣ、ＲＲＭＳ患者、およびＳＰＭＳ患者から採取した血清試料において判定した。
【図１６Ｂ】ＲＲＭＳ患者におけるＴＬＲ２アゴニストＨＳＰ６０（１６Ａ）、およびＳＰＭＳ患者における１５−ＨＣ（１６Ｂ）のレベルの増加をそれぞれ示す点グラフおよび棒グラフである。ＨＳＰ６０（１６Ａ）および１５−ＨＣ（１６Ｂ）のレベルは、ＨＣ、ＲＲＭＳ患者、およびＳＰＭＳ患者から採取した血清試料において判定した。
【００１４】
【図１７Ａ】ＨＳＰ６０ではなく、１５−ＨＣが、天然性免疫系の細胞においてＰＡＲＰ−１を活性化することを示す棒グラフである。ＨＳＰ６０、１５−ＨＣで処理および活性化したか、または未処理の健常対照（ＨＣ）の古典的単球（１７Ａ）、炎症性単球（１７Ｂ）、および樹状細胞（１７Ｃ）においてＦＡＣＳによって判定した平均ＰＡＲＰ−１活性。５つの試料／群の平均蛍光強度（ＭＦＩ）±ＳＤとしてデータを示す。
【図１７Ｂ】ＨＳＰ６０ではなく、１５−ＨＣが、天然性免疫系の細胞においてＰＡＲＰ−１を活性化することを示す棒グラフである。ＨＳＰ６０、１５−ＨＣで処理および活性化したか、または未処理の健常対照（ＨＣ）の古典的単球（１７Ａ）、炎症性単球（１７Ｂ）、および樹状細胞（１７Ｃ）においてＦＡＣＳによって判定した平均ＰＡＲＰ−１活性。５つの試料／群の平均蛍光強度（ＭＦＩ）±ＳＤとしてデータを示す。
【図１７Ｃ】ＨＳＰ６０ではなく、１５−ＨＣが、天然性免疫系の細胞においてＰＡＲＰ−１を活性化することを示す棒グラフである。ＨＳＰ６０、１５−ＨＣで処理および活性化したか、または未処理の健常対照（ＨＣ）の古典的単球（１７Ａ）、炎症性単球（１７Ｂ）、および樹状細胞（１７Ｃ）においてＦＡＣＳによって判定した平均ＰＡＲＰ−１活性。５つの試料／群の平均蛍光強度（ＭＦＩ）±ＳＤとしてデータを示す。
【図１７Ｄ】図１７Ａ〜Ｃに示す実験からのＰＡＲ染色の一セットの９つの代表的なＦＡＣＳプロットである。
【図１８Ａ】１５−ＨＣおよびＨＳＰ６０の両方が、順応免疫系の細胞中のＰＡＲＰ−１を活性化することを示す棒グラフである。ＨＳＰ６０、１５−ＨＣで処理および活性化したか、または未処理の健常対照（ＨＣ）のＣＤ４＋Ｔ細胞（１８Ａ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（１８Ｂ）、およびＢ細胞（１８Ｃ）におけるＦＡＣＳによって判定した平均ＰＡＲＰ−１活性。データを５つの試料／群の平均蛍光強度（ＭＦＩ）±ＳＤとして示す。
【図１８Ｂ】１５−ＨＣおよびＨＳＰ６０の両方が、順応免疫系の細胞中のＰＡＲＰ−１を活性化することを示す棒グラフである。ＨＳＰ６０、１５−ＨＣで処理および活性化したか、または未処理の健常対照（ＨＣ）のＣＤ４＋Ｔ細胞（１８Ａ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（１８Ｂ）、およびＢ細胞（１８Ｃ）におけるＦＡＣＳによって判定した平均ＰＡＲＰ−１活性。データを５つの試料／群の平均蛍光強度（ＭＦＩ）±ＳＤとして示す。
【図１８Ｃ】１５−ＨＣおよびＨＳＰ６０の両方が、順応免疫系の細胞中のＰＡＲＰ−１を活性化することを示す棒グラフである。ＨＳＰ６０、１５−ＨＣで処理および活性化したか、または未処理の健常対照（ＨＣ）のＣＤ４＋Ｔ細胞（１８Ａ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（１８Ｂ）、およびＢ細胞（１８Ｃ）におけるＦＡＣＳによって判定した平均ＰＡＲＰ−１活性。データを５つの試料／群の平均蛍光強度（ＭＦＩ）±ＳＤとして示す。
【図１８Ｄ】図１８Ａ〜Ｃに示す実験からのＰＡＲ染色の一セットの９つの代表的なＦＡＣＳプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
患者の大半において、ＭＳは、最終的に、治療にほとんど反応を示さない進行性の経過をとる（Ｒｏｖａｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌ  ５，３４３−３５４（２００６）；Ｌｏｐｅｚ−Ｄｉｅｇｏ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｅｒ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  ７，９０９−９２５（２００８））。よって、ＭＳの進行段階に寄与するプロセスの調査、および疾患の進行を監視するためのバイオマーカーの同定は、ＭＳの研究における優先事項である。
抗原マイクロアレイを使用して（Ｑｕｉｎｔａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１  Ｓｕｐｐｌ  ２，１４６１５−１４６２１（２００４）；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２１，１０３３−１０３９（２００３））、本発明者は、ＭＳ患者の血清において、コレステロールの酸化誘導体である１５−オキシステロールに対する抗体レベルの増加を検出した（Ｑｕｉｎｔａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０５，１８８８９−１８８９４（２００８））。１５−オキシステロールではないコレステロールの酸化誘導体である７−ケトコレステロール（７−ＫＣ）は、インビトロで神経損傷を引き起こすポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼ−１（ＰＡＲＰ−１）によって媒介される機構を介して、ミクログリアを活性化することが明らかになっている（Ｄｉｅｓｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９８，１７２９−１７４０（２００３））。進行性ＭＳの発症機序にとっての神経死の重要性に基づいて、ＭＳおよびＥＡＥにおける１５−オキシステロールの役割を調査した。進行性ＭＳおよびＥＡＥにおいて、１５−オキシステロール１５ａ−ヒドロキシコレステン（１５−ＨＣ）の血清レベルの増加が見られた。本明細書において実証されるように、１５−ＨＣは、Ｔｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）およびＰＡＲＰ−１を含むシグナル伝達経路を介して、マクロファージ、ミクログリア、および星状細胞をインビトロで活性化する。ＰＡＲＰ−１の阻害は、ＳＰＭＳのマウスモデルにおいて軸索消失および障害を抑制した。よって、１５−ＨＣは、ＭＳにおける疾患の進行を追跡するための潜在的なバイオマーカーであり、ＴＬＲ２／ＰＡＲＰ−１軸は、ＳＰＭＳの治療標的である。
【００１６】
ＭＳ／ＳＰＭＳの治療方法
多発性硬化症（ＭＳ）は、通常、ＣＮＳにおける病変によって引き起こされる再発性または慢性的に進行性の神経機能障害によって臨床的に特徴付けられる。病理学的に、病変は、脳、視神経、および脊髄に影響を及ぼす複数の脱髄領域を含む。根底にある病因は確かではないが、ＭＳは、少なくとも部分的に自己免疫性または免疫媒介性の疾患であると広く考えられている。
多発性硬化症の国際的に認識される４つの形態のうちの１つである二次性進行型多発性硬化症（ＳＰＭＳ）（その他の形態は、再発寛解型多発性硬化症、一次性進行型多発性硬化症、および再発進行型多発性硬化症）は、度重なる再発ならびに軽度の寛解および停滞期の有無にかかわらず、臨床的神経学的損傷の着実な進行によって特徴付けられる。一般に、ＳＰＭＳを発症する人々は、以前に、２〜４０年間またはそれ以上継続したかもしれない再発寛解型多発性硬化症（ＲＲＭＳ）の時期に苦しまされている。時々、対象は、ＳＰＭＳの発症後に何回か再発および寛解するが、これらは経時的に頻度が低くなる傾向にある。
【００１７】
ＭＳの診断は、時間的および空間的に広がった病変の存在および代替の診断の排除に基づいて行うことができる（Ｐｒｏｂｌｅｍｓ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｔｒｉａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：Ｒｅｐｏｒｔ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｐａｎｅｌ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｔｒｉａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．１２２：１９６５；５５２−５６８）。代替として、熱感受性、核間性眼筋麻痺、視神経炎、およびレルミット徴候を含む、臨床的兆候および症状の存在に基づいて診断を行うことができる（例えば、ＭｃＤｏｎａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  Ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐａｎｅｌ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２００１；５０：１２１、およびＰｏｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：２００５  Ｒｅｖｉｓｉｏｎｓ  ｔｏ  ｔｈｅ“ＭｃＤｏｎａｌｄ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ．”Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ  ２００５；５８：８４０−８４６を参照）。
