(57)【要約】  本発明は、イヌＦｃドメインに融合した治療用ペプチド及びタンパク質に関する。それらを使用する方法及び組成物が記載されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療用ペプチド又はタンパク質及びイヌ抗体Ｆｃドメインを含む融合タンパク質であって、ここで前記治療用ペプチド又はタンパク質は、直接又はリンカーを通してＦｃドメインと連結されており、ここで前記Ｆｃドメインは、イヌＩｇＧＡ、イヌＩｇＧＢ、イヌＩｇＧＣ及びイヌＩｇＧＤからなる群から選択されるイヌＩｇＧのヒンジ領域からなる群から選択される配列を有するヒンジ領域を含む、融合タンパク質。
【請求項２】
前記融合タンパク質が以下の式を含む、請求項１に記載の融合タンパク質：
Ｘ−Ｌａ−Ｆ：Ｆ−Ｌａ−Ｘ又はＸ−Ｌａ−Ｆ：Ｆ、であって、式中、
Ｘは、治療用ペプチド又はタンパク質であり；
Ｌは、ａ個のアミノ酸残基を含むリンカーであり；ａは少なくとも０である整数であり；
「：」は、化学会合又は架橋であり；かつ
Ｆは、ＦｃＲｎ結合部位を含むイヌ免疫グロブリンＦｃドメインの少なくとも一部分であり、かつイヌＩｇＧＡ、イヌＩｇＧＢ、イヌＩｇＧＣ及びイヌＩｇＧＤから選択されるヒンジ領域を含む。
【請求項３】
前記ヒンジ領域が、ＣＴＤＴＰＰＣＰ（配列番号１８）；ＣＰＫＣＰ（配列番号１９）；ＦＮＥＣＲＣＴＤＴＰＰＣＰ（配列番号２０）；ＰＫＲＥＮＧＲＶＰＲＰＰＤＣＰＫＣＰ（配列番号２１）；ＡＫＥＣＥＣＫＣＮＣＮＮＣＰＣＰＧＣＧＬ（配列番号２２）；及びＰＫＥＳＴＣＫＣＩＳＰＣＰ（配列番号２３）からなる群から選択される配列を含む、請求項１又は請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記治療用ペプチドが、ＡＮＰ、ＢＮＰ、ウロジラチン、ＤＮＰ又は生物学的に活性なそれらの配列改変体からなる群から選択されるナトリウム利尿（ｎａｔｉｕｒｅｔｉｃ）ペプチドである、請求項１又は２のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記治療用ペプチドが、ＡＮＰ又はＢＮＰである、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記融合タンパク質が、少なくとも２つの治療用ペプチドを含む、請求項１のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
両治療用ペプチドが同一である、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
少なくとも１つのペプチドがナトリウム利尿（ｎａｔｉｕｒｅｔｉｃ）ペプチドである、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
該ナトリウムペプチドが、配列番号８の配列を含む、請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
前記融合タンパク質が、少なくとも２つのＦｃドメインを含む、請求項１又は２のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
前記リンカーが、６アミノ酸長、１１アミノ酸長、１６アミノ酸長又は２０アミノ酸長である、請求項１又は２のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
前記リンカーが、６〜１１アミノ酸長、１１〜１６アミノ酸長、１６〜２０アミノ酸長、１６〜２５アミノ酸長又は２０〜３０アミノ酸長である、請求項１又は２のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
前記リンカーが、コハク酸グリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ  ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）リンカー、アミノ酸リンカー又はそれらの組合せである、請求項１又は２のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
前記アミノ酸リンカーが、ＧｌｙＧｌｙ（Ｌ２）、Ｇｌｙ（ＳｅｒＧｌｙＧｌｙ）２ＳｅｒＧｌｙ（Ｌ３）（配列番号１３）、（ＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）３ＧｌｙＧｌｙ（Ｌ４）（配列番号１４）、（ＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）４ＧｌｙＧｌｙ（配列番号１５）、（ＧｌｙＳｅｒＧｌｙ）５Ｇｌｙ（Ｌ５ａ）（配列番号１６）、（ＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）５Ｇｌｙ（Ｌ５）（配列番号１７）、又は（ＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）６ＧｌｙＧｌｙ（Ｌ６）（配列番号１２）である、請求項１又は２のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
ＣＴＤＴＰＰＣＰ；ＣＰＫＣＰ（配列番号１９）；ＦＮＥＣＲＣＴＤＴＰＰＣＰ（配列番号２０）；ＰＫＲＥＮＧＲＶＰＲＰＰＤＣＰＫＣＰ（配列番号２１）；ＡＫＥＣＥＣＫＣＮＣＮＮＣＰＣＰＧＣＧＬ（配列番号２２）；及びＰＫＥＳＴＣＫＣＩＳＰＣＰ（配列番号２３）からなる群から選択されるヒンジ配列を含むイヌ抗体Ｆｃドメインによって互いから分離されている少なくとも１つ以上の治療用ペプチドを含む融合タンパク質であって、該治療用ペプチドが、直接又はリンカーを通してＦｃドメインと結合体化されている、融合タンパク質。
【請求項１６】
前記融合タンパク質が以下の式を含む、請求項１５に記載の融合タンパク質：
Ｘ−Ｌａ−Ｆ：Ｆ−Ｌａ−Ｘであって、式中、
Ｘは、１つ以上の治療用ペプチド又はタンパク質であり；
Ｌは、アミノ酸残基を含むリンカーであり；ａは少なくとも０である整数であり；
「：」は、化学会合又は架橋であり；かつ
Ｆは、ＦｃＲｎ結合部位を含む免疫グロブリンＦｃドメインの少なくとも一部分である。
【請求項１７】
前記治療用ペプチドの少なくとも１つが、配列番号８の配列を有する、請求項１６に記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
Ｘが１つより多くのナトリウム利尿ペプチドである、請求項１６に記載の融合タンパク質。
【請求項１９】
配列番号２、配列番号３；配列番号５又は配列番号６の配列を有する、単離された融合タンパク質。
【請求項２０】
配列番号２、配列番号３、配列番号５及び配列番号６からなる群から選択される配列を有するポリペプチドと少なくとも９９％の配列同一性を示す、単離された融合タンパク質。
【請求項２１】
配列番号２、配列番号３、配列番号５及び配列番号６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコード化する、単離された核酸分子。
【請求項２２】
配列番号１及び配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコード化する、単離された核酸分子。
【請求項２３】
該融合タンパク質が、ほ乳動物発現系、原核生物発現系、酵母発現系、植物発現系、又はトランスジェニック発現系を用いることによって組換え生産される、請求項１、２、又は１６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項２４】
請求項１、２、又は１６のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含む、医薬組成物。
【請求項２５】
前記融合タンパク質が、静脈内、皮下又は経口投与に適合されている、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記融合タンパク質が、静脈内投与に適合されている、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
過剰レベルの細胞外液によって特徴付けられる状態の処置又は改善方法であって、前記方法が、請求項２４に記載の医薬組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項２８】
ＮＰＲＡ受容体の活性化が治療効果を与える病的状態の処置又は改善方法であって、請求項２４に記載の医薬組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項２９】
異常な利尿（ｄｉｒｕｒｅｔｉｃ）、ナトリウム利尿及び血管拡張作用に関連する疾患の処置又は改善方法であって、請求項２４に記載の医薬組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項３０】
ナトリウム利尿（ｎａｔｕｒｅｓｉｓ）、利尿、血管拡張を誘導するか又はレニン−アンギオテンシンＩＩ及びアルドステロン系を調節することが望ましい疾患の処置又は改善方法であって、請求項２４に記載の医薬組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項３１】
慢性心不全（非虚血性）、再灌流障害、左心室機能不全（ＬＶＤ）、心線維化（ｃａｒｄｉａｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、拡張期心不全、及び肥大型心筋症からなる群から選択される心血管系の病的状態の処置又は改善方法であって、請求項２４に記載の医薬組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項３２】
高血圧症、肺高血圧症、収縮期高血圧症及び抵抗性高血圧症からなる群から選択される高血圧性疾患の処置又は改善方法であって、請求項２４に記載の医薬組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項３３】
糖尿病性腎症の処置又は改善方法であって、請求項２４に記載の医薬組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イヌ抗体Ｆｃドメインに融合した治療用ペプチド及びタンパク質に関する。それらの使用方法及びそれらを使用する組成物が記載されている。
【背景技術】
【０００２】
Ｆｃ融合タンパク質の使用は現在では、所定の治療薬のｉｎ  ｖｉｖｏにおける半減期を増大させるための一般的な様式である。ヒトは、４つのヒトＩｇＧサブクラス（すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４）を有することが理解されており、これらの各ＩｇＧのＦｃドメインは、潜在的な治療用タンパク質の一部として、多様に用いられてきた。抗体「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域（ネイティブ配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列改変体Ｆｃ領域）に起因し得る生物学的活性である。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合；補体依存性細胞傷害；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；ファゴサイトーシス；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）の下方制御、等が挙げられる。
【０００３】
抗体のこれらのエフェクター機能は、ネイティブなＩｇＧサブクラスに依存して、変動する傾向がある。例えば、ＩｇＧは、ヒトＦｃドメインへのＡＤＣＣ毒性応答は、ＩｇＧの特定のサブクラスに依存して変動することが知られている。例えば、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３は、ＩｇＧ２よりもはるかに大きいＡＤＣＣ応答を誘導することが知られており、ＩｇＧ４は、ＩｇＧ２に基づいた治療方法よりも低いＡＤＣＣ応答を有する。Ｆｃ融合物からのＡＤＣＣ毒性応答を最小化することが望ましいことが認識されている。
【０００４】
イヌ、ヒト及びマウスＩｇＧγ鎖の定常領域の系統樹を比較した場合、種内のサブクラスの定常領域においては有意な配列相同性があるものの、種間で定常領域を比較した場合には、相同性は極めて低いことが容易に明らかとなる（非特許文献１；その中の図４を参照のこと）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｔｅｎｇら．Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈ．８０  ２００１，２５９−２７０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
Ｆｃドメインが重要なエフェクター機能を有することを考慮すれば、Ｆｃ融合物に基づいた治療用タンパク質の所定の治療効果が、融合タンパク質のＦｃ部分とは対照的に、治療用タンパク質に起因し得ることを決定することが重要である。動物において試験される薬剤については、応答がモニタリングされている種のＩｇＧに由来するＦｃ部分に基づいた、融合タンパク質応答を特徴付けることが有益となるだろう。これは特に、治療薬が、治験において試験されている場合及び投与計画のために試験されている場合に重要である。この点については、イヌにおける所定の治療用組成物の試験及び処置のために使用され得る具体的なＦｃドメインを作成する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本明細書中に記載される発明は、治療用ペプチド又はタンパク質及びイヌ抗体Ｆｃドメインを含む融合タンパク質であって、ここで前記治療用ペプチド又はタンパク質が、直接又はリンカーを通してＦｃドメインと連結されており、ここで前記Ｆｃドメインが、イヌＩｇＧＡ、イヌＩｇＧＢ、イヌＩｇＧＣ及びイヌＩｇＧＤからなる群から選択されるイヌＩｇＧのヒンジ領域からなる群から選択される配列を有するヒンジ領域を含む、融合タンパク質に関する。
【０００８】
好ましくは、前記融合タンパク質は以下の式：Ｘ−Ｌａ−Ｆ：Ｆ−Ｌａ−Ｘ又はＸ−Ｌａ−Ｆ：Ｆ、を含む、請求項１に記載の融合タンパク質：ここで
【０００９】
Ｘは、治療用ペプチドであり；Ｌは、ａ個のアミノ酸残基を含むリンカーであり；ａは少なくとも０である整数であり；「：」は、化学会合又は架橋であり；かつＦは、ＦｃＲｎ結合部位を含むイヌ免疫グロブリンＦｃドメインの少なくとも一部分であり、かつイヌＩｇＧＡ、イヌＩｇＧＢ、イヌＩｇＧＣ及びイヌＩｇＧＤから選択されるヒンジ領域を含む。
【００１０】
具体的な実施態様において、前記イヌヒンジ領域は、ＣＴＤＴＰＰＣＰ（配列番号１８）；ＣＰＫＣＰ（配列番号１９）；ＦＮＥＣＲＣＴＤＴＰＰＣＰ（配列番号２０）；ＰＫＲＥＮＧＲＶＰＲＰＰＤＣＰＫＣＰ（配列番号２１）；ＡＫＥＣＥＣＫＣＮＣＮＮＣＰＣＰＧＣＧＬ（配列番号２２）；及びＰＫＥＳＴＣＫＣＩＳＰＣＰ（配列番号２３）からなる群から選択される配列を含む。
【００１１】
前記治療用タンパク質は、Ｆｃ融合コンストラクトとして送達されるべきである任意の治療用タンパク質であり得、例証的な実施態様では、ＡＮＰ、ＢＮＰ、ウロジラチン、ＤＮＰ又は生物学的に活性なそれらの配列改変体からなる群から選択されるナトリウム利尿（ｎａｔｉｕｒｅｔｉｃ）ペプチドである治療用ペプチドが意図される。具体的な実施態様は、治療用ペプチドを、ＡＮＰ又はＢＮＰとして記載している。前記融合タンパク質は、少なくとも２つの治療用ペプチドを含み得る。両ペプチドは、同一であってもよく、又は異なるペプチドであってもよい。具体的な例において、少なくとも１つのペプチドは、ナトリウム利尿（ｎａｔｉｕｒｅｔｉｃ）ペプチドであり、好ましくは、配列番号８の配列を有する。
【００１２】
