【手続補正書】
【提出日】平成21年4月22日(2009.4.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の分解核酸集団のメンバーの検出方法であって、
ａ）前記分解核酸集団を含むサンプルを提供する段階と；
ｂ）ターゲットプライマー対（但し、
ｉ）各ターゲットプライマー対はフォワードターゲットプライマーとリバースターゲットプライマーを含み；
ｉｉ）前記フォワードターゲットプライマー及びリバースターゲットプライマーは各々（Ａ）分解核酸集団の少なくとも１個のメンバーのヌクレオチドサブ配列に相補的なターゲット特異的ヌクレオチド配列と、（Ｂ）ターゲット特異的配列に対して５’側に位置する少なくとも１個のユニバーサルプライミング配列を含む）を提供する段階と；
ｃ）前記ターゲットプライマー対をそのコグネイト分解核酸にアニールさせる段階と；
ｄ）アニールした前記ターゲットプライマーを酵素伸長させ、前記コグネイト分解核酸のサブ配列に対応する複数の産物（但し、複数の産物中の少なくとも１個のメンバーは分解核酸に対応する２００塩基対以下のヌクレオチド配列を含む）を生成する段階と；
ｅ）前記ユニバーサルプライミング配列に相補的なヌクレオチド配列を含む少なくとも１個のユニバーサルプライマーを使用して前記複数の産物を酵素増幅し、１個のターゲットアンプリコンの長さが少なくとも１個の他のターゲットアンプリコンの長さと相違する複数のターゲットアンプリコンを生成する段階と；
ｆ）前記複数のターゲットアンプリコンを検出することにより、サンプル中の分解核酸集団のメンバーを検出する段階を含む前記方法。
【請求項２】
核酸サンプル中に核酸分解が存在している場合にこれを識別する方法であって、
ａ）核酸分子を含む核酸サンプルを提供する段階と；
ｂ）少なくとも２個のターゲットプライマー対（但し、
ｉ）各ターゲットプライマー対はフォワードターゲットプライマーとリバースターゲットプライマーを含み；
ｉｉ）各プライマー対の前記フォワードターゲットプライマー及びリバースターゲットプライマーは各々ターゲット特異的ヌクレオチド配列を含み、各ターゲット特異的ヌクレオチド配列は前記サンプル中の同一コグネイト核酸分子のサブ配列に相補的である）を提供する段階と；
ｃ）前記ターゲットプライマー対を前記コグネイト核酸分子にアニールさせる段階と；
ｄ）アニールした前記ターゲットプライマーを酵素伸長させ、前記コグネイト核酸分子のヌクレオチドサブ配列に対応する異なる長さの少なくとも２個の産物（但し、（ｉ）前記少なくとも２個の産物は少なくとも４０塩基対長相違し、（ｉｉ）少なくとも１個の産物は前記コグネイト核酸分子に対応する２００塩基対以下のヌクレオチド配列を含む）を生成する段階と；
ｅ）前記産物を酵素増幅し、少なくとも２個のターゲットアンプリコンを生成する段階と；
ｆ）前記少なくとも２個のターゲットアンプリコンを定量する段階と；
ｇ）前記ターゲットアンプリコンの量を比較することにより、前記サンプル中に核酸分解が存在する場合にはこれをの識別する段階を含む前記方法。
【請求項３】
分解ＲＮＡサンプルから遺伝子発現プロファイルを作成する方法であって、
ａ）発現遺伝子に対応する分解ＲＮＡを含むサンプルを提供する段階と；
ｂ）複数のターゲットプライマー対（但し、
ｉ）各ターゲットプライマー対はフォワードターゲットプライマーとリバースターゲットプライマーを含み；
ｉｉ）前記フォワードターゲットプライマー及びリバースターゲットプライマーは各々（Ａ）前記サンプル中の少なくとも１個の分解ＲＮＡのヌクレオチドサブ配列に相補的なターゲット特異的ヌクレオチド配列と、（Ｂ）ターゲット特異的配列に対して５’側に位置する少なくとも１個のユニバーサルプライミング配列を含む）を提供する段階と；
ｃ）前記ターゲットプライマー対をそのコグネイト分解ＲＮＡにアニールさせる段階と；
ｄ）前記コグネイト分解ＲＮＡ分子のサブ配列に対応する複数の産物（但し、複数の産物中の少なくとも１個のメンバーは分解ＲＮＡ分子に対応する２００塩基対以下のヌクレオチド配列を含む）を酵素生成する段階と；
ｅ）前記ユニバーサルプライミング配列に相補的なヌクレオチド配列を含む少なくとも１個のユニバーサルプライマーを使用して前記複数の産物を酵素増幅し、１個のターゲットアンプリコンの長さが少なくとも１個の他のターゲットアンプリコンの長さと相違する複数のターゲットアンプリコンを生成する段階と；
