(57)【要約】  本発明は、一般的に、抗ＨＩＶ−１抗体を誘導する際に使用するのに適した配合物に、そして特に、リポソームに連結されたＨＩＶ−１エンベロープｇｐ４１のプレヘアピン中間体型を含む配合物に関する。本発明はまた、こうした配合物を用いて広域（ｂｒｏａｄｌｙ）中和抗ＨＩＶ−１抗体を誘導する方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
合成リポソームに連結されたＨＩＶ−１エンベロープｇｐ４１のプレヘアピン中間体型を含むｇｐ４１−脂質構築物を用いて、哺乳動物において、広域中和抗ＨＩＶ−１抗体を誘導する方法。
【請求項２】
前記リポソームがＴＬＲアゴニストを含む、請求項１の方法。
【請求項３】
前記ＴＬＲアゴニストがＴＬＲ  ７／８またはＴＬＲ９に特異的である、請求項２の方法。
【請求項４】
前記ＴＬＲアゴニストがＴＬＲ４またはＴＬＲ５に特異的である、請求項２の方法。
【請求項５】
ＩＦＮαが前記リポソーム内に取り込まれている、請求項１の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その全内容が本明細書に援用される、２００９年４月３日出願の米国仮出願第６１／１６６，６４８号に優先権を請求する。
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された助成金番号第ＡＩ  ０６７８５４号のもとに米国政府の援助を受けて作成された。米国政府は、本発明において特定の権利を有する。
【０００２】
技術分野
本発明は、一般的に、抗ＨＩＶ−１抗体を誘導する際に使用するのに適した配合物に、そして特に、リポソームに連結されたＨＩＶ−１エンベロープｇｐ４１のプレヘアピン中間体型を含む配合物に関する。本発明はまた、こうした配合物を用いて広域（ｂｒｏａｄｌｙ）中和抗ＨＩＶ−１抗体を誘導する方法にも関する。
【背景技術】
【０００３】
ＨＩＶ−１感染は、一般的に、ビリオン表面上の唯一の抗原である、エンベロープ糖タンパク質［三量体（ｇｐ１６０）３、切断されて（ｇｐ１２０／ｇｐ４１）３になる］に対する強い抗体反応を誘導する。しかし、誘導される抗体の大部分は、感染防止に無効であり、これは、これらが非中和性であるかまたは狭い単離体特異性を有するかいずれかであり、そしてウイルスが非常に迅速に複製するため、中和耐性突然変異体の選択が進行する間に、ウイルス進化が高アフィニティ抗体産生の「先を行く」ことが可能になるためである（Ｗｅｉら，  Ｎａｔｕｒｅ  ４２２：３０７−３１２（２００３））。さらに、抗体反応の多くは、ｇｐ１２０およびｇｐ４１の再編成されたまたは解離した型に対するものである可能性があり、こうした型では、優性エピトープは、超可変ループ中にあるか、またはビリオン由来エンベロープ三量体上に閉鎖された位置にあるかいずれかの可能性もある。稀に、エンベロープタンパク質上の３つの比較的保存された領域：ＣＤ４結合部位（ｍＡｂ  ｂ１２）（Ｂｕｒｔｏｎら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：１０２４−１０２７（１９９４））；外部ｇｐ１２０表面上の炭水化物（ｍＡｂ  ２Ｇ１２）（Ｔｒｋｏｌａら，  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  ７０．  １１００−１１０８（１９９６））；およびしばしば「膜近位外部領域」（ＭＰＥＲ）と称される、ウイルス膜に隣接するｇｐ４１外部ドメインのセグメント（ｍＡｂ  ２Ｆ５および４Ｅ１０）（Ｃａｒｄｏｓｏら，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２２：１６３−１７３（２００５）；  Ｏｆｅｋら，  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  ７８：１０７２４−１０７３７（２００４））の１つを認識する、「広域（ｂｒｏａｄｌｙ）中和」抗体が検出されてきている。
【０００４】
ウイルスおよびターゲット細胞膜の融合が、ＨＩＶ−１感染を開始する。受容体（ＣＤ４）および共受容体（例えばＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４）への結合に付随するｇｐ１２０のコンホメーション変化によって、ｇｐ１２０はｇｐ４１から解離し、そしてｇｐ４１では、一連の再フォールディング事象が導かれる（Ｈａｒｒｉｓｏｎ，  Ａｄｖ  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．  ６４：２３１−２５９（２００５））。これらの再編成経過中、ｇｐ４１のＮ末端融合ペプチドは転位置し、そしてターゲット細胞膜内に挿入される。こうして融合ペプチドが挿入されて、そして膜貫通アンカーがなおウイルス膜中にある、ｇｐ４１外部ドメインの提唱される伸長したコンホメーションは、「プレヘアピン中間体」と称されてきた（Ｃｈａｎら，  Ｃｅｌｌ  ９３：６８１−６８４（１９９８））。これは、最初に認可された融合阻害抗ウイルス薬であるＴ−２０／エンフビルチド（Ｋｉｌｂｙら，  Ｎ  Ｅｎｇ  Ｊ  Ｍｅｄ．  ３４８：２２２８−２２３８（２００３））を含む多様な融合阻害剤のターゲットであり、そして中間体の特性は、これらの阻害剤の特性からまたは短いｇｐ４１断片による模倣から推測されてきている（Ｅｃｋｅｒｔら，  Ｃｅｌｌ  ９９：１０３−１１５（１９９９））。続く、中間体からｇｐ４１の融合後状態への再編成は、３つの鎖各々のヘアピン様コンホメーションへの逆フォールディングを伴い、２つの逆平行αらせんがジスルフィド含有ループによって連結される。このプロセスは、融合ペプチドおよび膜貫通アンカーを、そしてしたがって２つの膜を、再フォールディングされたタンパク質の同じ端に一緒に近づける。
