【手続補正書】
【提出日】平成21年1月27日(2009.1.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨髄から単離されかつ増幅された幹細胞を、網膜特異的細胞に分化させるための方法であって、ここで、
（ａ）該幹細胞は、適切な培養培地中で増幅され；
（ｂ）該増幅された幹細胞は、脈絡膜馴化培地（ＣＣＭ）および／または網膜抽出物（ＲＥ）を含む分化培地中で培養され；そして
（ｃ）該網膜特異的細胞は、該分化培地から該細胞を分離することによって単離される、方法。
【請求項２】
前記骨髄由来の幹細胞が、間葉幹細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記間葉幹細胞が、ＣＤ５９、ＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＭＨＣ  Ｉからなる群より選択される少なくとも２つの表面抗原を発現することを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記間葉幹細胞が、表面抗原ＣＤ９０および表面抗原ＣＤ１０５を発現することを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
付着的に増殖する間葉幹細胞が、前記分化に使用されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記骨髄由来の幹細胞が、造血幹細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記造血幹細胞が、ＣＤ３４およびＣＤ４５からなる群より選択される少なくとも１つの表面抗原を発現することを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記造血幹細胞が、表面抗原ＣＤ３４および表面抗原ＣＤ４５を発現することを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記骨髄由来の幹細胞が、間葉幹細胞および造血幹細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
工程（ｃ）の後に、前記細胞が、液体培地中に浮遊させられることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記培地が、各々の場合において単独であるかまたはＨａｍ’ｓ  Ｆ１２栄養混合物との１：１混合物であるＲＰＭＩ、ＤＭＥＭ、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ培地および培地１９９、ならびに、ヒト内皮−ＳＦＭ、ＳＴＡＲＴ  ＶおよびＮｅｕｒｏｂａｓａｌ／Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ培地のような専用培地、またはその補充物Ｎ−２およびＢ２７からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記浮遊細胞が、凍結保護剤および感受性の生物学的物質を安定化させるためのタンパク質の添加後に、低温冷凍されることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記培地にＤＭＳＯもしくはメチルセルロースが、凍結保護剤として添加されることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
１０％  ＤＭＳＯが凍結保護剤として添加され、そして１０％血清もしくは無血清培養の場合には１０％アルブミンが感受性の生物学的物質を安定化させるために添加されることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記分化培地が、１〜２０％のＣＣＭおよび／または０．１〜５．０％のＲＥを含むことを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記分化培地が、１〜１５％のＣＣＭおよび／または０．１〜５．０％のＲＥを含むことを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記分化培地が、１０％のＣＣＭおよび／または１％のＲＥを含むことを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記方法の工程（ｂ）において、前記細胞が、３〜２１日間にわたって前記分化培地中で培養されることを特徴とする、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記方法の工程（ｂ）において、前記細胞が、１４〜２１日間にわたって前記分化培地中で培養されることを特徴とする、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記方法の工程（ｂ）において、前記細胞が、３〜１４日間の培養時間の間に最初に分化することを特徴とする、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記方法の工程（ｂ）において、前記細胞が、３〜９日間の培養時間の間に最初に分化することを特徴とする、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記方法の工程（ｂ）において、前記細胞が、５日間の培養時間の間に最初に分化することを特徴とする、請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
前記方法の工程（ｂ）において、ＣＣＭ含有分化培地中での３〜１４日間の培養時間の後に前記最初に分化した幹細胞が、ＲＥ含有分化培地中で１〜２８日間にわたってさらに分化することを特徴とする、請求項１〜１７いずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記方法の工程（ｂ）において、ＣＣＭ含有分化培地中での３〜５日間の培養時間の後に前記最初に分化した幹細胞が、ＲＥ含有分化培地中で１〜１４日間にわたってさらに分化することを特徴とする、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記方法の工程（ｂ）において、ＣＣＭ含有分化培地中で前記最初に分化した幹細胞が、ＲＥ含有分化培地以外の、ニューロン培養について証明済みである専用培地中でさらに分化することを特徴とする、請求項２３たは請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
さらなる分化のために使用される前記専用培地は、ＮｅｕｒｏｂａｓａｌまたはＳＴＡＲＴ  Ｖであることを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記方法の工程（ｂ）における前記幹細胞の密度は、１ｃｍ３あたり０．５×１０３個と２．５×１０３個との間であることを特徴とする、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記方法の工程（ｂ）における前記幹細胞の密度は、１ｃｍ３あたり２．０×１０３個であることを特徴とする、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
骨髄由来の幹細胞を網膜特異的細胞に分化させるための、脈絡膜馴化培地（ＣＣＭ）および／または網膜抽出物（ＲＥ）の使用。
【請求項３０】
前記骨髄由来の幹細胞が、間葉幹細胞であることを特徴とする、請求項２９に記載の使用。
【請求項３１】
前記骨髄由来の幹細胞が、造血幹細胞であることを特徴とする、請求項２９に記載の使用。
【請求項３２】
前記骨髄由来の幹細胞が、間葉幹細胞および造血幹細胞であることを特徴とする、請求項２９に記載の使用。
【請求項３３】
前記脈絡膜馴化培地（ＣＣＭ）は、ＦＧＦファミリーのメンバー、ニューロトロフィンファミリーのメンバー、ＢＭＰファミリーのメンバー、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＨＧＦおよびＮＧＦからなる群からの１種以上の成長因子を含むことを特徴とする、請求項２９〜３２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３４】
前記ＦＧＦファミリーのメンバーは、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ、ＦＧＦ−２）であることを特徴とする、請求項３３に記載の使用。
【請求項３５】
前記ニューロトロフィンファミリーのメンバーは、ＮＴ−３およびＮＴ−４であることを特徴とする、請求項３３に記載の使用。
【請求項３６】
前記ＢＭＰファミリーのメンバーは、ＢＭＰ−４であることを特徴とする、請求項３３に記載の使用。
【請求項３７】
ＰＤＧＦは、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢおよびＰＤＧＦ−ＡＢからなる群より選択されることを特徴とする、請求項３３に記載の使用。
【請求項３８】
請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法であって、骨髄からの前記単離の後、該方法の工程（ａ）における前記増幅の後の前記分化方法の間、もしくは該方法の工程（ｂ）における前記分化の後の、前記幹細胞の１種以上の外来性遺伝子によるトランスフェクション、または該細胞から分化した前記網膜特異的細胞の１種以上の外来性遺伝子によるトランスフェクションのいずれかが存在することを特徴とする、方法。