(57)【要約】  ブタノールを、微生物発酵を通じて生産するための方法であって、ここで上記ブタノール生成物は、第１の溶媒および第２の溶媒を含む水不混和性抽出剤組成物への抽出によって取り出される方法が提供される。第１の溶媒は、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アルコール、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸のエステル、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アルデヒド、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アミド、およびそれらの混合物からなる群から選択される。第２の溶媒は、Ｃ７〜Ｃ１１アルコール、Ｃ７〜Ｃ１１カルボン酸、Ｃ７〜Ｃ１１カルボン酸のエステル、Ｃ７〜Ｃ１１アルデヒド、およびそれらの混合物からなる群から選択される。また、ブタノールを発酵培地から回収するための方法が提供される。
2012523245.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
発酵培地からブタノールを回収するための方法であって、
ａ）ブタノール、水、少なくとも１つの発酵性炭素源、および少なくとも１つの発酵性炭素源を含む発酵培地からブタノールを生産する遺伝子組換え微生物を含む発酵培地を備えるステップと、
ｂ）該発酵培地を、第１の溶媒および第２の溶媒を含む水不混和性抽出剤組成物と接触させて、水相およびブタノール含有有機相を含む二相混合物を形成させるステップで、ここで第１の溶媒は、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アルコール、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸のエステル、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アルデヒド、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アミド、およびそれらの混合物からなる群から選択され、第２の溶媒は、Ｃ７〜Ｃ１１アルコール、Ｃ７〜Ｃ１１カルボン酸、Ｃ７〜Ｃ１１カルボン酸のエステル、Ｃ７〜Ｃ１１アルデヒド、およびそれらの混合物からなる群から選択される、ステップと、
ｃ）ブタノール含有有機相を水相から分離させるステップと、
ｄ）ブタノールをブタノール含有有機相から回収して、回収ブタノールを生産するステップと、
を含む、上記方法。
【請求項２】
ブタノールを生産するための方法であって、
ａ）少なくとも１つの発酵性炭素源を含む発酵培地からブタノールを生産する遺伝子組換え微生物を備えるステップと、
ｂ）該微生物を、水相と、第１の溶媒および第２の溶媒を含む水不混和性抽出剤組成物とを含む二相発酵培地中で、ブタノールを抽出剤組成物に抽出させるのに十分な時間、増殖させて、ブタノール含有有機相を形成させるステップで、ここで第１の溶媒は、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アルコール、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸のエステル、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アルデヒド、およびそれらの混合物からなる群から選択され、第２の溶媒は、Ｃ７〜Ｃ１１アルコール、Ｃ７〜Ｃ１１カルボン酸、Ｃ７〜Ｃ１１カルボン酸のエステル、Ｃ７〜Ｃ１１アルデヒド、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アミド、およびそれらの混合物からなる群から選択され、ここで二相発酵培地は、水不混和性抽出剤組成物の約１０容量％〜約９０容量％を含む、ステップと、
ｃ）ブタノール含有有機相を水相から分離させるステップと、
ｄ）ブタノールをブタノール含有有機相から回収し、回収ブタノールを生産するステップと、
を含む、上記方法。
【請求項３】
ブタノールを生産するための方法であって、
ａ）少なくとも１つの発酵性炭素源を含む発酵培地からブタノールを生産する遺伝子組換え微生物を備えるステップと、
ｂ）該微生物を、発酵培地中で成長させるステップで、ここで微生物は、ブタノールを発酵培地中に生産して、ブタノール含有発酵培地を生産する、ステップと、
ｃ）該ブタノール含有発酵培地の少なくとも一部を、第１の溶媒および第２の溶媒を含む水不混和性抽出剤組成物と接触させて、水相およびブタノール含有有機相を含む二相混合物を形成させるステップで、ここで第１の溶媒は、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アルコール、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸のエステル、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アルデヒド、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アミド、およびそれらの混合物からなる群から選択され、前記第２の溶媒は、Ｃ７〜Ｃ１１アルコール、Ｃ７〜Ｃ１１カルボン酸、Ｃ７〜Ｃ１１カルボン酸のエステル、Ｃ７〜Ｃ１１アルデヒド、およびそれらの混合物からなる群から選択される、ステップと、
ｄ）ブタノール含有有機相を水相から分離させるステップと、
ｅ）ブタノールをブタノール含有有機相から回収するステップと、
ｆ）水相の少なくとも一部を発酵培地に返すステップと、
を含む、上記方法。
【請求項４】
ブタノールは、イソブタノールである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
抽出剤組成物は、第１および第２の溶媒の総容量に基づいて約３０パーセント〜約９０パーセントの第１の溶媒を含有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
発酵培地に対する抽出剤組成物の比は、容量：容量ベースで約１：２０〜約２０：１である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
発酵培地を、抽出剤組成物と接触させる前に、第１の溶媒と接触させるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
抽出剤組成物と接触させるステップは、第１の溶媒と接触させるステップと同じ容器内で行われる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ａ）発酵培地からガスでブタノールをストリッピングして、ブタノール含有気相を形成させるステップと、
ｂ）ブタノール含有気相からブタノールを回収するステップと、
を含むプロセスにより、発酵培地からブタノールの一部を同時に取り出す、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
発酵培地は、エタノールをさらに含有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
エタノールは、ブタノール含有有機相中に存在する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ａ）イソブタノール、水、少なくとも１つの発酵性炭素源、およびイソブタノールを発酵培地から生産する遺伝子組換え微生物を含む発酵培地、ならびに
ｂ）Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アルコール、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸のエステル、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アルデヒドおよびそれらの混合物からなる群から選択される第１の溶媒と、Ｃ７〜Ｃ１１アルコール、Ｃ７〜Ｃ１１カルボン酸、Ｃ７〜Ｃ１１カルボン酸のエステル、Ｃ７〜Ｃ１１アルデヒド、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アミド、およびそれらの混合物からなる群から選択される第２の溶媒と、を含む水不混和性有機抽出剤組成物、
を含む二相混合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本願は、米国仮特許出願第６１／１６８６４０号明細書、米国仮特許出願第６１／１６８６４２号明細書、および米国仮特許出願第６１／１６８６４５号明細書（これら全部は２００９年４月１３日に出願された）、ならびに、米国仮特許出願第６１／２３１，６９７号明細書、米国仮特許出願第６１／２３１６９８号明細書、および米国仮特許出願第６１／２３１６９９号明細書（これら全部は２００９年８月６日に出願された）の優先権の便益性を主張する。参照される出願の各々は、その全体が参照により本明細書中で援用される。
【０００２】
本発明は、バイオ燃料の分野に関する。より詳細には、本発明は、微生物発酵を通じてブタノールを生成するための方法に関し、そこでブタノール生成物は、発酵の間、第１の溶媒および第２の溶媒を含む水不混和性抽出剤組成物への抽出によって取り出される。
【０００３】
ブタノールは、種々の用途、例えば燃料添加剤として、プラスチック産業における化学原料として、さらに食品および香料産業における食品等級の抽出剤としての用途を有する重要な産業化学物質である。毎年、１００〜１２０億ポンドのブタノールが石油化学的手段によって生産されており、この化学物質に対する需要は高まる可能性が高い。
【０００４】
いくつかの化学合成方法は既知であるが、ブタノールを生成するこれらの方法は、石油化学に由来する出発原料を使用し、一般に高価であり、環境に優しいとはいえない。発酵によってブタノールを生成するいくつかの方法もまた既知であり、例えばアセトン、１−ブタノール、およびエタノールの混合物を生産する発酵プロセスであるＡＢＥプロセスが挙げられる。クロストリジウム・アセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）によるアセトン−ブタノール−エタノール（ＡＢＥ）発酵は、最古の既知の工業発酵の１つであり、これらの溶媒の生成に関与する経路および遺伝子も同様である。ＡＢＥプロセスによる１−ブタノールの生成は、クロストリジウム・アセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）に対する１−ブタノールの毒性効果によって制限される。細菌に対して毒性を示さない特定の抽出剤を使用する原位置抽出発酵法は、クロストリジウム・アセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）を使用する発酵により、１−ブタノールの生成を促進することが報告されている（非特許文献１、２および３を参照）。
【０００５】
上記の天然クロストリジウム・アセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）に対し、１−ブタノール、２−ブタノール、およびイソブタノール生合成経路を発現する組換え微生物生成宿主についても記載がなされている。これらの組換え宿主は、アセトンおよびエタノールなどの副生成物を生成しないことから、ＡＢＥプロセスと比較して高収率でブタノールを生成する可能性を有する。これらの組換え宿主の場合、ブタノールの生物学的生成は、発酵において使用される宿主微生物のブタノール毒性閾値によって制限されるように見られる。特許文献１は、毒性の課題を克服する、少なくとも１つの発酵性炭素源からブタノールを作製する方法を開示しており、組換え微生物宿主を利用する発酵（ここでブタノールは、発酵の間、特定の有機抽出剤に抽出される）により、ブタノール生成の有効力価、有効速度、および有効収量の増大がもたらされる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００９０３０５３７０号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｒｏｆｆｌｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．３１：１３５−１４３頁、１９８８年；
【非特許文献２】Ｒｏｆｆｌｅｒら、Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ２：１−１２頁、１９８７年
【非特許文献３】Ｅｖａｎｓら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：１６６２−１６６７頁、１９８８年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
発酵培地からブタノールを生成し、回収するための改善された方法は、継続的に探求がなされている。より低コストのプロセスおよびプロセス操作性に対する改善もまた望まれている。発酵培地とともに使用される改善された抽出剤、例えば、より高い分配係数、より低い粘度、より低い密度、商業的に有用な沸点、および微生物との十分な生体適合性を示す抽出剤の同定については、常に探求がなされている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発酵培地からブタノールを回収するための方法であって、
ａ）ブタノール、水、少なくとも１つの発酵性炭素源、および少なくとも１つの発酵性炭素源を含む発酵培地からブタノールを生成する遺伝子組換え微生物を含む発酵培地を提供するステップと、
ｂ）発酵培地を、第１の溶媒および第２の溶媒を含む水不混和性抽出剤組成物と接触させ、水相およびブタノール含有有機相を含む二相混合物を形成するステップと、ここで、第１の溶媒は、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アルコール、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸のエステル、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アルデヒド、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アミド、およびそれらの混合物からなる群から選択され、かつ第２の溶媒は、Ｃ７〜Ｃ１１アルコール、Ｃ７〜Ｃ１１カルボン酸、Ｃ７〜Ｃ１１カルボン酸のエステル、Ｃ７〜Ｃ１１アルデヒド、およびそれらの混合物からなる群から選択される、
ｃ）ブタノール含有有機相を水相から分離させるステップと、
ｄ）ブタノールをブタノール含有有機相から回収し、回収ブタノールを生成するステップと、
を含む方法が本明細書中に提供される。
【００１０】
また、ブタノールを生成するための方法であって、
ａ）ブタノールを、少なくとも１つの発酵性炭素源を含む発酵培地から生成する遺伝子組換え微生物を提供するステップと、
ｂ）微生物を、水相と第１の溶媒および第２の溶媒を含む水不混和性抽出剤組成物とを含む二相発酵培地中で、ブタノールを抽出剤組成物に抽出することを可能にするのに十分な時間、成長させ、ブタノール含有有機相を形成するステップと、ここで、第１の溶媒は、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アルコール、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸のエステル、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アルデヒド、およびそれらの混合物からなる群から選択され、かつ第２の溶媒は、Ｃ７〜Ｃ１１アルコール、Ｃ７〜Ｃ１１カルボン酸、Ｃ７〜Ｃ１１カルボン酸のエステル、Ｃ７〜Ｃ１１アルデヒド、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アミド、およびそれらの混合物からなる群から選択され、ここで二相発酵培地は、水不混和性抽出剤組成物の約１０容量％〜約９０容量％を含み、
ｃ）ブタノール含有有機相を水相から分離させるステップと、
ｄ）ブタノールをブタノール含有有機相から回収し、回収ブタノールを生成するステップと、
を含む方法が提供される。
【００１１】
また、ブタノールを生成するための方法であって、
ａ）ブタノールを、少なくとも１つの発酵性炭素源を含む発酵培地から生成する遺伝子組換え微生物を提供するステップと、
ｂ）微生物を発酵培地中で成長させるステップと、ここで微生物は、ブタノールを発酵培地中に生成し、ブタノール含有発酵培地を生成する、
ｃ）ブタノール含有発酵培地の少なくとも一部を、第１の溶媒および第２の溶媒を含む水不混和性抽出剤組成物と接触させ、水相およびブタノール含有有機相を含む二相混合物を形成するステップと、ここで、第１の溶媒は、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アルコール、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸のエステル、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アルデヒド、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アミド、およびそれらの混合物からなる群から選択され、かつ第２の溶媒は、Ｃ７〜Ｃ１１アルコール、Ｃ７〜Ｃ１１カルボン酸、Ｃ７〜Ｃ１１カルボン酸のエステル、Ｃ７〜Ｃ１１アルデヒド、およびそれらの混合物からなる群から選択される、
ｄ）ブタノール含有有機相を水相から分離させるステップと、
ｅ）ブタノールをブタノール含有有機相から回収するステップと、
ｆ）水相の少なくとも一部を発酵培地に戻すステップと、
を含む方法が提供される。
【００１２】
一部の実施形態では、ブタノールは、１−ブタノールである。一部の実施形態では、ブタノールは、２−ブタノールである。一部の実施形態では、ブタノールは、イソブタノールである。
【００１３】
一部の実施形態では、第１の溶媒は、オレイルアルコール、ベヘニルアルコール、セチルアルコール、ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、ステアリルアルコール、オレイン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、ミリスチン酸メチル、オレイン酸メチル、ラウリンアルデヒド、１−ドデカノール、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。一部の実施形態では、第１の溶媒は、オレイルアルコールを含む。
【００１４】
一部の実施形態では、第２の溶媒は、１−ノナノール、１−デカノール、１−ウンデカノール、２−ウンデカノール、１−ノナナール、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。一部の実施形態では、第２の溶媒は、１−ノナノール、１−デカノール、１−ノナナール、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。一部の実施形態では、第２の溶媒は、１−デカノールを含む。一部の実施形態では、第１の溶媒は、オレイルアルコールを含み、また第２の溶媒は、１−デカノールを含む。
【００１５】
一部の実施形態では、抽出剤は、第１および第２の溶媒の総容量を基準として約３０パーセント〜約９０パーセントの第１の溶媒を含有する。一部の実施形態では、抽出剤は、約５０パーセント〜約７０パーセントの第１の溶媒を含有する。一部の実施形態では、発酵培地に対する抽出剤組成物の比は、容量：容量を基準として約１：２０〜約２０：１である。
【００１６】
一部の実施形態では、接触させるステップは、発酵培地を、発酵培地および第１の溶媒を第２の溶媒と接触させる前に、第１の溶媒と接触させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、第２の溶媒と接触させるステップは、第１の溶媒と接触させるステップと同じ容器内で行われる。一部の実施形態では、ブタノールの一部は、
ａ）ブタノールを、発酵培地からガスでストリッピングし、ブタノール含有気相を形成するステップと、
