(57)【要約】本開示は、「オリゴヌクレオチド」プローブを用いることによる、血液／血清／血漿試料中のチクングニアウィルス核酸の存在を決定する方法の詳細な記載を示す。設計された「オリゴヌクレオチド」プローブを、リアルタイムＰＣＲを用いることによって、感染した試料中のチクングニアウイルスの定性的な、または定量的な検出のために用いることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１および２を有するプローブ。
【請求項２】
チクングニア検出用である、請求項１に記載のプローブ。
【請求項３】
５’末端もしくは３’末端または両方にて検出可能な標識と結合した、配列番号１および２を有するプローブ。
【請求項４】
５’末端にてフルオロフォアと結合しており、３’末端にてクエンチャーと結合している、請求項３に記載のプローブ。
【請求項５】
フルオロフォアが、フルオレセインおよびフルオレセイン誘導体ＶＩＣ、ＪＯＥ、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸、クマリンおよびクマリン誘導体、ルシファーイエロー、テキサスレッド、テトラメチルローダミン、６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、テトラクロロ−６−カルボキシフルオレセイン、５−カルボキシローダミンならびにシアニン色素を含む群から選択される、請求項４に記載のプローブ。
【請求項６】
クエンチャーが、テトラメチルローダミン、４’−（４−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸、４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−マレイミド、テトラメチルローダミン、カルボキシテトラメチルローダミンおよびBlack Hole Quencher色素を含む群から選択される、請求項４に記載のプローブ。
【請求項７】
好ましいフルオロフォアが５’末端における６−カルボキシフルオレセイン［ＦＡＭ］であり、好ましいクエンチャーが３’末端におけるテトラメチルローダミン［ＴＡＭＲＡ］である、請求項５または６に記載のプローブ。
【請求項８】
配列番号３、４、５および６のプライマー。
【請求項９】
配列番号３および４を有するプライマーがセンスプライマーであり、配列番号５および６を有するプライマーがアンチセンスプライマーである、請求項８に記載のプライマー。
【請求項１０】
配列番号３および５を有するプライマーが、配列番号１のプローブに対応し、配列番号４および６を有するプライマーが、配列番号２のプローブに対応する、請求項９に記載のプライマー。
【請求項１１】
配列番号１および２を有するプローブが、任意に、検出可能な標識と、５’末端もしくは３’末端または両方にて結合している、請求項９に記載のプライマー。
【請求項１２】
チクングニアの検出のためのＰＣＲ反応混合物であって、前記混合物が、検出される試料、核酸増幅試薬、配列番号１および２を含む群から選択されるプローブ、ならびに配列番号３、４、５および６を含む群から選択される対応するプライマーを含む、前記ＰＣＲ反応混合物。
【請求項１３】
配列番号３および５を有するプライマーが、配列番号１のプローブに対応し、配列番号４および６を有するプライマーが、配列番号２のプローブに対応する、請求項１２に記載の反応混合物。
【請求項１４】
配列番号１および２を有するプローブが、任意に、検出可能な標識と、５’末端もしくは３’末端または両方にて結合している、請求項１３に記載の反応混合物。
【請求項１５】
試料が、血液、血清および血漿を含む群から選択される、請求項１２に記載の反応混合物。
【請求項１６】
チクングニア感染症を検出し、任意に定量する方法であって、前記方法が、以下のステップ：
ａ）検出するべき試料、核酸増幅試薬、配列番号１および２を含む群から選択されるプローブならびに配列番号３、４、５および６を含む群から選択される対応するプライマーを含む反応混合物を形成するステップ；
ｂ）反応混合物にＰＣＲを施して、標的配列のコピーを得、続いてチクングニア感染症を検出するための蛍光シグナルの増大を測定するステップ；ならびに、
ｃ）任意に検出されたシグナルから検量線を作成して、チクングニア感染症を定量するためのコピー数を得るステップ
を含む、前記方法。
【請求項１７】
配列番号３および４を有するプライマーがセンスプライマーであり、配列番号５および６を有するプライマーがアンチセンスプライマーであり、かつ試料が、血液、血清および血漿を含む群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
配列番号３および５を有するプライマーが、配列番号１のプローブに対応し、配列番号４および６を有するプライマーが、配列番号２のプローブに対応する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
配列番号１および２を有するプローブが、５’末端もしくは３’末端または両方にて検出可能な標識と結合し、かつ蛍光シグナルが、３’末端にてクエンチャーを有すると共に５’末端にてフルオロフォアを有するプローブによって発生する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
