(57)【要約】遺伝的に是正された誘導多能性幹細胞の作製および使用のための方法および組成物を提供する。2012527903.tif 000021
2012527903.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝的に是正された誘導多能性幹細胞を調製するための方法であって、以下の段階を含む方法：
（i）遺伝的疾患のある非多能性細胞に疾患是正遺伝子をコードする核酸をトランスフェクトして、遺伝的に是正された非多能性細胞を形成させる段階；
（ii）該遺伝的に是正された非多能性細胞に、OCT4タンパク質をコードする核酸、SOX2タンパク質をコードする核酸、KLF4タンパク質をコードする核酸およびcMYCタンパク質をコードする核酸をトランスフェクトして、トランスフェクトされ遺伝的に是正された非多能性細胞を形成させる段階；ならびに
（iii）該トランスフェクトされ遺伝的に是正された非多能性細胞を分裂させて、それにより、該遺伝的に是正された誘導多能性幹細胞を形成させる段階。
【請求項２】
前記遺伝的疾患のある非多能性細胞がヒト細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記遺伝的疾患のある非多能性細胞がマウス細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項４】
前記疾患是正遺伝子がFANCAタンパク質をコードする、請求項1記載の方法。
【請求項５】
前記疾患是正遺伝子がFANCD2タンパク質をコードする、請求項1記載の方法。
【請求項６】
段階（iii）のトランスフェクトされ遺伝的に是正された非多能性細胞に、少なくとも1つのキナーゼ阻害剤を導入する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項７】
段階（iii）のトランスフェクトされ遺伝的に是正された非多能性細胞に、MEK1キナーゼ阻害剤およびGSK3キナーゼ阻害剤を導入する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項８】
遺伝的に是正された誘導多能性幹細胞を調製するための方法であって、以下の段階を含む方法：
（i）遺伝的疾患のある非多能性細胞に、OCT4タンパク質をコードする核酸、SOX2タンパク質をコードする核酸、KLF4タンパク質をコードする核酸およびcMYCタンパク質をコードする核酸をトランスフェクトして、トランスフェクトされた遺伝的疾患のある非多能性細胞を形成させる段階；
（ii）該トランスフェクトされた遺伝的疾患のある非多能性細胞を分裂させて、それにより、遺伝的疾患のある誘導多能性幹細胞を形成させる段階；ならびに
（iii）該遺伝的疾患のある誘導多能性幹細胞に疾患是正遺伝子をコードする核酸をトランスフェクトして、該遺伝的に是正された誘導多能性幹細胞を形成させる段階。
【請求項９】
段階（ii）のトランスフェクトされた遺伝的疾患のある非多能性細胞に、少なくとも1つのキナーゼ阻害剤を導入する段階をさらに含む、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
段階（ii）のトランスフェクトされた遺伝的疾患のある非多能性細胞に、MEK1キナーゼ阻害剤およびGSK3キナーゼ阻害剤を導入する段階をさらに含む、請求項8記載の方法。
【請求項１１】
請求項1または8に記載の方法に従って調製される、遺伝的に是正された誘導多能性幹細胞。
【請求項１２】
遺伝的疾患のある哺乳動物から、遺伝的に是正された体細胞を生成させるための方法であって、以下の段階を含む方法：
（a）遺伝的に是正された誘導多能性幹細胞を細胞増殖因子と接触させる段階；および
（b）該遺伝的に是正された誘導多能性幹細胞を分裂させて、それにより、該遺伝的に是正された体細胞を形成させる段階。
【請求項１３】
前記遺伝的に是正された誘導多能性幹細胞が、以下の段階を含む方法に従って調製される、請求項12記載の方法：
（i）遺伝的疾患のある非多能性細胞に疾患是正遺伝子をコードする核酸をトランスフェクトして、遺伝的に是正された非多能性細胞を形成させる段階；
（ii）該遺伝的に是正された非多能性細胞に、OCT4タンパク質をコードする核酸、SOX2タンパク質をコードする核酸、KLF4タンパク質をコードする核酸およびcMYCタンパク質をコードする核酸をトランスフェクトして、トランスフェクトされ遺伝的に是正された非多能性細胞を形成させる段階；ならびに
（iii）該トランスフェクトされ遺伝的に是正された非多能性細胞を分裂させて、それにより、該遺伝的に是正された誘導多能性幹細胞を形成させる段階。
【請求項１４】
段階（iii）のトランスフェクトされ遺伝的に是正された非多能性細胞に、キナーゼ阻害剤を導入する段階をさらに含む、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
段階（iii）のトランスフェクトされ遺伝的に是正された非多能性細胞に、MEK1キナーゼ阻害剤およびGSK3キナーゼ阻害剤を導入する段階をさらに含む、請求項13記載の方法。
【請求項１６】
前記遺伝的に是正された誘導多能性幹細胞が、以下の段階を含む方法に従って調製される、請求項12記載の方法：
（i）遺伝的疾患のある非多能性細胞に、OCT4タンパク質をコードする核酸、SOX2タンパク質をコードする核酸、KLF4タンパク質をコードする核酸およびcMYCタンパク質をコードする核酸をトランスフェクトして、トランスフェクトされた遺伝的疾患のある非多能性細胞を形成させる段階；
（ii）該トランスフェクトされた遺伝的疾患のある非多能性細胞を分裂させて、それにより、遺伝的疾患のある誘導多能性幹細胞を形成させる段階；ならびに
（iii）該遺伝的疾患のある誘導多能性幹細胞に疾患是正遺伝子をコードする核酸をトランスフェクトして、該遺伝的に是正された誘導多能性幹細胞を形成させる段階。
【請求項１７】
段階（ii）のトランスフェクトされた遺伝的疾患のある非多能性細胞に、少なくとも1つのキナーゼ阻害剤を導入する段階をさらに含む、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
段階（ii）のトランスフェクトされた遺伝的疾患のある非多能性細胞に、MEK1キナーゼ阻害剤およびGSK3キナーゼ阻害剤を導入する段階をさらに含む、請求項16記載の方法。
【請求項１９】
組織修復を必要とする哺乳動物を治療する方法であって、以下の段階を含む方法：
（i）遺伝的に是正された誘導多能性幹細胞を該哺乳動物に投与する段階、
（ii）該遺伝的に是正された誘導多能性幹細胞を該哺乳動物において分裂させかつ体細胞に分化させて、それにより、該哺乳動物において組織修復を提供する段階。
【請求項２０】
前記遺伝的に是正された誘導多能性幹細胞が、以下の段階を含む方法に従って調製される、請求項19記載の方法：
（i）遺伝的疾患のある非多能性細胞に疾患是正遺伝子をコードする核酸をトランスフェクトして、遺伝的に是正された非多能性細胞を形成させる段階；
（ii）該遺伝的に是正された非多能性細胞に、OCT4タンパク質をコードする核酸、SOX2タンパク質をコードする核酸、KLF4タンパク質をコードする核酸およびcMYCタンパク質をコードする核酸をトランスフェクトして、トランスフェクトされ遺伝的に是正された非多能性細胞を形成させる段階；ならびに
（iii）該トランスフェクトされ遺伝的に是正された非多能性細胞を分裂させて、それにより、該遺伝的に是正された誘導多能性幹細胞を形成させる段階。
【請求項２１】
段階（iii）のトランスフェクトされ遺伝的に是正された非多能性細胞に、キナーゼ阻害剤を導入する段階をさらに含む、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
段階（iii）のトランスフェクトされ遺伝的に是正された非多能性細胞に、MEK1キナーゼ阻害剤およびGSK3キナーゼ阻害剤を導入する段階をさらに含む、請求項20記載の方法。
【請求項２３】
前記遺伝的に是正された誘導多能性幹細胞が、以下の段階を含む方法に従って調製される、請求項19記載の方法：
（i）遺伝的疾患のある非多能性細胞に、OCT4タンパク質をコードする核酸、SOX2タンパク質をコードする核酸、KLF4タンパク質をコードする核酸およびcMYCタンパク質をコードする核酸をトランスフェクトして、トランスフェクトされた遺伝的疾患のある非多能性細胞を形成させる段階；
（ii）該トランスフェクトされた遺伝的疾患のある非多能性細胞を分裂させて、それにより、遺伝的疾患のある誘導多能性幹細胞を形成させる段階；ならびに
（iii）該遺伝的疾患のある誘導多能性幹細胞に疾患是正遺伝子をコードする核酸をトランスフェクトして、該遺伝的に是正された誘導多能性幹細胞を形成させる段階。
【請求項２４】
段階（ii）のトランスフェクトされた遺伝的疾患のある非多能性細胞に、少なくとも1つのキナーゼ阻害剤を導入する段階をさらに含む、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
段階（ii）のトランスフェクトされた遺伝的疾患のある非多能性細胞に、MEK1キナーゼ阻害剤およびGSK3キナーゼ阻害剤を導入する段階をさらに含む、請求項23記載の方法。
【請求項２６】
疾患是正遺伝子をコードする核酸、OCT4タンパク質をコードする核酸、SOX2タンパク質をコードする核酸、KLF4タンパク質をコードする核酸およびcMYCタンパク質をコードする核酸を含む、遺伝的疾患のある非多能性細胞。
【請求項２７】
少なくとも1つのキナーゼ阻害剤をさらに含む、請求項26記載の遺伝的疾患のある非多能性細胞。
【請求項２８】
Mek1キナーゼ阻害剤およびGSK3キナーゼ阻害剤をさらに含む、請求項26記載の遺伝的疾患のある非多能性細胞。
【請求項２９】
前記疾患是正遺伝子がFANCAタンパク質をコードしている、請求項26記載の遺伝的疾患のある非多能性細胞。
【請求項３０】
前記疾患是正遺伝子がFANC2Dタンパク質をコードしている、請求項26記載の遺伝的疾患のある非多能性細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2009年5月27日に提出された米国特許仮出願第61／181,287号の恩典を主張し、その内容は全体としておよびあらゆる目的のために、参照により本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
成熟した体細胞を初期化（reprogram）してiPS細胞を作製する可能性により1-5、再生医療に新たな展望が切り開かれている。iPS細胞の作製は、細胞療法および遺伝子治療において広範囲にわたる用途を有する可能性があり、造血幹細胞数の漸進的な減少によって末梢血細胞の生成が制限される遺伝性骨髄機能不全（BMF）症候群の治療には特に適しうると考えられる。これらの場合には、遺伝的に是正され初期化された細胞からの無病の造血前駆細胞の作製により、以前は考えられていなかった新たな治療選択肢が切り開かれる可能性がある。種々の遺伝性BMF症候群の中で、ファンコニ貧血は最も頻度が高い9。FAは、FA／BRCA経路でこれまでに同定された13種の遺伝子のいずれかにおける突然変異によって引き起こされる稀な常染色体劣性またはX連鎖劣性の染色体不安定性障害である10。これらの患者の細胞は、典型的な染色体不安定性、およびDNA架橋剤に対する過感受性を呈し、それらはFAの診断を下すために用いられるという特徴を示す11。ほとんどのFA患者はBMFを発症し、その累積発生率は40歳までに90％に達する12。さらに、FA患者は悪性腫瘍、主として急性骨髄性白血病および扁平上皮癌を発症しやすい12。現在、FA患者に対して選択される治療法は、HLAが一致する兄弟姉妹（sibling）からの造血性移植片の移植であるが、これは血縁関係のないドナーからの移植術の結果が不良なためである13,14。組込みベクターによる自己HSCの遺伝的是正はFA患者に対する良い治療選択肢となりうるが、これまでに実施された遺伝子治療の治験は臨床的には成功していない15,16。FA患者の骨髄における造血幹細胞の不足16-18は、FA患者でBMFが起こる原因であるだけでなく12、FAの遺伝子治療の有効性を制約する主な要因の1つともなっている15,16。非造血性体細胞の初期化による、遺伝的に是正されたFA特異的iPS細胞の作製は、これらの患者における造血機能を回復させるために用いうる多数の自己造血幹細胞の生成をもたらすと考えられる。本明細書では、ファンコニ貧血（FA）患者由来の体細胞を、その遺伝的欠陥を是正した上で多能性を持つように初期化することで、患者特異的iPS細胞を作製しうることを示す。これらの細胞株は、コロニー形態、増殖特性、多能性に関連した転写因子および表面マーカーの発現、ならびにインビトロおよびインビボでの分化能の点で、ヒト胚性幹細胞および健常個体由来のiPS細胞と識別不能であると考えられる。最も重要なこととして、是正されたFA特異的iPS細胞は、表現型の上で正常な、すなわち無病の、骨髄細胞および赤血球系列の造血前駆細胞を生じうることが実証されている。これらのデータは、iPS細胞技術を、細胞療法の用途に有意義な見込みのある、疾患が是正された患者特異的細胞の作製のために用いうるという概念実証を与えるものである。
【発明の概要】
【０００３】
本明細書では、とりわけ、遺伝的に是正された誘導多能性幹細胞の作出および使用のための効率の高い方法および組成物を提供する。遺伝的に是正された誘導多能性幹細胞は、非多能性の、遺伝的疾患のある細胞の遺伝的是正および初期化を通じて作製することができる。
【０００４】
1つの局面においては、遺伝的に是正された誘導多能性幹細胞を調製するための方法を提供する。本方法は、遺伝的疾患のある非多能性細胞に疾患是正遺伝子をコードする核酸をトランスフェクトして、遺伝的に是正された非多能性細胞を形成させる段階を含む。遺伝的に是正された非多能性細胞に、OCT4タンパク質をコードする核酸、SOX2タンパク質をコードする核酸、KLF4タンパク質をコードする核酸およびcMYCタンパク質をコードする核酸をトランスフェクトして、トランスフェクトされ遺伝的に是正された非多能性細胞を形成させる。トランスフェクトされ遺伝的に是正された非多能性細胞を分裂させて、それにより、遺伝的に是正された誘導多能性幹細胞を形成させる。
【０００５】
別の局面においては、遺伝的に是正された誘導多能性幹細胞を調製するための方法を提供する。本方法は、遺伝的疾患のある非多能性細胞に、OCT4タンパク質をコードする核酸、SOX2タンパク質をコードする核酸、KLF4タンパク質をコードする核酸およびcMYCタンパク質をコードする核酸をトランスフェクトして、トランスフェクトされた遺伝的疾患のある非多能性細胞を形成させる段階を含む。トランスフェクトされた遺伝的疾患のある非多能性細胞を分裂させて、それにより、遺伝的疾患のある誘導多能性幹細胞を形成させる。その上で、遺伝的疾患のある誘導多能性幹細胞に疾患是正遺伝子をコードする核酸をトランスフェクトして、遺伝的に是正された誘導多能性幹細胞を形成させる。
【０００６】
別の局面において、遺伝的に是正された誘導多能性幹細胞は、本明細書において提供された方法に従って調製される。
【０００７】
別の局面においては、遺伝的疾患のある哺乳動物から遺伝的に是正された体細胞を生成させるための方法を提供する。本方法は、遺伝的に是正された誘導多能性幹細胞を細胞増殖因子と接触させる段階、および遺伝的に是正された誘導多能性幹細胞を分裂させて、それにより、遺伝的に是正された体細胞を形成させる段階を含む。
【０００８】
