(57)【要約】構造Ｉ：に従って提供されるポリマーであって、ここでＹは、以下の部分：のうちの１種以上から選択されるチオール反応性基であり、Ｚは、以下の部分：のうちの１種以上から選択されるイオン生成基であるポリマー。ポリマー基質の表面は、上記表面と、構造ＩＩもしくは構造ＩＩＩに従うポリマー：とを接触させ、上記表面を紫外線に曝すことによって、改変される。本発明は、ポリマー材料の表面（特に、ポリウレタン基材を含む）を改変して、上記基材表面上におけるその後の自己内皮播種を促進するための方法および組成物を提供する。
2012523480.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造Ｉ：
【化１３】
2012523480.tif 000016
に従うポリマーであって、ここでＹは、以下の部分：
【化１４】
2012523480.tif 000017
のうちの１種以上から選択されるチオール反応性基であり、
Ｚは、以下の部分：
【化１５】
2012523480.tif 000018
のうちの１種以上から選択されるイオン生成基であり、
ここでｎは、整数であり、ｋ、ｍおよびｎ−ｋ−ｍは、各々０ではないｎの分数である、ポリマー。
【請求項２】
Ｚは、−（ＣＨ２）２−ＣＯＯＨである、請求項１に記載のポリマー。
【請求項３】
Ｚは、
【化１６】
2012523480.tif 000019
である、請求項１に記載のポリマー。
【請求項４】
Ｙは、
【化１７】
2012523480.tif 000020
である、請求項１に記載のポリマー。
【請求項５】
Ｙは、
【化１８】
2012523480.tif 000021
である、請求項１に記載のポリマー。
【請求項６】
Ｙは、
【化１９】
2012523480.tif 000022
である、請求項１に記載のポリマー。
【請求項７】
ポリマー基材の表面を改変するための方法であって、該方法は、該ポリマー基材の表面と、構造ＩＩに従うポリマーおよび／もしくは構造ＩＩＩに従うポリマー：
【化２０】
2012523480.tif 000023
とを接触させ、ここでｎは整数であり、ｋ、ｍおよびｎ−ｋ−ｍは、各々ゼロでないｎの分数である、工程；ならびに該表面を紫外線に曝す工程、
を包含する、方法。
【請求項８】
前記ポリマー基材は、ポリウレタン基材である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリマー基材は、ポリエーテルポリウレタン基材である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
次に、前記
【化２１】
2012523480.tif 000024
部分を、−（ＣＨ２）２−ＳＨ部分に変換する工程をさらに包含する、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
次に、前記基材の表面と、構造Ｉ：
【化２２】
2012523480.tif 000025
に従う１種以上のポリマーとを、前記−（ＣＨ２）２−ＳＨ部分とチオール反応性基との反応を引き起こすに十分な条件下で、接触させる工程をさらに包含し、
ここでＹは、以下の部分：
【化２３】
2012523480.tif 000026
のうちの１種以上から選択される該チオール反応性基であり、Ｚは、以下の部分：
【化２４】
2012523480.tif 000027
のうちの１種以上から選択されるイオン生成基であり、
ここでｎは、整数であり、ｋ、ｍおよびｎ−ｋ−ｍは、各々ゼロでないｎの分数である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項９に記載の方法によって調製される、表面改変ポリウレタン基材。
【請求項１３】
前記ポリウレタン基材は、心臓弁である、請求項１２に記載の表面改変ポリウレタン基材。
【請求項１４】
前記ポリウレタン基材の表面は、前記構造ＩＩに従うポリマーと接触させられる、請求項１３に記載の表面改変ポリウレタン基材。
【請求項１５】
構造ＩＩＩ：
【化２５】
2012523480.tif 000028
に従うポリマーであって、
ここでｎは整数であり、ｋ、ｍおよびｎ−ｋ−ｍは、各々ゼロでないｎの分数である、ポリマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００９年４月９日に出願された米国仮特許出願第６１／１７６，９９３号の優先権を主張し、この米国仮特許出願の全体は、本明細書中に参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
