(57)【要約】  本発明は、癌の治療における、腫瘍抗原に特異的に結合するアフコシル化抗体と、ヒトＧＭ−ＣＳＦ、ヒトＭ−ＣＳＦ及び／又はヒトＩＬ−３の群から選択される１又は２以上のサイトカインとの組合せ療法に関する。【選択図】図５ｂ
2012521379.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＧＭ−ＣＳＦ、ヒトＭ−ＣＳＦ及びヒトＩＬ−３の群から選択される１又は２以上のサイトカインとの組合せにおける癌治療用の医薬の製造における、６０％以下のフコース量を伴う、腫瘍抗原に特異的に結合するアフコシル化抗体の使用。
【請求項２】
上記アフコシル化抗体が抗ＣＤ２０抗体であり、上記癌がＣＤ２０を発現する癌である、請求項１記載の使用。
【請求項３】
上記アフコシル化抗ＣＤ２０抗体が、ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体である、請求項２記載の使用。
【請求項４】
上記アフコシル化抗体が抗ＥＧＦＲ抗体であり、上記癌がＥＧＦＲを発現する癌である、請求項１記載の使用。
【請求項５】
上記アフコシル化抗ＥＧＦＲ抗体が、ヒト化ＩＣＲ６２抗体である、請求項４記載の使用。
【請求項６】
上記アフコシル化抗体が抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体であり、上記癌がＩＧＦ−１Ｒを発現する癌である、請求項１記載の使用。
【請求項７】
上記アフコシル化抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体が、ヒトＨＵＭＡＢ−クローン１８である、請求項６記載の使用。
【請求項８】
上記癌が、単球／周皮細胞浸潤性癌である、請求項１〜７のいずれか１項記載の使用。
【請求項９】
上記アフコシル化抗体が増大されたＡＤＣＣを示す、請求項１〜８のいずれか１項記載の使用。
【請求項１０】
サイトカインとして、ヒトＧＭ−ＣＳＦのみが、上記組合せ治療において共投与される、請求項１〜９のいずれか１項記載の使用。
【請求項１１】
上記組合せ治療において、サイトカインとしてヒトＭ−ＣＳＦのみが共投与される、請求項１〜９のいずれか１項記載の使用。
【請求項１２】
上記組合せ治療において、サイトカインとしてＩＬ−３のみが共投与される、請求項１〜９のいずれか１項記載の使用。
【請求項１３】
上記組合せ治療において、サイトカインとしてＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−３のみが共投与される、請求項１〜９のいずれか１項記載の使用。
【請求項１４】
上記組合せ治療において、サイトカインとしてヒトＧＭ−ＣＳＦ、ヒトＭ−ＣＳＦ及び／又はヒトＩＬ−３が共投与される、請求項１〜９のいずれか１項記載の使用。
【請求項１５】
他の１又は２以上の追加の細胞傷害薬、化学療法剤若しくは抗癌剤、又は、かかる薬剤の作用を増強する化合物若しくは電離性放射線が投与される、請求項１〜１４のいずれか１項記載の使用。
【請求項１６】
癌治療のための、６０％以下のフコース量と、ヒトＧＭ−ＣＳＦ、ヒトＭ−ＣＳＦ及び／又はヒトＩＬ−３から選択される１又は２以上のサイトカインとを伴う、腫瘍抗原に特異的に結合するアフコシル化抗体。
【請求項１７】
癌治療のための、６０％以下のフコース量と、ヒトＧＭ−ＣＳＦ、ヒトＭ−ＣＳＦ及び／又はヒトＩＬ−３から選択される１又は２以上のサイトカインとを伴う、腫瘍抗原に特異的に結合するアフコシル化抗体を含有する組成物。
【請求項１８】
癌を治療する方法であって、かかる治療を必要とする患者に、
（ｉ）６０％以下のフコース量を伴う、アフコシル化抗体の第一の有効量；及び
（ｉｉ）ヒトＧＭ−ＣＳＦ、ヒトＭ−ＣＳＦ及び／又はヒトＩＬ−３から選択される１又は２以上のサイトカインの第二の有効量
を投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍抗原に特異的に結合するアフコシル化抗体と、ヒトＧＭ−ＣＳＦ、ヒトＭ−ＣＳＦ及びヒトＩＬ−３の１又は２以上のサイトカインとによる、癌患者の組合せ治療、特に単球／周皮細胞浸潤性癌に罹患した患者の組合せ治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
アフコシル化抗体
Umana, P.らの論文（Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180）；及び米国特許第６，６０２，６８４号に記載のように、モノクローナル抗体の細胞媒介性エフェクター機能は、それらのオリゴ糖成分を操作することにより、増強することができる。ＩｇＧ１型抗体は、癌免疫療法において最も一般的に使用される抗体であるが、これは各ＣＨ２ドメイン内のＡｓｎ２９７に保存されたＮ連結グリコシル化部位を有する糖タンパク質である。このＡｓｎ２９７に結合された２つの複合二分岐オリゴ糖は、ＣＨ２ドメイン間に包埋されて、ポリペプチド骨格との広範な接触を形成し、その存在は、抗体が抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）等のエフェクター機能を媒介する上で必須である（Lifely, M.R.ら、Glycobiology, 5 (1995) 813-822；Jefferis, R.ら、Immunol. Rev. 163 (1998) 59-76；Wright, A.及びMorrison, S.L.、Trends Biotechnol. 15 (1997) 26-32）。Umana, P.らの論文（Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180）及びＷＯ９９／５４３４２は、二分されたオリゴ糖の形成を触媒するグリコシルトランスフェラーゼであるβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII（“ＧｎＴIII”）のチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞内での過剰発現が、抗体のインビトロＡＤＣＣ活性を著しく増大させることを示した。Ｎ２９７炭水化物の組成の改変又はその排除も、ＦｃγＲ及びＣ１ｑに結合するＦｃへの結合に影響を及ぼす（Umana, P.ら、Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180；Davies, J.ら、Biotechnol. Bioeng. 74 (2001) 288-294；Mimura, Y.ら、J. Biol. Chem. 276 (2001) 45539-45547；Radaev, S.ら、J. Biol. Chem. 276 (2001) 16478-16483；Shields, R.L.ら、J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604；Shields, R.L.ら、J. Biol. Chem. 277 (2002) 26733-26740；Simmons, L.C.ら、J. Immunol. Methods, 263 (2002) 133-147）。Iida, S.らの論文（Clin. Cancer Res. 12 (2006) 2879-2887）は、アフコシル化抗ＣＤ２０抗体の有効性が、フコシル化抗ＣＤ２０の添加により阻害されたことを示している。アフコシル化抗ＣＤ２０とフコシル化抗ＣＤ２０との１：９混合物（１０μｇ／ｍＬ）の有効性は、アフコシル化抗ＣＤ２０単独の１，０００倍希釈物（０．０１μｇ／ｍＬ）の有効性よりも劣っていた。彼等は、フコシル化された対応物を含まないアフコシル化ＩｇＧ１が、その高いＦｃγＲIIIａ結合を介して、血漿ＩｇＧのＡＤＣＣに対する阻害作用を回避することができると結論づけた。Natsume, A.らは、J. Immunol. Methods, 306 (2005) 93-103において、ヒトＩｇＧ１型抗体の複合型オリゴ糖からのフコースの除去は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を大きく増強することを示している。Satoh, M.らの論文(Expert Opin. Biol. Ther. 6 (2006) 1161-1173)は、次世代治療用抗体としてアフコシル化治療用抗体を考察している。Satoh, M.は、アフコシル化ヒトＩｇＧ１型のみからなる抗体は、理想的であると考えられると結論づけた。Kanda, Y.ら(Biotechnol. Bioeng. 94 (2006) 680-688)は、フコシル化ＣＤ２０抗体（９６％フコシル化、ＣＨＯ／ＤＧ４４ １Ｈ５）を、アフコシル化ＣＤ２０抗体と比較した。Davies, J.ら(Biotechnol. Bioeng. 74 (2001) 288-294)は、ＣＤ２０抗体に関して、ＡＤＣＣの増大は、ＦｃγＲIIIへの結合の増加と相関していることを報告している。
【０００３】
フコース量を低減することによりモノクローナル抗体の細胞媒介性エフェクター機能を増強する方法は、例えば、ＷＯ２００５／０１８５７２、ＷＯ２００６／１１６２６０、ＷＯ２００６／１１４７００、ＷＯ２００４／０６５５４０、ＷＯ２００５／０１１７３５、ＷＯ２００５／０２７９６６、ＷＯ１９９７／０２８２６７、米国公開特許第２００６／０１３４７０９号、米国公開特許第２００５／００５４０４８号、米国公開特許第２００５／０１５２８９４号、ＷＯ２００３／０３５８３５、ＷＯ２０００／０６１７３９、Niwa, R.ら、J. Immunol. Methods, 306 (2005) 151-160；Shinkawa, T.ら、J Biol Chem, 278 (2003) 3466-3473；ＷＯ０３／０５５９９３又は米国公開特許第２００５／０２４９７２２号等に開示されている。
【０００４】
ＣＤ２０及び抗ＣＤ２０抗体
ＣＤ２０分子（ヒトＢリンパ球限局性分化抗原又はＢｐ３５とも称される）は、プレＢリンパ球及び成熟Ｂリンパ球に存在する分子量およそ３５ｋＤの疎水性膜貫通タンパク質である（Valentine, M.A.ら、J. Biol. Chem. 264(19) (1989) 11282-11287；及び、Einfield, D.A.ら、EMBO J. 7(3):711-717 (1988)；Tedder, T.F.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 (1988) 208-12；Stamenkovic, I.ら、J. Exp. Med. 167 (1988) 1975-80；Tedder, T.F.ら、J. Immunol. 142 (1989) 2560-8）。ＣＤ２０は、末梢血又はリンパ器官由来のＢ細胞の９０％超の表面に認められ、初期のプレＢ細胞の発生時に発現されて、形質細胞に分化するまで残存する。ＣＤ２０は、正常Ｂ細胞と悪性Ｂ細胞の両方に存在する。特にＣＤ２０は、９０％超のＢ細胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）で発現している（Anderson, K.C.ら、Blood, 63(6) 1424-1433 (1984)）が、造血幹細胞、プロＢ細胞、正常形質細胞、又は他の正常組織には見られない（Tedder, T.F.ら、J, Immunol. 135(2) (1985) 973- 979）。
【０００５】
ＣＤ２０タンパク質の８５個のアミノ酸カルボキシル末端領域は、細胞質内に位置する。この領域の長さは、他のＢ細胞特異的表面構造が、比較的短い細胞質内領域を有する（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＧ重鎖又はクラスII組織適合抗原又はβ鎖等は、それぞれアミノ酸３、３、２８、１５及び１６個）のとは対照的である（Komaromy, M.ら、NAR, 11 (1983) 6775-6785）。最後の６１個のカルボキシル末端アミノ酸のうち、酸性残基は２１個もあるのに対し、塩基性は僅かに２個であり、この領域が強力な正味の負帯電を有することを示している。ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号はＮＰ−６９０６０５である。ＣＤ２０は、Ｂ細胞の活性化及び分化プロセスの初期段階の調節に関与し（Tedder, T.F.ら、Eur. J. Immunol.16 (8) (1986) 881-887）、カルシウムイオンチャンネルとして機能するであろう（Tedder, T.F.ら、J. Cell. Biochem. 14D (1990) 195）と考えられている。
【０００６】
抗ＣＤ２０抗体には２つの異なる型が存在し、これらはＣＤ２０結合様式及び生物学的活性が著しく異なる（Cragg, M.S.ら、Blood, 103 (2004) 2738-2743；及び、Cragg, M.S.ら、Blood, 101 (2003) 1045-1052）。例えば、リツキシマブ（通常のグリコシル化パターンを有する、非アフコシル化、非糖鎖操作型の抗体）等のＩ型抗体は、強力な補体媒介性細胞傷害性を有するのに対し、例えばトシツモマブ（Ｂ１）、１１Ｂ８、ＡＴ８０又はヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体等のII型抗体は、同時ホスファチジルセリン曝露を伴うカスパーゼ非依存性アポトーシスを介して、標的細胞の死滅を有効に開始する。
【０００７】
Ｉ型及びII型抗ＣＤ２０抗体に共通の特徴を表１に纏めて示す。
【０００８】
【表１−１】
2012521379.tif 000003
【０００９】
米国特許第５，７３６，１３７号は、通常のグリコシル化パターンを有する、非アフコシル化、非糖鎖操作型の抗体であるリツキシマブに関する。ＷＯ２００５／０４４８５９及びＷＯ２００７／０３１８７５は、対応する親抗体と比べ低下した量のフコースを有するアフコシル化抗ＣＤ２０抗体に関する。ＷＯ２００８／１２１８７６（Ａ２，Ａ３）は、対応する親抗体に比べて低下した量のフコースを有するアフコシル化抗ＣＤ２０抗体に関する。
【００１０】
ＥＧＦＲ及びＥＦＧＲ抗体
ヒト上皮増殖因子受容体（別名ＨＥＲ−１又はＥｒｂ−Ｂ１。本明細書では“ＥＧＦＲ”と称する。）は、ｃ−ｅｒｂＢ癌原遺伝子によりコードされた１７０ｋＤａの膜貫通受容体であり、かつ固有のチロシンキナーゼ活性を示す（Modjtahedi, H.ら、Br. J. Cancer, 73 (1996) 228-235；Herbst, R.S.及びShin, D.M.、Cancer, 94 (2002) 1593-1611）。ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースエントリーＰ００５３３は、ＥＧＦＲの配列を提供している。そこにはＥＧＦＲのアイソフォーム及び変種も存在し（例えば、選択的ＲＮＡ転写物、切断型、多型など）、これらはＳｗｉｓｓｐｒｏｔデータベースエントリー番号Ｐ００５３３−１、Ｐ００５３３−２、Ｐ００５３３−３、及びＰ００５３３−４により同定されたものを含むが、これらに限定されるものではない。ＥＧＦＲは、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子−α（ＴＧＦ−α）、アンフィレギュリン、ヘパリン−結合ＥＧＦ（ｈｂ−ＥＧＦ）、ベータセルリン、及びエピレギュリンを含むリガンドに結合することが分かっている（Herbst, R.S.及びShin, D.M.、Cancer, 94 (2002) 1593-1611；Mendelsohn, J.及びBaselga, J.、Oncogene, 19 (2000) 6550-6565）。ＥＧＦＲは、細胞の増殖、分化、細胞生存、アポトーシス、血管新生、有糸分裂誘発、及び転移を制御するシグナル伝達経路の活性化を含むが、これらに限定されるものではない、チロシンキナーゼ媒介したシグナル伝達経路を介し、多くの細胞プロセスを調節する（Atalay, G.ら、Ann. Oncology, 14 (2003) 1346-1363；Tsao, A.S.及びHerbst, R.S.、Signal, 4 (2003) 4-9；Herbst, R.S.及びShin, D.M.、Cancer, 94 (2002) 1593-1611；Modjtahedi, H.ら、Br. J. Cancer, 73 (1996) 228-235）。
【００１１】
インビトロにおいてかかる遮断を実現するいくつかのマウスモノクローナル抗体が作出され、かつこれらはマウス異種移植モデルにおける腫瘍増殖に対し影響を及ぼすそれらの能力について評価されている(Masui, H.ら、Cancer Res. 46 (1986) 5592-5598；Masui, H.ら、Cancer Res. 44 (1984) 1002-1007；Goldstein, N.ら、Clin. Cancer Res. 1 (1995) 1311-1318)。例えば、ＥＭＤ５５９００(EMD Pharmaceuticals)は、ヒト類表皮癌細胞株Ａ４３１に対し生じたマウス抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体であり、かつ喉頭又は下咽頭の進行性扁平上皮細胞癌の患者で臨床試験中である(Bier, H.ら、Eur. Arch. Otohinolaryngol. 252 (1995) 433-9)。加えてラットモノクローナル抗体ＩＣＲ１６、ＩＣＲ６２、及びＩＣＲ８０は、ＥＧＦＲの細胞外ドメインに結合するが、これらは、ＥＧＦ及びＴＧＦ−αの受容体への結合の阻害に有効であることが示されている(Modjtahedi, H.ら、Int. J. Cancer, 75 (1998) 310-316)。マウスモノクローナル抗体４２５は、ヒトＡ４３１癌細胞株に対し生じる別のＭＡｂであり、ヒト上皮増殖因子受容体の外部ドメイン上のポリペプチドエピトープに結合することが分かっている(Murthy, U.ら、Arch. Biochem. Biophys. 252 (2) (1987) 549-560)。治療的処置におけるマウス抗体の使用に伴う潜在的問題点は、非ヒトモノクローナル抗体は、ヒト宿主により異物タンパク質と認識され；その結果、かかる異物抗体の反復注射は、免疫応答の誘導につながり、有害な過敏反応につながり得ることである。マウス−ベースのモノクローナル抗体に関して、これは、ヒト抗マウス抗体反応、又は「ＨＡＭＡ」反応、又はヒト抗ラット抗体若しくは「ＨＡＲＡ」反応と称されることが多い。加えてこれらの「異物」抗体は、宿主の免疫系により攻撃され、その結果これらの抗体がそれらの標的部位に到達する前に、これらの抗体は事実上中和される。更に非ヒトモノクローナル抗体（例えば、マウスモノクローナル抗体）は、典型的には、ヒトエフェクター機能を欠き、すなわちこれらは、とりわけ補体依存型溶解を媒介することができないか、又はヒト標的細胞を、抗体依存性細胞傷害若しくはＦｃ−受容体媒介したファゴサイトーシスを介して溶解することができない。
【００１２】