具体的な実施態様において、前記融合タンパク質は、少なくとも２つのＦｃドメインを含む。前記Ｆｃドメインは、イヌＩｇＧＡ、ＩｇＧＢ、ＩｇＧＣ又はＩｇＧＤ由来である。前記２つのＦｃドメインは、両方とも同一のサブクラスのＩｇＧ由来であってもよく、又は異なるサブクラス由来であってもよい。したがって、第一Ｆｃドメインは、ＩｇＧＡ、ＩｇＧＢ、ＩｇＧＣ又はＩｇＧＤ由来であり得、第二Ｆｃドメインは独立して、ＩｇＧＡ、ＩｇＧＢ、ＩｇＧＣ又はＩｇＧＤから選択され、それは好ましくは第一Ｆｃドメインと同一であるが、異なっていてもよい。
【００１３】
発明の融合物における前記リンカーは、任意の長さであり得、それは好ましくは６アミノ酸長、１１アミノ酸長、１６アミノ酸長又は２０アミノ酸長である。他の実施態様は、６〜１１アミノ酸長、１１〜１６アミノ酸長、１６〜２０アミノ酸長、１６〜２５アミノ酸長又は２０〜３０アミノ酸長であるリンカーを意図する。具体的な実施態様は、コハク酸グリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ  ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）リンカー、アミノ酸リンカー又はそれらの組合せであるリンカーを意図する。
【００１４】
前記アミノ酸アミノ酸リンカーは、ＧｌｙＧｌｙ（Ｌ２）、Ｇｌｙ（ＳｅｒＧｌｙＧｌｙ）２ＳｅｒＧｌｙ（Ｌ３）（配列番号１３）、（ＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）３ＧｌｙＧｌｙ（Ｌ４）（配列番号１４）、（ＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）４ＧｌｙＧｌｙ（配列番号１５）、（ＧｌｙＳｅｒＧｌｙ）５Ｇｌｙ（Ｌ５ａ）（配列番号１６）、（ＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）５Ｇｌｙ（Ｌ５）（配列番号１７）、又は（ＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）６ＧｌｙＧｌｙ（Ｌ６）（配列番号１２）であり得る。
【００１５】
ＣＴＤＴＰＰＣＰ（配列番号１８）；ＣＰＫＣＰ（配列番号１９）；ＦＮＥＣＲＣＴＤＴＰＰＣＰ（配列番号２０）；ＰＫＲＥＮＧＲＶＰＲＰＰＤＣＰＫＣＰ（配列番号２１）；ＡＫＥＣＥＣＫＣＮＣＮＮＣＰＣＰＧＣＧＬ（配列番号２２）；及びＰＫＥＳＴＣＫＣＩＳＰＣＰ（配列番号２３）からなる群から選択されるヒンジ配列を含むイヌ抗体Ｆｃドメインによって互いから分離されている少なくとも１つ以上の治療用ペプチド（配列番号８の配列を有するぺプチド等）を含む融合タンパク質であって、ここで該治療用ペプチドが、直接又はリンカーを通してＦｃドメインと結合体化されている融合タンパク質もまた意図される。前記融合タンパク質は好ましくは、式：
【００１６】
Ｘ−Ｌａ−Ｆ：Ｆ−Ｌａ−Ｘであって、式中、
【００１７】
Ｘは、１つ以上の治療用ペプチドであり；
【００１８】
Ｌは、アミノ酸残基を含むリンカーであり；ａは少なくとも０である整数であり；
【００１９】
「：」は、化学会合又は架橋であり；かつ
【００２０】
Ｆは、ＦｃＲｎ結合部位並びにＣＴＤＴＰＰＣＰ（配列番号１８）；ＣＰＫＣＰ（配列番号１９）；ＦＮＥＣＲＣＴＤＴＰＰＣＰ（配列番号２０）；ＰＫＲＥＮＧＲＶＰＲＰＰＤＣＰＫＣＰ（配列番号２１）；ＡＫＥＣＥＣＫＣＮＣＮＮＣＰＣＰＧＣＧＬ（配列番号２２）；及びＰＫＥＳＴＣＫＣＩＳＰＣＰ（配列番号２３）からなる群から選択されるヒンジ領域を含む免疫グロブリンＦｃドメインの少なくとも一部分である。具体的な例において、治療用ペプチドの少なくとも１つは、配列番号８の配列を有する。具体的な実施態様において、Ｘは、１つより多くのナトリウム利尿ペプチドである。
【００２１】
配列番号２、配列番号３；配列番号５又は配列番号６の配列を有する、単離された融合タンパク質、及びそれを含む組成物もまた意図される。
【００２２】
別の実施態様は、配列番号２、配列番号３、配列番号５及び配列番号６からなる群から選択される配列を有するポリペプチドと少なくとも９９％の配列同一性を示す、単離された融合タンパク質を意図する。
【００２３】
さらなる実施態様は、配列番号２、配列番号３、配列番号５及び配列番号６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコード化する、単離された核酸分子を意図する。
【００２４】
またさらなる実施態様は、配列番号１及び配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコード化する、単離された核酸分子を意図する。
【００２５】
本明細書中に記載される融合タンパク質は、ほ乳動物発現系、原核生物発現系、酵母発現系、植物発現系、又はトランスジェニック発現系を用いることによって組換え生産され得る。
【００２６】
本発明の前記融合タンパク質を含む、医薬組成物が意図される。前記医薬組成物は好ましくは、静脈内、皮下又は経口投与に適合されている。
【００２７】
種々の状態の処置における組成物の使用方法もまた意図され、それは、過剰レベルの細胞外液によって特徴付けられる状態の処置又は改善；ＮＰＲＡ受容体の活性化が治療効果を与える病的状態の処置又は改善；異常な利尿（ｄｉｒｕｒｅｔｉｃ）、ナトリウム利尿及び血管拡張作用に関連する疾患の処置又は改善；ナトリウム利尿（ｎａｔｕｒｅｓｉｓ）、利尿、血管拡張を誘導するか又はレニン−アンギオテンシンＩＩ及びアルドステロン系を調節することが望ましい疾患の処置又は改善；慢性心不全（非虚血性）、再灌流障害、左心室機能不全（ＬＶＤ）、心線維化（ｃａｒｄｉａｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、拡張期心不全、及び肥大型心筋症からなる群から選択される心血管系の病的状態の処置又は改善；高血圧症、肺高血圧症、収縮期高血圧症及び抵抗性高血圧症からなる群から選択される高血圧性疾患の処置又は改善；並びに糖尿病性腎症の処置又は改善を含み、ここでそのような方法は、本明細書中に記載される医薬組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】組換えイヌＡＮＰ−Ｆｃ融合タンパク質のＤＮＡ及びタンパク質配列。マウスＩｇＧκ軽鎖シグナル配列は、ボールド体である。これは、切断して外され、最終産物上にはない。ＣａＡＮＰ２８には下線がひかれている。（ＧＧＳ）６ＧＧリンカーは、イタリック体にしてある。
【図２】イヌＡＮＰ−Ｆｃ融合物の、Ａ）ベクターマップ及びＢ）タンパク質マップ例。
【図３】イヌＡＮＰ−Ｆｃ融合タンパク質ｃＧＭＰ誘導アッセイの用量応答曲線。実線はＡＮＰであり、破線はイヌＡＮＰ−Ｆｃ融合物である。
【図４】覚醒イヌにおける血漿ＡＮＰ−ｃａＦｃレベルに対する、静脈内及び皮下ＡＮＰ−ｃａＦｃ投与の効果。
【図５】覚醒イヌにおける血漿ｃＧＭＰレベルに対する、静脈内及び皮下ＡＮＰ−ｃａＦｃ投与の効果。
【図６】研究番号１において、覚醒遠隔測定用ビーグルにおける血漿ｃＧＭＰレベルに対する皮下ＡＮＰ−ｃａＦｃ投与の効果。
【図７Ａ】図７Ａは、研究番号１における覚醒遠隔測定用ビーグルにおいて、投薬後第１日目における、絶対平均動脈圧に対する皮下ＡＮＰ−ｃａＦｃ投与の効果を示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、投薬後第１〜４日目にわたる平均動脈圧（ＭＡＰ）における絶対的相違を示す。ＡＮＰｃａ−Ｆｃは、覚醒イヌにおける平均動脈血圧を、用量依存的に降下させた。血液試料が、第１日目に取得された場合（↑）、ＭＡＰは予想通りに、覚醒イヌにおいて上昇した。
【図８Ａ】図８Ａは、研究番号１における覚醒遠隔測定用ビーグルにおいて、投薬後第１日目における、絶対心拍数（ＨＲ）に対する皮下ＡＮＰ−ｃａＦｃ投与の効果を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、投薬後第１〜４日目にわたるＨＲにおける絶対的相違を示す。ＡＮＰ−ｃａＦｃは、覚醒イヌにおけるＨＲを、用量依存的に増加させた。血液試料が、第１日目に取得された場合（↑）、ＨＲは予想通りに、覚醒イヌにおいて増加した。
【図９】研究番号２における覚醒遠隔測定用ビーグルにおける、循環ｃＧＭＰレベルに対する皮下ＡＮＰ−ｃａＦｃ投与の効果。
【図１０Ａ】図１０Ａは、研究番号２における覚醒遠隔測定用ビーグルにおいて、投薬後第１日目における、絶対平均動脈圧に対する皮下ＡＮＰ−ｃａＦｃ投与の効果を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ａは、投薬後第１〜４日目にわたる平均動脈圧（ＭＡＰ）における絶対的相違を示す。ＡＮＰｃａ−Ｆｃは、覚醒イヌにおける平均動脈血圧を、用量依存的に降下させた。血液試料が、第１日目に取得された場合（↑）、ＭＡＰは予想通りに、覚醒イヌにおいて上昇した。
【図１１Ａ】図１１Ａは、研究番号２における覚醒遠隔測定用ビーグルにおいて、投薬後第１日目における、絶対心拍数（ＨＲ）に対する皮下ＡＮＰ−ｃａＦｃ投与の効果を示す。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、投薬後第１〜４日目にわたるＨＲにおける絶対的相違を示す。血液試料が、第１日目に取得された場合（↑）、ＨＲは予想通りに、覚醒イヌにおいて増加した。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本開示は具体的には、直接か又はリンカーを通してのいずれかでイヌ抗体Ｆｃドメインと連結されている治療用ペプチド又はタンパク質を含む融合タンパク質の、製造及び使用方法、並びに融合タンパク質を製造及び使用するための組成物に関する。治療用ペプチド及び融合タンパク質のＦｃ領域は、融合タンパク質の効力に貢献する２つの別個の生物学的役割を果たす。驚くべきことに、リンカー長もまた、融合タンパク質の効力に影響する。本明細書中に記載される融合タンパク質は、イヌにおける薬物の治療効力の指標を提供し、他の動物における処置の効力を予測するために有用であるだろう。あるいは、発明の融合タンパク質はまた、イヌの処置のための獣医学療法において有用であり得る。
【００３０】
イヌ抗体Ｆｃドメインによって互いから分離されている少なくとも２つの治療用ペプチド又はタンパク質を含む融合タンパク質もまた提供され、ここで治療用ペプチド又はタンパク質は、直接又はリンカーを通して、イヌ抗体Ｆｃドメインと結合体化されている。イヌＦｃドメインが、イヌＩｇＧのヒンジ領域を含むことが、本発明の重要な特徴である。ヒンジ領域は、残りのイヌＦｃドメインと同一のＩｇＧサブクラス由来であってもよく、あるいは、ヒンジ領域は、Ｆｃ部分の残りが由来するＩｇＧとは異なるイヌＩｇＧ由来であってもよい。本発明において使用されるイヌＦｃヒンジ配列の具体的な配列例としては：
【００３１】
ＣＴＤＴＰＰＣＰ（配列番号１８；イヌＩｇＧＡ由来のヒンジ）；ＣＰＫＣＰ（配列番号１９；イヌＩｇＧＢ由来のヒンジ）；ＦＮＥＣＲＣＴＤＴＰＰＣＰ（配列番号２０；イヌＩｇＧＡ由来のヒンジ）；ＰＫＲＥＮＧＲＶＰＲＰＰＤＣＰＫＣＰ（配列番号２１；イヌＩｇＧＢ由来のヒンジ）；ＡＫＥＣＥＣＫＣＮＣＮＮＣＰＣＰＧＣＧＬ（配列番号２２；イヌＩｇＧＣ由来のヒンジ）；及びＰＫＥＳＴＣＫＣＩＳＰＣＰ（配列番号２３；イヌＩｇＧＤ由来のヒンジ）が挙げられる。
【００３２】
具体的な実施態様において、治療用ペプチド又はタンパク質はナトリウム利尿ぺプチド又はタンパク質であり、これは、イヌナトリウム利尿ぺプチドもしくはタンパク質又は別の種由来のナトリウム利尿ぺプチドもしくはタンパク質であり得る。
【００３３】
ＮＰＲＡ受容体の活性化が、対象に治療効果を与える病的状態（異常な利尿、イヌナトリウム利尿及び血管拡張作用に関連する疾患を含むが、それらに限定されない）の処置又は改善を含む用途のための、本発明の治療用融合タンパク質をコード化する核酸分子、及びイヌナトリウム利尿融合タンパク質をコード化するポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターもまた本明細書中に提供される。発明の融合タンパク質又は核酸分子は、医薬的に許容可能な添加剤、担体又は希釈剤を含む組成物中に存在し得る。
【００３４】
一態様において、本発明は、コハク酸グリシンリンカーによってＦｃドメインに結合された１つ以上の治療用ペプチドを含む融合タンパク質に関する。本明細書中に意図されるように、治療用ペプチドとイヌＦｃドメインとを連結するためにコハク酸グリシンリンカーが使用される場合、リンカーのグリシン残基がＦｃドメインのＮ末端に連結され、コハク酸部分（ｍｏｅｉｔｙ）が治療用ペプチドのＣ末端並びに／又は種々の長さ及び配列のアミノ酸リンカーに連結されている。リンカーに関して、治療用ペプチドの持続された効力を達成するために、前記長さ及び組成が必要である。本明細書中で意図されるように、治療用ペプチドは、異なる配向でＦｃドメインに連結され得る。１つの配向において、ペプチドのＣ末端は、ＦｃドメインのＮ末端に連結されており、別の配向においては、ペプチドのＮ末端が、ＦｃドメインのＮ末端に連結されている。Ｆｃドメインは、ヒンジ、ＩｇＧ分子のＣＨ２及びＣＨ３領域のホモ二量体として存在し、ここでＦｃドメインはＩｇＧヒンジ領域内の一番目のＮ末端システイン残基で開始し、ホモ二量体は、ヒンジ中のシステイン残基からの２つのジスルフィド結合によって、結びつけられている。
【００３５】
さらなる態様において、発明は、医薬的に許容可能な添加剤、担体又は希釈剤、及び本明細書中に記載される任意の融合ペプチドを含む医薬組成物又は処方物を含む。
【００３６】
追加の態様において、発明はまた、本明細書中に開示される融合タンパク質をコード化する核酸分子及び当該タンパク質を発現する発現ベクターに関する。
【００３７】
別の態様において、発明は、異常な利尿（ｄｉｒｕｒｅｔｉｃ）、イヌナトリウム利尿及び血管拡張作用に関連する疾患並びに／又はナトリウム利尿（ｎａｔｕｒｅｓｉｓ）、利尿、血管拡張を誘導するかもしくはレニン−アンギオテンシンＩＩ及びアルドステロン系を調節することが望ましい疾患を含むがそれらに限定されない、ＮＰＲＡ受容体の活性化が対象に治療効果を与える病的状態の処置又は改善方法に関する。これらの状態としては、過剰な細胞外液によって特徴付けられ得る状態が挙げられ、肺水腫を含むが、それに限定されない。特に好ましい実施態様において、発明は、慢性心不全（非虚血性）、心筋梗塞後心不全（虚血性ＣＨＦ）、急性心筋梗塞、再灌流障害、左心室機能不全（ＬＶＤ）、心線維化、拡張期心不全、及び肥大型心筋症を含むが、それらに限定されない心血管系の病的状態の処置又は改善方法を含む。さらに、例えば、肺高血圧症、収縮期高血圧症、抵抗性高血圧症等の高血圧症を含むがそれに限定されない高血圧性疾患、及び糖尿病性腎症等の他の心血管関連疾患が、本発明の方法によって処置又は改善され得る。本発明の融合タンパク質及び医薬組成物が、冠動脈バイパス手術（ＣＡＢＧ）を受けている対象に、治療効果を提供し得ることもまた、本明細書中に意図される。
【００３８】
発明が、上に提供された任意の病的状態の処置又は改善のための薬の製造における本発明の融合タンパク質の使用を含むこともまた、本明細書中に意図される。
【００３９】
いくつかの実施態様において、融合タンパク質は、以下の式を含む：
Ｘ−Ｌａ−Ｆ：Ｆ−Ｌａ−Ｘ又はＸ−Ｌａ−Ｆ：Ｆであって、式中、
Ｘは、例えば、配列ＳＬＲＲＳＳＣＦＧＧＲＭＤＲＩＧＡＱＳＧＬＧＣＮＳＦＲＹ（配列番号８）を有するイヌナトリウム利尿ペプチド等のタンパク質の治療用ペプチドであり；
【００４０】