【０００５】
提示される疑問には、この一連の事象において、中和抗体介入がどこで起こるのか、そしてこうした抗体いずれかが狭い範囲の単離体以上のものを中和可能であるのかが含まれる。これらの疑問に答えるための最初の工程は、定義されるそして均質な抗原特性を持つＨＩＶエンベロープ糖タンパク質の生化学的に均質な型の調製であり、これには、ｇｐ４１外部ドメインの主要な状態各々：融合前、プレヘアピン中間体、および融合後コンホメーションが含まれる。本明細書に開示するのは、適切な状態の三量体ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質の安定で均質な調製である。本発明は、少なくとも部分的に、ＭＰＥＲ抗体２Ｆ５および４Ｅ１０のエピトープが、プレヘアピン中間体を模倣するよう設計されたエンベロープ・タンパク質型上でのみ曝露されていることを立証する研究から生じる。これらの結果は、２Ｆ５および４Ｅ１０様抗体反応が稀であることを説明するのに役立ち、そしてこうした反応を誘発するのに使用可能な免疫原設計に関する見識を提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｗｅｉら，  Ｎａｔｕｒｅ  ４２２：３０７−３１２（２００３）
【非特許文献２】Ｂｕｒｔｏｎら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：１０２４−１０２７（１９９４）
【非特許文献３】Ｔｒｋｏｌａら，  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  ７０．  １１００−１１０８（１９９６）
【非特許文献４】Ｃａｒｄｏｓｏら，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２２：１６３−１７３（２００５）
【非特許文献５】Ｏｆｅｋら，  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  ７８：１０７２４−１０７３７（２００４）
【非特許文献６】Ｈａｒｒｉｓｏｎ，  Ａｄｖ  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．  ６４：２３１−２５９（２００５）
【非特許文献７】Ｃｈａｎら，  Ｃｅｌｌ  ９３：６８１−６８４（１９９８）
【非特許文献８】Ｋｉｌｂｙら，  Ｎ  Ｅｎｇ  Ｊ  Ｍｅｄ．  ３４８：２２２８−２２３８（２００３）
【非特許文献９】Ｅｃｋｅｒｔら，  Ｃｅｌｌ  ９９：１０３−１１５（１９９９）
【発明の概要】
【０００７】
一般的に、本発明は、抗ＨＩＶ−１抗体を誘導する際に使用するのに適した配合物に関する。より具体的には、本発明は、リポソームに連結されたＨＩＶ−１エンベロープｇｐ４１のプレヘアピン中間体型を含む配合物に関する。本発明はまた、こうした配合物を用いて、広域反応性中和抗ＨＩＶ−１抗体を誘導する方法にも関する。
【０００８】
本発明の目的および利点は、以下の説明から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ＨＩＶ−１  ｇｐ４１のプレヘアピン中間体構築物（ｇｐ４１中間体、Ｆｒｅｙら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  １０５：３７３９−３７４４（２００８））。ＨＩＶ−１  Ｅｎｖタンパク質のセグメントは、以下のように設計される：  ＨＲ１−７つ組反復１、ＨＲ２−７つ組反復２、Ｃ−Ｃループ−ジスルフィド結合を含む免疫優性ループ、ＭＰＥＲ−膜近位外部領域、Ｈｉｓ６−６ヒスチジンタグ、ｆｄ−フォルドン（ｆｏｌｄｏｎ）三量体化タグ、ＧＣＮ４−ロイシンジッパー三量体化ドメイン。
【図２】リポソームとともに配合されたＴＬＲアゴニストの構造。免疫原設計の模式図は、アジュバントとしてＴＬＲアゴニストを含有するペプチド−リポソームを示す；ＴＬＲ４（リピドＡ）；ＴＬＲ９（ｏＣｐＧ）およびＴＬＲ７（Ｒ８４８）。
【図３】アジュバントを含むおよび含まない合成リポソームへのｇｐ４１中間体タンパク質のコンジュゲート化。ｃ末端にヒスチジン残基の短い配列（Ｈｉｓ６）を含むＨＩＶ−１  ｇｐ４１中間体を、脂質分子（ＤＯＧＳ、１，２ジオレオイル−ｓｎ−グリセロール−３−スクシニル−ＮＴＡ−Ｎｉ）に共有結合したニッケルキレート基（Ｎ”，Ｎ”−ビス［カルボキシメチル］−Ｌ−リジン；ニトリロ酢酸、ＮＴＡ）を含有する合成リポソーム上に固定した。下部の図は、２つの異なるＴＬＲリガンドを含むｇｐ４１中間体リポソームの設計例である。
【図４】図４Ａ〜４Ｃ。ＴＬＲアジュバントにコンジュゲート化されたＭＰＥＲペプチド−リポソームと２Ｆ５  ｍＡｂの相互作用。図４Ａは、リピドＡ（２００μｇ用量当量）を含むｇｐ４１  ＭＰＥＲリポソーム構築物への２Ｆ５  ｍａｂの強い結合を示す。図４Ｂは、ｏＣｐＧ（５０μｇ用量当量）コンジュゲート化ｇｐ４１  ＭＰＥＲリポソームへの２Ｆ５  ｍＡｂの結合を示す。図４Ｃは、Ｒ８４８コンジュゲート化ｇｐ４１  ＭＰＥＲ含有リポソームに対する２Ｆ５  ｍＡｂの結合を示す。ＴＬＲアジュバントのみを含む対照リポソームに比較して、ｇｐ４１  ＭＰＥＲ−アジュバント・リポソーム構築物各々に対する、強い２Ｆ５  ｍＡｂ結合が観察された。ＭＰＥＲ二重エピトープ（ＭＰＥＲ６５６−ＮＥＱＥＬＬＥＬＤＫＷＡＳＬＷＮＷＦＮＩＴＮＷＬＷＹＩＫ）構築物には、２Ｆ５および４Ｅ１  ｍＡｂ両方の結合エピトープが含まれる。