２種以上の異なる種（例えばマウスとヒト）由来の抗体部分を含むキメラ抗体が、「接合型」抗体の代替として開発されている。例えば米国特許第５，８９１，９９６号(Mateo de Acosta del Rio, C.M.ら)は、ＥＧＦＲに対するマウス／ヒトキメラ抗体Ｒ３について考察し、かつ米国特許第５，５５８，８６４号は、マウス抗ＥＧＦＲ  ＭＡｂ４２５のキメラ型及びヒト化型の作出を考察している。同じくＩＭＣ−Ｃ２２５(エルビタックス（登録商標）；ImClone)は、様々なヒト異種移植モデルにおいて抗腫瘍能を示すことが報告されている、キメラマウス／ヒト抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体（これはヒト臨床試験においてＨＡＭＡ反応を生じている、マウスＭ２２５モノクローナル抗体を基本にしている）である(Herbst, R.S.及びShin, D.M.、Cancer, 94 (2002) 1593-1611)。ＩＭＣ−Ｃ２２５の有効性は、ＥＧＦＲシグナル伝達経路により、及び恐らくは増大された抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性により、調節される細胞事象の阻害を含む、いくつかの機序に起因すると考えられる(Herbst, R.S.及びShin, D.M.、Cancer, 94 (2002) 1593-1611)。ＩＭＣ−Ｃ２２５は、放射線療法及び化学療法との併用を含む、臨床試験においても使用された(Herbst, R.S.及びShin, D.M.、Cancer, 94 (2002) 1593-1611)。最近、Abgenix社(フリーモント、CA)は、癌療法のためにＡＢＸ−ＥＧＦを開発した。ＡＢＸ−ＥＧＦは、完全ヒト抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体である(Yang, X.D.ら、Crit. Rev. Oncol./Hematol. 38 (2001) 17-23)。
【００１３】
ＷＯ２００６／０８２５１５は、ラットモノクローナル抗体ＩＣＲ６２に由来したアフコシル化ヒト化抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体を開示している。
【００１４】
ＩＧＦ−１Ｒ及びＩＧＦ−１Ｒ抗体
インスリン−様増殖因子Ｉ受容体（ＩＧＦ−１Ｒ又はＩＧＦ−ＩＲとしても公知、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースエントリーＰ０８０６９、ＣＤ２２１抗原）は、膜貫通タンパク質チロシンキナーゼファミリーに属する(LeRoith, D.ら、Endocrin. Rev. 16 (1995) 143-163；及び、Adams, T.E.ら、Cell Mol. Life Sci. 57 (2000) 1050-1063)。ＩＧＦ−ＩＲは、高親和性でＩＧＦ−Ｉに結合し、かつインビボにおいてこのリガンドに対する生理学的反応を開始する。ＩＧＦ−ＩＲは、ＩＧＦ−ＩＩにも結合するが、はるかに低い親和性である。ＩＧＦ−ＩＲの過剰発現は、細胞の腫瘍性形質転換を促進し、かつＩＧＦ−ＩＲは、細胞の悪性転換に関与することの証拠が存在し、その結果癌治療に関する治療薬開発のための有用な標的である(Adams, T.E.ら、Cell Mol. Life Sci. 57 (2000) 1050-1063)。
【００１５】
ＩＧＦ−１Ｒ抗体
ＩＧＦ−ＩＲに対する抗体は、当上記技術分野において周知であり、かつインビトロ及びインビボにおけるそれらの抗腫瘍作用について調べられている(Benini, S.ら、Clin. Cancer Res. 7 (2001) 1790-1797；Scotlandi, K.ら、Cancer Gene Ther. 9 (2002) 296-307；Scotlandi, K.ら、Int. J. Cancer, 101 (2002) 11-16；Brunetti, A.ら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 165 (1989) 212-218；Prigent, S.A.ら、J. Biol. Chem. 265 (1990) 9970-9977；Li, S.L.ら、Cancer Immunol. Immunother. 49 (2000) 243-252；Pessino, A.ら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 162 (1989) 1236-1243；Surinya, K.H.ら、J. Biol. Chem. 277 (2002) 16718-16725；Soos, M.A.ら、J. Biol. Chem., 267 (1992) 12955-12963；Soos, M.A.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 5217-5221；O'Brien, R.M.ら、EMBO J. 6 (1987) 4003-4010；Taylor, R.ら、Biochem. J. 242 (1987) 123-129；Soos, M.A.ら、Biochem. J. 235 (1986) 199-208；Li, S.L.ら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 196 (1993) 92-98；Delafontaine, P.ら、J. Mol. Cell. Cardiol. 26 (1994) 1659-1673；Kull, F.C. Jr.ら、J. Biol. Chem. 258 (1983) 6561-6566；Morgan, D.O.及びRoth, R.A.、Biochemistry, 25 (1986) 1364-1371；Forsayeth, J.R.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987) 3448-3451；Schaefer, E.M.ら、J. Biol. Chem. 265 (1990) 13248-13253；Gustafson, T.A.及びRutter, W.J.、J. Biol. Chem. 265 (1990) 18663-18667；Hoyne, P.A.ら、FEBS Lett. 469 (2000) 57-60；Tulloch, P.A.ら、J. Struct. Biol. 125 (1999) 11-18；Rohlik, Q.T.ら、Biochem. Biophys. Res. Comm. 149 (1987) 276-281；及び、Kalebic, T.ら、Cancer Res. 54 (1994) 5531-5534；Adams, T.E.ら、Cell. Mol. Life Sci. 57 (2000) 1050-1063；Dricu, A.ら、Glycobiology, 9 (1999) 571-579；Kanter-Lewensohn, L.ら、Melanoma Res. 8 (1998) 389-397；Li, S.L.ら、Cancer Immunol. Immunother. 49 (2000) 243-252))。ＩＧＦ−ＩＲに対する抗体は、例えばArteaga, C.L.ら、Breast Cancer Res. Treatment, 22 (1992) 101-106；及び、Hailey, J.ら、Mol. Cancer Ther. 1 (2002) 1349-1353などの、多くの更なる刊行物においても説明されている。ＩＧＦ−ＩＲに対するヒト抗体の例は、ＷＯ０２／０５３５９６に開示されている。米国公開特許第２００５／０００８６４２Ａ１号は、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体、特にヒト抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢ−クローン１８（寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２５８７）及び＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢ−クローン２２（寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２５９４）を詳細に開示している。ＷＯ２００８／０７７５４６は、増大されたＡＤＣＣを示す、糖質操作されたアフコシル化ヒト抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢ−クローン１８（寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２５８７）及び＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢ−クローン２２（寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２５９４）を開示している。
【００１６】
サイトカイン：
サイトカインの特性
サイトカインは、免疫、炎症、及び造血を媒介及び調節する、小型の分泌タンパク質である。これらは、免疫刺激に反応して新規に生成されなければならない。これらは一般に（しかし常ではない）、短い距離及び短い時間間隔にわたり、かつ非常に低い濃度で作用する。これらは、特異的膜受容体に結合することにより作用し、これは次に、時にはチロシンキナーゼであるセカンドメッセンジャーを介して、細胞へシグナルを送り、その挙動を変更する（遺伝子発現）。サイトカインに対する反応は、膜タンパク質（サイトカイン受容体を含む）の発現、増殖、及びエフェクター分子の分泌の増加又は減少を含む。
【００１７】
サイトカインは一般名であり；他の名称は、リンホカイン（リンパ球により生成されたサイトカイン）、モノカイン（単球により生成されたサイトカイン）、ケモカイン（走化性を持つサイトカイン）、及びインターロイキン（１つの白血球により生成されかつ他の白血球に作用するサイトカイン）を含む。サイトカインは、それらを分泌する細胞（オートクリン作用）、近傍の細胞（パラクリン作用）、又は場合によっては遠位の細胞（エンドクリン作用）に作用することができる。
【００１８】
様々な細胞型について、同じサイトカインを分泌すること、又は単独のサイトカインについて、いくつかの異なる細胞型に作用すること（多面作用）は一般的である。サイトカインは、それらの活性が重複しており、これは類似機能が異なるサイトカインにより刺激されることを意味する。１つのサイトカインはその標的細胞を刺激し、追加のサイトカインを生成するので、サイトカインは、カスケードで生成されることが多い。サイトカインは、相乗的（２種以上のサイトカインが一緒に作用する）又は拮抗的（サイトカインは反対の活性を引き起こす）にも作用することができる。
【００１９】
それらの短い半減期、低い血漿濃度、多面作用、及び重複性は全て、サイトカインの単離及び特徴決定を複雑にした。新規サイトカインの探求は現在、既知のサイトカイン遺伝子に類似した遺伝子を同定するよう、ＤＮＡレベルで行われることが多い。
【００２０】
サイトカイン活性
サイトカイン活性は、インビトロにおいて組み換えサイトカイン及び精製された細胞集団を使用するか、又はインビボにおけるサイトカイン機能を特徴付けるために個々のサイトカイン遺伝子に関するノックアウトマウスを用い、特徴付けられる。サイトカインは多くの細胞集団により生成されるが、主な生産者は、ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）とマクロファージである。
【００２１】
サイトカインは、免疫細胞の増殖及び分化を刺激する。顆粒球単球コロニー−刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）及びマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）の群は、単球又は周皮細胞を分化する。
【００２２】
顆粒球単球コロニー−刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）は、白血球増殖因子として機能するサイトカインである。ＧＭ−ＣＳＦは、幹細胞を刺激し、顆粒球（好中球、好酸球、及び好塩基球）及び単球を生成する。単球は、循環から出て、組織へと遊走し、その時点でこれらはマクロファージに成熟する。従ってこれは、免疫／炎症カスケードの一部であり、これにより少数のマクロファージの活性化が、迅速にそれらの数を増加し、感染と闘うための重要なプロセスにつながる。このタンパク質の活性型は、ホモ二量体として細胞外で認められる(Wong, G.G.ら、Science, 228 (1985)810-5；Lee, F.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82 (1985) 4360-4；Cantrell, M.A.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82 (1985) 6250-4)。
【００２３】
ＧＭ−ＣＳＦは、化学療法後の白血球産生を刺激するための医薬として使用される。最近これは、ＨＩＶ−感染患者におけるワクチンアジュバントとしてのその能力についても、臨床試験において評価されてきている。予備的結果は有望であるが、しかしＧＭ−ＣＳＦは現時点でこの目的に関してはＦＤＡ承認されていない。ＧＭ−ＣＳＦは、モルグラモスチムとして、又は酵母細胞においてこのタンパク質が発現される場合はサルグラモスチム(Leukine)としても、公知である。Leukine(商標)は、Schering AGの子会社であるBerlex Laboratoriesにより製造されたサルグラモスチムの商品名である。１９９１年３月に、非ホジキンリンパ腫、急性リンパ球性白血病、又はホジキン病の患者における自家骨髄移植後の白血球回復の促進のためのその使用が、米国食品医薬局（ＦＤＡ）により承認された。１９９６年１１月に、ＦＤＡは、真菌感染の治療及び化学療法後の白血球の補充について、サルグラモスチムを承認した。
【００２４】
インターロイキン−３（ＩＬ−３）は、免疫系の一部としての疾患に対する体の自然な反応を改善することができる生物学的シグナル（サイトカイン）型のインターロイキンである。これは、インターロイキン−３受容体に結合することにより作用する。
【００２５】
ＩＬ−３は、多分化能造血幹細胞（多能性）の、骨髄系前駆細胞への分化を刺激する（分化がＩＬ−７により刺激されるリンパ系前駆細胞へとは対照的に）ことに加え、骨髄系の全ての細胞（赤血球、血小板、顆粒球、単球、及び樹状細胞）の増殖を刺激する。ＩＬ−３は、活性化されたＴ細胞により分泌され、免疫応答における骨髄からのＴ細胞の増殖及び分化を支援する。ヒトＩＬ−３遺伝子は、１５２個のアミノ酸長のタンパク質をコードしており、かつ天然に生じるＩＬ−３はグリコシル化されている。ヒトＩＬ−３遺伝子は、第５染色体上に局在化され、ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子からはわずかに９キロベースであり、かつその機能はＧＭ−ＣＳＦに極めて類似している(Yang, Y.C.ら、Cell, 47 (1986) 3-10)；Urdal, D.L.ら、Ann. N. Y. Acad. Sci. 554 (1989) 167-76；Wagemaker, G.ら、Biotherapy, (Dordrecht、オランダ) 2 (1990) 337-45；Kitamura, T.ら、Cell, 66 (1991) 1165-74)。
【００２６】
マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）は、造血幹細胞にマクロファージ又は他の関連細胞型へ分化するよう影響を及ぼす、分泌型サイトカインである。真核細胞も、細胞内ウイルス感染を根絶するために、Ｍ−ＣＳＦを生成する。Ｍ−ＣＳＦは、コロニー刺激因子１受容体に結合する。このタンパク質の活性型は、ジスルフィド−連結されたホモ二量体として細胞外で認められ、膜結合型前駆体のタンパク質分解性の切断により生成されると考えられる(Kawasaki, E.S.ら、Science, 230 (1985) 291-6；Wong, G.G.ら、Science, 235 (1987) 1504-8；Ladner, M.B.ら、EMBO J. 6 (1987) 2693-8；Sherr, C.J.ら、Cell, 41 (1985) 665-76)。
【発明の概要】
【００２７】
本発明は、癌治療用の医薬の製造における、フコース量６０％以下の腫瘍抗原に特異的に結合するアフコシル化抗体の、ヒトＧＭ−ＣＳＦ、ヒトＭ−ＣＳＦ及び／又はヒトＩＬ−３の群から選択される１又は２以上のサイトカインとの組合せによる使用を包含する。
【００２８】
上記アフコシル化抗体は、好ましくは抗ＣＤ２０抗体であり、好ましくはヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体であり、上記癌は、ＣＤ２０を発現している癌、好ましくはＢ細胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）である。
【００２９】
上記アフコシル化抗体は、好ましくは抗ＥＧＦＲ抗体、好ましくはヒト化ＩＣＲ６２抗体であり、上記癌は、ＥＧＦＲを発現する癌である。
【００３０】
上記アフコシル化抗体は、好ましくは抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体、好ましくはヒトＨＵＭＡＢ−クローン１８）であり、上記癌は、ＩＧＦ−１Ｒを発現する癌である。
【００３１】
本発明の一実施態様は、癌が、単球／周皮細胞浸潤性癌であることを特徴とする。
【００３２】
本発明の一実施態様は、上記組合せ治療において、サイトカインとして、ＧＭ−ＣＳＦのみが共投与されることを特徴とする。
【００３３】
本発明の一実施態様は、上記組合せ治療において、サイトカインとして、Ｍ−ＣＳＦのみが共投与されることを特徴とする。
【００３４】
本発明の一実施態様は、上記組合せ治療において、サイトカインとして、ＩＬ−３のみが共投与されることを特徴とする。
【００３５】
本発明の一実施態様は、上記組合せ治療において、サイトカインとして、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−３のみが共投与されることを特徴とする。
【００３６】
本発明の一実施態様は、上記組合せ治療において、サイトカインヒトＧＭ−ＣＳＦ、ヒトＭ−ＣＳＦ及び／又はヒトＩＬ−３が共投与されることを特徴とする。
【００３７】
本発明の一実施態様は、アフコシル化抗体が、増大されたＡＤＣＣを示すことを特徴とする。
【００３８】
本発明の一実施態様は、腫瘍抗原と特異的に結合するアフコシル化抗体と、ヒトＧＭ−ＣＳＦ、ヒトＭ−ＣＳＦ及び／又はヒトＩＬ−３から選択される１又は２以上のサイトカインとを含有する、癌の治療用の組成物である。
【００３９】
アフコシル化糖鎖操作抗腫瘍抗原抗体と、サイトカインＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ及び／又はＩＬ−３との組合せ治療は、対応する非アフコシル化・非糖鎖操作型の抗体と、サイトカインＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ及び／又はＩＬ−３との組合せに比べて、増強された抗腫瘍阻害活性を示す。この組合せ治療は、これらのサイトカインＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ及び／又はＩＬ−３によりマクロファージへ分化される単球／周皮細胞を介し、抗腫瘍効果を媒介し、かつ単球／周皮細胞により浸潤される癌の治療に特に価値がある。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１ａ】図１ａは、アフコシル化・糖質操作型ヒト化Ｂ−Ｌｙ１（Ｂ−ＨＨ６−Ｂ−ＫＶ１ ＧＥ）１０μｇ／ｍｌの存在下における、腫瘍細胞と共培養された周皮細胞／単球細胞のＦＡＣＳ解析を示す。
【図１ｂ】図１ｂは、ヒトＩｇＧ（アイソタイプ）１０μｇ／ｍｌの存在下における、腫瘍細胞と共培養された周皮細胞／単球細胞のＦＡＣＳ解析を示す。
【図２】図２は、ＳＵ−ＤＨＬ４腫瘍細胞の腹膜エフェクター細胞反応（周皮細胞／単球は、ｍＧＭ−ＣＳＦ／ｍＧ−ＧＣＳ／ｍＩＬ−３により刺激）を示す。Ａ＝１０μｇ／ｍｌリツキシマブＢ＝１０μｇ／ｍｌアフコシル化され糖質操作されたヒト化Ｂ−Ｌｙ１（Ｂ−ＨＨ６−Ｂ−ＫＶ１  ＧＥ）Ｃ＝未処置Ｄ＝ヒトＩｇＧ
【図３】図３は、腫瘍細胞排除試験（１０μｇ／ｍｌリツキシマブ使用）を示す。