フルオロフォアが、フルオレセインおよびフルオレセイン誘導体ＶＩＣ、ＪＯＥ、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸、クマリンおよびクマリン誘導体、ルシファーイエロー、テキサスレッド、テトラメチルローダミン、６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、テトラクロロ−６−カルボキシフルオレセイン、５−カルボキシローダミンならびにシアニン色素を含む群から選択され、またクエンチャーが、テトラメチルローダミン、４’−（４−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸、４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−マレイミド、テトラメチルローダミン、カルボキシテトラメチルローダミンおよびBlack Hole Quencher色素を含む群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
チクングニア感染症の検出のためのキットであって、前記キットが、個々に、または組み合わせて配列番号１および２のプローブを；個々に、または組み合わせて配列番号３、４、５および６の対応するプライマー対を、ならびに増幅試薬を含む、前記キット。
【請求項２２】
配列番号１および２を有するプローブが、任意に５’末端もしくは３’末端または両方にて検出可能な標識と結合する、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
増幅試薬が、塩化マグネシウム、Ｔａｑポリメラーゼおよび増幅用の緩衝液を含む組み合わせである、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、「オリゴヌクレオチド」プローブを用いることによって血液試料から単離した核酸を用いてチクングニアウイルス感染を検出するための方法に関する。検出のためにここで用いる方法は、リアルタイムＰＣＲによるものである。
【背景技術】
【０００２】
チクングニアウイルスは、熱帯アフリカおよびアジアの土地に固有であり、そこでは、感染した蚊、通常はAedes属の蚊が噛むことによってヒトに伝染する。チクングニアウイルスは、トガウイルス科の下位のアルファウイルスに属する。それは、「アルボウイルス（Arbovirus）」（Ａｒ−節足動物（arthropod）、ｂｏ−媒介性の（borne））である。ＣＨＩＫ熱の流行は、ヒト−蚊−ヒト伝染によって持続する。「チクングニア」の語は、地域方言における、この疾患と関連する重篤な関節痛に罹患している患者の歪められた姿勢の描写に由来すると考えられる。主なウイルス保有宿主はサルであるが、ヒトを含む他の種もまた、発症し得る。
【０００３】
チクングニア（Makonde言語において「上方に曲がる」）ウイルス（ＣＨＩＫＶ）は、アルファウイルス属の昆虫媒介性ウイルスであり、それは、ウイルスを保因する(Virus-carring)Aedes蚊によってヒトに伝染する。最近、重篤な病的状態と関連するＣＨＩＫＶのアウトブレイクがあった。ＣＨＩＫＶは、デング熱と同様の徴候を有する疾患を生じる。ＣＨＩＫＶは、２〜５日のみ継続する疾患の急性の発熱期、続いて四肢の関節を冒す長期にわたる関節痛の疾患(arthralgic disease)を伴って現れる。関節のＣＨＩＫＶ感染に関連する疼痛は、数週間または数ヶ月にわたり存続する。
【０００４】
チクングニア病の潜伏期間は、２〜４日である。疾患の徴候は、４０℃（１０４°Ｆ）までの熱、体幹および時折肢の点状出血性皮疹または斑状丘疹状皮疹、ならびに複数の関節を冒す関節痛または関節炎を含む。他の非特異的徴候は、頭痛、結膜の感染症およびわずかな羞明を含み得る。典型的に、熱は２日間継続し、突然終了する。しかし、他の徴候、即ち関節痛、強烈な頭痛、不眠症および極度の衰弱は、可変の期間の間；通常約５〜７日間継続する。患者は、彼らの年齢に依存して、はるかにより長い期間にわたって関節痛を訴えた。
【０００５】
チクングニアについての一般的な臨床検査は、ＲＴ−ＰＣＲ、ウイルス単離および血清学的試験を含む。ウイルス単離によって、最も決定的な診断が得られるが、完了に１〜２週間を要し、バイオセーフティーレベル３の研究所において行わなければならない。当該手法は、特定の細胞系を全血からの試料に曝露し、チクングニアウイルス特異性応答を確認することを含む。ネステッドプライマー対（nested primer pairs）を用いるＲＴ−ＰＣＲは、数種のチクングニアに特異的な遺伝子を全血から増幅する。結果を、１〜２日において決定することができる。血清学的診断には、他の方法より多量の血液が必要であり、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、チクングニアに特異的なＩｇＭ濃度を測定する。結果には２〜３日を要し、偽陽性が、他の関連するウイルス、例えばO'nyong'nyongウイルスおよびSemliki Forestウイルスを介した感染と共に発生し得る。
【発明の概要】
【０００６】