別の局面においては、組織修復を必要とする哺乳動物を治療する方法を提供する。本方法は、遺伝的に是正された誘導多能性幹細胞を哺乳動物に投与する段階、および遺伝的に是正された誘導多能性幹細胞を哺乳動物において分裂させかつ体細胞に分化させて、それにより、哺乳動物において組織修復を提供する段階を含む。
【０００９】
1つの局面においては、疾患是正遺伝子をコードする核酸、OCT4タンパク質をコードする核酸、SOX2タンパク質をコードする核酸、KLF4タンパク質をコードする核酸およびcMYCタンパク質をコードする核酸を含む、遺伝的疾患のある非多能性細胞を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ファンコニ貧血患者からの患者特異的誘導多能性幹細胞の誘導（derivation）。図1a〜1f：患者FA90に由来する遺伝的に是正された初代皮膚線維芽細胞の初期化の成功（図1a）。図1b：hES細胞様形態を示す、Matrigelでコーティングしたプレート上で増殖させたcFA90-44-14系統由来のiPS細胞のコロニー。図1c〜1f：この同じiPS細胞株は、強いAP染色（図1c）、ならびに、転写因子OCT4（図1d）、SOX2（図1e）およびNANOG（図1f）ならびに表面マーカーSSEA3（図1d〜e）およびSSEA4（図1f）の発現を示す。図1g：患者FA404由来の遺伝的に是正された線維芽細胞。図1h：典型的なhES細胞の形態を呈する、フィーダー細胞上で増殖させたcFA404-FiPS4F1系統由来のiPS細胞のコロニー。図1i〜1l：この同じiPS細胞株は、強いAP染色（図1i）、ならびに、多能性に関連した転写因子OCT4（図1j）、SOX2（図1k）およびNANOG（図1l）ならびに表面マーカーSSEA3（図1j）、SSEA4（図1k）およびTRA1-80（図11）の発現を示す。図1d〜1fおよび1j〜1lでは細胞核をDAPIで対比染色している。スケールバー、100μm（図1a、1c〜1g、1i〜1l）および250μm（図1b、1h）。
【図２】FA患者特異的iPS細胞株の分子特性決定。図2a：患者特異的iPS細胞株のcFA90-44-14およびcFA404-FiPS4F1における表記のレトロウイルス導入遺伝子を検出するためのゲノムDNAのPCR。初期化前の患者FA404由来の遺伝的に是正された線維芽細胞（Fibr.）を陰性対照として用いた。図2b〜2c：表記の患者の線維芽細胞（fibr.）および患者特異的iPS細胞株におけるレトロウイルス由来初期化因子の発現レベル（図2b）、ならびに初期化因子および多能性に関連した転写因子の全発現レベル（図2c）の定量的RT-PCR分析。hES細胞（ES[4]）および部分的にサイレンシングを受けるiPS細胞（KiPS4F3）を対照として含めている。GAPDH発現と対比した転写物の発現レベルをプロットしている。図2d〜2g：高レベルの内因性NANOG発現（図2e、2d）、およびFLAG免疫反応性の欠如（図2f、2d）を示しているcFA90-44-14 iPS細胞のコロニー。細胞核をDAPIで対比染色した（図2g、2d）。図2h：患者特異的iPS細胞株cFA90-44-14およびcFA404-KiPS4F3における脱メチル化を患者の線維芽細胞と比較して示している、OCT4プロモーターおよびNANOGプロモーターの重亜硫酸ゲノムシークエンシング。白丸および黒丸の記号はそれぞれ、表記のプロモーター位置での非メチル化CpGおよびメチル化CpGを示している。スケールバー、100μm。図2b〜2cにおけるヒストグラムは、データを以下の順で示している：cFA90 fibr.、cFA90-44-1、cFA90-44-11、cFA90-44-14、cFA90-44-21、cFA404 fibr.、cFA404-KIPS4F1、cFA404-KIPS4F3、cFA404-KIPS4F6、cFA404-FIPS4F1、cFA404-FIPS4F2、ES(4)およびKIPS4F3。
【図３】FA患者特異的iPS細胞の多能性。図3a〜3c：cFA404-FiPS4F2 iPS細胞のインビトロ分化実験により、3つの一次胚葉（primary germ cell layer）すべての派生細胞（cell derivative）を生じる能力が明らかになった。免疫蛍光分析により、図3a、内胚葉（α-フェトプロテイン；FoxA2）、図3b、神経外胚葉（TuJ1；GFAP）および中胚葉（α-アクチニン）のマーカーの発現が示されている。図3d〜3f：免疫不全マウスの皮下へのcFA90-44-14 iPS細胞の注入は、3つの主要な胚葉（embryonic germ layer）に相当する構造を含む奇形腫の形成をもたらす。内胚葉派生物（図3d〜3e）は、内胚葉マーカー（α-フェトプロテイン）で陽染される腺状構造を含む。外胚葉派生物（図3e）は、神経外胚葉マーカー（TuJ1）で陽染される構造を含む。中胚葉派生物（図3f）は、筋肉マーカー（α-アクチニン）で陽染される構造を含む。画像はすべて同じ腫瘍からのものである。スケールバー、100μm（a、b、d、e）および25μm（c、f）。
【図４】患者特異的iPS細胞株における機能的FA経路。図4a：FA患者特異的iPS細胞におけるFANCAの発現を示している、表記の細胞株からのタンパク質抽出物におけるFANCAのウエスタンブロット分析。ビンキュリンの発現をローディング対照として用いた。図4b：FANCD2は、患者FA404由来の線維芽細胞では、シクロブタンピリミジン二量体（CPD）に対する抗体を用いた免疫蛍光によって描出される、UVC放射線で誘発される停止した複製フォーク（stalled replication fork）に再配置されないが、一方、それは野生型線維芽細胞（対照）、是正された線維芽細胞（cFA404）またはFA-iPS由来の細胞（cFA404-FiPS4F2）では損傷部位への正常な蓄積を示す。図4c：形質導入を行っていないか、またはスクランブルshRNA（対照）もしくは表記のFANCA-shRNAを発現するレンチウイルスによる形質導入から6日後のcFA404-KiPS4F3細胞からのタンパク質抽出物におけるFANCAのウエスタンブロット分析。ビンキュリンの発現をローディング対照として用いた。下の値は、濃度測定定量によって測定し、ビンキュリン発現によって正規化した上で、形質導入を行っていないcFA404-KiPS4F3細胞を参照としたFANCA発現レベルを表している。図4d：スクランブルshRNA（対照）または表記のFANCA-shRNAを発現するレンチウイルスによる形質導入を行った後に1回継代したcFA404-KiPS4F3細胞の、播種1週後のアルカリホスファターゼ染色。図4e：スクランブル（対照）またはFANCA siRNAをトランスフェクトして、ジエポキシブタン（DEB）の非存在下または存在下でインキュベートした、cFA404-FiPS4F2由来細胞の分裂指数の値。挿入図は、ビンキュリンをローディング対照として用いたウエスタンブロットによって描出された、これらの実験でFANCA siRNAによって誘導されたFANCA枯渇を示している。
【図５】患者特異的iPS細胞株からの無病の造血前駆細胞の作製。図5a：造血性分化を行わせたiPS細胞におけるCD34マーカーおよびCD45マーカーの発現。図5b〜5c：半固形培養物中でのiPS由来CD34+細胞のインキュベーションの14日後に生じた代表的な赤血球（BFU-E）および骨髄細胞（CFU-GM）コロニー。図5d：CFU-GMコロニーが骨髄細胞性であることが、CFU-GMコロニーにおけるCD33およびCD45マーカーの共発現によって確認された。図5e：表記のFA-iPS細胞株に由来するCD34+細胞から、10nMのマイトマイシンC（MMC）の非存在下および存在下で生じたコロニー形成細胞（CFC）の総数。比較のために、クローン原性アッセイ法を、健常ドナー（2人の無関係なドナー由来の精製CD34+臍帯血細胞、CB CD34+；および単核骨髄細胞、BM MNC）、FA患者、ならびにES[2]細胞（hES）およびKiPS4F1細胞（KiPS）を含む対照ヒト多能性幹細胞から得られたCD34+細胞に由来する造血前駆細胞を用いても行った。図5f：マイトマイシンCで処理した、FA-iPS細胞に由来するCD34+細胞（系統cFA90-44-14）におけるFANCD2集中点を示している免疫蛍光分析。
【図６】ヒト線維芽細胞からの自己再生細胞の誘導。対照ヒト線維芽細胞を、OCT4、SOX2、KLF4およびc-MYCをコードするレトロウイルスに感染させ、阻害剤のPD0325901およびCT99021の存在下でhES細胞培地中での増殖に関して選択した。図6a〜6b：20日後（図6a）および30日後（図6b）に出現した、密集した細胞の明確なコロニー。図6c：マウスES細胞様コロニー形態を呈する、フィーダー上で増殖した10継代時の系統T1-4F#14の細胞。図6d：免疫不全マウスの精巣内へのT1-4F#14細胞の注入は、奇形腫に似ていない、未分化細胞で構成される均質な腫瘍を生じさせた（図6d'は、図6dの枠内の領域を拡大したものである）。図6e：T1-4F#14細胞のゲノムDNAに対するPCRでは、cMYC導入遺伝子の組込みが検出されたのみであった。
【図７】FA患者特異的iPS細胞の核型の正常性。43継代時のcFA90-44-14細胞および24継代時のcFA404-KiPS4F3細胞のGバンド核型分析により、FA患者特異的iPS細胞の核型が正常であることが明らかに示されている。
【図８】患者FA90に由来するそのほかのiPS細胞株の特性決定。患者FA90の是正された線維芽細胞に由来するクローン性iPS細胞株のコロニーにおける、多能性に関連した転写因子OCT4、SOX2およびNANOGならびに表面マーカーSSEA3、SSEA4およびTRA1-60の発現の免疫蛍光分析。
【図９】患者FA404に由来するそのほかのiPS細胞株の特性決定。患者FA404の是正された線維芽細胞に由来するクローン性iPS細胞株のコロニーにおける、多能性に関連した転写因子OCT4、SOX2およびNANOGならびに表面マーカーSSEA3、SSEA4およびTRA1-60のAP染色（上の列）および免疫蛍光分析。
【図１０】患者FA431に由来するiPS細胞株の特性決定。図10a：患者FA431由来の遺伝的に是正された線維芽細胞。図10b〜10f：FANCD2を発現するレンチウイルスによる形質導入を行った患者FA431由来の線維芽細胞（系統cFA431-44-1）の初期化によって作製したiPS細胞は、hES様コロニーとして増殖し（図10b）、AP活性に関して陽染され（図10c）、多能性に関連した転写因子OCT4（図10d）、SOX2（図10e）およびNANOG（図10f）ならびに表面マーカーSSEA3（図10d）、TRA1-81（図10e）およびTRA1-60（図10f）を発現する。図10g：未修正の （FA431-44-1）または遺伝的に是正された（cFA431-44-1）線維芽細胞から作製した系統のiPS様コロニーの、2継代から5日後（上の画像）ならびに3継代から15日後（下左）または7日後（下右）のAP染色。
【図１１】是正されたFA線維芽細胞から作製したiPS細胞株のレトロウイルス組込み。4種のレトロウイルスすべての組込みを示している、表記のiPS細胞株からのゲノムDNAに関するPCR。
【図１２】そのほかのFA患者特異的iPS細胞株のインビトロ分化能力。表記のiPS細胞株のインビトロ分化アッセイ法における、3つの主要な胚葉である内胚葉（α-フェトプロテイン；FoxA2）、外胚葉（TuJ1；チロシンヒドロキシラーゼ、TH；グリア線維酸性タンパク質、GFAP）および中胚葉（ビメンチン、α-アクチニン）を表す分化マーカーの免疫蛍光分析。
【図１３】そのほかのFA患者特異的iPS細胞株の奇形腫形成。免疫不全マウスの精巣内へのcFA404-KiPS4F1細胞の注入は、3つの主要な胚葉に由来する構造を含む複合的な奇形腫の形成を誘導した。内胚葉派生物（上の列）は、円柱状上皮、および内胚葉マーカー（α-フェトプロテインおよびFoxA2）で陽染される構造を含んでいた。外胚葉派生物（中央の列）は、色素上皮、神経ロゼット、および神経外胚葉マーカー（TuJ1およびGFAP）で陽染される構造を含んでいた。中胚葉派生物（下の列）は、軟骨、および筋肉マーカー（α-アクチニン）で陽染される構造を含んでいた。画像はすべて同じ腫瘍からのものである。左および中央の列はヘマトキシリンおよびエオジン染色であり、右の列は表記の抗体を用いた免疫蛍光分析である。
【図１４】FANCAをコードするレンチウイルスベクターによる形質導入後の患者FA404線維芽細胞の表現型修正。図14a：表記の細胞株のゲノム中に組み込まれたFANCA-IRES-EGFPを発現するレンチウイルスのコピー数。*：非クローン形質導入線維芽細胞におけるレンチウイルス組込みの平均数を表す。**：コピー数の値は、フィーダー細胞の混入のために2よりも幾分小さかった。図14b：初期化の前に、FA線維芽細胞にFANCA-IRES-EGFPLVによる形質導入を行った。フローサイトメトリーによるEGFP発現の分析（図14bのヒストグラムパネル）により、形質導入細胞の35〜50％がEGFP陽性であることが指し示された。
【図１５】FAiPS由来細胞における機能的FA経路。FANCD2は、患者FA404由来のFANCA欠損性線維芽細胞では、ヒドロキシ尿素によって誘発された停止および破損した複製フォーク（γ-H2AX集中点によって表示）に再配置されないが、一方、野生型線維芽細胞（対照）、是正されたFA線維芽細胞（cFA404）またはFA-iPS由来の線維芽細胞様細胞（cFA404-FiPS4F2）では正常な共存性の集中点を形成する。
【図１６】cMYCを用いないFA患者特異的iPS細胞の誘導。図16a〜16d：患者FA404に由来する遺伝的に是正された初代表皮ケラチノサイト（keratinocyte）の、c-MYCレトロウイルスの非存在下における初期化の成功。cFA404-KiPS3F1細胞は、転写因子OCT4（図16a）、SOX2（図16b）およびNANOG（図16c）ならびに表面マーカーSSEA3（図16a）、SSEA4（図16b）およびTRA1-60（図16c）の発現、強いAP染色（図16d）を示す。図16e〜16g：cFA404-KiPS3F1細胞の内胚葉（図16e、α-フェトプロテイン；FoxA2）および外胚葉（図16f、TuJ1）派生物へのインビトロ分化。分化の第10日時点の造血前駆細胞（中胚葉派生物）（図16g）。
【図１７】FA患者特異的iPS細胞における初期化因子のレトロウイルス組込み。表記のFA患者特異的iPS細胞株のゲノム中へのレトロウイルス組込みの数を分析するためのサザンブロット法。表記の制限酵素によって消化したゲノムDNAをブロッティングし、初期化因子に対して特異的なプローブとハイブリダイズさせた。患者FA404由来の遺伝的に是正された線維芽細胞（cFA404 fibr.）を内因性バンドに関する対照として用い、ブロットの左側に星印を付して示した。レトロウイルス組込みは矢印によって指し示している。cFA404-KiPS3F1細胞ではc-MYC組込みがないことに注目されたい。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
発明の詳細な説明
I．定義
以下の定義は、本明細書においてしばしば用いられるある種の用語の理解を容易にするために与えられ、本開示の範囲を限定しようとするものではない。
【００１２】
「核酸」とは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、および一本鎖または二本鎖のいずれかの形態にあるそれらの重合体、およびそれらの相補物のことを指す。
