(57)【要約】式（Ｉ）の化合物：2012515148.tif 000033またはその塩、好ましくは製薬上許容される塩は、脾臓チロシンキナーゼ（ＳＹＫ）の阻害剤であり、したがって不適切な肥満細胞活性化から起こる疾患、例えばアレルギー性疾患および炎症性疾患の治療において潜在的に有用であり、また癌、特に血液腫瘍の治療において潜在的に有用である。【選択図】なし
2012515148.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2012515148.tif 000030
の化合物またはその塩、好ましくはその製薬上許容される塩。
【請求項２】
２−｛［（３Ｒ，４Ｒ）−３−アミノテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル］アミノ｝−４−［（４−メチルフェニル）アミノ］−５−ピリミジンカルボキサミド；またはその塩、好ましくはその製薬上許容される塩である、請求項１記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項３】
請求項１または２で定義される式（Ｉ）の化合物またはその塩を調製するための方法であって、式（ＩＩ）：
【化２】
2012515148.tif 000031
の化合物を式（ＩＩＩ）：
【化３】
2012515148.tif 000032
（式中、Ｐは保護基、例えば、t-ブトキシカルボニル（Boc）である）の化合物と反応させ、その後、保護基を除去することを含む方法。
【請求項４】
請求項１または２で定義される式（Ｉ）の化合物またはその製薬上許容される塩、および１以上の製薬上許容される賦形剤を含む医薬製剤。
【請求項５】
治療で使用するための、請求項１または２で定義される式（Ｉ）の化合物またはその塩。
【請求項６】
Ｓｙｋキナーゼを阻害するための医薬の製造における、請求項１または２で定義される式（Ｉ）の化合物またはその塩の使用。
【請求項７】
請求項１または２で定義される式（I）の化合物またはその製薬上許容される塩の有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、癌、具体的には血液腫瘍、特に小胞（ＦＬ）、マントル細胞、バーキットおよびびまん性大細胞型Ｂ細胞（ＤＬＢＣＬ）リンパ腫を含む非ホジキンリンパ腫の治療方法。
【請求項８】
不適切な肥満細胞活性化と関連する疾患を治療するための医薬の製造における、請求項１または２で定義される式（Ｉ）の化合物またはその塩の使用。
【請求項９】
炎症性疾患の治療のための医薬の製造における、請求項１または２で定義される式（Ｉ）の化合物またはその塩の使用。
【請求項１０】
アレルギー性疾患を治療するための医薬の製造における、請求項１〜７のいずれかで定義される式（Ｉ）の化合物またはその塩の使用。
【請求項１１】
鼻炎を治療するための医薬の製造における、請求項１〜７のいずれかで定義される式（Ｉ）の化合物またはその塩の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脾臓チロシンキナーゼ（Ｓｙｋキナーゼ）に対する活性を有する新規化合物、それらの調製法、それらを含む製薬上許容される処方および治療におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、Ｓｙｋキナーゼは、活性化免疫受容体と、増殖、分化、および食作用をはじめとする種々の細胞性応答を媒介するシグナル下流事象とのカップリングに関与する非受容体型チロシンキナーゼである。Ｓｙｋキナーゼは、造血細胞において広く発現される。Ｓｙｋキナーゼ阻害剤は潜在的な抗炎症性および免疫調節活性を有する。それらは、Ｓｙｋキナーゼ媒介性ＩｇＧ  Ｆｃイプシロンおよびガンマ受容体ならびにＢＣＲ受容体シグナリングを阻害し、その結果、肥満細胞、マクロファージ、およびＢ細胞の活性化ならびに関連する炎症反応および組織損傷を阻害する。したがって、Ｓｙｋキナーゼ阻害剤は、関節リウマチ、Ｂ細胞リンパ腫および喘息／鼻炎の治療をはじめとする多数の治療領域に関心を集めている。
【０００３】
関節リウマチ（ＲＡ）は集団の約１％が発症する自己免疫疾患である。これは、骨および軟骨の消耗性破壊に至る関節の炎症を特徴とする。可逆的Ｂ細胞枯渇を引き起こすリツキシマブに関する最近の臨床研究（J.C.W. Edwards et al 2004, New Eng. J. Med. 350: 2572-2581）は、Ｂ細胞機能を標的とすることが、ＲＡなどの自己免疫疾患において適切な治療方針であることを示している。臨床的有益性は、自己反応性抗体（またはリウマチ因子）の減少と相関し、これらの研究は、Ｂ細胞機能および実際には自己抗体産生が、この疾患において起こっている病状の中核をなすことを示唆する。
【０００４】
Ｓｙｋキナーゼが欠損したマウス由来の細胞を用いた研究は、このキナーゼのＢ細胞機能における必須的役割を示している。Ｓｙｋキナーゼ欠乏は、Ｂ細胞発生におけるブロックを特徴とする（M. Turner et al 1995 Nature 379: 298-302およびCheng et al 1995, Nature 378: 303-306）。これらの研究は、Ｓｙｋキナーゼが欠損した成熟Ｂ細胞に関する研究（Kurasaki et al 2000, Immunol. Rev. 176:19-29）とともに、ＳｙｋキナーゼがＢ細胞の分化および活性化に必要であることを証明する。したがって、ＲＡ患者におけるＳｙｋキナーゼの阻害は、Ｂ細胞機能をブロックし、したがってリウマチ因子産生を減少させる可能性が高い。ＳｙｋキナーゼのＢ細胞機能における役割に加えて、ＲＡの治療に関連するのは、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）シグナリングにおけるＳｙｋキナーゼ活性の必要性である。ＲＡにおける免疫複合体によるＦｃＲ活性化は、複数のプロ炎症性メディエータの放出の一因となることが示唆されている。
【０００５】
Ｓｙｋキナーゼ依存性方法のＲＡの病状に対する寄与は、Ｗｏｎｇら（２００４、同書）により概説されている。
【０００６】
Ｓｙｋキナーゼ阻害剤Ｒ７８８（フォスタマチニブ二ナトリウム、Ｒｉｇｅｌ）に関する１２週の臨床試験の結果が公開されている：Treatment of rheumatoid arthritis with a syk kinase inhibitor: A twelve-week, randomized, placebo-controlled trial, Arthritis & Rheumatis, 58(11), 2008, 3309-3318。
【０００７】
Ｓｙｋ阻害剤は、癌治療、具体的には血液腫瘍（heme malignancies）、特に、小胞（ＦＬ）、マントル細胞、バーキットおよびびまん性大細胞型Ｂ細胞（ＤＬＢＣＬ）リンパ腫をはじめとする非ホジキンリンパ腫においても有用であり得る。
【０００８】
研究によって、Ｓｙｋは種々の原発性Ｂリンパ腫およびＢリンパ腫細胞系における過剰発現および／または構成的活性化により調節不全にされることが示されている。Ｓｙｋは、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路、ＰＬＤ経路およびＡＫＴ非依存性シグナリングによって、ｍＴＯＲ（ラパマイシンの哺乳類標的）を活性化し、これは次にＢ細胞生存および増殖を増大させる。インビトロでのＳｙｋの阻害の結果、ｍＴＯＲ活性化が低下し、ＦＬ細胞における間代性が減少する。Ｂリンパ腫（ＢＫＳ−２）のネズミモデルにおけるクルクミンを用いたＳｙｋキナーゼの阻害は、全脾細胞数によって測定される腫瘍量の有意な軽減をもたらした。（Leseux L. et al. Blood 15 Dec 2006, Vol 108, No 13 pp 4156-4162およびGururajan M. et al.  Journal of Immunology, 2007, 178 pp 111-121）。
【０００９】
再発性または難治性Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の患者におけるＲ７８８（フォスタマチニブ二ナトリウム）の第２相臨床試験結果により、当該化合物は、これらの患者の耐用性が良好であること、ならびにびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）および慢性リンパ性白血病／小リンパ球性リンパ腫（ＣＬＬ／ＳＬＬ）を患っている患者において治療効果が示される。この試験に参加した患者は疾患が進行し、市販の治療薬では奏功しなかったという事実にもかかわらず、これらのうちのかなりのものが、Ｒ７８８を用いたＳｙｋ阻害に対して特に反応性であった（www.Rigel.com）。
【００１０】
Ｓｙｋ阻害剤は、架橋ＦｃεＲ１およびまたはＦｃγＲ１受容体を架橋する下流細胞シグナル伝達に重要であり、シグナリングカスケードの初期に位置するので、喘息および鼻炎の治療においても有用であり得る。肥満細胞において、例えば、受容体−ＩｇＥ複合体のアレルゲン架橋後のＦｃεＲ１シグナリングの初期配列は、まずＬｙｎ（Ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ）、次にＳｙｋキナーゼを含む。
【００１１】
アレルギー性鼻炎および喘息は、肥満細胞、好酸球、Ｔ細胞および樹状細胞をはじめとする多数の細胞型を含む過敏性反応および炎症事象に関連する疾患である。アレルゲンにさらされた後、ＩｇＥ（ＦｃεＲＩ）およびＩｇＧ（ＦｃγＲＩ）の高親和性免疫グロブリン受容体は架橋するようになり、プロ炎症性メディエータおよび気道スパスモーゲンの放出に至る肥満細胞および他の細胞型における下流方法を活性化する。肥満細胞においては、例えば、アレルゲンによるＩｇＥ受容体架橋は、前もって形成された顆粒からのヒスタミンをはじめとするメディエータの放出、ならびにプロスタグランジンおよびロイコトリエンをはじめとする脂質メディエータの合成および新たに合成された脂質メディエータの放出をもたらす。
【００１２】
アレルギー性鼻炎の治療に関する第Ｉ／ＩＩ相研究において鼻内投与されるＳｙｋキナーゼ阻害剤Ｒ１１２（Ｒｉｇｅｌ）は、アレルギー性鼻漏の改善と非常に関係がある重要な免疫メディエータであり、インジケータの範囲全体にわたって安全であり、したがって局所Ｓｙｋキナーゼ阻害剤の臨床的安全性および有効性の最初の証拠を提供する、ＰＧＤ２の統計的に有意な減少をもたらすことが示された（Meltzer, Eli O.;Berkowitz, Robert B.;Grossbard, Elliott B. An intranasal Syk kinase inhibitor(R112) improves the symptoms of seasonal allergic rhinitis in a park environment. Journal of Allergy and Clinical Immunology (2005), 115(4), 791-796を参照）。しかし、さらなる第ＩＩ相臨床試験では、アレルギー性鼻炎に関して、Ｒ１１２はプラセボに対して有効性がないことが示された（Clinical Trials.gov Identifier NCT0015089）。
【００１３】
EP1184376B1/WO200007513およびEP1054004/WO9903101073（山之内製薬株式会社）は、Ｓｙｋ阻害活性を有する新規複素環式カルボキサミド誘導体を記載する。これらは、“Synthetic studies on novel Syk inhibitors. Part 1:Synthesis and structure-activity relationships of 5-pyrimidine-5-carboaxamidr derivatives (H. Hisamichi et al, Bioorg Med Chem 13(2005) 4936-4951)でさらに記載されている。特にこの論文から、好ましい化合物は、式（Ａ）：
【化１】
2012515148.tif 000003
【００１４】
の化合物であることが明らかであろう。
【００１５】
WO9903101073の範囲は、エチレンジアミン部分がｃｉｓ−１，２−ジアミノシクロヘキシルで置換されている組を含む、さらに広範囲の類似体を記載する。
【００１６】
WO 04/035604は、ヒトＳｙｋタンパク質の構造的同等物を開示する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】EP1184376B1/WO200007513
【特許文献２】EP1054004/WO9903101073
【特許文献３】WO04/035604
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】J.C.W. Edwards et al 2004, New Eng. J. Med. 350: 2572-2581
【非特許文献２】M. Turner et al 1995 Nature 379: 298-302
【非特許文献３】Cheng et al 1995, Nature 378: 303-306
【非特許文献４】Kurasaki et al 2000, Immunol. Rev. 176:19-29
【非特許文献５】Arthritis & Rheumatis, 58(11), 2008, 3309-3318
【非特許文献６】Leseux L. et al. Blood 15 Dec 2006, Vol 108, No 13 pp 4156-4162
【非特許文献７】Gururajan M. et al.  Journal of Immunology, 2007, 178 pp 111-121
【非特許文献８】Journal of Allergy and Clinical Immunology (2005), 115(4), 791-796
【非特許文献９】H. Hisamichi et al, Bioorg Med Chem 13(2005) 4936-4951
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
しかし、Ｓｙｋキナーゼの阻害剤であるさらなる化合物を同定する必要がある。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】実施例１で得られたスペクトルである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
したがって、発明の第１の態様において、本発明は、式（Ｉ）：
【化２】
2012515148.tif 000004
【００２２】
の化合物またはその塩、好ましくは製薬上許容される塩を提供する。
【００２３】
式（Ｉ）の化合物は、化学名：
２−｛［（３Ｒ，４Ｒ）−３−アミノテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル］アミノ｝−４−［（４−メチルフェニル）アミノ］−５−ピリミジンカルボキサミドを有する。
【００２４】
本発明の化合物はＳｙｋの阻害剤として有用である。本発明の化合物は、他の重要なキナーゼに対して、特にキナーゼＶＥＧＦＲ２およびＡｕｒｏｒａ  Ｂに対して、例えば少なくとも１０×（酵素のｐＫｉまたはｐＩＣ５０値のいずれかに基づく）のＳｙｋキナーゼに関する選択性を示す。本発明の化合物はまた、ｈＥＲＧアッセイにおいて低い活性を示し、これは潜在的な心毒性の主な尺度である。
【００２５】
本発明の化合物は、したがって、いくつかの癌療法、特に血液腫瘍、ならびにＢ細胞および／または活性化マクロファージを含む炎症状態、ならびに不適切な肥満細胞活性化から起こる疾患、例えばアレルギー性疾患および炎症性疾患の治療において潜在的に有用である。
