(57)【要約】  本発明は、プロシアニドリックオリゴマー(PCO)が脂肪酸でエステル化されている、フランスカイガンショウ(Pinus pinaster)の皮の抽出物を含む、皮膚老化の作用を修復する、及び随意的に予防するための、化粧品組成物に関する。前記組成物は、コラーゲン合成の増加を増加するため、皮膚を鎮静化するため、又はさらにフリーラジカルに対して皮膚を保護するために、特に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚老化の作用を修復するための化粧品組成物であって、以下：
a)  マツの皮から抽出されたプロシアニドリックオリゴマー(PCO)、ここで前記オリゴマーは、少なくとも一つの脂肪酸でエステル化されている；及び
b)  化粧品的に許容される担体、
を含む、化粧品組成物。
【請求項２】
皮膚老化の作用をさらに防ぐための、請求項1に記載の化粧品組成物。
【請求項３】
a)  マツの皮の抽出物、そのプロシアニドリックオリゴマー(PCO)は少なくとも一つの脂肪酸でエステル化されている；及び
b)  化粧品的に許容される担体、
を含む、請求項1又は2に記載の化粧品組成物。
【請求項４】
前記脂肪酸が、パルミチン酸である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の化粧品組成物。
【請求項５】
局所的使用を目的とした、請求項1〜4のいずれか一項に記載の化粧品組成物。
【請求項６】
軟膏、クリーム、オイル、乳液、ポマード、粉末、含浸パッド、溶液、ゲル、スプレイ、ローション、懸濁液、石鹸、又はシャンプーである、請求項5に記載の化粧品組成物。
【請求項７】
組成物の全重量基準で重量により表される、0.1％〜2.5％の前記抽出物を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の化粧品組成物。
【請求項８】
皮膚をさらに鎮静化するための、請求項1〜7のいずれか一項に記載の化粧品組成物。
【請求項９】
コラーゲンの合成を増加させるための、請求項1〜8のいずれか一項に記載の化粧品組成物。
【請求項１０】
フリーラジカルに対して皮膚をさらに保護するための、請求項1〜9のいずれか一項に記載の化粧品組成物。
【請求項１１】
皮膚老化の作用を修復するための、以下：
c)  マツの皮から抽出されたプロシアニドリックオリゴマー(PCO)、ここで前記オリゴマーは少なくとも一つの脂肪酸でエステル化されている；及び
d)  化粧品的に許容される担体、
を含む、化粧品組成物の使用。
【請求項１２】
請求項1〜11のいずれか一項に記載の化粧品組成物の適用、特に局所適用を含む、化粧品的処置方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚について、老化作用を修復する及び可能な限り防止するための、フランスカイガンショウ(Pinus pinaster)の皮の抽出物に基づく化粧品組成物であって、そのプロシアニドリックオリゴマー(PCO)は脂肪酸でエステル化されている組成物、に関する。これらの組成物は、コラーゲン合成を増加させるため、皮膚を鎮静化するため、又はさらにフリーラジカルに対して皮膚を保護するために特に有用である。
【背景技術】
【０００２】
プロアント‐シアニヂン又はプロアント‐シアニジックオリゴマーとも呼ばれるプロシアニドリックオリゴマー(PCO)は、自然界に大変広く存在している天然の分子である。実際、これらは、野菜、果物、穀物の中においてだけでなくまた、ブドウの種、及びマツの皮の中においても見つけられる。これらの分子の栄養学的及び生理学利点は、それらの抗酸化特性、及び心臓血管系に関するそれらの利点に関する。
【０００３】
PCOは、ポリフェノールの化学族、より具体的には、それらの抗酸化特性で認識される化合物である、フラボノイド種に属する。PCOは、一つ又はそれ以上のフラバン-3-オールの反復するモノマー単位により形成され、これらの単位はカテキン、又はエピカテキン又はエピカテキンガラートから独立して選択される。これらの単位は、一般的に、2〜4回繰り返され、もっとも一般的なPCOは、二量体の形態である。