【００１３】
「相補的な」または「相補性」という語は、1つのポリヌクレオチド中の核酸が、第2のポリヌクレオチド中の別の核酸と塩基対を形成する能力のことを指す。例えば、配列A-G-Tは配列T-C-Aに対して相補的である。相補性は部分的でもよく、この場合は核酸の一部のみが塩基対合に従って合致し、または完全でもよく、この場合はすべての核酸が塩基対合に従って合致する。
【００１４】
2つまたはそれ以上の核酸の文脈における「同一な」またはパーセント「同一性」という用語は、BLASTもしくはBLAST2.0配列比較アルゴリズムを下記のデフォルトのパラメーターで用いた、または手作業によるアラインメントおよび目視検査による計測で（例えば、NCBIのウェブサイトなどを参照）、同じであるか、または同じヌクレオチドが特定のパーセンテージである（すなわち、ある比較ウィンドウまたは指定領域にわたって最大の対応関係が得られるように比較およびアラインメントを行った場合に、特定された領域にわたって約60％の同一性、好ましくは65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上の同一性がある）、2つまたはそれ以上の配列または部分配列のことを指す。そのような配列はその場合、「実質的に同一である」という。この定義は被験配列の相補物のことも指し、またはそれにも適用されうる。この定義はまた、欠失および／または付加を有する配列、ならびに置換を有するものも含む。以下に述べる通り、好ましいアルゴリズムはギャップなどを考慮に入れている。好ましくは、同一性は、長さが少なくとも約25アミノ酸もしくはヌクレオチドである領域にわたって存在し、またはより好ましくは長さが50〜100アミノ酸もしくはまたはヌクレオチドである領域にわたって存在する。
【００１５】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という語句は、あるプローブが、典型的には核酸の複合混合物中で、その標的配列とはハイブリダイズするが、他の配列とはハイブリダイズしないと考えられる条件のことを指す。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、環境が異なれば異なると考えられる。配列が長いほど、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに関する詳細な手引きは、Tijssen, TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY--HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC PROBES, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993)に記載がある。一般に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度 pHでのその特定の配列の融解点（Tm）よりも約5〜10℃低くなるように選択する。Tmは、標的に対して相補的なプローブの50％が平衡状態で標的配列とハイブリダイズする（規定のイオン強度、pHおよび核酸濃度の下での）温度である（標的配列が過剰に存在するため、Tmでは平衡状態でプローブの50％が占有される）。また、ストリンジェントな条件を、ホルムアミドなどの脱安定剤の添加によって達成することもできる。選択的または特異的なハイブリダイゼーションの場合、陽性シグナルはバックグラウンドの少なくとも2倍、選択的にはバックグラウンドのハイブリダイゼーションの10倍である。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、以下のものであってよい：50％ホルムアミド、5×SSCおよび1％ SDSにて42℃でインキュベートを行うか、または5×SSC、1％ SDSにて65℃でインキュベートを行い、その上で0.2×SSCおよび0.1％ SDSにて65℃で洗浄する。
【００１６】
核酸ハイブリダイゼーション手法を用いる、特定のDNAおよびRNAの測定のための種々の方法が当業者に公知である（Sambrook、前記を参照）。いくつかの方法は電気泳動分離を伴うが（例えば、DNAの検出のためのサザンブロット法、およびRNAの検出のためのノーザンブロット法）、DNAおよびRNAの測定を電気泳動分離を用いずに行うこともできる（例えば、ドットブロットによる）。
【００１７】
ハイブリダイゼーションアッセイ法の感度を、検出しようとする標的核酸を大きく増加させる核酸増幅システムの使用を通じて高めることもできる。そのようなシステムの例には、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）システムおよびリガーゼ連鎖反応（LCR）システムが含まれる。当技術分野で最近記載されている他の方法には、核酸配列ベースの増幅（NASBA、Cangene, Mississauga, Ontario）およびQ Betaレプリカーゼシステムがある。これらのシステムは、選択した配列が存在する場合にのみPCRプライマーまたはLCRプライマーが伸長または連結するように設計されている場合、突然変異体を直接同定するために用いうる。または、選択した配列を、例えば非特異的PCRプライマーを用いて全体的に増幅し、増幅された標的領域をその後に、突然変異を指し示す特定の配列に対してプローブ検索することもできる。Taqman（登録商標）プローブおよび分子ビーコンプローブを含むさまざまな検出プローブを用いて、増幅反応産物を、例えばリアルタイムでモニターしうることは了解されている。
【００１８】
「ポリヌクレオチド」という語は、線状のヌクレオチド配列のことを指す。ヌクレオチドは、リボヌクレオチドであっても、デオキシリボヌクレオチドであっても、または両方の混合物であってもよい。本明細書で想定しているポリヌクレオチドの例には、一本鎖および二本鎖のDNA、一本鎖および二本鎖のRNA（miRNAを含む）、ならびに一本鎖および二本鎖のDNAおよびRNAの混合物を有するハイブリッド分子が含まれる。
【００１９】
「タンパク質」、「ペプチド」および「ポリペプチド」という語は、アミノ酸重合体、または2つまたはそれ以上の相互作用性もしくは結合したアミノ酸重合体のセットを表すために互換的に用いられる。
【００２０】
「遺伝子」という用語は、タンパク質の産生に関与するDNAのセグメントのことを指す；これには、コード領域の前および後の領域（リーダーおよびトレーラー）、ならびに個々のコードセグメント（エクソン）の間の介在配列（イントロン）も含まれる。リーダー、トレーラーならびにイントロンは、遺伝子の転写および翻訳の際に必要な調節エレメントを含む。さらに、「タンパク質遺伝子産物」とは、特定の遺伝子から発現されるタンパク質のことである。
【００２１】
「欠失」は、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列のいずれかにおける、それぞれ1つまたは複数のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が存在しない変化と定義される。
【００２２】
「挿入」または「付加」とは、本明細書で用いる場合、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列における、天然の配列と比較して、それぞれ1つまたは複数のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の追加がもたらされる変化のことである。
【００２３】
「置換」は、1つまたは複数のヌクレオチドまたはアミノ酸の、それぞれ異なるヌクレオチドまたはアミノ酸による置換えに起因する。
【００２４】
アミノ酸配列に関する「変異体」とは、本明細書において、1つまたは複数のアミノ酸が、別のアミノ酸、通常は類縁のアミノ酸とは異なっているアミノ酸配列を指し示すために用いられる。変異体は「保存的」変化を有してもよく、この場合には、置換されたアミノ酸が類似の構造または化学特性を有する（例えば、ロイシンのイソロイシンによる置換え）。変異体が、例えば、グリシンのトリプトファンによる置換えのような「非保存的」変化を有してもよい。同様の軽微な相違には、アミノ酸の欠失もしくは挿入（すなわち、付加）、またはその両方も含まれうる。
【００２５】
「座位」とは、本明細書で用いる場合、1つまたは複数の遺伝子によって占有されうる染色体上の定位置のことである。染色体上の遺伝子の座位は、その染色体上の他の遺伝子と対比したその直線的順序によって決定される。所与の座位でのDNA配列の変異体は「アレル」と呼ばれる。
【００２６】
「ウイルスベクター」とは、別の核酸を細胞内に輸送することのできる、ウイルス由来の核酸のことである。ウイルスベクターは、適切な環境に存在すると、そのベクターによって運ばれる1つまたは複数の遺伝子によってコードされる1つまたは複数のタンパク質の発現を導くことができる。ウイルスベクターの例には、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターが非限定的に含まれる。
【００２７】
「トランスフェクション」または「トランスフェクトすること」という用語は、非ウイルス的な方法およびウイルスをベースにした方法によって、核酸分子を細胞に導入する過程と定義される。非ウイルス的なトランスフェクション方法に関しては、核酸分子を細胞内に導入するための送達システムとしてウイルスDNAもウイルス粒子も用いない任意の適切なトランスフェクション法が、本明細書に記載された方法において有用である。例示的なトランスフェクション法には、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポソームトランスフェクション、ヌクレオフェクション、ソノポレーション、熱ショックを介したトランスフェクション、マグネトフェクションおよびエレクトロポレーションが含まれる。いくつかの態様において、核酸分子は、当技術分野において周知の標準的な手順に従ったエレクトロポレーションを用いて細胞内に導入される。ウイルスをベースにしたトランスフェクション方法に関しては、任意の有用なウイルスベクターを本明細書に記載された方法に用いうる。ウイルスベクターの例には、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターが非限定的に含まれる。
【００２８】
「発現」または「発現された」という語は、遺伝子に言及して本明細書で用いる場合、その遺伝子の転写産物および／または翻訳産物のことを意味する。細胞におけるDNA分子の発現レベルは、その細胞内に存在する対応するmRNAの量、またはその細胞によって産生されるそのDNAによってコードされるタンパク質の量のいずれかに基づいて決定しうる（Sambrook et al., 1989 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 18.1-18.88）。
【００２９】
トランスフェクトされた遺伝子の発現は、細胞において一過性にまたは安定的に起こってもよい。「一過性発現」の際には、トランスフェクトされた遺伝子は細胞分裂の際に娘細胞に移行しない。その発現はトランスフェクトされた細胞に限られるため、その遺伝子の発現は時間が経つと失われる。対照的に、遺伝子を、トランスフェクトされた細胞に選択優位性を付与する別の遺伝子とともにコトランスフェクトした場合には、トランスフェクトされた遺伝子の安定した発現が起こりうる。そのような選択優位性は、細胞に対して与えられるある種の毒素に対する耐性であってもよい。トランスフェクトされた遺伝子の発現を、さらに、宿主ゲノム中へのトランスポゾン媒介挿入によって実現することもできる。トランスポゾン媒介挿入の際には、宿主ゲノム中への挿入ならびにその後の切り出しを可能にする2つのトランスポゾンリンカー配列の間に遺伝子を配置する。
【００３０】
「プラスミド」という用語は、遺伝子および／または遺伝子の発現のために必要な調節エレメントをコードする核酸分子のことを指す。プラスミドからの遺伝子の発現は、シス性に起こってもまたはトランス性に起こってもよい。遺伝子をシス性に発現させる場合には、遺伝子および調節エレメントを同一のプラスミドによってコードさせる。トランス性の発現とは、遺伝子および調節エレメントが別々のプラスミドによってコードされる場合のことを指す。
【００３１】
「エピソーム性」という用語は、プラスミドが細胞内で染色体外状態にあることを指す。エピソーム性プラスミドとは、染色体DNAの一部でなく、それとは独立に複製する核酸分子のことである。
【００３２】
「細胞培養物」とは、生物の体外に存在する細胞集団のことである。これらの細胞は、任意で、細胞バンク、動物もしくは血液バンクから単離された初代細胞、またはこれらの供給源の1つに由来し、長期的なインビトロ培養のために不死化された二次細胞である。
【００３３】
「幹細胞」とは、有糸細胞分裂を通じての自己再生能力、および組織または臓器へと分化する潜在能力を特徴とする細胞のことである。哺乳動物幹細胞の中で、胚性幹細胞および体性幹細胞を区別することができる。胚性幹細胞は胚盤胞の中に存在し、胚組織を生じさせるが、一方、体性幹細胞は組織の再生および修復を目的として成体組織に存在する。
【００３４】
「多能性の」または「多能性」という用語は、適切な条件下で、3胚葉（内胚葉、中胚葉および外胚葉）由来の細胞系列に付随する特徴を全体として呈する複数の細胞種への分化を行いうる子孫を生じる能力を有する細胞のことを指す。多能性幹細胞は、出生前、出生後、または成体の動物の組織の元になりうる。8〜12週齢のSCIDマウスにおいて奇形腫を形成する能力のような当技術分野において認められている標準的な検査を用いることで、細胞集団の多能性を立証することができる。しかし、多能性幹細胞のさまざまな特徴の同定を用いて、多能性細胞を同定することもできる。
【００３５】
「多能性幹細胞の特徴」とは、多能性幹細胞を他の細胞と区別する目安となる細胞の特徴のことを指す。分子マーカーのある特定の組み合わせの発現または非発現（non-expression）は、多能性幹細胞の特徴の例である。より具体的には、ヒト多能性幹細胞は、以下の非限定的なリストのうちの少なくともいくつかの、任意ですべてのマーカーを発現しうる：SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、TRA-2-49/6E、ALP、Sox2、E-カドヘリン、UTF-1、Oct4、Lin28、Rex1、およびNanog。多能性幹細胞に付随する細胞形態も多能性幹細胞の特徴である。
【００３６】
「誘導多能性幹細胞」とは、非多能性細胞から人工的に得られた多能性幹細胞のことを指す。非多能性細胞は、多能性幹細胞よりも自己再生および分化の能力が低い細胞でありうる。能力が低い細胞は、体性幹細胞、組織特異的前駆細胞、初代細胞または二次細胞でありうるが、それらには限定されない。限定的ではないが、体性幹細胞は、造血幹細胞、間葉幹細胞、上皮幹細胞、皮膚幹細胞または神経幹細胞でありうる。組織特異的前駆細胞とは、特定の臓器または組織に分化することが運命づけられている、自己再生能力を持たない細胞のことを指す。初代細胞には、卵細胞、精子細胞および幹細胞を除く、成体または胎児生物の任意の細胞が含まれる。有用な初代細胞の例には、皮膚細胞、骨細胞、血液細胞、内臓の細胞および結合組織の細胞が非限定的に含まれる。二次細胞は初代細胞から得られ、長期的なインビトロ細胞培養のために不死化されている。
