(57)【要約】本発明は、精巣の機能及び疾患の診断のための１Ｈ磁気共鳴分光法の使用に関する。【選択図】図３【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の精巣のｉｎ  ｖｉｖｏでの１Ｈ磁気共鳴分光法スペクトルを得るステップと、
前記対象精巣スペクトルを対照対象の精巣のスペクトルと比較するステップと、
前記対象の前記精巣の状態を診断するステップと
を含む方法。
【請求項２】
診断される前記精巣の状態が、精子及び付随する生殖能力の存在又は欠如を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
精子の存在を診断するステップが、前記２つのスペクトルのホスホコリン、タウリン及び可能性のある他の代謝シグナルを比較することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記対象が、生殖能力又は不妊の治療のために外科的介入を受けたことがある、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記外科的介入が、精索静脈瘤修復術、精管切除術、精管復元術、腫瘍切除術、又は精巣固定術である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記対象が、不妊の内科的治療を受けたことがある、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記内科的治療が、クエン酸クロミフェン、タモキシフェン又は他の選択的エストロゲン受容体モジュレーターの投与、ＦＳＨ又はＬＨの注射による他のホルモン操作、全身性内科疾患の補正、非ホルモン治療、食事性サプリメント、抗酸化剤、ビタミン及びハーブ療法の使用を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記対象スペクトル及び前記対照対象スペクトルを得るステップが、スペクトル増強技術を用いることを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記スペクトル増強技術が、水抑制法、脂肪抑制法、刺激エコー取得モード（ＳＴＥＡＭ）分光法、点解像分光法（ＰＲＥＳＳ）、化学シフト画像法（ＣＳＩ）、磁気共鳴分光画像法（ＭＲＳＩ）、ショートＴ１反転回復法（ＳＴＩＲ）、高解像度ＭＲＳ、マジックアングルスピニング法及びこれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
診断される前記精巣の状態が、薬理学的作用剤への曝露、毒剤への曝露、過度の熱又は冷気などの異常な物理的状態への曝露、放射線療法への曝露、化学療法への曝露、疾患への曝露又は前記の任意の組合せの精子の産生に対する影響である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
診断される前記精巣の状態が、精巣疾患の存在である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記精巣疾患が、癌、停留精巣、ライディッヒ細胞などの良性腫瘍、間質性腫瘍又は腺腫、精索静脈瘤の影響、毒素を含む投薬又は曝露、並びに感染、炎症及び精管切除術からの長期の閉塞の影響である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記対象及び対照対象がヒトである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般には、医療用の研究及び診断における解析の手段及び技術の分野に関する。特に、本発明は、精巣の機能、特に、健常な精子を産生する精巣の能力を評価する際に使用するための、精巣の代謝（すなわち、メタボロミクス）プロファイルを得るための磁気共鳴分光法の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
カップルの１０〜１５％は不妊であり、そのうちの半分近い原因は男性の不妊であることが推定される。不妊の男性集団における６〜１０％は、非閉塞性無精子症（ＮＯＡ）と呼ばれる精巣障害のために、射出されない精子を産生することが見出されている。一部のＮＯＡ男性は、睾丸内に精子がわずかしかなく、それは一般に精巣内の「ポケット」又は局所領域に位置し、この精子は精子回収術を使用して抽出することができる。回収された精子は、その後、生物学的妊娠のためのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精及び細胞質内精子注入で使用される。
