(57)【要約】  分析の、診断の、又は予後のアッセイにおいて有用な種の単一分子分析を開示する。例示的実施形態において、アッセイは開示する方法によって調製された試料を利用し、アッセイに予想外の感度及び頑強さをもたらすものである。方法を、サイトカインアッセイを参照にすることによって非限定的に記載する。
2012503202.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出可能種が特異的に結合する分析物の単一分子に相関する、前記検出可能種の単一分子を検出するアッセイを行う方法であって、
（ａ）第１の容器中における、
（ｉ）前記分析物と、前記分析物に特異的に結合する、磁性粒子に固定化された捕獲種との複合体を形成するステップと、
（ｉｉ）（ｉ）の後、前記複合体を、前記分析物に特異的に結合する前記検出可能種と接触させることにより、前記検出可能種の固定化複合体を形成するステップと、
（ｂ）前記固定化複合体を、前記検出可能種を含まない第２の容器に移すステップと、
（ｃ）前記検出可能種を前記固定化複合体から溶出するステップと、
（ｄ）前記検出可能種の前記単一分子を検出するステップと
を含む上記方法。
【請求項２】
前記捕獲種が、共有結合的相互作用及び非共有結合的相互作用から選択される１種である相互作用によって前記磁性粒子に固定化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記捕獲種が、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用によって前記磁性粒子に固定化されている、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
（ａ）（ｉ）の前に、前記分析物の前記単一分子を、脂質上層、前記分析物の前記単一分子を含む中間層、及びフィブリン凝塊下層を含む３層の血漿試料の前記中間層から採取し、前記分析物の前記単一分子を、前記試料の前記中間層からアリコートで採取する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記捕獲種が、核酸、ポリペプチド、脂質、及び糖類から選択される１種である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記捕獲種が抗体である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記検出可能種が、核酸、ポリペプチド、脂質、及び糖類から選択される１種である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記検出可能種が抗体である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記分析物がサイトカイン及び増殖因子から選択される１種である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記サイトカインがインターロイキンである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記サイトカインが、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ｈＴＮＦα、ｍＴＮＦα、ＩＦＮγ、及びｈＶＥＧＦから選択される１種である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
２ｐｇ／ｍＬ以下の量の前記サイトカインを検出することができるアッセイを提供する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
０．５ｐｇ／ｍＬ以下の量の前記サイトカインを検出することができるアッセイを提供する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記サイトカインが、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ｈＴＮＦα、ｍＴＮＦα、ＩＦＮγ、及びｈＶＥＧＦから選択される１種であり、前記方法が０．４ｐｇ／ｍＬ以下の量の前記サイトカインを検出することができるアッセイを提供する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記サイトカインが、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ｈＴＮＦα、ＩＦＮγ、及びｈＶＥＧＦから選択される１種であり、前記方法が０．３ｐｇ／ｍＬ以下の量の前記サイトカインを検出することができるアッセイを提供する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記サイトカインが、ＩＬ−１β、ＩＬ−２１、Ｇ−ＣＳＦ、ｈＴＮＦα、及びｈＶＥＧＦから選択される１種であり、前記方法が０．２ｐｇ／ｍＬ以下の量の前記サイトカインを検出することができるアッセイを提供する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記サイトカインが、Ｇ−ＣＳＦ、ｈＴＮＦα、及びｈＶＥＧＦから選択される１種であり、前記方法が０．１ｐｇ／ｍＬ以下の量の前記サイトカインを検出することができるアッセイを提供する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記アッセイが２ｌｏｇを超えるダイナミックレンジを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記アッセイが少なくとも３ｌｏｇのダイナミックレンジを有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記アッセイが少なくとも４ｌｏｇのダイナミックレンジを有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記複合体が、２５μＬから約１０００μＬまでの体積のバッファー溶液中に形成される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記複合体が、少なくとも２５μＬの体積のバッファー溶液中に形成される、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記磁性粒子が、前記第１の容器中に０．１μｇから４０μｇまでの量で存在する複数種の磁性粒子の１種である、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記磁性粒子が、前記第１の容器中に少なくとも０．１μｇの量で存在する複数種の磁性粒子の１種である、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記検出可能種が、それに共有結合しているフルオロフォアを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記複合体が、
２５μＬから約１０００μＬまでのバッファー溶液に対して０．１μｇから４０μｇまでの複数種の磁性粒子
を含む混合物中の前記磁性粒子に形成される、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記複合体が、０．５μｇから２５μｇまでの前記複数の前記磁性粒子を、１００μＬから１０００μＬまでの血漿試料と接触させることによって形成される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
（ｅ）前記単一の検出可能種分子の集団の濃度を決定するステップ
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
（ｆ）前記単一の検出可能種の前記濃度を、前記分析物の前記単一分子の集団の濃度と相関させるステップ
をさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
（ｇ）前記単一の検出可能種分子の集団の個々のメンバーを計数することにより、前記単一の検出可能種分子の数を決定するステップ
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
（ｈ）前記単一の検出可能種分子の前記数を前記分析物の前記単一分子の数と相関させるステップ
をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項３２】
前記検出ステップが、
（ａ）
ｉ．電磁放射線を放射するための電磁放射線源、
ｉｉ．電磁放射線源から放射される電磁放射線を受けるように配置された第１のインタロゲーション空間、
ｉｉｉ．前記検出可能種の前記単一分子の第１の電磁波の特徴を測定するために、第１のインタロゲーション空間に作動可能に接続されている第１の電磁放射線検出器
を含む、前記検出可能種の前記単一分子を検出することができる分析器システム
を含む単一分子分析器を用いることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
前記分析器システムが、
（ｂ）少なくとも１つの試料を自動的にサンプリングし、試料コンテナと前記第１のインタロゲーション空間の間に液体の連絡を提供することができるサンプリングシステム
をさらに含んでいる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
分析器システムが、実質的に全試料の回収が可能である第１のインタロゲーション空間との液体の連絡中に試料回収システムをさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
分析器システムが試料調製システムをさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
電磁放射線源が連続波電磁放射線源である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
第１のインタロゲーション空間が０．０２ｐＬと３００ｐＬの間の体積を有する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
第１のインタロゲーション空間が０．０５ｐＬと５０ｐＬの間の体積を有する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
第１のインタロゲーション空間が０．１ｐＬと２５ｐＬの間の体積を有する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記第１のインタロゲーション空間の体積が調節可能である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
検出可能な抗体が特異的に結合する分析物の単一分子に相関する、前記検出可能な抗体の単一分子を検出するアッセイを行う方法であって、
（ａ）第１の容器中における、
（ｉ）前記分析物と、前記分析物に特異的に結合する捕獲抗体とのハプテン−抗体複合体を形成するステップであって、前記捕獲抗体がビオチンを含み、ストレプトアビジンを含む磁性粒子に前記ビオチンと前記ストレプトアビジンの間の相互作用によって固定化されている、ステップと、
（ｉｉ）（ｉ）の後、前記複合体を、前記分析物に特異的に結合する前記検出可能な抗体と接触させることにより、前記検出可能な抗体の固定化複合体を形成するステップと、
（ｂ）前記固定化複合体を、前記検出可能な抗体を含まない第２の容器に移すステップと、
（ｃ）前記検出可能な抗体を前記固定化複合体から溶出するステップと、
（ｄ）前記検出可能な抗体の前記単一分子を検出するステップと
を含む上記方法。
【請求項４２】
（ａ）（ｉ）の前に、前記分析物の前記単一分子を、脂質上層、前記分析物の前記単一分子を含む中間層、及びフィブリン凝塊下層を含む３層の血漿試料の前記中間層から採取し、前記分析物の前記単一分子を、前記試料の前記中間層からアリコートで採取する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記ビオチンが、前記捕獲抗体の、アミン部分及びヒンジのサッカリル（ｓａｃｃｈａｒｙｌ）部分から選択される１種である部位に結合している、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
検出可能種が特異的に結合するサイトカイン及び増殖因子から選択される１種である分析物の単一分子に相関する、前記検出可能種の単一分子を検出する試料のアッセイを行う方法であって、前記アッセイは５ｐｇ／ｍＬ以下の量の前記検出可能種を検出することができ、前記アッセイは少なくともｌｏｇ２のダイナミックレンジを有し、
（ａ）第１の容器中における、
（ｉ）前記分析物と、前記分析物に特異的に結合する捕獲種との複合体を形成するステップであって、前記捕獲種がビオチンを含み、ストレプトアビジンを含む磁性粒子に、前記ビオチンと前記ストレプトアビジンの間の相互作用によって固定化されている、ステップと、
（ｉｉ）（ｉ）の後、前記複合体を、前記分析物に特異的に結合する前記検出可能種と接触させることにより、前記検出可能種の固定化複合体を形成するステップと、
（ｂ）前記検出可能種の前記単一分子を検出するステップと
を含む上記方法。
【請求項４５】
（ｂ）の前に、
（ｃ）前記固定化複合体を、前記検出可能種を含まない第２の容器に移すステップ
をさらに含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
ステップ（ｂ）の前に、
（ｄ）前記検出可能種を前記固定化複合体から溶出するステップ
をさらに含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記アッセイが、対象の臨床上健康な非疾患状態に相関する範囲の前記分析物の検出を可能にするように設計されている、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
単一分子アッセイの結果に基づいて診断、予後、治療の状態、及び治療の方法から選択される１種を決定する方法であって、
（ａ）第１の容器中における、
（ｉ）捕獲種が磁性粒子に固定化されており、前記分析物と、前記分析物に特異的に結合する前記捕獲種との間に複合体を形成するステップと、
（ｉｉ）（ｉ）の後、前記複合体を、前記分析物に特異的に結合する前記検出可能種と接触させることにより、前記検出可能種の固定化複合体を形成するステップと、
（ｂ）前記固定化複合体を、前記検出可能種を含まない第２の容器に移すステップと、
（ｃ）前記検出可能種を、前記固定化複合体から溶出するステップと、
（ｄ）前記検出可能種の前記単一分子を検出するステップと、
（ｅ）複数の前記単一分子を定量することにより、前記単一分子の濃度を決定するステップと、
（ｆ）前記単一分子の前記濃度を、前記診断、予後、治療の状態、及び治療の方法から選択される１種と相関させるステップと
を含む上記方法。
【請求項４９】
アッセイから得られるデータセットであって、前記データセットが、
分析物の単一分子に対するアッセイから収集した前記分析物からのシグナルに対応する少なくとも１つのデータ点を含み、前記アッセイが０．５ｐｇ／ｍＬ未満の検出限界及び少なくとも２．５ｌｏｇのダイナミックレンジを有する、上記データセット。
【請求項５０】
検出可能種が特異的に結合する分析物の単一分子に相関する、前記検出可能種の単一分子を検出するアッセイを行う方法であって、
（ａ）前記分析物と、前記分析物に特異的に結合する、磁性粒子に固定化された捕獲種との複合体を形成するステップと、
（ｂ）（ａ）の後、前記複合体を、前記分析物に特異的に結合する前記検出可能種と接触させることにより、前記検出可能種の固定化複合体を形成するステップと、
（ｃ）前記検出可能種の前記固定化複合体を、前記検出可能種の前記固定化複合体に結合していない本質的に全ての検出可能種から分離するステップと、
（ｄ）前記検出可能種を前記固定化複合体から溶出するステップと、
（ｅ）前記検出可能種の前記単一分子を検出するステップと
を含む上記方法。
【請求項５１】
前記検出可能種が特異的に結合する分析物の単一分子に相関する、検出可能種を検出するアッセイを行う方法であって、
（ａ）分析物と、前記分析物に特異的に結合する、磁性粒子に固定化された捕獲種との複合体を形成するステップと、
（ｂ）（ａ）の後、前記複合体を、前記分析物に特異的に結合する前記検出可能種と接触させることにより、前記検出可能種の固定化複合体を形成するステップと、
（ｃ）前記検出可能種の前記固定化複合体を、前記検出可能種の前記固定化複合体に結合していない本質的に全ての検出可能種から分離するステップと、
（ｄ）前記検出可能種を前記固定化複合体から溶出するステップと、
（ｅ）前記検出可能種の単一分子に対応する光子、前記検出可能種の複数コピーに対応する事象光子、前記検出可能種の複数コピーに対応する全光子、及びこれらの組合せから選択される１種を検出するステップと
を含む上記方法。
【請求項５２】
前記分析物が試料体積の範囲内にあり、前記検出可能種が、前記試料体積より小さい溶出体積中に溶出される、請求項１、５０、又は５１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その全文が全ての目的で参照によって援用される、２００８年９月１９日出願の米国仮特許出願第６１／０９８７１２号の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、１つ又は複数の別個の、分析物の単一分子を検出するアッセイを目的とする。
【背景技術】
【０００３】
生物医学的研究、医学的診断、予後、モニタリング及び治療の選択、バイオテロリズムの検出、並びに低体積及び低濃度の分析物の複数の試料の分析に関する他の分野における進歩により、低下し続ける濃度の試料中の粒子を高感度に検出することを可能にする試料分析システムの開発がもたらされている。米国特許第４，７９３，７０５号及び同第５，２０９，８３４号は、極めて高感度の検出が実現されている以前のシステムを記載している。本発明は、当技術分野における、とりわけサイトカインの検出、定量、及びキャラクタリゼーションの分野におけるさらなる発展を提供する。
【０００４】
従来のサイトカインアッセイは血清又は血漿中のサイトカインの測定を伴うが、他の生体液中に様々なサイトカインが検出されている。例えば、Ｋｉｍｂａｌｌ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３３巻、２５６〜２６０頁（１９８４年）は、ヒト尿中のＩＬ−１生物活性を報告した。Ｔａｍａｔａｎｉら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、６５巻、３３７〜３４２頁（１９８８年）は、クロマトグラフィー法及びバイオアッセイ法を用いて、ヒト羊水中のＩＬ−１α及びＩＬ−１βの存在を公開している。同グループは酵素免疫測定法を用いて、ヒト羊水中のＩＬ−１α及びＩＬ−１βを測定した（Ｔｓｕｎｏｄａら、Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．、７巻、３３３頁、１９８８年）。Ｗｉｌｍｏｔｔら、Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．、７巻、３３４頁（１９８８年）は、他の疾患に比較した、嚢胞性線維症におけるヒト気管支肺胞洗浄液中のＩＬ−１β及びＩＬ−１の生物活性を測定した。Ｋｈａｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、５８巻、２２１〜２３０頁（１９８８年）は、高レベルのＩＬ−１様の生物活性が、ヒト卵巣卵胞液中に実証され得ることを報告した。類天疱瘡患者の水疱液中にリンホトキシンが報告されている（Ｊｅｆｆｅｓら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４巻、３１〜３５頁、１９８４年）。ＩＬ−１はヒトの汗中にも報告されている。（Ｄｉｄｉｅｒｊｅａｎら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、２巻、４３８〜４４６頁、１９９０年）。ＩＬ−１が、ネコ（Ｃｏｃｅａｎｉら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．、４４６巻、２４５〜２５０頁、１９８８年）、及びヒト（例えば、Ｐｅｔｅｒら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、４１巻、１２１〜１２３頁、１９９１年を参照されたい）の脳脊髄液（ＣＳＦ）中に見出されることが報告されている。臨床上健康なヒトの歯肉滲出液中に、ＩＬ−１様生物活性を有する因子が検出され（Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｐｒｏｃ．、１４巻、５５３〜５５５頁、１９８２年）、非炎症の歯肉の領域よりも炎症の領域において活性が高かった。
【０００５】
サイトカインレベルを測定するための結合アッセイは、固相又は均一な様式を用いることができる。適切なアッセイ方法には、サンドイッチアッセイ又は競合的結合アッセイが含まれる。サンドイッチ免疫アッセイの例は、Ｇｒｕｂｂらへの米国特許第４，１６８，１４６号、及びＴｏｍらへの米国特許第４，３６６，２４１号に記載されている。競合的免疫アッセイの例には、Ｄｅｕｔｓｃｈらへの米国特許第４，２３５，６０１号、Ｌｉｏｔｔａへの米国特許第４，４４２，２０４号、及びＢｕｅｃｈｌｅｒらへの米国特許第５，２０８，５３５号に開示されているものが含まれる。
【０００６】