【００２６】
本明細書で用いる場合、「製薬上許容される」という用語は、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、または他の問題もしくは合併症のない人間および動物の組織と接触した使用に適し、妥当な損益比に相応する化合物、物質、組成物、および投与形態を指す。当業者は、本発明の化合物の製薬上許容される塩を調製できることを理解するであろう。
【００２７】
本明細書において用いられる場合、「製薬上許容される塩」という用語は、対象の化合物の所望の生物学的活性を保持し、最小の望ましくない毒性効果を示す塩を指す。これらの製薬上許容される塩は、化合物の最終単離および精製中にその場で調製することができるか、または精製された化合物を遊離酸または遊離塩基形態で好適な塩基または酸とそれぞれ反応させることにより調製することができる。実際、本発明のある実施形態では、製薬上許容される塩は各遊離塩基または遊離酸よりも好適であり得る。なぜなら、このような塩は、分子に対してより高い安定性または溶解性を付与し、それにより投与形態への処方を促進するからである。
【００２８】
式（Ｉ）の化合物は、塩基性であり、したがって一般的に、好適な酸で処理することにより製薬上許容される酸付加塩を形成できる。好適な酸としては、製薬上許容される無機酸および製薬上許容される有機酸が挙げられる。代表的な製薬上許容される酸付加塩としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硝酸塩、メチル硝酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、スルファミン酸塩、リン酸塩、酢酸塩、ヒドロキシ酢酸塩、フェニル酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、イソ酪酸塩、吉草酸塩、マレイン酸塩、ヒドロキシマレイン酸塩、アクリル酸塩、フマル酸塩、リンゴ酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、サリチル酸塩、ｐ−アミノサリチル酸塩、グリコール酸塩、乳酸塩、ヘプタン酸塩、フタル酸塩、シュウ酸塩、コハク酸塩、安息香酸塩、ｏ−アセトキシ安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキシ安息香酸塩、マンデル酸塩、タンニン酸塩、ギ酸塩、ステアリン酸塩、アスコルビン酸塩、パルミチン酸塩、オレイン酸塩、ピルビン酸塩、パモ酸塩、マロン酸塩、ラウリン酸塩、グルタル酸塩、グルタミン酸塩、エストレート、メタンスルホン酸塩（メシル酸塩）、エタンスルホン酸塩（エシル酸塩）、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩（ベシル酸塩）、ｐ−アミノベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩（トシル酸塩）、およびナフタレン−２−スルホン酸塩が挙げられる。
【００２９】
本発明の化合物は固体または液体形態で存在し得る。固体状態で、本発明の化合物は、結晶性もしくは非結晶性（アモルファス）形態、またはそれらの混合物として存在し得る。結晶性形態である本発明の化合物に関して、当業者は、溶媒分子が、結晶化中に格子中に組み入れられる製薬上許容される溶媒和物を形成できることを理解するであろう。溶媒和物は、非水性溶媒、例えばこれらに限定されるものではないが、エタノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｉ−ブタノール、アセトン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ＤＭＳＯ、酢酸、エタノールアミン、および酢酸エチルを含み得るか、または溶媒和物は、格子中に組み込まれる溶媒として水を含み得る。水が格子中に組み入れられる溶媒である溶媒和物は、典型的には「水和物」と呼ばれる。水和物には、化学量論的水和物ならびに様々な量の水を含む組成物が含まれる。本発明はすべてのそのような溶媒和物を包含する。
【００３０】
当業者は、その種々の溶媒和物を含む結晶形態で存在する本発明の化合物は、多形（すなわち、異なる結晶構造で存在する可能性）を示し得ることをさらに理解するであろう。これらの種々の結晶形態は、典型的には「多形体」と呼ばれる。本発明は、全てのそのような多形体を包含する。多形体は、同じ化学組成を有するが、充填、幾何学的配置、および結晶性固体状態の他の記述的特性が異なる。したがって、多形体は、種々の物理的特性、例えば、形状、密度、硬度、変形能、安定性、および溶解特性を有し得る。多形体は、典型的には種々の融点、ＩＲスペクトル、およびＸ線粉末回折パターンを示し、これらを同定に使用することができる。当業者は、例えば、化合物を調製するために用いられる反応条件または試薬を変更または調節することによって、種々の多形体を産生することができることを理解するであろう。例えば、温度、圧力、または溶媒における変化によって、（複数の）多形体が得られる。加えて、１つの多形体がある条件下で別の多形体に自発的に変わる場合がある。
【００３１】
式（Ｉ）の化合物は、本明細書で以下に記載する一般的合成スキームにより調製することができる。
【００３２】
スキーム１  ［（３Ｒ，４Ｒ）−４−アミノテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３−イル］カルバミン酸１，１−ジメチルエチルの合成
【化３】
2012515148.tif 000005
【００３３】
スキーム２  ３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピランの別の合成法
【化４】
2012515148.tif 000006
【００３４】
スキーム３
【化５】
2012515148.tif 000007
【００３５】
したがって、さらなる態様において、本発明は、式（Ｉ）の化合物を調製する方法を提供し、この方法は、式（ＩＩ）：
【化６】
2012515148.tif 000008
【００３６】
の化合物を式（ＩＩＩ）：
【化７】
2012515148.tif 000009
【００３７】
（式中、Ｐは、保護基、例えばｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）である）の化合物で処理し、その後、保護基を除去することを含む。
【００３８】
次の式（ＩＶ）：
【化８】
2012515148.tif 000010
【００３９】
（式中、ＸはＮ３またはＮＨ２であり、Ｙは保護基、例えばｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）である）の中間体化合物（（３Ｒ，４Ｒ）立体化学を有する）は、新規であり、式（Ｉ）の化合物の調製に有用であり、したがって本発明のさらなる態様を提供する。
【００４０】
式（ＩＩＩ）および（ＩＶ）の化合物の調製における重要な態様は、Ｃ−３およびＣ−４で適切な立体化学を導入することである。これは、［（１Ｓ）−１−フェニルエチル］アミンなどのキラルアミン前駆体と、Ｃ２−４アルコール中、好ましくは第２アルコール、例えば２−プロパノールまたは２−ブタノール中、高温で、好ましくは還流条件下で反応させることにより、式（Ｖ）：
【化９】
2012515148.tif 000011
【００４１】
のエポキシドのＣ−３での位置特異的開環によって有利に行うことができることが判明している。反応は、トリメチルアルミニウムの存在下、ジクロロメタンなどの溶媒中で実施することができ、続いてフッ化ナトリウムで仕上げ処理して、アルミネートを分解する。初期反応生成物は、潜在的に、２つのＣ−３ジアステレオ異性体および２つのＣ−４ジアステレオ異性体の混合物であり、Ｃ−３：Ｃ−４比はエポキシド環の開環の位置特異性に依存する。Ｃ−３位置異性体混合物を次に分離し、キラル部分を除去して、式（ＶＩ）：
【化１０】
2012515148.tif 000012
【００４２】
の所望の３−アミノ，４−ヒドロキシテトラヒドロピラン中間体を高いエナンチオマー純度で得る。
【００４３】
したがって、さらなる態様では、本発明は式（ＩＶ）または（ＩＶ）の化合物の調製法を提供し、この方法は、式（Ｖ）の化合物をキラルアミン前駆体、例えば［（１Ｓ）−１−フェニルエチル］アミンと、Ｃ２−４アルコール、好ましくは２−プロパノールまたは２−ブタノールなどの第２アルコール中、高温、好ましくは還流条件下で反応させるステップを含む。
【００４４】
数例において、保護基を用いることが有用であり得ることは理解されるであろう。保護基およびそれらを除去するための手段の例は、T. W. Greene ‘Protective Groups in Organic Synthesis’(J. Wiley and Sons, 1991）に記載されている。好適なアミン保護基としては、これらに限定されるものではないが、スルホニル（例えばトシル）、アシル（例えばベンジルオキシカルボニルまたはｔ−ブトキシカルボニル）およびアリールアルキル（例えばベンジル）が挙げられ、これらは必要に応じて加水分解または水素化分解によって除去することができる。他の好適なアミン保護基には、トリフルオロアセチル（−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３）（塩基触媒加水分解により除去することができる）、または固相樹脂結合ベンジル基、例えばメリフィールド樹脂結合２，６−ジメトキシベンジル基（エルマンリンカー）（酸触媒加水分解（例えばトリフルオロ酢酸を使用）により除去することができる）が含まれる。
【００４５】
本発明の化合物は、Ｓｙｋの阻害剤として有用であり、したがって、ある癌治療、特に血液腫瘍、ならびにＢ細胞が関与する炎症状態、ならびに不適切な肥満細胞活性化の結果起こる疾患、例えばアレルギー性疾患および炎症性疾患の治療において潜在的に有用である。
【００４６】
したがって、さらなる態様では、本発明は、治療において用いられる、式（Ｉ）の化合物、またはその製薬上許容される塩を提供する。
【００４７】
さらなる態様では、本発明は、治療を必要とする患者に対して有効量の式（Ｉ）の化合物、またはその製薬上許容される塩を投与することを含む、Ｓｙｋキナーゼを阻害するための方法を提供する。
【００４８】
Ｓｙｋ阻害剤は、癌治療、具体的には血液腫瘍、特に小胞（ＦＬ）、マントル細胞、小リンパ球性リンパ腫／慢性リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ／ＣＬＬ）、バーキットおよびびまん性大細胞型Ｂ細胞（ＤＬＢＣＬ）リンパ腫をはじめとする非ホジキンリンパ腫に有用であり得る。
【００４９】
したがって、さらなる態様では、本発明は、癌、具体的には血液腫瘍、特に小胞（ＦＬ）、マントル細胞、バーキットおよびびまん性大細胞型Ｂ細胞（ＤＬＢＣＬ）リンパ腫を包含する非ホジキンリンパ腫を治療する方法を提供し、この方法は、治療を必要とする患者に対して有効量の式（Ｉ）の化合物、またはその製薬上許容される塩を投与することを含む。
【００５０】
本発明の化合物は、当該技術分野で公知の他の種類の癌化学療法剤と組み合わせた癌化学療法において用いることもできる。非ホジキンリンパ腫のためのそのような組み合わせで用いられる代表的な種類の薬剤としては、リタキシマブ（ｒｉｔａｘｉｍａｂ）、ＢＥＸＸＡＲ（トシツモマブおよびヨウ素Ｉ１３１トシツモマブ）、ピクサントロンおよび化学療法剤が挙げられる。本発明の化合物の組み合わせは、ＣＨＯＰ投薬計画（シクロホスファミド、アドリアマイシン、ビンクリスチン、プレドニゾン）またはＣＨＯＰ＋リタキシマブ（ＣＨＯＰ＋Ｒ）と組み合わせて用いることもできる。
【００５１】
本発明の化合物は、Ｂ細胞および／またはマクロファージ活性化が関与する自己免疫疾患、例えば全身性紅斑性狼瘡、シェーグレン症候群、ヴェグナー肉芽腫症、水疱性類天疱瘡、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、巨細胞動脈炎、慢性突発性蕁麻疹（自己抗体状態の有無を問わない）（慢性自己免疫性蕁麻疹）（Current Opinions in Immunology 2008 20:709-716における慢性蕁麻疹の新概念）、糸球体腎炎、慢性移植片拒絶反応、および関節リウマチの治療において潜在的に有用である。
【００５２】
さらなる態様では、本発明は、Ｂ細胞が関与する炎症性疾患を治療する方法を提供し、この方法は、治療を必要とする患者に対して有効量の式（Ｉ）の化合物、またはその製薬上許容される塩を投与することを含む。
【００５３】
本発明の化合物は、不適切な肥満細胞活性化から起こる疾患、例えばアレルギー性疾患および炎症性疾患の治療において潜在的に有用である。
【００５４】
さらなる態様では、本発明は、不適切な肥満細胞活性化を治療する方法を提供し、この方法は、治療を必要とする患者に有効量の式Ｉの化合物、またはその製薬上許容される塩を投与することを含む。
【００５５】
さらなる態様では、本発明は、炎症性疾患を治療する方法を提供し、この方法は、治療を必要とする患者に有効量の式（Ｉ）の化合物、またはその製薬上許容される塩を投与することを含む。
【００５６】
さらなる態様では、本発明は、アレルギー性障害を治療する方法を提供し、この方法は、治療を必要とする患者に有効量の式（Ｉ）の化合物、またはその製薬上許容される塩を投与することを含む。
【００５７】
Ｓｙｋキナーゼにより媒介されると考えられる疾患および病的状態としては、肥満細胞活性化が関与する炎症性およびアレルギー性障害、例えば慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、喘息、潰瘍性大腸炎、クローン病、気管支炎、結膜炎、乾癬、強皮症、蕁麻疹、皮膚炎、およびアレルギー性鼻炎が挙げられる。
【００５８】
本発明の化合物は、当該技術分野で公知の他の種類の治療薬と組み合わせて用いることもできる。そのような組み合わせで用いられる代表的な種類の薬剤としては、喘息の治療に関しては、抗炎症性ステロイド（特にコルチコステロイド）、ＰＤＥ４阻害剤、ＩＫＫ２阻害剤、Ａ２ａ作動物質、β２−アドレナリン受容体作動物質（短時間作用型および長時間作用型β２−アドレナリン受容体作動物質のどちらも包含する）、アルファ４インテグリン阻害剤、および抗ムスカリン性作用薬、ならびにアレルギーの治療に関しては、前記薬剤、ならびにヒスタミン受容体拮抗物質、例えばＨ１およびＨ１／Ｈ３拮抗物質が挙げられる。重度の喘息を治療するための治療と組み合わせて用いられる代表的な薬剤としては、局所作用型ｐ３８阻害剤、およびＩＫＫ２阻害剤が挙げられる。
【００５９】
抗炎症性コルチコステロイドは当該技術分野で周知である。代表例としては、フルチカゾンプロピオネート（例えば、米国特許第4,335,121号を参照）、ベクロメタゾン１７−プロピオン酸エステル、ベクロメタゾン１７，２１−ジプロピオン酸エステル、デキサメタゾンまたはそのエステル、モメタゾンまたはそのエステル（例えば、モメタゾンフロ酸エステル）、シクレソニド、ブデソニド、およびフルニソリドが挙げられる。抗炎症性コルチコステロイドのさらなる例は、WO 02/12266A1（Glaxo Group Ltd）に記載され、特に、実施例１の化合物（６α，９α−ジフルオロ−１７α−［（２−フラニルカルボニル）オキシ］−１１β−ヒドロキシ−１６α−メチル−３−オキソ−アンドロスタ−１，４−ジエン−１７β−カルボチオン酸Ｓ−フルオロメチルエステル）および実施例４１の化合物（６α，９α−ジフルオロ−１１β−ヒドロキシ−１６α−メチル−１７α−［（４−メチル−１，３−チアゾール−５−カルボニル）オキシ］−３−オキソ−アンドロスタ−１，４−ジエン−１７β−カルボチオン酸Ｓ−フルオロメチルエステル）、またはその製薬上許容される塩である。
