(57)【要約】  ポリペプチドの保存方法であって、  （ｉ）１種または複数種の糖、ポリエチレンイミンおよび前記ポリペプチドの水溶液を提供するステップであり、ポリエチレンイミンの濃度が、ポリエチレンイミンの数平均モル質量（Ｍｎ）に基づいて２５μＭ以下であり、糖濃度、または複数種の糖が存在する場合、合計糖濃度が０．１Ｍを超えるステップ、ならびに、（ｉｉ）前記溶液を乾燥し、前記ポリペプチドを含む非結晶性固体マトリックスを形成するステップを含む、方法。
2012503637.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドの保存方法であって、
（ｉ）１種または複数種の糖、ポリエチレンイミンおよび前記ポリペプチドの水溶液を提供するステップであり、ポリエチレンイミンの濃度が、ポリエチレンイミンの数平均モル質量（Ｍｎ）に基づいて２５μＭ以下であり、糖濃度、または複数種の糖が存在する場合、合計糖濃度が０．１Ｍを超えるステップ、および、
（ｉｉ）前記溶液を乾燥し、前記ポリペプチドを含む非結晶性固体マトリックスを形成するステップ
を含む、方法。
【請求項２】
（ａ）ポリエチレンイミンのＭｎが２０ｋＤａと１０００ｋＤａとの間であり、ポリエチレンイミンの濃度が、Ｍｎに基づき０．００１ｎＭと１００ｎＭとの間である、および／または
（ｂ）ポリエチレンイミンのＭｎが１Ｄａと１００００Ｄａとの間であり、ポリエチレンイミンの濃度が、Ｍｎに基づき０．０００１μＭと１０μＭとの間である、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ポリエチレンイミンの前記濃度が、（ａ）２０μＭ以下もしくは５００ｎＭ未満および／または（ｂ）０．０２５ｎＭ以上もしくは０．１ｎＭ以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ポリエチレンイミンの前記濃度が、０．１ｎＭと５μＭとの間または０．１ｎＭと２００ｎＭとの間である請求項１に記載の方法。
【請求項５】
（ａ）糖濃度または合計糖濃度が、０．５Ｍと２Ｍとの間である、および／または
（ｂ）糖がショ糖、スタキオース、ラフィノースまたは糖アルコールである、
請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
２種以上の糖が前記水溶液中に存在する、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ショ糖が別の糖と共に存在し、ショ糖と他の糖との濃度が３：７と９：１との間のモル濃度比であり、ステップ（ｉ）におけるポリエチレンイミンの濃度が、Ｍｎに基づいて０．００２５ｎＭと５μＭとの間である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
糖がショ糖およびラフィノースである、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｉｉ）において溶液がフリーズドライされる、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
ポリペプチドが、ホルモン、成長因子、ペプチドまたはサイトカインである、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
ポリペプチドが、タキキニンペプチド、血管作動性腸管ペプチド、膵臓ポリペプチド関連ペプチド、オピオイドペプチドまたはカルシトニンペプチドである、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ポリペプチドが、抗体またはそれらの抗原結合断片である、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
抗体または抗原結合断片がモノクロナール抗体またはそれらの断片である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
抗体または抗原結合断片が、キメラ、ヒト化もしくはヒト抗体またはそれらの断片である、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
抗体または抗原結合断片が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４またはそれらの抗原結合断片である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
抗体または抗原結合断片が、
（ａ）腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ２０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ３、ＲＳＶＦタンパク質、ＨＥＲ２／ｎｅｕ（ｅｒｂＢ２）受容体、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、抗ＴＲＡＩＬＲ２（抗腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド受容体２）、補体系タンパク質Ｃ５、α４インテグリンもしくはＩｇＥ、または
（ｂ）上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ムチン−１（ＭＵＣ１／Ｃａｎ−Ａｇ）、ＥＧＦＲ、ＣＤ２０、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＨＥＲ２、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ルイスＹもしくは前立腺特異的膜抗原（ＰＭＳＡ）と結合できる、請求項１２から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ポリペプチドが酵素である、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
酵素が、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼまたはリガーゼである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
酵素が、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、セリンプロテアーゼ、エンドペプチダーゼ、カスパーゼ、キマーゼ、キモトリプシ、エンドペプチダーゼ、グランザイム、パパイン、膵エラスターゼ、オリジン、プラスミン、レニン、スブチリシン、トロンビン、トリプシン、トリプターゼ、ウロキナーゼ、アミラーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、トランスグルタミナーゼ、細胞壁分解酵素、グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、凝固酵素、乳タンパク質加水分解物、細胞壁分解酵素、凝固酵素、リゾチーム、繊維分解酵素、フィターゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、プロテアーゼ、マンナーゼまたはグルコアミラーゼから選択される、請求項１７または１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
ポリペプチドがワクチン免疫原である、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
ワクチン免疫原が、完全長の、ウィルスまたは細菌のタンパク質、糖タンパク質もしくはリポタンパク質またはそれらの断片である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ポリペプチドの保存方法であって、
（ｉ）１種または複数種の糖、ポリエチレンイミンおよび前記ポリペプチドの水溶液を提供するステップ、および
（ｉｉ）前記溶液を乾燥し、前記ポリペプチドを含む非結晶性固体マトリックスを形成するステップ
を含む方法。    
【請求項２３】
得られた乾燥非結晶性固体マトリックスを、密閉されたバイアル、アンプルまたは注射器中の粉末の形態で提供するステップをさらに含む、請求項１から２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる、保存ポリペプチドを含む乾燥粉末。
【請求項２５】
ポリペプチド、１種または複数種の糖およびポリエチレンイミンを含む保存生成物であって、非結晶性固体の形態である保存生成物。
【請求項２６】
請求項２４に記載の乾燥粉末または請求項２５に記載の保存生成物を含有する密閉されたバイアル、アンプルまたは注射器。
【請求項２７】
ポリペプチドの保存のための、
（ａ）ショ糖、スタキオースもしくはラフィノースまたはそれらの任意の組合せ、および
（ｂ）Ｍｎに基づいて２５μＭ以下の濃度のポリエチレンイミン
を含む賦形剤の使用。
【請求項２８】
ポリエチレンイミン濃度が５μＭ以下である、請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
ワクチン免疫原の保存方法であって、
（ｉ）１種または複数種の糖、ポリエチレンイミンおよび前記ワクチン免疫原の水溶液を提供するステップであり、ポリエチレンイミンの濃度が、ポリエチレンイミンの数平均モル質量（Ｍｎ）に基づいて２５μＭ以下であり、糖濃度、または複数種の糖が存在する場合、合計糖濃度が０．１Ｍを超えるステップ、および
（ｉｉ）前記溶液を乾燥し、前記ワクチン免疫原を含む非結晶性固体マトリックスを形成するステップ
を含む、方法。
【請求項３０】
（ａ）ポリエチレンイミンのＭｎが２０ｋＤａと１０００ｋＤａとの間であり、ポリエチレンイミンの濃度がＭｎに基づいて０．００１ｎＭと１００ｎＭとの間である、および／または
（ｂ）ポリエチレンイミンのＭｎが１Ｄａと１００００Ｄａとの間であり、ポリエチレンイミンの濃度がＭｎに基づいて０．０００１μＭと１０μＭとの間である、
請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ポリエチレンイミンの前記濃度が、（ａ）２０μＭ以下もしくは５００ｎＭ未満および／または（ｂ）０．０２５ｎＭ以上もしくは０．１ｎＭ以上である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
ポリエチレンイミンの前記濃度が、０．１ｎＭと５μＭとの間または０．１ｎＭと２００ｎＭとの間である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
（ａ）糖濃度または合計糖濃度が０．５Ｍと２Ｍとの間である、および／または
（ｂ）糖が、ショ糖、スタキオース、ラフィノースまたは糖アルコールである、
請求項２９から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
２種以上の糖が前記水溶液中に存在する、請求項２９から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
ショ糖が別の糖と共に存在し、ショ糖と他の糖との濃度が３：７と９：１との間のモル濃度比であり、ステップ（ｉ）におけるポリエチレンイミンの濃度が、Ｍｎに基づいて０．００２５ｎＭと５μＭとの間である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
糖がショ糖およびラフィノースである、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３７】
ステップ（ｉｉ）において溶液がフリーズドライされる、請求項２９から３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
ワクチン免疫原が、サブユニットワクチン、結合型ワクチンまたはトキソイドである、請求項２９から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
サブユニットワクチン免疫原が、ウィルス表面タンパク質またはウィルスカプシドタンパク質に由来する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
ワクチン免疫原の保存方法であって、
（ｉ）１種または複数種の糖、ポリエチレンイミンおよび前記ワクチン免疫原の水溶液を提供するステップ、および
（ｉｉ）前記溶液を乾燥し、前記ワクチン免疫原を含む非結晶性固体マトリックスを形成するステップ
を含む、方法。  
【請求項４１】
得られた乾燥非結晶性固体マトリックスを、密閉されたバイアル、アンプルまたは注射器中の粉末の形態で提供するステップをさらに含む、請求項２９から４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
請求項２９から４０のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる、保存ワクチン免疫原を含む乾燥粉末。
【請求項４３】
ワクチン免疫原、１種または複数種の糖およびポリエチレンイミンを含む保存生成物であって、非結晶性固体の形態である保存生成物。
【請求項４４】
請求項４２に記載の乾燥粉末または請求項４３に記載の保存生成物を含有する密閉されたバイアル、アンプルまたは注射器。
【請求項４５】
請求項４２に記載の保存性生物および場合によりアジュバントを含むワクチン。
【請求項４６】
ワクチン免疫原の保存のための、
（ａ）ショ糖、スタキオースもしくはラフィノースまたはそれらの任意の組合せ、および
（ｂ）Ｍｎに基づいて２５μＭ以下の濃度のポリエチレンイミン
を含む賦形剤の使用。
【請求項４７】
ポリエチレンイミン濃度が５μＭ以下である、請求項４６に記載の使用。
【請求項４８】
ワクチン免疫原を含むワクチンの調製方法であって、
（ａ）１種または複数種の糖、ポリエチレンイミンおよび前記ワクチン免疫原の水溶液を提供するステップであり、ポリエチレンイミンの濃度が、ポリエチレンイミンの数平均モル質量（Ｍｎ）に基づいて１５μＭ以下であり、糖濃度、または複数種の糖が存在する場合、合計糖濃度が０．１Ｍを超えるステップ、ならびに、
（ｂ）場合により、アジュバント、バッファー、抗生物質および／または添加物を混合物に加えるステップ、ならびに
（ｃ）前記溶液を乾燥し、前記ワクチン免疫原を含む非結晶性固体マトリックスを形成するステップ
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、熱分解および乾燥からポリペプチドを保存する方法に関する。本発明はさらに、このように保存されたポリペプチドを含む生成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
いくつかの生物分子は、単離、精製およびその後の室温における溶液中の保存が可能なように十分安定である。しかし、このことは多くの材料には可能ではなく、低温保存、安定剤の添加、フリーズドライ、真空乾燥および空気乾燥を含む技術が、確実な長期保存のために試みられた。
【０００３】
これらの技術の利用可能性にもかかわらず、いくつかの生物材料は、いまだに保存期間中の安定性が不満足なレベルを示し、一部の技術は、追加のコストおよび不便さをもたらす。例えば、冷蔵輸送および冷蔵保存は高価であり、温度管理の任意の中断により生物分子の有効性の低下をもたらし得る。さらに、発展途上世界の国において、冷蔵輸送は薬品の輸送には多くの場合利用不可能である。
【０００４】
また、フリーズドライまたは凍結乾燥のストレスは、いくつかの生物材料に大きな損傷を与え得る。生物薬品のフリーズドライは、熱感受性バイオマテリアルの溶液または懸濁液の凍結およびその後の一次または二次乾燥を含む。この技術は、真空下、氷点下温度において、溶液が融解することのない水の昇華に基づく。フリーズドライは、固体タンパク質およびワクチン医薬品の製造において、鍵となるステップを表す。凍結バイオマテリアルからの水蒸気拡散の速度は非常に遅く、したがって、この方法は時間がかかる。加えて、凍結および乾燥の双方の段階は、タンパク質のアンフォールディングまたは変性を起こし得るストレスを導入する。
【０００５】
ＷＯ９０／０５１８２は、タンパク質を乾燥による変性から保護する方法を記載している。この方法は、タンパク質の水溶液と、可溶性カチオン性高分子電解質および環状ポリーオールとを混合し、溶液から水分を除去するステップを含む。ジエチルアミノエチルデキストラン（ＤＥＡＥ−デキストラン）およびキトサンが好ましいカチオン性高分子電解質であるが、ポリエチレンイミンもまた適切であると述べられている。
【０００６】
ＷＯ−Ａ−２００６／０８５００８２は、糖、ヒストンタンパク質などの帯電材料および乾燥または熱に感受性の生物成分を含む乾燥または保存された生成物を報告している。糖は、非結晶性固体マトリックスを形成する。しかし、保存された生物成分をヒトまたは動物に投与した場合、ヒストンは免疫学的重要性を有し得る。
【０００７】
ＷＯ２００８／１１４０２１は、ウィルス粒子の保存方法を記載している。この方法は、１種または複数種の糖、ポリエチレンイミンおよびウィルス粒子の水溶液を乾燥し、ウィルス粒子を含む非結晶性固体マトリックスを形成するステップを含む。この水溶液は、ポリエチレンイミンの数平均モル質量（Ｍｎ）に基づいて１５μＭ以下の濃度のポリエチレンイミンを含有し、糖濃度、または複数種の糖が存在する場合、合計糖濃度は０．１Ｍを超える。ＷＯ２００８／１１４０２１は、本出願の優先権主張日の後に公開されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
１種または２種以上の糖およびポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含有する水溶液と混合されたポリペプチド調製品が、フリーズドライなどの乾燥において良好に保存されることが現在発見されている。比較的低濃度のＰＥＩおよび比較的高濃度の糖が用いられる。このポリペプチドは、ホルモン、成長因子、ペプチドまたはサイトカイン；抗体またはそれらの抗原結合断片、酵素、またはワクチン免疫原であってよい。本発明はさらに、サブユニットワクチン、結合型ワクチンまたはトキソイドなどのワクチン免疫原にも適用できる。
【０００９】
したがって、本発明は、ポリペプチドの保存方法であって、
（ｉ）１種または複数種の糖、ポリエチレンイミンおよび前記ポリペプチドの水溶液を提供するステップであり、ポリエチレンイミンの濃度が、ポリエチレンイミンの数平均モル質量（Ｍｎ）に基づいて２５μＭ以下であり、糖濃度、または複数種の糖が存在する場合、合計糖濃度が０．１Ｍを超えるステップ、および
（ｉｉ）この溶液を乾燥し、前記ポリペプチドを含む非結晶性固体マトリックスを形成するステップ
を含む、方法を提供する。
【００１０】
本発明は、
本発明の方法により得ることができる、保存ポリペプチドを含む乾燥粉末、
ポリペプチド、１種または複数種の糖およびポリエチレンイミンを含む保存生成物であって、非結晶性固体の形態の保存生成物、
このような乾燥粉末または保存生成物を含有する、密閉されたバイアル、アンプルまたは注射器、および
ポリペプチドの保存のための、
（ａ）ショ糖、スタキオースまたはラフィノースあるいはそれらの任意の組合せ、および
（ｂ）Ｍｎに基づいて２５μＭ以下、例えば５μＭ以下の濃度のポリエチレンイミン
を含む賦形剤の使用をさらに提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例１において得られた結果を示す図である。この結果は、最終濃度が１．０３Ｍのショ糖、０．０９Ｍのラフィノースおよび２１ｎＭのＰＥＩ（Ｍｎ６０，０００に基づく）を含む賦形剤を使用した場合、ヒトカルシトニン（ｈＣＴ）はフリーズドライおよび／または熱処理から保護されることを実証している。図１は、試料を以下：    １．カルシトニンをＰＢＳに再懸濁し、凍結    ２．カルシトニンをＰＢＳに再懸濁し、フリーズドライ    ３．カルシトニン＋糖混合物（ショ糖およびラフィノース）をフリーズドライ    ４．カルシトニン＋糖混合物（ショ糖およびラフィノース）をフリーズドライ＋加熱    ５．カルシトニン＋賦形剤（ショ糖、ラフィノースおよびＰＥＩからなる保存用混合物）をフリーズドライ（本発明）    ６．カルシトニン＋賦形剤（ショ糖、ラフィノースおよびＰＥＩからなる保存用混合物）をフリーズドライおよび加熱処理（本発明）    に供した後の、ＥＬＩＳＡにより測定した検出可能なｈＣＴの平均結果を示す。
【図２】実施例２において得られた結果を示す図である。熱処理に対してＧ−ＣＳＦを安定させる、本発明に従った保存用混合物（賦形剤）の能力を、ＥＲＫ１／２のリン酸化を刺激するＧ−ＣＳＦの能力をモニタリングすることによって評価した。ＨＬ６０細胞を、２４時間血清飢餓状態にし、その後、表示の処理により５分間刺激した（１００ｎｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦ）。全細胞抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分割し、その後、ナイロンメンブレンに転写し、これらを、抗体を用いてリン酸化ＥＲＫ１／２および全ＥＲＫ１／２に対して免疫プローブした。  パネルＡ：対照（血清飢餓＋ＰＢＳ）、ＵＴ  Ｇ−ＣＳＦ（未処理Ｇ−ＣＳＦ）およびＧ−ＣＳＦ（標準Ｇ−ＣＳＦを賦形剤と混合し、凍結）試料を凍結融解。  パネルＢ：対照（血清飢餓＋ＰＢＳ）、ＵＴ  Ｇ−ＣＳＦ（未処理Ｇ−ＣＳＦ）および賦形剤／ＨＴＧ−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦを賦形剤と混合し、加熱）試料。  パネルＣ：対照（血清飢餓＋ＰＢＳ）、ＵＴ  Ｇ−ＣＳＦ（未処理Ｇ−ＣＳＦ）およびＧ−ＣＳＦ賦形剤／ＦＤ（Ｇ−ＣＳＦを賦形剤と混合し、フリーズドライ）試料。  パネルＤ：対照（血清飢餓＋ＰＢＳ）、ＵＴ  Ｇ−ＣＳＦ（未処理Ｇ−ＣＳＦ）およびＧ−ＣＳＦ賦形剤／ＦＤ／ＨＴ（Ｇ−ＣＳＦを賦形剤と混合し、フリーズドライおよび加熱処理）試料。
【図３】実施例３の結果を表す図である。抗ヒト腫瘍壊死因子α抗体（ラットモノクロナール抗ＴＮＦα、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号：ＳＫＵ＃ＲＨＴＮＦＡ００）の残留活性を、表示の処理後にＥＬＩＳＡにおいて評価した：１．抗ｈＴＮＦαラットｍＡｂ（被検物）−未処理＋ＰＢＳ（４℃）   ２．抗ｈＴＮＦαラットｍＡｂ−フリーズドライ＋賦形剤および４℃において保存   ３．抗ｈＴＮＦαラットｍＡｂ−フリーズドライ＋賦形剤および６５℃において２４時間加熱処理   ４．抗ｈＴＮＦαラットｍＡｂ−６５℃において２４時間加熱処理＋ＰＢＳ  賦形剤は、最終濃度０．９１Ｍのショ糖、０．１２５Ｍのラフィノースおよび２５ｎＭのＰＥＩ（Ｍｎ６０，０００に基づく）を含有した。結果は、抗体のフリーズドライ前に賦形剤を含むことにより、前記抗体が、有意に高レベルな、有意に長期間の熱チャレンジに耐える得ることを示す。
【図４】最終濃度１．０９２Ｍのショ糖、０．０４９９Ｍのスタキオースおよび２７ｎＭ、２．７ｎＭおよび０．２７ｎＭのいずれかのＰＥＩ（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｐ３１４３、Ｍｎ６０，０００）を含有する賦形剤（保存用混合物）中の、凍結およびその後の一晩のフリーズドライ後の実施例４におけるルシフェラーゼの保存を示す図である。明らかに分かるように、賦形剤の存在下で乾燥させた場合、ルシフェラーゼの熱安定性が改善される。
【図５】最終濃度０．９７Ｍのショ糖、０．１３Ｍのラフィノースおよび１３μＭ、２．６μＭ、０．２６μＭ、２６ｎＭまたは２．６ｎＭのＰＥＩ（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｐ３１４３、Ｍｎ６０，０００）を含有する賦形剤（保存用混合物）中の、フリーズドライ後の実施例５におけるベータガラクトシダーゼ活性の保存を示す図である。この実施例は、賦形剤中で乾燥させた場合、ベータガラクトシダーゼの熱安定性が有意に改善されることを、明らかに実証している。
【図６】抗ヒトＴＮＦα抗体の熱安定化をもたらす賦形剤の範囲を評価する、実施例６の実験結果を示す図である。さまざまな濃度のショ糖（Ｓｕｃ）、ラフィノース（Ｒａｆ）およびＰＥＩを含有する賦形剤中の抗体試料を、フリーズドライし、その後４５℃で１週間加熱した。
【図７】実施例７においてフリーズドライ（ＦＤ）後に測定された抗ＴＮＦαの量に関する賦形剤組成物の効果を示す図である。ＨＰＬＣのピーク面積を表す。ＰＢＳ中でフリーズドライした場合、抗体は全く測定されなかった。糖単独においてフリーズドライした場合抗ＴＮＦα抗体は有意な量消失していた。抗体を、糖およびＰＥＩと共にフリーズドライした場合、非常に多量な抗ＴＮＦαが測定された。
【図８】実施例８の実験結果を表す図である。抗ＴＮＦα抗体を、１Ｍの糖（０．９Ｍのショ糖および０．１Ｍのラフィノース）および０．００２５ｎＭのＰＥＩ中でフリーズドライした。
【図９】実施例９において試験したように、液体対照試料（液体ＰＢＳ）に対する、フリーズドライされたインフルエンザの血液凝集素（ＨＡ）の熱安定性を比較する図である。ＨＡタンパク質の試料を、ＰＢＳまたは１Ｍのショ糖／１００ｍＭのラフィノース／１６．６ｎＭのＰＥＩ（Ｍｎに基づく）の賦形剤混合物中で調製した。混合物を凍結乾燥（ＦＤ）した場合、二次乾燥は、３日間のサイクルにわたって−３２℃および２０℃の間において実施した。凍結乾燥後、試料の１つを８０℃において１時間熱チャレンジした（ＦＤ  ＨＴ賦形剤）。
【図１０】実施例１０において、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と共にフリーズドライされたルシフェラーゼに関する糖およびＰＥＩの効果を示す図である。この６パートの図は、糖混合物（ｓｍ）およびＰＥＩを、単独および一緒に、フリーズドライ（ＦＤ）前後に加えた場合の、ルシフェラーゼ活性に関する効果を示す。分析前に、フリーズドライ試料を、４５℃に２週間保ち、その後室温においてさらに２週間保った。エラーバーは、平均の標準誤差を示す。
