(57)【要約】  本発明は生物活性物質の送達に有用なヘリコバクター・ピロリ株に関する。特に、本発明は、（ａ）低病原性、（ｂ）自然に形質転換する能力、および（ｃ）宿主適応せずにマウスの胃粘膜にコロニー形成する能力を有するＨ．ピロリ分離株を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の特徴、（ａ）低病原性、（ｂ）自然に形質転換する能力、および（ｃ）宿主適応せずにマウスの胃粘膜にコロニー形成する能力、を有するＨ．ピロリ分離株。
【請求項２】
請求項１に記載のＨ．ピロリ分離株であって、前記Ｈ．ピロリは哺乳類対象において慢性感染を引き起こすことが可能なＨ．ピロリ分離株。
【請求項３】
請求項１または２に記載のＨ．ピロリ分離株であって、前記Ｈ．ピロリは１以上の機能性の病原性因子を発現しないＨ．ピロリ分離株。
【請求項４】
請求項３に記載のＨ．ピロリ分離株であって、前記病原性因子はｖａｃＡ  ｓ１またはｃａｇＡであるＨ．ピロリ分離株。
【請求項５】
Ｈ．ピロリ分離株は、
（ｉ）ｖａｃＡ  ｓ１もしくはｃａｇＡ陰性、または
（ｉｉ）ｖａｃＡ  ｓ２およびｃａｇＡ陽性、のどちらかであり、
前記Ｈ．ピロリ株は、
（ａ）低病原性、
（ｂ）自然に形質転換する能力、および
（ｃ）宿主適応せずにマウスの胃粘膜にコロニー形成する能力、を有するＨ．ピロリ分離株。
【請求項６】
請求項１から３ののＨ．ピロリ分離株であって、前記Ｈ．ピロリは受入番号第Ｖ０９／００９１０１号にてＮａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅに寄託されたＯＮＤ７３７、受入番号第Ｖ０９／００９１０２号にてＮａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅに寄託されたＯＮＤ７３８、受入番号第Ｖ０９／００９１０３号にてＮａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅに寄託されたＯＮＤ７３９、受入番号第Ｖ１０／０１４０５９号にてＮａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅに寄託されたＯＮＤ２４８、受入番号第Ｖ１０／０１４０６０号にてＮａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅに寄託されたＯＮＤ２５６、受入番号第Ｖ０９／００９１０４号にてＮａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅに寄託されたＯＮＤ７４０、または、それらの変異体もしくは誘導体から成る群より選択されるＨ．ピロリ分離株。
【請求項７】
受入番号第Ｖ０９／００９１０１号にてＮａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅに寄託された、Ｈ．ピロリ分離株ＯＮＤ７３７。
【請求項８】
受入番号第Ｖ０９／００９１０２号にてＮａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅに寄託された、Ｈ．ピロリ分離株ＯＮＤ７３８。
【請求項９】
受入番号第Ｖ０９／００９１０３号にてＮａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅに寄託された、Ｈ．ピロリ分離株ＯＮＤ７３９。
【請求項１０】
受入番号第Ｖ０９／００９１０４号にてＮａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅに寄託された、Ｈ．ピロリ分離株ＯＮＤ７４０。
【請求項１１】
受入番号第Ｖ１０／０１４０５９号にてＮａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅに寄託された、Ｈ．ピロリ分離株ＯＮＤ２４８。
【請求項１２】
受入番号第Ｖ１０／０１４０６０号にてＮａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅに寄託された、Ｈ．ピロリ分離株ＯＮＤ２５６。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれか一項に記載のＨ．ピロリ分離株であって、それは核酸分子によってコードされた対照遺伝子で形質転換されるＨ．ピロリ分離株。
【請求項１４】
請求項１３に記載のＨ．ピロリ分離株であって、前記単離された核酸分子はＨ．ピロリ株のゲノムに組み込まれるＨ．ピロリ分離株。
【請求項１５】
請求項１３または１４に記載のＨ．ピロリ分離株であって、前記単離された核酸分子はＨ．ピロリに相同なポリペプチドをコードするＨ．ピロリ分離株。
【請求項１６】
請求項１３または１４に記載のＨ．ピロリ分離株であって、前記単離された核酸分子はＨ．ピロリに非相同なポリペプチドをコードするＨ．ピロリ分離株。
【請求項１７】
請求項１から１６のいずれか一項に記載のＨ．ピロリ分離株を投与する段階を含む、哺乳類対象において抗体反応を誘導する方法。
【請求項１８】
生体内における生物活性物質の送達に適したＨ．ピロリ株を特定する方法であって、
（ａ）Ｈ．ピロリ感染のために無症状個体からＨ．ピロリ株を分離する段階、
（ｂ）前記株が自然に形質転換する能力を有するかどうかを決定する段階、および
（ｃ）前記株が宿主適応せずにマウスの胃粘膜にコロニー形成する能力を有するかどうかを決定する段階を含み、
自然に形質転換する能力および宿主適応せずにマウスの胃粘膜にコロニー形成する能力を有する株は、生体内において生物活性物質の送達に適している方法。
【請求項１９】
ヘリコバクター感染における最適化動物モデルであって、前記動物はカゼインが豊富な餌および／または酸性水が与えられているため、ヘリコバクター種によるコロニー形成は、カゼインが豊富な餌および／または酸性水が与えられていない動物と比較して強化され得る最適化動物モデル。
【請求項２０】
請求項１９に記載の最適化動物モデルであって、前記動物はカゼインが豊富な餌および酸性水が与えられており、前記水は約ｐＨ２である最適化動物モデル。
【請求項２１】
請求項１９または２０に記載の最適化動物モデルであって、前記動物はマウスである最適化動物モデル。
【請求項２２】
ヘリコバクター種を特定するためのランダム増幅多型ＤＮＡポリメラーゼ連鎖反応の使用。
【請求項２３】
請求項２２に記載の使用であって、ヘリコバクターＤＮＡは前記ヘリコバクター種から単離されて、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示される配列を有するフォワードプライマーおよびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示される配列を有するリバースプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって増幅される使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生物活性物質の送達に有用であるヘリコバクター・ピロリ株に関する。
【背景技術】
【０００２】
共生細菌または弱毒生病原体などの生細菌は、例えば、ワクチン抗原、生物活性分子、またはＤＮＡも含めた、様々な生物活性物質を送達するための魅力的な媒体として表される。細菌性送達媒体に内在する利点は、経口投与、および長期間にわたる化合物の持続放出を含み、それは反復投与の必要性を取り除くものである。
【０００３】
最近の市販のワクチンおよび薬剤は、大部分は非経口的に投与され、複数回の投与を必要とし、かつ医療スタッフおよび低温流通体系に依存している。生細菌性媒体は従来の予防薬および治療薬の代替手段を提供する。それらは経口で送達可能であり、１回の投与だけで十分であって、かつ例えば多重抗原などの大きな分子を送達可能である。さらに、細菌性媒体は大規模な製造および処方設計によく適しており、かつ凍結乾燥しても安定である。これらの特性はこの送達形態を魅力的なものとし、かつ様々なワクチンおよび薬剤に対して、服薬遵守の増加、より優れた分配、および費用削減をもたらし得る。
【０００４】
いくつかの細菌性送達システムは、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｐ．（米国特許第７，２３５，２３４号）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．（米国特許出願公開第２００９００２２６９１号）、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．（米国特許出願公開第２００９００７４７３４号）を含めた様々な細菌に基づいて提案されてきたが、これらのシステムには多数の問題が内在している。
【０００５】
一般に、細菌は送達媒体としての使用のために必要な特徴を有する株を産生するよう操作される。重要なことは、細菌の安全性プロフィールが確保されなければならないことである。伝統的に、送達媒体として使用される細菌は、病原性が弱いかまたは非病原性となるように弱毒化されてきた。しかしながら、病原性遺伝子は再取得可能であり、結果として細菌は病気を引き起こすことが可能な病原型に戻り得るため、これらの細菌の安全性を確保することは困難である。さらに、細菌株を形質転換または動物モデルにおけるコロニー形成に適するように操作することは、二次的な望ましくない特徴をもたらし、少なくとも実験の妨げとなり、かつ細菌性送達媒体の診療所への移行を遅らせる結果になり得る。例えば、実験がマウスなどの動物において実施可能である株の操作は、株が標的宿主、典型的にはヒトにコロニー形成しない結果になり得る。従って、所望の特徴を有する株を産生するための細菌の操作は、可能であれば避けるべきである。