結合試薬アレイの使用による多重化、標識のスペクトル弁別を用いた多重化、粒子で行われる結合アッセイのフローサイトメトリー分析による多重化（例えば、Ｌｕｍｉｎｅｘシステムを用いたもの）など、多重化アッセイ様式を用いて複数のサイトカインを測定することができる。別の取組みは、個々に同定され、問われ得るビーズ上にコーティングされた結合試薬の使用を伴う。国際公開第９９２６０６７Ａ１号（Ｗａｔｋｉｎｓら）は、複数の分析物をアッセイするためのサイズの異なる磁性粒子の使用を記載しており、様々な分析物をアッセイするのに様々な別々のサイズ範囲に属する粒子が用いられる。粒子はフローサイトメトリーによって区別され、個々に問われるようにデザインされている。Ｖｉｇｎａｌｉは、各々が均一で別々の割合の２種類の色素を有する、６４の異なるビーズセットの微小粒子を用いる多重結合アッセイを記載している（Ｖｉｇｎａｌｉ，Ｄ．Ａ．Ａ．、「Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ａｓｓａｙｓ」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、（２０００年）２４３巻、２４３〜２５５頁）。サイズ及び蛍光の異なる１５の異なるビーズを１セット有する同様の取組みが、肺炎球菌の多数の血清型を同時に型別するのに有用であると開示されている（Ｐａｒｋ，Ｍ．Ｋ．ら、「Ａ  Ｌａｔｅｘ  Ｂｅａｄ−Ｂａｓｅｄ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｃａｐａｂｌｅ  Ｏｆ  Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  Ｔｙｐｉｎｇ  Ｏｆ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  Ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ（Ｍｕｌｔｉｂｅａｄ  Ａｓｓａｙ）」、Ｃｌｉｎ  Ｄｉａｇｎ  Ｌａｂ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、（２０００年）７巻、４８６〜９頁）。Ｂｉｓｈｏｐ，Ｊ．Ｅ．らは、６種のヒトサイトカインを同時定量するための多重サンドイッチアッセイを記載している（Ｂｉｓｈｏｐ，Ｊ．Ｅ．ら、「Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｉｘ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｉｎ  ａ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｕｓｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ−ｂａｓｅｄ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．、（１９９９年）４５巻、１６９３〜１６９４頁）。
【０００７】
サイトカインのｍＲＮＡ又はサイトカインのポリペプチドを測定する方法を含む、特異的なサイトカインの発現を定量するための他の方法が用いられている。例えば、ＰＣＲ（商標）、競合的ＰＣＲ（商標）、ＰＣＲ−ＥＬＩＳＡ、マイクロアレイ、遺伝子発現ビーズに基づくアッセイ、及びインサイチューハイブリダイゼーション法を用いてサイトカインのｍＲＮＡを測定することができ、免疫組織化学を用いてサイトカインタンパク質レベルを測定することができる。公開されている米国特許出願公開第２００６０２０５０１２号は、試料中の１つ又は複数のサイトカインのレベルを測定するためのアッセイ方法を開示している。
【０００８】
サイトカインなど、低濃度の診断上又は予後上価値のある分析物を測定するためのより高感度の方法が現在必要とされている。さらに、分析物の単一分子を検出するためのより効果的且つ効率的な方法、化合物、及び系統が、様々な状況において診断及び予後における著しい進歩を表している。本発明はこれらの及びさらなる必要性を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、分析物の単一分子を検出するアッセイを行う方法を提供する。この方法は、現在利用可能な方法よりも低い検出閾値で、分析、診断、及び予後診断の対象となる種の検出をもたらす。さらに、本発明の様々な実施形態は、現在利用可能な方法よりも広いダイナミックレンジを有する単一分子アッセイを提供する。本発明の方法の重要性は、高感度及び頑強なダイナミックレンジの検出を必要とする、迅速で安価な単一のバイオマーカー及び多重のバイオマーカーの診断アッセイに対する強力な臨床上の必要性によって、さらに増大される。
【００１０】
本発明の方法はマイクロプレートベースのアッセイとは異なる。マイクロプレートベースのアッセイは、実質的に全ての非結合の検出種を、検出種と分析物で形成した複合体から除去する可能性を容易に許容しない。様々な実施形態において、本発明は、捕獲抗体−分析物−検出抗体のサンドイッチ複合体を、検出抗体を含まない容器に移し、その後検出抗体をサンドイッチ複合体から溶出することによって、複合体から非結合の検出可能種を分離することを含む方法を提供する。非特異的に結合している検出抗体が存在し、サンドイッチ複合体の特異的に結合している検出抗体と共に検出混合物中に溶出されるアッセイ混合物は、不正確に高いシグナルを生成する。
【００１１】
第１の態様において、本発明は、検出可能種が特異的に結合する分析物の単一分子に相関する検出可能種の単一分子を検出するアッセイを行う方法を提供する。この方法は、捕獲抗体−分析物−検出抗体のサンドイッチ複合体から本質的に全ての非結合の検出可能種を分離し、その後検出可能種を検出することを含む。したがって、例示的一実施形態において、本発明は、第１の容器中において、分析物と分析物に特異的に結合する捕獲種の間に複合体を形成することを含む方法を提供する。捕獲種は磁性粒子に固定化されている。分析物の捕獲後、やはり第１の容器中において、複合体を、分析物に特異的に結合する検出可能種と接触させることにより、検出可能種の固定化複合体を形成する。次いで、固定化複合体を第１の容器から除去し、検出可能種を含まない第２の容器に移す。次に第２の容器中において、検出可能種を固定化複合体から溶出する。単一分子検出に好適な装置を用いて、検出可能種の単一分子を検出する。
【００１２】
様々な実施形態において、検出可能種の単一分子は、本質的に同じ構造を有する検出可能種の複数の分子の１個である。様々な他の実施形態において、検出可能種の２つ以上の集団が存在し、各集団は様々な構造の検出可能種を含んでいる。例示的一実施形態において、捕獲種は抗体である。様々な実施形態において、検出可能種は標識抗体、例えば、フルオロフォアで標識されている抗体である。
【００１３】
例示的一実施形態において、本発明は、検出可能種の単一分子が、検出可能種が特異的に結合するサイトカイン及び増殖因子から選択される１種である分析物の単一分子に相関する、先に記載した方法を提供する。様々な実施形態において、アッセイは、約５ｐｇ／ｍＬ以下の量の検出可能種を検出することができる。ある実施形態において、アッセイは、約２ｐｇ／ｍＬ以下の量の検出可能種の単一分子を検出する。
【００１４】
本発明の方法は、頑強なダイナミックレンジを有するアッセイも提供する。例えば、様々な実施形態において、本発明は、少なくとも約２ｌｏｇ、好ましくは少なくとも３ｌｏｇ、より好ましくは少なくとも約４ｌｏｇのダイナミックレンジを有するアッセイを提供する。
【００１５】
様々な実施形態において、本発明は、単一分子アッセイの結果に基づいて診断、予後、治療の状態、及び／又は治療の方法を決定する方法を提供する。方法は実質的に先に述べた通りであるが、さらなるエレメントとして、単一分子ベースによって単一分子上の検出可能種の複数の単一分子を定量し（平均濃度とは異なる）、この定量に由来する量を、診断、予後、治療の状態、又は治療の方法に相関させる。
【００１６】
本発明は、本発明の方法を行うための試薬及びキットも含む。一実施形態において、キットは、本発明の方法において測定される分析物（例えば、サイトカイン）に対する抗体を含む。キットは、アッセイ希釈液、標準、対照、及び／又は検出可能な標識をさらに含むことができる。アッセイ希釈液、標準、及び／又は対照は、特定の試料マトリックスに対して最適化されていてよい。例えば、血液、血清、又は血漿の試料において測定するための希釈液、標準、及び対照は、ｉ）ヒトの血液、血清、若しくは血漿、ｉｉ）動物の血液、血清、若しくは血漿、又はｉｉｉ）人工の血液、血清、若しくは血漿の代替物を含むことができる。
【００１７】
様々な疾患を診断及び／又はモニタリングするための本発明の方法を行うための、並びに疾患を治療する有効性に対して薬物又は薬物候補をスクリーニングするための診断マーカー（単数又は複数）として、様々なサイトカインが潜在的に有用である。さらに、下記に詳しく記載するように、本発明のある実施形態は、これらの分析物及び他の分析物においてマーカー（単数又は複数）として働くための特定の候補のサイトカイン（単数又は複数）の有効性を決定するための方法を提供する。当業者であれば、本発明の方法を用いて、過度の実験をせずに、本明細書に詳しく列挙しておらず、実際にまだ発見されていないサイトカイン及び他のマーカーを含めた１つ又は複数の選択されたサイトカイン又は他のマーカーの能力が、本発明の様々な診断方法及びスクリーニング方法を行う際にその測定されたレベル／プロファイルを用いることができるマーカーとして有用であると決定することができる。
【００１８】
本発明のさらなる目的、利点、及び態様は、以下の発明を実施するための形態から明らかである。
【００１９】
本明細書に添付され、本明細書の一部を形成している図面は、本発明の特定の態様を示すために含めた。本発明、及び本発明で提供される構成要素及びシステム操作の明白な概念は、図面に示されている、例示的であり、したがって非限定的である実施形態を参照することによって容易に明らかになる。ここで同参照番号（２つ以上の図に見出される場合）は、同じエレメントを指す。本発明は、１つ又は複数のこれらの図面を、本明細書に示した説明と組み合わせて参照することによって、よく理解され得る。図面に例示された特徴は必ずしも縮尺通りではないことが留意されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の方法において有用である例示的な光学システムの略図である。
【図２】曲線のあてはめの正確度を示す図である。８回の連続したアッセイの実行によって生成したｃＴｎＩ（心筋トロポニン−Ｉ）標準曲線の逆補間（パネルＡ、定量化の全範囲及びパネルＢ、定量化の下端の範囲）。
【図３】１００体の異なる供血者から得たリチウムヘパリン血漿検体中のｃＴｎＩの度数分布を示すグラフである。
【図４Ａ】健康なヒトボランティアから得た血漿中のＩＬ−２及びＩＬ−５の度数分布を示すグラフである。
【図４Ｂ】健康なヒトボランティアから得た血漿中のＩＬ−７及びＩＬ−２１の度数分布を示すグラフである。
【図５Ａ】本発明の方法を使用して測定した、健康なボランティアからの試料中の種々のインターロイキン（ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＩＬ−７及びＩＬ−１ｂ）の濃度を示す表である。
【図５Ｂ】本発明の方法を使用して測定した、健康なボランティアからの試料中の種々のインターロイキン（ＩＦＮ−ｇ、ＩＬ−２１、ＩＬ−６及びＩＬ−１７Ａの濃度を示す表である。
【図５Ｃ】本発明の方法を使用して測定した、健康なボランティアからの試料中の種々のインターロイキン（ＴＮＦ−ａ、ＩＬ−４、ＩＬ−１ａ及びＧＭ−ＣＳＦ）の濃度を示す表である。
【図５Ｄ】本発明の方法を使用して測定した、健康なボランティアからの試料中の種々のインターロイキン（ＩＬ−１２、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−２２及びＩＬ−１０）の濃度を示す表である。
【図５Ｅ】本発明の方法を使用して測定した、健康なボランティアからの試料中の種々のインターロイキン（ＭＩＰ−１ａ、ＩＬ−１５、ＩＬ−２２及びＩＬ−１０）の濃度を示す表である。
【図６】図５からの、種々のインターロイキン濃度の比を示す表である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
序文
試料中の、分析、臨床、予後、及び／又は診断の対象の種の単一分子を検出するための本発明の方法の例を本明細書に開示する。様々な実施形態において、試料は対象から採取する。アッセイは、疾患のマーカー、炎症のマーカー、及び／又はサイトカインの測定など、生物学的試料中の分析物の測定を含むことができ、分析物のレベルは疾患の存在又は重症度を示す。
【００２２】
本発明の様々な実施形態は、様々な疾患を検出及び／又は識別し、このような疾患の経過及び／又は結果を予測するための方法、このような疾患を治療する方法、並びにこのような疾患の進行を防止又は停止するのに用いる薬剤に関する。本発明の例示的実施形態は、本発明のアッセイ様式に従って診断テストを投与し、及び／又は繰り返し投与することによって患者における疾患の進行又は治療をモニタリングする方法に関する。一例において、診断方法を用いて、薬物又は薬物候補で治療した患者、動物モデル、組織試料、及び細胞培養物からの試料における、疾患に特異的な分析物のレベルに対する、薬物又は薬物候補の影響を測定することによって、疾患を治療するための薬物又は薬物候補の有効性を評価する。
【００２３】
様々な実施形態において、本発明は、サイトカインが関与し、又は関係付けられる疾患を検出するための診断テストを行うための方法を提供する。例示的一実施形態は、診断上価値のある疾患のサイトカインマーカーを同定するためのアッセイである。様々な実施形態において、本発明は、本発明の方法における診断マーカー（単数又は複数）として働くための、疾患を診断及び／又はモニタリングするための、並びに疾患を治療する有効性に対して薬物又は薬物候補をスクリーニングするための、特定のサイトカイン（単数又は複数）などの特定の候補分析物の有効性を決定するための方法を提供する。
【００２４】
様々な実施形態において、混合液内の特異的な単一分子だけが標識される。特異的な標識化は、標的の単一分子を標識された結合パートナーと組み合わせることによって実現されてよく、この場合、結合パートナーは、相補的な結合表面によって標的の単一分子と特異的に相互作用する。パートナー同士の間の結合力は、疎水性、真水性、イオン結合及び水素結合、ファンデルワールス引力、又は配位錯体の形成など、共有結合的相互作用又は非共有結合的相互作用であってよい。結合パートナーの例には、細胞膜受容体に対するアゴニストとアンタゴニスト、毒素と毒液、抗体とウイルスのエピトープ、ホルモン（例えば、オピオイドペプチド、ステロイドなど）とホルモン受容体、酵素と酵素基質、補助因子と標的配列、薬物と薬物標的、オリゴヌクレオチドと核酸、タンパク質とモノクローナル抗体、抗原と特異的な抗体、ポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドとポリヌクレオチド結合性タンパク質、ビオチンとアビジン又はステレプトアビジン、酵素と酵素補助因子、及びレクチンと特異的な炭水化物がある。結合パートナーとして働くことができる例示的受容体には、天然に存在する受容体、例えば、チロキシン結合性グロブリン、レクチン、細胞の表面上に見られる様々なタンパク質（分化クラスター、又はＣＤ単一分子）などが含まれる。
【００２５】
一実施形態において、試料を、ビーズ又は微粒子、例えば、結合パートナー（例えば、標的の単一分子と反応する捕獲種）でコーティングされている磁性粒子と反応させる。ビーズを試料のあらゆる非結合の成分から分離する。一実施形態において、捕獲された分析物を検出可能種と接触させ、その後非結合の材料を除去し、分析物−検出可能種の複合体を、任意選択で洗浄され溶出混合物で処理されている別の容器に移し、溶出混合物は分析物を検出可能種から解離する。個々の分子は、本発明において用いるための単一分子分析器によって検出される検出可能種である。
【００２６】
定義
本明細書で用いられる「分析物」及び「結合パートナー」の語は、結合の相互作用に関与する分子を意味する。例示によると、分析物及び結合剤は、あらゆる有機の、無機の、又は生物学的な薬剤を含むことができる。このような薬剤の非限定的な例には、ＤＮＡ又はＲＮＡフラグメント（例えば、オリゴヌクレオチド）、アプタマー、ペプチド、及びタンパク質（例えば、抗体）、抗原、及び有機小分子（例えば、薬剤、戦争物質、殺虫剤、除草剤、農業用肥料）が含まれる。特定の一アッセイにおいて、リガンドと受容体の間の結合の相互作用を分析する。例示的一アッセイにおいて、分析物と結合パートナーの結合は、検出可能種の提供におけるステップであり、その１つ又は複数の分子を本発明のアッセイにおいて検出することができる。したがって、検出可能種は分析物の代理であり、検出可能種の分子は分析物の分子に相関し、対応する。相関は、１対１である必要はないが、推定することができ、又は実験的に決定することができる。分析物は、動物（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト、トリ、サカナなど）、植物、酵母菌、細菌、ウイルス、原虫などを含めたあらゆる原核生物又は真核生物の個体に由来する。本発明は、分析物の起源又は分析物を含む試料の起源に関して限定されない。
【００２７】
本明細書で用いられる「試料」は、本質的にあらゆる対象の源からの材料を含む。試料の非限定的な例には、血液、血清、血漿、気管支肺胞洗浄液、尿、脳脊髄液、胸膜滲出液、滑液、腹水、羊水、胃液、リンパ液、腸液、組織ホモジネート、細胞抽出液、唾液、痰、糞便、生理学的分泌物、涙、粘液、汗、乳汁、精液、精漿、膣分泌物、潰瘍及び他の表面噴出物からの液、水疱、及び膿瘍、並びに正常の、悪性の、及び疑わしい組織の生検を含む組織の抽出物、又は分析物を含み得る身体のあらゆる他の成分からなる群から選択されるものが含まれる。いくつかの実施形態において、試料は、血液、血漿、又は血清からなる群から選択される。本発明の方法のいくつかの実施形態において、試料は、対象の分析物分子に特異的な、蛍光標識した抗体と接触させた血清試料であり、前記分析物は、標識された分析物分子の存在、非存在、及び／又は濃度を検出することを含む。いくつかの実施形態において、選択された体積単位における検出可能種の分析物分子の数を計数し、定量することによって、濃度を決定する。いくつかのこれらの実施形態において、方法は、標識された分析物分子の前記存在、非存在、及び／又は濃度に基づいて、診断、予後、治療の状態、及び／又は治療の方法を決定することをさらに含む。
【００２８】
本明細書で用いられる「結合パートナー」は、本発明のアッセイにおいて、対象の分析物に結合する種を意味する。例示的結合パートナーには、「捕獲種」及び「検出可能種」が含まれ、これらは本質的に交換可能に用いられる。結合パートナーの非限定的な例には、タンパク質（例えば、抗体、受容体）、核酸、炭水化物、アミノ酸、脂質、毒素、毒液、薬物、ウイルス、細菌、細胞、及びこれらのあらゆる組合せが含まれる。様々な実施形態において、結合パートナーが検出可能種である場合、結合パートナーは検出可能な標識で標識される。いくつかの実施形態において、結合パートナーが捕獲種である場合、結合パートナーは共有結合的又は非共有結合的な相互作用によって磁性粒子に結合する。
【００２９】
本明細書で用いられる「検出可能種」は、分析物に対する第１の検出可能な結合パートナー、又は分析物と結合する様々な結合パートナーに対する検出可能な結合パートナーを意味する。例示的一実施形態において、検出可能種は、分析物に対する、又は分析物に対する様々な結合パートナーに特異的に結合する。様々な実施形態において、検出可能種の単一分子は本発明の方法を用いて検出可能である。本発明の多くの実施形態において、免疫アッセイ（例えば、サンドイッチ、Ｅｌｉｓａなど）に関する当技術分野における基礎的知識が適用可能であり、例示的検出可能種は検出可能標識にコンジュゲートしている抗体である。ある実施形態において、検出可能種の単一分子は本発明の方法によって検出可能である。様々な実施形態において、検出可能種は分析物に可逆的に結合し、したがって周囲の環境が変わるとき、分析物は検出可能種から放出される。好ましい一実施形態において、検出可能種は分析物に対する代理であり、推定することができ、又は実験的に決定することができるやり方において分析物の単一分子と相関している。
【００３０】
「捕獲種」は、試料中の、少なくとも１つの非分析物の汚染性物質から、分析物の分離を可能にする、分析物を特異的に認識する、分析物に対する結合パートナーを意味する。様々な実施形態において、分析物と捕獲種の間に形成された複合体は、１つ又は複数の洗浄ステップを通して安定であり、分析物の本質的に全ての汚染性物質からの分離を可能にする。様々な実施形態において、捕獲種は分析種に可逆的に結合し、したがって、周囲の環境が変わるとき、分析物は捕獲種から放出される。例示的捕獲種は抗体、例えば、サイトカイン、増殖因子、又は他の生物学的に関連のある分析物に対する抗体である。
【００３１】
本明細書で用いられる、「磁性粒子」の語は、永久双極子モーメント又は誘起双極子モーメントを有する磁性ビーズ又は磁性粒子を意味する。本発明において用いられる例示的磁性粒子には、分析物及び粒子に対して粒子と結合パートナー（「捕獲種」）の間のコンジュゲートを可能にする反応性官能性が含まれる。本質的に、この特徴を有するあらゆる様式の磁性粒子が、本発明において有用である。例えば、多糖がコーティングする常磁性微粒子又はナノ粒子を用いて粒子を標識してもよい。Ｍｏｌｄａｙに発行された米国特許第４，４５２，７７３号は、磁性の鉄−デキストラン磁性粒子の調製を記載しており、生物学的材料に付着するのに適する粒子を調製する様々な方法を記載する概要を提供している。急勾配磁力分離方法において用いられる磁性粒子に対するポリマー性コーティングの記載は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉに発行されたドイツ国特許第３７２０８４４号及び米国特許第５，３８５，７０７号に見出され、両方ともその全文が参照によって本明細書に援用される。常磁性の磁性粒子を調製するための方法は、米国特許第４，７７０，１８３号に記載されている。
【００３２】
磁性粒子は、あらゆる好適な方法によってそれに付着している結合パートナー分子で官能基化されている。例えば、磁性粒子は、当技術分野では知られているプロセスに従って、例えば、当技術分野では知られているいくつかのカップリング反応の１つで（Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９６年）；Ｌ．Ｉｌｉｕｍ、Ｐ．Ｄ．Ｅ．Ｊｏｎｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１１２巻、６７〜８４頁（１９８５年））、核酸、例えば、ＤＮＡ（オリゴヌクレオチド）又はＲＮＡのフラグメント、ペプチド又はタンパク質、アプタマー、及び有機小分子にコンジュゲートしていてよい。本発明のある実施形態において、官能基化された磁性粒子は、それに共有結合している結合パートナー分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はタンパク質）を有する。結合パートナー分子は、非共有結合的な（例えば、ファンデルワールス、疎水性−疎水性、親水性−親水性、又はイオン性の）相互作用によって磁性粒子に結合している。例示的実施形態において、結合パートナー分子は、ビオチン−ストレプトアビジンの相互作用によって磁性粒子にコンジュゲートしている。様々な実施形態において、磁性粒子はストレプトアビジンで官能基化されており、結合パートナーはアビジンで官能基化されている。他の実施形態において、磁性粒子はビオチンで官能基化されており、結合パートナーはストレプトアビジンにコンジュゲートしている。
【００３３】