【図５】２Ｆ５（Ｏｆｅｋら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ７８：１０７２４（２００４））および４Ｅ１０（Ｃａｒｄｏｓｏら，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２２：１６３−１７３（２００５））の結晶構造、ならびに脂質およびＨＩＶ−１ウイルス膜への結合を排除するためのＣＤＲ  Ｈ３ループ中の突然変異設計。
【図６】図６Ａおよび６Ｂ。４Ｅ１０（図６Ａ）および２Ｆ５（図６Ｂ）ＣＤＲ  Ｈ３ループの疎水性残基を置換すると、脂質結合が妨害され、そして両ｍＡｂがＨＩＶ−１を中和する能力が抑止される。
【図７】複数のＴＬＲリガンドを持つＭＰＥＲ  ｇｐ４１プレヘアピン中間体−リポソームの設計。ＴＬＲリガンドの２つの組み合わせを示し、一方の構築物は、ＴＬＲ４＋ＴＬＲ９を含み、そして第二のものはＴＬＲ９＋ＴＬＲ７／８を含む。これらの構築物は、二重ＴＬＲ誘発を通じて、Ｂ細胞反応において相乗作用を提供する潜在能力を有する。
【図８】ｇｐ４１中間体およびＴＬＲリガンドを含むリポソーム内へのインターフェロン・アルファ（ＩＦＮα）の被包。可溶性ＩＦＮαが被包されたリポソームを構築するために、図５に示すＴＬＲリガンドの組み合わせのいずれを用いてもよい。
【図９】ｇｐ４１中間体リポソームにコンジュゲート化されたＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）の設計。リポソーム内に被包された可溶性ＣＤ４０リガンド（上部パネル）または膜結合型ＣＤ４０Ｌのいずれを合成リポソーム内に取り込んでもよい。
【図１０】固定されたＮｉ−ＮＴＡリポソーム上のＨｉｓタグ化ｇｐ４１中間体の捕捉。
【図１１】図１１Ａおよび１１Ｂ。リポソームに係留されたｇｐ４１中間体に対するＭＰＥＲ中和ｍＡｂ  ２Ｆ５および４Ｅ１０の安定結合。
【図１２Ａ】寛容機構による広域中和抗体制御の仮説の状態。
【図１２Ｂ】寛容機構による広域中和抗体制御の仮説の状態。
【図１２Ｃ】寛容機構による広域中和抗体制御の仮説の状態。
【図１２Ｄ】寛容機構による広域中和抗体制御の仮説の状態。
【図１２Ｅ】寛容機構による広域中和抗体制御の仮説の状態。
【図１２Ｆ】寛容機構による広域中和抗体制御の仮説の状態。
【図１２Ｇ】寛容機構による広域中和抗体制御の仮説の状態。
【図１２Ｈ】寛容機構による広域中和抗体制御の仮説の状態。
【図１２Ｉ】寛容機構による広域中和抗体制御の仮説の状態。
【図１２Ｊ】寛容機構による広域中和抗体制御の仮説の状態。
【図１２Ｋ】寛容機構による広域中和抗体制御の仮説の状態。
【図１２Ｌ】寛容機構による広域中和抗体制御の仮説の状態。
【図１２Ｍ】寛容機構による広域中和抗体制御の仮説の状態。
【図１２Ｎ】寛容機構による広域中和抗体制御の仮説の状態。
【図１２Ｏ】寛容機構による広域中和抗体制御の仮説の状態。
【図１２Ｐ】寛容機構による広域中和抗体制御の仮説の状態。
【図１２Ｑ】寛容機構による広域中和抗体制御の仮説の状態。
【図１２Ｒ】寛容機構による広域中和抗体制御の仮説の状態。
【図１２Ｓ】寛容機構による広域中和抗体制御の仮説の状態。
【図１２Ｔ】寛容機構による広域中和抗体制御の仮説の状態。
【図１２Ｕ】寛容機構による広域中和抗体制御の仮説の状態。
【図１２Ｖ】寛容機構による広域中和抗体制御の仮説の状態。
【図１２Ｗ】寛容機構による広域中和抗体制御の仮説の状態。
【図１２Ｘ】寛容機構による広域中和抗体制御の仮説の状態。
【図１２Ｙ】寛容機構による広域中和抗体制御の仮説の状態。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、ＨＩＶ−１エンベロープｇｐ４１のプレヘアピン中間体型を提示する、リポソームに基づくアジュバント・コンジュゲートに、そして該コンジュゲートを用いて、被験体（例えばヒト被験体）において、中和抗ＨＩＶ−１抗体を誘導する方法に関する。適切な中和抗原には、ｇｐ４１ヘアピン中間体構築物の形のｇｐ４１  ＭＰＥＲエピトープ・ペプチド（またはその変異体（例えばｇｐ４１ヘアピン中間体のＬ６６９Ｓ変異体−米国仮出願第６１／１６６，６２５号を参照されたい））が含まれる。（Ｓｈｅｎら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８３：３６１７−２５（２００９））。
【００１１】
本発明で使用するのに適したリポソームには、限定されるわけではないが、ＰＯＰＣ、ＰＯＰＥ、ＤＭＰＡ（またはスフィンゴミエリン（ＳＭ））、リソホスホリルコリン、ホスファチジルセリン、およびコレステロール（Ｃｈ）を含むものが含まれる。最適比を当業者が決定することも可能であるが、例には、４５：２５：２０：１０の比のＰＯＰＣ：ＰＯＰＥ（またはＰＯＰＳ）：ＳＭ：Ｃｈ、あるいはＰＯＰＣ：ＰＯＰＥ（またはＰＯＰＳ）：ＤＭＰＡ：Ｃｈが含まれる。使用可能なリポソームの別の配合物には、９：７．５：１のモル比で配合されたＤＭＰＣ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）（またはリソホスホリルコリン）、コレステロール（Ｃｈ）およびＤＭＰＧ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）が含まれる（Ｗａｓｓｅｆら，  ＩｍｍｕｎｏＭｅｔｈｏｄｓ  ４：２１７−２２２（１９９４）；  Ａｌｖｉｎｇら，  Ｇ．  Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ（監修），  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  第２版，  ｖｏｌ．  Ｉｌｌ  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  ＦＬ（１９９３）；  Ｒｉｃｈａｒｄｓら，  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ６６（６）：２８５９０２８６５（１９９８））。上記脂質組成物をリピドＡと複合体形成させて、そして免疫原として用いて、リン脂質に対する抗体反応を誘導してもよい（Ｓｃｈｕｓｔｅｒら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １２２：９００−９０５（１９７９））。好ましい配合物は、Ｓｃｈｕｓｔｅｒら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １２２：９００−９０５（１９７９）にしたがって、リピドＡと複合体形成させた、６０：３０：１０の比のＰＯＰＣ：ＰＯＰＳ：Ｃｈを含む。
【００１２】
本発明にしたがって、免疫反応増進性ＴＬＲリガンド、例えばモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ−Ａ、ＴＬＲ４リガンド）、オリゴＣｐＧ（ＴＬＲ  ９リガンド）およびＲ−８４８（ＴＬＲ  ７／８リガンド）を、個々に、または組み合わせて、上述のリポソーム・コンジュゲート内に配合してもよい。ＴＬＲアゴニストの好ましい組み合わせは、ｏＣｐＧ（ＴＬＲ９）（Ｈｅｍｎｉら，  Ｎａｔｕｒｅ  ４０８：７４０−７４５（２００４））およびＲ８４８（ＴＬＲ７／８）（Ｈｅｍｎｉら，  Ｎａｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３：１９６−２００（２００２））を含む。
【００１３】
本発明の構築物のさらなる設計には、サイトカイン、インターフェロン（ＩＦＮ）−αが被包され、そして被包されたかまたは膜結合性のＣＤ４０リガンドを含むＭＰＥＲプレヘアピン中間体−リポソームが含まれる。２つの広域中和ｇｐ４１  ＭＰＥＲ抗体（２Ｆ５、４Ｅ１０）は、高いアフィニティでｇｐ４１プレヘアピン中間体構築物に結合する（Ｆｒｅｙら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  １０５：３７３９−３７４４（２００８））。これらの構築物を用いて、Ｂ細胞寛容を調節し、広域反応性中和抗体を作製可能な特定のＢ細胞集団に対してリポソームを向け、そして免疫原性が劣ったＨＩＶ−１  ｇｐ４１  ＭＰＥＲエピトープに対する抗体反応を増進することも可能である。
【００１４】
自己反応性Ｂ細胞は、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）およびＴＬＲの二重会合に依存する機構を通じて、ＴＬＲリガンドによって活性化可能である（Ｌｅａｄｂｅｔｔｅｒら，  Ｎａｔｕｒｅ  ４１６：６０３（２００２）；  Ｍａｒｓｈａｋ−Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎら，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２５：４１９−４１（２００７）、Ｈｅｒｌａｎｄｓら，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２９：２４９−２６０（２００８）、Ｓｃｈｌｏｍｃｈｉｋ，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２８：１８−２８（２００８））。本発明の好ましい免疫原設計において、可溶性ＩＦＮ−αは、ＭＰＥＲプレヘアピン中間体−リポソーム構築物内に被包される。ＩＦＮ−αは、ＢＣＲ活性化閾値を低下させることによって、自己反応性Ｂ細胞に対する選択性を調節し、そして緩和すると報告されてきている（Ｕｃｃｅｌｌｉｎｉら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １８１：５８７５−５８８４（２００８））。免疫原設計は、膜結合性ＭＰＥＲエピトープへの結合およびＨＩＶ−１の中和の両方に、ｇｐ４１  ＭＰＥＲ抗体の脂質反応性が必要であるという観察から生じる。
【００１５】
リポソームがターゲティング可能なＢ細胞サブセットには、脂質およびＭＰＥＲプレヘアピン中間体の両方と反応する多重反応性抗体を作製可能であるいかなるＢ細胞サブセットも含まれる。これらのＢ細胞サブセットには、限定されるわけではないが、辺縁帯ＩｇＭ＋  ＣＤ２７＋  Ｂ細胞サブセット（Ｗｅｉｌｌら，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２７：２６７−８５（２００９）、Ｌｉら，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ  １９５：１８１−１８８（２００２））、ヒトＢ細胞の移行性集団（Ｓｉｍｓら，  Ｂｌｏｏｄ  １０５：４３９０−４３９８（２００５））、およびマウス免疫グロブリン（Ｉｇ）軽鎖ラムダＸのヒト同等物を発現するＢ細胞のヒト同等物（Ｌｉら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  １０３：１１２６４−１１２６９（２００６）、Ｗｉｔｓｃｈら，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  ２０３：１７６１−１７７２（２００６））が含まれる。