【手続補正書】
【提出日】平成21年5月11日(2009.5.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
修飾Ａｃトランスポゼースまたは修飾Ａｃトランスポゼースをコードする核酸、および
前記修飾Ａｃトランスポゼースに結合できる逆方向反復間に位置するポリヌクレオチドを含んでなる核酸断片、
を含んでなる、脊椎動物細胞のＤＮＡにポリヌクレオチドを導入するための遺伝子導入系であって、修飾Ａｃトランスポゼースが切断ＡｃトランスポゼースのＮ末端に核局在化シグナル(ＮＬＳ)を含み、前記ＮＬＳが転移反応を前記脊椎動物細胞の核へと局在化させ、前記切断Ａｃトランスポゼースが配列番号８と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、脊椎動物細胞のＤＮＡへのポリヌクレオチドの組込みを触媒する、遺伝子導入系。
【請求項２】
前記逆方向反復が、
（ａ）Ｄｓ因子の一部である逆方向反復、
（ｂ）Ｄｓ５’末端シス要求配列の一部およびＤｓ３’末端シス要求配列の一部である逆方向反復、
（ｃ）配列番号４５に記載されたヌクレオチド配列を有するＤｓ５’末端シス要求配列の一部および配列番号４９に記載されたヌクレオチド配列を有するＤｓ３’末端シス要求配列の一部である逆方向反復、
（ｄ）配列番号１のヌクレオチド３６５７〜３９０３に記載されたヌクレオチド配列を有するＤｓ５’末端シス要求配列の一部および配列番号１のヌクレオチド４３〜４１２に記載されたヌクレオチド配列を有するＤｓ３’末端シス要求配列の一部である逆方向反復、および
（ｅ）（ｃ）または（ｄ）のＤｓ５’末端シス要求配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するＤｓ５’末端シス要求配列の一部および（ｃ）または（ｄ）のＤｓ３’末端シス要求配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するＤｓ３’末端シス要求配列の一部であり、Ｄｓ５’末端シス要求配列およびＤｓ３’末端シス要求配列が前記修飾Ａｃトランスポゼースに結合できる逆方向反復、
よりなる群から選択される、請求項１に記載の遺伝子導入系。
【請求項３】
前記ＮＬＳが、配列番号２または配列番号９に記載されたアミノ酸配列を含んでなる、請求項２に記載の遺伝子導入系。
【請求項４】
前記修飾Ａｃトランスポゼースが、配列番号２０または配列番号４４に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、脊椎動物細胞のＤＮＡへの前記ポリヌクレオチドの組込みを触媒する請求項３に記載の遺伝子導入系。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドが、オープンリーディングフレームの少なくとも一部を含んでなる請求項１に記載の遺伝子導入系。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチドが、オープンリーディングフレームの少なくとも一部に操作可能に結合したプロモーターを含んでなる請求項５に記載の遺伝子導入系。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチドが、少なくとも１つの発現制御領域を含んでなる請求項１に記載の遺伝子導入系。
【請求項８】
前記発現制御領域が、プロモーター、エンハンサーおよびサイレンサーよりなる群から選択される請求項７に記載の遺伝子導入系。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか一項に記載の遺伝子導入系を細胞に導入するステップ、および
前記ポリヌクレオチドを前記細胞のゲノム内に安定に組み込ませるように前記細胞を培養して遺伝子導入脊椎動物細胞を作出するステップ、
を含んでなる、脊椎動物細胞のＤＮＡにポリヌクレオチドを導入する方法。
【請求項１０】
前記修飾Ａｃトランスポゼースが前記細胞に導入されている、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記修飾Ａｃトランスポゼースをコードする核酸が前記細胞に導入されており、前記核酸がＲＮＡまたはＤＮＡである請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記ポリヌクレオチドを組込むことのできるＤＮＡが、細胞ゲノムである請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記脊椎動物が魚である請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
遺伝子導入非ヒト脊椎動物を作出する方法であって、
請求項１から８のいずれか一項に記載の遺伝子導入系を、非ヒト脊椎動物細胞に導入するステップ、