【０００６】
本発明の発明者は、細菌性送達システムにおけるヘリコバクター・ピロリの使用を以前に提案し（米国特許出願公開第２００７０１３４２６４号）、上記で特定した多数の問題を解決した。しかしながら、米国特許出願公開第２００７０１３４２６４号が細菌性送達媒体としてのＨ．ピロリの使用に関する豊富な情報を提供しても、特定の特徴を有する特定の細菌株の開発は有益であろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第７，２３５，２３４号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００９００２２６９１号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００９００７４７３４号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００７０１３４２６４号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
第１の態様では、本発明は以下の特徴を有するＨ．ピロリ分離株を提供する。（ａ）低病原性、（ｂ）自然に形質転換する能力、および（ｃ）宿主適応せずにマウスの胃粘膜にコロニー形成する能力。
【０００９】
Ｈ．ピロリは、生物活性物質のためにそれ自身の生細菌性送達媒体としての使用を適切とする固有の特徴を有する。本発明のＨ．ピロリ株は無症状の個体から分離されて最小の病状を示し、ヒトに使用するための安全な株を提供する。さらに、本発明の株は自然に形質転換可能であり、かつ事前に適応せずにＨ．ピロリ−マウスモデルにコロニー形成可能である。これは前臨床実験を促進し、かつ株の操作が最小限であり、ヒトに対して結果の正確、直接な翻訳を可能とすることを意味する。従って、本発明のＨ．ピロリ株は生細菌性送達媒体としての使用において大変適している。
【００１０】
いくつかの実施形態では、本発明のＨ．ピロリは哺乳類対象において慢性感染を引き起こすことが可能である。
【００１１】
いくつかの実施形態では、本発明のＨ．ピロリ株は、例えば、ｖａｃＡ  ｓ１またはｃａｇＡなどの１以上の機能性の病原性因子を発現しない。
【００１２】
第２の態様では、本発明はＨ．ピロリ分離株を提供し、それは、
（ｉ）ｖａｃＡ  ｓ１もしくはｃａｇＡ陰性、または
（ｉｉ）ｖａｃＡ  ｓ２およびｃａｇＡ陽性、のどちらかであり、
前記Ｈ．ピロリ株は、
（ａ）低病原性、
（ｂ）自然に形質転換する能力、および
（ｃ）宿主適応せずにマウスの胃粘膜にコロニー形成する能力、を有する。
【００１３】
いくつかの実施形態では、本発明は、受入番号第Ｖ０９／００９１０１号にてＮａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅに寄託されたＯＮＤ７３７、受入番号第Ｖ０９／００９１０２号にてＮａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅに寄託されたＯＮＤ７３８、受入番号第Ｖ０９／００９１０３号にてＮａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅに寄託されたＯＮＤ７３９、受入番号第Ｖ１０／０１４０５９号にてＮａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅに寄託されたＯＮＤ２４８、受入番号第Ｖ１０／０１４０６０号にてＮａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅに寄託されたＯＮＤ２５６、受入番号第Ｖ０９／００９１０４号にてＮａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅに寄託されたＯＮＤ７４０、または上述したように定義された能力を有するそれらの変異体もしくは誘導体から成る群より選択される株の特徴を有するＨ．ピロリ株を提供する。
【００１４】
第３の態様では、本発明は、受入番号第Ｖ０９／００９１０１号にてＮａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅに寄託されたＨ．ピロリ株ＯＮＤ７３７を提供する。
【００１５】
第４の態様では、本発明は、受入番号第Ｖ０９／００９１０２号にてＮａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅに寄託されたＨ．ピロリ株ＯＮＤ７３８を提供する。
【００１６】
第５の態様では、本発明は、受入番号第Ｖ０９／００９１０３号にてＮａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅに寄託されたＨ．ピロリ株ＯＮＤ７３９を提供する。
【００１７】
第６の態様では、本発明は、受入番号第Ｖ０９／００９１０４号にてＮａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅに寄託されたＨ．ピロリ株ＯＮＤ７４０を提供する。
【００１８】
第７の態様では、本発明は、受入番号第Ｖ１０／０１４０５９号にてＮａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅに寄託されたＨ．ピロリ株ＯＮＤ２４８を提供する。
【００１９】
第８の態様では、本発明は、受入番号第Ｖ１０／０１４０６０号にてＮａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅに寄託されたＨ．ピロリ株ＯＮＤ２５６を提供する。
【００２０】
Ｈ．ピロリ分離株は形質転換されることで、対象遺伝子（ｇｅｎｅ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ）を発現する組換え株を産生し得る。いくつかの実施形態では、対象遺伝子は核酸によってコードされ、それは単離された形態で得られることが好ましい。本発明の単離された核酸分子は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらのハイブリッド分子であり得ることが当業者に理解されよう。好ましくは、単離された核酸はｃＤＮＡである。
【００２１】
好ましくは、単離された核酸は組換え株のゲノムに組み込まれる。
【００２２】
単離された核酸は、Ｈ．ピロリに相同または非相同的なポリペプチドをコードし得る。
【００２３】
いくつかの態様では、単離された核酸は、抗原などの生物活性物質、有機分子、例えば遺伝子産物もしくは遺伝子配列（単離された核酸）などの治療薬または予防薬などの薬物をコードする。
【００２４】
特異的、非保護的な循環抗体および長期持続性の存在などのＨ．ピロリ感染における固有の特徴は、Ｈ．ピロリがワクチン抗原の送達に特に有用であることを意味する。従って、いくつかの実施形態では、本発明は対象抗原を発現する組み換えＨ．ピロリ株の投与によって、個体において抗体反応を誘導する方法を提供する。
【００２５】
第９の態様では、本発明は生体内において生物活性物質の送達に適したＨ．ピロリ株を特定する方法を提供する。それは、（ａ）Ｈ．ピロリ感染のために、Ｈ．ピロリ株を無症状の個体から分離すること、（ｂ）株が自然に形質転換する能力を有するかどうかを決定すること、および（ｃ）株が宿主適応せずにマウスの胃粘膜にコロニー形成する能力を有しているかどうかを決定することを含む。自然に形質転換する能力および宿主適応せずにマウスの胃粘膜にコロニー形成する能力を有する株は、生体内における生物活性物質の送達に適している。
【００２６】
第１１の態様では、本発明はヘリコバクター感染における最適化された動物モデルを提供する。動物はカゼインが豊富な餌および／または酸性水を与えられているため、カゼインが豊富な餌および／または酸性水が与えられていない動物と比較して、ヘリコバクター種のコロニー形成は強化され得る。
【００２７】
いくつかの実施形態では、動物はカゼインが豊富な餌および酸性水の両方が与えられており、水は約ｐＨ２である。いくつかの実施形態では、動物はマウスである。
【００２８】
第１２の態様では、本発明はヘリコバクター種を特定するためのランダム増幅多型ＤＮＡポリメラーゼ連鎖反応の使用を提供する。
【００２９】
いくつかの実施形態では、ヘリコバクターＤＮＡは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示される配列を有するフォワードプライマーおよびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示される配列を有するリバースプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって増幅される。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】Ｈ．ピロリ臨床分離株の自然形質転換を試験した。Ｋａｒｏｌｉｎｓｋａ（Ｋ）Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの１４株およびＳＣＧＨ（Ｈ）の２８株を、それらの抗生物質耐性表現型に基づいて、ＤＮＡを有する形質転換性であることを特定した。形質転換性株は選択プレート上に得られた形質転換コロニーの数によって示される。＋低（＜２０）、＋＋（２０−５０）、＋＋＋（＞５０）、＋＋＋＋（＞１００）。