これらのＢ細胞サブセットはすべて、多重反応性抗体を作製する能力を有し、そしてしたがって、脂質およびＨＩＶ−１  ｇｐ４１プレヘアピン中間体の両方と反応する特性を有する抗体を作製する能力を有する。リポソームがその内部に脂質およびｇｐ４１プレヘアピン中間体型の両方を有する特性を有する結果、これらの免疫原は関心対象のＢ細胞を選択的にターゲティングするはずである。これらのリポソームを用いて、Ｂ細胞の寛容を一過性に破壊するか、または稀なＢ細胞サブセットをターゲティングすることも可能であるため、以下に記載されるものなどの脱グリコシル化エンベロープ調製物などの他のＨＩＶ−１エンベロープ免疫原を、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ  ７／８アゴニストおよびＩＦＮαを含有するリポソーム中で配合してもよいことがわかる。
【００１６】
脱グリコシル化ＪＲＦＬ  ｇｐ１４０  Ｅｎｖタンパク質およびＣＤ４結合部位突然変異体ｇｐ１４０（ＪＲＦＬ  ＡＰＡ）が以前の出願に記載されてきている（例えばＷＯ２００８／０３３５００を参照されたい）。膜貫通ドメインを取り込むことによって、脱グリコシル化ｅｎｖおよび免疫抑制性でないようにＣＤ４に結合しないよう突然変異させたＥｎｖを、リポソーム中に係留してもよく、そして界面活性剤中で可溶化した後、合成リポソーム内に再構成してもよい。あるいは、Ｅｎｖ  ｇｐ１４０のＨｉｓタグ化（ｃ末端）型を、ＨＩＶ−１のｇｐ４１中間体型（ｇｐ４１中間体）に関して記載されるように、リポソーム内に係留してもよい。
【００１７】
多重反応性抗体を作製可能な多くのＢ細胞サブセットが、哺乳動物ＤＮＡにも結合することを考慮すると、リポソームへのＤＮＡの添加を用いて、免疫原を反応性Ｂ細胞にターゲティングすることも可能である。
【００１８】
本発明のリポソーム含有配合物を、例えば筋内、静脈内、腹腔内または皮下注射によって投与してもよい。さらに、配合物を鼻内経路によって、あるいは座薬様ビヒクルとして直腸内または膣に投与してもよい。一般的に、リポソームを生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．０などの水溶液中に懸濁する。最適投薬措置は、当業者によって容易に決定可能である。
【００１９】
本発明の特定の側面が、以下の限定しない実施例に、より詳細に記載されうる。公開ＰＣＴ出願第ＷＯ  ２００６／１１０８３１号および第ＷＯ  ２００８／１２７６５１号、米国公開出願第２００８／００３１８９０号および第２００８／００５７０７５号、米国仮出願第６０／９６０，４１３号、ならびに米国出願第１１／９１８，２１９号もまた参照されたい（また、２００９年４月３日出願の米国仮出願第６１／１６６，６２５号および“Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｄｅｌ”と題される関連出願（代理人整理番号０１５７９−１４３１）もまた参照されたい）。
【実施例】
【００２０】
実施例１
ｇｐ４１  ＭＰＥＲペプチド−ｇｐ４１プレヘアピン中間体コンジュゲートの説明：
図１は、合成リポソームにコンジュゲート化可能なＨＩＶ−１  ｇｐ４１  ＭＰＥＲのプレヘアピン中間体型を示す（Ｆｒｅｙら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  １０５：３７３９−３７４４（２００８））。さらなるコンホメーションの生化学的に均質な型を産生するため、伸長したプレヘアピン中間体コンホメーションのｇｐ４１を捕捉するよう設計された２つの構築物を作製した。図１に示すように、ｇｐ４１中間体は、以下の配列を有する：（ＨＲ２）−リンカー−［ＨＲ１−ＣＣループ−ＨＲ２−ＭＰＥＲ］−（三量体化タグ）、ここで、ＨＲ１およびＨＲ２は、ｇｐ４１中の第一および第二の「７つ組反復」（ヘアピンの融合後三量体において、らせんを形成するセグメント）であり、そして角括弧中の配列は、融合ペプチドを除いて、本質的に完全ｇｐ４１外部ドメインである。「リンカー」は、セリンおよびグリシンの短く柔軟なコネクターである。ｇｐ４１中間体鎖が三量体化する際、Ｎ末端ＨＲ２セグメントは、ＨＲ１セグメントと６らせん束を形成する；三量体化タグによって拘束されるＣ末端ＨＲ２セグメントは、６らせん束を形成できない。この構築物のコンホメーションを、Ｔ−２０などのＨＲ２ペプチドによって捕捉されたプレヘアピン中間体として描写することも可能である。それぞれ、フォルドンおよび三量体ＧＣＮ４とともに、２つの単離体：９２ＵＧ０３７．８およびＨＸＢ２由来の配列を用いることによって、ｇｐ４１中間体が発現された。どちらの場合でも、タンパク質を大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）中で発現させて、そしてｉｎ  ｖｉｔｒｏで再フォールディングさせてもよい。対照によって、細菌で発現されたタンパク質の再フォールディングには、そして昆虫細胞から可溶性の分泌タンパク質を得るには、Ｎ末端ＨＲ２セグメントが必要であることが示された（データ未提示）。ＳＩＶｍａｃ３２Ｈのｇｐ４１配列および三量体タグとして大腸菌アスパラギン酸トランスカルバモイラーゼの触媒サブユニットを含む類似の構築物（Ｆｒｅｙら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  １０５：３７３９−３７４４（２００８））もまた、昆虫細胞から分泌タンパク質として得ることが可能であり（データ未提示）、これによって、全体の設計が頑強であり、そしてＣ末端三量体化要素の選択からは独立であることが示された（Ｆｒｅｙら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  １０５：３７３９−３７４４（２００８）、米国仮出願第６１／０３２，７３２号）。