ＭＳにおける障害を定量化する方法は、Ｋｕｒｔｚｋｅの総合障害度評価尺度（ＥＤＳＳ）、ＭＲＩスキャン、Ｓｃｒｉｐｐｓの神経症状評価尺度（ＳＮＲＳ）、Ｋｒｕｐｐの疲労重症度尺度（ＦＳＳ）、不能状態尺度（ＩＳＳ）、機能的自立度評価法（ＦＩＭ）、歩行運動指数（ＡＩ）、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅの多発性硬化症基礎スコア（ＣＡＭＢＳ）、多発性硬化症の機能評価（ＦＡＭＳ）、感情プロフィール（ＰＯＭＳ）、および疾病影響プロフィール（ＳＩＰ）を含む。
ＭＳおよびＳＰＭＳに関するさらなる情報は、当該技術分野において、例えば、Ｓｐｉｎａｌ  Ｃｏｒｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，（Ｄｅｍｏｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，２００３）の、例えば、第３２章の第Ｖ項「Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ」に見出される。
【００１８】
本明細書に記載される方法は、ＰＡＲＰ−１の特異的阻害剤を使用するＳＰＭＳの治療のための方法を含む。方法は、ＳＰＭＳを有する対象を同定することと、治療的有効量のＰＡＲＰ−１の特異的阻害剤、例えば、ＰＡＲＰ−１の特異的阻害剤を含む治療組成物を、ＳＰＭＳを有する対象に投与することと、を含む。
一態様において、方法は、例えば、ＳＰＭＳの１つ以上の指標をスクリーニングすることによって、対象をＳＰＭＳについてスクリーニングすることを含む。ＳＰＭＳに罹患する対象を同定するための方法は当該技術分野において既知であり、本明細書に記載されるように、１５−ＨＣのレベルの増加を検出することによって対象を同定することも含むことができる。いくつかの実施形態において、ＭＳに罹患する対象の障害が、通常、運動／小脳機能においてＥＤＳＳ３．５以上に移行することによって、ＳＰＭＳが同定される。
【００１９】
いくつかの実施形態において、ＰＡＲＰ−１の特異的阻害剤は、ＭＳのための標準的治療、例えば、コルチコステロイド療法、インターフェロンβ−１ｂ、グラチラマー、ミトキサントロン、カンナビス、またはそれらの組み合わせの投与、と併用して投与される。いくつかの実施形態において、ＰＡＲＰ−１の特異的阻害剤は、ＭＳの１つ以上の症状、例えば、うつ病および疲労、膀胱機能障害、痙縮、疼痛、運動失調、ならびに企図振戦のための治療と併用して投与され、そのような治療は、薬理作用のある物質、運動、および適切な矯正装具を含む。ＭＳの診断および治療に関するさらなる情報は、ｗｗｗ．ｎａｔｉｏｎａｌｍｓｓｏｃｉｅｔｙ．ｏｒｇ上の国立多発性硬化症協会のウェブサイトで見出すことができ、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
この文脈において使用される場合、「治療する」とは、ＳＰＭＳに関連する障害のうちの少なくとも１つの症状を回復させることを意味する。治療は、ＭＳの１つ以上の症状、例えば、うつ病および疲労、膀胱機能障害、痙縮、疼痛、運動失調、ならびに企図振戦の軽減をもたらすことができる。治療的有効量は、急性発作の発症を防ぐため、または急性発作の期間を短縮するため、または１つ以上の症状、例えば、熱感受性、核間性眼筋麻痺、視神経炎、およびレルミット徴候の重症度を軽減するために十分な量であり得る。いくつかの実施形態において、治療的有効量とは、例えば、ＭＲＩ上に示されている様に、対象の脳、視神経、および脊髄のうちの１つ以上における脱髄病変の出現を防ぐため、その成長（すなわち、サイズ増加）を遅らせるかもしくは防ぐため、またはその治癒を促進させるために十分な量である。
【００２０】
化合物の投与量、毒性、および治療効果は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定するための、例えば、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順によって、決定することができる。治療効果と毒性効果との間の用量比は治療指数であり、それは比率ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。毒性の副作用を示す化合物が使用されてもよいが、感染していない細胞に対する損傷の可能性を最小限に抑えるため、すなわち、副作用を軽減するために、そのような化合物を罹患組織の部位に標的化する送達システムを設計するよう注意を払うべきである。
細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータは、ヒトに使用するための投与量範囲を定式化するのに使用することができる。そのような化合物の投与量は、好ましくは、毒性をほとんど有さないかまたは全く毒性のないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内である。投与量は用いられる剤形および用いられる投与経路によって、この範囲内で変化してもよい。本発明の方法において使用されるいずれの化合物についても、治療的有効用量は、最初に細胞培養アッセイから推定することができる。用量は、細胞培養において決定されるＩＣ５０（すなわち、症状の最大半数の阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように、動物モデルにおいて定式化されてもよい。そのような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。血漿中は、例えば、高速液体クロマトグラフィーを用いて測定されてもよい。
「有効量」とは、有益な効果または所望の効果をもたらすのに十分な量である。例えば、治療量は、所望の治療効果を達成する量である。この量は、疾患の発症または疾患の症状を防ぐために必要な量である予防的有効量と同じであってもよいかかまたは異なっていてもよい。有効量は、１つ以上の投与、適用、または投与量において投与することができる。組成物の治療的有効量は、選択される組成物に依存する。組成物は、１日１回以上〜１週間に１回以上まで投与することができる（１日おきに１回を含む）。当業者は、対象の疾患または障害の重症度、以前の治療、総体的な健康および／または年齢を含むが、これに限定されない特定の要因が、対象を効果的に治療するために必要とされる投与量およびタイミングに影響し得ることを理解するであろう。また、治療的有効量の本明細書に記載される組成物を用いた対象の治療は、単回治療または一連の治療を含むことができる。
【００２１】
診断方法
本明細書には、ＭＳを診断するための方法、またはＳＰＭＳもしくはＲＲＭＳを有する対象を同定するための方法が含まれる。方法は、対象由来の血清を含む試料を得ることと、試料中の１つ以上の１５−オキシステロール、例えば、１５−ケトコレステン（１５−ＫＥ）、１５−ケトコレスタン（１５−ＫＡ）、および１５−ヒドロキシコレステン（１５−ＨＣ）の存在および／またはレベルを評価することと、該存在および／またはレベルを、１つ以上の基準、例えば、１５−オキシステロールの正常レベル（例えば、非罹患対象におけるレベル）を表す対照基準、および／または、ＭＳ、ＲＲＭＳ、もしくはＳＰＭＳを有する対象における１５−オキシステロールのレベルを表す疾患基準と比較することと、を含む。好適な基準値は、図１Ａに示される基準値、例えば、約０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．５５、０．６、または０．７ｕｇ／ｍＬ超を含むことができる。１５−オキシステロールの存在および／またはレベルは、当該技術分野で既知である方法を使用して、例えば、ガスクロマトグラフィー／質量分析（ＧＣ／ＭＳ）、希釈質量分析、および／またはガス液体クロマトグラフィーを使用して、評価することができる。
【００２２】
いくつかの実施形態において、１５−オキシステロールの存在および／またはレベルは、疾患基準における１５−オキシステロールの存在および／またはレベルに相当し、対象はＭＳと関連する１つ以上の症状を有し、すなわち対象はＭＳを有する。いくつかの実施形態において、対象はＭＳ、ＲＲＭＳ、またはＳＰＭＳの明らかな兆候または症状を有しないが、評価される１５−オキシステロールのうちの１つ以上の存在および／またはレベルは、疾患基準におけるタンパク質（複数可）の存在および／またはレベルに相当し、すなわち対象は、ＭＳ、ＲＲＭＳ、またはＳＰＭＳを発症するリスクが増加している。いくつかの実施形態において、試料は、生体液、例えば、血液、血清、精液、尿、および／または脳脊髄液を含む。いくつかの実施形態において、一旦、あるヒトがＭＳ、ＲＲＭＳ、もしくはＳＰＭＳを有すると判定されると、またはＲＲＭＳもしくはＳＰＭＳを発症するリスクの増加を判定されると、例えば、当該技術分野で既知であるかまたは本明細書に記載される治療薬を投与することができる。
【００２３】
いくつかの実施形態において、方法は、１５−ケトコレステン（１５−ＫＥ）または１５−ケトコレスタン（１５−ＫＡ）のうちの１つまたは両方の存在および／またはレベルを評価し、ならびに試料中の１５−ヒドロキシコレステン（１５−ＨＣ）の存在および／またはレベルを評価することと、１５−ＫＥ、１５−ＫＡ、および１５−ＨＣの存在および／またはレベルを、対応する基準、例えば、非罹患対象における１５−ＫＥ、１５−ＫＡ、および１５−ＨＣの正常レベルを表す対照基準、ならびに／またはＲＲＭＳもしくはＳＰＭＳを有する対象におけるレベルを表す疾患基準と比較することと、を含む。いくつかの実施形態において、ＲＲＭＳまたはＳＰＭＳの識別診断が行われる：基準と比較して増加した１５−ＫＥ、１５−ＫＡ、および１５−ＨＣのレベルが見られることは、対象がＳＰＭＳを有するか、またはＳＰＭＳを発症するリスクが増加していることを示し、基準と比較して、１５−ＫＥおよび１５−ＫＡのレベルは増加したが、１５−ＨＣのレベルが増加していない場合は、対象がＲＲＭＳを有すること、例えば、まだＳＰＭＳに進行していないことを示す。