【図２】形質転換性Ｈ．ピロリ株のＤＢＡ／２マウスモデルの胃におけるコロニー形成を試験した。マウス（ｎ＝３）を１×１０９ＣＦＵ／ｍｌの細菌で攻撃（ｃｈａｌｌｅｎｇｅｄ）した。４週間後、細菌をマウスの胃組織から培養して定量した。コロニー形成レベルを得られたコロニーの数によってランク付けした。＋低（＜２０）、＋＋（２０−５０）、＋＋＋（＞５０）、＋＋＋＋（＞１００）。
【図３】形質転換性Ｈ．ピロリ株のＤＢＡ／２マウスモデルの胃におけるコロニー形成を試験した。マウス（ｎ＝１０−１２）を１×１０９ＣＦＵ／ｍｌの細菌で攻撃した。４週間後、細菌をマウスの胃組織から培養して定量した。コロニー形成頻度を群ごとにＨ．ピロリに感染したマウスの数によって決定した。結果を群ごとに個別および平均のコロニー形成比率として示す。
【図４】Ｈ．ピロリ株のＤＢＡ／２マウスモデルの胃における長期コロニー形成を試験した。マウス（ｎ＝４−６）を１×１０９ＣＦＵ／ｍｌの細菌で攻撃した。６ヶ月後、細菌をマウスの胃組織から培養して定量した。コロニー形成頻度を群ごとにＨ．ピロリに感染したマウスの数によって決定した。結果を群ごとに個別および平均のコロニー形成比率として示す。
【図５】生着菌および非生着菌のＨ．ピロリ株を使用してＤＢＡ／２マウスを攻撃し、Ｈ．ピロリ特異的抗体反応を測定した。マウス（ｎ＝５）を１×１０９ＣＦＵ／ｍｌの細菌で攻撃した。３ヵ月後に血清を回収し、ＩｇＧ特異抗体をＥＬＩＳＡを用いて測定した。結果を４０５ｎｍにおけるＯＤで示す。
【図６】生着菌のＨ．ピロリ株を試用してＤＢＡ／２マウスを攻撃し、Ｈ．ピロリ特異的抗体反応を測定した。マウス（ｎ＝５）を１×１０９ＣＦＵ／ｍｌの細菌で攻撃した。血清を攻撃から１、２、３および５ヵ月後に回収し、ＩｇＧ特異抗体をＥＬＩＳＡを用いて測定した。結果を４０５ｎｍにおけるＯＤで示す。
【図７】Ｈ．ピロリ株のＣ５７ＢＬ／６マウスモデルの胃におけるコロニー形成を２週間後に試験した。マウス（ｎ＝３）を１×１０９ＣＦＵ／ｍｌの細菌で攻撃した。細菌をマウスの胃組織から培養して定量した。コロニー形成頻度を群ごとにＨ．ピロリ群に感染したマウスの数によって決定した。結果を群ごとに個別および平均のコロニー形成比率として示す。
【図８】経口感染から４週間後に、Ｈ．ピロリ株の種々のマウス株の胃におけるコロニー形成を試験した。マウス（ｎ＝１０）を１×１０９ＣＦＵ／ｍｌの細菌で攻撃した。細菌をマウスの胃組織から培養して定量した。コロニー形成頻度を群ごとにＨ．ピロリに感染したマウスの数によって決定した。
【図９】Ｈ．ピロリ株の遺伝子型および臨床病理学。
【図１０】Ｈ．ピロリ株を用いた経口攻撃から３ヵ月後のＤＢＡ／２マウスにおけるプール血清を使用したイムノブロット。マウス（ｎ＝５）を１×１０９ＣＦＵ／ｍｌの細菌で攻撃した。細菌の全細胞溶解液（ｗ）、ならびに外膜（ｏ）および内膜（ｉ）タンパク質に対するイムノブロット分析のために、血清を回収してプールした。
【図１１】プライマー１２５４また１２８１で増幅されたＨ．ピロリ株のＲＡＰＤ  ＰＣＲ。レーンＭまたはＭ１：１ｋｂのＤＮＡラダー、レーンＮ：各プライマーに対するネガティブコントロール、ＯＮＤレーン：それぞれ個々のＨ．ピロリ株、レーンＭ２：１００ｂｐのＤＮＡラダー。命名法参照のために表１０を参照のこと。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明を詳細に説明する前に、本発明は特定の例示された方法に限定されず、かつ当然ながら変化し得ることが理解される。また、本明細書において使用される用語は本発明の特定の実施形態を説明する目的のためにのみ使用され、かつ限定することを意図せず、それは添付の特許請求の範囲によってのみ限定され得ることが理解される。
【００３２】
本明細書において引用される全ての刊行物、特許、および特許出願は、本明細書の前後を問わず、その全体が本明細書において参照により援用される。しかしながら、本明細書において言及される刊行物は、刊行物において報告される手順、試薬、およびベクターの説明および開示の目的のために引用され、それは本発明と関連して使用され得る。本発明は先の発明の存在によって、このような刊行物に先行する権利を有しないものと解釈されてはならない。
【００３３】
さらに、本発明の実施には、特に指示がない限り、当業者の技能の範囲内で、従来の微生物学、免疫学および分子生物学の技術、ならびに薬理学を使用する。このような技術は当業者に周知であり、文献において十分に説明されている。例えば、Ｐｒｅｓｃｏｔｔらの「Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」（１９９９年）第４版、ＷＣＢ  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ；Ｓａｍｂｒｏｏｋらの「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（１９８９年）（２００１年）第２版および第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；およびＲｏｉｔｔらの「Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（１９９８年）、第５版、Ｍｏｓｂｙを参照のこと。
【００３４】
本明細書および添付の請求の範囲において用いられる単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈から明らかにそうでないことが示されていなければ、複数のものを含むことに留意する必要がある。従って、例えば、「核酸」への言及は複数のそのような核酸を含み、かつ「分離された株」への言及は１以上の株への言及等である。別段の規定がない限りは、本明細書において用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるそれらと類似または同等のあらゆる材料および方法は、本発明を実施または試験するために使用可能であり、好ましい材料および方法をこれから記載する。
【００３５】
後の特許請求の範囲および本発明の前述の説明では、文脈から言語または必要な意味を表すために別に要求される場合を除いて、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含む（ｃｏｍｒｉｓｅｓ）もしくは「含まれている（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、包括的に、すなわち、述べられた特徴の存在を明細書に含めるために使用されるが、本発明の種々の実施形態におけるさらなる特徴の存在または追加を排除するために使用されるものではない。
【００３６】
本明細書で用いられる用語「から本質的になる」は、組成物および方法を定義するために使用されるとき、組み合わせに対するあらゆる本質的な意義の他の要素を排除することを意味するものとする。従って、本明細書において定義される要素から本質的になる組成物は、分離および精製の方法からの微量汚染物質、およびリン酸緩衝食塩水、防腐剤などの薬学的に受容可能なキャリアを排除するものではない。「からなる」は、その他の成分の微量元素および本発明の組成物を投与するための多くの方法段階を超えるものは排除されることを意味するものとする。これらの変化する用語のそれぞれから定義される実施形態は、本発明の範囲内である。
【００３７】
本発明は生細菌性送達媒体として有用なヘリコバクター・ピロリ株に関する。これらの株の重要な特徴は、それらの低病原性にある。用語「低病原性」は無症状、すなわち消化性潰瘍または胃癌を引き起こさず、かつ胃粘膜における最小の病状、すなわち胃上皮の萎縮、リンパ球浸潤、または顆粒球浸潤がわずかに存在するかまたは存在しない病状を引き起こす、感染を確立することが可能なＨ．ピロリ株を指す。
【００３８】
いくつかの実施形態では、本発明のヘリコバクター・ピロリ株は１以上の機能性の病原性因子を発現しない。病原性遺伝子によってコードされる病原性因子は、上皮細胞に損傷を与えることによる粘膜防壁の破壊、および消化性潰瘍および胃癌を含む明らかな疾患を引き起こす。例えば、病原性遺伝子のｖａｃＡ  ｓ１は細胞空胞化毒素をコードし、一方で、病原性遺伝子のｃａｇＡはＩＶ型分泌を介して宿主細胞に注入される毒素をコードする。特定の実施形態では、本発明の株はｖａｃＡ  ｓ１またはｃａｇＡのどちらかが欠損している、すなわち機能性のｖａｃＡ  ｓ１またはｃａｇＡのどちらかを発現しない。特定の仮説になんら束縛されるものではないが、これらの病原性因子の両方が病原性に必要とされるようである。
【００３９】
細菌性輸送手段は低病原性を有することが重要な一方で、それらが慢性感染を引き起こすことも望まれる。用語「慢性感染」は、６ヶ月以上継続する感染を指す。そのため、いくつかの実施形態では、本発明のＨ．ピロリ株は哺乳類対象において慢性感染を引き起こす能力を有し得る。
【００４０】
