(57)【要約】  本発明は、ＭＭＰ２およびＭＭＰ９の特異的阻害剤と、免疫抑制におけるそれらの使用とに関する。【選択図】  図１
2012518001.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
同種抗原によって誘発されるＴ細胞増殖を減少させる組成物であって、下記式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩、の治療有効量を含有する組成物。
【化１】
2012518001.tif 000015
式（Ｉ）
［式中、
ｍが０、１、２、３、４、または５であり、
ｎが０、１、２、３、４、または５であり、
ｐが１、２、または３であり、
Ｘが、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ２−、または直接結合であり、
Ｙが、−Ｃ（Ｏ）−、または−Ｓ（Ｏ）２−であり、
Ｚが、−Ｏ−、または−Ｓ−であり、
Ｒ１が、各出現において同一または異なり、独立して、アルキル、アルケニル、アラルキル、ハロアルキル、ハロゲン、−ＯＲ８、または−ＮＲ９Ｒ１０であり、
Ｒ２が、各出現において同一または異なり、独立して、アルキル、アルケニル、アラルキル、ハロアルキル、ハロゲン、−ＯＲ８、または−ＮＲ９Ｒ１０であり、
Ｒ３およびＲ４が、それぞれ同一または異なり、独立して、水素またはアルキルであり、
Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７が、それぞれ同一または異なり、独立して、水素またはアルキルであり、
Ｒ８が、水素、アルキル、アルケニル、またはアリールであり、
Ｒ９およびＲ１０が、それぞれ同一または異なり、独立して、水素またはアルキルである］
【請求項２】
式（Ｉ）の前記化合物が下記式（Ｉａ）の化合物である、請求項１に記載の組成物。
【化２】
2012518001.tif 000016
式（Ｉａ）
【請求項３】
前記化合物が下記に示されるＳＢ−３ＣＴである、請求項１に記載の組成物。
【化３】
2012518001.tif 000017
ＳＢ−３ＣＴ
【請求項４】
式（Ｉ）の前記化合物が、式（Ｉｂ）の化合物である、請求項１に記載の組成物。
【化４】
2012518001.tif 000018
式（Ｉｂ）
【請求項５】
式（Ｉ）の前記化合物が下記式（Ｉｃ）の化合物である、請求項１に記載の組成物。
【化５】
2012518001.tif 000019
式（Ｉｃ）
【請求項６】
移植患者が肺移植患者である、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記Ｔ細胞がＣＤ４＋  Ｔ細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
移植患者に臓器を提供する臓器提供者において臓器摘出前に使用される、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
移植患者または移植を必要としている患者においてコラーゲンに対する免疫応答を阻害する組成物であって、下記式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩、の治療有効量を含有する組成物。
【化６】
2012518001.tif 000020
式（Ｉ）
［式中、
ｍが０、１、２、３、４、または５であり、
ｎが０、１、２、３、４、または５であり、
ｐが１、２、または３であり、
Ｘが、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ２−、または直接結合であり、
Ｙが、−Ｃ（Ｏ）−、または−Ｓ（Ｏ）２−であり、
Ｚが、−Ｏ−、または−Ｓ−であり、
Ｒ１が、各出現において同一または異なり、独立して、アルキル、アルケニル、アラルキル、ハロアルキル、ハロゲン、−ＯＲ８、または−ＮＲ９Ｒ１０であり、
Ｒ２が、各出現において同一または異なり、独立して、アルキル、アルケニル、アラルキル、ハロアルキル、ハロゲン、−ＯＲ８、または−ＮＲ９Ｒ１０であり、
Ｒ３およびＲ４が、それぞれ同一または異なり、独立して、水素またはアルキルであり、
Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７が、それぞれ同一または異なり、独立して、水素またはアルキルであり、
Ｒ８が、水素、アルキル、アルケニル、またはアリールであり、
Ｒ９およびＲ１０が、それぞれ同一または異なり、独立して、水素またはアルキルである］
【請求項１０】
式（Ｉ）の前記化合物が下記式（Ｉａ）の化合物である、請求項９に記載の組成物。
【化７】
2012518001.tif 000021
式（Ｉａ）
【請求項１１】
前記化合物が下記に示されるＳＢ−３ＣＴである、請求項９に記載の組成物。
【化８】
2012518001.tif 000022
ＳＢ−３ＣＴ
【請求項１２】
式（Ｉ）の前記化合物が下記式（Ｉｂ）の化合物である、請求項９に記載の組成物。
【化９】
2012518001.tif 000023
式（Ｉｂ）
【請求項１３】
式（Ｉ）の前記化合物が下記式（Ｉｃ）の化合物である、請求項９に記載の組成物。
【化１０】
2012518001.tif 000024
式（Ｉｃ）
【請求項１４】
移植患者が肺移植患者である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１５】
移植の結果を改善する組成物であって、下記式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩、の治療有効量を含有する組成物。
【化１１】
2012518001.tif 000025
式（Ｉ）
［式中、
ｍが０、１、２、３、４、または５であり、
ｎが０、１、２、３、４、または５であり、
ｐが１、２、または３であり、
Ｘが、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ２−、または直接結合であり、
Ｙが、−Ｃ（Ｏ）−、または−Ｓ（Ｏ）２−であり、
Ｚが、−Ｏ−、または−Ｓ−であり、
Ｒ１が、各出現において同一または異なり、独立して、アルキル、アルケニル、アラルキル、ハロアルキル、ハロゲン、−ＯＲ８、または−ＮＲ９Ｒ１０であり、
Ｒ２が、各出現において同一または異なり、独立して、アルキル、アルケニル、アラルキル、ハロアルキル、ハロゲン、−ＯＲ８、または−ＮＲ９Ｒ１０であり、
Ｒ３およびＲ４が、それぞれ同一または異なり、独立して、水素またはアルキルであり、
Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７が、それぞれ同一または異なり、独立して、水素またはアルキルであり、
Ｒ８が、水素、アルキル、アルケニル、またはアリールであり、
Ｒ９およびＲ１０が、それぞれ同一または異なり、独立して、水素またはアルキルである］
【請求項１６】
式（Ｉ）の前記化合物が下記式（Ｉａ）の化合物である、請求項１５に記載の組成物。
【化１２】
2012518001.tif 000026
式（Ｉａ）
【請求項１７】
前記化合物が下記に示されるＳＢ−３ＣＴである、請求項１５に記載の組成物。
【化１３】
2012518001.tif 000027
ＳＢ−３ＣＴ
【請求項１８】
式（Ｉ）の前記化合物が下記式（Ｉｂ）の化合物である、請求項１５に記載の組成物。
【化１４】
2012518001.tif 000028
式（Ｉｂ）
【請求項１９】
式（Ｉ）の前記化合物が下記式（Ｉｃ）の化合物である、請求項１５に記載の組成物。
【化１５】
2012518001.tif 000029
式（Ｉｃ）
【請求項２０】
移植患者に臓器を提供する臓器提供者において、臓器摘出前に使用される、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２１】
移植患者が肺移植患者である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２２】
免疫応答阻害を必要としている患者において免疫応答を阻害する組成物であって、下記式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩、の治療有効量を含有する組成物。
【化１６】
2012518001.tif 000030
式（Ｉ）
［式中、
ｍが０、１、２、３、４、または５であり、
ｎが０、１、２、３、４、または５であり、
ｐが１、２、または３であり、
Ｘが、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ２−、または直接結合であり、
Ｙが、−Ｃ（Ｏ）−、または−Ｓ（Ｏ）２−であり、
Ｚが、−Ｏ−、または−Ｓ−であり、
Ｒ１が、各出現において同一または異なり、独立して、アルキル、アルケニル、アラルキル、ハロアルキル、ハロゲン、−ＯＲ８、または−ＮＲ９Ｒ１０であり、
Ｒ２が、各出現において同一または異なり、独立して、アルキル、アルケニル、アラルキル、ハロアルキル、ハロゲン、−ＯＲ８、または−ＮＲ９Ｒ１０であり、
Ｒ３およびＲ４が、それぞれ同一または異なり、独立して、水素またはアルキルであり、
Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７が、それぞれ同一または異なり、独立して、水素またはアルキルであり、
Ｒ８が、水素、アルキル、アルケニル、またはアリールであり、
Ｒ９およびＲ１０が、それぞれ同一または異なり、独立して、水素またはアルキルである］
【請求項２３】
免疫応答阻害を必要としている前記患者が、同種免疫によって誘発される臓器移植後の自己免疫、膠原血管病、および多発性硬化症、からなる群から選択される自己免疫疾患を有する、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
免疫応答阻害を必要としている前記患者が、ぜんそくを有する、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２５】
免疫応答阻害を必要としている前記患者が、Ｔ細胞介在性肺疾患を有する、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２６】
前記免疫応答がＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２７】
前記ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答が抗原特異的応答である、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記免疫応答がＣＤ４＋  Ｔ細胞応答を含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２９】
前記ＣＤ４＋  Ｔ細胞応答が抗原特異的応答である、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
制御性Ｔ細胞が式Ｉの前記化合物によって阻害されない、請求項２２に記載の組成物。
【請求項３１】
前記患者が固形臓器移植患者である、請求項２２に記載の組成物。
【請求項３２】
同種抗原によって誘発されるＴ細胞増殖を減少させる組成物であって、マトリックスメタロプロテイナーゼ２およびマトリックスメタロプロテイナーゼ９を選択的に阻害することのできる化合物の治療有効量を含有する組成物。
【請求項３３】
免疫応答阻害を必要としている患者において免疫応答を阻害する組成物であって、マトリックスメタロプロテイナーゼ２およびマトリックスメタロプロテイナーゼ９を選択的に阻害することのできる化合物の治療有効量を含有する組成物。
【請求項３４】
前記免疫応答が抗原特異的免疫応答である、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
式Ｉの化合物の有効量を、免疫抑制剤との組合せとして含有する組成物であって、前記免疫抑制剤の有効投与量が、式Ｉの前記化合物が存在しないときに通常使用される有効投与量と比較して減少する、組成物。
【請求項３６】
患者において免疫応答を抑制する組成物であって、式Ｉの化合物の有効量を、公知の免疫抑制剤との組合せとして含有する組成物。
【請求項３７】
前記免疫応答が抗原特異的免疫応答である、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】
前記公知の免疫抑制剤が、シクロスポリンＡ、ＦＫ５０６、ラパマイシン、コルチコステロイド、プリン代謝拮抗剤、キャンパス、抗リンパ球グロブリン、からなる群から選択される、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３９】
Ｖ型コラーゲンに対する免疫応答を減少させる組成物であって、Ｖ型コラーゲンに対する免疫応答減少を必要としている患者に、式Ｉの化合物の有効量を、Ｖ型コラーゲンまたはその寛容化部分の有効量と組み合わせて投与することを含む、組成物。
【請求項４０】
前記患者が、肺移植を必要としている患者、または肺移植患者である、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
前記Ｖ型コラーゲンまたはその寛容化部分が、経口投与または静脈内投与される、請求項３９に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、合衆国法典第３５巻米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、米国仮特許出願第６１／１５２，５１２号（出願日：２００９年２月１３日）の優先権を主張し、本仮特許出願は、参照によってその全体を本出願に援用する。
【０００２】
（連邦政府の利益に関する記載）
本発明は、国立衛生研究所によって供与された助成金ＮＨＬＢＩ  ＲＯ１  ＨＬ０８１３５０−０３のもとに、米国政府の援助下で行われたものである。米国政府は、この発明において一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）阻害剤およびその使用方法に関する。詳細には、本発明は、ＭＭＰ２およびＭＭＰ９の阻害剤と、免疫抑制におけるそれらの使用とに関する。
【背景技術】
【０００４】
細胞外マトリックスの中での細胞の特異的相互作用は、有機体が正常に機能するうえで極めて重要である。細胞外マトリックスの変化は、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）と称される亜鉛依存性エンドペプチダーゼのファミリーによってもたらされる。この変化は、さまざまな細胞過程、例えば、器官の形成、排卵、子宮内の胎児着床、胚発生、創傷治癒、血管形成などにおいて行われる（非特許文献１、非特許文献２）。ＭＭＰは、酵素の主たる５種類のグループ、すなわち、ゼラチナーゼ、コラゲナーゼ、ストロメライシン、膜型ＭＭＰ、およびマトリリシンからなる。正常な組織機能におけるＭＭＰの活性は、一連の複雑な酵素前駆体の活性化プロセスと、マトリックスメタロプロテイナーゼに対するタンパク質組織インヒビター（「ＴＩＭＰ」）による阻害によって、厳密に制御されている（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）。制御プロセスがうまくいかない場合における過度なＭＭＰ活性は、癌の成長、腫瘍転移、腫瘍における血管形成、関節炎および結合組織系の障害、循環器疾患、炎症、および自己免疫疾患に関連している（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献６）。ヒトのゼラチナーゼＭＭＰ２およびＭＭＰ９の活性レベルの上昇は、腫瘍転移のプロセスに関連している（非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０）。結果として、ＭＭＰ（例：ＭＭＰ２およびＭＭＰ９）の優れた阻害剤が強く求められている。
【０００５】
さらには、肺癌患者において異常なＭＭＰ２レベルが検出されており、ステージＩＶの患者、および遠隔転移のある患者では、血清ＭＭＰ２レベルが正常な血清値と比較して大幅に上昇していることが観察された（非特許文献１１、参照によって本出願に援用する）。さらに、結腸癌患者および乳癌患者において、血漿ＭＭＰ９レベルが上昇していることが観察された（非特許文献１２、参照によって本出願に援用する）。
【０００６】
ゼラチナーゼＭＭＰは、腫瘍の成長および拡散にもっとも密接に関与していることが示されている。ゼラチナーゼの発現のレベルは悪性腫瘍において上昇すること、および、ゼラチナーゼは基底膜を分解することができ、これが腫瘍転移につながることが知られている。充実性腫瘍の成長に必要な血管形成でも、病理学的にはゼラチナーゼ成分が含まれることが最近示された。さらには、アテローム性動脈硬化症に関連付けられる粥腫崩壊にゼラチナーゼが関与することを示唆する証拠が存在する。ＭＭＰが介在する他の病気・状態としては、動脈再狭窄、ＭＭＰ介在性骨減少症、中枢神経系の炎症性疾患、皮膚の老化、腫瘍の成長、変形性関節症、リウマチ性関節炎、敗血症性関節炎、角膜潰瘍、異常な創傷治癒、骨疾患、タンパク尿、大動脈瘤疾患、外傷性関節損傷の後の変成軟骨の消失、神経系の脱髄疾患、肝硬変、腎臓の糸球体疾患、早期破裂羊膜、炎症性大腸疾患、歯周疾患、加齢性の黄斑変性、糖尿病性網膜症、増殖性硝子体網膜症、未熟児網膜症、眼の炎症、円錐角膜、シェーグレン症候群、近視、目の腫瘍、眼球血管形成／新血管形成、角膜移植拒絶反応が挙げられる。最近の状況については、（１）非特許文献１３、（２）非特許文献１４、（３）非特許文献１５、（４）非特許文献１６、（５）非特許文献１７を参照されたい。炎症過程におけるＭＭＰの関与については、非特許文献１８に記載されている。
【０００７】
現在、ＭＭＰのいくつかの競合的阻害剤が知られている。ＭＭＰのこれらの阻害剤は、活性部位の亜鉛のキレート化を利用して活性を阻害する。ＭＭＰのためのこれらの競合的阻害剤は、この一般的な特性のため、亜鉛に依存する多くの生物学的経路に影響を及ぼし、宿主に対してしばしば毒性であり、このことが臨床用途において大きな障害となっている（非特許文献１９、非特許文献２０、非特許文献２１）。したがって、１種類または複数の特定のＭＭＰに対して、公知の競合的阻害剤よりも高い選択性を有するＭＭＰ阻害剤を使用することは有利である。このような方法は、長期的な負の副作用を含まないことが好ましい。
【０００８】
免疫調節剤は、全身性自己免疫疾患（例えば、エリテマトーデス、糖尿病）および免疫不全症の治療に有用であることが判明している。さらには、癌の免疫療法、あるいは臓器移植における他人の臓器または他の組織（例：腎臓、心臓、骨髄）の拒絶反応を防ぐ目的に、免疫調節剤は有用であり得る。
【０００９】
さまざまな免疫調節性化合物が発見されており、例えば、ＦＫ５０６、ムラミル酸ジペプチド誘導体、レバミソール、ニリダゾール、オキシスラン、フラジルのほか、インターフェロン、インターロイキン、ロイコトリエン、コルチコステロイド、シクロスポリンが挙げられる。しかしながら、これらの化合物の多くは、望ましくない副作用もしくは高い毒性、またはその両方を有することが判明している。したがって、特定の領域において広範囲の免疫調節機能を提供し、望ましくない副作用が最小限である新規の免疫調節性化合物が必要とされている。
【００１０】
したがって、免疫抑制剤およびＭＭＰ阻害剤の毒性を考えると、この技術分野では、ＭＭＰの調節不全が関与する免疫介在性疾患の有効な治療のための方法および化合物が必要とされている。本発明は、これらの方法および化合物、ならびにその他の利点を提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第06/036928号
【特許文献２】国際特許出願PCT/US第91/08694号
【特許文献３】国際特許出願PCT/US第91/04666号
【特許文献４】国際特許出願PCT/US第94/08542号
【特許文献５】欧州特許第0774464号明細書
【特許文献６】米国特許第5,798,035号明細書
【特許文献７】米国特許第5,789,172号明細書
【特許文献８】米国特許第5,751,629号明細書
【特許文献９】米国特許第5,168,053号明細書(Altmanら)
【特許文献１０】米国特許第5,190,931号明細書(Inouye)
【特許文献１１】米国特許第5,135,917号明細書(Burch)
【特許文献１２】米国特許第5,087,617号明細書(Smith)
【特許文献１３】米国特許第5,176,996号明細書(Hoganら)
【特許文献１４】米国特許第5,272,262号明細書
【特許文献１５】米国特許第5,168,053号明細書
【特許文献１６】米国特許第5,180,818号明細書
【特許文献１７】米国特許第5,116,742号明細書
【特許文献１８】米国特許第5,093,246号明細書(Cechら)
【特許文献１９】国際公開第99/32619号
【特許文献２０】国際公開第01/75164号
【特許文献２１】米国特許第6,506,559号明細書
【特許文献２２】国際公開第01/75164号
【非特許文献】
【００１２】
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【非特許文献３】Forget, M.-A.; Desrosier, R. R.; Beliveau, R. Can., J. Physiol. Pharmacol. 1999, 77, 465-480
【非特許文献４】Brew, K.; Dinakarpandian, D.; Nagase, H., Biochim. Biophys. Acta 2000, 1477, 267-283