【００６０】
β２−アドレナリン受容体作動物質の例としては、サルメテロール（例えば、ラセミ化合物または単一のエナンチオマー、例えばＲ−エナンチオマーとして）、サルブタモール、フォルモテロール、サルメファモール、フェノテロールまたはテルブタリンおよびその塩、例えばサルメテロールのキシナホ酸塩、サルブタモールの硫酸塩もしくは遊離塩基またはフォルモテロールのフマル酸塩が挙げられる。長時間作用型β２−アドレナリン受容体作動物質、特に２４時間にわたって治療効果を有するもの、例えばサルメテロールまたはフォルモテロールが好ましい。
【００６１】
抗ヒスタミンの例としては、メタピリレン、またはロラタジン、セチリジン、デスロラタジンまたはフェキソフェナジンが挙げられる。
【００６２】
抗コリン作用化合物の例としては、ムスカリン性（Ｍ）受容体拮抗物質、特にＭ１、Ｍ２、Ｍ１／Ｍ２、またはＭ３受容体拮抗物質、特に（選択的）Ｍ３受容体拮抗物質が挙げられる。抗コリン作用化合物の例は、WO03/011274A2およびWO 02/069945A2 / US2002/0193393A1およびUS2002/052312A1に記載されている。ムスカリン性Ｍ３拮抗物質の例としては、イプラトロピウムブロミド、オキシトロピウムブロミドまたはチオトロピウムブロミドが挙げられる。
【００６３】
本発明の化合物と組み合わせて用いることができる代表的なＰＤＥ４または混合ＰＤＥ３／４阻害剤としては、ＡＷＤ−１２−２８１（Ｅｌｂｉｏｎ）、ＰＤ−１６８７８７（Ｐｆｉｚｅｒ）、ロフルミラスト、およびシロミラスト（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）が挙げられる。ＰＤＥ４阻害剤のさらなる例は、WO2004/103998、WO2005/030212、WO2005/030725、WO2005/058892、WO2005/090348、WO2005/090352、WO2005/090353、WO2005/090354、WO2006/053784、WO2006/097340、WO2006/133942、WO2007/036733、WO2007/036734およびWO2007/045861（Glaxo Group Ltd）に記載されている。
【００６４】
本発明は、式（Ｉ）の化合物またはその製薬上許容される塩をβ２−アドレナリン受容体作動物質および抗炎症性コルチコステロイドとあわせて含む、いわゆる「トリプル併用」療法も提供する。好ましくは、この組み合わせは、喘息、ＣＯＰＤまたはアレルギー性鼻炎の治療および／または予防用である。β２−アドレナリン受容体作動物質および／または抗炎症性コルチコステロイドは、前述のとおり、および／またはWO03/030939A1に記載されているとおりであり得る。そのような「トリプル」組み合わせの代表例は、式（Ｉ）の化合物またはその製薬上許容される塩、サルメテロールまたはその製薬上許容される塩（例えば、サルメテロールキシナホ酸塩）およびフルチカゾンプロピオネートを含む。
【００６５】
本発明の化合物は、通常、医薬組成物に処方した後に患者に投与するが、必ずしもその必要はない。したがって、別の態様では、本発明は、本発明の化合物および１以上の製薬上許容される賦形剤を含む医薬組成物に関する。
【００６６】
本発明の医薬組成物は、安全かつ有効な量の本発明の化合物を抽出することができ、次いで患者に投与することができるバルク形態、例えば粉末またはシロップで調製し、包装することができる。あるいは、本発明の医薬組成物は、それぞれの物理的に独立した単位が安全かつ有効な量の本発明の化合物を含む単位投与形態で調製し、包装することができる。本発明の医薬組成物は、準単位投与形態（sub-unit dosage form）で調製し、包装することもでき、この場合、２以上の準単位投与形態が単位投与形態を提供する。単位投与形態で調製する場合、本発明の医薬組成物は、典型的には処方の性質に応じて、０．１〜９９．９重量％の本発明の化合物を含む。
【００６７】
加えて、本発明の医薬組成物は、場合によって１以上のさらなる製薬上活性な化合物をさらに含み得る。
【００６８】
本明細書において用いられる場合、「製薬上許容される賦形剤」とは、医薬組成物に形または堅さを付与するのに関与する製薬上許容される物質、組成物またはビヒクルを意味する。患者に投与された場合に本発明の化合物の有効性を実質的に減少させ、結果として製薬上許容できない組成物をもたらす相互作用が回避されるように、各賦形剤は、混合された場合に医薬組成物の他の成分と適合性でなければならない。加えて、各賦形剤は、もちろん製薬上許容されるようにするために十分高い純度のものでなければならない。
【００６９】
本発明の化合物および製薬上許容される（１以上の）賦形剤を含む本発明の組成物は、典型的には、患者に対して所望の投与経路により投与するために適合される投与形態として提供される。例えば、投与形態には、（１）エアゾルおよび溶液などの吸入に適合されるもの；（２）溶液またはスプレーなどの鼻内投与に適合されるもの；（３）錠剤、カプセル、カプレット、丸薬、トローチ、粉末、シロップ、エリキシル剤、懸濁液、溶液、乳剤、サシェ、およびカシェーなどの経口投与に適合されるもの；ならびに（４）滅菌溶液、懸濁液、および再構成するための粉末などの非経口投与に適合されるものが含まれる。
【００７０】
吸入または経口投与に適合される投与形態は、ＣＯＰＤを治療するために通常使用され；鼻内投与に適合される投与形態は、アレルギー性鼻炎を治療するために通常使用され；そして経口投与に適合される投与形態は、関節リウマチおよび血液腫瘍を治療するために通常使用されることは理解されるであろう。
【００７１】
好適な製薬上許容される賦形剤は、選択された特定の投与形態によって変わるであろう。加えて、好適な製薬上許容される賦形剤は、組成物において果たし得る特定の機能について選択され得る。例えば、ある製薬上許容される賦形剤は、均一な投与形態の製造を促進する能力について選択することができる。ある製薬上許容される賦形剤は、安定な投与形態の製造を促進するためのそれらの能力について選択することができる。ある製薬上許容される賦形剤は、本発明の化合物を患者に投与するとすぐに、１つの器官または身体部分から、別の器官または身体部分への移動または輸送を促進するそれらの能力について選択することができる。ある製薬上許容される賦形剤は、患者のコンプライアンスを向上させるそれらの能力について選択することができる。
【００７２】
好適な製薬上許容される賦形剤としては、以下の種類の賦形剤：希釈剤、フィラー、バインダー、崩壊剤、潤滑剤、流動促進剤、造粒剤、コーティング剤、湿潤剤、溶媒、共溶媒、懸濁化剤、乳化剤、甘味料、香味剤、フレーバーマスキング剤、着色剤、アンチケーキング剤、保湿剤、キレート剤、可塑剤、増粘剤、酸化防止剤、防腐剤、安定剤、界面活性剤、および緩衝剤が挙げられる。当業者は、ある製薬上許容される賦形剤が２以上の機能を果たし得、処方中にどれだけ多くの賦形剤が存在するか、またどのような他の成分が処方中に存在するかによって、別の機能を果たし得ることを理解するであろう。
【００７３】
当業者は、本発明において使用するために好適な製薬上許容される賦形剤を適切な量で選択することを可能にする当該技術分野における知識および技術を有する。加えて、製薬上許容される賦形剤を記載し、好適な製薬上許容される賦形剤を選択する際に有用であり得る、当業者に利用可能な資料が数多くある。例としては、Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company)、Remington: The Science and Practice of Pharmacy,(Lippincott Williams & Wilkins)、The Handbook of Pharmaceutical Additives(Gower Publishing Limited)、およびThe Handbook of Pharmaceutical Excipients(the American Pharmaceutical Association and the Pharmaceutical Press)が挙げられる。
【００７４】
本発明の医薬組成物は、当業者に公知の技術および方法を用いて調製する。当該技術分野で通常用いられる方法のいくつかは、Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company)に記載されている。
【００７５】
錠剤などの経口固体投与形態は、典型的には、１以上の製薬上許容される賦形剤を含み、これは、例えば満足できる加工および圧縮特性を錠剤に付与するか、またはさらなる望ましい物理的特性を錠剤に提供するのに役立つ可能性がある。そのような製薬上許容される賦形剤は、希釈剤、バインダー、流動促進剤、潤滑剤、崩壊剤、着色剤、香味剤（ｆｌａｖｏｒａｎｔ）、甘味料、ポリマー、ワックスまたは他の溶解度調節物質から選択することができる。
【００７６】
非経口投与用投与形態は、一般的に流体、特に静脈内流体、すなわち糖、アミノ酸または電解質などの単純な化学物質の滅菌溶液を含み、循環系によって容易に運ばれ、同化され得る。そのような流体は、典型的には注射用水ＵＳＰを用いて調製される。通常、静脈内（ＩＶ）用途に用いられる流体は、Remington, The Science and Practice of Pharmacy［完全な引用はすでに記載］に開示されている。そのようなＩＶ流体のｐＨは変化し得、典型的には当該技術分野で公知のように３．５〜８である。
【００７７】
鼻または吸入投与用投与形態は、エアゾル、溶液、滴剤、ゲルまたは乾燥粉末として都合よく処方することができる。
【００７８】
鼻腔への局所投与（鼻投与）用投与形態には、加圧ポンプによって鼻に投与される加圧型エアゾル処方および水性処方が含まれる。非加圧型で鼻投与用に適合させられる処方が特に興味深い。好適な処方は、このための希釈剤または担体として水を含む。鼻への投与用水性処方は、緩衝剤、等張性改良剤などの通常の賦形剤を用いて提供することができる。水性処方は、ネブライゼーションにより鼻へ投与することもできる。
【００７９】
さらなる実施形態では、鼻投与用投与形態は、定量装置中で提供される。投与形態は、分注ノズルまたは分注オリフィスを有する流体ディスペンサーからの送達用流体処方として提供することができ、流体ディスペンサーのポンプ機構に対して使用者が力を加えると、この分注ノズルまたは分注オリフィスを通して計量された量の流体処方が分注され得る。そのような流体ディスペンサーは、一般的に複数量の流体処方のレザバーを備え、用量は、連続的なポンプ作動により分注される。分注ノズルまたはオリフィスは、流体処方を鼻腔中に噴霧分注するために使用者の鼻孔中に挿入される構造であってよい。一実施形態では、流体ディスペンサーは、WO-A-2005/044354に記載、例示されている一般的タイプのものである。ディスペンサーは、流体処方を収容するための容器上に取り付けられた圧搾ポンプを有する流体放出装置を収納するハウジングを有する。ハウジングは、指で操作可能な少なくとも１つのサイドレバーを有し、これはハウジングに対して内側に動かすことができ、ハウジング中で上方向に容器をカム機構で押し上げて、これによりポンプが定量の処方を圧縮し、ハウジングの鼻ノズルを通ってポンプステムから外へと押し出す。特に好適な流体ディスペンサーは、WO-A-2005/044354の図３０〜４０に示される一般的なタイプのものである。
【００８０】
吸入投与に好適および／または適合される組成物について、式（Ｉ）の化合物または塩は、小型化粒子形態であるのが好ましく、さらに好ましくは、小型化形態は、マイクロ化により得られるかまたは得ることができる。小型化（例えば、マイクロ化）化合物または塩または溶媒和物の好ましい粒子サイズは、（例えば、レーザー回折を用いて測定すると）約０．５〜約１０ミクロンのＤ５０値により定義される。
【００８１】
例えば吸入投与用エアゾル組成物は、製薬上許容される水性または非水性溶媒中の活性物質の溶液または微粒子懸濁液（fine suspension）を含み得る。エアゾル処方は、噴霧装置または吸入器とともに使用するカートリッジまたはリフィルの形態を取ることができる密封容器中の滅菌形態において単回または複数回投与量で提供することができる。あるいは、密封容器は、単一の分注装置、例えば、容器の内容物を排出したら捨てることを意図された、単回投与鼻吸入器または絞り弁を備えたエアゾルディスペンサー（定量吸入器）であってよい。
【００８２】
投与形態がエアゾルディスペンサーを含む場合、これは好ましくは、圧力下の好適なプロペラント、例えば圧縮空気、二酸化炭素または有機プロペラント、例えばヒドロフルオロカーボン（ＨＦＣ）を含む。好適なＨＦＣプロペラントには、１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパンおよび１，１，１，２−テトラフルオロエタンが含まれる。エアゾル投与形態は、ポンプ噴霧器の形態を取ることもできる。加圧型エアゾルは、活性化合物の溶液または懸濁液を含み得る。これは、さらなる賦形剤、例えば共溶媒および／または界面活性剤を組み入れて、懸濁液処方の分散特性および均一性を改善する必要とする場合がある。溶液処方は、エタノールなどの共溶媒の添加も必要とする場合がある。他の修飾賦形剤（excipient modifier）を組み入れて、例えば処方の安定性および／または味および／または微粒子量特性（量および／またはプロファイル）を改善することもできる。
【００８３】
吸入投与に好適および／または適合させる医薬組成物に関して、医薬組成物が乾燥粉末の吸入可能な組成物であるのが好ましい。そのような組成物は、粉末基剤、例えばラクトース、グルコース、トレハロース、マンニトールもしくはデンプン、式（Ｉ）の化合物またはその塩もしくは溶媒和物を（好ましくは小型化粒子形態、例えばマイクロ化形態で）含み得、場合によっては、性能改良剤、例えばＬ−ロイシンまたは別のアミノ酸、セロビオースオクタ酢酸塩および／またはステアリン酸マグネシウムまたはカルシウムなどのステアリン酸の金属塩を含み得る。好ましくは、乾燥粉末の吸入可能な組成物は、ラクトースと式（Ｉ）の化合物またはその塩との乾燥粉末ブレンドを含む。ラクトースは、好ましくはラクトース水和物、例えばラクトース一水和物および／または好ましくは吸入グレードおよび／またはファイングレードラクトースである。好ましくは、ラクトースの粒子サイズは、ラクトース粒子の９０％以上（重量基準または体積基準）が直径１０００ミクロン（マイクロメートル）未満（例えば、１０〜１０００ミクロン、例えば３０〜１０００ミクロン）であること、および／またはラクトース粒子の５０％以上が直径５００ミクロン未満（例えば、１０〜５００ミクロン）であることにより定義される。さらに好ましくは、ラクトースの粒子サイズは、ラクトース粒子の９０％以上が直径３００ミクロン未満（例えば、１０〜３００ミクロン、例えば５０〜３００ミクロン）であること、および／またはラクトース粒子の５０％以上が直径１００ミクロン未満であることにより定義される。場合によって、ラクトースの粒子サイズは、ラクトース粒子の９０％以上が直径１００〜２００ミクロン未満であること、および／またはラクトース粒子の５０％以上が直径４０〜７０ミクロン未満であることにより定義される。最も重要なことには、約３〜約３０％（例えば、約１０％）（重量基準または体積基準）の粒子が直径５０ミクロン未満または２０ミクロン未満であるのが好ましい。例えば、これらに限定されるものではないが、好適な吸入グレードラクトースは、Ｅ９３３４ラクトース（１０％微粒子）（Borculo Domo Ingredients, Hanzeplein 25, 8017 JD Zwolle, Netherlands）である。