前記ポリヌクレオチドを前記非ヒト脊椎動物細胞のゲノム内に安定に組み込ませるように前記非ヒト脊椎動物細胞を培養して遺伝子導入非ヒト脊椎動物細胞を作出するステップ、および
前記遺伝子導入非ヒト脊椎動物細胞を遺伝子導入非ヒト脊椎動物へと成長させるステップ、
を含んでなる方法。
【請求項１５】
前記核酸断片の導入よりも前に、前記修飾Ａｃトランスポゼースをコードする核酸が前記細胞に導入され、前記細胞のゲノム内に安定に組み込まれている請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記修飾Ａｃトランスポゼースが前記細胞に導入されている請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記修飾Ａｃトランスポゼースをコードする核酸が前記細胞に導入され、前記核酸がＲＮＡまたはＤＮＡである請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記脊椎動物が魚である請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
遺伝子の機能を同定する方法であって、
（ａ）遺伝子内にポリヌクレオチド挿入体を有する脊椎動物細胞を調製すること、
ここで、前記ポリヌクレオチドは修飾Ａｃトランスポゼースに結合できる前記逆方向反復の一部を含んでなり、前記脊椎動物細胞は
（i）請求項１から８のいずれか一項に記載の遺伝子導入系を前記細胞に導入すること、および
（ii）前記ポリヌクレオチドを前記細胞のゲノム内に安定に組み込ませるように前記細胞を培養して遺伝子導入脊椎動物細胞を作出すること、
によって調製され、
（ｂ）対象となっている表現型または生化学的特徴に係わる挿入変異について前記脊椎動物細胞をスクリーニングすること、および
（ｃ）前記表現型または生化学的特徴と、遺伝子のヌクレオチド配列とを関連づけ、それにより遺伝子の機能を同定すること、
を含んでなる方法。
【請求項２０】
前記関連づけが、
前記挿入変異を有する遺伝子を同定すること、および
前記遺伝子のヌクレオチド配列を決定すること、
を含んでなる請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記遺伝子のホモログまたはオルソログについて配列データベースを探索するステップをさらに含んでなる請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
推定上の薬剤標的を同定する方法であって、
（ａ）遺伝子内にポリヌクレオチド挿入体を有する脊椎動物細胞を調製すること、
ここで、前記ポリヌクレオチドは修飾Ａｃトランスポゼースに結合できる前記逆方向反復の一部を含んでなり、前記脊椎動物細胞は
（i）請求項１から８のいずれか一項に記載の遺伝子導入系を前記細胞に導入すること、および
（ii）前記ポリヌクレオチドを前記細胞のゲノム内に安定に組み込ませるように前記細胞を培養して遺伝子導入脊椎動物細胞を作出すること、
によって調製され、
（ｂ）対象となっている表現型または生化学的特徴に係わる挿入変異を有する脊椎動物細胞を同定すること、および
（ｃ）同定された前記脊椎動物細胞に関して、前記遺伝子のヌクレオチド配列および前記遺伝子によりコードされたタンパク質のアミノ酸配列を同定して、それにより推定上の薬剤標的を同定すること、
を含んでなる方法。
【請求項２３】
前記遺伝子のホモログまたはオルソログについて配列データベースを探索するステップをさらに含んでなる請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
化合物の作用部位を同定する方法であって、
（ａ）遺伝子内にポリヌクレオチド挿入体を有する脊椎動物細胞を調製すること、
ここで、前記ポリヌクレオチドは修飾Ａｃトランスポゼースに結合できる前記逆方向反復の一部を含んでなり、前記脊椎動物細胞は
（i）請求項１から８のいずれか一項に記載の遺伝子導入系を前記細胞に導入すること、および
（ii）前記ポリヌクレオチドを前記細胞のゲノム内に安定に組み込ませるように前記細胞を培養して遺伝子導入脊椎動物細胞を作出すること、
によって調製され、
（ｂ）挿入変異を有する脊椎動物細胞を、対象となっている化合物に曝露すること、
（ｃ）野生型脊椎動物細胞を、前記対象となっている化合物に曝露すること、
（ｄ）挿入変異を有する前記脊椎動物細胞、および前記野生型脊椎動物細胞に及ぼす前記化合物の効果を評価すること、および
（ｅ）前記野生型脊椎動物細胞と比較して、前記化合物に応答しない挿入変異を有する前記脊椎動物細胞における遺伝子のヌクレオチド配列を同定して、それにより前記化合物の作用部位を同定すること、
を含んでなる方法。
【請求項２５】
