(57)【要約】  回転異性体ライブラリーおよびその使用方法が提供される。
2012524124.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨格依存的回転異性体ライブラリーを作製する方法であって、前記の回転異性体ライブラリーは、アミノ酸またはその類似体からなるセットについての可能な回転異性体のコンフォメーションのセットを含み、
（ａ）適応的カーネル密度推定においてフォン・ミーゼスカーネルを使用することにより、φおよびψの関数としての回転異性体の確率を決定すること；
（ｂ）ノンパラメトリック・カーネル回帰推定を使用することによってχ角度の平均および分散を決定すること；および
（ｃ）側鎖の自由度についてのデータ−適応的カーネル密度推定値および骨格の自由度についてのクエリ−依存的カーネル密度推定値の組み合わせを使用して、非回転異性体の自由度の骨格依存的な確率分布を決定することを含む、前記方法。
【請求項２】
ｒ１である骨格依存的密度推定値と他の自由度についての骨格に依存しない条件付確率との積を包含するベイズの事前確率を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法によって作製された、骨格依存的回転異性体ライブラリー。
【請求項４】
少なくとも１つのポリペプチドの最適化された構造を生成するための方法であって、以下の工程
（ａ）少なくとも１つのポリペプチドの骨格構造を提供する工程；
（ｂ）請求項３に記載の回転異性体ライブラリーを利用して、前記ポリペプチド内の少なくとも１つの可変性の残基位置についての潜在的な回転異性体の一群を確立する工程；および
（ｃ）工程ｂ）で得られた回転異性体のそれぞれと前記ポリペプチド構造の残りの少なくとも一部または全部との相互作用を分析し、
それによって少なくとも１つの前記ポリペプチドの側鎖の最適化された構造を生成する工程を含む、前記方法。
【請求項５】
リガンドまたは補因子の座標、および得られたポリペプチドの最適化された構造が、前記リガンドまたは補因子の存在下のものである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記リガンドまたは補因子が、非タンパク質性である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも１つの可変性の残基位置が、少なくとも２つの異なるアミノ酸の側鎖による回転異性体を有する、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記の少なくとも１つのポリペプチドの最適化された構造が、前記リガンドまたは補因子に対する増加した結合を有する、前記の少なくとも１つのポリペプチドのアミノ酸配列である、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
請求項４に記載の方法により得られた、最適化されたタンパク質の構造。
【請求項１０】
さらに、
（ｄ）前記リガンドまたは補因子に対する前記最適化された構造のインビトロまたはインビボでの結合親和性を、未修飾ポリペプチドと前記リガンドまたは補因子との結合親和性と比較することを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
第１のポリペプチドにおける改変が、前記第１のポリペプチドの第２のポリペプチドに対する結合をモジュレートするかどうかを決定する方法であって、
（ａ）前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドのアミノ酸残基に関する構造座標のセットを提供すること；
（ｂ）前記第１のポリペプチドと前記第２のポリペプチドとの間の相互作用をモデリングすること；
（ｃ）請求項３に記載の回転異性体ライブラリーを利用して、前記第１のポリペプチド内の少なくとも１つの可変性の残基位置についての潜在的な回転異性体の一群を確立し、それによって、改変した第１のポリペプチドを定義する構造座標のセットを作製すること；
（ｄ）前記改変した第１のポリペプチドと前記第２のポリペプチドとの相互作用をモデリングすること；および
（ｅ）前記改変が、前記第１のポリペプチドと前記第２のポリペプチドとの間の相互作用と比較して、前記改変した第１のポリペプチドと前記第２のポリペプチドとの間の相互作用を抑制または促進するかどうかを決定することを含む、前記方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法により定義されたように、第２のポリペプチドとの増大した相互作用を示す、改変したポリペプチド配列。
【請求項１３】
前記の第１のポリペプチドが抗体であり、かつ前記の第２のポリペプチドは前記抗体により認識されるエピトープを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
さらに、
（ｆ）前記第２のポリペプチドに対する前記改変した第１のポリペプチドのインビトロまたはインビボでの結合親和性を、前記第１のポリペプチドと前記第２のポリペプチドとの結合親和性と比較することを含む、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、２００９年４月２０日出願の米国特許仮出願第６１／１７０，９０８号の優先権を主張する。前述の出願は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、米国立衛生研究所から授与された助成金番号Ｐ２０  ＧＭ７６２２２およびＲ０１  ＧＭ８４４５３の下、米国政府の支援を得て行われた。米国政府は本発明においてある特定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、概して、タンパク質の構造予測ならびにタンパク質のモデリングおよび設計の分野に関する。
【背景技術】
【０００４】
前述の明細書において、本発明が関する技術分野の現状をより十分に説明するために、いくつかの刊行物および特許文書が引用されている。これらの引用のそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００５】
タンパク質およびタンパク質複合体の構造予測は、長い歴史を有する。問題の複雑さのため、大部分の試みは、別種の相同体の同定および配列−構造アラインメント(概説について、Dunbrack, R.L. (2006) Curr. Opin. Struct. Biol., 16:374-384を参照されたい)、ループ構造予測(Fiser et al. (2000) Prot. Science, 9:1753-1773; Tosatto et al. (2002) Protein Eng., 15:279-286; Jacobson et al. (2004) Proteins, 55:351-367; Zhang et al. (2004) Protein Sci., 13:391-399; Fernandez-Fuentes et al. (2005) Proteins, 60:746-57)、および側鎖のコンフォメーション予測(Mendes et al. （2001a） J. Comp. Aided. Mol. Design,15:721-740; Xiang and Honig (2001) J. Mol. Biol., 311:421-430; Desmet et al. (2002) Proteins, 48:31-43; Liang and Grishin (2002) Protein Sci., 11:322-331; Canutescu and Dunbrack (2003) Protein Sci., 12:963-972; Peterson et al. (2004) Protein Sci., 13:735-751; Xu, J. (2005) Rapid protein side-chain packing via tree decomposition, 9th Annual International Conference on Research in Computational Molecular Biology （RECOMB）. 423-439)などの、特定のプロセスの態様に限定されてきた。タンパク質のアブイニシォ（ab initio）構造予測は、結局のところ、小さなタンパク質についての現実的な選択肢になっているが(Bradley et al. (2005) Science, 309:1868-1871; Wu et al. (2007) BMC Biol., 5:17)、それは依然として、標的タンパク質の相同的な構造が入手可能である場合には、最良の構造予測を得ることができる事例である。同様に、小さなリガンドをタンパク質にアブイニシォにドッキングするためのプログラム(Lorber and Shoichet (2005) Curr. Top. Med. Chem., 5:739-749; Meiler and Baker (2006) Proteins, 65:538-548)および２つのタンパク質をアブイニシォにドッキングするためのプログラム(Fernandez-Recio et al. (2005) Proteins, 60:308-313; Schueler-Furman et al. (2005) Proteins, 60:187-194. )が入手可能である。
【０００６】
タンパク質は、特定の環境において所与の構造に折りたたまれやすい配列を決定することによっても設計することができる(Jones (1994) Protein Eng., 3:567-574; Dahiyat et al. (1997) J. Mol. Biol., 4:789-796; Kortemme et al. (2004) Nat. Struct. Mol. Biol., 11:371-379)。タンパク質の設計において、パッキング、疎水性相互作用、および水素結合のパターンを、一定の環境で一定の骨格（backbone）をもたらす側鎖のコンフォメーション（例えば、別のタンパク質またはリガンドまたはＤＮＡ）をサンプリングすることによって最適化することができる。
【０００７】
本発明の特定の態様は、回転異性体ライブラリーであり、回転異性体ライブラリーは、タンパク質の側鎖のコンフォメーションの平均二面角およびそれらの分散ならびに実験的に決定された構造において観察される関連頻度（associated frequencies）によってもたらされるタンパク質の側鎖のコンフォメーションのセットと定義することができる。回転異性体ライブラリーは、タンパク質の構造予測およびタンパク質の設計の全ての態様において、最も可能性が高い側鎖のコンフォメーションをサンプリングし、スコア化するために使用される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明によると、骨格依存的回転異性体ライブラリーおよびその作製方法が提供される。特定の実施形態では、骨格依存的回転異性体ライブラリーを作製する方法は、（ａ）適応的カーネル密度推定においてフォン・ミーゼス（von Mises）カーネルを使用することにより、回転異性体の確率を主鎖の二面角であるφおよびψの関数として決定すること；（ｂ）ノンパラメトリック・カーネル回帰推定を使用することによってχ角度の平均および分散を決定すること；および（ｃ）側鎖の自由度についてのデータ−適応的カーネル密度推定値および骨格の自由度についてのクエリ−依存的カーネル密度推定値の組み合わせを使用して、非回転異性体の自由度の骨格依存的な確率分布を決定することを含む。別の実施形態では、本方法は、χ１−回転異性体−骨格依存的密度推定値と他の自由度についての骨格に依存しない条件付確率の積を含むベイズの事前確率（Bayesian prior）を含む。さらに別の実施形態では、本方法は、コンピュータの支援で実行され、結果は、使用者に対して任意の所望の様式（例えば、プリントアウトまたは表示）で出力され、および／またはメモリに記憶される。さらに別の実施形態では、回転異性体ライブラリーを生成するために使用するデータセットの少なくとも一部は、実験的に決定される。
【０００９】
本発明の別の態様によると、少なくとも１つのポリペプチドの最適化された構造を生成するための方法が提供される。特定の実施形態では、本方法は、（ａ）少なくとも１つのポリペプチドの骨格構造を提供する工程；（ｂ）本発明の回転異性体ライブラリーを利用して、ポリペプチド内の少なくとも１つの可変性の残基位置に対する潜在的な回転異性体の一群を確立する工程；および（ｃ）工程ｂ）で得られた回転異性体のそれぞれとポリペプチド構造の残りの少なくとも一部または全部との相互作用を分析し、それによって少なくとも１つのポリペプチドの少なくとも１つのアミノ酸の側鎖の最適化された構造を生成する工程を含む。特定の実施形態では、本方法は、工程（ａ）においてリガンド（例えば、タンパク質性リガンドまたは非タンパク質性リガンド）の座標を含み、得られたポリペプチドの最適化された構造はリガンドの存在下のものである。さらに別の実施形態では、少なくとも１つの可変性の残基位置は、少なくとも２つの異なるアミノ酸の側鎖による回転異性体を有する。この方法を使用して、リガンドまたは第２のポリペプチドを結合させる（特に結合を増加させる）ための、ポリペプチドの最適なアミノ酸配列を決定することができる。この方法はコンピュータの支援で実施することができ、結果は、使用者に対して任意の所望の様式（例えば、プリントアウトまたは表示）で出力され、および／またはメモリに記憶される。さらに別の実施形態では、骨格構造は、実験的に決定することができる。さらに別の実施形態では、最適化されたポリペプチドを、リガンドまたは第２のポリペプチドのモジュレートされた結合について、野生型または変異前のポリペプチドと比較して実験的に試験することができる。
【００１０】
本発明のさらに別の態様に従って、第１のポリペプチドにおける改変が、第１のポリペプチドの第２のポリペプチドへの結合をモジュレートするかどうかを決定するための方法が提供される。特定の実施形態では、本方法は、（ａ）第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドのアミノ酸残基に関する構造座標のセットを提供すること；（ｂ）第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの間の相互作用をモデリングすること；（ｃ）本発明の回転異性体ライブラリーを利用して、第１のポリペプチド内の少なくとも１つの可変性の残基位置についての潜在的な回転異性体の一群を確立し、それによって、改変した第１のポリペプチドを定義する構造座標のセットを作製すること；（ｄ）改変した第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの相互作用をモデリングすること；および（ｅ）この改変が、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの間の相互作用と比較して、改変した第１のポリペプチドと前記第２のポリペプチドとの間の相互作用がモジュレートされるかどうかを決定することを含む。ある特定の実施形態では、相互作用のモジュレートは、ポリペプチドの結合活性または結合親和性におけるモジュレート（例えば、増加）である。特定の実施形態では、ポリペプチドの一方は抗体であり、他方のタンパク質は抗原またはエピトープ、特に抗体に認識される抗原またはエピトープである。本方法はコンピュータの支援で実施することができ、結果は、使用者に対して任意の所望の様式（例えば、プリントアウトまたは表示）で出力され、および／またはメモリに記憶される。さらに別の実施形態では、構造座標は、実験的に決定することができる。さらに別の実施形態では、改変した第１のポリペプチドを第２のポリペプチドのモジュレートされた結合について、第１のポリペプチドおよび／または野生型と比較して実験的に試験する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】セリンの３つのχ１回転異性体であるｇ＋、トランス、およびｇ−（左から右）についてのｐ（φ，ψ｜ｒ）のカーネル密度推定値のグラフ。ドットは、入力データポイントを表す。
【図２】セリンの３つのχ１回転異性体であるｇ＋、トランス、およびｇ−（左から右）についてのｐ（ｒ｜φ，ψ）のカーネル密度推定値のグラフ。ドットは、入力データポイントを表す。