【００２４】
いくつかの実施形態において、方法は、試料中の１５−ヒドロキシコレステン（１５−ＨＣ）の存在および／またはレベルを評価することと、１５−ＨＣの存在および／またはレベルを、対応する基準、例えば、非罹患対象における１５−ＨＣの正常レベルを表す対照基準、および／または、ＳＰＭＳを有する対象におけるレベルを表す疾患基準と比較することと、を含む。１５−ＨＣの増加が見られることは、対象がＳＰＭＳを有することを示す。
【００２５】
ＰＡＲＰ−１阻害剤を含む医薬組成物
本明細書に記載される方法は、ＰＡＲＰ−１の特異的阻害剤を有効成分として含む医薬組成物の製造および使用を含む。また、医薬組成物自体も含まれる。
５−クロロ−２−［３−（４−フェニル−３，６−ジヒドロ−１（２Ｈ）−ピリジニル）プロピル］−４（３Ｈ）−キナゾリノン（ＦＲ２４７３０４）（Ｉｗａｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＰＥＴ  ２００４；３１０：４２５−４３６）、ＰＪ３４（Ｆａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｓｕｒｇ．２００２  Ｆｅｂ；７３（２）：５７５−８１）、２−［（Ｒ）−２−メチルピロリジン−２−イル］−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−カルボキサミド（ＡＢＴ−８８８）（Ｐｅｎｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２００９  Ｊａｎ  ２２；５２（２）：５１４−２３）、キノリン−８−カルボキサミド（Ｌｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２００８  Ｄｅｃ  ３１．［Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ］）、５−アミノイソキノリン−１−オン（５ＡＩＱ）（Ｃａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐａｔｈｏｌ  Ｏｎｃｏｌ  Ｒｅｓ．２００８  Ｎｏｖ  ７．［Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ］）、ニコチンアミド、３−アミノベンザミド（３−ＡＢ）（Ｃｚａｐｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｌｅｔｔ．２００４  Ｆｅｂ  ６；３５６（１）：４５−８）、ベンザミド、３，４−ジヒドロ−５−メトキシイソキノリン−１（２Ｈ）−オン（ＰＤ  １２８７６３）または８−ヒドロキシ−２−メチルキナゾリン−４（３Ｈ）−オン（ＮＵ１０２５）（Ｂｏｕｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．１９９５  Ｏｃｔ；７２（４）：８４９−５６）、２−メチルベンゾイミダゾール−４−カルボキサミド（ＮＵ１０６４）（Ｂｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．１９９８  Ｎｏｖ；７８（１０）：１２６９−７７）、３−アミノベンザミド、４−アミノ−１，８−ナフタルイミド（Ｓｈａｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．２００８  Ｍａｒ  １２；８２（１１−１２）：５７０−６．Ｅｐｕｂ  ２００７  Ｄｅｃ  ２６、１，５−イソキノリンジオール（Ｄａｌｍａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１９９６  Ｏｃｔ  １０；２２８（１）：１４−８）、６（５Ｈ）−フェナントリジノン（Ｗｅｌｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｌ  Ｒｅｓ．１９９４；６（９）：３９９−４０３）、アデノシン置換２，３−ジヒドロ−ｌＨ−イソインドール−ｌ−オン、ＡＧ１４３６１（Ｖｅｕｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００３  Ｓｅｐ  １５；６３（１８）：６００８−１５）、ＡＧ０１４６９９（Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．２００７  Ｍａｒ；６（３）：９４５−５６）、２−（４−クロロフェニル）−５−キノキサリンカルボキサミド（ＦＲ２６１５２９）（Ｉｗａｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ．２００４  Ｓｅｐ；３１０（３）：１１１４−２４．Ｅｐｕｂ  ２００４  Ａｐｒ  ２７）、イソインドリノン誘導体ＩＮＯ−１００１（Ｓｈｉｍｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００３  Ｊｕｌ；２８５（１）：Ｌ２４０−９．Ｅｐｕｂ  ２００３  Ｍａｒ  ７）、４−ヒドロキシキナゾリノン（４−ＨＱＮ）（Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ．２００４  Ｊｕｌ；３１０（１）：２４７−５５���Ｅｐｕｂ  ２００４  Ｍａｒ  ３）、２−［３−［４−（４−クロロフェニル）−ｌ−ピペラジニル］プロピル］−４−３（４）−キナゾリノン（ＦＲ２５５５９５）（Ｉｗａｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ．２００４  Ｊｕｎ；３０９（３）：１０６７−７８．Ｅｐｕｂ  ２００４  Ｆｅｂ  ２５）、イソキノリノン誘導体、例えば、５−ベンゾイルオキシイソキノリノン−１（２Ｈ）−オン（Ｐｅｌｌｉｃｃｉａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＣｈｅｍＭｅｄＣｈｅｍ．２００８  Ｊｕｎ；３（６）：９１４−２３）、１，５−ジヒドロキシイソキノリノン（ＤＨＩＱ）（Ｃｚａｐｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｌｅｔｔ．２００４  Ｆｅｂ  ６；３５６（１）：４５−８）、３，４−ジヒドロ−５［４−（ｌ−ピペリジニル）（ブトキシ）−ｌ（２Ｈ）−イソキノロン；ＣＥＰ−６８００（Ｍｉｋｎｙｏｃｃｚｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．２００３  Ａｐｒ；２（４）：３７１−８２）、４−アミノ−１，８−ナフタルイミド（Ｋａｂｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｂｕｌｌ．２００４  Ｆｅｂ  １；６２（５）：４２５−３３）、ＧＰＩ−１５４２７（Ｔｅｎｔｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００３  Ｎｏｖ  １；９（１４）：５３７０−９）、３，４−ジヒドロ−５−［４−（１−ピペリジニル）ブトキシ］−１（２Ｈ）−イソキノリノン（ＤＰＱ）（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１９９９  Ｍａｙ  ２２；８２９（１−２）：４６−５４）、ＢＳ−２０１；４−［３−（４−シクロプロパンカルボニルピペラジン−１−カルボニル）−４−フルオロベンジル］−２Ｈ−フタラジン−１−オン（ＫＵ−００５９４３６，ＡＺＤ２２８１）（Ｍｅｎｅａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２００８  Ｏｃｔ  ２３；５１（２０）：６５８１−９１．Ｅｐｕｂ  ２００８  Ｓｅｐ  １９）、５−ヨード−６−アミノベンゾピロン（ＩＮＨ２ＢＰ）（Ｅｎｄｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９８  Ｊｕｎ  ２６；３５１（３）：３７７−８２）、およびＴＩＱ−Ａ  （Ｏｕｍｏｕｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６  Ｎｏｖ  １；１７７（９）：６４８９−９６）を含む、多数のＰＡＲＰ−１阻害剤が当該技術分野において既知である。
【００２６】
医薬組成物は、通常、薬学的に許容される担体を含む。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という文言は、薬学的投与に適合する生理食塩水、溶剤、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張性遅延剤および吸収遅延剤等を含む。また、補助的な活性化合物も、組成物に組み込むことができる。