【図１１】実施例１１に報告したように、糖／ＰＥＩ賦形剤の存在下のβ−ｇａｌの凍結の効果を示す図である。フリーズドライ後、β−ｇａｌの活性は、ＰＢＳと比較してショ糖／ラフィノース賦形剤において高かった。ショ糖／ラフィノースと組み合わせた、１３．３μＭのＰＥＩの存在は、ショ糖／ラフィノース単独と比較して、酵素活性をさらに強化した。エラーバーは、平均の標準誤差を示す。
【図１２】ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の試料を、フリーズドライに供し、−２０℃のフリーザーから取り出し、それらを３７℃のインキュベーターに４時間配置し、その後フリーザーに２０時間戻すこと２、４または６回の、２、４または６回の加熱−凍結サイクルに供する、実施例１２において得られる結果を示す。結果は、すべての処理条件および保存条件に関して、ＰＢＳ単独と比べて、ショ糖、ラフィノースの存在下では、ＰＥＩと一緒またはＰＥＩが不在のいずれにおいてもＨＲＰ活性がよりよく維持されることを示す。しかし、初期フリーズドライ段階におけるＰＥＩと組み合わせた糖の存在は、ＨＲＰ活性の消失を有意に減少させる。
【図１３】実施例１３において得られた結果を表す図である。賦形剤の存在下および不在下における湿潤、乾燥およびフリーズドライのアルコールオキシダーゼの活性を示す。  Ｄ０からＤ１６：３７℃においてインキュベートした日数（乾燥およびフリーズドライの試料）；  Ｎｏ  ＭｅＯＨ：メタノール非添加（陰性対照）；  湿潤：乾燥させ、保存し試験した試料（すなわち新鮮）；  ＦＤ：フリーズドライ；  Ｄ：乾燥；  Ｇ１およびＧ２：ＷＯ９０／０５１８２の実施例１０に従った、それぞれ、賦形剤混合条件Ｇｉｂｓｏｎ１および２、ならびに  Ｓ１およびＳ２：本発明に従った、それぞれ、賦形剤混合条件Ｓｔａｂｉｌｉｔｅｃｈ１および２。
【図１４】実施例１４において、組換えヒトＧ−ＣＳＦによって誘導された、ＨＬ−６０細胞中のリン酸化ＥＲＫ１／ＥＲＫ２のレベルの評価を示す図である。Ｇ−ＣＳＦをショ糖、ラフィノースおよびＰＥＩを含有する賦形剤と混合し、その後フリーズドライ（ＦＤ）および５６℃において加熱処理（ＨＴ）した。
【図１５】さまざまな賦形剤におけるフリーズドライおよび熱チャレンジ後の、実施例１５におけるＩｇＭの回収を示す図である。エラーバーは標準誤差を表す。
【図１６】実施例１６において、組換えヒトＧ−ＣＳＦによって誘導された、ＨＬ−６０細胞中のリン酸化ＥＲＫ１／ＥＲＫ２のレベルの評価を示す図である。Ｇ−ＣＳＦをショ糖、ラフィノースおよびＰＥＩを含有する賦形剤と混合し、その後フリーズドライ（ＦＤ）および３７℃または５６℃において加熱処理（ＨＴ）した。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、活性薬剤と保存用混合物とを接触させることによる、活性薬剤の保存に関する。活性薬剤は、ホルモン、成長因子、ペプチドもしくはサイトカインなどのポリペプチド；抗体もしくはそれらの抗原結合断片；または酵素であってよい。活性薬剤は、サブユニットワクチン、結合型ワクチンまたはトキソイドなどのワクチン免疫原であってもよい。
【００１３】
保存用混合物は、ＰＥＩおよび１種、２種またはそれ以上の糖の水溶液である。低濃度のＰＥＩおよび比較的高濃度の糖を使用する。活性薬剤が存在する得られた溶液を、その後乾燥し、活性薬剤を含む非結晶性固体マトリックスを形成させる。マトリックスは、周囲温度において安定に保存される。活性薬剤を含む水溶液の投与が要求される場合、使用直前に固体マトリックスから再構成される。
【００１４】
したがって、本発明は、乾燥ステップおよび保存の間、活性薬剤の構造および機能を保存することができる。したがって、乾燥後の活性薬剤の生物活性は維持される。保存された活性薬剤は、保存期間の延長、保存および輸送の簡便さならびに流通のためのコールドチェーンの必要性の除去を可能にする熱耐性および乾燥耐性の改善を実証する。したがって、保存用混合物は、凍結保護剤（凍結損傷に対する保護）、凍結乾燥保護剤（lyoprotectant）（乾燥に対する保護）および／または熱保護剤（thermoprotectant）（４℃を超えるまたは４℃未満の温度に対する保護）のような保護を提供する。
【００１５】
ポリペプチド
いずれのポリペプチドも、本発明における使用に適している。例えばポリペプチドは、６から１４アミノ酸（例えば、オキシトシン、シクロスポリン）などの１５アミノ酸未満の低分子ペプチド、１５から５０アミノ酸の間のより分子の大きいペプチド（例えば、カルシトニン、成長ホルモン放出ホルモン１〜２９（ＧＨＲＨ））、５０および２５０アミノ酸長の間の低分子タンパク質（例えば、インスリン、ヒト成長ホルモン）、２５０アミノ酸長を超えるより大きいタンパク質または２種以上のポリペプチド鎖の複合体を含むマルチサブユニットタンパク質であってよい。ポリペプチドは、ペプチドホルモン、成長因子またはサイトカインであってもよい。ポリペプチドは、抗原結合ポリペプチド、受容体阻害剤、リガンド模倣体または受容体遮断薬であってもよい。通常、ポリペプチドは実質的に純粋な形態である。したがって、ポリペプチドは単離ポリペプチドであってよい。例えば、ポリペプチドは、組換え体作製後に単離されてもよい。
【００１６】
例えば、ポリペプチドは、成長ホルモン（ＧＨ）、プロラクチン（ＰＲＬ）、ヒト胎盤性ラクトゲン（ｈＰＬ）、ゴナドトロピン（例えば、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）ファミリーのメンバー、バソプレシンおよびオキシトシン、ナトリウム利尿ホルモン、複甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、カルシトニン、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチンならびに消化管ホルモンから選択されるホルモンであってよい。
【００１７】
ポリペプチドは、タキキニンペプチド（例えば、サブスタンスＰ、カシニン、ニューロキニンＡ、エレドイシン、ニューロキニンＢ）、血管作動性腸管ペプチド（例えば、ＶＩＰ（血管作動性腸管ペプチド；ＰＨＭ２７）、ＰＡＣＡＰ（下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド）、ペプチドＰＨＩ２７（ペプチドヒスチジンイソロイシン２７）、ＧＨＲＨ１〜２４（成長ホルモン放出ホルモン１〜２４）、グルカゴン、セクレチン）、膵臓ポリペプチド関連ペプチド（例えば、ＮＰＹ、ＰＹＹ（ペプチドＹＹ）、ＡＰＰ（トリ膵臓ポリペプチド）、ＰＰＹ（膵臓ポリペプチド）、オピオイドペプチド（例えば、プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）ペプチド、エンケファリンペンタペプチド、プロダイノルフィンペプチド、カルシトニンペプチド（例えば、カルシトニン、アミリン、ＡＧＧ０１）または別のペプチド（例えば、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ））であってよい。
【００１８】
ポリペプチドは、上皮成長因子（ＥＧＦ）ファミリー、血小板由来成長因子ファミリー（ＰＤＧＦ）、線維芽細胞成長因子ファミリー（ＦＧＦ）、形質転換成長因子βファミリー（ＴＧＦ−β）、形質転換成長因子α（ＴＧＦ−α）、エリスロポエチン（Ｅｐｏ）、インスリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）のメンバーから選択される成長因子であってよい。通常、成長因子は形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ミオスタチン（ＧＤＦ−８）、成長分化因子９（ＧＤＦ９）、酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦまたはＦＧＦ−１）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦまたはＦＧＦ−２）、上皮成長因子（ＥＧＦ）または肝細胞成長因子（ＨＧＦ）である。
【００１９】
ポリペプチドは、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、腫瘍壊死因子β（ＴＮＦβ）、インターフェロン−γ（ＩＮＦ−γ）およびコロニー刺激因子（ＣＳＦ）から選択されるサイトカインであってよい。通常、サイトカインは顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）である。
【００２０】
ポリペプチドは、因子ＶＩＩＩ、因子Ｖ、フォン−ウィルブランド因子または凝固因子ＩＩＩなどの血液凝固因子であってよい。
【００２１】
抗体
本発明に使用する抗体は、全長抗体またはそれらの抗原結合断片のいずれであってもよい。
【００２２】
全長抗体
一実施形態において、抗体は、免疫グロブリン（Ｉｇ）のモノマー、ダイマー、テトラマー、ペンタマーまたは他のオリゴマーである。個々の抗体モノマーは、４つのポリペプチド鎖（例えば、２つの同一の重鎖および２つの同一の軽鎖からなる従来の抗体）を含むことができる。または、個々の抗体モノマーは、２つのポリペプチド鎖からなる（例えば、２つの同一の重鎖からなる重鎖抗体）。
【００２３】
抗体は、任意のクラスまたはアイソタイプの抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥ）または任意のサブクラスの抗体（例えば、ＩｇＧサブクラスのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはＩｇＡサブクラスのＩｇＡ１もしくはＩｇＡ２）であり得る。通常、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４抗体などのＩｇＧである。普通、抗体はＩｇＧ１またはＩｇＧ２抗体である。
【００２４】
通常、抗体または抗原結合断片は哺乳動物起源のものである。したがって、抗体は霊長類、ヒト、げっ歯類（例えば、マウスまたはラット）、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウマまたはラクダの抗体または抗体断片であってよい。抗体または抗体断片は、サメ起源のものであってよい。
【００２５】
抗体は、モノクロナール抗体またはポリクロナール抗体であってよい。モノクロナール抗体は、抗原における単一の決定因子に向かう、実質的に均一な抗体の集団から得られる。ポリクロナール抗体の集団は、異なるエピトープに向かう抗体の混合物を含む。
【００２６】
抗原結合断片
抗原結合断片は、抗原結合能力を保有する任意の抗体断片、例えばＦａｂ、Ｆ（Ａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合ｓｃＦｖ、ディアボディ、線状抗体、ドメイン抗体または多重特異性抗体であり得る。このような断片は、１つまたは複数の抗原結合部位を含む。一実施形態において、抗原結合断片は、４種のフレームワーク領域（例えば、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）および３種の相補性決定領域（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）を含む。断片の抗原結合能を検出するために適した方法、例えば免疫アッセイおよびファージディスプレイが、本明細書に記載され、当分野において周知である。
【００２７】
抗体結合断片は、単一特異性、二重特異性または多重特異性抗体であってよい。多重特異性抗体は、少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種またはそれ以上の異なるエピトープまたは抗原に対して結合特異性を有する。二重特異性抗体は、２種の異なるエピトープまたは抗原と結合できる。例えば、二重特異性抗体は、ＶＨおよびＶＬの２対、単一の抗原またはエピトープと結合する個々のＶＨ／ＶＬ対を含むことができる。二重特異性抗体の調製方法は当分野において公知であり、例えば、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の同時発現、所望の結合特異性を有する抗体可変領域と免疫グロブリン定常領域配列との融合または抗体断片の化学結合を含む。
【００２８】
二重特異性抗体「ディアボディ」は、同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）中に軽鎖可変ドメインと連結した重鎖可変ドメインを含む。ディアボディは、短すぎて同じ鎖において２つのドメインの間をペアリングできないリンカー（例えば、ペプチドリンカー）を使用して作製でき、その結果、ドメインは、別の鎖の相補性ドメインとペアリングせざるを得ず、２つの抗原結合部位を有する二量体分子を作製する。
【００２９】
適切なｓｃＦｖ抗体断片は、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含むことができ、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖内に存在する。一般的に、ＦｖポリペプチドはＶＨおよびＶＬドメインの間のポリペプチドリンカーをさらに含み、これは、ｓｃＦｖが抗原を結合するための所望の構造を形成することを可能にする。
【００３０】
本発明の方法において使用するためのドメイン抗体は、本質的に軽鎖可変ドメイン（例えばＶＬ）または重鎖可変ドメイン（例えばＶＨ）からなり得る。重鎖可変ドメインは、従来の４種の鎖の抗体または重鎖抗体（例えばラクダＶＨＨ）に由来し得る。
【００３１】
修飾
全長抗体またはそれらの断片は、リンカーなどの他の部分と結合でき、リンカーは、２つまたはそれ以上の断片または抗体と一つに接続するために使用できる。このようなリンカーは、化学的リンカーであってよく、または断片または全長抗体との融合タンパク質の形態で存在し得る。したがって、リンカーは全長抗体または断片を一つに接続するために使用でき、同じまたは異なる結合特異性を有する。
【００３２】
さらなる実施形態において、抗体または抗原結合断片は、毒素、治療薬（例えば化学治療薬）、放射性同位元素、リポソームまたはプロドラッグ活性化酵素などのさらなる部分と連結される。さらなる部分の型は、抗体または抗原結合断片の最終用途に依存すると思われる。
【００３３】
抗体または抗原結合断片は、１種もしくは複数種の低分子毒素（例えば、カリケアマイシン、メイタンシン、トリコテセンおよびＣＣ１０６５）または酵素的に活性な毒素もしくはその断片（例えば、ジフテリア毒素、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）由来エクソトキシンＡ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、シナアブラギリ（Aleurites fordii）タンパク質、ジアンチンタンパク質、クルシン、クロチン、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシンまたはトリコテセン）と連結できる。
【００３４】
抗体または抗原結合断片との連結に適切な放射線同位元素は、限定するものではないが、Ｔｃ９９、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２およびＰ３２を含む。
【００３５】
抗体または抗原結合断片は、例えばプロドラッグを活性抗がん剤に変換するまたは変換できるプロドラッグ活性化酵素と連結できる。例えば、アルカリホスファターゼは、リン酸塩含有プロドラッグを遊離の薬剤に変換するために使用でき、アリルスルファターゼは、硫酸塩含有プロドラッグを遊離の薬剤に変換するために使用でき、シトシンデアミラーゼは、非毒性５−フルオロシトシンを抗がん剤の５−フルオロウラシルに変換するために使用でき、セラシア属のプロテアーゼ、サーモシリン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼおよびカテプチンなどのプロテアーゼは、ペプチド含有プロドラッグを遊離の薬剤に変換するために有用である。酵素は、抗がん遺伝子療法において多くのプロドラッグの代謝に有用であるとして特定されているニトロ還元酵素であってもよい。または、酵素活性を有する抗体または抗原結合断片も、プロドラッグを遊離の活性薬剤に変換するために使用できる。
【００３６】
適切な化学治療薬は、限定するものではないが、チオテパおよびシクロホスファミドなどのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファンなどのスルホン酸アルキル；ベンゾドーパ（benzodopa）、カルボコン（carboquone）、メルレドーパ（meturedopa）およびウレドーパ（uredopa）などのアジリジン；クロラムブシル、クロルナファジン、イホスファミド、メルラファンなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチンおよびフォテムスチンなどのニトロソウレア（nitrosurea）；メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの代謝拮抗剤；デノプテリンおよびプテロプテリンなどの葉酸類似体；フルダラビンおよびチアミプリンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、カルモフールおよびドキシフルリジンなどのピリミジン類似体；パクリタキセルおよびドキセタキセルなどのトキソイド；ならびに上記の任意の医薬として許容可能な塩、酸または誘導体を含むことができる。
【００３７】
別の実施形態において、抗体または抗体断片はＰＥＧ化できる。したがって、１つまたは複数のポリエチレングリコール分子を、抗体分子または抗体断片分子に共有結合できる。１個から３個までのポリエチレングリコール分子が、個々の抗体分子または抗体断片分子に共有結合できる。このようなＰＥＧ化は、抗体もしくは抗体断片の免疫原性の低下および／または抗体もしくは抗体断片の循環半減期の延長のために主に使用される。
【００３８】
キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体
一実施形態において、抗体または抗原結合断片はキメラ抗体またはさまざまな天然抗体由来の配列を含むそれらの断片である。例えば、キメラ抗体または抗原結合断片は、特定の種または抗体クラスの抗体中の対応配列と同一または相同な、重鎖および／または軽鎖の一部を含むことができ、一方鎖の残りは別の種または抗体クラスの抗体中の対応配列と同一または相同である。通常、キメラ抗体または抗原結合断片は、マウスおよびヒトの抗体成分のキメラを含む。
【００３９】
非ヒト抗体のヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含有するキメラ抗体である。適切なヒト化抗体または抗原結合断片は、例えば、レシピエント抗体または抗原結合断片の超可変領域（例えばＣＤＲ由来）由来の残基が、所望の特異性、親和性および／または能力を有する、マウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの非ヒト種の超可変領域由来の残基（ドナー抗体）で置き換えられる免疫グロブリンを含むことができる。いくつかの事例において、ヒト免疫グロブリンのいくつかのフレームワーク領域残基は、対応する非ヒト残基で置き換えることができる。
【００４０】
ヒト化の代替として、ヒト抗体または抗原結合断片を作製することもできる。例えば、免疫化において、内因性免疫グロブリン産生の不在下で、ヒト抗体の完全なレパートリーを産生できるトランスジェニック動物（例えばマウス）を作製できる。例えば、キメラの生殖系列突然変異のマウスおいて、抗体重鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合型欠失は、内因性抗体産生の完全な阻害をもたらし得る。ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子をこのような生殖系列突然変異体マウスに転写し、抗原チャレンジにおいてヒト抗体の産生をもたらすことができる。ヒト抗体または抗原結合断片は、ファージディスプレイ技術を使用して、インビトロで作製することもできる。
【００４１】
標的
任意の標的抗原と結合できる抗体または抗原結合断片が、本発明の方法における使用に適切である。抗体または抗原結合断片は、自己免疫疾患（例えば、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、クローン病および重症筋無力症）に関連する抗原、がんまたは炎症状態に関連する抗原、骨粗しょう症に関連する抗原、アルツハイマー病に関連する抗原または細菌もしくはウィルス性抗原に結合できると思われる。
【００４２】
特に、抗体または抗原結合断片が結合可能な標的は、ＣＤ抗原、成長因子、成長因子受容体、アポトーシス受容体、タンパク質キナーゼまたはがんタンパクなどの細胞表面受容体であり得る。抗体または抗原結合断片は、例えば、キメラ、ヒト化またはヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４モノクロナール抗体または抗体断片は、したがって腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ２０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ３、ＲＳＶＦタンパク質、ＨＥＲ２／ｎｅｕ（ｅｒｂＢ２）受容体、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、抗ＴＲＡＩＬＲ２（抗腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド受容体２）、補体系タンパク質Ｃ５、α４インテグリンまたはＩｇＥと結合できる。
【００４３】
より具体的には、抗がんモノクロナール抗体と関連して、抗体または抗原結合断片は、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ムチン−１（ＭＵＣ１／Ｃａｎ−Ａｇ）、ＥＧＦＲ、ＣＤ２０、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＨＥＲ２、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ルイスＹおよび前立腺特異的膜抗原（ＰＭＳＡ）と結合できる抗体または抗体断片であってよい。この場合も、抗体は通常キメラ、ヒト化またはヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４モノクロナール抗体である。
【００４４】
適切なモノクロナール抗体は、限定するものでないが、インフリマキシブ（キメラ抗体、抗ＴＮＦα）、アダリムマブ（ヒト抗体、抗ＴＮＦα）、バシリキシマブ（キメラ抗体、抗ＩＬ−２）、アブシキシマブ（キメラ抗体、抗ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ）、ダクリズマブ（ヒト化抗体、抗ＩＬ−２）、ゲムツズマブ（ヒト化抗体、抗ＣＤ３３）、アレムツズマブ（ヒト化抗体、抗ＣＤ５２）、エドレコロマブ（ネズミＩｇ２ａ、抗ＥｐＣＡＭ）、リツキシマブ（キメラ抗体、抗ＣＤ２０）、パリビズマブ（ヒト化抗体、ＲＳＶ標的）、トラスツズマブ（ヒト化抗体、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ（ｅｒｂＢ２）受容体）、ベバシズマブ（ヒト化抗体、抗ＶＥＧＦ）、セツキシマブ（キメラ抗体、抗ＥＧＦＲ）、エクリズマブ（ヒト化抗体、抗補体系タンパク質Ｃ５）、エファリズマブ（ヒト化抗体、抗ＣＤ１１ａ）、イブリツモマブ（ネズミ抗体、抗ＣＤ２０）、ムロモナブ−ＣＤ３（ネズミ抗体、抗Ｔ細胞ＣＤ３受容体）、ナタリズマブ（ヒト化抗体、抗α４インテグリン）、ニモツズマブ（ヒト化ＩｇＧ１、抗ＥＧＦ受容体）、オマリズマブ（ヒト化抗体、抗ＩｇＥ）、パニツムマブ（ヒト抗体、抗ＥＧＦＲ）、ラニビズマブ（ヒト化抗体、抗ＶＥＧＦ）、ラニビズマブ（ヒト化抗体、抗ＶＥＧＦ）およびＩ−１３１トシツモマブ（ヒト化抗体、抗ＣＤ２０）を含む。
【００４５】
抗体の調製
適切なモノクロナール抗体は、例えば、ハイブリドーマ法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５頁（１９７５年）に始めて記載されたように）によって、組換えＤＮＡ法によって、および／または後続のファージもしくは他の抗体ライブラリからの単離に従って得ることができる。
【００４６】
ハイブリドーマ技術は、宿主動物（例えば、マウス、ハムスターまたはサル）を、所望の免疫原を用いて免疫化し、免疫原と特異的に結合する抗体を産生する、または産生できるリンパ球を誘発することを含む。または、このリンパ球はインビトロで免疫化できる。リンパ球はその後、ポリエチレングリコールなどの適切な融合剤を使用して骨髄腫細胞と融合され、ハイブリドーマ細胞を形成する。
【００４７】
モノクロナール抗体の単離のための従来のモノクロナール抗体のハイブリドーマ技術に対する代替として、抗体または抗体断片は、抗体ファージライブラリからも単離できる。特に、ファージディスプレイは、本発明の方法における使用のための抗原結合断片の同定に使用できる。抗原−抗体結合相互作用のハイスループットスクリーニングのためにファージディスプレイを使用することにより、ファージコートタンパク質上にディスプレイされた抗原結合断片は、ファージディスプレイライブラリから単離できる。標的抗原を固体支持体に固定することによって、その抗原を結合できる抗体をディスプレイするファージは支持体上に残存し、一方他は洗浄によって除去できるであろう。結合されたままのそれらのファージは、その後溶出され、例えば、選択またはパニングの反復サイクル後単離され得る。最終選択において溶出されたファージを使用し、ファージミドを収集する適切な細菌宿主に感染させ、関連抗原結合断片を同定するために、関連ＤＮＡ配列を切り取り、配列決定できる。