【図３】本発明の回転異性体ライブラリーを用い、ＭｏｌＩＤＥおよびＳＣＷＲＬにより構築した、ヒトのシスタチオニンβシンターゼのＣ末端制御ドメインの相同性モデルの画像。リガンドであるＳ−アデノシルメチオニンと接触する側鎖がスティック表示で示されている。
【図４】標的としてＣＢＳ−ＢＤを用いたＭｏｌＩＤＥ２の画像。ヒットの一覧（上部の左側）においてチェックされた構造は、得られる配列アラインメント（下部の左側）およびインタラクティブ構造ビューアー（中央の右側）に示されるように、構造的にアラインメントされる。構造的にアラインメントされた残基の塊が青色になっている。構造アラインメントから構築した隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を使用して、構造アラインメント（下部の左側）にクエリ配列を追加した。チェックされたエントリーにおけるリガンドの一覧が上部の右側に表示されており、それらのリガンドが相互作用するＰＦＡＭが表記されている。リガンドウィンドウ内のチェックされたエントリーは、所望のアデノシン類似体を含有する；それらの残基の相互作用が配列アラインメントにおいて強調表示されている。これらの構造は、リガンド・ツリーにおいても強調表示されている。
【図５】ＳＣＷＲＬ４の側鎖のコンフォメーションの予測における工程のフローチャート。
【図６】ｋ−次元の方向ポリトープ（Dimensional Oriented Polytopes：ｋＤＯＰ）の例。左側のパネル：平面（ｋ＝２、３、４）および３次元（ｋ＝３、４）におけるｋＤＯＰの例。右側のパネル：ｋＤＯＰ  ＡおよびｋＤＯＰ  Ｂについての重複検定。ｋＤＯＰの内部に囲まれた対象は、示された条件が満たされれば、衝突する可能性がある。
【図７】ＳＣＷＲＬ４のファンデルワールスポテンシャルのグラフ。この図では、ｘ＝ｄ／Ｒｉｊであり、θ＝０．８２５４である。
【図８】水素結合ポテンシャルの概略図。変数は、本文で定義されている。
【図９】２連結成分分解の一般化として提供する木分解。左側には、ＳＣＷＲＬ３の論文で使用されたグラフが、その２連結成分分解と一緒に示されている。右側には、同じグラフの木分解が示されている。残基ｃおよび残基ｄならびに残基ｈは、木分解の下に示されている木分解の条件２および条件３が満たされていることを例示している。
【図１０】ＳＣＷＲＬ３の正確度とＳＣＷＲＬ４の正確度における差異に対するＳＣＷＲＬ４の特徴の効果を実証している。示された正確度は、平均の絶対的な正確度であり、全ての側鎖二面角を包含する。「原子の半径」＝最適化された半径の使用であり；「内挿」＝回転異性体ライブラリーの確率および二面角の内挿であり；「ローカルＢＢ」＝以前は無視されていた、側鎖と残基ｉ−１の原子Ｎ、ＨＮおよび残基ｉ＋１の原子Ｃ、Ｏとの間の相互作用を加算することであり；「Ｐ＝９８％」＝頻度の降順にソートした回転異性体からの確率の上位９８％を読み込むこと（以前は９０％）であり；「Ｈ結合」＝新しい水素結合ポテンシャルであり；「新しいＲＬ」＝新しい回転異性体ライブラリーであり；「ＦＲＭ」＝フレキシブル回転異性体モデル（flexible rotamer model）であり；「パラメータのチューニング」＝ＦＲＭパラメータおよび回転異性体ライブラリーの重みをチューニングすることである。
【図１１】結晶隣接点を含めることによる正確度における改善を実証するグラフ。示されている正確度の数値は、本文に記載の平均の絶対的な正確度における差異を反映している。Ｃｙｓについては変化が観察されなかった。
【図１２】電子密度のパーセンタイルに対する正確度を示すグラフ。各二面角の自由度に対する条件付の正確度が、２０％のスライドウィンドウを使用して、電子密度のパーセンタイルの関数として示されている。
【図１３】ＳＣＷＲＬ４の正確度を示す表１。
【図１４】ＳＣＷＲＬ３に対してＳＣＷＲＬ４が改善されていることを示す表２。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
回転異性体ライブラリー(例えば、Dunbrack、R.L. Curr. Opin. Struct. Biol. (2002) 12:431-440を参照されたい)は、多くの研究グループからの多くのタンパク質の構造予測および設計のアプリケーションにおいて広範囲にわたって使用されており、ＳＣＷＲＬなどの側鎖の予測プログラムの基礎を形成する(Canutescu and Dunbrack (2003) Protein Sci., 12:963-972)。回転異性体は、タンパク質の側鎖などの有機部分の低エネルギーのコンフォメーションであり、高エネルギーの障壁によって他のそのようなコンフォメーションから分離されている。タンパク質の側鎖における自由度の大部分はこのように、高い障壁によって分離された別個のコンフォメーションであるという意味で、「回転異性体的」である。数種類の側鎖は少なくとも１つの「非回転異性体的な」二面の自由度を有し、通常、確率密度分布において、ただ１つの広範な非対称のピークを示す。ある特定の回転異性体的な状態は、隣接する原子との立体的な相互作用が原因で他よりもエネルギーが高い。水素結合を含めた静電気的な相互作用も、側鎖のエネルギーに影響を及ぼす。これらの相互作用は、「骨格に依存しない」（すなわち、残基の局所的な骨格のコンフォメーションに依存しない）、または「骨格に依存する」（すなわち、骨格の二面角であるφおよびψによって決定される局所的な骨格のコンフォメーションに依存する）ものであり得る。骨格依存的回転異性体ライブラリーにより、平均二面角およびそれらの分散ならびにタンパク質の側鎖のコンフォメーション（すなわち、回転異性体）の頻度が、骨格の二面角であるφおよびψに応じてもたらされる。頻度ならびに平均角度および分散はどちらも局所的な骨格のコンフォメーションに依存する(Dunbrack and Cohen (1997) Protein Sci., 6:1661-1681; Dunbrack and Karplus (1993) J. Mol. Biol., 230:543-574; Dunbrack and Karplus (1994) Nature Struct. Biol., 1:334-340; Dunbrack, R.L. (2006) Curr. Opin. Struct. Biol., 16:374-384)。
【００１３】
骨格依存的回転異性体ライブラリーの以前のバージョンは、ｋ−最近接を用いる単純なヒストグラム解析(Dunbrack and Karplus (1993) J. Mol. Biol., 230:543-574)またはベイズの事前確率を用いるヒストグラム解析(Dunbrack and Cohen (1997) Protein Sci., 6:1661-1681; Dunbrack, R.L. (2006) Curr. Opin. Struct. Biol., 16:374-384)に基づいていた。後者は、タンパク質の構造予測およびタンパク質の設計において、多くの研究グループによって広範囲にわたって使用されている。平均二面角および時にはそれらの分散を使用して、構造を予測し設計する間に、タンパク質における側鎖のコンフォメーションをサンプリングする。頻度を、ファンデルワールス、水素結合、および他のエネルギー項と一緒に、エネルギー項としていくつかの定数を掛けた頻度のそれぞれの負の自然対数を取ることによって、全体的なスコア関数の一部として使用する。Rosetta(Rohl et al. (2004) Methods Enz., 383:66-93)などの一部のプログラムでは、全体の構造のエネルギー最小化が実施され、骨格の自由度であるφおよびψに対して全てのエネルギー項の第１の導関数が必要とされる。
【００１４】
以前の回転異性体ライブラリーはいくつかの重大な欠点を有する。第１に、ベイズのヒストグラム解析から導かれる頻度はφおよびψに応じて非常にむらがある。これは、平滑で微分可能なエネルギー表面が必要とされる、構造を精密化する方法（Rosettaなど）に対して特に問題がある。しかし、これは、データ量が少ないことが原因でいくつかの頻度が不適切に推定されたという点においても問題である。この特徴は、ヒストグラム法の特性である。第２に、いくつかのφ、ψ格子点の近くのデータが少量であるので、平均角度およびそれらの分散にはさらにむらがあり、平均角度において大きな変化を伴う。これは、平均角度の多くが不適切に決定され、構造の完全なエネルギー最小化の間に、急激な動きが生じるであろうことを意味する。最後に、１８０°または３６０°（側鎖種に左右される）を包含するために３〜６個のみの別個の重複していない２成分を用いて、非回転異性体の自由度が回転異性体のものであるかのように扱われた。これらは、これらの自由度の連続的なエネルギー最小化を行うのに適していない。タンパク質の構造予測およびタンパク質の設計において、骨格依存的回転異性体ライブラリーが広範にわたって使用されているので、これらの問題を修正する改善された回転異性体ライブラリーは広範な影響力を有することになる。
【００１５】
本発明の回転異性体ライブラリーは、より厳密に選別されたデータセットから導かれ、全体的に異なる新規の統計学的な方法を使用する。実際に、本発明の回転異性体ライブラリーは、以下の特性の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または全部を含む。
【００１６】
第１に、新しい回転異性体ライブラリーは、現在入手可能である、過去の時点におけるライブラリーよりもはるかに大きなデータセットを活用し、電子密度の算出を使用して、不確実なコンフォメーションまたは座標を有する高度に動的な側鎖（またはタンパク質セグメント）を除く。実験的な構造因子が入手可能な任意の構造セットにおける側鎖について、原子の座標位置における電子密度を測定するためのソフトウェア(Shapovalov and Dunbrack (2007) Proteins, 66:279-303)。例えば、Uppsala Electron Density Server（EDS）(Kleywegt、et al. (2004) Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr., 60:2240-2249)から入手可能な電子密度マップを使用することができる。さらに、ＰＩＳＣＥＳサーバー(Wang and Dunbrack (2003) Bioinformatics, 19:1589-1591)により、固定されたカットオフよりも良好な分解能およびＲ値を有し、相互の配列同一性が設定値より低い構造セットを選択することに関する問題が処理される。ＰＩＳＣＥＳの１つの利点は、ＰＤＢエントリーまたは鎖の入力一覧を取得し、入力された単一の基準および対基準を使用してこれらのサブセットを選択することができることである。したがって、入手可能な構造因子データを有するＸ線の結晶エントリーの一覧（Ｘ線エントリーの約半分）を使用することができ、ＰＩＳＣＥＳを使用してこれらの適切なサブセットを決定することができる。例えば、１．７Åおよび５０％の配列同一性のカットオフにおいて、構造因子が入手可能である２，１２３種の鎖の一覧を生成することが可能である。構造因子の利用可能性を考慮しなければ、一覧の有するサイズは２，１９６種になる。比較のために、つい最近の回転異性体ライブラリー（２００２）では、１．７Åよりも良好な分解能および最大50％の相互の配列同一性を有する８５０種の鎖が使用された。
【００１７】
第２に、骨格の二面角であるφおよびψに応じた回転異性体の頻度が、フォンミーゼスカーネル関数(Hall et al. (1987) Biometrika, 74:751-762)を使用する適応的カーネル密度推定(Abramson (1982) Annals Stat., 10:1217-1223)を使用して算出されている。回転異性体ライブラリーの確率を、ベイズの法則を使用して各回転異性体種ｒのラマチャンドラン密度から導くことができる：
【００１８】
【数１】
2012524124.tif 000003
２次元では、回転異性体ｒについてのφ、ψの適応的カーネル密度推定値は：
【００１９】
【数２】
2012524124.tif 000004
ここで、λｉは、φ、ψに依存するが、回転異性体には依存しない：
【００２０】
【数３】
2012524124.tif 000005
Ｎはこの残基種についての残基の総数であり、Ｎｒは回転異性体ｒについての数値であり、κはカーネルの幅の全ての幾何平均である。試験的な推定値ｆは、同じカーネルの幅κを使用した非適応的カーネルの推定値に由来する：
【００２１】
【数４】
2012524124.tif 000006
カーネルの幅の幾何平均κは、回転異性体の確率の平滑化の程度を調節する。これは、ペナルティー付加最大尤度交差確認によって、κに対するガンマ事前確率により、得られる回転異性体の確率の平滑度が所望のレベルで提供される範囲にκが保持されるように選択することができる。関数ｐ（φ，ψ｜ｒ）およびｐ（ｒ｜φ、ψ）が、それぞれ図１および２に示されている。
【００２２】
第３に、ベイズの事前を使用して、長い側鎖を有するまれな回転異性体についての確率分布を改善することができる。これは、φおよびψに依存するχ１回転異性体ｒ１についてのカーネル密度推定と、骨格から離れた自由度（χ２、χ３、χ４）の条件付確率の骨格に依存しない推定値とを組み合わせることによって実現することができる：
【００２３】
【数５】
2012524124.tif 000007
【００２４】
第４に、当該回転異性体ライブラリーの重要な特徴は、各回転異性体についての二面角の平均および分散が平滑にφ、ψに依存することである。局所的な骨格との、立体的相互作用および静電気的相互作用の両方に起因して、これらの平均の角度は、各回転異性体について、φおよびψの強力かつ系統的な変動性を有する。この目的のために、本回転異性体ライブラリーでは、ノンパラメトリックなカーネル回帰推定を使用して、骨格の二面角の平滑な変動に応じてχ角度のそれぞれの平均を決定することができる。回転異性体ｒの任意の側鎖データポイントｉおよび二面の角度χ：
【００２５】
【数６】
2012524124.tif 000008
ここで、ｍは求められている回帰関数であり、εはランダム誤差である：
【００２６】
【数７】
2012524124.tif 000009
ｍおよびｖに対する推定値は、ゼロ次カーネル回帰またはナダラヤ−ワトソン（Nadaraya-Watson）カーネル回帰から導かれる(Nadaraya (1964) Theory Prob. Appl., 9:141-142)：
【００２７】
【数８】
2012524124.tif 000010
【００２８】
【数９】
2012524124.tif 000011
カーネル回帰のために、各データポイントではなくクエリポイントにおける密度に適応したカーネルが使用される：
【００２９】
【数１０】
2012524124.tif 000012
全てのφ、ψにわたる試験的な密度の最大値に基づいて、カーネルをクエリポイントの密度に適応させるスキームを使用することができる。
【００３０】
第５に、初期のライブラリーでは、全ての二面角の自由度を「回転異性体」として扱った。すなわち、二面角空間全体を２成分に分け、コンフォメーションを計数した。アスパラギンについて、例えば、ＤｕｎｂｒａｃｋおよびＣｏｈｅｎは、ＯＤ１原子およびＮＤ２原子を識別不能とみなすことによってχ２を３つの２成分、（−９０，−３０）、（−３０，＋３０）、（＋３０，＋９０）に分けた(Protein Sci. (1997) 6:1661-1681)。Ｄｕｎｂｒａｃｋは、水素結合のパターンの可能性を考慮するだけでなく、Ｗｏｒｄらの縮小プログラム(Word et al. (1999) J. Mol. Biol., 285:1735-1747)を使用してＡｓｎのＯＤ１およびＮＤ２を位置付けた(Curr. Opin. Struct. Biol. (2002) 12:431-440)。次に、χ２を、χ１回転異性体に依存する異なるオフセットを伴って、（−１８０，１８０）の範囲で６つの２成分に分けた。これらの２成分のそれぞれにおいて、平均二面角および標準偏差を算出した。これは密度に関して不十分なモデルであり、χ１回転異性体に依存して、いくらかの歪度を伴い単一のモードで広範に分布する。同じことが、Ａｓｐのχ２、Ｇｌｎのχ３、およびＧｌｕのχ３にも当てはまる。これは、ＰｈｅおよびＴｙｒのχ２にも、おそらくＰｈｅおよびＴｙｒについてはｒ１＝ｇ−の場合、第２のχ２回転異性体の少数の集団（平均角度約０°）を除いて、当てはまる。ＨｉｓおよびＴｒｐは、それらのχ２、密度において、それぞれ２つおよび３つの広範な非対称のピークを有し、同様に、他の非回転異性体の自由度と同じ方法を使用してモデリングすることができる。