医薬組成物は、通常、意図される投与経路に適応するように処方される。投与経路の例は、非経口（例えば、静脈内、皮内、皮下）、経口（例えば、吸入）、経皮的（局所的）、経粘膜的、および直腸内投与を含む。好適な医薬組成物を処方する方法は、当該技術分野において既知であり、例えば、Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ：ａ  Ｓｅｒｉｅｓ  ｏｆ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋｓ  ａｎｄ  Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ  （Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ）、およびＡｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｓｅｌ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ；８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（２００４）等の一連の本を参照のこと。医薬組成物は、投与指示書とともに、容器、パック、またはディスペンサーに含まれ得る。
【００２７】
スクリーニング方法
また、本発明には、ＳＰＭＳの治療において有用な物質を同定するために、試験化合物、例えば、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、無機または有機の大分子もしくは小分子の試験化合物をスクリーニングするための方法も含まれる。
本明細書で使用される場合、「小分子」とは、分子量約３，０００ダルトン未満の有機または無機の小分子を指す。一般に、本発明に有用な小分子は、３，０００ダルトン（Ｄａ）未満の分子量を有する。小分子は、例えば、少なくとも約１００Ｄａ〜約３，０００Ｄａ（例えば、約１００〜約３，０００Ｄａ、約１００〜約２５００Ｄａ、約１００〜約２、０００Ｄａ、約１００〜約１，７５０Ｄａ、約１００〜約１，５００Ｄａ、約１００〜約１，２５０Ｄａ、約１００〜約１，０００Ｄａ、約１００〜約７５０Ｄａ、約１００〜約５００Ｄａ、約２００〜約１５００、約５００〜約１０００、約３００〜約１０００Ｄａ、または約１００〜約２５０Ｄａ）であり得る。
試験化合物は、例えば、天然の産物またはコンビナトリアルケミストリーライブラリーのメンバーであってもよい。一連の種々の分子が、電荷、芳香族性、水素結合、可塑性、サイズ、側鎖の長さ、疎水性、および強剛性等の多様な機能を網羅するために使用されるべきである。小分子を合成するために好適なコンビナトリアル技術は、例えば、Ｏｂｒｅｃｈｔ  ａｎｄ  Ｖｉｌｌａｌｇｏｒｄｏ，Ｓｏｌｉｄ−Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ａｎｄ  Ｐａｒａｌｌｅｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｍａｌｌ−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−Ｗｅｉｇｈｔ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ−Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（１９９８）に例示されるように、当該技術分野において既知であり、「スプリットおよびプール」または「パラレル」合成技術、固相および液相技術、ならびにエンコーディング技術等の技術を含む（例えば、Ｃｚａｒｎｉｋ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏ．１：６０−６（１９９７）を参照のこと）。また、多数の小分子ライブラリーが市販されている。多数の好適な小分子試験化合物が米国特許第６，５０３，７１３号に列挙されており、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。
本発明の方法を使用してスクリーニングしたライブラリーは、多様な種類の試験化合物を含むことができる。所与のライブラリーは、構造的に関連するかまたは関連してない一セットの試験化合物を含むことができる。いくつかの実施形態において、試験化合物はペプチドまたはペプチド模倣分子である。いくつかの実施形態において、試験化合物は核酸である。
【００２８】
いくつかの実施形態において、試験化合物およびそのライブラリーは、例えば、当該技術分野において既知である方法または本明細書に記載される方法を使用して、第１の試験化合物（例えば、標的ポリペプチドの既知の天然結合パートナーと構造的に類似する第１の試験化合物、または標的ポリペプチドと結合することが可能であると同定された第１の小分子）の構造を体系的に改変し、その構造を結果的に生じた生物学的活性と相関させることによって（例えば、構造活性相関研究）、得ることができる。当業者は理解するように、そのような構造活性相関を行うための種々の標準的な方法が存在する。よって、ある場合において、研究はほとんど経験的である可能性があり、他の場合には、小分子化合物（単数または複数）の合理的な設計のための出発点として、内因性ポリペプチドの３次元構造またはその一部を使用することができる。例えば、一実施形態において、小分子の一般的なライブラリーは、例えば、本明細書に記載される方法を使用して、スクリーニングされる。
【００２９】
いくつかの実施形態において、試験化合物は、試験試料（例えば、細胞または生組織または器官）に適用され、試験化合物の１つ以上の効果が評価される。例えば培養細胞または初代細胞において、試験化合物がＰＡＲＰ−１を阻害する能力が評価される。
いくつかの実施形態において、試験試料は、本明細書に記載される障害のインビボモデルであるか、またはそれに由来する（例えば、そこから採取した試料である）。例えば、動物モデル、例えば、ラット等のげっ歯類を使用することができる。
これらの効果の各々を評価するための方法は、当該技術分野において既知である。例えば、タンパク質の発現を調節する能力は、例えば、定量的ＰＣＲ法または免疫学的検定法を使用して、遺伝子またはタンパク質レベルで評価することができる。いくつかの実施形態において、高スループット法、例えば、当該技術分野において既知であるタンパク質または遺伝子チップ（例えば、Ｃｈ．１２，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，ｉｎ  Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．Ｍｏｄｅｒｎ  ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，１９９９，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅｋｉｎｓ  ａｎｄ  Ｃｈｕ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９９，１７：２１７−２１８、ＭａｃＢｅａｔｈ  ａｎｄ  Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０００，２８９（５４８５）：１７６０−１７６３、Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；２００２、Ｈａｒｄｉｍａｎ，Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｎｕｔｓ＆Ｂｏｌｔｓ，ＤＮＡ  Ｐｒｅｓｓ，２００３を参照）が、表２および／または図４に列挙されるタンパク質のうちの２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上に対する効果を検出するために使用されてもよい。カリクレイン／キニン経路を介してシグナル伝達を調節する能力は、例えば、ブラジキニンまたは他のキニノゲンのタンパク質分解産物の遊離を利用して（例えば、Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒａｚ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｓ．２０００  Ｊｕｎ；３３（６）：６６５−７７を参照）、および環状グアニン一リン酸（ｃＧＭＰ）の測定を利用して、評価することができる。血管透過性は、例えば、本明細書に記載されるように評価することができる。
本明細書に記載される方法によってスクリーニングされ、ＰＡＲＰ−１を阻害すると判定された試験化合物は、候補化合物であると考えることができる。例えば、ＳＰＭＳのインビボモデルにおいてスクリーニングされ、障害に対する（例えば、障害の１つ以上の症状に対する）所望の効果を有すると判定された候補化合物は、候補治療薬であると考えることができる。一旦、臨床設定においてスクリーニングされた候補治療薬は、治療薬である。候補化合物、候補治療薬、および治療薬は、医薬組成物を形成するために生理学的に許容される賦形剤で、随意に、最適化および／または誘導体化、ならびに処方することができる。
【００３０】
よって、第１のスクリーニングで「ヒット」として同定された試験化合物（例えば、ＰＡＲＰ−１を阻害する試験化合物）は、例えば、結合親和性、結合活性、特異性、または他のパラメータを最適化するための合理的な設計を使用して、選択および体系的に改変することができる。そのような最適化もまた、本明細書に記載される方法を使用してスクリーニングすることができる。よって、一実施形態において、本発明は、当該技術分野において既知である方法および／または本明細書に記載される方法を使用して、化合物の第１のライブラリーをスクリーニングすることと、ライブラリー内の１つ以上のヒットを同定することと、該ヒットに構造的に関連する化合物の第２のライブラリーを作成するために、それらのヒットを体系的な構造改変に供することと、本明細書に記載される方法を使用して第２のライブラリーをスクリーニングすることと、を含む。