Ｌは、「ａ」個のアミノ酸残基を含むリンカーであり；ａは、少なくとも０である整数であり；「：」は、化学会合又は架橋であり；かつＦは、ＦｃＲｎ結合部位を含む免疫グロブリンＦｃドメインの少なくとも一部分である。好ましくは、Ｆｃドメインは、ＣＴＤＴＰＰＣＰＶＰＥＰＬＧＧＰＳＶＬＩＦＰＰＫＰＫＤＩＬＲＩＴＲＴＰＥＶＴＣＶＶＬＤＬＧＲＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＥＶＨＴＡＫＴＱＳＲＥＱＱＦＮＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＥＨＱＤＷＬＴＧＫＥＦＫＣＲＶＮＨＩＤＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＲＡＨＫＰＳＶＹＶＬＰＰＳＰＫＥＬＳＳＳＤＴＶＳＩＴＣＬＩＫＤＦＹＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＲＫＨＲＭＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＱＧＤＰＦＴＣＡＶＭＨＥＴＬＱＮＨＹＴＤＬＳＬＳＨＳＰＧＫ（配列番号９）の配列を有するか、又はＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＮＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧＫ（配列番号１０）の配列を有する。
【００４１】
いくつかの実施態様において、融合タンパク質は、以下の式を含む：
Ｘ−Ｌａ−Ｆ：Ｆ−Ｌａ−Ｘ、式中、Ｘは、１つ以上の治療用ペプチドであり、ここで少なくともイヌナトリウム利尿ペプチド上は配列番号８の配列を有し；Ｌは、アミノ酸残基を含むリンカーであり；ａは、少なくとも０である整数であり；「：」は、化学会合又は架橋であり；かつＦは、（好ましくは、配列番号９又は１０の配列を有する）ＦｃＲｎ結合部位を含む免疫グロブリンＦｃドメインの少なくとも一部分である。大多数のイヌナトリウム利尿ペプチドは、実際には配列番号８の配列の複数のコピー（即ち、Ｘ＝（配列番号８）ｎ：式中、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０以上の整数である）であり得ることが意図される。さらに、Ｘは、複数で存在する配列番号１０の断片（即ち、Ｘ＝（配列番号１０の断片）ｎ）であり得る。
【００４２】
いくつかの実施態様において、治療用ペプチドは、ＡＮＰ、ＢＮＰ、ウロジラチン、ＤＮＰ又は生物学的に活性なそれらの配列改変体からなる群から選択される。いくつかの実施態様において、イヌナトリウム利尿ペプチドは、ＡＮＰ又はＢＮＰである。
【００４３】
いくつかの実施態様において、融合タンパク質は、少なくとも２つの治療用ペプチドを含む。いくつかの実施態様において、Ｘは、１つより多いイヌナトリウム利尿ペプチドであり得る。いくつかの実施態様において、両イヌナトリウム利尿ペプチドは、ＡＮＰである。いくつかの実施態様において、両イヌナトリウム利尿ペプチドは、ＢＮＰである。
【００４４】
一定の実施態様において、化学会合、即ち（：）、は共有結合である。他の実施態様において、化学会合、即ち（：）、は非共有結合性の相互作用、例えば、イオン性相互作用、疎水性相互作用、親水性相互作用、ファンデルワールス相互作用又は水素結合、である。
【００４５】
いくつかの実施態様において、融合タンパク質は、少なくとも２つのＦｃドメインを含む。
【００４６】
いくつかの実施態様において、リンカーは、少なくとも２、４、６、９、１１、１６又は２０アミノ酸長である。他の実施態様において、リンカーは、少なくとも０、１、５、７、８、１０、１２、１３、１４、１５、１７、１８、１９、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０アミノ酸であるが、随意にそれよりも長くてもよく、例えば、３０と４０との間のアミノ酸長又は４０と５０との間のアミノ酸長であり得る。いくつかの実施態様において、リンカーは、６〜１１アミノ酸長、１１〜１６アミノ酸長、９〜２０アミノ酸長、１６〜２０アミノ酸長、１６〜２５アミノ酸長、２０〜３０アミノ酸長、２５〜３５アミノ酸長、３０〜５０アミノ酸長、３０〜４０アミノ酸長又は３５〜４５アミノ酸長から選択される。いくつかの実施態様において、リンカーは、１０より長い、１５より長い、２０より長い、２５より長い、又は３０より長いアミノ酸長である。いくつかの実施態様において、リンカーは、コハク酸グリシンリンカー（Ｌ１）、アミノ酸リンカー又はそれらの組合わせから選択される。いくつかの実施態様において、アミノ酸リンカーは、ＧｌｙＧｌｙ（Ｌ２）、Ｇｌｙ（ＳｅｒＧｌｙＧｌｙ）２ＳｅｒＧｌｙ（Ｌ３）、（ＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）３ＧｌｙＧｌｙ（Ｌ４）、（ＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）４ＧｌｙＧｌｙ、（ＧｌｙＳｅｒＧｌｙ）５Ｇｌｙ（Ｌ５ａ）、（ＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）５Ｇｌｙ（Ｌ５）又は（ＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）６ＧｌｙＧｌｙ（Ｌ６）である。
【００４７】
いくつかの実施態様において、融合タンパク質は、対応する野生型治療用ペプチド又はタンパク質よりも、タンパク質分解に耐性である。いくつかの実施態様において、融合タンパク質は、対応する野生型治療用ペプチド又はタンパク質よりも長い半減期を示す。いくつかの実施態様において、融合タンパク質は、組換え技術、合成化学又は半合成化学によって作られる。
【００４８】
具体的な実施態様において、本開示は、それぞれ配列番号３及び配列番号６の最終的にプロセシングされたタンパク質配列を有する、配列番号２又は５の任意の１つ（それぞれ、配列番号３３〜３６によってコードされる）を含む、イヌナトリウム利尿融合タンパク質を提供する。配列番号２及び配列番号４において示される配列は、切断して外され、最終産物上には存在しない、ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ（配列番号７）のマウスＩｇＧκ軽鎖シグナル配列を含む。
【００４９】
本開示は、本明細書中に記載されているような、イヌナトリウム利尿融合タンパク質を含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施態様において、融合タンパク質は、静脈内、皮下又は経口投与に適合されている。
【００５０】
本開示は、配列番号２、配列番号３、配列番号５及び配列番号６からなる群から選択されるポリペプチドをコード化する単離された核酸分子を提供する。本開示はまた、配列番号１及び配列番号４からなる群から選択されるポリペプチドをコード化する単離された核酸分子を提供する。いくつかの実施態様において、融合タンパク質は、ほ乳動物発現系、原核生物発現系、酵母発現系、植物発現系、又はトランスジェニック発現系を用いることによって組換え生産される。
【００５１】
本開示は、本明細書中に記載されているようなイヌＦｃヒンジ領域を含むイヌＦｃドメインに連結された治療用融合ペプチドを１つ以上含む医薬組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に投与することによる、過剰レベルの細胞外液によって特徴付けられる状態の処置又は改善方法を提供する。
【００５２】
ペプチドがナトリウム利尿（ｎａｔｉｕｒｅｔｉｃ）ペプチドである実施態様において、本開示は、本明細書中に記載されているようなイヌナトリウム利尿融合ペプチドを１つ以上含む医薬組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に投与することによる、ＮＰＲＡ受容体の活性化が治療効果を与える病的状態の処置又は改善方法を提供する。
【００５３】
本開示は、本明細書中に記載されているようなイヌナトリウム利尿融合ペプチドを１つ以上含む医薬組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に投与することによる、異常な利尿（ｄｉｒｕｒｅｔｉｃ）、イヌナトリウム利尿及び血管拡張作用に関連する疾患の処置又は改善方法を提供する。
【００５４】
本開示は、本明細書中に記載されているようなイヌナトリウム利尿融合ペプチドを１つ以上含む医薬組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に投与することによる、ナトリウム利尿（ｎａｔｕｒｅｓｉｓ）、利尿、血管拡張を誘導するか又はレニン−アンギオテンシンＩＩ及びアルドステロン系を調節することが望ましい疾患の処置又は改善方法を提供する。
【００５５】
本開示は、本明細書中に記載されているようなイヌナトリウム利尿融合ペプチドを１つ以上含む医薬組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に投与することによる、慢性心不全（非虚血性）、再灌流障害、左心室機能不全（ＬＶＤ）、心線維化、拡張期心不全、及び肥大型心筋症からなる群から選択される心血管系の病的状態の処置又は改善方法を提供する。
【００５６】
本開示は、本明細書中に記載されているようなイヌナトリウム利尿融合ペプチドを１つ以上含む医薬組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に投与することによる、高血圧症、肺高血圧症、収縮期高血圧症及び抵抗性高血圧症からなる群から選択される高血圧性疾患の処置又は改善方法を提供する。
【００５７】
本開示は、本明細書中に記載されているようなイヌナトリウム利尿融合ペプチドを１つ以上含む医薬組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に投与することによる、糖尿病性腎症の処置又は改善方法を提供する。
【００５８】
Ａ．定義
他に定義されていない限り、本明細書中で使用される全ての技術的及び科学的用語は、発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書中の発明の記載において使用される用語法は、特定の実施態様を説明する目的のためのみであって、発明を限定することを意図しない。見出しは、読者の利便性のために使用されており、これもまた発明を限定することを意図しない。本明細書中で言及されている全ての出版物、特許出願、特許、及び他の文献は、参照することによりそれらの全体が本明細書中に援用され、本明細書中にそれらのブランド名で言及されている任意のブランド薬の添付文書についても同様である。
【００５９】
明細書及び本明細書中に示されている実施態様において使用されている場合、以下の用語は、示された意味を有する。
【００６０】
単数形の「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他を示していない限り、複数形もまた含むことが意図される。
【００６１】
例えば、本明細書中で「イヌナトリウム利尿融合タンパク質」として用語が使用されているように、「融合タンパク質」は、共有結合している少なくとも２つのポリペプチドを有するタンパク質をいい、ここで、１つのポリペプチドは１つのタンパク質配列又はドメインに由来し、他のポリペプチドは、別のタンパク質配列又はドメインに由来する。一般的に、融合タンパク質のポリペプチドは、直接か又は共有結合リンカーを介してのいずれかで連結され得る。用語（「リンカー」）は、ポリグリシンリンカーなどのアミノ酸リンカー、又は例えば、コハク酸グリシンリンカー、炭水化物リンカー、脂質リンカー、脂肪酸リンカー、ポリエーテルリンカー等の別のタイプの化学的リンカーをいう。リンカーは、少なくとも２、４、６、９、１１、１６又は２０アミノ酸長から構成され得る。あるいは、リンカーは、少なくとも０、１、５、７、８、１０、１２、１３、１４、１５、１７、１８、１９、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０アミノ酸から構成され得るが、随意に、それよりも長くてもよく、例えば、３０と４０との間のアミノ酸長又は４０と５０との間のアミノ酸長であり得る。アミノ酸は、例えば、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、及びリジン等の、２０個の天然に存在するアミノ酸のＤ又はＬ異性体のいずれかの中から選択される。リンカーは、グリシン及びアラニン等の、過半数の立体障害のないアミノ酸からなり得る。リンカーは、例えば、６〜１１アミノ酸長、１１〜１６アミノ酸長、１６〜２０アミノ酸長、１６〜２５アミノ酸長、２０〜３０アミノ酸長、３０〜３５アミノ酸長、３５〜４０アミノ酸長、４０〜４５アミノ酸長又は４５〜５０アミノ酸長等の、広範な長さのアミノ酸残基を含み得る。これらのアミノ酸のいくつかは、糖鎖付加されていてもよい。非ペプチドリンカーもまた、可能である。例えば、−ＮＨ−（ＣＨ２）Ｓ−Ｃ（Ｏ）−、式中＝２〜２０、等のアルキルリンカーが使用され得る。これらのアルキルリンカーはさらに、低級アルキル基（例えば、Ｃ１〜Ｃ６）低級アシル基、ハロゲン基（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ）、ＣＮ基、ＮＨ２基、フェニル基等の、任意の非立体障害基によって置換されていてもよい。例証的な非ペプチドリンカーは、リンカーが、１００〜５０００ｋＤ、好ましくは１００〜５００ｋＤの分子量を有する、ＰＥＧリンカーである。ペプチドリンカーは、改変され得、上記と同一の様式で誘導体を形成し得る。本明細書中の例において記載されているように、本発明の融合タンパク質の好ましいリンカーは、基礎的なリピート（ＧＧＳ）ｘ又は（ＧＧＳ）ｘＧＧをもつ、ひと続きのアミノ酸である。例えば、ｘは、０〜１６の整数であり得る。具体的な配向は、本明細書中に詳細に記載されているものの、融合タンパク質を形成するポリペプチドは、Ｃ末端がＮ末端に連結されていてもよく、しかしそれらはまたＣ末端がＣ末端に、Ｎ末端がＮ末端に、又はＮ末端がＣ末端に連結されていてもよく、融合タンパク質のポリペプチドは、任意の順序であり得る。本発明の融合タンパク質は、２つのペプチド融合を含有し得ることもまた、本明細書中で意図される。例えば、融合タンパク質は、２つのＦｃドメインによって隣接された１つのペプチド（例えば、Ｆｃ−イヌナトリウム利尿ペプチド−Ｆｃであって、ここでイヌナトリウム利尿ペプチドが直接又はリンカーを通してＦｃドメインと結合体化されている）を含み得る。本明細書中で意図されるように、コハク酸グリシンリンカーが使用されて、イヌナトリウム利尿ペプチドとＦｃドメインとが連結されている場合、リンカーのグリシン残基は、ＦｃドメインのＮ末端に連結されており、コハク酸部分は、イヌナトリウム利尿ペプチドのＣ末端に連結されている。
【００６２】
用語「タンパク質」は、本明細書中で、「ポリペプチド」及び「タンパク質」と互換的に使用される。
【００６３】
「核酸」は、一本鎖か又は二本鎖形態いずれかの、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド及びそれらのポリマーをいう。用語は、基準核酸と類似した結合特性を有し、かつ基準ヌクレオチドに類似した様式で代謝される、合成、天然に存在する、及び天然に存在しない、公知のヌクレオチドアナログ又は改変された骨格残基もしくは結合を含有する核酸を包含する。そのようなアナログは、当業者によく知られており、例として、ホスホロチオエート及びホスホロアミダートが挙げられる。他に示されていない限り、特定の核酸配列はまた、保存的に改変されたそれらの改変体（例えば、縮重コドン置換）及び相補的配列、並びに明示的に示されている配列を暗に包含する。本明細書中で使用される時、用語「核酸」はまた、「遺伝子」、「ｃＤＮＡ」、「ｍＲＮＡ」、「オリゴヌクレオチド」、及び「ポリヌクレオチド」として言及されていてもよい。
【００６４】
本明細書中に意図されるように、本発明の融合タンパク質を含むポリヌクレオチド配列は、融合タンパク質の各個別のポリペプチドをコード化する各々のヌクレオチド配列に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する。融合ポリペプチドの個別のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列はしたがって、保存的に改変された改変体、多形改変体、対立遺伝子、変異体、部分配列、及び種間ホモログを含む。
