(57)【要約】  本開示は、変異体グリコシル化パターンを有する糖タンパク質を産生する細胞を含む組成物および方法を提供する。方法および組成物は、治療用の価値のある抗体およびタンパク質を産生する上で用いてもよい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
変異体グリコシル化パターンを呈するよう修飾された糖タンパク質であって、前記変異体グリコシル化パターンが、対応する野生型糖タンパク質と比較して少なくとも２種類の糖分子のレベルの変化によって特徴づけられる、糖タンパク質。
【請求項２】
前記変異体グリコシル化パターンが、グルコース、ガラクトース、またはその両方のレベルの変化によって証明される、請求項１に記載の糖タンパク質。
【請求項３】
前記ガラクトースのレベルの変化が低下である、請求項１に記載の糖タンパク質。
【請求項４】
前記グルコースのレベルの変化が増加である、請求項１に記載の糖タンパク質。
【請求項５】
前記変異体グリコシル化パターンが、グルコースレベルの増加、ガラクトースレベルの低下、およびフコースレベルの低下によって証明される、請求項１記載の糖タンパク質。
【請求項６】
前記変異体グリコシル化パターンが、末端グルコース部分によって証明される、請求項１に記載の糖タンパク質。
【請求項７】
前記変異体グリコシル化パターンが、式（Ｉ）または（ＩＩ）の構造：
【化１】
2012503656.tif 000012
を有するＮ連結型グリカンを含む、請求項１に記載の糖タンパク質。
【請求項８】
Ｎ連結型グリカンを含む、修飾された宿主細胞によって産生される抗体であって、修飾されていない宿主細胞によって産生される対応する抗体と比較して、Ｆｃγ受容体ＩＩＩａ（ＦｃγＲＩＩＩａ）に対して高い結合親和性を、および／または、Ｆｃγ受容体ＩＩｂ（ＦｃγＲＩＩｂ）に対して低い結合親和性を有し、それによりＦｃγＲＩＩＩａおよび／またはＦｃγＲＩＩｂを発現するエフェクター細胞に対してＡＤＣＣ（抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用）活性を増大させる、抗体。
【請求項９】
Ｎ連結型グリカンを含む、修飾された宿主細胞によって産生される抗体であって、対応する修飾されていない宿主細胞によって産生される対応する抗体と比較して、高いＡＤＣＣ活性を呈し、かつ前記高いＡＤＣＣ活性が、高親和性Ｆｃγ受容体であるＦｃγＲＩＩＩａ  １５８Ｖ／Ｖを発現するエフェクター細胞、および低親和性Ｆｃγ受容体であるＦｃγＲＩＩＩａ  １５８Ｆ／ＦまたはＦｃγＲＩＩＩａ  １５８Ｆ／Ｖを発現するエフェクター細胞に対してである、抗体。
【請求項１０】
前記Ｎ連結型グリカンが、１つのグルコース分子、４つのマンノース分子、および２つのＮ−アセチルグリコサミン分子を含む、請求項８または請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
前記Ｎ連結型グリカンが１つ以上のフコース分子を含む、請求項８または請求項９に記載の抗体。
【請求項１２】
Ｎ連結型グリカンが、式（Ｉ）または（ＩＩ）の構造：
【化２】
2012503656.tif 000013
を有する、請求項８または請求項９に記載の抗体。
【請求項１３】
前記Ｎ連結型グリカンが、前記抗体のＦｃ領域に結合する、請求項８または請求項９に記載の抗体。
【請求項１４】
前記抗体が、癌抗原に結合する、請求項８または請求項９に記載の抗体。
【請求項１５】
前記癌抗原が、ＨＥＲ２、免疫グロブリンεＦｃ受容体ＩＩ、Ａｌｋ−１、ＣＤ２０、ＥＧＦ受容体、ＶＥＧＦ受容体、ＦＧＦ受容体、ＮＧＦ受容体、ＰＤＧＦ受容体、ＥｐＣａｍ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５１、ＣＤ５５、ＣＤ８０、ＣＤ９５、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＴＬＡ−４、ムチン１、ムチン１６、エンドグリン、メソテリン受容体、ノゴ（Ｎｏｇｏ）受容体、葉酸受容体、ＣＸＣＲ４、インスリン様増殖因子受容体、ガングリオシドＧＤ３、ならびにαおよびβインテグリンからなる群から選択される、請求項１４に記載の抗体。
【請求項１６】
前記抗体が、阻害抗体である、請求項８または請求項９に記載の抗体。
【請求項１７】
前記抗体が、ＩｇＧ抗体である、請求項８または請求項９に記載の抗体。
【請求項１８】
前記抗体が、修飾されていないＣＨＯ細胞クローンであるＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＃ＣＣＬ−６１およびＣＲＬ−９６１８）またはＣＨＯ−ＤＧ４４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃１２６０９−０１２）によって産生される対応する抗体と比較して、低親和性ＦｃＲ、ＦｃγＲＩＩＩａ  １５８Ｆ／ＦまたはＦｃγＲＩＩＩａ  １５８Ｆ／Ｖを発現するエフェクター細胞に対して高いＡＤＣＣ（抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用）活性を有する、請求項８または請求項９に記載の抗体。
【請求項１９】
前記抗体が、修飾されていないＣＨＯ細胞クローンであるＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＃ＣＣＬ−６１およびＣＲＬ−９６１８）またはＣＨＯ−ＤＧ４４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃１２６０９−０１２）によって産生される対応する抗体と比較して、高親和性ＦｃＲであるＦｃγＲＩＩＩａ  １５８Ｖ／Ｖを発現するエフェクター細胞に対して高いＡＤＣＣ（抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用）活性を有する、請求項８または請求項９に記載の抗体。
【請求項２０】
前記宿主細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項８または請求項９に記載の抗体。
【請求項２１】
前記宿主細胞が、ＮＳ０、ＳＰ２／０、ＨＥＫ２９３、ＰＥＲ．Ｃ６、およびＹＢ２／０細胞からなる群から選択される、請求項８または請求項９に記載の抗体。
【請求項２２】
前記宿主細胞が、ミエローマ細胞である、請求項８または請求項９に記載の抗体。
【請求項２３】
前記エフェクター細胞が、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である、請求項８または請求項９に記載の抗体。
【請求項２４】
前記抗体が、抗Ｈｅｒ２抗体である、請求項８または請求項９に記載の抗体。
【請求項２５】
前記エフェクター細胞が、ＮＫ細胞、単球、マクロファージ、または多形核ニュートラフィルス（ｎｅｕｔｒａｐｈｉｌｓ）（ＰＭＮ）である、請求項８または請求項９に記載の抗体。
【請求項２６】
１つのグルコース分子、４つのマンノース分子、および２つのＮ−アセチルグリコサミン分子を含む、Ｎ連結型グリカン。
【請求項２７】
前記グルコースが、前記Ｎ連結型グリカンの末端に配置され、かつ前記Ｎ連結型グリカンが、１つ以上のフコース分子を任意に含む、請求項２６に記載のＮ連結型グリカン。
【請求項２８】
式（Ｉ）の構造
【化３】
2012503656.tif 000014
を有する、請求項２６に記載のＮ連結型グリカン。
【請求項２９】
式（ＩＩ）の構造
【化４】
2012503656.tif 000015
を有する、請求項２６に記載のＮ連結型グリカン。
【請求項３０】
請求項２６〜２９のいずれか一項記載のＮグリカンを含む、単離した糖タンパク質。
【請求項３１】
前記糖タンパク質が抗体である、請求項３０に記載の糖タンパク質。
【請求項３２】
前記糖タンパク質が酵素である、請求項３０に記載の糖タンパク質。
【請求項３３】
前記Ｎ連結型グリカンが、前記抗体のＦｃ領域に結合する、請求項３１に記載の糖タンパク質。
【請求項３４】
前記抗体が癌抗原に結合する、請求項３１に記載の糖タンパク質。
【請求項３５】
前記癌抗原が、ＨＥＲ２、免疫グロブリンεＦｃ受容体ＩＩ、Ａｌｋ−１、ＣＤ２０、ＥＧＦ受容体、ＶＥＧＦ受容体、ＦＧＦ受容体、ＮＧＦ受容体、ＰＤＧＦ受容体、ＥｐＣａｍ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５１、ＣＤ５５、ＣＤ８０、ＣＤ９５、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＴＬＡ−４、ムチン１、ムチン１６、エンドグリン、メソテリン受容体、ノゴ受容体、葉酸受容体、ＣＸＣＲ４、インスリン様増殖因子受容体、ガングリオシドＧＤ３、ならびにαおよびβインテグリンからなる群から選択される、請求項３４に記載の糖タンパク質。
【請求項３６】
前記抗体が、Ｎ連結したグリカンの実質的に均質な集団を産生する修飾された宿主細胞によって産生される、請求項３１に記載の糖タンパク質。
【請求項３７】
前記抗体が、修飾されていないＣＨＯ細胞クローンであるＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＃ＣＣＬ−６１およびＣＲＬ−９６１８）またはＣＨＯ−ＤＧ４４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃１２６０９−０１２）によって産生される対応する抗体と比較して、高いＡＤＣＣ（抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用）活性を有する、請求項３１に記載の糖タンパク質。
【請求項３８】
前記抗体が、修飾されていないＣＨＯ細胞クローンであるＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＃ＣＣＬ−６１およびＣＲＬ−９６１８）またはＣＨＯ−ＤＧ４４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃１２６０９−０１２）によって産生される対応する抗体と比較して、ＦｃγＲＩＩＩＡ受容体に対する高い結合親和性を有する、請求項３１に記載の糖タンパク質。
【請求項３９】
前記抗体が阻害抗体である、請求項３１に記載の糖タンパク質。
【請求項４０】
前記抗体がＩｇＧ抗体である、請求項３１に記載の糖タンパク質。
【請求項４１】
（ａ）前記修飾された糖タンパク質をコードする異種性ポリヌクレオチド配列を提供すること；
および
（ｂ）宿主細胞が、グルコース、ガラクトース、マンノース、およびグルコサミンからなる群から選択される１つ以上の糖部分のレベルにおける変化によって特徴づけられる変異体グリコシル化パターンを有するＮ連結型グリカンを産生する、前記修飾された糖タンパク質を前記宿主細胞において発現させること
を含む、修飾された糖タンパク質を産生する方法。
【請求項４２】
前記宿主細胞が、無血清培地において維持される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記宿主細胞が、懸濁培養において維持される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記修飾された糖タンパク質が、抗体である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記宿主細胞が、式（Ｉ）または（ＩＩ）の構造
【化５】
2012503656.tif 000016
を有するＮ連結型グリカンを産生する、請求項４１記載の方法。
【請求項４６】
修飾されていない親宿主細胞と比較して、グルコース、ガラクトース、マンノース、およびグルコサミンからなる群から選択される１つ以上の糖部分のレベルの変化によって特徴づけられる変異体グリコシル化パターンを有するＮ連結型グリカンを産生する、修飾された宿主細胞。
【請求項４７】
前記変異体グリコシル化パターンが、前記修飾されていない親宿主細胞と比較して、前記宿主細胞の表面に存在する少なくとも２種類の糖分子のレベルにおける変化によって特徴づけられる、請求項４６に記載の修飾された宿主細胞。
【請求項４８】
実質的に均質なパターンのＮ連結型グリカンを呈する糖タンパク質を産生する単離された宿主細胞。
【請求項４９】
前記実質的に均質なパターンのＮ連結型グリカンが、質量分析によって分離される単一ピークによって立証される、請求項４８に記載の宿主細胞。
【請求項５０】
Ｎ連結型グリカンを有する修飾された抗体を産生する能力によって特徴づけられる修飾された宿主細胞であって、前記抗体が、修飾されていない宿主細胞によって産生される対応する抗体と比較して、Ｆｃγ受容体ＩＩＩａ（ＦｃγＲＩＩＩａ）に対する高い結合親和性、および／またはＦｃγ受容体ＩＩｂ（ＦｃγＲＩＩｂ）に対する低い結合親和性を呈し、それにより、ＦｃγＲＩＩＩａおよび／またはＦｃγＲＩＩｂを発現するエフェクター細胞に対するＡＤＣＣ（抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用）活性を増大させる、宿主細胞。
【請求項５１】
前記増大されたＡＤＣＣ活性が、高親和性Ｆｃγ受容体であるＦｃγＲＩＩＩａ  １５８Ｖ／Ｖを発現するエフェクター細胞、および低親和性Ｆｃγ受容体であるＦｃγＲＩＩＩａ  １５８Ｆ／ＦまたはＦｃγＲＩＩＩａ  １５８Ｆ／Ｖを発現するエフェクター細胞に対してである、請求項５０に記載の宿主細胞。
【請求項５２】
前記Ｎ連結型グリカンが、ガラクトースのレベルの減少によって特徴づけられる変異体パターンを呈する、請求項４６〜５１のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項５３】
前記変異体グリコシル化パターンが、グルコースレベルの増加によって特徴づけられる、請求項４６〜５１のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項５４】
対応する修飾されていない宿主細胞よりも高いＡＤＣＣ活性を呈する抗体を産生する、請求項４６〜５１のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項５５】
前記変異体グリコシル化パターンが、末端グルコース部分の存在によって特徴づけられる、請求項４６〜５１のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項５６】
前記変異体グリコシル化パターンが、フコースレベルの減少、グルコースの増加、およびガラクトースの低下によって特徴づけられる、請求項４６〜５１のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項５７】
前記Ｎ連結したパターンが、式ＩまたはＩＩの構造：
【化６】
2012503656.tif 000017
を有する、請求項４６〜５１のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項５８】
前記宿主細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項４６〜５１のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項５９】
前記細胞が、ミエローマ細胞である、請求項４６〜５１のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項６０】
前記細胞が、少なくともおよそ６０回の継代後に変異体グリコシル化パターンを維持する、請求項４６〜５１のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項６１】
請求項４６〜５１のいずれか一項に記載の宿主細胞を含む培地。
【請求項６２】
無血清培地において請求項４６〜５１のいずれか一項に記載の複数の宿主細胞を含む培養発酵槽。
【請求項６３】
（ａ）複数の真核細胞を提供すること；
（ｂ）無作為な遺伝子突然変異を前記複数の真核細胞に導入すること；および
（ｃ）前記無作為な遺伝子突然変異に供されなかった対応する親細胞と比較して、少なくとも１種類の糖部分のレベルの変化によって特徴づけられる変異体グリコシル化パターンを呈する少なくとも１つの細胞を前記複数の細胞から選択すること
を含む、変異体グリコシル化パターンを用いて真核細胞を選択する方法。
【請求項６４】
前記遺伝子突然変異が、化学的変異原によって誘導される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記変異体グリコシル化パターンが、グルコース、ガラクトース、マンノース、およびグルコサミンからなる群から選択される１つ以上の糖部分のレベルの変化によって特徴づけられる、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記変異グリコシル化パターンが、ガラクトースのレベルの減少によって特徴づけられる、請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
前記変異グリコシル化パターンが、Ｄ−グルコサミンのレベルの減少によって特徴づけられる、請求項６３に記載の方法。
【請求項６８】
前記変異体グリコシル化パターンが、マンノースのレベルの増加によって特徴づけられる、請求項６３に記載の方法。
【請求項６９】
前記変異体グリコシル化パターンが、末端グルコース分子の存在によって特徴づけられる、請求項６３に記載の方法。
【請求項７０】
選択された前記真核細胞が、前記無作為な遺伝子突然変異に供されていない対応する細胞のＡＤＣＣ活性と比較して高いＡＤＣＣ活性を呈する抗体を産生する、請求項６３に記載の方法。
【請求項７１】
選択された前記真核細胞が、前記無作為の遺伝子突然変異に供されていない対応する細胞によって産生される対応する抗体と比較して、ＦｃγＲＩＩＩＡ受容体に対する高い結合親和性を有する抗体を産生する、請求項６３に記載の方法。
【請求項７２】
前記真核細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項６３に記載の方法。
【請求項７３】
前記真核細胞が、ＮＳ０、ＳＰ２／０、ＨＥＫ２９３、ＰＥＲ．Ｃ６、およびＹＢ２／０細胞からなる群から選択される、請求項６３に記載の方法。
【請求項７４】
前記真核細胞が、ミエローマ細胞である、請求項６３に記載の方法。
【請求項７５】
選択された前記細胞が、少なくともおよそ６０回の継代後に前記変異体グリコシル化パターンを維持する、請求項６３に記載の方法。
【請求項７６】
選択された前記細胞が、無血清培地において増殖する、請求項６３に記載の方法。
【請求項７７】
選択された前記細胞が、懸濁液において増殖する、請求項６３に記載の方法。
【請求項７８】
選択された前記細胞が、異種性糖タンパク質をコードする異種性配列を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項７９】
選択された前記細胞が、実質的に均質なパターンのＮ連結型グリカンを発現する、請求項６３に記載の方法。
【請求項８０】
前記Ｎ連結型グリカンの実質的に均質なパターンが、質量分析によって分離される単一のピークによって立証される、請求項７９記載の方法。
【請求項８１】
前記変異体グリコシル化パターンが、式ＩまたはＩＩの構造：
【化７】
2012503656.tif 000018
を有するＮ連結したパターンによって特徴づけられる、請求項６３に記載の方法。
【請求項８２】
前記変異体グリコシル化パターンが、ガラクトースのレベルの減少、グリコース（ｇｌｙｃｏｓｅ）の増加、およびフコースの減少によって特徴づけられる、請求項６３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、すべての目的においてそれらの全内容が本明細書に組み込まれる、２００８年９月２６日に出願した米国シリアル番号６１／１９４，２９２、２００８年１２月８日に出願した米国シリアル番号６１／１２０，７２２、および２００９年４月９日に出願した米国シリアル番号６１／１６８，１８６に対する優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
炭水化物、糖、または糖分子の組成物における変化によって、ＩｇＧ介在性免疫応答を細胞性エフェクター機能と関連させるＦｃγＲの３つのクラス（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩ）に対するＩｇＧの親和性に影響が及ぼされることが示されている（Ｗｒｉｇｈｔ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １５（１）：  ２６−３２；  Ｇｅｓｓｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ７６（６）：  ２３１−４８  （１９９８）；  Ｊｅｆｆｅｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  １６３：  ５９−７６  （１９９８）．  Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｂｏｌｌａｎｄ，  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９：  ２７５−９０  （２００１））。
【０００３】
糖タンパク質の糖鎖は、一般的に、タンパク質性部分への結合形態に基づいて下記の２つの大まかな種類に分けられる：すなわち、アスパラギンに結合する糖鎖（Ｎ−グリコシド連結型糖鎖）、およびセリンまたはトレオニンなどの他のアミノ酸に結合する糖鎖（Ｏ−グリコシド連結型糖鎖）である。典型的にこれらは、下記の構造式（Ｉ）：
【化１】
2012503656.tif 000002
によって示される基本の共通の中心構造を有する。
【０００４】
Ｎ−グリコシド連結型糖鎖は、種々の構造を有し、種々の糖分子を備えている。アスパラギンに結合する糖鎖末端は典型的に、還元末端と呼ばれ、反対側は非還元末端と呼ばれる。Ｎ−グリコシド連結型糖鎖には、マンノースが中心構造の非還元末端に単独で結合する高マンノース型；中心構造の非還元末端側が、ガラクトース−Ｎ−アセチルグルコサミン（Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ）の少なくとも１つの並列分岐を有し、かつＧａｌ−ＧｌｃＮＡｃの非還元末端側が、Ｎ−アセチルグルコサミンまたはその類似物を二分するシアル酸の構造を有する複合体型；中心構造の非還元末端側が高マンノース型および複合体型の両方の分岐を有するハイブリッド型；ならびにそれらの類似物を含むことができる。糖鎖の構造は、糖鎖を合成するグリコシルトランスフェラーゼについての遺伝子、および／または糖鎖を加水分解する解糖系酵素についての遺伝子など、糖鎖遺伝子によって決定することができる。
【０００５】
糖タンパク質は典型的に、小胞（ＥＲ）内腔における糖鎖を用いて修飾される。例えば、Ｎ−グリコシド連結型糖鎖の生合成工程の間、比較的大きな糖鎖は、ＥＲ内腔において伸長しているポリペプチド鎖に転移する。糖分子は、リン酸ドリコールなど、約２０個のα−イソプレン単位を含む長鎖脂質担体のリン酸基に連続して付加することができる。例えば、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）は、Ｐ−Ｄｏｌに転移してＧｌｃＮＡｃ−Ｐ−Ｐ−Ｄｏｌを形成した後、１つ以上のＧｌｃＮＡｃが転移して、ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｐ−Ｐ−Ｄｏｌを形成する。次に、５つのマンノース（Ｍａｎ）を転移し、それにより（Ｍａｎ）５−（ＧｌｃＮＡｃ）２−Ｐ−Ｐ−Ｄｏｌを形成した後、４つのＭａｎおよび３つのグルコース（Ｇｌｃ）が転移する。結果として、中心オリゴ糖である糖鎖前駆体（Ｇｌｃ）３−（Ｍａｎ）９−（ＧｌｃＮＡｃ）２−Ｐ−Ｐ−Ｄｏｌが形成される。次に、１４個の糖を含む糖鎖前駆体は、ＥＲ内腔におけるアスパラギン−Ｘ−セリン配列またはアスパラギン−Ｘ−トレオニン配列を有するポリペプチドに転移することができる。中心オリゴ糖に結合したピロリン酸ドリコール（Ｐ−Ｐ−Ｄｏｌ）は典型的に、ピロホスファターゼによる加水分解によって放出されて、リン酸ドリコール（Ｐ−Ｄｏｌ）となり、再利用される。糖鎖のトリミングは典型的に、糖鎖がポリペプチドに結合した後に始まる。例えば、３つのＧｌｃおよび１つまたは２つのＭａｎは、α−１，２−グルコシダーゼＩ、α−１，３−グルコシダーゼＩＩ、およびα−１，２−マンノシダーゼの作用などによって、ＥＲにおいて除去される。
【０００６】
ＥＲにおいてトリミングを受けた糖タンパク質は、ゴルジ体に転移して、さらに修飾されることができる。例えば、ゴルジ体のシス部分には、Ｎ−アセチルグルコサミンホスホトランスフェラーゼ（リン酸マンノースの付加を助ける）、Ｎ−アセチルグルコサミン１−ホスホジエステルα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｍｉｄａｓｅ）、およびαマンノシダーゼＩ（Ｍａｎ残基を５つに減少させる）が存在する。ゴルジ体の中央部分には、Ｎ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼＩ（ＧｎＴＩ）（複合体型Ｎ−グリコシド連結型糖鎖の最初の外側のＧｌｃＮＡｃの付加を助ける）、α−マンノシダーゼＩＩ（２つのＭａｎの除去を助ける。）、Ｎ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼＩＩ（ＧｎＴＩＩ）（外側から２番目のＧｌｃＮＡｃの付加を助ける）、およびα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ（還元末端Ｎ−アセチルグルコサミンへのフコースの付加を助ける）。ゴルジ体のトランス部分には、ガラクトースの付加を助けるガラクトーストランスフェラーゼ、およびＮ−アセチルノイラミン酸またはそれらの類似物などのシアル酸の付加に関連するシアリルトランスフェラーゼが存在する。このように、種々のＮ−グリコシド連結型糖鎖は、これらの種々の酵素の活性によって形成することができる。
【０００７】
糖鎖構造の変化、またはこのような鎖における種々の糖分子含有量による変異体グリコシル化パターンは、抗体などの糖タンパク質のエフェクター機能において重要な役割を担っている。例えば、ＩｇＧ型の抗体のＦｃ領域において、２つのＮ−グリコシド連結型糖鎖結合部位が典型的に存在する。血清ＩｇＧにおいて、糖鎖結合部位は一般に、複数の分岐を有する複合体型糖鎖を結合し、それにおいて、シアル酸または二分しているＮ−アセチルグルコサミンの付加は低い。ガラクトースの付加が、複合体型糖鎖の非還元末端に対してなされ、フコースが還元末端におけるＮ−アセチルグルコサミンに対してなされる多様な様式および形態がある（例えば、Ｌｅｐｐａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ３６，  ７０２６−７０３６  （１９９７）参照）。
【０００８】
フコシル化は、新たに合成された抗体を、細胞のゴルジ体におけるフコース糖類の付加によって修飾することができる過程の一例である。このタンパク質修飾は、フコースを用いて修飾したタンパク質に優先的に結合する化学物質であるフルオロフォア抱合ＬＣＡ（レンズクリマリス（ｃｕｌｉｍａｒｉｓ）凝集素−Ａ）を用いて細胞を染色することによって可視化することができる。近年、抗体のフコシル化は、ヒトＦｃγＲに結合する抗体および抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に影響を及ぼすことが観察されている。抗体結合親和性および抗体介在性ＡＤＣＣは、抗体が低レベルのフコースを有する場合、非常に高い（Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７（３０）：  ２６７３３−４  （２００２）；  Ｓｈｉｎｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８（５）：  ３４６６−７３  （２００３））。
【０００９】
タンパク質のフコシル化は、遊離フコースの取り込みで始まり、次いでフコースキナーゼによるリン酸化およびＧＤＰ−フコースピロホスホリラーゼによるＧＤＰ−フコースへの変換と続く過程である。フコシルトランスフェラーゼは、フコース残基を分泌経路内のグリカンまたはタンパク質に転移し、その後、修飾した糖タンパク質を分泌のために細胞表面に送達する。抗体産生細胞のフコシル化状態は、抗体における産生したフコース量と相関しており、しかも、細胞レベルおよび抗体レベルの両方において、フコシルトランスフェラーゼの欠如はフコシル化を抑止する（Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ８７（５）：  ６１４−２２  （２００４））。
【００１０】
ＡＤＣＣは、治療用抗体が免疫応答を誘導し、癌細胞の死滅を媒介する作用に関する重要な機序である。治療用抗体によるＡＤＣＣの増大は、臨床応答を改善し、治療的薬用量を減少させることができ、したがって、起こり得る副作用を低減することができる（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ８９（１０）：  ４２８５−９  （１９９２）；  Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ３７（４）：  ２５５−６３  （１９９３）；  Ｃｏｏｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２７（１０）：  １５３３−４１  （１９９９）；  Ｃｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ６（４）：  ４４３−６  （２０００）；  Ｒｅｐｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ９（７）：  ２４４０−６  （２００３）；  Ｇｅｎｎａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １０（１７）：  ５６５０−５  （２００４）；  Ｎａｈｔａ  ａｎｄ  Ｅｓｔｅｖａ，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ  ２３２（２）：  １２３−３８  （２００６））。インビボモデルおよび臨床治験は、ハーセプチンなどの治療用抗体が、ＡＤＣＣを含む細胞傷害特性を有することを示している。これらの特性は、ハーセプチン誘発性乳房腫瘍の退縮および肺転移からの保護における主要な因子である（Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７（３０）：  ２６７３３−４  （２００２）；  Ｓｈｉｎｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８（５）：  ３４６６−７３  （２００３））。
【００１１】
ヒトＩｇＧ１サブクラス抗体のＡＤＣＣ活性の発現は典型的に、キラー細胞、天然キラー細胞、活性化したマクロファージまたはその類似物（ＦｃγＲ）などのエフェクター細胞の表面に存在する抗体受容体および種々の補体成分に対する抗体のＦｃ領域の結合を必要とする。抗体のヒンジ領域の第二のドメイン並びにＣ領域（以後、「Ｃγ２ドメイン」と呼ぶ。）およびＣγ２ドメインに連結された糖鎖におけるいくつかのアミノ酸残基が、この結合反応に重要であることが示唆されている。
【００１２】