ｂ）ブタノールをブタノール含有気相から回収するステップと、
を含むプロセスにより、発酵培地から同時に除去される。
【００１７】
一部の実施形態では、遺伝子組換え微生物は、細菌、シアノバクテリア、糸状真菌、および酵母からなる群から選択される。一部の実施形態では、細菌は、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、およびブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）からなる群から選択される。一部の実施形態では、細菌は、ａ）イソブタノール生合成経路をコードする遺伝子セット；ならびに、ｂ）次の遺伝子、すなわち、ｐｆｌＢ、ＬｄｈＡ、ａｄｈＥ、およびｆｒｄＡ、ｆｒｄＢ、ｆｒｄＣ、およびＦｒｄＤのうちの少なくとも１つの欠失、を含む大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である。一部の実施形態では、遺伝子セットは、ａ）配列番号１で示されるｂｕｄＢ；ｂ）配列番号３で示されるｉｌｖＣ；ｃ）配列番号５で示されるｉｌｖＤ；ｄ）配列番号７で示されるｋｉｖＤ；ならびにｅ）配列番号９で示されるｓａｄＢ、を含む。一部の実施形態では、酵母は、イッサチェンキア（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）およびサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）からなる群から選択される。
【００１８】
一部の実施形態では、遺伝子組換え微生物は、ブタノール生合成経路を有する。実施形態では、ブタノール生合成経路は、微生物に対して異種である少なくとも１つの遺伝子を含む。一部の実施形態では、ブタノール生合成経路は、微生物に対して異種である少なくとも２つの遺伝子を含む。
【００１９】
一部の実施形態では、発酵培地は、エタノールをさらに含有し、かつブタノール含有有機相は、エタノールを含有する。
【００２０】
また、ブタノール、水、少なくとも１つの発酵性炭素源、およびブタノールを発酵培地から生成する遺伝子組換え微生物を含む発酵培地と、第１の溶媒および第２の溶媒を含む水不混和性抽出剤組成物と、を含む二相混合物が提供され、ここで、第１の溶媒は、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アルコール、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸のエステル、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アルデヒド、およびそれらの混合物からなる群から選択され、かつ第２の溶媒は、Ｃ７〜Ｃ１１アルコール、Ｃ７〜Ｃ１１カルボン酸、Ｃ７〜Ｃ１１カルボン酸のエステル、Ｃ７〜Ｃ１１アルデヒド、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アミド、およびそれらの混合物からなる群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】抽出剤に含まれる第１の溶媒および第２の溶媒が、発酵培地を発酵容器内で抽出剤と接触させる前に容器内で結合される、本発明の方法の一実施形態を略図で例示する。
【図２】抽出剤に含まれる第１の溶媒および第２の溶媒が、発酵培地が抽出剤と接触される発酵容器に別々に添加される、本発明の方法の一実施形態を略図で例示する。
【図３】抽出剤に含まれる第１の溶媒および第２の溶媒が、発酵培地を抽出剤と接触させるための異なる発酵容器に別々に添加される、本発明の方法の一実施形態を略図で例示する。
【図４】生成物の抽出が発酵槽の下流で行われ、かつ抽出剤に含まれる第１の溶媒および第２の溶媒が、発酵培地を異なる容器内で抽出剤と接触させる前に、容器内で結合される、本発明の方法の一実施形態を略図で例示する。
【図５】生成物の抽出が発酵槽の下流で行われ、かつ抽出剤に含まれる第１の溶媒および第２の溶媒が、発酵培地が抽出剤と接触される容器に別々に添加される、本発明の方法の一実施形態を略図で例示する。
【図６】生成物の抽出が発酵槽の下流で行われ、かつ抽出剤に含まれる第１の溶媒および第２の溶媒が、発酵培地を抽出剤と接触させるための異なる容器に別々に添加される、本発明の方法の一実施形態を略図で例示する。
【図７】生成物の抽出が、少なくとも１つのバッチ発酵槽内で、発酵もろみ（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｍａｓｈ）の底もしくはその近辺での第１の溶媒および第２の溶媒を含む水不混和性抽出剤の並行流を介して行われ、発酵槽は抽出剤（発酵槽の上部もしくはその近辺で発酵槽から流出する）で充填される、本発明の方法の一実施形態を略図で例示する。
【００２２】
以下の配列は、米国特許施行規則第１．８２１−１．８２５条（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列開示を有する特許出願の要件−配列の規則（Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ／ｏｒ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ−ｔｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｕｌｅｓ）」）に従い、世界知的所有権機関（Ｗｏｒｌｄ  Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｙ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）（ＷＩＰＯ）基準ＳＴ．２５（１９９８年）、ならびにＥＰＯおよびＰＣＴの配列表の要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、ならびに実施細則の第２０８節および付録Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データにおいて用いられる記号および形式は、米国特許施行規則第１．８２２条に示される規則に従う。
【００２３】
【表１】
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【００２４】
配列番号１１〜２２は、下記の本明細書中の遺伝子組換え微生物の項に記載される組換え大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株の作製に使用されるプライマーのヌクレオチド配列である。
【００２５】
配列番号２３は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株Ｋ−１２  ＭＧ１６５５由来のｐｆｌＢ遺伝子のヌクレオチド配列である。
【００２６】
配列番号２４は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株Ｋ−１２  ＭＧ１６５５由来のｌｄｈＡ遺伝子のヌクレオチド配列である。
【００２７】
配列番号２５は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株Ｋ−１２  ＭＧ１６５５由来のａｄｈＥ遺伝子のヌクレオチド配列である。
【００２８】
配列番号２６は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株Ｋ−１２  ＭＧ１６５５由来のｆｒｄＡ遺伝子のヌクレオチド配列である。
【００２９】
配列番号２７は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株Ｋ−１２  ＭＧ１６５５由来のｆｒｄＢ遺伝子のヌクレオチド配列である。
【００３０】
配列番号２８は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株Ｋ−１２  ＭＧ１６５５由来のｆｒｄＣ遺伝子のヌクレオチド配列である。
【００３１】
配列番号２９は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株Ｋ−１２  ＭＧ１６５５由来のｆｒｄＤ遺伝子のヌクレオチド配列である。
【００３２】
配列番号３０は、ｐＬＨ４７５−Ｚ４Ｂ８のヌクレオチド配列である。
【００３３】
配列番号３１は、ＣＵＰ１プロモーターのヌクレオチド配列である。
【００３４】
配列番号３４は、ＣＹＣ１ターミネーターのヌクレオチド配列である。
【００３５】
配列番号３５は、ＩＬＶ５プロモーターのヌクレオチド配列である。
【００３６】
配列番号３８は、ＩＬＶ５ターミネーターのヌクレオチド配列である。
【００３７】
配列番号３９は、ＦＢＡ１プロモーターのヌクレオチド配列である。
【００３８】
配列番号４２は、ｐＬＨ４６８のヌクレオチド配列である。
【００３９】
配列番号４７は、ｐＮＹ８のヌクレオチド配列である。
【００４０】
配列番号４８は、ＧＰＤ１プロモーターのヌクレオチド配列である。
【００４１】
配列番号４９、５０、５４、５５、６２〜７１、７３〜８３および８５〜８６は、実施例において使用されるプライマーのヌクレオチド配列である。
【００４２】
配列番号５１は、ｐＲＳ４２５：：ＧＰＭ−ｓａｄＢのヌクレオチド配列である。
【００４３】
配列番号５２は、ＧＰＭ１プロモーターのヌクレオチド配列である。
【００４４】
配列番号５３は、ＡＤＨ１ターミネーターのヌクレオチド配列である。
【００４５】
配列番号５６は、ｐＲＳ４２３  ＦＢＡ  ｉｌｖＤ（Ｓｔｒｅｐ）のヌクレオチド配列である。
【００４６】
配列番号５７は、ＦＢＡターミネーターのヌクレオチド配列である。
【００４７】
配列番号６０は、ＧＰＭ−ｓａｄＢ−ＡＤＨｔセグメントのヌクレオチド配列である。
【００４８】
配列番号６１は、ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ｒのヌクレオチド配列である。
【００４９】
配列番号７２は、ｉｌｖＤ−ＦＢＡ１ｔセグメントのヌクレオチド配列である。
【００５０】
配列番号８４は、ＵＲＡ３ｒ２鋳型ＤＮＡのヌクレオチド配列である。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
本発明は、ブタノールを、水不混和性抽出剤組成物への抽出により、微生物発酵培地から回収するための方法を提供する。発酵培地を、第１の溶媒および第２の溶媒を含む水不混和性抽出剤組成物と接触させ、水相およびブタノール含有有機相を含む二相混合物を形成するステップを含む方法が用いられる。第１および第２の溶媒は、抽出剤に対して高いブタノール分配係数が得られる一方、任意の低下した生体適合性を緩和するように選択される。ブタノール含有有機相は水相から分離され、ブタノールは回収される。ブタノールを生成するための方法もまた提供される。
【００５２】
定義
以下の定義は、本開示において使用される。
【００５３】
用語「水不混和性」は、発酵培地などの水溶液と混合し、１つの液相を形成することができない抽出剤または溶媒混合物を示す。
【００５４】
用語「抽出剤」は、本明細書で使用される場合、任意のブタノール異性体の抽出に使用される少なくとも２つの有機溶媒の混合物を示す。
【００５５】
用語「二相発酵培地」は、本明細書で使用される場合、発酵培地（すなわち水相）および適量の水不混和性有機抽出剤を含む二相成長培地を示す。
【００５６】
用語「有機相」は、本明細書で使用される場合、水性発酵培地を水不混和性有機抽出剤と接触させることによって得られる、有機抽出剤を含む二相混合物の相を示す。
【００５７】
用語「水相」は、本明細書で使用される場合、水性発酵培地を水不混和性有機抽出剤と接触させることによって得られる、水を含む二相混合物の相を示す。
【００５８】
用語「ブタノール」は、本明細書で使用される場合、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブタノール、またはこれらの混合物を示す。イソブタノールはまた、２−メチル−１−プロパノールとして知られる。
【００５９】
用語「発酵性炭素源」は、例えば本明細書中に開示の微生物によって代謝可能な炭素源を示す。好適な発酵性炭素源は、限定はされないが、単糖、例えば、グルコースまたはフルクトース；二糖、例えば、乳糖またはスクロース；オリゴ糖；多糖、例えば、デンプン、セルロース、またはリグノセルロース、ヘミセルロース；１炭素基質；およびこれらの組み合わせを含む。
【００６０】
用語「脂肪酸」は、本明細書で使用される場合、飽和または不飽和のいずれかである、Ｃ７〜Ｃ２２炭素原子の長い脂肪族鎖を有するカルボン酸を示す。
【００６１】
用語「脂肪族アルコール」は、本明細書で使用される場合、飽和または不飽和のいずれかである、Ｃ７〜Ｃ２２炭素原子の長い脂肪族鎖を有するアルコールを示す。
【００６２】
用語「脂肪族アルデヒド」は、本明細書で使用される場合、飽和または不飽和のいずれかである、Ｃ７〜Ｃ２２炭素原子の長い脂肪族鎖を有するアルデヒドを示す。
【００６３】
用語「脂肪族アミド」は、本明細書で使用される場合、飽和または不飽和のいずれかである、Ｃ１２〜Ｃ２２炭素原子の長い脂肪族鎖を有するアミドを示す。
【００６４】
本明細書中でＫｐとして略称される用語「分配係数」は、平衡状態にある２つの非混和性溶媒の二相の混合物中での化合物の濃度の比を意味する。分配係数は、２つの非混和性溶媒間での化合物の溶解度差の尺度である。用語「ブタノールにおける分配係数」は、本明細書で使用される場合、発酵培地を含む水相と抽出剤を含む有機相との間でのブタノールの濃度の比を示す。分配係数は、本明細書で使用される場合、分布係数という用語と同義である。
【００６５】
用語「ブタノール生合成経路」は、本明細書で使用される場合、１−ブタノール、２−ブタノール、またはイソブタノールを生成するための酵素経路を示す。
【００６６】
用語「１−ブタノール生合成経路」は、本明細書で使用される場合、アセチル補酵素Ａ（アセチル−ＣｏＡ）から１−ブタノールを生成するための酵素経路を示す。
【００６７】
用語「２−ブタノール生合成経路」は、本明細書で使用される場合、ピルビン酸塩から２−ブタノールを生成するための酵素経路を示す。
【００６８】
用語「イソブタノール生合成経路」は、本明細書で使用される場合、ピルビン酸塩からイソブタノールを生成するための酵素経路を示す。
【００６９】
用語「遺伝子」は、場合によってコード配列に対して先行する調節配列（５'非コード配列）および後続する調節配列（３'非コード配列）を含む、特定のタンパク質として発現可能な核酸断片を示す。「天然遺伝子」は、それ自体の調節配列とともに天然に見出される遺伝子を示す。「キメラ遺伝子」は、天然遺伝子でない任意の遺伝子を示し、天然には同時に見出されることのない調節配列およびコード配列を含む。したがって、キメラ遺伝子は、異なる供給源に由来する調節配列およびコード配列、または、同じ供給源に由来するが、天然に見出される場合とは異なる様式で配列される調節配列およびコード配列を含んでもよい。「内因性遺伝子」は、生物のゲノム内で天然の位置に存在する天然遺伝子を示す。「外来遺伝子」または「異種遺伝子」は、宿主生物において通常見出されないが、遺伝子導入によって宿主生物に導入される遺伝子を示す。外来遺伝子は、非天然生物に挿入される天然遺伝子、またはキメラ遺伝子を含み得る。
【００７０】
用語「有効力価」は、本明細書で使用される場合、発酵培地の１リットルあたりの発酵によって生成されるブタノールの総量を示す。ブタノールの総量は、発酵培地中のブタノールの量と、ガスストリッピングが用いられる場合での有機抽出剤組成物および気相から回収されるブタノールの量を含む。
【００７１】
用語「好気的条件」は、本明細書で使用される場合、酸素の存在下での成長条件を意味する。
【００７２】
用語「微好気的条件」は、本明細書で使用される場合、低レベルの酸素（すなわち正常な大気中酸素レベル未満）下での成長条件を意味する。
【００７３】
用語「嫌気的条件」は、本明細書で使用される場合、酸素の不在下での成長条件を意味する。
【００７４】
用語「最少培地」は、本明細書で使用される場合、一般にアミノ酸が存在しない場合での、成長のために考えられる最少の栄養素を含有する成長培地を示す。最少培地は、典型的には、発酵性炭素源およびさまざまな塩（微生物および成長条件の間で変わってもよい）を含有し、ここでこれらの塩は、一般に、微生物におけるタンパク質および核酸の合成を可能にするマグネシウム、窒素、リン、および硫黄などの必須元素を提供する
【００７５】
用語「限定培地」は、本明細書で使用される場合、既知の量のすべての成分、例えば、限定された炭素源および窒素源、ならびに微生物によって必要とされる微量元素およびビタミンを含有する成長培地を示す。
【００７６】
用語「生体適合性」は、本明細書で使用される場合、微生物が抽出剤の存在下でグルコースを利用する能力の尺度を示す。生体適合性のある抽出剤は、微生物がグルコースを利用することを可能にする。非生体適合性の（すなわち生物毒性がある）抽出剤では、微生物のグルコースの利用は、例えば抽出剤が存在しない場合の速度の約２５％以下でしか可能とならない。
【００７７】
用語「℃」は、セ氏温度を意味する。
【００７８】
用語「ＯＤ」は、光学密度を意味する。
【００７９】
用語「ＯＤ６００」は、６００ｎｍの波長での光学密度を示す。
【００８０】
用語ＡＴＣＣは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を示す。
【００８１】
用語「ｓｅｃ」は、秒を意味する。
【００８２】
用語「ｍｉｎ」は、分を意味する。
【００８３】
用語「ｈ」は、時間を意味する。
【００８４】
用語「ｍＬ」は、ミリリットルを意味する。
【００８５】
用語「Ｌ」は、リットルを意味する。
【００８６】
用語「ｇ」は、グラムを意味する。
【００８７】
用語「ｍｍｏｌ」は、ミリモルを意味する。
【００８８】
用語「Ｍ」は、モル濃度を意味する。
【００８９】
用語「μＬ」は、マイクロリットルを意味する。
【００９０】
用語「μｇ」は、マイクログラムを意味する。
【００９１】
用語「μｇ／ｍＬ」は、マイクログラム／リットルを意味する。
【００９２】
用語「ｍＬ／分」は、ミリリットル／分を意味する。
【００９３】
用語「ｇ／Ｌ」は、グラム／リットルを意味する。
【００９４】
用語「ｇ／Ｌ／ｈ」は、グラム／リットル／時間を意味する。
【００９５】
用語「ｍｍｏｌ／分／ｍｇ」は、ミリモル／分／ミリグラムを意味する。
【００９６】
用語「ｔｅｍｐ」は、温度を意味する。
【００９７】
用語「ｒｐｍ」は、回転／分を意味する。
【００９８】
用語「ＨＰＬＣ」は、高圧ガスクロマトグラフィーを意味する。
【００９９】
用語「ＧＣ」は、ガスクロマトグラフィーを意味する。
【０１００】
出願人は、特に、本開示において引用される全参考文献の内容全体を援用する。さらに、量、濃度、または他の値もしくはパラメータが、範囲、好ましい範囲、または好ましい上限値および好ましい下限値のリストのいずれかとして与えられる場合、これは、範囲が別々に開示されるか否かとは無関係に、任意の範囲上限もしくは好ましい値と任意の範囲下限もしくは好ましい値との任意のペアから形成される全範囲を具体的に開示するものとして理解されるべきである。数値の範囲が本明細書中で列挙される場合、他に明記されない限り、同範囲は、その終点と同範囲内のすべての整数および分数とを含むように意図される。本発明の範囲が、範囲を定義する場合に列挙される特定の値に制限されることは意図されない。
【０１０１】
ブタノール生合成経路
ブタノールの生成に適した生合成経路は、当該技術分野で既知であり、また特定の好適な経路は、本明細書中に記載されている。一部の実施形態では、ブタノール生合成経路は、宿主細胞に対して異種である少なくとも１つの遺伝子を含む。一部の実施形態では、ブタノール生合成経路は、宿主細胞に対して異種である２つ以上の遺伝子を含む。一部の実施形態では、ブタノール生合成経路は、生合成経路のそれぞれのステップに対応するポリペプチドをコードする異種遺伝子を含む。
【０１０２】