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【非特許文献６】Nelson, A. R.; Fingleton, B.; Rothenberg, M. L.; Matrisian, L. M., J. Clin. Oncol. 2000, 18, 1135
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【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の一態様は、同種抗原によって誘発されるＴ細胞増殖を減少させる方法であって、式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩、の治療有効量を臓器移植患者に投与することを含む方法を提供する。
【化１】
2012518001.tif 000003
式（Ｉ）
［式中、
ｍが０、１、２、３、４、または５であり、
ｎが０、１、２、３、４、または５であり、
ｐが１、２、または３であり、
Ｘが、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ２−、または直接結合であり、
Ｙが、−Ｃ（Ｏ）−、または−Ｓ（Ｏ）２−であり、
Ｚが、−Ｏ−、または−Ｓ−であり、
Ｒ１が、各出現において同一または異なり、独立して、アルキル、アルケニル、アラルキル、ハロアルキル、ハロゲン、−ＯＲ８、または−ＮＲ９Ｒ１０であり、
Ｒ２が、各出現において同一または異なり、独立して、アルキル、アルケニル、アラルキル、ハロアルキル、ハロゲン、−ＯＲ８、または−ＮＲ９Ｒ１０であり、
Ｒ３およびＲ４が、それぞれ同一または異なり、独立して、水素またはアルキルであり、
Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７が、それぞれ同一または異なり、独立して、水素またはアルキルであり、
Ｒ８が、水素、アルキル、アルケニル、またはアリールであり、
Ｒ９およびＲ１０が、それぞれ同一または異なり、独立して、水素またはアルキルである］
【００１４】
本発明の方法の一実施形態においては、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉａ）の化合物である。
【化２】
2012518001.tif 000004
式（Ｉａ）
【００１５】
本発明の方法のさらなる実施形態においては、化合物はＳＢ−３ＣＴである。
【化３】
2012518001.tif 000005
ＳＢ−３ＣＴ
【００１６】
本発明の方法のさらなる実施形態においては、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉｂ）または式（Ｉｃ）の化合物である。
【化４】
2012518001.tif 000006
式（Ｉｂ）
【化５】
2012518001.tif 000007
式（Ｉｃ）
【００１７】
本発明の方法の特定の実施形態においては、移植患者は肺移植患者である。本発明の方法の別の実施形態においては、Ｔ細胞はＣＤ４＋  Ｔ細胞である。さらなる実施形態においては、本方法は、移植患者に臓器を提供する臓器提供者に、式Ｉの化合物の治療有効量を、臓器摘出の前に投与することをさらに含む。
【００１８】
本発明の別の態様は、移植患者または移植を必要としている患者においてコラーゲンに対する免疫応答を阻害する方法であって、式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩の治療有効量を患者に投与することを含む方法を提供する。
【００１９】
特定の実施形態においては、式（Ｉ）の化合物は、本明細書に記載した式（Ｉａ）、式（Ｉｂ）、または式（Ｉｃ）の化合物である。本方法のさらなる実施形態においては、化合物はＳＢ−３ＣＴである。別の実施形態においては、移植患者は、肺移植患者である。
【００２０】
本発明の別の態様は、臓器移植の結果を改善する方法であって、式Ｉの化合物の治療有効量を移植患者に投与することを含む方法を提供する。特定の実施形態においては、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉａ）、式（Ｉｂ）、または式（Ｉｃ）の化合物、もしくはＳＢ−３ＣＴである。一実施形態においては、本方法は、移植患者に臓器を提供する臓器提供者に、式Ｉの化合物の治療有効量を、臓器摘出の前に投与することをさらに含む。本方法の特定の実施形態においては、移植患者は肺移植患者である。
【００２１】
本発明のさらに別の態様は、免疫応答阻害を必要としている患者において免疫応答を阻害する方法であって、式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩の治療有効量を患者に投与することを含む方法を提供する。一実施形態においては、免疫応答阻害を必要としている患者は、自己免疫疾患を有する。これに関して、本明細書においては、あらゆる自己免疫疾患が対象であり、例えば以下に限定されないが、同種免疫によって誘発される臓器移植（心臓、肺、肝臓、腎臓、膵臓、多臓器移植、造血幹細胞）後の自己免疫、膠原血管病（全身性エリテマトーデス、リウマチ性関節炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、強皮症）、多発性硬化症、インスリン依存の糖尿病、セリアック病、炎症性大腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、全身性エリテマトーデス、乾癬、インスリン依存の糖尿病（１型）が含まれる。特定の一実施形態においては、免疫応答阻害を必要としている患者は、ぜんそく、またはＴ細胞介在性肺疾患を有する。特定の実施形態においては、免疫応答は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答またはＣＤ４＋  Ｔ細胞応答を含む。一実施形態においては、制御性Ｔ細胞は、式Ｉの化合物によって阻害されない。さらなる実施形態においては、患者は、固形臓器移植患者である。
【００２２】
本発明の別の態様は、同種抗原によって誘発されるＴ細胞増殖を減少させる方法であって、マトリックスメタロプロテイナーゼ２およびマトリックスメタロプロテイナーゼ９を選択的に阻害することのできる化合物の治療有効量を移植患者に投与することを含む方法を提供する。
【００２３】
本発明のさらなる態様は、免疫応答阻害を必要としている患者において免疫応答を阻害する方法であって、マトリックスメタロプロテイナーゼ２およびマトリックスメタロプロテイナーゼ９を選択的に阻害することのできる化合物の治療有効量を患者に投与することを含む方法を提供する。
【００２４】
本発明の別の態様は、免疫抑制剤の投与量を減らす方法であって、免疫抑制剤の投与量減少を必要としている患者に、免疫抑制剤の投与の前または投与と同時に、式Ｉの化合物の有効量を投与することを含む方法を提供する。
【００２５】
本発明のさらなる態様は、免疫応答抑制を必要としている患者において免疫応答を抑制する方法であって、式Ｉの化合物の有効量を、公知の免疫抑制剤（免疫抑制薬）と組み合わせて患者に投与することを含む方法を提供する。これに関して、数多くの免疫抑制剤のうちの任意の免疫抑制剤を使用することができ、例えば、以下に限定されないが、シクロスポリンＡ、ＦＫ５０６、ラパマイシン、コルチコステロイド、プリン代謝拮抗剤（アザチオプリン、ミコフェノール酸など）、キャンパス、抗リンパ球グロブリンを使用することができる。
【００２６】
本発明の別の態様は、Ｖ型コラーゲンに対する免疫応答を減少させる方法であって、免疫応答減少を必要としている患者に、式Ｉの化合物の有効量を、Ｖ型コラーゲンまたはその寛容化部分（tolerizing fragment）の有効量と組み合わせて投与することを含む方法を提供する。一実施形態においては、患者は、肺移植を必要としている患者、または肺移植患者である。さらなる実施形態においては、Ｖ型コラーゲンまたはその寛容化部分は、経口投与または静脈内投与される。
【００２７】
本発明のさらなる態様は、移植患者において同種抗原によって誘発されるＴ細胞増殖を減少させる組成物であって、式Ｉの化合物の治療有効量を含有する組成物を提供する。特定の実施形態においては、式（Ｉ）の化合物は、本明細書に記載した式（Ｉａ）、式（Ｉｂ）、または式（Ｉｃ）の化合物、もしくはＳＢ−３ＣＴである。特定の実施形態においては、この組成物は、肺移植患者において同種抗原によって誘発されるＴ細胞増殖を減少させる。さらなる実施形態においては、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞である。特定の実施形態においては、組成物は、移植患者に臓器を提供する臓器提供者において臓器摘出前に使用する。
【００２８】
本発明の別の態様においては、移植患者または移植を必要としている患者においてコラーゲンに対する免疫応答を阻害する組成物であって、式Ｉの化合物の治療有効量を含有する組成物を提供する。特定の実施形態においては、式（Ｉ）の化合物は、本明細書に記載した式（Ｉａ）、式（Ｉｂ）、または式（Ｉｃ）の化合物、もしくはＳＢ−３ＣＴである。一実施形態においては、移植患者は、肺移植患者である。
【００２９】
本発明のさらなる態様は、移植の結果を改善する組成物であって、式Ｉの化合物の治療有効量を含有する組成物を提供する。特定の実施形態においては、式（Ｉ）の化合物は、本明細書に記載した式（Ｉａ）、式（Ｉｂ）、または式（Ｉｃ）の化合物、もしくはＳＢ−３ＣＴである。これに関して、一実施形態においては、組成物は、臓器提供者において臓器摘出の前に使用する。特定の実施形態においては、移植患者は、肺移植患者である。
【００３０】
本発明の別の態様は、免疫応答阻害を必要としている患者において免疫応答を阻害する組成物であって、式Ｉの化合物の治療有効量を含有する組成物を提供する。特定の実施形態においては、式（Ｉ）の化合物は、本明細書に記載した式（Ｉａ）、式（Ｉｂ）、または式（Ｉｃ）の化合物、もしくはＳＢ−３ＣＴである。特定の実施形態においては、免疫応答阻害を必要としている患者は、同種免疫によって誘発される臓器移植後の自己免疫、膠原血管病、および多発性硬化症からなる群から選択される自己免疫疾患を有する。一実施形態においては、免疫応答阻害を必要としている患者は、ぜんそく、またはＴ細胞介在性肺疾患を有する。特定の実施形態においては、Ｔ細胞応答は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答である。特定の一実施形態においては、ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答は、抗原特異的応答である。さらなる実施形態においては、免疫応答は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞応答を含んでおり、このＣＤ４＋  Ｔ細胞応答は抗原特異的応答とすることができる。特定の実施形態においては、組成物は、制御性Ｔ細胞を阻害しない。特定の実施形態においては、組成物は、固形臓器移植患者において使用する。
【００３１】
本発明のさらなる態様は、同種抗原によって誘発されるＴ細胞増殖を減少させる組成物であって、マトリックスメタロプロテイナーゼ２およびマトリックスメタロプロテイナーゼ９を選択的に阻害することのできる化合物の治療有効量を含有する組成物を提供する。
【００３２】
本発明の別の態様は、免疫応答阻害を必要としている患者において免疫応答を阻害する組成物であって、マトリックスメタロプロテイナーゼ２およびマトリックスメタロプロテイナーゼ９を選択的に阻害することのできる化合物の治療有効量を含有する組成物を提供する。これに関して、免疫応答は、抗原特異的な免疫応答とすることができる。
【００３３】
本発明のさらに別の態様は、式Ｉの化合物の有効量を、免疫抑制剤との組合せとして含有する組成物であって、免疫抑制剤の有効投与量が、式Ｉの化合物が存在しないときに通常使用される有効投与量と比較して減少する、組成物、を提供する。
【００３４】
本発明のさらなる態様は、患者において免疫応答を抑制する組成物であって、式Ｉの化合物の有効量を、公知の免疫抑制剤との組合せとして含有する組成物である。これに関して、免疫応答は、抗原特異的な免疫応答とすることができる。特定の実施形態においては、公知の免疫抑制剤は、以下に限定されないが、シクロスポリンＡ、ＦＫ５０６、ラパマイシン、コルチコステロイド、プリン代謝拮抗剤、キャンパス、抗リンパ球グロブリン、のうちの１つまたは複数とすることができる。
【００３５】
本発明の別の態様は、Ｖ型コラーゲンに対する免疫応答を減少させる組成物であって、Ｖ型コラーゲンに対する免疫応答減少を必要としている患者に、式Ｉの化合物の有効量を、Ｖ型コラーゲンまたはその寛容化部分の有効量と組み合わせて投与することを含む組成物である。特定の実施形態においては、患者は、肺移植を必要としている患者、または肺移植患者である。別の実施形態においては、Ｖ型コラーゲンまたはその寛容化部分は、経口投与または静脈内投与される。
【００３６】
本発明の別の態様は、薬剤の製造において、式（Ｉ）の化合物を含有する組成物を使用することであって、化合物は、式（Ｉａ）、式（Ｉｂ）、または式（Ｉｃ）の化合物、もしくはＳＢ−３ＣＴとすることができ、この薬剤は、移植患者において同種抗原によって誘発されるＴ細胞増殖を減少させる薬剤、移植患者または移植を必要としている患者においてコラーゲンに対する免疫応答を阻害する薬剤、移植の結果を改善する薬剤、免疫応答阻害を必要としている患者において免疫応答を阻害する薬剤、または、Ｖ型コラーゲンに対する免疫応答の減少を必要としている患者においてＶ型コラーゲンに対する免疫応答を減少させる薬剤である。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】ＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞におけるＭＭＰ９  ｍＲＮＡおよびタンパク質の異なる発現。脾臓の純粋なＡ）ＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＢ）ＣＤ８＋  Ｔ細胞を、抗ＣＤ３抗体（１μｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下で培養した。ＲＮＡを分離し、ｃＤＮＡを合成し、ｍＲＮＡの発現レベルを、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって測定した。データをβアクチンに対して正規化した。データは、トリプリケートで行った２回の別個の実験の代表値である。Ｃ）ＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の溶解物および上清のゼラチンザイモグラム分析。データは、４回の個別の実験のうちの１回の代表値である。
【図２】抗ＣＤ３抗体によって誘発されるＴ細胞増殖が、広範囲の特異的ＭＭＰ阻害によって抑止される。純粋脾臓ＣＤ４＋  Ｔ細胞を、Ａ）１，１０−フェナントロリン（０．００１〜０．１μＭ）またはＢ）ＣＯＬ−３（１〜１００μＭ）によって処理した。Ｃ）ＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＤ）ＣＤ８＋  Ｔ細胞を、ＳＢ３ＣＴ（５〜２５μＭ）またはビヒクル（ＣＲＰＭＩで同様に希釈したＤＭＳＯ＋ＰＥＧ）によって処理し、抗ＣＤ３抗体（０．５μｇ／ｍｌ）の存在下で７２時間培養した。Ｅ）ＳＢ３ＣＴ処理したＣＤ４＋  Ｔ細胞、Ｆ）ＳＢ３ＣＴ処理したＣＤ８＋  Ｔ細胞を、抗ＣＤ３抗体および外因性マウスＩＬ−２の存在下で７２時間培養した。Ｔ細胞の増殖を、３Ｈ−チミジン取り込みによって測定した。データは、トリプリケートで行った３回の実験の平均±の代表値である。＃ｐ＜０．０５、＊ｐ＜０．００１。
【図３】ＭＭＰ２欠損、ＭＭＰ９欠損、およびＭＭＰ２／９欠損のＣＤ４  Ｔ細胞では、増殖能力が変化する。野生型Ｔ細胞と、Ａ）ＭＭＰ２−／−ＣＤ４＋  Ｔ細胞、Ｂ）ＭＭＰ９−／−ＣＤ４＋  Ｔ細胞、Ｃ）ＭＭＰ２／９−／−ＣＤ４＋  Ｔ細胞、Ｄ）ＭＭＰ９−／−ＣＤ８＋  Ｔ細胞を、抗ＣＤ３抗体（０．５μｇ／ｍｌ）の存在下で７２時間培養した。Ｔ細胞の増殖を、３Ｈ−チミジン取り込みによって測定した。データは、トリプリケートで行った３回の別個の実験の平均±ＳＤの代表値である。＃ｐ＜０．０２、＊ｐ＝０．００６、＊＊ｐ＜０．００１。
【図４】ＭＭＰ欠損またはＭＭＰ阻害によってカルシウム流が減少する。Ａ）ＣＤ４＋  Ｔ細胞またはＢ）ＣＤ８＋  Ｔ細胞を、野生型マウスおよびＭＭＰ９−／−マウスから分離した。Ｃ、Ｄ）ＣＤ８＋  Ｔ細胞を、ＳＢ３ＣＴ（１０μＭ）またはビヒクル（ＣＲＰＭＩで同様に希釈したＤＭＳＯ＋ＰＥＧ）によって処理した。細胞を、Ａ〜Ｃ）カルシウムを含まない培地で、Ｄ）カルシウムを含んだ培地で培養し、抗ＣＤ３抗体（１０μｇ／ｍｌ）によって刺激した。カルシウム流を、リアルタイムで１００秒間測定した。データは、トリプリケートで行った３回の別個の実験のうちの１回の代表値である。
【図５】ＭＭＰ欠損またはＭＭＰ阻害によって、ＮＦＡＴｃ１およびＣＤ２５の発現が変化する。Ａ−Ｂ）野生型マウス、ＭＭＰ２−／−マウス、およびＭＭＰ９−／−マウスから、ＣＤ４＋  Ｔ細胞を分離した。Ｃ−Ｄ）ＣＤ４＋  Ｔ細胞を、ＳＢ３ＣＴ（５〜２０μＭ）またはビヒクル（ＣＲＰＭＩで同様に希釈したＤＭＳＯ＋ＰＥＧ）によって処理した。細胞を、抗ＣＤ３抗体（１μｇ／ｍｌ）の存在下および非存在下で培養した。ＮＦＡＴｃ１およびＣＤ２５の発現レベルを、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって測定した。データは、トリプリケートで行った３回の別個の実験の代表値である。＃ｐ＜０．０５、＃＃ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．００１。
【図６】ＭＭＰ９阻害によって、ＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞におけるＩＬ−２およびＩＦＮ−γの発現が下方制御される。Ａ−Ｂ）野生型マウスおよびＭＭＰ９−／−マウスからＣＤ４＋  Ｔ細胞を分離した。Ｃ−Ｄ）野生型ＣＤ４＋  Ｔ細胞を、ＳＢ３ＣＴ（１０μＭ）またはビヒクル（ＣＲＰＭＩで同様に希釈したＤＭＳＯ＋ＰＥＧ）によってさまざまな時間処理した。Ｅ−Ｆ）野生型マウスおよびＭＭＰ９−／−マウスからＣＤ８＋  Ｔ細胞を分離した。Ｇ−Ｈ）ＣＤ８＋  Ｔ細胞を、ＳＢ３ＣＴ（１０μＭ）によってさまざまな時間処理した。細胞を、抗ＣＤ３抗体（１μｇ／ｍｌ）の存在下および非存在下で培養した。ＩＬ−２およびＩＦＮ−γのｍＲＮＡ発現およびタンパク質発現を、それぞれ、定量的ＲＴ−ＰＣＲおよびＣＢＡ（サイトメトリビーズアレイ）によって測定した。データは、トリプリケートで行った３回の別個の実験の代表値である。＊ｐ＜０．００１。
【図７】ＭＭＰ９阻害は、制御性Ｔ細胞機能を誘発しない。野生型マウスおよびＭＭＰ９−／−マウスからＣＤ４＋  Ｔ細胞を分離し、ＳＢ３ＣＴ（１０μＭ）またはビヒクル（ＣＲＰＭＩで同様に希釈したＤＭＳＯ＋ＰＥＧ）によって処理し、抗ＣＤ３抗体（０．５μｇ／ｍｌ）の存在下および非存在下で培養した。Ａ，Ｂ）Ｆｏｘｐ３の発現を、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって測定した。Ｃ）細胞培養上清を採取し、ＩＬ−１０タンパク質の発現についてＣＢＡによって分析した。Ｄ）ＣＤ４＋２５−Ｔ細胞またはＥ）ＣＤ４＋２５＋  Ｔ細胞を、ＳＢ３ＣＴ（１０μＭ）によって処理し、抗ＣＤ３抗体（０．５μｇ／ｍｌ）の存在下で、未処理のＣＤ４＋２５−Ｔ細胞とのさまざまな混合割合で培養した。パネルＡおよびパネルＣのデータは、トリプリケートで行った１回の実験の代表値である。パネルＤおよびパネルＥのデータは、トリプリケートで行った３回の別個の実験の代表値である。＃ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．００１。
【図８】ＳＢ３ＣＴによって処理した抗原特異的Ｔ細胞（ＯＴ−Ｉ）は、増殖能力の減少を示す。Ａ）ＯＴ−ＩトランスジェニックＣＤ８＋  Ｔ細胞をＳＢ３ＣＴ（５〜２０μＭ）またはビヒクル（ＣＲＰＭＩで同様に希釈したＤＭＳＯ＋ＰＥＧ）によって処理し、ＯＶＡパルスした抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下で７２時間培養した。データは、トリプリケートで行った２回の別個の実験の代表値である。＃ｐ＜０．０５、＊ｐ＜０．００１。Ｂ）養子移入から７日後に、ＣＣ１０−ＯＶＡ（ＣＣ１０）マウスまたは非トランスジェニック（Ｂ６）マウスからのＢＡＬ液を分析し、ＢＡＬ液中に存在する全細胞を測定した。Ｃ）好中球をＧＲ１で染色し、フローサイトメトリーで分析した。刺激された野生型細胞と比較して、＊＊ｐ＜０．０１であった。治療群あたりマウスｎ＝１０（ＣＣ１０）および治療群あたりコントロールマウスｎ＝５（Ｂ６）。
【図９】抗原特異的ＣＤ８＋  エフェクターＴ細胞介在性の肺損傷のマウスモデル。Ａ）ＳＢ３ＣＴ（１０μＭ）またはビヒクル（ＣＲＰＭＩで同様に希釈したＤＭＳＯ＋ＰＥＧ）処理し、養子移入した後、ＣＤ８＋Ｔｈｙ１．１＋  Ｔ細胞をマウスの肺から分離した。Ｂ）ＣＣ１０−ＯＶＡマウスの肺からのＣＤ８＋Ｔｈｙ１．１＋  Ｔ細胞におけるＣＤ２５の発現。＊ｐ＜０．０１。治療群あたりマウスｎ＝９（ＣＣ１０）および治療群あたりコントロールマウスｎ＝５（Ｂ６）。