心臓弁疾患は、数百万人に影響を及ぼし、この時点では、弁置換もしくは修復手術によって処置され得るに過ぎない。心臓弁プロテーゼは、数十年で顕著には改善されておらず、１つの問題は、移植後１０〜１５年経つと心臓弁置換の性能が徐々に低下することである。このことは、さらなる手術を必要とするか、または病的の状態および死亡の状態をもたらす。さらに、ポリマー材料（代表的には、ポリウレタン）から調製される弁プロテーゼは、これが取り付けられる生体組織へ結合する能力が制限されている。従って、生体組織への効率的な取り付けを含む、インビボで良好な寿命を有する置換弁を提供するための方法は、かなり医学的に価値がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
（発明の要旨）
一局面において、本発明は、構造Ｉ：
【０００４】
【化１】
2012523480.tif 000003
に従うポリマーを提供し、
ここでＹは、以下の部分：
【０００５】
【化２】
2012523480.tif 000004
のうちの１種以上から選択されるチオール反応性基であり、
Ｚは、以下の部分：
【０００６】
【化３】
2012523480.tif 000005
のうちの１種以上から選択されるイオン生成（ｉｏｎｏｇｅｎｉｃ）基であり、
ここでｎは整数であり、ｋ、ｍおよびｎ−ｋ−ｍは、各々ゼロでないｎの分数分数である。
【０００７】
別の局面において、本発明は、上記ポリマー基材の表面を改変するための方法を提供する。上記方法は、上記ポリマー基材の表面と、構造ＩＩに従うポリマーおよび／もしくは構造ＩＩＩに従うポリマー：
【０００８】
【化４】
2012523480.tif 000006
とを接触させる工程であって、ここでｎは整数であり、ｋ、ｍおよびｎ−ｋ−ｍは、各々ゼロでないｎの分数である、工程；ならびに上記表面を紫外線に曝す工程を包含する。
【０００９】
さらに別の局面において、本発明は、構造ＩＩＩ：
【００１０】
【化５】
2012523480.tif 000007
に従うポリマーを提供し、
ここでｎは整数であり、ｋ、ｍおよびｎ−ｋ−ｍは、各々ゼロでないｎの分数である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、３週間にわたって、本発明に従うＡＮＧＩＯＦＬＥＸＴＭフィルムの表面へのＢＯＤＩＰＹ標識ＰＢＰＣ−ＣＰＢ−２Ａ結合の安定性を示すプロットである。
【図２】図２は、本発明に従うＰＢＰＣ−ＣＰＢ−２Ａで改変したＡＮＧＩＯＦＬＥＸＴＭ表面へのヒツジ血液の伸長内皮細胞（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌ）（ＢＯＥＣ）の結合と、非改変ＡＮＧＩＯＦＬＥＸＴＭ表面へのヒツジ血液の伸長内皮細胞の結合とを比較するデータを示す。
【図３】図３Ａは、２時間の剪断後の、本発明に従う表面改変ＡＮＧＩＯＦＬＥＸＴＭ（ＰＢＰＣ−ＣＰＢ−１Ａおよび−２Ａ）へのＢＯＥＣの接着と、非改変ＡＮＧＩＯＦＬＥＸＴＭへのＢＯＥＣの接着とを比較するデータを示す。図３Ｂは、静的条件下および２時間の剪断後の、表面改変ＡＮＧＩＯＦＬＥＸＴＭおよび非改変ＡＮＧＩＯＦＬＥＸＴＭへのＢＯＥＣ接着を示す顕微鏡写真を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ポリマー材料の表面（特に、ポリウレタン基材を含む）を改変して、上記基材表面上におけるその後の自己内皮播種を促進するための方法および組成物を提供する。適切に使用されるそのようなものとしては、例えば、僧帽弁置換として使用するための心臓弁プロテーゼが挙げられる。この分野における初期の研究により、予め形成されたポリウレタンを、ブロモアルキル化を介して活性化し、次いで、上記活性化したポリウレタンと、メルカプト官能化コレステロールとを接触させて、上記ポリマーを官能化することによって形成されたポリマー全体にわたってコレステロール置換基を担持するポリウレタン材料が提供された。