【手続補正書】
【提出日】平成21年8月21日(2009.8.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスを含むことが疑われる生物学的試料中の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの存在、不存在または量を検出する方法であって、
ａ）生物学的試料と、遺伝子改変された脊椎動物細胞とを試料との接触に先立って細胞中の少なくとも１つのウイルスヌクレオキャプシド蛋白質の不存在下にて接触させ、ここに該細胞は分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの人工セグメントまたはその相補体を含む組換えＲＮＡ分子を含み、該人工セグメントは分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの５’ＵＴＲ、ポリペプチドをコードするレポーター遺伝子を含み、ここに、そのポリペプチドの発現は、分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、および分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの３’ＵＴＲの細胞内の存在に依存し、ここに該ウイルスは、インフルエンザＡ型ウイルス、インフルエンザＢ型ウイルスおよびインフルエンザＣ型ウイルスよりなる群から選択され；次いで、
ｂ）レポーター遺伝子によりコード化されたポリペプチドの不存在、存在または量を検出することを特徴とする該方法。
【請求項２】
５'ＵＴＲを含む人工セグメントが、インフルエンザＡ型ウイルスのＮＰセグメントの５'ＵＴＲを含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
人工セグメントの３'ＵＴＲが、インフルエンザＡ型ウイルスのＮＰセグメントの３'ＵＴＲを含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
レポーター遺伝子によりコード化されたポリペプチドが、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β-グルコロニダーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質および分泌アルカリフォスファターゼよりなる群から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
レポーター遺伝子によりコード化されたポリペプチドが、緑色蛍光タンパク質およびホタルルシフェラーゼよりなる群から選択されることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
レポーター遺伝子によりコード化されたポリペプチドの不存在、存在または量の検出が、ポリペプチドにより発光された光量子シグナルの不存在、存在または量を検出することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】
遺伝子改変された脊椎動物細胞が、２９３Ｔ腎臓細胞、ＬＡ−４細胞、ＭＲＣ５細胞、Ａ５４９細胞、ＣＶ−１細胞、ベロ細胞、ＬＬＣ−ＭＫ１細胞、ＨＥｐ２細胞、２ｆＴＧＨ細胞、Ｕ３Ａ細胞、ＢＨＫ細胞、サル初代腎臓細胞およびチャイニーズハムスター卵巣細胞よりなる群から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項８】
分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスを含むことが疑われる生物学的試料中の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの存在、不存在または量を検出する方法であって、
ａ）生物学的試料と、遺伝子改変された脊椎動物細胞とを試料との接触に先立って細胞中の少なくとも１つのウイルスヌクレオキャプシド蛋白質の不存在下にて接触させ、ここに、該細胞は、作動可能に連結した：５'から３'の順序にて、
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーター；
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用の転写開始部位；
分節化されたマイナス鎖ウイルスの５’非翻訳領域（ＵＴＲ）のｃＤＮＡを含む人工セグメントをコード化するＤＮＡ配列、
ポリペプチドをコードするレポーター遺伝子、ここにポリペプチドの発現は該ウイルスのＲＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼの細胞内の存在に依存し、
分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの３’ＵＴＲのｃＤＮＡおよび
転写終結部位；
を含む組換えＤＮＡ分子を含み、ここに分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスはインフルエンザＡ型ウイルス、インフルエンザＢ型ウイルス、およびインフルエンザＣ型ウイルスよりなる群から選択され；次いで、
ｂ）レポーター遺伝子によりコード化されたポリペプチドの不存在、存在または量を検出することを特徴とする該方法。
【請求項９】
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼＩ用のプロモーターであることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
転写開始部位が、ＲＮＡポリメラーゼＩ用の転写開始部位であることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１１】
人工セグメントをコードするＤＮＡ配列が、人工セグメントの転写がアンチセンス配向にあるようにそのプロモーターに作動可能に連結されることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１２】
人工セグメントをコード化するＤＮＡが、人工セグメントの転写がセンス配向にあるようにそのプロモーターに作動可能に連結される請求項８記載の方法。
【請求項１３】
人工セグメントが、マイナス鎖ＲＮＡウイルスのセグメントの５'ＵＴＲのｃＤＮＡ、レポーター遺伝子、およびマイナス鎖ＲＮＡウイルスのセグメントの３'ＵＴＲのｃＤＮＡを含み、ここに、３'ＵＴＲおよび５'ＵＴＲの少なくとも１つは、生物学的試料を含むことが疑われるウイルスのＵＴＲであることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１４】
転写終結シグナルが、ＲＮＡポリメラーゼＩの転写終結シグナルであることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１５】
転写終結部位が、自己切断リボザイムをコードする配列を含むことを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１６】