したがって、本開示は、配列番号１および２を有するプローブ；５’末端もしくは３’末端または両方にて検出可能な標識と結合した、配列番号１および２を有するプローブ；配列番号３、４、５および６のプライマー；チクングニアの検出のためのＰＣＲ反応混合物であって、前記混合物が、検出すべき試料、核酸増幅試薬、配列番号１および２を含む群から選択されるプローブ、ならびに配列番号３、４、５および６を含む群から選択される対応するプライマーを含む、前記反応混合物；
【０００７】
チクングニア感染症を検出し、任意に定量するための方法であって、前記方法が、ａ）検出すべき試料、核酸増幅試薬、配列番号１および２を含む群から選択されるプローブならびに配列番号３、４、５および６を含む群から選択される対応するプライマーを含む反応混合物を形成するステップ、ｂ）反応混合物にＰＣＲを施して、標的配列のコピーを得、続いてチクングニア感染症を検出するための蛍光シグナルの増大を測定するステップ、ならびにｃ）任意に検出されたシグナルから検量線を作成して、チクングニア感染症を定量するためのコピー数を得るステップを含む、前記方法；ならびに、チクングニア感染症の検出のためのキットであって、前記キットが、個々のまたは組み合わせでの配列番号１および２のプローブ；個々のまたは組み合わせでの配列番号３、４、５および６の対応するプライマー対ならびに増幅試薬を含む、前記キットに関する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、チクングニア検量線を示す。
【０００９】
開示の詳細な説明
本開示は、配列番号１および２を有するプローブに関する。
本開示の態様において、前記プローブは、チクングニアの検出のためのものである。
本開示は、５’末端もしくは３’末端または両方にて検出可能な標識と結合した、配列番号１および２を有するプローブに関する。
【００１０】
本開示の態様において、プローブは、５’末端にてフルオロフォアと、また３’末端にてクエンチャーと結合している。
本開示の他の態様において、前記フルオロフォアは、フルオレセインおよびフルオレセイン誘導体ＶＩＣ、ＪＯＥ、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸、クマリンおよびクマリン誘導体、ルシファーイエロー(lucifer yellow)、テキサスレッド、テトラメチルローダミン、６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、テトラクロロ−６−カルボキシフルオレセイン、５−カルボキシローダミンならびにシアニン色素を含む群から選択される。
【００１１】
本開示のさらに他の態様において、前記クエンチャーは、テトラメチルローダミン、４’−（４−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸、４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−マレイミド、テトラメチルローダミン、カルボキシテトラメチルローダミンおよびBlack Hole Quencher色素を含む群から選択される。
【００１２】
本開示のさらなる他の態様において、好ましいフルオロフォアは、５’末端における６−カルボキシフルオレセイン［ＦＡＭ］であり、好ましいクエンチャーは、３’末端におけるテトラメチルローダミン［ＴＡＭＲＡ］である。
【００１３】
本開示は、配列番号３、４、５および６のプライマーに関連する。
本開示の態様において、配列番号３および４を有するプライマーは、センスプライマーであり、配列番号５および６を有するプライマーは、アンチセンスプライマーである。
【００１４】
本開示の他の態様において、配列番号３および５を有するプライマーは、配列番号１のプローブに対応し、配列番号４および６を有するプライマーは、配列番号２のプローブに対応する。
本開示のさらなる他の態様において、配列番号１および２を有するプローブは、任意に５’末端もしくは３’末端または両方にて検出可能な標識と結合する。
【００１５】
本開示は、チクングニアの検出のためのＰＣＲ反応混合物に関し、前記混合物は、検出すべき試料、核酸増幅試薬、配列番号１および２を含む群から選択されるプローブ、ならびに配列番号３、４、５および６を含む群から選択される対応するプライマーを含む。
【００１６】
本開示の態様において、配列番号３および５を有するプライマーは、配列番号１のプローブに対応し、配列番号４および６を有するプライマーは、配列番号２のプローブに対応する。
本開示の他の態様において、配列番号１および２を有するプローブは、任意に５’末端もしくは３’末端または両方にて検出可能な標識と結合する。
本開示のさらなる他の態様において、試料は、血液、血清および血漿を含む群から選択される。
【００１７】
本開示は、チクングニア感染症を検出し、任意に定量する方法であって、前記方法が、以下のステップ：
ａ）検出すべき試料、核酸増幅試薬、配列番号１および２を含む群から選択されるプローブならびに配列番号３、４、５および６を含む群から選択される対応するプライマーを含む反応混合物を形成するステップ；
ｂ）反応混合物にＰＣＲを施して、標的配列のコピーを得、続いてチクングニア感染症を検出するための蛍光シグナルの増大を測定するステップ；ならびに、
ｃ）任意に検出されたシグナルから検量線を作成して、チクングニア感染症を定量するためのコピー数を得るステップ
を含む、前記方法に関する。
【００１８】