【００８４】
場合によって、特に乾燥粉末の吸入可能な組成物に関して、吸入投与用医薬組成物を、好適な吸入装置内部にストリップまたはリボンで縦に取り付けた、複数の密封用量容器（例えば、乾燥粉末組成物を含む）中に組み入れることができる。容器は要望に応じて破裂させることができるかまたははがして開封することができ、例えば乾燥粉末組成物の用量を、GlaxoSmithKlineによって販売されているＤＩＳＫＵＳ（商標）装置などの装置により吸入によって投与することができる。ＤＩＳＫＵＳ（商標）吸入装置は、例えばＧＢ２２４２１３４Ａに記載され、そのような装置中で、粉末形態における医薬組成物用の少なくとも１つの容器（（１以上の）容器は好ましくは、ストリップまたはリボン状で縦に取り付けられた複数の密封用量容器である）は、互いに剥離可能に固定された２つの部材間で規定され；装置は：前記（１以上の）容器の開口地点（opening station）を規定する手段；部材を開口地点で剥離させて、容器を開封する手段；および開封された容器と連通するアウトレットであり、これを通して使用者は粉末形態の医薬組成物を開封された容器から吸入することができるアウトレットを含む。
【００８５】
鼻内投与用の本発明の組成物は、乾燥粉末処方として、吸入による投薬のために適合させることもできる。
【００８６】
本発明の化合物を、吸入、静脈内、経口または鼻内経路によって通常投与される他の治療薬と組み合わせて投与する場合、結果として得られる医薬組成物を同じ経路により投与することができると理解される。
【００８７】
本発明の化合物は、例えば１μｇ〜２ｇの量で都合よく投与することができる。正確な用量は、もちろん、患者の年齢および状態ならびに選択された特定の投与経路によって変わるであろう。
【実施例】
【００８８】
生物学的試験法
本発明の化合物は、次のアッセイにしたがってインビトロ活性について試験することができる：
基本的酵素活性 
１．Ｓｙｋ酵素アッセイ−時間分解蛍光共鳴エネルギー移動キナーゼアッセイ
組換えヒトＳｙｋは、Ｈｉｓ標識されたタンパク質＊として発現された。Ｓｙｋの活性を、時間分解蛍光共鳴エネルギー移動（ＴＲ−ＦＲＥＴ）アッセイを用いて評価した。
【００８９】
Ｓｙｋを室温で３０分間、１６．６ｍＭ  ＭｇＣｌ２、８．３ｍＭ  ＡＴＰの存在下でプレ活性化し、次いで４０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．４、０．０１％ＢＳＡ中で４ｎＭに希釈した。ビオチニル化ペプチド、ビオチン−ＡＡＡＥＥＩＹＧＥＩ（０．５μＭ最終）、ＡＴＰ（３０μＭ最終）およびＭｇＣｌ２（１０ｍＭ最終）を４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．０１％ＢＳＡ中に含む基質試薬３μｌを、Ｇｒｅｉｎｅｒ低容積３８４ウェルブラックプレート中、０．１μｌの種々の濃度の化合物またはＤＭＳＯビヒクル（１．７％最終）を含むウェルに添加した。３μｌの希釈Ｓｙｋ（２ｎＭ最終）を添加することにより反応を開始した。反応を６０分間室温でインキュベートし、次いで６０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｎＭ  ストレプトアビジンＡＰＣ（Prozyme, San Leandro, California, USA）、４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）中Ｗ−１０２４ユーロピウムキレートで標識された０．５ｎＭ抗ホスホチロシン抗体（Wallac OY, Turku, Finland）、０．０３％ＢＳＡを含む３μｌのリード試薬（read reagent）を添加することにより停止させた。反応を４５分間室温でさらにインキュベートした。ビオチン−ＡＡＡＥＥＩＹＧＥＩのリン酸化の程度を、ＢＭＧ  Ｒｕｂｙｓｔａｒプレートリーダー（BMG LabTechnologies Ltd, Aylesbury, UK）を用いて、特定の６６５ｎｍエネルギー移動シグナルの参考ユーロピウム６２０ｎｍシグナルに対する比として測定した。
【００９０】
式（Ｉ）の化合物は、このアッセイにおいて４０ｎＭのＩＣ５０値を有する。
【００９１】
＊組換えヒト完全長脾臓チロシンキナーゼ（Ｓｙｋ）Ｓｙｋの調製
完全長ヒトＳｙｋを、バキュロウイルス系（Invitrogen, Paisley, Scotland）を用いてＮ末端上の６Ｈｉｓタグで発現させた。ダウンス均質化により細胞を破壊し、デブリスを遠心分離により除去し、そして溶解物をＮｉＮＴＡ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ（Qiagen, Crawley, UK）と接触させた。ＮｉＮＴＡをカラム中に充填し、それぞれ１０カラム容積の緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  βＭｃＥｔＯＨ、１０％グリセロール）、緩衝液＋１Ｍ  ＮａＣｌ、緩衝液＋２０ｍＭイミダゾールおよび緩衝液＋３００ｍＭイミダゾールを用いて溶出させた。３００ｍＭのイミダゾールフラクションをプールし、緩衝液を、Ｇ２５Ｍ（Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK）を用いて２０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ６．０、２０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  βＭｃＥｔＯＨ，１０％  グリセロールに交換した。緩衝液交換６Ｈｉｓ−ＳｙｋをＳｏｕｒｃｅ１５Ｓカラム（Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK）にかけ、カラムを、ＮａＣｌ勾配０〜５００ｍＭを用いて５０カラム容積にわたって溶出させた。６Ｈｉｓ−Ｓｙｋ含有フラクションをプールし、限外濾過により濃縮した。６Ｈｉｓ−Ｓｙｋの同一性は、ペプチドマス・フィンガー・プリンティングおよびインタクトＬＣ−ＭＳによって確かめた。
【００９２】
キナーゼ選択性
２．Ａｕｒｏｒａ  Ｂ酵素アッセイ−蛍光偏光キナーゼアッセイ
組換えヒトＡｕｒｏｒａ  Ｂ（２−３４４）を、Ｆｌａｇ−６Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−標識タンパク質＊として発現させた。Ａｕｒｏｒａ  Ｂの活性を、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｏｌａｒｉｓａｔｉｏｎ  ＩＭＡＰアッセイ（Molecular Devices, Sunnyvale, US）を用いて評価した。
【００９３】
Ａｕｒｏｒａ  Ｂ（２μＭ）を、３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．４ｍＭ  ＡＴＰ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％  ＢＭＥ（ベータメルカプトエタノール）、０．１ｍＭバナジウム酸ナトリウム、１０ｍＭ  ＤＴＴ中等濃度のＧＳＴ−ＩＮＣＥＮＰ§により、３時間、３０℃でプレ活性化した。この溶液を次いで５時間、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２７０ｍＭスクロース、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  ＢＭＥ、１ｍＭ  ベンズアミジンおよび０．２ｍＭ  ＰＭＳＦに対して４℃で透析した。Ａｕｒｏｒａ  Ｂ／ＩＮＣＥＮＰ複合体を等分し、−８０℃で凍結した。
【００９４】
２ｎＭの最終濃度のＡｕｒｏｒａ  Ｂ／ＩＮＣＥＮＰ複合体をアッセイ緩衝液（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２５ｍＭ  ＮａＣｌ  ０．００２５％  Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．２  ０．０１５％  ＢＳＡ、１μＭ  ＤＴＴ）に添加した。３μｌのこの溶液を、Ｇｒｅｉｎｅｒ低容積３８４ウェルブラックプレート中、０．１μｌの種々の濃度の化合物またはＤＭＳＯビヒクルを含むウェルに室温で３０分間添加した。アッセイ緩衝液（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２５ｍＭ  ＮａＣｌ  ０．００２５％  Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．２  ０．０１５％  ＢＳＡ、１μＭ  ＤＴＴ）中１００ｎＭ  ５ＦＡＭ−ＰＫＡ−ｔｉｄｅ（ＧＲＴＧＲＲＮＳＩ−ＮＨ２）、２μＭ  ＡＴＰおよび２ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む３μｌの基質試薬の存在により反応を開始した（最終ＤＭＳＯレベル１．７％）。反応をさらに１２０分間室温でインキュベートし、次いで６μｌの製造業者緩衝液Ａ（Ｐａｒｔ：Ｒ７２８５）および製造業者緩衝液Ｂ（ＰａｒｔＲ７２８６）中１：５００希釈Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ溶液（Ｐａｒｔ：Ｒ７２８７）を添加することにより停止させ、１２０分間室温でインキュベートさせた。５ＦＡＭ−ＰＫＡ−ｔｉｄｅ（ＧＲＴＧＲＲＮＳＩ−ＮＨ２）のリン酸化の程度を、Ａｃｑｕｅｓｔプレートリーダー（Molecular Devices, Sunnyvale, US）（励起４８５ｎＭ、発光５３０ｎＭ、５０５ｎｍＭ二色レンズを使用）を用いて測定した。データを平行および垂直方向で取得し、装置によりｍｐに変換した。
【００９５】
式（Ｉ）の化合物はこのアッセイにおいて２０μＭの活性を有する。
【００９６】
＊組換えヒト完全長Ａｕｒｏｒａ  Ｂの調製
完全長ヒトＡｕｒｏｒａ  Ｂを、バキュロウイルス系（Invitrogen, Paisley, Scotland）を用いてＮ末端領域上の６Ｈｉｓタグで発現させた。ｓｆ９細胞を音波処理により溶解させ、デブリスを遠心分離により除去し、溶解物をＮｉＮＴＡ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ（Qiagen, Crawley, UK）と接触させた。ＮｉＮＴＡをカラムに充填し、１−３００ｍＭイミダゾール勾配を用いて溶出させた。３００ｍＭイミダゾールフラクションをプールし、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび２ｍＭ  ＤＴＴに対して透析して、イミダゾールを除去した。約６０％の純粋タンパク質を透析後に回収した。Ａｕｒｏｒａ  Ｂの同一性をＮ末端配列分析およびＬＣ−ＭＳによって確認した。
【００９７】
§ヒトＩＮＣＥＮＰ（８２６−９１９）クローンＤＵ９３０はUniversity of Dundeeから入手し、これはＧＳＴＮ末端標識タンパク質である。
【００９８】
３．ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ）酵素アッセイ−時間分解蛍光共鳴エネルギー移動キナーゼアッセイ
組換えヒトＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ）細胞内ドメイン（全キナーゼドメインを含む）をＧＳＴ−６Ｈｉｓ−標識タンパク質＊として発現した。ＶＥＧＦＲ２の活性を、時間分解蛍光共鳴エネルギー移動（ＴＲ−ＦＲＥＴ）アッセイを用いて評価した。１００％ＤＭＳＯまたは１００％ＤＭＳＯビヒクル中、所望の濃度の試験化合物を０．１μＬでＧｒｅｉｎｅｒ低容積３８４−ウェルブラックプレート（＃７８４０７６）に添加した。プレートを最低１０００ＲＰＭで１分間遠心分離して、液体の全てをウェルの底部に移動させた後、アッセイ試薬を添加した。
【００９９】
ＶＥＧＦＲ２（典型的には１００ｎＭ）を室温で２０分間、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００μＭ  ＡＴＰ、３００μＭ  ＤＴＴ、および０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡの存在下で活性化させた。２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００μＭ  ＡＴＰ、０．７２μＭビオチニル化ペプチド（ビオチン−アミノヘキシル−ＥＥＥＥＹＦＥＬＶＡＫＫＫＫ−ＮＨ２）を含む基質溶液を５μＬでアッセイプレートに添加した。活性化ＶＥＧＦＲ２の溶液を２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、０．２ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、および０．６ｍＭ  ＤＴＴ中で１００倍に希釈した。ＶＥＧＦＲ２触媒反応を５μＬの希釈活性化ＶＥＧＦＲ２の添加により開始した。最終アッセイ濃度は、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０μＭ  ＡＴＰ、０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、３００μＭ  ＤＴＴ、０．３６μＭ  ビオチニル化ペプチド基質、および０．５ｎＭ  ＶＥＧＦＲ２であった（ＶＥＧＦＲ２の最終アッセイ濃度は、酵素の種々のバッチの比活性に応じて変化し得る）。反応を９０分間室温で実施し、次いで５μＬの１５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８の添加により停止させた。アッセイのバックグラウンドシグナルをウェルにおいて確立し、この場合、１５０ｍＭ  ＥＤＴＡの添加は、基質および酵素溶液の前に行った。２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、３０ｎＭ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  ＳｕｒｅＬｉｇｈｔ（登録商標）−ＡＰＣ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，  Ｂｏｓｔｏｎ，  ＭＡ，  ＵＳＡ）、および４ｎＭ  ＬＡＮＣＥ（登録商標）ユーロピウム−標識抗ホスホチロシン  抗体（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，  Ｂｏｓｔｏｎ，  ＭＡ，  ＵＳＡ）を含むＨＴＲＦ検出溶液を５μＬで添加した。１０分間室温でインキュベーションした後、ビオチニル化ペプチド基質のリン酸化を、特定の６６５ｎｍエネルギー移動シグナルの参考ユーロピウム６１５ｎｍシグナルに対する比として、Ｖｉｅｗｌｕｘ  １４３０ウルトラＨＴＳ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｉｍａｇｅｒ（PerkinElmer, Turku, Finland）を用いて測定した。
【０１００】
式（Ｉ）の化合物は、このアッセイにおいて＞７．９μＭのＩＣ５０値を有する。
【０１０１】
＊組換えＧＳＴ−６Ｈｉｓ−ＶＥＧＦＲ２の精製