【０００３】
不都合にも、睾丸内に回収可能な精子を有するＮＯＡ男性を決定することは、大きな臨床的難題である。調査されてきた、精子回収に成功する潜在的に可能な予測因子としては、不妊診断、射出された精子の履歴、血清ホルモン、精巣容積及び精巣生検組織検査などが挙げられる。全て予測因子としては弱いが、精巣生検が精子の有無を最も予測する。しかし、生検は侵襲的手技であり、患者の視点から魅力的でないだけではなく、いずれの侵襲的手技にも付随する潜在的に可能性のある合併症を引き起こすのに対して、生検を行った領域についての情報しか得られず、精巣内の他の部分に存在し得る使用可能な精子のポケットについての情報は得られない。これらの因子及び他の因子を考慮して、生殖泌尿器科医らは、診断用細針吸引精巣マッピング及び多部位生検顕微解剖精子抽出などの代替の精子試料採取戦略を開発してきた。これらの先進技術であっても、中には依然としてかなり侵襲的であるものもあり、精子が見出されるのはＮＯＡ男性のうちの６０〜６５％のみである。
【０００４】
必要なのは、ＮＯＡ男性において生存可能な精子を明確に特定するための非侵襲的技術である。本発明は、こうした技術を提供する。上記は、現在のところ好ましい本発明の使用であるが、本明細書に開示の技術及び解析は、健康及び疾患の双方の精巣の機能に関する多数の他の状態の診断に同等に適用可能であろうことが予想される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
したがって、一態様において、本発明は、対象の精巣のｉｎ  ｖｉｖｏでの１Ｈ磁気共鳴分光法スペクトルを得るステップと、該対象精巣スペクトルを対照対象からのものと比較するステップと、該対象の該精巣の状態を診断するステップとを含む方法に関する。
【０００６】
本発明の一態様において、診断される精巣の状態は、精子及び付随する生殖能力の存在を含む。
【０００７】
本発明の一態様において、精子の存在を診断するステップは、該２つのスペクトルのホスホコリン、タウリン及び関連する可能性のある他の代謝シグナルを比較することを含む。
【０００８】
本発明の一態様において、該対象は、不妊の治療のために外科的介入を受けたことがある。
【０００９】
本発明の一態様において、該外科的介入は、精索静脈瘤修復術、精管切除術、精巣固定術、精管復元術又は関連する他の陰嚢手術である。
【００１０】
本発明の一態様において、該対象は、不妊の内科的治療を受けたことがある。
【００１１】
本発明の一態様において、該内科的治療は、クエン酸クロミフェン、タモキシフェン又は他の選択的エストロゲン応答モジュレーターの投与、並びに精子産生の他のホルモン操作（例えば、ＦＳＨ、ＬＨ注射、ドーパミンアンタゴニスト、ステロイド）又は非ホルモン操作（例えば、ビタミンサプリメント、ハーブ療法）を含む。
【００１２】
本発明の一態様において、該対象スペクトル及び該対照対象スペクトルを得るステップは、スペクトル増強技術を用いることを含む。
【００１３】
本発明の一態様において、該スペクトル増強技術は、水抑制法、脂肪抑制法、刺激エコー取得モード（ＳＴＥＡＭ）分光法、点解像分光法（ＰＲＥＳＳ）、化学シフト画像法（ＣＳＩ）、磁気共鳴分光画像法（ＭＲＳＩ）、ショートＴ１反転回復法（ＳＴＩＲ）、高解像度ＭＲＳ、マジックアングルスピニング法及びこれらの任意の組合せからなる群から選択される。
【００１４】
本発明の一態様において、診断される該精巣の状態は、薬理学的作用剤への曝露、毒剤への曝露、異常な物理的状態への曝露、放射線療法への曝露、化学療法への曝露、疾患への曝露又は前記の任意の組合せの精子の産生に対する影響である。
【００１５】
本発明の一態様において、診断される該精巣の状態は、精巣疾患、又は精巣機能及び特に精子産生に影響を与える全身性疾患若しくは曝露の存在である。
【００１６】
本発明の一態様において、該精巣疾患は、癌、停留精巣、精巣炎、精索静脈瘤の影響、投薬又は他の曝露、例えば、精管切除術若しくは他の流出管閉塞からの長期の遮断など、及び全身性毒素の影響である。
【００１７】
