【手続補正書】
【提出日】平成21年3月23日(2009.3.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１７】
細胞培養で増殖させたウマインフルエンザウイルスA/ウマ/オハイオ/03を刺激ウイルスとして使用した。気管内刺激では、刺激ウイルスは、カフ付き気管チューブ（サイズ 4.0/4.5、Sheridan, USA）および給液チューブ（サイズ 5Fr、1.7mm、長さ /16インチ、Kendall, USA）からなる送達チューブを介して、0.5〜1.0mlの液量で投与した。口鼻腔刺激では、刺激ウイルス（107〜108 TCID50/イヌ）を噴霧器（DeVilbiss Ultra-Neb（登録商標）99超音波噴霧器、Sunrise Medical, USA）を用いて2〜3mlの液量でミストとして投与した。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２４】
最初の群は、不活化してCARBIGEN（商標）でアジュバント化したウマインフルエンザウイルスA/ウマ/オハイオ/03ワクチンを8〜12週齢の時点で皮下（SQ）経路によってワクチン接種した5頭のイヌから構成された。A/ウマ/オハイオ/03は、標準的な方法を用いてバイナリーエチレンイミン（BEI）により不活化した。ワクチンの各用量には、質量に基づいて5％のCARBIGEN（商標）、不活化ウイルス 4096 HA単位、用量の総液量を1mlとするために十分なPBS、およびpHを7.2〜7.4に調整するために十分なNaOHが含まれた。H3N8ウマインフルエンザウイルス標準的プロトコル（SAM 124, CVB,USDA, Ames, IA）を用いてHI力価を測定するために、1回目および2回目ワクチン接種日、ならびに1回目および2回目ワクチン接種後7日および14日、ならびに刺激前に全てのイヌから血清試料を採取した。2回目ワクチン接種後3週に、ワクチン接種したイヌ5頭および齢期の対応するイヌ4頭からなる第2群（即ち、対照群）を細胞培養で増殖させたウマインフルエンザウイルスA/ウマ/オハイオ/03（107.0〜108.0 TCID50/イヌ）で1頭当たり1〜2mlの液量にて口鼻腔内投与により刺激した。刺激ウイルスは噴霧器（DeVilbiss Ultra-Neb（登録商標）99超音波噴霧器、Sunrise Medical, USA）を用いてミストとして投与した。刺激後14日間、インフルエンザ関連性の臨床徴候についてイヌを観察した。病理組織学的評価に備えて肺組織を10％緩衝ホルマリンに採取するために、刺激後7日に5頭（ワクチン接種群 3頭、対照群 2頭）および刺激後14日に4頭（対照群 2頭、ワクチン接種群 2頭）のイヌを人道的に安楽死させた。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３０】
手順：
雌雄の約16カ月齢の雑種20頭およびビーグル犬20頭を試験に使用した。イヌは各群6〜7頭の6群（表31）に無作為に振り分けた。1および4群のイヌには、16および17カ月齢の時点で、市販の不活化してアジュバント化したウマインフルエンザワクチン（EQUICINE（商標）, Intervet Inc., Millsboro, DE）を皮下（SQ）経路によりワクチン接種した。2および5群のイヌに修飾ウマ/ケンタッキー/91生インフルエンザワクチンを1mlの液量で鼻腔内投与（単一の鼻孔）によりワクチン接種した。標準的プロトコル（SAM 124, CVB, USDA, Ames, IA）を用いてH3N8ウマインフルエンザウイルスおよびイヌインフルエンザウイルスを用いたHI力価の測定に備えて、ワクチン接種日、1回目ワクチン接種後（1、2、4および5群）および2回目ワクチン接種後（1および4群）7および14日に血液試料を採取した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３１】
ワクチン接種群（最終のワクチン接種後72時間）および対照群に、細胞培養で増殖させたウマインフルエンザウイルス株であるA/ウマ/オハイオ/03（1頭当たり107.0〜108.0 TCID50）を1〜2mlの液量で口鼻腔内投与により刺激した。刺激ウイルスは噴霧器（DeVilbiss Ultra-Neb（登録商標）99超音波噴霧器、Sunrise Medical, USA）を用いてミストとしてイヌに投与した。刺激後12日間、インフルエンザ関連性の臨床徴候についてイヌを観察した。ウイルス分離のため、刺激後−1日から12日まで毎日、抗生物質（ネオマイシンおよびポリミキシンB）を加えたEarl MEM培地に鼻腔および口咽頭スワブを採取した。スワブ中のウイルスの存在は、動物が鼻/口分泌物中にウイルスを排出していることを示す。病理組織学的評価に備えて、全てのイヌを刺激後12日に人道的に屠殺して肺組織を10％緩衝ホルマリン中に採取した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４２】
