(57)【要約】  サンプル中の細胞を検出するための物品（６１０）が提供される。この物品は、細胞抽出剤を含むヒドロゲル（６４０）を含む。使用方法も開示される。【選択図】図６Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の細胞を検出するための物品であって、前記物品は、開口部を備えたハウジング、サンプル取得装置、及び細胞抽出剤を含むヒドロゲルを含み、前記ハウジングは前記サンプル取得装置を受容するよう構成されている、物品。
【請求項２】
前記ヒドロゲルが前記ハウジング内に配置されている、請求項１に記載の物品。
【請求項３】
前記ヒドロゲルが前記サンプル取得装置内に配置されている、請求項１に記載の物品。
【請求項４】
前記サンプル取得装置が中空シャフトを含み、前記ヒドロゲルが前記中空シャフト内に配置されている、請求項３に記載の物品。
【請求項５】
前記サンプル取得装置が試薬チャンバを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の物品。
【請求項６】
前記試薬チャンバが検出試薬を含む、請求項５に記載の物品。
【請求項７】
前記検出試薬が、酵素、酵素基質、指示染料、ステイン、抗体、及びポリヌクレオチドからなる群から選択される、請求項６に記載の物品。
【請求項８】
前記検出試薬が、ＡＴＰを検出するための試薬を含む、請求項６又は７に記載の物品。
【請求項９】
前記検出試薬が、ルシフェラーゼ又はルシフェリンを含む、請求項８に記載の物品。
【請求項１０】
前記検出試薬が、アデニル酸キナーゼを検出するための試薬を含む、請求項６〜９のいずれか一項に記載の物品。
【請求項１１】
サンプル中の細胞を検出するための物品であって、前記物品は、サンプルを受容するよう構成されている開口部を備えたハウジング、試薬チャンバを含むサンプル取得装置、及び細胞抽出剤を含むヒドロゲルを含み、前記ヒドロゲルは前記試薬チャンバ内に配置されている、物品。
【請求項１２】
前記ヒドロゲルが成形ヒドロゲルである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の物品。
【請求項１３】
前記成形ヒドロゲルがビーズ、繊維、リボン又はシートである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ヒドロゲルが固体基材上にコーティングされている、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の物品。
【請求項１５】
前記固体基材が、ポリマーフィルム、繊維、不織布、セラミック粒子、及びポリマービーズからなる群から選択される、請求項１４に記載の物品。
【請求項１６】
前記細胞抽出剤が、四級アミン、ビグアニド、非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、フェノール類、細胞溶解性ペプチド、及び酵素からなる群から選択される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の物品。
【請求項１７】
前記細胞抽出剤が微生物細胞抽出剤である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の物品。
【請求項１８】
体細胞抽出剤を更に含む、請求項１７に記載の物品。
【請求項１９】
前記ハウジングが、前記ハウジング内にコンパートメントを形成する脆いバリアを更に含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の物品。
【請求項２０】
前記コンパートメントが検出試薬を含む、請求項１９に記載の物品。
【請求項２１】
前記検出試薬が、酵素、酵素基質、指示染料、ステイン、抗体、及びポリヌクレオチドからなる群から選択される、請求項２０に記載の物品。
【請求項２２】
前記検出試薬が、ＡＴＰを検出するための試薬を含む、請求項２０又は２１に記載の物品。
【請求項２３】
前記検出試薬が、ルシフェラーゼ又はルシフェリンを含む、請求項２２に記載の物品。
【請求項２４】
前記脆いバリアが前記ヒドロゲルを含む、請求項１９に記載の物品。
【請求項２５】
前記コンパートメントが前記ヒドロゲルを含む、請求項１８〜２３のいずれか一項に記載の物品。
【請求項２６】
前記ヒドロゲルが水膨潤ヒドロゲルを含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の物品。
【請求項２７】
サンプル中の細胞を検出するための物品であって、前記物品が、開口部を備えたハウジング、サンプル取得装置、及び少なくとも２つの種類のヒドロゲルを含み、前記ハウジングは前記サンプル取得装置を受容するよう構成されている、物品。
【請求項２８】
前記少なくとも２つのヒドロゲル種類のうち１つが、細胞抽出剤を含む、請求項２７に記載の物品。
【請求項２９】
前記２つのヒドロゲル種類のうち少なくとも１つが、検出試薬を含む、請求項２７又は２８に記載の物品。
【請求項３０】
前記検出試薬が、酵素、酵素基質、指示染料、ステイン、抗体、及びポリヌクレオチドからなる群から選択される、請求項２９に記載の物品。
【請求項３１】
前記検出試薬が、ＡＴＰを検出するための試薬を含む、請求項２９又は３０に記載の物品。
【請求項３２】
前記検出試薬が、ルシフェラーゼ又はルシフェリンを含む、請求項３１に記載の物品。
【請求項３３】
サンプル中の細胞を検出するための物品であって、前記物品は、サンプルを受容するよう構成されている開口部を備えたハウジング、細胞抽出剤を含むヒドロゲル、及び検出試薬を含み、前記ヒドロゲル及び前記検出試薬は前記ハウジング内に配置されている、物品。
【請求項３４】
前記ハウジングがコンパートメントを更に含む、請求項３３に記載の物品。
【請求項３５】
前記ヒドロゲル又は前記検出試薬が前記コンパートメント内に配置されている、請求項３４に記載の物品。
【請求項３６】
細胞抽出剤を含むヒドロゲルが配置された、サンプル取得装置。
【請求項３７】
前記細胞抽出剤が微生物細胞抽出剤を含む、請求項３６に記載のサンプル取得装置。
【請求項３８】
前記細胞抽出剤が体細胞抽出剤を含む、請求項３６に記載のサンプル取得装置。
【請求項３９】
検出試薬を含むヒドロゲルを含む、サンプル取得装置。
【請求項４０】
サンプルを受容するよう構成されている開口部を含むハウジング、細胞抽出剤を含むヒドロゲル、及び検出システムを含む、キット。
【請求項４１】
サンプル取得装置を更に含み、前記開口部が前記サンプル取得装置を受容するよう構成されている、請求項４０に記載のキット。
【請求項４２】
前記細胞抽出剤が微生物細胞抽出剤である、請求項４０又は４１に記載のキット。
【請求項４３】
体細胞抽出剤を更に含む、請求項４２に記載のキット。
【請求項４４】
細胞抽出剤を含むヒドロゲルと、細胞を含むことが疑われるサンプルとを提供する工程と、
前記サンプルと前記ヒドロゲルとを含む液体混合物を形成する工程と、
前記液体混合物中の分析物を検出する工程と、
を含む、サンプル中の細胞を検出する方法。
【請求項４５】
サンプル取得装置と、前記サンプル取得装置を受容するよう構成されている開口部を含むハウジングと、細胞抽出剤を内部に配置されて含むヒドロゲルとを提供する工程と、
前記サンプル取得装置でサンプル材料を取得する工程と、
前記サンプル材料と前記ヒドロゲルとを含む液体混合物を形成する工程と、
前記液体混合物中の分析物を検出する工程と、
を含む、サンプル中の細胞を検出する方法。
【請求項４６】
細胞抽出剤を含むヒドロゲルを含むサンプル取得装置と、前記サンプル取得装置を受容するよう構成されている開口部を含むハウジングとを提供する工程と、
前記サンプル取得装置でサンプル材料を取得する工程と、
前記サンプル材料と前記ヒドロゲルとを含む液体混合物を形成する工程と、
前記液体混合物中の分析物を検出する工程と、
を含む、サンプル中の細胞を検出する方法。
【請求項４７】
サンプル取得装置及びハウジングを提供する工程であって、前記ハウジングが、
前記サンプル取得装置を受容するよう構成された開口部と、
細胞抽出剤を含むヒドロゲルとを含む工程と、
前記サンプル取得装置でサンプル材料を取得する工程と、
前記サンプル材料と前記ヒドロゲルとを含む液体混合物を形成する工程と、
前記液体混合物中の分析物を検出する工程と、
を含む、サンプル中の細胞を検出する方法。
【請求項４８】
前記分析物の検出が、生きた細胞の存在を示すものである、請求項４４〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記分析物の検出が、検出システムの使用を含む、請求項４４〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
分析物の検出が、微生物細胞に関係する分析物を検出することを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
体細胞抽出剤を提供し、前記サンプルを前記体細胞抽出剤と接触させる工程を更に含む、請求項４４〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記分析物の検出が、前記分析物の量を定量化することを含む、請求項４４〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記分析物の量が、２回又はそれ以上定量化される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
第一時点で検出された前記分析物の量が、第二時点で検出された分析物の量と比較される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記分析物の検出が、細胞からのＡＴＰの検出を含む、請求項４４〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記ＡＴＰの検出が、微生物細胞からのＡＴＰの検出を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記ＡＴＰの検出が、細菌細胞からのＡＴＰの検出を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記分析物の検出が、前記分析物を免疫学的に検出することを含む、請求項４４〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記分析物の検出が、前記分析物を遺伝学的に検出することを含む、請求項４４〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記分析物の検出が、前記サンプル中の生きた細胞から放出された酵素を検出することを含む、請求項４４〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記分析物の検出が、比色法、蛍光法、又は発光法によって検出することを含む、請求項４４〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記ヒドロゲルを圧縮する工程を更に含む、請求項４４〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、米国特許仮出願第６１／１０１，５４６号及び同第６１／１０１，５６３号（両方とも２００８年９月３０日出願）の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
サンプル（例えば表面、水、空気など）内の生物学的分析物の存在を評価するのに使用することができる、さまざまな試験が利用可能である。そのような試験には、ホタルルシフェラーゼ反応を用いたＡＴＰ検出に基づく試験、比色計を用いたタンパク質検出に基づく試験、微生物培養技法を用いた微生物検出に基づく試験、及び免疫化学技法を用いた微生物検出に基づく試験が挙げられる。表面は、スワブ装置を用いて、又は寒天平板などの培養装置との直接接触によって、サンプル採取することができる。このサンプルは、生きた細胞の存在、特に生きた微生物の存在について分析することができる。
【０００３】
これらの試験結果はしばしば、表面の清浄さに関する判断に用いられる。例えば、試験を使用して、食品加工機器が、生産に使用するのに十分洗浄されているかどうかを判断することができる。上記の試験は、汚染した表面の検出には有用であるが、試験実施には数多くの工程が必要であり得、また生きた細胞及び死んだ細胞の存在を迅速及び／又は容易に区別できないことがあり、場合によっては、結果を判定できるまでに長い時間（例えば数時間又は数日）を必要とすることがある。
【０００４】
これらの試験は、生きた微生物の存在を示すのに使用され得る。そのような試験では、生きた細胞に伴う生物学的分析物（例えばＡＴＰ）を放出するために、細胞抽出剤が使用されることが多い。細胞外物質（例えば、死んだ又はストレスのかかった動物細胞、植物細胞、及び／又は微生物から環境中に放出された非細胞内ＡＴＰなど）の存在が、高い「バックグラウンド」濃度のＡＴＰを生じることがあり、これが生きた細胞の検出を複雑にし得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
生きた細胞を検出するために数多くの方法及び装置が利用可能であるが、生きた細胞、特に生きた微生物細胞の検出のための単純かつ信頼できる試験のニーズが依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
全般に、本開示は、サンプル内の生きた細胞を検出するための物品及び方法に関連する。この物品及び方法により、表面上の細菌などの細胞の存在を迅速に検出（例えば蛍光、化学発光、又は色反応などにより）することが可能になる。いくつかの実施形態において、本発明物品は「サンプルレディ」であり、すなわちこの物品は、サンプル中の生きた細胞を検出するために必要なすべての機能を含んでいる。いくつかの態様において、本発明の物品及び方法は、真核細胞（例えば植物細胞又は動物細胞）に関連する生物学的分析物（例えばＡＴＰ又は酵素）を、原核細胞（例えば細菌細胞）に関連する類似又は同一の生物学的分析物と区別するための手段を提供する。更に、本発明の物品及び方法は、環境中に遊離している生物学的分析物（すなわち、非細胞性の生物学的分析物）を、生きた細胞に関連する類似又は同一の生物学的分析物と区別するための手段を提供する。本開示の方法により、操作者は、サンプル、及び細胞抽出剤を含むヒドロゲルを含む液体混合物を即座に生成することが可能になる。いくつかの実施形態において、この方法は操作者に対し、液体混合物を生成した後、所定の時間内に、この混合物中の生物学的分析物の量を測定して、サンプル中の非細胞性生物学的分析物の量を決定する手段を提供する。いくつかの実施形態において、この方法は操作者に対し、有効量の細胞抽出剤がヒドロゲルから液体混合物中へ放出される所定の時間後に、生物学的分析物の量を測定して、サンプル中の非細胞性物質及び生きた細胞からの生物学的分析物の量を調べる手段を提供する。いくつかの実施形態において、この方法は操作者に対し、第一の所定時間以内に、生物学的分析物の量の第一測定を実施し、更に、有効量の細胞抽出剤がヒドロゲルから放出される第二の所定時間内に、生物学的分析物の量の第二測定を実施して、サンプル中の生きた細胞の存在を検出する手段を提供する。いくつかの実施形態において、この方法により操作者は、サンプル中の生物学的分析物が、生きた植物細胞又は動物細胞から放出されたものか、それとも生きた微生物細胞（例えば細菌）から放出されたものかどうかを区別することが可能になる。本発明は、食品調理サービス施設、医療環境などの、比較的厳しい現場環境において操作者が使用することができる。
【０００７】
一態様において、本開示は、サンプル中の細胞を検出するための物品を提供する。この物品は、ヒドロゲルを含む封入部を含むことができ、ここでこのヒドロゲルは細胞抽出剤を含む。
【０００８】
本開示の物品は、サンプル取得装置を含むことができ、ここでこのサンプル取得装置は封入部を含む。
【０００９】
本開示の物品は、ハウジングを含むことができ、ここでこのハウジングは封入部を含む。
【００１０】
別の一態様において、本開示は、細胞抽出剤を含むヒドロゲルが配置されたサンプル取得装置を提供する。
【００１１】
細胞抽出剤を含むヒドロゲルは、固体基材上にコーティングすることができる。
【００１２】
別の一態様において、本開示はキットを提供する。このキットはハウジングを含み得、このハウジングは、サンプル取得装置と、細胞抽出剤を含むヒドロゲルとを受容するよう構成された開口部を含む。所望により、このキットは、サンプル取得装置を更に含むことができる。
【００１３】
用語解説
本明細書で使用されるとき、「生物学的分析物」は、生物内に生じる、又は生物によって形成される、分子又はその誘導体を指す。例えば、生物学的分析物には、アミノ酸、核酸、ポリペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、脂質、リン脂質、糖、多糖、及びこれらの組み合わせのうちの少なくとも１つが含まれ得るが、これらに限定されない。生物学的分析物の具体的な例には、代謝産物（例えばブドウ球菌エンテロトキシン）、アレルゲン（例えばピーナッツアレルゲン）、ホルモン、毒素（例えばＢａｃｉｌｌｕｓ属下痢毒素、アフラトキシンなど）、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、全ＲＮＡ、ｔＲＮＡなど）、ＤＮＡ（例えばプラスミドＤＮＡ、植物ＤＮＡなど）、タグ付きタンパク質、抗体、抗原、及びこれらの組み合わせを挙げることができるが、これらに限定されない。
【００１４】
「サンプル取得装置」は本明細書では広義に使用され、液体、半固体、又は固体のサンプル物質を採取するのに使用される用具を指す。サンプル取得装置の非限定的な例には、スワブ、ワイプ、スポンジ、しゃくし、スパチュラ、ピペット、ピペット先端、及びサイフォンホースが挙げられる。
【００１５】
本明細書で使用されるとき、用語「ヒドロゲル」は、親水性であり、かつ極性溶媒によって膨潤しているか又は膨潤可能であるかのいずれかの、高分子材料を指す。ポリマー材料は、通常、極性溶媒と接触すると膨潤はするが溶解はしない。すなわち、ヒドロゲルは、極性溶媒に不溶性である。膨潤したヒドロゲルは、乾燥することで、極性溶媒の少なくとも一部を除去することができる。
【００１６】
本明細書で使用されるとき、「細胞抽出剤」は、細胞膜若しくは細胞壁の浸透性を改変するか、又は細胞（例えば体細胞若しくは微生物細胞）の膜及び／若しくは壁の一体性を（すなわち、溶解若しくは孔の形成により）破壊することにより、生きた細胞に通常見られる生物学的分析物の抽出又は放出をもたらすような、任意の化合物又は化合物の組み合わせを指す。