遺伝子改変された脊椎動物細胞が、安定的にトランスフェクトした遺伝子改変された脊椎動物細胞であることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１７】
遺伝子改変された脊椎動物細胞が、一過性にトランスフェクトした遺伝子改変された脊椎動物細胞であることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１８】
生物学的試料中のインフルエンザＡ型、インフルエンザＢ型およびいずれでもないウイルス感染間の鑑別診断を決定する方法であって、
ａ）生物学的試料と、遺伝子改変された細胞の集団とを試料との接触に先立って細胞中の少なくとも１つのウイルスヌクレオキャプシド蛋白質の不存在下にて接触させ、ここに、実質的に複数の遺伝子改変された細胞は、インフルエンザＡ型ウイルス、インフルエンザＢ型ウイルスの人工セグメント、またはその相補体、該人工セグメントは該インフルエンザウイルスの５’ＵＴＲを含み、ポリペプチドをコードするレポーター遺伝子を含む組換えＲＮＡ分子を含み、ここに、該ポリペプチドの発現はインフルエンザウイルスのＲＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼ、および該インフルエンザウイルスの３’ＵＴＲの細胞内の存在に依存し；次いで
ｂ）遺伝子改変された細胞の集団におけるレポーター遺伝子の発現を測定することを特徴とする該方法。
【請求項１９】
組換えＲＮＡが、インフルエンザＡ型ウイルスの人工セグメントであり、人工セグメントが、インフルエンザＡ型ウイルスのセグメントの５'ＵＴＲ、ポリペプチドをコードするレポーター遺伝子のオープンリーディングフレームおよびインフルエンザＡ型ウイルスのセグメントの３'ＵＴＲを含むことを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
生物学的試料中の第１の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスおよび第２の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの存在、不存在または量を検出する方法であって、
ａ）生物学的試料と、遺伝子改変された脊椎動物細胞とを試料との接触に先立って細胞中の少なくとも１つのウイルスヌクレオキャプシド蛋白質の不存在下で接触させ、該細胞は、
ｉ）第１の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの人工セグメントまたはその相補体、該人工セグメントは第１の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの５’ＵＴＲを含み、発現が第１の分節化されたマイナス鎖ウイルスのＲＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼの細胞内の存在に依存する第１のレポーター遺伝子、および第１の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの３’ＵＴＲを含む第１の組換え分子、
ｉｉ）第２の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの人工セグメントまたはその相補体、該人工セグメントは第２の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの５’ＵＴＲを含み、発現が第２の分節化されたマイナス鎖ウイルスのＲＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼの細胞内の存在に依存する第２のレポ−ター遺伝子；および第２の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの３’ＵＴＲ、ここに、第１の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスおよび第２の分節化されたＲＮＡウイルスは、各々、インフルエンザＡ型ウイルス、インフルエンザＢ型ウイルス、およびインフルエンザＣ型ウイルスよりなる群から選択される；を含む第２の組換えＲＮＡ分子；
を含み；次いで、
ｂ）第１のレポーター遺伝子によりコード化された第１のポリペプチドの不存在、存在もしくは量、または第２のレポーター遺伝子によりコード化された第２のポリペプチドの不存在、存在もしくは量を検出することを特徴とする該方法。
【請求項２１】
第１もしくは第２の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスを含むことが疑われる生物学的試料中の第１の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスおよび第２の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの存在、不存在または量を検出する方法であって、
ｉ）生物学的試料と遺伝子改変脊髄動物細胞とを試料との接触に先立って細胞中の少なくとも１つのウイルスヌクレオキャプシド蛋白質の不存在下で接触させ、該細胞は、作動可能に連結した５’ないし３’順序で：
ａ）ＤＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーター；
ｂ）ＤＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼ用の転写開始部位；
ｃ）第１のセグメント、ここに該第１の人工セグメントは第１の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのセグメントの５’ＵＴＲのｃＤＮＡ、発現が該第１の分節化されたマイナス鎖ウイルスのウイルスＲＮＡの細胞内の存在に依存する第１のレポーター遺伝子のオープンリーディングフレームのＤＮＡ配列、および該第１の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのセグメントの３’ＵＴＲのｃＤＮＡを含み；
ｄ）ＤＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼ用の転写終結部位；
を含む第１の組み換えＤＮＡ分子；および
作動可能に連結した５’ないし３’順序で：
ｅ）ＤＮＡ−依存性ＲＮＡポリラメラーゼ用のプロモーター；
ｆ）ＤＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼ用の転写開始部位；
ｇ）第２の人工セグメント、ここに、該第２の人工セグメントは第２の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのセグメントの５’ＵＴＲのｃＤＮＡ、発現が該第２の分節化されたマイナス鎖ウイルスのウイルスＲＮＡの細胞内の存在に依存する第２のレポーター遺伝子のオープンリーディングフレームのＤＮＡ配列；および該第２の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡのセグメントの３’ＵＴＲのｃＤＮＡを含み；および