【００３１】
非回転異性体の自由度について、１０°×１０°格子におけるφ、ψのそれぞれについて、側鎖の二面角の全範囲にわたって密度推定することが望ましい。これは、φおよびψに対するχ２密度またはχ３密度に対する有効な回帰である。したがって、クエリ適応的カーネル密度推定およびデータ適応的カーネル密度推定の新規の組み合わせを使用して、所望の確率分布は：
【００３２】
【数１１】
2012524124.tif 000013
ここで、
【００３３】
【数１２】
2012524124.tif 000014
および
【００３４】
【数１３】
2012524124.tif 000015
【００３５】
【数１４】
2012524124.tif 000016
【００３６】
第６に、そして最後に、回転異性体ライブラリーについて平均の二面角を導くために、ＰＤＢに蓄積された座標から測定される角度を使用する。しかし、これらの回転異性体ライブラリーを構造予測に使用する場合、ＳＣＷＲＬまたはＲｏｓｅｔｔａと同様、「標準の」結合長および結合角を使用する。これらは、ほとんどの場合、ペプチドの結晶構造から導かれたＥｎｇｈおよびＨｕｂｅｒの値に由来する(Engh and Huber (1991) Acta. Cryst., A47:392-400)。非常に高分解能のタンパク質のセット（分解能≦１．１Å、５０％の同一性で１７７種の鎖）を使用してこれらの結合長および結合角の平均を再算出することができる。第２に、固定された結合長および結合角度を使用してＰＤＢエントリーに側鎖の座標を当てはめることによって二面角を再算出することができる。これは、二面角に応じたＲＭＳＤのまっすぐな最急降下最小化である。このように導かれた二面角は、座標から直接測定された分布と異なる分布を有する可能性がある。予測プログラムにおいて使用される固定された結合長および結合角度との組み合わせにおいて、これらの分布により、より一致した、かつ正確な構造予測がもたらされる。
【００３７】
修飾アミノ酸を含む回転異性体ライブラリー
ＰＤＢにおける十分なデータを用いて修飾するために、標準のアミノ酸の回転異性体ライブラリーが開発され、利用されている手段と同様の予測方法において使用することができる回転異性体ライブラリーを開発することができる。そのような修飾体としては、それだけに限らないが、リン酸化されたセリン、スレオニン、およびチロシン、ならびにそれぞれＮ結合型およびＯ結合型のグリコシル化されたアスパラギンおよびセリンが挙げられる。大部分の修飾は、γ重原子よりもさらに骨格から離れている側鎖の位置においてアミノ酸を変化させる。これは、側鎖の修飾された部分の回転異性体の集団に対して強力な骨格依存的な効果がないであろうことを意味する。したがって、ｐ（ｒ２，ｒ３，・・・｜ｒ１）として定義される、条件付の、骨格に依存しない回転異性体ライブラリーを導くことができる。ＳＣＷＲＬまたは他のプログラムにおいて予測するために、これらの条件付確率を、より長い側鎖について上記したｒ１についての骨格に依存する確率と組み合わせることができる。
【００３８】
【数１５】
2012524124.tif 000017
【００３９】
標準のアミノ酸と同様、いくつかの角度が、標準のアミノ酸のχ１二面と同様に、それらの分散と比較して、１つのモードにおいて狭く分布し得る、または、複数のモードでよく分離され得る。これらを、回転異性体のアミノ酸の側鎖に対する上記の方法を用いてモデリングすることができる。より複雑な密度を有する二面角を、非回転異性体のアミノ酸の側鎖に対する上記の方法を用いてモデリングすることができる。
【００４０】
他の標的は、タンパク質に共有結合しないものであっても、多くのタンパク質の構造において存在する有機分子（例えば、ＡＴＰおよびＳ−アデノシルメチオニン）を含み得る。
【００４１】
ＳＣＷＲＬ４：タンパク質の側鎖を予測するためのプログラム
本発明は、タンパク質の側鎖のコンフォメーションを予測するために使用することができる。側鎖のコンフォメーションを決定することは、タンパク質の構造予測およびタンパク質の設計において重要な工程である。多くのそのような方法が存在しているが、少数のみが広範にわたって使用されている。ＳＣＷＲＬはそのような方法の１つであり、ＳＣＷＲＬ３プログラム(Canutescu and Dunbrack (2003) Protein Sci., 12:963-972)が、そのスピード、正確度、および使いやすさによって、ホモロジーモデリングの目的のための人気を保っている。しかし、匹敵するスピードにおける、それよりも高度な正確度が望ましい。これは、ＳＣＷＲＬ４において、１）本発明によって定義されるカーネル密度推定に基づく新しい骨格依存的回転異性体ライブラリー；２）回転異性体ライブラリーにおける位置について、コンフォメーションのサンプルにわたって平均すること；３）高速な異方性水素結合関数；４）短距離の、穏やかなファンデルワールス原子−原子相互作用ポテンシャル；５）ｋ−離散方向ポリトープを使用して衝突を高速検出すること；６）組み合わせ問題を解くための木分解アルゴリズム；および７）結晶空間群の対称演算子を使用して、結晶環境内の相互作用グラフを決定することによって全てのパラメータを最適化すること、を通じて実現された(例えば、実施例２; Krivov et al. （Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics (2009) 77:778-795）; and dunbrack.fccc.edu/scwrlを参照されたい)。本発明の、タンパク質の側鎖を予測するためのプログラムは、上に列挙した特性の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、または全部を含み得る。側鎖の電子密度に応じた正確度により、電子密度がより高い側鎖は、電子密度が低く、コンフォメーションの無秩序性が推定される側鎖よりも予測しやすいことが実証される。タンパク質３７９種の試験セットについて、χ１角度の８６％およびχ１＋２の７５％が、Ｘ線による位置の４０°以内に正確に予測される。最低密度の側鎖（＜２５パーセンタイル）を除外すると、これらの数値は８９％および７９％に上昇する。新しいプログラムは、ホモロジーモデリングのために設計されたその単純なコマンドラインインターフェイスを維持することができ、他のソフトウェアプログラムに組み込むための動的に連結されたライブラリーとして入手可能である。
【００４２】
ＳＣＷＲＬ４は、タンパク質の構造を正確に予測するために使用されている。例えば、Friedrichらは、２重のＣ２ドメイン（ＤＯＣ２）をモデリングするためにＳＣＷＲＬ４を使用した(Mol. Neurobiol. (2010) 41:42-51)。Ｍａｘらは、βシートにおけるアミノ酸の側鎖をモデリングするためにＳＣＷＲＬ４を使用した(Proteins: Structure, Function, Bioinformatics (2009) 78:559-574)。
【００４３】
ＭｏｌＩＤＥ２：タンパク質およびタンパク質複合体をモデリングするための統合されたデータベースおよびアプリケーション
他のモデリングプログラムを使用することができるが、本発明の一態様によると、多数の鋳型に基づいて単一のタンパク質をモデリングするための、および複合体をモデリングするためのいくつかのアルゴリズムを組み込んだグラフィックプラットフォームが提供される（ＭｏｌＩＤＥ２と称される）。タンパク質の大部分は、ホモ二量体、ヘテロ二量体またはそれより大きなオリゴマー構造として生物学的に作用する。タンパク質の構造予測によって、機構、変異の表現型、および他の生物現象を理解するために、タンパク質の正確なオリゴマーの状態をモデリングできることが重要である。ＭｏｌＩＤＥ２は、機能的に関連性のある状態におけるタンパク質のホモロジーモデリングを提供するために開発された。このモデリングは、ＰＤＢにおいて所望のオリゴマーの状態または他のタンパク質−タンパク質相互作用もしくはタンパク質−リガンド相互作用を有する鋳型を見つけることに基づく。ＭｏｌＩＤＥ２では、１つまたは複数の入力配列を取得し、まず、（１つまたは複数の）クエリ配列に存在するドメインファミリーを同定する。次に、ドメイン内容が同じである全てのＰＤＢ鋳型を、事前にコンパイルされたリレーショナルデータベースから見つける。ＭｏｌＩＤＥ２を用いて開発され、配布されるこのデータベースにより、ＰＩＳＡデータベースサーバー(Krissinel and Henrick (2007) J. Mol. Biol., 372:774-797)によるＸ線結晶構造から導かれる推定上の生物学的なアセンブリーを含めた、包括的な配列情報、構造情報、機能情報、および他の生物学的情報が提供される。次に、使用者は、所望の生物学的に関連性のある構造（例えば、ホモ二量体またはヘテロ四量体）を有する鋳型を選択することができる。選択された鋳型を用いて、ＭｏｌＩＤＥ２により骨格の生成、側鎖の置き換え、およびループモデリングなどのホモロジーモデリングにおける標準の工程が行われる。最終的な出力は、モデリングされたタンパク質複合体の座標情報を含有するＰＤＢ形式のファイルである。
【００４４】
ＭｏｌＩＤＥ２は、以下の一部、または好ましくは全部を含み得る：１）ＰＤＢ内の相同的な鋳型を探索するためのＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ＿ＢＬＡＳＴ、ＨＭＭ−ＨＭＭおよびプロファイル−プロファイルアラインメント法；２）１つまたは複数の相同的なＰＤＢタンパク質を見つけたら、ＰＦＡＭ(Bateman et al. (2004) Nucleic Acids Res., 32 Databasee issue:D138-141)およびＳＣＯＰ(Murzin et al. (1995) J. Mol. Biol., 247:536-540)を使用して（１つまたは複数の）標的と相同なＰＤＢ内のタンパク質の全てまたはほぼ全てを同定すること；３）全ての相同な鋳型または手動で選択されたサブセットの多数の構造アラインメント；４）Ｕｎｉｐｒｏｔ／ＰＦＡＭから容易にアラインメントされた配列の追加を用い、多数の構造アラインメントに基づいて隠れマルコフモデルを構築すること；５）隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）法を使用した、多数の構造アラインメントに対するクエリ（またはクエリプロファイル）の配列アラインメント；６）生物学的対象になり得る任意の相同的な鋳型におけるリガンドを同定し、選択された（１つまたは複数の）リガンドを、鋳型の多数の構造アラインメント内に位置決めすること；７）全てが１つまたは複数の鋳型由来のコア構造、ループ、およびリガンドを含めた多数の構造アラインメントから成分を手動選択および自動選択することによってモデルのセットを構築すること；８）ＳＣＷＲＬ４を用いて標準のアミノ酸およびその修飾体の両方をモデリングすること；９）Ｒｏｓｅｔｔａまたは他のプログラムを使用して、精密化し、モデルを完成させること（例えば、鋳型が存在しないセグメントを構築すること）；１０）（１つまたは複数の）クエリ配列と相同な１つまたは複数のドメインを含有する全ての鋳型の入手可能な生物学的ユニットを図表化すること；１１）これらの生物学的ユニットに基づいてホモオリゴマーモデルを構築すること；および１２）これらの生物学的ユニットに基づいてヘテロオリゴマーモデルを構築すること。
【００４５】
合理的に設計され、遺伝子工学で作り出された分子標的化作用剤
抗体により、癌および他の疾患の治療における顕著な有効性および市場価値が実証されている。最大の臨床的影響を与える可能性を有する抗体は、多くの場合、シグナル伝達事象を開始すること（例えば、抗ＴＲＡＩＬ抗体を介してアポトーシスを開始すること）によって、またはリガンドの結合を遮断すること、およびシグナル伝達を阻害すること（例えば、ＥＧＦのＥＧＦＲへの結合を阻害すること）によってのいずれかで生物学的効果を直接媒介する抗体である。しかし、種間で高い程度の保存を示し得るリガンド結合部位と同様、多くの場合、現行の技術を使用して、これらの部位に結合し、所望の生物学的効果を開始する機能的な抗体を生成することは難しい。この課題を克服するために、本発明のタンパク質の構造予測方法を使用して、癌および他の疾患において決定的な役割を果たすリガンドと受容体との間の相互作用または抗原と抗体との間の相互作用をモデリングすることができる。計算的なタンパク質の設計を使用して、現存する抗体フレームワークに特異性および／または親和性の増強を示す修飾された機能的なドメインを含むリガンドを遺伝子工学で作り出すことができる。シグナル伝達が改善されたリガンドは、治療的に望ましいシグナル伝達事象を調節する臨床的な有用性を有する。
【００４６】
本発明の別の態様に従って、少なくとも１つのポリペプチドの最適化された構造を生成するための方法が提供される。使用者は、ポリペプチドを、任意の所望の特性に関して最適化することができる（例えば、モジュレートされた酵素活性、モジュレートされた結合親和性など）。一般には、少なくとも１つの他の化合物（例えば、リガンド、補因子、またはポリペプチド）について相互作用を調節する（例えば、親和性／結合活性を増加または減少させる）ためにポリペプチドを修飾する。特定の実施形態では、方法は、（ａ）少なくとも１つのポリペプチドの骨格構造を提供する工程；（ｂ）本発明の回転異性体ライブラリーを利用して、ポリペプチド内の少なくとも１つの可変性の残基位置に対する潜在的な回転異性体の一群を確立する工程；および（ｃ）工程ｂ）で得られた回転異性体のそれぞれとポリペプチド構造の残りの少なくとも一部または全部との相互作用を分析し、それによって少なくとも１つのポリペプチドの少なくとも１つのアミノ酸の側鎖の最適化された構造を生成する工程を含む。特定の実施形態では、方法は、工程（ａ）において、ポリペプチドまたは非タンパク質性（例えば、金属イオン、有機補因子、鉄−硫黄複合体など）であってよいリガンドおよび／または補因子の座標を含み、得られたポリペプチドの最適化された構造はリガンド/補因子の存在下にある。さらに別の実施形態では、少なくとも１つの可変性の残基位置は、少なくとも２つの異なるアミノ酸の側鎖による回転異性体を有する。この方法を使用して、少なくとも１つのリガンド、補因子、および／または第２のポリペプチドを結合させる（特に結合を増加させる）ためのポリペプチドの最適なアミノ酸配列を決定することができる。ある特定の実施形態では、第２のポリペプチドは、第１のポリペプチドと同じであってよい（変異型または野生型）。これにより、例えば、二量体（例えば、ホモ二量体）および他の多量体の相互作用を調節することが可能になる。この方法はコンピュータの支援で実施することができ、結果は、使用者に対して任意の所望の様式（例えば、プリントアウトまたは表示）で出力されるおよび／またはメモリに記憶される。さらに別の実施形態では、骨格構造は、実験的に決定することができる。
【００４７】
さらに別の実施形態では、最適化されたポリペプチドを、所望の特性について実験的に試験することができる。例えば、最適化されたポリペプチドを、リガンド、補因子、または第２のポリペプチドのモジュレートされた結合について、野生型または変異前のポリペプチドと比較して試験することができる。結合アッセイは、当技術分野で周知である。一実施形態では、ポリペプチドまたは結合パートナーは固定化されている。結合アッセイの例としては、これらに限定することなく、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、ＥＬＩＳＡ、免疫ブロット、免疫組織化学的検査、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー）、サイズ排除クロマトグラフィー、および質量分析が挙げられる。
【００４８】
ポリペプチドを合成する方法は、当技術分野で周知である。例えば、ポリペプチドは、合成的にまたは組換えによって作製することができる。ポリペプチドは、当技術分野で公知のインビトロ（in vitro）発現方法および無細胞発現系を使用して作製することができる。インビトロ転写翻訳系は、例えば、Promega Biotech（Madison、WI）またはＧｉｂｃｏ−ＢＲＬ（Gaithersburg、MD）から市販されている。ポリペプチドは、任意の適切な原核生物の系または真核生物の系において発現させることによって作製することができる。例えば、ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子の一部または全部を、Ｅ．コリ（E.coli）などの細菌の細胞における発現に適合させたプラスミドベクターに挿入することができる。そのようなベクターは、宿主細胞においてＤＮＡを発現させることができるように配置された、宿主細胞においてＤＮＡを発現させるために必要な制御エレメントを含む。そのような発現に必要とされる制御エレメントは、プロモーター配列、転写開始配列、および所望により、エンハンサー配列を含む。