現在、下記などの、腫瘍細胞に対するモノクローナル抗体介在性ＡＤＣＣを増大させるいくつかの戦略が提唱されている：１）免疫エフェクター細胞をより効率よく動員するために、抗体の１つのアームがＩｇＧ受容体に結合する特異的抗癌抗体を開発すること（Ｓｅｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８（１−２）：  １−６  （２００１））；２）組換えヒトサイトカインを用いて、免疫エフェクター細胞のエフェクター機能を増大させること（Ｃａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３１（１０）：  ３０１６−２５  （２００１）；  Ｒｅｐｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ９（７）：  ２４４０−６  （２００３））；３）ＩｇＧ−サイトカイン融合タンパク質を用いること（Ｐｅｎｉｃｈｅｔ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８（１−２）：  ９１−１０１  （２００１））；４）ＩｇＧ受容体に対する改善した結合のために、抗体のＦｃ配列を変化させること（Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６（９）：  ６５９１−６０４  （２００１））；および５）Ａｓｎ２９７連結型炭水化物のレベルの最適化（Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １７（２）：  １７６−８０  （１９９９）；  Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ７４（４）：  ２８８−９４  （２００１）；  Ｓｈｉｎｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８（５）：  ３４６６−７３  （２００３））。
【００１３】
１つのアプローチは、抗癌抗体のフコース内容を修飾して、ＦｃγＲに対する結合親和性およびＡＤＣＣを増大させることである。ＩｇＧ１は、中心フコースの存在または不在とともにトリマンノシル中心構造から構成され、Ｎ−アセチルグルコサミンおよび末端ガラクトースを二分する、Ａｓｎ２９７に結合した２つのＮ連結型オリゴ糖鎖を有する（Ｒａｄｅｍａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｓｙｍｐ  ５１：  １３１−４８  （１９８６））。免疫グロブリンＧエフェクターにおけるＡｓｎ２９７連結型炭水化物の性質および重要性は、永く認識されている。リンパ腫治療のための抗ＣＤ２０抗体である脱フコシル化型リツキサンは、高い親和性および１００倍高いＡＤＣＣ活性でＦｃγＲＩＩＩａに強く結合する（Ｓｈｉｎｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８（５）：  ３４６６−７３  （２００３）；  Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ８７（５）：  ６１４−２２  （２００４）；  Ｋａｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ９４（４）：  ６８０−８  （２００６））。その他は、低フコースのハーセプチンをＦｃγＲＩＩＩａに結合すると、正常フコースのハーセプチンの約１００倍改善し、結果としてハーセプチン介在性ＡＤＣＣは実質的に改善された（Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７（３０）：  ２６７３３−４０  （２００２））。このことは、抗癌抗体の脱フコシル化が、これらのＦｃγＲに対する結合親和性を増大させ、ＡＤＣＣを増強することを示す。さらに、このことは、フコース内容の修飾が、抗体の治療効能を増強し、フコシル化型抗体に応答しない癌患者に対する治療を発展させるよう、抗体の抗癌免疫応答を改善することであったことを示唆する。
【００１４】
しかしながら、高い治療能力の抗体を修飾する代替的な方法についての需要が残っている。
【発明の概要】
【００１５】
高いエフェクター機能を有する治療用タンパク質を産生する需要は存在したままである。本開示は、変異体グリコシル化パターンをまたは、対応する野生型タンパク質ともしくは修飾されていないグリコシル化パターンを有する細胞株において産生されたタンパク質と比較して修飾されたグリコシル化パターンを有する細胞株および糖タンパク質を産生することによって、この需要および関連する利点に合った方法および組成物を提供する。宿主細胞によって発現した糖タンパク質の糖鎖内容における差、および抗体など変異体グリコシル化パターンを有する糖タンパク質の産生に使用することのできる宿主細胞の開発は、より高いエフェクター機能を有することができる。
【００１６】
一実施形態において、修飾されていない親宿主細胞と比較して変異体グリコシル化パターンを生じるよう修飾された宿主細胞を産生および選択するための方法および組成物が本明細書で提供される。変異体グリコシル化パターンを有する宿主細胞を選択する方法は、複数の宿主細胞を提供すること；無作為な遺伝子突然変異を、複数の宿主細胞に導入すること；および複数の細胞から、無作為な遺伝子突然変異に供されなかった対応する親細胞と比較して少なくとも１種類の糖分子のレベルの変化によって特徴づけられる変異体グリコシル化パターンを呈する少なくとも１つの細胞を選択することを含んでもよい。さらにその上、遺伝子突然変異は、化学的変異原によって誘導されてもよい。
【００１７】
宿主細胞は、哺乳類細胞などの真核細胞であってもよい。修飾された宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞であり得る。宿主細胞は、ＣＨＯ−１Ｅ５、ＣＨＯ−３Ｆ、またはＣＨＯ−２．６細胞などの修飾されたＣＨＯであってもよい。また、宿主細胞はミエローマ細胞であってもよい。修飾された宿主細胞は、ＮＳ０、ＳＰ２／０、ＨＥＫ２９３、ＰＥＲ．Ｃ６、またはＹＢ２／０細胞であり得る。修飾された宿主細胞は、修飾されていない親宿主細胞と比較して、宿主細胞の表面に存在する少なくとも２種類の糖分子のレベルの変化によって特徴づけられることができる変異体グリコシル化パターンを呈する。レベルの変化は少なくともおよそ１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、またはそれよりも高くあり得る。変異体グリコシル化パターンは、フコシル化、マンノシル化、Ｎ−アセチルグルコサミニル化、またはこれらの組み合わせのレベルの変化によって立証することができる。いくつかの実施形態において、変化は、ガラクトース、グルコース、またはその両方のレベルにおいてであり得る。変化は、ガラクトース、グルコース、またはその両方のレベルの増加または低下であり得る。例えば、変化は、グルコースの増加およびガラクトースの低下であり得る。
【００１８】
いくつかの実施形態において、レベルの変化は、修飾されていない親宿主細胞と比較して、修飾された宿主細胞のフコシル化のレベルの低下であってもよい。また、変異体グリコシル化パターンは、α連結型マンノースのレベルなど、マンノシル化のレベルの変化によっても立証することができる。マンノシル化のレベルは、修飾された宿主細胞において高くてもよい。また、変異体グリコシル化パターンは、修飾された宿主細胞におけるＮ−アセチルグルコサミニル化の低下または増加など、Ｎ−アセチルグルコサミニル化のレベルの変化によって立証することもできる。Ｎ−アセチルグルコサミニル化は、α連結型またはβ連結型Ｎ−アセチルグルコサミンを包含してもよい。修飾されていない親宿主と比較して変異体グリコシル化パターンを生じるよう修飾された宿主細胞は、修飾されていない親宿主細胞の１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性に匹敵する上記活性を有してもよい。別の態様において、修飾された宿主細胞は、少なくともおよそ３０回、４０回、５０回、６０回、８０回、１００回、１２０回、１５０回、２００回、１０００回、またはそれより多くの回数の継代後に、上記宿主細胞の変異体グリコシル化パターンを維持することができる。また、修飾された宿主細胞は、無血清培地において、懸濁液において、および／または発酵槽において増殖してもよい。
【００１９】
別の態様において、本発明は、Ｎ連結型グリカンの実質的に均質なパターンを呈する抗体を産生する修飾された非リンパ球宿主細胞によって産生される抗体の集団を提供し、ここで、集団のメンバーは、少なくとも２つの種類の異なる抗原を結合する。
【００２０】
別の態様において、本発明は、グルコース、ガラクトース、マンノース、およびグルコサミンからなる群から選択される１つ以上の糖部分のレベルの変化によって特徴づけられる変異体グリコシル化パターンを有するＮ連結型グリカンを産生する修飾された宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態において、変異体グリコシル化パターンは、ガラクトースレベルの減少によって特徴づけられる。いくつかの実施形態において、変異体グリコシル化パターンは、Ｄ−グルコサミンのレベルの減少によって特徴づけられる。いくつかの実施形態において、変異体グリコシル化パターンは、マンノースのレベルの増加によって特徴づけられる。いくつかの実施形態において、変異体グリコシル化パターンは、グルコースのレベルの増加によって特徴づけられる。いくつかの実施形態において、修飾された宿主細胞は、対応する修飾されていない宿主細胞のＡＤＣＣ活性と比べて高いＡＤＣＣ活性を呈する抗体を産生する。いくつかの実施形態において、修飾された宿主細胞は、対応する修飾されていない宿主細胞によって産生される対応する抗体と比較して、ＦｃγＲＩＩＩＡ受容体に対する高い結合親和性を有する抗体を産生する。いくつかの実施形態において、修飾された宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。いくつかの実施形態において、修飾された宿主細胞は、ＮＳ０、ＳＰ２／０、ＨＥＫ２９３、ＰＥＲ．Ｃ６、およびＹＢ２／０細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、修飾された宿主細胞はミエローマ細胞である。いくつかの実施形態において、修飾された宿主細胞は、少なくともおよそ６０回の継代後に変異体グリコシル化パターンを維持する。いくつかの実施形態において、修飾された宿主細胞は、無血清培地において増殖する。いくつかの実施形態において、修飾された宿主細胞は、懸濁液において増殖する。いくつかの実施形態において、修飾された宿主細胞は、異種性の糖タンパク質をコードする異種性の配列を含む。
【００２１】
さらに別の態様において、本発明は、Ｎ連結型グリカンの実質的に均質なパターンを呈する糖タンパク質を産生する単離された宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態において、Ｎ連結型グリカンの実質的に均質なパターンは、質量分析によって分離される単一ピークによって立証される。いくつかの実施形態において、Ｎ連結型パターンは、フコース部分が右から最初の４ＧｌｃＮＡｃに任意に連結することができる式ＩまたはＩＩの構造：
【化２】
2012503656.tif 000003
を有する。
【００２２】
さらに別の態様において、修飾された宿主細胞は、異種性の配列を含んでもよく、ここで、異種性の配列は、抗体または酵素などの異種性の糖タンパク質をコードしてもよい。本明細書で開示されるように、修飾された糖タンパク質をコードする異種性のポリヌクレオチド配列を提供すること；および修飾された糖タンパク質を、修飾された宿主細胞において発現させることを含む修飾された糖タンパク質を産生する方法も提供される。このように、また、修飾されていない親宿主細胞によって産生されるなどの対応する野生型糖タンパク質と比較して、少なくとも２種類の糖分子のレベルの変化によって特徴づけられる変異体グリコシル化パターンを呈する異種性の配列によってコードされる異種性の糖タンパク質などの糖タンパク質も提供される。変異体グリコシル化パターンは、Ｎ連結型オリゴ糖のレベルの変化によって立証することができる。異種性の糖タンパク質は、修飾されていない親宿主細胞によって産生される対応する野生型糖タンパク質と比較して、低いレベルまたは高いレベルのグルコース、ガラクトース、フコース、マンノース、および／またはＮ−アセチルグルコサミンの含有量を呈してもよい。Ｎ−アセチルグルコサミンは、α連結型またはβ連結型のＮ−アセチルグルコサミンであってもよい。
【００２３】
一態様において、糖タンパク質は、抗体または抗体断片である。抗体は、癌抗原を結合してもよい。例えば、抗原は、ＨＥＲ２、ＣＤ２０、ＥＧＦ受容体、ＶＥＧＦ受容体、ＰＤＧＦ受容体、ＥｐＣａｍ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ５１、ＣＤ５５、ＣＤ８０、ＣＤ９５、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、葉酸受容体、ＣＸＣＲ４、インスリン様増殖因子受容体、およびインテグリンファミリーのメンバーからなる群から選択してもよい。また、抗体は、修飾されていない宿主細胞によって産生される対抗する抗体と比較して高い抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）も呈してもよい。さらにその上、抗体には、ＩｇＧ抗体を含んでもよい。本明細書で開示されるように、また抗体は、修飾されていない親宿主細胞によって産生されるなどの対応する野生型抗体と比較して少なくとも２種類の糖分子のレベルの変化によって特徴づけられる変異体グリコシル化パターンを呈してもよい。糖分子は、抗体のＦｃ領域を通じて結合してもよい。
【００２４】
別の態様において、本発明は、１つのグルコース分子、４つのマンノース分子、および２つのＮ−アセチルグリコサミン分子を含むＮ連結型グリカンを提供する。いくつかの実施形態において、Ｎ連結型グリカンは、１つ以上のフコース分子を含む。いくつかの実施形態において、Ｎ連結型グリカンは、フコース部分が右から最初の４ＧｌｃＮＡｃに任意に連結することができる式（Ｉ）の構造を有する。
【化３】
2012503656.tif 000004
いくつかの実施形態において、Ｎ連結型グリカンは、フコース部分が右から最初の４ＧｌｃＮＡｃに任意に連結することができる式（ＩＩ）の構造を有する。
【化４】
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【００２５】
別の態様において、本発明は、本明細書に開示されたＮ−グリカンを含む単離された糖タンパク質を提供する。いくつかの実施形態において、糖タンパク質は抗体である。いくつかの実施形態において、糖タンパク質は酵素である。いくつかの実施形態において、Ｎ連結型グリカンは、抗体のＦｃ領域に結合している。いくつかの実施形態において、抗体は癌抗原に結合する。いくつかの実施形態において、癌抗原は、ＨＥＲ２、免疫グロブリンεＦｃ受容体ＩＩ、Ａｌｋ−１、ＣＤ２０、ＥＧＦ受容体、ＶＥＧＦ受容体、ＦＧＦ受容体、ＮＧＦ受容体、ＰＤＧＦ受容体、ＥｐＣａｍ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５１、ＣＤ５５、ＣＤ８０、ＣＤ９５、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＴＬＡ−４、ムチン１、ムチン１６、エンドグリン、メソテリン受容体、ノゴ受容体、葉酸受容体、ＣＸＣＲ４、インスリン様増殖因子受容体、ガングリオシドＧＤ３、ならびにαおよびβインテグリンからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、抗体は、実質的に均質な集団のＮ連結型グリカンを産生する修飾された宿主細胞によって産生される。いくつかの実施形態において、抗体は、修飾されていないＣＨＯ細胞クローンであるＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＃ＣＣＬ−６１およびＣＲＬ−９６１８）またはＣＨＯ−ＤＧ４４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃１２６０９−０１２）によって産生される対応する抗体と比較して、高いＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）を有する。いくつかの実施形態において、抗体は、修飾されていないＣＨＯ細胞クローンであるＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＃ＣＣＬ−６１およびＣＲＬ−９６１８）またはＣＨＯ−ＤＧ４４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃１２６０９−０１２）によって産生される対応する抗体と比較して、ＦｃγＲＩＩＩＡ受容体に対する高い結合親和性を有する。いくつかの実施形態において、抗体は、阻害性抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、刺激性抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、ＩｇＧ抗体である。
【００２６】
いくつかの実施形態において、Ｎ連結型グリカンの実質的に均質なパターンを呈する糖タンパク質を産生する宿主細胞は、非リンパ球性細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞はＣＨＯ細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、Ｎ連結型グリカンの実質的に均質なパターンを呈する抗体を産生する。
【００２７】
さらに別の態様において、本発明は、（ａ）修飾された糖タンパク質をコードする異種性のポリヌクレオチド配列を提供すること；および（ｂ）本明細書で開示された宿主細胞において、修飾された糖タンパク質を発現させることを含む、修飾された糖タンパク質を産生する方法を提供する。いくつかの実施形態において、修飾された糖タンパク質は、宿主細胞によって分泌される。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、無血清培地において維持される。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、懸濁培養において維持される。いくつかの実施形態において、修飾された糖タンパク質は抗体である。
【００２８】
また、本明細書で開示された宿主細胞を含む培地も、本発明において提供される。いくつかの実施形態において、培地は無血清である。また、本発明は、変異体グリコシル化パターンを有するＮ−グリカンを、または、培地においてＮ−グリカンの実質的に均質なパターンを呈する糖タンパク質を産生する複数の宿主細胞を含む培養発酵槽も開示する。
【００２９】
別の態様において、本発明は、Ｎ連結型グリカンを含む、修飾された宿主細胞によって産生される抗体を提供し、ここで、抗体は、修飾されていない宿主細胞によって産生される対応する抗体と比較して、Ｆｃγ受容体ＩＩＩａ（ＦｃγＲＩＩＩａ）に対する高い結合親和性、および／またはＦｃγ受容体ＩＩｂ（ＦｃγＲＩＩｂ）に対する低い結合親和性を有し、それによりＦｃγＲＩＩＩａおよび／またはＦｃγＲＩＩｂを発現するエフェクター細胞に対するＡＤＣＣ（抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用）活性を高める。別の態様において、本発明は、Ｎ連結型グリカンを含む、修飾された宿主細胞によって産生される抗体を提供し、ここで、抗体は、対応する修飾されていない宿主細胞によって産生される対応する抗体と比較して、高いＡＤＣＣ活性を呈し、かつ高いＡＤＣＣ活性は、高親和性Ｆｃγ受容体であるＦｃγＲＩＩＩａ  １５８Ｖ／Ｖを発現するエフェクター細胞、および低親和性Ｆｃγ受容体であるＦｃγＲＩＩＩａ  １５８Ｆ／ＦまたはＦｃγＲＩＩＩａ  １５８Ｆ／Ｖを発現するエフェクター細胞に対してである。
【００３０】
本発明の抗体に関するいくつかの実施形態において、Ｎ連結型グリカンは、１つのグルコース分子、４つのマンノース分子、および２つのＮ−アセチルグリコサミン分子を含む。いくつかの実施形態において、Ｎ連結型グリカンは、１つ以上のフコース分子を含む。いくつかの実施形態において、Ｎ連結型グリカンは、フコース部分が右から最初の４ＧｌｃＮＡｃに任意に連結することのできる式（Ｉ）または（ＩＩ）の構造を有する。
2012503656.tif 000006
【００３１】
いくつかの実施形態において、Ｎ連結型グリカンは、抗体のＦｃ領域に結合する。いくつかの実施形態において、抗体は癌抗原に結合する。癌抗原には、ＨＥＲ２、免疫グロブリンεＦｃ受容体ＩＩ、Ａｌｋ−１、ＣＤ２０、ＥＧＦ受容体、ＶＥＧＦ受容体、ＦＧＦ受容体、ＮＧＦ受容体、ＰＤＧＦ受容体、ＥｐＣａｍ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５１、ＣＤ５５、ＣＤ８０、ＣＤ９５、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＴＬＡ−４、ムチン１、ムチン１６、エンドグリン、メソテリン受容体、ノゴ受容体、葉酸受容体、ＣＸＣＲ４、インスリン様増殖因子受容体、ガングリオシドＧＤ３、ならびにαおよびβインテグリンを含むことができるが、これらに限定されるわけではない。本発明の抗体は、阻害性抗体または刺激性抗体であり得る。いくつかの実施形態において、抗体はＩｇＧ抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、修飾されていないＣＨＯ細胞クローンであるＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＃ＣＣＬ−６１およびＣＲＬ−９６１８）またはＣＨＯ−ＤＧ４４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃１２６０９−０１２）によって産生される対応する抗体と比較して、低親和性ＦｃＲであるＦｃγＲＩＩＩａ  １５８Ｆ／ＦまたはＦｃγＲＩＩＩａ  １５８Ｆ／Ｖを発現するエフェクター細胞に対して高いＡＤＣＣ（抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用）活性を有する。いくつかの実施形態において、抗体は、修飾されていないＣＨＯ細胞クローンであるＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＃ＣＣＬ−６１およびＣＲＬ−９６１８）またはＣＨＯ−ＤＧ４４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃１２６０９−０１２）によって産生される対応する抗体と比較して、高親和性ＦｃＲであるＦｃγＲＩＩＩａ  １５８Ｖ／Ｖを発現するエフェクター細胞に対して高いＡＤＣＣ（抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用）を有する。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。宿主細胞には、ＮＳ０、ＳＰ２／０、ＨＥＫ２９３、ＰＥＲ．Ｃ６、およびＹＢ２／０細胞を含むことができるが、これらに限定されるわけではない。また、宿主細胞は、ミエローマ細胞でもあり得る。いくつかの実施形態において、エフェクター細胞は、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。いくつかの実施形態において、エフェクター細胞は、ＮＫ細胞、単球、マクロファージ、または多形核ニュートラフィルス（ｎｅｕｔｒａｐｈｉｌｓ）（ＰＭＮ）である。
【００３２】
別の態様において、本発明は、Ｎ連結型グリカンを有する修飾された抗体を産生する能力によって特徴づけられる修飾された宿主細胞を提供し、ここで、抗体は、修飾されていない宿主細胞によって産生される対応する抗体と比較して、Ｆｃγ受容体ＩＩＩａ（ＦｃγＲＩＩＩａ）に対する高い結合親和性を呈し、それにより、ＦｃγＲＩＩＩａおよび／またはＦｃγＲＩＩｂを発現するエフェクター細胞に対するＡＤＣＣ（抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用）活性を高める。さらに別の態様において、本発明は、Ｎ連結型グリカンを有する修飾された抗体を産生する能力によって特徴づけられる修飾された宿主細胞を提供し、ここで、抗体は、対応する修飾されていない宿主細胞によって産生される対応する抗体と比較して高いＡＤＣＣ活性を呈し、かつ高いＡＤＣＣ活性は、高親和性Ｆｃγ受容体であるＦｃγＲＩＩＩａ  １５８Ｖ／Ｖを発現するエフェクター細胞、および低親和性Ｆｃγ受容体であるＦｃγＩＩＩａ  １５８Ｆ／ＦまたはＦｃγＲＩＩＩａ  １５８Ｆ／Ｖを発現するエフェクター細胞に対してである。
【００３３】
本発明の修飾された宿主細胞に関するいくつかの実施形態において、Ｎ連結型グリカンは、グルコース、ガラクトース、マンノース、およびグルコサミンからなる群から選択される１つ以上の糖部分のレベルの変化によって特徴づけられる変異体グリコシル化パターンを呈する。いくつかの実施形態において、変異体グリコシル化パターンは、ガラクトースのレベルの減少によって特徴づけられる。いくつかの実施形態において、変異体グリコシル化パターンは、Ｄ−グルコサミンのレベルの減少によって特徴づけられる。いくつかの実施形態において、変異体グリコシル化パターンは、マンノースのレベルの増加によって特徴づけられる。いくつかの実施形態において、変異体グリコシル化パターンは、グルコースのレベルの増加によって特徴づけられる。いくつかの実施形態において、Ｎ連結型グリカンは、フコース部分が、右から最初の４ＧｌｃＮＡｃに任意に連結することのできる式ＩまたはＩＩの構造：
【化６】
2012503656.tif 000007
を有する。
【００３４】
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、対応する修飾されていない宿主細胞によって産生される対応する抗体と比較して、高親和性Ｆｃ受容体であるＦｃγＲＩＩＩａ  １５８Ｖ／Ｖを発現するエフェクター細胞に対して高いＡＤＣＣ活性を、および低親和性Ｆｃ受容体であるＦｃγＲＩＩＩａ  １５８Ｆ／ＦまたはＦｃγＲＩＩＩａ  １５８Ｆ／Ｖを発現する細胞に対して高いＡＤＣＣ活性を呈する抗体を産生する。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、修飾されていない宿主細胞によって産生される対応する抗体と比較して、Ｆｃγ受容体ＩＩＩａ（ＦｃγＩＩＩａ）に対する高い結合親和性を、および／またはＦｃγ受容体ＩＩｂ（ＦｃγＲＩＩｂ）に対する低い結合親和性を呈する抗体を産生する。いくつかの実施形態において、抗体は、癌抗原に結合する。癌抗原には、ＨＥＲ２、免疫グロブリンεＦｃ受容体ＩＩ、Ａｌｋ−１、ＣＤ２０、ＥＧＦ受容体、ＶＥＧＦ受容体、ＦＧＦ受容体、ＮＧＦ受容体、ＰＤＧＦ受容体、ＥｐＣａｍ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５１、ＣＤ５５、ＣＤ８０、ＣＤ９５、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＴＬＡ−４、ムチン１、ムチン１６、エンドグリン、メソテリン受容体、ノゴ受容体、葉酸受容体、ＣＸＣＲ４、インスリン様増殖因子受容体、ガングリオシドＧＤ３、ならびにαおよびβインテグリンを含むことができるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。宿主細胞には、ＮＳ０、ＳＰ２／０、ＨＥＫ２９３、ＰＥＲ．Ｃ６、およびＹＢ２／０細胞を含むことができるが、これらに限定されない。また、宿主細胞はミエローマ細胞でもあり得る。いくつかの実施形態において、細胞は、少なくともおよそ６０回の継代後に変異体グリコシル化パターンを維持する。いくつかの実施形態において、修飾された宿主細胞は、無血清培地において増殖する。いくつかの実施形態において、修飾された宿主細胞は、懸濁液において増殖する。いくつかの実施形態において、修飾された宿主細胞は、異種性の糖タンパク質をコードする異種性の配列を含む。
【００３５】
また、障害を予防または治療することを必要とする対象に、本明細書に開示された有効量の対象抗体を投与することを含む方法も本発明によって提供される。いくつかの実施形態において、障害は、癌、アレルギー、心血管疾患、炎症性疾患、代謝性疾患、神経学的疾患、ウイルス感染、および／または細菌感染からなる群から選択される。例えば、障害は、癌またはアレルギーであり得る。いくつかの実施形態において、対象は哺乳類、例えばヒトである。いくつかの実施形態において、対象抗体の投与は、非経口注射、注入、経口投与、または吸入を介する。また、本発明は、（ａ）修飾された抗体をコードする異種性のポリヌクレオチド配列を提供すること；および（ｂ）本明細書に開示された対象宿主細胞において、修飾された抗体を発現させることを含む、修飾された抗体を産生する方法も提供する。いくつかの実施形態において、修飾された抗体は、宿主細胞によって分泌される。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、無血清培地において維持される。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、懸濁培養において維持される。また、本発明は、対象宿主細胞を含む培地、および培地における複数の対象宿主細胞を含む培養発酵槽も包含する。いくつかの実施形態において、培地は無血清である。
【００３６】
本出願において言及されるすべての刊行物および特許出願は、各個々の刊行物または特許出願が、参照により組み込まれるよう具体的かつ個々に示されているかのような場合と同一の程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
本開示の新規の特徴は、付属の特許請求の範囲において特に示される。本開示の特徴および利点をより良好に理解することは、実例となる実施形態を示す下記の詳細な説明に対する参照により得られるであろうし、実施形態において、本開示の原理が利用され、それに付随する図は下記である：
【００３８】
【図１】化学物質誘発性無作為突然変異誘発後に低フコースを有するＣＨＯ−Ｋ１細胞を濃縮する戦略の模式図である。ＣＨＯ−Ｋ１細胞は、無作為突然変異誘発を誘導するよう化学物質で処理される。フコシル化を抑制する突然変異を生じる機会は稀なので、ＬＣＡ−ビオチンおよびストレプトアビジン−サポリンを用いることによって高フコースを有する細胞を枯渇させる独特な過程を用いる。これら２つの試薬をまず混合して、ビオチン−ストレプトアビジン複合体含有培地を形成する。化学物質誘発性突然変異誘発後に、複合体を細胞に添加した。高フコースを有する細胞の表面に結合するＬＣＡは、細胞膜にきわめて近接してサポリンをもたらすであろうし、その結果、細胞を死滅させる。
【図２】化学物質誘発性無作為突然変異誘発後に低フコースＣＨＯ−Ｋ１突然変異株細胞を選択する流れ図である。
【図３】高フコースを有するＣＨＯ−Ｋ１細胞を死滅させるためのＬＣＡ−ビオチンおよびストレプトアビジン−毒素の至適濃度の決定を示すグラフである。１ウェルあたり１０５個のＣＨＯ−Ｋ１細胞を９６ウェルプレートに播種した。ＬＣＡ−ビオチンおよびストレプトアビジン−サポリンを、示されるように異なる濃度で培地において混合し、細胞に添加した。１０日後にＭＴＴアッセイによって細胞増殖を測定した。毒素を有さない培地中で増殖した細胞を対照として用いた。
【図４】ＬＣＡ／毒素選択が、化学物質誘発性無作為突然変異誘発後の低フコースを有する細胞集団を徐々に濃縮することを示す。Ａ）ＣＨＯ−Ｋ１細胞において無作為突然変異をＩＣＲ−１９１によって導入し、細胞をＬＣＡ−ビオチンおよびストレプトアビジン−サポリンで７０日間処理した。細胞のフコシル化状態を、ＦＩＴＣ抱合したＬＣＡによる標識および蛍光標示式細胞分取器分析によって毎週調べた。親ＣＨＯ−Ｋ１細胞をポジティブコントロールとして用いた。Ｂ）メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）を用いて、ＣＨＯ−Ｋ１細胞における無作為突然変異誘発を誘導した。選択およびフコシル化のモニタリングは、Ａ）において説明したとおりであった。
【図５】ＬＣＡ／毒素耐性細胞における低フコース内容が遺伝子レベルで安定していることを図示するグラフを示す。低フコシル化を伴うクローンのうちの１つを増殖させ、ＬＣＡ−ビオチンおよびストレプトアビジン−サポリンを含まない培地において３ヶ月間増殖させおよび拡張した。細胞のフコシル化状態を、ＦＩＴＣを抱合したＬＣＡによる標識および蛍光標示式細胞分取器分析によって毎週調べた。
【図６】低ＬＣＡを結合する突然変異株ＣＨＯ−Ｋ１細胞のＮ−グリカン特性を示す。ＬＣＡ−ビオチンおよびストレプトアビジン−サポリン選択後の安定した細胞集団を、ＦＩＴＣ抱合したレクチン（ＬＣＡ、ＷＧＡ、ＣｏｎＡ、およびＧＳ−ＩＩ）で標識し、蛍光標示式細胞分取器によって分析した。クローンのうちの１つの特性を示す。