【図１０】ＭＭＰ阻害（ＳＢ３ＣＴ）または非存在（ＭＭＰ９欠損）に対応するＴ細胞活性化の差の概略図。正常な細胞条件下では、ＴＣＲ刺激（１）の後、カルシウム流の増大（３，４）など多数のシグナル伝達現象（２）が上方制御され、これによってＮＦＡＴ（５）、ＣＤ２５（６）、およびＩＬ−２（８）の発現が上方制御され、したがって、ＣＤ２５の細胞表面発現およびＩＬ−２の結合が可能となり細胞が活性化する。ＭＭＰ９が存在しないと、カルシウム流入が有意に増大するが、ＮＦＡＴの発現が下方制御される。ＮＦＡＴの発現が減少することでＣＤ２５およびＩＬ−２の発現が減少し、その一方で、調節経路であるＦｏｘｐ３およびＩＬ−１０が上方制御され、これによって細胞活性化が減少する。
【図１１】ＣＤ４＋  ＭＭＰ９−／−Ｔ細胞およびＣＤ８＋  ＭＭＰ９−／−Ｔ細胞の表現型分析。脾臓の純粋なＡ）ＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＢ）ＣＤ８＋  Ｔ細胞を、野生型マウス（実線、影の付いていないヒストグラム）およびＭＭＰ９欠損（影の付いたヒストグラム）マウスから分離した。細胞を抗ＣＤ３抗体（０．５μｇ／ｍｌ）の存在下で２４時間培養した。細胞を採取し、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６９、ＣＤ２５、ＣＤ４４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ６２Ｌ、およびＣＴＬＡ−４の表面発現を、フローサイトメトリーで分析した。破線のヒストグラムは、アイソタイプコントロールを表す。データは、２回の個別の実験のうちの１回の代表値である。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本発明は、ＭＭＰ２およびＭＭＰ９がＴ細胞内に存在し、Ｔ細胞の活性化を制御するという予期しない発見に関連する。したがって、本発明は、ＭＭＰ２およびＭＭＰ９の標的阻害によって免疫応答を阻害する方法を提供する。本発明は、ＭＭＰ阻害を必要としている被験体において、ＭＭＰ２もしくはＭＭＰ９またはその両方を選択的に阻害することによって、免疫応答を阻害する方法に関する。詳細には、本発明は、ＭＭＰ２もしくはＭＭＰ９またはその両方を選択的に阻害することによって、Ｔ細胞の応答を阻害する方法に関する。
【００３９】
マトリックスメタロプロテイナーゼ２およびマトリックスメタロプロテイナーゼ９
ＭＭＰ２およびＭＭＰ９の発現の上昇は、浸潤癌および腫瘍の癌、例えば、大腸腫瘍、胃癌、膵臓癌、乳癌、口腔癌、黒色腫、悪性神経膠腫、軟骨肉腫、および消化器腺癌において、しばしば見られる。悪性星細胞腫、癌性髄膜炎、および脳転移においてもレベルが増大する。浸潤癌においては、ＭＭＰは、基底膜および間質結合組織（いずれもＥＣＭ（細胞外マトリックス）の成分）を分解することによって、腫瘍の進行および転移を促進する。ＩＶ型コラーゲンはＥＣＭの主成分である。ＥＣＭの他の成分としては、ラミニン−５、プロテオグリカン、エクタクチン、およびオステオネクチンが挙げられる。ＭＭＰ２およびＭＭＰ９は、ＩＶ型コラーゲンを効果的に分解し、これによって転移癌細胞が基底膜を超えて移動することができる（非特許文献２２を参照）。
【００４０】
ＭＭＰは、多くの呼吸器系疾患において細胞外マトリックスのリモデリングを制御することも知られている。Ｗｉｓｔａｒ−Ｋｙｏｔｏラットモデルにおける実験では、虚血再灌流傷害を誘発させて非特異的ＭＭＰ阻害剤であるＣＯＬ−３によって処理したラットと、肺移植の前後にＭＭＰ阻害剤によって処理したラットとを比較した（非特許文献２３）。結果は、虚血再灌流傷害により、成長関連癌遺伝子／ＣＩＮＣ−１に依存する好中球流入が誘発され、腫瘍壊死因子αが上方制御された。（４時間後および２４時間後の）ＭＭＰ２およびＭＭＰ９の誘発は、ＢＡＬおよび肺間質において検出された抗原性コラーゲン（Ｖ）に関連付けられる。ＣＯＬ−３による処理によって、炎症因子が減少し、気管支肺胞洗浄における抗原性コラーゲン（Ｖ）のレベルが下がった。提供者の肺において肺の摘出前に、およびレシピエントにおいて移植後にＭＭＰを阻害することによって、酸素供給が改善され、同種移植片への多形核白血球の流入が減少した。
【００４１】
肺移植のラットモデルの実験結果から、非特異的阻害剤と比較して、特異的ＭＭＰ阻害剤の恩恵が示された。具体的には、メタロプロテイナーゼの組織阻害剤（ＴＩＭＰ−１およびＴＩＭＰ−２）は、ドナー抗原およびＶ型コラーゲン（拒絶反応に関与する抗原）に対する遅延型過敏反応にはそれぞれ異なる効果を有するが、拒絶反応の発現には影響しないことが、実験によって示されている。対照的に、ＣＯＬ−３（非特異的ＭＭＰ阻害剤）は、遅延型過敏反応のみならず、腫瘍壊死因子αおよびインターロイキン−１βの局所的な産生も抑制した。ＣＯＬ−３では、拒絶反応が阻止されず、移植組織内のＢ細胞過形成が誘発され、これは移植後のリンパ増殖性疾患を示唆する。
【００４２】
これまで、ＭＭＰが細胞内で機能して免疫細胞機能を制御できることは知られていない。ラットの肺移植モデルでは、非特異的ＭＭＰ阻害剤によってインビボでＭＭＰを非特異的にブロックすると、同種抗原および自己抗原によって誘発されるＴ細胞増殖が下方制御され（非特許文献２３）、このことは、拒絶反応の発症にＭＭＰ活性が関与していることを示唆している。
【００４３】
ＭＭＰ２およびＭＭＰ９のアミノ酸配列およびポリヌクレオチド配列は、ＧＥＮＢＡＮＫあるいはＳＷＩＳＳＰＲＯＴなどのデータベースにおいて公的に利用可能である。代表的な配列は、ＧＥＮＢＡＮＫ受入番号ＡＫ３１０３１４［ｇｉ：１６４６９２１００］、ＡＫ３１２７１１［ｇｉ：１６４６９０５１３］、およびＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  Ｐ０８２５３（０１−ＦＥＢ−１９９１、配列バージョン２）（ＭＭＰ２）、ならびにＮＭ＿００４９９４［ｇｉ：７４２７２２８６］、ＡＡＤ３７４０４［ｇｉ：５００２２９４］、およびＮＰ＿００４９８５［ｇｉ：７４２７２２８７］（ＭＭＰ９）に見出すことができる。当業者には認識されるように、これらは代表的な配列であり、さまざまな公共データベースにおいてＭＭＰ２およびＭＭＰ９の他の配列変異体を見出すことができ、本発明による標的阻害において対象となる。
【００４４】
本発明は、ＭＭＰ２およびＭＭＰ９を阻害する方法および化合物を提供する。詳細には、本発明は、ＭＭＰ２およびＭＭＰ９がＴ細胞内に存在しており、Ｔ細胞の活性化を制御するという発見に関連する。さらには、本発明は、ＭＭＰ２およびＭＭＰ９の特異的阻害剤であって、同種抗原および自己抗原によって誘発されるＴ細胞増殖を阻害する特異的作用により免疫抑制薬として使用することのできる阻害剤、を提供する。
【００４５】
ＳＢ−３ＣＴ系化合物の概要
一般的には、本明細書に記載されている方法に適するＭＭＰ阻害剤は、一般に３つの部分、すなわち、（１）大きな疎水性ポケットであるＰ１’サブサイトと相互作用する疎水性領域（例：ビフェニル部分）、（２）水素結合によってタンパク質骨格においてアミドと結合する水素結合供与部分（例：スルホン部分またはカルボニル部分）、（３）求核付加反応を受け、配位結合によって活性部位においてＺｎ２＋に結合することのできる求電子性部分（例：チイラン環またはエポキシド環）、を有する構造を有する。
【００４６】
適切なＭＭＰ阻害剤としては、例えば、特許文献１に記載されている阻害剤が挙げられ、当該文献はその全体を参照によって本出願に援用する。
【００４７】
式（Ｉ）
特定の具体的な実施形態においては、本明細書に記載されている方法に適する化合物は、式（Ｉ）によって表される。
【化６】
2012518001.tif 000008
式（Ｉ）
［式中、
ｍは、０、１、２、３、４、または５であり、
ｎは、０、１、２、３、４、または５であり、
ｐは、１、２、または３であり、
Ｘは、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ２−、または直接結合であり、
Ｙは、−Ｃ（Ｏ）−、または−Ｓ（Ｏ）２−であり、
Ｚは、−Ｏ−、または−Ｓ−であり、
Ｒ１は、各出現において同一または異なり、独立して、アルキル、アルケニル、アラルキル、ハロアルキル、ハロゲン、−ＯＲ８、または−ＮＲ９Ｒ１０であり、
Ｒ２は、各出現において同一または異なり、独立して、アルキル、アルケニル、アラルキル、ハロアルキル、ハロゲン、−ＯＲ８、または−ＮＲ９Ｒ１０であり、
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ同一または異なり、独立して、水素またはアルキルであり、
Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７は、それぞれ同一または異なり、独立して、水素またはアルキルであり、
Ｒ８は、水素、アルキル、アルケニル、またはアリールであり、
Ｒ９およびＲ１０は、それぞれ同一または異なり、独立して、水素またはアルキルである］
本明細書に記載した化合物の、薬学的に許容される塩も本発明に含まれる。
【００４８】
定義
「アルキル」は、炭素原子および水素原子のみからなり、不飽和を含んでおらず、１〜１５個の炭素原子を有する直鎖または分岐状の炭化水素鎖基を意味する。特定の実施形態においては、アルキルは、１〜８個の炭素原子を含んでいることができる。別の実施形態においては、アルキルは、１〜６個の炭素原子を含んでいることができる。アルキルは、単結合によって分子の残りに結合しており、例えば、メチル（Ｍｅ）、エチル（Ｅｔ）、ｎ−プロピル、１−メチルエチル（イソプロピル）、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、１，１−ジメチルエチル（ｔ−ブチル）、３−メチルヘキシル、２−メチルヘキシル、その他である。本明細書において特に明記しない限りは、アルキル基は、以下の置換基、すなわち、ハロ、シアノ、ニトロ、オキソ、チオキソ、トリメチルシラニル、−ＯＲａ、−ＯＣ（Ｏ）−Ｒａ、−Ｎ（Ｒａ）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒａ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲａ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒａ）２、−Ｎ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）ＯＲａ、−Ｎ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）Ｒａ、−Ｎ（Ｒａ）Ｓ（Ｏ）ｔＲａ（ｔは１または２）、−Ｓ（Ｏ）ｔＯＲａ（ｔは１または２）（各Ｒａは、独立して、水素、アルキル、ハロアルキル、アリール、アラルキルである）の１つまたは複数を有していてもよい。
【００４９】
「アルケニル」は、炭素原子および水素原子のみからなり、少なくとも１つの二重結合を含んでおり、２〜１２個の炭素原子を有する直鎖または分岐状の炭化水素鎖基を意味する。特定の実施形態においては、アルケニルは、２〜８個の炭素原子を含んでいることができる。別の実施形態においては、アルケニルは、２〜４個の炭素原子を含んでいることができる。アルケニルは、単結合によって分子の残りに結合しており、例えば、エテニル（すなわちビニル）、プロプ−１−エニル（すなわちアリル）、ブト−１−エニル、ペント−１−エニル、ペンタ−１，４−ジエニル、その他である。本明細書において特に明記しない限りは、アルケニル基は、以下の置換基、すなわち、ハロ、シアノ、ニトロ、オキソ、チオキソ、トリメチルシラニル、−ＯＲａ、−ＯＣ（Ｏ）−Ｒａ、−Ｎ（Ｒａ）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒａ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲａ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒａ）２、−Ｎ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）ＯＲａ、−Ｎ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）Ｒａ、−Ｎ（Ｒａ）Ｓ（Ｏ）ｔＲａ（ｔは１または２）、−Ｓ（Ｏ）ｔＯＲａ（ｔは１または２）および−Ｓ（Ｏ）ｔＮ（Ｒａ）２（ｔは１または２）（各Ｒａは、独立して、水素、アルキル、ハロアルキル、アリール、アラルキルである）の１つまたは複数を有していてもよい。
【００５０】
「アリール」は、環の炭素原子から水素原子を取ることによって芳香族単環炭化水素環系または芳香族多環炭化水素環系から誘導される基を意味する。芳香族単環炭化水素環系または芳香族多環炭化水素環系は、水素原子と、６〜１８個の炭素原子のみを含んでおり、環系における環の少なくとも１つは完全に不飽和である、すなわち、ヒュッケル（Ｈuｃｋｅｌ）理論に従って、周期的な非局在化（４ｎ＋２）π電子系を含んでいる。アリール基としては、例えば、以下に限定されないが、フェニル、フルオレニル、ナフチルが挙げられる。本明細書において特に明記しない限りは、用語「アリール」または接頭辞「ａｒ−」（例えばアラルキル）は、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロ、ハロアルキル、シアノ、ニトロ、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいアラルキルから独立して選択される１つまたは複数の置換基によって置換されていてもよいアリール基を含むものとする。
【００５１】
「アラルキル」は、式「−Ｒｂ−アリール」（Ｒｂはアルキレン鎖）の基を意味する。アルキレンは、直鎖または分岐状の二価炭化水素鎖であり、分子の残りをラジカル基に結合させ、炭素および水素のみから構成されており、不飽和を含んでおらず、１〜１２個の炭素原子を有し、例えば、メチレン、エチレン、プロピレン、ｎ−ブチレン、その他である。アルキレン鎖は、分子の残りと単結合によって結合しており、ラジカル基に単結合によって結合する。アルキレン鎖と分子の残りおよびラジカル基との結合点は、アルキレン鎖中の１個の炭素またはアルキレン鎖中の任意の２個の炭素によることができる。例示的なアラルキルとして、ベンジル、ジフェニルメチルが挙げられる。アラルキル基のアルキレン鎖部分は、アルキルについて上述したように任意の置換基を有していてもよい。アラルキル基のアリール部分は、アリール基について上述したように任意の置換基を有していてもよい。
【００５２】
「ハロゲン」は、ブロモ、クロロ、フルオロ、またはヨードを意味する。
【００５３】
「ハロアルキル」は、アルキル基（上に定義されている）に、１つまたは複数のハロ基（上に定義されている）の置換基を有するものを意味し、例えば、トリフルオロメチル、ジフルオロメチル、２，２，２−トリフルオロエチル、１−フルオロメチル−２−フルオロエチル、トリクロロメチル、その他である。ハロアルキル基のアルキル部分は、アルキル基について上述したように任意の置換基を有していてもよい。
【００５４】
式（Ｉ）の亜属
特定の実施形態においては、Ｘが−Ｏ−、Ｙが−Ｓ（Ｏ）２−、Ｚが−Ｓ−である。式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉａ）によって表すことができる。
【化７】
2012518001.tif 000009
式（Ｉａ）
【００５５】
式（Ｉａ）のさらなる実施形態においては、ｍが０、ｎが０、ｐが１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７が、それぞれ水素であり、式（Ｉａ）はＳＢ−３ＣＴである。
【化８】
2012518001.tif 000010
化ＳＢ−３ＣＴ
【００５６】
特定の別の実施形態においては、Ｘが−Ｓ−、Ｙが−Ｓ（Ｏ）２−、Ｚが−Ｓ−である。式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉｂ）によって表すことができる。
【化９】
2012518001.tif 000011
式（Ｉｂ）
【００５７】
特定の別の実施形態においては、Ｘが−ＣＨ２−、Ｙが−Ｓ（Ｏ）２−、Ｚが−Ｓ−である。式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉｃ）によって表すことができる。
【化１０】
2012518001.tif 000012
式（Ｉｃ）
【００５８】
式（Ｉ）、式（Ｉａ）、式（Ｉｂ）、および式（Ｉｃ）の化合物の製造方法
式（Ｉ）の化合物（式（Ｉａ）、式（Ｉｂ）、および式（Ｉｃ）の化合物を含む）は、以下の一般的な反応スキームに従って調製することができる。
【化１１】
2012518001.tif 000013
【００５９】
ＭＭＰ２およびＭＭＰ９の他の阻害剤
ＭＭＰ２活性もしくはＭＭＰ９活性、またはその両方（遺伝子発現またはタンパク質の活性）を阻害する本発明の化合物または薬剤は、合成化合物や天然化合物のライブラリを含めた幅広い入手源から得ることができる。例えば、各種の有機化合物および生体分子のランダム合成および指向性合成のための膨大な手段を利用することができる（例えば、ランダムオリゴヌクレオチドおよびランダムオリゴペプチドの発現）。あるいは、細菌、真菌、植物、および動物の抽出物の形での天然化合物のライブラリが利用可能である、または容易に作成することができる。さらには、天然または合成によって作成されたライブラリおよび化合物を、従来の化学的手段、物理的手段、および生化学的手段によって容易に修飾することができ、これらを使用してコンビナトリアルライブラリを作成することができる。さらには、公知の薬剤に指向的またはランダムな化学的修飾（例えば、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化）を行って、構造的類似体を生成することもできる。合理的薬物設計またはコンピュータモデリングなどの方法を使用して、新しい治療薬候補を作成することもできる。
【００６０】
本発明による、ＭＭＰ２もしくはＭＭＰ９またはその両方を阻害するために使用する薬剤は、化合物、組成物、または分子の「ライブラリ」、すなわちコレクションからスクリーニングすることができる。このような分子は、一般には、この技術分野において「低分子」として知られている化合物であって、分子量が１０５ダルトン未満、好ましくは１０４ダルトン未満、さらに好ましくは１０３ダルトン未満である化合物を含んでいる。例えば、試験化合物のライブラリのメンバーを、精製したＭＭＰ２もしくはＭＭＰ９またはその両方に接触させるかまたは加える、あるいは適切な動物モデル（例えば、本明細書に記載したマウスやラットモデル）においてインビボで投与することができる。ＭＭＰ２もしくはＭＭＰ９またはその両方を阻害する能力があると識別された化合物は、治療目的に有用であり得る。なぜなら、そのような化合物は、本明細書に記載した病気を治療することができ、治療において免疫抑制剤として使用できるためである。
【００６１】
さらには、ＭＭＰ２もしくはＭＭＰ９またはその両方を阻害する化合物を、コンビナトリアルライブラリのメンバーとして提供することができ、コンビナトリアルライブラリは、複数の反応容器において実行される複数の所定の化学反応に従って調製される合成化合物を含んでいることが好ましい。例えば、特定の構成物に対して、反応条件の複数の順列もしくは組合せまたはその両方を追跡しながら実施することのできる固相合成、記録される無作為混合法（recorded random mix methodologies）、記録される反応分離手法（recorded reaction split techniques）のうちの１つまたは複数を採用して、さまざまな出発化合物を調製することができる。得られた生成物のライブラリに対して、スクリーニングの後に反復的な選択・合成手順を行うことができ、このようなライブラリとしては、ペプチドの合成コンビナトリアルライブラリー（例えば、特許文献２および特許文献３を参照）または本明細書に提示した低分子を含む他の組成物の合成コンビナトリアルライブラリー（例えば、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７、および特許文献８を参照）が挙げられる。この技術分野における通常の技能を有する者には、このようなライブラリーの多様な種類を確立された方法に従って作成し、従来の公知のスクリーニング法を使用して試験できることが理解されるであろう。
【００６２】
ＭＭＰ２もしくはＭＭＰ９またはその両方を阻害する本発明の物質および化合物は、ＭＭＰ２ポリペプチドもしくはＭＭＰ９ポリペプチドまたはその両方に結合する抗体を含んでいることもできる。抗体は、インビボでポリペプチドの活性を阻害またはブロックする修飾剤として機能することができる。これに代えて、またはこれに加えて、ＭＭＰ２もしくはＭＭＰ９またはその両方の内因性活性についてのスクリーニングにおいて抗体を使用することができ、あるいは、このポリペプチドを精製するため、あるいは試料内でこのポリペプチドの活性レベルを分析するため、あるいはこのポリペプチドの発現を研究する目的で、抗体を修飾剤として使用することができる。このような抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルとすることができ、一般的にＭＭＰ２もしくはＭＭＰ９またはその両方に特異的である。特定の実施形態においては、抗体はポリクローナルである。
【００６３】
