【手続補正書】
【提出日】平成21年2月2日(2009.2.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３１２】
【表８】
2007528736.tif 000001
2007528736.tif 000002
2007528736.tif 000003
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３１３】
【表９】
2007528736.tif 000004
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３１４】
【表１０】
2007528736.tif 000005
2007528736.tif 000006
2007528736.tif 000007
2007528736.tif 000008
2007528736.tif 000009
2007528736.tif 000010
2007528736.tif 000011
2007528736.tif 000012
2007528736.tif 000013
2007528736.tif 000014
2007528736.tif 000015
2007528736.tif 000016
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３１５】
【表１１】
2007528736.tif 000017
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３１６】
【表１２】
2007528736.tif 000018
2007528736.tif 000019
2007528736.tif 000020
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３１７】
【表１３】
2007528736.tif 000021
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３１９】
【表１５】
2007528736.tif 000022
2007528736.tif 000023
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３２０】
【表１６】
2007528736.tif 000024
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３２２】
【表１８】
2007528736.tif 000025
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３２６】
【表２２】
2007528736.tif 000026
2007528736.tif 000027
2007528736.tif 000028
（他の実施形態）
本発明の幾つかの実施形態について記載してきた。しかし、当然ながら、本発明の思想
および範囲から逸脱することなく、さまざまな変更形態を作製することが可能である。し
たがって、他の実施形態も特許請求の範囲の範疇内にある。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３２７】
【図面の簡単な説明】
【図１】１２１アミノ酸の形態の血管内皮増殖因子、ＶＥＧＦ１２１のｍＲＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１）を示す図。開始コドンの最初のヌクレオチドがヌクレオチド１である。シグナルペプチドはヌクレオチド１〜７８である。
【図２】ＨｅＬａ細胞を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおける、突出部分が１つおよび２つのｓｉＲＮＡの活性の比較分析を示すグラフ。中実の記号を有する実線は突出部分が１つのｓｉＲＮＡを表し、中空の記号を有する実線は突出部分が２つのｓｉＲＮＡを表し；破線は対照のｓｉＲＮＡを表す。対照ｓｉＲＮＡであるｈＶＥＧＦは、ライヒら（Ｒｅｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．）（Ｍｏｌ．Ｖｉｓ．９：２１０、２００３）に記載されており；対照ｓｉＲＮＡであるｈｒｍＶＥＧＦはフィレウアーら（Ｆｉｌｌｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．）（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３：３９１９、２００３）に記載されている。「Ｌ２０００」は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００試薬を表す。ｈＶＥＧＦの発現（ｙ軸）は内在性ＶＥＧＦの発現を表す。
【図３】ＡＲＰＥ−１９細胞における、突出部分が１つおよび２つのｓｉＲＮＡの活性の比較分析を示すグラフ。中実の記号を有する実線は突出部分が１つのｓｉＲＮＡを表し、中空の記号を有する実線は突出部分が２つのｓｉＲＮＡを表し；破線は対照のｓｉＲＮＡを表す。対照ｓｉＲＮＡであるｈＶＥＧＦはライヒら（Ｒｅｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．）（Ｍｏｌ．Ｖｉｓ．９：２１０、２００３）に記載されており；対照ｓｉＲＮＡであるｈｒｍＶＥＧＦはフィレウアーら（Ｆｉｌｌｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．）（上記）に記載されている。「Ｌ２０００」はＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００試薬を表す。ｈＶＥＧＦの発現（ｙ軸）は内在性ＶＥＧＦの発現を表す。