Ｓｔａｃｈｅｌｅｋら，Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ−ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ  ｐｏｌｙｕｒｅｔｈａｎｅ：ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ，Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  Ａ  ２００５，７２：２００−２１２およびＳｔａｃｈｅｌｅｋら，Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｐｏｌｙｕｒｅｔｈａｎｅ  ｖａｌｖｅ  ｃｕｓｐｓ  ｓｈｏｗ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ，Ａｎｎ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｓｕｒｇ，２００６，８１：４７−５５（これら文献はともに、本明細書に参考として援用される）を参照のこと。
【００１３】
しかし、本発明者らは、このアプローチがコレステロール基を担持する表面を提供する一方で、得られた大量の（ｂｕｌｋ）官能化が、概して、時間を経ると上記ポリマーの物理的特性にとって有害となり、これにより、性能低下を生じることを見いだした。本発明者らは、今や、既に形成されたポリマー基材（例えば、プロテーゼの心臓弁リーフレットにおいて使用されるポリウレタンフィルム）の表面のみをコレステロール改変するための方法を開示する。上記表面改変は、連続する２工程を含む。第１の工程において、マルチポイント光反応性ポリマー架橋剤を、上記ポリウレタンの表面上で照射して、複数のチオール基を担持する安定なチオール化表面を（以下に記載するようなジチオ基の還元後に）提供する。次いで、上記チオール化表面を、コレステロールを担持するチオール反応性ポリマーで処理して、コレステロール基を上記チオール化ポリウレタン表面に共有結合させる。これら工程は、説明を容易にするために、ポリウレタンを例示的基材として使用して、ここで詳述される。しかし、本発明は、他のポリマー基材の処置も同様に包含することが理解されるべきである。
【００１４】
（ポリウレタン表面チオール化）
上記第１の工程において、ポリウレタン表面は、米国特許出願公開第２００６／０１４７４１３号（その全体は、本明細書に参考として援用される）に記載される方法に従って作製され得るポリマー光反応性架橋剤ＰＢＰＣで改変される（スキームＡ）：
【００１５】
【化６】
2012523480.tif 000008
スキームＡ。ＳＨ基でのＡＮＧＩＯＦＬＥＸＴＭ（ポリウレタン）の表面改変。
【００１６】
ｎの値は、代表的には、少なくとも５０であり、代表的には、多くて２０００もしくは多くて１０００である。本発明者らは、ＰＢＰＣの合成においてＰＡＡの２種の市販の改変体を使用した：一方は、ｎが約１００を有するものであり、他の一方は、ｎが約５００を有するものである。この範囲内の値は、本発明の目的で最も代表的に使用されるものである。ｋ、ｍおよびｎ−ｋ−ｍの値は、各々ゼロでないｎの分数である。ｋの値は、一般に、０．１ｎ〜０．３ｎの範囲にあり、ｍについては、その範囲は、代表的には、０．３ｎ〜０．６ｎである。一般に、ｋは、約０．２ｎであり、ｍは、約０．４ｎである。
【００１７】
本明細書中の例は、ポリウレタンの改変を記載するが、ポリマーの多くのタイプが、ＰＢＰＣもしくはＰＢＰＣ−Ａ（本明細書中で後に記載される）で改変され得、および後に、本発明の方法を使用して、ＣＰＢポリマーで改変され得る。ポリビニルクロリド、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリエステル、ポリアミドなどにおけるＣ−Ｈ結合の存在は、これらを表面改変に適切なものにしている。芳香族ケトン（ベンゾフェノン誘導体およびアントラキノン誘導体が挙げられる）と、Ｃ−Ｈ結合を有するほぼあらゆる種類の基材とのＵＶで開始した光化学反応は、上記基材と励起したケトンとの間に共有結合のＣ−Ｃ結合を形成することが公知である。
【００１８】
特定の適用（例えば、心臓弁のため）において、ポリウレタンは、一般的に使用されている。任意のポリウレタンが、本発明に従って改変され得、１つの例示的ポリウレタンは、商品名ＡＮＧＩＯＦＬＥＸＴＭ（Ａｂｉｏｍｅｄ三葉心臓弁（Ａｂｉｏｍｅｄ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡによって供給される）において使用されるポリエーテルポリウレタン）として販売されている。ポリウレタン基材（例えば、ＡＮＧＩＯＦＬＥＸＴＭ）は、ＡＮＧＩＯＦＬＥＸＴＭフィルムの表面を含むベンゾフェノン架橋反応における関与が可能な豊富なＣ−Ｈ結合を有する。
【００１９】
【化７】