本発明の一態様において、該対象及び対照対象はヒトである。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】正常に精子形成をする５名の男性（上部スペクトル）及び精子形成しない５名の男性からのプールされたｅｘ  ｖｉｖｏ精巣生検試料からの１Ｈ高解像度ＭＲＳスペクトルを含む図である。コリン含有化合物が群の間で劇的に異なることは容易に明らかであり、これらの化合物は生殖能力に関連した疾患段階の関連バイオマーカーであることを示している。
【図２】正常の精子形成、抑制された精子産生（成熟抑制）、及びセルトリ細胞単独症候群のため精子形成なし（無精子）の男性におけるホスホコリン（ＰＣ）濃度（ｍｍｏｌ／ｋｇ）を示しているグラフである。
【図３】３名の異なる患者からの（Ａ）正常、（Ｂ）成熟抑制及び（Ｃ）セルトリ細胞単独の精巣生検試料の１Ｈ  ＮＭＲを示した図である。
【図４】図３の３名の患者からの（Ａ）正常、（Ｂ）成熟抑制及び（Ｃ）セルトリ細胞単独の精巣生検試料のＣピークの二次元スペクトル分解を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
考察
他に明記がない限り、特許請求の範囲を含む本出願にわたる単数の使用は複数を含み、その逆もまた同様であることが理解される。すなわち、「１つの（ａ）」及び「該（ｔｈｅ）」は、１種又は複数のいかなる単語修飾も指すとして解釈される。非限定的な実施例として、「精巣（ａ  ｔｅｓｔｉｓ）」、これは、他に明記がない限り、又は意図されないことが文脈から明確に明らかでない限り、１個の精巣又は双方の複数の精巣を含むと理解される。同様に、限定されるものではないが、「スペクトル（ａ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ）」は、ここでも、他に明記がない限り、又は意図されないことが文脈から絶対的に明らかでない限り、単一の通過スペクトル、複数の通過スペクトル又は２つ又はそれ以上の別々のスペクトルの結合を指し得る。この逆も真と考えられ、すなわち、複数の項目に対する引用は、複数のみが意図されることが他に文脈から明確に明らかでない限り、単数を含む。
【００２０】
本明細書中で使用される場合、全ての専門用語は、異なる意味が意図されることが単語又は文脈から明白に述べられているか又は明らかでない限り、当業者によって与えられるであろう意味を有することを意図するものである。本明細書に記載のこうした説明の中にあるいかなる認知された誤り、矛盾及び／又は省略も意図的ではない。
【００２１】
本明細書中で使用される場合、近似の単語、例えば、限定されるものではないが、「およそ」「実質的に」、「本質的に」及び「約」は、その用語に修飾される単語又は句が正確に記載のものである必要はなく、その記載の説明からある程度まで変化してもよいことを意味する。説明がどの程度まで変化してもよいかは、どれだけ大きい変化を、定めることができ、修飾される単語又は句の性質、特徴及び機能を依然として有するものとして、修飾型を当業者に依然として認識させるかによって決まることになる。一般に、しかし、上記の説明を考慮して、近似の単語によって修飾されている本明細書中の数値は、表示値から±１５％まで変化してもよい。
【００２２】
本明細書中で使用される場合、「好ましい」、「好ましくは」、又は「より好ましい」などの使用は、特許出願の出願時に存在した優先性を指す。
【００２３】
本明細書中で使用される場合、ｉｎ  ｖｉｖｏとは、天然の状態にある生物上で行われる操作を指す。すなわち、精巣のｉｎ  ｖｉｖｏ磁気共鳴分光法スペクトルは、いかなる様式の侵襲性の方法も受けてきていない、天然の環境にある完全な精巣上で行われる。反対に、ｅｘ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏは、本質的に互換可能であると考えられている用語であり、摘出して単離した生物組織上の操作を表すのに使用される。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、磁気共鳴分光法（ＭＲＳ）とは、核磁気共鳴すなわちＮＭＲ分光法として有機化学において一般に知られているのと同じ解析手法を指し、実際に、この用語は、当技術分野及び本明細書において互換可能に使用される。最も単純な用語では、ＭＲＳ及びＮＭＲとは、変化する高周波の一定の磁場に曝露されるときに特徴的なスピンを有する原子核に対する影響の検出、又はその逆もまた同様であり、すなわち、一定の周波数に曝露した原子核に対する磁気強度を変化させることの影響の検出を指す。従来、前者は、最も一般に採用される技術である。奇数の陽子、奇数の中性子又は双方を有する全ての核は固有のスピンを示すことになるが、有機化学者及び医学研究者に最も関心が持たれている核は、１Ｈ、１３Ｃ、１９Ｆ及び３１Ｐである。本発明の目的で現在のところ好ましいのは、１Ｈ核をプローブするＮＭＲである。