【図４】塩基対を成すヌクレオチドの数が２１である、突出部分が１つのｓｉＲＮＡのＨｅＬａ細胞におけるｓｉＲＮＡ活性を、その類似体である平滑末端ｓｉＲＮＡと比較分析したグラフ。対照ｓｉＲＮＡのｈＶＥＧＦはライヒら（Ｒｅｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．）（Ｍｏｌ．Ｖｉｓ．９：２１０、２００３）に記載されており；対照ｓｉＲＮＡのｈｒｍＶＥＧＦはフィレウアーら（Ｆｉｌｌｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．）（上記）に記載されている。「Ｌ２０００」はＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００試薬を表す。ｈＶＥＧＦの発現（ｙ軸）は内在性ＶＥＧＦの発現を表す。
【図５】塩基対を成すヌクレオチドの数が１９である、突出部分が２つのｓｉＲＮＡのＨｅＬａ細胞におけるｓｉＲＮＡ活性を、その類似体である平滑末端ｓｉＲＮＡと比較分析したグラフ。対照ｓｉＲＮＡのｈＶＥＧＦはライヒら（Ｒｅｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．）（上記）に記載されており；対照ｓｉＲＮＡのｈｒｍＶＥＧＦはフィレウアーら（Ｆｉｌｌｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．）（上記）に記載されている。「Ｌ２０００」はＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００試薬を表す。ｈＶＥＧＦの発現（ｙ軸）は内在性ＶＥＧＦの発現を表す。
【図６】（Ａ）正常な酸素条件下（正常酸素条件、２０％酸素）の細胞における、ＯＲＦ３１９（配列番号３２０）を標的とする突出部分が１つおよび２つのｓｉＲＮＡ（それぞれＡＬ−ＤＰ−４００２およびＡＬ−ＤＰ−４０１４）ならびにＯＲＦ３４３（配列番号３４４）を標的とする突出部分が１つおよび２つのｓｉＲＮＡ（それぞれＡＬ−ＤＰ−４０９４およびＡＬ−ＤＰ−４１０７）の活性を示すグラフ。  （Ｂ）低酸素条件下（１％酸素）の細胞における、ＯＲＦ３１９（配列番号３２０）を標的とする突出部分が１つおよび２つのｓｉＲＮＡ（それぞれＡＬ−ＤＰ−４００２およびＡＬ−ＤＰ−４０１４）ならびにＯＲＦ３４３（配列番号３４４）を標的とする突出部分が１つおよび２つのｓｉＲＮＡ（それぞれＡＬ−ＤＰ−４０９４およびＡＬ−ＤＰ−４１０７）の活性を示すグラフ。  （Ｃ）低酸素条件下（１３０μＭのデフェロキサミン）の細胞における、ＯＲＦ３１９（配列番号３２０）を標的とする突出部分が１つおよび２つのｓｉＲＮＡ（それぞれＡＬ−ＤＰ−４００２およびＡＬ−ＤＰ−４０１４）ならびにＯＲＦ３４３（配列番号３４４）を標的とする突出部分が１つおよび２つのｓｉＲＮＡ（それぞれＡＬ−ＤＰ−４０９４およびＡＬ−ＤＰ−４１０７）の活性を示すグラフ。
【図７】ＨｅＬａ細胞における、ＯＲＦ３１９（配列番号３２０）を標的とする突出部分が２つの非修飾ｓｉＲＮＡ（ＡＬ−ＤＰ−４０１４）と、ホスホロチオエート修飾されたｓｉＲＮＡ（ＡＬ−ＤＰ−４１２７、ＡＬ−ＤＰ−４１２８、ＡＬ−ＤＰ−４１２９）との、活性比較を示すグラフ。対照ｓｉＲＮＡのｈＶＥＧＦはライヒら（Ｒｅｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．）（上記）に記載されており；対照ｓｉＲＮＡのｈｒｍＶＥＧＦはフィレウアーら（Ｆｉｌｌｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．）（上記）に記載されている。「Ｌ２０００」はＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００試薬を表す。ｈＶＥＧＦの発現（ｙ軸）は内在性ＶＥＧＦの発現を表す。
【図８】（Ａ）正常な酸素条件下（正常酸素条件、２０％酸素）の細胞における、ＯＲＦ３１９（配列番号３２０）を標的とするｓｉＲＮＡ（ＡＬ−ＤＰ−４０１４およびＡＬ−ＤＰ−４１２７）ならびに突然変異型のＡＬ−ＤＰ−４１４０（表５）の活性を示すグラフ。対照ｓｉＲＮＡのＣａｎｄ５は図７のｈＶＥＧＦ対照と同一であり、ライヒら（Ｒｅｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．）（上記）に記載されている。「Ｌ２０００」はＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００試薬を表す。ＶＥＧＦの発現（ｙ軸）は内在性ＶＥＧＦの発現を表す。  （Ｂ）  標準または低酸素条件下（低酸素条件、１％酸素）の細胞における、ＯＲＦ３１９（配列番号３２０）を標的とするｓｉＲＮＡ（ＡＬ−ＤＰ−４０１４およびＡＬ−ＤＰ−４１２７）ならびに突然変異型のＡＬ−ＤＰ−４０１４（表５）の活性を示すグラフ。対照ｓｉＲＮＡについては（Ａ）に記載したとおりである。
