【手続補正書】
【提出日】平成21年9月18日(2009.9.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
【化１】
2009510145.tif 000001
［式中、
Ｒ１は、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、（Ｃ0−Ｃ6）アルキレン（Ｃ3−Ｃ6）シクロアルキル、（Ｃ0−Ｃ6）アルキレン−Ｏ−（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、（Ｃ0−Ｃ6）アルキレン−Ｏ−（Ｃ3−Ｃ6）シクロアルキル、（Ｃ0−Ｃ6）アルキレン−（Ｃ6−Ｃ14）アリール、（Ｃ0−Ｃ6）アルキレン−（Ｃ5−Ｃ15）ヘテロアリールであり、ここで、アルキル、アルキレン、アリール、ヘテロアリール及びシクロアルキルは無置換、又はＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、Ｏ−（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、ＣＦ3、ＯＣＦ3、ＣＮ、ＣＯ−（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、ＣＯＯ（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、ＣＯＮ（（Ｃ0−Ｃ6）アルキレン−Ｈ）（（Ｃ0−Ｃ6）アルキレン−Ｈ）、Ｓ（Ｏ）m（Ｃ1−Ｃ6）アルキルにより一、二若しくは三置換されても良く；
Ｒ２、Ｒ３は、独立に、Ｈ、ハロゲン、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、（Ｃ0−Ｃ4）アルキレン−Ｏ−（Ｃ0−Ｃ4）アルキレン−Ｈ、ＣＮ、ＣＯＯ（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、ＣＯＮ（（Ｃ0−Ｃ6）アルキレン−Ｈ）（（Ｃ0−Ｃ6）アルキレン−Ｈ）、Ｓ（Ｏ）m（Ｃ1−Ｃ6）アルキルであり、ここで、アルキル及びアルキレンは無置換、又はＦにより一、二若しくは三置換され；
Ａは、（Ｃ6−Ｃ14）アリール又は（Ｃ3−Ｃ12）ヘテロアリールであり；
Ｒ４、Ｒ５は、独立に、Ｈ、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、ＣＮ、ＣＯ−（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、ＣＯＯ−（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、ＣＯＮ（（Ｃ0−Ｃ6）アルキレン−Ｈ（（Ｃ0−Ｃ6）アルキレン−Ｈ）、Ｓ（Ｏ）m（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、Ｎ（（Ｃ0−Ｃ6）アルキレン−Ｈ）（（Ｃ0−Ｃ6）アルキレン−Ｈ）、Ｎ（（Ｃ0−Ｃ6）アルキレン−Ｈ）−ＣＯ−（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、ハロゲン、（Ｃ0−Ｃ6）アルキレン−Ｏ−（Ｃ0−Ｃ6）アルキレン−Ｈ、（Ｃ0−Ｃ6）アルキレン−Ｏ−（Ｃ6−Ｃ14）アリール、ＳＣＦ3、Ｓ（Ｏ）2ＣＦ3、ＮＯ2であり、ここで、アルキル及びアルキレンは無置換、又はＦにより一、二若しくは三置換され；
Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８及びＲ９は、独立に、Ｈ、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、（Ｃ0−Ｃ6）アルキレン−（Ｃ3−Ｃ6）シクロアルキル、（Ｃ0−Ｃ6）アルキレン−（Ｃ6−Ｃ14）アリール、（Ｃ0−Ｃ6）アルキレン−（Ｃ5−Ｃ15）ヘテロアリール、（Ｃ0−Ｃ6）アルキレン−（Ｃ3−Ｃ15）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ0−Ｃ6）アルキレン−（Ｃ3−Ｃ15）