【００４９】
特定の実施形態では、ポリペプチドをインビボ（in vivo）で（例えば、動物モデルにおいて核酸を発現させることによって）アッセイする。別の実施形態では、組換え型の原核生物の系または真核生物の系において遺伝子発現させることによって作製されたポリペプチドを当技術分野で公知の方法に従って精製することができる。市販の発現／分泌系を使用することができ、それによって、組換え型のポリペプチドが発現され、その後、宿主細胞から分泌され、周囲の培地から容易に精製される。発現／分泌ベクターを使用しない場合、代替の手法は、組換え型のポリペプチドを、アフィニティー分離によって、例えば、少なくとも１つの精製タグ（例えば、６〜８個のヒスチジン残基のタグ）を用いてタグをつけた組換え型のポリペプチドを単離するための、組換え型のタンパク質に特異的に結合する抗体または他のカラム（例えば、Ｎｉカラム）との免疫学的相互作用によって精製することを含む。上記の方法によって調製された本発明のポリペプチドは、標準の手順に従って分析することができる。例えば、そのようなタンパク質は、公知の方法に従ってアミノ酸配列解析に供することができる。
【００５０】
本明細書において上記したように、第１のポリペプチドにおける改変が、第１のポリペプチドの第２の化合物またはポリペプチドへの結合をモジュレートするかどうかを決定するための方法が提供される。例えば、この方法を使用して、例えば、二量体の相互作用、受容体−リガンド、抗体−抗原、受容体−ホルモン、受容体−リガンド、アゴニスト−アンタゴニスト、レクチン−糖質などを含めた、結合対の相互作用を調節することができる。特定の実施形態では、方法は、（ａ）第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドのアミノ酸残基に関する構造座標のセットを提供すること；（ｂ）第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの間の相互作用をモデリングすること；（ｃ）本発明の回転異性体ライブラリーを利用して第１のポリペプチド内の少なくとも１つの可変性の残基位置に対する潜在的な回転異性体の一群を確立し、それによって、改変した第１のポリペプチドを定義する構造座標のセットを作製すること；（ｄ）改変した第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの相互作用をモデリングすること；および（ｅ）この改変により、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの間と比較して、改変した第１のポリペプチドと前記第２のポリペプチドとの相互作用が調節されるかどうかを決定することを含む。ある特定の実施形態では、相互作用の調節は、ポリペプチドの結合活性または結合親和性における調節（例えば、増加）である。特定の実施形態では、ポリペプチドの一方は抗体であり、他方のタンパク質は抗原またはエピトープ、特に抗体に認識される抗原またはエピトープである。この方法はコンピュータの支援で実施することができ、結果は、使用者に対して任意の所望の様式（例えば、プリントアウトまたは表示）で出力されるおよび／またはメモリに記憶される）。さらに別の実施形態では、構造座標は、実験的に決定することができる。さらに別の実施形態において、および上記の通り、第１のポリペプチドおよび／または野生型と比較して、改変した第１のポリペプチドを第２のポリペプチドのモジュレートされた結合について実験的に試験する。
【００５１】
「抗体」または「抗体分子」は特異的な抗原に結合する抗体およびその断片を含めた任意の免疫グロブリンである。この用語は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単一ドメイン（Ｄａｂ）、ミニボディ（minibody）、二機能性抗体、テトラボディ（tetrabody）、および二重特異性抗体を含む。本明細書で使用される、抗体または抗体分子は、組換えによって生成したインタクトな免疫グロブリン分子、およびこれらに限定することなく：Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ２、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、単一の可変ドメイン（例えば、可変重ドメイン、可変軽ドメイン）などの免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分を意図している。Ｄａｂは、単一の可変軽鎖ドメインまたは可変重鎖ドメインで構成されてよい。本発明のある特定の実施形態では、ポリペプチドについてモデリングされた可変軽鎖ドメインおよび／または可変重鎖ドメインを、上記の抗体構築体の骨格に挿入することができる。組換えによって抗体を作製するための方法は、当技術分野で周知である。例えば、ｓｃＦｖｓからＩｇＧを作製するための定常遺伝子を含む市販のベクターが、Lonza Biologics (Slough、United Kingdom）によって提供される。
【実施例】
【００５２】
本発明の種々の実施形態を例示するために、以下の実施例が提供される。実施例は、例示的なものであり、本発明をいかようにも限定するものではない。
【実施例１】
【００５３】
ＣＢＳ  Ｂａｔｅｍａｎドメインのモデリング
ＭｏｌＩＤＥ２の機能性の一部を実証するための実際のモデリングの例として、ヒトのシスタチオニンβ−シンターゼ（ＣＢＳ）のＣ末端ドメインを標的配列として使用した。ＣＢＳは、セリンとメチオニンの代謝産物であるホモシステインとの共有結合を触媒してシスタチオニンを生成させる。シスタチオニンはその後システインに転換される。高レベルのホモシステインは心疾患に強く関連付けられ(Refsum et al. (1998) Annu. Rev. Med., 49:31-62)、ホモシスチン尿症の患者はＣＢＳをコードする遺伝子において変異を有することが見出されている(Kraus et al. (1999) Hum. Mutat., 13:362-375)。そのような患者の大部分は、ＣＢＳに共有結合するビタミンＢ６（ＰＬＰ）に反応する。ＣＢＳの酵素ドメインは、トリプトファンシンターゼのβ鎖に基づいて以前モデリングされ、結合したＰＬＰの近くでＢ６−無反応性の変異の位置が同定された。
【００５４】
ヒトＣＢＳの酵素ドメインは、ヘムに結合する７５アミノ酸のプロリンリッチ領域が先行し、１５５アミノ酸領域のＣ末端ドメインが続く。このドメインは、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ、塩素イオンチャネル、および５’−ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼを含めた多くのタンパク質において見られる約６０アミノ酸のモチーフの２つのコピーを含有する。このモチーフは、ＣＢＳにおける存在に関しては「ＣＢＳドメイン」と称される。ＣＢＳドメインは常に縦列の対として現れ、現在は多くの場合「Ｂａｔｅｍａｎドメイン」(Bateman, A. (1997) Trends Biochem. Sci., 22:12-13)と統一的に称される。実際に、ＣＢＳ自体は単一のＣＢＳドメインを有すると長く考えられてきたが、ＣＢＳにおいて第２のＣＢＳドメインが存在することを示す配列モチーフが同定された(Shan et al. (2001) Hum. Mol. Genet., 10:635-643)。多くのタンパク質では、Ｂａｔｅｍａｎドメインの機能はアデノシンヌクレオチド、ＡＭＰおよびＡＴＰに結合し、それによって、関連するタンパク質の活性を調節することと思われる。ＣＢＳは、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）の結合によって活性化される。Ｂａｔｅｍａｎドメイン領域を排除することにより、構成的に活性な、ＳＡＭに対して無反応性の酵素が作製される(Shan and Kruger (1998) Nat. Genet., 19:91-93)。
【００５５】
ＣＢＳのＢａｔｅｍａｎドメインのモデルを用いて調べるとができる多くの疑問がある。第１に、ＳＡＭがどのようにＣＢＳ−ＢＤに結合するのか、およびこのことがＣＢＳの活性化にどのようにつながるのかを決定することができる。第２に、酵素ドメインにおけるいくつかの変異が、全長のタンパク質におけるＣＢＳの機能には影響を及ぼすが、Ｃ末端領域が欠けている切断されたタンパク質におけるＣＢＳの機能には影響を及ぼさない理由を決定することができる。第３に、ホモシスチン尿症に関連するＣＢＳ−ＢＤにおけるいくつかの変異が、ＳＡＭの活性化およびＣＢＳの機能にどのように影響を与えるかを決定することができる。第４に、Ｂａｔｅｍａｎドメイン領域が、ＣＢＳのホモ二量体からのホモ四量体の形成をどのように安定化させるかを決定することができる。ＣＢＳ−ＢＤのモデルは図３に示されており、図４は、ＭｏｌＩＤＥ２のスクリーンショットを提供する。モデルは、結合したＳ−アデノシルメチオニンを含有するＰＤＢエントリーである１ＰＶＭおよび２ＹＺＱから構築した。モデルは、タンパク質の側鎖のコンフォメーションをサンプリングし、スコア化するために本発明を使用するＭｏｌＩＤＥ２およびＳＣＷＲＬ４を用いて構築した。
【実施例２】
【００５６】
ＳＣＷＲＬ４
諸言
側鎖のコンフォメーションの予測の問題は、タンパク質の構造決定、タンパク質の構造予測、およびタンパク質の設計の不可欠な構成要素である。一部位突然変異体および密接に関連するタンパク質において、骨格は多くの場合ほとんど変化せず、側鎖を正確に予測することによって構造予測を実現することができる(Veenstra et al. (1997) Protein Eng., 10:789-807)。リガンドと他のタンパク質とのドッキングにおいて、側鎖のコンフォメーションの変化を考慮することが、多くの場合、複合体の正確な構造予測のために決定的である(Gray et al. (2003) J. Mol. Biol., 331:281-299; Meiler et al. (2006) Proteins, 65:538-548; Leach, A.R. (1994) J. Mol. Biol., 235:345-356)。骨格のコンフォメーションにおける変化を考慮する方法においてさえも、プロセスにおける一工程は側鎖のコンフォメーションを算出しなおすこと、または「パッキングしなおすこと」である(Rohl et al. (2004) Proteins, 55:656-677)。モデルの精密化において多くの骨格のコンフォメーションをサンプリングすることができるので、側鎖の予測はまた、非常に高速でなければならない。タンパク質の設計では、配列における変化がＭｏｎｔｅ  Ｃａｒｌｏ工程または他のアルゴリズムによって提案されるので、その変化が好都合であるか否かを決定するために、側鎖のコンフォメーションを正確に予測することが必要である(Jones, D.T. (1994) Prot. Eng., 3:567-574; Dahiyat et al. (1996) Prot. Sci., 5:895-903; Kuhlman et al. (2003) Science 302:1364-1368)。
【００５７】
大部分の側鎖予測法は、既知の構造において観察された側鎖のコンフォメーションの統計学的なクラスタリングである回転異性体ライブラリーに依存する試料空間に基づいている(Dunbrack, R.L (2002) Curr. Opin. Struct. Biol., 12:431-440)。そのような回転異性体ライブラリーは、局所的な骨格のコンフォメーションにかかわらず全ての側鎖がひとまとまりになっている、骨格に依存しないものであってよく(Lovell et al. (2000) Proteins 40:389-408)、または、頻度および二面角が骨格の二面角であるφおよびψに伴って変動するような骨格に依存するものであってよい(Dunbrack et al. (1993) J. Mol. Biol., 230:543-574; Dunbrack et al. (1997) Protein Sci., 6:1661-1681)。統計学的な回転異性体ライブラリーを使用することの代替は、既知の構造からの側鎖のサンプルであり、通常デカルト座標の形であり、したがって結合長、結合角、および二面角の変動性を説明している配座異性体ライブラリーを使用することである(De Maeyer et al. (1997) Fold Des., 2:53-66; Shetty et al. (2003) Protein Eng., 16:963-969; Peterson et al. (2004) Protein Sci., 13:735-751; Xiang et al. (2001) J. Mol. Biol., 311:421-430)。回転異性体（および、一部の場合では、回転異性体の周りのサンプル）または配座異性体の形の探索空間が定義されたら、サンプリングされたコンフォメーションの適合性を評価するためにスコア関数が必要になる。これらは、観察された回転異性体ライブラリーの頻度の自然対数(Bower et al. (1997) J. Mol. Biol., 267:1268-1282; Liang et al. (2002) Protein Sci., 11:322-331; Rohl et al. (2004) Methods Enzymol., 383:66-93; Lu et al. (2008) Protein Sci., 17:1576-1585)、異なる側鎖の原子間のファンデルワールス相互作用または剛体球の立体的な相互作用、および時には静電項、水素結合項、および溶媒和項(Lu et al. (2008) Protein Sci., 17:1576-1585; Jackson et al. (1998) J. Mol. Biol., 276:265-285; Mendes et al. (2001) J. Comp. Aided Mol. Design, 15:721-740; Jacobson et al. (2002) J. Mol. Biol., 320:597-608; Camacho, C.J. (2005) Proteins 60:245-251)を含み得る。単一の残基または残基対の周期最適化(Dunbrack et al. (1993) J. Mol. Biol., 230:543-574; Xiang et al. (2001) J. Mol. Biol., 311:421-430)、Monte Carlo(Rohl et al. (2004) Proteins 55:656-677; Liang et al. (2002) Protein Sci., 11:322-331; Holm et al. (1992) J. Mol. Biol., 225:93-105)、デッドエンド除去(Desmet et al. (1992) Nature 356:539-542; Goldstein, R.F. (1994) Biophys. J., 66:1335-1340)、自己無撞着平均場最適化(Koehl et al. (1994) J. Mol. Biol., 239:249-275)、整数計画法(Kingsford et al. (2005) Bioinformatics 21:1028-1036)、およびグラフ分解(Bower et al. (1997) J. Mol. Biol., 267:1268-1282; Canutescu et al. (2003) Protein Sci., 12:2001-2014; Xu, J. (2005) 9th Annual International Conference on Research in Computational Molecular Biology （RECOMB）, pages 423-439)を含めた多くの探索アルゴリズムが適用されている。これらの方法は、どれだけ高速に組み合わせ問題を解くことができるか、および所与のエネルギー関数の大域的な最小値を保証するかどうか、またはその代わりに、そのような保証なしで低エネルギーを探索しているかどうかにおいて異なる。一般に、エネルギー関数の近似の性質を考えると、そのような保証は必要なく、予測方法のより重要な特徴は、全体的な予測の正確度およびスピードである。
