(57)【要約】本発明は、全体として、薬物の同定および評価ならびに治療最適化の領域に関する。より具体的には、本発明は、ゲノミック発現シグネチャーまたはプロテオミック発現シグネチャーに基づき、TNFα関連糖尿病または糖尿病に関連した状態の処置において有用な化合物を同定するためのプロトコルを提供する。糖尿病およびそれに関連した状態についての診断および予後判定のプロトコルも、本発明の一部を形成する。治療介入の最適化も、本発明に包含される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
2型糖尿病またはその症状を示す遺伝子発現シグネチャー（GES）または対応するプロテオミック発現シグネチャー（PES）であって、PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1（FACL2）、CS、およびCLUを含むリストより選択される少なくとも2種の遺伝子または遺伝子産物の発現レベルを含むGESまたはPES。
【請求項２】
PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1（FACL2）、CS、およびCLUを含むリストより選択される少なくとも2種〜7種の遺伝子または遺伝子産物を含む、請求項1記載のGESまたはPES。
【請求項３】
PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1（FACL2）、CS、およびCLUを含むリストより選択される少なくとも3種〜7種の遺伝子または遺伝子産物を含む、請求項1記載のGESまたはPES。
【請求項４】
PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1（FACL2）、CS、およびCLUを含むリストより選択される少なくとも4種〜7種の遺伝子または遺伝子産物を含む、請求項1記載のGESまたはPES。
【請求項５】
PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1（FACL2）、CS、およびCLUを含むリストより選択される少なくとも5種〜7種の遺伝子または遺伝子産物を含む、請求項1記載のGESまたはPES。
【請求項６】
PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1（FACL2）、CS、およびCLUを含むリストより選択される少なくとも6種または7種の遺伝子または遺伝子産物を含む、請求項1記載のGESまたはPES。
【請求項７】
遺伝子または遺伝子産物PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1（FACL2）、CS、およびCLUを含む、請求項1記載のGESまたはPES。
【請求項８】
2型糖尿病がTNFα関連2型糖尿病である、請求項1〜7のいずれか一項記載のGESまたはPES。
【請求項９】
インスリン感受性の状況が、対照と比べての、PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、およびCLUの発現の減少により示される、請求項1〜8のいずれか一項記載のGESまたはPES。
【請求項１０】
インスリン感受性の状況が、対照と比べての、ACS1（FACL2）およびCSの発現の増加により示される、請求項1〜9のいずれか一項記載のGESまたはPES。
【請求項１１】
対象における2型糖尿病、2型糖尿病の発症の素因、または2型糖尿病に関連した合併症の診断または予後判定のための方法であって、
（a）対象から生物学的試料を入手する工程；
（b）生物学的試料中のPKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1、CS、および／またはCLUのうちの2種以上に基づく、インスリン感受性または抵抗性のレベルを指し示すGESまたは対応するPESを決定する工程；ならびに
（c）生物学的試料中のGESを統計的に実証された閾値と比較する工程
を含む方法。
【請求項１２】
GESまたは対応するPESが、PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1（FACL2）、CS、およびCLUを含むリストより選択される少なくとも2種〜7種の遺伝子または遺伝子産物を含む、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
GESまたは対応するPESが、PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1（FACL2）、CS、およびCLUを含むリストより選択される少なくとも3種〜7種の遺伝子または遺伝子産物を含む、請求項11記載の方法。
【請求項１４】
GESまたは対応するPESが、PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1（FACL2）、CS、およびCLUを含むリストより選択される少なくとも4種〜7種の遺伝子または遺伝子産物を含む、請求項11記載の方法。
【請求項１５】
GESまたは対応するPESが、PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1（FACL2）、CS、およびCLUを含むリストより選択される少なくとも5種〜7種の遺伝子または遺伝子産物を含む、請求項11記載の方法。
【請求項１６】
GESまたは対応するPESが、PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1（FACL2）、CS、およびCLUを含むリストより選択される少なくとも6種または7種の遺伝子または遺伝子産物を含む、請求項11記載の方法。
【請求項１７】
GESまたは対応するPESが、遺伝子または遺伝子産物PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1（FACL2）、CS、およびCLUを含む、請求項11記載の方法。
【請求項１８】
2型糖尿病がTNFα関連2型糖尿病である、請求項11〜17のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
インスリン感受性の状況が、対照と比べての、PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、およびCLUの発現の減少により示される、請求項11〜18のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
インスリン感受性の状況が、対照と比べての、ACS1（FACL2）およびCSの発現の増加により示される、請求項11〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
細胞におけるインスリン抵抗性のレベルを低下させる化合物を同定する方法であって、インスリン抵抗性を指し示す第1のGESまたは対応するPES（第1の知識ベース）を有するインスリン抵抗性細胞を接触させる工程、次いで、インスリン感受性を指し示す第2のGESまたは対応するPES（第2の知識ベース）についてスクリーニングし、第2のGESの発生を促進する化合物を前記化合物として選択する工程を含む方法。
【請求項２２】
GESまたは対応するPESが、PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1（FACL2）、CS、およびCLUを含むリストより選択される少なくとも2種〜7種の遺伝子または遺伝子産物を含む、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
GESまたは対応するPESが、PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1（FACL2）、CS、およびCLUを含むリストより選択される少なくとも3種〜7種の遺伝子または遺伝子産物を含む、請求項21記載の方法。
【請求項２４】
GESまたは対応するPESが、PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1（FACL2）、CS、およびCLUを含むリストより選択される少なくとも4種〜7種の遺伝子または遺伝子産物を含む、請求項21記載の方法。
【請求項２５】
GESまたは対応するPESが、PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1（FACL2）、CS、およびCLUを含むリストより選択される少なくとも5種〜7種の遺伝子または遺伝子産物を含む、請求項21記載の方法。
【請求項２６】
GESまたは対応するPESが、PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1（FACL2）、CS、およびCLUを含むリストより選択される少なくとも6種または7種の遺伝子または遺伝子産物を含む、請求項21記載の方法。
【請求項２７】
GESまたは対応するPESが、遺伝子または遺伝子産物PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1（FACL2）、CS、およびCLUを含む、請求項21記載の方法。
【請求項２８】
インスリン抵抗性が2型糖尿病に関連している、請求項21〜27のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９】
2型糖尿病がTNFα関連2型糖尿病である、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
インスリン感受性の状況が、対照と比べての、PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、およびCLUの発現の減少により示される、請求項21〜29のいずれか一項記載の方法。
【請求項３１】
インスリン感受性の状況が、対照と比べての、ACS1（FACL2）およびCSの発現の増加により示される、請求項21〜30のいずれか一項記載の方法。
【請求項３２】
2型糖尿病の処置のための医薬の製造における、請求項1〜10のいずれか一項記載のGESまたはPESの使用。
【請求項３３】
2型糖尿病についての診断アッセイの製造における、請求項1〜10のいずれか一項記載のGESまたはPESの使用。
【請求項３４】
細胞におけるインスリン抵抗性を低下させるかまたはインスリン感受性を促進する化合物の製造における、請求項1〜10のいずれか一項記載のGESまたはPESの使用。
【請求項３５】
治療介入を容易にするため、2型糖尿病に対する処置を必要とする対象を層別化する方法であって、PKM2、Skp1a1、CD63、ACS1（FACL2）、CS、およびCLUより選択される少なくとも2種の遺伝子の発現レベルを含む、対象についてのGESまたは対応するPESを決定する工程、ならびに対象を層別化するために使用されたGESまたはPESと同一であるかまたは実質的に類似しているGESまたは対応するPESを使用して糖尿病症状逆転剤として同定された医薬を選択する工程を含む方法。
【請求項３６】
2型糖尿病またはその症状を有する対象の処置の方法であって、PKM2、Skp1a1、CD63、ACS1（FACL2）、CS、およびCLUより選択される少なくとも2種の遺伝子の発現レベルを含む、対象についてのGESまたは対応するPESを決定する工程、ならびに対象において決定されたGESまたはPESと同一であるかまたは実質的に類似しているGESまたは対応するPESを使用して糖尿病症状逆転剤として同定された医薬を投与する工程を含む方法。
【請求項３７】
2型糖尿病またはその症状を有する対象の処置の方法であって、PKM2、Skp1a1、CD63、ACS1（FACL2）、CS、およびCLUより選択される少なくとも2種の遺伝子の発現レベルを含む、対象についてのGESまたは対応するPESを決定する工程、ならびに対象において決定されたGESまたはPESと同一であるかまたは実質的に類似しているGESまたは対応するPESを使用して糖尿病症状逆転剤として同定された医薬を投与する工程、ならびにGESまたは対応するPESを経時的にモニタリングする工程、ならびに対象について最後に決定されたGESまたはPESと同一であるかまたは実質的に類似しているGESまたは対応するPESを前記医薬が有するように投薬を調整する工程を含む方法。
【請求項３８】
GESまたは対応するPESが、PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1（FACL2）、CS、およびCLUを含むリストより選択される少なくとも2種〜7種の遺伝子または遺伝子産物を含む、請求項35または36または37のいずれか一項記載の方法。
【請求項３９】