【００２１】
精製９２ＵＧ−ｇｐ４１中間体は単分散三量体であり、複数周期のゲルろ過クロマトグラフィー後、安定である。ＣＤスペクトルによって、二次構造混合物であることが示唆される。ネガティブ染色電子顕微鏡は、長さ１５０オングストロームおよび幅≒４５オングストロームのロッド様粒子を示す。Ｎ末端６らせん束およびＣ末端フォルドンの予期される長さは、それぞれ、７５および２８オングストロームである。≒１００残基の介在セグメント（Ｃ−Ｃループ、ＨＲ２、およびＭＰＥＲ）は、比較的コンパクトな折り目を有し、軸方向距離がわずか４５〜５０オングストロームに渡るものでなければならない（Ｆｒｅｙら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  １０５：３７３９−３７４４（２００８））。
【００２２】
ｇｐ４１  ＭＰＥＲプレヘアピン中間体−アジュバント・コンジュゲートの説明：
図２に示すようなＴｏｌｌ様受容体リガンドを、ｇｐ４１  ＭＰＥＲペプチド免疫原またはｇｐ４１中間体タンパク質とともに、リポソーム型で配合した（図１および図３（Ｆｒｅｙら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  １０５：３７３９−３７４４（２００８）））。図２中の構造は、例のみであり、そしてＴＬＲアゴニストの他の型（Ｔａｋｅｄａら，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２１：３３５−３７６（２００３））もまた、類似のリポソーム内に取り込み可能である。本構築物で使用するのが好ましいＴＬＲアゴニストの組み合わせは、ｏＣｐＧ（ＴＬＲ９；  Ｈｅｍｎｉら，  ２００４，  Ｎａｔｕｒｅ  ４０８：７４０−７４５）およびＲ８４８（ＴＬＲ９；  Ｈｅｍｎｉら，  Ｎａｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２００２）である。
【００２３】
リピドＡおよびＲ−８４８含有ＭＰＥＲペプチド・リポソームの構築には、膜係留アミノ酸配列を有するＭＰＥＲペプチドおよび合成脂質、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸（ＤＭＰＡ）およびコレステロールを、それぞれ、０．２１６、４５．００、２５．００、２０．００および１．３３のモル分率で同時可溶化する方法を利用した（Ａｌａｍら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７８：４４２４−４４３５（２００７））。適切な量のＭＰＥＲペプチドをクロロホルム−メタノール混合物（７：３  ｖ／ｖ）中に溶解し、リピドＡをクロロホルム中に溶解するかまたはＲ−８４８をメタノール中に溶解し、適切な量のリン脂質のクロロホルムストックを窒素流中で乾燥させ、その後、一晩真空乾燥させた。押出し技術を用いて、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ  ７．４）中で、乾燥したペプチド−脂質フィルムから、リポソームを作製した。
【００２４】
オリゴ−ＣｐＧ複合体化ＭＰＥＲペプチド・リポソームの構築には、ＰＯＰＣの代わりに、陽イオン性脂質、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＰＯＥＰＣ）を用いた。ペプチド免疫原を含有する陽イオン性リポソームを、望ましい用量に適した量のｏＣｐＧストック溶液（１ｍｇ／ｍｌ）と混合することによって、ｏＣｐＧのコンジュゲート化を行った。
【００２５】
２Ｆ５  ｍＡｂの、ＭＰＥＲ  ２Ｆ５ペプチド・エピトープ−リポソーム構築物中のそのエピトープに対する結合に関する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイによって、ＴＬＲアジュバントの取り込みまたはコンジュゲート化が、リポソーム中のｇｐ４１ペプチドに対するＨＩＶ中和抗体２Ｆ５の結合に影響を及ぼさないことが明らかになった。図４に記載するペプチド・リポソーム構築物中で、両方のｍＡｂ、２Ｆ５および４Ｅ１０の強い結合が観察された。
【００２６】
実施例２
自己反応性Ｂ細胞は、ＢＣＲおよびＴＬＲの二重会合に依存する機構を通じて、ＴＬＲリガンドによって活性化可能である（Ｌｅａｄｂｅｔｔｅｒら，  Ｎａｔｕｒｅ  ４１６：６０３（２００２）；  Ｍａｒｓｈａｋ−Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎら，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２５：４１９−４１（２００７）、Ｈｅｒｌａｎｄｓら，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２９：２４９−２６０（２００８）、Ｓｃｈｌｏｍｃｈｉｋ，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２８：１８−２８（２００８））。この免疫原設計において、可溶性ＩＦＮ−αは、ＭＰＥＲ６５６またはＭＰＥＲ６５６−Ｌ６６９Ｓペプチドいずれかにコンジュゲート化されたリポソーム内に被包されている。ＩＦＮ−αは、ＢＣＲ活性化閾値を低下させることによって、自己反応性Ｂ細胞に対する選択性を調節し、そして緩和すると報告されてきている（Ｕｃｃｅｌｌｉｎｉら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １８１：５８７５（２００８））。これらの免疫原の設計はまた、膜結合性ＭＰＥＲエピトープへの結合およびＨＩＶ−１の中和の両方に、ｇｐ４１  ＭＰＥＲ抗体の脂質反応性が必要であるという観察にも基づく。