【００３７】
「初期化」という用語は、非多能性細胞を、多能性幹細胞の特徴を呈する細胞に脱分化させる過程のことを指す。
【００３８】
「治療すること」という用語は、治療しようとする疾患を軽快させること、抑制すること、消失させること、および／または、その発病を遅らせることを意味する。
【００３９】
II．遺伝的に是正された誘導多能性幹細胞の調製方法
1つの局面においては、遺伝的に是正された誘導多能性幹細胞を調製するための方法を提供する。本方法は、遺伝的疾患のある非多能性細胞に疾患是正遺伝子をコードする核酸をトランスフェクトして、遺伝的に是正された非多能性細胞を形成させる段階を含む。遺伝的に是正された非多能性細胞に、OCT4タンパク質をコードする核酸、SOX2タンパク質をコードする核酸、KLF4タンパク質をコードする核酸およびcMYCタンパク質をコードする核酸をトランスフェクトして、トランスフェクトされ遺伝的に是正された非多能性細胞を形成させる。トランスフェクトされ遺伝的に是正された非多能性細胞を分裂させて、それにより、遺伝的に是正された誘導多能性幹細胞を形成させる。
【００４０】
「遺伝的に是正された誘導多能性幹細胞」とは、遺伝的疾患のある非多能性細胞から作り出され、遺伝的欠陥に関して是正された誘導多能性幹細胞のことを指す。遺伝的疾患のある非多能性細胞は、単一の遺伝子またはアレルの遺伝的欠陥を含む。非多能性細胞の初期化を行う前に、遺伝的欠陥の是正を通じて、遺伝的に是正された誘導多能性幹細胞を作製する。遺伝的欠陥が単一遺伝子疾患の基礎をなしてもよく、これにはある遺伝子における塩基対の欠失、挿入または突然変異が非限定的に含まれる。単一遺伝子疾患には単一の遺伝子の欠陥に起因する障害が含まれ、これは優性、劣性またはX連鎖性でありうる。劣性の単一遺伝子疾患は、ある遺伝子の両方のコピーの欠陥を特徴とする。優性の単一遺伝子疾患は、遺伝子の一方のコピーのみに欠陥を伴う。X連鎖性の単一遺伝子疾患とは、X染色体上の欠陥遺伝子と関連している障害のことである。単一遺伝子疾患の例には、重症複合免疫不全症、サラセミア、鎌状赤血球貧血、ファンコニ貧血、血友病A、血友病B、嚢胞性線維症、α1-アンチトリプシン欠損症、カナヴァン病、筋ジストロフィー、アデノシンデアミナーゼ欠損症、テイ・サックス病、脆弱X染色体症、ハンチントン病、ゴーシェ病、ハーラー病、フォンレックリングハウゼン病、家族性高コレステロール血症、フォンビルブラント病、先天性レプチン欠損症、先天性神経原性尿崩症、ファブリー病、およびポンペ病がある。
【００４１】
遺伝的疾患のある非多能性細胞は、疾患是正遺伝子を導入することによって是正することができる。疾患是正遺伝子とは、その疾患の原因となる欠陥遺伝子の、欠陥のない型のことである。疾患是正遺伝子は、本明細書に記載されたトランスフェクション法に従って、遺伝的疾患のある非多能性細胞に導入することができる。疾患是正遺伝子の発現により、非罹病細胞が生じ、それにより、遺伝的に是正された非多能性細胞が形成される。
【００４２】
本明細書において称する「OCT4タンパク質」には、天然型のオクタマー4転写因子、またはOct4転写因子活性を維持している（例えば、Oct4と比較して少なくとも50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％または100％の活性の範囲にある）その変異体の任意のものが含まれる。いくつかの態様において、変異体は、天然のOct4ポリペプチド（例えば、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2またはSEQ ID NO：3）と比較して、配列全体または配列の一部分（例えば、50、100、150または200個の連続したアミノ酸の部分）にわたって、少なくとも90％、95％、96％、97％、98％、99％または100％のアミノ酸配列同一性を有する。他の態様において、Oct4タンパク質は、アイソフォーム1に対応するNCBI参照番号gi:42560248（SEQ ID NO：1）、ならびにアイソフォーム2に対応するgi:116235491およびgi:291167755（SEQ ID NO：2およびSEQ ID NO：3）によって特定されるタンパク質である。
【００４３】
本明細書において称する「SOX2タンパク質」には、天然型のSox2転写因子、またはSox2転写因子活性を維持している（例えば、Sox2と比較して少なくとも50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％または100％の活性の範囲にある）その変異体の任意のものが含まれる。いくつかの態様において、変異体は、天然のSox2ポリペプチド（例えば、SEQ ID NO：4）と比較して、配列全体または配列の一部分（例えば、50、100、150または200個の連続したアミノ酸の部分）にわたって、少なくとも90％、95％、96％、97％、98％、99％または100％のアミノ酸配列同一性を有する。他の態様において、Sox2タンパク質は、NCBI参照番号gi:28195386（SEQ ID NO：4）によって特定されるタンパク質である。
【００４４】
本明細書において称する「KLF4タンパク質」には、天然型のKLF4転写因子、またはKLF4転写因子活性を維持している（例えば、KLF4と比較して少なくとも50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％または100％の活性の範囲にある）その変異体の任意のものが含まれる。いくつかの態様において、変異体は、天然のKLF4ポリペプチド（例えば、SEQ ID NO：5）と比較して、配列全体または配列の一部分（例えば、50、100、150または200個の連続したアミノ酸の部分）にわたって、少なくとも90％、95％、96％、97％、98％、99％または100％のアミノ酸配列同一性を有する。他の態様において、KLF4タンパク質は、NCBI参照番号gi:194248077（SEQ ID NO：5）によって特定されるタンパク質である。
【００４５】
本明細書において称する「cMYCタンパク質」には、天然型のcMyc転写因子、またはcMyc転写因子活性を維持している（例えば、cMycと比較して少なくとも50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％または100％の活性の範囲にある）その変異体の任意のものが含まれる。いくつかの態様において、変異体は、天然のcMycポリペプチド（例えば、SEQ ID NO：6）と比較して、配列全体または配列の一部分（例えば、50、100、150または200個の連続したアミノ酸の部分）にわたって、少なくとも90％、95％、96％、97％、98％、99％または100％のアミノ酸配列同一性を有する。他の態様において、cMycタンパク質は、NCBI参照番号gi:71774083（SEQ ID NO：6）によって特定されるタンパク質である。
【００４６】
トランスフェクトされ遺伝的に是正された非多能性細胞を分裂させて、それにより、遺伝的に是正された誘導多能性幹細胞を形成させることには、トランスフェクトされ遺伝的に是正された非多能性細胞のトランスフェクション後の増大（expansion）、トランスフェクトされた細胞の任意の選択、および多能性幹細胞の同定が含まれうる。本明細書で用いる場合の増大には、容器内のおよび当技術分野において周知の条件下での、トランスフェクトされ遺伝的に是正された非多能性細胞子孫細胞の生成が含まれうる。増大は、適した培地および細胞増殖因子の存在下で生じさせることができる。細胞増殖因子とは、細胞を移動させる、分化させる、形質転換させる、または成熟させて分裂させる、作用物質のことである。それらは、さまざまな正常および悪性の哺乳動物細胞種から通常、単離しうるポリペプチドである。また、いくつかの増殖因子は、遺伝的に操作された微生物、例えば細菌（大腸菌（E. coli））および酵母などによって産生させることもできる。細胞増殖因子は培地に加えてもよく、および／または、そのような細胞増殖因子を分泌する照射処理済みの胚性線維芽細胞との共培養を介して与えてもよい。細胞増殖因子の例には、FGF、bFGF2およびEGFが非限定的に含まれる。
【００４７】
適切な場合に、トランスフェクトされ遺伝的に是正された非多能性細胞の増大を、選択過程の下で行ってもよい。選択の過程には、トランスフェクション時に神経幹細胞に導入された選択マーカーが含まれうる。選択マーカーは、酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であってよい。酵素活性には、アセチルトランスフェラーゼおよびホスホトランスフェラーゼの活性が非限定的に含まれる。いくつかの態様において、選択マーカーの酵素活性は、ホスホトランスフェラーゼの活性である。選択マーカーの酵素活性が、トランスフェクトされた神経幹細胞に、毒素の存在下における増大能力を付与してもよい。そのような毒素は、典型的には、細胞の増大を阻害する、および／または細胞死を引き起こす。そのような毒素の例には、ハイグロマイシン、ネオマイシン、ピューロマイシンおよびゲンタマイシンが非限定的に含まれる。いくつかの態様において、毒素はハイグロマイシンである。選択マーカーの酵素活性を通じて、毒素は、トランスフェクトされ遺伝的に是正された非多能性細胞の増大を阻害することも細胞死を引き起こすことももはやない非毒素に変換されると考えられる。毒素に曝露させると、選択マーカーを持たない細胞は除去され、その結果、増大が起こらないようにすることができる。
【００４８】
遺伝的に是正された誘導多能性幹細胞の同定には、前述の多能性幹細胞の特徴の評価が非限定的に含まれうる。そのような多能性幹細胞の特徴には、さらに限定するわけではないが、分子マーカーのある特定の組み合わせの発現または非発現が含まれる。さらに、多能性幹細胞に付随する細胞形態も多能性幹細胞の特徴である。
【００４９】
遺伝的疾患のある非多能性細胞は哺乳動物細胞であってよい。いくつかの態様において、遺伝的疾患のある非多能性細胞はヒト細胞である。他の態様において、遺伝的疾患のある非多能性細胞はマウス細胞である。
【００５０】
疾患是正遺伝子が、発現されると遺伝子欠陥を代償し、非罹病細胞の状態を回復させることのできるポリペプチドをコードしてもよい。いくつかの態様において、疾患是正遺伝子は、FANCAタンパク質をコードする。本明細書において称する「FANCAタンパク質」とはファンコニ貧血相補群Aのことであり、これには、天然型のFANCAタンパク質、またはFANCAタンパク質活性を維持している（例えば、FANCAと比較して少なくとも50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％または100％の活性の範囲にある）その変異体の任意のものが含まれる。いくつかの態様において、変異体は、天然のFANCAポリペプチド（例えば、SEQ ID NO：7）と比較して、配列全体または配列の一部分（例えば、50、100、150または200個の連続したアミノ酸の部分）にわたって、少なくとも90％、95％、96％、97％、98％、99％または100％のアミノ酸配列同一性を有する。他の態様において、他の態様において、FANCAタンパク質は、NCBI参照番号gi:66880553（SEQ ID NO：7）によって特定されるタンパク質である。他の態様において、疾患是正遺伝子はFANCD2タンパク質をコードする。本明細書において称する「FANCD2タンパク質」とはファンコニ貧血相補群D2のことであり、これには、天然型のFANCD2タンパク質、またはFANCD2タンパク質活性を維持している（例えば、FANCD2と比較して少なくとも50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％または100％の活性の範囲にある）その変異体の任意のものが含まれる。いくつかの態様において、変異体は、天然のFANCD2ポリペプチド（例えば、SEQ ID NO：8）と比較して、配列全体または配列の一部分（例えば、50、100、150または200個の連続したアミノ酸の部分）にわたって、少なくとも90％、95％、96％、97％、98％、99％または100％のアミノ酸配列同一性を有する。他の態様において、FANCD2タンパク質は、NCBI参照番号gi:21361861（SEQ ID NO：8）によって特定されるタンパク質である。
【００５１】
本明細書に記載された方法は、トランスフェクトされ遺伝的に是正された非多能性細胞を分裂させて、それにより、遺伝的に是正された多能性幹細胞を形成させる際に、キナーゼ阻害剤の導入を含みうる。キナーゼ阻害剤とは、1つまたは複数のプロテインキナーゼの作用を特異的に阻止する酵素阻害剤のことである。リン酸化されるアミノ酸に応じて、キナーゼは、セリンおよびスレオニンキナーゼ、チロシンキナーゼおよびヒスチジンキナーゼに細分することができる。キナーゼ阻害剤はそのようなアミノ酸のリン酸化を妨げる。キナーゼ阻害剤の例には、モノクローナル抗体、小型分子および有機化合物が非限定的に含まれる。キナーゼ阻害剤は、遺伝的に是正された非多能性細胞に対して、OCT4タンパク質、SOX2タンパク質、KLF4タンパク質およびcMYCタンパク質をコードする核酸によるトランスフェクション時に添加してもよい。キナーゼ阻害剤を、遺伝的に是正された非多能性細胞に対して、OCT4タンパク質、SOX2タンパク質、KLF4タンパク質およびcMYCタンパク質をコードする核酸によるトランスフェクション後に添加してもよい。いくつかの態様においては、少なくとも1つのキナーゼ阻害剤を、段階（iii）のトランスフェクトされ遺伝的に是正された非多能性細胞に導入する。他の態様においては、MEK1キナーゼ阻害剤およびGSK3キナーゼ阻害剤を、段階（iii）のトランスフェクトされ遺伝的に是正された非多能性細胞に導入する。
【００５２】
別の局面においては、遺伝的に是正された誘導多能性幹細胞を調製するための方法を提供する。本方法は、遺伝的疾患のある非多能性細胞に、OCT4タンパク質をコードする核酸、SOX2タンパク質をコードする核酸、KLF4タンパク質をコードする核酸およびcMYCタンパク質をコードする核酸をトランスフェクトして、トランスフェクトされた遺伝的疾患のある非多能性細胞を形成させる段階を含む。トランスフェクトされた遺伝的疾患のある非多能性細胞を分裂させて、それにより、遺伝的疾患のある誘導多能性幹細胞を形成させる。その上で、遺伝的疾患のある誘導多能性幹細胞に疾患是正遺伝子をコードする核酸をトランスフェクトして、遺伝的に是正された誘導多能性幹細胞を形成させる。
【００５３】
トランスフェクトされた遺伝的疾患のある非多能性細胞を分裂させて、それにより、遺伝的疾患のある誘導多能性幹細胞を形成させることには、トランスフェクトされた遺伝的非多能性細胞のトランスフェクション後の増大、任意でのトランスフェクトされた細胞の選択、および多能性幹細胞の同定が含まれうる。本明細書で用いる場合の増大には、容器内のおよび当技術分野において周知の条件下での、トランスフェクトされ遺伝的に是正された非多能性細胞の子孫細胞の生成が含まれうる。増大は、適した培地および細胞増殖因子の存在下で生じさせることができる。細胞増殖因子とは、細胞を移動させる、分化させる、形質転換させる、または成熟させて分裂させる、作用物質のことである。それらは、さまざまな正常および悪性の哺乳動物細胞種から通常、単離しうるポリペプチドである。また、いくつかの増殖因子は、遺伝的に操作された微生物、例えば細菌（大腸菌）および酵母などによって産生させることもできる。細胞増殖因子は培地に加えてもよく、および／または、そのような細胞増殖因子を分泌する照射処理済みの胚性線維芽細胞との共培養を介して与えてもよい。細胞増殖因子の例には、FGF、bFGF2およびEGFが非限定的に含まれる。