【００２５】
磁束の国際単位であるテスラ（Ｔ）に関して、ＮＭＲにおいて使用される磁場の強度は、４５Ｔまでの場の使用が報告されているが、およそ１〜およそ２０Ｔである。１テスラは、およそ１０，０００ガウスと等しい。対照として、地球の磁束は地表面でおよそ１０−４Ｔである。生物が磁場に直接に曝露される本発明の目的では、およそ１Ｔ〜およそ７Ｔの場の強度が現在のところ好ましい。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、スペクトルは、好ましくは１Ｈ核の存在における、所与の磁場強度での核の主共鳴周波数付近における周波数の関数としての、標的核のシグナル強度に関する応答の読み出しである。例えば、２１Ｔでは、１Ｈは９００ＭＨｚで共振する。次いで、この周波数掃引は９００ＭＨｚ付近にあることになり、実際に、かなり近いので、周波数掃引の全範囲は、１００万分のいくらか又はｐｐｍで規定される。ｉｎ  ｖｉｖｏ試験の一般的な場の強度である３Ｔでは、１Ｈはおよそ１００ＭＨｚで共振する。このスペクトルは、適切な周波数範囲を通しての単一の通過の結果であってもよく、その範囲を通しての複数の通過の合計、又は主共鳴周波数若しくはその付近での多数の短パルスの結果であってもよく、これは、一般にフーリエ変換ＮＭＲと呼ばれる。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、「スペクトル増強」技術とは、機器的、方法的、計算的又は他の方法で、対象から得られる、より容易に且つより明確に解釈可能なＭＲＳスペクトルの、求められている情報から見て、最も関連する部分を表示するあらゆる技術を指す。限定されるものではないが、水抑制法、脂肪抑制法、刺激エコー取得モード、ショートＴ１（縦緩和時間又はスピン−格子緩和時間）反転回復法、高解像度ＭＲＳ、高解像度マジックアングルスピニング法（ＨＲＭＡＳ）及びこれらの任意の組合せなどの現在利用可能な技術を使用して、本発明の目的で得られたスペクトルを増強することもできる。当然、将来生じ得るスペクトル増強技術も、本発明によって求められている情報の型に適用可能である限り、本発明の範囲内にある。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、「対象」とは、種の雄の精巣内で産生される精子の存在を必要とする性生殖系を特徴とする生物を指す。特に、本明細書中の対象は、哺乳動物であり、最も特に現在、対象はヒトである。本明細書中で使用される場合、「対照対象」とは、対象と同じ種の哺乳動物を指し、ここで、対照対象は、精子産生に関して正常に機能する健常な精巣を有するか、又は薬理学的作用剤、毒性学的作用剤、化学療法、放射線療法、例えば慢性的全身性疾患、過度の熱、精索静脈瘤、遮断などの異常な物理的状態に対する曝露などの既知の損傷の結果として阻害された精巣機能を有するかのいずれかである。対照は、精巣疾患又は精巣の機能に影響を及ぼす他の疾患に罹った対照でもよい。
【００２９】
本明細書中で使用される場合、診断とは、薬理学的作用剤又は毒性学的作用剤に対する曝露、熱などの過度の物理的な力、精索静脈瘤、遮断などの他の因子及び熟練した診断医が考慮に入れるであろうあらゆる他の因子などの考慮と共に、ＭＲＳスペクトルの解析を通しての器官の機能の決定を指す。現在好ましい、該器官は精巣であり、診断される該機能は、健常な精子を産生する精巣の能力である。現在好ましいのは、対象の精巣のｉｎ  ｖｉｖｏでの１Ｈ  ＭＲＳスペクトルに主として基づく診断である。
【００３０】
本明細書中で使用される場合、「無精子症」又は「無精子症の」とは、精液が精子を含まない状態を指す。この用語は、精子は産生されるが物理的遮断のために残りの射精液と混合されない閉塞性無精子症を含むか、又は精子形成に問題がある非閉塞性無精子症であってもよい。さらに、重症精液過少症とは、精液に含まれる精子が、極めて少ないか又は使用不可能である状態を指す。これらの場合、精巣の精子は、妊娠のための代替と考えられる。
【００３１】