本明細書において用いられる用語「哺乳類対象」は、ヒト、霊長類、ウマ科の動物、イヌ科の動物、またはネコ科の動物を指す。
【００４１】
また、本発明のＨ．ピロリ株は自然に形質転換する能力を有する。用語「自然に形質転換する」、「自然形質転換」、およびそれらの文法的に同等なものは、自然界において通常発生しない、例えばエレクトロポレーションなどの条件を用いずに、実験室条件における外来性ＤＮＡの取り込み、ゲノムへの組み込み、および発現から生じる細胞の遺伝子変異を指す。この特徴は生物活性物質をコードする対象遺伝子の細菌ゲノムへの組み込み、および「組換株」の産生を促進する。
【００４２】
また、本発明のＨ．ピロリ株は事前に宿主適応せずに、マウスに感染およびコロニー形成する能力を有する。ヒトから採取された細菌は、必ずしもマウスなどの異なる種を感染させるというわけではない。従って、宿主適応は、マウスモデルにおける実験が始まる前によく要求される。マウスの宿主適応は、一般に、宿主適応変異株を産生するためにマウス間で細胞を継代することを含む。さらに、一旦実験がマウスにおいて完結すると、株は次にヒトに感染およびコロニー形成し得ず、それはさらなる操作が要求される結果となる。従って、宿主適応を行わずにマウスに感染可能なヒトからのＨ．ピロリ分離株の使用は、Ｈ．ピロリに対する操作を限定し、株のヒトへの直接の翻訳を可能とする。
【００４３】
本発明の発明者は上述した細菌性輸送媒体の望ましい特徴を有するＨ．ピロリの臨床分離株の非排他的な例を特定した。特定されたＨ．ピロリ株を、ブダペスト条約に従って、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＭＩ），１／１５３  Ｂｅｒｔｉｅ  Ｓｔｒｅｅｔ，Ｐｏｒｔ  Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ｖｉｃｔｏｒｉａ，Ａｕｓｔｒａｌｉａに、２００９年４月２２日（ＯＮＤ７３７、ＯＮＤ７３８、ＯＮＤ７３９、およびＯＮＤ７４０）、ならびに２０１０年５月２８日（ＯＮＤ２４８およびＯＮＤ２５６）に寄託した。Ｈ．ピロリ株には、以下の受入番号が割り当てられた。Ｖ０９／００９１０１（ＯＮＤ７３７）、Ｖ０９／００９１０２（ＯＮＤ７３８）、Ｖ０９／００９１０３（ＯＮＤ７３９）、Ｖ０９／００９１０４（ＯＮＤ７４０）、Ｖ１０／０１４０５９（ＯＮＤ２４８）、およびＶ１０／０１４０６０（ＯＮＤ２５６）。
【００４４】
また、本発明は、Ｈ．ピロリ株のＯＮＤ７３７、ＯＮＤ７３８、ＯＮＤ７３９、ＯＮＤ７４０、ＯＮＤ２４８、およびＯＮＤ２５６の変異体または誘導体も検討する。本明細書において用いられる用語「変異体」または「誘導体」は、Ｈ．ピロリ株のＯＮＤ７３７、ＯＮＤ７３８、ＯＮＤ７３９、ＯＮＤ７４０、ＯＮＤ２４８、およびＯＮＤ２５６と、少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、および最も好ましくは少なくとも約９５％同一のゲノムＤＮＡを有し、かつ本明細書に記載の株の特徴と一致する細菌を指す。
【００４５】
本発明のＨ．ピロリ株は、生物活性物質を送達するために使用され得る。生細菌性送達媒体は、生物活性物質をコードする遺伝子（ｇｅｎｅまたはｇｅｎｅｓ）を発現することによって生物活性物質を送達する。一般に、対象遺伝子は核酸によってコードされ、それは単離された形態で得られることが好ましい。本発明の単離された核酸分子は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらのハイブリッド分子であり得ることが当業者に理解されるであろう。好ましくは、単離された核酸はｃＤＮＡである。
【００４６】
本明細書において用いられる用語「単離された核酸」は核酸であり、その構造は、あらゆる天然型の核酸、または３つを超える別々の遺伝子にまたがる天然型のゲノム核酸のいかなる断片とも同一ではない。従って、用語は、例えば（ａ）天然型ゲノムＤＮＡ分子の一部の配列を有するが、天然型の生物ゲノムにおける分子の一部に隣接（ｆｌａｎｋ）するコード配列の両方に隣接しないＤＮＡ分子、（ｂ）結果的に生じる分子がいかなる天然型のベクターまたはゲノムＤＮＡとも同一にならないように、原核生物または真核生物のベクターもしくはゲノムＤＮＡに組み込まれる核酸、（ｃ）ｃＤＮＡ、ゲノム断片、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって産生される断片、または制限断片などの別々の分子、および（ｄ）ハイブリッド遺伝子、すなわち融合タンパク質をコードする遺伝子の一部である組換えヌクレオチド配列、を網羅する。核酸を単離するための方法は当業者に周知である。
【００４７】
単離された核酸は相同または非相同であり得る。しかしながら、一般に、単離された核酸は非相同であり得る、すなわち、Ｈ．ピロリによって、もしくは細菌への導入の前に、またはそれらの祖先によってまったく発現されない。
【００４８】
いくつかの実施形態では、単離された核酸は生物活性物質をコードする。本発明の方法は様々な生物活性物質を送達するために使用可能であることが、当業者に理解され得る。適した薬剤の例としては、例えば局所または全身の代謝に影響を与える内分泌活性をもたらすことが可能な薬剤、および／または、免疫／造血システムに属する細胞の活性を制御可能な薬剤、および／または体内の様々な正常細胞または新生細胞における生存率、成長、および分化に影響を与え、または損傷および感染に対する急性期炎症反応における免疫の制御または誘導に影響を与えることが可能な薬剤、および／またはそれらの標的細胞受容体に作用するケモカインによって仲介される細胞および組織の感染に対する抵抗、または上皮細胞の増殖、または創傷治癒の促進を、増強または誘導することが可能である薬剤、および／、または体内での細胞による物質の発現または産生を調節する薬剤などの、局所的または体系的に機能させることが可能なものが挙げられる。
【００４９】
このような生物活性物質の特定の実施形態には、インスリン、成長ホルモン、プロラクチン、カルシトニン、黄体形成ホルモン、副甲状腺ホルモン、ソマトスタチン、甲状腺刺激ホルモン、血管作動性腸管ポリペプチド、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＩＦＮ−γ、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＣＮＴＦ、ＧＨ、ＰＲＬ、またはＩＦＮ  α／βなどの逆平行４αヘリックス束構造を取る構造群１サイトカイン、しばしば細胞表面結合性であり、対称性ホモトリマーを形成し、サブユニットがサイトカインの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリー、例えばＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＣＤ４０、ＣＤ２７もしくはＦＡＳリガンド、サイトカインのＩＬ−１ファミリー、線維芽細胞成長因子ファミリー、血小板由来成長因子、形質転換成長因子β、および神経成長因子などの特定のウイルスコートタンパク質について記載されたβ−ジェリーロールの構造を取る構造群２サイトカイン、各々が細胞外領域において少なくとも１つの上皮成長因子（ＥＧＦ）ドメインを含む大きな膜貫通型前駆体分子として生産される短鎖α／β分子、例えば、サイトカインのＥＧＦファミリー、保存されたシステイン残基の周辺でグループ化されたアミノ酸配列を持つことを特徴とするケモカイン（Ｃ−ＣもしくはＣ−Ｘ−Ｃケモカインサブグループ）、またはインスリン関連サイトカインを含む構造群３サイトカイン、例えばＥＧＦ、免疫グロブリン様およびクリングルドメインなどの異なるドメインからなるヘレグリンまたはニューレグリンなどのモザイク構造を示す構造群４サイトカインが含まれる。
【００５０】
あるいは、生物活性物質は上記で定義した生物活性物質に対する受容体または拮抗薬であり得る。
【００５１】
従って、本発明は、薬学的用途のため、例えばヒトまたは動物の治療法、特に予防法（ワクチン接種）における使用のために、生物活性物質を発現する組換えＨ．ピロリ株を提供する。
【００５２】
特異的、非保護的な循環抗体および長期持続性の存在などのＨ．ピロリ感染の固有の特徴は、Ｈ．ピロリがワクチン抗原の送達および個人における抗体反応の誘導に特に有用であることを意味している。従って、特定の実施形態では、本発明は抗原を発現する組み換えＨ．ピロリ株、および細菌を個体に投与することによって個体における抗体反応を誘導する方法を提供する。「抗体反応」は、組換え細菌によって発現された対象抗原に対する特異的な抗体の誘導を指す。
【００５３】
生物活性物質をコードする単離された核酸は、当技術分野で周知のあらゆる方法によってＨ．ピロリ株のゲノムに組み込まれ得る。例えば、発現ベクターおよび／またはベクタープラスミドは、単離された核酸の形態の対象遺伝子を細菌染色体に挿入するために使用され得る。好ましい実施形態では、単離された核酸は、自然形質転換および相同組換えによって、細菌染色体に組み込まれ得る。例えば、５−１５μｌのＴＥ緩衝液中に抗生物質マーカーまたは変異ｒｐｓＬ対立遺伝子(Ｄａｉｌｉｄｉｅｎｅら、（２００６年）「Ｃｏｎｔｒａｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ」  Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，７２，５９０８−５９１４）を含む、０．３−２μｇのＤＮＡ断片を、Ｈ．ピロリ培養物に加えて混合する。その後、細菌をガス室において２４時間インキュベートする。ＤＮＡ処理細胞を回収し、カナマイシン（１０μｇ／ｍｌ）、クロラムフェニコール（１０μｇ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１０μｇ／ｍｌ）、およびエリスロマイシン（１０μｇ／ｍｌ）が添加された選択血液寒天培地に蒔く。細菌の成長は、形質転換が成功したことを示す。