結合パートナー分子での磁性粒子の官能基化には、例えば、指定される磁性粒子に対してあらゆる数々の望ましい結合パートナーを付着させるための標準の液体処理ロボット及び９６ウェルの様式を用いて平行して行うことができる、１段階又は２段階の反応を典型的に必要とする。試料をＱＣ測定用に吸引することができる。各バッチの磁性粒子は、アッセイ対アッセイの変動が最小になるように、多重アッセイ用の材料を潜在的に提供する。磁性粒子を、必要とされるまで緩衝化されたバルク懸濁液中に貯蔵することができる。
【００３４】
分析物を、磁性粒子−固定化した捕獲種に付着させるための正確な方法は本発明を行うのに重要ではなく、数々の代替が当技術分野において知られている。付着は、一般的に、分析物分子の、磁性粒子のコーティングにコンジュゲートし、相互作用のために官能基を提供する特異的な結合パートナーとの相互作用によるものである。抗体は結合パートナーの例である。抗体が高親和性の結合システムの１種（例えば、ビオチン）にカップリングすることができ、分析物分子が他の１種（例えば、アビジン）に付着することができる。抗マウスＩｇ及び抗ラットＩｇなどの、第１の抗体の種特異的なエピトープを認識する第２の抗体を、本発明において用いることもできる。間接的なカップリング方法により、様々な分析物分子とともに、例えば、抗体、アビジンなど、磁力的にカップリングする単一の実体の使用が可能になる。
【００３５】
本明細書で用いられる「標識」の語は、本発明において用いる単一分子分析器において、１つ若しくは複数の単一分子、又は１つ若しくは複数の検出可能種を個々に検出可能にするあらゆる種を意味する。本発明において用いる標識には、色素タグ、電荷タグ、質量タグ、量子ドット、又はビーズ、磁性タグ、光散乱タグ、高分子色素、及びポリマーに付着する色素が含まれる。
【００３６】
蛍光の標識、又は色素は、本発明において用いる標識のタイプの非限定的な例である。蛍光標識の例は、ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＴ  ＰＲＯＢＥＳ  ＡＮＤ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ＰＲＯＤＵＣＴＳ（Ｒ．Ｈａｕｇｌａｎｄ、第９版、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｐｕｂ．、（２００４年））に見出すことができる。色素には、材料に色を加え、及び／又は発光若しくは蛍光の光の産生を可能にする非常に様々な化合物が含まれる。色素は、特異的な波長で光を吸収し、又は光を放射することができる。色素は、インターカレートし、又は分析物分子に対して非共有結合的若しくは共有結合的に結合することができる。色素はそれ自体、副溝構造、十字部、ループ、又は分析物分子の他の高次構造エレメントなど、分析物上の様々な構造を検出すプローブを構成することができる。色素は、ＢＯＤＩＰＹ及びＡＬＥＸＡ色素、Ｃｙ［ｎ］色素、ＳＹＢＲ色素、エチジウムブロマイド及び関連色素、アクリジンオレンジ、二量体シアニン色素（例えば、ＴＯＴＯ、ＹＯＹＯ、ＢＯＢＯ、ＴＯＰＲＯ  ＰＯＰＲＯ、及びＰＯＰＯ、並びにこれらの誘導体）、ｂｉｓ−ベンズイミド、ＯｌｉＧｒｅｅｎ、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ及び関連色素、シアニン色素、フルオレセイン、ＬＤＳ７５１、ＤＡＰＩ、ＡＭＣＡ、カスケードブルー（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ）、ＣＬ−ＮＥＲＦ、Ｄａｎｓｙｌ、ジアルキルアミノクマリン、４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、２’，７’−ジクロロフルオレセイン、ＤＭ−ＮＥＲＦ、エオジン、エリスロシン、フルオレセイン、ヒドロキシクマリン、イソスルファンブルー、リサミンローダミンＢ、マラカイトグリーン、メトキシクマリン、ナフトフルオレセイン、ＮＢＤ、オレゴングリーン、ＰｙＭＰＯ、ピレン、ローダミン、ロドールグリーン（Ｒｈｏｄｏｌ  Ｇｒｅｅｎ）、２’，４’，５’，７’−テトラブロモスルホンフルオレセイン、テトラメチルローダミン、テキサスレッド、Ｘ−ローダミン、ジオミック色素（Ｄｙｏｍｉｃ  ｄｙｅ）系、Ａｔｔｏ−ｔｅｃ色素系、クマリン、フィコビリタンパク質（フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン）、緑色、黄色、赤色、及び他の蛍光タンパク質、アップコンバーティングホスファー（ｕｐ−ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｓ）、並びに量子ドットを含むことができる。当業者であれば、本発明の範囲内で用いることができる他の色素を認めるであろう。これは網羅的な列挙ではなく、許容される色素は、本発明の方法を用いて、標識された分析物分子の検出を可能にするのに用いることができる、現在知られていない、又は将来知られる色素が全て含まれる。
【００３７】
例示的一実施形態において、検出可能な標識は、発光標識、又は光散乱標識である。一実施形態において、検出可能な標識は発光標識である。本発明の範囲から逸脱することなしに他の発光標識を用いることができるが、有用な発光標識には、数ある中で、蛍光標識、化学発光標識、及び生物発光標識が含まれる。さらに、蛍光消光もモニタリングすることができる。さらに、本発明の範囲から逸脱することなしに、他の光散乱標識を用いることができる。有用な光散乱標識には、数ある中で、金、銀、白金、セレン、及び酸化チタンなどの金属が含まれる。検出可能な標識は、分析物分子の内因的な性質及び外因的な性質のあらゆる組合せによって生成することもできる。
【００３８】
本発明において用いることができる光散乱タグには、白金、金、銀、セレン、及び酸化チタンなどの金属が含まれる。当業者であれば、他の微粒子又はビーズも光散乱タグとして用いることができることを認めるであろう。他の有用な標識には、電気泳動速度、及び／又は電気泳動では分離することができない同じ若しくは異なるサイズの標的の分析物分子の分離に影響を及ぼす標識が含まれる。このような標識は、電荷／重量タグと呼ばれる。電荷／重量タグが付着することにより、その電気泳動の移動度及び分離に影響を及ぼす方法で、及び影響を及ぼす程度に、電荷の、標的の分析物分子の翻訳の摩擦抵抗に対する比が変化する。
【００３９】
別の一実施形態において、標識は、電荷、又は質量、又は電荷と質量の組合せを変化させる。分析物分子に結合している電荷／質量タグは、電界におけるこれらの挙動における空間的相違によって、又は電界におけるこれらの挙動における速度の相違によって、非結合の分析物の分子又は非結合のタグから識別することができる。
【００４０】
分析物分子に対する結合パートナーを標識するための方法、結合パートナーを検出可能種に変換するための方法は、当業者にはよく知られている。分析物分子に対する標識の付着は、直接的な付着、又は結合パートナーの使用を含めたあらゆる知られている方法を用いることができる。いくつかの場合において標識化の方法は非特異的である。例えば、核酸の特異的なヌクレオチド配列に関係なく核酸を全て標識する方法が知られている。他の場合において、標識されたオリゴヌクレオチドが標的の核酸配列に特異的に結合する場合におけるように、標識化は特異的である。
【００４１】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、試料における複数の分析物分子に対して分析を行うことを含む。これらのいくつかの実施形態において、複数の分析物分子の検出された分析物分子の各々は標識を含み、この場合検出された各分析物分子は、標識の同一性、標識の強度、移動度、又はこれらの組合せからなる群から選択される特徴によって他分子と識別される。
【００４２】
本明細書で用いられる「ビン（ｂｉｎ）」の語は、その間に検出可能種からのシグナルが検出／測定される予め決定された時間を意味する。例示的一実施形態において、ビンは、その間に発光標識からの光子が検出／測定される時間の単位である。
【００４３】
「事象光子（単数又は複数）」の語は、本発明の方法において検出可能な光子の収集物を意味する。事象光子（単数又は複数）は、ビンにおける光子が検出される時間における所与の点の、「ビン」内に位置する光子である。事象光子は、ビン内の光の振幅の尺度として数量化できる。
【００４４】
「全光子（単数又は複数）」の語は、本発明の方法において検出可能な光子の収集物を意味する。全光子は、ビンにおける光子を全て合計することによって測定される。
【００４５】
実施形態
第１の態様において、本発明は、検出可能種が特異的に結合する分析物の分析物分子に相関する検出可能種の分析物分子を検出するアッセイを行う方法を提供する。本発明のこの方法及び他の方法において、分析物に特異的に結合していない本質的に全ての検出可能種がアッセイ混合物から除去された後に検出可能種が検出され、測定され、且つ／又は定量されるのが一般的に好ましい。
【００４６】
様々な実施形態において、本発明の方法は、第１の容器中において、分析物と、分析物に特異的に結合する捕獲種の間に複合体を形成することを含む。捕獲種は磁性粒子に固定化されている。分析物の捕獲の後、依然として第１の容器中において、複合体を、分析物に特異的に結合する検出可能種と接触させることにより、検出可能種の固定化複合体を形成する。次いで、固定化複合体を第１の容器から除去し、検出可能種を含まない第２の容器に移す。次に第２の容器中において、検出可能種を固定化複合体から溶出する。分析物分子を検出するのに好適な装置を用いて、検出可能種の単一分子を検出する。
【００４７】
ある実施形態において、検出可能種の単一分子は、本質的に同じ構造を有する検出可能種の複数の分子のうちの１個である。他の様々な実施形態において、検出可能種の２つ又はそれを超える個体数が存在し、各個体数は、識別可能な異なる構造の検出可能種を含んでいる。
【００４８】
様々な実施形態において、本発明は、本発明のアッセイの結果に基づいて、診断、予後、治療の状態、及び治療の方法を決定する方法を提供する。例示的方法には、単一分子ベースによって単一分子上の検出可能種の複数の分析物分子を定量し（平均濃度とは別のものとして）、この定量に由来する量を、診断、予後、治療の状態、又は治療の方法に相関させる、さらなるエレメントとともに、先に記載したステップが含まれる。
【００４９】
単一分子分析器を用いて少なくとも１個の分析物分子を検出するための方法も提供する。有用な単一分子分析器の特定の特徴は、広範囲の分析物分子を検出する能力である。分析器によって検出することができる分析物分子には、それだけには限定されないが、有機及び無機の分子及び生物学的薬剤、超分子複合体、細胞小器官、ビーズ、分子の会合、超分子複合体の会合、並びに生物体が含まれる。本発明の分析器及び方法を用いて検出可能な分析物の非限定的な例には、タンパク質などの生体高分子、例えば、サイトカイン、核酸、炭水化物、並びに有機及び無機両方の小分子化学実体が含まれる。後者の例には、それだけには限定されないが、抗自己免疫欠損症候群物質、抗体、抗癌物質、抗生物質、抗ウイルス物質、酵素、酵素阻害薬、神経毒、オピオイド、催眠薬、抗ヒスタミン薬、トランキライザー、抗痙攣薬、筋肉弛緩薬及び抗パーキンソン物質、鎮痙薬及び筋収縮薬、縮瞳薬及び抗コリン薬、免疫抑制薬（例えば、シクロスポリン）、抗緑内障溶質、抗寄生虫薬及び／又は抗原虫溶質、降圧薬、鎮痛薬、解熱薬及び抗炎症薬（例えば、非ステロイド性抗炎症薬）、局所麻酔薬、眼科（ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃｓ）、プロスタグランジン、抗うつ薬、抗精神病物質、制吐薬、造影剤、特異的ターゲティング剤、神経伝達物質、タンパク質及び細胞応答調節薬が含まれる。
【００５０】
同様に、検出可能な化学実体は、アミノ酸、ヌクレオチド、脂質、糖、薬物、毒素、毒液、基質、ファルマコフォア、及びこれらのあらゆる組合せなどの小分子を包含する。タンパク質は、細胞集合体、血液型、病原体、病原体に対する免疫応答、免疫複合体、糖類、レクチン、天然に存在する受容体などの検出など、広範囲の治療及び診断における対象でもある。検出可能な分子の他の例には、ナノ粒子、微粒子、デンドリマー、染色体、細胞小器官、ミセル、及び担体分子が含まれる。
【００５１】
本発明の方法において検出可能なものには、単一分子の複合体から構成される単一種、標識が結合している生物体、２つ又はそれを超える核酸の複合体、及び１つ若しくは複数の抗体又は抗体フラグメントに結合している標的の単一分子の複合体もある。２つ又はそれを超えるタイプの単一分子が検出される場合の例示的複合体には、タンパク質、受容体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、炭水化物、オルガネラ、ウイルス、細胞、細菌、真菌、それらのフラグメント、及びこれらの組合せから選択される単一分子が含まれる。当業者であれば、本明細書に提供する多数の例に鑑みて、これら及び他の単一分子を検出するのに、本発明の分析器及び関連方法を適応させる方法を認めるであろう。
【００５２】
一実施形態において、本発明の方法によって検出される化学実体には、合成の、又は天然に存在するホルモン、天然に存在する薬物、合成の薬物、汚染物質、アレルゲン、アフェクター（ａｆｆｅｃｔｅｒ）分子、増殖因子、ケモカイン、サイトカイン、リンホカイン、アミノ酸、オリゴペプチド、化学的中間体、ヌクレオチド、及びオリゴヌクレオチドが含まれる。
【００５３】
本発明の方法は、試料中の、通常の会合を有する、又は所望の情報を提供する複数のタイプの単一分子、即ち「パネル」の存在、非存在、及び／又は濃度を検出することを含む。本明細書で用いる「パネル」は、その存在が本発明のアッセイによって検出され得る１群の分析物分子を包含する。分析物分子は、本発明のシステムによってその検出が可能になる内因的な特徴を有していてよく、又は検出されるために標識化を必要としてもよい。したがって、本発明の方法は、１パネルの分析物分子の１つ若しくは複数の１種の存在、非存在、及び／又は濃度を検出するための好適な標識、又は複数の標識に試料を接触させることを含むことができる。このような分析物分子のパネルは、例えば、バイオテロ試料の分析、医学的試験、診断、予後、モニタリング、及び／又は治療の選択、生物医学的研究、法医学、農学的分析、及び工業的応用において有用である。例えば、パネルは、特定のタイプの診断（例えば、感染性生物のパネル、心臓血管疾患、癌若しくは特定のタイプの癌、糖尿病、関節炎、アルツハイマー病などの疾患に対するマーカーのパネル、又は様々な系統の機能を評価するためのパネル、例えば、内分泌のパネル）に関連していてよく、パネルは、バイオテロに関連していてよく（例えば、バイオテロの生物体若しくは毒素の可能性があるパネル）、パネルは医学的スクリーニングにおいて有用であってよく（例えば、特定の遺伝子多型、或いは特定の疾患又は病理学的状態に関連する突然変異に関連する、又は通常若しくは過正常の状態に関連するタンパク質のパネル）、パネルは予後に関連していてよい（例えば、特定の症候群、疾患、又は障害（例えば、癌）に関連するマーカーのパネルを用いて、症候群、疾患、又は障害を根絶するための治療後の症候群、疾患、又は障害の再発及び／又は進行を決定することができる）。パネルはまた、血液試料をスクリーニングするのに有用であり、数々の感染性物質、及び／又はそれに対して血液がスクリーニングされる抗体を含むことができる。同様に、単一の試料を本発明の方法において分析して、あらゆる数々の乱用物質、環境物質、又は獣医学的に重要な物質を検出することができる。本発明の利点は、これにより、障害、疾患、又は症候群を有すると疑われる個体に対して運転して障害、疾患、又は症候群に対する原因物質を同時に検出することができる試験のパネルを構築することができるようになることである。パネルが有用である他の領域には研究が含まれる。
【００５４】
本発明は、本発明の方法を行うための試薬及びキットも含む。一実施形態において、キットは、本発明の方法において測定される分析物（例えば、サイトカイン）に対する抗体を含む。キットは、アッセイ希釈液、標準、対照、及び／又は検出可能な標識をさらに含むことができる。アッセイ希釈液、標準、及び／又は対照は、特定の試料マトリックスに対して最適化することができる。例えば、血液、血清、又は血漿試料における測定に対して、希釈液、標準、及び対照は、ｉ）ヒトの血液、血清、若しくは血漿、ｉｉ）動物の血液、血清、若しくは血漿、又はｉｉｉ）人口の血液、血清、又は血漿代替物を含むことができる。
【００５５】
本発明によって検出可能な分析物タンパク質分子の一例として、様々なサイトカインは、様々な疾患を診断及び／又はモニタリングするための、及び疾患の治療における有効性に対して薬物又は薬物候補をスクリーニングするための、本発明の方法を行うための、診断マーカー（単数又は複数）として潜在的に有用であることが注目される。実際、以下により詳しく記載する通り、本発明のある実施形態は、そのような診断マーカー（単数又は複数）として働くことができる特定の候補のサイトカイン（単数又は複数）の有効性を決定するための方法を提供する。本発明の方法を用いて、当業者であれば過度の実験を行わずに、その測定されたレベル／プロファイルが本発明の様々な診断方法及びスクリーニング方法を行うのに用いることができるマーカーとして有用であると、本明細書に詳しく列挙されておらず、実際にまだ発見されていないサイトカイン及び他のマーカーを含めた１つ又は複数の選択されたサイトカイン又は他のマーカーの能力を決定することができる。
【００５６】
サイトカイン
様々な実施形態において、本発明のアッセイ方法を用いて検出される分析物分子は、免疫応答の調節に関与する分泌されるタンパク質であるサイトカインなどの炎症マーカーを含む。サイトカインには、インターロイキン（ＩＬ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、ケモカイン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、及び様々なコロニー刺激因子（ＣＳＦ）が含まれる。研究及び診断の両方に対して、サイトカインは、数々の状態、疾患、病理などのマーカーとして有用であり、いくつかの異なるパネルにおいて含まれていてよい。現在、その協調的な又は不調和な調節が臨床的に注目されているサイトカイン／ケモカインは１００種を超えて存在する。現在マーカーのパネルにおいて用いられ、本発明の方法及び組成物において用いられるパネルにおいて用いることができる例示的サイトカインには、それだけには限定されないが、ＢＤＮＦ、ＣＲＥＢ  ｐＳ１３３、ＣＲＥＢ  Ｔｏｔａｌ、ＤＲ−５、ＥＧＦ、ＥＮＡ−７８、エオタキシン、脂肪酸結合性タンパク質、ＦＧＦ−ｂａｓｉｃ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＣＰ−２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＲＯ−ＫＣ、ＨＧＦ、ＩＣＡＭ−１、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１２  ｐ４０／ｐ７０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−１ｒａ／ＩＬ−ＩＦ３、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＰ−１０、ＪＥ／ＭＣＰ−１、ＫＣ、ＫＣ／ＧＲＯａ、ＬＩＦ、リンホタシン（Ｌｙｍｐｈｏｔａｃｉｎ）、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−１（ＭＣＡＦ）、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−５、ＭＤＣ、ＭＩＧ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−１γ、ＭＩＰ−２、ＭＩＰ−３β、ＯＳＭ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＲＡＮＴＥＳ、Ｒｂ（ｐＴ８２１）、Ｒｂ（ｔｏｔａｌ）、ＲｂＰＳｐＴ２４９／２５２、Ｔａｕ（ｐＳ２１４）、Ｔａｕ（ｐＳ３９６）、Ｔａｕ（ｔｏｔａｌ）、組織因子、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＴＮＦ−ＲＩ、ＴＮＦ−ＲＩＩ、ＶＣＡＭ−Ｉ、ＶＥＧＦが含まれる。本発明で用いられるサイトカインの語には、可溶性サイトカイン受容体も含まれる。
【００５７】
当業者であれば理解されるように、サイトカインは、本発明の方法によって検出可能な有用なマーカーの代表例である。サイトカインに焦点をあてたのは説明を明確にするためであり、サイトカインを参照して本明細書に記載する方法は、他のマーカーの分析物分子の検出に等しく適する。
【００５８】
様々な実施形態において、特定の疾患プロセスをサイトカインレベルの変化と相関させるために、有望な取組みは本発明の方法を用いて複数のサイトカインに関して各試料を分析することである。
【００５９】
本発明の様々な実施形態によると、サイトカイン又は他の疾患マーカー候補のレベルを、疾患を有すると臨床的に診断された個体、或いは疾患を有すると疑われる（例えば、医師の問診、内視鏡検査、画像化、及び／又は生検などの従来の診断方法を用いて）個体から、並びに健康個体から収集した試料において測定する。本発明の非限定的な例の範囲内では、正常と疾患患者を識別するマーカーとして価値のある特定のサイトカインは、データの目視検査を用いて、例えば、一次元若しくは多次元のグラフ上にプロットしたデータ、又は統計学的分析の方法（例えば、対照の個体と疾患患者の間の統計学的に重みをつけた差、及び／又は受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線分析）を用いることによって同定され得る。本発明のこの実施形態及び他の実施形態において用いるデータ分析のさらなる方式を本明細書の以下に述べる。
【００６０】
本発明のいくつかの実施形態において、疾患の存在又は程度の決定は、１つ又は複数のサイトカインのレベルを、疾患の非存在、存在、又は程度を示すサイトカインプロファイルと比較することを含むことができる。一例において、血液、血清、及び血漿試料中の１つ又は複数のサイトカインのレベルを、疾患の存在又は程度を示すサイトカインプロファイルと比較する。例示的一実施形態において、比較のステップは、サイトカインレベルを検出のカットオフ値と比較すること、サイトカインレベルの比を検出のカットオフ比値と比較すること、２つのサイトカインのレベルを２つの分析物の相関プロットにおける検出のカットオフラインと比較すること、多数のサイトカインのレベルを多分析物の相関プロットにおける検出のカットオフ曲線若しくは表面と比較すること、及び／又は多数のサイトカインのレベルを多分析物相関プロットにおける検出帯域（例えば、検出面積若しくは検出体積）と比較することを含むことができる。