抗体は、この技術分野における通常の技能を有する者に公知であるさまざまな手法のいずれかによって作製することができる（例えば非特許文献２４を参照）。このような手法の１つでは、最初に、ＳＰＬポリペプチドまたはその抗原部分を含んでいる免疫原を、適切な動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ）に、好ましくは、１回または複数の追加免疫を組み込んだ所定のスケジュールに従って注入する。ウサギの使用が好ましい。免疫原性を高めるため、免疫原を、例えばグルタルアルデヒドまたはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合させることができる。注入の後、定期的に動物から採血し、ＭＭＰ２もしくはＭＭＰ９またはその両方に結合するポリクローナル抗体を含んだ免疫後血清を得る。次いで、ＭＭＰ２ポリペプチドもしくはＭＭＰ９ポリペプチドまたはその両方、もしくは適切な固体支持体に結合したその抗原部分を使用し、例えば親和性クロマトグラフィーによって、このような抗血清からポリクローナル抗体を精製することができる。このようなポリクローナル抗体は、スクリーニング目的またはウエスタンブロット法に直接使用することができる。
【００６４】
より具体的には、（例えばニッケルカラムを使用して）精製された１０μｇのＳＫポリペプチドまたはＳＰＬポリペプチドを、体積１ｍＬの完全フロイントアジュバント（１：１  ｖ／ｖ）で乳化することで、成体ウサギ（例：ＮＺＷ）を免疫化することができる。免疫化は、少なくとも６箇所の異なる皮下部位における注射によって達成することができる。それに続いて、５μｇのＭＭＰ２ポリペプチドもしくはＭＭＰ９ポリペプチドまたはその両方を完全フロイントアジュバントで乳化し、同様に注射することができる。免疫化は、適切な血清抗体価が得られるまで続けることができる（一般には合計で３回程度の免疫化）。免疫化の直前にウサギから採血して免疫前血清を得て、その後、各免疫化から７〜１０日後に採血する。
【００６５】
特定の実施形態においては、モノクローナル抗体が望ましい。モノクローナル抗体は、例えば、非特許文献２５の方法およびその改良された方法を使用して、調製することができる。要約すれば、これらの方法では、望ましい特異性（すなわち対象のポリペプチドに対する反応）を有する抗体を産生することのできる不死化細胞株を作製する。このような細胞株は、例えば、上述したように免疫化した動物から得られる脾臓細胞から作製することができる。例えば、骨髄腫細胞融合パートナー、好ましくは、免疫化した動物と同系である骨髄腫細胞融合パートナーとの融合によって、脾臓細胞を不死化することができる。例えば、脾臓細胞および骨髄腫細胞を非イオン系界面活性剤と数分間混合し、骨髄腫細胞の成長を支持せずハイブリッド細胞の成長を支持する選択培地上で低密度において培養することができる。好ましい選択方法として、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）選択を使用する。十分な時間の後（通常では約１〜２週間後）、ハイブリッドのコロニーが観察される。シングルコロニーを選択し、ポリペプチドに対する結合活性について試験する。高い反応性および特異性を有するハイブリドーマが好ましい。
【００６６】
モノクローナル抗体は、成長中のハイブリドーマコロニーの上清から分離することができる。さらに、適切な脊椎動物宿主（例えばマウス）の腹膜腔にハイブリドーマ細胞株を注入するなど、さまざまな技術を使用して収率を上げることができる。この場合、モノクローナル抗体を腹水液または血液から採取することができる。夾雑物は、従来の技術（例えば、クロマトグラフィー、ゲルろ過、沈殿、および抽出）によって、抗体から除去することができる。
【００６７】
ＭＭＰ２もしくはＭＭＰ９またはその両方に特異的に結合する抗体は、Ｋａが約１０４Ｍ−１以上、好ましくは約１０５Ｍ−１以上、より好ましくは約１０６Ｍ−１以上、さらに好ましくは約１０７Ｍ−１〜１０９Ｍ−１以上においてポリペプチドに結合するならば、上記のポリペプチドと特異的結合を介して相互作用する。結合パートナー（例えば抗体）と、結合パートナーが結合するポリペプチドの親和性は、従来の技術（例えば、非特許文献２６、非特許文献２７、または非特許文献２８に記載されている技術）を使用して容易に求めることができる。
【００６８】
上述したように、本発明は、ＭＭＰ２ポリペプチドもしくはＭＭＰ９ポリペプチドまたはその両方の発現（転写または翻訳）、安定性、活性のうちの少なくとも１つを変化させる物質または化合物を提供する。そのような修飾剤を同定するため、さまざまなスクリーニングのいずれかを実行することができる。候補の修飾剤は、さまざまな入手源（例えば、植物、真菌、化学物質のライブラリ、小分子、ランダムペプチド）から周知の技術を使用して得ることができる。本発明のＭＭＰ２ポリペプチドまたはＭＭＰ９ポリペプチドに結合する抗体と、ＭＭＰ２タンパク質もしくはＭＭＰ９タンパク質またはその両方をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするアンチセンスポリヌクレオチドは、ＭＭＰ２およびＭＭＰ９を阻害する本発明の方法において使用することができ、免疫抑制剤として機能することができる。特定の実施形態においては、このような阻害剤は、副作用が最小限であり、毒性がない。いくつかの用途においては、細胞を浸透することのできる阻害剤が好ましい。
【００６９】
ＭＭＰ２もしくはＭＭＰ９またはその両方を阻害する化合物は、膨大な化学的クラスを包含するが、一般には有機分子であり、好ましくは、５０ダルトンより大きく約２５００ダルトン未満の分子量を有する低分子有機化合物である。阻害性の化合物は、タンパク質との構造的相互作用（特に水素結合）に必要な官能基有し、一般には、少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシル、またはカルボキシル基を含んでおり、好ましくはこれら化学的官能基のうちの少なくとも２つを含んでいる。阻害性の化合物は、１つまたは複数の上記の官能基によって置換された環状炭素または複素環構造、あるいは芳香族構造または多環芳香族構造をしばしば含む。また、候補化合物は、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、およびこれらの誘導体、構造的類似体、これらの組合せを含む生体分子の中からも見出される（ただしこれらに限定されない）。
【００７０】
本明細書には、ＭＭＰ２活性もしくはＭＭＰ９活性またはその両方を阻害する化合物が記載されているが、本発明の実施形態に従って使用するためのさらなる好適な化合物は、通常の方法（例えば、本出願に援用する参考文献に記載されている方法）に従って同定することができる。例えば、本明細書には、ＭＭＰ２活性もしくはＭＭＰ９活性またはその両方を検出する方法を、実施例に記載した。ＭＭＰ２活性およびＭＭＰ９活性を阻害する化合物（例えば、ＭＭＰポリペプチドをコードする核酸分子を作製するためのポリヌクレオチド配列及びＭＭＰポリペプチドを産生するためのポリヌクレオチド配列）を対象として、化合物ライブラリをスクリーニングする方法は、この技術分野において公知であり、商業的に入手可能である。例えば、非特許文献２９を参照。分子生物学の方法に関連する実施形態の場合、この技術分野における通常の技能を有する者に周知である組成物および方法は、例えば、非特許文献３０、非特許文献３１、非特許文献３２、そのほかさまざまな文献に記載されている。本明細書に記載した特定の実施形態では、被験体において免疫機能を調節する方法であって、ＭＭＰ２もしくはＭＭＰ９またはその両方を阻害する化合物（例えばＳＢ−３ＣＴ）を、任意に１つまたは複数の追加の化合物（例えば他の免疫抑制剤）と組み合わせて投与することを含む方法を、明示的に意図している。
【００７１】
本明細書に記載したように、意図される特定の実施形態は、ＭＭＰ２活性もしくはＭＭＰ９活性またはその両方を減少させる化合物を投与することによって、被験体において免疫機能を阻害する方法、に関し、この化合物は、特定の実施形態においては、タンパク質に直接結合することによって、ＭＭＰ２活性もしくはＭＭＰ９活性またはその両方を減少させる化合物、を含んでいることができ、その一方で、別の特定の実施形態においては、ＭＭＰ９活性またはその両方を減少させる化合物は、例えば、ＭＭＰ活性に影響を及ぼす別の細胞分子成分と相互作用することによって、ＭＭＰ活性を間接的に減少させる。意図する特定の実施形態は、タンパク質の発現レベルを低下させることによって、ＭＭＰ２活性もしくはＭＭＰ９活性またはその両方を減少させることのできる化合物に関する。ＧＥＮＢＡＮＫＴＭおよびＳＷＩＳＳＰＲＯＴＴＭ、ならびにＰｕｂＭｅｄなどの公共データベースからは、ＭＭＰ２ポリペプチドもしくはＭＭＰ９ポリペプチドまたはその両方をコードする核酸分子と、それらを測定する方法を記載している豊富な開示情報を得ることができる。また、非特許文献３３も参照されたい。当業者には容易に理解できるように、ＭＭＰ２もしくはＭＭＰ９またはその両方をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチドは、本明細書においては、例えば、中程度に厳格な条件下でハイブリダイズするヌクレオチドが意図されており、このような条件としては、例えば、５Ｘ  ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中で予洗し、５０〜６５℃、５Ｘ  ＳＳＣにおいて一晩ハイブリダイズさせた後、０．１％  ＳＤＳを含んだ２Ｘ、０．５Ｘ、および０．２Ｘ  ＳＳＣによって、６５℃において２０分間にわたり２回洗浄することによる。
【００７２】
関連する特定の実施形態によると、ＭＭＰ２発現レベルもしくはＭＭＰ９発現レベルまたはその両方を減少させる化合物は、ＭＭＰ２ポリペプチドもしくはＭＭＰ９ポリペプチドまたはその両方をコードする核酸分子に特異的にハイブリダイズするアンチセンスポリヌクレオチド、ＭＭＰ２ポリペプチドまたはＭＭＰ９ポリペプチドをコードする核酸分子を特異的に切断するリボザイム、ＭＭＰ２ポリペプチドもしくはＭＭＰ９ポリペプチドまたはその両方をコードする核酸分子を妨害することのできる低分子干渉ＲＮＡ、または、ＭＭＰ２ポリペプチドもしくはＭＭＰ９ポリペプチドまたはその両方をコードする核酸分子に結合される調節要素の活性を変化させる化合物、とすることができる。本明細書に開示し、かつこの技術分野において公知であるように、このような核酸配列に基づく化合物は、通常の方法を使用して容易に調製することができる。
【００７３】
したがって、コード配列の少なくとも一部分に相補的なポリヌクレオチド（例えば、アンチセンスポリヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、またはリボザイム）を使用して、ＭＭＰ２をコードする遺伝子の発現もしくはＭＭＰ９をコードする遺伝子の発現またはその両方をモジュレートすることができる。アンチセンス剤として使用するオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、およびリボザイムの同定と、それらの標的送達のための遺伝子をコードするＤＮＡの同定では、この技術分野において周知の方法を使用する。例えば、このようなオリゴヌクレオチドの望ましい特性、長さ、およびその他の特徴は、周知である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一般には、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、スルホン、スルフェート、ケチル、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデート、リン酸エステルなどの結合、および他のこのような結合を使用することによって、内因性の核酸分解酵素による分解に耐性を有するように設計する（例えば、非特許文献３４、非特許文献３５、非特許文献３６、非特許文献３７、非特許文献３８、非特許文献３９、非特許文献４０、非特許文献４１、非特許文献４２、非特許文献４３、を参照）。
【００７４】
アンチセンスポリヌクレオチドは、配列特異的に核酸（例えば、ｍＲＮＡまたはＤＮＡ）に結合するオリゴヌクレオチドである。相補的な配列を有するｍＲＮＡに結合すると、アンチセンスは、そのｍＲＮＡの翻訳を阻止する（例えば、特許文献９、特許文献１０、特許文献１１、特許文献１２、非特許文献４４（ダンベルアンチセンスオリゴヌクレオチドを記載している）を参照）。三本鎖分子とは、一本鎖ＤＮＡが二本鎖ＤＮＡと結合して共直線性の三重鎖分子を形成し、それにより転写を阻止することを指す（例えば、二本鎖ＤＮＡ上の標的部位に結合する合成オリゴヌクレオチドを作製する方法を記載している特許文献１３を参照）。
【００７５】
特に有用なアンチセンスヌクレオチドおよび三本鎖分子は、ＭＭＰ２ポリペプチドもしくはＭＭＰ９ポリペプチドまたはその両方をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡのセンス鎖に相補的な分子、またはセンス鎖に結合する分子である、または、ＭＭＰ２ポリペプチドもしくはＭＭＰ９ポリペプチドまたはその両方をコードするｍＲＮＡの翻訳の阻害が影響されるように、内因性のＭＭＰ２もしくはＭＭＰ９またはその両方の発現に関連する他の任意のプロセスを調節するタンパク質である。アンチセンスＲＮＡに転写することのできるｃＤＮＡ構築物を細胞または組織に導入して、アンチセンスＲＮＡの生成を促進することもできる。アンチセンス技術を使用することで、ポリメラーゼ、転写因子、または他の調節分子の結合の妨害を通じて遺伝子発現を制御することができる（非特許文献４５）。あるいは、アンチセンス分子を、ＭＭＰをコードする遺伝子の制御領域（例えば、プロモーター、エンハンサー、または転写開始部位）とハイブリダイズして遺伝子の転写をブロックするように設計する、または、リボソームへの転写産物の結合を阻害することによって翻訳をブロックするように設計することができる。
【００７６】
本発明は、ＭＭＰ２もしくはＭＭＰ９またはその両方をコードする核酸配列に特異的なリボザイムの使用も意図する。リボザイムは、ＲＮＡ基質（例えばｍＲＮＡ）を特異的に切断するＲＮＡ分子であり、結果として、細胞遺伝子発現が特異的に阻害または妨害される。ＲＮＡ鎖の切断もしくは連結またはその両方に関与するリボザイムは、少なくとも５つのクラスが知られている。リボザイムは、任意のＲＮＡ転写を特異的に標的とすることができ、このような転写物を触媒的に切断することができる（例えば、特許文献１４、特許文献１５、特許文献１６、特許文献１７、特許文献１８を参照）。ＭＭＰ２  ｍＲＮＡ特異的リボザイムもしくはＭＭＰ９  ｍＲＮＡ特異的リボザイムまたはその両方、あるいはそのようなリボザイムをコードする核酸を、宿主細胞に送達して、ＭＭＰ２遺伝子発現もしくはＭＭＰ９遺伝子発現またはその両方の阻害をもたらすことができる。したがって、真核生物プロモーター（例えば真核ウイルス生物プロモーター）に結合するリボザイムをコードするＤＮＡによって、リボザイムを宿主細胞に送達することができ、したがって、核内に入るとリボザイムが直接転写される。リボザイム標的として使用するための、ＭＭＰ２をコードするｍＲＮＡもしくはＭＭＰ９をコードするｍＲＮＡまたはその両方の特に有用な配列領域は、この技術分野において公知である通常の配列アラインメントツール（例えばＢＬＡＳＴまたはＭｅｇＡｌｉｇｎ）を使用して見出すことができ、特定の細胞内に存在しうる別の転写配列に対して、ＭＭＰ２をコードするｍＲＮＡもしくはＭＭＰ９をコードするｍＲＮＡまたはその両方に特有である配列であることが好ましい。
【００７７】
ポリヌクレオチドをさらに修飾して、インビボでの安定性を高めることができる。可能な修飾としては、以下に限定されないが、５’末端もしくは３’末端またはその両方においてフランキング配列を追加すること、主鎖においてホスホジエステル結合ではなくホスホロチオエートまたは２’Ｏ−メチルを使用すること、非伝統的な塩基（例えば、イノシン、キューオシン、ワイブトシン）のほか、アデニン、シチジン、グアニン、チミン、ウリジンのアセチル化、メチル化、チオ化、およびその他の修飾形態を含めること、などが挙げられる。
【００７８】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、二本鎖ＲＮＡによって生じる、ポリヌクレオチド配列特異的な、転写後遺伝子サイレンシング・メカニズムであり、このメカニズムは特定のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の分解を起こし、これにより、ｍＲＮＡによってコードされる所望の標的ポリペプチドの発現が減少する（例えば、特許文献１９、特許文献２０、特許文献２１、非特許文献４６、非特許文献４７、非特許文献４８、非特許文献４９を参照）。哺乳動物（ヒトを含む）など高度な真核生物において特定のポリペプチドの発現を妨害する「低分子干渉ＲＮＡ」（ｓｉＲＮＡ）またはＤＮＰ−ＲＮＡポリヌクレオチドも議論されている（例えば、非特許文献５０、非特許文献５１、非特許文献５２、非特許文献５３を参照。さらには例えば、非特許文献５４、非特許文献５５、非特許文献５６、非特許文献５７、非特許文献５８、非特許文献５９、非特許文献６０、非特許文献６１、非特許文献６２、非特許文献４８、非特許文献６３、非特許文献６４、非特許文献６５も参照）。ヒトまたは他の哺乳動物の細胞に、約１８〜２７のヌクレオチド塩基対長の二本鎖ＲＮＡを導入すると、対応するヌクレオチド配列を含んだメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）によってコードされる特定のポリペプチドの発現が配列特異的に妨害される（特許文献２２、非特許文献４８、非特許文献６６、非特許文献４９、非特許文献６７、非特許文献６８、非特許文献６９）。
【００７９】
上述したように、特定の実施形態においては、ＭＭＰ２発現レベルもしくはＭＭＰ９発現レベルまたはその両方を減少させる化合物は、ＭＭＰ２ポリペプチドもしくはＭＭＰ９ポリペプチドまたはその両方をコードする核酸分子に結合する調節要素の活性を変化させることができる。上記の実施形態および関連する実施形態は、代表的な例として、これに限定されないが、ＭＭＰ２をコードする遺伝子もしくはＭＭＰ９をコードする遺伝子またはその両方の転写を抑制することによってＭＭＰ２活性もしくはＭＭＰ９活性またはその両方を下方制御することのできる適切な化合物を意図しており、これらの化合物は、この技術分野において受け入れられている方法を使用して、ＭＭＰ２遺伝子転写もしくはＭＭＰ９遺伝子転写またはその両方の機能ブロッカーをスクリーニングすることで、容易に識別することができる。
【００８０】
使用方法
本発明の方法は、免疫応答を阻害することが望ましいさまざまな病気の状態において使用することができる。本発明は、ＭＭＰ２およびＭＭＰ９がＴ細胞内に存在し、Ｔ細胞の活性を制御するという予期しない知見に関連する。したがって、本発明は、ＭＭＰ２およびＭＭＰ９の標的阻害によって免疫応答を阻害する方法を提供する。詳細には、本発明は、患者、または免疫応答阻害を必要としている被験体において免疫応答を阻害する方法であって、本明細書に記載されている化合物など、ＭＭＰ２特異的阻害剤もしくはＭＭＰ９特異的阻害剤またはその両方の治療有効量を患者に投与することによって、ＭＭＰ２もしくはＭＭＰ９またはその両方を特異的に阻害することによる方法、を提供する。これに関して、本発明は、さまざまな自己免疫疾患において免疫応答を阻害する目的に使用することができ、そのような疾患としては、以下に限定されないが、同種免疫によって誘発される臓器移植後の自己免疫（心臓、肺、肝臓、腎臓、膵臓、多臓器移植、造血幹細胞）、膠原血管病（全身性エリテマトーデス、リウマチ性関節炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、強皮症）、リウマチ性関節炎、多発性硬化症、インスリン依存の糖尿病、アジソン病、セリアック病、慢性疲労症候群、炎症性大腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、線維筋痛症、全身性エリテマトーデス、乾癬、シェーグレン症候群、甲状腺機能高進症／グレーブス病、甲状腺機能低下症／橋本病、インスリン依存の糖尿病（１型）、重症筋無力症、子宮内膜症、強皮症、悪性貧血、グッドパスチャー症候群、ヴェーゲナー病、糸球体腎炎、再生不良性貧血、発作性夜間血色素尿症、骨髄異形成症候群、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性溶血性貧血、エバンス症候群、第ＶＩＩＩ因子阻害剤症候群、全身性血管炎、皮膚筋炎、多発性筋炎、リウマチ熱が挙げられる。
【００８１】
本明細書において提供する方法は、ぜんそく、特発性肺線維症、線維性疾患などの疾患においてと、損傷、例えば、人工呼吸器誘発肺損傷、虚血再灌流傷害、オゾンによる肺損傷、脊髄損傷、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、スティーブンスジョンソン症候群、単純ヘルペスウイルス脳炎において、免疫応答を減少させることも意図している。
【００８２】
本発明は、固形臓器移植において同種抗原によって誘発されるＴ細胞増殖を減少させる方法を提供する。これに関して、本発明の方法は、任意の固形臓器移植、例えば、以下に限定されないが、肺、心臓、腎臓、肝臓、膵臓、および腸、の移植において使用することができる。したがって、本発明は、同種抗原によって誘発されるＴ細胞増殖を減少させる方法であって、ＭＭＰ２特異的阻害剤もしくはＭＭＰ９特異的阻害剤またはその両方の治療有効量を移植患者に投与することを含む方法を提供する。本発明の特定の実施形態においては、阻害剤は、本明細書に記載されている式Ｉの化合物または他の関連する化合物、または、ＭＭＰ２もしくはＭＭＰ９またはその両方の発現を下方制御するｓｉＲＮＡ分子、または、ＭＭＰ２もしくはＭＭＰ９またはその両方の活性をブロックする抗体、を有しうる。特定の実施形態においては、本発明は、本明細書に記載されている阻害剤など、ＭＭＰ２特異的阻害剤もしくはＭＭＰ９特異的阻害剤またはその両方の治療有効量を、移植患者に臓器を提供する臓器提供者に、臓器摘出の前に投与する。これによって、同種抗原によって誘発される応答がさらに減少する。