2012523480.tif 000009
スキームＢ。ベンゾフェノン誘導体とＣ−Ｈ基材との光反応。
【００２０】
いかなる特定の理論にも説明にも拘束されることは望まないが、本発明者らは、光分解条件下で、上記ＰＢＰＣが、ＡＮＧＩＯＦＬＥＸＴＭ（もしくは他のポリマー）表面を、上記表面へのＰＢＰＣの移植（ｇｒａｆｔｉｎｇ）を介して共有結合したピリジルジチオ（ＰＤＴ）基で改変すると考えている。次いで、上記ピリジルジチオ基は、適切な還元剤（例えば、ＴＣＥＰ）で切断されて、チオール基を形成し得る（スキームＡ）。チオール官能化は、ＰＢＰＣ−Ａ（本明細書中以降に記載されるＰＢＰＣのアントラキノンベースのアナログ）で同様に行われ得、ＰＢＰＣおよびＰＢＰＣ−Ａの組み合わせもまた、使用され得る。
【００２１】
（コレステロールを担持するチオール反応性ポリマー）
上記チオール化ＡＮＧＩＯＦＬＥＸＴＭ表面へコレステリル残基を結合させるために、本発明者らは、コレステリル残基を有する、数種のタイプのポリアリルアミンベースの三官能性の水溶性チオール反応性ポリマー（スキームＣにおいて「ＣＰＢ」と称される）を合成した。チオール反応性基は、以下に示され（ＰＤＴ（改変体１）、またはマレイミド（改変体２および改変体３））、それは別の１０〜２０ｍｏｌ％のポリアリルアミン（ＰＡＡ）連結部（ｍ＝０．１ｎ〜０．２ｎ）に結合させた。ｎの値は、代表的には、少なくとも５０であり、代表的には、多くて２０００もしくは多くて１０００である。本発明者らは、ＣＰＢの合成において２種の市販のＰＡＡの改変体を使用した：一方は、ｎが約１００を有するものであり、もう一方は、ｎが約５００を有するものであり、この範囲内の値は、本発明の目的のために最も代表的に使用されるものである。
【００２２】
ｋ、ｍおよびｎ−ｋ−ｍの値は、各々ゼロでないｎの分数である。ｋの値は、一般に、０．１ｎ〜０．２ｎの範囲にある、ｍについては、その範囲が、代表的には、０．１ｎ〜０．３ｎである。一般に、ｋは、約０．２ｎであり、ｍは、約０．１ｎ〜０．２ｎである。
【００２３】
本発明者らは、Ｎ−スクシンイミジル  ３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネートから得たスペーサーを使用して、ＰＤＴ基およびマレイミド基結合についてはスペーサーの２種の改変体を結合した：Ｎ−スクシンイミジル  ６−マレイミドカプロエートから得られる直鎖状脂肪族スペーサー（改変体２）およびＮ−スクシンイミジル  ｔｒａｎｓ−４−マレイミドメチルシクロヘキサンカルボキシレートから得られるシクロ脂肪族スペーサー（改変体３）。本発明者らは、上記改変体３化合物のシクロヘキサン環が、自発的な架橋に向かうＣＰＢの安定性を著しく増強することを見いだした。本発明に従うＣＰＢポリマーはまた、同じポリマー分子中の上記のチオール反応性基の混合物を含み得る。単一のＣＰＢポリマーもしくは異なるものの混合物は、本発明の目的で使用され得る。
【００２４】
【化８】
2012523480.tif 000010
スキームＣ。ＣＰＢ：コレステリル残基を有するＰＡＡベースのチオール反応性ポリマー。
【００２５】
上記ＰＡＡ連結部（６５〜７０ｍｏｌ％）の残りにおける上記イオン生成基（上記のスキームＣにおける改変体Ａおよび／もしくは改変体Ｂ）を組み込んで、上記ＣＰＢポリマーに水溶性を付与した。このことは、ＡＮＧＩＯＦＬＥＸＴＭ改変のための水性媒体の使用および有機溶媒の使用の回避を可能にした。本発明に従うＣＰＢポリマーはまた、同じポリマー分子中もしくは別個の分子中のいずれかに、上記のイオン生成基の混合物を含み得る。
【実施例】
【００２６】
（ＰＢＰＣの調製）
従って、上記光反応性ポリマー架橋剤ＰＢＰＣを、Ｃｈｏｒｎｙら，Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｇｅｎｅ  ｖｅｃｔｏｒ  ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ  ｔｏ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｓｕｒｆａｃｅｓ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ  ｅｎｔｒｙ  ａｎｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２００６，１４：３８２−３９１（本明細書に参考として援用される）に記載されるように合成し特徴付けた。