【００４８】
所望の抗体を含有するポリクロナール抗血清は、動物から当分野において周知の技術を使用して単離される。ヒツジ、ウサギまたはヤギなどの動物は、この抗原（免疫原）を動物に注射することによって、時として頻回注射後に、例えば対象の抗原に対する抗体の作製に使用できる。抗血清の収集後、抗体は、免疫吸着剤による精製または当分野において公知の他の技術を使用して精製できる。
【００４９】
本発明の方法に使用する抗体または抗原結合断片は、天然発生ヌクレオチド配列または合成配列から組換え的に作製できる。このような配列は、例えば、適切な天然発生鋳型（例えば、細胞から単離されたＤＮＡまたはＲＮＡ）、ライブラリから単離されたヌクレオチド配列（例えば、発現ライブラリ）、天然発生ヌクレオチド配列に突然変異を導入することによって調製されたヌクレオチド配列（公知の任意の適切な技術、例えばミスマッチＰＣＲを使用する）、重複プライマーを使用するＰＣＲによって調製されたヌクレオチド配列またはＤＮＡ合成のための技術を使用して調製されたヌクレオチド配列からＰＣＲによって単離することができる。親和性成熟（例えば、合成、ランダムまたは天然発生の免疫グロブリン配列から出発する）、ＣＤＲグラフティング、ベニアリング（veneering）、異なる免疫グロブリン配列由来の断片の組合せなどの技術および免疫グロブリン配列を操作する他の技術もまた使用できる。
【００５０】
対象のこのようなヌクレオチド配列は、本発明における使用のための抗体または抗原結合断片の作製において、当業者に周知の技術に従って、インビトロまたはインビボで使用できる。
【００５１】
モノクロナール抗体または抗原結合断片の組換え作製のために、モノクロナール抗体または抗原結合断片をコードする核酸を単離し、さらなるクローニングまたは発現のために複製可能なベクターに挿入する。限定するものではないが、ベクター成分は一般的に以下の１つまたは複数を含む：シグナル配列、複製開始点、１種または複数のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーターおよび転写終結配列。ベクターにおけるＤＮＡのクローニングまたは発現のための適切な宿主細胞は、原核生物、酵母または大腸菌（E.coli）などの高等真核生物の細胞およびＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞である。グリコシル化抗体の発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物由来である。宿主細胞を、抗体作製のための発現ベクターまたはクローニングベクターにより形質転換させ、プロモーターの誘導、形質転換体の選択または所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適切なように修正した従来の栄養培地において培養する。
【００５２】
組換え技術に使用する場合、抗体は、細胞内に産生または培地に直接分泌され得る。抗体が細胞内に産生される場合、第１ステップとして、宿主細胞または溶解細胞のいずれかの微粒子のデブリを、例えば遠心分離または限外ろ過によって除去する。抗体が培地に分泌される場合、一般的に、発現系の上清を、市販のタンパク質濃縮フィルターを使用してまず濃縮する。細胞から調製された抗体組成物を、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析およびアフィニティクロマトグラフィーを使用して精製できる。
【００５３】
精製抗体を、その後単離し、場合により抗原結合断片化および／または誘導体化できる。
【００５４】
酵素
任意のタンパク質酵素が、本発明における使用に適切である。このような酵素は活性部位を含み、基質と結合できる。酵素は１本のポリペプチド鎖からなるモノマーであってよい。または、酵素はダイマー、テトラマーまたは多重ポリペプチド鎖からなるオリゴマーであってよい。ダイマー、テトラマーまたはオリゴマーは、それぞれホモまたはヘテロのダイマー、テトラマーまたはオリゴマーであってよい。例えば、酵素は、完全な生物活性または酵素機能がもたらされる前に、会合体（例えば、ダイマー、テトラマーまたはオリゴマー）を形成する必要があり得る。酵素は、アロステリック酵素、アポ酵素またはホロ酵素であってよい。
【００５５】
酵素は、別の部分（例えば、リガンド、抗体、炭水化物、エフェクター分子またはタンパク質融合パートナー）と結合してもよく、および／または１つまたは複数の補因子（例えば、補酵素または補欠分子族）と結合してもよい。
【００５６】
酵素が結合する部分は、レクチン、アビジン、代謝産物、ホルモン、ヌクレオチド配列、ステロイド、糖タンパク質、糖脂質またはこれらの成分の任意の誘導体を含み得る。
【００５７】
補因子は、無機化合物（例えば、鉄などの金属鉄、マグネシウム、コバルト、銅、亜鉛、セレン、モリブデン）または有機化合物（例えば、フラビンまたはヘム）を含む。適切な補酵素は、リボフラビン、チアミン、ＮＡＤまたはＮＡＤＰ＋によってもたらされる鉄水素化物（Ｈ−）を担持し得る葉酸、補酵素Ａにより担持されるアセチル基、葉酸によって担持されるホルミル、メテニルまたはメチルの各基およびＳ−アデノシルメチオニンによって担持されるメチル基を含む。
【００５８】
別の実施形態において、酵素は、特に酵素が患者に投与される治療用酵素である場合、ＰＥＧ化できる。したがって、１個または複数個のポリエチレングリコールを酵素分子に共有結合できる。１個から３個までのポリエチレングリコール分子が、個々の酵素分子に共有結合できる。このようなＰＥＧ化は、酵素の免疫原性の低下および／または酵素の循環半減期の延長のために主に使用される。
【００５９】
適切な酵素は、オキシドレダクターゼ（ＥＣ１）、トランスフェラーゼ（ＥＣ２）、ヒドラーゼ（ＥＣ３）、リアーゼ（ＥＣ４）、イソメラーゼ（ＥＣ５）またはリガーゼ（ＥＣ６）を含めた、国際生化学分子生物学連合酵素分類系のＥＣ番号のもとで分類された任意の酵素である。通常の酵素は工業的に使用される任意の酵素である。
【００６０】
任意の型の基質に特異的な酵素が、本発明における使用に適切である。適切な酵素の例は、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、セリンプロテアーゼ、エンドペプチダーゼ（例えば、システインエンドペプチダーゼ）、カスパーゼ、キマーゼ、キモトリプシ、エンドペプチダーゼ、グランザイム、パパイン、膵エラスターゼ、オリジン（oryzin）、プラスミン、レニン、スブチリシン、トロンビン、トリプシン、トリプターゼ、ウロキナーゼ、アミラーゼ、（例えば、α−アミラーゼ）、キシラナーゼ、リパーゼ、トランスグルタミナーゼ、細胞壁分解酵素、グルカナーゼ、（例えば、β−グルカナーゼ）、グルコアミラーゼ、凝固酵素、乳タンパク質加水分解物、細胞壁分解酵素、血液凝固酵素、ヘメンチン（hementin）、リゾチーム、繊維分解酵素、フィターゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ポリメラーゼ、プロテアーゼ、マンナーゼまたはグルコアミラーゼを含む。
【００６１】
したがって、本発明に従って保存された酵素は、疾患または他の病態の治療に使用される治療用酵素、ブドウ糖または果糖などの大量生産品の工業的生産、食品加工および食品分析、洗濯および自動食器洗い用洗剤、繊維製品、パルプ、製紙および動物飼料の工業、合成または精製化学工業品における触媒として、臨床診断などにおける診断的適用、バイオセンサーまたは遺伝子操作に使用される酵素であってよい。
【００６２】
本発明を適用できる治療用酵素は、
ＤＮＡａｓｅ、例えば、嚢胞性線維症を有する小児の肺疾患粘膜中のＤＮＡを切断するパルモザイム（Pulmozyme）またはドルナーゼなどの組換えＤＮＡａｓｅＩ；
胃リパーゼ、例えば、膵外分泌機能リパーゼ不全に関連する脂質吸収不良の治療用組換え哺乳動物胃リパーゼであるメリパーゼ（Meripase）；
マンノース末端化グルコセレブロシダーゼ、例えば、酵素のグルコセレブロシダーゼの欠乏により起こる遺伝性疾患であるゴーシェ病の治療用組換えマンノース末端化グルコセレブロシダーゼであるセレザイム（Cerezyme）；
α−ガラクトシダーゼ、関連グリコーゲン蓄積症のファブリ病の治療に使用される；
アデノシンデアミラーゼ（ＡＤＡ）、例えば、重症複合免疫不全症のＡＤＡ欠乏症の治療に使用されるペガデマーゼ（Pegademase）；
フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、例えば、フェニルケトン尿症の治療に使用されるＰＥＧ化組換えフェニルアラニンアンモニアリアーゼのクバン（Kuvan）；
組織プラスミノーゲン活性化因子のウロキナーゼおよびストレプトキナーゼ、血栓を治療するための血液溶解に使用される；
尿酸オキシダーゼ、例えば、遺伝的に修飾された酵母により産生され、白血病またはリンパ腫を有する患者において高尿酸血の治療または予防に使用される組換え尿酸オキシダーゼであるエリテック（Elitek）（ラスブリカーゼ）；
Ｌ−アスパラギナーゼ、小児急性リンパ芽球性白血病の治療に使用される
因子ＶＩＩａ、血友病の患者に使用される；
因子ＩＸ、血友病Ｂの治療に使用される；および
ス−パーオキシドジスムターゼ、例えば、家族性筋萎縮性側索硬化症の治療に使用される、ウシス−パーオキシドジスムターゼ、オルゴテイン（Orgotein）；
を含む。
【００６３】
ベーキングなどの食品用途に使用する酵素は、アミラーゼ、キシラナーゼ、オキシドレダクターゼ、リパーゼ、プロテアーゼおよびトランスグルタミナーゼを含む。果汁生産および果実加工に使用する酵素は、細胞壁分解酵素を含む。醸造に使用する酵素は、マッシングにおける細菌性α−アミラーゼ、β−グルカナーゼおよびグルコアミラーゼ、醗酵における真菌性α−アミラーゼおよび醗酵後におけるシステインエンドペプチダーゼを含む。酪農用途に使用する酵素は、凝固酵素、リパーゼ、リゾチーム、乳タンパク質加水分解物、トランスグルタミナーゼおよびβ−ガラクトシダーゼを含む。洗剤組成物に使用する酵素は、プロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、およびマンナナーゼを含む。動物飼料に使用する酵素は、繊維分解酵素、フィターゼ、プロテアーゼおよびアミラーゼを含む。パルプおよび紙加工に使用する酵素は、セルラーゼおよびヘミセルラーゼを含む。
【００６４】
または酵素は、研究または開発用途に使用される酵素であってもよい。例えば、ルシフェラーゼは、細胞培養、個々の細胞および生物全体の培養における遺伝子発現のリアルタイム画像に使用できる。さらに、ルシフェラーゼは、例えば、ルシフェラーゼを用いてトランスフェクトされた細胞において、特異的プロモーターからの転写活性を試験するための分子研究においてリポータータンパク質として使用できる。酵素は、薬物設計、例えば、実験室において酵素阻害剤の試験にもまた使用できる。さらに、酵素は、バイオセンサー（例えば、グルコースオキシダーゼを使用する血中グルコースバイオセンサー）に使用できる。
【００６５】
ルシフェラーゼ酵素は、ホタル、甲虫もしくは鉄道虫（railroad worm）のルシフェラーゼまたはそれらの誘導体であってよい。特に、ルシフェラーゼは、北米ホタル（North American firefly）（フォチナス・フィラリス（Phorinus pyralis））、ゲンジボタル（Luciola cruciata）（日本のホタル）、ヘイケボタル（Luciola lateralis）（日本のホタル）、ルキオラ・ミンゲリカ（Luciola mingelica）（ロシアのホタル）、Ｂｅｎｅｃｋｅａ  ｈａｎｅｇｉ（海洋細菌ルシフェラーゼ）、ヒカリコメツキ（Pyrophorus plagiophthalamus）（クリックビートル）、ミヤコマドボタル（Pyrocelia miyako）（ホタル）、イリオモテボタル（Ragophthalamus ohbai）（鉄道虫）、ヒカリコメツキ（Pyrearinus termitilluminans）（クリックビートル）、フリクソスリックス・ヒトラス（Phrixothrix hirtus）（鉄道虫）、フリクソスリックス・ビビアニ（Phrixothrix vivianii）、ヒメボタル（Hotaria parvula）およびフォツリス・ペンシルベニカ（Photuris pensilvanica）ならびにそれらの突然変異体由来であってよい。
【００６６】
通常、α−ガラクトシダーゼもしくはβ−ガラクトシダーゼは、細菌（大腸菌（Escherichia coli.）など）、哺乳動物（ヒト、マウス、ラットなど）または他の真核生物由来である。
【００６７】
酵素は、天然発生の酵素であっても、合成酵素であってもよい。このような酵素は、宿主である動物、植物または微生物由来であってよい。
【００６８】
酵素の生産に使用される微生物菌株は、天然の菌株または連続培養および選択もしくは組換えＤＮＡ技術を使用する突然変異生成および選択による、天然菌株に由来する突然変異の菌株であってもよい。例えば、微生物は真菌、例えばサーモマイセス・アクレモニウム（Thermomyces acermonium）、アスペルギルス（Aspergillus）属、ペニシリウム（Penicillium）属、ケカビ（Mucor）属、アカパンカビ（Neurospora）属およびトリコデルマ（Trichoderma）であってよい。サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cereviseae）またはピキア−パストリス（Pishia pastoris）などの酵母は、本発明の方法に使用する酵素の生産に使用できる。
【００６９】
合成酵素は、進化およびＤＮＡシャッフリングを対象とする合理的設計などの当分野において周知のタンパク質工学技術を使用して得ることができる。
【００７０】
宿主生物は、所望の酵素をコードするヌクレオチド配列によって形質転換され、酵素の生産を促し、細胞および／または培養培地から酵素を回収しやすい条件下で培養され得る。
【００７１】
ワクチン免疫原
本発明における使用に適切なワクチン免疫原は、ワクチンの任意の免疫原性成分を含む。ワクチン免疫原は、特定の疾患または病態に対するワクチンとして使用した場合、個体において免疫応答を誘発できる抗原を含む。ワクチン免疫原は、ワクチン調製品の処方前それ自体により提供され得る、またはワクチン調製品の一部として提供され得る。ワクチン免疫原は、サブユニットワクチン、ワクチンとして有用な結合型ワクチンまたはトキソイドであってよい。ワクチン免疫原は、タンパク質、細菌特異性タンパク質、ムコタンパク質、糖タンパク質、ペプチド、リポタンパク質、多糖類、ペプチドグリカン、核タンパク質または融合タンパク質であってよい。
【００７２】
ワクチン免疫原は、微生物（細菌、ウィルス、真菌など）、原生動物、腫瘍、悪性細胞、植物、動物、ヒトまたはアレルゲン由来であってよい。ワクチン免疫原は、ウィルス粒子ではないことが好ましい。したがって、ワクチン免疫原は、全ウィルスまたはビリオン、ウィルス様粒子（ＶＬＰ）もしくはウィルスのヌクレオカプシドではないことが好ましい。このようなウィルス粒子の保存は、ＷＯ２００８／１１４０２１に記載されている。
【００７３】
ワクチン免疫原は、合成、例えば組換えＤＮＡ技術を使用して得られるものであってもよい。免疫原は、病原体関連抗原、腫瘍関連抗原、アレルギー関連抗原、神経欠損関連抗原、心臓血管疾患抗原、関節リウマチ関連抗原などの疾患関連抗原であってよい。
【００７４】
特に、ワクチン免疫原が由来する病原体は、ヒトパピローマウィルス（ＨＰＶ）、ＨＩＶ、ＨＳＶ２／ＨＳＶ１、インフルエンザウィルス（Ａ、ＢおよびＣ型）、パラインフルエンザウィルス、ポリオウィルス、ＲＳＶウィルス、ライノウィルス、ロタウィルス、Ａ型肝炎ウィルス、ノーウォークウィルス、エンテロウィルス、アストロウィルス、麻疹ウィルス、ムンプスウィルス、帯状疱疹ウィルス、サイトメガロウィルス、エプスタイン・バーウィルス、アデノウィルス、風疹ウィルス、ヒトＴ細胞リンパ腫Ｉ型ウィルス（ＨＴＬＶ−Ｉ）、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウィルス、ポックスウィルス、ワクチニアウィルス、サルモネラ属（Salmonella）、ナイセリア属（Neisseria）、ボレリア属（Borrelia）、クラミジア属（Clamydia）、百日咳菌（Bordetella pertussis）などのボルデレラ属（Bordetella）、マラリア原虫（Plasmodium）、トキソプラズマ（Coxoplasma）、肺炎球菌（Pneumococcus）、髄膜炎菌（Meningococcus）、クリプトコッカス属（Cryptococcus）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）、コレラ菌（Vibriocholerae）、エルシニア属（Yersinia）、特にペスト菌（Yersinia pestis）、ブドウ球菌（Staphylococcus）、ヘモフィルス属（Haemophilus）、ジフテリア菌（Diptheria）、破傷風菌（Tetanus）、百日咳（Pertussis）、エシェリヒア属（Escherichia）、カンジダ属（Candida）、アスペルギルス属（Aspergillus）、エントアメーバ属（Entamoeba）、ジルジア属（Giardia）およびトリパノソーマ属（Trypanasoma）を含むことができる。ワクチンはさらに、口蹄疫（血清型Ｏ、Ａ、Ｃ、ＳＡＴ−１、ＳＡＴ−２、ＳＡＴ−３およびＡｓｉａ−１を含む）、コロナウィルス、ブルータング、ネコ白血病ウィルス、鶏インフルエンザ、ヘンドラウィルスおよびニパウィルス、ペスチウィルス、イヌパルボウィルスならびにウシウィルス性下痢ウィルスなどの多数の家畜の疾患に対する適切な免疫応答を提供するために使用できる。
【００７５】
腫瘍関連抗原は、例えば、黒色腫関連抗原、乳がん関連抗原、大腸がん関連抗原または前立腺がん関連抗原を含む。
【００７６】
アレルゲン関連抗原は、ワクチンが投与された個体においてアレルギー反応を抑制するワクチンの使用に適切な、任意のアレルゲン抗原を含む（例えば、花粉、イエダニ、昆虫、食物アレルゲン、ハウスダスト、毒物、寄生生物に由来する抗原）。
【００７７】
サブユニットワクチン免疫原
適切なサブユニットワクチン免疫原は、微生物（例えば、ウィルスまたは細菌）由来のタンパク質、リポタンパク質または糖タンパク質の任意の免疫原性サブユニットを含む。または、サブユニットワクチン免疫原は、腫瘍関連タンパク質などの疾患関連抗原に由来し得る。サブユニットワクチン免疫原は、天然発生分子であっても、合成タンパク質のサブユニットであってもよい。ワクチン免疫原は、完全長の、ウィルスまたは細菌のタンパク質、糖タンパク質もしくはリポタンパク質、または完全長の、ウィルスもしくは細菌のタンパク質、糖タンパク質もしくはリポタンパク質の断片であってよい。
【００７８】
ワクチン免疫原として適切なウィルスタンパク質は、構造的または非構造的タンパク質に由来し得る。適切なウィルスサブユニット免疫原は、ウィルスの他の部分が存在しない場合であっても対象の免疫系を刺激できる。適切なウィルスサブユニットワクチン免疫原は、カプシドタンパク質、表面糖タンパク質、エンベロープタンパク質、ヘキソンタンパク質、繊維タンパク質、コートタンパク質またはこのようなタンパク質もしくは糖タンパク質の免疫原性の断片または誘導体を含む。
【００７９】
例えば、ウィルスサブユニットワクチン免疫原は、インフルエンザＡ、ＢまたはＣ型ウィルスの表面タンパク質から構成され得る。特に、ワクチン免疫原は、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、核タンパク質、Ｍ１、Ｍ２、ＮＳ１、ＮＳ２（ＮＥＰ）、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ１−Ｆ２および／またはＰＢ２タンパク質または任意のこれらのタンパク質の免疫原性の誘導体もしくは断片であってよい。免疫原は、ＨＡ１、ＨＡ２、ＨＡ３、ＨＡ４、ＨＡ５、ＨＡ６、ＨＡ７、ＨＡ８、ＨＡ９、ＨＡ１０、ＨＡ１１、ＨＡ１２、ＨＡ１３、ＨＡ１４、ＨＡ１５および／またはＨＡ１６、それらの任意の免疫原性の断片もしくは誘導体ならびにＨＡタンパク質、断片もしくは誘導体の任意の組合せであってよい。ノイラミニダーゼは、ノイラミニダーゼ１（Ｎ１）またはノイラミニダーゼ２（Ｎ２）であってよい。
【００８０】
ウィルスサブユニットワクチン免疫原は、Ｂ型肝炎ウィルスのウィルスエンベロープタンパク質またはそれらの断片もしくは誘導体であってよい。例えば、サブユニットワクチン免疫原は、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨｂｓＡｇ）またはそれらの免疫原性の断片または誘導体であってよい。
【００８１】
通常、細菌サブユニットワクチン免疫原は、細菌の細胞壁タンパク質（例えば、フラジェリン、外膜タンパク質、外面タンパク質）、多糖類抗原（例えば、髄膜炎菌（Neisseria meningitis）、肺炎球菌（Streptococcus pneumonia）由来）、毒素またはこのようなタンパク質、多糖類もしくは毒素の免疫原性の断片または誘導体である。
【００８２】
天然発生タンパク質の誘導体は、１個または複数個のアミノ酸の付加、置換および／または欠失を有するタンパク質を含む。このようなアミノ酸修飾は、当分野において公知の技術、例えば、部位特異的突然変異生成などを使用して作製できる。
【００８３】
サブユニットワクチン免疫原は、例えば、細菌もしくはウィルスのタンパク質またはそれらの免疫原性の断片もしくは誘導体と結合した融合タンパク質のパートナーを含む融合タンパク質であってよい。適切な融合タンパク質のパートナーは、融合タンパク質の発現後、ウィルス融合タンパク質が多量体に集合することを防ぐことができる。例えば、融合タンパク質のパートナーは、ウィルスタンパク質が、融合タンパク質のパートナーが存在しない状態で組換え的に発現した場合、自発的に形成すると思われる、ウィルス様構造の形成を防ぐことができる。適切な融合パートナーは、融合タンパク質の精製を容易にでき、または融合タンパク質産物の組換え発現を強化できる。融合タンパク質は、麦芽糖結合タンパク質、金属イオンに結合できるポリヒスチジンセグメント、抗体が結合する抗原、Ｓ−タグ、グルタチオン−Ｓ−転移酵素、チオレドキシン、ベータ−ガラクトシダーゼ、エピトープタグ、緑色蛍光タンパク質、ストレプトアビジンまたはジヒドロ葉酸レダクターゼであってよい。
【００８４】
サブユニットワクチン免疫原は、例えば単離ペプチド、タンパク質、リポタンパク質または糖タンパク質の調製のための当分野において公知の技術を使用して調製できる。例えば、対象の組換えタンパク質をコードする遺伝子を、同定し、病原体から単離し、大腸菌またはタンパク質の大量生産のための他の適切な宿主において発現させることができる。対象のタンパク質は、次いで、宿主細胞から単離され、（例えば、アフィニティクロマトグラフィーを使用する精製によって）精製される。
【００８５】
ウィルスサブユニット免疫原の場合、サブユニットはウィルス粒子の単離後ウィルス粒子から、または組換えＤＮＡのクローンニングおよび適切な宿主細胞におけるウィルスサブユニットタンパク質の発現によって精製できる。ウィルス粒子の調製のために適切な宿主細胞は、ウィルスに感染させることができ、所望のウィルス抗原を産生できなければならない。このような宿主細胞は、微生物、培養動物細胞、トランスジェニック植物または昆虫の幼虫を含むことができる。対象のタンパク質の一部は、宿主細胞由来の可溶性タンパク質として分泌され得る。ウィルスエンベロープまたは表面タンパク質の場合、このようなタンパク質は、界面活性剤を用いて可溶化し、それらをウィルスエンベロープから抽出し、その後相分離し、界面活性剤を除去する必要があると思われる。
【００８６】
サブユニットワクチン免疫原は、同じ調製品中に組み合わせることができ、１種、２種、３種またはそれ以上の他のサブユニットワクチン免疫原と一緒に保存できる。
【００８７】
トキソイド
本発明は、トキソイドに適用できる。トキソイドは、免疫原性であるが、（例えば、遺伝子突然変異によって、化学的治療または別の部分との接合によって）不活性化されており、標的対象に対する毒性を取り除かれた、例えば、病原体、動物または植物由来の毒素である。毒素は、例えば、タンパク質、リポタンパク質、多糖類、リポ多糖類  または糖タンパク質であってよい。したがって、トキソイドは、トキソイド化されたエンドトキシンまたはエクソトキシンであってよい。
【００８８】
トキソイドは、破傷風毒素、ジフテリア毒素、百日咳毒素、ボツリヌス毒素、クロストリジウム・ディフィシル（C.difficile）の毒素、コレラ毒素、志賀毒素、炭疽毒素、細菌細胞溶解素または肺炎球菌溶血素およびそれらの断片または誘導体などの細菌毒素に由来するトキソイドであってよい。したがって、トキソイドは、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイドまたは百日咳トキソイドであってよい。トキソイドが由来できる他の毒素は、動物または植物、例えばガラガラヘビ（Crotalis atrox）から単離された毒物を含む。通常、トキソイドは、ボツリヌス毒素または炭疽毒素に由来する。例えば、ボツリヌス毒素は、血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦまたはＧのボツリヌス菌（Clostridium botulinum）に由来し得る。ボツリヌス毒素に由来するワクチン免疫原は、同じ調製品中に組み合わせることができ、１種または複数種の、他のボツリヌス毒素に由来するワクチン免疫原と一緒に保存できる（例えば、ボツリヌス血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦまたはＧに由来する免疫原の組合せ、例えば、Ａ、ＢおよびＥなど、）。
【００８９】