【図９】（Ａ）〜（Ｅ）ＡＬ−ＤＰ−４０９４の配列を有するが異なるヌクレオチド修飾を含んでいるｓｉＲＮＡ（表４参照）の活性を示すグラフ。図９Ａのセンス鎖は配列番号６５２として、そして図９Ａのアンチセンス鎖は配列番号６５３〜６５８として、それぞれ示した順に開示された。図９Ｂのセンス鎖は配列番号６５９として、そして図９Ｂのアンチセンス鎖は配列番号６５３〜６５８として、それぞれ示した順に開示された。図９Ｃのセンス鎖は配列番号６６０として、そして図９Ｃのアンチセンス鎖は配列番号６５３〜６５８として、それぞれ示した順に開示された。図９Ｄのセンス鎖は配列番号６６１として、そして図９Ｄのアンチセンス鎖は配列番号６５３〜６５８として、それぞれ示した順に開示された。図９Ｅのセンス鎖は配列番号６６２〜６６５、６５２、６５２および６５２として、そして図９Ｅのアンチセンス鎖は配列番号６５３、６５３、６５３、６５３および６６６〜６６８として、それぞれ示した順に開示された。対照ｓｉＲＮＡ「Ａｃｕｉｔｙ」は、図８ＡのＣａｎｄ５対照および図７のｈＶＥＧＦ対照と同一である。「Ｆｉｌｌｅｕｒ」対照ｓｉＲＮＡは、図７のｈｒｍＶＥＧＦ対照ｓｉＲＮＡに相当する。
【図１０】ＨｅＬａ細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでのｓｉＲＮＡの発現抑制活性を示すグラフ。
【図１１】ヒト血清中でインキュベーションした後のＡＬ−ＤＰ−４０９４ｓｉＲＮＡの、ＲＰ−ＨＰＬＣスキャンを示す図。
【図１２】ＬＣ／ＭＳにより測定したＡＬ−ＤＰ−４０９４断片のマッピングの概要を示す図。ヒト血清中でのｓｉＲＮＡのインキュベーション後に、分析を行った（それぞれ示した順に、配列番号６０８〜６０９、１０８０〜１０８２、１０８２〜１０８３、６０８、６６１、６１１および１０８４）。
【図１３】２’−Ｏ−メチル修飾および／または２’−フルオロ修飾されたｓｉＲＮＡの、ＨｅＬａ細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現抑制活性を示すグラフ（表６）。
【図１４】２’−Ｏ−メチル修飾および／または２’−フルオロ修飾されたｓｉＲＮＡの、ＨｅＬａ細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現抑制活性を示すグラフ（表６）。
【図１５】２’−Ｏ−メチル修飾および／または２’−フルオロ修飾されたｓｉＲＮＡの、ＨｅＬａ細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現抑制活性を示すグラフ（表６）。
【図１６】２’−Ｏ−メチル修飾および／または２’−フルオロ修飾されたｓｉＲＮＡの、ＨｅＬａ細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現抑制活性を示すグラフ（表６）。
【図１７】２’−Ｏ−メチル修飾および／または２’−フルオロ修飾されたｓｉＲＮＡの、ＨｅＬａ細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現抑制活性を示すグラフ（表６）。
【図１８】２’−Ｏ−メチル修飾および／または２’−フルオロ修飾されたｓｉＲＮＡの、ＨｅＬａ細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現抑制活性を示すグラフ（表６）。
【図１９】２’−Ｏ−メチル修飾および／または２’−フルオロ修飾されたｓｉＲＮＡの、ＨｅＬａ細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現抑制活性を示すグラフ（表６）。
【図２０】２’−Ｏ−メチル修飾および／または２’−フルオロ修飾されたｓｉＲＮＡの、ＨｅＬａ細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現抑制活性を示すグラフ（表６）。
【図２１】２’−Ｏ−メチル修飾および／または２’−フルオロ修飾されたｓｉＲＮＡの、ＨｅＬａ細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現抑制活性を示すグラフ（表６）。
【図２２】２’−Ｏ−メチル修飾および／または２’−フルオロ修飾されたｓｉＲＮＡの、ＨｅＬａ細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現抑制活性を示すグラフ（表６）。
【図２３】２’−Ｏ−メチル修飾および／または２’−フルオロ修飾されたｓｉＲＮＡの、ＨｅＬａ細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現抑制活性を示すグラフ（表６）。
【図２４】２’−Ｏ−メチル修飾および／または２’−フルオロ修飾されたｓｉＲＮＡの、ＨｅＬａ細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現抑制活性を示すグラフ（表６）。
【図２５】２’−Ｏ−メチル修飾および／または２’−フルオロ修飾されたｓｉＲＮＡの、ＨｅＬａ細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現抑制活性を示すグラフ（表６）。
【図２６】２’−Ｏ−メチル修飾および／または２’−フルオロ修飾されたｓｉＲＮＡの、ＨｅＬａ細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現抑制活性を示すグラフ（表６）。