前記遺伝子のホモログまたはオルソログについて配列データベースを探索するステップをさらに含んでなる請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
脊椎動物の挿入変異ライブラリーであって、前記ライブラリーの各メンバーが、遺伝子内にポリヌクレオチド挿入体を有し、前記ポリヌクレオチドが、修飾Ａｃトランスポゼースに結合できる前記逆方向反復の一部を含んでなり、前記ライブラリーが、前記脊椎動物ゲノムの遺伝子の少なくとも１５％にポリヌクレオチド挿入体を有する、ライブラリー。
【請求項２７】
修飾Ａｃトランスポゼースが切断ＡｃトランスポゼースのＮ末端に核局在化シグナル(ＮＬＳ)を含み、前記ＮＬＳが転移反応を前記脊椎動物細胞の核へと局在化させ、前記切断Ａｃトランスポゼースが配列番号８と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、脊椎動物細胞のＤＮＡへの前記ポリヌクレオチドの組込みを触媒する、請求項２６に記載のライブラリー。
【請求項２８】
前記ライブラリーのメンバーが、脊椎動物の精子細胞、前記ポリヌクレオチド挿入体について異型接合性である脊椎動物個体、前記ポリヌクレオチド挿入体について同型接合性である脊椎動物個体、脊椎動物の一倍体胚、および脊椎動物の雌性発生二倍体胚からなる群から選択される、請求項２６に記載のライブラリー。
【請求項２９】
各ポリヌクレオチド挿入体に関連する遺伝子についてのＤＮＡ配列、前記遺伝子によりコードされたタンパク質についてのアミノ酸配列、および前記ＤＮＡ配列および前記アミノ酸配列の両方、からなる群から選択される配列をさらに含んでなる、請求項２６に記載のライブラリー。
【請求項３０】
前記脊椎動物が魚である請求項２６に記載のライブラリー。
【請求項３１】
遺伝子の機能を同定する方法であって、
対象となっている表現型に関する請求項２６に記載の脊椎動物挿入変異ライブラリーの少なくとも１つのメンバーをスクリーニングすること、および
前記対象となっている表現型と、前記ライブラリーの遺伝子のＤＮＡ配列とを関連づけ、それにより前記遺伝子の機能を同定すること、
を含んでなる方法。
【請求項３２】
前記遺伝子のホモログまたはオルソログについて配列データベースを探索するステップをさらに含んでなる請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
推定上の薬剤標的を同定する方法であって、
対象となっている表現型に関連する請求項２６に記載の脊椎動物挿入変異ライブラリーのメンバーを同定すること、および
前記ライブラリーの同定されたメンバーについて、前記遺伝子のＤＮＡ配列および前記遺伝子によりコードされたタンパク質のアミノ酸配列を同定して、それにより推定上の薬剤標的を同定すること、
を含んでなる方法。
【請求項３４】
前記遺伝子のホモログまたはオルソログについて配列データベースを探索するステップをさらに含んでなる請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
化合物の作用部位を同定する方法であって、
請求項２６に記載の脊椎動物挿入変異ライブラリーの少なくとも１つのメンバーを、対象となっている化合物に曝露すること、
野生型脊椎動物個体を前記対象となっている化合物に曝露すること、
前記ライブラリーのメンバーおよび前記野生型脊椎動物個体に及ぼす前記化合物の効果を評価すること、
前記野生型脊椎動物個体と比較して、前記化合物に応答しない前記ライブラリーのメンバーを同定すること、および
前記ライブラリーの同定されたメンバーにおける遺伝子のＤＮＡ配列を同定して、それにより前記化合物の作用部位を同定すること、
を含んでなる方法。
【請求項３６】
前記遺伝子のホモログまたはオルソログについて配列データベースを探索するステップをさらに含んでなる請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記効果が、生化学的特徴、酵素、表現型または導入遺伝子について評価される請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
対象となっている遺伝子を同定する方法であって、
請求項２６に記載の脊椎動物挿入変異ライブラリーのメンバーを、対象となっている特徴についてスクリーニングすること、
対象となっている特徴を有する前記ライブラリーの特定のメンバーにおいて前記対象となっている遺伝子の存在を関連づけること、および
前記ライブラリーの特定のメンバーに関連する前記遺伝子のＤＮＡ配列から対象となっている遺伝子を同定すること、
を含んでなる方法。
【請求項３９】
前記遺伝子のホモログまたはオルソログについて配列データベースを探索するステップをさらに含んでなる請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
請求項１から８のいずれか一項に記載の遺伝子導入系の使用。