【００８３】
さらなる実施形態においては、本発明は、臓器移植患者または臓器移植を必要としている患者においてコラーゲンに対する免疫応答を阻害する方法であって、ＭＭＰ２もしくはＭＭＰ９またはその両方の特異的阻害剤の治療有効量を患者に投与することを含む方法を提供する。特定の実施形態においては、移植患者は、肺移植レシピエントである。本発明の関連する実施形態においては、特定の条件時に、経口的、または静脈内、または本明細書に記載されている他の経路によるＶ型コラーゲンの投与と併用して、ＭＭＰ２もしくはＭＭＰ９またはその両方の特異的阻害剤を投与することが望ましい。
【００８４】
さらに、本発明は、臓器移植の結果を改善する方法であって、本明細書に記載されている化合物など、ＭＭＰ２特異的阻害剤もしくはＭＭＰ９特異的阻害剤またはその両方の治療有効量を移植患者に投与することを含む方法を提供する。特定の実施形態においては、移植患者に臓器を提供する臓器提供者に、本明細書に記載されている化合物など、ＭＭＰ２阻害剤もしくはＭＭＰ９阻害剤またはその両方の治療有効量を、臓器摘出の前に投与することが望ましい。「結果を改善する」とは、移植片の受け入れを改善する、移植片拒絶反応あるいは移植片対宿主病を減少させる、移植後の移植片への酸素供給を維持することを意味する。
【００８５】
免疫抑制剤は、毒性が高いことが周知である。ステロイド系薬物は１０年にわたり使用されており、その有害作用は周知である。長期的にステロイド治療を受けている全患者に予測される副作用としては、骨粗しょう症、中心性肥満、創傷治癒の遅延、感染症、小児の成長遅延が挙げられる。それより発生頻度の少ない副作用としては、筋疾患、高血圧、脂質異常症、糖尿病、白内障が挙げられる。いくつかの副作用は、進行するため患者の監視が必要となる。そのような副作用として、緑内障、頭蓋内圧高進、腸穿孔、潰瘍が挙げられる。
【００８６】
自己免疫疾患、例えば、重症筋無力症（ＭＧ）、リウマチ性関節炎（ＲＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症（ＭＳ）、若年性関節炎（最初にコルチコステロイドによって治療されることが多い）において、ステロイドによる治療が効かなくなると、さらに毒性の強い薬剤（例えば、アザチオプリン、メトトレキサート、シクロホスファミド）が用いられる。アザチオプリンの主たる効果は、ＤＮＡ合成を阻害することによりＴリンパ球およびＢリンパ球の数を減らす。さらに、アザチオプリンは、混合リンパ球反応および免疫グロブリン産生を阻害するが、遅延型過敏症につねに有効であるわけではない。アザチオプリンの主な副作用は、汎血球減少症、特に、リンパ球減少症および顆粒球減少症である。結果として、ウイルス、真菌、マイコバクテリア、原虫に感染する危険性が高まる。腎臓移植患者では、リンパ網内系悪性腫瘍の増大も報告されているが、リウマチ性関節炎患者ではそのような報告はない。
【００８７】
メトトレキサートは、葉酸の合成を阻害し、細胞毒性であり、骨髄を抑制する。リウマチ性関節炎に対してメトトレキサートを少量で使用する場合、リンパ球の数は減少せず、ＩｇＭおよびＩｇＧが低下する。副作用としては、肺炎、吐き気、胃のもたれ、口内炎、白血球減少、血小板減少、および肝線維症（肝生検でのみ診断されうる）が挙げられる。
【００８８】
リウマチ性関節炎の治療には、シクロホスファミドも使用される。シクロホスファミドは肝臓内で代謝され、ＤＮＡに架橋を形成する化合物が生成される。シクロホスファミドは細胞毒性であり、たとえ少量でも強い毒性が見られる。リウマチ性関節炎に対する作用として、Ｂリンパ球およびＴリンパ球の数を減少させ、免疫グロブリン濃度を下げ、増殖刺激に対するＢ細胞の反応性を低下させる。脱毛、感染症、強い吐き気は一般に見られる。長期投与した場合、患者の悪性腫瘍の発症率が高まる。
【００８９】
シクロスポリンは、白血球を抑制しないが、強い免疫抑制剤であり、リウマチ性関節炎の治療に効果的である。しかしながら、重要な副作用は腎臓毒性である。
【００９０】
ＣＤ４に対するモノクローナル抗体は、自己免疫疾患において使用されてきたが、非特異的な免疫抑制が生じる。新しい治療として、Ｔリンパ球への特異的誘発抗原の最初の提示を妨害することが推奨されてきた（非特許文献７０）。
【００９１】
リウマチ性関節炎において特に使用されてきた他の薬剤としては、金塩、抗マラリア薬、スルファサラジン、ペニシラミンが挙げられる。金塩は、筋肉注射によって投与され、効果が数ヶ月間見られないことがある。金塩による治療の副作用としては、骨髄形成不全、糸球体腎炎、肺毒性、血管運動反応、炎症が挙げられる。抗マラリア薬は、リンパ球の数を減少させることなく免疫系にいくつかの影響を及ぼす。抗マラリア薬の最も重大な副作用としては、網膜色素沈着、発疹、胃腸障害が挙げられる。スルファサラジンは、リウマチ性関節炎に対していくつかの効果を有するが、多数の副作用がある。ペニシラミンは、リウマチ性関節炎において効果的に使用されてきたが、その多くの副作用のため使用が制限される。ペニシラミンは、別の自己免疫疾患（例えば、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス）を引き起こすことが報告されている。
【００９２】
患者が同種移植片（他人または別の移植元から移植された組織）を受け入れるとき、免疫抑制剤が投与されない場合、患者の免疫系によって同種移植片が迅速に破壊されうる。現在では、何種類もの臓器および組織（例えば、腎臓、心臓、肺、皮膚、骨髄、角膜、肝臓）が移植されている。移植患者に高い頻度で使用される薬剤としては、シクロスポリン、アザチオプリン、ラパマイシン、その他のマクロライド（例えばＦＫ５０６）、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、ＣＤ４抗体、シクロホスファミドが挙げられる。これらの薬剤は、移植患者には自己免疫疾患の患者よりも多量かつ長期にわたり投与しなければならないことが多い。したがって、（上に挙げた）これらの薬剤による副作用は、移植患者では一般的に見られ、かつ重大である。
【００９３】
要約すれば、免疫抑制剤は、毒性が高いことが周知である。ＭＭＰ２阻害剤もしくはＭＭＰ９阻害剤またはその両方と治療を組み合わせることによって、必要な投与量を減らすことは有利である。したがって、本発明は、ＭＭＰ２もしくはＭＭＰ９またはその両方に特異的な阻害剤の投与と、さまざまな公知の免疫抑制剤との投与とを組み合わせることによって、毒性の免疫抑制剤の必要な投与量を減らす方法、をさらに提供し、この場合の公知の免疫抑制剤は、例えば、シクロスポリン、タクロリムス（ＦＫ５０６）、シロリムス（ラパマイシン）、メトトレキサート、アザチオプリン、メルカプトプリン、細胞毒性抗生物質（例えば、ダクチノマイシン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、およびミトラマイシン）、シクロホスファミド、プリン類似体、グルココルチコイド、抗体（例えば、ＣＤ２０抗体、ＣＤ３抗体、抗ＩＬ−２レセプター）、インターフェロン、ＴＮＦ結合タンパク質、およびミコフェノール酸モフェチルである。
【００９４】
さらに、本発明は、ＭＭＰ２もしくはＭＭＰ９またはその両方に特異的な阻害剤を、他の公知の治療法（例えば他の免疫抑制剤）と組み合わせて投与することによって、免疫応答を減少または阻害する方法、を提供する。
【００９５】
本明細書において使用する「免疫応答」とは、免疫系の細胞、例えば、以下に限定されないが、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、および樹枝状細胞、が活性化されて、特定の細胞の特定のエフェクター機能が誘発されることを意味する。エフェクター機能としては、例えば、以下に限定されないが、抗原の提示、増殖、サイトカインの産生、抗体の分泌、調節分子もしくは接着分子またはその両方の発現、活性化分子の発現、細胞崩壊を誘発する能力が挙げられる。免疫系の任意のＴ細胞、例えば、ＣＤ８＋  Ｔ細胞、ＣＤ４＋  Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、アロ反応性Ｔ細胞、抗原特異的Ｔ細胞、記憶Ｔ細胞が、本明細書で使用する「免疫応答」の一部となることができる。当業者には認識されるように、免疫系の細胞は、細胞表面マーカーの発現パターン、サイトカイン発現パターン、またはエフェクター機能によって、同定、精製、または測定することができる。
【００９６】
本明細書で使用する「免疫応答を減少または阻害する」とは、免疫系の成分（例：サイトカイン）の量、または免疫系の成分を特徴付ける活性のいずれかを減少させることを意味する。一例として、被験体の免疫応答を阻害することとして、存在するサプレッサーＴリンパ球または制御性Ｔリンパ球の数を増大させる、被験体におけるサプレッサーＴリンパ球または制御性Ｔリンパ球による免疫抑制因子の分泌を増大させる、被験体に存在する細胞傷害性Ｔリンパ球の数を減少させる、被験体における細胞傷害性Ｔリンパ球の細胞障害活性を減少させる、抗体の量を減少させる、補体タンパク質の量を減少させる、補体タンパク質が細胞と相互作用する能力を減少させる、などが挙げられる。したがって、「減少させる」または「阻害する」は、特定の免疫調節サイトカインまたは免疫系の特定の細胞（例えば制御性Ｔ細胞）の活性または量が増大することも意味しうる。
【００９７】
免疫応答の変化を測定するためのアッセイおよび方法は、この技術分野において周知である。例えば、免疫系の成分は、各種のサイトカインのレベルを、この技術分野において公知である多数のアッセイ（例えば、非特許文献７１に記載されているアッセイ）のいずれかを使用して測定することによって、全身的に（例えば末梢血から）、または局所的に（例えば、特定の細胞試料（例：脾臓細胞、リンパ節細胞、腫瘍、ＭＡＬＴ、ＧＡＬＴなど）から）、測定することができる。サイトカインに特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を使用してサイトカインの発現を検出および測定するためのさまざまなプロトコルは、この技術分野において公知である。その例として、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ＥＬＩＳＰＯＴ、細胞内サイトカイン染色アッセイ（ＩＣＳ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）、細胞ベースのアッセイ（例えばＩＬ−２依存Ｔ細胞アッセイ）が挙げられる。いくつかの用途においては、特定のポリペプチド上で２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を利用する、モノクローナルベースの２部位免疫測定が好ましいが、競合結合アッセイも使用することができる。上記およびその他のアッセイは、特に、非特許文献７２および非特許文献７３に記載されている。
【００９８】
免疫応答のエフェクター機能の増大および減少を測定するためのさまざまな細胞アッセイが、当業者には周知であり、例えば非特許文献７１に記載されている。これらのアッセイとしては、増殖アッセイ、細胞毒性Ｔ細胞アッセイ（例えばクロム放出アッセイまたは類似するアッセイ）、細胞内サイトカイン染色アッセイ、ＥＬＩＳＰＯＴのほか、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはＲＴ−ＰＣＲベースの任意の数のアッセイを使用した遺伝子発現分析が挙げられる。本明細書に記載されている方法を実施するために有用である一般的なアッセイおよび技術は、例えば、非特許文献７４、非特許文献７５、非特許文献３２、およびその他の文献にも記載されている。さらに、抗体産生の測定（特異的抗体または一般的な抗体）を使用して、免疫応答およびその変化を測定することもできる。
【００９９】
一般的には、免疫応答を減少させるまたは阻害することには、体液性応答もしくは細胞性応答またはその両方の減少が含まれるが、本明細書で前述したように、制御性Ｔ細胞またはサプレッサーＴ細胞、またはそのような細胞によって産生されるサイトカインの数もしくは活性またはその両方が増大することも含まれる。免疫応答のそのような「阻害」または「減少」としては、１種類または複数の該当する免疫細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞、抗原提示細胞、樹枝状細胞、その他）のレベル、または、１種類または複数のこれら免疫細胞の活性（ＣＴＬ活性、ヘルパーＴリンパ球（ＨＴＬ）活性、サイトカイン産生、サイトカイン産生状況の変化）のレベルを、この技術分野において公知である技術、および本明細書に記載されている技術を使用して測定したときの、統計的に有意な任意の減少（または適切な場合、例えば制御性Ｔ細胞またはサプレッサーＴ細胞においては増大）が含まれる。
【０１００】
特定の実施形態においては、免疫応答の阻害には、ＭＭＰ２阻害剤もしくはＭＭＰ９阻害剤またはその両方が投与された被験体において、抗原特異的Ｔ細胞またはアロ反応性Ｔ細胞の活性が、１／１．５〜１／５に減少することが含まれる。別の実施形態においては、免疫応答の阻害には、本明細書に記載されているＭＭＰ２阻害剤もしくはＭＭＰ９阻害剤またはその両方が投与された被験体において、抗原特異的Ｔ細胞またはアロ反応性Ｔ細胞の活性が、約１／２、１／２．５、１／３、１／３．５、１／４、１／４．５、１／５、１／５．５、１／６、１／６．５、１／７、１／７．５、１／８、１／８．５、１／９、１／９．５、１／１０、１／１０．５、１／１１、１／１１．５、１／１２、１／１２．５、１／１５、１／１６、１／１７、１／１８、１／１９、１／２０、またはそれ以下に減少することが含まれる。
【０１０１】
さらなる実施形態においては、免疫応答の阻害には、本明細書に記載されているＭＭＰ２阻害剤もしくはＭＭＰ９阻害剤またはその両方が投与された被験体において、抗原特異的ＨＴＬまたはアロ反応性ＨＴＬの活性（例えば、ヘルパーＴ細胞の増殖）が、１／１．５〜１／５に減少することが含まれる。別の実施形態においては、免疫応答の阻害には、本明細書に記載されているＭＭＰ２阻害剤もしくはＭＭＰ９阻害剤またはその両方が投与された被験体において、抗原特異的ＨＴＬまたはアロ反応性ＨＴＬの活性（例えば、ヘルパーＴ細胞の増殖）が、約１／２、１／２．５、１／３、１／３．５、１／４、１／４．５、１／５、１／５．５、１／６、１／６．５、１／７、１／７．５、１／８、１／８．５、１／９、１／９．５、１／１０、１／１０．５、１／１１、１／１１．５、１／１２、１／１２．５、１／１５、１／１６、１／１７、１／１８、１／１９、１／２０、またはそれ以下に減少することが含まれる。これに関して、ＨＴＬ活性の阻害には、１種類または複数の特定のサイトカイン（例えば、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、またはその他のサイトカイン）の産生が減少することが含まれる。
【０１０２】
さらなる実施形態においては、免疫応答の阻害には、本明細書に記載されているＭＭＰ２阻害剤もしくはＭＭＰ９阻害剤またはその両方が投与された被験体において、抗原特異的ＣＴＬまたはアロ反応性ＣＴＬの活性（例えば、細胞毒性Ｔ細胞の増殖）が、１／１．５〜１／５に減少することが含まれる。別の実施形態においては、免疫応答の阻害には、本明細書に記載されているＭＭＰ２阻害剤もしくはＭＭＰ９阻害剤またはその両方が投与された被験体において、抗原特異的ＣＴＬまたはアロ反応性ＣＴＬの活性が、約１／２、１／２．５、１／３、１／３．５、１／４、１／４．５、１／５、１／５．５、１／６、１／６．５、１／７、１／７．５、１／８、１／８．５、１／９、１／９．５、１／１０、１／１０．５、１／１１、１／１１．５、１／１２、１／１２．５、１／１５、１／１６、１／１７、１／１８、１／１９、１／２０、またはそれ以下に減少することが含まれる。これに関して、ＣＴＬ活性の阻害には、この技術分野において公知の適切なアッセイ（例：クロム放出アッセイ、細胞内サイトカイン染色アッセイ、ＥＬＩＳＰＯＴ）によって測定される、ＣＤ８＋  Ｔ細胞の細胞毒性活性が減少することが含まれる。
【０１０３】
さらなる実施形態においては、免疫応答の減少または阻害には、本発明の方法によってＭＭＰ２阻害剤もしくはＭＭＰ９阻害剤またはその両方が投与された被験体において、特異的抗体の産生が、１／１．５〜１／５に減少することが含まれる。別の実施形態においては、免疫応答の減少または阻害には、本発明の方法によってＭＭＰ２阻害剤もしくはＭＭＰ９阻害剤またはその両方が投与された被験体において、特異的抗体の産生が、約１／２、１／２．５、１／３、１／３．５、１／４、１／４．５、１／５、１／５．５、１／６、１／６．５、１／７、１／７．５、１／８、１／８．５、１／９、１／９．５、１／１０、１／１０．５、１／１１、１／１１．５、１／１２、１／１２．５、１／１５、１／１６、１／１７、１／１８、１／１９、１／２０、またはそれ以下に減少することが含まれる。
【０１０４】
本発明の特定の実施形態においては、本発明のＭＭＰ２阻害剤もしくはＭＭＰ９阻害剤またはその両方の投与は、制御性Ｔ細胞に影響を及ぼさない。制御性Ｔ細胞は、本明細書に記載されているアッセイを使用して測定することができ、細胞表面マーカーの発現によって同定することができる。具体的には、当業者には理解されるように、制御性Ｔ細胞は、古典的には、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＧＩＴＲ＋、およびＦｏｘＰ３＋表現型を有する（例えば、非特許文献７６、非特許文献７７、非特許文献７８、非特許文献７９、非特許文献８０を参照）。制御性Ｔ細胞の同定および定量には、他のマーカーも有用であり得る（例えば、非特許文献８１を参照）。
【０１０５】
本明細書において使用する「被験体」は、任意の哺乳動物を意味する。特定の実施形態においては、被験体はヒトの患者である。さらなる実施形態においては、被験体は、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ヒト以外の霊長類、ブタ、またはその他の実験動物である。特定の実施形態においては、被験体は、免疫抑制治療を必要としているヒトの患者、臓器移植を必要としている患者、または臓器移植患者である。
【０１０６】
当業者には容易に理解されるように、免疫応答の阻害または減少の測定には、別の方法として、免疫応答の臨床的表出など、例えば、以下に限定されないが、移植の拒絶反応の減少または改善、ＧＶＨＤまたは移植片対宿主拒絶反応の減少、自己免疫症状の減少など測定することができる。
【０１０７】
医薬組成物
本発明のＭＭＰ２およびＭＭＰ９阻害剤化合物、またはその薬学的に許容される塩単独またはその適切な医薬組成物としての投与は、類似する効用を提供する化合物の一般的に受け入れられている投与形態のいずれかによって行うことができる。本発明の医薬組成物は、本発明の化合物を、薬学的に許容される適切な担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせることによって調製することができ、固体、半固体、液体、または気体の形で（例えば、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、軟膏、液剤、座薬、注射、吸入剤、ジェル、ミクロスフェア、エアゾールとして）製剤することができる。さらには、他の医薬活性成分（例えば他の免疫抑制剤）もしくは適切な賦形剤（例えば、塩、緩衝剤、安定剤）またはその両方を、組成物に含めることができる。
【０１０８】
投与は、さまざまな異なる経路（例えば、経口、非経口、経鼻、静脈内、皮内、皮下、または局所的）によって達成することができる。好ましい投与形態は、治療または予防する状態の性質に依存する。投与の後に、免疫応答の発現またはそのような反応の臨床的表出が減少、阻害、予防、または遅延する量を、有効量とみなす。
【０１０９】
特定の実施形態においては、投与する量は、本明細書において記載したように免疫活性が減少するうえで十分な量である。正確な投与量および治療の期間は、治療する疾病の関数であり、公知の試験プロトコルを使用することによって、またはこの技術分野において公知のモデルシステムにおいて組成物を試験し、そこから外挿することによって、実験的に求めることができる。比較臨床試験を行うこともできる。投与量は、緩和する状態の重症度によっても変わる。医薬組成物は、一般的には、治療上有用な効果が得られる一方で、望ましくない副作用が最小であるように製剤して投与する。組成物は、一回に投与する、または、複数の少ない量に分けて間隔をあけて投与することができる。特定の被験体においては、時間の経過とともに必要に応じて用法・用量を調整することができる。
【０１１０】
本発明の化合物は、単独で投与する、または他の公知の治療法、例えば、免疫抑制療法、放射線療法、化学療法、臓器移植、経口型コラーゲン療法、免疫療法、ホルモン療法、光線力学療法と組み合わせて投与することができる。
【０１１１】
したがって、上記および関連する医薬組成物の一般的な投与経路としては、以下に限定されないが、経口、局所的、経皮、吸入、非経口、舌下、口腔、直腸、膣内、経鼻が挙げられる。本明細書において使用される用語「非経口」は、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、胸骨注射、または点滴法が挙げられる。本発明の医薬組成物は、組成物が患者に投与されたときに、中に含まれている活性成分が生物学的に利用可能となる（bioavailable）ように製剤する。被験体または患者に投与される組成物は、１つまたは複数の投与単位の形をとり、例えば、錠剤を１投与単位とすることができ、エアゾール形式での本発明の化合物の容器は、複数の投与単位を保持することができる。このような投与形態を調製する実際の方法は、この技術分野において公知である、または明らかであり、例えば、非特許文献８２を参照。いずれの場合も、投与される組成物は、本発明の教示内容に従って対象の疾病または状態を治療することを目的として本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩の治療有効量を含んでいる。