GESまたは対応するPESが、PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1（FACL2）、CS、およびCLUを含むリストより選択される少なくとも3種〜7種の遺伝子または遺伝子産物を含む、請求項35または36または37のいずれか一項記載の方法。
【請求項４０】
GESまたは対応するPESが、PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1（FACL2）、CS、およびCLUを含むリストより選択される少なくとも4種〜7種の遺伝子または遺伝子産物を含む、請求項35または36または37のいずれか一項記載の方法。
【請求項４１】
GESまたは対応するPESが、PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1（FACL2）、CS、およびCLUを含むリストより選択される少なくとも5種〜7種の遺伝子または遺伝子産物を含む、請求項35または36または37のいずれか一項記載の方法。
【請求項４２】
GESまたは対応するPESが、PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1（FACL2）、CS、およびCLUを含むリストより選択される少なくとも6種または7種の遺伝子または遺伝子産物を含む、請求項35または36または37のいずれか一項記載の方法。
【請求項４３】
GESまたは対応するPESが、遺伝子または遺伝子産物PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1（FACL2）、CS、およびCLUを含む、請求項35または36または37のいずれか一項記載の方法。
【請求項４４】
2型糖尿病がTNFα関連2型糖尿病である、請求項35〜43のいずれか一項記載の方法。
【請求項４５】
請求項35〜44のいずれか一項記載の方法、または2型糖尿病に対する対象の処置を最適化する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
領域
本発明は、全体として、薬物の同定および評価ならびに治療最適化の領域に関する。より具体的には、本発明は、ゲノミック発現シグネチャーまたはプロテオミック発現シグネチャーに基づく、TNFα関連糖尿病または糖尿病に関連した状態の処置において有用な化合物を同定するためのプロトコルを提供する。糖尿病およびそれに関連する状態についての診断および予後判定のプロトコルも、本発明の一部を形成する。治療介入の最適化も本発明に包含される。
【背景技術】
【０００２】
背景
本明細書において著者により言及される刊行物の書誌の詳細は、説明の最後にアルファベット順にまとめられている。
【０００３】
本明細書における先行技術についての言及は、この先行技術が、いずれかの国における一般的な一般知識の一部を形成することの認識または何らかの形態の暗示ではなく、そのように理解されるべきではない。
【０００４】
遺伝子発現シグネチャー（GES）および対応するプロテオミック発現シグネチャー（PES）は、協調的に発現された遺伝子のクラスタに関する情報を提供し（Alizadeh et al.Nature 405:503-511,2000（非特許文献1））、異なる生物学的または生理学的な状況を記載するために使用され得る（van de Vijver et al.N Engl J Med 347:1999-2009,2002（非特許文献2））。GESは、腫瘍分類、予後予測、および治療介入に対する患者の応答を補助するために、癌生物学において使用されている（Cooper et al.Nat Clin Pract Urol 4:677-687,2007（非特許文献3）；Nuyten and van de Vijver Semin Radiat Oncol 18:105-114,2008（非特許文献4））。単一遺伝子の発現に基づくスクリーニングアプローチは、PGC-1αのような代謝遺伝子標的を調節する薬物を同定するために使用されているが（Arany et al.Proc Natl Acad Sci USA 105:4721-4726,2008（非特許文献5））、GESは、mRNA発現が環境に対する細胞の統合的な応答を指し示すような遺伝子の群を表す。そのため、GESはクラスタ内の遺伝子に関係なく入手される。従って、これらの遺伝子は、変化した代謝状況を直接的には調節しないかもしれない；むしろ、それらはその象徴的なマーカーとなり得る。そのため、遺伝子機能を割り当てる必要なしに、指示アッセイが設計され得る。
【０００５】
2型糖尿病（T2D）は、世界中に蔓延している主要な健康問題である。この疾患の最大の特色はインスリン抵抗性である。インスリン抵抗性の原因は、多因子性であると考えられており、高レベルの循環血中非エステル化脂肪酸、慢性炎症、小胞体ストレス、および酸化ストレスが、全て、寄与する可能性がある（Mlinar,et al.Clin Chim Acta 375:20-35,2007（非特許文献6））。炎症誘発性サイトカインである腫瘍壊死因子α（TNFα）のレベルの上昇は、脂肪組織を含むいくつかの組織において、インスリン感受性を低下させるよう自己分泌的にも傍分泌的にも機能するため、TNFαは、肥満およびT2Dにおいて見られるインスリン抵抗性の誘導に関係付けられている（Hotamisligil,Nature 444:860-867,2006（非特許文献7）；Ruan and Lodish Cytokine Growth Factor Rev 14:447-455,2003（非特許文献8））。脂肪細胞により分泌されるTNFαは、脂肪分解および脂肪酸放出の誘導、インスリンシグナル伝達の障害、ならびにGLUT4レベルの低下を含む、様々な機序により、インスリン感受性を減少させることができる（Ruan and Lodish 2003（前記））。TNFαの作用は、p38 MAPキナーゼ、Jun-N末端キナーゼ、プロテインキナーゼC（PKC）を含むいくつかのキナーゼ、核内因子κB（NFκB）の活性化、およびペルオキシソーム増殖剤活性化受容体γ（PPATγ）のダウンレギュレーションにより媒介される［Qi and Pekala Proc Soc Exp Biol Med 223:128-135,2000（非特許文献9）；Tang et al.Proc Natl Acad Sci USA 103:2087-2092,2006（非特許文献10）］。アスピリン（ASA）およびチアゾリジンジオン系トログリタゾン（TGZ）のような薬剤は、インビボでインスリン感受性を改善することができ（Miles et al.Diabetes 46:1678-1683,1997（非特許文献11）；Yuan et al.Science 295:1673-1677,2001（非特許文献12））、インビトロでは、複数の経路を介してTNFαの影響に対抗すると考えられている（Gao et al.J Biol Chem 278:24944-24950,2003（非特許文献13）；Ohsumi et al.Endocrinology 135:2279-2282,1994（非特許文献14）；Peraldi and Spiegelman J Clin Invest 100:1863-1869,1997（非特許文献15））。従って、脂肪細胞におけるTNFαの効果を逆転させる薬剤は、全身のインスリン感受性を改善する可能性を有する。
【０００６】
社会における糖尿病の増加し続けている罹患率のため、糖尿病の処置または症状の改善において有用な薬物、ならびに糖尿病、または肥満、失明、腎症、および／もしくは心血管疾患のような糖尿病に関連した状態の診断およびモニタリングにおいて有用な薬物を同定することが緊急に必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Alizadeh et al.Nature 405:503-511,2000
【非特許文献２】van de Vijver et al.N Engl J Med 347:1999-2009,2002
【非特許文献３】Cooper et al.Nat Clin Pract Urol 4:677-687,2007
【非特許文献４】Nuyten and van de Vijver Semin Radiat Oncol 18:105-114,2008
【非特許文献５】Arany et al.Proc Natl Acad Sci USA 105:4721-4726,2008
【非特許文献６】Mlinar,et al.Clin Chim Acta 375:20-35,2007
【非特許文献７】Hotamisligil,Nature 444:860-867,2006
【非特許文献８】Ruan and Lodish Cytokine Growth Factor Rev 14:447-455,2003
【非特許文献９】Qi and Pekala Proc Soc Exp Biol Med 223:128-135,2000
【非特許文献１０】Tang et al.Proc Natl Acad Sci USA 103:2087-2092,2006
【非特許文献１１】Miles et al.Diabetes 46:1678-1683,1997
【非特許文献１２】Yuan et al.Science 295:1673-1677,2001
【非特許文献１３】Gao et al.J Biol Chem 278:24944-24950,2003
【非特許文献１４】Ohsumi et al.Endocrinology 135:2279-2282,1994
【非特許文献１５】Peraldi and Spiegelman J Clin Invest 100:1863-1869,1997
【発明の概要】
【０００８】
概要
本発明によると、T2D、特に、TNFα関連インスリン抵抗性T2Dのような糖尿病に関連した生物学的または生理学的な状況を定義するために、ゲノムアプローチ／プロテオミックアプローチが適用される。特に、細胞のTNFα関連インスリン抵抗性または感受性の状況を反映するGESが確立され、これが、インスリン抵抗性改善剤をスクリーニングするため、そして対象におけるTNFα関連T2Dを同定するかまたはモニタリングするため、使用される。一つの態様において、TNFαによりインスリン抵抗性にされ、次いで、ASAおよびTGZによる後処理により「インスリン感受性が回復した」細胞において、GESが生成される。このモデルは、個体が、典型的には、疾患の診断後に特定の薬物により処置される、ヒトの状態と一致している。ASAおよびTGZの両方の使用は、インスリン抵抗性の逆転における複数のシグナル伝達経路の活性化を確実にする。インスリン抵抗性状況とインスリン感受性回復状況とで発現が統計的に異なる、遺伝子発現プロファイリングを使用して同定されたGESは、遺伝子バイオマーカーPKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1、CS、および／またはCLUのうちの2種以上を含む。これらの遺伝子のmRNA発現が、可能性のあるインスリン抵抗性改善化合物を検索するため、薬物ライブラリーをスクリーニングするための基礎として使用される。GESにより同定された化合物およびそれらの薬物クラスは、インスリン抵抗性改善能力を決定するためにインビトロおよびインビボの両方で実証される。「GES」との言及には、その対応するプロテオミック発現シグネチャーまたはPESを介した遺伝子発現レベルの決定が含まれる。タンパク質検出アッセイが、PESを決定するために使用され得る。
【０００９】
そのため、本発明は、T2D、特に、TNFα関連T2Dにおけるインスリン感受性または抵抗性の生物学的または生理学的な状況に関連しているGES（または対応するPES）の生成において有用な、2種以上、特に、2〜7種の遺伝子バイオマーカーのパネルを提供する。GESは、T2Dを発症する素因、または肥満、失明、腎症、および／もしくは心血管疾患のようなT2Dに関連した状態、特に、TNFα関連T2Dを対象が発症する確率も予測する。一つの局面において、本発明の2種以上のバイオマーカーのパネルは、TNFα関連T2Dを有しているかまたはTNFα関連インスリン抵抗性を発症しつつある対象において、PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、およびCLUの遺伝子発現レベルが増加し、ACS1およびCSが減少するよう、差次的に発現される。インスリン感受性に特徴的なGES（または対応するPES）を誘導する薬物が同定される。
【００１０】
従って、本発明は、PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1（FACL2）、CS、およびCLUを含むリストより選択される少なくとも2種の遺伝子または遺伝子産物の発現レベルを含む、2型糖尿病またはその症状を示す遺伝子発現シグネチャー（GES）または対応するプロテオミック発現シグネチャー（PES）を提供する。
【００１１】