【００３１】
ヒットとして同定された試験化合物は、ＳＰＭＳの治療において有用な候補治療化合物であると考えることができる。「ヒット」の構造を判定するために有用な種々の技術、例えば、ＮＭＲ、質量分析、電子捕獲検出器を装備したガスクロマトグラフィー、蛍光分光法、および吸収分光法を、本明細書に記載される方法において使用することができる。よって、本発明はまた、本明細書に記載される方法によって「ヒット」として同定された化合物、ならびに、本明細書に記載される障害の発症もしくは進行の治療、予防、または遅延においてそれらを投与および使用するための方法も含む。
候補治療化合物として同定された試験化合物は、本明細書に記載されるように、ＳＰＭＳの動物モデルに対する投与によってさらにスクリーニングすることができる。動物は、障害における変化について、例えば、障害のパラメータ（例えば、臨床転帰に関連するパラメータ）の向上について、監視することができる。いくつかの実施形態において、モデルはＥＡＥであり、パラメータはＥＡＥの臨床的兆候であり、例えば、以下のスコアにしたがって評価される：０＝無症状、１＝尾の緊張の低下、２＝後肢不全麻痺、３＝後肢完全麻痺、４＝四肢麻痺、５＝瀕死（向上は、ＥＡＥスコアにおける減少（例えば、４から３へ）である）。いくつかの実施形態において、対象はヒト、例えば、ＳＰＭＳを有するヒトであり、パラメータはＳＰＭＳの臨床症状であり、向上は、障害の軽減をもたらす。
実施例
本発明は、以下の実施例においてさらに説明されるが、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００３２】
１５−ＨＣの血清レベルの増加は、ヒトおよび実験的ＳＰＭＳと関連している
１５−オキシステロールのＭＳにおける役割を調査するために、ＲＲＭＳ患者、ＳＰＭＳ患者、および健常対照（ＨＣ）由来の血清中の１５−ケトコレステン（１５−ＫＥ）、１５−ケトコレスタン（１５−ＫＡ）、および１５−ヒドロキシコレステン（１５−ＨＣ）のレベルを測定した。
ＲＲＭＳ患者、ＳＰＭＳ患者、および対照由来の血清試料は、ＭＳ  ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｂｒｉｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｏｍｅｎ’ｓ  ＨｏｓｐｉｔａｌおよびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｅｖｉｌｌａで回収した。患者および対象の臨床的特性を表１に列挙する。
【００３３】
【表１】
2012515924.tif 000003
【００３４】
各群のＮ、性別、年齢、罹病期間、およびＥＤＳＳは、中央値および範囲として示される。ＮＡは該当なしを意味する。
患者の血清およびＣＳＦ中の１５−オキシステロールを、記載されるようにガスクロマトグラフィー／質量分析（ＧＣ／ＭＳ）によって分析した（Ｄｉｅｓｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９８，１７２９−１７４０（２００３））。簡単に説明すると、脂質抽出後、Ｗａｔｅｒｓ社製Ｑｕａｔｔｒｏ  ｍｉｃｒｏ  ＧＣ／ＭＳ／ＭＳ（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｄｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）上で試料を分析した。該当するピークは、外部標準と比較したそれらの相対保持時間およびイオン質量分析に基づいて同定し、検量線に関連させて、積分によって定量化した。
ＲＲＭＳ試料における１５−ＫＥおよび１５−ＫＡレベルの増加（Ｐ＜０．０５、図１Ａ）、ならびにＳＰＭＳにおけるさらなる上方制御（Ｐ＜０．０５、図１Ａ）が見られた。特筆すべきは、ＳＰＭＳ患者由来の血清試料においてのみ、１５−ＨＣレベルが増加したことである（Ｐ＜０．０１、図１Ａ）。
ＭＯＧ３５−５５で免疫した１０週齢の非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスが、ＳＰＭＳに似たＥＡＥの一形態を発症した（Ｂａｓｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１８，１５３２−１５４３（２００８））。このモデルでは、自己限定的な急性神経学的症候群が免疫後１８日目にピークに達して、その後部分的に回復し、この初期発作後に不可逆性進行性神経学的障害の段階が続く（Ｂａｓｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１８，１５３２−１５４３（２００８））。このＳＰＭＳの実験モデルは、急性ＥＡＥ発作のピーク時（１８日目）およびＥＡＥの進行段階にける（５５日目）１５−オキシステロールのレベルを分析するために使用した。
１０週齢のメスＮＯＤマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ，ＵＳＡ）を、記載されるように、ＣＦＡ（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に乳濁した１００μｇのＭＯＧ３５−５５で免疫した（Ｂａｓｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１８，１５３２−１５４３（２００８））。０日目および２日目に、マウス１匹当たり１５０ｎｇの百日咳毒素（Ｓｉｇｍａ）を腹腔内投与した。以下のスコアにしたがってＥＡＥの臨床的兆候を評価した：０＝無症状、１＝尾の緊張の低下、２＝後肢不全麻痺、３＝後肢完全麻痺、４＝四肢麻痺、５＝瀕死。
【００３５】
結果は、１５−ＫＡおよび１５−ＫＥが、急性発作およびＥＡＥの進行段階の両方において上方制御されたことを示した（図１Ｂ）。しかしながら、１５−ＨＣレベルは、ＥＡＥの進行段階においてのみ上方制御され（Ｐ＜０．０１、図１Ｂ）、１５−ＨＣが、ヒトおよび実験的な進行性ＭＳの両方において、進行性の神経学的障害と関連していることを示唆した。
よって、１５−オキシステロール１５−ＫＡおよび１５−ＫＥの血清レベルはＲＲＭＳおよびＳＰＭＳの両方において上方制御されたが、ＳＰＭＳにおけるレベルがより高かった。オキシステロール７−ＫＣの血清およびＣＳＦレベルも、ヒトおよび実験的ＭＳにおいて増加したことが分かったが（Ｄｉｅｓｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９８，１７２９−１７４０（２００３）；Ｌｅｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ  ４６，１９１−１９５（２００５））、それらの値は、ＥＡＥの慢性段階の正常範囲内に含まれる（Ｄｉｅｓｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９８，１７２９−１７４０（２００３））。反対に、１５−ＨＣの血清レベルは、ヒトおよび実験的ＳＰＭＳの進行段階においてのみ増加し、段階特異的なプロセスが１５−ＨＣの生成を制御することを示唆している。ＳＰＭＳへの移行は、大規模なミクログリアの活性化と関連している（Ｋｕｔｚｅｌｎｉｇｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｒａｉｎ  １２８，２７０５−２７１２（２００５））。ミクログリアによるミエリンの分解は、オキシステロールの重要な源であるため（Ｄｉｅｓｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９８，１７２９−１７４０（２００３）；Ｂｏｎｇａｒｚｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ  ４１，２１３−２２１（１９９５））、（理論に束縛されるわけではないが）ＣＮＳの天然性免疫応答における変化がコレステロールの局所的な異化を改変し、ＳＰＭＳにおける１５−ＨＣの産生に有利に働く可能性がある。ＳＰＭＳにおいてより高い１５−ＨＣ血清レベルをもたらす特異的な機構が何であれ、ヒトおよび実験的ＳＰＭＳとの関連性、ならびにＴＬＲ２／ＰＡＲＰ−１経路による疾病の発症機序に対する寄与は、１５−ＨＣが疾患の進行を監視するための潜在的バイオマーカーであることを示唆するものである。バイオマーカーとしての１５−ＨＣの使用についてのさらなる証拠は、それが血清試料中に検出されることによってもたらされ、大量の独立した一連の試料の評価、および臨床設定における使用を容易にする。
【実施例２】
【００３６】
ＰＡＲＰ−１の阻害は、実験的ＳＰＭＳにおいて軸索消失および進行性疾患を抑制する
７−ケトコレステロールは、核酵素ＰＡＲＰ−１を活性化すると報告されている（Ｄｉｅｓｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９８，１７２９−１７４０（２００３））。進行性ＭＳにおけるＰＡＲＰ−１の役割を調査するために、ＳＰＭＳのＮＯＤ実験モデルにおいて特異的ＰＡＲＰ−１阻害剤５−アミノイソキノリノン（ＡＩＱ）を使用した（Ｓｕｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ  ６，１０７−１１７（１９９１））。ＡＩＱの投与は、ＥＡＥの急性段階に対する効果をほとんど示さないかまたは全く示さなかったが、進行性ＥＡＥの臨床兆候において有意な抑制をもたらした（図２Ａ〜Ｂ）。