【００１７】
本明細書で使用されるとき、「検出システム」は、生物学的分析物を検出するのに使用される構成成分を指し、これには酵素、酵素基質、結合相手（例えば抗体又は受容体）、標識、染料、並びに吸光度若しくは反射率、蛍光、及び／又は発光（例えば生物発光若しくは化学発光）を検出するための装置が含まれる。
【００１８】
語句「好ましい」及び「好ましくは」は、特定の環境において特定の利益を供し得る発明の実施形態を示す。しかしながら、同じ又は他の状況下において、他の実施形態もまた好ましい可能性がある。更に、１つ以上の好ましい実施形態の詳細説明は、他の実施形態が有用でないことを示すものではなく、本発明の範囲内から他の実施形態を排除することを意図するものではない。
【００１９】
用語「含む」及びこの変形は、これらの用語が現れる説明及び請求項を制限する意図を持たない。
【００２０】
本明細書で使用するとき、「１つの（a）」、「１つの（an）」、「その（the）」、「少なくとも１つの」及び「１つ以上の」は、同じ意味で使用される。よって、例えば、「１つの（a）」検出試薬を含むハウジングとは、ハウジングが「１つ又は複数の」検出試薬を含み得ることを意味するものとして解釈することができる。
【００２１】
用語「及び／又は」は、挙げられた要素の１つ若しくはすべて、又は挙げられた要素のうちの任意の２つ以上の組み合わせを意味する。
【００２２】
また本明細書において、端点による数の範囲の列挙には、その範囲内に包含されるすべての数（例えば１〜５には、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５、など）が包含される。
【００２３】
上記の本発明の概要は、本発明の開示した実施形態それぞれ又はすべての実現形態を説明することを意図したものではない。以下の説明は、説明に役立つ実施形態をより詳細に例示する。本出願のいくつかの箇所で、実施例の一覧として説明を提供するが、実施例は各種組み合わせにて使用することが可能である。それぞれの事例において、列挙される一覧は代表的な群としてのみ与えられるのであって、限定的な一覧として解釈されるべきではない。
【００２４】
本発明は、以下に列挙される図面を参照して更に説明され、類似構造は、いくつかの図にわたって、類似番号によって参照される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ヒドロゲルが上に配置されたサンプル取得装置の一実施形態の側面図。
【図２】ヒドロゲルが入った封入部を含むサンプル取得装置の一実施形態の部分的断面図。
【図３】ヒドロゲルが中に配置されたハウジングの一実施形態の断面図。
【図４】脆弱シールを更に含む、図３のハウジングの断面図。
【図５】ヒドロゲル、脆弱シール、及び検出試薬を含む、ハウジングの一実施形態の断面図。
【図６Ａ】図５のハウジングを含む検出装置の一実施形態の断面図、及びサンプル取得装置がその中の第一位置に配置された側面図。
【図６Ｂ】同じサンプル取得装置がその中の第二位置に配置された状態の、図６Ａの検出装置の部分的断面図。
【図７】ハウジング、ヒドロゲルが間に配置された複数の脆弱シール、及びサンプル取得装置を含む、検出装置の一実施形態の部分的断面図。
【図８】ハウジング、ヒドロゲルを含むキャリア、及びサンプル取得装置を含む、検出装置の一実施形態の部分的断面図。
【図９】図８のキャリアの底面斜視図。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本明細書に引用されている特許、特許出願、政府出版物、政府規制、及び参照文献はすべて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。何らかの不一致がある場合は、定義を含めて本明細書の記述が優先される。
【００２７】
生物学的分析物は、サンプル中の生きた細胞など、生物学的物質の存在を検出するのに使用することができる。生物学的分析物は、それらが関与し得るさまざまな反応によって検出することができる（例えば結合反応、触媒反応など）。
【００２８】
化学発光反応は、流体中及び処理済み材料中の細胞（例えば細菌細胞）を検出するのに、さまざまな形態で使用することができる。本開示のいくつかの実施形態において、酵素ルシフェラーゼの存在下におけるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）とルシフェリンとの反応に基づく化学発光反応による光の生成は、生物学的分析物ＡＴＰを検出するための信号生成のための化学的根拠を提供する。ＡＴＰは、あらゆる微生物細胞を含め、生きているすべての細胞中に存在するため、この方法は、サンプル中の生きた細胞の数の、定量的又は準定量的評価を得るための迅速な分析を提供することができる。基礎となっている反応の性質、その発見の経緯、及び適用性の一般分野に関する初期の論説は、Ｅ．Ｎ．Ｈａｒｖｅｙ（１９５７）、Ａ  Ｈｉｓｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ：Ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｅａｒｌｉｅｓｔ  Ｔｉｍｅｓ  Ｕｎｔｉｌ  １９００、Ａｍｅｒ．Ｐｈｉｌ．Ｓｏｃ．、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、Ｐａ．及びＷ．Ｄ．ＭｃＥｌｒｏｙ  ａｎｄ  Ｂ．Ｌ．Ｓｔｒｅｈｌｅｒ（１９４９）、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２２：４２０〜４３３に記載されている。
【００２９】
細菌及びその他の微生物種はある程度のＡＴＰを含んでいるため、ＡＴＰ検出は、細菌及びその他の微生物種を検出するのに信頼性の高い手段である。ＡＴＰから得られる化学結合エネルギーは、ホタルＰｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓの尾部で起こる生物発光反応に利用されている。この反応の生化学的構成成分はＡＴＰを含まずに分離することができ、これを他の供給源のＡＴＰを検出するのに使用することができる。このホタルの生物発光反応のメカニズムは、十分に特性付けられている（ＤｅＬｕｃａ，Ｍ．ら、１９７９  Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９５：１９４〜１９８）。
【００３０】
本開示の発明物品及び方法は、生きた細胞からの生物学的分析物の放出を好都合に制御するための単純な方法を提供し、これにより、未知のサンプル中の生きた細胞の存在、所望によりその種類（例えば微生物か非微生物か）及び所望によりその量を調べることができる。この物品及び方法には、細胞抽出剤を含むヒドロゲルが含まれる。本発明の方法は、米国特許出願第６１／１０１，５６３号「ＢＩＯＤＥＴＥＣＴＩＯＮ  ＭＥＴＨＯＤＳ」（２００８年９月３０日出願）に開示されており、この全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００３１】
ヒドロゲル
本開示の物品には、ヒドロゲルが含まれる。好適なヒドロゲルには、架橋ヒドロゲル、膨潤ヒドロゲル、及び乾燥又は部分的に乾燥したヒドロゲルが挙げられる。
【００３２】
本開示の好適なヒドロゲルには、例えば、ヒドロゲル、及びそのヒドロゲルから製造されるポリマービーズが挙げられ、これらはＰＣＴ国際公開特許公報第ＷＯ  ２００７／１４６７２２号に記述されており、この全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００３３】
その他の好適なヒドロゲルには、エチレン性不飽和カルボキシル含有モノマーと、カルボン酸、ビニルスルホン酸、セルロースモノマー、ポリビニルアルコールから選択されるコモノマーとを含む、ポリマー（米国特許出願公開第ＵＳ２００４／０１５７９７１号に記載）；でんぷん、セルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレングリコール、及びこれらのコポリマーを含むポリマー（米国特許出願公開第ＵＳ  ２００６／００６２８５４号に記載）；分子量２０００ダルトン未満の、多官能基ポリ（アルキレンオキシド）のフリーラジカル重合性マクロモノマーを含むポリマー（米国特許第７，００５，１４３号に記載）；液体媒体にさらされると架橋するシラン官能化ポリエチレンオキシドを含むポリマー（米国特許第６，９６７，２６１号に記載）；ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、及びプロピレングリコールから選択される少なくとも１つのアルコールを伴うポリウレタンプレポリマーを含むポリマー（米国特許第６，８６１，０６７号に記載）；多糖類、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリウレタン、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、コラーゲン及びゼラチンから選択される親水性ポリマーを含むポリマー（米国特許第６，６６９，９８１号に記載）が挙げられ、これらの開示はすべてその全体が参照により本明細書に組み込まれる。その他の好適なヒドロゲルには、寒天、アガロース、ポリアクリルアミドヒドロゲル、及びこれらの誘導体が挙げられる。
【００３４】
本開示は、成形ヒドロゲルを含む物品及び方法を提供する。成形ヒドロゲルには、例えば、ビーズ、シート、リボン、及び繊維に成形したヒドロゲルが挙げられる。成形ヒドロゲルの更なる例、及び成形ヒドロゲルを製造することができる代表的なプロセスは、米国特許出願公開第２００８／０２０７７９４  Ａ１号、「ＰＯＬＹＭＥＲＩＣ  ＦＩＢＥＲＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＭＡＫＩＮＧ」及び米国特許出願第６１／０１３，０８５号、「ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＭＡＫＩＮＧ  ＳＨＡＰＥＤ  ＰＯＬＹＭＥＲＩＣ  ＭＡＴＥＲＩＡＬＳ」に開示されており、これらは両方ともその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００３５】
本開示のヒドロゲルは、細胞抽出剤を含み得る。細胞抽出剤を含むヒドロゲルは、２つの基本的プロセスで製造することができる。第一のプロセスでは、細胞抽出剤が、ヒドロゲルポリマーの合成中にヒドロゲル内に組み込まれる。第一のプロセスの例は、ＰＣＴ国際公開特許公報第ＷＯ  ２００７／１４６７２２号、及び本明細書に記述されている調製例１に見出すことができる。第二のプロセスでは、細胞抽出剤が、ヒドロゲルポリマーの合成後にヒドロゲル内に組み込まれる。例えば、ヒドロゲルを細胞抽出剤の溶液に入れ、細胞抽出剤をヒドロゲルに吸収及び／又は吸着させる。第二のプロセスの例は、後述の調製例５に記述されている。第二のプロセスの更なる例は、ヒドロゲルにイオン性モノマーを組み込む、例えばカチオン性モノマーをヒドロゲル内に組み込むことである（本明細書の調製例２に記述）。
【００３６】
本開示のヒドロゲルは、酵素又は酵素基質などの検出試薬系を含み得る。そのようなヒドロゲルは、検出試薬を保存、及び／又はサンプル中の生きた細胞検出のためにサンプルと細胞抽出剤とを含む液体混合物に対して送達するのに、便利に使用することができる。
【００３７】
ヒドロゲルポリマーの合成中に、酵素をヒドロゲル内に組み込むことができる。例えば、後述の調製例４に記載されているように、ポリマーの合成中にヒドロゲルにルシフェラーゼを組み込むことができる。ヒドロゲルの合成後に、酵素をヒドロゲル内に組み込むことができる。例えば、後述の調製例８に記載されているように、ヒドロゲルにルシフェラーゼを組み込むことができる。
【００３８】
ヒドロゲルポリマーの合成中に、酵素基質をヒドロゲル内に組み込むことができる。例えば、後述の調製例３に記載されているように、ポリマーの合成中にヒドロゲルにルシフェリンを組み込むことができる。ヒドロゲルの合成後に、酵素基質をヒドロゲルに組み込むことができる。例えば、後述の調製例７に記載されているように、ヒドロゲルにルシフェリンを組み込むことができる。
【００３９】
酵素などのタンパク質を、ヒドロゲルに組み込むことができる。例えば、ヒドロゲルの合成中にヒドロゲルに酵素（ルシフェラーゼ）を組み込む例は、後述の調製例４に記述されている。タンパク質はヒドロゲルポリマー合成中にヒドロゲルに組み込むことができるものの、重合プロセスに使用される化学物質及び／又はプロセス（例えば紫外線硬化プロセス）は、特定のタンパク質（例えば、特定の酵素、又は抗体などの結合タンパク質）によりいくらかの生物活性を損う可能性がある。タンパク質は、後述の調製例８に記載されているように、ヒドロゲル合成後にヒドロゲルに組み込むこともできる。ヒドロゲルの合成後にヒドロゲルにタンパク質を組み込むと、タンパク質の生物活性の保持改善がもたらされ得る。
【００４０】
いくつかの用途においては、細胞抽出剤又は検出試薬を含むヒドロゲルが、乾燥状態又は部分的乾燥状態であることが望ましい場合がある。例えば、蒸発プロセス、熱対流炉、電子レンジ、及び真空炉内での乾燥、並びに凍結乾燥などの、当業者に既知の方法によって、膨潤ヒドロゲルを乾燥させることができる。この乾燥したヒドロゲルを液体又は水溶液にさらすと、細胞抽出剤又は検出試薬がヒドロゲルから拡散し得る。細胞抽出剤又は検出試薬は、液体又は水溶液にさらされるまでは、ビーズ内で本質的に休止状態に留まっていることができる。すなわち、細胞抽出剤は、ビーズが液体にさらされるまで、この乾燥ヒドロゲル内に保存されることができる。これにより、不要時に細胞抽出剤又は検出試薬の無駄や損失を防ぐことができ、加水分解、酸化、又はその他のメカニズムによって劣化する可能性がある、数多くの感湿性の細胞抽出剤又は検出試薬の安定性を改善することができる。
【００４１】
細胞抽出剤
本開示のヒドロゲルは、細胞抽出剤を含み得る。化学的細胞抽出剤には、タンパク質（例えば細胞溶解性ペプチド及び酵素）などの生化学物質が含まれる。いくつかの実施形態において、細胞抽出剤は細胞の浸透性を高め、これにより細胞の内部からの生物学的分析物の放出を起こす。いくつかの実施形態において、細胞抽出剤は、細胞の溶解（例えば破裂又は部分的破裂）を起こすか又は促進することができる。
【００４２】
細胞抽出剤には、当該技術分野において既知のさまざまな化学物質及び化学物質混合物が挙げられ、例えば、界面活性剤及び第四級アミン、ビグアニド、界面活性剤、フェノール類、細胞溶解性ペプチド、並びに酵素が挙げられる。典型的に、細胞抽出剤はヒドロゲルに対して強くは結合せず（共有結合的にも非共有結合的にも）、ヒドロゲルが水性液体に接触するとヒドロゲルから出て拡散することができる。いくつかの実施形態において、ヒドロゲルが生成される前駆体組成物には、例えばＰＣＴ国際公開特許ＷＯ  ２００７／１４６７２２号（参照により本明細書に組み込まれる）に記述されているアニオン性又はカチオン性モノマーが含まれ得、これはヒドロゲルに組み込まれ、これにより細胞抽出剤の活性を保つことができる。いくつかの実施形態において、アニオン性又はカチオン性モノマーは、ヒドロゲルの表面に架橋され得る。ヒドロゲルのビーズ又は繊維をカチオン性モノマーの溶液に短時間浸してからすぐに取り出し、化学線（例えば紫外線、電子線）を使用して架橋させることができる。これにより、カチオン性モノマーが、ヒドロゲルのビーズ又は繊維の外表面に化学的に結合することになる。
【００４３】
界面活性剤は、一般に、親水基及び疎水基の両方を含有する。ヒドロゲルは、アニオン性、非イオン性、カチオン性、両性（ampholytic）、両性（amphoteric）及び双極性界面活性剤、並びにこれらの混合物から選択される１つ以上の界面活性剤を含有し得る。水中で解離し、カチオン及びアニオンを放出する界面活性剤は、イオン性と称される。存在する場合には、両性（ampholytic）、両性（amphoteric）及び双極性界面活性剤は、一般に、１つ以上のアニオン性及び／又は非イオン性界面活性剤と組み合わせて使用される。好適な界面活性剤及び第四級アミンの非限定的な例には、ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（ＮＰ−４０）、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ、サルコシル、Ｔｗｅｅｎ、ＳＤＳ、Ｉｇｅｐａｌ、サポニン、ＣＨＡＰＳＯ、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、「セトリミド」（ドデシル−、テトラデシル−、及びヘキサデシル−トリメチルアンモニウムブロミドの混合物）、塩化セチルピリジウム、メタ（アクリルアミドアルキルトリメチルアンモニウム塩（例えば３−メタクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウムクロリド、及び３−アクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウムクロリド）、並びに（メタ）アクリロキシアルキルトリメチルアンモニウム塩（例えば２−アクリロキシエチルトリメチルアンモニウムクロリド、２−メタクリロキシエチルトリメチルアンモニウムクロリド、３−メタクリロキシ−２−ヒドロキシプロピルトリメチルアンモニウムクロリド、３−アクリロキシ−２−ヒドロキシプロピルトリメチルアンモニウムクロリド、及び２−アクリロキシエチルトリメチルアンモニウムメチル硫酸塩）が挙げられる。他の好適なモノマーの第四級アミノ塩には、ジメチルアルキルアンモニウム基として、アルキル基が２〜２２個の炭素原子又は２〜２０個の炭素原子を有するものが挙げられる。すなわち、モノマーは式−Ｎ（ＣＨ３）２（ＣｎＨ２ｎ＋１）＋の基を含み、式中、ｎは２〜２２の値を有する整数である。代表的なモノマーには、以下の式のモノマーが挙げられるが、これらに限定されない。
【化１】
2012503988.tif 000003
式中、ｎは２〜２２の範囲の整数である。
【００４４】
好適なビグアニド（ビス−ビグアニドを含む）の非限定的な例には、ポリヘキサメチレンビグアニド塩酸塩、ｐ−クロロフェニルビグアニド、４−クロロ−ベンズヒドリルビグアニド、アレキシジン、ハロゲン化ヘキシジン（例えばクロルヘキシジン（１，１’−ヘキサメチレン−ビス−５−（４−クロロフェニルビグアニド）を含むがこれに限定されない）、及びこれらの塩が挙げられる。
【００４５】
好適なフェノール類の非限定的な例には、フェノール、サリチル酸、２−フェニルフェノール、４−ｔ−アミルフェノール、