【００５４】
適切な場合に、トランスフェクトされた遺伝的疾患のある非多能性細胞の増大を、選択過程の下で行ってもよい。選択の過程には、トランスフェクション時に神経幹細胞に導入された選択マーカーが含まれうる。選択マーカーは、酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であってよい。酵素活性には、アセチルトランスフェラーゼおよびホスホトランスフェラーゼの活性が非限定的に含まれる。いくつかの態様において、選択マーカーの酵素活性は、ホスホトランスフェラーゼの活性である。選択マーカーの酵素活性が、トランスフェクトされた神経幹細胞に、毒素の存在下における増大能力を付与してもよい。そのような毒素は、典型的には、細胞の増大を阻害する、および／または細胞死を引き起こす。そのような毒素の例には、ハイグロマイシン、ネオマイシン、ピューロマイシンおよびゲンタマイシンが非限定的に含まれる。いくつかの態様において、毒素はハイグロマイシンである。選択マーカーの酵素活性を通じて、毒素は、トランスフェクトされ遺伝的に是正された非多能性細胞の増大を阻害することも細胞死を引き起こすことももはやない非毒素に変換されると考えられる。毒素に曝露させると、選択マーカーを持たない細胞は除去され、その結果、増大が起こらないようにすることができる。
【００５５】
遺伝的疾患のある誘導多能性幹細胞の同定には、前述の多能性幹細胞の特徴の評価が非限定的に含まれうる。そのような多能性幹細胞の特徴には、さらに限定するわけではないが、分子マーカーのある特定の組み合わせの発現または非発現が含まれる。さらに、多能性幹細胞に付随する細胞形態も多能性幹細胞の特徴である。
【００５６】
遺伝的疾患のある非多能性細胞は哺乳動物細胞であってよい。いくつかの態様において、遺伝的疾患のある非多能性細胞はヒト細胞である。他の態様において、遺伝的疾患のある非多能性細胞はマウス細胞である。
【００５７】
疾患是正遺伝子が、発現されると遺伝子欠陥を代償し、非罹病細胞の状態を回復させることのできるポリペプチドをコードしてもよい。いくつかの態様において、疾患是正遺伝子は、FANCAタンパク質をコードする。他の態様において、FANCAタンパク質は、NCBI参照番号gi:66880553によって特定されるタンパク質である。いくつかの態様において、疾患是正遺伝子はFANCD2タンパク質をコードする。他の態様において、FANCD2タンパク質は、NCBI参照番号gi:21361861によって特定されるタンパク質である。
【００５８】
本明細書に記載された方法は、トランスフェクトされた遺伝的疾患のある非多能性細胞を分裂させて、それにより、遺伝的疾患のある多能性幹細胞を形成させる際に、キナーゼ阻害剤の導入を含みうる。キナーゼ阻害剤は、遺伝的疾患のある非多能性細胞に対して、OCT4タンパク質、SOX2タンパク質、KLF4タンパク質およびcMYCタンパク質をコードする核酸によるトランスフェクション時に添加してもよい。キナーゼ阻害剤を、遺伝的疾患のある非多能性細胞に対して、OCT4タンパク質、SOX2タンパク質、KLF4タンパク質およびcMYCタンパク質をコードする核酸によるトランスフェクション後に添加してもよい。いくつかの態様においては、少なくとも1つのキナーゼ阻害剤を、段階（ii）の遺伝的疾患のある非多能性細胞に導入する。他の態様においては、MEK1キナーゼ阻害剤およびGSK3キナーゼ阻害剤を、段階（ii）の遺伝的疾患のある非多能性細胞に導入する。
【００５９】
疾患是正遺伝子は、本明細書に記載されたトランスフェクション法に従って、遺伝的疾患のある多能性細胞に導入することができる。疾患是正遺伝子の発現により、非罹病細胞の状態が生じ、それにより、遺伝的に是正された多能性幹細胞が形成される。
【００６０】
III．遺伝的に是正された誘導多能性幹細胞
1つの局面において、遺伝的に是正された誘導多能性幹細胞は、本明細書において提供された方法に従って調製される。
【００６１】
IV．遺伝的に是正された誘導多能性幹細胞からヒト体細胞を生成させるための方法
別の局面においては、遺伝的疾患のある哺乳動物から遺伝的に是正された体細胞を生成させるための方法を提供する。本方法は、遺伝的に是正された誘導多能性幹細胞を細胞増殖因子と接触させる段階、および遺伝的に是正された誘導多能性幹細胞を分裂させて、それにより、遺伝的に是正された体細胞を形成させる段階を含む。細胞増殖因子の例には、SCF、GMCSF、FGF、TNF、IFN、EGF、IGF、およびインターロイキンファミリーのメンバーが非限定的に含まれる。遺伝的に是正された誘導多能性幹細胞が、本発明によって提供された方法に従って調製される。いくつかの態様においては、遺伝的疾患のある非多能性細胞に疾患是正遺伝子をコードする核酸をトランスフェクトして、遺伝的に是正された非多能性細胞を形成させる。遺伝的に是正された非多能性細胞に、OCT4タンパク質をコードする核酸、SOX2タンパク質をコードする核酸、KLF4タンパク質をコードする核酸およびcMYCタンパク質をコードする核酸をトランスフェクトして、トランスフェクトされ遺伝的に是正された非多能性細胞を形成させる。トランスフェクトされ遺伝的に是正された非多能性細胞を分裂させて、それにより、遺伝的に是正された誘導多能性幹細胞を形成させる。いくつかの態様においては、少なくとも1つのキナーゼ阻害剤を、段階（iii）のトランスフェクトされ遺伝的に是正された非多能性細胞に導入する。他の態様においては、MEK1キナーゼ阻害剤およびGSK3キナーゼ阻害剤を、段階（iii）のトランスフェクトされ遺伝的に是正された非多能性細胞に導入する。
【００６２】
他の態様においては、遺伝的疾患のある非多能性細胞に、OCT4タンパク質をコードする核酸、SOX2タンパク質をコードする核酸、KLF4タンパク質をコードする核酸およびcMYCタンパク質をコードする核酸をトランスフェクトして、トランスフェクトされた遺伝的疾患のある非多能性細胞を形成させる。トランスフェクトされた遺伝的疾患のある非多能性細胞を分裂させて、それにより、遺伝的疾患のある誘導多能性幹細胞を形成させる。遺伝的疾患のある誘導多能性幹細胞に疾患是正遺伝子をコードする核酸をトランスフェクトして、遺伝的に是正された誘導多能性幹細胞を形成させる。いくつかの態様においては、少なくとも1つのキナーゼ阻害剤を、段階（ii）の遺伝的疾患のある非多能性細胞に導入する。他の態様においては、MEK1キナーゼ阻害剤およびGSK3キナーゼ阻害剤を、段階（ii）の遺伝的疾患のある非多能性細胞に導入する。
【００６３】
別の局面においては、組織修復を必要とする哺乳動物を治療する方法を提供する。本方法は、遺伝的に是正された誘導多能性幹細胞を哺乳動物に投与する段階、および遺伝的に是正された誘導多能性幹細胞を哺乳動物において分裂させかつ体細胞に分化させて、それにより、哺乳動物において組織修復を提供する段階を含む。遺伝的に是正された誘導多能性幹細胞が、本発明によって提供された方法に従って調製される。いくつかの態様においては、遺伝的疾患のある非多能性細胞に疾患是正遺伝子をコードする核酸をトランスフェクトして、遺伝的に是正された非多能性細胞を形成させる。遺伝的に是正された非多能性細胞に、OCT4タンパク質をコードする核酸、SOX2タンパク質をコードする核酸、KLF4タンパク質をコードする核酸およびcMYCタンパク質をコードする核酸をトランスフェクトして、トランスフェクトされ遺伝的に是正された非多能性細胞を形成させる。トランスフェクトされ遺伝的に是正された非多能性細胞を分裂させて、それにより、遺伝的に是正された誘導多能性幹細胞を形成させる。いくつかの態様においては、少なくとも1つのキナーゼ阻害剤を、段階（iii）のトランスフェクトされ遺伝的に是正された非多能性細胞に導入する。他の態様においては、MEK1キナーゼ阻害剤およびGSK3キナーゼ阻害剤を、段階（iii）のトランスフェクトされ遺伝的に是正された非多能性細胞に導入する。
【００６４】
他の態様においては、遺伝的疾患のある非多能性細胞に、OCT4タンパク質をコードする核酸、SOX2タンパク質をコードする核酸、KLF4タンパク質をコードする核酸およびcMYCタンパク質をコードする核酸をトランスフェクトして、トランスフェクトされた遺伝的疾患のある非多能性細胞を形成させる。トランスフェクトされた遺伝的疾患のある非多能性細胞を分裂させて、それにより、遺伝的疾患のある誘導多能性幹細胞を形成させる。遺伝的疾患のある誘導多能性幹細胞に疾患是正遺伝子をコードする核酸をトランスフェクトして、遺伝的に是正された誘導多能性幹細胞を形成させる。いくつかの態様においては、少なくとも1つのキナーゼ阻害剤を、段階（ii）の遺伝的疾患のある非多能性細胞に導入する。他の態様においては、MEK1キナーゼ阻害剤およびGSK3キナーゼ阻害剤を、段階（ii）の遺伝的疾患のある非多能性細胞に導入する。
【００６５】
V．非多能性細胞
遺伝的に是正された誘導多能性幹細胞の作出における中間体として有用な、遺伝的疾患のある非多能性細胞を本明細書において提供する。
【００６６】
1つの局面においては、疾患是正遺伝子をコードする核酸、OCT4タンパク質をコードする核酸、SOX2タンパク質をコードする核酸、KLF4タンパク質をコードする核酸およびcMYCタンパク質をコードする核酸を含む、遺伝的疾患のある非多能性細胞を提供する。いくつかの態様において、遺伝的疾患のある非多能性細胞は、少なくとも1つのキナーゼ阻害剤を含む。他の態様において、遺伝的疾患のある非多能性細胞は、MEK1キナーゼ阻害剤およびGSK3キナーゼ阻害剤を含む。いくつかの態様において、疾患是正遺伝子はFANCAタンパク質をコードしている。他の態様において、疾患是正遺伝子はFANCD2タンパク質をコードしている。
【実施例】
【００６７】
本研究では、6人のFA患者から試料を入手したが、このうち4人はFA-A相補群からであり（患者FA5、FA90、FA153およびFA404）、2人はFA-D2相補群からである（FA430およびFA431）。患者FA5、FA90、FA153、FA430およびFA431からの試料は、継代回数が明確でない凍結保存された初代皮膚線維芽細胞であった。患者FA404からは皮膚生検試料を入手し、そこから皮膚線維芽細胞および表皮ケラチノサイトの初代培養物を樹立した。誘導初期化の現行のプロトコールは、ヒト線維芽細胞、特に成人線維芽細胞に対しては極めて非効率的である。OCT4、SOX2、KLF4およびc-MYCをコードするレトロウイルスによる成人線維芽細胞の初期化の成功は、マウスのレトロウイルス受容体のレンチウイルス形質導入を事前に行うことにより2、hTERTおよびSV40ラージT4の同時形質導入により、またはVSVg-偽型レトロウイルスを用いることにより6,7、達成されている。そのような条件下でさえも、成人線維芽細胞の初期化効率は0.01〜0.02％という低さである。同様に、OCT4、SOX2、NANOGおよびLIN28のレンチウイルス送達も成人線維芽細胞を初期化させることが報告されているものの、その効率ははるかに低い（およそ0.001％、参照文献8）。この理由から、健常ドナーの包皮生検試料からの初代皮膚線維芽細胞を用いる初期化プロトコールを初めて試みた。図6参照。この改良された初期化プロトコールは、N末端FLAGタグが付加された型のOCT4、SOX2、KLF4およびc-MYCをコードする、マウス幹細胞ウイルス（MSCV）をベースとするレトロウイルスを、6日間の間隔をおいて2回感染させることからなる。形質導入された線維芽細胞を、有糸分裂を不活化させた初代ヒト線維芽細胞のフィーダー層の上に5日後に継代し、その翌日にヒト胚性幹（hES）細胞用培地に切り換えた。同じく、フィーダー上へのプレーティングの1週後から1週間にわたる、阻害剤のPD0325901およびCT99021（マウスES細胞の誘導および増殖を向上させる、2iと名付けられた組み合わせ19）によるMEK1およびGSK3の複合阻害に基づく選択段階も含めた。
【００６８】
FA細胞の遺伝的不安定性およびアポトーシス傾向のために20、FA-A患者およびFA-D2患者からの皮膚細胞は、それぞれFANCAまたはFANCD2をコードするレンチウイルスベクターによる遺伝的是正によって直ちに、またはその後に初期化された。これらのベクターによるヒトおよびマウスのFA細胞の遺伝的補完により、FA表現型が効率的に是正されることが以前に示されている21。患者FA5、FA153またはFA430の線維芽細胞からは、未修正であるか是正されたかにかかわらず、少なくとも5回の初期化試行後にiPS様コロニーは得られなかった。いかなる理論にも拘束されることは望まないが、この結果はおそらく、あまりにも多くの継代および／または核型異常を重ねた細胞のせいであろうと考えられている。以下の表1参照。しかし、患者FA90からは、遺伝的に是正された線維芽細胞を用いたところ、iPS様コロニーが容易に得られた（図1a）。3回の独立した実験のそれぞれにおいて、全体で10〜15個のiPS様コロニーが得られた。これらのうちコロニー10個をランダムに採取したところ、そのすべてがフィーダー層またはMatrigelをコーティングしたプレートの上で順調に増大することができ、核-細胞質比が高く、hES細胞と形態的に識別不能であり、かつアルカリホスファターゼ（AP）活性に関して強く陽染される（図1c）、密集した細胞の平坦コロニーとして増殖した（図1b）。これらの系統のうち5つ（cFA90-44-1、-11、-14、-20および-21）を、さらなる特性決定のために選択した。これらはすべて、12〜16継代時点で正常核型（46 XX）を呈し、少なくとも20継代にわたって培養下で維持することができた。それどころか、cFA90-44-14は、複製上の危機（replicative crisis）の徴候を何ら伴うことなく、正常核型を維持したまま、43継代に耐えた（図7）。
【００６９】
（表１）FA患者特異的iPS細胞株の誘導試行の概要
2012527903.tif 000003
【００７０】
5つの系統の免疫蛍光分析により、多能性細胞に特徴的な転写因子（OCT4、SOX2、NANOG）および表面マーカー（SSEA3、SSEA4、TRA1-60、TRA1-81）の高レベルの発現が明らかになった（図1d〜1fおよび図8）。これらの結果から、1人のFA-A患者の線維芽細胞からの患者特異的iPS細胞株の作製の成功が指し示された。別の一連の実験では、別のFA-A患者である患者FA404からの体細胞の初期化を試み、同様の結果を得た。FANCAをコードするレンチウイルスによる形質導入を行った線維芽細胞（図1g）は容易に初期化されて、iPS様細胞が生じた（図1h）。2つの細胞株（cFA404-FiPS4F1およびcFA404-FiPS4F2）を樹立し、それらを増大させて詳細に分析した。これらの細胞株は典型的なhES様形態および増殖特性を呈し、AP活性に関して陽染され、かつ、多能性に関連した被験マーカーのすべてを発現した（図1i〜1lおよび図9）。研究室で最近確立された効率的なプロトコール22を用いて初期化することを試みた患者FA404からも初代表皮ケラチノサイトを得た。FANCAを発現するレンチウイルスによる形質導入を行ったケラチノサイトからはiPS細胞が作製されることに成功したが、是正されていないケラチノサイトからは作製されなかった。患者FA404由来のケラチノサイトの全体的な初期化効率は、健常ドナー由来の継代初期の初代幼若ケラチノサイトのものよりもはるかに低かった（およそ20分の1）22。しかしながら、これらの実験から樹立された3つのiPS細胞株（cFA404-KiPS4F1、-KiPS4F3および-KiPS4F6）は、真のiPS細胞およびhES細胞の主な特徴のすべて（図9）、ならびに正常な46 XY核型（図7）を呈した。