【００６１】
本発明の一実施形態は、疾患を診断するための方法を含む。方法は、本明細書に記載する単一分子検出を用いて試料中のサイトカインのレベルを測定すること、及び測定したレベルから対象における疾患の存在又は非存在を診断することを含む。
【００６２】
本発明の様々な実施形態において、疾患を有すると疑われる患者から得た試料などの試料中のサイトカインのレベルを測定すること、及び測定したレベルから前記患者における疾患の存在又は非存在を診断することを含む、疾患を検出するための方法を提供する。一実施形態において、試料は、血液、血清、又は血漿の試料である。
【００６３】
本発明のいくつかの実施形態において、方法は、患者が炎症性疾患を有する場合は測定したサイトカインレベルから決定すること、及び／又は測定したサイトカインレベルから炎症性疾患による炎症のレベルを決定すること、及び／又は炎症性疾患の進行若しくはそのような疾患に対する治療の有効性をモニタリングするために様々な時間に試料を得、測定することを伴う。一実施形態において、方法はサイトカインのレベルを測定することを含む。
【００６４】
ある実施形態において、本発明は、複数のサイトカインを測定することを含む方法を提供し、これらのサイトカインのレベルを、疾患を示すと決定されるサイトカインのプロファイルと比較することを含むこともできる。様々な試料を分析することができる。ある実施形態において、試料を、ヒト患者から非外科的な侵襲性の方法によって得ることができ、例えば、血液、血清、血漿、糞便、又は尿の試料を含むことができる。
【００６５】
特定のサイトカインの特定のレベルは、様々な集団から測定したレベルに基づいて、高い又は低いと決定することができる。例示的集団には、制限なく、強直性脊椎炎患者、関節外の併発を有する患者、軸関節の破壊を有する患者、及び健康個体の集団が含まれる。特定の症候群、疾患、又は障害と同定される他のサイトカインは当業者には知られており、本明細書に開示し、例示する方法において利用することができる。
【００６６】
当技術分野において、同様の疾患の徴候を表す患者は、患者の血清、血漿、滑液、組織、脳脊髄液、又は他の体液の試料内に様々なレベルの特定のサイトカインを有し得ることが認められている。したがって、末梢の血液、血清、血漿、滑液、組織、脳脊髄液、又は他の体液のサイトカインプロファイルの決定は、各患者個体に対する適切な治療プロトコールを決定するのに用いることができる。例えば、同様の症状を有する２人の患者では、患者の血清内のＩＬ−１０レベルが異なることがある。低レベルの患者はＩＬ−１０治療の恩恵を受け、ＩＬ−１０高レベルの患者は、生物学的薬物と呼ばれる医薬品のクラスである抗ＩＬ−１０抗体薬物などのＩＬ−１０阻害薬での治療の恩恵を受けることがある。このように、患者からのサイトカインのプロファイルの決定は、適切な治療を決定し、治療に対する個々の患者の反応を測定するのに用いることができる情報を医師及び患者に提供する手助けとなり得る。
【００６７】
本発明の一実施形態は、第一のサイトカインのレベルを測定すること、例えば、炎症性疾患を有する、又は有すると疑われる患者から得た試料において測定すること、１つ又は複数のさらなるサイトカインのレベルを測定すること（この場合、１つ又は複数のさらなるサイトカインは第１のサイトカインと異なる）、及び測定したレベルから、疾患からの炎症の程度を決定することを含む方法を含んでいる。
【００６８】
相互からの分析物のサイトカイン分子のタイプを識別するための例示的方法を本明細書に記載する。とりわけ、分析物の単一分子に相関する検出可能種の単一分子を検出するための方法は（原動力が電気運動である場合は、）組合せの標識シグナル強度（例えば、異なる単一分子上の異なる数の標識）、標識同一性（例えば、異なる単一分子上の異なる標識）、及び標識の移動性（例えば、異なる単一分子に対する異なる移動性）、又はこれらの組合せを用いることができる。
【００６９】
本発明の方法のある実施形態は、選択されたサイトカインの測定されたレベルに基づいて第１の疾患と第２の疾患をさらに識別することができる。例えば、第１の疾患と第２の疾患を識別する例示的方法は、測定されたサイトカインレベルを識別のカットオフ値と比較することを含み、この場合測定されたレベルが識別のカットオフ値未満であればクローン病を示すと考えられ、識別のカットオフ値を超えたら潰瘍性大腸炎を示すと考えられる。
【００７０】
例示的一実施形態において、患者が疾患を有する場合、第１のサイトカインレベルから、及び１つ又は複数のさらなるサイトカインレベルから決定することは、１つ又は複数のサイトカインレベルを、疾患を示すと決定されるサイトカインのプロファイルと比較することを含む。比較のステップは、サイトカインレベルを検出のカットオフ値と比較すること、レベルの比を検出のカットオフ比値と比較すること、及び／又はレベルを多重分析物相関プロットにおける検出のカットオフライン、曲線、若しくは表面に比較することを含むことができる。
【００７１】
比較のステップは、レベルを識別カットオフ値と比較すること、レベルの比を識別カットオフ比値と比較すること、及び／又はレベルを識別カットオフラインと比較することを含むことができる。
【００７２】
一実施形態において、サイトカインレベルをサイトカイン識別カットオフ値と比較することによって第１の疾患を第２の疾患と識別し、サイトカインレベルがサイトカイン識別カットオフ値未満であれば第１の疾患を示すと考えられ、サイトカイン識別カットオフ値を超えれば第２の疾患を示すと考えられる。さらに別の一実施形態において、サイトカインレベルをサイトカイン識別カットオフラインと比較することによって潰瘍性大腸炎はクローン病と識別され、この場合、サイトカインレベルがサイトカイン識別カットオフライン未満であればクローン病を示すと考えられ、サイトカイン識別カットオフラインを超えれば潰瘍性大腸炎を示すと考えられる。
【００７３】
さらに別の一実施形態において、測定したサイトカインレベルを、相関プロット上の第１の検出カットオフラインと第２の識別カットオフライン間に位置する領域と規定されるサイトカインプロファイルに比較することによって、第１の疾患を第２の疾患と識別する。
【００７４】
さらに別の一実施形態において、（ａ）患者の試料を得ること、（ｂ）本発明の方法に従って患者の試料内の１つ又は複数のサイトカインレベルを測定すること、（ｃ）測定したサイトカインレベルを、重症の炎症性疾患又は自己免疫疾患の状態を発症する又は有する患者において見出されるサイトカインの予め規定されたレベルと比較すること、及び（ｄ）前記患者が重症の炎症性疾患又は自己免疫疾患の状態を発症しやすくなるか否かを決定することを含む、炎症性疾患又は自己免疫疾患の状態を有する患者が重症の炎症性疾患又は自己免疫疾患の状態を発症しやすくなっているか否かを決定するための方法を提供する。
【００７５】
一実施形態において、患者において測定された２つ又はそれを超えるサイトカインを、これらの２つ又はそれを超えるサイトカインプロファイル（例えば、潰瘍性大腸炎を有する患者、クローン病を有する患者、及び健康個体を示す、相関プロット上の値、比、ライン、又は帯域）と比較することによって、潰瘍性大腸炎をクローン病と識別する。
【００７６】
一実施形態において、第１のサイトカインレベルがサイトカイン検出のカットオフ値を超え、さらなるサイトカインのレベルがサイトカイン検出のカットオフ値未満であると疾患を示すと考えられる。別の一実施形態において、第１のサイトカインレベルのさらなる１つのサイトカインレベルに対する比が検出のカットオフ比値を超えると疾患を示すと考えられる。さらに別の一実施形態において、サイトカインレベルがサイトカイン検出のカットオフラインを超えると疾患を示すと考えられる。
【００７７】
本発明の他の様々な実施形態において、疾患を治療するための薬物又は薬物候補の有効性を評価するための方法を提供する。例えば、本発明は、疾患を有するヒト若しくは非ヒト動物、及び／又はモデル系統、例えば、組織、細胞培養物、若しくは生化学系統を薬物又は薬物候補に曝露すること、ヒト若しくは非ヒト動物若しくはモデル系統から得た試料中のサイトカインのレベルを測定すること、並びに本発明の方法によって測定されたサイトカインレベルから薬物若しくは薬物候補の有効性を決定することを含む、薬物及び／又は薬物候補の有効性を評価するための方法を含む。
【００７８】
別の一例において、本発明は、疾患を有するヒト若しくは非ヒト動物、及び／又はモデル系統、例えば、組織、細胞培養物、若しくは生化学系統を薬物又は薬物候補に曝露すること、ヒト若しくは非ヒト動物若しくはモデル系統から得た試料中の第１のサイトカインのレベルを測定すること、同じヒト若しくは非ヒト動物若しくはモデル系統から得た同じ試料若しくは異なる試料中の１つ又は複数のさらなるサイトカインのレベルを測定すること（この場合、１つ又は複数のさらなるサイトカインは第１のサイトカインと異なる）、並びに測定されたレベルから薬物若しくは薬物候補の有効性を決定することを含む、薬物又は薬物候補の有効性を評価するための方法を含む。
【００７９】
方法は、１つ又は複数のサイトカインレベルを、薬物又は薬物候補で治療しなかった対照のヒト又は非ヒト動物におけるレベルと比較することも含むことができる。これらの薬物評価方法におけるヒト又は非ヒト動物は、疾患の挙動を模範とする組織、細胞培養物、又は生化学系統などのｉｎ  ｖｉｔｒｏの疾患モデル系統と置き換えることができる。
【００８０】
また、（ａ）炎症性疾患又は自己免疫疾患の状態の患者に治療を受けさせること、（ｂ）前記患者から試料を得ること、（ｃ）患者試料内の複数のサイトカインのレベルを測定すること、（ｄ）複数のサイトカインのレベルを、予め規定したサイトカインレベルと比較すること、及び（ｅ）治療が効果的であったか否かを決定すること、を含む炎症性疾患又は自己免疫疾患の状態に対する治療を評価するための方法も提供する。
【００８１】
方法は、有効性の決定に基づいた治療レジメンの改変に関する決定を行うことをさらに含むことができる。様々な実施形態において、患者の試料には、末梢血、血清、血漿、脳脊髄液、組織試料、皮膚、又は他の体液試料が含まれる。予め決定されたレベルは、患者の試料中に見出されるサイトカインの中央値のレベルに対する情報を含むことができる。予め決定されたレベルは、１つ又は複数のサイトカインの治療前のレベル、健康対象及び／又は疾患を有する患者において観察された１つ又は複数のサイトカインのレベルを含むことができる。例示的一実施形態において、患者の試料は、関節外の併発を有する患者及び／又は大関節の破壊を有する患者からのものである。
【００８２】
本発明の一実施形態に従って、診断上価値のあるサイトカインを、本明細書の以下に記載する群から選択することができる。さらに、この実施形態に従って、これらのサイトカインに付随する様々な徴候の診断、予後、及び治療の経過を、本発明の方法を用いて決定することができる。
【００８３】
インターロイキン−１α（ＩＬ−１α）は、ヒトケラチノサイトによって大量に発現される。ＩＬ−１αは、様々な源からの活性型マクロファージ（肺胞のマクロファージ、クッパー細胞、脾臓及び腹膜の粘着性のマクロファージ）によっても生成され、また末梢好中球顆粒球、内皮細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞、ケラチノサイト、皮膚のランゲルハンス細胞、破骨細胞、アストロサイト、胸腺及び角膜の上皮細胞、Ｔ細胞、並びにＢ細胞によっても生成される。
【００８４】
ＩＬ−１の合成は、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、及びＩＦＮ−βを含めた他のサイトカインによって、また細菌の内毒素、ウイルス、分裂促進因子、及び抗原によっても誘発され得る。ヒト皮膚の線維芽細胞において、ＩＬ−１α及びＴＮＦ−αはＩＬ−１βの合成を誘発する。ヒト単核細胞は、細菌の内毒素に対して非常に感受性であり、ピコグラム／ｍＬ量の内毒素に反応してＩＬ−１を合成する。ヒト単球において、細菌のリポ多糖は、ＩＬ−１αよりもＩＬ−１βに対しておよそ１０倍多いｍＲＮＡ及びそれぞれのタンパク質を誘発する。
【００８５】
ＩＬ−１の主な生物学的活性はＴヘルパー細胞の刺激であり、Ｔヘルパー細胞は誘発されてＩＬ−２を分泌し、ＩＬ−２受容体を発現する。ウイルス感染したマクロファージは、Ｔ細胞成熟欠損患者における日和見感染及び細胞の形質転換を支持することがあるＩＬ−１阻害物質（ＩＬ−１ｒａ）を大量に生成する。
【００８６】
ＩＬ−１はＮＫ細胞及び線維芽細胞、胸腺細胞、神経膠芽腫細胞の増殖及び活性化を刺激する。これはアストログリア及びミクログリアの増殖も促進し、アストログリオーシス及び脱髄などの病理学的過程に関与することがある。ＩＬ−１は、ヒト胃癌細胞及び甲状腺癌細胞に対する自己分泌増殖調節因子であると思われる。ＩＬ−１は、ある種の腫瘍細胞タイプに対する抗増殖活性及び細胞破壊活性も有する。ＩＬ−１は、静脈血栓、動脈硬化、血管炎、及び播種性血管内凝固などの病理学的過程において重要な役割を果たす。ＩＬ−１は、線維芽細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、内皮細胞、肝細胞、及び破骨細胞などの炎症細胞におけるアラキドン酸（とりわけプロスタサイクリン及びＰＧＥ２）の代謝を顕著に増強する。ＩＬ−１は破骨細胞を活性化し、したがって新しい骨の形成を抑制する。しかし、ＩＬ−１の濃度が低いと新しい骨の増殖が促進される。ＩＬ−１は、脂肪細胞における酵素リポタンパク質リパーゼを阻害する。血管平滑筋細胞及び皮膚の線維芽細胞において、ＩＬ−１は、これらの細胞の分裂促進因子であるｂＦＧＦの合成を誘発する。インターロイキン−２（ＩＬ−２）同様、ＩＬ−１もニューロンの電気生理学的挙動を変調する。ＩＬ−１は、また中枢神経系に直接影響を及ぼす。
【００８７】
ＩＬ−２は、従来の治療に抵抗性である癌を有する患者を治療するのにますます用いられている（Ｗａｌｄｍａｎｎら、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、６８５巻、６０３〜１０頁、１９９３年）。客観的且つ永続的な臨床反応が、メラノーマ又は急性骨髄性白血病を有するある割合の患者においても記述されている（Ｂｒｏｏｍら、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ、６６巻、１１８５〜７頁、１９９２年）。
【００８８】
ＩＬ−４は、ホジキンリンパ腫に対する自己分泌増殖調節因子であると考えられている（Ｏｋａｂｅら、Ｌｙｍｐｈｏｍａ、８巻、５７〜６３頁、１９９２年）。
【００８９】
ＩＬ−４は、単球及びＴ細胞によるＩＬ−１、ＩＬ−６、及びＴＮＦ−αなどの炎症性サイトカインの生成を阻害するので、炎症性疾患及び自己免疫疾患の治療において臨床的に重要である可能性がある。ＩＬ−４は大腸癌及び乳癌の増殖を阻害する（Ｔｏｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５２巻、２７５〜９頁、１９９２年）。ＩＬ−４は、リンホカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ細胞）の発生を増大することが示されている。ＩＬ−４は、慢性リンパ性白血病の病原において本質的な役割を果たすことがあり、慢性リンパ性白血病は、悪性Ｂ細胞の死及び増殖の両方を防ぐことによってその分化が中間段階で停止された、分裂が遅く、長命のモノクローナルＢ細胞の蓄積を特徴とする。ＩＬ−４は、アポトーシス及び保護遺伝子であるＢＣＬ−２の発現の上方制御によって、慢性リンパ性白血病のＢ細胞を死滅から保護する（Ｄａｎｃｅｓｃｕら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１７６巻、１３１９〜２６頁、１９９２年）。
【００９０】
ＩＬ−６血清レベルの決定は、骨髄腫の活性をモニタリングし、腫瘍細胞の重量を計算するのに有用であることがある。ＩＬ−６の低血清レベルは、単クローン性ガンマグロブリン血症及びくすぶり型骨髄腫において見られ、進行性疾患を有する患者及び形質細胞白血病を有する患者において血清ＩＬ−６レベルは顕著に増大する（Ｖａｎ  Ｏｅｒｓら、Ａｎｎ．Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ、６６巻、２１９〜２３頁（１９９３年））。
【００９１】
ＩＬ−６の発現の調節解除は、おそらく数々の疾患の病原に関与する主要な因子の１つである（Ｌｅｇｅｒ−Ｒａｖｅｔら、Ｂｌｏｏｄ、７８巻、２９２３〜３０頁、１９９１年）。ＩＬ−６の過大な過剰産生が、関節リウマチ、多発性骨髄腫、レンネルト（Ｌｅｎｎｅｒｔ）症候群（組織球性リンパ腫）、キャッスルマン病（形質細胞の大量の浸潤を有するリンパ節腫脹、高ガンマグロブリン血症、貧血、及び急性期タンパク質濃度の亢進）、心臓粘液腫、及び肝硬変などの様々な病理学的状態において観察されている（Ｈｓｕら、Ｈｕｍ．Ｐａｔｈｏｌ．、２４巻、８３３〜９頁、１９９３年）。神経膠芽腫によるＩＬ−６の構成的な合成、及び脳脊髄液中へのＩＬ−６の分泌は、血清における急性期タンパク質及び免疫複合体のレベルの増大を説明することができる（Ｍｕｌｅら、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１４３巻、７７７〜９頁、１９９１年）。
【００９２】
ＩＬ−６は慢性多発性関節炎の病原においてもおそらく役割を果たしている、というのは滑液中に過剰濃度のＩＬ−６が見られるからである。造血細胞に対するその効果によって、あるタイプの貧血及び血小板減少症の治療にはＩＬ−６が適切であり得ることが示唆されている（Ｂｒａｃｈら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２２巻、１４３〜５１頁、１９９２年）。ＩＬ−３で前治療し、引き続きＩＬ−６を投与すると、血小板計数値を増大することが示されている。ＩＬ−６は、他のサイトカイン（例えば、ＩＬ−２）と併用して、いくつかの腫瘍タイプの治療に有用であり得る（Ｄｕｌｌｅｎｓら、Ｉｎ  ｖｉｖｏ、５巻、５６７〜７０頁、１９９１年）。
【００９３】
細菌性及びウイルス性の髄膜炎において、脳脊髄液中に非常に高レベルのＩＬ−６が頻繁に観察される。移植を受けた患者の尿中における高濃度のＩＬ−６の検出は、移植片対宿主反応の早期の指標であることがある（Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏら、Ｂｌｏｏｄ、７４巻、１〜１０頁、１９９０年）。羊水中におけるＩＬ−６の検出は羊水内感染の指標であることがある。炎症性腸疾患において、ＩＬ−６の血漿レベルの増大は疾患状態の指標であることがある（Ｗｏｌｖｅｋａｍｐら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、２４巻、１〜９頁、１９９０年）。糸球体増殖性糸球体腎炎を有する患者における尿中ＩＬ−６レベルの増大は疾患状態の指標でもある（Ｖａｎ  Ｓｎｉｃｋら、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、８巻、２５３〜７８頁、１９９０年）。手術後血清ＩＬ−６レベルをモニタリングすると、炎症状態の推定及び急性期反応の早期検出に、Ｃ反応性タンパク質レベルをモニタリングするより有用であることがある（Ｏｈｚａｔｏら、Ｓｕｒｇｅｒｙ、１１１巻、２０１〜９頁、１９９２年）。血清及び尿中ＩＬ−６レベルは、川崎病活性を予測する因子であることが示されている（Ｆｕｒｕｋａｗａら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｅｄｉａｔｒ、１５１巻、４４〜７頁、１９９２年）。
【００９４】
したがって、ＩＬ−７は、単独で、又はＩＬ−２と併用して、自己骨髄移植後の患者における悪性腫瘍に対する強化免疫療法として用いられ得ることが示唆されている。
【００９５】
炎症性皮膚疾患及び皮膚Ｔ細胞リンパ腫の病原におけるＩＬ−７の関与が、ＩＬ−７の増殖促進効果及びケラチノサイトによるＩＬ−７の合成によって示唆される。
【００９６】
ＩＬ−８は、乾癬及び関節リウマチにおいて臨床上関連があり得る。乾癬性鱗屑において濃度の増大が観察され、これは、これらの細胞において高い増殖率が観察されることを説明することができる（Ｇｉｌｌｉｔｚｅｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ、９７巻、７３〜９頁、１９９１年）。ＩＬ−８はまた、様々な炎症過程のマーカーである可能性がある。
【００９７】
ＩＬ−１０は、活性の非ホジキンリンパ腫を有する患者のサブグループの血清中に検出されている。ＩＬ−１０レベルは、中間又は高悪性度の非ホジキンリンパ腫を有する患者の生存が劣ることに関連すると思われる（Ｂｌａｙら、Ｂｌｏｏｄ、８２巻、２１６９〜７４頁、１９９３年）。
【００９８】
ＩＬ−１２の最も強力な誘発因子は細菌、細菌生成物、及び寄生体である。ＩＬ−１２は、ヘアリーセル白血病を有する患者を含めた数々の状態において、ナチュラルキラー細胞が媒介する細胞毒性を増強することが示されている（Ｂｉｇｄａら、Ｌｅｕｋ．Ｌｙｍｐｈｏｍａ、１０巻、１２１〜５頁、１９９３年）。
【００９９】
ＩＬ−１３は、活性型ＣＤ４（＋）Ｔ細胞クローンの存在下、高度に精製された表面ＩｇＤ陽性の、又は全てのＢ細胞の培養物中、相当なレベルのＩｇＭ及びＩｇＧを誘発するがＩｇＡは誘発しない。ＩＬ−１３は、細菌のリポ多糖によって誘発される組織因子の発現を強力に阻害し、ＩＬ−１又はＴＮＦの発熱性の効果を低減し、したがって炎症のメディエータが誘発するプロコアギュラントの変化に対して内皮及び単球の表面を保護することが示されている。ＩＬ−１３は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで初期の血液由来ヒトマクロファージにおけるヒト免疫不全ウイルス１型の生成を阻害する。
【０１００】
ＩＬ−１３は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで初期の血液由来ヒトマクロファージにおけるヒト免疫不全ウイルス１型の生成を阻害する。
【０１０１】
ＩＬ−１５はＴ細胞の増殖を刺激する。さらに、ＩＬ−１５は、細胞溶解性細胞及び（リンホカインが活性化するキラー）ＬＡＫ細胞の産生を誘発することもできる。ＩＬ−１５は、ＮＫ細胞に特異的な成熟因子として機能すると思われる。ＩＬ−１５はまた、ｉｎ  ｖｉｖｏでＮＫ細胞の生存因子として機能することも示されている。高親和性のＩＬ−１５の結合性が、末梢血単球、及びＮＫ細胞を含めた多くのリンパ球の細胞型に対して観察されている。
【０１０２】
インターロイキン−１７（ＩＬ−１７）は、血管内皮細胞の遊走及び脊髄の形成を刺激する血管新生のメディエータとして機能し、血管新生を促進する様々な増殖因子の生成を調節する（Ｎｕｍａｓａｋｉら、Ｂｌｏｏｄ、１０１巻（７）、２６２０〜７頁、２００２年）。
【０１０３】
インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）は、Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ生成の誘発因子をコードしており（Ｏｋａｍｕｒａら、Ｎａｔｕｒｅ、３７８巻、８８〜９１頁、１９９５年；Ｍｉｃａｌｌｅｆら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ、４３巻、３６１〜３６７頁、１９９６年）、ＩＬ−１２よりも強力な誘発因子であるナチュラルキラー細胞は（Ｔｓｕｔｓｕｉら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１５７巻、３９６７〜３９７３頁、１９９６年）、単球及びマクロファージが様々なＩＬ−１８種を大量に生成することを実証している（Ｋｉｋｋａｗａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、２８１巻（２）、４６１〜７頁、２００１年）。
【０１０４】
ＩＬ−１８は、急性免疫反応の間にマクロファージ及び未熟な樹状細胞によって生成される。
【０１０５】
ＩＬ−１８は、炎症促進性サイトカインの１つであると考えられている。ＩＬ−１８の重要な機能は、細胞媒介性免疫反応に必要とされる機能的に異なるサブセットのＴヘルパー細胞の調節である（Ｎａｋａｎｉｓｈｉら、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９巻、４２３〜７４頁、２００１年）。ＩＬ−１８は、Ｔｈ１細胞に対する増殖因子及び分化因子として機能する。
【０１０６】
顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）は、単球、マクロファージ、及び好中球によって、細胞活性化後に分泌される（Ｄｅｍｅｔｒｉら、Ｂｌｏｏｄ、７８巻、２７９１〜２８０８頁、１９９１年）。これは間質細胞、線維芽細胞、及び内皮細胞によっても生成される。上皮性の癌、急性骨髄性白血病細胞、及び様々な腫瘍細胞系（膀胱癌、髄芽腫）もこの因子を発現する。Ｇ−ＣＳＦの合成は、細菌の内毒素、ＴＮＦ、ＩＬ−１、及びＧＭ−ＣＳＦによって誘発され得る。骨髄を回収する前に組換えヒトＧ−ＣＳＦで前処理すると、移植片を改善することができる。Ｇ−ＣＳＦで処理する一般的な効果の１つは、重度の感染症及び発熱の発症を著しく低減することであると思われ、これらはコストマン症候群を有する患者に生じることが通常観察される（Ｊａｋｕｂｏｗｓｋｉら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、３２０巻、３８〜４２頁、１９８９年）。Ｇ−ＣＳＦ処置はまた、様々な抗腫瘍薬のレジメンでの投与量の増大を可能にする（Ｇｉａｎｎｉら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、１０巻、１９５５〜６２頁、１９９２年）。
【０１０７】
ＧＭ−ＣＳＦは、血液細胞の異常な成熟又は白血球生成の減少のいずれかによって特徴付けられる全ての疾患における造血の生理学的再構成に使用され得る。ＧＭ−ＣＳＦは化学療法が誘発する血球減少を矯正し、血球減少が関連する、感染症及び出血の傾向に対抗するのにも用いることができる（Ｆａｎら、Ｉｎ  ｖｉｖｏ、５巻、５７１〜８頁、１９９１年）。いくつかの研究は、ＧＭ−ＣＳＦの使用が細胞毒性薬物治療に対する耐性を増強し、細胞毒性薬物治療の副作用によって必要とされる投与量の低減を防ぐのに用いられ得ることを実証している（Ｎｅｇｒｉｎら、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、２３巻、２６３〜２９６頁、１９９２年）。現在、ＧＭ−ＣＳＦは骨髄移植における重要な進歩を象徴し、標準的な治療法となっている（Ａｒｍｉｔａｇｅら、Ｓｅｍｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ、２９巻、ｓｌ４〜８頁、１９９２年）。ＧＭ−ＣＳＦは自己骨髄移植又は同種骨髄移植を受けている患者、及び骨髄移植後の生着の遅い患者における造血系の再構成を増強する（Ｓｃｈｕｓｔｅｒら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ、２０巻、Ｓ９５〜９頁、１９９２年）。
【０１０８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるいくつかの腫瘍細胞型の増殖は、腫瘍関連細胞の表面の抗原の合成も刺激し得るＩＦＮ−αによって阻害される。腎臓癌において、ＩＦＮ−αはＥＧＦに対する受容体の発現を低減する。ＩＦＮ−αはまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで線維芽細胞及び単球の増殖を阻害する。ＩＦＮ−αはまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＢ細胞の増殖を阻害し、抗体の合成を阻止する。ＩＦＮ−αは、いくつかのミトコンドリア遺伝子の発現も選択的に阻止する。
【０１０９】
ＩＦＮ−βは、低親和性ＩｇＥ受容体ＣＤ２３の合成を増強する。活性型の単球において、ＩＦＮ−βはネオプテリンの合成を誘発する。ＩＦＮ−βはまた、β２−ミクログロブリンの血清濃度を増強する。ＩＦＮ−βは、いくつかのミトコンドリア遺伝子の発現を選択的に阻止する。
【０１１０】
他のインターフェロン同様、ＩＦＮ−γは抗ウイルス薬及び抗寄生虫薬として用いることができる（Ｓｔｕａｒｔ−Ｈａｒｒｉｓら、Ｍｅｄ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｕｓｔ．、１５６巻、８６９〜７２頁、１９９２年）。ＩＦＮ−γは、慢性多発性関節炎の治療において有効であることも示されている（Ｍａｃｈｏｌｄら、Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．、５１巻、１０３９〜４３頁、１９９２年）。この治療はマクロファージ活性の変調をおそらく伴うもので、関節痛を著しく低減し、様々な臨床パラメータを改善し、コルチコステロイドの投与量を低減させる。ＩＦＮ−γは、ＡＩＤＳ患者の日和見感染の治療においても価値があることがある。ＩＦＮ−γは、重症のアトピー性皮膚炎において炎症、臨床症状、及び好酸球増加を低減することも示されている（Ｈａｎｉｆｉｎら、Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ、２８巻、１８９〜９７頁、１９９３年）。
【０１１１】
腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）は、マクロファージ、単球、好中球、Ｔ細胞、ＮＫ細胞によって、これらを細菌リポ多糖によって刺激した後に分泌される（Ｂｅｕｔｌｅｒら、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５７巻、５０５〜１８頁、１９８８年）。化学療法薬とは対照的に、ＴＮＦ−βは悪性細胞を特異的に攻撃する。広範な前臨床試験により、ヌード（免疫不全）マウスにおける皮下のヒト異種移植片及びリンパ節転移に対するＴＮＦ−αの直接的な細胞分裂抑制効果及び細胞毒性効果、並びに好中球、マクロファージ、及びＴ細胞を含めた様々な免疫エフェクター細胞に対する様々な免疫調節効果が実証されている（Ｇｉｆｆｏｒｄら、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ、３巻、１０３〜１１頁、１９９１年）。
【０１１２】
現在ＣＣＬ２と呼ばれるマクロファージ走化タンパク質−１（ＭＣＰ−１）は、ｉｎ  ｖｉｖｏで単球及びマクロファージの殺腫瘍活性を活性化する。ＭＣＰ−１は、細胞表面抗原（ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｂ）の発現、並びにサイトカインＩＬ−１及びＩＬ−６の発現を調節する（Ｊｉａｎｇら、１９９２）。ＣＣＬ２は、脱顆粒及びヒスタミンの放出を誘発する、ヒト好塩基球の強力な活性化因子である（Ｂｉｓｃｈｏｆｆら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１７５巻、１２７１〜５頁、１９９２年）。ＩＬ−３、ＩＬ−５、又はＧＭ−ＣＳＦによって活性化された好塩基球において、ＣＣＬ２はロイコトリエンＣ４の合成を増強する（Ｂｉｓｃｈｏｆｆら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２３巻、７６１〜７頁、１９９３年）。ＣＣＬ２は、化学走性以外の生物学的活性を表すことも示されている。これは、ＣＨＡＫ（ＣＣ−ケモカイン活性化キラー）として知られているキラー細胞の増殖及び活性化を誘発することができ、ＣＨＡＫはＩＬ−２によって活性化された細胞（ＬＡＫ細胞）に似ている（Ｈｏｒａら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＵＳＡ、８９巻、１７４５〜９頁、１９９２年）。ＣＣＬ２は強力なヒスタミン誘発因子の１つでもある。
【０１１３】
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、神経及び他の腫瘍の病態生理において重要であり、おそらくヒトグリオーマに対する血管新生の強力なプロモーターとして機能する。ＶＥＧＦの合成は低酸素によっても誘発される。ＶＥＧＦに対する反応として観察される細胞の血管外遊走は、遠位部位のコロニー形成を決定する重要な因子である可能性がある。ＶＥＧＦの血管透過性に対する影響のために、ＶＥＧＦは、正常及び病理学的な条件下での血液脳関門の機能の変化にも関与している可能性がある。
【０１１４】
上皮成長因子（ＥＧＦ）は、線維芽細胞、腎上皮細胞、ヒトグリア細胞、卵巣顆粒膜細胞、及び甲状腺細胞を含めた、表皮細胞及び上皮細胞の増殖を制御及び刺激する。ＥＧＦは単独で、及び他のサイトカインと併用して、創傷治癒過程を媒介する重要な因子である。ＥＧＦは、消化管粘膜に対する栄養物質である可能性があり、粘膜細胞の増殖を刺激する能力があるため胃保護の役割を果たす可能性がある。ＥＧＦは、胃酸の合成を阻害しない濃度で潰瘍の治癒を効果的に促進することが示されている。
【０１１５】
本発明の方法によって検出可能な、ある種のサイトカインに関連する例示的、非限定的な徴候を、本明細書以下に記載する。記載する例示的サイトカインは各々、単一分子ベースで検出され得るものであり、又は事象光子若しくは全光子を計数することによって検出され得るものである。
【０１１６】
様々な例示的実施形態において、疾患状態は強直性脊椎炎であり、検出されるサイトカインは、ＣＣＬ４、ＣＣＬ２、ＣＣＬ１１、ＥＧＦ、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＣＸＣＬ８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＴＮＦ−α、ＩＦＮγ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、及びこれらの組合せからなる群から選択される。
【０１１７】
様々な例示的実施形態において、疾患状態は乾癬性関節炎であり、検出されるサイトカインは、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１７、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１β、ＣＣＬ１１／エオタキシン、ＥＧＦ、ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１、及びこれらの組合せからなる群から選択される。
【０１１８】
様々な例示的実施形態において、疾患状態は反応性関節炎であり、検出されるサイトカインは、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１β、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１、ＴＮＦ−α、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＣＬ１１／エオタキシン、ＥＧＦ、ＩＬ−６、及びこれらの組合せからなる群から選択される。
【０１１９】
様々な例示的実施形態において、疾患状態は腸疾患に基づく関節炎であり、検出されるサイトカインは、ＣＸＣＬ８／ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−４、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１、ＣＣＬ１１／エオタキシン、ＥＧＦ、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、及びこれらの組合せからなる群から選択される。
【０１２０】
様々な例示的実施形態において、疾患状態は潰瘍性大腸炎（ＵＣ）であり、検出されるサイトカインは、ＩＬ−７、ＣＸＣＬ８／ＩＬ−８、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＩＬ−１β、及びこれらの組合せからなる群から選択される。
【０１２１】
様々な例示的実施形態において、疾患状態はクローン病（ＣＤ）であり、検出されるサイトカインは、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１３、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＣＸＣＬ８／ＩＬ−８、及びこれらの組合せからなる群から選択される。
【０１２２】
様々な例示的実施形態において、疾患状態は関節リウマチであり、検出されるサイトカイン分子は、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−５、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１β、ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＩＬ−７、及びこれらの組合せからなる群から選択される。
【０１２３】
様々な例示的実施形態において、疾患状態は全身性エリテマトーデスであり、検出されるサイトカインの分子は、ＩＬ−１０、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γ、ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１β、ＣＸＣＬ−８／ＩＬ−８、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＩＬ−１７、及びこれらの組合せからなる群から選択される。
【０１２４】
様々な例示的実施形態において、疾患状態は家族性地中海熱（ＦＭＦ）であり、検出されるサイトカインの分子は、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＣＸＣＬ８／ＩＬ−８、及びこれらの組合せからなる群から選択される。
【０１２５】
様々な例示的実施形態において、疾患状態は筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）であり、検出されるサイトカインの分子は、ＣＣＬ２／ＭＩＰ−１β、ＣＸＣＬ８／ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１β、ＶＥＧＦ、ＩＬ−１３、及びこれらの組合せからなる群から選択される。
【０１２６】
様々な例示的実施形態において、疾患状態は過敏性腸症候群（ＩＢＳ）であり、検出されるサイトカインの分子は、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１、ＣＸＣＬ８／ＩＬ−８、及びこれらの組合せからなる群から選択される。
【０１２７】
様々な例示的実施形態において、疾患状態は若年性関節リウマチ（ＪＲＡ）であり、検出されるサイトカインの分子は、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−５、ＩＬ−７、及びこれらの組合せからなる群から選択される。
【０１２８】
様々な例示的実施形態において、疾患状態はシェーグレン症候群であり、検出されるサイトカインの分子は、ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１、ＩＬ−１２、ＣＸＣＬ８／ＩＬ−８、ＣＣＬ１１／エオタキシン、ＴＮＦα、ＩＬ−２、ＩＦＮα、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、及びこれらの組合せからなる群から選択される。
【０１２９】
様々な例示的実施形態において、疾患状態は初期の関節炎であり、検出されるサイトカインの分子は、ＣＣＬ４／ＭＩＰ１β、ＣＸＣＬ８／ＩＬ−８、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−１３、ＴＮＦα、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、及びこれらの組合せからなる群から選択される。
【０１３０】
様々な例示的実施形態において、疾患状態は神経炎症であり、検出されるサイトカインの分子は、ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−１７、及びこれらの組合せからなる群から選択される。
【０１３１】
様々な実施形態において、本発明のアッセイにおいて測定される特定のサイトカインには、それだけには限定されないが、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ｈＴＮＦα、ｍＴＮＦα、ＩＦＮγ、及びｈＶＥＧＦが含まれる。本発明の一態様に従って、分析物が、サイトカインが関係する、或いはその検出及び／又は定量が診断又は予後の利益を生じる疾患を有する患者、或いは有することが疑われる患者から非外科的な侵襲性の採取技術によって得られた試料、例えば、血液、血清、血漿、糞便、又は尿の試料において測定されるのが有利である。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、方法は、本発明の検出方法を用いて１つを超える、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０種、又はそれを超えるサイトカインのレベルを決定することを含む。
【０１３３】
例示的一実施形態において、本発明は、検出可能種の単一分子が、前記検出可能種が特異的に結合する、サイトカイン及び増殖因子から選択される１種である分析物の単一分子に相関する、先に記載した方法を提供する。様々な実施形態において、アッセイは、約５ｐｇ／ｍＬ以下の量の前記検出可能種を検出することができる。ある実施形態において、アッセイは、約２ｐｇ／ｍＬ以下の量の検出可能種の単一分子を検出する。
【０１３４】
本発明は、頑強なダイナミックレンジのアッセイも提供する。例示的実施形態において、検出のダイナミックレンジは、少なくとも約２ｌｏｇ、好ましくは少なくとも約３ｌｏｇ、より好ましくは少なくとも約４ｌｏｇである。
【０１３５】
本発明のアッセイは、サイトカイン及び他の疾患マーカーに対して高度に感度が高い。例えば、一実施形態において、方法は、約５ｐｇ／ｍＬ、４ｐｇ／ｍＬ、３ｐｇ／ｍＬ、２ｐｇ／ｍＬ、１ｐｇ／ｍＬ、０．５ｐｇ／ｍＬ以下の量、及びさらには約０．１ｐｇ／ｍＬ以下の量の少なくとも１つのサイトカインを検出することができるアッセイを提供する。
【０１３６】
様々な実施形態において、本発明は、約２ｐｇ／ｍＬ未満、約１ｐｇ／ｍＬ未満、約０．８ｐｇ／ｍＬ未満、約０．６ｐｇ／ｍＬ未満、約０．４ｐｇ／ｍＬ未満、又は約０．３ｐｇ／ｍＬ未満の濃度のＩＬ−２を検出する方法を提供する。様々な実施形態において、検出される量は、健康対象において見出されるＩＬ−２の量に対応する。
【０１３７】
例示的一実施形態において、本発明は、約０．１ｐｇ／ｍＬ以下である（例えば、約０．０７ｐｇ／ｍＬ）ＩＬ−２に対する感度（検出限界（ＬＯＤ））を有する、ＩＬ−２に対するアッセイを提供する。様々な実施形態において、本発明のアッセイは、約０．１ｐｇ／ｍＬから約２ｐｇ／ｍＬまで、好ましくは約０．１６ｐｇ／ｍＬから約１．５ｐｇ／ｍＬまでの範囲の血漿中ＩＬ−２を定量する。例示的アッセイのＩＬ−２に対するＬＯＤは、約０．１ｐｇ／ｍＬ以下（例えば、約０．０７ｐｇ／ｍＬ）であり、約０．１ｐｇ／ｍＬから約２ｐｇ／ｍＬまで、好ましくは約０．１６ｐｇ／ｍＬから約１．５ｐｇ／ｍＬまでの範囲内の血漿中ＩＬ−２を定量する。一実施形態において、血漿は健康対象からのものである。
【０１３８】
様々な実施形態において、本発明は、約２０ｐｇ／ｍＬ未満、約１０ｐｇ／ｍＬ未満、約８ｐｇ／ｍＬ未満、約６ｐｇ／ｍＬ未満、又は約４ｐｇ／ｍＬ未満の濃度のＩＬ−５を検出する方法を提供する。様々な実施形態において、検出される量は、健康対象において見出されるＩＬ−５の量に対応する。
【０１３９】
例示的一実施形態において、本発明は、約１．２ｐｇ／ｍＬ以下である（例えば、約０．９ｐｇ／ｍＬ）ＩＬ−５に対する感度（検出限界（ＬＯＤ））を有する、ＩＬ−５に対するアッセイを提供する。様々な実施形態において、本発明のアッセイは、約１．５ｐｇ／ｍＬから約１９．５ｐｇ／ｍＬまで、好ましくは約２．０ｐｇ／ｍＬから約１９ｐｇ／ｍＬまでの範囲の血漿中ＩＬ−５を定量する。例示的アッセイのＩＬ−５に対するＬＯＤは、約１．２ｐｇ／ｍＬ以下（例えば、約０．９ｐｇ／ｍＬ）であり、約１．５ｐｇ／ｍＬから約１９．５ｐｇ／ｍＬまで、好ましくは約２．０ｐｇ／ｍＬから約１９ｐｇ／ｍＬまでの範囲内の血漿中ＩＬ−５を定量する。一実施形態において、血漿は健康対象からのものである。
【０１４０】
様々な実施形態において、本発明は、約３ｐｇ／ｍＬ未満、約２ｐｇ／ｍＬ未満、約１ｐｇ／ｍＬ未満、約０．８ｐｇ／ｍＬ未満、又は約０．６ｐｇ／ｍＬ未満の濃度のＩＬ−７を検出する方法を提供する。様々な実施形態において、検出される量は、健康対象において見出されるＩＬ−２の量に対応する。
【０１４１】
例示的一実施形態において、本発明は、約０．０２ｐｇ／ｍＬ以下である（例えば、約０．０１２ｐｇ／ｍＬ）、ＩＬ−７に対する感度（検出限界（ＬＯＤ））を有する、ＩＬ−７に対するアッセイを提供する。様々な実施形態において、本発明のアッセイは、約０．５ｐｇ／ｍＬから約３ｐｇ／ｍＬまで、好ましくは約０．４ｐｇ／ｍＬから約２．７ｐｇ／ｍＬまでの範囲の血漿中ＩＬ−７を定量する。例示的アッセイのＩＬ−７に対するＬＯＤは、約０．０２ｐｇ／ｍＬ以下（例えば、約０．０１２ｐｇ／ｍＬ）であり、約０．５ｐｇ／ｍＬから約３ｐｇ／ｍＬまで、好ましくは約０．４ｐｇ／ｍＬから約２．７ｐｇ／ｍＬまでの範囲内の血漿中ＩＬ−７を定量する。一実施形態において、血漿は健康対象からのものである。