【０００４】
【化１】
2012528838.tif 000002
【０００５】
しかしながら、PCOのフェノール官能基は、これらの化合物を、異なる分解要素、例えば、光、空気、及び酸又は塩基のpHなどに対して、特に傷つきやすくする。この不安定性は、大抵の場合、それらの有用な作用を生かすことへの障害である。これらの化合物を安定化するために、長い炭化水素鎖を有する脂肪酸の誘導体による、ポリフェノールのオリゴマー抽出物のエステル化は、とりわけ提案されている(FR 2 723 943)。
【０００６】
発明者らは、今回、マツの皮の抽出物、そのプロシアニドリックオリゴマー(PCO)は脂肪酸でエステル化されている、は特に、興味深い化粧品的特性を有していることを示している。それ故、松の皮から抽出されたPCOエステルは、ヒトの真皮の線維芽細胞によりコラーゲンの合成を増加させ、それ故、皮膚老化の作用を修復する可能性が得られたことが示された。また、これらのPCOエステルは、さらに、抗炎症、及び抗ラジカル特性を有し、それは、皮膚を鎮静化し、及び皮膚老化の作用を防ぐために、それらを、特に有用にすることが示される。
【発明の概要】
【０００７】
本発明の目的は、それ故、皮膚老化の作用を修復するための化粧品組成物であって以下：
a)  マツの皮から抽出されたプロシアニドリックオリゴマー(PCO)、ここで前記のオリゴマーは少なくとも一つの脂肪酸でエステル化されている；及び
b)  化粧品的に許容される担体、
を含む、組成物である。
【０００８】
好ましい実施形態によれば、本発明による化粧品組成物は、以下：
a)  マツの皮の抽出物、そのプロシアニドリックオリゴマー(PCO)は少なくとも一つの脂肪酸でエステル化されている、及び
b)  化粧品的に許容される担体、
を含む。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
「化粧品的に許容される担体」は、何らかの適切でない毒性、炎症、アレルギー反応などを含まない、有利性/妥当性のリスク比で釣り合いのとれた、ヒト及び動物の細胞、特に表皮の細胞、と接触して用いられるために適合した担体を意味する。
【００１０】
マツの皮の抽出物、特にフランスカイガンショウは、多種多様な、特にケラチンモノマーを含むプロシアニドリックオリゴマー、及びタキシホリオール、及びフラバン‐3‐オールの2〜5単位を含むプロシアニドリックオリゴマー、主成分として存在するモノマー及びダイマーを含む。
【００１１】
マツの皮の抽出物の組成物は、植物由来の他の抽出物、特に、VITAFLAVAN（登録商標）の名称で商業的に特に思い出されるブドウの種子の抽出物のそれから、定性的及び/又は定量的方法で区別される。より具体的には、マツの皮から抽出されたプロシアニドリックオリゴマーは、特に、タキシホリオール、タキシホリオールグルコシド、フェルレートグルコシド、及び異なるフェノール酸を含み、それはブドウ種子抽出物に存在しない。後者とは異なって、他方では、それらは、エピカテキン又はエピカテキンガラートを含まない。PCOは、一般的に、マツの皮の抽出物の全重量の重量で、約70％を表す。
【００１２】
フランスカイガンショウの皮の抽出物は、商業的に入手可能であり(OLIGOPIN（登録商標）、DRT)、それらはまた、特許FR 998 508に記載された一つのような、従来の抽出方法により得られる。
【００１３】
マツの皮の抽出物は、特に、フランスカイガンショウ(Pinus Pinaster)、例えば、ランド(Landes)由来のマツなど、の抽出物でよい。
【００１４】
本発明の好ましい実施形態によれば、フランスカイガンショウの皮の抽出物に含まれるプロシアニドリックオリゴマー(PCO)は、特許出願FR 2 723 943に記載されている方法に従って、脂肪酸でエステル化される。より具体的には、PCOは、以下のステップ：
a)  ある懸濁液を得るように、得られるべきエステルのための溶媒ではなく、前記抽出物のための非溶媒の液体媒体中で、フランスカイガンショウの皮の抽出物を接触させ、