同様に、指定される基質から生成物への変換に対する触媒能を有する特定の好適なタンパク質は、本明細書中に記載され、かつ他の好適なタンパク質が、当該技術分野で提供される。例えば、米国特許出願公開第２００８０２６１２３０号明細書および米国特許出願公開第２００９０１６３３７６号明細書（参照により本明細書中に援用される）は、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼについて記載し；米国特許出願第１２／５６９，６３６号明細書（参照により援用される）は、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼについて記載し；アルコールデヒドロゲナーゼは、米国特許出願公開第２００９０２６９８２３号明細書（参照により本明細書中に援用される）中に記載されている。
【０１０３】
１−ブタノール生合成経路
使用可能な１−ブタノールを生成するための生合成経路は、米国特許出願公開第２００８０１８２３０８Ａ１号明細書（参照により本明細書中に援用される）においてＤｏｎａｌｄｓｏｎらによって記載がなされている。この生合成経路は、次の基質から生成物への変換を含む。
ａ）アセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡ（例えばアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼによって触媒され得る）；
ｂ）アセトアセチル−ＣｏＡから３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ（例えば３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼによって触媒され得る）；
ｃ）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡからクロトニル−ＣｏＡ（例えばクロトナーゼによって触媒され得る）；
ｄ）クロトニル−ＣｏＡからブチリル−ＣｏＡ（例えばブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼによって触媒され得る）；
ｅ）ブチリル−ＣｏＡからブチルアルデヒド（例えばブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼによって触媒され得る）；および
ｆ）ブチルアルデヒドから１−ブタノール（例えば１−ブタノールデヒドロゲナーゼによって触媒され得る）。
【０１０４】
一部の実施形態では、１−ブタノール生合成経路は、酵母細胞に対して異種の、少なくとも１つの遺伝子、少なくとも２つの遺伝子、少なくとも３つの遺伝子、少なくとも４つの遺伝子、または少なくとも５つの遺伝子を含む。
【０１０５】
２−ブタノール生合成経路
使用可能な２−ブタノールを生成するための生合成経路は、米国特許出願公開第２００７０２５９４１０Ａ１号明細書および米国特許出願公開第２００７０２９２９２７Ａ１号明細書、およびＰＣＴ公開の国際公開第２００７／１３０５２１号パンフレット（これら全部が、参照により本明細書中に援用される）においてＤｏｎａｌｄｓｏｎらによって記載がなされている。１つの２−ブタノール生合成経路は、次の基質から生成物への変換を含む。
ａ）ピルビン酸からα−アセト乳酸（例えばアセト乳酸シンターゼによって触媒され得る）；
ｂ）α−アセト乳酸からアセトイン（例えばアセト乳酸デカルボキシラーゼによって触媒され得る）；
ｃ）アセトインから２，３−ブタンジオール（例えばブタンジオールデヒドロゲナーゼによって触媒され得る）；
ｄ）２，３−ブタンジオールから２−ブタノン（例えばブタンジオールデヒドラターゼによって触媒され得る）；および
ｅ）２−ブタノンから２−ブタノール（例えば２−ブタノールデヒドロゲナーゼによって触媒され得る）。
【０１０６】
一部の実施形態では、２−ブタノール生合成経路は、酵母細胞に対して異種の、少なくとも１つの遺伝子、少なくとも２つの遺伝子、少なくとも３つの遺伝子、または少なくとも４つの遺伝子を含む。
【０１０７】
イソブタノール生合成経路
使用可能なイソブタノールを生成するための生合成経路は、米国特許出願公開第２００７００９２９５７Ａ１号明細書およびＰＣＴ公開の国際公開第２００７／０５０６７１号パンフレット（参照により本明細書中に援用される）中に記載されている。１つのイソブタノール生合成経路は、次の基質から生成物への変換を含む。
ａ）ピルビン酸からアセト乳酸（例えばアセト乳酸シンターゼによって触媒され得る）；
ｂ）アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｉｓｏｖａｌｅｒａｔｅ）（例えばアセトヒドロキシ酸によって触媒され得る）；
ｃ）２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸からα−ケトイソ吉草酸（例えばアセトヒドロキシ酸デヒドラターゼによって触媒され得る）；
ｄ）α−ケトイソ吉草酸からイソブチルアルデヒド（例えば分枝鎖ケト酸デカルボキシラーゼによって触媒され得る）；および
ｅ）イソブチルアルデヒドからイソブタノール（例えば分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼによって触媒され得る）。
【０１０８】
一部の実施形態では、イソブタノール生合成経路は、酵母細胞に対して異種の、少なくとも１つの遺伝子、少なくとも２つの遺伝子、少なくとも３つの遺伝子、または少なくとも４つの遺伝子を含む。
【０１０９】
遺伝子組換え微生物
ブタノール生成のための微生物宿主は、細菌、シアノバクテリア、糸状真菌および酵母から選択してもよい。使用される微生物宿主は、収率が宿主に対する生成物の毒性によって制限されないように、生成されるブタノール生成物に対して耐性を示す必要がある。ブタノール生成のための微生物宿主の選択は、下記に詳述される。
【０１１０】
高い力価レベルのブタノールで代謝的に活性な微生物は、当該技術分野で周知でない。ブタノール耐性突然変異体は発溶媒性クロストリジア（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）から単離されているが、他の潜在的に有用な細菌株のブタノール耐性に関する情報はほとんど利用できない。細菌におけるアルコール耐性の比較に関する試験の大部分は、ブタノールがエタノールより毒性があることを示唆している（ｄｅ  Ｃａｖａｌｈｏら、Ｍｉｃｒｏｓｃ．Ｒｅｓ．Ｔｅｃｈ．６４：２１５−２２頁（２００４年）およびＫａｂｅｌｉｔｚら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．２２０：２２３−２２７頁（２００３年））。Ｔｏｍａｓら（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８６：２００６−２０１８頁（２００４年））は、クロストリジウム・アセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）における発酵中での１−ブタノールの収率がブタノール毒性によって制限されるかもしれないことを報告している。クロストリジウム・アセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）に対する１−ブタノールの主な効果は、膜機能の破壊である（Ｈｅｒｍａｎｎら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５０：１２３８−１２４３頁（１９８５年））。
【０１１１】
ブタノールの生成のために選択される微生物宿主は、ブタノールに耐性を示し、かつ、下記の導入される生合成経路を用いて炭水化物をブタノールに変換できる必要がある。好適な微生物宿主の選択における基準は、次のもの、すなわち、ブタノールに対する固有の耐性、高率の炭水化物利用、遺伝子操作のための遺伝的ツールの利用可能性、および安定な染色体改変をもたらす能力を含む。
【０１１２】
ブタノールに対する耐性を有する好適な宿主株は、株の固有の耐性に基づくスクリーニングによって同定してもよい。ブタノールに対する微生物の固有の耐性は、最少培地中で成長する場合での成長速度の５０％阻害（ＩＣ５０）に関与するブタノールの濃度を測定することによって測定してもよい。ＩＣ５０値は、当該技術分野で既知の方法を用いて測定してもよい。例えば、目的の微生物は、さまざまな量のブタノールの存在下で成長させてもよく、成長速度は、６００ナノメートルでの光学密度を測定することによって監視してもよい。倍加時間は、成長曲線の対数部分から計算し、成長速度の尺度として使用してもよい。成長の５０％阻害をもたらすブタノールの濃度は、成長のパーセント阻害対ブタノール濃度のグラフから判定してもよい。好ましくは、宿主株は、約０．５％を超える、ブタノールにおけるＩＣ５０を有する必要がある。より好適なのは、ブタノールにおけるＩＣ５０、すなわち約１．５％超を有する宿主株である。特に好適なのは、ブタノールにおけるＩＣ５０、すなわち約２．５％超を有する宿主株である。
【０１１３】
ブタノール生成のための微生物宿主はまた、グルコースおよび／または他の炭水化物を高率で利用する必要がある。大部分の微生物は、炭水化物を利用することができる。しかし、特定の環境微生物は、炭水化物を効率的に利用できず、それ故、好適な宿主とならないであろう。
【０１１４】
宿主を遺伝的に修飾する能力は、任意の組換え微生物の生成にとって必須である。使用してもよい遺伝子導入技術の様式は、エレクトロポレーション、複合、形質導入または天然形質転換によるものを含む。広範囲宿主の複合プラスミドおよび薬剤耐性マーカーが使用可能である。生物とともに使用されるクローニングベクターは、宿主生物に対して、その宿主内で機能可能な抗生物質耐性マーカーの性質に基づいて適合される。
【０１１５】
微生物宿主はまた、さまざまな遺伝子を不活性化することによって炭素流における競合経路を不活性化するため、操作してもよい。これは、不活性化を誘導するためのトランスポゾンまたは染色体組込みベクターのいずれかの可用性を必要とする。さらに、化学的突然変異誘発の影響を受けやすい生成宿主は、化学的突然変異誘発および突然変異体スクリーニングを通じて、固有のブタノール耐性における改善を受けうる。
【０１１６】
上記の基準に基づき、ブタノールの生成に適した微生物宿主は、限定はされないが、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、イサチェンキア（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属およびサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属のメンバーを含む。好ましい宿主は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、アルカリゲネス・ユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、パエニバチルス・マセランス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ）、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス・ガリナラム（Ｅｎｔｅｒｏｃｃｏｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、ペディオコッカス・ペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を含む。
【０１１７】
上記の微生物は、当該技術分野で既知の方法を用いて、遺伝子組換えを行い、発酵性炭素源をブタノール、具体的には１−ブタノール、２−ブタノール、またはイソブタノールに変換してもよい。特に好適な微生物は、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、およびサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）を含み、ここでは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｌ．プランタラム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）およびＳ．セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が特に好ましい。さらに、微生物は、Ｂｒａｍｕｃｃｉら（米国特許出願第１１／７６１４９７号明細書；および国際公開第２００７／１４６３７７号パンフレット）によって記載の方法を用いて単離される上掲の微生物のうちの１つのブタノール耐性株であってもよい。１つのかかる株の例が、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）株ＰＮ０５１２（ＡＴＣＣ：ＰＴＡ−７７２７、米国特許出願第１１／７６１４９７号明細書において２００６年７月１２日に行われた生物学的寄託物）である。
【０１１８】
発酵性炭素源をブタノールに変換することが可能にする遺伝子組換えがなされた微生物は、イソブタノール生合成経路と、イソブタノール生成を制限する競合経路を除外するための次の遺伝子、すなわち（ピルビン酸・ギ酸リアーゼをコードする）配列番号２３として与えられるｐｆｌＢ、（乳酸デヒドロゲナーゼをコードする）配列番号２４として与えられるｌｄｈＡ、（アルコールデヒドロゲナーゼをコードする）配列番号２５として与えられるａｄｈＥ、および（フマル酸レダクターゼをコードする）ｆｒｄＡＢＣＤオペロンを含む少なくとも１つの遺伝子、具体的には配列番号２６として与えられるｆｒｄＡ、配列番号２７として与えられるｆｒｄＢ、配列番号２８として与えられるｆｒｄＣ、および配列番号２９として与えられるｆｒｄＤ、の欠失を含む組換え大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株であってもよい。
【０１１９】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株は、（ａ）次の遺伝子、すなわち、（配列番号２として与えられる）アセト乳酸シンターゼをコードするクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来の（配列番号１として与えられる）ｂｕｄＢ、（配列番号４として与えられる）アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼをコードする大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の（配列番号３として与えられる）ｉｌｖＣ、（配列番号６として与えられる）アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼをコードする大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の（配列番号５として与えられる）ｉｌｖＤ、（配列番号８として与えられる）分枝鎖ケト酸デカルボキシラーゼをコードするラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）由来の（配列番号７として与えられる）ｋｉｖＤ、および（配列番号１０として与えられる）ブタノールデヒドロゲナーゼをコードするアクロモバクター・キシロスオキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）由来の（配列番号９として与えられる）ｓａｄＢによってコードされるイソブタノール生合成経路と、（ｂ）次の遺伝子、すなわちｐｆｌＢ（配列番号２３）、ｌｄｈＡ（配列番号２４）、ａｄｈＥ（配列番号２５）、およびｆｒｄＢ（配列番号２７）の欠失を含んでもよい。イソブタノール生合成経路の遺伝子によってコードされる酵素は、上記のようにピルビン酸塩をイソブタノールに変換するための生成物変換に対して基質を触媒する。詳細には、アセト乳酸シンターゼは、ピルビン酸塩のアセト乳酸塩への変換を触媒し、アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼは、アセト乳酸塩の２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸への変換を触媒し、アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼは、２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸のα−ケトイソ吉草酸への変換を触媒し、分枝鎖ケト酸デカルボキシラーゼは、α−ケトイソ吉草酸のイソブチルアルデヒドへの変換を触媒し、かつブタノールデヒドロゲナーゼは、イソブチルアルデヒドのイソブタノールへの変換を触媒する。この組換え大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株は、本明細書中、下記の当該技術分野で既知の方法（米国特許出願公開第２００９０３０５３７０Ａ１号明細書および米国特許出願公開第２００９０３０５３６９Ａ１号明細書を参照）を用いて作成し得る。
【０１２０】
組換え大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株ＮＧＣＩ−０３１の作成
イソブタノール生合成経路と、次の遺伝子、すなわちｐｆｌＢ（配列番号２３、ピルビン酸・ギ酸リアーゼをコードする）、ｌｄｈＡ（配列番号２４、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする）、ａｄｈＥ（配列番号２５、アルコールデヒドロゲナーゼをコードする）、およびｆｒｄＢ（配列番号２７、フマル酸レダクターゼのサブユニットをコードする）の欠失を含む組換え大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株は、下記のように作成してもよい。イソブタノール生合成経路における遺伝子は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来のｂｕｄＢ（配列番号１として与えられる）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）由来のｉｌｖＣ（配列番号３として示される）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）由来のｉｌｖＤ（配列番号５として与えられる）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）由来のｋｉｖＤ（配列番号７として与えられる）、およびアクロモバクター・キシロスオキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）由来のｓａｄＢ（配列番号９として与えられる）である。組換え株の作成は、２つのステップで行ってもよい。最初に、上記の遺伝子欠失を有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株が作成される。次いで、イソブタノール生合成経路をコードする遺伝子が株に導入される。
【０１２１】
ｐｆｌＢ、ｌｄｈＡ、ａｄｈＥおよびｆｒｄＢ遺伝子の欠失を有する組換え大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株の作成
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株のＫｅｉｏ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｂａｂａら、Ｍｏｌ．Ｓｙｓｔ．Ｂｉｏｌ．、２：１−１１頁、２００６年）は、本明細書中で４ノックアウト（ｆｏｕｒ−ｋｎｏｃｋ  ｏｕｔ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株と称される意図された遺伝子欠失を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の生成に使用可能である。Ｋｅｉｏ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎは、ＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒの方法によって大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＢＷ２５１１３中で生成される単一の遺伝子ノックアウトのライブラリーである（Ｄａｔｓｅｎｋｏ  Ｋ．Ａ．およびＷａｎｎｅｒ  Ｂ．Ｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、Ｕ．Ｓ．Ａ．９７  ６６４０−６６４５頁、２０００年）。Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ中での各欠失遺伝子は、Ｆｌｐリコンビナーゼによって除去可能なＦＲＴで隣接されるカナマイシンマーカーと置換される。４ノックアウト大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株は、ノックアウト−カナマイシンマーカーをＫｅｉｏドナー株からＰ１形質導入によってレシピエント株に移すことによって作成される。ノックアウトを生成するための各Ｐ１形質導入後、カナマイシンマーカーは、Ｆｌｐリコンビナーゼによって除去される。このマーカーレス株は、次のＰ１形質導入のための新しいドナー株として機能する。