【００７１】
FA-D2患者である患者FA431由来の線維芽細胞の初期化も成功して行われた（図10a）。この場合には、非改変線維芽細胞または遺伝的に是正された線維芽細胞のいずれからも、ほぼ同じ数のiPS様コロニーが出現した（表1参照）。両方の条件から2つのiPS様コロニーを採取したところ、それらは継代後にiPS様コロニーとして増殖し、AP活性に関して陽染された（図10c、10g）。しかし、是正された線維芽細胞（cFA431-44-1およびcFA431-44-2）に由来するものは培養下で長期間（例えば、少なくとも18継代）にわたって維持可能であり、多能性に関連した転写因子および表面マーカーの発現を示したのに対して（図10d〜10f）、未修正の線維芽細胞から派生したものは漸増的な増殖遅延を来し、第3継代を越えて維持することはできなかった（図10g）。患者FA431由来の是正されていないFA-D2線維芽細胞を初期化させることができた一方で、iPS細胞は患者FA90またはFA404由来のFANCAが補完された線維芽細胞のみから得られたという観察所見は、FA-D2患者、特にFA431が、残存性FANCD2タンパク質の発現と矛盾しないハイポモルフ突然変異を保有しているという事実23によって説明しうると考えられる。
【００７２】
これらの研究において作製した19種の患者特異的iPS細胞株のうち、10種をさらに綿密な特性決定のために選択した（表1参照）。それらのゲノム中に組み込まれた初期化用導入遺伝子の存在は、ゲノムDNAのPCR（図2aおよび図11）、ならびにそれらのHLA型およびDNAフィンガープリントを患者の体細胞のものと比較することによるiPS細胞株の起源によって確認された。以下の表2参照。次に、レトロウイルス性初期化用導入遺伝子の発現がサイレンシングを受けたか否かを、導入遺伝子特異的プライマーを用いる定量的RT-PCR分析によって分析した。試験した系統のすべてにおいて、4因子のトランスジェニック発現は、OCT4およびc-MYCのレトロウイルス性発現がサイレンシングを受けないことが以前に示されているiPS細胞株（KiPS4F3）と比較して、低いかまたは検出不能なレベルに低下していた22（図2b）。さらに、試験した患者特異的iPS細胞株はすべて、内因性OCT4およびSOX2、ならびに、NANOG、REX-1およびCRIPTOといった多能性に関連した他の転写因子の発現の再活性化も示した（図2c）。これらの試験に用いたレトロウイルス性導入遺伝子にはFLAGタグが付加されているという事実を利用して、免疫蛍光法により、iPS細胞が呈する抗FLAG免疫反応性が無視しうる程度であることが確認された（図2d〜2g）。その上、患者の線維芽細胞では高度にメチル化されている、多能性に関連した転写因子OCT4およびNANOGのプロモーターは、FA特異的iPS細胞では脱メチル化されており（図2h）、このことは多能性へのエピジェネティックな初期化を指し示している。
【００７３】
（表２）FA線維芽細胞およびiPS細胞株の分子型判定
2012527903.tif 000004
【００７４】
次に、患者特異的iPS細胞が、3胚葉すべての派生細胞に分化する能力について分析した。インビトロで、iPS由来の胚様体は、細胞形態、ならびにそれぞれα-フェトプロテイン／FoxA2、TuJ1／GFAPおよびα-アクチニンによる特異的な免疫染色によって判定したところ、内胚葉、外胚葉および中胚葉の派生物に容易に分化した（図3a〜3cおよび図12）。特定のインビトロ分化プロトコールの後に、iPS細胞は、特化した中胚葉由来細胞種、例えば律動性に拍動する心筋細胞および造血前駆細胞などを生じた（下記参照）。また、患者特異的iPS細胞を、ヒト細胞の多能性を評価するために使用しうる最も厳格な検査である真性奇形腫の形成条件下にもおいた24。このために、8種類の異なる系統由来の細胞を免疫不全マウスの精巣に注入した。いずれの場合にも、8〜10週後に、確定的内胚葉マーカーで陽染される腺状構成物、神経外胚葉マーカーを発現する神経構造、ならびに筋肉および軟骨などの中胚葉派生物を含む、3種の主要な胚葉に相当する複合構造で構成される奇形腫を回収することができた（図3d〜3f、図13）。最近、比較アッセイ法を用いて、hES細胞25、および健常ドナーから作製されたiPS細胞22を含む種々の正常ヒト多能性幹細胞株のインビトロ分化能力および奇形腫誘導能力が特徴づけられている。全体的には、hES細胞または正常iPS細胞のものと比較して、FA患者特異的iPS細胞株が被験細胞系列の任意のものに分化する能力に関して差は認められなかった。
【００７５】
単一遺伝子疾患の患者からの、無限に自己再生するiPS細胞の作製は、制御されたエクスビボ遺伝子治療のためのまたとない好機をもたらす。FA患者特異的iPS細胞株を、FAを是正するレンチウイルスによる形質導入を以前に行った体細胞から作製した。実際に、遺伝子治療ベクターの組み込まれたコピーの存在を、試験したすべてのFA-iPS細胞株におけるゲノムDNAの定量的PCRによって検出することができた（図14a）。遺伝子治療戦略に伴う懸念は、是正用導入遺伝子のサイレンシングである。レンチウイルス導入遺伝子はhES細胞におけるサイレンシングに関して特に耐性があるものの26、これはプロモーター依存的であると考えられ27、最近、誘導初期化の状況でほとんど完全な サイレンシングが観察されている3,8。これらの実験では、是正用導入遺伝子の不完全な程度のサイレンシングがFA-iPS細胞で起こった。患者の細胞を感染させるために用いたFANCAを発現するレンチウイルスは、EGFPレポーターをIRESエレメントの後に保有しており、それは弱いものの検出可能な蛍光を形質導入細胞に付与した（図14b）。しかし、EGFP発現はFA-iPS細胞でもFA-iPS由来細胞でももはや検出不能であり（非提示データ）、このことは、導入遺伝子が少なくとも部分的にサイレンシングを受けたことを指し示している。導入遺伝子のサイレンシングの程度を調べるために、患者FA90またはFA404由来の是正されていない線維芽細胞では存在しない、FANCAの発現について分析した（図4a）。分析したFA-iPS細胞株はすべてレンチウイルス由来のFANCAを発現し、このことは、それらのいずれにおいても導入遺伝子が完全にはサイレンシングを受けなかったことを示している（図4a）。FA-iPS細胞株の大半は、FANCAをhES細胞のそれに匹敵するレベルで発現したが、いくつかの系統における発現ははるかに弱かった。この点に関しては、FANCAの弱い発現でも、FA-A細胞におけるFA経路を回復させるのには十分であることが最近示されている21。
【００７６】
FA-iPS細胞が無病表現型を持つことを確認するために、一連の機能試験を行った。FA経路が機能的であれば、FANCD2が活性化され、その後、FANCAに依存する過程で、停止した複製フォークに再配置される10。停止した複製フォークの核内蓄積を、孔径5μmのフィルターを通した高エネルギー局所UV照射によって誘発させ、シクロブタンピリミジン二量体（CPD）に対する抗体を用いる免疫蛍光によって描出させた、局所的に損傷された核内領域に、FANCD2が再配置されたか否かを調べた28。それらの実験では、FANCD2は、正常線維芽細胞または補完されたFA線維芽細胞において、さらにはFA-iPS細胞から派生した線維芽細胞様細胞においても、停止した複製フォークに再配置されたが、是正されていないFA線維芽細胞ではそうではなかった（図4b）。加えて、FA-iPS由来細胞を、DNA複製阻害剤であるヒドロキシ尿素（HU）で処理することにより、複製フォークの崩壊を誘発させた。停止および破損した複製フォークは、リン酸化ヒストンH2AX（γ-H2AX）の免疫反応性によって検出した。この場合にはまた、正常線維芽細胞、遺伝的に補完されたFA線維芽細胞、またはFA-iPS由来細胞では、HUで誘発された停止した複製フォークに通常は再配置されるFANCD2が、是正されていないFA線維芽細胞ではそうではないことも見いだされた（図15）。これらの結果は、FA-iPS細胞における永続的なFANCA発現と総合して考慮すると、遺伝的に是正されたFA体細胞から作製されたiPS細胞が、完全に機能的なFA経路を維持しており、それ故に表現型の上で無病であることを明らかに示している。
【００７７】
FA細胞の初期化の成功がFANCAを発現するレンチウイルスによる形質導入を行ったもののみで起こり（是正用レンチウイルスによる形質導入を実際に受けた細胞は35〜50％に過ぎなかったにもかかわらず；図14b参照）、レンチウイルス導入遺伝子がFA-iPS細胞において完全にはサイレンシングを受けていないという知見により、機能的なFA経路はiPS細胞の作製および／または維持に対して強い選択優位性を付与することが示唆される。これは、罹患アレルの一方で病原性突然変異が自然に復旧したモザイク性FA患者由来29-31の、または治療用レンチウイルスによって遺伝的に治療したFAマウス由来32の造血幹細胞で観察される著しい増殖優位性と合致する。この可能性について直接取り扱うために、FA-iPS細胞におけるFANCAのトランスジェニック発現を、FANCA-shRNAのレンチウイルス送達によってノックダウンさせた。試験した5種類の異なるshRNAのうち3種は、cFA404-KiPS4F3細胞においてFANCA発現の70％を上回る下方制御を達成した（図4c）。注目に値することとして、FANCAレベルが最も低かったiPS細胞は、1継代後に増殖することができなくなった（図4d）。これらの実験をcFA90-44-14細胞で繰り返したところ、極めて類似した結果が得られた（非提示データ）。補完的なアプローチとして、FA-iPS由来細胞におけるFANCA発現の一過性下方制御をsiRNAトランスフェクションによって誘導したところ、これはスクランブルsiRNAをトランスフェクトした細胞と比較して、細胞増殖の著しい低下（およそ7分の1）を招いた（図4e）。FANCA siRNAによって誘導された細胞増殖の低下は、ジエポキシブタン誘発性DNA損傷に対する応答でははるかに顕著（15分の1を上回る）であった（図4e）。これらの結果は、FA患者特異的iPS細胞のFA無病状態に関するさらなる証拠を提供するとともに、重要なこととして、多能性幹細胞の自己再生の維持において決定的な役割を果たすという、FA経路のこれまで予想されていなかった役割を明らかにするものである。正常なiPS細胞の増殖のためにFANCAが必要とされることが、例えば、是正用導入遺伝子が完全にはサイレンシングを受けておらず、かつ閾値レベルを超えてFANCAを発現するiPS細胞を陽性選択することにより、FA患者特異的iPS細胞を確実に無病に維持させる上で重要な役割を果たしたと想定することは可能である。
【００７８】
FAの最も顕著な特徴は、機能的な造血幹細胞数の漸進的な減少に起因するBMFである16-18。このため、患者特異的iPS細胞を、有望な細胞療法の用途のための造血細胞の供給源として用いうるか否かについて検証した。6種類の異なる患者特異的iPS細胞株（cFA90-44-11および-44-14、cFA404-FiPS4F2、-KiPS4F1、-KiPS4F3および-KiPS4F6）由来の胚様体を、造血性サイトカインの存在下における、OP9間質細胞33との共培養に基づく分化実験に用いた。いずれの場合にも、フローサイトメトリーによってCD34+細胞を第5日から検出することができ、これは第12日にピークに達した（7.23±2.57％、n＝7）。CD45+細胞もそれらの培養物において第10日から検出することができ、これは第12日までに0.95±0.38％（n＝6）に達した（図5a）。患者特異的iPS細胞から得られた造血前駆細胞の出現のタイミングおよび頻度は、健常個体由来のiPS細胞を用いて得られたものと同程度であり（第12日時点のCD34+細胞は7.24±3.43％、n＝2つの無関係なiPS細胞株に由来する5つ）およびhES細胞（第12日時点のCD34+細胞は6.62±1.03％、n＝2つの無関係なhES細胞株に由来する5つ；参照文献34も参照のこと）。これらの結果は、FA患者特異的iPS細胞がインビトロで初期造血へと至る正常な潜在能力を呈することを示している。
【００７９】
FA-iPS由来のCD34+細胞を、クローン原性前駆細胞アッセイ法におけるそれらの造血分化能力を検証するために、分化プロトコールの第12日の時点で2回の磁気活性化細胞ソーティング（MACS）によって精製した。FA-iPS細胞由来のCD34+細胞が、メチルセルロース培養下で14日後に赤血球（赤芽球バースト形成単位［BFU-E］）および骨髄細胞（顆粒球・単球系コロニー形成単位［CFU-GM］）コロニーを生じることを観察することができた（図5b〜5c）。CFU-GMコロニーが骨髄細胞性であることは、これらのコロニーにおけるCD33およびCD45マーカーの発現によって確認された（図5d）。FA-iPS細胞由来のCD34+細胞の造血能力は強固であり、クローン原性アッセイ法で得られたコロニー形成細胞（CFC）の数は、hES細胞または対照iPS細胞に由来するCD34+細胞から得られたものと同等であった（図5e、色付きバー）。これらの結果は、患者特異的iPS細胞が赤血球および骨髄細胞系列の造血前駆細胞に分化することに成功したことを指し示している。いくつかの実験では、iPS由来のCD34+細胞を造血増殖因子とともに7日間維持した。これらの場合には、CFCの数は非常に著しく増加し（約60倍）、このことはこれらの培養物における漸進的な造血分化を示唆する。また、遺伝的に是正されたFA-iPS細胞に由来するCD34+細胞を移植したNOD／SCIDマウスで血液細胞を生じさせることも試みたが、それらの動物ではヒト造血細胞の生着は全く観察されず、これは免疫不全マウスでインビトロで分化したhES細胞35を再増殖させる現在の技術的限界を示す従来のデータと一致する。
【００８０】
遺伝的に是正されかつ初期化されたFA-A細胞に由来する造血前駆細胞がFA-iPS細胞の無病表現型を維持しているか否かを検証するために、DNA架橋剤に対する過感受性がFA細胞の顕著な特徴であることから11、造血コロニーをマイトマイシンCの存在下でインキュベートした。FA-iPS由来CD34+細胞から得られたマイトマイシンC耐性コロニーの割合は、健常ドナー由来の単核骨髄細胞から、またはhES細胞もしくは健常ドナーの体細胞から作製したiPS細胞のいずれかに由来するCD34+細胞から得られたものと同程度であり、FA単核骨髄細胞によって示されたマイトマイシンCに対する過感受性とは極めて対照的であった（図5e、白のバー）。その上、FA-iPS細胞由来のCD34+細胞は、FANCD2をマイトマイシンCで誘発されたDNA損傷の集中点に配置させることができ（図5f）、このことは FA経路が機能的であることを実証している。FA-iPS由来の造血前駆細胞における無病表現型の維持は、インビトロ造血分化の過程におけるレンチウイルスFANCA導入遺伝子の持続的発現によってもさらに裏づけられている（非提示データ）。
【００８１】