【００５８】
近年、回転異性体の位置の周りのいくらかの柔軟性(Peterson et al. (2004) Protein Sci., 13:735-751; Xiang et al. (2001) J. Mol. Biol., 311:421-430; Mendes et al. (1999) Proteins, 37:530-543)およびより複雑なエネルギー関数(Lu et al. (2008) Protein Sci., 17:1576-1585; Jacobson et al. (2002) J. Phys. Chem. B, 106:11673-11680)が、側鎖のパッキングおよび予測を改善するために必要であることが明らかになった。
【００５９】
ＳＣＷＲＬ３は、その種類が２００９年２月１６日現在、７２カ国において２８９１のライセンスを有する、最も広く使用されるプログラムの１つである。ＳＣＷＲＬ３では、骨格依存的回転異性体ライブラリー(Dunbrack et al. (1997) Protein Sci., 6:1661-1681)、ライブラリーの回転異性体の頻度に基づく単純なエネルギー関数および純粋に反発的な立体エネルギー項、ならびに組み合わせパッキング問題を解くためのグラフ分解(Canutescu et al. (2003) Protein Sci., 12:2001-2014)が使用される。ＳＣＷＲＬ３は、それを広く使用されるべくした幾つかの特徴を有する。それらの特徴の１番目はスピードであり、配列−構造アラインメントからタンパク質の構造を予測するいくつかのウェブサーバー上でプログラムを使用することを可能とし、１日当たり何百もの予測を実行することができる(Jaroszewski et al. (2005) Nucleic Acids Res., 33:W284-288)。２番目は、正確度である。発表された当時、ＳＣＷＲＬ３は側鎖を最も正確に予測する方法の１つであった。しかし、より高い正確度を主張するいくつかの他の方法が現れたが(Peterson et al. (2004) Protein Sci., 13:735-751; Liang et al. (2002) Protein Sci., 11:322-331; Lu et al. (2008) Protein Sci., 17:1576-1585; Liu et al. (2003) Proteins 50:49-62)、多くの場合、ＣＰＵ時間がはるかに長い。ＳＣＷＲＬ３の３番目の特徴は使い勝手である。このプログラムでは、入力ＰＤＢ座標、所望により新しい配列、および出力予測座標が、側鎖について予測された座標を伴う入力構造と同じ残基の番号付けおよび鎖の識別子で取得される。この特徴は単純であるが、実際、ほとんどとまでは言わないが多くの側鎖の予測プログラムでは、入力構造の残基が再度番号付けされ、鎖の識別子が取り除かれて、それらをホモロジーモデリングにおいて使用することが難しくなる。ＳＣＷＲＬ３の１つの不利な特徴は、使用されるグラフ分解方法により、迅速に解くことができる組み合わせの最適化が必ずしももたらされるのではないことである。そのような場合には、このプログラムには問題を単純化し、迅速に完了するためのどんな発見的な方法も欠けているので、プログラムは数秒で完了する代わりに数時間進行する可能性がある。
【００６０】
ＳＣＷＲＬ４と称される新世代ＳＣＷＲＬ開発では、いくつかの目標があった。第１に、ＳＣＷＲＬ４の正確度が、ここ何年かに開発されたプログラムと匹敵する、またはそれらに勝るように、ＳＣＷＲＬ３を超えて正確度を増加させることが望ましかった。第２に、ほとんどの同様のプログラムを超えてきたＳＣＷＲＬのスピードの利点を維持することが望ましかった。第３に、ホモロジーモデリングおよび他の目的のためのプログラムの使い勝手を維持することが望ましかった。この一部として、このプログラムにより、たとえグラフが十分に分解性でなくても、常に構造予測プログラムが妥当な時間内に解かれることを確実にすることが望ましかった。これは、近似を用いて実現され、回転異性体の探索空間を考慮すると必ずしもエネルギー関数の全体的な最小値を保証するものではないが、試験した全ての場合において迅速に算出が終了される。
【００６１】
本明細書においては、ＳＣＷＲＬ４プログラムの開発をタンパク質の側鎖のコンフォメーションの予測について記載する。いくつかの異なる手法を使用して上記の目標を実現した。ＳＣＷＲＬエネルギー関数は、骨格の二面角であるφおよびψに応じて平滑に変動する回転異性体の頻度、二面角、および分散をもたらすためにカーネル密度推定および回帰を使用する、新しい、骨格に依存する回転異性体ライブラリーを使用して改善した。ＳＣＷＲＬ４は、ＳＣＷＲＬ３において使用される線形の反発的のみの関数ではなく原子間の短距離の穏やかなファンデルワールス相互作用、ならびにＲｏｓｅｔｔａ(Kortemme et al. (2003) J. Mol. Biol., 326:1239-1259)において使用されるものと同様の異方性の水素結合関数（しかし、評価することについてそれよりも高速な異なる関数形式を使用する）も含む。回転異性体ライブラリーにおいて示される平均値周辺の二面角の変動を説明するために、Ｍｅｎｄｅｓらの手法(Proteins (1999) 37:530-543)を使用し、ライブラリーの値の周辺の角度をサンプリングし、側鎖が異なる回転異性体間の相互作用のエネルギーをこれらのサンプルにわたって平均し、その結果、単一の自由エネルギー様のスコア関数がもたらされた。ＳＣＷＲＬ３において使用されるのと同様、相互作用グラフを決定するために、衝突（すなわち、ある程度の距離未満の原子−原子相互作用）を検出するための方法を、ｋ−離散方向ポリトープ（「ｋＤＯＰ」）を使用して実行した。ｋＤＯＰは、共通の固定軸に対して垂直の面を有する３次元の形状であり、それによって原子の２つのグループの周辺のｋＤＯＰを重複について迅速に試験することができる(Klosowski et al. (1998) IEEE Trans Visualization Comp Graphics, 4:21-36)。
【００６２】
ＳＣＷＲＬ３では、残基の相互作用グラフを、関節点と称される単一の残基の部分で重なる２連結成分に分けるグラフ分解方法を使用した。ほとんどの場合、これによりグラフが迅速に解かれる。しかし、回転異性体的な二面角に関して範囲がより長いエネルギー関数およびサンプリングを用いると、これはもはや当てはまらない。したがって、グラフの木分解のバージョンを実行した(Xu. J. (2005) 9th Annual International Conference on Research in Computational Molecular Biology （RECOMB）, pages 423-439)。これはほぼ常時、成功するが、少数の場合、なお容易に解決できる組み合わせ問題がもたらされない可能性がある。したがって、いくらかの閾値内の、自己エネルギーに対する対エネルギーのヒューリスティック投影を加えた。この完全な予測問題の近似により、たとえ大域的最小値が見出されることが保証されなくても、常に解がもたらされる。最後に、その関数をループモデリングおよびタンパク質の設計などの他のプログラムによって容易に呼び出すことができるように、新しいプログラムをライブラリーとして開発した。
【００６３】
方法
図５には、側鎖の予測問題を解くためのＳＣＷＲＬ４における基本的な工程のフローチャートが示されている。これらを以下でさらに考察する。主要な工程は、１）データを入力し、側鎖の座標を構築すること；２）エネルギーを算出すること；３）グラフ計算（もしあれば対称演算子を用いる）；４）グラフを辺分解（edge decomposition）、デッドエンド除去および木分解によって解くこと；５）結果を出力することである。ＳＣＷＲＬ４を、いくつかの必要なフラッグおよび随意のフラッグを用いてコマンドラインにおいて実行する。いくつかの他の選択肢およびパラメータを、標準の名称＝値形式を使用する拡張子．ｉｎｉを伴う必要な初期化ファイルにおいて指定する（例えば、en.wikipedia.org/wiki/ INI_fileを参照されたい）。
【００６４】
入力および座標の構築。
個々の残基の位置を、ＰＤＢ形式の入力ファイルにおいて骨格の４つの原子（Ｎ、Ｃα、Ｃ、Ｏ）を指定することによって定義する。これらの個々の残基部位は、各残基について骨格の二面角であるφおよびψが算出される１つまたは複数のポリペプチド鎖を含んでよい。回転異性体ライブラリーにおいて残基を検索する目的のために、Ｎ末端残基のφを−６０°に設定する。同様に、Ｃ末端残基について、ψを６０°に設定する。これらの値は、欠けている二面角に回転異性体の確率が弱く依存する値である(Dunbrack et al. (1994) Nature Struct. Biol., 1:334-34)。Ｃｉ−１−Ｎｉ原子距離を確認して、鎖内に欠けている内部残基があるかどうかを決定する。
【００６５】
各残基について、本発明の骨格依存的回転異性体ライブラリーから回転異性体を読み出す。この回転異性体ライブラリーは、はるかに大きなデータセットに基づき、カーネル密度推定およびカーネル回帰を使用することで導かれる。回転異性体ライブラリーは、回転異性体の頻度ならびに離散的な（φ，ψ）格子にわたる平均二面角およびそれらの標準偏差を含む。このライブラリーは、非回転異性体の自由度、特に、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、ＴｒｐおよびＴｙｒについてのχ２、ならびにＧｌｕおよびＧｌｎについてのχ３に関して、はるかに多数の詳細を含む。所望により、ＳＣＷＲＬ４では、ライブラリー内の４つの隣接する格子点から双一次内挿することによって頻度および二面角のパラメータを決定することができる。ＳｅｒおよびＴｈｒのχ１回転異性体のそれぞれについて、ＳＣＷＲＬ４により、ヒドロキシル基の水素について二面χ２が−６０°、＋６０°および１８０°に設定され、分散が１０°に設定された３つの回転異性体が生成する。Ｔｙｒのχ１回転異性体、χ２回転異性体のそれぞれについて、ヒドロキシル基の水素について、二面χ３が中性子回析研究において観察された値である０°および１８０°に設定された２つの回転異性体が生成する(Kossiakoff et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci., 87:4468-4472)。Ｈｉｓについて、単独でプロトン化された状態（ＮＤ１またはＮＥ２におけるプロトン）に対して余分の回転異性体が創出された。荷電したＨｉｓは比較的まれなので、ＳＣＷＲＬ４では荷電したＨｉｓは考慮しない。
【００６６】
Flexible Rotamar Model（ＦＲＭ、以下を参照されたい）に使用される全ての回転異性体について、およびこれらの回転異性体に関する亜回転異性体（subrotamer）について、一般には二面角±１標準偏差（またはその固定された比率）を用いて側鎖の座標を構築する。亜回転異性体については、複数の偏差を許容することにより、正確度は改善されないが、算出が遅くなることが分かったので、ある時点におけるただ１つの二面は、ライブラリー値とは異なる。側鎖を、２つ以上のコンフォメーションに共通の原子（例えば、異なるχ２配座異性体に対する同じＣＧ位置）が算出され、一度のみ記憶されるように、木様構造で表す(Leaver-Fay et al. (2005) Algorithms in Bioinformatics、Volume 3692、Lecture Notes in Computer Science. Berlin: Springer, pages 389-400)。デカルト変換方法に対して高速増分ねじりを使用して座標を構築する(Parsons et al. (2005) J. Comput. Chem., 26:1063-1068)。
【００６７】
ＳＣＷＲＬ４では多数の回転異性体および部分回転異性体が使用されるので、ｋ次元の離散方向ポリトープまたはｋＤＯＰに基づく高速な衝突の検出アルゴリズムを実行した(Klosowski et al. (1998) IEEE Trans Visualization Comp Graphics, 4:21-36)。ｋＤＯＰアルゴリズムは、２つの重要な概念に基づく。第１の概念は、幾何的対象のそれぞれを独特の凸状の多面体で囲み、これらを、衝突を確認するための境界ボックスとして使用することである。特定のクラスのｋＤＯＰは、ｋ対の非共線単位ベクトルのセットによって定義され、２ｋのファセットを有する凸状の多面体の全てからなり、したがっていずれのファセットもこれらのベクトルのうちの１つに対して垂直になる。例が図６に示されている。例えば、ｋ＝３の場合、これらは、ｘ軸、ｙ軸およびｚ軸であってよく、したがって全ての境界ボックスが、面がデカルト軸に対して垂直である直角平行六面体になる。第２の重要な概念は、幾何的対象の特定の群に関連する全ての境界ボックスを、階層として組織化することである。次に、これらの階層を、全ての可能性のある個々の境界ボックス間の衝突を効率的に探索するために使用することができる。境界ボックスを定義するためにベクトルの単一のセットを使用することの利点は、図６に例示されているように、同じｋＤＯＰクラスの２つの境界ボックスを衝突について効率的に確認することができることである。これは、対応する基本的な軸を横切るそれらの射影を表す実際の間隔の重複を試験することによって行う。｛ａｉ｝ki＝ｌおよび｛ｂｉ｝ｋｉ＝ｌを、それぞれ、２つのｋＤＯＰ、「Ａ」および「Ｂ」についてのこれらの間隔のセットとする。ｉ∈｛１．．ｋ｝、したがってｍｉｎ（ａｉ）＞ｍａｘ（ｂｉ）が存在する場合、またはｊ∈｛１．．ｋ｝、したがってｍｉｎ（ｂｊ）＞ｍａｘ（ａｊ）が存在する場合、「Ａ」は「Ｂ」と衝突しない。これらの条件のどちらにも適合しない場合は、これらの２つのボックスの内部に囲まれた根底にある対象が衝突する可能性があるが、必ずしもそうなる必要はない。最後は、境界ボックスで囲まれた対象の対距離を算出することによって確認することである。
【００６８】
幾何的対象の周囲のｋＤＯＰの構築は、対象の、基本的な軸に対する射影を見つけることからなる。次節に記載のファンデルワールス関数および水素結合ポテンシャルの両方は、そこを超えるとポテンシャルがゼロである、ある特定の境界の距離を有する。これらの距離を使用して、各原子をある特定の半径を有する球として表す。全側鎖の周囲に境界ボックスを構築するために、各原子をｋＤＯＰで囲み、次に基本のシェルをマージする。側鎖の回転異性体および亜回転異性体を単一のｋＤＯＰで囲むことができ、それによって全ての残基−残基相互作用を非常に迅速に確認することができる。ＳＣＷＲＬ４では、個々の原子、各残基の骨格の原子、各側鎖の一部、個々の回転異性体（すなわちその亜回転異性体の全セット）およびあらゆる残基（全ての回転異性体）の周囲の４つの基本的な軸およびコンストラクト境界ボックスが使用される。基本的な軸により四面体の形状が形成される：
【００６９】
【数１６】
2012524124.tif 000018
【００７０】
修飾されたフレキシブル回転異性体モデルによる自己エネルギーおよび対エネルギーの算出。
ＳＣＷＲＬ４では、ＳＣＷＲＬ３と同様の剛性の回転異性体モデル（ＲＲＭ）、およびフレキシブル回転異性体モデル（ＦＲＭ）の両方が使用される(Mendes et al. (1999) Proteins, 37:530-543)。剛性の回転異性体モデルでは、系の全エネルギーは以下の通り表される：
【００７１】
【数１７】
2012524124.tif 000019
ここで、ベクトルｒは系におけるＮ残基のそれぞれについての単一の回転異性体を列挙する。この場合、各回転異性体の自己エネルギーは：
【００７２】
【数１８】
2012524124.tif 000020
ここで、第１の項は、残基ｉの骨格二面角であるφおよびψを考慮して、最もポピュレートされた回転異性体、ｒｍａｘに対する回転異性体のエネルギーを表し、骨組みの項は、側鎖と骨格および任意のリガンドまたは存在する他の固定された原子との相互作用を表す。対数項の前の一定の値は、残基に依存させておく。
【００７３】