それらの遺伝子のうちの2〜7種のパネルに基づきGES（または対応するPES）を決定することによる、TNFα関連T2D、TNFα関連T2Dの素因、またはTNFα関連T2Dに関連した状態を発症する確率の診断および予後判定も、本発明の一部を形成する。TNFα関連T2D、TNFα関連T2Dの素因、またはTNFα関連T2Dに関連した状態を発症する確率を診断するかまたは予後判定する能力は、治療計画のモニタリングのような、対象の状態の処置および／または管理にとって重要な意義を有する。
【００１２】
GES内の遺伝子または対応するタンパク質は、本明細書において、バイオマーカーと呼ばれる。本発明は、単一遺伝子の発現に頼るのではなく、GES内の2種以上の遺伝子の発現により入手された集合的な情報に関する。
【００１３】
「バイオマーカー」との言及には、TNFα関連T2D、糖尿病の素因、またはTNFα関連T2Dに関連した状態を発症する確率、またはTNFα関連T2Dを発症する素因のマーカーが含まれる。GESは、2〜7種の遺伝子またはそれらの発現産物のパネルの発現レベルを決定することにより形成される。遺伝子のタンパク質性産物をスクリーニングする場合には、プロテオミック発現シグネチャーまたはPESが同定される。そのため、本発明には、PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1、CS、および／またはCLUのうちの2種以上に基づく、インスリン抵抗性または感受性のGESまたはPESが包含される。「2種以上」または「2〜7種」との言及には、前述の遺伝子のうちの2種、3種、4種、5種、6種、または7種が含まれる。
【００１４】
「TNFα関連T2D」または「TNFα関連インスリン抵抗性もしくは感受性」または「TNFα関連インスリン抵抗性T2D」との言及には、T2D状態のスペクトルが包含される。
【００１５】
本発明は、まず、GESまたは対応するPESに基づき、対象を特定の群へ層別化し、次いで、同一または類似のGES/PESを有する医薬を選択し投与することによる、T2Dに対する治療介入の最適化を、さらに可能にする。GES/PESを経時的にモニタリングし、対象のGES/PESと選択された医薬のGES/PESとの間の類似の相関の維持に基づき、医薬を変更することも可能である。
【００１６】
従って、本発明は、PKM2、Skp1a1、CD63、ACS1（FACL2）、CS、およびCLUより選択される少なくとも2種の遺伝子の発現レベルを含む、対象についてのGESまたは対応するPESを決定すること、ならびに対象を層別化するために使用されたGESまたはPESと同一であるかまたは実質的に類似しているGESまたは対応するPESを使用して糖尿病症状逆転剤として同定された医薬を選択することを含む、治療介入を容易にするため、2型糖尿病に対する処置を必要とする対象を層別化する方法を企図する。
【００１７】
本発明は、PKM2、Skp1a1、CD63、ACS1（FACL2）、CS、およびCLUより選択される少なくとも2種の遺伝子の発現レベルを含む、対象についてのGESまたは対応するPESを決定すること、ならびに対象において決定されたGESまたはPESと同一であるかまたは実質的に類似しているGESまたは対応するPESを使用して糖尿病症状逆転剤として同定された医薬を投与することを含む、2型糖尿病またはその症状を有する対象の処置の方法をさらに提供する。
【００１８】
本発明の別の局面は、PKM2、Skp1a1、CD63、ACS1（FACL2）、CS、およびCLUより選択される少なくとも2種の遺伝子の発現レベルを含む、対象についてのGESまたは対応するPESを決定すること、ならびに対象において決定されたGESまたはPESと同一であるかまたは実質的に類似しているGESまたは対応するPESを使用して糖尿病症状逆転剤として同定された医薬を投与すること、ならびにGESまたは対応するPESを経時的にモニタリングすること、ならびに対象について最後に決定されたGESまたはPESと同一であるかまたは実質的に類似しているGESまたは対応するPESを前記医薬が有するように投薬を調整することを含む、2型糖尿病またはその症状を有する対象の処置の方法に関する。
【００１９】
本発明は、TNFα関連T2Dまたはそれに関連した状態の処置のための医薬の製造における、TNFα関連インスリン抵抗性または感受性のGESまたはPESの使用を企図する。
【００２０】
従って、本発明の一つの局面は、PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、および／もしくはCLUの細胞における発現が対照と比べて増加しており、かつ／またはACS1および／もしくはCSが対照と比べて減少している場合に、インスリン抵抗性の状況が同定されるような、PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1（FACL2としても公知）、CS、およびCLU、またはそれらのホモログのうちの2種以上より選択される遺伝子を含む、TNFα関連インスリン抵抗性または感受性のレベルのGESまたは対応するPESを提供する。
【００２１】
これに関して、「対照」には、インスリン感受性細胞における発現レベルが含まれる。
【００２２】
別の態様において、本発明は、PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、および／もしくはCLUの細胞における発現が対照と比べて減少しており、かつ／またはACS1および／もしくはCSが対照と比べて増加している場合に、TNFα関連インスリン感受性の状況が同定されるような、PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1、CS、およびCLU、またはそれらのホモログのうちの2種以上より選択される遺伝子を含む、TNFα関連インスリン抵抗性または感受性のレベルのGESまたは対応するPESを企図する。
【００２３】
この局面において、「対照」には、インスリン抵抗性細胞における発現レベルが含まれる。
【００２４】
本発明は、インサイチューで実施されてもよいし、または対象からの生物学的試料に対して実施されてもよい。そのため、本発明は、（a）対象から生物学的試料を入手すること；（b）生物学的試料中のPKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1、CS、および／またはCLUのうちの2種以上に基づいて、TNFα関連T2Dインスリン感受性または抵抗性のレベルを指し示すGESまたは対応するPESを決定すること；ならびに（c）生物学的試料中のGESを統計的に実証された閾値と比較すること：を含む、対象におけるTNFα関連T2D、またはTNFα関連T2DもしくはTNFα関連T2Dに関連した合併症の発症の素因の診断または予後判定のための方法をさらに提供する。
【００２５】
そのため、TNFα関連T2Dインスリン抵抗性または感受性の一つの生物学的／生理学的状況におけるGESは、本明細書において、知識ベースと呼ばれる。複数の薬剤または薬物の存在下における複数の知識ベース間でのGESまたは対応するPESを比較することにより、TNFα関連T2Dの有用な医薬または処置が同定される。
【００２６】
従って、本発明は、TNFα関連T2Dインスリン抵抗性を指し示す第1のGESまたは対応するPES（第1の知識ベース）を有するTNFα関連T2Dインスリン抵抗性細胞を接触させ、次いで、TNFα関連T2Dインスリン感受性を指し示す第2のGESまたは対応するPES（第2の知識ベース）についてスクリーニングし、第2のGESの発生を促進する化合物を、細胞におけるTNFα関連T2Dインスリン抵抗性のレベルを低下させる化合物として選択することを含む、細胞におけるTNFα関連T2Dインスリン抵抗性のレベルを低下させる化合物を同定する方法をさらに企図する。
【００２７】
第1および第2の知識ベースは、アッセイにおいて決定されてもよいし、または統計的に実証された対照の一部であってもよい。
【００２８】
本発明は、特に、ヒトの処置におけるTNFα関連T2Dの医薬の同定に関する。
【００２９】
GESの使用は、T2Dの単一遺伝子指標の使用より効率的であり、これは、治療のモニタリング、およびインスリン抵抗性改善特性を有する可能性のある医薬のスクリーニングにおいて特に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
いくつかの図面は、カラーの表示または実体を含有している。カラー写真は、特許権者から要請により、または適切な特許庁から、入手可能である。特許庁から入手する場合には、料金が課せられる可能性がある。
【００３１】
【図１】TNFαに基づくGESを使用した低分子ライブラリースクリーニング結果の概要のグラフ表示である。A.10種以上のメンバーを含む各化合物ファミリーについての平均Zrccスコアの順位付け。インスリン感受性が回復したTNFα＋TGZおよびASAにより同時処理された対照（TTA）、ならびにインスリン抵抗性のTNFαにより処理された対照（TNF）が表される（＊ TNFに対してp＜0.05、∧ TTAに対してp＜0.05；n＝10〜62）。
【図２】図2aおよび2bは、3T3-L1脂肪細胞におけるHAタグ付きGLUT4の細胞膜への移行の化合物による刺激のグラフ表示である。脂肪細胞を、20時間、10μMの各化合物と共にインキュベートした後、0.5nMのインスリンにより急性刺激し、HAタグ付きGLUT4の細胞膜への移行を測定した。a.TNFα＋ASAおよびTGZとコインキュベートされた試料のGESプロファイルに最も近い化合物クラス（図1参照）の、HAタグ付きGLUT4の移動に対する効果。データは、1.0に設定された0.5nMインスリン単独と比較した変化倍率として提示され、平均値±SEMを表す；各クラスn＝12〜40。b.GLUT4の移動に対する個々のCAIメンバーの効果。各バーは、デュプリケート試料の平均値＋SDを表し、0.5nMインスリンの値（「1」に設定）に対する変化倍率として表される。* 0.5nMインスリン単独と比較してp＜0.003。陰性対照および陽性対照には、それぞれ、0.5nMインスリン単独と比較された、0nMインスリン（p＝1.51×10-13、n＝32）および急性最大200nMインスリン（p＝2.55×10-9、n＝32）、10μM TGZ（n＝8）および5mM ASA（n＝8）の20時間のインキュベーションが含まれる。
【図３】図3a〜3eは、DIOマウスおよびdb/dbマウスにおける代謝パラメータに対するメタゾラミドの効果のグラフ表示である。A.14日間、50mg/kg/dで対応する各薬物により処理されたDIOマウスにおける、腹腔内グルコース負荷試験後の、媒体により処理された動物に対する割合（％）として表された血中グルコース曲線下面積（AUC）の変化。略語：2-アミノベンゼンスルホンアミド（2ABS）、クロルサリドン（CTD）、フロセミド（FUR）、ジクロフェナミド（DCP）、メタゾラミド（MTZ）、およびN-メチルメタゾラミド（MMTZ）。B.DIOマウスにおける血中グルコースレベル（上パネル）および血漿インスリンレベル（下パネル）に対するMTZの用量依存性の効果。動物は、14日間、示された用量でMTZにより処理された。*∧ 媒体（n＝6）と50mg/kg（n＝5）と、媒体と100mg/kg（n＝5）とでそれぞれp＜0.05。C.db/dbマウスにおける空腹時血中グルコースレベルに対するMTZの用量依存性の効果。マウスは、8日間、媒体（n＝24）または50mg/kg MTZ（n＝23）により処理された。* 0日目に対してp＜0.05、∧ 対応する媒体に対してp＜0.05。D.28日間、50mg/kg MTZにより処理した後の、db/dbマウスにおけるグリコシル化ヘモグロビン（Hb1Ac）に対するMTZの用量依存性の効果。ヒストグラムは平均値±SEM（n＝5〜12）を表す。* 媒体に対してp＜0.05。E.db/dbマウスにおける空腹時血中グルコースに対するMTZとメトホルミンとの組み合わせの効果。8日間、媒体、20mg/kg MTZ、300mg/kgメトホルミン、または20mg/kg MTZおよび300mg/kgメトホルミンにより処理されたマウスにおけるグルコースレベルの変化。* 媒体に対してp＜0.05、∧ メトホルミン単独に対してp＜0.05。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
詳細な説明
本明細書の全体にわたって、前後関係がそうでないことを要求しない限り、「含む（comprise）」という単語、または「含む（comprises）」もしくは「含む（comprising）」のような変化形は、明示された要素もしくは整数、または要素もしくは整数の群が含まれることを意味し、他の要素もしくは整数、または要素もしくは整数の群が排除されることを意味するのではないことが理解されるであろう。
【００３３】
本明細書において使用されるように、単数形（「a」、「an」、および「the」）には、前後関係がそうでないことを明らかに指示しない限り、複数相が含まれることに注意しなければならない。そのため、例えば、「GES」との言及には、単一のGESのみならず、2種以上のGESも含まれ；「薬剤」との言及には、単一の薬剤のみならず、2種以上の薬剤も含まれ；「本発明」との言及には、発明の単一または複数の局面が含まれ；他も同様である。