【０１４２】
様々な実施形態において、本発明は、約１２ｐｇ／ｍＬ未満、約１０ｐｇ／ｍＬ未満、約８ｐｇ／ｍＬ未満、約６ｐｇ／ｍＬ未満、又は約４ｐｇ／ｍＬ未満の濃度のＩＬ−２１を検出する方法を提供する。様々な実施形態において、検出される量は、健康対象において見出されるＩＬ−２の量に対応する。
【０１４３】
例示的一実施形態において、本発明は、約０．１ｐｇ／ｍＬ以下である（例えば、約０．０６ｐｇ／ｍＬ）、ＩＬ−２１に対する感度（検出限界（ＬＯＤ））を有する、ＩＬ−２１に対するアッセイを提供する。様々な実施形態において、本発明のアッセイは、約２ｐｇ／ｍＬから約１０ｐｇ／ｍＬまで、好ましくは約１．８ｐｇ／ｍＬから約９．３ｐｇ／ｍＬまでの範囲の血漿中ＩＬ−２１を定量する。例示的アッセイのＩＬ−２１に対するＬＯＤは、約０．１ｐｇ／ｍＬ以下（例えば、約０．０６ｐｇ／ｍＬ）であり、約２ｐｇ／ｍＬから約１０ｐｇ／ｍＬまで、好ましくは約１．８ｐｇ／ｍＬから約９．３ｐｇ／ｍＬまでの範囲内の血漿中ＩＬ−２１を定量する。一実施形態において、血漿は健康対象からのものである。
【０１４４】
様々な実施形態において、本発明は、約１２ｐｇ／ｍＬ未満、約０．４ｐｇ／ｍＬ未満、約０．３ｐｇ／ｍＬ未満、約０．２ｐｇ／ｍＬ未満、又は約０．１ｐｇ／ｍＬ未満の濃度のＩＬ−１ｂを検出する方法を提供する。様々な実施形態において、検出される量は、健康対象において見出されるＩＬ−１ｂの量に対応する。
【０１４５】
例示的一実施形態において、本発明は、約０．１ｐｇ／ｍＬ以下である（例えば、約０．０６ｐｇ／ｍＬ）、ＩＬ−１ｂに対する感度（検出限界（ＬＯＤ））を有する、ＩＬ−１ｂに対するアッセイを提供する。様々な実施形態において、本発明のアッセイは、約０．０３ｐｇ／ｍＬから約０．３ｐｇ／ｍＬまで、好ましくは約０．０５ｐｇ／ｍＬから約０．２ｐｇ／ｍＬまでの範囲内の血漿中ＩＬ−１ｂを定量する。例示的アッセイのＩＬ−１ｂに対するＬＯＤは、約０．１ｐｇ／ｍＬ以下（例えば、約０．０６ｐｇ／ｍＬ）であり、約０．０３ｐｇ／ｍＬから約０．３ｐｇ／ｍＬまで、好ましくは約０．０５ｐｇ／ｍＬから約０．２ｐｇ／ｍＬまでの範囲内の血漿中ＩＬ−１ｂを定量する。一実施形態において、血漿は健康対象からのものである。
【０１４６】
様々な実施形態において、本発明は、約７ｐｇ／ｍＬ未満、約６ｐｇ／ｍＬ未満、約５ｐｇ／ｍＬ未満、約４ｐｇ／ｍＬ未満、又は約３ｐｇ／ｍＬ未満の濃度のＩＦＮｇを検出する方法を提供する。様々な実施形態において、検出される量は、健康対象において見出されるＩＬ−１ｂの量に対応する。
【０１４７】
例示的一実施形態において、本発明は、約０．１ｐｇ／ｍＬ以下である（例えば、約０．０９ｐｇ／ｍＬ）、ＩＦＮｇに対する感度（検出限界（ＬＯＤ））を有する、ＩＦＮｇに対するアッセイを提供する。様々な実施形態において、本発明のアッセイは、約７ｐｇ／ｍＬから約２ｐｇ／ｍＬまで、好ましくは約６．７ｐｇ／ｍＬから約２．６ｐｇ／ｍＬまでの範囲内の血漿中ＩＦＮｇを定量する。例示的アッセイのＩＦＮｇに対するＬＯＤは、約０．１ｐｇ／ｍＬ以下（例えば、約０．０６ｐｇ／ｍＬ）であり、約７ｐｇ／ｍＬから約２ｐｇ／ｍＬまで、好ましくは約６．７ｐｇ／ｍＬから約２．６ｐｇ／ｍＬまでの範囲内の血漿中ＩＦＮｇを定量する。一実施形態において、血漿は健康対象からのものである。
【０１４８】
様々な実施形態において、本発明は、約９ｐｇ／ｍＬ未満、約６ｐｇ／ｍＬ未満、約３ｐｇ／ｍＬ未満、約２ｐｇ／ｍＬ未満、又は約１ｐｇ／ｍＬ未満の濃度のＩＬ−６を検出する方法を提供する。様々な実施形態において、検出される量は、健康対象において見出されるＩＬ−１ｂの量に対応する。
【０１４９】
例示的一実施形態において、本発明は、約０．０１ｐｇ／ｍＬ以下である（例えば、約０．００３ｐｇ／ｍＬ）、ＩＬ−６に対する感度（検出限界（ＬＯＤ））を有する、ＩＬ−６に対するアッセイを提供する。様々な実施形態において、本発明のアッセイは、約９ｐｇ／ｍＬから約０．５ｐｇ／ｍＬまで、好ましくは約８．９ｐｇ／ｍＬから約０．４８ｐｇ／ｍＬまでの範囲内の血漿中ＩＬ−６を定量する。例示的アッセイのＩＬ−６に対するＬＯＤは、約０．０１ｐｇ／ｍＬ以下（例えば、約０．０６ｐｇ／ｍＬ）であり、約９ｐｇ／ｍＬから約０．５ｐｇ／ｍＬまで、好ましくは約８．９ｐｇ／ｍＬから約０．４８ｐｇ／ｍＬまでの範囲内の血漿中ＩＬ−６を定量する。一実施形態において、血漿は健康対象からのものである。
【０１５０】
様々な実施形態において、本発明は、約１ｐｇ／ｍＬ未満、約０．８ｐｇ／ｍＬ未満、約０．６ｐｇ／ｍＬ未満、約０．４ｐｇ／ｍＬ未満、又は約０．１ｐｇ／ｍＬ未満の濃度のＩＬ−１７Ａを検出する方法を提供する。様々な実施形態において、検出される量は、健康対象において見出されるＩＬ−１７Ａの量に対応する。
【０１５１】
例示的一実施形態において、本発明は、約０．１ｐｇ／ｍＬ以下である（例えば、約０．０８ｐｇ／ｍＬ）、ＩＬ−１７Ａに対する感度（検出限界（ＬＯＤ））を有する、ＩＬ−１７Ａに対するアッセイを提供する。様々な実施形態において、本発明のアッセイは、約０．７ｐｇ／ｍＬから約０．０５ｐｇ／ｍＬまで、好ましくは約０．６ｐｇ／ｍＬから約０．０６ｐｇ／ｍＬまでの範囲内の血漿中ＩＬ−１７Ａを定量する。例示的アッセイのＩＬ−１７Ａに対するＬＯＤは、約０．１ｐｇ／ｍＬ以下（例えば、約０．０８ｐｇ／ｍＬ）であり、約０．７ｐｇ／ｍＬから約０．０５ｐｇ／ｍＬまで、好ましくは約０．６ｐｇ／ｍＬから約０．０６ｐｇ／ｍＬまでの範囲内の血漿中ＩＬ−１７Ａを定量する。一実施形態において、血漿は健康対象からのものである。
【０１５２】
様々な実施形態において、本発明は、約３ｐｇ／ｍＬ未満、約２ｐｇ／ｍＬ未満、約１ｐｇ／ｍＬ未満、約０．８ｐｇ／ｍＬ未満、又は約０．６ｐｇ／ｍＬ未満の濃度のＴＮＦａを検出する方法を提供する。様々な実施形態において、検出される量は、健康対象において見出されるＴＮＦａの量に対応する。
【０１５３】
例示的一実施形態において、本発明は、約０．０１ｐｇ／ｍＬ以下である（例えば、約０．００６ｐｇ／ｍＬ）、ＴＮＦａに対する感度（検出限界（ＬＯＤ））を有する、ＴＮＦａに対するアッセイを提供する。様々な実施形態において、本発明のアッセイは、約０．３ｐｇ／ｍＬから約０．５ｐｇ／ｍＬまで、好ましくは約２．７ｐｇ／ｍＬから約０．６ｐｇ／ｍＬまでの範囲内の血漿中ＴＮＦａを定量する。例示的アッセイのＴＮＦａに対するＬＯＤは、約０．０１ｐｇ／ｍＬ以下（例えば、約０．０８ｐｇ／ｍＬ）であり、約０．３ｐｇ／ｍＬから約０．５ｐｇ／ｍＬまで、好ましくは約２．７ｐｇ／ｍＬから約０．６ｐｇ／ｍＬまでの範囲内の血漿中ＴＮＦａを定量する。一実施形態において、血漿は健康対象からのものである。
【０１５４】
様々な実施形態において、本発明は、約１．５ｐｇ／ｍＬ未満、約１ｐｇ／ｍＬ未満、約０．７５ｐｇ／ｍＬ未満、約０．５ｐｇ／ｍＬ未満、又は約０．４ｐｇ／ｍＬ未満の濃度のＩＬ−４を検出する方法を提供する。様々な実施形態において、検出される量は、健康対象において見出されるＩＬ−４の量に対応する。
【０１５５】
例示的一実施形態において、本発明は、約０．１５ｐｇ／ｍＬ以下である（例えば、約０．１１ｐｇ／ｍＬ）のＩＬ−４に対する感度（検出限界（ＬＯＤ））を有する、ＩＬ−４に対するアッセイを提供する。様々な実施形態において、本発明のアッセイは、約１ｐｇ／ｍＬから約０．１ｐｇ／ｍＬまで、好ましくは約０．８ｐｇ／ｍＬから約０．２ｐｇ／ｍＬまでの範囲内の血漿中ＩＬ−４を定量する。例示的アッセイのＩＬ−４に対するＬＯＤは、約０．１５ｐｇ／ｍＬ以下（例えば、約０．１１ｐｇ／ｍＬ）であり、約１ｐｇ／ｍＬから約０．１ｐｇ／ｍＬまで、好ましくは約０．８ｐｇ／ｍＬから約０．２ｐｇ／ｍＬまでの範囲内の血漿中ＩＬ−４を定量する。一実施形態において、血漿は健康対象からのものである。
【０１５６】
様々な実施形態において、本発明は、約１ｐｇ／ｍＬ未満、約５ｐｇ／ｍＬ未満、約０．３ｐｇ／ｍＬ未満、約０．２ｐｇ／ｍＬ未満、又は約０．１ｐｇ／ｍＬ未満の濃度のＩＬ−１ａを検出する方法を提供する。様々な実施形態において、検出される量は、健康対象において見出されるＩＬ−１ａの量に対応する。
【０１５７】
例示的一実施形態において、本発明は、約０．１ｐｇ／ｍＬ以下である（例えば、約０．０６ｐｇ／ｍＬ）、ＩＬ−１ａに対する感度（検出限界（ＬＯＤ））を有する、ＩＬ−１ａに対するアッセイを提供する。様々な実施形態において、本発明のアッセイは、約０．６ｐｇ／ｍＬから約０．０５ｐｇ／ｍＬまで、好ましくは約０．５ｐｇ／ｍＬから約０．０７ｐｇ／ｍＬまでの範囲内の血漿中ＩＬ−１ａを定量する。例示的アッセイのＩＬ−１ａに対するＬＯＤは、約０．１ｐｇ／ｍＬ以下（例えば、約０．０６ｐｇ／ｍＬ）であり、約０．６ｐｇ／ｍＬから約０．０５ｐｇ／ｍＬまで、好ましくは約０．５ｐｇ／ｍＬから約０．０７ｐｇ／ｍＬまでの範囲内の血漿中ＩＬ−１ａを定量する。一実施形態において、血漿は健康対象からのものである。
【０１５８】
様々な実施形態において、本発明は、約２ｐｇ／ｍＬ未満、約１．５ｐｇ／ｍＬ未満、約１ｐｇ／ｍＬ未満、約０．８ｐｇ／ｍＬ未満、又は約０．５ｐｇ／ｍＬ未満の濃度のＧＭ−ＣＳＦを検出する方法を提供する。様々な実施形態において、検出される量は、健康対象において見出されるＧＭ−ＣＳＦの量に対応する。
【０１５９】
例示的一実施形態において、本発明は、約０．０５ｐｇ／ｍＬ以下である（例えば、約０．０３ｐｇ／ｍＬ）、ＧＭ−ＣＳＦに対する感度（検出限界（ＬＯＤ））を有する、ＧＭ−ＣＳＦに対するアッセイを提供する。様々な実施形態において、本発明のアッセイは、約１．３ｐｇ／ｍＬから約０．２ｐｇ／ｍＬまで、好ましくは約１．１ｐｇ／ｍＬから約０．３ｐｇ／ｍＬまでの範囲内の血漿中ＧＭ−ＣＳＦを定量する。例示的アッセイのＧＭ−ＣＳＦに対するＬＯＤは、約０．０５ｐｇ／ｍＬ以下（例えば、約０．０６ｐｇ／ｍＬ）であり、約１．３ｐｇ／ｍＬから約０．２ｐｇ／ｍＬまで、好ましくは約１．１ｐｇ／ｍＬから約０．３ｐｇ／ｍＬまでの範囲内の血漿中ＧＭ−ＣＳＦを定量する。一実施形態において、血漿は健康対象からのものである。
【０１６０】
様々な実施形態において、本発明は、約２ｐｇ／ｍＬ未満、約１ｐｇ／ｍＬ未満、約０．５ｐｇ／ｍＬ未満、約０．２ｐｇ／ｍＬ未満、又は約０．１ｐｇ／ｍＬ未満の濃度のＩＬ−１２を検出する方法を提供する。様々な実施形態において、検出される量は、健康対象において見出されるＩＬ−１２の量に対応する。
【０１６１】
例示的一実施形態において、本発明は、約０．００８ｐｇ／ｍＬ以下である（例えば、約０．０１ｐｇ／ｍＬ）、ＩＬ−１２に対する感度（検出限界（ＬＯＤ））を有する、ＩＬ−１２に対するアッセイを提供する。様々な実施形態において、本発明のアッセイは、約１．２ｐｇ／ｍＬから約０．０５ｐｇ／ｍＬまで、好ましくは約１ｐｇ／ｍＬから約０．０８ｐｇ／ｍＬまでの範囲内の血漿中ＩＬ−１２を定量する。例示的アッセイのＩＬ−１２に対するＬＯＤは、約０．００８ｐｇ／ｍＬ以下（例えば、約０．０１ｐｇ／ｍＬ）であり、約１．２ｐｇ／ｍＬから約０．０５ｐｇ／ｍＬまで、好ましくは約１ｐｇ／ｍＬから約０．０８ｐｇ／ｍＬまでの範囲内の血漿中ＩＬ−１２を定量する。一実施形態において、血漿は健康対象からのものである。
【０１６２】
様々な実施形態において、本発明は、約１５０ｐｇ／ｍＬ未満、約１００ｐｇ／ｍＬ未満、約８０ｐｇ／ｍＬ未満、約６０ｐｇ／ｍＬ未満、又は約４０ｐｇ／ｍＬ未満の濃度のＧ−ＣＳＦを検出する方法を提供する。様々な実施形態において、検出される量は、健康対象において見出されるＧ−ＣＳＦの量に対応する。
【０１６３】
例示的一実施形態において、本発明は、約０．２ｐｇ／ｍＬ以下である（例えば、約０．１２ｐｇ／ｍＬ）、Ｇ−ＣＳＦに対する感度（検出限界（ＬＯＤ））を有する、Ｇ−ＣＳＦに対するアッセイを提供する。様々な実施形態において、本発明のアッセイは、約１１０ｐｇ／ｍＬから約３０ｐｇ／ｍＬまで、好ましくは約９７ｐｇ／ｍＬから約２５ｐｇ／ｍＬまでの範囲内の血漿中Ｇ−ＣＳＦを定量する。例示的アッセイのＧ−ＣＳＦに対するＬＯＤは、約０．２ｐｇ／ｍＬ以下（例えば、約０．０１ｐｇ／ｍＬ）であり、約１１０ｐｇ／ｍＬから約３０ｐｇ／ｍＬまで、好ましくは約９７ｐｇ／ｍＬから約２５ｐｇ／ｍＬまでの範囲内の血漿中Ｇ−ＣＳＦを定量する。一実施形態において、血漿は健康対象からのものである。
【０１６４】
様々な実施形態において、本発明は、約５０ｐｇ／ｍＬ未満、約４０ｐｇ／ｍＬ未満、約３０ｐｇ／ｍＬ未満、約２０ｐｇ／ｍＬ未満、又は約１０ｐｇ／ｍＬ未満の濃度のＩＬ−２２を検出する方法を提供する。様々な実施形態において、検出される量は、健康対象において見出されるＩＬ−２２の量に対応する。
【０１６５】
例示的一実施形態において、本発明は、約０．０３ｐｇ／ｍＬ以下である（例えば、約０．０２ｐｇ／ｍＬ）、ＩＬ−２２に対する感度（検出限界（ＬＯＤ））を有する、ＩＬ−２２に対するアッセイを提供する。様々な実施形態において、本発明のアッセイは、約４０ｐｇ／ｍＬから約３ｐｇ／ｍＬまで、好ましくは約３９ｐｇ／ｍＬから約４ｐｇ／ｍＬまでの範囲内の血漿中ＩＬ−２２を定量する。例示的アッセイのＩＬ−２２に対するＬＯＤは、約０．０３ｐｇ／ｍＬ以下（例えば、約０．０１ｐｇ／ｍＬ）であり、約４０ｐｇ／ｍＬから約３ｐｇ／ｍＬまで、好ましくは約３９ｐｇ／ｍＬから約４ｐｇ／ｍＬまでの範囲内の血漿中ＩＬ−２２を定量する。一実施形態において、血漿は健康対象からのものである。
【０１６６】
様々な実施形態において、本発明は、約４０ｐｇ／ｍＬ未満、約３０ｐｇ／ｍＬ未満、約２０ｐｇ／ｍＬ未満、又は約１０ｐｇ／ｍＬ未満の濃度のＩＬ−１０を検出する方法を提供する。様々な実施形態において、検出される量は、健康対象において見出されるＩＬ−１０の量に対応する。
【０１６７】
例示的一実施形態において、本発明は、約０．５ｐｇ／ｍＬ以下である（例えば、約０．４ｐｇ／ｍＬ）、ＩＬ−１０に対する感度（検出限界（ＬＯＤ））を有する、ＩＬ−１０に対するアッセイを提供する。様々な実施形態において、本発明のアッセイは、約４０ｐｇ／ｍＬから約８ｐｇ／ｍＬまで、好ましくは約３５ｐｇ／ｍＬから約１０ｐｇ／ｍＬまでの範囲内の血漿中ＩＬ−１０を定量する。例示的アッセイのＩＬ−１０に対するＬＯＤは、約０．５ｐｇ／ｍＬ以下（例えば、約０．４ｐｇ／ｍＬ）であり、約４０ｐｇ／ｍＬから約８ｐｇ／ｍＬまで、好ましくは約３５ｐｇ／ｍＬから約１０ｐｇ／ｍＬまでの範囲内の血漿中ＩＬ−１０を定量する。一実施形態において、血漿は健康対象からのものである。
【０１６８】
様々な実施形態において、本発明は、約７０ｐｇ／ｍＬ未満、約６０ｐｇ／ｍＬ未満、約５０ｐｇ／ｍＬ未満、約４０ｐｇ／ｍＬ未満、又は約３０ｐｇ／ｍＬ未満の濃度のＭＩＰ−１ａを検出する方法を提供する。様々な実施形態において、検出される量は、健康対象において見出されるＭＩＰ−１ａの量に対応する。
【０１６９】
例示的一実施形態において、本発明は、約０．３ｐｇ／ｍＬ以下である（例えば、約０．２ｐｇ／ｍＬ）、ＭＩＰ−１ａに対する感度（検出限界（ＬＯＤ））を有する、ＭＩＰ−１ａに対するアッセイを提供する。様々な実施形態において、本発明のアッセイは、約６５ｐｇ／ｍＬから約２５ｐｇ／ｍＬまで、好ましくは約６３ｐｇ／ｍＬから約２２ｐｇ／ｍＬまでの範囲内の血漿中ＭＩＰ−１ａを定量する。例示的アッセイのＭＩＰ−１ａに対するＬＯＤは、約０．３ｐｇ／ｍＬ以下（例えば、約０．２ｐｇ／ｍＬ）であり、約６５ｐｇ／ｍＬから約２５ｐｇ／ｍＬまで、好ましくは約６３ｐｇ／ｍＬから約２２ｐｇ／ｍＬまでの範囲内の血漿中ＭＩＰ−１ａを定量する。一実施形態において、血漿は健康対象からのものである。
【０１７０】
さらに、本発明の検出方法は、広範なダイナミックレンジを有する頑強なアッセイを提供する。例えば、本発明の方法は、ダイナミックレンジが少なくとも１ｌｏｇ、１．５ｌｏｇ、２ｌｏｇ、２．５ｌｏｇ、３ｌｏｇ、３．５ｌｏｇ、及び最高４ｌｏｇ、及び少なくとも４ｌｏｇを超えるアッセイを提供する。
【０１７１】
例示的一実施形態において、本発明は、患者が健康であるか、又は疾患、症候群、若しくは他の疾病に罹患しているか否かを決定する方法を提供する。方法は、分析物の試料を調製すること、及び本明細書に記載する分析物の単一分子に対応する検出可能種を検出することを含む。様々な実施形態において、検出されるサイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、及びこれらの組合せから選択される１種である（図５）。サイトカインの測定される濃度を、サイトカインの濃度標準品又は健康個体に対応する閾値のサイトカイン濃度と比較する。試料中の測定されるサイトカイン濃度が、標準品における濃度から、又は閾値の健康サイトカイン値から、予め決定された量を超えて逸脱する場合、これは対象が、疾患、症候群、又は他の疾病に罹患していることを示す。
【０１７２】
これらの実施形態に対する一変形において第１のサイトカイン濃度と第２のサイトカイン濃度の比をとる。次いで、この比を参照の比（例えば、健康対象におけるサイトカイン濃度に対応する比）と比較し、試料中で測定されたサイトカイン濃度の比の値が、参照の比の値から予め決定された量を超えて異なる場合、これは対象が、疾患、症候群、又は他の疾病に罹患していることを示す。例示的実施形態において、比は、［ＩＬ−５］／［ＩＬ−２］、［ＩＬ−５］／［ＩＬ−７］、［ＩＬ−５］／［ＩＬ−２１］、及びこれらの組合せから選択される（図６）。例示的実施形態において、［ＩＬ−５］／［ＩＬ−２］の比は、健康個体が約３０以下、約２０以下、約１５以下、約１０以下、又は約８以下であることを示す。例示的実施形態において、［ＩＬ−５］／［ＩＬ−７］の比は、健康個体が約２５以下、約１５以下、約１０以下、約５以下、又は約３以下であることを示す。様々な実施形態において、［ＩＬ−５］／［ＩＬ−２１］の比は、健康個体が約５以下、約４以下、約３以下、約２以下、又は約１以下であることを示す。
【０１７３】
試料調製
本発明の様々な実施形態は、ある試料パラメータは、感度及びダイナミックレンジの増強したアッセイをもたらすという認識に基づくものである。一般的に、先行技術は、小体積のアッセイ試料を調製し、それによってアッセイ感度の損失の一因となる移動損失を最小にすることからの利点を認めている。本発明は、当技術分野において有用であると一般に認められている体積より大きい体積を用いることによってアッセイの感度が増大する方法を提供する。より大きな液体体積の使用によって変化するアッセイの特徴の中には、アッセイ混合物内の非分析物種の非特異的なマトリックス効果の結合による、感度に対する有害作用がある。例示的一実施形態において、本発明は、低体積の同一のアッセイ混合物よりも低い規模のマトリックス結合効果を提供するのに十分な体積のアッセイ混合物を提供する。
【０１７４】
例えば、ある実施形態において、分析物と捕獲種の間の複合体の形成は、少なくとも約２５μＬの、例えば、約２５μＬから約１０００μＬまで、約４０μＬから約８００μＬまで、約６０μＬから約５００μＬまで、及び約７５μＬから約３００μＬまでの量のバッファー溶液中で行われる。
【０１７５】
同様に、本発明者らは、特定の重量範囲の磁性粒子が固定化する捕獲種を用いて、磁性粒子が固定化する捕獲種と分析物の間に複合体が形成されると、アッセイの感度及びダイナミックレンジが増強されることを認めている。例示的一実施形態において、少なくとも約０．１μｇ、例えば、約０．１μｇから約４０μｇまで、約０．５μｇから約２０μｇまで、及び約１．０μｇから約１０μｇまでの、捕獲種にコンジュゲートしている磁性粒子が用いられる。
【０１７６】
様々な実施形態において、本発明のアッセイの感度は、分析物、捕獲種、及び検出可能種を含む複合体から検出可能種を溶出するのに利用される体積の規模を制御することによって増強される。したがって、一実施形態において、検出可能種の溶出体積はオリジナルの試料サイズよりも小さい。様々な実施形態において、溶出体積はオリジナルの試料体積よりも約２倍から約１００倍小さく、例えば、オリジナルの試料体積よりも約２倍から約２０倍小さい。様々な実施形態において、溶出体積はオリジナルの試料体積よりも約５倍から約１５倍小さい。
【０１７７】
例示的一実施形態において、本発明の方法の間に、約２００μＬの試料サイズは、オリジナルの試料体積よりも約２倍から約２０倍小さい溶出体積に低減される。別の例示的一実施形態において、本発明の方法の間に、約１００μＬの試料サイズは、オリジナルの試料体積よりも約２倍から約２０倍小さい溶出体積に低減される。他の例示的一実施形態において、約１００μＬから約２００μＬまでのオリジナルの試料体積は、約１μＬから約４０μＬまで、例えば、約５μＬから約３０μＬまで、又は約１０μＬから約２０μＬまでの体積に低減される。
【０１７８】
例示的一実施形態において、捕獲種と分析物の間の複合体は、約２５μＬから約１０００μＬまでのバッファー溶液に対して約０．１μｇから約４０μｇまでの複数種の磁性粒子を含む混合物中に形成される。ある実施形態において、複合体は、約０．５μｇから約２５μｇまでの複数種の磁性粒子を、約１００μＬから約１０００μＬまでの血漿試料と接触させることによって形成される。
【０１７９】
一実施形態において、提供する方法はサンドイッチアッセイに類似する。したがって、結合パートナーとしてモノクローナル抗体が用いられる。一次抗体は磁性粒子に連結して捕獲抗体として働く（「捕獲種」）。次いで試料を加え、抗体によって認識されるエピトープを有する単一分子が表面上の抗体に結合する。非結合の分析物分子を洗い流し、特異的に結合している分析物の分子だけを本質的に残す。結合している分析物分子／抗体が、検出可能標識を含んでいる検出抗体（「検出可能種」）と反応する。インキュベートして検出抗体と分析物分子の間を反応させ、非特異的に結合している検出抗体を洗い流す。例示的一実施形態において、他のアッセイ成分、とりわけ検出可能種が非存在である容器に磁性粒子を移すことによって、分析物−抗体−検出可能種の複合体が、混入している非結合の検出可能種を本質的に含まないようにする。溶出バッファーを用いて単一分子及び検出抗体を分離し、検出可能種は単一分子分析器中にある。或いは、検出可能種に結合している標識のみを放出し、検出し、それによって単一分子を間接的に検出することができる。当業者であれば理解される通り、捕獲種及び／又は検出可能種として抗体を使用するのは説明を明確にするためであり、本実施例中に組み入れる抗体を、本発明の精神から逸脱することなく、本質的にあらゆる他の捕獲種又は検出可能種に置き換えることができる。さらに、当業者であれば、非結合の検出可能種を分析物−抗体−検出可能種複合体から分離するための他の方法は本発明の範囲内であることを理解するであろう。
【０１８０】
様々な実施形態において、本方法の正確さは、繰返し可能な組成物の試料を使用することによって増強される。したがって、例示的一実施形態において、試料は、高濃度及び低濃度の試料成分の領域に分割され、又は均一な試料を生成するように均質化される。一実施形態において、試料は、その様々な成分の濃度勾配に分けられた血清試料である。例えば、１試料を遠心分離して、３層又はそれを超える層に検出可能に分離された試料が生成される。一例において、試料を、脂質層（例えば、脂質上層）、対象の分析物を含む中間層、及びフィブリン凝塊を含む層（例えば、フィブリン下層）を含む検出可能な３層に分離する。様々な例示的実施形態において、対象の分析物は中間層に存在する。本発明は、試料を中間層から回収するアッセイを提供する。