【００６５】
「アミノ酸」は、本明細書中では、他に特定されていない限り、任意の天然に存在する、人工の、又は合成アミノ酸であって、そのＬか又はＤ立体異性体のいずれか、として定義される。用語「残基」は、用語「アミノ酸」と互換的に使用され、しばしば所定のアミノ酸配列における特定の位置を有するように指定される。
【００６６】
「生物学的に活性」は、アゴニスト、部分アゴニスト又はアンタゴニスト等の、治療活性又は薬理活性を有する薬剤をいう。
【００６７】
本明細書中に提供される「有効量」は、望ましい治療効果を提供するための、無毒性であるが、十分な量をいう。以下に指摘される通り、必要とされる正確な量は、年齢、対象の全身状態、処置されている状態の重症度、投与される特定の生物学的に活性な薬剤等に依存して、対象によって変動する。任意の個別の症例における適切な「有効」量は、関係している文書及び文献の参照によって並びに／又は日常的な実験を使用することによって、当業者によって決定され得る。
【００６８】
本明細書中で使用するとき、用語「Ｆｃドメイン」は、「Ｙ」の基部に由来する抗体のその部分をいい、各々２つ〜３つの定常ドメイン（抗体のクラスに依存する）を与える２つの重鎖から構成される。Ｆｃ領域は、種々の細胞受容体及び補体タンパク質に結合し、抗体の異なる生理学的作用を媒介する。本明細書中で意図されるように、任意の抗体の、最小限のエフェクター機能を示すか又はエフェクター機能を示さないＦｃドメインが、本発明で使用され得る。これらとしては、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４が挙げられるが、それらに限定されず、また、当業者によく知られている方法によって、最小限のエフェクター活性を持つようにその配列が改変された任意の抗体の任意のＦｃドメインもまた含まれ得る。
【００６９】
あるいは、用語「Ｆｃドメイン」は、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含むＩｇＧ重鎖として記載され得、ここで、ＩｇＧ重鎖は、ヒンジ領域内の最初のＮ末端システイン残基で開始し、最初及び二番目のＮ末端システイン残基において、別のＦｃドメインとホモ二量体を形成する。
【００７０】
用語「Ｆｃ」はまた、融合タンパク質の部分を記載するのに使用される。この文脈において、Ｆｃは、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含むＩｇＧ重鎖であり、ＩｇＧ重鎖は、ヒンジ領域内の最初のＮ末端システイン残基で開始し、最初及び二番目のＮ末端システイン残基において、別のＦｃとホモ二量体を形成する。換言すれば、Ｆｃホモ二量体の各鎖のＮ末端アミノ酸配列は、ＩｇＧヒンジ領域のＣｙｓＰｒｏＰｒｏＣｙｓＰｒｏ（配列番号１１）で開始し、両Ｃｙｓ残基は、ジスルフィド結合している。
【００７１】
本明細書中で使用するとき、ペプチドは、それが実質的に細胞性物質を含んでいないか、又は化学的前駆体もしくは他の化学物質を含んでいない場合に、「単離された」又は「精製された」といわれる。本発明の融合タンパク質は、均質又は他の程度の純度まで、精製され得る。精製のレベルは、意図される用途に基づくだろう。決定的な特徴は、製剤が、かなりの量の他の成分の存在下であっても、ペプチドの望ましい機能を可能とすることである。
【００７２】
本明細書中でいう「イヌナトリウム利尿ペプチド」としては、ほ乳動物イヌナトリウム利尿因子（ＡＮＰ、ＢＮＰ、ＣＮＰ）、ウロジラチン及びそれらに類似したペプチド、並びにそれらのアナログ、活性断片、分解産物、塩、改変体、誘導体及び組合せが挙げられる。具体的には、イヌＡＮＰ及びＢＮＰとしては、「イヌＡＮＰ２８」及び「イヌＢＮＰ３２」が挙げられ、それらが具体的に意図される。
【００７３】
いかなる作用機序によっても限定されるものではないが、本明細書中で言及される場合、「徐放性、又は持効性処方物」の薬物動態は、ＦｃＲｎ結合及び酸性のリソソーム内から全身循環へと戻るＦｃＲｎ結合型分子の再循環によって、バイオアベイラビリティの上昇を示すこととして特徴付けられ得る（Ｖ．Ｇｈｅｔｉｅ及びＥ．Ｓ．Ｗａｒｄ，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１８，７３９−７６６，（２０００））。
【００７４】
本明細書中で使用される用語「半合成」は、本発明の融合タンパク質の合成プロセスをいい、合成化学及び組換え技術の両方の使用を含む。例えば、本明細書中で開示される融合タンパク質のＦｃドメインは、組換えで作られ得、一方で、イヌナトリウム利尿ペプチド及びリンカーは、合成的に作られ得る。
【００７５】
Ｂ．ペプチド分子
本発明は、イヌを供給源とするＩｇＧ又は他の抗体のＦｃ領域に連結した、１つ以上のイヌナトリウム利尿ペプチドから構成される新規の生物学的に活性な融合タンパク質であって、異常な利尿（ｄｉｒｕｒｅｔｉｃ）、イヌナトリウム利尿及び血管拡張作用に関連する疾患を含むが、それらに限定されない、ＮＰＲＡ受容体の活性化が対象に治療効果を与える病的状態の処置又は改善を含む用途のための、融合タンパク質に関する。本発明の融合タンパク質は、医薬的に許容可能な添加剤、担体又は希釈剤を含む組成物中に存在し得る。
【００７６】
発明は、以下の一般式Ａ又はＢのいずれか一方を有し得る、本明細書中に記載された融合タンパク質に関し、
【化１】
2012521784.tif 000002
【００７７】
式中、治療用ペプチド又はタンパク質は、
（ｉ）免疫グロブリンではないポリペプチドであり、かつ
（ｉｉ）アミノ酸配列のＮ’からＣの配向、アミノ酸配列のＣからＮ’の配向又は１つより多くの治療用ペプチドの場合、Ｎ’からＣの配向、ＣからＮ’の配向もしくはＮ’からＣ及びＣからＮ’の混合した配向であり得；かつＦｃドメインは、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含むＩｇＧ重鎖であり、ここでＩｇＧ重鎖は、ヒンジ領域内の最初のＮ末端システイン残基で開始し、最初及び二番目のＮ末端システイン残基において、別のＦｃドメインとホモ二量体を形成し、ここでＦｃドメインは、ＦＣＡＢ又はＦＣＢＡによって示され、ここでＡＢは、両ＦｃドメインのＮ’からＣの配向であり、ＢＡは、両ＦｃドメインのＣからＮ’の配向である。ＦＣ配列は好ましくは、配列番号９及び／又は配列番号１０の配列を有する。例えば、一般式Ａ又は一般式Ｂのいずれにおいても、両Ｆｃドメインは、配列番号９の配列を有し得；又は両Ｆｃドメインは、配列番号１０の配列を有し得、又はＦｃドメインの一方は配列番号９の配列を有し得、他方は配列番号１０の配列を有し得る。
【００７８】
上記の一般式の治療用タンパク質は、任意の治療用タンパク質であり得る。例えば、それは、サイトカイン、リガンド結合タンパク質、ホルモン、ニューロトロフィン、ニュートロフィン（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｎ）受容体、体重の制御因子、血清タンパク質、凝固因子、プロテアーゼ、細胞外マトリクス成分、血管新生因子、抗血管新生因子、免疫グロブリン受容体、血液因子、癌抗原、スタチン、成長因子、治療用ペプチド、非ヒトタンパク質、非ほ乳動物タンパク質及びタンパク質毒素からなる群から選択され得る；具体的な例において、治療用ペプチド又はタンパク質は、１つ以上のイヌＡＮＰ、イヌＢＮＰ、イヌウロジラチン、イヌＤＮＰ及びそれらの生物学的に活性な配列改変体からなる群から選択され；好ましくは、配列番号８の配列を有する；さらに他の例証的な治療用タンパク質としては、造血因子、インターフェロン、インターロイキン及び腫瘍壊死因子等のサイトカイン；エリスロポエチン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子及び顆粒球コロニー刺激因子等の造血因子；ＣＤ分子、ＣＴＬＡ−４、ＴＮＦ受容体、及びインターロイキン受容体等のリガンド結合タンパク質、が挙げられる。
【００７９】
本明細書中で意図されるように、一態様において、本発明は、リンカーを経由して抗体のＦｃドメインに結合体化されている少なくとも１つのイヌナトリウム利尿ペプチドを含む融合タンパク質を包含する。融合タンパク質は実際には、イヌ抗体由来の抗体Ｆｃドメインに結合体化されている１つのイヌナトリウム利尿ペプチド又は２つのイヌナトリウム利尿ペプチドを含み得る。以下に詳述されるように、ペプチドとＦｃドメインとを結合体化するために用いられているリンカーの配列及び長さは、融合タンパク質が、１つ又は２つのイヌナトリウム利尿ペプチドを含むかによって、変動し得る。
【００８０】
発明の一態様は、以下の一般式１又は２のいずれか一方を有する融合タンパク質に関し、
【化２】
2012521784.tif 000003
【００８１】
式中、ナトリウム利尿ペプチドは、（ｉ）１つ以上のイヌＡＮＰ、イヌＢＮＰ、イヌウロジラチン、イヌＤＮＰ及びそれらの生物学的に活性な配列改変体からなる群から選択され、かつ好ましくは、配列番号８の配列を有し、（ｉｉ）アミノ酸配列のＮ’からＣの配向、アミノ酸配列のＣからＮ’の配向又は１つより多いイヌナトリウム利尿ペプチドの場合、Ｎ’からＣの配向、ＣからＮ’の配向又はＮ’からＣ及びＣからＮ’の混合した配向であり得；リンカーは、コハク酸−グリシンリンカー（Ｌ１）、ＧｌｙＧｌｙリンカー（Ｌ２）、Ｇｌｙ（ＳｅｒＧｌｙＧｌｙ）２ＳｅｒＧｌｙリンカー（Ｌ３）、（ＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）ｙＧｌｙＧｌｙリンカー、（式中、ｙは３〜６（Ｌ４）、及び７（Ｌ６）である）、（ＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）５Ｇｌｙ（Ｌ５）並びに（ＧｌｙＳｅｒＧｌｙ）５Ｇｌｙリンカー（Ｌ５ａ）からなる群から選択される１つ以上のリンカーであり；かつ、Ｆｃドメインは、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含むＩｇＧ重鎖であって、ここでＩｇＧ重鎖は、ヒンジ領域内の最初のＮ末端システイン残基で開始し、最初及び二番目のＮ末端システイン残基において、別のＦｃドメインとホモ二量体を形成し、ここでＦｃドメインは、ＦＣＡＢ又はＦＣＢＡによって示され、ここでＡＢは、両ＦｃドメインのＮ’からＣの配向であり、ＢＡは、両ＦｃドメインのＣからＮ’の配向である。ＦＣ配列は好ましくは、配列番号９及び／又は配列番号１０の配列を有する。例えば、一般式１又は一般式２のいずれにおいても、両Ｆｃドメインは、配列番号９の配列を有し得；又は両Ｆｃドメインは、配列番号１０の配列を有し得、又はＦｃドメインの一方は配列番号９の配列を有し得、他方は配列番号１０の配列を有し得る。
【００８２】
本発明の別の態様において、融合タンパク質は、以下の式３を有し；
【化３】
2012521784.tif 000004
【００８３】
式中、ＡＮＰは、ＡＮＰのアミノ酸配列のＮ’からＣの配向（ＡＮＰＸＹ）であるか、又は配列番号８のアミノ酸配列のＣからＮ’の配向であり（ＡＮＰＹＸ）；リンカーは、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ５ａ及びＬ６からなる群から選択される１つ以上のリンカーであり、ここで、Ｌ１は、本明細書中に記載されるコハク酸グリシンリンカーであり、Ｌ２はＧｌｙＧｌｙリンカーであり、Ｌ３はＧｌｙ（ＳｅｒＧｌｙＧｌｙ）２ＳｅｒＧｌｙリンカーであり、Ｌ４は（ＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）３ＧｌｙＧｌｙリンカーであり、Ｌ５は（ＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）５Ｇｌｙリンカーであり、Ｌ５ａは（ＳｅｒＧｌｙＧｌｙ）５Ｇｌｙであり、かつＬ６は（ＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）６ＧｌｙＧｌｙリンカーであり；かつＦｃは（ｉ）ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含むＩｇＧ重鎖であって、ここでＩｇＧ重鎖は、ヒンジ領域内の最初のＮ末端システイン残基で開始し、最初及び二番目のＮ末端システイン残基において、別のＦｃとホモ二量体を形成し、かつ（ｉｉ）ＦＣＵＢ、ＦＣＩＢＡ、ＦＣ２ＡＢ又はＦｃ２ＢＡによって示され、ここでＦｃ１はＩｇＧＩ分子由来であり、Ｆｃ２はＩｇＧ２分子由来であり、ＡＢは、ＦｃのＮ’からＣの配向であり、かつＢＡは、ＦｃのＣからＮ’の配向である。ＦＣ配列は好ましくは、配列番号９及び／又は配列番号１０の配列を有する。例えば、一般式３において、両Ｆｃドメインは、配列番号９の配列を有し得；又は両Ｆｃドメインは、配列番号１０の配列を有し得、又はＦｃドメインの一方は配列番号９の配列を有し得、他方は配列番号１０の配列を有し得る。
【００８４】
本発明のさらに別の態様において、融合タンパク質は以下の式４を有し、
【化４】
2012521784.tif 000005
【００８５】
式中、ＡＮＰは、配列番号８のアミノ酸配列のＮ’からＣの配向（ＡＮＰＸＹ）であるか、又は配列番号８のアミノ酸配列のＣからＮ’の配向である（ＡＮＰｙｘ）；リンカーは、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ５ａ及びＬ６からなる群から選択される１つ以上のリンカーであり、ここで、Ｌ１は、本明細書中に記載されるコハク酸グリシンリンカーであり、Ｌ２はＧｌｙＧｌｙリンカーであり、Ｌ３はＧｌｙ（ＳｅｒＧｌｙＧｌｙ）２ＳｅｒＧｌｙリンカーであり、Ｌ４は（ＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）３ＧｌｙＧｌｙリンカーであり、Ｌ５は（ＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）５Ｇｌｙリンカーであり、Ｌ５ａは（ＳｅｒＧｌｙＧｌｙ）５Ｇｌｙであり、かつＬ６は（ＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）６ＧｌｙＧｌｙリンカーであり；かつＦｃは（ｉ）ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含むＩｇＧ重鎖であって、ここでＩｇＧ重鎖は、ヒンジ領域内の最初のＮ末端システイン残基で開始し、最初及び二番目のＮ末端システイン残基において、別のＦｃとホモ二量体を形成し、かつ（ｉｉ）ＦＣＵＢ、ＦＣＩＢＡ、ＦＣ２ＡＢ又はＦｃ２ＢＡによって示され、ここでＦｃ１はＩｇＧＩ分子由来であり、Ｆｃ２はＩｇＧ２分子由来であり、ＡＢは、ＦｃのＮ’からＣの配向であり、かつＢＡは、ＦｃのＣからＮ’の配向である。好ましくは、ＦＣ配列は、配列番号９及び／又は配列番号１０の配列を有する。例えば、一般式４において、両Ｆｃドメインは、配列番号９の配列を有し得；又は両Ｆｃドメインは、配列番号１０の配列を有し得、又はＦｃドメインの一方は配列番号９の配列を有し得、他方は配列番号１０の配列を有し得る。
【００８６】
本発明の融合タンパク質は、生物学的に活性な分子であり、例えば、それらは、ｃＧＭＰを触媒することができるが、それらが大変長い半減期を持ち、またタンパク質分解に対する感受性がより低いため、治療用目的のために、より有用である。その上、ＦｃＲｎ媒介輸送を活用することによって、本明細書中に開示される治療用融合タンパク質は、ボーラス注入によって投与され得、しかしながら、遅効性の持効性処方物の薬物動態特性に似た薬物動態特性を示し得る。
【００８７】