【００３４】
本発明は、集合的な発現が、糖尿病、特に、TNFα関連T2Dに関連した生物学的または生理学的な状況を説明するかまたは指し示すGES（または対応するPES）を定義する遺伝子のクラスタを同定する。より具体的には、生物学的または生理学的な状況は、細胞のTNFα関連T2Dインスリン抵抗性または感受性のレベルである。TNFα関連T2Dインスリン抵抗性または感受性の特定の状況を定義するGESまたはPESは、本明細書において知識ベースと呼ばれる。そのため、TNFα関連T2Dインスリン感受性からインスリン抵抗性への進展は、異なる知識ベースを生成する。薬剤の存在下でのこれらの知識ベースの比較は、対象におけるTNFα関連T2Dインスリン感受性を誘導する薬剤の同定を可能にする。
【００３５】
GESは、PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1（FACL2としても公知）、CS、およびCLUより選択される2種以上の遺伝子に関する発現情報を含む。「2種以上」または「2〜7種」との言及には、これらの遺伝子のうちの2種、3種、4種、5種、6種、または7種が含まれる。上にリストされたような2種以上の遺伝子の全ての任意の組み合わせが、本発明に包含される。特定の態様において、第1の知識ベースは、PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、およびCLUの発現が増加し、ASC1およびCSの発現が減少する、TNFα関連T2Dインスリン抵抗性として同定される。第2の知識ベースは、PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、およびCLUの発現が減少し、ACS1およびCSの発現が増加する、TNFα関連T2Dインスリン感受性について同定される。
【００３６】
そのため、本発明は、PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、および／もしくはCLUの細胞における発現が対照と比べて増加しており、かつ／またはACS1および／もしくはCSが対照と比べて減少している場合に、TNFα関連T2Dインスリン抵抗性または感受性の状況が同定される、PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1、CS、およびCLU、またはそれらのホモログのうちの2種以上より選択される遺伝子を含む、TNFα関連T2Dインスリン抵抗性または感受性のレベルのGESまたは対応するPESも提供する。
【００３７】
従って、本発明は、PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1（FACL2）、CS、およびCLUを含むリストより選択される少なくとも2種の遺伝子または遺伝子産物の発現レベルを含む、2型糖尿病またはその症状を示す遺伝子発現シグネチャー（GES）または対応するプロテオミック発現シグネチャー（PES）を提供する。
【００３８】
これに関して、「対照」には、インスリン感受性細胞における発現レベルが含まれる。
【００３９】
別の態様において、本発明は、PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、および／もしくはCLUの細胞における発現が対照と比べて減少しており、かつ／またはACS1および／もしくはCSが対照と比べて増加している場合に、TNFα関連T2Dインスリン感受性の状況が同定される、PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1、CS、およびCLU、またはそれらのホモログのうちの2種以上より選択される遺伝子を含む、TNFα関連T2Dインスリン抵抗性または感受性のレベルのGESまたは対応するPESを企図する。
【００４０】
この局面において、「対照」には、インスリン抵抗性細胞における発現レベルが含まれる。
【００４１】
本発明は、（a）対象から生物学的試料を入手すること；（b）生物学的試料中のPKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1、CS、および／またはCLUのうちの2種以上に基づく、TNFα関連T2Dのレベルを指し示すGESまたは対応するPESを決定すること；ならびに（c）生物学的試料中のGESを統計的に実証された閾値と比較すること：を含む、対象におけるTNFα関連T2DまたはTNFα関連T2DもしくはTNFα関連T2Dに関連した合併症の発症の素因の診断または予後判定のための方法をさらに提供する。
【００４２】
本発明は、まず、GESまたは対応するPESに基づき、対象を特定の群に層別化し、次いで、同一または類似のGES/PESを有する医薬を選択し投与することによる、T2Dに対する治療介入の最適化をさらに可能にする。GES/PESを経時的にモニタリングし、対象のGES/PESと選択された医薬のGES/PESとの間の類似の相関の維持に基づき、医薬を変更することも可能である。
【００４３】
従って、本発明は、PKM2、Skp1a、CD63、ACS1（FACL2）、CS、およびCLUより選択される少なくとも2種の遺伝子の発現レベルを含む、対象についてのGESまたは対応するPESを決定すること、ならびに対象を層別化するために使用されたGESまたはPESと同一であるかまたは実質的に類似しているGESまたは対応するPESを使用して糖尿病症状逆転剤として同定された医薬を選択することを含む、治療介入を容易にするため、2型糖尿病に対する処置を必要とする対象を層別化する方法を企図する。
【００４４】
本発明は、PKM2、Skp1a、CD63、ACS1（FACL2）、CS、およびCLUより選択される少なくとも2種の遺伝子の発現レベルを含む、対象についてのGESまたは対応するPESを決定すること、ならびに対象において決定されたGESまたはPESと同一であるかまたは実質的に類似しているGESまたは対応するPESを使用して糖尿病症状逆転剤として同定された医薬を投与することを含む、2型糖尿病またはその症状を有する対象の処置の方法をさらに提供する。
【００４５】
本発明の別の局面は、PKM2、Skp1a、CD63、ACS1（FACL2）、CS、およびCLUより選択される少なくとも2種の遺伝子の発現レベルを含む、対象についてのGESまたは対応するPESを決定すること、ならびに対象において決定されたGESまたはPESと同一であるかまたは実質的に類似しているGESまたは対応するPESを使用して糖尿病症状逆転剤として同定された医薬を投与すること、ならびにGESまたは対応するPESを経時的にモニタリングすること、ならびに対象について最後に決定されたGESまたはPESと同一であるかまたは実質的に類似しているGESまたは対応するPESを前記医薬が有するように投薬を調整することを含む、2型糖尿病またはその症状を有する対象の処置の方法に関する。
【００４６】
「糖尿病症状逆転剤」との言及には、糖尿病、特に、2型糖尿病を逆転させる薬剤が含まれる。
【００４７】
「生物学的試料」には、全血、血漿、血清、粘液、尿、単離された末梢血単核細胞、リンパ球、精液、糞便、胆汁、細胞抽出物、気道液、洗浄液、リンパ液、唾液、およびその他の組織分泌物または液体のような生物学的液体試料が含まれるが、これらに限定されない。特定の生物学的液体は、全血、血漿、および血清である。従って、生物学的試料は、液体に基づく試料、または固体支持体に捕獲された細胞を含む、細胞であり得る。対象から生物学的試料を物理的に取り出すことは必要ではないが、生物学的試料を取り出し、その後、その中のバイオマーカーを分析することは、本発明の方法を実施するための最も便利な方法である。生物学的液体は濃縮過程を受けてもよく、またはアッセイにおいて干渉する可能性のある存在量の多い分子が除去されてもよい。
【００４８】
本発明は、2種以上の集合的な発現が、TNFα関連T2D、ならびに肥満、失明、腎症、および／もしくは心血管疾患のようなTNFα関連T2Dに関連した合併症、またはTNFα関連T2Dを発症する確率を指し示すようなバイオマーカーの同定に、一部分、基づく。
【００４９】
「同定」との言及には、インスリン抵抗性／感受性、またはそれらから発生する合併症を示す、選択された2種以上のバイオマーカーの順位付け、層別化、またはプロファイリングが含まれる。順位付け、層別化、およびプロファイリングは、全て、「発現シグネチャー」という用語に包含される。
【００５０】
本発明は、GES内または対応するPES内の遺伝子の誘導体およびホモログにも及ぶ。そのため、本発明のバイオマーカーには、上にリストされたもののみならず、それらとの70％の同一性を有するヌクレオチド配列を有する遺伝子、または高ストリンジェンシー条件下でそれらの配列もしくはそれらの相補鎖にハイブリダイズすることができる遺伝子、またはそれらの遺伝子によりコードされるアミノ酸配列との少なくとも70％の類似性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子も含まれる。
【００５１】
少なくとも70％との言及には、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、および100％が含まれる。
【００５２】
特定の類似率または同一率は、少なくとも約80％、少なくとも約90％、または少なくとも約95％を有する。
【００５３】
「類似性」という用語には、本明細書において使用されるように、ヌクレオチドレベルまたはアミノ酸レベルで比較された配列の間の正確な同一性が含まれる。ヌクレオチドレベルで非同一性が存在する場合、「類似性」には、それにも関わらず、構造的、機能的、生化学的、および／または立体構造的なレベルで相互に関連している、異なるアミノ酸をもたらす配列間の差が含まれる。アミノ酸レベルで非同一性が存在する場合、「類似性」には、それにも関わらず、構造的、機能的、生化学的、および／または立体構造的なレベルで相互に関連しているアミノ酸が含まれる。特に好ましい態様において、ヌクレオチドおよび配列の比較は、類似性ではなく同一性のレベルでなされる。
【００５４】
2種以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの間の配列関係を記載するために使用される用語には、「参照配列」、「比較ウインドウ」、「配列類似性」、「配列同一性」、「配列類似率」、「配列同一率」、「実質的に類似している」、および「実質的同一性」が含まれる。「参照配列」は、ヌクレオチド残基およびアミノ酸残基を含むモノマー単位、少なくとも12個の長さであるが、15〜18個の長さであることが多く、しばしば、少なくとも25個以上、例えば、30個の長さであり、例には、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、および25個が含まれる。2種のポリヌクレオチドは、各々、（1）2種のポリヌクレオチドの間で類似している配列（即ち、完全ポリヌクレオチド配列の一部のみ）、および（2）2種のポリヌクレオチドの間で異なる配列、を含み得るため、2種（またはそれ以上）のポリヌクレオチドの間の配列比較は、典型的には、配列類似性の局所的な領域を同定し比較するため、「比較ウインドウ」で2種のポリヌクレオチドの配列を比較することにより実施される。「比較ウインドウ」とは、参照配列と比較される、典型的には12連続残基の概念的セグメントをさす。2種の配列の最適のアラインメントのため、比較ウインドウは、（付加または欠失を含まない）参照配列と比較して、約20％以下の付加または欠失（即ち、ギャップ）を含むことができる。比較ウインドウを整列化するための配列の最適のアラインメントは、アルゴリズム（Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0内のGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA（Genetics Computer Group,575 Science Drive Madison,WI,USA））のコンピューター化された実装により、または視察により実施され得、様々な方法のいずれかにより生成された最適なアラインメント（即ち、比較ウインドウにおける最も高い相同率をもたらすもの）が選択される。例えば、Altschulら（Nucl Acids Res 25:3389,1997）により開示されたような、BLASTファミリーのプログラムも、参照することができる。配列分析の詳細な考察は、Ausubelら（"Current Protocols in Molecular Biology" John Wiley & Sons Inc,Chapter 15,1994-1998）のユニット19.3に見出され得る。
【００５５】