ＧＳＴ−６Ｈｉｓ−ＶＥＧＦＲ２をＳｆ９昆虫細胞においてバキュロウイルス発現系を用いて、Ｎ末端ＧＳＴおよび６Ｈｉｓタグで過剰発現させた。細胞（１００〜１２０グラム）を５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、および２０ｍＭイミダゾール（５ｍｌ／ｇ細胞）中に室温で懸濁させた。全ての他の精製操作は４℃であった。細胞をＢｒａｎｓｏｎ  ４５０ソニファイアー（７０％粉末、１分間５０％サイクル）で溶解させ、細胞溶解物を３０，０００×ｇで３０分間遠心分離した。上清を、１．２μｍ  Ｐａｌｌフィルターを通して濾過し、次いで５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、および２０ｍＭイミダゾールで平衡化した１５０ｍｌ  Ｑｉａｇｅｎ  Ｎｉ−ＮＴＡ（ＱＩＡＧＥＮ  Ｉｎｃ．，  Ｖａｌｅｎｃｉａ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）カラムにかけた（１０〜２０ｍｌ／分）。カラムを５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、および２０ｍＭイミダゾールで２８０ｎｍでの吸収が０．１未満になるまで洗浄し、次いで５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾールから５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾールの勾配の５カラム容積で溶出させた。フラクション（１０〜３０ｍｌ）を集めた。所望のタンパク質フラクションをプールし、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、および２ｍＭ  ＥＤＴＡで平衡化させた２５ｍｌグルタチオンＳｅｐｈａｒｏｓｅ（GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA）カラムにかけた（５ｍｌ／ｍｉｎ）。カラムを、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、および２ｍＭ  ＥＤＴＡで洗浄し、タンパク質を５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、および２０ｍＭグルタチオンの勾配の３カラム容積で溶出させた。フラクションを集め、所望のタンパク質フラクションをプールし、１０，０００ＭＷＣＯ膜を有するＰａｌｌ  ＪｕｍｂｏＳｅｐ濃縮器（Pall Corporation, Portsmouth, England）で約２０ｍｌまで濃縮した。１８００ｍｌのＳｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ２００または２３ｍｌのＧ２５（GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA）カラムを２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、および１ｍＭ  ＤＴＴで平衡化した。濃縮物をカラムに８ｍｌ／分でかけ、カラムを２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、および１ｍＭ  ＤＴＴで溶出させた。タンパク質フラクション（約２０ｍｌ）を集め、所望のフラクションをプールし、１０，０００  ＭＷＣＯ膜を有するＰａｌｌ  ＪｕｍｂｏＳｅｐ濃縮器で濃縮した。濃縮したタンパク質を、ＶＥＧＦＲ２酵素活性アッセイにおいて後に使用するために望ましい体積に等分して、−８０℃で保存した。ＧＳＴ−６Ｈｉｓ−ＶＥＧＦＲ２の同一性は、インタクト液体クロマトグラフィーおよび質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）ならびにタンパク分解とそれに続いて液体クロマトグラフィーおよびタンデム質量分析法（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）により結果として得られるペプチドを分析することによって確認した。
【０１０２】
Ｂ細胞活性アッセイ
４．Ｒａｍｏｓ  ｐＥｒｋアッセイ
アッセイの原理
Ｒａｍｏｓ  Ｂ細胞（バーキットリンパ腫のヒトＢ細胞）を、抗ＩｇＭを用いて刺激する。この結果、ＳＹＫがＢ細胞受容体に動員される。その後のＳｙｋの自己リン酸化によりシグナリングカスケードが開始され、その結果、Ｅｒｋ  ＭＡＰキナーゼ経路によりＢ細胞が活性化される。その結果、Ｅｒｋがリン酸化され、その後の細胞溶解を免疫捕捉アッセイによって検出する。
【０１０３】
抗ＩｇＭを用いたＲａｍｏｓ細胞の刺激
細胞を９６ｖ−ウェルポリプロピレンプレートにおいて２５μｌの体積のアッセイ培地（１０％加熱不活性化ウシ胎仔血清、１％Ｌ−グルタミンおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ）中、５×１０５／ウェルの密度で播種した。２５μｌの適切に希釈された化合物溶液を添加し、プレートを３０分間３７℃で５％ＣＯ２とともにインキュベートした。細胞を５μｌのヤギ抗ヒトＩｇＭのＦａｂ’２フラグメント（５μｇ／ｍｌ最終）で７分間３７℃にて刺激した。細胞を５５μｌの２×ＲＩＰＡ溶解緩衝液の添加により２時間４℃で溶解させる。
【０１０４】
ｐＥｒｋ  ＭＳＤアッセイ
５０μｌ細胞溶解物を、抗ｐＥｒｋ１／２（Ｔｈｒ／Ｔｈｙ：２０２／２０４；１８５／１８７）捕捉抗体でコーティングされた９６ウェルＭＳＤプレートに移し、１６時間４℃でインキュベートした。プレートを洗浄し、抗ｐＥｒｋ検出抗体を２時間室温で添加した（２５μｌ／ウェル）。これを除去し、１５０μｌのＭＳＤリード緩衝液を添加し、結果として得られた電気化学発光シグナルを測定した。
【０１０５】
式（Ｉ）の化合物は、このアッセイにおいて５０ｎＭのＩＣ５０値を有する。
【０１０６】
化合物調製
化合物をＤＭＳＯ中１０ｍＭストックとして調製し、９連続５倍希釈を用いてＤＭＳＯ中で希釈シリーズを調製した。この希釈シリーズをアッセイ培地でさらに１：１００に希釈して、５×１０−５〜２．５６×１０−１１Ｍの試験される濃度範囲を得た。化合物希釈物を、Ｂｉｏｍｅｋ  ２０００およびＢｉｏｍｅｋ  Ｎｘ自動化ロボットピペッティングシステムを用いて調製した。
【０１０７】
５．ＣＤ６９  ＰＢＭＣアッセイ
アッセイの原理
末梢血Ｂ細胞を、抗ＩｇＭを用いてエクスビボで刺激する。この結果、ＳｙｋがＢ細胞受容体へ動員される。その後のＳｙｋの自己リン酸化により、シグナリングカスケードが開始され、その結果、細胞表面上での活性化マーカーＣＤ６９の発現により示されるように、Ｂ細胞が活性化される。ＣＤ２０／ＣＤ６９＋ｖｅ全血Ｂ細胞はフローサイトメトリーにより検出される。
【０１０８】
抗ＩｇＭを用いた末梢血Ｂ細胞の刺激
末梢血Ｂ細胞をヘパリン化ヒト血液から密度勾配遠心分離によって調製した。細胞を９６ｖ−ウェル・ポリプロピレンプレート中、２５μｌのアッセイ培地（１０％加熱不活性化ウシ胎仔血清、１％Ｌ−グルタミンおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ）の体積中１×１０５／ウェルの密度で播種した。２５μｌの適切に希釈された化合物溶液を添加し、プレートを３０分間３７℃で５％ＣＯ２とともにインキュベートした。細胞をヤギ抗ヒトＩｇＭ（５μｇ／ｍｌ最終）の５μｌのＦａｂ’２フラグメントでさらに３．５時間、すでに記載した条件下で刺激した。存在する赤血球を溶解させ、２００μｌのＬｙｓｅ／Ｆｉｘ緩衝液を室温で１０分間添加することにより、全ての他の細胞を固定した。
【０１０９】
ＣＤ６９アッセイ
細胞を、マウス抗ヒトＣＤ２０ＦＩＴＣおよびマウス抗ヒトＣＤ６９ＡＰＣ結合抗体のカクテルを用いて染色した。試料中に存在するＣＤ２０／ＣＤ６９＋ｖｅＢ細胞をフローサイトメトリーにより検出した。
【０１１０】
化合物調製
化合物をＤＭＳＯ中１０ｍＭストックとして調製し、希釈シリーズを、９連続５倍希釈を用いてＤＭＳＯ中で調製した。この希釈シリーズを、アッセイ培地でさらに１：１００に希釈して、５×１０−５〜２．５６×１０−１１Ｍの試験される濃度範囲を得た。化合物希釈物を、Ｂｉｏｍｅｋ  ２０００およびＢｉｏｍｅｋ  Ｎｘ自動化ロボットピペッティングシステムを用いて調製した。
【０１１１】
６．ＣＤ６９全血アッセイ
アッセイの原理
全血Ｂ細胞を、抗ＩｇＭを用いてエクスビボで刺激する。この結果、ＳｙｋがＢ細胞受容体に動員される。その後のＳｙｋの自己リン酸化によりシグナリングカスケードが開始され、その結果、細胞表面上の活性化マーカーＣＤ６９の発現により示されるようにＢ細胞が活性化される。ＣＤ２０／ＣＤ６９＋ｖｅ全血Ｂ細胞は、フローサイトメトリーにより検出される。
【０１１２】
抗ＩｇＭを用いた全血Ｂ細胞の刺激
１００μｌのヘパリン化ヒト血液を、１μｌの適切に希釈した化合物溶液を含む５ｍｌのポリプロピレン試験管に添加し、３０分間３７℃で５％ＣＯ２とともにインキュベートした。Ｂ細胞を、１０μｌのヤギ抗ヒトＩｇＭのＦａｂ’２フラグメント（６７．５μｇ／ｍｌ最終）でさらに３．５時間、前述の条件下で刺激した。赤血球を溶解させ、全ての他の細胞を、２ｍｌのＬｙｓｅ／Ｆｉｘ緩衝液の添加により１０分間室温で固定した。
【０１１３】
ＣＤ６９アッセイ
細胞を、マウス抗ヒトＣＤ２０ＦＩＴＣおよびマウス抗ヒトＣＤ６９  ＡＰＣ結合抗体のカクテルを用いて染色した。試料中に存在するＣＤ２０／ＣＤ６９＋ｖｅＢ細胞をフローサイトメトリーにより検出した。
【０１１４】
化合物調製
化合物をＤＭＳＯ中１０ｍＭストックとして調製し、希釈シリーズを、７連続３倍希釈を用いてＤＭＳＯ中で調製して、１×１０−５〜４．５×１０−１０Ｍの試験される濃度範囲を得た。化合物希釈物を、Ｂｉｏｍｅｋ  ２０００自動化ロボットピペッティングシステムを用いて調製した。
【０１１５】
肥満細胞活性
７．ＬＡＤ２アッセイ
アッセイの原理
ＬＡＤ２は、肥満細胞肉腫／白血病の患者由来の骨髄穿刺液からＮＩＨによって確立された幹細胞因子（ＳＣＦ）依存性ヒト肥満細胞系である。ＬＡＤ２細胞はＣＤ３４＋由来ヒト肥満細胞に類似し、機能的ＦｃεＲＩを発現する。ＦｃεＲＩは、ＩＬ−４、ＳＣＦおよびＩｇＥの存在下で上方調節され、その後、細胞結合ＩｇＥの架橋の結果、脱顆粒が起こり、これはヘキソサミニダーゼ放出として測定することができる。
【０１１６】
ＦｃεＲＩを上方制御するためのＬＡＤ２細胞のプライミング
ＬＡＤ２細胞を１×１０５／ｍｌで、ヒト組換えＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）、ヒト組換えインターロイキン−４（６ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）およびＩｇＥ（１００μｇ／ｍｌ；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を追加した完全ｓｔｅｍ  ｐｒｏ−３４ＳＦＭ（Ｓｔｅｍ  Ｐｒｏ−３４栄養サプリメント（１：４０）、グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン（１００μｇ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＧｉｂｃｏ  Ｃａｔ  １０６４０−０１９培地）中に再懸濁させた。細胞を次いで５日間、３７℃、５％ＣＯ２、加湿雰囲気中で維持する。
【０１１７】
化合物調製
化合物を１００％ＤＭＳＯ中２ｍＭストックから滴定して、９連続１：３希釈を得た（Ｖ９６−ウェルＮｕｎｃ；Ｂｉｏｍｅｋ  ２０００）。このマスタープレートから、３μｌをドータープレート（平底９６−ウェルＮｕｎｃＢｉｏｍｅｋ  Ｆｘ）中に分配し、これを次いで、２ｍＭグルタミンを含むＲＰＭＩ中で１：４０に希釈し、２０μｌの希釈化合物をＧｒｅｉｎｅｒ細胞プレート中に移した。したがって、最終化合物濃度範囲は一定の０．５％ＤＭＳＯ中で１×１０−５Ｍ〜５×１０−１０Ｍであった。対照ウェルを０．５％ＤＭＳＯで処理した。
【０１１８】
抗ＩｇＥでのＬＡＤ２細胞の活性化
プライム化ＬＡＤ２細胞を遠心分離し（４００ｇ、５分）、上清を捨て、細胞ペレットを１×１０４細胞ｓ／ｍｌで、グルタミン（２ｍＭ）を追加したＲＰＭＩ中に再懸濁させる。さらに遠心分離（４００ｇ、５分）した後、細胞を、グルタミン（２ｍＭ）を含む新しいＲＰＭＩ中に再懸濁させ、５．７×１０５／ｍｌの密度に調節し、２０μｌの希釈化合物（前段で詳述するようにして調製）を含む滅菌Ｖ−ウェルプレート（７０μｌ／ウェル；Ｇｒｅｉｎｅｒ）中にピペットで移す。細胞を次いで１時間インキュベート（３７℃、５％ＣＯ２、加湿雰囲気中）した後、亜最大濃度の抗ＩｇＥ（１０μｌ体積で１：２７００の最終アッセイ希釈度を得る；Ｓｉｇｍａ）で活性化する。４０分のインキュベーション（３７℃、５％ＣＯ２、加湿雰囲気中）後、プレートを遠心分離し（１２００ｇ、１０分、４℃）そして上清をヘキソサミニダーゼアッセイのために除去する。細胞ペレットを１００μｌ／ウェルｔｒｉｔｏｎ−Ｘ（ＲＰＭＩ中０．５％  ２ｍＭグルタミン）中、３７℃で３０分間溶解させる。
【０１１９】
ベータ−ヘキソサミニダーゼアッセイ
ベータ−ヘキソサミニダーゼ活性を、４−メチルウンベリフェリルＮ−アセチル−ε−Ｄグルコサミニド（Ｓｉｇｍａ）を蛍光生成物に変換することによって測定する。上清または溶解物（２５μｌ）を等体積の４−メチルウンベリフェリルＮ−アセチル−ε−Ｄグルコサミニド（０．２Ｍナトリウムクエン酸塩緩衝液中５００μＭ、ｐＨ４．５）とともにブラック９６−ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）中、１時間、３７℃でインキュベートする。反応を次いで、Ｔｒｉｚｍａ  ｐＨ９（９０μｌ）を添加することにより停止させ、蛍光生成物を、励起３５６ｎｍおよび発光４５０ｎｍ（Ｔｅｃａｎ  Ｓａｆｉｒｅ）を用いて測定した。
【０１２０】
ｈＥＲＧ活性
８．ｈＥＲＧについてのＣｙ３Ｂドフェチリドフルオロ−リガンド結合アッセイ
化合物有効性は、フルオロ−リガンド（Ｃｙ３ｂ−ドフェチリド）蛍光偏光アッセイによって測定した。
【０１２１】
ｈＥＲＧ発現ＣＨＯ−Ｋ１膜＊（６０μｇ／ｍｌ）を１．０ｎＭフルオロ−リガンド§とともに、アッセイ緩衝液（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＫＣｌおよび０．１％プルロニック、５Ｍ  ＫＯＨを用いてｐＨ７．４に調節）中でインキュベートした。アッセイ中、最終カリウム濃度は１００ｍＭであった。７０分間室温、暗所で混合した後、１０μｌを、０．１μｌのＤＭＳＯ中試験化合物を含むブラックＬＶ  Ｇｒｅｉｎｅｒ  ３８４ウェルプレートの各ウェル中に分注した。プレートを２時間放置して平衡化させた後、Ａｃｑｕｅｓｔ（商標）／Ａｎａｌｙｓｔ（商標）イメージャで読み取った。ｐＩＣ５０データを１１ポイント阻害曲線（最高アッセイ濃度５０μＭおよび１：３段階希釈）から得、ＡＢａｓｅおよびＸＣ５０を用いて６パラメータ曲線適合を適用して、データを分析し、曲線を適合させた。
【０１２２】
式（Ｉ）の化合物は、このアッセイにおいて２５μＭのＩＣ５０値を有する。
【０１２３】
＊ＣＨＯ−Ｋ１膜
ヒトｈＥＲＧ受容体を安定して発現するチャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を８０％コンフルエンシーまで増殖させた後、トリプシン化により集め、続いて５００ｇで１０分間遠心分離した。細胞ペレットを−８０℃で凍結した後、膜を生成させた。凍結したペレットを氷上で解凍し、１０体積の膜緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、２×１０−６ＭペプスタチンＡ）中に再懸濁させ、均質化した。膜懸濁液を２０分間５００ｇで遠心分離し、ペレットを捨て、上清を４８，０００ｇで３０分間再度スピンさせた。２回目の遠心分離の後、膜フラクションを含む残りのペレットを適切な体積（凍結細胞ペレット１ｍｌあたり４ｍｌ）中に再懸濁させ、タンパク質濃度について分析した。