【図７】懸濁液における無血清培地に適応させた突然変異株ＣＨＯ−Ｋ１クローンのうちの１つのＮ−グリカン特性を図示する。突然変異株クローンを、限定希釈による単一細胞クローニングによって単離した。クローンを無血清懸濁液に適応させ、突然変異株クローンをＦＩＴＣ抱合したレクチンで標識し（ＬＣＡ、ＷＧＡ、ＣｏｎＡ、およびＧＳ−ＩＩ）、ＦＡＣＳによって分析した。クローンのうちの１つの特性を示す。
【図８】Ｆｕｔ８の発現が、突然変異株ＣＨＯ−Ｋ１クローンにおいて変化しないことを図示する。
【図９】懸濁液における無血清培地において増殖した突然変異株クローンによって産生した抗体の独特なＮ−グリカン特性を示す。発現した抗体ＥＴ１０１をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって分離し、Ａ）クマシーブルーで染色し、またはＢ）ニトロセルロースメンブレンに転移して、ビオチンと抱合したＬＣＡ、ＷＧＡ、ＣｏｎＡ、およびＧＳ−ＩＩでブロッティングした後、ＨＲＰ抱合したストレプトアビジンとともにインキュベートした。
【図１０Ａ】懸濁液における無血清培地において増殖するのに適応した突然変異株クローンによって産生される抗体における単糖類組成物の独特な特性を示す。Ａ）親ＣＨＯ細胞、突然変異株ＣＨＯ−ＩＥ５クローン、突然変異株ＣＨＯ−３Ｆクローン、または突然変異株ＣＨＯ−２．６クローンによって産生される抗体ＥＴ１０１における単糖類の定量。すべてのＣＨＯクローンは、懸濁液において培養される無血清培地に適応していた。
【図１０Ｂ】Ｂ）親ＣＨＯ細胞、突然変異株ＣＨＯ−１Ｅ５クローン、突然変異株ＣＨＯ−３Ｆクローン、または突然変異株ＣＨＯ−２．６クローンによって産生されるヒトＩｇＧ１（ＥＴ１０１およびＥＴ２０１）の単糖類組成。
【図１０Ｃ】Ｃ）Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｇｅｎｇ．  ８７：６１４−６２２  （２００４）由来のＦｕｔ８−／−ノックアウトＣＨＯ細胞によって産生されるヒトＩｇＧ１の単糖類組成分析。
【図１１】血清含有培地において増殖した突然変異株細胞集団によって産生されるＥｒｂＢ２を遮断するヒトＩｇＧ１（Ｅｔ１０１）によって示される高いＡＤＣＣ活性を図示する。Ａ）１０％ＦＢＳを含む１ｍＬの培養上清由来の発現した抗体ＥＴ１０１を、タンパク質Ｌビーズによって沈殿させ、還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって分離し、クマシーブルーで染色した。空の増殖培地をネガティブコントロールとして用いた。Ｂ）ＳＫＢＲ３細胞を用いたＡＤＣＣアッセイにおける突然変異株クローン（ＩＲＣ２．２）または野生型ＣＨＯ（親）において発現したＥＴ１０１抗体。
【図１２】グラフにおいてＥＴ１０１と示される親細胞株によって産生されるヒトＩｇＧ１（ＥＴ１０１）と比較して、ＥＴ１０１−１Ｅ５と示され無血清培地に適応したＣＨＯ−Ｋ１細胞クローンによって産生されるＥｒｂＢ２遮断抗体であるＥＴ１０１による、癌細胞株ＳＫＯＶ３およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１に対する高いＡＤＣＣ活性を図示する。
【図１３】野生型ＣＨＯ株（ＣＨＯ）によって産生されるＥＴ１０１と比較して、無結成培地に適応した複数の個々の突然変異株ＣＨＯ−Ｋ１細胞クローン（ＩＥ５、２．６、および３Ｆ）によって産生されるＥｒｂＢ２遮断抗体であるヒトＩｇＧ１（ＥＴ１０１）による、細胞株ＳＫＯＶ３およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１に対する高いＡＤＣＣ活性を図示する。ＰＢＳまたは非特異的抗体をネガティブコントロールとして用いた。
【図１４】ＥＧＦＲを標的とする別の遮断抗体であるヒトＩｇＧ１（ＥＴ２０１）による高いＡＤＣＣ活性癌細胞株Ａ５４９を図示する。野生型のＣＨＯ株（ＣＨＯ）によって産生されるＥＴ２０１と比較して、無結成培地に適応した２つの個々の突然変異株ＣＨＯ−Ｋ１細胞クローン（ＩＥ５および３Ｆ）によって産生されるＥＴ２０１を図示する。ＰＢＳまたは非特異的抗体をネガティブコントロールとして用いた。
【図１５】図１５ａおよびｂは、ＣＨＯ−１Ｅ５として示される、本発明の修飾された宿主相棒によって合成されるＮ連結型オリゴ糖の組成および構造の模式図を表す。
【図１６】無血清懸濁液における野生型ＣＨＯ親宿主細胞（上部パネル）およびＣＨＯ−１Ｅ５細胞（中央パネル）および対応する単糖類標準物質（下部パネル）によって産生される抗体における単糖類の特性を示す。
【図１７】野生型親ＣＨＯ細胞（上部パネル）およびＣＨＯ−１Ｅ５細胞（下部パネル）によって産生される抗体由来のＮ連結型オリゴ糖のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトルを示す。
【図１８】野生型親ＣＨＯ細胞（上部パネル）およびＣＨＯ−１Ｅ５細胞（下部パネル）によって産生される抗体から放出されるＮ連結型グリカンの溶出特性を示す。本結果は、ＣＨＯ−１Ｅ５細胞によって産生される抗体が、野生型ＣＨＯ細胞によって産生される抗体における混合型集団と比較して、単一集団のＮ連結型オリゴ糖を有することを示す。Ｎ−グリカンは、ＰＮＧａｓｅ  Ｆを用いて２００μｇの抗体を３７℃で７２時間消化することによって放出された。タンパク質を７０％エタノールによって−２０℃で一晩沈殿させ、遠心分離によって除去した。上清を真空下で乾燥させ、２００μＬの脱イオン水に再懸濁した。Ｃ１８、ＡＧ５０ＷＸ８、およびＡＧ４ｘ４でパックしたマイクロカラムに試料をロードした。次に、カラムを３００μＬの脱イオン水で洗浄した。溶出物を回収し、オリゴ糖をＰＡ２００カラムおよびＤｉｏｎｅｘ  ＩＣＳ−３０００によって分析した。
【図１９】ＣＨＯ−１Ｅ５によって産生されるオリゴ糖の組成および推定構造を示す。１９Ａ．ＣＨＯ−１Ｅ５によって産生されるＮ−グリカンの単糖類組成を、図１６および図１７において説明したとおり、ＰＡ１カラム／Ｄｉｏｎｅｘ  ＩＣＳ−３０００システムおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって決定した。１９Ｂ．Ｎ−グリカンの推定構造を、単糖類分析およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳの結果から推定した。
【図２０】α１，２，３マンノシダーゼの消化を通じてＣＨＯ−１Ｅ５によって産生されたオリゴ糖の構造決定を示す。ＣＨＯ−１Ｅ５および親宿主細胞によって合成された抗体（ＥＴ１０１）をα１，２，３マンノシダーゼとともに３７℃で２４時間インキュベートした。抗体および酵素を除去するために、消化した抗体溶液をまずＭｉｃｒｏＣｏｎ  ＹＭ１０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，  Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，  ＭＡ）に、次いでＭｉｃｒｏＣｏｎ  ＹＭ１００（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，  Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，  ＭＡ）に通過させた。試料をＰＡ１カラム／Ｄｉｏｎｅｘ  ＩＣＳ−３０００システムによって分析した。Ａ．親宿主細胞の試料由来のＮ−グリカンのα１，２，３マンノシダーゼ消化部位。バンドＣ．親宿主細胞の試料から１８ｍＭ  ＮａＯＨ（Ｂ）によっておよび９０ｍＭ  ＮａＯＨ（Ｃ）によって溶出したサッカリド特性。ＤおよびＥ．ＣＨＯ−１Ｅ５の試料から１８ｍＭ  ＮａＯＨ（Ｄ）によっておよび９０ｍＭ  ＮａＯＨ（Ｅ）によって溶出したサッカリド特性。ＦおよびＧ．ＣＨＯ−１Ｅ５によって合成されたＮ−グリカンの構造を分析によって推定する。
【図２１】還元条件下で野生型親ＣＨＯ細胞およびＣＨＯ−１Ｅ５細胞によって産生される抗体重鎖（およそ５０ＫＤ）および軽鎖（およそ２５ＫＤ）に相当するバンド、ならびに非還元条件下で野生型親ＣＨＯ細胞およびＣＨＯ−１Ｅ５細胞によって産生される抗体（およそ１５０ＫＤ）に相当するバンドを示す電気泳動ゲルの複写物である。本結果は、グリコシル化パターンを呈するオリゴ糖が、ＣＨＯ−１Ｅ５細胞によって産生される抗体のタンパク質構造および構築を変化させないことを示す。
【図２２Ａ】ＣＨＯ−１Ｅ５細胞によって産生されるグリコシル化パターンを呈する抗体による高いＡＤＣＣ活性を示す細胞溶解アッセイの結果を示す。８Ａ．無血清培地に適応したＣＨＯ−１Ｅ５細胞クローンによって産生されるＥｒｂＢ２遮断抗体であるヒトＩｇＧ１（ＥＴ１０１）による複数の癌細胞株（ＳＫＯＶ３およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１）に対する高いＡＤＣＣ活性。ＣＨＯ−１Ｅ５細胞において発現したＥＴ１０１抗体を培養上清から、プロテインＡクロマトグラフィーによって精製し；およびＵＶ２８０によって定量した。親ＥＴ１０１を野生型ＣＨＯ細胞において発現させ、同じ方法で精製した。ＡＤＣＣアッセイについて、１００μＬの標的細胞懸濁液を、発現したＥｒｂＢ２を遮断する５０μＬの抗体ＥＴ１０１とともに、９６ウェルプレートにおいて３７℃で３０分間プレインキュベートした。次に、５０μＬのＰＢＭＣを２０：１のエフェクター／標的細胞比で添加した。１６時間インキュベートした後、プレートを遠心沈殿させ、５０μＬの無細胞上清を新しいプレートに移した。ＣｙｔｏＴｏｘ９６非放射性細胞傷害アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）によって、放出されたＬＤＨを測定した。細胞溶解を式（Ｅ−Ｓ）／（Ｍ−Ｓ）（Ｅ：実験による放出、Ｓ：自発的放出、Ｍ：最大放出）によって算出した。ＰＢＳまたは非特異的抗体をネガティブコントロールとして用いた。８Ｂ：無血清培地に適応したＣＨＯ−１Ｅ５細胞クローンによって産生されたＥＧＦＲ遮断抗体である人ＩｇＧ１（ＥＴ２０１）による肺癌細胞株（Ａ５４９）に対する高いＡＤＣＣ活性。ＣＨＯ−１Ｅ５細胞において発現したＥＴ２０１抗体を、プロテインＡクロマトグラフィーによって培養上清から精製し；ＵＶ２８０によって定量した。
【図２２Ｂ】同上。
【図２３】抗体／Ｆｃ受容体の結合親和性の結果を示す。本結果は、ＣＨＯ−１Ｅ５細胞によって呈されるＮ−グリカンが、ＦｃγＲＩＩＩＡ受容体に対する抗体結合を改善することを示す。抗体をまずビオチン化し、ストレプトアビジン被覆したバイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，  Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，  ＣＡ）にロードした。組換えＦｃγＲＩおよびＦｃγＲＩＩＩｂタンパク質を、１００〜４００ｎＭ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，  ＭＮ）の濃度で懸濁した。ＦｏｒｔｅＢｉｏの標準的な動力学的プロトコールにしたがって、結合親和性（ＫＤ，ｎＭ）を評価した。
【図２４】ＣＨＯ−１Ｅ５細胞によって産生された抗体のインビボでの薬物動態特性を示す。本結果は、ＣＨＯ−１Ｅ５細胞によって産生された抗体の薬物動態が、野生型親ＣＨＯ細胞によって産生される薬物動態と実質的に同一であることを示す。
【図２５】α１，２，３マンノシダーゼおよびα１，２，３，６マンノシダーゼの消化を通じてＣＨＯ−１Ｅ５によって産生されるオリゴ糖の構造決定を示す。（Ａ）１Ｅ５細胞の試料からの１８ｍＭ  ＮａＯＨおよびＮ−グリカンのα１，２，３マンノシダーゼ消化部位によって溶出されたサッカリドまたはポジティブコントロール（Ｂ）。（Ｃ）１Ｅ５細胞の試料から１８ｍＭ  ＮａＯＨおよびＮ−グリカンのα１，２，３，６マンノシダーゼ消化部位によって溶出されたサッカリドまたはポジティブコントロール（Ｄ）。
【図２６ａ】種々のＦｃγＲＩＩＩａ受容体に対する抗体結合親和性を決定するための細胞溶解アッセイを示す。図２６ａは、低結合親和性ＦｃγＲＩＩＩａ  １５８Ｆ／Ｆを発現するヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として用いた場合、独特なグリコシル化をともなう抗体は、高いＡＤＣＣ活性を有することを示す。
【図２６ｂ】図２６ｂは、高親和性ＦｃγＲＩＩＩａ  １５８Ｖ／Ｖを発現するヒトＰＢＭＣへの、独特なグリコシル化をともなう抗体の結合を示す。
【図２７】親ＣＨＯ細胞によって産生される抗体およびＮ−グリカンの独特な構造を有する抗体のヒトＦｃγＲに対する結合親和性のフローサイトメトリー測定結果を示す。図２７Ａは、Ｎ−グリカンの独特な構造が、活性化しているＦｃγＲＩＩＩａ受容体への結合親和性を改善することを示し、図２７Ｂは、Ｎ−グリカンの独特な構造をともなう抗体が、阻害性受容体ＦｃγＲＩＩｂへの結合親和性を減少させることを示す。
【図２８】ＣＨＯ−Ｋ１−１Ｅ５によって産生される抗体が、阻害性受容体ＦｃγＲＩＩｂへの低い結合親和性を有し、かつ活性化している受容体ＦｃγＲＩＩＩａへの高い結合親和性を有することを示す。外来性Ｆｃγ受容体を安定して発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞は、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ／ＰＢＳによって脱着され、単一の細胞へと分散した。ＣＨＯ（ＣＨＯ−ＥＴ１０１）またはＣＨＯ−Ｋ１−１Ｅ５（ＣＨＯ−１Ｅ５−ＥＴ１０１）によって産生したビオチン化抗体とともに、細胞を氷上で１時間インキュベートした。ＰＢＳを用いて洗浄した後、細胞をストレプトアビジン−ＦＩＴＣとともにインキュベートし、ＦＡＣＳ分析によって分析した。蛍光強度の幾何平均を獲得してプロットした。
【図２９】与えられた抗体（例えば、ＣＨＯ−１Ｅ５クローンによって産生された抗体）の免疫原性またはその欠失が、霊長類などの試験動物において評価される実験手順を示す。Ａ）雌のカニクイザルは、野生型ＣＨＯ細胞によって産生された抗体ＥＴ１０１、またはＣＨＯ−１Ｅ５細胞によって産生されたＥＴ１０１抗体を８ｍｇ／ｍＬ／ｋｇの用量で受容する。０．５ｍＬの血液を注射７日前に、および注射３、５、７、１４、２１、２８、３５日後に採取する。血清試料を単離し、−８０℃で凍結させる。ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、カニクイザルにおけるＥＴ１０１−ＣＨＯ−１Ｅ５抗体の免疫原性を決定する。本アッセイは、投与されたＥＴ−１０１抗体に特異的なサル血清におけるＩｇＭの存在を検出する。ＥＬＩＳＡプレートにＥＴ１０１−ＣＨＯ抗体またはＥＴ１０１−ＣＨＯ−１Ｅ５抗体を被覆する。単離された異なる希釈のサル血清試料をプレートに適用して、被覆した標的抗体に結合させる。結合したＩｇＭを抗ＩｇＭ二次抗体によって検出する。Ｃ）期待されたＥＬＩＳＡ結果は、ＥＴ１０１−ＣＨＯとＥＴ１０１−ＣＨＯ−１Ｅ５の間に免疫原性（サル血清におけるＥＴ１０１特異的ＩｇＭレベル）に何ら有意差を示さない。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本開示の組成物および方法は、変異体グリコシル化パターンを有するよう修飾された細胞株を提供する。このような細胞株を用いて、高い抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性などの高いエフェクター機能を有する抗体などのタンパク質を産生することができる。また、タンパク質は典型的に、変異体グリコシル化パターンも有する。
【００４０】
宿主細胞
修飾されていない親宿主細胞と比較して変異体グリコシル化パターンを生じるよう、本開示の宿主細胞を修飾する。宿主細胞には、個々の細胞、細胞培養物、および／または細胞株を含む。宿主細胞には、単一の宿主細胞の後代を含む。宿主細胞には、本開示の異種性配列をトランスフェクトすることができる。宿主細胞は、グリコシル化することのできる細菌細胞、真菌細胞、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、およびこれらの類似物などの原核細胞または真核細胞であり得る。
【００４１】
細菌宿主細胞の例には、エシェリキア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属、およびこれらの類似のものに属する微生物を含む。例えば、細菌宿主細胞には、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、ＤＨ１、ＭＣ１０００、ＫＹ３２７６、Ｗ１４８５、ＪＭ１０９、ＨＢ１０１、Ｎｏ．４９、ｉＷ３１１０、ＮＹ４９、Ｇ１６９８、またはＴＢ１を含んでもよいが、これらに限定されない。他の細菌宿主細胞には、セラチア・フィカリア、セラチア・フォンティコーラ、セラチア・リクファシエンス、霊菌、枯草菌、バチルス・アミロリクエファシエンス、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス、ブレビバクテリウム・イマリオフィラム（ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ）ＡＴＣＣ１４０６８、ブレビバクテリウム・サッカロリチカム（ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１４０６６、ブレビバクテリウム・フラバムＡＴＣＣ１４０６７、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＡＴＣＣ１３８６９、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３８６９、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）ＡＴＣＣ１３８７０、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム（ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ）ＡＴＣＣ１５３５４、シュードモナス・プチダ、シュードモナス菌種Ｄ−０１１０、およびこれらの類似のものを含んでもよいが、それらに限定されない。
【００４２】
酵母宿主細胞には、出芽酵母、分裂酵母、キラー酵母、トリコスポロン・プルランス（ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）、シュワニオミケス・アルビウス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ａｌｌｕｖｉｕｓ）、カンジダ・ウルティス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）、およびこれらの類似のものなどなど、サッカロミケス属、シキゾサッカロミケス属、クルイベロミケス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、トリコスポロン属、シュワニオミケス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属、ピキア属、カンジダ属、およびこれらの類似のものに属する微生物を含んでもよい。
【００４３】
真核細胞の他の例には、哺乳類細胞などの動物細胞を含む。例えば、宿主細胞には好ましくは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または、ＣＯＳ細胞などのサル細胞を含むが、これらに限定されない。ＣＨＯ細胞には、ＣＨＯ／ｄｈｆｒ細胞またはＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を含んでもよいが、これらに限定されない。チャイニーズハムスター卵巣組織由来のＣＨＯ細胞には、チャイニーズハムスター（Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ）（チャイニーズハムスター（ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ））の卵巣組織から確立された細胞株である任意の細胞を含む。例には、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  １０８，  ９４５  （１９５８）；  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ６０  ，  １２７５  （１９６８）；  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  ５５，  ５１３  （１９６８）；  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ，  ４１，  １２９  （１９７３）；  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １８，  １１５  （１９９６）；  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １４８，  ２６０  （１９９７）；  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ７７，  ４２１６  （１９８０）；  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ６０，  １２７５  （１９６８）；  Ｃｅｌｌ，  ６，  １２１  （１９７５）；  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  Ａｐｐｅｎｄｉｘ  Ｉ，  ＩＩ  （ｐｐ．  ８８３−９００）；およびこれらの類似のものなどの文書において説明されたＣＨＯ細胞を含む。加えてまた、ＡＴＣＣ（米国培養細胞系統保存機関）に登録されたＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）、ＤＵＸＢ１１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−９０９６）、およびＰｒｏ−５（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１７８１）ならｂに市販のＣＨＯ−Ｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  カタログ番号１１６１９）または種々の培地を用いて細胞株を適応させることによって得られるサブ細胞株も例示することができる。
【００４４】
代替的な実施形態において、親細胞株は、Ｂ細胞株などのリンパ球系細胞株に由来する。宿主細胞は、ハイブリドーマ作製において用いられる細胞株に由来してもよい。細胞株は、ＭＯＰＣ−２１、ＭＰＣ−１１、ＮＳ０、ＳＰ−２、Ｓｐ２／０、Ｓ１９４、およびＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞などだがこれらに限定されないマウスミエローマ株；Ｎａｍａｌｗａ、Ｋａｒｐａｓ  ７０７Ｈ、ＲＰＭＩ  ８２２６、８２２６  ＡＲ／ＮＩＰ４−１、ＫＭ−２Ｒ、およびＵ−２６６などだがこれらに限定されないヒトミエローマ細胞株；またはＹＢ２／０、ＹＢ２／３．０．Ａｇ．２０、Ｙ３−Ａｇｌ．２．３、ＩＲ９８３Ｆなどだがこれらに限定されないラットミエローマ細胞株などに由来するミエローマ細胞であり得る。また、ＨｅＬａ、ＨＥＫ−２９３、ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＮＳＯ、ＰＥＲ．Ｃ６、Ｋ５６２、Ｌ１．２、ＪＹ、ＢＨＫ、Ｋ５６２、２９３Ｆ、３Ｔ３、およびＪｕｒｋａｔなどの細胞株も、本開示において使用してもよい。例えば、いくつかの実施形態において、宿主細胞は、ＣＨＯ−１Ｅ５、ＣＨＯ−３Ｆ、またはＣＨＯ−２．６のクローンである。
【００４５】
昆虫宿主細胞の例には、Ｓｆ９およびＳｆ２１などのヨトウガ卵巣細胞（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９２））；Ｈｉｇｈ  ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎにより製造）などのイラクサキンウワバ卵巣細胞；およびこれらの類似のものを含む。植物宿主細胞の例には、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、ナタネ、アルファルファ、コメ、コムギ、オオムギ、およびこれらの類似のものの植物細胞を含む。
【００４６】
本開示の修飾された宿主細胞は、培養物において、および発酵槽を含む培養物を増殖させるのに用いられてもよい任意の装置において増殖してもよい。これらは、単層として増殖してもよく、または表面に結合してもよい。あるいは、宿主細胞は、懸濁液において増殖してもよい。細胞は、無血清である培地において増殖することができる。培地は、８ｍＭ  Ｌ−グルタミンなどのグルタミンを補充したＯｐｔｉ−ＣＨＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号１２６８１）などだがそれに限定されない市販の培地であり得る。修飾された宿主細胞は、培養における何回もの継代についてその変異体グリコシル化パターンを維持することができる。例えば、修飾された宿主細胞は、少なくともおよそ２０、３０、４０、または５０回の継代後にその変異体グリコシル化パターンを維持することができる。いくつかの実施形態において、修飾された宿主細胞は、少なくともおよそ６０回の継代後にその変異体グリコシル化パターンを維持することができる。さらに他の実施形態において、修飾された宿主細胞は、少なくともおよそ１００、１５０、２００、５００、もしくは１０００回またはそれより多くの継代後にその変異体グリコシル化パターンを維持することができる。
【００４７】
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、非リンパ球系細胞である。リンパ球は、脊椎動物免疫系における白血球細胞の一種である。リンパ球には典型的に、Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。非リンパ球系細胞は、リンパ球ではない任意の種類の細胞を包含する。本発明の宿主細胞は、ヒト、マウス、ラット、果実、ハエ、虫（ｗｏｒｍ）、酵母、および細菌からなる群から選択される種起源を有してもよい。宿主細胞は、血液、筋肉、神経、脳、心臓、肺、肝臓、膵臓、脾臓、胸腺、食道、胃、腸、腎臓、精巣、卵巣、毛髪、皮膚、骨、乳房、子宮、膀胱、脊髄、または種々の種類の体液を含むがこれらに限定されない適切な組織に由来してもよい。Ｎ−グリカンを産生する宿主細胞は、胚期および成熟期を含む任意の発達段階に、ならびにエコトダーム性の（ｅｃｏｔｏｄｅｒｍａｌ）、中胚葉系、および外胚葉系起源などの発達起源に由来してもよい。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、ＣＨＯ、ＮＳ０、ＳＰ２／０、ＨＥＫ２９３、ＰＥＲ．Ｃ６、またはＹＢ２／０細胞である。
【００４８】
修飾された細胞株の作製
本開示は、変異体グリコシル化パターンを生じるよう修飾された宿主細胞を作製および選択するための方法を提供する。修飾されたグリコシル化パターンを用いて宿主細胞を選択する方法は、複数の宿主細胞を提供すること；無作為な遺伝子突然変異を複数の宿主細胞に導入すること；および無作為な遺伝子突然変異に供されなかった対応する親細胞と比較して少なくとも１種類の糖分子のレベルの変化によって特徴づけられる変異体グリコシル化パターンを呈する少なくとも１つの細胞を複数の細胞から選択することを含む。宿主細胞は、ＣＨＯ細胞またはＹＢ２．０細胞などの真核細胞を含む、本明細書に記載された任意のものであってもよい。
【００４９】
遺伝子突然変異は、変異原によって誘導することができる。変異原は、遺伝子的媒介物、化学的媒介物、または放射線媒介物であってもよいが、これらに限定されない。例えば、変異原は、紫外線光、γ線、またはアルファ粒子などだがこれらに限定されないイオン化放射線であってもよい。他の変異原には、写し違いを生じることのできる塩基類似体；亜硝酸などの脱アミノ化剤、臭化エチジウムなどのインターカレート剤；ブロモウラシルなどのアルキル化剤；トランスポゾン；天然および合成アルカロイド；臭素およびその誘導体；アジ化ナトリウム；ソラレン（例えば、紫外線照射と併用）を含んでもよいが、これらに限定されない。変異原は、ＩＣＲ１９１、１，２，７，８−ジエポキシ−オクタン（ＤＥＯ）またはメタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）などだがこれらに限定されない化学的変異原であってもよい。異なる変異原は、宿主細胞に導入される場合、連続的または同時のいずれかで併用してもよい。
【００５０】
方法には、図１および２に示される方法、または実施例２において説明される方法を含んでもよい。例えば、宿主細胞集団を修飾して変異体グリコシル化パターンを有する修飾された宿主細胞を獲得するために、化学的変異原などの１つ以上の変異原を細胞に適用して、無作為な遺伝子突然変異を生じることができる。化学物質誘発性の無作為な突然変異誘発は、フコシル化、マンノシル化、および／またはＮ−アセチルグルコサミニル化などだがこれらに限定されない糖の生合成およびタンパク質のグリコシル化過程を制御または調節する遺伝子の突然変異をもたらすことができる。また、化学的変異原は、高フコシル化をともなうものなど、特定のグリコシル化パターンを有する宿主細胞を選択的に死滅させてもよい。したがって、突然変異誘発後の低レベルのフコシル化をともなう安定したクローンは、高フコシル化をともなう細胞を特異的に標的とし除去するＬＣＡ毒素を用いて細胞を選択することによって、濃縮し単離することができる（図１および図２、実施例２参照）。変異体グリコシル化パターンを有するよう遺伝子修飾された宿主細胞は、無血清培地において維持され、懸濁液において増殖し、および／または発酵槽において増殖するよう選択することができる。また、修飾された宿主細胞は、収穫または収集することのできる糖タンパク質を産生してもよい。糖タンパク質は、本明細書においてさらに説明されるように、分泌され、変異体グリコシル化パターンを呈し、および／または治療用途を有してもよい。糖タンパク質は、本明細書でさらに説明されるように、異種性の配列によってコードされてもよく、および／または修飾されていない親宿主細胞において産生される対応する抗体と比較して高いＡＤＣＣ活性を有する抗体などの抗体であってもよい。
【００５１】
親宿主細胞のグリコシル化パターンは、修飾された宿主細胞の変異体グリコシル化パターンと比較することができ、１種類以上の糖分子のレベルの変化によって立証することができる。例えば、変異体グリコシル化パターンは、以下にさらに説明されるように、フコシル化、マンノシル化、およびＮ−アセチルグルコサミニル化からなる群から選択される少なくとも２種類のグリコシル化の変化によって特徴づけられることができる。さらにその上、変異体グリコシル化パターンは、グルコースの増加およびガラクトースの低下など、グルコースおよび／またはガラクトースのレベルの変化によって立証することができる。追加的な変法を下記のとおり説明する。
【００５２】
グリコシル化パターン
本開示の宿主細胞は、例えば、修飾されていない親宿主細胞と比較して宿主細胞の表面に存在する少なくとも２種類の糖分子のレベルの変化によって特徴づけられる変異体グリコシル化パターンを生じるよう修飾される。また、本開示の宿主細胞を用いて、タンパク質または糖タンパク質を産生してもよい。タンパク質は、抗体または酵素であってもよく、治療薬として用いてもよい。さらにその上、糖タンパク質は分泌されてもよい。タンパク質は、変異体グリコシル化パターンを呈する修飾された宿主細胞への異種性配列の導入から産生されるタンパク質などの異種性タンパク質であってもよい。異種性手段は、比較されておりかつ核酸配列などのポリヌクレオチドまたはポリペプチドに適用することができる実体の残りとは遺伝子型的に異なる実体に由来しており、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドまたはタンパク質を意味する。
【００５３】