簡潔には、ＰＡＡヒドロクロリド（Ｍｎが約１０ｋＤａ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を、Ｄｏｗｅｘ  Ｇ−５５（ＯＨ−形態）を用いた処理によってＰＡＡ塩基へと変換した。２−プロパノール−ＣＨ２Ｃｌ２における塩基を、０℃において、Ｎ−スクシンイミジル  ４−ベンゾイルベンゾエートおよびＮ−スクシンイミジル  ３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）の混合物と反応させ、ＣＨ２Ｃｌ２溶液中に滴下して加えた。上記活性エステルの量を、ＰＡＡアミノ基の完全なアシル化には不十分であるように選択し、次いで、上記反応しなかったアミノ基を、過剰のコハク酸無水物との反応によってカルボン酸基へと変換した。上記ＡＮＧＩＯＦＬＥＸＴＭ表面に結合したＰＢＰＣの量を定量するために、ＰＢＰＣのいくつかのバッチを、適切な蛍光プローブ（ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ）で標識し、市販のアミノ反応性形態ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ  ＳＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）として、他の活性エステルと一緒に合成過程において反応混合物へと添加した。上記標識を、ＰＡＡアミノ基のうちの０．５ｍｏｌ％未満（０．８重量％未満）に結合させたところ、ＰＢＰＣの溶解度および化学的特性に対して顕著な影響を引き起こさなかった。ＢＯＤＩＰＹ蛍光団の蛍光は、ＡＮＧＩＯＦＬＥＸＴＭバックグラウンドとはほぼ無関係であるので、本発明者らは、上記標識ＰＢＰＣで処理したＡＮＧＩＯＦＬＥＸＴＭフィルムの蛍光と、既知量の上記標識ポリマーを含むＰＢＰＣ溶液の蛍光とを比較することによって、上記ＡＮＧＩＯＦＬＥＸＴＭ表面上のＰＢＰＣの量を決定できた。
【００２７】
（ＰＢＰＣ−Ａの調製）
上記光反応性ポリマー架橋剤ＰＢＰＣ−Ａを合成し、ＰＢＰＣと同様に特徴付けた。簡潔には、ＰＡＡヒドロクロリド（Ｍｎが約１０ｋＤａ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を、Ｄｏｗｅｘ  Ｇ−５５（ＯＨ形態）を用いた処理によって、ＰＡＡ塩基へ変換した。２−プロパノール−ＣＨ２Ｃｌ２中の塩基を、Ｎ−スクシンイミジル  アントラキノン−２−カルボキシレートおよびＮ−スクシンイミジル  ３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）の混合物と、０℃において反応させた。上記活性エステルの量を、ＰＡＡアミノ基の完全なアシル化には不十分であるように選択し、次いで、上記反応していないアミノ基を、以下に示すように、過剰なコハク酸無水物との反応によって、カルボン酸基へと変換した。
【００２８】
【化９】
2012523480.tif 000011
上記結合した基の量は、上記のＰＢＰＣの実施例における量と同様であり（ｋが約０．２ｎ，ｍが約０．４ｎ）、ＰＢＰＣ−Ａの特性は、類似であった。一般に、ＰＢＰＣ−Ａポリマーのｋ、ｍおよびｎに関する代表的な範囲は、本明細書に先に記載されるＰＢＰＣについての範囲と同じである。モデル実験は、アントラキノン基が、ベンゾフェノン基のほぼ４倍程度効率的な光架橋剤であることを示した。従って、ＰＢＰＣの代わりにＰＢＰＣ−Ａを使用すると、より低いＵＶ光曝露レベルでのポリウレタン表面への結合を可能にすると予測される。
【００２９】
（ＣＰＢの調製）
ＣＰＢ合成の方法論は、ＰＢＰＣについて使用されるものと似ており、それによりいくつかのＣＰＢ処方物が調製された。ＰＡＡ塩基（Ｍｗが約７５ｋＤａを有するＰＡＡヒドロクロリド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）からの）を、２−プロパノール−ＣＨ２Ｃｌ２中、０℃において、Ｎ−スクシンイミジル  β−コレステリルオキシアセテートおよびチオール反応性基もまた含む別のスクシンイミドエステル（例えば、ＳＰＤＰ（上記スキームＣの改変体１）、Ｎ−スクシンイミジル  ６−マレイミドカプロエート（ＥＭＣＳ，改変体２）二官能性架橋剤もしくはＮ−スクシンイミジル  ｔｒａｎｓ−４−マレイミドメチルシクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ，改変体３）二官能性架橋剤）の混合物とを反応させた。次いで、上記ＰＡＡの過剰なアミノ基を、コハク酸無水物もしくはＮ−スクシンイミジル  ６−トリメチルアンモニオカプロエートブロミドのいずれかと反応させたところ、対応して、カルボン酸イオン生成基（下位改変体Ａ）もしくは四級アンモニウムイオン生成基（下位改変体Ｂ）を形成した。アリルアミド反復ユニットのうちの約２０ｍｏｌ％が、コレステリル残基で改変された（ｋ＝０．２ｎ）。