ｆ）前記複数のターゲットアンプリコンを定量することにより、分解ＲＮＡサンプルから遺伝子発現プロファイルを作成する段階を含む前記方法。
【請求項４】
分解核酸を含むサンプルの分析用キットであって、
ａ）複数のターゲットプライマー対（但し、
ｉ）各ターゲットプライマー対はフォワードターゲットプライマーとリバースターゲットプライマーを含み；
ｉｉ）前記フォワードターゲットプライマー及びリバースターゲットプライマーは各々（Ａ）前記サンプル中の少なくとも１個のコグネイト分解核酸のヌクレオチドサブ配列に相補的なターゲット特異的ヌクレオチド配列と、（Ｂ）ターゲット特異的配列に対して５’側に位置する少なくとも１個のユニバーサルプライミング配列を含み；
ｉｉｉ）ターゲットプライマー対の各プライマーは３’末端を含み、前記ターゲットプライマーを前記コグネイト分解核酸とハイブリダイズさせるとき、少なくとも１個のプライマー対の１個のプライマーの前記３’末端は前記プライマー対の第２のプライマーの３’末端から２０塩基対以内である）と；
ｂ）分解核酸を含むサンプルを分析するための説明書を含む前記キット。
【請求項５】
核酸サンプルの核酸分解メトリックの誘導方法であって、
ａ）核酸分子集団を含む核酸サンプルを提供する段階と；
ｂ）前記サンプル中の１個のコグネイト核酸分子ターゲットに特異的な少なくとも２個のターゲットプライマー対（但し、
ｉ）各ターゲットプライマー対はフォワードターゲットプライマーとリバースターゲットプライマーを含み；
ｉｉ）前記フォワードターゲットプライマー及びリバースターゲットプライマーは各々ターゲット特異的ヌクレオチド配列を含み、各ターゲット特異的ヌクレオチド配列はコグネイト核酸分子のサブ配列に相補的であり；
ｉｉｉ）前記ターゲットプライマー対は異なる長さのターゲットヌクレオチド配列を含むアンプリコンを生成することができる）を提供する段階と；
ｃ）前記ターゲットプライマー対をコグネイト核酸ターゲットにアニールさせる段階と；
ｄ）アニールした前記ターゲットプライマーを酵素伸長させ、前記コグネイト核酸分子のヌクレオチドサブ配列に対応する異なる長さの少なくとも２個のターゲットアンプリコンを生成する段階と；
ｅ）前記少なくとも２個のターゲットアンプリコンを定量し、アンプリコン定量値を生成する段階と；
ｆ）アンプリコン長の変化の関数としてアンプリコン定量値の変化を表すメトリックを誘導することにより、前記核酸サンプルの前記核酸分解メトリックを誘導する段階を含む前記方法。
【請求項６】
ＲＮＡサンプルのＲＮＡ分解メトリックを誘導し、前記サンプル中の少なくとも１個の発現遺伝子の発現を定量する方法であって、
ａ）ｉ）発現遺伝子に対応するＲＮＡ分子の集団を含むＲＮＡサンプルと；
ｉｉ）前記サンプル中の第１のコグネイト核酸分子ターゲットに特異的な少なくとも２個のターゲットプライマー対（但し、
Ａ）各ターゲットプライマー対はフォワードターゲットプライマーとリバースターゲットプライマーを含み；
Ｂ）前記フォワードターゲットプライマー及びリバースターゲットプライマーは各々ターゲット特異的ヌクレオチド配列を含み、各ターゲット特異的ヌクレオチド配列はコグネイト核酸分子のサブ配列に相補的であり；
Ｃ）前記ターゲットプライマー対は異なる長さのターゲットヌクレオチド配列を含むアンプリコンを生成することができる）と；
ｉｉｉ）（ｉｉ）の第１のコグネイト核酸分子ターゲットと異なる前記サンプル中の第２のコグネイト核酸ターゲットに特異的な少なくとも１個の付加プライマー対を提供する段階と；
ｃ）前記ターゲットプライマー対を夫々のコグネイト核酸ターゲットにアニールさせる段階と；
ｄ）アニールした前記ターゲットプライマーを酵素伸長させ、（Ａ）前記第１のコグネイト核酸分子のヌクレオチドサブ配列に対応する異なる長さの少なくとも２個のＲＮＡメトリックアンプリコンと、ｂ）前記第２のコグネイト核酸分子のヌクレオチドサブ配列に対応する少なくとも１個の付加アンプリコンを生成する段階と；
ｅ）前記アンプリコンを定量してアンプリコン定量値を生成することにより、前記サンプル中の少なくとも１個の発現遺伝子の発現を定量する段階と；