【図４】図４は、エフェクター：標的比滴定の抗腫瘍効果（アフコシル化・ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体Ｂ−ＨＨ６−Ｂ−ＫＶ１  ＧＥ（＝□）及び非アフコシル化リツキシマブ（＝△）を１０μｇ／ｍｌで使用）を示す。
【図５ａ】図５ａは、アフコシル化・糖質操作型の抗体（Ｂ−ＨＨ６−Ｂ−ＫＶ１  ＧＥ）の、非アフコシル化抗体（野生型Ｂ−ＨＨ６−Ｂ−ＫＶ１及びリツキシマブ）に対する、エフェクター：標的比（Ｅ：Ｔ）＝１：１での、異なる抗体濃度における抗腫瘍効果／腫瘍細胞排除の比較（ＳＵ−ＤＨＬ４（びまん性大細胞型リンパ腫細胞））を示す。
【図５ｂ】図５ｂは、アフコシル化・糖質操作型の抗体（Ｂ−ＨＨ６−Ｂ−ＫＶ１  ＧＥ）の、非アフコシル化抗体（野生型Ｂ−ＨＨ６−Ｂ−ＫＶ１及びリツキシマブ）に対する、エフェクター：標的比（Ｅ：Ｔ）＝３：１での、異なる抗体濃度における抗腫瘍効果／腫瘍細胞排除の比較（ＳＵ−ＤＨＬ４（びまん性大細胞型リンパ腫細胞））を示す。図５ａと対比すれば、アフコシル化・糖質操作型抗体（Ｂ−ＨＨ６−Ｂ−ＫＶ１  ＧＥ）が、特に野生型（ｗｔ）親抗体（ｗｔ  Ｂ−ＨＨ６−Ｂ−ＫＶ１）との比較において、より高い有効性を有することが明らかである。
【図６】図６は、ヒトＭ−ＣＳＦ、並びに、ａ）アフコシル化・ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体Ｂ−ＨＨ６−Ｂ−ＫＶ１ ＧＥ、ｂ）非アフコシル化（非糖質操作型）リツキシマブ１０μｇ／ｍｌ及びｃ）抗体なし（及び対照）による治療時の、ヒトマクロファージによる腫瘍細胞（ＳＵ−ＤＨＬ４（びまん性大細胞型リンパ腫細胞）及びＺ−１３８（マントル細胞リンパ腫））の抗腫瘍効果／腫瘍細胞排除を示す。
【図７】図７は、ヒトＭ−ＣＳＦと、−  １０μｇ／ｍｌのアフコシル化抗ＥＧＦＲヒト化ＩＣＲ６２、又は−  １０μｇ／ｍｌの野生型・非アフコシル化（非糖質操作型）抗ＥＧＦＲヒト化ＩＣＲ６２とによる治療時の、ヒトマクロファージによるＡ４３１腫瘍細胞における抗腫瘍効果／排除の比較を示す。
【図８】図８は、ヒトＭ−ＣＳＦと、−  １０μｇ／ｍｌのアフコシル化抗ＩＧＦ−１Ｒ  ＨＵＭＡＢ−クローン１８、又は−  １０μｇ／ｍｌの野生型・非アフコシル化（非糖質操作型）抗ＩＧＦ−１Ｒ ＨＵＭＡＢ−クローン１８とによる治療時の、Ｈ３２２Ｍ腫瘍細胞における抗腫瘍効果／排除の比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
本発明は、癌の治療用の医薬を製造するための、ヒトＧＭ−ＣＳＦ、ヒトＭ−ＣＳＦ及び／又はヒトＩＬ−３の群から選択される１又は２以上のサイトカインと組合せた、Ａｓｎ２９７でのオリゴ糖（糖質）総量の６０％以下のフコース量を伴う、腫瘍抗原に特異的に結合するＩｇＧ１又はＩｇＧ３アイソタイプ（好ましくはＩｇＧ１アイソタイプ）のアフコシル化抗体の使用を含み、ここで癌は上記腫瘍抗原を発現している。
一実施態様において、フコース量は、Ａｓｎ２９７でのオリゴ糖（糖質）の総量の２０％〜６０％である。
【００４２】
用語「抗体」は、全抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、及びモノクローナル抗体、キメラ抗体若しくは組み換え抗体などの遺伝子操作された抗体、更には本発明の特徴的特性が維持されている限りはかかる抗体の断片を含むが、これらに限定されるものではない様々な型の抗体を包含している。本明細書において使用される用語「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」とは、単独のアミノ酸組成の抗体分子の調製品をいう。従って用語「ヒトモノクローナル抗体」とは、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来した可変領域及び定常領域を有する、単独の結合特異性を示す抗体をいう。一実施態様において、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合されたヒト重鎖導入遺伝子及びヒト軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する、トランスジェニック非ヒト動物、例えばトランスジェニックマウスから得られたＢ細胞を含む、ハイブリドーマにより産生される。
【００４３】
用語「キメラ抗体」は、通常組み換えＤＮＡ技術により調製される、１つの給源又は種由来の可変領域、すなわち結合領域、及び異なる給源又は種由来の定常領域の少なくとも一部を含む、モノクローナル抗体をいう。マウス可変領域及びヒト定常領域を含むキメラ抗体は、特に好ましい。かかるマウス／ヒトキメラ抗体は、マウス免疫グロブリン可変領域をコードしているＤＮＡセグメント及びヒト免疫グロブリン定常領域をコードしているＤＮＡセグメントを含む、発現された免疫グロブリン遺伝子の産物である。本発明に包含される他の形の「キメラ抗体」は、クラス又はサブクラスが、当初の抗体のそれから修飾又は変更されているものである。かかる「キメラ」抗体は、「クラス−スイッチ」抗体とも称される。キメラ抗体を作製する方法は、当上記技術分野において現在周知である従来の組み換えＤＮＡ技術及び遺伝子トランスフェクション技術に関与している。例えばMorrison, S.L.ら、Proc. Natl. Acad Sci. USA, 81 (1984) 6851-6855；米国特許第５，２０２，２３８号及び第５，２０４，２４４号を参照のこと。
【００４４】
用語「ヒト化抗体」は、フレームワーク又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）が、親免疫グロブリンのＣＤＲと比べて、異なる特異性の免疫グロブリンのＣＤＲを含むように修飾されている抗体をいう。好ましい実施態様において、マウスＣＤＲは、ヒト抗体のフレームワーク領域にグラフトされ、「ヒト化抗体」を調製する。例えば、Riechmann, L.ら、Nature, 332 (1988) 323-327；及び、Neuberger, M.S.ら、Nature, 314 (1985) 268-270を参照のこと。特に好ましいＣＤＲは、キメラ抗体及び二価抗体について先に記した抗原を認識するそれらの代表的配列に相当している。
【００４５】
本明細書において使用される用語「ヒト抗体」は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する抗体を含むことが意図されている。ヒト抗体は、当上記技術分野において周知である(van Dijk, M.A.及びvan de Winkel, J.G.、Curr. Opin. Chem Biol. 5 (2001) 368-374)。かかる技術を基に、非常に様々な標的に対するヒト抗体を産生することができる。ヒト抗体の例は、例えばKellermann, S.A.ら、Curr Opin Biotechnol. 13 (2002) 593-597に説明されている。
【００４６】
本明細書において使用される用語「組み換えヒト抗体」は、例えばＮＳＯ細胞若しくはＣＨＯ細胞などの宿主細胞から、又はヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物（例えばマウス）から単離された抗体、又は宿主細胞にトランスフェクションされた組み換え発現ベクターを用い発現された抗体などの、組み換え手段により、調製、発現、作出若しくは単離された全てのヒト抗体を含むことが意図されている。かかる組み換えヒト抗体は再編成された形のヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変領域及び定常領域を有する。本発明の組み換えヒト抗体には、インビボ体細胞超変異が施されている。その結果組み換え抗体のＶＨ領域及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨ及びＶＬ配列に由来しかつこれらに関連があるにもかかわらず、インビボにおいてヒト抗体生殖系列レパトア内には天然には存在しない配列である。
【００４７】
本明細書において使用される用語「結合する」又は「特異的に結合する」は、精製された野生型抗原とのインビトロアッセイにおける、好ましくはプラズモン共鳴アッセイ(BIAcore、GE-Healthcare、ウプサラ、スウェーデン)における腫瘍抗原のエピトープへの抗体の結合をいう。結合の親和性は、用語ｋａ（抗体／抗原複合体からの抗体の会合に関する速度定数）、ｋD（解離定数）、及びＫD（ｋD／ｋａ）により規定される。結合する又は特異的に結合するは、結合親和性（ＫD）１０-8ｍｏｌ／ｌ以下、好ましくは１０-9Ｍ〜１０-13ｍｏｌ／ｌを意味する。従って本発明のアフコシル化抗体は、結合親和性（ＫD）１０-8ｍｏｌ／ｌ以下、好ましくは１０-9Ｍ〜１０-13ｍｏｌ／ｌで腫瘍抗原に特異的に結合する。
【００４８】
本明細書において使用される用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子を含むことが意図される。核酸分子は、一本鎖又は二本鎖であってよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【００４９】
「定常ドメイン」は、抗体の抗原への結合には直接関与していないが、エフェクター機能（ＡＤＣＣ、補体結合、及びＣＤＣ）には関与している。
【００５０】
本明細書において使用される「可変領域」（軽鎖可変領域（ＶＬ）、重鎖可変領域（ＶＨ））は、抗体の抗原への結合に直接関与している、軽鎖と重鎖の対の各々を意味する。可変ヒト軽鎖及び重鎖のドメインは、同じ一般構造を有し、かつ各ドメインは、４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を含み、それらの配列は広範に保存され、３つの「超可変領域」（又は相補性決定領域、ＣＤＲ）により接続されている。これらのフレームワーク領域は、β−シート高次構造を採用し、かつＣＤＲは、このβ−シート構造に接続するループを形成することができる。各鎖内のＣＤＲは、フレームワーク領域によりそれらの三次元構造が保持され、かつ他の鎖に由来するＣＤＲと一緒に、抗原結合部位を形成する。
【００５１】
用語「超可変領域」又は「抗体の抗原−結合部分」は、抗原−結合に寄与する抗体のアミノ酸残基をいう。超可変領域は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」又は「ＦＲ」領域は、ここで定義された超可変領域残基以外のそれらの可変ドメイン領域である。従って抗体の軽鎖及び重鎖は、Ｎ−末端からＣ−末端に、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４を含む。特に重鎖ＣＤＲ３は、抗原結合に最も貢献する領域である。ＣＤＲ領域及びＦＲ領域は、Kabatらの「Sequences of Proteins of Immunological Interest」(第5版、公衆衛生局(PHS)、米国国立衛生研究所(NIH)、ベセスダ、MD(1991))の標準の定義及び／又は「超可変ループ」からのそれらの残基に従い、決定される。
【００５２】
ヒト「ＧＭ−ＣＳＦ」（顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、ＧＭＣＳＦ、コロニー刺激因子２（顆粒球−マクロファージ）、コロニー刺激因子２、ＣＳＦ２、アミノ酸配列同一性が＞９８．５％である配列番号：２１−２２の変種）は、顆粒球及びマクロファージの生成、分化、及び機能を制御するサイトカインである。このタンパク質の活性型は、ホモ二量体として、細胞外に認められる(Wong, G.G.ら、Science, 228 (1985) 810-5；Lee, F.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82 (1985) 4360-4；Cantrell, M.A.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82 (1985) 6250-4)。ＧＭ−ＣＳＦは、モルグラモスチムとして、又はこのタンパク質が酵母細胞において発現される場合はサルグラモスチム(Leukine)としても公知である。Leukine(商標)は、Schering AGの子会社であるBerlex Laboratoriesにより製造されたサルグラモスチムの商品名である。その使用は、米国食品医薬局（ＦＤＡ）により承認された。本発明の用語「ＧＭ−ＣＳＦ」は、配列番号：２１と＞９８．５％のアミノ酸配列同一性を有するヒト顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子をいう。好ましくはＧＭ−ＣＳＦは、配列番号：２１のアミノ酸配列を有する。
【００５３】
ヒト「ＩＬ−３」（インターロイキン３、ＭＣＧＦ（マスト細胞増殖因子）、Ｐ−細胞刺激因子、造血系増殖因子、多系列−コロニー−刺激因子、アミノ酸配列同一性が＞９８．５％である配列番号：２３−２５の変種）は、強力な増殖促進性サイトカインである。このサイトカインは、広範な造血細胞型の増殖を支援することが可能である。これには、細胞増殖、分化及びアポトーシスなどの多種多様な細胞の活性が関与している。Yang, Y.C.ら、Cell, 47 (1986) 3-10；Urdal, D.L.ら、Ann. N. Y. Acad. Sci. 554 (1989) 167-76；Wagemaker, G.ら、Biotherapy, (Dordrecht、オランダ) 2 (1990) 337-45；Kitamura, T.ら、Cell, 66 (1991) 1165-74。インターロイキン−３（ＩＬ−３）は、免疫系の一部として疾患に対する体の自然な反応を改善することができる生物学的シグナル（サイトカイン）型のインターロイキンである。これは、インターロイキン−３受容体への結合により、作用する。ＩＬ−３は、多分化能造血幹細胞（多能性）の、骨髄系前駆細胞への分化を刺激する（分化がＩＬ−７により刺激されるリンパ系前駆細胞へとは対照的に）ことに加え、骨髄系の全ての細胞（赤血球、血小板、顆粒球、単球、及び樹状細胞）の増殖を刺激する。ＩＬ−３は、活性化されたＴ細胞により分泌され、免疫応答における骨髄からのＴ細胞の増殖及び分化を支援する。ヒトＩＬ−３遺伝子は、１５２個のアミノ酸長のタンパク質をコードしており、かつ天然に生じるＩＬ−３はグリコシル化されている。ヒトＩＬ−３遺伝子は、第５染色体上に局在化され、ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子からはわずかに９キロベースであり、かつその機能はＧＭ−ＣＳＦに極めて類似している。本発明の用語「ＩＬ−３」は、配列番号：２３とのアミノ酸配列の同一性が＞９８．５％である、ヒトインターロイキン３をいう。好ましくはＩＬ−３は、配列番号：２３のアミノ酸配列を有する。
【００５４】
ヒト「Ｍ−ＣＳＦ」（マクロファージコロニー刺激因子、ＭＣＳＦ、コロニー刺激因子１（マクロファージ）、コロニー刺激因子１、ＣＳＦ１；配列番号：２６とのアミノ酸配列同一性が＞９８．５％である配列番号：２６−２７の変種）は、マクロファージの生成、分化及び機能を制御するサイトカインである。このタンパク質の活性型は、ジスルフィド−連結したホモ二量体として細胞外に認められ、かつ膜結合型前駆体のタンパク質分解性切断により生成されると考えられる。このコードされたタンパク質は、胎盤の発達に関与している。３つの異なるアイソフォームをコードしている４つの転写物変種が、この遺伝子について分かっている(Kawasaki, E.S.ら、Science, 230 (1985) 291-6；Wong, G.G.ら、Science, 235: (1987) 1504-8；Ladner, M.B.ら、EMBO J. 6 (1987) 2693-8)。本発明の用語「Ｍ−ＣＳＦ」は、配列番号：２６とアミノ酸配列同一性が＞９９．５％である、ヒトマクロファージコロニー刺激因子をいう。好ましくはＭ−ＣＳＦは、配列番号：２６のアミノ酸配列を有する。
【００５５】
用語「アフコシル化抗体」とは、Ａｓｎ２９７での低下したレベルのフコース残基を有する、変更されたグリコシル化パターンをＦｃ領域内に有する、ＩｇＧ１又はＩｇＧ３アイソタイプ（好ましくはＩｇＧ１アイソタイプ）の抗体をいう。ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ３のグリコシル化は、Ａｓｎ２９７での最大２個のＧａｌ残基で終結された、コアフコシル化された二分岐複合オリゴ糖グリコシル化として生じる。これらの構造は、末端Ｇａｌ残基の量に応じて、Ｇ０、Ｇ１（α１，６又はα１，３）又はＧ２グリカン残基と称される(Raju, T.S.、BioProcess Int. 1 (2003) 44-53)。抗体Ｆｃ部分のＣＨＯ型グリコシル化は、例えばRoutier, F.H.の論文(Glycoconjugate J. 14 (1997) 201-207)に説明されている。糖鎖修飾されないＣＨＯ宿主細胞において組み換えにより発現された抗体は、Ａｓｎ２９７で、通常少なくとも８５％の量がフコシル化されている。
【００５６】
従って本発明のアフコシル化抗体とは、Ａｓｎ２９７でのフコース量がオリゴ糖（糖質）総量の６０％以下である（これは、Ａｓｎ２９７でのＦｃ領域のオリゴ糖少なくとも４０％以上が、アフコシル化されることを意味する）、ＩｇＧ１又はＩｇＧ３アイソタイプ（好ましくはＩｇＧ１アイソタイプ）の抗体を意味する。一実施態様において、フコース量は、Ａｓｎ２９７で、Ｆｃ領域のオリゴ糖の２０％〜６０％の間である。一実施態様において、フコース量は、Ａｓｎ２９７で、Ｆｃ領域のオリゴ糖の４０％〜６０％の間である。別の実施態様において、フコース量は、Ａｓｎ２９７で、Ｆｃ領域のオリゴ糖の５０％以下であり、更に別の実施態様において、フコース量は、３０％以下である。本発明での「フコース量」とは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により測定し、かつ平均値として算出した、Ａｓｎ２９７に結合した全てのオリゴ糖（糖質）の合計（例えば、複合型、混成型及び高マンノース型構造）に対する、Ａｓｎ２９７でのオリゴ糖（糖質）鎖内の上記オリゴ糖（フコース）の量を意味する（フコース量を決定する詳細な手順については、実施例８を参照のこと）。
【００５７】
更にＦｃ領域のオリゴ糖は、好ましくは二分されている。本発明のアフコシル化抗体は、Ｆｃ領域においてオリゴ糖を部分的にフコシル化するのに十分な量のＧｎＴIII活性を有するポリペプチドをコードしている少なくとも１個の核酸を発現するように操作された糖鎖修飾された宿主細胞において発現されることができる。一実施態様において、ＧｎＴIII活性を有するポリペプチドは、融合ポリペプチドである。あるいは、宿主細胞のα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性は、米国特許第６，９４６，２９２号に従い減少又は排除することができ、糖鎖修飾された宿主細胞を生じる。抗体フコシル化の量は、例えば、発酵条件（例えば発酵時間）、又は異なるフコシル化量を持つ少なくとも２種の抗体の組合せのいずれかにより、予め決定することができる。かかるアフコシル化抗体及び各々の糖鎖操作する方法は、ＷＯ２００５／０４４８５９、ＷＯ２００４／０６５５４０、ＷＯ２００７／０３１８７５、Umana, P.ら、Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180、ＷＯ９９／１５４３４２、ＷＯ２００５／０１８５７２、ＷＯ２００６／１１６２６０、ＷＯ２００６／１１４７００、ＷＯ２００５／０１１７３５、ＷＯ２００５／０２７９６６、ＷＯ９７／０２８２６７、米国公開特許第２００６／０１３４７０９号、米国公開特許第２００５／００５４０４８号、米国公開特許第２００５／０１５２８９４号、ＷＯ２００３／０３５８３５、ＷＯ２０００／０６１７３９に開示されている。これらの糖質操作された抗体は、増大したＡＤＣＣを有する。本発明のアフコシル化抗体を得るその他の糖質操作する方法は、Niwa, R.ら、J. Immunol. Methods 306 (2005) 151-160；Shinkawa, T.ら、J Biol Chem, 278 (2003) 3466-3473；ＷＯ０３／０５５９９３又は米国公開特許第２００５／０２４９７２２号に説明されている。
