【手続補正書】
【提出日】平成21年6月16日(2009.6.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡの第１鎖および第２鎖を含む標的核酸分子をＤＮＡ増幅させるＲＰＡプロセスであって：
（ａ）リコンビナーゼ因子を第１核酸プライマーおよび第２核酸プライマーならびに１つまたは複数の非相補的もしくは修飾された内部残基を含む第３伸長ブロック化プライマーと接触させて、第１核タンパク質プライマー、第２核タンパク質プライマーおよび第３核タンパク質プライマーを形成させる工程と；
（ｂ）該第１核タンパク質プライマーおよび該第２核タンパク質プライマーを該二本鎖標的核酸と接触させ、それにより、該第１核タンパク質プライマーと該ＤＮＡの第１鎖の第１部分の該第１鎖との間で第１二本鎖構造を形成させ、そして該第２核タンパク質プライマーと該ＤＮＡの第２鎖の第２部分の該第２鎖との間で第２二本鎖構造を形成させ、その結果、該第１核タンパク質プライマーの３’末端および該第１核タンパク質プライマーの３’末端が、該３’末端間に標的核酸の第３部分を有して同一標的核酸分子上で相互に向けて方向付けられる工程と；
（ｃ）１つまたは複数のポリメラーゼおよびｄＮＴＰを用いて該第１核タンパク質プライマーおよび該第２核タンパク質プライマーの３’末端を伸長させて、該核酸の第３部分を含む内部領域を備える第１の増幅された標的核酸を生成する工程と；
（ｄ）該増幅された標的核酸を該第３核タンパク質プライマーと接触させて、ヌクレアーゼの存在下で該増幅させた標的核酸の第３部分で第３二本鎖構造を形成する工程であって：このとき該ヌクレアーゼは、該第３二本鎖構造の形成後にのみ該非相補的もしくは修飾された内部残基を特異的に切断して、第３の５’プライマーおよび第３の３’伸長ブロック化プライマーを形成する工程と；
（ｅ）１つまたは複数のポリメラーゼおよびｄＮＴＰを用いて該第３の５’プライマーの３’末端を伸長させて、該第１核酸プライマーおよび該第３の５’プライマーを含む第２二本鎖増幅核酸を生成する工程と；
（ｆ）所望の程度の第２二本鎖増幅核酸が達成されるまで、（ｂ）から（ｅ）を繰り返して反応を継続する工程と、を含むプロセス。
【請求項２】
前記第１二本鎖構造は第１Ｄループの一部であり、前記第２二本鎖構造は第２Ｄループの一部である、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
前記ヌクレアーゼは、ＤＮＡグリコシラーゼもしくはＡＰエンドヌクレアーゼである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項４】
前記修飾された内部残基は、ウラシル残基もしくはイノシン残基である、請求項１に記載のプロセス。
【請求項５】
前記ヌクレアーゼは前記ウラシル残基もしくは前記イノシン残基を認識し、前記第３伸長ブロック化プライマーを該ウラシル残基もしくは該イノシン残基において切断する、請求項４に記載のプロセス。
【請求項６】
前記ヌクレアーゼは前記第３伸長ブロック化プライマーの非相補的塩基と前記標的核酸との間の塩基ミスマッチを認識し、該第３伸長ブロック化プライマーを該非相補的塩基において切断する、請求項１に記載のプロセス。
【請求項７】
前記ヌクレアーゼは、ｆｐｇ、Ｎｔｈ、ＭｕｔＹ、ＭｕｔＳ、ＭｕｔＭ、大腸菌ＭＵＧ、ヒトＭＵＧ、ヒトＯｇｇ１、脊椎動物Ｎｅｉ様（Ｎｅｉｌ）グリコシラーゼ、ウラシルグリコシラーゼ、ヒポキサンチン−ＤＮＡグリコシラーゼならびにそれらの機能的アナログからなる群から選択される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項８】
前記ヌクレアーゼは大腸菌Ｎｆｏもしくは大腸菌エキソヌクレアーゼＩＩＩであり、前記修飾された残基はテトラヒドロフラン残基もしくは炭素リンカーである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項９】
前記修飾された内部塩基は、８−オキソグアニン、チミングリコールおよび無塩基性部位模擬体からなる群から選択される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１０】