本開示のタンパク質または糖タンパク質は、内在性または異種性であり得、変異体グリコシル化パターンを呈するよう修飾された宿主細胞において産生される。また、糖タンパク質は、対応する野生型糖タンパク質（例えば、修飾されていない宿主細胞において産生される糖タンパク質）と比較して、少なくとも２種類の糖分子のレベルの変化を特徴としてもよい変異体グリコシル化パターンを呈してもよい。糖分子は糖タンパク質に直接的に（例えば、糖タンパク質にＮ連結またはＯ連結している。）または間接的に（例えば、糖タンパク質にＮ連結またはＯ連結している他の糖を通じて連結されている。）結合してもよい。糖鎖における種々の糖分子含有量による糖鎖構造の変化または変異体グリコシル化パターンは、糖タンパク質のエフェクター機能における重要な役割を担っている。例えば、糖タンパク質の変異体グリコシル化パターンは、抗体の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を増大させるなど、糖タンパク質のエフェクター機能を増大させることができる。
【００５４】
宿主細胞のグリコシル化パターンは、任意のタンパク質性部分のＮ−グリコシル化またはＯ−グリコシル化であってもよく、ここで、１つ以上の糖分子の付加は、アスパラギンのアミド窒素またはヒドロキシリシンヒドロキシプロリン、セリン、もしくはトレオニンのそれぞれのヒドロキシル酸素においてなされてもよい。グリコシル化パターンは、単糖類、二糖類、多糖類またはオリゴ糖類などの少なくとも２つ以上の糖分子またはサッカリドのレベルの変化を特徴としてもよい。例えば、糖分子は、デオキシヘキソースなどのデオキシ糖などのトリオース、テトロソース（ｔｅｔｒｏｓｏｓｅ）、ペントース、ヘキソース、ヘプトース、オクトース、ノノース、またはこれらの誘導体；シアル酸などのＮ置換もしくはＯ置換誘導体；またはアミノ基を有する糖であってもよい。糖分子には、ガラクトース（Ｇａｌ）、グルコース（Ｇｌｃ）、マンノース（Ｍａｎ）、Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ）、フコース（Ｆｕｃ）、Ｎ−アセチルガラクトースアミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）；およびキシロース（Ｘｙｌ）を含んでもよいが、これらに限定されない。糖分子は、αまたはβ連結を介して他の糖分子に連結してもよい。
【００５５】
本開示の変異体グリコシル化パターンは、少なくとも２種類の糖分子のレベルの変化によって立証されてもよく、宿主細胞または糖タンパク質の異なる種類のグリコシル化の変化によって立証することができる。例えば、フコシル化、マンノシル化、Ｎ−アセチルグルコサミニル化、および／またはこれらの組み合わせのレベルを、変異体グリコシル化パターンの証拠として用いてもよい。例えば、フコシル化、マンノシル化、および／またはＮ−アセチルグルコサミニル化のレベルは、修飾されていない親細胞と比較して、修飾された宿主細胞において低くまたは高くあり得る。糖タンパク質のフコシル化、マンノシル化、および／またはＮ−アセチルグルコサミニル化のレベルは、（すなわち、修飾されていない親宿主細胞において産生される）対応する野生型糖タンパク質と比較して低くまたは高くあり得る。例えば、異種性の糖タンパク質は、修飾されていない宿主細胞によって産生される対応する野生型糖タンパク質と比較して低レベルのフコース、マンノース、および／またはＮ−アセチルグルコサミン含有量を呈してもよい。グリコシル化は、α連結もしくはβ連結したマンノースまたはα連結もしくはβ連結したＮ−アセチルグルコサミンなどのα連結もしくはβ連結した糖を包含することができる。さらにその上、変異体グリコシル化パターンを有する宿主細胞はさらに、修飾されていない親宿主細胞の１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子活性と比較して、活性をさらに含んでもよくおよび／または維持してもよい。
【００５６】
また、本開示の変異体グリコシル化パターンは、修飾されていない親細胞と比較して、グルコース、ガラクトース、またはその両方のレベルの変化によっても立証することができる。例えば、変化は、ガラクトースレベルの増加または低下であり得る。また、変化は、グルコースレベルの増加または低下でもあり得る。いくつかの実施形態において、変化は、図１０Ａ、Ｂに示されるなどのように、グルコースレベルの増加、ガラクトースレベルの低下、またはグルコースレベルの増加かつガラクトースレベルの低下であり得る。変異体グリコシル化パターンは、図１６および図２０に示されるなどのように、グルコースおよび／またはガラクトースの変化を、フコース、グルコース、マンノース、およびＮ−アセチルグルコサミンなどだがこれらに限定されない他の単糖類のレベルの変化とともに含むことができる。糖類の異なる組み合わせおよびこのような糖類の変化するレベル、例えば、親細胞と比較したレベルの増加または低下は、本明細書において意図される。
【００５７】
変異体グリコシル化パターンは、少なくとも２種類の糖分子のレベルの変化によって立証されてもよく、ここで、少なくとも１種類の糖分子のレベルの変化は、少なくともおよそ２倍である。あるいは、レベルの変化は、少なくとも２種類の糖について少なくともおよそ２倍である。変化は、糖分子のレベルの増加または低下であってもよい。レベルの変化は、少なくともおよそ３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、５０、７５、１００、５００、１０００倍またはそれよりさらに高くさえあってもよい。
【００５８】
いくつかの実施形態において、本発明は、対象のＮ連結型グリカンを含む組成物を提供し、抗体において呈される場合、抗体の高い抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を結果的に生じる。Ｎ連結型グリカンは、タンパク質のアスパラギン側鎖のアミド窒素に結合する。３つの主な種類のＮ連結型糖類：高マンノースオリゴ糖、複合体オリゴ糖、およびハイブリッドオリゴ糖がある。高マンノースＮ連結型グリカンは典型的には、多くのマンノース残基を有する２つのＮ−アセチルグルコサミンを含む。複合体オリゴ糖は典型的に、他の種類のほぼ任意の数の糖類を含む。タンパク質は、異なる部分のタンパク質に関して両方の種類のオリゴによってグリコシル化することができる。Ｎ連結型グリカンは、グルコース、マンノース、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、フコース、およびシアル酸を含む種々の異なる単糖類を用いて修飾することができる。
【００５９】
Ｎ連結型オリゴ糖の対象のＮ連結型グリカンの組成および構造は、ＣＨＯ−１Ｅ５と呼ばれる典型的な修飾されたＣＨＯ細胞クローンによって産生することができる。抗体に関する単一のＮ−グリカン構造は、ＣＨＯ−１Ｅ５によって産生される。ＣＨＯ−１Ｅ５は、Ｎ−グリカンの生合成を変化させ、この宿主細胞クローンによって産生される抗体は、フコースをともにまたはともなわずに、グルコース、マンノース、およびＮ−アセチルグルコサミンからなるグリコシル化特性を呈する。Ｎ−グリカンの構造式は、Ｇｌｕ−ＧｌｃＮＡｃ２−Ｍａｎ４（＋／−Ｆｕｃ）として示されている。このグリカンは、中心のＮ連結型オリゴ糖の基本構造：３Ｍａｎ−２ＧｌｕＮＡｃを有し、フコースをともなうかまたはともなわないが、２つの外側のアセチルグルコサミンを欠失している。中心オリゴ糖の側鎖のうちの１つに結合したグルコース分子および余分なマンノース分子がある（図１５）。いくつかの実施形態において、グリコシル化パターンは、構造式（Ｉ）の組成を表し、この中で、フコース部分は、右から最初の４ＧｌｃＮＡｃに任意に連結することができる：
【化７】
2012503656.tif 000008
【００６０】
いくつかの実施形態において、グリコシル化パターンは、構造式（ＩＩ）の組成を表し、この中で、フコース部分は、右から最初の４ＧｌｃＮＡｃに任意に連結することができる。
【化８】
2012503656.tif 000009
【００６１】
先におよび図１５に図示した構造式（Ｉ）および（ＩＩ）は、フコース分子が、対象のＮ連結型グリカンに存在し得または欠失し得ることを示す。いくつかの実施形態において、対象のＮ連結型グリカンは、１つのグルコース分子を含む。いくつかの実施形態において、グルコース分子は、対象のＮ連結型グリカンの末端（すなわち末端グルコース）にある。いくつかの実施形態において、対象のＮ連結型グリカンは、１つ以上の末端グルコース分子を含む。いくつかの実施形態において、対象のＮ連結型グリカンは、４つのマンノース分子を含む。いくつかの実施形態において、対象のＮ連結型グリカンは、２つのＮ−アセチルグルコサミン分子を含む。
【００６２】
いくつかの実施形態において、グリコシル化パターンは、構造式（Ｉ）および（ＩＩ）の混合型組成を表す。いくつかの実施形態において、ＣＨＯ−１Ｅ５と呼ばれる本発明の修飾された宿主細胞によって合成されるＮ−グリカンは、ガラクトースを欠失し、低レベルのフコースおよびＮ−アセチルグルコサミンを有し、かつ野生型親宿主細胞によって産生されるＮ−グリカンと比較して末端グルコースを含む（図１６）。いくつかの実施形態において、ＣＨＯ−１Ｅ５クローンによって呈されるＮ−グリカンは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析によって単一のピークとして特徴づけられ、オリゴ糖の実質的に均質な集団を示唆している。
【００６３】
宿主細胞または糖タンパク質のグリコシル化パターンは、具体的な糖分子または具体的な糖分子と会合しもしくは糖分子を用いて修飾されたタンパク質性部分を特異的にまたは優先的に認識しまたは結合する媒介物を用いて検出することができる。媒介物には、フコースを用いて修飾されたタンパク質に特異的に結合する化学物質であるレンズクリマリス凝集素Ａ；Ｎ−アセチルグルコサミンに対する優先的な結合を有するコムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）；α連結型マンノースを認識するコンカナバリンＡ（Ｃｏｎ  Ａ）；およびα連結型またはβ連結型Ｎ−アセチルグルコサミン残基に結合するグリフォニア（バンデイラエア（Ｂａｎｄｅｉｒａｅａ））シンプリシフォリア（Ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ）レクチンＩＩ（ＧＳ−ＩＩ）を含んでもよいが、これらに限定されない。
【００６４】
媒介物は、直接的にまたは間接的に検出されてもよい。例えば、媒介物は、標識に抱合してもよい。蛍光標識などの任意の検出可能な標識を用いることができる。フローサイトメトリーなどの当業者に公知の検出方法は、標識した細胞を検出および／または分離するのに使用してもよい。例えば、検出および／または分離は、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によってもよい。標識には、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、オレゴングリーン、東京グリーン、ＳＮＡＦＬ、カルボキシナフトフルオレセイン（ＣＦＳＥ）、カルボキシフルオレセインジアセタートスクシンイミジルエステル（ＣＦＤＡ−ＳＥ）、ＤｙＬｉｇｈｔ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、フィコエリトリン、Ｐｅｒｉｄｉｎｉｎ  Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌタンパク質（ＰｅｒＣＰ）、ＰＥ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００、ＰＥ−Ｃｙ５（ＴＲＩ−ＣＯＬＯＲ）、ＰＥ−Ｃｙ５．５ｍ、ＰＥ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０、ＰＥ−Ｃｙ７、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、ＡＰＣ−Ｃｙ７、およびこれらの誘導体を含んでもよい。また、上記の標識を用いて、糖タンパク質のグリコシル化パターンを分析してもよい。あるいは、媒介物は、例えば、ウェスタンブロッティングおよび当該技術分野で周知の他の方法によるなど、抗体を用いて媒介物を検出することによって直接的に検出してもよい。
【００６５】
グリコシル化パターンを分析する他の方法には、中性の糖およびアミノ基を有する糖など、異なる種類の糖の組成分析を含んでもよい。例えば、ガラクトース、マンノース、フコース、またはそれらの類似のものなどの中性の糖、およびＮ−アセチルグルコサミンまたはその類似のものなどアミノ基を有する糖、およびシアル酸またはその類似のものなどの酸性の糖を分析することができる。組成比は、糖鎖の酸加水分解によって中性の糖またはアミノ糖を放出することによって分析することができる。方法には、Ｄｉｏｎｅｘによって製造された糖組成分析装置（ＢｉｏＬＣ）を用いる方法を含んでもよいが、これに限定されない。ＢｉｏＬＣは、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ（高性能陰イオン交換クロマトグラフィーパルス化電流測定検出）方法（Ｒｏｃｋｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｌｉｇ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  ６（９），  １５７７−１５９０  （１９８３））によって糖組成を分析するための装置である。また、組成比は、２−アミノピリジン（ＰＡ）を用いる蛍光標識方法によって分析することもできる。具体的には、組成比は、公知の方法（Ｋｏｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ５５（１），  ２８３−２８４  （１９９１））に従って２−アミノピリジンを用いて酸加水分解した試料を蛍光標識して、ＨＰＬＣ分析を実施することによって算出することができる。
【００６６】
また、グリコシル化パターンは、２次元糖鎖マッピング法（Ｔｏｍｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １７１，  ７３−８０  （１９８８）；  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄ  ２３−−Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｓｔｕｄｙｉｎｇ  Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｕｇａｒ  Ｃｈａｉｎｓ  （Ｇａｋｋａｉ  Ｓｈｕｐｐａｎ  Ｃｅｎｔｅｒ），  ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｒｅｉｋｏ  Ｔａｋａｈａｓｈｉ  （１９８９））によっても分析することができる。２次元糖鎖マッピング法は、例えば、Ｘ軸として逆相クロマトグラフィーによる糖鎖の保持時間または溶出位置を、Ｙ軸として順相クロマトグラフィーによる糖鎖の保持時間または溶出位置をプロットし、その結果を公知の糖鎖の結果と比較することによって概算される方法である。
【００６７】
糖鎖は、ヒドラジン分解によって放出することができ、その後、２−アミノピリジンによる糖鎖の蛍光標識（Ｈａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ９５，  １９７３２０３  （１９８４））が実施される。糖鎖は、ゲル濾過によって過剰のＰＡ試薬およびその類似のものから分離され、逆相クロマトグラフィーに供される。その後、分画した糖鎖の各ピークを順相クロマトグラフィーによって分析する。これらの結果に基づいて、糖鎖構造は、２次元糖鎖マップ上にスポットをプロットし、スポットを糖鎖の標準物質（Ｔａｋａｒａ  Ｓｈｕｚｏによって製造）または基準物質（Ｔｏｍｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １７１，  ７３−８０  （１９８８））のスポットと比較することによって概算することができる。
【００６８】
加えて、グリコシル化パターンは、各糖鎖のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳまたはその類似のものなどの質量分析によって分析することができる。
【００６９】
異種性配列
変異体グリコシル化パターンを生じるよう修飾された本開示の宿主細胞は、異種性の配列を含んでもよい。異種性の配列は、核酸配列を含んでもよい。本明細書で用いられるように、核酸配列は、ポリヌクレオチド、ヌクレオチド、ヌクレオチド配列、核酸、およびオリゴヌクレオチドと同じ意味で用いられる。これらは、任意の長さのデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれか、またはその類似体の多型を指す。ポリヌクレオチドは、任意の３次元構造を有してもよく、公知のまたはまだ分かっていない任意の機能を実行してもよい。下記は、ポリヌクレオチドに関する非限定的な例である：遺伝子または遺伝子断片のコード化領域または非コード化領域、連鎖分析から規定される遺伝子座（ｌｏｃｉ）（遺伝子座（ｌｏｃｕｓ））、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐鎖ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化したヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体など、修飾されたヌクレオチドを含んでもよい。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリマーの構築の前または後に与えられてもよい。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断されてもよい。ポリヌクレオチドは、標識成分との抱合などにより、重合の後でさらに修飾されてもよい。
【００７０】
本開示の異種性配列は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを包含する、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、アミノ酸配列を指すタンパク質性部分をコードすることができる。ポリマーは直鎖または分岐鎖であってもよく、修飾されたアミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸によって中断されてもよい。タンパク質性部分は、例えばジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質修飾、アセチル化、リン酸化、または標識成分との抱合などのその他の操作で修飾されたアミノ酸ポリマーを包含する。さらにその上、アミノ酸は、グリシン、およびＤ型またはＬ型の両方の光学異性体、アミノ酸類似体、ならびにペプチド模倣薬を含むがこれらに限定されない天然および／または非天然または合成アミノ酸のいずれかを指す。
【００７１】
本開示の異種性配列によってコードされるタンパク質は典型的に、糖タンパク質であり、酵素または抗体などの免疫学的機能のある分子を含んでもよいがこれらに限定されない。変異体グリコシル化パターンを生じる修飾された細胞株は、関心対象の抗体（ヒト化またはキメラ）、抗体断片、サイトカイン、ホルモン、またはその他のタンパク質を産生する異種性配列を発現してもよい。細胞株によって産生されたタンパク質は、細胞によって分泌および収穫されてもよい。あるいは、細胞は、収穫され、細胞からタンパク質を抽出してもよい。タンパク質または糖タンパク質を治療的に用いて、有益なまたは所望の結果をもたらしてもよい。
【００７２】
異種性配列は、挿入された核酸分子を宿主細胞におよび／または宿主細胞間に転移させる、好ましくは自己複製する核酸分子であるベクターを含んでもよい。ベクターには、細胞へのＤＮＡまたはＲＮＡの挿入のために主として機能するベクター、ＤＮＡまたはＲＮＡの複製のために主として機能するベクターの複製、ならびにＤＮＡあるいはＲＮＡの転写および／または翻訳のために機能する発現ベクターを含んでもよい。また、先の機能の２つ以上を提供するベクターも含まれる。発現ベクターは、適切な宿主細胞に導入された場合にポリペプチドに転写および翻訳することのできるポリヌクレオチドである。
【００７３】
タンパク質をコードする異種性配列は、単一のまたは複数のベクターによって発現することができる。核酸配列は、単一のオペロンにおいて、または１つもしくは複数のベクターに配置される個別のオペロンにおいて任意のオーダーで配置することができる。所望の場合、２つ以上の発現ベクターを採用することができ、それらの各々は、単一のオペロンにおいて操作できるよう連結された１つ以上の異種性配列を含む。連結されたとは、化学的抱合または組換え手段を含むものどんな手段によっても、２つ以上の化学的な成分または要素の互いに抱合を指す。操作できるよう連結されたとは、そのように説明された要素が、要素の意図された様式で機能できる関係にある並置を指す。例えば、プロモーター配列が、コード化配列の転写を促進する場合、プロモーター配列は、コード化配列に連結されまたは操作できるよう連結される。
【００７４】
単一のまたは複数のベクターの選択および単一のまたは複数のプロモーターの使用は、異種性配列の大きさおよびベクターの容量に依存してもよいが、選択された宿主細胞において発現する場合、ベクターが提供することのできる所与の糖タンパク質の全体的な収量に大きく依存するであろう。いくつかの場合、２オペロン実験系は、より高い収量の糖タンパク質を提供する。対象のベクターは、エピソームで複製可能で、または宿主細胞ゲノムの統合した部分としてとどまることができる。
【００７５】
本開示の異種性配列は、単一の調節エレメントの制御下にあることができる。いくつかの場合、異種性核酸配列は、単一のプロモーターによって調節される。他の場合において、異種性核酸配列は、単一のオペロン内に配置される。さらに他の場合において、異種性核酸配列は、単一のリーディングフレーム内に配置される。
【００７６】
対象の核酸の調製は、種々の所定の組換え技術および合成手順によって実施できる。標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該技術分野で周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．，  Ｆｒｉｔｓｃｈ，  Ｅ．  Ｆ．  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｔ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  （１９８９）  （Ｍａｎｉａｔｉｓ）によって、およびＴ．  Ｊ．  Ｓｉｌｈａｖｙ，  Ｍ．  Ｌ．  Ｂｅｎｎａｎ，  ａｎｄ  Ｌ．  Ｗ．  Ｅｎｑｕｉｓｔ，  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．  （１９８４）およびＡｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｐｕｂ．  ｂｙ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  （１９８７）によって説明されている。簡潔には、対象の核酸は、調製されたゲノムＤＮＡ断片、ｃＤＮＡ、およびＲＮＡであり得、これらはすべて、細胞から直接抽出でき、またはＰＣＲおよびリアルタイムＰＣＲを含むがこれらに限定されない種々の増幅過程によって組換えで産生することができる。
【００７７】
核酸の直接的な化学合成は典型的には、伸長中のヌクレオチドポリマー鎖の末端５’−ヒドロキシル基への３’−遮断したおよび５’−遮断したヌクレオチドモノマーの連続的な付加を包含し、ここで、各付加は、典型的にはホスホトリエステル、ホスホールアミダイト、またはこれらの類似のものなどのリン誘導体である付加されたモノマーの３’位において伸長中の鎖の末端５’−ヒドロキシル基の求核攻撃によってもたらされる。このような方法論は、当業者に公知であり、直接関係のある教科書および文献に説明されている（例えば、Ｍａｔｔｅｕｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｅｔ．  Ｌｅｔｔ．  ５２１：７１９  （１９８０）；Ｃａｒｕｔｈｅｒｓらに対する米国特許第４，５００，７０７号；ならびにＳｏｕｔｈｅｒｎらに対する米国特許第５，４３６，３２７号および同第５，７００，６３７号）。
【００７８】
調節エレメントには、例えば、糖タンパク質をコードする１つ以上の異種性配列の発現を増大させるよう遺伝子操作することもできるプロモーターおよびオペレーターを含む。プロモーターとは、ＲＮＡポリメラーゼ酵素によって核酸配列の転写を開始および制御するヌクレオチドの配列である。オペレーターとは、所望の核酸配列の転写を制御するよう機能する、プロモーターに隣接したヌクレオチドの配列である。オペレーターは、特異的なリプレッサータンパク質が結合できるタンパク質結合ドメインを含む。適切なリプレッサータンパク質の不在下で、転写はプロモーターを通じて開始する。適切なリプレッサータンパク質の存在下で、リプレッサータンパク質はオペレーターに結合し、それによりプロモーターからの転写を阻害する。
【００７９】
本開示のいくつかの実施形態において、発現ベクターに用いられるプロモーターは誘導性である。他の実施形態において、発現ベクターに用いられるプロモーターは構成的である。いくつかの実施形態において、１つ以上の核酸配列は、誘導性プロモーターに操作できるよう連結されており、１つ以上の他の核酸配列は、構成的プロモーターに操作できるよう連結されている。真核宿主細胞において用いるのに適したプロモーターに関する制限のない例には、ＣＭＶ前初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期または後期ＳＶ４０プロモーター、レトロウイルス由来のＬＴＲ、およびマウスメタロチオネイン−Ｉプロモーターを含むがこれらに限定されない。
【００８０】
また、発現ベクターにおける遺伝子は、任意のコードされたｍＲＮＡ遺伝子産物の直接的な翻訳（すなわち、合成）へのリボソーム結合部位もコードするであろう。発現ベクターに用いてもよい他の調節エレメントには、転写エンハンサーエレメントおよび転写終結因子を含む。例えば、Ｂｉｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  １５３：５１６−５４４  （１９８７）を参照されたい。
【００８１】
発現ベクターは、特定の種類の宿主細胞において使用するのに適し得るが、他の種類ではそうではない。しかしながら、当業者は、特定の発現ベクターが所与の宿主細胞に適しているかどうかを、所定の実験を通じて容易に決定することができる。例えば、発現ベクターを宿主生物へと導入することができ、次に、ベクターに含まれる任意の遺伝子の生存率および発現についてモニターする。
【００８２】
また、発現ベクターは、１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子を含んでもよく、マーカー遺伝子が発現の際に、発現ベクターを保有する宿主細胞を選択しまたはそれに替わるものとして同定するのに有用な１つ以上の表現型形質を与える。真核細胞に適切な選択可能なマーカーに関する制限のない例には、ジヒドロ葉酸レダクターゼおよびネオマイシン耐性を含む。
【００８３】
対象のベクターは、種々の確立された技術によって安定してまたは一過性に宿主細胞へと導入することができる。例えば、１つの方法は、塩化カルシウム処理を包含し、ここで、発現ベクターは、カルシウム沈殿を介して導入される。また、他の塩、例えばリン酸カルシウムを同様の手順の後に用いてもよい。加えて、電気穿孔（すなわち、核酸に対する細胞の透過性を増大させるための電流の適用）を用いてもよい。他の形質転換方法には、微量注射、ＤＥＡＥデキストラン介在性形質転換、および酢酸リチウムの存在下での熱ショックを含む。また、脂質複合体、リポソーム、およびデンドリマーを採用して、宿主細胞をトランスフェクトしてもよい。
【００８４】
異種性配列を宿主細胞に導入する際、種々の方法を実施して、対象ベクターが導入された宿主細胞を同定することができる。１つの典型的な選択方法は、個々の細胞を継代培養して、個々のコロニーを形成した後に所望のタンパク質産物の発現について試験することを包含する。別の方法は、発現ベクター内に含まれる選択可能なマーカー遺伝子の発現を通じて与えられた表現型形質に基づいて異種性配列を含む宿主細胞を選択することを内含する。当業者は、これらまたは当該技術分野で利用可能な他の方法を用いて、遺伝子修飾した宿主細胞を同定することができる。
【００８５】
例えば、本開示の種々の異種性配列の宿主細胞への導入は、ＰＣＲ、サザンブロット、またはノーザンブロットハイブリッド形成などの方法によって確認することができる。例えば、核酸は、結果として生じる宿主細胞から調製することができ、関心対象の具体的な配列は、関心対象の配列に特異的なプライマーを用いるＰＣＲによって増幅することができる。増幅した産物をアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、または毛細管電気泳動に供した後、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ溶液、もしくはこれらの類似のものを用いた染色、またはＵＶ検出を用いたＤＮＡの検出を実施する。あるいは、関心対象の配列に特異的な核酸プローブは、ハイブリッド形成反応において採用することができる。具体的な遺伝子配列の発現は、逆転写を連結したＰＣＲであるノーザンブロットハイブリッド形成を介して対応するｍＲＮＡを検出することによって、またはコードした遺伝子産物に反応する抗体を用いたイムノアッセイによって確認することができる。典型的なイムノアッセイには、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、およびサンドイッチイムノアッセイを含むが、これらに限定されない。
【００８６】
さらにその上、本開示の種々の異種性配列の宿主細胞への導入は、異種性配列のコードする酵素の酵素活性によって確認することができる。酵素は、当業者に公知の種々の方法によってアッセイすることができる。一般に、酵素活性は、調査下の酵素反応の産物の形成または基質の変換によって確認することができる。反応は、インビトロまたはインビボで実施することができる。
【００８７】
抗体産生
一態様において、本開示は、抗体を産生する変異体グリコシル化パターンを生じるよう修飾された宿主細胞を提供する。本明細書で用いられる抗体には、組換え抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、融合抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、およびこれらの類似のものなどのすべての形態の抗体を含む。抗体は断片であってもよい。また、抗体は、薬剤、毒素、または治療用放射性同位体と抱合してもよい。また、２つ以上の抗原に結合するハイブリッド抗体を含む二重特異性抗体融合タンパク質も、本開示の宿主細胞によって産生することができる。それゆえ、抗体は、単一特異性または多選択性であってもよいネイキッド抗体および抱合した抗体ならびに抗体断片を包含する。
【００８８】
また、抗体は、対応する野生型抗体（すなわち、修飾されていない親宿主細胞において産生された抗体）と比較して少なくとも２種類の糖分子のレベルの変化によって特徴づけられてもよい変異体グリコシル化パターンを有することもできる。糖分子は、糖タンパク質に直接的に（例えば、糖タンパク質にＮ連結またはＯ連結している。）または間接的に（例えば、糖タンパク質にＮ連結またはＯ連結した他の糖を通じて連結している。）結合してもよい。糖鎖構造のバリエーション、またはこのような差における種々の糖分子含有量による変異体グリコシル化パターンは、糖タンパク質のエフェクター機能において重要な役割を担っている。例えば、抗体の、先に説明したような変異体グリコシル化パターンは、抗体の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を増大させるなど、抗体のエフェクター機能を増大させることができる。変異体グリコシル化パターンは、修飾されていない親宿主細胞において産生された対応する抗体と比較して、抗体のＦｃ領域を通じて結合している少なくとも２種類の糖分子のレベルの変化によって立証することができる。