本発明の融合タンパク質は、イヌＩｇＧ等のイヌ抗体のＦｃ領域に、直接又はリンカーを通して結合体化されている治療用ペプチドであり、Ｆｃ領域は、イヌＩｇＧ由来のヒンジ領域を具体的に含む。ペプチドを抗体のＦｃ領域に結合体化することによって、これらの融合タンパク質は、結合体化されていないペプチドよりも大変長い半減期を示す。イヌＦｃヒンジ領域の選択は、治療用タンパク質又はペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ取込みにとって重要である。いかなる作用機序によっても限定されるものではないが、本発明の融合タンパク質は、Ｆｃ領域が新生児定常領域断片受容体（ＦｃＲｎ）へと結合すると、飲作用されて隔離され得、ＦｃＲｎ活性型担体系を活用することによって（ＦｃＲｎ経路は、移行抗体（ＩｇＧ）を、新生仔の腸上皮を通して輸送する）、本明細書中に開示されている融合タンパク質のレベルが、細胞内リソソーム分解から保護され得るとともに、中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）又はＮＰＲクリアランス受容体への曝露が低減される。融合タンパク質は、細胞から正常に放出されると、再循環され、循環へと呈示され得る。この方法では、リガンドのボーラス投薬後に典型的であるようなＮＰＲＡ受容体のいっせいの活性化が、回避され得る。本発明の融合タンパク質のバイオアベイラビリティは、遅効性の持効性製剤によりよく似ていてもよい。
【００８８】
ＦｃＲｎ受容体は、成人において、肺、腎臓及び腸を含むいくつかの異なるタイプの組織における内皮細胞の表面上に発現される。いかなる作用機序によっても限定されるものではないが、ＦｃＲｎ受容体の通常の機能が、無数の臨床用途のために、生物学的活性な治療用Ｆｃ融合タンパク質を投与する手段として活用され得る。例えば、心血管系の病的状態の処置又は改善方法に加え、本発明の融合タンパク質は、ＮＰＲＡ受容体の活性化が対象に治療効果を与える、異常な利尿、イヌナトリウム利尿及び血管拡張作用に関連する疾患の処置方法においても使用され得る。
【００８９】
いくつかの例証的な実施態様において、本発明の融合タンパク質は、イヌＡＮＰ又はイヌＢＮＰを含むがそれらに限定されない、任意のイヌナトリウム利尿ペプチドを含み得る。
【００９０】
配列改変体に加え、当該ペプチドの断片も本明細書中に開示される発明の範囲内に含まれることがまた意図され、そのような断片は、本発明の方法において治療上有効であるために、十分な大きさである。当業者は、過度の実験を行うことなく、生物学的活性及び／又は治療効果に影響しないペプチドの長さにおける変化及び配列の変種を決定し得る。タンパク質は、酸性もしくは塩基性塩の形態であり得、又は中性形態であり得る。個々のアミノ酸残基はまた、酸化又は還元によって改変され得る。
【００９１】
発明の範囲内である他の改変体としては、融合タンパク質の一次アミノ酸構造が、他のペプチドもしくはポリペプチド、又はグリコシル基、脂質、リン酸、アセチル基等のような化学的部分、と共有結合性又は凝集性の接合体を形成することによって修飾されている、融合タンパク質が挙げられる。共有結合誘導体は、例えば、アミノ酸側鎖に、又はＮもしくはＣ末端において、特定の官能基を連結することによって、調製され得る。
【００９２】
本発明の融合タンパク質は、糖鎖付加されていても、糖鎖付加されていなくてもよい。酵母又はほ乳動物発現系において発現された融合タンパク質は、発現系によって、分子量及び糖鎖付加パターンにおいて、ネイティブな分子と類似しているか、又はネイティブな分子からわずかに異なり得る；大腸菌などの細菌におけるＤＮＡコード化ポリペプチドの発現は、糖鎖付加されていない分子を提供する。
【００９３】
一定の実施態様において、本発明の二量体コンストラクトは、単量体コンストラクトと比較した場合に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増強された効力を有することが見出されている。本明細書中に記載されているような、イヌ抗体Ｆｃドメインに連結された治療用ペプチドの二量体コンストラクトの増強された効力は、イヌナトリウム利尿ペプチドリガンド（例えば、ＡＮＰ、ＢＮＰ等）とそれらの細胞表面受容体との間の単量体相互作用を考慮すると、特に驚くべきことである。本明細書中に記載されているような二量体コンストラクトは、細胞及び／又は受容体と相互作用することからは、立体的に妨害されるであろうことが予想され、したがって、そのような二量体コンストラクトのわずかな活性及び／又は無活性が予測されるだろう。
【００９４】
一定の実施態様において、本発明の単量体コンストラクトは、二量体コンストラクトと比較した場合に、増加したｉｎ  ｖｉｖｏ血清濃度（Ｃｍａｘ）を有することが見出されている。明細書中に記載されているような、抗体Ｆｃドメインに連結されたイヌナトリウム利尿ペプチドの単量体コンストラクトの増加したＣｍａｘは、二量体ＥＰＯ−Ｆｃコンストラクトの静脈内投与と比較した場合により低いＣｍａｘを示した単量体ＥＰＯ−Ｆｃコンストラクトの静脈内投与からの、以前の結果を考慮すると、驚くべきことである（例えば、米国特許出願公開番号第２００７／０１７２９２８号の表４を参照のこと）。
【００９５】
治療用ペプチドに結合体化されているイヌＦｃドメインは、好ましくは、ＩｇＧＡ、ＩｇＧＢ、ＩｇＧＣ又はＩｇＧＤを含むがそれらに限定されない、イヌＩｇＧのＦｃドメインである。しかしながら、最小限のエフェクター機能を持つか又はエフェクター機能を持たないように改変された場合には、他の抗体のＦｃドメインが使用され得る。イヌ抗体Ｆｃドメインが好ましいが、他の種型、野生型形態並びに配列改変体も使用され得、例えば、本明細書中に提供される実施例において、組換えＦｃ分子が記載されている。本発明の一態様において、Ｆｃドメインは、ＩｇＧＩ又はＩｇＧ２アイソタイプ由来の２つのＦｃ重鎖からなり、ヒンジ残基は、システイン残基の鎖間ジスルフィド結合を可能とするために、各鎖上のＣＰＰＣＰ配列までが除去されている。理想的には、本発明の融合タンパク質は、ＦｃＲｎ受容体に結合可能であり、この受容体の活性担体機能を惹起可能であり、かつ有害なＡＤＣＣ毒性応答を引き起こすことなく、細胞中への融合タンパク質の送達を引き起こすことが可能である、イヌＦｃドメインを含む。いったん細胞内に入ると、ｐＨの変化が、ＦｃＲｎ受容体からの融合タンパク質の遊離をもたらし、融合タンパク質は、最終的には細胞から放出され、循環中へと戻され得る。（Ｒｏｏｐｅｎｉａｎ  Ｄ．Ｃ．ら．（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １７０：３５２８−３５３３；Ｌｅｎｃｅｒ，Ｗ．Ｉ．ら，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １５（１）：５−９（２００５））。
【００９６】
治療用タンパク質とイヌＦｃドメインとを結合体化するのに使用されるアミノ酸リンカーの長さ及び配列は、変動し得る。イヌＦｃドメインに関して結合したイヌＡＮＰを含むＮＰＲＡの構造モデル化が、ＮＰＲＡの活性部位へのイヌＦｃ融合イヌＡＮＰの挿入を可能とするために必要な最小限のリンカー距離を予測するために使用され得る。リンカー長は、イヌナトリウム利尿ペプチドとＦｃドメインとの間の立体的及び静電気的な反発を最小化する長さであるべきである。例えば、ＡＮＰのＣ末端からの望ましい最小距離は、Ｆｃホモ二量体の最も近いＮ末端から１２Ａであり、Ｆｃホモ二量体の他のＮ末端から１７Ａである。さらに、Ｆｃホモ二量体に１つのＡＮＰのみが融合している場合は（例えば、単量体）、４〜６アミノ酸の最小リンカー長で足りるであろう。Ｆｃホモ二量体に２つのＡＮＰペプチドが結合しており（例えば、二量体）、ＮＰＲＡ受容体に１つのＡＮＰのみが結合している（すなわち、１：１のＦｃ二量体：ＮＰＲＡ比で）場合、例えば、各リンカーにつき９アミノ酸の、より長いリンカー長が好ましいかもしれない。両ＡＮＰがＮＰＲＡに結合するためには（例えば、２つの隣接した受容体に、又は非静的な、交代性の様式で、１つのＮＰＲＡ受容体に対して）、その場合、１２アミノ酸の例証的な長さをもつリンカーが使用され得る。リンカー長を増加することは、融合タンパク質の性質に対して、有益な効果を有し得る。例えば、増加されたリンカー長は、融合タンパク質が、融合されたイヌナトリウム利尿ペプチドの効力に働きかけることを可能とし得る。例えば、より長いリンカー長（例えば、２０アミノ酸長）は、イヌナトリウム利尿ペプチドの効力（ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのｃＧＭＰの誘導能によって測定されたもの）を増大し得る。
【００９７】
したがって、リンカー長を増加することが、融合タンパク質の効力を増大させる場合。本発明の実施態様において、融合タンパク質の効力はしたがって、１６と５０との間のアミノ酸、好ましくは１６と４０との間のアミノ酸、最も好ましくは１６と３０との間のアミノ酸、のリンカー長で改善され得る。
【００９８】
（ＧＧＳ）ｘのリピート（例えば、ここでｘは、０〜１６の整数である）を含む、本発明において用いられるリンカー配列は、慣用的な合成、半合成、又は組換え方法に従って作られ得る（例えば、Ｅｖｅｒｓ  Ｔ．Ｈ．ら（２００６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４５：１３１８３−１３１９２を参照のこと）。用いられるリンカーの実際のアミノ酸配列に関しては、グリシン及びセリンが典型的には好ましく、これは、リンカーにおけるグリシンの存在が可動性を提供し、セリンの存在が溶解性を提供するためである。好ましいリンカー配列は、これらのアミノ酸の連続したリピート（例えば、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧ又はＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧ等の、（ＧＧＳ）ｘ−ＧＧであって、例えば、ここでｘは０〜１６の整数である）からなる。この、後者のＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧの配列が特に好ましい。
【００９９】
上記のとおり、Ｆｃドメインと治療用（ｔｈｅｒａｐｅｕｉｔｃ）ペプチドとの結合体化の配向は異なっていてもよい。例えば、治療用ペプチドのカルボキシ末端は、イヌＦｃドメインのアミノ末端に、通常のペプチド結合によって連結され得る。あるいは、治療用ペプチドのアミノ末端は、イヌＦｃドメインのアミノ末端に連結され得る。後者において、その化学作用は、融合物の１つのアミノ酸の代わりに、コハク酸部分を残す。よって当業者は、通常のペプチド結合が２つのアミノ末端間で起こらないため、後者の融合タンパク質は、組換え的に作られ得ないことを理解するであろう。集められたデータは、配向が所定の融合タンパク質の効力には影響しないらしいことを示す。
【０１００】
発明の具体的な治療用コンストラクトは、イヌＦｃドメインに融合したイヌＡＮＰを使用して例証されており、ここでは、１つ以上のイヌＡＮＰ、１つ以上のリンカー及び１つ以上のイヌＦｃが使用されている。以下のイヌＡＮＰ−イヌＦｃ融合コンストラクトが、本発明によって意図されている。
【０１０１】
ＡＮＰＸＹ（コンストラクト１）を含む例証的な融合コンストラクト（コンストラクト２）は：
ＡＮＰＸＹ−Ｌ４−Ｆｃ１ａｂ
によって表わされる。
【０１０２】
コンストラクトは、ＡＮＰＸＹ−Ｌ４−ＦＣ１ＡＢを含み、式中、ＡＮＰＸＹは、配列番号８の配列を有し、ＬはＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧ配列番号１２であり、かつＦＣ１ａｂは、配列番号９の配列を有する。ＡＮＰＸＹ−Ｌ−ＦＣ１ＡＢは、配列番号３によって表わされる。ＡＮＰＸＹ−Ｌ−Ｆｃ１ａｂコンストラクトが、組換えで作られる場合、ホモ二量体が生産され得、例えば、ＡＮＰＸＹ−Ｌ−ＦＣ１ａｂは、第二のＡＮＰＸＹ−Ｌ−ＦＣ１ａｂコンストラクトに、ジスルフィド結合を介して、連結されていてもよい。
【０１０３】
例証的な融合コンストラクト（コンストラクト３）は、以下によって表わされ：
【０１０４】
ＡＮＰＸＹ−Ｌ−ＦＣ２ａｂ
【０１０５】
式中、ＡＮＰＸＹは、配列番号８の配列を有し、ＬはＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧ配列番号１２であり、かつＦＣ２ａｂは、配列番号１０の配列を有する。ＡＮＰＸＹ−Ｌ−ＦＣ２ａｂは、配列番号６によって表わされる。ＡＮＰＸＹ−Ｌ−Ｆｃ２ａｂコンストラクトが、組換えで作られる場合、ホモ二量体が生産され得、例えば、ＡＮＰＸＹ−Ｌ−ＦＣ２ａｂは、第二のＡＮＰＸＹ−Ｌ−ＦＣ２ａｂコンストラクトに、ジスルフィド結合を介して、連結されていてもよい。
【０１０６】
別の例証的な融合コンストラクト（コンストラクト４）は：
【化５】
2012521784.tif 000006
によって表わされる。
【０１０７】
このコンストラクトにおいて、ＡＮＰ  ＹＸは、そのＣ末端からＮ’末端への配向に反転された配列番号８であり、Ｌ１は、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧ（配列番号１２）の配列を有するリンカーであり、かつＦＣ１ＡＢは、配列番号９又は配列番号１０である。ＡＮＰＹＸ−Ｌ１−ＦＣ１ＡＢは、第二のＦＣ１ＡＢに、ジスルフィド結合を介して連結されていてもよく、第二のＦＣ１ＡＢは、第一のＦＣ１ＡＢと同一の配列を有していてもよく、又は第一のＦＣ１ＡＢの配列と異なっていてもよい。
【０１０８】
別の例証的な融合コンストラクト（コンストラクト５）は：
【化６】
2012521784.tif 000007
によって表わされる。
【０１０９】
このコンストラクトにおいて、ＡＮＰ  ＹＸは、そのＣ末端からＮ’末端への配向に反転された配列番号８であり、Ｌ１は、配列番号１２であり、かつＦＣ１ＡＢは、配列番号９又は配列番号１０である。ＡＮＰＹＸ−Ｌ１−ＦＣ１ＡＢは、第二のＡＮＰＸＹ−Ｌ１−ＦＣＩＡＢコンストラクトに、ジスルフィド結合を介して連結されていてもよく、両ユニットにおけるＦＣ１ＡＢは、配列番号９であってもよく、又は配列番号１０であってもよく、又は一方のユニットにおいて配列番号９であり、他方において配列番号１０であってもよい。
【０１１０】
Ｃ．融合タンパク質の合成
本明細書中に他に示されない限り、本発明の融合タンパク質は、当業者によく知られているタンパク質化学又は分子生物学の数々の技術の任意のものによって作られ得る。（例えば、Ｄａｗｓｏｎら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６９：９２３−９６０，２０００を参照のこと。）可能な合成のシナリオは、本明細書中に提供される実施例中に記載されており、合成及び半合成化学合成並びに組換え方法が含まれる。
【０１１１】
融合タンパク質は、化学的方法を全体又は部分的に使用し、古典的又は非古典的なアミノ酸もしくは化学的アミノ酸アナログを適切に使用して、生産され得る。技術としては、固相化学（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ，８５：２１４９，１９６４；Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：５１３２，１９８５）が挙げられ、そのようなポリペプチドの自動合成のための機器は、市販されている（例えば、アプライドバイオシステムズ、フォスターシティ、カリフォルニア州）。合成ペプチドは、高速液体クロマトグラフィー等の従来法を使用して精製され得る。合成融合ポリペプチドの組成は、当業者に公知の技術を使用して、アミノ酸解析又はシークエンシングによって確認され得る。酸化条件下での合成タンパク質のさらなる処置もまた、正常なネイティブのコンフォメーションを得るために利用され得る。例えば、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｓｅｔｌｏｗ，Ｊ．Ｋ．編，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，第１２巻，ｐｐ１−１９，１９９０のＫｅｌｌｅｙ，Ｒ．Ｆ．＆  Ｗｉｎｋｌｅｒ，Ｍ．Ｅ．；Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｊ．Ｍ．＆  Ｙｏｕｎｇ，Ｊ．Ｄ．  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，１１１，１９８４を参照のこと）。