前記無塩基性部位模擬体は、テトラヒドロフラン残基またはＤ−スペーサーである、請求項９に記載のプロセス。
【請求項１１】
前記第３伸長ブロック化プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長に抵抗性であるブロック化３’残基を含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１２】
前記ブロック化３’残基は、ポリメラーゼによる前記プライマーの伸長を防止するブロック部分を含む、請求項１１に記載のプロセス。
【請求項１３】
前記ブロック部分は、３’残基の糖の３’部位または２’部位に付着させられる、請求項１２に記載のプロセス。
【請求項１４】
前記ブロック部分は、検出可能標識である、請求項１２に記載のプロセス。
【請求項１５】
前記検出可能標識は、蛍光体、酵素、クエンチャー、酵素阻害剤、放射性標識、結合対の一方のメンバーおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１４に記載のプロセス。
【請求項１６】
前記ブロック化３’残基は、ジデオキシヌクレオチドである、請求項１１に記載のプロセス。
【請求項１７】
前記第１核酸プライマーは第１検出可能標識を含み、前記第３伸長ブロック化プライマーは第２検出可能標識を含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１８】
前記第１検出可能標識と前記第２検出可能標識とは相違しており、前記第２二本鎖増幅核酸の産生は、単一の二本鎖ＤＮＡ分子上の該第１検出可能標識および該第２検出可能標識の存在を検出することによって監視される、請求項１７に記載のプロセス。
【請求項１９】
前記第２二本鎖増幅核酸の産生は、第１抗体が前記第１検出可能標識に結合し、第２抗体が前記第２検出可能標識に結合するサンドイッチアッセイによって検出される、請求項１８に記載のプロセス。
【請求項２０】
前記第３伸長ブロック化プライマーは１つまたは複数の検出可能標識をさらに含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項２１】
前記プロセスは、前記第３伸長ブロック化プライマー上の前記検出可能標識を検出することによってＲＰＡ反応の進行を監視する工程をさらに含む、請求項２０に記載のプロセス。
【請求項２２】
前記検出可能標識は、蛍光体、酵素、クエンチャー、酵素阻害剤、放射性標識、結合対の一方のメンバーおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２０に記載のプロセス。
【請求項２３】
前記蛍光体は、蛍光体−ｄＴアミダイト残基によって前記第３伸長ブロック化プライマーに付着させられる、請求項２２に記載のプロセス。
【請求項２４】
前記クエンチャーは、クエンチャー−ｄＴアミダイト残基によって前記第３伸長ブロック化プライマーに付着させられる、請求項２２に記載のプロセス。
【請求項２５】
前記第３伸長ブロック化プライマーは蛍光体およびクエンチャーを含む、請求項２２に記載のプロセス。
【請求項２６】
前記蛍光体と前記クエンチャーとは０〜２塩基離れている、請求項２５に記載のプロセス。
【請求項２７】
前記蛍光体と前記クエンチャーとは０〜５塩基離れている、請求項２５に記載のプロセス。
【請求項２８】
前記蛍光体と前記クエンチャーとは０〜８塩基離れている、請求項２５に記載のプロセス。
【請求項２９】
前記蛍光体と前記クエンチャーとは０〜１０塩基離れている、請求項２５に記載のプロセス。
【請求項３０】
前記蛍光体と前記クエンチャーとは、前記伸長ブロック化プライマーが前記標的核酸にハイブリダイズする場合よりも、該伸長ブロック化プライマーがハイブリダイズしない場合の方が長い距離離れている、請求項２５に記載のプロセス。
【請求項３１】
前記蛍光体または前記クエンチャーは、非相補的もしくは修飾された内部残基に付着させられ、該蛍光体および該クエンチャーは、前記ヌクレアーゼによる修飾された内部残基の切断に続いて分離される、請求項２５に記載のプロセス。