【０１１２】
本発明の医薬組成物は、固体または液体の形をとることができる。一態様においては、担体は微粒子であり、したがって、組成物は、例えば、錠剤形態または粉末形態である。担体を液体とすることができ、この場合、組成物は、例えば、経口油、注入可能な液体、またはエアゾールであり、エアゾールは特に吸入投与において有用である。
【０１１３】
経口投与を意図する場合、医薬組成物は、固体形態または液体形態であることが好ましく、この場合、半固体、半液体、懸濁液、およびジェルの形態も、本明細書において固体または液体とみなされる形態に含まれる。
【０１１４】
経口投与用の固体組成物としては、医薬組成物は、粉末、顆粒、圧縮錠、丸薬、カプセル、チューインガム、ウエハースなどの形態に製剤することができる。このような固体組成物は、一般には、１種類または複数の不活性希釈剤または食用担体を含んでいる。さらには、結着剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、微結晶性セルロース、トラガカント、ゼラチン）、賦形剤（例えば、スターチ、ラクトース、デキストリン）、崩壊剤（例えば、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、プリモゲル、コーンスターチ）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステロテックス）、流動促進剤（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）、甘味剤（例えば、スクロース、サッカリン）、香料添加剤（例えば、ペパーミント、メチルサリチル酸、オレンジフレーバー）、および着色剤、のうちの１種類または複数を含めることができる。
【０１１５】
医薬組成物がカプセル（例えばゼラチンカプセル）の形態であるとき、医薬組成物は、カプセルの材料に加えて、液体担体（例えばポリエチレングリコールまたはオイル）を含んでいることができる。
【０１１６】
医薬組成物は、液体の形態（例えば、エリキシル剤、シロップ、溶液、エマルジョン、懸濁液）とすることができる。液体は、２種類の例として、経口投与または注射投与とすることができる。経口投与を意図するときには、好ましい組成物は、本発明の化合物に加えて、甘味剤、防腐剤、染料／着色剤、調味料のうちの１種類または複数を含んでいる。注射による投与を意図する組成物においては、界面活性剤、防腐剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、緩衝剤、安定剤、等張剤のうちの１種類または複数を含めることができる。
【０１１７】
本発明の液体医薬組成物は、溶液、懸濁液、または他の類似する形態のいずれにおいても、補助剤として、滅菌希釈剤（例えば、注射用蒸留水、食塩水（好ましくは生理食塩水）、リンガー溶液、等張食塩水、固定油（例えば合成モノグリセリドまたは合成ジグリセリド（溶媒または懸濁化剤の役割を果たす））、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の溶媒）、抗菌剤（例えば、ベンジルアルコール、メチルパラベン）、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸水素ナトリウム）、キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸）、緩衝剤（例えば、アセテート、クエン酸塩、リン酸塩）、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム、Ｄ形グルコース）、のうちの１種類または複数を含んでいることができる。非経口製剤は、アンプル、使い捨て注射器、またはガラス製またはプラスチック製の複数回投与用バイアルに封入することができる。生理食塩水は、好ましい補助剤である。注入可能な医薬組成物は、滅菌されていることが好ましい。
【０１１８】
非経口投与または経口投与のいずれかを意図する本発明の液体医薬組成物は、適切な用量が得られるような量の本発明の化合物を含んでいるべきである。この量は、一般には、組成物における本発明の化合物が少なくとも０．０１％である。経口投与を意図するときには、この量は、組成物の重量の０．１％〜約７０％の範囲内の値でありうる。特定の経口医薬組成物は、本発明の化合物を約４％〜約７５％を含んでいる。本発明による特定の医薬組成物および医薬品は、本発明の希釈前の化合物の０．０１〜１０重量％が非経口投与単位に含まれるように調製する。
【０１１９】
本発明の医薬組成物は、局所投与を意図することができ、この場合、担体は、溶液、エマルジョン、軟膏、またはジェル基剤を適切に有しうる。基剤は、例えば、ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、蜜蝋、鉱油、希釈剤（例えば、水、アルコール）、乳化剤、安定剤のうちの１種類または複数を有しうる。局所投与用の医薬組成物には、増粘剤を含めることもできる。経皮投与を意図する場合、本組成物は、経皮貼布またはイオントフォレーゼ装置を含んでいることができる。局所製剤は、本発明の化合物を約０．１〜約１０％（ｗ／ｖ：単位体積あたり重量）の濃度で含んでいる。
【０１２０】
本発明の医薬組成物は、直腸投与（例えば座薬の形）を意図することができ、座薬が直腸内で溶けて薬剤を放出する。直腸投与用の組成物は、適切な非刺激性の賦形剤として脂肪性基剤を含んでいることができる。このような基剤としては、以下に限定されないが、ラノリン、ココアバター、ポリエチレングリコールが挙げられる。
【０１２１】
本発明の医薬組成物は、固体投与単位または液体投与単位の物理形態のバリエーションとしてさまざまな材料を含んでいることができる。例えば、本組成物は、活性成分の周囲のコーティング層を形成する材料を含んでいることができる。コーティング層を形成する材料は、一般には不活性であり、例えば、砂糖、セラック、その他の腸溶性コーティング剤から選択することができる。あるいは、活性成分をゼラチンカプセルで包むことができる。
【０１２２】
固体形態または液体形態における本発明の医薬組成物は、本発明の化合物に結合し、それによって化合物の送達を支援する化合物を含んでいることができる。このような役割を果たし得る適切な化合物としては、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、タンパク質、またはリポソームが挙げられる。
【０１２３】
本発明の医薬組成物は、エアゾールとして投与することのできる投与単位からなることができる。用語「エアゾール」は、コロイド的性質の系から、圧縮パッケージから構成される系までさまざまな系を表すために使用している。送達は、液化または圧縮された気体によって、または活性成分を送り込む適切なポンプシステムによって、行うことができる。本発明の化合物のエアゾールは、活性成分を送り込むために単一相系、二相系、または三相系で送達することができる。エアゾールの送達には、必要な容器、活性剤、弁、副容器が含まれ、これらは１つのキットを形成している。この技術分野における通常の技能を有する者には、必要以上の実験を行うことなく、好ましいエアゾールを決定することができる。
【０１２４】
本発明の医薬組成物は、薬学分野において周知の方法によって調製することができる。例えば、注射によって投与するように意図される医薬組成物は、本発明の化合物を、滅菌蒸留水と混合して溶液とすることにより調製することができる。均一な溶液または懸濁液の形成を促進するため、界面活性剤を加えることができる。界面活性剤は、水性送達系における化合物の溶解または均一な懸濁を促進するように、本発明の化合物と非共有結合的に相互作用する化合物である。
【０１２５】
本発明の化合物、またはその薬学的に許容される塩は、治療有効量において投与され、治療有効量は、使用する特定の化合物の活性を含むさまざまな要因、すなわち、化合物の代謝的安定性および作用の長さ、患者の年齢、体重、健康状態、性別、および食生活、投与の形態および時間、排泄速度、薬物の組合せ、特定の疾患または状態の重症度、治療を受ける被験体、に依存して変化する。一般的には、治療上有効である日用量は、（７０ｋｇの哺乳動物の場合）約０．００１ｍｇ／ｋｇ（すなわち０．０７ｍｇ）〜約１００ｍｇ／ｋｇ（すなわち７．０ｇ）であり、好ましくは、治療上有効である日用量は、（７０ｋｇの哺乳動物の場合）約０．０１ｍｇ／ｋｇ（すなわち０．７ｍｇ）〜約５０ｍｇ／ｋｇ（すなわち３．５ｇ）であり、より好ましくは、治療上有効である日用量は、（７０ｋｇの哺乳動物の場合）約１ｍｇ／ｋｇ（すなわち７０ｍｇ）〜約２５ｍｇ／ｋｇ（すなわち１．７５ｇ）である。
【０１２６】
本発明の化合物、またはその薬学的に許容される塩は、１種類または複数の別の治療薬と同時に、別の治療薬の前に、または別の治療薬の後に、投与することもできる。このような組合せ治療としては、本発明の化合物と１種類または複数の追加の活性薬剤とを含んでいる単一の医薬投与製剤を投与する方法と、本発明の化合物と各活性薬剤とをそれぞれ個別の医薬投与製剤において投与する方法とが挙げられる。例えば、本発明の化合物および別の活性薬剤を錠剤またはカプセルなど１個の経口投与組成物において一緒に患者に投与することができ、または、各薬剤を個別の経口投与製剤において投与することができる。個別の投与製剤を使用するときには、本発明の化合物と１種類または複数の追加の活性薬剤とを、本質的に同じ時刻に（すなわち同時に）投与する、または時間をずらせて（すなわち連続的に）投与することができる。組合せ治療は、これらの投薬方式すべてを含むことを理解されたい。
【０１２７】
本発明の化合物は、本明細書に記載した疾病または疾患、例えば、自己免疫疾患あるいは臓器移植に関連付けられる疾患に罹った個人に投与することができる。ヒトの病気を治療する目的でインビボで使用する場合、本明細書に記載した化合物は、一般的には、投与する前に医薬組成物に配合される。医薬組成物は、本明細書に記載されている化合物の１種類または複数を、本明細書に記載した生理学的に許容される担体または賦形剤との組合せにて含有する。医薬組成物を調製するには、１種類または複数の化合物の有効量を、当業者に公知である医薬担体または賦形剤と混合して、特定の投与形態に適するようにする。医薬担体は、液体、半液体、または固体とすることができる。非経口投与、皮内投与、皮下投与、および局所投与に使用される溶液または懸濁液は、例えば、滅菌希釈剤（例えば水）、食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、およびその他の合成溶媒と、抗菌剤（例えば、ベンジルアルコール、メチルパラベン）、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸水素ナトリウム）およびキレート剤（例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））、緩衝剤（例えば、アセテート、クエン酸塩、リン酸塩）を含んでいることができる。静脈内投与する場合には、適切な担体は、生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）と、増粘剤および可溶化剤（例えば、グリコール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはこれらの混合物）を含んだ溶液とを含んでいる。
【０１２８】
本明細書に記載した化合物は、身体から短時間で排泄されないように化合物を保護する担体（例えば、徐放製剤またはコーティング）を用いて調製することができる。このような担体は、制御放出製剤を含んでおり、例えば、以下に限定されないが、埋込錠およびマイクロカプセルを用いる送達システムや、生分解性かつ生体適合性のポリマー（例えば、エチレン酢酸ビニール、ポリ無水物、ポリグリコール酸、ポリオルトエステル、ポリ乳酸、およびこの技術分野における通常の技能を有する者に公知である他の物質）が挙げられる。
【実施例】
【０１２９】
実施例１
ＭＭＰ９がＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞において発現する
Ｔ細胞の活性化におけるＭＭＰの役割を調べる目的で、マウス脾臓の活性化したＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の細胞溶解物及び条件培地（conditioned media）において、ＭＭＰ９のｍＲＮＡ発現パターンおよびタンパク質発現パターンを、定量的ＲＴ  ＰＣＴおよび基質ザイモグラフィーによって測定した。図１に示したように、刺激する前のＣＤ４＋  Ｔ細胞（図１Ａ）およびＣＤ８＋  Ｔ細胞（図１Ｂ）において、ＭＭＰ９  ｍＲＮＡ発現は検出可能なレベルであった。抗ＣＤ３抗体による刺激の後、ＭＭＰ９  ｍＲＮＡ転写レベルは両方の細胞集団において増大したが、ＣＤ８＋  転写レベルの方が顕著であった。ＭＭＰ９タンパク質発現の分析（図１Ｃ）では、未処理のＣＤ４＋  Ｔ細胞溶解物およびＣＤ８＋  Ｔ細胞溶解物においてプロＭＭＰ９の高い発現が見られた。抗ＣＤ３抗体による刺激の後、Ｔ細胞溶解物ではプロＭＭＰ９発現がわずかに減少し、上清において活性ＭＭＰ９が発現している。
【０１３０】
実施例２
抗ＣＤ３によって誘発されるＴ細胞増殖が広域ＭＭＰ阻害によって抑止される
Ｔ細胞活性化に対するＭＭＰの影響を調べる目的で、増殖アッセイを使用した。このアッセイでは、１，１０−フェナントロリン（非特異的な亜鉛キレート剤、０．００１〜０．１μＭ）およびＣＯＬ−３（１〜１００μＭ）によってＴ細胞を６時間処理した後、可溶性の抗ＣＤ３抗体によって７２時間刺激した。図２Ａに示したように、０．００１μＭの１，１０−フェナントロリンによって処理したＴ細胞は、そのような処理をせずに抗ＣＤ３抗体によって刺激した細胞と同程度の増殖反応を示したのに対して、高い用量では、増殖反応が大幅に抑止された（ｐ＜０．００１）。高濃度のフェナントロリンにおいて観察されたこの抑制効果は、処理後に細胞が生存しているため、毒性によるものではない。１μＭのＣＯＬ３によって処理したＴ細胞は、未処理のコントロールと同じように増殖反応を示した。しかしながら高用量では、用量に依存してＴ細胞の増殖が減少した（図２Ｂ）。全体としてこれらのデータは、抗ＣＤ３抗体によって誘発されるＴ細胞増殖が、広域ＭＭＰ阻害によって抑止されることを実証しており、Ｔ細胞の活性化におけるＭＭＰの重要な役割を示唆している。
【０１３１】
実施例３
抗ＣＤ３によって誘発されるＴ細胞増殖が、ＭＭＰ２およびＭＭＰ９の高選択的阻害によって抑止される
広域ＭＭＰ阻害剤（ＭＭＰＩ）を使用した過去の研究では、特異性の欠如と、ＭＭＰに関連しない他のシグナル伝達現象に対する負の影響とが報告されている（Ｓａｎｄｌｅｒら、２００５）。したがって、上述した、Ｔ細胞増殖に対するＣＯＬ−３および１，１０−フェナントロリンの影響は、ＭＭＰに関連しない活性に起因していることも考えられる。この状況を回避するため、選択性の高いＭＭＰ２およびＭＭＰ９（ゼラチナーゼ）阻害剤であるＳＢ−３ＣＴを使用した。この阻害剤は、ＭＭＰ２およびＭＭＰ９の活性部位における酵素依存プロセスにおいて変換され、（Ｂｒｏｗｎら、２０００；  Ｔｏｔｈら、２０００）強結合性阻害（tight-binding inhibition）につながる（Ｆｏｒｂｅｓら、２００９）。Ｔ細胞増殖に対するゼラチナーゼ特異的阻害の影響を調べるため、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスからＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を分離し、ＳＢ−３ＣＴによって処理した後、可溶性の抗ＣＤ３抗体の存在下で培養した。ＳＢ−３ＣＴによって処理したＣＤ４＋  Ｔ細胞（図２Ｃ）およびＣＤ８＋  Ｔ細胞（図２Ｄ）では、ビヒクルによって処理した細胞と比較して、抗ＣＤ３抗体による刺激に応答しての増殖が投与量に依存して減少した。さらに、タンパク質レベルにおけるゼラチナーゼ阻害を確認するため、ＭＭＰ９タンパク質発現をゼラチンザイモグラフィーによって測定した。この実験では、ＳＢ−３ＣＴ（１０μＭ）によって処理した後、ＣＤ８＋  Ｔ細胞においてＭＭＰ９発現が減少することが実証された。
【０１３２】
ここまでの実施例に記載したデータによると、ＳＢ−３ＣＴによって誘発される細胞毒性またはアネルギーが、増殖に対して観察される影響の原因となっている可能性も高い。しかしながら、トリパンブルー色素排除試験およびアネキシン染色（早期の細胞死を検出するために使用される）によると、ＳＢ−３ＣＴによって処理した後には細胞のバイアビリティが９０％以上であり、このことは、増殖能力の減少が細胞死によるものではないことを示唆している。ＳＣ−３ＣＴ処理によってＴ細胞のアネルギーが誘発されるのかを評価するため、Ｔ細胞増殖アッセイを使用し、このアッセイでは、ビヒクルまたはＳＢ−３ＣＴによって処理したＴ細胞に外因性ＩＬ−２を加えて、可溶性の抗ＣＤ３抗体の存在下で培養した。図２Ｅ〜図２Ｆに示したように、ＩＬ−２を加えることによって、ＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞における増殖反応がある程度回復したが、ＳＢ−３ＣＴの濃度が増すにつれて、増殖は投与量に依存する形で減少していく。これらのデータは、外因性ＩＬ−２によってＴ細胞の増殖がある程度回復することを示しており、このことは、ゼラチナーゼ阻害剤によって誘発されるＴ細胞増殖抑制においてアネルギーが果たしうる役割を示唆している。
【０１３３】
実施例４
ゼラチナーゼ欠損ＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞では増殖が減少する
ＳＢ−３ＣＴは、ＭＭＰ２およびＭＭＰ９を高選択的に阻害する（Ｂｒｏｗｎら、２０００；Ｔｏｔｈら、２０００）。したがって、この阻害剤の効果は、ＭＭＰ２またはＭＭＰ９いずれかがブロックされることによるものと考えられる。Ｔ細胞活性化に対する各ＭＭＰの役割を認識するため、ＭＭＰ２−／−マウス、ＭＭＰ９−／−マウス、ＭＭＰ２／９−／−マウスからのＣＤ４＋  Ｔ細胞において、抗ＣＤ３によって誘発される増殖を調べた。野生型Ｔ細胞と比較して、ＭＭＰ２−／−ＣＤ４＋  Ｔ細胞では、２０％の増殖減少を示したにすぎないのに対し（図３Ａ）、ＭＭＰ９欠損では、８０％以上の増殖減少につながった（図３Ｂ）（ｐ＜０．００１）。さらに、ＭＭＰ２／９−／−細胞（二重欠損）の増殖は、ＭＭＰ２−／−ＣＤ４＋  Ｔ細胞の増殖とＭＭＰ９−／−ＣＤ４＋  Ｔ細胞の増殖の中間であった（図３Ｃ）（ｐ＝０．００６）。ＣＤ８＋  Ｔ細胞もＭＭＰ９欠損による影響を受けるかを調べるため、ＭＭＰ９−／−欠損ＣＤ８＋  Ｔ細胞の増殖能力を調べた。結果として、Ｔ細胞の増殖が８５％以上減少した（図３Ｄ）（ｐ＜０．００１）。これらの結果から、ＳＢ−３ＣＴによって処理した細胞における前述した発見が確認され、この場合、ＭＭＰ９はＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の増殖をＭＭＰ２よりも制御することが示される。
【０１３４】
実施例５
ＭＭＰ９欠損Ｔ細胞およびＳＢ−３ＣＴで処理したＴ細胞において、抗ＣＤ３抗体によって誘発されるカルシウム流が増大する
細胞内のカルシウム流の増大は、Ｔ細胞レセプターを介してのＴ細胞活性化後の早期現象の１つであり（Ｈａｌｌ、Ｒｈｏｄｅｓ、２００１；Ｚｉｔｔら、２００４）、したがって、小胞体（ＥＲ）からの細胞内カルシウム放出に対するＭＭＰ阻害の影響について調べた。Ｔ細胞の増殖に対してＭＭＰ９欠損が最も大きく影響したため、ＭＭＰ９−／−ＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞において、抗ＣＤ３抗体によって誘発される細胞内カルシウム流を調べた。平行して、ＳＢ−３ＣＴによって処理した野生型ＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の試験も実施した。ＭＭＰ９−／−ＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞は、予想に反して、野生型のコントロールＴ細胞と比較して、細胞内カルシウム流（小胞体からの放出に対応する）をより大きく示した（図４Ａ、図４Ｂ）。ＳＢ−３ＣＴによる処理においても、ＭＭＰ９−／−Ｔ細胞について示した結果と同様に、小胞体からのカルシウムの放出に対応する細胞内カルシウム流が増大した（図４Ｃ）。さらに、抗ＣＤ３抗体によって誘発されるカルシウム流に対するゼラチナーゼ阻害の有意性を調べるため、培地に外因性カルシウムが存在することによって、ＳＢ−３ＣＴ処理後にカルシウムの流入が変化するかを調べた。抗ＣＤ３抗体によって処理した野生型ＣＤ８＋  Ｔ細胞を、カルシウムを含んだ培地の存在下でインキュベートした。予測どおり、カルシウムの存在下では、ＳＢ−３ＣＴによって処理して抗ＣＤ３抗体によって刺激した後、小胞体からのカルシウム放出が増大する（図４Ｄ）のみならず、外因性カルシウム流入も激増した。これらの結果を考え合わせると、ＭＭＰ９は、抗ＣＤ３抗体によって誘発される活性化に応答しての正常Ｔ細胞における細胞内カルシウム流を下方制御することが実証される。
【０１３５】
実施例６