本明細書中で使用される場合、「メタボロミクス」とは、細胞内で見出される低分子代謝産物−一般に大きさが１ｋＤａより小さい−によって証明されるような、特定の細胞プロセスによって生じる固有の化学的フィンガープリントの試験を指す。完全なメタボロミクスプロファイルとは、いくつかの解析手段と技術との統合を必要とすることになる、所与の時間における所与の細胞の代謝組成物の完全な特徴解析を指すが、本発明の目的では、メタボロミクスプロファイルとは、標的細胞のＭＲＳスペクトルから得ることができるものを指す。
【００３２】
正常のイヌ、虚血性のイヌ及びホルモン処理したイヌの完全に緩和した３１Ｐ  ＭＲＳスペクトルは、ホスホモノエステル（ＰＭ）、ホスホジエステル（ＰＤ）、無機リン（Ｐｉ）のピーク及びアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の３つのピークを含む、同様のスペクトルパターンを表すことが示されている。しかし、虚血性の精巣は、正常の対照と比較して、迅速な特徴的なＡＴＰ及びＰＭの欠乏並びにＰｉの増大を示した。この関連性は、次いで、ラットモデルにおいて確認されている。
【００３３】
ヒトでは、無精子症の対象及び生殖能力のある対照対象の精巣の３１Ｐ  ＭＲＳが、これらの２つの群からの精液の分析及び精巣生検の所見を使用して比較されている。上記の動物試験で認められたのと同様のピークが観察された。さらに、ＰＭ／β−ＡＴＰ、ＰＭ／ＰＤ及びＰｉ／ＰＭのピーク面積比は、生殖能力のある対照と精子数のない男性との間で有意に異なった。さらに、閉塞のために精子数のない男性を、精巣障害による無精子症と比較した場合、ＰＭ／β−ＡＴＰ比は有意に低下した。これらの試験により、ＰＭ、特にＰＣ（ホスホコリン）は精巣の代謝のプロファイリングの重要なマーカーであることと、こうしたマーカーは不妊の男性集団を見分けることができるはずであることが明白に示唆される。
【００３４】
特定のいかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、上記の知見の根拠は、ＰＭが、細胞膜リン脂質合成を可能にして且つ細胞膜リン脂質合成において活性を正確に反映する、代謝プールを形成するということであってもよい。この活性は、細胞増殖の速度と直線的に相関すると考えられている。精巣において、リン脂質合成によって測定されるような、細胞増殖の速度における変化は、増殖している生殖細胞の数、特に、最終的に精子になるために減数分裂を受けている精原細胞及び精母細胞の数と関連がある。精巣の支持細胞、特に、ライディッヒ細胞及びセルトリ細胞は、もし複製するとしてもゆっくりと複製するだけであり、リン脂質合成に有意義に寄与することは期待されないであろう。精子を産生している健常な精巣は、恒常的な膜合成を必要とし、且つしたがって、大きなＰＭの基質プールを有する。精子産生が弱い又はない、精巣障害を有する無精子症の個体では、膜生成が減少し、且つより小さいＰＭのプールが存在するはずである。これは、上記の実験結果、特に、正常な、生殖能力のある男性と比較してより低い、無精子症の男性のＰＭ／β−ＡＴＰ比によって確認される。
【００３５】
３１Ｐ  ＭＲＳは、上記の決定をするのに十分なデータを提供することができ得るが、１Ｈ  ＭＲＳにおける現在の進歩は、上記のような、現在、メタボロミクスプロファイリングと呼ばれる、正常及び異常な状態のヒト精子形成についての特徴的な代謝の「フィンガープリント」の定義において特に興味があるこの技術を与えた。これらのフィンガープリント又はプロファイルは、精巣の健康及び精巣の疾患の臨床的状態を定めることができるバイオマーカーとして有用となるはずである。すなわち、約１０００精子／秒が産生される生殖細胞（精子形成）から生じる代謝活性は、精巣内の体細胞（セルトリ細胞、ライディッヒ細胞及び筋様細胞）のそれよりも著しく高く、１Ｈ  ＭＲＳは、固有に、この相違を検出することができるはずである。
【００３６】