ＳＰＭＳのＮＯＤ実験モデルにおいて、臨床的障害の進行性蓄積は、大規模な軸索消失および脱髄と関連している（Ｂａｓｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１８，１５３２−１５４３（２００８））。対照およびＡＩＱで処理したマウスの組織学的分析は、ＡＩＱによるＰＡＲＰ−１の阻害が、ＮＯＤ  ＥＡＥの進行段階と関連する軸索消失および脱髄を有意に減少させたことを示した（図２Ｃ）。よって、ＰＡＲＰ−１の活性化は、実験的ＳＰＭＳの進行段階を制御する。
ＡＩＱによるＮＯＤ  ＥＡＥの進行段階の抑制は、ＣＮＳのＣＤ１１ｂ＋細胞中のＰＡＲＰ−１活性の抑制と関連していたが、適応性の脳炎誘発性免疫応答には影響を及ぼさなかったため、ＰＡＲＰ−１は、ＣＮＳの天然性免疫系に作用することによって、ＭＳの進行に寄与することが示唆される。この解釈は、ヒトおよび実験的ＳＰＭＳにおいて観察されるミクログリアの活性化（Ｂａｓｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１８，１５３２−１５４３（２００８）；Ｋｕｔｚｅｌｎｉｇｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｒａｉｎ  １２８，２７０５−２７１２（２００５））、ならびに、培養物中の活性化されたミクログリアによるニューロンの損傷におけるＰＡＲＰ−１の関与（Ｄｉｅｓｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９８，１７２９−１７４０（２００３）（Ｄｉｅｓｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９８，１７２９−１７４０（２００３）；Ｋａｕｐｐｉｎｅｎ  ａｎｄ  Ｓｗａｎｓｏｎ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７４，２２８８−２２９６（２００５）；Ｕｌｌｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ３，１０３５−１０４２（２００１））と合致する。
【実施例３】
【００３７】
ヒトおよび実験的ＳＰＭＳにおいてＰＡＲＰ−１が活性化される
ＰＡＲＰ−１による進行性ＥＡＥの制御を調査するために、ＡＩＱで処理したマウスにおいて適応性の脳炎誘発性反応を調べた。
脾細胞およびリンパ節細胞をＸ−ＶＩＶＯ培地で培養し、ＭＯＧ３５-５５の存在下で１ウェル当たり５×１０５細胞で７２時間播種した。最後の１６時間は、１μＣｉの［３Ｈ］−チミジン（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で細胞をパルスし、その後、グラスファイバーフィルター上に回収し、ベータ線測定器（１４５０  Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ  Ｔｒｉｌｕｘ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）において、組み込まれた［３Ｈ］−チミジンの分析を行った。培養から４８時間後、ＥＬＩＳＡを用いたサイトカイン測定のために上清を回収した。
ＡＩＱおよび対照で処理したマウス由来の脾細胞をＭＯＧ３５−５５またはＣＤ３に対するマイトジェン抗体で活性化すると、同様の増殖反応を示し（図３Ａ）、また、それらのサイトカイン分泌プロファイルに差異は見られなかった（図７）。よって、ＡＩＱによる実験的ＳＰＭＳの進行段階の抑制は、適応性の脳炎誘発性反応に対する活性に起因するものではない。
ミクログリアおよび星状細胞の活性化は、実験的ＳＰＭＳの進行段階と関連していたため（Ｂａｓｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１８，１５３２−１５４３（２００８））、ＥＡＥの進行段階においてＮＯＤマウスのＣＮＳにおけるＰＡＲＰ−１の活性化を分析した。ミクログリア／ＣＮＳ浸潤マクロファージおよび星状細胞をそれぞれ同定するために、Ｉｂａ−１およびＧＦＡＰに対する抗体と組み合わせて、ＰＡＲＰ−１活性化の産物であるＰＡＲに対する抗体を使用して、ＣＮＳ部分における活性ＰＡＲＰ−１を検出した。
【００３８】
ＡＩＱ処理を行ったかまたは行わないＮＯＧ免疫ＮＯＤマウス由来の脊髄組織試料を５５日目に回収し、４％パラホルムアルデヒド中で固定し、２０％スクロース中で凍結保護し、ＯＣＴ中で凍結させた。凍結した脊髄の部分を１０μｍに切断し、組織学的分析、免疫組織化学、または免疫蛍光検査のためにプロセスした。軸索消失および脱髄を、それぞれ、Ｂｉｅｌｓｃｈｏｗｓｋｙの銀染色およびルクソールファストブルーによって評価した（Ｂａｓｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１８，１５３２−１５４３（２００８））。画像解析のために、１群当たり４つの異なる動物の領域的特徴にしたがって、３つまたは４つの腰髄部分を選択した。ソフトウェアＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）を使用して画像解析を行った。定量化には、陽性染色または陰性染色を判定するためのカットオフ値として、標識化の「閾値」のレベルを使用した。抗Ｉｂａ−１（Ｗａｋｏ、ＶＡ，ＵＳＡ）、抗ＧＦＡＰ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＭＡ，ＵＳＡ）、および抗ＰＡＲ（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ、ＭＤ，ＵＳＡ）を使用して、免疫蛍光検査を行った。
ＮＯＤ  ＥＡＥの進行段階において、ミクログリア／ＣＮＳ浸潤マクロファージおよび星状細胞のＰＡＲＰ−１を活性化したところ（図３Ｂ）、ＡＩＱで処理したマウスにおいてＰＡＲＰ−１の活性化が低下した（データは図示せず）。ＥＡＥの進行段階の間にＮＯＤマウスから単離したＣＮＳのＣＤ１１ｂ＋細胞においてＰＡＲＰ−１の酵素活性を測定した際にも、同様の結果が観察された（図３Ｃ）。
これらの所見のヒトＭＳとの関連性を評価するために、ＭＳ患者においてＰＡＲＰ−１の活性を測定した。ＰＡＲＰ  ＨＴ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  Ｋｉｔ（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ、ＭＤ，ＵＳＡ）を使用して、製造者の指示に従ってＰＡＲＰ−１の活性を測定した。ＲＲＭＳおよびＳＰＭＳ患者の末梢血単球においてＰＡＲＰ−１の活性が増加し（Ｐ＜０．０５およびＰ＜０．０１、図３Ｄ）、ＳＰＭＳ患者においてレベルが有意に高かった（Ｐ＜０．０５、図３Ｄ）。したがって、これらのデータは、ＰＡＲＰ−１の活性化がヒトおよび実験的ＳＰＭＳと関連していることを示唆するものである。
【実施例４】
【００３９】
１５−ＨＣは、ＰＡＲＰ−１を介してミクログリア、マクロファージ、および星状細胞を活性化する
コレステロールの酸化誘導体７−ＫＣは、ＰＡＲＰ−１依存性経路によって、ＤＮＡを損傷し、ミクログリアを活性化することが明らかになっている（Ｄｉｅｓｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９８，１７２９−１７４０（２００３））。よって、１５−ＨＣがＰＡＲＰ−１の活性に与える影響を、インビトロ系を使用して調査した。未損傷ＤＮＡまたは１５−ＨＣだけのいずれかを用いた組み換えＰＡＲＰ−１のインキュベーションのみでは、ＰＡＲＰ−１の活性に有意な効果を与えなかった。しかしながら、１５−ＨＣでＤＮＡをプレインキュベーションすると、７−ＫＣまたは一本鎖ＤＮＡ切断を用いて達成される活性化されたもの相当するレベルまでＰＡＲＰ−１の活性化がもたらされた（図５Ａ）。
【００４０】
次いで、１５−ＨＣが細胞ＰＡＲＰ−１の活性に与える効果を調査した。マクロファージ、ミクログリア、または星状細胞を１５−ＨＣでインキュベーションすると、７−ＫＣを用いて達成されるのと同様の、ＰＡＲＰ−１の用量依存性の活性化がもたらされた（図４Ｂ）。１５−ＨＣによるＰＡＲＰ−１の活性化は、ＡＩＱを用いて、用量依存性の様式で抑制することができた（図４Ｃ）。１５−ＨＣを用いたミクログリア、マクロファージ、または星状細胞のインキュベーションは、ＮＯ、ＣＣＬ−２、およびＴＮＦ−αの分泌をもたらしたが、ＰＡＲＰ−１特異的阻害剤ＡＩＱを用いた共インキュベーションにより阻害することができた（図４Ｄ）。よって、１５−ＨＣは、ＰＡＲＰ−１依存性機構を介して、ミクログリア、マクロファージ、および星状細胞を活性化する。