「高ストリンジェンシー条件」とは、プローブが、非特異的なハイブリダイゼーションより検出可能に強力な量で、標的配列に特異的にハイブリダイズする条件を意味する。よって、高ストリンジェンシー条件は、正確な相補配列を有するポリヌクレオチド、またはほんの少数の散在したミスマッチを含有しているものを、プローブとマッチする少数の小さな領域（例えば、3〜10塩基）を偶然有したランダム配列から、区別する条件であろう。そのような小さな相補性の領域は、14〜17塩基以上の全長相補鎖より容易に融解され、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションはそれらを容易に区別できるようにする。比較的高いストリンジェンシー条件には、例えば、約0.02M〜約0.10M NaClまたは等価物、約50℃〜約70℃の温度により提供されるような、低塩および／または高温の条件が含まれるであろう。そのような高ストリンジェンシー条件は、プローブとテンプレートまたは標的鎖との間のミスマッチを、たとえ許容したとしても、ほとんど許容せず、特定のバイオマーカーの発現を検出するために特に適しているであろう。増加する量のホルムアミドの添加により、条件をよりストリンジェントにし得ることが、一般に認識される。
【００５６】
本明細書において、高ストリンジェンシーとの言及には、ハイブリダイゼーションのための少なくとも約0〜少なくとも約15％v/vホルムアミド、および少なくとも約1M〜少なくとも約2Mの塩、ならびにハイブリダイゼーションのための31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、および50％v/vホルムアミドのような少なくとも約31％v/v〜少なくとも約50％v/vホルムアミド、および0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、および0.15Mのような少なくとも約0.01M〜少なくとも約0.15Mの塩、ならびに洗浄条件のための0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、および0.15Mのような少なくとも約0.01M〜少なくとも約0.15Mの塩が含まれ、包含される。一般に、洗浄は、Tm＝69.3＋0.41(G＋C)％（Marmur and Doty,J.Mol.Biol.5:109,1962）で実施される。しかしながら、二重鎖DNAのTmは、ミスマッチ塩基対の数が1％増加する毎に1℃減少する（Bonner and Laskey,Eur J Biochem 46:83,1974）。ホルムアミドは、これらのハイブリダイゼーション条件において任意である。従って、高ストリンジェンシーは、少なくとも65℃の温度での0.1×SSC緩衝液、0.1％w/v SDSとして定義される。
【００５７】
別の態様において、本発明は、対象からの生物学的試料において、表3にリストされたバイオマーカーであるタンパク質または該タンパク質もしくはそのホモログをコードするmRNAのレベルについてスクリーニングすることを含む、対象におけるTNFα関連糖尿病もしくはTNFα関連糖尿病から発生する合併症、または対象のTNFα関連糖尿病を発症する素因を診断する方法を提供する。本法において、統計的に実証された閾値と比較されたタンパク質のレベルの差が、TNFα関連糖尿病、またはそれから発生する合併症、またはそれらを発症する素因を示す。
【００５８】
発現レベル（またはPESの場合、タンパク質レベル）は、7種のバイオマーカーのうちの2種以上の群において検討された場合、生物学的または生理学的な状況の統計的に実証された一貫した定義を提供する。
【００５９】
本願において指定された様々な範囲における数値の使用は、そうでないことが特記されない限り、明示された範囲の最低値および最大値の両方に「約」という単語が先行するかのごとく、近似として明示されている。このように、明示された範囲の上下のわずかな変動は、範囲内の値と実質的に同一の結果を達成するために使用され得る。また、これらの範囲の開示は、最低値と最大値との間の全ての値を含む連続的な範囲であるものとする。さらに、シグネチャーは、インスリン抵抗性のリスクのレベルに関連した数値を提供するバイオマーカーの2つ以上のレベルの比率にも及ぶ。
【００６０】
2種以上のバイオマーカーのレベルまたは濃度の決定は、統計アルゴリズムおよび機械学習アルゴリズムの適用に基づく診断ルールの確立を可能にする。そのようなアルゴリズムは、（既知のインスリン抵抗性または感受性の状況を有する）訓練データにおいて観察された、バイオマーカーとインスリン抵抗性または感受性との間の関係を使用し、未知の状況を有する患者の状況を予測するために次いで使用される関係を推論する。患者がTNFα関連インスリン抵抗性を有する確率、またはTNFα関連インスリン抵抗性を発症する確率、従って、TNFα関連T2Dを発症する確率の指標を提供するアルゴリズムが利用される。
【００６１】
そのため、本発明は、未知のインスリン抵抗性状況を有する患者からの同バイオマーカーのレベルを含むデータの第2の知識ベースを入力した時に、インスリン抵抗性または感受性がTNFαに関連しているか否かを予測する確率の指数を提供する、アルゴリズムを生成するための、TNFα関連インスリン抵抗性を有する対象からの本明細書に記載されるような2種以上のバイオマーカーのレベルを含む訓練データの知識ベースの使用を企図する。
【００６２】
「対象」は一般にヒトである。しかしながら、本発明は、獣医学的適用にも及ぶ。そのため、対象は、ウシ科、ウマ科、ヒツジ科、ブタ科、イヌ科、ネコ科の動物、または非ヒト霊長類のような非ヒト哺乳動物であってもよい。にもかかわらず、本発明は、ヒトにおけるTNFα関連T2Dの検出に特に適用可能である。「TNFα関連T2D」との言及には、「T2D」または「2型糖尿病」という用語に包含されるT2D状態のスペクトルが含まれる。
【００６３】
「訓練データ」という用語には、対照と比べての2種以上のバイオマーカーのレベルの知識が含まれる。「対照」には、既知のインスリン抵抗性もしくは感受性を有するか、または状態から治癒した対象におけるバイオマーカーのレベルとの比較が含まれ、または「対照」は試験に基づく統計的に決定されたレベルであってもよい。「レベル」という用語には、バイオマーカーのレベルの比率も包含される。
【００６４】
「訓練データ」には、PMK2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1、CS、および／またはCLUのうちの一つまたは複数の濃度も含まれる。
【００６５】
本発明は、対象におけるTNFα関連T2Dインスリン抵抗性または感受性の検出のためのバイオマーカーのパネルをさらに企図する。該パネルは、PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1、CS、および／またはCLUのうちの2種以上から選択されるバイオマーカーに特異的に結合する薬剤を含み、2種以上のバイオマーカーのレベルが決定され、次いで、そのレベルが、状態に関して未知の状況の対象からの同バイオマーカーのレベルを含むデータの第1の知識ベースから生成されたアルゴリズムに供される。該アルゴリズムは、対象がTNFα関連T2Dインスリン抵抗性または感受性を有するか否かの確率の指数を提供する。
【００６６】
バイオマーカーに「特異的に結合する」薬剤には、一般に、抗体もしくはハイブリッド、その組換え型もしくは修飾型を含む誘導体、またはその抗原結合断片のような免疫相互作用性分子が含まれる。薬剤は、受容体またはその他のリガンドであってもよい。これらの薬剤は、バイオマーカーのレベルの決定を補助する。
【００６７】
本発明は、ある種の局面において、対象から入手された生物学的試料におけるGES（または対応するPES）を比較することによる、TNFα関連T2D、またはTNFα関連T2Dインスリン抵抗性もしくは感受性の状況、またはそれらに関連した合併症、またはTNFα関連T2Dを発症する素因の診断または予後判定に関する。GESまたはPESは、統計的に実証された閾値と比較されてもよい。統計的に実証された閾値は、対照集団、例えば、一般集団または選択されたヒト対象の集団から入手された、比較可能な試料におけるバイオマーカーのレベルに基づく。例えば、選択された集団は、明らかに健康な対象から構成され得る。本明細書において使用されるように「明らかに健康な」とは、糖尿病の家族歴、低い活動レベル、粗悪な食事、過剰の体重（特に、胴回り）、45歳を超える年齢、高血圧、高い血中トリグリセリドレベル、35未満のHDLコレステロール、医師により過去に同定された耐糖能異常、過去の妊娠中の糖尿病、または9ポンドを超える体重の新生児のうちの一つまたは複数を含む、TNFα関連T2Dに関連した要因の証拠のうちの一つまたは複数を含む、TNFα関連T2Dの存在を示す兆候または症状を過去に有したことがない個体を意味する。明らかに健康な個体は、その他にも疾患の症状を示さない。換言すると、そのような個体は、医療従事者により調査されたならば、健康であり、疾患の症状を有しないとして特徴決定されるであろう。そのため、選択される対照値は、試験対象が属するカテゴリを考慮に入れるかもしれない。適切なカテゴリは、当業者によって、ルーチンの実験のみを用いて選択され得る。
【００６８】
統計的に実証された閾値は、対象から入手された、核酸であってもよいしまたはポリペプチドであってもよいバイオマーカーのレベルを特徴決定するために使用される値に関する。そのため、バイオマーカーであるヌクレオチドまたはポリペプチドのレベルが、特定の転写物のコピー数または血液1ml当たりのタンパク質のレベルまたは細胞数のような絶対値である場合には、対照値も、特定の転写物のコピー数または血液1ml当たりのタンパク質のレベルまたは細胞数に基づく。
【００６９】
統計的に実証された閾値は、多様な形態をとることができる。統計的に実証された閾値は、中央値または平均値のような単一のカットオフ値であってもよい。統計的に実証された閾値は、一つの明確な群におけるリスクが、別の明確な群におけるリスクの2倍である場合のように、比較群に基づき確立されてもよい。統計的に実証された閾値が、低リスク群、中リスク群、および高リスク群のような群に、または四つの区分（最低の象限は最低のリスクを有する個体であり、最高の象限は最も高いリスクを有する個体である）に、均等に（または不均等に）分割され、対象の糖尿病を有するリスクまたは糖尿病を発症する素因が、対象の試験値が属する群に基づいていてもよい。
【００７０】
例えば、平均レベル、中央レベル、または「カットオフ」レベルのような、入手されたバイオマーカーの統計的に実証された閾値は、一般集団または選択された集団における個体の大きい標本をアッセイし、参照により具体的に本明細書に組み入れられるKnapp,R.G.,and Miller,M.C.(1992).Clinical Epidemiology and Biostatistics.William and Wilkins,Harual Publishing Co.Malvern,Pa.に記載されるような、陽性基準を選択するための適中率法（predictive value method）、または最適の特異度（最高の真陰性率）および感度（最高の真陽性率）を定義する受信者動作特性曲線のような統計モデルを使用することにより確立される。「カットオフ」値は、アッセイされる各バイオマーカーについて決定され得る。
【００７１】
対象の生物学的試料における選択された各バイオマーカー核酸（ゲノムマーカーもしくはヌクレオミクス（nucleomic）マーカー）またはポリペプチド（プロテオミックマーカー）のレベルは、単一の対照値と比較されてもよいし、またはある範囲の対照値と比較されてもよい。対象の生物学的試料におけるバイオマーカーのレベルが、統計的に実証された閾値と異なる場合、その試験対象は、統計的に実証された閾値と比較可能なレベルを有する個体より、TNFα関連T2DまたはTNFα関連T2Dに関連した状態または対象のTNFα関連T2Dを発症する素因を発症するかまたは有するリスクが高い。対象のGES/PESバイオマーカーレベルと統計的に実証された閾値との間の差の程度も、TNFα関連T2Dインスリン抵抗性または感受性のリスクの程度を特徴決定し、それにより、どの個体がある種の治療から最も大きい利益を得るであろうかを決定するために有用である。高リスク、標準リスク、および低リスクの個体についての統計的に実証された閾値の範囲のように、統計的に実証された閾値の範囲が、複数の群へ分割される場合、比較は、対象の関連リスク予測因子のレベルがどの群に属するかの決定を含む。
【００７２】
本発明の予測テストは、TNFα関連T2Dの防止、またはTNFα関連T2Dの進行の遅延、またはTNFα関連T2Dに関連した状態の処置を標的とする治療剤が、個体に処方されるべきか否か、またはテスト化合物群から選択されるべきか否か、そしてそれらがいつであるかを決定するために有用である。例えば、統計的に実証された閾値と異なるGES（もしくはPES）の値を有するか、または「正常範囲」のより高い三分位もしくは四分位にある個体は、糖尿病治療、生活習慣変化等による治療介入を必要とするものとして同定され得る。