炭疽毒素は、炭疽菌（Bacillus anthracis）の菌株に由来し得る。トキソイドは、炭疽毒素の１種もしくは複数種の成分またはこのような成分の誘導体、例えば、防御抗原（ＰＡ）、浮腫因子（ＥＦ）および致死因子（ＬＦ）などのから構成され得る。通常、炭疽毒素由来のトキソイドは、防御抗原（ＰＡ）からなる。
【００９０】
トキソイドは、トキソイドワクチンとして使用するために、例えば融合タンパク質として別の部分に結合できる。トキソイド結合体における適切な部分は、トキソイドの精製に役立つ（例えば、ヒスチジンタグ）、または標的対象に対する毒性を低下させる物質を含む。または、トキソイドは、トキソイドが結合する抗原の免疫原性を増加することによってアジュバントとして作用できる。例えば、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）のＢ多糖類を、ジフテリアトキソイドと組み合わせることができる。
【００９１】
ワクチン免疫原は、同じ調製品中に組み合わせることができ、１種、２種、３種またはそれ以上のワクチン免疫原と一緒に保存できる。例えば、ジフテリアトキソイドは、破傷風トキソイドおよび百日咳ワクチン（ＤＰＴ）と一緒に保存できる。ジフテリアトキソイドは、破傷風トキソイド（ＤＴ）だけと一緒に保存でき、またはジフテリアトキソイドはジフテリアトキソイド、破傷風トキソイドおよび無細胞性百日咳（ＤＴａＰ）と一緒に保存できる。
【００９２】
トキソイドの調製技術は、当業者に周知である。毒素の遺伝子は、適切な宿主細胞においてクローン化させ、発現させることができる。その後、毒素産物を精製し、例えば、ホルマリンまたはグルタルアルデヒドを使用して、化学的にトキソイドに変換できる。または、毒素遺伝子を、例えば、１個または複数個のアミノ酸の付加、欠失および／または置換によって、毒性が低下した、または毒性の無い毒素をコードするように操作できる。修飾毒素は、その後、適切な宿主細胞において発現させ、単離できる。毒素遺伝子の毒性は、毒素遺伝子またはそれらの断片をさらなる部分（多糖類またはポリペプチド）に結合させることによってもまた、不活性化できる。
【００９３】
結合型ワクチン免疫原
結合型ワクチン免疫原は、抗原（例えば、多糖類または他のハプテン）と結合する抗原の免疫原性を刺激する担体部分（例えば、ペプチド、ポリペプチド、リポタンパク質、糖タンパク質、ムコタンパク質またはそれらの任意の免疫刺激性の誘導体または断片）との結合体であってよい。例えば、結合型ワクチン免疫原は、対象の免疫原（例えば、多糖類）と結合した組換えタンパク質、組換えリポタンパク質または組換え糖タンパク質であってよい。
【００９４】
結合型ワクチン免疫原は、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumonia）、インフルエンザ菌（Haemophilus influenza）、髄膜炎菌（meningococcus）（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｘ、ＹおよびＷ１３５株）または肺炎球菌（Pneumococcal）株に対するワクチンに使用できる。例えば、ワクチンは、例えば、七価の肺炎球菌ＣＲＭ１９７結合型ワクチン（ＰＣＶ７）、ＭＣＶ−４またはｂ型インフルエンザ菌（Ｈｉｂ）ワクチンであってよい。
【００９５】
結合型ワクチン免疫原は、同じ調製品中に組み合わせることができ、１種、２種、３種またはそれ以上の他の結合型ワクチン免疫原と一緒に保存できる。
【００９６】
結合型多糖類−タンパク質結合体の調製方法は、当分野において周知である。例えば、結合は、リンカー（例えば、Ｂ−プロピオン酸アミド、ニトロフェニルエチルアミン、ハロゲン化ハロアルキル、グリコシド結合）を介して起こり得る。
【００９７】
保存用混合物
本発明の保存用混合物は、１種または複数種の糖およびポリエチレンイミン（ＰＥＩ）の水溶液を含む。水溶液は緩衝化されてよい。溶液は、ＨＥＰＥＳ溶液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）または純水であってよい。
【００９８】
本発明に使用する適切な糖は、ブドウ糖、果糖、グリセルアルデヒド、乳糖、アラビノースおよび麦芽糖などの還元糖ならびにショ糖などの非還元糖を含む。糖は、単糖類、二糖類、三糖類または他のオリゴ糖であってよい。「糖」という用語は、糖アルコールを含む。
【００９９】
ガラクトースおよびマンノースなどの単糖類、乳糖および麦芽糖などの二糖類、ラフィノースなどの三糖類およびスタキオースなどの四糖類が想定される。トレハロース、ウンベリフェロース（umbelliferose）、ベルバコース（verbascose）、イソマルトース、セロビオース、マルツロース（maltulose）、ツラノース（turanose）、メレジトース（melezitose）およびメリビオース（melibiose）もまた本発明に適している。適切な糖アルコールはマンニトールである。
【０１００】
好ましくは、水溶液はショ糖、ラフィノースおよびスタキオースから選択される１種、２種、３種の糖の溶液である。特に、ショ糖はブドウ糖と果糖との二糖類であり、ラフィノースは、ガラクトース、果糖およびブドウ糖から構成される三糖類であり、スタキオースは、２個のＤα−ガラクトース単位、１個のＤα−ブドウ糖単位および１個のＤβ−果糖単位が順に結合した四糖類である。ショ糖およびスタキオース特にショ糖およびラフィノースの組合せが好ましい。
【０１０１】
少なくとも２種の糖を本発明の保存用混合物に使用する場合、生物活性の保存は特に有効である。したがって、１種または複数種の糖の溶液は、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種または少なくとも５種の糖の溶液を含む。２、３、４、５、６、７、８、９、１０種などの糖の組合せが想定される。好ましくは、２種またはそれ以上の糖の溶液は、ショ糖およびラフィノースまたはショ糖およびスタキオースを含む。
【０１０２】
ＰＥＩは、−（ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ）−で表される化学単位が繰り返されることを特徴とする脂肪族ポリアミンである。本明細書におけるＰＥＩの言及は、ポリエチレンイミンのホモポリマーまたはコポリマーを含む。ポリエチレンイミンのコポリマーは、ランダムコポリマーまたはブロックコポリマーであってよい。例えば、ＰＥＩは、ポリエチレンイミンと、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの別のポリマーとのコポリマーから構成されてよい。ポリエチレンイミンは、線状または分枝型であってよい。
【０１０３】
ＰＥＩの言及は、ポリエチレンイミンの誘導体化された形態もさらに含む。ポリエチレンイミンは、さまざまな位置に窒素原子を含有する。窒素原子は末端アミノ基に存在し、例えばＲ−ＮＨ２、ポリマー構造内のアルキル基またはアルキレン基に割り込む基などの内部の基に存在し、例えばＲ−Ｎ（Ｈ）−Ｒ’、ポリマーの枝の交差点に存在し、例えばＲ−Ｎ−（−Ｒ’）−Ｒ”、例えばＲ、Ｒ’およびＲ”はアルキレン基であり得る。アルキル基またはアリール基は、水素原子に加えて、または水素原子の変わりに窒素中心に結合できる。このようなアルキルおよびアリール基は置換されていても、非置換であってもよい。アルキル基は通常、Ｃ１〜Ｃ４のアルキル基、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチルまたはｔｅｒｔ−ブチルであると思われる。アリール基は通常フェニルである。
【０１０４】
ＰＥＩは、ポリエチレングリコールなどのさまざまな他のポリマーと共有結合しているポリエチレンイミンであってよい。ＰＥＩの他の修飾された型が製造されており、いくつかは市販されている：分枝型ＰＥＩ２５ｋＤａ、ｊｅｔＰＥＩ（登録商標）、ＬＭＷ−ＰＥＩ５．４ｋＤａ、擬似デンドリマー（Pseudodendrimeric）ＰＥＩ、ＰＥＩ−ＳＳ−ＰＥＩ、ＰＥＩ−ＳＳ−ＰＥＧ、ＰＥＩ−ｇ−ＰＥＧ、ＰＥＧ−ｃｏ−ＰＥＩ、ＰＥＧ−ｇ−ＰＥＩ、ＰＥＩ−ｃｏ−Ｌ乳酸アミド−ｃｏ−コハク酸アミド、ＰＥＩ−ｃｏ−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル−エチレンイミン）、ＰＥＩ−ｃｏ−Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド、ＰＥＩ−ｇ−ＰＣＬ−ブロック−ＰＥＧ、ＰＥＩ−ＳＳ−ＰＨＭＰＡ、ＰＥＩ−ｇ−デキストラン１００００およびＰＥＩ−ｇ−トランスフェリン−ＰＥＧ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ８５（登録商標）／Ｐｌｕｒｏｎｉｃ１２３（登録商標）−ｇ−ＰＥＩ。ＰＥＩは、完全メチル化ポリエチレンイミンまたはポリエチレンイミン−エタンスルホン酸であってよい。
【０１０５】
ＰＥＩは、広範囲の数平均モル質量（Ｍｎ）、例えば、３００Ｄａと８００ｋＤａとの間で利用可能である。好ましくは、数平均モル質量は、３００と２０００Ｄａとの間、５００と１５００Ｄａとの間、１０００と１５００Ｄａとの間、１０と１００ｋＤａとの間、２０と１００ｋＤａとの間、３０と１００ｋＤａとの間、４０と１００ｋＤａとの間、５０と１００ｋＤａとの間、６０と１００ｋＤａとの間、５０と７０ｋＤａとの間または５５と６５ｋＤａとの間である。およそ６０ｋＤａの比較的高いＭｎのＰＥＩまたは１２００Ｄａの比較的低いＭｎのＰＥＩが適切である。
【０１０６】
好ましくは、ＰＥＩ重量平均モル質量（Ｍｗ）は、５００Ｄａと１０００ｋＤａとの間である。最も好ましくは、ＰＥＩのＭｗは５００Ｄａおよび２０００Ｄａの間、１０００Ｄａおよび１５００Ｄａの間または１ｋＤａと１０００ｋＤａとの間、１００ｋＤａと１０００ｋＤａとの間、２５０ｋＤａと１０００ｋＤａとの間、５００ｋＤａと１０００ｋＤａとの間、６００ｋＤａと１０００ｋＤａとの間、７５０ｋＤａと１０００ｋＤａとの間、６００ｋＤａと８００ｋＤａの間、７００ｋＤａと８００ｋＤａの間である。およそ７５０ｋＤａの比較的高いＭｗまたはおよそ１３００Ｄａの比較的低いＭｗが適切である。
【０１０７】
ＰＥＩの重量平均モル質量（Ｍｗ）および数平均モル質量（Ｍｎ）は、当業者に周知の方法によって決定できる。例えば、Ｍｗは、光散乱法、中性子小角散乱法（ＳＡＮＳ）、Ｘ線散乱法または沈降速度法によって決定できる。Ｍｎは、例えば、ゲル浸透クロマトグラフィー、粘度法（Ｍａｒｋ−Ｈｏｕｗｉｎｋの方程式）および蒸気圧法などの束一的方法または末端基滴定によって決定できる。
【０１０８】
ＰＥＩのさまざまな形態が市販されている（例えば、Ｓｉｇｍａ、Ａｌｄｒｉｃｈ）。例えば、Ｍｎがおよそ６０ｋＤａおよびＭｗがおよそ７５０ｋＤａの、本明細書において使用される、分枝型で、比較的高分子量の形態のＰＥＩが市販されている（Ｓｉｇｍａ  Ｐ３１４３）。このＰＥＩは、以下の式で表すことができる：
【０１０９】
【化１】
2012503637.tif 000003
【０１１０】
Ｍｗ１３００ＤａおよびＭｎ１２００Ｄａを有する、本明細書において使用される比較的低分子量の形態のＰＥＩもまた市販されている（例えば、Ａｌｄｒｉｃｈ  ４８２５９５）。
【０１１１】
本発明において、ＰＥＩの水溶液および１種、２種またはそれ以上の糖を含む保存用混合物を提供する。通常、活性薬剤は保存用混合物と混合され、乾燥用水溶液が提供される。特定の活性薬剤に用いられるＰＥＩおよび糖の濃度は、活性薬剤に依存すると思われる。濃度は、日常的な実験によって決定できる。したがって、最も優れた安定性をもたらす最適なＰＥＩおよび糖の濃度が選択できる。ＰＥＩおよび糖は、安定性の改善のために相乗的に作用できる。
【０１１２】
乾燥用水溶液中の糖の濃度は、０．１Ｍを超える。好ましくは、乾燥用水溶液中の糖濃度、または複数種の糖が存在する場合の乾燥用水溶液中の合計糖濃度は、少なくとも０．２Ｍ、０．３Ｍ、０．４Ｍ、０．５Ｍ、０．６Ｍ、０．７５Ｍ、０．９Ｍ、１Ｍまたは２Ｍから飽和まで、例えば、室温における飽和または３Ｍ、２．５Ｍもしくは２Ｍまでである。糖濃度または複数種の糖が存在する場合の合計糖濃度は、０．５から２Ｍであってよい。複数種の糖が存在する場合、個々の糖は０．２Ｍ、０．３Ｍ、０．４Ｍ、０．５Ｍ、０．６Ｍ、０．７５Ｍ、０．９Ｍ、１Ｍまたは２Ｍから飽和まで、例えば、室温における飽和または３Ｍ、２．５Ｍもしくは２Ｍまでの濃度で存在してよい。
【０１１３】
乾燥用水溶液中のＰＥＩの濃度は、一般的にＭｎに基づいて２０μＭ以下、または好ましくは１５μＭ以下である。ＰＥＩ濃度は、Ｍｗに基づいて１０μＭ以下であってよい。ＰＥＩのこのような濃度は、生物活性の保存に特に有効である。
【０１１４】
本発明の好ましい実施形態において、ＰＥＩは、Ｍｎに基づいて５μＭ未満、５００ｎＭ未満、１００ｎＭ未満、４０ｎＭ未満、２５ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、５ｎＭ未満、１ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、０．２５ｎＭ未満、０．１ｎＭ未満、０．０７５ｎＭ未満、０．０５ｎＭ未満、０．０２５Ｎｍ未満または０．００２５ｎＭ未満の濃度で提供される。通常、ＰＥＩ濃度は、Ｍｎに基づいて０．００２５ｎＭ以上、０．０２５ｎＭ以上または０．１ｎＭ以上である。適切なＰＥＩ濃度は、Ｍｎに基づいて、０．００２５ｎＭと５μＭとの間または０．０２５と２００ｎＭとの間の範囲である。さらに好ましい濃度の範囲は、０．１ｎＭおよび５μＭならびに０．１ｎＭと２００ｎＭとの間である。
【０１１５】
好ましくは、ＰＥＩ濃度は、Ｍｗに基づいて５μＭ未満、１μＭ未満、０．１μＭ未満、０．０１μＭ未満、５ｎＭ未満、４ｎＭ未満、２ｎＭ未満、１ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、０．２５ｎＭ未満、０．１ｎＭ未満、０．０５ｎＭ未満、０．０２ｎＭ未満、０．００２ｎＭ未満または０．１ｎＭ未満である。通常、ＰＥＩ濃度は、Ｍｗに基づいて０．００００１ｎＭ以上、０．００１ｎＭ以上または０．０１ｎＭ以上である。適切なＰＥＩ濃度範囲は、Ｍｗに基づいて０．００００１と２０ｎＭとの間、０．０００１と２０ｎＭとの間または０．０００１と５ｎＭとの間である。
【０１１６】
通常、比較的高分子量のＰＥＩは、比較的低分子量のＰＥＩより低濃度で有効であることが見出されている。したがって：
比較的高いＭｗ例えば、２０から１０００ｋＤａの範囲のＰＥＩを使用する場合、Ｍｗに基づいて０．００１ｎＭと５ｎＭとの間のＰＥＩ濃度が好ましい。比較的低いＭｗ、例えば３００Ｄａから１０ｋＤａの範囲のＰＥＩを使用する場合、０．０００１μＭと１０μＭとの間のＰＥＩ濃度が好ましい。
比較的高いＭｎ、例えば２０から１０００ｋＤａの範囲のＰＥＩを使用する場合、Ｍｎに基づいて０．００１ｎＭと１００ｎＭとの間のＰＥＩ濃度が好ましい。比較的低いＭｎ例えば、１Ｄａから１０ｋＤａの範囲のＰＥＩを使用する場合、０．０００１μＭと１０μＭとの間のＰＥＩ濃度が好ましい。
【０１１７】
一実施例において、活性薬剤と初めに接触させる保存用混合物は、Ｍｎに基づいて２μＭ未満の濃度のＰＥＩおよび少なくとも０．１Ｍ、少なくとも０．２Ｍ、少なくとも０．３Ｍ、少なくとも０．４Ｍ、少なくとも０．５Ｍ、少なくとも０．７５Ｍ、少なくとも０．９Ｍ、少なくとも１Ｍまたは少なくとも２Ｍの濃度の１種または複数種の糖の溶液を含む。
【０１１８】
１種または複数種の糖の溶液が２種以上の糖を含む場合、ＰＥＩの最も有効な濃度は、保存用混合物に使用される、特定の型の糖に依存すると思われる。例えば、２種以上の糖の一方がショ糖であり、他方がスタキオースである場合、Ｍｎに基づいて２μＭ未満の濃度のＰＥＩ、特に０．０２５ｎＭと２μＭとの間の濃度のＰＥＩが保存に有効である。好ましい実施形態において、本発明の方法は、活性薬剤と、（ｉ）これらの糖の一方がショ糖であり、他方がスタキオースである、１種または複数種の糖、および（ｉｉ）Ｍｎに基づいて２μＭ未満の濃度のＰＥＩの水溶液とを混合するステップを含む。
【０１１９】
２種以上の糖の水溶液が、ショ糖およびラフィノースの水溶液を含む場合、ＰＥＩの好ましい濃度は２μＭ未満または０．００２５ｎＭと２μＭとの間の範囲であることが見出される。したがって、さらなる実施形態において、本発明の方法は、活性薬剤と、（ｉ）ショ糖およびラフィノースならびに（ｉｉ）０．００２５ｎＭと２μＭとの間の濃度のＰＥＩの水溶液とを混合するステップを含む。好ましくは、比較的高い分子量、例えばＭｎに基づいて１０ｋＤａと１００ｋＤａとの間のＰＥＩを使用する場合、ＰＥＩ濃度はＭｎに基づいて０．１ｎＭと１００ｎＭとの間である。
【０１２０】
保存用混合物において２種の糖を組み合わせて使用する際、本発明者らは、活性薬剤の保存に関するこれらの糖のさまざまなモル濃度比の効果を調査した。１種の糖と別の糖との特定のモル濃度が特に有効であるが、正確な比は使用する糖の型に依存する。したがって、２種以上の糖の一方がショ糖を含む、本発明の一実施形態において、ショ糖と他の糖との濃度比は、３：７と９：１との間のモル濃度比であり、好ましくは少なくとも４：６、少なくとも５０：５０、少なくとも６：４、少なくとも７：３、少なくとも８：２または少なくとも９：１の比である。ショ糖およびスタキオースの場合、ショ糖：スタキオースが少なくとも３：７、少なくとも４：６、少なくとも５０：５０、少なくとも６：４、少なくとも７：３、少なくとも３：１、少なくとも８：２または少なくとも９：１のモル濃度比であることにより、特に有効に保存されることが実証された。好ましくは、２種以上の糖の溶液は、５０：５０および８：２の間のモル濃度比であるショ糖およびスタキオースの溶液を含む。
【０１２１】
さらなる実施形態において、本発明の保存用混合物は、（ｉ）糖の一方がショ糖であり、ショ糖と他の糖との濃度が３：７と９：１との間のモル濃度比である２種以上の糖、ならびに（ｉｉ）１００ｎＭ未満またはＭｎに基づいて０．０２５ｎＭと１００ｎＭとの間の濃度のＰＥＩの水溶液を含む。
【０１２２】
保存
本発明の保存技術は、乾燥、凍結および／または熱チャレンジに対する活性薬剤の保存に特に適切である。活性薬剤の保存は、本発明の保存用混合物と混合した活性薬剤を乾燥させることによって達成される。乾燥において、非結晶性固体が形成される。「非結晶」は、非構造的および可能な規則的または反復する分子の組織を有さないこと（すなわち、非結晶質）を意味する。
【０１２３】
通常、乾燥は、フリーズドライ、急速凍結、真空乾燥、スプレイドライまたはスプレイフリーズドライによって達成される。スプレイフリーズドライ特にフリーズドライが好ましい。材料から水分を除去し、バイアルに材料を密閉することによって、材料は容易に保存し、輸送し、その元の形態に再構成できる。したがって、活性薬剤は、冷蔵の必要なく、周囲温度において安定な形態で保存し輸送できる。
【０１２４】
フリーズドライ
フリーズドライは、傷みやすい材料を保存または材料をより輸送に便利にする脱水方法である。フリーズドライは、固体タンパク質およびワクチン医薬品を製造するための鍵となるステップを表す。しかし、生物材料は、この手順の間に凍結ストレスおよび乾燥ストレスに供され、これらのストレスはタンパク質をアンフォールディングまたは変性させる可能性がある。さらに、凍結生物材料からの水蒸気の拡散率は非常に低く、したがって、この方法は時間がかかる。本発明の保存技術は、フリーズドライ手順の乾燥および／または熱のストレスに対して生物材料を保護できる。
【０１２５】
この技術には３つの主な段階、凍結、一次乾燥および二次乾燥がある。凍結は、通常フリーズドライ機械を使用して実施される。このステップにおいて、生物材料を、材料の固体相と液体相が共存できる最も低い温度であるその共結晶点以下で冷却することが重要である。このことが、次のステップにおいて融解ではなく昇華が起こるであろうことを確実にする。または、非結晶材料は共結晶点を有さないが、生成物が、それ以下では一次乾燥および二次乾燥の間のメルトバックまたは崩壊が防止されるように維持されるはずの臨界点も有さない。
【０１２６】
一次乾燥の間、圧力を低くし、水が昇華するために十分な熱を材料に供給する。材料中の約９５％の水がこの段階で昇華する。過剰な加熱は生物材料の構造を分解または変化させ得るので、一次乾燥はゆっくりでよい。圧力を管理するために、昇華を加速する部分真空を適用する。冷却室および／または冷却プレートは、表面に水蒸気を再凝固させる。
【０１２７】
二次乾燥過程において、吸着された水分子は凍結過程の間に昇華される。温度は、第１の乾燥相より高く上昇させ、水分子と凍結生物材料との間に形成されるいかなる物理化学的相互作用も破壊する。通常、昇華を促進するために圧力も低くする。フリーズドライ過程の完了後、窒素などの不活性ガスを用いて真空を破り、その後材料を密閉する。
【０１２８】
急速凍結
一実施形態において、混合物を凍結することによって、例えば急速凍結することによって乾燥を達成する。「急速凍結」という用語は、事実上瞬間的な凍結、例えば、生成物を液体窒素に入れることによって達成される。いくつかの実施形態において、急速凍結は、完了に１から２秒未満で完了する凍結ステップを指す。
【０１２９】
真空乾燥
特定の実施形態において、乾燥は約１３００Ｐａにおける真空乾燥を使用して実施する。しかし、真空乾燥は本発明に必須ではなく、他の実施形態において、ポリペプチドと接触させた保存用混合物を回転させる（すなわち、回転乾燥）または（下記にさらに述べるように）フリーズドライさせる。有利なことには、本発明の方法は、活性薬剤を含有する保存用混合物を真空に供するステップをさらに含む。便利なことには、真空は、２０，０００Ｐａ以下、好ましくは１０，０００Ｐａ以下の圧力で適用される。有利なことには、真空は少なくとも１０時間の期間、好ましくは１６時間またはそれ以上の期間適用される。当業者に公知なように、真空適用期間は、試料、使用する機械および他のパラメーターの大きさに依存するであろう。
【０１３０】
スプレイ乾燥およびスプレイフリーズドライ
別の実施形態において、乾燥は、本発明の保存用混合物と混合した活性薬剤を、スプレイ乾燥またはスプレイフリーズドライすることによって達成される。これらの技術は当業者に周知であり、ガス、例えば空気、無酸素ガスもしくは窒素またはスプレイフリーズドライの場合液体窒素を通して液体飼料を乾燥する方法を含む。液体飼料は、液滴のスプレイに霧化される。次いで、液滴は乾燥室においてガスと、または液体窒素と接触させられる。
【０１３１】
非結晶性固体マトリックス
活性薬剤および保存用混合物の混合物を乾燥させ、非結晶性固体マトリックスを形成させる。混合物をさまざまな残留水分含有量に乾燥させ、冷蔵温度を超える、例えば、約４℃から約４５℃の範囲内または冷蔵温度を下回る、例えば、約０℃から−７０℃またはそれ以下の範囲内の長期保存を提供する。したがって、非結晶性固体マトリックスは、重量で５％以下、４％以下または２％以下の水分含有量を有する。
【０１３２】
本発明の一実施形態において、非結晶固体は乾燥粉末の形態で得られる。非結晶固体は、易流動性粒子の形態をとることができる。非結晶固体は、密閉されたバイアル、アンプルまたは注射器中の粉末として、通常提供される。吸入用の場合、粉末は乾燥粉末吸入器中に提供できる。または、非結晶固体マトリックはパッチとして提供できる。
【０１３３】
固体支持体上への乾燥
本発明のさらなる実施形態において、活性薬剤を含む混合物は、固体支持体上に乾燥される。固体支持体は、ビーズ、試験管、マトリックス、プラスチック支持体、マイクロタイターディッシュ、マイクロチップ（例えば、シリコン、シリコン−ガラスまたは金のチップ）または膜を含んでよい。別の実施形態において、本発明に従って保存された活性薬剤が乾燥されたまたは結合された固体支持体を提供する。
【０１３４】
ポリペプチドの保存の測定
ホルモン、成長因子、ペプチドまたはサイトカインなどのポリペプチドに関する保存は、乾燥、凍結、０℃以下、−５℃以下、−１０℃以下、−１５℃以下、−２０℃以下または−２５℃以下の温度、フリーズドライ、室温、−１０℃より高い、−５℃より高い、０℃より高い、５℃より高い、１０℃より高い、１５℃より高い、２０℃より高い、２５℃より高いまたは３０℃より高い温度条件への曝露の下の、物理的または化学的分解、凝集および／または細胞成長、細胞増殖または細胞の分化を刺激する能力、細胞シグナル伝達経路、結合ホルモン受容体または抗体結合のための保存エピトープを促進する能力などの生物活性の消失に対するポリペプチドの耐性を指す。ポリペプチドの保存は、多数の異なる方法において測定できる。例えば、ポリペプチドの物理的安定性は、濁度もしくは色の外観検査、および／または例えば、ＵＶ光散乱もしくはサイズ排除クロマトグラフィーによって測定される清澄度によって決定される、凝集、沈殿および／または変性の検出手段を使用して測定できる。
【０１３５】
ポリペプチドの生物活性の保存の評価は、評価される生物活性の型に依存するであろう。例えば、細胞増殖を刺激する成長因子の能力は、当分野において周知のさまざまな技術（Ｓ期の細胞をモニターする細胞培養アッセイまたは塩基類似体（例えば、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の組込みなど）を使用して細胞増殖における変化の指標として評価できる。細胞増殖または細胞分化のさまざまな態様は、免疫蛍光法、免疫沈降法、免疫組織化学法などの技術を使用してモニターできる。
【０１３６】
エピトープの保存および抗体−ポリペプチド複合体の形成の評価は、免疫アッセイ、例えば酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用して決定できる。
【０１３７】
本発明の保存ポリペプチドの使用
保存ポリペプチドの非結晶形態は、ポリペプチドを長期間保存可能にし、ポリペプチドの保存期間を最大にできる。ポリペプチドの効力および有効性は維持される。本発明に従って保存されたポリペプチドを投入する具体的な使用はポリペプチドの性質に依存する。しかし、通常ポリペプチドの水溶液は、ポリペプチドの使用前に、ポリペプチドを組み込む乾燥非結晶性固体マトリックスから再構成される。
【０１３８】