約12週齢の時点でイヌを刺激した。孵化鶏卵で増殖させたイヌインフルエンザウイルス（A/イヌ/フロリダ/242/03）ウイルスを刺激ウイルスとして使用した。各イヌに、合計約107.2 TCID50のウイルスを2ml（口鼻腔内投与）または4ml（気管内/鼻腔内投与）のいずれかの液量で投与した。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５２】
結論：
本試験で用いられたもののようなH3N8イヌインフルエンザ分離物は、104.8〜106.8 TCID50の刺激用量範囲で、本試験で記載された方法または同様の方法を用いてイヌにおいてイヌインフルエンザ様またはケンネルコフ様の疾病を誘発するために用いられ得る。雑種犬およびビーグル犬に認められた臨床徴候にはいくつかの相違があった。一般に、ビーグル犬は雑種犬に比してより軽度のインフルエンザ関連性の臨床徴候を示す傾向がある。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５８】
ワクチン接種群および齢期の対応する対照群の全てのイヌを、1および4群の2回目ワクチン接種後ならびに2群の1回目ワクチン接種後2週に病原性イヌインフルエンザウイルス（1頭当たりA/イヌ/フロリダ/242/2003 107.7 TCID50）の口鼻腔内投与により刺激した。刺激ウイルスは噴霧器（Nebulair（商標））を用いてミストとして1頭当たり2mlにて投与した。刺激後17日間、インフルエンザ関連性の臨床徴候についてイヌを観察した。刺激後−1日（即ち、刺激前日）から17日までウイルス分離のため、ウイルス輸送培地 2mlを含む試験管に鼻腔および口咽頭スワブを採取した。病理組織学に備えて、全てのイヌを刺激後17日に安楽死させて、肺および気管の試料を10％緩衝ホルマリンに採取した。HI力価測定のため、刺激後7および14日に血液試料を採取した。刺激後観察において用いられた臨床徴候スコア割付を表36に示す。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７４】
ワクチン接種群および齢期の対応する対照群の全てのイヌを、1群の2回目ワクチン接種後および2群の1回目ワクチン接種後2週に病原性イヌインフルエンザウイルス（1頭当たりA/イヌ/フロリダ/242/2003 107.3 TCID50）の口鼻腔内投与により刺激した。刺激ウイルスは噴霧器（Nebulair（商標））を用いてミストとして1頭当たり2mlにて投与した。刺激後14日間、インフルエンザ関連性の臨床徴候についてイヌを観察した。病理組織学に備えて、全てのイヌを刺激後14日に安楽死させて、肺および気管の試料を10％緩衝ホルマリンに採取した。HI力価測定のため、刺激後7および14日に血液試料を採取した。刺激後観察において用いられた臨床徴候スコア割付を表42に示す。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８７】
ワクチン接種群および齢期の対応する対照群の全てのイヌを、2回目ワクチン接種後2週に病原性イヌインフルエンザウイルス（1頭当たりA/イヌ/フロリダ/242/2003 107.4 TCID50）の口鼻腔内投与により刺激した。刺激ウイルスは噴霧器（Nebulair（商標））を用いてミストとして1日当たり2mlにて投与した。刺激後14日間、インフルエンザ関連性の臨床徴候についてイヌを観察した。HI力価測定のため、刺激後7および14日に血液試料を採取した。病理組織学に備えて、全てのイヌを刺激後14日に安楽死させて、肺および気管の試料を10％緩衝ホルマリンに採取した。刺激後観察において用いられた臨床徴候スコア割付を表47に示す。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３０１】
ワクチン接種群および齢期の対応する対照群の全てのイヌを、2回目ワクチン接種後2週に病原性イヌインフルエンザウイルス（1頭当たりA/イヌ/フロリダ/242/2003 107.2 TCID50）の口鼻腔内投与により刺激した。刺激ウイルスは噴霧器（Nebulair（商標））を用いてミスト（2ml/イヌ）として投与した。刺激後14日間、インフルエンザ関連性の臨床徴候についてイヌを観察した。刺激後−1日（即ち、刺激前日）から14日までウイルス分離のために、ウイルス輸送培地 2mlを含む試験管に毎日、鼻腔および口咽頭スワブを採取した。HI力価測定のため、刺激後7および14日に血液試料を採取した。刺激後観察において用いられた臨床徴候スコア割付を表52に示す。