ＳＣＷＲＬ３とは対照的に、ＳＣＷＲＬ４では、骨組みおよび対の回転異性体エネルギーは、反発的なファンデルワールス項および誘引性のファンデルワールス項ならびに水素結合項からなる。反発的なファンデルワールス項は、ＳＣＷＲＬ３において使用される区分的線形項と同様であるが、以下の通り短距離の誘引性ポテンシャルと組み合わされる。Ｒｉｊが原子ｉおよび原子ｊの剛体球半径の合計であり、Ｅｉｊが、
【００７４】
【数１９】
2012524124.tif 000021
（ここで、Ｅｉ値はCHARMM param19ポテンシャル（Brooks et al. (1983) J. Comput. Chem., 4:187-217）からのＥｍｉｎ値である）であり、ｄが２つの原子間の距離である場合：
【００７５】
【数２０】
2012524124.tif 000022
【００７６】
このポテンシャルは図７に示されている。剛体球半径を、訓練セットの正確度に対して手動で最適化した。
【００７７】
ＳＣＷＲＬ４における水素結合項は、Ｒｏｓｅｔｔａ(Kortemme et al. (2003) J. Mol. Biol., 326:1239-1259)において使用される水素結合項と類似しているが、図８に示されるように、異なる手段でパラメータ化する。ｄは、この場合、極性水素（ＨＮ−またはＨＯ−）と水素結合の受容体（酸素）との間の距離として定義し、ｎはＯ受容体からＨまでの単位ベクトルとして、ｅ０は水素結合の供与体である重原子（Ｄ）からＨへの共有結合に沿った単位ベクトルとして、および２つの単位ベクトル、ｅ１およびｅ２は水素結合の受容体から酸素の孤立電子対の電子雲の中央までである。カルボニル基の酸素について、これらの２つのベクトルは二重結合から１２０°離れており、カルボニル基の炭素置換基と同一平面上にある。ヒドロキシル基の酸素について、これらの２つのベクトルは互いおよび他の２つの酸素置換基（ＨおよびＣ）から１０９．５°であり、四面体の配置を形成する。ｅ１およびｅ２の両方について水素結合関数を評価する。ｅ１について、水素結合についての重みｗを定義する：
【００７８】
【数２１】
2012524124.tif 000023
ここで、
【００７９】
【数２２】
2012524124.tif 000024
は、Ｄ−Ｈ結合とＨ．．．Ｏベクトルとの間の角度であり、
【００８０】
【数２３】
2012524124.tif 000025
は、Ｏ−孤立電子対とＯ．．．Ｈベクトルとの間の角度である。平方根の中の被乗数が負の場合は、スコアをゼロに設定する。このスコアを算出することにより、効率的な実行が可能になり、距離ｄおよびベクトルｎと一緒に、算術演算３０回、除算１回、および平方根評価２回以内で行うことができる。
【００８１】
重みｗをコンピュータ計算した後、それを使用して、初期状態のファンデルワールスエネルギーと純粋な水素結合引力項とを平衡させることによって酸素−水素相互作用の最終的なエネルギーを導く：
【００８２】
【数２４】
2012524124.tif 000026
ここで、ｑＨおよびｑＯは、CHARMM param19ポテンシャルからの電荷である。上記の式は、５つの原子に依存しない係数：ｄ０、σｄ、αｍａｘ、βｍａｘ、Ｂを含む。これらの係数の値を、訓練セットタンパク質に対して最適化した。
【００８３】
単一の回転異性体を使用すると、ホモロジーモデリングにおける二面角のゆらぎおよび骨格の不正確な表示に起因して、時には不十分なパッキング予測がもたらされる。回転異性体ライブラリーで得られた平均値と１つまたは複数の二面角が１つの標準偏差（または、この値のいくらかの一定倍）だけ異なるコンフォメーションとして定義される亜回転異性体の使用を調査した：
【００８４】
【数２５】
2012524124.tif 000027
この様式において、全ての二面角における変動が許容される場合、亜回転異性体を追加的な回転異性体として扱うことにより、ＳＣＷＲＬ３において使用されるグラフ分解アルゴリズムを使用すると処理しにくい算出がもたらされる。ＳＣＷＲＬ４において実行される（以下を参照されたい）Ｘｕの木分解(Xu, J. (2005) 9th Annual International Conference on Research in Computational Molecular Biology （RECOMB）, pages 423-439)を用いてさえ、算出は多くの場合処理しにくいままである。したがって、Ｋｉｒｋｗｏｏｄの重ね合わせ近似(Kirkwood, J.G. (1935) J. Chem. Phys., 3:300-313)を使用して、亜回転異性体を統合して近似自由エネルギーを作製するＭｅｎｄｅｓらのフレキシブル回転異性体モデル(Mendes et al. (1999) Proteins 37:530-543)を実行した：
【００８５】
【数２６】
2012524124.tif 000028
第１の項は「自己自由エネルギー」として扱い、第２の項は「対自由エネルギー」として扱う。Ａｓｅｌｆ（ｒｉ）およびＡｐａｉｒ（ｒｉ、ｒｊ）は、次式として定義される。
【００８６】
【数２７】
2012524124.tif 000029
【００８７】
【数２８】
2012524124.tif 000030
Ｅframe（ｒｉ、ｓｉ）項およびＡframe（ｒｉ）項は、ファンデルワールスエネルギーおよび水素結合エネルギーのみを含有する。この実行では、各残基種は別々に最適化された温度を有し、対自由エネルギーについて、Ｔｉｊ＝（Ｔｉ＋Ｔｊ）／２である。
【００８８】
グラフの構築。
ＳＣＷＲＬ３と同様に、自己エネルギーが高いいくつかの回転異性体は、予測される構造の一部になる見込みが非常に少ないので、それらを算出から除去する。これらの回転異性体を不活性として印をつける。ＳＣＷＲＬ３では、ある特定の残基に依存しない境界を超える自己エネルギーを有する回転異性体を不活性化した。しかし、それにより、時には全ての回転異性体がこの境界を超える自己エネルギーを有するということが起こる。この場合、全ての回転異性体を再度活性化した。ＳＣＷＲＬ４では、この発見的な手法を、各側鎖についてエネルギーが最も低い回転異性体と相対的な境界を設けることと差し替えた。この手法により、少なくとも１つの回転異性体が活性なままになることが保証される。設定ファイルによって閾値の正確な値をカスタマイズすることができる。
【００８９】
グラフを構築する前に、ジスルフィド結合について解決した。ＳＣＷＲＬ４では、２つのシステイン残基がジスルフィド結合を形成し得るかどうかを同定するためにＳＣＷＲＬ３と同じ基準を使用するが、曖昧さを解決するための新しい手順を導入する。曖昧さは、特定のシステイン残基の２つ以上の回転異性体がジスルフィド結合を形成し得る場合、または１つの回転異性体が２つ以上の他のシステイン側鎖とジスルフィド結合を形成し得る場合に生じる。特定の衝突のないジスルフィド結合の組み合わせを選択するために、ＳＣＷＲＬ４では、全てのジスルフィド結合の全エネルギーを、相互に排他的な制約に関して最小化する。これを行うために、目的関数を以下の形で使用した：
【００９０】
【数２９】
2012524124.tif 000031
ここで、総計は全ての可能性のあるジスルフィド結合にわたって実行され、Ｃは大きな正定数であり、ηは特定のジスルフィド結合のスイッチが入る、またはそうでなければゼロになるかどうかを評価する２変数関数である。上記の関数は、回転異性体の割り当ての全エネルギーをコンピュータ計算するために使用する関数と同じ形である。したがって、同じ最適化手順によって、関数ηについてそれを最小化することができる。これを行うことにより、衝突を有さない最適なジスルフィド結合の一覧が得られる。特定の残基に対して回転異性体の１つが最適なジスルフィド結合に関与する場合は、全ての他の回転異性体はその残基について不活性化される。ジスルフィドにおけるシステインの相互作用のエネルギーを、相互作用する距離内の側鎖の回転異性体の自己エネルギーに加算する。
【００９１】
ＳＣＷＲＬでは、側鎖の位置付け問題を表すために相互作用グラフが使用される(Bower et al. (1997) J. Mol. Biol., 267:1268-1282; Canutescu et al. (2003) Protein Sci., 12:2001-2014)。このグラフでは、頂点は残基を表し、一方、頂点間の辺は、１つの残基の少なくとも１つの回転異性体が、辺によって連結された別の残基からの回転異性体とゼロでない相互作用を有することを示す。単一のタンパク質またはタンパク質複合体について、全残基の周囲のｋＤＯＰの重複を確認することによって、次に回転異性体および亜回転異性体によってグラフを構築する。１つの残基の少なくとも１つの回転異性体または亜回転異性体が、ゼロでないエネルギーを伴って別の残基の回転異性体または亜回転異性体と相互作用し得る場合は、これらの残基を表しているグラフにおいて頂点間に辺をグラフに追加する。
【００９２】
ＳＣＷＲＬ４により、対称の複合体において、および結晶において、入力ＰＤＢファイルＣＲＹＳＴ１レコードにおいて得られる空間群の対称演算子を使用して側鎖をモデリングすることができる。結晶については、入力ＰＤＢファイルが非対称単位を含有する場合、入力座標と接触する可能性がある非対称単位における全ての残基を、記載の通り構築する(Xu et al. (2008) J. Mol. Biol., 381:487-507)。対称コピーの残基、回転異性体、亜回転異性体、および原子の周囲に境界ボックスを構築する。入力構造およびその側鎖内の原子と対称コピーおよびその側鎖内の原子との相互作用を決定する。入力構造における側鎖が対称コピーの骨格またはリガンドと相互作用する場合は、これらの残基の静的な骨組みエネルギーを適宜修正する。入力構造の側鎖が対称コピーの側鎖と相互作用する場合、対応する残基間に辺がすでに存在していなければ、辺を創出する。存在している場合は、対称的に関連するタンパク質間の追加的な相互作用を説明するために、対エネルギーを修正する。したがって、結晶の対称性により、タンパク質の一方の側にある残基は、タンパク質の他方の側にある残基との辺を有することがある。
【００９３】
木分解によるグラフの解法。
ダイナミック・プログラミングによって主要な最適化が開始される前に、相互作用グラフに辺分解およびデッドエンド除去からなるいくつかの予備処理を行う。一般には、これにより、かなりの数の回転異性体ならびにいくつかの辺およびノードが排除される。辺は、境界ボックスの重複に基づいて形成されるので、それらの一部は対の回転異性体−回転異性体エネルギーについてゼロのみを含有する可能性がある。この場合、または相互作用の実際のエネルギーがゼロに非常に近い場合は、辺を除去する。
【００９４】
辺分解により、単一残基のエネルギーにわたる合計として近似することができる辺を除去する。この表示がある特定の閾値内で実行可能な場合は、対応する自己エネルギーを修正し、辺を除去する。より大きな閾値を用いると、より多くの辺が除去され得る。この予備処理段階では、閾値を非常に小さな値、ε＝０．０２ｋｃａｌ／ｍｏｌに設定する。
【００９５】
剛性の回転異性体モデルにおける２つの残基の対エネルギー、Ｅｐａｉｒ（ｒｉ，ｒｊ）またはフレキシブル回転異性体モデルにおける自由エネルギー、Ａｐａｉｒ（ｒｉ，ｒｊ）は、回転異性体、ｋ＝１．．ｍおよびｌ＝１．．ｎについて、実際の数字ｅｋｌの行列によって表すことができる。このタスクは、実際の数字の２つのセット
【００９６】
【数３０】
2012524124.tif 000032
および
【００９７】
【数３１】
2012524124.tif 000033
を見出すためのものであり、これにより平均偏差が最小化される：
【００９８】
【数３２】
2012524124.tif 000034
ａｋおよびｂｌに関してδの偏導関数をゼロに設定することにより、これらの２つのセットは以下の方程式を満たすはずである：
【００９９】
【数３３】
2012524124.tif 000035
【０１００】
【数３４】
2012524124.tif 000036
最初のタスクは、その解が唯一ではないので、十分定義されない。したがって、全てのａｋにいくつかの値を加算すること、および全てのｂｌの同じ値を減算することによって合計ａｋ＋ｂｌは変化しない。したがって、ａは任意の値に設定することができる。例えばａは、次式に設定することができる：
【０１０１】
【数３５】
2012524124.tif 000037
この値を第２の方程式に代入すると、ｂに対応する値を見出すことができる：
【０１０２】
【数３６】
2012524124.tif 000038
これらの値を使用して、ａｋ＋ｂｌを決定することができ、最大の絶対偏差を評価することができる：
【０１０３】
【数３７】
2012524124.tif 000039
ＳＣＷＲＬ４では、この偏差がある特定の閾値未満であるかどうかが確認され、その場合は、対応する辺を除去することができ、残基ｉのｋ番目の回転異性体および残基ｊのｌ番目の回転異性体の自己エネルギーを修正することができる：
【０１０４】
【数３８】
2012524124.tif 000040
上記のように、閾値の最初の値は、アルゴリズムによってほとんど全ての冗長な「ゼロに近い」辺を排除することができる０．０２である。現時点でゼロの辺を有するこれらのノードをグラフから除去することができる；その割り当てられた回転異性体はＥｓｅｌｆが一番低い回転異性体である。
【０１０５】
次の工程は、大域的な解の一部になり得ない回転異性体を同定し、除去するデッドエンド除去（ＤＥＥ）を実施することである。これらの回転異性体は、ＳＣＷＲＬ３において使用されたゴールドスタイン（Goldstein）の基準(Goldstein, R.F. (1994) Biophys. J., 66:1335-1340)によって同定される。ある特定の残基について、ＤＥＥの後にただ１つの回転異性体が残る場合は、その回転異性体は解の一部である。この残基が隣接する辺を有する場合は、残りの回転異性体を伴う全ての対エネルギーを、隣接する残基からの対応する回転異性体の自己エネルギーに組み込み、これらの辺を除去する。これにより、残基が単離され、これは、残基をグラフから除去することができることを意味する；その単一の回転異性体の自己エネルギーを最小のエネルギーの合計値に加算する。辺分解およびＤＥＥの工程を、さらに何も除去されなくなるまで繰り返す。
【０１０６】
ＳＣＷＲＬ３と同様、得られるグラフは、分離したグラフまたはクラスター間に辺がないクラスターを含有し得る；その時は、これらのクラスターのそれぞれがグラフ分解に供される。ＳＣＷＲＬ３では、グラフ分解は、単一のノードを除去することによっては部分に分けることができない部分グラフである２連結成分の決定に基づいた。その時は、グラフは関節点と称される単一ノードによって連結された２連結成分のセットである。木分解は、２連結成分に基づいたグラフ分解の一般化とみなすことができる(Xu, J. (2005) 9th Annual International Conference on Research in Computational Molecular Biology （RECOMB）, pages 423-439)。これを理解するために、ＳＣＷＲＬ３の論文に記載のものと同じグラフ、２連結成分へのその分解、およびその木分解が図９に示されている。
【０１０７】
定義：グラフＧ＝（Ｖ，Ｅ）は対（Ｔ，Ｚ）であり、ここでＴ＝（Ｗ，Ｆ）は頂点セットＷおよび辺セットＦを伴う木分解（すなわち、サイクルをもたないグラフ）であり、
【０１０８】
【数３９】
2012524124.tif 000041
は、以下の条件を満たすＴの頂点と１対１で関連するセットＶのサブセットのファミリーである：
１．
【０１０９】
【数４０】
2012524124.tif 000042
【０１１０】
セットＺとセットＷとの間の１対１の対応により、木Ｔの頂点は「バッグ」と称することができる。図９に、残基の全てが１つまたは複数のバッグ内に存在するので、条件１がこの木分解によって満たされることが示されている。残基ｃ、ｄにより、辺ｃ−ｄが少なくとも１つ（この場合、２つ）のバッグ内に含有されるので、条件２が満たされることが例示されている。残基ｈにより、ｈを含有するバッグの全てが単一の部分木に連結されているので、条件３が例示されている。
【０１１１】
一般には、所与のグラフに対していくつかの異なる木分解を構築することができる。特定の木分解の幅は、最も大きなバッグから１を引いたサイズである。所与のグラフについて、最小の可能性のある幅を有する木分解が最適な木分解であり、その幅はグラフの木幅と称される。この特性により、グラフがどれほどよく木分解性であるかが示される。例えば、グラフがサイクルを有さない（したがって、木である）場合は、その木幅は１と等しいが、単純なサイクルについては、木幅は２と等しい。