ｆ）アンプリコン長の変化の関数としてＲＮＡメトリックアンプリコン定量値の変化を表すメトリックを誘導することにより、前記ＲＮＡサンプルの前記核酸分解メトリックを誘導する段階を含む前記方法。
【請求項７】
核酸サンプルの核酸分解メトリックを誘導する統合システムであって、
ａ）核酸サンプル中の単一核酸分子ターゲットに特異的な少なくとも２つのターゲットプライマー対を含む核酸増幅成分であって、各ターゲットプライマー対がターゲット特異的配列とユニバーサル配列を含み、ターゲットプライマー対が前記サンプル中の単一核酸分子ターゲットから誘導される少なくとも２個のアンプリコンを生成し、前記少なくとも２個のアンプリコンは少なくとも長いアンプリコンと２００以下の塩基対を含む短いアンプリコンとを含み、前記少なくとも２個のアンプリコンが少なくとも２個のシグナルを生成する、前記核酸増幅成分と；
ｂ）長いアンプリコンと短いアンプリコンのアンプリコン定量値に相関する前記シグナルを検出するための検出器と；
ｃ）検出器に制御可能に接続されており、
ｉ）前記検出器から前記シグナルを受け取り、
ｉｉ）シグナルを長いアンプリコンと短いアンプリコンに対応するアンプリコン定量値と相関し、
ｉｉｉ）アンプリコン長の関数としてアンプリコン定量値の変化を表すメトリックを計算することにより、前記核酸サンプルの前記核酸分解メトリックを誘導する相関モジュールを含む前記統合システム。
【請求項８】
前記少なくとも２個のシグナルが３個のシグナルから構成される請求項７に記載の統合システム。
【請求項９】
前記少なくとも２個のシグナルが電気泳動システムから発生される請求項７に記載の統合システム。
【請求項１０】
前記短いアンプリコンが１００塩基対以下の核酸ターゲット分子ヌクレオチド配列を含む請求項７に記載の統合システム。
【請求項１１】
前記短いアンプリコンが８０塩基対以下の核酸ターゲット分子ヌクレオチド配列を含む請求項７に記載の統合システム。
【請求項１２】
前記短いアンプリコンが６０塩基対以下の核酸ターゲット分子ヌクレオチド配列を含む請求項７に記載の統合システム。
【請求項１３】
前記短いアンプリコンが約４０〜約６０塩基対の核酸ターゲット分子ヌクレオチド配列を含む請求項７に記載の統合システム。
【請求項１４】
アンプリコンサイズの変化の関数としてアンプリコン定量値の変化を表す前記メトリックが特徴的傾き、Ｘ切片及びＹ切片をもつ一次方程式である請求項７に記載の統合システム。
【請求項１５】
前記検出器が蛍光検出器である請求項７に記載の統合システム。
【請求項１６】
前記相関モジュールが前記核酸分解メトリックの計算用の１個以上のアルゴリズムを含む請求項７に記載の統合システム。
【請求項１７】
請求項７に記載の統合システムを使用して核酸分解メトリック値を誘導する段階と、前記メトリックを規定閾値品質スコアと比較する段階を含む核酸サンプルの品質の評価方法。
【請求項１８】
ａ）分解核酸分子集団と；
ｂ）前記核酸分子集団のメンバーである同一コグネイト核酸ターゲットに特異的な少なくとも２個のターゲットプライマー対（但し、
ｉ）各ターゲットプライマー対はフォワードターゲットプライマーとリバースターゲットプライマーを含み；
ｉｉ）前記フォワードターゲットプライマー及びリバースターゲットプライマーは各々ターゲット特異的ヌクレオチド配列を含み、各ターゲット特異的ヌクレオチド配列はコグネイト核酸分子のサブ配列に相補的であり；
ｉｉｉ）前記フォワードターゲットプライマー及びリバースターゲットプライマーは各々少なくとも１個のユニバーサルプライミング配列を含み、前記ユニバーサルプライミング配列はターゲット特異的配列に対して５’側に位置しており；
ｉｖ）前記ターゲットプライマー対は前記コグネイト核酸分子に対応する異なる長さのヌクレオチド配列を含む少なくとも２個のアンプリコンを生成すると予想され、（Ａ）前記アンプリコンは前記コグネイト核酸分子に対応する少なくとも４０塩基対長のヌクレオチド配列が相違し、（Ｂ）少なくとも１個の予想アンプリコンは前記コグネイト核酸ターゲットに対応する２００塩基対以下のヌクレオチド配列を含む）と；
ｃ）前記ユニバーサルプライミング配列に相補的なヌクレオチド配列を含む少なくとも１個のユニバーサルプライマーと；
ｄ）前記ターゲットプライマー対を酵素伸長させることが可能な核酸ポリメラーゼを含む反応混合物。