ホルモン、成長因子、ペプチドまたはサイトカインなどの治療用ポリペプチドの場合、ポリペプチドの水溶液は、例えば、注射用滅菌水またはリン酸緩衝生理食塩水を、保存ポリペプチドを含む粉末に加えることによって再構成できる。次いで、ポリペプチドの溶液を、標準的技術に従って患者に投与できる。投与は、非経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮、肺経路経由を含む任意の適切な様式による、またはカテーテルによる適切な直接注入によることができる。投与の用量および頻度は、患者の年齢、性別および病態、他の薬剤の同時投与、禁忌ならびに臨床医により考慮に入れられるべき他のパラメーターに依存するであろう。
【０１３９】
一般的に、本発明に従って保存された治療用ポリペプチドは、薬理学的に適切な担体と一緒に精製された形態で利用される。通常、これらの担体は、水性またはアルコール性／水性の溶液、乳剤または懸濁液、生理食塩水および／または緩衝化された媒体を含む任意のものを含む。非経口のビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウムならびに乳酸加リンゲルを含む。懸濁液中でポリペプチド複合体を維持する必要がある場合、適切な、生理学的に許容できるアジュバントは、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリジン、ゼラチンおよびアルギン酸塩などの増粘剤から選択することができる。静脈内ビヒクルは、リンゲルデキストロースに基づくものなどの、液体ならびに栄養補給および電解質補給を含む。保存料および抗菌剤、酸化防止剤、キレート剤および不活性ガスなどの他の添加剤もまた存在してよい。
【０１４０】
上記のように本発明に従って保存された他のポリペプチドは、診断薬として使用される。
【０１４１】
抗体または抗原結合断片の保存の測定
抗体または抗原結合断片に関する保存は、乾燥、凍結、０℃以下、−５℃以下、−１０℃以下、−１５℃以下、−２０℃以下または−２５℃以下の温度、フリーズドライ、室温、−１０℃より高い、−５℃より高い、０℃より高い、５℃より高い、１０℃より高い、１５℃より高い、２０℃より高い、２５℃より高いまたは３０℃より高い温度条件への曝露の下の、物理的もしくは化学的分解および／またはタンパク質の凝集または分解などの生物活性の消失、抗原結合能力、標的を中和する、免疫応答を刺激する、エフェクター細胞を刺激する、補体経路を活性化させる能力の消失に対する抗体または抗原結合断片の耐性を指す。
【０１４２】
抗体またはそれらの抗原結合断片の保存は、多数の異なる方法において測定できる。
【０１４３】
例えば、抗体の物理的安定性は、濁度もしくは色の外観検査、および／または例えば、ＵＶ光散乱もしくはサイズ排除クロマトグラフィーによって測定される清澄度によって決定される、凝集、沈殿および／または変性の検出手段を使用して測定できる。
【０１４４】
抗体または抗原結合断片の化学的安定性は、抗体または断片の化学的に改変された形態の検出および定量によって評価できる。例えば、抗体または断片のサイズの変化は、サイズ排除クロマトグラフィー、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび／またはマトリックス支援レーザー脱離イオン化法／飛行時間質量分析法（ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ  ＭＳ）を使用して評価できる。荷電変化を含む化学的改変の他の型は、当分野において公知の技術、例えば、イオン交換クロマトグラフィーまたは分画電気泳動を使用して評価できる。
【０１４５】
抗体または抗原結合断片の生物活性の保存は、抗体または抗原結合断片の能力、例えば、抗原に結合する、免疫応答を上昇させる、標的（例えば病原体）を中和する、エフェクター機能を促進する（例えば、オプソニン化、貪食、脱顆粒、サイトカインまたはサイトトキシンの放出）または補体経路を活性化する能力を測定することによって評価できる。このような生体機能を測定する適切な技術は当分野において周知である。例えば、抗体または抗原結合断片の生体機能を試験するために動物モデルを使用してもよい。例えば、抗原結合能力を検出するために、免疫アッセイなどの抗原結合アッセイが使用できる。
【０１４６】
２種のタンパク質部分間の結合を検出するための当分野において公知の任意の方法によって、試料中で抗体が抗原に結合するかどうかの決定を実施できる。結合は、結合が起こったときに変化する、分光化学的変化などの抗体または抗原どちらかの特徴を測定するによって決定できる。保存抗体または抗原結合断片の抗原と結合する能力は、参照抗体（例えば、保存抗体または抗原結合断片と同じ特異性を有する、本明細書に記載された方法に従って保存されていない抗体）と比較できる。
【０１４７】
一般的に、抗体−抗原の結合を検出する方法は、水溶液において実施される。特定の実施形態において、抗体または抗原は固体支持体に固定される。通常、このような支持体は、マイクロタイタープレートのウェル表面などの、この方法を実施する容器の表面である。他の実施形態において、支持体は、シート（例えば、ニトロセルロースまたはナイロンシート）またはビーズ（例えば、セファロースまたはラテックス）であってよい。
【０１４８】
好ましい実施形態において、保存抗体試料は固体支持体（上記のような支持体など）に固定される。支持体を抗原に接触させた時、抗体は抗原と結合し、複合体を形成できる。場合によって、その後固体支持体の表面を洗浄し、抗体に結合されない任意の抗原を除去する。次いで、抗体が抗原と結合することを示す、固体支持体に結合された抗原の存在（抗体との結合を介して）が決定できる。このことは、例えば、固体支持体（支持体に結合される抗原を有していても、有していなくてもよい）を抗原と特異的に結合する薬剤と接触させることによって実施することができる。
【０１４９】
通常、この薬剤は、特異的な様式で抗原と結合できる第２の抗体であり、一方、抗原は、さらに抗原と結合する、初めに固定された試料抗体と結合する。二次抗体は、検出可能な標識によって、直接または間接的のいずれかで標識できる。第２の抗体は、第２の抗体のＦｃ領域に特異的な第３の抗体と接触させることによって間接的に標識でき、第３の抗体は検出可能な標識を担持している。
【０１５０】
検出可能な標識の例は、（例えば、ホースラディッシュの）ペルオキシダーゼ、ホスファターゼなどの酵素、放射性元素、金（または他のコロイド金属）または蛍光標識を含む。酵素標識は、化学発光または発色に基づく系を使用して検出できる。
【０１５１】
独立した実施形態において、抗原は固体支持体に固定され、その後保存抗体を固定された抗原と接触させる。抗原−抗体複合体は、抗原と結合できる第２の抗体または固定された抗体を使用して測定できる。
【０１５２】
異種免疫アッセイ（非結合抗体または抗原を除去するステップを必要とする）または同種免疫アッセイ（このステップを必要としない）が、保存抗体または抗原結合断片の抗原と結合する能力を測定するために使用できる。異種アッセイとは対照的に、同種アッセイにおいて、候補抗体と抗原との結合相互作用は、アッセイの全要素が加えられた後でさらなる液体操作を必要とせずに分析できる。例は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）およびアルファスクリーン（Alpha Screen）を含む。競合的または非競合的異種免疫アッセイを使用できる。例えば、競合的免疫アッセイにおいて、試験試料中の非標識保存抗体は、公知の抗原結合能力の標識抗体（対照試料、例えば、乾燥、熱処理、フリーズドライおよび／または保存前にサンプリングされた抗体）と競合する能力によって測定できる。双方の抗体は、限定量の抗原との結合に対して競合する。非標識抗体の抗原結合能力は、測定された標識の量と反比例する。試料中の抗体が参照抗体と抗原の間の結合を阻害できる場合、このことは、このような抗体は抗原と結合できることを示している。
【０１５３】
本発明の保存抗体の抗原結合能力を測定するために適切な特定のアッセイは、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）などの酵素結合免疫アッセイ、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）などの同種結合アッセイ、蛍光偏光免疫測定法（ＦＰＩＡ）、微粒子酵素免疫測定法（ＭＥＩＡ）、化学発光磁気免疫アッセイ（ＣＭＩＡ）、アルファスクリーン表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）および抗体−抗原相互作用をアッセイする当業者に公知の他のタンパク質または細胞アッセイを含む。
【０１５４】
ＥＬＩＳＡアッセイを使用する一実施形態において、抗原を、本発明に従って保存抗体または抗原結合断片（または参照抗体、例えば本発明の方法に従って保存されていない抗体または抗原結合断片）で表面がコーティングされた固体支持体（例えば、マイクロタイタープレート）と接触させる。場合により、その後プレートをバッファーで洗浄し、非特異的結合抗体を除去する。抗原に結合できる二次抗体を、場合によりもう１度洗浄後、プレートに用いる。二次抗体は、検出可能な標識に直接または間接的に結合できる。例えば、二次抗体は、適切な基質を提供された場合、発色生成物を産生する酵素、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼと結合できる。
【０１５５】
独立した実施形態において、固体支持体は抗原でコーティングされ、保存抗体または抗原結合断片を固定抗原と接触させる。保存抗体のような抗原に特異的な抗体を使用して、抗原−抗体複合体を検出できる。
【０１５６】
さらなる実施形態において、保存抗体と標的との結合相互作用は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して分析される。ＳＰＲまたは生体分子相互作用分析（ＢＩＡ）は、任意の相互作用体を標識することなく、リアルタイムで生体特異的相互作用を検出する。ＢＩＡチップの結合表面における質量の変化（結合事象の表示）は表面近くの光の屈折率の改変（表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の光学現象）をもたらす。屈折性の変化は、生物分子間のリアルタイムの反応の指標として測定される、検出可能なシグナルを発生する。
【０１５７】
ＳＰＲからの情報を使用して、平衡解離定数（ＤＤ）、および生体分子と標的との結合に関するＫｏｎおよびＫｏｆｆを含む動力学的パラメーターの正確かつ定量的な測定をもたらす。
【０１５８】
通常、本発明に従って保存し、得られた生成物の３７℃、７日間のインキュベーション後の、抗体−抗原複合体を形成する抗体の能力は、このようなインキュベーション前または本発明に従った保存およびこのようなインキュベーションの直前のこのような複合体を形成する抗体の能力の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％である。
【０１５９】
保存抗体またはそれらの抗原結合断片の使用
保存抗体またはそれらの抗原結合断片は、インビボの治療および予防適用、インビトロおよびインビボの診断適用およびインビトロのアッセイならびに試薬適用に用いることができる。
【０１６０】
診断適用において、血液、尿、唾液、痰、胃液などの体液、他の血液成分、尿もしくは唾液または体組織を、保存抗体または抗原結合断片と結合する抗原の存在および量に関してアッセイできる。アッセイは、当分野において公知の多数の日常的な方法、免疫アッセイ（例えばＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ）などによって実施できる。
【０１６１】
例えば、体液の試料を、抗体および抗原結合抗体の検出のためのマーカー系を含有するアッセイ混合物に加えることができる。試験試料を使用して得られた結果と対照試料を使用して得られた結果を比較することによって、特定の疾患または病態に特異的な抗原の存在を決定することができる。特定の疾患または病態に付随する抗原を、定性的または定量的に決定するこのような方法は、その疾患または病態の診断に使用できる。
【０１６２】
ウェスタン分析および標準的免疫化学的手順によるインサイツのタンパク質検出などの他の技術を診断適用に使用でき、保存抗体または抗原結合断片が使用された特定の技術に適切に標識できる。保存抗体または抗原結合断片は、樹脂などのクロマトグラフィーの支持体と複合体を形成する場合、アフィニティクロマトグラフィーの手順にも使用できる。
【０１６３】
診断適用は、病院、医局および診療所、民間の参考検査室、血液バンクおよび家庭におけるヒト臨床検査を含む。非ヒトの診断適用は、食品試験、水質試験、環境試験、生体防御、動物試験およびバイオセンサー内を含む。
【０１６４】
保存抗体または抗原結合断片は、薬剤開発、基礎研究および学術研究などの研究適用にも使用できる。最も一般的には、抗体は、細胞内および細胞外のタンパク質を特定し位置付けするための研究適用に使用される。本明細書に記載の保存抗体または抗原結合断片は、フローサイトメトリ、免疫沈降、ウェスタンブロット、免疫組織化学法、免疫蛍光法、ＥＬＩＳＡまたはＥＬＩＳＰＯＴなどの一般的研究室技術に使用できる。
【０１６５】
診断、治療または研究適用に使用される保存抗体または抗原結合断片は、固体支持体上で保存できる。診断適用において、例えば、体液（血液、尿、唾液、痰、胃液など）などの患者の試料を、本明細書に記載の方法に従って、患者試料および固体支持体（例えば、マイクロタイタープレート、シートまたはビーズ）上の本発明の保存用混合物を含む混合物を乾燥させることによって保存できる。その後、保存された患者試料（例えば血清）を、試料中の抗体の存在に関して、例えば、ＥＬＩＳＡなどの免疫アッセイを使用して試験できる。
【０１６６】
または、対象の抗体または抗原結合断片は、本明細書に記載の方法に従って、抗体または抗原結合断片および本発明の保存用混合物を含む混合物を乾燥させることによって、固体支持体上に保存できる。患者試料は、対象の抗体または抗原結合断片を結合させた固体支持体を接触させることによって、特定の抗原の存在に関して試験できる。抗原−抗体複合体の形成は、測定可能なシグナルを誘発できる。形成された抗原−抗体の存在および／または量を使用し、疾患、感染または病態の存在を示し、予後を提供できる。
【０１６７】
治療適用に関して、本明細書に記載の保存抗体または抗原結合断片は、通常炎症状態、アレルギー性過敏症、がん、細菌またはウィルス感染および／または自己免疫疾患（例えば、限定するものではないが、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、クローン病および重症筋無力症を含む）の予防、抑制または治療における使用を見出すであろう。
【０１６８】
抗体はそれ自体が治療薬であり得、または治療薬もしくは特定の細胞型、組織もしくは位置に対する他の部分を標的とすることができる。一実施形態において、本発明の保存抗体または抗原結合断片は、さまざまな疾患または病態の治療のために、放射線同位元素、毒素、薬剤（例えば、化学治療薬）、酵素、プロドラッグまたはリポソームと結合できる。
【０１６９】
酵素保存の測定
酵素に関する保存は、乾燥、凍結、０℃以下、−５℃以下、−１０℃以下、−１５℃以下、−２０℃以下または−２５℃以下の温度、フリーズドライ、室温、−１０℃より高い、−５℃より高い、０℃より高い、５℃より高い、１０℃より高い、１５℃より高い、２０℃より高い、２５℃より高いまたは３０℃より高い温度条件への曝露の下の、物理的分解および／またはタンパク質分解、触媒活性の低下などの生物活性の消失、基質結合能力の消失、生成物産生、酵素の有効性（例えば、ｋｃａｔ／Ｋｍの減少）または反応速度の低下に対する酵素の耐性を指す。酵素の保存は、多数の異なる方法で測定できる。例えば、酵素の物理的安定性は、凝集、沈殿および／または変性の検出手段を使用して測定でき、例えば、濁度の外観検査または色および／または透明度の外観検査によって決定でき、ＵＶ光散乱またはサイズ排除クロマトグラフィーによって測定できる。
【０１７０】
酵素の触媒活性の保存は、時間に伴う基質の消費または生成物の産生を測定するための酵素アッセイを使用して評価できる。保存酵素の触媒活性は、本発明に従って保存されていない、同じ特異性を有する参照酵素と比較できる。
【０１７１】
酵素反応の基質、生成物または補因子の放射線同位元素、蛍光または化学発光の組込み、またはこのような基質、生成物または補因子と結合する物質における変化を使用して、このようなアッセイにおいて酵素の触媒活性をモニターできる。
【０１７２】
例えば、連続酵素アッセイ（例えば、分光光度測定アッセイ、蛍光分析アッセイ、熱量アッセイ、化学発光アッセイまたは光散乱アッセイ）または非連続酵素アッセイ（例えば、放射分析アッセイまたはクロマトグラフィーアッセイ）が使用できる。連続アッセイとは対照的に、非連続アッセイは、特定の間隔での酵素反応のサンプリングおよびこれらの試料中の生成物産生または基質消費の量の測定を含む。
【０１７３】
例えば、分光光度アッセイは、生成物および反応体の間の光の吸光度の変化の測定を含む。このようなアッセイは、連続的に反応速度を測定可能にし、吸光度の変化をもたらす酵素反応に適切である。分光光度アッセイの型は、モニタリングする特定の酵素／基質反応に依存するであろう。例えば、補酵素のＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨは、それらの還元型でＵＶ光を吸収するが、酸化型では吸収しない。したがって、ＮＡＤＨを基質として使用するオキシドレダクターゼは、次に来る補酵素を消費するＵＶ吸光度の減少によってアッセイできる。
【０１７４】
放射分析アッセイは、（試料の除去およびカウントを必要とする）酵素反応の間の、時間に伴い産生される生成物の量を測定するための、放射活性の組込みまたは放出を含む。これらのアッセイにおける使用に適切な放射性同位元素の例は、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｃおよび１２５Ｉを含む。質量分析法などの技術を使用し、基質が生成物に変換され、安定な同位元素の組み込みまたは放出をモニターできる。
【０１７５】
クロマトグラフィーアッセイは、反応混合物をクロマトグラフィーによってその成分に分離することによって、生成物の形成を測定する。適切な技術は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および薄層クロマトグラフィーを含む。
【０１７６】
蛍光分析は、基質と生成物の蛍光の差を使用して酵素反応を測定する。例えば、還元型は蛍光性であり、酸化型は非蛍光性であると思われる。このような酸化反応において、反応後は蛍光が減少する。還元反応は、蛍光の増加によってモニターできる。酵素触媒反応において蛍光色素を放出する合成基質もまた使用できる。
【０１７７】
化学発光アッセイは、光の放射を含む酵素反応に使用できる。このような放射は、生成物形成の検出に使用できる。例えば、酵素のルシフェラーゼに関与する酵素反応は、その基質であるルシフェリンからの光の発生を含む。光の放射は、ルミノメーターまたは改良された光学顕微鏡などの光感受性装置によって検出できる。
【０１７８】
本発明の保存酵素の使用
保存酵素の非結晶型は、酵素の長期保存を可能にし、酵素の保存期間を最大にする。酵素の効力および有効性は維持される。本発明に従って保存された酵素を投入する具体的な使用は酵素の性質に依存する。しかし、通常、酵素の水溶液は、酵素の使用前に、酵素を組み込む乾燥非結晶性固体マトリックスから再構成される。
【０１７９】
治療用酵素の場合、例えば、酵素の水溶液は、例えば注射用水またはリン酸緩衝生理食塩水を、保存酵素を含む乾燥粉末に加えることによって再構成できる。次いで、酵素の溶液を、標準的技術に従って患者に投与できる。投与は、非経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮、肺経路経由を含む任意の適切な様式による、またはカテーテルによる適切な直接注入によることもできる。投与の用量および頻度は、患者の年齢、性別および病態、他の薬剤の同時投与、禁忌ならびに臨床医により考慮に入れられるべき他のパラメーターに依存するであろう。
【０１８０】
一般的に、本発明に従って保存された治療用酵素は、薬理学的に適切な担体を一緒に精製された形態で利用される。通常、これらの担体は、水性またはアルコール性／水性の溶液、乳剤または懸濁液、生理食塩水および／または緩衝化された媒体を含む任意のものを含む。非経口のビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウムならびに乳酸加リンゲルを含む。懸濁液中でポリペプチド複合体を維持する必要がある場合、適切な、生理学的に許容できるアジュバントは、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリジン、ゼラチンおよびアルギン酸塩などの増粘剤から選択することができる。静脈内ビヒクルは、リンゲルデキストロースに基づくものなどの、液体ならびに栄養補給および電解質補給を含む。保存料および抗菌剤、酸化防止剤、キレート剤および不活性ガスなどの他の添加剤もまた存在してよい。
【０１８１】
本発明に従った他の酵素は、上記のように、診断薬として、バイオセンサーにおいて、ブドウ糖および果糖などの大量生産品の生産において、食品加工および食品分析において、洗濯および自動食器洗い用洗剤において、繊維製品、パルプ、製紙および動物飼料の工業において、精製化学工業品の合成における触媒として、臨床診断または遺伝子操作などの研究用途に使用できる。
【０１８２】
ワクチン免疫原保存の測定
ワクチン免疫原に関する保存は、乾燥、凍結、０℃以下、−５℃以下、−１０℃以下、−１５℃以下、−２０℃以下または−２５℃以下の温度、フリーズドライ、室温、−１０℃より高い、−５℃より高い、０℃より高い、５℃より高い、１０℃より高い、１５℃より高い、２０℃より高い、２５℃より高いまたは３０℃より高い温度条件下の、物理的もしくは化学的分解および／またはタンパク質分解などの生物活性の消失、細胞性もしくは液性免疫応答を刺激する能力の消失、抗体産生を刺激するまたは抗体と結合する能力の消失に対するワクチン免疫原の耐性を指す。
【０１８３】
ワクチン免疫原の保存は、多数の異なる方法で測定できる。例えば、抗原性は、免疫原特異的抗体と結合するワクチン免疫原の能力を測定することによって評価できる。このことは、当分野において公知のさまざまな免疫アッセイにおいて試験でき、ワクチン免疫原に対する抗体を検出できる。通常、抗体に関する免疫アッセイは、保存ワクチン免疫原（または本発明の方法に従って保存されていないワクチン免疫原の参照試料）などの試験試料の選択および調製、ならびにその後の、抗原−抗体複合体の形成が可能な条件下で、問題となっている免疫原に特異的な抗血清と一緒にインキュベートすることを含むであろう。
【０１８４】
さらに、インフルエンザヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼに対する抗体は、ヘマグルチニン阻害試験およびノイラミニダーゼ阻害試験、赤血球を使用する凝集アッセイにおいて、または一元放射拡散法（ＳＲＤ）を使用して日常的にアッセイできる。ＳＲＤは、支持アガロースゲルマトリックスにおける抗原とその同種抗体の間の可視反応の形成に基づく。ウィルス免疫原はゲルに組み込まれ、同種抗体は、固定免疫原を介して適用された点から放射上に拡散できる。測定可能なオパール色のゾーンが、得られた抗原−抗体複合体により生み出される。
【０１８５】
保存ワクチン免疫原の使用
本発明の保存ワクチン免疫原は、ワクチンとして使用される。例えば、保存されたサブユニットワクチン免疫原、結合型ワクチン免疫原またはトキソイド免疫原は、それぞれサブユニットワクチン、結合型ワクチンまたはトキソイドワクチンとしての使用に適している。ワクチンとして、本発明の保存ワクチン免疫原は、限定するものではないが、ウィルス感染、限定するものではないが、ウィルス、動物または昆虫誘発性毒性を含むウィルス感染の後遺症、がんおよびアレルギーを含む多数の病態の治療または予防のために使用できる。このような抗原は、宿主の免疫系を刺激し、液性および／または細胞性の抗原特異的応答を生み出すであろう１つまたは複数のエピトープを含有する。
【０１８６】
本発明の保存ワクチン免疫原は、ヒトパピローマウィルス（ＨＰＶ）、ＨＩＶ、ＨＳＶ２／ＨＳＶ１、インフルエンザウィルス（Ａ、ＢおよびＣ型）、パラインフルエンザウィルス、ポリオウィルス、ＲＳＶウィルス、ライノウィルス、ロタウィルス、Ａ型肝炎ウィルス、ノーウォークウィルス、エンテロウィルス、アストロウィルス、麻疹ウィルス、ムンプスウィルス、帯状疱疹ウィルス、サイトメガロウィルス、エプスタイン−バーウィルス、アデノウィルス、風疹ウィルス、ヒトＴ細胞リンパ腫Ｉ型ウィルス（ＨＴＬＶ−Ｉ）、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウィルス、ポックスウィルス、ワクチニアウィルスなどのウィルスによる感染の予防または治療に、ワクチンとして使用できる。ワクチンはさらに、口蹄疫（血清型Ｏ、Ａ、Ｃ、ＳＡＴ−１、ＳＡＴ−２、ＳＡＴ−３およびＡｓｉａ−１を含む）、コロナウィルス、ブルータング、ネコ白血病ウィル、鶏インフルエンザ、ヘンドラウィルスおよびニパウィルス、ペスチウィルス、イヌパルボウィルスおよびウシウィルス性下痢ウィルスなどの多数の家畜の疾患に対する適切な免疫応答を提供するために使用できる。または、ワクチンは、動物、昆虫誘発性毒性（例えば、ヘビ毒または他の動物毒により誘発される）に対する適切な免疫応答を提供するために使用できる。一実施形態において、ワクチンは多価ワクチンである。
【０１８７】
本発明のワクチン組成物は、１種または複数種の糖およびＰＥＩを含有する、本発明の保存用混合物と混合されたワクチン免疫原を含む。ワクチン組成物は、適切なバッファーおよび抗生物質、アジュバントなどの添加物または免疫系の特定の細胞に対するワクチン免疫原の提示を強化する他の分子を、さらに含むことができる。
【０１８８】