【０１８１】
検出
本明細書に記載の方法により、単一分子がインタロゲーション空間を通過するときに、それらを１つずつ数え上げることができる。試料の濃度は、設定された時間の長さにおいて計数された単一分子の数及びインタロゲーション空間を通過する試料の体積から決定することができる。インタロゲーション空間が試料の流れの横断面全体を包含する場合、試料の濃度を算出するためには、設定された時間の長さにおいて計数された単一分子の数及び試料の流れの横断面を通過する体積のみが必要である。インタロゲーション空間が試料の流れよりも小さい場合、単一分子の濃度は、標準濃度の対照試料を用いて生成した標準曲線から、補間によって決定することができる。種々の実施形態では、単一分子の濃度は、測定された単一分子を内部の単一分子の標準と比較することによって決定することができる。濃度は、計数された単一分子の数から推定することができる。例えば、試料の希釈度が分かると、出発試料中の単一分子の濃度を算出することができる。
【０１８２】
本発明の方法による、単一分子を検出するための例示的な装置は、共有の米国特許出願公開第２００６００７８９９８号及び同第２００８０１７１３５２号に記載されている。適切なシステムの別の例は、図１の、Ｓｉｎｇｕｌｅｘ，Ｉｎｃ．によって製造された光学システムである。
【０１８３】
ある例示的な実施形態では、単一分子の検出には、単一分子分析器を利用する。例示的な単一分子分析器としては、電磁放射線を放射するための電磁放射線源が挙げられる。放射線源は、場合によって連続的な波動放射源である。分析器は、電磁放射線源から放射される電磁放射線を受信するように配置された第１のインタロゲーション空間も含む。インタロゲーション空間は、場合によって調節可能であり、一部の実施形態では、約０．０２ｐＬ〜約３００ｐＬ、約０．０５ｐＬ〜約５０ｐＬ、又は約０．１ｐＬ〜約２５ｐＬの体積を有する。
【０１８４】
分析器は、前記検出可能種の単一分子の第１の電磁波の特徴を測定するための、第１のインタロゲーション空間に作動可能に接続されている第１の電磁放射線検出器も含む。種々の実施形態では、分析器は、少なくとも１つの試料を自動的にサンプリングし、試料コンテナと前記第１のインタロゲーション空間の間に流体連通を提供することができるサンプリングシステムも含む。特定の実施形態では、分析器システムは、第１のインタロゲーション空間と流体連通した試料回収システムをさらに含む。理想的には、回収システムによって、実質的に全試料の回収が可能である。分析器は、場合によって試料調製システムを含み得る。
【０１８５】
本発明の方法の非常に高い感度に寄与する特徴は、検出可能種を検出し、計数する方法であり、検出可能種は、一部の実施形態では、検出される単一分子に結合している、又は検出される単一分子に一致する。簡単に述べると、ある例示的な実施形態では、検出装置を通って流れる処理試料は、標識に使用された蛍光部分に対して適切な励起波長で光線を放射するレーザーからのＥＭ照射に所与のインタロゲーション空間を所定の期間供し、その期間中に放射された光子を検出することによって、一連の検出事象に有効に分割される。検出器によって検出されたシグナルは、それぞれが予め選択された時間の長さ（ビンの幅）を有する任意の時間区分（ビン）に分割される。本発明の範囲から逸脱することなく他のビンの幅を使用することができるが、一実施形態では、ビンの幅は約１０μｓ〜約５ｍｓの範囲で選択される。例示的なビンの幅は１ｍｓである。各セグメントに含有されるシグナルの数は確立されている。
【０１８６】
所定の期間それぞれが「ビン」である。所与のビンにおいて検出された光子の総数が所定の閾値レベルを超える場合、そのビンに対して検出事象が登録される、即ち、標識が検出されている。光子の総数が所定の閾値レベルでない場合、検出事象は登録されない。一部の実施形態では、処理試料の濃度は、検出事象の大部分について、検出事象が、元の試料の対象の単一分子に対応する１つの、ウィンドウを通過する検出可能種のみを表す、つまり、単一のビンにおいて、少数の検出事象が２つ以上の標識を表すのに十分に希釈する。一部の実施形態では、さらなる改良を適用して、処理試料中の高い標識濃度、即ち、２つ以上の標識が単一の検出事象として検出される確率がもはや意味がない濃度を正確に検出できるようにする。
【０１８７】
ある例示的な実施形態では、この方法は、単一分子のみを計数することによる検出を提供する。本発明の方法は、単一のビンにおいて検出可能種の複数コピーを計数することも含み得る。したがって、別の実施形態では、本発明は、単一分子、事象光子、全光子及びそれらの組合せからの光子から選択される１種を計数することによる検出を提供する。
【０１８８】
一実施形態では、検出されたシグナルは、データを利用する前に、まず分析してノイズレベルを決定し、閾値を超えるシグナルを選択する。一実施形態では、ノイズレベルは、多くのビンにわたってシグナルを平均することによって決定する。他の実施形態では、バックグラウンドレベルは、平均ノイズレベル、又は二乗平均平方根ノイズから決定する。他の場合において、典型的なノイズ値は、選択された値又は統計値である。ほとんどの場合、ノイズはポアソン分布に従うことが予想される。
【０１８９】
種々の実施形態では、真のシグナル（ピーク、衝突、単一分子）とノイズを識別するために閾値を決定する。はねられる真のシグナルの数が最小であると同時に、無作為のノイズからの偽陽性シグナルの数が最小になるように、閾値の選択には注意しなければならない。閾値を選択するための方法は、ノイズレベルを超える固定値を決定し、ノイズシグナルの分布に基づいて閾値を算出することを含む。一実施形態では、閾値は、バックグラウンドレベルを超える標準偏差の固定値に設定する。ノイズのポアソン分布を想定して、この方法を使用し、実験の時間経過にわたる偽陽性シグナル数を見積もることができる。
【０１９０】
一部の実施形態では、本発明で利用する分析器又は分析システムにより、分析物、例えば、１ナノモル未満、又は１ピコモル未満、又は１フェムトモル未満、又は１アトモル未満、又は１ゼプトモル未満のレベルのバイオマーカーを検出することができる。一部の実施形態では、分析器又は分析システムにより、１つ又は複数の分析物、例えば、１つ又は複数のバイオマーカーの濃度の、１つの試料から別の試料までの、約０．１％未満、約１％未満、約２％未満、約５％未満、約１０％未満、約２０％未満、約３０％未満、約４０％未満、約５０％未満、約６０％未満、又は約８０％未満の変化を、試料中にバイオマーカーが１ナノモル未満、又は１ピコモル未満、又は１フェムトモル未満、又は１アトモル未満、又は１ゼプトモル未満の濃度で存在するとき、及びそれぞれの試料のサイズが約１００μＬ未満、約５０μＬ未満、約４０μＬ未満、約３０μＬ未満、約２０μＬ未満、約１０μＬ未満、約５μＬ未満、約２μＬ未満、約１μＬ未満、約０．１μＬ未満、約０．０１μＬ未満、約０．００１μＬ未満、又は約０．０００１μＬであるとき、検出することができる。一部の実施形態では、分析器又は分析システムにより、第１の試料から第２の試料の、分析物の約２０％未満の濃度の変化を、分析物が、約１ピコモル未満の濃度で存在するとき、及びそれぞれの試料のサイズが約５０μＬ未満であるとき、検出することができる。一部の実施形態では、分析器又は分析システムにより、第１の試料から第２の試料への分析物の約２０％未満の濃度の変化を、分析物が約１００フェムトモル未満の濃度で存在するとき、及びそれぞれの試料のサイズが約５０μＬ未満であるとき、検出することができる。一部の実施形態では、分析器又は分析システムによって、第１の試料から第２の試料への分析物の約２０％未満の濃度の変化を、分析物が約５０フェムトモル未満の濃度で存在するとき、及びそれぞれの試料のサイズが約５０μＬ未満であるとき、検出することができる。一部の実施形態では、分析器又は分析システムにより、第１の試料から第２の試料への分析物の約２０％未満の濃度の変化を、分析物が約５フェムトモル未満の濃度で存在するとき、及びそれぞれの試料のサイズが約５０μＬ未満であるとき、検出することができる。一部の実施形態では、分析器又は分析システムにより、第１の試料から第２の試料への分析物の約２０％未満の濃度の変化を、分析物が約５フェムトモル未満の濃度で存在するとき、及びそれぞれの試料のサイズが約５μＬ未満であるとき、検出することができる。一部の実施形態では、分析器又は分析システムにより、第１の試料から第２の試料への分析物の約２０％未満の濃度の変化を、分析物が約１フェムトモル未満の濃度で存在するとき、及びそれぞれの試料のサイズが約５μＬ未満であるとき、検出することができる。
【０１９１】
１つ又は複数の分析物の単一分子は、１つ又は複数の検出可能種における１つ又は複数の標識を検出することによって検出することができる。本発明のある例示的な実施形態では、検出可能種の単一分子を検出可能にしている外因性の性質は、少なくとも２つの標識によってもたらされる。例えば、標的の単一分子は、２つ以上の標識で標識されていて、各ラベルは、１つ又は複数の波長で検出される放射が他のラベル（単数又は複数）の放射と区別可能なので、別個である。この例では、単一分子は、遊離の標識（又は、分析物又は試料構成要素に付随的に結合したもの）と、２つ以上の波長で検出された放射の比によって区別される。別の実施例において、単一分子は、２つ以上の標識で標識され、その標識の少なくとも２つは同じ波長で放射する。この例では、単一分子は、各単一分子に結合させた２つ、３つ、又はそれ以上の標識からの放射によって生成する蛍光の検出強度に基づいて区別される。
【０１９２】
別の実施形態では、色素は、同一又は重複する励起スペクトルを有するが、区別可能な放射スペクトルを持つ。色素は、実質的に異なる放射スペクトルを持つように選択することが好ましく、約１０ｎｍ超で分離される最大放射を有することが好ましく、約２５ｎｍ超で分離される最大放射を有することがより好ましく、約５０ｎｍ超で分離される最大放射を有することがいっそう好ましい。機器を用いた方法を使用して２つの色素を区別することが望ましい場合、種々のフィルター及び回折格子によって、それぞれの放射スペクトルを独立に検出することができる。機器を用いた識別は、バンド幅が広い色素よりもバンド幅が狭い色素を選択することによって増強することもできるが、そのような色素は、必ず高振幅の放射を持たなければならない、又は統合されたシグナルの強さが失われることがシグナルの検出に不都合にならない十分な濃度で存在しなければならない。
【０１９３】
２つ以上の標識を使用する種々の実施形態では、第２の標識によって第１の標識の蛍光が消光し、その結果二重に標識された単一分子の蛍光シグナルが失われることがある。適切な蛍光発生／消光対としては、５’６−ＦＡＭＴＭ／３’Ｄａｂｃｙｌ、５’Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）４８８−Ｘ  ＮＨＳ  Ｅｓｔｅｒ／３’Ｄａｂｃｙｌ，５’Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）−Ｘ  ＮＨＳ  Ｅｓｔｅｒ／３’ＢｌａｃｋＨｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）−１（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）が挙げられる。
【０１９４】
別の実施例において、励起状態の２つの色素単一分子間の距離依存性相互作用である蛍光共鳴エネルギー転移（「ＦＲＥＴ」）のために、２つの標識を使用することができる。この場合、供与体から光子が放射されずに供与体から受容体単一分子に励起が転移される。供与体及び受容体単一分子は、近接近していなければならない（例えば、〜約１００Åの範囲内）。適切な供与体、受容体の対としては、フルオレセイン／テトラメチルローダミン、ＬＡＥＤＡＮＳ／フルオレセイン、ＥＤＡＮＳ／ｄａｂｃｙｌ、フルオレセイン／ＱＳＹ７、（Ｒ．Ｈａｕｇｌａｎｄ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ」、第９版、２００４年）及び他の多くの当業者に公知のものが挙げられる。
【０１９５】
単一分子は、色素タグ及び質量タグなどの２種以上の標識で標識して検出及び／又は識別を容易にすることができる。例えば、分析物は、一方が標識されず、質量タグ又は質量／電荷タグとして働き、他方が色素タグを有するような２つの検出可能種（例えば、２つの区別可能な抗体）で標識することができる。一部の実施形態では、例えば、輸送力として電気泳動を使用する場合、タンパク質は、色素タグを持つ抗体にのみゆっくりした速度で結合する、同様のサイズのタンパク質と区別される（追加的に結合した抗体の質量又は質量／電荷が増加することによって引き起こされる）。
【０１９６】
データ処理
試料中の単一分子の検出データを収集した後、種々の実施形態では、データを、同じ実験条件下で取得した参照セットデータと比較して、分析的、診断的又は予後的な値の差異の特徴を示す変動が分析物の単一分子の検出において存在するかどうかを決定する。例示的な実施形態では、試験データと参照データの差異は、疾患の状態、疾患の状態の進行、疾患の状態の期、又は疾患の状態に対する治療モダリティの有効性を示している。この比較を行ういくつもの手段が有効である。ある例示的な実施形態では、多変量解析を使用する。
【０１９７】
微妙な変動を有する試料から取得したデータ間の識別には、強力且つ繊細な分析方法の使用が必要である。これらの方法は、種々の原因によって生じ得る非線形性についてモデリングし、並びに器具の設定における日々のずれを説明しなければならない。試料の取扱いの間違い、縞ノイズ、基線の変化、バッチ間の変動、非診断的なデブリの存在、及び識別に不都合な影響を与える他の因子全てについても十分に説明し、モデリングすることが好ましい。最後に、強さを証明する方法のために、質の良いデータと質の悪いデータを区別し、参照セットを代表していない試料を除外しなければならない。代表していない試料は、外れ値の試料と称される。外れ値の試料は、参照セットの他の試料全てと統計的に異なる試料である。サイトカインなどの種の単一分子検出の場合、外れ値データセットは、単一分子のコピー数が最適に満たない試料、及び／又は非診断的なデブリが豊富な試料に由来し得る。
【０１９８】
種々の実施形態では、参照データセットは、選択された単一分子についてのデータセットにおける、全ての予想される変動を表している。次に、全試料のデータを、例えば、分光データの解析又は多変量解析の古典的な方法などの方法を使用して処理する。
【０１９９】
生体試料を分析するために多変量解析が使用されている。例えば、米国特許第４，９７５，５８１号（１９９０年１２月４日発行）において、Ｒｏｂｉｎｓｏｎらは、多変量解析を使用して既知の生体液における生体分析物の類似性を決定するための定量的な方法を記載している。
【０２００】
主成分分析（ＰＣＡ）及び識別分析を使用して正常な生体試料と異常な生体試料を区別する。Ｇｅら、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ  ４９巻：４３２〜４３６頁（１９９５年）を参照されたい。米国特許第５，５９６，９９２号（１９９７年、１月２８日発行）においてＨａａｌａｎｄらは、正常な細胞試料と悪性の細胞試料の差異を検出するための、多変量的な方法の使用を教示している。
【０２０１】
本発明において、多変量解析を使用する場合、単一分子の検出データの比較は、前処理（即ち、平滑化及び／又は誘導体化）される可能性がある、又は、平滑化及び誘導体化されない可能性があるデータに対する部分最小二乗法（ＰＬＳ）又は主成分分析（ＰＣＡ）統計的方法によって行うことができる。主成分回帰（ＰＣＲ）を使用する比較は、ＰＣＡを使用して行うことが好ましい。これらの統計的方法を行ういくつものコンピュータプログラムが利用可能であり、それらとしてＰＣＲ−３２（登録商標）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．，ＵＳＡから）及びＰＬＳ−ＰＬＵＳ（登録商標）及びＤＩＳＣＲＩＭＩＮＡＴＥ（登録商標）（Ｇａｌａｃｔｉｃ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｓａｌｅｍ，ＮＨ，ＵＳＡから）が挙げられる。根源的な理論及び算出についての考察は、例えば、Ｈａａｌａｎｄら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６０巻：１１９３〜１２０２頁（１９８８年）；Ｃａｈｎら、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、４２巻：８６５〜８７２頁（１９８８年）；及びＭａｒｔｅｎｓら、ＭＵＬＴＩＶＡＲＩＡＴＥ  ＣＡＬＩＢＲＡＴＩＯＮ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ（１９８９年）において見ることができる。ＰＣＲ及びＰＬＳはどちらも、参照セットを作成するための参照単一分子試料の単一分子に由来するデータのライブラリーを使用し、ここで各データセットは本質的に同一の条件下で取得される。データ解析の技法は、データの比較（ＰＣＲの場合、このステップはＰＣＡとして公知である）、及び線形回帰からなる。因子又は主成分の線形結合を使用して再構築されたデータセットを導き出す。この再構築されたデータセットを、分類のための基礎になる未知検体のデータセットと比較する。
【０２０２】
本発明の特定の態様では、個々のデータセットに対して生成した予測スコアを、検出された単一分子の特定の種について取得したデータセット全体にわたって「平均する」。試料全体にわたる個々のデータセットからの「平均」スコアを、試料の集合全体にわたって「平均」する。「平均する」方法は、単純に予測値の算術に基づいた平均をとることからなってよく、又は、当分野で公知の、母集団の分布を決定するための他の統計的方法に頼ってよい。この方法としては、例えば、中央値を決定すること、及び予測スコア集団の平均を決定することが挙げられる。集団が、決定された中央のどちらかの側に分散する程度を、例えば、標準偏差、四分位範囲、範囲及び平均偏差などの、ばらつきの測定を確立することによって評価する。本発明を実行するのに有用な、予測スコア集団の「平均」値及び集団の分散の程度の両方を確立するための他の方法は、当業者に明らかであろう。
【０２０３】
未知試料を分析する前に、同じ単一分子の別のデータセットを使用して参照を検証し最適化することができる。この第２のデータセットにより、モデルの順位を決定することによってＰＣＲモデル又はＰＬＳモデルの予測の正確度が増強される。最適な順位は、既知の診断についてのＰＣＲ予測又はＰＬＳ予測を比較することによる順位の範囲から決定する。最適と決定されたことから順位を上げる又は下げることは、ＰＬＳ予測又はＰＣＲ予測に不都合な影響を与える恐れがある。例えば、最適から最適以下に順位が徐々に下がるにつれて、ＰＣＲ又はＰＬＳは、参照スペクトルにおける変動を次第に説明しなくなる。対照的に、順位が最適であると決定されたところを超えて徐々に上がると、ＰＣＲ方法体系又はＰＬＳ方法体系によって、参照スペクトルにおける重要な情報ではなく無作為な変動のモデリングが引き起こされることになる。
【０２０４】
一般に、参照セットが含む単一分子の検出データが多いほど、モデルが良好になり、機器のずれ及び屈折率の変化によって生じ得るバッチ間の変動、基線の変化及び非線形性を説明する見込みが良好になる。参照データにより未知試料が真の代表になっている限り、下手な試料の取扱い及び調製による間違い、試料が不純であること、及びオペレーターのミスも同様に説明することができる。
【０２０５】
ＰＣＲ分析及びＰＬＳ分析を使用することの別の利点は、これらの方法により、参照データに相対的な未知試料のノイズレベルデータが測定されることである。生体試料を、複数の摂動源に供する。これらの摂動の一部はデータの質に激しく影響を及ぼし、「診断」の結果に不都合に影響する。したがって、参照データに適合するデータと参照データに適合しないデータ（例えば、外れ値の試料）を区別することが好ましい。データセット（試料）の参照データに対する適合又はあてはまりの悪さを検出することにおいて、Ｆ値が強力なツールである。一般に、Ｆ値が参照のＦ値よりも相当大きいことにより、「あてはまりの悪さ」が示され、それは分析から除外するべきである。外れ値の試料を除外できることは、質が悪く、損なわれたデータから「診断」を作成することが回避されるので、ＰＣＲ及びＰＬＳに強さ及び信頼性を加える。Ｆ値は、Ｈａａｌａｎｄら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６０巻：１１９３〜１２０２頁（１９８８年）、及びＣａｈｎら、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ  ４２巻：８６５〜８７２（１９８８年）に記載の方法によって算出することができる。
【０２０６】
異なる試料からの単一分子のデータ間を識別する場合、生体材料はもはや既知濃度の構成物を有さない。結果的に、例示的な実施形態では、参照データは、参照の１種として分類される試料に対して許容される変動の範囲を決定し、また参照データは、試料の作製における多様性を説明する前処理アルゴリズムも含むべきである。
【０２０７】
他のデータ処理アルゴリズムが本発明において有用である。例えば、本発明の一例示的な実施形態では、診断的に有益なサイトカイン（又は他のマーカー）は、まず、対照の個体と疾患患者の統計的に加重した差異を使用して同定することができ、Ｄ−ＮσＤ＊σＮとして算出することができる。ここでＤは特定の疾患を有すると診断される患者におけるサイトカインの濃度の中央値であり、Ｎは対照の個体の中央値であり、（Ｄ＊はＤの標準偏差であり、σＮはＮの標準偏差である。規模が大きくなるほど、疾患集団と正常集団の統計的差異は大きくなる。
【０２０８】
本発明の一実施形態によると、対照の個体と疾患患者の統計的に加重した差異が、０．２、０．５、１、１．５、２、２．５又は３を超えるサイトカインが診断的に有益なマーカーとして同定される。
【０２０９】
当業者には当然のことながら、患者自身が「対照」であり得る。例えば、アッセイが、疾患の進行を治療する経過のモニタリングの一部である場合、治療の経過の開始時点又は疾患が発見若しくは診断されたときに患者から取得したデータは、治療又は疾患の進行による疾患マーカーの変化を評価するための参照データセットとして役立ち得る。患者からのデータが、参照データセット又は基線のデータセットとして役立つ、本発明のアッセイのための試料をもたらす他の実施形態は、当業者に明らかであろう。
【０２１０】