【００３０】
本明細書に記載されるＣＰＢ組成物を、７５ｋＤａ  ＰＡＡを使用して創製し、上記ＰＢＰＣ処方物は、１５ｋＤａ  ＰＡＡを使用したが、本発明は、これらの分子量に限定されない。ＰＡＡは、異なる活性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（各々は、スキームＣにおいて示されるように、３種の残基（コレステリル、チオール反応性およびイオン生成性）のうちの１種を含む）と同時に非水性溶媒系中で反応させ得る。これらアシル化剤は、上記ＰＡＡアミノ基と安定なアミド結合を形成し、従って、その対応する基を、上記ＰＡＡ高分子の中に無作為に挿入する。カルボン酸イオン生成基の場合は、１，ω−ジカルボン酸（コハク酸、グルタル酸もしくはアジピン酸）の無水物が、上記対応するＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの代わりにアシル化剤として使用され得る。Ｎ−スクシンイミジル  コレステリルオキシアセテート（Ｃｈｏｌ−ＯＣＨ２ＣＯＯＳｕ）（これは、ＣＰＢの中にコレステリル残基を挿入するために使用され得る）は、スキームＤに示されるようにコレステロールから調製され得る。
【００３１】
【化１０】
2012523480.tif 000012
スキームＤ。Ｎ−スクシンイミジルコレステリルオキシアセテートの合成。
【００３２】
ＣＰＢポリマーのカチオン性改変体へとトリメチルアンモニオ基を挿入するために、活性エステルであるＮ−スクシンイミジル  ６−トリメチルアンモニオカプロエートブロミド（これは、スキームＥに示されるように、６−ブロモカプロン酸に由来する純粋な結晶性化合物として調製されうる）が使用され得る。
【００３３】
【化１１】
2012523480.tif 000013
スキームＥ。Ｎ−スクシンイミジル  ６−トリメチルアンモニオカプロエートブロミドの合成。
【００３４】
スキームＣは、特定のＣＰＢポリマーを指定するための命名システムの基礎を提供する。ここで上記チオール反応性基のタイプは、数字（１、２もしくは３）によって示され、および上記イオン生成基のタイプは、文字（ＡもしくはＢ）によって示される。よって、４種のＣＰＢポリマー（ＣＰＢ−１Ａ、ＣＰＢ−２Ａ、ＣＰＢ−３ＡおよびＣＰＢ−１Ｂ）を合成し、１Ｈ  ＮＭＲによって特徴付けた。ＣＰＢのいくつかのバッチもまた、上記ＡＮＧＩＯＦＬＥＸＴＭ表面に結合したポリマーの定量を可能にするために、蛍光標識（ＢＯＤＩＰＹ  ５６４／５７０（ＰＢＰＣを標識するために上記のように結合される））を含んだ。
【００３５】
（ＰＢＰＣでのポリウレタン表面の光活性化）
ＰＢＰＣでの光活性化を、以下のように行った。ＰＢＰＣを、ＫＨＣＯ３（０．６７ｍｇ／ｍｌ）を含む水に溶解し（１ｍｇ／ｍｌ）、ＫＨ２ＰＯ４（２３ｍｇ／ｍｌ）でｐＨを約５に緩衝化した。ＡＮＧＩＯＦＬＥＸＴＭリーフレットもしくはフィルムを、暗所で３０〜４０分間にわたって過剰なＰＢＰＣ溶液に曝し（ＰＢＰＣの吸着層を形成する）、次いで、分析用曝露においてＢｉｏＲＡＤ  ＵＶ  Ｔｒａｎｓｉｌｌｕｍｉｎａｔｏｒ  ２０００を使用して、ＵＶ光に曝した。ＵＶ曝露を、上記フィルムもしくはリーフレットの各側面に対して１５分間にわたって行い、続いて、ＫＨＣＯ３緩衝液への曝露を２０分間行い、二回蒸留水での徹底的な洗浄を行った。次いで、上記ＡＮＧＩＯＦＬＥＸＴＭ材料を、ＣＰＢと反応させる前に、滅菌条件下で４℃において一晩貯蔵した。
【００３６】
（チオール化ポリウレタン表面のコレステロール改変）
ＣＰＢ溶液と、表面チオール化ＡＮＧＩＯＦＬＥＸＴＭとの反応により、安定な連動ネットワーク（ｉｎｔｅｒｌｏｃｋｅｄ  ｎｅｔｗｏｒｋ）の迅速な形成を生じ、これにより、複数の共有結合で、上記ＡＮＧＩＯＦＬＥＸＴＭ表面へのコレステリル残基を結合させた（スキームＦ）。７に近いｐＨを有する水−メタノール中のＣＰＢの溶液（１ｍｇ／ｍＬ）（アニオン性ＣＰＢ、改変体Ａに関しては、塩基としてのコリンビカーボネートの添加を必要とした）を、室温で、ＵＶ照射下で、ＰＢＰＣを用いて表面改変し（上記のように）、ＴＣＥＰで直ぐに還元したＡＮＧＩＯＦＬＥＸＴＭフィルムと反応させた。