【０１１２】
ＳＣＷＲＬ３では、グラフの解法は、単一の関節点を有する任意の２連結成分を用いて、関節点の各回転異性体について２連結成分残基の最小のエネルギーを見出すことによって開始される。次に、このエネルギーを関節点の回転異性体の自己エネルギーに加算し、この最小のエネルギーを実現する２連結成分の回転異性体を関節点の回転異性体に割り当てる。次に、２連結成分を除去することができ、残りのグラフにおける１つの関節点を有する全ての２連結成分に対してプロセスを続ける。したがって、組み合わせ問題により、最も大きな２連結成分（すなわち、最も多数の回転異性体の組み合わせを有する２連結成分）の順序が下がる。
【０１１３】
木分解では、単一ノードを使用してグラフを分離するのではなく、グラフを１つ、２つまたはそれ以上のノードを除去することによって分離することができる。これを理解するために、図９における木分解では、各バッグｗが２つの残基セット、ＬｗおよびＲｗに分けられ、ここでＬｗ内の残基は、バッグ内の、そのバッグと直接の親バッグとの間で共有される残基である。この図における各バッグについて、これらは縦棒の左側に列挙されている。バッグ内の残りの残基、セットＲｗは、親の中にない残基であり、縦棒の右側に置かれている。セットＬｗのそれぞれは、グラフＧ４５の分離セットである；つまり、Ｌｗ内の残基を除去すると、元の残基グラフが２つ以上の別々の非連結グラフに分かれる。例えば、残基ｂおよび残基ｃを除去することにより、元のグラフが２つのグラフに分かれ、その一方は残基ａからなり、他方は残基ｂおよび残基ｃの下のグラフの残りである。
【０１１４】
グラフの最小のエネルギーを解くことは、ＳＣＷＲＬ３において行われるのと同様に進行する。葉（子をもたないバッグ）ｙ、例えば「ｂ  ｃ  ｜  ａ」を含有するものから開始し、Ｌｙ（この場合、残基ｂおよび残基ｃ）における回転異性体の組み合わせのそれぞれに対して、Ｒｙ（この場合、残基ａ）における（１つまたは複数の）残基の最低エネルギーを、Ｒｙにおける対応する回転異性体の割り当てをセーブしながら見つけだす。次に、これらのエネルギーを、木分解の定義によりｂおよびｃを含有する親バッグ内の回転異性体の組み合わせに加算する。この手順を木からｙの親ノード（例えば、ノードｚ）まで続ける。再度、Ｒｚにおけるこれらの残基の回転異性体の組み合わせ全ての最小のエネルギーを、親のＬｚセットにおける回転異性体の組み合わせのそれぞれについて算出する。これらのエネルギーには、子ノードｙについて算出されたｂ、ｃについてのエネルギーを含めることが必要である。この手順を、根のバッグのみが残るまで続ける。以下にこの手順をより形式的に説明する。
【０１１５】
各バッグ内の残基の回転異性体の組み合わせの全てを数え上げることが必要であるので、解の複雑さは木の幅に関連する。木幅をコンピュータ計算し、最適な木分解を見出すことは一般に難しく、任意のグラフについてＮＰ困難であることが証明されている(Arnborg et al. (1987) SIAM J Algebraic and Discrete Methods, 8:277-284)。木分解を構築するために、発見的なアルゴリズムを開発した。
【０１１６】
第１の工程において、セットＺのファミリーを構築する。以下の工程のループを使用して入力グラフを徐々に解体する：
１．隣接する辺の数が最も少ない任意の頂点を選択する。
２．この頂点およびその隣接点の全てから木のバッグを形成する。選択された頂点は、対応するバッグの主要な頂点として示される。
３．選択された頂点の隣接点がクリークになるように、処理されているグラフに辺を追加する（全てのノードが互いに対する辺を有する部分グラフ）。
４．選択された頂点および全ての隣接する辺をグラフから除去する。
５．グラフに頂点が残らなくなるまで第１の工程から繰り返す。
このようにして、木分解の頂点を表す「バッグ」のセットが得られる。
【０１１７】
バッグを、それらの構築の順番で番号付けする。ここで、任意の反復の範囲内でのバッグｗと残りのグラフ（Ｓｗ）の頂点との交差は、関係しているバッグの最初の頂点の隣接点（Ｎｗ）単独からなる、Ｚｗ∩Ｓｗ＝Ｎｗであることに注意することが重要である。頂点とバッグとの間の１対１の対応により、木分解の定義における第１の条件が自動的に満たされることが立証される。同様に、バッグの構築の間に辺が単独で除去されること、および任意の辺が除去されると、隣接する頂点の両方がバッグ内に含まれることが明らかである。これにより、木分解の定義における第２の条件が満たされることが保証される。
【０１１８】
第２の工程は、「バッグ」を連結して、木分解の定義に適合する木を得ることである。これは、これらのバッグを、それらが構築されたときと逆の順序で木に逐次的に結びつけることによって行う。したがって、最後に創出されたバッグが木の根になる。次のバッグがそれに連結するようになり、したがって、それの直接の子になる。次のバッグについては、どちらに付くか２つの選択肢がある。しかし、木分解の適切なノードは、以下の条件に適合しなければならない：
【０１１９】
【数４１】
2012524124.tif 000043
この条件に従って、適切なノードにおける頂点のセットは、すでに木に存在する、追加されるべきバッグからの全ての頂点を含有しなければならない。
【０１２０】
ちょうど得られた木分解は、いくつかの追加的な副次的プロセスを受ける。これは、２つの正規化の法則からなり、それらは、さらに適用することができなくなるまで適用される：１）いくつかのバッグに関連する全ての頂点がその直接の親の頂点セットに属する場合は、このノードを除去し、その直接の子の全てを親ノードに再連結させる。２）いくつかのバッグが、その親ノードに関連する全ての頂点を含有する場合は、親バッグをこのバッグと置換し、したがって１つの辺を根に移動させる。
【０１２１】
最小エネルギーの回転異性体の立体配置は、以下の通り算出する。セットＬおよびセットＲからなる葉ノードを用いて開始すると、上で定義された各バッグの左側部分および右側部分により、〈Ｌ〉は、セットＬにおける残基の全ての回転異性体の組み合わせのセットとして定義され、同様に、セットＲに対して〈Ｒ〉が定義される。〈Ｌ〉の単一のメンバーはｌと示され、これは回転異性体の割り当てのベクトル、セットＬ内の各残基ｉに対する１つの回転異性体ｌｉであり；同様に、〈Ｒ〉に対してｒが定義される。葉ノードについて、各ベクトルｌについてエネルギーを算出する：
【０１２２】
【数４２】
2012524124.tif 000044
ここで、
【０１２３】
【数４３】
2012524124.tif 000045
および
【０１２４】
【数４４】
2012524124.tif 000046
Ｌ内の固定された回転異性体については、Ｒ内の回転異性体との対相互作用のみを含めるが、Ｒにおいては、回転異性体の間の自己相互作用および対相互作用の両方を加算しなければならない。フレキシブル回転異性体モデルについては、ＥｓｅｌｆおよびＥｐａｉｒの代わりにＡｓｅｌｆおよびＡｐａｉｒの値を使用する。内部ノードについては、その子によってノード内の回転異性体の組み合わせに割り当てられたエネルギーを加算する：
【０１２５】
【数４５】
2012524124.tif 000047
ここで
【０１２６】
【数４６】
2012524124.tif 000048
ここで、合計は内部ノードの子ｃにわたり、ｌｃはセットＬｃ内の残基の回転異性体のベクトルであり、したがってこれらの回転異性体は下記セット内にある。
【０１２７】
【数４７】
2012524124.tif 000049
木分解の定義により、Ｌｃ内の残基の全ては｛Ｌ  ∪  Ｒ｝である。内部ノードのエネルギーを算出するために、ノードは葉から根の順序で横断しなければならない。根は親を有さないので、セットＬを有さない。そのエネルギーは、次式によって得られる
【０１２８】
【数４８】
2012524124.tif 000050
アルゴリズムの最後の部分において、木分解のノードは根から葉の順序で横断して、処理されているクラスターに対する回転異性体の大域的な割り当てが組み立てられる。根を除く任意のノードについて、Ｌにわたる回転異性体の任意の回転異性体の割り当てに対するＲの回転異性体の最適な割り当てを得ることを可能にする、局所的で部分的な解がある。しかし、親バッグに属するＬの構築によると、それは親ノードにおける最適な割り当てが分かっていれば、いくつかのバッグ内の全残基にわたる最適な割り当てを容易に引き出すことができることを意味する。したがって、根ノードから開始する全体のクラスターに対する割り当てを徐々に拡大する帰納的な手順がある：
【０１２９】
【数４９】
2012524124.tif 000051
根の子ｃそれぞれについて、根の回転異性体の割り当て、および全体に加算される最小のエネルギーを考慮してＲｃ内の残基に対する回転異性体の割り当てを行うことができる：
【０１３０】
【数５０】
2012524124.tif 000052
ここで、ｌｃ内の割り当ては、ｒｒｏｏｔからすでに分かっている。深さ優先探索において根から全ての葉までたどり、各ｃの子のそれぞれなどに対して、回転異性体を割り当て、エネルギーを更新する。
【０１３１】
局所的な解の実際の探索は、対応するバッグ内の回転異性体数の積が非常に多くはない場合に非常に手頃な、徹底的な直接列挙によって行う。特定のバッグにわたる、可能性のある回転異性体の割り当ての数は、ノードの局所的な複雑さと称することができる。全てのノードの局所的な複雑さの合計により、最適化の全体的な計算的な複雑さが生じる。一般には、木分解の幅が小さいほど、複雑さが低くなる。単一の回転異性体を割り当てるためのＳＣＷＲＬ４に必要とされる時間を制限するために、全体的な複雑さの上限１０８を導入することができる。実際の複雑さがこの上限を上回る場合は、最適化を扱いやすくないとして扱い、ＳＣＷＲＬ４を、辺分解の閾値を２倍にすることによってグラフ構築の工程（辺分解およびＤＥＥ）に戻す。このプロセスを解が見出されるまで続ける。
【０１３２】
結果の出力
最適化により、モデル全体の最小の全エネルギーおよび対応する回転異性体の割り当てがどちらも解決される。実行可能なＳＣＷＲＬ４により、解決された全タンパク質モデルの最適なコンフォメーションをＰＤＢファイル内にセーブする。全エネルギーの対応する値を、さらなる解析のためにファイルに転送することができる標準の出力に書き込む。タスクをセットアップし、それをＳＣＷＲＬ４ライブラリーのＡＰＩによって解く場合は、この次の算出において、修飾された、または修飾されていない対応する作業空間を使用することができる。
【０１３３】
訓練セットおよび試験セット
パラメータおよび手順を最適化するためのタンパク質の訓練セット、およびＳＣＷＲＬ４の正確度を報告するための別々の試験セットを構築した。電子密度の算出を使用して側鎖の座標の信頼度を推定することが望ましかったので、一般に構造因子が蓄積された、Uppsala Electron Density Server(Kleywegt et al. (2004) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr., 60:2240-2249)から入手可能な電子密度を有するＰＤＢエントリーの一覧を用いて開始した。電荷、水素の位置、またはリガンドのファンデルワールス半径を必要とせずに側鎖を予測することができるように、水以外のリガンドを伴うエントリーを除去した。このセットは、ＰＩＳＣＥＳサーバー(Wang et al. (2003) Bioinformatics, 19:1589-1591; Wang et al. (2005) Nucleic Acids Res., 33:W94-98)を使用して、最大の相互の配列同一性３０％、分解能≦１．８Å、および最大Ｒ値２０％において選別した。側鎖を結晶の形で予測することによってエネルギー関数を最適化することを計画したので、ＣＲＹＳＴ１の記録およびスケール行列によって実現可能な結晶が作製されるかどうかを確認した。非対称単位の結晶隣接点が構築されたときにタンパク質原子の大規模な衝突を生じたいくつかのエントリーを除去した（例えば、ＰＤＢエントリーの１ＲＷＲ）。得られるタンパク質の一覧を訓練セットおよび試験セットに分け、訓練セットは、下記の最適化手順のスピードを上げるために単量体の非対称単位からなった。
【０１３４】
得られるタンパク質一覧における完全な側鎖の全てについて、電子密度の幾何平均を以前に記載された通りに算出した(Shapovalov et al. (2007) Proteins, 66:279-303)。この先行研究では、平均電子密度の低い値は非回転異性体の側鎖およびコンフォメーション的に不規則な側鎖と相関した。各残基種について、訓練セットおよび試験セットについての平均電子密度をソートし、電子密度が最低の側鎖に対して０％、電子密度が最高の側鎖に対して１００％のパーセンタイルに変えた。
【０１３５】
両方のセットに対して、ＳＨＥＬＸから入手可能なＳＩＯＣＳプログラム(Sheldrick, G.M. (2008) Acta Crystallogr A, 64:112-122)を使用して、反転した状態のＡｓｎおよびＨｉｓのχ２ならびにＧｌｎのχ３の曖昧さを解決した。ＳＩＯＣＳでは、これらの側鎖が結晶構造において正確に位置付けられているかどうか、または末端の二面角が１８０°まで反転する可能性があるかどうかを示すために、水素結合および結晶接触（crystal contact）が使用される。
【０１３６】
結晶モードでは、非対称単位に対して、結晶隣接点との相互作用を算入して算出を行った。しかし、正確度は、ＰＩＳＣＥＳによって提供される非対称単位の１つのタンパク質に対してのみ査定した。
【０１３７】
エネルギーパラメータの最適化
ＳＣＷＲＬ４の正確度は、回転異性体ライブラリーの選択、非結合エネルギー関数およびそれらのパラメータ、フレキシブル回転異性体モデル（ＦＲＭ）において使用されるパラメータ、ならびにいくつかの他の手続き上の選択に依存する。第１に、最適化するために目的関数を決定することが必要であった。ＲＭＳＤ、いくらかの閾値（以前の文献において、一般には４０°）の範囲内の正しいパーセントχ１、正しいパーセントχ１＋２、および正しい側鎖のパーセント（いくらかの閾値の範囲内に全てのχ角度を有する側鎖）を含めたいくつかの可能性のある選択肢がある。平均の絶対的な正確度を使用することに決定した。Ｌｙｓなどの側鎖種について、これは正しいパーセントχ１、パーセントχ１＋２、パーセントχ１＋２＋３、およびパーセントχ１＋２＋３＋４の平均である：
【０１３８】
【数５１】
2012524124.tif 000053
ここで、例えばＮ１２は、４０°の範囲内の正しいχ１およびχ２の両方を有するリジンの側鎖の数である。この値により、より確実に決定された骨格により近い自由度に加算された重みがもたらされる。全ての側鎖種について正確度を得るために、頻度により各アミノ酸種について重みＰＣＸｘｘを加えた：
【０１３９】
【数５２】
2012524124.tif 000054
最適化することができる多数のパラメータ
第１に、亜回転異性体についてのχ−角度の偏差δｉを、二面の自由度のそれぞれについて個々に設定することができる。ＳＣＷＲＬ４では、回転異性体ライブラリーにおいてもたらされる定数倍の標準偏差が使用され、定数は各側鎖種の自由度のそれぞれに特異的である：
【０１４０】
【数５３】
2012524124.tif 000055
使用される「温度」も、ＦＲＭ手順において各アミノ酸種に対して別々に最適化する。対の回転異性体−回転異性体エネルギーを算出するために、温度を、対応するアミノ酸種の温度の算術的な平均とみなす。最後のパラメータは、回転異性体ライブラリー項の前の係数であり、これは、回転異性体の自己エネルギーにおける静的な骨組みおよび回転異性体ライブラリーの影響を平衡化する。したがって、あらゆるアミノ酸種についてｌ＋２パラメータを得、ここでｌはある特定のアミノ酸種の側鎖のコンフォメーションを指定するために必要なχ角度の数である。これらのパラメータにより、予測の質を改善するために探索することができる７８次元の空間が形成される。さらに、予測の正確度を改善するために最適化することができる水素結合パラメータおよび原子の半径もある。
【０１４１】