本開示の態様において、配列番号３および４を有するプライマーは、センスプライマーであり、配列番号５および６を有するプライマーは、アンチセンスプライマーであり、ここで試料は、血液、血清および血漿を含む群から選択される。
本開示の他の態様において、配列番号３および５を有するプライマーは、配列番号１のプローブに対応し、配列番号４および６を有するプライマーは、配列番号２のプローブに対応する。
【００１９】
本開示のさらなる他の態様において、配列番号１および２を有するプローブは、５’末端もしくは３’末端または両方にて検出可能な標識と結合し、かつ蛍光シグナルは、３’末端にてクエンチャーを有すると共に５’末端にてフルオロフォアをを有するプローブによって発生する。
【００２０】
本開示のさらなる他の態様において、フルオロフォアは、フルオレセインおよびフルオレセイン誘導体ＶＩＣ、ＪＯＥ、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸、クマリンおよびクマリン誘導体、ルシファーイエロー、テキサスレッド、テトラメチルローダミン、６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、テトラクロロ−６−カルボキシフルオレセイン、５−カルボキシローダミンならびにシアニン色素を含む群から選択され、またここでクエンチャーは、テトラメチルローダミン、４’−（４−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸、４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−マレイミド、テトラメチルローダミン、カルボキシテトラメチルローダミンおよびBlack Hole Quencher色素を含む群から選択される。
【００２１】
本開示は、チクングニア感染症の検出のためのキットであって、前記キットが、個々に、または組み合わせて配列番号１および２のプローブを；個々に、または組み合わせて配列番号３、４、５および６の対応するプライマー対を、ならびに増幅試薬を含む、前記キットに関する。
【００２２】
本開示の態様において、配列番号１および２を有するプローブは、任意に５’末端もしくは３’末端または両方にて検出可能な標識と結合する。
本開示の他の態様において、前記増幅試薬は、塩化マグネシウム、Ｔａｑポリメラーゼおよび増幅のための緩衝液を含む組み合わせである。
【００２３】
本開示の原理的な目的は、感染した血液試料から単離した核酸を用いたチクングニアウイルス感染の検出である。検出の方式は、フルオロフォアおよびクエンチャーで標識した「オリゴヌクレオチド」プローブを用いたリアルタイムＰＣＲを用いることによって蛍光の増大をモニタリングすることによるものである。
【００２４】
プローブおよびプライマーの設計
配列番号３および５を有するプライマーと共に配列番号１を有するプローブを、チクングニアの非構造的タンパク質ｎｓＰ４遺伝子用に設計した。同様に、配列番号４および６のプライマーと共に配列番号２のプローブを、チクングニアの構造タンパク質遺伝子用に設計した。
【００２５】
本開示は、チクングニアウイルス感染の検出のための、配列番号３および５と指定したプライマーと共に配列番号１のプローブと指定した「オリゴヌクレオチド」プローブに関連し、ここで前記プライマーは、それぞれセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーであり、チクングニアウイルス感染の検出のための、配列番号２のプローブ、これと共に配列番号４および６と指定したプライマーに関連し、ここで前記プライマーは、それぞれセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーである。
【００２６】
本開示において、それぞれのセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーと共に配列番号１のプローブは、チクングニアの非構造タンパク質ｎｓＰ４遺伝子用に設計される。同様に、対応するセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーと共に配列番号２のプローブは、チクングニアの構造タンパク質遺伝子用に設計される。本開示において、前記「オリゴヌクレオチド」プローブは、５’末端にてフルオロフォアを有し、３’末端にてクエンチャーを有する検出可能な標識に結合する。フルオロフォアを、フルオレセインおよびフルオレセイン誘導体ＦＡＭ、ＶＩＣ、ＪＯＥ、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸、クマリンおよびクマリン誘導体、ルシファーイエロー、テキサスレッド、テトラメチルローダミン、６−カルボキシフルオレセイン、テトラクロロ−６−カルボキシフルオレセイン、５−カルボキシローダミンならびにシアニン色素を含む群から選択する。
【００２７】
本開示のさらなる他の態様において、前記クエンチャーは、テトラメチルローダミン、４’−（４−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸、４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−マレイミド、テトラメチルローダミン、カルボキシテトラメチルローダミンおよびＢＨＱ色素を含む群から選択される。