【００３７】
【化１２】
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スキームＦ。コレステリル残基でのチオール化ＡＮＧＩＯＦＬＥＸＴＭ（ポリウレタン）の改変。
【００３８】
（ＡＮＧＩＯＦＬＥＸＴＭ表面上のＰＢＰＣ−ＣＰＢの結合および安定性のレベル）
上記の手順を使用して、ＢＯＤＩＰＹ標識ＣＰＢ−２Ａを、ＰＢＰＣ活性化ＡＮＧＩＯＦＬＥＸＴＭフィルムと反応させた。その表面結合物を、蛍光法で定量し、次いで、サンプルフィルムを、生理学的かつ完全に沈めた条件（ｓｉｎｋ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）下で経時的にインキュベートした（図１）。これらデータは、ＡＮＧＩＯＦＬＥＸＴＭフィルム１ｃｍ２あたり約２．０ナノモルのコレステロール架橋能があることを実証する。表面結合したコレステロールのこのレベルは、Ｓｔａｃｈｅｌｅｋら（上記）によって報告されたとおりに大量改変された、以前に報告されたポリウレタンに存在するレベルに匹敵する。上記蛍光法による読み取り値によりまた、経時的な結合の安定性（２１日間）が示された。従って、このことは、コレステロール誘導体化ＡＮＧＩＯＦＬＥＸＴＭ表面が、持続的にＢＯＥＣと相互作用してＢＯＥＣ接着を促進するという考察を裏付ける。本発明者らは、持続的な内皮播種（例えば、本明細書に記載されるとおりの）の、以前の実験的実証および臨床的実証のいずれも認識していないが、このことから、弁置換、特に左側の弁置換について実質的な利益が提供されると予測する。
【００３９】
（ＰＢＰＣ−ＣＰＢ走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）結果および１軸試験）
これらデータから、ＰＢＰＣ−ＣＰＢ−２Ａ改変ＡＮＧＩＯＦＬＥＸＴＭは、非改変ＡＮＧＩＯＦＬＥＸＴＭ（データは示さず）からの表面形態の点では異ならない、均一で滑らかな表面を生じることが確認された。さらに、１軸試験結果から、ＰＢＰＣ−ＣＰＢ改変  対  非改変ＡＮＧＩＯＦＬＥＸＴＭの間に検出可能な差異はないことが実証された（表１）。これら１軸研究において、本発明者らは、ＡＮＧＩＯＦＬＥＸＴＭ標本のバルク機械的特性に対する光活性表面化学物質（ＰＢＰＣ−ＣＰＢ）の効果を試験した。３群を試験した：コントロール、ＰＢＰＣ−ＣＰＢ−１Ａ、およびＰＢＰＣ−ＣＰＢ−２Ａ（スキームＣを参照のこと）。各群は、１０ｍｍ×２ｍｍの矩形ストリップ（５：１比）の５サンプルからなった。Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｍａｃｈｉｎｅ（ＭＴＳ  Ｔｙｔｒｏｎ  ２５０  Ｍｉｃｒｏｆｏｒｃｅ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）を使用し、各標本を、５サイクルについては、初期標本長の３０％において１０ｍｍ／分で調節し（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ）、次いで、１０ｍｍ／分で停止する（ｆａｉｌｕｒｅ）まで負荷した。力、変位（ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、および時間のデータ取得を、３０Ｈｚのサンプリング速度で行った。上記個々の標本のうちの各々について、極限応力、極限伸び、転移歪み（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｓｔｒａｉｎ）と関連する接線係数、総仕事量および靱性（ｔｏｕｇｈｎｅｓｓ）を計算した。全標本の機械的特性を、平均値および標準誤差として報告する。一元配置ＡＮＯＶＡを、処理（コントロール、アニオン性、カチオン性）の関数としての各独立した変数について行って、機械的特性に有意差があったか否かを評価した。試験結果から、３群全てが、「古典的な」非線形エラストマー引っ張り応答（データは示さず）を実証したことが示された。さらに、上記異なる表面処理の間で、材料特性における有意差はなかった。表１は、コントロール非改変ＡＮＧＩＯＦＬＥＸＴＭポリウレタンの機械的特性と、本発明に従う２種の表面改変で処理したＡＮＧＩＯＦＬＥＸＴＭとを比較するデータを示す。上記報告されたデータは、極限応力および歪み、総仕事量および靱性を含む。
【００４０】
【表１】