ＭＭＰ２欠損およびＭＭＰ９欠損のＴ細胞またはＳＢ−３ＣＴで処理したＴ細胞において、ＮＦＡＴｃ１およびＣＤ２５  ｍＲＮＡ発現が変化する
カルシウムシグナル伝達の後、活性化したＴ細胞の核内転写因子（ＮＦＡＴ）の核移行は、Ｔ細胞の活性化にとってと、ＩＬ−２Ｒα（ＣＤ２５）およびＩＬ−２の発現の転写を促進するうえで重要である（Ｙｏｓｈｉｄａら、１９９８）。活性化したＴ細胞におけるＮＦＡＴおよびＣＤ２５のｍＲＮＡ発現に対する、ゼラチナーゼ欠損およびＳＢ−３ＣＴ処理の影響について調べた。ここまでのデータから、ＣＤ４＋  Ｔ細胞の応答とＣＤ８＋  Ｔ細胞の応答が類似していることが示されたため、以下の一連の試験ではＣＤ４＋  Ｔ細胞を使用した。ＭＭＰ２−／−ＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＭＭＰ９−／−ＣＤ４＋  Ｔ細胞を、抗ＣＤ３抗体によって刺激し、ＮＦＡＴｃ１およびＣＤ２５サイトカイン転写を定量的ＲＴ−ＰＣＲによって分析した。ＭＭＰ２−／−ＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＭＭＰ９−／−ＣＤ４＋  Ｔ細胞は、抗ＣＤ３抗体による刺激後、ＮＦＡＴｃ１を発現させる能力が、野生型コントロールＴ細胞と比較して著しく低下した（図５Ａ）。ＮＦＡＴｃ１の誘発減少に合致して、ＣＤ２５転写の発現（ＮＦＡＴｃ１に依存する）も、両方のタイプの細胞において著しく減少し、減少はＭＭＰ９−／−Ｔ細胞において最大であった（図５Ｂ）。
【０１３６】
さらに、ＣＤ４＋  Ｔ細胞において、ＳＢ−３ＣＴ処理によるゼラチナーゼ阻害の後、これらの試験を行った。ＳＢ−３ＣＴ処理により、ＮＦＡＴｃ１およびＣＤ２５転写の発現は、ビヒクルによって処理したＴ細胞と比較して、投与量に依存する形で抑止された（それぞれ図５Ｃおよび図５Ｄ）。これらを考え合わせると、ゼラチナーゼ阻害またはゼラチナーゼ欠損に対応してＮＦＡＴおよびＣＤ２５  ｍＲＮＡ発現（いずれも細胞内で制御される）が減少したことによって示唆されることとして、細胞内基質を標的とすることでＴ細胞活性化が阻止されることにより、ゼラチナーゼはＴ細胞活性化を制御することができる。
【０１３７】
実施例７
ＭＭＰ９−／−およびＳＢ−３ＣＴ処理した野生型ＣＤ４＋  Ｔ細胞またはＣＤ８＋  Ｔ細胞において、サイトカイン転写およびタンパク質発現が減少する
抗ＣＤ３による活性化に応答してＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞においてＩＬ−２およびＩＦＮ−γが産生される。したがって、ゼラチナーゼ阻害またはＭＭＰ９欠損が、これらのサイトカインの発現にどのような役割を果たすかを調べた。ＭＭＰ９の遺伝的欠損では、ＣＤ４＋  Ｔ細胞（図６Ａ、図６Ｂ）およびＣＤ８＋  Ｔ細胞（図６Ｅ、図６Ｆ）におけるＩＬ−２およびＩＦＮ−γの転写およびタンパク質発現が著しく下方制御された。同じタイプの細胞において、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γのタンパク質発現および転写発現に対するゼラチナーゼ阻害の影響を、さまざまなタイミングにおいて調べた。ＩＬ−２転写発現は、ＳＢ−３ＣＴによる処理に応答して時間とともに増大したが、タンパク質発現は下方制御された（図６Ｃ、図６Ｄ）。ＳＢ−３ＣＴによって処理した細胞におけるＩＦＮ−γについても、同様の傾向が観察された（図６Ｇ、図６Ｈ）。
【０１３８】
実施例８
ゼラチナーゼ阻害によって制御性Ｔ細胞の機能は誘発されない
研究によると、抗ＣＤ３抗体による刺激の後、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）はＩＬ−２を増殖または産生することができないが、ＩＬ−１０を分泌することによって、またはフォークヘッド転写因子（Ｆｏｘｐ３）（ＮＦＡＴ発現を阻害する）を上方制御することによって、増殖反応およびサイトカイン産生を抑制できることが示されている（Ｔｈｏｒｎｔｏｎ、Ｓｈｅｖａｃｈ、１９９８）。ＭＭＰ９欠損またはＳＢ−３ＣＴで処理したＴ細胞が制御性Ｔ細胞の特性を示すかを調べるため、抗ＣＤ３による刺激に応答してのＦｏｘｐ３  ｍＲＮＡ発現およびＩＬ−１０タンパク質発現を試験した。ＭＭＰ９−／−ＣＤ４＋  Ｔ細胞では、抗ＣＤ３抗体によって刺激したＭＭＰ２−／−細胞および野生型細胞と比較して、Ｆｏｘｐ３転写レベルが大幅に増大した（図７Ａ）。さらに、ＳＢ−３ＣＴに応答してＦｏｘｐ３転写が増大した（図７Ｂ）。ＩＬ−１０タンパク質の発現は、Ｆｏｘｐ３と同様に、ＭＭＰ２−／−ＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＭＭＰ９−／−ＣＤ４＋  Ｔ細胞において増大した（図７Ｃ）。全体として、これらのデータによると、ゼラチナーゼ阻害または欠損が、制御性Ｔ細胞機能につながりうることを示唆している。
【０１３９】
ゼラチナーゼ阻害によって制御性Ｔ細胞機能が誘発されるかを直接調べるため、サプレッサーアッセイを使用し、このアッセイでは、ＣＤ４＋２５−Ｔ細胞をＳＢ−３ＣＴによって処理し、未処理のＣＤ４＋２５−Ｔ細胞とのさまざまな混合割合において、照射した抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下で７２時間共培養した。図７Ｄに示したように、ＳＢ−３ＣＴ処理では、各割合において、Ｔ細胞増殖が５０％阻害された。しかしながら、ＳＢ−３ＣＴで処理した細胞の割合が増すほどＴ細胞増殖も増大し、ＳＢ−３ＣＴ処理によって制御性Ｔ細胞の機能が誘発されないことを示唆している。
【０１４０】
制御性Ｔ細胞の機能がＳＢ−３ＣＴ処理に応答して影響されるかを調べるため、サプレッサーアッセイにおいてＣＤ４＋２５＋Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）をＳＢ−３ＣＴによって処理し、上記のようにさまざまな混合割合において共培養した。ＣＤ４＋２５＋Ｔ細胞は、その抑制機能を維持した（図７Ｅ）。しかしながら注目すべき点として、ＳＢ−３ＣＴで処理したＣＤ４＋２５＋Ｔ細胞は、抑制能力がやや変化し、抑制特性を示すためには、ＳＢ−３ＣＴ処理した細胞がより多く必要である。これらのデータを考え合わせると、ＭＭＰ９阻害では、Ｆｏｘｐ３およびＩＬ−１０の発現が増大するにもかかわらず制御性Ｔ細胞のメカニズムは誘発されないことが示唆される。しかしながら、これらのデータは、ＭＭＰ９がＦｏｘｐ３およびＩＬ−１０の発現に関与していることを示唆している。
【０１４１】
実施例９
ＭＭＰ９欠損により、抗ＣＤ３抗体に応答してのＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の表現型が変化する
Ｔ細胞に由来するＭＭＰ９の役割をさらに詳しく調べるため、ＭＭＰ９非存在（ＭＭＰ９欠損）に対応してのＴ細胞の表現型に関する試験を、フローサイトメトリーによって行った。Ｔ細胞表面の７個の活性化マーカーのパネルを評価した（Ｂａｒｏｊａら、２００２；Ｂｏｕｒｇｕｉｇｎｏｎら、２００１；Ｆｅｎｇら、２００２；Ｉｒｉｅ−Ｓａｓａｋｉら、２００３；Ｉｖｅｔｉｃ、Ｒｉｄｌｅｙら、２００４；Ｌｅｏら、１９９９；Ｓｔａｕｂｅｒら、２００６）。野生型マウスおよびＭＭＰ９−／−Ｃ５７ＢＬ／６マウスから、ＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を分離した。ＭＭＰ９欠損または対応する野生型ＣＤ４＋  Ｔ細胞またはＣＤ８＋  Ｔ細胞を、可溶性の抗ＣＤ３抗体の存在下および非存在下で培養し、さまざまなマーカーについて染色した。野生型ＣＤ４＋  Ｔ細胞の分析では、Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４４、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ４０Ｌ、およびＣＤ４５ＲＯのすべての表面発現レベルが増大した（図１１および表１）。これと比較して、ＭＭＰ９欠損Ｔ細胞からのＣＤ４＋  Ｔ細胞の分析では、ＣＤ６２Ｌ、ＣＴＬＡ−４、およびＣＤ４５ＲＯの表面発現レベルが増大した。ＣＤ４４およびＣＤ４０Ｌの発現レベルは、野生型細胞と比較してわずかに減少した。ＣＤ２５およびＣＤ６９の発現レベルは、いずれも著しく減少した。これらのデータから、ＭＭＰ９欠損ＣＤ４＋  Ｔ細胞は、野生型ＣＤ４＋  Ｔ細胞と比較したとき、細胞表面ＣＤ２５およびＣＤ６９のレベルは大幅に低下する一方で、ＣＤ４５ＲＯおよびＣＴＬＡ−４のレベルは増大する。
【０１４２】
【表１】
2012518001.tif 000014
抗ＣＤ３によって刺激した野生型およびＭＭＰ９−／−ＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞のＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６９、ＣＤ２５、ＣＤ４４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＴＬＡ−４の表面発現について、フローサイトメトリーによって分析した。データは、図１１に示した陽性に染色された細胞の割合を示している。データは、２回の個別の実験の代表値である。
【０１４３】
野生型ＣＤ８＋  Ｔ細胞における細胞表面発現の分析では、ＣＤ２５、ＣＤ６２Ｌ、およびＣＤ６９において増大した（図１１および表１）。さらに、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、およびＣＴＬＡ−４では、発現したが発現の割合は２０％以下であった。ＣＤ４５ＲＯでも極めて低いレベルで発現した（５％未満）。ＭＭＰ９欠損ＣＤ８＋  Ｔ細胞の分析では、野生型ＣＤ８＋  Ｔ細胞と比較して、ＣＤ６９、ＣＤ２５、ＣＤ６２Ｌにおいて発現レベルが低かった。ＣＤ４５ＲＯおよびＣＤ４０Ｌの表面発現レベルは、野生型細胞と同じ程度のままであった。ＣＴＬＡ−４およびＣＤ４０Ｌの表面発現は、野生型細胞と比較してわずかに増大した（図１１および表１）。ＭＭＰ９−／−Ｔ細胞では、抗ＣＤ３刺激に応答してＣＤ２５発現は増大せず、これはＮＦＡＴ発現が誘発されないことと矛盾しない。以上を考え合わせると、これらのデータから、ＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞は、ＭＭＰ９の非存在下で異なる細胞表面発現を示す。
【０１４４】
実施例１０
ゼラチナーゼ阻害によって、抗体特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞によって誘発される肺損傷が抑止される
ここまでのデータによると、抗ＣＤ３に応答して発現するＭＭＰ９レベルがＣＤ４＋  Ｔ細胞よりもＣＤ８＋  Ｔ細胞において高いことと、ゼラチナーゼ阻害または欠損によって細胞機能が下方制御されることが実証された。過去において、Ｍｅｄｏｆｆらは、末梢気道の上皮細胞がＣＣ１０プロモーターの制御下で構造的にＯＶＡを発現するマウスモデル（ＣＣ１０−ＯＶＡマウス）を報告した（Ｍｅｄｏｆｆら、２００５）。ＯＶＡ特異的Ｔ細胞レセプター（ＯＴ−Ｉ）を発現する活性化したＣＤ８＋  Ｔ細胞を、レシピエントマウスの肺に注入すると、激しい細気管支周囲炎症が誘発される（Ｍｅｄｏｆｆら、２００５）。したがって、インビボでのＣＤ８＋  Ｔ細胞由来ゼラチナーゼの役割を調べる目的で、ＣＤ８＋  Ｔ細胞におけるゼラチナーゼ阻害によって肺損傷が下方制御されるかを、ＣＣ１０−ＯＶＡマウスモデルを使用して試験した（Ｓｔｒｉｐｐら、１９９２）。肺損傷を誘発するため、クラスＩ  ＭＨＣ  Ｈ−２Ｋｂに結合するＯＶＡペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬに特異的なＴＣＲを有するＯＴ−ＩトランスジェニックマウスからＣＤ８＋  Ｔ細胞を分離し、ＣＣ１０−ＯＶＡマウスの肺に注入した（ＣａｒｂｏｎｅおよびＢｅｖａｎ、１９８９）。
【０１４５】
先の実施例における試験では、抗ＣＤ３を介してのポリクローナルＴ細胞活性化に対するＭＭＰの影響を調べた。ＳＢ−３ＣＴによる高選択的ゼラチナーゼ阻害によって、抗原特異的Ｔ細胞増殖機能が影響されるかを調べるため、報告されているようにＯＴ−１細胞をＳＢ−３ＣＴで処理し、ペプチド（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）パルスした抗原提示細胞の存在下で培養した。図８Ａに示したように、未処理またはビヒクル処理したＯＴ−ＩトランスジェニックＣＤ８＋  Ｔ細胞は、ＯＶＡペプチドパルスした抗原提示細胞に応答して増殖した。ＯＴ−１  Ｔ細胞をＳＢ−３ＣＴ処理すると、ＯＶＡパルスした抗原提示細胞に応答しての増殖が完全に抑止された。ＯＴ−ＩＩトランスジェニックマウスからのＣＤ４＋  Ｔ細胞の試験では、同様の傾向が明らかになった。これらのデータから、抗ＣＤ３を介してのポリクローナル活性化と同様に、高選択的ゼラチナーゼ阻害によっても、ＣＤ８＋  Ｔ細胞の抗原特異的増殖が抑止されることが実証された。
【０１４６】
抗原特異的Ｔ細胞が介在する肺損傷に、ゼラチナーゼ阻害がインビボで影響するかを調べるため、本明細書および過去の研究に記載されているように、抗ＣＤ３およびＳＢ−３ＣＴで処理したＯＴ−Ｉ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞をＯＶＡの存在下でインビトロで活性化した（Ｍｅｄｏｆｆら、２００５）。培養したＯＴ−Ｉ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞を、ＣＣ１０−ＯＶＡトランスジェニックマウスまたは非トランスジェニック野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスの肺の気管内に移入した。養子移入から７日後、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）中の合計の細胞蓄積の分析では、ＳＢ−３ＣＴ処理した（ＭＭＰＩ）群およびビヒクル群において回収された全ＢＡＬ細胞の量に差は見られなかった（図８Ｂ）。しかしながら、好中球（Ｇｒ−１＋）（このモデルにおける損傷のマーカー）（Ｍｅｄｏｆｆら、２００５）の量は、ＳＢ−３ＣＴ処理群において有意に減少した（図８Ｃ）（ｐ＜０．００１）。ＯＴ−ＩトランスジェニックマウスはＴｈｙ１．１陽性であり、したがって、ＣＣ１０−ＯＶＡマウス（Ｔｈｙ１．２＋バックグラウンドであった）において移入細胞を追跡する手段を提供した。次に、肺におけるＣＤ８＋  Ｔｈｙ１．１＋  Ｔ細胞の蓄積が、２つのＣＣ１０−ＯＶＡ処理群（ビヒクルまたはＳＢ−３ＣＴ）の間で異なるかを調べた。ＳＢ−３ＣＴによる処理では、肺実質におけるＣＤ８＋  Ｔｈｙ１．１＋（ドナー）細胞が有意に減少した（図９Ａ）（ｐ＜０．０１）。さらには、ＳＢ−３ＣＴによる処理では、活性化マーカーＣＤ２５発現が減少した（図９Ｂ）（ｐ＜０．０１）。
【０１４７】
ゼラチナーゼ阻害した細胞を受け取ったＣＣ１０−ＯＶＡマウスの肺において好中球およびドナー由来ＣＤ８＋  Ｔ細胞が少ないことは、肺損傷の重傷度が低いことを示唆している。実際に、Ｈ＆Ｅ染色によって評価した肺の組織構造が示すところでは、養子移入前のＯＴ−Ｉ  Ｔ細胞のゼラチナーゼ阻害によって、血管周囲および細気管支周囲の炎症の発生が抑止された。
【０１４８】
結果の考察
本発明の試験のデータによると、特にＭＭＰ９が、Ｔ細胞の活性化を制御するうえで重要な役割を果たすことが明らかになった。この結論は、ＭＭＰ９阻害によってＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の活性化が大きく減少することを示すデータから導かれる。しかしながら、ＭＭＰ９は、活性化されたＣＤ８＋  Ｔ細胞においてＣＤ４＋  Ｔ細胞よりも大きく誘発される。本発明の試験では、広域ＭＭＰ阻害、ＭＭＰ９特異的阻害、およびＭＭＰ９の遺伝子欠損のいずれおいても、ＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞においてポリクローナル活性化によって誘発される増殖が下方制御されることが示された。ＮＦＡＴｃ１およびＣＤ２５遺伝子発現は下方制御され、その一方でＦｏｘｐ３遺伝子発現およびＩＬ−１０タンパク質発現のレベルは上昇した。ＩＬ−２およびＩＦＮ−γのサイトカイン遺伝子発現およびタンパク質発現の分析では、ＭＭＰ９阻害およびＭＭＰ９欠損に対応して遺伝子発現およびタンパク質発現が下方制御されることが明らかになった。しかしながら、抗ＣＤ３を介してのポリクローナル刺激に応答しての細胞内カルシウム放出は、ゼラチナーゼ欠損またはゼラチナーゼ阻害に対応して増大した（図１０）。さらに、インビボモデルにおいて、ＭＭＰ９阻害によって、Ｔ細胞介在性肺損傷の程度が減少することが実証された。全体としてこれらのデータは、Ｔ細胞の活性化プロセスにおいてＴ細胞由来ＭＭＰ９の役割を明らかに示している。
【０１４９】
最近、同種移植の拒絶反応におけるＭＭＰの機能的役割およびＴ細胞同種反応性におけるＭＭＰの役割を示す報告が見られるようになった。Ｆｅｒｎａｎｄｅｚらは、気管支同種移植における閉塞性気道疾患（ＯＡＤ）モデルにおいて、ＭＭＰ９欠損宿主マウスではＯＡＤが発症しなかったが、Ｔ細胞同種反応性が強められたことを報告した（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら、２００５）。しかしながら、本発明の試験では、ＭＭＰ９欠損によってＴ細胞増殖が大きく抑止されることが明らかになった。このような異なる結果の１つの理由として、ＯＡＤモデルでは、バルクＴ細胞（ＣＤ３＋）を同種異系ＤＣによって刺激したため、非特異的Ｔ細胞活性化が誘発されたためである。しかしながら、本発明の試験では、ＭＭＰ９欠損ＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を抗ＣＤ３抗体の存在下で個別に培養したため、これら２種類の細胞集団がＴ細胞活性化プロセスにおいてどのように機能するかを個別に試験することができた。Ｔ細胞およびマクロファージはＯＡＤの発症において重要であることが報告されており（Ｋｅｌｌｙら、１９９８；Ｎｅｕｒｉｎｇｅｒら、２０００）、遺伝的Ｔ細胞欠損を有するマウス（例えば、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスあるいはリコンビナーゼ活性化遺伝子１欠損（ＲＡＧ−／−））では、ＯＡＤが発症しないことが示されている（Ｎｅｕｒｉｎｇｅｒら、１９９８）。これらの研究では、ＯＡＤの発症においてＴ細胞が重要である強い証拠が記載されており、Ｔ細胞由来ＭＭＰ９がＯＡＤ発症に重要な役割を果たしていることを示唆している。したがって、Ｔ細胞由来ＭＭＰを阻害することによってＴ細胞活性化を減少させることができ、これにより、さまざまな病態に対応する保護効果を提供することができる。
【０１５０】
上に開示したように、Ｔ細胞内シグナル伝達現象を調べる中で、ゼラチナーゼ欠損または阻害に対応して、抗ＣＤ３抗体による刺激の後、Ｔ細胞は、小胞体からの高いレベルのカルシウム解放および外因的カルシウム流入を示す。これらの発見から、ＭＭＰ９阻害またはＭＭＰ９欠損に対応してのカルシウム流入の増大は、細胞が有効な活性化現象の欠如を補おうとするメカニズムであることが示唆される。したがって、ＭＭＰ９は、カルシウム介在性現象の強いダウンレギュレータとして機能しうる。さらには、これらの結果では、ＭＭＰ９欠損Ｔ細胞またはＳＢ−３ＣＴ処理Ｔ細胞においてＮＦＡＴ遺伝子発現が抑止されることが示された。
【０１５１】
ＮＦＡＴはＴ細胞活性化における転写因子として重要であるため、ＮＦＡＴ発現が変化すると、他のＮＦＡＴ依存遺伝子（例えば、正常に機能するうえでＮＦＡＴの移行を必要とするＩＬ−２Ｒα（ＣＤ２５）およびＩＬ−２）の発現が変化するものと考えられる。実際に、ＭＭＰ９欠損Ｔ細胞およびＳＢ−３ＣＴ処理Ｔ細胞では、ＣＤ２５  ｍＲＮＡおよび表面発現の減少が観察された。これらの発見は、ゼラチナーゼ阻害によって、おそらくはＮＦＡＴ転写が抑制される（これによりＣＤ２５およびＩＬ−２の発現が減少する）ことでＮＦＡＴ活性化が下方制御されることを強く示唆している。ＣＤ２５の発現の減少は、細胞表面に存在するＣＤ２５が少ないことを意味し、これにより、ＩＬ−２と結合して増殖を誘発するうえで利用可能なレセプターの数が制限され、このためＴ細胞活性化が抑止される。このことは、図２に示したようにＳＢ−３ＣＴ処理した細胞における増殖応答が外因性ＩＬ−２によって回復しない理由を説明する。この結果は、ゼラチナーゼ阻害に起因してＴ細胞が制御性Ｔ細胞機能を示しうることを示唆しているため、制御性Ｔ細胞に特徴的に見つかる標的について調べた。予測に反して、ＳＢ−３ＣＴ処理Ｔ細胞およびＭＭＰ９欠損Ｔ細胞において、Ｆｏｘｐ３発現の増大が観察された。
【０１５２】
制御性Ｔ細胞系列を導入したＴ細胞においてＩＬ−２およびＩＦＮ−γを産生できないことは、転写抑制の結果であると考えられる（Ｃｈｅｎら、２００６；Ｌｅｅら、２００８；Ｍａｒｓｏｎら、２００７；Ｗｕら、２００６）。本発明の試験では、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γのレベルの減少が実証された。したがって、Ｆｏｘｐ３が、ＴＣＲライゲーションに応答してのＩＬ−２およびＩＦＮ−γ遺伝子発現を抑制しており、これに起因してＴ細胞活性化が減少している。ＩＬ−１０は、制御性Ｔ細胞およびＴｒ１細胞によって分泌される特徴的な免疫抑制サイトカインであるため、ＭＭＰ９欠損Ｔ細胞においてＩＬ−１０タンパク質発現について評価し、ＭＭＰ９欠損Ｔ細胞では抗ＣＤ３抗体による刺激の後にＩＬ−１０が増大することを報告した。ゼラチナーゼ阻害によって制御性Ｔ細胞の機能は誘発されなかった。
【０１５３】