【０１２２】
４ノックアウト大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株は、ＪＷ０８８６に加えて３つのＫｅｉｏ株から調製されたＰ１ファージ溶解物でのＰ１ｖｉｒ形質導入により、Ｋｅｉｏ株ＪＷ０８８６において作成してもよい。使用されるべきＫｅｉｏ株が、以下に挙げられる。
−  ＪＷ０８８６：ｋａｎマーカーがｐｆｌＢ遺伝子内に挿入される
−  ＪＷ４１１４：ｋａｎマーカーがｆｒｄＢ遺伝子内に挿入される
−  ＪＷ１３７５：ｋａｎマーカーがｌｄｈＡ遺伝子内に挿入される
−  ＪＷ１２２８：ｋａｎマーカーがａｄｈＥ遺伝子内に挿入される
【０１２３】
Ｐ１ｖｉｒ形質導入は、いくつかの修飾を伴い、Ｍｉｌｌｅｒによる記載のように行ってもよい（Ｍｉｌｌｅｒ  Ｊ．Ｈ．、１９９２年、「Ａ  Ｓｈｏｒｔ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．」  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ））。つまり、形質導入溶解物を調製するため、ドナー株の細胞を振とうしながら、ルリア−ベルターニ（ＬＢ）培地中、３７℃で一晩成長させる。これらの細胞の一晩成長は、０．００５Ｍ  ＣａＣｌ２を含有するＬＢ培地中に継代培養され、通気のない３７℃の水槽内に入れられる。ファージ添加の１時間前、細胞は、振とうしながら３７℃でインキュベートされる。細胞の最終成長後、一定分量１．０ｍＬの培養物が１４ｍＬのチューブに分注され、約１０７個のＰ１ｖｉｒファージが加えられる。チューブが３７℃の水槽内で２０分間インキュベートされた後、２．５ｍＬの０．８％ＬＢ上層寒天が各チューブに加えられる。チューブの内容物は、ＬＢ寒天プレート上に展開され、３７℃でインキュベートされる。翌日、軟質寒天層は遠心管内にこすり取られる。プレートの表面がＬＢ培地で洗浄され、遠心管に加えられた後、ＣＨＣｌ３数滴が加えられ、次にチューブがボルテックスミキサーを使用して激しく撹拌される。４，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離後、Ｐ１ｖｉｒ溶解物を含有する上清が回収される。
【０１２４】
形質導入においては、レシピエント株を１〜２ｍＬのＬＢ培地中で、振とうしながら３７℃で一晩成長させる。培養物を、例えば、１０，０００ｒｐｍ、室温で１分間の微量遠心管での遠心分離によってペレット状にする。細胞ペレットは、等しい容量のＭＣ緩衝液（０．１Ｍ  ＭｇＳＯ４、０．００５Ｍ  ＣａＣｌ２）中に再懸濁され、０．１ｍＬの一定分量でチューブに分注され、０．１ｍＬおよび０．０１ｍＬのＰ１ｖｉｒ溶解物が加えられる。また、Ｐ１ｖｉｒ溶解物を全く含有しない対照チューブを含めてもよい。チューブが３７℃で２０分間インキュベートされた後、０．２ｍＬの０．１Ｍクエン酸ナトリウムが加えられ、Ｐ１の感染が停止される。チューブが３７℃で１時間インキュベートされる前、１ｍＬのＬＢ培地が各チューブに加えられる。インキュベーション後、細胞は上記のようにペレット状にされ、２５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢプレート上に展開する前に５０〜２００μＬのＬＢ中に再懸濁され、３７℃で一晩インキュベートされる。形質導入体は、カナマイシンマーカー挿入物の上流および下流の領域に隣接する染色体に特異的なプライマーを使用するコロニーＰＣＲによってスクリーニングすることができる。
【０１２５】
染色体からのカナマイシンマーカーの除去は、カナマイシン−耐性株をプラスミドｐＣＰ２０で形質転換した後（Ｃｈｅｒｅｐａｎｏｖ  Ｐ．Ｐ．およびＷａｃｋｅｒｎａｇｅｌ  Ｗ．、Ｇｅｎｅ、１５８：９−１４頁、１９９５年）、ＬＢアンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）プレート上に展開し、３０℃でインキュベートすることによって実現してもよい。ｐＣＰ２０プラスミドは、λＰＲプロモーターの制御下で酵母ＦＬＰリコンビナーゼを有する。このプロモーターからの発現は、プラスミド上に存在するｃＩ８５７温度感受性リプレッサーによって制御される。ｐＣＰ２０の複製の複製起点もまた、温度感受性がある。アンピシリン耐性コロニーは、ＬＢ寒天プレート上にストリークされ、４２℃でインキュベートされる。インキュベーション温度が高くなると同時にＦＬＰリコンビナーゼの発現が誘発され、ｐＣＰ２０プラスミドが細胞から回復される。単離されたコロニーは、カナマイシン（２５μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢプレートと、ＬＢアンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）プレートおよびＬＢプレート上のグリッドにパッチされる。得られたカナマイシン感受性、アンピシリン感受性コロニーは、コロニーＰＣＲによってスクリーニングされ、カナマイシンマーカーの染色体からの除去を確認してもよい。
【０１２６】
コロニーＰＣＲ増幅においては、ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）；カタログ番号７１８０５−３）を、製造業者のプロトコルに従って使用してもよい。０．２μＭの各染色体に特異的なＰＣＲプライマーを含有する２５μＬのＭａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ反応物に、少量のコロニーが加えられる。増幅は、ＤＮＡ  Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ  ＧｅｎｅＡｍｐ  ９７００（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ））で行うことができる。典型的なコロニーＰＣＲ条件は、９５℃で１５分；９５℃で３０秒間を３０サイクル、５０〜５８℃の範囲の３０秒間のアニーリング温度、約１分／ＤＮＡのｋｂの伸長時間、７２℃で伸長されるプライマー；次いで７２℃で１０分間、次いで４℃で保持であった。ＰＣＲ産物サイズは、既知の分子量標準との比較により、ゲル電気泳動によって測定することができる。
【０１２７】
形質転換においては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のエレクトロコンピテント細胞は、Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ｍ．ら、（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９８７年、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）で記載のように調製してもよい。細胞を２５〜５０ｍＬのＬＢ培地中、３０〜３７℃で成長させ、１０，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により、０．５〜０．７のＯＤ６００で収穫してもよい。これらの細胞は、培養物の元の開始容量に等しい容量の無菌氷冷水で２回洗浄される。最終洗浄後、細胞は、滅菌水中に再懸濁され、形質転換されるべきＤＮＡが加えられる。細胞およびＤＮＡは、冷却したキュベットに移され、製造業者の使用説明書に従い、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩでエレクトロポレートされる（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ））。
【０１２８】
ＪＷ０８８６株（ΔｐｆｌＢ：：ｋａｎ）は、プラスミドｐＣＰ２０で形質転換され、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢプレート上に３０℃で展開される。次いで、アンピシリン耐性形質転換体が選択され、ＬＢプレート上にストリークされ、４２℃で成長させる。単離されたコロニーは、アンピシリンおよびカナマイシン選択培地プレートならびにＬＢプレート上にパッチされる。カナマイシン感受性およびアンピシリン感受性コロニーは、プライマーｐｆｌＢ  ＣｋＵｐ（配列番号１１）およびｐｆｌＢ  ＣｋＤｎ（配列番号１２）を伴うコロニーＰＣＲによってスクリーニングしてもよい。ＰＣＲ反応ミックスの一定分量１０μＬは、ゲル電気泳動によって分析してもよい。予想された約０．４ｋｂのＰＣＲ産物が認められ、それからマーカーの除去が確認され、「ＪＷ０８８６マーカーレス」株が生成される。この株は、ｐｆｌＢ遺伝子の欠失を有する。
【０１２９】
「ＪＷ０８８６マーカーレス」株は、ＪＷ４１１４（ｆｒｄＢ：：ｋａｎ）由来のＰ１ｖｉｒ溶解物で形質導入され、２５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢプレート上にストリークされる。カナマイシン耐性形質導入体は、プライマーｆｒｄＢ  ＣｋＵｐ（配列番号１３）およびｆｒｄＢ  ＣｋＤｎ（配列番号１４）を伴うコロニーＰＣＲによってスクリーニングされる。予想された約１．６ｋｂのＰＣＲ産物を生成するコロニーは、上記のようにエレクトロコンピテントにされ、上記のようにマーカーの除去のため、ｐＣＰ２０で形質転換される。形質転換体はまず、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢプレート上に３０℃で展開され、次いでアンピシリン耐性形質転換体が選択され、ＬＢプレート上にストリークされ、４２℃で成長させる。単離されたコロニーは、アンピシリンおよびカナマイシン選択培地プレートならびにＬＢプレート上にパッチされる。カナマイシン感受性、アンピシリン感受性コロニーは、プライマーｆｒｄＢ  ＣｋＵｐ（配列番号１３）およびｆｒｄＢ  ＣｋＤｎ（配列番号１４）を伴うＰＣＲによってスクリーニングしてもよい。予想された約０．４ｋｂのＰＣＲ産物が認められ、それからマーカーの除去が確認され、二重ノックアウト株「ΔｐｆｌＢ  ｆｒｄＢ」が生成されるかもしれない。
【０１３０】
二重ノックアウト株は、ＪＷ１３７５（ΔｌｄｈＡ：：ｋａｎ）由来のＰ１ｖｉｒ溶解物で形質導入され、２５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢプレート上に展開される。カナマイシン耐性形質導入体は、プライマーｌｄｈＡ  ＣｋＵｐ（配列番号１５）およびｌｄｈＡ  ＣｋＤｎ（配列番号１６）を伴うコロニーＰＣＲによってスクリーニングされる。予想された１．１ｋｂのＰＣＲ産物を生成するクローンは、エレクトロコンピテントにされ、上記のようにマーカーの除去のため、ｐＣＰ２０で形質転換される。形質転換体は、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢプレート上に３０℃で展開され、アンピシリン耐性形質転換体は、ＬＢプレート上にストリークされ、４２℃で成長させる。単離されたコロニーは、アンピシリンおよびカナマイシン選択培地プレートならびにＬＢプレート上にパッチされる。カナマイシン感受性、アンピシリン感受性コロニーは、０．３ｋｂの産物について、プライマーｌｄｈＡ  ＣｋＵｐ（配列番号１５）およびｌｄｈＡ  ＣｋＤｎ（配列番号１６）を伴うＰＣＲによってスクリーニングされる。予想された約０．３ｋｂのＰＣＲ産物を生成するクローンにより、マーカーの除去が確認され、「３ノックアウト株」（ΔｐｆｌＢ  ｆｒｄＢ  ｌｄｈＡ）と称される三重ノックアウト株が生成される。
【０１３１】
「３ノックアウト株」は、ＪＷ１２２８（ΔａｄｈＥ：：ｋａｎ）由来のＰ１ｖｉｒ溶解物で形質導入され、２５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢプレート上に展開される。カナマイシン耐性形質導入体は、プライマーａｄｈＥ  ＣｋＵｐ（配列番号１７）およびａｄｈＥ  ＣｋＤｎ（配列番号１８）を伴うコロニーＰＣＲによってスクリーニングされる。予想された１．６ｋｂのＰＣＲ産物を生成するクローンは、エレクトロコンピテントにされ、マーカーの除去のため、ｐＣＰ２０で形質転換される。形質転換体は、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢプレート上に３０℃で展開される。アンピシリン耐性形質転換体は、ＬＢプレート上にストリークされ、４２℃で成長させる。単離されたコロニーは、アンピシリンおよびカナマイシン選択プレートならびにＬＢプレート上にパッチされる。カナマイシン感受性、アンピシリン感受性コロニーは、プライマーａｄｈＥ  ＣｋＵｐ（配列番号１７）およびａｄｈＥ  ＣｋＤｎ（配列番号１８）を伴うＰＣＲによってスクリーニングしてもよい。予想された約０．４ｋｂのＰＣＲ産物を生成するクローンは、「４ノックアウト株」（ΔｐｆｌＢ  ｆｒｄＢ  ｌｄｈＡ  ａｄｈＥ）と称される。
【０１３２】
４ノックアウト大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株へのイソブタノール生合成経路をコードする遺伝子セットの導入
プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ：：ｂｕｄＢ−ｉｌｖＣ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤは、米国特許出願公開第２００７／００９２９５７号明細書（参照により本明細書中に援用される）の実施例９〜１４中に記載のように作成してもよい。このプラスミドは、次の遺伝子、すなわち、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来のアセト乳酸シンターゼをコードするｂｕｄＢ（配列番号１）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のアセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼをコードするｉｌｖＣ遺伝子（配列番号３）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のアセトヒドロキシ酸デヒドラターゼをコードするｉｌｖＤ（配列番号５）、およびラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）由来の分枝鎖ケト酸デカルボキシラーゼをコードするｋｉｖＤ（配列番号７）を含む。ブタノールデヒドロゲナーゼをコードするアクロモバクター・キシロスオキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）由来のｓａｄＢ遺伝子（配列番号９）は、下記のようにｐＴｒｃ９９Ａ：：ｂｕｄＢ−ｉｌｖＣ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤプラスミドにサブクローン化される。
【０１３３】
（米国特許出願公開第２００９０２６９８２３号明細書中に開示される）アクロモバクター・キシロスオキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）由来のブタノールデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ断片（ＤＮＡ：配列番号９；タンパク質：配列番号１０）は、標準条件を使用して、Ａ．キシロスオキシダンス（Ａ．ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）ゲノムＤＮＡから増幅される。ＤＮＡは、グラム陰性生物に対して推奨されるプロトコルに従い、Ｇｅｎｔｒａ  Ｐｕｒｅｇｅｎｅキット（Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）；カタログ番号Ｄ−５５００Ａ）を使用して調製してもよい。ＰＣＲ増幅は、Ｐｈｕｓｉｏｎ  ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））とともに、フォワードおよびリバースプライマーのＮ４７３およびＮ４６９（各々配列番号１９および２０）を使用して行ってもよい。ＰＣＲ産物は、ｐＣＲ４  ＢＬＵＮＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にＴＯＰＯ−Ｂｌｕｎｔクローニングを行い、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ：：ｓａｄＢを生成してもよく、それは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｍａｃｈ−１細胞に形質転換される。それに続き、プラスミドが４つのクローンから単離され、配列が検証される。
【０１３４】
次いで、ｓａｄＢコード領域は、ベクターｐＴｒｃ９９ａ（Ａｍａｎｎら、Ｇｅｎｅ  ６９：３０１−３１５頁、１９８８年）にクローン化される。ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ：：ｓａｄＢはＥｃｏＲＩで消化され、ｓａｄＢ断片を放出し、それはＥｃｏＲＩで消化されたｐＴｒｃ９９ａとライゲートされ、ｐＴｒｃ９９ａ：：ｓａｄＢが生成される。このプラスミドは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｍａｃｈ１細胞に形質転換され、得られた形質転換体は、Ｍａｃｈ１／ｐＴｒｃ９９ａ：：ｓａｄＢと称される。これらの細胞におけるｓａｄＢ遺伝子から発現される酵素の活性は、標準としてイソブチルアルデヒドを使用して分析される場合、無細胞抽出液中で３．５ｍｍｏｌ／分／ｍｇのタンパク質であると判定されるかもしれない。
【０１３５】
次いで、ｓａｄＢ遺伝子は、次のように、ｐＴｒｃ９９Ａ：：ｂｕｄＢ−ｉｌｖＣ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤにサブクローン化される。ｓａｄＢコード領域は、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））とともに、プライマーＮ６９５Ａ（配列番号２１）およびＮ６９６Ａ（配列番号２２）を使用し、ｐＴｒｃ９９ａ：：ｓａｄＢから増幅される。増幅は、９８℃で１分間の初期変性、次いで９８℃で１０秒間の変性の３０サイクル、６２℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で２０秒間の伸長および７２℃で５分間の最終伸長サイクル、次いで４℃で保持の条件で行われる。プライマーＮ６９５Ａは、クローニングにおけるＡｖｒＩＩ制限部位と、ｓａｄＢコード領域のＡＴＧ開始コドンの上流にＲＢＳ（リボソーム結合部位）を有する。Ｎ６９６Ａプライマーは、クローニングにおけるＸｂａＩ部位を含む。１．１ｋｂのＰＣＲ産物は、ＡｖｒＩＩおよびＸｂａＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））で消化され、Ｑｉａｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ））を使用してゲル精製される。精製断片は、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））を使用し、同じ制限酵素で切断済みのｐＴｒｃ９９Ａ：：ｂｕｄＢ−ｉｌｖＣ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤとライゲートされる。ライゲーション混合物は、１６℃で一晩インキュベートされ、次いで製造業者のプロトコルに従い、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｍａｃｈ１（商標）コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換される。形質転換体は、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを有するＬＢ寒天上で成長させた後に得られる。形質転換体由来のプラスミドＤＮＡが、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ））を使用し、製造業者のプロトコルに従って調製される。得られたプラスミドは、ｐＴｒｃ９９Ａ：：ｂｕｄＢ−ｉｌｖＣ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤ−ｓａｄＢと称される。エレクトロコンピテント４ノックアウト大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞（上記のように調製される）は、ｐＴｒｃ９９Ａ：：ｂｕｄＢ−ｉｌｖＣ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤ−ｓａｄＢで形質転換される。形質転換体は、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢ寒天プレート上にストリークされる。得られた組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株は、プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ：：ｂｕｄＢ−ｉｌｖＣ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤ−ｓａｄＢによってコードされるイソブタノール生合成経路と、ｐｆｌＢ、ｆｒｄＢ、ｌｄｈＡ、およびａｄｈＥ遺伝子の欠失を含み、株ＮＧＣＩ−０３１と称される。