当分野において周知のさまざまなアジュバントは、ワクチンの効力を増加するため、および／または液性および細胞性の免疫応答を調整するために使用できる。適切なアジュバントは、限定するものではないが、水中油型乳剤含有アジュバントまたは油中水型アジュバント、鉱物油など、アルミニウムに基づくアジュバント、スクワレン／リン酸塩に基づくアジュバント、完全／不完全フロイントアジュバント、サイトカイン、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）および免疫刺激剤として作用し、ワクチンの有効性を強化する任意の他の物質を含む。アルミニウムに基づくアジュバントは、リン酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウムを含む。ＩＳＣＯＭは、コレステロール、脂質および／またはサポニンを含むことができる。ＩＳＣＯＭは、広範囲の全身性免疫応答を誘発できる。
【０１８９】
本発明のワクチン組成物は、適切な保存を提供し、調製品の保存期間を最大にするためにフリーズドライ（凍結乾燥）形態であってよい。フリーズドライ（凍結乾燥）形態は、ワクチンの長期間の備蓄を可能にし、免疫原性、効力および有効性の維持に役立つ。本発明の保存用混合物は、フリーズドライ／凍結乾燥プロトコルの間に遭遇する乾燥および熱性のストレスに対するウィルス物質の保存に特に適している。したがって、保存用混合物は、収集後すぐにワクチン免疫原に加え、その後、試料をフリーズドライ手順に供することが適切である。
【０１９０】
本発明に従って調製されたワクチンの保存を測定するために、ワクチンの効力を当業者に周知の技術を使用して測定できる。例えば、細胞性または液性の免疫応答の発生を、適切な動物モデルにおいて、抗体の産生またはワクチンに対する免疫細胞応答をモニタリングすることによって試験できる。本発明の方法に従って調製されたワクチン試料の免疫応答を誘発する能力は、同じ保存技術に供されていないワクチンと比較できる。
【０１９１】
本発明は、以下の実施例により例示される。
【実施例】
【０１９２】
実施例１
カルシトニンの安定化
試料の調製
乾燥ｈＣＴ（ヒトカルシトニン）のバイアルをＳｉｇｍａ（コード  Ｔ３５３５）から入手し、個々の実験前に製造業者の記載する質量含有量を使用して、ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ）中で最終濃度３μｇ／μｌに再構成した。
糖、ショ糖およびラフィノース（糖混合物）およびＰＥＩ（Ｓｉｇｍａ  カタログ番号：Ｐ３１４３−水中５０％ｗ／ｖ溶液；Ｍｎ６０，０００）の水溶液を、４パート１．８２Ｍショ糖溶液：１パート０．７５Ｍラフィノース：１パートＰＥＩ（Ｍｎに基づき１５０ｎＭのＰＥＩ濃度）に調製した。５０μｌアリコートの賦形剤を、３μｌのｈＣＴに加え、容量をＰＢＳを用いて６０μｌにした。糖およびＰＥＩの最終濃度は：
ショ糖：１．０３Ｍ
ラフィノース：０．０９Ｍ
ＰＥＩ：２１ｎＭ（Ｍｎに基づき６０，０００）
であった。
【０１９３】
対照として、ＰＢＳを賦形剤の代わりに使用した。複数の６０μｌアリコートを以下のように試験のために調製した：
１．カルシトニンをＰＢＳに再懸濁し、凍結
２．カルシトニンをＰＢＳに再懸濁し、フリーズドライ
３．カルシトニン＋糖混合物をフリーズドライ
４．カルシトニン＋糖混合物をフリーズドライ＋加熱（４５℃、１６時間）
５．カルシトニン＋賦形剤をフリーズドライ（本発明）
６．カルシトニン＋賦形剤をフリーズドライおよび加熱処理（４５℃、１６時間）（本発明）
【０１９４】
６０μｌアリコートを、個別のガラスバイアル（Ａｄｅｌｐｈｉ  Ｇｌａｓｓ）に分配し、凍結またはフリーズドライした。バイアルを、Ｍｏｄｕｌｙｏ  Ｄフリーズドライ装置（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ）においてフリーズドライした。より具体的には、バイアルを、３０ｍｌの水を含有するフリーズドライトレイにおいて、−８０℃で、部分的にゴム栓をして凍結した。凍結したバイアルを、予備冷却したフリーズドライヤーのストッパリングシェルフ（stoppering shelf）に移し、１６時間乾燥させた。フリーズドライヤーから取り出す前に、真空下でゴム栓をバイアルに完全に下げた。
【０１９５】
その後、凍結およびフリーズドライの試料群双方のバイアルを、−２０℃において保存または熱チャレンジのいずれかに供した。その後、乾燥試料を、滅菌ｄｄＨ２Ｏ（再蒸留水）を使用して、それらの元の容量である６０μｌに再構成した。個々の溶液の５０μｌを、各段階の最初の希釈液として使用した。
【０１９６】
２．ＥＬＩＳＡプロトコル
ＮＵＮＣ  ＥＬＩＳＡプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）Ｓｕｒｆａｃｅ）を、ＰＢＳで１：２０００に希釈した１００μｌの精製ウサギ抗ヒトカルシトニンポリクロナール抗体（Ａｂｃａｍ、コードａｂ８５５３）を用いて、室温（ＲＴ）において２時間コーティングした。次いで、ウェルをＰＢＳで１回洗浄し、その後、１００μｌのブロッキングバッファー（５％ショ糖、５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のＰＢＳ中溶液；新に調製）で、４℃において一晩ブロックした。その後プレートを、ＰＢＳで３回洗浄した。
【０１９７】
段階希釈液の調製において、その後５０μｌのＰＢＳを各ウェルに加えた。上記の「試料の調製」のように調製した０．１５ｕｇ／ｍｌの濃度のｈＣＴ試料を、次いで５０μｌアリコートとして各希釈段階の最初のウェルに加え、初期濃度０．０７５ｕｇ／ｕｌとし、各段階２倍希釈した。すべてのウェルが５０μｌを含有するように、５０μｌの溶液を各段階の最終希釈点から廃棄した。その後プレートを室温において２時間インキュベートし、次いでＰＢＳで３回洗浄した。
【０１９８】
その後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識二次抗体を加えた。ＰＢＳで１：２０００に希釈した１００μｌの精製モノクロナールＨＲＰ標識マウス抗ｈＣＴ抗体（Ａｂｃａｍ、コードａｂ１１４８４）を各ウェルに加え、ＲＴにおいて２時間インキュベートした。その後、ウェルを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有する１００μｌのＰＢＳで１回洗浄し、次いでＰＢＳで５回洗浄した。
【０１９９】
その後、結合した活性ｈＣＴを定量した。１００μｌの新に調製された比色分析試薬混合物、ＴＭＢ（３，３’，５，５’テトラメチルベンジシン）およびＨ２Ｏ２を各ウェルに加え、その後暗所において３０分間インキュベートした。次いで、プレートを、自動プレートリーダーを使用して４５０ｎｍにおいて読み取り、光学密度（ＯＤ）の値をＥｘｃｅｌにエクスポートした。
【０２００】
３．結果および考察
図１に結果を要約する。図１は、試料を上記のように長期間熱チャレンジに供した後、ＥＬＩＳＡにより測定した、検出可能なｈＣＴの平均結果（波長４５０ｎｍにおけるＯＤを使用）を示す。１．０３Ｍのショ糖、０．０９Ｍのラフィノースおよび２１ｎＭのＰＥＩ（Ｍｎに基づく）の賦形剤を用いた場合、フリーズドライ試料の安定性が劇的に改善されたことが明らかに理解できる。興味深いことに、フリーズドライまたは熱チャレンジに供していないが、代わりに第２の凍結に供した陽性対照と比較して、糖およびＰＥＩの組合せが、フリーズドライ試料を実質的に保護する。
【０２０１】
実施例２
ヒト組換えＧ−ＣＳＦの保存
１．材料と方法
材料
リン酸化部位特異的ＥＲＫ１／２に対する抗体をＳｉｇｍａ（Ｄｏｒｓｅｔ、ＵＫ）から購入し、抗ＥＲＫ２は（Ｚｙｍｅｄ  ＵＫ）から入手した。ＰＥＩ（Ｍｎ６０，０００；Ｓｉｇｍａカタログ番号：Ｐ３１４３）、ショ糖（Ｓｉｇｍａ）、ラフィノース（Ｆｌｕｋａ）、ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ）、ガラスバイアル（Ａｄｅｌｐｈｉ  ｇｌａｓｓ）、ゴム栓（Ａｄｅｌｐｈｉ  ｇｌａｓｓ）およびＧ−ＣＳＦ（Ｓｉｇｍａ）。
【０２０２】
試料の調製
Ｇ−ＣＳＦの凍結乾燥試料を、１０μｇ／ｍｌの濃度に再構成した。１６０μｌのショ糖（１．８２Ｍ）および４０μｌのラフィノース（０．７５Ｍ）を、５０μｌのＰＥＩ（Ｍｎに基づき１５０ｎＭの濃度）と混合し、保存用混合物を完成させた。５０μｌの再構成Ｇ−ＣＳＦ溶液を加え、よく混合した。糖およびＰＥＩの最終濃度は：
ショ糖：０．９１Ｍ
ラフィノース：０．１２５Ｍ
ＰＥＩ：２５ｎＭ（Ｍｎに基づく）
【０２０３】
１００μｌアリコートの最終混合物を個別のバイアルに分配し、凍結またはフリーズドライした。凍結乾燥を、実施例１に記載のように一晩実施した。凍結およびフリーズドライ群の双方からの試料を、その後、−２０℃における保存または３７℃において７２時間の熱チャレンジのいずれかに供した。インキュベーション後、試料をＲＰＭＩ中で再構成し、その後使用した。
【０２０４】
組織培養
ＨＬ６０細胞（マイコプラズマ非感染が示されている）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および２ｍＭのグルタミン添加の、フェノールレッド含有ＲＰＭＩ１６４０において維持した。細胞を、週に１度継代し、培地は２〜３日ごとに補充した。
【０２０５】
細胞刺激アッセイ
刺激アッセイのために、ＨＬ６０細胞を採取し、６ウェルプレートの無血清培地に５×１０５／ウェルの密度で移した。２４時間後、細胞を、図２に示した（１００ｎｇ／ｍｌ  Ｇ−ＣＳＦ）および以下に示す処理で５分間刺激した：
図２パネルＡ：対照（血清飢餓＋ＰＢＳ）、ＵＴ  Ｇ−ＣＳＦ（未処理Ｇ−ＣＳＦ）および凍結融解Ｇ−ＣＳＦ（標準Ｇ−ＣＳＦと賦形剤とを混合し、凍結）試料。
図２パネルＢ：対照（血清飢餓＋ＰＢＳ）、ＵＴ  Ｇ−ＣＳＦ（未処理Ｇ−ＣＳＦ）および賦形剤／ＨＴ  Ｇ−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦと賦形剤とを混合し、加熱）試料。
図２パネルＣ：対照（血清飢餓＋ＰＢＳ）、ＵＴ  Ｇ−ＣＳＦ（未処理Ｇ−ＣＳＦ）およびＧ−ＣＳＦ賦形剤／ＦＤ（Ｇ−ＣＳＦと賦形剤とを混合し、フリーズドライ）試料。
図２パネルＤ：対照（血清飢餓＋ＰＢＳ）、ＵＴ  Ｇ−ＣＳＦ（未処理Ｇ−ＣＳＦ）およびＧ−ＣＳＦ賦形剤／ＦＤ／ＨＴ（Ｇ−ＣＳＦと賦形剤とを混合し、フリーズドライおよび加熱処理）試料。
【０２０６】
全細胞抽出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ナイロン膜に転写し、これらをリン酸化されたものに対し全ＥＲＫ１／２に対して抗体を用いて免疫プローブした。
【０２０７】
免疫ブロットのための全細胞抽出液の調製
細胞懸濁液を採取し（１０００ｒｐｍ、５分間）、氷冷ＰＢＳで洗浄した。次いで、細胞ペレットを抽出バッファー中（１％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ１００、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、５ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのフッ化ナトリウム、２ｍＭのＮａ３ＶＯ４および１錠のＣｏｍｐｌｅｔｅ（商標）阻害剤混合物（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）／１０ｍｌのバッファー）で溶解し、２６ゲージの針を６回通過させることによって均一化した。
【０２０８】
溶解物を氷上で１０分インキュベートし、その後遠心分離（４℃において、１４，０００ｒｐｍ、１０分間）によって浄化した。次いで、タンパク質濃度を、ＢＳＡ試薬（Ｂｉｏｒａｄ、Ｉｎｃ．）を使用して定量した。等量のタンパク質（５０ｍｇ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％ゲル）によって分解し、その後免疫ブロット分析に供した。抗原−抗体相互作用を、ＥＣＬ（Ｐｉｅｒｃｅ、ＵＫ）を用いて検出した。
【０２０９】
２．結果
結果を図２に示す。血清飢餓状態下で、７０〜８０％の細胞をＧ０で停止させた。リン酸化ＥＲＫ１／２のレベルの評価は、予想通り血清飢餓ビヒクル処理対照において発現の限定を示した。Ｇ−ＣＳＦ（天然）は、全ＥＲＫ１／２レベルに影響なくリン酸化の強化を示した。
さらに：
その後、Ｇ−ＣＳＦと保存用混合物（賦形剤）との混合物は、図２Ａで示したように、天然Ｇ−ＣＳＦと同様のプロファイルを示した。
Ｇ−ＣＳＦと賦形剤とを混合すること、その後の熱処理の効果の評価は、未処理Ｇ−ＣＳＦと比較して活性の著しい消失を示した（図２Ｂ）。
Ｇ−ＣＳＦと賦形剤との組合せ、その後のフリーズドライは、未処理Ｇ−ＣＳＦ形態と比較してＧ−ＣＳＦの効力を維持していると思われる（図２Ｃ）。
特に注目すべきは、フリーズドライと組み合わせた賦形剤は、熱不活性化からＧ−ＣＳＦを保護すると思われる（図２Ｄと図２Ｂを比較されたい）。
【０２１０】
実施例３
抗ＴＮＦα抗体の安定化
１．実験の概要
抗ヒト腫瘍壊死因子−α抗体（ラットモノクロナール抗ＴＮＦα、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号：ＳＫＵ＃ＲＨＴＮＦＡ００）の以下の試料を調製し、示した処理：
１．抗ｈＴＮＦαラットｍＡｂ（被検物）−未処理＋ＰＢＳ（４℃）（対照）
２．抗ｈＴＮＦαラットｍＡｂ−フリーズドライ＋賦形剤および４℃において保存
３．抗ｈＴＮＦαラットｍＡｂ−フリーズドライ＋賦形剤および６５℃において２４時間加熱処理
４．抗ｈＴＮＦαラットｍＡｂ−６５℃において２４時間加熱処理＋ＰＢＳ
の後、ＥＬＩＳＡを使用して、それらの保存をｈＴＮＦαと結合するそれらの正常な機能性活性の保持により評価した。
【０２１１】
賦形剤は、最終濃度０．９１Ｍのショ糖、０．１２５Ｍのラフィノースおよび２５ｎＭのＰＥＩ（Ｍｎ６０，０００）を含有した。ＥＬＩＳＡプレート（ＮＵＮＣ  ＥＬＩＳＡプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標））を、ｈＴＮＦαを対象とするラットモノクロナール抗体（ラットｈＴＮＦαｍＡｂ）でコーティングした。ｈＴＮＦαをプレートに加え、コーティングされたプレートに結合可能にした。結合したＴＮＦαをビオチン化ポリクロナールラット抗ｈＴＮＦαで検出し、その後、１００μｌのＴＭＢ基質（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンおよび過酸化水素）を加えることによる比色反応において、ストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識を使用して可視化した。
【０２１２】
暗所における３０分間のインキュベーション後、反応を、５０μｌの１Ｎの塩酸を加えることによって停止させた。ＥＬＩＳＡプレートを、その後、４５０ｎｍにおいてＥＬＩＳＡリーダー（Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴ）を使用して読み取った。結果をＥｘｃｅｌにプロットした。
【０２１３】
２．方法
材料
ＮＵＮＣ  ＥＬＩＳＡプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標））。抗ｈＴＮＦαラットｍＡｂ（カタログ番号：ＳＫＵ＃ＲＨＴＮＦＡ００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、２００μｇ／ｍｌ）。抗ｈＴＮＦα検出キット（ＴｉｔｅｒＺｙｍｅ（登録商標）ＥＩＡ、アッセイ設計、カタログ番号：９００−０９９）
賦形剤の調製
賦形剤を、１６０μｌのショ糖（１．８２Ｍ）、４０μｌのラフィノース（０．７５Ｍ）および５０μｌのＰＥＩ（Ｍｎの６０，０００を使用して見積もって１５０ｎＭの濃度）を混合することによって調製した。
【０２１４】
フリーズドライ（ＦＤ）のための試料の調製
以下の試料を調製し、示した期間後ＥＬＩＳＡアッセイにおいて試験した。
１．抗ｈＴＮＦαラットｍＡｂ（被検物）−未処理＋ＰＢＳ（４℃）（対照）
２．抗ｈＴＮＦαラットｍＡｂ−フリーズドライ＋賦形剤および４℃において保存
３．抗ｈＴＮＦαラットｍＡｂ−フリーズドライ＋賦形剤および６５℃において２４時間加熱処理
４．抗ｈＴＮＦαラットｍＡｂ−６５℃において２４時間加熱処理＋ＰＢＳ
【０２１５】
５０μｌの希釈していない抗ＴＮＦα抗体（ラットｍＡｂ）を、２５０μｌの上記の賦形剤調製品に加えた。賦形剤混合物中の個々の成分の最終濃度は、０．９１Ｍのショ糖、０．１２５Ｍのラフィノースおよび２５ｎＭのＰＥＩ（６０，０００のＭｎに基づく）。１００μｌアリコートを、フリーズドライバイアルに加え、ＶｉｒＴｉｓフリーズドライヤーに供した。
【０２１６】
試料のフリーズドライ後、バイアルを、さまざまな期間、４℃で保存するか、または加熱処理し、アッセイの前にＰＢＳ（１００μｌのＦＤアリコートに対し３３３μｌ）中で再構成した。。
【０２１７】
５０μｌの対照（上記の試料１）ラットｍＡｂ（ＰＢＳ中１：２０希釈）および５０μｌの個々の再構成溶液を、ＥＬＩＳＡプレート上に４℃において一晩コーティングした。アッセイの残りを、製造業者の概要に従って実施した（ＴｉｔｅｒＺｙｍｅ（登録商標）ＥＩＡ、アッセイ設計、カタログ番号：９００−０９９）。
【０２１８】
ＥＬＩＳＡの設定
ＥＬＩＳＡプレートを、５０μｌ（１：２０希釈）の精製抗ｈＴＮＦαラットｍＡｂでコーティングし、４℃において一晩（ｏ／ｎ）インキュベートした。
【０２１９】
ヒトＴＮＦα標準品を、製造業者の概要に従って調製し（出発濃度は１０００ｐｇ／ｍｌ）、プレート上に２連で分配した。
【０２２０】
ｈＴＮＦαに対するウサギポリクロナール抗体、ストレプトアビジン標識ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ＴＭＢ基質および停止溶液を、市販のキット（ＴｉｔｅｒＺｙｍｅ（登録商標）ＥＩＡ、上記を参照されたい）の概要に従って分配した。簡潔に言うと、個々のインキュベーションステップ後、４回の洗浄を実施し、その後次の試薬を加え、さらに３７℃において６０分間インキュベーションした。停止溶液を加えた後、プレートを４５０ｎｍで読み取った。ブランクウェル（組換えｈＴＮＦαを含まないｈＴＮＦαに対するラットｍＡｂでコーティングされている）を並行して操作した。
【０２２１】
陽性対照として、キットの予備コーティングＥＬＩＳＡのストリップを並行して実施し、市販のキットの使用された試薬すべてが機能性であることを検証した（データ非掲載）。
【０２２２】
３．結果
上に要約した処理後、本発明者らは、ＥＬＩＳＡにより残存抗体活性のレベルを評価できた。結果を図３に示す。
【０２２３】
抗体のフリーズドライ前に賦形剤調製物を包含することは、前記抗体が、有意に長期間の有意に高いレベルの熱チャレンジに対する抵抗を可能にすることが明らかであった。ＰＢＳで希釈され、熱チャレンジに供された抗体は、同じ期間わたってその有効性を、４０％を超えて失う。
【０２２４】
実施例４
ルシフェラーゼの保存
すべての溶液を、５ｍｌのガラスバイアル（Ａｄｅｌｐｈｉ  Ｇｌａｓｓ）において調製した。１８０μｌのショ糖（１．８２Ｍ、Ｓｉｇｍａ）および２０μｌのスタキオース（０．７５Ｍ、Ｓｉｇｍａ）を加え、全２００μｌの容量の糖混合物を得た。次いで、５０μｌのＰＥＩ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ３１４３、Ｍｎ６０，０００）を、さまざまな濃度で加え、保存用混合物を完成させた。最終的に、０．１ｍｇ／ｍｌの５０μｌのルシフェラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）または５０μｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、Ｓｉｇｍａ）を加え、混合物をボルテックス攪拌した。ＰＥＩおよび糖の最終濃度は：
ＰＥＩ：２７ｎＭ、２．７ｎＭまたは０．２７ｎＭ
ショ糖：１．０９２Ｍ、および
スタキオース：０．０４９９Ｍ
であった。
【０２２５】
３００μｌのＰＢＳを含有する対照をさらに用意した。すべてのバイアルを、３連に用意した。
【０２２６】
バイアルを、Ｍｏｄｕｌｙｏ  Ｄフリーズドライヤー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）においてフリーズドライした。より具体的には、バイアルを、３０ｍｌの水を含有するフリーズドライトレイにおいて、−８０℃で、部分的にゴム栓をして凍結した。凍結バイアルを、予備冷却したフリーズドライヤーのフリーズドライヤーストッパリングシェルフ（stoppering shelf）に移し、１６時間乾燥させた。フリーズドライヤーから取り出す前に、真空下でゴム栓をバイアルに完全に下げた。
【０２２７】
バイアルは、易流動性フリーズドライ粉末を含有した。粉末を、１ｍｌのＰＢＳを加えることによって再構成した。得られた溶液のそれぞれ１００μｌを、９６ウェルプレートに移した。ルシフェラーゼアッセイ試薬を、製造業者の指示書に従って各ウェルに加え、Ｓｙｎｅｒｇｙ２ルミノメーターにおいて発光を読み取った。
【０２２８】
結果を図４に示す。スチューデントＴ検定を実施し、ＰＲＩＳＭ  Ｇｒａｐｈｐａｄソフトウェア、バージョン４．００を使用して、さまざまな賦形剤間の有意位性を分析した。Ｐ値のサマリ（summaries）は＊ｐ＜０．１０；＊＊ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０．００５である。
【０２２９】
実施例５
β−ガラクトシダーゼの保存
すべての溶液を、５ｍｌのガラスバイアル（Ａｄｅｌｐｈｉ  Ｇｌａｓｓ）において調製した。１６０μｌのショ糖（１．８２Ｍ、Ｓｉｇｍａ）および４０μｌのラフィノース（１Ｍ、Ｓｉｇｍａ）を加え、全２００μｌの容量の糖混合物を得た。次いで、５０μｌのＰＥＩ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ３１４３、Ｍｎ６０，０００）を、さまざまな濃度で加え、保存用混合物を完成させた。最終的に、５０μｌのβ−ガラクトシダーゼ（１００単位／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）または５０μｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、Ｓｉｇｍａ）を加え、混合物をボルテックス攪拌した。ＰＥＩおよび糖の最終濃度は：
ＰＥＩ：１３μＭ、２．６μＭ、０．２６μＭ、２６ｎＭまたは、２．６ｎＭ
ショ糖：０．９７Ｍ、および
ラフィノース：０．１３Ｍ
であった。
【０２３０】
糖を含まない、ＰＥＩの効果を評価するために、５０μｌのＰＥＩを２５０μｌのＰＢＳに加えた。３００μｌのＰＢＳを含有する対照をさらに用意した。すべてのバイアルを、３連に用意した。
【０２３１】
バイアルを、Ｍｏｄｕｌｙｏ  Ｄフリーズドライヤー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）においてフリーズドライした。より具体的には、バイアルを、３０ｍｌの水を含有するフリーズドライトレイにおいて、−８０℃で、部分的にゴム栓をして凍結した。凍結バイアルを、予備冷却したフリーズドライヤーのフリーズドライヤーストッパリングシェルフに移し、１６時間乾燥させた。フリーズドライヤーから取り出す前に、真空下でゴム栓をバイアルに完全に下げた。
【０２３２】
バイアルは、易流動性フリーズドライ粉末を含有した。粉末を、１ｍｌのＰＢＳを加えることによって再構成した。得られた溶液のそれぞれ１００μｌを、９６ウェルプレートに移した。β−ガラクトシダーゼ活性を、基質としてＸ−ゲルを用いてアッセイした。結果を図５に示す。スチューデントＴ検定を実施し、ＰＲＩＳＭ  Ｇｒａｐｈｐａｄソフトウェア、バージョン４．００を使用して、さまざまな賦形剤間の有意位性を分析した。Ｐ値のサマリは＊ｐ＜０．１０；＊＊ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０．００５である。
【０２３３】
実施例６
抗ＴＮＦα抗体の安定化
１．材料
Ｌ９２９細胞（ＥＣＣＡＣ  ８５０１１４２６）
ＰＥＩ（Ｓｉｇｍａ  Ｐ３１４３、ロット１２７Ｋ０１１０、Ｍｎ６０，０００）
ショ糖（Ｓｕｃ、Ｓｉｇｍａ  １６１０４、ロット７００４０）
ラフィノース（Ｒａｆ、Ｓｉｇｍａ  Ｒ０２５０、ロット０３９Ｋ００１６）
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、Ｓｉｇｍａ  Ｄ８６６２、ロット１１８Ｋ２３３９）
水（Ｓｉｇｍａ  Ｗ３５００、ロット８Ｍ０４１１）
チアゾリルブルーテトラゾリウムブロミド（Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide）（ＭＴＴ）
抗ヒトＴＮＦα精製抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＲＨＴＮＦＡＯＯ、ロット５５５７９０Ａおよび４７７７５８Ｂ）。２００μｇ／ｍｌのＰＢＳのストック溶液を調製し、２〜８℃において保存。
５ｍｌガラスバイアル（Ａｄｅｌｐｈｉ  Ｔｕｂｅｓ  ＶＣＤ００５）
１４ｍｍのフリーズドライ用栓（Ａｄｅｌｐｈｉ  Ｔｕｂｅｓ  ＦＤＩＡ１４ＷＧ／Ｂ）
１４ｍｍのキャップ（Ａｄｅｌｐｈｉ  Ｔｕｂｅｓ  ＣＷＰＰ１４）
トータルリカバリーＨＰＬＣバイアル（Total recovery HPLC vials）（Ｗａｔｅｒｓ  １８６００３８４Ｃ、ロット０３８４６９１８３０）
【０２３４】
２．方法
試料の調製
表１に記載の成分に従ってＰＢＳ中で賦形剤を調製した。ＰＥＩ濃度はＭｎに基づく。２５０μの個々の賦形剤混合物および５０μｌのＰＢＳ中１０μｇの抗ＴＮＦα抗体を、次いで、適切にラベルをつけた５ｍｌのガラスバイアルに入れ、ボルテックス攪拌した。ボルテックス攪拌後、バイアルを、ＶｉｒＴｉｓ  Ａｄｖａｎｔａｇｅフリーズドライヤー（Ｂｉｏｐｈａｒｍａ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）のストッパリングシェルフに移した。フリーズドライ前のバイアル中のショ糖、ラフィノースおよびＰＥＩの最終濃度を、表１に示す。