ヘテロシクロアルケニルであり、ここで、アルキル、アルキレン及びシクロアルキルは無置換、又はハロゲン、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、（Ｃ0−Ｃ6）アルキレン−Ｏ−（Ｃ0−Ｃ6）−アルキレン−Ｈ、ＣＦ3、ＯＣＦ3、ＣＮ、ＣＯ−（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、ＣＯＯ−（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、ＣＯＮ（（Ｃ0−Ｃ6）アルキレン−Ｈ）（（Ｃ0−Ｃ6）アルキレン−Ｈ）、Ｓ（Ｏ）m（Ｃ1−Ｃ6）アルキルにより一、二若しくは三置換され、ここで、アリール、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルケニル及びヘテロアリールは無置換、又はハロゲン、ＣＦ3、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル及び（Ｃ0−Ｃ4）アルキレン−Ｏ−（Ｃ0−Ｃ4）アルキレン−Ｈにより一、二若しくは三置換され；
更にここで、Ｒ６及びＲ７、Ｒ８及びＲ９、又はＲ７及びＲ８の内の少なくとも１対は、それらが結合しているＣ原子と一緒になって、（Ｃ3−Ｃ13）シクロアルキル、（Ｃ3−Ｃ9）−ヘテロシクロアルキル又は（Ｃ3−Ｃ9）−ヘテロシクロアルケニルを形成し、ここで、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル及びヘテロシクロアルケニルは無置換、又はハロゲン、ＣＦ3、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル及び（Ｃ0−Ｃ4）アルキレン−Ｏ−（Ｃ0−Ｃ4）アルキレン−Ｈにより一、二若しくは三置換され；
ｍは、０、１、２である］
の化合物、全てのその立体異性体、エナンチオマー体及び任意の割合での混合物、並びにその生理学的に許容される塩及び互変異性体。
【請求項２】
Ｒ１は、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、（Ｃ0−Ｃ6）アルキレン（Ｃ3−Ｃ6）シクロアルキル、（Ｃ0−Ｃ6）アルキレン−Ｏ−（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、（Ｃ0−Ｃ6）アルキレン−（Ｃ6−Ｃ14）アリールであり、ここで、アルキル、アルキレン、アリール及びシクロアルキルは無置換、又はＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、Ｏ−（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、ＣＦ3、ＯＣＦ3により置換されても良く；
Ｒ２、Ｒ３は、独立に、Ｈ、ハロゲン、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、（Ｃ0−Ｃ4）アルキレン−Ｏ−（Ｃ0−Ｃ4）アルキレン−Ｈであり、ここで、アルキル及びアルキレンは無置換、又はＦにより一、二若しくは三置換され；
Ａは、（Ｃ6−Ｃ14）アリール又は（Ｃ3−Ｃ12）ヘテロアリールであり；
Ｒ４、Ｒ５は、独立に、Ｈ、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、ＣＮ、ＣＯ−（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、ＣＯＯ−（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、ＣＯＮ（（Ｃ0−Ｃ6）アルキレン−Ｈ（（Ｃ0−Ｃ6）アルキレン−Ｈ）、ハロゲン、（Ｃ0−Ｃ6）アルキレン−Ｏ−（Ｃ0−Ｃ6）アルキレン−Ｈ、ＳＣＦ3、Ｓ（Ｏ）2ＣＦ3であり、ここで、アルキル及びアルキレンは無置換、又はＦにより一、二若しくは三置換され；
Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８及びＲ９は、独立に、Ｈ、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、（Ｃ0−Ｃ6）アルキレン−（Ｃ3−Ｃ6）シクロアルキル、（Ｃ0−Ｃ6）アルキレン−（Ｃ6−Ｃ14）アリー
ルであり、ここで、アルキル、アルキレン及びシクロアルキルは無置換、又はハロゲン、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、（Ｃ0−Ｃ6）アルキレン−Ｏ−（Ｃ0−Ｃ6）−アルキレン−Ｈ、ＣＦ3により一、二若しくは三置換され、そして、ここで、アリール及びシクロアルキルは無置換、又はハロゲン、ＣＦ3、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル及び（Ｃ0−Ｃ4）アルキレン−
Ｏ−（Ｃ0−Ｃ4）アルキレン−Ｈにより一、二若しくは三置換され；
更にここで、Ｒ６及びＲ７、Ｒ８及びＲ９、又はＲ７及びＲ８の内の少なくとも１対は、それらが結合しているＣ原子と一緒になって、（Ｃ3−Ｃ13）シクロアルキル又は（Ｃ3−Ｃ9）−ヘテロシクロアルキルを形成し、ここで、シクロアルキル及びヘテロシクロアルキルは無置換、又はハロゲン、ＣＦ3、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル及び（Ｃ0−Ｃ4）アルキレン−Ｏ−（Ｃ0−Ｃ4）アルキレン−Ｈにより一、二若しくは三置換される；
請求項１に記載の式Ｉの化合物、全てのその立体異性体、エナンチオマー体及び任意の割合での混合物、並びにその生理学的に許容される塩及び互変異性体。
【請求項３】
Ｒ１は、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、（Ｃ0−Ｃ6）アルキレン（Ｃ3−Ｃ6）シクロアルキル、（Ｃ0−Ｃ6）アルキレン−Ｏ−（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、（Ｃ0−Ｃ6）アルキレン−（Ｃ6−Ｃ14）アリールであり、ここで、アルキル、アルキレン、アリール及びシクロアルキルは無置換、又はＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、Ｏ−（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、ＣＦ3、ＯＣＦ3により一、二若しくは三置換されても良く；
Ｒ２、Ｒ３は、独立に、Ｈ、ハロゲン、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、（Ｃ0−Ｃ4）アルキレン−Ｏ−（Ｃ0−Ｃ4）アルキレン−Ｈであり、ここで、アルキル及びアルキレンは無置換、又はＦにより一、二若しくは三置換され；
Ａは、（Ｃ6−Ｃ14）アリール、（Ｃ5−Ｃ6）ヘテロアリールであり；
Ｒ４、Ｒ５は、独立に、Ｈ、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、ハロゲン、（Ｃ0−Ｃ6）アルキレン−Ｏ−（Ｃ0−Ｃ6）アルキレン−Ｈ、ＳＣＦ3であり、ここで、アルキル及びアルキレンは無置換、又はＦにより一、二若しくは三置換され；
Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８及びＲ９は、独立に、Ｈ、無置換又はハロゲンにより一、二若しくは三置換された（Ｃ1−Ｃ6）アルキルであり；
更にここで、Ｒ６及びＲ７、Ｒ８及びＲ９、又はＲ７及びＲ８の内の少なくとも１対は、それらが結合しているＣ原子と一緒になって、（Ｃ3−Ｃ13）シクロアルキル又は（Ｃ3−Ｃ9）−ヘテロシクロアルキルを形成し、ここで、シクロアルキル及びヘテロシクロアルキルは無置換、又はハロゲン及び（Ｃ1−Ｃ6）アルキルにより一、二若しくは三置換される；
請求項１又は２に記載の式Ｉの化合物、全てのその立体異性体、エナンチオマー体及び任意の割合での混合物、並びにその生理学的に許容される塩及び互変異性体。
【請求項４】
Ｒ１は無置換、又はＦにより一、二若しくは三置換された（Ｃ1−Ｃ6）アルキルであり；