【０１３６】
発酵性炭素源をブタノールに変換できるように遺伝子組換えがなされる微生物は、イソブタノール生合成経路を含む組換えサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株であってもよい。好ましいサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株は、次の遺伝子、すなわち、アセト乳酸シンターゼ（配列番号３３）をコードする枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のａｌｓＳコード領域（配列番号３２）、アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ（ＫＡＲＩ；配列番号４１）をコードするＳ．セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＩＬＶ５（配列番号４０）、および／または例えばＰｆ５．ＩｌｖＣ−Ｚ４Ｂ８によってコードされる突然変異体ＫＡＲＩ（配列番号３６；タンパク質配列番号３７）、アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼ（配列番号５９）をコードするストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）由来のｉｌｖＤ（配列番号５８）、分枝鎖ケト酸デカルボキシラーゼ（配列番号４４）をコードする枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のｋｉｖＤ（配列番号４３）、ならびにブタノールデヒドロゲナーゼ（配列番号１０）をコードするアクロモバクター・キシロスオキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）由来のｓａｄＢ（配列番号９）によってコードされるイソブタノール生合成経路を含んでもよい。イソブタノール生合成経路の遺伝子によってコードされる酵素は、本明細書中に記載のように、ピルビン酸塩をイソブタノールに変換するための生成物変換に対して基質を触媒する。
【０１３７】
組換えサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株は、当該技術分野で既知の方法を用いて作成してもよい。イソブタノール経路を発現する好適な酵母株は、米国特許出願公開第２００９０３０５３６３号明細書（参照により本明細書中に援用される）に記載のように、サイトゾルにおいてアセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）活性を有し、かつ、内因性ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）遺伝子の欠失を有する。
【０１３８】
好適な株は、本明細書中、下記のように作成してもよい。
【０１３９】
酵母株ＮＧＩ−０４９の作成
ＮＧＩ−０４９は、内因性ＰＤＣ１、ＰＤＣ５、およびＰＤＣ６遺伝子の挿入不活性化を有し、かつ発現ベクターｐＬＨ４７５−Ｚ４Ｂ８およびｐＬＨ４６８を有するサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株である。ＰＤＣ１、ＰＤＣ５、およびＰＤＣ６遺伝子は、ピルビン酸デカルボキシラーゼの３つの主要なアイソザイムをコードする。同株は、融合されるかまたはプラスミド上に存在する、イソブタノール生合成経路における酵素をコードする遺伝子を発現する。
【０１４０】
発現ベクターｐＬＨ４７５−Ｚ４Ｂ８
酵母におけるＡＬＳおよびＫＡＲＩの発現のため、ｐＬＨ４７５−Ｚ４Ｂ８プラスミド（配列番号３０）を作成してもよい。ｐＬＨ４７５−Ｚ４Ｂ８は、次のキメラ遺伝子、すなわち、
１）ＣＵＰ１プロモーター（配列番号３１）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のアセト乳酸シンターゼのコード領域（ＡｌｓＳ；配列番号３２；タンパク質配列番号３３）およびＣＹＣ１ターミネーター（配列番号３４）；
２）ＩＬＶ５プロモーター（配列番号３５）、Ｐｆ５．ＩｌｖＣ−Ｚ４Ｂ８コード領域（配列番号３６；タンパク質配列番号３７）およびＩＬＶ５ターミネーター（配列番号３８）；ならびに
３）ＦＢＡ１プロモーター（配列番号３９）、Ｓ．セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＫＡＲＩコード領域（ＩＬＶ５；配列番号４０；タンパク質配列番号４１）およびＣＹＣ１ターミネーター
を有するｐＨＲ８１ベクター（ＡＴＣＣ番号８７５４１）である。
【０１４１】
Ｐｆ５．ＩｌｖＣ−Ｚ４Ｂ８コード領域は、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）由来のＫＡＲＩをコードするが、突然変異を有する配列であり、それは米国特許出願第１２／３３７７３６号明細書（参照により本明細書中に援用される）中に記載される。Ｐｆ５．ＩｌｖＣ−Ｚ４Ｂ８でコードされるＫＡＲＩ（配列番号３７）は、天然シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）のＫＡＲＩに対して次のアミノ酸変化、すなわち、Ｃ３３Ｌ（システインが位置３３でロイシンに変化）、
Ｒ４７Ｙ（アルギニンが位置４７でチロシンに変化）、
Ｓ５０Ａ（セリンが位置５０でアラニンに変化）、
Ｔ５２Ｄ（トレオニンが位置５２でアスパラギンに変化）、
Ｖ５３Ａ（バリンが位置５３でアラニンに変化）、
Ｌ６１Ｆ（ロイシンが位置６１でフェニルアラニンに変化）、
Ｔ８０Ｉ（トレオニンが位置８０でイソロイシンに変化）、
Ａ１５６Ｖ（アラニンが位置１５６でトレオニンに変化、および
Ｇ１７０Ａ（グリシンが位置１７０でアラニンに変化）
を有する。
【０１４２】
Ｐｆ５．ＩｌｖＣ−Ｚ４Ｂ８コード領域は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現のために最適化されるコドンに基づき、ＤＮＡ２．０（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ；配列番号６）によって合成してもよい。
【０１４３】
発現ベクターｐＬＨ４６８
ｐＬＨ４６８プラスミド（配列番号４２）は、酵母におけるＤＨＡＤ、ＫｉｖＤおよびＨＡＤＨの発現のために作成される。
【０１４４】
枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（ＫｉｖＤ）およびウマ肝臓アルコールデヒドロゲナーゼ（ＨＡＤＨ）におけるコード領域は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現のために最適化されるコドンに基づき、ＤＮＡ２．０によって合成され（各々、配列番号４３および４５）、プラスミドｐＫｉｖＤｙ−ＤＮＡ２．０およびｐＨａｄｈｙ−ＤＮＡ２．０において提供される。コードされるタンパク質は、それぞれ配列番号４４および４６である。ＫｉｖＤおよびＨＡＤＨに対する各発現ベクターが作成される。ｐＬＨ４６７（ｐＲＳ４２６：：ＰＧＰＤ１−ｋｉｖＤｙ−ＧＰＤ１ｔ）を構築するため、ベクターｐＮＹ８（配列番号４７；ｐＲＳ４２６．ＧＰＤ−ａｌｄ−ＧＰＤｔとも称され、米国特許出願公開第２００８／０１８２３０８号明細書の実施例１７（参照により本明細書中に援用される）中に記載）が、ＡｓｃＩおよびＳｆｉＩ酵素で消化されることにより、ＧＰＤ１プロモーターおよびａｌｄコード領域が切断される。ｐＮＹ８由来のＧＰＤ１プロモーター断片（配列番号４８）はＰＣＲ増幅され、５’プライマーＯＴ１０６８および３’プライマーＯＴ１０６７（配列番号４９および５０）を使用し、５’末端にＡｓｃＩ部位および３’末端にＳｐｅＩ部位が付加される。ＡｓｃＩ／ＳｆｉＩで消化されたｐＮＹ８ベクター断片は、ＡｓｃＩおよびＳｐｅＩで消化されたＧＰＤ１プロモーターＰＣＲ産物とライゲートされ、かつ、コドン最適化されたｋｉｖＤコード領域を有するＳｐｅＩ−ＳｆｉＩ断片は、ベクターｐＫｉｖＤ−ＤＮＡ２．０から単離される。３通りのライゲーションにより、ベクターｐＬＨ４６７（ｐＲＳ４２６：：ＰＧＰＤ１−ｋｉｖＤｙ−ＧＰＤ１ｔ）が生成された。ｐＬＨ４６７は、制限マッピングおよび配列決定によって検証してもよい。
【０１４５】
ｐＬＨ４３５（ｐＲＳ４２５：：ＰＧＰＭ１−Ｈａｄｈｙ−ＡＤＨ１ｔ）は、ベクターｐＲＳ４２５：：ＧＰＭ−ｓａｄＢ（配列番号５１）（米国特許出願公開第２００９０３０５３６３Ａ１号明細書の実施例３（参照により本明細書中に援用される）に記載）に由来する。ｐＲＳ４２５：：ＧＰＭ−ｓａｄＢは、ＧＰＭ１プロモーター（配列番号５２）、アクロモバクター・キシロスオキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）のブタノールデヒドロゲナーゼ由来のコード領域（ｓａｄＢ；配列番号９；タンパク質配列番号１０：米国特許出願公開第２００９０２６９８２３Ａ１号明細書中に開示）、およびＡＤＨ１ターミネーター（配列番号５３）を有するキメラ遺伝子を有するｐＲＳ４２５ベクター（ＡＴＣＣ番号７７１０６）である。ｐＲＳ４２５：：ＧＰＭｐ−ｓａｄＢは、ｓａｄＢコード領域の５’および３’末端にそれぞれＢｂｖＩおよびＰａｃＩ部位を有する。ＮｈｅＩ部位が、プライマーＯＴ１０７４およびＯＴ１０７５（配列番号５４および５５）を使用する部位特異的突然変異誘発により、ｓａｄＢコード領域の５’末端側に付加され、ベクターｐＲＳ４２５−ＧＰＭｐ−ｓａｄＢ−ＮｈｅＩが生成され、それは配列決定によって検証してもよい。ｐＲＳ４２５：：ＰＧＰＭ１−ｓａｄＢ−ＮｈｅＩが、ＮｈｅＩおよびＰａｃＩで消化され、ｓａｄＢコード領域が除外され、また、ベクターｐＨａｄｈｙ−ＤＮＡ２．０由来のコドン最適化されたＨＡＤＨコード領域を有するＮｈｅＩ−ＰａｃＩ断片とライゲートされ、ｐＬＨ４３５が生成される。
【０１４６】
ＫｉｖＤおよびＨＡＤＨの発現カセットを単一ベクター内で結合させるため、酵母ベクターｐＲＳ４１１（ＡＴＣＣ番号８７４７４）が、ＳａｃＩおよびＮｏｔＩで消化され、３通りのライゲーション反応において、ＰＧＰＭ１−Ｈａｄｈｙ−ＡＤＨ１ｔカセットを有するｐＬＨ４３５由来のＳａｌＩ−ＮｏｔＩ断片とともに、ＰＧＰＤ１−ｋｉｖＤｙ−ＧＰＤ１ｔカセットを有するｐＬＨ４６７由来のＳａｃＩ−ＳａｌＩ断片とライゲートされる。これにより、ベクターｐＲＳ４１１：：ＰＧＰＤ１−ｋｉｖＤｙ−ＰＧＰＭ１−Ｈａｄｈｙ（ｐＬＨ４４１）が得られ、それは制限マッピングによって検証してもよい。
【０１４７】
低級イソブタノール経路内の３つの遺伝子ｉｌｖＤ、ｋｉｖＤｙおよびＨａｄｈｙのすべてにおける同時発現ベクターを生成するため、ＩｌｖＤ遺伝子の供給源として、ＰＣＴ公開の国際公開第２０１０／０３７１１２号パンフレットに記載のｐＲＳ４２３  ＦＢＡ  ｉｌｖＤ（Ｓｔｒｅｐ）（配列番号５６）を使用してもよい。このシャトルベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における維持のためのＦ１複製起点（ｎｔ１４２３〜１８７９）および酵母における複製のための２ミクロンの複製起点（ｎｔ８０８２〜９４２６）を有する。ベクターは、ＦＢＡプロモーター（ｎｔ２１１１〜３１０８；配列番号３９）およびＦＢＡターミネーター（ｎｔ４８６１〜５８６０；配列番号５７）を有する。さらに、それは、酵母における選択のためのＨｉｓマーカー（ｎｔ５０４〜１１６３）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における選択のためのアンピシリン耐性マーカー（ｎｔ７０９２〜７９４９）を有する。ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）ＵＡ１５９（ＡＴＣＣ番号７００６１０）由来のｉｌｖＤコード領域（ｎｔ３１１６〜４８２８；配列番号５８；タンパク質配列番号５９）は、ＦＢＡプロモーターとＦＢＡターミネーターの間に位置し、発現のためのキメラ遺伝子を形成する。さらに、ｉｌｖＤコード領域（ｎｔ４８２９〜４８４９）に融合されたLｕｍｉｏ（商標）ｔａｇが存在する。
【０１４８】
第１のステップは、ｐＲＳ４２３  ＦＢＡ  ｉｌｖＤ（Ｓｔｒｅｐ）（ｐＲＳ４２３−ＦＢＡ（ＳｐｅＩ）−ＩｌｖＤ（ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ））−Ｌｕｍｉｏとも称される）を、ＳａｃＩおよびＳａｃＩＩ（ＳａｃＩＩ部位はＴ４  ＤＮＡポリメラーゼを使用して平滑末端化される）で直鎖状化し、全長が９，４８２ｂｐのベクターを得ることである。第２のステップは、ｋｉｖＤｙ−ｈＡＤＨｙカセットをｐＬＨ４４１から、ＳａｃＩおよびＫｐｎＩ（ＫｐｎＩ部位はＴ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化される）で単離し、６，０６３ｂｐの断片を得ることである。この断片は、ｐＲＳ４２３−ＦＢＡ（ＳｐｅＩ）−ＩｌｖＤ（ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ））−Ｌｕｍｉｏ由来の９，４８２ｂｐのベクター断片とライゲートされる。これにより、ベクターｐＬＨ４６８（ｐＲＳ４２３：：ＰＦＢＡ１−ｉｌｖＤ（Ｓｔｒｅｐ）Ｌｕｍｉｏ−ＦＢＡ１ｔ−ＰＧＰＤ１−ｋｉｖＤｙ−ＧＰＤ１ｔ−ＰＧＰＭ１−ｈａｄｈｙ−ＡＤＨ１ｔ）が生成され、それは制限マッピングおよび配列決定によって確認してもよい。
【０１４９】
ｐｄｃ６：：ＧＰＭｐ１−ｓａｄＢ組込みカセットの作成およびＰＤＣ６の欠失：
ｐｄｃ６：：ＧＰＭ１ｐ−ｓａｄＢ−ＡＤＨ１ｔ−ＵＲＡ３ｒ組込みカセットが、ｐＲＳ４２５：：ＧＰＭ−ｓａｄＢ（上記）由来のＧＰＭ−ｓａｄＢ−ＡＤＨｔセグメント（配列番号６０）をｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ｒ由来のＵＲＡ３ｒ遺伝子と連結することによって作成される。ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ｒ（配列番号６１）は、インビボでの相同組換えおよびＵＲＡ３マーカーの除去を可能にする、７５ｂｐの相同リピート配列によって隣接されたｐＲＳ４２６（ＡＴＣＣ番号７７１０７）由来のＵＲＡ３マーカーを有する。２つのＤＮＡセグメントは、Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）；カタログ番号Ｆ−５４０Ｓ）およびプライマー１１４１１７−１１Ａ〜１１４１１７−１１Ｄ（配列番号６２、６３、６４および６５）、ならびに１１４１１７−１３Ａおよび１１４１１７−１３Ｂ（配列番号６６および６７）とともに、鋳型としてｐＲＳ４２５：：ＧＰＭ−ｓａｄＢおよびｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ｒプラスミドＤＮＡを使用するＳＯＥ  ＰＣＲ（Ｈｏｒｔｏｎら（１９８９年）  Ｇｅｎｅ  ７７：６１−６８頁で記載）によって連結される。
【０１５０】
ＳＯＥ  ＰＣＲにおける外部プライマー（１１４１１７−１３Ａおよび１１４１１７−１３Ｂ）は、ＰＤＣ６プロモーターおよびターミネーターの上流および下流の領域に相同な約５０ｂｐの５’および３’領域をそれぞれ有する。標準の遺伝子技術（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２００５年、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、２０１−２０２頁）を用いて、完全カセットＰＣＲ断片は、ＢＹ４７００（ＡＴＣＣ番号２００８６６）に形質転換され、かつ、形質転換体は、２％グルコースが３０℃で補充されたウラシル欠損合成完全培地上で維持される。形質転換体は、プライマー１１２５９０−３４Ｇおよび１１２５９０−３４Ｈ（配列番号６８および６９）と１１２５９０−３４Ｆおよび１１２５９０−４９Ｅ（配列番号７０および７１）を使用するＰＣＲによってスクリーニングされ、ＰＤＣ６コード領域の欠失を伴うＰＤＣ６遺伝子座での組込みについて検証してもよい。ＵＲＡ３ｒマーカーは、標準プロトコルに従い、３０℃で２％グルコースおよび５−ＦＯＡが補充された合成完全培地上にプレーティングすることによって再生してもよい。マーカーの除去は、５−ＦＯＡプレートからのコロニーをＳＤ−ＵＲＡ培地上にパッチすることによって確認し、成長がないことを検証してもよい。得られた同定株は、遺伝子型：ＢＹ４７００  ｐｄｃ６：：ＰＧＰＭ１−ｓａｄＢ−ＡＤＨ１ｔを有する。
【０１５１】
ｐｄｃ１：：ＰＤＣ１−ｉｌｖＤ組込みカセットの作成およびＰＤＣ１の欠失：
ｐｄｃ１：：ＰＤＣ１ｐ−ｉｌｖＤ−ＦＢＡ１ｔ−ＵＲＡ３ｒ組込みカセットが、Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）；カタログ番号Ｆ−５４０Ｓ）およびプライマー１１４１１７−２７Ａ〜１１４１１７−２７Ｄ（配列番号７３、７４、７５および７６）とともに、鋳型としてｐＬＨ４６８およびｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ｒプラスミドＤＮＡを使用するＳＯＥ  ＰＣＲ（Ｈｏｒｔｏｎら（１９８９年）  Ｇｅｎｅ  ７７：６１−６８頁で記載）により、ｐＬＨ４６８（上記）由来のｉｌｖＤ−ＦＢＡ１ｔセグメント（配列番号７２）をｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ｒ由来のＵＲＡ３ｒ遺伝子と連結することによって作成される。
【０１５２】
ＳＯＥ  ＰＣＲにおける外部プライマー（１１４１１７−２７Ａおよび１１４１１７−２７Ｄ）は、ＰＤＣ１プロモーターの下流およびＰＤＣ１コード配列の下流の領域に相同な約５０ｂｐの５’および３’領域を有する。標準の遺伝子技術（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２００５年、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、２０１−２０２頁）を用いて、完全カセットＰＣＲ断片は、ＢＹ４７００  ｐｄｃ６：：ＰＧＰＭ１−ｓａｄＢ−ＡＤＨ１ｔに形質転換され、かつ、形質転換体は、２％グルコースが３０℃で補充されたウラシル欠損合成完全培地上で維持される。形質転換体は、プライマー１１４１１７−３６Ｄおよび１３５（配列番号７７および７８）とプライマー１１２５９０−４９Ｅおよび１１２５９０−３０Ｆ（配列番号７０および７９）を使用するＰＣＲによってスクリーニングされ、ＰＤＣ１コード配列の欠失を伴うＰＤＣ１遺伝子座での組込みについて検証してもよい。ＵＲＡ３ｒマーカーは、標準プロトコルに従い、３０℃で２％グルコースおよび５−ＦＯＡが補充された合成完全培地上にプレーティングすることによって再生してもよい。マーカーの除去は、５−ＦＯＡプレートからのコロニーをＳＤ−ＵＲＡ培地上にパッチすることによって確認し、成長がないことを検証してもよい。得られた同定株「ＮＹＬＡ６７」は、遺伝子型：ＢＹ４７００ｐｄｃ６：：ＧＰＭ１ｐ−ｓａｄＢ−ＡＤＨ１ｔ  ｐｄｃ１：：ＰＤＣ１ｐ−ｉｌｖＤ−ＦＢＡ１ｔを有する。