特定のサイトカイン（単数又は複数）などの、診断マーカー（単数又は複数）として機能する特定の候補分析物の有効性を決定するための、本発明の方法に有用な別の統計分析方法は、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線分析である。ＲＯＣ曲線は、陽性の試料又は対象及び陰性の試料又は対象を正確に同定するための診断の能力に対するカットオフの基準（例えば、アッセイのシグナル又は分析物のレベルなどの診断的指標に対するカットオフ値）の効果を調べるためのグラフによる手法である。例示的な分析において、ＲＯＣ曲線の一方の軸は真陽性率（ＴＰＲ、真陽性の試料／対象が、陽性であると正しく同定される確率）、又は、代替として、偽陰性率（ＦＮＲ＝１−ＴＰＲ、真陽性の試料／対象が、陰性であると誤って同定される確率）である。他方の軸は、真陰性率（ＴＮＲ、真陰性の試料が、陰性であると正しく同定される確率）、又は、代替として、偽陽性率（ＦＰＲ＝１−ＴＮＲ、真陰性の試料が、陽性であると誤って同定される確率）である。ＲＯＣ曲線は、試料／対象の集団に対するアッセイ結果を使用して、試料／対象を陽性又は陰性であると同定するのに使用する診断的なカットオフ値を変化させ、各カットオフ値に対して算出したＴＰＲ（又はＦＮＲ）及びＴＮＲ（又はＦＰＲ）の値をプロットすることによって生成する。曲線下面積（本明細書ではＲＯＣ面積と称する）は、陽性の試料／対象と陰性の試料／対象を分離するための診断の能力の１つの指標である。
【０２１１】
データの診断的アッセイ及び統計分析の当業者は、本明細書において提供される教示及び手引きを考えれば、特定の適用のための必要（例えば、感度及び特異性）を最もよく満たす適切なカットオフ値、カットオフライン、カットオフ比、カットオフ帯域などを過度な負担なしで選択することができるであろう。例えば、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線などの種々の統計的なツールは、アッセイの性能（例えば、予測された真陽性画分、偽陽性画分、真陰性画分及び偽陰性画分）に対する、カットオフの調節の効果を評価するために利用することができる。或いは、患者集団の統計分析により、特異的な分析物の値を、患者が疾患を有する確率又は有さない確率に変換することができ得る。参照範囲を決定するために個体集団を選択し分析することにおけるバックグラウンドについては、Ｂｏｙｄ  Ｊ．Ｃ．「Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｌｉｍｉｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ」ｉｎ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｉｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  Ｔｅｘｔ；Ｄ．Ｒ．Ｄｕｆｏｕｒ  Ｅｄ．、１９９９年、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃ．ＣＬＩＮ．ＣＨＥＭ．、Ｃｈａｐｔｅｒ  ２、２−１から２−７頁を参照されたい。疾患の可能性についての決定の限界（即ち、カットオフ）を試験結果から選択又は計算することにおけるバックグラウンドについては、Ｂｏｙｄ  Ｊ．Ｃ．「Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ａｉｄｓ  ｆｏｒ  Ｔｅｓｔ  Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ」ｉｎ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｉｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  Ｔｅｘｔ；Ｄ．Ｒ．Ｄｕｆｏｕｒ  Ｅｄ．、１９９９年、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃ．ＣＬＩＮ．ＣＨＥＭ．、Ｃｈａｐｔｅｒ  ３、３−１から３−１１頁を参照されたい。
【０２１２】
本発明の教示を考えれば、当業者は、第１のマーカー（例えば、第１のサイトカイン）及び１つ又は複数の追加のマーカー（例えば、第２のサイトカイン）の選択により、相関プロット軸を入れ換えることができ、したがって、患者試料の測定されたマーカーレベルが特定のカットオフ比、カットオフライン及び／又はカットオフプロファイルを上回るか下回るかを決定するための基準によって疾患の状態が示され、それに合うように分析を調節することができることも理解するであろう。
【０２１３】
本発明は、分析物の単一分子の分析から取得したデータセットも提供する。ある例示的な実施形態では、データセットは、前記分析物の単一分子に対するアッセイから収集した分析物からのシグナルに対応する少なくとも１つのデータ点を含み、前記アッセイは、０．５ｐｇ／ｍｌ未満の検出限界及び少なくとも２．５ｌｏｇのダイナミックレンジを有する。
【０２１４】
別の態様では、本発明は、ビジネスモデルを提供する。一実施形態では、本発明は、事業体が本発明の方法を使用して試料のアッセイについて結果を得ること、前記結果を報告すること、そして、結果を報告することに対して、事業体に支払いがなされることを含むビジネスを行う方法を提供する。一部の実施形態では、事業体は、臨床検査改善修正（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  Ａｍｅｎｄｍｅｎｔｓ）（ＣＬＩＡ）研究所である。一部の実施形態では、事業体は、ＣＬＩＡ研究所ではない研究所である。試料は、単一粒子検出器によって分析することができる任意の種類の試料であってよい。一部の実施形態では、試料は個体からのものである。個体は、本明細書に記載の任意の種類の個体であってよい。一部の実施形態では、個体は、治療方法のスクリーニング、診断、予後、モニタリング及び／又は決定が望まれる患者（例えば、動物、例えば、ヒト）である。一部の実施形態では、個体は、臨床試験又は前臨床試験に参加している個体（例えば、動物、例えば、ヒト）である。一部の実施形態では、試料は、研究計画、例えば、生物医学的研究、農業研究、工業研究、教育的研究、バイオテロリズム研究などに関わっている個体からのものである。一部の実施形態では、支払いは、結果報告を受け取る個体、例えば、医療の専門家及び／又は試料を得た個体によって、分析を行う事業体、例えば、ＣＬＩＡ研究所に対してなされ得る、又は、試料を得た個体によって、分析を行う事業体から報告を受け取る個体に対して、若しくは事業体自体に対して、若しくは両者に対して、若しくはそのいくつかの組合せに対してなされ得る。別の実施形態では、本発明は、個体からの試料のアッセイについての結果を得るために、単一粒子を検出することができる２つのインタロゲーション空間を備える検出器を医療の提供者が使用すること、前記結果を個体又はその代表者に報告すること、及び前記結果を報告することに対して個体から支払いがなされることを含むビジネスを行う方法を提供する。
【０２１５】
キット
本発明は、本発明の分析を行うためのキットも提供する。ある例示的な実施形態では、キットは、１つ又は複数の捕獲種、検出可能種、及び磁性粒子を含む。キットは、本発明の方法を行うのに使用する１つ又は複数の試薬も含む。本発明のアッセイを行うための説明書も提供される。ＩＬ−６の検出における例示的なキット及びその使用を例２に記載する。
【０２１６】
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態を例示するために提供され、それら又は本発明の他の実施形態のいずれにも限定するものではない。
【実施例】
【０２１７】
（例１）
材料と方法
材料
抗体及び分析物（組換え）は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から入手した。抗体の対応対については製造者の推奨に従った。抗体の標識に使用した蛍光色素及びビオチンサクシニミジルエステルは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から入手した。ラット、イヌ及びサルのｃＴｎＩは、天然源から精製されたものであり、Ｈｙｔｅｓｔ（Ｓｗｅｄｅｎ）から入手した。ヒトクエン酸リチウム血漿検体は、Ｉｎｔｅｒｓｔａｔｅ  ｂｌｏｏｄ  ｂａｎｋ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。ストレプトアビジンで被覆した常磁性微粒子（ＭＰ）は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手した（ＭｙＯｎｅ，＃６５０−０１）。抗体は、製造者の推奨を活用して蛍光色素（検出抗体、通常ポリクローナル）及びビオチン（捕獲抗体、通常モノクローナル）で標識した。ＭＰは、飽和条件下でビオチン標識した抗体で被覆し（製造者の推奨に従って）、洗浄し、アッセイバッファー中に保存した。アッセイバッファーは、１％ＢＳＡ、トリス緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４、０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００及び異種親和性／ＨＡＭＡ抗体遮断試薬（Ｓｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから購入）からなり、製造者の推奨に従って使用した。
【０２１８】
Ｅｒｅｎｎａイムノアッセイ
他に明記しない限り、典型的なＥｒｅｎｎａイムノアッセイは、以下の通り行った。試料又は標準物質（例えば５０μＬ〜１００μＬ）を捕獲抗体で被覆したＭＰ（例えば１５０μＬ）を含有するアッセイバッファーで希釈し、９６ウェルプレート中、２５℃で１〜２時間、振とうしながらインキュベートした。全ての血漿試料又は血清試料を前処理なしでそのまま試験した。磁気ベッド（Ａｍｂｉｏｎ，Ｔｅｘａｓ）を使用してＭＰを分離した。上清を除去し、ＭＰを１回洗浄し、次いで検出抗体（アッセイバッファー中に希釈、５０〜５００μｇ／ｍＬ）２０μＬを加え、２５℃で６０分、振とうしながらインキュベートした。ＭＰを再度磁気的に分離し、トリス緩衝食塩水＋０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を使用して６回洗浄した。残った洗浄バッファーを除去した後、溶出バッファー（４Ｍの尿素）２０μＬを加えた。この試薬は、抗体−分析物相互作用を破壊し、ＭＰから検出抗体を遊離させる。次いで、各９６ウェル中の溶液を３８４ウェルの濾過プレート（０．２ミクロン、ＡｃｒｏＰｒｅｐ，Ｅａｓｔ  Ｈｉｌｌｓ  ＮＹ）に移し、３，０００ＲＰＭで３分遠心分離して溶出バッファー中の検出抗体をＭＰから分離した。次いで、溶出、濾過された３８４ウェルプレート中の材料をＥｒｅｎｎａイムノアッセイシステム（Ｓｉｎｇｕｌｅｘ，Ｉｎｃ．）に置いた。
【０２１９】
Ｅｒｅｎｎａイムノアッセイシステム
Ｅｒｅｎｎａイムノアッセイシステムは、単一分子計数技術に基づいている。（直径１００マイクロメートルの）キャピラリーフローセルによって、３８４ウェルプレートの各ウェルから液体を少しずつ吸い上げ、汲み出す。液体は、キャピラリー内部のインタロゲーション空間を通過する。図１に示すように、レーザーから発生する光線は二色性ミラー及び共焦点顕微鏡レンズを経由してインタロゲーション空間内に向けられる。色素標識した抗体がこのインタロゲーション空間を通過すると、その抗体は、共焦点顕微鏡レンズ及び光子検出器を経由して測定される蛍光光線を放射する。検出器からの出力は、パルスの列であり、各パルスが検出された光子１つを表している。これらのパルスは、計数用電子機器に送られ、そこでパルスは１ミリ秒ビンで計数される。出力シグナルの組合せを使用することによって４．５＋ｌｏｇダイナミックレポートレンジを得る。最初に、バックグラウンドレベルを決定し、このレベルに基づいて、バックグラウンドを超える５標準偏差閾値を作成する。この閾値より大きい光線の閃光のみを計数する。これらの個々のピーク（シグナル強度ではない）を１分の間隔又は１，０００ピークが得られるまでのいずれかにわたって合計する。最後のシグナルは、それらの測定された事象全ての合計であり、検出事象（ＤＥ）と称される。第２の出力は事象光子（ＥＰ）と称され、全検出事象において計数された全光子の合計である。２つの分子が同じ１ｍｓ計数ビンの検出器を通過する確率がかなりある場合、この測定を高濃度で使用する。分析物の濃度が最も高いところでは、ＥＰ事象は飽和し始め、全光子事象の合計である総光子（ＴＰ）を使用する。ＤＥ、ＥＰ及びＴＰシグナルを使用して、各シグナル種について加重した４パラメータロジスティック曲線のあてはめを生成する。未知の濃度を見積もるために、ＤＥシグナル、ＥＰシグナル及びＴＰシグナルをそれぞれの標準曲線から離して補間して３つの別々の濃度の見積もりを得る。これら３つの濃度を、標準曲線の傾きに基づく加重平均を使用して組み合わせる。これにより、＞４．５ｌｏｇ線形レポートレンジがもたらされる。
【０２２０】
結果
本節は、Ｅｒｅｎｎａイムノアッセイシステムの性能についての全体的な見通しをもたらす目的で、異なる分析物を使用した一連の異なる実験からの例示的なデータを提示する。
【０２２１】
レポートレンジ、線形性、正確度及び再現性
ヒトＩＬ−１７アッセイを用いて生成した典型的なシグナルデータの例を表１に示す。標準曲線を構築するために使用するＤＥシグナル、ＥＰシグナル及びＴＰシグナルを太字フォントで示す。曲線のあてはめの正確度を決定するために、表１のシグナル値を、曲線のあてはめアルゴリズムを使用して逆補間し、結果を測定ｐｇ／ｍＬ対予測ｐｇ／ｍＬとして示す。
【表１】
2012503202.tif 000003
【０２２２】
平均バイアス（測定／予測）は９９％（範囲８４〜１２３％）であり、６０ｆｇ／ｍＬ〜１ｎｇ／ｍＬで線形応答（Ｒ２＝０．９９；ｙ＝０．８６＋５．４）が観測され、これは４．３ｌｏｇレポートレンジを超える正確な曲線のあてはめを表している。生体試料における定量化の正確度を、分析物（ＩＬ−１７、ＩＬ−６及びヒト心筋トロポニン−Ｉ、ｃＴｎＩ）のヒト血漿パネルへのスパイク回収率（スパイク５ｐｇ／ｍＬ及びスパイク５０ｐｇ／ｍＬ）を測定することによって決定した。平均％回収率は、どちらの濃度においても９０％〜１１０％であった（データは示さず）。８回の連続した実行にわたる（毎日１ロットの試薬及び新鮮に調製した較正物質を使用して６日間にわたった）Ｅｒｅｎｎａ  ｃＴｎＩイムノアッセイ及び標準曲線の逆補間を使用した曲線のあてはめアルゴリズムの正確度を図２に示す。これらの実験において、使用した最高濃度の標準物質は１００ｐｇ／ｍＬであった。示した標準曲線の上端及び下端のどちらにおいても線形応答（Ｒ２＝０．９９）が観測された。較正物質を逆補間決定するための８回のアッセイ実行のＣＶは、＞０．７８ｐｇ／ｍＬの全ての値について＜１０％であった。ＣＶは、０．３９ｐｇ／ｍＬ及び０．２ｐｇ／ｍＬの値について、それぞれ、１６％及び２３％であった（表２）。既知量の分析物をスパイクした血漿又は血清を使用して、アッセイ間の精度及びアッセイ内の精度の試験を行った。これらの実験で得られた結果の例として、ヒトＩＬ−１７アッセイは３〜８％（ＩＬ−１７＞０．４ｐｇ／ｍＬ）の範囲及び１０％（０．２ｐｇ／ｍＬ）のアッセイ内（４連）ＣＶ、並びに３〜９％（ＩＬ−１７＞０．４ｐｇ／ｍＬ）の範囲及び１１％（０．２ｐｇ／ｍＬ）のアッセイ間（６回のアッセイ実行）がもたらされた。
【表２】
2012503202.tif 000004
【０２２３】
感度
Ｅｒｅｎｎａイムノアッセイシステムについての検出の分析的な感度又は限界（ＬｏＤ；ＤＥシグナルの線形部分の傾きで割ったゼロ分析物「バックグラウンド」からのシグナルの２つの標準偏差として定義される；バックグラウンドシグナルから９５％の信頼度で区別することができる分析物濃度の最低レベルを表す）は、分析物によって変動し、使用した試料（標準物質）の体積に左右された。表３は、各アッセイについて２つの異なる試料体積を使用した１０回の異なるＥｒｅｎｎａヒトイムノアッセイについてのＬｏＤを示す。
【表３】
2012503202.tif 000005
【０２２４】
試料の体積が多いと、一貫してＬｏＤが低くなり、感度が増強された。例えば、＞５０μＬの試料体積ではＬｏＤが０．０１ｐｇ／ｍＬ（ヒトＩＬ−６）〜０．１２ｐｇ／ｍＬ（ヒトＶＥＧＦ）の範囲になった。試料の体積が減少するにつれて、ＬｏＤは比例して増加した（平均比例関係１０５％）。本発明者らは、最適な感度、試料中にスパイクされた分析物の回収及び希釈の線形性を得るために、試料（血漿）に対するアッセイバッファーの体積比をアッセイ特異的な形で変動させる必要があることを見出した。表３に示したアッセイの体積は、そのような最適化を表す。全てのアッセイを、１〜２時間の捕獲及び１時間の検出の２ステップの形で行った。
【０２２５】
アッセイの感度に対するアッセイのインキュベーション時間の影響を理解するために実験を行った。これらの実験の目的は、Ｅｒｅｎｎａシステムを急速な試験環境で使用することの潜在的な適用性を理解することであった。これを実現するために、単一ステップのｃＴｎＩアッセイと組み合わせたインキュベーションのステップを、試料５０μＬ（加えてアッセイバッファー１５０μＬ）を使用して行い、同時に捕獲反応及び検出反応（１０μｇ／ウェルのＭＰ及び１００ｎｇ／ｍＬの検出抗体）を行った。インキュベーション時間が長くなるにつれて、アッセイの感度が改善した。これは、時間の関数として傾き応答が改善した（１５分、傾き６４；３０分、傾き９０；６０分、傾き１０２；１２０分、傾き１５２）一方、アッセイのバックグラウンド（ゼロ分析物較正物質のＤＥシグナル）は時間を経ても一定のままであったことに起因した。注目すべきことに、ＮＩＳＴ参照材料を使用して１５分のインキュベーションでさえも、ＬｏＤ０．６１ｐｇ／ｍＬが得られた（データは示さず）。
【０２２６】
ヒトｃＴｎＩアッセイの感度を使用して、１００人のヒト血液供与者から得たヒト血漿中のｃＴｎＩ（試料サイズ５０μＬ）の範囲を定義した。結果を図３に示す。値は＜２ｐｇ／ｍＬ〜３９ｐｇ／ｍＬの範囲であり、平均値は２．１９＋／−４．１ｐｇ／ｍＬであった。３つの血漿は、ＬｏＤである＜０．２ｐｇ／ｍＬの値を有した。百分位９９位の値は９ｐｇ／ｍＬであった。明白な外れ値３９ｐｇ／ｍＬをデータセットから除去した場合、集団の平均は１．８３＋／−１．９ｐｇ／ｍＬであり、百分位９９位は８ｐｇ／ｍＬであった。
【０２２７】
（例２）
材料と方法
【表４】
2012503202.tif 000006
【表５】
2012503202.tif 000007
【表６】
2012503202.tif 000008
【０２２８】
手順
９６ウェルポリプロピレンプレートの各ウェルに捕獲試薬（１００μＬ）、その後標準物質／試料７５μＬを加えた。プレートに蓋をし、室温で２時間インキュベート／振とうした。蓋を除去し、ＭＰが定着／集積するのに十分な時間、プレートを磁石の上に置いた。上清を除去した。プレートを磁石に置いたまま、洗浄バッファー（２５０μＬ）を加えた。２分後、バッファーを除去した。プレートを磁石から除去し、ＩＬ−６検出試薬（２０μＬ）を加えた。プレートを１２０×ｇでパルス遠心分離し、次いで蓋をし、室温で１時間インキュベート／振とうした。プレートを、ＭＰが集積する間、約２分間磁石上に置いた。上清を除去した。洗浄バッファー（２５０μＬ）を加え、磁石の近くに磁気的に集積したＭＰを回収した（３×）。各サイクルの間、バッファーを吸引する前に、粒子を適用したそれぞれの洗浄バッファーと一緒に２分間インキュベートした。磁石を除去し、洗浄バッファー（２５０μＬ）を加え、プレートを１０秒間振とうしてＭＰを再懸濁させた。プレートの全内容物を新しい９６ウェルプレートに移した。移動させた後、プレートを磁石の上に置き、２分後に上清を除去した。プレートを磁石から除去し、洗浄バッファー（２５０μＬ）を加えた。プレートを１０秒間振とうした。洗浄ステップを繰り返した。プレートを磁石から除去し、各ウェルに溶出バッファー（２０μＬ）を加えた。プレートを１２０×ｇでパルス遠心分離した。プレートに蓋をし、室温で３０分間インキュベート／振とうした。濾過プレートを、３８４ウェルプレートを覆って置き、９６ウェルプレートの内容物を３８４ウェルプレートに移した。濾過プレートコンボに蓋をし、１，２００×ｇで１時間遠心分離した。一番上の濾過プレートを除去し、廃棄した。一番上の濾過プレートを除去し、３８４ウェルプレートに蓋をし、穴開け可能なプレートシールカバーで蓋をし、アッセイ混合物を光学リーダーに移した（例えば、Ｅｒｅｎｎａ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｓｉｎｇｕｌｅｘ）。
【０２２９】
結果
以下は、例示的な曲線標準ＩＬ−６曲線である。
【表７】
2012503202.tif 000009
【０２３０】
本発明は、細胞種間の化学的差異を検出するため、及び正常細胞試料と疾患細胞試料を区別するための実質的に新規の方法を提供する。特定の実施例を提供したが、上記の説明は例示的であり、制限するものではない。本明細書を参照すれば、当業者には開示した方法の多くの変形が明らかになるであろう。したがって、本発明の範囲は、上記の説明を参照して決定されるのではなく、添付の特許請求の範囲、それに加えてその均等物の全範囲を参照して決定されるべきである。
【０２３１】
当業者には当然のことながら、上記の技法、特に診断に関連する種の単一分子の検出は、本明細書で例証したものに加えて、他の診断種に適用される。本明細書に記載し列挙した技法は、実施例としてのものであり、明示的な診断種を用いて使用することに本発明の範囲を限定するものではない。
【０２３２】
本明細書で言及した全ての刊行物、特許及び特許明細書は、個々の刊行物、特許又は特許明細書について、あらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み込まれることを特にそれぞれ示したのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【図１】
2012503202.tif 000010
【図２】
2012503202.tif 000011
【図３】
2012503202.tif 000012
【図４Ａ】
2012503202.tif 000013
【図４Ｂ】
2012503202.tif 000014
【図５Ａ】
2012503202.tif 000015
【図５Ｂ】
2012503202.tif 000016
【図５Ｃ】
2012503202.tif 000017
【図５Ｄ】
2012503202.tif 000018
【図５Ｅ】
2012503202.tif 000019
【図６】
2012503202.tif 000020
【国際調査報告】
2012503202.tif 000021
2012503202.tif 000022
2012503202.tif 000023