これらの結果は、iPS細胞技術を用いて、細胞療法の用途への潜在的な価値を有する、患者特異的な、疾患が是正された細胞を作製しうることを実証している。成体の体細胞へのOCT4、SOX2、KLF4およびc-MYCのレトロウイルス形質導入は、ヒトiPS細胞を作製するための現時点で最も効率的な方法ではあるものの、望ましくない導入遺伝子の永続的な組込みをもたらす。レトロウイルス導入遺伝子は初期化の際にサイレンシングを受けるものの、細胞分化過程におけるそれらの再活性化（特に癌遺伝子c-Mycのそれ）は、腫瘍形成と関連づけられている36。ヒトiPS細胞をc-MYCを用いずに作製することはできるが、この場合には初期化効率が著しく低下する22,37。FA患者特異的iPS細胞をc-MYCのレトロウイルス形質導入を用いずに作製しうるか否かについて確かめるために、患者FA404からの初代ケラチノサイトを用いた。3回の初期化試行の後に1つのiPS細胞株（cFA404-KiPS3F1）が作製され、これは活発に増大するとともに、4因子を用いて作製されたiPS細胞の特徴および分化能力をすべて示し、インビトロで造血前駆細胞を生じた（図16）。案の定、初期化因子に対して特異的なプローブを用いたサザンハイブリダイゼーション（図17）およびゲノムDNAのPCR（非提示データ）によって判明した通り、cFA404-KiPS3F1細胞のゲノムはc-MYCレトロウイルスの組込みを含まなかった。遺伝的に是正されたiPS細胞は治療用導入遺伝子の安全な組込み部位のスクリーニングに向いていることから、患者特異的iPS細胞の可用性は、挿入性発癌（insertional oncogenesis）40のリスクに起因する、現行の遺伝子治療戦略の主な限界を克服しうると考えられる。加えて、遺伝性疾患を有する患者からのiPS細胞の作製は、相同組換えに基づく遺伝子標的化アプローチを用いてこれらの細胞を是正しうるという可能性も提供する41。したがって、これらの研究は、iPS技術の再生医療への適用可能性に向けての進歩であると考えられる。
【００８２】
VI．材料および方法
患者
試験は、本発明者らの施設内審査委員会による承認を受けた上で、ヘルシンキ宣言に準拠して実施した。患者は彼らの機密保護のためにコード化し、書面によるインフォームドコンセントを得た。ヒトiPS細胞の作製は、スペインの所轄官庁（Comision de Seguimiento y Control de la Donacion de Celulas y Tejidos Humanos del Instituto de Salud Carlos III）によって承認されたプロトコールに従って行った。ファンコニ貧血の患者は、臨床症状、およびDNA架橋剤を用いた末梢血細胞の染色体切断検査に基づいて診断した。患者FA5、FA90およびFA153は以前に記載されている42；患者FA430およびFA431はそれぞれ、参照文献23における患者#2および#10に対応する。患者FA404は、以前に記載された通りに42、EGFPおよびFANCAレトロウイルスベクターによる形質導入を行った上でマイトマイシンCに曝露させた皮膚線維芽細胞のG2期停止を分析することにより、サブタイプを判定した。
【００８３】
細胞株
293T細胞およびHT1080細胞（ATCC CRL-12103）を、それぞれ、レンチウイルスの製造および力価測定のために用いた。これらの細胞株は、10％ウシ胎仔血清（FBS；Biowhitaker（商標））を加えたダルベッコ変法培地（DMEM, Invitrogen）中で増殖させた。ES[2]およびES[4]系統のhES細胞は、最初に記載された通りに維持管理した25。対照iPS細胞株であるKiPS4F1およびKiPS3F1、ならびに部分的にサイレンシングを受けたKiPS4F3細胞株は、報告されている通りに培養した22。
【００８４】
iPS細胞の作製
線維芽細胞を、10％ FBSを加えたDMEM（いずれもInvitrogen）中で、37℃、5％ CO2、5％ O2にて培養し、2〜6継代で用いた。初期化実験に関しては、6ウェルプレートの1ウェル当たり約50,000個の線維芽細胞を播種し、FLAGタグを付加したOCT4、SOX2、KLF4およびc-MYCT58Aのレトロウイルス上清の1：1：1：1混合物（参照文献22）に、1μg／mlポリブレンの存在下で感染させた。感染は、750×gでの45分間のスピンフェクション（spinfection）を行い、その後に上清を37℃、5％ CO2にて24時間にわたって細胞と接触させておくことからなった。連日にわたる3度の感染を1回または2回、補遺テキストに表記した時点で実施した。最後の回の感染を開始してから5日後に、線維芽細胞をトリプシン処理し、同じ細胞培地中にある照射処理済みのヒト包皮線維芽細胞のフィーダー層上に播種した。24時間後に、培地を、10％ KO-Serum Replacement（Invitrogen）、0.5％ヒトアルブミン（Grifols, Barcelona, Spain）、2mM Glutamax（Invitrogen）、50μM 2-メルカプトエタノール（Invitrogen）、非必須アミノ酸（Cambrex）および10ng／mlのbFGF（Peprotech）を加えたKO-DMEM（Invitrogen）からなるhES細胞用培地に交換した。培地を隔日に交換しながら、培養物を37℃、5％ CO2にて維持管理した。フィーダー上へのプレーティングの1週後から、培地に1μM PD0325901および1μM CT99021（両方ともStem Cell Sciences）を1週間にわたって加えた。初期感染の45〜60日後にコロニーを形態に基づいて採取し、新たなフィーダー上にプレーティングした。患者特異的iPS細胞の系統は、hES細胞用培地中でのコロニーの機械的解離およびフィーダー細胞上への1：3分割により、または、限定的トリプシン消化およびマウス胚性線維芽細胞（MEF）によってあらかじめ馴化させたhES細胞用培地を含むMatrigelコーティングプレート上への継代により、維持管理した。他の阻害剤は、補遺テキストに表記した通りに、以下の濃度で用いた：10μM U0126（Calbiochem）、25μM PD098059（Calbiochem）、5μM BIO（Sigma）、10μM Y27632（Calbiochem）。患者特異的KiPS細胞の作製は、本質的には以前に報告された通り22に行ったが、ただし、初代表皮ケラチノサイトは、10％ FBS、1μg／ml EGF（BioNova）、0.4μg／ml ヒドロコルチゾン、5μg／mlトランスフェリン、5μg／mlインスリン、2×10-11M リオチロニン（すべてSigma）ならびに10-10Mのコレラ毒素（Quimigen）を加えたDMEM／Hams-F12（3：1）中で、照射処理済みの線維芽細胞の存在下において、小さな生検エクスプラントから派生させた。
【００８５】
定量的RT-PCR、導入遺伝子の組込み、およびプロモーターメチル化の分析
レトロウイルス導入遺伝子および多能性に関連した内因性の転写因子の発現、ゲノムPCRまたはサザンブロットによるレトロウイルス導入遺伝子の組込み、ならびにOCT4およびNANOGプロモーターメチル化状態は、以前に報告された通りに評価した22。
【００８６】
HLA型判定およびDNAフィンガープリント法
細胞株の分子型判定は、Banc de Sang i Teixits（Barcelona, Spain）によって実施された。hES細胞株のHLA型判定には、AlleleSEQR（登録商標）HLA Sequencing Kit（Atria Genetics）による配列ベースの型分類（SBT）を用いた。マイクロサテライトDNAフィンガープリント法は、9種のマイクロサテライト／短タンデム反復配列（STR）にアメロゲニン遺伝子を加えた多重ポリメラーゼ連鎖反応を、AmplFISTR（登録商標）Profiler Plus Kit（Applied Biosystems）を用いることで行った。
【００８７】
プロウイルスのコピー数および導入遺伝子発現の分析
細胞当たりのプロウイルスコピー数の定量は、FANCA導入遺伝子に対するプライマー：hFANCA-F：
2012527903.tif 000005
およびhFANCA-R：
2012527903.tif 000006
を用いて、Rotor Gene（商標）RG-3000（Corbett Research Products）におけるqPCRによって分析し、検出にはTaqman（登録商標）プローブFANCA-P：
2012527903.tif 000007
を用いた。細胞数の定量のためにはアクチンプライマー：DNA-RNA-βアクチン-F：
2012527903.tif 000008
およびDNA-βアクチン-R：
2012527903.tif 000009
を用い、検出にはプローブDNA-RNA-βアクチン-P：
2012527903.tif 000010
を用いた。形質導入細胞当たりの平均プロウイルスDNAの測定のために、LV：（FANCA-IRES-EGFP）およびβアクチンDNA増幅の標準曲線を作成した。次に、細胞当たりの平均プロウイルス数を、標準曲線における各DNA試料のhFANCA βアクチン比の外挿によって推定した。ヒトFANCA導入遺伝子の発現は、全RNAから得たcDNAに対するリアルタイム定量的逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応（qRT-PCR）によって分析した。健常ドナーおよびFA患者からの試料を対照として用いた。hFANCAの内因性発現と導入遺伝子に起因する発現とを識別するために、全hFANCA発現をhFANCAプライマーおよびプローブを用いて分析し、かつ内因性発現をh3 'FANCA-F：
2012527903.tif 000011
およびh3 'FANCA-R：
2012527903.tif 000012
を用いて分析して、検出にはTaqman（登録商標）プローブ：h3 'FANCA-P：
2012527903.tif 000013
を用いた。ハウスキーピング対照発現に関しては、βアクチンを、DNA-RNA-βアクチン-Fプライマー、RNA-βアクチン-Rプライマー：
2012527903.tif 000014
およびTaqman（登録商標）プローブDNA-RNA-βアクチン-Pを用いて分析した。hFANCAおよびh3 'FANCAを用いて得られた発現間の差により、組み込まれたプロウイルスの発現が指し示される。
【００８８】
ウエスタンブロット
細胞抽出物を標準的なRIPA緩衝液を用いて調製した。手短に述べると、収集した細胞をPBSで3回洗浄し、続いてRIPA緩衝液中に懸濁させた。続いて、上清中の全タンパク質濃度を、Bio-Radタンパク質アッセイ法（Biorad, Hercules, CA, USA）を製造元の指示に従って用いて測定した。続いて40μgの全タンパク質を6％ SDS-PAGEにローディングし、標準的なウエスタンブロット手順に供した上で、その後に、ファンコニ貧血研究基金（Fanconi Anemia Research Fund）、Eugene, Portland, USAによって寄贈された抗ヒトFANCA抗体による免疫検出を行った。ビンキュリン（Abcam, カタログ番号ab18058；1：5000）を、内部ローディング対照として用いた。
【００８９】
iPS由来細胞におけるFA経路の機能試験
停止した複製フォークの核内蓄積は、若干の変更を加えた上で、本質的には記載された通りに28、局所UVC照射によって誘発させた。手短に述べると、細胞（初代線維芽細胞またはiPS由来細胞）を22×22mmの無菌カバースリップ上に播種した。照射の前に、培地を吸引し、細胞をPBSで洗浄した。続いて細胞を、直径の5μmの孔を有するIsopore（商標）ポリカーボネートフィルター（Millipore, Badford, MA, USA）で覆い、Philips 15W UV-C灯G15-T8を用いて60J／m2のUVCを上方から照射した。その後に、フィルターを除去し、あらかじめ温めておいた新たな培地を細胞に戻し、それを培養条件に復帰させた上で、6時間後に免疫蛍光のための処理を行った。並行した実験において、初代線維芽細胞およびiPS由来細胞をヒドロキシ尿素（HU、2mM）に24時間曝露させ、続いて固定して、下記の通りに免疫蛍光のための処理を行った。
【００９０】
UVで誘発された停止した複製フォークでのFANCD2の検出のためには、細胞を4％ホルムアルデヒド（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA）を含むPBSにより、室温（RT）で15分間かけて固定し、PBSで洗浄した上で、PBS、0.5％ Triton（Sigma-Aldrich）とともに室温で10分間インキュベートした。次に、細胞をPBSで洗浄し、その後に、PBS中の5％ウシアルブミン（Sigma-Aldrich）および0.05％ Tween20（Sigma-Aldrich）からなる洗浄用緩衝液（WB）ですすぎ洗いした。続いて細胞を1M HClにより37℃で5分間処理した上で、FANCD2に対するウサギ一次抗体（Abcam, Cambridge, UK；1：1000）を抗CPD抗体（Kamiya Biomed, MC-062；1：500）と混合したものとともに37℃で1時間インキュベートした。続いて細胞をWB中で穏やかに振盪しながら15分間洗浄して、WB中に希釈した二次抗体抗マウスAlexaFluor（登録商標）488（Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA）および抗ウサギ AlexaFluor（登録商標）555（Molecular Probes）とともに37℃で30分間インキュベートし、その後にWB中で穏やかに振盪しながら15分間の洗浄段階を行い、蒸留水ですすぎ洗いして、風乾させた上で、4'-6'-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI, Sigma）を含む退色防止用媒質中にマウントした。HU実験では、停止および破損した複製フォークを表す集中点を描出するために、抗CPDの代わりにHCl洗浄段階および抗γH2AXに対する初代マウス抗体（Upstate；1：3000）を用いた点を除き、免疫検出は同一とした。この色の組み合わせを用いると、核は青色で、停止した複製フォークの部位（UV照射スポットまたはHUで誘発された集中点）は緑色で、FANCD2は赤色で描出される。顕微鏡分析および画像取得は、すべての細胞種に対して、AxioCam MRc 5カメラを装着したZeiss Axio Observer A1落射蛍光顕微鏡およびAxioVision（商標）、Rel. 4.6ソフトウエアを用いて、同一の光学条件および露出条件下で行った。
【００９１】
免疫蛍光およびAP分析
