【手続補正書】
【提出日】平成21年8月21日(2009.8.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロモーター、外来タンパク質をコードする配列、終結配列、および分泌シグナルペプチドをコードする転移配列を含む、組み換えDNAコンストラクトを含む遺伝子組み換えアロエ植物であり、
前記外来タンパク質は、インターフェロン、免疫グロブリン、リンフォカイン、哺乳類成長因子、哺乳類ホルモン、血液因子、組織適合抗原、SEQ. ID. NO. 36によってコードされるプロトロンビン、およびSEQ. ID. NO. 30によってコードされるダームシジンから選択される哺乳類タンパク質であり、
前記外来タンパク質は前記DNAコンストラクトから発現され、
前記外来タンパク質の少なくとも一部は、アロエ細胞から、前記遺伝子組み換えアロエ植物のアロエ葉のゲルに転移される、
ことを特徴とする、遺伝子組み換えアロエ植物。
【請求項２】
前記プロモーターは、トウモロコシ由来のユビキチンプロモーター（SEQ. ID. NO. 44）である、請求項１に記載の植物。
【請求項３】
前記転移配列は、イネ（Oryza sativa）由来のアルファアミラーゼ分泌配列（SEQ. ID. NO. 29）である、請求項１もしくは２に記載の植物。
【請求項４】
植物内で、前記植物に対して外来性の生物活性タンパク質を生成する方法であり、
プロモーター、前記外来タンパク質をコードする配列、終結配列、および分泌シグナルペプチドをコードする転移配列を含む組み換えDNAコンストラクトを含む遺伝子組み換え植物を提供するステップと、
前記DNAコンストラクトから前記外来タンパク質が発現するように前記植物を培養するステップと、
前記植物から前記タンパク質を抽出するステップと、
を含み、
前記植物はアロエであり、
前記DNAコンストラクトは、前記外来タンパク質の少なくとも一部がアロエ葉のゲルに転移されるように、分泌シグナルペプチドを含み、前記外来タンパク質は前記葉のゲルに抽出され、
前記外来タンパク質は、インターフェロン、免疫グロブリン、リンフォカイン、哺乳類成長因子、哺乳類ホルモン、血液因子、組織適合抗原、SEQ. ID. NO. 36によってコードされるプロトロンビン、およびSEQ. ID. NO. 30によってコードされるダームシジンから選択される哺乳類タンパク質である、
ことを特徴とする、方法。
【請求項５】
前記プロモーターはトウモロコシ由来のユビキチンプロモーター（SEQ. ID. NO. 44）である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記転移配列は、イネ（Oryza sativa）由来のアルファアミラーゼ分泌配列（SEQ. ID. NO. 29）である、請求項４もしくは５に記載の方法。
【請求項７】
アロエ種子からアロエ胚細胞を得るステップと、
培養液中の前記アロエ細胞を、カルスを形成するために、1-ナフタレン酢酸（NAA）もしくはインドール3-酢酸（IAA）および6-ベンジルアミノプリン（BAP）を含む栄養培地で培養するステップと、
前記カルスを前記組み換えDNAコンストラクトとともに形質転換するステップと、
前記カルスを、0.2 mg/l NAAもしくはIAAおよび2 mg/mlのBAPを含む発芽・選択培地で培養しながら、前記組み換えDNAコンストラクトを含む形質転換アロエ細胞を選択するステップと、
前記発芽・選択培地で再生された芽を、0.2 mg/l NAAを含む発根培地で培養するステップと、
一旦根が形成し始めたら、小植物体を土壌に移すステップと、
を含むプロセスによって、前記遺伝子組み換え植物を作り出すステップを含む、請求項４から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
植物内で、前記植物に対して外来性の生物活性タンパク質を生成するために、遺伝子組み換えアロエ植物を生成する方法であり、
アロエ細胞の未分化カルスを、1-ナフタレン酢酸（NAA）もしくはインドール3-酢酸（IAA）および6-ベンジルアミノプリン（BAP）を含む栄養培地で培養するステップと、
前記カルスに、プロモーター、前記外来タンパク質をコードする配列、終結配列、および分泌シグナルペプチドをコードする転移配列を含む組み換えDNAコンストラクトを導入するステップと、
前記カルスを、0.2 mg/l NAAもしくはIAAおよび2 mg/ml BAPを含む発芽・選択培地で培養するステップと、
前記発芽・選択培地で再生された芽を、0.2 mg/l NAAを含む発根培地で培養するステップと、
一旦根が形成し始めたら、小植物体を土壌に移すステップと、
を含み、
前記外来タンパク質は、インターフェロン、免疫グロブリン、リンフォカイン、哺乳類成長因子、哺乳類ホルモン、血液因子、組織適合抗原、SEQ. ID. NO. 36によってコードされるプロトロンビン、およびSEQ. ID. NO. 30によってコードされるダームシジンから選択される哺乳類タンパク質である、
ことを特徴とする、方法。
【請求項９】
前記カルスはアロエ種子由来である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記カルス組織は前記組み換えDNAコンストラクトを直接打ち込まれる、請求項８もしくは９に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