【００７３】
この態様の実施において、上にリストされたバイオマーカーに特異的なmRNAの全長に相補的な核酸セグメントを使用することもできるし、またはmRNAの一部に相補的なより小さなセグメントを使用することもできる。そのようなより小さなセグメントは、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、約25、約25、約30、約50、約75、約100、またはさらには数百塩基長であり得、プロモーター、制限酵素認識部位、またはその他の発現もしくはメッセージプロセシングもしくは複製の機能のようなその他の機能を提供するより大きなセグメントに含有されていてもよい。一つの態様において、そのようなプローブは、上にリストされたバイオマーカーまたはそれらのタンパク質産物に選択的にハイブリダイズするよう設計される。また、PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1、CS、および／またはCLUからなる群より選択される配列を有する核酸セグメントに選択的にハイブリダイズするよう設計されたプローブまたはプライマーの使用も、有用である。
【００７４】
本発明の方法は、ハイブリダイズした産物の量を決定することも含むかもしれない。そのような決定は、プローブ上の放射性タグ、蛍光性タグ、もしくはその他のタグの使用のような標識されたハイブリダイズしたプローブの直接の検出によってもよいし、または標的配列の増幅および増幅された産物の定量化の使用によってもよい。有用な増幅法は、本明細書に記載されるような逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）である。そのような方法の実施において、増幅は、標的リボ核酸を、バイオマーカーのmRNAを増幅するために設計された1対の増幅プライマーと接触させることを含んでいてもよいし、またはさらにはリボ核酸を、PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1、CS、および／もしくはCLUからなる群より選択される配列の核酸配列もしくはその相補鎖を含む核酸セグメントもしくはその相補鎖を増幅するために設計された1対の増幅プライマーと接触させることを含んでいてもよい。
【００７５】
診断および予後判定のための方法は、対象または患者から生物学的試料を入手すること、実質的に相補的な核酸のハイブリダイゼーションを可能にするために有効な条件の下で、PJM2、Skp1a、CS63、STEAP4、ACS1、CS、および／またはCLUのうちの2種以上についてリストされたバイオマーカーに特異的な単離された核酸セグメントと、生物学的試料からの核酸を接触させること、ならびにそのようにして形成されたハイブリダイズした相補的な核酸を、検出し、任意で、さらに特徴決定することに基づき得る。
【００７６】
方法は、試料の細胞内に位置している試料核酸のインサイチューの検出を含んでいてもよい。試料核酸は、接触前に、細胞から分離されてもよい。試料核酸は、DNAまたはRNAであり得る。
【００７７】
ホモログは、別の動物種からのバイオマーカー遺伝子であると見なされる。本発明は、ヒト、マーモセット、オランウータン、およびゴリラを含む霊長類、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ロバ）、実験動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ）、ペット（例えば、ネコ、イヌ）、および捕獲された野生動物（例えば、げっ歯類、キツネ、シカ、カンガルー）からの、ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列および／または機能により決定されるような相同遺伝子にも及ぶ。
【００７８】
抗体は、TNFα関連T2DのPESを決定するための診断または予後判定のツールとして特に有用である。
【００７９】
例えば、特異的抗体は、バイオマーカータンパク質についてスクリーニングするために使用され得る。後者は、例えば、細胞抽出物、または血清、血液、尿、もしくは唾液のようなその他の生物学的液体の中のバイオマーカーのうちの一つまたは複数のレベルについてスクリーニングするための手段として重要である。本明細書に企図されたアッセイのための技術は、当技術分野において公知であり、例えば、サンドイッチアッセイおよびELISAを含む。
【００８０】
イムノアッセイは、最も単純で直接的な意味において、結合アッセイである。ある種の好ましいイムノアッセイは、当技術分野において公知の様々な型の酵素連結免疫吸着アッセイ（ELISA）およびラジオイムノアッセイ（RIA）である。組織切片を使用する免疫組織化学的検出も、特に有用である。しかしながら、検出がそのような技術に限定されず、ウエスタンブロッティング、ドットブロッティング、FACS分析等も使用され得ることは容易に認識されるであろう。
【００８１】
一つの例示的なELISAにおいては、本発明のコードされたタンパク質に結合する抗体が、ポリスチレンマイクロタイタープレートの中のウェルのようなタンパク質親和性を示す選択された表面に固定化される。次いで、臨床試料のような糖尿病バイオマーカー抗原を含有していると推測される試験組成物が、ウェルに添加される。結合、および非特異的に結合した免疫複合体を除去するための洗浄の後、結合した抗原が検出され得る。検出は、一般に、検出可能標識に連結された、標的タンパク質に特異的な二次抗体の添加により達成される。この型のELISAは、単純「サンドイッチELISA」である。検出は、二次抗体を添加し、続いて、二次抗体に対する結合親和性を有する、検出可能標識に連結された三次抗体を添加することによっても達成され得る。
【００８２】
別の例示的なELISAにおいては、バイオマーカー抗原を含有していると推測される試料が、ウェル表面に固定化され、次いで、本発明の抗体と接触させられる。結合、および非特異的に結合した免疫複合体を除去するための洗浄の後、結合した抗原が検出される。一次抗体が検出可能標識に連結されている場合には、免疫複合体は直接検出され得る。この場合にも、免疫複合体は、一次抗体に対する結合親和性を有する、検出可能標識に連結された二次抗体を使用して検出されてもよい。
【００８３】
タンパク質またはペプチドが固定化される別のELISAは、検出における抗体競合の使用を含む。このELISAにおいては、標識された抗体がウェルに添加され、バイオマーカータンパク質に結合させられ、標識によって検出される。次いで、コーティングされたウェルとのインキュベーションの前または間に、試料を標識された抗体と混合することにより、未知の試料の中のマーカー抗原の量が決定される。試料の中のマーカー抗原の存在は、ウェルに結合するために利用可能な抗体の量を低下させるよう作用し、従って、最終シグナルを低下させる。これは、未標識の抗体が抗原によりコーティングされたウェルに結合し、やはり、標識された抗体に結合するために利用可能な抗原の量を低下させる、未知の試料の中の抗体の検出に適切である。
【００８４】
利用されるフォーマットに関係なく、ELISAは、コーティング、インキュベーションまたは結合、非特異的に結合した種を除去するための洗浄、および結合した免疫複合体の検出のような、ある種の特色を共通に有する。
【００８５】
本発明は、PES内のタンパク質に対するモノクローナル抗体を使用して、TNFα関連T2DまたはTNFα関連T2Dの前臨床的な徴候を画像化するインビボの方法にも関する。特に、この方法は、画像化に有効な量の検出可能に標識されたバイオマーカーモノクローナル抗体またはその断片と薬学的に有効な担体とを対象へ投与すること、および罹患組織への標識されたモノクローナル抗体の結合、またはアップレギュレートもしくはダウンレギュレートされるマーカー遺伝子の場合には、健康組織への標識されたモノクローナル抗体の結合を検出することを含む。「インビボ画像化」という用語は、対象の体内に位置する罹患組織に特異的に結合する、本発明の標識されたモノクローナル抗体またはその断片の検出を可能にする任意の方法をさす。「画像化に有効な量」とは、投与された検出可能に標識されたモノクローナル抗体またはその断片の量が、罹患組織へのモノクローナル抗体もしくはその断片の結合、または罹患組織に比べて大きな割合での健康組織へのモノクローナル抗体もしくはその断片の結合を検出することを可能にするのに十分であることを意味する。
【００８６】
キットも本発明の一部を形成し、TNFα関連T2Dの処置において有用な、本明細書に同定された薬物も、本発明の一部を形成する。
【００８７】
本発明は、本明細書に記載されたGESまたは対応するPESの、2型糖尿病に対する医薬もしくは診断アッセイの製造における使用、または細胞内のインスリン抵抗性を低下させるかもしくはインスリン感受性を促進する化合物のための使用をさらに提供する。
【００８８】
以下の非限定的な実施例により、本発明をさらに説明する。
【実施例】
【００８９】
実施例1
インスリン抵抗性のGESの決定
最初に、3T3-L1脂肪細胞におけるTNFαにより誘導されたインスリン抵抗性のモデルを、以前に記載されたようにして確立した（Sartipy and Loskutoff J Biol Chem 278:52298-52306,2003）。3T3-L1脂肪細胞を72時間3ng/ml TNFαに曝露した後、細胞がインスリンに応答して2-デオキシグルコース（2-DOG）を取り込む能力により、インスリン抵抗性を決定した。TNFαは、インスリンにより刺激された媒体により処理された細胞と比較して、2-DOG取り込みの37％の減少を引き起こした（p＜0.0001）（表1）。TNFαの効果を逆転させるため、5mM ASAおよび10μM TGZによる後処理を、72時間のTNFα処理の最後の24時間に含めたところ、TNFαによる障害が修復されることが見出された（TNFαにより処理された細胞に対してp＝0.0053）。ASAおよびTGZは、個別にも、TNFα効果を完全に逆転させた（TNFα＋TGZについてはTNFαにより処理された細胞に対してp＝0.0035、TNFa＋ASAについてはTNFαにより処理された細胞に対してp＝0.0011）。
【００９０】
各生物学的状況（「インスリン抵抗性」および「インスリン感受性回復」）を表すGESを同定するため、これらの条件の下で、包括的な遺伝子発現を研究した。媒体により処理された3T3-L1脂肪細胞試料、TNFαにより処理された3T3-L1脂肪細胞試料、TNFα＋ASAおよびTGZにより同時処理された3T3-L1脂肪細胞試料のマイクロアレイ分析を、合同予測因子の統計的推定を容易にするために、各処理につき20の複製試料を使用して実施した。得られた尤度比検定を伴う（多変量t分布に基づく）ロバストな線形モデルを使用したところ、全体で3325種の遺伝子の発現が、媒体により処理された脂肪細胞と比較してTNFα処理により影響を受けた（名目p＜0.01）。これらのうち、1022種の遺伝子の発現が、ASAおよびTGZによる処理の後、逆転した（名目p＜0.01）。これらの1022種の遺伝子を、ベイズモデル選択法（Bayesian model selection procedure）（Blangero et al.Hum Biol 77:541-559,2005）に供し、GESとして役立つベイズ平均回帰方程式（Bayesian averaged regression equation）を入手するための最大7種の遺伝子のモデルを生成した。インスリン抵抗性状況とインスリン感受性回復状況とを識別する98％の予測力を有することが見出された、7種の遺伝子からなる一つのモデルを、TNFαに基づくGESとして選択した。これらの遺伝子は、アシルCoA合成酵素1（ACS1）、6回膜貫通型前立腺上皮抗原（six transmembrane epithelial antigen of the prostate）4（STEAP4）、S期キナーゼ関連タンパク質（S-phase kinase associated protein）1A（Skp1a）、M2型ピルビン酸キナーゼ（pyruvate kinase,muscle 2）（PKM2）、CD63、クエン酸合成酵素（CS）、およびクラスタリン（CLU）であることが同定され、多様な機能を示す（表2）。TNFα処理後、7種の遺伝子のうちの5種（STEAP4、PKM2、Skp1a、CD63、およびCLU）は、増加した発現を有することが見出され、2種の遺伝子（ACS1およびCS）は、媒体処理に比べて減少した遺伝子発現を有していたことが、DNAマイクロアレイ発現プロファイルにより明らかになった（表3）。
【００９１】