【００５４】
また、本発明は細菌性送達媒体としての使用に適したＨ．ピロリ株を特定する方法を提供する。該方法の第１段階は、Ｈ．ピロリ感染のために、Ｈ．ピロリ株を無症状の個体から単離することを含む。好ましくは、個体は少なくとも５０歳であり、Ｈ．ピロリ感染に対して無症状であり、かつ胃上皮の萎縮を示さないかわずかに示す。その後、単離された株は、株が自然に形質転換する能力を有するかどうか、かつ宿主適応せずにマウスの胃粘膜にコロニーを形成する能力を有するかどうかを決定するために試験され得る。自然に形質転換可能かつ宿主適応せずにマウスの胃粘膜にコロニー形成可能である単離された株は、細菌性送達媒体としての使用、および生体内における生物活性物質の送達に適していると指定され得る。
【００５５】
本発明は以下の限定されない実施例のみを参照してさらに説明される。しなしながら、以下の実施例は例示性を示すのみであり、決して上述の本発明の一般性を制限するものとして見なされるべきではないことが理解されるべきである。
【実施例１】
【００５６】
臨床株の分離
２３個のＨ．ピロリ臨床分離株を、スウェーデンのＫａｒｏｌｉｎｓｋａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから入手し、５０個のＨ．ピロリ臨床分離株を、西オーストラリア州のＳｉｒ  Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｇａｒｄｉｎｅｒ  Ｈｏｓｐｉｔａｌから入手した。臨床分離株をグリセロールストックから起こし、ガス制御室内で６つの抗生物質選択血液寒天培地（バンコマイシン  １０μｇ／ｍｌ、乳酸トリメトプリム  μｇ／ｍｌ、ポリミキシンＢ  ２５００ＩＵ／Ｌ、アンホテリシンＢ  ２．５μｇ／ｍｌ）で成長させた。２４時間の成長の後、細菌をプレートから採取し、ＢＨＩＢ（Ｏｘｏｉｄ社）中で再懸濁させた。細菌をプレートから直接収集し、光学濃度を６００ｎｍ（ＯＤ６００）で測定して、１ｍｌ当たり約１×１０９の細菌を得た。株の遺伝子型決定は以前に説明したように実施した（Ｔｉｗａｒｉら、（２００７年）「Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｄｉａｇｎｏｓｉｎｇ  ｖｉｒｕｌｅｎｔ  Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｂｉｏｐｓｙ  ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ  ｆｒｏｍ  ｓｕｂｊｅｃｔｓ  ｗｉｔｈ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｇａｓｔｒｏ−ｄｕｏｄｅｎａｌ  ｄｉｓｅａｓｅｓ」Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１０３，２３５３−２３６０）。
【００５７】
全ての臨床分離株を、ＤＮＡを取り出して相同組換えによってＤＮＡをそれらのゲノムに組み込むそれらの能力のために、スクリーニングした。Ｈ．ピロリ臨床分離株をグリセロールストックから選択寒天培地に接種した。プレートを、２つのＣａｍｐｙｇｅｎキットガスパックを含むガス制御室において、２−４日間３７℃でインキュベートした。細菌を継代培養し、新たなプレートに再度蒔いた。プレートを３７℃にて１８−２０時間室内でさらにインキュベートし、単一コロニーをＤＥＮＴ（Ｏｘｏｉｄ社、ＳＲ０１４７）が添加された新たなプレートに蒔いた。プレートをＣＯ２インキュベータ中で５時間インキュベートした。次に、５−１５μｌのＴＥ緩衝液中に抗生物質マーカーまたは変異ｒｐｓＬ対立遺伝子（Ｄａｉｌｉｄｉｅｎｅら、（２００６年）「Ｃｏｎｔｒａｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ」  Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，７２，５９０８−５９１４)を含む、０．３−２μｇのＤＮＡ断片を、Ｈ．ピロリ株に加えて混合した。細菌をガス室内でさらに２４時間インキュベートした。ＤＮＡ処理細胞を回収し、カナマイシン（１０μｇ／ｍｌ）、クロラムフェニコール（１０μｇ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１０μｇ／ｍｌ）、およびエリスロマイシン（１０μｇ／ｍｌ）が添加された選択血液寒天培地に蒔いてインキュベートした。細菌の成長を形質転換後に決定した。
【００５８】
図１は自然に形質転換することが可能で、かつ抗生物質耐性となった株の頻度を示している。スクリーニングした７３個の株のうち、約６０％（４２／７３）、Ｋａｒｏｌｉｎｓｋａ（Ｋ）Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅからの１４株、およびＳＣＧＨ（Ｈ）からの２８株が、それらの抗生物質耐性の表現型に基づいて、ＤＮＡを有した自然形質転換性であると特定された。次いで、これらの株をそれらのコロニー形成能のために、マウスモデルにおいて生体内で試験した（実施例２）。
【実施例２】
【００５９】
Ｈ．ピロリ  ＤＢＡ／２Ｊマウスモデルにおいて胃にコロニー形成する臨床分離株の特定
実施例１（図１）で特定された４２個の臨床分離株の、ＤＢＡ／２Ｊマウスモデルにおいて胃粘膜にコロニー形成するそれらの能力を試験した。
【００６０】
６−８週齢の雌のＤＢＡ／２Ｊマウスモデルを、オーストラリアのＡｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｃｅｎｔｒｅから購入した。全てのマウスはＨ．ピロリフリーであり、実験の開始前に２週間の順化期間が認められた。動物は、特別の定めのない限り、酸性水および標準（魚粉ベース）の囓歯類飼料を自由に与えた。いくつかの実験では、動物に、菜食（魚粉フリー）、または準合成のカゼインが豊富なタンパク質飼料、および中性（非酸性の）飲料水を与えた。飼料は西オーストラリア州のＳｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｆｅｅｄｓ社から供給された。全ての実験研究は、承認ＲＡ  ３／１００／６７６を受けて、ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ  Ａｎｉｍａｌ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認されている。
【００６１】
マウス（ｎ＝３）をＢＨＩＢ中で１×１０９ＣＦＵ／ｍｌの細菌を用いて攻撃した。コロニー形成のレベルを決定するために、胃組織を攻撃から４または２４週間後のどちらかに動物から収集した。胃を大弯に沿って切開し、残留した餌をＰＢＳを用いて穏やかに洗浄して除去した。開いた胃を５００μｌのＰＢＳに入れて、振動数３０にて３０秒間５ｍｍのステンレス鋼ビーズを用いて均質化した（Ｑｉａｇｅｎ  ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ  ＩＩ）。サンプルを振動数１０にて２分間さらに均質化した。ホモジネートの段階希釈を、アンホテリシンＢ（８μｇ／ｍｌ）、トリメトプリム（５μｇ／ｍｌ）およびバンコマイシン（６μｇ／ｍｌ）、ナリジクス酸（１０μｇ／ｍｌ）、ポリミキシンＢ（１０μｇ／ｍｌ）、およびバシトラシン（２００μｇ／ｍｌ）が添加されたＢＨＩ寒天培地に蒔いた。プレートを２つのＣａｍｐｙｇｅｎキットガスパック（Ｏｘｏｉｄ社、ＣＮ００２５Ａ）を含むガス制御室におき、３７℃でインキュベートした。細菌成長を蒔いてから５−７日後に決定した。
【００６２】
自然形質転換性であると特定された４２株のうち、たった１５株がＤＢＡ／２ＪＨ．ピロリマウスモデルにおけるコロニー形成に成功することが可能であった（図２）。供給源からの予備実験結果を表１にまとめた。最良のコロニー形成株を特定し、生体内でのコロニー形成の強さおよび感染頻度をさらに実証した。
【００６３】
形質転換性のコロニー形成Ｈ．ピロリ臨床分離株の概要
【００６４】
【表１】
2012528575.tif 000002
【実施例３】
【００６５】
感染の強さおよび頻度
実施例２においてマウスモデルにコロニー形成した１５個の株の強さをさらに調査するために、より多くの動物数を用いたより多くの実験を実施した。これは真の生着菌である臨床分離株の選択を可能とした。自然に形質転換可能であり、かつマウスの胃粘膜にコロニー形成可能と上記で特定された各株に対して複数回の実験を行った。つまり、マウス（ｎ＝１０−１２）を１×１０９ＣＦＵ／ｍｌの細菌を用いて攻撃した。４週間後、細菌をマウスの胃組織から培養して定量した。
【００６６】