b)  ピリジン以外の少なくとも一つの有機塩基の触媒量の存在下で、少なくとも一つの低融点脂肪族三級アミンを前記懸濁液に添加し、
c)  少なくとも一つの脂肪酸塩化物をこの混合物に導入し、反応混合物は40℃未満の温度で撹拌し、その後、蒸発により濃縮して、PCOがエステル化された抽出物を得ること、
を含む、方法に従ってエステル化される。
【００１５】
好ましくは、PCOは、飽和脂肪酸、特にパルミチン酸、及びステアリン酸、より好ましくはパルミチン酸により、エステル化される。
【００１６】
本発明による化粧品組成物の適用は、局所経路を介して行われる。
【００１７】
組成物は、より具体的には、皮膚の処理を目的とし、軟膏、クリーム、オイル、乳液、ポマード、粉末、含浸ワッド(wad)、溶液、ゲル、スプレイ、ローション、懸濁液、石鹸として用いてもよい。
【００１８】
本発明による組成物は、マイクロ‐エマルジョン、含水アルコールゲル、クリーム、オイル、含水アルコールローションとして、水中油型又は油中水型エマルジョン、又は複数エマルジョン、の形態での化粧品組成物でもよい。
【００１９】
好ましくは、本発明による組成物は、組成物の全重量に対する重量で表して、0.1％〜2.5％、好ましくは0.2〜1.0％の前記エステル化された抽出物を含んでもよい。
【００２０】
本発明による化粧品組成物は、特に、ヒトの真皮の線維芽細胞による、コラーゲンの合成を増加させるために有用である。それらはさらに、有利なことに、皮膚を鎮静化するために、及び/又はフリーラジカルに対して皮膚を保護するために、有用である。それらは、従って、皮膚老化の作用、特に光老化を防ぐために有用である。
【００２１】
本発明の目的はまた、皮膚老化の作用を修復するための、以下：
a)  マツの皮から抽出されたプロシアニドリックオリゴマー(PCO)、前記オリゴマーは少なくとも一つの脂肪酸でエステル化されている；及び
b)  化粧品的に許容される担体、
を含む、化粧品組成物の使用である。
【００２２】
本発明はまた、上記で定義された化粧品組成物の適用、特に局所適用を含む、化粧品的処置方法に関する。
【００２３】
従って、本発明は、マツの皮から抽出されたプロシアニドリックオリゴマー(PCO)、前記オリゴマーは少なくとも一つの脂肪酸でエステル化されている；及び化粧品的に許容される担体、を含む、化粧品組成物の適用を含む、皮膚老化の作用を修復するための、化粧品的処置方法に関する。
【００２４】
本発明はまた、マツの皮の抽出物、そのプロシアニドリックオリゴマー(PCO)は少なくとも一つの脂肪酸でエステル化されている、及び化粧品的に許容される担体、を含む化粧品組成物、の適用を含む、皮膚老化の作用を修復するための、化粧品的処置方法に関する。
【００２５】
下記の実施例は、本発明を限定することなく、説明する。
【実施例】
【００２６】
実施例1
エステル化されたPCOを含むフランスカイガンショウの皮の抽出物の調製
マツの皮の抽出物(Oligopin（登録商標）)は、特許出願FR 2 723 943に記載された方法により、パルミチン酸でエステル化された。
下記の実施例では、「マツPCOエステル」の用語は、本実施例1によるエステル化されたマツの皮の抽出物を意味する。
【００２７】
実施例2
培養細胞の単分子層に関するマツPCOエステルの細胞毒性活性の試験
1.  試験の目的
試験の目的は、インビトロ試験により、ヒト線維芽細胞の単分子層に対する細胞毒性作用を誘導する、実施例1により調製されたマツPCOエステルの能力を評価することである。
【００２８】
2.試験の原則
試験の目的は、正常なヒト線維芽細胞の初代培養への細胞毒性作用を誘導する、マツPCOエステルの能力を評価することである。
24時間の細胞における前記生成物の適用後、細胞の生存率は、生存細胞のミトコンドリアのコハク酸脱水素酵素の活性の測定により、評価された。この酵素は、MTT(3(4,5‐ジメチルチアゾール‐2‐イル)‐2,5‐ジフェニルテトラゾリウムブロミド)を青いホルマザン結晶に変換する。これらの結晶の溶解後、分光光度計の測定が行われた。この測定された吸光度は、生存細胞の数に比例する。
【００２９】
3.試験系
継代1において、ヒト皮膚細胞(白人子供陰茎包皮)由来の線維芽細胞が用いられた。