【０１１２】
本明細書中に開示される融合タンパク質はまた、遺伝子合成、クローニング及び発現方法論が関与する組換え技術によっても、作られ得る。これらの技術は周知であり、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第Ｉ、ＩＩ、及びＩＩＩ巻，１９９７（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ編）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，第Ｉ及びＩＩ巻，１９８５（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；シリーズ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ，１９８７（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ及びＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；並びにＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  第１５４巻及び第１５５巻（それぞれ、Ｗｕ及びＧｒｏｓｓｍａｎ編、並びにＷｕ編）において説明されている。
【０１１３】
簡潔には、本発明の融合タンパク質は、従来のクローニング又は化学合成方法によって、本明細書中に記載された任意のアミノ酸配列をコード化する核酸配列を単離又は合成することによって、組換え的に作られ得る。例えば、異なる融合タンパク質配列をコードするＤＮＡ断片は、従来の技術に従ってインフレームに一緒に連結され得、又は自動ＤＮＡ合成機を含む従来技術によって、合成され得る。あるいは、遺伝子断片のＰＣＲ増幅が、アンカープライマーを使用して実行され得、これは、２つの連続した遺伝子断片間で相補的なオーバーハングを生じさせ、これらは次いで、アニーリングされ、再増幅され得、キメラ遺伝子配列が作出され得る。組換え核酸はさらに、タンパク質精製のプロトコルを促進するために、アフィニティータグをコード化する配列などの、他のヌクレオチド配列を含み得る。
【０１１４】
本発明の融合タンパク質をコード化する核酸配列は、適切な宿主中でその核酸配列を発現する能力がある適切な発現ベクター中へと連結され得、その後、核酸配列が連結された発現ベクターで宿主が形質転換され、宿主は核酸配列の発現に適切な条件下で培養され、それによって、選択された核酸配列によってコード化されるタンパク質は、宿主によって発現され、生産されたタンパク質が精製される。この過程において、連結の工程はさらに、核酸が、適切な分泌シグナルに作動可能に連結されるよう、核酸を適切な発現ベクター中へと連結することを意図し得、それによって、アミノ酸配列が宿主によって分泌される。本発明での使用に適切な分泌シグナルとしては、マウスＩｇＧκ軽鎖シグナル配列が挙げられるが、それらに限定されない（Ｈｏら．ＰＮＡＳ（２００６）１０３（２５）：９６３７−９６４２）。
【０１１５】
上記のとおり、本明細書中に記載される融合タンパク質をコード化する核酸配列は、宿主細胞を形質転換するのに使用され得る、適切なプラスミド又は発現ベクター中へと挿入され得る。一般に、宿主細胞と適合性の種由来の複製配列及び制御配列を含有するプラスミドベクターが、それらの宿主と関連して使用される。ベクターは通常、複製部位、並びに形質転換細胞における表現型選択を提供する能力のあるタンパク質をコード化する配列を保有する。例えば、大腸菌は、大腸菌種由来のプラスミドであるｐＢＲ３２２（Ｍａｎｄｅｌ，Ｍ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５３：１５４，１９７０）を使用して形質転換され得る。プラスミドｐＢＲ３２２は、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含有し、したがって、選択のための簡単な手段を提供する。他のベクターは、異なるプロモーター等の異なる特徴を含み、それらはしばしば、発現において重要である。ほ乳動物の発現に使用されるベクターはしばしば、構成的ＣＭＶプロモーターを含有し、これは高い組換えタンパク質発現を引き起こす。これらのベクターはまた、安定な発現細胞系の作出に使用される選択配列遺伝子を含有する。
【０１１６】
宿主細胞は、原核又は真核であり得る。ＤＮＡ配列をクローニング及び発現させ、親ポリペプチド、セグメント置換ポリペプチド、残基置換ポリペプチド及びポリペプチド改変体を生産するためには、原核生物が好ましい。当業者によく知られているそのような原核細胞はとしては、大腸菌、枯草菌（Ｂ  ｓｕｂｔｉｌｌｕｓ）、及び緑膿菌の細胞株が挙げられるが、それらに限定されない。原核生物に加え、酵母培養物等の真核生物、又は多細胞生物由来の細胞も使用され得る。脊椎動物細胞もまた、有用な宿主細胞系として使用され得る。有用な細胞及び細胞系は、当業者によく知られており、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系、ＷＩ  ３８、２９３、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７及びＭＤＣＫ細胞系が含まれるが、それらに限定されない。
【０１１７】
発明はまた、本発明のイヌナトリウム利尿融合タンパク質をコード化する、単離又は精製されたポリヌクレオチドに関する。上で議論された通り、融合タンパク質、その断片、又はその機能的同等物をコード化する、発明のポリヌクレオチドは、適切な宿主細胞において、融合タンパク質、その断片、又はその機能的同等物の発現を指向する組換え核酸分子を作出するために使用され得る。そのようなポリヌクレオチドによってコード化される融合ポリペプチド産物は、コード配列の分子操作によって、変更され得る。
【０１１８】
遺伝暗号の固有の縮重のため、実質的に同一又は機能的に同等なアミノ酸配列をコード化する他のＤＮＡ配列が、融合ポリペプチドの発現のために、発明の実施において使用され得る。そのようなＤＮＡ配列としては、本明細書中に記載される低、中又は高ストリンジェントな条件下で、本明細書中に開示されるコード配列又はそれらの相補物（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｓ）とハイブリッド形成する能力のある配列が挙げられる。
【０１１９】
発明にしたがって使用され得る変更されたヌクレオチド配列としては、異なるヌクレオチド残基の欠失、付加又は置換であって、同一又は機能的に同等な遺伝子産物をコード化する配列をもたらすものが挙げられる。遺伝子産物自身が、サイレントな変化をもたらすアミノ酸残基の欠失、付加又は置換を含有し得る。
【０１２０】
発明のヌクレオチド配列は、種々の目標のために、融合タンパク質コード配列を変更するために、操作され得、遺伝子産物のプロセシング及び発現を改変する変更を含むが、それらに限定されない。例えば、制限部位を挿入又は除去するため、糖鎖付加パターン、リン酸化を変更するため、翻訳、開始、及び／もしくは終了配列を作成及び／もしくは破壊するため、又はコード領域に多様性をもたらすため、又はさらなるｉｎ  ｖｉｔｒｏ修飾を促進するため等、当技術分野において周知の技術を使用して、突然変異が導入され得る。当業者は、所定の核酸コンストラクトにおいて変更を作出する多くの方法を認識するであろう。そのような周知の方法としては、例えば、部位特異的突然変異誘発、縮重オリゴヌクレオチドを使用したＰＣＲ増幅、核酸を含有する細胞の、化学的突然変異誘発剤又は放射線への暴露、望ましいオリゴヌクレオチドの化学合成（例えば、大きな核酸を作出するために、ライゲーション及び／又はクローニングと組合わせて）並びに他の周知の技術が挙げられる。
【０１２１】
精製された融合タンパク質は、本発明のＤＮＡの組換え翻訳産物を発現させるために適切な宿主／ベクター系を培養することによって、調製され得、組換え翻訳産物は次いで、培地又は細胞抽出物から精製される。例えば、培地中へと組換えポリペプチドを分泌する系からの上清は最初に、例えば、Ａｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニット等の、市販されているタンパク質濃縮フィルターを使用して濃縮され得る。濃縮工程後、濃縮物は、適切な精製マトリクスにアプライされ得る。親和性クロマトグラフィー又は逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）もまた、本発明の融合タンパク質を精製するために使用され得る。
【０１２２】
Ｄ．処方物
本発明の治療用融合タンパク質は、動物における特定の疾患の処置のための動物用組成物として投与され得、又はイヌを動物モデルとして、化合物の投薬及び効力を試験するために使用され得る。例えば組成物は、異常な利尿（ｄｉｒｕｒｅｔｉｃ）、イヌナトリウム利尿及び血管拡張作用に関連し、かつ／又はナトリウム利尿（ｎａｔｕｒｅｓｉｓ）、利尿、血管拡張を誘導するかもしくはレニン−アンギオテンシンＩＩ及びアルドステロン系を調節することが望ましい疾患を含むが、それらに限定されない、ＮＰＲＡ受容体の活性化が、対象に治療効果を与える病的状態の処置又は改善方法における使用のためである。そのような病的状態としては、上に詳しく説明されているような心血管系の障害が挙げられる。これらの状態としては、過剰の細胞外液によって特徴付けられ得る状態が挙げられ、慢性心不全（ＣＨＦ）及び肺水腫が含まれるが、それらに限定されない。特に好ましい実施態様において、発明は、慢性心不全（非虚血性）、心筋梗塞後心不全（虚血性ＣＨＦ）、急性心筋梗塞、再灌流障害、左心室機能不全（ＬＶＤ）、心線維化、拡張期心不全、及び肥大型心筋症を含むが、それらに限定されない心血管系の病的状態の処置又は改善方法を含む。そのうえ、例えば、肺高血圧症、収縮期高血圧症、抵抗性高血圧症等の高血圧症を含むが、それらに限定されない高血圧性疾患、及び糖尿病性腎症等の他の心血管関連疾患も、本発明の方法によって処置又は改善され得る。本発明の融合タンパク質及び医薬組成物は、冠動脈バイパス手術を受けている対象に、治療効果を提供するために使用され得ることもまた、本明細書中に意図される。
【０１２３】
本発明に従った使用のための医薬組成物は、例えば、吸入もしくは吹送によって（口又は鼻のいずれかを通して）又は局所、経口、口腔、非経口もしくは直腸投与等の、種々の手段による投与のための１つ以上の生理学的に許容可能な担体又は添加剤を使用して、従来の様式で処方され得る。例えば、非経口としては、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内及び硬膜外投与が挙げられ得る。組成物は、例えば、注入又はボーラス注入によって、上皮又は粘膜皮膚内層（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜及び腸管粘膜等）を通した吸収によって、等の任意の都合のよい経路によって投与され得、他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与され得る。投与は、全身性又は局所的であり得る。好ましい実施態様において、任意の適切な経路によって、発明の医薬組成物を患部組織中へと導入することが望ましいかもしれない。例えば、吸入器又は噴霧器の使用、及びエアロゾル投与剤を含む処方によって、肺投与もまた用いられ得る。
【０１２４】
医薬組成物はさらに、ビヒクル又は医薬的に許容可能な担体を含む担体、を含み得る。具体的な実施態様において、用語「医薬的に許容可能」は、動物における使用、より詳細にはヒトにおける使用、のために、連邦もしくは州政府の規制当局によって認可されているか又は米国薬局方もしくは他の一般的に認知された薬局方に収載されていることを意味する。用語「担体」は、医薬組成物が共に投与される、希釈剤、アジュバント、添加剤、又はビヒクルをいう。そのような医薬担体は、水及び油（ピーナッツ油、大豆油、鉱物油、胡麻油等の、石油由来、動物由来、植物由来又は合成由来のものを含む）等の無菌の液体であり得る。医薬組成物が静脈内投与される場合には、水が好ましい担体である。生理食塩水溶液並びに水性デキストロース及びグリセロール溶液もまた、特に注射可能な溶液の、液体担体として用いられ得る。適切な医薬添加剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、ショ糖、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等が挙げられる。望ましい場合、組成物はまた、微量の湿潤剤もしくは乳化剤、又はｐＨ緩衝剤を含有し得る。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放性処方物等の形態を有し得る。組成物は、伝統的な結合剤及びトリグリセリド等の担体と共に、座剤として処方され得る。経口処方物としては、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等の標準的な担体が挙げられ得る。適切な医薬担体の例は、参照することによりその全体が本明細書中に援用される、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。処方物は、投与方法に適しているべきである。
【０１２５】
経口投与のためには、医薬組成物は、例えば、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）；増量剤（例えば、ラクトース、結晶セルロース又はリン酸水素カルシウム）；滑択剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク又はシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプン又はデンプングリコール酸ナトリウム）；又は湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）等の医薬的に許容可能な添加剤と共に従来法によって調製された、錠剤又はカプセル剤の形態をとり得る。錠剤は、当技術分野において周知の方法によって、コーティングされ得る。経口投与のための液体製剤は、例えば、溶液、シロップもしくは懸濁剤の形態をとり得、又はそれらは、使用前に水もしくは他の適切なビヒクルで構成されるための乾燥製品として与えられ得る。そのような液体製剤は、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体又は硬化食用油脂）；乳化剤（例えば、レシチン又はアラビアゴム）；非水ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール又は分別植物油）；及び保存剤（例えば、メチルもしくはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾアート又はソルビン酸）等の医薬的に許容可能な添加物と共に、従来法によって調製され得る。製剤はまた、必要に応じて、緩衝塩、香料、着色料及び甘味料を含有し得る。
【０１２６】
適正な場合、経口投与のための製剤は、活性化合物の制御放出を与えるように、適切に処方され得る。
【０１２７】
適正な場合、組成物は口腔投与のために、従来法で処方された錠剤又はロゼンジの形態をとり得る。
【０１２８】
別の実施態様において、本発明の融合タンパク質は、吸入もしくは吹送による投与（口又は鼻のいずれかを通して）用である。したがって、本発明による使用のための化合物は、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又は他の適切な気体等の適切な噴霧剤を使用して、加圧包装又は噴霧器からのエアロゾルスプレー体裁の形態で簡便に送達され得る。加圧エアロゾルの場合、投薬単位は、定量を送達するための弁を提供することによって、決定され得る。例えば、吸入器又は注入器における使用のためのゼラチン、のカプセル剤及び薬包は、化合物の散剤混合物及びラクトース又はデンプンなどの適切な散剤の基剤を含有するよう処方され得る。