実際に、ｅｘ  ｖｉｖｏの１Ｈ高解像度マジックアングルスピニングＭＲＳ（ＨＲＭＡＳ−ＭＲＳ）を使用して、不妊の精巣及び生殖能力のある精巣におけるいくつかの固有の代謝バイオマーカーが特定されている。すなわち、生殖能力のある男性及び不妊の男性からの精巣生検試料のｅｘ  ｖｉｖｏ解析において、予測された決定的なバイオマーカーの比が比較された。図１は、精巣生検試料の２つのプールにおける１Ｈ  ＨＲＭＡＳ−ＭＲＳの結果を示し、１つのプールは、正常な精子形成を示している男性から得られ（上部スペクトル）、１つのプールは、精子形成の欠如を示している男性から得られた（下部スペクトル）。容易にわかるように、２つのプールの間でコリン含有化合物が劇的に異なり、健常な精巣と精子産生ができない精巣とを、又は低下した精子産生のみしかできない精巣とを見分ける関連バイオマーカーがあることが示唆される。１１．７Ｔ磁石を使用して得られた、スペクトルは、実際に、１９種の既知の代謝産物を明らかにすることにも留意されたい。上記の結果より、生殖能力のある男性と不妊の男性との間の全コリンピークは、精子産生のための重要な代謝バイオマーカーであることが明らかにされるが、タウリンを含む、これらの他の代謝産物のうちのいくつか又は全てにおける相違は、薬理学的作用剤、毒性学的作用剤、異常な環境的又は物理的な状態などのような多様な状態に曝露することによる、精巣の全体的な機能に対する影響に関するさらなるバイオマーカーを提供し得る。さらに、こうしたバイオマーカーは、癌、停留精巣、精巣炎、良性腫瘍、閉塞などのような多様な精巣疾患を示すことが見出される可能性がある。
【００３７】
別の試験では、欠陥があって精子を産生しない男性を、正常に精子を産生する男性と比較した。正常精巣内のホスホコリン（ＰＣ）濃度は、精子を産生しない精巣内で認められる濃度よりも有意に高く、５．３５±１．３７ｍｍｏｌ／ｋｇ対１．５２±０．２７ｍｍｏｌ／ｋｇであった。これについては、図２にグラフで示している。２つの群の間のＰＣ濃度に重複がないことに留意されたい。これは、無精子症の又は重症の精液過少症が存在し、妊娠のための精子を見つけるために侵襲性の精子回収術が考えられている、多くの男性不妊例における重要な問題である、精巣内で精子が少しでも産生されているか否かを決定するための１Ｈ  ＭＲＳの使用を示唆している。
【００３８】
現在の臨床的なＭＲスキャナー（１．５〜３．０Ｔ）を使用すれば、現在提供される侵襲性の精巣マッピング及び生検の技術を使用して達成することができるものよりも、双方の精巣のより多くの領域を指示的なバイオマーカーの存在又は欠如について調べることも可能なはずである。すなわち、前立腺癌を調査するために以前使用された、１Ｈ磁気共鳴分光画像法（ＭＲＳＩ）技術を使用する現在の臨床的ＭＲスキャナー上で、双方の睾丸を、連続した０．１６ｃｍ３ボクセル（５．５ｍｍ×５．５ｍｍ×５．５ｍｍ）からのメタボロミクスバイオマーカーの存在について試験することもあり、ボクセルは、ＭＲＳによって検査される組織の容積の尺度として定められているものである。
【実施例】
【００３９】
実施例１：生検された精巣試料の１Ｈ  ＭＲＳ
【００４０】
精管復元術を受けている男性からの精巣生検試料を、正常な精子形成を確認するために、組織学的に再調査した。ＮＯＡの評価をされている不妊の男性に、生検標本の組織学的再調査と、生検を行った精巣の残部からのＦＮＡマッピングの所見の細胞学的再調査との双方を行った。Ｌｅｖｉｎ、Ｈｕｍ．Ｐａｔｈｏｌ、１９７９、１９：５６９〜５８４の判定基準に従って、精巣生検試料を評価した。生検試料のパターンを以下の通りに分類した：正常精子形成、形成不全若しくは精子形成減少、完全な若しくは早期の成熟抑制（ＥＭＡ）、ＳＣＯ（セルトリ細胞単独）、不完全な若しくは後期の成熟抑制（ＬＭＡ）又はその他（硬化症を含む）。生検試料が標本の全体にわたって単一の組織学的パターンを含む場合には、それを純性パターンとみなした。生検試料が２つ又はそれ以上のパターンを示した場合には、混合パターンに割り当てた。生検を行った精巣の残部からのＦＮＡマッピングからの細胞学的所見を、Ｍｅｎｇら、Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｐｒｏｄ．、２０００、１５：１９７３〜１９７７によって報告されているように、組織学的に分類した。精巣の表現型の多様性を可能な限り減らすために、純性の組織学的パターンに一致するＦＮＡマッピングからの純性の細胞学的パターンのみを、この試験におけるＳＣＯ患者に含めた。
【００４１】