これらの結果は、ＭＭＰ９の阻害によって、制御性Ｔ細胞の特徴を示す、ＩＬ−１０を分泌する新しいＴ細胞サブセットの発生につながりうるが、制御性Ｔ細胞の機能にはつながらないことを示唆している。ＭＭＰ９阻害によって制御性Ｔ細胞の機能は誘発されなかったが、ＭＭＰ９阻害に対応して制御性Ｔ細胞の機能が変化した。Ｐａｎらによる報告によると、制御性Ｔ細胞におけるＦｏｘｐ３依存性遺伝子サイレンシングをＥｏｓ（亜鉛フィンガー転写因子）が介在することが実証された（Ｐａｎら、２００９）。本開示においては、ＭＭＰ９阻害によってＥｏｓが誘発され、ＥｏｓがＩＬ−２およびＩＦＮ−γのＦｏｘｐ３依存性抑制を介在し、これに起因して正常Ｔ細胞活性化が減少する。
【０１５４】
インビボでのゼラチナーゼ阻害の調査において、ＣＣ１０−ＯＶＡマウスの肺におけるＣＤ８＋  Ｔｈｙ１．１＋  Ｔ細胞の割合の有意な減少が観察され、このことは、ゼラチナーゼ阻害がＴ細胞移動に影響する、もしくは細胞活性化を減少させる、またはその両方であることを示唆している。肺中のＣＤ８＋  Ｔｈｙ１．１＋  Ｔ細胞におけるＣＤ２５表面発現のさらなる分析では、ＣＤ２５表面発現が劇的に減少することが明らかになり、このことは、細胞活性化の減少を示唆している。これらの結果は、ゼラチナーゼ阻害に対応してＣＤ２５  ｍＲＮＡ発現および細胞表面発現が有意に減少することを実証したインビトロデータに似ている。ＣＣ１０−ＯＶＡマウスから採取した肺の組織学的分析では、ビヒクル処理したＯＴ−１細胞の移入後に血管周囲および核周囲の浸潤が高いことが実証された。対照的に、ＳＢ−３ＣＴ処理したＯＴ−１細胞の養子移入の後、単核細胞浸潤は最小限であり、このことは、ＭＭＰ９阻害によって肺内の炎症程度が弱められ、したがってＴ細胞介在性肺損傷の程度が有意に減少することを示唆している。
【０１５５】
これらの結果は、ＭＭＰ９がＴ細胞活性化において明らかな役割を果たしていることを強く示しており、この役割がｍＲＮＡ発現およびタンパク質発現の調節によって細胞内で行われることを示唆している。
【０１５６】
本発明の試験では、ＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を活性化するうえでの機能性Ｔ細胞由来ゼラチナーゼの重要な役割が明らかになり、ゼラチナーゼ阻害が、Ｔ細胞依存性疾患（例えば、同種臓器移植拒絶反応、自己免疫疾患）の治療における免疫抑制の新規の方法となり得ることを示唆している。
【０１５７】
本明細書の実施例に記載した実験は、以下の方法を使用して行った。
【０１５８】
動物
６〜１０週齢の雌のＢａｌｂ／ｃマウスおよびＣ５７ＢＬ／６マウスをＨａｒｌａｎ社（インディアナ州インディアナポリス）から購入、または独立して飼育した。ＭＭＰ２欠損（ＭＭＰ２−／−）、ＭＭＰ９欠損（ＭＭＰ９−／−）、およびＭＭＰ２／ＭＭＰ９二重欠損（ＭＭＰ２／９−／−）のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド）（Ｂａｙｌｏｒ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、テキサス州ヒューストン）、ＣＣ１０−ＯＶＡマウス（Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド）、およびＯＴ−１  ＴＣＲトランスジェニックマウス（Ｃ５７ＢＬ／６−Ｔｈｙ１．１バックグラウンド）を使用した（Ｃｏｒｒｙら、２００４；Ｓｈｉｌｌｉｎｇら）。マウスによるすべての試験は、動物実験委員会（institutional animal care and usage）のガイドラインに従って行った。
【０１５９】
Ｔ細胞の分離
５〜７匹のマウスの脾臓から単一細胞懸濁液を調製した。赤血球をＮＨ４ＣＬ溶解緩衝液で溶解した。マウスのＣＤ４（Ｌ３Ｔ４）ＭｉｃｒｏｂｅａｄｓおよびＣＤ８（ＣＤ８ａ−Ｌｙ２）Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、カリフォルニア州オーバーン）をメーカーの指示に従って使用し、ＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を分離した。ＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の純度（フローサイトメトリーによって求めた）は、９７〜９９％の範囲内であった。この分離プロトコルを使用して、Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウス、ＭＭＰ２欠損マウス、ＭＭＰ９欠損マウス、ＭＭＰ２／９欠損マウス、ＯＴ−Ｉトランスジェニックマウス、およびＯＴ−ＩＩトランスジェニックマウスから、Ｔ細胞を分離した。マウスＣＤ４＋ＣＤ２５＋  分離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、カリフォルニア州オーバーン）を使用して、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を分離した。フローサイトメトリーによって求めた制御性Ｔ細胞の純度は、９３％以上であった。照射を記載した箇所では、ＣＤ４−  画分をγ照射し（２０００ｒａｄ）、抗原提示細胞として使用した。
【０１６０】
マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤（ＭＭＰＩ）の調製
非特異的ＭＭＰ阻害剤である１，１０−フェナントロリン（Ｓｉｇｍａ社、ミズーリ州セントルイス）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で１Ｍ溶液とし、完全ＲＰＭＩ（ｃＲＰＭＩ）において０．００１〜０．１μＭに希釈した。完全ＲＰＭＩは、４００ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕのペニシリンストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ社、カリフォルニア州カールズバッド）、１０％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社、ユタ州ローガン）、および５×１０−５Ｍの２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ社、ミズーリ州セントルイス）からなる。ＣＯＬ−３は、化学的に修飾されたテトラサイクリンであり、非特異的ＭＭＰ阻害剤である（ＣｏｌｌａＧｅｎｅｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，  Ｉｎｃ．社、ペンシルベニア州ニュータウン）。ＣＯＬ−３をＤＭＳＯ中で１Ｍ溶液とし、ｃＲＰＭＩにおいて１〜１００μＭに希釈した。ＳＢ−３ＣＴは、特異的メカニズムベースのＭＭＰ２／９阻害剤であり、これをＤＭＳＯおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）中で１Ｍ溶液とし、ｃＲＰＭＩにおいて０．０００１〜１ｍＭに希釈した。
【０１６１】
Ｔ細胞増殖アッセイ
野生型Ｂａｌｂ／ｃマウスまたはＣ５７ＢＬ／６マウスからＣＤ４＋  Ｔ細胞またはＣＤ８＋  Ｔ細胞を分離し（１×１０６／ｍｌ）、記載した濃度のＭＭＰＩ濃度またはビヒクルコントロールを使用して６時間インキュベートした。過去に報告されているように、処理した細胞をＲＰＭＩで３回洗浄し、９６ウェルプレートを用いて、２００μｌのｃＲＰＭＩにおいて抗ＣＤ３抗体（０．５〜１μｇ／ｍｌ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カリフォルニア州サンホセ）の存在下で３７℃において７２時間培養し（１×１０５／ウェル）、採取した（Ｓｕｍｐｔｅｒら、２００８）。この一般化されているプロトコルを使用して、記載したさまざまな分離方法および処理条件の後にＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞のＴ細胞増殖を測定した。ＭＭＰ欠損の平行試験では、ＭＭＰ２−／−マウス、ＭＭＰ９−／−マウス、ＭＭＰ２／９−／−マウス、および同腹子コントロールを、抗ＣＤ３抗体の存在下で７２時間培養した。抗原特異的増殖アッセイにおいて、ＯＴ−ＩＩトランスジェニックＴ細胞およびＯＴ−ＩトランスジェニックＴ細胞を、記載した濃度のＳＢ−３ＣＴまたはビヒクルコントロールを使用して６時間インキュベートし、ＲＰＭＩで３回洗浄し、ＯＶＡパルスした（ＯＴ−ＩＩ：ＯＶＡペプチド、ＯＴ−Ｉ：ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド）抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下で、７２時間培養した（１×１０５／ウェル）。Ｔ細胞サプレッサーアッセイでは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスから分離したＣＤ４＋２５−  Ｔ細胞またはＣＤ４＋２５＋  Ｔ細胞を、記載した濃度のＳＢ−３ＣＴまたはビヒクルコントロールを使用して６時間インキュベートした。過去に報告されているように、細胞をＲＰＭＩで３回洗浄し、２００μｌのｃＲＰＭＩにおいて、未処理のＣＤ４＋２５−  Ｔ細胞とのさまざまな割合（処理：未処理）で、γ照射した抗原提示細胞の存在下で、３７℃において７２時間共培養し、採取した（Ｓｕｍｐｔｅｒら、２００８）。
【０１６２】
ゼラチンザイモグラフィー
細胞溶解物および条件培地上清を採取し、４倍に濃縮し、遠心分離して細胞残屑を取り除き、８０℃においてアッセイまで保管した。過去に報告されているように、試料に対してザイモグラフィーを行った（Ｙｏｓｈｉｄａら、２００７）。
【０１６３】
定量的ＲＴ−ＰＣＲによるサイトカインプロファイリング
純化したＣＤ４＋  Ｔ細胞を、記載した濃度のＳＢ−３ＣＴによって６時間インキュベートし、ＲＰＭＩ１６４０で３回洗浄した。薬剤またはビヒクルで処理したＴ細胞を、ｃＲＰＭＩにおいて抗ＣＤ３抗体（０．５μｇ／ｍｌ）とともに１〜１２時間培養した（１×１０６／ｍｌ）。細胞を採取し、ＲＮｅａｓｙ  ＲＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ社、カリフォルニア州バレンシア）を使用して全ＲＮＡを分離し、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７５００においてＰｅｒｆｅＣＴａＴＭ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＦａｓｔＭｉｘ，  Ｌｏｗ  ＲＯＸ（Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、メリーランド州ゲイサースバーグ）をメーカー指示に従って使用し、ｍＲＮＡ発現レベルを検出した。各試料をマウスβアクチンに対して正規化した。プライマー配列は、公的に利用可能な配列に基づいて、各サイトカインを特異的に増幅するように、通常の方法を使用して設計、最適化されている。
【０１６４】
ＣＢＡ（サイトメトリビーズアレイ）によるサイトカインプロファイリング
純化したＭＭＰ９欠損ＣＤ４＋  Ｔ細胞またはＳＢ−３ＣＴ処理（１０μＭ）ＣＤ４＋  Ｔ細胞を６時間インキュベートし、ＲＰＭＩ１６４０で３回洗浄した。ＭＭＰ９欠損Ｔ細胞またはＳＢ−３ＣＴ処理Ｔ細胞（１ｘ１０６／ｍｌ）を、ｃＲＰＭＩにおいて抗ＣＤ３抗体（０．５μｇ／ｍｌ）とともに１〜１２時間培養した。上清を採取し、マウス炎症性サイトカイン・ビーズアレイキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カリフォルニア州サンホセ）をメーカー指示に従って使用して、サイトカインのタンパク質レベルを測定した。
【０１６５】
細胞内カルシウム流
野生型またはＭＭＰ９欠損のＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞と、ＳＢ−３ＣＴ処理（１０μＭ）したＣＤ８＋  Ｔ細胞について、Ｆｌｕｏ−４  ＮＷカルシウムアッセイキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社、カリフォルニア州カールズバッド）をメーカーのプロトコルに従って使用し、カルシウム流を測定した。次に、細胞を抗ＣＤ３抗体（１０μｇ／ｍｌ）によって刺激し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ  Ｉ（カリフォルニア州サニーベール）において３００秒にわたりリアルタイムで測定した。
【０１６６】
ＭＭＰ９−／−Ｔ細胞の細胞表現型の分析
野生型マウスおよびＭＭＰ９欠損マウスから、ＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を分離した。さまざまな処理条件の後、細胞を採取し、ＦＡＣｓ緩衝液（ＰＢＳ中１０％ＢＳＡ）で洗浄した。抗ＣＤ１６／抗ＣＤ３  Ａｂ（０．５μｇ／ウェル、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、カリフォルニア州サンディエゴ）を加えたＦＡＣｓ緩衝液によって、非特異的結合をブロックした。次に、抗マウスＣＤ４−ＦＩＴＣ、ＣＤ８−ＰＥ、ＣＤ２５−ＰＥ、ＣＤ４０Ｌ−ＰＥ、ＣＤ４４−ＰＥ、ＣＤ４５ＲＯ−ＦＩＴＣ、ＣＤ６２Ｌ−ＡＰＣ、ＣＤ６９−ＦＩＴＣ、およびＣＴＬＡ−４−ＰＥ抗体を使用し、対応するアイソタイプコントロールとともに細胞を染色した（すべてｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社から）。染色の後、３％パラホルムアルデヒドで固定し、ただちにフローサイトメーターで分析した。ライブゲート（live gate）における１００００の細胞のデータをＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）によって分析した。さらに、ＦＣＳ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＤｅＮｏｖｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、カリフォルニア州ロサンジェルス）を使用して分析した。
【０１６７】
ＯＴ−Ｉ  Ｔｈｙ１．１＋  ＣＤ８＋  Ｔ細胞の活性化とＣＣ１０−ＯＶＡマウスへの養子移入
Ｔｈｙ１．１＋  ＯＴ−Ｉトランスジェニックマウスからリンパ節および脾臓を分離し、脾臓のＣＤ８＋  Ｔ細胞を上述したように分離した。次に、ＯＴ−Ｉ  Ｔｈｙ１．１＋  ＣＤ８＋  Ｔ細胞を、１０μＭのＳＢ−３ＣＴまたは対応するビヒクルコントロール（ＤＭＳＯ  ＋  ＰＥＧ）によって６時間処理し、培地において３回洗浄した。γ照射した５×１０７の野生型脾細胞を、０．７μｇ／ｍｌのＯＶＡペプチド（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）を加えた３０ｍｌの１０％  ＤＭＥＭで５分間培養した後、ＯＴ−Ｉ  Ｔｈｙ１．１＋  ＣＤ８＋  Ｔ細胞（５×１０６）と、抗ＣＤ２８抗体（２μｇ／ｍｌ）と、ＩＬ−２（１３２．０２Ｕ／ｍｌ）と、ＩＬ−１２（１０ｎｇ／ｍｌ）とを加えた。３日目に細胞を分けて、さらにＩＬ−２（２５Ｕ／ｍｌ）を加えて最終体積を３０ｍｌとした。５日目に細胞を採取し、ＣＣ１０−ＯＶＡマウスへの養子移入の準備を行った。細胞をＰＢＳに再懸濁させ、７．５×１０５の細胞をＣＣ１０−ＯＶＡマウスの肺の気管内に移入した。
【０１６８】
養子移入後のＣＣ１０−ＯＶＡマウスの肺におけるＯＴ−Ｉ  Ｔｈｙ１．１＋  ＣＤ８＋  Ｔ細胞の同定
ＳＢ−３ＣＴ処理またはビヒクル処理したＯＴ−Ｉ  Ｔｈｙ１．１＋  ＣＤ８＋  Ｔ細胞の養子移入から１０日後に、ＣＣ１０−ＯＶＡマウスの肺を潅流して摘出した。肺を氷の上で細かく切った後、５％のウシ胎仔血清を含んだＲＰＭＩ媒体において、２５μｇ／ｍｌのＤＮａｓｅの存在下、コラゲナーゼ／ディスパーゼ（それぞれ０．２ｍｇ／ｍｌ）によって３７℃で６０〜９０分温浸した。細胞を７０μｍの細胞濾過器に通し、洗浄し、密度遠心分離によって肺のリンパ球を分離した。細胞をＦＡＣｓ緩衝液（ＰＢＳ中１０％ＢＳＡ）に再懸濁させ、ただちにＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）によって分析した。さらに、ＦＣＳ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＤｅＮｏｖｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、カリフォルニア州ロサンジェルス）を使用して分析した。
【０１６９】
ＢＡＬ液中の細胞サブセットの同定
ビヒクル処理およびＳＢ−３ＣＴ処理したＯＴ−１トランスジェニックＴ細胞の養子移入の後、１．０ｍｌの滅菌１Ｘ  ＰＢＳによってマウスの肺を洗浄することによって、野生型マウスおよびＣＣ１０マウスの肺からＢＡＬを採取した。採取した液体を２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。２００μｌの滅菌１Ｘ  ＰＢＳに細胞ペレットを再懸濁させた。次に、細胞を抗ＧＲ１抗体によって染色し、ただちにＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）によって分析した。さらに、ＦＣＳ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＤｅＮｏｖｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、カリフォルニア州ロサンジェルス）を使用して分析した。
【０１７０】
組織構造
中性緩衝ホルマリンによって肺を潅流して膨らませ、固定した。組織片をパラフィンに埋め込んで切断し、ヘマトキシリンおよびエオシンによって染色した。Ｏｌｙｍｐｕｓ製の顕微鏡およびデジタルカメラＤＰ１２を使用して２０倍で画像を撮影した（Ｏｌｙｍｐｕｓ社、ペンシルバニア州センターバレー）。
【０１７１】
統計解析
データは、ｐａｉｒｅｄ  ｔ−検定またはノンパラメトリックｔ−検定を用いる２要因分散分析（２−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）により、Ｐｒｉｓｍ  ４（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、カリフォルニア州サンディエゴ）またはＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｏｆｆｉｃｅ  Ｅｘｃｅｌ  ２００７（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社、ワシントン州シアトル）を使用して分析した。
【０１７２】
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【０１７３】
本明細書の中で参照されている、もしくは出願データシートに一覧されている、またはその両方である米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、非特許文献のすべては、米国仮特許出願第６１／１５２，５１２号（ただしこれに限定されない）を含めて、その全体が参照によって本出願に援用する。
【０１７４】
ここまでの説明から理解されるように、本明細書には本発明の具体的な実施形態を説明を目的として記載したが、本発明の概念および範囲から逸脱することなく、さまざまな変更を行うことができる。したがって、本発明は、添付の請求項によってのみ制限される。
【図１Ａ】
2012518001.tif 000031
【図１Ｂ】
2012518001.tif 000032
【図２Ａ】
2012518001.tif 000033
【図２Ｂ】
2012518001.tif 000034
【図２Ｃ】
2012518001.tif 000035
【図２Ｄ】
2012518001.tif 000036
【図２Ｅ】
2012518001.tif 000037
【図２Ｆ】
2012518001.tif 000038
【図３Ａ】
2012518001.tif 000039
【図３Ｂ】
2012518001.tif 000040
【図３Ｃ】
2012518001.tif 000041
【図３Ｄ】
2012518001.tif 000042
【図４Ａ】
2012518001.tif 000043
【図４Ｂ】
2012518001.tif 000044
【図４Ｃ】
2012518001.tif 000045
【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
2012518001.tif 000060
【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１Ｃ】
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【図１１Ａ−１】
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【図１１Ａ−２】
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【図１１Ｂ−１】
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【図１１Ｂ−２】
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【国際調査報告】
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