【００２７】
ＭＰＥＲ中和ｍＡｂ、４Ｅ１０および２Ｆ５の長いＣＤＲ  Ｈ３ループは、ビリオン膜脂質と相互作用すると仮定される疎水性面を有する（Ｏｆｅｋら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７８：１０７２４（２００４）；  Ｃａｒｄｏｓｏら，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２２：１６３−１７３（２００５））。４Ｅ１０（ｓｃＦｖ）および２Ｆ５（ＩｇＧ）のＣＤＲＨ３突然変異体が構築されてきており（図５）、そして中和ＭＰＥＲ  ｍＡｂの結合が経時的に起こり、そしてｇｐ４１の融合前中間体状態への結合前に、ウイルス膜脂質へのｍＡｂの結合によって開始されることが見出されてきている。４Ｅ１０  ｓｃＦｖは、名目（ｎｏｍｉｎａｌ）エピトープ・ペプチドおよび三量体ｇｐ４１融合中間体タンパク質の両方に強く結合するが、ＨＩＶ−１およびＳＩＶビリオンの両方に弱く結合し、そしてしたがって、４Ｅ１０がウイルス膜脂質に結合するが、ｇｐ４１の融合前状態には結合しないことが示される。４Ｅ１０のＣＤＲ  Ｈ３ループの疎水性面上の位でのアラニン置換（Ｗ１００ａ／Ｗ１００ｂ／Ｌ１００ｃＡ）は、ｇｐ４１エピトープへの同様の結合を示したが、同じ置換は、４Ｅ１０がＨＩＶ−１ウイルス膜に結合する能力を妨害した（図６）。ｇｐ４１中間体タンパク質に結合するが、ＨＩＶ−１ウイルス膜に結合しない、４Ｅ１０  ＣＤＲ  Ｈ３突然変異体は、ＨＩＶ−１中和に失敗した。同様に、ＨＩＶ−１ビリオンへの結合が妨害されるが、ｇｐ４１エピトープ・ペプチドへの結合が妨害されていない、２Ｆ５  ＣＤＲ  Ｈ３突然変異体は、ＨＩＶ−１中和に失敗した（図６）。ｇｐ４１融合中間体タンパク質による４Ｅ１０のＨＩＶ−１中和活性の遮断によって、４Ｅ１０がウイルス融合前ｇｐ４１に結合しないことがさらに示唆された。これらの結果によって、中和ＭＰＥＲ  ｍＡｂの結合が経時的に起こり、そしてｇｐ４１の融合前中間体状態への結合前に、ウイルス膜脂質へのｍＡｂの結合によって開始されるというモデルが裏付けられる。この結果の重要な暗示は、ＨＩＶ−１膜が、４Ｅ１０および２Ｆ５による結合および中和の、さらなる構造構成要素を構成することである。したがって、免疫原が４Ｅ１０および２Ｆ５様抗体反応を誘導するには、脂質構成要素が必要である可能性もある。
【００２８】
したがって、この戦略は、Ｂ細胞寛容を調節し、免疫原を反応性Ｂ細胞サブセットにターゲティングし、そしてリン脂質およびｇｐ４１  ＭＰＥＲエピトープに結合する多重反応性Ｂ細胞の誘導を可能にする潜在能力を有する。ＴＬＲリガンドと組み合わせて用いた際、リポソーム中のＩＦＮ−αの送達は、自己反応性プール由来の、そしてｇｐ４１  ＭＰＥＲエピトープに対する望ましい特異性を持つＢ細胞のＴＬＲ依存性活性化を可能にする潜在能力を有する。
【００２９】
構築物の説明：
ＨＩＶ−１  ｇｐ４１  ＭＰＥＲ  ｇｐ４１中間体構築物（図１）を、上に概略し、そして先に記載されるように、合成リポソームにコンジュゲート化してもよい。超音波処理したＭＰＥＲ  ｇｐ４１中間体構築物−リポソーム（図７および８）の各々を調製し、そして次いで可溶性ＩＦＮαタンパク質と混合し、そして次いで、乾燥させ、そして再水和させて、サイトカインを被包してもよい。短時間ボルテックスした後、被包したＩＦＮαとともに再水和させたリポソームを３０分間超遠心することによって、収集してもよい。第一の設計において、リポソームをｏＣｐＧ（ＴＬＲ９）、ＭＰＬ−Ａ（ＴＬＲ４）またはＲ８４８（ＴＬＲ７／９）のいずれかにコンジュゲート化する（図２および３）。これらのアジュバント化リポソーム構築物各々を、図３に示すようなｇｐ４１プレヘアピン中間体の形を用いて調製することも可能である。第二の設計を図７および８に示し、そしてこれには、複数のＴＬＲリガンドが含まれ、ＴＬＲ９＋ＴＬＲ４およびＴＬＲ９＋ＴＬＲ  ７／８が同じリポソーム内に取り込まれる。これらの構築物の設計は、ＴＬＲ誘発において相乗作用を提供し、そして多重反応性Ｂ細胞を活性化する際に、ＴＬＲリガンドの強度を潜在的に増進することも可能である。さらに、設計される構築物は、図９に示すように、可溶性ＣＤ４０Ｌまたは膜結合ＣＤ４０Ｌいずれかがｇｐ４１中間体リポソームとともに取り込まれるように設計されている。
【００３０】
図４に記載するように、２Ｆ５および４Ｅ１０  ｍＡｂ結合のＳＰＲ分析によって、アジュバント化リポソーム構築物上のＭＰＥＲエピトープ提示の評価を行ってもよい。
実施例３
実験詳細