【００５８】
本発明の一実施態様は、アフコシル化抗体は、増大したＡＤＣＣを示すことを特徴としている（対応するアフコシル化されない親抗体と比べ）。一実施態様において、アフコシル化抗体は、エフェクター細胞として新たに単離されたＰＢＭＣ及び好適に抗原を発現している腫瘍細胞（例えばＩＧＦ１−ＲについてＨ３２２Ｍ、ＣＤ２０についてＲａｊｉ、及びＥＧＦＲについてＡ５４９）により、少なくとも５０％の対応するアフコシル化されない親抗体と比べ、増大したＡＤＣＣを有する（１０ｎｇ／ｍｌ抗体濃度及びエフェクター細胞／腫瘍細胞Ｅ：Ｔ比２５：１で）。
【００５９】
例えば抗ＣＤ２０抗体、抗ＥＧＦＲ抗体又は抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体として、本発明のアフコシル化抗体は、増大した抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を有する。
【００６０】
「増大した抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を伴うアフコシル化抗体（例えば、抗ＣＤ２０抗体、抗ＥＧＦＲ抗体又は抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体）」は、本明細書において定義されている用語として、当業者に公知の任意の好適な方法により決定された増大したＡＤＣＣを有する、アフコシル化抗体（例えば、抗ＣＤ２０抗体、抗ＥＧＦＲ抗体又は抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体）を意味する。
【００６１】
対応する野生型親抗体と比べ、アフコシル化抗体の増大したＡＤＣＣを決定するための一つの許容されたインビトロＡＤＣＣアッセイは、下記のようにＷＯ２００５／０４４８５９に開示されている：
１）本アッセイは、抗体の抗原−結合領域により認識される標的抗原を発現することがわかっている標的細胞を使用する；
２）本アッセイは、エフェクター細胞として、無作為に選択された健常ドナーの血液から単離されたヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を使用する；
３）本アッセイは、下記プロトコールに従い実行される：
ｉ）ＰＢＭＣを、標準密度勾配遠心分離手順を用いて単離し、ＲＰＭＩ細胞培養培地内に５×１０6個細胞／ｍｌで懸濁する；
ｉｉ）これらの標的細胞を、標準組織培養法により増殖させ、９０％よりも高い生存度で指数増殖相から収集し、ＲＰＭＩ細胞培養培地により洗浄し、51Ｃｒ  １００μキュリーで標識し、細胞培養培地により２回洗浄し、かつ細胞培養培地中に密度１０5個細胞／ｍｌで懸濁する；
ｉｉｉ）上記最終標的細胞懸濁液１００μＬを、９６−ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに移す；
ｉｖ）抗体を、４０００ｎｇ／ｍｌから０．０４ｎｇ／ｍｌまで、細胞培養培地中に連続希釈し、得られる抗体溶液５０μＬを、９６−ウェルマイクロタイタープレート内の標的細胞に添加し、上記濃度範囲を全て対象とする、様々な抗体濃度で、３つ組みで試験する；
ｖ）最大放出（ＭＲ）対照に関して、標識された標的細胞を含むプレート内の３つの追加ウェルに、抗体溶液（上記工程ｉｖ）の代わりに、非イオン性界面活性剤(Nonidet、Sigma、セントルイス）の２％（ＶＮ）水溶液５０μＬを加える；
ｖｉ）自然放出（ＳＲ）対照に関して、標識された標的細胞を含むプレート内の３つの追加ウェルに、抗体溶液（上記工程ｉｖ）の代わりに、ＲＰＭＩ細胞培養培地５０μＬを加える；
ｖｉｉ）次に９６−ウェルマイクロタイタープレートを、５０×ｇで１分間遠心し、４℃で１時間インキュベーションする；
ｖｉｉｉ）ＰＢＭＣ懸濁液（上記工程ｉ）の５０μＬを、各ウェルに添加し、エフェクター細胞：標的細胞の比２５：１を生じ、かつこれらのプレートを、５％ＣＯ2大気下、３７℃で４時間、インキュベーターに配置する；
ｉｘ）各ウェルから無細胞上清を収集し、実験的に放出された放射活性（ＥＲ）を、ガンマカウンターを用いて定量する；
ｘ）特異的溶解の割合は、各抗体濃度について、式（ＥＲ−ＭＲ）／（ＭＲ−ＳＲ）×１００に従い計算する（式中、ＥＲは、その抗体濃度に関して定量された平均放射活性であり（上記工程ｉｘ参照）、ＭＲは、ＭＲ対照に関して（上記工程ｖ参照）定量された平均放射活性であり（上記工程ｉｘ参照）、並びにＳＲは、ＳＲ対照に関して（上記工程ｖｉ参照）定量された平均放射活性である（上記工程ｉｘ参照））；
４）「増大したＡＤＣＣ」は、先に試験された抗体濃度範囲内で観察された特異的溶解の最大割合の増加、及び／又は先に試験された抗体濃度範囲内で観察された特異的溶解の最大割合の半分を達成するのに必要な抗体濃度の減少のいずれかとして定義される。好ましい実施態様において、増大したＡＤＣＣは、４時間後に、エフェクター細胞として新たに単離されたＰＢＭＣ及び好適に抗原−発現している腫瘍細胞（例えばＩＧＦ１−ＲについてＨ３２２Ｍ、ＣＤ２０についてＲａｊｉ、及びＥＧＦＲについてＡ５４９）により、抗体濃度１０ｎｇ／ｍｌ及びエフェクター細胞／腫瘍細胞Ｅ：Ｔ比２５：１で認められた特異的溶解の割合の増加として定義される。
【００６２】
ＡＤＣＣの増加は、当業者に公知の同じ標準の生成、精製、配合及び貯蔵方法を使用し、同じ宿主細胞型により産生されたが、ＧｎＴIIIを過剰発現するように操作された宿主細胞により産生されない、同じ抗体により媒介された、上記アッセイにより測定されたＡＤＣＣに対してである。
【００６３】
上記「増大されたＡＤＣＣ」は、上記抗体の糖鎖操作により得ることができ、これは、Umana, P.ら、Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180及び米国特許第６，６０２，６８４号に説明されたように、それらのオリゴ糖成分を操作することにより、モノクローナル抗体の上記天然の細胞媒介性エフェクター機能を増強することを意味する。かかる糖鎖操作された抗体のフコース量は６０％以下であるのに対し、対応する野生型親抗体（その糖鎖構造は操作されていない）のフコース量は通常８５％以上である。
【００６４】
用語「補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）」は、補体の存在下での本発明の抗体によるヒト腫瘍標的細胞の溶解をいう。ＣＤＣは好ましくは、ＣＤ２０発現している細胞の調製品の、補体の存在下での本発明の抗ＣＤ２０抗体による処置により測定される。ＣＤＣは、抗体が、濃度１００ｎＭで、４時間後に、腫瘍細胞の２０％以上の溶解（細胞死）を誘導する場合に認められる。このアッセイは好ましくは、51Ｃｒ又はＥｕ標識された腫瘍細胞により実行され、かつ放出された51Ｃｒ又はＥｕが測定される。対照は、補体を含むが抗体を含まない腫瘍標的細胞のインキュベーションである。
【００６５】
本明細書において使用される「腫瘍抗原」とは、ヒト起源の腫瘍抗原をいい、かつ腫瘍細胞の腫瘍形成性に寄与することが分かっているか又は寄与すると考えられる腫瘍細胞上に発現された（又はその発達に伴い会合された）任意の分子を含む、当上記技術分野において公知の意味を含んでいる。多くの腫瘍抗原が当上記技術分野において公知である。分子が腫瘍抗原であるかどうかは、例えば、クローン原性アッセイ、形質転換アッセイ、インビトロ又はインビボ腫瘍形成アッセイ、ゲル移動度アッセイ、遺伝子ノックアウト解析などの、当業者に周知の技術及びアッセイにより決定することもできる。好ましくは用語「腫瘍抗原」は、本明細書において使用される場合、ヒト膜貫通タンパク質、すなわち細胞の脂質二重層に繋がれた細胞膜タンパク質をいう。このヒト膜貫通タンパク質は一般に、リガンドに結合し得る本明細書において使用される「細胞外ドメイン」；親油性膜貫通ドメイン、保存された細胞内ドメイン、チロシンキナーゼドメイン、及びリン酸化され得るいくつかのチロシン残基を収容しているカルボキシル−末端シグナル伝達ドメインを含む。腫瘍抗原は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＣＥＡ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬ−受容体１、ＴＲＡＩＬ−受容体２、リンホトキシン−β受容体、ＣＣＲ４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ８０、ＣＳＦ−１Ｒ、ＣＴＬＡ−４、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、ヘプシン、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＣＤＣＰ１、ＶＥＧＦ受容体１、ＶＥＧＦ受容体２、ＩＧＦ１−Ｒ、ＴＳＬＰ−Ｒ、ＴＩＥ−１、ＴＩＥ−２、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ様のアポトーシスの弱い誘導因子（ＴＷＥＡＫ）、ＩＬ−１Ｒなどの分子を、好ましくはＭＣＳＰ、ＥＧＦＲ、ＣＥＡ、ＣＤ２０、又はＩＧＦ１−Ｒを、より好ましくはＣＤ２０、ＩＧＦ１−Ｒ又はＥＧＦＲを、更により好ましくはＣＤ２０又はＥＧＦＲを含む。従って本発明のアフコシル化抗体は、抗ＣＤ２０、抗ＩＧＦ１−Ｒ又は抗ＥＧＦＲ抗体が好ましい。
【００６６】
従って本発明の一態様は、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ及びＩＬ−３の群から選択される１又は２以上のサイトカインと組合せ、癌の治療用の医薬を製造するための、Ａｓｎ２９７でのオリゴ糖（糖質）の総量の６０％以下のフコース量を伴う、腫瘍抗原に特異的に結合するＩｇＧ１又はＩｇＧ３アイソタイプ（好ましくはＩｇＧ１アイソタイプ）のアフコシル化抗体の使用であり、ここで腫瘍抗原は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＣＥＡ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬ−受容体１、ＴＲＡＩＬ−受容体２、リンホトキシン−β受容体、ＣＣＲ４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ８０、ＣＳＦ−１Ｒ、ＣＴＬＡ−４、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、ヘプシン、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＣＤＣＰ１、ＶＥＧＦ受容体１、ＶＥＧＦ受容体２、ＩＧＦ１−Ｒ、ＴＳＬＰ−Ｒ、ＴＩＥ−１、ＴＩＥ−２、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ様のアポトーシスの弱い誘導因子（ＴＷＥＡＫ）、ＩＬ−１Ｒから、好ましくはＭＣＳＰ、ＥＧＦＲ、ＣＥＡ、ＣＤ２０、又はＩＧＦ１−Ｒから、より好ましくはＣＤ２０、ＩＧＦ１−Ｒ又はＥＧＦＲから、更により好ましくはＣＤ２０又はＥＧＦＲから選択される。一実施態様において、フコース量は、Ａｓｎ２９７でのオリゴ糖（糖質）の総量の２０％〜６０％である。別の実施態様において、フコース量は、Ａｓｎ２９７でのオリゴ糖（糖質）の総量の４０％〜６０％である。
【００６７】
従って本発明の一態様は、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ及びＩＬ−３の群から選択される１又は２以上のサイトカインと組合せ、癌の治療用の医薬を製造するための、Ａｓｎ２９７でのオリゴ糖（糖質）の総量の６０％以下のフコース量を伴う、腫瘍抗原に特異的に結合するＩｇＧ１又はＩｇＧ３アイソタイプ（好ましくはＩｇＧ１アイソタイプ）のアフコシル化抗体の使用であり、ここで癌は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＣＥＡ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬ−受容体１、ＴＲＡＩＬ−受容体２、リンホトキシン−β受容体、ＣＣＲ４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ８０、ＣＳＦ−１Ｒ、ＣＴＬＡ−４、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、ヘプシン、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＣＤＣＰ１、ＶＥＧＦ受容体１、ＶＥＧＦ受容体２、ＩＧＦ１−Ｒ、ＴＳＬＰ−Ｒ、ＴＩＥ−１、ＴＩＥ−２、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ様のアポトーシスの弱い誘導因子（ＴＷＥＡＫ）、ＩＬ−１Ｒから、好ましくはＭＣＳＰ、ＥＧＦＲ、ＣＥＡ、ＣＤ２０、又はＩＧＦ１−Ｒから、より好ましくはＣＤ２０、ＩＧＦ１−Ｒ又はＥＧＦＲから、更により好ましくはＣＤ２０又はＥＧＦＲから選択される上記腫瘍抗原を発現する。一実施態様において、フコース量は、Ａｓｎ２９７でのオリゴ糖（糖質）の総量の２０％〜６０％である。別の実施態様において、フコース量は、Ａｓｎ２９７でのオリゴ糖（糖質）の総量の４０％〜６０％である。
【００６８】
本明細書において使用される用語「結合する」又は「特異的に結合する」とは、精製された野生型抗原とのインビトロアッセイにおける、好ましくはプラズモン共鳴アッセイ(BIAcore、GE-Healthcare、ウプサラ、スウェーデン)における抗原エピトープへの抗体の結合をいう。結合の親和性は、用語ｋａ（抗体／抗原複合体からの抗体の会合に関する速度定数）、ｋD（解離定数）、及びＫD（ｋD／ｋａ）により規定される。結合する又は特異的に結合するは、結合親和性（ＫD）１０-8ｍｏｌ／ｌ以下、好ましくは１０-9Ｍ〜１０-13ｍｏｌ／ｌを意味する。従って本発明のアフコシル化抗体は、結合親和性（ＫD）が１０-8ｍｏｌ／ｌ以下、好ましくは１０-9Ｍ〜１０-13ｍｏｌ／ｌで特異的に腫瘍抗原に結合する。
【００６９】
本明細書において使用される「ＥＧＦＲ」は、ヒト上皮増殖因子受容体（ＨＥＲ−１又はＥｒｂ−Ｂ１としても知られ、本明細書においては”ＥＧＦＲ”と称される）をいい、ｃ−ｅｒｂＢ癌原遺伝子によりコードされた１７０ｋＤａ膜貫通受容体であり、かつ固有のチロシンキナーゼ活性を示す(Modjtahedi, H.ら、Br. J. Cancer, 73 (1996) 228-235；Herbst, R.S.及びShin, D.M.、Cancer, 94 (2002) 1593-1611)。ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースエントリーＰ００５３３は、ＥＧＦＲの配列を提供している。Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔデータベースエントリー番号Ｐ００５３３−１、Ｐ００５３３−２、Ｐ００５３３−３、及びＰ００５３３−４により同定されるものを含むが、これらに限定されるものではない、ＥＧＦＲのアイソフォーム及び変種（例えば、選択的ＲＮＡ転写物、切断型、多型など）も存在する。ＥＧＦＲは、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子−α（ＴＧＦ−α）、アンフィレギュリン、ヘパリン−結合ＥＧＦ（ｈｂ−ＥＧＦ）、ベータセルリン、及びエピレギュリンを含むリガンドに結合することが分かっている(Herbst, R.S.及びShin, D.M.、Cancer, 94 (2002) 1593-1611；Mendelsohn, J.及びBaselga, J.、Oncogene, 19 (2000) 6550-6565)。ＥＧＦＲは、細胞の増殖、分化、細胞生存、アポトーシス、血管新生、有糸分裂誘発、及び転移を制御するシグナル伝達経路の活性化を含むが、これらに限定されるものではない、チロシンキナーゼ媒介したシグナル伝達経路を介し、多くの細胞プロセスを調節する(Atalay, G.ら、Ann. Oncology, 14 (2003) 1346-1363；Tsao, A.S.及びHerbst, R.S.、Signal, 4 (2003) 4-9；Herbst, R.S.及びShin, D.M.、Cancer, 94 (2002) 1593-1611；Modjtahedi, H.ら、Br. J. Cancer, 73 (1996) 228-235)。
【００７０】
本発明の用語「アフコシル化抗ＥＧＦＲ抗体」は、ヒトＩＧＦ−１Ｒ抗原に特異的に結合する抗体である。抗ＥＧＦＲ抗体の例は、例えばラットモノクローナル抗体ＩＣＲ６２に由来したアフコシル化ヒト化抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体を開示しているＷＯ２００６／０８２５１５に説明されている。好ましい実施態様において、アフコシル化抗ＥＧＦＲ抗体は、重鎖可変ドメインとして配列番号：３０、及び軽鎖可変ドメインとして配列番号：３１を含む、アフコシル化ヒト化ＩＣＲ６２をいう。
【００７１】
本明細書において使用される「ＩＧＦ−１Ｒ」は、膜貫通タンパク質チロシンキナーゼファミリーに属する、ヒトインスリン−様増殖因子Ｉ受容体（ＩＧＦ−１Ｒ又はＩＧＦ−ＩＲとしても公知、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースエントリーＰ０８０６９、ＣＤ２２１抗原）をいう(LeRoith, D.ら、Endocrin. Rev. 16 (1995) 143-163；及び、Adams, T.E.ら、Cell. Mol. Life Sci. 57 (2000) 1050-1063)。ＩＧＦ−ＩＲは、高親和性でＩＧＦ−Ｉに結合し、かつインビボにおいてこのリガンドに対する生理学的反応を開始する。ＩＧＦ−ＩＲも、ＩＧＦ−ＩＩに結合するが、はるかに低い親和性である。ＩＧＦ−ＩＲの過剰発現は、細胞の腫瘍性形質転換を促進し、かつＩＧＦ−ＩＲは、細胞の悪性転換に関与することの証拠が存在し、その結果癌治療に関する治療薬開発のための有用な標的である(Adams, T.E.ら、Cell. Mol. Life Sci. 57 (2000) 1050-1063)。
【００７２】