【００３０】
4.試験の方法
参照要素：
以下：
−陰性対照：完全培養培地
−陽性対照：SDS
の対照は、それぞれの分析に含まれる。
【００３１】
一連の定義：
0.005％のtween 60及び0.05%の綿実油を含む培養培地中で調製された、それぞれのサンプルの6つの希釈は、濃度あたり、5試験ウェルの量で試験された。参照要素は、5ウェルで試験された。
【００３２】
5.結果の表現及び解釈
吸光度は、540 nmで測定された。結果は、陰性対照と比較された死亡百分率として表現された。
【００３３】
【数１】
2012528838.tif 000003
【００３４】
6.結果
【００３５】
【表１】
2012528838.tif 000004
【００３６】
陽性対照は、30％超の死亡率を有し、これは試験を有効にする。
【００３７】
7.結論
保持された実験的条件下で、実施例1によるマツPCOエステルは、何らかの有意な細胞毒性を有さなかった。有効性の全ての試験について、用いられた最大濃度は、1,000μg/mLであった。
【００３８】
実施例3
抗炎症性および抗ラジカル力のスクリーニング試験
【００３９】
1.試験の原則
ヒト表皮は、インビトロで、培養インサートにおいて再構築された。濾紙ディスクの上で、試験される物質(予防的処理)は、「角質層」の上に置かれた。24時間後、それは、UVBにより照射され、その後、試験される物質(治療的処理)は、再び適用された。
24時間後、以下：
−細胞毒性(MTT)の試験
−培養培地におけるIL‐1α、炎症誘発性介在物質の試験
−MDA(マロンアルデヒド)(ラジカル種又は酸素により活性化される種の形成により誘導される脂質過酸化プロセスの間で形成される最終生成物)の試験
はともに行われた。
【００４０】
2.試験される物質の同定
溶媒E(w/wで50％イソプロパノール‐50％イソプロピルミリスチン酸)中の1％(w/w)溶液中での実施例1によるエステル化PCO
【００４１】
3.手順
3.1.  反応系の調製：ヒト表皮層の再構築：
−マイコプラズマフリーの3回継代でのヒトケラチン生成細胞の培養
−ヒトケラチン生成細胞部位は、インサートに、100 x 103細胞/cm2の密度で播かれ、その底部は、ポリカーボネート膜から成る(間隙率 0.4μm−1cm2)。
−細胞は、培養培地：EGF(5 ng/mL)、インスリン(5μg/mL)、ヒドロコルチゾン(0.5μg/mL)、BPE(70μg/mL)が補充されたMCDB/153、に「浸漬された状況」で、5％(v/v)CO2を含む湿度の高い雰囲気で、24時間、37℃でインキュベートされた。
−培養培地は、6日間、「浸漬された状況」で、単分子層の層化を誘導するために、1 mMのCa++が補充された同じ培養培地と置き換えられた。培養培地は、3日ごとに変えられた。
−表皮層は、6日目に「浮上した状況」に置かれ、すなわち、それは、基底細胞、空気に曝露されている角質層、を介してのみ供給される。
【００４２】
3.2.  試験される物質の調製：
インキュベーションから14日目、培養培地は、1％の抗生物質(10,000 U ペニシリン‐10,000μg/Lストレプトマイシン−25μLアンホテリシン)が補充された同様の培養培地で変えられ、及び置き換えられ、20μLの試験される物質(3つの非細胞毒性濃度)、又は20μLの陰性対照(培養培地)、又は溶媒対照は、滅菌条件下で再構築された表皮の表面を覆う濾紙ディスク(Whatman n゜3 MMChr)上に適用され、その側に、「角質層」に接触する、試験される物質及び対照が置かれた。
【００４３】
3.3  一連の定義：
以下の組：
−3つの表皮から成るそれぞれの試験される物質(5、50、及び500μg/mL)の3組(照射される)、
−絶対的な陰性対照の1組(照射されない)、
−絶対的な陰性対照の1組(照射される)、
−溶媒対照の1組(照射されない)、
−溶媒対照の1組(照射される)、
−陽性対照1(ビタミンE：200μg/mL)の1組(照射される)、
−陽性対照2(インドメタシン：10μg/mL)の1組(照射される)、
は、3重に適用される。
【００４４】