【００８９】
いくつかの実施形態において、抗体は、構造式Ｇｌｕ−ＧｌｃＮＡＣ２−Ｍａｎ４（＋／−Ｆｕｃ）を有するＮ−グリカンを呈する。いくつかの実施形態において、抗体は、フコース部分が右から最初の４ＧｌｃＮＡｃに任意に連結することのできる構造式（Ｉ）：
【化９】
2012503656.tif 000010
を有するグリコシル化パターンを呈する。いくつかの実施形態において、抗体は、フコース部分が右から最初の４ＧｌｃＮＡｃに任意に連結することのできる構造式（ＩＩ）：
【化１０】
2012503656.tif 000011
を有するグリコシル化パターンを呈する。
【００９０】
構造式（Ｉ）および（ＩＩ）は、１つ以上のフコース分子が対象のＮ−グリカンにおいて存在しまたは不在である両方のシナリオを包含する。いくつかの実施形態において、フコースはＮ−グリカンに存在する。他の実施形態において、フコースはＮ−グリカンに不在である。
【００９１】
産生された抗体は、未処置の抗体の４つの主要なクラスのうちの１つに由来し得る：例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ。産生された抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、およびＩｇＡ２から選択されるサブクラスのうちの１つのメンバーである。
【００９２】
本開示の抗体は、モノクローナルであってもよく、実質的に均質な抗体の集団に由来する抗体を指し、すなわち、集団を含む個々の抗体は同一であり、および／または同一のエピトープを結合するが、例外として、モノクローナル抗体の産生の間に生じるかもしれない起こり得る変異体を除くものであり、このような変異体は一般に少量で存在する。このようなモノクローナル抗体には典型的に、標的を結合するポリペプチド配列を含む抗体を含み、ここで、標的結合ポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列からの単一の標的結合ポリペプチド配列の選択を含む過程によって得られた。例えば、選択過程は、ハイブリドーマクローン、ファージクローン、または組換えＤＮＡクローンのプールなど、フック数のクローン由来の独特なクローンの選択であり得る。
【００９３】
選択された標的結合配列をさらに変化させて、例えば、標的に対する親和性を改善し、標的結合配列をヒト化し、細胞培養におけるその産生を改善し、インビボでのその免疫原性を減少させ、多選択性抗体を作製するなどができ、かつ変化した標的結合配列を含む抗体も、本開示のモノクローナル抗体であることは理解されるべきである。異なる決定因子（エピトープ）に対して配向する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体の調製とは対照的に、モノクローナル抗体調製の各モノクローナル抗体は、抗原における単一の決定因子に対して配向する。モノクローナル抗体調製物の特異性に加えて、モノクローナル抗体調製物は、他の免疫グロブリンが典型的に混入していないという点で有利である。修飾語「モノクローナル」とは、抗体の実質的に均質な集団から得られた抗体の特徴を示しており、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものとして解釈されるべきではない。例えば、本開示に従って用いられるべきモノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２５６：４９５  （１９７５）；  Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ２ｎｄ  ｅｄ．  １９８８）；  Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ｉｎ：  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ５６３−６８１，  （Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，  Ｎ．Ｙ．，  １９８１））、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号参照）、ファージディスプレイ技術（例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３５２：６２４−６２８  （１９９１）；  Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２２２：５８１−５９７  （１９９１）；  Ｓｉｄｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３３８（２）：２９９−３１０  （２００４）；  Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３−１０９３  （２００４）；  Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０１（３４）：１２４６７−１２４７２  （２００４）；  およびＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８４（１−２）：１１９−１３２  （２００４）参照）およびヒト免疫グロブリン遺伝子座もしくはヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子の一部またはすべてを有する動物におけるヒトまたはヒト様抗体を産生するための技術（例えば、ＷＯ  １９９８／２４８９３；  ＷＯ  １９９６／３４０９６；  ＷＯ  １９９６／３３７３５；  ＷＯ  １９９１／１０７４１；  Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９０：２５５１  （１９９３）；  Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３６２：２５５−２５８  （１９９３）；  Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．，  ７：３３  （１９９３）；  米国特許第５，５４５，８０６号；第５，５６９，８２５号；第５，５９１，６６９号（すべてＧｅ��Ｐｈａｒｍ社）；米国特許第５，５４５，８０７号；  ＷＯ  １９９７／１７８５２；米国特許第５，５４５，８０７号；第５，５４５，８０６号；第５，５６９，８２５号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；および第５，６６１，０１６号；  Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １０：  ７７９−７８３  （１９９２）；  Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３６８：  ８５６−８５９  （１９９４）；  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３６８：  ８１２−８１３  （１９９４）；  Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １４：  ８４５−８５１  （１９９６）；  Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １４：  ８２６  （１９９６）；ならびにＬｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，  Ｉｎｔｅｒｎ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １３：  ６５−９３  （１９９５）参照）を含む種々の技術によって作製してもよい。
【００９４】
本明細書のモノクローナル抗体には、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来する抗体または特定の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一でありまたは相同であるが、鎖の残りが、別の種に由来する抗体または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体および所望の生物学的活性を呈する限りのこのような抗体の断片における対応する配列と同一でありまたは相同であるキメラ抗体を含む（米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８１：６８５１−６８５５  （１９８４））。本明細書における関心対象のキメラ抗体には、非ヒト霊長類（例えば、旧世界ザル、類人猿など）に由来する可変ドメイン抗原結合配列とヒト定常領域配列とを含む「霊長類化」抗体を含む。
【００９５】
また、本開示の宿主細胞を用いて、抗体の産生のためのハイブリドーマを作製することもできる。マウスまたは他の適切な宿主動物（とりわけ、ハムスター、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ウマ、ブタ、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、またはスナネズミなど）を免疫化して、免疫化に用いられるタンパク質に特異的に結合するであろう抗体を産生するまたは産生することのできるリンパ球を誘発することができる。あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫化してもよい。次に、ポリエチレングリコールなどの適切な融合剤を用いて、リンパ球をミエローマ細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，  ｐｐ．  ５９−１０３  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８６））。
【００９６】
このように調製されたハイブリドーマ細胞を、好ましくは、融合していない親ミエローマ細胞の増殖または生存を阻害する１つ以上の物質を含む適切な培地に播種し増殖させる。例えば、親ミエローマ細胞が、酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠失している場合、ハイブリドーマのための培地は典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（ＨＡＴ培地）を含むであろうし、これらの物質は、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を防止する。
【００９７】
一実施形態において、効率よく融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定した高レベルの産生を支持し、かつＨＡＴ培地などの培地に対して選択的であるミエローマ細胞が用いられる。いくつかの実施形態において、ミエローマ細胞株は、マウスミエローマ株（ＭＯＰＣ−２１、ＭＰＣ−１１、ＳＰ−２、またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞を含むがこれらに限定されない。）、ヒトミエローマ細胞株（Ｋａｒｐａｓ  ７０７Ｈ、ＲＰＭＩ  ８２２６、８２２６  ＡＲ／ＮＩＰ４−１、ＫＭ−２Ｒ、またはＵ−２６６）、またはラットミエローマ細胞株（ＹＢ２／３．０．Ａｇ．２０、ＹＢ２／０、Ｙ３−  Ａｇｌ．２．３、ＩＲ９８３Ｆ）である。
【００９８】
ハイブリドーマ細胞が増殖している培地は、抗原に対して配向するモノクローナル抗体の産生のためにアッセイされる。ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によってまたは、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）もしくは固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）などのインビトロでの結合アッセイによって決定することができる。モノクローナル抗体の結合親和性は例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ分析によって決定することができる（例えば、Ｍｕｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １０７：２２０  （１９８０）参照）。
【００９９】
所望の特異性、親和性、および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後、限界希釈手順によってクローンをサブクローニングし、標準的な方法によって増殖させてもよい（Ｇｏｄｉｎｇ，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，  ｐｐ．  ５９−１０３  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８６））。この目的に適した培地には、例えば、Ｄ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地を含む。加えて、ハイブリドーマ細胞を、動物における腹水腫瘍としてインビボで増殖させてもよい。
【０１００】
次に、サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティクロマトグラフィーなどの従来の抗体精製手順によって、培地、腹水液、または血清から適切に分離することができる。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、モノクローナル抗体は、（１）Ｌｏｗｒｙ法によって決定される抗体の９５重量％を超えるまで、もっとも好ましくは９９重量％を超えるまで、（２）スピニングカップ配列決定装置の使用によってＮ末端もしくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、または（３）クマシーブルーもしくは好ましくは銀染色を用いた還元条件下もしくは非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均質になるまで精製することができる。
【０１０２】
代替的な実施形態において、本開示の方法によって産生される細胞集団は、組換えＤＮＡ法による抗体の産生に用いられる（それらのすべての内容が全体として参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，８１６，５６７号）。変異体グリコシル化パターンを呈する修飾された宿主細胞は、ＨｅＬａ、ＨＥＫ−２９３、ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＮＳＯ、ＰＥＲ．Ｃ６、Ｋ５６２、Ｌ１．２、ＪＹ、ＢＨＫ、Ｋ５６２、２９３Ｆ、３Ｔ３、またはＪｕｒｋａｔなどの親細胞株から産生することができる。代替的な実施形態において、修飾された宿主細胞は、Ｂ細胞株などのリンパ球系細胞株に由来する親細胞株に由来する。
【０１０３】
一実施形態において、重鎖または軽鎖をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、成熟Ｂ細胞またはハイブリドーマ培養物などの適切な源から単離され、ＲＮＡ単離精製および任意でサイズベースの単離の標準的な技術を採用することによって得られる。次に、ｃＤＮＡライブラリ構築、ファージライブラリ構築、および特異的な関連プライマーを用いたスクリーニングまたはＲＴ−ＰＣＲなど、糖技術分野で公知の技術を用いて、重鎖または軽鎖をコードするｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡを産生しおよび単離する。いくつかの実施形態において、ｃＤＮＡ配列は、具体的な所望のｃＤＮＡを産生するための公知のインビトロＤＮＡ操作技術を用いて全体的にまたは部分的に産生される配列であってもよい。次に、ｃＤＮＡ配列は、遺伝子とともにリーディングフレームにおいてプロモーターを含み、かつ修飾度の低い宿主細胞と適合性のあるベクターに配置することができる。適切なプロモーター、制御配列、リボソーム結合部位、および転写終結部位、ならびに任意で便利なマーカーを含む数多くのプラスミドが当該技術分野で公知であり、これらには、米国特許第４，６６３，２８３号および第４，４５６，７４８号に説明されているベクターを含むが、これらに限定されない。一実施形態において、軽鎖をコードするｃＤＮＡおよび重鎖をコードするｃＤＮＡを個別の発現プラスミドに挿入してもよい。代替的な実施形態において、軽鎖をコードするｃＤＮＡおよび重鎖をコードするｃＤＮＡを、各々が適切なプロモーターおよび翻訳制御の下にある限り、同じプラスミドにともに挿入してもよい。
【０１０４】
次に、先に構築した発現ベクターを用いて、本開示の修飾された宿主細胞を形質転換することができる。一実施形態において、軽鎖および重鎖を、同じかまたは異なる種のいずれかの個別の修飾された宿主細胞培養物へと形質転換してもよい。代替的な実施形態において、軽鎖および重鎖についての個別のプラスミドを用いて、単一の修飾された宿主細胞培養物を同時形質転換してもよい。別の実施形態において、両方の遺伝子を含みかつ軽鎖および重鎖の両方についての遺伝子を発現することのできる単一発現プラスミドを単一の修飾された宿主細胞培養物へと形質変換してもよい。
【０１０５】
重鎖および軽鎖が同じ宿主で同時発現する場合、単離手順は、再構築した抗体を収集するよう設計される。このことは、例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティクロマトグラフィーなどの従来の抗体精製手順によって達成することができる。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、組換え方法によって精製されたモノクローナル抗体は、（１）Ｌｏｗｒｙ法によって決定される抗体の９５重量％を超えるまで、もっとも好ましくは９９重量％を超えるまで、（２）スピニングカップ配列決定装置の使用によってＮ末端もしくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、または（３）クマシーブルーもしくは好ましくは銀染色を用いた還元条件下もしくは非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均質になるまで精製することができる。
【０１０７】
先に示した組換え方法によって産生される抗体は、ヒトキメラ抗体などのヒト化抗体、またはヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）移植抗体（ｇｒａｆｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）であり得る。ヒト化形態の非ヒト（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ウシ、またはウサギ）抗体は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小の配列を含むキメラ抗体である。ヒト化抗体は典型的には、レシピエントの超可変領域由来の残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ウサギ、または非ヒト霊長類などの非ヒト種の超可変領域に由来する残基（ドナー抗体）によって置換されるヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの場合、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらにその上、ヒト化抗体は、レシピエント抗体においてもドナー抗体においても認められない残基を含んでもよい。これらの修飾は、抗体の性能をさらに洗練させる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つの、および典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、それらにおいて、超可変ループのすべてまたは実質的にすべてが、非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに相当し、ＦＲのすべてまたは実質的にすべてが、ヒト免疫グロブリン配列のＦＲである。また、ヒト化抗体は任意に、免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものを含むであろう。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５  （１９８６）；  Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９  （１９８８）；  ａｎｄ  Ｐｒｅｓｔａ，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  ２：５９３−５９６  （１９９２）を参照されたい。
【０１０８】
用語「可変」とは、抗体のうちで配列において広範に異なっている可変ドメインのある一部を指し、各特定の抗体の特定の抗原に対する抗体の結合および特異性において用いられる。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメインを通じて均一には分布していない。可変性は、軽鎖および重鎖の両可変ドメインにおいて超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに通常濃縮される。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインは各々、βシート構造を主として採用する４つのＦＲを含み、ループ接続を形成しかついくつかの場合、βシート構造を形成する３つの超可変領域によって接続されている。各鎖における超可変領域は、ＦＲによって他の鎖由来の超可変領域と近接して互いに保持されており、抗体の抗原結合部位の形成に関与している（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ５ｔｈ  Ｅｄ．  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍｄ．  （１９９１）参照）。定常ドメインは、抗体を抗原に結合する上で直接的には関与していないが、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）における抗体の参加などの種々のエフェクター機能を呈する。
【０１０９】
用語「超可変領域」は、本明細書で用いられる場合、抗原結合を生じる抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は一般に、ＣＤＲ由来のアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメインにおける残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）、および８９〜９７（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメインにおける３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）、および９５〜１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ５ｔｈ  Ｅｄ．  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍｄ．  （１９９１））および／または「超可変ループ」由来のアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメインにおける残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、および９１〜９６（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメインにおける２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）、および９６〜１０１（Ｈ３）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９６：９０１−９１７  （１９８７））を含む。「フレームワーク領域」または「ＦＲ」残基は、本明細書に定義される超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【０１１０】
ヒトキメラ抗体とは、両方ともヒト以外の動物の抗体重鎖可変領域（以後、「ＨＶ」または「ＶＨ」と呼び、重鎖は「Ｈ鎖」である。）および軽鎖可変領域（以後、「ＬＶ」または「ＶＬ」と呼び、軽鎖は「Ｌ鎖」である。）、ヒト抗体重鎖定常領域（以後、「ＣＨ」とも呼ぶ。）およびヒト抗体軽鎖定常領域（以後、「ＣＬ」とも呼ぶ。）を含む抗体である。ハイブリドーマがそこから産生することができる限り、ヒト以外の動物として、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはこれらの類似のものなどの任意の動物を用いることができる。
【０１１１】
ヒトキメラ抗体は、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマから、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするｃＤＮＡを得ること、ｃＤＮＡを、ヒト抗体ＣＨおよびヒト抗体ＣＬをコードする遺伝子を有する宿主細胞のための発現ベクターに挿入し、それによりヒトキメラ抗体発現ベクターを構築すること、およびその後、ベクターを低フコシル化細胞に導入して抗体を発現させることによって産生することができる。
【０１１２】
ヒトキメラ抗体の重鎖定常領域（ＣＨ）に関して、ヒト免疫グロブリン（以後、「ｈＩｇ」と呼ぶ。）クラスである限り、任意のＣＨを用いることができる。いくつかの実施形態において、ＣＨは、ｈＩｇＧクラスまたは、ｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、およびｈＩｇＧ４などのｈＩｇＧクラスに属するサブクラスのうちの１つに属する。同様に、ヒトキメラ抗体の軽鎖定常領域（ＣＬ）に関して、ｈＩｇクラスに属する限り、任意のＣＬを用いることができる。いくつかの実施形態において、ヒトキメラ抗体の軽鎖定常領域（ＣＬ）は、κクラスまたはλクラスに属する。
【０１１３】
ヒトＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物に由来する抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲが、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲへと移植された可変領域をコードするｃＤＮＡを構築すること、ｃＤＮＡを、ヒト抗体ＣＨおよびヒト抗体ＣＬをコードする遺伝子を有する宿主細胞のための発現ベクターに挿入し、それによりヒトＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築すること、およびその後、本開示の修飾された宿主細胞に発現ベクターを導入して、ヒトＣＤＲ移植抗体を発現させることによって産生することができる。
【０１１４】
好ましくは、本発明の抗体は本質的に、親抗体と比較して抗原を結合する能力を保持する。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、抗原に対する結合親和性が親抗体よりも例えば少なくとも１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、２、３、４、または５倍高いことを呈する。他の実施形態において、本発明の抗体は、抗原に対する結合親和性が、抗原に対する親抗体の結合親和性の例えば、５％以上、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、または５０％以上低いことを呈する。本発明の抗体の結合能力は例えば、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）分析または放射線免疫検定法（ＲＩＡ）などの技術を用いて決定してもよい。
【０１１５】
本開示の変異体グリコシル化パターンを有する抗体および／または修飾された宿主細胞によって産生される抗体は、癌抗原などの抗原を結合してもよい。抗原は、請求項９に記載の糖タンパク質からなる群から選択してもよく、ここで、癌抗原は、ＨＥＲ２、免疫グロブリンεＦｃ受容体ＩＩ、Ａｌｋ−１、ＣＤ２０、ＥＧＦ受容体、ＶＥＧＦ受容体、ＦＧＦ受容体、ＮＧＦ受容体、ＰＤＧＦ受容体、ＥｐＣａｍ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５１、ＣＤ５５、ＣＤ８０、ＣＤ９５、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＴＬＡ−４、ムチン１、ムチン１６、エンドグリン、メソテリン受容体、ノゴ受容体、葉酸受容体、ＣＸＣＲ４、インスリン様増殖因子受容体、ガングリオシドＧＤ３、ならびにαおよびβインテグリンからなる群から選択される。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、ヒト化ＨＥＲ２抗体は、変異体グリコシル化パターンを呈する修飾された宿主細胞において産生される。ヒト化ＨＥＲ２抗体には、参照により本明細書に明白に組み込まれる米国特許第５，８２１，３３７号の表３に説明されているｈｕＭＡｂ４Ｄ５−１、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−２、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−３、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−４、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−５、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−６、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−７、およびｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８またはトラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））；ヒト化５２０Ｃ９（ＷＯ９３／２１３１９）；およびペルツズマブなどのヒト化２Ｃ４抗体を含むが、これらに限定されない。
【０１１７】
別の実施形態において、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、またはＨＥＲ４抗体などのＨＥＲ阻害剤をコードするベクターは、本開示の修飾された宿主細胞株へと導入される。ＨＥＲ阻害剤抗体には、トラスツズマブ、ペルツズマブ、セツキシマブ、ＡＢＸ−ＥＧＦ、ＡＢＸ０３０３、ＥＭＤ７２００、Ｃ１１０３３、ＩＭＣ−１１Ｆ８、およびＩＭＣ−１１Ｆ５を含む。修飾された宿主細胞において産生されるＨＥＲ阻害剤は、修飾されていない親宿主細胞において産生されるＨＥＲ阻害剤と比較して、先に説明した少なくとも２つの糖分子のレベルの変化など、変異体グリコシル化パターンを呈することができる。
【０１１８】
本開示のＨＥＲ抗体または阻害剤を用いて、ＨＥＲの発現、増幅、または活性化を示す癌細胞を治療することができる。ＨＥＲの活性化とは、任意の１つ以上のＨＥＲ受容体の活性化またはリン酸化を指す。一般に、ＨＥＲ活性化は、（例えば、ＨＥＲ受容体または基質ポリペプチドにおけるＨＥＲ受容体リン酸化チロシン残基の細胞内キナーゼドメインによって生じる）シグナル伝達を結果として生じる。ＨＥＲ活性化は、関心対象のＨＥＲ受容体を含むＨＥＲ二量体に結合するＨＥＲリガンドによって介在し得る。ＨＥＲ二量体に結合するＨＥＲリガンドは、二量体におけるＨＥＲ受容体の１つ以上のキナーゼドメインを活性化し、それによりＨＥＲ受容体の１つ以上におけるチロシン残基のリン酸化および／またはＡｋｔもしくはＭＡＰＫ細胞内キナーゼなどの追加的な基質ポリペプチドにおけるチロシン残基のリン酸化を結果として生じ得る。