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、ヘキサクロロフェン、４−クロロ−３，５−ジメチルフェノール（ＰＣＭＸ）、２−ベンジル−４−クロロフェノール、トリクロサン、ブチル化ヒドロキシトルエン、２−イソプロピル−５−メチルフェノール、４−ノニルフェノール、キシレノール、ビスフェノールＡ、
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、並びにフェノチアジン類（クロルプロマジン、プロクロルペラジン、及びチオリジジンなど）が挙げられる。
【００４６】
好適な細胞溶解性ペプチドの非限定的例には、Ａ−２３１８７（カルシウムイオノフォア）、デルマセプチン、リステリオリシン（Listerolysin）、レナレキシン、アエロリシン、デルマトキシン、マクラチン、ラナテウリン（Ranateurin）、アンホテリシンＢ、動物毒液由来の直接溶解因子、マガイニン、ルゴシン（Rugosin）、アスカフィン（Ascaphin）、ジフテリア毒素、マキシミン（Maxymin）、サポニン、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属溶血素、ジスチンクチン（Distinctin）、メリチン、黄色ブドウ球菌毒素（α、β、χ、δ）、アラメシチン、エスクレチン、メトリジオリシン、ストレプトリシンＯ、アポリポタンパク質、フィリピン（Filipin）、ニゲリシン、ストレプトリシンＳ、ＡＴＰトランスロカーゼ、ガエグリン、ナイスタチン、シネキシン、ボンビニン、ＧＡＬＡ、オセラチン、スルファクチン、ブレビニン、グラミシジン、Ｐ２５、ツブリン、ブフォリン、らせん構造赤血球溶解ペプチド、パルストリン、バリノマイシン、カエリン、溶血素、ホスホリパーゼ類、ビブリオリシン、セレオリシン、イオノマイシン、フィロキシン、コリシン類、ＫＡＬＡ、ポリエン抗生物質、デルマジスチンクチン、ＬＡＧＡ、ポリミキシンＢが挙げられる。
【００４７】
好適な酵素の非限定的な例には、リゾチーム、リソスタフィン、バクテリオファージ溶解素、アクロモペプチダーゼ、ラビアーゼ、ムタノリジン、ストレプトリジン、テタノリジン、ａ−ヘモリジン、リチカーゼ、菌類由来の溶解酵素、セルラーゼ、ペクチナーゼ、Ｄｒｉｓｅｌａｓｅ（登録商標）、Ｖｉｓｃｏｚｙｍｅ（登録商標）Ｌ、ペクトリアーゼが挙げられる。
【００４８】
いくつかの実施形態において、細胞抽出剤のさまざまな組み合わせが、前駆体組成物（これからヒドロゲルが合成される）中、又はソルビン酸塩（ヒドロゲルの合成後にヒドロゲル内に搭載される）中に使用できる。前駆体組成物又はその結果として生じるヒドロゲルと相溶する任意の他の既知の細胞抽出剤を用いることができる。これらのものとしては、クロルヘキシジン塩、例えば、グルコン酸クロルヘキシジン（ＣＨＧ）、パラクロロメタキシレノール（ＰＣＭＸ）、トリクロサン、ヘキサクロロフェン、グリセリン及びプロピレングリコールの脂肪酸モノエステル及びモノエーテル、例えばモノラウリン酸グリセロール、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、モノカプリル酸グリセロール、モノカプリン酸グリセロール、モノラウリン酸プロピレングリコール、モノカプリル酸プロピレングリコール、モノカプリン酸プロピレングリコール、（Ｃ１２〜Ｃ２２）疎水性物質及び四級アンモニウム基又はプロトン化三級アミノ基を含むフェノール類、界面活性剤及びポリマー、四級シラン及びポリ四級アミンのような四級アミノ含有化合物、例えば、ポリヘキサメチレンビグアニド、遷移金属イオン、例えば銅含有化合物、亜鉛含有化合物、及び銀含有化合物、例えば、金属銀、銀塩、例えば、塩化銀、酸化銀、及びスルファジアジン銀、メチルパラベン類、エチルパラベン類、プロピルパラベン類、ブチルパラベン類、オクテニデン、２−ブロモ−２−ニトロプロパン−１，３ジオール、又は上記の任意の２つ以上の混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４９】
好適な細胞抽出剤には更に、ジアルキルアンモニウム塩（Ｎ−（ｎ−ドデシル）−ジエタノールアミンなど）；カチオン性エトキシル化アミン類（「Ｇｅｎａｍｉｎｏｘ  Ｋ−１０」、Ｇｅｎａｍｉｎｏｘ  Ｋ−１２、「Ｇｅｎａｍｉｎ  ＴＣＬ０３０」、及び「Ｇｅｎａｍｉｎ  Ｃ１００」など）；アミジン類（プロパミジン及びジブロモプロパミジンなど）；ペプチド抗生物質（ポリミキシンＢ及びナイシンなど）；ポリエン抗生物質（ナイスタチン、アンホテリシンＢ、及びナタマイシンなど）；イミダゾール類（エコナゾール、クロトラミゾール及びミコナゾールなど）；酸化剤（安定な形態の塩素及びヨウ素など）；並びに米国特許第７，４２２，８６８号（この全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記述されている細胞抽出剤が挙げられる。
【００５０】
細胞抽出剤は、本発明の検出システム（例えばルシフェラーゼ酵素などの検出試薬）を不活性化しないよう選択されるのが好ましい。強い細胞抽出剤（例えばイオン性洗剤など）を必要とする微生物については、改善された検出システム（例えば、これら試薬の存在下で強化された安定性を示すルシフェラーゼなどで、これらは米国特許出願第２００３／０１０４５０７号に開示されているものが挙げられ、この全体が参照により本明細書に組み込まれる）が特に好ましい。
【００５１】
本発明の方法は、ヒドロゲルから有効量の細胞抽出剤を放出させることにより、生きた細胞からの生物学的分析物の放出を起こす。本開示には、当該技術分野において既知のさまざまな細胞抽出剤が含まれ、これらそれぞれは、ヒドロゲルから異なる速度で放出され得、かつ、他とは異なる濃度で生きた細胞に対して影響を及ぼし得る。以下は、細胞抽出剤の選択、及びヒドロゲル中に含める有効量の決定の際に、考慮すべき要素に関するガイダンスを提供する。
【００５２】
どの細胞抽出剤の有効性も、濃度及び曝露時間という主に２つの要素によって決定されることは、当該技術分野において既知である。すなわち、一般に、細胞抽出剤の濃度が高いほど、生きた細胞にもたらす効果（例えば、細胞膜の浸透化及び／又は細胞からの生物学的分析物の放出）は大きくなる。更に、任意の所定濃度の細胞抽出剤において、一般に、細胞抽出剤に生きた細胞をさらす時間が長いほど、細胞抽出剤の効果は大きくなる。他の付帯的な要素（例えばｐＨ、共溶媒、イオン強度、及び温度）は、特定の細胞抽出剤の有効性に影響を与えることが当該技術分野において既知である。これらの付帯的要素は、例えば、温度制御器、緩衝液、サンプル調製などによって制御できることが知られている。これらの要素並びに細胞抽出剤は、生物学的分析物の検出に使用される検出システムに対して影響を与えることもできる。いくつかの単純な実験を実施することによって、本開示の物品を生成し本開示の方法を実行するのに有効な量の細胞抽出剤を決定することは、当業者の把握する領域内である。更なるガイダンスが、本明細書の実施例において提供される。
【００５３】
細胞及び／又は検出システムに対する、さまざまな濃度の細胞抽出剤の効果を判定するための初期実験を実施することができる。最初に、細胞抽出剤を含むヒドロゲルは、生物学的分析物検出システムに対する影響に関してスクリーニングを行うことができる。例えば、ヒドロゲルは、本明細書の実施例１９に記述されているものに類似のＡＴＰアッセイ（細菌細胞なし）にかけることができる。このアッセイを試薬等級ＡＴＰ溶液（例えば約０．１〜約１００ピコモルのＡＴＰ）で実行することができ、ヒドロゲルを伴うサンプル中のルシフェラーゼ反応によって発光する生物発光量を、ヒドロゲルのないサンプルによって発光する生物発光量と比較することができる。好ましくは、ヒドロゲルを伴うサンプル中の生物発光量は、ヒドロゲルのないサンプル中の生物発光量の５０％を超える。より好ましくは、ヒドロゲルを伴うサンプル中の生物発光量は、ヒドロゲルのないサンプル中の生物発光量の９０％を超える。最も好ましくは、ヒドロゲルを伴うサンプル中の生物発光量は、ヒドロゲルのないサンプル中の生物発光量の９５％を超える。
【００５４】
加えて、細胞からの生物学的分析物の放出に対するヒドロゲルの効果は、実施例１９に記述されているように、実験によって決定することができる。例えば、細胞（例えば黄色ブドウ球菌などの微生物細胞）の懸濁液を、比較的幅広い範囲の濃度の細胞抽出剤（例えばＢＡＲＤＡＣ  ２０５Ｍ）に、検出システムの存在下で、一定時間（例えば数分以内）さらすことにより、細胞からの生物学的分析物を検出することができる（例えば、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、及びｐＨ約７．６〜７．８の緩衝液を含むＡＴＰ検出システム）。この生物学的分析物を定期的に測定し、第一測定は通常、細胞抽出剤を混合液に加えた直後に行い、これにより、細胞からの生物学的分析物（この例ではＡＴＰ）の放出が検出できるかどうかを調べることができる。この結果は、その細胞から放出される生物学的分析物を検出するための最適条件（すなわち、細胞抽出剤の液体濃度及び曝露時間）を示すことができる。表２４に示すように、この結果は、より高い細胞抽出剤の濃度で、細胞抽出剤は効果が低くなることがあり、及び／又は検出システムに干渉することがある（すなわち、検出試薬によって発生した光又は色を吸収することがある）ことも示し得る。
【００５５】
液体混合物中の細胞抽出剤の有効量を決定した後、本明細書に記述されている方法によってヒドロゲルに組み込む細胞抽出剤の量を考慮すべきである。細胞抽出剤を含むヒドロゲルが液体混合物を形成するとき（例えば、水性懸濁液中に生きた細胞を含むことが疑われるサンプル）、細胞抽出剤の濃度がヒドロゲルと液体との間で平衡に達するまで、細胞抽出剤はヒドロゲルから出て拡散する。理論に束縛されるものではないが、平衡に達するまで、細胞抽出剤の濃度勾配が液体中に存在し、ヒドロゲルの近くにある液体部分ではより高濃度の抽出剤が存在すると推定できる。細胞抽出剤の濃度が、細胞を含む液体部分で有効濃度に達すると、細胞は生物学的分析物を放出する。放出された生物学的分析物は、ここで、検出システムによって検出することができるようになる。
【００５６】
サンプルを含む液体中で細胞抽出剤を有効濃度にするのは、いくつかの要素によって制御することができる。例えば、ヒドロゲルに搭載された細胞抽出剤の量は、平衡に達した液体中での細胞抽出剤の最終濃度に影響する。加えて、ヒドロゲルの量、及び液体混合物中のヒドロゲルの表面積値は、ヒドロゲルからの細胞抽出剤の放出速度、及び平衡時の液体中での細胞抽出剤の最終濃度に影響し得る。更に、水性媒体の温度は、ヒドロゲルが細胞抽出剤を放出する速度に影響し得る。他の要素、例えば細胞抽出剤及びヒドロゲルのイオン特性及び／又は疎水性特性が、ヒドロゲルから放出される細胞抽出剤の量、及び細胞抽出剤がヒドロゲルから放出される速度に影響し得る。これらの要素のすべてを、サンプル中の細胞の検出のために、望ましいパラメータ（例えばその物品の製造時検討事項及びその方法の結果を得るまでの時間など）を達成するよう、当業者が定期的に実験を行うことにより最適化することができる。一般的に、ヒドロゲルとサンプル材料を含むある量の液体との間で細胞抽出剤が平衡に達したときに、少なくとも細胞抽出剤の有効量（ヒドロゲルなしの実験により決定される）を達成できるのに十分な細胞抽出剤をヒドロゲルに組み込むのが望ましい。ヒドロゲルが有効量の細胞抽出剤を放出するのにかかる時間を短縮するためには、ヒドロゲルに、（ヒドロゲルなしの実験で決定された量よりも）より多くの量の細胞抽出剤を加えることが望ましい場合がある。
【００５７】
いくつかの実施形態において、細胞抽出剤の有効濃度を達成することには、サイズ選択したヒドロゲル組成物を使用することが含まれ得る。例えば、ヒドロゲルビーズに細胞抽出剤（例えば、ＢＡＲＤＡＣ  ２０５Ｍの５０％（ｗ／ｖ）水溶液、又は塩化ベンザルコニウムの１０％、１７．５％、又は２５％（ｗ／ｖ）水溶液）を搭載することができる（例えば吸収及び／又は吸着によって）。このヒドロゲルビーズは、均一なサイズのビーズを得るよう、サイズ選択することができる（例えば、Ｇｌｉｓｏｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ（オハイオ州ルイスセンター）から販売されている異なる微細シリーズのメッシュサイズであるＮｏ．１０（２．０ｍｍ）、Ｎｏ．１２（１．７ｍｍ）、Ｎｏ．１４（１．４ｍｍ）、Ｎｏ．１６（１．１８ｍｍ）及びＮｏ．１８（１．０ｍｍ）の８”（２０．３ｃｍ）試験用丸型ふるいにかけることによって）。このヒドロゲルビーズは、細胞抽出剤を搭載する前及び／又は後で、サイズ選択することができる。いくつかの実施形態において、サイズ選択されたヒドロゲルビーズの平均直径は約１．０ｍｍ、約１．１８ｍｍ、約１．４ｍｍ、約１．７ｍｍ、又は約２．０ｍｍであり得る。いくつかの実施形態において、サイズ選択されたヒドロゲルビーズの平均直径は１．０ｍｍ未満であってもよい。いくつかの実施形態において、サイズ選択されたヒドロゲルビーズの平均直径は２．０ｍｍより大きくてもよい。有利なことに、サイズ選択されたヒドロゲルビーズは、ヒドロゲルが細胞抽出剤の有効量を放出するのにかかる時間をより良く制御することができる。
【００５８】
いくつかの実施形態において、サイズ選択されたヒドロゲルビーズの選択された量を、検出装置に使用することができる。例えば、いくつかの実施形態において、ＢＡＲＤＡＣ  ２０５Ｍを含むヒドロゲルビーズを約２．５ｍｇ〜約４ｍｇ、検出装置に使用することができる。いくつかの実施形態において、ＢＡＲＤＡＣ  ２０５Ｍを含むヒドロゲルビーズを約５ｍｇ〜約１０ｍｇ、検出装置に使用することができる。いくつかの実施形態において、ＢＡＲＤＡＣ  ２０５Ｍを含むヒドロゲルビーズを約１１ｍｇ〜約１４ｍｇ、検出装置に使用することができる。
【００５９】
細胞抽出剤は、ヒドロゲル内に拡散し、ヒドロゲルから出て拡散し、又はその両方であり得る。拡散速度は、例えば、高分子材料及び架橋密度を変えること、ヒドロゲルが作製される極性溶媒を変えること、ヒドロゲルが作製される極性溶媒中の細胞抽出剤の溶解度を変えること、並びに細胞抽出剤の分子量を変えることによって、制御可能であるべきである。拡散速度は、ヒドロゲルの形状、サイズ、及び表面トポグラフィーを変えることによっても改善することができる。
【００６０】
ヒドロゲルは、液体サンプル材料と静的に接触させるか、動的に接触させる（すなわち、例えば振動、攪拌、エアレーション、又は圧縮によって混合）か、あるいはこれらの組み合わせで接触させることができる。実施例１６は、混合により、ヒドロゲルから有効量の細胞抽出剤をより迅速に放出させることができることを示している。実施例１７は、ヒドロゲルの圧縮により、ヒドロゲルから有効量の細胞抽出剤をより迅速に放出させることができることを示している。ヒドロゲルの圧縮には、例えば、表面に対してヒドロゲルを押し付けること、及び／又はヒドロゲルを破砕することが含まれ得る。よって、いくつかの実施形態において、混合することにより、細胞抽出剤のより迅速な放出が有利にもたらされ、これによりサンプル中の生物学的分析物（例えば生きた細胞から）のより迅速な検出がもたらされ得る。いくつかの実施形態において、ヒドロゲルの圧縮（例えばスワブ若しくはスパチュラ、キャリア（後述）、又は他の好適な用具などのサンプル取得装置を使用してヒドロゲルに対し圧力を加えることによって）により、細胞抽出剤のより迅速な放出が有利にもたらされ、これによりサンプル中の生物学的分析物のより迅速な検出がもたらされ得る。加えて、ヒドロゲル圧縮の工程は、操作者に便利な時点で細胞抽出剤の放出を加速させるために行うことができる。いくつかの実施形態において、静的な接触は、有効量の細胞抽出剤放出を遅らせることがあるため、生物学的分析物の検出の前に、操作者が他の処理（例えば試薬の追加、装置の較正、及び／又は検体の輸送など）を実施するための追加時間を提供することができる。いくつかの実施形態において、最初の生物学的分析物測定が行われるまでは混合物を静的に保持し、それから、有効量の細胞抽出剤放出に必要な時間を短縮するために動的にサンプルを混合することが、有利な場合がある。
【００６１】
本発明の方法において機能的な最も好ましい濃度又は濃度範囲は、異なる微生物及び異なる細胞抽出剤によって異なり、本明細書に記述されている方法、又は当業者に周知の方法を用いて経験的に決定され得ることが、十分に予測される。
【００６２】
サンプル及びサンプル取得装置：
本開示の物品及び方法は、サンプル中の生物学的分析物の検出を提供する。いくつかの実施形態において、この物品及び方法は、サンプル中の生きた細胞からの生物学的分析物の検出を提供する。特定の好ましい実施形態において、この物品及び方法は、サンプル中の生きた微生物細胞の検出を提供する。特定の好ましい実施形態において、この物品及び方法は、サンプル中の生きた細菌細胞の検出を提供する。
【００６３】
本明細書で使用されるとき、用語「サンプル」は、最も広義で使用される。サンプルは、本発明の使用により分析される生物学的分析物（例えばＡＴＰ）を含むことが疑われる組成物である。サンプルはしばしば、所望により培地又は細胞可溶化物中において、１個の細胞又は細胞集団を含むことが知られているか又は含むことが疑われるものであるが、サンプルはまた、付着した１個の細胞又は細胞集団を含むことが疑われる固体表面（例えばスワブ、膜、フィルター、粒子）でもあり得る。そのような固体表面については、その固体を液体（例えば水溶液）と接触させることにより水性サンプルを作製することが想到される。場合によっては、サンプルを濾過してサンプルを生成することが望ましい（例えば、本発明のプロセスによって液体又は気体サンプルを試験する場合）。大量の希釈された気体又は液体からサンプルを採取する場合は、濾過することが好ましい。濾液は、例えば液体中に懸濁させてから、本開示のヒドロゲルと接触させることができる。
【００６４】
好適なサンプルには、固体材料（例えば微粒子、フィルター）、半固体材料（ゲル、固体の懸濁液、又はスラリー）、液体、又はこれらの組み合わせのサンプルが挙げられる。好適なサンプルには更に、固体、液体、又はこれらの組み合わせを含む表面残留物が挙げられる。表面残留物の非限定的な例には、環境表面（例えば床、壁、天井、媒介物、機器、水、及び水容器、エアフィルター）、食品表面（例えば野菜、果物、及び肉の表面）、食品加工表面（例えば食品加工装置及びまな板）、並びに臨床表面（例えば組織サンプル、皮膚、及び粘膜）からの残留物が挙げられる。
【００６５】
生物学的分析物の検出のためのサンプル材料（表面残留物を含む）の採取は、当該技術分野において既知である。スパチュラ、スポンジ、スワブなど、さまざまなサンプル取得装置について記述がなされている。本開示では、本明細書に記述されるように、独自の機能及び有用性を備えたサンプル取得装置を提供する。
【００６６】