【請求項３２】
前記蛍光体は、フルオレセイン、ＦＡＭ、ＴＡＭＲＡの群から選択される、請求項２５に記載のプロセス。
【請求項３３】
前記クエンチャーはダーククエンチャーである、請求項２５に記載のプロセス。
【請求項３４】
前記ダーククエンチャーは、Ｄａｒｋ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ  １、Ｄａｒｋ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ  ２、Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ  １およびＢｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ
Ｑｕｅｎｃｈｅｒ  ２からなる群から選択される、請求項３３に記載のプロセス。
【請求項３５】
前記第１プライマー、前記第２プライマーもしくは前記第３伸長ブロック化プライマーは、長さが１２〜３０残基である、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３６】
前記第１プライマー、前記第２プライマーもしくは前記第３伸長ブロック化プライマーは、長さが１２〜４０残基である、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３７】
前記第１プライマー、前記第２プライマーもしくは前記第３伸長ブロック化プライマーは、長さが１２〜６０残基である、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３８】
前記プロセスは、１４℃〜２１℃の温度で実施される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３９】
前記プロセスは、２１℃〜２５℃の温度で実施される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項４０】
前記プロセスは、２５℃〜３０℃の温度で実施される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項４１】
前記プロセスは、３０℃〜３７℃の温度で実施される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項４２】
前記プロセスは、４０℃〜４３℃の温度で実施される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項４３】
前記プロセスは、前記標的核酸の少なくとも第３部分を少なくとも１０７倍増幅させる、請求項１に記載のプロセス。
【請求項４４】
前記プロセスは、１％〜１２％のＰＥＧの存在下で実施され、その結果、該ＰＥＧが増幅を刺激する、請求項１に記載のプロセス。
【請求項４５】
前記プロセスは、６％〜８％のＰＥＧの存在下で実施され、その結果、該ＰＥＧが増幅を刺激する、請求項１に記載のプロセス。
【請求項４６】
前記ｄＮＴＰはｄＵＴＰを含み、前記ＲＰＡプロセスは２０分間未満の第１期間にわたりウラシルグリコシラーゼの存在下で実施され、該プロセスは該第１期間後にウラシルグリコシラーゼ阻害剤の存在下で実施される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項４７】
前記プロセスは、前記ウラシルグリコシラーゼの温度に基づく不活性化を伴わずに実施される、請求項４６に記載のプロセス。
【請求項４８】
前記ウラシルグリコシラーゼ阻害剤は、枯草菌ファージＰＢＳ１ウラシルグリコシラーゼ阻害剤または枯草菌ファージＰＢＳ２ウラシルグリコシラーゼ阻害剤である、請求項４６に記載のプロセス。
【請求項４９】
前記ｄＮＴＰは、ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰからなる、請求項４６に記載のプロセス。
【請求項５０】
前記ｄＮＴＰはｄＴＴＰを含有していない、請求項４６に記載のプロセス。