【０１５３】
ＨＩＳ３の欠失
内因性ＨＩＳ３コード領域を欠失させるため、ｈｉｓ３：：ＵＲＡ３ｒ２カセットがＵＲＡ３ｒ２鋳型ＤＮＡ（配列番号８４）からＰＣＲ増幅される。ＵＲＡ３ｒ２は、インビボでの相同組換えおよびＵＲＡ３マーカーの除去を可能にする、５００ｂｐの相同リピート配列によって隣接されたｐＲＳ４２６（ＡＴＣＣ番号７７１０７）由来のＵＲＡ３マーカーを有する。ＰＣＲは、Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼとプライマー１１４１１７−４５Ａおよび１１４１１７−４５Ｂ（配列番号８５および８６）を使用して行われ、約２．３ｋｂのＰＣＲ産物が生成される。各プライマーのＨＩＳ３部分は、ＵＲＡ３ｒ２マーカーの組込みがＨＩＳ３コード領域の置換をもたらすように、ＨＩＳ３プロモーターの上流の５’領域およびコード領域の下流の３’領域から得られる。標準の遺伝子技術（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２００５年、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、２０１−２０２頁）を用いて、ＰＣＲ産物は、ＮＹＬＡ６７に形質転換され、かつ、形質転換体は、２％グルコースが３０℃で補充されたウラシル欠損合成完全培地上で選択される。形質転換体は、スクリーニングされ、形質転換体の２％グルコースが３０℃で補充されたヒスチジン欠損合成完全培地上へのレプリカプレーティングによって正確な組込みについて検証してもよい。ＵＲＡ３ｒマーカーは、標準プロトコルに従い、２％グルコースおよび５−ＦＯＡが３０℃で補充された合成完全培地上でのプレーティングによって再利用してもよい。マーカーの除去は、５−ＦＯＡプレートからのコロニーをＳＤ−ＵＲＡ培地上にパッチすることによって確認し、成長がないことを検証してもよい。得られた同定株「ＮＹＬＡ７３」は、遺伝子型：ＢＹ４７００  ｐｄｃ６：：ＧＰＭ１ｐ−ｓａｄＢ−ＡＤＨ１ｔ  ｐｄｃ１：：ＰＤＣ１ｐ−ｉｌｖＤ−ＦＢＡ１ｔ  Δｈｉｓ３を有する。
【０１５４】
ｐｄｃ５：：ｋａｎＭＸ組込みカセットの作成およびＰＤＣ５の欠失：
ｐｄｃ５：：ｋａｎＭＸ４カセットが、Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼとプライマーＰＤＣ５：：ＫａｎＭＸＦおよびＰＤＣ５：：ＫａｎＭＸＲ（配列番号８０および８１）を使用し、ＹＬＲ１３４Ｗ染色体ＤＮＡ株（ＡＴＣＣ番号４０３４０９１）からＰＣＲ増幅され、約２．２ｋｂのＰＣＲ産物が生成される。各プライマーのＰＤＣ５部分は、ｋａｎＭＸ４マーカーの組込みがＰＤＣ５コード領域の置換をもたらすように、ＰＤＣ５プロモーターの上流の５’領域およびコード領域の下流の３’領域から得られる。標準の遺伝子技術（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２００５年、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、２０１−２０２頁）を用いて、ＰＣＲ産物は、ＮＹＬＡ７３に形質転換され、かつ、形質転換体は、１％エタノールおよびジェネティシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）（２００μｇ／ｍｌ）が３０℃で補充されたＹＰ培地上で選択される。形質転換体は、ＰＣＲによってスクリーニングされ、プライマーＰＤＣ５ｋｏｆｏｒおよびＮ１７５（配列番号８２および８３）を使用するＰＤＣ５コード領域の置換を伴うＰＤＣ遺伝子座での正確な組込みについて検証してもよい。同定された正確な形質転換体は、遺伝子型：ＢＹ４７００  ｐｄｃ６：：ＧＰＭ１ｐ−ｓａｄＢ−ＡＤＨ１ｔ  ｐｄｃ１：：ＰＤＣ１ｐ−ｉｌｖＤ−ＦＢＡ１ｔ  Δｈｉｓ３  ｐｄｃ５：：ｋａｎＭＸ４を有する。
【０１５５】
プラスミドベクターｐＬＨ４６８およびｐＬＨ４７５−Ｚ４Ｂ８は、標準の遺伝子技術（「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」、２００５年、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）を用いて、ＢＹ４７００  ｐｄｃ６：：ＧＰＭ１ｐ−ｓａｄＢ−ＡＤＨ１ｔ  ｐｄｃ１：：ＰＤＣ１ｐ−ｉｌｖＤ−ＦＢＡ１ｔ  Δｈｉｓ３  ｐｄｃ５：：ｋａｎＭＸ４株に同時に形質転換され、１％エタノールが３０℃で補充されたヒスチジンおよびウラシル欠損合成完全培地上で維持される。
【０１５６】
有機抽出剤
本明細書中に記載の方法において有用な抽出剤組成物は、水不混和性であり、かつ第１の溶媒および第２の溶媒を含み、その双方は水不混和性である。好適な有機抽出剤組成物は、ブタノールを生成または回収するための商業的な二相抽出発酵にとって理想的な溶媒としての基準を満たす必要がある。詳細には、抽出剤組成物は、（ｉ）微生物、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）と生体適合性があり、（ｉｉ）発酵培地と実質的に不混和性であり、（ｉｉｉ）ブタノールの抽出における高い分配係数（ＫＰ）を有し、（ｉｖ）栄養素の抽出における低い分配係数を有し、（ｖ）発酵培地とエマルジョンを形成する傾向が低く、かつ（ｖｉ）低コストで無害である必要がある。さらに、改善されたプロセス操作性および経済性を目的として、抽出剤は、（ｖｉｉ）低い粘度（μ）を有し、（ｖｉｉｉ）水性発酵培地に対してより低い密度（ρ）を有し、かつ（ｉｘ）抽出剤とブタノールの下流分離に適した沸点を有する必要がある。抽出剤の粘度は、システムの物質移動特性、例えばブタノール溶質がバルク水相から抽出剤相へ抽出され得る効率に影響を与える。抽出剤の密度は、相分離がいかに速やかにかつ清浄に生じるかに影響を与える。沸点は、ブタノール回収のコストおよび方法に影響を与え得る。例えば、ブタノールが抽出剤相から蒸留によって回収される場合、抽出剤の沸点は、ブタノールの分離を、抽出剤の任意の熱分解または副反応を最小にしながら可能にし、または蒸留プロセスにおいて真空が必要であることから、十分に低い必要がある。
【０１５７】
抽出剤は、微生物と生体適合性がある、すなわち微生物に対して無害であるか、または微生物が受ける損傷が許容可能なレベルであるような程度に限って有害である必要があり、それにより、微生物は、ブタノール生成物を発酵培地に生成し続ける。抽出剤の生体適合性の程度は、限定された発酵条件下で測定される、抽出剤およびブタノール生成物の存在下での微生物のグルコース利用速度によって判定することができる（実施例を参照）。生体適合性のある抽出剤は、微生物がグルコースを利用することを可能にする一方、非生体適合性の抽出剤では、微生物は、例えば抽出剤が存在しない場合の速度の約２５％以下の速度でしかグルコースを利用することができない。発酵生成物であるブタノールの存在が、微生物の抽出剤に対する感受性に影響を与え得ることから、発酵生成物は、抽出剤の生体適合性試験の間に存在する必要がある。追加的な発酵生成物、例えばエタノールの存在は、抽出剤の生体適合性に同様に影響を与えるかもしれない。抽出剤の生体適合性が、抽出の間に存在する追加的な発酵生成物が低減する場合、改善されるものと予想すれば、納得されることになる。ブタノール生成物の存在下での異なる抽出剤の生体適合性は、グルコース利用速度を参照抽出剤の場合に対する百分率として表すことにより、比較可能である。
【０１５８】
抽出剤に含まれる第１および第２の溶媒は、上で考察のように、ブタノール発酵生成物の存在下で抽出剤の望ましい特性を最大限に生かすように選択される必要がある。実施例に示されるように、炭素鎖がより長い第１の溶媒および炭素鎖がより短い第２の溶媒を含む抽出剤の使用は、第１の溶媒のみからなる抽出剤の使用全般において利点を提供し得る。炭素鎖がより長い第１の溶媒は、高い生体適合性という望ましい特性だけでなく、ブタノールにおける比較的低い分配係数、より高い粘度、および／またはより高い沸点といったあまり望ましくない特性を有するかもしれない。それに対し、炭素鎖がより短い第２の溶媒は、生体適合性がより低いというあまり望ましくない特性だけでなく、ブタノールにおける比較的高い分配係数、より低い粘度、および／またはより低い沸点といったより望ましい特性を有するかもしれない。特に、本明細書中に記載の、第１の溶媒と第２の溶媒との適切な組み合わせは、ブタノールを発酵プロセスから取り出すための、その経済的使用を可能にする、ブタノールにおける十分な分配係数および微生物との十分な生体適合性を有する抽出剤を提供するかもしれない。
【０１５９】
第１の溶媒は、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アルコール、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸のエステル、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アルデヒド、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アミド、およびそれらの混合物からなる群から選択される。好適な第１の溶媒は、さらに、オレイルアルコール（ＣＡＳ番号１４３−２８−２）、ベヘニルアルコール（ＣＡＳ番号６６１−１９−８）、セチルアルコール（ＣＡＳ番号３６６５３−８２−４）、ラウリルアルコール（ＣＡＳ番号１１２−５３−８）（１−ドデカノールとも称される）、ミリスチルアルコール（ＣＡＳ番号１１２−７２−１）、ステアリルアルコール（ＣＡＳ番号１１２−９２−５）、オレイン酸（ＣＡＳ番号１１２−８０−１）、ラウリン酸（ＣＡＳ番号１４３−０７−７）、ミリスチン酸（ＣＡＳ番号５４４−６３−８）、ステアリン酸（ＣＡＳ番号５７−１１−４）、ミリスチン酸メチル（ＣＡＳ番号１２４−１０−７）、オレイン酸メチル（ＣＡＳ番号１１２−６２−９）、ラウリンアルデヒド（ＣＡＳ番号１１２−５４−９）、オレイン酸アミド（ＣＡＳ番号３０１−０２−０）、リノールアミド（ＣＡＳ番号３９９９−０１−７）、パルミトアミド（ＣＡＳ番号６２９−５４−９）およびステアリルアミド（ＣＡＳ番号１２４−２６−５）ならびにそれらの混合物からなる群から選択される。一実施形態では、第１の溶媒は、オレイルアルコールを含む。
【０１６０】
第２の溶媒は、Ｃ７〜Ｃ１１脂肪族アルコール、Ｃ７〜Ｃ１１脂肪族カルボン酸、Ｃ７〜Ｃ１１脂肪族カルボン酸のエステル、Ｃ７〜Ｃ１１脂肪族アルデヒド、およびそれらの混合物からなる群から選択される。一実施形態では、第２の溶媒は、Ｃ７〜Ｃ１０脂肪族アルコール、Ｃ７〜Ｃ１０脂肪族カルボン酸、Ｃ７〜Ｃ１０脂肪族カルボン酸のエステル、Ｃ７〜Ｃ１０脂肪族アルデヒド、およびそれらの混合物からなる群から選択してもよい。好適な第２の溶媒は、さらに、１−ノナノール（ＣＡＳ番号１４３−０８−８）、１−デカノール（ＣＡＳ番号１１２−３０−１）、１−ウンデカノール（ＣＡＳ番号１１２−４２−５）、２−ウンデカノール（ＣＡＳ番号１６５３−３０−１）、１−ノナナール（ＣＡＳ番号１２４−１９−６）、およびそれらの混合物からなる群から選択される。一実施形態では、第２の溶媒は、１−ノナノール、１−デカノール、１−ノナナール、およびそれらの混合物からなる群から選択される。一実施形態では、第２の溶媒は、１−デカノールを含む。
【０１６１】
一実施形態では、第１の溶媒は、オレイルアルコールを含み、かつ第２の溶媒は、１−デカノールを含む。
【０１６２】
用語「それらの混合物」は、本明細書で使用される場合、基員（ｇｒｏｕｐ  ｍｅｍｂｅｒｓ）内の混合物および基員間の混合物の双方、例えばＣ１２〜Ｃ２２脂肪族アルコール内の混合物に加え、例えばＣ１２〜Ｃ２２脂肪族アルコールとＣ１２〜Ｃ２２脂肪酸の間の混合物を包含する。
【０１６３】
抽出剤を形成する第１および第２の溶媒の相対量は、好適な範囲内で変動し得る。一実施形態では、抽出剤は、第１および第２の溶媒の総容量を基準として約３０パーセント〜約９０パーセントの第１の溶媒を含有してもよい。一実施形態では、抽出剤は、約４０パーセント〜約８０パーセントの第１の溶媒を含有してもよい。一実施形態では、抽出剤は、約４５パーセント〜約７５パーセントの第１の溶媒を含有してもよい。別の実施形態では、抽出剤は、約５０パーセント〜約７０パーセントの第１の溶媒を含有してもよい。最適な範囲は、抽出剤特性の最大化、例えばブタノールにおける比較的高い分配係数の、許容レベルの生体適合性での均衡を反映する。ブタノールを生成または回収するための二相抽出発酵においては、温度、接触時間、発酵培地中のブタノール濃度、抽出剤および発酵培地の相対量、使用される特定の第１および第２の溶媒、第１および第２の溶媒の相対量、他の有機溶質の存在、ならびに微生物の量およびタイプが関連することから、これらの変数を適切な制限の範囲内で必要に応じて調節し、抽出プロセスを本明細書中に記載のように最適化してもよい。
【０１６４】
第１および第２の溶媒は、様々な供給源、例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から、様々なグレードで市販されている場合があり、それらの多くが、本明細書中に開示の方法によってブタノールを生成または回収するための抽出発酵における使用に適しているかもしれない。溶媒のテクニカルグレードは、所望される成分ならびにより高い分子量およびより低い分子量の成分または異性体を含む、化合物の混合物を含有してもよい。例えば、１つの市販のテクニカルグレードのオレイルアルコールは、約６５％のオレイルアルコールならびに高級および低級脂肪族アルコールの混合物を含有する。
【０１６５】
発酵
微生物は、ブタノールを生成する、好適な発酵槽内の好適な発酵培地中で培養してもよい。撹拌槽発酵槽、エアリフト発酵槽、気泡（ｂｕｂｂｌｅ）発酵槽、またはこれらの任意の組み合わせを含む任意の好適な発酵槽を使用してもよい。微生物培養物の維持および成長のための材料および方法は、微生物学または発酵科学の当業者に周知である（例えば、Ｂａｉｌｅｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ、第２版、ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，、１９８６年を参照）。好適な発酵培地、ｐＨ、温度、および好気的、微好気的、または嫌気的条件に対する要件に対しては、微生物、発酵、およびプロセスの特定の要件に応じて熟慮しなければならない。使用される発酵培地は重要ではないが、それは、使用される微生物の成長を支持し、所望されるブタノール生成物の生成に必要な生合成経路を促進する必要がある。限定はされないが、酵母抽出物またはペプトンなどの有機窒素源および少なくとも１つの発酵性炭素源を含有する複合培地；最少培地；ならびに限定培地を含む従来の発酵培地を使用してもよい。好適な発酵性炭素源は、限定はされないが、単糖、例えばグルコースまたはフルクトース；二糖、例えば乳糖またはスクロース；オリゴ糖；多糖、例えばデンプンまたはセルロース；１つの炭素基質；およびそれらの混合物を含む。好適な炭素源に加え、発酵培地は、当業者に既知の好適な窒素源、例えばアンモニウム塩、酵母抽出物またはペプトン、ミネラル、塩、共同因子、緩衝液および他の成分を含有してもよい（Ｂａｉｌｅｙら、上記）。抽出発酵に適した条件は、使用される特定の微生物に依存し、通常の実験を用いて、当業者によって容易に測定されるかもしれない。
【０１６６】
抽出発酵を用いてブタノールを回収するための方法
ブタノールは、ブタノールを少なくとも１つの炭素源から生合成経路を介して生成するため、ブタノール、水、少なくとも１つの発酵性炭素源、および遺伝子組換え（すなわち遺伝子操作）がなされている微生物を含有する発酵培地から回収することが可能である。かかる遺伝子組換え微生物は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からなる群から選択され得る。プロセスにおける第１ステップは、上記のように、発酵培地を、第１の溶媒および第２の溶媒を含む水不混和性有機抽出剤組成物と接触させ、水相およびブタノール含有有機相を含む二相混合物を形成するステップである。「接触する」とは、発酵培地および有機抽出剤組成物またはその溶媒成分が、発酵プロセスの間の任意の時間に物理的接触状態にされることを意味する。一実施形態では、発酵培地はエタノールをさらに含有し、かつブタノール含有有機相はエタノールを含有し得る。
【０１６７】
接触させるステップは、予め結合されている抽出剤組成物の第１および第２の溶媒で行ってもよい。例えば、第１および第２の溶媒は、混合タンクなどの容器内で結合させて抽出剤を形成してもよく、次いでそれは発酵培地を有する容器に添加される。あるいは、接触させるステップは、接触させるステップの間に結合状態になる第１および第２の溶媒で行ってもよい。例えば、第１および第２の溶媒は、発酵培地を有する容器に別々に添加してもよい。一実施形態では、発酵培地を有機抽出剤組成物と接触させるステップは、発酵培地および第１の溶媒を第２の溶媒と接触させる前に、発酵培地を第１の溶媒と接触させるステップをさらに含む。一実施形態では、第２の溶媒と接触させるステップは、第１の溶媒と接触させるステップと同じ容器内で行われる。一実施形態では、第２の溶媒と接触させるステップは、第１の溶媒と接触させるステップとは異なる容器内で行われる。例えば、第１の溶媒は、一方の容器内で発酵培地と接触させ、かつ、内容物は、第２の溶媒と接触させるステップが行われる他方の容器に移してもよい。
【０１６８】
有機抽出剤組成物は、発酵の開始時に発酵培地と接触させ、二相発酵培地を形成してもよい。あるいは、有機抽出剤組成物は、微生物が所望される量の成長を達成してから（培養物の光学密度を測定することによって判定可能である）、発酵培地と接触させてもよい。一実施形態では、抽出剤組成物の第１の溶媒は、一方の容器内で発酵培地と接触してもよく、かつ、抽出剤組成物の第２の溶媒は、同じ容器内で発酵培地および第１の溶媒と接触してもよい。別の実施形態では、抽出剤組成物の第２の溶媒は、第１の溶媒が発酵培地と接触する場合と異なる容器内で発酵培地および第１の溶媒と接触してもよい。
【０１６９】
さらに、有機抽出剤組成物は、発酵培地中のブタノールレベルが予め選択されたレベルに達する時点、例えばブタノール濃度が毒性レベルに達する前に発酵培地と接触させてもよい。ブタノール濃度は、当該技術分野で既知の方法を用いて、例えばガスクロマトグラフィーまたは高性能液体クロマトグラフィーにより、発酵中に監視してもよい。
【０１７０】
発酵は、光学密度測定によって判定されるように、培養物における予め選択されたレベルの成長を得るための十分な時間、好気的条件下で行ってもよい。次いで、誘導物質を添加し、修飾微生物におけるブタノール生合成経路の発現を誘発してもよく、米国特許出願公開第２００９／０３０５３７０Ａ１号明細書の実施例６において詳述されるように、発酵条件は微好気的または嫌気的条件に変更され、ブタノール生成が刺激される。抽出剤は、微好気的または嫌気的条件への変更後に加えられる。一実施形態では、抽出剤の第１の溶媒は、発酵培地および第１の溶媒が第２の溶媒と接触する前に、発酵培地と接触してもよい。例えば、バッチ発酵プロセスでは、発酵培地を第１および第２の溶媒と接触させる前に、適度な時間が経過することが許容されてもよい。連続発酵プロセスでは、発酵培地を第１の溶媒と接触させるステップは第１の容器内で行い、かつ容器の内容物を第２の溶媒と接触させるステップは第２の容器内で行ってもよい。
【０１７１】
発酵培地の有機抽出剤との接触を通じて、ブタノール生成物は有機抽出剤に分配され、微生物を含有する水相中の濃度が減少し、それによって生成微生物の阻害性のブタノール生成物への暴露が制限される。使用されるべき有機抽出剤の容量は、下記のように、発酵培地の容量、発酵槽のサイズ、ブタノール生成物に対する抽出剤の分配係数、および選択される発酵方法を含む要素の数に依存する。有機抽出剤の容量は、発酵槽の作動容量の約３％〜約６０％であってもよい。発酵培地に対する抽出剤の比は、容量：容量を基準として、約１：２０〜約２０：１、例えば約１：１５〜約１５：１、または約１：１２〜約１２：１、または約１：１０〜約１０：１、または約１：９〜約９：１、または約１：８〜約８：１である。