Ｒ２、Ｒ３は、独立に、Ｈ、ハロゲン、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、（Ｃ0−Ｃ4）アルキレン−Ｏ−（Ｃ0−Ｃ4）アルキレン−Ｈであり、ここで、アルキル及びアルキレンは無置換、又はＦにより一、二若しくは三置換され；
Ａは、（Ｃ6−Ｃ10）アリール、（Ｃ5−Ｃ6）ヘテロアリールであり；
Ｒ４、Ｒ５は、独立に、Ｈ、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、ハロゲン、（Ｃ0−Ｃ6）アルキレン−Ｏ−（Ｃ0−Ｃ6）アルキレン−Ｈであり、ここで、アルキル及びアルキレンは無置換、又はＦにより一、二若しくは三置換され；
Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８及びＲ９は、独立に、Ｈ、又は無置換若しくはハロゲンにより一、二若しくは三置換された（Ｃ1−Ｃ6）アルキルであり；
更にここで、Ｒ６及びＲ７、Ｒ８及びＲ９、又はＲ７及びＲ８の内の少なくとも１対は、それらが結合しているＣ原子と一緒になって、（Ｃ3−Ｃ13）シクロアルキル又は（Ｃ3−Ｃ9）−ヘテロシクロアルキルを形成し、ここで、シクロアルキル及びヘテロシクロアルキルは無置換、又はハロゲン及び（Ｃ1−Ｃ6）アルキルにより、一、二若しくは三置換される；
請求項１〜３のいずれか１項に記載の式Ｉの化合物、全てのその立体異性体、エナンチオマー体及び任意の割合での混合物、並びにその生理学的に許容される塩及び互変異性体。
【請求項５】
Ｒ１は、無置換、又はＦにより一、二若しくは三置換された（Ｃ1−Ｃ6）アルキルであり；
Ｒ２、Ｒ３は、独立に、Ｈ、ハロゲン、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、（Ｃ0−Ｃ4）アルキレン−Ｏ−（Ｃ0−Ｃ4）アルキレン−Ｈであり；
Ａは、フェニル、チオフェンであり；
Ｒ４は、Ｏ（Ｃ1−Ｃ4）アルキルであり、そして、オルト位にあり；
Ｒ５は、ＣＦ3であり、そして、パラ位にあり；
Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８及びＲ９の内の２つはＨであり、そして、Ｒ６及びＲ７又はＲ７及びＲ８の内の少なくとも１対は、それらが結合しているＣ原子と一緒になって、（Ｃ3−Ｃ13）シクロアルキルを形成する；
請求項１〜４のいずれか１項に記載の式Ｉの化合物、全てのその立体異性体、エナンチオマー体及び任意の割合での混合物、並びにその生理学的に許容される塩及び互変異性体。
【請求項６】
Ｒ１は、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、ＣＦ3であり；
Ｒ２、Ｒ３は、Ｈであり；
Ａは、フェニルであり；
Ｒ４は、Ｏ（Ｃ1−Ｃ4）アルキルであり、そして、オルト位にあり；
Ｒ５は、ＣＦ3であり、そしてパラ位にあり；
Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８及びＲ９の内の２つは、Ｈであり、そして、
Ｒ６及びＲ７又はＲ７及びＲ８の内の少なくとも１対は、それらが結合しているＣ原子と一緒になって、（Ｃ5−Ｃ6）シクロアルキルを形成する；
請求項１〜５のいずれか１項に記載の式Ｉの化合物、全てのその立体異性体、エナンチオマー体及び任意の割合での混合物、並びにその生理学的に許容される塩及び互変異性体。
【請求項７】
Ａは、フェニルであり；
Ｒ４は、エトキシであり、そしてオルト位にある；
請求項１〜６のいずれか１項に記載の式Ｉの化合物、全てのその立体異性体、エナンチオマー体及び任意の割合での混合物、並びにその生理学的に許容される塩及び互変異性体。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の１つ又はそれ以上の式Ｉの化合物を含む医薬品。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の式Ｉの化合物を含む、脂肪酸代謝の障害及びグルコース利用障害の治療又は予防用医薬。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の式Ｉの化合物を含む、インスリン抵抗性が関与する障害の治療又は予防用医薬。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の式Ｉの化合物を含む、糖尿病に伴う続発症の予防を含む糖尿病の治療又は予防用医薬。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の式Ｉの化合物を含む、異脂肪血症及びその続発症の治療又は予防用医薬。