【０１２４】
§フルオロ−リガンド（オクタヒドロベンゾ［２”，３”］インドリジノ［８”，７”：５’，６’］ピラノ［３’，２’：３，４］ピリド［１，２−ａ］インドール−５−イウム−２−スルホン酸塩
ＴＦＡ塩はJ.M.C. 2007, 50(13), 2931-2941に記載されている。
【０１２５】
Ｎ−［４−（｛２−［（６−アミノヘキシル）（２−｛４−［（メチルスルホニル）アミノ］フェニル｝エチル）アミノ］エチル｝オキシ）フェニル］メタンスルホンアミド（１．５０８ｍｇ）をアセトニトリル（１００μｌ）中溶液として、固体Ｃｙ３Ｂ−ＯＮＳｕ（１４−｛２−［（２，５−ジオキソ−１−ピロリジニル）オキシ］−２−オキソエチル｝−１６，１６，１８，１８−テトラメチル−６，７，７ａ，８ａ，９，１０，１６，１８−オクタヒドロベンゾ［２”，３”］インドリジノ［８”，７”：５’，６’］ピラノ［３’，２’：３，４］ピリド［１，２−ａ］インドール−５−イウム−２−スルホン酸塩（１．７ｍｇ、ＷＯ９９３１１８１）にシラン化された４ｍｌバイアル中で添加した。さらなるアセトニトリル（１００μｌ）を添加し、続いてヒューニッヒ塩基（０．９μｌ）を添加した。ジメチルホルムアミドを２回添加し（２×５０μｌ）、反応混合物を減圧下で濃縮した。残留物をジメチルホルムアミド（２００μｌ）中に再溶解させた。ヒューニッヒ塩基（０．９μｌ）を添加し、混合物を２２時間ボルテックス混合した。反応混合物を蒸発乾固させ、アセトニトリル／水／酢酸（５／４／１、約５００μｌ）中に再溶解させ、濾過し、半分取Ｓｐｈｅｒｉｓｏｒｂ  ＯＤＳ２  ＨＰＬＣカラムにかけ、次の勾配で溶出した（流速＝５ｍｌ／分、ＡＵ  ５．０、２１４ｎｍ、ＡＵ  ２、２５６ｎｍ、Ａ＝０．１％ＴＦＡ／水、Ｂ＝９０％アセトニトリル／１０％水／０．１％ＴＦＡ）：ｔ＝０分：Ｂ＝５％；ｔ＝１０分：Ｂ＝５％；ｔ＝３０分：Ｂ＝２５％；ｔ＝９０分：Ｂ＝５５％；ｔ＝１０５分：Ｂ＝１００％；ｔ＝１２０分：Ｂ＝１００％。主成分は４６％〜４８％Ｂの間で溶出し、１つのフラクション中に集め、これを蒸発乾固させ、紫色固体を、溶媒としてメタノールを使用してバイアルに移した。メタノールを減圧下で除去し、紫色固体を乾燥エーテルで磨砕した。固体を一晩、１ミリバールにて乾燥ピストル中で乾燥して、標題化合物（１．２ｍｇ）を得た。
【０１２６】
Ｎ−［４−（｛２−［（６−アミノヘキシル）（２−｛４−［（メチルスルホニル）アミノ］フェニル｝エチル）アミノ］エチル｝オキシ）フェニル］メタンスルホンアミド
粗Ｎ−［４−（｛２−［［６−（１，３−ジオキソ−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−イソインドール−２−イル）ヘキシル］（２−｛４−［（メチルスルホニル）アミノ］フェニル｝エチル）アミノ］エチル｝オキシ）フェニル］メタンスルホンアミド（１４２ｍｇ）をメチルアミン（エタノール中３３％、１０ｍｌ、０．２１６）中に溶解させ、２２℃で４８時間放置した。過剰の試薬を減圧下で蒸発させ、油状残留物を２回分のさらなるエタノールと共沸した。粗生成物をアセトニトリル／水／酢酸（５／４／、＜２ｍｌ）中に溶解させ、半分をＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ１８  ＨＰＬＣカラムにかけ、次の勾配を用いて溶出した（流速＝１０ｍｌ／分、ＡＵ  ２０．０、２１４ｎｍ、ＡＵ１０、２５６ｎｍ、Ａ＝０．１％ＴＦＡ／水、Ｂ＝９０％  アセトニトリル／１０％水／０．１％ＴＦＡ）：ｔ＝０分：Ｂ＝５％；ｔ＝１０分：Ｂ＝５％；ｔ＝１００分：Ｂ＝３５％；ｔ＝１１５分：Ｂ＝１００％；ｔ＝１３０分：Ｂ＝１００％。おもにゆっくりと溶出する成分を含むフラクション（＞９０％）をプールし、蒸発させて、標題化合物（１４．９ｍｇ）を得た。残りの粗生成物をＣ１８カラムにかける。ただし、勾配を変更した：ｔ＝０分：Ｂ＝５％；ｔ＝１０分：Ｂ＝５％；ｔ＝１５分：Ｂ＝１０％；ｔ＝９５分：Ｂ＝３０％；ｔ＝１１０分：Ｂ＝１００％；ｔ＝１２５分：Ｂ＝１００％。主に所望の生成物を含むフラクションを合し、先と同様に蒸発させて、標題化合物（２１．３ｍｇ  約８０％純度）を得た。この物質をさらに精製することなく使用した。
【０１２７】
Ｎ−［４−（｛２−［［６−（１，３−ジオキソ−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−イソインドール−２−イル）ヘキシル］（２−｛４−［（メチルスルホニル）アミノ］フェニル｝エチル）アミノ］エチル｝オキシ）フェニル］メタンスルホンアミド
２−［６−（［２−（４−アミノフェニル）エチル］｛２−［（４−アミノフェニル）オキシ］エチル｝アミノ）ヘキシル］−１Ｈ−イソインドール−１，３（２Ｈ）−ジオン（１０８．３ｍｇ）をＤＣＭ（５ｍｌ）中に溶解させ、氷浴中で０〜４℃に冷却した。ヒューニッヒ塩基（０．２２７ｍｌ）を添加し、続いて塩化メシル（０．０５１ｍｌ）を滴加した。反応を０〜４℃で０．５時間維持し、次いで室温までゆっくりと温めた。３時間後、反応混合物を蒸発乾固させ、粗製のまま次のステップで使用した。
【０１２８】
２−［６−（［２−（４−アミノフェニル）エチル］｛２−［（４−アミノフェニル）オキシ］エチル｝アミノ）ヘキシル］−１Ｈ−イソインドール−１，３（２Ｈ）−ジオン  ２−［６−（［２−（４−ニトロフェニル）エチル］｛２−［（４−ニトロフェニル）オキシ］エチル｝アミノ）ヘキシル］−１Ｈ−イソインドール−１，３（２Ｈ）−ジオン（０．３５ｇ）を、エタノール（４０ｍｌ）、水（５ｍｌ）および酢酸（５ｍｌ）の混合物中に溶解させ、結果として得られる溶液を減圧下で脱気した。１０％炭素上パラジウム（５６％ペースト、０．２７ｇ）を添加し、結果として得られる混合物を水素雰囲気（大気圧）下で１２時間激しく撹拌した。反応混合物を、Ｃｅｌｉｔｅ（商標）を通して濾過し、エタノールで洗浄した。濾液および洗浄液を蒸発乾固させて標題化合物（０．３１３ｇ）を得、これをさらに精製することなく使用した。
【０１２９】
２−［６−（［２−（４−ニトロフェニル）エチル］｛２−［（４−ニトロフェニル）オキシ］エチル｝アミノ）ヘキシル］−１Ｈ−イソインドール−１，３（２Ｈ）−ジオン
［２−（４−ニトロフェニル）エチル］｛２−［（４−ニトロフェニル）オキシ］エチル｝アミン（２５３ｍｇ）および２−（６−ブロモヘキシル）−１Ｈ−イソインドール−１，３（２Ｈ）−ジオン（１１８６ｍｇ）をＤＭＦ（４ｍｌ）中に溶解させ、ＤＩＰＥＡ（０．６６５ｍｌ）を添加することにより塩基性化した。反応物を１２０時間撹拌した。反応混合物を蒸発乾固させ、残留物をＤＣＭ中に溶解させ、溶液をシリカのパッド上に吸収させ、シリカカードリッジ（１２ｇ）上、次の勾配で溶出して精製した：（Ａ＝ＤＣＭ、Ｂ＝メタノール）ｔ＝０分：Ｂ＝１０％；ｔ＝７．５分：Ｂ＝０％；ｔ＝２２．５分：Ｂ＝５％。所望の生成物は約１５％Ｂ（定組成）で溶出し、溶液を蒸発乾固させて、標題化合物（０．３６４ｇ）を得た。
【０１３０】
［２−（４−ニトロフェニル）エチル］｛２−［（４−ニトロフェニル）オキシ］エチル｝アミン
［［２−（４−ニトロフェニル）エチル］アミン（４９８．９ｍｇ）および１１１−［（２−ブロモエチル）オキシ］−４−ニトロベンゼン２−ブロモエチル４−ニトロフェニルエーテル（５１３ｍｇ）をＤＭＦ（５ｍｌ）中に２２℃で溶解させ、ＤＩＰＥＡ（０．８７２ｍｌ）を添加した。反応混合物を６０ｈ時間２２℃で放置し、蒸発乾固させ、残留物をＤＣＭ中に溶解させた。化合物をシリカ上に吸収させ、シリカカートリッジ（１２ｇ）上、２バッチで精製し、メタノール／ＤＣＭ勾配（０〜１５％）で溶出した。純粋な生成物を含むフラクションをプールし、溶媒を減圧下で除去した。結果として得られる標題化合物を濃黄色油状物として単離し、これは高真空下（２５３ｍｇ）で部分的に凝固した。
【０１３１】
結果
【表１】
2012515148.tif 000013
【０１３２】
参考例１は、化合物：
【化１１】
2012515148.tif 000014
【０１３３】
であり、これはWO9903101073（山之内製薬株式会社）において実施例３５として、ラセミ混合物として記載されている。
【０１３４】
中間体および実施例
概論
全ての温度は℃である。
【０１３５】
ＤＢＵは、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデク−７−エンを指す。
【０１３６】
ＤＣＭは、ジクロロメタンを指す。
【０１３７】
ＤＭＳＯはジメチルスルホキシドを指す。
【０１３８】
ＤＭＦはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを指す。
【０１３９】
ｄｐｐｆは、１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセンを指す。
【０１４０】
エーテルはジエチルエーテルを指す。
【０１４１】
ＨＰＬＣは高性能液体クロマトグラフィーを指す。
【０１４２】
ＩＰＡはプロパン−２−オールを指す。
【０１４３】
ｍＣＰＢＡはｍ−クロロ過安息香酸を指す。
【０１４４】
ｒ．ｔ．は室温を指す。
【０１４５】
ＴＢＭＥはｔ−ブチルメチルエーテルを指す。
【０１４６】
ＴＨＦはテトラヒドロフランを指す。
【０１４７】
１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、テトラメチルシランを基準として、Ｂｒｕｋｅｒ  ＤＰＸ  ４００ＭＨｚを用いて記録した。
【０１４８】
ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）を、Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８カラム（５０ｍｍ×２．１ｍｍ内径、１．７μｍ充填直径）上、４０摂氏度で実施し、アンモニア溶液（溶媒Ａ）およびアセトニトリル（溶媒Ｂ）を用いてｐＨ１０に調節した水中１０ｍＭ重炭酸アンモニウムで、次の溶出勾配を使用して溶出た：０〜１．５分  １〜９７％Ｂ、１．５〜１．９分  ９７％Ｂ、１．９〜２．０分  １００％Ｂ（流速１ｍｌ／分）。ＵＶ検出は、波長２１０ｎｍ〜３５０ｎｍの合計シグナルであった。質量スペクトルを、Waters ZQ Mass SpectrometerでAlternate-scan Positive and Negative Electrosprayを用いて記録した。イオン化データは、四捨五入して最も近い整数にした。
【０１４９】
ＬＣ／ＭＳ（方法Ｂ）は、Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８カラム（５０ｍｍ×２．１ｍｍ内径、１．７μｍ充填直径）上、４０摂氏度で実施し、０．１％ｖ／ｖ水中ギ酸溶液（溶媒Ａ）および０．１％ｖ／ｖアセトニトリル中ギ酸溶液（溶媒Ｂ）で次の溶出勾配を使用して溶出した：０〜１．５分  ３〜１００％Ｂ、１．５〜１．９分  １００％Ｂ、１．９〜２．０分  ３％Ｂ（流速１ｍｌ／分）。ＵＶ検出は、波長２１０ｎｍから３５０ｎｍの合計シグナルであった。質量スペクトルは、Waters ZQ Mass Spectrometerで、Alternate-scan Positive and Negative Electrosprayを用いて記録した。イオン化データは四捨五入して最も近い整数にした。
【０１５０】
シリカクロマトグラフィー技術には、自動化（Flashmaster）技術または充填済みカートリッジ（ＳＰＥ）または手動で充填されたフラッシュカラム上マニュアルクロマトグラフィーのいずれかが含まれる。
【０１５１】
商業的供給業者の名称を化合物または試薬の後に記載する場合（例えば「化合物Ｘ（Ａｌｄｒｉｃｈ）」または「化合物Ｘ／Ａｌｄｒｉｃｈ」）、これは、この化合物Ｘが記載した商業的供給業者などの商業的供給業者から入手可能であることを意味する。
【０１５２】
同様に、引例または特許文献を化合物名の後に記載する場合（例えば化合物Ｙ（EP 0 123 456))、これは、この化合物の調製法が記載した文献に記載されていることを意味する。
前記実施例の名称は、化合物命名プログラム「ＡＣＤ  Ｎａｍｅ  Ｐｒｏ  ６．０２」を用いて得られた。
【０１５３】
本発明の化合物は（３Ｒ，４Ｒ）絶対立体化学を有する。
【０１５４】
２，４−ジクロロ−５−ピリミジンカルボニルクロリド
【化１２】
2012515148.tif 000015
【０１５５】
２，４−ジヒドロキシピリミジン−５−カルボン酸（５０ｇ）および五塩化リン（２３９ｇ）のオキシ塩化リン（２３０ｍｌ）中溶液を１１５℃で一晩撹拌した。過剰のオキシ塩化リンを真空中で除去し、酢酸エチル（２００ｍｌ）を残留物に添加した。混合物を濾過し、濾液を濃縮して、黄色油状物（７８ｇ）を粗２，４−ジクロロ−５−ピリミジンカルボニルクロリドとして得、これをさらに精製することなく次のステップで使用した。
【０１５６】
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，  Ｄ６−ＤＭＳＯ）：  δＨ  ９．１３（１Ｈ，  ｓ）。
【０１５７】
２，４−ジクロロ−５−ピリミジンカルボキサミド
【化１３】
2012515148.tif 000016
【０１５８】
アンモニア（１４ｇ）の１，４−ジオキサン（５００ｍｌ）中溶液を、２，４−ジクロロ−５−ピリミジンカルボニルクロリド（７８ｇ、粗製）の１，４−ジオキサン（４００ｍｌ）中氷冷・撹拌溶液に窒素下で滴加した。氷浴をはずし、溶液を３０分間撹拌し、濃縮した。固体残留物を酢酸エチル（５００ｍｌ）と飽和水性重炭酸ナトリウム（５００ｍｌ）との間で分配し、有機物を飽和水性重炭酸ナトリウムで洗浄し（５００ｍｌ、×２）、続いて食塩水（３００ｍｌ）で洗浄した。有機相を乾燥し（硫酸ナトリウム）、濃縮して、黄色固体を得た。残留物にジエチルエーテル（５０ｍｌ）を添加し、結果として得られる懸濁液を超音波下で８分間処理し、次いで濾過した。残留物をエチルエーテル（５０ｍｌ）で洗浄して、標題化合物を白色固体（３０ｇ）として得た。
【０１５９】
ＭＳ：  ＭＨ＋  １９２
１Ｈ  ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ，  Ｄ６−ＤＭＳＯ）：  δＨ  ８．９０（１Ｈ，  ｓ），  ８．１９（１Ｈ，  ｓ），  ８．０７（１Ｈ，  ｓ）。
【０１６０】
２−クロロ−４−［（４−メチルフェニル）アミノ］−５−ピリミジンカルボキサミド
【化１４】
2012515148.tif 000017
ｐ−トルイジン（４６．９ｇ）のＤＭＦ（１００ｍｌ）中溶液を２，４−ジクロロ−５−ピリミジンカルボキサミド（８０ｇ）およびトリエチルアミン（６３．９ｍｌ）のＤＭＦ（３００ｍｌ）中溶液に氷冷しながら滴加した。混合物を２時間撹拌して、室温まで温め、次いで水（１ｌ）に添加し、２０分間撹拌した。スラリーを濾過し、固体を水で洗浄した。固体をメタノール（５００ｍｌ）とエーテル（５００ｍｌ）との混合物中に懸濁させ、２０分間撹拌し、濾過して、２−クロロ−４−［（４−メチルフェニル）アミノ］−５−ピリミジンカルボキサミドを淡黄色固体（９４．２ｇ）として得た。
【０１６１】
ＬＣＭＳ（方法Ｂ）：Ｒｔ  １．０２分、ＭＨ＋  ２６３／２６５。
【０１６２】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，  ＭｅＯＤ）：  δＨ  ８．６３（１Ｈ，  ｓ），  ７．５３（２Ｈ，  ｄ），  ７．１８（２Ｈ，  ｄ），  ２．３３（３Ｈ，  ｓ）。