先に記載される方法（Ａｌａｍら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７８：４４２４−４４３５（２００７））を用いて、それぞれ４５、２５、５および２５のモル分率の合成脂質ＰＯＰＣ、ＰＯＰＥ、ＤＯＧＳ（１，２ジオレオイル−ｓｎ−グリセロール−３−スクシニル−ＮＴＡ−Ｎｉ）から、Ｎｉ−ＮＴＡ（Ｎ”，Ｎ”−ビス［カルボキシメチル］−Ｌ−リジン；ニトリロ酢酸、ＮＴＡ）リポソームを構築した。表面プラズモン共鳴実験によって、Ｎｉ−ＮＴＡリポソームへのＨｉｓタグ化ｇｐ４１中間体のコンジュゲート化を検証した。Ｈｉｓタグ化ｇｐ４１中間体を、固定されたリポソーム表面上に注入した際、該中間体は、Ｎｉ−ＮＴＡを欠く対照リポソームに比較して、Ｎｉ−ＮＴＡリポソームに選択的に結合した。非コンジュゲート化Ｎｉ−ＮＴＡリポソームのものと、ｇｐ４１中間体所持Ｎｉ−ＮＴＡリポソームへの２Ｆ５および４Ｅ１２  ｍＡｂの結合を比較することによって、ｇｐ４１中間体にコンジュゲート化されたリポソーム中のＭＰＥＲ中和抗体エピトープの提示を調べた。２Ｆ５および４Ｅ１０  ｍＡｂはどちらも、ｇｐ４１中間体所持Ｎｉ−ＮＴＡリポソームに選択的に結合した。
【００３１】
結果
図１０は、固定されたＮｉ−ＮＴＡリポソーム上のＨｉｓタグ化ｇｐ４１中間体の捕捉を示す。ｃ末端にヒスチジン残基（Ｈｉｓ６）の短い配列を含むＨＩＶ−１  ｇｐ４１中間体（図１に記載）を、脂質分子（ＤＯＧＳ、１，２ジオレオイル−ｓｎ−グリセロール−３−スクシニル−ＮＴＡ−Ｎｉ）に共有結合したニッケルキレート基（Ｎ”，Ｎ”−ビス［カルボキシメチル］−Ｌ−リジン；ニトリロ酢酸、ＮＴＡ）を含有する合成リポソーム上に固定した。ＳＰＲ結合アッセイによって、ｇｐ４１中間体がＮｉ−ＮＴＡリポソームに特異的に捕捉されるが、Ｎｉ−ＮＴＡを欠く対照リポソームには捕捉されないことが示される。ｇｐ４１中間体の緩慢な解離は、ｇｐ４１中間体がリポソームに安定に固定されている指標となる。
【００３２】
図１１は、リポソームに係留されたｇｐ４１中間体へのＭＰＥＲ中和ｍＡｂ、２Ｆ５および４Ｅ１０の安定な結合を示す。ｇｐ４１中間体タンパク質をＮｉ−ＮＴＡリポソームに係留し、そしてその後、２Ｆ５  ｍＡｂ（Ａ、５０μｇ／ｍＬ）および４Ｅ１０  ｍＡｂ（Ｂ、５０μｇ／ｍｌ）を注入した。ｇｐ４１中間体リポソームへの２Ｆ５および４Ｅ１０  ｍＡｂ両方の強い結合が観察された。対照である、ｇｐ４１タンパク質を含まないＮｉ−ＮＴＡリポソームおよびセンサー表面（ブランクフローセル）へのバックグラウンド結合もまた示す。２Ｆ５および４Ｅ１０  ｍＡｂ両方の結合は、ＭＰＥＲペプチド−脂質コンジュゲートのものに比較した際、はるかにより緩慢な解離速度を示す。これらのデータは、ｇｐ４１中間体がＮｉ−ＮＴＡリポソームと安定な複合体を形成可能であり、そして三量体ｇｐ４１中間体上のＭＰＥＲエピトープが、２Ｆ５および４Ｅ１０  ｍＡｂへの高アフィニティ結合のために最適に提示されることを示す。これは、ＴＬＲアジュバントおよびサイトカイン（ＴＮＦ−ａ）コンジュゲート化リポソームへのｇｐ４１中間体タンパク質の係留の基盤となり、そして多重反応性および広域中和ＭＰＥＲ  ｍＡｂ誘導のための免疫原として使用される基盤となる。
【００３３】
上に引用するすべての文書および他の情報供給源は、その全体が本明細書に援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１２Ｇ】
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【図１２Ｈ】
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【図１２Ｉ】
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【図１２Ｊ】
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【図１２Ｋ】
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【図１２Ｌ】
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【図１２Ｍ】
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【図１２Ｎ】
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【図１２Ｏ】
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【図１２Ｐ】
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【図１２Ｑ】
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【図１２Ｒ】
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【図１２Ｓ】
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【図１２Ｔ】
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【図１２Ｕ】
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【図１２Ｖ】
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【図１２Ｗ】
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【図１２Ｘ】
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【図１２Ｙ】
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