その結果、予備の生体内スクリーニングにおいて特定された５株（Ｋ６、Ｋ８、Ｋｌ８、Ｈ２７、およびＨ４０）は、マウスの胃粘膜において強い生着菌である一方で、残りの１０株は弱い生着菌であることが示された。ＳＣＧＨ臨床分離株が弱くて不整合なコロニー形成結果を示したので、２回目の実験後に終了した（図３）。また、ＳＣＧＨ株はＫａｒｏｌｉｎｓｋａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅからの供給された株と比較してよりゆっくりと成長した。これらの差異は、個々の場所での培養および貯蔵の技術の差異に起因するものであろう。
【実施例４】
【００６７】
ＤＢＡ／２Ｊマウスモデルにおける長期コロニー形成
Ｈ．ピロリ株による慢性感染を確立する能力について、長期コロニー形成実験を実施することによって取り組んだ。初回（１回目）のコロニー形成データに基づいて、最も強いコロニー形成臨床分離株と最も弱いコロニー形成臨床分離株の選択物を試験した。実施例２において購入および扱ったマウス（ｎ＝４−６）を、１×１０９ＣＦＵ／ｍｌのコロニー形成Ｈ．ピロリ株（Ｋ６、Ｋ８、Ｋ１１、Ｋ１８、Ｈ２７、およびＨ４１）、ならびに非コロニー形成株（Ｋ１２、Ｋ１４、Ｋ１６、Ｋ１７、Ｈ２３、およびＨ４４）を用いて経口攻撃した。経口攻撃から６ヵ月後、上述の実施例において説明したように、細菌をマウスの胃組織から収集して培養し、定量した。強い生着菌株；Ｋ６、Ｋ８、Ｋ１８、およびＨ２７は、約５０％の動物をなお感染させることが可能であった（図４）。予想通り、非コロニー形成株に感染したマウスはコロニー形成せず、弱いコロニー形成株Ｋ１１およびＨ４１は、長期の間マウスの胃粘膜にコロニー形成することは不可能であった。これは、異なる株はマウスの胃にコロニー形成するための異なる能力を有していることを示しており、ここに私たちは宿主適応せずにコロニー形成可能である少なくとも４つの株を特定した。
【実施例５】
【００６８】
コロニー形成Ｈ．ピロリ臨床分離株の免疫原性
次に、私たちは生体内マウスモデルにおいて特定されたコロニー形成Ｈ．ピロリ株の免疫原性を決定し、かつそれらを非コロニー形成株と比較した。Ｈ．ピロリ臨床分離株を、ＤＢＡ／２Ｊマウスモデルにおける経口攻撃から３ヶ月後に、それらの特異的ＩｇＧ抗体反応を誘導する能力に対して試験した。マウス（ｎ＝５）を、１×１０９ＣＦＵ／ｍｌのコロニー形成Ｈ．ピロリ株（Ｋ６、Ｋ８、Ｋ１１、Ｋ１８、Ｈ２７、およびＨ４１）、ならびに非コロニー形成株（Ｋ１２、Ｋ１４、Ｋ１６、Ｋ１７、Ｈ２３、およびＨ４４）を用いて経口攻撃した。感染から３か月後、動物を出血させ、血清を回収し、かつＨ．ピロリ特異的ＩｇＧ抗体をＥＬＩＳＡによって測定した。
【００６９】
９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ社  Ｍａｘｉｓｏｒｂ（登録商標））を１０μｇ／ｍｌのＨ．ピロリＸ４７細胞溶解物で被覆し、４℃で一晩インキュベートした。その後、プレートをＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０で５回洗浄し、３７℃で２時間２％のＢＳＡでブロックした。プレートを２回洗浄し、血清サンプル（１／２０希釈）をウェルに加え、二つ組で行った。その後、プレートを室温（ＲＴ）にて１時間インキュベートし、次いで洗浄し、検出抗体（アルカリホスファターゼと結合する抗−マウスＩｇＧ、１／１０００、Ｓｉｇｍａ社）を加えた。さらに、プレートを室温で１時間インキュベートし、その後洗浄した。プレートを４０分間ｐ−ＮＰＰを用いて作成し、その後反応を２ＭのＮａＯＨで停止させた。光学濃度値を４０５ｎｍで測定することで抗体力価を示した。
【００７０】
その結果、２つの最も強い生着菌株であるＫ６およびＫ８が、最も免疫原性が高いことを示した（図５）。臨床分離株、Ｋ１１、Ｋ１８、Ｈ２７、およびＨ４１は極めて免疫原性が低かった。興味深いことに、臨床分離株Ｈ４４は、マウスモデルに感染してから４週間後に胃粘膜にコロニー形成することが不可能であるにもかかわらず、経口攻撃から３か月後に強いＨ．ピロリ特異的ＩｇＧ反応を示した。それはこの株が実験の進行中における早い時期にマウスに一時的に感染し得ることが示唆される。
【００７１】
さらなる分析では、Ｈ．ピロリ特異的ＩｇＧ抗体を、コロニー形成株を用いて攻撃されたマウスにおいて最大で５か月まで測定した。その結果、Ｋ６およびＫ８の株は、攻撃から最大で５か月後まで、最も強くかつ最も持続的なＨ．ピロリ特異的抗体反応を誘導することが示された（図６）。これらのデータは、Ｋ６およびＫ８の株が最も免疫原性が高い一方で、Ｋ１１、Ｋ１８、Ｈ２７、およびＨ４１は免疫原性が低いという観察結果を支持している。
【実施例６】
【００７２】
Ｈ．ピロリＣ５７ＢＬ／６マウスモデルにおいて胃にコロニー形成する臨床分離株の特定
候補Ｈ．ピロリ株をＤＢＡ／２マウスモデルにおけるスクリーニング（実施例２）において見落としていないことを確保するために、私たちはＣ５７ＢＬ／６マウスモデルのスクリーニングを再検討した。これは臨床分離株による感染に対して非許容的である。
【００７３】
６−８週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６マウスをオーストラリアのＡｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｃｅｎｔｒｅから購入した。全てのマウスはＨ．ピロリフリーであり、実験の開始前に２種間の順化期間が認められた。動物は、特別の定めのない限り、酸性水および標準（魚粉ベース）の囓歯類飼料を自由に与えた。いくつかの実験では、動物に、菜食（魚粉フリー）、または準合成のカゼインが豊富なタンパク質飼料、および中性（非酸性の）飲料水を与えた。飼料は西オーストラリア州のＳｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｆｅｅｄｓ社から供給された。全ての実験研究は、承認ＲＡ  ３／１００／６７６を受けて、ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ  Ａｎｉｍａｌ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認されている。
【００７４】
実施例１によって特定された１４個の形質転換性Ｈ．ピロリ株を、実施例２において使用されたものと同様の手順によってコロニー形成を試験した。私たちは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスモデルにおいてコロニー形成に成功したさらなる株Ｋ４を特定し、かつ第２の株のＫ１２も、この株のコロニー形成は極めて弱いが検出した（図７）。また、Ｋ８株も本モデルにおいて弱い生着菌として発見した。全ての残りのＨ．ピロリ臨床分離株はＣ５７ＢＬ／６マウスにおいてコロニー形成不可能であった。
【実施例７】
【００７５】
Ｈ．ピロリマウスモデルの最適化
モデルマウスがＨ．ピロリに対して自然宿主ではなく、かつ本モデルにおいて感染の確立は難しいところもあるので、私たちは、生体内におけるＨ．ピロリ株のコロニー形成を向上させるために、餌および水を含めた飼料における改良を試験してマウスモデルを最適化することを設定した。
【００７６】
初めに、私たちは標準魚粉ベース飼料、菜食（非魚粉）、および準合成のカゼインが豊富なタンパク質飼料（９３Ｇ）を含む異なる飼料を比較した。次に、私たちは酸性（ｐＨ２．５）対中性（ｐＨ６）の飲料水の効果を評価した。これらの手法を試験することで、どれがＸ４７研究室株を用いたＣ５７ＢＬ／６およびＤＢＡ／２マウスモデルにおけるコロニー形成の改善をもたらすかを決定した。
【００７７】
その結果、標準魚粉飼料と比較すると、カゼインが豊富な９３Ｇの飼料（Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｆｅｅｄｓ社、西オーストラリア州）が与えられたマウスにおいてＨ．ピロリによる改善されたコロニー形成が示された（表２）。菜食（魚粉フリー）の飼料はコロニー形成においていかなる改善も示さなかった（データ非表示）。準合成のカゼインが豊富な飼料を使用することで、マウスにおけるＨ．ピロリコロニー形成の比率を増加させ、改善したマウスモデルをもたらした。興味深いことに、標準酸性水（ｐＨ２）から中性水（ｐＨ６）へ飲料水を変更することで胃における細菌量が減少し、モデルに対して悪影響を及ぼした（表２）。実際、酸性水の使用は、マウスの胃においてその他の細菌の存在を抑制する可能性が高いため、マウスにとってより好ましかった。その後の生体内におけるスクリーニング試験はこれらの飼料条件下で実施した。
【００７８】
マウスモデルにおいて飼料がＨ．ピロリのコロニー形成に与える影響
【００７９】
【表２】
2012528575.tif 000003
Ｈ．ピロリ株Ｘ４７のＣ５７ＢＬ／６およびＤＢＡ／２マウスモデルの胃におけるコロニー形成を２−４週間後に試験した。マウス（ｎ＝３）を１×１０９ＣＦＵ／ｍｌの細菌で攻撃した。細菌をマウスの胃組織から培養して定量した。胃組織の１ｍＬ当たりのコロニー形成量を各動物ごとに決定した。その結果を群当たり平均細菌量として示す。
【実施例８】
【００８０】
さらなるマウスモデルにおけるＨ．ピロリコロニー形成株のスクリーニング