【請求項１３】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の式Ｉの化合物を含む、メタボリックシンドロームに関連する可能性のある状態の治療又は予防用医薬。
【請求項１４】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の式Ｉの化合物を含む、中枢及び末梢神経系の脱髄障害及び他の神経変性障害の治療又は予防用医薬。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１４】
ＭＣ４作動薬（例えば、［２−（３ａ−ベンジル−２−メチル−３−オキソ−２，３，３ａ，４，６，７−ヘキサヒドロ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−５−イル）−１−（４−クロロフェニル）−２−オキソエチル］−１−アミノ−１，２，３，４−テトラヒドロ−ナフタレン−２−カルボキサミド（ＷＯ第０１／９１７５２号））、又はＬＢ５３２８０、ＬＢ５３２７９、ＬＢ５３２７８若しくはＴＨＩＱ、ＭＢ２４３、ＲＹ７６４、ＣＨＩＲ−７８５、ＰＴ−１４１、又はＷＯ第２００５０６０９８５号、ＷＯ第２００５００９９５０号、ＷＯ第２００４０８７１５９号、ＷＯ第２００４０７８７１７号、ＷＯ第２００４０７８７１６号、ＷＯ第２００４０２４７２０号、ＵＳ第２００５０１２４６５２号、ＷＯ第２００５０５１３９１号、ＷＯ第２００４１１２７９３号、ＵＳ第２００５０２２２０１４号、ＵＳ第２００５０１７６７２８号、ＵＳ第２００５０１６４９１４号、ＵＳ第２００５０１２４６３６号、ＵＳ第２００５０１３０９８８号、ＵＳ第２００４０１６７２０１号、ＷＯ第２００４００５３２４号、ＷＯ第２００４０３７７９７号、ＷＯ第２００５０４２５１６号、ＷＯ第２００５０４０１０９号、ＷＯ第２００５０３０７９７号、ＵＳ第２００４０２２４９０１号、ＷＯ第２００５０１９２１号、ＷＯ第２００５０９１８４号、ＷＯ第２００５０００３３９号、ＥＰ第１４６００６９号、ＷＯ第２００５０４７２５３号、ＷＯ第２００５０４７２５１号、ＥＰ第１５３８１５９号、ＷＯ第２００４０７２０７６号、ＷＯ第２００４０７２０７７号若しくはＷＯ第２００６０２４３９０号に記載のもの；
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５７】
アッセイ手順
ＰＰＡＲガンマ作動薬活性を、以下に記述される４日アッセイにおいて測定した。トランスフェクションの前に、ＨＥＫ細胞を、以下の添加物：１０％ＦＣＳ（＃１６０００−０４４、Invitrogen）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン溶液（＃１５１４０−１２２、Invitrogen）及び２ｍＭのＬ−グルタミン（＃２５０３０−０２４、Invitrogen）を添加して混合したＤＭＥＭ（４１９６５−０３９、Invitrogen）で培養した。
１日目