ｈ）ＤＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼ用の転写終結部；を含む第２の組換えＤＮＡ分子を含み；
ここに、該第１の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスおよび第２の分節化されたＲＮＡウイルスは、各々、インフルエンザＡ型ウイルス、インフルエンザＢ型ウイルス、およびインフルエンザＣ型ウイルスよりなる群から選択され、次いで、
ｂ）第１および第２のレポーター遺伝子によりコード化されたポリペプチドの不存在、存在または量を検出することを特徴とする該方法。
【請求項２２】
遺伝子改変された脊椎動物細胞が、
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用の第１のプロモーター；
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用の第１の転写開始部位；
第１の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの第１の５'ＵＴＲおよび第１の３'ＵＴＲならびに第１のレポーター遺伝子のオープンリーディングフレームを含む第１の人工セグメントをコードする第１のＤＮＡ配列；
第１の転写終結部位；
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用の第２のプロモーター；
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用の第２の転写開始部位；
第２の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの第２の５'ＵＴＲおよび第２の３'ＵＴＲならびに第２のレポーター遺伝子のオープンリーディングフレームを含む第２の人工セグメントをコードする第２のＤＮＡ配列；ならびに
第２の転写終結部位を含む組換えＤＮＡ分子を含むことを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
使用説明書および単離された組換えＤＮＡ分子を含み、ここに、該単離された組換えＤＮＡ分子は、作動可能に連結された５’ないし３’順序で：
ＤＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーター；
ＤＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼ用の転写開始部位；
分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの５’非翻訳領域（ＵＴＲ）のｃＤＮＡを含む人工セグメントをコードするＤＮＡ配列；
該分子でトランスフェクトされた細胞における発現が該分節化されたマイナス鎖ウイルスのＲＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼの細胞内の存在に依存するレポーター分子；分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの３’ＵＴＲのｃＤＮＡ；および該ＤＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼ用の転写終結部を含み、
ここに、該分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスはインフルエンザＡ型ウイルス、インフルエンザＢ型ウイルス、およびインフルエンザＣ型ウイルスよりなる群から選択され、およびここに、該レポーター分子は、感染に先立って細胞中の少なくとも１つのウイルスヌクレオキャプシド蛋白質の不存在下で細胞においてトランスフェクトされることを特徴とする、分節化されたマイナス鎖ウイルスの存在、不存在または量を検出するためのキット。
【請求項２４】
分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスに指向された抗ウイルス薬についての定量的スクリーニング方法であって、
ａ）候補抗ウイルス化合物と、遺伝子改変された細胞または細胞集団とを試料との接触に先立って該細胞または該細胞集団中の少なくとも１つのウイルスヌクレオキャプシド蛋白質の不存在下において接触させ、ここに、該細胞または細胞集団は、その発現がそのウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの細胞内の存在に依存するポリペプチドをコードするレポーター遺伝子を含む組換えＲＮＡ分子を含み、該細胞または該細胞集団はさらに分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを含み、ここに該第１の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスおよび該第２の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスは、各々、インフルエンザＡ型ウイルス、インフルエンザＢ型ウイルス、およびインフルエンザＣ型ウイルスよりなる群から選択され；次いで、
ｂ）細胞または細胞集団により生成されたポリペプチドの量を検出する
ことを特徴とする該方法。
【請求項２５】
候補抗ウイルス化合物と、そのウイルスによる増殖感染に感受性である第１の細胞とを接触させ；
第１の細胞を分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスで感染させ、それにより生成試料を供し；
第２の細胞とその生成試料とを接触させ、ここに、該第２の細胞は、試料との接触に先立って細胞中において少なくとも１つのウイルスヌクレオキャプシド蛋白質は不存在であり、かつ人工セグメントを含み、該人工セグメントは分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの５’ＵＴＲ、発現が分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに依存するポリペプチドをコードするレポーター遺伝子、および分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのセグメントの３’ＵＴＲを含み、ここに、該第１の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスおよび第２の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡは、各々、インフルエンザＡ型ウイルス、インフルエンザＢ型ウイルス、およびインフルエンザＣ型ウイルスよりなる群から選択され；次いで、
第２の細胞により生成されたポリペプチドの量を検出することを含む、
分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスに指向された抗−ウイルス薬のための定量的スクリーニング方法。
【請求項２６】
遺伝子改変された脊椎動物細胞が、安定的にトランスフェクトした遺伝子改変された脊椎動物細胞であり、該細胞が組換えＲＮＡをコード化する組換えＤＮＡをさらに含むことを特徴とする請求項２５記載の抗ウイルス薬についての定量的スクリーニング方法。