【０１２９】
特に好ましい実施態様において、本発明の医薬組成物は、例えば、ボーラス注入又は連続注入等の注入による非経口投与のために処方され得る。そのうえ、本明細書中に意図されるように、本発明の融合タンパク質及び医薬組成物は、それを必要とする対象による自己注射のため（例えば、ＣＨＦの長期的治療）に適切であってもよい。注入のための処方物は、例えば、保存剤が添加されたアンプル中又は多用量容器中等の単位投薬形態で、与えられ得る。組成物は、油性又は水性ビヒクル中の懸濁剤、溶液又はエマルジョン等のような形態をとり得、かつ懸濁剤、安定化剤及び／又は分散剤等の製剤化剤を含有し得る。
【０１３０】
あるいは、活性成分は、適切なビヒクル（例えば、無菌の発熱因子を含まない水）による、使用前の構成のための散剤形態であり得る。例えば、凍結乾燥タンパク質組成物は、吸入され得るか、又は適切なビヒクル中で再構成され、次いで注入され得る。
【０１３１】
化合物はまた、例えば、カカオバター又は他のグリセリド等の従来の座剤基剤を含有する、座剤又は保留浣腸剤（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｅｎｅｍａｓ）等の直腸用組成物中に処方され得る。
【０１３２】
遅効性処方物に類似した薬物動態を示し得る前記の処方物に加え、化合物はまた、実際の持効性製剤としても処方され得る。そのような長時間作用性の処方物は、移植（例えば、皮下又は筋肉内）によって、又は筋肉内注射によって投与され得る。したがって、例えば、化合物は、適切な重合もしくは疎水性材料と共に（例えば、許容可能な油中のエマルジョンとして）又はイオン交換樹脂と共に処方され得、又は、難溶性誘導体として（例えば、難溶性塩として）処方され得る。
【０１３３】
望ましい場合、組成物は、活性成分を含有する１つ以上の単位投薬形態を含有し得る包装又は調合器装置中に与えられ得る。包装は例えば、ブリスター包装等のように、金属又はプラスチックホイルを含み得る。包装又は調合器装置は、投与のための説明書を伴い得る。
【０１３４】
発明における使用のために適切な医薬組成物としては、活性成分が、意図される目的を達成するのに有効な量で含有されている組成物が挙げられる。有効な用量の決定は、十分に当業者の能力の範囲内である。例えば、任意の化合物について、治療上有効な用量は、細胞培養アッセイ（例えば、新生細胞の）において、又は通常、マウス、ウサギ、イヌ、又はブタの動物モデルにおいてのいずれかで、初めに推定され得る。動物モデルはまた、適正な濃度範囲及び投与経路を決定するためにも使用され得る。用量は、ＩＣ５０（すなわち、症状の最大半量の阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するために、動物モデルにおいて処方され得る。そのような情報は次いで、ヒトにおける有用な用量及び投与経路を決定するために使用され得る。
【０１３５】
治療上有効な用量又は「有効量」は、無毒性であるが、望ましい治療効果を提供するために十分である活性成分の量をいう。例えば、ＥＤ５０（母集団の５０％において治療上有効である用量）及びＬＤ５０（母集団の５０％に対して致死的である用量）等の治療効力及び毒性は、細胞培養物又は実験動物における標準的な医薬的手順によって決定され得る。毒性効果と治療効果との間の用量比が治療指数であり、それは、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表わされ得る。大きな治療指数を示す医薬組成物が好ましい。細胞培養アッセイ及び動物試験から得られたデータは、ヒトにおける使用のための投薬量の範囲を公式化することにおいて使用される。そのような組成物中に含有される投薬量は好ましくは、ＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内であり、毒性がわずかであるか又は毒性が全くない。投薬量は、用いられる投薬形態、対象の感受性、及び投与経路に依存して、この範囲内で変動する。
【０１３６】
正確な投薬量は、処置を必要としている対象に関連する要素を踏まえて、医者によって決定されるであろう。投薬量及び投与は、十分なレベルの活性部分が提供されるよう、又は望ましい効果が保持されるよう、調節される。考慮され得る要素としては、疾患状態の重症度、対象の全体的な健康、対象の年齢、体重、及び性別、食事、投与の時間及び頻度、薬物の組合せ、反応感受性、並びに療法に対する耐性／応答、が挙げられる。長期作用型の医薬組成物は、特定の処方物の半減期及びクリアランス速度によって、３〜４日ごと、毎週、又は２週に一度、投与され得る。
【０１３７】
通常の投薬量は、投薬経路に依存して、０．１〜１００，０００μｇ、最大で約１ｇの全量まで、異なり得る。特定の投薬量及び送達方法についての案内は、文献中に提供され、かつ当技術分野における医者に一般的に入手可能である。当業者は、タンパク質又はそれらの阻害剤とは異なる処方を、ヌクレオチドについて用いる。同様に、ポリヌクレオチド又はポリペプチドの送達は、特定の細胞、状態、位置等に特異的であるだろう。タンパク質の経口投与に適切な医薬処方物は、例えば、米国特許第５，００８，１１４号；同第５，５０５，９６２号；同第５，６４１，５１５号；同第５，６８１，８１１号；同第５，７００，４８６号；同第５，７６６，６３３号；同第５，７９２，４５１号；同第５，８５３，７４８号；同第５，９７２，３８７号；同第５，９７６，５６９号；及び同第６，０５１，５６１号中に記載されている。
【０１３８】
本発明はさらに、任意の上記方法と共に使用されるキットを提供する。そのようなキットは典型的には、本明細書中に記載される方法を実施するために必要な２つ以上の構成要素を含む。構成要素は、化合物、試薬、容器及び／又は機器であり得る。例えば、キット内の１つの容器は、本発明の融合タンパク質を含む医薬組成物を含有し得る。１つ以上の追加の容器が、試薬もしくは緩衝剤、又は医薬組成物を投与する方法において使用されるべき機器等の要素を封入し得る。
【０１３９】
本発明の融合タンパク質及び医薬組成物は、単独で、又は本明細書中に記載される任意の病的状態を処置するために使用され得る他の化合物又は物質と組合わせて、投与され得ることが、本明細書中でまた意図される。本発明での併用療法において使用され得るそのような化合物又は処方物としては、例えば、利尿薬、ベータ遮断薬、及びＡｎｇＩＩ受容体遮断薬が挙げられる。
【０１４０】
本明細書中に記載される発明は、記載される特定の方法論、プロトコル、及び試薬が変動し得るために、これらの特定の方法論、プロトコル、及び試薬に限定されないことが意図される。本明細書中に使用される用語法は、特定の実施態様を説明する目的のみのためであって、いかなる意味でも本発明の範囲を限定することを意図するものではないこともまた理解されるべきである。
【０１４１】
本明細書中に記載される方法及び材料と類似した又は等価である任意の方法及び材料が、本発明の実施又は試験において使用され得るものの、好ましい方法、装置及び材料が、これより説明される。本明細書中に記載される全ての文献は、参照することによって明確に援用される。
Ｅ．実施例
【実施例１】
【０１４２】
組換えイヌＡＮＰ−Ｆｃ融合タンパク質生産及び特徴付け：
イヌＡＮＰ−Ｆｃ融合コンストラクトの作出：２つのＤＮＡコンストラクト（配列番号１及び４）を、従来のオリゴヌクレオチド合成技術に従って合成し、ほ乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（ジーンアート社（Ｇｅｎｅａｒｔ））中へとサブクローニングする。各コンストラクトは、マウスＩｇＧκ軽鎖シグナル配列、イヌＡＮＰ２８配列、リンカー配列とそれに続くイヌＦｃγ配列という同一の基本的な順番を含有する。利用したマウスＩｇＧκ軽鎖シグナル配列は、ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ（受入番号ＡＡＡ３８７７８−配列番号７）である。イヌＡＮＰ２８配列は、ＮＣＢＩデータベース由来であり、受入番号Ｐ０７４９９（配列番号８）である。リンカー配列は、（ＧＧＳ）６ＧＧモチーフのグリシン及びセリン残基のリピートからなる、２０アミノ酸のペプチドをコード化する。１つのコンストラクトにおいては、リンカーを、イヌＩｇＧ−Ａ（受入番号ＡＡＬ３５３０）のＦｃ領域に連結し、一方で、２つ目のコンストラクトにおいては、リンカーを、イヌＩｇＧ−Ｂ（受入番号ＡＡＬ３５３０２）のＦｃ領域に連結する。イヌＩｇＧ−Ａ及びＩｇＧ−ＢアイソタイプのＦｃ領域［Ｖｅｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ａｎｄ  ｌｍｍｕｎｏｐａｔｈ（２００１）８０（３−４）：２５９−２７０］が、イヌにおけるそれらの優位性並びにヒトＩｇＧ１及びＩｇＧ２に対するそれらのヒンジ構造の類似性のために、利用される。ＩｇＧ−Ａ及びＩｇＧ−Ｂアイソタイプの両方に対するＦｃ融合物を、ヒンジ領域が２つのシステイン残基のみを含むように切断して（ＩｇＧ−Ａ  ＦｃではＣＴＤＴＰＰＣＰ（配列番号１８）であり、ＩｇＧ−Ｂ  ＦｃではＣＰＫＣＰ（配列番号１９）である）、ヒンジにおけるジスルフィド結合が２つのＦｃアイソタイプで類似することを保証するような方法で、作出する。各コンストラクトを、標準的なコドン表を使用して、ほ乳動物発現のためにコドン最適化した。
【０１４３】
イヌＡＮＰ−Ｆｃ融合物のほ乳動物発現：全てのイヌＡＮＰ−Ｆｃ融合コンストラクトの最初の発現は、１Ｌのスケールで一過性形質転換プロトコルを使用して、ＨＥＫ２９３細胞系から行う。ＨＥＫ２９３細胞を、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３培地中で生育させ、２９３Ｆｅｃｔｉｎ試薬及び製造者（インビトロジェン）によって説明されるプロトコルを使用して、形質導入する。一過性形質転換細胞を、３７℃で５％ＣＯ２にて９０ｒｐｍで撹拌して、スピナーフラスコ中で生育させる。細胞を、細胞密度、生存率、及び直径、グルコースレベル、乳酸レベル、グルタミンレベル及びｐＨレベルについて、毎日モニタリングする。馴化培地を、形質導入後７２〜９６時間で、３６００ｒｐｍで１５分間の遠心分離によって回収し、新鮮な状態で精製にもっていく。発現レベルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット解析によって決定する。各コンストラクトについて、いったん発現レベルを決定したら、必要な場合、必要なタンパク質を生産するために安定なプールを作出する。安定なプールの作出は、フラスコ内で開始して、４００μｇ／ｍｌのＧ４１８で安定な細胞を選択し、次いでスピナー中へと移した。これらの条件下でいったん細胞が安定化したら、細胞を増殖させ、ウェーブバイオリアクターにおいて５−２５Ｌのランを実行する。
【０１４４】
組換えイヌＡＮＰ−Ｆｃ融合タンパク質の精製：全ての精製は、４℃にて、ＡＫＴＡシステム（ＧＥヘルスケア社）を使用して実施する。１リットルの馴化培地毎に、５ミリリットルのプロテアーゼ阻害剤カクテル（シグマ社）を添加する。カラムに、１リットルの馴化培地毎に３−４ｍＬのＰｒｏｔｅｉｎＡ  Ｃｅｒａｍｉｃ  ＨｙｐｅｒＤ（登録商標）Ｆ樹脂（ポール社）を充填し、１０ＣＶの平衡化緩衝液（Ｍｇ／Ｃａを含まない１×ダルベッコのＰＢＳ、ｐＨ７．３、インビトロジェン）で、１ｍＬ／分にて平衡化する。カラム上に馴化培地を、一晩、培地の容積に依存して、１−５ｍＬ／分にてロードする。次いで、洗浄緩衝液１（Ｍｇ／Ｃａを含まないＤＰＢＳ、ｐＨ７．３）、洗浄緩衝液２（Ｍｇ／Ｃａを含まないＤＰＢＳ  ｐＨ７．３＋１Ｍ  ＮａＣｌ）、次いで、再度の洗浄緩衝液１、の一連の１０ＣＶで樹脂を洗浄する。結合されたタンパク質を、１０ＣＶの溶出緩衝液（０．１Ｍグリシン／ＨＣｌ、ｄＨ２Ｏ中ｐＨ２．５）で、２．５ｍｌ／分にて溶出する。３ｍＬの画分を、３００μＬ（画分の１０％）の中和緩衝剤（１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、インビトロジェン）で直ちに中和する。イヌＡＮＰ−Ｆｃ融合タンパク質含有画分をプールし、Ｓセファロース（ＧＥヘルスケア社）陽イオン交換樹脂で充填されたカラムに直列で連結された、Ｑセファロース（ＧＥヘルスケア社）陰イオン交換樹脂で充填されたカラム上にロードする（両カラムを、２０ｍＭ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ６．０であらかじめ平衡化した）。ロード後、カラムを１０ＣＶの２０ｍＭ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ６．０で洗浄した。次いで、Ｑカラムをシステムから切り離し、Ｓカラムを、最大で１Ｍ  ＮａＣｌまでの勾配で溶出した。イヌＡＮＰ−Ｆｃ融合物含有画分を、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５  １０ｋＤａ  ＭＷＣＯ濃縮器（ミリポア社）を使用して、およそ３ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。アリコートを、液体窒素中で急速冷凍し、次いで−８０℃にて保管する。最終産物を、生物学的機能のアッセイにかけられる前に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元及び還元）、分析用超遠心及び質量分析解析によって特徴付ける。エンドトキシン混入物レベルを、ＥｎｄｏＳａｆｅ  ＰＴＳシステム（チャールス・リバー・ラボラトリーズ社）を使用して決定する。
【０１４５】
イヌＡＮＰ−Ｆｃ融合コンストラクトを、１Ｌの一過性ほ乳動物発現を使用して、初めに生産する。発現産物を、３工程のプロセス（プロテインＡ、Ｑ陰イオン交換、Ｓ陽イオン交換）を通して精製して、高品質のタンパク質を作出する。この一過性生産プロセスは、＞９０％純粋（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）な、わずか〜１ｍｇ／ＬのＡＮＰ−Ｆｃ（ＣａＩｇＧ−Ａ）融合物と２５−３０ｍｇ／ＬのＡＮＰ−Ｆｃ（ＣａＩｇＧ−Ｂ）融合物とをもたらす。増大するタンパク質の需要を満たすために、安定なプールを作出し、大規模なウェーブバイオリアクター生産を実行した。これらの安定なプールは、グラム量のイヌＡＮＰ−Ｆｃ融合物の作出を可能とした。
【０１４６】
組換えイヌＡＮＰ−Ｆｃ融合タンパク質の分析用超遠心：沈降速度実験を行って、精製されたイヌＡＮＰ−Ｆｃ融合物の純度及び凝集物含量を評価する。イヌＡＮＰ−Ｆｃ融合物を、１０ｍＭ  リン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有するｐＨ７．３のリン酸緩衝食塩水緩衝液中で、遠心沈降によって評価する。試料を、ダブルセクターチャコール−エポンセンターピース（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｅｃｔｏｒ  ｃｈａｒｃｏａｌ−ｅｐｏｎ  ｃｅｎｔｅｒｐｉｅｃｅ）及び石英窓を含有する遠心分離セル中へとロードする。Ｂｅｃｋｍａｎ  ＸＬＩ分析用超遠心機を、２８０ｎｍ、５０，０００ｒｐｍかつ２０℃で使用して、データを収集する。自動Ａｎｔｏｎ−Ｐａａｒ  ＡＭＶｎ／ＳＰ３−Ｖ粘度計及びＤＭＡ４５００／ＤＭＡ５０００濃度計を２０℃で使用して、溶液の密度及び粘度を測定する。沈降データを、プログラムＳＥＤＦＩＴ（ｖ９．３ｂ）を使用して解析する。
【０１４７】
組換えイヌＡＮＰ−Ｆｃ融合物の質量分析解析：インタクトな分子量を測定し、酵素消化及びペプチドマッピングを介した部分配列の検証を実施し、かつイヌＡＮＰ−Ｆｃ融合物の分解産物を同定するために、質量分析実験を行う。
【０１４８】