【０１１９】
ＨＥＲ阻害剤には、ＨＥＲ二量体の形成を阻害する媒介物である二量体化阻害剤を含む。ＨＥＲ二量体化阻害剤は、抗体、例えば、そのヘテロ二量体結合部位においてＨＥＲ２に結合する抗体であり得る。抗体は、変異体グリコシル化パターンを呈する抗体など、本明細書に説明されている抗体であってもよい。本明細書で意図される二量体化阻害剤は、ペルツズマブまたはモノクローナル抗体２Ｃ４（ＭＡｂ  ２Ｃ４）である。ＨＥＲ二量体化阻害剤に関する他の例には、ＥＧＦＲに結合してＥＧＦＲと１つ以上の他のＨＥＲ受容体との二量体化を阻害する抗体（例えば、ＥＧＦＲモノクローナル抗体８０６、ＭＡｂ  ８０６、活性化型または非繋留型ＥＧＦＲに結合；Ｊｏｈｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７９（２９）：３０３７５−３０３８４  （２００４）参照）；ＨＥＲ３に結合してＨＥＲ３と１つ以上の他のＨＥＲ受容体との二量体化を阻害する抗体；ＨＥＲ４に結合してＨＥＲ４と１つ以上の他のＨＥＲ受容体との二量体化を阻害する抗体；ペプチド二量体化阻害剤を含む。そのすべての内容が全体として参照により本明細書により組み込まれる米国特許第６，４１７，１６８号を参照されたい。ペルツズマブなど、ＨＥＲ二量体化を阻害する抗体を用いて癌細胞を治療してもよく、抗体はＨＥＲ２受容体を過剰発現させたり増幅したりしない。
【０１２０】
また、修飾された宿主細胞を用いて、変異体グリコシル化パターンを有する、全長抗体以外の組換えタンパク質を産生することもできる。当該技術分野で標準的な技術を用いて、組換えタンパク質をコードするベクター（プラスミドまたはウイルスなど）を、修飾された宿主細胞へと導入することができ、組換えタンパク質は、ホルモン、サイトカイン、およびＦｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦＶ、または二重特異性抗体の断片などの抗体断片を含む、関心対象の任意のタンパク質であってもよい。
【０１２１】
Ｆｖ断片は、完全な抗原認識および抗原結合部位を含む最小の抗体断片である。この領域は、密な非共有結合における１つの重鎖および１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。この構成において、各可変ドメインの３つの超可変領域は、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面における抗原結合部位を明確にするよう相互作用する。集約的に、６つの超可変領域は、抗体に対する抗原結合特異性を与える。しかしながら、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的なたった３つの超可変領域を含むＦｖの半分）でさえ、抗原を認識しおよび結合する能力を有するが、結合部位全体よりも親和性が低い。
【０１２２】
また、Ｆａｂ断片は、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第一の定常ドメイン（ＣＨ１）も含む。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端において数個の残基を付加することによってＦａｂ断片と異なる。Ｆａｂ’−ＳＨとは、定常ドメインのシステイン残基が少なくとも１つの遊離チオール基を有するＦａｂ’についての本明細書における名称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は本来、ヒンジシステインを間に有するＦａｂ’断片の対として産生される。また、抗体断片に関する他の化学的連結も公知である。
【０１２３】
一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体断片は、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、ここで、これらの断片は、一本鎖ポリペプチドに存在する。いくつかの実施形態において、Ｆｖポリペプチドはさらに、ＶＨドメインとＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーを含み、このことによってｓｖＦｖが抗原結合のために所望の構造を形成することができる。ｓｃＦｖに関する総説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  ｖｏｌ．  １１３，  Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ｐｐ．  ２６９−３１５  （１９９４）を参照されたい。ＨＥＲ２抗体のｓｃＦｖ断片は、それらのすべての内容が全体として参照により本明細書により組み込まれるＷＯ０３／１６１８５；米国特許第５，５７１，８９４号；および米国特許第５，５８７，４５８号に説明されており、本開示の修飾された宿主細胞によって産生してもよい。
【０１２４】
用語「二重特異性抗体」とは、断片が、同一のポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）におけるＶＬドメインに接続されたＶＨドメインを含む２つの抗原結合部位を有する低分子抗体断片を指す。短すぎて同一鎖における２つのドメイン間で対形成できないリンカーを用いることによって、ドメインは、別の相補的ドメインと対形させられ、２つの抗原結合部位を作製する。二重特異性抗体は、それらのすべての内容が全体として参照により本明細書により組み込まれるＥＰ  ４０４，０９７；ＷＯ  ９３／１１１６１；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  ９０：６４４４−６４４８  （１９９３）においてより十分に説明されている。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、抗体は阻害性抗体である。阻害性抗体は、抗体が結合する抗原の１つ以上の生物学的活性を阻害してもよい。例えば、阻害性抗体は、抗原の活性を阻害することによって対応する抗原のシグナル伝達をダウンレギュレートすることができ、または抗原の発現を阻害することができる。いくつかの実施形態において、抗体は中和抗体である。中和抗体は、感染媒介物など、可溶性抗原のまたは生微生物の何らかの生物活性を減少させまたは消失させる。中和抗体は、その抗原についての天然のリガンドまたは受容体と競合してもよい。いくつかの実施形態において、抗体は刺激性のまたは活性化抗体である。刺激性の抗体または活性化抗体は、抗原の結合の際に対応する抗原のシグナル伝達を活性化して、それにより抗原の活性を活性化しもしくはアップレギュレートし、または抗体が結合する抗原の発現をアップレギュレートし得るアゴニスト抗体であってもよい。
【０１２６】
本発明のＮ−グリカンを含んでもよい抗体には、アブシキシマブ（ＲｅｏＰｒｏ（登録商標））、，  アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ（登録商標））、アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標））、バシリキシマブ（Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（登録商標））、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））、ダクリズマブ（Ｚｅｎａｐａｘ（登録商標））、ダセツズマブ、エクリズマブ（Ｓｏｌｉｒｉｓ（登録商標））、エファリズマブ（Ｒａｐｔｉｖａ（登録商標））、エドレコロマブ（Ｐａｎｏｒｅｘ（登録商標））、エピラツズマブ、イブリツモマブ（Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標））、チウキセタン、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標））、ムロモナブ−ＣＤ３（ＯＫＴ３）、ナタリズマブ（Ｔｙｓａｂｒｉ（登録商標））、オマリズマブ（Ｘｏｌａｉｒ（登録商標））、パリビズマブ（Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標））、パニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標））、ラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標））、ゲムツズマブオゾガミシン（Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標））、オレゴボマブ（ＯｖａＲｅｘ（登録商標））、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標））、トシツモマブ（Ｂｅｘｘａｒ（登録商標））、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））、ＭｅｔＭＡｂ、オクレリズマブ、ペルツズマブ、Ｒａｐｔｉｖａ（登録商標）（エファリズマブ）、ｈｕ  Ｍ１９５Ｍａｂ、ＭＤＸ−２１０、ＢＥＣ２、抗−Ａβ、抗−ＣＤ４、抗−ＩＬ−１３、抗−ｏｘＬＤＬ、トラスツズマブ−ＤＭ１、，  アポマブ（ａｐｏｍａｂ）、ｒｈｕＭＡｂβ７、ｒｈｕＭＡｂ  ＩＦＮα、ＧＡ１０１、抗−ＯＸ４０Ｌ、イピリムマブ、バロルチム（Ｖａｌｏｒｔｉｍ）、ウステキヌマブ、ゴリムマブ、オファツムマブ、ザルツムマブ、トレメリムマブ、モタビズマブ、ミツモマブ（ｍｉｔｕｍｏｍａｂ）、エクロメキシマブ（ｅｃｒｏｍｅｘｉｍａｂ）、ＡＢＸ−ＥＧＦ、ＭＤＸ０１０、ＸＴＬ  ００２、Ｈ１１  ＳＣＦＶ、４Ｂ５、ＸＴＬ００１、ＭＤＸ−０７０、ＴＮＸ−９０１、ＩＤＥＣ−１１４、ならびに補体Ｃ５、ＣＢＬ、ＣＤ１４７、ｇｐ１２０、ＶＬＡ４、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８、ＶＥＧＦ、ＣＤ４０Ｌ、ａｎｔｉ−Ｉｄ、ＩＣＡＭ１、ＣＤ２、ＥＧＦＲ、ＴＧＦ−β２、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ受容体、Ｅ−セレクチン、ＦａｃｔＩＩ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、Ｆ  ｇｐ、ＣＤ１１／１８、ＣＤ１４、ＣＤ８０、ＩＣＡＭ３、ＣＤ４、ＣＤ２３、β２−インテグリン、α４β７、ＣＤ５２、ＣＤ２２、ＯＸ４０Ｌ、ＩＬ−５受容体、ＧＭ−ＣＳＦ受容体、ＧＭ−ＣＳＦ、ＨＬＡ−ＤＲ、ｏｘＬＤＬ、ＣＤ６４  （ＦｃＲ）、ＴＣＲαβ、ＣＤ３、Ｈｅｐ  Ｂ、ＣＤ１２５、ＤＲ５、ＥｐＣＡＭ、ｇｐＩＩｂＩＩＩａ、ＩｇＥ、β７インテグリン、ＣＤ２０、ＩＬ１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１２／ＩＬ−２３、ＩＬ−１５、ＩＦＮ−α、ＶＥＧＦＲ−１、血小板由来増殖因子受容体α（ＰＤＧＦＲα）、血管接着タンパク質１（ＶＡＰ１）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、Ａｐｏ２／ＴＲＡＩＬ、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＨＬＡ、Ｆ  ｇｐ、ＩｇＥ、ＣＴＬＡ−４、ＩＰ−１０、抗���ロストリジウム・ディフィシル毒素Ａおよび毒素Ｂ、バチルス・アントラシス、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）、マンノース受容体／ｈＣＧβ、インテグリン受容体、ＰＤ１、ＰＤＬ−１、ＣＤ１９、ＣＤ７０、およびＶＮＲインテグリンを含むがこれらに限定されない抗原に特異的な任意の抗体断片を含むが、これらに限定されない。
【０１２７】
本発明のＮ−グリカンを含む抗体は、天然の抗体または修飾されていない宿主細胞によって産生される抗体の半減期に匹敵する良好な半減期を有する。抗体の半減期とは典型的には、抗体分子の形成後の抗体分子の平均生存時間の測定結果を指し、通常、動物の身体由来の既知の量の免疫グロブリンの５０％を除去するのに必要な時間として表される。半減期は、免疫グロブリンのクラスによって変化し、また、種によっても変化し得る。いくつかの実施形態において、ＣＨＯ−１Ｅ５細胞によって産生される対象のＮ−グリカンを発現する抗体は、親ＣＨＯ細胞によって産生される抗体の末端半減期に匹敵するインビボでの末端半減期を有する。いくつかの実施形態において、対象の抗体は、少なくとも４、８、１２、２４、４８、７２時間、またはそれより長くさえある試験動物における末端半減期を有する。末端半減期は、初回投与後および規定された時間経過にわたって、対象の生物学的流体（例えば、血液または血清）にとどまる抗体の量を定量することによって評価することができる。初回投与は、静脈内で、皮下で、または当該技術分野で公知のもしくは本明細書に開示されたその他の適切な経路で実施することができる。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、本発明のＮ−グリカンを含む対象の抗体は、修飾されていない宿主細胞によって産生される親抗体または本発明の独特なＮ−グリカンを欠失する抗体と比較して、高いＡＤＣＣ活性を有するが、実質的に高い免疫原性を誘発しない。免疫原性とは、抗原またはエピトープなど、特定の物質が、免疫応答、体液性および／または細胞介在性免疫応答を誘発する能力を指す。タンパク質および多糖類は、免疫原性であり得る。一実施形態において、対象のＮ−グリカンを含む抗体は、親ＣＨＯ細胞によって産生される抗体の免疫原性に匹敵する免疫原性またはインビボでのその欠失を呈する。免疫原性またはその欠失を評価するための方法は、当該技術分野で公知である。例えば、従来のアプローチは、血清抗体力価など、抗体応答を誘発させる免疫原性の能力を測定することである。実施例１４および図２９で説明するように、インビボでの免疫原性は、本発明の対象の抗体に対する抗体力価によって測定される。具体的には、一例において、野生型ＣＨＯ細胞によって産生される対象のＥＴ１０１抗体またはＣＨＯ−１Ｅ５細胞によって産生されるＥＴ１０１は、２群の非ヒト霊長類へと個別に注射される。注射した対象の抗体に応じた血清ＩｇＭ産生をＥＬＩＳＡによって測定する。血清ＩｇＭ力価は、対象の抗体によってインビボで誘発される免疫原性のレベルを反映する。抗体力価は、血清の１：１〜１：１，０００，０００希釈の範囲で測定することができる。いくつかの実施形態において、ＣＨＯ細胞またはＣＨＯ−１Ｅ５細胞によって産生される対象の抗体に対するＩｇＭ力価は、１００，０００ｎｇ／血清ｍＬ以下、１０，０００ｎｇ／ｍＬ以下、１，０００ｎｇ／ｍＬ以下、１００ｎｇ／ｍＬ以下、またはさらに１０ｎｇ／ｍＬ以下の範囲にある。いくつかの実施形態において、ＩｇＭ力価は、１：１００の血清希釈で４０５ｎｍにおける約０．１の光学密度（ＯＤ）であり、約５００ｎｇ〜１０００ｎｇ／ＩｇＭ／血清ｍＬに相当する。図２９に示すように、ＩｇＭ力価は、抗体注射後、７日間超、１４日間超、２０日間超、２４日間超、３０日間超、３５日間超、またはさらにそれより長い間にわたって増大しない。
【０１２９】
対象の抗体の免疫原性を評価するためにＩｇＭまたは他の抗体のアイソタイプ力価を測定するのに適したアッセイには、放射性リガンド、酵素、蛍光、化学発光、または電気化学発光による検出系を用いた直接結合アッセイ、架橋アッセイ、捕捉（サンドイッチ）アッセイ、および競合的イムノアッセイを含むが、これらに限定されない。標的抗体のインビボでの免疫原性を評価するための１つの代替的な方法は、高い循環濃度の標的抗体、すなわちＥＴ１０１−ＣＨＯ−１Ｅ５抗体の存在下でヒトおよびカニクイザルの血清における抗薬剤抗体（ＡＤＡ）を決定するための磁気ビーズベースの免疫沈降法後の定量的液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ／ＭＳ）である。利用可能なＡＤＡ結合部位は、過剰量の標的抗体の添加によって飽和させた後、磁気ビーズベースのＩｇＧ抗体のならびに抗体の結合した抗原のプロテインＧにより単離した後、溶出および消化を行う。次に、標的抗体のペプチドを、全ＡＤＡの存在を推測する安定同位体標識した標準物質を用いたＬＣ／ＭＳによって定量する。このアプローチの補完によって、免疫原性応答の評価についての方法論が確立された（Ｈｅｎｄｒｉｋ  Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２００８ｖｏｌ．８０，ｎｏ１８，ｐｐ．６９０７−６９１４）。
【０１３０】
標的抗体によって誘導される望ましくない免疫原性は、体液性および細胞性免疫応答を含むことができる。所望の場合、体液性および細胞性の両方の免疫応答を測定することができる。たいていの場合、成熟型ＩｇＧ応答の顕性は、潜在的な抗原に特異的なヘルパーＴ細胞の関与を含意する。本発明の対象の抗体の投与の際に細胞介在性応答を検出する／評価するためのアッセイの例には、Ｔ細胞刺激／増殖アッセイ、サイトカイン（例えば、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＦＮ−γ）産生／放出法、受容体のリン酸化状態の測定、または１つ以上のＴ細胞もしくはＢ細胞の細胞内マーカーの調節を含むが、これらに限定されない。これらは、他の細胞種、例えば樹状細胞の調製物と時々同時に培養されるＴ細胞調製物の使用を包含する。エリスポットおよびフローサイトメトリー手順は、これらのアッセイに共通して用いられる。記憶Ｂ細胞（および時には記憶Ｔ細胞）アッセイは、免疫応答の性質に関する有用な情報を提供することができ、免疫原性の顕性の予測の一助となり得る。ペプチドまたは全長の標的タンパク質、例えばＥＴ１０１−ＣＨＯ−１Ｅ５抗体（アッセイおよびアッセイの目的による。）およびエリスポット法を用いた研究を用いることができる（“ＧＵＩＤＥＬＩＮＥ  ＯＮ  ＩＭＭＵＮＯＧＥＮＩＣＩＴＹ  ＡＳＳＥＳＳＭＥＮＴ  ＯＦ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ−ＤＥＲＩＶＥＤ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ”，  ２００７参照）。
【０１３１】
Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合
一態様において、本発明は、修飾された宿主細胞によって産生された抗体を提供し、ここで、抗体は、修飾されていない宿主細胞によって産生される対応する抗体と比較して、Ｆｃ受容体であるＦｃγＩＩＩａに対する高い結合親和性、および／または別のＦｃ受容体であるＦｃγＩＩｂに対する低い結合親和性を有し、それにより、このようなＦｃ受容体を発現するエフェクター細胞に対する抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用を高める。別の態様において、本発明は、修飾された抗体を産生する能力によって特徴づけられる修飾された宿主細胞を提供し、ここで、抗体は、修飾されていない宿主細胞によって産生される対応する抗体と比較してＦｃγＩＩＩａに対する高い結合親和性、および／またはＦｃγＩＩｂに対する低い結合親和性を呈する。
【０１３２】
抗体および抗体−抗原複合体と免疫系の細胞との相互作用は、抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）を含む種々の応答に影響をもたらす（Ｄａｅｒｏｎ，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５：２０３−２３４  （１９９７）；Ｗａｒｄ  ａｎｄ  Ｇｈｅｔｉｅ，  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２：７７−９４  （１９９５）；およびＲａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ９：４５７−４９２  （１９９１）において概説）。
【０１３３】
用語「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を説明するために用いられる。典型的なＦｃＲは、天然配列のヒトＦｃＲである。その上、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体を結合し（γ受容体）、かつＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を含むものであり、受容体には受容体の対立遺伝子変異体および選択的にスプライシングした形態を含む。ＦｃγＲＩＩ受容体には、主としてその細胞質ドメインにおいて異なる類似したアミノ付加配列を有するＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害性受容体」）を含む。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインにおける免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。阻害する受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシン阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む（総説Ｍ．  ｉｎ  Ｄａｅｒｏｎ，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５：２０３−２３４  （１９９７）参照）。ＦｃＲは、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７−９２  （１９９１）；Ｃａｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２５−３４  （１９９４）；およびｄｅ  Ｈａａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｌａｂ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｅｄ．  １２６：３３０−４１  （１９９５）に概説されている。将来同定されるべきものを含む他のＦｃＲは、用語「ＦｃＲ」によって本明細書に包含される。また、用語には、材料ＩｇＧの胎仔への転移を生じる新生仔受容体ＦｃＲｎも含む（Ｇｕｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １１７：５８７  （１９７６）  ａｎｄ  Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２４：２４９  （１９９４））。
【０１３４】
いくつかの抗体エフェクター機能は、抗体のＦｃ領域を結合するＦｃ受容体（ＦｃＲ）によって媒介される。ＦｃＲは、免疫グロブリンのアイソタイプに対するその特異性によって定義される：ＩｇＧ抗体に対するＦｃ受容体は、ＦｃγＲと、ＩｇＥに対するものはＦｃεＲと、ＩｇＡに対するものはＦｃαＲと、等々呼ばれる。３つのサブクラスのＦｃγＲが同定されている：ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）。各ＦｃγＲサブクラスは、２つまたは３つの遺伝子によってコードされており、選択的ＲＮＡスプライシングは、複数の転写産物をもたらすので、ＦｃγＲアイソフォームにおける広範な多様性が存在する。ＦｃγＲＩサブクラスをコードする３つの遺伝子（ＦｃγＲＩＡ、ＦｃγＲＩＢ、およびＦｃγＲＩＣ）は、染色体１の長いアームの領域１ｑ２１．１にクラスター化され；ＦｃγＲＩＩアイソフォームをコードする遺伝子（ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、およびＦｃγＲＩＩＣ）およびＦｃγＲＩＩＩをコードする２つの遺伝子（ＲｃγＲＩＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＢ）はすべて、領域１ｑ２２においてクラスター化される。これらの異なるＦｃＲサブタイプは、異なる細胞種において発現する（Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ９：４５７−４９２  （１９９１）に概説）。例えば、ヒトではＦｃγＲＩＩＩＢが好中球でのみ認められるのに対し、ＦｃγＲＩＩＩＡは、マクロファージ、単球、ＮＫ細胞、およびＴ細胞亜集団において認められる。特に、ＦｃγＲＩＩＩＡは、ＮＫ細胞に存在する唯一のＦｃＲであり、細胞種の１つはＡＤＣＣに含まれている。ＦｃγＲＩＩＩＡは、マクロファージおよびＮＫ細胞において発現した活性化膜貫通受容体である。また、ＦｃγＲＩＩＩＡは、好中球オプソニン受容体でもある（Ｒａｖｅｔｃｈ，  Ｊ．  ａｎｄ  Ｌ．  Ｌａｎｉｅｒ，  ２０００，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９０：８４）。ＦｃγＲＩＡは、３つの細胞外Ｉｇ様ドメインを有する膜貫通タンパク質である。ＦｃγＲＩは、単球およびマクロファージにおいて構成的に発現し、好中球および好酸球において誘導することができる。造血細胞におけるＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７−９２  （１９９１）において概説されており、そのすべての内容が全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３５】
一実施形態において、本発明は、ＦｃＲ結合親和性の変化した抗体を提供する。ＦｃＲ結合親和性の「変化した」抗体とは、親抗体とまたは天然配列Ｆｃ領域を含む抗体と比較して高いまたは低いいずれかのＦｃＲ結合活性および／またはＡＤＣＣ活性を有する抗体である。ＦｃＲに対して「高い結合を示す」本発明の抗体は、親抗体よりも良好な親和性で少なくともＦｃＲを結合する。ＦｃＲに「低い結合を示す」本発明の抗体は、親抗体よりも低い親和性で少なくとも１つのＦｃＲを結合する。ＦｃＲに対して低い結合を示すこのような変異体は、ＦｃＲに対してはっきりとした結合をほとんどまたはまったく有し得ず、例えば、天然配列ＩｇＧ  Ｆｃ領域と比較してＦｃＲに対する０〜２０％の結合を有し得る。
【０１３６】
親抗体よりも高い親和性でＦｃＲを結合する本発明の抗体は、独特なＮ連結型グリカンを有する抗体および親抗体がかなりの量で適用される場合、親抗体よりも実質的に高い結合親和性で先に同定したＦｃＲの任意の１つ以上を結合する抗体である。例えば、高いＦｃＲ結合親和性を有する抗体は、親抗体と比較してＦｃＲ結合親和性において約１．１倍〜約１０，０００倍、例えば、１．１５倍、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、５００、１，０００、１０，０００倍またはそれより多く示し得、ここで、ＦｃＲ結合親和性は、例えば本明細書の実施例において開示されるように決定される。
【０１３７】
句「低親和性受容体」は、例えば約５０ｎＭ以下の親和性の結合定数を有する関心対象のリガンドに対して弱い結合親和性を有する受容体を示す。典型的な低親和性受容体には、ＦｃγＲＩＩＩａ  １５８Ｆ／ＦおよびＦｃγＲＩＩＩａ  １５８Ｆ／Ｖを含むが、これらに限定されない。
【０１３８】
いくつかの実施形態において、ＣＨＯ  １Ｅ５細胞によって産生される抗体は、活性化ＦｃγＲであるＦｃγＲＩＩＩａに対して高い結合を示し、さらに、阻害性ＦｃγＲであるＦｃγＲＩＩｂに対して低い結合を示し得る。
【０１３９】
抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性
本開示の修飾された宿主細胞を用いて、先に説明した抗体または機能的抗体断片を産生することができる。また、これらの細胞によって産生された抗体または機能的抗体断片は、修飾されていない親宿主細胞において産生される対応する抗体または機能的抗体断片と比較して、少なくとも２つの糖分子のレベルの変化など、本明細書に説明された変異体グリコシル化も呈することができる。さらにその上、変異体グリコシル化パターンを有するこれらの抗体または断片は、修飾されていない親宿主細胞において産生される対応する抗体または抗体断片と比較して、改善された抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または他の抗体エフェクター機能を有することができる。あるいは、変異体グリコシル化パターンを有する抗体または抗体断片は、変異体グリコシル化パターンを欠失する対応する抗体と比較して、高いＡＤＣＣを呈する。また、改善されたまたは高いＡＤＣＣ活性を有する抗体または抗体断片は、変異体グリコシル化パターンを有してもよい。
【０１４０】
例えば、親ＣＨＯ細胞株は、変異体グリコシル化パターンを有する修飾されたＣＨＯ細胞株を生じるよう修飾することができる。次に、修飾されたＣＨＯ細胞株は、親ＣＨＯ細胞によって産生される抗体よりも高いＡＤＣＣ活性を有する抗体を産生することができる。また、修飾されたＣＨＯ細胞株によって産生される抗体は、変異体グリコシル化パターンを有することができる。
【０１４１】
「抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用」（ＡＤＣＣ）は、ＦｃＲを発現するエフェクター細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）が、標的細胞において結合した抗体を認識し、その後、標的細胞の溶解を生じさせる細胞介在性反応を指す。ＡＤＣＣを介在する主要な細胞は、ＮＫ細胞、単球、およびマクロファージを含む。ＮＫ細胞は典型的に、ＦｃγＲＩＩＩを主として発現するのに対し、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７−９２  （１９９１）に要約される。
【０１４２】
「エフェクター細胞」とは、１つ以上のＦｃＲを発現しかつエフェクター機能を実行する白血球である。好ましくは、細胞は、少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現しかつＡＤＣＣエフェクター機能を実行する。ＡＤＣＣを介在するヒト白血球の例には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞、および好中球を含み；ＰＢＭＣおよびＮＫ細胞が好ましい。エフェクター細胞は、その天然源から、例えば本明細書に説明されている血液またはＰＢＭＣから単離されてもよく、または当該技術分野で公知の方法を用いてインビトロで増殖してもよい。
【０１４３】
一実施形態において、本発明の抗体は、対象の抗体がかなりの量で適用される場合、ヒトエフェクター細胞の存在下で、親宿主細胞によって産生される対応する抗体よりも効果的に抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）を媒介する。一般に、ＡＤＣＣ活性は、本明細書に開示されたアッセイを用いて確認することができるが、例えば、動物モデルなどにおけるＡＤＣＣ活性を決定するための他のアッセイまたは方法が意図される。本発明の抗体は、例えば本明細書に開示されるインビトロアッセイにおいて、親抗体よりも介在するＡＤＣＣにおいて効果的な約１．１倍〜約１０，０００倍、例えば、１．１５、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、５００、１，０００、１０，０００倍またはそれより多くである。
【０１４４】