ここで図を参照すると、図１は、本開示による一実施形態のサンプル取得装置１３０の側面図を示す。サンプル取得装置１３０は、ハンドル１３１を含み、これはサンプル採取中に操作者が掴むことができる。ハンドルは、端部１３２と、所望により複数の固定部材１３３とを含む。固定部材１３３は、ハウジング（例えば図３及び４に示すハウジング３２０又はハウジング４２０）に滑動可能にフィットするよう形成され得る。いくつかの実施形態において、固定部材１３３は、耐液性封止シールを形成してハウジングからの流体の漏れを防ぐことができる。
【００６７】
サンプル取得装置１３０は、細長いシャフト１３４及び先端１３９を更に含む。いくつかの実施形態において、シャフト１３４は中空であってよい。シャフト１３４は、ハンドル１３１と反対側の、シャフト１３４の端部近くに位置する、先端１３９を含む。先端１３９は、サンプル材料を採取するのに使用することができ、例えば繊維（レーヨン若しくはダクロン繊維など）又はフォーム（ポリウレタンフォームなど）などの多孔質材料から構成することができ、これをシャフト１３４に付けることができる。いくつかの実施形態において、先端１３９は、米国特許出願第６１／０２９，０６３号（２００７年１２月５日出願）「ＳＡＭＰＬＥ  ＡＣＱＵＩＳＩＴＩＯＮ  ＤＥＶＩＣＥ」（この全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、成形先端であってよい。サンプル取得装置１３０の構成は、当該技術分野において既知であり、例えば米国特許第５，２６６，２６６号（この全体が参照により本明細書に組み込まれる）に見出すことができる。
【００６８】
所望により、サンプル取得装置１３０は更に、細胞抽出剤を含むヒドロゲル１４０を含み得る。いくつかの実施形態において、ヒドロゲル１４０は、サンプル採取に使用される先端１３９とは別の位置（例えば図１に示すようにシャフト１３４上）に、サンプル取得装置１３０の中又は表面に配置される。ヒドロゲル１４０は、本明細書に記述されるようにシャフト１３４上にコーティングすることができ、又は、例えば感圧接着剤若しくは水溶性接着剤（図示なし）によってシャフト１３４に接着することができる。接着剤は、生きた細胞からの生物学的分析物を検出するために使用される検出システムとの適合性に関して選択されるべきである（すなわち、接着剤は、検出システムの精度又は感受性を顕著に損うものであってはならない）。
【００６９】
使用中、サンプル取得装置１３０の先端１３９は、サンプル材料（例えば固体、半固体、懸濁液、スラリー、液体、表面など）と接触して、細胞を含むことが疑われるサンプルを得る。サンプル取得装置１３０は、本明細書に記述されているように、サンプルを検出システムに移すのに使用することができる。
【００７０】
図２は、本開示による別の実施形態のサンプル取得装置２３０の部分的断面図を示す。この実施形態において、サンプル取得装置２３０は、端部２３２を有するハンドル２３１、ハウジング（図示なし）内に滑動可能にフィットする所望による固定部材２３３、中空の細長いシャフト２３４、及び多孔質材料を含む先端２３９を含む。サンプル取得装置２３０は、シャフト２３４の内部に配置された細胞抽出剤を含むヒドロゲル２４０を更に含む。これにより、サンプル取得装置２３０は、ヒドロゲル２４０を含む封入部（シャフト２３４）を提供する。先端２３９を構成する材料は、ヒドロゲル２４０が材料を通って先端２３９から流出することなく、シャフト２３４の内部に液体が自由に流れることができるよう、十分に多孔質である。
【００７１】
使用中、サンプル取得装置２３０は、表面（好ましくは乾いた表面）に接触させて、サンプル材料を取得するのに使用することができる。サンプル取得後、サンプル取得装置２３０の先端２３９は液体（例えば水又は緩衝液、所望により、酵素及び／又は酵素基質などの検出試薬を含む）で湿潤され、これにより有効量の細胞抽出剤がヒドロゲル２４０から放出され、サンプル材料に接触する。有効量の細胞抽出剤がヒドロゲル２４０から放出されることにより、サンプル取得装置２３０は、本明細書に記述されているように、生きた細胞からの生物学的分析物を検出するための方法にて使用することが可能となる。
【００７２】
細胞抽出剤を含むヒドロゲルを含むサンプル取得装置の別の一実施形態（図示せず）は、Ｎａｓｏｎによる米国特許第５，２６６，２６６号（以下、「Ｎａｓｏｎ特許」と称する）で開示されている「Ｓｐｅｃｉｍｅｎ  Ｔｅｓｔ  Ｕｎｉｔ」から誘導されることができる。具体的には、Ｎａｓｏｎ特許の図７〜９を参照すると、本明細書に記述されているサンプル取得装置のハンドルは、ハウジング底部１４（試薬チャンバ３６を形成する）及び封止シール付属品４８のＮａｓｏｎの機能要素を組み入れるよう改変することができ、これには、中空スワブシャフト２２に接続された中央分配通路５０（所望によりハウジングキャップ３０を備える）が含まれる。封止シール付属品４８の中央通路５０は、細径スコア（reduced diameter score）５６を介して通路５０内部の端部で封止シール付属品４８に接続された延長したロッドセグメント５４の形態にて、ブレークオフ先端（break-off nib）５２によって閉じられることができる。これにより、本開示の一実施形態において、サンプル取得装置ハンドルは、Ｎａｓｏｎにより記述されているように、試薬チャンバを含む。この実施形態のサンプル取得装置のハンドル内にある試薬チャンバは、細胞抽出剤を含むヒドロゲル粒子（例えばビーズ）を含む。これにより、この実施形態のサンプル取得装置は、ヒドロゲルを含む封入部（試薬チャンバ３６）を提供する。この実施形態において、ヒドロゲル粒子は、ヒドロゲルから細胞抽出剤の放出を引き起こす液体媒体中に懸濁していない。ヒドロゲル粒子は、個々の粒子が中央通路５０及び中空シャフト２２に入り自由に通り抜けられるような大きさ及び形状にされる。
【００７３】
使用中、試薬チャンバを有するハンドルを含むサンプル取得装置は、本明細書に記述されるようにサンプルを取得するのに使用することができる。サンプルが液体の場合、Ｎａｓｏｎ特許に記述されているように、ブレークオフ先端５２が作動して、シャフトを貫通するヒドロゲルの通路がスワブ先端内の液体サンプルに接触し、これによりサンプルとヒドロゲルとを含む液体混合物の形成が可能となる。このサンプルとヒドロゲルとを含む液体混合物は、本明細書に記述されるように、生きた細胞に関連する生物学的分析物の検出に使用することができる。サンプルが固体又は半固体の場合、サンプル取得装置の先端は液体溶液に接触又は浸すことができ、Ｎａｓｏｎ特許に記述されているようにブレークオフ先端５２が作動でき、これによりシャフトを貫通するヒドロゲルの通路がスワブ先端内の液体サンプルに接触し、これによりサンプルとヒドロゲルとを含む液体混合物の形成が可能となる。このサンプルとヒドロゲルとを含む液体混合物は、本明細書に記述されるように、生きた細胞に関連する生物学的分析物の検出に使用することができる。
【００７４】
検出装置
図３は、本開示による検出装置のハウジング３２０の一実施形態の断面図を示す。ハウジング３２０は、サンプル取得装置を受容するよう構成されている開口部３２２、及び少なくとも１つの壁３２４を含む。ハウジング３２０内に、細胞抽出剤を含むヒドロゲル３４０が配置される。これにより、ハウジング３２０はヒドロゲル３４０を収容する封入部を提供する。
【００７５】
図３において、ヒドロゲル３４０は、全体的に球形のビーズの形態の成形ヒドロゲルである。ビーズは、ハウジング３２０での使用に好適な、本明細書に開示されているさまざまな形状のヒドロゲルの一例にすぎないことが理解されよう。
【００７６】
いくつかの実施形態において（図示なし）、ヒドロゲル３４０は固体基材（例えばハウジング３２０の壁３２４）の上にコーティングすることができる。本開示のヒドロゲル３４０をコーティングすることができる、その他の好適な固体基材の非限定的な例（図示なし）には、ポリマーフィルム、繊維、不織布、セラミック粒子、紙、及びポリマービーズが挙げられる。固体基材は、さまざまなプロセスによってヒドロゲル３４０でコーティングすることができ、例えば、ディップコーティング、ナイフコーティング、カーテンコーティング、スプレー、キスコーティング、グラビアコーティング、オフセットグラビアコーティング、及び／又は印刷手法（スクリーン印刷及びインクジェット印刷など）を使用して、望ましい場合にはパターンで、基材上にヒドロゲル組成物を塗布することができる。コーティングプロセスの選択は、固体基材の形状及び寸法によって影響され、任意の所与の固体基材をコーティングするための好適なプロセスを判別することは、当業者の把握する範囲内である。
【００７７】
本実施形態及び他のすべての実施形態（例えば図１、２、４、５、６Ａ〜Ｂ、７、及び８に説明される実施形態）において、ヒドロゲル（例えばヒドロゲル３４０）は、複数（例えば少なくとも２個、３個、４個、５個、１０個以下、２０個以下、５０個以下、１００個以下、５００個以下、１０００個以下）の、ビーズ、繊維、リボン、コーティングされた基材などのヒドロゲル体を含み得る。例えば、ヒドロゲル３４０は、２個以下、３個以下、４個以下、５個以下、１０個以下、２０個以下、５０個以下、１００個以下、５００個以下、１０００個以下、又はそれ以上のヒドロゲル体を含み得る。
【００７８】
ハウジング３２０の壁３２４は、例えば円筒形であり得る。他の有用な形状（複数の壁３２４を含む場合がある）が可能であり、これは当業者の把握する範囲内であることが理解されよう。ハウジング３２０は、例えばプラスチック（例えばポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート）又はガラスなど、さまざまな材料で構成することができる。好ましくは、ハウジング３２０の少なくとも一部分は、光（例えば可視光）を透過させる光学的特性を有する材料から構成される。好適な材料は、例えばＡＴＰ試験などの生化学的アッセイに使用される装置において周知である。
【００７９】
所望により、ハウジング３２０はキャップ（図示なし）を含むことができ、これはハウジング３２０の開口部３２２を覆う形状及び寸法にすることができる。他のハウジング（例えば図４及び図５にそれぞれ示され、本明細書で説明される、ハウジング４２０及びハウジング５２０）も、キャップを含み得ることが認識されよう。
【００８０】
いくつかの実施形態において、ハウジング３２０は、サンプル取得装置（図示なし）と共に使用することができる。所望により、サンプル取得装置は、例えば図１及び図２にそれぞれ示され、本明細書で説明される、サンプル取得装置１３０又は２３０のように、ヒドロゲルを含んでもよい。サンプル取得装置中のヒドロゲルは、ヒドロゲル３４０と同じ組成物及び／又は量の細胞抽出剤を含み得る。サンプル取得装置中のヒドロゲルは、ヒドロゲル３４０とは異なる組成物及び／又は量の細胞抽出剤を含み得る。いくつかの実施形態において、サンプル取得装置は体細胞抽出剤を含むことができ、ハウジング３２０は微生物細胞抽出剤を含むことができる。いくつかの実施形態において、サンプル取得装置は微生物細胞抽出剤を含むことができ、ハウジング３２０は体細胞抽出剤を含むことができる。他のハウジング（例えば図４及び図５にそれぞれ示され、本明細書で説明される、ハウジング４２０及びハウジング５２０）は、所望によりヒドロゲルを含み得るサンプル取得装置を同様に含んでもよいことが理解されよう。
【００８１】
ハウジング３２０は、サンプル中の生きた細胞を検出するための方法に使用することができる。使用中、操作者はハウジング３２０内で液体（例えば水性液体、又はグリコール及び／若しくはアルコールを含む水溶液）混合物を形成することができ、この混合物は液体サンプル及びヒドロゲル３４０を含む。いくつかの実施形態において、この混合物は検出試薬を更に含むことができる。サンプルとヒドロゲル４４０とを含む液体混合物は、生きた微生物に関連する生物学的分析物の検出に使用することができる。
【００８２】
図４は、本開示による検出装置のハウジング４２０の一実施形態の部分的断面図を示す。ハウジング４２０は、サンプル取得装置を受容するよう構成されている開口部４２２を備えた壁４２４を含む。脆弱シール４６０が、ハウジング４２０を、上のコンパートメント４２６と反応槽４２８との２つの部分に区分する。反応槽４２８内には、ヒドロゲル４４０が配置される。これにより、ハウジング４２０はヒドロゲル４４０を収容する封入部を提供する。
【００８３】
脆弱シール４６０は、上のコンパートメント４２６（これにはハウジング４２０の開口部４２２が含まれる）と反応槽４２８との間のバリアを形成する。いくつかの実施形態において、この脆弱シール４６０は耐水性バリアである。脆弱シール４６０は、さまざまな脆い材質から構成することができ、この材質には、例えば、ポリマーフィルム、金属コーティングされたポリマーフィルム、金属ホイル、溶解性フィルム（例えば低分子量のポリビニルアルコール又はヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）で製造されたフィルム）、及びこれらの組み合わせが挙げられる。
【００８４】
脆弱シール４６０は、さまざまな技法を用いてハウジング４２０の壁４２４に接続することができる。脆弱シール４６０を壁４２４に取り付けるための好適な技法としては、超音波溶接、任意の熱接着技法（例えば熱及び／又は圧力を加えて壁４２４の一部、脆弱シール４６０の一部、又はその両方を融解する）、接着剤結合、ステープル、及び縫合が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の好ましい一実施形態では、脆弱シール４６０は、超音波溶接プロセスを使用して壁４２４に取り付けられる。
【００８５】
ハウジング４２０は、サンプル中の細胞を検出するための方法に使用することができる。本開示の方法には、本明細書に記述されるように、サンプル材料とヒドロゲル４４０とを含む液体混合物を形成することが含まれ、かつ、生物学的分析物を検出することが含まれる。
【００８６】
サンプルが液体サンプル（例えば水、ジュース、牛乳、肉汁、野菜洗浄液、食品抽出物、体液及び分泌物、唾液、創傷滲出物、並びに血液）の場合、その液体サンプルは直接、上のチャンバ４２６に移すことができる（例えば注ぐ又はピペットを用いて）。検出試薬は、サンプルをハウジング４２０に移す前にサンプルに加えることができる。検出試薬は、サンプルをハウジング４２０に移した後にサンプルに加えることができる。検出試薬は、サンプルをハウジング４２０に移しているときにサンプルに加えることができる。脆弱シール４６０は、液体サンプルをハウジング４２０に移す前に、破ることができる（例えばピペット先端又はサンプル取得装置で突き刺すことによって）。脆弱シール４６０は、液体サンプルをハウジング４２０に移した後に、破ることができる。脆弱シール４６０は、液体サンプルをハウジング４２０に移しているときに破ることができる。液体サンプルがハウジング４２０内にあり、脆弱シールが破られると、サンプルとヒドロゲル４４０とを含む液体混合物が形成される。このサンプルとヒドロゲル４４０とを含む液体混合物は、生きた微生物に関連する生物学的分析物の検出に使用することができる。
【００８７】
サンプルが固体サンプルの場合（例えば粉末、微粒子、半固体、サンプル取得装置で採取された残留物、エアフィルター）、ハウジング４２０は容器として有利に用いることができ、この中でサンプルを、例えば水又は緩衝液などの液体懸濁媒体と混合することができる。好ましくは、液体懸濁媒体は微生物を実質的に含まない。より好ましくは、液体懸濁媒体は無菌である。固体サンプルを液体懸濁媒体と混合する前、後又は最中に、検出試薬をこの液体懸濁媒体に加えることができる。固体サンプルを液体懸濁媒体と混合する前、後、又は最中のいずれかの時点で、脆弱シール４６０を破ることができ（例えばピペット先端又はスワブで突き刺すことによって）、これにより、サンプルと、細胞抽出剤を含むヒドロゲル４４０とを含む液体混合物を形成することができる。このサンプルとヒドロゲル４４０とを含む液体混合物は、生きた細胞に関連する生物学的分析物を検出する方法に使用することができる。
【００８８】
図５は、本開示による検出装置のハウジング５２０の一実施形態の部分的断面図を示す。ハウジング５２０は、サンプル取得装置を受容するよう構成されている開口部５２２を備えた壁５２４を含む。脆弱シール５６０が、そのハウジング５２０を、上のコンパートメント５２６と反応槽５２８との２つの部分に区分する。上のコンパートメント５２６内に、細胞抽出剤を含むヒドロゲル５４０が配置される。反応槽５２８は、検出試薬５７０を更に含む。
【００８９】
図５において、ヒドロゲル５４０は、ハウジング５２０の上のチャンバ５２６内、脆弱シール５６０の上に配置される。これにより、ハウジング５２０はヒドロゲル５４０を収容する封入部を提供する。いくつかの実施形態において（図示なし）、ヒドロゲル５４０は、上のチャンバ５２６の脆弱シール５６０又は壁５２４に結合していてよい。例えば、ヒドロゲル５４０は、ハウジング５２０の上のチャンバ５２６の一部を形成する表面（例えば脆弱シール５６０及び／又は壁５２４）の１つに、接着剤で接合（例えば感圧接着剤又は水溶性接着剤を介して）、あるいはコーティングすることができる。
【００９０】
ハウジング５２０の試薬槽５２８は、検出試薬５７０を含む。所望により、この検出試薬５７０は検出試薬を含むことができる（すなわち、検出試薬はこの検出試薬５７０中に溶解及び／又は懸濁されてよい）。他の実施形態において（図示なし）、試薬槽５２８は、検出試薬５７０の代わりに、乾燥検出試薬（例えば粉末、粒子、微粒子、錠剤、ペレットなど）が含むことができる。
【００９１】
ハウジング５２０は、サンプル中の細胞を検出するための方法に使用することができる。本開示の方法には、本明細書に記述されるように、サンプル材料とヒドロゲル４４０とを含む液体混合物を形成することが含まれ、かつ、生物学的分析物を検出することが含まれる。
【００９２】
サンプルが液体サンプル（例えば水、ジュース、牛乳、肉汁、野菜洗浄液、食品抽出物、体液及び分泌物、唾液、創傷滲出物、並びに血液）の場合、その液体サンプルは直接、上のチャンバ５２６に移すことができ（例えば注ぐ又はピペットを用いて）、これによりサンプルとヒドロゲル５４０とを含む液体混合物を形成することができる。ハウジング５２０にサンプルを移す前、後又は最中に、検出試薬をこの液体サンプルに加えることができる。ハウジング５２０に液体サンプルを移す前、後又は最中に、脆弱シール５６０を破ることができる（例えばピペット先端又はスワブで突き刺すことによって）。サンプルとヒドロゲル５４０とを含む液体混合物は、脆弱シール５６０を破る前及び／又は後に、生きた微生物に関連する生物学的分析物の検出に使用することができる。
【００９３】