【００２８】
本開示のさらなる他の態様において、前記フルオロフォアは６−カルボキシフルオレセイン［ＦＡＭ］であり、クエンチャーはテトラメチルローダミン［ＴＡＭＲＡ］である。
本開示のさらなる他の態様において、前記検出は、事実上定性的であるかまたは定量的である。
【００２９】
本開示は、チクングニアウイルス感染の検出のためのＰＣＲ反応混合物に関連し、ここで前記混合物は、核酸増幅試薬、配列番号３および５または配列番号４および６と指定したプライマーと組み合わせる配列番号１または配列番号２と指定した「オリゴヌクレオチド」プローブ、ならびに血液／血清／血漿試料から単離されたチクングニア核酸を含む。
【００３０】
本開示は、チクングニアウイルス感染を検出する方法であって、核酸増幅試薬、対応するプライマーと共に配列番号１または配列番号２と指定した「オリゴヌクレオチド」プローブおよび試験試料を含む前記ＰＣＲ混合物に、リアルタイムＰＣＲを用いた増幅を施して標的配列のコピーを得る、前記方法に関連する。増幅を、蛍光シグナルの増大に関して測定する。
【００３１】
「オリゴヌクレオチド」プローブは、２０〜２６のヌクレオチドの範囲内の大きさを有する。設計されたプローブは、５’末端にてフルオロフォアを有し、３’末端にてクエンチャーを有する。５’末端におけるフルオロフォアは、６−カルボキシフルオレセイン［ＦＡＭ］であり、クエンチャーは、３’末端にて存在する場合にはテトラメチルローダミン［ＴＡＭＲＡ］である。本開示を、血液／血清／血漿試料中に存在するチクングニアウイルス感染の検出のために用いる。検出のために用いる方法は、ＰＣＲの間の蛍光の増大をモニタリングすることによるものある。
【００３２】
本開示において、「オリゴヌクレオチドプローブ」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の短い配列を指す。オリゴヌクレオチドプローブは、感染してないＤＮＡへの非特異的ハイブリダイゼーションを示さずに、標的ＤＮＡに特異的にハイブリダイズすることができる。
【００３３】
ここで用いるプローブは、Taqman化学の原理に従う。またDouble-Dyeオリゴヌクレオチドまたは二重標識プローブと呼ばれるTaqManプローブは、最も広く用いられているタイプのプローブである。
【００３４】
したがって、本発明の「オリゴヌクレオチド」プローブは、チクングニアウィルス配列を試験試料においてリアルタイムＰＣＲによって特異的に増幅し、検出するために用いることができる、対応するセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーとさらに組み合わせて提供される。また、検量線から得られるＣｔに基づくウイルス量を定量することができる。
【００３５】
配列番号１および２を有するプローブ、これと共にそれらの対応するプライマーは、表１および表２に記載した配列を有する。
【００３６】
【表１】
2012518431.tif 000002
【００３７】
【表２】
2012518431.tif 000003
【００３８】
配列番号１および２を、以下に表すようにフルオロフォアおよびクエンチャーとさらに結合させることができる：
５’−フルオロフォア−ＴＴＣＧＡＴＧＣＣＡＴＣＡＴＡＧＣＣＧＣＡＣＡＣＴＴ−クエンチャー−３’
５’−フルオロフォア−ＣＣＣＴＧＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＴＴＧ−クエンチャー−３’
本開示を、以下の例および図面によってさらに詳述する。しかし、これらの例を、開示の範囲を限定するものと解釈するべきではない。
【００３９】
例１
上記の発明をより良く理解するために、確立した試料パネルおよび血液、血清および血漿から採集した感染した試料について、配列番号１および２を有する本開示のプローブを用いて、研究を行った。陽性の結果が、当該研究について得られ、結果を以下に強調する：
【００４０】
対応するセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーと共に配列番号１および２を有するプローブを用いて、１０のチクングニア陽性試料および１０のチクングニア陰性試料からなる試料パネルを、リアルタイムＰＣＲに施した。ＰＣＲ混合組成物および反応条件は、表３および４に示す通りである。増幅を、ＰＣＲ反応経過の間の蛍光シグナルの増大に関して測定した。
【００４１】
【表３】
2012518431.tif 000004
【００４２】
【表４】
2012518431.tif 000005
【００４３】
得られた結果は、以下のことを示した；
配列番号１、即ち非構造的ｎｓＰ４遺伝子用に設計したプローブは、１０の既定陽性を４０サイクル以内にすべて感知した（陽性試料カットオフ）。
配列番号２、即ち構造遺伝子用に設計したプローブは、１０の既定陽性を４０サイクル以内にすべて感知した（陽性試料カットオフ）。それらは、陰性試料について偽の増幅を何ら示さなかった。配列番号１および２を有するプローブは共に、すべての陽性試料を感知するにあたって１００％の感受性および特異性を示した。表５を参照されたい。
【００４４】
【表５】
2012518431.tif 000006
【００４５】
例２