【０１７２】
次のステップは、限定はされないが、サイフォニング、デカンテーション、遠心分離、重力沈降槽の使用、膜支援（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ａｓｓｉｓｔｅｄ）相分離などを含む当該技術分野で既知の方法を用いて、ブタノール含有有機相を水相から分離することである。ブタノール含有有機相からのブタノールの回収は、限定はされないが、蒸留、樹脂による吸着、分子ふるいによる分離、パーベーパレイションなどを含む当該技術分野で既知の方法を用いて行うことが可能である。具体的には、蒸留を用いて、ブタノール含有有機相からブタノールを回収してもよい。場合により、抽出剤の第１および第２の溶媒は、相互に分離してもよい。抽出剤または溶媒は、ブタノール生成および／または回収プロセスへと再生してもよい。
【０１７３】
ガスストリッピングを有機抽出剤組成物の溶媒と併用し、ブタノール生成物を発酵培地から取り出してもよい。大気、窒素、または二酸化炭素などの気体を発酵培地に対して通過させることによってガスストリッピングを行い、それによってブタノール含有気相を形成してもよい。ブタノール生成物は、当該技術分野で既知の方法を用いて、例えばブタノールを濃縮するための冷水トラップ（ｃｈｉｌｌｅｄ  ｗａｔｅｒ  ｔｒａｐ）を用いて、または気相を溶媒で洗い落とす（ｓｃｒｕｂｂｉｎｇ）ことにより、ブタノール含有気相から回収してもよい。
【０１７４】
発酵の実行終了後、発酵培地中に残留する任意のブタノールは、新しいまたは再生された有機抽出剤を使用する連続抽出によって回収してもよい。あるいは、ブタノールは、当該技術分野で既知の方法、例えば蒸留、共沸蒸留、液体−液体抽出、吸着、ガスストリッピング、膜蒸発、パーベーパレイションなどを用いて、発酵培地から回収し得る。
【０１７５】
二相抽出発酵法は、撹拌槽発酵装置において連続モードで実施してもよい。このモードでは、発酵培地とブタノール含有有機抽出剤組成物の混合物は、発酵槽から取り出される。２つの相は、上記のように、限定はされないが、サイフォニング、デカンテーション、遠心分離、重力沈降槽の使用、膜支援相分離などを含む当該技術分野で既知の手段によって分離される。分離後、発酵培地は、発酵槽へと再利用するかまたは新しい培地と交換してもよい。次いで、抽出剤は、上記のように、処理し、ブタノール生成物が回収される。次いで、抽出剤は、生成物のさらなる抽出のため、発酵槽に戻して再利用してもよい。あるいは、新しい抽出剤を発酵槽に連続添加し、取り出された抽出剤と交換してもよい。運転のこの連続モードは、いくつかの利点を提供する。生成物は反応器から連続的に取り出されることから、より小容量の有機抽出剤組成物が必要とされ、それによってより大容量の発酵培地の使用が可能になる。この結果、より高い生成収率が得られる。有機抽出剤組成物の容量は、発酵槽の作動容量の約３％〜約５０％、発酵槽の作動容量の３％〜約２０％、または発酵槽の作動容量の３％〜約１０％であってもよい。発酵槽内で、可能な限り最も小容量の抽出剤を使用し、水相の容量、ひいては発酵槽内の細胞の量を最大にすることは有益である。本プロセスは、抽出剤が発酵槽と分離装置の間で連続的に再利用され、かつ発酵培地が発酵槽から連続的に取り出され、新しい培地で補充されるような完全連続モードで運転されてもよい。この完全連続モードでは、ブタノール生成物は重大な毒性濃度に達することが許容されず、発酵が長期間実施できるように新しい栄養素が連続的に提供される。これらのモードの二相抽出発酵の実施に使用してもよい装置は、当該技術分野で周知である。例が、例えば米国特許第４，８６５，９７３号明細書中、Ｋｏｌｌｅｒｕｐらによって記載されている。
【０１７６】
バッチ式発酵モードもまた使用してもよい。当該技術分野で周知であるバッチ発酵は、発酵培地の組成物が発酵開始時に設定され、かつプロセスの間、人為的改変を受けない閉鎖系である。このモードでは、大量の有機抽出剤組成物が発酵槽に加えられ、かつ抽出剤はプロセスの間に取り出されない。有機抽出剤組成物は、第１および第２の溶媒の別々の添加により、発酵槽内で形成してもよく、または、抽出剤組成物の発酵槽への添加前に、溶媒は、結合させ、抽出剤組成物を形成してもよい。このモードは上記の連続または完全連続モードより簡素であるが、発酵培地中の阻害性ブタノール生成物の濃度を最小限にするには、より大量の有機抽出剤組成物が必要とされる。結果として、発酵培地の容量はより少なく、かつ生成される生成物の容量は、連続モードを使用して得られるものより少ない。バッチ式モードにおける有機抽出剤組成物の容量は、発酵槽の作動容量の２０％〜約６０％、または発酵槽の作動容量の３０％〜約６０％であってもよい。上記の理由から、発酵槽内で、可能な限り最も小容量の抽出剤を使用することは有益である。
【０１７７】
フェドバッチ発酵モードもまた使用してもよい。フェドバッチ発酵は、標準バッチ系の変形であり、ここでは栄養素、例えばグルコースが発酵中に徐々に加えられる。栄養素の添加の量および速度は、通常の実験によって判定してもよい。例えば、発酵培地中の重要栄養素の濃度は、発酵中に監視してもよい。あるいは、ｐＨ、溶解酸素、および排ガス、例えば二酸化炭素の分圧などのより容易に測定される要素を監視してもよい。これらの測定されるパラメータから、栄養素添加の速度が判定してもよい。このモードで使用される有機抽出剤組成物の量および添加方法は、上記のバッチ式モードで使用されるものと同じである。
【０１７８】
生成物の抽出は、原位置ではなく発酵槽の下流で行ってもよい。この外部モードでは、ブタノール生成物の有機抽出剤組成物への抽出は、発酵槽から取り出される発酵培地上で実施される。使用される有機溶媒の量は、発酵槽の作動容量の約２０％〜約６０％、または発酵槽の作動容量の３０％〜約６０％である。発酵培地は、発酵槽から連続的または定期的に取り出してもよく、また有機抽出剤組成物によるブタノール生成物の抽出は、発酵培地からの細胞の除去にかかわらず行ってもよい。細胞は、限定はされないが、濾過または遠心分離を含む当該技術分野で既知の手段により、発酵培地から除去してもよい。上記の手段による抽出剤からの発酵培地の分離後、発酵培地は、発酵槽へと再利用し、廃棄し、または任意の残留ブタノール生成物を取り出すために処理してもよい。同様に、単離細胞はまた、発酵槽へと再利用してもよい。抽出剤組成物、第１の溶媒、および／または第２の溶媒は、ブタノール生成物を回収するために処理した後、抽出プロセスにおける使用のため、再利用してもよい。あるいは、新しい抽出剤を使用してもよい。このモードでは、抽出剤は発酵槽内に存在しないことから、抽出剤の毒性はほとんど問題にならない。細胞が抽出剤との接触前に発酵培地から分離される場合、抽出剤毒性の問題はさらに低減される。さらに、この外部モードを用いると、エマルジョンを形成する可能性は低下し、かつ抽出剤の蒸発は最低限となり、環境影響は緩和される。
【０１７９】
第１の溶媒および第２の溶媒を含む抽出剤による抽出発酵を用いて、ブタノールを生成するための方法
ブタノールを生成するための改善された方法が提供され、ここで、少なくとも１つの炭素源から生合成経路を介してブタノールを生成するように遺伝子組換えがなされている微生物を、二相発酵培地中で成長させる。かかる遺伝子組換え微生物は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からなる群から選択し得る。二相発酵培地は、水相と第１の溶媒および第２の溶媒を含む水不混和性有機抽出剤組成物とを含み、ここで、第１の溶媒は、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アルコール、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸のエステル、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アルデヒド、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アミド、およびそれらの混合物からなる群から選択され、かつ、第２の溶媒は、Ｃ７〜Ｃ１１アルコール、Ｃ７〜Ｃ１１カルボン酸、Ｃ７〜Ｃ１１カルボン酸のエステル、Ｃ７〜Ｃ１１アルデヒド、およびそれらの混合物からなる群から選択され、ここで二相発酵培地は、有機抽出剤組成物の容量を基準として約１０％〜約９０％を含む。あるいは、二相発酵培地は、有機抽出剤組成物の容量を基準として約３％〜約６０％、または約１５％〜約５０％を含んでもよい。微生物は、ブタノールを抽出剤に抽出するのに十分な時間、二相発酵培地中で成長し、ブタノール含有有機相を形成する。一実施形態では、発酵培地がエタノールをさらに含有し、かつブタノール含有有機相はエタノールを含有し得る。次いで、ブタノール含有有機相は、上記のように水相から分離される。その後、ブタノールは、上記のようにブタノール含有有機相から回収される。
【０１８０】
また、ブタノールを生成するための改善された方法が提供され、ここで少なくとも１つの炭素源から生合成経路を介してブタノールを生成するように遺伝子組換えがなされている微生物は、発酵培地中で成長させ、ここで微生物は、ブタノールを発酵培地に生成し、ブタノール含有発酵培地を生成する。かかる遺伝子組換え微生物は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からなる群から選択し得る。ブタノール含有発酵培地の少なくとも一部は、第１の溶媒および第２の溶媒を含む水不混和性有機抽出剤組成物と接触され、水相およびブタノール含有有機相を含む二相混合物を形成し、ここで、第１の溶媒は、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アルコール、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸のエステル、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アルデヒド、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アミド、およびそれらの混合物からなる群から選択され、かつ第２の溶媒は、Ｃ７〜Ｃ１１アルコール、Ｃ７〜Ｃ１１カルボン酸、Ｃ７〜Ｃ１１カルボン酸のエステル、Ｃ７〜Ｃ１１アルデヒド、およびそれらの混合物からなる群から選択される。一実施形態では、発酵培地は、エタノールをさらに含み、かつブタノール含有有機相は、エタノールを含有し得る。次いで、ブタノール含有有機相は、上記のように、水相から分離される。その後、ブタノールは、上記のように、ブタノール含有有機相から回収される。水相の少なくとも一部は、発酵培地に戻される。
【０１８１】
イソブタノールは、米国特許出願公開第２００９−０３０５３７０Ａ１号明細書中に開示される、組換え大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株を有機抽出剤としてのオレイルアルコールと併用した抽出発酵によって生成してもよい。本方法は、イソブタノールにおいて、従来の発酵技術の使用に対してより高い有効力価（すなわち３７ｇ／Ｌ）をもたらす（米国特許出願公開第２００９−０３０５３７０Ａ１号明細書の実施例６を参照）。例えば、Ａｔｓｕｍｉら（Ｎａｔｕｒｅ  ４５１（３）：８６−９０頁、２００８年）は、イソブタノール生合成経路を有するように遺伝子組換えがなされた大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）での発酵を利用する、イソブタノールの最大で２２ｇ／Ｌの力価について報告している。米国特許出願公開第２００９−０３０５３７０Ａ１号明細書中に開示される抽出発酵法の場合に得られるより高いブタノール力価は、部分的には、発酵培地からの毒性ブタノール生成物の除去から得られることから、同レベルは、微生物に対して有害であるレベル未満に保持される。本明細書中に定義される第１の溶媒および第２の溶媒を含む水不混和性有機抽出剤組成物を利用する本抽出発酵法が、同様の方法で用いられ、かつ同様の結果をもたらすものと仮定することは理にかなっている。
【０１８２】
本明細書中に開示の方法によって生成されるブタノールは、発酵培地の２２ｇ／Ｌを超える有効力価を有するかもしれない。あるいは、開示される方法によって生成されるブタノールは、発酵培地の少なくとも２５ｇ／Ｌの有効力価を有するかもしれない。あるいは、本明細書中に記載の方法によって生成されるブタノールは、発酵培地の少なくとも３０ｇ／Ｌの有効力価を有するかもしれない。あるいは、本明細書中に記載の方法によって生成されるブタノールは、発酵培地の少なくとも３７ｇ／Ｌの有効力価を有するかもしれない。
【０１８３】
本方法は、一般に、図１〜図７に関連して、下記の通りである。
【０１８４】
ここで図１を参照すると、原位置抽出発酵を用いてブタノールを生成し、回収するためのプロセスの一実施形態の略図が示される。少なくとも１つの発酵性炭素源の水性流１０は、少なくとも１つの発酵性炭素源をブタノールに変換できるように遺伝子組換えがなされようとしている少なくとも１つの微生物（図示せず）を含有する発酵槽２０に導入される。第１の溶媒の流れ１２および第２の溶媒の流れ１４は、容器１６に導入され、ここで溶媒は結合され、抽出剤１８を形成する。抽出剤の流れ１８は発酵槽２０に導入され、それにより、水相およびブタノール含有有機相を含む二相混合物を形成する上での発酵培地と抽出剤との接触が生じる。水相および有機相の双方を含む流れ２６は容器３８に導入され、ここで水相と有機相の分離がなされ、ブタノール含有有機相４０および水相４２が生成される。
【０１８５】
ここで図２を参照すると、原位置抽出発酵を用いてブタノールを生成し、回収するためのプロセスの一実施形態の略図が示される。少なくとも１つの発酵性炭素源の水性流１０は、少なくとも１つの発酵性炭素源をブタノールに変換できるように遺伝子組換えがなされようとしている少なくとも１つの微生物（図示せず）を含有する発酵槽２０に導入される。抽出剤に含まれる第１の溶媒の流れ１２および第２の溶媒の流れ１４は、発酵槽２０に別々に導入され、それにより、水相およびブタノール含有有機相を含む二相混合物を形成する上での発酵培地と抽出剤との接触が生じる。水相および有機相の双方を含む流れ２６は、容器３８に導入され、そこで水相および有機相の分離がなされ、ブタノール含有有機相４０および水相４２が生成される。
【０１８６】
ここで図３を参照すると、原位置抽出発酵を用いてブタノールを生成し、回収するためのプロセスの一実施形態の略図が示される。少なくとも１つの発酵性炭素源の水性流１０は、少なくとも１つの発酵性炭素源をブタノールに変換できるように遺伝子組換えがなされた少なくとも１つの微生物（図示せず）を含有する第１の発酵槽２０に導入される。抽出剤に含まれる第１の溶媒の流れ１２は、発酵槽２０に導入され、かつ第１の溶媒と発酵槽２０の内容物の混合物を含む流れ２２は、第２の発酵槽２４に導入される。抽出剤に含まれる第２の溶媒の流れ１４は、第２の発酵槽２４に導入され、それにより、水相およびブタノール含有有機相を含む二相混合物を形成する上での発酵培地と抽出剤との間の接触が生じる。水相および有機相の双方を含む流れ２６は、容器３８に導入され、そこで水相と有機相の分離がなされ、ブタノール含有有機相４０および水相４２が生成される。
【０１８７】
ここで図４を参照すると、生成物の抽出が原位置ではなく発酵槽の下流で行われる、ブタノールを生成し、回収するためのプロセスの一実施形態の略図が示される。少なくとも１つの発酵性炭素源の水性流１１０は、少なくとも１つの発酵性炭素源をブタノールに変換できるように遺伝子組換えがなされた少なくとも１つの微生物（図示せず）を含有する発酵槽１２０に導入される。第１の溶媒の流れ１１２および第２の溶媒の流れ１１４は、容器１１６に導入され、そこで溶媒は結合され、抽出剤１１８が形成される。発酵槽１２０内の発酵培地の少なくとも一部（流れ１２２として示される）は、容器１２４に導入される。抽出剤の流れ１１８はまた、容器１２４に導入され、それにより、水相およびブタノール含有有機相を含む二相混合物を形成する上での発酵培地と抽出剤との接触が生じる。水相および有機相の双方を含む流れ１２６は、容器１３８に導入され、そこで水相と有機相の分離がなされ、ブタノール含有有機相１４０および水相１４２が生成される。
【０１８８】
ここで図５を参照すると、生成物の抽出が原位置ではなく発酵槽の下流で行われる、ブタノールを生成し、回収するためのプロセスの一実施形態の略図が示される。少なくとも１つの発酵性炭素源の水性流１１０は、少なくとも１つの発酵性炭素源をブタノールに変換できるように遺伝子組換えがなされた少なくとも１つの微生物（図示せず）を含有する発酵槽１２０に導入される。抽出剤に含まれる、第１の溶媒の流れ１１２および第２の溶媒の流れ１１４は、容器１２４に別々に導入され、そこで溶媒は結合され、抽出剤１１８が形成される。発酵槽１２０内の発酵培地の少なくとも一部（流れ１２２として示される）はまた、容器１２４に導入され、それにより、水相およびブタノール含有有機相を含む二相混合物を形成する上での発酵培地と抽出剤との接触が生じる。水相および有機相の双方を含む流れ１２６は、容器１３８に導入され、そこで水相と有機相の分離がなされ、ブタノール含有有機相１４０および水相１４２が生成される。
【０１８９】
ここで図６を参照すると、生成物の抽出が原位置ではなく発酵槽の下流で行われる、ブタノールを生成し、回収するためのプロセスの一実施形態の略図が示される。少なくとも１つの発酵性炭素源の水性流１１０は、少なくとも１つの発酵性炭素源をブタノールに変換できるように遺伝子組換えがなされた少なくとも１つの微生物（図示せず）を含有する発酵槽１２０に導入される。抽出剤に含まれる第１の溶媒の流れ１１２は、容器１２８に導入され、かつ発酵槽１２０内の発酵培地の少なくとも一部（流れ１２２として示される）はまた、容器１２８に導入される。第１の溶媒と発酵槽１２０の内容物との混合物を含む流れ１３０は、第２の容器１３２に導入される。抽出剤に含まれる第２の溶媒の流れ１１４は、第２の容器１３２に導入され、それにより、水相およびブタノール含有有機相を含む二相混合物を形成する上での発酵培地と抽出剤との接触が生じる。水相および有機相の双方を含む流れ１３４は、容器１３８に導入され、そこで水相と有機相の分離がなされ、ブタノール含有有機相１４０および水相１４２が生成される。
【０１９０】
本明細書中に記載の抽出プロセスは、バッチプロセスとして作動するか、または連続モードで作動することが可能であり、この場合、新しい抽出剤が加えられ、使用済み抽出剤が、発酵槽内の抽出剤の量が全発酵プロセスの間で一定に保持されるように吐出される。発酵からの生成物および副生成物のかかる連続抽出は、有効な速度、力価および収率を高め得る。
【０１９１】
さらに別の実施形態では、一連のバッチ発酵槽が使用される場合、バッチ動作特性における差異を決定づけるフレキシブルな並流またはその代わりとしての向流の方法で、液体−液体抽出を操作することも可能である。このシナリオでは、発酵槽は発酵性マッシュで充填され、それにより、少なくとも１つの発酵性炭素源および微生物が、プラントが稼働している間、連続的な方法で次々と提供される。図７を参照すると、一旦、発酵槽Ｆ１００がマッシュおよび微生物で充填されると、マッシュおよび微生物の供給物は、連続ループで、発酵槽Ｆ１０１、次いで発酵槽Ｆ１０２に進み、次いで発酵槽Ｆ１００に戻される。任意の１つの発酵槽内での発酵は、一旦マッシュおよび微生物が共に存在すると開始され、発酵が完了するまで継続する。マッシュおよび微生物の充填時間は、発酵槽の数で全サイクル時間（充填、発酵、空化および清浄）を除したものに等しい。全サイクル時間が６０時間であり、かつ３つの発酵槽がある場合、充填時間は２０時間である。全サイクル時間が６０時間であり、かつ４つの発酵槽がある場合、充填時間は１５時間である。
【０１９２】