【０２３５】
【表１】
2012503637.tif 000004
【０２３６】
試料を、ＶｉｒＴｉｓ  Ａｄｖａｎｔａｇｅフリーズドライヤーによっておよそ３日間フリーズドライした。試料を、初期は２００ミリＴｏｒｒで真空にする前に、−４０℃において１時間凍結した。シェルフ温度および真空を、この過程の間を通して調整し、冷却機は−４２℃に維持した。ステップ８を、試料に栓をし、その後真空を放出するまで延長した。使用した乾燥サイクルを以下に示す：
【０２３７】
【表２】
2012503637.tif 000005
【０２３８】
フリーズドライ後、真空下でガラスバイアルに栓をし、４５℃で１週間の熱チャレンジのためにＭａｘＱ４４５０インキュベーター（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に移した。インキュベーション後、試料をＬ９２９アッセイ用に調製した。具体的には、試料を滅菌蒸留水中で再構成した。
【０２３９】
ＴＮＦαの中和を評価するためのＬ９２９アッセイ
抗体活性を、抗ＴＮＦα中和アッセイを使用して測定した。このため、Ｌ９２９細胞（マウスＣ３Ｈ／Ａｎ結合組織）を使用した。３．５×１０５細胞／ｍｌの懸濁液を、ＲＰＭＩ中２％ＦＢＳにおいて調製し、１００μｌの細胞懸濁液を９６ウェルプレートの各ウェルに加え、３７℃、５％ＣＯ２において一晩インキュベートした。別の９６ウェルプレーにおいて、組換えＴＮＦαの中和を、５０μｌのＲＰＭＩ中２％ＦＢＳを各ウェルに加えることによって始動した。５０μｌの１０μｇ／ｍｌの濃度の対照ラット抗ヒトＴＮＦα抗体（Ｃａｌｔａｇ）を、列３〜１２に加えた。次の列において、フリーズドライ生成物から再構成した抗ＴＮＦα抗体を、１０μｇ／ｍｌの濃度でさらに加えた。
【０２４０】
１：２希釈を実施した。５０μｌの組換えヒトＴＮＦα（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、ウェルの列２〜１２に加えた。得られた抗体・サイトカイン混合物を３７℃において２時間インキュベートした。インキュベーション後、５０μｌ／ウェルの抗体・サイトカイン溶液を、Ｌ９２９細胞を含有するプレートの対応するウェルに移した。５０μｌの０．２５μｇ／ｍｌアクチノマイシンを各ウェルに加えた。
【０２４１】
プレートを３７℃、５％ＣＯ２で、加湿インキュベーターにおいて２４時間インキュベートした。５μｇ／ｍｌのＭＴＴ溶液の５ｍｌの新鮮なストックを、ＰＢＳ中で作製した。２０μｌのＭＴＴ溶液を各ウェルに加えた。その後、ＭＴＴが代謝されるように、細胞を３〜４時間インキュベート（３７℃、５％ＣＯ２）した。インキュベーション後、培地を廃棄し、ウェルを乾燥させた。
【０２４２】
ホルマザン生成物を１００μｌのＤＭＳＯに再懸濁し、振動テーブルに５分間配置し、ホルマザンを溶媒に完全に混合した。プレートを、ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴプレートリーダーにおいて読み取り、５６０ｎｍにおいて光学密度を読み取った。６７０ｎｍにおけるバックグラウンドを差し引き、最終Ｏ．Ｄ．を得た。
【０２４３】
３．結果
結果を図６に示す。この実験は、糖濃度およびＰＥＩ濃度の変化による賦形剤濃度最適化のマトリックスを設定する。高いＯ．Ｄ．は優れた抗体安定化に相当し、抗ＴＮＦα抗体によるＴＮＦα有効な中和を反映する。
【０２４４】
１週間の４５℃におけるチャレンジ後、図６に示すように、比較的高濃度のＳｕｃ／Ｒａｆは、熱チャレンジ後の保護の増加を提供するように思われる。加えて、実験に使用した比較的高濃度のＰＥＩは、比較的高濃度の糖と組み合わせて使用した場合、本実験においてさらに保護の増加を提供する。
【０２４５】
実施例７
抗ＴＮＦα抗体の安定化
１．材料
実施例６と同じ。
【０２４６】
２．方法
ショ糖溶液を、５０ｍｌのファルコンチューブにおいて１０ｇのショ糖を１０ｍｌのＰＢＳに加えることによって調製し、１．８Ｍの濃度のストックを得た。溶液をマイクロ波において穏やかに加熱し、溶解を促進した。ラフィノース溶液を、５０ｍｌのファルコンチューブにおいて２．５ｇのラフィノースを５ｍｌのＰＢＳに加えることによって調製し、０．６３Ｍの濃度のストックを得た。溶液をマイクロ波において穏やかに加熱し、完全に溶解させた。一度完全に溶解したら、糖混合物を、４ｍｌのラフィノース溶液を１６ｍｌのショ糖溶液に加えることによって調製した。
【０２４７】
ＰＥＩ溶液を、１ｇのＰＥＩを５０ｍｌのＰＢＳに溶解することによって調製し、Ｍｎに基づき０．１６７ｍＭの濃度を得た。さらに、ＰＥＩ溶液の希釈液をＰＢＳ中で調製した。
【０２４８】
フリーズドライＰＢＳ対照を、抗体ロット４７７７５８Ｂを用いて調製し、他のすべての試料は、抗体ロット５５５７９０Ａを用いて調製した。フリーズドライ用試料を、１００μｌの糖混合物、１００μｌのＰＥＩ溶液および１００μｌの抗ＴＮＦα抗体を、ガラスバイアルに加えることによって調製した。これらの試料の糖およびＰＥＩの最終濃度を以下に示す。ＰＦＤ＝フリーズドライ前；ＦＤ＝フリーズドライ。
【０２４９】
【表３】
2012503637.tif 000006
【０２５０】
試料をボルテックス攪拌し、ＶｉｒＴｉｓ  Ａｄｖａｎｔａｇｅフリーズドライヤー（Ｂｉｏｐｈａｒｍａ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、実施例６に記載のようにフリーズドライした。乾燥試料の完了において、試料に栓をし、キャップをした。一連の試料を６０℃における１週間の熱処理後に分析した。
【０２５１】
フリーズドライおよび熱処理試料を、１５０μｌの水に再懸濁した。試料をＨＰＬＣ用ガラスバイアルに移した。２８０ｎｍ（流速０．３ｍｌ／分、およそ１２００ｐｓｉ）において吸光度を測定する、サイズ排除ＨＰＬＣ（移動相ＰＢＳ、周囲温度）によって、１００μｌの注入液を比較した。ピーク面積を決定した。
【０２５２】
３．結果
結果を図７に示す。ＰＢＳ中でフリーズドライした場合、抗体は測定されなかった。糖単独中でフリーズドライした場合、有意量の抗ＴＮＦα抗体が失われた。抗体を、糖およびＰＥＩと共にフリーズドライした場合、非常に大量の抗ＴＮＦα抗体が測定された。
【０２５３】
実施例８
抗ＴＮＦα抗体の安定化
実施例６の手順後、０．９Ｍのショ糖、０．１Ｍのラフィノースおよび０．００２５ｎＭのＰＥＩを含有する、抗ＴＮＦα抗体のＰＢＳ試料を調製した。試料を、実施例６に記載のようにフリーズドライした。その後、試料を、４５℃において２週間熱処理した。熱処理試料を、２％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩを用いて再構成した。ＴＮＦαの中和を、実施例６に記載のＬ９２９アッセイにおいて評価した。結果を図８に示す。優れた抗体の安定化が達成されている。
【０２５４】
実施例９
インフルエンザヘマグルチニンの安定化
１．材料
ポリエチレンイミン（Ｐ３１４３、Ｍｎ６０，０００）
ショ糖（Ｓｉｇｍａ）
ラフィノース（Ｆｌｕｋａ）
ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｓｉｇｍａ）
ガラスバイアル（Ａｄｅｌｐｈｉ  ｇｌａｓｓ）
ゴム栓（Ａｄｅｌｐｈｉ  ｇｌａｓｓ）
ＵＶ透過性９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ（登録商標））
マキシソーブ（Maxisorb）９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）
クエン酸（Ｓｉｇｍａ）
ウサギ抗ヒツジＩｇ  ＨＲＰ標識（ＡｂＣａｍ）
３０％のＨ２Ｏ２溶液（Ｓｉｇｍａ）
オルトフェニレンジアミン（Orthophenylenediamine）（ＯＰＤ）錠剤（Ｓｉｇｍａ）
Ｈ２ＳＯ４（Ｓｉｇｍａ）
ポリクロナール単一特異性ヒツジ抗Ｈ１抗体（Ｓｏｌｏｍｏｎ  Ｉｓｌａｎｄｓ）（ＮＩＢＳＣ）
ポリオキシソルビタンモノラウレート（Polyoxysorbitan monolaurate）（Ｔｗｅｅｎ２０）（Ｓｉｇｍａ）
脱脂粉乳粉末（Ｍａｒｖｅｌ）
Ｘ３１（Ｈ３Ｎ２）由来ブロメライン可溶化精製インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）
【０２５５】
２．方法
試料の調製
１×５７μｇのバイアルのインフルエンザＨＡタンパク質を、４７５μｌの滅菌蒸留水（ＳＤＷ）を用いて再構成し、１２０μｇ／ｍｌのストックの濃度を得た。その後、このストックを、ＳＤＷ中で１／４にさらに希釈し、次いでＰＢＳ中、またはショ糖、ラフィノースの組合せおよびＰＥＩを含む賦形剤混合物ならびにさらに滅菌蒸留水中で１／６に希釈した。これにより、最終濃度１Ｍのショ糖／１００ｍＭのラフィノース／１６．６ｎＭのＰＥＩ（Ｍｎに基づく）を含む賦形剤中、最終濃度５μｇ／ｍｌのＨＡが得られる。
【０２５６】
これらの溶液の２００μｌアリコートを、フリーズドライ（ＦＤ）用に５ｍｌのバイアルに入れた。凍結乾燥および二次乾燥を、実施例６に記載のプロトコルを使用してＶｉｒＴｉｓ  Ａｄｖａｎｔａｇｅフリーズドライヤーにおいて実施した。フリーズドライ後、賦形剤中のフリーズドライ試料の１つをウォーターバス中８０℃において１時間熱チャレンジした。その後、すべての試料を周囲温度において平衡化させ、フリーズドライ試料を２００μｌのＳＤＷで再構成し、すべての試料を、１μｇ／ｍｌの初期濃度から２倍段階希釈で、以下に記載のようにＥＬＩＳＡによって滴定した。
【０２５７】
ＥＬＩＳＡのプロトコル
ＰＢＳで希釈した個々の試料の５０μｌを、マキシソーブ９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）の適切なウェルに加えた。プレートを軽くたたき、確実にウェルの底部にわたって分注させ、カバーをし、３７℃において１時間インキュベートした。ＰＢＳ、５％脱脂粉乳および０．１％Ｔｗｅｅｎ２０からなるブロックバッファーを調製した。プレートを、ＰＢＳを大量に使用して３回洗浄し、洗浄液を廃棄し、その後、軽くたたいて乾燥させた。
【０２５８】
ヒツジ抗Ｈ１抗体（ポリクロナール単一特異性ヒツジ抗Ｈ１抗体、Ｓｏｌｏｍｏｎ  Ｉｓｌａｎｄｓ、ＮＩＢＳＣ）の１／２００希釈液をブロッキングバッファーで調製し、各ウェルに５０μｌを加えた。プレートにカバーをし、３７℃において１時間インキュベートした。その後、プレートをＰＢＳで３回洗浄した。
【０２５９】
ウサギおよびヒツジのＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭの１／１０００希釈液をブロッキングバッファーで調製した。その後、この溶液の５０μｌを各ウェルに加えた。プレートにカバーをし、３７℃において１時間インキュベートした。その後、プレートをＰＢＳで３回洗浄した。
【０２６０】
次いで、基質／ＯＰＤ溶液を、ＯＰＤ（オルトフェニレンジアミン）を加えることによって、クエン酸塩／リン酸塩バッファー中最終濃度０．４μｇ／ｍｌ、ｐＨ５．０に調製した。５０μｌの０．４μｇ／ｍｌの３０％Ｈ２Ｏ２溶液を、その後各アッセイウェルに加え、プレートを周囲温度において１０分間インキュベートした。その後、反応を、５０μｌ／ウェルの１ＭのＨ２ＳＯ４を加えることによって停止させ、吸光度を４９０ｎｍにおいて読み取った。
【０２６１】
３．結果
結果を図９に示す。液体ＰＢＳは、ＰＢＳ単独中のＨＡの対照試料を表す。実質的には、ショ糖、ラフィノースおよびＰＥＩ賦形剤（ＦＤ賦形剤およびＦＤ  ＨＴ賦形剤）を含有するフリーズドライＨＡ試料中には、賦形剤を含まないフリーズドライ試料（ＦＤ  ＰＢＳ）より多くのＨＡが、ＥＬＩＳＡにより検出された。
【０２６２】
実施例１０
ルシフェラーゼの保存
１．方法
ルシフェラーゼのストックはＰｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（コードＥ１７０１）から購入し、およその分子量６０ｋＤａを使用して２．１３×１０−４Ｍに相当する、１３．５ｍｇ／ｍｌの濃度の、１ｍｇの精製タンパク質で構成されていた。ストックを融解し、４μＬアリコートを−４５℃において再凍結した（手付かず、賦形剤は何も加えていない）。これらのアリコートを、続くすべての実験に使用した。
【０２６３】
ルシフェリンは、ＡＴＰも含むキット（コードＥ１５００）として、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入した。このキットを、これからはルシフェリン試薬と称するものとし、使用前に混合する必要がある対のバイアルから構成されていた。一方のバイアルには凍結乾燥粉末が含有され、他方には１０ｍｌの凍結液体が含有されていた。ストックを作製するために、これらのバイアルを混合し、その後、標準１．５ｍｌエッペンドルフチューブにおいて、１ｍｌアリコートを、−２０℃において再凍結した。バイアルおよび再構成ルシフェリン試薬を、−２０℃において不透明な箱の中で保存し、暗所に近い条件下でのみ取り出した。
【０２６４】
賦形剤（下記）およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を、使用したＰＢＳバッファー全体の実際のＰＢＳ濃度の偏差が最小になるように、ＰＢＳに溶解またはＰＢＳで希釈した。ＢＳＡのストックを１００ｍｇ／ｍｌに仕上げ、続いて希釈して、作業濃度１ｍｇ／ｍｌを得た。ルシフェラーゼの希釈に使用する場合はいつでも、ＰＢＳバッファーに１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを常に補給し、ルシフェラーゼを、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを添加しない限りいずれの溶液にも曝露しなかった。
【０２６５】
固定比率のショ糖：ラフィノース（糖混合物または「ｓｍ」）を、すべての実験を通して使用したが、この比率の最終濃度は変更した。この実験に使用した糖およびＰＥＩ（ＳｉｇｍａＰ３１４３、Ｍｎ６０，０００）の最終濃度を以下に示す。
【０２６６】
ショ糖溶液を、３２ｇのショ糖粉末を３２ｍｌのＰＢＳに、５０ｍｌのファルコンチューブにおいて加えることによって調製し、最終濃度６１．５４％に相当する最終容量５２ｍｌを得た。溶液をマイクロ波において穏やかに加熱し、初期の溶媒和を促進したが、その後は４℃において保存した。ラフィノース溶液を、５０ｍｌのファルコンチューブにおいて４ｇのラフィノースを８ｍｌのＰＢＳに加えることによって調製し、最終濃度３９．２％に対応する、最終容量１０．２ｍｌを得た。溶液をマイクロ波において加熱し、完全に溶媒和させた。一度完全に溶解し、任意の期間、室温または４℃において単独で保存する場合、ラフィノース溶液は沈殿すると思われる。
【０２６７】
最終糖混合物を作製するために、上記のショ糖およびラフィノース溶液を、４：１の比で混合した。実際には、３２ｍｌのショ糖溶液を、８ｍｌのラフィノース溶液に混合した。一度構成させたら、糖混合物を無期限に４℃において保存し、沈殿は起こらなかった。
【０２６８】
ルシフェラーゼアッセイは、さまざまな濃度のルシフェラーゼと、未希釈のルシフェリン試薬アリコートとを、黒色の不透明９６ウェルプレートにおいて混合するステップを含んだ。その後、この発光性反応の初期（線形）相を、ルミノメーターにより直ちに定量した。製造業者の推奨のように、ルシフェラーゼ試料は１００μｌの容量であり、発光を、１００μｌのルシフェリン試薬を加えることによって開始させた。ルシフェリン試薬に関係するすべてのステップは、ほぼ暗所において実施した。
【０２６９】
不可避なバックグラウンドのノイズの補正のため、および信頼性の確保のために、個々の試料を、線形応答を生み出すことが期待される複数の濃度点においてアッセイした（３連）。急速なシグナル減衰により、１度に３種の試料だけをアッセイした。これらは、個々の濃度点の３連の試料の調製品に対応した。１度読み取ったら、その後、次の濃度点に対応する３連の試料を調製し、アッセイした。以下の５種の濃度点を各試料に関してアッセイした：
６×１０−１０Ｍ
５×１０−１０Ｍ
４×１０−１０Ｍ
３×１０−１０Ｍ
２×１０−１０Ｍ
【０２７０】
プロトコルの詳細な説明
ルシフェラーゼは、アッセイ前に段階希釈を必要とする非常に高い特異活性を有する。ルシフェラーゼは非常に壊れやすいので、アッセイ直前にこのような希釈を実施することが最善である。したがって、個々の実験の開始時に、−４５℃の保存品から２．２１×１０−４Ｍの手付かずのストックルシフェラーゼの４μｌアリコート１つを取り出し、直ちに氷上に配置し、その後、８８０μｌの氷冷ＰＢＳで迅速に希釈し、１×１０−６Ｍの濃度を得た。
【０２７１】
ルシフェラーゼの所望の作業濃度を得るために、以下に記載のように次いでさらなる段階希釈液を調製した。１００μｌの新鮮に調製した１×１０−６Ｍルシフェラーゼ溶液を、９００μｌの氷冷ＰＢＳに加え、１×１０−７Ｍの１ｍｌを得た。この溶液の１００μｌを、次いで、９００μｌの氷冷ＰＢＳに加え、１×１０−８Ｍの１ｍｌを得た。この溶液の２０μｌから６０μｌを１ｍｌの氷冷ＰＢＳに加え、５種の最終ストック溶液を得、１０倍希釈し、上記の５種の作業濃度を得た（すなわち、最終ストックは、２から６×１０−９Ｍであった）。これらのストックの１０μｌを、１ｍｇ／ｍＬＢＳＡを含有するＰＢＳを使用して、最終アッセイ容量の１００μｌに希釈し、（賦形剤含有または非含有）容量１００μｌに仕上げた。
【０２７２】
フリーズドライするアリコートおよびアッセイ前に再懸濁されたフリーズドライアリコートを含むすべての試料は、常に１００μｌ容量であった。賦形剤の含有量または濃度にかかわらず、すべての１００μｌアリコートは、最終ＢＳＡ濃度１ｍｇ／ｍｌを含有した。糖混合物およびＰＥＩを、単独および一緒に、さまざまな濃度（それぞれ０から６７％および１×１０−０から１×１０−７％）で試験し、フリーズドライの前後のいずれかに加えた。すべてにおいて、以下の組合せを試験した（「群」の列において特に明記しない限り、賦形剤はフリーズドライ前に加えた）：
【０２７３】
【表４−１】
2012503637.tif 000007
【表４−２】
2012503637.tif 000008
【０２７４】
試料は、常に以下の順番で作り上げた：１０μｌのルシフェラーゼストックに（２×１０−９Ｍから６×１０−９Ｍ）に、ＰＢＳ（１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ含有）を加え、次いで糖混合物、その後ＰＥＩを、後者のうちのいずれかが試料中に示されている場合、それらが排除されない限り（上記の表を参照されたい）加えた。すべての場合において、最終試料容量は、１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ含有ＰＢＳを用いて１００μｌに仕上げた。
【０２７５】
アッセイの手順
最高濃度（６×１０−１０Ｍのルシフェラーゼ）の１００μｌアリコート３つを、予備冷却した黒色の不透明のウェルプレートの隣接するウェルにピペットで分注した。次いで、９６ウェルプレートを、ルミノメーターのリーディングトレイに配置した。その後、マルチチャンネルピペットを使用して、１００μｌアリコートのルシフェリン試薬をウェルに加え、短時間混合した。その後、読み取りを迅速に開始した。各々を読み取った後、９６ウェルプレートを迅速に氷に戻し、再冷却し、その後、次を読み取った。次いで、次の３連の試料を調製しアッセイする前に、データをセーブした。
【０２７６】
フリーズドライ試料の再懸濁
１００μｌアリコートとしてフリーズドライ用試料を調製した。糖混合物を含有するフリーズドライ試料を、最終容量１００μｌを得るために、それより少ない容量に再懸濁した（糖混合物が容量に影響するため）。濃度６６．７％で使用する場合、１００μｌの容量のうち２３．４μｌが糖混合物によることがあらかじめ示されていた（データ非掲載）。したがって、このような試料は、７４．６μｌを加えることによって再懸濁された。これより少ない糖混合物を有する試料中の糖混合物によって影響された容量は、上記の値から計算し、それに応じて調整し、最終容量１００μｌが得られる。
【０２７７】
２．結果
結果を図１０に示す。まず、最適糖混合物（ｓｍ）濃度は、２０％（０．２９Ｍのショ糖、０．０３Ｍのラフィノース）から３０％（０．４３Ｍのショ糖、０．０４Ｍのラフィノース）である。これは、ＰＥＩ（初めの２つのデータセット）の不在下および存在下の双方において当てはまる。標準糖混合物濃度は６６．７％（０．９６Ｍのショ糖、０．０９Ｍのラフィノース）である。最適ＰＥＩ濃度は、糖混合物の不在下では１．０×１０−３％のＰＥＩ（Ｍｎに基づき１６７ｎＭ）（４番目のデータセット）であり、一方６６．７％の糖混合物の存在下では（５番目のデータセット）１．０×１０−１％から１．０×１０−３％のＰＥＩ（Ｍｎに基づき１６．７μＭから１６７ｎＭ）を維持する。したがって、最も低い最適賦形剤濃度は、２０％の糖混合物（０．２９Ｍのショ糖、０．０３Ｍのラフィノース）および１．０×１０−３％ＰＥＩ（Ｍｎに基づき１６７ｎＭ）である。
【０２７８】
糖混合物およびＰＥＩの凍結乾燥保護剤の効果は相乗的であり、双方を一緒に加えた場合にピークである（２番目および５番目のデータセット）。この効果は、ＰＥＩ単独によって提供される保護（４番目のデータセット）と、糖混合物が同時である場合に観察される保護（５番目のデータセット）とを比較した場合に最も顕著である。最も重要なことには、ＰＥＩの存在が、糖混合物単独の使用と比較して、追加の凍結乾燥保護を提供する（それぞれ、１番目および２番目のデータセット）。
【０２７９】
しかし、この相乗効果は、双方の成分が凍結乾燥前に加えられた場合にのみ観察される。いずれかの成分がフリーズドライ後に加えられると、その成分が排除された場合に対してその寄与は無効になる：賦形剤は保護できるが、復活できない。
【０２８０】
実施例１１
β−ガラクトシダーゼの保護
試料の調製
β−ガラクトシダーゼを含有する賦形剤混合物を、下記の表に従って調製し、ボルテックス攪拌した。１０単位のβ−ガラクトシダーゼを各バイアルに加えた。２００μｌのボルテックス攪拌した混合物を、適切にラベル付けした５ｍｌのガラスバイアルに配置した。ＰＥＩは、Ｓｉｇｍａから入手した（Ｐ３１４３、Ｍｎ６０，０００）。
【０２８１】
【表５】
2012503637.tif 000009
【０２８２】
ボルテックス攪拌後、バイアルを、３０ｍｌの水を含有するフリーズドライトレイにおいて、−８０℃で、部分的にゴム栓をして凍結した。凍結したバイアルを、予備冷却したフリーズドライヤー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）のストッパリングシェルフに移し、１６時間乾燥させた。冷却室は−７０℃であった。しかし、フリーズドライ設備においてシェルフの対照は存在しなかった。フリーズドライヤーから取り出す前に、真空下でゴム栓をバイアルに完全に下げた。
【０２８３】
ベータ−ガラクトシダーゼアッセイ
フリーズドライ後、バイアルを１ｍｌのＰＢＳで再構成した。各バイアルから得られた溶液の１００μｌを、２連で平底９６ウェルプレートの個々のウェルに加えた（合計で６つの読み取り／賦形剤型を得た）。基質のｘ−ｇａｌを、製造業者の指示書に従って加えた。簡潔に言うと、２０ｍｇ／ｍｌのストック溶液をＤＭＳＯ中で作製し、１ｍｇ／ｍｌの作業濃度で使用した。１００μｌを各ウェルに加え、溶液を１０分にわたって発色させた。発色後、吸光度を、ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴマイクロプレートにおいて６３０ｎｍで測定した。その後、ブランクのウェルからのバックグラウンドを全読み取り値から差し引き、結果をＰｒｉｓｍ  Ｇｒａｐｈｐａｄを使用して評価した。
【０２８４】
結果
結果を図１１に示す。この実験は、糖／ＰＥＩ賦形剤の存在下でのフリーズドライβ−ガラクトシダーゼの効果を調べた。フリーズドライ後、β−ガラクトシダーゼ活性は、ＰＢＳと比較してショ糖／ラフィノース賦形剤において高かった。ＰＥＩを含有するショ糖／ラフィノース賦形剤において、β−ガラクトシダーゼ活性はさらに強化されていた。
【０２８５】
実施例１２
ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の保存
ＩＶ型  ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を、
１．ＰＢＳ単独
２．１ＭのＳｕｃ／１００ｍＭのＲａｆ（Ｓｍｉｘ）
３．１ＭのＳｕｃ／１００ｍＭのＲａｆ／１６．６ｎＭのＰＥＩ（ＳｍｉｘＰ）
において１μｇ／ｍｌに希釈した。
【０２８６】
ＰＥＩはＳｉｇｍａから入手した（Ｐ３１４３、Ｍｎ６０，０００）。ＰＥＩ濃度は、Ｍｎに基づいた。上記の各溶液の１０×１００μｌ容量を、５ｍｌのフリーズドライバイアルに調製した。各溶液の５つの複製を、実施例６に記載のプロトコルを使用して、ＶｉｒＴｉｓ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ実験室フリーズドライヤーにおいてマイナス３２℃、３日間のサイクルでフリーズドライした。
【０２８７】
液体および乾燥させた各溶液からの１つのバイアルを４℃に配置し、残りを−２０℃において凍結した。液体および乾燥溶液それぞれからの試料を、−２０℃のフリーザーから取り出し、それらを３７℃、４時間のインキュベーターに配置し、その後、それらをフリーザーに２０時間を２、４および６回の、２、４、および６回の加熱−凍結サイクルに供した。各々１つのバイアルを、対照として−２０℃に保持した。
【０２８８】
全試料について、−２０℃および４℃における維持を含むサイクル供与が完了した時、サイクルに供していない対照を室温に平衡化した。次いでフリーズドライ試料を、室温において１００μｌ／バイアルの脱イオン水で再構成した。
【０２８９】