最初の8組は、インキュベートのために、5％(v/v)のCO2(処理されるシリーズのための予防処理)を含む湿度の高い雰囲気に、37℃で24時間、置かれた。
陽性対照2(インドメタシン)に対応する9組は、再構築された表皮と接触して置かれた濾紙ディスク(Whatman n゜3 MMChr)の上に20μLの10μg/mLのインドメタシン溶液を置くことにより、形成され、先行するシリーズの適用の21時間後に、37℃で3時間インキュベートされた。
次に、濾紙ディスクは、注意深く回収され、全ての組は、絶対的な陰性対照及び溶媒対照に対応する組を除いて、UVB(0.6 J/cm2)(Spectroline モデル X-15N/F、λ=312 nm)で照射された。
治療的処理は、その後、陽性対照の組2(インドメタシン)を除いて、24時間に亘る期間の予防的処理のために、上述のように適用された。
【００４５】
3.4  細胞集団の評価(MTT*を用いた試験)：
MTT試験は、出版物：Hausen M. B, Nielsen S. E. 及び Berg K. Re-examination and further development of a precise and rapid dye method for measuring cell growth/cell kill. J. Immunol. Methods. 1989, 1 19, 203 ; 及び Mosmann T., Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival : Application to proliferation and cytotoxic assays, J. Immunol. Methods. 1983, 65, 55-63、に記載の条件により行われた。
選択されたインキュベーション時間の終了に、Whatman紙ディスクは、注意深く拾い上げられ、「角質層」は、リンスされ、表皮層を支える多孔質の膜は、柳葉刀でインサートから分離された。培養培地は、IL‐1α、及びMDAを分析するために用いられた。
【００４６】
表皮層は：
−PBSでリンスされ(2回)、
−0.5 mg/mLの培養培地で、2 mLのMTT(3(4,5‐ジメチルチアゾール‐2-イル)‐2,5‐ジフェニルテトラゾリウムブロミド)の存在下で、暗所、37℃で、3時間インキュベートされた。
−PBSでリンスされた(2回)。
【００４７】
ミトコンドリアの酵素によるMTTの切断により生産される、紫色のホルマザン結晶は、2 mLのDMSOに溶解され、周囲温度で1時間、穏やかに撹拌された。
それぞれの層について、200μLの得られた溶液は、プレートリーダー(FL600-BIO-TEK)で、λ＝540 nmで、分光分析を行うために、96ウェルプレートにピペットされた。
【００４８】
3.5  IL‐1αの試験：
IL‐1αの試験は、試験キットに記載された手順に従って、1/10、及び1/20に希釈された、サンプルされた培養培地(n=3)で行われた。
【００４９】
3.6  MDAの試験：
MDA範囲標準の調製：
−1％(w/w)硫酸中の10μMのマロンアルデヒドビス[ジメチルアセタール](malonaldehyde bi[dimethylacetal])母溶液(周囲温度で2時間)、
−希釈は、0.1及び10μMの間で行われた(0.1−1−2.5−5及び10μM)。
500μLの培養培地(又は500μLの標準範囲)は、1 mLの≪TCA、TBA、HCl≫溶液(0.15％(w/w)のTCAトリクロロ酢酸、0.375％(w/w)のTBA(2-チオバルビツール酸)、0.25MのHCl)(TBAを溶解するために、100℃で15分加熱され、その後冷却のために放置された)と共に、力強くボルテックスミキサーで混合された。
混合物は、100℃で15分間インキュベートされ、≪TCA、TBA、HCl≫溶液で形成されたブランクに対して、ODはλ=535 nmで測定された。
【００５０】
4.結果
【００５１】
【表２】
2012528838.tif 000005
【００５２】
【表３】
2012528838.tif 000006
【００５３】
4.1 細胞毒性