凍結解凍した精巣組織を計量して（平均１３．６４±６．８９ｍｇ）、３．０μｌのＤ２Ｏ＋０．７５％ＴＳＰ（３−（トリメチルシリル）−プロピオン−２，２，３，３−ｄ４酸ナトリウム塩）を含む、カスタム設計した２０μｌ又は３５μｌの漏れ止めジルコニウムローターに入れた。１Ｈ−ＭＲＳデータを、４ｍｍのｇＨＸナノプローブを備えたＶａｒｉａｎ  ＩＮＯＶＡ分光計を使用して、１１．７Ｔ、１℃、且つ２２５０Ｈｚのスピン速度で得た。定量１−Ｄスペクトルを、２ｓの緩和、２ｓの前飽和、２ｓの取得（ＴＲ＝６ｓ）、４０，０００の点、２０，０００Ｈｚのスペクトル幅及び２５６の過渡で得た。ＥＲＥＴＩＣ法を、定量の濃度標準として使用した（Ｔｅｓｓｅｍら、Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．Ｍｅｄ．、２００８、６０：５１０〜５１６）。データを、４０，０００点を含む短エコー時間１Ｈ−ＭＲＳスペクトルの解析のために構成された、高解像度−ＱＵＥＳＴ（ＨＲ−ＱＵＥＳＴ）と呼ばれる、セミパラメトリック量子推定（ＱＵＥＳＴ）に基づいた定量ソフトウェアのカスタム版で定量化した（Ｒａｔｉｎｅｙら、ＮＭＲ  Ｂｉｏｍｅｄ．、２００５、１９：１〜１３）。１９種の代謝産物の基底系スペクトルを溶液中で収集して、ＨＲ−ＱＵＥＳＴに適合している日常の操作手順の中に組み込んだ。ＭＲで認められるヒト精巣内の主な１Ｈ代謝産物−コリン（Ｃｈｏ）、クレアチン（Ｃｒ）、グルタメート（Ｇｌｕ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、ラクテート（Ｌａｃ）、ミオ−イノシトール（ｍＩ）、ホスホクレアチン（ＰＣｒ）、ホスホコリン（ＰＣ）、ホスホエタノールアミン及びタウリン（Ｔａｕ）−を定量して評価した。既知の巨大分子及び未知の化合物からのピークも、基底系の一部として含めた。ＨＲ−ＱＵＥＳＴは、Ｈａｎｋｅｌ−Ｌａｎｃｚｏｓ特異値分解（ＨＬＳＶＤ）アルゴリズムを使用してバックグラウンドシグナルを推定し、代謝産物の適合とバックグラウンドのモデル化との間で６回反復した。最後に、ＥＲＥＴＩＣシグナルのピーク面積と比較して、濃度を算出した。
【００４２】
各生検試料についての二次元全相関分光法（ＴＯＣＳＹ）１Ｈ−ＭＲＳデータも得て、ＰＣグリセロールホスホコリン（ＧＰＣ）、ホスホエタノールアミン（ＰＥ）及びグリセロールホスホエタノールアミンの相対量をさらに定量するために使用した。これは、これらの代謝産物が、精巣の１−Ｄ  １Ｈ−ＭＲＳスペクトルにおいて重複するためである。ＴＯＣＳＹスペクトルは、ローターと同時の断熱（ＷＵＲＳＴ−８）混合スキーム（Ｚｅｋｔｚｅｒら、Ｍａｇｎ、Ｒｅｓ．Ｍｅｄ．、２００５、５３：４１〜４８）を、１ｓの前飽和遅延、０．２ｓの取得時間、４０ｍｓの混合時間、２４の過渡／増分、２０，０００×６０００Ｈｚのスペクトル幅、４０９６×６４の複合点、時間約１ｈで使用して得た。
【００４３】
もしあるとすれば、どの代謝産物が３種の組織の有意な指標となるかを識別するために、一方向ＡＮＯＶＡを使用して探索的な試験を行った。正規性の検定を行い、正規分布について評価した。
【００４４】
精巣生検組織の二値従属変数（正常又はＳＣＯ）並びに独立変数、年齢及び単一の代謝産物を使用して、ロジスティック回帰分析を行った。年齢補正したＰ値＜０．０５を有する代謝産物の場合は、正常対ＳＣＯ患者についてロジスティック回帰式を使用した、ＥＭＡ精巣組織試料についての「正常な精子形成」の予測される確率をモデル化した。オッズ比（ＯＲ）と９５％信頼区間を決定した。
【００４５】
精管復元術時の男性から又は非閉塞性無精子症を有する男性から、合計２７名の患者の生検試料を評価した。患者を、生検及び／又はＦＮＡマッピング法で、正常（ｎ＝９）、ＭＡ（早期、ｎ＝５及び後期、ｎ＝４）又は純性のＳＣＯ（ｎ＝９）の組織を有すると特定した。正常の生殖能力のある群の平均年齢は、他のいずれの群の平均年齢よりも高かった。
【００４６】
正常（Ａ）、ＭＡ（Ｂ）及びＳＣＯ組織（Ｃ）を有する患者から採取した生検試料からの代表的な１−Ｄ  １Ｈ−ＭＲＳスペクトルを図３に示している。スペクトルピークは、それらに対応する代謝産物で標識され、ＥＲＥＴＩＣピークに対して測定されるので、代謝産物濃度における本当の且つ実際の相違を視覚的に反映する。ＰＣで標識されたスペクトルピークは、正常においてＳＣＯ患者と比較して著しく高められ、ＭＡ患者のＰＣピークは、正常群のピークとＳＣＯ群のピークとの間であることに注意されたい。ＧＰＣ及びＰＣの共鳴は、１−Ｄ精巣スペクトルでは、これらが重複するために、解析することができない。しかし、同じ精巣試料の２−Ｄ  ＴＯＣＳＹスペクトルは、ＧＰＣ及びＰＣの双方からなるＰＣピークが主にＰＣからなっていたことを示す（図４）。図４では、一次元１Ｈ  ＮＭＲは主にＰＣからなることが示される。ＧＰＣで標識された円は、グリセロールホスホコリンが存在する場合に出現するであろう場所を示す。存在する他の物質は、ＧＰＥ、グリセロールホスホエタノールアミン、ＰＥ、ホスホエタノールアミン並びにＣｈｏ＋Ｍｙｏ−Ｉ、コリンとミオ−イノシトールである。別の解析では、タウリンの平均濃度は、正常群、ＳＣＯ群又はＭＡ群について、それぞれ０．９６、２．４６、及び１．７３ｍｍｏｌ／Ｋｇで有意に異なった（ＯＲ＝０．２９、ＣＩ９５％（０．０９〜０．９３）  ｐ＝０．０３７）。これは、タウリンも、睾丸内の精子の予測因子としての可能性を有し得ることを示唆している。