さらに、検量線から得られるＣｔ値を比較することによって、血液、血清または血漿から採集した感染した試料からの寄生生物量を定量することもまた、可能である。
【００４６】
プラークアッセイによるコピー数の計算のためのプロトコル
ベロ（Vero）のコンフルエントな単層を、６ウェルプレート中に調製した。ウイルスの１０倍希釈（１０１〜１０７）を、冷却した維持培地（ＭＥＭ、１％血清を有する）中に調製した。次に、培養培地を取り除き、０．２ｍｌのウイルス接種原を、最も高い希釈から開始して加えた。培地の膜が細胞シートを完全に覆ったことが確実となるように、注意を払った。次に、プレートを間欠的に揺り動かしながら、３７℃にて１時間インキュベートした。次に接種原を、ピペットで取り除き、その後１．５ｍｌのアガロースオーバーレイ培地（０．３％アガロースおよび２．５％ＦＣＳを有する成育培地）をそれに加えた。
【００４７】
オーバーレイ培地が単層全体に均一に拡散したことが確実になるように注意を払い、これを次に、室温にて１０分間放置し、次に３７℃にてインキュベートした。単層を、インキュベーションの２日目から開始して毎日観察した。プラークが通常インキュベーション後４日目までに発生した後に、次に各々の希釈におけるプラークの数を計数した。アガロースオーバーレイを取り除き、単層をＰＢＳで穏やかに洗浄し、プレートを０．１％クリスタルバイオレット溶液で染色して、プラークを再び計数した。ウイルス力価を、適切な希釈におけるプラーク数を計数することによって、１ｍｌあたりのプラーク形成単位（ｐｆｕ／ｍｌ）として推定した。例えば：
生じたプラークの数＝９
ウイルスの希釈＝１×１０５
接種原の容積＝０．２ｍｌ
ウイルス力価＝１ｍｌあたり９×１×１０５×５ｐｆｕ＝４．５×１０６
【００４８】
検量線を図１に示し、Ｃｔに関する検量線値を表６に提供する。
【表６】
2012518431.tif 000007
【００４９】
結論
ａ）配列番号１および２を有するプローブは共に、すべての陽性試料を感知した。それらは、陰性試料について偽の増幅を何ら示さなかった。したがって、１００％の特異性および１００％の感受性が示される。
ｂ）全体的な評価研究に基づいて、配列番号１および２を有するどちらのプローブも、リアルタイムＰＣＲに基づいてチクングニア検出のために用いることができる。
【図１】
2012518431.tif 000008
【配列表】
2012518431000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成22年10月21日(2010.10.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１および２を有するプローブ。
【請求項２】
チクングニア検出用である、請求項１に記載のプローブ。
【請求項３】
５’末端もしくは３’末端または両方にて検出可能な標識と結合した、配列番号１および２を有するプローブ。
【請求項４】
５’末端にてフルオロフォアと結合しており、３’末端にてクエンチャーと結合している、請求項３に記載のプローブ。
【請求項５】
フルオロフォアが、フルオレセインおよびフルオレセイン誘導体ＶＩＣ、ＪＯＥ、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸、クマリンおよびクマリン誘導体、ルシファーイエロー、テキサスレッド、テトラメチルローダミン、６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、テトラクロロ−６−カルボキシフルオレセイン、５−カルボキシローダミンならびにシアニン色素を含む群から選択される、請求項４に記載のプローブ。
【請求項６】
クエンチャーが、テトラメチルローダミン、４’−（４−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸、４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−マレイミド、テトラメチルローダミン、カルボキシテトラメチルローダミンおよびBlack Hole Quencher色素を含む群から選択される、請求項４に記載のプローブ。
【請求項７】
好ましいフルオロフォアが５’末端における６−カルボキシフルオレセイン［ＦＡＭ］であり、好ましいクエンチャーが３’末端におけるテトラメチルローダミン［ＴＡＭＲＡ］である、請求項５または６に記載のプローブ。
【請求項８】
配列番号３、４、５および６のプライマー。
【請求項９】
配列番号３および４を有するプライマーがセンスプライマーであり、配列番号５および６を有するプライマーがアンチセンスプライマーである、請求項８に記載のプライマー。
【請求項１０】
配列番号３および５を有するプライマーが、配列番号１のプローブに対応し、配列番号４および６を有するプライマーが、配列番号２のプローブに対応する、請求項９に記載のプライマー。
【請求項１１】
配列番号１および２を有するプローブが、任意に、検出可能な標識と、５’末端もしくは３’末端または両方にて結合している、請求項９に記載のプライマー。
【請求項１２】
チクングニアの検出のためのＰＣＲ反応混合物であって、前記混合物が、検出される試料、核酸増幅試薬、配列番号１および２を含む群から選択されるプローブ、ならびに配列番号３、４、５および６を含む群から選択される対応するプライマーを含む、前記ＰＣＲ反応混合物。