植物細胞で活性のある数多くの他のプロモーターが文献に記載され、アロエ細胞で有効である可能性がある。これらは、植物ゲノムに存在するプロモーターだけでなく、他の起源由来のプロモーターも含む。すなわち、Agrobacterium tumefaciensの腫瘍誘導プラスミド上にあるノパリンシンターゼ（NOS）プロモーターおよびオクトピンシンターゼ（OCS）プロモーター、ならびにカリフラワーモザイクウィルスなどのcaulimovirusプロモーターを含む。さらに、種々の他のプロモーターも様々な参考文献で同定されており、カリフラワーモザイクウィルス（CaMV35S）由来の構成的プロモーターの種類を開示しているU.S. Pat. No. 5,858,742および5,322,938、イネアクチンプロモーターを開示しているU.S. Pat. No. 5,641,876、効果的な植物発現ベクターの設計に有用な5',3'およびイントロンエレメントを開示しているU.S. Patent Application Publication 2002/0192813A1、トウモロコシ葉緑体アルドラーゼプロモーターを開示しているU.S. patent application Ser. No. 09/757,089、イネグルテリンプロモーターを開示しているU.S. patent application Ser. No. 08/706,946、トウモロコシアルドラーゼ（FDA）プロモーターを開示しているU.S. patent application Ser. No. 09/757,089、トウモロコシニコチアナミンシンターゼプロモーターを開示しているU.S. patent application Ser. No. 60/310,370を含むが、これらに限定はされず、これら全ては引用により本明細書に組み込まれる。植物細胞内で機能する、これらの、また数多くの他のプロモーターは、所望の治療タンパク質の発現のために遺伝子組み換えアロエ植物内で機能し得る。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
上述の通り、プロモーターは、遺伝子発現を高める一助となる、複数の“エンハンサー配列”を含むように改変されてもよい。そのようなエンハンサーは当該技術分野で周知である。エンハンサー配列をコンストラクトに含めることにより、選択されたタンパク質の発現が促進され得る。これらのエンハンサーは、しばしば真核細胞で機能するプロモーターの5’から転写開始点に見つかるが、しばしば上流（5’）もしくは下流（3’）からコード配列に挿入されてもよい。いくつかの場合には、これらの5’増強エレメントはイントロンである。特に有用なエンハンサーは、イネアクチン1の5’イントロン（U.S. Pat. No. 5,641,876を参照）およびイネアクチン2遺伝子、トウモロコシアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子イントロン、トウモロコシ熱ショックタンパク質70遺伝子イントロン（U.S. Pat. No. 5,593,874）およびトウモロコシshrunken 1遺伝子である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
本発明の態様に従うコンストラクトは、典型的にポリアデニル化シグナルとポリアデニ
ル化部位を含む3’エレメントを含んでもよい。よく知られている3’エレメントは、例えばU.S. Pat. No. 6,090,627（引用により本明細書に組み込まれる）に開示されている、nos 3’、tml 3’、tmr 3’、tms 3’、ocs 3’、tr7 3’などのAgrobacterium tumefaciens遺伝子由来のもの、小麦（Triticum aesevitum）熱ショックタンパク質17（Hsp17 3’）、小麦ユビキチン遺伝子、小麦フルクトース-1,6-ビフォスファターゼ遺伝子、イネグルテリン遺伝子、イネ乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、およびイネベータチューブリン遺伝子などの、植物遺伝子由来の3’エレメント（これらは全て、引用により本明細書に組み込まれるU.S. published patent application 2002/0192813 A1に開示されている）、ならびに、エンドウマメ（Pisum sativum）リブロースビフォスフェートカルボキシラーゼ遺伝子（rbs 3’）、および宿主植物内の遺伝子由来の3’エレメントを含む。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
上記の通り、DNAコンストラクトは分泌シグナルも含んでもよい。コンストラクトは、治療タンパク質を、そのタンパク質が形成された細胞から除去する標的とし得るようなシグナルペプチドをコードする転移配列も含んでもよい。植物で機能し、特にアロエ植物などの単子葉植物で機能する種々のシグナル配列が文献で同定されている。これらは、コンストラクトもしくは目的遺伝子の中に機能的に組み込まれてもよい。一態様では、イネ（Oryza sativa）由来のアルファアミラーゼ分泌配列（SEQ. ID. NO. 29）が用いられてもよい。このシグナル配列は、“The alpha-amylase genes in Oryza sativa”Mol Gen Genet., 1990 April;221(2):235-44で述べられており、この開示はその全容が引用により本明細書に組み込まれる。あるいは、例えばインターフェロンなどのいくつかの目的遺伝子は、インターフェロンを分泌の標的とする、天然もしくは合成のドメインを含んでもよい。分泌シグナルは、典型的にはタンパク質が細胞を離れる際に切断されるか、あるいはいくつかの場合には、実質的にタンパク質の機能に影響を与えることなく、タンパク質に保持されてもよい。分泌シグナルは、転移に分泌シグナルを必要とし得る種々のタンパク質に加えられてもよい。これらの分泌配列は種々の植物分泌配列に由来してもよい。