【００４７】
実施例２：ｉｎ  ｖｉｖｏの精巣の１Ｈ  ＭＲＳ
【００４８】
睾丸内の生存可能な精子のバイオマーカーである高いホスホコリンの存在及び空間分布を評価するために、泌尿器科医は、不妊の男性を精巣のＭＲＩ／１Ｈ  ＭＲＳＩ試験について調査した。患者を、同意させ、すべてのＭＲＩ禁忌症についてスクリーニングした。ＭＲ画像法試験は、３．０テスラの全身ＭＲスキャナー（Ｓｉｇｎａ；ＧＥ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）上で行った。励起のためにボディコイルを使用し、且つシグナル受信のために６”表面コイル（ＧＥ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）を使用して、患者をスキャンした。ローカライザーシーケンスに従って、以下のパラメータを用いて、睾丸のＴ２強調高速スピン−エコー画像を得た：ＴＲ／有効  ＴＥ  ５０００／９６ｍｓ、エコートレイン数＝１６、スライス厚＝３ｍｍ、スライス間ギャップ＝０ｍｍ、撮像領域＝１４ｃｍ、マトリックス２５６×１９２、前後の周波数エンコード、且つ３回の励起。
【００４９】
軸方向のＴ２強調画像の再調査後、双方の睾丸の適用範囲を最大にするように、ＭＲ分光画像法の容積を選択した。三次元ＭＲ分光画像法データを、精巣代謝産物の定量的検出のために最適化された、２回の１８０°励起パルスについてのスペクトル空間パルス、及びインターリーブフライバックエコー−平面読み出しで、水及び脂質抑制ダブルスピンエコー点解像分光シーケンス技術を使用して得た。外側のボクセルの飽和パルスを採用して、容積の選択をさらに鋭くし、睾丸の形状に対する選択された容積に一致させる。データセットを、１６×１０×８位相エンコードスペクトルアレイ（０．１６ｃｍ３の空間分解能を有する１２８０ボクセル）、ＴＲ／ＴＥ  ８５／２０００ｍｓ、且つ５分間の取得時間として得た。三次元ＭＲ分光画像法データを、特に３Ｄ−ＭＲ分光画像法試験のために以前に開発された組織内ソフトウェアを利用して、オフラインで処理した。精巣の全コリン（ＰＣ＋ＧＰＣ＋コリン）、クレアチン、ミオイノシトール、タウリン、及びラクテートについて統合したピーク面積値を、各ボクセルについて自動的に算出した。ＭＲ分光画像法データ（スペクトル及び関連する代謝の画像）を、対応する軸方向のＴ２強調画像上に重ね合わせた。
【００５０】
上記の試験において得られたスペクトルは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの１Ｈ  ＭＲＳが、ｅｘ  ｖｉｖｏでの精巣生検試料から得られるものと同じ種類の情報を生じるという原則についての証拠を提供した。したがって、ｅｘ  ｖｉｖｏでの精巣生検試料の解析において認められたホスホコリン（ＰＣ）濃度、並びに男性の３１Ｐ  ＭＲＳ  ｉｎ  ｖｉｖｏスキャンからのＰＭ／β−ＡＴＰ、ＰＭ／ＰＤ及びＰｉ／ＰＭのピーク面積比における傾向及びパターンと同様に、ｉｎ  ｖｉｖｏでの１Ｈ  ＭＲＳから得られた特徴的なＰＣ濃度又は他のＰＭ、ＰＤ若しくはＰｉに対するＰＣの比率を使用して、精子の存在、虚血状態の領域、及び精巣機能に影響を及ぼす他の異常を明確にすることができる。こうした解析は、以下を決定する際に有用であろう：１）妊娠のための生存可能な精子が精巣に含まれているかどうか、２）精巣が健常であるか、健常でないか、又は虚血性であるか、及び３）精巣内での異常が悪性であるか又は良性であるか。この技術は、精子形成における多様な薬剤の相対的な生殖毒性又は精巣機能に対する精索静脈瘤又は精索静脈瘤修復術の影響を決定するためにも有用となることが期待される。
【００５１】
関連出願
本出願は、２００９年４月２２日に出願の米国仮特許出願第６１／１７１，７５８号に関し、これについての利益を主張する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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