【０１６３】
３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン  
【化１５】
2012515148.tif 000018
水酸化ナトリウム（１０Ｎ、１７４５ｍｌ）を４−ブロモテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン（１１３３．７ｇ）に添加し、混合物を撹拌しながら９０℃まで温め、約９０℃で２７時間撹拌した。混合物を常温まで冷却させ、１８００ｍｌの水性相を分離し、有機相の大半を集めた。残りの水性相＋少量の有機相および界面物質を水（２０ｍｌ）で洗浄し、濾過し、濾液を水酸化ナトリウム溶液（１０Ｎ、５ｍｌ）で洗浄した。有機相を分離し、物質の大半に添加して、３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン（２４２．２ｇ）を得た。
【０１６４】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δＨ  ５．８５（１Ｈ，  ｍ），  ５．７２（１Ｈ，  ｄ），  ４．１３（２Ｈ，  ｍ），  ３．７９（２Ｈ，  ｔ），  ２．１４（２Ｈ，  ｍ）。
【０１６５】
３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン  
【化１６】
2012515148.tif 000019
【０１６６】
テトラヒドロ−４−ピラノール（１００５．２ｇ）、ＤＣＭ（５５３０ｍｌ）およびトリエチルアミン（１６４０ｍｌ）を合し、１℃まで冷却した。塩化メシル（１２４３．８ｇ）を、冷却・撹拌された混合物に制御された方法で約２．５時間にわたって温度を１５℃より低く維持しながら添加した。塩化メシルをＤＣＭ（５００ｍｌ）中で洗浄し、反応を常温まで一晩温めた。混合物を水性塩化アンモニウム（約２ｌ、９．８％ｗ／ｗ）で処理し、５分間撹拌し、相を分離した。有機相を水性塩化アンモニウム（約２ｌ、９．８％ｗ／ｗ）、水（約２ｌ）で洗浄し、乾燥した（硫酸ナトリウム）。有機相を真空中で濃縮して（３９℃、約１５ミリバール）、油状物を得、これは放置すると急速に凝固した（１７３３．９ｇ）。この物質をゆっくりとＤＢＵ（約３００ｍｌ）で５２℃にて３０分にわたって処理し、溶液が形成し、これをＤＢＵ（１．７ｌ）で処理し、混合物を約１００℃（外温）まで１時間にわたって温め、この温度で２時間維持した。温度を１４８℃（外部）までゆっくりと上昇させ、集めた３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン（５２７．５ｇ）を蒸留した。
【０１６７】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δＨ  ５．８５（１Ｈ，  ｍ），  ５．７２（１Ｈ，  ｄ），  ４．１３（２Ｈ，  ｍ），  ３．７９（２Ｈ，  ｔ），  ２．１４（２Ｈ，  ｍ）。
【０１６８】
１，５：３，４−ジアンヒドロ−２−デオキシペンチトール  
【化１７】
2012515148.tif 000020
【０１６９】
１３℃でｍＣＰＢＡ（７１．１％、１５２４．２ｇ）のクロロホルム（４．２２ｌ）中懸濁液に３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン（５２６．５ｇ）を約２時間にわたって添加し、固体を、間隔を置いてクロロホルム（合計約１．５ｌ）で数回に分けて容器のネック部から洗い落とした。さらにクロロホルム（０．５ｌ）を添加し、反応混合物を１５℃で２．２５時間撹拌した。反応混合物を２０℃まで４０分にわたって温め、２０℃で一晩撹拌した。反応混合物を０℃まで冷却し、濾過し、固体を冷クロロホルム（３．５℃、１０５５ｍｌ）で洗浄した。合した濾液と洗浄液とを水性炭酸ナトリウム（２０％ｗ／ｗ、１５８２ｍｌ）で洗浄し、相を分離し、有機相を亜硫酸ナトリウム（１ｋｇ）で処理した。有機物を濾過し、真空中で濃縮（２５℃、１５０ミリバール）して、標題化合物（５０６ｇ）を得た。真空濃度からの溶媒を真空中で再濃縮して、標題化合物の第２部分（４１．２ｇ）を得た。
【０１７０】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，  Ｄ６−ＤＭＳＯ）：  δＨ  ３．９１（１Ｈ，  ｄ），  ３．７７（１Ｈ，  ｄ），  ３．３５−３．２９（３Ｈ，  ｍ  水により部分的に不明瞭），  ３．１５（１Ｈ，  ｓ），  １．８７（２Ｈ，  ｍ）。
【０１７１】
１，５−アンヒドロ−２，４−ジデオキシ−２−｛［（１Ｓ）−１−フェニルエチル］アミノ｝−Ｌ−トレオ−ペンチトール  
【化１８】
2012515148.tif 000021
方法１
１，５：３，４−ジアンヒドロ−２−デオキシペンチトール（５８９．２ｇ、９２．７％ｗ／ｗ）を［（１Ｓ）−１−フェニルエチル］アミン（６６０ｇ）およびイソプロパノール（５００ｍｌ）に添加した。さらにイソプロパノール（２８００ｍｌ）を添加し、混合物を６９℃まで温め、この温度で９６時間維持した。溶媒を真空中で蒸発させ、粗生成物をＴＢＭＥ（２６４０ｍｌ）でスラリー化した。混合物を濾過し、残留物をＴＢＭＥ（６６０ｍｌ）、ＴＢＭＥ／ヘプタン（１：１、６６０ｍｌ）、およびヘプタン（２×１３２０ｍｌ）で洗浄し、４０℃にて真空中で一晩乾燥して、標題化合物（２９７．５ｇ）を得た。ＴＢＭＥおよびＴＢＭＥ／ヘプタン洗浄液を合し、真空下で減じて乾固させた。残留物を温めながらＴＢＭＥ（９９０ｍｌ）中に溶解させ、溶液を３２℃まで冷却し、一晩回転させた。固体を濾過により単離し、ＴＢＭＥ（１３０ｍｌ）、ＴＢＭＥ／ヘプタン（１：１、１３０ｍｌ）、およびヘプタン（２×２６０ｍｌ）で洗浄した。固体を４０℃にて真空中、一晩乾燥して、標題化合物の第２収量（５８．６９ｇ）を得た。
【０１７２】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，  Ｄ６−ＤＭＳＯ）：  δＨ  ７．３４−７．２７（４Ｈ，  ｍ），  ７．１９（１Ｈ，  ｔ），  ４．８７（１Ｈ，  ｄ），  ３．８８（１Ｈ，  ｍ），  ３．６７（１Ｈ，  ｍ），  ３．３５−３．３０（２Ｈ，  ｍ，  水により部分的に不明瞭），  ３．２０（１Ｈ，  ｔ），  ２．７０（１Ｈ，  ｔ），  ２．２５（１Ｈ，  ｍ），  １．９２（１Ｈ，  ｓ），  １．７６（１Ｈ，  ｄｄ），  １．３８（１Ｈ，  ｍ），  １．２４（３Ｈ，  ｄ）。
【０１７３】
方法２
２−ブタノール（１．５ｍｌ）を、１，５：３，４−ジアンヒドロ−２−デオキシペンチトール（１．６８ｇ、９０．４％ｗ／ｗ）および［（１Ｓ）−１−フェニルエチル］アミン（２．０２ｇ）の混合物に添加し、反応を９０℃にて窒素下で２０時間加熱した。反応を７２℃まで冷却し、ヘプタン（１３．５ｍｌ）を３０分にわたって反応混合物に滴加した。加熱を停止し、反応を３４℃まで冷却させ、固体が生じなかったので、反応を４０℃まで再度温め、１，５−アンヒドロ−２，４−ジデオキシ−２−｛［（１Ｓ）−１−フェニルエチル］アミノ｝−Ｌ−トレオ−ペンチトールで播種した。結果として得られる懸濁液を３５℃で３０分間撹拌し、２３℃まで３０分にわたって冷却させ、この温度で２時間２５分間放置した。固体を濾過により集め、２−ブタノール／ヘプタン（１０％ｖ／ｖ、３ｍｌ）、次いでヘプタン（２×６ｍｌ）で洗浄した。固体を真空中、３５℃で乾燥して、標題化合物（１．１０ｇ）を得た。
【０１７４】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，  Ｄ６−ＤＭＳＯ）：  δＨ  ．３４−７．２７（４Ｈ，  ｍ），  ７．２０（１Ｈ，  ｔ），  ４．９２（１Ｈ，  ｄ），  ３．８８（１Ｈ，  ｍ），  ３．６７（１Ｈ，  ｍ），  ３．３６−３．２９（２Ｈ，  ｍ，  水により部分的に不明瞭），  ３．１９（１Ｈ，  ｔ），  ２．６９（１Ｈ，  ｔ），  ２．２４（１Ｈ，  ｍ），  １．９４（１Ｈ，  ｓ），  １．７６（１Ｈ，  ｄｄ），  １．３６（１Ｈ，  ｍ），  １．２３（３Ｈ，  ｄ）。
【０１７５】
１，５−アンヒドロ−２，４−ジデオキシ−２−｛［（１Ｒ）−１−フェニルエチル］アミノ｝−Ｌ−トレオ−ペンチトール  
【化１９】
2012515148.tif 000022
窒素下、−５〜０℃で撹拌した［（１Ｒ）−１−フェニルエチル］アミン（３．５ｍｌ）のＤＣＭ（２０ｍｌ）中溶液に、トリメチルアルミニウム（１４．６ｍｌ）のトルエン中溶液を３０分にわたって数回に分けて添加した。反応混合物を＜０℃で４０分間撹拌し、次いでピランエポキシド（７．７ｇ）のＤＣＭ（２０ｍｌ）中溶液を１０分にわたって添加した。氷冷しながら撹拌を５時間続け、反応を１５時間にわたって温めた。混合物を氷中で２．５℃まで冷却し、フッ化ナトリウム（５ｇ）を添加し、続いて水（３．２ｍｌ）を添加して、温度を２８℃まで上昇させ、次いで１５分で５℃まで降下させた。氷浴を外し、撹拌を１時間続けた。混合物を、セライトのパッドを通して濾過した。セライトをＤＣＭで洗浄した（３×約３０ｍｌ）。３回目の洗浄液を捨てるが、濾液の残りを濃縮して、無色油状物（６．０５ｇ）を得、これを結晶化させて、ワックス状固体を得た。このワックス状固体（５．９４ｇ）をエーテル（１０ｍｌ）で磨砕し、１時間放置した。結果として得られる白色固体を濾過して除去し、４０〜６０ガソリンで洗浄し、残留物をさらに４０〜６０ガソリンで磨砕した。濾液を蒸発させて、ガム状物（３．０４ｇ）を得、これに４０〜６０ガソリン（２５ｍｌ）を添加し、混合物を旋回させ、１時間放置した。ガソリンをデカントし、取っておく。結晶が形成し、これを３日後に濾過して除去して、１，５−アンヒドロ−２，４−ジデオキシ−２−｛［（１Ｒ）−１−フェニルエチル］アミノ｝−Ｌ−トレオ−ペンチトール（１０４ｍｇ）を得た。
【０１７６】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，  Ｄ６−ＤＭＳＯ）：  δＨ  ７．３４−７．２８（４Ｈ，  ｍ），  ７．２１（１Ｈ，  ｍ），  ４．８０（１Ｈ，  ｄ），  ３．８７（１Ｈ，  ｄｄ），  ３．７８（１Ｈ，  ｍ），  ３．７０（１Ｈ，  ｍ），  ３．３１−３．２２（２Ｈ，  ｍ，  ，  水により部分的に不明瞭）  ２．９２（１Ｈ，  ｍ），  ２．２１（１Ｈ，  ｍ），  ２．０６（１Ｈ，  ｍ），  １．７２（１Ｈ，  ｍ），  １．３２−１．２０（４Ｈ，  ｍ）。
【０１７７】
２−アミノ−１，５−アンヒドロ−２，４−ジデオキシ−Ｌ−トレオ−ペンチトール
【化２０】
2012515148.tif 000023
【０１７８】
方法１
１，５−アンヒドロ−２，４−ジデオキシ−２−｛［（１Ｓ）−１−フェニルエチル］アミノ｝−Ｌ−トレオ−ペンチトール（３４８．６ｇ）と木炭上水酸化パラジウム（２０％ｗ／ｗ、約５０％の水で湿らせる、３５ｇ）の混合物をエタノール（５２３０ｍｌ）中に懸濁させた。反応容器に水素（１５ｐｓｉ）を装入し、ベントし（×２）、次いで混合物を１５ｐｓｉの水素下、約２５℃で一晩水素化した。容器を窒素（×８）、次いで水素（×１）でパージし、１５ｐｓｉの水素下での水素化を約５時間続けた。容器を窒素（×５）、次いで水素（×１）でパージし、１５ｐｓｉの水素下での水素化を約１５時間続けた。反応物を、セライトを通して濾過し、次いで１ミクロンのＤｏｍｉｎｉｃｋ  Ｈｕｎｔｅｒを通して濾過した後、溶媒を真空中で蒸発させた。残留物を温めながらメタノール中に溶解させ、セライトを通して濾過し、次いで０．２ミクロンのＤｏｍｉｎｉｃｋ  Ｈｕｎｔｅｒを通して濾過した後、溶媒を真空中で蒸発させると、標題化合物が残った。この物質をさらに精製することなく使用した。
【０１７９】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，  Ｄ６−ＤＭＳＯ  ｉｎｃｌｕｄｅｓ）：  δＨ  ３．７６（１Ｈ，  ｄ），  ３．６９（１Ｈ，  ｄｄ），  ３．２６（１Ｈ，  ｔ），  ３．１４（１Ｈ，  ｍ），  ２．８５（１Ｈ，  ｔ），  ２．３９（１Ｈ，  ｍ），  １．７４（１Ｈ，  ｄｄ），  １．３６（１Ｈ，  ｍ）。
【０１８０】
方法２
１，５−アンヒドロ−２，４−ジデオキシ−２−｛［（１Ｓ）−１−フェニルエチル］アミノ｝−Ｌ−トレオ−ペンチトール（２５．５ｇ）のエタノール（５００ｍｌ）中溶液を２０％炭素上水酸化パラジウム（２．５ｇ）上で１８時間室温にて水素化した（１気圧）。触媒は、セライトカートリッジ（１０ｇ）を通して濾過することにより除去し、濾液を真空下で減じて乾固させて、標題化合物（１３．２６ｇ）を得た。
【０１８１】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，  Ｄ６−ＤＭＳＯ）：  δＨ  ３．７４（１Ｈ，  ｍ），  ３．６７（１Ｈ，  ｍ），  ３．２４，（１Ｈ，  ｍ），  ３．１３（１Ｈ，  ｍ），  ２．８４（１Ｈ，  ｍ），  ２．３８（１Ｈ，  ｍ），  １．７２（１Ｈ，  ｍ），  １．３４（１Ｈ，  ｍ）。
【０１８２】
旋光度：＋３４．２°、ｃ＝１（メタノール中、２４℃）。
【０１８３】
方法３
１，５−アンヒドロ−２，４−ジデオキシ−２−｛［（１Ｒ）−１−フェニルエチル］アミノ｝−Ｌ−トレオ−ペンチトール（８０ｍｇ）をメタノール（８ｍｌ）中に溶解させた。反応を、Ｈ−ｃｕｂｅ（商標）流通水素化（ｆｌｏｗ  ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｉｏｎ）（設定：５０℃、５０バール、１ｍｌ／分流速）を用いて炭素上水酸化パラジウム（２０％、ＣａｔＣａｒｔ  ３０）上で水素化した。結果として得られる溶液を窒素流下で減じて乾固させ、結果として得られる白色固体を真空中で乾燥して、２−アミノ−１，５−アンヒドロ−２，４−ジデオキシ−Ｌ−トレオ−ペンチトール（２１ｍｇ）を得た。
【０１８４】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，  Ｄ６−ＤＭＳＯ  ｉｎｃｌｕｄｅｓ）：  δＨ  ３．７６（１Ｈ，  ｍ），  ３．６９（１Ｈ，  ｍ），  ３．２６（１Ｈ，  ｍ），  ３．１５（１Ｈ，  ｍ），  ２．８５（１Ｈ，  ｍ），  ２．４０（１Ｈ，  ｍ），  １．７４（１Ｈ，  ｍ），  １．３５（１Ｈ，  ｍ）。
【０１８５】
旋光度：＋３１°、ｃ＝１．０１６（メタノール中、２５．２℃）。
【０１８６】
１，５−アンヒドロ−２，４−ジデオキシ−２−（｛［（１，１−ジメチルエチル）オキシ］カルボニル｝アミノ）−Ｌ−トレオ−ペンチトール
【化２１】
2012515148.tif 000024
【０１８７】
方法１
メタノール（１３００ｍｌ）中２−アミノ−１，５−アンヒドロ−２，４−ジデオキシ−Ｌ−トレオ−ペンチトール（約１８４ｇ）をトリエチルアミン（２２ｍｌ）で処理した。二炭酸ビス（１，１−ジメチルエチル）（３６９ｇ）をメタノール（５３０ｍｌ）中に溶解させ、混合物に３５分にわたって添加し、メタノール（３０ｍｌ）で洗浄した。反応を２０℃で約２１．５時間撹拌し、減圧下で濃縮した。ＴＢＭＥ（２８０ｍｌ）およびシクロヘキサン（２５２０ｍｌ）を残留物に添加し、混合物を２０℃で約２．５時間回転させた。結果として得られる固体を濾過により単離し、シクロヘキサンで洗浄した（２×７８０ｍｌ）。固体を３０〜３５℃、真空下で乾燥して、標題化合物を白色固体（３２５．７６ｇ）として得た。