【請求項１３】
配列番号３および５を有するプライマーが、配列番号１のプローブに対応し、配列番号４および６を有するプライマーが、配列番号２のプローブに対応する、請求項１２に記載の反応混合物。
【請求項１４】
配列番号１および２を有するプローブが、任意に、検出可能な標識と、５’末端もしくは３’末端または両方にて結合している、請求項１３に記載の反応混合物。
【請求項１５】
試料が、血液、血清および血漿を含む群から選択される、請求項１２に記載の反応混合物。
【請求項１６】
チクングニア感染症を検出し、任意に定量する方法であって、前記方法が、以下のステップ：
ａ）検出するべき試料、核酸増幅試薬、配列番号１および２を含む群から選択されるプローブならびに配列番号３、４、５および６を含む群から選択される対応するプライマーを含む反応混合物を形成するステップ；
ｂ）反応混合物にＰＣＲを施して、標的配列のコピーを得、続いてチクングニア感染症を検出するための蛍光シグナルの増大を測定するステップ；ならびに、
ｃ）任意に検出されたシグナルから検量線を作成して、チクングニア感染症を定量するためのコピー数を得るステップ
を含む、前記方法。
【請求項１７】
配列番号３および４を有するプライマーがセンスプライマーであり、配列番号５および６を有するプライマーがアンチセンスプライマーであり、かつ試料が、血液、血清および血漿を含む群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
配列番号３および５を有するプライマーが、配列番号１のプローブに対応し、配列番号４および６を有するプライマーが、配列番号２のプローブに対応する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
配列番号１および２を有するプローブが、５’末端もしくは３’末端または両方にて検出可能な標識と結合し、かつ蛍光シグナルが、３’末端にてクエンチャーを有すると共に５’末端にてフルオロフォアを有するプローブによって発生する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
フルオロフォアが、フルオレセインおよびフルオレセイン誘導体ＶＩＣ、ＪＯＥ、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸、クマリンおよびクマリン誘導体、ルシファーイエロー、テキサスレッド、テトラメチルローダミン、６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、テトラクロロ−６−カルボキシフルオレセイン、５−カルボキシローダミンならびにシアニン色素を含む群から選択され、またクエンチャーが、テトラメチルローダミン、４’−（４−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸、４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−マレイミド、テトラメチルローダミン、カルボキシテトラメチルローダミンおよびBlack Hole Quencher色素を含む群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
チクングニア感染症の検出のためのキットであって、前記キットが、個々に、または組み合わせて配列番号１および２のプローブを；個々に、または組み合わせて配列番号３、４、５および６の対応するプライマー対を、ならびに増幅試薬を含む、前記キット。
【請求項２２】
配列番号１および２を有するプローブが、任意に５’末端もしくは３’末端または両方にて検出可能な標識と結合する、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
増幅試薬が、塩化マグネシウム、Ｔａｑポリメラーゼおよび増幅用の緩衝液を含む組み合わせである、請求項２１に記載のキット。
【手続補正書】
【提出日】平成23年10月20日(2011.10.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１および２を有するプローブ。
【請求項２】
チクングニア検出用である、請求項１に記載のプローブ。
【請求項３】
５’末端もしくは３’末端または両方にて検出可能な標識と結合した、配列番号１および２を有するプローブ。
【請求項４】
５’末端にてフルオロフォアと結合しており、３’末端にてクエンチャーと結合しており；かつ
前記フルオロフォアが、フルオレセインおよびフルオレセイン誘導体ＶＩＣ、ＪＯＥ、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸、クマリンおよびクマリン誘導体、ルシファーイエロー、テキサスレッド、テトラメチルローダミン、６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、テトラクロロ−６−カルボキシフルオレセイン、５−カルボキシローダミンならびにシアニン色素を含む群から選択され；かつ