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表１に報告される全ての値は、平均±ＳＤとして報告され、ここでｎ＝５／群である。任意の測定されたパラメーターにおいても群間で統計学的差異はなかったことに注目すべきである。従って、上記ポリウレタンのバルク機械的特性は、表面改変後に保持された。
【００４１】
（ヒツジＢＯＥＣ結合）
３０分間の期間にわたるＢＯＥＣ結合を、光活性化ＰＢＰＣ−ＣＰＢ−２Ａ（スキームＣ）での表面改変ありおよびなしのＡＮＧＩＯＦＬＥＸＴＭについて比較した。図２に示されるように、ＰＢＰＣ−ＣＰＢ−２Ａ（Ａｎｇ−Ｃｈｏｌ）で改変したＡＮＧＩＯＦＬＥＸＴＭは、非改変ＡＮＧＩＯＦＬＥＸＴＭ（Ａｎｇ）のほぼ３倍程度のＢＯＥＣ結合のレベル（ｐ＜０．００１）を示した。
【００４２】
ＰＢＰＣ−ＣＰＢ−１Ａおよび−２Ａで改変したＡＮＧＩＯＦＬＥＸＴＭへのヒツジＢＯＥＣ接着をまた、高剪断条件下で評価した。３つの実験において、本発明者らは、ＢＯＥＣ播種表面上に２時間の高剪断流（４５ダイン／ｃｍ２）を有する、ＦＬＥＸＣＥＬＬ（登録商標）Ｔｅｎｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｆｌｅｘｃｅｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｈｉｌｌｓｂｏｒｏｕｇｈ，ＮＣ）を使用する、本発明者らの公開された方法論（本明細書の先のＳｔａｃｈｅｌｅｋらの参考文献を参照のこと）を使用して、２種のＰＢＰＣ−ＣＰＢ（スキームＣ命名法に従って、１Ａおよび２Ａ）表面改変処方物を比較した。次いで、ＰＣＰＢ−ＣＰＢ（−１Ａおよび−２Ａ）およびコントロールスライドに、５００，０００ヒツジＢＯＥＣを播種し、上記細胞をコンフルエントになるまで増殖させた（２日間）。次いで、上記細胞を、Ｆｌｅｘ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｒｅａｍｅｒ（Ｈｉｌｌｓｂｏｒｏｕｇｈ  ＮＣ）流体フロー送達装置を介して、４５ダイン／ｃｍ２の層流剪断（ｌａｍｉｎａｒ  ｓｈｅａｒ）に、２時間にわたって曝した。スライドを、ＰＢＳ中で洗浄し、パラホルムアルデヒド中で固定した。保持された細胞を、位相差顕微鏡を使用して撮影し、ＤＡＰＩで染色した。細胞を、蛍光顕微鏡を使用して手動で定量して、ＤＡＰＩ陽性細胞の数を定量した。
【００４３】
図３Ａは、本発明に従う表面改変ＡＮＧＩＯＦＬＥＸＴＭが、非改変ＡＮＧＩＯＦＬＥＸＴＭが示すよりも、２時間後に有意に大きな（ｐ＜０．００１）ＢＯＥＣ接着を示すことを示すデータを示す。図３Ｂは、剪断に曝し、そして図３Ａにおいて評価した表面の写真、ならびに４５ダイン／ｃｍ２剪断の前の静的条件下でのこれら表面の写真を示す。
【００４４】
この検証試験（ｃｈａｌｌｅｎｇｉｎｇ  ａｓｓａｙ）において、上記ＢＯＥＣのうちの９０％より多くが、剪断後に上記両方のＰＢＰＣ−ＣＰＢ改変表面に接着したままであったのに対して、上記非改変ＡＮＧＩＯＦＬＥＸＴＭでは、５％より少なかった。これらデータは、コレステロールでバルク改変された（表面改変されていない）ポリウレタン、ならびに図３Ａおよび３ＢにおけるＰＢＰＣ−ＣＰＢ改変ＡＮＧＩＯＦＬＥＸＴＭサンプルとほぼ同じレベルの表面コレステロールを有したポリウレタンについての公開された結果（Ｓｔａｃｈｅｌｅｋら，本明細書で先に引用されている）に匹敵する。従って、接着は、本発明に従うＰＢＰＣ−ＣＰＢで改変したＡＮＧＩＯＦＬＥＸＴＭ表面については非常に良好であったが、対照的に、非改変ＡＮＧＩＯＦＬＥＸＴＭへの接着はほとんどもしくは全く認められなかった。
【００４５】
完全に組み立てられたポリマー弁の細胞播種は、インビボで使用する前に可能であるが、完全に組み立てられた弁の形成後に、本発明の方法および組成物を介しても可能である。従って、弁製作もしくは組み立て手順における変化は、製造には必要とされない。
【００４６】
本発明は、具体的実施形態を参照しながら本明細書で例示されかつ記載されてきたが、本発明は、示される詳細に限定されるとは意図されない。むしろ、種々の改変は、本発明から逸脱することなく、特許請求の範囲の範囲の等価物の範囲（ｓｃｏｐｅ  ａｎｄ  ｒａｎｇｅ）内で行われ得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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