サンプルが固体サンプルの場合（例えば粉末、微粒子、半固体、サンプル取得装置で採取された残留物）、ハウジング５２０は容器として有利に用いることができ、この中でサンプルを、例えば水又は緩衝液などの液体懸濁媒体と混合することができる。好ましくは、液体懸濁媒体は微生物を実質的に含まない。より好ましくは、液体懸濁媒体は無菌である。
【００９４】
固体サンプルと液体懸濁媒体とを混合することにより、サンプルとヒドロゲル５４０とを含む液体混合物が形成される。固体サンプルを液体懸濁媒体と混合する前、後又は最中に、検出試薬をこの液体懸濁媒体に加えることができる。固体サンプルを液体懸濁媒体と混合するプロセスの前、後、又は最中に、脆弱シール５６０を破ることができる（例えばピペット先端又はスワブで突き刺すことによって）。このサンプルとヒドロゲル５４０とを含む液体混合物は、本明細書に記述されるように、生きた微生物に関連する生物学的分析物の検出に使用することができる。
【００９５】
図６Ａ〜６Ｂは、本開示による検出装置６１０の部分的断面図を示す。図６Ａを参照すると、検出装置６１０は、本明細書に記述されるように、ハウジング６２０とサンプル取得装置６３０とを含む。ハウジング６２０は、脆弱シール６６０、上のコンパートメント６２６に配置された細胞抽出剤を含むヒドロゲル６４０、及び所望により、試薬槽６２８に配置された検出試薬６７０を含む。これにより、ハウジング６２０はヒドロゲル６４０を収容する封入部を提供する。検出試薬６７０は、検出試薬を更に含んでもよい。
【００９６】
サンプル取得装置６３０は、ハンドル６３１を含み、これはサンプル採取中に操作者が掴むことができる。サンプル取得装置６３０は図６Ａにおいて第一位置「Ａ」に示されており、ハンドル６３１は実質的にハウジング６２０の外に延びている。一般に、ハンドル６３１は、検出装置６１０の保管中は位置「Ａ」にある。使用中、サンプル取得装置６３０がハウジング６２０から引き抜かれ、先端６２９はサンプルを採取する領域又は材料に接触する。サンプル採取後、サンプル取得装置をハウジング６２０に再び挿入し、典型的には、ハウジング６２０が定位置に保持されている間、ハンドル６３１の端部６３２をハウジング６２０の方に（例えば指の力で）押して、サンプル取得装置６３０をほぼ位置「Ｂ」へと動かし、これにより先端６３９が脆弱シール６６０を貫通して、反応槽６２８内の検出試薬６７０（存在する場合）に入る（図６Ｂを参照）。先端６３９が脆弱シール６６０を破ると、ヒドロゲル６４０も反応槽６２８内に移動する。このプロセスにより、サンプルとヒドロゲル６４０とを含む液体混合物が形成される。このサンプルとヒドロゲル６４０とを含む液体混合物は、本明細書に記述されるように、生きた細胞に関連する生物学的分析物の検出に使用することができる。
【００９７】
図７は、本明細書に記述されるように、ハウジング７２０とサンプル取得装置７３０とを含む検出装置７１０の断面図を示す。ハウジング７２０は、脆弱シール７６０ａ及び７６０ｂによって、上のチャンバ７２６と反応槽７２８とに区分されている。脆弱シール７６０ａと７６０ｂとの間には、細胞抽出剤を含むヒドロゲル７４０が配置される。これにより、ハウジング７２０はヒドロゲル７４０を収容する封入部を提供する。反応槽７２８は検出試薬７７０を含む。
【００９８】
使用中、サンプル取得装置７３０の先端７３９は、前述のように、サンプル材料（例えば固体、半固体、懸濁液、スラリー、液体、表面など）と接触する。サンプルを採取した後、サンプル取得装置７３０をハウジング７２０に再び挿入し、前述のように、ハンドルをハウジング７２０の方に押して、これにより先端７３９が脆弱シール７６０ａ及び７６０ｂを貫通して、反応槽７２８内の検出試薬に入る。先端７３９が脆弱シール７６０ａ及び７６０ｂを貫通すると、ヒドロゲル７４０も反応槽７２８内の検出試薬７７０内に移動する。このプロセスにより、サンプルとヒドロゲル７４０とを含む液体混合物が形成される。このサンプルとヒドロゲル７４０とを含む液体混合物は、本明細書に記述されるように、生きた微生物に関連する生物学的分析物の検出に使用することができる。
【００９９】
図８は、本開示による検出装置８１０の部分的断面図を示す。検出装置８１０は、本明細書に両方とも記述されるように、ハウジング８２０とサンプル取得装置８３０とを含む。本明細書に記述される脆弱シール８６０ｂは、ハウジングを、上のコンパートメント８２６と試薬チャンバ８２８との２つの部分に区分している。試薬チャンバ８２８は検出試薬８７０を含み、これは液体検出試薬８７０（図示）、又は本明細書に記述される乾燥検出試薬であり得る。上のコンパートメント８２４内に滑動可能に配置され、脆弱シール８６０ｂの近位にあるのは、キャリア８８０である。キャリア８８０は、細胞抽出剤を含むヒドロゲル８４０と、所望により脆弱シール８６０ａとを含む。これにより、キャリア８８０はヒドロゲル８４０を収容する封入部を提供する。キャリア８８０は、例えば、成形プラスチック（例えばポリプロピレン又はポリエチレン）から構成され得る。図示されている実施形態において、脆弱シール８６０ａは、保管及び取扱い時に、ヒドロゲル８４０（ヒドロゲルビーズとして示されている）をキャリア８８０内に保持する機能を果たす。いくつかの実施形態において、ヒドロゲル８４０はキャリア８８０上にコーティングされ、保管及び取扱い時にヒドロゲル８４０を保持するための脆弱シール８６０ａは不要になり得る。
【０１００】
使用中、サンプル取得装置８３０は検出装置８１０から取り出され、本明細書に記述されているように、先端８３９上にサンプルが採取される。サンプル取得装置８３０をハウジング８２０に再び挿入し、図６Ａ〜Ｂの検出装置に関して述べたように、ハンドル８３１をハウジング８２０内に押す。サンプル取得装置８３０の先端８３９が脆弱シール８６０Ａ（存在する場合）を破り、脆弱シール８６０ｂを超えてキャリア８８０を押し出す。サンプルを含む先端８３９が検出試薬８７０に接触するとキャリア８８０が検出試薬８７０中に落ち、これにより、サンプルと、細胞抽出剤を含むヒドロゲルとを含む液体混合物が形成される。このサンプルとヒドロゲル８４０とを含む液体混合物は、本明細書に記述されるように、生きた細胞に関連する生物学的分析物の検出に使用することができる。
【０１０１】
図９は、図８のキャリア９８０の一実施形態の底面斜視図を示す。キャリア９８０は、円筒形の壁９８２と底部９８４とを含む。壁９８２は、ハウジング（図示なし）内に滑動可能にフィットするような形状及び寸法にされる。キャリア９８０は、所望により脆弱シール９６０ａを更に含む。底部９８４には穴９８５及び穿刺部材９８６があり、この穿刺部材が穿刺点９８８を形成している。穿刺点９８８は、ハウジング（図示なし）内の脆弱シールを破るのを容易にすることができる。
【０１０２】
生きた細胞からの生物学的分析物の検出方法：
本開示の方法は、有効量の細胞抽出剤にさらされた後の、生きた細胞（例えば生きた微生物）から放出された生物学的分析物を検出するための方法を含む。
【０１０３】
生物学的分析物の検出は、検出システムの使用を伴う。ヌクレオチド（例えばＡＴＰ）、ポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ若しくはＲＮＡ）、又は酵素（例えばＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ若しくはアデニル酸キナーゼ）などの特定の生物学的分析物についての検出システムは、当該技術分野において既知であり、本開示に従って使用することができる。本開示の方法は、生物学的分析物を検出するための既知の検出システムを含む。好ましくは、この検出システムの精度及び感受性は、細胞抽出剤によって顕著に低減されない。より好ましくは、検出システムは、均質アッセイを含む。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、検出システムは、検出試薬を含む。検出試薬には、例えば、染料、酵素、酵素基質、結合相手（例えば抗体、モノクローナル抗体、レクチン、受容体）、及び／又は補助因子が含まれる。いくつかの実施形態において、検出システムは機器を含む。検出機器の非限定的な例には、分光光度計、照度計、プレートリーダー、サーモサイクラー、インキュベーターが挙げられる。
【０１０５】
検出システムは当該技術分野において既知であり、生物学的分析物を比色（すなわち吸光度及び／又は光散乱による）、蛍光、又は発光によって検出するのに使用することができる。発光による生体分子検出の例は、Ｆ．Ｇｏｒｕｓ  ａｎｄ  Ｅ．Ｓｃｈｒａｍ（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｂｉｏ−ａｎｄ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９７９、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２５：５１２〜５１９）に記述されている。
【０１０６】
生物学的分析物検出システムの一例として、ＡＴＰ検出システムがある。ＡＴＰ検出システムは、酵素（例えばルシフェラーゼ）及び酵素基質（例えばルシフェリン）を含み得る。ＡＴＰ検出システムは、照度計を更に含み得る。いくつかの実施形態において、照度計には、例えばＦＢ−１２単管照度計（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＵＳＡ（テネシー州オークリッジ））などのベンチトップ型照度計が含まれ得る。いくつかの実施形態において、照度計には、例えばＮＧ照度計ＵＮＧ２（３Ｍ  Ｃｏｍｐａｎｙ（英国ブリッジェンド））などの携帯型照度計が含まれ得る。
【０１０７】
本開示の方法は、生きた細胞を含むことが疑われるサンプルと、細胞抽出剤を含むヒドロゲルとを含む、液体混合物を形成することを含む。本開示の方法は、生物学的分析物を検出することを更に含む。生物学的分析物の検出は、サンプル中の生物学的分析物の量を定量化することを更に含み得る。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、生物学的分析物の検出には、サンプルと、細胞抽出剤を含むヒドロゲルとを含む液体混合物が形成される容器内（例えば試験管、マルチウェルプレートなど）で、分析物を直接検出することが含まれ得る。いくつかの実施形態において、生物学的分析物の検出には、サンプルと、細胞抽出剤を含むヒドロゲルとを含む液体混合物が形成される容器とは別の容器に、その液体混合物の少なくとも一部を移すことが含まれ得る。いくつかの実施形態において、生物学的分析物の検出には、例えばｐＨ調整、希釈、濾過、遠心分離、抽出などの１つ以上のサンプル調製プロセスが含まれることがある。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、生物学的分析物は、単一時点で検出される。いくつかの実施形態において、生物学的分析物は、２回以上の時点で検出される。２回以上の時点で生物学的分析物が検出される場合、１回目（例えば、サンプルの少なくとも一部において生きた細胞からの生物学的分析物放出を起こすための有効量の細胞抽出剤がヒドロゲルから放出される前）の時点で検出された生物学的分析物の量を、２回目（例えば、サンプルの少なくとも一部において生きた細胞からの生物学的分析物放出を起こすための有効量の細胞抽出剤がヒドロゲルから放出された後）の時点で検出された生物学的分析物の量と比べることができる。いくつかの実施形態において、１回以上の時点での生物学的分析物の測定は、プロセッサを備えた機器で実施される。特定の好ましい実施形態において、１回目の時点の生物学的分析物の量と、２回目時点での生物学的分析物の量との比較は、プロセッサによって実施される。
【０１１０】
例えば、操作者は、サンプルと、細胞抽出剤を含むヒドロゲルとを含む液体混合物を形成した後のサンプルにおいて、生物学的分析物の量を測定する。この第一測定（Ｔ０）における生物学的分析物の量は、「遊離」（すなわち非細胞性）の生物学的分析物、及び／又は、サンプル中の非生存細胞に由来する生物学的分析物の存在を示し得る。いくつかの実施形態において、この第一測定は、サンプルと、細胞抽出剤を含むドロゲルとを含む液体混合物を形成した直後（例えば約１秒後）に行うことができる。いくつかの実施形態において、第一測定は、サンプルと、細胞抽出剤を含むヒドロゲルとを含む液体混合物を形成してから少なくとも約５秒後、少なくとも約１０秒後、少なくとも約２０秒後、少なくとも約３０秒後、少なくとも約４０秒後、少なくとも約６０秒後、少なくとも約８０秒後、少なくとも約１００秒後、少なくとも約１２０秒後、少なくとも約１５０秒後、少なくとも約１８０秒後、少なくとも約２４０秒後、少なくとも約５分後、少なくとも約１０分後、少なくとも約２０分後に行うことができる。これらの時間は例示的なものであり、生物学的分析物の検出を開始するまでの時間のみが挙げられている。生物学的分析物の検出の開始には、サンプルの希釈、及び／又は、細胞抽出剤の活性を阻害する試薬の添加が含まれ得る。特定の検出システム（例えば核酸増幅又はＥＬＩＳＡ）は、通常、完了するのに数分〜数時間かかり得ることが理解されるであろう。
【０１１１】
操作者は、生物学的分析物の第一測定を行った後、細胞抽出剤を含むヒドロゲルにサンプルを一定時間接触させる。サンプルを一定時間ヒドロゲルと接触させた後、生物学的分析物の第二測定が行われる。いくつかの実施形態において、この第二測定は、生物学的分析物の第一測定を行ってから、約０．５秒以内、約１秒以内、約５秒以内、約１０秒以内、約２０秒以内、約３０秒以内、約４０秒以内、約６０秒以内、約９０秒以内、約１２０秒以内、約１８０秒以内、約３００秒以内、約１０分以内、約２０分以内、約６０分以内、又はそれ以降に行うことができる。これらの時間は例示的なものであり、生物学的分析物の検出の第一測定を開始してから、生物学的分析物の検出の第二測定を開始するまでの時間のみが挙げられている。生物学的分析物の検出の開始には、サンプルの希釈、及び／又は、細胞抽出剤の活性を阻害する試薬の添加が含まれ得る。
【０１１２】
好ましくは、生物学的分析物の第一測定は、サンプルと、細胞抽出剤を含むヒドロゲルとを含む液体混合物を形成してから約１秒後〜約２４０秒後に行われ、第一測定の後に行われる第二測定は、液体混合物を形成してから約１．５秒後〜約５４０秒後に行われる。より好ましくは、生物学的分析物の第一測定は、液体混合物を形成してから約１秒後〜約１８０秒後に行われ、第一測定の後に行われる第二測定は、液体混合物を形成してから約１．５秒後〜約１２０秒後に行われる。最も好ましくは、生物学的分析物の第一測定は、液体混合物を形成してから約１秒後〜約５秒後に行われ、第一測定の後に行われる第二測定は、液体混合物を形成してから約１．５秒後〜約１０秒後に行われる。
【０１１３】
操作者は、第一測定で検出された生物学的分析物の量を、第二測定で検出された生物学的分析物の量と比較する。第二測定で検出された生物学的分析物の量の増加は、サンプル中に１つ以上の生きた細胞が存在することを示す。
【０１１４】
特定の方法において、生きた体細胞（例えば非微生物細胞）の存在を検出することが望ましい場合がある。これらの実施形態において、ヒドロゲルには、体細胞から生物学的分析物を選択的に放出させる細胞抽出剤が含まれる。体細胞抽出剤の非限定的な例には、例えば非イオン性エトキシル化アルキルフェノール類などの非イオン性洗剤が挙げられ、これには、エトキシル化オクチルフェノールＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ＴＸ−１００）及びその他のエトキシル化アルキルフェノール類；ベタイン洗剤、例えばカルボキシプロピルベタイン（ＣＢ−１８）、ＮＰ−４０、ＴＷＥＥＮ、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ、Ｉｇｅｐａｌ、市販のＭ−ＮＲＳ（Ｃｅｌｓｉｓ（イリノイ州シカゴ））、Ｍ−ＰＥＲ（Ｐｉｅｒｃｅ（イリノイ州ロックフォード））、ＣｅｌＬｙｔｉｃ  Ｍ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）が挙げられるが、これらに限定されない。細胞抽出剤は、好ましくは、分析物及びその検出試薬を不活性化しないよう選択される。
【０１１５】
特定の方法において、生きた微生物細胞の存在を検出することが望ましい場合がある。これらの実施形態において、ヒドロゲルには、微生物細胞から生物学的分析物を選択的に放出させる細胞抽出剤が含まれる。微生物細胞抽出剤の非限定的な例には、四級アンモニウム化合物、例えば塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、「セトリミド」（ドデシル−、テトラデシル−、及びヘキサデシル−トリメチルアンモニウムブロミドの混合物）、塩化セチルピリジウム；アミン類、例えばトリエチルアミン（ＴＥＡ）及びトリエタノールアミン（ＴｅｏｌＡ）；ビス−ビグアニド類、例えばクロルヘキシジン、アレキシジン及びポリヘキサメチレンビグアニド；ジアルキルアンモニウム塩、例えばＮ−（ｎ−ドデシル）−ジエタノールアミン、抗生物質、例えばポリミキシンＢ（例えばポリミキシンＢ１及びポリミキシンＢ２）、ポリミキシン−β−ノナペプチド（ＰＭＢＮ）；アルキルグルコシド又はアルキルチオグルコシド、例えばオクチル−β−Ｄ−１−チオグルコピラノシド（全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，１７４，７０４号を参照）；非イオン性洗剤、例えば非イオン性エトキシル化アルキルフェノール類、これにはエトキシル化オクチルフェノールＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ＴＸ−１００）及びその他のエトキシル化アルキルフェノール類が含まれるが、これらの限定されない）；ベタイン洗剤、例えばカルボキシプロピルベタイン（ＣＢ−１８）；並びにカチオン性、抗菌性、孔形成性、膜活性、及び／又は細胞壁活性のポリマー、例えばポリリシン、ナイシン、マガイニン、メリチン、ホスホリパーゼＡ２、ホスホリパーゼＡ２活性化ペプチド（ＰＬＡＰ）；バクテリオファージ、及び同様物が挙げられる。例えば、イオン性界面活性化合物を開示しているＭｏｒｂｅら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．（１９９７）ｖｏｌ．１５２、ｐｐ．３８５〜３９４、及び米国特許第４，３０３，７５２号を参照のこと（これらは全体が参照により本明細書に組み込まれる）。細胞抽出剤は、生物学的分析物、及び／又はその生物学的分析物を検出するのに使用される検出試薬を不活性化しないよう選択されるのが好ましい。
【０１１６】