先ず、溶液Ａ、即ちＤＭＥＭに加えて、先に記述された全ての４つのプラスミドを含有するトランスフェクション混合物を調製した。一つのアッセイにつき各９６穴のマイクロタイタープレート当り、３ｍｌの溶液Ａにするために：２６２２μｌの抗生物質も無血清も含まないＤＭＥＭ（＃４１９６５−０３９、Invitrogen）、１００μｌの参照プラスミドｐＲＬＣＭＶ（１ｎｇ／μｌ）、１００μｌのルシフェラーゼレポータープラスミドｐＧＬ３ｂａｓｉｃ−５ｘＧＡＬ４−ＴＫ（１０ｎｇ／μｌ）、１００μｌのＰＰＡＲガンマ発現プラスミドｐｃＤＮＡ３−ＧＡＬ４−ヒトＰＰＡＲガンマＬＢＤ（１００ｎｇ  μｌ）、及び７８μｌのプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）（５００ｎｇ／μｌ）の量を用いた。次いで、２ｍｌの溶液Ｂを、各９６穴のウエルマイクロタイタープレート当り、１．９ｍｌのＤＭＥＭ（＃４１９６５−０３９、Invitrogen）を、１００μｌのＰｏｌｙＦｅｃｔトランスフェクション試薬（Qiagenから）と混合することによって作成した。次いで、３ｍｌの溶液Ａを２ｍｌの溶液Ｂと混ぜて、５ｍｌの溶液Ｃとし、それを複数のピペッティングによって十分に混合し、１０分の間常温でインキュベートした。
１７５ｃｍ3の容量の細胞培養瓶からの８０％−コンフルエントのＨＥＫ細胞を、１５ｍｌのＰＢＳ（＃１４１９０−０９４（Invitrogen）で一回洗浄し、３ｍｌのトリプシン溶液（＃２５３００−０５４、Invitrogen）で３７°Ｃで２分間処理した。次に、細胞を１０％ＦＣＳ（＃１６０００−０４４、Invitrogen）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン溶液（＃１５１４０−１２２、Invitrogen）及び２ｍｍＬ−グルタミン（＃２５０３０−０２４、Invitrogen）を混合した１５ｍｌのＤＭＥＭ（＃４１９６５−０３９、Invitrogen）に溶解した。細胞懸濁液を細胞カウンターで計数した後、懸濁液を２５万細胞／ｍｌに希釈した。１マイクロタイタープレート当り１５ｍｌのこの細胞懸濁液を、５ｍｌの溶液Ｃと混ぜ合わせた。２００μｌの懸濁液を、透明なプラスチックベース（３６１０、Corning Costar）を有する９６穴のマイクロタイタープレートの各ウェルに播種した。プレートを、細胞培養インキュベーター中、３７℃及び５％ＣＯ2で２４時間インキュベートした。
２日目
テストするＰＰＡＲ作動薬を１０ｍｍの濃度でＤＭＳＯに溶解した。このストック溶液を、２％のUltroser（＃１２０３９−０１２、Biosepra）、１％のペニシリン・ストレプトマイシン溶液（＃１５１４０−１２２、Invitrogen）及び２ｍＭのＬ−グルタミン（＃２５０３０−０２４、Invitrogen）を混合したＤＭＥＭ（＃４１９６５−０３９、Invitrogen）中に希釈した。試験物質は、１０μＭから１００ｐｍの範囲の合計１１の異なった濃度でテストした。より強力な化合物は、１μＭから１０ｐｍの濃度範囲でテストした。
１日目にトランスフェクションして播種したＨＥＫ細胞の培地を、アスピレーターによって完全に除去し、培地中に希釈された試験物質を、細胞へ直ちに加えた。物質の希釈及び追加は、ロボット(Beckman FX)によって行った。培地中に希釈された試験物質の最終容積は、９６穴のマイクロタイタープレートの１ウェル当たり１００μｌであった。各プレートは、個々のプレート中のアッセイが機能していることを実証するために、１１の異なる濃度で同様に希釈した標準ＰＰＡＲガンマ作動薬を入れた。アッセイプレートを、インキュベーター中、３７℃及び５％ＣＯ2でインキュベートした。
４日目
アスピレーターにより培地を除去した後、細胞を溶解し、細胞中に形成された蛍ルシフェラーゼ（Photinus pyralis）の基質を与えるために、製造会社の説明書に従って、５０μｌのDual-GloTM試薬（Dual-GloTM Luciferase Assay System; promega）をそれぞれのウェルに追加した。室温で１０分間の暗所でのインキュベーション後、蛍ルシフェラーゼ媒介化学発光を測定器（測定時間／ウェル：１秒；WallacからのTrilux）で測定した。その後、蛍ルシフェラーゼの活性を停止させ、かつ参照プラスミドｐＲＬ−ＣＭＶによって発現されたRenillaルシフェラーゼの基質を供給させるために、５０μｌのDual-GloTM STOP & Glo試薬（Dual-GloTMのルシフェラーゼアッセイシステム; Promega）を各ウェルに添加した。室温で更に１０分間の暗所でのインキュベーション後、Renillaシフェラーゼによって媒介された化学発光を、再度測定器でウェル当たり１秒間測定した。