３連の１０μｌの試料を、各バイアルから平底のＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｂ）のウェルに取り出した。その後、各ウェルに、０．４ｍｇ／ｍｌのオルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）および０．４ｕｌ／ｍｌの３０％過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を含有する５０ｕｌの色素原／基質溶液基質を加えた。発色させた後で、反応を５０μｌ／ウェルの１Ｍの硫酸（Ｈ２ＳＯ４）を加えることによって停止させた。吸光度を、ＢｉｏＴｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴ分光光度計において、４９０ｎｍで測定し、光学密度（ＯＤ）としてプロットした。
【０２９０】
結果
結果を図１２に示す。すべての処理および保存条件に関して、ＨＲＰ活性は、ＰＥＩ含有または非含有のいずれにおいても、ＰＢＳ単独よりも、ショ糖／ラフィノースの存在下においてより多く維持されている。連続加熱／凍結サイクル後のＨＲＰの減衰パターンは、すべての懸濁媒体において同様に思われる。しかし、糖および、特にＰＥＩと組み合わせた糖の存在は、初期フリーズドライ段階においてＨＲＰ活性の消失を有意に減少させる。賦形剤処理試料は、６回の加熱／凍結サイクル後でさえ、ＰＢＳ中の非チャレンジ試料より多くのＨＲＰ活性を未だ維持していた。
【０２９１】
実施例１３
アルコールオキシダーゼ活性の保存
この実験の目的は、ＷＯ９０／０５１８２（Ｇｉｂｓｏｎら）の実施例１０に従ってラクチトールおよびＰＥＩ安定剤を使用して、ならびに本発明を使用して、アルコールオキシダーゼ活性の保存の有効性を比較することである。
【０２９２】
試薬（すべての試薬はＳｉｇｍａから購入した）
ドデシル硫酸ナトリウム；ＳＤＳ−カタログ番号Ｌ４３９０
２，２’−アジノ−ビス−３−エチルベンズチアゾリン−６−硫酸；ＡＢＴＳ−カタログ番号Ａ１８８８
メタノール−カタログ番号６５５４３
アルコールオキシダーゼ；ＡｏＸ−カタログ番号Ａ０４３８
ホースラディッシュペルオキシダーゼ−カタログ番号Ｐ８２５０
糖混合物（試薬の調製を参照されたい）
ラクチトール−カタログ番号Ｌ３２５０
ＰＥＩ−カタログ番号Ｐ３１４３、Ｍｎ６０，０００
【０２９３】
保存および調製
ＳＤＳを除くすべての試薬は、各実験の前に新鮮に作製した。２ｍＭのＡＢＴＳおよびＳＤＳを除くすべての試薬は、各実験の間氷上に維持した。２ｍＭのＡＢＴＳおよび２０％のＳＤＳは室温において保存した。
【０２９４】
ＳＤＳの２０％の作業溶液を、５ｇのＳＤＳ粉末を２３．６ｍｌのＰＢＳ溶液に加えることによって調製し、最終容量２５ｍｌを得た。粉末を、ボルテックス攪拌によって完全に溶液にさせ、次いで遠心分離器にかけ、表面の泡をつぶした。
【０２９５】
１ｇのＡＢＴＳを１８．２ｍｌのＰＢＳと混合し、１００ｍＭの溶液を得た。この溶液の１ｍｌを、５０ｍｌのＰＢＳに加え、２ｍＭの作業濃度を得た。
【０２９６】
メタノールの１％の作業溶液を使用し、５００μｌのメタノールを５０ｍｌのＰＢＳに加えることによって調製した。
【０２９７】
１０Ｕ／ｍｌのアルコールオキシダーゼ（ＡｏＸ）の作業溶液を使用し、１００Ｕの酵素を１０ｍｌのＰＢＳに再懸濁することによって調製した。
【０２９８】
ホースラディッシュペルオキシダーゼを２５０Ｕ／ｍｌで使用し、５ｋＵの酵素を２０ｍｌのＰＢＳに再懸濁することによって調製した。
【０２９９】
ラクチトールの２０％の作業溶液を、５ｇのラクチトールを２５ｍｌのＰＢＳに溶解することによって調製した。ＰＥＩを、必要に応じてラクチトールに加えた。ラクチトールおよびＰＥＩの混合物を、必要に応じてアルコールオキシダーゼと混合した。
【０３００】
糖混合物は、ショ糖（Ｓｉｇｍａ、１６１０４）対ラフィノース５水和物（Ｓｉｇｍａ、Ｒ０２５０）の４：１（重量）比で構成され、最終賦形剤混合物中に６７％または２０％のいずれかの濃度で使用した。６７％の糖混合物は、０．９６Ｍのショ糖および０．０９Ｍのラフィノースの最終濃度に相当し、一方、２０％の糖混合物は、０．２９Ｍのショ糖および０．０３Ｍのラフィノースの最終濃度に相当する。
【０３０１】
ショ糖溶液を、５０ｍｌのファルコンチューブにおいて３２ｇのショ糖粉末を３２ｍｌのＰＢＳに加えることによって調製し、最終濃度６１．５４％に相当する、最終容量５２ｍｌを得た。この溶液を、マイクロ波において穏やかに加熱し、初期の溶媒和を促進したが、その後は４℃において保存した。ラフィノース溶液を、５０ｍｌのファルコンチューブにおいて４ｇのラフィノースを８ｍｌのＰＢＳに加えることによって調製し、最終濃度３９．２２％に相当する、最終容量１０．２ｍｌを得た。溶液をマイクロ波において穏やかに加熱し、完全に溶解させた。一度完全に溶解し、任意の期間、室温または４℃において単独で保存する場合、ラフィノース溶液は沈殿すると思われる。
【０３０２】
最終糖混合物を作製するために、上記のショ糖およびラフィノース溶液を、４：１の比で混合した。実際には、３２ｍｌのショ糖溶液を、８ｍｌのラフィノース溶液に混合した。一度構成させたら、糖混合物を無期限に４℃において保存し、沈殿は起こらなかった。必要に応じてＰＥＩを糖に加えた。糖混合物およびＰＥＩの混合物を、以下の説明のようにアルコールオキシダーゼと混合した。
【０３０３】
乾燥およびフリーズドライのための試料調製
すべての試料を２連に調製し、アッセイした。すべての試料を、必要に応じて、ＰＢＳを用いて１００μｌに仕上げた。示された試薬が存在する場合、試薬を加える順番は常に以下の通りであった：１０Ｕ／ｍｌのアルコールオキシダーゼストックにまずＰＢＳを加え、次いで、糖混合物またはラクチトールその後ＰＥＩを加えた。個々の試料に加えたアルコールオキシダーゼの実際の量は、１０Ｕ／ｍｌのストックを１０μｌであった。個々の試料に加えた糖混合物の実際の量は、上記のように調製した非希釈ストックを、２０μｌ（２０％試料用）または６７μｌ（６７％試料用）であった。個々の試料に加えたラクチトールの実際の量は、２０％のストックを２５μｌであった。個々の試料に加えたＰＥＩの実際の量は、所与のストック濃度を常に１０μｌであった：Ｇｉｂｓｏｎ１（Ｇ１）試料に関しては１％（１６７μＭ）のストック、Ｇｉｂｓｏｎ２（Ｇ２）およびＳｔａｂｉｌｉｔｅｃｈ１（Ｓ１）試料に関しては０．１％（１６．７μＭ）のストックまたはＳｔａｂｉｌｉｔｅｃｈ２（Ｓ２）試料に関しては０．０１％（１．６７μＭ）のストック。
【０３０４】
異なる日に試験した同一の試料に関して、単一のマスター混合物を調製し、次いで、サブアリコートを取り、最終的な１００μｌの試料を得た。乾燥およびフリーズドライの試料を、乾燥後アッセイ時まで３７℃において保存した。対照は、特に明記しない限り０日目のみ試験した。以下の試料を調製しアッセイした。
【０３０５】
【表６】
2012503637.tif 000010
【０３０６】
乾燥およびフリーズドライ
乾燥を、３０℃、５０％大気圧において１０時間実施した。フリーズドライを、ＶｉｒＴｉｓ  Ａｄｖａｎｔａｇｅフリーズドライヤーにおいて、以下のプログラムを使用して標準として実施した：
【０３０７】
【表７】
2012503637.tif 000011
【０３０８】
試料のアッセイ
湿潤対照試料のために、１μｌのアルコールオキシダーゼ、賦形剤および最大９０μｌのＰＢＳをガラスの乾燥／フリーズドライバイアルにとり、最終容量１００μｌを得た。代わりに、乾燥およびフリーズドライの試料を、最終容量１００μｌのＰＢＳに再懸濁した。その後、２．８ｍｌの２ｍＭのＡＢＴＳを各バイアルに加えた。次いで、１０μｌペルオキシダーゼを各バイアルに加えた。その後バイアルを短時間ボルテックス攪拌した。
【０３０９】
その後、比色反応を、１０μｌの１％ＭｅＯＨを各バイアルに加えることによって開始した。試料を、５分ごとに５５分まで採取し、９６ウェルプレートのウェルに加えた。プレートを前もって調製し、７５μｌの２０％ＳＤＳを各ウェルに入れ、反応を停止させた。プレートを最終時点の後で、４０５ｎｍにおいて読み取った。酵素活性を以下の反応速度で評価した（時間に対する吸光度の変化の割合として定義した）。勾配が有効に自己ブランクであるので、ブランクを採ることは実施しなかった。
【０３１０】
結果
結果を図１３に示す。賦形剤の存在下および不在下の、湿潤、乾燥およびフリーズドライのアルコールオキシダーゼ活性を示す：
Ｄ０からＤ１６：３７℃においてインキュベートした日数（乾燥およびフリーズドライの試料）；
Ｎｏ  ＭｅＯＨ：メタノール非添加（陰性対照）；
湿潤：乾燥させずに保存し試験した試料（すなわち新鮮）；
ＦＤ：フリーズドライ；
Ｄ：乾燥；
Ｇ１およびＧ２：ＷＯ９０／０５１８２の実施例１０に従った、それぞれ賦形剤混合物条件Ｇｉｂｓｏｎ１および２の、ならびに
Ｓ１およびＳ２：本発明に従った、それぞれ賦形剤混合物条件Ｓｔａｂｉｌｉｔｅｃｈ１および２。
【０３１１】
Ｇ１だけが、活性に対する有意な負の効果（いずれの乾燥とも無関係であり、乾燥前である）を示し、一方、Ｇ１およびＧ２は、いずれの乾燥とも無関係であり、乾燥前である湿潤状態において活性の最も大きな弱力化を表す。フリーズドライＳ１は、最も大きな保護レベルを提供した。Ｇ１およびＧ２は、乾燥した場合よりフリーズドライした場合に、（Ｓ１ほど優れてはいないが）有意に優れた保護を提供した。したがって、本発明のプロトコルは、ＰＥＩ含有賦形剤混合物に関してＷＯ９０／０５１８２（Ｇｉｂｓｏｎら）の実施例１０に記載されたプロトコルより大幅に優れて機能する。
【０３１２】
少なくとも初めの２週間に関して、３７℃において保存されたフリーズドライＳ１は、４℃において保存された手付かずの湿潤ストックと基本的に同じ活性プロファイルを表す。したがって、３７℃において保存されたフリーズドライＳ１でさえ、冷湿潤保存品に対して活性は弱力化しなかった。さらに、活性消失率は、大部分の活性が長期保存の間持続可能なことを示す、２週間の時系変化にわたって減衰する。この特徴は、５日目にバックグラウンドまで減衰した、ＷＯ９０／０５１８２（Ｇｉｂｓｏｎら）に記載された最もよい結果（フリーズドライＧ２）には存在しない。
【０３１３】
乾燥Ｇ１およびフリーズドライＧ１およびＧ２は、基本的に保護の提供は０であった。Ｇ１が、予備乾燥湿潤状態において沈殿を誘導することおよび、Ｇ１およびＧ２は双方とも凍結乾燥保護がかなり足りないという発見は、ＷＯ９０／０５１８２（Ｇｉｂｓｏｎら、）における賦形剤またはプロトコルが優れた保護レベルを提供するという見解を支持しない。
【０３１４】
フリーズドライＳ２は、フリーズドライＳ１に対する中間保護を提供するが、フリーズドライＧ２とは異なり、この保護は、全２週間の試験期間を通して安定であった。
【０３１５】
賦形剤の不在下の乾燥またはフリーズドライは、検出可能な活性を完全に排除する。このことは、ＷＯ９０／０５１８２（Ｇｉｂｓｏｎら）においてなされた観察と正反対である。ＷＯ９０／０５１８２（Ｇｉｂｓｏｎら）は、乾燥した賦形剤非含有状態に対するすべての賦形剤保護効率をさらに引用している。さらに、ＷＯ９０／０５１８２（Ｇｉｂｓｏｎら）は、賦形剤含有または非含有の乾燥において有意な活性の消失が生じる可能性が最も高いので、この実験のために、より有望な取り組みは、湿潤した、手付かずの（すなわち、基準の純粋な）酵素に対する結果を引用することであると思われた。
【０３１６】
実施例１４
Ｇ−ＣＳＦの保存
１．材料
ヒト組換えＧ−ＣＳＦ（１０μｇ）（ＭＢＬ  ＪＭ−４０９４−１０）
３７％のホルムアルデヒド（ＢＤＨ  ２０９１０．２９４）
３０％のＨ２Ｏ２（Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅｈａｅｎ  ３１６４２）
ホスホ−ＥＲＫ１／ＥＲＫ２（Ｔ２０２／Ｙ２０４）
細胞に基づくＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  ＳＹＳＴＥＭＳ  ＫＣＢ１０１８）
ＨＬ−６０細胞（ＥＣＡＣＣ９８０７０１０６）
ＲＰＭＩ１６４０（Ｓｉｇｍａ  Ｒ８７５８）
ポリ−Ｌ−リジン（０．０１％溶液）（Ｓｉｇｍａ  Ｐ４７０７）
トリパンブルー（ＳｉｇｍａＴ６１４６−５Ｇ）
ペニシリン／ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ  １５０７０）
ＰＥＩ（Ｓｉｇｍａ  Ｐ３１４３、ロット１２７Ｋ０１１０；Ｍｎ６０，０００）
Ｓｕｃ（Ｓｉｇｍａ  １６１０４、ロット７００４０）
Ｒａｆ（Ｓｉｇｍａ  Ｒ０２５０、ロット０３９Ｋ００１６）
ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ  Ｄ８６６２、ロット１１８Ｋ２３３９）
水（Ｓｉｇｍａ  Ｗ３５００、ロット８Ｍ０４１１）
５ｍｌのガラスバイアル（Ａｄｅｌｐｈｉ  Ｔｕｂｅｓ  ＶＣＤ００５）
１４ｍｍのフリーズドライ栓（Ａｄｅｌｐｈｉ  Ｔｕｂｅｓ  ＦＤＩＡ１４ＷＧ／Ｂ）
１４ｍｍのキャップ（Ａｄｅｌｐｈｉ  Ｔｕｂｅｓ  ＣＷＰＰ１４）
ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ  Ｆ７５２４）
【０３１７】
２．方法
以下の溶液を調製した：
【０３１８】
【表８】
2012503637.tif 000012
【０３１９】
糖溶液の調製
ショ糖溶液を、３２ｇのショ糖粉末を３２ｍｌのＰＢＳに、５０ｍｌのファルコンチューブにおいて加えることによって調製し、最終濃度６１．５４％に相当する最終容量５２ｍｌを得た。溶液をマイクロ波において穏やかに加熱し、初期の溶媒和を促進したが、その後は４℃において保存した。
【０３２０】
ラフィノース溶液を、５０ｍｌのファルコンチューブにおいて４ｇのラフィノースを８ｍｌのＰＢＳに加えることによって調製し、最終濃度３９．２％に相当する、最終容量１０．２ｍｌを得た。溶液をマイクロ波において加熱し、完全に溶媒和させた。
【０３２１】
最終糖混合物を作製するために、上記のショ糖およびラフィノース溶液を、４：１の比で混合した。実際には、３２ｍｌのショ糖溶液を、８ｍｌのラフィノース溶液に混合した。一度構成させたら、糖混合物を４℃において保存し、沈殿は起こらなかった。
【０３２２】
ＰＥＩ溶液の調製
６ｇのＰＥＩ（５０％ｗ／ｖ）を５００ｍｌのＰＢＳに加え、６ｍｇ／ｍｌを作製し、その後１／１０に希釈し、６００ｕｇ／ｍｌを作製した。次いで、６００μｇ／ｍｌを希釈し、ＰＥＩの１００μｇ／ｍｌ溶液を作製した。１／１０段階希釈液をＰＢＳで濃度０．０１μｇ／ｍｌまで調製した。ＰＥＩの最終濃度に関して以下の表２に言及する。濃度は、Ｍｎに基づき計算した。
【０３２３】
賦形剤と混合するためのＧ−ＣＳＦの調製
１０μｇの９８％精製組換えヒトＧ−ＣＳＦを、１ｍｌのＰＢＳで再構成し、出発濃度１０μｇ／ｍｌからＰＢＳ中０．２ｎｇ／ｍｌ（１／５０，０００希釈液）に希釈した。Ｇ−ＣＳＦから、１５μｌのアリコートをエッペンドルフチューブにとり、さらなる使用のために−２０℃において保存した。
【０３２４】
第１の希釈液：１０μｌの１０μｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦを、９９０μｌのＰＢＳに加えた（１／１００希釈液）。第２の希釈液：１０μｌのＧ−ＣＳＦの１／１００希釈液を、４．９９ｍｌのＰＢＳに加えた（１／５００希釈液）。Ｇ−ＣＳＦの最終濃度に関して表２に言及する。
【０３２５】
賦形剤の調製
賦形剤を、表２に従って調製した。Ｇ−ＣＳＦの最終濃度は、０．２ｎｇ／ｍｌ／バイアルであった。ショ糖、ラフィノースおよびＰＥＩの最終濃度を表２に示す。賦形剤を、混合のためにボルテックス攪拌し、個々の適切にラベル付けした５ｍｌのガラスバイアルに１００μｌを配置した。試料を、ＶｉｒＴｉｓ  Ａｄｖａｎｔａｇｅフリーズドライヤーによりおよそ３日間フリーズドライした。
【０３２６】
【表９】
2012503637.tif 000013
【０３２７】
試料の再懸濁
試料を、１００μｌアリコートとして調製した。フリーズドライ試料を、１００μｌの水に再懸濁した。
【０３２８】
１日目
以下に記載のＥＬＩＳＡアッセイ方法は、細胞に基づくアッセイキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）の一般的アッセイ手順に従った。
【０３２９】
組織培養
ＨＬ６０細胞を、２０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、グルタミンおよびペニシリン・ストレプトマイシン添加のフェノールレッド含有ＲＰＭＩ１６４０において維持した。ＨＬ−６０細胞を、週に１度継代し、培地は２〜３日ごとに補充した。
【０３３０】
ＨＬ−６０（３代継代）を遠心チューブに移し、１３００ｒｐｍにおいて５分、４℃で遠沈させた。上清をＴ−７５フラスコに出した。ペレットを、１０ｍｌ冷媒体に再懸濁した。
【０３３１】
２００μｌの細胞懸濁液、５ｍｌのピペットを使用してエッペンドルフチューブに移した。別のエッペンドルフチューブにおいて、１００μｌの細胞懸濁液を１００μｌのトリパンブルーに加え混合した。
【０３３２】
血球計算器を、細胞の計測に使用し、細胞濃度を５×１０５細胞／１０ｍｌ中に調整した。
【０３３３】
プレートのコーティング
１００μｌ／ウェルの１０μｇ／ｍｌのポリ−Ｌ−リジンをマイクロプレートに加えた。プレートにシールプレートでカバーし、３７℃において３０分間インキュベートした。ポリ−Ｌ−リジンを個々のウェルから除去し、１００μｌの１×ＰＢＳで２回洗浄した。
【０３３４】
１００μｌ／ウェルのＨＬ−６０細胞系（１０ｍｌ中５×１０５細胞）をプレートに加えた。プレートにカバーをし、３７℃、５％ＣＯ２において一晩インキュベートした。
【０３３５】
２日目
細胞刺激
試験試料のバイアルを、１００μｌの滅菌水で再構成した。プレートを１００μｌの１×ＰＢＳで３回洗浄した；各洗浄ステップを５分間実施した。９０μｌ／ウェルの完全ＲＰＭＩ培地をプレートに加え、次いで、１０μｌ／ウェルの再構成試験試料をプレートに加えた。プレートにカバーをし、３７℃、５％ＣＯ２において１時間インキュベートした。
【０３３６】
細胞の固定
ＥＬＩＳＡプレートを、前記のように洗浄し、１００μｌ／ウェルの１×ＰＢＳ中８％のホルムアルデヒドをプレートに加えた。プレートにカバーをして、室温において２０分間インキュベートした。
【０３３７】
ホルムアルデヒド溶液を除去し、プレートを、２００μｌの１×洗浄バッファーで３回洗浄し各洗浄ステップは、穏やかに揺らしながら５分間実施した。
【０３３８】
洗浄バッファーを除去し、１００μｌ／ウェルのクエンチングバッファーをプレートに加えた。プレートにカバーをして、室温において２０分間インキュベートした。クエンチングバッファーを除去し、前記のようにプレートを洗浄し、１００μｌ／ウェルのブロッキングバッファーをプレートに加えた。プレートにカバーをして、室温において１時間インキュベートした。
【０３３９】
一次および二次抗体の結合
ブロッキングバッファーを除去し、プレートを前記のように洗浄し、１００μｌ／ウェルの一次抗体混合物をプレートに加えた。プレートにカバーをして、４℃において一晩インキュベートした。
【０３４０】
３日目
一次抗体混合物を除去し、プレートを前記のように洗浄し、１００μｌ／ウェルの二次抗体混合物をプレートに加えた。プレートにカバーをして、室温において２時間インキュベートした。
【０３４１】
蛍光原の検出
二次抗体混合物を除去し、前記のように細胞を洗浄し、その後、２００μｌの１×ＰＢＳで２回洗浄した。各洗浄ステップは、穏やかに揺らしながら５分間実施した。
【０３４２】
１×ＰＢＳを除去し、７５μｌ／ウェルの基質（ＲｎＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓによる標識基質Ｆ１）をプレートに加え、プレートにカバーをし、ホイルで包み室温において１時間インキュベートした。７５μｌ／ウェルの第２の基質（ＲｎＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓによる標識基質Ｆ２）をプレートに加え、プレートにカバーをし、ホイルで包み室温において４０分間インキュベートした。
【０３４３】
ＥＬＩＳＡプレートの発色
ＥＬＩＳＡプレートを２回読み取って、１回目の読み取りは、励起が５４０ｎｍおよび発光が６００ｎｍであった。次いで、プレートを、励起が３６０ｎｍおよび発光が４５０ｎｍで、蛍光プレートリーダーにより読み取った。
【０３４４】
結果を、細胞中のリン酸化ＥＲＫ１／ＥＲＫ２の量を表す６００ｎｍにおいて読み取った吸光度、および細胞中の全ＥＲＫ１／ＥＲＫ２の量を表す４５０ｎｍにおいて読み取った吸光度として表した。
【０３４５】
データ分析
個々の試料に関して２連のウェル平均ＯＤ６００ｎｍを計算した。個々の試料に関して２連のウェルの平均ＯＤ４５０ｎｍを計算した。６００ｎｍおよび４５０ｎｍにおける平均吸光度を計算し、組換えヒトＧ−ＣＳＦを含有する試験試料（賦形剤および賦形剤非含有）に対してプロットした。
【０３４６】
３．結果
結果を図１４に示す。この結果は、Ｇ−ＣＳＦと、１．６μＭ、０．１６μＭまたは０．０１６μＭのＰＥＩを含有する賦形剤と、ショ糖およびラフィノースを一緒に混合し、その後、フリーズドライおよび加熱処理することで、高レベルのリン酸化ＥＲＫ１／ＥＲＫ２をもたらすことを示す。
【０３４７】
この結果により、フリーズドライ賦形剤が、熱による不活性化からＧ−ＣＳＦを保護すると思われることが確認された。細胞に基づくバイオアッセイにおいて明らかに示されるように、ＰＥＩおよび糖を含む賦形剤を使用する場合、Ｇ−ＣＳＦによるリン酸化ＥＲＫ１／ＥＲＫ２の活性化レベルが最も高い。ＰＥＩのレベルが高いＧ−ＣＳＦフリーズドライが最も優れた効率を有するという、このアッセイの陽性の結果もまた確認される。これらの結果は、高レベルのＰＥＩと組み合わせた糖が、５６℃においてＧ−ＣＳＦの優れた熱保護を有することを示唆する。
【０３４８】
実施例１５
ＩｇＭ抗体の安定化
１．方法
試験試料の調製
ヒト血清から精製されたＩｇＭ（Ｓｉｇｍａカタログ番号１８２６０）のストックを、緩衝化水溶液（０．０５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．２Ｍの塩化ナトリウム、ｐＨ８．０、１５ｍＭのアジ化ナトリウム含有）で得、４℃において保存した。アリコートの１０μｍＩｇＭを、ＰＢＳからなる賦形剤、ＰＢＳ中１Ｍショ糖および０．１Ｍのラフィノースからなる賦形剤、１Ｍのショ糖、０．１Ｍのラフィノースおよびさらに全容量５０μｌのＰＢＳ中１６．７μＭ（１ｍｇ／ｍｌ）のＰＥＩ（Ｓｉｇｍａカタログ番号１８２６０）からなる賦形剤と混合した。
【０３４９】
個々の製剤の処理を２連に実施した。試料を、ＶｉｒＴｉｓ  Ａｄｖａｎｔａｇｅフリーズドライヤーにおいて、実施例６に記載のプロトコルを使用して凍結乾燥した。このプログラムには、試料に蓋をした時から３日間かかった。実験３日目に、試料を、３７℃において１２時間、その後−２０℃において１０時間、各温度の間に１時間のランピングを有する温度サイクル計画を有する人工気候室に配置した。
【０３５０】
実験１０日目に、温度サイクルの７日後、試料を、１ｍｌのＰＢＳで再構成し、サイズ排除ＨＰＬＣにより分析した。
【０３５１】
ＨＰＬＣ分析
試験試料および基準液を、シリカに基づくサイズ排除カラム（ＴＳＫ−Ｇｅｌ  Ｓｕｐｅｒ  ＳＷ３０００  ＳＥＣカラム、内径４．６ｍｍ、長さ３０ｃｍ）および適合性のあるガードカラム（ＴＳＫ−Ｇｅｌ  ＰＷＸＬ  Ｇｕａｒｄカラム、内径６．０ｍｍ、長さ４．０ｃｍ）に通した。移動相はＰＢＳ（ｐＨ７．０）であった。１００μｌの注入容量を、周囲温度において流速０．３ｍｌ／分、実行時間２５分のカラムに適用した。ＩｇＭおよび分解生成物の一次検出は、１９５および２９０ｎｍの間の最大吸光度を測定することによった。
【０３５２】
データの変換
既知のＩｇＭ濃度（１０〜０．１μｇ／ｍｌ）の基準液を１５０μｌのＰＢＳ中で作製した。これらの基準液を、サイズ排除ＨＰＬＣによりさらに分析し、主要ピークの高さを測定し（保持時間１４．５および１６．１分の間）、最小二乗回帰線を作製しデータを説明した。この等式を使用して、試験試料中のＩｇＭ濃度を試算し、その後これを、既知の出発濃度（１０μｇ／ｍｌ）に対するＩｇＭ回収率に変換した。
【０３５３】
２．結果
ＩｇＭ含有量の試算のための標準曲線
サイズ排除ＨＰＬＣおよびフォトダイオードアレイを使用した成分の検出は、０．０５μｇ（０．５μｇ／ｍｌ）ほど少ないＩｇＭを検出できる。１０〜０．５μｇ／ｍｌの範囲のＩｇＭにおいて、好ましい線形相関が、ＩｇＭ濃度と主要ピークの高さ（Ｒ２＝０．９９３）の間に観察された。最小二乗回帰分析を使用して、適合を説明し（ｙ＝９１３６．７ｘ＋１６５９．２、ここで、ｙ＝ピークの高さおよびｘ＝ＩｇＭ濃度）、作製された等式を使用して試料中のＩｇＭ濃度を試算した。
【０３５４】
ＩｇＭの耐熱性
サイズ排除ＨＰＬＣは、天然のＩｇＭの回収率の見積もりだけをもたらし得る。熱サイクル条件下のＩｇＭの回収は非常に少なく、わずか７日後に出発ＩｇＭの５％未満が得られる。糖（１Ｍのショ糖および０．１Ｍのラフィノース）を添加すると、この回収の２倍を超える（１２．９％）。しかし、依然として回収は低いままである。１６．６７μＭのＰＥＩの添加により、賦形剤の効率は著しく強化され、熱保護としては３５．６％のＩｇＭの回収であった（図１５を参照されたい）。
【０３５５】
実施例１６
Ｇ−ＣＳＦの保存
材料は、実施例１４の通りであった。賦形剤を表３の通りに用意し、フリーズドライ後１週間の間５６℃および３７℃においてインキュベーションさせた。熱チャレンジ後、ＥＲＫ１／２のリン酸化レベルを実施例１４のようにアッセイした。
【０３５６】
【表１０】
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【０３５７】
結果を図１６に示す。結果は、１．６μＭ、０．１６μＭまたは０．０１６μＭのＰＥＩとショ糖およびラフィノースとを一緒に含有する賦形剤を含むＧ−ＣＳＦは、フリーズドライおよび熱チャレンジの間Ｇ−ＣＳＦを保護し、安定化することを示す。Ｇ−ＣＳＦの保護の最も高いレベルは、ＥＲＫ１／２のリン酸化のより高いレベルに反映するように、糖を、最終濃度１．６μＭのＰＥＩと組み合わせて使用した場合に見られる。このことは３７℃および５６℃のインキュベーション双方において明白である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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