【図２７】２’−Ｏ−メチル修飾および／または２’−フルオロ修飾されたｓｉＲＮＡの、ＨｅＬａ細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現抑制活性を示すグラフ（表６）。
【図２８】２’−Ｏ−メチル修飾および／または２’−フルオロ修飾されたｓｉＲＮＡの、ＨｅＬａ細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現抑制活性を示すグラフ（表６）。
【図２９】２’−Ｏ−メチル修飾および／または２’−フルオロ修飾されたｓｉＲＮＡの、ＨｅＬａ細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現抑制活性を示すグラフ（表６）。
【図３０】２’−Ｏ−メチル修飾および２’−フルオロ修飾が交互になっているｓｉＲＮＡの、ＨｅＬａ細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現抑制活性を示すグラフ（表７）。
【図３１】コレステロールおよびコラン酸が結合したｓｉＲＮＡの、ＨｅＬａ細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現抑制活性を示すグラフ（表８）。
【図３２】コレステロールおよびコラン酸が結合したｓｉＲＮＡの、ＨｅＬａ細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現抑制活性を示すグラフ（表８）。
【図３３】コレステロールおよびコラン酸が結合したｓｉＲＮＡの、ＨｅＬａ細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現抑制活性を示すグラフ（表８）。
【図３４】ナプロキセンが結合したｓｉＲＮＡの、ＨｅＬａ細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現抑制活性を示すグラフ（表９）。
【図３５】ビオチンが結合したｓｉＲＮＡの、ＨｅＬａ細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現抑制活性を示すグラフ（表１０）。
【図３６】５’−レチナール結合ｓｉＲＮＡの、ＨｅＬａ細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現抑制活性を示すグラフ（表１１）。
【図３７】リボ−ジフルオロトルイル修飾されたｓｉＲＮＡの、ＨｅＬａ細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現抑制活性を示すグラフ（表１３）。
【図３８】２’−アラフルオロ−２’−デオキシヌクレオシド修飾されたｓｉＲＮＡの、ＨｅＬａ細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現抑制活性を示すグラフ（表１４）。
【図３９】オリゴヌクレオチド合成用の５’−Ｏ−ＤＭＴｒ−２’−デオキシ−２’−フルオロＡ、Ｃ、ＧおよびＵのＣＰＧ支持体を示す図。これらの支持体は、表６および７に列挙する選択された配列の合成に使用された。
【図４０】オリゴヌクレオチドとの結合用の、コレステロールおよび５β−コラン酸（またはコラン酸）結合用構成単位を示す図。これらの構成単位は、表８に列挙する選択された配列の合成に使用された。
【図４１】オリゴヌクレオチド合成用の、５ＭｅＣおよび５ＭｅＵのＲＮＡ構成単位を示す図。これらの構成単位は、表８に列挙する選択された配列の合成に使用された。
【図４２】オリゴヌクレオチドとの結合用の、ナプロキセン−トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリノールおよびナプロキセン−セリノール構成単位を示す図。これらの構成単位は、表９に列挙する選択された配列の合成用に使用された。
【図４３】オリゴヌクレオチドとの結合用の、ビオチン−トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリノールおよびビオチン−セリノール構成単位を示す図。これらの構成単位は、表１０に列挙する選択された配列の合成用に使用された。
【図４４】合成後に結合するための構成単位−オキシム法を示す図。これらの構成単位は、表１１に列挙する選択された配列の合成用に使用された／される。
【図４５】合成後に結合するための構成単位−活性エステル法を示す図。これらの構成単位は、表１２に列挙する選択された配列の合成に使用された。
【図４６】オリゴヌクレオチド合成用の、ＤＦＴのアミダイトおよびＣＰＧを示す図。これらの構成単位は、表１３に列挙する選択された配列の合成に使用された。
【図４７】オリゴヌクレオチド合成用の２’−デオキシ−２’−アラｆアミダイトを示す図。これらの構成単位は、表１４に列挙する選択された配列の合成に使用された。
【図４８】リボ５ＭｅＵおよびリボＣ（ＮＡｃ）のＰ−メチルホスホンアミダイトを示す図。これらの構成単位は、表１５に列挙する選択された配列の合成に使用された。
【図４９】Ｃ５−アミノアリルＵアミダイトを示す図。この構成単位は、表１６に列挙する選択された配列の合成に使用された。
【図５０】チオコレステロール結合の構成単位を示す図。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2007528736000001.app