本発明の用語「抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体」は、ヒトＩＧＦ−１Ｒ抗原に特異的に結合する抗体である。抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の例は、当上記技術分野において周知であり、かつインビトロ及びインビボにおけるそれらの抗腫瘍作用について調べられている(Benini, S.ら、Clin. Cancer Res. 7 (2001) 1790-1797；Scotlandi, K.ら、Cancer Gene Ther. 9 (2002) 296-307；Scotlandi, K.ら、Int. J. Cancer, 101 (2002) 11-16；Brunetti, A.ら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 165 (1989) 212-218；Prigent, S.A.ら、J. Biol. Chem. 265 (1990) 9970-9977；Li, S.L.ら、Cancer Immunol. Immunother. 49 (2000) 243-252；Pessino, A.ら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 162 (1989) 1236-1243；Surinya, K.H.ら、J. Biol. Chem. 277 (2002) 16718-16725；Soos, M.A.ら、J. Biol. Chem., 267 (1992) 12955-12963；Soos, M.A.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86 (1989) 5217-5221；O'Brien, R.M.ら、EMBO J. 6 (1987) 4003-4010；Taylor, R.ら、Biochem. J. 242 (1987) 123-129；Soos, M.A.ら、Biochem. J. 235 (1986) 199-208；Li, S.L.ら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 196 (1993) 92-98；Delafontaine, P.ら、J. Mol. Cell. Cardiol. 26 (1994) 1659-1673；Kull, F.C. Jr.ら、J. Biol. Chem. 258 (1983) 6561-6566；Morgan, D.O.及びRoth, R.A.、Biochemistry 25 (1986) 1364-1371；Forsayeth, J.R.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987) 3448-3451；Schaefer, E.M.ら、J. Biol. Chem. 265 (1990) 13248-13253；Gustafson, T.A.及びRutter, W.J.、J. Biol. Chem. 265 (1990) 18663-18667；Hoyne, P.A.ら、FEBS Lett. 469 (2000) 57-60；Tulloch, P.A.ら、J. Struct. Biol. 125 (1999) 11-18；Rohlik, Q.T.ら、Biochem. Biophys. Res. Comm. 149 (1987) 276-281；及び、Kalebic, T.ら、Cancer Res. 54 (1994) 5531-5534；Adams, T.E.ら、Cell. Mol. Life Sci. 57 (2000) 1050-1063；Dricu, A.ら、Glycobiology, 9 (1999) 571-579；Kanter-Lewensohn, L.ら、Melanoma Res. 8 (1998) 389-397；Li, S.L.ら、Cancer Immunol. Immunother. 49 (2000) 243-252))。ＩＧＦ−ＩＲに対する抗体は、多くの更なる刊行物においても説明されており、例えばArteaga, C.L.ら、Breast Cancer Res. Treatment, 22 (1992) 101-106；及び、Hailey, J.ら、Mol. Cancer Ther. 1 (2002) 1349-1353がある。ＩＧＦ−ＩＲに対するヒト抗体の例は、ＷＯ０２／０５３５９６に開示されている。更なる抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、ＷＯ２００３／０５９９５１及びＷＯ２００３／１００００８に開示されている。米国公開特許第２００５／０００８６４２Ａ１号は、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体、特にヒト抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢ−クローン１８（寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２５８７）及び＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢ−クローン２２（寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２５９４）を詳細に開示している。
【００７３】
ＷＯ２００８／０７７５４６は、増大されたＡＤＣＣを示す、糖質操作されたアフコシル化ヒト抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体ＨＵＭＡＢ−クローン１８及びＨＵＭＡＢ−クローン２２を開示している。本発明の好ましい実施態様において、アフコシル化抗体は、抗ＩＧＦ１−Ｒ抗体であり、好ましくは重鎖可変ドメインとして配列番号：２８、及び軽鎖可変ドメインとして配列番号：２９を含む、ＷＯ２００８／０７７５４６に開示されたアフコシル化ＨＵＭＡＢ−クローン１８である。
【００７４】
本明細書において使用される「ＣＤ２０」は、ヒトＢ−リンパ球抗原ＣＤ２０（ＣＤ２０、Ｂ−リンパ球表面抗原Ｂ１、Ｌｅｕ−１６、Ｂｐ３５、ＢＭ５、及びＬＦ５としても公知；その配列はＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースエントリーＰ１１８３６により特徴付けられる）をいい、これはプレＢリンパ球及び成熟Ｂリンパ球上に位置する分子量およそ３５ｋＤの疎水性膜貫通タンパク質である(Valentine, M.A.ら、J. Biol. Chem. 264(19) (1989) 11282-11287；Tedder, T.F.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 (1988) 208-12；Stamenkovic, I.ら、J. Exp. Med. 167 (1988) 1975-80；Einfeld, D.A.ら、EMBO J. 7 (1988) 711-7；Tedder, T.F.ら、J. Immunol. 142 (1989) 2560-8)。対応するヒト遺伝子は、ＭＳ４Ａ１としても公知の、膜貫通型４−ドメイン、サブファミリーＡ、メンバー１である。この遺伝子は、膜貫通型４Ａ遺伝子ファミリーのメンバーをコードしている。この発生期のタンパク質ファミリーのメンバーは、共通の構造上の特徴及び類似のイントロン／エキソンスプライシング境界により特徴付けられ、かつ造血細胞と非リンパ系組織の間で独自の発現パターンを示す。この遺伝子は、Ｂ細胞の形質細胞への発達及び分化において役割を果たすＢリンパ球表面分子をコードしている。このファミリーメンバーは、ファミリーメンバーのクラスターの中でも、１１ｑ１２に局在化している。この遺伝子の選択的スプライシングは、同じタンパク質をコードしている２種の転写物変種を生じる。
【００７５】
用語「ＣＤ２０」及び「ＣＤ２０抗原」は、本明細書において互換的に使用され、かつ細胞により天然に発現されているか、又はＣＤ２０遺伝子によりトランスフェクションされた細胞において発現されている、任意のヒトＣＤ２０の変種、アイソフォーム及び種ホモログを含む。本発明の抗体のＣＤ２０抗原への結合は、ＣＤ２０の不活化により、ＣＤ２０を発現している細胞（例えば腫瘍細胞）の殺傷を媒介する。ＣＤ２０を発現している細胞の殺傷は、下記の機構の１又は複数により生じる：細胞死／アポトーシス誘導、ＡＤＣＣ及びＣＤＣ。
【００７６】
当上記技術分野において認められるようにＣＤ２０の同義語は、Ｂリンパ球抗原ＣＤ２０、Ｂリンパ球表面抗原Ｂ１、Ｌｅｕ−１６、Ｂｐ３５、ＢＭ５、及びＬＦ５を含む。
【００７７】
本発明の用語「抗ＣＤ２０抗体」は、ＣＤ２０抗原に特異的に結合する抗体である。抗ＣＤ２０抗体のＣＤ２０抗原への結合特性及び生物学的活性に応じて、２種の抗ＣＤ２０抗体（Ｉ型及びＩＩ型抗ＣＤ２０抗体）が、Cragg, M.S.ら、Blood, 103 (2004) 2738-2743；及び、Cragg, M.S.ら、Blood, 101 (2003) 1045-1052に従い、識別することができる（表２参照のこと）。
【００７８】
【表１−２】
2012521379.tif 000004
【００７９】
ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体の例は、例えば、ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体ＩｇＧ１（ＷＯ２００５／０４４８５９に開示されたキメラヒト化ＩｇＧ１抗体）、１１Ｂ８  ＩｇＧ１（ＷＯ２００４／０３５６０７に開示された）、及びＡＴ８０  ＩｇＧ１を含む。典型的にはＩｇＧ１アイソタイプのＩＩ型抗ＣＤ２０抗体は、特徴的ＣＤＣ特性を示す。ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプのＩ型抗体と比べ、減少したＣＤＣを有する（ＩｇＧ１アイソタイプの場合）。
【００８０】
Ｉ型抗ＣＤ２０抗体の例は、例えばリツキシマブ、ＨＩ４７  ＩｇＧ３（ＥＣＡＣＣ、ハイブリドーマ）、２Ｃ６  ＩｇＧ１（ＷＯ２００５／１０３０８１に開示された）、２Ｆ２  ＩｇＧ１（ＷＯ２００４／０３５６０７及びＷＯ２００５／１０３０８１に開示された）、及び２Ｈ７  ＩｇＧ１（ＷＯ２００４／０５６３１２に開示された）がある。
【００８１】
本発明のアフコシル化抗ＣＤ２０抗体は、好ましくはＩＩ型抗ＣＤ２０抗体であり、より好ましくはＷＯ２００５／０４４８５９及びＷＯ２００７／０３１８７５に開示された、アフコシル化ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体である。
【００８２】
「リツキシマブ」抗体（参照抗体；Ｉ型抗ＣＤ２０抗体の例）は、ヒトＣＤ２０抗原に対するモノクローナル抗体を含む、遺伝子操作されたキメラヒトγ１マウスの定常ドメインである。しかしこの抗体は、糖質操作されず、かつアフコシル化されることもなく、従って少なくとも８５％のフコース量を有する。このキメラ抗体は、ヒトγ１定常ドメインを含み、かつIDEC Pharmaceuticals社に譲渡された、１９９８年４月１７日に公開された米国特許第５，７３６，１３７号(Andersenら)において、名称「Ｃ２Ｂ８」により同定されている。リツキシマブは、再発性又は難治性の低悪性度又は濾胞性ＣＤ２０陽性Ｂ細胞性非ホジキンリンパ腫の患者の治療について承認されている。作用試験のインビトロ機構は、リツキシマブは、ヒト補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を発揮することを示した(Reff, M.E.ら、Blood, 83(2) (1994) 435-445)。加えてこれは、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を測定するアッセイにおいて活性を示す。用語「ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体」は、ＷＯ２００５／０４４８５９及びＷＯ２００７／０３１８７５に開示されたヒト化されたＢ−Ｌｙ１抗体をいい、これは、ＩｇＧ１由来のヒト定常ドメインとキメラ化し、引き続きヒト化することにより、マウスモノクローナル抗ＣＤ２０抗体Ｂ−Ｌｙ１（マウス重鎖の可変領域（ＶＨ）：配列番号：１；マウス軽鎖の可変領域（ＶＬ）：配列番号：２−Poppema, S.及びVisser, L.、Biotest Bulletin, 3 (1987) 131-139参照）から得られた（ＷＯ２００５／０４４８５９及びＷＯ２００７／０３１８７５を参照のこと）。これらの「ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体」は、ＷＯ２００５／  ０４４８５９及びＷＯ２００７／０３１８７５に詳細に開示されている。
【００８３】
好ましくは、「ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体」は、配列番号：３から配列番号：２０の重鎖可変領域（ＶＨ）（ＷＯ２００５／０４４８５９及びＷＯ２００７／０３１８７５のＢ−ＨＨ２からＢ−ＨＨ９及びＢ−ＨＬ８からＢ−ＨＬ１７）を有する。特に好ましいのは、配列番号：３、４、７、９、１１、１３及び１５（ＷＯ２００５／０４４８５９及びＷＯ２００７／０３１８７５のＢ−ＨＨ２、ＢＨＨ−３、Ｂ−ＨＨ６、Ｂ−ＨＨ８、Ｂ−ＨＬ８、Ｂ−ＨＬ１１及びＢ−ＨＬ１３）である。好ましくは「ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体」は、配列番号：２０の軽鎖可変領域（ＶＬ）（ＷＯ２００５／０４４８５９及びＷＯ２００７／０３１８７５のＢ−ＫＶ１）を有する。好ましくは、「ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体」は、配列番号：７の重鎖可変領域（ＶＨ）（ＷＯ２００５／０４４８５９及びＷＯ２００７／０３１８７５のＢ−ＨＨ６）、及び配列番号：２０の軽鎖可変領域（ＶＬ）（ＷＯ２００５／０４４８５９及びＷＯ２００７／０３１８７５のＢ−ＫＶ１）を有する。更にヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体は、ＩｇＧ１抗体が好ましい。本発明に従い、かかるアフコシル化ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体は、ＷＯ２００５／０４４８５９、ＷＯ２００４／０６５５４０、ＷＯ２００７／０３１８７５、Umana, P.ら、Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180、及びＷＯ９９／１５４３４２に説明された手順に従い、Ｆｃ領域において糖質操作される（ＧＥ）。アフコシル化され糖質操作されたヒト化Ｂ−Ｌｙ１（Ｂ−ＨＨ６−Ｂ−ＫＶ１  ＧＥ）は、本発明の一実施態様において好ましい。このような糖質操作されたヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体は、Ｆｃ領域にグリコシル化の変更されたパターンを有し、好ましくは低下したレベルのフコース残基を有する。好ましくは、フコース量は、Ａｓｎ２９７でのオリゴ糖の総量の６０％以下である（一実施態様において、フコース量は４０％〜６０％であり、別の実施態様において、フコース量は５０％以下であり、更に別の実施態様において、フコース量は３０％以下である。）。更にＦｃ領域のオリゴ糖は、二分されることが好ましい。これらの糖質操作されたヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体は、増大されたＡＤＣＣを有する。
【００８４】
上記オリゴ糖成分は、物理的安定性、プロテアーゼ攻撃に対する抵抗性、免疫系との相互作用、薬物動態、及び特異的生物活性を含む、治療的糖タンパク質の有効性に関連した特性に有意に影響を及ぼすことができる。かかる特性は、オリゴ糖の有無によってのみ左右されるのではなく、オリゴ糖の特異的構造によっても左右される。オリゴ糖構造と糖タンパク質機能の間のいくつかの総括を作製することができる。例えば、ある種のオリゴ糖構造は、特異的炭水化物結合タンパク質との相互作用を介して血流からの糖タンパク質の迅速なクリアランスを媒介する一方、他のものは、抗体により結合され、望ましくない免疫応答を誘発し得る(Jenkins, N.ら、Nature Biotechnol. 14 (1996) 975-81)。
【００８５】
哺乳動物細胞は、ヒト適用について最も適合性がある形でタンパク質をグリコシル化するそれらの能力のために、治療的糖タンパク質の作出に好ましい宿主である(Cumming, D.A.ら、Glycobiology, 1 (1991) 115-30；Jenkins, N.ら、Nature Biotechnol. 14 (1996) 975-81)。細菌は、タンパク質をグリコシル化することは非常に稀であり、類似の他の種類の一般的宿主、例えば酵母、糸状菌、昆虫及び植物の細胞は、血流からの迅速なクリアランス、望ましくない免疫相互作用、及び一部の特定の場合においては低下した生物学的活性に関連したグリコシル化パターンを生じる。哺乳動物細胞の中で、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が、最近２０年間では最も一般的に使用されている。これらの細胞は、好適なグリコシル化パターンをもたらすことに加え、遺伝的に安定し、高度に生産性のクローン性細胞株の一貫した生成を可能にする。これらは、血清非含有培地を用い、単純なバイオリアクター内で高密度にまで培養することができ、安全かつ再生可能なバイオプロセスの開発を可能にする。その他の通常使用される動物細胞は、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、ＮＳＯ−及びＳＰ２／０−マウス骨髄腫細胞を含む。より最近になって、トランスジェニック動物からの作出も試験されている(Jenkins, N.ら、Nature Biotechnol. 14 (1996) 975-981)。
【００８６】
全ての抗体は、重鎖定常領域内の保存された位置に炭水化物(carbohydrate)構造を含み、各アイソタイプは、Ｎ−連結された炭水化物構造の識別できるアレイを有し、これはタンパク質の集成、分泌及び機能活性に様々に影響を及ぼす(Wright, A.及びMorrison, S.L.、Trends Biotech. 15 (1997) 26-32)。結合されたＮ−連結された炭水化物の構造は、プロセッシングの程度に応じてかなり変動し、かつ高−マンノース型、多−分岐型更には二分岐型の複合オリゴ糖を含むことができる(Wright, A.及びMorrison, S.L.、Trends Biotech. 15 (1997) 26-32)。典型的には、特定のグリコシル化位置で結合されたコアオリゴ糖構造の不均一なプロセッシングが存在し、結果的にモノクローナル抗体であっても、複数のグリコフォームとして存在する。同様に、抗体グリコシル化の大きな差異が細胞株の間で生じ、かつ例え小さい差異であっても、異なる培養条件下で増殖された所定の細胞株について認められることが示されている(Lifely, M.R.ら、Glycobiology, 5(8) (1995) 813-22)。
【００８７】
簡単な製造プロセスを維持しかつ恐らく著しい望ましくない副作用を避けながら、効能の大きい増加を得る一法は、Umana, P.ら、Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180及び米国特許第６，６０２，６８４号に開示されたように、それらのオリゴ糖成分を操作することにより、モノクローナル抗体の天然の細胞媒介性エフェクター機能を増強することである。癌免疫療法において最も一般的に使用されるＩｇＧ１型抗体は、各ＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に、保存されたＮ−連結されたグリコシル化部位を有する糖タンパク質である。Ａｓｎ２９７に結合された２つの複合二分岐オリゴ糖は、ＣＨ２ドメインの間に埋められ、ポリペプチド骨格との過度な接触を形成し、かつそれらの存在は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）などのエフェクター機能を媒介するために、抗体にとって必須である(Lifely, M.R.ら、Glycobiology, 5 (1995) 813-822；Jefferis, R.ら、Immunol. Rev. 163 (1998) 59-76；Wright, A.及びMorrison, S.L.、Trends Biotechnol. 15 (1997) 26-32)。
【００８８】