患者特異的iPS細胞をプラスチック製カバースライドチャンバー上で増殖させて、4％パラホルムアルデヒド（PFA）で固定した。以下の抗体を用いた：ChemiconのTra-1-60（MAB4360、1：100）、Tra-1-81（MAB4381、1：100）およびSox2（AB5603、1：500）；Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of IowaのSSEA4（MC-813-70、1：2）およびSSEA-3（MC-631、1：2）、TuJ1（1：500；Covance）、TH（1：1000；Sigma）、α-フェトプロテイン（1：400；Dako）、α-アクチニン（1：100；Sigma）、Oct-3／4（C-10、SantaCruz、1：100）、Nanog（Everest Biotech；1：100）、GFAP（1：1000；Dako）、ビメンチン（1：500、Chemicon）、FoxA2（1：100；R&D Biosystems）。用いた二次抗体はすべて、InvitrogenのAlexa Fluor（登録商標）シリーズであった（すべて1：500）。画像はLeica SP5共焦点顕微鏡を用いて取得した。直接AP活性は、アルカリホスファターゼBlue／Red Membrane Substrate溶液キット（Sigma）を製造元の指針に従って用いて分析した。FANCD2免疫蛍光アッセイ法のためには、細胞をプラスチック製カバースライドチャンバー上で増殖させた上で、30nMマイトマイシンCで処理した。16時間後に細胞をPBS中の3.7％ PFAで15分間かけて固定し、その後にPBS中の0.5％ Triton X-100による透過処理を5分間行った。ブロッキング用緩衝液（10％ FBS、0.1％ NP-40、PBS中）中で30分間かけてブロッキングを行った後に、細胞をポリクローナルウサギ抗FANCD2抗体（Novus Biologicals, NB 100-182, 1／250）とともにインキュベートした。抗ウサギTexas red結合抗体（Jackson Inmunoresearch Laboratories）を二次抗体（1：500）として用いた。スライドは、100倍／1.45油浸用作動距離0.17mmの対物レンズを用いて蛍光顕微鏡Axioplan2（Carl Zeiss, Gottingen, Germany）によって分析した。
【００９２】
インビトロ分化
内胚葉、心原性中胚葉および神経外胚葉への分化は、本質的には記載された通りに行わせた25。線維芽細胞様細胞への分化は、胚様体（EB）を、90％ DMEM、10％ FBS中にて、ゼラチンでコーティングしたプレート上にプレーティングし、線維芽細胞様形態を有する分化した細胞の反復継代を行うことによって実施した。造血分化のためには、集密iPSウェルを掻き取り、EB培地（90％ DMEM、10％ FBS）中での浮遊培養を24〜48時間行うことによってEBを生じさせた。続いてEBを、OP9間質細胞の集密したフィーダー層の上に乗せて付着させた。分化の最初の48時間に用いる培地は50％がEB培地、50％が造血分化用培地とした。造血分化用培地は、サイトカインBMP4（10ng／ml）、VEGF（10ng／ml）、SCF（25ng／ml）、FGF（10ng／ml）、TPO（20ng／ml）およびFltリガンド（10ng／ml）を加えたStemSpan（登録商標）無血清培地（StemCell Technologies）とした。48時間後からは細胞を造血分化用培地とともに培養し、分化プロトコールの終わりであるEBプレーティング後の第13日まで48時間毎に培地を交換した。第13日に、OP9およびEBをトリプシン処理（0.25％トリプシン）によって収集し、洗浄して、抗CD34ビーズ結合抗体（Miltenyi Biotec）により製造元の指定に従って標識した。CD34+画分をMACSによって精製し、画分純度を2回目のMACSによって高めた。CD34に関して収集した細胞の最終的な純度を、MACS溶出液の一部に対してフローサイトメトリーにより確かめた。残りのCD34+細胞は、10％ DMSOおよび20％ FBSを含む培地IMDM中にて凍結させ、以後に用いるまで液体窒素中で保存した。コロニー形成細胞（CFC）の評価のためには、各試料を3つずつ、Methocult（登録商標）H4434（Stem Cell Technologies）中で、37℃、5％ CO2、5％ O2および95％加湿空気中にて培養した。2週間の培養後にコロニーを算定した。造血前駆細胞のマイトマイシンC耐性を分析するためには、CFC培養物を10nMのマイトマイシンC（Sigma）で処理した。いくつかの実験では、iPS由来のCD34+細胞を、造血増殖因子SCF（Amgen、300ng／ml）、TPO（R&D Systems、100ng／ml）およびFltリガンド（BioSource、100ng／ml）を加えたStemSpan（登録商標）無血清培地（StemCell Technologies）中で7日間培養した。
【００９３】
フローサイトメトリー分析
表面表現型判定のためには、以下の蛍光色素（フィコエリトリン［PE］またはアロフィコシアニン［APC］）標識モノクローナル抗体を用いた（すべてBecton Dickinson Biosciences）：抗CD34 PE（581／CD34）、抗CD45 APC（HI30）。ゲート処理は、アイソタイプの一致する対照mAbを用いて行った。最終洗浄には、死細胞を除去するためにHoechst 33528（H258）を1μg／mL含めた。分析はすべて、Summitソフトウエアで動作するMoFlo（商標）セルソーター（DakoCytomation）で行った。造血前駆細胞の表現型の分析のためには、CFU-GMコロニーを採取して、PBSで洗浄した。細胞を、抗ヒトCD45-PECy5 mAb（Clone J33、Immunotech）と抗ヒトCD33-PE mAb（D3HL60.251、Immunotech）との組み合わせで染色した。続いて細胞をPBA（0.1％ BSAおよび0.01％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝塩類溶液）で洗浄し、2μg／mLヨウ化プロピジウムを加えたPBAに再懸濁させて、EPICS ELITE-ESP細胞計算器（Coulter）を用いて分析した。オフライン分析は、CXP Analysis 2.1フローサイトメトリー用ソフトウエア（Beckman Coulter Inc）によって行った。
【００９４】
奇形腫の形成
患者特異的iPS細胞の奇形腫誘導能力の試験には、本質的には記載された通りに22、重症複合免疫不全（SCID）ベージュマウス（Charles River Laboratories）を用いた。動物実験はすべて、スペインおよび欧州の法律および規制を完全に遵守した上で、実験動物に関する施設内倫理委員会によって以前に承認された実験プロトコールに従って実施した。
【００９５】
レンチウイルスベクターによるFA細胞の遺伝的是正
内部の脾臓フォーカス形成ウイルス（SFFV）U3プロモーターの制御下にあるhFANCA-IRES-EGFPカセットを保有するレンチウイルス（LV）ベクター（FANCA-LV；参照文献21）を用いて、FA-A患者由来の線維芽細胞およびケラチノサイトの形質導入を行った。FA-D2患者由来の線維芽細胞には、vavプロモーターの制御下にあるFANCD2 cDNAを保有するLV（FANCD2-LV、参照文献21）による形質導入を行った。これらのプロモーターのいずれかを保有するレンチウイルスベクターは、ヒトFA細胞の表現型を是正する効率が等しかった21。VSV-G偽型LVのベクターストックは、本質的には記載された通りに43、293T細胞における4プラスミドのリン酸カルシウム媒介トランスフェクションによって調製した。トランスフェクションの24時間後および48時間後に上清を回収し、0.45μmを通して濾過した。感染性LVの機能的力価は、24ウェルプレートの1ウェル当たり3.5×104個をプレーティングして、いずれかのLV上清の種々の希釈物によって一晩感染させたHT1080細胞において決定した。細胞を洗浄し、新たな培地とともにインキュベートして、EGFP+細胞の割合を5日後にフローサイトメトリーによって、または8日後にqPCRによって決定した。
【００９６】
FANCAのノックダウン
スクランブルshRNAおよび5種類の異なるFANCA-shRNAを発現するレンチウイルスベクター（Sigma、MISSION shRNA NCBIアクセッションgi:NM_000135）を製造元の指示に従って用いて、ウイルス粒子を作製した。感染のためには、FA患者特異的iPS細胞を6ウェルプレート中でウイルス上清とともに24時間インキュベートした。レンチウイルス感染の3日後にピューロマイシン選択（2μg／ml）を24時間かけて適用し、細胞を3日間かけて回復させた後に分割を行った。siRNAによる一過性RNA干渉実験を、以前に記載された通りに行った44。手短に述べると、細胞を10％ FCSを加えた抗生物質を含まないOPTI-MEM（登録商標）培地（Gibco、カタログ番号31985）中で増殖させた上で、Lipofectamin（商標）RNAiMAXトランスフェクション試薬（Invitrogen、カタログ番号13778-075）を用いて、10nMのFANCA siRNA（参照文献45）または対照としてのルシフェラーゼsiRNA
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を、24時間にわたって2回トランスフェクトした。2回目のトランスフェクションから24時間後に、細胞を0.02μg／mlのジエポキシブタン（DEB）で3日間処理するか、または処理せずにそのままにし、その後にタンパク質溶解物のために収集するか、または標準的な細胞遺伝学的方法に従って処理を行った。1箇所当たり500〜6000個の細胞における有糸分裂細胞の数を2回ずつ算定することにより、分裂指数を算出した。ルシフェラーゼsiRNA（SEQ ID NO：19）は、デオキシチミジンを20〜21位に有するDNA／RNA複合分子である。
【００９７】
線維芽細胞初期化プロトコールの最適化
まず、健常ドナー（HD）の包皮生検試料由来の初代皮膚線維芽細胞を用いて、初期化プロトコールを最適化した。このために、約50,000個の線維芽細胞に、N末端FLAGタグが付加された型のOCT4、SOX2、KLF4およびc-MYCをコードする、幹細胞ウイルス（MSCV）をベースとするレトロウイルスによる形質導入を第0日、第1日および第2日に行った。形質導入されたHD線維芽細胞を、有糸分裂を不活化させた初代ヒト線維芽細胞のフィーダー層の上に5日後に継代し、第6日にヒト胚性幹（hES）細胞用培地に切り換えた。これらの条件下では、第13日前後から数百個の「粒状」コロニーが出現し、3〜4個のiPS様コロニーが第30日までに認められるようになった（非提示データ、参照文献47も参照のこと）。しかし、このプロトコールを用いてファンコニ貧血（FA）線維芽細胞由来のiPS様コロニーを得ることは、数はより少ないものの「粒状」コロニーが同程度の時間で出現したにもかかわらず、できなかった。次に、MEK／ERKシグナル伝達48,49、グリコーゲンシンターゼキナーゼ-3（GSK3）活性50,51、またはRho結合キナーゼ（ROCK）活性52の阻害といった、ES細胞の誘導および／または維持を改善することが報告されている実験操作によって、線維芽細胞の初期化効率を高めることを試みた。MEK阻害剤であるU0126またはPD098059、GSK3阻害剤であるBIO、またはROCK阻害剤であるY27632による第6〜20日または第13〜20日における処理は、HD線維芽細胞から得られる粒状またはiPS様コロニーの数を増加させなかった（非提示データ）。対照的に、初期化プロトコールの第13〜20日における阻害剤のPD0325901およびCT99021（マウスES細胞の誘導および増殖を強化する、2iと名付けられた組み合わせ53）によるMEK1およびGSK3の複合阻害は少数の小さな「粒状」コロニーを生じさせ、それは翌週には消失したが、約20〜30個の密集性の境界明瞭なコロニーが第20日前後から出現した（図6a、6b）。これらのコロニーは容易に増大することができ、マウスES細胞に非常によく似た小さな丸い密集性の細胞コロニーとして増殖したものの、それらは多能性に関連した内因性の転写因子も表面マーカーも検出可能なレベルでは発現せず、しかもそれらはインビトロ分化を行うことも、免疫不全マウスに注入した際に奇形腫を形成させることもできなかった（図6c、6d）。ゲノムDNAに対するPCRによるレトロウイルス組込みの分析では、それらの細胞株におけるOCT4および／またはc-MYCをコードするレトロウイルスの存在が検出されたのみであり（図6e）、このことは、線維芽細胞は初期化されたのではなくて不死化されており、しかしながら、MEK1／GSK3の複合阻害により、自己再生能力を獲得した細胞が効率的に選択されたことを指し示している。
【００９８】
これらの結果に基づき、第17〜24日の2i-選択段階は維持したままで、4因子による2回目のレトロウイルス感染を第5〜7日に含めるように、初期化プロトコールを修正した。これらの条件下では、HD線維芽細胞は多能性を持つように初期化され、数十個のiPS様コロニーが第30日から第60日にかけて出現した（hES様形態を有するAP+コロニーが42±17個、n＝3）。
【００９９】
VII．参照文献
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【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図２ｅ】
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【図２ｆ】
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【図２ｇ】
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【図２ｈ】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図４ｅ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図５ｄ】
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【図５ｅ】
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【図５ｆ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１０ｃ】
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【図１０ｄ】
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【図１０ｅ】
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【図１０ｆ】
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【図１０ｇ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６ａ】
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【図１６ｂ】
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【図１６ｃ】
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【図１６ｄ】
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【図１６ｅ】
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【図１６ｆ】
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【図１６ｇ】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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