星状細胞、ミクログリア、およびＣＮＳ浸潤単球は、サイトカイン（Ｊａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ  ８１，３６３−３７３（２００５）；Ｎａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ６５，２７０２−２７２０（２００８））またはＮＯ（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｌａｓｓｍａｎｎ，Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌ  １，２３２−２４１（２００２））によるニューロンの直接的な破壊、ＣＮＳへの末梢細胞の漸加（Ｃｈａｒｏ  ａｎｄ  Ｒａｎｓｏｈｏｆｆ，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５４，６１０−６２１（２００６））、および末梢の順応免疫を調節するサイトカインの分泌（Ｌｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１７，３３０６−３３１５（２００７））を含むいくつかの機構によって、ＭＳの経過に影響を及ぼす。本明細書に記載されるように、インビトロでの１５−ＨＣを用いたミクログリア、マクロファージ、および星状細胞の活性化は、ＴＮＦａ、ＮＯ、およびＣＣＬ２の分泌をもたらした。よって、理論に束縛されるわけではないが、１５−ＨＣに誘発されたＴＮＦａおよびＮＯの分泌は、軸索変性および疾患の進行に直接関与している可能性があり（Ｊａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ  ８１，３６３−３７３（２００５）；Ｎａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ６５，２７０２−２７２０（２００８）；Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｌａｓｓｍａｎｎ，Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌ  １，２３２−２４１（２００２））、ＣＣＬ２の生成は、炎症誘発性の高い細胞をＣＮＳに漸加することによって、この発症機序を増幅することができる（Ｃｈａｒｏ  ａｎｄ  Ｒａｎｓｏｈｏｆｆ，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５４，６１０−６２１（２００６））。
【実施例５】
【００４１】
１５−ＨＣはＴＬＲ２依存性経路によってＰＡＲＰ−１を活性化する
動態研究により、マクロファージまたはミクログリアを１５−ＨＣで５分間インキュベーションするとＰＡＲＰ−１の活性化がもたらされるが、７−ＫＣにはより長いインキュベーション時間が必要であることが分かった（図５Ａ）。これらのデータは、１５−ＨＣが、ＰＡＲＰ−１の活性化を引き起こすさらなる経路を誘発することを示唆している。１５−ＨＣによるＰＡＲＰ−１の活性化に関与するシグナル伝達経路を特徴付けるために、逆タンパク質アレイ（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｒｒａｙｓ（ＲＰＡ））（Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １０，１３９０−１３９６（２００４））を使用した。ＲＰＡは、１５−ＨＣによるミクログリアまたマクロファージの活性化後の異なる時点（０〜３０分）で、調製した細胞溶解物のマイクロアレイに見つけることによって構築した。次いで、該当するシグナル伝達経路に関連するタンパク質またはリン酸化タンパク質に特異的な抗体でＲＰＡをプローブした（表２に列挙）。
Ｃ８Ｂ４ミクログリア細胞株、Ｃ８−Ｄ１Ａ星状細胞、およびＲａｗ２６４．７マクロファージを、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）から購入した。１０％ウシ胎児血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、および１ｍＭピルビン酸ナトリウムを補充したＤＭＥＭで培地を培養した。無血清培地中で、対数増殖細胞を１μｇ／ｍＬの１５−ＨＣで１分、５分、１５分、および３０分間処理した。いくつかの実験において、遮断抗体（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を最終濃度１０ｕｇ／ｍＬで加えた。上述した時点で細胞を等しい体積の２Ｘ溶解バッファに溶解させ、リン酸化におけるいずれの変化をも防ぐために急速冷凍した。細胞溶解物を３８４ウェルのポリプロピレンプレートに移し、硬いスポットピンに装着されたロボット制御によるマイクロアレイヤー（Ｇｅｎｅｔｉｘ、Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して、Ｓｕｐｅｒ  Ｅｐｏｘｉスライド（Ｔｅｌｅｃｈｅｍ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）上にスポットした（Ｑｕｉｎｔａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１  Ｓｕｐｐｌ  ２，１４６１５−１４６２１（２００４））。次いで、スライドをプローブし、プロセスして、前述のとおりに分析した（Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １０，１３９０−１３９６（２００４））。実験で使用したリン特異的抗体を表２に列挙する。
【００４２】
【表２】
2012515924.tif 000004
【００４３】
2012515924.tif 000005
【００４４】
2012515924.tif 000006
【００４５】
ミクログリアまたはマクロファージ細胞を１５−ＨＣで処理することにより、ＴＡＫ１、ＩＲＡＫ、Ａｋｔ、ｐ３８−ＭＡＰＫ、ＰｙＫ２、ＰＫＣ、ＰＩ３Ｋ、およびＥＲＫ１／２を含む、ＴＬＲシグナル伝達を媒介するタンパク質のリン酸化がもたらされ（Ａｋｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．１２４，７８３−８０１（２００６））（図５Ｂ）、ウエスタンブロットを用いてこれらのタンパク質を分析したときに、同様の結果が得られた（図８）。次いで、特異的阻害剤を使用して、ＲＰＡを用いて同定したタンパク質キナーゼの、１５−ＨＣによるＰＡＲＰ−１の活性化との機能的関連性を調査した。Ｅｒｋ、Ａｋｔ、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＣ、またはｐ３８−ＭＡＰＫの特異的阻害剤の存在下でミクログリアまたはマクロファージを１５−ＨＣで処理することにより、ＰＡＲＰ−１活性化の有意な阻害がもたらされた（図５Ｃ）。
Ｅｒｋ１／２キナーゼは、ＰＡＲＰ−１と物理的に相互作用することが分かっており、ＤＮＡの損傷とは独立した機構によってＰＡＲＰ−１の活性化がもたらされる（Ｃｏｈｅｎ−Ａｒｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２５，２９７−３０８（２００７））。よって、１５−ＨＣがＰＡＲＰ−１を活性化する機構をより十分に特徴付けるために、共免疫沈降試験を実行した。ミクログリアおよびマクロファージを１５−ＨＣで活性化し、免疫沈降にはＥＲＫ特異的抗体を使用し、プルダウンした物質をＰＡＲＰ−１に対する抗体でプローブした。ミクログリアおよびマクロファージを１５−ＨＣで処理することで、ＥｒｋとＰＡＲＰ−１との有意な相互作用がもたらされた（図５Ｄ）。
次いで、遮断抗体を使用して、１５−ＨＣによるＰＡＲＰ−１の活性化におけるＴＬＲの役割を確認し、関与する特異的ＴＬＲを同定した。ＴＬＲ４に対する抗体ではなく、ＴＬＲ２に対する抗体が、１５−ＨＣによるＰＡＲＰ−１の活性化を抑制し、アイソタイプが一致した対照抗体を使用したときには効果が見られなかった（図６Ａ）。この１５−ＨＣによるＰＡＲＰ−１の活性化の抑制は、ＴＡＫ１、ＩＲＡＫ、Ａｋｔ、ｐ３８−ＭＡＰＫ、ＰｙＫ２、ＰＫＣ、ＰＩ３Ｋ、およびＥＲＫ１／２のリン酸化の完全な抑制と関連していた（図９）。
【００４６】
１５α−ＨＣによるＰＡＲＰ−１の活性化におけるＴＬＲ２の役割をさらに確認するために、ＰＡＲＰ−１を発現するがＴＬＲ２は発現しないヒト胎児腎細胞株ＨＥＫ−２９３を使用した。１５−ＨＣを用いたＨＥＫ−２９３細胞の処理は、ＰＡＲＰ−１の活性において有意な効果を示さなかった（図６Ｂ）。しかしながら、ＴＬＲ２をコードするプラスミドでＨＥＫ−２９３細胞をトランスフェクションすると、１５α−ＨＣによるＰＡＲＰ−１の有意な活性化がもたらされた（図６Ｂ）。これらの結果を総合すると、１５−ＨＣは、ＴＬＲ２／ＰＡＲＰ−１依存性シグナル伝達経路を介してミクログリア、マクロファージ、および星状細胞を活性化することが示唆される。
１５−ＨＣのより高い血清、そしてヒトＳＰＭＳに見られた単球ＰＡＲＰ−１の活性化の増加を考慮すると、ＴＬＲ２／ＰＡＲＰ−１シグナル伝達経路を介して作用する１５−ＨＣは、ＳＰＭＳを特徴付けるミクログリアの活性化に寄与する可能性が高い（Ｋｕｔｚｅｌｎｉｇｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｒａｉｎ  １２８，２７０５−２７１２（２００５））。これらの観察は、ＣＮＳの天然性免疫の異常が、ＳＰＭＳにおける神経変性および障害の蓄積を促進するモデルと合致する。したがって、ＳＰＭＳのための新しい治療アプローチは、グルタミン酸毒性のような神経変性の特異的機構（Ｂａｓｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１８，１５３２−１５４３（２００８）；Ｐｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ６，６７−７０（２０００）；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ６，６２−６６（２０００））、およびそれらを促進する天然性免疫応答の両方を標的にするべきである。本明細書において実証されるように、ＰＡＲＰ−１は、ＳＰＭＳのヒトおよび実験的モデルにおいて軸索消失および障害の蓄積を促進するＣＮＳの免疫応答を停止させるための潜在的な治療標的である。
【００４７】