・照射された絶対的な陰性対照：OD(AU MTT) 37％の減少(P＜0.05)は、絶対的な陰性対照に対して観測され、これは、用いられた照射量(0.6 J/cm2)について一般的に得られる細胞毒性作用に対応し、照射を実証する。
・照射の前に3時間、インドメタシンによる処理を受けた、照射された絶対的な陰性対照：細胞毒性に関してインドメタシンの保護的効果はなかった。
・照射の前に24時間、ビタミンEを用いた処理を受けた、照射された陰性対照：細胞毒性作用がたったの13％(NS)、すなわち、ビタミンEの不在下で観察されたそれの約3分の1であったので、ビタミンEの保護的効果は観察された。
・溶媒対照：これは、細胞増殖を有意には変化させなかった。
・照射された溶媒対照：これは、照射された全体的な陰性対照と有意な違いはなかった。
・試験物質：保護効果が観察された。500μg/mLについて、細胞毒性作用は17%(NS)であった。
【００５４】
4.2 IL-1α分析の試験(表1)：
・照射された絶対的な陰性対照：培養培地中のIL-1αレベルは、大変大きかった：絶対的な陰性対照に対して290％(P＜0.02)。この結果は、特に反応性であると考えられる反応系を実証する。
・照射前に3時間、インドメタシンを用いて処理を受けた照射された絶対的な陰性対照：予防に用いられたインドメタシンは、培養培地におけるIL‐1αの合成及び分泌を部分的に阻害した(−20％)。もっとも、この作用は、統計学的に有意ではなく、それは、通常得られる値に相当する。
・溶媒対照：これは、絶対的な陰性対照と有意な違いはなかった。
・照射された溶媒対照：照射された絶対的な陰性対照と同様に、IL‐1αレベルは、著しく増加した。この増加は、照射された絶対的な対照に対して観察されたものと有意な違いはなかった。
・試験物質(マツPCOエステル)：培養培地におけるIL‐1αレベルの減少は観察され；この効果は、高濃度(500μg/mL)について特に明らかであり：照射された溶媒に対して−41％(P＜0.02)、それは、インドメタシンにより誘導された阻害の2倍を表した。
【００５５】
4.3 MDAの試験(表2)：
・照射された絶対的な陰性対照：MDAレベルは、非照射の絶対的な陰性対照に対して、175％(P＜0.02)増加し、それは、反応系を実証する。
・照射の前後にビタミンEを用いた処理を受けた、照射された絶対的な陰性対照：MDAレベルの増加は、たったの58％(P＜0.05)であり、それは、非処理の照射された絶対的な陰性対照に対して観察されたレベルの3分の1を表す。
・照射されていない溶媒対照：絶対的な陰性対照に対して、MDAレベルへの有意な効果はなかった。
・照射された溶媒対照：照射された絶対的な陰性対照に対して、MDAレベルへの有意な効果はなかった。
・試験物質(マツPCOエステル)：試験された全ての濃度について、培養培地中で、MDAレベルの減少が観察された。50μg/mLについて、UVBで照射された溶媒対照に対して、43％の阻害が観察された。
【００５６】
5.結論
調査された非-細胞毒性濃度、5、50、及び500μg/mLについて、試験物質、溶媒E(w/wで、50％イソプロパノール−50％イソプロピルミスリチン酸)中の1％(w/w)溶液での、実施例1のエステル化されたPCOは：
−UVBにより誘導された細胞毒性から照射された表皮を保護し；
−UVBによる照射後、培養培地に分泌されたIL‐1αのレベルを減少させ： 500μg/mLの照射された溶媒対照に対して−42％；
−培養培地に分泌されたMDAレベルを減少させた：35％から45％。
これらの「スクリーニング」結果は、抗-炎症性及び抗ラジカル活性さえ示した。
正及び陰性対照は、実験を有効にする。
【００５７】
実施例4
ヒト線維芽細胞によるコラーゲンの合成に対する試験要素(実施例1からのマツPCOエステル)の効果の試験
1.試験の目的
本試験の目的は、インビトロ試験により、ヒトの初代の線維芽細胞の培養によるコラーゲンの合成に関する実施例1のマツPCOエステルの効果、を評価することである。
【００５８】
2.試験の原則