各Ｈ．ピロリ臨床分離株が固有の特性を有し、かつ特徴的に異なるため、遺伝的背景が異なるその他のマウス株が生体内モデルとしてより適している可能性があった。従って、私たちはＣ３Ｈ、ＦＶＢ／ｎ、ＣＢＡ、ＤＢＡ／２、１２９／ｓ、およびＳｗｉｓｓ（ＡＲＣ）を含む６個のマウス株における、以前に特定した５個のＨ．ピロリ株（Ｋ４、Ｋ８、Ｋ１２、Ｋ１１、およびＫ１８）のコロニー形成に対してスクリーニングした。
【００８１】
６−８週齢の雌のＤＢＡ／２Ｊ、Ｃ３Ｈ、ＣＢＡ、ＦＶＢ／ｎ、１２９／ｓ、Ｓｗｉｓｓ（ＡＲＣ）、およびＣ５７ＢＬ／６マウスを、オーストラリアのＡｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｃｅｎｔｒｅから購入した。全てのマウスはＨ．ピロリフリーであり、実験の開始前に２種間の順化期間が認められた。動物は、特別の定めのない限り、酸性水および標準（魚粉ベース）の囓歯類飼料を自由に与えた。いくつかの実験では、動物に、菜食（魚粉フリー）、または準合成のカゼインが豊富なタンパク質飼料、および中性（非酸性の）飲料水を与えた。飼料は西オーストラリア州のＳｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｆｅｅｄｓ社から供給された。全ての実験研究は、承認ＲＡ  ３／１００／６７６を受けて、ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ  Ａｎｉｍａｌ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認されている。
【００８２】
培養が困難なために、Ｋ６株を本実験に含めなかった。さらに、マウス適応株Ｘ４７をコンパレータとして含め、全ての実験は準合成のカゼインが豊富なタンパク質飼料（９３Ｇ飼料）および酸性水を与えたマウスを用いて実施した。
【００８３】
その結果、Ｋ４、Ｋ８、およびＫ１８の株はほとんどのマウス株に良好から高度な程度にコロニー形成可能であることが示された。Ｋ１１およびＫ１２の株はかなり低い頻度ではあるが、種々のマウスにコロニー形成可能であった。予想通り、Ｘ４７はすべてのマウス株において、高レベルの細菌量を有してしっかりコロニー形成可能であった。これらの結果を以下の表３および図８に示す。
【００８４】
総合すると、Ｋ４、Ｋ８、およびＫ１８は、マウスにおける広域スペクトルの強い生着菌であると考えられ、種々のマウスモデルにおいて最も良好に機能した。その一方で、Ｋ１１およびＫ１２はマウスのより弱い生着菌であった。
【００８５】
種々のマウス株におけるＨ．ピロリ臨床株のコロニー形成比率
【００８６】
【表３】
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Ｈ．ピロリ株の経口感染から４週間後に、種々のマウス株の胃におけるコロニー形成を試験した。マウス（ｎ＝１０）を１×１０９ＣＦＵ／ｍｌの細菌で攻撃した。細菌をマウスの胃組織から培養して定量した。コロニー形成頻度を群ごとにＨ．ピロリに感染したマウスの数によって決定した。
【実施例９】
【００８７】
スナネズミモデルにおけるＨ．ピロリコロニー形成株のスクリーニング
６個の特定されたＨ．ピロリ株（Ｋ４、Ｋ６、Ｋ８、Ｋ１２、Ｋ１１、およびＫ１８）が強くて広域の生着菌であるかどうかを検証するために、それらをスナネズミモデルにおいてスクリーニングした。スナネズミモデルは、ヒト感染において観察される病状（胃炎）と密接に類似しているため、Ｈ．ピロリ感染とより関連するモデルである。
【００８８】
つまり、８−１２週齢の動物を、ウマ血清（８％）、バンコマイシン（１０ｍｇ／ｌ）、トリメトプリム（５ｍｇ／ｌ）、ナイスタチン（１ｍｇ／ｌ）が添加された寒天培地（ＧＣ  ａｇａｒ、Ｏｘｏｉｄ社、ドイツ）において成長した約１×１０９の生存Ｈ．ピロリ（５株の個別の株またはプール）を用いて、５日間にわたって３回経口攻撃した。動物を感染から３−５週間後に犠牲にし、胃を大弯に沿って開け、胃組織を幽門洞と胃体部に分離して保存した。各幽門洞と胃体部の組織試料を１ｍｌのブルセラブロス中で均質化し、適切な希釈を選択血清プレート（ＧＣ  ａｇａｒ，上述を参照のこと）上に広げ、３７℃で最大５日間、微好気的条件下（８５％Ｎ２、１０％ＣＯ２、５％Ｏ２）でインキュベートした。コロニー形成単位（ＣＦＵ）の数を胃組織１グラム当たりで示した。
【００８９】
最初のスクリーニングでは、全ての４株（個々に攻撃）はスナネズミの胃粘膜にコロニー形成できなかった。次いで、残りの形質転換性の１０個のＫ株を試験するために、２回目のスクリーニングを実施した。スナネズミを５株の混合物を用いて攻撃し、コロニー形成株を胃の生体組織から培養し、遺伝子型決定指紋法によって特定した。興味深いことに、Ｋ４およびＫ１２の２株はスナネズミ宿主にコロニー形成可能であり（図９）、両方の株はＤＢＡ／２マウスモデルにおける最初のスクリーニングでは特定されなかった。
【００９０】
さらに、マウスにおける広範囲のスクリーニングの後、Ｋ４株はマウスおよびスナネズミのモデルの両方における良好で強い生着菌であることが示された。これらのデータは、Ｈ．ピロリ株の多様性、および前臨床動物モデルでのヒト臨床分離株の使用における困難性を反映している。
【実施例１０】
【００９１】
サルモデルにおけるＨ．ピロリコロニー形成株のスクリーニング
非ヒト霊長類（サル）はヒトと密接に関係していると考えられており、そのため、Ｈ．ピロリ感染を含めてヒト疾患の関連モデルである。ここに、私たちは以前に特定したＨ．ピロリ株をサルモデルにおいて検証するよう設定した。
【００９２】
Ｖａｌｌｅｙ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（ウエストサクラメント、カリフォルニア州）から入手した成長した（＞５歳）カニクイザルを、サルにおいて９５％の感受性および９４％の特異性がある血清学（Ｓｏｌｎｉｃｋら、（２００１年）、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９：６８８７−６８９２）を用いて、Ｈ．ピロリ感染に対して最初にスクリーニングした。また、血清陰性のサルは内視鏡検査を受け、Ｈ．ピロリのそれらの陰性培養および組織像を、Ｈ．ピロリ攻撃実験において使用するために、デービスのＣａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｉｍａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒに転送した。私たちは、動物の約２５％が血清陰性であり、７５％が胃生検において陰性であることを予測する。
【００９３】
Ｈ．ピロリに感染していないサルをＨ．ピロリ攻撃またはコントロールを受け取るように無作為に割り当てた。Ｈ．ピロリ株のＫ６（ＯＮＤ７３７）、Ｋ８（ＯＮＤ７３８）、およびＫ１１（ＯＮＤ７３９）の混合物を攻撃に使用した。培養が困難なために、ＯＮＤ７４０を本実験に使用しなかった。約１×１０９の生存Ｈ．ピロリをケタミン（１０ｍｇ／ｋｇ  ＩＭ）で鎮静されたサルに経口投与で接種した。攻撃から１ヵ月後に胃生検を行い、Ｈ．ピロリ感染を確認した。ＣＦＵを以前に記載したように定量した。
【００９４】
Ｋ６およびＫ１１の２株はサルの胃にコロニー形成することに成功した（図９）。
【実施例１１】
【００９５】
株の臨床的および遺伝子型の特徴
４つの選択マウス−コロニー形成株および２つのスナネズミ−コロニー形成株（Ｋ４、Ｋ１２）の臨床的および組織学的なデータを図９にまとめた。６つの選択株を、それぞれＯＮＤ７３７、ＯＮＤ７３８、ＯＮＤ７３９、ＯＮＤ７４０、ＯＮＤ２４８、およびＯＮＤ２５６と指定した（表４）。
【００９６】
Ｈ．ピロリ株の命名法
【００９７】
【表４】
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Ｈ．ピロリ臨床分離株に対する命名法システムのための参考資料。各形質転換性Ｋ株には固有のＯＮＤ番号が割り当てられている。
【００９８】
全ての株は５２歳を超える無症状の患者に由来するものである。内視鏡検査において、胃上皮の萎縮はわずかにまたは全く観察されず、かつＫ１８（ＯＮＤ７４０）株のみが高度の顆粒球浸潤を示した。株の遺伝子型において、ｖａｃＡ  ｓ１、ｖａｃＡ  ｓ２、ｃａｇＡ、ｃａｇＴ、ｃａｇＰＡＩ、およびｈｒｇＡの対立遺伝子の存在をマルチプレックスＰＣＲで試験した。興味深いことに、株はｖａｃＡ  ｓ１もしくはｃａｇＡ陰性（Ｋ６）、またはｖａｃＡ  ｓ２およびｃａｇＡ陽性のどちらかであり、それはｖａｃＡ  ｓ１の対立遺伝子およびｃａｇＡが無症状の患者において排他的に存在することを示唆している。
【００９９】
その結果、Ｈ．ピロリのヒト臨床分離株において、それらの病原性、免疫原性、および毒性は著しく変化し得ることが示された。ここに、私たちは、Ｈ．ピロリ株は、ＤＮＡを取り出し、それを相同組換えによってそれらのゲノムに組み込み、マウスの胃にコロニー形成し、かつ特異的抗体を誘導するそれらの能力もまた変化することを示す。本研究は、宿主適応せずにＨ．ピロリ動物モデルにおいて強い生着菌である６個のＨ．ピロリ株を特定した。
【０１００】
さらに、特定株の２つは特異抗体の高力価を誘導し、かつ１つの株は両モデルにおいて強い生着菌であった。総合すると、本研究は、それらの無症状の高齢患者からの分離、胃における低級の臨床病状、遺伝子操作、動物モデルにおける胃にコロニー形成する能力、および強い免疫反応を誘発する能力に基づいて、細菌性送達媒体としての使用に適した複数のＨ．ピロリ株を特定した。