全体として、我々のデータは、ＴＬＲ２／ＰＡＲＰ−１依存性シグナル伝達経路を介して作用する１５−ＨＣが、ＳＰＭＳにおいて、ＣＮＳにおける局所的な天然性免疫炎症を永続化させることを示唆している。ミエリンの分解が１５−ＨＣの生成をもたらし、ＣＮＳの天然性免疫を活性化し、さらなる軸索破壊およびより多くの１５−ＨＣの生成をもたらす。よって、ＴＬＲ２／ＰＡＲＰ−１軸は、ＳＰＭＳのための潜在的な治療標的であり、１５−ＨＣは、ＭＳにおける疾患の進行を監視するための新しいバイオマーカーを構成する可能性がある。
【実施例６】
【００４８】
ＳＰＭＳにおけるＴＬＲ２／ＰＡＲＰ−１軸
ＴＬＲ２／ＰＡＲＰ−１軸がヒトにおいて機能的であるかどうかを調査するために、ＰＡＲＰ−１またはＴＬＲ２阻害剤の存在下または非存在下において、１５−ＨＣを用いて健常対照由来のＰＢＭＣを活性化した。図１０Ａは、ヒトＰＢＭＣを１ｕｇ／ｍＬの１５−ＨＣで処理することにより、酵素活性検出キット（すなわち、ＰＡＲＰ  ＨＴ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  Ｋｉｔ  （Ｔｒｅｖｉｇｅｎ））を使用して測定された様にＰＡＲＰ−１酵素活性の活性化がもたらされることを示している。この活性化は、ＰＡＲＰ−１阻害剤ＡＩＱまたはＴＬＲ２遮断抗体を用いて抑制することができるが、アイソタイプ制御抗体では抑制することができない（図１０Ａ）。マウスにおいて観察されたものと同様に、１ｕｇ／ｍＬの１５−ＨＣでヒト単球を活性化することにより、ＰＡＲＰ−１およびＴＬＲ２依存性の様式でＴＮＦａおよびＣＣＬ２の生成がもたらされた（図１０Ｂ）。よって、１５−ＨＣは、炎症誘発性メディエーターＴＮＦａおよびＣＣＬ２の放出をもたらすＴＬＲ２依存性経路によって、ヒト単球においてＰＡＲＰ−１を活性化する。
【００４９】
特異的抗体を用いたＰＡＲＰ−１産物ＰＡＲの細胞内検出に基づいてＰＡＲＰ−１の活性化を検出するために、新しいＦＡＣＳに基づく方法が開発された。簡単に説明すると、非特異的抗体結合をブロックするために、ＣＤ１６／３２に対する抗体で細胞をインキュベートし、次いで、表面マーカー染色した。洗浄後、細胞をＦｉｘ／Ｐｅｒｍ（ＢＤ）で透過処理し、次いで、ウサギ抗ＰＡＲ抗体（または対照ウサギＩｇＧ）で３０分間４℃で染色し、その後、抗ウサギＰＥで３０分間室温で染色した。次いで、ＦＡＣＳにより試料を分析した。
１５−ＨＣによるヒト単球の活性化は、ＰＡＲ染色における有意な増加をもたらし（図１１Ａ）、それは、特異的ＰＡＲＰ−１阻害剤ＡＩＱで、またはＴＬＲ２に対する遮断抗体でブロックすることができた（図１１Ａ）。酵素キットまたは新しく開発されたＦＡＣＳに基づく方法を使用してヒト単球上で検出されたＰＡＲＰ−１活性との間に線形相関が見られた（図１１Ｂ）。
【００５０】
ＲＲＭＳ患者、ＳＰＭＳ患者、および健常対照の循環血液中に存在する天然性免疫系の細胞におけるＰＡＲＰ−１の活性を特徴付けるために、ＦＡＣＳに基づく方法を使用した。ＳＰＭＳ患者の炎症性単球（図１２Ａ）、古典的単球（図１２Ｂ）、およびＤＣ（図１２Ｃ）において、ＰＡＲＰ−１の活性に有意な上方制御が見られた。この上方制御は、健常対照（ＨＣ）またはＲＲＭＳ患者に検出されたＰＡＲＰ−１の活性と比較して有意であった。同じ患者の順応免疫系の細胞を分析したとき、ＣＤ８＋Ｔ細胞（図１３Ａ）、Ｂ細胞（図１３Ｂ）、およびＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞（図１３Ｃ）おいて、ＲＲＭＳ患者およびＳＰＭＳ患者の両方でＰＡＲＰ−１の活性が増加していた。よって、ＰＡＲＰ−１の活性は、ＳＰＭＳ患者では天然性免疫系の細胞において上方制御され、ＲＲＭＳ患者およびＳＰＭＳ患者の両方では順応免疫系の細胞において上方制御される。
次いで、ＳＰＭＳとＲＲＭＳとの間の差異が、ＳＰＭＳ患者由来の単球における１５−ＨＣまたは他のＴＬＲアゴニストに対する応答の悪化に起因するものであるかどうかを判定するために、単球においてＳＰＭＳおよびＲＲＭＳにおけるＰＡＲＰ−１の活性を評価した。１５−ＨＣでインキュベーションすると、健常対照、ＲＲＭＳ患者、およびＳＰＭＳ患者由来の単球は、ＰＡＲＰ−１の活性化と同様のレベルに達した（図１４Ａおよび１４Ｂ）。さらに、この３つの実験群において、１５−ＨＣによるＰＡＲＰ−１の活性化は、ＰＡＲＰ−１特異的阻害剤１５−ＨＣおよびＴＬＲ２遮断抗体によって抑制することができた（図１４Ａおよび１４Ｂ）。また、ＰＡＲＰ−１の活性化を誘発することでも知られる他のＴＬＲアゴニストに対する応答において、有意な差異は見られなかった（図１５Ａおよび１５Ｂ）。よって、ＳＰＭＳ患者の天然性免疫系に見られたＰＡＲＰ−１活性の増加は、過反応性ＴＬＲ／ＰＡＲＰ−１シグナル伝達軸に起因しない。
【００５１】
ＳＰＭＳ患者におけるＴＬＲ２／ＰＡＲＰ−１軸の活性増加が、ＴＬＲ２リガンドレベルの増加に起因するかどうかを調査するために、健常対照、ＲＲＭＳ患者、およびＳＰＭＳ患者由来の血清試料において１５−ＨＣおよびＨＳＰ６０のレベルを測定した。ＲＲＭＳ患者の血清試料にＨＳＰ６０レベルの増加が見られ（図１６Ａ）、ＳＰＭＳ患者の血清試料に１５−ＨＣレベルの増加が見られた（図１６Ｂ）。ＨＳＰ６０および１５−ＨＣの両方がＴＬＲ２アゴニストであると報告されているため、それらが天然性免疫系および順応免疫系の細胞を活性化する能力をインビトロで比較した。順応免疫系または天然性免疫系の異なる細胞を、異なる濃度のＨＳＰ６０（１、５、もしくは１０ｎｇ／ｍＬ）または１５−ＨＣ（１、５、もしくは１０ｕｇ／ｍＬ）でインキュベートした。結果は、１５−ＨＣのみが、順応免疫系の細胞を活性化できたが（図１７）、ＨＳＰ６０および１５−ＨＣの両方が、順応免疫応答の細胞を活性化できたことを示した（図１８）。よって、ＨＳＰ６０および１５−ＨＣの両方がＴＬＲ２リガンドであるが、それらは、順応免疫系または天然性免疫系の細胞のＴＬＲ２／ＰＡＲＰ−１軸を活性化させる能力において異なる。さらに、これらのデータは、１５−ＨＣレベルの増加は、ＭＳの進行期において、ＰＡＲＰ−１による天然性免疫活性を促進することを示している。
【００５２】
他の実施形態
本発明を、その詳細な説明とともに記載してきたが、上記説明は例示を目的とするものであって、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を制限するものではないことを理解されたい。他の態様、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
【図１Ａ】
2012515924.tif 000007
【図１Ｂ】
2012515924.tif 000008
【図２Ａ】
2012515924.tif 000009
【図２Ｂ】
2012515924.tif 000010
【図２Ｃ】
2012515924.tif 000011
【図３Ａ】
2012515924.tif 000012
【図３Ｃ】
2012515924.tif 000013
【図３Ｄ】
2012515924.tif 000014
【図４Ａ】
2012515924.tif 000015
【図４Ｃ】
2012515924.tif 000016
【図４Ｄ】
2012515924.tif 000017
【図５Ａ】
2012515924.tif 000018
【図６Ａ】
2012515924.tif 000019
【図６Ｂ】
2012515924.tif 000020
【図７】
2012515924.tif 000021
【図８】
2012515924.tif 000022
【図９】
2012515924.tif 000023
【図１０Ａ】
2012515924.tif 000024
【図１０Ｂ】
2012515924.tif 000025
【図１１Ｂ】
2012515924.tif 000026
【図１４Ｂ】
2012515924.tif 000027
【図１５Ｂ】
2012515924.tif 000028
【図１６Ａ】
2012515924.tif 000029
【図１６Ｂ】
2012515924.tif 000030
【図１７Ａ】
2012515924.tif 000031
【図１７Ｂ】
2012515924.tif 000032
【図１７Ｃ】
2012515924.tif 000033
【図１８Ａ】
2012515924.tif 000034
【図１８Ｂ】
2012515924.tif 000035
【図１８Ｃ】
2012515924.tif 000036
【図３Ｂ】
2012515924.tif 000037
【図４Ｂ】
2012515924.tif 000038
【図５Ｂ】
2012515924.tif 000039
【図５Ｃ】
2012515924.tif 000040
【図５Ｄ】
2012515924.tif 000041
【図１１Ａ】
2012515924.tif 000042
【図１２Ａ】
2012515924.tif 000043
【図１２Ｂ】
2012515924.tif 000044
【図１２Ｃ】
2012515924.tif 000045
【図１３Ａ】
2012515924.tif 000046
【図１３Ｂ】
2012515924.tif 000047
【図１３Ｃ】
2012515924.tif 000048
【図１４Ａ】
2012515924.tif 000049
【図１５Ａ】
2012515924.tif 000050
【図１７Ｄ】
2012515924.tif 000051
【図１８Ｄ】
2012515924.tif 000052
【国際調査報告】
2012515924.tif 000053
2012515924.tif 000054
2012515924.tif 000055