特別な技法を使用して、関係しているパラメータの７８次元の空間における最適化を実施した。主要な概念は、古典的なブロック座標降下法(Briggs et al. (2000) A Multigrid Tutorial, Philadelphia: SIAM)と同様であり、各反復に対して、１つまたはいくつかの軸に沿った最適が解決される。この場合、任意の反復の探索空間は単一のアミノ酸種のパラメータからなるが、一方、目的関数はこれらのパラメータの現在の値に多少近い範囲内に最大化される。全ての反復により、対応するアミノ酸種に関連するパラメータのみが更新されるが、一方、他のアミノ酸種のパラメータは変化しないままである。この方法では、任意の反復により、パラメータは、目的関数の値が増加するように更新される、またはそうでなければパラメータは変化しないまま保たれる。1回の反復から別の反復でアミノ酸種を変更することにより、それに沿って目的関数の値が徐々に増加する（または、少なくとも変化しないままになる）、元の７８次元の空間における点の配列が課される。反復をラウンド−ＡＬＡおよびＧＬＹを除く全ての残基種を含有する、１８回の反復のランダムにシャッフルされた連続にグループ化する。実験により、目的関数のいくつかの（必ずしも大域的でない）最大値を見出だすために、一般には数ラウンドで十分であることが示された。この制約された最適化タスクの近似解を、特別な技法を使用して得た。
【０１４２】
このプロトコールの重要な利点は、これにより、回転異性体の割り当て手順の内部構造の特異的な性質が利用されることである。フレキシブル回転異性体モデルが使用可能になる場合、予測全体のうち最もＣＰＵを消費する部分は、相互作用グラフの算出、特に対エネルギーの算出である。しかし、アミノ酸のいくつかの対について、回転異性体のいずれも変化しなかった場合は、それらの間の対相互作用の現在のエネルギーが妥当であり、再算出する必要がない。逆に、いくつかのアミノ酸種のパラメータの変化は、その種類の回転異性体と、それらの任意の他の種類の回転異性体との相互作用のみに影響を及ぼす。単一の反復の間、１つのアミノ酸種の側鎖のみが修飾されるので、相互作用グラフの大部分を保存することができ、ほんの一部のみを再度コンピュータ計算しなければならない。さらに、回転異性体ライブラリーのエネルギー項の重みのみが変化する場合は、静的な骨組みエネルギーも対相互作用のエネルギーも再度コンピュータ計算する必要がない。パラメータを、全ての側鎖がそれらの結晶環境にあり、非対称単位の結晶隣接点と相互作用するように最適化した。これは、非対称単位間に接触がある極性の側鎖に対して特に重要である。
【０１４３】
ライブラリー
ＳＣＷＲＬ４を、その最適化エンジンをタンパク質の設計などの他の筋書きにおいて使用することができるようにライブラリーとして再設計した。したがって、これを遅延計算モデルとして利用する。まず、モデルデータ（作業空間と称される）を定義する。これは、ライブラリーの関数を呼び出すことによって、適切な回転異性体を有するアミノ酸残基の位置を指定することを意味する。その後、呼び出しプログラムによりライブラリーにおいてＳＣＷＲＬ４エンジンが使用されて回転異性体の最適な割り当てが導かれる。これには、ＳＣＷＲＬ４により必要なエネルギーの全てを算出し、組み合わせ最適化を行うことが必要とされ、その後に各残基について、その回転異性体のうちの１つが最適であると印がつけられる。次に、この情報を他のアプリケーションにおいて使用することができる。ＳＣＷＲＬ４ライブラリーにより、モデルは、最適な割り当てが見出された後でさえ、さらに使用するために生きたまま保たれる。これは、最適な回転異性体が解決された後に、いくつかの修飾をモデルに導入することができ、最適化が再度必要になることを意味する。この場合、ＳＣＷＲＬ４により、モデルにおける変化によって修正されるべきエネルギーのみが再算出され、一方、持続性の対象間のエネルギーについてはキャッシュされた値が使用される。
【０１４４】
結果
訓練セットおよび試験セット
それぞれタンパク質１００種およびタンパク質３７９種の、別々の訓練セットおよび試験セットを使用して、ＳＣＷＲＬ４を開発するための種々のパラメータおよびアルゴリズムの選択を最適化し、試験した。両方のセットのための分解能のカットオフは１．８Åであり、最大の相互の配列同一性は３０％であった。以下の全ての算出は、非対称単位に対して、または結晶の対称性を使用してのいずれかで実施したが、各場合において、正確度の結果は各配列のただ１つの鎖からなるセットにコンパイルする。
【０１４５】
ＳＣＷＲＬ４の正確度
電子密度が２５〜９５パーセンタイルの側鎖に対する全体的なＳＣＷＲＬ４の正確度が表１（図１３）に提示されている（方法を参照されたい）。正確度は、３つの異なる手段で報告される。第１に、各側鎖種について、二面の自由度、χｉのそれぞれについての条件付の正確度が報告される。これは、骨格により近いχ角度、χｉ−１，．．．，χ１も正しいとすれば、正しいχｉのパーセントである。したがって、例えば、Ｍｅｔについて、χ１およびχ２の両方が正しい残基について、７６．４％が正しいχ３を有する。「全て」の列は、そのような自由度を有する残基種のみを計数する。第２に、各側鎖について、自由度のそれぞれにおける絶対的な正確度は、χｉ，．．．，χ１が全て正しい種類の全ての残基のパーセンテージである。したがって、例えば、Ｍｅｔについて、全ての残基の５９．７％が、χ１，χ２、およびχ３について正確に予測される。最後に、各側鎖種について平均ＲＭＳＤがもたらされる（すなわち、全てのタンパク質にわたって所与の残基種についての全座標にわたってＲＭＳＤを算出するのではなく、各残基についてＲＭＳＤを算出し、これらの値を平均する）。
【０１４６】
側鎖の予測の正確度について最も頻繁に挙げられる数字は、全側鎖種にわたるχ１およびχ１＋２の割合であり、ここでχ１＋２は表１（図１３）におけるχ２自由度における絶対的な正確度である。これらの値は、２５〜９５パーセンタイルの電子密度については、それぞれ８９．０％および７９．２％である。全側鎖については、これらの値は８６．１％および７４．８％に落ちる。１８残基種のうち９種については、χ１の正確度は９０％を超え、これらは、大部分が脂肪族残基種および芳香族残基種である。Ｓｅｒを予測するのが最も難しく、正確度の割合は７５．４％である。
【０１４７】
表２（図１４）において、ＳＣＷＲＬ３に対するＳＣＷＲＬ４の予測の正確度における改善が、各残基種について、および条件付の正確度の測定値および絶対的な正確度の測定値に対して示されている。χ１の正確度における全体的な改善は３．４％（タンパク質３７９種の同じ試験セットに対するＳＣＷＲＬ４の正確度−ＳＣＷＲＬ３の正確度）である。最も大きな改善は、Ｔｒｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、およびＳｅｒにおいてであり、その全てが、全体の絶対的な正確度で６％を超える改善である。
【０１４８】
ＳＣＷＲＬ３に対する、ＳＣＷＲＬ４における正確度の改善は、サンプリング空間、エネルギー関数、およびアルゴリズムにおけるいくつかの異なる変化によって実現された。これらの特徴の変化のそれぞれは、タンパク質１００種の訓練セットにおける改善に基づいて選択および／または最適化した。図１０において、ＳＣＷＲＬ３に加えられた各変化（ボックスＲ〜Ｔ）または最終的なＳＣＷＲＬ４プロトコールから除去された各変化（ボックスＡ〜Ｉ）の効果が示されている。この図は、それぞれの特徴の効果が状況に依存する；すなわち、効果は、新しい特徴を含有しないＳＣＷＲＬ３に加えられたときと、新しい特徴の全てを含有する最終的なＳＣＷＲＬ４から除去されたときとで異なることを実証している。図の外側に沿った、ＳＣＷＲＬ３からＳＣＷＲＬ４に通じる有向グラフは、それぞれの特徴が継続的に加えられるにしたがった改善を示している。最も重要な変化は、本発明の新しい回転異性体ライブラリーであるフレキシブル回転異性体モデル、水素結合関数の追加、使用される原子の半径における変化、および回転異性体ライブラリーのより大きなパーセンテージを使用すること（ＳＣＷＲＬ３において使用された９０％ではなく、回転異性体の密度の上位９８％）を含む。
【０１４９】
結晶における側鎖のコンフォメーションの予測
ＳＣＷＲＬ４における側鎖のコンフォメーションの予測において、結晶の対称性を考慮することができた。これは、結晶内の非対称単位に隣接する鎖との関連で相互作用グラフを決定することによって実現される。したがって、グラフ内の残基は、その残基が結晶隣接点における残基と接触する場合、タンパク質の他方の側における隣接点を有する可能性がある。以前の研究に記載の通り結晶を構築し、隣接点を決定した(Xu et al. (2008) J. Mol. Biol., 381:487-507)。結晶の対称性を考慮に入れる場合に予測の正確度に対する効果を決定することを対象とする。隣接する非対称単位内の側鎖は、構造が予測されている非対称単位と同じコンフォメーションを有するので、これは結晶内部の真実の予測であることに注意するべきである。
【０１５０】
図１１において、結晶の対称性特徴が使用可能である場合の、全ての側鎖について、および結晶接触における側鎖についての正確度における改善が示されている。示されている正確度の値は平均の絶対的な正確度であり、表２（図１４）に示されているχ１、χ２、χ３、およびχ４の絶対的な正確度の平均である。結晶隣接点による影響を受けないＣｙｓを除く全ての側鎖種について改善が生じる。ただ結晶接触における側鎖のみではなく全ての側鎖の中で、効果は、最も表面上にありやすい側鎖、特に、より長い側鎖、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、およびＧｌｎに対して最も高い。しかし、他の側鎖種が結晶のインターフェイスにある場合、それらの正確度も、結晶隣接点の存在によって強力に影響される。これは、特に、ＴｒｐおよびＭｅｔにも当てはまる。電子密度が２５〜９５％パーセンタイルである側鎖についての結晶におけるχ１の正確度およびχ１＋２の正確度は、それぞれ９０．５％および８２％である。全側鎖については、値は８７．４％および７７．１％である。
【０１５１】
電子密度に対する側鎖のコンフォメーションの予測
回転異性体の側鎖が非回転異性体の側鎖より高い電子密度を有すること、および非回転異性体の側鎖が、結晶において２つ以上のχ１回転異性体で存在することが示され得る側鎖と同様の様式で不規則になりやすいことが以前に示された(Shapovalov et al. (2007) Proteins 66:279-303)。ＳＣＷＲＬ４により、側鎖当たりただ１つのコンフォメーションが予測されるので、電子密度がより低い側鎖は、観察可能な電子密度のごく一部にのみ置かれ得るので、予測するのがより困難になるはずだと思われる。図１２において、自由度のそれぞれの条件付の正確度が、側鎖全体の電子密度のパーセンタイルに応じて示されている。各点は、パーセンタイルの２０点幅の２成分を表している。低いパーセンタイルは低い電子密度、不規則な側鎖に対応し、高いパーセンタイルは高い電子密度、秩序だった側鎖に対応する。全ての側鎖種および全ての自由度について、電子密度が増加するのに伴って条件付の正確度が上昇する。いくらかの自由度については、これは低電子密度、および３０パーセンタイルを上回る正確度プラトーにおいてのみ当てはまる。しかし、より長い側鎖については、正確度の増加は、０〜２０パーセンタイルから８０〜１００パーセンタイルまでに及ぶ。全ての側鎖について、χ１の正確度およびχ２の条件付の正確度は、最低電子密度における７５％から最高電子密度における９０%超まで増加する。χ３の条件付の正確度およびχ４の条件付の正確度は、最低電子密度から最高電子密度まで、５０％から約８０％まで増加する。
【０１５２】
考察
配列−構造アラインメントのプロセスは多くの入手可能なウェブサーバーおよびダウンロード可能なプログラムによってよく表されているが、標的−鋳型アラインメントから３次元の座標を作製するためのプログラムは、比較的少数が存在する(Wang et al. (2005) Proteins)。ＭｏｌＩＤＥプログラムは、以前に開発され、入力標的配列を取得し、入手可能な既知構造の相同なタンパク質に対するこの標的配列のアラインメントを作製する(Canutescu et al. (2005) Bioinformatics, 21:2914-2916; Wang et al. (2008) Nature Protocols)。グラフィカルな環境では、次にＳＣＷＲＬ３プログラムを使用し、入力配列の番号付けを保持している標的配列のモデルを作製することが可能である。ＳＣＷＲＬ４では、現存するＭｏｌＩＤＥの範囲内で同じ関数を実施することができるが、正確度がＳＣＷＲＬ３よりも高い。これは、ＦＦＡＳ０３などの、遠い相同体の探索を実施する現存するウェブサーバーにおいても使用することができる(Jaroszewski et al. (2005) Nucleic Acids Res., 33:W284-288)。剛性の回転異性体モデルを使用すると、ＳＣＷＲＬ４はＳＣＷＲＬ３よりも高速である。フレキシブル回転異性体モデルでは、ＳＣＷＲＬ４は、約７つの因子によっていくらか遅いがより正確である。ＳＣＷＲＬ４は、同様の使い勝手の良さを有し、したがってＳＣＷＲＬ３と同様の環境において機能するが、正確度はそれよりも高い。
【０１５３】
ネイティブな骨格に基づいて予測された側鎖のコンフォメーションと実験的な構造との間の不一致のいくつかの潜在的な原因がある。本明細書においては、これらのうちのいくつかを説明する。第１の最も明白な原因は、タンパク質において側鎖を位置付ける物理的な力を現実的に表すに違いないスコア関数である。ＳＣＷＲＬが依存する改善された回転異性体ライブラリーは、特に、それらの自由度において、厳密に言えば回転異性体的ではない。これらは、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、およびＧｌｎのアミド部分およびカルボン酸部分、ならびにＰｈｅ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、およびＴｒｐの芳香環を含む。第２に、サンプリングの課題は、Ｍｅｎｄｅｓらのフレキシブル回転異性体モデル手法(Mendes et al. (1999) Proteins, 37:530-543)を使用して、回転異性体の位置の近くのコンフォメーションを含めることによって調査されてきた。これらの課題のそれぞれは、さらに、例えば溶媒和エネルギー項ならびにＲｏｓｅｔｔａ(Rohl et al. (2004) Methods Enzymol., 383:66-93)において実施されるような連続的な二面角の最小化を含めることによって調査することができる。後者については、新しい回転異性体ライブラリーにより、回転異性体の定義とは独立して側鎖のχ二面角に応じて連続的なエネルギー関数が提供されることによってその機会が与えられる。
【０１５４】
全体的な正確度に影響を与える、側鎖の予測の２つの他の態様が調査されてきた。これらのうちの１つ目は、結晶内での側鎖の相互作用を含む。初めて、結晶の対称性を説明する、すなわち、結晶内の全ての側鎖のコンフォメーションを予測することができる側鎖の予測プログラムが開発された。ほとんど全ての側鎖種、特に最も結晶接触になりやすい側鎖種の正確度に増加が見られる。結晶における改善は、２つの理由のために興味深い。第１に、分子を置き換えるため、または構造を精密化するために側鎖の予測を使用する場合は、結晶の対称性を考慮できることが非常に有用になる。第２に、ＳＣＷＲＬ４を用いたタンパク質−タンパク質インターフェイスにおける側鎖のコンフォメーションの予測が、表面上にあるが、タンパク質インターフェイスにない側鎖よりも有意に良好になりやすいことはいくらかの徴候である。
【０１５５】
第２に重要な課題は、以前に研究された、結晶における多くの側鎖の明らかな不規則性である(Shapovalov et al. (2007) Proteins, 66:279-303)。予測の正確度が、電子密度が増加するのに伴って単調に改善され、したがって結晶において１つのコンフォメーションにはっきり配置される側鎖が最も容易に予測されることが示された。ＳＣＷＲＬ４アルゴリズムは、十分に高速であり、残りの側鎖のコンフォメーションを予測することによって各側鎖の各回転異性体のエネルギーを推定することが可能である。このように、コンフォメーションにおける関係している変化を説明することができる。
【０１５６】
本発明のある特定の好ましい実施形態を上に記載し、詳細に例示したが、本発明はそのような実施形態に限定されるものではない。以下の特許請求の範囲に記載の本発明の範囲および主旨から逸脱することなく、それらに種々の改変を行うことができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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