サンプル中の生きた微生物細胞の存在を検出するための特定の代替方法において、サンプルは一定時間、体細胞抽出剤で前処理することができる（例えば、体細胞を抽出するのに十分な時間、サンプルを体細胞抽出剤に接触させてしてから、サンプルと、微生物細胞抽出剤を含むヒドロゲルとを含む液体混合物を形成する）。この代替の実施形態において、第一測定で検出される生物学的分析物の量には、体細胞から放出されたいかなる生物学的分析物も含まれ、第二測定で検出された追加の生物学的分析物（もしあれば）の量は、サンプル中の生きた微生物細胞からの生物学的分析物を含むことになる。
【実施例】
【０１１７】
ここで、本発明は、できる限り可能な説明のため、発明者により予見されたいくつかの具体的な実施形態を参照にして記載されてきた。現在予見されていない修正などの、本発明の実体のない修正は、仮定的であっても、それらと同等のものを構成し得る。したがって、本発明の範囲は、本明細書に記載される詳細及び構造によって限定されず、むしろ以下の請求項及びそれと同等のものによってのみ限定されるべきである。
【０１１８】
調製例１
ヒドロゲル重合中のヒドロゲルビーズへの細胞抽出剤の組み込み。
【０１１９】
ビーズは、ＰＣＴ国際公開特許公報ＷＯ  ２００７／１４６７２２号の実施例１に記述されているように製造され、ここでは、脱イオン水が、望ましい搭載溶液に置き換えられた。２０モルのエトキシル化トリメチロールプロパントリアクリレート（ＥＯ２０−ＴＭＰＴＡ）（ＳＲ４１５、Ｓａｒｔｏｍｅｒ（ペンシルバニア州エクセター）から販売）４０グラム、脱イオン（ＤＩ）水６０グラム、及び光開始剤０．８グラム（ＩＲＧＡＣＵＲＥ  ２９５９、Ｃｉｂａ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（ニューヨーク州タリータウン）から販売）を混合することによって、均質な前駆体組成物を調製した。前駆体組成物を漏斗内へ注いで、前駆体組成物が、２．０ミリメートル径のオリフィスを通って漏斗から出るようにした。前駆体組成物は、０．９１メートル長、５１ミリメートル径の石英管の垂直軸に沿って落下した。石英管はＵＶ曝露ゾーンを通って延びており、ＵＶ曝露ゾーンは、光シールドと、２４０Ｗ／ｃｍの照射器（Ｆｕｓｉｏｎ  ＵＶ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、メリーランド州ゲーサーズバーグから販売）とによって画定されている。照射器には、２５ｃｍ長の「Ｈ」バルブが備え付けられており、バルブは、バルブの向きが落下中の前駆体組成物と平行になるように、一体化された後部反射器に結合されている。照射器の下に、ポリマービーズが得られた。プロセス全体は、周囲条件の下で行われた。
【０１２０】
ＢＡＲＤＡＣ  ２０５  Ｍ及び２０８Ｍ（四級アンモニウム化合物とアルキルジメチルベンジルアンモニウムクロリドの配合物；Ｌｏｎｚａ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ．（スイス、ヴァレ）から販売）のヒドロゲルビーズが次のように調製された：ＰＣＴ国際公開特許公報ＷＯ  ２００７／１４６７２２号の実施例１の記述に従い、２０グラムのＥＯ２０−ＴＭＰＴＡ、３０グラムのＢＡＲＤＡＣ  ２０５Ｍ又は２０８Ｍ溶液、及び０．４グラムのＩｒｇａｃｕｒｅ  ２９５９を混合し、ＵＶ光を照射して、ビーズを調製した。ビーズは、ＢＡＲＤＡＣ  ２０５Ｍ及び２０８Ｍの脱イオン水溶液１２．５％及び２５％（ｗ／ｖ）溶液を使用して調製した。ビーズ回収後、瓶に入れて室温で保管した。ビーズは以下のように命名された：
【０１２１】
【表１】
2012503988.tif 000004
【０１２２】
調製例２
ヒドロゲル重合中のヒドロゲルビーズへのカチオン性モノマーの組み込み。
【０１２３】
カチオン性モノマーを有するポリマービーズは、ＰＣＴ国際公開特許ＷＯ２００７／１４６７２２号の実施例３０〜３４の記述に従って調製された。ビーズ製造に使用された前駆体組成物を表１に示す。前駆体組成物の種々の成分をアンバージャー内で、抗菌性モノマーが溶解するまで一緒に攪拌した。
【０１２４】
ＤＭＡＥＭＡ−Ｃ８Ｂｒを、機械攪拌器、温度プローブ、及び凝縮器を取り付けた三つ口丸底反応フラスコ内で生成した。反応フラスコに、ジメチルアミノエチルメタクリレート２３４部、アセトン６１７部、１−ブロモエタン５００部、及びＢＨＴ酸化防止剤０．５部を入れた。この混合物を２４時間、３５℃で攪拌した。この時点で、反応混合物を室温まで冷まし、わずかに黄色い透明溶液が得られた。この溶液を丸底フラスコに移し、減圧下４０℃で回転蒸発によりアセトンを除去した。結果として得られた固体を、低温の酢酸エチルで洗い、減圧下４０℃で乾燥させた。同様の手順を用いて、１−ブロモオクタンを１−ブロモデカン及び１−ブロモドデカンに置き換えることにより、それぞれＤＭＡＥＭＡ−Ｃ１０Ｂｒ及びＤＭＡＥＭＡ−Ｃ１２Ｂｒが形成された。
【０１２５】
３−（アクリロアミドプロピル）トリメチルアンモニウムクロリドは、東京化成工業（Tokyo Kasei Kogyo Ltd）（日本）から入手した。Ａｇｅｆｌｅｘ  ＦＡ−１Ｑ８０ＭＣは、Ｃｉｂａ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから入手した。
【０１２６】
【表２】
2012503988.tif 000005
【０１２７】
調製例３
ヒドロゲル重合中のヒドロゲルビーズへのルシフェリンの組み込み。
【０１２８】
ルシフェリンを含むヒドロゲルビーズが、次のように同様に生成された：ＰＣＴ国際公開特許公報ＷＯ  ２００７／１４６７２２  Ａ１号の実施例１の記述に従い、２０部のＥＯ２０−ＴＭＰＴＡを、３０部のルシフェリン（１４ｍＭのリン酸緩衝液３０ｍＬ中２ｍｇ、ｐＨ  ６．４）及び０．４部の光開始剤（ＩＲＧＡＣＵＲＥ  ２９５９）を混合し、ＵＶ光を照射して、ビーズを調製した。このビーズは次いで瓶に入れて４℃で保管し、Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ−１ｓと命名された。
【０１２９】
調製例４
ヒドロゲル重合中のヒドロゲルビーズへのルシフェラーゼの組み込み。
【０１３０】
ルシフェラーゼを含むヒドロゲルビーズが、次のように生成された：ＰＣＴ国際公開特許公報ＷＯ  ２００７／１４６７２２  Ａ１号の実施例１の記述に従い、２０部のポリマーを、３０部のルシフェラーゼ（１４ｍＭのリン酸緩衝液３０ｍＬ中、６．８ｍｇ／ｍＬを１５０μＬ、ｐＨ  ６．４）及び０．４部の光開始剤（ＩＲＧＡＣＵＲＥ  ２９５９）を混合し、ＵＶ光を照射して、ビーズを調製した。このビーズは次いで瓶に入れて４℃で保管し、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ−１ｓと命名された。
【０１３１】
調製例５
ヒドロゲル重合後のヒドロゲルビーズへの細胞抽出剤の組み込み。
【０１３２】
ヒドロゲルビーズは、ＰＣＴ国際公開特許公報ＷＯ  ２００７／１４６７２２号の実施例１の記述に従い、調製された。活性ビーズは、ＰＣＴ国際公開特許公報ＷＯ  ２００７／１４６７２２号の実施例１９の記述に従って乾燥させ、次いで実施例２３の記述に従って活性溶液に浸すことによって、調製された。ビーズ１グラムを６０℃で２時間乾燥させて、ビーズから水を除去した。乾燥させたビーズを２グラムのＢＡＲＤＡＣ  ２０５Ｍに、室温で少なくとも３時間〜一晩浸した。浸漬後、ビーズをブフナー漏斗に注いでビーズの水分を切り、次いで１０〜２０ｍＬの蒸留水ですすいだ。ペーパータオルを押し付けることによって、過剰の水をビーズ表面から除去した。このビーズは、ＢＡＲＤＡＣ  ２０５Ｍの１０％、１２．５％、２０％、２５％、５０％及び１００％（ｗ／ｖ）水溶液、２０８Ｍの５％、１０％、１２．５％、２５％及び５０％水溶液、トリクロサン（Ｃｉｂａ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）の２０％溶液、クロロヘキシジンジグルコネート（ＣＨＧ；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（ミズーリ州セントルイス））の１％及び５％溶液、並びにセチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）の０．２５％及び０．５％溶液を使用して調製された。このビーズは次いで瓶に入れて室温で保管された。ビーズは以下のように命名された。
【０１３３】
【表３】
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【０１３４】
ＶＡＮＴＯＣＩＬ（Ａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、コネチカット州ノーウォーク））、ＣＡＲＢＯＳＨＩＥＬＤ（Ｌｏｎｚａ）及びＶａｎｔｏｃｉｌとＣａｒｂｏＳｈｉｅｌｄとの配合物のヒドロゲルビーズが同様に調製された。乾燥されたヒドロゲルビーズを、ＶＡＮＴＯＣＩＬの５０％溶液（蒸留水中）、又はＣＡＲＢＯＳＨＩＥＬＤ  １０００の１００％溶液、又はＶａｎｔｏｃｉｌ  ５０％溶液とＣａｒｂｏｓｈｉｅｌｄ  １００％溶液との１：１混合物に浸した。ＶＡＮＴＯＣＩＬとＣＡＲＢＯＳＨＩＥＬＤとの混合物を有するビーズは、２５％のＶａｎｔｏｃｉｌビーズ及び５０％のＣａｒｂｏｓｈｉｅｌｄのビーズをもたらした。このビーズは次いで瓶に入れて室温で保管し、以下のように命名された。
【０１３５】
【表４】
2012503988.tif 000007
【０１３６】
調製例６
ヒドロゲル重合後のヒドロゲル繊維への細胞抽出剤の組み込み。
【０１３７】
ポリマー繊維は、米国特許出願公開第ＵＳ２００８／２０７７９４号の実施例１の記述に従って作製された。脱イオン水中で、約５００グラムの４０重量％  ２０モルＥＯ２０−ＴＭＰＴＡ（ＳＲ４１５、Ｓａｒｔｏｍｅｒから販売）と、１重量％の光開始剤（ＩＲＧＡＣＵＲＥ  ２９５９、Ｃｉｂａ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから販売）とを含有する、均質な前駆体組成物が調製された。この前駆体組成物を、米国特許出願公開第ＵＳ２００８／２０７７９４号の実施例１の記述に従って処理して、ポリマー繊維を作製した。
【０１３８】
繊維１グラムを６０℃で２時間乾燥させて、繊維から水を除去した。乾燥させた繊維を２グラムの５０％  ＢＡＲＤＡＣ  ２０５Ｍ溶液に室温で少なくとも３時間〜一晩浸した。浸漬後、繊維をブフナー漏斗に注いで繊維の水分を切り、次いで１０〜２０ｍＬの蒸留水ですすいだ。ペーパータオルを押し付けることによって、過剰の水を繊維表面から除去した。この繊維は次いで瓶に入れて室温で保管された。
【０１３９】
調製例７
ヒドロゲル重合後のヒドロゲルビーズへのルシフェリンの組み込み。
【０１４０】
ヒドロゲルビーズ（１×グラム）を６０℃で２時間乾燥させ、２×グラムのルシフェリン溶液（１４ｍＭのリン酸緩衝液３０ｍＬ中２ｍｇ、ｐＨ６．４）に４℃で少なくとも１６時間浸した。浸漬後、ビーズをブフナー漏斗に注いでビーズの水分を切り、次いで蒸留水ですすいだ。ペーパータオルを押し付けることによって、過剰の水をビーズ表面から除去した。このビーズは次いで瓶に入れて４℃で保管し、Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ−１ｐと命名された。
【０１４１】
調製例８
ヒドロゲル重合後のヒドロゲルビーズへの酵素の組み込み。
【０１４２】
ヒドロゲルビーズ（１×グラム）を６０℃で２時間乾燥させ、２×グラムのルシフェラーゼ溶液（１４ｍＭのリン酸緩衝液３０ｍＬ中、６．８ｍｇ／ｍＬを１５０μＬ、ｐＨ６．４）に４℃で少なくとも１６時間浸した。浸漬後、ビーズをブフナー漏斗に注いでビーズの水分を切り、次いで蒸留水ですすいだ。ペーパータオルを押し付けることによって、過剰の水をビーズ表面から除去した。リゾチーム又はリソスタフィンを含むヒドロゲルビーズは同様に、０．５ｍｇ／ｍＬのリゾチーム又は５０μｇ／ｍＬのリソスタフィンを含む５０ｍＭ  ＴＲＩＳ溶液（ｐＨ  ８．０）２×グラムに浸して調製した。このビーズは次いで瓶に入れて４℃で保管され、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ−１ｐ、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ−１ｐ及びＬｙｓｏｓｔａｐｈｉｎ−１ｐと命名された。
【０１４３】
調製例９
ヒドロゲル重合及びヒドロゲルビーズへの細胞抽出剤組み込みの後の、ヒドロゲルビーズのサイズ選択。
【０１４４】
ヒドロゲルビーズは、ＰＣＴ国際公開特許公報ＷＯ  ２００７／１４６７２２号の実施例１の記述に従い、調製された。このヒドロゲルビーズは、Ｇｌｉｓｏｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ（オハイオ州ルイスセンター）の、異なる微細シリーズのメッシュサイズであるＮｏ．１０（２．０ｍｍ）、Ｎｏ．１２（１．７ｍｍ）、Ｎｏ．１４（１．４ｍｍ）、Ｎｏ．１６（１．１８ｍｍ）及びＮｏ．１８（１．０ｍｍ）の８”（２０．３ｃｍ）試験用丸型ふるいにかけて、均一なサイズのビーズを得た。ビーズは、モデルＡＳ２００振盪器（Ｒｅｔｓｃｈ，Ｉｎｃ．（ペンシルバニア州ニュータウン））を使用し、１．００ｍｍ／「ｇ」で１５秒間隔に設定してふるいにかけた。各バッチの合計振盪時間は１０分間であった。調製例５の記述に従って、さまざまにサイズ選択されたビーズから、活性ビーズが調製された。一部のビーズは、５０％（ｗ／ｖ）ＢＡＲＤＡＣ  ２０５Ｍ水溶液を使用して調製された。他のビーズは、塩化ベンザルコニウム（ＢＡＣ；Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ（マサチューセッツ州ワードヒル））の１０％、１７．５％、又は２５％（ｗ／ｖ）水溶液を使用して調製された。このビーズは次いでアンバージャーに入れ、室温で保管された。ビーズは以下のように命名された。
【０１４５】
【表５】
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【０１４６】
（実施例１）
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ及びＥ．ｃｏｌｉ細胞からのＡＴＰ放出に対する、ＢＡＲＤＡＣ  ２０５Ｍ消毒剤搭載ヒドロゲルビーズの効果
【０１４７】
この実施例で使用された微生物種（表２）はＡＴＣＣ（バージニア州マナサス）から入手された。３Ｍ（商標）Ｃｌｅａｎ−Ｔｒａｃｅ（商標）表面ＡＴＰシステム及びＮＧ照度計ＵＮＧ２は、３Ｍ  Ｃｏｍｐａｎｙ（ミネソタ州セントポール）から入手された。レーヨン先端アプリケータは、Ｐｕｒｉｔａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（メイン州ギルフォード）から入手された。ＢＡＲＤＡＣ  ２０５Ｍを含むビーズは、調製例５に従って作製された。
【０１４８】
【表６】
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【０１４９】
微生物株の純粋培養物をトリプシン大豆培養液に接種し、３７℃で一晩培養した。Ｃｌｅａｎ−Ｔｒａｃｅ表面ＡＴＰ衛生試験の一部のスワブ（微生物細胞抽出剤を含む）を、滅菌済みレーヨン先端アプリケータ（微生物細胞抽出剤を含まない）に置き換えた。さまざまな量（１ｍＬ当たりそれぞれ約１０６、１０７及び１０８のコロニー形成単位（ＣＦＵ））の細菌を、バターフィールド緩衝液中に懸濁させ、細胞懸濁液を直接、Ｃｌｅａｎ−Ｔｒａｃｅ表面ＡＴＰスワブ（１０μＬ）又はレーヨン先端アプリケータ（１００μＬ）に加えた。各スワブ又はアプリケータは、メーカーの指示に従い、試薬チャンバ内に押し込んで活性化した。試験装置をすぐに、ＮＧ照度計ＵＮＧ２の読取りチャンバ内に挿入し、相対的光単位（ＲＬＵ）の初期（Ｔ０）測定値を記録した。ＢＡＲＤＡＣ  ２０５Ｍを含むヒドロゲルビーズ（２０５Ｍ−１ｐ）１個を、試験装置の一部に加え、照度計の「Ｕｎｐｌａｎｎｅｄ  Ｔｅｓｔｉｎｇ（無計画試験）」モードを用いて、続くＲＬＵ測定値を２０秒間隔で記録し、ＲＬＵ値が平坦になるまで行った。ＮＧ照度計に付属のソフトウェアを使用してデータをダウンロードした。２０５Ｍ−１ｐビーズは、表３のデータに示されているように、細菌を溶解させ、細胞からＡＴＰを放出させることができた。相対的光単位（ＲＬＵ）は、ＢＡＲＤＡＣ  ２０５Ｍビーズがある場合は経時的に増加し、ビーズがない場合のバックグラウンド値は増加しなかった。Ｃｌｅａｎ−Ｔｒａｃｅ表面ＡＴＰスワブを使用した実験では、ＲＬＵは２０秒以内に最大値に達してから、減少し始めたことを示した。
【０１５０】
【表７】
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【０１５１】
（実施例２）
Ｓ．ａｕｒｅｕｓからのＡＴＰ放出に対する、ＶＡＮＴＯＣＩＬ及びＣＡＲＢＯＳＨＩＥＬＤ消毒剤搭載ヒドロゲルビーズの効果。
【０１５２】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ一晩培養物が、実施例１の記述に従って調製された。ＶＡＮＴＯＣＩＬ及び／又はＣＡＲＢＯＳＨＩＥＬＤを含むヒドロゲルビーズは、調製例５の記述に従って調製された。ルシフェラーゼ／ルシフェリン液体試薬溶液（３００μＬ）をＣｌｅａｎ−Ｔｒａｃｅ表面ＡＴＰ衛生試験装置から取り出し、１．５ｍＬ微量遠心管に移した。細菌培養物をバターフィールド緩衝液で１０７ＣＦＵ／ｍＬに希釈し、この希釈懸濁液１０μＬを、個々の微量遠心管に直接加えた（すなわち、管１本当たり約１０５ＣＦＵ）。細菌懸濁液を加えてからすぐに、管をベンチトップ型照度計（ＦＢ−１２単管照度計、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＵＳＡ（テネシー州オークリッジ））に入れ、ＲＬＵの初期（Ｔ０）測定値を記録した。ＦＢ１２  Ｓｉｒｉｕｓ  ＰＣソフトウェアを使用する照度計から、初期値（及びそれ以降の発光測定値）が得られた。光信号は１秒間集積され、その結果はＲＬＵ／秒で表わされる。
【０１５３】
ＶＡＮＴＯＣＩＬ（Ｖａｎ−１ｐ）、ＣＡＲＢＯＳＨＩＥＬＤ（Ｃａｒｂｏ−１ｐ）、又はＶＡＮＴＯＣＩＬとＣＡＲＢＯＳＨＩＥＬＤとの両方（Ｖａｎ−Ｃａｒｂｏ−１ｐ）を含むヒドロゲルビーズを個々の管に加え、ＲＬＵ測定値を１０秒間隔で記録し、ＲＬＵ値が平坦になるまで行った（表３）。
【０１５４】
表４に示すように、個々の消毒剤又は消毒剤混合物を含むヒドロゲルビーズは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ細胞からＡＴＰを抽出し、そのＡＴＰは、Ｃｌｅａｎ−Ｔｒａｃｅ表面ＡＴＰ装置のＡＴＰ検出試薬と反応した。相対的光単位（ＲＬＵ）は、消毒剤を搭載したビーズを受け入れた管において経時的に増加したが、ビーズを含まない管では、時間が経ってもＲＬＵの有意な増加は見られなかった。
【０１５５】
【表８】