線維芽細胞は、真皮の主な細胞である。それらは、タンパク質線維の2つの種類：細胞外マトリックスを構成する、コラーゲン線維及びエラスチン線維の合成に特化されている。コラーゲンは、真皮のタンパク質の70％を組成し、引っ張り、及びけん引に対するその耐性をそれに提供する。
この試験の目的は、正常なヒト線維芽細胞の単分子層との接触から24時間後の、コラーゲンの合成への試験要素の効果を評価することである。
【００５９】
3.試験系
使用された細胞：
使用された細胞は、2継代の、ヒト子供皮膚組織(男性、白人)由来の線維芽細胞である。
線維芽細胞は、調製され、手順に行う実際の従って曝露された。
【００６０】
参照要素：
以下の対照は、それぞれの分析に含まれる：
−陰性対照：完全培地
−陽性対照：TGFβ 10 ng/mL
【００６１】
一連の定義：
0.005％のtween 60及び0.05％の綿実油を含む培養培地に調製される、3つのそれぞれのサンプルの非-細胞毒性希釈物は、濃度あたり3つウェルの量で試験される。
参照要素はまた、3つのコピーで試験された。
【００６２】
4.試験の方法
試験下で、生成物と接触する細胞の配置：
細胞は、50,000細胞/cm2で播かれた。37℃、5％CO2での培養の24時間後、それらは、試験下で生成物、及び参照要素と、1％FCS培地で24時間インキュベートされた。
【００６３】
コラーゲンの分析：
コラーゲンは、細胞外マトリックスで、及び培養培地で、分析ボックスSircol、Biocolor Ltd, Irelandの手法により、ボックスに記載された手順に従って、分析された。
【００６４】
分析は、天然のコラーゲンの三重螺旋構造(Gly-X-Y)nに対して特異的な親和性を有する赤色発色試薬Sirius (Direct Red 80)で行った。
色素‐コラーゲン複合体の吸光度は、540 nmで分光光度計を用いて測定された。
標準曲線は、I型のコラーゲンの0及び50μg/mLの間で作成した。
【００６５】
細胞密度の測定：
細胞密度は、前と同様の条件下で、生存細胞のミトコンドリアのコハク酸脱水素酵素の活性を測定することにより、評価された。この酵素は、MTT(3(4,5‐ジメチルチアゾール‐2‐イルブロミド)‐2,5‐ジフェニルテトラゾリウム)を青いホルマザン結晶に変換する。これらの結晶の溶解後、分光光度計の測定が行われた。この測定された吸光度は、生存細胞の数に比例する。
【００６６】
5.結果の説明と解釈
細胞密度を評価するために、測定された吸光度はMTT単位(U MTT)として表現される。それは、それぞれのウェルに存在する細胞の量に比例する。
コラーゲン濃度は、細胞外マトリックスにおける、及び培養培地における、コラーゲン/ml/U MTTのμgで表される。
【００６７】
【表４】
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【００６８】
【表５】
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【００６９】
10μg/mLでのTGFβ1は著しくコラーゲンの全合成を刺激した(38％)。この結果は、使用されたモデルを有効にする。この刺激は、細胞マトリックスで特に効果的であった(88％)。
【００７０】
試験された生成物の効果の観点から、全コラーゲンの合成の大変に著しい刺激は、生成物の50μg/mLの濃度について、175％超の最大で注目された。
生成物は、陽性対照(TGFβ1)について観察されるだろうものに反して、コラーゲンの分泌への本質的な効果を有することが観察された。
【００７１】
この効果は、200及び50μg/mLの濃度で最大であった。
500μg/mLにおいて、効果は、大変顕著であり続けたが、しかし、低い著しさであった。5μg/mLにおいて、生成物は、もはや何らかの効果もなかった。この種類の釣鐘形の反応は、この種類の試験において、しばしば観察される。
【００７２】
6.結論
保持された実験的条件下で、実施例1によるマツPCOエステルは、コラーゲンの合成に対する実質的効果を有した。
【国際調査報告】
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