二分されたオリゴ糖の形成を触媒するグリコシルトランスフェラーゼであるβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII（”ＧｎＴＩＩ１７ｙ）のチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞における過剰発現は、操作されたＣＨＯ細胞により産生された抗神経芽細胞腫キメラモノクローナル抗体（ｃｈＣＥ７）のインビトロＡＤＣＣ活性を有意に増加することが先に示された(Umana, P.ら、Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180；及び、WO 99/154342を参照し、これらの内容の全体は参照により本明細書に組み入れられる）。抗体ｃｈＣＥ７は、ＧｎＴIII酵素を欠いている標準の産業用細胞株において産生される場合、高い腫瘍親和性及び特異性を有するが、臨床的に有用である効能は非常に小さい、非結合型モノクローナル抗体の大きいクラスに属する(Umana, P.ら、Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180)。この研究は最初に、ＡＤＣＣ活性の大きい増加は、ＧｎＴIIIを発現するように抗体産生細胞を操作することにより得られ、これは更に天然の抗体において認められるレベルを超える、二分されたフコシル化されないオリゴ糖を含む、定常領域（Ｆｃ）−会合された二分されたオリゴ糖の割合の増加にもつながることを示した。
【００８９】
本明細書において使用される用語「癌」は、それにアフコシル化抗体が特異的に結合する腫瘍抗原を発現している癌又は腫瘍をいう。かかる癌は、リンパ腫、リンパ性白血病、肺癌、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）癌、細気管支肺胞細胞肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚黒色腫又は眼内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、消化管癌、結腸癌、乳癌、子宮癌、ファローピウス管の癌腫、子宮内膜の癌腫、子宮頚癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺腺癌、副甲状腺腺癌、副腎腺癌、軟組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓又は尿管癌、腎細胞癌腫、腎盂の癌腫、中皮腫、肝細胞癌、胆道癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、脊髄腫瘍、脳幹神経膠腫、多形性膠芽腫、星状細胞腫、神経鞘腫、上衣細胞腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫、上記癌のいずれかの再発型、又は上記癌の１又は２以上の組合せを含む。
【００９０】
好ましくは、本発明のアフコシル化抗体を、ヒトＧＭ−ＣＳＦ、ヒトＭ−ＣＳＦ及び／又はヒトＩＬ−３（これらは全てヒト単球／周皮細胞をマクロファージに分化する）から選択されるサイトカインと組合せた組合せ治療は、単球／周皮細胞により浸潤される癌又は腫瘍の治療のために使用され；かつ、単球／周皮細胞による高い浸潤を伴う癌又は腫瘍の治療に特に価値がある。癌又は腫瘍の単球／周皮細胞の浸潤は、ＣＤ１４のような単球−特異的マーカーを用いる単球／周皮細胞−特異的染色により、検出されることができる（生検後の腫瘍組織において）(Wright S.D.ら、Science, 249 (1990) 1431-1433；Bogman M.J.ら、Transplant Proc. 23 (1991) 1293-1294；Andreesen, R,ら、J Leukoc Biol. 47(6) (1990) 490-7)。典型的には、当業者は、それにアフコシル化抗体が特異的に結合する腫瘍抗原を過剰発現する単球／周皮細胞−浸潤した癌又は腫瘍の治療のために、本発明のアフコシル化抗体を、ヒトＧＭ−ＣＳＦ、ヒトＭ−ＣＳＦ及び／又はヒトＩＬ３から選択されるサイトカインと組合せた組合せ治療を使用するであろう。そのため一実施態様において、癌は、単球／周皮細胞−浸潤した癌（単球特異的ＣＤ１４抗原により検出可能）である。
【００９１】
用語「ＣＤ２０抗原の発現」とは、細胞内での、好ましくは各々腫瘍又は癌由来の、好ましくは非−固形癌由来のＴ−又はＢ細胞、より好ましくはＢ細胞の細胞表面での、ＣＤ２０抗原の発現の有意なレベルを示すことが意図されている。「ＣＤ２０発現している癌」を有する患者は、当上記技術分野において公知の標準アッセイにより決定することができる。例えばＣＤ２０抗原発現は、免疫組織化学（ＩＨＣ）検出、ＦＡＣＳ又は対応するｍＲＮＡのＰＣＲ−ベースの検出を用いて測定される。
【００９２】
本明細書において使用される用語「ＣＤ２０発現している癌」は、癌細胞がＣＤ２０抗原の発現を示す全ての癌をいう。好ましくは本明細書において使用されるＣＤ２０発現している癌は、リンパ腫（好ましくはＢ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ））及びリンパ性白血病をいう。かかるリンパ腫及びリンパ性白血病は、例えば、ａ）濾胞性リンパ腫、ｂ）小型非開裂細胞性リンパ腫／バーキットリンパ腫（風土性バーキットリンパ腫、散発性バーキットリンパ腫及び非−バーキットリンパ腫を含む）、ｃ）辺縁帯リンパ腫（節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（粘膜−会合したリンパ組織リンパ腫、ＭＡＬＴ）、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫及び脾臓辺縁帯リンパ腫、ｄ）マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、ｅ）大細胞型リンパ腫（Ｂ細胞びまん性大細胞型リンパ腫（ＤＬＣＬ）、びまん性混合細胞型リンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、縦隔原発大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管中心性リンパ腫−肺Ｂ細胞リンパ腫を含む）、ｆ）ヘアリーセル白血病、ｇ）リンパ球性リンパ腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、ｈ）急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）／小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、Ｂ細胞前リンパ性白血病、ｉ）形質細胞腫、形質細胞性骨髄腫、多発性骨髄腫、形質細胞腫、ｊ）ホジキン病を含む。
【００９３】
より好ましくはこのＣＤ２０発現している癌は、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）である。特にＣＤ２０発現している癌は、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ細胞びまん性大細胞型リンパ腫（ＤＬＣＬ）、バーキットリンパ腫、ヘアリーセル白血病、濾胞性リンパ腫、多発性骨髄腫、辺縁帯リンパ腫、移植後のリンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）、ＨＩＶ関連のリンパ腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、又は原発性ＣＮＳリンパ腫である。
【００９４】
本明細書において使用される用語「ＥＧＦＲ発現している癌」は、癌細胞がＥＧＦＲ抗原の発現を示す全ての癌をいう。本明細書において使用される用語「ＩＧＦ−１Ｒ発現している癌」は、癌細胞がＩＧＦ−１Ｒ抗原の発現を示す全ての癌をいう。
【００９５】
用語「治療方法」又はその同等物は、例えば癌に適用される場合、患者における癌細胞の数を減少するか又は排除するように、又は癌の症状を緩和するようにデザインされた対策の手順又はコースをいう。癌又は他の増殖性障害の「治療方法」は、癌細胞又は他の障害が事実上排除されること、細胞又は障害の数が事実上減少されること、或いは癌又は他の障害の症状が事実上緩和されることを必ずしも意味しない。時には癌の治療方法は、例え成功する可能性が低いとしても、患者の病歴及び推定余命を考慮し、それでもなお全般的に恩恵のある対策コースを誘導すると考えられる場合には、実行される。
【００９６】
用語「共投与する」又は「共投与している」とは、上記アフコシル化抗体、好ましくはアフコシル化抗ＣＤ２０抗体、抗ＥＧＦＲ抗体又は抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体、並びに上記ヒトＧＭ−ＣＳＦ、ヒトＭ−ＣＳＦ及び／又はヒトＩＬ−３から選択されるサイトカインの、ひとつの単独製剤として又は二つの個別の製剤としての投与をいう。この共投与は、同時又はいずれかの順番で逐次であることができ、ここで両方（又は全ての）活性物質がそれらの生物学的活性を同時に発揮する時間が存在することが好ましい。上記アフコシル化抗体並びに上記ヒトＧＭ−ＣＳＦ、ヒトＭ−ＣＳＦ及び／又はヒトＩＬ−３から選択されるサイトカインは、同時又は逐次に共投与される（例えば、連続注入による静脈内（ｉ．ｖ．）を介して（抗体についてひとつ、並びにヒトＧＭ−ＣＳＦ、ヒトＭ−ＣＳＦ及び／又はヒトＩＬ−３から選択されるサイトカインについて最終的にはひとつ）。両方の治療的物質が逐次的に共投与される場合、その投薬は、２回の個別の投与で同日に、又は物質の一方は１日目に投与され、かつ第二の物質は２日目から７日目に、好ましくは２日目から４日目に共投与されるかのいずれかで投与される。従って用語「逐次的」とは、第一の成分（サイトカイン又は抗体）の投薬後７日以内、好ましくは第一の成分の投薬後４日以内を意味し；並びに、用語「同時に」とは、同じ時刻でを意味する。上記アフコシル化抗体並びにヒトＧＭ−ＣＳＦ、ヒトＭ−ＣＳＦ及び／又はヒトＩＬ−３から選択されるサイトカインの維持量に関する用語「共投与」は、これらの維持量は、治療サイクルが両方の薬物に適している場合、例えば毎週、同時に共投与されることができるか；又は、ヒトＧＭ−ＣＳＦ、ヒトＭ−ＣＳＦ及び／若しくはヒトＩＬ−３から選択されるサイトカインは、例えば１から３日目毎に投与され、かつ上記アフコシル化抗体は毎週投与されるか；又は、これらの維持量は、１日若しくは数日以内に、逐次共投与されるか：のいずれかを意味する。
【００９７】
抗体は、研究者、獣医師、医師又は他の臨床者により求められる組織、系、動物又はヒトの生物学的又は医学的反応を発揮する各化合物の又はそれらの組合せの量である、「治療的有効量」（又は簡単に「有効量」）で、患者へ投与されることは自明の理である。
【００９８】
上記アフコシル化抗体及び上記ヒトＧＭ−ＣＳＦ、ヒトＭ−ＣＳＦ及び／又はヒトＩＬ−３から選択されるサイトカインの共投与の量、並びに共投与の時期は、治療される患者の種類（種、性別、年齢、体重など）及び状態、並びに治療される疾患又は状態の重症度により左右される。上記アフコシル化抗体及び上記ヒトＧＭ−ＣＳＦ、ヒトＭ−ＣＳＦ及び／又はヒトＩＬ−３から選択されるサイトカインは、治療の一時点で又は一連の治療にわたり、患者へ適切に共投与される。疾患の種類及び重症度に応じ、上記アフコシル化抗体約１μｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ）、並びに上記ヒトＧＭ−ＣＳＦ、ヒトＭ−ＣＳＦ及び／又はヒトＩＬ−３から選択されるサイトカイン１μｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ）が、両方の薬物の患者への共投与に関する候補初回量である。投与が静脈内である場合、上記アフコシル化抗体又は上記ヒトＧＭ−ＣＳＦ、ヒトＭ−ＣＳＦ及び／若しくはヒトＩＬ−３から選択されるサイトカインの最初の注入時間は、例えば最初の注入に関して約９０分間であり、かつ（初期注入が良く忍容される場合）引き続きの注入について約３０分間である。
【００９９】
上記アフコシル化抗体の好ましい用量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇの範囲内であろう。従って約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ又は３０ｍｇ／ｋｇの１つ又は複数の投与量（又はそれらの任意の組合せ）が、患者へ共投与されてよい。上記ヒトＧＭ−ＣＳＦ、ヒトＭ−ＣＳＦ及び／又はヒトＩＬ−３から選択されるサイトカインの好ましい用量は、ヒトＧＭ−ＣＳＦ、ヒトＭ−ＣＳＦ及び／又はヒトＩＬ−３について０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、例えば０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０．０ｍｇ／ｋｇの範囲内であろう。患者の種類（種、性別、年齢、体重など）及び状態並びにアフコシル化抗体及びヒトＧＭ−ＣＳＦ、ヒトＭ−ＣＳＦ及び／又はヒトＩＬ−３から選択されるサイトカインの種類に応じ、上記アフコシル化抗体の用量及び投与スケジュールは、ヒトＧＭ−ＣＳＦ、ヒトＭ−ＣＳＦ及び／又はヒトＩＬ−３から選択されるサイトカインの用量とは異なることができる。例えば、上記アフコシル化抗体は、例えば１〜３週間毎に投与されることができ、かつ上記ヒトＧＭ−ＣＳＦ、ヒトＭ−ＣＳＦ及び／又はヒトＩＬ−３から選択されるサイトカインは、毎日又は２〜１０日毎に投与されることができる。より高い初回負荷量、それに続く１回以上のより低い投与量も、投与されることができる。
【０１００】
好ましい実施態様において、本医薬は、癌、好ましくは単球／周皮細胞浸潤性癌に罹患した患者における転移又は更なる播種の予防又は軽減に有用である。本医薬は、かかる患者の生存の期間を延長するため、かかる患者の進行のない生存を延長するため、反応の期間を増加するため、生存の期間、進行のない生存、反応率若しくは反応期間により測定される治療された患者の統計学的に有意かつ臨床的に意味のある改善を生じるために、有用である。好ましい実施態様において、本医薬は、患者群の反応率を増加するために有用である。
【０１０１】
本発明の状況において、追加の他の細胞傷害薬、化学療法剤若しくは抗癌剤、又はかかる薬剤の作用を増強する化合物（例えばサイトカイン）が、癌のアフコシル化抗体及びサイトカイン（ヒトＧＭ−ＣＳＦ、ヒトＭ−ＣＳＦ及び／又はヒトＩＬ−３）の組合せ治療において使用されてよい。かかる分子は、好適には、意図される目的に有効な量の組合せで存在する。好ましくは上記アフコシル化抗体及びサイトカイン（ヒトＧＭ−ＣＳＦ、ヒトＭ−ＣＳＦ及び／又はヒトＩＬ−３）の組合せ治療は、かかる追加の細胞傷害薬、化学療法剤若しくは抗癌剤、又はかかる薬剤の作用を増強する化合物を伴わずに使用される。
【０１０２】
かかる薬剤は例えば：アルキル化剤又はアルキル化作用を持つ物質、例えばシクロホスファミド（ＣＴＸ；例えばサイトキサン（登録商標））、クロラムブシル（ＣＨＬ；例えばリューケラン（登録商標））、シスプラチン（ＣｉｓＰ；例えばプラチノール（登録商標））、ブスルファン（例えばミレラン（登録商標））、メルファラン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ストレプトゾトシン、トリエチレンメラミン（ＴＥＭ）、マイトマイシンＣなど；抗代謝産物、例えばメトトレキセート（ＭＴＸ）、エトポシド（ＶＰ１６；例えばベペシド（登録商標））、６−メルカプトプリン（６ＭＰ）、６−チオグアニン（６ＴＧ）、シタラビン（Ａｒａ−Ｃ）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、カペシタビン（例えばキセロダ（登録商標））、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）など；抗生物質、例えばアクチノマイシンＤ、ドキソルビシン（ＤＸＲ；例えばアドリアマイシン（登録商標））、ダウノルビシン（ダウノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシンなど；アルカロイド、例えばビンクリスチン（ＶＣＲ）、ビンブラスチンなどのビンカアルカロイド；並びに、他の抗腫瘍薬、例えばパクリタキセル（例えばタキソール（登録商標））及びパクリタキセル誘導体、細胞増殖抑制剤、デキサメタゾン（ＤＥＸ；例えばデカドロン（登録商標））などの糖質コルチコイド及びプレドニソンなどのコルチコステロイド、ヒドロキシ尿素などのヌクレオシド酵素阻害剤、アスパラギナーゼなどのアミノ酸枯渇酵素、ロイコボリン及び他の葉酸誘導体、並びに類似の多様な抗腫瘍薬である。下記薬剤を追加の薬剤として使用することもできる：アミフォスチン（例えばエチヨル（登録商標））、ダクチノマイシン、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、ストレプトゾシン、シクロホスファミド、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ドキソルビシンリポ（例えばドキシル（登録商標））、ゲムシタビン（例えばゲムザール（登録商標））、ダウノルビシンリポ（例えばダウノキソーム（登録商標））、プロカルバジン、マイトマイシン、ドセタキセル（例えばタキソテレ（登録商標））、アルデスロイキン、カルボプラチン、オキサリプラチン、クラドリビン、カンプトテシン、ＣＰＴ１１（イリノテカン）、１０−ヒドロキシ７−エチル−カンプトテシン（ＳＮ３８）、フロキシウリジン、フルダラビン、イホスファミド、イダルビシン、メスナ、インターフェロンβ、インターフェロンα、ミトキサントロン、トポテカン、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、プリカマイシン、ミトタン、ペガスパルガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、タモキシフェン、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロラムブシルである。アフコシル化抗体及びサイトカイン（ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ及びＩＬ−３）の組合せ治療は、かかる追加の薬剤を伴わずに使用されることが好ましい。
【０１０３】
化学療法投与計画における先に説明された細胞傷害薬及び抗癌剤に加え、プロテインキナーゼ阻害剤のような抗増殖標的−特異性抗癌剤の使用は、癌療法の技術分野において、一般に良く特徴付けられており、かつ本明細書におけるそれらの使用は、若干の調節を伴い、忍容性及び有効性のモニタリング並びに投与経路及び用量の制御に関して同じ考察下に収まる。例えば、細胞傷害薬の実際の用量は、組織培養法を使用することにより決定される患者の培養された細胞の反応に応じて変動することができる。一般に、その用量は、追加の他の薬剤が存在しない場合の使用量に比べ、減少されるであろう。
【０１０４】
有効な細胞傷害薬の典型的用量は、製造業者により推奨された範囲内であることができ、インビトロ反応又は動物モデルにおける反応により示される場合、濃度又は量を最大ほぼ１桁下げることができる。従って実際の用量は、医師の判断、患者の状態、及び初代培養された悪性細胞若しくは組織培養された組織試料のインビトロ反応を基にした治療法の有効性、又は好適な動物モデルにおいて観察された反応に左右されるであろう。
【０１０５】