【実施例１２】
【０１０１】
Ｈ．ピロリ臨床分離株のイムノブロット分析
Ｈ．ピロリ株がそれらの免疫原性特性の点で異なるかどうかを決定するためにイムノブロット分析を実施し、ＤＢＡ／２マウスモデルにおいて得られた血清を使用して、選択されたＨ．ピロリ臨床分離株（Ｋ６、Ｋ８、Ｋ１１、Ｋ１８、およびＨ４１）のタンパク質パターンを特定した。全細胞溶解液、ならびに外膜および内膜のタンパク質に対するイムノブロットをそれぞれのＨ．ピロリ株に対して比較した。Ｘ４７を使用し、この株はマウスにおいて免疫原性があることが知られているためベンチマークとして含めた。
【０１０２】
プレート培養から収集した細菌を４００μｌの１×ＰＢＳ中で１０ＯＤ６００ｎｍの濃度に希釈し、２回３０秒間、超音波処理した。超音波処理の後、細菌懸濁液をＳＤＳ−ＰＡＧＥのために５分間９５℃で加熱して室温まで冷却し、１００μｌの５×サンプル緩衝液中で変性させた。
【０１０３】
あるいは、細菌を収集して、外膜タンパク質をグリシン抽出によって抽出した。１０ＯＤ６００ｎｍの単位に相当する細胞ペレットを、２００μｌのグリシン緩衝液（ｐＨ２．２）中に再懸濁させて、室温にて５分間インキュベートした。その後、細胞を遠心分離した（２分、１４０００ｒｐｍ、室温）。上清を３０μｌのＴｒｉｓ（ｐＨ１０．８）と混合し、タンパク質分画を中和した。上述したＳＤＳ−ＰＡＧＥのために、グリシン抽出のペレットを４００μｌの１×ＰＢＳ中で再懸濁し、超音波処理して５×サンプル緩衝液中で変性させた。
【０１０４】
サンプル（各レーン１０μｌ）を、４％の濃縮用ゲルおよび１０％の分離ゲルを用いたＭｉｎｉＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）Ｔｅｔｒａ  Ｃｅｌｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｅ  ｕｎｉｔ（Ｂｉｏｒａｄ社）を使用して、ＳＤＳポリアクリルアミドミニゲルにて電気泳動した。分離した抗原を、Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ（登録商標）ＳＤ  Ｓｅｍｉ−Ｄｒｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｃｅｌｌ（Ｂｉｏｒａｄ社）を用いて、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ（０．４５μＭ）ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に転写した。１×ＴＢＳ＋０．２％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０中で５％の脱脂粉乳を用いて４℃で一晩膜をブロックした。
【０１０５】
膜を各Ｈ．ピロリ株（１×ＴＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０中にて１：５０希釈）で感染させたマウスの血清を用いて、室温で１時間インキュベートした。膜を１×ＴＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を用いて３回洗浄し、その後、１×ＴＢＳ＋０．１％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０中で希釈したＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃγ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ社）の１：５０００希釈を用いて室温にて１時間インキュベートした。膜を上述したように１×ＴＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を用いて洗浄し、Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−３  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ社）を用いてインキュベートした。膜をＦｕｊｉＦｉｌｍ  ＬＡＳ−３０００撮像装置を用いてバンドパターンを評価した。
【０１０６】
その結果、各細菌株には、免疫原性タンパク質の一般的なパターンがあり、そのパターン特性はわずかに変化することが示された。Ｋ６、Ｋ８、およびＫ１８の株はより強いバンドパターンを示した。それはこれらの株が生体内においてより免疫原性があり得ることを示唆しており（図１０）、以前に示した血清学データと一致している。
【実施例１３】
【０１０７】
Ｈ．ピロリ臨床分離株の遺伝子指紋法
遺伝子指紋法は細菌集団の遺伝的変異性を評価するために使用可能である。これらの指紋法は各株に対して固有の特定パターンをもたらす。１４個の形質転換性Ｋ株の遺伝子指紋を、宿主がいくつかの株の混合物で攻撃された実験条件にて産生細菌分離株を特定するために作成した。ＲＡＰＤ  ＰＣＲ分析は各Ｈ．ピロリ株を解析するための固有の遺伝子パターンを可能にする。
【０１０８】
細菌株を微好気性環境中においてコロンビア血液寒天培地上で３７℃で４８時間培養した。密集成長した寒天培地の約半分からの細菌細胞量を０．８５％の塩化ナトリウム溶液中に注意深く収集し、４０００ｇで８分間遠心分離した。上澄みを廃棄し、ペレットを１８０μｌの消化緩衝液および２０μｌのプロテイナーゼＫ中で懸濁させた。サンプルを時々ボルテックスしながら５５℃で４−１２時間インキュベートし、その後、ゲノムＤＮＡを指示書に従って、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＰｕｒｅｌｉｎｋゲノムＤＮＡミニキットを用いて精製した。
【０１０９】
ＲＡＰＤを、Ａｋｏｐｙａｎｚらの（１９９２年）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０：５１３７−５１４２に記載されているように実施した。
【０１１０】
プライマー１２５４および１２８１を使用した。プライマーはＰＳＲ反応において常時別々に使用した。
【０１１１】
１２５４（５’−ＣＣＧＣＡＧＣＣＡＡ−３’）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１
１２８１（５’−ＡＡＣＧＣＧＣＡＡＣ−３’）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２
【０１１２】
ＰＣＲ反応（５０μｌ体積）最終濃度：
−緩衝液        １００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ  ８．３
−ｄＮＴＰｓ    各２５０μＭ
−プライマー    ０．８μＭ  １２５４または１２８１のどちらか
−ＭｇＣｌ２    ３ｍＭ
−ＢＳＡ        ０．０１％（ｗ／ｖ）
−テンプレート  １０−１００  ｎｇ  ＤＮＡ（通常、５μｌの抽出ｇＤＮＡサンプル）
−Ｔａｑ        ２単位（Ｒｏｃｈｅ社の組換えＴａｑポリメラーゼ）
【０１１３】
増幅サイクル：
４サイクル［９４℃、５分；３６℃、５分；および７２℃、５分］
３０サイクル［９４℃、１分；３６℃、１分；および７２℃、２分］
７２℃で１０分
【０１１４】
ゲル電気泳動：
１０−１５μｌのＰＣＲ産物を１時間９０Ｖにて１．５％（ｗ／ｖ）のアガロースゲルを介して分離した。
【０１１５】
予想通り、両方のプライマーから、１４個の個々のＫ株の任意に増幅したゲノムＤＮＡサンプルの固有バンドパターンを得た（図１１）。ある株については、どちらかのプライマーはより特徴的なバンドパターンを形成した。ＯＮＤ２５８（Ｋ１４）およびＯＮＤ２５３（Ｋ９）は最もよく似ており、家族性株であることを示している可能性がある。表４には、ＯＮＤ特定番号に関連するＨ．ピロリ株の命名法をまとめている。
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【図１】
2012528575.tif 000007
【図２】
2012528575.tif 000008
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2012528575.tif 000012
【図７】
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【図８】
2012528575.tif 000014
【図９】
2012528575.tif 000015
【図１０】
2012528575.tif 000016
【図１１】
2012528575.tif 000017
【図１２】
2012528575.tif 000018
【配列表】
2012528575000001.app
【国際調査報告】
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2012528575.tif 000020
2012528575.tif 000021
2012528575.tif 000022
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