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【０１５６】
（実施例３）．
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ及びＥ．ｃｏｌｉ細胞からのＡＴＰ放出に対する、消毒剤搭載ビーズの数の影響。
【０１５７】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ及びＥ．ｃｏｌｉの一晩培養物を、実施例１の記述に従って調製した。実施例１の記述に従って、３Ｍ  Ｃｌｅａｎ−Ｔｒａｃｅ表面ＡＴＰシステムスワブを、滅菌レーヨン先端アプリケータに置き換えた。細菌懸濁液をバターフィールド緩衝液で約１０７ＣＦＵ／ｍＬに希釈した。この懸濁液の１００μＬアリコートをスワブに直接加えた。ＢＡＲＤＡＣ  ２０５Ｍヒドロゲルビーズは、調製例５の記述に従って調製された。最高３個のヒドロゲルビーズ（すなわちビーズ０個、１個、又は３個）を個々の試験装置に加え、各アプリケータをＣｌｅａｎ−Ｔｒａｃｅ表面ＡＴＰ試験装置に挿入して、メーカーの指示に従ってＡＴＰ検出を作動させた。この試験装置をすぐにＮＧ照度計ＵＮＧ２の読取りチャンバに挿入し、照度計の「Ｕｎｐｌａｎｎｅｄ  Ｔｅｓｔｉｎｇ（無計画試験）」モードを用いて、ＲＬＵ測定値を２０秒間隔で記録し、ＲＬＵ値が平坦になるまで行った。結果を表５に示す。データは、ＢＡＲＤＡＣ  ２０５Ｍビーズ２０５Ｍ−１ｐが細菌を浸透化し、細胞からＡＴＰを放出させたことを示している。相対的光単位（ＲＬＵ）は、ＢＡＲＤＡＣビーズを含むサンプルにおいて経時的に増加し、ビーズの数が多い場合には短時間でより大きな増加が観察された。これに対して、ビーズのないサンプルでは、ＲＬＵの同じような増加は示されなかった。
【０１５８】
【表９】
2012503988.tif 000012
【０１５９】
（実施例４）
さまざまな量の微生物細胞抽出剤にさらされた微生物細胞からのＡＴＰの検出。
【０１６０】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ及びＥ．ｃｏｌｉの一晩培養物を、実施例１の記述に従って調製した。これらの試験に使用する直前に、細菌懸濁液をバターフィールド緩衝液で希釈して、濃度約１０６及び１０７ＣＦＵ／ｍＬとした。Ｃｌｅａｎ−Ｔｒａｃｅ表面ＡＴＰシステムからルシフェラーゼ／ルシフェリン試薬（３００μＬ）を取り出し、１．５ｍＬ微量遠心管に加えた。１０μＬの量の細菌懸濁液を、試薬の入った個々の微量遠心管に直接加えた。ＢＡＲＤＡＣ  ２０５Ｍヒドロゲルビーズは、調製例５の記述に従って調製された。最高３個のヒドロゲルビーズ（すなわちビーズ０個、１個、又は３個）を各管に加えた。実施例２の記述に従い、ベンチトップ型照度計（ソフトウェア付きＦＢ−１２単管照度計）において、相対的光単位（ＲＬＵ）を１０秒間隔で記録した。この実験結果を表６に示す。この結果は、ＢＡＲＤＡＣ  ２０５Ｍビーズ（２０５Ｍ−１ｐ）が、細菌を溶解させ、細胞からＡＴＰを放出させることができたことを示している。相対的光単位（ＲＬＵ）は、少なくとも１個のＢＡＲＤＡＣ  ２０５Ｍビーズを含む管において経時的に増加し、ビーズの数が多い場合に短時間でより大きな増加が観察された。ビーズを含まない管は、ＲＬＵの有意な増加は示さなかった。
【０１６１】
【表１０】
2012503988.tif 000013
【０１６２】
（実施例５）
ＢＡＲＤＡＣ  ２０５Ｍ抗菌剤を含むヒドロゲルビーズにさらされた、生きた微生物細胞及び死んだ微生物細胞の懸濁液からのＡＴＰの検出。
【０１６３】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ及びＥ．ｃｏｌｉの一晩培養物を、実施例１の記述に従って調製した。トリプシン大豆培養液中の一晩培養物１ｍＬ（約１０９ＣＦＵ／ｍＬ）を１０分間煮沸して、細胞を溶解させた。生きた細胞の懸濁液と死んだ細胞の懸濁液の両方を、バターフィールド緩衝液で約１０７及び１０８ＣＦＵ／ｍＬに希釈した。実施例１の記述に従って、３Ｍ  Ｃｌｅａｎ−Ｔｒａｃｅ表面ＡＴＰシステムスワブを、滅菌レーヨン先端アプリケータに置き換えた。１０μＬの量の生菌の懸濁液、死菌の懸濁液、又は生菌の懸濁液と死菌の懸濁液との混合物を、レーヨンアプリケータ又はＣｌｅａｎ−Ｔｒａｃｅ表面ＡＴＰスワブに直接加えた。ＢＡＲＤＡＣ  ２０５Ｍヒドロゲルビーズ（２０５Ｍ−１ｐ）１個を試験装置に加え、各アプリケータ又はスワブを、Ｃｌｅａｎ−Ｔｒａｃｅ表面ＡＴＰ試験装置に挿入して、メーカーの指示に従ってＡＴＰ検出を作動させた。この試験装置をＮＧ照度計ＵＮＧ２機器に挿入し、照度計の「Ｕｎｐｌａｎｎｅｄ  Ｔｅｓｔｉｎｇ（無計画試験）」モードを用いて、このＲＬＵ測定値を１５秒間隔で記録し、ＲＬＵ値が平坦になるまで行った。結果を表７に示す。死んだ細胞を含むサンプルで観察されたＲＬＵは約３０秒以内に最大値に達し、ＢＡＲＤＡＣビーズを加えても、測定可能なＲＬＵに有意な変化は生じなかった。生きた細胞及び死んだ細胞の両方を含むサンプルにおいては、ＢＡＲＤＡＣビーズを加えると、数分間かけて比較的ゆるやかにＲＬＵが増加し、ビーズが生きた細胞からＡＴＰを放出させたことを示している。一方、Ｃｌｅａｎ−Ｔｒａｃｅ表面ＡＴＰスワブ（細胞抽出剤を含む）を含む管は、ＲＬＵが最初に増加し、約３０秒〜１分以内に最大値に達することを示した。
【０１６４】
【表１１】
2012503988.tif 000014
【０１６５】
（実施例６）
追加した純粋ＡＴＰの存在下でＢＡＲＤＡＣ  ２０５Ｍ抗菌剤を含むヒドロゲルビーズにさらされた微生物細胞の懸濁液からのＡＴＰの検出。
【０１６６】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ及びＥ．ｃｏｌｉの一晩培養物を、実施例１の記述に従って調製した。これらの試験に使用する直前に、細菌懸濁液をバターフィールド緩衝液で希釈して、濃度約１０８ＣＦＵ／ｍＬとした。Ｃｌｅａｎ−Ｔｒａｃｅ表面ＡＴＰシステムからルシフェラーゼ／ルシフェリン試薬（３００μＬ）を取り出し、１．５ｍＬ微量遠心管に加えた。ＡＴＰ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の１００ｎＭ溶液を滅菌水で調製した。ＡＴＰ溶液１０μＬを、試薬の入った個々の微量遠心管に加えた。細菌懸濁液１０μＬを、試薬及びＡＴＰの入った一部の管に加えた。ＢＡＲＤＡＣ  ２０５Ｍヒドロゲルビーズを、調製例５の記述に従って調製し、ビーズ１個（２０５Ｍ−１ｐ）を一部の管に加えた。実施例２の記述に従い、ベンチトップ型照度計（ソフトウェア付きＦＢ−１２単管照度計）において、相対的光単位（ＲＬＵ）を１０秒間隔で記録した。この実験結果を表８に示す。この結果は、純粋なＡＴＰ含有溶液に細菌を加えると、ＢＡＲＤＡＣ  ２０５Ｍビーズの存在下において、信号が増加することを示している。ビーズからの抽出剤は、細胞からＡＴＰを放出させることができ、これによりＡＴＰ濃度の増加が生じ、これが純粋なＡＴＰバックグラウンドを上回る信号増加に寄与している。ビーズも細菌も含まない管は、純粋なＡＴＰのみの場合に比べて、ＲＬＵの有意な増加は示さなかった。
【０１６７】
【表１２】
2012503988.tif 000015
【０１６８】
（実施例７）
牛乳中の生きた微生物ＡＴＰの検出。
【０１６９】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓの一晩培養物を、実施例１の記述に従って調製した。ＢＡＲＤＡＣ  ２０５Ｍビーズは、調製例５の記述に従って調製された。新鮮な未殺菌牛乳を、ワイオミング州リバーフォールズの牧場から入手した。この牛乳をバターフィールド緩衝液で希釈した（１００倍及び１０００倍）。希釈した牛乳１００μＬを、１．５ｍＬ管中で、Ｃｌｅａｎ−Ｔｒａｃｅ表面ＡＴＰシステムのルシフェラーゼ／ルシフェリン試薬１００μＬと混合し、実施例２の記述に従い、ベンチトップ型照度計（ソフトウェア付きＦＢ−１２単管照度計）で、初期（Ｔ０）発光測定値を記録した。数回の測定後、ＢＡＲＤＡＣ  ２０５Ｍビーズ（２０５Ｍ−１ｐ）１個を牛乳に加え、続く発光測定値を１０秒間隔で記録した。他のサンプルには、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（１０μＬバターフィールド緩衝液中に約１０５個の細胞）を加え、初期発光測定を行った後、２０５Ｍ−１ｐビーズ１個をサンプルに加えた。続く発光測定値を１０秒間隔で記録した。結果を表９に示す。データは、牛乳に追加した細菌をＢＡＲＤＡＣビーズが溶解させ、細胞からＡＴＰを放出させることができ、これにより高い発光測定値が生じたことを示している。追加した細菌のないサンプルでは、ＢＡＲＤＡＣビーズを追加した後の発光の同じような増加は示さなかった。
【０１７０】
【表１３】
2012503988.tif 000016
【０１７１】
（実施例８）
微生物ＡＴＰと体細胞ＡＴＰとの識別。
【０１７２】
ＣＲＦＫネコ腎臓細胞（ＣＣＬ−９４、ＡＴＣＣ）を、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で、８％血清と共に、ＣＯ２雰囲気中３７℃で培養して、集密度７０％を得た。瓶から培地を取り出し、細胞の単層を洗浄し、約５分間トリプシン化した（０．２５％トリプシン）。離れた細胞を新鮮な培地で希釈し、３Ｋで５分間遠心分離にかけた。この細胞を更に２回洗い、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁させた。細胞をＰＢＳで希釈して、望ましい細胞濃度を得た。１．５ｍＬ管中で、細胞１００μＬを、Ｃｌｅａｎ−Ｔｒａｃｅ表面ＡＴＰシステムのルシフェラーゼ／ルシフェリン試薬１００μＬと混合した。１つの実験において、この管を、実施例２の記述に従い、ベンチトップ型照度計（ソフトウェア付きＦＢ−１２単管照度計）に入れ、初期発光測定値を記録した。いくつかの初期測定後、ＢＡＲＤＡＣ  ２０５Ｍビーズ（２０５Ｍ−１ｐ）１個を細胞懸濁液に加え、発光を１０秒間隔でモニターした。別の実験において、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（バターフィールド緩衝液１０μＬ中に約１０５個又は１０６個の細胞）を管に加えてから、発光測定を開始した。結果を表１０に示す。データは、ＢＡＲＤＡＣビーズが、哺乳類細胞及び細菌細胞の両方からのＡＴＰ放出を引き起こし、ビーズを加えた後に発光の増加をもたらすことができたことを示している。別の実験において、ＣＲＦＫ細胞及びＢＡＲＤＡＣビーズの入ったサンプルで、発光がモニターされた。３分後、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ細胞を同じサンプルに加え、更に２分間、発光がモニターされた。その結果は、表１０に示すように、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ細胞の追加によって発光量が増加したことを示している。
【０１７３】
【表１４】
2012503988.tif 000017
【０１７４】
（実施例９）
食物抽出物における生きた微生物細胞からのＡＴＰの検出。
【０１７５】
ストマッカーバッグ中のＰＢＳ  １００ｍＬに、食品サンプル１０ｇを加え、ストマッカー中で消化することによって、さまざまな食物抽出物（ホウレンソウ、バナナ、七面鳥ひき肉）が調製された。１００μＬのホウレンソウ及びバナナ抽出物、並びに１００μＬの希釈した七面鳥肉抽出物（１０倍及び１００倍）を、１．５ｍＬ管中で、Ｃｌｅａｎ−Ｔｒａｃｅ表面ＡＴＰシステムのルシフェラーゼ／ルシフェリン試薬１００μＬと混合し、ベンチトップ型照度計（２０／２０ｎ単管照度計、Ｔｕｒｎｅｒ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州サニーベール））でバックグラウンド測定値が測定された。照度計に付属の２０／２０ｎ  ＳＩＳソフトウェアを使用する照度計から初期値（及びそれ以降の発光測定値）が得られた。光信号は１秒間集積され、その結果はＲＬＵ／秒で表わされる。何回かの測定後、ＢＡＲＤＡＣ  ２０５Ｍビーズ（２０５Ｍ−１ｐ）１個を食物抽出物に加え、１０秒間隔でＡＴＰ放出がモニターされた。バックグラウンドレベルはバナナ及び七面鳥肉抽出物で非常に高く、ＢＡＲＤＡＣビーズ追加によってレベルは増加した。２分後、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ細胞（１０５個）を食物抽出物及びＢＡＲＤＡＣビーズを含む同じサンプルに加え、更に４分間、ＡＴＰ放出をモニターした。ＡＴＰレベルは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ細胞の追加によって増加した（表１１）。
【０１７６】
【表１５】
2012503988.tif 000018
【０１７７】
（実施例１０）
水中の微生物細胞からのＡＴＰの検出。
【０１７８】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓの一晩培養物を、実施例１の記述に従って調製した。地域の冷却塔２ヶ所から、冷却塔水サンプルを取得した。各冷却塔の水１００μＬを、個々の１．５ｍＬ微量遠心管内で、Ｃｌｅａｎ−Ｔｒａｃｅ表面ＡＴＰシステムのルシフェリン／ルシフェラーゼ試薬１００μＬと混合した。実施例９の記述に従い、ベンチトップ型照度計（ソフトウェア付き２０／２０ｎ単管照度計）で、１０秒間隔で発光が測定された。何回かの測定の後、ＢＡＲＤＡＣ  ２０５Ｍビーズ（２０５Ｍ−１ｐ）１個を水サンプルに加え、追加の発光測定値を記録して、水サンプル中の固有の細胞からＡＴＰが放出されたかどうかを調べた。同じ冷却塔からの冷却水の他のサンプルに対し、約１０５ＣＦＵのＳ．ａｕｒｅｕｓ（１０μＬのバターフィールド緩衝液中に懸濁）を、ルシフェリン／ルシフェラーゼ試薬の入った個々の１．５ｍＬ管に加えた。ベンチトップ型照度計（２０／２０ｎ単管照度計）で発光が測定された。バックグラウンド（Ｔ０）測定を行った後、ＢＡＲＤＡＣ  ２０５Ｍビーズ（２０５Ｍ−１ｐ）１個をサンプルに加え、１０秒間隔で発光が記録された。結果を表１２に示す。データは、水に追加した細菌をＢＡＲＤＡＣビーズが溶解させ、また細胞からＡＴＰを放出させることができ、これにより経時的に発光が増加したことを示している。
【０１７９】
【表１６】
2012503988.tif 000019
【０１８０】
（実施例１１）
水性抽出剤、及び抽出剤を含むヒドロゲルビーズにさらされた生きた微生物細胞の懸濁液からのＡＴＰの検出。
【０１８１】
ＢＡＲＤＡＣ  ２０５Ｍ及び２０８Ｍビーズが、調製例５の記述に従って製造された。１ｇのＢＡＲＤＡＣ  ２０５Ｍビーズ（２０５Ｍ−１ｐ）を、１００ｍＬの蒸留水に加え、水溶性抗菌剤成分をビーズからバルク溶媒中に４５分間拡散させた。このビーズを取り出し、抗菌剤溶液（「ビーズ抽出液」）を取り置いた。放出された四級塩化アンモニウム（ＱＡＣ）の量を、ＬａＭｏｔｔｅ  ＱＡＣ試験キットモデルＱＴ−ＤＲ（ＬａＭｏｔｔｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ、メリーランド州チェスタータウン）を使用して推定した。４５分経過後に放出されたＱＡＣの量は２４０ｐｐｍであった。
【０１８２】
蒸留水で、溶菌液（０．０７％  ｗ／ｖクロルヘキシジンジグルコネート（ＣＨＧ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）及び０．１６％  ｗ／ｖ  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）が調製された。実施例１の記述に従ってＳ．ａｕｒｅｕｓ一晩培養物を調製し、細胞をバターフィールド緩衝液で希釈した。約１０５個の細胞が入った１．５ｍＬ微量遠心管中に、Ｃｌｅａｎ−Ｔｒａｃｅ表面ＡＴＰシステムのルシフェリン／ルシフェラーゼ試薬１００μＬを加えた。溶菌液（２５又は５０μＬ）又はビーズ抽出液（２５又は５０μＬ）を、微量遠心管の１つに加え、結果として得られる発光を、実施例９の記述に従って、ベンチトップ型照度計（ソフトウェア付き２０／２０ｎ単管照度計）でモニターした。別のサンプルセットにＢＡＲＤＡＣ  ２０５Ｍ又は２０８Ｍビーズ１個を加え、発光を同様にモニターした。結果を表１３に示す。データは、細菌からのＡＴＰの放出によって生成された発光は、ＢＡＲＤＡＣビーズを受け入れたサンプルにおいて非常にゆるやかであったことを示している。一方、溶菌液又はビーズ抽出液を受け入れたサンプルは、発光の急激な増加を示し、細菌からのＡＴＰの急速な放出に対応している。
【０１８３】
【表１７】
2012503988.tif 000020
【０１８４】
（実施例１２）
さまざまな量の抽出剤を含むヒドロゲルビーズにさらされた微生物細胞の懸濁液からのＡＴＰの検出。
【０１８５】
さまざまな量のＢＡＲＤＡＣ  ２０５Ｍ又は２０８Ｍを有するヒドロゲルビーズが、調製例５の記述に従って調製された。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ及びＥ．ｃｏｌｉの一晩培養物を、実施例１の記述に従って調製した。Ｃｌｅａｎ−Ｔｒａｃｅ表面ＡＴＰシステムのルシフェラーゼ／ルシフェリン試薬１００μＬを、各細菌培養物の１つを約１０５ＣＦＵ含む個々の１．５ｍＬ微量遠心管に加えた。ビーズ１個又はＣｌｅａｎ−Ｔｒａｃｅ表面ＡＴＰスワブを各管に加えた。細胞からのＡＴＰ放出によって起こる発光を、実施例９の記述に従って、ベンチトップ型照度計（ソフトウェア付き２０／２０ｎ単管照度計）で１０秒間隔で記録した。結果を表１４及び表１５に示す。データは、ビーズを含むサンプルにおいてＡＴＰ放出が非常にゆるやかであったことを示している。一方、スワブ（これには細胞抽出剤溶液が含まれる）を含むサンプルでは、細胞からのＡＴＰの非常に急速な放出が示された。
【０１８６】
【表１８】
2012503988.tif 000021
【０１８７】
【表１９】
2012503988.tif 000022
【０１８８】
（実施例１３）
さまざまな抗菌剤搭載ヒドロゲルビーズにさらされたＳ．ａｕｒｅｕｓからのＡＴＰの放出。
【０１８９】
さまざまな量のＢＡＲＤＡＣ  ２０５Ｍ又は２０８Ｍを有するヒドロゲルビーズが、調製例１の記述に従って調製された。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ一晩培養物が、実施例１の記述に従って調製された。微量遠心管（１．５ｍＬ）が、Ｃｌｅａｎ−Ｔｒａｃｅ表面ＡＴＰシステムのルシフェリン／ルシフェラーゼ試薬１００μＬを加えることによって準備された。希釈した懸濁液１００μＬを、個々の微量遠心管に直接加えた（すなわち管１本当たり約１０５ＣＦＵ）。実施例９の記述に従って、細菌懸濁液を加えてからすぐに、管をベンチトップ型照度計（ソフトウェア付き２０／２０ｎ単管照度計）に入れ、ＲＬＵの初期（Ｔ０）測定値を記録した。抽出剤を含むヒドロゲルビーズを個々の管に加え、ＲＬＵ測定値を１０秒間隔で記録し、ＲＬＵ値が平坦になるまで、又は減少し始めるまで行った（表１６）。データは、ビーズ製剤の４つすべてが、微生物細胞からのＡＴＰ放出を起こしたことを示している。