本発明の状況において、電離性放射線の有効量が実行されることができ、及び／又は放射性医薬を、ＣＤ２０発現している癌のアフコシル化抗体及びサイトカイン（ヒトＧＭ−ＣＳＦ、ヒトＭ−ＣＳＦ及び／又はヒトＩＬ−３）組合せ治療に加え、使用することができる。放射線源は、治療される患者の外部又は内部のいずれかであることができる。この給源が患者の外部である場合、この療法は、外部照射放射線療法（ＥＢＲＴ）として公知である。この給源が患者の内部である場合、この治療は、密封小線源治療（ＢＴ）と称される。本発明の状況において使用するための放射性原子は、ラジウム、セシウム−１３７、イリジウム−１９２、アメリシウム−２４１、金−１９８、コバルト−５７、銅−６７、テクネチウム−９９、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、及びインジウム−１１１を含むが、これらに限定されるものではない群から選択されることができる。抗体を、かかる放射性同位元素で標識することも可能である。好ましくはアフコシル化抗体及びサイトカイン（ヒトＧＭ−ＣＳＦ、ヒトＭ−ＣＳＦ及び／又はヒトＩＬ−３）組合せ治療は、かかる電離性放射線を伴わずに使用される。
【０１０６】
放射線療法は、切除不可能又は手術不可能な腫瘍及び／又は腫瘍転移を管理するための標準治療である。放射線療法が化学療法と組合せられた場合に、改善された結果が認められている。放射線療法は、標的領域に送達された高線量放射線は、腫瘍組織及び正常組織の両方の増殖細胞(reproductive cell)の死滅を生じるという原理を基にしている。放射線投与計画は、一般に放射線の吸収量（Ｇｙ）、時間及び線量分割に関して規定され、かつ腫瘍専門医により慎重に規定される。患者が受け取る放射線の線量は、様々な考察により左右されるが、２つの最も重要なものは、体の他の重要な構造又は臓器に対する腫瘍の位置、及び腫瘍の広がりの程度であろう。放射線療法を受けている患者に関する典型的治療コースは、１日１回約１．８〜２．０Ｇｙの分割で、１週間に５日間患者に投与される総線量１０〜８０Ｇｙで、１〜６週間にわたる治療スケジュールであろう。本発明の好ましい実施態様において、ヒト患者における腫瘍が本発明の組合せ治療と放射線で治療される場合、相乗性が存在する。別の言い方をすると、本発明の組合せを含有する薬剤による腫瘍増殖の阻害は、放射線と、任意に追加の化学療法剤又は抗癌剤と組合せた場合に、増強される。アジュバント放射線療法のパラメータは、例えばＷＯ９９／６００２３に含まれている。
【０１０７】
アフコシル化抗体が、ボーラスとしての静脈内投与によるか、又は筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑膜内、若しくは髄腔内経路による、ある期間にわたる連続注入により、公知の方法に従い、患者へ投与される。本抗体の静脈内又は皮下投与が好ましい。
【０１０８】
ヒトＧＭ−ＣＳＦ、ヒトＭ−ＣＳＦ及び／若しくはヒトＩＬ−３から選択されるサイトカイン又はそれらの組合せは、ボーラスとしての静脈内投与によるか、又は筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑膜内、髄腔内若しくは経口の経路による、ある期間にわたる連続注入により、公知の方法により、患者へ投与される。ヒトＧＭ−ＣＳＦ、ヒトＭ−ＣＳＦ及び／若しくはヒトＩＬ−３又はそれらの組合わせから選択されるサイトカインの静脈内、皮下又は経口投与が、好ましい。
【０１０９】
本明細書において使用される「医薬として許容し得る担体」は、溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張化剤及び吸収遅延剤、並びに医薬投与と適合性がある他の物質及び化合物を含む、医薬投与と適合性がある任意の及び全ての物質を含むことが意図される。任意の従来の媒体又は物質が本活性化合物と不適合である限りを除き、本発明の組成物におけるそれらの使用が企図されている。栄養補助の活性化合物も、本組成物に混入することができる。
【０１１０】
医薬組成物
医薬組成物は、例えば抗ＣＤ２０抗体、抗ＥＧＦＲ抗体若しくは抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体として本発明のアフコシル化抗体、並びに／又は本発明のヒトＧＭ−ＣＳＦ、ヒトＭ−ＣＳＦ及び／又はヒトＩＬ−３から選択されるサイトカインを、医薬として許容し得る無機担体又は有機担体と一緒に処理することにより得ることができる。乳糖、トウモロコシデンプン又はそれらの誘導体、タルク、ステアリン酸又はそれらの塩などは、例えば、錠剤、コート錠、糖衣錠及び硬ゼラチンカプセル剤などのための担体として使用することができる。軟ゼラチンカプセル剤に適した担体は、例えば、植物油、ワックス、脂肪、半固形及び液体ポリオールなどである。しかし活性物質の性質に応じ、軟ゼラチンカプセル剤の場合には、担体は通常必要とされない。液剤及びシロップ剤の製造に適した担体は、例えば水、ポリオール、グリセロール、植物油などである。坐薬に適した担体は、例えば、天然油又は硬化油、ワックス、脂肪、半固形又は液体ポリオールなどである。
【０１１１】
本医薬組成物は、防腐剤、可溶化剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、甘味料、着色剤、香味料、浸透圧を変動する塩、緩衝剤、遮蔽剤、又は抗酸化剤を更に含有することができる。これらは、更に他の治療上で価値のある物質を含有することもできる。
【０１１２】
本発明の一実施態様は、癌、特にＣＤ２０発現している癌の治療において使用するための、フコース量が６０％以下の上記アフコシル化抗体（好ましくは上記アフコシル化抗ＣＤ２０抗体、抗ＥＧＦＲ抗体又は抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体）、並びにヒトＧＭ−ＣＳＦ、ヒトＭ−ＣＳＦ及び／又はヒトＩＬ−３から選択される１又は２以上のサイトカインの両方を含有する組成物である。
【０１１３】
上記医薬組成物は、１又は２以上の医薬として許容し得る担体を更に含有してよい。
本発明は、（ｉ）フコース量が６０％以下のアフコシル化抗体（好ましくは、アフコシル化抗ＣＤ２０抗体、抗ＥＧＦＲ抗体又は抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体））の第一有効量、及び（ｉｉ）ヒトＧＭ−ＣＳＦ、ヒトＭ−ＣＳＦ及び／又はヒトＩＬ−３から選択される１又は２以上のサイトカインの第二有効量：を含有する、特に癌において使用される医薬組成物を更に提供する。かかる組成物は任意に、医薬として許容し得る担体及び／又は賦形剤を含有する。
【０１１４】
本発明に従い単独で使用されるアフコシル化抗体の医薬組成物は、貯蔵のために、凍結乾燥製剤又は水溶液の形状で、望ましい純度を有する抗体を、任意の医薬として許容し得る担体、賦形剤又は安定剤（「レミントン薬科学、第16版、Osol, A.編集、(1980))と混合することにより、調製される。許容し得る担体、賦形剤、又は安定剤は、利用される用量及び濃度では、レシピエントには無毒であり、かつリン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンを含む、抗酸化剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル若しくはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチル若しくはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及び、ｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなどの、タンパク質；ポリビニルピロリドンなどの、親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシンなどの、アミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む、単糖、二糖、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡなどの、キレート剤；ショ糖、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの、糖類；ナトリウムなどの、塩−形成性対イオン；金属錯体（例えばＺｎ−タンパク質複合体）；及び／又は、ＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの、非イオン性界面活性剤を含む。
【０１１５】
ヒトＧＭ−ＣＳＦ、ヒトＭ−ＣＳＦ及び／又はヒトＩＬ−３から選択されるサイトカインの医薬組成物は、それらの医薬特性によって左右される。かかる組成物は、アフコシル化抗体について先に説明されたものに類似することができる。
【０１１６】
ひとつの更なる本発明の実施態様において、本発明の医薬組成物は、好ましくは上記アフコシル化抗体並びに上記ヒトＧＭ−ＣＳＦ、ヒトＭ−ＣＳＦ及び／又はヒトＩＬ−３から選択されるサイトカインについての２つの個別の製剤である。
【０１１７】
これらの活性成分は、例えばコアセルベーション技術によるか又は界面重合(interracial polymerization)により調製されるマイクロカプセル、例えば各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−（メチルメタアシレート）マイクロカプセル、コロイド薬物送達（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）中又はマイクロエマルジョン中に捕獲されてもよい。かかる技術は、レミントン薬科学、第16版、Osol, A.編集、(1980)に明らかにされている。
【０１１８】
持続放出調製品が調製されてよい。好適な持続放出調製品の例は、本抗体を含有する固形疎水ポリマーの半透過性マトリックスを含み、このマトリックスは、成形品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形状である。持続放出マトリクスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタミン酸塩のコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えばＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドで構成された注射可能なミクロスフェア）、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を含む。
【０１１９】
インビボ投与に使用される製剤は、無菌でなければならない。これは、無菌の濾過膜を通る濾過により容易に実現され得る。
【０１２０】
本発明は更に、（ｉ）フコース量が６０％以下のアフコシル化抗体（好ましくはアフコシル化抗ＣＤ２０抗体、抗ＥＧＦＲ抗体又は抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体）の第一の有効量；並びに、（ｉｉ）ヒトＧＭ−ＣＳＦ、ヒトＭ−ＣＳＦ及びヒトＩＬ−３から選択される１又は２以上のサイトカインの第二の有効量：を、かかる治療を必要とする患者へ投与することを含む、癌の治療方法を提供する。
【０１２１】
一実施態様において、本方法は、アフコシル化抗体が、増大されたＡＤＣＣを示すことを特徴としている。
一実施態様において、本方法は、上記アフコシル化抗体が、抗ＣＤ２０抗体であり、かつ上記癌がＣＤ２０を発現している癌であることを特徴としている。
一実施態様において、本方法は、上記アフコシル化抗ＣＤ２０抗体が、ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体であることを特徴としている。
【０１２２】
一実施態様において、本方法は、上記アフコシル化抗体が、抗ＥＧＦＲ抗体であり、上記癌がＥＧＦＲを発現する癌であることを特徴としている。
一実施態様において、本方法は、上記アフコシル化抗ＥＧＦＲ抗体が、ヒト化ＩＣＲ６２抗体であることを特徴としている。
【０１２３】
一実施態様において、本方法は、上記アフコシル化抗体が、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体であり、上記癌がＩＧＦ−１Ｒを発現する癌であることを特徴としている。
一実施態様において、本方法は、上記アフコシル化抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体が、ヒトＨＵＭＡＢ−クローン１８であることを特徴としている。
【０１２４】
一実施態様において、本方法は、上記癌が、単球／周皮細胞浸潤性癌であることを特徴としている。
一実施態様において、本方法は、サイトカインとして、ヒトＧＭ−ＣＳＦのみが、上記組合せ治療において共投与されることを特徴としている。
一実施態様において、本方法は、サイトカインとして、ヒトＭ−ＣＳＦのみが、上記組合せ治療において共投与されることを特徴としている。
一実施態様において、本方法は、サイトカインとして、ＩＬ−３のみが、上記組合せ治療において共投与されることを特徴としている。
一実施態様において、本方法は、サイトカインとして、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−３のみが、上記組合せ治療において共投与されることを特徴としている。
一実施態様において、本方法は、サイトカインヒトＧＭ−ＣＳＦ、ヒトＭ−ＣＳＦ及び／又はヒトＩＬ−３が、上記組合せ治療において共投与されることを特徴としている。
【０１２５】
一実施態様において、本方法は、１又は２以上の追加の他の細胞傷害薬、化学療法剤若しくは抗癌剤、又はかかる薬剤の作用を増強する化合物若しくは電離性放射線が、投与されることを特徴としている。
【０１２６】
本明細書に使用される用語「患者」は好ましくは、任意の目的のために、アフコシル化抗体、好ましくはアフコシル化抗ＣＤ２０抗体、抗ＥＧＦＲ抗体又は抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体による治療を必要とするヒト（例えば、各々、ＣＤ２０、ＥＧＦＲ又はＩＧＦ−１Ｒを発現する癌に罹患している患者）、より好ましくは癌、又は前癌状態若しくは病巣を治療するためにかかる治療を必要とするヒトをいう。しかし用語「患者」は、非ヒト動物、好ましくはイヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジなどの哺乳動物、及びとりわけ非ヒト霊長類もいうことができる。
【０１２７】
本発明は更に、ヒトＧＭ−ＣＳＦ、ヒトＭ−ＣＳＦ及び／又はヒトＩＬ−３から選択される１又は２以上のサイトカインと組合せた、癌の治療のための、アフコシル化抗体、好ましくはアフコシル化抗ＣＤ２０抗体、抗ＥＧＦＲ抗体又は抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体を含む。
【０１２８】
本発明は更に、癌の治療のための、フコース量が６０％以下である、腫瘍抗原（これはＣＤ２０、ＥＧＦＲ又はＩＧＦ−１Ｒ、より好ましくはＣＤ２０である）に特異的に結合するアフコシル化抗体、並びにヒトＧＭ−ＣＳＦ、ヒトＭ−ＣＳＦ及び／又はヒトＩＬ−３から選択される１又は２以上のサイトカインを含む。
【０１２９】
一実施態様において、上記癌は、単球／周皮細胞浸潤性癌である。
一実施態様において、アフコシル化抗体は、増大されたＡＤＣＣを示す。
一実施態様において、上記アフコシル化抗体は、抗ＣＤ２０抗体であり、かつ上記癌はＣＤ２０を発現している癌である。
一実施態様において、上記アフコシル化抗ＣＤ２０抗体は、ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体である。
一実施態様において、上記アフコシル化抗体は、抗ＥＧＦＲ抗体であり、かつ上記癌は、ＥＧＦＲを発現する癌である。
一実施態様において、上記アフコシル化抗ＥＧＦＲ抗体は、ヒト化ＩＣＲ６２抗体である。
【０１３０】
一実施態様において、上記アフコシル化抗体は、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体であり、かつ上記癌は、ＩＧＦ−１Ｒを発現する癌である。
一実施態様において、上記アフコシル化抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、ヒトＨＵＭＡＢ−クローン１８である。
【０１３１】
一実施態様において、アフコシル化抗体（好ましくはアフコシル化抗ＣＤ２０抗体、抗ＥＧＦＲ抗体又は抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体））は、ＧＭ−ＣＳＦと組合せて使用される。
一実施態様において、アフコシル化抗体（好ましくはアフコシル化抗ＣＤ２０抗体、抗ＥＧＦＲ抗体又は抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体））は、Ｍ−ＣＳＦと組合せて使用される。
一実施態様において、アフコシル化抗体（好ましくはアフコシル化抗ＣＤ２０抗体、抗ＥＧＦＲ抗体又は抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体））は、ＩＬ−３と組合せて使用される。
一実施態様において、アフコシル化抗体（好ましくはアフコシル化抗ＣＤ２０抗体、抗ＥＧＦＲ抗体又は抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体））は、ヒトＧＭ−ＣＳＦ、ヒトＭ−ＣＳＦ及び／又はヒトＩＬ−３と組合せて使用される。
一実施態様において、アフコシル化抗体（好ましくはアフコシル化抗ＣＤ２０抗体、抗ＥＧＦＲ抗体又は抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体））は、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−３と組合せて使用される。
好ましくはこのＣＤ２０発現している癌は、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）である。
【０１３２】
下記実施例及び図面は、本発明の理解を助けるために提供され、その真の範囲は、添付された請求項に示されている。本発明の精神から逸脱しない限りは、示された手順に修飾を施すことができることが理解される。
【０１３３】
配列リスト
配列番号：１  マウスモノクローナル抗ＣＤ２０抗体Ｂ−Ｌｙ１の重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列。
配列番号：２  マウスモノクローナル抗ＣＤ２０抗体Ｂ−Ｌｙ１の軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列。
配列番号：３−１９  ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体（Ｂ−ＨＨ２からＢ−ＨＨ９、Ｂ−ＨＬ８、及びＢ−ＨＬ１０からＢ−ＨＬ１７）の重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列。
配列番号：２０  ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体Ｂ−ＫＶ１の軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列。
配列番号：２１−２２  ヒトＧＭ−ＣＳＦ及び変種のアミノ酸配列。
配列番号：２３−２５  ヒトＧＭ−ＣＳＦ及び変種のアミノ酸配列。
配列番号：２６−２７  ヒトＧＭ−ＣＳＦ及び変種のアミノ酸配列。
配列番号：２８  ヒト抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体ＨＵＭＡＢ−クローン１８の重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列。