いくつかの実施形態において、独特なＮ連結型グリカンを有する本発明の抗体は、親抗体と比較して異なる遺伝子型のＦｃγＲＩＩＩａを発現するエフェクター細胞に対して高いＡＤＣＣを呈する。一例において、独特なＮ連結型グリカンを有する抗体は、親抗体と比較して、（アミノ酸１５８が２つの対立遺伝子においてバリンである場合）ＩｇＧのＦｃ断片に対して高い親和性を有するＦｃγＲＩＩＩａ  １５８Ｖ／Ｖを発現するエフェクター細胞に対して高いＡＤＣＣを呈する。別の例において、独特なＮ連結型グリカンを有する抗体は、親抗体と比較して、（アミノ酸１５８が対立遺伝子のうちの両方または１つにおいてフェニルアラニンである場合）ＦｃγＲＩＩＩ  １５８Ｆ／ＦまたはＦｃγＲＩＩＩ  １５８Ｆ／Ｖを発現するエフェクター細胞に対して高いＡＤＣＣを呈する。ＦｃγＲＩＩＩａにおけるアミノ酸１５８においてバリン（Ｖ）またはフェニルアラニン（Ｆ）の表現型に対応する遺伝子多型は、ＦｃγＲに対するＩｇＧ１の親和性に大きく影響することが公知である（Ｋｏｅｎｅ  ＨＲ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｌｏｏｄ  ９０：１１０９−１１１４，  １９９７）。加えて、ＦｃγＲＩＩＩａ  Ｖ対立遺伝子を有する免疫エフェクター細胞は、Ｆ対立遺伝子を有する細胞よりも良好に抗ＨＥＲ−２／ｎｅｕ  ＩｇＧ１変異体のＡＤＣＣを介在する（Ｓｈｉｅｌｄｓ  ＲＬ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ９：６５９１−６６０４，  ２００１）。抗ＨＥＲ−２／ｎｅｕモノクローナル抗体であるトラスツズマブは、活性化抗体受容体（断片Ｃ受容体（ＦｃγＲＩＩＩａ；ＦｃγＲＩＩａ））および阻害性抗体受容体（ＦｃγＲＩＩｂ）の両方に結合することが示されており、ナチュラルキラー細胞／単球の抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）に影響を及ぼし得るＦｃγＲ多型が同定されている。複数の研究は、ＦｃγＲ多型が、トラスツズマブを受容した乳癌患者の臨床外来と関連しているかどうかを調べた。ＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｖ／Ｖ遺伝子型は、奏効率（ＯＲＲ）および無進行生存（ＰＦＳ）と有意に相関していることが認められた。また、ＦｃγＲＩＩａ−１３１  Ｈ／Ｈ遺伝子型について、ＯＲＲおよびＰＦＳにおける傾向的有意性があった。２つの好性の遺伝子型（ＶＶおよび／またはＨ／Ｈ）が独立して、他の組み合わせと比較してより良好なＯＲＲおよびＰＦＳと関連していた。ＡＤＣＣ分析は、Ｖ／Ｖおよび／またはＨ／Ｈ  ＰＢＭＣが、異なる遺伝子型を有するＰＢＭＣよりも有意に高いトラスツズマブ介在性細胞傷害を有することを示した。ＦｃγＲＩＩＩａ  １５８Ｖ／Ｖを有する患者のＰＦＳ概算値は、１５８Ｖ／Ｆ、１５８Ｆ／Ｆ、またはＦ担体（Ｖ／Ｆ＋Ｆ／Ｆの組み合わせ）を有する患者に関してよりも有意に長い（Ａｎｔｏｎｉｎｏ  Ｍｕｓｏｌｉｎｏ，ｅｔ  ａｌ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌｕｍｅ  ２６，  Ｎｏ．  １１，  Ａｐｒｉｌ  １０  ２００８）。このように、修飾されていない抗体と比較して、ＦｃγＲＩＩＩ  １５８Ｖ／Ｖを発現する細胞およびＦｃγＲＩＩＩ  １５８Ｆ／Ｆを発現する細胞に対して高いＡＤＣＣ活性を有する本発明の抗体は、抗体ベースの治療法で治療された癌を含む種々の障害を有する患者の臨床外来を高める上で非常に有用であり得る。
【０１４５】
また、本明細書に用いられているＡＤＣＣ活性は、キラー細胞、ナチュラルキラー細胞、活性化型マクロファージ、またはこれらの類似のものなど、エフェクター細胞の表面に存在するＦｃ受容体に対する抗体のＦｃ領域の結合を介してエフェクター細胞を活性化することによって、細胞、例えば腫瘍細胞を損傷させる活性も包含する（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｃｈａｐｔｅｒ  ２．１  （１９９５））。例えば、ＡＤＣＣ活性は、生体における腫瘍細胞の細胞表面抗原に結合した抗体が、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）（例えば、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、単球、細胞傷害性Ｔ細胞ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）を発現するエフェクター細胞を活性化して、標的細胞における結合した抗体の認識をもたらした後、標的細胞の溶解を生じる細胞傷害活性であり得る（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｃｈａｐｔｅｒ  ２．１  （１９９５））。関心対象の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５，５００，３６２号または第５，８２１，３３７号において説明されたものなどのインビトロ  ＡＤＣＣアッセイを実施してもよい。このようなアッセイのための有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。あるいは、または加えて、関心対象の分子のＡＤＣＣ活性を、例えばＣｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５：６５２−６５６  （１９９８）に開示したものなど、動物モデルにおいてインビボで評価してもよい。
【０１４６】
また、抗体のエフェクター機能には、Ｃ１ｑ結合；補体依存性細胞傷害；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）のダウンレギュレーションなども含むが、これらに限定されない。補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）は、補体の存在下で標的を溶解する分子の能力を指す。補体活性化経路は、補体系（Ｃ１ｑ）の第一成分が、同族の抗原と複合体形成した分子（例えば、抗体）に結合することによって開始される。補体の活性化を評価するために、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３  （１９９６）において説明されたＣＤＣアッセイを実施してもよい。
【０１４７】
本発明の抗体は、親抗体と比較して生物活性の任意の変化を評価するための１つ以上のアッセイに供してもよい。
【０１４８】
ＦｃＲを結合する本発明の抗体の能力を評価してもよい。ＦｃＲが、ＦｃγＲＩＩＩＡ−１５８Ｖ／Ｖなどの高親和性Ｆｃ受容体である場合、結合は、対象の抗体を滴定すること、および標準的なＥＬＩＳＡフォーマットにおける本発明の抗体に特異的に結合する抗体を用いて結合した抗体を測定することによって測定することができる。
【０１４９】
本発明の抗体のＡＤＣＣ活性を評価するために、変化するエフェクター：標的比を用いて、実施例１２において説明されているものなどのインビトロＡＤＣＣアッセイを実施してもよい。このようなアッセイに有用な「エフェクター細胞」には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。あるいは、または加えて、本発明の抗体のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えばＣｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  ＰＮＡＳ  （ＵＳＡ）  ９５：６５２−６５６  （１９９８）において開示されたものなどの動物モデルにおいて評価してもよい。
【０１５０】
製剤、投与、および治療
高いＡＤＣＣ活性を有する本発明の抗体は、種々の障害の予防および治療に有用であり得る。
【０１５１】
本明細書で用いられる「障害」は、本発明の修飾された宿主細胞によって産生される抗体を用いた治療から恩恵を受けるであろう任意の容態を指す。これには、問題の障害に哺乳類をかかりやすくする病理学的容態を含む慢性および急性の障害または疾患を含む。障害の例には、癌、アレルギー、心血管疾患、炎症性疾患、代謝性疾患、神経学的疾患、ウイルス感染、および／または細菌感染を含むが、これらに限定されない。一実施形態において、障害は癌である。癌の例には、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病を含むが、これらに限定されない。このような癌のより特定の例には、副腎皮質癌、肛門癌、形成不全癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨転移、中枢神経系（ＣＮＳ）癌、末梢神経系（ＰＮＳ）癌、乳癌、キャッスルマン病、子宮頚癌、小児非ホジキンリンパ腫、結腸直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、腫瘍のユーイングファミリー（例えば、ユーイング肉腫）、眼癌、胆嚢癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、毛髪様細胞白血病、ホジキン病、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭および下咽頭癌、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、小児白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、肝癌、肺癌、肺カルシノイド腫瘍、非ホジキンリンパ腫、男性乳癌、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性疾患、鼻腔および副鼻腔癌、鼻咽腔癌、神経芽腫、口腔および中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、陰茎癌、下垂体腫瘍、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、肉腫（成人柔組織癌）、メラノーマ皮膚癌、非メラノーマ皮膚癌、胃癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宮癌（例えば、子宮肉腫）、膣癌、外陰癌、およびワルデンシュトレーム・マクログロブリン血症を含むが、これらに限定されない。癌の一例は、「ＨＥＲ２発現癌」であり得、癌は、抗ＨＥＲ２抗体が癌に結合することができるよう細胞表面に存在するＨＥＲ２受容体タンパク質（Ｓｅｍｂａ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ  （ＵＳＡ）  ８２：６４９７−６５０１  （１９８５）およびＹａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  ３１９：２３０−２３４  （１９８６））（Ｇｅｎｅｂａｎｋ寄託番号Ｘ０３３６３）を有する細胞を含む。
【０１５２】
例えば、悪性腫瘍などの癌において、高ＡＤＣＣ活性を有する抗体は、その細胞傷害効果を通じて癌細胞の増殖を損傷させることによって癌を治療することができる。種々の腫瘍細胞に及ぼす抗体の抗腫瘍効果は、先に説明した方法によって分析することができる。例えば、ＣＤＣ活性測定法、ＡＤＣＣ活性測定法、およびこれら類似のものなどだがこれに限定されないインビトロ試験、ならびにマウスなどの実験動物における腫瘍系を用いた抗腫瘍実験またはこの類似のものなどのインビボ試験を実施してもよい。ＣＤＣ活性およびＡＤＣＣ活性測定並びに抗腫瘍実験は、Ｓｈｉｔａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，  ３６，  ３７３−３８０  （１９９３）；Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ５４，  １５１１−１５１６  （１９９４）、およびこれらの類似のものに説明された方法に従って実施することができる。
【０１５３】
アレルギー反応が、免疫細胞からのメディエーター分子の放出によって典型的に誘発されるアレルギーの治療のために、アレルギー反応は、高ＡＤＣＣ活性を有する抗体を用いて免疫細胞を除去することによって阻害することができる。心血管疾患は、高ＡＤＣＣ活性を有する抗体を用いることによって、治療後の再狭窄における動脈細胞の増殖を阻害することによって予防し治療することができる。ウイルスまたは細菌感染を含む種々の疾患は、高ＡＤＣＣ活性を有する固体を用いてウイルスまたは細菌に感染した細胞の増殖を阻害することによって予防しおよび治療することができる。
【０１５４】
いくつかの実施形態において、グリコシル化パターンＧｌｕ−ＧｌｃＮＡＣ２−Ｍａｎ４（＋／−Ｆｕｃ）を呈する抗体は、修飾されていない親宿主細胞によって産生される対応する抗体と比較して乳癌細胞、卵巣癌細胞、および肺癌細胞を含むがこれらに限定されない種々の癌細胞に対して高いＡＤＣＣ活性を有する。いくつかの実施形態において、グリコシル化パターンＧｌｕ−ＧｌｃＮＡＣ２−Ｍａｎ４（＋／−Ｆｕｃ）を呈する抗体は、修飾されていない親宿主細胞によって産生される対応する抗体と比較して、ＦｃγＲＩＩＩＡ受容体に対する高い結合親和性を有する。Ｇｌｕ−ＧｌｃＮＡＣ２−Ｍａｎ４（＋／−Ｆｕｃ）を呈する抗体は、修飾されていない親宿主細胞によって産生される対応する抗体と類似したインビボでの薬物動態特性を有する。
【０１５５】
本明細書に開示されたＮ連結型グリコシル化パターンを有する対象の抗体は、野生型親宿主細胞によって産生される抗体のものに匹敵する薬物動態特性を呈する。薬物動態特性は、薬剤が身体によってどのように吸収され、分配され、代謝され、および排出されるかに関するパラメータを説明する。薬物動態は、吸収、分配、組織における局在性、生体内変換、および排泄の過程を含む、身体におおける薬剤の経時的な作用に関する研究である。薬物動態パラメータには、薬剤投与の経路、分配容積（Ｖｄ）を含む第一オーダーの動態、薬剤のクリアランス（Ｃｌ）、排出定数（ｋｅｌ）、排出半減期（ｔ１／２）、血清濃度、生物学的利用率、インビボ溶解度、０オーダー排出、投薬計画、肝臓での薬剤クリアランス、薬剤分配、タンパク質結合、およびイオン化の程度を含むが、これらに限定されない。薬物動態は、薬剤の効果の開始、持続時間、および強度を決定する。
【０１５６】
本発明の抗体の治療用製剤は、所望の程度の純度を有する抗体を、任意の生理学的に許容し得る担体、賦形剤、または安定化剤と混合することによって、凍結乾燥した製剤または水溶液の形態で保存のために調製される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ
’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｏｓｏｌ，  Ａ．  Ｅｄ．  （１９８０））。許容し得る担体、賦形剤、または安定化剤は、採用される薬用量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、リン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存料（塩化アンモニウムオクタデシルジメチルベンジル；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む、単糖類、二糖類、または他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；ショ糖、マンニトール、トレハロース、またはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；および／またはＴｗｅｅｎ、プルロニクス（商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。
【０１５７】
また、本明細書の製剤は、治療中の特定の適応症に必要な２つ以上の活性化合物、好ましくは互いに有害な影響をもたらさない相補的な活性を有する活性化合物も含んでもよい。このような分子は、意図される目的に有効な量で組み合わせにおいて適切に存在する。
【０１５８】
また、活性成分は、例えばコアセルベーションによってまたは界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセル、およびポリ（メチルメタクリラート）マイクロカプセルに、コロイド薬剤送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、ミクロエマルション、ナノ粒子、およびナノカプセル）に、またはマクロエマルションに閉じ込めてもよい。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｏｓｏｌ，  Ａ．  Ｅｄ．  （１９８０）に開示されている。
【０１５９】
インビボでの投与に用いられるための製剤は、滅菌済みでなければならない。このことは、滅菌濾過膜による濾過によって容易に達成される。持効性調製物を調製してもよい。持効性調製物の適切な例には、本発明の抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスを含み、マトリックスは、成形された物品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形態である。持効性マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリラート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、Ｌｕｐｒｏｎ  Ｄｅｐｏｔ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドから構成される注射可能なミクロスフェア）などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を含む。エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸などのポリマーが、１００日間を超えて分子の放出を可能にするのに対し、アルヒドロゲルは、タンパク質をより短い期間放出する。封入された抗体が、身体に長い時間残存する場合、抗体は、３７℃で湿気に曝露した結果として変性または凝集し、結果的に生物活性を失い、免疫原性に起こり得る変化を生じる。合理的な戦略は、関与する機序に応じた安定化について考案することができる。例えば、凝集の機序が、チオ−ジスルフィド相互変化を通じての分子間Ｓ−Ｓ結合形成であると発見される場合、安定化は、スルフヒドリル残基を修飾すること、酸性溶液から凍結乾燥させること、湿気含有量を制御すること、適切な添加物を用いること、および具体的なポリマーマトリックス組成物を開発することによって達成してもよい。
【０１６０】
本発明の１Ｅ５細胞によって産生される抗体が、哺乳類、例えば、抗体の投与から恩恵を受け得る、疾患または障害に罹患しているまたはそうなりやすい患者を治療するために用いてもよいことは熟慮される。本発明の抗体を用いて治療することのできる容態は多く、癌（例えば、癌において、本発明の抗体がＨＥＲ２受容体、ＣＤ２０、または血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を結合する）；喘息などのアレルギー容態（抗ＩｇＥ抗体を用いる。）；およびＬＦＡ−１介在性障害（例えば、障害において、本発明の抗体は、抗ＬＦＡ−１または抗ＩＣＡＭ−１抗体である。）などを含む。
【０１６１】
抗体がＨＥＲ２受容体を結合する場合、障害は好ましくは、ＨＥＲ２発現癌、例えば、ＨＥＲ２受容体の過剰発現によって特徴づけられる良性または悪性腫瘍である。このような癌には、乳癌、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、消化管癌、膵癌、膠芽腫、子宮頚癌、卵巣癌、膀胱癌、肝細胞癌、結腸癌、大腸癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、腎癌、肝癌（ｌｉｖｅｒ  ｃａｎｃｅｒ）、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌（ｈｅｐａｔｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、および種々の種類の頭頚部癌を含むが、これらに限定されない。本明細書の教示によると、改善されたまたは低いＡＤＣＣ活性を有する変異体Ｆｃ領域を備えたポリペプチドを調製してもよい。このような分子によって、異なる障害の治療における応用が見出されるであろう。
【０１６２】
例えば、改善されたＡＤＣＣ活性を有する抗体は、組織または外来微生物の破壊または排除が望ましい疾患または障害の治療において採用してもよい。例えば、本発明の抗体を用いて、癌；炎症性障害；感染（例えば、細菌、ウイルス、真菌、または酵母感染）；および組織の除去が望ましい（甲状腺腫などの）他の容態などを治療してもよい。
【０１６３】
抗体が低いＡＤＣＣ活性を有する場合、このような抗体を用いて、長い半減期のＦｃ領域含有ポリペプチドが所望である疾患または障害を治療してもよいが、本発明の抗体は好ましくは、望ましくないエフェクター機能を有さない。例えば、Ｆｃ領域含有ポリペプチドは、抗組織因子（ＴＦ）抗体；抗ＩｇＥ抗体；および抗インテグリン抗体（例えば、抗α４−β７抗体）であってもよい。このようなＦｃ領域含有ポリペプチドの作用の所望の機序は、リガンド−受容体結合対を遮断することであってもよい。その上、低いＡＤＣＣ活性を有するＦｃ領域含有ポリペプチドは、アゴニスト抗体であってもよい。
【０１６４】
本発明の抗体は、非経口、皮下、腹腔内、肺内、および鼻内を含む任意の適切な手段によって、および所望の場合、局所的な免疫抑制治療、病巣内投与のために投与される。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹膜内、または皮下投与を含む。加えて、本発明の抗体は、特に本発明の抗体の用量を低下させながら、パルス注入によって適切に投与される。好ましくは、投薬は、注入によって、最も好ましくは静脈内注射または皮下注射によって、投与が短時間であるか慢性であるかに一部依存して与えられる。
【０１６５】
疾患の予防または治療のために、本発明の抗体の適切な薬用量は、治療されるべき疾患の種類、疾患の重度および経過、本発明の抗体が予防目的に投与されるのかまたは治療目的のために投与されるのか、先行療法、患者の病歴、および本発明の抗体に対する応答、ならびにかかりつけの医師の裁量に依存するであろう。本発明の抗体は、１回でまたは一連の治療にわたって患者に適切に投与される。
【０１６６】
疾患の種類および重度に応じて、本発明の抗体の約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ）が、患者への投与のための初期候補薬用量であり、例えば、１回以上の個別投与によるのかまたは連続的な注入によるのかどうかによる。典型的な１日薬用量は、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であり得、先に述べた因子による。数日間またはそれより長期にわたって反復される投与については、容態に応じて、治療は、疾患症状の所望の抑制が生じるまで持続される。しかしながら、他の薬用量計画は有用であり得る。この治療法の進行は、従来の技術およびアッセイによって容易にモニターされる。
【０１６７】
抗体組成物は、良好な薬務と一致した様式で製剤され、調薬され、および投与されるであろう。本文脈における考慮についての因子には、治療中の特定の障害、治療中の特定の哺乳類、個々の患者の臨床容態、障害の原因、媒介物の送達の部位、投与方法、投与計画、および医療従事者に公知の他の因子を含む。投与されるべき抗体の「治療的有効量」は、このような考慮によって管理されるであろうし、疾患または障害を予防し、寛解させ、または治療するのに必要な最小量である。抗体は、必要性はないものの、問題の障害を予防しまたは治療するのに現に用いられる１つ以上の媒介物とともに任意で製剤される。このような他の媒介物の有効量は、製剤に存在する抗体の両、障害または治療の種類、および先に論議した他の因子による。これらは、一般に、以前に用いられたのと同一の薬用量および投与経路で用いられ、または以前採用された薬用量の約１〜９９％で用いられる。
【０１６８】
いくつかの実施形態において、本発明の抗体および／または宿主細胞を用いて、哺乳類の障害を予防しまたは治療してもよい。哺乳類は、ヒト、非ヒト霊長類、齧歯類、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウサギ、モルモット、またはヤギからなる群から選択される。
【０１６９】
発酵および産生方法
一態様において、本発明は、修飾された糖タンパク質をコードする異種性ポリヌクレオチド配列を提供することと、本明細書に開示された宿主細胞において修飾された糖タンパク質を発現させることとを含む、修飾された糖タンパク質を産生する方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書に開示された宿主細胞を含む培地を包含する。他の実施形態において、本発明はさらに、培地における本発明の複数の宿主細胞を含む培養発酵槽を含む。
【０１７０】
発酵は、しばしば好気性増殖条件下での生化学物質および産業用タンパク質を含む生物学的分子の分解および再構築のための関連する分野で周知の標準的な過程である。本明細書で用いられる発酵槽またはバイオリアクターは、大規模または小規模発酵において、および糖タンパク質、例えば抗生物質を含むがこれに限定されない生物学的マクロ分子の商業的産生において用いられる微生物、例えば本発明の宿主細胞の増殖のための至適条件を維持する装置を指す。
【０１７１】
組換えモノクローナル抗体の産生は、「レパートリークローニング」または「ファージディスプレイ／酵母ディスプレイ」と呼ばれる技術を包含する。組換え抗体工学は、抗体を作製するためのマウスよりもむしろウイルスまたは酵母の使用を包含する。これらの技術は、所望の特異性を有する抗体を選択することのできるわずかに異なるアミノ酸配列を有する抗体のライブラリを作製するための免疫グロブリン遺伝子セグメントの迅速なクローニングによる。これらの技術を用いて、抗体が抗原を認識する特異性、種々の環境条件における抗体の安定性、抗体の治療効能、および抗体の診断応用における検出能を高めることができる。発酵チャンバーを用いて、これらの抗体が大規模で産生されてきた。いくつかの実施形態において、本発明の独特なＮ−グリカンを発現する抗体は、培養発酵槽において産生することができる。
【実施例】
【０１７２】
実施例１：死滅剤の至適濃度の選択
変異体グリコシル化パターンを有する細胞集団を獲得するために、化学物質を細胞に適用して、変異体グリコシル化パターンを有する細胞を選択しもするであろう無作為なゲノム突然変異を生じさせた。化学物質誘発性の無作為な突然変異誘発は、糖の生合成およびフコシル化などのタンパク質のグリコシル化過程を制御しまたは調節する遺伝子の突然変異をもたらすことができる。突然変異誘発後の低フコシル活性を有する安定したクローンは、高フコシル活性を有する細胞が排除されるであろうように、細胞表面のフコシル化タンパク質に結合し毒素を有するＬＣＡを用いて細胞を標的とすることによって、濃縮されおよび単離される（図１および図２参照）。
【０１７３】
ＬＣＡ−ビオチンを添加して、細胞表面に結合させた。次に、ストレプトアビジン−サポリンを培地に添加した。ビオチン−ストレプトアビジン相互作用は、複合体が細胞内へと内部移行し得るよう、サポリンを細胞膜近くへともたらす。いったん細胞内に入ると、サポリンは標的剤から切り離すことができ、リボソームを失活させて、死に至らすことができる。
【０１７４】
ＬＣＡ−ビオチンおよびストレプトアビジン−サポリンの至適濃度を決定するために、高フコシル化活性を有する細胞を効率よく死滅するために、非特異的死滅を減少させて、したがって、結果的に変異体グリコシル化パターンを有する細胞を生じるために、親ＣＨＯ−Ｋ１細胞の死滅に及ぼすＬＣＡ−ビオチンおよびストレプトアビジン−サポリン濃度の異なる組み合わせの効果を実施した。およそ１０μｇ／ｍＬの濃度のＬＣＡ−ビオチンおよびおよそ２μｇ／ｍＬのストレプトアビジン−サポリンは、親ＣＨＯ−Ｋ１細胞の大部分を死滅する至適組み合わせであった（図３）。
【０１７５】
実施例２：変異体グリコシル化パターンを有する細胞株の安定性
２つの化学的変異原であるＩＣＲ１９１およびメタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）を用いて、無作為なゲノム突然変異を導入した。フレームシフト突然変異およびグアニンアルキル化をそれぞれ典型的に生じるＩＣＲ１９１またはＥＭＳを用いて、ＣＨＯ−Ｋ１細胞を処理した。化学物質を１６時間後に洗浄した。細胞を５日間回復させた。生き残っていた細胞を１０μｇ／ｍＬの濃度のＬＣＡ−ビオチンおよび２μｇ／ｍＬのストレプトアビジン−サポリンで４週間選択した。細胞をＦＩＴＣ−ＬＣＡで所定の手順で染色した後、ＦＡＣＳ分析を実施した。選別された細胞を高密度で培養して、細胞の集団を拡張させ、その後のＬＣＡ標識およびＦＡＣＳ選別のために細胞を得た。
【０１７６】
選択によって、ＩＣＲ１９１またはＥＭＳ誘発性突然変異誘発後に低フコシル化集団を徐々に濃縮した（図４）。４週間の選択後、ＬＣＡ−ビオチンおよびストレプトアビジン−サポリンを含まない培地において、細胞を２ヶ月間超増殖させた。獲得した集団は、培地にＬＣＡ−ビオチンおよびストレプトアビジン−サポリンの存在なしで、集団の低フコシル化状態を維持した（図４Ａ）。産生株として安定した細胞クローンを得るために、限界希釈を用いて、９６ウェルプレートに細胞を播種し、ＬＣＡ−ビオチンおよびストレプトアビジン−サポリンを含まない培地において単一のクローンを拡張した。細胞のフコシル化状態をＦＡＣｓ分析によって毎週３ヶ月間超モニターした。これらの得られたクローンは、非常に安定した低フコシル化を長期間示し、これらのクローンは、親細胞に匹敵する細胞増殖速度を有していた。クローンのうちの１つにおける低フコシル化状態の安定性を図５に示す。これらの結果は、本無作為突然変異誘発および選択戦略が、低フコシル化細胞を特異的に濃縮することを示す。
【０１７７】
実施例３：変異体グリコシル化パターンを有する細胞株のグリコシル化特性
低フコシル化細胞クローンは、修飾されていない細胞株または親細胞株と比較して変化したグリコシル化パターンの独特かつ一貫した特性を有する。この特性は、Ｎ−アセチルグルコサミン、α連結型マンノースを認識するコンカナバリンＡ（Ｃｏｎ  Ａ）、およびα連結型またはβ連結型Ｎ−アセチルグルコサミン残基に結合するグリフォニア（バンデイラエア）シンプリシフォリアレクチンＩＩ（ＧＳ−ＩＩ）を用いて親細胞および低フコシル化クローンを染色することによって確立した。標識された細胞をＦＡＣＳによって分析した。また、低フコシル化クローンは、ＷＧＡに対する低い結合親和性を有し、これらのクローンは、低レベルのＮ−アセチルグルコサミンを有することを示唆する（図６）。対照的に、これらのクローンのＣｏｎ  ＡおよびＧＳ−ＩＩへの結合は、対照の結合よりも有意に高く、これらのクローンが、非常により高い含有量のα連結型マンノースおよびα連結型またはβ連結型Ｎ−アセチルグルコサミンを有することを示す（図６）。また、グリコシル化パターンのこの独特な特性の安定性も試験した。これらのクローンは、ＬＣＡ−ビオチン非含有培地において増殖させた場合、同一の特性を８週間超維持した（図５）。ＣＨＯ−Ｋ１突然変異クローンは、懸濁液における無血清培地において増殖し、同様のＮ−グリカン特性を有した（図７）。
【０１７８】
実施例４：抗体のグリコシル化特性
変異体グリコシル化パターンを有する細胞株において発現した抗体は、低フコース内容を有する。また、抗体は、図９Ｂに示される変異体グリコシル化パターンも有する。変異体グリコシル化パターンを呈する突然変異体ＣＨＯ−Ｋ１クローン１Ｅ５において、ヒト化抗ＥｒｂＢ２抗体ＥＴ１０１を発現させた。１Ｅ５変異体クローンは、無血清懸濁液において増殖し、修飾されていない宿主細胞と比較して、１，６−フクソチルトランスフェラーゼ（１，６−ｆｕｃｓｏｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）（Ｆｕｔ８）の類似のレベルの遺伝子産物を有していた（図８）。細胞から単離した全ＲＮＡを単離することによって、転写産物レベルを決定した。転写産物をｃＤＮＡへと逆転写し、Ｆｕｔ８転写産物をＲＴ−ＰＣＲによって増幅した。アガロースゲルにおける電気泳動によってＰＣＲ産物を分離し、アクチンのレベルをロード対照として用いた。
【０１７９】
突然変異体クローン１Ｅ５の培養上清から、抗体を得た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシーブルー染色によって抗体の発現を決定した（図９Ａ）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて泳動した一定分量の試料をニトロセルロースメンブレンに転移し、Ｎ−アセチルグルコサミンに（α−１，６）連結したフコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、α連結型マンノース、およびα連結型またはβ連結型アセチルグルコサミンにそれぞれ優先的に結合するビオチン化ＬＣＡ、ＷＧＡ、ＣｏｎＡ、およびＧＳ−ＩＩを用いてブロットした。同一の抗体は、図９Ｂにおいて「ＣＨＯ」として示すように、対照として親ＣＨＯ−Ｋ１細胞において発現した。