前記クエンチャーが、テトラメチルローダミン、４’−（４−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸、４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−マレイミド、テトラメチルローダミン、カルボキシテトラメチルローダミンおよびBlack Hole Quencher色素を含む群から選択される、請求項３に記載のプローブ。
【請求項５】
好ましいフルオロフォアが５’末端における６−カルボキシフルオレセイン［ＦＡＭ］であり、好ましいクエンチャーが３’末端におけるテトラメチルローダミン［ＴＡＭＲＡ］である、請求項４に記載のプローブ。
【請求項６】
配列番号３、４、５および６のプライマー。
【請求項７】
配列番号３および４を有するプライマーがセンスプライマーであり、配列番号５および６を有するプライマーがアンチセンスプライマーであり；かつ
配列番号３および５を有するプライマーが、配列番号１のプローブに対応し、配列番号４および６を有するプライマーが、配列番号２のプローブに対応し；かつ
配列番号１および２を有するプローブが、任意に、検出可能な標識と、５’末端もしくは３’末端または両方にて結合している、請求項６に記載のプライマー。
【請求項８】
チクングニアの検出のためのＰＣＲ反応混合物であって、前記混合物が、検出される試料、核酸増幅試薬、配列番号１および２を含む群から選択されるプローブ、ならびに配列番号３、４、５および６を含む群から選択される対応するプライマーを含む、前記ＰＣＲ反応混合物。
【請求項９】
配列番号３および５を有するプライマーが、配列番号１のプローブに対応し、配列番号４および６を有するプライマーが、配列番号２のプローブに対応し；かつ
配列番号１および２を有するプローブが、任意に、検出可能な標識と、５’末端もしくは３’末端または両方にて結合している、請求項８に記載の反応混合物。
【請求項１０】
試料が、血液、血清および血漿を含む群から選択される、請求項８に記載の反応混合物。
【請求項１１】
チクングニア感染症を検出し、任意に定量する方法であって、前記方法が、以下のステップ：
ａ）検出するべき試料、核酸増幅試薬、配列番号１および２を含む群から選択されるプローブならびに配列番号３、４、５および６を含む群から選択される対応するプライマーを含む反応混合物を形成するステップ；
ｂ）反応混合物にＰＣＲを施して、標的配列のコピーを得、続いてチクングニア感染症を検出するための蛍光シグナルの増大を測定するステップ；ならびに、
ｃ）任意に検出されたシグナルから検量線を作成して、チクングニア感染症を定量するためのコピー数を得るステップ
を含む、前記方法。
【請求項１２】
配列番号３および４を有するプライマーがセンスプライマーであり、配列番号５および６を有するプライマーがアンチセンスプライマーであり、かつ試料が、血液、血清および血漿を含む群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
配列番号３および５を有するプライマーが、配列番号１のプローブに対応し、配列番号４および６を有するプライマーが、配列番号２のプローブに対応し；かつ
配列番号１および２を有するプローブが、５’末端もしくは３’末端または両方にて検出可能な標識と結合し、かつ蛍光シグナルが、３’末端にてクエンチャーを有すると共に５’末端にてフルオロフォアを有するプローブによって発生する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
フルオロフォアが、フルオレセインおよびフルオレセイン誘導体ＶＩＣ、ＪＯＥ、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸、クマリンおよびクマリン誘導体、ルシファーイエロー、テキサスレッド、テトラメチルローダミン、６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、テトラクロロ−６−カルボキシフルオレセイン、５−カルボキシローダミンならびにシアニン色素を含む群から選択され、またクエンチャーが、テトラメチルローダミン、４’−（４−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸、４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−マレイミド、テトラメチルローダミン、カルボキシテトラメチルローダミンおよびBlack Hole Quencher色素を含む群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
チクングニア感染症の検出のためのキットであって、前記キットが、個々に、または組み合わせて配列番号１および２のプローブを；個々に、または組み合わせて配列番号３、４、５および６の対応するプライマー対を、ならびに増幅試薬を含む、前記キット。
【請求項１６】
配列番号１および２を有するプローブが、任意に５’末端もしくは３’末端または両方にて検出可能な標識と結合する、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
前記増幅試薬が、塩化マグネシウム、Ｔａｑポリメラーゼおよび増幅用の緩衝液を含む組み合わせである、請求項１５に記載のキット。
【国際調査報告】
2012518431.tif 000009
2012518431.tif 000010
2012518431.tif 000011