【０１９０】
【表２０】
2012503988.tif 000023
【０１９１】
（実施例１４）
抗菌剤搭載ヒドロゲルビーズにさらされたさまざまな微生物細胞からのＡＴＰの放出。
【０１９２】
さまざまな量のＢＡＲＤＡＣ  ２０５Ｍ又は２０８Ｍを有するヒドロゲルビーズが、調製例５の記述に従って調製された。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ及びＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの培養物が、実施例１の記述に従って調製された。微量遠心管（１．５ｍＬ）が、Ｃｌｅａｎ−Ｔｒａｃｅ表面ＡＴＰシステムのルシフェリン／ルシフェラーゼ試薬１００μＬを加えることによって準備された。希釈した懸濁液１００μＬを、個々の微量遠心管に直接加えた（すなわち管１本当たり約１０５ＣＦＵ）。実施例９の記述に従って、細菌懸濁液を加えてからすぐに、管をベンチトップ型照度計（ソフトウェア付き２０／２０ｎ単管照度計）に入れ、ＲＬＵの初期（Ｔ０）測定値を記録した。抽出剤を含むヒドロゲルビーズを個々の管に加え、ＲＬＵ測定値を１０秒間隔で記録し、ＲＬＵ値が平坦になるまで、又は減少し始めるまで行った（表１７）。データは、ビーズ製剤すべてが、微生物細胞からのＡＴＰ放出を起こしたことを示している。
【０１９３】
【表２１】
2012503988.tif 000024
【０１９４】
（実施例１５）
ＢＡＲＤＡＣ  ２０５Ｍヒドロゲルビーズにさらされたさまざまな微生物細胞からのＡＴＰの放出。
【０１９５】
ＢＡＲＤＡＣ  ２０５Ｍの５０％溶液を有するヒドロゲルビーズが、調製例５の記述に従って調製された。多くの異なる微生物の培養物が、実施例１の記述に従って調製された。微量遠心管（１．５ｍＬ）が、Ｃｌｅａｎ−Ｔｒａｃｅ表面ＡＴＰシステムのルシフェリン／ルシフェラーゼ試薬１００μＬを加えることによって準備された。希釈した懸濁液１００μＬを、個々の微量遠心管に直接加えた（すなわち管１本当たり約１０５又は１０６又は１０７ＣＦＵ）。実施例９の記述に従って、細菌懸濁液を加えてからすぐに、管をベンチトップ型照度計（ソフトウェア付き２０／２０ｎ単管照度計）に入れ、ＲＬＵの初期（Ｔ０）測定値を記録した。５０％  ＢＡＲＤＡＣ  ２０５Ｍ溶液から製造したヒドロゲルビーズ（２０５Ｍ−２ｐ）を個々の管に加え、ＲＬＵ測定値を１０秒間隔で記録し、ＲＬＵ値が平坦になるまで、又は減少し始めるまで行った（表１８）。データは、ＢＡＲＤＡＣ  ２０５Ｍを含むヒドロゲルビーズがさまざまな微生物細胞からのＡＴＰ放出を起こしたことを示している。
【０１９６】
【表２２】
2012503988.tif 000025
【０１９７】
（実施例１６）
連続攪拌した場合と攪拌しない場合の、ヒドロゲルビーズを含むＢＡＲＤＡＣ  ２０５Ｍにさらされた微生物細胞の懸濁液からのＡＴＰの検出。
【０１９８】
ＢＡＲＤＡＣ  ２０５Ｍ（２０５Ｍ−２ｐ）の５０％溶液を有するヒドロゲルビーズが、調製例５の記述に従って調製された。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ及びＥ．ｃｏｌｉの一晩培養物を、実施例１の記述に従って調製した。Ｃｌｅａｎ−Ｔｒａｃｅ表面ＡＴＰシステムのルシフェリン／ルシフェラーゼ試薬１００μＬを、各細菌培養物の１つを約１０５ＣＦＵ又は１０６含む個々の１．５ｍＬ微量遠心管に加えた。実施例９の記述に従って、細菌懸濁液を加えてからすぐに、管をベンチトップ型照度計（ソフトウェア付き２０／２０ｎ単管照度計）に入れ、ＲＬＵの初期（Ｔ０）測定値を記録した。２０５Ｍ−１ｐビーズ１個を各管に加えた。一方の管セットは、各読取りの間５秒間、渦動させ、細胞からのＡＴＰ放出による発光を１０秒間隔で記録した。もう一方の管セットは、渦動させず、各読取りの間５秒間静置した。結果を表１９に示す。データは、混合した管ではＡＴＰ放出が非常に急速であり、混合しなかったサンプルでは非常にゆるやかであったことを示している。
【０１９９】
【表２３】
2012503988.tif 000026
【０２００】
（実施例１７）
ヒドロゲルビーズを含む、破砕したＢＡＲＤＡＣ  ２０５Ｍ及び破砕していないＢＡＲＤＡＣ  ２０５Ｍにさらされた微生物細胞の懸濁液からのＡＴＰの検出。
【０２０１】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ及びＥ．ｃｏｌｉの一晩培養物を、実施例１の記述に従って調製した。Ｃｌｅａｎ−Ｔｒａｃｅ表面ＡＴＰシステムのルシフェラーゼ／ルシフェリン試薬１００μＬを、各細菌培養物の１つを約１０５ＣＦＵ又は１０６含む個々の１．５ｍＬ微量遠心管に加えた。実施例９の記述に従って、細菌懸濁液を加えてからすぐに、管をベンチトップ型照度計（ソフトウェア付き２０／２０ｎ単管照度計）に入れ、ＲＬＵの初期（Ｔ０）測定値を記録した。ＢＡＲＤＡＣ  ２０５Ｍビーズ（２０５Ｍ−２ｐ）１個を各管に加え、一方の管セットでは、滅菌綿棒の丸い端部を使ってビーズを破砕した。細胞からのＡＴＰ放出による発光を、１０秒間隔で記録した。結果を表２０に示す。データは、破砕したビーズは細胞からＡＴＰを急速に放出し、一方で破砕していないビーズは、ＡＴＰレベルのゆるやかな増加を示している。
【０２０２】
【表２４】
2012503988.tif 000027
【０２０３】
（実施例１８）
さまざまな抽出剤を含むヒドロゲルビーズにさらされた微生物細胞の懸濁液からのＡＴＰの検出。
【０２０４】
さまざまな量のクロルヘキシジンジグルコネート（ＣＨＧ）又はセチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）及びトリクロサンを有するヒドロゲルビーズが、調製例５の記述に従って調製された。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ及びＥ．ｃｏｌｉの一晩培養物を、実施例１の記述に従って調製した。Ｃｌｅａｎ−Ｔｒａｃｅ表面ＡＴＰシステムのルシフェリン／ルシフェラーゼ試薬１００μＬを、各細菌培養物の１つを約１０６ＣＦＵ含む個々の１．５ｍＬ微量遠心管に加えた。実施例９の記述に従って、細菌懸濁液を加えてからすぐに、管をベンチトップ型照度計（ソフトウェア付き２０／２０ｎ単管照度計）に入れ、ＲＬＵの初期（Ｔ０）測定値を記録した。抽出剤を含むビーズ１個を各チューブに加えた。細胞からのＡＴＰ放出による発光を、１０秒間隔で記録した。結果を表２１に示す。データは、ＣＨＧ、ＣＴＡＢ及びトリクロサンビーズが細胞からＡＴＰを放出させることができたことを示している。
【０２０５】
【表２５】
2012503988.tif 000028
【０２０６】
（実施例１９）
カチオン性モノマーを含むヒドロゲルビーズにさらされた微生物細胞の懸濁液からのＡＴＰの検出。
【０２０７】
カチオン性モノマーを有するヒドロゲルビーズが、調製例２の記述に従って調製された。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ及びＥ．ｃｏｌｉの一晩培養物を、実施例１の記述に従って調製した。Ｃｌｅａｎ−Ｔｒａｃｅ表面ＡＴＰシステムのルシフェリン／ルシフェラーゼ試薬１００μＬを、各細菌培養物の１つを約１０６ＣＦＵ含む個々の１．５ｍＬ微量遠心管に加えた。実施例９の記述に従って、細菌懸濁液を加えてからすぐに、管をベンチトップ型照度計（ソフトウェア付き２０／２０ｎ単管照度計）に入れ、ＲＬＵの初期（Ｔ０）測定値を記録した。抽出剤を含むビーズ１個を各チューブに加えた。細胞からのＡＴＰ放出による発光を、１０秒間隔で記録した。結果を表２２に示す。データは、カチオン性モノマーを含むビーズが、細胞からＡＴＰを放出させることができたことを示している。
【０２０８】
【表２６】
2012503988.tif 000029
【０２０９】
（実施例２０）
微生物抽出剤を含むヒドロゲル繊維にさらされた微生物細胞の懸濁液からのＡＴＰの検出。
【０２１０】
ヒドロゲル繊維は、調製例６の記述に従って調製された。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ及びＥ．ｃｏｌｉの一晩培養物を、実施例１の記述に従って調製した。Ｃｌｅａｎ−Ｔｒａｃｅ表面ＡＴＰシステムのルシフェリン／ルシフェラーゼ試薬１００μＬを、各細菌培養物の１つを約１０５ＣＦＵ又は１０６ＣＦＵ含む個々の１．５ｍＬ微量遠心管に加えた。実施例９の記述に従って、細菌懸濁液を加えてからすぐに、管をベンチトップ型照度計（ソフトウェア付き２０／２０ｎ単管照度計）に入れ、ＲＬＵの初期（Ｔ０）測定値を記録した。抽出剤を含むヒドロゲル繊維約５ｍｇを、各管に加えた。細胞からのＡＴＰ放出による発光を、１０秒間隔で記録した。結果を表２３に示す。データは、微生物抽出剤を含む繊維が、細胞からＡＴＰを放出させることができることを示している。
【０２１１】
【表２７】
2012503988.tif 000030
【０２１２】
（実施例２１）
水性抽出剤にさらされた生きた微生物細胞の懸濁液からのＡＴＰの検出
【０２１３】
ＢＡＲＤＡＣ  ２０５Ｍを水で希釈して、０．１％、０．５％、及び１％の水溶液とした。実施例１に説明されるようにＳ．ａｕｒｅｕｓ及びＥ．ｃｏｌｉ一晩培養物を調製し、細胞をバターフィールド緩衝液で希釈した。約１０５個の細胞が入った１．５ｍＬ微量遠心管に、Ｃｌｅａｎ−Ｔｒａｃｅ表面ＡＴＰシステムのルシフェリン／ルシフェラーゼ試薬１００μＬを加えた。実施例９の記述に従って、細菌懸濁液を加えてからすぐに、管をベンチトップ型照度計（ソフトウェア付き２０／２０ｎ単管照度計）に入れ、ＲＬＵの初期（Ｔ０）測定値を記録した。ＢＡＲＤＡＣ  ２０５Ｍ溶液を１〜５μＬを、微量遠心管それぞれに加え、結果として生じる発光を、ベンチトップ型照度計（２０／２０ｎ単管照度計）でモニターした。結果を表２４に示す。良好な信号を達成するＢＡＲＤＡＣ  ２０５Ｍの有効濃度は０．００２５〜０．００５％であった。
【０２１４】
【表２８】
2012503988.tif 000031
【０２１５】
（実施例２２）
ルシフェリンヒドロゲルビーズ
【０２１６】
ルシフェリンを含むヒドロゲルビーズが、直接法（調製例３）又は後吸収法（post-absorption）（調製例７）のいずれかを使用して製造された。
【０２１７】
１００μＬのＰＢＳ、１０μＬの１μＭ  ＡＴＰ、及び１μＬの６．８μｇ／ｍＬルシフェラーゼを入れた微量遠心管が準備された。実施例９の記述に従い、バックグラウンド測定値をベンチトップ型照度計（ソフトウェア付き２０／２０ｎ単管照度計）で測定し、ルシフェリンを含むヒドロゲルビーズを管に加えた後、１０秒間隔で測定した。後吸収ビーズは、調製ビーズよりも活性が高かった（表２４）。
【０２１８】
【表２９】
2012503988.tif 000032
【０２１９】
（実施例２３）
ルシフェラーゼヒドロゲルビーズ
【０２２０】
ルシフェラーゼを含むヒドロゲルビーズが、直接法（調製例４）又は後吸収法（調製例８）のいずれかを使用して製造された。
【０２２１】
１００μＬのルシフェラーゼアッセイ基質緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ウィスコンシン州マディソン）の入った微量遠心管が準備された。バックグラウンド測定値をベンチトップ型照度計（ソフトウェア付き２０／２０ｎ単管照度計、実施例９の記述に従う）で測定し、ルシフェラーゼを含むヒドロゲルビーズを管に加えた後、１０秒間隔で測定した。両方のタイプのビーズが、良好な活性を示した（表２６）。
【０２２２】
【表３０】
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【０２２３】
類似の実験において、後吸収ルシフェラーゼビーズの数を増やした場合の効果が試験された。１００μＬのルシフェラーゼアッセイ基質緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）の入った微量遠心管が準備され、ルシフェラーゼヒドロゲルビーズ（管１本当たりビーズ１〜４個）を加えた。すぐに、ベンチトップ型照度計（ソフトウェア付きＦＢ−１２単管照度計、実施例２の記述に従う）で発光をモニターした。実験は同じものを３回実施した。表２７に示す結果は、管当たりのビーズの数とルシフェラーゼ活性量との間には全般的に線形関係があることを示している。
【０２２４】
【表３１】
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【０２２５】
（実施例２４）
さまざまなサイズのＢＡＲＤＡＣ  ２０５Ｍ搭載ヒドロゲルビーズにさらされた微生物細胞からのＡＴＰの検出。
【０２２６】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ一晩培養物が、実施例１の記述に従って調製された。これらの試験に使用する直前に、細菌懸濁液をバターフィールド緩衝液で希釈して、濃度約１０８ＣＦＵ／ｍＬとした。Ｃｌｅａｎ−Ｔｒａｃｅ表面ＡＴＰシステムからルシフェラーゼ／ルシフェリン試薬（６００μＬ）を取り出し、１．５ｍＬ微量遠心管に加えた。１０μＬの量の細菌懸濁液を、試薬の入った個々の微量遠心管に直接加えた。サイズ選択されたＢＡＲＤＡＣ  ２０５Ｍヒドロゲルビーズは、調製例９の記述に従って調製された。各サイズ選択された群のヒドロゲルビーズ３個を管に加え、各ビーズについて別々の管５本で試験を実施した。ベンチトップ型照度計（ソフトウェア付き２０／２０ｎ単管照度計、実施例９の記述に従う）で、１０秒間隔で発光が測定された。この実験結果を表２８及び２９に示す。表に示す重量は、それぞれの各管中にあるビーズの合計質量を示す。この結果は、サイズ選択されたＢＡＲＤＡＣ  ２０５Ｍビーズすべてが細菌を溶解させ、細胞からＡＴＰを放出させることができたことを示している。
【０２２７】
【表３２】
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【０２２８】
【表３３】
2012503988.tif 000036
【０２２９】
（実施例２５）
さまざまなサイズの塩化ベンザルコニウム搭載ヒドロゲルビーズにさらされた微生物細胞からのＡＴＰの検出。
【０２３０】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ及びＥ．ｃｏｌｉの一晩培養物を、実施例１の記述に従って調製した。これらの試験に使用する直前に、細菌懸濁液をバターフィールド緩衝液で希釈して、濃度約１０８ＣＦＵ／ｍＬとした。Ｃｌｅａｎ−Ｔｒａｃｅ表面ＡＴＰシステムからルシフェラーゼ／ルシフェリン試薬（６００μＬ）を取り出し、１．５ｍＬ微量遠心管に加えた。１０μＬの量の細菌懸濁液を、試薬の入った個々の微量遠心管に直接加えた。サイズ選択されたＢＡＣヒドロゲルビーズは、調製例９の記述に従って調製された。各サイズ選択された群から、ヒドロゲルビーズ６個（ＢＡＣ−１ｐ）又はヒドロゲルビーズ８個（ＢＡＣ−２ｐ、ＢＡＣ−３ｐ及びＢＡＣ−４ｐ）を管に加え、各ビーズについて別々のいくつかの管で試験を実施した。ベンチトップ型照度計（ソフトウェア付き２０／２０ｎ単管照度計、実施例９の記述に従う）で、１０秒間隔で発光が測定された。この実験の結果を表３０〜３２に示す。表に示す重量は、それぞれの各管中にあるビーズの合計質量を示す。この結果は、ＢＡＣ搭載ビーズが細菌を溶解し、細胞からＡＴＰを放出させることができたことを示している。ＢＡＣを含むサイズ選択されたビーズ（１．４〜１．７ｍｍ及び１．１８〜１．４ｍｍビーズ）は、複製でも一貫して、信号を着実に増加させた。
【０２３１】
【表３４】
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【０２３２】
【表３５】
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【０２３３】
【表３６】
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【０２３４】
（実施例２６）
Ｓ．ａｕｒｅｕｓからのＡＴＰ放出に対する、塩化ベンザルコニウム搭載ビーズの数の影響。
【０２３５】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ一晩培養物が、実施例１の記述に従って調製された。これらの試験に使用する直前に、細菌懸濁液をバターフィールド緩衝液で希釈して、濃度約１０７及び１０８ＣＦＵ／ｍＬとした。Ｃｌｅａｎ−Ｔｒａｃｅ表面ＡＴＰシステムからルシフェラーゼ／ルシフェリン試薬（６００μＬ）を取り出し、１．５ｍＬ微量遠心管に加えた。１０μＬの量の細菌懸濁液を、試薬の入った個々の微量遠心管に直接加えた。サイズ選択されたＢＡＣヒドロゲルビーズは、調製例９の記述に従って調製された。さまざまな量のヒドロゲルビーズ（ＢＡＣ−３ｐ）を管に加え、いくつかの複製において試験を行った。ベンチトップ型照度計（ソフトウェア付き２０／２０ｎ単管照度計、実施例９の記述に従う）で、１０秒間隔で発光が測定された。この実験の結果を表３３及び３４に示す。表に示す重量は、それぞれの各管中にあるビーズの合計質量を示す。この結果は、ＢＡＣ搭載ビーズが細菌を溶解し、細胞からＡＴＰを放出させることができたことを示している。ＢＡＣを含むサイズ選択されたビーズ（１．１８〜１．４ｍｍビーズ）は、異なる量のビーズを有する複製でも一貫して、信号を着実に増加させた。
【０２３６】
【表３７】
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【０２３７】
【表３８】
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【０２３８】
ここで、本発明は、できる限り可能な説明のため、発明者により予見されたいくつかの具体的な実施形態を参照して記載してきた。現在予見されていない修正などの、本発明の実体のない修正は、仮定的であっても、それらと同等のものを構成し得る。したがって、本発明の範囲は、本明細書に記載される詳細及び構造によって限定されず、むしろ以下の請求項及びそれと同等のものによってのみ限定されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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