【手続補正書】
【提出日】平成21年8月26日(2009.8.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸分子のプールから複数の選択された核酸分子を増幅する方法であって：
（ａ）複数の外側のプライマー対を含む第１ラウンド多重増幅反応において、複数の選択された核酸分子を増幅するステップであり、各対が選択された核酸配列に特異的であり、前記増幅反応が、反応成分を求めるアンプリコン間での有意な競合が起きる前のポイントまで進行できる、ステップ；並びに、
（ｂ）前記完了した多重反応の一部を鋳型として、及び、内側のプライマーの対を少なくとも１つそれぞれ含む複数の第２ラウンド増幅反応において、前記選択された核酸分子をさらに増幅するステップであり、各第２ラウンド反応が前記複数の選択された核酸分子のサブセットをそれぞれさらに増幅するように各対が前記選択された核酸配列の１つに特異的である、ステップ；
を含む方法。
【請求項２】
核酸分子のプールから複数の選択された核酸分子を増幅する方法であって：
（ａ）複数の外側のプライマー対を含む第１ラウンド多重増幅反応において、複数の選択された核酸分子を増幅するステップであり、各対が選択された核酸配列に特異的であり、前記増幅反応が、反応成分を求めるアンプリコン間での有意な競合が起きる前のポイントまで進行できる、ステップ；並びに、
（ｂ）前記完了した多重反応の一部を鋳型として、及び、プライマーの対を少なくとも１つそれぞれ含む複数の第２ラウンド増幅反応において、前記選択された核酸分子をさらに増幅するステップであり、各第２ラウンド反応が前記複数の選択された核酸分子のサブセットをそれぞれさらに増幅するように、各対が、内側のプライマー及び前記外側のプライマーの１つを含み、さらに、前記選択された核酸配列の１つに特異的である、ステップ；
を含む方法。
【請求項３】
核酸分子のプールから選択された核酸分子の数を見積もる方法であって：
（ａ）複数の外側のプライマー対を含む第１ラウンド多重増幅反応において、複数の選択された核酸分子を増幅するステップであり、各対が選択された核酸配列に特異的であり、前記増幅反応が、反応成分を求めるアンプリコン間での有意な競合が起きる前のポイントまで進行できる、ステップ；
（ｂ）検出可能なレポーター、前記完了した多重反応の一部を鋳型として、及び、内側のプライマーの対を少なくとも１つそれぞれ含む複数の第２ラウンド増幅反応において、前記選択された核酸分子をさらに増幅するステップであり、各対が前記選択された核酸配列の１つに特異的であり、それによって各第２ラウンド反応が前記複数の選択された核酸分子のサブセットをそれぞれさらに増幅する、ステップ；並びに、
（ｃ）各選択された配列の選択された核酸分子の数が見積もられるように、各第２ラウンド増幅反応を前記検出可能なレポーターによりモニターするステップ；
を含む方法。
【請求項４】
核酸分子のプールから選択された核酸分子の数を見積もる方法であって：
（ａ）複数の外側のプライマー対を含む第１ラウンド多重増幅反応において、複数の選択された核酸分子を増幅するステップであり、各対が選択された核酸配列に特異的であり、前記増幅反応が、反応成分を求めるアンプリコン間での有意な競合が起きる前のポイントまで進行できる、ステップ；並びに、
（ｂ）検出可能なレポーター、前記完了した多重反応の一部を鋳型として、及び、プライマーの対を少なくとも１つそれぞれ含む複数の第２ラウンド増幅反応において、前記選択された核酸分子をさらに増幅するステップであり、各第２ラウンド反応が前記複数の選択された核酸分子のサブセットをそれぞれさらに増幅するように、各対が、内側のプライマー及び前記外側のプライマーの１つを含み、さらに、前記選択された核酸配列の１つに特異的である、ステップ；並びに、
（ｃ）各選択された配列の選択された核酸分子の数が見積もられるように、各第２ラウンド増幅反応を前記検出可能なレポーターによりモニターするステップ；
を含む方法。
【請求項５】
請求項３又は請求項４に記載された、核酸分子のプールから選択された核酸分子の数を見積もる方法であって、前記蛍光発生レポーターが、二本鎖ＤＮＡの間に介入する色素、又は、一本鎖ＤＮＡと相互作用するプローブである方法。
【請求項６】
請求項３又は請求項４に記載された、核酸分子のプールから選択された核酸分子の数を見積もる方法であって、前記第２ラウンド増幅反応が、各選択された配列の複数の選択された核酸分子が増幅及び定量化されるように、複数のプライマー対及び複数の蛍光発生プローブを含む方法。
【請求項７】
前記核酸分子がＤＮＡ分子を含む、上記請求項のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８】
上記請求項のいずれか１つに記載の方法であって、前記第２ラウンド増幅反応に含まれた前記プライマーが、前記第１ラウンド増幅反応に含まれた前記外側のプライマーのうち少なくとも１つよりも高いＴｍを有し、前記第２ラウンド増幅反応における前記オリゴヌクレオチドプライミングが、前記のより高いＴｍを有する前記プライマーを好んで実質的に偏っているようになっている、方法。
【請求項９】
上記請求項のいずれか１つに記載の方法であって、前記外側のプライマーのうち少なくとも１つが、ＵＴＰヌクレオチドを含み、それによって、前記プライマーは、ＵＮＧ酵素による消化を受け入れられる、方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、前記外側のプライマーは、ＵＮＧ酵素を用いた消化により前記第１ラウンドの増幅の終わりで除去され、その結果、前記第１ラウンドのプライマーによる前記第２ラウンド増幅反応の汚染を実質的に防いでいる、方法。
【請求項１１】
前記第１ラウンド多重増幅反応が、約１乃至３０サイクルで進行できる、上記請求項のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１２】
上記請求項のいずれか１つに記載の方法であって、遺伝子多型、突然変異、挿入及び遺伝子欠失の検出、並びに／又は、疾患及び障害の診断に使用される方法。
【請求項１３】
前記疾患又は障害が腫瘍である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記腫瘍が乳癌又は結腸直腸癌である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１乃至１１のいずれか１つに記載の方法であって、選択された生物の検出及び同定に使用される方法。
【請求項１６】
前記方法が、増幅された核酸分子の融解曲線分析を含む、請求項１２乃至１５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１７】
前記増幅反応が、熱サイクル装置において自動的に進行される、上記請求項のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１８】
前記熱サイクル装置が、マルチウェルリアルタイム熱サイクル装置、又は、連続フローＰＣＲ装置である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記熱サイクル装置が、回転式の熱サイクル装置である、請求項１７に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
好ましくは、前記熱サイクル装置は、マルチウェルリアルタイム熱サイクル装置（ｍｕｌｔｉ−ｗｅｌｌ  ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｉｎｇ  ａｐｐａｒａｔｕｓ）である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
いくつかの実施形態において、前記熱サイクル装置は、連続フローＰＣＲ装置である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
当業者は、便宜上、３８４穴プレート、９６穴プレート、又は連続フロー装置等のいかなる他の適切な形式も使用できることを理解するけれども、以下の記述された形式は、Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社「Ｇｅｎｅ−Ｄｉｓｃ」の使用に関する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８８】
好ましくは、増幅反応は、マルチウェルリアルタイム熱サイクル装置又は連続フローＰＣＲ装置におけるフルイディックス（ｆｌｕｉｄｉｃｓ）ロボットにより自動的に進行する。