【０１８８】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，  Ｄ６−ＤＭＳＯ）：  δＨ  ６．６０（１Ｈ，  ｂｄ），  ４．７７（１Ｈ，  ｄ），  ３．７２（２Ｈ，  ｍ），  ３．３９（１Ｈ，  ｍ），  ３．２６−３．１１（２Ｈ，  ｍ），  ２．８９（１Ｈ，  ｔ），  １．８２（１Ｈ，  ｍ），  １．３８（１０Ｈ，  ｍ）。
【０１８９】
方法２
２−アミノ−１，５−アンヒドロ−２，４−ジデオキシ−Ｌ−トレオ−ペンチトール（１３．２ｇ）をＴＢＭＥ（２２０ｍｌ）中に懸濁させた。トリエチルアミン（１．５７ｍｌ）および二炭酸ビス（１，１−ジメチルエチル）（２９．５ｇ）を添加し、混合物を一晩加熱還流した。シクロヘキサン（２２０ｍｌ）を反応に添加し、浴温を８５℃まで上昇させて、混合物を還流温度で保持した。反応混合物を３時間かけてゆっくりと室温まで冷却させ、次いで冷蔵庫中で２時間保持した。結晶を濾過し、冷シクロヘキサン／ＴＢＭＥ（１：１、２５ｍｌ）、シクロヘキサン（２５ｍｌ）で洗浄し、減圧下４０℃で乾燥して、標題化合物（１６．４４ｇ）を得た。標題化合物の第２収量を濾液から得た（０．４９５ｇ）。
【０１９０】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，  Ｄ６−ＤＭＳＯ）：  δＨ  ６．６４（１Ｈ，  ｄ），  ４．７９（１Ｈ，  ｄ），  ３．７５（１Ｈ，  ｍ），  ３．６９（１Ｈ，  ｄｄ），  ３．３８（１Ｈ，  ｍ），  ３．２６−３．１２（２Ｈ，  ｍ），  ２．８８（１Ｈ，  ｍ），  １．８２（１Ｈ，  ｍ），  １．４４−１．３５（１０Ｈ，  ｍ）．
旋光度：＋３１．３°、ｃ＝１（メタノール中、２３．７℃）。
【０１９１】
１，５−アンヒドロ−２，４−ジデオキシ−２−（｛［（１，１−ジメチルエチル）オキシ］カルボニル｝アミノ）−３−Ｏ−（メチルスルホニル）−Ｌ−トレオ−ペンチトール  
【化２２】
2012515148.tif 000025
【０１９２】
ＤＣＭ（１００ｍｌ）中メタンスルホニルクロリド（３０ｍｌ）を、１，５−アンヒドロ−２，４−ジデオキシ−２−（｛［（１，１−ジメチルエチル）オキシ］カルボニル｝アミノ）−Ｌ−トレオ−ペンチトール（７５ｇ）およびトリエチルアミン（５８ｍｌ）のＤＣＭ（９００ｍｌ）中溶液に０℃で滴加し、添加中、温度を３℃未満に維持した。混合物を３０分間撹拌し、２５℃まで温め、２時間撹拌した。反応混合物を水で洗浄し（２×１．４ｌ）、有機相を乾燥し、溶媒を蒸発させて、１，５−アンヒドロ−２，４−ジデオキシ−２−（｛［（１，１−ジメチルエチル）オキシ］カルボニル｝アミノ）−３−Ｏ−（メチルスルホニル）−Ｌ−トレオ−ペンチトール（１０３．１ｇ）を得た。
【０１９３】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δＨ  ５．０２（１Ｈ，  ｂｄ），  ４．７５（１Ｈ，  ｍ），  ４．０１（１Ｈ，  ｄｄ），  ３．８７（１Ｈ，  ｍ），  ３．７０−３．５７（２Ｈ，  ｍ），  ３．４６（１Ｈ，  ｍ），  ３．１０（３Ｈ，  ｓ），  ２．２０（１Ｈ，  ｍ），  １．９３（１Ｈ，  ｍ），  １．４５（９Ｈ，  ｓ）。
【０１９４】
［（３Ｒ，４Ｒ）−４−アジドテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３−イル］カルバミン酸１，１−ジメチルエチル  
【化２３】
2012515148.tif 000026
【０１９５】
酢酸ナトリウム（１２９ｇ）、アジ化ナトリウム（１０２ｇ）および１，５−アンヒドロ−２，４−ジデオキシ−２−（｛［（１，１−ジメチルエチル）オキシ］カルボニル｝アミノ）−３−Ｏ−（メチルスルホニル）−Ｌ−トレオ−ペンチトール（２３２ｇ）をＤＭＦ（１ｌ）中で混合し、そして９５℃で６時間撹拌し、加熱した。水（２ｌ）を添加し、混合物をよく混合し、酢酸エチル（１．５ｌ）を添加し、混合物を５分間撹拌した。相を分離し、水性相を酢酸エチル（１ｌ）で抽出し、合した有機相を水で洗浄し（２×２ｌ）、乾燥し、減じて真空中で乾固させて、［（３Ｒ，４Ｒ）−４−アジドテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３−イル］カルバミン酸１，１−ジメチルエチル（１５３ｇ）を得た。
【０１９６】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δＨ  ４．８４（１Ｈ，  ｂｄ），  ３．９２（２Ｈ，  ｍ），  ３．７６（１Ｈ，  ｍ），  ３．６３（２Ｈ，  ｍ），  ３．５２（１Ｈ，  ｍ），  １．９２（２Ｈ，  ｍ），  １．４６（９Ｈ，  ｓ）。
【０１９７】
１，５−アンヒドロ−２，４−ジデオキシ−２−（｛［（１，１−ジメチルエチル）オキシ］カルボニル｝アミノ）−３−Ｏ−（メチルスルホニル）−Ｌ−トレオ−ペンチトール
【化２４】
2012515148.tif 000027
【０１９８】
酸化白金および［（３Ｒ，４Ｒ）−４−アジドテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３−イル］カルバミン酸１，１−ジメチルエチル（４２ｇ）の混合物を窒素でパージし（×３）、エタノール（１ｌ）を添加した。容器を水素でパージし（×３）、水素を装入し、２０℃で冷却しながら４００ｒｐｍで撹拌し、３時間撹拌した。容器を窒素でパージし（×３）、水素を再充填し、さらに３．５時間撹拌した。容器を水素で１５ｐｓｉにてパージし、再充填し、一晩撹拌した。容器をパージし、再充填し、１．５時間撹拌した。混合物を、窒素雰囲気下でセライトを通して濾過し、フィルターケーキをエタノールで洗浄し（２×５００ｍｌ）、濾液を真空中で減じて乾固させて、［（３Ｒ，４Ｒ）−４−アミノテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３−イル］カルバミン酸１，１−ジメチルエチル（３８ｇ）を得た。
【０１９９】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δＨ  ５．００（１Ｈ，  ｄ），  ３．９０（１Ｈ，  ｍ），  ３．８１（１Ｈ，  ｍ），  ３．７４（１Ｈ，  ｍ），  ３．５０（１Ｈ，  ｄｄ），  ３．４４（１Ｈ，  ｍ），  ３．０２（１Ｈ，  ｍ），  １．７１（１Ｈ，  ｍ），  １．５２−１．４６（１０Ｈ，  ｍ）。
【０２００】
［（３Ｒ，４Ｒ）−４−（｛５−（アミノカルボニル）−４−［（４−メチルフェニル）アミノ］−２−ピリミジニル｝アミノ）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３−イル］カルバミン酸１，１−ジメチルエチル
【化２５】
2012515148.tif 000028
【０２０１】
［（３Ｒ，４Ｒ）−４−アミノテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３−イル］カルバミン酸１，１−ジメチルエチル（３８ｇ）、２−クロロ−４−［（４−メチルフェニル）アミノ］−５−ピリミジンカルボキサミド（４６．２ｇ）およびトリエチルアミン（４９．０ｍｌ）のＤＭＦ（２５０ｍｌ）中混合物を９０℃で加熱し、撹拌した。混合物を水（１ｌ）に添加し、析出した固体を濾過により集めた。沈殿物を水で洗浄し（２×２００ｍｌ）、一晩４０℃にて真空中で乾燥した。生成物を酢酸エチル（６００ｍｌ）中に懸濁させ、３０分間加熱還流し、氷中で５℃まで冷却し、そして生成物を濾過により集めた。これを酢酸エチルで洗浄し（２×１００ｍｌ）、４０℃にて真空中で乾燥して、［（３Ｒ，４Ｒ）−４−（｛５−（アミノカルボニル）−４−［（４−メチルフェニル）アミノ］−２−ピリミジニル｝アミノ）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３−イル］カルバミン酸１，１−ジメチルエチル（５３．０ｇ）を得た。
【０２０２】
ＬＣＭＳ（方法Ａ）：Ｒｔ  １．０５分、ＭＨ＋  ４４３。可変温度１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，  Ｄ６−ＤＭＳＯ，  １１９℃）：  δＨ  １１．２１（１Ｈ，  ｂｓ），  ８．５５（１Ｈ，  ｓ），  ７．５３（２Ｈ，  ｍ），  ７．１４（４Ｈ，  ｍ），  ６．５７（１Ｈ，  ｄ），  ６．０１（１Ｈ，  ｄ），  ４．２１（１Ｈ，  ｍ），  ３．９１−３．７８（３Ｈ，  ｍ），  ３．５１−３．４２（２Ｈ，  ｍ），  ２．３０（３Ｈ，  ｓ），  ２．００−１．８８（１Ｈ，  ｍ），  １．７４−１．６２（１Ｈ，  ｍ），  １．３７（９Ｈ，  ｓ）。
【０２０３】
実施例１  ２−｛［（３Ｒ，４Ｒ）−３−アミノテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル］アミノ｝−４−［（４−メチルフェニル）アミノ］−５−ピリミジンカルボキサミド
【化２６】
2012515148.tif 000029
【０２０４】
［（３Ｒ，４Ｒ）−４−（｛５−（アミノカルボニル）−４−［（４−メチルフェニル）アミノ］−２−ピリミジニル｝アミノ）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３−イル］カルバミン酸１，１−ジメチルエチル（５２．２ｇ）をイソプロパノール中塩化水素（５Ｍ、３００ｍｌ）およびエタノール（４００ｍｌ）の混合物に添加した。混合物を撹拌しながら加熱還流し、激しく撹拌しながら加熱を２４時間続けた。混合物を室温まで冷却させ、濾過し、固体をエタノール（１００ｍｌ）で洗浄し、真空中で乾燥した。粗生成物を水（９００ｍｌ）中に懸濁させ、加熱還流して、透明溶液を得た。溶液を水酸化ナトリウム溶液（２Ｍ、３００ｍｌ）で塩基性化し、氷中で冷却した。析出した生成物を濾過により集め、水で洗浄し（２×１００ｍｌ）、ベージュ色固体を真空オーブン中４０℃で２時間乾燥して、２−｛［（３Ｒ，４Ｒ）−３−アミノテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル］アミノ｝−４−［（４−メチルフェニル）アミノ］−５−ピリミジンカルボキサミドをベージュ色固体（３７．８ｇ）として得た。
【０２０５】
ＬＣＭＳ（方法Ａ）：Ｒｔ  ０．８５分、ＭＨ＋  ３４３
可変温度１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，  Ｄ６−ＤＭＳＯ，  １１９℃）：  δＨ  １１．２２（１Ｈ，  ｂｓ），  ８．５５（１Ｈ，  ｓ），  ７．５４（２Ｈ，  ｍ），  ７．１４（４Ｈ，  ｍ），  ６．５２（１Ｈ，  ｂｄ），  ４．０６（１Ｈ，  ｍ），  ３．８３（１Ｈ，  ｍ），  ３．７０（１Ｈ，  ｍ），  ３．５３（１Ｈ，  ｄ），  ３．４１（１Ｈ，  ｔ），  ２．９６（１Ｈ，  ｓ），  ２．３０（３Ｈ，  ｓ），  １．８９−１．６５（２Ｈ，  ｍ），  １．５０（２Ｈ，  ｓ）。
【０２０６】
２−｛［（３Ｒ，４Ｒ）−３−アミノテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル］アミノ｝−４−［（４−メチルフェニル）アミノ］−５−ピリミジンカルボキサミド（３７．８ｇ）をエタノール（１．２リットル）中で加熱還流した。熱溶液を、ガラス製シンター（ｓｃｉｎｔｅｒ）漏斗を通して濾過して、非溶解沈殿物を除去し、濾液を室温まで冷却させ、次いで氷中で５℃まで冷却し、固体結晶性生成物を濾過により集めて、２−｛［（３Ｒ，４Ｒ）−３−アミノテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル］アミノ｝−４−［（４−メチルフェニル）アミノ］−５−ピリミジンカルボキサミド（３６．６ｇ）を淡ベージュ色結晶性固体として得た。
【０２０７】
Ｘ’Ｃｅｌｅｒａｔｏｒ検出器を備えたＰＡＮａｌｙｔｉｃａｌ  Ｘ’Ｐｅｒｔ  Ｐｒｏ粉末回折計でＸＲＰＤデータを取得した。取得条件は次のとおりであった：放射線：Ｃｕ  Ｋα、発生器電圧：４０ｋＶ、発生器電流：４５ｍＡ、出発角：２．０°２θ、最終角：  ４０．０°２θ、ステップサイズ：０．０１６７°２θ。ステップあたりの時間は３１．７５０秒。数ミリグラムの試料をＳｉウェハ（ゼロバックグラウンド）プレート上に載せることにより試料を調製し、結果として粉末の薄層を得た。このようにして得られたスペクトルを図１に示す。
【手続補正書】
【提出日】平成23年9月13日(2011.9.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2012515148.tif 000034
の化合物またはその塩。
【請求項２】
２−｛［（３Ｒ，４Ｒ）−３−アミノテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル］アミノ｝−４−［（４−メチルフェニル）アミノ］−５−ピリミジンカルボキサミド；またはその塩である、請求項１記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項３】
請求項１もしくは請求項２記載の化合物またはその製薬上許容される塩。
【請求項４】
請求項１または２で定義される式（Ｉ）の化合物またはその塩を調製するための方法であって、式（ＩＩ）：
【化２】
2012515148.tif 000035
の化合物を式（ＩＩＩ）：
【化３】
2012515148.tif 000036
（式中、Ｐは保護基である）の化合物と反応させ、その後、保護基を除去することを含む方法。
【請求項５】
請求項３で定義される式（Ｉ）の化合物またはその製薬上許容される塩、および１以上の製薬上許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項６】
治療で使用するための、請求項３で定義される式（Ｉ）の化合物またはその製薬上許容される塩。
【請求項７】
Ｓｙｋキナーゼを阻害するための医薬の製造における、請求項３で定義される式（Ｉ）の化合物またはその製薬上許容される塩の使用。
【請求項８】
癌の治療で使用するための医薬の製造における、請求項３で定義される式（Ｉ）の化合物またはその製薬上許容される塩の使用。
【請求項９】
癌の治療で使用するための請求項３で定義される式（Ｉ）の化合物またはその製薬上許容される塩。
【請求項１０】
癌が、血液腫瘍、特に、小胞（ＦＬ）、マントル細胞、バーキットおよびびまん性大細胞型Ｂ細胞（ＤＬＢＣＬ）リンパ腫を含む非ホジキンリンパ腫から選択される、請求項９に記載の使用のための式（Ｉ）の化合物またはその製薬上許容される塩。
【請求項１１】
不適切な肥満細胞活性化と関連する疾患の治療で使用するための、請求項３で定義される式（Ｉ）の化合物またはその製薬上許容される塩。
【請求項１２】
炎症性またはアレルギー性障害の治療で使用するための、請求項３で定義される式（Ｉ）の化合物またはその製薬上許容される塩。
【請求項１３】
前記炎症性またはアレルギー性障害が、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、喘息、潰瘍性大腸炎、クローン病、気管支炎、結膜炎、乾癬、強皮症、蕁麻疹、皮膚炎およびアレルギー性鼻炎から選択される、請求項１２に記載の使用のための式（Ｉ）の化合物またはその製薬上許容される塩。
【請求項１４】
前記炎症性またはアレルギー性障害が蕁麻疹である、請求項１３で定義される使用のための式（Ｉ）の化合物またはその製薬上許容される塩。
【請求項１５】
別の種類の治療薬と組み合わせた、請求項３で定義される式（Ｉ）の化合物またはその製薬上許容される塩。
【国際調査報告】
2012515148.tif 000037
2012515148.tif 000038