適応並流抽出は、より高い培養液相の力価で作動する発酵槽で、ブタノール濃度が最高の抽出溶媒流を用いることが可能であり、最低の培養液相の力価で作動する発酵槽が、ブタノール濃度が最低の抽出溶媒流の便益を得ることを前提とした発酵特性に従う。例えば、再び図７を参照し、発酵槽Ｆ１００が発酵の開始時に、比較的低いブタノール培養液相（Ｂ）の力価で作動している場合を考慮すると、発酵槽Ｆ１０１は、比較的適度なブタノール培養液相の力価で作動する発酵の中間段階であり、かつ発酵槽Ｆ１０２は、比較的高いブタノール培養液相の力価で作動する発酵の終了間際である。この場合、抽出されるブタノールが最小であるかまたは全くない希薄な抽出溶媒（Ｓ）は、発酵槽Ｆ１００に供給可能であり、次いで抽出されるブタノール成分を有する発酵槽Ｆ１００からの「溶媒流出（ｓｏｌｖｅｎｔ  ｏｕｔ）」流（Ｓ’）は、その「溶媒流入（ｓｏｌｖｅｎｔ  ｉｎ）」流として発酵槽Ｆ１０１に供給可能であり、次いでＦ１０１からの溶媒流出流は、その溶媒流入流として発酵槽Ｆ１０２に供給可能である。次いで、Ｆ１０２からの溶媒流出流は、送出され、処理され、同流中に存在するブタノールが回収されうる。ブタノールの大部分が除去された処理済みの溶媒流は、希薄な抽出溶媒としてシステムに戻すことが可能であり、その場合、上記の発酵槽Ｆ１００への供給される溶媒となる。
【０１９３】
発酵が規則正しく進行すると、抽出溶媒マニホールド内の弁は、最も希薄な抽出溶媒を最低のブタノール培養液相の力価で作動する発酵槽に供給するように再配置し得る。例えば、（ａ）発酵槽Ｆ１０２がその発酵を完了させ、再負荷されてから発酵が再開されると仮定すると、（ｂ）発酵槽Ｆ１００は、適度なブタノール培養液相の力価で作動するその発酵の中間段階であり、かつ（ｃ）発酵槽Ｆ１０１は、比較的より高いブタノール培養液相の力価で作動するその発酵の終了間際である。このシナリオであれは、最も希薄な抽出溶媒は、Ｆ１０２に供給され、Ｆ１０２に残留する抽出溶媒は、発酵槽Ｆ１００に供給され、また発酵槽Ｆ１００に残留する抽出溶媒は、発酵槽Ｆ１０１に供給されることになる。この方法を実施する利点は、培養液相のブタノールの力価を、できるだけ長期間、できるだけ低く維持し、生産性における改善を実現することであり得る。さらに、より高いブタノール培養液相の力価で運転中の、発酵段階までさらに進行している他の発酵槽内の温度を低下させることは可能であり得る。温度の低下は、より高いブタノール培養液相の力価に対する改善された耐性を許容し得る。
【０１９４】
本方法の利点
本抽出発酵法は、ガソリンの場合と同様のエネルギー含量を有することで知られ、かつ任意の化石燃料と混和可能であるブタノールを提供する。ブタノールは、標準内燃機関内で燃焼される場合、ＣＯ２のみを生成し、ＳＯＸまたはＮＯＸをほとんど生成しないことから、燃料または燃料添加剤として好ましい。さらにブタノールは、今日まで最も好ましい燃料添加剤であるエタノールより腐食性が低い。
【０１９５】
本方法によって生成されるブタノールは、バイオ燃料または燃料添加剤としてのその有用性に加え、新興の燃料電池産業における水素流通問題に影響を与える可能性を有する。今日、燃料電池は、水素の輸送および流通に関連した安全性の懸念によって悩まされている。ブタノールは、その水素含量において容易に改質し、燃料電池または車両のいずれかにとって要求される純度で、既存のガソリンスタンドを通じて流通させることが可能である。さらに、本方法は、ブタノールを植物由来の炭素源から生成し、ブタノール生成のための標準の石油化学プロセスに関連した負の環境影響を回避する。
【０１９６】
本方法の利点の１つが、本明細書中に記載される第１および第２の溶媒の適切な組み合わせによって得られるより高いブタノール分配係数である。より高い分配係数を有する抽出剤は、発酵培地からのブタノールのより有効な抽出を提供し得る。本方法の別の利点は、炭素鎖がより短い溶媒（望ましいことにより高い分配係数を有するが、望ましくないことにより低い生体適合性を有する溶媒）を含む抽出剤を使用し、かつ、炭素鎖がより長い溶媒と組み合わせることにより、より低い生体適合性を緩和する能力である。結果として、より有効な抽出剤、すなわち微生物の持続的な生存度を有する微生物の存在下で使用可能な抽出剤が得られる。
【０１９７】
さらに、本方法の利点は、抽出剤の改善されたプロセス操作性の特性を含み、それはオレイルアルコールなどの炭素鎖がより長い抽出剤の特性に対するものである。本方法の抽出剤は、オレイルアルコールより低い粘度、より低い密度、およびより低い沸点を有し、それは、かかる抽出剤を使用する抽出プロセスに対して改善をもたらす。抽出剤の改善された粘度および密度は、抽出の効率を改善し、かつ相分離を容易にし得る。沸点の低下は、蒸留分離に要求されるエネルギーを低下させ、かつ、ブタノールを抽出剤から分離する蒸留カラム内の底の温度を低下させる可能性がある。これらの特性を併せると、本明細書で開示される抽出剤を使用する抽出発酵において経済的利点が提供されるかもしれない。
【実施例】
【０１９８】
本発明はさらに以下の実施例にて定義される。これらの実施例が本発明の好ましい実施形態を示す一方であくまで例示目的で与えられることは理解されるべきである。上記の考察およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的な特性により、その趣旨および範囲から逸脱することなく本発明に対してさまざまな変更および改良を行うことで、本発明のさまざまな利用および条件への適合が可能であることが確認できる。
【０１９９】
材料
実施例においては、以下の材料を使用した。すべての市販試薬は、提供される様式で使用した。
【０２００】
すべての溶媒は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手し、さらなる精製を行わずに使用した。使用したオレイルアルコールは、テクニカルグレードであり、オレイルアルコール（６５％）と高級および低級脂肪族アルコールの混合物を含有した。使用した他の溶媒の純度は、次の通りであった。１−ノナノール、９８％；１−デカノール、９８％；１−ウンデカノール、９８％；２−ウンデカノール、９８％；ドデカノール、９８％；１−ノナナール、９８％。イソブタノール（純度９９．５％）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手し、さらなる精製を行わずに使用した。
【０２０１】
野生型サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＢＹ４７４１株は、ＡＴＣＣから入手した。
【０２０２】
一般的方法
微生物細胞濃度を測定するための光学密度読みとりを、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｈｅｌｉｏｓ  α分光光度計を使用して行った。測定は、典型的には６００ナノメーターの波長を用いて行った。
【０２０３】
培養ブロス中のグルコース濃度を、２７００  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＹＳＩ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｙｅｌｌｏｗ  Ｓｐｒｉｎｇｓ，ＯＨ））を使用して速やかに測定した。培養ブロス試料を、１．８ｍＬのエッペンドルフチューブ内、１３，２００ｒｐｍ、室温で２分間遠心分離し、水性上清のグルコース濃度について分析した。各発酵槽試料セットをアッセイする前、アナライザは既知のグルコース標準で自己較正を行い、外部標準もまた定期的にアッセイし、培養ブロスアッセイの完全性を保証した。分析のためのアナライザ仕様は、次の通りであった。
試料サイズ：１５μＬ
黒プローブ化学物質：デキストロース
白プローブ化学物質：デキストロース
【０２０４】
水相中のイソブタノールおよびグルコース濃度は、溶離剤として０．０１Ｎの水性硫酸（定組成）を使用する、適切なガードカラムを備えたＢｉｏＲａｄ  Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈカラム（７．８ｍｍ×３００ｍｍ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ））を使用し、ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  Ｍｏｄｅｌ（Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）またはＡｇｉｌｅｎｔ  １２００  Ｓｅｒｉｅｓ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ））によって測定した。試料を、０．２μｍの遠心分離フィルタ（Ｎａｎｏｓｅｐ  ＭＦ修飾ナイロン）を通過させ、ＨＰＬＣバイアルに入れた。ＨＰＬＣ実行条件は、次の通りであった。
注入容量：１０μＬ
流速：０．６０ｍＬ／分
実行時間：４０分
カラム温度：４０℃
検出器：屈折率
検出器温度：３５℃
ＵＶ検出：２１０ｎｍ、８ｎｍの帯域幅
【０２０５】
実行後、試料中の濃度は、化合物の各々における標準曲線から判定した。イソブタノールおよびグルコースにおける保持時間は、それぞれ３２．６分および９．１分であった。
【０２０６】
比較例Ａ〜Ｇ
単一の溶媒を含む抽出剤のスクリーニング
一連の比較例を、表１に列挙される水不混和性有機抽出剤を使用して実施した。各抽出剤は、下記のように発酵培地およびイソブタノールと接触させ、抽出剤の分配係数を測定した。抽出剤の生体適合性もまた、抽出の間での微生物のグルコース利用速度を測定することによって評価した。
【０２０７】
【表２】
2012523245.tif 000004
【０２０８】
以下の実験手順を用いた。これらの実験では、エタノールの量は、グルコース消費の量に依存したが、典型的なエタノール価は、１０〜１５ｇ／Ｌの範囲内であった。これらの濃度でのエタノールの存在が、グルコース消費およびブタノールの抽出剤への分配に影響することは想定されない。２５０ｍＬの酵母抽出物／ペプトン／デキストロース（ＹＰＤ）培地を含有するシード振とうフラスコ（ｓｅｅｄ  ｓｈａｋｅ  ｆｌａｓｋ）に、１５０μＬのサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＢＹ４７４１接種材料を接種し、それを、卓上振とう器（Ｉｎｎｏｖａ  ４２３０、Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ））上、２５０ｒｐｍで撹拌しながら３０℃で約１４時間インキュベートした。ＯＤ６００が約０．４に達した時、培養ブロス中のグルコース濃度を、Ｓｅｌｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎａｌｙｚｅｒによって迅速に分析し、さらなるグルコースを添加し、最終濃度を約２５ｇ／Ｌにした。培養ブロスを１２５ｍＬのフラスコに分け、各々は７５ｍＬの培養ブロスを含有した。表１に示されるように、抽出剤（２５ｍＬ）を適切なフラスコに添加した。２００ｒｐｍで振とうしながら３０℃でインキュベートして１時間後、水相中の初期イソブタノール濃度を４０ｇ／Ｌにするため、３．７５ｍＬのイソブタノールを各フラスコに添加した。水相およびブタノール含有有機相を含む二相発酵培地のインキュベーションを、１００ｒｐｍで振とうしながら３０℃で８時間継続した。各フラスコ内の水相および有機相を、デカンテーションによって分離した。水相を遠心分離し（エッペンドルフ遠心管モデル５４１５Ｒを使用して１３，０００ｒｐｍで２分間）、細胞を取り出し、上清中のグルコース、エタノール、およびイソブタノールについて、ＨＰＬＣによって分析した。
【０２０９】
グルコース利用速度は、試料間でのグルコース濃度の差異および試料間の時間を記録し、それにより、速度、例えば（［グルコース］ｔ２−［グルコース］ｔ１）／（ｔ２−ｔ１）（式中、ｔ１はｔ２より短い時間を示し、［グルコース］はグルコースの濃度を意味する）を計算することによって計算した。
【０２１０】
有機相および水相の間でのイソブタノール分布における分配係数は、フラスコに添加した既知量のイソブタノールおよび水相において測定したイソブタノール濃度データから計算した。抽出剤相におけるイソブタノールの濃度は、物質収支によって判定した。分配係数は、有機相と水相におけるイソブタノール濃度の比、すなわちＫｐ＝［イソブタノール］有機相／［イソブタノール］水相として判定した。
【０２１１】
比較例Ａを３回繰り返し、結果を平均化した。比較例Ａ〜Ｇの抽出剤においては、イソブタノールにおける分配係数およびグルコース利用速度は、下の表３において、オレイルアルコール（比較例Ａ）に対して判定された平均値の百分率として表される。１００％より大きい値は、オレイルアルコールにおける値より数値的に大きい結果を示す。１００％より小さい値は、オレイルアルコールにおける値より数値的に小さい結果を示す。１００％の値は、オレイルアルコールにおける値と同じ結果を示す。米国特許出願公開第２００９−０３０５３７０Ａ１号明細書中に開示されるように、オレイルアルコールは、イソブタノールを生成するための単一の溶媒抽出発酵において、優れた機能を発揮した。
【０２１２】
実施例１〜１５
第１および第２の溶媒を含む抽出剤のスクリーニング
表２に列挙される抽出剤は、次の修飾を伴うこと以外では、上記の手順を用いて評価した。培養ブロスを１２５ｍＬのフラスコに分けてから（各々は７５ｍＬの培養ブロスを含有する）、オレイルアルコールを、第１の溶媒として各フラスコに、表２に示される量で添加した。２００ｒｐｍで振とうしながら３０℃でインキュベートして１時間後、表２中に示される、対応する第２の溶媒を各フラスコに添加し、抽出剤の形成を完了後、水相中の初期イソブタノール濃度を４０ｇ／Ｌにするため、３．７５ｍＬのイソブタノールを添加した。その後、さらなるインキュベーション、検査、および測定を、上記のように行った。
【０２１３】
【表３】
2012523245.tif 000005
【０２１４】
実施例１〜１５の抽出剤においては、イソブタノールにおける分配係数およびグルコース利用速度は、下の表３において、比較例Ａ〜Ｇにおける結果と併せて、オレイルアルコール（比較例Ａ）に対して判定された平均値の百分率として表される。１００％より大きい値は、オレイルアルコールにおける値より数値的に大きい結果を示す。１００％より小さい値は、オレイルアルコールにおける値より数値的に小さい結果を示す。１００％の値は、オレイルアルコールにおける値と同じ結果を示す。
【０２１５】
【表４】
2012523245.tif 000006
【０２１６】
表３中のデータは、指定される単一の溶媒（比較例Ａ〜Ｇ）を含むすべての抽出剤が、オレイルアルコールの場合より大きいイソブタノール分配係数を有することを示し、これは、これらの抽出剤が、抽出発酵プロセスにおいて使用する場合、有利になることを示す。しかし、単一の溶媒抽出剤は、オレイルアルコールおよび１−ドデカノールを除き、ゼロのパーセントグルコース利用速度を有し、それは、微生物との生体適合性が著しく欠如していることを示す。生体適合性の欠如の程度により、抽出剤が発酵プロセスにおいて原位置で生成物を取り出すために使用される場合、分配係数の潜在的利点が失われることになる。
【０２１７】
表３中のデータはまた、比較例Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、およびＦの抽出剤の、試験したサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の株に対する生物毒性効果が、Ｃ７〜Ｃ１１アルコール、Ｃ７〜Ｃ１１カルボン酸、Ｃ７〜Ｃ１１カルボン酸のエステル、Ｃ７〜Ｃ１１アルデヒド、およびそれらの混合物からなる群から選択される、これらの炭素鎖がより短い溶媒を、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アルコール、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸のエステル、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アルデヒド、およびそれらの混合物からなる群から選択される、炭素鎖がより長い溶媒と組み合わせ、上記のように第１の溶媒および第２の溶媒を含む抽出剤を形成することによって緩和され得ることを示す。溶媒の組み合わせはまた、一般に改善されたイソブタノールにおける分配係数を提供する。本明細書中に開示の抽出剤を使用すると、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の、組換え株を含む他の株に対するイソブタノールと同様、他のブタノールの毒性が緩和され得る一方、ブタノールにおける改善された分配係数をさらに提供し得ることを想定すれば理にかなうことになる。また、緩和効果が、少なくとも１つの発酵性炭素源をブタノールに変換する能力がある遺伝子組換えがなされている大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）およびラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）に拡張可能であることを想定すれば理にかなうことになる。
【０２１８】
実施例１および２から得られたデータは、７０／３０オレイルアルコール／１−ノナノール（容量／容量基準）または５０／５０オレイルアルコール／１−ノナノールを含む抽出剤が、オレイルアルコールより低いパーセントグルコース利用速度を有する一方、依然として微生物との生体適合性を示し、それにより、抽出剤の存在下でのブタノールの生成を可能にすることを示す。オレイルアルコール／１−ノナノール抽出剤はまた、改善されたイソブタノール分配係数を有し、これらは、原位置で生成物を取り出すプロセスにとって有利である。
【０２１９】
同様に、実施例３〜５から得られたデータは、７０／３０、５０／５０、または３０／７０のオレイルアルコール／１−ウンデカノールを含む抽出剤が、１−ウンデカノールより有意に優れた微生物との生体適合性およびオレイルアルコールより高いイソブタノール分配係数を有することを示す。
【０２２０】
実施例６および７から得られたデータは、７０／３０または５０／５０のオレイルアルコール／２−ウンデカノールを含む抽出剤が、２−ウンデカノールより有意に優れた微生物との生体適合性およびオレイルアルコールと同じかまたはそれより高いイソブタノール分配係数を有することを示す。
【０２２１】
実施例８および９から得られたデータは、７０／３０または５０／５０のオレイルアルコール／１−ノナナールを含む抽出剤が、１−ノナナールより優れた生体適合性およびオレイルアルコールとほぼ同じかまたはそれより高いイソブタノール分配係数を有することを示す。
【０２２２】
実施例１０〜１２から得られたデータは、７０／３０、５０／５０、または３０／７０のオレイルアルコール／デカノールを含む抽出剤が、デカノールより高い生体適合性およびオレイルアルコールより高いイソブタノール分配係数を有することを示す。
【０２２３】
同様に、実施例１３〜１５から得られたデータは、７０／３０、５０／５０、または３０／７０のオレイルアルコール／１−ドデカノールを含む抽出剤が、１−ドデカノールより高い生体適合性およびオレイルアルコールより高いイソブタノール分配係数を有することを示す。
【０２２４】
表４は、実施例１〜１５および比較例Ａ〜Ｇの抽出剤における計算された粘度、密度、および沸点データを、オレイルアルコールにおける値に対して示す。物理特性計算を、例えば「Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｇａｓｅｓ  ａｎｄ  Ｌｉｑｕｉｄｓ」（Ｒｅｉｄ、Ｐｒａｕｓｎｉｔｚ、およびＰｏｌｉｎｇ、ＭｃＧｒａｗ−ｈｉｌｌ、１９８７年）に記載の標準の方法に従って行った。純粋成分におけるデータは、例えば物理特性データベースまたは公開文献から入手してもよい。
【０２２５】
【表５】
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【０２２６】
表４中のデータは、実施例の抽出剤が、オレイルアルコールの基本的な場合に対し、有意に低下した沸点および粘度ならびにやや低下した密度を有し得ることを示す。したがって、プロセス操作性の観点からいえば、実施例の抽出剤は、単一の溶媒のみを含む抽出剤を超える利点を提供するかもしれない。
【０２２７】
本発明の特定の実施形態が先の説明中に記述されているが、本発明に対し、本発明の精神または本質的属性から逸脱することなく、極めて多数の変更、代用、および再調整を施すことが可能であることは、当業者によって理解されるであろう。本発明の範囲を示すものとして、前述の明細書ではなく、添付の特許請求の範囲に対して参照がなされるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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