【請求項５１】
１つの反応において１つまたは複数の二本鎖標的核酸上で１より多くのＲＰＡプロセスを実施する工程を含むＲＰＡの多重プロセスであって、各プロセスが以下の工程：
（ａ）リコンビナーゼ因子を第１核酸プライマーおよび第２核酸プライマーならびに１つまたは複数の非相補的もしくは修飾された内部残基を含む第３伸長ブロック化プライマーと接触させて、第１核タンパク質プライマー、第２核タンパク質プライマーおよび第３核タンパク質プライマーを形成させる工程と；
（ｂ）該第１核タンパク質プライマーおよび該第２核タンパク質プライマーを該二本鎖標的核酸と接触させ、それにより、該第１核タンパク質プライマーと該ＤＮＡの第１鎖の第１部分の該第１鎖との間で第１二本鎖構造を形成させ、そして該第２核タンパク質プライマーと該ＤＮＡの第２鎖の第２部分の該第２鎖との間で第２二本鎖構造を形成させ、その結果、該第１核タンパク質プライマーの３’末端および該第１核タンパク質プライマーの３’末端が、該３’末端間に標的核酸の第３部分を有して同一標的核酸分子上で相互に向けて方向付けられる工程と；
（ｃ）１つまたは複数のポリメラーゼおよびｄＮＴＰを用いて該第１核タンパク質プライマーおよび該第２核タンパク質プライマーの３’末端を伸長させて、該核酸の第３部分を含む内部領域を備える第１増幅された標的核酸を生成する工程と；
（ｄ）該増幅された標的核酸を該第３核タンパク質プライマーと接触させて、ヌクレア
ーゼの存在下で該増幅させた標的核酸の第３部分で第３二本鎖構造を形成する工程であって：このとき該ヌクレアーゼは、該第３二本鎖構造の形成後にのみ該非相補的もしくは修飾された内部残基を特異的に切断して、第３の５’プライマーおよび第３の３’伸長ブロック化プライマーを形成する工程と；
（ｅ）１つまたは複数のポリメラーゼおよびｄＮＴＰを用いて該第３の５’プライマーの３’末端を伸長させて、該第１核酸プライマーおよび該第３の５’プライマーを含む第２二本鎖増幅核酸を生成する工程と；
（ｆ）所望の程度の第２二本鎖増幅核酸が達成されるまで、（ｂ）から（ｅ）を繰り返して反応を継続する工程と；を含み、
このとき各ＲＰＡプロセスは、該第１核酸プライマーおよび該第２核酸プライマーの相違する組み合わせを用いて実施され、各プロセスは同一の第３伸長ブロック化プライマーを用いて実施されるプロセス。
【請求項５２】
前記１より多くのＲＰＡプロセスは、少なくとも２つの別個のＲＰＡプロセスを含む、請求項５１に記載のプロセス。
【請求項５３】
前記１より多くのＲＰＡプロセスは、少なくとも４つの別個のＲＰＡプロセスを含む、請求項５１に記載のプロセス。
【請求項５４】
前記１より多くのＲＰＡプロセスは、少なくとも５つの別個のＲＰＡプロセスを含む、請求項５１に記載のプロセス。
【請求項５５】
前記１より多くのＲＰＡプロセスは、少なくとも７つの別個のＲＰＡプロセスを含む、請求項５１に記載のプロセス。
【請求項５６】
前記１より多くのＲＰＡプロセスは、少なくとも１０の別個のＲＰＡプロセスを含む、請求項５１に記載のプロセス。
【請求項５７】
前記修飾された内部残基は、ウラシル残基またはイノシン残基である、請求項５１に記載のプロセス。
【請求項５８】
前記第２二本鎖増幅核酸の形成を検出して、前記１より多くのＲＰＡプロセスのいずれかの累積増幅を決定する工程をさらに含む、請求項５１に記載のプロセス。
【請求項５９】
各ＲＰＡプロセスの前記第１核酸プライマーは同一の第１検出可能標識で標識され、前記第３伸長ブロック化プライマーは第２検出可能標識で標識され、および前記検出する工程は該第１検出可能標識および該第２検出可能標識の両方を含む二本鎖核酸を検出する工程を含む、請求項５１に記載のプロセス。
【請求項６０】
前記第２二本鎖増幅核酸の産生は、第１抗体が前記第１検出可能標識に結合し、第２抗体が前記第２検出可能標識に結合するサンドイッチアッセイによって検出される、請求項５９に記載のプロセス。
【請求項６１】
前記ヌクレアーゼはＤＮＡグリコシラーゼもしくはＡＰエンドヌクレアーゼである、請求項５１に記載のプロセス。
【請求項６２】