TNFαによるACS1 mRNAレベルのダウンレギュレーションおよびSTEAP4 mRNAレベルのアップレギュレーションは、以前に報告されている（Moldes et al.J Biol Chem 276:33938-33946,2001；Weiner et al.J Biol Chem 266:23525-23528,1991）。本発明者らの知る限り、PKM2、Skp1a、およびCD63の転写の直接のTNFαによる調節は、報告されていない。7種の遺伝子は、各々、媒体により処理された状況とTNFαにより処理された状況との間で遺伝子発現のレベルが有意に異なり、TNFαにより処理された試料と、TNFα＋ASAおよびTGZにより同時処理された試料との間でも有意に異なった（p＜0.005）。それらの遺伝子のうちの4種（STEAP4、PKM2、CD63、およびCLU）は、媒体による処理と、TNFα＋ASAおよびTGZによる同時処理との間で、有意に異なったままであり（p＜0.002）、インスリン抵抗性改善剤によるTNFα効果の部分的な逆転しか示さなかったが、ACS1、Skp1a、およびCSの遺伝子発現は、ASAおよびTGZによって媒体対照レベルへと完全に回復した。各条件における各遺伝子についての遺伝子発現の変化のレベルを、各処理についてより少数の試料を使用した半定量的リアルタイムPCRにより確認した（表3）。ここでも、全ての遺伝子が、媒体処理とTNFα処理との間で、またはTNFα処理とTNFα＋ASAおよびTGZによる同時処理との間で、有意に異なったままであった（p＜0.05）。
【００９２】
新たなインスリン抵抗性改善剤を同定するため、1120種の高純度のオフパテント化合物からなる低分子ライブラリーを、GESを使用してスクリーニングした。まず、3T3 L1脂肪細胞を、14枚の96穴プレートにおいて培養し、72時間、3ng/ml TNFαと共にインキュベートし、TNFα処理の最後の24時間に、10μMの各化合物を添加した。対照として役立つ、媒体対照により処理されたウェル4個、TNFαにより処理されたウェル4個、ならびにTNFα＋ASAおよびTGZにより処理されたウェル2個を、各96穴プレートに含めた。スクリーニングの目標は、7遺伝子GESの発現が、インスリン感受性が回復した細胞において観察される発現レベルに最も近くなるようにした化合物を同定することであった。これは、これらの細胞が、回復したインスリン感受性を有することを示す可能性が高いためである。RNA抽出およびcDNA合成の後、7遺伝子GESの遺伝子発現分析を、MassARRAY（Sequenom,San Diego,CA）［Cullinan and Cantor Pharmacogenomics 9:1211-1215,2008］を使用して実施した。データは、Zスコア残差係数相関（Z-score residual coefficient correlation）（Zrcc）；試料間変動および各遺伝子がGESの予測力に与える相対的寄与についてノーマライズされたZスコアとして表される。化合物を、Zrccスコアに基づき、最高から最低へと順位付けし、最初の概念実証型バリデーションテストとして、上位に順位付けされた30種の化合物、および23種のランダムに選ばれた中間順位の化合物を、可能性のあるインスリン抵抗性改善効果を決定するため、2-DOG取り込みアッセイに供した。3T3 L1脂肪細胞を、25μMの各化合物と共にインキュベートした後、最大未満量のインスリンの存在下または非存在下で、2-DOG取り込みアッセイを実施した（0.5nM、15分間）。その結果として、上位の30種の化合物のうちの50％および63％が、それぞれ、0nMインスリンおよび0.5nMインスリンで、グルコース取り込みを有意に増加させたが、それに対して、中間域の化合物は、13％および30％であった（p＜0.03）（表4）。10μM用量では、上位の30種の化合物のより高い割合が、中間域の化合物と比較して、0nMインスリンおよび0.5nMインスリンで、グルコース輸送を増加させたが、有意には達しなかった（表4）。全体として、これらのデータは、GES分析が、インスリン抵抗性改善特性を有する化合物を濃縮したことを示している。
【００９３】
GESにより順位付けされた化合物を、次に、既知の作用機序または共通の構造的特色に基づく大きなクラスに分類し、Zrcc平均値として再び表した。10以上のメンバーを含む化合物クラスのみを、さらに検討した。その結果として、最高スコアを示し、従って、最もインスリン感受性の細胞を表す処理のクラスは、1.76±0.37の平均Zrccスコアを有する媒体により処理された細胞であった（TNFα処理に対してp＜0.0001、TNFα＋ASAおよびTGZによる同時処理に対してp＜0.002）。TNFα＋ASAおよびTGZとコインキュベートされた試料を含む、上位20に順位付けされた化合物クラスのうちの13が、TNFα処理と比較して有意に増加した平均Zrccスコアを有し（p＜0.05）、グルココルチコイドおよびβアドレナリン作用性アゴニストのみが、TNFα試料より有意に低いスコアを有していた（p＜0.05）（図1）。
【００９４】
次に、最大未満の0.5nMインスリンの存在下で、外因性HAタグ付きGLUT4の細胞膜への移行に影響を与える能力を決定するため、インスリン感受性が回復したTNFα＋ASAおよびTGZにより同時処理された試料と順位が最も類似していた8つの薬物クラスを試験するため、二次スクリーニングを行った（Govers et al.Mol Cell Biol 24:6456-6466,2004）。ナトリウムチャンネル遮断薬、βラクタム、GABAアンタゴニスト、スルファミド系葉酸代謝拮抗薬、リポキシゲナーゼ阻害薬、ドーパミンアンタゴニスト、炭酸脱水酵素阻害薬（CAI）、および抗生物質からのメンバーを、20時間、10μM用量でインキュベートし、各クラスメンバーの全体効果を査定し、平均化した。急性最大200nMインスリンに加えて、CAIクラスおよびナトリウムチャンネル遮断薬クラスからのメンバーの組み合わせのみが、最大未満のインスリンより高くHA-GLUT4移行を有意に増加させることが見出された（p＜0.03）（図2a）。ナトリウムチャンネル遮断薬クラスを構成する化合物をさらに調査したところ、キナ酸（GESスクリーニングで1.673のZrcc）、プロカイン（Zrcc＝0.312）、およびジソピラミド（Zrcc＝0.126）を含む、それらの多くが、グルコースおよび脂質の代謝に影響を与えることが公知であることが明らかになった（Boden et al.Circulation 85:2039-2044,1992；Hope-Gill et al.Horm Metab Res 6:457-463,1974；Kojima et al.Chem Pharm Bull (Tokyo) 51:1006-1008,2003；Taketa and Yamamoto Acta Med Okayama 34:289-292,1980）。従って、CAIのクラスを、さらなる分析のための重点的な対象とした。メトラゾンを除く、各CAIメンバーが、TGZおよびASAによる処理と同様に、最大未満のインスリンの効果より高く、HA-GLUT4移行を増加させることが見出された（図2b）。
【００９５】
CAIのうち選択されたものが、インビボでインスリン抵抗性改善効果を示すか否かを調査した。食事により誘導された肥満（DIO）マウスを、14日間、50mg/kg/日で、各CAIにより処理した。CAIである2-アミノベンゼンスルホンアミド（2ABS）、クロルサリドン（CTD）、フロセミド（FUR）、およびジクロフェナミド（DCP）は、DIOマウスにおけるグルコース処理に影響を与えなかった（図3a）。他方、メタゾラミド（MTZ）は、媒体により処理された動物と比較して、グルコース曲線下面積（AUC）増加の27％の低下を誘発した（p＜0.03）。メタゾラミドのN-メチル化誘導体（MMTZ）によりDIOマウスを処理した場合には、この表現型は観察されなかった（図3a）。これらの誘導体は、CA阻害を担うアミン水素のうちの1個が、CAへの結合を防止するメチル基に交換されており（Relman et al.J Clin Invest 39:1551-1559,1960）、典型的には、100倍低い炭酸脱水酵素阻害活性をインビトロで示す。循環血中グルコースレベルにおけるMTZの効果は、媒体により処理されたマウスと比較して、体重、食物摂取量、水分摂取量、または精巣上体脂肪量の有意な変化なしに達成された。さらに、24時間尿量およびクレアチン排泄は、MTZにより処理されたマウスと媒体により処理されたマウスとの間で有意には改変されず、このことから、これらの動物におけるグルコース代謝に観察された差が、MTZの利尿効果によったのではないことが示された。2ABS、CTD、FUR、またはDCPにより処理されたDIOマウスにおける付加的な研究は、14日間、20〜100mg/kg/日の濃度範囲で、耐糖能に対する有意な効果を見出さなかった。MTZ処理は、20mg/kgを超える濃度で、媒体により処理されたマウスと比較して、循環血中グルコースレベルの有意な低下を引き起こした（図3b、上パネル）。血中グルコース降下効果には、血漿インスリンレベルの用量依存性の減少が伴った（図3b、下パネル）。
【００９６】
次に、2型糖尿病の動物モデルであるdb/dbマウスにおいて、MTZのインビボの効力を決定した。14日間、20または50mg/kg/dのMTZにより処理されたマウスは、空腹時グルコースレベルの用量依存性の減少を有した（p＜0.05；図3c）。この効果は、3日間のMTZ投与の後に見られ、7日後にピークに達した。媒体により処理された動物および20mg/kg MTZにより処理された動物において、体重、食物摂取量、または水分摂取量の変化は観察されなかった。しかしながら、50mg/kg MTZによる7日間の処理の後には、体重の4％の低下（媒体により処理された動物38.6±1.0に対して、MTZにより処理された動物37.0±1.0g；p＜0.001）、および食物摂取量の27％の減少（媒体により処理された動物6.3±0.3に対して、MTZにより処理された動物4.8±0.5g/日；p＜0.01）が観察された。MTZにより引き起こされた糖血症の減少が、食物摂取量の低下および体重の減少によるのか否かを調査するため、ペアフィードの媒体により処理されたdb/dbマウスおよびMTZにより処理されたdb/dbマウスにおいて、8日間、血中グルコースの変化をモニタリングした。これは、媒体により処理されたマウスにおける体重の8％の低下をもたらした（0日目の41.7±2.7gに対して、8日目の38.3±3.2g、n＝6/群；p＜0.001）。しかしながら、MTZにより処理された動物のみが、処理期間後に有意に低下した空腹時血中グルコースを示した（ペアフィードの媒体処理0.6±1.9mMに対して、MTZ処理-6.2±1.5mM；p＜0.02）。これらの結果は、MTZの血中グルコース降下効果が食物摂取量の低下または体重減少によるのではなかったことを示す。さらに、db/dbマウスにおけるMTZの抗糖尿病効果は、尿分泌によるグルコース損失の増加によるのではなかった。14日間、MTZ（50mg/kg/d）により処理されたマウスを、24時間、代謝ケージに置いた。MTZ処理は、媒体により処理されたマウスと比較して18％、尿中グルコース濃度を有意に低下させたが（p＜0.03）、全尿中グルコース排泄、尿容量、および水分摂取量の有意な差は観察されなかった。db/dbマウスにおけるHbA1cレベルに対するMTZ処理の効果を、次に調査した。MTZによる処理は、23％も低いHbA1cレベルをもたらすことが見出された（p＜0.003）（図3d）。他の公知のインスリン抵抗性改善治療剤とのMTZの組み合わせ効果も調査した。8日間、300mg/kgメトホルミンまたは20mg/kg MTZにより処理されたdb/dbマウスは、両方とも、媒体により処理された動物と比較して有意に低い血中グルコースレベル変化を示した（p＜0.05）（図3e）。メトホルミンとMTZとの同時投与は、メトホルミン単独のものに対して、さらなる血中グルコース低下効果を引き起こした（p＜0.02）。
【００９７】
実施例2
TNFαに基づくGESを使用したインビボのインスリン抵抗性集団の特徴決定
インビトロで生成されたTNFαに基づくGESの、インビボでの生物学的関連性を試験した。GESがヒトにおけるインスリン抵抗性表現型を特徴決定し得るか否かを評価するため、包括的なヒト遺伝子発現データセットを使用した。このプロファイリングは、San Antonio Family Heart Study（Blangero Nat Genetics 2007）の一部としてリンパ球に対して行われ、Illuminaのビーズに基づく技術を使用して、42の拡大家系からの1,240個体において47,289種の転写物の発現をマッピングした。この集団における糖尿病の頻度は、15.4％であった。対象の特徴は、以下の通りであった（平均値±SD）：年齢39.3±16.7歳、BMI 29.3±6.6kg/m2、空腹時グルコース100.6±43.8mg/dl、空腹時インスリン16.2±19.1。
【００９８】