インタクトな分子量を評価するために、２μｌの融合タンパク質を、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌカラム（５ｕｍ、１．０×７５ｍｍ）上へ、１００μｌ／分の流量で注入する。タンパク質を、６分間にわたる２０％〜６５％Ａの勾配で溶出させる［移動相Ａは、９８／２／０．１（水／アセトニトリル／ギ酸）であり、移動相Ｂは９５／５／０．１（アセトニトリル／水／ギ酸）である］。溶出物を、２秒間のスキャン時間で、６００〜２５００ａｍｕをスキャンしながら、Ａｇｉｌｅｎｔ  ６２１０  ＬＣ／ＴＯＦ質量分析計中へと流し込む。Ａｇｉｌｅｎｔ  ＴＯＦ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎソフトウェアを使用して、データをデコンボリューションし、分子量を得る。
【０１４９】
ペプチドマッピング及び分解解析のために、融合タンパク質をトリプシン又はＥｎｄｏ−ＬｙｓＣ（８０１０−１０８）で消化する。簡潔には、２５μｌの各試料を変性させ、還元し、アルキル化する。トリプシン又はＥｎｄｏ−ＬｙｓＣを添加し、試料を、一晩、３７℃の水浴中でインキュベートする。ＨＰＬＣ／ＦＴＭＳを介して、解析を実施する。装置は、クロマトグラフ分離の間に、およそ５０，０００の分解能で、複数の走査を行う。各溶出ペプチドの質量は、０．０００５％相対誤差の精度で、決定される。酵素特異性に基づいて予測されたペプチドは、理論値が実験的に決定された値の０．０００５％以内である場合に、一致する。可能性のあるアミノ酸欠失に対応する質量を探すことによって、Ｅｎｄｏ−ＬｙｓＣデータもまたＮ末端切断について探索する。トリプシンとは異なり、Ｅｎｄｏ−ＬｙｓＣ実験は、インタクトなアミノ末端領域の観察を可能とする。
【０１５０】
試験されている組換え生産されたイヌＡＮＰ−Ｆｃ融合物の品質を保証するために、上記の特徴付けのためのプラットホームを実行した。イヌＡＮＰ２８は、イヌＮＰＲＡ  ｃＧＭＰアッセイにおいて非常に強力（ＥＣ５０〜１ｎＭ）であるため、質量分析手段を使用して、作出された全てのＡＮＰ−Ｆｃ融合物ロットにおける「遊離」ＡＮＰ量（インタクトな質量及びトリプシン消化物）をモニタリングすることが重要であった。これらの質量分析解析はまた、イヌＡＮＰ２８構造における機能性のために必要である数々の重要なアミノ酸及びジスルフィドがインタクトであることを発明者らが保証することを可能とした。主要な糖鎖付加構造（Ｇ０、Ｇ１、及びＧ２）をインタクト質量解析で同定した一方で、完全な糖鎖解析は、実施しなかった。質量分析Ｅｎｄｏ−ＬｙｓＣ消化プロトコルもまた実行して、ＡＮＰ−Ｆｃ融合ペプチドのＮ末端を評価した。＞９０％のインタクトなＮ末端を持つロットを、さらなる解析のために選択した。生産された全てのロットは、それらのＣ末端リジン残基が欠損していることが発見された。凝集のレベルを、分析用超遠心機における沈降速度実験によって試験し、ここで全てのロットが＞８５％の単量体を含有することを発見した。
【実施例２】
【０１５１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＮＰＲＡ細胞アッセイのための安定な細胞系の作出：
全長ＮＰＲＡ配列を含有するプラスミドを、オリジーン・テクノロジーズ社（ＯｒｉＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）（ロックビル、メリーランド州）から購入し、次いで、ｐｃＤＮＡ３．１中へとサブクローニングする。各コンストラクトの挿入の配向及びヌクレオチド配列は、社外のベンダーによって検証される（シークライト（ＳｅｑＷｒｉｇｈｔ）社）。ｐｃＤＮＡ３．１−ＮＰＲＡクローンを、リポフェクタミン（インビトロジェン）を使用して、ＨＥＫ２９３細胞中へと形質導入し、ここで、Ｇ４１８を使用してＮＰＲＡを発現する安定な細胞系を選択する。下に記載されるナトリウム利尿ペプチド誘導ｃＧＭＰアッセイを使用して、クローンをスクリーニングする［ＮＰＲＡクローンは、ＡＮＰ（シグマ社）で処置する］。ｃＧＭＰ高生産クローンを増殖させる。細胞系を、１００μｇ／ｍｌ  ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミン、４００μｇ／ｍｌのＧ４１８、及び１０％ＦＢＳ（ハイクローン（Ｈｙｃｌｏｎｅ））を含有するＤＭＥＭ中で生育させる。
【実施例３】
【０１５２】
ナトリウム利尿ペプチド融合タンパク質誘導ｃＧＭＰアッセイ：
＞９５％のＨＰＬＣ純度のナトリウム利尿ペプチドを、シグマ社から取得する。９０％のコンフルエンスまで生育させたＨＥＫ２９３  ＮＰＲＡ細胞を、ＨＡＮＫＳベースの細胞解離培地（ＧＩＢＣＯ）を使用して回収する。細胞を洗浄し、事前に温めたダルベッコのＰＢＳ、ｐＨ７．４、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．１％ＢＳＡ、５００μＭ  ３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）［アッセイ緩衝液］中で、３．３×１０５細胞毎ｍＬに再懸濁する。アッセイを、オプチプレート９６（Ｏｐｔｉｐｌａｔｅ−９６）白色不透明９６ウェルマイクロプレート（パーキン・エルマー社）中で実施する。１５μＬの細胞懸濁液を、３連で、アッセイ緩衝液中１５μＬの２Ｘ融合タンパク質に添加し、２０分間、３７℃にてインキュベートする。ｃＧＭＰ濃度を、ヒットハンター（ＨｉｔＨｕｎｔｅｒ）（登録商標）ｃＧＭＰアッセイキット（ディスカバーエックス社）を使用して測定する。ｃＧＭＰ生産の用量応答曲線を、レーベンバーグ・マルカートアルゴリズムを使用してＸＬｆｉｔ４．２データ解析ソフトウェア（ＩＤビジネスソリューションズ社）に適合させた４パラメータのロジスティック方程式で作成する。
【実施例４】
【０１５３】
組換えイヌＡＮＰ−Ｆｃ融合タンパク質
組換えイヌＡＮＰ−Ｆｃ融合タンパク質を生産するために、ほ乳動物発現コンストラクトを作出する。これらの融合コンストラクトは、共通のシグナル配列、イヌＡＮＰ２８配列、リンカー配列、及びイヌＩｇＧ−Ａ又はＩｇＧ−ＢのＦｃ領域のいずれかを含むように設計する。これらの融合タンパク質は各々、切断して外され、最終産物上にはないＮ末端マウスＩｇＧκ軽鎖シグナル配列（配列番号７）を含有する。グリシンは可動性を高め、一方でセリンは溶解性を高めるため、２０アミノ酸のグリシン−セリンリンカーを利用する。イヌにおけるそれらの優位性並びにヒトＩｇＧ１及びＩｇＧ２に対するそれらのヒンジ構造の類似性のために、イヌＩｇＧ−Ａ及びＩｇＧ−ＢアイソタイプのＦｃ領域［Ｖｅｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ａｎｄ  ｌｍｍｕｎｏｐａｔｈ（２００１）８０（３−４）：２５９−２７０］を利用する。ＩｇＧ−Ａ及びＩｇＧ−Ｂアイソタイプの両方に対するＦｃ融合物を、ヒンジ領域が２つのシステイン残基のみを含むよう切断し（ＩｇＧ−Ａ  ＦｃではＣＴＤＴＰＰＣＰ（配列番号１８）であり、ＩｇＧ−Ｂ  ＦｃではＣＰＫＣＰ（配列番号１９）である）、ヒンジにおけるジスルフィド結合が２つのＦｃアイソタイプで類似することを保証するような方法で、作出する。作出された組換えイヌＡＮＰ−Ｆｃ融合物それぞれのＤＮＡ及びタンパク質配列（配列番号１〜６）を、図１に詳述する。イヌ融合タンパク質コンストラクトの発現は、ｐｃＤＮＡ３．１ほ乳動物発現ベクターの強力なＣＭＶプロモーターによって駆動される（図２）。
【０１５４】
組換えイヌＡＮＰ−Ｆｃ融合物の作出のために、生産プラットホームを開発した。イヌＡＮＰ−Ｆｃ融合コンストラクトを、１Ｌの一過性ほ乳動物発現を使用して、初めに生産する。発現産物を、３工程のプロセス（プロテインＡ、Ｑ陰イオン交換、Ｓ陽イオン交換）を通して精製して、高品質のタンパク質を作出する。この一過性生産プロセスは、＞９０％純粋（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）である、わずか〜１ｍｇ／ＬのＡＮＰ−Ｆｃ（ＣａＩｇＧ−Ａ）融合物と２５−３０ｍｇ／ＬのＡＮＰ−Ｆｃ（ＣａＩｇＧ−Ｂ）融合物とをもたらす。増大するタンパク質の需要を満たすために、安定なプールを作出し、大規模なウェーブバイオリアクター生産を実行した。これらの安定なプールは、グラム量のイヌＡＮＰ−Ｆｃ融合物の作出を可能とした。非還元型ＣａＡＮＰ−Ｆｃ融合物の推定分子量は６０．４ｋＤａ及び５９．４ｋＤａ（それぞれ、ＩｇＧ−Ａ及びＩｇＧ−Ｂ  Ｆｃ融合物）であり、一方で、還元型ＣａＡＮＰ−Ｆｃ融合物の推定分子量は、３０．２ｋＤａ及び２９．７ｋＤａ（それぞれ、ＩｇＧ−Ａ及びＩｇＧ−Ｂ  Ｆｃ融合物）である。
【０１５５】
試験されている組換え生産されたＡＮＰ−Ｆｃ融合物の品質を保証するために、特徴付けのためのプラットホームを実行した。イヌＡＮＰ２８は、イヌＮＰＲＡ  ｃＧＭＰアッセイにおいて非常に強力（ＥＣ５０〜１ｎＭ）であるため、質量分析手段を使用して、作出された全てのＡＮＰ−Ｆｃ融合物ロットにおける「遊離」ＡＮＰ量（インタクトな質量及びトリプシン消化物）をモニタリングすることが重要であった。これらの質量分析解析はまた、イヌＡＮＰ２８構造における機能性のために必要である多くの重要なアミノ酸及びジスルフィドがインタクトであることを発明者らが保証することを可能とした。主要な糖鎖付加構造（Ｇ０、Ｇ１、及びＧ２）をインタクト質量解析で同定した一方で、完全な糖鎖解析は、実施しなかった。質量分析Ｅｎｄｏ−ＬｙｓＣ消化プロトコルもまた実行して、ＡＮＰ−Ｆｃ融合ペプチドのＮ末端を評価した。＞９０％のインタクトなＮ末端を持つロットを、さらなる解析のために選択した。生産された全てのロットは、それらのＣ末端リジン残基が欠損していることが発見された。凝集のレベルを、分析用超遠心機における沈降速度実験によって試験し、ここで全てのロットが＞８５％の単量体を含有することを発見した。
【０１５６】
全体的に、これらのプロセスは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ解析のための、グラム量の組換えタンパク質の生産を可能とした。また、これらのランからの最終タンパク質は、少量の凝集物（＜１０％）を有し、低エンドトキシン（＜１ＥＵ／ｍｌ）であり、インタクトであることが発見された。
【０１５７】
組換え生産されたイヌＡＮＰ−Ｆｃ融合コンストラクトを、イヌＮＰＲＡ  ｃＧＭＰ誘導アッセイにおいて試験する（表１）。代表的なｃＧＭＰアッセイのデータセットを、図３に図示する。組換えイヌＡＮＰ−Ｆｃ融合タンパク質で見られる効力におけるシフトは、曲線における右側へのシフトによって描出されている。イヌＡＮＰ−Ｆｃ融合物は、試験されたロットによって、ＡＮＰ２８から１０〜２０倍の範囲にシフトされる効力を有する。
【０１５８】
【表１】
2012521784.tif 000008
【０１５９】
ラットにおけるＰＫ研究は、これらのタンパク質が、ｉｎ  ｖｉｖｏで増大した半減期を有したことを示した。
【実施例５】
【０１６０】
イヌにおけるイヌ融合タンパク質の予備的ＰＫＰＤ評価
イヌに、単一の静脈内用量（１ｍｇ／ｋｇ又は１７ｎｍｏｌ／ｋｇ）又は皮下用量（２．５ｍｇ／ｋｇ又は４２ｎｍｏｌ／ｋｇ）のＡＮＰ−ｃａＦｃを投与して、４〜７日間の期間にわたるＰＫＰＤを評価した。イヌにおいてＣａｒｄｅｖａ（組換えヒト血清アルブミン−ＢＮＰ融合タンパク質）を評価するのに用いられた用量範囲に類似していたために、これらの用量を選択した。図４は、この研究において達成された血漿ＡＮＰ−ｃａＦｃレベルの推定値を示す。イヌ血漿におけるＡＮＰ−ｃａＦｃを確かに検出するために使用したＥＬＩＳＡの感度は、イヌ血漿において〜５０ｎＭの最小検出レベルを有することによって、制限されていた。血漿マトリックス効果を回避するためには、ビーグル犬を評価する場合に、最低でも１：５０の希釈が必要であった。ＰＢＳにおけるアッセイの線形範囲は、１００ｐＭからおよそ１００ｎＭである。２％ビーグル血漿において、曲線の線形範囲は、１ｎＭから約８０又は９０ｎＭである。図４は、推定血漿レベルの推定値を提供するのみであり、表２は、ＡＮＰ−ｃａＦｃの薬物動態を示す。
【０１６１】
【表２】
2012521784.tif 000009
【０１６２】
皮下投薬後の血漿ｃＧＭＰは、投薬後＞４８時間で、ベースラインを超えて上昇しているようにみえた（図５）。
【実施例６】
【０１６３】
遠隔測定用イヌにおけるイヌ融合タンパク質の血行動態評価
イヌ心疾患モデルにおいて効力を実証するために使用され得るＡＮＰ−ｃａＦｃ用量を同定するために、遠隔測定用の覚醒イヌにおける研究を実施した。用量選択のための判定基準は、用量が、ベースラインよりも下に、５−１０ｍｍＨｇを超えて平均動脈血圧を降下させることができず、かつそれが血漿ｃＧＭＰ濃度を、ベースラインより上に、およそ１．５Ｘ−２Ｘ上昇させるべきことであった。最初の判定基準は、望ましい臨床プロファイルを達成すること、すなわち、いくらかの心不全患者を潜在的に危険にさらすであろう動脈血圧の降下なしに効力が実証され得ること、に基づいて確立された。血漿ｃＧＭＰにおける１．５Ｘ−２Ｘの上昇というのは、この規模の血漿ｃＧＭＰの増加を生じさせた用量において好ましい心腎臓効果を実証した、イヌＢＮＰを使用し、ペーシングされたイヌにおいて行われた研究を基にした（Ｈ−Ｈ  Ｃｈｅｎら．ＪＡＣＣ  ２０００；３６：１７０６−１２）。研究番号１において、合計５匹のイヌに、改変ラテン方格法に基づいて、４週間の期間にわたり、ビヒクル、又はＡＮＰ−ｃａＦｃを０．５、１及び２．５ｍｇ／ｋｇにて皮下投薬した。この用量範囲を選択したのは、単一用量のイヌ薬物動態研究に基づき、目標とする血漿ｃＧＭＰの増加と重複することが期待されたためである。投薬の間隔は、７日間であった。研究の間の遠隔測定装置の故障のため、最終的なデータ解析から１匹の動物を除外した。ＡＮＰ−ｃａＦｃは、ｃＧＭＰの血漿レベルのピークにおいて用量依存的な上昇を生じさせ（ビヒクル日価（ｖｅｈｉｃｌｅ  ｄａｙ  ｖａｌｕｅ）の値の３．７倍、３．５倍及び６．６、図６）、用量依存的な平均動脈血圧のピークの減少を生じさせ（ＭＡＰ；ビヒクルに対し、−１３±５、−１９±４、及び−２０±５ｍｍＨｇ−図７Ａ及び７Ｂ）、かつ心拍数のピークは増加した（＋３０±１０、＋２９±９、及び＋２５±９拍毎分−図８Ａ及び８Ｂ）。
【０１６４】
全３つの用量のピーク効果の間、ＭＡＰが１０ｍｍＨｇを超えて減少したため、研究２は、類似の研究計画を使用して、同じ４匹のイヌにおいて、より低い用量で実施した（０．０５及び０．２５ｍｇ／ｋｇ）。研究番号２は、０．２５ｍｇ／ｋｇのＡＮＰ−ｃａＦｃ投薬が、ＭＡＰの減少（ビヒクルに対して、−６．６±１．６ｍｍＨ−図１０）への閾値効果を及ぼし、心拍数の増加（２０±９拍毎分−図１１）への閾値効果を及ぼし、かつ血漿ｃＧＭＰにおける中程度の増加（図９）への閾値効果を及ぼしたことを明らかにした。ＡＮＰ−ｃａＦｃの０．０５ｍｇ／ｋｇの投薬は、ＭＡＰ（１．９±１．４ｍｍＨｇ）、ＨＲ（１．８±０．６拍毎分）、又は血漿ｃＧＭＰに対する影響を有さなかった。（ｃＧＭＰ排出量測定のために尿試料もまた採取したが、しかしながら、試料は飲料水によって汚染され、使用することができなかった）。
【図１】
2012521784.tif 000010
【図２】
2012521784.tif 000011
【図３】
2012521784.tif 000012
【図４】
2012521784.tif 000013
【図５】
2012521784.tif 000014
【図６】
2012521784.tif 000015
【図７Ａ】
2012521784.tif 000016
【図７Ｂ】
2012521784.tif 000017
【図８Ａ】
2012521784.tif 000018
【図８Ｂ】
2012521784.tif 000019
【図９】
2012521784.tif 000020
【図１０Ａ】
2012521784.tif 000021
【図１０Ｂ】
2012521784.tif 000022
【図１１Ａ】
2012521784.tif 000023
【図１１Ｂ】
2012521784.tif 000024
【配列表】
2012521784000001.xml
【国際調査報告】
2012521784.tif 000028
2012521784.tif 000029
2012521784.tif 000030