前記ヌクレアーゼは前記第３伸長ブロック化プライマーの非相補的塩基と前記標的核酸との間の塩基ミスマッチを認識し、該第３伸長ブロック化プライマーを該非相補的塩基で切断する、請求項５１に記載のプロセス。
【請求項６３】
前記ヌクレアーゼは、ｆｐｇ、Ｎｔｈ、ＭｕｔＹ、ＭｕｔＳ、ＭｕｔＭ、大腸菌ＭＵＧ、ヒトＭＵＧ、ヒトＯｇｇ１、脊椎動物Ｎｅｉ様（Ｎｅｉｌ）グリコシラーゼ、ウラシルグリコシラーゼ、ヒポキサンチン−ＤＮＡグリコシラーゼならびにそれらの機能的アナログからなる群から選択される、請求項５１に記載のプロセス。
【請求項６４】
前記ヌクレアーゼは大腸菌Ｎｆｏもしくは大腸菌エキソヌクレアーゼＩＩＩであり、前記修飾された残基はテトラヒドロフラン残基もしくは炭素リンカーである、請求項５１に記載のプロセス。
【請求項６５】
前記修飾された内部塩基は、８−オキソグアニン、チミングリコール、または無塩基性部位模擬体からなる群から選択される、請求項５１に記載のプロセス。
【請求項６６】
前記無塩基性部位模擬体は、テトラヒドロフラン残基またはＤ−スペーサーである、請求項６５に記載のプロセス。
【請求項６７】
前記無塩基性部位模擬体は、テトラヒドロフラン残基またはＤ−スペーサーである、請求項６６に記載のプロセス。
【請求項６８】
前記第３伸長ブロック化プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長に抵抗性であるブロック化３’残基を含む、請求項５１に記載のプロセス。
【請求項６９】
前記ブロック化３’残基は、ポリメラーゼによる前記プライマーの伸長を防止するブロック部分を含む、請求項６８に記載のプロセス。
【請求項７０】
前記ブロック部分は、３’残基の糖の３’部位または２’部位に付着させられる、請求項６９に記載のプロセス。
【請求項７１】
前記ブロック化３’残基は、ジデオキシヌクレオチドである、請求項７０に記載のプロセス。
【請求項７２】
ＤＮＡの第１鎖および第２鎖を含む二本鎖標的核酸分子をＤＮＡ増幅させるＲＰＡプロセスであって、以下の工程：
（ａ）リコンビナーゼ因子を第１核酸プライマーおよび第２核酸プライマーと接触させて、第１核タンパク質プライマーおよび第２核タンパク質プライマーを形成させる工程と；
（ｂ）該第１核タンパク質プライマーおよび該第２核タンパク質プライマーを該二本鎖標的核酸と接触させ、それにより、該第１核タンパク質プライマーと該ＤＮＡの第１鎖の第１部分の該第１鎖との間で第１二本鎖構造を形成させ、そして該第２核タンパク質プライマーと該ＤＮＡの第２鎖の第２部分の該第２鎖との間で第２二本鎖構造を形成させ、その結果、該第１核タンパク質プライマーの３’末端および該第１核タンパク質プライマーの３’末端が、同一の二本鎖標的核酸分子上で相互に向けて方向付けられる工程と；
（ｃ）１つまたは複数のポリメラーゼならびにｄＮＴＰおよびｄＵＴＰを用いて該第１核タンパク質プライマーおよび第２核タンパク質プライマーの３’末端を伸長させて、増幅された標的核酸分子を生成する工程と；
（ｄ）ウラシルグリコシラーゼの存在下で２０分間以内の第１期間にわたり（ｂ）および（ｃ）を繰り返すことで反応を継続する工程と；
（ｅ）所望の程度の増幅が達成されるまで、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤の存在下で、（ｂ）および（ｃ）の繰り返しを通して反応を継続する工程と、を含むプロセス。
【請求項７３】
前記第１期間は１０分間以内である、請求項７２に記載のプロセス。
【請求項７４】
前記第１期間は５分間以内である、請求項７２に記載のプロセス。
【請求項７５】
前記第１期間は２分間以内である、請求項７２に記載のプロセス。
【請求項７６】
前記ウラシルグリコシラーゼ阻害剤は、枯草菌ファージＰＢＳ１ウラシルグリコシラーゼ阻害剤または枯草菌ファージＰＢＳ２ウラシルグリコシラーゼ阻害剤である、請求項７２に記載のプロセス。
【請求項７７】
前記ｄＮＴＰは、ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰからなる、請求項７２に記載のプロセス。
【請求項７８】
前記ｄＮＴＰはｄＴＴＰを含有していない、請求項７２に記載のプロセス。