このデータセットは、（BMIおよびその他の身体組成測定値のような）人体測定、インスリン感受性測定値（経口グルコース負荷試験）、ならびに血漿中のグルコース、インスリン、脂質、およびサイトカインのレベルを含む標準的な血液化学的パラメータも含む。このデータセットを使用して、本発明者らは、ヒト発現プロファイリングデータセットにおいて、3T3-L1脂肪細胞から同定された7遺伝子GESを検出し、変化の方向を考慮に入れて、これらの7種の遺伝子の各々の標準化発現単位の絶対値の合計を含む合計GESスコアを計算した。Homa_IR（インスリンおよびグルコースに基づくインスリン抵抗性についての査定のホメオスタシスモデル）により測定されるような、より高いレベルのインスリン抵抗性が、高いGESスコアを有する対象において観察された（Spearmans rho 0.138；p＝0.0000012）。年齢および性別の効果についてのノーマライゼーションの後、GESスコアに基づく対象の最高の四分位と最低の四分位との間に、空腹時血漿インスリン（p＝0.0004）、BMI（p＝0.00000044）、トリグリセリドレベル（p＝0.001）、およびHoma_IR（p＝0.00081；表5）について統計的有意差が観察された（各四分位n＞400）。これらの観察は、この研究集団における最もインスリン抵抗性のサブグループのGESによる特徴決定と一致している。
【００９９】
（表１）3T3-L1脂肪細胞におけるTNFαにより誘導されたインスリン抵抗性の逆転
2012518989.tif 000002
【０１００】
3T3-L1脂肪細胞を、上に詳述されたようにして、媒体（Veh）、3ng/ml TNFα（TNF）、または3ng/ml TNFα＋10μM TGZおよび5mM ASA（TTA）により処理した。次いで、細胞を、30分間、インスリン（0または10nM）により処理し、続いて、インスリン刺激の最後の10分間に、2-デオキシグルコース（2-DOG）取り込みを測定した。データは、媒体により処理されインスリンにより刺激された細胞と比較した、2-DOG取り込みの変化％として提示されており、3回以上の独立の実験の平均値±SEMを表し、各データポイントはトリプリケートでアッセイされた。媒体により処理されインスリンにより刺激された脂肪細胞についての2-DOG取り込みの基底レベルに対する増加倍率は、6.6±0.6であった（媒体による処理単独と比較してp＝1.77×10-7）。媒体により処理された脂肪細胞において輸送された2-DOGの量は、20.5±3.4pmol/分/ウェルであった。統計分析は、両側分布および二標本等分散を仮定してスチューデントt検定を使用して実施された。
【０１０１】
（表２）TNFαに基づくGESを構成する7種の遺伝子の同一性
2012518989.tif 000003
【０１０２】
略語：ACS1、アシルCoA合成酵素長鎖ファミリーメンバー1／FACL2、脂肪酸補酵素Aリガーゼ長鎖2；STEAP4、6回膜貫通型前立腺上皮抗原／TIARP、TNFα誘導脂肪関連タンパク質／STAMP2、6回膜貫通型前立腺タンパク質2；Skp1a、S期キナーゼ関連タンパク質1A；Pkm2、M2型ピルビン酸キナーゼ；CD63、CD63抗原／黒色腫関連抗原MLA1／黒色腫関連抗原ME491／グラニュロフィシン；CS、クエン酸合成酵素、およびCLU、クラスタリン／アポリポタンパク質J／マウス硫酸化糖タンパク質-2（MSGP-2）
【０１０３】
（表３）TNFαに基づくGESの発現プロファイリング
2012518989.tif 000004
【０１０４】
媒体により処理された3T3-L1脂肪細胞（Veh）、TNFαにより処理された3T3-L1脂肪細胞（TNF）、ならびにTNFα＋TGZおよびASAにより同時処理された3T3-L1脂肪細胞（TTA）における7遺伝子GESのマイクロアレイ発現プロファイリング（a）およびリアルタイムPCR分析（b）。7種の遺伝子とは、アシルCoA合成酵素1（ACS1）、6回膜貫通型前立腺上皮抗原4（STEAP4）、S期キナーゼ関連タンパク質1A（Skp1a）、M2型ピルビン酸キナーゼ（PKM2）、CD63抗原（CD63）、クエン酸合成酵素（CS）、およびクラスタリン（CLU）である。遺伝子発現値は、（「1」として表された）媒体により処理された値に対してノーマライズされている。データは、平均値±SEMとして表される；各試料n＝20（a）またはn＝5（b）。* 媒体により処理された試料に対してp＜0.05、∧ TNFαにより処理された試料に対してp＜0.05。統計分析は、両側分布および二標本等分散を仮定してスチューデントt検定を使用して実施された。
【０１０５】
（表４）TNFαに基づくGESによる化合物ファミリーの順位付け
2012518989.tif 000005
【０１０６】
（表５）TNFαに基づく7遺伝子GESの量的形質との相関
＊＊ 相関が0.01レベルで有意である（両側）
＊ 相関が0.05レベルで有意である（両側）
2012518989.tif 000006
【０１０７】
そのため、GESは、（インスリンにより駆動される）Homa IR指数による、増加したインスリン抵抗性を有する、高レベルのインスリンを有する肥満個体を有意に同定した。年齢によるGESスコアの標準化は、関連の強度を低下させたが、体脂肪量を除く全てのケースで、有意に異なるままであった。
【０１０８】
実施例3
7遺伝子TNFαGESと単一遺伝子TNFαGESとの比較
この実施例は、インビトロおよびインビボでインスリン作用を損なうことが公知の化合物とは対照的に、インスリン抵抗性改善特性を有する化合物についてスクリーニングするための、7遺伝子GESと単一遺伝子候補との効力を強調する。7種の遺伝子とは、PM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1（FACL2）、CS、およびCLUであった。比較の目的のため選択された単一遺伝子は、ACS1（FACL2）、CD63、PKM2、およびSkp1aであった。
【０１０９】
TNFαに基づく7遺伝子GESは、-0.6±0.1という負のスコアを有するインスリン抵抗性（TNF）脂肪細胞から、0.5±0.2という正のZrccスコアを有するインスリン感受性回復（TTA）脂肪細胞を有意に特徴決定することができた（p＝2.9×10-7）［表6］。表6のデータは、ACS1（FACL2）、CD63、PKM2、またはSkp1aのみによりスクリーニングを実施した場合、そのような単一遺伝子スクリーニングは、インスリン抵抗性（TNF）細胞からインスリン感受性回復（TTA）細胞を区別しないであろうことを証明している。CD63のみによるスクリーニングにおいては、TTA結果が負のスコアを有し、TNF結果が正のスコアを有していた（p＝0.02）。スクリーニングにおける内部対照として役立つよう、3T3-L1脂肪細胞を、媒体（0.2％w/v DMSO）により72時間（n＝55）、3ng/ml TNFαにより72時間（TNF）（n＝57）、または3ng/mlTNFαにより72時間＋TNFαインキュベーションの最後の24時間、10μM TGZおよび5mM ASA（TTA）（n＝29）により処理した。GESの遺伝子発現分析は、Mass ARRAYシステム（Cullinan and Cantor,2008（前記））を使用して実施された。データは、全発現レベルについての調整の後、ベイズ予測モデルに由来する相関係数を組み入れた、残差成分のZスコア（Zrcc）として計算される。得られる測定基準は、試料間変動および各遺伝子がGESの予測力に与える相対的寄与についてノーマライズされたZスコアである。データは、（TNFにより処理された試料と比較されたp値と共に）平均Zrcc値±SEMとして表される。統計分析は、両側分布および二標本等分散を仮定してスチューデントt検定を使用して実施された。
【０１１０】
（表６）7遺伝子TNFαGESおよび単一遺伝子TNFαGESによるインスリン感受性回復（TTA）細胞およびインスリン抵抗性（TNF）細胞の順位付け
2012518989.tif 000007
【０１１１】
モノアミンオキシダーゼ阻害薬であるフラゾリドン（FUR）、NSAIDであるメサラミン（MES）およびホスホサール（FOS）、ならびにエストロゲン（EST）のような公知のインスリン抵抗性改善薬を、GESスクリーニングにおけるダイナミックレンジおよび信頼性を確立するために使用したところ、全ての化合物が正のZrccスコアを有していた。対照的に、グルコース取り込み阻害薬であるアジュマリン（AJM）およびグルココルチコイドであるコルチコステロン（COR）のような公知のインスリン抵抗性誘導化合物は、負のZrccスコアを有し、スクリーニングをさらに実証した。これらのスクリーニングバリデーションパラメータの内、正のZrccを有し、TTCの類似した範囲にある化合物を、可能性のあるインスリン抵抗性改善化合物と見なし、二次スクリーニングに入れた。VVP808は、これらのパラメータを使用して、インスリン抵抗性改善作用を有する化合物として同定された（表7）。CSまたはSTEAP4のみによるスクリーニングは、TNFにより処理された細胞から、TTAにより処理された細胞を区別するであろうが、TTA様化合物とTNF様化合物とを差別化するのには十分でない狭いダイナミックレンジを有する（CS：TTAの0.1±0.1に対して、TNFの-0.05±0.03、p＝0.001；STEAP4：TTAの0.2±0.05に対して、TNFの-0.02±0.05、p＝0.005）。表7を参照のこと。CSまたはSTEAP4のみによるスクリーニングは、バリデーションパラメータについても失敗し、フラゾリドンおよびホスホサールまたはメサラミンが偽陰性としてスコア化され、アジュマリンが偽陽性としてスコア化された。CLUのみによるスクリーニングは、TNFにより処理された細胞から、TTAにより処理された細胞を区別したであろう（TTAの0.3±0.1に対して、TNFの0.3±0.1、p＝2.9×10-7）。しかしながら、化合物ライブラリーをスクリーニングするためのCLUのみの使用は、可能性のあるインスリン抵抗性改善剤としてVVP808を選択することに失敗した（偽陰性）。
【０１１２】
このアッセイにおいては、3T3-L1脂肪細胞を、72時間、TNFαと共にインキュベートし、TNFα処理の最後の24時間に、10μMの各化合物を添加した（n＝2）。化合物には、VVP808、発表されているインスリン抵抗性改善薬であるフラゾリドン（FUR）（モノアミンオキシダーゼ阻害薬）、メサラミン（MES）およびホスホサール（FOS）（NSAID）、ならびにエストラジオール-17-β（EST）と、アジュマリン（AJM）（グルコース取り込み阻害薬）およびコルチコステロン（COR）（グルココルチコイド）のような公知のインスリン抵抗性誘導化合物とが含まれる。スクリーニングにおける内部対照として役立つよう、3T3-L1脂肪細胞を、媒体（0.2％DMSO）により72時間（n＝55）、3ng/ml TNFαにより72時間（TNF）（n＝57）、または3ng/ml TNFαにより72時間＋TNFαインキュベーションの最後の24時間、10μM TGZおよび5nM ASA（TTA）（n＝29）により処理した。上に詳述されたようにして、GESの遺伝子発現分析およびZスコアの計算を実施した。データは平均Zrcc値±SEMとして表される。結果は表7に提示される。
【０１１３】
（表７）TNFαに基づく7遺伝子GESおよびTNFαに基づく単一遺伝子GESによるVVP808および公知のインスリン抵抗性改善化合物またはインスリン抵抗性誘導化合物の順位付け
2012518989.tif 000008
【０１１４】
実施例4
2型糖尿病処置の最適化
同一または類似のGESを使用して同定された化合物を使用することにより処置が最適化されるよう、糖尿病患者を分類するためにGESが使用される。このアプローチは、増加した肥満およびインスリン抵抗性を有する患者のサブグループを同定するためにGESが使用され得ることを示す、実施例2のデータ（表5）により支持される。これらの患者は、同一のGESを使用して同定された薬物による処置から利益を得ることが提唱される。
【０１１５】
処置の過程を通してGESをモニタリングすることは、例えば、脂肪酸またはグルココルチコイドの効果の逆転のために変化するシグネチャーをもたらすかもしれず、これらの異なるGESが患者において測定される。次いで、処置が、それらが最も密接に表すGESに応じて最適化される。
【０１１６】
本明細書に記載された本発明は、具体的に記載されたもの以外の変動および修飾を受け入れることを、当業者は認識するであろう。本発明はそのような変動および修飾を全て含むことが理解されるべきである。また、本発明は、個々にまたは集合的に本明細書において言及されたかまたは示された工程、特色、組成物、および化合物を全て含み、該工程または特色のうちの任意の二つ以上の組み合わせを全て含む。
【０１１７】
参考文献
2012518989.tif 000009
2012518989.tif 000010
【図１】
2012518989.tif 000011
【図２】
2012518989.tif 000012
【図３】
2012518989.tif 000013
【国際調査報告】
2012518989.tif 000014
2012518989.tif 000015
2012518989.tif 000016