配列番号：２９  ヒト抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体ＨＵＭＡＢ−クローン１８の軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列。
配列番号：３０  ヒト化抗ＥＧＦＲ  ＩＣＲ６２の重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列。
配列番号：３１  ヒト化抗ＥＧＦＲ  ＩＣＲ６２の軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列。
【実施例】
【０１３４】
実験手順
材料及び方法
１．細胞培養
ヒトびまん性大細胞型リンパ腫細胞株ＯＣＩ−Ｌｙ１９、ＳＵ−ＤＨＬ４、Ｎａｍａｌｗａ及びヒトマントル細胞リンパ腫株Ｚ−１３８を、１０％ＦＣＳ(Gibco, カタログ番号10500-064)及び２ｍＭ Ｌ−グルタミン(PAA, カタログ番号 M11-004)を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地(PanBiotech GmbH、カタログ番号PO4-18500)において、培養で維持した。
【０１３５】
ヒト類表皮癌細胞株Ａ４３１及びヒトＮＳＣＬＣ細胞株Ｈ３２２Ｍを、１０％ＦＣＳ(Gibco、カタログ番号10500-064)及び２ｍＭ Ｌ−グルタミン(PAA、カタログ番号M11-004)を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地(PanBiotech GmbH、カタログ番号PO4-18500)において維持した。
【０１３６】
２．抗体及び試薬
使用した抗体を、表１に列記した（下記参照）。
【０１３７】
【表２−１】
2012521379.tif 000005
【０１３８】
３．腹膜単球の調製
簡単に述べると、ＳＣＩＤベージュマウスを、頚椎脱臼により殺傷し、かつ氷冷したＰＢＳ  ５ｍｌを腹膜に注射した。１〜２分間マッサージした後、できる限り多くの腹腔洗浄液（最大４ｍｌ）を、腹腔から採取し−収量１匹のマウスにつき〜１０6個腹腔細胞を生じた。遠心分離後、これらの細胞を完全培養培地（上記提供業者：ＲＰＭＩ−１６４０＋１０％ＦＣＳ＋２ｍＭグルタミン）１ｍｌで再懸濁し、かつ９６ウェル丸底プレートに１００μｌ／ウェルで播種した。周皮細胞／単球の刺激は、サイトカイン（表２）により、３日間（可能な限り７日間まで）行い、その後それらのエフェクター機能アッセイに使用した。
【０１３９】
４．使用したサイトカイン及び濃度
【表２−２】
2012521379.tif 000006
【０１４０】
５．周皮細胞／単球の腫瘍細胞との共培養
２×１０4個の単離された周皮細胞／単球を、９６ウェル丸底プレートに、１ウェル（１００μｌ）につき播種し、各サイトカインと共に３〜７日間培養した。その後５×１０3個腫瘍細胞及び各抗体を添加し（１００μｌ）、かつ分析まで、最大３日間（実験に応じて）インキュベーションした。
【０１４１】
６．ヒト単球の調製及び腫瘍細胞との共培養
簡単に述べると、ＥＤＴＡ−血液（ＥＤＴＡを１ｍＭに減少）１００ｍｌを使用し、単球を分離した。StemCell Tech. Inc.の「ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ  Ｋｉｔ」(カタログ番号15068)を適用し、単球を、ＲＰＭＩ−１６４０培地(PanBiotech GmbH, カタログ番号 PO4-18500)＋１０％ＦＣＳ(Gibco, カタログ番号10500-064)＋４ｍＭグルタミン(Sigma、オーダー番号G7513)＋５０ｎｇ／ｍｌ  ＩＧＦ−Ｒ３−ｌｏｎｇ(JRH Biosciences、製品コード85580)中の２０ｎｇ／ｍｌ  ｈＭ−ＣＳＦにより刺激した。細胞を洗浄し、かつ〜２×１０5個細胞／ｍｌに希釈した。１００μｌを、ａ．ｍ．培養培地を含む９６−ウェル丸底プレートに２日間播種し、その後培養培地１００μｌを更に４日間添加した。上清１００μｌを取り出した後、腫瘍細胞及び各抗体を添加した（１０5個細胞／ｍｌのＳＵ−ＤＨＬ４懸濁液５０μｌ）。３日後、この共培養物のＦＡＣＳ解析を行った。
【０１４２】
７．ＦＡＣＳ解析
共培養した細胞を、ウェル中で再懸濁し、その後チューブに移し、４００×ｇで遠心し、次に１０μｇ／ｍｌ  ＰＩを含有する培養培地３００μｌ中に再懸濁した。これらのチューブを、解析まで、氷上に維持した。ＦＳＣ、対、ＦＬ−３Ｈ（ＰＩ）ドットプロットから、生存細胞をゲート制御し、かつ解析した。これらの生存集団内で、ＦＳＣ、対、ＦＬ−１Ｈ自家蛍光を解析し、腫瘍細胞及びエフェクター細胞の割合を計算した。図１は、ＦＡＣＳによる示差解析のドットプロットを示している。
【０１４３】
実施例１
様々なサイトカインによる腹腔単球の刺激及び腫瘍細胞殺傷に対するそれらの特異的作用
第一の実験において、サイトカインの組合せを使用し、腹腔細胞の増殖を確実にした。図２は、マウス単球の分化並びに顆粒球及びマクロファージの増殖を支援するｍＧＭ−ＣＳＦ／ｍＧ−ＧＣＳ／ｍＩＬ−３により刺激された周皮細胞／単球は、腫瘍細胞を効果的に排除することができたことを示している。
【０１４４】
図２：ＳＵ−ＤＨＬ４細胞に対する腹腔エフェクター細胞反応
【０１４５】
これらの実験のほとんどにおいて、前述のｍＧＭ−ＣＳＦ／ｍＧ−ＧＣＳ／ｍＩＬ−３刺激が選択されたが、以下の実験においては、単独のサイトカイン刺激も同じ有効性を生じた。
【０１４６】
表３は、単独の刺激因子又は組合せとして試験したサイトカインをまとめている。作用は、排除された腫瘍細胞が≧９０％の場合＋＋、≧２０％の場合＋、及び排除がない場合−として特徴付けた。全ての実験において、１０μｇ／ｍｌ抗ＣＤ２０抗体（アフコシル化糖質操作ヒト化Ｂ−Ｌｙ１（Ｂ−ＨＨ６−Ｂ−ＫＶ１  ＧＥ）、非アフコシル化非−糖質操作ヒト化Ｂ−Ｌｙ１（Ｂ−ＨＨ６−Ｂ−ＫＶ１）、又はリツキシマブ）を使用した。
【０１４７】
【表２−３】
2012521379.tif 000007
【０１４８】
表３に図示されたように、アフコシル化ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体Ｂ−ＨＨ６−Ｂ−ＫＶ１  ＧＥ又はリツキシマブと組み合わされた場合、マウス周皮細胞は、ｍＩＬ−３、ｍＭ−ＣＳＦ及びｍＧＭ−ＣＳＦの単独又は組合せにより刺激され、腫瘍細胞を最終的に排除することができる。ｍＩＬ−４刺激は、腫瘍細胞の抗体依存性殺傷を媒介した。抗体を含まないか又はアイソタイプ抗体を使用する場合、これらのサイトカインは、腫瘍細胞排除を生じなかった。同様に、ヒトサイトカインＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、及びＩＬ−３は、本発明のアフコシル化抗体と組合せられた場合に、腫瘍細胞殺傷について、高い作用を有した（例えば実施例７参照）。ｍＧＭ−ＣＳＦとｍＩＬ−３の組合せを、本明細書に説明した下記実施例のほとんどにおいて使用した。
【０１４９】
実施例２
ＣＤ２０特異性腫瘍細胞殺傷
ＣＤ２０陽性細胞株（ＳＵ−ＤＨＬ４及びＺ−１３８）に加え、ＣＤ２０陰性細胞株（ＯＣＩ−Ｌｙ１９及びＮａｍａｌｗａ）を使用し、刺激された周皮細胞／単球による、腫瘍細胞の抗体が媒介した殺傷は、標的特異性であることを示した。表４は、本実験の結果をまとめており、ここで周皮細胞はｍＧＭ−ＣＳＦ＋ｍＩＬ３により刺激した。
【０１５０】
【表２−４】
2012521379.tif 000008
【０１５１】
表４は、ＣＤ２０陽性細胞のみが、抗体が媒介した殺傷を示すことを例示している。
【０１５２】
実施例３
抗体のＦｃ部分の貢献
ＳＵ−ＤＨＬ４細胞を、ｍＧＭ−ＣＳＦ＋ｍＩＬ３により刺激された周皮細胞／単球と共培養し、かつ各抗体又は断片１０μｇ／ｍｌを共培養時に添加した。作用を、排除された腫瘍細胞が≧９０％の場合＋＋、≧２０％の場合＋、及び作用は小さいがゼロではない場合＋／−、排除がない場合−として特徴付けた。これらの作用を、表５にまとめている。
【０１５３】
【表２−５】
2012521379.tif 000009
ＳＵ−ＤＨＬ４細胞は、全抗体が使用された場合、刺激された周皮細胞／単球により、効果的に排除された。Ｆ（ａｂ）２断片は、小さい程度に作用し、このことは抗体の結合特性に固有のアポトーシス／抗増殖性の貢献を反映しているであろう。Ｆａｂ断片及び無関係の抗体は、全く腫瘍細胞に影響せず、これは抗体Ｆｃ−部分が、単球が媒介した細胞殺傷に必要であることを示している。
【０１５４】
実施例４
動態試験
ＳＵ−ＤＨＬ４細胞を、１０μｇ／ｍｌで、様々な時間間隔で、ｍＧＭ−ＣＳＦ＋ｍＩＬ３により刺激された周皮細胞と共培養した。非−糖質操作リツキシマブのみをこれらの実験に適用したが、しかしアフコシル化糖質操作ヒト化Ｂ−Ｌｙ１（Ｂ−ＨＨ６−Ｂ−ＫＶ１  ＧＥ）について同等のデータが予想される。図３は、様々な時点での残存している生存腫瘍細胞の割合を示している。
【０１５５】
図３：腫瘍細胞排除の動態試験（リツキシマブ１０μｇ／ｍｌを使用した）
【０１５６】
図３は、腫瘍細胞の排除は、５時間後に＞５０％であり、かつ７２時間の処置期間にほとんど完了したことを示している。
【０１５７】
実施例５
有効性に必要なエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比の精緻化
ＳＵ−ＤＨＬ４細胞を、様々な比のｍＧＭ−ＣＳＦ＋ｍＩＬ３により刺激された周皮細胞／単球と共培養した。この実験において、１０μｇ／ｍｌのアフコシル化糖質操作ヒト化Ｂ−Ｌｙ１（Ｂ−ＨＨ６−Ｂ−ＫＶ１  ＧＥ）及びリツキシマブを使用した。
【０１５８】
図４：エフェクター／標的比（Ｅ：Ｔ）滴定（アフコシル化糖質操作ヒト化Ｂ−Ｌｙ１（Ｂ−ＨＨ６−Ｂ−ＫＶ１  ＧＥ）及びリツキシマブは１０μｇ／ｍｌで使用した）
【０１５９】
図４に示されたように、アフコシル化糖質操作ヒト化Ｂ−Ｌｙ１（Ｂ−ＨＨ６−Ｂ−ＫＶ１  ＧＥ）は、Ｅ：Ｔ比１．２５：１で腫瘍細胞を全体的に排除したのに対し、リツキシマブは、この比でのみ４０％腫瘍細胞を排除することができた。これは、アフコシル化糖質操作ヒト化Ｂ−Ｌｙ１（Ｂ−ＨＨ６−Ｂ−ＫＶ１  ＧＥ）は、リツキシマブよりも優れていることを示している。固定されたＥ：Ｔ比での抗体の滴定は、これらの結果を裏付けているはずである。
【０１６０】
実施例６
腫瘍細胞排除−腫瘍細胞の周皮細胞／単球との共培養時のｍＧＭ−ＣＳＦ＋ｍＩＬ３と組合せた様々な抗体の処置−固定されたエフェクター：標的比（Ｅ：Ｔ比）での抗体滴定
ＳＵ−ＤＨＬ４細胞を、固定された比でｍＧＭ−ＣＳＦ＋ｍＩＬ３により刺激された周皮細胞／単球と共培養し、かつ抗体を滴定した。図５は、Ｅ：Ｔ比３：１及び１：１での、生存腫瘍細胞の割合を示す。
【０１６１】
図５：Ｅ：Ｔ比ａ）１：１及びｂ）３：１での、様々な抗体濃度の有効性
【０１６２】
図５に示されるように、既により低い濃度のアフコシル化糖質操作ヒト化Ｂ−Ｌｙ１（Ｂ−ＨＨ６−Ｂ−ＫＶ１  ＧＥ）抗体は、ＳＵ−ＤＨＬ４細胞を完全に排除した。加えて、より多い数のエフェクター細胞が存在する場合に、本抗体の濃度を低下することができる。非アフコシル化抗体（フコース量＞８０％を伴う非−糖質操作ヒト化Ｂ−Ｌｙ１（Ｂ−ＨＨ６−Ｂ−ＫＶ１）及びリツキシマブ）の両方共、より少ない有効性を示す（両方は同等の有効性を有する）。アフコシル化され糖質操作されたヒト化Ｂ−Ｌｙ１（Ｂ−ＨＨ６−Ｂ−ＫＶ１  ＧＥ）及び非アフコシル化非−糖質操作ヒト化Ｂ−Ｌｙ１（Ｂ−ＨＨ６−Ｂ−ＫＶ１）は、それらのフコシル化の程度のみ異なり、かつその結果ＦｃγIIIＡ受容体に対するそれらの親和性が異なり、アフコシル化糖質操作ト化Ｂ−Ｌｙ１（Ｂ−ＨＨ６−Ｂ−ＫＶ１  ＧＥ）の非アフコシル化非−糖質操作ヒト化Ｂ−Ｌｙ１（Ｂ−ＨＨ６−Ｂ−ＫＶ１）に勝る優れた有効性は、エフェクター細胞のより良い動員を基にしている。このことは、ＣＤ２０腫瘍抗原に対するアフコシル化抗体の特異的結合は、腹腔単球により増強されたエフェクター細胞媒介された殺傷を媒介することを強力に裏付けている。
【０１６３】
実施例７
腫瘍細胞排除−腫瘍細胞のヒト周皮細胞／単球との共培養時のｈＭ−ＣＳＦと組合せた様々な抗体の処置−ヒトマクロファージのエフェクターとしての有効性
これらの知見をヒトの状況に翻訳するために、ヒト単球を血液から単離し、ｈＭ−ＣＳＦにより刺激し、マクロファージへの分化を誘導した。その後ＳＵ−ＤＨＬ４細胞を、１０μｇ／ｍｌのアフコシル化糖質操作ヒト化Ｂ−Ｌｙ１（Ｂ−ＨＨ６−Ｂ−ＫＶ１  ＧＥ）又はリツキシマブと３日間共培養し、腫瘍細胞の排除を、図６に示したように分析した。
【０１６４】
図６：ヒトマクロファージによる腫瘍細胞の排除
【０１６５】
図６に示したように、ヒトマクロファージは、抗体処置時に腫瘍細胞（ＳＵ−ＤＨＬ４及びＺ１３８）を排除することもできる。選択された濃度１０μｇ／ｍｌで、リツキシマブ及びアフコシル化糖質操作ヒト化Ｂ−Ｌｙ１（Ｂ−ＨＨ６−Ｂ−ＫＶ１  ＧＥ）の細胞結合の飽和が存在し、その結果これらの抗体間の分化は予想されなかった。
【０１６６】
実施例８
抗体の糖鎖構造の分析
フコース−及び非−フコース（ア−フコース）含有オリゴ糖構造の相対比を決定するために、精製された抗体物質の放出されたグリカンを、ＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ−質量分析により分析した。これのために、抗体試料（約５０μｇ）を、タンパク質骨格からオリゴ糖を放出させるために、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中で５ｍＵ  Ｎ−グリコシダーゼＦ(Prozyme# GKE-5010B)と一緒に、３７℃で一晩インキュベーションした。引き続き、放出されたグリカン構造を単離し、かつＮｕＴｉｐ−Ｃａｒｂｏｎピペットチップ(Glygenから入手：NuTip1-10μl、カタログ番号NT1CAR)を用いて脱塩した。第一工程として、ＮｕＴｉｐ−Ｃａｒｂｏｎピペットチップを、１Ｍ  ＮａＯＨ  ３μＬ、引き続き純水２０μＬで(例えばBakerからのHPLC-勾配等級, # 4218)、３０％ｖ／ｖ酢酸３μＬ、及び再度純水２０μｌで洗浄することにより、これらをオリゴ糖の結合のために調製した。これに関して、各溶液は、ＮｕＴｉｐ−Ｃａｒｂｏｎピペットチップ内のクロマトグラフィー材料の一番上側に装荷し、かつそれを通過させた。その後先に説明されたＮ−グリコシダーゼＦ消化を４〜５回上昇及び下降させることにより、抗体１０μｇに対応するグリカン構造を、ＮｕＴｉｐ−Ｃａｒｂｏｎピペットチップ内の物質に結合させた。ＮｕＴｉｐ−Ｃａｒｂｏｎピペットチップ内の物質に結合したグリカンを、純水２０μＬで先に説明された方法で洗浄し、かつ各々、１０％アセトニトリル０．５μＬ及び２０％２．０μＬで、段階溶出した。この工程について、溶出液は、０．５ｍＬ反応バイアルに充填し、かつ各々４〜５回上昇及び下降させた。ＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ質量分析による分析のために、両方の溶出液を一緒にした。この測定について、一緒にした溶出液０．４μＬを、ＭＡＬＤＩ標的上で、ＳＤＨＢマトリックス溶液（２０％エタノール／５ｍＭ  ＮａＣｌに５ｍｇ／ｍｌで溶解した２，５−ジヒドロキシ安息香酸／２−ヒドロキシ−５−メトキシ安息香酸[Bruker Daltonics #209813])１．６μＬと混合し、かつ適切に調整されたBruker Ultraflex ＴＯＦ／ＴＯＦ装置により分析した。慣習的に、５０〜３００ショットを記録し、かつ１回の実験にまとめた。得られたスペクトルは、Ｆｌｅｘ解析ソフトウェア(Bruker Daltonics)により評価し、かつ検出された各ピークに関して質量を決定した。引き続き、ピークを、各構造に関して算出された質量を理論的に予想された質量と比較することにより、フコース又はア−フコース（非−フコース）含有グリコール構造（例えば各々フコースを伴う又は伴わない、複合型、混成型及びオリゴ−又は高−マンノース型）に割り当てた。
【０１６７】
混成型構造の比の決定に関して、抗体試料を、Ｎ−グリコシダーゼＦ及びエンドグリコシダーゼＨにより同時消化させ、Ｎ−グリコシダーゼＦは、全てのＮ−連結したグリカン構造（複合型、混成型及びオリゴ−又は高−マンノース型構造）をタンパク質骨格から放出し、かつエンドグリコシダーゼＨは、グリカンの還元末端で２個のＧｌｃＮＡｃ−残基間で全ての混成型グリカンを追加的に切断した。この消化物は、引き続き処理し、かつＮ−グリコシダーゼＦ消化された試料について先に説明されたものと同じ様式で、ＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ質量分析により分析した。Ｎ−グリコシダーゼＦ消化物と一緒にしたＮ−グリコシダーゼＦ／エンドＨ消化物からのパターンを比較することにより、特異的糖鎖構造(glycol structure)のシグナルの還元の程度を使用し、混成型構造の相対含量を概算する。
【０１６８】
各糖鎖構造の相対量は、個々のグリコール構造のピーク高さの比及び検出された全ての糖構造のピーク高さの合計により、算出した。フコース量は、Ｎ−グリコシダーゼＦ処理試料中の同定された全ての糖鎖構造（各々、例えば複合型、混成型及びオリゴ−又は高−マンノース型構造）に対するフコース−含有構造の割合である。アフコシル化の量は、Ｎ−グリコシダーゼＦで処理した試料中で同定された全ての糖鎖構造（各々、例えば複合型、混成型及びオリゴ−又は高−マンノース型構造）に対する、フコースを欠いている構造の割合である。
【０１６９】
実施例９
腫瘍細胞排除−様々な腫瘍細胞のヒト周皮細胞／単球との共培養時のｈＭ−ＣＳＦと組合せた様々なアフコシル化抗体（ＣＤ２０、ＥＧＦＲ及びＩＧＦ−Ｒに対する）の処理
周皮細胞／単球−刺激したサイトカイン、例えばｈＭ−ＣＳＦの、様々なアフコシル化抗体との組合せは、これらのサイトカインによる非−糖質操作（非アフコシル化）親抗体の組合せと比べ、腫瘍細胞−ヒト周皮細胞／単球共培養物（これはヒトのインビボの状況を反映している）中の増強された腫瘍細胞死につながることを示すために、ヒト単球を血液から単離し、かつｈＭ−ＣＳＦにより刺激し、マクロファージへの分化を誘導した。
【０１７０】
Ａ）その後、Ａ４３１細胞及び刺激された単球を、アフコシル化糖質操作＜ＥＧＦＲ＞  ＧＡ２０１又は非−糖質操作（非アフコシル化）親抗体の１０μｇ／ｍｌで始まる漸減濃度の抗体と、３日間共培養し、かつ腫瘍細胞の排除を図７に示したように分析した。
【０１７１】
Ｂ）その後、Ｈ３２２Ｍ細胞及び刺激された単球を、アフコシル化糖質操作＜ＩＧＦ−１Ｒ＞  ＨＵＭＡＢ−クローン１８又は非−糖質操作（非アフコシル化）野生型親抗体＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢ−クローン１８の１０μｇ／ｍｌで始まる漸減濃度の抗体と、３日間共培養し、かつ腫瘍細胞の排除を図８に示したように分析した。
【図１ａ】
2012521379.tif 000010
【図１ｂ】
2012521379.tif 000011
【図２】
2012521379.tif 000012
【図３】
2012521379.tif 000013
【図４】
2012521379.tif 000014
【図５ａ】
2012521379.tif 000015
【図５ｂ】
2012521379.tif 000016
【図６】
2012521379.tif 000017
【図７】
2012521379.tif 000018
【図８】
2012521379.tif 000019
【配列表】
2012521379000001.app
【国際調査報告】
2012521379.tif 000020
2012521379.tif 000021
2012521379.tif 000022
2012521379.tif 000023
2012521379.tif 000024
2012521379.tif 000025