【０１８０】
本結果は、クローン１Ｅ５によって産生された抗体が、対照と比較してＬＣＡ、ＷＧＡ、ＧＳＩＩに対する有意に低い結合親和性およびＣｏｎＡに対する高い結合親和性を有する変異体グリコシル化パターンを有するよう修飾されたことを示す（図９Ｂ）結果は、抗体のフコース内容が劇的に低下したことを示す。
【０１８１】
また、異なるＣＨＯ株によって産生された抗体ＥＴ１０１およびＥＴ２０１の単糖類特性も図１０Ａ、Ｂに示すように決定した。抗体ＥＴ１０１またはＥＴ２０１は、親ＣＨＯ細胞、突然変異体ＣＨＯ−１Ｅ５クローン、突然変異体ＣＨＯ−３Ｆクローン、または突然変異体ＣＨＯ−２．６クローンにおいて産生された。ＣＨＯクローンはすべて、懸濁液において培養される無血清培地において増殖するのに適していた。単糖類は、４Ｍトリフルオロ酢酸とともに１００℃で２時間加熱することによって、１ｍｇの抗体ＥＴ１０１およびＥＴ２０１から放出された。次に、単糖類を真空下で乾燥させ、水で再構成した。ＤＸ−ＩＳＣ−３０００システム（ＤＩＯＮＥＸ，  Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，  ＣＡ）を用いる高性能イオン交換クロマトグラフィーによって、単糖類を分析した。ＣａｒｂｏＰａｃ−ＰＡ−１カラム（ＤＩＯＮＥＸ，  Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，  ＣＡ）を用いて、０．８ｍＬ／分の流速、３５℃で単糖を分離した。試料の注入後、単糖類を１８ｍＭ  ＮａＯＨで２０分間分離し、２００ｍＭ  ＮａＯＨによる１０分間の溶出によってカラムを再生した。カラムを１８ｍＭ  ＮａＯＨで３０分間保持した後、次の注入を行った。親ＣＨＯおよび変異体クローンによって産生されるＥＴ１０１における単糖類の定量を図１０Ａに示す。親ＣＨＯ細胞および変異体クローンによって産生されるヒトＩｇＧ１（ＥＴ１０１およびＥＴ２０１）の単糖組成を図１０Ｂに示しており、親細胞において産生されるものと比較して、変異体クローンにおいて産生されたガラクトースレベルの低下およびグルコースレベルの増加を示す。
【０１８２】
Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｇｅｎｇ．  ８７：６１４−６２２  （２００４）において開示されたＦｕ８−／−ノックアウトＣＨＯ細胞によって産生されるヒトＩｇＧ１の単糖組成分析を図１０Ｃに示し、図１０Ｃは、ガラクトースレベルおよびグルコースレベルが、野生型細胞とＦｕｔ８−／−ノックアウトＣＨＯ細胞の間で比較的一定であることを示す。
【０１８３】
実施例５：高いＡＤＣＣ活性を有する抗体
変異体グリコシル化パターンを有する突然変異体クローンにおいて、ヒト化抗ＥｒｂＢ２抗体を発現させ、親細胞において産生された抗体と比較して、細胞株によって合成されたＥｒｂＢ２遮断抗体が高いＡＤＣＣ活性を有することを示した。高いＡＤＣＣ活性を示すために、Ａ５４９、ＳＫＢＲ３、ＳＫＯＶ３、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１、およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の抗体介在性溶解を評価して、細胞傷害の効率を比較した。標的細胞を、クローン１Ｅ５、２．６、または３Ｆから産生されたＥｒｂＢ２遮断抗体（ＥＴ１０１またはＥＴ２０２１）とともにプレインキュベートして、抗体をその標的と結合させた。次に、ヒトＰＢＭＣを標的細胞とともにインキュベートした。図１１Ｂ、１２、１３、および１４において示されるように、対照抗体は、期待されるように細胞の溶解を誘導することができ、変異体グリコシル化パターン化した細胞によって産生される抗体は細胞溶解を有意に高め、このことは、ＡＤＣＣ効率が、変異体グリコシル化パターン化した細胞株の産生する抗体によって高められることを示した。
【０１８４】
図１１Ａに示すように、１０％ＦＢＳを含む１ｍＬの培養上清から発現した抗体ＥＴ１０１を、プロテインＬビーズによって沈殿させ、還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、クマシーブルーを用いて染色した。空の増殖培地をネガティブコントロールとして用いた。突然変異体異クローンにおいて発現したＥＴ１０１抗体を、１０％ＦＢＳを含む培養上清からプロテインＬクロマトグラフィーによって精製し、ＵＶ２８０によって定量した。親ＥＴ１０１を野生型ＣＨＯにおいて発現させ、同一の方法で精製した。同様の方法を用いてＥＴ２０１を得た。
【０１８５】
図１１Ｂ、１２、１３、および１４において示されるＡＤＣＣアッセイについて、突然変異体クローンにおいて発現したＥＴ１０１またはＥＴ２０１抗体を、培養上清からプロテインＡクロマトグラフィーによって精製し、ＵＶ２８０によって定量した。親ＥＴ１０１またはＥＴ２０１を野生型ＣＨＯにおいて発現させ、同一の方法のように精製した。１００μＬの標的細胞懸濁液を５０μＬの発現したＥｒｂＢ２遮断抗体ＥＴ１０１とともに９６ウェルプレートにおいて３７℃で３０分間プレインキュベートした。次に、５０μＬのＰＢＭＣを２０：１のエフェクター／標的細胞比で添加した。１６時間のインキュベーション後、プレートを遠心沈殿させ、５０μＬの無細胞上清を新たなプレートに移した。放出された乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）をＣｙｔｏＴｏｘ９６非放射性細胞傷害アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）によって測定した。細胞溶解を、式（Ｅ−Ｓ）／（Ｍ−Ｓ）（Ｅ：実験による放出、Ｓ：自発的放出、Ｍ：最大放出）によって算出した。ＰＢＳまたは非特異的抗体をネガティブコントロールとして用いた。
【０１８６】
実施例６：抗体は細胞増殖を阻害する
ＥｒｂＢ２を過剰発現している乳癌細胞株ＳＫＢＲ３をリアルタイム増殖アッセイのための９６ウェルプレートにおいて、またはコロニー形成アッセイのための低密度での２４ウェルプレートにおいて播種する。細胞を一晩結合させた後、種々の濃度の抗体、対照物、または変異体グリコシル化パターンを有する細胞クローンから産生された種々の抗体を培地に添加し、細胞増殖に及ぼすこれらの阻害を試験した。変異体グリコシル化パターンを有する細胞クローンから産生されたＥｒｂＢ２遮断抗体は、対照抗体（親細胞によって産生された抗体）に匹敵するまたはそれよりも大きな程度まで細胞増殖を阻害する。細胞増殖の阻害は、コロニー形成アッセイ、リアルタイム増殖アッセイ、または当該技術分野で公知の他の方法などの方法によって確認される。
【０１８７】
実施例７：Ｎ−グリカンの組成および構造の決定
Ｎ−グリカンの単糖類の成分を決定するために、ＣＨＩ−１Ｅ５細胞の産生した抗体および無血清懸濁液における親宿主細胞によって産生された抗体を、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で加水分解した。精製した抗体（１００μｇ）をトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）と混合して４ＭのＴＦＡの終濃度にした。混合物を２時間沸騰させ、溶液を真空下で乾燥させた。ペレットを２００μＬの脱イオン水に溶解した。１００μＬの再懸濁した試料をＰＡ１カラムに注入して、単糖類の組成をＤｉｏｎｅｘ  ＩＣＳ−３０００システム（Ｄｉｏｎｅｘ，  Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，  ＣＡ）によって分析した。図１６に示すように、ＣＨＯ−１Ｅ５によって合成されたＮ−グリカンは、野生型親宿主細胞によって産生されたＮ−グリカンと比較して、ガラクトースを欠失し、低いフコースおよびＮ−アセチルグルコサミンを有し、グルコース分子を有している。
【０１８８】
本発明のＮ−グリカンの組成をさらに確立するために、Ｎ−グリカンを、ＣＨＯ−１Ｅ５およびその親宿主細胞によって産生した抗体からＰＮＧａｓｅ  Ｆ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｉｐｓｗｉｃｈ，  ＭＡ）によって切断した。２００μｇの抗体をＰＮＧａｓｅ  Ｆを用いて３７℃で７２時間消化することによって、Ｎ−グリカンを放出した。タンパク質を７０％エタノールによって−２０℃で一晩沈殿させ、遠心分離によって除去した。上清を真空下で乾燥させ、２００μＬの脱イオン水に再懸濁した。Ｃ１８（Ｗａｔｅｒｓ，  Ｍｉｌｆｏｒｄ，  ＭＡ）、ＡＧ５０ＷＸ８、およびＡＧ４ｘ４（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）を充填したミクロカラムに試料をロードした。次に、カラムを３００μＬの脱イオン水で洗浄した。通過画分を回収し、真空下で乾燥させた後、Ｎ−グリカンを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分光計を用いてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳについて分析した。ｍ／ｚ値は、ナトリウムと会合したオリゴ糖イオンに相当する。各ピークは、［Ｍ＋Ｎａ］＋に相当する。２つのピークを、親細胞によって産生される抗体に由来するＮ−グリカンにおいて観察し、これは、Ｇ１（Ｇａｌ１−Ｆｕｃ１−ＧｌｃＮＡＣ４−Ｍａｎ３）およびＧ０（Ｆｕｃ１−ＧｌｃＮＡＣ４−Ｍａｎ３）Ｎ−グリカンの質量に相当する（図１７）。対照的に、ＣＨＯ−１Ｅ５細胞によって合成された抗体に由来するＮ−グリカンにおいて、１２５７．４の質量を有する単一のピークがある（図１７）。単糖類の組成との組み合わせ（図１６）で、ＣＨＯ−１Ｅ５によって合成されたＮ−グリカンの分子組成は、Ｇｌｕ−ＧｌｃＮＡＣ２−Ｍａｎ４（＋／−Ｆｕｃ）であると決定された。
【０１８９】
ＣＨＯ−１Ｅ５によって合成されたＮ−グリカンの単一の集団を、オリゴ糖分析によってさらに決定した。Ｎ−グリカンを抗体から放出し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析のために精製した。簡潔には、２００μｇの抗体をＰＮＧａｓｅを用いて３７℃で７２時間消化することによって、Ｎ−グリカンを放出した。タンパク質を７０％エタノールによって−２０℃で一晩沈殿させ、遠心分離によって除去した。上清を真空下で乾燥させ、２００μＬの脱イオン水に再懸濁した。Ｃ１８、ＡＧ５０ＷＸ８、およびＡＧ４ｘ４を充填したミクロカラムに試料をロードした。次に、カラムを３００μＬの脱イオン水で洗浄した。通過画分を回収し、オリゴ糖をＰＡ２００カラムに注入した。Ｄｉｏｎｅｘ  ＩＣＳ−３０００システムによって分析した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析による知見と一致して、ＣＨＯ−１Ｅ５によって産生される抗体に由来するオリゴ糖は、親宿主細胞によって産生されるオリゴ糖の異種性特性とは異なる単一ピークおよび実質的に均質な集団として存在する（図１８）。
【０１９０】
ＣＨＯ−１Ｅ５によって合成されたＮ−グリカンの単糖類の組成および分子量を基にして、Ｎ−グリカンの６個の考えられ得る構造を推定した（図１９Ａおよび図１９Ｂ）。ＣＨＯ−１Ｅ５によって合成されたＮ−グリカンの構造をさらに決定するために、異なるマンノシダーゼを用いて、抗体におけるＮ−グリカンを消化し、放出された単糖をＰＡ１カラム／Ｄｉｏｎｅｘ  ＩＣＳ−３０００システムによって分析し、α１，２マンノシダーゼ（Ｐｒｏｚｙｍｅ，  Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，  ＣＡ）を用いて、ＣＨＯ−１Ｅ５および親細胞によって合成されたＮ−グリカンを切断して、マンノース間にα１，２結合があるかどうかを決定した。α１，２マンノース結合が、野生型ＣＨＯ細胞によって産生されたＮ−グリカンに存在しないことは十分に確立されている。抗体がα１，２マンノシダーゼで消化された後に抗体からのサッカリドの放出はなく、このことは、ＣＨＯ−１Ｅ５によって合成されたＮ−グリカンに存在するα１，２マンノース結合がないことを示した。ポジティブコントロールを用いて酵素活性を確認した（オリゴマンノース９、Ｐｒｏｚｙｍｅ，  Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，  ＣＡ）。次に、別の酵素α１，２，３マンノシダーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｉｐｓｗｉｃｈ，  ＭＡ）を用いて抗体からＮ−グリカンを切断し、放出されたサッカリドの特性を分析した。野生型ＣＨＯ細胞によって合成されたＮ−グリカンの伝統的な構造に基づいて、α１，３−マンノース結合の唯一の切断部位があり、この酵素が、二糖または三糖を放出することができたと推論された（Ｆｉｇ．２０Ａ）。ＣＨＯ−１Ｅ５および親宿主細胞によって合成された抗体（ＥＴ１０１）をα１−２，３マンノシダーゼとともに３７℃で２４時間インキュベートした。抗体および酵素を除去するために、消化した抗体溶液をまずＭｉｃｒｏＣｏｎ  ＹＭ１０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，  Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，  ＭＡ）に、次にＭｉｃｒｏＣｏｎ  ＹＭ１００（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，  Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，  ＭＡ）に通過させた。ＰＡ１カラム／Ｄｉｏｎｅｘ  ＩＣＳ−３０００システムによって試料を分析した。図２０Ｂおよび図２０Ｃに示すように、単糖は、１８ｍＭ  ＮａＯＨによって溶出されず、９０ｍＭ  ＮａＯＨによって溶出される場合、二糖（ショ糖）の溶出時間に相当するピークが現れた。ＣＨＯ−１Ｅ５によって産生される抗体におけるＮ−グリカンを、α１−２，３マンノシダーゼによって消化した場合、マンノースは１８ｍＭ  ＮａＯＨによって溶出され、二糖は９０ｍＭ  ＮａＯＨによって溶出された（図６Ｄおよび図６Ｅ）。α１，２マンノース結合の欠失および、ＣＨＯ−１Ｅ５により産生され抗体から放出されたサッカリドのα１，２，３マンノシダーゼによる特性は、α１，２，３マンノシダーゼによる消化の特性と符合する２つの構造を示唆している（図２０ＦおよびＧ）。
【０１９１】
実施例８：Ｎ−グリカンは、抗体の構築に影響しない
糖グリコシル化の変化が、タンパク質の折りたたみおよび機能的構築に影響し得るので、抗体をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動において分離することによって、この問題に取り組んだ。親宿主細胞およびＣＨＯ−１Ｅ５によって産生される精製された抗体を、還元条件下および非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動に供し、クマシーブルーを用いて染色した。図２１に示すように、単量体（軽鎖および重鎖）およびＣＨＯ−１Ｅ５によって合成された抗体全体の泳動は、還元条件下および非還元条件下で親宿主細胞によって産生された抗体と同一であり、このことは、ＣＨＯ−１Ｅ５細胞によって産生されたＮ−グリカンが、産生された抗体の機能的構築に干渉しないことを示唆する。
【０１９２】
実施例９：高いＡＤＣＣ活性およびＦｃγＲＩＩＩａに対するより高い結合親和性を有する抗体
本発明のＮ−グリカンを用いた抗体の修飾が、ＡＤＣＣ活性などのその生物学的機能を改善するかどうかを決定するために、ＥｒｂＢ２およびＥＧＦＲを標的とする２つの精製された抗体を用いて、これらのインビトロでのＡＤＣＣ活性を試験した（それぞれＥＴ１０１およびＥＴ２０１）。ＥＴ１０１抗体は、ＥｒｂＢ２を遮断するＩｇＧ１である。ＣＨＯ−１Ｅ５細胞によって産生されたＥＴ１０１を、培養上清からプロテインＡクロマトグラフィーによって精製し；およびＵＶ２８０によって定量した。修飾されていない親ＥＴ１０１を、野生型ＣＨＯ細胞において発現させ、同一の方法で精製した。ＡＤＣＣアッセイのために、１００μＬの標的細胞懸濁液を５０μＬの発現したＥｒｂＢ２遮断抗体ＥＴ１０１とともに９６ウェルプレートにおいて３７℃で３０分間プレインキュベートした。１６時間のインキュベーションの後、プレートを遠心沈殿させ、５０μＬの無細胞上清を新たなプレートに移した。放出されたＬＤＨを、ＣｙｔｏＴｏｘ９６非放射性細胞傷害アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）によって測定した。細胞溶解を式（Ｅ−Ｓ）／（Ｍ−Ｓ）（Ｅ：実験による放出：Ｓ：自発的放出、Ｍ：最大放出）によって算出した。ＰＢＳまたは非特異的抗体をネガティブコントロールとして用いた。卵巣癌細胞株（ＳＫＯＶ３）および乳癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）に対する無血清培地におけるＣＨＯ−１Ｅ５細胞クローンによって産生されたＮ−グリカンを呈するＥＴ１０１のＡＤＣＣ活性は、親ＣＨＯ細胞によって産生される修飾されていないＥＴ１０１のＡＤＣＣ活性と比較して有意に高かった（図２２Ａ）。
【０１９３】
ＥＴ２０１は、抗ＥＧＦＲ抗体である。ＣＨＯ−１Ｅ５細胞において発現したＥＴ２０１を、培養上清からプロテインＡクロマトグラフィーによって精製し、ＵＶ２８０によって定量した。図８Ａにおいて説明されるのと同一の方法を用いて、ＡＤＣＣアッセイを実施した。肺癌細胞株（Ａ５４９）に対する無血清培地におけるＣＨＯ−１Ｅ５細胞クローンによって産生されたＮ−グリカンを呈するＥＴ２０１のＡＤＣＣ活性は、親ＣＨＯ細胞によって産生された修飾されていないＥＴ１０１のＡＤＣＣ活性と比較して高かった（図２２Ｂ）。
【０１９４】
本発明のＮ−グリカンがＡＤＣＣ活性をどのように改善するのかをさらに同定するために、組換えＦｃγＲＩａおよびＦｃγＲＩＩＩａ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，  ＭＮ）およびＦｏｒｔｅＢｉｏシステム（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，  Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，  ＣＡ）を用いて、これら２つのＦｃ受容体に対する抗体の結合親和性を測定した。抗体をまずビオチン化し、ストレプトアビジンで被覆したバイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，  Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，  ＣＡ）にロードした。組換えＦｃγＲＩおよびＦｃγＲＩＩＩｂタンパク質を１００〜４００ｎＭの濃度で懸濁した（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，  ＭＮ）。結合親和性（ＫＤ、ｎＭ）をＦｏｒｔｅＢｉｏの標準的な動力学プロトコールに従って評価した。ＣＨＯ−１Ｅ５細胞によって産生された抗体は、親ＣＨＯ細胞によって産生された抗体と比較して、ＦｃγＲＩＩＩａに対する高い結合親和性を有していたが、ＦｃγＲＩａに対する結合においては有意差がなかった（図２３）。これらの結果は、本明細書に説明された組成および構造を有するＮ−グリカンによるタンパク質のグリコシル化が、ＦｃγＲＩＩＩａに対する改善された結合親和性および高いＡＤＣＣ活性を抗体に与えることを示す。
【０１９５】
実施例１０：Ｎ−グリカンを呈する抗体の薬物動態
ＣＨＯ−１Ｅ５細胞によって合成されるＮ−グリカンによるグリコシル化が、インビボでの抗体の薬物動態に影響を及ぼすことができるかどうかを決定するために、親宿主細胞によってまたはＣＨＯ−１Ｅ５細胞によってのいずれかで産生される抗体を、各抗体につき３個体の１３週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスに尾静脈を通じて１０ｍｇ／ｋｇで注射した。５０μＬの血液を５分、１時間、６時間、７２時間、および１２０時間で採取した。抗体の血清濃度を注射１、６、７２、および１２０時間後にモニターした。血清における抗体濃度をＯＣＴＥＴ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，  Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，  ＣＡ）によって測定した。５分の時の抗体濃度を１００％として考えた。ＣＨＯ−１Ｅ５によって産生された抗体の薬物動態は、親宿主細胞によって産生された抗体の薬物動態に匹敵し（図２４）、このことは、本発明のＮ−グリカンが、抗体のインビボでの薬物動態に影響されないことを示す。
【０１９６】
実施例１１：ＣＨＯ−１Ｅ５によって産生されるオリゴ糖のさらなる構造分析
１Ｅ５細胞によって合成されたＮ−グリカンの構造をさらに実証するために、ＰＮＧａｓｅ  Ｆによって放出された高品質のＮ−グリカンを大量に精製し、精製されたＮ−グリカンおよびポジティブコントロール（オリギマンノース（Ｏｌｉｇｉｍａｎｎｏｓｅ）９，  Ｇｌｙｋｏ，  Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，  ＣＡ）をα１，２，３マンノシダーゼまたはα１，２，３，６マンノシダーゼで消化し、消化産物をＰＡ１カラムおよびＤｉｏｎｅｘ  ＩＣＳ−３０００システム（Ｄｉｏｎｅｘ，  Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，  ＣＡ）によって分析した。
【０１９７】
１Ｅ５（ＡおよびＣ）によって合成された抗体（ＥＴ１０１）およびポジティブコントロールＮ−グリカン（バンドＤ）（オリゴマンノース９，  Ｇｌｙｋｏ，  Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，  ＣＡ）を、α１，２，３マンノシダーゼ（ＡおよびＢ）またはα１，２，３，６マンノシダーゼ（ＣおよびＤ）とともに３７℃で２４時間インキュベートした。抗体および酵素を除去するために、消化した抗体溶液をまず、Ｃ１８、ＡＧ５０ＷＸ８、およびＡＧ４ｘ４を充填したミクロカラムに通過させた。次に、カラムを３００μＬの脱イオン水で洗浄した。通過画分を回収し、真空下で乾燥させ、ＰＡ１カラム／Ｄｉｏｎｅｘ  ＩＣＳ−３０００システムによって分析した。
【０１９８】
消化産物を１８ｍＭ  ＮａＯＨによって溶出すると、２つのピークを観察した。１つのピークは、マンノース標準物質の溶出時間に相当する１７分であった。別のものは、二糖標準物質に類似している２４分であった（図２５Ａ）。α１，２，３マンノシダーゼによる消化パターンは、２つの構造、すなわち、本明細書で開示された式１および式２の予想と一致し、マンノースが、α１，２，３マンノシダーゼ消化によって放出されると予測し得なかったので、他の推定構造の可能性を除外する。α１，２，３マンノシダーゼによるオリゴマンノース９の産物は、予想と一致していた（図２５Ｂ）。α１，２，３，６マンノシダーゼによって消化される場合、マンノース、二糖、および三糖の標準物質に相当する３つのピークを１８ｍＭ  ＮａＯＨにより溶出した（図２５Ｃ）。また、α１，２，３，６マンノシダーゼによる消化パターンも、構造式１および構造式２の予想と一致した（図２５Ｃ）。これらのデータは、構造式１および構造式２が、１Ｅ５細胞によって合成されたＮ−グリカンの２つの最終候補構造であることをさらに確立する。これら２つの構造を識別する利用可能な方法は今のところない。
【０１９９】
実施例１２：低親和性ＦｃγＲＩＩＩａ  １５８Ｆ／Ｆを発現する細胞に対する高いＡＤＣＣ
ヒトＦＣγＲＩＩＩａは、アミノ酸１５８における多型を有する。アミノ酸１５８が、２つの対立遺伝子においてバリンである場合、ＦＣγＲＩＩＩａは、ＩｇＧのＦｃ断片に対して高い親和性を有する（ＦＣγＲＩＩＩａ  １５８Ｖ／Ｖと命名）。アミノ酸１５８においてフェニルアラニン担体である場合、ＩｇＧのＦｃ断片に対するＦＣγＲＩＩＩａの結合親和性は低い（ＦＣγＲＩＩＩａ  １５８Ｆ／Ｆまたは１５８Ｆ／Ｖ）。ＡＤＣＣ活性は、Ｆｃ断片によるＦＣγＲＩＩＩａ結合親和性と正の相関関係にある。ＡＤＣＣアッセイにおいて用いられるＰＢＭＣのＦＣγＲＩＩＩａの多型を、先に示すように遺伝子型同定した。
【０２００】
ＡＤＣＣアッセイについて、１００μＬの標的細胞懸濁液を５０μＬの発現したＥｒｂＢ２遮断抗体ＥＴ１０１とともに９６ウェルプレートにおいて３７℃で３０分間プレインキュベートした。次に、５０μＬのＰＢＭＣを２０：１のエフェクター／標的細胞比で添加した。１６時間のインキュベーション後、プレートを遠心沈殿させ、５０μＬの無細胞上清を新たなプレートに移した。放出されたＬＤＨをＣｙｔｏＴｏｘ９６非放射性細胞傷害アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）によって測定した。細胞溶解を式（Ｅ−Ｓ）／（Ｍ−Ｓ）（Ｅ：実験による放出、Ｓ：自発的放出、Ｍ：最大放出）によって算出した。ＰＢＳまたは非特異的抗体をネガティブコントロールとして用いた。これらのアッセイに用いたＰＭＢＣからゲノムＤＮＡを単離した。ＦｃγＲＩＩＩａの多型を遺伝子同定するＰＣＲアッセイは、当該技術分野で標準的なプロトコールに従っている。ＡＤＣＣ活性を卵巣癌細胞株（ＳＫＩＶ３）および乳癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）に対して測定した。高親和性ＦＣγＲＩＩＩａ  １５８Ｖ／Ｖまたは低親和性ＦＣγＲＩＩＩａ  １５８Ｆ／Ｆのいずれかを発現することなる遺伝子背景のＰＢＭＣをエフェクター細胞として用いる場合、ＣＨＯ−１Ｅ５細胞によって産生された独特なＮ−グリカンを発現する抗体は、ＡＤＣＣ活性を等しく効率的に高めることが認められた（図２６Ａおよび図２６Ｂ）。ＣＨＯ−１Ｅ５細胞によって産生されたＥＴ１０１抗体は、低親和性ＦＣγＲＩＩＩａ  １５８Ｆ／Ｆに等しく十分に結合し、強いＡＤＣＣ応答を誘発した。
【０２０１】
実施例１３：ＩＥ５細胞によって産生される抗体は、親抗体と比較してＦｃγＲＩＩＩａに対するより高い結合親和性およびＦＣγＲＩＩｂに対するより低い結合親和性を呈する
ＡＤＣＣは、細胞表面抗原を標的とする特異的な抗体がまず細胞に結合し、次に、抗体のＦｃ断片が、ナチュラルキラー細胞および単球などのエフェクター細胞を標的細胞へと、エフェクター細胞の細胞表面に発現したＦｃ受容体に対するＦｃ結合を通じて動員する過程である。エフェクター細胞によって標的細胞を死滅するために、動員によって標的およびエフェクター細胞を接近させる。Ｆｃ受容体は、Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩの３種類からなる。ＦＣγＲＩａ、ＦＣγＲＩＩａ、およびＦＣγＲＩＩＩａは、活性化された場合にＡＤＣＣを介在し高める活性化受容体である。ＦＣγＲＩＩｂは、活性化された場合、ＡＤＣＣを遮断する阻害性受容体である。そのため、ＦＣγＩａ、ＦＣγＲＩＩａ、またはＦＣγＲＩＩＩａに対する高親和性を有する抗体は、高いＡＤＣＣ活性を有する。しかしながら、ＦＣγＲＩＩｂに対する親和性を有する抗体は、ＡＤＣＣ活性を阻害し得、その逆もまた同じであり得る（図２７）。
【０２０２】
ＩＥ５細胞によって産生された抗体によるこの高いＡＤＣＣ活性の機序を決定するために、ＦＣγＲに対する抗体の結合親和性を評価した。ヒト全長ＦｃγＲＩＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩｂを発現ベクターへとクローニングし、ＣＨＯ−Ｋ１細胞において安定して発現させた。２０ｍＭ  ＥＤＴＡ含有ＰＢＳによって組織培養皿から細胞を放出し、単一の細胞へと分けた。細胞を、５％ＦＢＳを有するＰＢＳにおける１０μｇ／ｍＬのビオチン化抗体とともに、氷上で３０分間インキュベートした。ＰＢＳによる３回の洗浄後、細胞をＦＩＴＣ抱合型ストレプトアビジンとともにインキュベートし、ＦＡＣＳによって分析し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を獲得した。（１０μｇ／ｍＬにおける）阻害性ＦｃγＲＩＩｂ（Ａ）および活性化ＦｃγＲＩＩＩＡ（Ｂ）との抗体結合親和性、ならびに機序スキームを図２７に示す。
【０２０３】
細胞表面にＦＣγＲＩＩｂおよびＦＣγＲＩＩＩａ  １５（Ｖ／Ｖ型−高親和性）を含むヒトＦｃγ受容体を安定して過剰発現したＣＨＯ−Ｋ１細胞株を確立した。ＦＡＣＳアプローチを用いることによって、親ＣＨＯ細胞および１Ｅ５細胞によって産生された抗体とこれらのＦｃγ受容体との結合親和性を、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を定量することによって測定した。１Ｅ５細胞によって産生された抗体は、親ＣＨＯ細胞によって産生された抗体と比較した場合、阻害性受容体ＦＣγＲＩＩｂとの有意に低い結合親和性を有することが認められ（図２７Ａおよび図２８）、阻害性受容体が、ＣＨＯ−１Ｅ５細胞によって産生された抗体によって非常に低く活性化されることを示唆する。さらにその上、１Ｅ５細胞によって産生された抗体は、親ＣＨＯ細胞によって産生された抗体としてのＩｇＧ（ＦｃＲＮ）に匹敵する、ＦＣγＲＩおよび新生仔Ｆｃ受容体に対する結合親和性を有した（図２８）。これらの結果は、１Ｅ５により産生された後退による高いＡＤＣＣ活性が、活性化ＦＣγＲＩＩＩａの高い活性化および阻害性ＦＣγＲの低い活性化によって介在されるという機序を示唆する。
【０２０４】
実施例１４：ＣＨＯ−１Ｅ５細胞によって産生される抗体の免疫原性
修飾されていない親ＣＨＯ細胞によって産生される抗体のＡＤＣＣ活性と比較して高いＡＤＣＣ活性を呈するＣＨＯ−１Ｅ５細胞によって産生される抗体の免疫原性を評価するために、対象の抗体のインビボでの免疫原性を、霊長類における対象抗体に対して特異的な抗体の力価を測定することによって評価する。具体的には、体重４〜６キログラム（ｋｇ）の３〜５歳の雌カニクイザルは、野生型ＣＨＯ細胞によって産生された抗Ｈｅｒ２抗体ＥＴ１０１、またはＣＨＯ−１Ｅ５細胞によって産生されたＥＴ１０１を、８ｍｇ／ｍＬ／体重ｋｇの用量で受ける。各群２個体であり、０．５ｍＬの血液を抗体注射の７日前、および抗体注射の３、５、７、１４、２１、２８、３５日後に採取した。血清試料を単離し、−８０℃で凍結した（図２９Ａ）。ＥＬＩＳＡを用いて、カニクイザルにおけるＥＴ１０１−ＣＨＯ−１Ｅ５抗体の免疫原性を決定した。本アッセイは、投与したＥＴ−１０１抗体に特異的なサル血清におけるＩｇＭの存在を検出した。ＥＬＩＳＡプレートをＥＴ１０１−ＣＨＯまたはＥＴ１０１−ＣＨＯ−１Ｅ５抗体で被覆する。単離された異なる希釈のサル血清試料を、被覆したプレートに適用して、被覆したＥＴ−１０１−ＣＨＯまたはＥＴ−１０１−ＣＨＯ−１Ｅ５抗体に結合させる。結合したＩｇＭを抗ＩｇＭ二次抗体で検出する（図２９Ｂ）。ＥＬＩＳＡの結果は、ＥＴ１０１−ＣＨＯおよびＥＴ−１０１−ＣＨＯ−１Ｅ５抗体の間で免疫原性に有意差を示さない（すなわち、サル血清におけるＥＴ１０１特異的ＩｇＭレベル）。本実施例は、ＣＨＯ−１Ｅ５クローンによって産生された抗体が、野生型ＣＨＯ細胞によって産生された抗体よりも高い免疫原性を誘発しないことを示す。
【０２０５】
本開示は、先に説明した実施形態に限定されるのではなくて、下記の特許請求の範囲内で変更することができる。当業者は、所定の実験だけを用いて、本明細書に説明される本開示の具体的な実施形態の多くの等価物を認識するであろうし、または確認することができるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６ａ】
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【図２６ｂ】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【国際調査報告】
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